Seminar Nasional Perhimpunan Hortikultura Indonesia 2011

PRESENTER PARTICIPATION
Studies on Different Disinfectanct Material on
Sterility and Viability of Mango lmmature Flower Bud
in Vitro Culture
Written by:
Mochammad Roviq
Tatik Wardiyati
Presented at "Seminar Nasional Perhimpunan Hortikultura lndonesia 2011"
in Balitsa Lembang, 23-24 November 2011
AGRICULTURE FACULTY
BRAWIJAYA UNIVERSITY
MALANG
2011
ITAS DAN VIABILITAS TUNAS BUNGA MUDA
GA PADA PERBEDAAN BAHAN DISINFBKTAN
DALAM KULTURIN YITRO
DISINFECTANT MATENAL ON STEMLITY AND VIABILTTY
OF MANGO IMMATAXE FLOWTR BUD
IN
IN WTRO CALTARE
Mochammad Roviqr)-, Tatik lVardiyatir)
Pertanian Universitas Brawijaya (FP-UB), Jl. Yeteran Malang 65145
Indonesia, TelplFax. 0341 -5516l I/0341-56001
I
Email : [email protected]
ABSTRACT
&trface disinfection is
a critical
early stage affecting culwre initiation and subsequent
. However, during explant preparation
system of Mangifera indica unapened .flov'er
it is wry dilJicult to obtain plenty of sterilized materials b\t using ordinary disinfectant.
ily
was to determine the
ffict
of l0% (viu) of sodium fuipochlorite (5;25% NaOCI) .fot l0
as ane treotment ard. of 5% (vru) sodium hypochlorite -for 5 minutes and
(4.8%
C8IIfiO),fur
The aim o.f
I% (vlu) of
5 minutes as the other treatment on in vitro viability and growth
of
tlower bud of mango. A high success rate (85- l00yo) in sut'ace disinfectd was sstociated
@ants from
5%o
oJ'chloroxylenol Jbr 5 minutes and 5%o stltum hypochlorite
far
5 minutes. The
contamination rate alter 14 days was below l5%; in conlrosL a contamination rate up to
vas observed in l0% of sulium hypachlorite.for lA minutes. Nevurtheless, all explants sterilized
chloroxylenol in a disinfectant solution wers stagnant until
I
months afier tra*sferreel into
trlia.
ta
An the conffary, aseptic explan$ sterilized, only by todium lyrychlorite were viable
getsrale callus for 3 - 5 weeh infirst establishnert slage.
nango, .fl aw e r, i ffima t ur e. chl or oxy leno l, di s i n-fec t snt
PENDAHULUAN
Hingga saat ini penelitian embryogenesis somatik pada mangga beltrm pernah
organ bunga. Banyak penelitian menuqfukkan bahwa embriogenesis
menggrurakan nucellus sebagai eksplan adalah metode yang paling sukses
propagasi
d.1994;
invito pada qangga(Li1uet a1.,1982;DeWald
et a1.,1989a, b;Jana
Ara et a1.,1.999; Patena et a1.,2002; Xiao et al., Ermayanti dan Rantau,
Teknik ini telah diterapkan pada beberapa kultivar mangga India, Australia
Aurerika (Litz, 1984;
Litz et al, 1998; Thomas, 1999). Sesungguhnya,
bunga sebagai eksplan tidak sekedar memanfaatkan tingginya kerontokan
mangga tetapi juga tidak perlu mengambil embrio bdi pada buah rnangga"
lebih menghemat waktu.
Kendala pengunaan bunga muda manga yang belum mekar sebagai eksplan
kultur in vitro adalah kontaminasi yang sangat tinggi. Kontarninasi eksplan
fuirgsi dari hubungan antara tanaman dengan faktor lingkungan seperti spesies
urnur, sumber eksplan dan kondisi cuaca yang berlangsung pada
diambil (Singh et
karena berada
saat
al.,2All). Tidak sebagaimana embrio yangjauh lebilr lebih
di dalam biji dan buah,
tunas bunga mangga terpapar oleh
saat pertumbuhannya. Upaya mengurangi kontaminasi
dengan
tanaman pada rumah kaca atau lingkungan yang lebih terbatas dan
i tidaklah berlaku uutuk mangga yang merupakan tauaman tahtrnan, Faktor
tiogkungal yang dapat meningkatkan kontaminan adatah adanya debu, kelembaban
dan hujan. Debu yang menempel pada daun dengan mudah menyebar ke bagian
hrnga akibat percikan air hujan. lntensitas hujan yang tinggr ini menyebabkan kondisi
yang lembab disekitar kuncup bunga. Hal ini menyebabkan jamur dan bakteri dapat
I
b-
berkembang dengan baik. Kontaminasi
ini akan semakin tinggi jika
ada berkas debu
ir
atau kotoran yang menempel pada kuncup bunga. Untuk rnengurangi sumber
kontaminan hanya dipilih bunga yang relatif bersih, tidak ada tanda kotoran dan jejak-
jejak adanya serangga yang bersarang di kuncup bunga. Oleh karena itu, keberhasilan
tahap sterilisasi untuk ekplan
ini
sangat penting uutuk mencapai tahap
kulnr in intro
selanjutnya.
Sterilisasi yang merupakan pembebasan eksplan dari kontarninasi adalah
sebualr proses awal yang sangat penting dalam kulrur jaringan. Berbagai sterilan
r
r
i
digunakan untuk mendekontarninasi organ atau jaringan terutarna dari bakteri dan
cendawan. Tetapi, sterilan tersebut juga beracun bagi jaringan tanaman. Konsentrasi
yang tepat dari sterilan, lamanya eksplan terpapar berbagai sterilan,
urutan
pengguman sterilan harus diupayakan dapat meminirnalkan kerusakan eksplan dan
mampLr menjaga peluang hidupnya dengan lebih baik (CPRI, 1992).
Terdapat dua jenis bahan sterilan berdasarkan penggunaannya yaitu
disinfektan dan antiseptik. Disinfektan yang secara luas digunakan adalah sodium
hipokloriq kalsiurn hipoklorit, etanol (atau isopropil alkohol), merkuri kloridq
hidrogen peroksida, perak nitrat dan bromin. Hipoklorit dikenal sebagai'pembunuh
bakteri yang sangat efektif, dan meskipun hanya dalam konsentrasi miko molar
mampu mengurangi populasi bakteri secara nyata (Singh et
al.,20ll).
Sodiurn
hipoklorit (NaOCl) ditemukan lebih baik dalarn mengendalikan infeksi dan tidak
mernberikan efek bnruk pada eksplan bahkan dalam jangka waktu yang lama (Badoni
dan Chauhan, 2010). Sodiurn hipoklorit banyak digunakan sebagai disinfektan dalarn
embryogenesis sornatik,
sebaliknya, kloroksilenol (csHeclo) yang merupakan disinfektan yang dapat
ditemukan dan kornposisinya mencapai 4.s% dmt penylsur Dettol lebih jarang
digunakan sebagai bahan sterilan daripada NaOCl. Kloroksilenol ialah senyawa
antimikrobayang digrrnakan untuk rnengendalikan bakteri, alga dan cendawan dengan
kadar iritasi rendah dan tidak bersifat korosif. Kloroksilenol efektif rnengendalikan
bakteri gram positif tetapi kurang. aktif dalam mengendalikan bakteri gram negative
(Hoffinan, et a1.,2004). Penelitian bertujuan untuk mengetahui efektifitas dari sodiurn
hipoklorit dan kloroksilenol sebagai disinfektan pada sterilisasi kultur kuncup bunga
mangga yang belum mekar dan untuk mengetahui viabilitas ekplan hingga
mernbentuk kalus.
BAHAN DAN METODE
Kturcup brurga mangga diambil dari kebun koleksi Balai Benih Induk poh
Jenfrek Pasuruan. Kuncup bturga dipilih yang rnasih muda dan belum mekar. Kmcup
bunga dipilih yang berukuran sedang dan belurn membuka. Pada pagi hari sekitar jam
G7, burga tersebut dipotong dengan menyertakal cabang tandan burga. Bunga
beserta tandannya dimasukkan dalarn kontainer yang berisi es kering untuk rnenjaga
tesegarannya dan kemudian
di bawa ke Laboratorium Kultur Jaringan Fp-UB di
Malang. Kernudian, bunga beserta tandannya dibilas menggunakan air kran mengalir
mtuk membersihkan debu, berkas embun atau hujan yang nampak. Bunga beserta
mdannya direndam-dikocok dalam detergen sebanyak dua kali masing-masing
r
cdama 5 menit. Selanjutnya dibilas menggrurakan air kran rnengalir. Bunga beserta
dan yang sudah bebas dari detergen dimasukkan ke dalarn larutan fungisida benlate
O37o selarna 30 rnenit. Setelah diambil dan ditiriskan, bunga beserta tandannya
direidam pada perlakuan bahan sterilan yairu perlakuan pertama Bayclin l0o/o (10o/o
(v/v) sodium hipoklorit {5.25% NaOC$ selama 10 menit atau perlakuan
lainnya
edalah 5% (vlv) sodium hipoklqrit (5.25%NaOCl) dikombinasikan dengan t% (vtv)
ltoroksilenol; Dettol (4.8% CsHgClO) rnasing-nrasing selama
5 menit secara
berurutan. Kemudian bunga beserta tandannya dibilas rnenggunakan aquades steril
sebanyak
3 kali.
Kuncup
,b*gu
yang telah steril dipindahkan ke cawan petri.
Dihindari memindahkan terlalu banyak air dari dalam taburg pada saat memindahkan
hmcup bunga ke cawan petri baru. Bunga beserta tandannya kemudian di potong
dalam I00 ppm larutan vitamin
C untuk menekan poterxi
pencoklatan. Bunga
dilepaskan dari tandannya. Kuncup btrnga diiris dengan posisi rnelintang sekitar 1/3
panjang btrnga dari dasar btrnga menggturakan pisau skalpel steril. Kemudian bunga
da
tangkai tunggal ditanarir pada media % MS yang mengandung 0.2 ppm BA, 2
1pm 2.4D dan4.5olo sukrosa. Eksplan ditanaru menyebar di permukaan media (1 botol
d4at berisi 4 eksplant). Botol ditutup rapat menggunakan plastik transparan yang
lc'ah diterilkan dan ditempatkan pada kondisi gelap. Pengamatan
*silisasi
dilakukan sehari sampai
l4 hari
keberhasilan
sefelah inokulasi. Pengamatan peftumbuhan
telus diamati rnulai 2 minggtr hingga 12 rninggu pasca inolarlasi. Apabila muncul
hilus, maka dilakukan sub kultur ke media baru setelah 4 minggu.
HASIL DAN PBMBAHASAN
Hasil pengamatan menunjukkan bahwa 1% kloroksilenol (4.8% C*IsClO)
5 menit dan 5Yo
(v/v) sodium hipoklorit (5.Z|o/oNaocl) selama 5 menit lebih
mengurangi tingkat kontaminasi ekplan bunga mangga daripada
Itrfim
hipoklorit (5.25% NaOCI) selama
l0
l0% (vlv)
menit. Tingkat sterililitas dari
frrrbinas; desinfektan kloroksilenol dan sod.iun hipoklorit mampu
meuekan
trynminasi hingga l00o/o dengan tingkat kontaminasi maksimal adalah 16%.
s:tatilcnya penggunaan disinfektan lao/o (v/v) sodium hipoklorit (5.25% Naocl)
Lrya
mampu menekan kontamhasi maksimal adalah 55o/o dengan tingkat
Saminasi
mencapai 87% (Grafik
l).
^80Yn
}R
€
.E oo,..r,
E
E
c
to 4ovi,
rl
J
6!
tr
tr 2o,i
*'
tt
",1'"0 oo',,}lLl'j
"
"'o
L Tingkat
kontarninasi (%Q pada kultur tunas burga mangga behun mekar
pada ljo/a (viv) sodiurn hipoklorit {5.25% Naocl) lebih ringgi daripada
S%(v/v) sodium hipoklorit + l% kloroksilenol (4.8%CaH(lO)
sodium hiploklorit sudah dikenal efektif sebagai disinfektan pada berbagai
kultur jaringan (pustaka). Namun demikian pada sterilisasi eksplan bunga
yang belum mekar ini, kontaminasi pada
l0%(vlv) sodiwn hipoklorit (5.25o/o
selama 10 menit sangat tinggr. Tingginya kontaminasi tersebut diduga lebih
disebabkan oleh tingginya kontaminan yang terdapat pada bunga mangga yang
dimbil langsurg di lapang. Anatomi
yang belum mekar pada taldan
fuuras mangga
!:
i:
k
5
ri
cagal menyulitkan proses sterilisasi. Bunga dalarn cluster yang
bergerornbol
menyebabkan banyak bagian yang lebih sulit dijangkau daripada
jika
bentgk
perrrukaan eksplan rata dan halus (Gambar).
s$
.{
'*.
Gambar 2. a. kuncup bunga mangga yang belun mekar sebagai eksplan b. bunga
mangga beserta tandannya disterilkan dalarn larutan disiniektan disertai
dengan pengocokan untuk meningkatkan penetrasi bahan aktif ke sela
antar turas bunga, c. kontaminasi akibat jamur, d. kontaminasi akibat
bakteri
Kecepatan munculnya kontaminasi menunjukkan bahwa kornbinasi L% (v/v)
kloroksilenol (4.8% CsHqCIO;Dettol) selama 5 menit dan 5%(v/v) sodiwn hipoklorit
(5-25% NaOCI) selama 5 menit lebilr efektif menekan wakru munculnya kontaminasi
drylan bunga mangga daripada l0% (vlv) sodium hipoklorit (5.25%Naocl) selama
l0
menit. Kontarninasi mulai muncul pada hari pertama hingga keernpat
pasca
irokulasi pada penggruraau NaOCl sebagai sterilan tunggal dengan kisaran lg hingga
tlYo. Sebaliknya, pada kornbinasi desinfektan kloroksilenol dan sodigm hipoklorit,
&mtaminasi banr mtrrcul pada harikeenam dan ketuju setelah inokulasi (Gambar
3).
I (xl'r,.
ll.r,-.,- L
!l{.I:',.
8ll':''l
'E
'E
lr
6
.x
f
7tr,r',
t,rI,.
!,{.t''.,,,
.5
F'
t
to'"'
f,!.r,.,'.
ll'.,.,
-.H",:1,:,
no
+
2l-|':',:,
10':ii
{
rhll
}':'ir
tl).
1567
Waktu munculnya kontaminan {hari}
Gambar 3. Kontaminasi pada
l\yo (vlv) sodium hipoklorit (s,25% Naocl) mulcul
lebih cepat daripada
5a/o
(.vlv) sodium hipoklorit
+ lYo kloroksilenol
(4.8% CsHsClO)
Namun demikian keberhasilan menekan kontaminasi oleh kornbinasi antara
1% (v/v) kloroksilenol (4.s% csHeclo) selama 5 menit
dan s% (v/v)
sodiurn
hipoklorit (5.25% NaOCI) selama 5 menit tidak diikuti dengan perhunbuhan kalus
pada eksplan bunga mangga yang belurn mekar hingga enam belas minggu paska
inokulasi. Sebaliknya, seluruh eksplant steril yang terbebas dari kontaminasi pada
penggunaan l0% (v/v) sodium hipoklorit (5.25o/o
NaoCl)
selama
l0
menit
membentuk kalus sekitar tiga hingga empat rninggu setelah inokulasi (Gambar 3).
Kegagalan pernbentukan kalus pada penambahan perlakuan khloroxylenol
ceF{sClo; Dettol) pada sodium hipoklorit diduga bahwa daya disinfektasi
sangat kuat. Sebuah penelitian yang dilakuk an padakasus mikroba nosokomial
bahwa Dettol adalah agen yang mematikan dan tidak ada penurunan
n'-rretian mikroba setelah periode kematian eksponensiel.
Hal ini rnenunjukkan
ri&k
ada subpopulasi yang dapat bertahan pada larutan Dettol (El Mahmood
r*
r
F
F
,
I
I
,
dan Doughari, 2008). Selama sterilisasi, hanya kontarninan yang
harus dihilangkan,
li
!
I
sehingga eksplan disterilkzur dengan larutan disinfektan baik tunggal
maupun
tombinasi pada konsentrasi yang cocok dalarn suatu periode tertentu
maghilangan aktivitas biologis tanaman atau ekplan (oyebanji et
al.,
tanpa
z0og).
Meskipun daya toksik kloroksilenol, bahan utama yang mencapai 4.g%
dan
komposisi Dettol, dilaporkan tidak sangat beracun, niunul Dettol
sendiri merupakan
larutan campuran. Bahan penyusun Dettol yang lain adalah isopropanol,
minyak
pinus, minyak jarak, karamel dan air. Diantara bahan penyusun
dettol selain
kloroksilenol' minyak pinus dan rninyak jarak telah diketahui memiliki
daya racun
yang cukup tinggimasing-masing secara bertrmrtan mengandung
senyawa fenolik dan
ricin. Beberapa penelitian menyebutkan bahwa Dettol sering dikombinasikan
de,gan
HgClz efektif sebagai disinfektan (Gawde dan paratkar,2003;
Govindara dan Dian4
2007; Satdive, et al-,2011). Aplikasi dettol lebih awal, kemudian
dibilas tiga hingga
lima kali, di beberapa penelitian dengan menggunakan alcohol, setelah
itu dilanjutkan
dengan HgCl2. Urutan ke{a
ini lebih
menguntmgkan dan lebih menjamin sisa
disinfektan tidak menempel pada eksplan, bahkan hingga l0% (v/v)
Dettol
(Govindara dan Dian+ 20a7). Dettol yang tersusun
antara lain oleh minyak pinus dan
minyak jarak memiliki peluang besar urfuk menyisakan bahan
aktif sterilan pada
ekplan. Kedua faktor yaitu kornbinasi bahan beracun dan berkas
sterilan yang tidak
bersih pada ekplan inilah yang diduga menjadi penyebab
tidak muncglnya kalus
selama empat bulan.
Kalus hanya turnbuh pada rnetocle sterilisasi menggunak
an l}o/o(vlv) sodium
hipoklorit (5.25% Naocl) serama r0 menit. Semua kuncup
bunga mangga yang roros
dari kontarninasi dapat rnenghasilkan kalus. Kalus rnulai narnpak
terbentuk pada umur
10
3 minggu setelah inokulasi. Pennukaan kalus berwarna gelap atau hitam meskipun
media tumbuh tidak mengalami pencoklatan (Garnbar 4). Sub kultur dilakukan empat
rninggu sekali unfuk menjaga kecepatan penurnbtrhan kalus.
Gambar 4. Perkembangan kalus. (a) ekspant pada saat inokulasi pada pedia % MS- (b)
eksplant bunga mangga umur 2 bulan yang sudah tumbuh kalus (c) eksptant
bunga mangga umur 4 bulan
KESIMPULAN
KESIMPULAN
T% (vlv) kloroksilenol; Dettol (4.s% csHqclo) yang diberikan setelah 5%
(v/v) sodium hipoklorit (5.25% NaOCI) masing-masing selama 5 menit efektif
sebagai disinfektan, namun ekplan kuncup bunga mangga yang belum mekar gagal
dalam membenhrk kalus.
SARAN
Perlu diteliti lebih lanjut prosedur penggmaan Dettol sebagai disinfektan, baik
sebagai sterilan tunggal atau kornbinasi dalam hal konsentrasi, urutan perlakuan dan
pem.bersihan bahan aktif yang dapat tersisa pada ekplan.
11
UCAPAN TERIMA KASIH
Terima kasih disampaikan kepada Direllorat Jenderal Pendidikan Tinggi,
Kementerian Pendidikan Nasional dan Rektor Universitas Brararijaya yang telah memberikan
dana penelitian serta Balar Benih Induk Poh Jentrek yang telah menyediakan bahan penelitian
DAFTAR PUSTAKA
Ara H, Jaiswal u, Jaiswal vs .1999.. Germination arrd plantlet regeneration fi'om
encapsulated somatic embryos of mango (Mangifera indicaL.). Plant Cell
Reports. l9: 166-170.
Badoni, A. and J. S. Chauhan. 2010. In Vitro Sterilization Frotocol for
Micropropagation of Solanunt luberoxrm cv. 'Kufri Hirnalini'. Acadernia
Arena. 2(4):
Central Potato Research Institute, Shimla .1992.. Tissue Culture technique for potato health,
conservation, micro propagation and improvement. CPRI, Shimla.l-23
Dewald, sG Litz RE, Moore, GA .1989a. optimizing somatic ernbryo production in
mango. J. An. Soc. Hort. Sci.ll4'.712-716
DeWald, SG, Litz RE, Moore, GA .1989b. Maturation and germination ofmango
somatic embryos. J, Arn. Soc. Hort. Sci. 114:837-841
EL Mahftood, A. M. and J.H. Doughari. 2008, Effect of Dettol on viability of some
microorganisms associated with nosocomial infections. African Joumal of
Biotechnology. 7 (10): 1554-1562
Ermayanti, TM and Rantau DE.2009. Establishment of somatic embryogenesis of
some mango cultivars (Mangifera indica L.) grown in Indonesia. Joumal of
Biotechnology Research in Tropical Region. 2 (2)
Gawde, A.J. and DT. Paratkar. 2003. Micropropagation of liclipta a/ba Hassk": An
approach to shorten the protocol. Indian Jounralof Biotechlogy.3:lz$-132
Govindara, S., and R.K.B. Diana, 2a07. Efftcient in vilro micropropagation and
regeneration of Artemisia wlgaris L. Crop Breeding and Applied
Biotechnolo gy . 7 :1 17 -124
MM, Nadgauda RS, Rajrnohan, K, Mascarenhas, AF .1994. Rapid somatic
embryogenesis from the nucelli ofmonoembryonic mango varieties. In Vitro
C e I ltil ar D e ve loptn en t B i o logt -1, lun t. 3 : 5 5 -5'l .
LiE RE .1984. In vitro somatic embryogenesis from nucellar callus of
monoembryonic maflgo . Hort Science. 19: 715-717 .
Jama
I
t2
Litz RE, Hendrix RC, Moon PA, chavez vM .lggS.Induction of embryogenic mango
cultures as affected by genotype, explanting,2,4-D and embryogenic nurse
culture. Plant Cell, Tissue andOrganCultare.53: 13-18.
Litz RE, Knight RL, Gazit s ,1982. Somatic ernbryos from cultured ovules of
polyernbryonic Mangifera indicqL. Plant Cell Reports. l:254-266
Oyebanji, O. 8., O. Nweke, O. Odeburuni, N. B. Galadima, M. S. Idris, U. N. Nnodi,
A. s, Afolabi and G. H. ogbadu. 2009. simple, efffective and economical
explant-surface sterilization protocol for cowpea, rice and sorghum seeds.
African Journal of Biotechnolory.S (20): 5395-5399
Patena LF, carlos-Refuerzo LR" Barba RC .2002. Somatic embryogenesis and planlet
regeration in mango (Mangifera indica L.) In vitro cell Dev. Biol. plant.
38:173-177
Satdive, R.K., s, Eapen, and D.P. Fulzele. 2011. Bioactive constituents and
antimicrobial activity of cell cultures of Azadirachta indica.Intemational
Joumal of Pharma and Bio Sciences. 2(4):
singh, v., A. Tyagi, P.K. clrauhan, P. Kumari and s. Kaushal. 20r r. Idenrification
and prevention of bacterial contimination on explant used in plant tissue culture
labs. International Journal of Pharmacy and Pharmaceutical Sciences. 3(4):
Thomas, P .1999. Somatic ernbryogenesis and plantlet regeneration from nucellar
tissue of monoembryonic mango. J Hort sci Biotechnor. T4: r3s-139.
Xiao, JN, Huang XL, wu YJ, Zhou, MD and, Engelmann F .2003. Direct somatic
embryogenesis induced from cotyledons of mango immahre zygotic embryos