marcadores molecuiares tipo microsatelites andres pedraza llinas

Transcription

VARIABILIDAD GENETICA EN POBTACIONES DE GANADO CRIOLLO
COLOMBIANO DE RAZA BLANCO OREJINEGRO MEDIANTE
MARCADORES MOLECUIARES TIPO MICROSATELITES
ANDRES PEDRAZA LLINAS
UNIVERSIDAD DE CIENCIAS APTICADAS Y AMBIENTALES
UDCA
FACULTAD DE CIENCIAS PECUARIAS
MEDICINA VETERINARIA
BOGOTA D.C.
2010
UDCA
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VARIABILIDAD GENETICA EN POBLACIONES DE GANADO CRIOLLO
ÍI,IARCADORES MOLECU LARES
Tt
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MtC
RO9{TEL|TES
TRABAJO DE GRADO
Presentado como requisito para optar al título de
MEDICO VETERINARIO
Director:
RODRIGO ALFREDO ÍT4ARTÍNEZ PhD
Codirector:
FERNANDO GALLEGO PhD
UNIVERSIDAD DE CIENCIAS APLICADAS Y AMBIENTALES
UDCA
FACULTAD DE CIENCIAS PECUARIAS
MEDICINA VETERINARIA
Bogotá 2010
COLOMBIANO DE RAZA BI.ANCO OREJINEGRO MEDIANTE
MARCADORES MOLECUIARES TIPO MICROSATELITES
APROBADO
Rodrigo Martlnez Phd.
Dlrector
APROBADO
Fernado Gallego Phd.
VARNBIIDAD GENETICA EN POBLACIONES DE GANADO CRIOLLO
COLOMBIANO DE RAZA BIáNCO OREJINEGRO MEDIANTE
MARCADORES MOLECUI.ARES TIPO MICRO&\TELITES
ANDRES PEDRAZA LLIMS
APROBADO
Rodrlgo llardnez Phd.
Dlrector
APROBADO
Fernado Gallego Phd.
ITIARCADORES MOLECUTARES T|PO MICROSATELITES
APROBADO
DEDICATORIA
Agradezco a Dios por hab€rrne permitido cr¡lminar esta dificil pero gratificante
etapa
de mi vida, por darme la
fortaleza
y la inmensa sabiduría,
espec¡almente en los momentos en que pensaba que no podía continuar.
A mi madre, por creer siempre en mi, por sus valiosos rezos y porque nunca
me abandono.
A mi familia en general, por su confianza y respaldo.
A todos mis amigos, que en algún momento con sus palabras de aliento, me
motivtfon a seguir adelante siempre demostrando la confianza en mí y en
mis capacidades.
Y fnalmente a todas esas personas que estuv¡eron a mi lado y que hic¡eron
de este trabajo, un gran logro para mi vida profesional y pe6onal.
GRACIAS POR SIEMPRE
AGRADECIMIENTOS
A la
Facultad de Medicina Veterinaria de la UDCA, porque siempre he
encontredo en ellos apoyo para @ntinuar con este trabajo. A coRpotcA y
al personal, que hirieron
6ible y colaboraron en el desarrolk¡ de este
proyecto de recuperación y conservación del bovino criollo Blanco
orejinegro
desde su inicio hasta la fecha, a ASocRloLLo por varorar y creer en ras
ventsjas product¡vas de este recurso genético animal. A todes les families de
productores por su colaboración, y los integrantes de las redes que trabajan
en la Conservación de la Biodiversidad de los Animales Domésticos.
Al Dr. Rodrigo Ahhedo Martínez, quién me aportó su ctaridad conceptual y
lo$o contagiarn€ s{¡ pernanente optim¡smo a favor de la conservacirn de
los recursos genéticos animales, además de su aporte y dedicación al trabajo
y porque sin é1, hubiese sido imposible.
A Paola, Sandra y Lina por su dedicación al trabajo en laboratorio dándome
confianza y ánimo a seguir adelante a pesar de las adversidades, a ellas por
su entrañable hospitalidad, generosidad y compañerismo, por su espíritu
constructivo y sus siempre acertadas contribuciones. Además que me dieron
srfanza
y me animaron a escritúr-
Al recuerdo de mi mamá que siempre quiso que yo estudiara y progresara, a
mi papá porque siempre estará y nunca fallará así el no esté aquí, a mis
hoÍnenas quienes han sido mi fuente de inspiración y lucha, a ellas quienes
son mi familia y lo que más amo en mí vida.
A mis amigos de siempre a pesar que unos son médicos veterinarios y otros
no
b
son y que sin comprender bien de que se trata este asunto, me
ayudaron a cre@r personal y profesionalmente, y a todas aquellas pers(xlas
que de una u otra forma hicieron posible la realización de este trabajo de
grado.
INDICE GENERAL
Página
1. Planteamiento del problema
1
2. Justiñcac¡ón
3. ObFtivos
3.1 . Objetivo general
3.2. Objetivos específi cos
4. Antecedentes Bibliográfi cos
4.1. Historia del ganado bovino criollo colombiano
I
I
I
I
I
4.2. Ganado criollo colombiano Blanco Orejinegro BON
12
4.2.1. Origen del Blanco Orejinegro BON
12
4.2.¿
Ar€
de influencia
13
4.2.3. Descripción fenotípica del Blanco Orejinegro
13
4.2.3.1. Conformación
13
4.2.3.2. Características productivas.
14
4-3- lmportancia del ganado bovino criollo y colombiano
19
4.3.1. Extinción de la diversidad de los animales domésticos
19
4.3.2. Causas de la disminución de la cría de razas criollas y colombianas
puras
20
4.3.3. Acciones y estrategias para la conservación de las razas bovinas
criollas
colomb¡anas
4.4. Catúenz¡ción de la diversidad
21
animal
4.4-1. Bi¡diversidad de los animales domesticos
22
(DAD)
23
4.4.1.1. Componentes de la diversidad de los animales domésticos (DAD) 24
4.4.1.2. Elección de razas a
c¡nservar
Genéticos
4.4.2.'1. Marcadores Moleculares o Genéticos
4.4.2.2. Tipos de Marcadores Moleculares basados en el ADN
4.4.2 Historia de los Marcadores Morblogicos y
27
2E
30
30
4.4.2.3. Aplicaciones de los Marcadores
4.4.3. M¡crosatélites
(STRs)
Moleculares
34
36
Mictoeatélites
4.4.5. Mecan¡smos de mutación de los microsatélites
40
4.4.5.1. Modelos de Mutación
41
4.¿t.4. Aplicaciones, ventajas y desventajas de tos
gg
4.5. Sdección de miqosatélites para caracterizar genéücamente poblaciones
bovinas
42
4.6. Técnicas para la caracterización alélica de microsatélites
43
4.6.1. Enores en la tipifcación de microsatélites
45
4-6.2, Parámetros estadísticos para cr.nnüfcar variabilidad genética.
48
4.6.3. Cálculo de frecuencias alélicas
48
4.6.4. Equilibrio Hardy - Weinberg
49
4.6.5. Pruebas para calcular la desviación del Equilibrio Hardy-Weinbcrg
51
4.6.5.1. Test X2
51
4.6.5.2. Probabilidad de verosimilitud
52
4.6.5.3. Test exacto o de probabilidad de Fisher
53
4.6.6. tleterocigosis
53
4.6.6. 1. Heterocigosidad Observada (Ho)
53
4.6.6.2. Heterocigosidad Esperada o Diversidad Genética (He)
54
4.6.7. Contenido de Información Polimórfica (PlC)
54
4.6.E. índices de Fijación o Estadísticos F
55
4.6.9. El coeficiente de diferenciación genética Gsf
60
4.6. 10. Distancias Genéticas
60
4.6.10.1. Modelo dásico de mutaciónderiva
63
4.6.10.2. Modelo de deriva puro.
64
4.6.10.3. Medidas
de
distancia genética utilizadas para comparar
poblacÍones
65
4.6.10.4. Consideraciones prác{icas en estudios de distancia genética
oo
4.6.10.4.1. Muestreo
66
4.6.10.4.2. Modelos y realidad
67
ll
4.6.10.4.3. Arboles de distancia
genética
4.6.10.5. Métodos para construcción de árboles de distancia
¿1.6.10.5.1. Máodo Neighbor -
68
genética
Joining
70
70
UPGMA
4.6.10.6. Métodos de remuestreo
4.6.10.6.1. Bootstrapping
4.6.'10.6.2. Jack knife
4.6.10.6.3. Permutación de caracleres
4.6.10.6.4. Análisis Multivariado
74
4.6.10.6.5. Asignación de individuos a poblaciones
74
4.6.10.6.6. Consideraciones sobre los métodos de asignación
5. Metodología
76
4.6.10.5.2.
71
72
Z2
7s
73
78
- Gerec,tcrización Genética
7E
5.2. Muestras de cada población
78
5.
1
5.3. Obtención de ADN a partir de muestras de sangre
5.4. Extracción de ADN a partir de pBL con Chelex 20 %
EO
5.5. Exkaccion de ADN a partir de tarje{as FTA
81
5.6. Extracción de ADN a partir de muestras de semen
5.7. Cuantificación de ADñ
5.
E. M¡crmatélites Estudiados
79
8t
82
63
5.8.1. Amplificación de los microsatélites
83
5.8.2. Condiciones de amplificación de los microsatélites
83
5.8.2.1. Materiales
83
5.8.2.2. Amplificacion de ADN por reacción en cadena de la polimoasa
(PCR)
84
5.8.2.3. Preparación de las muestras
85
5.6.3. Detecc¡ón del polimorfismo mediante geles de poliaoilamida
65
5.8.4. Detección del polimorfismo mediante electroforesis capilar.
86
5.8.5. Electroforesis y tipificación de las muestras
66
5.9. Análisis Estadístico y Software Utilizado
87
ll¡
6. Resultados
89
6.1. Descrif¡ón Genética del Bovino Blanco Orejinegro BON
6. 2. Frecr¡encias Alélicas
6.2.1. Frecuencias Alélicas para el marcador BM18lB:
6.2.2. Frccuencias Alélicas para el marcador BM1g24
6.2.3. Frecuencias Alélicas para el marcador BM21 13
6.2.4. Frecuencias Alélicas para el marcador ETHIO
89
91
92
93
94
95
6.2.5. Frecuencias Alélicas para el marcadot ETH 225
6.2.6. Frecuencias Alélicas para el marcador ETH3
97
6-2-7, Frecuencias Alélicas para el marcador |NRA023
98
6.2.8. Frecuencias Alélicas para el marcador SpS 115
6.2.9. Frecuencias Alélicas para el marc¿dorTGLA 122
99
96
100
6.2.10. F¡ecuencias Alélicas para el marcador TGLA 126
6.2. 1 L Frecuencias Alélicas para el marcad or TGIA 221
f0l
6.2.12. Frecuencias Alélicas para el marcador TGI_A 53
103
6.2.13. Frecuencias Alélicas para el marcador INRA 063
1U
102
6.214. Frea¡enciasAlélicas para el marcador INRA 005
105
6.3. Número promedio de alelos por loci (NpA) y contenido de información
polimórfica (PlC) para las poblaciones
106
6.4. Fleterocigosidades por marcador
106
6.5. Medidas de Diversidad Genética
110
6.5.f . Estadístico Fis
110
6.6. Diversidad genética comparada
112
6.6.1. Heterocigosis por población
112
6.
7. Equilibrio Hardy-Weinberg
113
6.6. Análisis de componentes principales
115
8.9. DFtanc¡a Genética
116
6.'10. Asignación de individuos
122
7. Discusión
129
7. 1.
Caracferización Genética
130
iv
7.1 .1. Variabitidad Genética
7.1.2. Análisis de la estruclura poblacional (Estadísücos
7.
1.3. Diferenciación Genética
130
D
r35
136
8. Conclusiones
143
9. Recomedaciones
145
10. Bibliografia
147
I
l. Anexos
180
índice de tablas
página
Ts|a
1 Cornparación productiva del Holstein y el F1 BON X Holstein en el
centro Paysandu, Universidad Nacional , Medellín. 2000.
15
Tabla 2a Informes productivos y reproductivos según el tipo de cruce, en la
hacienda Vegas de La Clara, de la Universidad de Anüoquia.
2000.
'16
Tabla 3 fndices productivos para producción de leche por lactancia, para los
diferentes cruces de Holstein
X BON, en la hacienda Vegas de La
Clara
(Unúersidad de Antioquia). 2000.
18
TSla 4 lndices productivos para producción de came por parto, en d hato de
BON en la hacienda Vegas de La Clara (Universidad de Antioquia). 2000. 18
Tabfa 5 Subpoblaciones y número de animales analizados dela¡aza BON 79
Tabh 6 Ubicacién de las Subpoblaciones de animales de la raza
BON
Tabla 7 NPA para todas las poblaciones
90
107
Tabla 8 Número promedio de alelos y contenido de información polimórfica
para cada
marcador.
107
TaUa 9 Heterocigosis esperada (He) y Observada (Ho)
y
F,s para cada
microsatélite.
109
Tabla 10 Estadísticos F para todos los loci en todas las poblaciones. Método
dc 4u3te por remuestreo boostraping 10.000 permutacionca. Progrema
111
Genetix
Tabla 11 Heterocigosis esperada (He)
y
observada (Ho) en las
subpoUaciones de animales de la raza BON
113
Tabla 12 Valores de Equilibrio Hardy Wdnberg
114
Tabla
l3
la metodología de Nei 1982
utilizando la metodología de Cavalli Sfoza
Distancia genética utilizando
Tabla 14 Distancia genética
vll
117
119
Tabla 15 Distancia genética utilizando
la
metodología de Reynolds
Tabla 16 Proporción de individuos asignados a cada cluster
Tabla 17 Valores de Fsi asignados a cada dusler
Tabla
l8
Proporción de individuos asignados a cada cluster
Tabla l9 Valores de Fs¡ asignados a cada cluster
wtr
¡
121
124
125
127
128
lndice de figuras
Página
Figura
I
Razas criollas colombianas bovinas. Tomado
wlvw.cofporca.org.co
Figura
2
de
10
Microsatélites. Ejemplo de un dinucleótido A-C (n). Tomado de
Aranguren- Méndez y Jordana,
2001.
38
Figura 3 Mapa de Colombia de las Subpoblac¡ones de animales de la raza
BON
90
Figura 4 ABI 310 (Applied Biosystems/Perkin Elmer, Foster City, CA, USA).
190
ix
lndice de gráficos
Página
Gráfico
1
el
Frecuencias alélicas para
marcador BM1g1g
subpoblaciones de la raza Blanco Orejinegro
Gráfico
2
92
el
marcador BM1B24
GÉfco
3
marcador BM2'l i3
subpoUaciones de la raza Blanco Orejinegro
Gráfico
4
marcador ETH10
subpobfaciones de la raza Blanco Orejinegro
Gráfico
5
10
95
el
10
94
el
Frecuencias alélicas Dara
10
93
el
10
marcador ETH225
10
96
Gráfico 6 Frecuencias alélicas para el marcador ETH3 en 10 subpoblaciones
b raze Blanco Orejinegro
Gnifico 7 Frecuencias alélicas para
de
97
el
marcador |NRA023
GÉfico
8
98
el
marcador SPS115
subpoüacion* de la raza Blanco Orcjinegro
Gráffco
9
el
s¡¡bpobfaclones
&
marcador TGLA122
el
marcador TGl3126
el
Frecr¡encias alélicas para
el
marcador fGllC2T
el
subpobfaciones de la raza Blanco Orejinegro
10
't02
marcador TGIá53
10
103
subpoblaciones de la raza Blanco Orcjinegro
Gráñco 13 Frecuencias alélicas para
10
101
Gráfio 12
10
100
la raza Blanco Orejinegro
Gráfco 11 Frecuencias alélicas para
10
99
Gráfico 10 Frecuencias alélicas para
10
marcador |NRAO63
t0
104
GÉfico 14 Frecuencias alélicas para
su@blaciones de la raza Blanco
Gráfico
15
el
marcador lNM005
Orejinegro
de
Análisis Factorial
la
tO
tOs
conespondencias Múttiples en
subpoblaciones de animales de la raza BON y
GÉfico 16 Dendograma utilizando
en
cebú.
metodología
115
de Nei entre las
subpobfaciones de la raza BON, usando el algoritmo Neighbor- Joining del
programa Phylip @ con bootstraping de 1000 réplicas
117
Gráñco 17 Dendograma utilizando
la
metodología de Cavalli Sfoza entre las
subpoblaciones de la raza BON, usando el algoritmo Neighbor- Joining del
programa Phylíp
@
con bootstraping de 1000 réplicas
Gráfico 18 Dendograma utilizando
la
119
metodología de Reynolds entre las
subpoblaciones de la raza BON, usando el algoritmo Neighbor- Joining del
programa Phylip
@
con boobtraping de 1000 Éplicas
Gráfico 19 Asignación individual
a
Cluster para las subpoblaciones de
124
animales BON
Gráfco 20 Asignación individual
12'l
a
Cluster para las subpoblaciones de
anirnabs BON
127
xl
fndice de anexoa
Página
Anexo 1 Electroforesis en Gel de Agarosa
't80
Anexo 2 Marcadores molecuhres tipo microsatélites
182
Anexo 3 Condiciones de PCR mix microsatélites
1E4
Anexo 4 Condiciones de PCR
1U
tue¡o 5 Preparación de la Poliacrilamida
185
An6xo 6 Cámara de Elec{roforesis Vertbal
186
Anexo 7 Tinción con Nitrato de Plata y revelado con Hidróxido de Sodio para
geles de Poliacrilamida
189
310
capilar
Anexo E Electrobresis capilar en secuenc¡ador automáüco ABI
190
Anexo 9 Preparación de las muestras Para la Electroforesis
190
Anexo 10 Frecuencias alélicas en todas las subpoblaciones de animales de
la raza BON para cada
microsatélite.
191
fuio<o 11 Valores de Gontenido de información polimórfica (Pic) para ceda
microsatélite en las subpoblaciones de animales de la raza
BON
201
Ane¡o 12 Valores de heterocigoc¡dad esperada y observada (He y Ho) para
202
cada microsatélite en las subpoblacione de BON y Cebú
Anexo
l3
204
Preparación de Soluciones
xll
I.
PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA
El secitor agropecuario tiene un rol fundamental en el desarrollo rural
sostenible del país, debido a que genera empleos y divisas, la ganadería
bovina ha mantenido una importancia relativamente estable en la economía
nacbnal, que qrenta en la adualidad con 22.3 millones de cabezas que
pastan en 37 millones de hectáreas, equivalentes a 24.5o/o de la superficie
totaf del país y a 54o/o del total del área agropecuaria y un número de predios
ex¡stentes de 849.000 (Ministerio de Agricultura y Desanollo Rural. 2003).
Así mismo la actividad ganadera, coÍro g€neradora de empleo, ha ganado
importancia dentro del sector agropecuario y en la economía en su conjunto.
En los últimos 10 años se observa una disminución en la población boüna
res@o a la humana; gran parte de esta
disminución del inventario bovino
se origina en las dificultades derivadas de la inseguridad en el campo y la
liquidación
de hatos en algunas regiones (Ministerio de agricultura
y
desaÍolb rural. 2003).
Se cpera que en los próximos veinte años se duplicará la produccón
pecuaria en el mundo en desanollo, debido al crecimiento demográfico, la
urbanización y el incremento de los ingresos (FAO, 2007) y para satisfacer
ests dcmanda se está inlensificando la prcducción, que depende cada vcz
mas de un pequeño número de razas que pueden dar un rendimiento
elevado (FAO, 2007), como es el caso en Colombia los sistemas de
prodrrcón se basan en pocas ftizas, como en el caso de ganadería de
lecfe epecializada, donde el 45
o/o
de la producción es obtenida de la raza
Holstein y en el caso de ganadería de carne, el 85 % corresponde a animales
Cebú y cruzados (lnforme de recursos zoogenéticos 2003).
Cdonrtia es importante por su mega diversidad y sus recursos genéticos de
microorganismos, de vegetales y de animales, no solamente en el ámbito
silvestre sino también de los recursos domésticos' hasta el punto de ocupar
el primer lugar en Latinoamérica en cuanto a la diversidad de
animales
donÉsticos criollos (Moreno, 200i ).
Cabe anotar que la población de animales de ganado criollo ha disminuido
drásticamente en los últimos 30 años, y debido a la falta de gestión genética
de las poblaciones criollas, los productores cada vez mantienen un número
más rcducido de toros y no tienen un control de las relaciones de parentesco
de la
población, por
lo que se
puede incunir con frecuencia en
apareamientos consanguíneos, que afectan de forma muy importante la
variabilidad genética y la productividad de las poblaciones.
Por otro
hdo, el tamaño poblacional de las razas
criollas ha sido limitado
debido a que las razas foráneas han ido ocupando el lugar de estas como es
el caso de la raza Holstein y Cebú, es así como; estas razas criollas han sido
sometidas
a
cn¡zamientos absorbentes, con
el objeto infundado
de
aumentar la productividad, de manera que se está perdiendo la oportunidad
de aprovechar ef¡ci€ntemente estos animales que son altamente productivos
y competitivos frente a otros tipos de ganado, cuando son manejados en
sis{emas de produccion semi-extensivos ó extensivos, en condiciones de
trópico medio y bajo, y que en cierta forma podrían ayudar al país a la
producción más eficiente de alimentos para una población que está en
coffitente aumento.
Por este motivo se ven amenazadas las razas bovinas criollas colombianas,
las cuales han presentado sensibles descensos en sus poblaciones, el
inventar¡o total de ejemplares registrados para
el año 2OO4 fue de
20-102
anirnafes, de los cr¡ales 3.968 son pertenec¡entes a la raza BON' 1.552 a los
ejemplares CCC, 2.049 de la raza Hartón del Valle y 3.173 de ejemplares de
la raza Romosinuano respeclivamente (Asocriollo, 2003). Esta situación de
pérúide de los recuros zoogená¡oos se ha dado por la falta dc
conocimiento acerca
los caraderes de
adaptación' como aspectos
reproduc{ivos, resistencia a paÉsitos y enfermedades, de gran importancia
que se constituyen en una gran ahemativa para los sistemas de producción
de tropico medio y bajo, por su potencial productivo para uso en forma pura y
la habilidad combinaloria que podrían tener al cruzarlas con razas de origen
cebuíno, por lo cual se constituyen en un valioso recuÉo genético, adaptado
al trópico.
el último censo de razas criollas, (Martínez, 1999) el número de
ejemplares BON racialmente puros que se @nservan en el tenitorio
Para
colombiano apenas asciende a 2866 animales, esta es una de las principales
ra¿ones que hace imprescindible que esta única e invaluable fuente genética
sea protegida antes que desaparezca, debido al cruzamiento indiscriminado
y
ab€orbente
de las razas modemas de ganados foráneos, altarpnte
eficientes en producción Láctea o cárnica.
Cabe resaltar que no solo es ¡mportante e imprescind¡ble conservar las razas
crkllss, sino que también se deben uülizar máodos adecuados de sclccción
y mejoramiento para estos animales, que permitan dar respuesta a las
necesidades de seguridad alimentaria para el país (FAO, 2001).
Para Colombia es muy importante @nseryar estas
razas
criollas y
cobmtianas; debido a que estos r€cursos genétbos se caracferizan porque
son animales tan adaptados a nuestro medio que se pueden mantener con
brrajes de pobre calidad nutricional, son mas resistentes a las enfermedades
intucciosás reproduc{¡vas (Martínez y col. 2005), pr$entan tasas de fcrt¡lided
tanto de hembras como de los machos reproductores más altas, así mismo
se señala también que los espermatozoides de las razas criollas son mas
resistentes a los procesos de criopreservación (Cardozo y col 2008) portando
@rán ser utilizados en el futuro, Fra
de mejoramiento, aportar para el mejoramiento de la
una fi-rente de genes específicos que
soportar los programas
Balud animal
y en general para el mejoramiento de los
s¡stemas de
produccitin animal sostenible, contribuyendo al desanollo de la ganadería
colombiana y a la conservación animal.
Es por esta razón que el presente trabajo tiene como objetivo determinar la
variabilidad genética existente en 10 subpoblaciones comerciales de
garudo criollo de raza Blanco Orejinegro (BON) en Colombia, mediante el
uso de marcadores genéticos tipo microsatélites, lo que permitirá estimar
parámetros poblacionales y valores de consanguinidad y estimar el grado de
pureza racial que t¡enen estras poblac¡ones comerciales de animales, y así
poder determinar el estado genético de cada una y basado en dichos
parámelros, diseñar estrategias de gestión genética que permitan su uso
efpiente y el mantenimiento en el tiempo, aportando a la conservación y
n¡eirramiento de esta raza.
2.
JUSTTF|CAC|ÓN
El meriio genáico que se puede eslimar en un individuo depende de la
proporción de combinaciones de alelos favorables con efectos aditivos, y su
cálculo nos permiten categorizar los toros por su habilidad para transm¡tir
dibr€ncias por encima o por debajo del promedio de una población, y de
esta forma se puede tener la posibilidad de una selección más exacta a favor
de obtener un mayor número de hijos de aquellos animales que tengan una
categoría prcductiva superior, esta información, junto con las med¡das de
distmcias genéticas entre poblaciones proveén una persp€ctiva acerca d6 la
variabilidad genética presente entre
y
dentro de poblaciones, así como
también dan una idea de las relaciones genéticas existentes entre razas o
líreas, ayudando a seleccionar y priorizar aquellas a ser conseryadas.
Los primeros estudios de variabilidad genética se concentraron en detectar
variaciones cuantificables como;
el
color, variaciones
morfolfuicas,
abenaciones cromosóm¡cas y tipos de grupo sanguíneos (Hedrick, 2005).
Es*as vadac¡ones fueron muy importantes
y excelentes casos de
est¡¡dio
pero no estimaron la cantidad de variaciones que pueden existir en el
genoma
de una población.
Actualmente,
se
están
desanollando
inveotigaciones usando henamientas de biotecnología para la preservación,
caracterización genética
y
utilización del germoplasma
de razas
criollas
colombianas, muchos de estos estudios de caracterización se basan en los
análisis genéticos, a través del uso marcadores moleculares, entre ellos los
microsatélites
o
'sDorf tandem repeat" (str), estos marcadores üpo
microsatélites son segmentos cortos de ADN de 1 a 6 pares de bases (pb)'
los cuales se repiten en tándem y de forma aleatoria en el genoma de los
sarls vive. Una de las ventajas de estos marcadoreg vcfsus otros
(minisatélites, RFLP, RAPD) radica en que están considerados, por la
mayoría de autores como la más poderosa henamienta para los estudios de
genétirx de poblaciones (Cheng H' and Críttenden, L.B. 1994)' ya que: son
muy pol¡mórlicos, presentan herencia mendeliana simple, son codominantes
(pudiéndose diferenciar los individuos homocigotos de los heterocigotos), son
fáoile¡s de medir y analizar, y son confiables, repetitivos y ar.domatizablec. Un
buen marcador molecular debe reunir una serie de características para
maxim¡zar su utilidad: buena distribución a lo largo del genoma, alto grado de
polimorfismo, la tá:nica para analizar el marcador debe ser Épida y pÉciica,
y debe poder repetirse con fiabilidad en otros laboratorios (Hedrick P. 2005).
Estos marcadores, permiten diGrenciar individuos homo
y
heterocigotos,
varba loci microsatélites han sido identificados en varias especies de
anirmhs domésticos, y algunos nuevos han sido encontrados
continuamente, por ejemplo, mas de 120 han sido mapeados en bovinos y
mas del doble de estos son conocidos; cerca de 70 están disponibles para
ovcjas, y alredcdor de 190 microsatélites han s¡do descrítc para ccrdos. Y
una proporción significativa de los microsatélites bovinos han
sido
identificados por ser polimórficos en búfalos y cabras (Zhang, 2004).
La FAO ha propuesto una estrategia para la caracterización de los recureos
genéticos
de
animales domésticos usando dicha
metodología,
recomendando el análisis de 50 individuos no emparentados por raza {25
nrachos y 25 hembras) y un mínimo de 25 microsatélites (Baker, y col
1993).Durante los últimos años se han realizado muchos estudios que han
utilizado los microsatélites para análisis filogenéticos, concluyendo que, con
un buen número de loci investigados y si estos presentan apropiadas tasas
de mutac¡ón, los microsatélites pueden dar una muy buena aproximación de
la filogenia (Takezaki,N. and Nei, M 1996)' Probablemente este es el campo
en el cual han sido más efensamente utilizados, mientras que su otro gran
campo de acción ha sido para la construcción de mapas genéticos. En los
€$dios de genética poblacional, estos marcadores permiten la idenüfrcación
de cada a|e|o por |ocus, y obtener datos pob|aciona|es, calcu|ar
6
las
frecuencias alélicas, y a partir de estas estimar las distancias genéticas entre
las poblaciones o individuos (Bowcock
Por medio de estudios
A
M. y col i994).
desarrollados
con estos
marc¿dores tipo
microsatélites, se ha reportado una gran variedad genética en
el ganado
BON y Romosinuano en trabajos recientes, Banera y col. (2006), realizaron
un estudio de genéüca de poblaciones en 7 razas de ganado
colombiano
Y
reportaron valores
de
c¡ioflo
heterocigocidad observada promedio
de 0.6729; con valores de endogamia (Fis) promedio de 0.1148; en términos
geri€rulcg se encontro un número de alelos promedio por locus (NPA) fuc dc
6.6. El valor de NPA encontrado en la raza BON fue de 23. valor alto.
comparado con varias razas africanas, como el encontrado para la raza
cebuína afticana Maure (NPA=6.2) de la misma manera la heterocigocidad
ob€rvada (Ho) en BON (He.67) es superior a la detec{ada en las diferentes
razas nativas en donde el mayor valor se encontró en la ¡aza cebuína
africana Butana (Ho 0.652) (Lopez y col, 2001).
Por eda nazón se hace necesario aplicar henamientas de genética moleq¡lar
para la caracterización genética de poblaciones de estas razas estas razas,
con el fin de conocer el estado genético de los núcleos comerciales
exisle{rles en Colombia, así que se debe continuar con este trabajo utilizantlo
mas marcadores y un mayor numero de muestras de individuos lo menos
emparentados posible (Moreno, Osss, y col. 2001).
Ee así como este trabajo contribuirá a la genética de poblac¡ones en
búsqueda de mejorar los mecanismos de conservación y multiplicación de
nuestras razas criollas colombianas, las cuales tendrán un ¡mportante aporte
af desanollo de la ganadería colombiana fumentando la
oía y reproducción
de edas ¡azas criotlas para las cuales, la corporación cokrmbiana
de
invesügación agropecuaria'Corpoica' ha estado encargado de recuperar y
conservar estas razas criollas colombianas con el fin de evitar la extinciÓn
definitiva de ellas.
3.
OBJETIVOS
3.t. O$etivo general
Realizar estud¡os que perm¡tan determinar la variabilidad genética en
poblaciones comerciales de ganado criollo colombiano de raza Blanco
Orejinegro -BON- por medio del uso de marcadores tipo microsatélites.
3.2 Obioüvos especlf ¡cos
Determinar frecuencias genotípicas
y
alélicas para marcadores
mol€culares tipo microsatélites en 10 subpobfaciones comerciales de
la raza criolla BON de diferente origen genético.
Estimar peÉmetros de genética de poblaciones dentro y entre grupos
mediante
el cálculo de valores de
heterocigocidad observada y
esperada así como los índices de fijación y aporte
a la variabilidad
total de la población.
Establecer medidas de distancia genética ex¡stente entre poblaciones,
así como también determinar el grado de pureza racial de
las
poblrciones de esta rc?a y @n esta información poder recomendar
estnateg¡as de manejo que permitan la conservación y uso efic¡ente de
su variabilidad genética.
4.
ANTECEDENTES BIBLIOGRAFICOS
¡l.t. Htrtoda del ganado boyino criollo colombiano
El ganado bov¡no criollo colombiano inicialmente estuvo compuesto por
animales cruzados traíd6 por los españoles en el siglo XVI (Jordan, .1993;
Rouse, 1977), los cuales contribuyeron en mayor grado a moldear la
civifización y a dat estabil¡dad al nuevo hombre americano y colombiano en
part¡cular (Pinzón, 1984). Los primeros embarques
de vacunos hacia
el
Nr¡evo Mundo se remontan al segundo viaje de Colon (1493) con desüno
hacia la isla de Santo Domingo (Primo, 1992).
Posteriormente, durante
importación de bovinos
y
la época de la
conquista, se dio inicio
otrc,s animales domésticos
a
a
la
Colomb¡a, durante
este período hubo tres entradas de ganado a nuestro país: la primera fue en
jufio de 1525, la cual constaba de un lote de 200 vacas provenientes de la
Española -hoy República Dominicana y Haití- el cual fue traído por Rodrigo
de
B*lilas
a Santa Mala, con esta se dio origen al primer núcleo gana&ro
colombiano en la Costa Atlántica, el más importante del país desde aquella
época (Pinzón, 1984); la segunda entrada de ganado a Colombia, se dio en
1542, año en el cual llegó un pequeño lote traído por Albnso Luis de Lugo
procedente de Las Canarias que parece ser, fue el grupo que migro más
rápidamente al nuevo Reino de Granada, hacia las vertientes del Magdalena
y del Carca y se establec¡eron núcleos ganaderos en el sur y en oriente del
país; y en tercer lugar, fr.e el ganado proveniente de Venezuela, los cuabs
se distribuyeron por las distintas regiones del país, dando origen así a las
diÉrentes razas criollas colomb¡anas (Pinzón, 1984; CEGA, 1987 y Pinzón'
1996: Beteta, O., 2003; Rabasa, 1993).
Asf, en la Costa Atlántica se encuentran el Costeño Con Cuemos (CCC) y el
Romosinuano (R), en la región Andina el Blanco Orejinegro (BON) y el Chino
Santandereano (Ch), en los valles inlerandinos (Valle del Cauca) el Hartón
del Valle (HV) y en los Llanos orientales y ra Amazonía El san Martinero
(SM) y el Casanareño (CA). La influencia de los ganados blancos y cárdenos
de Exlremadura, o del mediodía español, sólo se reñeja en la raza BON. Esta
cantidad y calidad de razas criollas colocan a Colombia en primer lugar en
diversidad bovina en América Latina (pinzón, 1984
Sáncfez, 2005).
Figura 1 Raz¡3 crlolL3 colombl¡na!
bov¡n[.
Tomado
y
Moreno, 2001;
d. www.coeok¡|.o|!,co
Adualmente, no se sabe con certeza o no se tiene una idea clara de cómo
se formaron las diferentes razas criollas colombianas. Sin embargo, de
acuerdo con
lo
publicado por Pinzón
en el año de 19g4, las
Romosinuano, San Martinero, Chino Santandereano
razas
y Harton del Valle
se
derivan direciamente del Costeño Con Cuemos. De acuerdo al origen de la
raza Romosinuano, se tiene dos hipótesis planteadas: una describe una
mutación en el Costeño Con Cuernos, y otra, propone una mezcla entre la
raza Costeño Con Cuernos y Angus Rojo.
El ofi¡en del San Martinero se dio posiblem€nte a la mezcla entre Costeño
Con Cuernos y ganados del occidente del país, Casanare y venezolanos. La
raza Chino Santandereano pudo ser el resultado del cruzamiento de dos
rezas dibr€nt€s, este cruce se presento entre la raza Costeño Con Cuemog
con ganados del oriente (Venezuela) y del sur occidente (Huila y Tolima). Por
otra parte, el origen de la raza Hartón del Valle, se pudo dar por una mezcla
t0
del costeño con cuemos con ganados del sur proven¡entes de países como
Peru y Ecuador (Pinzón, 19S4; CEGA, 1987 y pinzón, 1996b).
La raza Blanco orejinegro es la única de las razas criollas colombianas de
color blanco, las demás razas varían entre rubias y hoscas (oscuras) con una
mayor inñuencia de las diferentes tonalidades de rqo. El origen de esta raza,
ha sido discutido durante muchos años, pero todos los reportes descritos,
concfuyen que
la raza Blanco Orejinegro procede del ganado Berrendo
Español. Sus primeros núcleos se formaron en los departamentos de Cauca,
Huila y Tolima, descartando la posibilidad que Antioquia tue el lugar de
ori¡err de esta raza, como se cree popularmente (tr¡!e¡sd., l9E0; P¡nzón,
1984; Franco y Mejía, 1996; Pinzón, 1996a y 4¡6e¡sda y Cáceres, 1998).
En Colombia exislen pequeñas poblaciones de ganado vacuno que son
únios en el mundo. Estos animales, descendientes del ganado europ€o,
tienen una adaptación de cerca de 500 años a las condiciones
medioambientales locales, del trópico.
Algunas de las caraderísticas deseables que han sido observadas en estas
razas, induyen la resislencia
a parásitos ¡ntemos y extemos, la hatilktad
para sobrevivir bajo condiciones medioambientales extremas, habilidad para
utilizar bnajes de baja calidad nutricional, buena eficiencia reproductiva y su
natural Íes¡stenc¡a a enbrmedades inftcciosas.
El número de ejemplares Blanco Orejinegro racialmente puros que se
@nservan en el tenitorio colombiano apenas asciende a 2866 animales
(censo 2004). Por lo tanto es imperativo entonces que esta única e
invel.¡able fuente genética sea protegida antes de que desaparezca, debido a
su extinción o a su disolución por el cruzam¡ento indiscriminado y absoóente
de las razas modernas de ganados europeos, altamente eficientes en la
produccl5n de leche o de carne.
tl
4.2. Ganado criollo colombiano Blanco Orejinegro BON
4.2.l.Origen del Blanco Orejinegro BON
Sobre el origen del ganado Blanco Orejinegro se han poslulado varias
teorías:
1.
Teoría sobre el origen i[Érico del Blanco Orejinegro
Como todas las razas criollas colombianas, se acepta que el BON desciende
diredamente de los ganados introducidc a América por los conquistadores
epañdes en el siglo XV. En los relatos sobte el ganado español traí&
a
América no se menciona que hubiera animales de color blanco con las orejas
negras; por el contrario en los Estados Unidos, Santo Domingo, México,
Venezuela y Colombia predominan los colores rojo o amarillo, con algunas
manchas blancas
o
negras. Por consiguiente,
si el
BON desciende
directamente de los ganados españoles, hay que aceptar que se formó por
rigurosa selección natural en nuestro
Ror¡sa, ciüado por Buitrago
mdio (Martínez, 1992).
y Gutiénez (1999), afirma que el posible origen
del BON, es el ganado español progenitor de las benendas andaluzas, que
llegado a Panamá dio también origen a los ganados con oreias negras del
Beni Bdiviano, ecuador, Nicaragua y Honduras.
2.Teoria sobre la British \Mite Park como origen del BON
Esta raza British White posee una gran similitud con el Blanco Orejinegro' y
de aanerdo con las tmrías de Danrvin y Rutimeller, es el pariente mas
cercano del ganado salvaje de Escocia.
3. El 'urus' o Bos primigenius. De este descenderían todos los ganados del
occidente asiático, del norte de Africa y de toda Europa'
t2
1.2.2. Arca de influencia
El ganado Blanco Orejinegro tiene su hábitat natural en las estribaciones de
las cordilleras Central y Occidental, en alturas entre los 800 y 1.800 msnm.
Esta región se comprende la zona media o cabtera, que incluye
princ¡palmente a los departamentos de Cauca, Valle del Cauca, Huila,
Tolima, Cundinamarca, Antioquia, Risaralda, Caldas y Quindío.
Ecolfuicamente esta es una zona de transición entre bosque húmedo y
bosque muy húmedo tropical. Su topografía es bastante quebrada, inegular y
ereirnaUe; con suelos ácidos, de escasa cnpa vegetal, deficientes
en
calcio, fosforo y relativamente altos en potasio.
Las principales gramíneas de cobertura son el pasto puntero (Hypanhenia
ruft), dl gordura (Paniatm purpunsrens) y, en los úllimos años, algunás
áreas sembradas en Brachíaria decumbens y Brcchíaria humfdicola.
También
se encuentran algunas gramíneas naturales como la
maciega
(Paspalum dellatum),la grama trenza (Paspalum notatum), la grama común
y
d
pasto estrella, entre otras.
Con estas gramíneas se encuentran algunas leguminosas naturales como
los trebofes, los frijolillos, la alfalfa nativa (Medicago spp.), el pega p€ga
(b*ndium
ssp.) y otras. (Bemal, 1994)
4.2.3. Descripción fenotlpica del Blanco Orejinegro
4.2.3.1. Conformación
Esta raza es considerada como de doble propósito (came y leche)' pero
(tiro y
anteriormente también se le utilizaba como un animal de trabajo
€Ea)'Laestructuradeesteesmuyvariab|e,encontÉndoseejemp|aresmuy
finos y angulados hasta ejemplares gruesos y pesados'
l3
En general no es una raza de buen balance corporal y se le critica ante todo
el gran tamaño de su cabeza, el dorso ensillado, el anca caída, la inserción
afta de la cola, la debilidad torácica, la poca profundidad corporal, k¡s
isquiones muy estrechos, la falta de refinamiento y las ubres bastante
defecfuosas. Asocriollo (2003)
Aunque algunos consideran que estos defeclos son compensados por
algunas de las características de adaptación y rusticidad, es evidente que el
hato de Blanco Orejinegro debe ser sometido a programas de selección y
meixamiento genético para conegir en
la
progenie estos defectos y
eumerrtar así su potencial producfivo en las ganaderías colombianas,
4.2.3.2. Características productiyas.
En la raza BON hay ejemplares que tienden a producir más came que leche
y
viceversa, aunque sus parámetros productivos, son menores que los
alcanzados por las razas foráneas especializadas según Buitrago, 1999. Esta
raza es considerada de doble propósito y posee alto poder b¡ológ¡co para el
cruzamiento tanto con razas lecheras como de carne (Munevar, 1990).
Son muy pocas las fuentes de inbrmación que se tienen sobre la producción
de bctre en el ganado BON, debido principalmente a que la mayoría de las
vacas criollas puras no se ordeñan. Sin embargo, Quijano, 2000, reporta que
en la hacienda Paysandú, de la Universidad Nacional de Medellín, encontró
producciones de2.27 Kg de leche por vaca y por día.
Ps otra parte, las altas ganancias de peso diario desde el nacimiento hasta
el destete citadas por la mayoría de los autores, y en particular las
enconhadas en el hato de BON de la Universidad de Antioquia (626 gramos
en las hembras y 706 gfamos en los machos), sugieren indÉcutiblerneflte
una rnayor capacidad de producción de leche.
son también muy pocos los informes sobre la producción de leche en los
cruces del BoN con otras razas especializadas. Hasta ahora, y motivados
t4
por los magníficos resultados obten¡dos en los hatos cruzados de
Universidad de Antioquia, y más recientemente los reportados por
la
la
Univ€rsidad Nacional de Medellín, un número creciente de ganaderos, eata
iniciando sus programas de ordeño con vacas cruzadas.
Con el aumento en la proporción de sangre BON, las duraciones de las
lactancias tienden a ser mas cortas y menor la producción de leche por
laclancia. Sin embargo, los niveles
{
de
producción con suplementos
concentrados son bastante altos en la F1, con costos de producción mucho
meriores que en las vacas con mayor porcentaje de sangre Holstein.
En bs Tablas 3 y 4 a y b se muestran k¡s resuhados de las características de
producción de leche en los hatos cruzados en mmparación con los del
Holstein puro.
Tabla
I
Comparación productiva del Holstein y el
Fl
BON X Holstein en
e¡ centro Paysandu, Univercidad Nacional , Medellln. 2000.
Producc¡ón roal lact¡nc¡a {Kg)
7292
3361
tluraclón de la lactancia (Olasl
330
2U
Proü¡cción con€g¡da a 305 - 2r
Et
(Kg)
Pro.fGión po. Vacdoi. (l(gl
7096
22.1
% gra3a
3.2
% proto¡n¡
2.8
razas
v
15
13.2
3.3
Tabla 2a Informes productivos y reproductivos según el tipo de cruce,
en la hacienda Vegas de La Clara, de la Universidad de Antioquia. 2000.
100 %
Holrtoln 6
7E Holfoin lr8
BON
5r¡[
Hol6ln t/4
-
BON
5'E Hol¡toln 3/8
BON
lnHo&lnln
BON
3r8
Hollieln 5/8
BON
92.25
4
25.'t6 35,47 13r.00
168.00
2
t2..O3
31.02 133.95
98.€D
10
16 22.42 31.78 151.45 74.n
1
20.74
1
18.51
BON
h¡to
raztS
N.V
20.03 30.41 172.28
flf llolícln 3/4
Totd dol
Vacas
60
190.00
26.85
21.93 31.6
y co|omD|anaS
colombianag purag.
ló
146.96
101.27
Tabla 4b Informee productivos y reproductivos según el tipo de cruce,
en la hacienda Vegas de La Clara, de la Universidad de Antioquia.2ü)0.
l0O %
tlo|stoh
7r8 Holstein
l/8
BON
3ra
Hd|t.¡n lra
BON
1.80
450.34 338.76
3.975,92
1.67
431.33 258.75
3.052.22
1.42
415.74
2s.72
3.554.00
1.76
418.42 291.49
3.349.62
427.31
3.583,60
5/8 Holstoin U8
BON
112
Hd.t
tn 1t2
BON
E8 Holstoln 5/8
BOil
tra Ho|rúoln 3r¡l
1.00
BON
1.U
Totrl dol hato
fgJzag
306.26
@nven|o
colomb¡anes
Agocriollo.2003.
Los altos índices de fecundidad, longevidad y habilidad matema de las Vacas
BON, se reflejan en las buenas prcducciones de Kg de peso corporal
destetado. En las Tablas 5 y 6 se pres€ntan los índices productivos para
producckín de leche y c€tme por parto. Estos índices deben entenderse como
los Kg de leche y carne producida por día de edad de la vaca al momento de
terminar la lactancia respectiva.
17
Tabla 3 Indices productivos para producción de leche por lactancia,
para loo difercntes cruoes de Holetein X BON, en la hacienda Vegas de
La Clara (Univeruidad de Antioquia). 2üXl.
2.35 3.70 4.U
5.8S 6.23 5.62 6.41
5.91
Tabla 4 índices productivos para producción de carne por parto, en el
hato de BON en la hacienda Vegas de La Clara (Universidad de
Anüoquia).20(Xt.
0.174 0.229 0.251 0.282 0.300 0.307 0.3',t7 0.306
Son muy pocas
la
referencias bibliográficas sobre
la
0.316
capacidad de
producción de carne en la ceba de novillos BON' Los autores afirman que
sus p€sos finales no son rentablemente compet¡t¡vos con los de otras razas
especiafizadas. Las verdaderas ventajas de la raza para la producción de
came se han encontrado en el cruzamiento con el Cebú.
l8
4.3. lmportancia del ganado bovino criollo y colombiano
Lor animales criollos y colombianos presentan una serie de
ventajas
significativas, que los hace un recurso de vital importancia para el sector
agropecuar¡o colombiano. Dentrc de estas ventajas se puede mencionar su
amflia capacidad de adaptación a diversas cond¡c¡ones climáticas
(principalmente regiones de clima cálido), reproductivas, nutricionales,
sanitarias, entre otras (Syrstad
y Ruane, 1998). Estos animales a su
aprovechan los recursos naturales
y
vez,
residuos de cosecha pobres en
nut¡bntes, para sob,revivir bajo limitdos recursos alimenticios; además,
responden de manera adecuada
a los sistemas de ceba intensiva, en las
labores de cría y manejo en las que participa directamente la familia. De igual
forma, s€ pueden explotar en sistemas extensivos, buscando la reducción de
la inversión y de los costos de producción, además presentan unos buenos
niveles productivos en cuanto
a came y leche
principalmente en áreas
geognáficas dificiles, que generan sostenibilidad a los pequeños y medianos
plicduciores (Anzola, 200? Casas y Valdenama, 1998).
4.3.l.Extinción de la divercidad de los animales domésücos
Actualmente (2010) existen 6379 variedades de 30 razas de mamíferos y
aves, de las cuales ya se han extinguido 1000 razas, y si no se toman las
rnedidas necesarias
y
preventivas, más
de 2000 razas de
animales
domost¡@s podrían desaparecer del planeta en los próximos dos decenios
(FAO, 2OOf 1. Uno de estos casos se refiere a la población bovina de nuestro
país, estimada en 23 millones de cabezas de ganado, de los cuales sólo
unos 25OOO animales son de razas bovinas criollas y colombianas. Así lo
registra la tercera edición de la L¡sta Mundial de alerta para la diversidad de
los animales domésticos (FAO, 2001t)-
19
A pesar de los grandes avan@s alcanzados en el campo de la biotecnologÍa,
que intentan mejorar las razas, no es posible sustituir la diversidad perdida,
la elilinción es definitiva (Barker, 1999). para la FAO 2 (2001) ta biotecnología
no podría regenerar y recuperar las razas perdidas.
Por todo lo mencionado anteriormente, en Colombia se debería empezar a
elaborar
el libro rojo de los animale donÉsticos criollos
cotombianos, y
según ef Ministerio del Medio Ambiente de Colombia (2002) de esta forma se
retomarfa la voz de alerta frente a lo que atenta contra la diversidad animal,
para proteger los animales criollos y colombianos, que en este siglo tienen un
últuro muy promisorio.
4.3.2.Causas
de la disminución de la c¡ía de razas criollas y
coüomurtntS purrr
Dentro de las causas más importantes e influyentes en la disminución del
ganado bovino criollo se encuentran: la escasa valoración de estos recursos
geneticos, la falta de conocimiento del potencial de estos animales, los
cruzambntos absorbentes con otras razas, la introducción de razas foráneas
mejoradas,
la
degradacíón
de los
desplazamiento del hombre del campo
ecosistemas donde hab¡tan, el
a la ciudad, los cambios en los
petrofm de consumo de poblaciones urbanas y rurales, d€sastr$ naturales
como sequias muy prolongadas, políticas ganaderas equivocadas que
promueven soluciones inmediatas y no sostenibles a largo plazo, la carencia
de transbrencia de tecnología sobre los ganados criollos colombianos y los
problamas socioeconómicos del país (FAO 1998; Delgado' 2006)'
Varios autores han señalado que, uno de los principales factores que
amenazan la diversidad de los animales domésticos criollos, es cl que se
refiele a la exportación de razas mejoradas de los países desanollados a los
que están en vía de desanollo (Anzola, 2002 y Hall y Ruane, 1993; FAO
1s98).
Esta problemática conduce a menudo al cruce absorbente de razas y hasta
la sustitución total de los bovinc criollos, tal como sucedió en Colombia en
loc últimos 60 años. Las razas bovinas de loo países industrializados se
consideran más productivas, pero el problema de estos animales es que
estos no se encuentran adaptados
a las condiciones
ambientales de la
región Ecuatorial de Colombia, y sobreviven con mucha dificultad en su
nuevo hábitat tropical.
La prcducción de came y leche se verá obligada a incrementarse en los
próximos 20 años para poder alimentar a la creciente población mundial. Por
so,
une de hs soluciones que plantea la FAO (2}O1flr es utilízar todas las
variedades zoogenéticas posibles, ya que esta diversidad genética animal
representa una fuente valiosa y confiable ante futuros peligros como hambre,
sequía y epidemias.
4.3.3,Acciones y $trateg¡as para la conservación de las razas bovinas
criollas colomb¡anas
La hrequeda de la preservación de los recursos genét¡cos animales, se dab€
basar principalmente en la creación de una política nacional y regional para
la
cdombianes, apoyando
la
y
mejora de las razas bovinas criollas
iniciativa para el desanpllo de programas
recuperación, conservac¡ón
nacionales de conservación y utilización, para fomentar los bovinos criollos
en sistemas integrados de producción, promover la conservación in situ y ex
situ de las especies de interÉs actual y potencial (Anzola, 2002)' es así como
la Corporacion Colombiana de lnvestigación Agropecuaria CORPOICA ha
desanollado junto con El Ministerio de Agricultura y Desarrollo Rural y el
Instituto Colombiano Agropecuario (lCA), el Programa Nacional de Fomento
de Bovinoe criollos; el cual se basa en promover la uülización de bovinos cle
las razas criollas puras adaptadas al ambiente colombiano, que permita
promover conjuntamente con los ganaderos el ¡ncremento en la cría de estas
21
razas, y tener información útil para implementar un plan de mejoramiento
ganaclero, olmpliendo con los propósitos de protección, mejoramiento,
mutiplicación, repoblamiento, conservación y preservación de las diferentes
razas bovinas cíollas (Resolución 007147 del 15 de marzo de 2004)
(Martínez, y col 2009).
Este plan de bmento t¡ene como objetivo introducir en las ganaderías
animales, que mejorarán la producción bovina
a
menores costos; es bien
sabido que estas razas tienen muchas propiedades
de
interés en
compaft¡cón con las razas bovinas furáneas infoducidas en la ganadería
a€fua|.
4.4.Ca¡acterización de la divelsidad an¡mal
La biodiversidad se ha definido como la variabilidad genética de los diversos
tipos de recursos genéticos animales a nivel de poblaciones y genes, de los
que se deben @nservar tantos alelos o variantes como sea posible (Henson
1992; Crossa, y col 1993; Smith, 1984). La¡azón principal para incentivar las
estrategias de conservación es que sin una intervenciÓn apropiada, especies
enteras podrían perder
la
llexibilidad para adaptarse
a
dibrentes
circunstancias (enÉrmedades, demandas del mercado, etétera) y resentirse
sus niveles de producción. La FAO enfatiza que la variación genética en
caracteres, tanto conocidos como desconocidos, puede ser útil para
manter¡er los caracteres productivos a pesar de los posibles cambios en el
entofiio. Esto im$ica que los esfuerzos de conservación se enfocaÉn hrcia
la diversidad de una especie en conjunto, sin preferencias de ciertos
caractergs sobre otros.
Para cefadefizar la diversidad en q¡anto a recursos genéticos animales; se
trabaja con dos tipos de variabilidad: la fenotfpica, que se observa fácilmente
y se puede medir directamente sobre los individuos evaluados y la genéüca,
que se mide utilizando diversos marcadores genéticos. Para ambos casos
hay
henamientas matemáticas
que nos
permiten
caracterizar
adecuadamente la variabilidad existente dentro y entre poblaciones y de esta
fonna pueden oantificarse las diúerencias entre y dentro de las poblaciones
animales.
Existen diversas metodologías para medir
la
diversidad genética que
proporc¡onan resultados a veces @ntrapuestos, y se discute sobre el peso
que debe tener la diversidad genét¡ca entre y dentro de razas o poblaciones.
No existe una conclusión clara, acerca de si debe darse más importancia a la
diversidad entre razas o
a la diversidad dentro de las mismas. Desde un
Wnfo de vista pÉctico, favorecer la diversidad dentro de razas es úül en
procesos de selección y adaptación, mientras que dar más importancia a la
diversidad entre razas sería más razonable cuando lo que se pretende es
resultado de c¡uzam¡entos (García y Cañón, 2oo7l.
Recientemente ha habido numerosos trabajos que describen la diversidad
genética de las poblaciones bovinas criollas europeas, las cuales son
carderizadas fenotípica y genéücamente para pnonzar su conservaciÓn
exddar
el
(Van Marte-Koster y Nel, 2003; Talle, ycol 2005).
4.¡f.l.Biodiver¡idad de los animales domésticoe (DAD)
De acuerdo con la Convención sobre Biodiversidad (CBD), que fue firmada
por la mayoría de los países del mundo en Río de Janeiro en 1992'
biodiversidad es el conjunto de ecosistemas, especies y variedades
g€rnthas existentes en un país y, si bien cada país posee la soberanía y la
responsabilidad sobre sus prop¡os recursos genéticos, estos deben ser
considerados como un bien de la humanidad. según la citada convención,
las principales causas de la perdida de biodiversidad son la aceleración tlel
crecimiento de
la población humana, el incremento del consumo de los
recursos naiurales y su explotación no planificada'
23
La biodiversidad de los animales domésticos (DAD), contribuye de fiorma
eserrc¡al a la biodiversidad en general y a la producción alimenticia en
partícular, proveyendo direcia o indireclamente el 30 al 40 % del vatr¡r total
mundial de la producción agrícola y de alimentos (FAO 1999). La DAD se
define como las d¡ferencias entrc individuos que son heredables y por lo
tanlo pemanentes y pueden enconlrarse entre dases taxonómicas, familias,
especies, razas, poblaciones y entre individuos (Loftus y col 1993).
4.4.7.1.Componentes
de la diwsidad de los animales domésücos
(DAD}
La DAD, está compuesta por los recursos genéticos animales (RGA), que
comptnden todas las especies, razas y estirpes que revisten inlaés
económico, científico y cultural para la agricultura, tanto ahora como en el
futuro. Las especies comunes comprenden ovejas, cabras, bovinos, caballos,
y
aves de conal (FAO 1998). (Hodges 1990) considera
(RGA) a todas las poblaciones que tengan rasgos genáicos particulares y
cerdos, búfalos
únicos, con base en el valor de uso que tengan. En este sentido es
importante considerar el concepto de raza como el componente principal de
la dir¡ersidad de los animales domésticos (DAD), ya que las razas son el
resuliado de la diversificación genética dentro de las distintas especies
durante el proceso evolutivo y por lo tanto toda la diversidad de la especie
está representada por sus razas. Rodero y Henera (1998)' conciben la
wa
corno urxr categoría taxonómica de orden subespecífico en cuya brrnac¡on
intervienen dos proc€sos, uno biologlco y otro antropológico' que determinan
las siguientes etapas en su desanollo:
a) Subepecies geogÉfcas, previas a la domest¡cac¡ón.
b) Razas primitivas, con limitada intervención del hombre'
c) Razas naturales, etapa de transición a las actuales'
24
d) Razas actuales, intensa intervención humana pero conservando
car&er
el
regional.
e) Razas mejoradas, que tienen proyección internacional.
Sostienen además que los mecanismos que intervienen en la diferenciación
de las razas son: el efecto de las mutaciones, el aislamiento reproductivo, la
deriva genética, la selección natural y la artiñcial. También estos mecanismos
intervienen en la ficrmación de distintos grupos subraciales:
Subrazas: Se forman principalmente por el efecto de la selección natural.
Varietiades: Se forman principalmente por el efecto de la selección artificial.
Estirpas: Son poblaciones de una raza aisladas reproduciivamente por
algunos ganaderos, con apareamientos consanguíneos, sin introducción de
material elrterno al menos durante cinco generaciones.
Línes: Son una suMivisión de la estirpe, originadas por métodos
de
cruzamientos reproduct¡vos idóneos que exigen un aislamiento de un menor
número de generaciones que la estirpe.
Por último, definen ftrza como: 'poblaciones que s€ distinguen por un
st¡unto de carac'teres visibles exteriorr}enie, que están determindos
genéticamente y que se han diferenciado de otras de la misma especie a lo
largo de proceso histórico, teniendo en cuenta que se han originado y
localizado en un área determinada con un ambiente común'.
Una definición clásice de raza es la de Aparicio Sánchez, (1956): "Conjunto
de individuos con caracteres morfolfuicos, fisiológicos y psicolfuicos propios'
por los que se les distingue de otros de su misma especie y que son
transrnisibles por herencia dentro de un rnargen de fluc{uación conocido'.
Existen otras definiciones como la de Alderson (1974): 'Grupo de animales
de característ¡cas similares que reproduciéndose entre si dan una progenie
dC m¡smo t¡po, dentro de los estándares publicados por la oqanización cle
registro", o la de Schebrt (2000): 'Grupo subespecffico de animales
doméstios con características extemas definidas e identificables que le
permite ser diferenciado por apreciación visual de otros grupos definidos de
la misma especie", a la cual añade una variante .Grupo de animales para el
cual la separación geográfca y/o cultural de otros fenotípicamente similares,
le ha permitido que se acepte para ellos una identidad distinta, en ecte
sentido la raza es a menudo aceptada mas como un conc€pto cultural que
tecnico". Esta definición es la propuesta ofcialmente por FAO y siendo éste
un organismo suftagado por la mayor parte de los países de nuestro contexto
iberoamericano, incluidos Argentina y España, ésta es sin duda la definición
a la que nos debemos referir oficialmente.
Una definición mas amplia es la propuesta por S¡ena (2001): 'Raza es un
concepto técnico científico, identifcador
y
diftrenciador de un grupo de
animales, a través de una serie de características (morfológicas, produc.tivas,
psicológicas,
de adaptación) que son lransmisibles a la
descendencia,
manteniendo por otra parte una cierta variabílidad y dinámica evolut¡va"
Queda claro que
el conc€pto de raza está sustentado en la
.
diversidad
biolfuica de la especie, marcando diferencias mayores o menores dentro de
la
especie,
difererrcbdor
o
como expresa Siena (2001): "El concepto
y el hecho
de diversos grupos animales dentro de la misma esp€cie
seguirá existiendo, aunque podamos llamar a estos subconjuntos dentro del
conjunto especie de
la forma que queramos acordar (subespecie,
raza,
subraza, variedad.)". Lo que es difíc¡l de determinar es q¡aler¡ son los límites
de los ganaderos que la proponen y de los técnicos que la reconocen, ya que
en@ntramos diferentes magnitudes de identidad entre grupos de animales a
dist¡ntos niveles dentro de una misma especie. Por otra parte es importante
resaltar la conveniencia de mantener
la mayor diversidad posible en los
animales domésticos a efectos de contar con suficiente fuente de variación
para ser aprovechada en planes de mejora y obtenciÓn de mayor cantidad y
calitlad de p¡oduc*os. Además muchas razas son portadoras de genes
únicos o combinaciones únicas de genes y su ¡Érdida puede comprometer la
existencia de líneas, familias o razas únicas' Una vez pérdidas no pueden
26
ser regeneradas nuevamente, por lo que su desaparición, si ocuniese, sería
permanente.
Teniendo en ctrenta todo lo expuesto, en la práctica podemos admitir que
una raza es aquella población de animales domésticos que la entidad
administrativa competente estima como tal. En tal sentido, cada país se
organiza de acuerdo a su prop¡a legislación para reconocer ofic¡almente sus
razas, generalmente apoyándose en criterios técnicos, pero también
administrativos y políticos.
Quiás sería necesar¡o alcr,nz:r un @nsenso intemacional en tal sentido, ya
qre lo que es indiscutible, es@ialmente desde el punto de vistra genét¡co es
que las razas son una realidad biologica que probablemente suponga un
punto de ananque en la especiación.
4.4.1.2, Elección de razas a consewar
Existen varios criterios que pueden ayudar a la hora de tomar una decisión
sobre las poblaciones que se van a @nservar (grado de amenaza de la
población, adaptación de la misma al medio, que posea caracteres de interés
económico, caracteres únicos
o que posean un valor cultural o
histórico).
(Thaon D-Amoldi y col 1998) propusieron seleccionar las razas a oonsetvar
en función de la diversidad genética que se obtiene a partir de una matriz de
distancias genéticas, entendiendo que cuanto más distante sea una Íaza de
las demás con las que se está comparando, mayor diversidad genética
sta raza. Esta propuesta ha sido criticada por (Caballero y col' 2002)'
por no tener en cuenta la diversidad genética dentro de las razas'
Recientemente a partir de los datos obtenidos en proyectos europ€os
tendrá
coordinados de bovino, ovino, caprino
y
porcino, se puede afirmar que la
distancia genética no es un criter¡o fiable para determinar el valor genét¡co de
que
una raa pues refleja más el grado de aislamiento genético de la misma
sus características singulares. En princ¡pio, aunque la información obtenida
27
@n los marcadores moleculares es fundamental para seleccionar una raza
pana @nservación, es muy aniesgado condenar a otra a su
n@nservación
ba¡ándose sólo en esta información. (Simianer 2002). También (Simianer
2005), recomienda combinar la diversidad genética con otros criterios como
presencia
de
caracteres genéticos espec¡ales (p.ej. resistencia a
enbrmedades, caracferes productivos, valor cultural.) Piyasatian y Kinghom
(2003) proponen seleccionar las razas o poblaciones que deben introducirse
en un programa de conservación teniendo en cuenta la diversidad genét¡ca,
el mérito genético y la viabilidad de las poblaciones @nservadas.
4.4.2. Historia de los Marcadores Morfológicos y Genéticos
Hasta mediados de la década de los 60. los marcadores utilizados en los
esüdb6 de genetica y mejoramiento animal eran aquellos controladG por
genes asociados a caracleres morfológicos, en general fenotipos de fácil
identificación visual y de igual manera se basaban en criterios bioquímicos
(Bredtey et al, 1996 y Saitou y Nei, f 987). Sin embaryo, el pequeño número
de marcadores morblógicos distintos en un mismo linaje, reducía la
probabilidad de encontrar asociaciones significativas entre estos marcadores
y caracteres de
¡mportanc¡a económica en diferentes poblaciones. Por lo
tanto, sdo ocasionalmente eran identificados marcadores morldfuicos
ligados a genes de importancia económ¡ca, lo cual limitaba su empleo en
programas de mejoramiento. Además,
la
disponibilidad
de
marcadores
nrorblogicos €taba esenc¡almente restringida a unas pocas especies, donde
la intensidad de los estudios y la disponibilidad de informaciones genéticas
eran mayores (Feneira y Grattapaglia' 1998).
Por otra parte, la taxonomía siempre ha estudiado
características
observaciones muy exhaustivas de los
organismos en diferentes fases de crecimiento. Los criterios utilizados
morfulogicas,
lo cr¡al requiere
carecen muy 8 menudo de definición y objetividad y, en cua|quier caso, 3on
marcadores ambiguos debido
a las influencias ambientales (Claros
Díaz,
1998; Gentsch, y col 1992).
Con la aparición de los marcadores molecr¡lares, se logro eliminar tanto los
inconvenientes de una selección basada en el análisis exclusivo del fenotipo,
como la identificación de especies y variedades de una forma más rigurosa y
repeütiva.
Los marcadores moleculares son biomoléculas que se pueden relacionar con
un rasgo genét¡co, pueden ser de dos tipos: proteínas (antígenos e
isoenzimas) y ADN (genes conocidos y fragmentos de secuencia de función
desonocida). Los marcadores funotípicos y genotípicos, pueden ser
monomórficos o polimórficos. Un marcador monomórfico es invariable en
todos los organismos estudiados, pero cuando presenta diferencias en la
secuerlcia, aciividad enzimática, estrudura o sitios de restricción, se dice que
es
polimórftco.
A
veces el grado de variación es tal que se denomina
hipervariable (Claros Díaz, '1998; Gentsch, y col 1992).
Los primeros marcadores desanollados a finales de los 70 s€ basaron en la
idenlificacion
de proteínas e isoenzimas por electroforesis en geles
de
almidón o poliacrilamida. Con ellos se abrió el conocimiento de la estructura y
heterogeneidad genética
entre dibrentes especies, variedades, y
de d¡st¡nto origen geogÉfico. Pero esta técnica tenía la
limitación de no detectar suficientes polimorfismos entre variedades o
poüac¡ones
espec¡es próximas (Claros Díaz, 199E).
El
número
de
marcadores genéticos disponibles
fue
ampliado
cons¡ds"ablemente y la aplicación de la técnica se extendió pÉclicamste a
todas las especies eucarióticas (Saitou y Nei, 1987; Bradley y col, 1998)' Con
la llegada de las técnicas modemas de biología molecular, surgieron diversos
rnáo&s de detección de polimorfismo genético directamente a nivel de ADN
(Feneira y Grattapaglia, 199E).
29
4.4.2.1. Marcadorce Moleculares o Genéticos
Cualquier gen que muestre polimorfismo (dos
o
más aleloo)
y que loa
estable durante la vida de un individuo se puede utilizar como marcador
genético. Los marcadores genéticos son loci que presentan caraclerísticas
detedables que pueden d¡brir entre individuos. Se acepta que son sinónimos
de variación en las secuencias del ADN y que ésta puede ser revelada
mediante diferentes técnicas. Los marcadores genéticos tienen las
características inherentes al material genético, son caracteres constantes,
p€rmanefttes, indelebles, se presentan en el individuo durante toda su vida y
son ajenos a la acciÓn del medio ambiente. El nivel de variación de los
marcadores genéticos
es fundamental cuando se estud¡an
relaciones
getráirps dentro y entre razas (Bretting y Widdechner' '1995)'
4.4.2.2.Tipos de Marcadoree Moleculares basados en el ADN
Las técnicas con base en marcador€s moleculares están enfocadas a
determinar la organización de la estruc{ura genéüca en una poblack¡n o
individuos de interés, aun cuando las bases moleculares de dichas técnicas
difieran en requerimientos tá:nicos y experimentales'
que se puoden
Exist€n varias tá:nicas para identificar marcador€s de ADN,
y 2'
agrupar en dos categorías principales: 1. Por hibridación tipo Southern
PCR'
Con base en la reacción en cadena de la polimerización o
1. La h¡bridac¡ón consiste en la furmación de una moláe¡la de doble
@na
mediantee|apareamientoounióndebasescomp|ementariasdeC|os
explora las
moléculas de una sola cadena. La hibridaciÓn tipo Southem
de ADN oca3iofladas
variaciones en la longitud o tamaño de los fragmentG
particular o
por la restricciÓn del genoma mediada por una enzima
primero' la e{racción de ADN del
endonucleasa. Esta técnica comprende,
material que se desea estud¡ar; luego, la adición de enzimas de restricción o
endonucleasas,
las cuales cortan el ADN en fragmentos de
diferente
lorigitud. Estos ftagmentos son separados en geles de agarosa para realizar
por capilaridad, la transferencia de los fragmentos
a una membrana de
nitrocelulosa o de nylon. Ver anexo 1. Finalmente, se hibridan los fragmentos
de la membrana con sondas marcadas con radiadividad o sin radiactividad
para visualizar y detectar las bandas hibridadas (Solís Ramos, y Andrade
Tones, 2005). Dentro de esta técnica se encuentran los marcadores basados
en los polimorfismos de la longitud de los ftagmentos de restricción del ADN
(RFLP).
2. Metodologías fundamentadas en la reacc¡ón en cadena de la polimerasa
(PCR).
La técn¡ca de PCR, o reacción en cadena de la polimerasa, e{t una
tecnología utilizada para la síntesis in vitro de fragmentos específicos de
ADN con la finalidad de detectar una secuencia o gen de interés en el
g€norna del individuo en estudio. Se basa en la amplificación de tagmentos
d6 ADN
a partir de
secuencias de nucleótidos denominadas 'cebadore o
iniciadores" (primers), que son c€¡paces de reconocer una secuencia blanco
para la cual es complementaria. Dentro de esta metodología existen diversas
varianles de la técnica trad¡c¡onal tales como PCR anidada, PCR múltiplex,
RT- PCR, PCR rn srÍu, PCR, entre otras.
La PCR múltiplex, es una táxica en la cual se amplifica más de
una
s€cuenc¡a en una misma reacciÓn. Esta reacción consiste en combinar dos o
rnés pares de cebadores (oligonucleótidos) en una reaccion única' con el fin
de amplificar simultáneamente múltiples segmentos de ADN de tamaño
conocido (Solís Ramos, y Andrade Tones, 2005). La PCR múltiplex tiene la
ventaja de ahonar tiempo y esfuerzo dent¡o del laboratorio' sin comprometer
la etuctividad de la prueba. Las condiciones de PCR, como la compatibilidad
entre los primers dentro de la reacción y la no interferencia, son de gran
importancia técnica. cuando sea posible, la PCR múltiplex debe ev¡tar el uso
3l
de primers anidados que requieran una segunda ronda de amplificación, esto
debido a los resuttados falsos positivos, consecuencia de la contaminación
generada. (Elnifto, y col 2000).
Este técnica ha sido empleada para evaluaciones genéticas, genotipificacón,
detecc&in
de
patogenos
o de organismos genéticamente
modificados,
análisis de microsatélites y otras aplicaciones, donde es necesario amplificar
varios productos en una sola reacción, pero es ¡mportante tener en cuenta
que esta técnica requiere de una optimización adecuada debido a que los
dírreroe de primers y otros productos inespecífrcos pueden interferir con la
amplificación de los produstos deseados. Por otra parte, la especilicidad de
la reacción puede estar influenciada por varios factores como; el
buffer
utilizado en la PCR y la concentración de primers (Lotrert, y col 1999).
3.
Marcadores basados en variación
de nucleótidos: Los
marcadores
conocidos como 'Polimorfismos de Nucleótido Simple", ó SNPs (del inglés
'single nucleotide polymorphisms"), son una variación de una sola base en la
seanncia del ADN, que se están convirtbndo rápidamente en una bu€na
opción para definir marcadores para estudios de asociación Hirschhorn y col
(2005) Tesfai y col (2001). Si bien estas mutaciones pueden expresarsie o no,
según la zona del genoma donde se encuentnen, los SNPs son una fuente
¡mportante de variabilidad fenotípica.
Los SNP son marcadores bialélicos muy abundantes y están distribuidos a lo
largo de todo el genoma; sin embargo los de mayor importanc¡a a ñnes de
explotación ganadera se ubican principalmente en cercanías de genes que
interv¡enen en procesos metabólicos que modifican la producción de leche, la
temeza de la came, el metabolismo de la grasa, el control del balance
energético y la al¡mentación del animal (Maudet y col 2002)'
+
La selección también trata de eliminar características no deseadas. A nivel
genético, esas caraclerÍsticas productivas distint¡vas se deben
a difererües
alteraciones a nivel molecular, incluyendo mutaciones de un sólo nucffio,
o SNPs. Los SNPs se pueden usar para caracter¡zar poblaciones bovinas
(grado de parentesco, consanguinidad, distancia genética, etc.), debido que
estas mutaciones son una fuente importante de variabilidad ÉnotÍpica
(Ferguson y
al
2007).
de
Existen diferentes métodos
genotipado para SNps que
desanollado recientemente. S¡n €mbargo,
la
se
han
mayoría de ellos son muy
@stosos. El uso de enzimas de restricc¡ón para la genotipificación de SNp es
un método bastante rentable. Sin embargo, la minería de
las
enzimas de
restriccion para el estudio de SNP en una s€cuencia del genoma es aún un
desafio para los investigadores que no tienen una base en la genómica y la
bioinformática. La futura evolución en estos análisis incluirá la mejora de los
programas computacionales
de
PCR-RFLP proporcionando una mejor
visualizrción y un entomo más ¡nteractivo para la genotipificación de SNP y
así, poder integrar estos con otras henamientas utilizadas en estudios de
asociación. (Chuang y col 2008)
El nlvel de variación observada en la especie bov¡na por medio de los
análisis con microsatélites permite el uso de pocos loci para la identificación
del ganado así como para la
determinación
de su
filiación.
Por el contrario los SNPs son una henamienta mucho más simple que los
microsatélites y que también sirve para determinar la variación existente en €l
ADN, esto se debe a que existe solamente un cambio en un nucleótido en
una posición exacta del código genético. Esta falta de diversidad hace que
los marcadores SNP provean menos inbrmación que los marcadores tipo
microsatélites. Así mismo, una variante SNP no discrimina muy bien entre
individuos. Sin embargo, el genotipado de varios SNPs puede superar este
problema.
El gpnotipado de SNPs también tiene ventajas con respecto al genotipado
cott STRs. debido a su menor tamaño, son menos propensos a la mutación
gamética. Los SNP son más robustos en su interpretación y en el análisis de
además pueden ser genotipados, mediante una variedad de
méto6 de alto rendimiento en varias platabrmas, muchas de las cuals se
pueden automatizar haciendo menos costoso su genotipado. (Allen y col
informes,
2O1O)
Existen
f0
millones de SNPs @munes que consütuyen
el
90oÁ
de
la
varíación en la población humana y animal. Aunque la mayoría de los SNP,
hasta la fecha, no juegan un papel importante en la función celular, se han
encontrado SNPs asociados a alteración de proteínas o rasgos fenotípicos.
Le
SNPs tienden a segre{¡arse iuntos, como un haplotipo, las conelaciones
de posición, denominadas desequilibrio de ligamiento; son fundamentales
para gran parte de la investigación genét¡ca; donde se estudian variantes de
s€d¡€nc¡a ubicadas en, o cerca de, la mutación causal de una caras{erbtica.
Estas tecnologías de genotipado de SNP presentan muchos retos
estadísticos
e
informáticos, ftente
a los cuales se ha desarrollo varios
algoritmos de genotipado que son altamente precisos, escalable' efic¡enles y
esÉmbos,
como son los microanay SNP. (Xiao y @l2OO7)
4.4.2.3.Aplicaciones de los Marcadorcs Moleculares
Las ventajas de los marcadores moleculares se resumen en su estabilidad,
permitiendo que sean detectados, sin importar la etapa de desarrollo del
animal y por no estar afiectados por la interacción con el medio ambiente. Por
lo tento, son henamientas ideeles para un análisis objetivo, preciso y verez
(Caetano-Anollés & Trigiano 1997, Stuber y col 1999).
34
De un modo general, el empleo de marcadores moleculares en
el
mejoramiento genético puede ser distribuido en diversas aplicaciones anyos
resutado8 presenlan expeclstivas
aplicaciones
a
a corto, mediano y largo plazo. Las
corto plazo incluyen, básicamente,
la
identificación y
discriminación de genotipos. En las aplicaciones analíticas de medio y largo
plazo, los marcadores permiten cuantificar la variabilidad genética existente a
nivel de secuencia del ADN y conelacionarla con la expresión fenotípica en
procedimientos de mapeo genáico (McHugh,
col., i994). En las
y
la información generada en la fase analítica, es
integrda a las metodologías de selección y recombinación de genotipos
como una herramienta adicional para promover el avance genético. Los
aplicaciones sintéticas,
marcadores moleculares se han constituido en henamientas fundamentales
en la oonstrucción de mapas genét¡cos de genomas eucar¡otas y han
posibilitado la clonación de genes que pueden ser utilizados en el
mejoramiento mediante transformación genética (Ferreira & Grattapaglia,
1998).
De esta forma, la genética molecular ofrece actualmente una seríe de
henamientas que pueden aplicarse para facilitar la identificación y registro de
individuos (Cornide, 2002), en la determinación del grado de consanguinidad
WnSht 1969) y diversidad genética existente entre y dentro de las disüntas
poblaciones animales, así como también en la estimación de las distancias
genéticas (Nei, 1987; Weir, 1996; Beaumonl, y col 1998) presentes entre las
poblac$ones animales
y en la definición de sus orígenes y
prooe{tos
evolutivos (Nagamine y Higuchi, 2001).
Entre otras apl¡caciones que pres€ntan los marcadores moleculares se
siguientes: identificación de origen parenta¡,
identificación y protección de variedades, disc¡iminación entre clones,
análisis filogenéticos y taxonÓmicos, cuantificación de variabilidad gárica
ptreden encontrar
las
intra e interespecífica, asistencia a programas de retrocruzamiento, estudios
35
de diversidad, certificación de pureza genética, control de cruzamientos,
dsarollo de linajes, mejoramiento de carac'terísücas cuantitativas, entre
otras (Claroe Díaz, 1998).
En relación con la medición de la variabilidad genétíca' los marcadores
moleculares deben reunir una serie de caraclerísticas para maximizar su
utilidad: buena distribución a lo largo del genoma, alto grado de polimorfismo,
rapidez
y
practicidad para analizar
el
marcador
de interés y debe
ser
repetibb.
4.4.3.
M¡crcatélites (STRs)
Los microsatélites o sTRs (Short Tandem Repeats), son secuencias simples
deADN(cuyotamañovadesdeunpardebaseshastas€isparesdebases)
genoma
repetidas en tándem entre 1O a 50 veces e intercaladas al azar en el
eucariotas (Hartl, y Clark, 1997' Crawford y
de todos los organismos
poca muy
y
Cuthbertson, 1996; Goldstein y Pollock, 1997; Jame' 1996) en
(Ver
rpdida en bs procariotas (Hamada, y col 1982; Weber y May, 1989)
es
figura número 3). La frecuencia de las distintas secuencias microsatélites
que en t'odos
diGrente según el genoma estudiado, aunque se ha observado
de las
ellos las más comunes son lag repeticiones dinucleotídicas, seguidas
medida (Tautz y
mononucleotídicas, trinucleotídicas y del resto en menor
a su
Renz, 1984; Beckmann y Saller, 1990)' Los STRs, de acuerdo
únicamente un
estrudura, pueden ser de tres tipos: perfectos, que cont¡enen
repetido n veoes' imperbctos' que contienen una
rdir¡o nuchtídico
secuencianorepetitivainterca|adaentrelasrepeticiones,ycompuestos'que
estánconstituidospordosomástramosdemotivosrepetit¡vosdiÉrentes
Weber,1S90).
marcadores moleculares
Una de las características de importancia de estos
visua|izar ambos a|elos on un
eg que son codominantes, es decir, permiten
36
individuo heterocigótico diferenciándolo del homocigoto, facilitando la
deteminac¡ón del origen de los alelos heredados por la progenie de un
cn zamiento y relacionar los genotipos, con las caracÍerísticas fenolípicas de
interés (Feneira & Grattapaglia 1998; Becena y Paredes, j999). La variación
en el número de repeticiones crea diÉrentes alelos los cuales se distinguen
entre sí por la longitud totaf del ftagmento.
a
que los STRs son secuencias altamente repetitivas, que
generalmente no están sometidas a presiones selectivas, puesto que no
Debido
codifican para características fenotípicas, tienen alüas tasas de mutación
presentando un alto polimorfismo en su longitud. Por diferir en unos pocos
pares de bases de nucleótidos, el producto amplificado debe ser conido en
geles de poliacrilamida o en agarosa de alta resolución. El alto polimorfismo
permite una discriminación precisa entre individuos altamente emparentaclos
(Feneira & Grattapaglia 1998; Senior & Heun, 1993).
Los STRs están distribuidos al azar en genomas eucariotas y son muy
Iteanentes, lo que permite un completo seguimiento con estos marcadores
en cualquier genoma eucarionte, incluso entre géneros. Además, en algunos
casos están conservados entre especies relacionadas lo cual brinda la
posibílidad de transferir marcadores entre esp€cies (Ferreira & Grattapaglia,
1s8; Stalling, y col 1991; Moore, y col 1991). Pé¡in, y col., 1995, tipúñcaron
un panel de 70 STRs bovinos en la especie caprina y otras especies
proximas y encuentran un total de 41 marcadores que pueden ser
susceptibles de amplificar en ellas.
Los STRs son marcadores neutros con respecto a la selección' ya que no se
ven modificadas sus frecuencias @mo consecuencia de la selección llevada
a cabo en una población (FAO f999). Para un marcador neutral, el grado de
polimorfismo está en función de la tasa de mutación. La tssa y la dirección de
la mutación constituyen dos factores Msicos en la estimaciÓn de distancias
3I
genéticas, particularmente cuando
se tiene en cuenta el tiempo de
diveruEncia entre dos poblaciones.
Además de esto, los STRs usan cantidades pequeñas de ADN, son fáciles
de manipular y son ideales para los experimentos de selección asistida por
marcdor€s cuando un número alto de individuos debe ser probado (Feneira
& Gratapaglia, 1998: Holland, 2001).
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Jordrni
2001.
4.4.4.Aplicacionea, ventajas y desventaias de los llicroeatélites
una de las ventajas de estos marcadores yersus otros (minisatélites, RFLP'
de autores
RAPD, SNP's) radica en que están considerados' por la mayoría
genético y físico (Vaiman'
como la más poderosa henamienta para el mapeo
y
y col., 1994; Ashwell, y col., 1996; Thieven, y col', 1997; Solignac' col''
estudios de
2004), para la identificación y discrim¡nac¡ón de genoüpos' en
como
genética de poblaciones, invesligaciones en difurerfes enfermedades
y Crittenden' 1994; Russell' y
€l cáncer (Goldstein y SchÓtterer, 1999; Cheng
y
1995; Garcíacoll., 2000; Caskey, y col', 1992; Glorratzki- Mullis' col''
y col''
y
1996 y Todd, 1992) estud¡os de filogenia (Machugh'
Morerp,
col.,
consanguinidad (Paris€t' y
1997: Mommens, y col., 1999; Ritz, y col', 2OO0)'
38
col., 2003; Chikhi, y col., 2004), además se han empleado en trabajos de
¡nvestigación, que buscan la caraclerización racial
y determinación de las
relrciones genáicas entre diversas razas bovinas (Cañón ,
Freeman,
y
col., 2006; Jodana,
y
col., 2003; Machugh,
y
col
.
,
20O I
;
y col., 1994;
Machugh, y col., 1998; Moazami- Goudazi, y col., 1994; Moazami-Goudazi,
y
ol.,
1997). Estras múltiples aplicac¡ones se deben principalmente
a que
este tipo de marcadores moleculares son muy polimórficos, presentan
herencia mendeliana simple, son codominantes, son fáciles de medir y
analizar, y son cien por ciento fiables y automatizables (Goldstein and
Po[ock, 1997; Maleviciute, y col., 2002; Fries, y col., 1990; Boichard, y col.,
1
998; Martínez, y col., 2006"; Farooq & Azam, 2002).
Además, son muy frecuentes y están distribuidos al azar, permitiendo la més
completa cobertura de cualquier gengma eucariota. Se ha observado' por lo
menos en genomas animales, que los sitios microsatélites están bien
conservados entre especies relacionadas, lo cual permite en algunos casos,
la transGrenc¡a de marcadores entre esp€c¡es incluso entre géneros usando
primers heterólogos (Moore, y col., 1991; Menottiraymond y Obrien' 1995;
Stallings, R. 1., 1992).
tlebido al costo, la rapidez y facilidad de su uso, los STRs han reemplazaclo
a los RFLPs en varios programas de cruzamiento trad¡cional, acelerando la
introgresión, la recuperación del genoma parental recunente, disminuyendo
el número poblacional requerido y algunos costos de evaluación en campo
(Dr€h€r
y col. 2000, Frish & melchinger' 2001),
además este tipo de
marcador molecular no requiere materiales radiactivos, se torna más seguro
para el medio ambiente y para la manipulación en laboratorio'
Debido a la excepcional variabilidad y a la facilidad en su identificación, los
sTRs son considerados ectualm€nte como los marcadores genéticos más
poderosos para estudios poblacionales (Goldstein y Pollock' 1997)'
Se ha probado que los STRs son marcadores moleculares
versátiles,
particularmente para los análisis poblacionales (Laval, y col., 2000), pero no
por ello se encuentran ausentes de limitaciones. Los
microsatélites
desanollados para unas especies particulares pueden con frecuencia ser
aplicadas a especies emparentadas, pero el porcentaje de loci que se
amplifcan satisfactoriamente puede disminuir cuando aumenüa la distancia
genética.
4.4.5.Mecanismos de mutación de los microsatélites
Los marcadores microsatélites han tenido gran impacto en la genética de
poblaciones; se han convertido en los marcadores codominantes de elección.
Mutan a una tasa extremadamente alta y se piensa que evoluc¡onan bajo el
ffEdslo de mr¡tacón por pasos (steprnse Mutation Model), caracterizaclc por
la adición o supresión de uno o más grupos de bases (Xu y col 2000)'
aunque los dinucleotídicos, tienen un modelo de muüación más parecido al
moddo de alelos inftnitos (1,4M) (Shriver y col 1995)' Se ha obs€rvado que
los microsatélites más largos tienden a acoftarse cuando ocurre
una
mutación (Calabrese y ml 2001). La alta tasa de mutación conduce a varios
problemas:laprobabilidaddediferenciardosale|osidénticospor
dsg|denciaoporestadodecrececonbrmelatasademutaciórso
Fst,
incrementa (Rousset 1996); las inferencias tomadas a partir del valor de
por la
como d€tectar el nÚmero de migrantes, pueden resultar sesgadas
impoeitilirladdeseparar|o3efecfosdemutaciónymigración(Ba||ouxycol
2ooo).
Abrtunsdamente,sehademostradoquecuandoe|procesodemutaciónes
cone|modeloporpasos,|amigraciónpuedegerdiferenciadade|procesode
puede aplicar con la
mr¡tacÚr (Rousset 1996). Desafortunadamente, no se
mismaeficaciaen|osmicrosaté|itesd¡nuc|eotídicosdonde|asimi|itudno
debidaalparentesco(homop|asia)esfrecuente.Lahomop|asiacausauna
40
subestimación de la variación entre poblaciones y por ende de las distancias
genéticas y por tanto se produce una sobreestimación de las similitudes
eñtre hrs poblaciones (Aranguren-Méndez 2005). La tasa de mutación ds los
microsatélites consta de
est¡mado una tasa
10-3
a
10-5
por loculgenerac¡ón. En humanos se ha
de 103 y en ratones de
10-3
a
10a por locus por
generación (Dallas 1992).
4.4.5.1. Modelos de Mutación
La mutación de los microsatélites generalmente involucra un cambio en el
tarnafu de una repetición, pero a veces, involucra varias unidade de
repetición (Beckmann y Weber 1992).
Los modelos de mutación son necesarios si las frecuencias alélicas de dos
grupos de individuos van a r¡cr uülizadas para calcular d¡stanc¡as gerÉthas
entre ellas. La utilización de un modelo de mutación especílico es esencial
para la estimación de parámetros de las poblaciones (diferenciación
genétba, número de migrantes por generación.) que son dependientes del
moddo de mutación propuesto para los marcadores (Goldstein y Scttldtwer
1999). Clásicamente se han propuesto para microsatélites dos modelos de
mutación opuestos, el modelo infnitesimal (lAM) (Kimura y Grow 1964) y el
de mutación por pasoe (SMM) (Kimura y Ohta 1976). El SMM
describe la mutación de los alelos de los microsatélites por la ¡Érdida o
ganancia de una unidad de repetición de la serie y que puede mutar y
modelo
convertirse en algún alelo ya existente en la población. En contraste' bajo el
lAM, una mutación involucra cualquier número de repeticiones y siempre
resulta en un alelo que no existía en la población.
Se han propuesto métodos de SMM intermedios y más complejos y los
resultados cle los parámetros de los modelog matemáticos estimadoo por
máxima verosimilitud (Whittaker y col 2003) son comparados con medioones
de variabilidad (heteroc¡gosidad, varianza del número de repeticiones,
4l
asimetría de la distribuc¡ón) observadas dentro de las poblaciones
rec¡ertemente con la distribución de
lc
y
más
microsatélites en bases de datos de
genómica (Ellegren 2004).
4.5.
Sefección
de
microsatéliües
para carac|e,úzar
genét¡camente
poblaciones bovinas
La FAO (1993), a través de un grupo de expertos de la Sociedad
Iniemacional de Genética Animal (ISAG)' estableció una serie de
recomendaciones acerca de las propiedades que deben reunir los
microsatáites para el análisis d€ distancia genáica y la caraclerización de
las distintas especies de interés zootécnico, ellas son:
a. tleben ser de dominio Público'
y
b. Es importánte conocer 3u situac¡ón en los mapas genéticos de la especb
no presentar relaciones de ligamiento entre ellos'
c. Las variantes alélicas deben tener una herencia mendeliana s¡mple'
microsatélite debe tener al menos cuatro alelos, aunque los
rnsfd.es con un alto grado de mutación no siempre son los más idóneos
d. cda
puespuedendar|ugaradesajustesen|asegregaciónynoseradecuados
para los análisis de distancia genética.
c. cuando sea pocible sicmpre es mejor utilizar marcadorca intcrcEpccífi@s
(comunes a varias especies) Siguiendo estos criterios, la FAO (FAO' 1998)
recomendó una lista de 30 microsatélites para estudios de biodiversidad
bovina.Enelaño2oo4sepub|icaron|osresultadosdeunaencr¡esta
¡fr¡Ü¿z€,EporlaFAosobreestudiosdediversidadgenéticaenan¡meles
no era muy
domésticos (Baumung 2004) que mostraban que esta lista
utilizadaenestudiosdebovinos,loquellevÓaquelaFAOrecomendaseuna
nueva lista de microsatélites para bov¡nos'
(http:/twww. user. gwdg.de/FAO/cattle' htm)'
¡
42
4.6. Técnicas para la caracterización alélica de microsatél¡teg
Existen tres etapas para la caraclerización de microsatélites de DNA: la
extracción del DNA, la reacción de amplificación mediante la Reacción en
Cadena de
la
Polimerasa (PCR)
y la electrobresis del producto de la
reacción. Los protocolos de extracción de DNA o Rl{A dependen del material
biologico utilizado (sangre, semen, pelo, orina, heces, saliva, etc.) y la
utilización posterior del ácido nucleico obtenido. En general, los protocolos de
extracción de
DM
constan de dos partes, en una primera se pretende lisar
bs élulas y solubilizar el Dt{A y, en la segunda, eliminar por
métodos
enzimáticos y/o químicos, las proteínas, el RNA y otras macromoléculas. Con
estas tá;nicas se obtienen grandes cantidades de DNA de alto peso
mohcular a partir de pequeñas muestrag de tejido ftesco o congelado, así
como la posibilidad de mantener conservado durante largos periodos de
tiempo el material obtenido.
El DNA eucariótico purificado se ha obtenido clásicamenle
sometiendo
muestras de tejidos a una digestión con proteinasa K en presencia de SDS y
EDTA, varias extracciones con fenol y cloroformo y finalmente precipitación
alcohólica en presencia de sales (Blin y Stafford 1976; Maniatis y col 1982;
David y col 1986). A partir de este prctocolo inicial han suryido otros que
intentan reducir el riesgo al manipulador, el t¡empo empleado para obtener el
y por último, los costos (Miller y col 1988), (Grobet y col
En el caso de utilizar el DM obtenido exclusivamente para amplificar
Dl,lA purificado
1991).
secuenc¡es microsatélites mediante la PCR, las exigencias de purifimión
disminuyen enormemente habiéndose diseñado estrategias realmente
sencillas para preparar la muestra. Una vez obtenido el DNA molde a ser
gmptifcedo la siguicnte etapa conaislc en la reacción de amplifcación. La
duplicación del DNA in vitro ocune de forma semejante
dentro de la
élula exigiendo básicamente los mismos
a lo que ocurre
componentes: DNA
molde. desoxinucleót¡dos trifosfatados (dATP, dCTP, dTTP, dGTP)' Dl.|A
43
polimerasa
repetkJos
y
cebadores oligonucleotídos.
La PCR consiste en
ciclos
de amplificación, de 30 a 45, con tres etapas en cada ciclo:
denaturación del DNA a temperaturas entre 90 y 95 oC, anillamiento de los
cebadores a una temperatura entre 50 y 60 oC y la elongación de la cadena
por la polimerasa a72 oC (Fisher y col 2000). Con el objeto de ahonar l¡empo
y esñrezo, se pueden amplificar simultáneamente dibrentes secuencias en
una ún¡c€¡ reacción, proceso conocido como PCR múltiplex.
Un factor importante en la PCR es la conecta elección de los cebadores, que
deben asegurar la especificidad y eficiencia de la amplificación, utiliándose
cebadores con
h
mínima longitud y evitando que los oligonucleótidos sean
complementarios entre sí (Rychlik y col 1993). La electroforesis en gel es una
de las técnicas más
utilizadas para
microsatélites. Generalmente
la
se eledúa la
de
variantes de
elec,trobrcsis en geles de
detección
poliacrilamida que permiten una resolución de un sÓlo nucleótido. Para
localizar las bandas de migración del DNA en los geles clásicamente se
revebban los mismos con soluciones de bromuro de etidio, med¡ante la
imprasion de placas radiogÉficas por la emisión de isotopos radiacfivos o la
tinción con plata como un método alternativo por su sencillez y seguridad
(Budorrle 1991). La detección de las bandas se hace cada vez más sencilla
utilizando cebadores marcados con sustanc¡as ffuorescentes, emisor€s de
rayos láser y fotodetectores de fluorescencia. La introducciÓn de estas
técnicas lleva consigo el disponer de un secuenciador automático, con lo que
esta supeditada a las posibilidades del laboratorio en el que se realice la
invsti¡*ion. Los secuenciadores automáti@s son sistemas capae de
determinar las secuencias y tamaños de fragmentos cuantificando la
f,uorescencia emitida por oligonucleótidos o dNTPs marcados con
inorocrcmos.
Para calcular el tamaño de un fragmento de DNA desconocido se utiliza un
patrón o estándar formado por tragmentos de DM marcados de d¡versas
|ongitudesconocidas,evitandoqueSeso|apendichosfragmentosconlos
que se están estudiando. Se genera, de esta forma una curva de ajuste de
tamaños mediante un análisis de regresión. Esta curva está basada en el
tiempo en el que el secuenciador detecta los ftagmentos del estándar en la
ventana de detección. Así, cuando se someten a electrofioresis fragmentos
desconocidos junto al estándar se puede determinar con precisión la longitud
molecular de los mismos.
Se pueden emplear diferentes fluorocromos de manera que el número de
fragmentos de igual tamaño que se anal¡cen juntos puede ser tan grande
como fluorocromos se utilicen. Los resultados oblenidos se recogen en un
ebctrofurograma
y
mediante progrEmas inbrmáticos se analizan los datos
recogidos por el secuenciador.
,[.6.l.Errores en la tipificación de microcrtélitet
En la década pasada la optimización de las técnicas de análisis
de
marcadores moleculares condujo a la aparición de grandes bancos de datos
de una amplia variedad de organismos. Desafortunadamente el número de
error€ en el genotipado también se ha incrementado (Sobel y cp,l- 20fl,2;
Hoffman y Amos 2005). Un enor de genotipado se produce cuando el
genotipo de un individuo delerminado después de un análisis molecular no
cons,ponde al genotipo real (Bonin y col. 2004), sin embargo, el ve¡dadero
genotipo es inaccesible directamente, por lo que ha de ser adjudicado por
medio de análisis moleculares. Estudios recientes han demostrado que aún
c¡¡ando se mantenga una tasa pequeña de enor, se pueden distorsionar
serbmente los resultados y la inbrencia que se haga con dlos en trabajos
relacionados con diversidad genética, tamaño efectivo y estructura de
poblaciones, tasas de migraciÓn y relaciones de parentesco (Hoffman y
Arnoc 2005). A pesar de esto, muy pocos catud¡os reportan la taga dc cnor'
Para ilustrar el caso, Bonin y col. (2004), revisaron todos los estudios
publÍcados en la revista Molecular Ecology durante el año 2003 que uülizaron
45
microsatélites y solo el 6Vo de 125 trabajos, mencionan la tasa de enor o al
menos el porcentaje de alelos no ampliñcados o'dropout' o amplifcaciones
falsas. Los error€s de genotipado pueden generarse en cada paso del
proceso (muestreo, extracción
de DNA, análisis
molecular, calificación,
análisis de los datos) y por varios factores (casualidad, enores humanos,
equipo utilizado, técnica de laboratorio). Mrtualmente todos los bancos de
datos para genotipado contienen errores que no se deben despreciar a la
hora de sacar conclusiones.
Cuendo la cantidad de Dl,lA es baja y/o de baja calidad, como es normal en
estudbs empleando muestras de tejido no invasivo, la amplificación por PCR
puede ser poco fiable (Hoffman y Amos 2005). Un problema común es la
fatta esüccástica de la amplificación de un alelo llevando a que los individuos
h€tcfltcigotos aparczcan como homocigotos. Esto se ve mág frccuentemcnté
en loci con alelos de tamaño muy diferente, y el efecto se produce debido a
que un alelo (frecuentemente el más pequeño) in¡c¡a su amplificación primero
en la PCR, en detrimento del alelo más grande y si la cantidad de Dl.|A es
peq¡eña, el alelo más grande podría no ser visible. Este efec{o se cd}oce
como alelo no amplificado o "dropout' (Bjorklund 2005).
Otra fuente de enor son las amplificaciones inespecíficas, que pueden ser
malinterpretadas como alelos vedaderos, como gucedió en un estudio hecho
con heces de gorila en el que hubo amplificación cruzada de un microsatélite
con baclerias clostridium perfringens y Escherichia coli, que también están
en el intesüno de los animales domésticos (Bradley y Mgilant 2002). Aunque
el brÉnrer¡o rio es muy común, sí representa una fuente potencial de eÍor'
A consecuencia de lo anterior, se han desanollado numerosos protocolos
para controlar la calidad de los proyectos; entre las recomendaciones más
cünun€s están: amplificaciones múltiples de una migma muestra'
comparación de resultados con muestras de sangre o tejido, reamplificaciÓn
estraté€¡ca
de algunos loci, cuantiñcación del DNA, estudios piloto y
simulacirln (Hoftnan
y Amos 2005). Aun cuando se espera que el
DNA
extraído de sangre y tejidos sea de la calidad y cantidad adecuadas, los
eÍores de üpificación también ocurren. Los más usuales pueden
ser:
múacón del sitio de unión del cebador (alelos nutos), enores debido,s al
equipo de electroforesis, designación enónea de los alelos y errores en la
captura de datos. De estos,
quiá el más común es la designación
enónea
de los alelos, en particufar se dificulta por las bandas "tartamudas'generadas
por el deslizamiento de la polimerasa durante la PCR y también por la
adición de nucleótidos no presenles en la cadena molde, usualmente
adenina en el extremo 3'de los productos de la PCR (Johansson y col 2003).
Esúoe p{oHemas son más pronunciados en los microsatélites dinucleotídbos,
cuando los individuos heterocigotos pueden diferir en solo una unidad de
repetición (dos nucleótidos en este caso).
Aurgue las tasas de eror sean pequeñas, los efec'tos pueden ser
considerables. Una tasa de enor de 1% en la designación de los alelos,
genotipando 12 loci, conduce a tener al menos un error en el
25o/o
de los loci.
Peor aún, con un error del 2o/o la probabilidad de obtener el mismo genotipo
dd misrp individuo dos veces, es inferior al 407o (Hofirnan
y Amos 2005). En
estudios de genética de poblaciones, los errores de genotipado afectan tanto
a las frecuencias alélicas como a la de los genotipos. Se obtienen falsas
fecuericias alélicas que pueden generar un exceso de homoc¡gote o una
falsa desviación del equilibrio Hardy-Weinberg, sobreestimación de la
consanguinidad o una inferencia enonea sobre la estruclura de las
poblaciones (Bonin y col 2004).
Existen algunas tárricas para identificar los enores de genotipado. La más
sencilla es el genotipado repetido de algunos individuos, aunque esto implica
un gasto y esfuerzo extra. Lo más económ¡co es hacer pruebas estadísticas
d€ bs rcsultados obtenidos como determinar si existe una desviación clel
equilibrio Hardy-weinberg que revelaría el exceso de homocigosis debido a
los alelos nulos o los dropout (Gomes y col 1999). Las pruebas de equilibrio
son menos efuctivas cuando la diversidad alélica es aha y la muestra es
47
pequeña (Guo
y
Thompson 1992). Paradójicamente, aunque los
microsatélites se utilizan para hacer pruebas de patemidad, la forma más
efuctiva para delectar los enores de tipificación es la utilización de las
pruebas de patemidad. Algunos alelos que no se amplifican conectamente,
se ponen de manifiesto al ¡e,aliza¡ las pruebas de patemidad.
4.6.2. Parámetros estadisticos para cuantificar variabilidad genétíca'
Los parámetros estadísticos más empleados para cuantifcar la variabilidad
ger¡ftica son: porcentaje de loci polimórficos, el número medio de alelos por
locus, fa heterocigosis esperada (He) y observada (Ho) y el Contenido de
Inbrmación Polimórfica lPlC) (Aranguren y col 2002). El tamaño de muestra
óptimo es muy variable pues depende del número de loci y de los alelos por
locus. Un trabajo teórico de Kalinowski (2002), sugiere que la prec¡sión es
similar al estimar el Fst entre un locus con 11 alelos y 10 loci con dos alelos'
para pobhciones aisladas y en equilibrio HW. Sin embargo, para obtener
rnayor precisión se requiere hacer un muestreo adecuado del genoma y
disminuir la probabilidad de utilizar marcadores sujetos a selección.
,f.6.3. Cálculo de
\
fiecuencia¡ alélicae
una población en sentido genético es no sólo un grupo de individuos, sino un
grupo reproductivo, de forma que la constitución genética de los individuos
se transmite de una generación a la siguiente (Falconer y Mackay 1996)'
Durante dicha transmisión los genotipos de los padres se disocian y un
nuevo grupo de genotipos s€ constituye en la progenie' Los genes
generación
transmitidos en la población de esta furma tienen continuidad de
engorreración.Sepuededeftnir|aftecuenciaa|élicaogénicacomoe|
población
cociente resultante de dívidir el número de alelos iguales en una
por el número total de alelos. El cálculo de las frecuencias alélicas se hace
por recuento directo de los alelos presentes, asumiendo que la observación
de un solo alelo se conesponde con la condición de homocigosis, por lo tianto
qrre no hay alelos nulos. Asumiendo que existe (HWE), la varianza de una
frecuencia alélica puede describirse mediante la expresión binomial:
ox2= x(l-x)
2n
x: frecuencia alélica y n.'número de individuos de la muestra.
El enor estándar (SE) de la frecuencia alélica se obtiene mediante la raíz
o¡edrda de la varianza (Nei 1987). Para una ftecuencia dada, el
error
estándar disminuye a medida gue aumenta el tamaño de la muestra, pero se
acerca
a cero
asintóticamente
a partir de unos 30 individuos. Se
puede
considerar, por tanto, que un iamaño óptimo de muestra sería de 30 a 60
individuos.
4.6.4.Equilibrio Hardy - Weinberg
Para describir la constitución genética de una población tendríamos que
determinar sus genotipos y decir cuántos individuos existen de cada uno de
elbs, pero la genética de una población no solo se refiere a la constitución
gendkla de los individuos, sino también a la transmisiÓn de los alelos d€ una
generación a la siguiente. En dicha transmisión los genotipos de los padres
se disocian y un nuevo grupo de genotipos se constituye en los hijos con los
aHos t€smitidos por los gametos, de esta forma los alelos tienen
continuidad de generaciÓn en generación, pefo no los genotipos portaclores.
La constitución genética de una población referida a los alelos se describe
por el conjunto de frecuencias alél¡cas es decir por la especiñcación de los
alelos presentes en cada /ocus y el número o proporciÓn de los diftrentes
alelos en cada /ocus (Falconer y Mackay 1996)'
Una población diploide se considera que está en equilibrio Hardy-Weinberg
(HWE) para un /ocus genéüco polimórfico si la proporción de gencdipos
obccrvados en la población puede ser complelamente definida por las
frecuencias alélicas del /ocus en cuestión. En otras palabras, los alelos del
/ocus están distribuidos al aza¡ en la población y no existe asoc¡ac¡ón entre el
par de aldos que un hijo recibe de sus padres.
Las desviaciones del HWE pueden producirse debido a varios faclores:
a. Los apareamientos no se producen al azar
b. Existen subdivisiones dentro de la población (Principio de Wahlund)
c. Coancestros, antepasados @munes
d. Selección natural (ventaja de los heterocigotos)
e. Migración o flujo de genes desde una población extema
f. DiÉrcncias sexeespecíficas en las frccr.rencias alélicas
g. Técnica de muestreo inconecta
e. Presencia de alelos nulos no detectables experimentalmente
determ¡narse si hay
desvirciones significativas del HWE en los /oci estudiados. si la propoción
En un estud¡o sobre variación genética debe
que ha
de genotipos para un solo /ocus no está en HWE, se puede atribuir a
habido selección que ha afectado dicho /ocus o a la existencia de alelos
nuloc, pcro
s¡ son varios /oci indepcndicntes los que sc
dcavíen
que dentro de
significativamente del HWE, este fenómeno puede deberse a
la población existen subdivisiones, a que existe migración o flujo de genes
desde una fuente extema o se están produciendo apareamientos dirigidos
(no aleatorios) (Biorklund 2005)- La dihrencia entre la heterocigosidad
observada
y la heterocigosidad
esperada calculada
a
partir de
fiecuencias alélicas bajo al asunción de equilibrio Hardy-weinbers
las
(HVVE)
puedausarse@mounmétodomuybásicoparadetectardesequilibriosen|a
mucho más exacto es
estructura de una población. No obslante, un método
compar¿¡r
la
d¡stribución
de genot¡pos observados con la
distribuciÓn
esperadasilapob|aciónestuvieraenHWE.Cua|quierdesviaciónsigniñcaüva
indicaÉ que la población está subdividida, que existe una consanguinidad
significativa o que existe un fiujo de genes de otra población. Estas
citr¡nstancias pueden ser estudiadas ugando tesls exaclos o procedimienlos
de proporción de verosimilitud. Estos análisis son necesarios debido al gran
número de alelos de los microsatáites
y al elevado número de posibles
genoüpos.
4.6.5. Pruebas para calcular la desviación del Equilibrio Hardy-Weinberg
Una forma clásica de comprobar la existencia de desviaciones del equilibnio
HW cons¡ste en la comparación de los genotipos observados con los
esperados dentro de una muestra. Este sistema es adecuado para
polimorfismos que se caraclerizan por tener pocos alelos, como es el caso de
@eínas. Pero en el carc de los mioosatélit$, que por¡een gran núrnero
de alelos, el número de genotipos es tan elevado que algunas frecuencias
les
gsnotípicas son cero, sobre todo cuando las frecuencias alélicas son muy
bajas. Este fenómeno es una de las limitaciones de la prueba )É para probar
el equilibrb y aunque la base para medir el equilibrio sigue siendo la prueba
de f,
se han desarrollado algunos algoritmos que tratan de ser
más
precisos cuando se utilizan genotipos multilocus muy grandes (Wellek 2004).
En estas circunstanc¡as se utilizan tests e)€ctos
o
procedimientG de
proporción de verosimilitud mediante aplicaciones informáticas que real¡zan
la importante cantidad de élculos que las probabilidades exaclas requ¡eren.
¿1.6.5.1.
Tect
Xz
Se usa el estadístico
*
pa¡a detectar la discordancia de las frecuencias
genotfpicas para cada combinación loars/poblaciÓn. se construye una tabla
de conüngencia de genotipos y se hace un cálculo de)Ícon los datos de los
5l
genotipos observados frente
a los esperados. Con este procedimiento
se
obtbnen resultados aceptables cuando el tamaño de la muestra es grande y
el número de aletos de cada locus es pequeño. Cuando el iamaño de la
muestra es pequeño y el número de alelos grande los valores de )É no son
fiabfes. Una regla a seguir para que el valor *fuera fiable sería que cada
elemento de la tabla de contingencia tuv¡era al menos 5 observaciones
(Gomes y col. 1999).
Estos inconvenientes se evitan utilizando programas informáticos que
gerpran una distribución sintáica de la poblaciÓn a partir de los genotipos
obsorudos. Se usan métodos como el Monte Carlo que unen aldos
aleatoriamente en genotipos, repitiendo esta operación por ejemplo 1'000
ve@s, con lo que se produce una serie de nuevas poblaciones que son
t*tedes para el HWE haciendo un cálculo de f' La proporción de vcccs
que estos f exceden el valor observado verifica la probabilidad de
equivocarse al rechazar la hipótesis nula (no desviación del HWE)' Como
para un cálctlo
aaemativa se pueden usar aboritmos en cadena de Markov
p€€ar
no segado de la Fobatilidad exacla (Rayrnond y Rouss€t 1995)' A
del uso de estos potentes programas informáticos, desviaciones sutiles del
muestra
H\ñlE pueden no ser detectadas a menos que se usen tamaños de
adeo.¡ados.
4.6.5.2.Probabilidad de verosimilitud
Sebasaene|usodeuntestdeproporcióndeverosimi|itudquedetecta|a
esperado y el
discordancia de cada frecuencia genotíp¡ca con el valor
el mismo método de
significado empírico de cada test L se calcula con
1990)'
permutac¡ón de flujo de alelos descrito en el apartado anterior Weir
52
4.6.5.3. Test exacto o de probabilidad de Fisher
Consiste en observar todos tos posibles lotes de frecuencias gendípicas
para un determinado lote de frecuencias alélicas y rechazar la hipótesis de
HWE si las frecuencias genotípicas resultan ser inusuales. Si hay más de
cuatro alelos para un focus, se realiza un cálculo no sesgado de la
probabilidad de HWE usando el método de Monte Carlo basado en cadenas
de Markov, con miles de iteraciones (Guo y Thompson '1992).
4.5.6.lhbrocigosis
Se acepta generalmente que un locus es polimórfico cuando el alelo más
común t¡ene una frecuencia inftrior
a 0.95. Una medida de la variación
genética es la proporción de loci polimórficos, o simplemente polimorlfsmo,
en una población. No obstante, dado que no siempre se utiliza el mlsmo
criterio de polimorfismo, una mejor valoración de la variación genética es la
heterocigosidad
de la población medida como la frecuencia media de
individuos heterocigotos por locus (Aranguren Méndez y col 2005).
Los términos helerocigosidad y diversidad genética suelen usarce
indiscriminadamente en la bibliografia. Generalmente se usa el término
heterocigosidad para referirse a heterocigosidad observada (Ho), y el de
diversidad genética para referirse a la heterocigosidad esperada (He).
4.6.6.1- Heterocigosidad Obeervada (Ho)
Es la proporción de individuos heterocigotos observada en una muestra de la
d¡rcclam€nte a partir de los genotipe cncontfados
en la población para todos los loci, se trata de la heterocigosidad media
observada (Ho). La Ho se calcula por recuenlo directo'
poblecüh.
si se calcula
fJ
1.6.6.2. Heterocigosidad Esperada o Divenidad Genética (He)
La He, desde el punto de vista matemáiico, es la probabilidad de que dos
alefos tomados al aTar de la población sean diferentes (Crow y Kimura 1970).
En una población en equilibrio HW, la ftecuencia de los heterocigotos viene
dada por la ecuación 2 pq
&
calcula como (Nei 't 973):
k
He=!-2r,,
i=L
xi
: Frecuencia del alelo Í y k: número de alelos
Este estadístico es equivalente a la heterocigosidad observada (HO) cuando
las poblaciones están en (HWE).
4.6.7. Contenido de Información Polimórfica (PlG)
El contenido de información polimórfica (PlC) es un paÉmetro introducido
por Bdstein y col en 1980, como un indicador de la calidad de un marcador
en estudios de cartografía génica. Su valor depende del número de alelos y
de la distribución de frecuencias de tal forma que se expresa c,omo:
PIC =
Donde
'-(¿ 4-z-,¿,
zxlxf
k es el número de alelos, XL Xj. ¡re¡q;uencia de los alelos i y
J
respectivamente.
Log marcadores con valores de PIC superiores a 0.5 se consideran muy
informativos, bs que tienen valo,res entre 0.25 y 0.5 medianamonte
54
infurmativos y los que muestran valores inferiores a 0.2S pocú informativos
(Botstein y col 1980)
En los últimos años se ha popularizado su cálculo a fin de obtener una
valoración de la calidad de un marcador para estudios genéticos (de
segregación, de identifcación y control de patemidad, de población) pues
refreja
el
polimor'lismo detectado. No obstante, dada su dependencia del
número de alelos
y de sus frecuencias, la
información que aporta no es
sufciente para basar en ella la elección de un marcador u otro (Moazami-
ycol
Goudarzi
1994).
4.6.8. indices de Fijación o Estadísticos F
La teoría de los índices de fijación o estadísticos F fue concebida
in¡idrn€r¡te por Sewall Wright y posteriormente desanollada por dros
autores (Chakraborty
y Danker-Hopfe
1991). Wright propone med¡r las
desviaciones de frecuencias genotípicas en poblac¡ones suMivididas por
medb de tres parámetros: F¡s, F¡ y Fsr. Fs es la conelación entre dos alelos,
relativa a la subpoblaciÓn, Frr es la correlación relativa a la población total.
Fs¡ es
h
correlación entre dos alelos tomando
al azar uno de cada
subpoblación. Los tres parámetros están relac¡onados mediante la siguiente
eo¡acion:
/1 - F¿ü\
Fst=1-lrr-¡¿r/
También se definen como: Fr, índice de fjación de los individuos respecto al
total de la población, o desviación de las frecuencias genotípicas observadas
en la poblaciÓn total respecto a las esperadas considerando que
existe
equilibrio Hardy-weinberg. Frs, índice de fijadón de los individuos respecto a
las wbpoblaciones o desviación de las frecuencias genotípicas observadas
en las subpoblaciones respecto a las esperadas considerando el equilibrio
]J
Hardy-Weinberg. Fs1 indica del grado de diferenciación genética entre las
subpoblaciones.
El cátc.ulo de los *tadísticos F para @mparar poblaciones es muy común y
frecuente. Para un conjunto de
t
poblaciones con frecuencias alélicas para
cada afelo & (i= 1, 2,3,... k), el estadístico Fsr puede definirse como:
Fsü
Donde x = x
,
E
-,l' /t - t
f,t''
:=
i(L - i)
o2
x(L
- i)
f es la frecuencia media en la muestra de todoe los ablos y
todas las muestras, y o2 es la varianza de la muestra. En el caso de que las
muestras tengan tramaños diferentes
y varianzas
ni
hay que tener en cuenta las medias
mn lo cual la ecuación quedaría:
I,,',
Fsü =
.
Í)'
/t-t
r$-x)
s-r
x= Ln¿ r, D,n,
¡
ñ=
s-r
Ln,
t
/,
Este valor aumenta cuando las fecuenc¡as alélicas divergen, pero es difícil
cr¡a¡rtifrcar la significación de la divergencia (Weir 1996).
Nei redefinió los índices de fijación y mostró que los tres estadísticos F
pueden calcularse usando la heterocigosidad observada y esperada (Nei
19771.
Fis
Donde
= 1-
H
HE
-,
F es la frecuencia
Fít =
H
L_ffi,
Fst
m
= I-:HeT
observada de heterocigotos,
hderocigosidad €sperada en equilibrio Hardy-Weinberg
fl-
y
F-eT son la
o la medids de la
diversidad genética en las subpoblaciones y población total respec,t¡vamente.
Con los estadísticos F se puede @nocer la estructura poblacional tanto en
situaciones en las que exista selección como en aquellas en que no haya
porgue los términos se encuentran deñnidos por las trecuencjas alélicas y
genotípicas de la población en un momento concreto (Nei 1977).
En el supuesto de individuos diploides muestreados de una serie
de
poUacft¡nes, Cockerham (1969, 1973) definió tres parámetros equivalentes a
los F de Wright el coeficiente de consanguinidad F que representa
la
correlación de alelos dentro de los individuos de todas las poblaciones y se
coneponde con el Frr de Wright; 0, que es equivalente al Fsr de Wright,
qu€
6
la
correlación
de alelos de dilerent€s individuos en la
misma
población o coeficiente de parentesco, y el f equivalente al Frs de Wright que
es la c¡nelación de los alelos dentro de individuos y dentro de
supoblaciones. F = Fri 0 =Fsr; f=Fs
las
Estos tres parámetros se relac¡onan entre sí mediante la siguiente expresión:
r_@-
'- (t-
o)
o)
El cálculo se realiza mediante un análisis de componentes de la varianza,
existiando tr€s fuentes de variaciÓn: poblaciones, individuos dentro de
poblaciones y alelos dentro de los individuos. El análisis de componentes de
vanarva para datos de genotipo en poblaciones genéticas s€ construye con
las frecuencias alél¡cas y genotípicas (Weir 1996).
57
Eslric{amente hablando,
la medida Fsr estándar no puede considerarse
como una medida de distancia genética ya que Fs¡ se define para varias
poblaciones y la distancia genética se defniría para un par de poblaciones.
Nei propone una vers¡ón modificada de Fs¡ Qu€ puede ser usada como
medida de d¡stancia genética cuando se consideran sólo dos poblac¡ones
(Nei 1987). Para dos poblaciones, Fs¡sedeline corro Fsr:
(xL
Fstí =
Zzi(L
X
Y¡:
- yi )'
- zí)
frecr¡encias de un alelo dado de un /ocus en dos poblaclones
de X¡,
y
f:
Z: media
Fsn puede ser calculado para cada alelo, hacer la media para
cada bcus y después para todos los /ocr.
El enor estándar de Fsr 6s:
o2=
*X'*.*)
,: número de loci estudiados
k
media del número cle alelos en c€¡da ,ocus
n: número de individuos estudiados
Observando
la ecuación puede verse que el enor estándar está
más
inflr¡ercido por el número de toci empleados que por el tamaño de la
muestra. Además, cuando el tamaño de la muestra es de 20 individuos o
más. su efecto sobre el enor estándar es irrelevante.
El egtsdísüco Fs¡ (Wright 1969), €s la consanguinidad d€ntro ds una
subpoblación respecto a la población total, es una medida de diversidad
genética muy utilizada en producción animal. Aquí las razas son
consideradas subpoblaciones de una gran población que comprende todas
las rezas estudiadas. Fs7 s'e puede exgresar en términos de heterocigosktad'
(Nagylaki '1998):
58
Fsf
=1-n-\rrr,
t+j
xr
es la frecuencia del alelo x de un /ocus i en la población estudiada.
Si subpoblaciones finitas están aisladas unas de otras, cada una de ellas
puede sufir consanguinidad, con fijación de alelos. Los alelos fijados pueden
ser dibrcntes en cada población. S¡ la consanguinidad continúa, aumenta la
diversidad entre razas. Nagylaki dice que Fs¡ €s uoa medida adecuada de
divergencia entre poblaciones
si la diversidad genética es baja en un
princip¡o (Nagylaki 1998). Excepto para poblaciones completamente
consanguíneas, Fsr siempre es menor de 1, incluso para poblaciones
completamente diferenciadas. Si tenemos K poblaciones fijadas para un
/ocus con L (<K) alelos, la heterocigosidad media dentro de las poblaciones
s€ñi 0, Fsf1. Fsr indicará una diftrenciación total entre líneas' En 6tos
cásos Fsr no sirve como medida de diversidad genética'
Las distancias genéticas clásicas no tienen en cuenta la migración, Perc Fs¡
se Srede usar para el cálculo de tasa de migración entre poblaciones' Si 3e
asume que existe equilibrio entre deriva genética y migración, el coeficiente
de consanguinidad en el estado de equilibrio toma una forma similar al
coeficiente
de consanguinidad en el caso de equilibrio entre deriva
y
mutrici.ir, Un aumento en la tasa de migracón produce un descenso en el
coeficiente de consanguinidad. La migración y la mutación mantienen la
diversidad genética dentro de las poblaciones naturales. Entre poblaciones,
la migrack5n permite un intercambio de genes (flujo de genes), que tiende a
homogeneizar
la constitución genética de un grupo de poblaciones'
La
migración produce un descenso en la diversidad genética entre poblaciones.
)v
4.6.9.E| coeficiente de diferenciación genética Gsf
Nei (1973), propuso una metodología altemativa para analizar la subdivisón
de poblaciones en la que no es necesario conocer las
frecuencias
genotípicas, ya que se trabaja directamente con frecuencias alélic€s en
términos
de
heterocigosidades esperadas (diversidad genética) dentro y
entre poblaciones. En otras palabras, no se tiene en cuenta la distribución de
frecuencias genotípicas dentro de una población, sino la variación genómica
intra e interpoblacional (Nei 1987). Este método tiene la ventaja de que no
está infuenciado por el número de alelos por /ocus, ni por el modelo de
evolución (diseñado teniendo en cuenta la mutación, selección y migración)
ni por el sistema de reproducciÓn del organismo en cuestiÓn. La magnitud
rdetiva de la diferenciación genética entre subpoblaciones puede ser medida
por el coeficiente de diferenciación genética:
Grt
FA- na
=_
H es; diversidad genética media dentro de las subpoblaciones.
H ef: diversidad genética media en la población total.
4.6.1 0.Distancias Genéticae
El grado en que dos poblaciones difieren en sus frecuencias alélicas recibe el
nombre de distancia genética.
si dos poblaciones con el mismo origen t¡enen
distinto desanollo histórico, pueden diferenciarse y cuanto más tiempo clure
(Nei
ta divergencia, rnayor será la difurencia entre sus trecuencias génicas
1987). Las distancias genéticas ayudan a entender las relaciones evolutivas
de
entre poblaciones y permiten obtener inficrmación para la caracterización
razas (Nagamine Y Higuchi 2001).
genética de
se considera que son cuatro las fuezas que pueden modificar la
las poblaciones: deriva genética, mutación, selección y migración' Los
ó0
modelos para estudiar divergencia entre dos poblaciones que descienden de
una población ancestral común se diseñaron originalmente para especies, y
asurnen una evolución independiente de cada población. Después de la
espec¡ación
(el momento en que dos poblaciones se convierten en dos
especies d¡stintas), por definición, no ex¡ste migración entre poblaciones, por
lo que la migración se ignora en los modelos utilizados. Cuando se utilizan
microsatélites, que son neutros, se asume que la selección tampoco afecta a
los cemb¡os en las frecuencias alélicas de estos marcadores. Por lo tanto, la
diversklad genética observada viene determinada por dos paÉmetros: deriva
gst€É¡ca y, para periodos de üempo laryos, mutación, El modelo cl¿ísico de
deriva genética
y mutación se diseñó en principio para el estudio de
relaciones entre eapecies, por lo que el periodo de tiempo que se estudia es
largo por definición (miles de generaciones). Cuando se estudian razas, 3e
estudian periodos de tiempo más cortos (cientos de años), por lo que el
efecto de la mutación se puede ignorar. Las distancias genéticas pueden
dividirse en dos grupos:
a)
Basadas
en la distribución de ftecuencias: Nei (1972; 1973; 1977)'
Reynolds (1983), Gavalli-Sforza y Edwards (1967).
b) Basadas en la distribución del tamaño de los alelos: Goldstein D B y col
(1995e), Shriver M D y col (1993).
El cálculo de la distancia genética entre dos poblaciones da una estimación
refativa del tiempo que
ha
pasado desde que las poblaciones se
diferenciaron. Estimaciones pequeñas de distancia enlre dos poblac¡oneg
pueden indicar subestructura de las poblaciones y que existe flujo genético
entre las poblaciones, o también pueden indicar un completo aislamiento de
las mismas pero se han separado hace poco tiempo. Cuando dos
poblaciones están aisladas genéticamente' los procesos de mutación y
deriva llevan a la dibrenciación en las ftecuenclas alélicas; conforme se
61
incrementa
el tiempo de separación, las frecuencias alélicas también
se
difierencian (Felsenstein 2004).
La rieutralidad de cada ,ocus debe ser analizada. Selección, mutación y
deriva pueden conducir a la divergencia de las frecuencias alélicas, mientras
que la migración conducirá a la homogenización de las frecuencias alélicas.
Las desviaciones de las trecuencias alélicas se pueden deber a varias
causas. Si hay un exceso de heterocigotos puede indicar la presencia de
selección por sobredominancia
o la existencia de cruzamientos
entre
poUaciones. Un exceso de homocigotos puede ser debido a la existencia de
un bc¡¡s bajo selección, alelos nulos, consanguinidad en la pobhión,
presencia de subestructura de la población o efecto Wahlund (apareamiento
más probable en individuos relacionados).
€ jr¡ son fas ftecuencias del alelo i en las poblaciones X e Y
respectivamente. Para simplificar, las formulas se dan para un solo /ocus.
En gcricrel,
X¡
a más /oci se deben sumar todas las distancias para cada
dividir por el número de loci cuyos alelos aparecen en las
Para ampliar
/ocus
y
exprgs¡ones. (lPGRl y Cornell University, 2004)
Distancia estándar de Ne¡: D
=
-rtl+\
\Jxi'Í
Distancia de Goldstein:
Fy
=Etili
(dp)t=
/
t¿y¡
(pr-pr)2
donde P,=
fl¡ixi y donde
son los tamaños medios de los alelos de cada población
Distancia de Cavalli-Sfoza (DC): Dc
Distancia de Nei (DA): DA
=
= (2/n) z(L
-E^[k-y)
| -Ei,Fl
Distanc¡a mínima de Nei (Dm): 9¡n = lrLi@i
-
y¡)
Distsrciade Reynolds (DReynolds): DRerwMs
62
=
2
tW#'
4.6-10.1.
ilodelo clásico de mutaciónderiva
En este modelo se asume que la población está en equilibrio con respecto a
la deriva genética y a la mutación y después de muchas generaciones, el
coefc¡ente de consanguinidad F alcanza un estado de equ¡librio dado por la
e¡Cresio¡r:
1
-F*- l+ 4Np
N es el tamaño de la población
y
r¿ la tasa de mutación expresada como el
número de mutaciones por individuo por /ocus
significa que
la
y
por generación. Esto
divergencia entre dos poblaciones depende
de
las
mutecbnes ocun¡das en muchas generac¡ones.
En etr¡dlos previos de distancia genética entre poblaciones la medida más
utilizada era la distancia genética estándar de Nei (DS) (Nei 1972). Una
medida alternativa para poblaciones muy relacionadas entre
sí donde
la
derive genét¡ca es el determinante principal de la dibrenciación evolutiva, es
la distancia de Cavalli-Sfoaa modificada (DA) (Nei y col 1983). Se
ha
demostrado que usando la DA se pueden construir árboles filogenéticos de
poilac,iones muy relacionadas entre sí más fiables que con otras medidas de
disúarrcia. La medida de Cavalli-Sforza original (DC) (Gavalli
Sfoza 1969)'
está influenciada por la existencia de alelos raros y disminuye a medida que
aumenta el tamaño de la muestra. Nei y col 1983, modificaron esta medida
para correg¡r esta deficiencia e introdujeron la citada DA. Desde el punto de
vista de la evolución, en periodos de tiempo cortos la DA es lineal con el
tiempo astronómico, pero esta relación se rompe a medida que aumenta la
disüancia genética por encima de un determinado nivel. Este problema es
microsatélites de poblaciones
particr.rlarmente agudo con datos
de
divergentes debido
a una alta tasa de mutación y un elevado número de
alelos.
63
se han propuesto nuevas medidas de distancia para ser
utilizadas específicamente con variaciones de frecuencias alélicas de
microoatélites que se supone que evolucionan siguiendo un moddo de
Recientemente
paso (SSM) o cercano a él (Goldstein y col 1995a),
(Goldstein y col 1995b), (Shriver y col 1995). Una de estas medidas es la
distancia genética "stepfliseweighted" (DSW. Estas medidas han
demostrado, mediante simulaciones con ordenador, que son lineales para
mutac¡ón paso
a
per¡odos de tiempo más largos que las medidas de distancia estándar.
4&10.2.tlodelo de deriva puro.
Cuando los tiempos de divergencia son cortos la cantidad de mutaciones
eptrtcktes cs insignificante. Cuando se quieren comparar poblaciones muy
relacionadas,
el principal factor para describir variabilidad
es
genét¡ca
la
deriva genética.
En este modelo el coeficiente de consanguinidad F no alenza un estado de
equ¡l[brb, y su dinámica viene dada por la expresión:
Fr=1-(#),
Donde f es el número de generaciones.
En este modelo, las distancias genéticas habituales, como la distancia
estándar (DS) de Nei, son una tunción de (F1+F2), es decir, del coeficiente
de consanguinidad de las poblaciones I y 2. Este tipo de distancias miden
consanguinidad, un ejemplo es la distancia mínima de (Nei 1973)'
Reynolds (1983) introdujo una medida de distancia genética que
distrncia mínima
de Nei normalizada con una
valoración
es
la
de
la
Xtlx¡y¡l) (Reynolds 1983) Si
la
se asume el modelo de deriva puro, los valores de distancia no rellejan
h€teroc¡gos¡dad en la poblac¡ón tundadora (1
g
-
filogenia exacta de las poblaciones estudiadas, ya que las distancias están
influenciadas por el número de generaciones y por el tamaño de la población.
4.6.10.3.
Medidas
de distancia genética utilizadas para
comparar
poblaciones
No existe un oonsenso general sobre cual de las distintas medidas de
distancia genética es la más apropiada para analizar poblaciones dentro de
especies, como es el caso de razas de animales domésticos y menos aún
entrc variedades dentro de las razas. No obtante, las conelaciones entrc
varias medidas de distancia son, generalmente, bastante altas (Nei 1983)'
particularmente cuando se aplican a poblaciones locales como es el caso de
poblaciones ganaderas. La distanc¡a estándar de Nei ha sido la más usada
en estr¡dbs de evolución genética de poblaciones naturales. Medidas de
distancia basadas en el estadístico FSf de Wright (Reynolds 1983) son más
apropiadas para procesos evolutivos a corto plazo como es el caso de
d¡vcrgcncia cntre poblaciones ganaderas, esp€cialmcntc
si el
tamaño
efectivo de las poblaciones varía en el tiempo y entre razas.
han desarrollado medidas de distancia genética para estudios de
subdivisión de poblaciones, que incorpor€¡n los mecanismos mutacionales
se
qrp rk¡en la evolución de los alelos de los microsatélites como el sMM. So ha
visto que estas distanc¡as son más apropiadas, en general, gara loci
microsatélites (Goldstein y col 1995b).
Pu€gtoquelaspropiedadematemáticasy|asbasesbio|ógicasdelas
que el uso
distintas medidas de distancia genética difieren, es comprensible
de las mismas pueda conducir a diferentes interpretaciones de las relaciones
filogpnéilicasentrevariasrazas,sinpoderdeterminarcualeslame'or
'filogenia',esdecir,cualdeellasseacercamásalarealidad'Cadamétodo
que los
hac€ asunc¡ones ac€rca de los datos y de los pfocesos evolutivos
genera, y a veces es imposible saber si las poblaciones muestreadas
cumplen estas asunciones y si no lo hacen, cuánto se desvían de ellas. En la
práctica, se aconseja calcular dos o más distanc¡as genéticas y examinar las
similitudes
y las diferencias entre ellas para determinar en qué grado
las
conclusiones obtenidas dependen de la elección de la distancia genética y
saber si estas conclusiones son robustas.
4.6.10.4. Consideraciones prácticas en estudios de distancia genética
4.6.l0.4.l.Muestr€o
Ya que el cálculo de la distancia genética un método estadístico, el proceso
de muestreo es muy importante. Este debe realizarse de una
forma
jerárquica: primero se muestrean los individuos y luego los /oci. El grupo de
/oo'seleccionado debe ser igual para todas las poblaciones estudiadas. Los
individuos muestreados deben elegirse al azar para reflejar la composición
astual de la población. Generalmente, es un requerimiento mínimo que N=25
(FAO f99E), que producen 2N=50 alelos por cada locus eetudiado' Esto derá
una idea razonable de las frecuencias alélicas. En el caso de poblaciones
muy pequeñas podría ser necesario estudiar toda la población, en cuyo caso
se conocerían las frecuencias alélicas reales. Los /oci elegidos no deben
estsr ligados unos a otros y si dos ,oci están en el mismo cromosoma, deben
estar separados al menos 50 cM. Los /oci deben ser informativos y mostrar
suficiente polimorfismo. Las distancias genéticas dependen
de
la
que dos
consanguinidad, entendiendo por consanguinidad la probabilidad de
individuos que poseen dos copias de un alelo desciendan del mismo
ancestro: estos alelos son idénticos por descendencia. No obstante, los
del
alelos pueden ser también indistinguibles unos de otros sin descender
genéticas es
mismo indMduo, gara realizar un cálculo cor€cto de distancias
importante que la probabilidad de que esto ocurra sea mínima'
Esto se puede conseguir usando loci can el máximo polimorfismo posible,
aunque los marcadores muy polimórficos pueden tener otros tipos de
¡nconvenienter (pruebas de equilibrio difíciles de realizar y problemas
técnicos para la carac'terización alélica). En los paneles de mioosatélites
selecc¡onados por la FAO, la regla adoptada es que los /oci deben tener al
merxls 4 alelos diferentes. Uno de los requisitos de los marcadores usados
para cálculos de distancia genética es que deben seguir una herencia
mendeliana simple (Bretting y Widrlechner 1995). Se debe evitar el uso de
rnarcadores ligados al sexo y, si no es posible, utilizarlos con precaución.
4.6.1 0.4.2. Modelos y
rcalidad
En la pÉctica existe intercambio de material genético entre razas mediante
m{fa¡on o cruca de razas. Los modelos que asumen aislamiento y
la
evolución independiente de las poblaciones después de la divergencia son
válidos, por definición, para especies. En el caso de razas, la representación
red de las relaciones entre ellas se parecerá más a una red que a un árbol
binario simple. En el caso de razas híbridas en las que dos poblaciones se
combinan para originar el híbrido, el desarrollo es contrario al asumido en los
modelos donde una población ac'túa como fundadora de dos poblaciones
hilas_ Estas circunsiancias, que pueden disminuir la diversidad genética enlre
razas también hacen que disminuya
la distancia genética. Razas muy
relacionadas, independientemente de su relación, pueden ser reconocidas
coqno tales. Con fines de conservación no es necegario pr$tar mucha
atención a la migración, pefo se puede calcular la tasa de migración entre
poblaciones usando el Fs¡.
67
¡1.6.10.¡!.3.Arboles de distancia genética
Las matriccs de distancia genética contienen toda la informacón que
proporcionan los marcadores genéticos estudiados acerca de las relaciones
entre ¡as razas estudiadas, pero ésta es difícil de interpretar sin análisis
adicionales. Los datos de distancia obtenidos se utilizan en análisis de
agrupam¡ento
y se real¡zan representaciones
gráficas para facilitar la
interpretación de los mismos. Los árboles de distancia son representac¡ones
gÉÍcas o mapas de la matriz de distancias entre poblaciones y pueden ser
corsirlerados en algunos casos como una representación de la flogenia.
Existen dos métodos para construir árboles filogenéticos: fenético
y
cladístico. Las relaciones fenéticas son similitudes basadas en un grupo de
carader€ Énotípicos de los o$etos bajo estudio, mientras que les
elaciones cladísticas contienen información acerca de la ascendencia y por
tanto pueden usarse para estudiar comportamientos evolutivos. Los dos t¡pos
de relaciones se representan en dendrogramas.
Medianie
el
método 'Tenáico"
se
construyen árboles filogenet¡cos
considerando el conjunto de similitudes fenotípicas entre especies s¡n tratar
de entender la historia evolutiva de las mismas' En estos árboles se
clasifrcan organismos basándose solamente
en el número absolulo
de
caracteres que comparten.
Los programas informáticos basados en este modelo utilizan para @nstru¡r
los árboles filogenéticos una matriz de distancias y algoritmos de
agrupam¡ento simples como el UPGMA (un'¡veighted pair group method using
arithmetic averages) (sneath y sokal 1973) y el NJ (neighbor-joining) (saitou
y Nei 1987). Estos árboles se construyen agrupando primero parejas
de
poblrciones con las mínimas diferencias alélicas, sumando las siguientes
más distantes y repitiendo este proceso hasta que todas las poblaciones
que
están incluidas. El método cladístico se basa en el $tudio de clanes,
son grupos de individuos relacionados. se rcconsiruyen árboles evolutivos
teniendo en cuenta los caminos evolutivos diferentes posibles (puntos de
ramiñcación donde los grupos divergen
a partir de un ancestro común)
y
eligiendo deepués el mejor árbol posible de ellos. Se consideran tanto las
relaciones ancestrales conocidas como los datos actuales.
Los algoritmos informáticos basados en eete método generalmente se basan
en los métodos de parsimonia (el mínimo número de cambios evolutivos) o
de la máxima verosimilitud (los ancestros más probables) para construir los
árboles filogenéticos. Para datos como los caracteres morfológicos clásicos o
para niveles taxonómicos más profundos (es decir, a nivel molecular), el
rrntodo cladísüco es superior, pero a veoes es necesario asumir premisas
que no siempre satisfacen los datos obtenidos a nivel molecular. Los datos
moleculares son caracteres fenotípicos puros, ya gue no hay una razón
inhererite para que un investigador piense que una mutación eg más
importante o más antigua que otra. El método fenético utiliza algoritmos
(UPGlrA y NJ) más rápidos y a menudo tienen propiedades estadísticas más
adecuadas para los datos moleculares. Los métodos de pars¡monia y
mfuima verosimilitud son más lerfos que los anteriores y sus requerimientos
informáticos son mayores. Los árboles filogenéticos pueden ser con raÍz
(rooted) o sin raíz (unrooted). Los árboles con raíz conllevan la noción de
or{8flamiento temporal de las especies o de los genes en el árbol, mientras
que los que no tiene raíz sólo reflejan las distancias entre las unidades
representadas sin tener en cuenta cual es el ascendente de cual. Los datos
usados para ordenar especies en un árbol filogenético son de dos tipos:
dabe de caracteres que dan inbrmación acerca de genes,
individuos,
poblaciones o especies, y datos de distancia o de similitud que se refieren a
pares de genes, de individuos, de poblaciones o de especies. Para los datos
de carrc{eres se puede usar una matriz, y hay varios métodos aplicaues
como son los ciiados de parsimonia y de máxima verosimilitud. Las
caracteres'
distancias o similitudes pueden obtenerse a partir de valores de
pero
pero no al contrario. En ambos casos los datos se ordenan en matrices'
los métodos para construir los árboles filogenéticos son diferentes. Los
métodos de matrices de distancia se basan en las distancias calculadas
enlre cada par de unidadee taxonómicas. Las distanciag normalmente se
basan en modelos genéticos y usualmente se refieren al número de camb¡os
entre las unidades. La calidad de los árboles resultantes depende de la
calidad de la medida de distancia usada.
4.6.10.5. tlétodos para construcción de árbolee de distancia genética
En la construcción de los árboles de distancia existen diferentes métodos
para dibuiar la matriz de d¡stancias. Los más empleados son el Ne¡ghborJoining y el UPGMA, que generalmente dan buenos resultados. El primero
parece s,er superior cuando se suponen en el modelo diferentes tasas cle
evokrcirin (Eding y Laval 1999)
4.6.10.5.1.itétodo Neighbor - Joining
Saltou y col. en 1987 describieron un método para identificar los pares más
prorinm, o vecinos, de poblaciones o grupos de poblaciones (unidades
taxonómicas), de forma que se minimice la longitud total de un árbol. un par
de vecinos son dos unidades conectadas por un simple nodo en un árbol sin
ralzy @ndos ramas que 3e unen en un nodo interior. En general, es pGible
defnir la topología de un árbol por la unión sucesiva de pares de veclnos
para formar nuevos pares de vecinos. Al principio se obtiene una figura como
unaestre||aen|aquetodas|asr€¡maspartende|mismopunto.Se
ongirleran vecinos el par de grupos que, cuando se juntan, producen el
árbolcuya|ongitudtotialeslamáscorta,yéstosseunenparaformaruna
un
unidad combinada. El procsdimi€nto para identificar los vecinos entr€
quedan tres
número reducido de unidades es repetido hastia qu€ sólo
que con
y
unidades. Así se obtiene un árbol sin raí2. saitou col' establecen
este método se cons¡gue el árbol correcto para datos puramente aditivos, en
dorde la distancia entre cada par de unidades (unidades taxonómicas) es la
suma de las longitudes de las ramas que las unen en el árbol. Este máodo
ha demostrado ser el más eficiente en la práctica cuando no todos los
supuestos estadísticos se cumplen (Takahashi y Nei 2000).
En el caso aditivo el NJ serÍa el árbol de mínima evolución, es decir, que la
suma de las desviaciones entre las dislancias de pares de taxa
y
las
longitudes de cada paso del árbol es mínima.
4A10.5.2 UPGMA
El
método UPGMA (Unweighted Pa¡r-Group Method using Ariihmetic
Averages), define la distancia entre poblaciones o grupos de poblaciones
como
h
media de todas las distancias de los miembros (tomados de dos en
e).
En bs dendrogramas construidos con este método las rarnas surgen
del punto medio entre dos grupos. La distancia entre dos agrupam¡entos es
la suma de la longitud de las ramas. Se caracteriza porque supone una tasa
constante de cambios evolutivos, es decir, supone la existenc¡a de un rcloj
evolutivo y los árboles tienen raíz. Este método a veces se denomina
fenograma porque originalmente se usó para representar
el grado de
similitud fenotípica en un grupo de especies. Puede utilizarse para reconstruir
fibgenias a partir de datos moleculares, particularmente cuando se uülizan
datos de frecuencias alélicas y este modelo produce árboles razonablemente
buenos aunque produce más enores cuando el número de /oci es pequeño
(Td<ezaki y Nei 1996). Nei y col (19S3), compa¡aron diferentes métodos para
que
construir árboles filogenéticos mediante estudios de simulación y v¡eron
el uPGMA se comportaba bien cuando las tasas de sustitución eran
mismas para todas las ramas del árbol.
nl
las
4.6. 10.6.
f,létodos de romuestreo
Los árboles de distancia son representaciones gráficas de las matrices de
distancia
y son útiles para identificar las diferencias entre poblaciones y
poder analizarlas desde el punto de vista estadístico. El número de posibles
topologías rápidamente
se incrementa conbrme aumenta el número
poblaciones (m). En el caso de árboles
[(2m
Esfio
-
3)l
qn
de
raiz'.
/
¡ ¡2n-z(m _ z)l
irdba que el número de topologías para rt= 2, 3, 4, 5 y 6 son 1 , 3,
15,
105 y 945, respectivamente (Nei y Kumar 2000). Para el caso de árboles sin
raí2, se sustituye m por m-1 . Es muy difícil encontrar la topología verdadera
cuando m es grande.
Los métodos de remuestreo son técnicas estadísticas que permiten dibujar
múltiples árboles y estimar la fiabilidad para los diferentes nodos en el árbol'
así como el nivel de confianza del árbol (Weir 1990). Existen tres métodos de
refiiuBtreo:
4.6.l0.6.l.Bootstrapping
El bootstrapping es una técnica que genera informaciÓn adicional acerca de
la distribución de los parámetros. se basa en que la distribución del
paránretro verdadero puede ser estimada por la generación de repeticiones y
anáisis de datos artifciales' Dado que los datos consisten en n
observaciones, un bootstrap genera una muestra de n dibujos al azar,
realizado por medio del reemplazamiento de los datos originales. De este
modo, todas las observac¡ones originales tienen la m¡3ma opoftunidad de ser
(bootstrapt será el promedio
reemplazadas, y al final el valor de los nuevos
para el parámetro muestreado (T¡vang 1994; Weir 1990). Genera|mente este
proceso se repit€ un gran número de veces (generalmente 1000)' creando
muchos nuevos conjuntos de datos, pudiéndose usar además para estimar
rledias y desviaciones estándares de un estimador calculado con los datos
en q¡estión.
La interpretac¡ón correcta no siempre es fácil, debido a que se considera la
confianza estadística de todo el grupo en cuest¡ón (todas las regiones), sin
embargo, es complicado evaluar la confianza total en varias regiones del
mismo árbol, debido a la poca relación de los valores asignados a distintos
grupos. Conforme más grupos se @nsideren simultáneamente, los valores
decrecen drásticamente y en árboles grandes, difícilmente son significativos
(Felsenstein 2004). El método de bootstrap ha mostrado que los valo,res de
probabilidad son demasiado pesimistas debido
a que subestima el valor
verdadero (Bradley y col 1996; Zharkikh y Li 1995); ellos indican que valores
tan pequeños como 70% podrían significar valores de
probabilidad
adecuados para estudios de distancias genéticas.
4.6.10.6.2.Jack knife
Este método consiste en realizar un muestreo aleatorio de la mitad de los
caracteres e incluirlos en los datos. Los lotes de datos resultantes tienen la
mitad de tamaño del original y los caracteres no se duplican. La variaciÓn
abatoria obtenida mediante este método es muy similar
a la obten¡da
mediante el método de "bootstraping".
¿t.6.l0.6.3.Permutación de caructercs
En este método no se realiza un remuestreo en el sent¡do estr¡cto' ya que
consiste en permutar las columnas de la matriz de datos por separado. Esto
proürce matrices de datos con el mismo número y tipo de carac-teres' perc
sin estructura taxonÓmica. se utiliza para distintos propósitos que el método
de "bootstraping" y examina, no la variación del árbol calculado, sino la
hipótesis de que no hay estructura taxonómica en los datos: si un posible
estadístico como
el número de escalones evolutivos es significativamente
menor en loo datoe actuales que en loo permulados, se puede afirmar que
existe alguna estructura taxonómica en los datos.
4.6.10.6.4.Análisis ilultivariado
El análisis multivariado brinda los métodos estadísticos para el análisis
conjunto de dos o más variables que pueden estar ¡nterrelacionadas. Debido
a que las variables se
consideran en forma simultánea, estas técnicas
permiten realizar interpretaciones más complejas que las que surgen
mediante la utilización de métodos univariados. El análisis multivariado utiliza
las relaciones
4.6.l0.6.5.Asignac¡ón de individuos a poblaciones
Se han descrito varios métodos para asignar con€ctamente individuos a
poOIa*orps (Paetkau y col '1995; Rannala y Mountain 1997; Comuet y col
1999; Pritchard y col 2000; Falush y col 2003; Paetkau y col 2004).
Básicamente, existen dos tipos
de métodos para asignar individuos a
poumiones: a) Métodos basados en dÉtancia genética: Se calcula la matriz
de distancia entre cada par de individuos, se representa de forma gráfica en
forma de árbol y los clusters son identificados de manera visual. son
genefalmente fáciles de aplicar, aunque tienen algunas desventajas como
que los clusters identifcados suelen ser muy dependientes de los métodos
de distancia empleados y de la representación gráfica escogida; es difícil
que
evaluar la conftanza de los clusters obtenidos en esta forma y determinar
si los resultados son significativos y su dificultad para ¡ntroducir información
complementaria como
la
localización geográfica
de los
individuos
muestreados. se han definido numerosas distancias genéticas, sin embargo
74
estias
se pueden dividir en dos grandes bloques: las distancias entre
poblaciones (Cavalli-Sforza y Eórards 1967; Nei 1972; Reynolds y col 't9E3),
y
tas distancias entre individuos (distancia de atelos
compartidos)
(Chakraborty y Jin 1993). b) Métodos basados en modelos probabilísticos:
Trabajan bajo los supuestos de que las frecuencias alélicas se encuentran en
equilibrio Hardy-Weinberg y que no
eiste
desequilibrio de ligamiento. Los
métodos probabilísticos se dividen en dos:
1) Método de frecuencias: Asigna los individuos a la población en la que el
genot¡po del individuo es más probable que ocuna. Lo hace en tres pasos:
- Cornputa las fecuencias alélicas de las poblaciones potenciales
- Computa la verosimilitud de que el genotipo
multilocus ocuna en cada
población
- Asl¡ne el individuo a la población en la cual el genotipo obtuvo la mayor
probabilidad.
2) Métodos Bayesianos: Se basan en determinar si unas partes del genoma
(clusters) son heredados en una tasa mas alta de la normal desde una
póladón parental y para ello se requiere que las poblaciones ss hayan
muestreado adecuadamente (Falush
y col 2003), Este método asigna
individuos a poblaciones con base a sus genotipos estimando las frecuencias
alélicas de cada locus. Pritchard y col (2000) introdujeron un mélodo pára
identifcar poblaciones diferentes; posteriormente se estudia la ascendencia
de los
Se consideran dos modelos para
la
el primero un modelo nGcombinado, en
el
individuos muestreados.
ascendencia de los individuos,
qr¡€ sa asume que los individuos son tomados de forma pura de una de las k
poblaciones
y el modelo combinado, en el que se perm¡te mezcla de
los
ancestros; es decir, una fracción qk del genoma de un individuo viene de la
subpoblación K (Ek qk =1)- Porotra parte, Falush ycol (2003) introdujeron un
modelo en el que se acepta ligamiento entre los marcadores, el cual se
incluye en el modelo combinado, para explicar la conelaciÓn entre los
marcadores ligados. Este modelo permite la estimación del origen de la
región del cromosoma dentro del individuo
y
proporciona una mejor
resolr¡cón en el estudio del proceso histórico de la muestra. Estos modelos
eetán disponibles
en el
programa Structure
v 2.1 disponible en:
http://pritch. bsd. uchicago. edu/.
Los supuestos principales para estos modelos son que las frecuenc¡as
alélicas están en equilibrio de ligamiento y que existe equilibrio HardyWeinberg dentro de las poblaciones, por tanto, la similitud del genotipo del
individuo i está condicionada por las frecuencias alélicas en su población de
origen (Zi).
4.6.10.6.6.Consideraciones sobre los métodoe de asignación
La asignación individual a partir de los métodos de distancia genéüca
rep¡seantedos por medio de un árbol, permite a simple vista constatar Ia
presencia de los cluster de cada raza y se pueden detectar individuos que
tienen algo diferente a su población; sin embargo, adolece de alguna brma
objet¡ve de constatar la precisión del método, por lo que se pusden util¡2ar
pare una primera exploración de los datos, ya que son fáciles de hacer y hay
varios programas informáticos para su elaboración. otro inconveniente de
y en
este método es que asignan los individuos a las razas preestablecidas
a|gunascircunstanciasnopermitendetecfaranimalesquenocofTespofidena
(2000), es
las razas de referencia. Respecto al algoritmo de Pritchad y col
y
una henamienta muy poderosa, que permite detectar los clusters además
que
da una fiabil¡dad elevada a los resultados. Tiene también la ventaja de
las
aunque se desconozca el origen de las poblaciones, de acuerdo a
cluster
los individuos, asigna estos
frecuencias alélicas
al
de
coff€spondiente,
a la vez que indica el número de dusters o
poblaciones
es
irnoluc¡adas en la muestra. Sin embargo, la interpretación de los datc
genéticament€ pues el
complicada cuando se tienen individuos mezclados
76
número de poblaciones se determina en el ámbito de probabilidad
algunos casos es difícil seleccionar el número conecto de poblaciones.
77
y
en
5.
METODOLOGíA
Para la genotipificación con microsatélites, se analizaron 102 animal6, no
emparentados, representantes de la raza bovina criolla colombiana: Blanco
Orejinegro provenientes de 9 núcleos comerciales y 'l núcleo de animales del
Banco
de
germoplasma
de propidad de la
nación Colombiana y
administrados por (CORPOICA), y adicionalmente, se incluirán 42 animales
dela.:aza Cebú como control efemo.
5. 1.
Garacterización Genética
Los análisis de los marcadores microsatélites de todas las poblaciones
incluidas en este estudio se han realizado en el Laboratorio de Genáica
Molecular Animal
de la
Corporación Cotombiana
de
investigación
Agropecuaria CORPOICA.
5.2 Iuestras de cada Población
El muestreado del bovino criollo Blanco Orejinegro BON ha sido realizado
personal del laboratorio de Genética Molecular Animal de CORPOICA'
mientras que el análisis y procesamiento ha sido realizado por el autor de la
por
d
tesis. En la Tabla 8 se observa el número de muestras procesadas de cada
subpoblación.
78
Tabla 5 Subpoblaciones y número de animales analizados de la raza
BON
5.3. Obtención de ADN a part¡r de muestras de sangrc
recoleclaron muestras de sangre periférica en tubos vacut¡ainer con
ant¡@4ulante (EDTA) en 10 subpoblaciones de la ¡aza BON e individuos
se
de la raza Cebú los cuales son utilizados como control extemo'
La oüención de glóbulos blancos se r€al¡zó utilizando un bufbr de lisis
(sucrosa tritón 2 x (según el protocolo lN-R-34 utilizado en el laboratorio de
genética molecular animal de la corporación colombiana de Investigación
Agropecuaria -CORPOICA-. )
Lag muestras de sangre son transferidas a tubos fálcon de 15ml'
2x, mezclándolas
ad¡c¡onando el mismo volumen de solución sucrosa tritón
79
manualmente con ¡ntervalos
de quince minutos durante el periodo
de
incubación en hielo por treintra minutos, luego de este paso se centrifugan las
mu€8tras durante veinte minutos a 2500 rpm, a una temperatura de cr¡at¡o
grados centígrados, pasado este tiempo se descarta
el
sobrenadante
obtenido, y nuevamente este precipitrado seÉ resuspendido en sucrosa tritón
2x y nuevamente centrifugado durante cinco minutos hasta obtener un pellet
completamente blanco. Luego
de esto el pellet seÉ resuspendido
en
solución buffer salino fosfato (PBS), y se centrifuga duranle cinco minutos a
una temperatura de cuatro grados centígrados durante cinco minutos a 2500
rpm
y se descarta el sobrenadante, separando dos alícuotas en tubos
eppendorf de 1.5m1 de este PBL (Peripheric Blood Leucocytes), uno de estos
se almaceno a menos veinte grados centígrados y el otro se utilizo para la
extrmión deADN.
5.4. Extracción de ADN a partir de PBL con Chelex 20 %
La obtención de ADN a partir de PBL con Chelex 100 resin (BIORAD) (se
rcdizó según el protocolo lN-R-34 uülizado en el laboratorio de genéüca
molecular animal
de la
Corporación Colombiana
de
Investigación
Agropecuaria CORPOICA).
Para esto Se tomo un tubo eppendorf con el PBL obtenido y se adiciono
170u1 de chelex el cual debe ser preparado previamente al 20o/o, se incuban
las muestras a baño maría previamente precalenlado a c¡ncuenta y sels
grados centígrados donde p€rmanecen cerca de treinta minutos, luego las
muestras se pasan a un beaker con agua destilada previamente calentada
hasta punto de ebullición donde se colocan las muestras en un flotador
cuirladoeamente durante ocho m¡nutos. Estos tubos se centrifugan durante
tres minutos a 15000 rpm, de allí se toma el sobrenadante y se adiciona en
80
otro tubo eppendorf, teniendo como resultado el ADN concentrado, el cual se
almacena a-20'C.
5.5. Extracción de ADN a partir de tarjetas FTA
A partir de las tarjetas FTA, se cortó una cuadrícula de 0.3 x 0.3 c€ntímetros
(crn) y se colocó la muestra en un tubo eppendorf de 1.5m1 con
lml
cle
4ua
ultra pura, luego se mezcló con vortex y se incubó a temperatura ambiente
por 30 minutos en agitación. En el caso de tarjetas muy rojas, se agregó 10pl
de SDS al 0.5% y se incubó en baño termostatado a 37"C por 30 minutos.
Posteriormente se centrifugó los tubos a l2000rpm durante 3 minutos a
temp€ratura ambiente
y se descartó el
sobrenadante, luego se adicionó
170¡rl de chelex al 20%, y finalmente se siguió el procedimiento descfito en
d nune¡al
anter¡or.
5.6. Extracción de ADN a partir de muestras de semen
se colocó el contenido de 2 pajillas de semen en un tubo eppendorf nuevo
de 0.5m1, al cual se le adicionó 500p1 de PBS estéril y luego se
resuspendió. Posteriormente se centrifugó a 12000rpm por 5 minutos, se
el
descaló el sobrenadante y s€ adicionó 500u1 de buffer de extraccion,
proteinasa
cual previamente se calentó a 56"c. Luego se adicionó 25pl de
por 3
K (2Omg/ml) y se homogenizó, después se incubó en baño serológico
hofas a 56oC. Pasado el tiempo se adicionó 500¡r| de feno|: c|orofofmo:
alcohol isoamílico
y se mezcló suavemente por inversión durante 5
minutos, se centrifugó
a 12000 rpm por 15 minutos' luego se recupero el
de cloroformo y
sobf€fiadante en tubo eppendorf nuevo y se adicionó 384¡rl
por
16pl de alcohol isoamílico, posteriormente se mezdó suavemente
a 12ooo rpm por 5
inversión durante 5 m¡nutos, se centrifugÓ nuevamente
un tubo eppendorf nuevo y
minutos y luego se recuperó el sobrenadante en
8l
se ad¡c¡onó 1000p1 de etanol absoluto frío y 40yl de acetato de sodio 3 M.
Se mezcló suavemente por inversión durante cinco minutos (donde se
verifico la condensación del ADN).
El siguiente paso fue la centrifugación a 12000 rpm por 5 minutos y se
descartó cu¡dadosamente
500¡rl de etanol al 70olo
!
el
sobrenadante. Posteriormente
se
adicionó
se desprendió el pellet del fondo del tubo, luwo
se centrifugó a 12000 rpm por 5 minutos, se descartó cuidadosamente el
sobrenadante y se dejó secar el pellet a temperatura ambiente. Finalmente
se resuspendió el pellet con 200p1 de agua ultrapura estéril.
5.7. Cuantificación de ADN
La cr¡antifcación de ADN se realizara según (protocolo GM | -23 utilizado en
el bboratorio de genéüca molecular animal de la Gorporación colombiana de
Investigación Agropecuaria CORPOICA).
El equ¡po a utilizar se calibra para obtener una muestra blanco (agua ultra
pura) luego se limpia con papel de arroz y se adiciona una pequeña cantidad
de ADN concentrado y se aplica sobre el pedestal de medida del
Nano drop, (ND - lOOO) equipo de Fluorospectrobtometría que determ¡na la
de
1.7U1
genera
Breze y concentración de ADN) y se baja la tapa de cubierta la cual
una tensión entre la muestra y el pedestal, mediante el uso del programa
computarizado del equipo se realizó la lectura de la muestra la cual nos
proporciona resultados en 260 y 280 nm loE cuales son ¡nterpretados como la
conc€ntración y pureza de ADN respectivamente, cpn lo cual se real¡zo una
conversión para obtener una solución
concentración de
1
OUg¡/Pl
82
de trabajo de este ADN a
una
5.E. Microsatélites Estudiadoe
Se eeludiaron 14 microsatélites (Anexo 2), seleccionados a parlir de las
recomendaciones hechas por la FAO/ISAG (Food and Agriculture
Organization/ International Society of Animal Genetics) para realizar estudios
de biodive¡sidad bovina (FAO 2004) y por el Proyecto Europeo de "Análisis
de la Diversidad Genética en los Bovinos', coordinado por el Instituto Roslin,
(ver htto:/Arww. oroiects. roslin.ac. uUcdiv/markers. html).
5.&f .Amplificación de loc microaatélites
Los microsatélites se han amolificado mediante la técnica de la reacción en
cathna de la polimerasa (PCR). Se han diseñado varias reacciones múltiples
para reducir los costos de los experimentos. Las condiciones de amplificación
se presentan en. Ver Anexo 3.
5.&aGondiciones de amplificación de loe microeatélites
La amplificación de los microsatélites se ha realizado utilizando el material y
cordicbnes básicas siguientes:
5.8.2.1. Materiales
MgCl2 2.5 mM
Desoxiribonucleótidos: dATP 25 mM, dCTP 25 mM, dGTP 25 mM, dTTP 25
mM (Pharmacía)
Cebador Directo: 100 UM
Cob€dor Reverso: 100 ¡tM
Taq DNA polimerasa: 5 U/¡tl (Promega)
Muestra: D}.lA obtenido
83
Aceite mineral (Sigma)
Agua ultrapura
Placas de 96 tubos de 0.2 ml Thermo-Fast@96 (Avanced Technologies)
Termociclador PTC-1 00 (MJ-Research)
5.8.2.2. Ampllficación de ADN por rcacción en cadena de la polimerasa
(PCR)
La ampfilicación de ADN mediante PCR se realizó de acuerdo al protocolo
lN-R-{2 descrito en el laboratorio de genética molecular animal de la
Corporación Colombiana de Investigación Agropecuaria CORPOICA.
La técnica de PCR se llevó a cabo en un equipo MJ PTC-100 Perkin Elmer.
Pere este procedimiento se utilizó 14 pares de cebadores o primers
reportados y recomendados para estudios de variabilidad en razas bovinas
criollas. Ver Anexo
2. La amplificación de los
microsatélites
se
real¡zó
mediante PCR estándar con 50ng de ADN, en un volumen final de reacción
de 25ul que contiene: 200 UM de dNTP's (Pharmacia B¡otech, USA), 0.5 UM
de cada uno de los cebadores directo y reverso, 2U de Taq ADN polimerasa
(Promega, USA) y 2.25 mM de MgCl2 (Promega, USA). VerAnexo 4.
El programa utilizado para la amplificación se realizó como se indica
a
continuación:
La muestra se desnaluralizó a 95'C por 4 minutos y se continuó con 35
cifu,
bajo las síguientes condiciones:
1. Temperatura de desnaturalización:
95' C por 1 minuto
2. Temperatura de anillamiento: esta temperatura depende del par
cebadores o primers utilizados (C") por I minuto
3. Temperatura de extensión: 72" C por 1 minuto
4. Ciclo final de extensión
73
C por
l0
minutos
u
de
5.8.2.3. Preparación de las muestras
A 25pt de muestra, resultado de la amplificacón, se adicionó 12.5¡ll de buffer
de carga 1X (95% de formamida, 0.057o de azul de bromofenol y 0.05
xilene cyanol). Las muestras se denaturan a
94'C
o/o
de
durante 10 minutos en el
termocidador, e inmediatamente se incubaron en hielo.
La amplificación se realizará mediante PCR múltiplex con 50 ng de ADN, 200
¡rM de dNTP (Pharmacia Biotech, USA), 0.5 pM de cada uno de los
iniriadores directo y reverso, 2U de Taq ADN polimerasa (Promega,USA) y
2.25 mM de MgCl2 (Promega, USA). El volumen total de la reacción será de
25 ul. La PCR se realizará en un termociclador PTC 100 (MJResearch, INC)
programado con un ciclo de platabrma.
5.8.3. Detección del polimorfismo mediante geles de poliacrilamida
se elaborará un gel de acrilamida según (protocolo lN-R-35 utilizado en el
leboratorio de genética molecr¡lar animal de la corporación colombiana de
investigación agropecuaria CORPOICA), así como la visualización por
eleclrobresis en geles de acrilamida se realizará según (protocolo |N-R-2E
utilizado en el laborátorio de genética molecular an¡mal de la corporación
colombiana de investigaciÓn agropecuaria CORPOICA) Ver anexo 5 y 6'
Los produc{os de amplificación junto con un marcador de peso molecular de
poliacrilamida
10 pb y 25 pb (lnvitrogen, USA) serán separados en geles de
por 3
al 6% (59:1) en condiciones denaturantes (Urea 7M) a 1800 voltios
horas. Para la visualización de los fragmentos, los geles son teñidos con
nitrato de plata y su tamaño se calculara por medio del programa GeneSnap
de SYNGENE.
E5
5.8.4. Detección del polimorfismo mediante electrofores¡s capilar.
Para realizar la separación por tamaños de los fragmentos oHenidos
mediante la PCR se han sometido éstos a una electroforesis capilar en un
secuenc¡ador automático ABI 310 (Applied Biosystems/Perkin Elmer, Foster
City, CA, USA). Ver anexo 7.
En la preparacíón de las muestras de ADN, para su posterior amplificación se
ha utilizado una mezcla de marcadores
microsatélites, s¡gu¡endo las
recomendaciones del fabricante. Ver anexo 3.
Luego de la amplifcación por PCR se preparo la muestra para analizarla en
el secuenciador, agregando formamida y el marcador de peso LIZ 500
(Applied BiosystemlPerkin Elmer, Foster City, CA, USA). Anexo 8
5.8.5. Electroforcsis y
tipiflcación de las muestras
Las muestras resultantes de la PCR se han mezclado de forma que se
pndisan analizar en cada gel varios microsatélites. De esta manefE¡, para
analizar los 14 microsatélites en cada muestra, se han realizado ensayos con
los productos de la amplificación de las distintas rea@iones. Para cargar el
grd se han tomado 0.5 pl de la mezcla con€spond¡ente y se le han añadido
0.5 gl del tampón de carga (1 1.5 ¡rl de formamida desionizada, y 0 5 pl del
estándar de tamaños Genescan Llz 500). se han denaturalizado las
0c durante 5 minutos. La electroforesis ha durado
muestÉs calentando a 95
aproximadamenie30minutospormuestra,transcurridas|ascualessaha
procedido a la tipifcac¡Ón de las muestras, Con el programa Genemapper se
los datos obtenidos con el secuenciador automático. El
han analizado
programa Genemapper construye curvas de regresión en función de los
problema, el tamaño en función
tamaños del estándar y asigna a cada banda
Genescan 500-LlZ' útil
de dichas curvas. El estándar de tamaños utilizado es
de fragmentos entre 35 y 500 nucleótidos' Este
para calcular tamaños
estándar está brmado por fragmentos de tamaño conocido (35, 50, 70, 100,
139, 150, 160, 200, 300, 340, 350, 400, 500) marcados con LlZ. Una vez
que se liene el tamaño de cada banda se procede a seleccionar aquellas que
representen un alelo y a descartar las secundarias e inespecíficas. Esta labor
tiene cierta dificultad en algunos marcadores pues el efecto de bandas
sombras es característico de microsatélites cuya variación se basa en
repeticiones de grupos de dos bases como es el caso de los que se han
tipificado en este trabajo. El criterio seguido en este caso fue el de observar
las gráfrcas de cada grupo de bandas y s€leccionar el pico conespondiente
al fragnento de mayor longitud del grupo de fragmentos que comporier¡ el
alelo y que suele coincidir con el de mayor intensidad de señal.
5.8.
Análl¡is E¡tadistico y Softwarc Utilizado
Para el análisis de la genética de poblaciones se utilizó el programa GENE
POP (Raymond y Rousset 1995) versión 3.3 (Laboratoire du Genetique et
Envircrnent, Monpellier, France), el cual permitió calcular los valores de Ho y
He {treterocigosidad observada y esperada, respeclivamente), los índices de
frjación de Wright Fs, Frr Y Fsr (los cuales se calcularon según el método
wEir & cockerham 1984), el equilibrio de Hardy- weinberg y el cálculo de las
frectJenc¡as alélicas alélicaE
y genotípicas de cada locus y la prueba
de
equilibrio HW, según Guo y Thompson (1992) con el algoritmo en Cadena de
Monte Carlo Markov
La heterocigosidad observada y esperada, los estadísticos F, el Gst' el
pobhiÓn
fadorial de conespondencias múltiples y el valor de Fls por
ar¡flisis
y
2003)'
se ha realizado con el programa GENETIX V' 4'05 (Belkhir col
y col
Los valores de Ptc se han calculado mediante la fórmula de Botstein
(1980) con
el complemento The Excel Mic¡osatellite Toolkit (Park 2001)'
utilizando el programa MS EXCEL 2000'
87
Las distancias genéticas se calcularon utilizando tres metodologías: Nei
(1978), Cavalli- Sfoza (1944) y Reynolds (1983); mediante el módulo
Gendist incluido en el programa Phyli@ (Felsenstein, 1993), con un
ptwso
previo de bootstraping de 10.000 remuestreos, utilizando el modulo seqboot,
del mismo programa. La reconstrucción de los árboles filogenéticos se realizó
por medío de la metodología Neaghbor- Joining (Saitou y Nei, 1987) incluida
en el mismo programa.
Para el análisis de componentes principales se utilizó el programa Genetix@
(tabontoire Génome, Populations et lnteractions, CNRS-UMR 5000,
Uniwrsité de Montpellier ll, Montpellier, France) (Belkhir y col., 1996). Para
estimar la pureza racial de las poblaciones se utilizó un modelo (Q,
coeficiente de membresía) basado en un método de agrupamiento que
péfmitc inferir la estruc-tura de la población ugando datos dc genot¡pe 6
partir de marcadores no ligados (Pritchard, et al., 2000). Esta metodología
individuos
poblaciones
identifica migrantes
asigna individuos
a
e
e
mezclados. Se asume un modelo en el cual hay k poblaciones cada una de
las cr¡ales se caracferiza por un perfil de fiBcuencias de alelos en cada locus,
cada individuo se asigna con una probabilidad a una población o
conjuntamente a dos o más poblaciones si su genotipo indica que es un
individuo mezclado. Este modelo asume que los loci eslán en equilib,rio de
Hardy- Weinberg dentro de las poblaciones, así como en equilibrio de
ligamiento. En esla parte del análisis es importante menc¡onar que' se
incluyó información de genotipos de 42 individuos de la raza Cebú, que
frraorrgeroüpadosenestudiosanteriofespara|osmismosmarcadorey
que se utilizaron en este caso, para definir un patrón de frecuencias alélicas
de una ra?a @n la cual podría haber sido cruzada alguna de la
subpoHaciones de la raza Blanco Orejinegro anal¡zadas aquí'
88
6.
RESULTADOS
6.1. Deecdpción Genética del Bovino Blanco Orcjinegro BON
En este trabajo se presenta el estudio de la variabilidad genética de l0
poblaciones comerciales de
la raza bovina Criolla Blanco Orejinegro BON
mediante los resultados del análisis de catorce (14) microsatélites en una
mr¡egtra
de
1O2 animales
de la raza Blanco
Orejinegro (Figura 5),
provenientes de los departamentos de Antioquia las haciendas Campoalegre
(CA), Vegas de la Clara (Universidad de Antioquia - UDEA) Paysandú
(Univ€€idad nacional de Medellín - Unal Med) y los provenientes del BG de
Corpoica (BG), del departamento de Cundinamarca tenemos: la hacienda El
palmar (EP), del departamento de Córdoba la hacienda La Esmeralda (ES),
del departamento
de
Risaralda las haciendas Azufral (AZ), Bohemia (BH) y
Hato vbjo (HV) y del departamento del Tolima la hacienda Jorge Patanoyo
QP), y a2 animales de la raza Cebú. Ver figura 5. Tabla 9
89
Figura 3 ilapa de Golombia de las Subpoblaciones de animales de la
raza BON
Tabla 6 Ubicación de las Subpoblaclones de animales de la raza BON
90
6.2. Frecuencias Alélicas
En loe catorce mi$osatáites evaluados en las poblacionee estudiadas se
detectaron en total 192 variantes alélicas, con una media de 13.7 alelos por
/ocus. El número de alelos por locus (Na) ha variado sign¡ficativamente
siendo los microsatélites que presentaron mayores valores BM 1818, BM
1824, TGLA 227, quienes prÉrsentaron cada uno dieciséis alelos, para los loci
efH225, ETH3, lNM023, se presentaron en promedio quince alelos con un
valor intermedio el marcado¡ fGlA122, que presentó catorce alelos y con
merior numero se presento ETHIO quien presento un número de ahlos
(trece alelos), para el marcador |NRA063 se presentaron doce alelos, diez
para los loci TGLA 126, INRA 005, y nueve para el loci BM 2113. Ninguno de
los micrcsatélites ha mostrsdo varianles con frecuencias superiores a 0.95
por lo cual los catorce marcadores han sido polimórlicos ver tabla frecuencias
alélicas anexo 9
9l
6.2.1. Frecuencias Alélicas para el marcador
BMl8l8:
Para el marcador 8M1818, se en@ntraron en total 8 alelos que variaron en
tamaño entre 249 a 272 parcs de bases, de los cuales el alelo de 261 pb se
encontro en la mayoría de las poblaciones en frecuencias que variaron entre
0.25 y 0.72, y únicamente estuvo ausente en la población de CA, en donde
solamente se encontó el alelo de 257 pb., alelo que también se encontro en
casi todas las poblaciones a más baja frecuencia, con excepción de las
poblac¡ones EP y el BG.
8H
CA
PA
HV
JP
ES
UDEA
1249 1253 1257 r 259 .261 .263 1265 *269
GráftcofFf€auench3!|.|icr'p.ra.lm.rc.dorBl8l!en,lo3ubPobl¡¡cionosd.hr!z.Bbnco
Or€j¡ncgto
92
6.2.2.Frccuencias Alélicas para el marcador BMl824
En c;uanlo al marcqdor BM 1824, se encontraron en total 16 alelos, con
tamaños que variaron entre 170 a 2'18 pares de bases, en esle marcador el
afelo más común tuvo un tamaño de 174 pb que se presentó en todas las
poblacione con frecuencias que variaron entro 0.f
I
en UDEA hasta 0.58 en
CA, población que presentó poca variabilidad para este marcador, pues solo
presentó el mencionado alelo, conjuntamente con los alelos de 172
y
186
pares de bases, y que fueron alelos comunes pues se encontraron en 6 de
las 10 poblaciones en análisis a ftecuencias intermedias (variando entr€ 0.1
a 0.38).
I
I
ll
;
:i,t
BG
t¿
.L70.!72.174.L76.t7A ¡ 180 1182 r184
¡ ú6 r 188 r19O ¡ 192 4 ZN -' 214 " 216 * 218
Gfffco
2
Frrcl¡.nc|l¡ dóllaa¡ Fr¡ ál ¡n¡rcador Bü1!2"n lO 'ubPobhclom' d' h r¡zt Bl¡nco
Or.j¡n gfo
93
6.2.3.Frccuencias Alélicas para el marcador Blti2l13
de g alelos, en este caso
LE presentaron ocho de los nueve alelos
El marcador BM 21 't3, presentó un número total
las poblaciones de HV
y
errcontrados en esta población, con excepción del alelo
de 140 pares
de
bases, que solo se presentó en la población de la UDEA. En este marcador
los alefos más comunes que se presentaron fueron el alelo de 132, 120 y
134 pb que se presentaron en nueve de las poblaciones estudiadas estos,
tuvbron ftecuenc¡as intermedias entre 0.08 a 0.3, para el alelo de 132 y de
0.05 a 0.5 para el alelo siguiente de 120 pb y con fecuencias inferiores (0.05
a 0.25) para el alelo de 134 pb.
€0,00
s0,00
¡lO
00
I
30,00
il
20,00
10,00
I
tl
rl
I tt
I
,ll
h
L
000
N
BH CA PA HV IP
rLm rt22 .L24 .126
ES
UDEA
UM
1130 1132 1134 {136 r
BG
t4O
Gr{flco 3 Fr.cuéncl¡3 alólica3 p¡ra €l mafc¡dof BM2l13 rn l0 ¡ubpobhcionas d. lr r¡z¡ Eenco
Orijinegro
94
6.2.4. Frccuencias Alélicas para el marcador ETHI0
En d.¡anto al marcador ETH10, se en@ntraron en total 13 alelos, con
tamaños que variaron entre 207 a 233 pares de bases, en este marcador el
alelo más común tuvo un tamaño de 2'15 pb que se presentó en nueve de las
poblaciones estudiadas con frecr¡encias que variaron entre 0.25 en UDEA
hasta 0.66 en BH, con excepción de los alelos 207,225 y 233 pb de las
poblaciones JP y BG que presentaron poca variabilidad para esle marcador.
.207
¡
209
.2Lí
.213
r2$
.217
r
219
.22t
J225
.2U
.228
.2Zg
" 233
Gn¡tlco
¡0
Frtcu.nc¡r3 rlólic¡3 p.rl ol mrcador
ETH1O
OÉ¡lnegro
95
'n
lO subpoblacion'3
d' L f.t'
Bhnao
6.2.5.
F
recuencias Alélicas para el
ma rca
do¡ ETH 225
En cüanto al marcador ElH225, se encontraron en total 15 alelos, con
alelo más común tuvo un tamaño de 134 pb que se presentó en diez de las
poblac¡ones estud¡adas con frecuencias que variaron entro 0.06 en HV hasta
0.66 en
CA el alelo 156 pb se presentó únicamente en la población EP para
este marcador, con una frecuencia ¡ntermedia de 0.06. El alelo 144 pb se
presentó en 9 de las poblaciones estudiadas con una fiecuencia ¡ntermed¡a
de 0.16 en la población de
My
de 0.38 en la Unal Med.
30,00
20,N
10,00
8H CA PA HV JP ES UDEA
a132.L4 r 136 r 138 .L40.t42.'u.t46
I
148
r
150
.152
f
L54 s 156
Grlfco 5 Ffrcu.ocLr.lólic.3 par¡ €l m.rca.ror
'
ETHZUT
OÉJinsgro
96
158 .160
.n
10 subpobbc¡ono¡
d. L ñzt B||nco
6.2.6. Frecuencias Alélicas para el marcador ETH3
En cuanto al marcador ETH3, se en@ntraron en total 15 alelos, con lamañog
que variaron entre 88 a 131 pares de bases, en este marcador el alelo más
ll3
pb que se presentó en nueve de las
poblaciones estudiadas con trecuencias que variaron entro 0.25 en BH y
común tuvo un tamaño de
Unal Med hasta 0.50 en CA; el alelo 103 pb se presentó únicamente en la
población JP para este marcador, con una frecuencia intermedia de 0.07. El
alelo 105 pb se presentó en
I
de las poblaciones estudiadas con una
frcct-€ncia intermedia de 0.55 en la población de la UDEA y de 0.25 en la
Población de BH.
70
60
50
¿10
30
20
10
0
ES
BH CA PA HV JP
r89 r99
r
Grúfico 0 Fftcu.nclrs
117
r
119
1101 ¡103 1105 1111
.I2I.I23 -'L25
97
UM
1113r1Ú
L29 ' !3L
.léllcr¡ prrr rl m.rc¡dof ETH3.n
Orliinegro
UDEA
10
¡ubpobhc¡on$ d. lr r.zr Bbnco
6.2.7.Frecuencias Alélicas para el marcador lNM023
En cüanto al marcador iNRA023, s€ encontraron en total 15 alelos, con
tamaños que variaron entre 195 a 231 pares de bases, en este marc€dor los
alefos más @munes presentaron un tamaño de 205
y
211 pb que se
presentó en ocho de las poblaciones estudiadas con frecuencias que
variaron entre 0.07 en la población de la UDEA hasta 0.42 en AZ para el
alelo de 205 pb; para el alelo
21
'l
las frecuencias intermodias encontradas
fueron de 0.08 en la población de LE hasta 0.25 en la población de EP. El
ablo 197 pb se presentó únicamente en las poblaciones JP y LE para este
marcador, con una frecuencia intermedia de 0.30 y 0.04 respectivamente.
¡ 195 ¡ 197 r $9 r 201 | 203 r 205 .m7 .zo9
.2J-2J.3 .215 r 2l-7 ¿ 2L9 - 223 23L
la
Gráfico 7 FFouencbs !lól¡c¡3 prrr al mrEador |NRAO23 on l0 3ubpobbcion" de
B.rs
Ortj¡n gro
98
¡tt¡
6.2.8.Frecuencias Alélicas para el marcador SPS l15
En c-t¡anto al marcador SPSI 15, se encontraron en total 7 alelos, con
tamaños que variaron entre 240 a 254 pares de bases, en este marcador los
afelos más @munes presenüaron un tamaño de 240
pres€nüaron
y 242 pb que se
en ocho de las poblaciones estudiadas con ftecuencias que
variaron entro 0.16 en la Unal Med hasta 0.87 en EP para el primer alelo, y
de 0.12 en HV hasta O.77 en BH; el alelo 254 pb se presentó únicamente en
las poblac¡ones de HV
y LE para este marcador,
con una frecuencia
intenredia de 0.03 hasta 0.3.
100,m
90,00
8q00
70,00
60@
50,00
I
I
¿o,m
:'(},00
II
t
20,OO
I
10,00
I
ll
LI
0,ü)
BG
AZ
a 24O a242
of¡fioo
.244 a246 a248 .252
! F||ot¡.noht ¡lÓllo.. prfr at m¡fo¡dor sPallS.n
q.iin€gro
99
f0
1254
aubPobl¡olona. da b
f|tr
BLnoo
6.2.9. Frecuencias Alélicas para el marcador TGLA 122
En c1¡anio al marcador TGI¡{122 se encontraron en total 14 alelos, con
alelos más comunes presentaron un tamaño de 141
y
149 pb que se
presentaron en nueve de las poblaciones estudiadas con ftecuenc¡as que
variaron entro 0.07 en la población JP hasta 0.50 en CA para el primer alelo
y de 0.25 en BH hasta 0.64 en EP; los alelos 143, 147, 175 y 185 pb se
presentiaron únicamente en las poblaciónes de la UDEA, Unal Med, EP y JP
@ivamente
0.1 1 , O.O7
para este marcador, con una frecuencia intermedia de 0.06,
y 0.07 respectivamente para estas poblaciones. El alelo 1 51 pb se
presentó en 6 de las poblaciones estudiadas con una trecuencia ¡ntermedia
de 0.11 en la población de Unal Med hasta 0.37 en AZ y BH.
70,00
60,00
50,m
40,00
30,@
20,00
10,00
0,00
BH CA PA HV JP ES
r
r
UDEA
133
r
135
.737 .747 a143.t45.L47
149
r
151
.155
¡
161
r
175 ri 179 185
d' l¡ ñza
Gr|flco I F tct¡nch. alélicr3 para el rn rÉdotr TGI¡122 en l0 subPobbc¡on'r
B¡mo OFjin gro
100
I
6.2.10.Frecuencias Alélicas para el marcador TGLA 126
En ef marcador TG\A122 se encontraron en total 10 aletos, con tamaños que
variaron entre 105 a 131 pares de bases, en este marcador los alelos más
comunes presentaron un tamaño de 1'15
y
'123 pb que se pres€ntaron en
nueve de las poblaciones estudiadas con fecuencias que variaron entro 0.21
en la población JP hasta 0.50 en EP para el primer alelo y de 0.12 en UDEA
hasta 0.38 en HV; los alelos 105
y
125 pb se presentaron únicamente en la
población de LE para este marcador, con una frecuencia intermed¡a de 0'31
para estas poblaciones. El alelo 111 y 131 pb se presentó en 2 dé las
poblaciones estudiadas con una frecuencia intermedia de 0.06 en la UDEA
hasta O.O7 en la poblaciÓn de JP para el alelo 111, y para el alelo 131 las
fecuencias de 0.03 en LE hasta 0.10 en CA.
N
BH CA
PA HV JP
1105 1111 ¡113 ¡115
.ll7 .
ES
UDEA
L2L u L2? tL25
UM
Í129
BG
1131
d'
Grftco l0 Fl¡cuonci¡¡.|óllc.¡ 9.fr C rmrt'dor TGI¡120 'n l0 ¡ubpobtrc¡ono'
Bhnoo O¡ciln gro
101
|a taza
6.2. I l. Frccuenciae
Alélicas para el marca dor T GLA 227
En cuanto al marcador TGt.l227 se encontraron en total 16 alelos, con
alelo más común presentó un tamaño de 62 pb que se prosentó en una de
las poblaciones estudiadas con frecuencias que variaron entre 0.25 en la
poblac¡ón de HV hasta 0.50 en EP. El alelo 60 se presentó en ocho de las
poblaciones estudiadas con trecuencias que varían entre 0.08
en
la
población de LE hasta 0.50 en CA. El alelo 108 pb se presentó en una de las
@laciones estudiadas con una frecuencia intermedia de 0.05 en
población de EP.
60,00
s0,00
¡t0.00
30,00
20,@
10,00
0,00
BH CA PA HV )P
ES
UDEA UM
160 162 164 166 168 r70 .72 .76
t78 l8O r82 rE4 886 -E8 -92 =1m
Grtllco 11 Ftrcuoncir3 alól¡ca3 p.r¡ .1 ln rcrdor TGLA2?7 en l0 subpobhcion'3 d' lr n¿'
BLnao Ort¡ln€ero
t02
la
6.2.l2.Frecuencias Alélicas para el marcador TGLA 53
En el marcador TGIAS3 se encontraron en total 15 alelos, con tamañoe que
a 't92 pares de bases, en este marcador el alelo más
común presenta un tamaño de 152 pb que se presentó en ocho de las
poblaciones estudiadas con frecuencias que variaron entre 0.08 en la
población JP hasta 1.00 en EP; los alelos 148 y 150 pb se presentaron en
siete de las poblaciones, con una frecuencia intermedia de 0.05 en la
varieron entre 148
población de BH hasta 0.12 en la población de Fú. para el primer alelo; y de
0.12 en UDEA hasta 0.66 en JP para el alelo 150. Los alelos 134 y 192 en la
población de la UDEA se presentaron únicamente en esta población con una
frecuencia de 0.06 y 0.12 respectivamente.
100 00
80,m
8H CA PA HV JP ES
UDEA
r$2 r19t rü6 ¡ 158 ¡160 ¡162
r 164 ¡ 166 I 168 r 180 * 188 r¡ 190 1 192
¡1¡t8 r15o
Gr.flco12Fncu.nc|a¡¡tólic¡.pafa.lm¡fa¡dorTGLAll3enl0¡ubpobleo|onr.d.|ar¡za
BLnao OÉi¡n gro
103
6.2.l3.Frecuencias Alélicas para el marcador INRA 063
En el marcador iNRA063 se en@ntraron en total 12 alelos, con tamaños que
variaron entre 170 a 198 pares de bases, en este marcador los alelos más
comunes presentaron un tamaño de 1 76 y 180 pb que se presentó en seis de
las poblaciones estudiadas con ftecuencias que variar,n entro 0.11 en la
población de la UDEA hasta 0.40 en HV para el primer alelo y de 0.10 en BH
hasta 0.40 en Az; los alelos 170, f 90 y 198 pb se presentaron únicamente en
las pobhciónes de Unal Med y EP y respec'tivamente para este marcador,
cdr una trecuencia intermedia de 0.05,0-16, y 0.11 respec{ivamente
para
estas poblaciones. El alelo 178 pb se presentó en tres de las poblaciones
estudiadas con una frecuencia intermedia de 0.15 en la población de Unal
Med hasta 0.50 en la población de la UDEA.
80
70
60
50
¡
40
30
20
¡
I
I
10
I
0
ll
I
AZ BH CA PA HV JP ES
.t70.174 .L76.L781180 r182 r
Grffico f3 Fncr¡enci¡r¡
rf[c.r
184
¡186
p.r. d tn¡rc.dot [tlftAttG:t
BLnco OEiln€gro
104
I
UDEA
188
r
190
UM
'
192
8G
r
198
3n l0 3ubPobhcion6s do
h r¡2'
6.2.14.Frccuenc¡as Alóllcas para el marcador INRA 005
En cuanio al marcador INRA005 se en@ntraron en total 10 alelos, con
alelo más común presentó un tamaño de 140 pb que se pres€ntó en cinco de
las poblaciones estudiadas con fiecuencias que variaron entro 0.14 en la
poblac¡ón de la Unal Med hasta 0.66 en la población de EP; los alelos 134 y
141 pb se presentaron únicamente en tres de las poblaciones para este
marcador. con una frecuencia intermedia de 0.07 en BH hasta, 0.40 en EP
para el alelo 134, y una frecuencia intermedia de 0.14 en BH hasta 0'28 en la
población de la Unal Med para el alelo 141.
P¿ 8H CA PA HV JP ES
aL33
.Iy
UDEA
1135 1136 ¡137 ¡ 138 1140 t141
Grúfico la Fftq¡ancL¡ rlél¡c.a
|
UM
1142
BG
'L4¿
t0 $¡bpobbcior€ d' |! rtz¡
p.rr .l mafcrdor lt{RAO06
'n
BLnco Otli¡n grc
105
6.3.
Número promedio de alelos por loci (NPA)
y
contenido de
información polimórfica (PlC) para las poblaciones
Para las 10 poblaciones estudiadas se encontró un número medio de alelos
por loci (NA) de 13,7 y en este caso el mayor valor se ha encontrado en la
rcbhción de la UDEA con un promedio de 6.29 alelos por loci, seguido por la
@eion de LE (6,21) y el BG (5,75) y el menor valor se encontró en la
población de CA (2.55). En la población de la UDEA, se encontro que doce
de los catorce marcadores han moslrado valores de PIC superiores a 0'50 y
estos han resultado medianamente informativos (enke 0.25 y 0.50) (tablas 10
v 11).
El contenido de información polimórfica PIC depende tanto del número de
alelos como de la distribución de sus frecuencias en la población, en este
estudb se encontro un valor promedio de PIC de 0.66' para un NPA de
13.7. Se observó una importante variación €n cuanto al P/C de los
marcadores, en la tabla
mayorcs valores de
11 se muestran los valores para cada marcador, los
PIC
fueron en@ntrados para el marcador BM21
'13
(0.73) y por el contrario el menor valor se encontró para el marcador SPS1 15
(0.42). Algunos marcadores muestran un PIC elevado aunque su NPA es
bajo como por ejemplo BM21 13 (0.73), y otros marcadores presentan un P/C
bajo
y un NPA mayor como por ejemplo BM1818 (0'48)' En resumen tres
marcadores han resultado altamente informativos con valores mayores de
0.60 como es el caso de los marcadores 8M2113, 8M1824, TGI-\227'
ETH3. TGI-A126 e lNM063, y los marcadores con valofe{¡ inferiores a 0.50
fueron SPSI 15 Y 8M1818. (Ver anexo 10)
106
Tabla 7 NPA para todas las poblaciones
Tabla 8 Número promedio de alelos y contenido de información
polimórf¡ca para cada marcador.
Btl82¡t 16
Bt2rt3 9
ETHIo 22
0,735
0,616
ETH3 15
0,666
15
0,694
7
0,423
|l{RA023
SPrS{f
5
ÍGLA122 1!*
o,e?3
10
0,664
16
0,686
TGLA63 15
0,561
-TGLAI28
rclj¡Zn
fNRA
-rrttA
063 12 0,u1
005 '10 0,580
107
¡i
0,693
6.4. Flebrocigosidades por marcador
Para los catorce marcadores analizados, se estimaron los valores de
heterocigosidad esperada (He), y se encontro en general un valor promedio
de 0.71, con los valores mas altos encontrados para
el
marcador BM 21 13,
que gr€sentó un valor de 0,81, de manera similar los marcadores INRA023 y
TG\A122 tuvieron valores superiores a 0,77, Wr el contrario el menor valor
tue encontrado en el marcador SPSI 15 que presentó un valor de 0,50. Por
otre psrte, la hcicrocigosidad obscrvada prcmed¡o tuc de 0.61'
y
la
heterocigosidad observada por marcador mostro valores mayores para TGIA
227 (0.87), así mismo el marcador |NRA005 presentó el valor mínimo de
heterocigosidad
(0. I 8).
Csr
a
respecto
los valores de Fis el valor promedio fue de
0-15'
0resentándose un valor mayor en el marcador |NRA005 con un valor de 0 73'
oor el contrario, los marcadores TGI-A227, TG|A126, ETH3 Y TGIA122,
prg€fltaron valores negativos
de
-0.14, -0.079, -0.039
respectivamente para cada marcador. Ver tabla 9
108
y
{'016
Tabla 9 Heüerocigosis espenada (He,f y Observada (Ho) y F¡s para cada
microoatélite.
t8l8
0.5728 0.514
0.7126 0,632
7193 0,477
109
0,1'133
0,
6.5. f,ledidas de Divercidad Genética
6.5.l.Ectadíctico F6.
El Fc mide la reducción en la heterocigosidad debida a los apareamientos no
aleatorios en la población, por lo cual indica el nivel de endogamia de los
individuos de la población. Este valor es una conelación estadística que toma
valores desde -1
a + 1. El signo negativo indica exceso de heterocigotos
mientras que el signo positivo indica exceso de homocigotos. La magnitud
dd
Frs, viene dada por el valor absoluto del índice, siendo bajo sí el valor
esta entre 0 y 0.05, medio si se encuentra entre 0.06 y 0.15, alto si se
encuentra entre 0.16 y 0.25 y muy alto si es mayor a 0.25 (Hartl 198E). En la
táSe f 3, 3e obocrva el valor de Fls para cada marcador, el mayor vaktr 3c
encuentra en los marcadores lNM005 con 0.73,y SPS115 con 0.3f debido a
un alto numero de heterocigotos y muy bajo de homocigotos; pero es
la mayoría de los marcadores presentan signo
pos¡tivo, Los marcadores BM1818, 8M1824, BM21 13' ETH10 y ETII225
oresentaron valores medios de 0.102, 0.07, 0.075, 0'113 y 0.146
¡mportante destacar que
respectivamente. Por el contrario los marcadores TGI-A227, TGLA126' ETH3
Y TGI-A122, presentaron valorcs negat¡vos de -0.14, -0.079, -0.039 y {.0f 6
respeclivamente para cada marcador, demostrando
así un exceso de
heterocigotos para estos mercadores.
Los valores Fis, calculados para los individuos de todas las poblaciones y
para todoo los loc¡, han mostrado 10 valores positivos y 4 negaüvos' los
valores
Fít catorce positivos y por otro lado, todos los valores de FsÚ
encontrados wra cl¡da uno de los marcadores presentaron valores positivos
que un l0'5 %
Feü,la f 4). Los valorcs de Fst pan fodos /os /ocu3 mucatra
del total de la variación genética puede atribuirse a la diferencia entre
poblaciones mientras que el remanente 89.5 % conesponde a diferencias
110
entre individuos (tabla
l4). El rango de valores F¡s por msrcador han sido
encontrado entre 0.73 (|NRA005) y -0,14 (TGLA227).
Tabla
l0 Estadísticos F para todos los loci en todas
las poblaciones.
Método de ajuste por remuestr€o boostraping 10.000 permutaciones.
Programa Genetix
8 0.102
0.22162
0.09385
0,1¿t66 0.24't19
0.10514
4.0157 0.25UO
0.11
0.26111
0.11
1518 0.23855 0.10583
Los valof€s mayorgs de Frs obtenidos 8e €ncugntran en las subpoblaciones
la Unal Med, UDEA HV, con valores de 0'23, 0'16 0'14
de
respectivamente,
y
y
los valores mínimos de F¡5 se encuentran en
subpoblaciones de EP (0.04), AZ (0'069) y BH (0'092)'
lll
las
6.6. Diversidad genótica comparada
6.6.1. lletcroc¡goEis por población
La heterocigosis esperada o diversidad genética media (He), presentó un
valor promedio de 0.71 donde el menor valor se encontrÓ en la subpoblación
de CA con 0.54 seguido de la subpoblación de EP con 0.61, y por el
contrario los mayores valores se encontraron en las subpoblaciones del BG
con 0.77, que presentó valores similares a la poblaciÓn de UDEA (0,78), las
otras potfaciones presentaron valores intermedios que variaron entre 0'72 y
0,75, por su parte la heterocigosidad observada (Ho) fue superior a la
espeftrda en la subpoblación perteneciente a JP 0.73, seguida por las
subpoblaciones de AZ y BG que presentaron valores de 0.6E y 0.67
respectivamente, por su parte, los valores inferiores se presentaron en la
subpoblación de CA (0.49), seguido por la subpoblación de la Unal Med
(0,.55) (Tabla16).
El
rrarcador TGlAl?2. ha presentado
la
máxima He
en todas las
subpoblaciones particularmente la subpoblación de cA presentó el valor mas
alto (Ho= 1.00) m¡entras que sPSl 15 ha presentado la menor He en todas
las subpoblaciones (He= 0.23).
Los marcadores que han presentado las mayores diferencias de He entre
poblaciones han sido para el marcador sPSl 15, en las subpoblaciones de
LE
(H*0.72\
y
EP (He= 0.23) y para el marcador TGLA
122
las
sr$poblaciones de CA (He= I '00) y la subpoblación de EP (He- 0'57)'
En cuanto a la heterocigosidad observada, se encontró para el mafcador
TGLA22TelmáximovalordeHoenlasubpoblacióndeJP,HV'LEyAZ'
para las
micntras que ETHS ha prescntado un valor alto de Ho
supoblaciones de CA' HV Y JP
en la supoblación de
El menor valor de Ho ha eido encontrada para sPSl 15
valores de Ho= 0'13'
AZ y TGIA53 para la subpoblación de HV' ambos con
112
En el Anexo 11, se pr$entan los valores de heterocigosis para cada
marcador en todas las subpoblaciones.
Tabla
ll
Heúerocigosis esperada (He) y observada (Ho) en las
subpoblaciones de animales de la ¡aza BON
5.69
0.6180
0,7529
0,7490
0.5908
0,
0,
0,7506
o,
0,6736
0.1311
6.7. Equilibrio Hardy-Weinberg
Para definir si una población muestra una desviación del equilibrio H-
W,
es
ímportante analizar el valor de Fs. Guando este índice tiende a cero significa
que la población está cerca del equilibrio de H- W, puesto que la
heterocigosidad observada (Ho) es semejante a la heterocigosidad esperada
(l,l€) pof individuo. Las desviaciones de 0 pueden ser positivas o negativas;
un valor negativo significa un aumento en la heterocigosidad, mientras que
un valor positivo indica una deficiencia significativa d€ heterocigotos (Hartl.,
199E).
Todos los microsatélites se han mostrado en equilibrio H-w excepto BM21'13
(Hen la subpoblación CA con un valor de (H-W=0.0698), ETHIO en CA
W=0.0713), TG;-PA27
en la
subpoblación EP (H-W=0'0638)
113
y en la
subpoblac¡ón
de LE (H-W= 0.0005), ninguno ha mostrado un
exceso
signifrcativo de heterocigotos pero 8M2113, ETH10, TGIA227 han mostrado
una dilerencia signiñcativa por déñcit de heteroc¡9ot6. (Tabla 17)
Tabla 12 Valores de Equilibrio Hardy Weinborg
0.873
.u7
.487
0.
1.000
0.968 0.069 1.
0.653 0.281 0.41
0.970
0.
0.998
0.
0
0.614 0.638
.9¿14 0.995
0.149
0.
1
0
0.472
1.000
0.830
0.985
0.
-
0.
0.
0.985
1.000
0.595
0.659
0
0.997
l14
0.562
0.1
n
.1
0.071
787 0.508
507 0.915
0.6@
13
0.623
1.000
328
o.747
0.
o.324
0.
0.989
.627
0.1
0.998
6.8.
Anállsis de componentes principales
En el Gráfico 15, se observa la representación espacial de cada uno
animales BON en las
clasificatoria
l0
de
los
poblaciones en estudio, empleando como variable
los genotipos individuales para los
f4
microsatélites. Los
resultados indican que en la primera dimensión, los individuos se agrupan
alrededor del centroide, pero dividiéndose claramente los grupos de las
poblaciones de BON y de Cebú, este primer eje factorial es el que controla la
mayor parte, pues explica el 37.f5 o/o de la variación total, la mayor
variaUlidad se presenta en la subpoblación del BG y la menor variación se
nota en las demás poblaciones BON, las cuales se agruparon muy @rcanas
a la derecha del centroide. El segundo eje factorial que explica el 'l 1'35
7o
de
la variación, muestra que los animales Cebú se agrupan de manera mág
homogénea, que los animales de las poblaciones de BON que muestran
mayor dispersión
8. 33olo
;Ofl:l!
rt1
=.1
:-l
:: .c
..¿:a ,ad
Gráfco
13
ds
Análbi¡ F.c'tofi.l d. cor.spond.nchs Íúltipha an 3ubpobhcion" de an¡m'ht
lr rrzr BoN y c.h¡.
115
6.9. Distancias Genéticas entre subpoblaciones de la raza BON
Si bien es cierto que las medidas de distancia genética calculadas entr€ las
poblaciónes, sin considerar otras como referencia,
no nos brindan
una
información completa de la población, en este trabajo se han calculado las
distancia genéticas de Nei DS (Nei 1983) , Cavall¡
1 983 entre las f 0 poblaciones.
Sbrza
1967 y Reynolds
Las tres medidas de distancia han coincidido en que las subpoblaciones mas
disüantes en este estudio son las subpoblaciones
de la UDEA y CA, así
observa que todas las subpoblaciones se d¡starrc¡an
genéticamente entre sí. Los valores de las distancias genéticas y los
mismo
se
dendogramas de cada una se Gpresentan en la tabla 18, y el grafico 16.
Utilizando el método de análisis de distancia estándar de Nci (1982), 3c he
observado una clara diferenciación genética entre las subpoblaciones de la
raza BON principalmente entre
la
subpoblación
de la UDEA y
la
subpoblación de CA, donde se en@ntraron los valores de distancia genética
mas altos (D¡=1.1696), así como las subpoblaciones del BG Y EP (0.7521)'
y este ultimo también presenta un alto valor de distancia genética con la
subpoblación de CA (0,77) lo que indica que dichas subpoblaciones
coffipaflen pocos alelos y la frecuencia de los alelos @mpsftidos €ntre ellas
son muy diferentes por lo que están genéticamente distanciadas. Por el
contrario se observan los menores valores de distancia genética entre las
subpoblaciones de LE y EP (0.1600) y como era de esperarse, las
y AZ
también presentaron muy baja distancia
genética (0,17), pues son subpoblac¡ones que se encuentran muy @rcanas
geográfcamente y han compartido recientemente reproductores. Por otra
subOodmiones de BH
parte, la subpoblación
de
EP presento valores de dbtanc¡a muy bajos con la
poblaciónde|aUna|Med(0,19),unva|orsimilardedistanciafueencontrado
bajos de
entre las poblaciones de JP y LE (0,19), que tueron los valores más
distancia entre poblaciones. Ver Tabla 18 y gráfco 16'
1ló
0.5229 0.7795
JP(
7)
0.3160
la metodologla
de Nei 1982
0.0000
o.
.1600 0.2553 0.1937
o,oegz Ó.zosg 1,1696 0.2290 0.2192
Unanl€d(l0) 0.4835 0.3142 0.6869 0.1
0.0000
76 0'&1 0'7052 0'3438
Azulrol
Bohamlo
CATTPOALEGR
Jorgopotor
Bg.rmop
ELPALI'AR
LqEsm"rold
UnolMed
Hotovi€jo
UDEA
Lt tubpobLciorr.s d€ |! rü'
m'todologh d' ¡¿'i
'ntn O con booú¡tr¡plng ú 1000
progr¡mr Phyllp
Bof{, u|.ndo .l .lgorftmo l{.lehbor- Jo¡n¡ng d'l
rú9llD..
Grañco t6 O.ndoeitm. uüllz¡ndo
h
t17
Similar situación se vio cuando se utilizó la medida de distancia de Cavalli-
se
de
distancia entre las
subpoblaciones de LE y EP (0,03) con valores similares de LE y Unal Med,
Sforza donde
en@ntraron valores bajos
con los mismos valores de dislancia. Pero mayores valores de distancia se
en@ntraron entre las subpoblaciones de AZ, BH y HV, que presentaron
a 0.5. En este caso también los mayores valores de
distancia se reportaron entre las subpoblaciones de UDEA y CA (0'14)
valores cercanos
seguidas por las subpoblaciones de BG y EP (0'12)' pero en este caso se
destacó un valor alto de distancia entre HV y CA (0,11), valor que no tue alto
uülizardo la distancia de Nei (1982). Tabla 19 y gráfico 17.
utilizando
la medida de distancia genética de cavalli-sforza (1967)
se
enconffi la formación de un primer grupo claramente definido, formado por
grupos dibrenciados, El primer grupo, se forma entre las subpoblaciones de
LE y EP, los cuales a su vez forman otro grupo muy cercano con Unal Med
primer
Por otro lado, la subpoblación de UDEA también forma parte de este
grupo. Posteriormente, este grupo se unió con un cluster formado por las
s¡.wuaciones de AZ, HV y BH las cuales se encuentran muy cercf¡nas
entre ellas. Formando; un cluster separado se encuentran las
subpoblaciones de BG, que forma un grupo con JP y por último, muy
abiado del €sto de subpoblacioncs se encuentra el grupo de CA'
118
0)
la metodologla de Cavalli Sforza
0.
0.0537 0.0826 0.1103
@
0.0656
0.0363 o.o5s9 o-0s99 o.oooo
.0569 0.1045 0.0620 '0.
tl.oesz 0.0566 0.0386 0.
0.637 0.0702 01068
0'
Azulrol
Hotovl.Jo
Bgharñio
ELPALT/IAR
LdE¡rrrorold
UnolMcd
UDEA
JorEapotor
Bgormop
CA¡\,POALEGR
Gráfrco
lT D.ndogrrma r¡til¡rrndo
h
nFtodologlá de C'\T ll¡ Sfor¿' entll las subpobLclom' d€
hírr.3oN'uxñdo.|¡|go'ütrol.|.|ghbof.Jo¡n|ned.lprogrernePhy||Pooonboot.tnP|ngd.
l00O
rtP[ctl
119
Los valores de distancia genética de Reynolds mostraron una clara
diferenciación entre las subpoblaciones de la raza BON, es así como los
valores mas altos se presentaron enire las subpoblaciones de la UDEA y CA
(0.3661), así como las del BG y EP (0.1980), estos valores han mostrado que
las subpoblaciones están genéticamente d¡stanc¡adas. Por el contrario se
observa una gran cercanía genética en las distancias de las subpoblaciones
de LE y EP (0.0660), así como
y EP, Unal Med y LE
en
las subpoblaciones de AZ y BH, Unal Med
(0.085), estos valores determinan que dichas
subpoblaciones comparten muchos alelos
y la frecuencia de estos
alelos
compartidos entre ellas son muy similares por lo que ex¡ste cierta cercanía
genéüca entre si, estas son subpoblaciones que s€ encuentran muy
scilEts
geográficamente
y
han compartido recientemente
genético. Ver Tabla 20 y gráfico 18.
tzo
material
AZIOl
0.0000
BH(10)
0.0854 0,0000
cA(6)
0.1791 0.1873
EP(11)
0.2145 0.1869 0.3¿[60 0.0000
la metodologfa de Reynolds
O.0OOO
@¡
0.1372 0.1035 o.oooo
4
00000
0.1017 0.0000
EqiD--¡ls4s
0.15s2 0.2sso 0.1980
utilizando
01634 01201
0.13¿10 0
O00C{l
entre laa
ía
subpoblaciones de la raza BON, usando el algoritmo Neighbor'Joln¡ng
del programa Phylip @ con bootstraping de 1000 réplicas
Azufrol
Bohatnlo
ELPALMAR
UnolU.d
Jorgap€tor
LoEtrñ.r€ld
Hotoüajo
UDEA
D9€rmop
C¡l¡gPO/ALEGR
d€ L
O.ndogr¡m. uüliando L matodologúe d' R'ynoldt 'ntrr lat 3¡bPobü¡c¡otE
Phyllp o con booLtfrping ds
BOI{, u¡rndo .l ttgofitmo l,Lighbof- Joln¡ng d.l Progfrmr
lo00 rúPl¡crt
Gr{ñao
n¡t
lf
121
6.10. Asignaclón de individuos
Mediante el programa Structure v.2.1. (Pitcfiard
y col 2000), utilizando un
algoritmo bayesiano se ha determinado la distribución a poster¡ori de cada
coeficiente de membresía de cada individuo (O). La media de ésta
distribución representa una estimación de la proporción del perfil genétioo de
un individuo que pertenece a alguna de las posibles subpoblaciones que
integran el grupo de análisis, suponiendo que eslas están en equilibrio H-W.
En otras palabras, este proc€dimiento realiza la asignación de individuos a
wbpoHaciones (Clusters) en función de su parecido genético suponbndo
que las frecuencias génicas están conelacionadas y que las poblaciones en
estudio están mezcladas. Para cada valor de K (número de poblaciones) se
rudizaron 500 rcplicas. Los resulüados de cada conida están basados cn
10.000 iteraciones.
El resultado de este análisis para cada individuo puede observarse en los
gráfcos 19 y 20, cada uno está representado por una bana vertical dividida
en K s€gmentos de dibrente color. cuando la bara vertical es de un solo
color significa que el perfil genético de ese individuo se asigna con un i 00 %
de probabilidad a un soro cluster (K), de acuerdo a los alelos presentes y
sus ñ¿cuenc¡as en un individuo dado, mientras que si tiene dos o mas
colores significa que se asigna a dos o mas subpobraciones ro que
significaría que comparte cierta simiraridad con otras subpobraciones (K).
En este trabajo se ¡ealizaron dos üpos de simulación, un primer análisis
simub la existencia de tres subpoblaciones, una claramente definida, que es
la población Cebú
y
se asume que dentro de la poblacíón BON podrían
existir al menos dos grupos dibrenciados.
cl scgundo análisis se simuló la existencia de seis subpoblacioncs, un
primer grupo control el grupo de la población Cebú, y otros cinco grupos
En
pertenecientes a la raza BON.
Pana el primer análisis de simulación (Gráfco 19), se incluyó un total
122
de 144
individuos, 102 animales de la raza BON y 42 animales de la n?a Cebú, que
se asignaron a tres grupos (K=3), en este caso siempre se diferenció
daramenle el grupo Cebuíno asignándose con un
100o/o
de probabilidad en
la mayoría de los casos al grupo el grupo identificado con el mlor rojo (k1)
las subpoblaciones CA, Unal Med, HV, BH, se agruparon en el grupo
identificado con el color verde (K2) y las subpoblaciones de LE, UDEA, AZ,
BG y JP quienes mostraron pertenecer al grupo identificado con el color
verde, pero es de resaltar que este grupo presentó mayor variación, es de
anotar que los estimadores de veros¡militud han s¡do consistentes entre
cqridas independ¡entes.
Los valores obtenidos, indican que el 98.40lo de los individuos de la
subpoblación Cebú, están agrupados en el cluster rojo, teniendo una
estrudura de la población definida, Sin embargo uno de |os 42 animales
cebú presenta un perfil genético distinto, que lo asigna al cluster azul, donde
principalmente se encuentran animales de la ¡aa BON. La subpoblación de
la UDEA, presentó un valor de
membresía del 88.9olo, que
la
agrupa
principalmente en el cluster Verde, así mismo 85.4% de los animales de la
subpoblación JP y 87.5o/o de los animales de la subpoblación del BG se
ubican en el cluster Azul. (Ver tabla 21)'
Los irdividuos de las subpoblaciones EP y CA, presentaron valore de
membresía que los agrupa principalmente en el cluster identificado con el
color verde (86.70/o y 71.7o/o Para EP y CA respectivamente)'
a¿J
Tabla 16 Proporción de individuos asignados a cada clusüer
BH
JP
lled
0.000 0.490
0.0m 0.717
0.000 0.867
0.000
0.510
0.283
0.133
0.1
0.000 0.588
0.000 0.125
0.984 0.0@
0.412
0.87s
0.016
r.00
0.80
0.60
0.10
0.20
0.00
dé lnimal€3 BON
Gráf¡co l9 A¡ignación individull a Clu3tor par¡ la3 ¡ubPoblrciones
de Q'
Es ¡mportante tener en cuenta los valores de Fsr Para las est¡maciones
la subestructura
debido a que este parámetro nos indica la significancia de
población y de esta forma se puede determinar el grado de
en una
di€rcrciadóngenét¡caentre|as,|0subpob|acionespertenecientesa|af€za
aquí'
BON y fa población de animales dela¡aza Cebú, evaluadas
cuenta las poblaciones
Los valores de Fsr, fueron recalculados, ten¡endo en
y también
a analizar (10 subpoblaciones de la raza BON y 1 de la raza cebú)'
(Q= 3)'
de acuerdo a la simulación de tres agrupamientos
124
El valor más alto de Fs¡ se encontró en el K1 (0.1468), que corresponde al
cluster en
el que se presenüaron
principalmente
los individuos de
las
subpoblacion$ de la raza Cebú; el K2 por su parte presentó un valor infe,rior
(Fsr =0.0636), que representa principalmente los individuos con perfil
genético predominante en la raza BON y el K3 mostro el valor levemente
más bajo (Fsr =0.0578)
y que indica que estias dos subgrupos
podrían
constitu¡r un mismo agrupamiento. Ye¡ tabla 22.
Tabh 17 Valores de Fst asignados a cada clueter
se realizó otra simulación de las estimaciones de Q, asumiendo que seis
presente en la
subgrupos podrían explicar la sub-estructura de la población
Los
raza boüna Blanco orejinegro BON y su diferenciación con la raza cebú.
6c|ustersogruposfuerondefinidosporco|oresdeacuerdoa|as¡gu¡ente
clasifcación:
Kl
(amarillo), K2 (Rojo), K3 (Morado), K4 (Verde)' K5 (Azul)' K6
(AzulClaro). (Ver gÉfico 20).
la
Los valores obtenidos indican que, los individuos pertenecientes a
que los agruparon
subpoblaciÓn CA, presentaron valores de membresía
(60%)' Así
principalmente en el cluster identificado con el color Amarillo
Med se agruparon
mis¡no 43.8olo de los animales de la subpoblación de unal
tiene una estructura
en e| cluster Amari||o, mostrando que esta subpob|ación
que tienen orígenes
genéiica no muy bien definida, ya que presenta animales
difuientcg, ó ha sido mezclada recientcmente con otras subpoblaciones'
presentó un 4l'8% de individuos
Por otro lado, la subpoblación de la UDEA
agrupadosenelclusterRojo,un2l'1o/odeindividuosenelcluslerMoradoy
125
un grupo muy reducido de animales en los cluster restantes, asumiendo que
los individuos de la subpoblación presentan perfiles gerÉticos variados, lo
que también se explica por el uso de reproductores de diferente origen
genético, provenientes del BG.
También, se pudo observar que los individuos referentes a la subpoblaciones
y
BH (45.8olo y 44% respecfivamente) presentaron un valor de
membresía que los agrupa al cluster verde. También se presento en la
de A2
subpoblación BH un valor
de
membresía del 397o agrupado
a
esta
subpoblación principalmente en el cluster Amarillo.
La sr¡bpoblación JP mostro un valor de membresía del 84-9o/o para el grupo
Azul, lo que se define como una agrupación claramente definida. Por otra
parte,
subpoblación del Banco de Germoplasma presentó mayor
la
variabifidad genética, ya que
el
agrupados en el cluster Azul, un
14
0/o
32.8c/o
25o/o
de los individuos se encontreft,n
que se agruparon en el cluster Rojo, el
en el cluster verde, el 120/o en el cluster Morado y finalmente
100/o
€n el
que
cluster Verde lo cual indica una mayor variabilidad genética y muestra
esta pobhción ha aportado genes a las diferentes poblaciones estudiadas.
Enestecasoesimportanteresa|tarqueningúnind¡Viduodelas
que es
supobfaciones de la raza BON se agrupó dentro del cluster 6'
prudominantemente de la población cebú, lo que indica que no ha cx¡stido
(Ver gráfim 20)'
cruzamiento en estas subpoblaciones de raza BON
(97.4o/o) en
La población de raza cebú, mostró un valor mayor de membresía
presenta un
el duster azul claro. sin embargo uno de los 42 animales cebú
pgsgenéücodistinto,que|oasignaalc|ustermorado,dondeprincipalrnente
se encuentran animales de la raza BON' (Ver tabla23)'
126
Tabla 18 Proporción de individuos asignados a cada cluster
o.ou I
o.o74
0.000
0.000
0.007 0.030 0.020
o.mo
0.2m 0.049 0,076 0.ü)9 I
0.094 0.128 0.136 0.000
JP
0.006 0.129 0.003 0.014
0.104 0.055 0.115
n
n
0.130 0.216 0.084
.108
I
0.128
0.0m 0.002 0.002
1
0.000
0.
0.000
0.140
0.001
.00
0,80
0.60
0.t0
0.20
0.00
Gáf¡co 20 Asignación ¡nd¡vidual a c|uster
plr¡ L3
subpoblac¡on€s de an¡nral€3 BON
Los valores de Fs¡, fueron recalculados, teniendo en cuenta las poblac¡ones
a analizar, de acuerdo a la simulación de seis agrupamientos (Q= 6). El valor
más alto de Fsr, se encontó en el K6 (Fsr =0.1400), que conesponde al
cluster en el que s€ presentaron principalmente los individuos de las
subpobfaciones de la raza cebú; los valores de Fsr Para los demás cluster
fueron inferiores y variaron entre K5 (Fs¡ =0'0705) hasta el valor mas bajo
enK3(Fsr=0,0078)indicandounagrupamientonomuybiendefinido'Para
t27
el K1
(amarillo)
se presentó un valor de Fsr intermedio (0.0504),
que
representa principalmente los individuos con perfil genético predominante en
la raza BON (Ver tabla 24)
Tabla 19 Valores de Fsr as¡gnados a cada cluster
128
7.
D|SCUSION
La mayoría de los carac{eres desde el punto de vista económico en los
animales domésticos están determinados por múltiples genes, y estos
caracteres pueden ser medibles y sus componentes genéticos est¡mables a
través de estrategias de genética cuantitat¡va. La variación que ocurre en un
carácter de este
tipo, es el material con el que trabaja la genética
cuantitativa, esta variación es necesaria para procesos de mejoramiento,
dado que todos los caracteres están afectados por factores genéticos
no aditivos y ambientales, pero se ha encontrado que en
poblaciones reducidas y con altas tasas de consanguinidad, los efectos
genéticos tienden a disminuir y los ambientales y no aditivos tienden a
adiüvos,
aumentar, como resultado de deriva génica.
proporción de
Los valores genéticos que se pueden estimar dependen de la
por su
estos efectos aditivos, y su élculo nos permiten categorizar los toros
promedio de
habilidad para transm¡lir diferencias por encima o por debajo del
unapob|ación,ydeestaformasepuedetenerlaposibi|idaddeuna
de aquellos
selección más exacta a favor de obtener mayor número de hijos
animales que tengan una categorÍa productiva superior'
Pa¡aobtenerunmejoramientogenéticosostenidoegimportántegarant¡zaf
procesos de
que la poblac¡ón tiene variación genética que soporte estos
selección,porlocualesimportantecuantificarestavariabilidad'
D€sehacemuchosehandesano|ladoinvestigacionesusando
genética del
herramientas de biotecnología para la caracterización
para determinar la
germoplasma y desde hace varios años, se han utilizado
como también para la
variebilidad en las razas criollas colombianas así
genética con otras razas; la
identificación de pureza racial e introgresión
se basan en análisis genéticos'
mayoría de estos estudios de eradtenzactón
atravésdelusomarcadoresmolecularestipomicrosatélites'porestarazón
129
el objetivo del presente trabajo fue determinar la variabilidad genética en 10
poblaciones comerciales dela¡aza BON, comparada con la raza cebú, para
esslecer
7
la posible introgresión genética con esta raza foránea.
.1. Caracb¡ización Genética
7.1.1. Variabilidad Genética
La variabilidad genética, desde el punto de vista matemático, es la
pfobeH|kraddequedosalelostomadosa|'zA|delapob|acóns6an
diferentes (Grow
Pa,
Y
Kimura., 1970).
@rad(enTf¡r la variabilidad en cuanto a recursos genéticos animales; se
dos tipos de componenles: la variabilidad fenotípica' que se
tmbaje con
observa fácilmente
y se puede medir directamente sobre los individuos
en la
evaluados y la variabilidad genética, que se puede medir directamente
genéticos. Pero en
secuencia de ADN, ó uti|izando diversos marcadores
amboscasoshayhenamientasmatemáticasquenospermitenc€¡rac,;ei|zer
poblaciones y de esta
adecuadamente la variabilidad existente dentro y entre
las poblaciones
ñorma pueden cuantificarse las diferencias entre y dentro de
animabs.
Desdeunpuntodevistapráctico'favorecer|avariabi|idaddentroderazases
más
útil en procesos de selección y adaptación, mientras que dar
¡mpoÍtanc¡aa|avariabi|idadentrerazasseríamásrazonab|ecuandoloque
(García y Cañón''
se prdende es explotar el resultado de cruzamientos
2007).
variabilidad'
utilizar información molecular para determinar esta
poblacionales' entre ellos el
norñielmente se utilizan algunos paÉmetrcs
y
ellos se
promedio de alelos, los valores de heterocigosidad con
Al
número
1969)
determinan los índices de fijación (Wright''
130
En este estudio, la
microsatélites
mediante
el
variabilidad genética encontrada pal.a
los
14
en las 10 subpoblaciones de la raza BON se determinó
número promedio de alelos, que fue para este trabajo de 13.7
alelos por locus, siendo este valor mayor al observado en otros estudios,
realizados en la misma raza BON del Banco de Germoplasma, (Npa=8.57)
(Banera y col., 2006), pero esto puede ser debido a que se utilizó un número
superior de animales (n=40), en
el mismo trabajo se indican valores
muy
inferiores en la raza Sanmartinero (Npa = 4.57) , Hartón del Valle (Npa =
5.1a), y CCC (Npa = 5.00), donde la población analizada fue reducida, pero
en la raza Caqueteño que se analizaron un numero alto de an¡males (80) de
diferentes orígenes, donde se encontraron valores levemente super¡ores
(Npa
= 9.21), comparadas con las otras razas del mismo trabajo, pero
s¡emprc inferiores a los registrados en este trabajo. Por otro lado, Martíncz,
y col. (2005), también en@ntraron en bovinos de raza española Mostrenca
valores inferiores para este parámetro (Npa=6.7), al igual que Mendez y col.
(2002), qu¡enes realizaron estudios en la ¡aza bovina Mallorquina y
de Npa (Npa=4.4). En estos trabaios, los
están relacionados con la cantidad de muestras y marcadores
reg¡streron valores menores
resultados
fue
analizados en estas razas, donde a pesar de que el numero de animales
26
considefable (Mostrenca= 340 animales y 26 marcadores, Mallorquina=
anima|esyl5marcadores)|avariabi|idadencontradafuemenorque|a
registrada en la raza BON.
una menor
En otros estudios realizados por Riojas y Col', (2006) se encontró
intensa
variat¡ilidad en raz¿¡s puras brahmán (Npa=8''125) debido a su
de Brangus
selección, y en el mismo estudio se encontraron en los cruces
la encontrada en las
(Npa=16,'l) respecto
a
una mayor variabilidad
prcducto
po$miones de BON, esto se presento debido a que esta raza es
animales 3/8 Brahman
del cruzamiento que tuvo que realizarse hasta obtener
5/8 Angus.
l3l
La variabilidad e informatividad por marcador se ha evaluado mediante un
parámetro conocido como el Contenido de información polimórfica' que para
eete trabajo, los mayores valores de PIC fueron encontrados para el
marcador 8M2113 (0.73) y por el contrario el menor valor se encontró para el
marcador SPS115 (0.42), lo que indicaría que este marcador podría no ser
útil para nuestras poblaciones criollas. En cuanto a la informatividad de cada
microsatélite algunos marcadores muestran un P/C elevado aunque su NPA
es bajo como por ejemplo BM2't 13 (0.73), y otros marcadores presentan un
PtChrilo y un NPA mayor como por ejemplo BM1818 (0.48)' Estos resultados
irdican que para la población en estudio, los marcadores más
rs
informativos son TGLA122, BM21 13 y ETHI0, por lo tanto serian los
marcadores de elección, cuando se requieran nuevos trabajos de variabilidad
gerÉirx.
otro parámetro ¡mportante en genética de poblaciones es la Heterocigosidad
proporción de
esperada y observada, que se puede obtener a part¡r la
e
individuos que tienen en cada uno de los loci genotipos heterocigotos'
que lleva a
irdica desvío del equilibrio de Hardy & Weimberg' situación
identificardisminuciÓnen|avariabi|idadgenéticacuandoseencuentran
pob|acionescondéficitdeheterocigotos,porefeclodeapareamientosentre
cuando existe
animabg cercanamente emparentados ó por el contrar¡o
de cruzamiento
exceso de heteroc¡gotos, que indicaría procesos rec¡entes
en las diez
entre razas. En este trabajo los valores de He encontrados
poblacionesde|a¡azaBoN(He=0.71)fueronsimi|aresa|osencontradosen
Criollo Uruguayo (He 0'67)
otras poblaciones bov¡nas Griollas como la raza
Longhorn de
y
(Armstrong y col 2004); Florida Craker, Pineywoods Te)€s
ó la raza Criollo Casanare
Estados Unidos (He=0.7) (Mac Neil y col'' 2006)
Sin embargo' otro3 autorcs hen
dc Cdombia (He 0.82) (Banera y col 2006)'
los encontrados en la raza BON'
encontrado unos valores de He superiores a
en Griollo Saavedreño
y
como es el caso presentado por Lirón col''(2006)
132
(He= 0.86), en Criollo Chaqueño y en Criollo Yacumeño de Bolivia (He= o.72
y
He
cual se debió a que estas poblac¡ones han
sido cruzadas con razas cebuínas y estas poblaciones actualmente no son
O.77) respectivamente, lo
completamente puras como fue indicado por el autor.
El valor de diversidad genética o heterocigosidad esperada (He) en las
subpoblaciones de animales de ¡aza BON es mayor al encontrado en otras
razas bovinas puras como por ejemplo Simmental (He = 0.58) (Edwards y
col., 2000), Nelore (He = 0.515) (Lara y col 2005), las razas Highland (He =
0.57), Hereford (He =0.60) y Shorthom (He =0.58) (McNeil y col 2006), que
indba que a causa de la intensiva selección estas poblaciones s€ han vuelto
más homocigotas, situaciÓn que no se encuentra en las diferentes
pobfaciones de la raza BON donde la heterocigosis media entre las
poblaciones no pnesenta diferencias estadísücas signiñcativas, lo cual indica
una variabilidad genética similar para todas las poblaciones lo cual podría
indicar que se tiene variación suficiente para procesos de selección. Esto se
confirma por el hecho de que en las subpoblaciones de animales de la ¡aza
heterocigosidad observada (Ho= 0.6)' ha presentado un valor muy
similar a la esperada (He = 0.61) lo cual refleja que en estas subpoblaciones
se encuentran en términos generales muy cerca al equilibrio dada la
BON
h
que
similaridad entre los dos valores de heteroc¡gosis. otra forma de vef
estas subpoblaciones se encuentra en equilibrio de H&W, es que en las
subooblaciones de animales dela ¡aza BON, de un total de 14 marcadores
valor de
micfosatél¡tes, tienen tan solo 2 marcadores, que presentan mayor
Haq¡c.He.
E|marcadorTG|Al22hapresentado|osva|oresmása|tosdeHeentodas
las poblaciones (1.00)' al igual que lo encontrado en un estudio realizado
entfcrez|scrio||asycomercia|esenBrasi|dondee|marcadorTG|A122
Por el
presento los valores de He mas altos (He=0.925) (Egito y col., 2007)'
menor valor cle
contrario, el marcador SPSI 15 fue el que presentó el
Heterocigosidad(He=0.23)simi|ara|oinformadoenunestudiorea|izadoen
133
el bovino de raza berrenda negra, donde este marcador también presentó los
menores valores de heterocigosidad (He=0.27) (Zamorano y col.' 1998).
Esto6 datos concrerdan con los obtenidoe por Machugh y col.'(1994) que
estudiaron la variabilidad genética entre varias poblaciones bovinas mediante
marcadores microsatélites,
y
hallaron valores similares de heterocigosidad
para el marcador ETH225 (He=o.s) en la ¡aza Friesian comparado con los
encontrados en la población de animales de la ¡aza BON (He=0'83)'
La He, solo mostró d¡ferencias estadísticas significativas entre la población
de LE, CA y EP en 2 marcadores del total de 14 estudiados, es así como'
para fos marcadores SPS115 (HeclOJ2\ TGIA122 (He=1'00) se
y
presentaron valores máximos para
las
subpoblaciones
LE
y
CA
respectivamente.
La Ho, mostro dibrencias significativas entre la subpoblación de HV
(Ho=0.13) y la subpoblación de la UDEA (Ho=0'88) en tres marcadores:
TGLAs3,SPs115|NRA063,perosó|oenesteúltimomarcadore|va|ordeHo
para la subpoblación AZ (Ho=0.80) tue mayor el encontrado en la
subpoUación UDEA (Ho=0.22).
de HardyLa probabilidad del test exacto de Fisher para probar equilibrio
en el marcador
Weinberg fue de (H-W= 0.0698) para la subpoblación de CA
8M2113 y ETH1O (H-W= 0.0713), mientras que el marcadorTGllA2T Q{en la subpoblación
W=0.06385) en la subpoblación de EP y (H-W=0'0005)
en la subpoblación
de LE, presentaron menores valores a los enc¡ntrados
se encuentran en equilibrio
de CA. Demostrando que todos los marcadores
por el contrario ex¡ste un
de H-W y no se presenta défic¡t de heterocigotos'
excesodeheterocigotos,dentrode|assubpob|acionesestudiadas,|ocua|
la raza BON se conserva en
nos indica que esta población de animales de
estado de heterocigosis.
t34
7.1.2.Análisis de la estructura poblacional (Estadísticos F)
aislamiento genético persiste por varias
generaciones, la consecuencia principal, desde el punto de vista de la
Cuando
un
proceso
de
genética de poblaciones, es la consanguinidad y la deriva génica (Falconer y
Mackay 1996). Para los 14 microsatélites utilizados en este estudio, el valor
de F¡s Fr€sentó una magnitud intermedia (0.1518)' lo que muestra que
animales de la raza BON presentan moderada endogamia, que indica una
de sus alelos en heterocigosis, similar a lo
erpr¡tradoporBedoyaycol-,(2001)'quienesestudiandocinco
significativa proporción
microsatélites encontraron valores de Frs=
0.1148, en una población de
animales de la raza BON de la universidad de Antioquia, donde evaluaron
tembién un núment menor de animales. Los valores encontrados en el
presente trabajo se diferencian básicamente en la cantidad de muestras
los estudiados
analizadas y de marcadores evaluados que fueron mayores a
por Bedoya
Y
col., (2001).
y
drc lado Lirón y col., (2006) en bovinos criollos del Noroeste fugenüno
razas criollas bolivianas mediante nueve marcadores tipo microsatélite'
Noroeste
encontraron valores negativos de Frs Para el bovino criollo del
Por
Yacumcño (Frs
Alwnüno (Fn= {.007), así como para los Criollos Bol¡vianos:
-0'091)' situación que
-0.003), Chaqueño (Frs = -0.047) y Saavedreño (Frs =
=
noseencontróen|apob|aciónde|arazaBoN.Estosva|oressug¡erenun
estudio debido a que algunos
exceso de heteroogotos en las poblaciones de
(314) pueden haber sido cruzados con
de
b
de animales muestreados
mayores valores de Ho'
animales de otras razas' y por lo tanto presentarse
en las poblaciones de la
comparado con He, situación que no se observó
rele BON.
BON medido a través del
El grado de homocigosis de los animales dela,aTa
valor que comprometa la supervivencia
Frs, no Pued€ considerarse como un
cuenta que al comparar los
de la población, principalmente si tenemos en
135
valores de Frs en la población de animales de la raza BON entre las
subpoblaciones, cuatro de ellas han presentado valores más elevados, entre
elloe UnalMed (F¡s = 0.230), UDEA (Fs = 0.166),
presentaron las poblaciones de HV
0.092) y GA (Frs = 0.083) y otras
con valores intermedios se
(Fs= 0.142), BG
tres poblaciones
(Frs = 0.1311), BH (Frs =
M (Fs = 0.069), EP 16t =
0.O44) y JP (F¡s = 0.017) presentaron los valores más bajos de Fis' debido
pos¡blemente
a que estas subpoblaciones de AZ, EP y JP han cambiado
dentro de sus planes de cría algunos machos reproductores lo cual da un
valor bajo de consanguinidad en estas subpoblaciones.
por
Los valores eficontrados en este trabaio son similares a los en@ntrados
Moioli y col. (2004) quienes reportan valores de Frs en tres razas italianas
= 0.102), Maremmana (F's = 0.138) y Podolica (Frs =
0-10€), esto se justifica debido a que las poblaciones de este catudio
Piedmontese (Frs
provienen de poblaciones diferentes, las cuales tampoco han sido somet¡das
que recientemente
a programas de selección, puesto que los autores indican
para
sólo la raza Maremmana ha iniciado pruebas de comportamiento
en
@amiento genético, situación similar al estado de la Eza BON
donde también hemos evaluado varias poblaciones que tienen
colombia
planes de
intercambio genético entre ellas, y donde también se inician los
íis¡ofámiento.
7.1.3. Diferenciación Genética
El Fsr obtenido (Fs¡ = 0'105)' muestra una moderada diferenciación
gsdhe, lo que indica que no existe una subeslructura marcada entre las
subpob|acionesde|arazaBoN.Esteva|orfuesimilara|oencontradoentre
estos valores por
siete razas puras francesas (Fsr = 0 0S), y analizando
(Fsr = 0' 1 12)'
parce de fazas en@ntramos que Abondance y Holstein
presentaronva|oressimi|ares,peroentre|asrazasMontbe|iafdeyVi||ardde
posiblemente debido a
Lans (Fsr = 0.043) presentaron valores inferiores'
136
causa de la cercanía geográfica e histórica que han tenido estos dos últimas
rl¡zts, ya que son de origen alpino
y la raza Holstein la cual fue introducida
en loo inicios del siglo XtX, y han sido utilizadas con casi todas las áreas
donde estas razas eran endémicas (Maudet y col.' 2002).
También este valor es similar al encontrado en otros estud¡os con varias
raz¡s eurctpeas reportados por Dalvit y col.' (2007) trabajando con doce
microsatélites encontraron que entre las razas Burlina y Brown Swiss el valor
Fs¡fue de 0.103 y entre las razas Frisona y Brown Swiss de 0101' por
de
otro lado, Muralidhar y col., (2004) reportan un valor de Fsr = 0 1 17 entre las
razas Deoni y Ongole, así mismo, Chung y col.' (2006) utilizaron once
microsatélites y encontraron un valor de F5¡ = 0.110 entre las razas Angus'
Shorthom, Limousine, Holstein y Korean cattle' '
mundo
Estos velores de Fsr entrc distintas fazas, en diferentes regioncs dcl
por lo que
son semejantes al existente entre el Criollo BON en Colombia'
poblaciones dentro de
cabe considerar que existe variabilidad genética entre
r€¡zts,ensuperiormagnitudqueentrerazastaurinasdea|tase|eccióndonde
se B.do haber perdido la variabilidad genética'
Según (Felsenstein 2OO4), cuando dos poblaciones
están
aisladas
genéticamente|ospro@sosdemutaciónyderival|evana|adiferenciación
en las frecuencias alélicas y conbrme se incrementa el tiempo de
separación,|asd¡ferenciasen|asfrecuenciasa|é|icastambiénse
las subpoblaciones de
incrementan. Este fenómeno no se observa entre
anima|esde|arazaBoNyaquecompartenunnúmerosignificativodealelos
de que en esta reza
(22 aldos), en todas las poblaciones, dado por el hecho
intercambian individuos entre sí' con
la
mayoría
de los
productores
quien solamente aporta material
excepción del banco de germoplasma'
por ser un núcleo
gefÉtico, mas no utiliza individuos de otras poblaciones'
cenado.
137
En los estudios hechos por Russel y col., (2000) también en@ntraron
diFrencias significativas entre los bovinos criollos mexicanos para el
ma¡cador BM2113 donde el Criollo Mexicano presentó 10 únicas variantes.
Si bien algunos autores consideran que las medidas de distanc¡a genética
entre poblaciones, sin tomar como referencia otras, no es un valor confiable,
cuando éstas medidas son tomadas teniendo en cuentia un número
importante de marcadores genéticos y todas ellas coinciden en mostrar la
misma relación entre las poblaciones, queda una clara tendenc¡a que luego
conviene confirmar con la inclusión de otras razas de referenc¡a.
Entre los las subpoblaciones de la raza criolla Blanco orejinegro BON se han
(r983) (Ds)'
calculado tres medidas de distancia genética, la Distancia de Nei
(196a)
Distancia de Reynolds (1983) (Dn) y Distancia de cavalli-sfoza (Dc)
tenaefldo en cuentia las ft€cuenc¡as de los alelos para los 14 microsatél¡tes'
donde los valores máximos se encontraron entre las poblaciones de la UDEA
y de CA (Ds= 1.1696)), (Dn=0.3661), (Dc=O'1415)'
A partir de estas medidas de distancia genética se construyen in¡cialmente
para
urios erupamientos mediante la metodología de neighbom ioining'
finalmente construir un dendograma
ó
árbol de distanc¡as individuales
10000 replicas)' y en
utilizando una técnica de remuestreo (Bootstraping, con
estetrabajoseobservaque|osindividuosde|aUDEAconformanungrupo
b¡endiferenciadodelosindividuosdeCA,noexistiendoningúnindividuo
mezclado entre sl.
Enotrostrabajosrealizadosenrazascriol|assehizounaná|isisfi|ogenético'
la ¡aza BON con otras razas
con d fin de inferir las relaciones genéücas de
deganadocrio||oydeterminarsiexistíasuficientediferenciaciÓngenét¡ca'es
con respecto a otras razas
decir, si la poblaciÓn presentaba independencia
genéticas de Nei (Ds)
Bane¡a G. y col. (2006), calcularon las distancias
considerando|aSfrecuenciasa|é|icasde|asrazascrio||asco|ombianasy
encontraronque|ad¡stanciaentree|crio||oBoNye|crio||ode|casanareño
Martinero de (Ds=0'6334)' Estos
tue de (Ds=0'5074), entre BON y criollo San
138
autores @nfirman los valores de distancia genética entre animales criollos
colombianos y así mismo puede observarse, que la población de BON se
separa de las otras poblaciones de ganado criollo colombiano lo que indica
que esta población tiene estructura racial definida y además se ubica en un
grupo distante de Cebú que fue la raza utilizada como control extemo para
determinar
la probabilidad de introgresión de esta en las demás
razas
criollas.
Los métodos bayesianos, se basan en que dada una distribución a priori, se
g¡ade establecer una distribución y para ello se requiere que las poblaciones
se hayan muestreado adecuadamente (Falush y col 2003). Para el análisis
de la estructura poblacional, Pritchard y col (2000) ha diseñado un algoritmo
quc $igna individuos a poblaciones con base en sus genotipos e3t¡mendo
las ftecuencias alélicas de cada locus. Pritchard y col (2000) introdujeron
este método para identificar poblaciones diferentes; posteriormente se
estudia la ascendencia de los individuos en el analisis. se consideran dos
rpdelos para la ascendencia de los individuos, el primero un modelo no-
combinado,ene|queseasumeque|osindividuosSontomadosdeforma
pura de una de las k poblaciones y el modelo combinado, en el que se
permite mezc|a de |os ancestros; es decir, una fracción qk de| genoma de un
y col
individuo viene de la subpoblación K (Ek qk =1) Por otra parte' Falush
(2003)introdujeronunmode|oene|queseacepta|igamientoentrelos
para explicar la
marcadores, el cual se incluye en el modelo combinado,
coffde¡fuentrelosmarcadores|igados.Estemode|opermitelaestimrción
de|origende|aregiónde|cromosomadentrode|individuoyproporc|onauna
mejor resolución en el estudio del proceso histÓrico de la muestra'
que las
Los supuestos principales para estos modelos están basados en
y que existe equilibrio
frecuencias alélicas están en equilibrio de ligamiento
Hardy-Weinbergdentrodelaspoblaciones,portanto'lasimilituddelgenotipo
139
del individuo i está condicionada por las frecuencias alélicas en su población
<,e
orben (Zi).
La asignación de indñiduos a clusters mediante el programa Structure'
presento una visión del grado de diferenciación genética de las poblaciones,
siendo un método que supone que las poblaciones están mezcladas y va
asignando cada individuo a un cluster en función de su parecido genético. El
análisis permite simular la estructura de la población, lo que permite analiza¡
la ooblación si tuviera un número mas probable de cluster, en este caso al
suponer que la estructura de la poblaciÓn con 3 grupos o clusters (K=3)' en
ed6 caso se ha agrupado el 88.9 016 de los animales de la UDEA en un
primer cluster, y el 85.4
o/o
de los animales de JP y el
87 .5o/o
de los animales
def BG en un segundo cluster y por último, los animales dela n7a Cebú' los
agrupa estrictamente en un tercer cluster, en el cual no aparecen animales
de I raza BON.
También es importante destacar que al continuar con el análisis y asignar los
individuos a 6 clusters para determinar si existe subdivisión en las
poblaciones
ó
mezcla
diferenciándose de AZ
de
individuos
se observó que BG'
conünuó
y BH mostrándose más homogéneo. En el cluster
la subpoblación
c-uatro (K=4) se agruparon principalmente los individuos de
(45.E%l y la subpoblación BH (44Yo) que se conservaron en el m¡smo
AZ
c|uster,mientrasqueAZyBHdividieron|amayoríadesusindividuosen|os
otros posibles cluster (AZ 54.2
o/o
y BH 56%)'
(84'9%) se ubicó en un sólo
Por otro lado, la mayoría de los animales de JP
los tres anteriores' Estos r€sultados no son
dusts (K5)
dist¡nto
de
población del JP proviene de una
sorprendentes s¡ tenemos en cuenta que la
más heterogéneo'
región geografica diferente, pero tiene un origen
Considerandoqueenestetipodeestudim,loserroresdemuestreopueden
destacar que en este
alterar sustancialmente los resuhados' es importante
tipo' dada la similitud entre los
caso son muy ¡mprobables los enores de este
toma de la muestra' puesto que
tamaños de muestra y la metodología en la
140
los animales han sido extraídos totalmente al azar de
poblaciones
comerciales de animales de la raza BON.
En eete trabajo, se ha podido comprobar la diferenciación genáica exist'ente
raza criolla Blanco orejinegro BON de una
población de referencia que en este caso fue la ¡aza cebú. Dentro de las
entre subpoblaciones de
la
poblaciones de la misma raza criolla, los resultados coinciden en determinar
que la mayor distancia se encontró entre la subpoblación de la UDEA y es la
subpoblación de cA. Lo cual puede explicarse por el hecho de que estos dos
grupos no habrían intercambiado individuos' y el hato UDEA podría haber
teni&inf,uenciadedibrentespob|acionescomoBHen|osañosrecientega
genéticas
diferencia del grupo cA. También los valores de las distancias
coinciden
en mostrar que la
diferenc¡a entre las poblaciones
de Blanco
ofei¡fl€groBoN,ess¡milara|aexistenteentreotrasrazascrio|las'queson
razasbiendefinidasyreconocidasdesdehacemuchot¡empo.Estare|ación
que' tienen
es lógica si tenemos en cuenta el proceso histórico' ya
pÉdicamente el mismo origen genético y han permanecido en condiciones
de las
climátbas similares durante más de 500 años' Los resultados
estudiadas y que también
distancias genéticas entre las poblaciones de BON
confirman mediant'e el
se observan gráficamente en los dendogramas' se
AnátisisFadoria|deCorrespondenciasMú|tip|es,quehadiferenciadoa|os
la raza BON en grupos muy bien
animales de las poblaciones de an¡males de
definidos.
el
de los individuos a los clusters definidos' mediante
genética entre las
programa Structure, ha confirmado la diferenciación
La
asignaciÓn
permite reconocer que los individuos
subpoblaciones de BON, pero además
También queda claro'
se separan en 3 grupos separados y homogéneos'
quecuandoseagumeunmayornumeK,degrupos(K=6)|aspob|acionesc|e
genéticamente más homogénea que
poblacional
entidad
una
y
son
BH
AZ
h
entre estas dos subpoblaciones se
las otras. La relaciÓn general existente
t4t
puede explicar por el cercano origen genético de BH y la hacienda Az, pues
ambas subpoblaciones pertenecen a un mismo núcleo familiar'
Los resultados del presente trabajo indican que la variabilidad genética
presente en las subpoblaciones de animales de la raza BON es alta, es por
estoqueesnecesariomantener|acomounapob|acióngenea|ógicamente
cerada a efectos de no perder la combinación de genes que se ha logrado
propone
por medio de la selección realizada por los productores' Por ello se
aAsocrio||omantenerregistrosgenea|ógicosdeestaspob|acionesae€ctos
deasegurar|aconservaciónde|amayordiversidadgenéticadentrode|a
taza.
142
8.
.
CONCTUSIONES
Los resultados del presente trabajo han mostrado un alto polimorfismo
presente
en todos los
marcadores genéticos evaluados
en
las
subpoblaciones de BON lo cual nos indica la alta variabilidad presente en
esta raza y nos da la posibilidad del desanollo de programas de
mejoramientogenético,conelfindemejorarelcomportamiento
productivo de esta raza.
oL¿sfrecuenciasalélicasen|assubpob|acionesestudiadasfueron
heterogéneasencontrándoseva|oresmayoresen|asubpob|aciónde|a
UDEA,asímismo,elvalormasaltodepolimorfismoseencontroenel
las
marcador ETH1O, quien presentó 22 alelos d¡brentes en todas
presentada
subpoblaciones, estos resultados junto con la alta variación
utilizados
en los pares de marcadores, nos indican que estos marcadores
sonadecuadosparaestudiosdecontro|defi|iaciónycaracterización
genáúba de esta raza'
.
heterocigotos
Los valores de Fis encontrados muestran un exceso de
marcadores lNM005'
@ntro de las subpoblaciones de BON para los
SPS115 fGlA122, TGLA126' TGL\A2T' ETH3
v un déficit de
además los indices
heteroc¡gotos en el resto de marcadores evaluados'
deconsanguinidadpresentaronva|oresintermediossiendocríticospara
de desanollar
a$unas subpoblaciones, lo que indica la necesidad
y evitar
de gestión genética para el control de la endogamia
estrategias
productivas'
así los eúeclos deletéreos sobre las características
oTodas|assubpob|acionesmostraronungrandistanciamientogenético
entree|las'mostrandoqueestascompartenpocosa|elosysus
Exceptuando a las poblaciones de
frecuencias han sido muy diferentes'
143
AZ, BH, UDEA, Unal med, EP y LE quienes presentan una gran cercanía
genética entre si.
Las medidas de distancia genética nos indican que existen grupos
claramente diferenciados los cuales se agrupan posiblemente por su
para |a
origen genético, esta información permite tener una herramienta
sebcción de animales por su similaridad genáica y para el planeamiento
de los apareamientos buscando mínima consanguinidad'
El análisis de la estruc{ura de la población' incluyo la raza cebú como
pureza racial del bon'
control extemo y los resultados dan evidencia de la
que
nlnguna de las poblaciones estudiadas se observo
dado
en
introgresión de
la
raza cebú. Todos estos resultados en conjunto nos
criolla colombiana Blanco oreiinegro presenta
irxlban que la raza
variabi|idadgenéticasuficiente,unaestructurapob|aciona|definiday
procesos oe
dado su censo poblacional puede ser objeto de
rnci:rám¡ento genético.
144
9.
RECOMEDACIONES
Hasla el presente se ha considerado a la población de animales de la raza
BON como una población única, con características genéticas similares' Los
resultados del presente trabajo indican que ésta hipótesis solo se confirma
medhnte los indicadores de variabilidad genética (Número medio de alelos
por marcador y heterocigocidad), que han mostrado entre las poblaciones
resultados similares, y la población BG mostró mayor variabilidad genética.
Es evidente que el origen del criollo Blanco orejinegro, su aislam¡ento
regodrctivo,y|apermanenciadurantemásdeveintegenerac¡onesenun
razas de
clima variado favoreció la d¡ferenciación genética respecto de otras
Bovino Criollo y que es una población que no ha sido objeto de cruzamiento
c introgrcsión Por la raza Cebú.
una
Si bien es difícil en esta instancia, clasificar a la población de BON como
teniendo
variedad dentro de las razas criollas ó como una raza independiente
actuales'
en cuenta las diferencias encontradas y los criterios intemacionales
mantenga como una pobbción
que
BON
es
r¡ecesario
el
se
genea|ógicamentecerradaaefec{osdenoperder|acombinacióndegenes
propone a la
que se ha logrado por medio de la selección natural Por ello' se
AsocirciónCo|ombianadeCriadoresdeGanadoBovinoCrio||o,mantener
poblaciones a efectos de
registros genealógicos separados para ambas
genética posible dentro cle
asegurar la conservación de la mayor diversidad
entre
la raza, lo cual no significa que no puedan realizarse apareamientos
grupos.
genética de las
Este estudio contribuye al conocimiento de la estructura
para el diseño
poblaciones de ésta raza y constituye una valiosa herramienta
La inbrmación
de planes de conseryación y repoblamiento de ésta'
en futuros programas de
encontrada en esta raza, puede ser incluida
ya que además de la evaluación genéüca'
selección y meioram¡ento animal'
que tan diversos son los
la inlormación molecular permiie establecer
145
individuos que se emplearan como reproductores y de este modo se asegura
que se transmita dicha variabilidad a la siguiente generación. Es importante
que las poblaciones mantengan una variabilidad genética para que no se
pierdan alelos que puedan contribuir al mejoramiento genético de las mismas
a futuro.
De igual forma, la identificación de genética de los individuos, permiiirá el
y
fortalecimiento de los registros genealógicos y pruebas de paternidad, se
que
@nv¡erte en una información clave para la creación de bases de datos
seÉn la solución a problemas como el abigeato y la falta de trazabilidad en
las
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t79
Ir.ANEXOS
Anexo
I
Electrofo¡esis en Gel de Agarooa
Prepanación de la base para el gel
l).
Colocar la cama base en el soporte de nivelación que sella los extremos
de la cama base y ajustar con la llave correspond¡ente.
2). Nivelar la base principal utilizando el nivel y los tornillos de nivelación a
los extremos de la base principal.
Pepa¡ación de la solución de agarosa
Los geles están compuestos generalmente por 1% de agarosa en 1X de
TAE. En este procedimiento el polvo de agarosa se ad¡ciona al buffer del gel
en una con@ntración de 1X y se calienta hasta el punto de ebullición durante
1 m¡nuto. Se debe asegurar que todas las partículas de agarosa se disuelvan
completamente.
Posteriormente
la solución se deja enfriar aproximadamente hasta 60'C,
luego se adiciona el reac'tivo de tinción de ADN (en este caso SYBR). Agitar
hasta que se diluya el reac'tivo de tinción.
Llenado de la cámara base
l).
El gel de agarosa se sirve en estado líquido en la úmara, e
inmediatamente se le coloca las respectivas peinetas que forman los pozos
para luego sembrar las diferentes muestras a evaluar.
180
2). Después de servir el gel se deja solidificar durante 20 minutos, luego de lo
cual, se retiran las peinetas y se adiciona el buffer TAE 1X en la cámara
hasta qrbrir completamente el gel'
3). Mezclar las muestras con buffer de carga 6X (aproximadamente 2ul de
bufier por cada 10ul de muestra) y servir en los pozos conespondientes'
4). Tapar cuidadosamente la cámara, asegurándose de que tenga suficiente
una fuente
buffer que cubra el gel y poster¡ormente conectar los electrodos a
y positivo (rojo)'
de poder en el sitio conespondiente negativo (negro)
que Ia
y
5). Aplicar el voltaje necesario (80 voltios comúnmente) asegurarse
corrienteestepasandoatravésde|ge|mediante|aformacióndeburbujasen
el buffer.
181
Anexo 2 Marcadores moleculares tipo microsatélites
Solinas- Toldo Y col. (1993)
Steffen
21A
ñ
y col. (1993)
Bishopycol.(1994)
Bishop
y col. (1994)
Vaiman Y col. (1994)
i3i--Sol¡nas
ffi
Toldo
Y
col 1993
vaiman D., et al.
(1
Georges, et al. (1
iñGeorges,
et al. (1992).
, S.S. et al. (1
M. et al. (1
M
r82
Detal
(1994)
Secuencias marcadores moleculareg tipo microsatélites
CCT CCA GCC CAC TTT CTC TTC TC
ACA TC'A CAG CCA GCT GCT ACT
B¡ll6'lE
BütE2'
AGT
Gcr rrc AAG GTc cAT Gc
o\T Tcr ccA Acr ccr rcc
rrc
CTTCCTGAGAGMGCAACACC
,NRA063
tut{ cci\ cAG Aoo TGc rrc
GAA
c
CTTCAGGCATACCCTACACC
ACTCTGCCTGTGGCCAAGTAGG
CTTCCTGAGAGMGCMCACC
ATCTTCACATGATATTACAGCAGA
AACGAGTGTCCTAGf TTGGCTGTG
TGI-A126
fclá12?
.NRAo23
TTGGTcrcrATTcrcrGMTATTcc
AAT.A.ATGG.AAATAAGTA.ATA.
TM.TA.AGGGTGfiAGATGM.T.
183
Anexo 3 Condiciones de PCR mix microsatélites
Condiciones de Termociclador Para la Mix de microsatélites
2. 35 ciclos de: 95oC'tls
3. 7?C' G0 minutos
4. 4'C' hÍ¡nito
seg,
61'C'
90 seg'
7?C'
90 3eg'
Anrxo 4 Condiciones de PCR
de Hzo varía con cada par
Nota: La concentrac¡ón final de Mgclz y cantidad
de la PCR'
de iniciadores de acuerdo a la estandarización
184
Anexo 5 Preparación de la Poliacrilamida
l.
Preparación Solución Stock Acrilamida- bis acrilamida ¡f0%
2. Preparación Solución de trabajo Acrilamida'bis acrilamida
7olo
Condiciones Denaturantes
6%
3. Solución para Polimerización Acrilamida- bis acrilamida
deneü¡|anto
de amon¡o
Almacenar a 4'C, en condiciones de oscuridad'
185
Anexo 6 Cámara de Electroforesis Vertical
l)
Preparación del vidrio
a)
Laver cada lado del vidrio con esponjilla y jaMn en sentido vertical y
trorizontal y enjuagar. Repeür 2 veces-
b)Hacertres|impiezasconetano|a|7|o/oyservi||etapor|acarade|
vidrio que se va a utilizar.
c) Agrcgar la solución de pegante (3pl de Bind Silane (Sigma)' 5pl de
ácido aético glacial y 100Opl de etanol 95o/o) y esparcirla
y
uniformemente en el vidrio con una serv¡lleta en sentido vertical
horizontal de manera ÉPida'
d) Agregar
1 ml de etanol al 90% y ret¡rar el exceso de pegante con una
servilleta en sentido vertical y horizontal'
e)
Repetir el Paso d.
2) Limpieza
de la cubeta
limpia con etanol al
La cámara de secuenciación (Sequi-Gen cell 21x50) se
spray, se deja
70%, 3 veces en varias direcciones, luego se agrega silicona
secar por 10 minutos.
3) Armado de le cámara
la cubeta'
a) Ubicar los separadores en los extremos laterales de
(figura 2)'
Colocar el v¡dr¡o con la cara tratada sobre la cub€ta
en su sitio
Teniendo en cuenta que los separadores permanezcan
entre los vidrios'
186
b)
Colocar los párales lateralmente que ajusten los dos vidrios
intermedios, asegurándose que alineen con los vidrios y los
separadores en la parte inferior de la cámara (figura 3).
c) Asegurar los párales con la palanca (figura 1) empujándola hacia la
cámara.
d) colocar el extremo del peine diente de tiburón con los dientes hacia
(formar el frente de conido) en uno de los extremos de la
aniba
cámara.
e) sellar la parte inferior de la cámara con las base de
precisión
correspondientea|aémarayasegurarcon|a||aves|atera|es(Figura
4)
4) Llcnado de la cámara
a)Nive|ar|acámaraenformahorizonta|uti|izandounn¡ve|deagua.
jeringa (figura 5)
b) Preparar la poliacrilamida y cárguela en una
en el
inmediatamente después inserte la manguera con el adaptador
orificio infurior de la base de precisión'
c)
Dispense lentamente pero constante
la
poliacrilamida' hasta que
observee|||enadocomp|etoyuniformedelacámara(figura6)'
d)|nt¡oducire|re3tode|peinecon|osorificiosmediosfrentea|bordede|
vidriohasta|amitad,paraformare|frentedecorrido(figura7)'
e)
f)
la base de precisión'
y
Dejar polimerizar el tiempo necesario retirar
la cámara sobre esta'
y
Nivelar la base con un nivel de agua colocar
y la
g) Llanar la cámara (cubeta) con buffer de conido TBE 1X
aoroximadamente 2/3 del volumen'
187
base
Figura
I
Figura 2
Llaves laterales
de la base dE
precisión
;l
Figura 4
Figura 3
Figura 5
P€in€ entr€ le
cubeta y el
vidrio
Figura 7
Figura 6
188
Anexo 7 Tinción con Nitrato de Plata y revelado con Hidróxido de Sodio
para gelee de Poliacrilamida
1), Desarmar la cámara y separar suavemente la cámara del vidrio usando
dos espátulas.
2). Colocar el vidrio con el gel adherido en una bandeja de tinción.
3). Verter 500m1 de la solución de fiiación (2-5ml de ácido acético al 0.5%'
50ml de etanol al llo/o y 447.5m1de agua) y mantener en agitación durante 6
minutos.
4). Ret¡rar el vidrio de la solución de fijación y adicionar 500m1 de la solución
de tinción (tomar 140m1 del stock el cual contiene 109 de nitrato de plata en
lOOOml y completarlo con agua desionizada hasta obtener un volumen final
de 700m1) y dejarlo en agitación por 15 m¡nutos.
5). Retirar de la solución de tinción (esta solución se puede reutilizar hasta
tres veces) y lavar el gel dos veces con agua destilada'
6).Adicionar500m|de|aso|uciónderevelado(7.5gdeHidróxidodeSodio'
75q.ll de formaldehido al 0.15% y completiar con agua destilada a 500m1 de
por 20 minutos.
volumen final) preparada previamente y agitarlo suavemente
en el gel.
En esta etapa de la tinción las bandas irán apareciendo levemente
189
Anexo 8 Etectroforeeis capilar en secuenciador automático ABI 310
City' CA UsA)'
Figur! a ABI 3lO (APplicd B¡oryltdm'P'ddn Elm'r' Fo'tlr
capilar
Anexo 9 Preparación de las muestns Para la Electroforesis
para la electroforesis' se procede a
Nota: Luego de preparar las muestras
5 minutos' seguido de un shock
denaturar las muestras a 95oC durante
previamente al montaje de las muestras
térmico en h¡elo durante 5 minutos'
en el equ¡Po ABI 310.
190
Anexo l0 Frecuencias alélicas en todas las subpoblaciones de animales
dela¡aza BON para cada microeatélite'
BM1818
9,23
ffi
ffipo
35,71
23,08
11,11
7,14
3,8s 7,14
ffi-3oF--?Z€o--¿o¡t u,2e 72,22 33'33
191
BM 1824
3o,oo
ffi,36
26,47 38,89
17,65 11,11 5o,oo
@,57
33,33
11,11
178 15,00
15,
zÁz a,az 20,m 33,33
f55-58---tz,os 16,67 lo,oo 16,67
gm
5,56 5,00
5,00 35,71
29,41
BM 2113
@
sa 27'78 5'00
t,t¿ u,tt 16,67 45'
tz'es
11'11
5'56 15'00
5,56 10'
ffi¿,tt
r
ejt-1o,oo 7,14 8'
192
5,56
ETH IO
7
7J4
,14 7 ,14 6,25 5,
5'56
,71 17,f36
41'
',to,71 6,25 16,67
4,
se'sz 25,00 33'33 20'
25,00
193
11'11
8'33
ETH225
37.50 14,29 14,29
27,78
39,29 16,67 27'78
ffi]t
,86
:ffi
194
8'
22,22 22'22 33'33
2.,2 3€,89 25'w
ETH 3
8,82
@
5,56
10,
5,88 16,67
tz,es $,33
60'
00 7,14 5,88
13,64
5,00
lffi--z¡¿
195
INRA 023
ffi2o,oo
16,57
10,00
12,50 7,14
12,50 7'14
10,
12,s
8,33
ffi
2n
16.67 7,t4
100,00
10,
t96
7,14
1o'oo
sPs
ffi50
115
75,00 so,oo 26,67 57,14 16,67
12,50 16,67 6,67 21,43 6,67
7.ffi -77.78
---O@
25,00
10,00
TGLA122
,re n,50 27'7A
,33 7,14 3,57
s'oo 43'75 38'89
ffitt'zs
11'
t97
TGLA 126
,14
1q75
30,00
10,00 5,56 21,43 18,75
25,OO 27'78
iJ5-'-875--37F 30,00 tt0,00 33,33 21,43 4,38 37,50 22'22
u,zg 6,25
@
6,25
7,14 6,25
12,50
s0.00 20,00 38,89 28,57 25,00
12,50
11,11
TGLA227
m
47,06 37,50
ze,4
ffi
198
4o,oo
6,25
5,oo
TGLA 53
5,56
tso 37.50 38.89
6,25 8,33 3,13
25.@ 6,67 18,7s 12,50
18,
00 50,00 8,33 ¿13,75 37,50
INRA 063
3,85
199
1',|,11 15'
INRA
OO5
14,29
l3'f
7.14
40.00
14,29
35
14,29
12,50
28,57
66,67 50,00
14,29
33,33
14,29
,14
200
ll
Valores de Contenido de información polimórfica (Pic) para
cada miclwatéliúe en las subpoblacione de animales de la raza BON
Anexo
BM
1818 0,40 0,55
ffi68
0,
o.an o.52 0,40 0,62
o'z¿ 0,74 0'65 0'69
0,84 0,66 0,83 o'77 o'
0,77 0,73 0,71
ts 0,76 0,67 0'75
ooo o,zg o,82 0,72
0,81
o.24 0j9 0,37 0,60
o,ss 0,48 0,60 0,60
0,69
@
o,z¿ o,72
o,7o
o,7'l 0,79
0,52
o'zo
0,35 0,60 0,74
o,7o 0'64 o'70
ffi8
201
0'81
0'
o'77
0'61
o'
Anexo 12 Valores de heterocigocidad esperada y observada (He y Ho)
para cada micrcatélite en las subpoblaciones de BON y Cebú
0,59
ffi
0,¿16 0,73
0,40 0'62
0'60
o'72 0'78
0'83
0,84
o,71 0,76 0,56
@o,ez
ffi,go
o,77
0'
0'81 0'78
'oo 0'42
0'76
@o'ea
6iT-w7
o,aa 0,75
81 0,75 0,59
o'
o,44
202
0'60
o'az 0'91
o:
1'00 0'86
0'
2 0'66
0'43
0'
0'
o'
o:
0'36
ñ-dE
@
ffio,se
o,es o,so o,so 0,67 0,86 0,88 0,88
0.82 0,87 0,69 0,82
1,oo 1,oo 0,88
ó.oo-o,sg
o,77 0,86
0,38 0,88
o'
0,
o'70
0,60
o,25
o'oo 0,70
0,23 0,22 0'60
0'
óss o,7o 0,84
0'66
030 0.25 0,00
0'55
0645 0696
0'
st 056 0674 0'
203
Anexo 13 Preparación de Soluciones
Extracción de ADN
1. Solución de Sucrosa Tritón
¡lrO
Completar a 1000m1
2. Soluclón Buffer Salino Foafato (PBS) 1X
(SDS) r0%
3. Soluciiln de Sodio Dodecil Sulfato
5s-
1oos
-trzo-ocomPletaraloooml
5.
Solución Prcúeinasa K 20 ¡tg/¡tl
204
6.
Solución de Acetato do Sodio
--r'/64
7.
3tl
Completar alOml con H2O
so¡uciltn TRIS. Cl 0.5t pH 8.0
TrÉ.
el
19.709
--T-
25oml
7. Solución Buffer de Extracción de Semen
A pH 8.0 (0.
8.
Solución Chelex 20%
Chelex
20%
Zo
g
F;ó----@tEÉr a loo ml
20s
Geles de agarosa
l.
Buffer TAE 50X
2. Bufrer de carga 6X
Geles de Poliacrilamida
L Buffer
TBE lOX
206
2. EDTA 0.5M (pH: 8.0)
lg
1000rnl
0.5M
Ammio
2.59
3. Persulfato de Amonio
Persulfato de
ttrO
Completar a 10ml
Reac'tivos para la amplificación de ADN por PGR
Solución buffer nonident
Solución de trabaio
)
20'l
(100mM)
12'

marcadores molecuiares tipo microsatelites andres pedraza llinas

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