peqGOLD MicroSpin Gel Extraction Kit

Transcription

Arbeitsanleitung – Instruction Manual
V0815
INHALT
EINLEITUNG
1
FUNKTIONSPRINZIP
1
KITBESTANDTEILE
2
LAGERUNG
2
WICHTIGE HINWEISE
2
GEFÄHRLICHE INHALTSSTOFFE
3
PEQGOLD MICROSPIN GEL EXTRACTION KIT PROTOKOLL
5
QUANTIFIZIERUNG DER DNA
7
TROUBLESHOOTING TIPS
8
PEQGOLD MICROSPIN PCR PURIFICATION PROTOKOLL
9
QUANTIFIZIERUNG UND LAGERUNG DER DNA
10
10
BESTELLINFORMATIONEN
11
CONTENT
INTRODUCTION
12
BENEFITS PRINCIPLE
12
BINDING CAPACITY
12
KIT COMPONENTS
13
STORAGE AND STABILITY
13
BEFORE STARTING
13
DANGEROUS COMPONENTS
14
PEQGOLD GEL EXTRACTION KIT PROTOCOL
16
YIELD AND QUALITY OF DNA
18
19
PURIFICATION AND CONCENTRATION OF PCR PRODUCTS
20
21
ORDERING INFORMATION
21
22
APPENDIX
23
EINLEITUNG
Die Aufreinigung von DNA aus Agarosegelen ist eine gängige Technik, um spezifische
Fragmente aus komplexen Reaktionsgemischen zu isolieren. Dabei kommt es allerdings in
vielen Fällen zu Problemen mit der vollständigen Entfernung der Agarose (was nachteilige
Auswirkungen auf Folgeanwendungen haben kann), zum Scheren der DNA oder zu
unbefriedigend niedrigen Erträgen – Schwierigkeiten, die bei Verwendung des peqGOLD
MicroSpin Gel Extraction Kits nicht auftreten. Mit seiner Hilfe können aus allen Arten von
Agarosegelen DNA-Fragmente mit einer Größe zwischen 60 bp und 40 kbp in einem
geringen Volumen von 10 – 20 µl und somit sehr konzentriert, extrahiert werden. Hierbei
sind Wiederfindungsraten von 80 % erreichbar. Jede PerfectBind MicroSpin DNA-Säule
kann bis zu 10 µg DNA binden.
DNA, die mit dem peqGOLD MicroSpin Gel Extraction Kit extrahiert wurde, kann direkt für
alle Arten von Folgeexperimenten, wie Ligationen, PCRs, Sequenzierungen,
Restriktionsverdaus und unterschiedlichste Labeling-Reaktionen eingesetzt werden.
FUNKTIONSPRINZIP
Das Gelstück mit der interessierenden Bande wird ausgeschnitten und in Bindepuffer gelöst.
Die erhaltene Lösung wird durch eine PerfectBind MicroSpin DNA-Säule zentrifugiert, in
der die DNA reversibel an eine PerfectBind Silikamembran binden kann. Nach zwei bis
drei kurzen Waschschritten wird die gereinigte DNA mit speziellem Elutionspuffer in einem
geringen Volumen eluiert.
Vorteile
!
Schnelligkeit – DNA-Extraktionen in weniger als 15 Minuten.
!
Geringes Elutionsvolumen - Spezielle Säulen ermöglichen die Aufreinigung von
konzentrierter DNA.
!
Zuverlässigkeit – Optimierte Puffer garantieren reinste DNA.
!
Sicherheit – Keine Notwendigkeit für organische Extraktionen.
!
Qualität – Für alle Folgeanwendungen geeignete DNA.
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1
Art.-Nr. 12-6294
KITBESTANDTEILE
5 Präparationen
50 Präparationen
200 Präparationen
12-6294-00
12-6294-01
12-6294-02
PerfectBind MicroSpin
DNA Columns
5
50
200
2 ml Collection Tubes
5
50
200
GP-Buffer
5 ml
30 ml
120 ml
MCP-Buffer
3 ml
30 ml
120 ml
CG-Wash Buffer
3 ml
20 ml
3 x 20 ml
Elution Buffer
2 ml
5 ml
20 ml
1
1
1
peqGOLD MicroSpin Gel
Extraction Kit
Bestellnummer
Bestandteile
Manual
LAGERUNG
Die Aufbewahrung des peqGOLD MicroSpin Gel Extraction Kits sollte bei Raumtemperatur
erfolgen. Bei einer Umgebungstemperatur von 22 – 25 °C bleiben die Komponenten des
Kits für mindestens 12 Monate ab Lieferung stabil. Es muss darauf geachtet werden, dass
die Flasche mit Bindepuffer zwischen zwei Anwendungen immer dicht verschlossen ist.
WICHTIGE HINWEISE
Bitte lesen Sie das vorliegende Protokoll vor der ersten Verwendung des Kits vollständig
durch und legen Sie vor Präparationsbeginn alle für die Isolierung benötigten Materialien
bereit. Das Arbeiten mit peqGOLD Kits liefert zuverlässig sehr gute Resultate, wenn die
Extraktionen sorgfältig nach den Anweisungen der Protokolle ausgeführt werden.
! Der DNA-Waschpuffer CG wird als Konzentrat geliefert und muss vor seiner ersten
Verwendung mit absolutem Ethanol verdünnt werden:
Kit 12-6294-00
3 ml CG-Wash Buffer mit 12 ml 100 % EtOH mischen.
Kit 12-6294-01
20 ml CG-Wash Buffer mit 80 ml 100 % EtOH mischen.
Kit 12-6294-02
3 x 20 ml CG-Wash Buffer mit 3 x 80 ml 100 % EtOH mischen.
! Alle Zentrifugationsschritte müssen bei 22 – 25 °C ausgeführt werden.
Die Zentrifugationsgeschwindigkeit beträgt 10.000 x g* (~13.000 rpm).
* Umrechnung g (rcf) / rpm siehe Appendix, S. 19
PEQLAB_v0815_D
2
Art.-Nr. 12-6294
GEFÄHRLICHE INHALTSSTOFFE
Bestandteile
Signalwort /
Symbole
Gefährliche
Inhaltsstoffe
H- und P-Sätze
DNA Columns
-
-
-
-
-
-
guanidinium
thiocyanate 50-100%,
acetic acid 1-≤2.5%,
polyethylene glycol
octylphenol ether 0.3<1%, CAS: 593-84-0,
64-19-7, 9002-93-1
H302+H312+H332,
H314, H412, P101,
P102, P103, P260,
P280,
P303+P361+P353,
P305+P351+P338,
P405, P501
propan-2-ol 50-100%,
diammonium
hydrogen 2hydroxypropane1,2,3-tricarboxylate
1-≤2.5%, CAS: 6763-0, 3012-65-5
H225, H319, H336,
P101, P102, P103,
P210, P261,
P303+P361+P353,
P305+P351+P338,
P405, P501
DANGER
GP-Buffer
DANGER
MCP Buffer
CG-Wash Buffer
-
-
-
Elution Buffer
-
-
-
PEQLAB_v0815_D
3
Art.-Nr. 12-6294
H- und P-Sätze
H225
H302+H312+H332
H314
H319
H336
H412
P101
P102
P103
P210
Erläuterungen
Flüssigkeit und Dampf leicht entzündbar.
Gesundheitsschädlich bei Verschlucken, Hautkontakt oder
Einatmen.
Verursacht schwere Verätzungen der Haut und schwere
Augenschäden.
Verursacht schwere Augenreizung.
Kann Schläfrigkeit und Benommenheit verursachen.
Schädlich für Wasserorganismen, mit langfristiger Wirkung.
Ist ärztlicher Rat erforderlich, Verpackung oder
Kennzeichnungsetikett bereithalten.
Darf nicht in die Hände von Kindern gelangen.
Vor Gebrauch Kennzeichnungsetikett lesen.
Von Hitze, heissen Oberflächen, Funken, offenen Flammen
sowie anderen Zündquellenarten fernhalten. Nicht rauchen.
P260
Staub/Rauch/Gas/Nebel/Dampf/Aerosol nicht einatmen.
P261
Einatmen von Staub/Rauch/Gas/Nebel/Dampf/Aerosol
vermeiden.
Schutzhandschuhe/Schutzkleidung/Augenschutz/Gesichtsschut
z tragen.
BEI BERÜHRUNG MIT DER HAUT (oder dem Haar): Alle
kontaminierten Kleidungsstücke sofort ausziehen. Haut mit
Wasser abwaschen/duschen.
BEI KONTAKT MIT DEN AUGEN: Einige Minuten lang behutsam
mit Wasser ausspülen. Eventuell vorhandene Kontaktlinsen nach
Möglichkeit entfernen. Weiter ausspülen.
P280
P303+P361+P353
P305+P351+P338
P405
P501
Unter Verschluss aufbewahren.
Inhalt/Behälter … zuführen.
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4
Art.-Nr. 12-6294
PEQGOLD MICROSPIN GEL EXTRACTION KIT PROTOKOLL
Benötigte Materialien, die nicht im Lieferumfang enthalten sind:
!
!
!
!
100 % Ethanol
Sterile 1.5 ml / 2 ml Zentrifugenröhrchen (farblos)
Steriles dH2O oder steriler TE-Puffer (optional)
evtl. 3 M Na-Acetat, pH 5.2
1. DNA Auftrennung
DNA-Fragmente durch Agarosegelelektrophorese auftrennen und mittels Ethidiumbromidfärbung sichtbar machen.
Für die Gelelektrophorese können alle Arten von Agarosen verwendet werden. Als Laufpuffer
sollte vorzugsweise frisches TAE benutzt werden, da mehrfach verwendeter Puffer einen erhöhten
pH-Wert aufweist, der den Extraktionsertrag mindert. Es kann auch frisches TBE eingesetzt
werden, das aber in der Regel ebenfalls zu schlechteren Erträgen führt.
2. Ausschneiden der Bande
Gewünschte Bande nach dem Trennen der DNA mit möglichst wenig überschüssiger
Agarose unter UV-Licht ausschneiden. Dabei möglichst langwelliges UV-Licht verwenden
und Expositionszeiten über 30 Sekunden vermeiden. Gelstück in ein vorgewogenes,
sauberes 2 ml Zentrifugenröhrchen überführen.
UV-Licht bewirkt Verbrennungen der Haut und schädigt die Augen. Bei entsprechenden Arbeiten
muss deshalb ein Augen- oder besser ein Gesichtsschutz getragen werden.
3. Lösen der Agarose
Durch Wiegen des Gelstücks dessen ungefähres Gewicht bestimmen. Bei einem Gelstück
von ca. 150 mg 500 µl GP-Buffer zugeben. Bei Gelstücken größer 150 mg ein
ungefähres Volumen von 1 ml GP-Buffer zugeben und mischen. Mischung für ca.
10 Minuten bei 50 °C bis 65 °C in einem Wasserbad oder Heizblock inkubieren, dabei
alle 2-3 Minuten schütteln oder vortexen. Sollten nach 10 Minuten noch Reste des
Agarosestücks erkennbar sein, muss die Inkubation bis zum vollständigen Lösen der
Agarose fortgesetzt werden. Nicht über 65 °C erhitzen!
Ein zu starkes Erhitzen der Agarose kann zu einer Beeinträchtigung der DNA führen.
PEQLAB_v0815_D
5
Art.-Nr. 12-6294
4. Überprüfen des pH-Wertes
Nach dem vollständigen Lösen der Agarose sollte der GP-Buffer eine hellgelbe Farbe
aufweisen. Ist die Farbe orange oder rötlich, ist die Zugabe von 5 µl einer 3 M Na-AcetatLösung, pH 5.2, und kurzes Mischen erforderlich. Die Farbe sollte anschließend wieder in
helles Gelb umschlagen (entsprechend der Farbe des GP-Buffers vor Zugabe und Lösen der
Agarose).
Die Effizienz der DNA-Bindung an die PerfectBind Säulenmatrix ist in hohem Maße abhängig vom
pH-Wert. Der korrekte pH wird durch die gelbe Farbe des GP-Buffers angezeigt. Liegt der pH bei
einem Wert > 7.5 (orange oder rote Farbe des Puffers), ist die vollständige Bindung der DNA an
die Matrix nicht gewährleistet. Die Ausbeute kann erheblich beeinträchtigt werden.
5. Laden und Binden
Zugabe von 250 µl MCP-Buffer, wenn 500 µl GP-Buffer verwendet wurden, ansonsten
500 µl MCP-Buffer dem 1ml GP-Buffer zufügen und anschließend vortexen.
Eine PerfectBind MicroSpin DNA Column in ein 2 ml Collection Tube stecken und 750 µl
der DNA/Agarose/GP-/MCP-Lösung auf die Säule pipettieren. Collection Tube mit Säule
für 1 Minute bei 10.000 x g* und Raumtemperatur zentrifugieren. Säulendurchfluss
verwerfen. Für Volumina > 750 µl Säule erneut mit maximal 750 µl laden und
Zentrifugationsschritt wiederholen. Dabei ist zu beachten, dass die maximale
Bindekapazität der Säule bei rund 10 µg liegt. Bei größeren DNA-Mengen sollte die Probe
auf eine geeignete Anzahl von Säulen verteilt werden.
6. Waschen I
700 µl des komplettierten CG-Wash Buffers (Pufferkonzentrat plus 5 Volumina 100 %
Ethanol) auf die Säule pipettieren, 2 – 3 Minuten warten, anschließend für 1 Minute bei
10.000 x g* zentrifugieren. Säulendurchfluss verwerfen.
7. Waschen II
PerfectBind MicroSpin DNA Column wieder in das geleerte 2 ml Collection Tube stecken
und 700 µl CG-Wash Buffer auf die Säule geben. Für 1 Minute bei 10.000 x g*
zentrifugieren.
8. Trocknen
Zentrifugensäule in das geleerte 2 ml Collection Tube stecken und durch einminütiges
Zentrifugieren bei 10.000 x g* vollständig trocknen.
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6
Art.-Nr. 12-6294
9.
Elution
MicroSpin Column in ein sauberes 1.5 ml Zentrifugenröhrchen stecken und die DNA mit
10 µl bis 20 µl Elution Buffer eluieren. Dazu die Elutionslösung direkt auf die Mitte der
Säulenmatrix pipettieren und 2 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren. Anschließend für
1 Minute bei 10.000 x g* zentrifugieren. Dabei werden 80 % der gebundenen DNA
eluiert.
Eine optionale zweite Elution verbessert den absoluten Ertrag, erniedrigt jedoch die Konzentration.
QUANTIFIZIERUNG DER DNA
Um die Konzentration und Reinheit einer DNA-Lösung zu bestimmen, muss die Absorption
eines geeignet verdünnten Aliquots (10- bis 50-fach) bei 260 nm und 280 nm gemessen
werden. Eine A260-Einheit entspricht dabei 50 µg DNA/ml. Die Konzentration berechnet
sich demnach wie folgt:
DNA-Konzentration (µg/ml) = Absorption260 x 50 x Verdünnungsfaktor
Das A260/280-Verhältnis ist ein Indikator für die Reinheit der isolierten Nukleinsäuren. Die mit
dem peqGOLD MicroSpin Gel Extraction Kit erzielbaren Werte von 1.8 bis 2.0
entsprechen DNA einer Reinheit von 90 % bis 100 %.
Alternativ können der ungefähre Ertrag und die Qualität der erhaltenen DNA auch durch
Agarosegelelektrophorese mit anschließender Ethidiumbromidfärbung bestimmt werden.
PEQLAB_v0815_D
7
Art.-Nr. 12-6294
Problem
Ursache
Abhilfe
Niedrige DNAErträge.
Zu wenig GP-Buffer
zum Gel gegeben.
• GP-Buffer zugeben (wie im Manual angegeben).
Gelstück nicht
vollständig im GPBuffer gelöst.
• Sicherstellen, dass die Temperatur des Wasserbades
bzw. Heizblockes 50 °C bis 65 °C beträgt und
Gelstück
vollständig
schmelzen
lassen.
Gegebenenfalls mehr GP-Buffer zugeben.
Ungeeigneter
Elutionspuffer.
• Elution wenn möglich mit dem mitgelieferten Elution
Buffer durchführen.
TAE-Laufpuffer war
nicht frisch.
• Bei mehrfacher Benutzung verliert TAE seine
Pufferkapazität und erhält einen steigenden pH-Wert.
Dadurch steigt auch der pH-Wert der
DNA/Agaroselösung, so dass die DNA-Bindung an
der PerfectBind Matrix beeinträchtigt wird. Nach
Lösen des Agarosestückes Farbe des GP-Buffers
überprüfen und gegebenenfalls durch Zugabe von
5 µl einer 3 M Na-Acetat-Lösung, pH 5.2,
korrigieren. Zur Gelreinigung immer frisch
angesetzten TAE-Puffer verwenden.
Unzureichende
Elution.
• Elutionspuffer in die Mitte der PerfectBind Säule
geben, 2 Minuten einwirken lassen. Evtl. Elution
Buffer auf 50 °C bis 60 °C vorwärmen.
PEQLAB_v0815_D
8
Art.-Nr. 12-6294
PEQGOLD MICROSPIN PCR PURIFICATION PROTOKOLL
Benötigte Materialien, die nicht mitgeliefert werden:
! 100 % Ethanol
! Sterile 1.5 ml / 2 ml Zentrifugenröhrchen
1. Agarosegelanalyse des PCR-Ansatzes
PCR-Ansatz
durch
Agarosegelelektrophorese
fraktionieren
und
mittels
Ethidiumbromidfärbung sichtbar machen, um den Erfolg und die Qualität der
Amplifikationsreaktion zu verifizieren.
2. Laden und Binden
Je 50µl PCR-Ansatz durch Vortexen sorgfältig mit 450 µl GP-Buffer und 250 µl MCPBuffer mischen.
Eine PerfectBind Microspin DNA Column in ein 2 ml Collection Tube stecken und maximal
750 µl der Mischung aus PCR-Ansatz, GP-Buffer und MCP-Buffer auf die Säule
pipettieren. 1 Minute bei 10.000 x g* bei Raumtemperatur zentrifugieren.
Säulendurchfluss verwerfen und Collection Tube weiterverwenden.
Beträgt das Probenvolumen mehr als 750 µl, so kann das gesamte Volumen in mehreren Schritten
auf die Säule geladen werden. Hiefür Schritt 2 mehrmals wiederholen.
3. Waschen
700 µl des komplettierten CG-Wash Buffer (Pufferkonzentrat plus 5 Volumen absolutes
Ethanol) auf die Säule pipettieren und für 1 Minute bei 10.000 x g* durch die Säule
zentrifugieren. Säulendurchfluss verwerfen.
4. Trocknen
Zentrifugensäule in das geleerte 2 ml Collection Tube stecken und durch einminütiges
Zentrifugieren bei 10.000 x g* vollständig trocknen.
5. Elution
Zentrifugensäule in ein sauberes 1.5 ml Zentrifugenröhrchen stecken und die DNA mit 10 –
20 µl DNA Elution Buffer eluieren. Dazu Elution Buffer direkt auf die Säulenmatrix
pipettieren und für 2 Minute bei Raumtemperatur inkubieren. Anschließend 1 Minute bei
10.000 x g* zentrifugieren.
Dabei werden 80 % bis 90 % der gebundenen DNA eluiert. Eine optionale zweite Elution verbessert
den absoluten Ertrag auf bis zu 95 %, erniedrigt jedoch die Konzentration.
PEQLAB_v0815_D
9
Art.-Nr. 12-6294
QUANTIFIZIERUNG UND LAGERUNG DER DNA
Um die Konzentration und Reinheit einer DNA-Lösung zu bestimmen, muss die Absorption
eines geeignet verdünnten Aliquots (10- bis 50-fach) bei 260 nm und 280 nm gemessen
werden. Eine A260-Einheit entspricht dabei 50 µg DNA/ml. Die Konzentration berechnet
sich demnach wie folgt:
DNA-Konzentration (µg/ml) = Absorption260 x 50 x Verdünnungsfaktor
Das A260/280-Verhältnis ist ein Indikator für die Reinheit der isolierten Nukleinsäuren. Die mit
dem peqGOLD MicroSpin Gel Extraction Kit erzielbaren Werte von 1.8 bis 2.0
entsprechen DNA einer Reinheit von 90 - 100 %.
Alternativ können der ungefähre Ertrag und die Qualität der erhaltenen DNA auch durch
Agarosegelelektrophorese mit anschließender Ethidiumbromidfärbung im Vergleich mit bekannten
DNA-Proben bestimmt werden.
Problem
Ursache
Abhilfe
Keine DNA im
Eluat.
WaschpufferKonzentrat nicht mit
absolutem Ethanol
verdünnt.
• Waschpuffer-Konzentrat wie angegeben mit
absolutem Ethanol verdünnen.
PCR-Reaktionsansatz
ohne MCP-Buffer
vermischt.
• PCR-Produkt, GP-Buffer und MCP-Buffer zusammen
vermischen, anschließend auf die Säule geben.
Ethanol nach den
Waschschritten nicht
vollständig von der
Säule entfernt.
• Säule vor der Elution trockenzentrifugieren, wie in
Schritt 4 angegeben.
DNA-Probe
fließt beim Laden
aus der
Geltasche.
PEQLAB_v0815_D
10
Art.-Nr. 12-6294
BESTELLINFORMATIONEN
für die DNA-Extraktion aus Gelen und Reaktionsansätzen:
peqGOLD Gel Extraction Kit
12-2501-00
5 Reinigungen
(Classic-Line)
12-2501-01
50 Reinigungen
(DNA aus Agarosegelen)
12-2501-02
200 Reinigungen
12-2500-00
5 Reinigungen
(Safety-Line)
12-2500-01
50 Reinigungen
12-2500-02
200 Reinigungen
peqGOLD Cycle-Pure Kit
12-6493-00
5 Reinigungen
(Classic-Line)
12-6493-01
50 Reinigungen
(DNA aus PCR-Ansätzen)
12-6493-02
200 Reinigungen
12-6492-00
5 Reinigungen
(Safety-Line)
12-6492-01
50 Reinigungen
12-6492-02
200 Reinigungen
12-6294-00
5 Reinigungen
(Safety-Line)
12-6294-01
50 Reinigungen
12-6294-02
200 Reinigungen
peqGOLD MicroSpin Cycle-Pure Kit
12-6293-00
5 Reinigungen
(Safety-Line)
12-6293-01
50 Reinigungen
12-6293-02
200 Reinigungen
PEQLAB_v0815_D
11
Art.-Nr. 12-6294
INTRODUCTION
The peqGOLD family of products is an innovative system that radically simplifies
extraction and purification of nucleic acids from a variety of sources. Key to the system is
the new PerfectBind matrix that specifically, but reversibly, binds DNA or RNA under
certain optimal conditions allowing proteins and other contaminants to be removed.
Nucleic acids are easily eluted with deionized water or low salt buffer.
The MicroSpin DNA Gel Extraction Kit is a convenient system for fast and reliable
purification of DNA from agarose gels, PCR reactions or enzyme reactions (such as
labeling reaction) with relative small elution volume of 10 – 20 µl.
The method uses PerfectBind technology to recover DNA bands 60 bp – 40 kb DNA free
of agarose, oligonucleotides, nucleotides and polymerase in yields exceeding 80 %.
Binding conditions are adjusted by addition of a specially formulated buffer, and the
sample is applied to a PerfectBind DNA spin-column. Following a rapid wash step, DNA
is eluted with deionized water (or low salt buffer) and ready for other applications. No
organic extractions or alcohol precipitations means safe and rapid processing of multiple
samples in parallel. The product is suitable for T-A ligations, PCR sequencing, restriction
digestion, or various labelling reactions. In addition the kit can be used to purify DNA
from any other enzymatic reaction.
BENEFITS PRINCIPLE
The peqGOLD MicroSpin DNA Gel Extraction Kit means:
! Low elution volume – Special designed column allows purification of concentrated DNA
fragments in as little as 10 µl
! Speed - DNA recovery from enzymatic reactions <15 min
! Reliability - optimized buffers guarantee pure DNA
! Safety - No organic extractions
! Quality - purified DNA suitable for any application
BINDING CAPACITY
Each PerfectBind MicroSpin DNA column can bind ~10 µg DNA.
PEQLAB_v0815_E
12
Order No. 12-6294
KIT COMPONENTS
5 Purifications
50 Purifications
200 Purifications
12-6294-00
12-6294-01
12-6294-02
DNA Columns
5
50
200
5
50
200
GP-Buffer
5 ml
30 ml
120 ml
MCP-Buffer
3 ml
30 ml
120 ml
CG-Wash buffer
3 ml
20 ml
3 x 20 ml
Elution Buffer
2 ml
5 ml
20 ml
1
1
1
peqGOLD MicroSpin Gel
Extraction Kit
Order No.
Components
Instruction manual
STORAGE AND STABILITY
All peqGOLD MicroSpin Gel Extraction Kit components are stable for at least 12 months
from the date of purchase when stored at room temperature (22 – 25 °C). Ensure that the
bottle of MCP-Buffer is tightly capped when not in use.
Note: Keep all buffers tightly capped
BEFORE STARTING
Briefly examine this booklet and become familiar with each step. Prepare all components
and have the necessary materials ready before starting.
!
CG-Wash Buffer is concentrated and has to be diluted with absolute ethanol as
follows:
Kit 12-6294-00 Add 12 ml 100 % EtOH to 3 ml CG-Wash Buffer
Kit 12-6294-01 Add 80 ml 100 % EtOH to 20 ml CG-Wash Buffer
Kit 12-6294-02 Add 3 x 80 ml 100 % EtOH to 3 x 20 ml CG-Wash Buffer
PEQLAB_v0815_D
13
Art.-Nr. 12-6294
DANGEROUS COMPONENTS
Components
Signal word /
symbols
Dangerous
components
H and P statements
DNA Columns
-
-
-
-
-
-
guanidinium
thiocyanate 50-100%,
acetic acid 1-≤2.5%,
polyethylene glycol
octylphenol ether 0.3<1%, CAS: 593-84-0,
64-19-7, 9002-93-1
H302+H312+H332,
H314, H412, P101,
P102, P103, P260,
P280,
P303+P361+P353,
P305+P351+P338,
P405, P501
propan-2-ol 50-100%,
diammonium
hydrogen 2hydroxypropane1,2,3-tricarboxylate
1-≤2.5%, CAS: 6763-0, 3012-65-5
H225, H319, H336,
P101, P102, P103,
P210, P261,
P303+P361+P353,
P305+P351+P338,
P405, P501
DANGER
GP-Buffer
DANGER
MCP Buffer
CG-Wash Buffer
-
-
-
Elution Buffer
-
-
-
PEQLAB_v0815_D
14
Art.-Nr. 12-6294
H and P statements
H225
H302+H312+H332
H314
H319
H336
H412
P101
Descriptions
Highly flammable liquid and vapour.
Harmful if swallowed, in contact with skin or if inhaled.
Causes severe skin burns and eye damage.
Causes serious eye irritation.
May cause drowsiness or dizziness.
Harmful to aquatic life with long lasting effects.
If medical advice is needed, have product container or label at hand.
P102
P103
P210
Keep out of reach of children.
Read label before use.
Keep away from heat, hot surfaces, sparks, open flames and other
ignition sources. No smoking.
Do not breathe dust/fume/gas/mist/vapours/spray.
Avoid breathing dust/fume/gas/mist/vapours/spray.
Wear protective gloves/protective clothing/eye protection/face
protection.
IF ON SKIN (or hair): Take off immediately all contaminated clothing.
Rinse skin with water/shower.
IF IN EYES: Rinse cautiously with water for several minuts. Remove
contact lenses, if present and easy to do. Continue rinsing.
P260
P261
P280
P303+P361+P353
P305+P351+P338
P405
P501
Store locked up.
Dispose of contents/container to …
PEQLAB_v0815_D
15
Art.-Nr. 12-6294
PEQGOLD GEL EXTRACTION KIT PROTOCOL
Materials required, but not supplied:
! 100 % Ethanol
! TE buffer or sterile deionized water
! Sterile 1.5 ml / 2 ml centrifuge tubes
1. DNA separation
Perform agarose /ethidium bromide gel electrophoresis to fractionate DNA fragments.
Any type or grade of agarose may be used. It is strongly recommended to use fresh TAE buffer as
running buffer. Do not reuse running buffer as its pH is increased and will reduce yields. Fresh TBE
may also be used, but usually gives lower yields.
2. Excision of DNA bands
When adequate separation of bands has occurred, carefully excise the DNA fragment of
interest using a UV light box ensuring not to take more agarose gel as necessary. Avoid
more than 30 seconds exposure of UV light to the DNA. Transfer the gel slice to a fresh
2 ml microcentrifuge tube.
Always use protective eye-ware or better a UV shield when working with UV light.
3. Dilution of agarose
Determine the approximate volume of the gel slice by weighing it in the 2 ml microfuge
tube. Add 500 µl of GP-Buffer for gel slices up to 150 mg. For gel slices > 150 mg add
1 ml of GP-Buffer. Incubate the mixture at 50 °C – 65 °C for 10 min or until the gel has
completely melted. Mix by shaking or vortex the tube every 2 – 3 minutes.
4. Monitoring of pH value
GP-Buffer should have a light yellow color after dissolving the agarose piece. If the color of
the mixture becomes orange or red, add 5 µl of 3 M sodium acetate, pH 5.2 and mix
thoroughly to bring the pH down. After this adjustment, the colour of the Gel/GP-Buffer
mixture should be light yellow (similar to the original GP-Buffer).
DNA binding efficiency to the column matrix is highly dependent of the pH value. The correct pH
value is indicated by a light yellow color of the GP-Buffer. The DNA yield will be significantly
decreased at pH > 7.5.
PEQLAB_v0815_D
16
Art.-Nr. 12-6294
5. Load and Bind
Add 250 µl MCP-Buffer to the agarose/GP solution if you have added 500 µl GP-Buffer,
or add 500 µl MCP-Buffer if you have used 1 ml GP-Buffer. Mix the suspension by
vortexing.
Place a fresh PerfectBind MicroSpin DNA column in a 2 ml collection tube and add
750 µl of the DNA/agarose solution. Centrifuge the spin column / collection tube
assembly for 1 min at 10.000 x g*. Discard the flow-through and keep the collection tube
for further steps.
For volumes higher than 750 µl load the column again and centrifuge successively,
750 µl at a time. Each PerfectBind MicroSpin extraction column has a total capacity of
10 µg DNA. If the expected yield is higher, divide the sample into the appropriate
number of columns
6. Wash
Place the PerfectBind MicroSpin DNA column in the collection tube already used and add
700 µl of CG-Wash Buffer diluted with ethanol. Centrifuge at 10.000 x g* for 1 min at
room temperature.
Discard the flow-through liquid and repeat step 5 with another 700 µl CG-Wash Buffer.
7. Dry (Important, do not skip this step!)
Place the PerfectBind MicroSpin DNA column containing your DNA in the collection tube
used in step 5 and centrifuge for 1 min at 10.000 x g* to dry the column matrix. This step
is essential to remove ethanol from the column.
8. Elution
Place the PerfectBind MicroSpin DNA column into a fresh 1.5 ml microcentrifuge tube.
Add 10 – 20 µl (depending on the desired final concentration of DNA) Elution Buffer
directly to the binding matrix in the spin column and incubate for 2 minutes at room
temperature. Centrifuge for 1 min at 10.000 x g* to elute DNA.
This first elution represents approximately 70 % of the bound DNA. An optional second elution will
yield any residual DNA, though at a lower concentration.
* Translation of g (rcf) / rpm see Appendix, page 23
PEQLAB_v0815_D
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Art.-Nr. 12-6294
Determine the absorption of an appropriate dilution (20- to 50-fold) of the sample at
260 nm and at 280 nm. One A260-unit is about 50µg DNA/ml. The DNA concentration is
calculated as follows:
DNA conc. (µg/ml) = Absorption260 × 50 × Dilution Factor
The ratio of A260/280 is an indication of nucleic acid purity. A value higher than 1.8
indicates > 90 % nucleic acid. Typically, the majority of the DNA eluted is in monomeric
supercoiled form, though concatamers may also be present.
Alternatively, quantity (as well as quality) can be determined by agarose /ethidium bromide gelelectrophoresis in comparison to DNA samples of known concentrations.
Store the redissolved DNA at +4 °C or at –20 °C.
PEQLAB_v0815_D
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Art.-Nr. 12-6294
Problem
Low DNA
yields.
Likely cause
Suggestion
Too
little
MCP-Buffer Volume of agarose gel slice was determined
added to gel.
incorrectly. Add enough MCP- Buffer as instructed.
Agarose
gel
not
completely dissolved in
MCP-Buffer.
TAE running buffer was
not fresh.
Column
clogged.
Agarose
gel
not
completely dissolved in
MCP- Buffer.
No DNA
eluted.
Wash Buffer concentrate
not diluted with absolute
ethanol.
Incorrect amount of MCPBuffer added.
Optical
Trace contaminants eluted
densities do not from column increase
agree
with A260.
DNA yield on
agarose gel.
DNA floats out Ethanol not completely
of well while
removed from column
loading
following wash steps.
agarose gel.
PEQLAB_v0815_D
Make sure water bath is set to 50 °C to 65 °C and
allow gel to melt completely.
With overuse, TAE loses its buffering capacity and
increases in pH. This raises the pH of the agarose/
DNA/ MCP- Buffer solution which interferes with
DNA binding to PerfectBind matrix. Use freshly
prepared TAE buffer for gel purification (and
prevent contamination of isolated DNA in addition
to improving yields).
Make sure water bath is set to 50 oC to 65 oC and
allow gel to melt completely. For large agarose
slices it is recommended that the gel is diced into
smaller fragments to aid melting.
Prepare Wash Buffer Concentrate with 100 %
ethanol as instructed above.
Add an 500 µl of Buffer GP for gel slices 150 mg.
For gel slices > 150 mg add 1 ml Buffer GP
Make sure to wash column as instructed in step 5.
Alternatively, rely on agarose /ethidium bromide
gel-electrophoresis for quantitation.
Centrifuge column as instructed in step 6 to dry
completely.
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Art.-Nr. 12-6294
PURIFICATION AND CONCENTRATION OF PCR PRODUCTS
Please read this booklet thoroughly to ensure that you are familiar with the entire
procedure. PeqGOLD Kits are designed to be simple, fast, and reliable provided that all
steps are followed diligently. All centrifugation steps must be performed at room
temperature.
1. Load and Bind
Determine the volume of the PCR reaction, transfer to a clean 1.5 ml microfuge tube and
add 450 µl of GP-Buffer and 250 µl MCP-Buffer to each 50 µl of the PCR reaction. Vortex
thoroughly.
Apply a maximum of 700 µl of the sample to a PerfectBind MicroSpin DNA column
assembled in a clean 2 ml collection tube (provided) and centrifuge in a microcentrifuge
at 10.000 x g* for 1 min at room temperature. Discard the liquid.
If the sample volume is more than 700 µl, load the remaining sample to the column and
centrifuge as above.
2. Wash
Place the PerfectBind MicroSpin DNA column in the collection tube already used and add
700 µl of CG-Wash Buffer diluted with ethanol. Centrifuge at 10.000 x g* for 1 min at
room temperature.
Discard the flow-through liquid
3. Dry
Place the PerfectBind MicroSpin DNA column containing your DNA in the collection tube
and centrifuge for 1 min at 10.000 x g* to dry the column matrix. This step is essential to
remove ethanol from the column
4. Elution
Place column into a clean 1.5 ml microcentrifuge tube. Add 10 – 20 µl DNA Elution
Buffer directly onto the column matrix and incubate for 2 min at room temperature.
Centrifuge 1 min at 10.000 x g* to elute DNA.
* Translation of g (rcf) / rpm see Appendix, page 23
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Art.-Nr. 12-6294
Determine the absorption of an appropriate dilution (20- to 50-fold) of the sample at
260 nm and at 280 nm. One A260-unit is about 50 µg DNA/ml. The DNA concentration
is calculated as follows:
DNA conc. (µg/ml) = Absorption260 × 50 × Dilution Factor
The ratio of A260/280 is an indication of nucleic acid purity. A value higher than 1.8
indicates > 90 % nucleic acid. Typically, the majority of the DNA eluted is in monomeric
supercoiled form, though concatamers may also be present.
Alternatively, quantity (as well as quality) can be determined by agarose /ethidium bromide gel
electrophoresis in comparison to DNA samples of known concentrations.
Store the redissolved DNA at +4 °C or at –20 °C.
ORDERING INFORMATION
For the purification of nucleic acids oft PRC Products or agarose gels:
12-2501-00
5 Preparations
(Classic-Line)
12-2501-01
50 Preparations
(DNA from agarose gels)
12-2501-02
200 Preparations
12-2500-00
5 Preparations
(Safety-Line)
12-2500-01
50 Preparations
12-2500-02
200 Preparations
12-6493-00
5 Preparations
(Classic-Line)
12-6493-01
50 Preparations
(DNA from PCR reactions)
12-6493-02
200 Preparations
12-6492-00
5 Preparations
(Safety-Line)
12-6492-01
50 Preparations
12-6492-02
200 Preparations
12-6294-00
5 Preparations
(Safety-Line)
12-6294-01
50 Preparations
12-6294-02
200 Preparations
peqGOLD MicroSpin Cycle-Pure Kit
12-6293-00
5 Preparations
(Safety-Line)
12-6293-01
50 Preparations
12-6293-02
200 Preparations
PEQLAB_v0815_D
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Art.-Nr. 12-6294
Problem
Low
yields.
Likely cause
Suggestion
DNA Incorrect or no ethanol added to Prepare the Buffer exactly as described in the
wash buffer
manual.
Store the Buffer with firmly fixed cap.
Poor elution of DNA
Problems with Contamination
downstream
components
applications,
e.g. ligation
with
Add the Elution Buffer directly onto the centre
of the Spin Filter.
salt Wash the column as described in the manual
Contamination of the final DNA Keep the given centrifugation time, extend if
with etanol
necessary
PEQLAB_v0815_D
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Art.-Nr. 12-6294
APPENDIX
Abb. 1: Umrechnungstabelle rcf/rpm. Werte für Zentrifugen, abhängig vom Rotordurchmesser.
Fig. 1: Table rcf/rpm. Values for centrifuges depending on rotor diameter.
PEQLAB_v0815_E
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Order No. 12-6294

peqGOLD MicroSpin Gel Extraction Kit

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