Caracterización de la resistencia a germicidas en cepas de Listeria

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Caracterización de la resistencia a germicidas en cepas de Listeria
RESUMEN
En la industria de alimentos una de las medidas para controlar la presencia de
microorganismos patógenos como Listeria monocytogenes es la desinfección
química de equipo y superficies, y alimentos que son consumidos crudos. En
un trabajo previo se aislaron cepas de L. monocytogenes en una fábrica que
procesa espinaca precocida y congelada; estas cepas mostraron mayor
resistencia a cloro y ácido peracético comparadas con las de colección.
Actualmente los mecanismos de adaptación bacteriana a estrés químico han
sido poco estudiados. El objetivo de este trabajo fue caracterizar
fenotipicamente la resistencia a germicidas en cepas de L. monocytogenes
aisladas de un proceso de producción de espinaca precocida y congelada.
Empleando cinco cepas de L. monocytogenes aisladas de un proceso de
producción de espinaca (denominadas L15, L18, F6, L26, L75) y cinco cepas
de colección (Scott A, 101-M, V7, LCDC, 101-14) se evaluó su resistencia a
hipoclorito de sodio (200 ppm) y ác. peracético (80 ppm). Cuadros de
espinacas (5 x 5 cm) se inocularon (~8 log UFC/espinaca), se sometieron a
secado y se expusieron a los germicidas (5 min.). Se seleccionaron las cepas
que mostraron mayor y menor reducción en la población bacteriana. Para
determinar la máxima concentración de cloro que pudiera tolerar la cepa más
resistente, se realizaron exposiciones en buffer de fosfatos adicionado de
hipoclorito de sodio a diferentes concentraciones (10, 20 y 40 ppm) durante 30,
60 y 90 segundos. Las células sobrevivientes fueron expuestas nuevamente a
cloro; este procedimiento se repitió cada tercer día en cinco ocasiones. La
inducción de la resistencia a cloro se investigó de manera similar en espinacas
(200 ppm/ 5 min.), láminas de acero inoxidable y N-rubber (20 ppm/ 1 min).
Para conocer la resistencia de las cepas seleccionadas a hipoclorito de sodio a
bajas concentraciones (~1.5 ppm, preparado en medio Evans) se indujo la
adaptación mediante la exposición de éstas al germicida durante 150 min. a 22
y 30°C. Al final del almacenamiento se investigó la presencia de ADN
plasmídico (metodología de lisis alcalina) en las células de L. monocytogenes y
se hicieron preparaciones para observar mediante microscopia electrónica de
transmisión el daño ocasionado a las células por efecto del germicida. La cepa
L15 fue la más resistente y la Scott A la más sensible, mostrando reducciones
de 1 y 2 log UFC/espinaca, respectivamente. La exposición consecutiva de
células de L. monocytogenes (cepa L15) a concentraciones subletales de cloro
en suspensión o materiales inertes, no mostró una tendencia clara que haga
suponer un incremento en la resistencia. La cepa L15 expuesta a cloro en
medio Evans redujo 5.86 y 3.70 log UFC/ml, después de la incubación a 22 y
30ºC, respectivamente En contraste, la cepa de referencia Scott A mostró
reducciones mayores de 7.95 y 7.45 log UFC/ml a 22 y 30°C, respectivamente;
la cepa L15 (P<0.05) es significativamente más resistente a cloro (~1.50 ppm)
comparada con la cepa Scott A. En ambas cepas no se detectó la presencia de
ADN plásmidico. Las micrografías electrónicas de transmisión mostraron daños
en la membrana y en el citoplasma de las células expuestas a cloro a partir de
los 20 min. de exposición. La cepa L15 aislada de la fábrica en donde
teóricamente estuvo expuesta a concentraciones subletales de hipoclorito de
sodio, mostró mayor capacidad de adaptación al germicida que Scott A. Esta
resistencia pudiera estar regulada a nivel transcripcional o cromosómico, o bien
estar relacionada con la formación de biopelículas.
(Palabras clave: cloro, estrés subletal, espinaca, Listeria monocytogenes)
i
SUMMARY
In food industry one of the measures to control the presence of foodborne
pathogens such as Listeria monocytogenes is the chemical disinfection of
equipment, surfaces and food items that are eaten raw. In a previous study,
strains of L. monocytogenes were isolated from the production process of precooked frozen spinach; these strains showed resistance to chlorine and
peracetic acid. Currently the mechanisms of bacterial adaptation to chemical
stress are poorly understood. The aim of this study was to phenotypic
characterize the resistance to germicides in strains of L. monocytogenes
isolated from the production process of pre-cooked frozen spinach. Five strains
of L. monocytogenes isolated from spinach production process (L15, L18, F6,
L26, L75) and five strains from culture collection (Scott A, 101-M, V7, LCDC,
101-14) were used to evaluate the resistance to sodium hypochlorite (200 ppm)
and peracetic acid (80 ppm). Spinach squares (5 x 5 cm) inoculated with the
strains (~ 8 log CFU / spinach) were dried and then subjected to disinfection
treatments (5 min). Strains that showed the highest and lowest reduction in the
bacterial population were selected. To determine the maximum concentration of
chlorine that the most resistant strain could tolerate, the culture were incubated
in phosphate buffer added with sodium hypochlorite at different concentrations
(10, 20, and 40 ppm) during 30, 60, and 90 seconds. Surviving cells were
recovered, then exposed again to the germicide; this procedure was repeated
five times. Similarly, the resistance induction to chlorine was investigated in
spinach (200 ppm / 5 min), stainless steel and N-rubber (20 ppm / 1 min). To
determine the resistance of selected strains to sodium hypochlorite at low
concentrations (~ 1.5 ppm prepared in Evans broth) the cells were exposed to
the germicide for 150 min at 22 and 30°C. At the end of the incubation time the
presence of plasmidic DNA in the cells was investigated. Samples were also
prepared for observation by transmission electron microscopy to determinate
the damage in the cells exposed to the germicide. The L15 strain was the most
resistant and Scott A most sensitive, showing reductions of 1 and 2 log CFU /
spinach, respectively. Consecutive exposure of L. monocytogenes cells to
sublethal concentrations of chlorine in suspension or inert materials, did not
show a clear tendency to assume a resistance increase to chorine. The L15
strain exposed to chlorine in Evans broth reduce 5.86 and 3.70 log CFU / ml at
22 and 30°C, respectively. In contrast, the strain Scott A showed greater
reductions of 7.95 and 7.45 log CFU / ml at 22 and 30°C, respectively; L15
strain (P < 0.05) is significantly more resistant to chlorine (~ 1.50 ppm)
compared with strain Scott A. In both strains the presence of plasmidic DNA
was not found. The transmission electron micrographs showed damage on the
membrane and into the cytoplasm of cells exposed to chlorine after 20 min. The
L15 strain isolated from the factory was in theory exposed to sublethal
concentrations of sodium hypochlorite this fact induced their adaptation to
chorine. This resistance could be regulated at transcriptional level or
chromosome, or be associated with biofilm formation.
(Keywords: chlorine, sublethal stress, spinach, Listeria monocytogenes)
ii
Dedicado para la persona más importante en mi vida mi madre por
su amor incondicional el cual estoy segura continúa conmigo y es
infinito.
A mi padre y mi hermana por su amor, apoyo incondicional y
paciencia.
A las personas que me han enseñado que ser feliz es vivir la
serenidad que me da saber que estoy en el camino correcto hacia
algo que tiene sentido para mí.
iii
AGRADECIMIENTOS
Al Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología por el apoyo brindado para la
realización de los estudios de posgrado.
A la Universidad Autónoma de Querétaro y al Programa de Posgrado en
Alimentos del Centro de la República.
A los profesores y al personal del DIPA.
A la Universidad Nacional Autónoma de México por el apoyo para llevar a cabo
los estudios de microscopia electrónica de barrido y transmisión. En especial al
Biólogo Armando Zepeda (Laboratorio de Microscopia Electrónica Facultad de
Medicina) y a la I. B. Ma. de Lourdes Palma Tirado (Instituto de Neurobiología
Campus Juriquilla) por su asesoría y apoyo en el procesamiento de las
muestras.
A la Dra. Montserrat por su apoyo pero sobre todo por su tiempo, conocimiento,
paciencia pero sobre todo por darme la oportunidad de compartir está
experiencia.
A Dr. Eduardo Fernández Escartín, Dra. Sofía Ma. Arvizú Medrano, Dr.
Leopoldo Orozco Ramírez, Dr. Sergio de Jesús Romero Gómez y Dr. Luis
Miguel Salgado por su asesoría para llevar a cabo este trabajo.
A Meyli, Miguel, Fernando, Brenda Luz, Sra. Martha y Erika por su apoyo
cuando más lo necesite.
A todas las personas que me brindaron algún consejo o apoyo para lograr la
realización de este proyecto.
iv
ÍNDICE
Página
Resumen
i
Summary
ii
Dedicatoria
iii
Agradecimientos
iv
Índice
v
Índice de cuadros
ix
Índice de figuras
x
I. Introducción
1
II. Antecedentes
3
2.1 Microbiología de frutas y verduras
3
2.2 Enfermedades asociadas al consumo de frutas y verduras
4
2.2.1 Listeria monocytogenes
7
2.2.1.1 Listeriosis
9
2.3 Tratamientos de desinfección química aplicados a frutas y verduras 10
2.3.1 Cloro
11
2.3.2 Ácido peracético
12
2.4 Estrés bacteriano
13
2.4.1 Mecanismos de resistencia bacteriana a varios tipos de estrés
14
2.4.1.1 Resistencia innata
14
2.4.1.2 Resistencia adquirida
15
2.5 Detección de genes involucrados en la respuesta bacteriana a
condiciones de estrés
2.5.1 Proteínas expresadas por las bacterias en condiciones de
estrés
v
16
16
2.6 Adaptación de L. monocytogenes a condiciones de estrés
17
2.7 Formación de biopelículas
18
2.7.1 Etapas en la formación de biopelículas
19
2.7.2 Capacidad de L. monocytogenes para formar biopelículas
20
2.8 Espinaca
21
2.8.1 Espinaca precocida y congelada
2.9 Planteamiento del problema
21
23
III. Objetivos
25
3.1 Objetivo general
25
3.2 Objetivos específicos
25
IV. Materiales y Métodos
26
4.1 Material biológico
26
4.2 Selección de cepas de L. monocytogenes resistentes
y sensibles a hipoclorito de sodio y ácido peracético
26
4.2.1 Preparación del inóculo
26
4.2.2 Inoculación de cuadros de espinaca
27
4.2.3 Preparación de las soluciones desinfectantes
27
4.2.4 Aplicación de los tratamientos de desinfección
27
4.2.5 Recuento de microorganismos sobrevivientes a los
tratamientos de desinfección
28
4.2.6 Análisis estadístico
28
4.3 Inducción de la resistencia a cloro en cepas de L. monocytogenes
seleccionadas
4.3.1 Exposición consecutiva de las células de la cepa
L15 a cloro en suspensión (buffer de fosfatos)
30
30
4.3.2 Exposición consecutiva a cloro de células de L. monocytogenes
inoculadas en la superficie de espinaca, acero inoxidable y Nrubber
30
vi
4.3.2.1 Comportamiento de células de L. monocytogenes en
CST expuestas consecutivamente a cloro
4.3.3 Exposición de las células de L. monocytogenes a bajas
concentraciones de cloro durante tiempos prolongados
31
32
4.3.3.1 Preparación del inóculo
32
4.3.3.2 Preparación de medio Evans modificado
32
4.3.3.3 Comportamiento de L. monocytogenes en medio
Evans modificado
33
4.3.3.4 Exposición de células de L. monocytogenes a cloro en
medio Evans modificado
33
4.3.3.5 Detección de ADN plasmídico en las cepas
seleccionadas
34
4.3.3.6 Observación de células de L. monocytogenes
expuestas a cloro mediante el microscopio
electrónico de transmisión
35
4.4 Evaluación de la capacidad de las cepas de L. monocytogenes
seleccionadas para producir biopelículas en acero inoxidable y
polipropileno
36
4.4.1 Preparación del inóculo
36
4.4.2 Preparación de los materiales inertes
36
4.4.3 Inoculación del medio Evans modificado
36
4.4.4 Inducción de la formación de biopelículas
36
4.4.5 Observación de la superficie de los materiales inertes
mediante microscopio electrónico de barrido
37
V. Resultados y Discusión
38
5.1 Selección de cepas de L. monocytogenes resistentes y sensibles a cloro
y ácido peracético
38
5.2 Exposición consecutiva de las células de la cepa L15 a cloro en
suspensión (buffer de fosfatos)
44
5.2.1 Exposición consecutiva a cloro en células de
L. monocytogenes inoculadas en la superficie de espinaca,
acero inoxidable y N-rubber
46
vii
5.2.2 Comportamiento de células de L. monocytogenes en CST
expuestas consecutivamente a cloro
47
5.3 Comportamiento de L. monocytogenes en medio Evans modificado
48
5.3.1 Exposición de células de L. monocytogenes a cloro en medio
Evans modificado
49
5.3.2 Detección de ADN plasmídico en las cepas seleccionadas
53
5.3.3 Cambios en la estructura celular de L. monocytogenes expuestas a
cloro
54
5.4 Inducción de la formación de biopelículas
57
VI. Conclusiones
65
VII. Bibliografía
66
VIII. Anexo
85
viii
ÍNDICE DE CUADROS
Cuadro
Página
1. Microorganismos patógenos que pueden ser transmitidos por el
consumo de alimentos
4
2. Microorganismos patógenos implicados en brotes por el consumo
de frutas y verduras EE.UU., 2001.
6
3. Incidencia de L. monocytogenes en alimentos.
4. Composición del medio Evans modificado.
8
32
5. Valores F y significancia estadística en el análisis de varianza para
los factores y su interación.
42
6. Reducción de la cepa L15 en soluciones de cloro a
diferentes concentraciones y tiempos de contacto.
45
7. Reducción en la población de L. monocytogenes en materiales
inertes y espinaca por efecto de la exposición consecutiva a cloro.
46
8. Células de las cepas Scott A y L15 sobrevivientes a la exposición
a cloro.
51
9. Valores F y significancia estadística para los factores y su interacción.
51
10. Prueba de Tukey de las reducciones obtenidas con las cepas
seleccionadas.
52
ix
ÍNDICE DE FIGURAS
Página
Figura
1. Estado fisiológico de células que han sido sometidas a diferentes
grados y tipos de estrés.
14
2. Producción anual de espinaca en México.
23
3. Evaluación de los tratamientos de desinfección química en espinaca
inoculada con L. monocytogenes.
29
4. Reducción global en las poblaciones de L. monocytogenes en espinaca por
efecto de la desinfección con cloro y ácido peracético
40
5. Reducción global en la población de L. monocytogenes por efecto del
tratamiento con cloro, ácido peracético y agua. Los valores representan la
media de 9 valores ± error estándar.
43
6. Comportamiento de L. monocytogenes en CST a 35ºC.
47
7. Dinámicas de crecimiento de la cepa L15 en medio Evans modificado
a tres diferentes concentraciones.
49
8. Comportamiento de las cepas de L. monocytogenes seleccionadas en
medio Evans modificado adicionado de cloro.
9. ADN de las cepas L15 y Scott A.
50
54
10. Micrografías electrónicas de transmisión (TEM) células de la cepa L15
(~1 x 10 8 UFC/ml); después de la exposición a cloro (~1.50 ppm a 30ºC)
y células que no fueron expuestas a cloro incubadas en CST
(18 h/35ºC)
55
x
11. Micrografías electrónicas de barrido de la superficie de acero inoxidable
incubado a 22ºC en medio Evans inoculado con la cepa L15.
60
12. Micrografías electrónicas de barrido de la superficie de polipropileno
incubado a 22ºC en medio Evans inoculado con la cepa L15.
61
13. Micrografías electrónicas de barrido de la superficie de acero inoxidable
incubado a 22ºC en medio Evans inoculado con la cepa Scott A.
62
14. Micrografías electrónicas de barrido de la superficie de polipropileno
incubado a 22ºC en medio Evans inoculado con la cepa Scott A.
xi
63
I. INTRODUCCIÓN
En la actualidad la demanda de frutas y verduras se ha incrementado,
debido a que la población busca llevar una dieta que aporte los requerimientos
nutricionales que ayuden a reducir el riesgo de enfermar y mantener un buen
estado de salud y bienestar. Las verduras frecuentemente son consumidas sin
recibir un tratamiento térmico que asegure su inocuidad microbiana.
Generalmente antes de ser consumidas sólo se les aplican tratamientos de
desinfección física o química; en nuestros días aun no existe un desinfectante
químico totalmente efectivo. Por tal motivo el consumo de este tipo de
alimentos puede representar un riesgo a la salud del consumidor (Curtis et al.,
2002).
Dentro de los microorganismos patógenos que pueden ser transmitidos
por las hortalizas se encuentra la bacteria Listeria monocytogenes la cual esta
ampliamente distribuida en el ambiente. Se le ha asociado a brotes en donde el
alimento implicado fueron los denominados “listos para el consumo” como
embutidos y quesos, y raramente verduras (Johansson et al., 1999; Miettinen et
al., 1999; Mena et al., 2004). Sin embargo, ha sido aislada de algunas frutas y
hortalizas como tomate, col y lechuga (Schlech et al., 1983; FDA, 2001;
Pingulkar et al., 2001).
En la industria de alimentos una de las medidas para controlar la
presencia de microorganismos patógenos como L. monocytogenes es la
desinfección de equipo, superficies y alimentos (como frutas y hortalizas) con
compuestos químicos. La susceptibilidad que muestran las bacterias a los
germicidas está determinada por el género y la especie. Sin embargo, las
condiciones ambientales previas a las que los microorganismos hallan sido
expuestos tiene efecto en su capacidad para sobrevivir cuando son sometidos
condiciones adversas u agentes estresantes (Sapers, 2001). Se ha especulado
que la resistencia a germicidas puede propiciarse con las exposiciones
continuas con germicidas a concentraciones subletales (To et al., 2002). Sin
embargo, hasta ahora los mecanismos a través de los cuales las bacterias
pueden adquirir resistencia a los compuestos químicos empleados en la
desinfección no han sido completamente caracterizados.
1
Otro factor que puede disminuir la eficiencia de los tratamentos
germicidas es la capacidad de los microorganismos para formar biopelículas,
las cuales son agrupaciones microbianas que se encuentran adheridas a
superficies por medio de una matriz de polisacáridos. Se ha reportado la
capacidad de L. monocytogenes para formar biopelículas en la superficie de
diversos materiales (Jeong y Frank, 1994). Al formar parte de una biopelícula
los microorganismos adquieren protección ante circunstancias adversas con lo
que se incrementa su resistencia a la acción de germicidas químicos (Hood y
Zottola, 1997; Sinde y Carballo, 2000; Chae et al., 2006). Otro posible
mecanismo por el cual las bacterias presentan resistencia frente a germicidas
es la síntesis de proteínas que pueden reparar el daño subletal de las células o
bien neutralizar el efecto germicida. Ambos mecanismos pueden ser
características innatas o adquiridas de cada microorganismo, inducidos e
incrementados por la exposición frecuente a germicidas cuando estos se
encuentran a concentración subletales, situación frecuente en las industrias
que procesan alimentos (Lupi et al., 1995; To et al., 2002; Small et al., 2007).
La caracterización de los mecanismos de resistencia que algunos
microorganismos manifiestan cuando son expuestos a germicidas químicos
generará información que contribuya a diseñar e implementar estrategias
adecuadas con la finalidad de optimizar los tratamientos de desinfección
química existentes (Lupi et al., 1995; Small et al., 2007).
El objetivo de este trabajo fue caracterizar fenotipicamente la
resistencia
a
tratamientos
germicidas
que
presentan
cepas
de
L.
monocytogenes aisladas de una planta procesadora de espinaca precocida y
congelada.
2
II. ANTECEDENTES
2.1 Microbiología de frutas y verduras
El origen, las características físicas y estructurales así como la
composición química de las verduras, son determinantes del contenido
cualitativo y cuantitativo de los microorganismos presentes. Las diferencias
morfológicas en la superficie, así como su diversidad en la composición interna,
proveen una amplia variedad de nichos ecológicos propicios para el desarrollo
de los microorganismos (Beuchat, 2002). La composición de la cubierta externa
de las frutas y verduras, limita la presencia de microorganismos a la parte
externa (Fernández, 2000).
La flora microbiana normal de las frutas y verduras está compuesta
principalmente por microorganismos que se encuentran en la tierra, como
coliformes fecales del género Klebsiella, bacterias deterioradoras, levaduras,
hongos y algas; ocasionalmente se encuentra la presencia de bacterias
patógenas, parásitos y virus capaces de causar enfermedades al hombre y
animales (Madden, 1992; Wilson y Lindow, 1994; Beuchat, 1996; DeRoever,
1998, Fernández, 2000). Estos microorganismos pueden mantenerse viables
con una cantidad mínima de carbohidratos, proteínas, sales inorgánicas que se
disuelven en la superficie por el agua que proviene de la exudación del propio
alimento o del ambiente en el cual se encuentre. El Cuadro 1 muestra algunos
de los microorganismos patógenos que pueden ser transmitidos por el
consumo de alimentos.
3
Cuadro 1. Microorganismos patógenos que pueden ser
transmitidos por el consumo de alimentos
Bacterias
Shigella
Salmonella
Escherichia coli enterohemorrágica y enterotoxigénica
Campylobacter jejuni
L. monocytogenes
Yersinia enterocolitica
Bacillus cereus
Clostridium botulinum
Virus
Parásitos
Giardia lamblia
Cyclospora cayetanensis
Cryptosporidium parvum
Fuente: Beuchat, 1996; Ortega, 1997; DeRoever, 1998;
Sterling et al., 1999.
2.2 Enfermedades asociadas al consumo de frutas y verduras
Asegurar que existan alimentos nutritivos e inocuos ayudará a que la
humanidad sobreviva con una buena calidad de vida. Las investigaciones
actuales indican que la población ha incrementado su interés en consumir
alimentos inocuos, es decir libres de microorganismos patógenos, pesticidas,
plaguicidas u hormonas que pueden afectar su salud (Middlekauff y Shubik,
1989; WHO 1997; Lund et al., 2000).
El control de las ETAs (enfermedades transmitidas por el consumo
alimentos) es complicado debido a la gran cantidad de factores que intervienen,
los alimentos pueden contaminarse desde su origen, de forma directa o
cruzada (Fernández, 2000), una vez contaminados las condiciones en las
4
cuales estos sean manipulados puede favorecer o no el desarrollo o
sobrevivencia de los microorganismos.
El consumo de frutas y verduras frescas ha incrementado, de igual
forma el número de brotes de enfermedades transmitidas por el consumo de
alimentos frescos. Aunque, según reportes del Centro para el Control y
Prevención de Enfermedades de los EE. UU., este incremento también es
atribuido a las mejoras en los sistemas de vigilancia epidemiológica (Bean y
Griffin, 1990; CDC, 1996; Mukherjee et al., 2006).
La exposición a agentes patógenos por el consumo de alimentos, se
traduce en aproximadamente 76 millones de casos, 325,000 hospitalizaciones
y 5000 muertes en EE. UU. cada año (Mead et al., 1999). Pimentel et al. (2001)
reportaron que las pérdidas económicas por ETAs es de apróximadamente 6.5
millones de dólares por año en EE. UU. Las enfermedades transmitidas por
alimentos se incrementaron en un 5.3% en el periodo de 1973 a 1997
(Sivapalasingam et al., 2004).
Las enfermedades asociadas al consumo de verduras involucran
diversos factores. Las verduras deben contener microorganismos patógenos y
estos deben sobrevivir hasta el momento de su consumo en niveles suficientes
para causar la enfermedad. La dosis infectante (mínimo número de organismos
necesarios para causar la enfermedad) depende de cada microorganismo y de
la susceptibilidad del individuo. En algunos la cantidad necesaria para causar
enfermedad es muy alta, mientras que en otros los microorganismos sólo
necesitan sobrevivir sin reproducirse para causar enfermedad (FDA, 2001). Por
ejemplo, los parásitos y virus son incapaces de multiplicarse fuera de un ser
humano o animal, basta con su presencia en el alimento para causar
enfermedad (FDA, 2001).
En el Cuadro 2 se muestran algunos de los microorganismos asociados
a brotes de enfermedad por el consumo de frutas y verduras datos reportados
por la FDA en EE. UU en el 2001.
5
Cuadro 2. Microorganismos patógenos implicados en brotes por el
consumo de frutas y verduras EE. UU., 2001.
Patógeno
B. cereus
C. cayetanensis
E. coli O157:H7
E. coli enterotóxigenica
G. lamblia
Virus hepatitis A
L. monocytogenes
Virus Norwalk
Salmonella
Shigella
Vibrio cholerae
C. parvum
E. coli O157:H7
Salmonella
Alimento
Purés, soya, berro, semillas de mostaza
Frambuesas, ensalada de lechuga, albahaca
Lechuga, semillas de alfalfa, rábanos
Zanahorias
Ensaladas verdes
Lechuga, frambuesas, fresas congeladas
Col
Rebanadas de melón, ensaladas verdes, apio
Jitomates, sandía, melón, semillas de alfalfa, mamey,
mango
Lechuga, perejil
Col
Jugos de Manzana
Jugos de Manzana
Jugos de Manzana y naranja
Fuente: FDA, 2001.
Se ha reportado que ensaladas ”listas para el consumo” han sido
vehículo de microorganismos patógenos como E. coli y L. monocytogenes
ocasionando brotes de enfermedad (Beuchat y Brackett, 1991; Abdul-Raouf et
al., 1993).
Salmonella es el patógeno que se reporta con más frecuencia en
brotes de gastroenteritis por el consumo de frutas y verduras en los EE. UU.
(Bean y Griffin, 1990). En 1990 se reportaron brotes de salmonelosis causados
por el consumo de jitomates contaminados con S. Javiana (Wood et al., 1991) y
S. Montevideo (Hedberg et al., 1994). Davis et al. (1988) reportaron casos de
gastroenteritis asociados al consumo de lechuga contaminada con Shigella
sonnei; también se reportaron otros casos por el consumo de ensalada de
verduras contaminada con E. coli (Merson et al., 1976). El melón ha sido
vehículo de Salmonella en diversos brotes de enfermedad. En 1990 se reportó
un brote por consumo de este alimento el cual se encontraba contaminado en
su superficie con S. Chester (Ries et al., 1990). Los casos se presentaron en
30 estados, provocando dos muertes; la estimación de personas infectadas fue
de 25,000. El estudio epidemiológico reveló que los melones no se lavaron
6
previo al corte y la contaminación se diseminó hacia el interior de la fruta (Ries
et al., 1990). Otro ejemplo es el ocurrido en quince estados de EE. UU. y dos
provincias de Canadá, donde se presentó un brote causado por S. Poona con
185 casos confirmados en EE. UU. y 56 en Canadá. Estos brotes fueron
asociados también con el consumo de melón y ensalada (Joseph, 1992).
En
el
2006
el
consumo
de
espinacas
(Spinacea
oleracea)
contaminadas con E. coli O157:H7 causó tres muertes, numerosas
hospitalizaciones y pérdidas económicas estimadas en 150 millones de dólares
(Hileman, 2006). L. monocytogenes ha tenido importancia como agente causal
de enfermedades en humanos, debido al consumo de repollo crudo
contaminado con heces de oveja (Joseph, 1992).
2.2.1 Listeria monocytogenes
L. monocytogenes es un bacilo gram positivo, no esporulado,
anaerobio facultativo, oxidasa negativo, psicrótrofo ya que tiene la capacidad
de crecer a temperaturas de refrigeración, presenta movilidad tipo "tumbling"
(20-25oC) (Brackett, 1988), puede crecer a pH y aw inferior a 5.2 y 0.92,
respectivamente (Novak, 2003; Lovett y Twetd, 1998). Además tiene capacidad
para formar biopelículas en diversas condiciones (Blackman et al., 1996;
Herald, 1988; Norwood, 1988; FDA, 2008).
El género Listeria comprende seis especies: L. monocytogenes. L.
innocua, L. ivanovii, L. welshimeri, L. seeligeri y L. grayi (McLauchlin, 1997). De
estas, sólo dos especies son consideradas como patógenas: L. monocytogenes
para humanos y L. ivanovii para otros mamíferos. Sin embargo, se han
reportado enfermedades en humanos causadas por L. seeligeri y L. ivanovii
(Rocourt et al., 1986; Cummins et al., 1994). L. monocytogenes es una bacteria
comúnmente encontrada en tierra, agua, animales y verduras en estas últimas,
ha sido aislada a partir de repollo, apio, perejil, lechuga, pepino, rábanos y
cebollín (Van Reuterghem et al., 1991; Ryu et al., 1992). Es relativamente
resistente a la desecación y otros factores ambientales adversos para su
7
desarrollo y sobrevivencia; puede crecer con cantidades mínimas de nutrientes
(Fernández, 2000).
La dosis infectante de L. monocytogenes es desconocida: al igual que
para otros patógenos varía dependiendo del tipo de cepa y la susceptibilidad de
cada individuo así como del alimento involucrado (CDC, 2008).
Reportes de la incidencia de listeriosis posteriores a 1987 indican que
existen más de 1,600 casos con 415 muertes por año en los EE.UU., la
mayoría de éstos son esporádicos por lo que incrementa la dificultad de
descubrir cuál fue el alimento involucrado en la transmisión del patógeno (CDC,
2008; FDA, 2009).
En el Cuadro 3 se muestra la incidencia de L. monocytogenes en
diversos alimentos entre estos verduras, las cuales exhiben una elevada
incidencia de esta bacteria solamente superada por la observada en carnes de
aves.
Cuadro 3. Incidencia de L. monocytogenes en alimentos
Alimento
Incidencia (%)
Leche cruda
>5
Productos lácteos no fermentados
2.5
Quesos
10
Carnes de res
38
Carne de cerdo
36
Carne de aves
15-80
Papas
21
Verduras crudas
44
Fuente: Lund et al., 1989.
8
2.2.1.1 Listeriosis
La enfermedad originada por la bacteria L. monocytogenes es conocida
como listeriosis, zoonosis de baja morbilidad y alta letalidad, que puede ser
transmitida por el consumo de alimentos contaminados. Los individuos que
tienen mayor riesgo de adquirir esta enfermedad son aquellos en los cuales el
sistema inmunológico se encuentra comprometido, como son ancianos,
mujeres embarazadas, neonatos y personas que han recibido trasplantes de
órganos (NACMCF, 1991). Cuando personas inmunológicamente competentes
llegan a consumir alimentos contaminados con esta bacteria pueden o no
manifestar gastroenteritis no invasiva autolimitada (FDA, 2008).
En infecciones severas se han reportado septicemia e infecciones del
sistema nervioso central que pueden llevar a la muerte; estas enfermedades
pueden iniciar con síntomas gastrointestinales tales como náuseas, vómito,
diarrea, fiebre o dolor de cabeza (Farber, 1992). La listeriosis invasiva de baja
incidencia se caracteriza por una alta letalidad, que va del 20 a 30% (Schlech,
1998; Wing y Gregory, 2000; FDA, 2008). La mayoría de los casos de listeriosis
ocurren esporádicamente, es decir de forma aislada sin ningún patrón
aparente. Sin embargo, en la actualidad se han incrementado los reportes de
esta enfermedad (FDA, 2008).
Con la finalidad de reducir a niveles mínimos la contaminación
microbiana de origen en alimentos y evitar el posterior desarrollo de estos en
los alimentos es necesario aplicar medidas estrictas de higiene y control de la
temperatura (Novak et al., 2003).
En 1967, Blenden y Szatalowicz informaron que en el periodo de 1933
a 1966 en los EE. UU. se reportaron 731 casos humanos de listeriosis entre los
posibles vehículos del patógeno se encontraban alimentos como lechuga y
otras verduras. En 1979 en Boston se presentó un brote de listeriosis, con un
total de 23 pacientes afectados, en este los alimentos involucrados fueron:
apio, jitomate y lechuga, los cuales anteriormente no había sido relacionados
como vehículo de microorganismos patógenos (Schlech et al., 1983; Ho et al.,
9
1986). En 1981 en las provincias Maritine (Prince Edward Island, Nova Scotia
and New Brunswick) se reportó otro brote de listerosis en este se propuso que
la col pudo haber sido vehículo del microorganismo (Schlech et al., 1983)
.
2.3 Tratamientos de desinfección química aplicados a frutas y verduras
Para reducir el riesgo de enfermar por el consumo de alimentos
minimamente procesados los cuales se ingieren sin un tratamiento térmico, es
necesario generar información con el objetivo de mejorar la desinfección
química actual (Seymour et al., 2002).
La selección del tipo de germicida químico, así como la concentración
empleada depende del alimento sobre el cual se aplicará la desinfección, el
empleo de agentes surfactantes y solventes así como la manipulación
mecánica (como el cepillado), pueden reducir o eliminar la hidrofobicidad
(material ceroso) presente en el exterior de las frutas y verduras favoreciendo
la exposición de los microorganismos a los germicidas (Parish et al., 2003).
Los agentes germicidas generalmente dañan la membrana microbiana
interfiriendo con el transporte activo a través de está lo que puede provocar
pérdida total de la viabilidad de los microorganismos (Wang y Johnson, 1992;
Oh y Marshall, 1993; Larson et al., 1996).
Los desinfectantes químicos utilizados actualmente son potencialmente
tóxicos y no logran inactivar completamente a los microorganismos en
productos frescos como frutas y verduras (Koseki y Itoh, 2001; Park et al.,
2001). Idealmente un desinfectante debe ser efectivo en presencia de materia
orgánica, no tóxico para las personas ni corrosivo para el equipo, estable
durante su almacenamiento, sin olor, soluble en agua y lípidos, con tensión
superficial baja lo cual les permitira la penetración en grietas y económico
(Prescott, 2003). Entres los factores que influyen principalmente en la acción de
los desinfectantes químicos se encuentran: la concentración, temperatura así
10
como el tipo de microorganismo que este siendo expuesto al germicida
(Prescott, 2003).
2.3.1 Cloro
El cloro (hipoclorito de sodio) ha sido usado ampliamente para la
desinfección de alimentos por varias décadas y es quizá el desinfectante más
ampliamente usado en la industria alimenticia así como en los hogares (Walter
y LaGrange, 1991; Cherry, 1999).
El principio activo del hipoclorito de sodio es el cloro, ya que al
combinarse con agua forma ácido hipocloroso (HClO) y libera cloro molecular
el cual es oxidante a pH neutro o ácido (Rojas y Guevara, 2000).
Cl2 + H2O → HClO + Cl- + H+
Se piensa que el cloro oxida los grupos sulfihidrilos (SH) de las
proteínas transformándolos en disulfuros (S-S), causando inactivación de
enzimas o alterando la integridad de la membrana (Vignoli, 2008). También se
ha propuesto que el mecanismo de acción del HOCl evita que se lleve a cabo
la fosforilación oxidativa, pero hasta la fecha no se ha dilucidado un mecanismo
de acción que explique completamente el efecto de este germicida en los
microorganismos (Rutala, 1996; McDonnell y Russell, 1999).
En soluciones acuosas, el equilibrio entre el ácido hipocloroso (HClO) y
el ion hipoclorito (OCl-) depende del pH de tal manera que la concentración de
HClO incrementa cuando el pH decrece; si el pH de la solución se ajusta a un
rango de 4-7 la proporción de HClO es mayor a 60%. Este reacciona con la
materia orgánica perdiendo su efecto germicida. La máxima solubilidad del
HClO en agua se obtiene a 4oC. La concentración de HClO también es
afectada por la temperatura, luz, aire y algunos metales (Parish et al., 2003).
11
Actualmente para desinfectar frutas y verduras se utilizan soluciones de
cloro en agua (50-200 ppm); sumergiendolas en estás se consigue reducir la
cantidad de microorganismos hasta 2 log UFC/g (Beuchat, 1992; Brackett,
1992; Taormina y Beuchat, 1999).
Investigaciones reportadas por Nguyen-the y Carlin (1994) sugieren
que la inactivación de L. monocytogenes en vegetales utilizando cloro es
limitada debida a las características de la superficie de este tipo de alimentos.
Mientras que Zhang y Farber (1996) demostraron que el tratamiento de lechuga
rebanada y col con cloro (200 ppm) por 10 minutos reducen la población de L.
monocytogenes en 1.7 y 1.2 log CFU/g, respectivamente. Escudero et al.
(1999) obtuvieron resultados similares en lechuga picada e inoculada con
Yersinia enterocolitica, la cual recibió un tratamiento con cloro (100 a 300 ppm)
durante 10 minutos logrando reducir de 2 a 3 log de UFC/g.
2.3.2 Ácido peracético
El ácido peracético, o ácido peroxiacético, es una mezcla de peróxido
de hidrógeno y ácido acético (Parish et al., 2003). Se ha propuesto que el
mecanismo de acción del ácido peracético es la desnaturalización de proteínas
y enzimas, incrementando de esta forma la permeabilidad de la pared celular
de las bacterias ocasionada por la oxidación de los enlaces sulfidrilo y bisulfuro
de las proteínas presentes en la membrana (Lippincott et al., 2001).
La eficacia del ácido peracético para inactivar microorganismos
patógenos para humanos ha sido probada en diversos materiales y alimentos.
Por ejemplo, la desinfección de láminas de acero inoxidable en las cuales se en
contraban bacterias como L. monocytogenes y Pseudomonas spp. formando
parte de una biopelícula, soluciones de ácido peracético lograron reducciones
mayores en la inactivaión de estas bacterias comparando con las reducciones
obtenidas al emplear soluciones de cloro, quizá sea debido a que a diferencia
del cloro el ácido peracético no es neutralizado por la materia orgánica (Fatemi
y Frank, 1999).
12
Este germicida también se ha utilizado para desinfectar frutas y
hortalizas. Cuando se aplicó ácido peracético (40 y 80 ppm) en la superficie de
melón, se obtuvieron reducciones significativas en las poblaciones de
Salmonella y E. coli O157:H7 (Park y Beuchat, 1999). En otro estudio se evaluó
el efecto del ácido peracético sobre las bacterias mesófilas de la superficie de
naranjas. Las poblaciones fueron reducidas en un 85%, después de lavarlas y
cepillarlas con agua, para finalmente desinfectarlas por inmersión durante 15
segundos en ácido peracético (200 ppm). Las reducciones microbianas
ocasionadas por arrastre mecánico (lavadas, cepilladas y sumergidas en agua)
fue únicamente del 60% del total de la población (Winniczuk, 1994).
En ensalada de verduras mixta se redujo aproximadamente 100 veces
la cuenta total de coliformes fecales después de la aplicación de tratamientos
con ácido peracético (90 ppm) o utilizando cloro (100 ppm). Los resultados
reportados para las desinfecciones realizadas en varias empresas son
variables. Por ejemplo, sumergir jitomates en una mezcla de ácido peracético
(60 ppm) y agentes surfactantes durante 2 minutos reduce la población de S.
javiana, L. monocytogenes y E.coli O157:H7 por 96%, 99.96% y 99.5%,
respectivamente, comparado con el tratamiento en agua estéril (Parish et al.,
2003). Resultados similares fueron obtenidos con una mezcla de ácido
peracético (40 ppm) y agentes surfactantes (Parish et al., 2003).
2.4 Estrés bacteriano
Durante la producción y procesamiento de alimentos las bacterias son
sometidas a diferentes condiciones de estrés. Entre los tipos de estrés se
encuentran la exposición a tratamientos térmicos, congelación, desecación,
cambios en la presión osmótica, exposición a conservadores, detergentes y
desinfectantes, entre otros. La capacidad de las bacterias para sobreponerse a
un estado de estrés puede incrementarse si se exponen frecuentemente o por
periodos de tiempo prolongados al agente causante del estrés (Yousef y
Juneja, 2003).
13
Existen diferentes grados de estrés que se clasifican de acuerdo con el
efecto que tiene sobre los microorganismos (Figura 1). En el estrés subletal no
se presenta pérdida total de la viabilidad, sólo reduce o inhibe la tasa de
desarrollo microbiano. El estrés letal generalmente causa pérdida de la
viabilidad en los microorganismos (Yousef y Juneja, 2003).
A
D
A
P
T
A
C
I
Ó
N
Adaptación a estrés
Reparación
Estado de equilibrio
Estrés ligero
Reparación de daño
causado por estrés
Reparación
Estado de estrés
Estrés moderado
A
Reparación
Lesión
E
S
T
R
É
S
Muerte
ESTADO FISIOLÓGICO
Figura 1. Estado fisiológico de células que han sido sometidas a diferentes
grados y tipos de estrés.
Fuente: Yousef y Juneja, 2003.
2.4.1 Mecanismos de resistencia bacteriana a varios tipos de estrés
Los mecanismos de resistencia pueden ser clasificados como innatos o
adquiridos (Russell, 1991).
2.4.1.1 Resistencia innata. Es una capacidad que se encuentra
asociada con el propio microorganismo. Esta resistencia varía de acuerdo al
género, especie o cepa del microorganismo bajo estudio. Los mecanismos de
resistencia incluyen barreras que se encuentran en la membrana externa por
14
ejemplo en bacterias Gram negativas los ácidos teicoícos (polímero de glicerol
o ribitol) y en bacterias Gram positivas el transporte de compuestos a través de
la membrana los cuales pueden inactivar rutas metabólicas.
Los desinfectantes químicos generalmente no actúan sobre sitios
específicos ni son selectivos, por lo que probablemente la resistencia sea
ocasionada por características innatas como por ejemplo, la reducción en la
permeabilidad de la membrana (Russell et al., 1997).
2.4.1.2 Resistencia adquirida. La adquisición de este tipo de resistencia
es resultado de cambios genéticos en la célula microbiana a través de
mutaciones o bien ganancia de material genético.
Los microorganismos pueden adaptarse a condiciones ambientales de
estrés, como el producido por la exposición a sales, ácidos, temperaturas altas
y bajas, especies reactivas de oxígeno (ROS), escazes de nutrientes entre
otros, por medio de la expresión de genes (Hengge-Aronis, 2000; Costa y
Moradas, 2001; Hecker y Völker, 2001).
Se ha especulado que la resistencia microbiana a germicidas químicos
es generada de forma similar a la resistencia ocasionada por antibióticos; está
última puede ocasionar inactivación o modificación enzimática evitando que se
lleve a cabo el metabolismo, provocando disminución en el transporte a través
de la membrana, o bien perdida de la integridad de está permitiendo la salida
de los componentes celulares (Russell et al., 1997).
En respuesta a estados de estrés las células microbianas pueden:
a)
Producir proteínas que reparan el daño o bien protegen a los
microorganismos neutralizando a los agentes estresantes.
b)
Reducir a un minímo la tasa metabólica o bien pasar a un estado
de inactividad celular (formación de esporas o entrar en estado viable-nocultivable).
15
c)
Generar mecanismos de evasión de los anticuerpos del
huésped.
d)
Mutaciones adaptativas.
2.5 Detección de genes involucrados en la respuesta bacteriana a
condiciones de estrés
Se ha reportado que ante condiciones de estrés, existen genes que
desencadenan mecanismos, como el aumento de la síntesis de novo de
proteínas que incrementan la resistencia a condiciones de estrés (Koonin et al.,
2000). Estas proteínas de estrés comúnmente son llamadas “proteínas de
choque térmico”. La comparación de los genomas de las cepas sensibles con
las resistentes puede permitir conocer cuales son los genes involucrados en la
respuesta a condiciones de estrés (Koonin et al., 2000).
Small et al. (2007) realizaron un estudio que permitió la comparación
de tres tratamientos de desinfección con Pseudomonas aeruginosa realizados
por separado después de la exposición a una concentración subletal de
hipoclorito de sodio, ácido peracético y peróxido de hidrógeno. Los resultados
mostraron que las bacterias incrementan la expresión de genes en diferente
grado dependiendo del tipo de desinfectante al cual se exponga.
Se han realizado estudios de microarreglos para caracterizar
molecularmente cómo se modifica el transcriptoma de las bacterias como el
Bacillus subtilis (Hayashi et al., 2005), Staphylococcus aureus (Chang et al.,
2006) y Streptococcus pneumoniae expuestas a tratamientos con peróxido de
hidrógeno (Ulijasz et al., 2004).
2.5.1 Proteínas expresadas por las bacterias en condiciones de estrés
La síntesis de proteínas por los microorganismos en respuesta a
condiciones de estrés pueden tener como objetivo reparar el daño o bien
16
neutralizar el efecto del agente estresante. Entre las proteínas que se sintetizan
en respuesta a condiciones de estrés, se encuentran proteínas reguladoras
(por ejemplo, σ32 en E. coli y σB en L. monocytogenes), chaperonas (por
ejemplo, GroEL), proteasa dependiente de ATP (por ejemplo Lon), y proteínas
encargadas de reparar daños en el ADN (por ejemplo UspA) (Rosen et al.,
2002). La detección y caracterización de estas se ha logrado mediante
electroforesis bidimensional (Rince et al., 2002).
2.6 Adaptación de L. monocytogenes a condiciones de estrés
Se ha reportado que L. monocytogenes se adapta a la exposición a
diferentes tipos y grados de estrés como el osmótico, el térmico y el químico
(Lou y Yousef, 1997). La tolerancia ante ácidos por L. monocytogenes ha sido
demostrada por varios investigadores (Kroll y Patchett, 1992; Hill et al., 1995;
Davis et al., 1996; Phan-Thanh et al., 2000). La resistencia de las bacterias a la
acidez depende de varios factores como el tipo y la concentración del ácido al
que se expongan y las condiciones ambientales previas.
L. monocytogenes posee el gen σB, encargado de regular varios
mecanismos en respuesta al estrés. Este gen es análogo al encontrado en B.
subtilis que se asocia con la osmotolerancia (Becker et al., 1998). Se ha
reportado en varias investigaciones que el incremento en la resistencia
bacteriana puede incrementar la virulencia (Becker et al., 1998; Wiedmann et
al., 1998; Hecker y Völker, 2001). Lou y Yousef (1997) reportaron que al
exponer las células de L. monocytogenes a etanol (5% v/v), HCl (pH 4.5-5.0),
H2O2 (500 ppm) o NaCl (7% w/v) adicionados a cultivos en fase exponencial
durante una hora estos agentes provocaron una protección cruzada, ya que
además de generar resistencia a los agentes expuestos, también mostraron
resistencia a etanol (17.5% v/v), HCl (pH 3.5) y H2O2 (0.1%) y NaCl (25% w/v).
Ravishankar et al. (2000) reportaron que la adaptación de las células de
Listeria sp frente a ácidos genera protección cruzada contra la actividad del
sistema
lactoperoxidasa.
concentraciones
crecientes
La
de
exposición
acidez
17
de
L.
incrementa
monocytogenes
su
capacidad
a
de
sobrevivencia en alimentos ácidos, por ejemplo durante la fermentación de la
leche esta pude permanecer viable (Hill et al., 1995; Gahan et al., 1996). Juneja
et al. (1998) reportaron que la resistencia que se genera en células de L.
monocytogenes cuando es sometida a temperaturas crecientes es afectada por
el pH, acidez y temperatura y tipo de sustrato en el que se encuentren.
2.7 Formación de biopelículas
Las biopelículas son organizaciones microbianas compuestas por
microorganismos que se adhieren a las superficies gracias a la producción de
exopolímeros compuestos de glicocálix (75%) (Costerton, 1999; Betancourt et
al., 2004). Las estructuras superficiales de las bacterias (apéndices)
incrementan la superficie de contacto favoreciendo de esta forma la adhesión.
Por ejemplo: flagelos, fimbrias y pilis que presentan algunas bacterias (Lejeune,
2003).
Una biopelícula microbiana representa un mecanismo de supervivencia
ya que proporciona protección a factores ambiéntales y frente a tratamientos de
erradicación microbiana. Se ha propuesto que cuando los microorganismos se
encuentran sometidos a circunstancias adversas incrementan su capacidad
para formar biopelículas (Betancourt et al., 2004). Cuando los microorganismos
forman parte de una biopelícula disminuyen su tasa metabólica, esto les
proporciona menor susceptibilidad a los tratamientos aplicados (Stewart y
Costerton, 2001); eventualmente los microorganismos que forman parte de una
biopelícula pueden liberarse, desplazarse y depositarse en otros sitios (Watnik
y Kolter, 2000).
Estas organizaciones poseen un sistema de canales que le permiten
construir un vínculo con el medio externo y de esta forma realizar intercambio
de nutrientes así como eliminar metabolitos de desecho las colonias
organizadas e incluidas en el exopolimero forman una capa impermeable en
donde sólo los microorganismos que se encuentran en la superficie son
afectados por las condiciones ambientales. Los microorganismos que forman
18
parte de esta estructura se encuentran comunicados a nivel bioquímico entre
ellos por un mecanismo denominado quorum sensing, este involucra la
regulación y expresión de genes específicos a través de moléculas de
señalización que controlan la comunicación intercelular (Wirtanen y Sandholm,
1992; Betancourt et al., 2004).
Evitar la formación de biopelículas es de primordial importancia para
las industrias que producen alimentos, para esto es necesario realizar un
lavado correcto que incluya cepillado de las superficies, seguido de un
tratamiento químico o físico de desinfección, de esta forma se logra reducir la
incidencia de formación de biopelículas (Hoyle y Costerton, 1991); ya que la
resistencia a germicidas de los microorganismos que forman parte de una
biopelícula puede incrementar de 100 a 1000 veces comparada con su estado
libre o plactónico (Hoyle y Costerton, 1991).
2.7.1 Etapas en la formación de biopelículas
Marshall et al. (1971) propusieron dos etapas para la formación de
biopelículas microbianas. En la primera los microorganismos son atraídos hacia
una superficie por medio de interacciones debiles como hidrofóbicas,
electrostáticas y fuerzas de van der Waals; en esta etapa los microorganismos
aun no han tenido contacto con la superficie por lo tanto es reversible. Está
atracción es influida por la naturaleza de la superficie así como por las cargas
superficiales de las bacterias (Hood y Zottola, 1995; Teixeira y Oliveira, 1999).
En la segunda etapa existe la producción de polisacáridos que se
adhieren a las superficies formando una matriz la cual por medio de
interacciones hidrofóbicas, dipolo-dipolo, iónicas, covalentes y puentes de
hidrógeno. En esta etapa las células que forman parte de la estructura pueden
multiplicarse formando microcolonias en el interior de las biopelículas
(Christensen, 1989).
19
Notermans et al. (1991) plantearon una tercera etapa, donde ocurre
adsorción de las células a la superficie con la consecuente consolidación de las
interacciones electrostáticas, fuerzas de van der Waals, fortaleciendo la
estructura de la biopelícula (red de polisacáridos) incrementando el desarrollo y
colonización de los microorganismos. Barros de Macedo (2000) sugiere que la
capacidad de los microorganismos para adherirse a una superficie depende su
carga eléctrica así como de la rugosidad de esté.
Las bacterias que forman parte de las biopelículas pueden ser
cuantificadas siguiendo técnicas de raspado y posterior cuenta en placa
(Ganesh y Anand, 1998). Otras técnicas para el monitoreo de la población
microbiana que forma parte de una biopelícula incluyen la microscopia de
epifluorescencia (Wirtanen y Sandholm, 1993), microscopía electrónica de
barrido (Oh y Marshall, 1995; Farid et al., 1998) y microscopía confocal láser de
barrido (Burnett et al., 2000).
2.7.2 Capacidad de L. monocytogenes para formar biopelículas
L. monocytogenes en escaséz de algunos carbohidratos como manosa
y trialosa mostró incremento en su capacidad para adherirse en superficies
abióticas. Jeong y Frank (1994) reportaron la formación de biopelículas a 10oC
sobre superficies de acero inoxidable en conjunto con algunas especies de
Flavobacterium.
En
varias
investigaciones
se
ha
reportado
que
L.
monocytogenes es capaz de adherirse a superficies de plástico, rubber, acero
inoxidable y vidrio (Mafu et al., 1990; Hood et al., 1997; Sinde y Carballo, 2000;
Stepanovic et al., 2004; Chae et al., 2006).
En varias investigaciones se ha observado que las bacterias al formar
parte de una biopelícula sufre cambios en su fisiología celular mostrando
disminución en su tasa metabólica comparada con su estado libre (Wilks et al.,
2005; Azevedo et al., 2006; Wilks et al., 2006).
20
2.8 Espinaca
La espinaca es una verdura perteneciente a la familia Chenopodiaceae,
especie Spinacea oleracea su nombre hace referencia a las espinas que
presentan sus frutos maduros. En una primera fase de crecimiento esta planta
forma una roseta de hojas de duración variable según condiciones climáticas y
posteriormente emite el tallo. De las axilas de las hojas o directamente del
cuello surgen tallos laterales que dan lugar a ramificaciones secundarias, en las
que pueden desarrollarse flores (Cantwell y Reid, 1993). Existen plantas
masculinas, femeninas e incluso hermafroditas. Su tallo es erecto de 30 cm a 1
m de longitud en este se sitúan las flores, sus hojas parte comestible presentan
un color verde oscuro y brillante. Las flores masculinas se presentan agrupadas
en número de 6-12 en las espigas, terminales o axiales estas son de color
verde y están formadas por un periantio con 4-5 pétalos y 4 estambres. Las
flores femeninas se reúnen en glomérulos axiales y están formadas por un
periantio bi o tetradentado, con ovarios uniovulares, estilo único y estigma
dividido en 3-5 segmentos (Cantwell y Reid, 1993).
Desarrolla en terrenos con una composición química equilibrada, que
contenga materia orgánica y nitrógeno. Las condiciones óptimas de desarrollo
para la espinaca son 0°C y 95-98% H.R.; está verdura, están compuestas en
su mayor parte por agua contiene un porcentaje relativamente bajo de hidratos
de carbono y grasas (Cantwell y Reid, 1993). Los grupos de vitaminas que
encontramos son: E, A, C y B y alto contenido de folatos; también contienen
calcio, potasio, hierro, magnesio, fósforo, yodo y sodio; son una buena fuente
de fibra para el ser humano (PROFECO, 2009).
2.8.1 Espinaca precocida y congelada
Las espinacas precocidas y congeladas se definen como aquellas que
han sido sometidas a un proceso térmico (temperatura que no modifique sus
características sensoriales), seguido de un enfriamiento y posterior congelación
de tal forma que el agua contenida en ellas se convierte en hielo. Una vez
21
recolectadas las verduras, se seleccionan y se lavan, eliminando las partes no
comestibles y los restos de tierra y suciedad, posteriormente se someten al
blanqueado o escaldado, que consiste en sumergirlas en agua hirviendo
durante unos minutos y el doble de tiempo en agua bien helada (shock térmico)
consiguiendo inactivar las enzimas que intervienen en las reacciones
bioquímicas y a los microorganismos patógenos, gracias a este proceso
conservan las características sensoriales del producto y se incrementa la vida
de anaquel del producto (PROFECO, 2009).
Para llevar a cabo la congelación de las espinacas después de ser
enfriadas y secadas, se lleva a cabo la congelación rápida a temperatura
inferior a -18°C conservando la textura, color, sabor y calidad. La congelación
puede realizarse por dos métodos: a) congelación con nitrógeno líquido en
donde la verdura se coloca en túneles que son enfriados con nitrógeno líquido;
b) congelación a través de chorros de aire, el cual se encuentra a temperaturas
inferiores a 0ºC. Una vez congeladas deben mantenerse a una temperatura de
-18 ó -20°C, para asegurar su calidad sensorial y microbiológica no debe
interrumpirse esta temperatura (PROFECO, 2009).
El sector de las verduras congeladas ha cobrado importancia en el
terreno de la exportación. México es el segundo proveedor de EE. UU. en el
sector agroindustrial, según cifras del Consejo Nacional de la Industria
Maquiladora de Exportación de las frutas y verduras congeladas que se
consumen en los EE.UU. el 70% son maquiladas en México (PROFECO,
2009). En 2004 México exportó, principalmente a EE.UU., 554.5 millones de
dólares de legumbres y frutas preparadas o en conserva, un incremento de
90% con respecto a la década anterior, de acuerdo con estadísticas del Banco
de México y del Departamento de Comercio estadounidense (PROFECO,
2009). Al igual que para otros tipos de alimentos la política de ”cero tolerancia”
para Listeria spp. es aplicable a la espinaca precocida y congelada.
La Figura 2 muestra la producción anual de espinaca en México (19972006).
22
30,000.00
25,000.00
TON
20,000.00
15,000.00
10,000.00
5,000.00
0.00
1997 1998 1999 2000 2001 2002 2003 2004 2005 2006
AÑO
Figura 2. Produccion anual de espinaca en México.
Fuente: Anuario Estadístico de la Producción Agrícola SAGARPA, 2008.
2.9 Planteamiento del problema.
Una empresa que procesa espinaca precocida y congelada presentó
problemas de contaminación con L. monocytogenes en el producto terminado.
Con la finalidad de aplicar sistemas dirigidos al aseguramiento de la inocuidad
de este alimento, en un trabajo realizado previamente por Esquivel (2009) se
generó información que condujo a conocer las fuentes de contaminación que
estaban operando en la empresa. Para lograrlo se obtuvo información acerca
de la incidencia de L. monocytogenes durante la producción en la planta
mediante la recolección y análisis de 428 muestras de las diferentes áreas de
proceso, incluyendo espinaca, superficies, equipo y agua. Las cepas de L.
monocytogenes
aisladas
fueron
tipificadas
molecularmente
mediante
electroforesis en gel por campos pulsados (EGCP) siguiendo el protocolo del
Pulse Net (CDC, 2004) con algunas modificaciones. Posteriormente se
evaluaron varios tratamientos de desinfección empleados en la inactivación de
L. monocytogenes en espinacas crudas. Se evaluaron: hipoclorito de sodio
(200 ppm,
Clorox®), dióxido de cloro (5 ppm, Vibrex Horticare®), ácido
peracético (80 ppm, Ecolab®), plata coloidal (1.4 ppm, Microdyn®) y
metabisulfito de sodio (50000 ppm, Sigma México).
23
En esa serie de experimentos se utilizaron espinacas inoculadas con
dos diferentes mezclas de cepas de orígenes distintos. Se empleó una mezcla
de cepas de colección (V7, Scott A, 101-M, 101-14 y LCDC) y una mezcla de
cepas aisladas de la planta (F6, F15, F16, F26 y L75). Las cepas de colección
inoculadas en las espinacas mostraron reducciones de 3.2 y 4.0 log
UFC/espinaca después de haber sido expuestas a hipoclorito de sodio y ácido
peracético, respectivamente. En contraste, la mezcla de las cepas aisladas de
la planta mostró reducciones menores: 1.65 y 2.11 log UFC/espinaca después
del contacto con hipoclorito de sodio y ácido peracético, respectivamente
(Esquivel, 2009). Los resultados observados para el resto del los germicidas
estudiados fueron similares para ambas mezclas de L. monocytogenes
estudiadas.
Este hallazgo, llevó a plantear la hipótesis de que las cepas de L.
monocytogenes dentro de la planta procesadora donde se encuentran
expuestas continuamente a concentraciones subletales de los germicidas de
uso común (ácido peracético e hipoclorito de sodio) en esa industria. De tal
forma que las bacterias pueden generar mecanismos de resistencia a dichos
compuestos, logrando sobrevivir a los tratamientos de desinfección química
actualmente utilizados. Situación que incrementa el riesgo de enfermar por
parte del consumidor, ya que pueden llegar a estar presentes microorganismos
patógenos en los alimentos aún después de aplicar los tratamientos
germicidas. La caracterización de los mecanismos por los cuales las bacterias
adquieren resistencia a los desinfectantes químicos generará información que
contribuya a diseñar e implementar estrategias adecuadas de desinfección
química.
24
III. OBJETIVOS
3.1 Objetivo general
Caracterizar fenotípicamente la resistencia a germicidas en cepas de L.
monocytogenes aisladas de espinacas y diversas áreas en una planta
procesadora de espinaca precocida y congelada.
3.2 Objetivos específicos
1. Seleccionar cepas de L. monocytogenes resistentes y sensibles a
hipoclorito de sodio y ácido peracético.
2. Inducir de la resistencia a cloro en cepas de L. monocytogenes
seleccionadas.
3. Evaluar la capacidad de las cepas de L. monocytogenes
seleccionadas para producir biopelículas en acero inoxidable y polipropileno.
25
IV. MATERIALES Y MÉTODOS
4.1 Material biológico
Cepas. Se utilizaron cinco cepas de L. monocytogenes aisladas de un
proceso de producción de espinaca precocida y congelada (F6, L15, L18, L26,
L75) y cinco cepas de L. monocytogenes de colección (Scott A, V7, 101-M,
LCDC, 101-14) del cepario del laboratorio de Inocuidad Microbiana de los
Alimentos del Posgrado en Alimentos de la Facultad de Química de la
Universidad Autónoma de Querétaro.
En todas las cepas se seleccionaron las células resistentes a
rifampicina (Sanofis Aventis de México, S.A. de C.V.) por el método señalado
por Kaspar y Tamplin (1993). Para la conservación de los cultivos se utilizó
caldo soya tripticaseína adicionado de glicerol al 15% (Bioxon, Becton
Dickinson, México) a -18ºC.
Espinacas. Las espinacas fueron adquiridas en centros comerciales de
la ciudad de Querétaro. Se seleccionaron aquellas que no presentaron daño
mecánico. Previo a la aplicación de los tratamientos de desinfección, se realizó
un enjuague bajo el chorro de agua potable; una vez lavadas se cortaron en
cuadros utilizando una plantilla de plástico de 5 x 5 cm.
4.2 Selección de cepas de L. monocytogenes resistentes y sensibles a
hipoclorito de sodio y ácido peracético
4.2.1 Preparación del inóculo
La activación de cada cepa se realizó transfiriendo 10 µl de los viales
que se mantuvieron en congelación a un tubo con 3 ml de caldo soya
tripticaseína (CST, Bioxon), fueron incubados a 35ºC/24h. A partir de estos
cultivos se realizó una segunda transferencia a CST y los tubos se incubaron a
35ºC/18h; finalmente se cosecharon las células por centrifugación (3500 rpm,
10 min, 22ºC). Los paquetes celulares se lavaron y se resuspendieron en
26
solución salina isotónica estéril (SSI, 0.85%), se centrifugaron nuevamente
(3500 rpm, 10 min, 22ºC), para finalmente resuspender las células en agua
destilada estéril (vehículo).
El recuento de las células que contenía cada suspensión celular
(inóculo) se realizó en agar soya tripticaseína suplementado con rifampicina
(200 mg/L) y pimaricina (100 mg/L) (ASTRP) empleando la técnica de
extensión en superficie. Las placas se incubaran a 35ºC /48h.
4.2.2 Inoculación de cuadros de espinaca
Los cuadros de espinaca se inocularon por separado con 100 µl
(aproximadamente 10 gotas de 10µL cada una) de la suspensión de cada una
de las cepas de L. monocytogenes (4.1), distribuidas en la superficie del cuadro
de espinaca. La cantidad final de células por cuadro de espinaca fue de
aproximadamente 1 x 108 UFC. Una vez inoculadas, se secaron durante 45
min/22 ± 2ºC en campana de flujo laminar.
4.2.3 Preparación de las soluciones desinfectantes
El día en el que se realizó el experimento se prepararon soluciones
desinfectantes de ácido peracético (80 ppm, Ecolab®) e hipoclorito de sodio
(200 ppm, Cloralex®); a esta ultima solución se le ajustó el pH a 6.5 ± 0.5
adicionando solución de ácido clorhidrico (20%, J. T. Baker). La concentración
de la solución de hipoclorito de sodio (cloro) se verificó por el método
yodométrico (Anexo 1, Greenberg et al., 1992) y la del ácido peracético por el
método reportado por Greenspan y Mackellar (1948) metodología descrita en el
Anexo 2. Finalmente las soluciones desinfectantes se distribuyeron (50 ml) en
en bolsas de polietileno (17.8 x 23.3 cm).
4.2.4 Aplicación de los tratamientos de desinfección
Las muestras de espinaca inoculadas y secadas fueron sumergidas
durante cinco minutos sin agitación de forma individual en cada una de las
27
soluciones germicidas (4.2.3) y agua destilada estéril (control de arrastre
mecánico).
4.2.5 Recuento de microorganismos sobrevivientes a los tratamientos de
desinfección
Transcurrido el tiempo de contacto para cada tratamiento, las muestras
(espinacas) fueron transferidas a caldo neutralizante (D/E, DifcoTM) y colocadas
en un homogenizador mecánico (Bag Mixer® 400, Interscience) durante 1
minuto. De la suspensión obtenida se prepararon diluciones decimales en
diluyente de peptona estéril (0.01%) para realizar el recuento de los
microorganismos viables mediante extensión en superficie en ASTRP.
Finalmente las placas fueron incubadas a 35 ± 2ºC durante 48 h. En la Figura 3
se muestra la metodología para el recuento de microorganismos sobrevivientes
a los tratamientos de desinfección.
4.2.6 Análisis estadístico
El diseño experimental empleado fue un factorial completamente al
azar donde los factores estudiados fueron tipo de cepa (F6, L15, L18, L26, L75,
Scott A, V7, 101-M, LCDC, 101-14) y la solución desinfectante (hipoclorito de
sodio, ácido peracético y agua como control de arrastre). De cada experimento
se realizaron tres replicas cada una con tres repeticiones. Se realizó un análisis
de varianza y comparación de medias mediante prueba de Tukey utilizando el
paquete estadístico J.M.P. versión 5.0.1.
28
Suspensión L.
moncytogenes
Espinacas lavadas
Inoculación con 10 gotas
(10µl c/u)
Ctrl. Inóculo
espinaca t' 0
Cuadros 5 x 5 cm
Resuspender H2O
Secar/45 min
Sumergir
Cloro (50 ml)
Sumergir
Lavar SSI (0.85%)
Ctrl. Secado
Sumergir
Ac. Peracético (50 ml)
H2O (50 ml)
5 min
Neutralizar 50 ml
Caldo D/E
Homogenizar/1 min
Diluciones
Inocular ASTRP
Incubar 2448hrs/35oC
Reportar UFC/cuadro de
espinaca
Figura 3. Evaluación de los tratamientos de desinfección química en espinaca
inoculada con L. monocytogenes
29
4.3 Inducción de la resistencia a cloro en cepas de L. monocytogenes
seleccionadas
4.3.1. Exposición consecutiva de las células de la cepa L15 a cloro en
suspensión (buffer de fosfatos)
Se utilizó una suspensión bacteriana de la cepa L15 (~1x109 UFC/ml)
preparada siguiendo la metodología descrita (4.2.1) de esta suspensión
bacteriana se transfirió de manera individual 1 ml a tres tubos con 9 ml de
solución de cloro a concentraciones de 10, 20 y 40 ppm (preparado en buffer
de fosfatos). El tiempo de contacto de las células con el germicida fue de 30, 60
y 90 seg. para cada concentración. Las concentraciones de las soluciones de
cloro fueron verificadas como se describió en el apartado 4.2.3.
Transcurridos los tiempos de exposición de las células con las
soluciones de cloro, se agregó 1 ml de solución de tiosulfato de sodio (0.5%,
KEM MR) a cada tubo y se homogenizaron en vortex. De la suspensión obtenida
se realizaron diluciones decimales en diluyente de peptona estéril (0.01%). El
recuento de los microorganismos viables se realizó mediante la técnica de
extensión en superficie utilizando ASTRP. Las placas se incubaron a 35 ± 2ºC
durante 48 h. Paralelamente, de la misma suspensión una vez neutralizada se
transfirieron 10 µl a caldo soya tripticaseína (3 ml), estos tubos se incubaron a
35ºC de 24 a 38 horas hasta obtener una absorbancia de 0.50 a 0.55 nm
(concentración bacteriana ~ 1x109 UFC/ml). La metodología descrita se repitió
de forma consecutiva por cinco ocasiones.
4.3.2. Exposición consecutiva a cloro de células de L. monocytogenes
inoculadas en la superficie de espinaca, acero inoxidable y N-rubber
Se emplearon cuadros de espinaca (5 x 5 cm), cuadros de de N-rubber
(5 x 5 cm) y cuadros de acero inoxidable (2 x 2 cm). Los materiales inertes se
lavaron con detergente, se enjuagaron perfectamente con agua potable,
seguido de un enjuague con etanol (70%) y agua destilada para finalmente ser
esterilizados en autoclave (121ºC, 15 lb, 15 min.); los cuadros de espinaca
30
fueron preparados siguiendo la metodología descrita (4.1). Posteriormente los
tres materiales se inocularon con la suspensión bacteriana de la cepa L15,
seguida de la técnica descrita en el apartado 4.2.2. Se prepararon soluciones
de hipoclorito de sodio a concentraciones de 20 y 200 ppm (verificando su
concentración siguiendo la metodología descrita en el apartado 4.2.3).
Los cuadros de espinaca se sumergieron en 50 ml de cloro (200 ppm)
durante 5 minutos y los cuadros de acero inoxidable y n-rubber fueron
sumergidos en 50 ml de cloro (20 ppm) durante 1 minuto. Transcurridos los
tiempos de contacto todos los cuadros fueron transferidos a caldo D/E (50 ml),
para efectuar el recuento de los sobrevivientes (4.2.5).
De las placas de ASTRP donde se realizó el recuento de células
viables se picó una colonia y se inoculó en un tubo con CST (3 ml) el cual fue
incubado a 35ºC durante 24 a 30 horas (hasta obtener una D.O. de 0.5 a 0.55
nm). El procedimiento completo de exposición a cloro, neutralización y
transferencia de las celulas expuestas al germicida para cada uno de los
materiales se repitió en seis ocasiones, en cada pase se realizó el recuento de
células viables.
4.3.2.1 Comportamiento de células de L. monocytogenes en CST
expuestas consecutivamente a cloro
Las células de L. monocytogenes que se recuperaron a partir de
espinaca después de dos exposiciones consecutivas y de acero inoxidable y nrubber después de seis exposiciones consecutivas, fueron lavadas con SSI. Se
inocularon microplacas con las células resuspendidas en CST (300 µl para
cada fosa) a dos concentraciones (2 y 6 UFC/ml); los cambios en la densidad
óptica de las muestras fueron medidas en el equipo automatizado BIOSCREEN
C de forma individual. Con el propósito de conocer si las células que habían
sido expuestas de manera consecutiva a cloro adquirían cierta resistencia,
simultáneamente estas células fueron expuestas a cloro (~10 ppm) en CST.
Los registros de las dinámicas se realizaron durante 45 horas bajo las
siguientes condiciones: 35ºC, con lecturas cada 30 min. y agitación durante 5
31
segundos previo a la lectura la cual fue medida a una longitud de onda de 0.6
nm.
4.3.3
Exposición
de
las
células
de
L.
monocytogenes
a
bajas
concentraciones de cloro durante tiempos prolongados
4.3.3.1 Preparación del inóculo
Se utilizaron las cepas L15 y la Scott A, que resultaron ser la más
resistente y la más sensible, respectivamente. Las suspensiones bacterianas
fueron preparadas como se indicó en el apartado 4.2.1.
4.3.3.2 Preparación de medio Evans modificado
Los experimentos correspondientes al apartado 4.3.3 fueron realizados
en medio Evans modificado. En el Cuadro 4 se indican las cantidades de cada
reactivo necesarias para preparar un litro de medio, estas fueron basadas en lo
reportado por Evans (1970) con algunas algunas modificaciones.
Cuadro 4. Composición del medio Evans modificado
Reactivo
Cantidad
Marca
NaH2PO4.2H2O
312 mg
J.T. Baker, México
K2HPO4.3H2O
2.28 g
J.T. Baker, México
NH4Cl
2.14 g
J.T. Baker, México
KCl
298 mg
J.T. Baker, México
Na2SO4
113 mg
J.T. Baker, México
ZnO
816 µg
J.T. Baker, México
MgCl2.6H2O
35.6 mg
J.T. Baker, México
CaCl2.2H2O
1.18 mg
Merck México, S.A.
Na2EDTA.2H2O
29.3mg
J.T. Baker, México
Na2MoO4.2H2O
9.7 µg
KEM MR
FeCl3.6H2O
10.8 mg
J.T. Baker, México
32
MnCl2.4H2O
4 mg
J.T. Baker, México
CuCl2.2H2O
340 µg
J.T. Baker, México
CoCl2.6H2O
952 µg
J.T. Baker, México
H3BO3
124 µg
Fisher Scientific, U.S.A.
Acetato (0.15%
1.5 g
J.T. Baker, México
como acetato de
sódio) fuente de
carbono
Fuente: Evans et al., 1970.
Las sales fueron colocadas en un matraz el cual se aforó a un litro con
agua destilada, posteriormente esta suspensión fue mezclada con agitación
durante 2 horas a 22 ± 2ºC, seguida de zonicación a 60 setsonics/min a 22 ±
2ºC durante 3 horas (zonicador Branson 3510). Finalmente el pH se ajustó a
7.15 ± 0.2 y se esterilizó a 121ºC durante 15 min a 15 lb.
4.3.3.3 Comportamiento de L. monocytogenes en medio Evans modificado
Empleando una suspensión bacteriana con una concentración de 1x105
UFC/ml, se transfirió una alícuota a medio Evans modificado a tres diferentes
concentraciones completo (descrito anteriormente en el Cuadro 3), diluido en
agua destilada a la mitad y diluido diez veces. La concentración final de
bacterias en los tres medios fue de ~1x103 UFC/ml. Estas muestras fueron
incubadas a 22 y 30 ± 2ºC durante 48 horas con agitación a 120 rpm. De cada
una se realizaron recuentos microbianos a las 0, 6, 12, 24, 30, 36 y 48 horas de
incubación; las muestras fueron diluidas en diluyente de peptona estéril
(0.01%) e inoculadas en ASTRP mediante la técnica de extensión. Las placas
se incubaron a 35 ± 2ºC durante 48 h.
4.3.3.4 Exposición de células de L. monocytogenes a cloro en medio
Evans modificado
Medio Evans modificado diluido al 50% con solución de hipoclorito de
sodio (~3 ppm) fue inoculado con la cepa L15 y Scott A (~1x1010 UFC/ml) cada
33
una de forma independiente, obteniendo una concentración final para cada
muestra de ~1x108 UFC/ml y 1.5 ppm de cloro. Ambas muestras (cepa L15 y
Scott A) fueron incubadas a 22 ± 2ºC y 30 ± 2ºC durante 150 min.
Periódicamente, se tomaron alicuotas para efectuar el recuento de células
viables a los 0, 20, 40, 60, 90 y 150 minutos de incubación siguiendo la
metodología descrita en el apartado (4.3.3.3).
De estas muestras de forma paralela transcurridos 150 minutos de
incubación se tomaron alícuotas de 10 ml (células sobrevivientes) de los
frascos inoculados con la cepa L15 y Scott A que fueron incubados a 30 ± 2ºC.
A cada una de estas alícuotas se les agregó 100 µl de tiosulfato de sodio
(0.5%, KEMMR).
4.3.3.5 Detección de ADN plasmídico en las cepas seleccionadas
Las muestras de L. monocytogenes (cepas L15 y Scott A) obtenidas
siguiendo la metodología descrita en el apartado 4.3.3.4 fueron centrifugadas
durante 15 minutos a 3500 rpm a 22 ± 2ºC y el paquete celular se resuspendió
en 10 ml de SSI estéril; este procedimiento se repitió en dos ocasiones, está
suspensión fue centrifugada (5,000 rpm, 5 min., 22ºC) y posteriormente al
sedimento se le adicionó 50 µl de lisozima (5%, Quiagen). Las muestras
obtenidas hasta este paso fueron tratadas siguiendo la metodología de lisis
alcalina para la extracción de ADN plásmidico como se describe en el Anexo 3.
Para correr la muestra se utilizó un gel de agarosa a 0.3% (ultra-pure
Invitrogen, U.K), el se colocó en una cámara de electroforesis (Bio-Rad), las
muestras se mezclaron con el buffer de carga (1X TAE) y se colocaron en los
carriles de carga, posteriormente el gel fue cubierto con buffer (Invitrogen) al
cual se le aplicó un voltaje de 60 volts (Bio-Rad) durante 25 minutos. El gel fue
revelado en solución de bromuro de etidio (Invitrogen, Carlsbad, CA). Las
imágenes de los geles se obtuvieron con Fotodocumentador BIO-RAD
(Universal Hood II, V~50/60Hz-200VA, modo UV) analizado con el programa
Quantity-One.
34
4.3.3.6 Observación de células de L. monocytogenes expuestas a cloro
mediante el microscopio electrónico de transmisión
De los matraces que contenian medio Evans modificado inoculado con
la cepa L15 (4.3.3.4) se tomaron alícuotas (15 ml) después de 20 y 120
minutos de incubación a 30 ± 2ºC. Las alícuotas se colocaron en tubos Falcón
y el cloro fue neutralizado adicionando 100 µl de tiosulfato de sodio (0.5%,
KEMMR). Se homogenizaron y centrífugaron (3,500 rpm, 22 ± 2ºC, 10 min), los
paquetes celulares fueron conservados a 18ºC durante 4 h, a éstos se les
adicionó 1 ml de glutaraldehído (3%) durante 48 h a 22 ± 2ºC. Se retiró el
glutaraldehído se enjuagó en dos ocasiones, con 1 ml de buffer de cacodilato
de sodio (0.2 M, pH 7.4), se añadió 1 ml de tetraóxido de osmio (1%, pH 7.4)
manteniendo las muestras sumergidas en hielo (a 4ºC durante 2 horas). La
concentración del glutaraldehído y el tetraóxido de osmio utilizados se
ajustaron a 3 y 1% respectivamente, utilizando solución amortiguadora de
cacodilato de sodio (0.1 M pH 7.4). Una vez que las células fueron fijadas y
postfijadas, se deshidrataron sumergiéndolas en etanol con gradientes de
concentración creciente (de 0 a 100%) a 4ºC. Posteriormente las células fueron
secadas en un desecador de punto crítico y atrapadas en resina epóxica
(polybed EMbed 812: epón 812, ddsa: anhídrido dodecenil succinico, nma:
anhídrido metil nadico, bdma: catalizado benzil dimetil amina) las muestras
inmersas en está se cortaron con un ultramicrótomo (MT-X, RMC) obteniendo
rebanadas con un grosor de 60 nm. Posteriormente estas fueron montadas
sobre porta-muestras de cobre (círculos de 0.3 cm de diámetro), que a su vez
se colocó en una rejilla y se observaron en el microscopio electrónico de
transmisión (JEOL, modelo JEM-1010) el cual trabaja en un rango de 60-80 Kv
con resolución de 0.25 nm aproximadamente. Las muestras de los tratamientos
fueron observadas y comparadas con un control negativo (células que no
fueron expuestas a ningún germicida cultivadas en caldo soya tripicaseína).
35
4.4 Evaluación de la capacidad de las cepas de L. monocytogenes
seleccionadas
para
producir
biopelículas
en
acero
inoxidable
y
polipropileno
4.4.1 Preparación del inóculo
Las cepas empleadas fueron L15 y Scott A de las cuales se utilizaron
suspensiones obtenidas siguiendo la metodología descrita anteriormente
(4.2.1) con la variante de que las temperaturas de incubacion para la activación
del inóculo en el medio (CST) fue 22 y 30ºC las cuales corresponden a las
temperaturas empleadas para inducir la formación de biopeliculas.
4.4.2 Preparación de los materiales inertes
Se utilizaron círculos (1.2 cm de diámetro) de acero inoxidable (Cal. 20,
304 Grado Alimenticio) y polipropileno (PPBB65-P1-L90) se lavaron con
solución de detergente, seguido de enjuague a chorro de agua potable
posteriormente fueron sumergidos en etanol (70%) y enjuagados con agua
destilada, secados y esterilizados en autoclave a 121ºC, 15 lb durante 15
minutos.
4.4.3 Inoculación del medio Evans modificado
Matraces con medio Evans modificado adicionado de cloro (150 ml de
medio Evans y 147 ml de solución de hipoclorito de sodio, ~3 ppm) y sin cloro
(150 ml de medio Evans modificado y 147 ml de agua destilada) de forma
independiente se inocularon con 3 ml de la suspensión bacteriana de la cepa
L15 o Scott A (1x1010 UFC/ml). La concentración final para cada muestra fue
de aproximadamente de 1x108 UFC/ml.
4.4.4 Inducción de la formación de biopelículas
A cada matraz con Medio Evans (con y sin cloro) se introdujeron cuatro
círculos de cada material (acero inoxidable y polipropileno) posteriormente se
36
incubaron con agitación (120 rpm) a 22 ó 30 ± 2ºC durante 150 min. De las
suspensiones contenidas en cada uno de los frascos se realizó el recuento de
células viables a los 0 y 150 min de incubación. Alícuotas (1 ml) fueron
transferidas a tubos que contenían 9 ml de caldo neutralizante (D/E Difco TM) de
esta suspensión se realizó recuento de células viables siguiendo la técnica de
extensión en superfice en ASTRP, las placas se incubaron a 37ºC durante 48
horas. Paralelamente a los recuentos en el medio Evans modificado, también
se estimó la población adherida a las superficies de acero inoxidable y
polipropileno. Para ello se retiraron círculos (acero inoxidable y polipropileno)
del medio Evans modificado a los 0 y 150 minutos de incubación. Estos fueron
lavados en tres ocasiones con agua destilada estéril con la finalidad de
únicamente realizar recuento de las células adheridas. Posteriormente cada
círculo se colocó en 5 ml de caldo neutralizante (D/E Difco
TM
) y se
homogenizaron durante 2 minutos (Bag Mixer® 400, Interscience). A partir de
esta suspensión se realizó el recuento de las células viables siguiendo la
técnica de extensión en superficie en ASTRP.
4.4.5 Observación de la superficie de los materiales inertes mediante
microscopio electrónico de barrido
Transcurridos 150 minutos de incubación de las muestras descritas en
el apartado (4.4.4) se removieron los círculos que estuvieron inmersos en
medio Evans con y sin hipoclorito de sodio y se enjuagaron en tres ocasiones
con agua destilada estéril. Los círculos se secaron a 37ºC durante 2 horas y se
sumergieron en solución de glutaraldehído (3%) durante 2 h a 18ºC, se
enjuagaron con solución de buffer de cacodilato de sodio (0.2 M, pH 7.4),
seguida de postfijación en solución de tetraóxido de osmio (1%, pH 7.4) a 4ºC
durante 2 horas. Se enjuagaron por inmersión en solución de buffer de
cacodilato de sodio, se deshidrataron sumergiéndolas en soluciones de etanol
a concentraciones crecientes (de 0 a 100%) y se desecaron en un desecador
de punto crítico (Polaron E5000). Para la observación mediante microscopio
electrónico de barrido (Digital Scanning Microscope DSM 950, ZElZZ, West
Germany) los círculos fueron montados en portamuestras, recubiertos con
carbón y aerosoles de oro ionizado.
37
V. RESULTADOS Y DISCUSIÓN
5.1 Selección de cepas de L. monocytogenes resistentes y sensibles a
cloro y ácido peracético
Encuestas realizadas en frutas y verduras crudas demuestran que una
amplia variedad de estos productos son susceptibles de contaminación con
microorganismos, incluyendo patógenos a humanos. Las frutas y verduras
listas para consumo contaminadas con patógenos que provengan del medio
ambiente, de materia fecal de animales o humana, pueden causar enfermedad.
Como no es posible evitar la contaminación en este tipo de productos, una
medida alternativa para disminuir los riesgos a la salud asociados a su
consumo es el lavado y desinfección (NACMCF, 1999). Existen en la literatura
innumerables reportes de estudios en donde se ha evaluado la eficacia de los
compuestos químicos que comúnmente se utilizan en los hogares y a nivel
industrial para desinfectar frutas y verduras (Beuchat et al., 1998). Sin
embargo, aún no existe un método estándar de prueba para llevar a cabo dicha
evaluación. Recientemente se han desarrollado protocolos encaminados a
establecer un método confiable que permita evaluar la efectividad de los
germicidas. El método de desinfección que aplicamos en nuestro trabajo está
basado en una serie de estudios realizados en nuestro laboratorio y es afín a
los esquemas de evaluación propuestos en la literatura (Beuchat et al., 2001;
Harris et al., 2001).
Como se mencionó en el apartado de antecedentes, este trabajo tuvo
como precedente una investigación realizada dentro de una empresa en donde
se llevó a cabo el aislamiento de 63 cepas de L. monocytogenes a partir de
espinacas y de la superficie de diversos materiales dentro de una planta
procesadora de espinaca precocida y congelada. En ese trabajo se observó
que al comparar la eficacia de diversos germicidas (entre ellos el cloro y el
ácido peracético) para la inactivación de L. monocytogenes en la superficie de
hojas de espinaca, las cepas que se aislaron de la empresa mostraron una
mayor resistencia a los tratamientos de desinfección en comparación con
cepas de colección (Esquivel, 2009).
38
En nuestra investigación a diferencia la realizada por Esquivel (2009),
la susceptibilidad a cloro y al ácido peracético se evaluó de forma
independiente en cada una de las cinco cepas aisladas del proceso de
producción. Se utilizaron como control, cepas de L. monocytogenes de
colección que teóricamente no habían sido expuestas a los germicidas. Se ha
reportado
que
las
condiciones
ambientales
previas
a
las
que
los
microorganismos hallan sido expuestos influye en la resistencia ante los
tratamientos de erradicación microbiana como la desinfección química, ya que
los que han sido expuestos a alguna condición estresante logran sobrevivir en
mayor proporción en comparación con aquellas células que no han sido
expuestas a condiciones que les genere estrés (Sapers, 2001).
Las variaciones en los resultados obtenidos en las desinfecciones de
verduras y frutas pueden deberse a la composición y la estructura de las hojas
estas presentan estomas, lenticelas, tricomas y quizá daños algunos
mecánicos en su superficie no detectables a simple vista, todos sitios donde los
microorganismos pueden penetrar quedar protegidos del efecto de los agentes
germicidas y cada espinaca es una unidad experimental que presenta
diferencias con las otras espinacas utilizadas (Burnett y Beuchat, 2001;
Beuchat, 2002).
En la Figura 4 se muestran las medias de reducción global para los tres
tratamientos aplicados en cada una de las cepas probadas.
39
2.4
LOG DE UFC/ESPINACA
2.2
a
a
2
a
a
1.8
a
1.6
a
a
a
1.4
a
a
1.2
1
0.8
0.6
0.4
0.2
0
Scott A
101-M
LCDC
F6
V7
L75
101-14
L26
L18
L15
CEPAS
Figura 4. Reducción global en las poblaciones de L. monocytogenes en
espinaca por efecto de la desinfección con cloro y ácido peracético.
Los valores de las reducciones microbianas para las diferentes cepas
probadas no mostraron diferencia estadística significativa entre ellas, con una
diferencia en los valores de reducción entre la cepa Scott A y L15 de 0.81 log
de UFC, la amplia variabilidad en los resultados no permite que el análisis de
varianza indique que entre estas talvéz si exista diferencia significativa en su
resistencia a los germicidas probados; la cepa que mostró mayor reducción fue
la Scott A la cual no ha tenido contacto previo con germicidas ni se ha expuesto
a otro tipo de factor estresante comparada con la cepa L15 la cual fue aislada
de restos de espinaca que se encontraban en el piso de la planta (Esquivel,
2009); sitio donde es común encontrar restos de germicidas los cuales no
contienen la concentración suficiente para lograr la inactivación de los
microorganismos. Adicionalmente los restos de espinaca pueden permanecer
en el piso durante varios días en donde los microorganismos se encuentran en
condición de estrés el cual les provoca daño subletal, la exposición de las
bacterias a germicidas a concentraciones subletales puede inducir el
incremento de la resistencia microbiana a estos agentes (Mereghetti et al.,
2000). Se ha sugerido que tanto el uso de germicidas químicos como el de
antibióticos deben ser utilizados a los tiempos y a las concentraciones
recomendadas, para evitar la adaptación bacteriana.
40
Los mecanismos de adapatación que generan los microorganismos
ante condiciones adversas en nuestros días han sido poco caracterízados. Heir
et al. (1998) y Aase et al. (2000) propusieron que la resistencia que expresan
los microorganismos a germicidas químicos es causada por la activación de
mecanismos internos de expulsión que evitan el paso de sustancias tóxicas al
interior de las células o bien eliminándolas de su interior. Este mecanismo se
ha demostrado en algunas cepas de L. monocytogenes expuestas a cloruro de
benzalconio (Heir et al., 1998; Aase et al., 2000).
Mereghetti et al. (2000) reportaron que cepas de L. monocytogenes
mostraron resistencia a QACs (sales cuaternarias de amonio) a los que se
exponían constantemente; en estas cepas no se detectó la presencia de
plásmidos, por lo que su resistencia fue atribuida a sus características innatas.
Sapers (2001) reportó que los métodos actuales de lavado y
desinfección, no logran reducir la carga microbiana en más de 2 log por tal
motivo es necesario comprender los mecanismos por los cuales las bacterias
lograr sobrevivir a los tratamientos de desinfección actualmente utilizados, con
la finalidad de mejorar su eficacia y de esta forma reducir el riesgo de enfermar
por el consumo de alimentos minimamente procesados.
Beuchat et al. (2005) obtuvieron reducciones microbianas mayores en
hojas de lechuga completas comparadas a las obtenidas en hojas picadas
empleando cloro, esto fue quizá porque al realizar el corte, los microorganimos
pueden adherirse a los bordes y evitar el contacto con el germicida; o bien la
liberación de fluidos (materia orgánica) que reaccionan con el cloro
neutralizándolo.
Zhang y Farber (1996) evaluaron el efecto de los germicidas cloro (200
ppm, 10 min.), dióxido de cloro (5 ppm, 10 min.) y fosfato trisodico (SalmideR,
200 ppm, 10 min.) en lechuga y col inoculadas con L. monocytogenes. Las
máximas reducciones al aplicar cloro a 4 y 22ºC fueron de 1.3 y 1.7 log para
lechuga y 0.9 y 1.2 log para col, respectivamente. El dióxido de cloro a 4 y 22ºC
redujo 1.1 y 0.8 log UFC en lechuga, y 0.4 y 0.8 log UFC en col,
41
respectivamente mientras que SalmideR a 22ºC redujo 1.8 y 0.6 log UFC en
lechuga y col, respectivamente. En nuestro estudio se obtuvieron reducciones
con valores cercanos al utilizar hipoclorito de sodio (200 ppm, 5 min.) en
espinacas inoculadas con L. monocytogenes.
El Cuadro 5 muestra el análisis de varianza, el efecto de cada uno de
los factores (cepa y desinfectante) asi como su interacción en las reducciones
microbianas obtenidas en cada tratamiento. El tipo de cepa así como el tipo de
desinfectante tienen efecto significativo en las reducciones obtenidas siendo el
tipo de desinfectantes el factor de mayor importancia en las reducciones
obtenidas (p=<0.0001) seguida de el tipo de cepa (p=0.0418); la interacción
entre ambos factores no tuvo efecto significativo (p=0.7381).
Cuadro 5. Valores F y significancia estadística en el análisis de varianza
para los factores y su interacción.
Factor
Grados de Libertad
F
Valor de P
Cepa (A)
9
2.12
0.0418
Desinfectante (B)
2
46.56
<0.0001
18
0.76
0.7381
Interacción
AB
(P<0.05)
En la Figura 5 se muestran las medias de las reducciones obtenidas con cada
una de los germicidas empleados, al efectuar la comparación entre estos
valores mediante la prueba de Tukey, las reducciones obtenidas presentaron
diferencia estadística significativa entre ellas. Beuchat (1998) reportó una
reducción máxima de 2 Log utilizando solución de cloro a 100 ppm durante 20
minutos. Brackett (1997) desinfectó coles de bruselas inoculadas con L.
monocytogenes mediante inmersión en solución de cloro a 200 ppm durante 10
segundos y obtuvo una reducción de 2 log. Los resultados de ambos estudios
son valores similares a los obtenidos en esta investigación al utilizar hipoclorito
de sodio ya que obtuvimos una reducción de 2.23 log.
42
REDUCCIÓN (LOG UFC/ESPINACA)
2.5
a
2
b
1.5
1
c
0.5
0
CLORO
ÁCIDO
PERÁCETICO
AGUA
Figura 5. Reducción global en la población de L. monocytogenes por
efecto del tratamiento con cloro, ácido peracético y agua. Los valores
representan la media de 9 valores ± error estándar. a, b, c Letras
diferentes indican diferencia estadística significativa.
Beuchat et al. (2004) reportaron una reducción de 0.62 log de UFC/g
después de sumergir en agua durante 15 s hojas de lechuga inoculadas con L.
monocytogenes. Serna (2008) observó una reducción de 0.6 log después de
sumergir cilantro inoculado con Salmonella en agua durante 5 minutos;
resultados similares a los obtenidos en está investigación, después de sumergir
espinacas inoculadas con L. monocytogenes en agua durante 5 minutos se
obtuvo una redución de 0.64 log, reducciones debidas al arrastre mecánico.
Esquivel (2009) evaluó la efectividad del hipoclorito de sodio (200
ppm/5 min.) y ácido peracético (80 ppm/5 min) en la inactivación de L.
monocytogenes inoculada en espinaca; las reducciones obtenidas fueron de
1.65 y 2.11 log UFC/espinaca para hipoclorito de sodio y acido peracetico,
respectivamente. En su investigación se utilizó una mezcla de cinco de las
cepas aisladas de la planta procesadora: F6, F15, F26, F75 y F16. Las mismas
cepas se utilizaron en esta investigación, sin embargo cada una de ellas se
estudio de manera individual. Los valores encontrados por Esquivel (2009)
muestran que el germicida más eficaz en la reducción microbiana fue el ácido
peracético; en contraste con esta investigación el hipoclorito de sodio fué el
43
germicida más efectivo. La diferencia en los resultados pudo deberse al ajuste
del pH a 6.5 ± 0.5 de la solución de hipoclorito de sodio empleada en nuestro
trabajo, propiciando un incremento en el porcentaje de ácido hipocloroso
(HClO) en la solución aumentando su efecto germicida.
Beuchat et al. (2004) obtuvieron reducciones en poblaciones de L.
monocytogenes de 1.33 log en lechuga picada y 1.68 log en piezas completas
de lechuga después de exponer el producto a soluciones de cloro (100
ppm)..En el mismo trabajo se evaluoo la efectividad de Tsunami 100 (ácido
peracético) a 80 ppm; obtuvieron reducciones de 1.59 log, resultados similares
a los obtenidos en esta investigación en donde la reducción observada
después de exponer las células a la solución de Tsunami (80 ppm) fue de 1.53
UFC/espinaca.
5.2 Exposición consecutiva de células de la cepa L15 a cloro en
suspensión (buffer de fosfatos)
De las diez cepas probadas en los tratamientos de desinfección se
seleccionó la cepa que mostró menor reducción en la población bacteriana
(cepa L15), es decir la cepa más resistente. Con la finalidad de determinar la
máxima concentración de cloro que pudiera tolerar, se realizaron exposiciones
en buffer de fosfatos adicionado de hipoclorito de sodio a diferentes
concentraciones (10, 20 y 40 ppm) durante 30, 60 y 90 segundos. Las células
sobrevivientes se recuperaron y fueron expuestas nuevamente al germicida;
este procedimiento se repitió hasta por cinco ocasiones de forma consecutiva.
El Cuadro 6 muestra los valores obtenidos en cada uno de los tratamientos.
44
Cuadro 6. Reducción de la cepa L15 en soluciones de cloro a
diferentes concentraciones y tiempos de contacto.
Día
1
2
3
4
5
Concentración Tiempo
(ppm)
(s)
Reducción (Log UFC/ml)
. 4.90
.4.91
.3.44
.4.77
> 6.79
30
6.27
5.85
5.78
5.76
> 6.79
10
60
6.59
> 6.65
> 6.80
> 6.79
> 6.79
90
20
30
60
90
4.80
5.54
6.37
4.32
5.61
6.40
4.61
5.92
> 6.80
4.76
5.98
> 6.79
> 6.79
> 6.79
> 6.79
40
30
60
90
4.42
6.95
> 6.85
6.04
6.71
> 6.65
4.68
5.72
> 6.80
> 6.79
> 6.79
> 6.79
> 6.79
> 6.79
> 6.79
La exposición consecutiva de las células de la cepa L15 a cloro en
suspensión aparentemente no ocasionó incremento en la resistencia. To et al.
(2002) en un estudio similar obtuvieron un incremento en la tolerancia de
células de L. monocytogenes expuestas a cloruro de benzalconio de forma
gradual al exponer durante una semana las células del patógeno a
concentraciones crecientes del germicida; en la décima transferencia el
patógeno expresó la mayor resistencia al germicida. La falta de la expresión de
la resistencia en nuestros experimentos puede tener varias explicaciones: 1) el
tiempo de contacto de las celulas de L. monocytogenes con el germicida no fue
suficiente para propiciar el incremento en la resistencia, 2) durante los pases de
las células a caldo y agar las células dejaron de estar en contacto con el agente
estresante (cloro) propiciando que las celulas cancelaran el mecanismo de
defensa ante el agente estresante. Esta situación llevó al planteamiento de una
nueva estrategia: aumentar el tiempo de contacto de las células con el
germicida y reducir la concentración.
.
45
5.2.1 Exposición consecutiva a cloro en células de L. monocytogenes
inoculadas en la superficie de espinaca, acero inoxidable y N-rubber
En el Cuadro 7 se muestran los resultados obtenidos después de
aplicar tratamientos con cloro en la superficie de espinaca, acero inoxidable y
N-rubber inoculados con L. monocytogenes. Al igual que en la suspensión de
buffer de fosfatos no se observó un incremento en la resistencia de las células
al germicida. Al sexto dia de transferencia de las células unicamente
recuperamos sobrevivientes de los tratamientos que fueron realizados en la
superficie de acero y N-rubber. Esto quizá pudo ser ocasionado por la
concentración del germicida ya que para estos materiales fue menor que la
utilizada en los tratamientos realizados en espinaca.
Cuadro 7. Reducción en la población de L. monocytogenes en materiales
inertes y espinaca por efecto de la exposición consecutiva a cloro.
Material
Acero
N-rubber
Espinaca
Concentración
(ppm)
Tiempo
(min)
Réplica
20
1
20
Día
1
2
3
4
5
6
1
3.67
>7.30
>7.30
>7.30
>7.30
>7.30
1
2
3.53
3.23
2.28
1.93
3.49
3.13
20
1
3
2.91
>7.30
>7.30
>7.30
>7.30
>7.30
20
1
1
4.11
2.40
3.11
3.21
3.51
3.75
20
1
2
4.76
2.67
3.12
3.06
4.16
3.19
20
1
3
3.60
3.16
2.39
2.74
4.33
3.47
200
5
1
1.56
4.68
1.31
>7.30
>7.30
>7.30
200
5
2
1.89
4.31
2.42
>7.30
>7.30
>7.30
200
5
3
2.34
4.40
2.44
>7.30
>7.30
>7.30
46
5.2.2 Comportamiento de células de L. monocytogenes en CST expuestas
consecutivamente a cloro
Con la finalidad de conocer si el comportamiento de las células de L.
monocytogenes (cepa L15) recuperadas después de las exposiciones
consecutivas a cloro en la superficie de espinaca, acero inoxidable y N-rubber,
era diferente, se efectuaron mediciones de los cambios en la densidad óptica
(D.O.) utilizando el equipo computarizado Bioscreen C (Figura 6).
0.7
0.6
0.6
0.5
0.5
Tiempo (horas)
2 UFC/ml
2 UC/ml Cloro
6 UFC/ml Cloro
2 UFC/ml
C
20
17
18.5
14
15.5
11
2 UFC/ml Cloro
6 UFC/ml Cloro
D
N-RUBBER
0.7
ACERO
0.6
0.3
Tiempo (horas)
2 UFC/ml
2 UFC/ml Cloro
18.5
0
20
17
18.5
14
15.5
11
12.5
9.5
8
6
4.5
0
3
0
1.5
0.1
0
0.1
15.5
0.2
12.5
0.2
0.4
9.5
0.3
0.5
6
0.4
3
0.5
D.O. (nm)
D.O. (nm)
12.5
Tiempo (horas)
0.7
0.6
8
0
20
17
18.5
14
15.5
11
12.5
8
9.5
6
3
0
4.5
0
0
0.1
1.5
0.1
9.5
0.2
3
0.2
0.3
4.5
0.3
0.4
1.5
0.4
B
ESPINACA
6
A
CONTROL
D.O. (nm)
D.O. (nm)
0.7
Tiempo (horas)
2 UFC/ml
6 UFC/ml Cloro
2 UFC/ml Cloro
6UFC/ml Cloro
Figura 6. Comportamiento de L. monocytogenes en CST a 35ºC. A)
células no expuestas a cloro; B) células recuperadas despúes de tres
exposiciones consecutivas a cloro en la superficie de espinaca; C) células
recuperadas despúes de seis exposiciones consecutivas a cloro en la
superficie de acero; D) células recuperadas despúes de seis exposiciones
consecutivas a cloro en la superficie de N-rubber.
47
En estos experimentos se utilizaron dos niveles de inóculo (bajo 2
UFC/ml y alto 6 UFC/ml) en ambos se agrego cloro con el objetivo de comparar
si las células que estuvieron previamente en contacto con el germicida (células
recuperadas) mostraban cambios en la duración de cada fase de la curva de
crecimiento. El comportamiento de las células previamente expuestas a cloro
mostraron un comportamiento similar al de las células control (sin exposición
previa al germicida), lo que puede indicar que en las células expuestas no hubo
cambios importantes a nivel fisiológico.
5.3 Comportamiento de L. monocytogenes en medio Evans modificado
La siguiente estrategia que se planteó para inducir resistencia a cloro
en la cepa L15, fue exponer las células al germicida durante periodos de
tiempo más prolongados a los probados en los experimentos previos. En esta
estrategia se mantuvo a las células en contacto con el germicida evitando las
transfrencias en caldo o medio de cultivo lo cual pudo haber interferido con la
expresión de la resistencia. Para llevar a cabo lo anterior se disminuyó la
concentración de cloro y se necesitó de un medio que no tuviera materia
orgánica ya que esta reacciona con el cloro neutralizando su efecto germicida.
En la literatura se ha reportado que un medio empleado para caracterizar
proteínas que los microorganismos expresan cuando se encuentran en
contacto con germicidas químicos es el medio Evans (Lupi et al., 1995). Así
que para conocer si el medio Evans era adecuado para nuestros propósitos se
efectuaron dinámicas de crecimiento. Se evaluaron tres concentraciones del
medio Evans: preparado conforme lo reportado por Lupi et al. (1995), diluido
1:1 y 1:10 en agua, con el objetivo de conocer si la concentración tenia efecto
en el desarrollo microbiano. La Figura 7 muestra el desarrollo de L.
monocytogenes a 22 y 30ºC en el medio a las tres concentraciones estudiadas.
48
7
30ºC
6
5
Log UFC/ml
Log UFC/ml
7
22ºC
6
4
3
2
5
4
3
2
1
1
0
0
0
6
12
24
30
Tiempo (horas)
ME
ME 1:1
36
0
48
6
12
24
30
36
48
Tiempo (horas)
ME 1:10
ME
ME 1:1
ME 1:10
Figura 7. Dinámicas de crecimiento de la cepa L15 en medio Evans
modificado a tres diferentes concentraciones. -ME: medio completo; -ME:
medio diluido al 50%; -ME: medio diluido 90%.
Se observa que el desarrollo de los microorganismos a 22ºC fue más
lento en el medio no diluído comparado con el desarrollo microbiano en el
medio diluido. Este comportamiento pudo ser ocasionado por la concentración
de sales ya que estas pudieron ejercer estrés osmótico sobre las células
disminuyendo su crecimiento. A 30ºC el desarrollo en el medio fue similar para
las tres concentraciones probadas. Por lo anterior se decidió seguir utilizando el
medio diluido 50% (en agua) para los experimentos sucesivos.
5.3.1 Exposición de células de L. monocytogenes a cloro en medio Evans
modificado
Con el objetivo de conocer la resistencia de las cepas seleccionadas
(más resistente L15 y más sensible Scott A) a hipoclorito de sodio a
concentraciones relativamente bajas (~1.5 mg/L, preparado en medio Evans
modificado) estas fueron expuestas al germicida durante 150 min. a 22 y 30°C
(Figura 8).
49
Reducción (Log UFC/ml)
Reducción (Log UFC/ml)
8
8
7
6
5
4
3
2
1
6
5
4
3
2
1
0
0
0
20
40
60
90
150
Tiem po (m in)
0
20
40
60
90
Tiempo (min)
A
8
150
B
8
Reducción (Log UFC/ml)
Reducción (Log UFC/ml)
7
7
6
5
4
3
2
1
0
7
6
5
4
3
2
1
0
0
20
40
60
Tiem po (m in)
90
150
0
C
20
40
60
Tiem po (m in)
90
150
D
Figura 8. Comportamiento de las cepas de L. monocytogenes
seleccionadas en medio Evans modificado adicionado de cloro. A)
cepa L15, 22ºC; B) cepa Scott, 22ºC; C) cepa L15, 30ºC; D) cepa Scott A,
30ºC.
Las células de la cepa L15 mostraron una reducción de 5.86 log
UFC/ml después de 150 minutos de incubación a 22ºC mientras que la
reducción obtenida después de 150 minutos a 22ºC de la cepa Scott A fue de
7.95 log UFC/ml; ambos resultados indican una tendencia a la inactivación en
fución del tiempo lo que nos permite concluir que las células no estan
expresado adaptación al germicida. Sin embargo el comportamiento de las
células de la cepa L15 a 30ºC después de 150 minutos redujo en 3.70 log
UFC/ml, mientras que para la cepa Scott A la reducción obtenida fue de 7.45
log UFC/ml. Estos resultados nos indican que la cepa L15 tiene una mayor
capacidad de sobrevivir en presencia del germicida cuando este se encuentra a
concentración subletal comparada con la cepa de colección Scott A.
50
En el Cuadro 8 se muestran los valores de los microorganismos
sobrevivientes a la exposición a cloro de las cepas L15 y Scott A después de
150 minutos de incubación.
Cuadro 8. Células de las cepas Scott A y L15 sobrevivientes a la
exposición a cloro
Tiempo
Sobrevivientes (Log UFC/ ml)
(min.)
L15
Scott A
22ºC
30ºC
22ºC
30ºC
0
7.73
7.38
7.76
7.84
20
6.64
6.46
6.50
6.81
40
5.62
5.84
5.68
5.63
60
5.27
5.53
4.62
5.24
90
4.63
5.18
<1.00
0.67
150
2.20
4.41
<1.00
<1.00
Los valores obtenidos para ambas cepas a 22ºC muestran que la
sobreviencia después de 150 minutos fue casi nula con una diferencia entre
ellas de 2.20 log UFC/ml; mientras que a 30ºC la cepa L15 mostró mayor
resistencia comparada con la cepa Scott A con una diferencia entre ambas de
4.41 log UFC/ml.
El Cuadro 9 muestra el análisis de varianza de los resultados de las
reducciones obtenidas después de exponer las células de las cepas Scott A y
L15 a cloro en medio Evans.
Cuadro 9. Valores F y significancia estadística para los factores y su
interacción.
Factor
Grados de Libertad
F
Valor de P
Cepa (A)
1
29.0763
<0.0001
Temperatura (B)
1
3.0203
0.0869
Tiempo (C)
1
243.6152
<0.0001
Interacciones
AB
1
0.4668
0.4968
ABC
1
1.2455
0.2685
(P < 0.05).
51
Se puede observar que el tipo de cepa (p=<0.0001) y el tiempo
(p=<0.0001) tienen efecto significativo en la resistencia de las células al
germicida, mientras que la temperatura muestra un ligero efecto (p=0.0869), sin
embargo como se observa en las gráficas la temperatura de incubación si
influye en las reducciones obtenidas, quizá la amplia variabilidad obtenida en
los resultados eviten que en el análisis de varianza el efecto de este factor sea
considerado estadísticamente significativo. La interacción cepa temperatura no
tiene efecto significativo (p=0.4968) ni la interacción cepa temperatura tiempo
(p=0.2685).
En el Cuadro 10 se muestra los resultados de la prueba de Tukey para
las medias de reducción obtenidas en ambas cepas; en estos resultados
podemos comparar los resutados globales obtenidos de los tratamientos
realizados.
Cuadro 10. Prueba de Tukey de las reducciones
obtenidas con las cepas seleccionadas.
Cepa
Media
L15
2.20a
Scott A
3.66b
a, b
Los valores seguidos de letras distintas
indican diferencia estadística significativa.
Las reducciones obtenidas en las cepas Scott A y L15 muestra
diferencia estadística siginificativa lo cual nos confirma que la cepa L15 tiene
mayor capacidad para sobrevivir en presencia de cloro (~1.50 ppm) comparada
con la cepa Scott A.
Se ha reportado que la fase de crecimiento en la cual se encuentren las
bacterias cuando son expuestas a algún tipo de estrés es un factor primordial
en su capacidad para adaptarse ante estas condiciones. Se especula que las
bacterias muestran mayor tolerancia al estrés cuando se encuentran en la fase
52
estacionaria, debido a que en esta incrementan los niveles del factor sigma
RpoS. Al inicio de esta fase, este factor incrementa la expresión de genes, los
cuales codifican enzimas, incluidas proteínas que reparan los daños
ocasionados por el agente estresante (Fratamico et al., 2005). En esta
investigación las células de L. monocytogenes se inocularon en el medio Evans
cuando se encontraban en fase estacionaria para evaluar su susceptibilidad al
cloro ya que en está son más resistentes ante estrés y el factor sigma RpoS
puede inducir la transcripción de proteínas responsables de proteger a las
celulas del daño ocasionado por el estrés químico, o bien inducen la activación
de sistemas encargados de reparar proteínas, ADN u otras moléculas que
fueron dañados por el agente estresante.
5.3.2 Detección de ADN plasmídico en las cepas seleccionadas
Con la finalidad de explicar la aparente resistencia a cloro mostrada por
la cepa L15 se investigó la presencia de ADN plasmídico ya que se ha
reportado que el material genético que se encuentra en los plásmidos pueden
contener información genética que confiera resistencia a antibióticos, está
resistencia puede generar alteraciones en la membrana celular y estas a su vez
provocar mayor susceptiblidad ante tratamientos germicidas (Russell, 1991).
Russell y Day (1996) propusieron que puede existir resistencia cruzada
entre la resistencia a antibióticos y la resistencia a germicidas. Russell (1997)
reportó que la resistencia a antibióticos que es mediada por plásmidos, puede
conferir protección cruzada a los germicidas; por ejemplo: cepas de
Sthaphylococcus aureus y Sthaphylococcus epidermidis ambas resistentes a
antibióticos mostraron resistencia a clorhexidina y a compuestos de amonio
cuaternario.
Moken et al. (1997) reportaron que cepas de Escherichia coli
resistentes a antibióticos expresan protección cruzada contra algunos
desinfectantes domésticos como el aceite de pino.
En está investigación se utilizaron células de la cepa L15 (más
resistente) y como control células de la cepa Scott A (más sensible); para lo
cual se tomaron muestras de los tratamientos realizados siguiendo la
53
metodología descrita en el apartado 4.3.3.4 al final del tiempo de incubación
(150 min) ya que si un porcentaje de la población bacteriana tiene plásmido es
probable que las células sobrevivientes después de la exposición a cloro sean
las que lo contengan considerando que este les confiera reistencia al
germicida. Los resultados se muestran en la Figura 9. Las bandas observadas
no se asocian con la presencia de ADN plásmidico, ya que de encontrarse
presentes se esperaría observar bandas desplazadas a mayor distancia de los
carriles de carga (pozos) debido a que el peso molecular de los plásmidos es
menor comparado con el del ADN genómico.
1 2 3 4 5
Figura 9. ADN de las cepas L15 y
Scott A. Carriles 1) L15, 2) Scott A, 3)
L15, 4) Scott A, 5) L15.
5.3.3 Cambios en la estructura celular de L. monocytogenes expuestas a
cloro
Las células de la cepa L15 expuestas a cloro durante 20 y 120 min a
30ºC se observaron al microscopio electrónico de transmisión para visualizar
posibles cambios en las estructuras célulares causados por el germicida.
En la Figura 10 se muestran las micrografías electrónicas de
transmisión de las células de la cepa L15: células control (cultivadas en CST
54
por 24 h a 35ºC, sin exposición a cloro) y las que fueron expuestas a cloro
durante 20 y 120 minutos.
a
b
c
d
e
f
Figura 10. Micrografías electrónicas de transmisión (TEM) células de la
cepa L15 (~1 x 10 8 UFC/ml); después de la exposición a cloro (~1.50 ppm
a 30ºC) y células que no fueron expuestas a cloro incubadas en CST (18
h/35ºC). a y b) Células control (sin exposición previa a cloro); c y d) células
expuestas a cloro durante 20 min.; e y f) células expuestas a cloro durante 120
min.
Las micrografías de las células de L. monocytogenes que no fueron
expuestas a cloro presentan una membrana intacta y un citoplasma
homogéneo, lo que nos indica que estas quizá se encontraban en un estado
fisiológico óptimo (micrografías a y b, Figura 10).
Varias investigaciones señalan que el cloro actua principalmente en la
pared y membrana celular ocasionando pérdida su integridad permitiendo que
salgan aminoácidos libres, ATP, ocasionando pérdida irreversible de la
viabilidad (Abee et al., 1994; McDonnell y Russell, 1999; Vignoli, 2008).
55
En las micrografías c y d de la Figura 10 se muestran los cambios en la
estructura de las células de L. monocytogenes después de que fueron
expuestas a hipoclorito de sodio durante 20 minutos a 30ºC, Las células
presentan alteraciones: invaginaciones o repliegues en la membrana y algunas
precipitaciones en el citoplasma alteriaciones producidas por el germicida.
Las micrografías e y f (Figura 10) muestran el efecto del cloro en las
células de L. monocytogenes después de 120 min de contacto. En estás un
mayor porcentaje de la población presenta precipitación en su citoplasma en
comparación con las micrografías de las células que fueron expuestas al
germicida durante 20 min., lo que indica un incremento en el número de
microorganismos dañados por el germicida.
Sivarooban et al. (2008) en su investigación expusieron células de L.
monocytogenes sensibles (nativas) y resistentes a nisina (1,000 IU) durante 3 h
a 37ºC, estás fueron observadas mediante microscopio electrónico de
transmisión. Los cambios morfológicos observados en la membrana de las
células resistentes y sensibles a nisina fueron similares.
McDonnell y Russell (1999) propusieron que la resistencia a germicidas
químicos mostrada por células de L. monocytogenes es ocasionada por
modificaciones en el grosor y el grado de entrecruzamiento del peptidoglucano
de la pared celular. Estos cambios también pueden generar alteraciones en el
perfil de ácidos grasos provocando que la morfología y cargas superficiales
sean diferentes comparadas con las que poseen las células sensibles. Se ha
reportado que en respuesta al estrés y para lograr una adaptación, se lleva a
cabo un reacomodo de los ácidos grasos de la membrana bacteriana, con la
finalidad de impedir la entrada de sustancias tóxicas al citoplasma bacteriano.
Otras modificaciones reportadas en células que expresaron mayor resistencia a
sales cuaternarias de amonio (QACs) son cambios en la proporción
carbohidrato:lípido de los lipopolisacáridos de la membrana celular, logrando
evitar la penetración de QACs, este mecanismos fue dilucidado en células
Gram-negativas (Guerin-Mechin et al., 2000). Sin embargo existe poca
56
información sobre los mecanismos y alteraciones ocasionados en las células
Gram-positivas que expresan resistencia a germicidas químicos.
To et al. (2002) encontraron que células de L. monocytogenes
incrementaron su resistencia ante la exposición a cloruro de benzalconio
cuando este se encontraba a concentraciones subletales, después de una
semana de exposición. La resistencia incrementó hasta la décima transferencia
en el germicida el cual se utilizó en concentraciones crecientes; a partir de la
décima transferencia no se incrementó la resistencia. Los cambios encontrados
en la superficie de las células resistentes al germicida fueron: incremento en el
grosor de la membrana la cual mostró ser rugosa y áspera comparada con las
células que no expresaron resistencia al germicida. En esa misma investigación
por medio de micrografías electrónicas de transmisión se especuló que se
había activado un mecanismo de una bomba interna en las células bacterianas
que mostraron ser resistentes ya que esta puede excretar algún polímero o
sustancia o quizá este mecanismo le permita evitar la penetración de
sustancias, cambio que no se observó en las células sensibles. Otra teoría fue
que en las cepas que mostraron mayor resistencia existe un incremento en la
cantidad de ácidos grasos que conforman la membrana, los cuales tienen
efecto en su incremento en la resistencia a cloruro de benzalconio (To et al.,
2002).
5.4. Inducción de la formación de biopelículas
Para conocer si la resistencia al hipoclorito de sodio observada en la
cepa L15 se asociaba a la producción de biopelículas, se repitió el experimento
en las mismas condiciones (medio Evans con y sin la adición de cloro e
inoculado con las cepas L15 y Scott A) y en el medio Evans se introdujeron
círculos de acero inoxidable y polipropileno.
Varios investigadores han reportado que la exposición prolongada de
los microorganismos a niveles de estrés subletal tanto físicos como químicos
genera resistencia cruzada a otros tipos de estrés; por ejemplo, la exposición a
57
ácidos induce la resistencia a altas temperaturas, radiaciones UV, etc. (To et
al., 2002; Fratamico et al., 2005).
En las Figuras 11, 12, 13 y 14 se muestran las micrografías
electrónicas de barrido de los diferentes tratamientos. En ninguna de estas se
observa la presencia de biopelículas, aunque se observan células aisladas de
L. monocytogenes adheridas a la superficie de ambos materiales. Estos
resultados indican que posiblemente el tiempo de incubación no fue el
suficiente para permitir que las bacterias sintetizaran los polisacáridos y por
ende la biopelícula (Costerton, 1999; Betancourt et al., 2004), o quizá la mínima
cantidad de nutrientes que contiene el medio Evans no fue suficiente para que
las células realizaran la síntesis de los exopolisacáridos durante los 150
minutos de incubación. En cuanto a la viabilidad de las células adheridas a la
superficie de ambos materiales (acero inoxidable y polipropileno) los resultados
obtenidos en los diferentes tratamientos realizados no permiten deducir cual
fue el comportamiento de las células adheridas en las superficies debido a la
baja cantidad de células encontradas.
Ravishankar et al. (2000) reportaron que células de Listeria que han
sido expuestas ante ácidos incrementan su resistencia a estos y también al
estrés generado por la actividad del sistema lactoperoxidasa. En nuestra
investigación se propuso que el estrés oxidativo provocado por el contacto de
las células con hipoclorito de sodio adicionado al medio Evans podría
incrementar la capacidad de las células para formar biopelículas, y de está
forma permitirnos distinguir la diferencia en la capacidad de formar biopelículas
que pudiera existir entre las cepas probadas (L15 y Scott A).
Silva et al. (2008) en su investigación acerca de la adhesión y viabilidad
de L. monocytogenes en la superficie de acero inoxidable, polipropileno, vidrio
y mármol en la cual las condiciones fueron similares a las utilizadas en esta
investigación (incubaron 25ºC durante 120 minutos con agitación a 120 rpm).
Utilizaron un inóculo de aprox. 1x108 ufc/ml, transcurrido el tiempo de
incubación la viabilidad de las células adheridas en los diferentes materiales
fue diferente en cada material y dependiente de su rugosidad del material y
58
carga electrostática de las células y del material inerte. Se ha reportado que el
estrés por escasez de nutrientes provoca en los microorganismos de forma
general disminución en su tasa metabólica por lo que estás entran en fase
estacionaria; en los microorganismos no esporulados una vez que se
encuentran en está fase ocurren cambios en la composición de las proteínas
celulares ya que estás son utilizadas para obtener energía reduciendo el gasto
de energía con la fnalidad de conservar su viabilidad (Kolter et al., 1993).
L. monocytogenes presenta movilidad tipo "tumbling" en el rango de
temperatura de 20-25oC, ya que a esta temperatura expresa sus flagelos
(Brackett, 1988). Es conocido que los estructuras bacterianas como flagelos y
pilis pueden favorecer la adhesión de las bacterias a superficies ya que se
aumenta el área de contacto entre las bacterias y las superficies (Lejeune,
2003). Por esta razón en esta investigación se realizó a 22ºC.
59
A
B
D
C
Figura 11. Micrografías electrónicas de barrido de la superficie de acero
inoxidable incubado a 22ºC en medio Evans inoculado con la cepa L15. A
y B) sin cloro; C y D) adicionadas de cloro (~1.5 ppm).
Las muestras correspondientes a las micrografías A y B de la Figura 11
presentan menor cantidad de bacterias adheridas a la superficie de acero
comparadas con las micrografías C y D, en estas últimas las bacterias se
encontraban en presencia de cloro.
60
A
B
D
C
Figura 12. Micrografías electrónicas de barrido de la superficie de
polipropileno incubado a 22ºC en medio Evans inoculado con la cepa L15.
A y B) sin cloro; C y D) adicionadas de cloro (~1.5 ppm).
En las micrografías A, B y D de la Figura 12 se observan pocas
bacterias. La cantidad de bacterias fue similar a la encontrada en las muestras
que tienen cloro y las que no, lo cual indica que la presencia de este no
incrementó la adhesión a la superficie por parte de las bacterias.
61
A
C
B
Figura 13. Micrografías electrónicas de barrido de la superficie de acero
inoxidable incubado a 22ºC en medio Evans inoculado con la cepa Scott
A. A) sin cloro; B y C) adicionadas de cloro (~1.5 ppm).
En la micrografía A de la Figura 13 se observa una estructura la que
quizá sea una agrupación bacteriana que se encuentre cubierta por
polisacáridos. En las micrografías B y C muestran la presencia de algunas
bacterias adheridas a la superficie.
62
A
B
Figura 14. Micrografías electrónicas de barrido de la superficie de
polipropileno incubado a 22ºC en medio Evans inoculado con la cepa
Scott A. A y B) sin cloro.
La resistencia de L. monocytogenes a cloro es afectada principalmente
por varios factores como el tipo de material donde se encuentre el
microorganismo adherido, la temperatura y el pH (Azevedo et al., 2006). Los
microorganismos que se encuentran formando parte de una biopelícula sufren
cambios fisiológicos que pueden tener efecto en su viabilidad (Azevedo, et al.,
2006). Se ha comprobado que cuando L. monocyotgenes forma parte una
biopelícula incrementa su resistencia comparada con la resistencia que
muestra en estado libre (Folsom y Frank, 2006).
Lundén et al. (2003) reportaron que en cepas de L. monocytogenes
aisladas de varias industrias que procesan alimentos las cuales fueron
expuestas de forma consecutiva a concentraciones crecientes de hipoclorito de
sodio y sales cuaternarias de amonio incrementaron su resistencia a ambos
germicidas. La resistencia expresada a hipoclorito de sodio se incrementó de
forma paulatina hasta el séptimo día, ya que después de este tiempo de
contacto la resistencia no se incremento más. Las células de L. monocytogenes
resistentes a los germicidas mostraron cambios fisiológicos, a los cuales se les
atribuyó el incremento en la resistencia es posible que estos se pierdan con el
tiempo si no se mantienen a las células en contacto con el agente estresante
(germicida). Células de L. monocytogenes expresaron adaptación ante la
exposición a QACs (concentraciones subletales) después de 2 horas su CMI
63
incrementó tres veces posterior al tiempo de contacto también se pesentaron
cambios fisiológicos en las células. La magnitud de la resistencia mostrada por
las cepas persistentes y esporádicas tuvo un valor cercano entre ambos tipos
de cepas.
Folsom y Frank (2006) reportaron que la resistencia de L.
monocytogenes a cloro cuando se encuentran en suspensión no es afectada
por el subtipo genético de cada cepa en contraste con las células que forman
parte de una biopelícula donde el subtipo genético estás posiblemente puede
influir en la resistencia que las células manifiestan en presencia de cloro. La
resistencia a cloro en células que forman parte de una biopelícula también
puede ser regulada por mecanismos diferentes a los que expresan las células
cuando se encuentran en suspensión. Se ha especulado que el incremento en
la resistencia bacteriana a los desinfectantes químicos puede ser ocasionada
por varios mecanismos que pueden llevarse a cabo simultáneamente (Aase et
al., 2000).
Wirtanen y Sandholm (1992) reportaron que la exposición de las
células de L. monocytogenes a cloro incrementa de forma significativa su
capacidad de sintetizar exopolisácaridos (menos tiempo para que se forme la
biopelícula).
En varias investigaciones se ha reportado que el incremento en la
resistencia a cloro mostrada por las células que formaban parte de una
biopelícula no depende de la cantidad de microorganismos ni de su morfología
celular. Se ha propuesto que la resistencia de las células es afectada por la
cantidad y el tipo de polisacáridos que forman la biopelícula; por lo tanto la
resistencia (innata) de cada una de las células que forman parte de una
biopelícula no tiene efecto en la resistencia a germicidas que muestran cuando
forman parte de una biopelícula (Aase et al., 2000; Pan et al., 2006).
64
VI CONCLUSIONES
1. El hipoclorito de sodio resultó el germicida más efectivo en la reducción de L.
monocytogenes inoculada en espinaca.
2. La cepa de L. monocytogenes que mostró mayor resistencia a la exposición
a cloro fue la L15. Esta cepa fue aislada de residuos de espinaca encontrados
en el piso de la fábrica donde se procesa la espinaca precocida y congelada.
Teóricamente las células inmersas en este material estuvieron expuestas a
concentraciones subletales de germicida, situación que pudo haber influído en
la adquisición de la aparente resistencia a cloro observada en este estudio.
3. La resistencia a cloro expresada por la cepa L15 no parece ser regulada por
un plásmido. Es posible que otros mecanismos, como la síntesis de proteínas
esten operando.
4. La resistencia observada en la cepa L15 tampoco se asoció con la formación
de biopeliculas en la superficie de acero inoxidable y polipropileno bajo las
condiciones probadas en este trabajo.
65
VII. BIBLIOGRAFÍA
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84
ANEXO
1.- Valoración de cloro disponible (Greenberg y col., 1992).
-Colocar 25 ml de la muestra
-Adicionar 10 ml de yoduro de potasio al 10% y 5 ml de ácido acético
glacial, agitar
-Titular con solución valorada de tiosulfato de sodio 0.01 M hasta aparición
de color amarillo pálido
-Adicionar 1 ml de solución de almidón al 0.5%, agitar
-Titular con solución valorada de tiosulfato de sodio 0.01 M hasta
desaparición de color azul
Cálculos:
V1 x N 1 x 3.55 x 104
Cloro disponible (ppm)
=
------------------------------------------m
V1 = Volumen de tiosulfato de sodio consumido en la titulación (ml)
N1 = Normalidad del tiosulfato de sodio
m = cantidad de muestra
2.- Valoración del ácido peracético (Greenspan y Mackellar, 1948).
Determinación del % de peróxido de hidrógeno
-Adicionar 10 ml de muestra en un matraz Erlenmeyer con 50 ml de ácido
sulfúrico 1 N
-Agregar dos gotas de indicador de ferroína y mezclar
85
-Titular con tiosulfato cérico 0.1 N hasta que persista la desaparición del
color naranja por un minuto. Registrar el volumen donde se observó el vire
de color como punto de equivalencia.
Determinación del % de ácido peracético
-Después de alcanzar el punto de equivalencia mencionado anteriormente,
agregar 10 ml de solución 2 N de yoduro de potasio y 2 ml de la solución
indicadora de almidón (solución 1 %), agitar
-Titular rápidamente con solución valorada de tiosulfato de sodio 0.1 N
hasta que el color naranja original aparezca. Registrar los mililitros de
tiosulfato gastados al punto de equivalencia.
Cálculos:
V1 x N 1 x meqH2O2 x F1x 100
% H 2O 2 =
------------------------------------------m
V1 = Volumen de sulfato cérico consumido en la titulación del H2O2 (ml)
N1 = Normalidad del sulfato cérico
meq H2O2 = PM H2O2 / no. e- cargados en la reacción redox = 0.017
F1 = Factor de dilución
m = cantidad de muestra
V2 x N 2 x meqAPA x F2x 100
% APA =
-------------------------------------m
V2 = Volumen de tiosulfato de sodio consumido en la titulación del APA
(ml)
N2 = Normalidad del tiosulfato de sodio
meq APA = PM APA / no. e- cargados en la reacción redox = 0.038
F2 = Factor de dilución
m = cantidad de muestra
86
NORMALIDAD REAL CERIO
F1 =
NORMALIDAD REAL DE
TIOSULFATO
--------------------------------------
F2 =
0.1
------------------------------------------0.1
3.- Metodología (lisis alcalina) extracción de ADN plásmidico
Sambrook et al. (1989).
Una vez que se obtiene el sedimento de las células de ambas cepas
se prosigue con el siguiente procedimiento:
1.- Resuspender las células en 1 ml de lisozima (0.5%), e incubar a 35
± 2ºC/20 min., posteriormente centrifugar durante 15 min. a 3500 rpm a 22ºC,
decantar el sobrenadante y adicionar 1 ml de solución STE (18ºC);
resuspender la pastilla, enseguida de centrifugación a 5,000 rpm durante 5
minutos a 22 ± 2ºC, decantar nuevamente el sobrenadante y dejar secar el
exceso de solución durante 5 min. a 22ºC, posteriormente adicionar 300 µl de
solución P1 (50 mM Tris/HCl, pH 8; 10 mM EDTA, pH 8; 400 µg/ ml RNAsa A),
nuevamente resuspender la pastilla con pequeños golpes evitando de esta
forma la desnaturalización de la RNAsa, agregar 300 µl de la solución P2
(NaOH 0.2M y SDS 1%), la cual debe ser preparada en el momento de su
utilización, mezclar por inversión de 4 a 6 veces e incubar a 22 ± 2ºC durante 5
minutos después de este tiempo puede ocasionarse degradación de el ADN
plasmídico (tiempo crítico).
2.- Agregar a la muestra 300 µl de P3 (solución de acetato de potasio
2.55 M y ácido acético glacial 35%, 4ºC), enseguida se mezclar por inversión
de 4 a 6 veces (lentamente). Esta mezcla se incuba durante 10 minutos a 4 ºC
(en hielo). Transcurrido este tiempo centrifugar (14,000 rpm/20 minutos, 4ºC),
recuperar el sobrenadante y transifirirlo a otro tubo, adicionar 600 µl de
isopropanol y mezclar en voxtex.
3.- Incubar a 22 ± 2ºC durante 5 minutos, posteriormente centrifugar
(14,000 rpm durante 20 minutos), decantar el sobrenadante y adicionar 500 µl
87
de etanol (70%), homogenizar la muestras completamente y centrifugar a
14,000 rpm durante 10 minutos, decantar el sobrenadante, secar durante 10
minutos a 22 ± 2ºC.
4.- Resuspender la pastilla en 50 µl de TE 1X.
88

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