Accès à la ressource - Université Bordeaux I

Thèse n° 3759
THÈSE
PRÉSENTÉE A
L’UNIVERSITÉ BORDEAUX 1
ÉCOLE DOCTORALE DES SCIENCES DE LA VIE ET DE LA
SANTE
Par
Anne-Laure DINEL
POUR OBTENIR LE GRADE DE
DOCTEUR EN NUTRITION
Impact de l'inflammation à bas bruit associée à l'obésité sur
l'établissement des troubles de l'humeur et de la cognition
Soutenue le 19 décembre 2008
Devant la commission d’examen formée de :
Pr. Marc LANDRY, Professeur à l’Université Bordeaux 2
Dr. Rémy BURCELIN, Directeur de recherche à l’INSERM, Université de Toulouse
Dr. Muriel DARNAUDERY, Maître de Conférence à l’Université de Lille
Dr. Dragan MILENKOVIC, Chargé de recherche à l’INRA, Clermont-Ferrand
Pr. Paul HIGUERET, Professeur à l’Université Bordeaux 1
Dr. Nathalie CASTANON, Chargée de recherche à l’INRA, Université Bordeaux 2
Président
Rapporteur
Rapporteur
Examinateur
Directeur de thèse
Directeur de thèse
Université Bordeaux 1 – Les Sciences et les Technologies au service de l'Homme et de l'environnement
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3
4
Remerciements
Remerciements
Je tiens à remercier le Professeur Marc Landry pour m’avoir fait l’honneur d’accepter
de présider ce jury de thèse.
Je remercie sincèrement le Docteur Muriel Darnaudery et le Docteur Remy Burcelin
d’avoir accepté d’être les rapporteurs de cette thèse.
Je remercie également le Docteur Dragan Milenkovic d’avoir accepté de faire partie
du jury de cette thèse en tant qu’examinateur.
Je tiens à remercier le Professeur Paul Higueret d’avoir accepté d’être le Directeur
officiel de cette thèse.
Je remercie également Robert Dantzer et Francoise Moos qui m’ont accueillie
successivement au sein de leur laboratoire.
Et surtout je tiens à remercier Nathalie pour avoir « examiné » ce travail pendant 3
ans ! Merci pour ton optimisme, ton ouverture d’esprit, tes conseils et pour avoir toujours été
présente quelques soient les évènements. Merci aussi de m’avoir soutenu dans ce début de
thèse un peu original entre Sup de Co et le labo et d’avoir eu confiance en moi !!
Finalement je n’aurais pas eu besoin de 6 ans pour la faire cette thèse, même si la dernière
ligne droite a été un peu sportive !!
Je tiens aussi à remercier tous les Psynugens qui m’ont aidé et en particulier :
Agnès, Jérôme, Philippe, Jean-Luc, Claudine, Véro et tous les autres pour leur aide,
Caro, ma « binôme » de thèse, sans qui je n’aurais pas connu le stress de la souris
sauteuse et la joie de la préparation de la boulette chips-lardons-chocolat !
Sophie, pour tes inoubliables « mais quelle est ta question ? » mais aussi pour ta
disponibilité, ta bonne humeur et tes coups de gueule, ton aide et ton soutien à chaque fois
que j’en ai eu besoin,
Julie, grâce à qui je ne pourrais plus jamais écouté « tout le bonheur du monde »!! Merci
pour ton foutu caractère mais surtout pour ta joie de vivre!
Mais surtout un grand merci à mes sœurs de thèse : Virginie, Linette, Lélé, Vanessa
(presque une sœur de thèse…) et Aurélie, grâce à qui la vie dans notre bureau rose ou dans
l’aquarium a quand même été bien sympa !! Nos discussions, nos râleries et nos fous rires
vont bien me manquer mais je connais un endroit sympa à Cestas pour continuer tout ça !
Bien évidemment, je remercie aussi tous ceux qui sont présents dans ma vie et qui m’ont
soutenu pendant cette sympathique période qu’est la thèse,
Alors merci
à toute la clique des copains et à nos soirées cartes et vieux souvenirs 100 fois
racontés…
aux Corinettes et à leurs délires souvent incontrôlables…..
aux BBFI (les membres permanents mais aussi les pièces rapportées) sans qui , bien sûr,
je ne serai rien ou presque….
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à mon cousin, mon prof de gratte préféré qui m’a permis de bien décompresser ces
derniers mois,
à Mister Lacrampe, merci pour les vagues….
à Florent dit Oreste la Loutre, et Suzanne pour leur amitié
à Lolo et Virginie (et Aymeric et Titou aussi bien sûr), pas besoin d’en dire plus,
à Dam’s et à ma ‘tite sœur, merci ma loute !
à mes parents qui m’ont toujours soutenue dans mes choix et m’ont fait partager leur
passion,
à Olivier, merci de supporter mon caractère « tendre et facile » surtout ces derniers
mois, et d’accepter mes décisions parfois un peu égoïstes,…
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Résumé
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Résumé
De nombreuses études menées chez l’homme ont montré que l’obésité est associée à un état
inflammatoire chronique caractérisé par une augmentation de la sécrétion de nombreuses molécules
dont la leptine et des cytokines inflammatoires comme le TNF-α et l’IL-6 (Clement et al., 2004). Des
données récentes suggèrent que cette inflammation périphérique pourrait également présenter une
composante au niveau cérébral se caractérisant notamment par une augmentation de l’expression de
différentes cytokines inflammatoires (IL-6, TNF-α, IL-1β…) et de l’activation de leurs voies de
signalisation intracellulaire (augmentation de l’activité c-Jun-N-terminal kinase et de NFkB)(De Souza
et al., 2005). De plus, l’intensité de la situation inflammatoire semble être liée au degré d’obésité.
Ainsi, il est possible de distinguer différentes situations d’obésité : une obésité modérée qui ne
s’accompagne pas forcément de pathologies comorbides et une obésité morbide associée à différents
types de complications comme des maladies cardio-vasculaires, de l’hypertension artérielle ou un
diabète de type 2. L’obésité s’accompagne également d’une forte prévalence de troubles de l’humeur
(anxiété, dépression) et de la cognition.
Notre laboratoire a été un des pionniers dans l’étude de l’expression et de l’action des cytokines
au niveau central et de leurs conséquences, tant comportementales que neurobiologiques. Cette
relation entre système de l'immunité innée et cerveau a particulièrement été étudiée dans le cadre du
comportement de maladie regroupant un ensemble de symptômes non spécifiques (fièvre, activations
neuroendocriniennes, anorexie, anhédonie, repli sur soi, perte d’intérêt pour l’environnement…)
observés chez les individus malades et pouvant être reproduits chez l’animal en réponse à l’injection
d’un inducteur de cytokines tel que le lipopolysaccharide (LPS)(Dantzer, 2001). Dans le cas d’une
exposition prolongée ou non régulée de l’activation du réseau de cytokines, le comportement de
maladie peut laisser place à de véritables troubles de l’humeur et de la cognition associés à une chute
des taux circulants de tryptophane, un acide aminé essentiel servant de précurseur et de facteur
limitant à la synthèse de sérotonine. Il a été montré que l'indoléamine 2,3-dioxygénase (IDO), une
enzyme dégradant le tryptophane en réponse aux cytokines (Lestage et al., 2002; Moreau et al., 2005)
est impliquée dans l’induction des symptômes de type dépressif observés notamment suite à
production soutenue de cytokines et que cette action serait dépendante du catabolisme du tryptophane
via la voie de la kynurenine (O'Connor et al., 2008). L’activation de l’IDO en situation inflammatoire
aboutit à la production de dérivés neurotoxiques (3-OH-kynurénine, acide quinolinique) se comportant
comme des agonistes des récepteurs glutamatergiques de type NMDA (Taylor and Feng, 1991), au
dépend de la production de sérotonine. Ainsi, l’activation de l’IDO par les cytokines pourrait jouer un
rôle dans l’apparition de troubles cognitifs associés aux états inflammatoires via l’altération de la
neurotransmission sérotoninergique et/ou glutamatergique. Ces mêmes mécanismes pourraient
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également sous-tendre le développement des troubles de l’humeur et de la cognition couramment
observés chez les personnes obèses.
L’ensemble des études réalisées dans ce travail de thèse a donc eu pour objectif général de
déterminer chez la souris si l’inflammation chronique à bas bruit qui est associée à un état d’obésité
entraînait le développement de troubles de l’humeur et de la cognition. De plus, afin d’identifier au
mieux les bases neurobiologiques potentielles à l’origine de ces troubles, nous avons choisi de nous
placer dans deux situations différentes : un état d’obésité modérée induite par l’administration d’un
régime enrichi mais n’entraînant pas le développement de pathologies co-morbides graves, et un état
d’obésité morbide d’origine génétique associée à d’autres pathologies notamment un diabète de type 2.
Dans les deux cas, les conséquences de cette obésité sur l’état d’activation inflammatoire et les
altérations neurochimiques et comportementales qui en découlent ont été étudiées en détail.
Nos résultats montrent que :
1)
l’intensité de la perturbation du système immunitaire est corrélée au degré d’obésité
puisqu’une obésité modérée est associée à une altération de la capacité du système immunitaire à
répondre à une infection, tandis qu’une obésité morbide entraine la mise en place d’un état
inflammatoire même en conditions non stimulées.
2)
les modifications physiopathologiques induites par le développement d’un état d’obésité
altèrent le système immunitaire, comme en témoignent l’activation accrue de la production de
cytokines périphériques et cérébrales, en particulier l’IL-6, l’exacerbation des réponses
neurochimiques (stimulation de l’IDO pulmonaire et cérébrale) et neuroendocriniennes (sur-activation
de l’axe HPA) et de leurs conséquences sur la réactivité comportementale.
3)
les souris obèses présentent des altérations de leurs capacités cognitives, des troubles de type
anxieux, ainsi qu’une modulation de leur réponse émotionnelle dont la mise en place dans le temps
semble se faire de façon indépendante, selon des modalités qui restent à préciser.
En conclusion, ces résultats originaux permettent de mettre en évidence le rôle clé de
l’inflammation associée à l’obésité dans le développement des troubles de l’humeur et de la cognition.
Ce travail pourrait ainsi contribuer à l’identification de cibles moléculaires potentielles pour le
développement de nouvelles stratégies thérapeutiques ou nutritionnelles visant à améliorer la qualité
de vie des patients obèses.
Mots clés : Obésité, inflammation, cytokines, IDO, troubles de l’humeur, cognition
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Abstract
Severe obesity is associated with a low grade inflammation characterized by an increased
release of inflammatory markers like cytokines and leptin. It has been suggested that some of these
mediators of inflammation could also be found in the brain, as manifested by the increased
hypothalamic expression of inflammatory cytokines (IL-6, TNF-α, IL-1) and the activation of their
intracellular pathways. Moreover, the intensity of the inflammation state seems to increase with the
degree of obesity. Morbid obesity, which is accompanied by different comorbid pathologies like
cardiovascular disease, hypertension, type 2 diabetes and a high prevalence of mood (anxiety,
depression) and cognitive disorders, is clearly associated with peripheral inflammation. Such an
association is less clear in the case of a moderate obesity which is not systematically associated with
comorbid pathologies.
It is clearly established that during an infection brain actions of cytokines that are released as a
result of the innate immune system activation induce development of sickness behaviour. In the case
of a prolonged and/or unregulated activation of the cytokine network, sickness behaviour that includes
non-specific symptoms such as behavioral alterations, fever and neuroendocrine activation can lead to
the development of mood and cognitive disorders. Moreover, such a development is associated with a
drastic drop of circulating levels of tryptophan, the essential amino acid acting as limiting factor of the
serotonin synthesis. It has been proposed that these alterations could be at least partially explained by
cytokine-induced peripheral and/or central activation of the indoleamine 2,3-dioxygenase (IDO), a
tryptophan-catabolizing enzyme that is potently induced in monocytes, macrophages and brain
microglia by cytokines. IDO activation can result in the lowering of the bioavailability of tryptophan
for 5-HT synthesis and the increase of neurotoxic derivates (3-OH-kynurenine, quinolinic acid). Both
consequences of cytokine-induced IDO activation may play a role in the development of the cognitive
and mood disorders associated with obesity.
The present study aimed therefore at studying in mice the relationship between inflammation
and development of mood and cognitive disorders associated with obesity. This study was performed
in two different but complementary experimental conditions reproducing 1) a moderate obesity devoid
of marked pathological complications (a model of diet induced obesity) and 2) a morbid obesity
associated with comorbid pathologies like type 2 diabetes (db/db mice).
Our results showed that:
1) The degree of obesity is correlated with the intensity of the alterations affecting innate
immune system activation.
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2) Obesity exacerbates the innate immune system activation as manifested by the increase of
peripheral and central cytokine production, and related neurochemical, neuroendocrine
and behavioral alterations.
3) The inflammation-related alterations induced by obesity are associated with impairment of
cognitive abilities and emotional reactivity, as well as development of anxiety-like
symptoms, although differences in their respective time-course of appearance seem to
exist.
Taken together, these findings showed the key role of the inflammation associated with obesity
in its related mood and cognitive disorders. This work provides therefore a first important step towards
the identification of new pharmacological and/or nutritional strategies aimed at ameliorating life
quality of obese subjects and preventing development of related comorbidities.
Key words : Obesity, inflammation, cytokines, IDO, mood disorders, cognition
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Table des matières
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Table des matières
matières
Remerciements ................................................................................................................................ 1
Résumé ............................................................................................................................................ 7
Abstract ......................................................................................................................................... 11
Table des matières ......................................................................................................................... 13
Introduction générale..................................................................................................................... 21
A.
Cytokines et réaction inflammatoire ............................................................................. 23
1. L’immunité innée ................................................................................................... 23
2. La réaction de phase aiguë ....................................................................................... 23
3. Les cytokines............................................................................................................ 24
4. La réaction inflammatoire locale.............................................................................. 26
5. La réaction inflammatoire systémique ..................................................................... 27
6. La composante centrale de la réaction de phase aiguë............................................. 28
a) Voies d’accès des cytokines au système nerveux central .................................... 29
b) L’état de maladie.................................................................................................. 31
B.
Cytokines et Troubles de l’humeur et de la cognition .................................................. 35
1. Cytokines et troubles de l’humeur .......................................................................... 36
a) Troubles anxieux .................................................................................................. 36
b) Troubles dépressifs............................................................................................... 38
2. Cytokines et troubles cognitifs................................................................................. 40
a) La mémoire .......................................................................................................... 40
b) Les troubles .......................................................................................................... 42
3. Mécanismes potentiellement impliqués ................................................................... 45
a) Implication de l’IDO ............................................................................................ 45
b) Implication de l’axe HPA..................................................................................... 49
C.
L’obésité........................................................................................................................ 51
1. Définition et caractérisation ..................................................................................... 51
2. Prévalence et cause................................................................................................... 54
3. Rappel sur la régulation alimentaire et les molécules mises en jeu ......................... 56
4. Les conséquences de l’obésité.................................................................................. 62
a) Une pathologie inflammatoire chronique à bas bruit ........................................... 62
b) Les troubles de l’humeur et du comportement..................................................... 69
Objectifs ........................................................................................................................................ 77
Démarche expérimentale............................................................................................................... 81
A.
Le choix des modèles utilisés........................................................................................ 83
B.
Objectifs et expériences mises en œuvre....................................................................... 85
1. Objectif 1 :................................................................................................................ 85
a) Régime enrichi entraînant l’obésité: un modèle physiopathologique
d’inflammation chronique. ........................................................................................... 85
b) Démarche expérimentale...................................................................................... 86
2. Objectif 2 :................................................................................................................ 86
15
a)
b)
Le LPS : un modèle d’activation aiguë du système immunitaire......................... 87
Démarche expérimentale...................................................................................... 88
3. Objectif 3 :................................................................................................................ 88
a) Obésité d’origine génétique: une situation d’inflammation chronique exacerbée88
b) Démarche expérimentale...................................................................................... 89
Resultats ........................................................................................................................................ 91
Chapitre 1 ...................................................................................................................................... 93
Chapitre 2 .................................................................................................................................... 125
Chapitre 3 .................................................................................................................................... 155
C hapitre 4 ................................................................................................................................... 169
Discussion générale..................................................................................................................... 203
Synthèse des principaux résultats................................................................................................ 205
Choix des modèles expérimentaux.............................................................................................. 207
Conséquence de l’obésité sur la réaction inflammatoire............................................................. 209
Obésité et vulnérabilité à une infection....................................................................................... 212
Obésité et troubles du comportement et de la cognition ............................................................. 216
Les acteurs biologiques mis en jeu.............................................................................................. 221
Conclusion et perspectives .......................................................................................................... 229
Bibliographie............................................................................................................................... 237
Publications et communications.................................................................................................. 279
Abréviations ................................................................................................................................ 283
Index des figures ......................................................................................................................... 287
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AvantAvant-propos
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18
AvantAvant-propos
Le cerveau a longtemps était considéré comme un organe privilégié du point de vue
immun, puisque la barrière hématoencéphalique (BHE), grâce à ses jonctions serrées, limitent
la transmigration des cellules de l’immunité spécifique au sein du parenchyme cérébral.
Toutefois, le cerveau possède un système de défense qui, en plus de s’activer en réponse aux
stimuli immuns, communique avec le système immunitaire (Ader et al., 1995). La réponse
immunitaire est la stratégie de défense mise en jeu par l’organisme lorsque l’agression de
l’individu prend la forme d’un agent pathogène. Elle est coordonnée par des médiateurs
moléculaires appelés cytokines qui assurent la communication entre le système immunitaire et
le système nerveux. Par leur action sur le cerveau, les cytokines sont à l’origine d’un cortège
de modifications physiologiques et comportementales telles que la fièvre, la fatigue, la
diminution de la prise alimentaire et le repli sur soi. Ces symptômes non spécifiques
développés par l’individu en réponse aux cytokines sont regroupés sous le terme d’ « état de
maladie » et représentent une stratégie adaptative permettant à l’individu de retrouver son état
d’équilibre, de bien-être initial (Dantzer, 2001). Une caractéristique essentielle de l’état de
maladie est donc son aspect transitoire, ce qui dépend de façon essentielle des multiples
mécanismes mis en jeu pour réguler l’expression et l’action des cytokines dans le cerveau
(Dantzer et al., 2008).
Mais dans certains cas liés à une inflammation chronique, le comportement de maladie
peut laisser place à une situation de dysfonctionnement neuronal et au développement de
troubles de l’humeur et de la cognition. Dans ce contexte, l’obésité, en tant que situation
inflammatoire à bas bruit, pourrait permettre l’étude des implications physiopathologiques de
l’altération de la régulation des cytokines.
L’obésité est devenue la première maladie non infectieuse de l’histoire. C’est une
véritable épidémie qui frappe aussi bien les pays industrialisés que les pays en voie de
développement. L’Organisation Mondiale de la Santé (OMS) définit « le surpoids et l'obésité
comme une accumulation anormale ou excessive de graisse corporelle qui peut nuire à la
santé ». L’obésité est associée à un état inflammatoire chronique caractérisé par une
augmentation de la sécrétion de nombreuses molécules inflammatoires comme le TNF-α et
l’IL-6 (Clement et al., 2004) en périphérie mais également en central (De Souza et al., 2005).
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De plus, l’intensité de la situation inflammatoire semble être liée au degré d’obésité. Ainsi, il
est possible de distinguer différentes situations d’obésité : une obésité modérée qui ne
s’accompagne pas forcément de pathologies comorbides et une obésité morbide associée à
différents types de complications comme des maladies cardio-vasculaires, de l’hypertension
artérielle ou un diabète de type 2. L’obésité s’accompagne également d’une forte prévalence
de troubles de l’humeur (anxiété, dépression) et de la cognition. De plus, il a pu être observé
une réduction des taux circulants de Trp chez les sujets obèses (Brandacher et al., 2006;
Breum et al., 2003). Au sein de l’organisme, le Trp, qui participe à la synthèse protéique
comme tous les autres acides aminés, est aussi utilisé soit comme précurseur de la synthèse de
sérotonine (5-HT), soit catabolisé via la voie de la kynurénine, favorisant alors la formation
de composés neurotoxiques agissant sur les récepteurs au glutamate (Wirleitner et al., 2003).
Il est désormais connu que les troubles de l’humeur et de la cognition sont entre autre,
fortement associés à une altération des systèmes sérotoninergiques et glutamatergiques
(Muller and Schwarz, 2007). De la même façon, la production de composés neurotoxiques
issus de la voie de la kynurénine pourrait être impliqués dans la mise en place de troubles de
l’humeur et dans l’altération de la mémoire, de l’apprentissage et de la cognition (Baran et
al., 1999; Heyes et al., 1989). Ainsi, ces données suggèrent qu’en conditions inflammatoires,
la dérégulation du métabolisme du Trp pourrait jouer un rôle causal dans l’apparition des
troubles de l’humeur et de la cognition.
Différentes données expérimentales obtenues dans notre laboratoire et complétant
celles décrites dans la littérature notamment chez l’homme, nous ont amené à proposer qu’une
des interactions entre le SI et le métabolisme du Trp passe par l’activation de l’enzyme
initiant le catabolisme du Trp en conditions inflammatoires, l’indoléamine 2,3-dioxygénase
(IDO). En effet, il a été montré au laboratoire que l’activité enzymatique de l’IDO est
fortement induite en périphérie ainsi qu’au niveau cérébral après une stimulation aiguë ou
chronique du SI chez la souris (Lestage et al., 2002; Moreau et al., 2005) et que cette
activation est associée à l’apparition de changements comportementaux (Frenois et al., 2007;
Moreau et al., 2008b)
Dans ce contexte, ce travail de thèse a visé à identifier les mécanismes sous-tendant les
interactions entre obésité, inflammation chronique, activation neuroendocrinienne et troubles
de l’humeur et de la cognition.
20
Introduction générale
21
22
Introduction générale
A. Cytokines et réaction inflammatoire
1. L’immunité innée
Le système immunitaire est un système extrêmement complexe dont le but est de
maintenir l’intégrité de l’individu, en discriminant le « soi » du « non soi ». Le système
immunitaire a donc la tâche de reconnaître et de tolérer d’une part les cellules appartenant à
l’organisme constituant le soi et d’éliminer d’autre part les molécules du non soi, encore
dénommées antigènes. L’immunité innée est considérée comme la première ligne de défense
de l’organisme contre les agents pathogènes et elle est toujours activée lors de l’infiltration
d’un agent pathogène dans le corps. Elle met en jeu principalement les cellules phagocytaires
mononucléaires (monocytes et macrophages) ou polynucléaires (neutrophiles) qui sont
capables de capturer et de détruire les éléments du non soi par phagocytose.
2. La réaction de phase aiguë
Durant de nombreuses années la caractérisation de l’inflammation se faisait sur des
critères visuels : rubor (rougeur), tumor (tuméfaction), calor (chaleur), dolor (douleur). Ces
critères furent décrits pour la première fois par Cornélius Celsus dès le premier siècle avant
J.C. Puis ce fut Claude Galien (130-200 après J.C) qui décrivit le cinquième signe cardinal :
functio laesa ou perte de fonction. De nos jours, l’inflammation est décrite comme la
succession de modifications se produisant dans un tissu vivant lorsque celui-ci est lésé
(Punchard et al., 2004). La réponse inflammatoire correspond à la composante locale d’un
ensemble de mécanismes de défense de l’hôte regroupé sous le nom de réaction de phase
aiguë (Figure 1). Ce terme désigne les modifications physiologiques adaptatives qui ont pour
objectifs de stopper la progression des lésions tissulaires, d’isoler et d’éliminer les agents
infectieux et d’activer les processus de réparation nécessaires au rétablissement de l’état
initial de l’organisme (Baumann and Gauldie, 1994). Cette réaction se décline en trois
niveaux : la composante locale ou réaction inflammatoire, la composante systémique et la
composante centrale et met en jeu des médiateurs de l’inflammation appelés cytokines.
23
Composante centrale
Fièvre
Activation de l’axe
corticotrope
Fatigue
Repli sur soi
Prise alimentaire
Composante locale
Composante systémique
Vasodilatation des
capillaires sanguins
Exsudation des
protéines plasmatiques
Migration des cellules
de l’immunité innée
Phagocytose
Protéine de phase aiguë
Activation de l’hématopoïèse
Modifications métaboliques
Nutriments et minéraux
Cytokines
Inflammatoires :
IL-1β, TNFα,
Agents
Phagocyte
Figure 1 : La réponse inflammatoire
3. Les cytokines
Les cytokines sont des médiateurs protéiques solubles qui contrôlent le déroulement
de la phase aiguë. Lors de la détection d’un agent pathogène, les cellules de l’immunité innée
reconnaissent des motifs moléculaires à la surface des micro-organismes infectieux, appelés
PAMPs (pathogen-associated molecular patterns) (Medzhitov, 2001). La fixation des
PAMPS à leurs récepteurs spécifiques PRR (pattern-recognition receptors), tels que ceux
appartenant à la famille des TLR (toll-like receptors) active des voies de signalisation
intracellulaires contrôlant la transcription de gènes impliqués dans la réponse inflammatoire.
Ceci aboutit rapidement à la libération par les phagocytes de nombreuses molécules dans le
milieu extracellulaire dont les cytokines. Ces cytokines sont des polypeptides de masse
24
moléculaire en général inférieure à 60 kDa, produits par différents types cellulaires. Les
interleukines (IL) tiennent leur nom de leur rôle d’agent de communication entre les
leucocytes, mais elles agissent en réalité sur de nombreux autres types cellulaires. Trente cinq
cytokines portent aujourd’hui le nom d’interleukines (Chen et al., 2006; Collison et al., 2007).
Les chémokines ou chimiokines sont responsables de la migration des cellules du système
immunitaire sur le site de l’infection ou de la lésion par leur pouvoir chemioattractant
(Matsukawa et al., 2000). Les interférons (IFN) sont entre autre impliqués dans la lutte
contre les virus dont ils inhibent la réplication (Stetson and Medzhitov, 2006). Les tumor
necrosis factors (TNF), capables d’induire une nécrose tumorale, et les transforming growth
factors (TGF), qui peuvent induire la croissance des fibroblastes, sont également impliqués
dans la régulation du système immunitaire (Fiers, 1991; Wahl, 1992).
Les cytokines sont impliquées dans la communication intercellulaire du système
immunitaire. Ce sont des médiateurs à court rayon d’action ayant une fonction autocrine (sur
la cellule productrice) ou paracrine (sur les cellules voisines) ou agissant plus rarement à
distance comme de véritables hormones (fonction endocrine). Elles forment un réseau de
molécules interdépendantes qui influencent leur propre synthèse et la synthèse des autres
cytokines du réseau par des boucles de rétroaction positives et négatives (Cavaillon, 1993;
Cavaillon and Haeffner-Cavaillon, 1993). Au
cours de la réaction de phase aiguë, les
cytokines exercent des activités biologiques multiples et souvent redondantes. Les principales
cytokines inflammatoires impliquées dans la réaction de phase aiguë sont l’interleukine-1β
(IL-1β), le facteur de nécrose tumorale TNFα et l’interleukine-6 (IL-6). En plus de leur propre
synthèse, l’IL-1β et le TNFα peuvent chacun induire la production de l’autre ainsi que la
synthèse d’IL-6 (Brouckaert et al., 1993; Dinarello et al., 1987; Libert et al., 1990). Ces trois
cytokines sont parfois appelées « triade inflammatoire » car elles exercent leur effet de façon
synergique et souvent redondante.
Cette réaction inflammatoire est régulée par la production de cytokines antiinflammatoires. Parmi elles, l’IL-4 inhibe la synthèse d’IL-1β et augmente celle de
l’antagoniste du récepteur de l’IL-1 (IL-1ra) (Jenkins and Arend, 1993; Vannier et al., 1992).
L’IL-10 inhibe la synthèse de l’IL-1, de l’IL-6 et du TNFα par les macrophages activés
(Fiorentino et al., 1991). Le TGFβ (transforming growth factor β) inhibe la production d’IL-1
et de TNFα par les macrophages activés par du lipopolysaccharide (LPS), un fragment de
paroi de bactéries à Gram négatif, qui est couramment utilisé pour induire une réponse
inflammatoire de façon expérimentale (Chantry et al., 1989). L’IL-6 est elle aussi parfois
25
considérée comme une cytokine anti-inflammatoire car elle réduit notamment la production
de TNFα induite par le LPS (Aderka et al., 1989; Benveniste et al., 1995). L’action biologique
du TNFα est inhibée par la forme soluble du récepteur du TNFα (Higuchi and Aggarwal,
1993). Lors d’une infection aiguë, l’immunité innée activée met donc en jeu une réponse
inflammatoire non spécifique et induit une production massive mais transitoire de cytokines,
ne dépassant pas 24 à 48 h.
Cependant, cette réponse inflammatoire peut devenir chronique lorsque le système
immunitaire ne parvient pas à éliminer le pathogène. La réponse immunitaire spécifique ou
réponse adaptative alors mise en place met en jeu les macrophages qui libèrent l’IL-12,
recrutant les lymphocytes T de type helper et les cellules natural killer (NK) (Brunda, 1994).
Ces dernières activées sécrètent l’IFNγ provoquant la différenciation des lymphocytes T vers
un phénotype Th1. La sous-population Th1 induit une réponse immune à médiation cellulaire
(phagocytose) en agissant comme activateur des macrophages au travers d’une forte
production d’IFNγ (Janeway et al., 1997). La réponse de type Th2, à médiation humorale
(anticorps), permet d’induire la production d’IL-4 et d’IL-10 agissant notamment comme
régulateur de la réponse Th1 (Mosmann et al., 1986; Tada et al., 1978). L’inflammation
chronique peut alors durer plusieurs semaines et dans certains cas des années (tuberculose,
polyarthrite rhumatoïde…).
Résumé :
Les cytokines coordonnent la réponse inflammatoire afin d’éliminer l’agent
pathogène.
Une infection aiguë ou chronique entraîne une production massive de cytokines dont
l’IL-1β, le TNFα, l’IL-6 ou encore l’IFNγ.
4. La réaction inflammatoire locale
L’inflammation locale s’effectue en grande partie par des échanges entre le sang et le
tissu lésé. Les cellules endothéliales qui régissent ces échanges jouent un rôle majeur dans la
réaction inflammatoire. Ces cellules activées par les cytokines sont capables de développer
une activité coagulante conduisant à une coagulation intravasculaire (Shimizu et al., 1992).
26
Les cellules endothéliales jouent aussi une rôle actif dans les phénomènes d’adhésion
puisqu’elles expriment des molécules d’adhésion complémentaires à celles des leucocytes
(Makgoba et al., 1992). L’IL-1β et le TNFα régulent la synthèse de ces molécules par les
cellules endothéliales ce qui permet la diapédèse des leucocytes vers le site de la réaction
inflammatoire (May and Ager, 1992). Ces cytokines induisent également la production de
prostaglandines par les fibroblastes et les macrophages. Ces médiateurs exercent un rôle clé
dès les premiers stades de l’inflammation en augmentant la perméabilité vasculaire. Les
prostaglandines régulent en retour la synthèse des cytokines inflammatoires (Dendorfer et al.,
1994). Localement, l’IL-1β et le TNFα induisent la production de radicaux libres dérivés de
l’oxygène notamment par les macrophages et les cellules endothéliales. Ces molécules
participent à la destruction des pathogènes de par leur toxicité mais peuvent aussi provoquer
des lésions des tissus de l’hôte (Klebanoff, 1980). D’autres activités locales des cytokines
inflammatoires comme la libération d’enzymes par les ostéoclastes, les cellules synoviales et
les fibroblastes permettent le développement de l’inflammation au niveau du site d’infection.
Le TNFα induit également une protéolyse musculaire à l’origine de la libération d’acides
aminés qui servent à une synthèse protéique (Moldawer et al., 1988). La douleur associée à
l’inflammation est le résultat de l’action des kinines sur les terminaisons des neurones
afférents. La synthèse de ces composés est induite à la fois par les cytokines, les autres
médiateurs de l’inflammation et le complément (Dray and Perkins, 1993).
5. La réaction inflammatoire systémique
Une fois synthétisées et libérées localement au site de l’inflammation, les cytokines
peuvent être distribuées dans tout l’organisme par l’intermédiaire de la circulation sanguine et
entraînent alors des modifications systémiques. Les cytokines activent l’hématopoïèse
permettant le remplacement continu des phagocytes. Le taux de certaines protéines
plasmatiques normalement présentes dans le sang augmente rapidement. Ces « protéines de la
phase aiguë » dont la protéine C réactive (CRP), la protéine amyloïde A sérique et
l’haptoglobine, contribuent à la régulation négative de l’inflammation (Berczi et al., 2000). La
CRP est une des principales protéines de la phase aiguë dont la production est induite par
l’IL-6 au niveau du foie et elle joue un rôle capital dans la réaction inflammatoire systémique
puisqu’elle participe à l’activation de la cascade du complément (Mold et al., 1999), stimule
la phagocytose (Schultz and Arnold, 1990) et peut induire la production d’IL-6, d’IL-1β et de
27
TNFα par les monocytes (Ballou and Lozanski, 1992; Li and Chen, 2003). Enfin la CRP
stimule également la production de cytokines anti-inflammatoires telles que l’IL-1ra et l’IL10 (Mold et al., 2002; Pue et al., 1996; Tilg et al., 1993). D’autre part, il y a diminution de la
concentration plasmatique d’un certain nombre de nutriments et minéraux (zinc, fer,
sélénium), ainsi que l’altération des principaux métabolismes, en particulier l’induction d’une
hypertriglycéridémie (Grunfeld and Feingold, 1992), une néoglucogénèse et un catabolisme
protéique accrus (Lennie et al., 1995; Moldawer et al., 1988). Ces régulations métaboliques,
ainsi que la perte de poids associée, seraient une adaptation de l’individu afin de diminuer
l’énergie nécessaire à la recherche de nourriture, et non une complication due à
l’inflammation (Cuthbertson, 1982). Cette théorie de la réponse adaptative est confortée par
les travaux montrant que la diminution de la prise alimentaire de souris infectées par la
bactérie Listéria augmente la survie des animaux, alors que leur gavage la diminue (Murray
and Murray, 1979).
Ainsi l’organisme met en place pendant les premières heures suivant l’infection un
système de défense périphérique de l’organisme via la production de cytokines. Mais cette
réponse inflammatoire présente également une composante centrale.
6. La composante centrale de la réaction de phase
phase aiguë
Lors d’une infection, l’individu malade a de la fièvre et présente une augmentation de
la fatigue et du sommeil. Il se sent faible, présente une modification de son comportement qui
se traduit entre autres par une perte d’intérêt pour les activités sociales et une diminution de sa
prise alimentaire. De plus, il éprouve des difficultés à se concentrer (Dantzer, 2001). Ces
modifications, ou symptômes non spécifiques, sont régulées au niveau du système nerveux
central (SNC) et sont primordiales dans le maintien de l’homéostasie (Hopkins and Rothwell,
1995).
Pourtant le cerveau a longtemps été considéré comme un organe privilégié du point de
vue immunologique puisque la barrière hématoencéphalique (BHE) et ses jonctions serrées
empêchent la transmigration des cellules du système immunitaire spécifique. Toutefois le
cerveau possède son propre système de défense qui peut se mettre rapidement en alerte à la
moindre infection systémique. Les récepteurs TLR des PAMP, ainsi que les récepteurs des
cytokines,
sont
présents
au
niveau
des
cellules
endothéliales
et
des
organes
28
circumventriculaires (OCV) où les vaisseaux sanguins n’ont pas de jonctions serrées
semblables à celles qui caractérisent la BHE du tissu nerveux. A la suite d’une infection
périphérique par un agent pathogène, les cellules endothéliales et les structures dépourvues de
BHE sont les premières à réagir (Lacroix and Rivest, 1998). La réaction inflammatoire
s’étend ensuite progressivement dans tout le tissu cérébral, mettant en jeu principalement les
cellules microgliales qui sont les macrophages résidents du cerveau, et les astrocytes (Aloisi,
2001; Dong and Benveniste, 2001). Comme à la périphérie, la réponse cérébrale se fait via
des molécules de type protéique telles que les cytokines, des molécules lipidiques comme les
prostaglandines et les radicaux libres (Brochu et al., 1999; Nadeau and Rivest, 2000, 2001).
Les cytokines, agissant comme des agents de communication entre le système immunitaire et
le système nerveux central, ont une action au niveau cérébral et induisent l’apparition d’un
véritable état de maladie (Dantzer et al., 2008; Kelley et al., 2003; Konsman et al., 2002).
a)
Voies
Voies d’accès des cytokines au système nerveux central
Plusieurs mécanismes ont été proposés pour expliquer la relation qui existe entre les
cytokines inflammatoires périphériques et leur production dans le système nerveux central,
impliquant d’une part une voie d’accès humorale et d’autre part une voie d’accès nerveuse.
(1) La voie humorale
Plusieurs études montrent que l’IL-1β, le TNFα et l’IL-6 pourraient entrer dans le
cerveau par des systèmes de transport actif saturables au niveau des cellules endothéliales de
la BHE, même si les transporteurs responsables restent à identifier (Banks et al., 1994; Banks
et al., 1991; Pan et al., 1997). De cette façon, il est possible que les cytokines circulantes
induisent la synthèse des cytokines cérébrales par les cellules microgliales ou les
macrophages périvasculaires situés à proximité de la BHE.
Les cytokines peuvent aussi atteindre le cerveau au niveau des OCV. Ces capillaires
sanguins présentent de larges espaces périvasculaires qui facilitent la diffusion des molécules.
(Gross, 1992). A ce niveau, les cytokines pourraient quitter la circulation sanguine, entrer
dans ces espaces périvasculaires puis diffuser dans le parenchyme adjacent pour atteindre les
cellules microgliales et les macrophages périvasculaires (Konsman et al., 2002; Konsman et
al., 2000). Il a en effet été démontré que l’induction d’IL-1β par le LPS est rapide dans les
OCV et les vaisseaux sanguins situés à l’interface périphérie/cerveau, alors qu’elle apparaît
plus tardivement dans le parenchyme cérébral (Konsman et al., 1999).
29
Il a aussi été proposé que les cytokines induisent la synthèse de molécules
intermédiaires comme les prostaglandines en agissant sur les récepteurs au niveau des cellules
endothéliales. Les cytokines cérébrales induisent l’expression par les cellules microgliales et
les macrophages périvasculaires de l’enzyme COX-2 qui catalyse la synthèse des
prostaglandines E2 (PGE2) à partir de l’acide arachidonique (Elmquist et al., 1997; Lacroix
and Rivest, 1998; Rivest, 1999).
(2) La voie nerveuse
Puisque deux des points cardinaux de l’inflammation (chaleur et douleur)
correspondent à des modalités sensorielles, il a été proposé que les cytokines puissent activer
des neurones sensoriels qui transmettent le message de la périphérie vers le SNC (Dantzer,
1994). Lorsque le LPS ou les cytokines sont injectés dans la cavité abdominale, ils
provoquent une inflammation locale au niveau du péritoine. Or les branches afférentes du nerf
vague qui assurent l’innervation de la cavité péritonéale contiennent au sein de leur gaine
périneurale, une gaine de tissu conjonctif qui entoure le nerf, des macrophages qui expriment
les TLR et qui sont capables de produire de l’IL-1β en réponse à une injection intrapéritonéale
de LPS (Goehler et al., 1999). Les neurones sensoriels du nerf vague expriment les récepteurs
de l’IL-1 et leur activité électrique peut être stimulée par l’IL-1β circulante (Ek et al., 1998).
Les afférences vagales projettent vers le noyau du tractus solitaire et l’injection de LPS ou
d’IL-1β en périphérie active dans cette structure des neurones qui émettent des projections
vers de nombreuses structures du SNC, dont le noyau paraventriculaire de l’hypothalamus
contenant les neurones à CRH de l’axe corticotrope (Elmquist and Saper, 1996; Ericsson et
al., 1994; Sagar et al., 1995). L’implication de cette voie nerveuse dans la production et
l’action des cytokines cérébrales a été montrée par des expériences de transsection du nerf
vague.
Des
animaux
vagatomisés
présentent
une
atténuation
des
modifications
comportementales normalement observées après l’injection de LPS confirmant ainsi
l’implication du nerf vague dans la réponse centrale à l’inflammation (Bluthe et al., 1996a, b;
Bluthe et al., 1994).
30
b)
L’état de maladie
(1) La fièvre
Une des premières réponses adaptées de l’organisme est la fièvre. Elle est un des
signes majeurs de l’inflammation systémique. Cette élévation de la température corporelle
résultant d’une élévation du point de consigne thermique (Kluger, 1991) est régulée par les
neurones thermosensibles de l’aire préoptique de l’hypothalamus (Boulant, 2000). La fièvre
participe à la lutte contre l’infection notamment car elle stimule la prolifération des cellules de
l’immunité tout en inhibant la prolifération de nombreux organismes pathogènes (Kluger,
1991; Romanovsky and Szekely, 1998). C’est au 20ème siècle que Kluger démontre, en
étudiant les effets antipyrétiques chez le lézard, que la prévention de la fièvre augmente le
taux de mortalité des animaux (Kluger et al., 1975). La fièvre est le premier effet attribué à
une action centrale des cytokines inflammatoires alors connues sous le terme de pyrogènes
endogènes (Atkins, 1960).
L’IL-1β est un de ces pyrogènes endogènes puisque son administration par voie intraveineuse (iv) chez l’homme et par voie intracérébroventriculaire (icv) chez le rongeur induit
une réponse fébrile (Avitsur et al., 1997; Nemunaitis et al., 1994). De plus, l’IL-1ra injectée
par voie intrapéritonéale (ip) inhibe la fièvre induite par le LPS (Luheshi et al., 1996). Mais
l’IL-6 parait tout aussi indispensable à la mise en place de la fièvre que l’IL-1β puisque chez
des souris dont le gène de l’IL-6 a été inactivé (IL6-KO), l’injection de LPS ou d’IL-1β
n’induit pas de réponse fébrile (Chai et al., 1996). L’IL-1β et l’IL-6 affecteraient l’activité
neuronale de l’aire préoptique responsable de la régulation du point de consigne via l’action
des prostaglandines (Xin and Blatteis, 1992).
(2) Regulation de l’axe corticotrope
Les
cytokines
inflammatoires
activent
l’axe
hypothalamo-hypophyso-
corticosurrénalien (axe HPA) ou axe corticotrope (Turnbull and Rivier, 1995). Cet axe est
constitué par une partie centrale, le noyau paraventriculaire (PVH) de l’hypothalamus
contenant des neurones à CRH (corticotropin releasing hormone), les cellules corticotropes à
ACTH (adrenocorticotropin hormone) de l’antéhypophyse, et la partie corticale de la glande
surrénale qui sécrète les glucocorticoïdes (GC) impliqués dans la réponse au stress (Figure 2).
Suite à une activation par les centres nerveux supérieurs, les peptides hypothalamiques : la
CRH et l’arginine vasopressine (AVP) libérées par l’hypothalamus, stimulent la libération
dans la circulation sanguine de l’ACTH par l’antéhypophyse. L’ACTH stimule alors la
31
synthèse et la libération des glucocorticoïdes par le cortex surrénalien. Les glucocorticoïdes
exercent un rétrocontrôle négatif sur l’activité de l’axe corticotrope au niveau de l’hypophyse,
de l’hypothalamus et des centres nerveux supérieurs.
L’axe corticotrope est entre autres activé par les cytokines inflammatoires IL-1, IL-6
et le TNFα (Besedovsky et al., 1991; Tilders et al., 1994). L’IL1-β, le TNFα et l’IL-6
augmentent l’expression et la sécrétion de CRH (Berkenbosch et al., 1987; Suda et al., 1990;
Watanobe and Takebe, 1992), ainsi que la sécrétion d’ACTH et corticostérone plasmatique
(van der Meer et al., 1996). Les glucocorticoïdes agissent en retour sur les cellules
productrices de cytokines pour en inhiber la synthèse (Akira et al., 1990; Baybutt and
Holsboer, 1990). Cet effet immunosuppresseur des glucocorticoïdes apparaît alors comme un
phénomène de protection de l’organisme contre l’infection au cours des processus
inflammatoires (Yeager et al., 2004).
Hypothalamus antérieur
CR
Hypophyse
ACT
Glande surrénale
Glucocorticoïdes
Catécholamines
Minéralocorticoïdes
Figure 2 : L’axe hypothalamohypothalamo-hypophysohypophyso-corticosurrénalien
32
(3) Réponse neurochimique
Les cytokines ont également des effets sur la neurotransmission monoaminergique et
en particulier sur la sérotonine (5-HT), la noradrénaline (NA) et la dopamine (DA). En effet,
l’administration d’IL-1β induit une augmentation du turnover des systèmes 5-HT, NA et DA
dans l’hypothalamus, l’hippocampe, ainsi que le noyau accumbens (Dunn, 1988b; Kabiersch
et al., 1988; Linthorst et al., 1995; Lacosta et al., 1994). De plus, ces mêmes effets sont
également observés après l’injection de LPS et peuvent être atténués par l’administration
d’IL-1ra (Dunn, 2000; Linthorst et al., 1995). Outre l’IL-1β, d’autres cytokines telles que
l’IL-6, le TNFα et l’IL-2 sont également capables d’affecter l’activité de la 5-HT, NA et DA
dans différentes régions cérébrales dont le cortex préfrontal, l’hypothalamus et l’hippocampe
(Pauli et al., 1998; Zalcman et al., 1994). Enfin, l’IFNγ active l’expression d’une enzyme
l’indoléamine 2,3-dioxygénase (IDO) qui en induisant la dégradation du tryptophane va
entraîner la diminution du pool de 5-HT (Wirleitner et al., 2003).
(4) L’anorexie inflammatoire
On constate chez les individus malades une perte d’appétit qui peut sembler a priori
paradoxale. En effet l’activité pyrogène des cytokines laisse à penser que pour compenser ce
coût énergétique, l’organisme va avoir besoin d’un apport alimentaire conséquent. Pourtant
cette anorexie inflammatoire est une stratégie de lutte contre l’agent pathogène puisqu’elle
réduit la disponibilité des nutriments (dont le fer et le zinc) essentiels à la prolifération des
micro-organismes pathogènes. Ainsi l’augmentation de la température corporelle associée à la
faible teneur en nutriments du milieu freine la multiplication bactérienne (Weinberg, 1984).
Une injection centrale d’IL-1β (McCarthy, 2000; Plata-Salaman et al., 1988; Uehara et
al., 1989), d’IL-6 (McCarthy, 2000; Plata-Salaman et al., 1996) ou de TNFα (McCarthy,
2000; Plata-Salaman et al., 1988) entraîne une diminution de la prise alimentaire. De plus,
l’injection centrale d’IL1-ra atténue l’anorexie induite par une injection périphérique d’IL-1β
ou de LPS (Kent et al., 1996; Laye et al., 2000), même si elle ne la bloque pas complètement.
Par contre, une injection de LPS chez des souris knock-out pour le récepteur fonctionnel de
l’IL-1 (IL-1RI KO) induit tout de même une anorexie. L’absence d’action de l’IL-1β est donc
probablement compensée par une autre cytokine comme le TNFα (Bluthe et al., 2000a). En
effet, l’immuno-neutralisation du TNFα périphérique chez le rat atténue l’anorexie due au
LPS (Sharma et al., 1992). Le rôle de l’IL-6 est plus difficile à mettre en évidence. L’injection
33
de LPS à des souris knock-out pour le gène de l’IL-6 (IL-6 KO) entraîne tout de même une
anorexie, donc l’IL-6 ne semble pas indispensable à l’apparition de l’anorexie inflammatoire
(Fattori et al., 1994).
(5) Effets comportementaux : le
le comportement de maladie
Lors d’épisodes infectieux, un malaise s’installe chez l’individu malade, accompagné
de difficultés de concentration, d’une grande faiblesse et d’un manque d’intérêt pour son
entourage (Dantzer, 2001). C’est ce que l’on nomme comportement de maladie et qui ne
regroupe que les altérations comportementales de l’état de maladie (Hart, 1988). Ces
changements comportementaux apparaissent être l’expression d’un état motivationnel qui
réorganise les priorités de l’individu malade dans le but de lutter contre l’infection (Dantzer et
al., 1999). Comme les réponses neurendocriniennes et neurochimiques, les réponses
comportementales observées au cours de l’infection apparaissent également suite à
l’administration systémique ou centrale de cytokines comme l’IL-1β (Dantzer, 2001; Kent et
al., 1992; Larson and Dunn, 2001; Valentine et al., 1998). Le désintérêt du sujet malade pour
son environnement peut être modélisé chez le rongeur par une diminution du comportement
d’exploration sociale. L’IL-1β est la cytokine la plus impliquée dans la diminution des
interactions sociales lors de l’épisode infectieux. Injectée à la périphérie ou dans les
ventricules cérébraux, elle induit une diminution du temps d’exploration sociale (Bluthe et al.,
1997). L’injection d’IL-1ra bloque la diminution de l’exploration sociale induite par l’IL-1β,
que ces deux cytokines soient injectées par la même voie (centrale/centrale ou
périphérique/périphérique) ou par des voies différentes (IL-1ra centrale/ IL-1β périphérique)
(Bluthe et al., 1995; Kent et al., 1992). L’IL-1ra injecté par voie intrapéritonéale (ip) bloque
les effets du LPS sur l’exploration sociale. Mais ce blocage n’a pas lieu lorsque l’IL-1ra est
injecté par voie icv (Bluthe et al., 1992). Les souris IL-1RI KO présentent néanmoins une
diminution du temps d’exploration sociale suite à la stimulation périphérique par le LPS,
grâce à un phénomène de compensation par le TNFα (Bluthe et al., 2000a). En effet, la
diminution d’interaction sociale induite par le LPS chez la souris IL-1RI KO est inhibée par
l’administration centrale d’un fragment du récepteur soluble du TNFα, ce qui démontre qu’en
l’absence d’IL-1 fonctionnelle, l’action centrale du TNFα est responsable de la diminution du
temps d’exploration sociale (Bluthe et al., 2000a). L’administration centrale ou périphérique
de TNFα entraîne également une diminution du temps d’exploration sociale (Bluthe et al.,
1994). Cependant, celle-ci est bloquée par l’injection d’IL-1ra, ce qui suggère que l’effet du
TNFα sur l’interaction sociale est indirect (Bluthe et al., 1994). L’IL-6 est elle aussi impliquée
34
dans la diminution d’exploration sociale consécutive à l’administration ip de LPS ou d’IL-1β,
puisqu’elle est atténuée chez les souris déficientes pour le gène de l’IL-6 (Bluthe et al.,
2000b)
Résumé
En plus de leur action locale, les cytokines sont capables grâce à leur propriété
endocrine d’agir sur le SNC pour réguler la composante centrale de la réaction
inflammatoire.
Les cytokines agissent en central par l’intermédiaire des voies humorale et nerveuse et
entraînent entre autre, une hyperactivité de l’axe HPA, une altération de la
neurotransmission monoaminergique ainsi que des changements comportementaux regroupés
sous le terme de comportement de maladie.
B. Cytokines et Troubles
Troubles de l’humeur et de la cognition
cognition
Comme nous l’avons vu précédemment, l’action cérébrale des cytokines
inflammatoires est responsable des modifications comportementales observées chez l’individu
et l’animal malades, telles qu’un repli sur soi et la diminution de la prise alimentaire. Le
comportement de maladie est normalement réversible en raison de la capacité du système
immunitaire à éliminer l’agent pathogène et à mettre en place des mécanismes qui s’opposent
à la production et à l’action des cytokines pro-inflammatoires périphériques et centrales. Mais
la dérégulation des mécanismes qui contrôlent le comportement de maladie peut avoir lieu
chez des patients vulnérables. Leur réponse immunitaire est plus intense du fait de la
dérégulation de la balance entre cytokines pro et
anti-inflammatoires au profit de
l’inflammation. Cette dérégulation peut aussi avoir lieu chez des patients dont l’inflammation
devient chronique. C’est le cas de sujets recevant des immunothérapies. On assiste alors à la
mise en place de troubles de l’humeur, définition qui regroupent à la fois les symptômes de
type dépressif et anxieux, et de troubles cognitifs (Bonaccorso et al., 2001).
Nous allons maintenant nous intéresser à la relation entre cytokines et troubles de
l’humeur et de la cognition dans le cas d’une situation inflammatoire chronique. Ces
situations inflammatoires peuvent être diverses puisqu’elles peuvent être la conséquence de
pathologies telles que des polyarthrites, de traitement comme des immunothérapies, mais
35
également des situations d’inflammation chronique à bas bruit telles que décrites dans le
vieillissement ou l’obésité.
1. Cytokines et troubles de l’humeur
a)
Troubles anxieux
Le stress est aujourd’hui un mot utilisé aussi bien dans le langage quotidien que dans
le domaine médical. Le stress correspond à l’action de l’environnement sur l’organisme et aux
réponses de ce même organisme pour s’adapter à son environnement. Les ajustements
comportementaux permettent à l’organisme d’agir directement sur l’environnement et
l’activation neuroendocrinienne, qui met en jeu principalement l’axe corticotrope et le
système nerveux autonome, adapte le milieu intérieur aux besoins de l’action
comportementale. Ce fonctionnement général est fortement modulé par les caractéristiques
individuelles de réactivité qui définissent la personnalité psychobiologique, conditionnée par
des facteurs génétiques, des influences précoces et l’expérience préalable du sujet (Ramos and
Mormede, 1998).
Les troubles anxieux constituent un ensemble de troubles psychologiques et
psychiatriques très divers qui ont en commun d'avoir une anxiété pathologique comme
symptôme principal. L'anxiété n'est pas en soi pathologique. On parle de trouble anxieux
lorsque cette émotion devient envahissante et qu'elle entraîne de manière permanente ou
discontinue une souffrance significative ou une gêne au fonctionnement individuel. Une
anxiété intense peut-être présente au cours d'autres troubles que les troubles anxieux, dans la
schizophrénie par exemple, ou bien dans la dépression , elle est alors associée à d'autres
symptômes (Vaccarino et al., 2008).
Chez l’homme, le lien entre troubles anxieux et état cytokinergique reste encore peu
exploré mais des études réalisées sur des étudiants ont montré que les plus anxieux présentent
une production de cytokines pro-inflammatoires (TNFα, IFNγ, IL-6) plus élevée et une
production de cytokines anti-inflammatoires (IL-4, IL-10) plus faible (Maes et al., 1998). De
plus, il a été montré que des traitements d’immunothérapie à l’IFNα chez des patients atteints
d’un cancer entraînent des modifications du comportement dont des troubles anxieux (Raison
et al., 2005).
Afin d’étudier cette relation, plusieurs tests comportementaux permettant de modéliser
les troubles de type anxieux chez l’animal ont été mis au point. Le labyrinthe en croix
surélevé (Elevated Plus Maze ou EPM) est un test comportemental largement utilisé pour
36
mesurer les troubles de type anxieux chez les rongeurs de laboratoire (Handley and Mithani,
1984). Le labyrinthe est habituellement construit en forme de croix avec 2 bras ouverts et 2
bras fermés par des parois latérales, le tout surélevé au dessus du sol. L'expérience exploite le
conflit, chez les rongeurs, entre la peur des espaces ouverts et le désir d'explorer un nouvel
environnement. Un animal anxieux aura naturellement tendance à préférer les espaces clos et
sombres aux espaces ouverts et éclairés. Partant de ce principe, l'anxiété comportementale est
mesurée par le degré d'évitement des espaces ouverts du labyrinthe (Belzung and Griebel,
2001). Le test d’open-field (OF) consiste à placer l’animal dans un grand espace pourvue de
parois empêchant sa fuite. Les déplacements libres de l’animal sont observés, mais aussi son
niveau d’anxiété selon qu’il explore préférentiellement la périphérie de l’OF ou le centre qui
est plus anxiogène (Prut and Belzung, 2003).
Chez la souris, l’injection de LPS à une dose permettant d’induire la synthèse de
cytokines cérébrales (Laye et al., 2000) entraîne une diminution d’exploration des bras
ouverts de l’EPM sans modification de l’exploration des bras fermés 2 h après l’injection
(Lacosta et al., 1999). L’endotoxine aurait donc une action anxiogénique indépendante de
l’effet inhibiteur du LPS sur l’activité locomotrice. L’injection ip de LPS ou d’IL-1β entraîne,
2 h après l’injection, une diminution similaire du nombre d’entrées dans les bras ouverts de
l’EPM, ainsi qu’une diminution de l’exploration du centre de l’OF (Swiergiel and Dunn,
2007).
L’injection d’IL-1β ou de TNFα directement dans le cerveau de rats par voie icv induit
45 minutes plus tard une diminution de l’exploration des bras ouverts de l’EPM, tandis que
l’injection d’IL-6 n’a pas d’effet dans ces conditions (Connor et al., 1998). D’autre part, les
souris surexprimant l’IL-1ra présentent une augmentation du temps d’exploration des bras
ouverts de l’EPM, ainsi que des taux plus faibles de dopamine et de sérotonine suggérant une
action régulatrice de l’IL-1 dans les troubles anxieux qui pourrait s’exercer au niveau des
systèmes de neurotransmetteurs monoaminergiques (Oprica et al., 2005). L’IL-6 endogène
pourrait être impliquée dans la régulation de l’anxiété puisque les souris IL-6 KO présentent
une diminution de l’exploration des bras ouverts de l’EPM (Armario et al., 1998).
Ainsi la présence de cytokines, lors d’une infection ou encore d’une immunothérapie,
semble participer à la mise en place rapide d’épisodes de type anxieux. Mais peu d’études ont
été réalisées pour évaluer l’impact des cytokines dans le cadre de patholgies inflammatoires
chroniques, ou d’inflammation à bas bruit.
37
b)
Troubles dépressifs
La dépression est une pathologie dont les signes cliniques sont multiples et se
manifestent à différents niveaux : comportemental, psychologique et physiologique. La
dépression est difficile à caractériser car elle englobe un ensemble de manifestations cliniques
qui peuvent être diagnostiquées en utilisant le DSM (Diagnostic and statistical manual of
mental disorders), un manuel qui décrit les différents critères de diagnostic d’un épisode
dépressif majeur. Ainsi, le diagnostic d’une dépression majeure est effectif quand cinq des
neuf symptômes définis par le DSM IV (comme la diminution de l’intérêt et du plaisir, une
humeur dépressive, l’insomnie, la fatigue, la dévalorisation de soi, les troubles de la
concentration,…) sont présents presque quotidiennement, pendant au moins 15 jours et dont
au moins un des symptômes est soit une humeur dépressive, soit une perte d’intérêt ou de
plaisir (DSM Fourth Edition, 1994)
Les patients atteints de dépression présentent des caractéristiques biologiques
particulières. Ainsi la dépression est associée chez 50 à 70 % des patients à une activation de
l’axe HPA (Strohle and Holsboer, 2003). Il a également été constaté des dérégulations des
systèmes de neurotransmission sérotoninergiques (5-HT), noradrénergiques (NA) et
dopaminergiques (DA) cérébraux (Dursun et al., 2001; Ressler and Nemeroff, 1999, 2000;
Schildkraut, 1995). La dépression est aussi associée à des variations d’expression des
différents sous-types de récepteurs, dont les récepteurs 5-HT et en particulier 5HT1A, 5HT1D,
5HT2A, 5HT2C, 5HT6 et 5HT7 (Arango et al., 1995; Escriba et al., 2004; Mann et al., 1999;
Pauwels, 2000).
D’importantes modifications de la fonction immunitaire ont également été mises en
évidence chez des patients atteints de dépression majeure. On observe une augmentation des
concentrations plasmatiques des cytokines inflammatoires : IL-1β, IL-2, TNFα et IL-6
libérées par les macrophages activés et l’IFNγ par les lymphocytes T (Frommberger et al.,
1997; Levine et al., 1999; Maes, 1995; Seidel et al., 1995) et cette augmentation est également
observée dans le liquide céphalorachidien des patients souffrant de troubles dépressifs (Levine
et al., 1999). De plus, cette augmentation de la libération de cytokines est corrélée avec la
sévérité des symptômes psychiatriques dont, entre autres, l’humeur dépressive (Maes et al.,
1999). Toutes ces données permettent donc de formuler une hypothèse cytokinergique de la
dépression.
L’hétérogénéité des symptômes de la dépression rend difficile la réalisation de
modèles reproduisant ces désordres chez l’animal et aucun modèle simple ne peut mimer tous
38
les aspects de cette pathologie chez le rongeur. Toutefois plusieurs comportements et
symptômes caractérisant la dépression humaine, telles que l’anhédonie ou la résignation ont
pu être reproduits chez le rongeur (Cryan and Mombereau, 2004). Dans le test de nage forcée
mis au point par Porsolt (FST pour forced swim test), l’utilisation d’antidepresseurs sur des
souris a permis d’inhiber le comportement de résignation des animaux, faisant alors de ce test
un bon modèle d’évaluation des troubles de type dépressif. Le FST consiste à placer le
rongeur dans un cylindre rempli d’eau d’où il ne peut s’échapper et où l’on distingue le temps
passé par l’animal à nager et se débattre du temps où il reste immobile (Porsolt et al., 1977). Il
existe également un autre paradigme expérimental où l’animal est suspendu par la queue TST
(pour tail suspension test) et où l’on discrimine le temps passé par l’animal à essayer de se
retourner du temps où il reste immobile (Steru et al., 1985). Dans ces deux tests, le temps que
les animaux passent immobiles peut être interprété comme un comportement de résignation.
De plus l’utilisation d’antidépresseurs reverse cette immobilité aussi bien dans le FST (Porsolt
et al., 1977) que dans le TST (Steru et al., 1985).
L’administration périphérique de LPS ainsi que d’IL-1β induit une augmentation du
temps d’immobilité des souris dans le TST et le FST (Dunn and Swiergiel, 2005). Cependant
il est important de noter que, lors de ces expériences, les tests comportementaux ont été
réalisés dans les deux heures suivant la stimulation immune, ne permettant pas de dissocier
l’effet du LPS sur le comportement de résignation de son impact global sur l’activité
locomotrice. Au laboratoire, Frenois et collaborateurs ont récemment montré que 24 h après
l’administration ip de LPS, les souris qui ont retrouvé leur activité locomotrice de base,
présentent des troubles de type dépressif se traduisant par une augmentation du temps
d’immobilité dans le FST et le TST (Frenois et al., 2007). De plus le blocage de l’activation
microgliale par l’administration de minocycline inhibe les troubles de type dépressif induit
par le LPS dans ces deux tests (O'Connor et al., 2008).
L’IL-6 pourrait jouer un rôle dans la survenue des troubles de l’humeur. Il a été
montré que des souris IL-6 KO présentent moins de symptômes dépressifs dans le FST et le
TST (Chourbaji et al., 2006). Cependant, une autre étude ne montre aucune différence de
comportement entre les souris IL-6 KO et les témoins dans le FST et le TST. Mais un FST
réalisé une heure après l’injection d’IL-6 recombinant démontre la mise en place de troubles
de type dépressif associée à l’augmentation de l’expression hypothalamique d’IL-6 endogène
(Matsumoto et al., 2006). Enfin, l’inactivation du gène du TNFα chez des souris
39
transgéniques diminue le temps d’immobilité dans le FST, indiquant une possible action
dépressogène du TNFα endogène (Yamada et al., 2000).
Ainsi là encore, la présence de cytokines dans le cadre d’une immunothérapie ou
d’une pathologie à composante inflammatoire pourrait être un facteur favorisant le
developpement de troubles de l’humeur.
2. Cytokines et troubles cognitifs
a)
La mémoire
L'apprentissage est un processus permettant de conserver des informations acquises,
des états affectifs et des impressions capables d'influencer le comportement. L'apprentissage
est la principale activité du cerveau, c'est-à-dire modifier constamment sa structure pour
mieux refléter les expériences rencontrées. On peut dire aussi que l'apprentissage correspond
à l'encodage, première étape du processus de mémorisation. Son résultat, la mémoire, est la
persistance de données autobiographiques aussi bien que de connaissances générales.
Stimulus
Organes sensoriels
perception
Mémoire sensorielle
(msec. -1 sec.)
attention
répétition
Mémoire à court terme
(<1 min.)
Oubli
Mémoire à long terme
(jours, mois, anné
années)
Figure 3 : Les diffé
différents types de mé
mémoire
40
La mémoire n'est toutefois pas entièrement fidèle et subit des transformations suite aux
reconstructions tributaires du traitement en parallèle de l'information dans le cortex.
La mémoire sensorielle est la mémoire automatique, fruit de nos capacités perceptives,
s'évanouissant généralement en moins d'une seconde (Haenschel et al., 2005).
La mémoire à court terme dépend de l'attention portée aux éléments de la mémoire
sensorielle. Elle permet de garder en mémoire une information pendant moins d'une minute
environ et de pouvoir la restituer pendant ce délai (Cowan, 2008).
La mémoire de travail est un système de mémoire active qui s'occupe à la fois du traitement
et du maintien des informations à court terme. Elle serait donc plus largement impliquée dans
des processus faisant appel à un raisonnement, comme lire, écrire ou calculer par exemple
(Baddeley, 2000). La mémoire de travail serait constituée de plusieurs systèmes indépendants,
ce qui impliquerait que nous ne sommes pas conscients de toute l'information qui y est
stockée à un instant donné. Le cortex préfrontal joue un rôle primordial dans la mémoire de
travail. Il permet de maintenir disponibles certaines données nécessaires au raisonnement en
cours. Pour ce faire, il doit coopérer avec plusieurs autres aires corticales desquelles il
récupère de l'information pour de brèves périodes. Le destin de cette information, autrement
dit son passage vers une mémoire à plus long terme dépend probablement de la mise en jeu du
système limbique (Cowan, 2008).
La mémoire à long terme comprend la mémoire des faits récents, où les souvenirs sont
encore fragiles, et la mémoire des faits anciens, où les souvenirs ont été consolidés. Elle peut
être schématisée comme la succession dans le temps de 3 grands processus de base :
l'encodage, le stockage et la restitution (ou récupération) des informations (Cowan, 2008).
L'encodage vise à donner un sens à la chose à remémorer. De la profondeur de l'encodage,
donc de l'organisation des données, dépendra l'efficacité de la récupération. Une information,
même bien encodée, est toujours sujette à l'oubli. Le stockage peut être considéré comme le
processus actif de consolidation rendant les souvenirs moins vulnérables à l'oubli. C'est cette
consolidation qui différencie le souvenir des faits récents du souvenir des faits anciens qui,
eux, sont associés à un plus grand nombre de connaissances déjà établies (Miller and Matzel,
2000). Finalement, la restitution des souvenirs, volontaires ou non, fait appel à des
mécanismes actifs qui vont utiliser les indices de l'encodage. L'information est alors copiée
temporairement de la mémoire à long terme dans la mémoire de travail pour être utilisée. Plus
un souvenir sera codé, élaboré, organisé, structuré, plus il sera facile à retrouver. Si la
mémoire à long terme peut être subdivisée en mémoire explicite et implicite, et même si cette
dernière peut être subdivisée à son tour en différents types de mémoire, il ne faut pas perdre
41
de vue que la mémoire humaine constitue une association de différents sous-systèmes en
constante interaction (Figure 3).
Les recherches récentes apportent une image complexe et très intriquée des fonctions
mnésiques et de leur localisation. L'hippocampe, les lobes temporaux, de même que les
structures du système limbique qui leur sont reliées, sont essentiels à la consolidation de la
mémoire à long terme (Gluck et al., 2003). Aucun neurone isolé ne contient en lui-même
l'information nécessaire à la restitution d'un souvenir. La trace mnésique est plutôt latente, ou
encore virtuelle, dans la mesure où son existence ne peut être mise en évidence que lorsqu'un
réseau de plusieurs neurones interconnectés est activé. L'association des ces groupes de
neurones corticaux répartis dans différentes aires cérébrales est rendue possible par certains
réseaux de neurones pré-câblés pour accomplir cette tâche. Parmi eux, les circuits de la
formation hippocampique, impliqués dans l'établissement de la mémoire explicite à long
terme, sont certainement les mieux connus de tous (Wirth et al., 2003).
L'information en provenance des cortex associatifs visuels, auditifs ou somatiques
parvient d'abord à la région parahippocampique du cortex, puis passe au cortex enthorinal et
finalement à l'hippocampe. À travers celui-ci, l'information va passer successivement à travers
trois régions distinctes. En effet, l'hippocampe proprement dit est fait des régions pourvues de
neurones pyramidaux étroitement groupées, principalement les aires CA1, CA2 et CA3. C'est
ce que l'on appelle le circuit ou la boucle trisynaptique de l'hippocampe. C'est dans ces
synapses que la mémoire spatiale associée à l'hippocampe semble être encodée (Winters et al.,
2008). Cette région démontre aussi une forte propension à la potentialisation à long terme
(PLT), bien que l'on observe ce phénomène à plusieurs autres endroits dans l'hippocampe
ainsi que dans le cortex (Abraham and Williams, 2008).
b)
Les troubles
Les individus en proie à une infection présentent des altérations de divers processus
cognitifs allant de l’attention à la mémoire. Ainsi, les individus atteints de maladies
infectieuses (grippe ou rhume) induites expérimentalement ou non, présentent des altérations
des performances psychomotrices ainsi que des déficits des processus d’attention sélective
permettant de se concentrer sur un stimulus particulier et de négliger les stimuli non pertinents
(Smith et al., 1987a; Smith et al., 1987b). Des sujets étudiés lors d’un épisode grippal
présentent des performances mnésiques significativement plus faibles que celles des sujets
sains (Capuron et al., 1999). De plus, l’administration d’endotoxine bactérienne à des sujets
42
volontaires provoque une diminution des performances mnésiques associées à la mémoire
déclarative et non-déclarative, qui est corrélée à l’augmentation des taux circulants de
cytokines dont l’IL-6 et le TNFα (Reichenberg et al., 2001; Yirmiya et al., 2000). Dans une
autre étude, l’injection par voie intraveineuse d’une faible dose d’endotoxine ne provoque pas
d’altération mnésique significative, mais le taux plasmatique d’IL-6 est inversement corrélé à
la performance de mémoire déclarative (Krabbe et al., 2005).
Plusieurs tests comportementaux permettant de mesurer les performances cognitives
chez l’animal ont été utilisés afin d’étudier l’impact des cytokines inflammatoires sur les
processus cognitifs. Ainsi, il est possible d’étudier la mémoire spatiale des rongeurs en se
basant sur l’attirance des rongeurs pour la nouveauté, un comportement spontané qui les
amène à explorer préférentiellement les endroits les moins familiers (Conrad et al., 1996;
Dellu et al., 1992). L’animal est placé dans un labyrinthe composé de trois bras identiques
disposés en forme de Y (Y maze). Au cours d’une première phase d’acquisition, un des bras
du Y est aléatoirement fermé, de façon à ce que l’animal explore seulement les deux bras
restants. Apres un intervalle de rétention de durée variable, les animaux sont replacés dans le
labyrinthe avec cette fois-ci un accès libre à l’ensemble des bras. Des indices spatiaux
permettent à l’animal d’établir une représentation spatiale afin de distinguer les bras qui sont
strictement identiques, ce qui nécessite la mise en jeu de l’hippocampe (Conrad et al., 1996).
Les animaux ayant identifiés dans l’espace les bras explorés durant l’acquisition explorent
préférentiellement le bras nouveau (Dellu et al., 1992). Il a récemment été montré que cette
tâche mnésique de reconnaissance spatiale est altérée par l’administration périphérique de
LPS 24 h avant le test (Noble et al., 2007), mais la dose de LPS utilisée (250µg/souris)
induisait un choc sceptique. Il est donc difficile de differencier l’effet du choc sceptique sur
l’activité locomotrice de l’effet sur la cognition. Le rôle des cytokines dans des conditions
d’inflammation plus modérée, comme dans le cas d’une inflammation chronique à bas bruit,
reste donc à élucider.
Il existe d’autres tests permettant d’évaluer la mémoire implicite ou explicite, comme
le test du labyrinthe aquatique de Morris qui permet d’évaluer une forme de mémoire
explicite relationnelle impliquant l’hippocampe (Morris et al., 1982) ou encore la mémoire de
travail en modifiant le paradigme du test (Sparkman et al., 2005). Mais le Y maze est un test
très peu stressant pour les animaux et ne necessitant pas d’apprentissage, ce qui en fait un test
efficace et pertinent.
43
Un des mécanismes pouvant expliquer l’action des cytokines cérébrales sur les
performances cognitives est leur action sur la plasticité synaptique. L’hippocampe est le
siège de phénomènes importants de plasticité synaptique. La potentialisation à long terme
(PLT) semble en particulier jouer un rôle essentiel dans les processus d’apprentissage et de
mémoire. La PLT désigne l’augmentation de la réponse synaptique consécutive à la
stimulation haute fréquence des fibres afférentes (Bear and Malenka, 1994; Jeffery and
Morris, 1993). Il a été montré que l’administration d’IL-1β au sein de tranches d’hippocampe
altère la PLT au niveau des champs CA1 (Bellinger et al., 1993) et CA3 de l’hippocampe
(Katsuki et al., 1990), ainsi qu’au niveau du gyrus dentelé où cet effet est de plus bloqué par
l’IL1-ra (Cunningham et al., 1996). Il a de plus été montré in vivo que l’administration d’IL1β par voie icv inhibe la PLT dans le gyrus dentelé (Murray and Lynch, 1998). L’injection
systémique de LPS altère également la PLT probablement via l’IL-1β puisque celle-ci
augmente au niveau hippocampique suite au LPS et que l’effet du LPS est fortement atténué
chez les souris transgéniques dépourvues du récepteur de l’IL-1 de type 1 (Kelly et al., 2003).
Le TNFα affecte également la plasticité synaptique puisque l’administration de TNFα au sein
d’une tranche d’hippocampe inhibe la PLT au niveau du champ CA1 (Tancredi et al., 1992) et
du gyrus dentelé de façon similaire à l’effet de l’IL-1β et du LPS (Cunningham et al., 1996).
Enfin, un effet inhibiteur de l’IL-6 sur la PLT est rapporté par plusieurs travaux. L’incubation
de tranches d’hippocampe avec de l’IL-6 entraîne une inhibition de la PLT au niveau du
champ CA1 (Li et al., 1997; Tancredi et al., 2000). Les souris transgéniques surexprimant
l’IL-6 au niveau cérébral présentent une réduction de la PLT dans le gyrus dentelé (Bellinger
et al., 1995).
Une activation chronique du réseau de cytokines peut également être à l’origine de
troubles cognitifs. Une des premières études cliniques sur les effets secondaires des
traitements par les cytokines montre que la moitié des patients atteints de cancers métastasés
recevant de l’IL-2 par voie intraveineuse présente après 3 mois une détérioration des
performances cognitives mesurée lors de tests psychométriques (Denicoff et al., 1987). Ces
altérations cognitives se traduisent par une augmentation du temps de réaction, une baisse de
la vigilance et de la performance dans la reconnaissance d’images (Walker et al., 1996). Des
patients traités par l’IFNα présentent des difficultés dans la réalisation de tâches logiques
impliquant la mémoire verbale, une baisse de performance en calcul et en écriture et une
altération de la rapidité de traitement de l’information et/ou des fonctions exécutives alors que
des améliorations sont observées dès l’arrêt du traitement (Poutiainen et al., 1994; Pavol et al.,
44
1995; Scheibel et al., 2004). Sous l’effet d’un traitement conjoint par l’IFNα et l’IL-2 ou par
l’IL-2 seule, il a été observé des perturbations de la mémoire de travail et de la planification
de tâches (Capuron et al., 2001).
Résumé
L’anxiété et la dépression sont des pathologies psychiatriques multifactorielles
associant symptômes psychiques et somatiques
Les troubles de la mémoire sont des phénomènes complexes du fait de l’existence de
différents types de mémoire.
La présence de cytokines inflammatoires dans le cadre d’une immunothérapie ou
d’une pathologie à composante inflammatoire serait un facteur favorisant le developpement
de troubles de l’humeur et de la cognition.
3. Mécanismes potentiellement impliqués
a)
Implication de l’IDO
Le L-tryptophane (Trp) est le moins abondant des acides aminés essentiels chez les
mammifères. Le tryptophane est utilisé pour la synthèse des protéines (plus de 95%), mais
également pour la synthèse de sérotonine (5-HT), un des systèmes de neurotransmission
perturbés au cours de la symptomatologie dépressive. Seule une faible concentration du Trp
provenant de l’alimentation est convertie en 5-HT. Outre la voie métabolique conduisant à la
5-HT, la majeure partie du Trp est catabolisée sous l’influence de la tryptophane 2-3dioxygénase (ou TDO) et de l’indoléamine 2,3-dioxygénase (ou IDO) en kynurenine (Kyn)
(Moroni, 1999; Schwarcz and Du, 1991; Stone, 1993) (Figure 4). Ces enzymes pourraient
être impliquées dans la mise en place des troubles décrits précédemment.
La voie de la kynurénine est la voie majoritaire de métabolisation non protéique du
Trp (Takikawa et al., 1986). La première étape de cette dégradation permet la formation de Nformylkynurénine convertie ensuite en L-kynurénine, précurseur de l’acide nicotinique ainsi
que de l’acide xanthurénique (Grohmann et al., 2003; Schwarcz and Du, 1991). A terme, la
voie de la kynurénine permet la production du coenzyme ubiquitaire, le nicotinamide adénine
45
dinucléotide (NAD), impliqué dans un grand nombre de réactions cellulaires et
particulièrement essentiel lors de la synthèse d’adénosine triphosphate (ATP) (Figure 5).
Stimuli
immun
L-Tryptophane
Cytokines
Inflammatoires
Sang
BHE
SNC
L-tryptophane
décarboxylase
L-Tryptophane
5-HT P
IDO
L-Kynurenine
Décarboxylase
Sérotonine
Figure 4 : Les voies de catabolisme du Tryptophane
46
L -Tryptophane
IDO
TDO
Kynurenine aminotransferase
KAT 1/2
Acide Kynur
Kynuré
é nique
L -Kynur
Kynuré
é nine
Kynureninase
KYN-ase
Acide Anthranilique
Kynurenine hydroxylase
KYNOH-ase
3 -Hydroxykynurenine
KYN-ase
Acide 3
3--Hydroxyanthranilique
3-hydroxyanthranilate 3,4 dioxygenase
3-HAO
Quinolinate phosphoribosyltransferase
QPRT-ase
NAD
Acide Quinolinique
Picolinic carboxylase
PIC-ase
Acide Picolinique
Figure 5 : La voie de la Kynurenine
La formation de la N-formylkynurénine à partir du Trp fut tout d’abord observée dans
des extraits de foie et attribuée à une enzyme, la tryptophane pyrrolase (Kotake and
Masayama, 1936). Elle est par la suite décrite comme un système peroxydase-oxydase,
possédant une haute spécificité pour l’isomère L-Trp (Tanaka and Knox, 1959). Alors appelée
TDO, cette hémoprotéine initie le catabolisme du Trp par le clivage oxydatif de son noyau
indole. Exclusivement mesurée dans le foie (Knox and Auerbach, 1955), l’activité de la TDO
est augmentée en quelques heures après administration de Trp, ainsi que par les
glucocorticoïdes, alors qu’elle est inhibée par l’administration de certains anti-dépresseurs
(Badawy and Evans, 1981; Knox and Auerbach, 1955). Cependant, la découverte de la
présence de D-kynurénine dans les urines de lapins nourris avec du D-Trp par Kotake et Ito,
en 1937, a suggéré la présence d’une enzyme au sein des tissus extra-hépatiques (Higuchi and
Hayaishi, 1967). Purifiée à partir d’intestin grêle de lapin, cette hémoprotéine permettrait la
conversion du D-Trp en formyl-D-kynurénine en catalysant le clivage oxydatif du noyau
indole du D-Trp (Higuchi and Hayaishi, 1967; Yamamoto and Hayaishi, 1967).
Contrairement à la TDO, cette enzyme n’est pas spécifique du D-Trp, mais est aussi
capable de métaboliser le L-Trp, ainsi que d’autres indoléamines telles que la tryptamine ou la
5-HT (Yamamoto and Hayaishi, 1967; Shimizu et al., 1978). Du fait de sa large spécificité de
substrats, elle fut alors appelée l’indoléamine 2,3-dioxygénase ou IDO (Hirata et al., 1975).
Contrairement à la TDO, l’IDO est largement distribuée au sein des tissus extra-hépatiques
47
des mammifères tels que l’intestin et le colon, la rate, les reins, l’estomac, les poumons, ainsi
que le cerveau (Hayaishi et al., 1975). Au niveau cellulaire, l’IDO est fortement exprimée,
chez l’homme et le rongeur, par les cellules dendritiques et les macrophages, ainsi que par les
cellules endothéliales cérébrales, les astrocytes, la microglie et les neurones (Carlin et al.,
1989; Guillemin et al., 2005b; Kwidzinski et al., 2005). Son activité n’est pas influencée par
le Trp alors que sa synthèse de novo est stimulée par des agents activant la production de
cytokines tel que le LPS (Hayaishi and Yoshida, 1978; Yoshida and Hayaishi, 1978). Ainsi,
l’IFNγ produit au sein des macrophages et des cellules dendritiques va induire l’activation de
l’IDO (Byrne et al., 1986; Koide and Yoshida, 1994; Taylor and Feng, 1991; Williams et al.,
2008). De plus, il a été montré au sein du laboratoire qu’hormis l’IFNγ, le TNFα semble
impliqué dans l’activation cérébrale de l’IDO. Le rôle d’autres cytokines comme l’IL-6 reste
encore à élucider.
Bien que la TDO hépatique représente la voie majoritaire de dégradation du Trp en
conditions physiologiques, l’IDO jouerait un rôle essentiel dans la modulation des
concentrations en Trp nécessaires au bon fonctionnement de l’organisme en conditions
inflammatoires. En effet, en conditions physiopathologiques, son activation par le système
immunitaire pourrait être responsable des variations de Trp au sein d’un grand nombre de
tissus du fait de sa distribution ubiquitaire et plus particulièrement au niveau cérébral, où
l’activation de l’IDO pourrait induire une déplétion en Trp suffisante pour être à l’origine
d’une perturbation du métabolisme de la 5-HT et ainsi participer à la mise en place de
troubles de l’humeur (Schiepers et al., 2005). Ainsi, l’IDO semble être un bon candidat dans
l’induction des troubles de l’humeur associés à une activation du système immunitaire.
En conditions inflammatoires, l’activation de l’IDO pourrait réduire de manière
suffisante les concentrations de Trp pour intervenir sur le fonctionnement 5-HT. Parmi les
effets cérébraux résultant d’un dysfonctionnement de la 5-HT, il est connu qu’une
hypoactivité des systèmes sérotoninergiques intervient très probablement chez les patients
déprimés et chez les maniaco-dépressifs (Owens and Nemeroff, 1994; van Praag, 1982). A
l’inverse, l’anxiété généralisée pourrait être associée à une exacerbation de la transmission 5HT cérébrale (Baldwin and Rudge, 1995; Chaouloff et al., 1999; Eison and Eison, 1994;
Handley and McBlane, 1993). Il a été montré par notre laboratoire l’existence d’altérations du
métabolisme du Trp périphérique et cérébral en relation avec des modifications
comportementales de type dépressif au cours de la réaction inflammatoire (Dantzer et al.,
2008). L’activation du système immunitaire agit au niveau du SNC et modifie l’activité
48
neuronale et la réponse neurochimique cérébrale. En condition aiguë, elle influence fortement
le métabolisme du Trp et le système 5-HT cérébral (O'Connor et al., 2008).
L’activation de l’IDO, tout en induisant une déplétion en Trp, va donc entrainer la
synthèse de kynurénine. Ce métabolite peut à son tour être métabolisé vers deux voies
différentes. La kynurénine-3-monooxygénase (KMO) convertit la kynurénine en radicaux
libres neurotoxiques producteurs de 3-hydroxykynurénine (3-OH KYN) qui sera ensuite
métabolisé en acide quinolinique (QUIN) excitotoxique. La kynurénine aminotransférase II
(KAT II) métabolise la kynurénine en acide kynurénique (KYNA), un composé
neuroprotecteur du fait de ses propriétés antagonistes des récepteurs NMDA (Connor et al.,
2008). La 3OH-KYN augmente l’activité des monoamines oxydases et de ce fait pourrait être
impliquée dans le developpement des troubles de l’humeur en diminuant indirectement les
taux de 5-HT. De plus, une production élevée de QUIN ou de 3OH-KYN a été observée dans
de nombreuses pathologies neurodégénatives à composante inflammatoire (Heyes et al., 1989;
Ogawa et al., 1992; Reynolds and Pearson, 1989).
Il a été montré que les cerveaux des patients atteints de maladie d’Alzheimer
présentent un métabolisme de la kynurénine élevé. Le blocage des récepteurs NMDA par la
KYNA pourrait être responsable de l’altération de la mémoire, de l’apprentissage et de la
cognition chez les patients atteints d’Alzheimer (Baran et al., 1999). Enfin, le système
serotoninergique semble impliqué dans le contrôle neurobiologique de l’apprentissage et de la
mémoire. Ainsi les récepteurs 5-HT(1A), 5-HT(4) et 5-HT(6) sont fortement associés à
l’apprentissage et la mémoire (King et al., 2008).
b)
Implication de l’axe HPA
Les cytokines inflammatoires activent l’axe corticotrope, ce qui conduit à la libération
des hormones glucocorticoïdes (Matta et al., 1993; van der Meer et al., 1996). L’activation de
l’axe corticotrope est associée à l’apparition de troubles anxieux impliquant une action
centrale de la CRH ainsi que des glucocorticoïdes (Korte, 2001; Owens and Nemeroff, 1991).
Il pourrait donc participer à l’action des cytokines sur les troubles de l’humeur observés lors
d’une activation du système immunitaire. En effet, l’administration de LPS ou d’IL-1β par
voie ip induit une augmentation des taux plasmatiques d’ACTH et de corticostérone,
s’accompagnant d’une diminution d’exploration des bras ouverts de l’EPM ou du
compartiment fortement éclairé dans la « light/dark box » traduisant un état d’anxiété
(Lacosta et al., 1998, 1999). Enfin, l’injection d’IL-1β par voie icv induit une augmentation
49
de la corticostérone plasmatique qui s’accompagne d’une augmentation du comportement de
type anxieux dans l’EPM chez le rat (Connor et al., 1998).
Dans le cadre de la dépression, l’implication de l’axe HPA semble également être
démontrée. En effet, il a pu être observé une hyperactivité de l’axe HPA chez les patients
dépressifs (Strohle and Holsboer, 2003). En effet, ces patients présentent une augmentation
des taux plasmatiques et urinaires de cortisol, ainsi qu’une élévation marquée des
concentrations de CRH dans le liquide céphalo-rachidien (Banki et al., 1987; Maes, 1995). Le
cortisol étant incapable de freiner la production d’ACTH et de CRH, l’hypothèse d’un
dysfonctionnement du rétrocontrôle négatif de l’axe HPA dans la dépression a été suggérée
(Sheline, 2000 ; Pariante, 2003). Cette altération serait due à une réduction de la fonction des
récepteurs aux glucocorticoïdes (Modell et al., 1997; Pariante, 2004). De plus, il a été montré
que suite à la première injection d’IFNα lors d’un traitement immunothérapeutique, les
patients qui présentaient une réponse exacerbée de l’axe HPA en terme de sécrétion d’ACTH
et de cortisol étaient les sujets qui développaient par la suite des épisodes de type dépressif.
Ces mêmes conclusions ont été observées après l’induction d’un stress chez ces patients
(Capuron et al., 2003).
Enfin, dans le cas des pathologies d’Alzheimer, l’activation de l’axe HPA pourrait
participer au developpement de la maladie puisque l’hypercortisolémie présente lors de cette
pathologie serait associé à une atrophie de l’hippocampe (Pomara et al., 2003). De plus, lors
du vieillissement, l’élévation de la concentration de glucocorticoïdes circulants semble être
liée au developpement du déclin cognitif via les lésions qu’ils induiraient au niveau
hippocampique. Dans certaines conditions, l’utilisation d’inhibiteurs des glucocorticoïdes
apparait avoir une action thérapeutique (Pomara et al., 2003).
Résumé
Les troubles de l’humeur et de la cognition sont des symptômes souvent accompagnés
de modifications neurobiologiques telles qu’une hyperactivité de l’axe HPA, une dérégulation
du système 5-HT et une production accrue de cytokines inflammatoires.
Une diminution des taux de Trp ayant pour conséquence une réduction de la synthèse
de 5-HT pourrait indirectement être impliquée dans les troubles de l’humeur et de la
cognition.
50
L’IDO pourrait intervenir dans le developpement des troubles de l’humeur et de la
cognition en perturbant à la fois les systèmes sérotoninergiques, via la réduction des taux de
Trp disponibles, et glutamatergiques, en favorisant la production de composés neurotoxiques,
QUIN et 3-OH KYN.
L’activation de l’axe HPA et principalement la production exacerbée de
glucocorticoïdes pourrait également intervenir dans les troubles de l’humeur et de de la
cognition.
C. L’obésité
Par leur synthèse et leur action dans le cerveau, les cytokines sont à l’origine de
modifications transitoires du comportement qui seraient une stratégie adaptative contribuant à
éliminer l’agent pathogène et à retourner à l’état d’équilibre initial. Mais dans certaines
situations comme une inflammation chronique, le comportement de maladie peut laisser place
à une situation de dysfonctionnement neuronal et au développement de troubles de l’humeur
et de la cognition. Dans ce contexte, l’obésité, en tant que situation inflammatoire à bas bruit,
pourrait permettre l’étude des implications physiopathologiques de l’altération de la
régulation des cytokines.
1. Définition et caractérisation
L’obésité est devenue la première maladie non infectieuse de l’histoire. C’est une
véritable épidémie qui frappe aussi bien les pays industrialisés que les pays en voie de
développement. L’Organisation Mondiale de la Santé (OMS) définit « le surpoids et l'obésité
comme une accumulation anormale ou excessive de graisse corporelle qui peut nuire à la
santé » et place actuellement sa prévention et sa prise en charge comme une priorité dans le
domaine de la pathologie nutritionnelle.
Le plus souvent, l'obésité est appréciée par le poids mais il faut noter qu'il n'y a pas de
stricte équivalence entre poids et obésité puisque dans le poids interviennent, outre la masse
grasse, le tissu osseux, l'eau et le muscle.
L'obésité est définie par l’Indice de Masse Corporelle (IMC). L'IMC est calculé en
divisant le poids de la personne par le carré de sa taille (kg/m²). Si l’indice est compris entre
25 et 30, on parle de surpoids. Lorsqu’il est supérieur ou égal à 30, l'individu est considéré
51
comme obèse. Au-delà de 40 kg/m², le patient présente une obésité morbide. On sait
également aujourd'hui que l'IMC n'est qu'un outil de mesure du rapport poids/taille et n'est pas
suffisant pour évaluer un risque de morbidité chez la personne obèse. Il existe donc d’autres
indicateurs de surpoids comme le rapport tour de taille/tour de hanches. Il doit être inférieur à
1 chez l'homme et à 0,85 chez la femme. Ces indices sont complémentaires puisque l’homme
et la femme ne présentent pas un profil de répartition de la masse graisseuse identique. En
effet, chez l'homme elle s'accumule généralement sur l'abdomen et le thorax où l’on parle
d’obésité androïde (en forme de pomme) tandis que la masse de graisse se repartit
préférentiellement sur les hanches et les cuisses chez la femme qui présente alors une obésité
gynoïde (en forme de poire) (Blouin et al., 2008) (Figure 6). On distingue alors trois types de
tissus adipeux de topographie différente : le tissu adipeux gynoïde qui prédomine à la partie
inférieure du corps au niveau des cuisses et des fesses, le tissu adipeux androïde sous-cutané
et viscéral. Ce tissu adipeux se localise au contraire à la partie supérieure du corps. Il est
caractérisé par une hypertrophie adipocytaire et une sensibilité lipolytique importante. Cette
topographie androïde avec surcharge adipeuse viscérale serait favorisée entre autre par une
augmentation du tonus sympathique et par l'hyperinsulinisme. Les complications
cardiovasculaires et métaboliques associées à l'obésité sont en rapport avec la distribution
androïde et le type viscéral de tissu adipeux. Celui-ci est doté d'une capacité sécrétrice, et les
adipokines libérées par le tissu adipeux viscéral peuvent directement ou indirectement
promouvoir l'apparition d'un diabète de type 2, d'une dyslipidémie ou d'une hypertension
artérielle. Ces facteurs de risque associés très directement à l'activité du tissu adipeux viscéral
vont favoriser la progression de l'athérosclérose et de ses complications (Pathak, 2007).
Obé
Obésité
sité gynoï
gynoïde
ou en forme de
poire
Obé
Obésité
sité androï
androïde
ou en forme de
pomme
Figure 6 : La ré
répartition de la masse grasse chez la femme et chez ll’’homme
52
Dans le cas d’une obésité dite « modérée », les risques d’apparition de problèmes
comorbides, comme le diabète et l’hypertension, augmentent mais ces pathologies associées
ne sont pas forcément présentent chez ces sujets obèses. Quand on parle d’obésité morbide,
on voit apparaître une morbidité secondaire à différents types de complications telles que des
maladies cardio-vasculaires, de l’hypertension artérielle, une hypercholestérolémie ou un
diabète de type 2. Ce diabète de type 2 est non insulino-dependant contrairement au diabète
de type 1 qui lui est insulino-dependant. L’ensemble de ces symptômes constitue alors le
syndrome métabolique. D’autres pathologies peuvent également apparaître comme des apnées
du sommeil et des troubles respiratoires, des douleurs articulaires, des reflux gastrooesophagiens, des problèmes psychologiques et une infertilité (Basdevant et al., 2002).
Quelque soit la sévérité de l’obésité, le tissu adipeux va être à l’origine de la production
de cytokines inflammatoires. L’obésité va donc être associée à une situation inflammatoire
chronique à bas bruit (Clement et al., 2004; Cottam et al., 2004; Trayhurn and Wood, 2004).
Mais si l’obésité est à l’origine d’une situation inflammatoire chronique par la
production de cytokines inflammatoires par le tissu adipeux, d’autres hypothèses sont
proposées suggérant que l’écologie microbactérienne chez l’homme peut être un facteur
important affectant l’homéostasie énergétique. Ainsi, les individus prédisposés à développer
une obésité auraient une colonie bactérienne intestinale qui favoriserait l’occurrence de
maladies métaboliques (Backhed et al., 2004; Backhed et al., 2007; Ley et al., 2005). Mais
l’impact du microbiote sur le statut inflammatoire reste encore peu connu. De plus, il a
également été montré que certains traitements antibiotiques, en modifiant le microbiote
intestinal, protègent partiellement contre le développement de diabète de type 1, chez des rats
présentant une insulite (Brugman et al., 2006). Mais un des facteurs qui pourraient être
responsable de l’apparition et du maintien d’une inflammation lors de la consommation d’un
régime hyperlipidique est le lipopolysaccharide bactérien (LPS). Le LPS endogène est un
facteur continuellement produit par le tractus intestinal et transloqué à travers les capillaires
intestinaux par un mécanisme TLR4-dépendant. De plus, il est transporté jusqu’aux organes
cibles via les lipoprotéines, en particulier les chylomicrons synthétisés lors de la
consommation d’un régime hyperlipidique. Enfin le LPS est un agent inflammatogène qui
entraîne la sécrétion de cytokines proinflammatoires quand il se lie à son récepteur, le
complexe CD14/TLR4 présent à la surface des cellules de l’immunité innée (Neal et al.,
2006). De façon intéressante, il a été montré que la consommation d’un régime hyperlipidique
augmente de façon significative l’endotoxémie. En effet, la consommation pendant 4
semaines par des souris d’un régime hyperlipidique entraîne l’augmentation de la
53
concentration plasmatique de LPS dans une proportion deux à trois fois plus importante que
l’endotoxémie métabolique. De plus, la consommation d’un régime hyperlipidique modifie le
microbiote intestinal en favorisant le développement de bactéries Gram négatif (Cani et al.,
2007a). Mais si la consommation d’un régime riche en graisse augmente la concentration de
LPS plasmatique, une endotoxémie métabolique chronique expérimentalement induite
entraîne une obésité, un diabète et une insulino-resistance au niveau du foie (Cani et al.,
2007a). En effet, l’infusion sous-cutanée continue de LPS pendant 4 semaines chez la souris
entraîne une augmentation de la glycémie, une augmentation de l’insulinémie, une
augmentation du poids du tissu adipeux, du foie et de la souris, et enfin une augmentation de
l’expression de facteurs inflammatoires de façon similaire à ce qui est observé lors de la
consommation d’un régime riche en graisses (Cani et al., 2007b).
Ainsi, l’endotoxémie métabolique participe au contrôle du statut inflammatoire et peut
entraîner une prise de poids et un diabète. De plus les régimes hyperlipidiques modulent la
composition du microbiote intestinal et la concentration plasmatique de LPS, et par
conséquent l’endotoxémie métabolique. Enfin, les modifications du microbiote intestinal
semblent controler l’occurrence des maladies métaboliques en contrôlant l’endotoxémie
métabolique, l’inflammation et les pathologies associées via un mécanisme qui pourrait
impliquer la perméabilité intestinale (Cani et al., 2008).
Ainsi, l’obésité est fortement liée à l’inflammation, en tant que cause de la pathologie
mais également comme conséquence de la modification morphologique et fonctionnelle du
tissu adipeux. C’est cet aspect de la relation entre obésité et inflammation que nous allons
plus particulièrement étudié dans ce travail de thèse.
2. Prévalence et cause
D’après les dernières estimations mondiales de l’OMS pour 2005, environ 1,6
milliards d’adultes (âgés de 15 ans et plus) étaient en surpoids et au moins 400 millions
d’adultes étaient obèses. L’OMS prévoit en outre que d’ici 2015, quelques 2,3 milliards
d’adultes présenteront un surpoids et plus de 700 millions seront obèses. Au moins 20
millions d’enfants de moins de cinq ans étaient en surpoids en 2005.
Depuis les années 1990 l'élévation de la prévalence de l'obésité et du surpoids est très
importante: la prévalence de l'obésité passe de 5 à 10 % pour les hommes et de 6 à 10 % pour
54
les femmes entre 1992 et 2007. La France compte ainsi 6 millions d'adultes de moins de 65
ans obèses en 2007 (source : étude ObEpi issue d’une enquête réalisée auprès de 25 770
personnes âgées de plus de 15 ans) (Charles et al., 2008). Quant au surpoids, il touche
toujours beaucoup plus les hommes (35 %) que les femmes (21 %).
Si les différences de corpulence, et en particulier l'obésité, sont pour une part liées à
des facteurs génétiques, ces derniers ne peuvent expliquer cette brusque augmentation de la
corpulence, qui tient plus à des facteurs sociaux, économiques et culturels. En 2003, on
retrouve par exemple une nette sur-représentation des obèses chez les ménages les plus
pauvres par rapport aux plus aisés et l'écart a même légèrement augmenté (Thibaut de Saint
Pol, 2007).
Les causes de l’obésité sont bien évidemment nombreuses et multifactorielles. Tout
d’abord il est important de noter que pour la première fois dans l’histoire de l’humanité, une
grande proportion des humains peuvent s'alimenter à suffisance, voire se suralimenter ou
s'alimenter sans tenir compte de leurs besoins, alors que par le passé l’homme a toujours dû
vivre malgré les restrictions alimentaires et les famines (Corbeau, 1992). De plus, les modes
de vie ont changé et ont fait place à la sédentarité. La forte réduction de l'activité physique
due au développement des transports (voiture, transports en commun,...), des nouvelles
technologies (télécommandes, télévision, ordinateurs,...) ne permet pas d'équilibrer le bilan
énergétique. Il ne faut pas croire que l'abondance alimentaire a fatalement occasionné une
hausse des apports énergétiques qui expliquerait la pandémie de l'obésité. En effet, il a été
constaté à l'heure actuelle une baisse des apports énergétiques journaliers qui reste toutefois
supérieure aux dépenses énergétiques journalières. C'est ce dernier élément qui reste un
facteur d'obésité (Poulain, 2004).
La consommation d’aliments gras et sucrés en dehors des repas, le grignotage, est
également fortement responsable de la prise de poids d’une partie de la population mondiale.
L’industrie agroalimentaire a su créer des aliments addictifs présentant un fort index
glycémique qui sont consommés au détriment des fruits et légumes. Enfin, les sociétés
contemporaines sont sources de stress qui peut être à l’origine d’un comportement alimentaire
compensateur.
Mais l’obésité présente parfois aussi une origine génétique. Le rôle de l’hérédité est de
mieux en mieux connu : des gènes responsables ont été identifiés, qui interviennent sur la
production de leptine par les adipocytes. On a remarqué également l'influence des modes de
vie sur les facteurs génétiques. Notre corps a été habitué pendant des millénaires à faire face
55
au manque et la sélection naturelle aurait plutôt favorisé les personnes capables de stocker en
période d'abondance pour faire face aux périodes de disette. Paradoxalement, ces personnes
seraient aussi celles le moins adaptées à une abondance régulière. Mais cette théorie sur la
capacité de l’homme à créer des réserves de graisse en période de disette comme facteur ayant
permis la survie de l’espèce est actuellement controversée, puisqu’il apparaît que la pression
sélective se soit plutôt faite devant la capacité à fuir face aux agresseurs. Par ailleurs, avec une
même alimentation et une même pratique physique, la prise de masse varie selon les individus
et leur métabolisme.
3. Rappel sur la régulation alimentaire
alimentaire et les molécules mises en jeu
L’homéostasie énergétique met en jeu l’intégration d’informations par le cerveau, dont
la résultante est le maintien de paramètres énergétiques tels que le poids corporel dans des
conditions environnementales données. Pour cela, un comportement alimentaire finement
régulé est nécessaire. La principale fonction de ce comportement est d’assurer l’apport de
substrats énergétiques et de composés biochimiques nécessaires à l’ensemble des cellules de
l’organisme.
Le comportement alimentaire inclut au sens large la recherche, la sélection et le
stockage des aliments. L’épisode de prise alimentaire se déroule en trois phases : une phase
pré-ingestive caractérisée par une sensation de faim, une phase prandiale correspondant à la
prise alimentaire et au processus progressif de rassasiement, et enfin une phase post-prandiale,
caractérisée par un état de satiété dont la durée est variable et détermine l’intervalle entre les
repas.
L’homéostasie énergétique ou pondérale a longtemps été considérée comme
dépendante d’un contrôle par rapport à un point de consigne, tout comme l’est la température
corporelle. Cependant, les recherches de ces dernières années démontrent que ce modèle est
trop simpliste. En effet l’homéostasie pondérale de l’individu est soumise à de nombreux
facteurs faisant face, en plus des contraintes internes (stocks, dépenses énergétiques,…), à des
contraintes externes (difficulté d’accès aux ressources). Ces facteurs sont d’ordre écologique,
physiologique (reproduction, vieillissement), social ou métabolique (Collier, 1985; Havel,
2001; Woods and Seeley, 2000). Ils interviennent dans une régulation de l’ordre de jours à
plusieurs années. Parallèlement, un ensemble de signaux de rétrocontrôle est mis en jeu suite
56
à l’ingestion d’aliments (Smith, 2000). Ces signaux sont généralement des facteurs de satiété
à court terme, de nature nerveuse principalement, directement générés par la détection de
l’absorption d’aliments au cours du repas. La prise alimentaire ne serait donc pas régulée par
rapport à un point de consigne déterminée par la stricte adéquation entre apports et dépenses
énergétiques, mais plutôt par rapport à une zone de consigne déterminée par une multitude de
facteurs internes et environnementaux dans laquelle une marge de variation du poids corporel
et de la prise alimentaire est tolérée par l’organisme (Levitsky, 2002).
Le cerveau peut être considéré comme un lieu de convergence et d’intégration
d’informations métaboliques et sensorielles, dont la réponse en terme de régulation de la prise
alimentaire est également modulée par des facteurs émotionnels (Berthoud, 2002; Saper et al.,
2002). De ce fait, le cerveau est capable de trier et d’attribuer de multiples qualités
sensorielles à un acte d’ingestion alimentaire pour ajuster un ensemble de réponses motrices,
endocrines et végétatives dépendantes des dépenses énergétiques. Diverses expériences,
notamment basées sur des techniques de lésions, ont mis en évidence le rôle prépondérant de
l’hypothalamus et du tronc cérébral dans le contrôle de la prise alimentaire (Anand and
Brobeck, 1951). Ainsi le noyau du tractus solitaire (NTS), une large structure du tronc
cérébral qui reçoit des afférences sensorielles gustatives et viscérales, et le noyau arqué de
l’hypothalamus fonctionnent de façon coordonnée entre eux et le reste du système nerveux,
pour initier ou arrêter la prise alimentaire (Grill and Norgren, 1978). Le noyau arqué abrite
des circuits neuronaux soit orexigènes, soit anorexigènes capables de répondre de façon
opposée à un ensemble de stimuli métaboliques (Baskin et al., 1999;Elmquist et al., 1999).
Ainsi la leptine, l’hormone impliquée dans la sensation de satiété, joue un rôle anorexigène en
inhibant l’activité des neurones à neuropeptide Y (NPY) (Tatemoto et al., 1982) et à agoutirelated protein (AgRP) (Broberger et al., 1998) qui stimule la prise alimentaire et en activant
les neurones libérateurs d’α-melanocyte-stimulating hormone (α-MSH) (Mains et al., 1977).
En retour, ces circuits régulent l’activité d’un certain nombre de fonctions cérébrales
impliquées dans la régulation de la prise alimentaire. La balance entre la libération d’un
ensemble de peptides et de neurotransmetteurs orexigènes et anorexigènes va orienter
l’individu vers un état de satiété ou d’appétit (Figure 7).
57
Figure 7 : La prise alimentaire
(1) La leptine
La leptine est une hormone peptidique de 16 kDa comportant 167 acides aminés et
dont la séquence est fortement conservée parmi différentes espèces chez les mammifères
(Gaucher et al., 2003). La structure de la leptine et de son récepteur est très proche de celle
des cytokines de la famille de l’IL-6 et de leurs récepteurs. Le gène codant pour la leptine est
nommé ob. La leptine régule le poids corporel en diminuant l’appétit et en augmentant les
dépenses énergétiques (Friedman and Halaas, 1998). Le récepteur de la leptine Ob-R, le
produit du gène db, est un membre de la famille des récepteurs de cytokines de classe I, qui
inclut gp-130, le récepteur des cytokines de la famille de l’IL-6 (Baumann et al., 1996). Par
épissage alternatif, au moins 5 transcrits différents sont produits à partir du gène db, nommés
Ob-Ra à Ob-Re (Fei et al., 1997). Les effets anorexigènes de la leptine sont dépendants du
récepteur Ob-Rb, dont la partie cytoplasmique est plus longue que celle de toutes les autres
isoformes (Halaas et al., 1995). Le récepteur Ob-Rb est retrouvé de manière abondante au
niveau de l’hypothalamus, qui est une région du cerveau jouant un rôle important dans le
contrôle de l’appétit. Les souris déficientes en leptine (ob/ob) ou en l’expression de la forme
58
longue de son récepteur (db/db) présentent un phénotype d’obésité sévère, se caractérisant par
une augmentation de la prise alimentaire et une diminution des dépenses énergétiques (Zhang
et al., 1994). L’administration de leptine recombinante aux souris ob/ob corrige le phénotype
obèse, mais n’a aucun effet chez les souris db/db. L’injection de leptine à des souris normales
diminue la prise alimentaire. Les cas d’obésité génétique sont rares chez l’homme. Des cas
exceptionnels de déficit en leptine entrainent chez les patients un développement précoce de
l’obésité, associé une altération de la production d’hormones de croissance (Clement et al.,
1998; Strobel et al., 1998).
La leptine est produite de manière prépondérante par les adipocytes. Toutefois, la
synthèse de leptine a également été détectée au niveau de l’hypothalamus, de l’hypophyse (Jin
et al., 1999), du placenta, de l’estomac (Bado et al., 1998), du muscle (Wang et al., 1998) et à
un moindre degré dans d’autres tissus (Margetic et al., 2002). Les taux circulants de leptine
corrèlent avec l’importance de la masse grasse et par conséquent, les individus obèses
présentent des taux sériques de leptine plus élevés que les sujets minces (Considine et al.,
1996). Cette corrélation entre taux sériques de leptine et pourcentage de la masse grasse
suggère que pour la plupart, les patients obèses présentent une diminution de la sensibilité à la
leptine et non pas un défaut de production.
En plus de ses effets sur l’appétit et la consommation d’énergie, la leptine influence le
système endocrinien, la reproduction, l’agrégation plaquettaire, la formation osseuse et la
réponse immune (Ahima and Flier, 2000b; Fantuzzi and Faggioni, 2000; Konstantinides et al.,
2001; Takeda et al., 2002). Les souris ob/ob et db/db ne sont par conséquent pas seulement
obèses, mais présentent également de nombreuses anomalies hormonales, une augmentation
de la masse osseuse, une infertilité et des anomalies de l’hématopoïèse et de la réponse
immune (Ahima and Flier, 2000b; Fantuzzi and Faggioni, 2000; Konstantinides et al., 2001).
Chez les patients obèses, le déficit en leptine n’est pas seulement associé à une obésité
morbide, mais également à un hypogonadisme et à une susceptibilité accrue aux infections
(Ozata et al., 1999; Strobel et al., 1998).
Le rôle de la leptine dans la modulation de la réponse immune et inflammatoire a été
récemment décrit dans de nombreuses études. Le fait que la production de leptine soit
modifiée dans des modèles d’infection et d’inflammation suggère que la production de cette
hormone est contrôlée par la cascade des cytokines impliquée dans la réponse immune
(Faggioni et al., 2001; Pecoits-Filho et al., 2002). Comme d’autres membres de la famille de
59
l’IL-6, la leptine peut activer des réponses cellulaires par la stimulation de signaux de la voie
Janus Kinase/Signal transducer and activator of transcription (JAK/STAT) (Baumann et al.,
1996). La leptine peut induire l’expression de suppressor-of-cytokine signaling (SOCS)-3, qui
inhibe les signaux intra-cellulaires de STAT (Bjorbaek et al., 1998). La leptine peut
également stimuler deux autres voies de signalisation intra-cellulaires : phosphatidylinositol
3-kinase (PI3K) et mitogen-activated protein kinase (MAPK) (Martin-Romero and SanchezMargalet, 2001). L’activation de ces différentes voies de signalisation intra-cellulaires est
caractéristique des effets des cytokines de la famille de l’IL-6 (Heinrich et al., 2003). La
leptine peut influencer les réponses inflammatoires en modulant la production de cytokines
pro- ou anti-inflammatoires et en induisant des signaux inhibiteurs intra-cellulaires, tels que
SOCS-3 (Xiao et al., 2003).
Plusieurs études ont montré que les taux circulants de leptine sont augmentés au cours
de processus infectieux et inflammatoires. L’expression du gène ob dans le tissu adipeux et
les taux circulants de leptine augmentent après l’administration de stimuli pro-inflammatoires
tels que l’administration systémique de LPS (Grunfeld et al., 1996). Le LPS peut stimuler in
vitro la production de leptine par les cellules mononucléées chez des primates mais également
chez des sujets sains (Landman et al., 2003). Le LPS ainsi que certains de ses médiateurs,
TNFα et l’IL-1, augmentent l’expression du transcrit codant pour la leptine dans le tissu
adipeux chez les rongeurs (Grunfeld et al., 1996). De plus, certains ont retrouvé une
diminution des taux plasmatiques de leptine chez des patients tuberculeux (van Crevel et al.,
2002). L’injection intraveineuse de staphylocoques dorés à des souris a également été suivie
d’une diminution des taux circulants de leptine (Hultgren and Tarkowski, 2001). Les souris
ob/ob, de même que des souris normales maintenues à jeun, présentent une susceptibilité
accrue à l’injection de LPS (Palmer and Gabay, 2003) ou plus directement de cytokines dont
le TNF-α (Takahashi et al., 1999). La réaction inflammatoire exacerbée induite par le LPS
peut être expliquée par la surproduction de cytokines inflammatoires qui n’est pas contrebalancée par un taux suffisant de médiateurs anti-inflammatoires. Après administration de
LPS aux souris ob/ob, plusieurs auteurs ont constaté des taux circulants relativement bas de
cytokines anti-inflammatoires tels que IL-10 et IL-1Ra, contrastant avec des taux élevés de
cytokines pro-inflammatoires, incluant l’IL-12 et l’IFN-γ. En résumé, ces travaux indiquent
que la leptine pourrait avoir un rôle anti-inflammatoire en augmentant la production de
cytokines anti-inflammatoires tout en diminuant la synthèse de médiateurs proinflammatoires.
60
Cependant, il est important de noter que les souris déficientes en leptine ou en son
récepteur présentent également des taux circulants élevés de corticostérone (Coleman and
Burkart, 1977; Guillaume-Gentil et al., 1990; Takeshita et al., 2000). Etant donné que les
glucocorticoïdes tels que la corticostérone, peuvent moduler la réponse immune et
inflammatoire (Goujon et al., 1996; Stenberg et al., 1990), les souris db/db permettent
également d’étudier l’implication de l’axe HPA dans la réponse inflammatoire associée à
l’obésité morbide.
(2) La ghréline
La ghréline est un peptide de 28 acides aminés sécrété principalement par l'estomac au
niveau périphérique, mais également l'hypophyse et l'hypothalamus dans le cerveau.
Découverte en tant que ligand endogène du récepteur hypophysaire des sécrétagogues de
l'hormone de croissance (GHSs), outre son puissant effet libérateur de GH, elle joue
également un rôle important dans la régulation de la prise alimentaire et du poids à long
terme. Elle est à l'heure actuelle la seule hormone orexigène d’origine intestinale connue. La
concentration plasmatique de ghréline augmente rapidement avant chaque repas et diminue
tout aussi rapidement dès l'ingestion d'aliments (effet à court terme). La concentration basale
de ghréline plasmatique est inversement corrélée à l'importance des réserves énergétiques, elle
est plus faible chez l'obèse et plus élevée chez l'anorexique que chez le sujet sain. Elle
augmente avec un régime et diminue avec une prise de poids (effet à long terme). L'impact de
la ghréline sur la régulation de la balance énergétique passe par une activation des neurones
hypothalamiques du noyau arqué, sécréteurs des puissants neuropeptides anaboliques : le
NPY et l'AgRP. La ghréline apparaît comme la « coordinatrice » de la sécrétion de GH et de
la prise alimentaire afin d'assurer une croissance harmonieuse et la stabilité de la balance
énergétique (Tounian, 2005).
(3) La résistine
A l’origine découverte comme étant le facteur responsable de l’insulinorésistance, la
résistine est une protéine de 114 acides aminés, principalement sécrétée par les adipocytes
(Steppan et al., 2001). Elle appartient à une famille de molécules riches en cystéine,
impliquées dans la régulation de l’inflammation (Holcomb et al., 2000). Son ARNm est
61
exprimé dans de nombreux tissus chez l’homme et la souris incluant le tissu adipeux,
l’hypothalamus, les muscles squelettiques, les glandes surrénales, la rate, le pancréas ou
encore le tractus gastrointestinal (Kusminski et al., 2005). Bien que la synthèse de sa protéine
semble être restreinte aux adipocytes chez la souris, d’autres types cellulaires tels que les
macrophages sont capables de produire la résistine chez l’homme. Ainsi, le traitement de
macrophages humains par le LPS ou par l’IL-1β, le TNFα et l’IL-6 augmente l’expression de
l’ARNm de la résistine, tandis que l’administration périphérique de LPS entraîne une
élévation marquée des taux de résistine sérique (Kaser et al., 2003; Lehrke et al., 2004). De
plus, la résistine stimule l’expression des cytokines inflammatoires incluant l’IL-1β, le TNFα,
l’IL-6 et l’IL-12 (Bokarewa et al., 2005; Silswal et al., 2005). Enfin, la résistine est fortement
exprimée en conditions inflammatoires chroniques telles que l’arthrite rhumatoïde (Kusminski
et al., 2005; Bokarewa et al., 2005). Bien que cette idée soit controversée, la résistine
semblerait donc être fortement impliquée dans la pathogenèse de l’obésité associée au diabète
de type II (Kim et al., 2001; Steppan et al., 2001; Fève et al., 2006).
4. Les conséquences de l’obésité
a)
Une pathologie inflammatoire chronique à bas bruit
(1) Mise en évidence
Le tissu adipeux blanc exerce un rôle central dans l’homéostasie lipidique ainsi que le
maintien de l’équilibre énergétique. Principaux constituants cellulaires du tissu adipeux, les
adipocytes stockent l’énergie sous forme de triglycérides ou la libèrent sous forme d’acides
gras suivant l’état nutritionnel de l’individu. Le développement du tissu adipeux résulte de la
différenciation des cellules précurseurs ou préadipocytes présents dans la fraction non
adipocytaire ou fraction stroma-vasculaire (Gesta et al., 2007). Le passage des préadipocytes
en adipocytes différenciés est influencé par les glucocorticoïdes et l’accumulation des
triglycérides et principalement orchestré par deux catégories de facteurs de transcription
appartenant d’une part à la famille des PPAR (Peroxisome proliferator activated receptor) et
d’autre part à la famille C/ EBP (Enhancer binding proteins) (Hauner et al., 1989; Rosen and
MacDougald, 2006). L’obésité se caractérise par une hypertrophie et/ou une hyperplasie
adipocytaire entraînant ainsi une altération de la morphologie et de la fonction sécrétoire du
tissu adipeux (Batchelor et al., 1976). En effet, les cellules formant le tissu adipeux régulent le
métabolisme énergétique en sécrétant des composés inflammatoires dont les cytokines telles
62
que le TNFα et l’IL-6, ou encore des hormones telles que la leptine (pour revue (Tilg and
Moschen, 2006)). La mise en évidence du développement d’un état systémique
d’inflammation à bas bruit chez des sujets fortement obèses a permis de caractériser
l’obésité comme une maladie inflammatoire
chronique (Clement et al., 2004; Cottam et al., 2004; Trayhurn and Wood, 2004). Le tissu
adipeux blanc, longtemps considéré comme un organe inerte servant uniquement de réserve
énergétique, est surtout un organe endocrine ayant une forte capacité à sécréter un grand
nombre de facteurs protéiques regroupés sous le terme d’adipokines (Ahima and Flier, 2000a;
Trayhurn and Wood, 2004). En effet, les adipocytes sécrètent la leptine, la résistine et
l’adiponectine, hormones impliquées dans le contrôle de l’homéostasie énergétique, ainsi que
des molécules inflammatoires telles que des chémokines, des protéines de la phase aiguë dont
la protéine C réactive et surtout les cytokines inflammatoires, TNFα et IL-6. Ainsi, il a été
montré que le tissu adipeux exprimait un grand nombre de protéines associées à
l’inflammation, mais que les gènes codant pour ces protéines étaient préférentiellement
localisés dans la fraction stroma-vasculaire (Clement et al., 2004). De plus, la plupart de ces
gènes sont connus pour être impliqués dans la biologie des macrophages, suggérant un rôle de
ces derniers dans la mise en place de l’inflammation chronique observée chez la souris obèse
(Xu et al., 2003a). En effet, il a pu être démontré une accumulation des macrophages dans le
tissu adipeux, positivement corrélée à la masse corporelle et à la taille des adipocytes
(Weisberg et al., 2003).
Le tissu adipeux est donc à l’origine d’une inflammation et d’une infiltration
progressive des macrophages au fur et à mesure du développement de l’obésité (Weisberg et
al., 2003). Cependant, l’origine et la succession des évènements conduisant à la mise en place
de cette inflammation restent mal comprises. En particulier, l’inflammation induite par les
adipocytes est-elle responsable de l’infiltration des macrophages ou au contraire, est-ce
l’accumulation des macrophages au sein du tissu adipeux qui initie la mise en place de
l’inflammation chronique? Néanmoins, il a pu être montré que des changements
morphologiques des adipocytes induisaient des variations physiques dans leur environnement,
ainsi que des modifications de la fonction paracrine du tissu adipeux (Wellen and
Hotamisligil, 2003). Au cours de l’obésité, les adipocytes libèrent de faibles quantités de
TNFα qui vont stimuler la production de MCP-1 (Monocyte chemoattractant protein-1) par
les préadipocytes (Xu et al., 2003a). De façon similaire, les cellules endothéliales sont
également capables de sécréter le MCP-1 en réponse aux cytokines, permettant ainsi
63
l’attraction des macrophages vers le tissu adipeux. De plus, l’augmentation de la sécrétion de
leptine par les adipocytes pourrait également contribuer au recrutement des macrophages en
facilitant leur transport vers le tissu adipeux via la stimulation de l’angiogénèse (SierraHonigmann et al., 1998). Il serait intéressant de tester cette hypothèse en étudiant le
recrutement macrophagique soit chez des souris ob/ob ou chez des souris db/db, soit chez des
animaux ayant reçu des injections de leptine. Ainsi, l’accumulation d’adipocytes et de
macrophages au sein du tissu adipeux serait donc responsable de la forte production de
cytokines inflammatoires observée au cours de l’obésité (Clement et al., 2004) (Figure 8).
Adipocyte
Cellule endothéliale
Préadipocyte
Prise de poids
TNFα
MCP-1
angiogénèse
VEGF
Leptine
Recrutement des
macrophages
Prise de poids
TNFα
IL-6
IL-1β
MCP-1
Recrutement des
macrophages
Figure 8 : L’
L’obé
obésité
sité, une pathologie inflammatoire chronique
IL: Interleukine, MCP-1: Monocyte chemotacttractant protein-1, TNFα: Tumor necrosis factor alpha, VEGF: Vascular endothelial
growth factor
64
(2) Les cytokines impliquées
Le TNFα a été la première cytokine inflammatoire dont l’expression et la sécrétion ont
été localisées dans le tissu adipeux blanc. En effet, l’expression de l’ARNm du TNFα est
fortement augmentée dans ce tissu, dans des modèles d’obésité chez la souris (Hotamisligil et
al., 1993). Le TNFα semble impliqué dans le développement de l’insulinoresistance. En effet,
il a été montré que les taux élevés de TNFα étaient positivement corrélés à l’insulinémie. Le
TNFα participerait à la mise en place de l’insulinorésistance en inhibant la voie de
transduction associée à l’insuline (Coppack, 2001; Hotamisligil, 2003). Chez l’homme,
plusieurs études ont montré que la sécrétion de TNFα serait majoritairement induite par des
cellules de la fraction stroma-vasculaire et plus particulièrement les macrophages infiltrants
(Fain et al., 2004; Weisberg et al., 2003). Au niveau du tissu adipeux, le TNFα a une action
autocrine et paracrine de régulation locale, induisant ainsi de nombreux processus comme
l’apoptose (Coppack, 2001; Prins et al., 1997). De plus, le TNFα est impliqué dans la
synthèse, la sécrétion et l’action d’autres cytokines dont l’IL-6 et la protéine C (Bullo et al.,
2003; Coppack, 2001). Contrairement à d’autres adipokines, la libération dans la circulation
sanguine du TNFα synthétisé par le tissu adipeux reste discutée, bien que le degré d’obésité
ait été corrélé à une augmentation des taux plasmatiques du récepteur soluble du TNFα
(Bastard et al., 2000; Bullo et al., 2003).
L’IL-6 est l’autre cytokine inflammatoire majeure exprimée par les adipocytes dans
une situation d’obésité, mais également au niveau des noyaux hypothalamiques qui régulent la
composition corporelle (Fried et al., 2000). Dans des conditions physiologiques normales, il a
été estimé que plus d'un tiers de la concentration circulante totale d'IL-6 a pour origine le tissu
adipeux. Comme le TNF-α, l'IL6 est exprimé dans le tissu adipeux mais la source cellulaire
pourrait être les adipocytes matures, les préadipocytes ou la fraction stroma-vasculaire
(Clement et al., 2004; Yudkin et al., 2000). Chez les patients obèses, les taux circulants d’IL-6
sont augmentés de façon corrélée avec l’IMC (Mohamed-Ali et al., 1997). Parmi ses effets,
l'IL6 est un des facteurs importants du contrôle de la production de CRP. Des travaux chez
l'homme ont mis en évidence une relation positive entre les quantités d'IL6 dans le tissu
adipeux, les concentrations circulantes d'IL6 et celles de CRP (Bastard et al., 1999). D'autres
paramètres métaboliques comme la sensibilité à l'insuline sont également corrélés aux
concentrations circulantes d'IL-6. L’IL-6 est capable de stimuler l'axe corticotrope et
augmente les concentrations circulantes de triglycérides et de glucose. De plus, l'IL6 serait
65
mis en cause dans l'insulinorésistance qui se développe lors d'obésité. Le récepteur de l'IL6, le
gp130, fait partie de la famille des récepteurs des cytokines de classe I qui recrutent les Janus
Kinases (JAK) pour propager le signal cellulaire. L'activation des JAK entraîne la
phosphorylation de facteurs de transcription de la famille de STATs, ce qui permet leur
dimérisation, leur activation et leur translocation dans le noyau où ils vont affecter la
transcription de gènes cibles (Ihle et al., 1995) (Figure 9). Des travaux récents ont permis de
démontrer l'existence d'interactions entre les voies de signalisation de l'IL-6 et celle de
l'insuline (Hotamisligil et al., 1996; Kroder et al., 1996; Mooney et al., 2001). Ces interactions
se traduisent en général par une diminution de la signalisation de l'insuline en présence de
cytokines.
Les taux circulants d’IL-6 sont également corrélés à l’apparition de perturbations
métaboliques et cardio-vasculaires. Enfin, une étude a mis en évidence les effets "antiobésité" de l'IL-6. Les souris dont le gène codant pour l'IL-6 a été inactivé (IL-6-/-) ont un
poids normal à la naissance et développent à l'âge adulte une obésité en partie corrigée par
l’administration d’IL-6 (Wallenius et al., 2002).
D’autres cytokines sont probablement mises en jeu. Ainsi, la consommation d’un
régime hyperlipidique chez des rats entraîne, en plus de l’augmentation de l’expression de
TNFα et d’IL-6, une augmentation de l’expression hypothalamique d’IL-1β, d’IL-2 et d’IL-7
(De Souza et al., 2005). De plus, suite à une perte de poids, le tissu adipeux de sujets obèses
présente une augmentation de l’expression des gènes codant pour des cytokines antiinflammatoires telles que l’IL-10 et l’IL-1ra (Clement et al., 2004).
66
Leptine
IL-6
gp130
IL-6R
ObR
P
P
JAK2
JAK
Sos
SH
P
Grb2
JAK2
P
P
-2
P
P
IRS
STAT3
P
Ras
Akt
Activation de la voie
JAK/STAT
Raf
STAT3
Activation de la voie
des MAPK
P
MEK
P
STAT3
PI3K
ERK
Transcription
gènes cibles
Figure 9 : Voie de signalisation associé
associée à la leptine et à l’ILIL-6
Akt: Sérine/Thréonine kinase, ERK: Extracellular signal-regulated kinase, gp130: Glycoprotéine 130, Grb2: Growth factor receptor
bound protein 2, IL-6R: Interleukine 6 receptor, IRS: Insulin receptor substrat, JAK2: Janus kinase 2, MEK: Extracellular signalregulated kinase kinase, ObR: Leptin receptor, PI3K: phosphatidylinositol 3-kinase, Raf: Sérine/Thréonine kinase, Ras: Small GTP
binding protein, SHP-2: SH2 domain containing tyrosine phosphatase 2, Sos: Son of svenless, STAT3: Signal of transducer and
activator of transcription 3
(3) Modulation de la répose immunitaire
Si l’obésité est associée à une augmentation de l’expression des cytokines
inflammatoires, elle est également accompagnée d’une perturbation de la réponse immunitaire
(Nieman et al., 1999). Ainsi, une réduction du nombre de lymphocytes, ainsi que de leur
67
réponse proliférative, a été établie à la fois chez des patients obèses et dans des modèles
génétiques d’obésité chez les rongeurs (Lord et al., 1998; Nieman et al., 1999).
De plus, des études cliniques récentes ont suggéré que l’obésité serait associée à un
dysfonctionnement de la réponse immunitaire et de ce fait, exacerberait la sensibilité à
certains pathogènes. Ainsi, l’obésité pourrait contribuer à la pathogenèse de l’asthme puisqu’il
a été montré une corrélation positive entre l’IMC et l’incidence de l’asthme chez les jeunes
garçons (Mannino et al., 2006). De plus, l’augmentation des septicémies chez les sujets
obèses pourrait être due à une exacerbation de l’inflammation microvasculaire, ainsi qu’à la
suractivation des cellules endothéliales (Vachharajani et al., 2005). Un modèle de rats
génétiquement obèses (fa/fa) présente une perturbation du comportement de maladie, en
particulier une exacerbation de la fièvre et de l’anorexie, en réponse à la microinfusion i.c.v.
d’IL-1β (Plata-Salaman et al., 1998). Enfin, une augmentation de la production d’IFNγ par les
lymphocytes T activés a été observée chez des enfants obèses, suggérant que la prédominance
de la réponse Th1 contribue à l’inflammation associée à l’obésité (Pacifico et al., 2006).
Cet état inflammatoire associé à l’obésité pourrait jouer un rôle dans la pathogenèse de
nombreuses maladies co-morbides telles que le diabète de type 2, l’hypertension,
l’insulinorésistance, l’athérosclérose, certains cancers, ainsi que dans le développement de
troubles de l’humeur fréquemment décrit chez les sujets obèses.
Résumé
L’obésité, pathologie complexe aux causes multifactorielles, est désormais une
véritable épidémie mondiale. Problème de santé publique, elle est associée à un grand
nombre de pathologies co-morbides.
L’obésité se caractérise par un excès de tissu adipeux dont la morphologie et la
fonction sécrétoire sont altérées, entraînant la mise en place d’une inflammation à bas bruit.
Les principaux constituants cellulaires du tissu adipeux, les adipocytes et les
macrophages de la fraction stroma-vasculaire sécrètent des adipokines qui jouent entre autre
un rôle dans le maintien de la balance energétique et/ou dans la mise en place de la réponse
inflammatoire telles que la leptine, le TNFα et l’IL-6.
68
b)
Les troubles de l’humeur et du comportement
L’obésité qui s’accompagne chez la plupart des patients de troubles de la conduite
alimentaire est souvent caractérisée par une diminution de l’estime de soi, une insatisfaction
globale de la vie, de l’impulsivité, des phobies et de l’hostilité. Mais les patients obèses
présentent également des troubles caractéristiques de l’humeur et du comportement. Ainsi,
l’association obésité-troubles de la conduite alimentaire est souvent accompagnée par le
développement de dépression, d’anxiété ou encore de troubles bipolaires. Une étude récente
réalisée sur des femmes obèses montrent que 75 % d’entre elles présentent un score positif au
test d’auto-évaluation de la dépression, et environ 60 % souffrent d’anxiété moyenne à élevée
(Giusti and Panchaud, 2007).
L’impact psychologique dans l’apparition de ces troubles est bien évidemment à prendre
en compte. En effet, la société de consommation qui nous entoure a créé un monde où l’image
corporelle se doit de correspondre à des standards de poids et de taille. La discrimination
associée au rejet de la différence participe donc à l’état de dévalorisation psychologique de
certains sujets obèses. Mais cet aspect psychologique n’est probablement pas le seul à
intervenir. En effet, l’inflammation à bas bruit associée à l’obésité est responsable de la
libération de médiateurs inflammatoires, les cytokines dont l’action a été décrite
précédemment. Ainsi il serait cohérent d’envisager que l’état d’inflammation chronique à bas
bruit observé dans l’obésité puisse avoir des conséquences sur le cerveau et entraîner la mise
en place de troubles de l’humeur.
(1) Les troubles anxieux
De plus en plus d’études mettent en évidence un lien entre obésité et anxiété. Ainsi,
une étude réalisée sur des femmes obèses a mis en évidence que les sujets présentant une
obésité sévère avaient déjà eu au cours de leur vie des épisodes dépressifs et anxieux (Wadden
et al., 2006). L’obésité augmente significativement les troubles de l’anxiété à n’importe quelle
période de la vie. Le risque de développer des troubles de type anxieux est deux fois plus
élevé chez des femmes obèses que chez des femmes avec un faible IMC (Becker et al., 2001).
Cette augmentation de la prévalence des troubles anxieux chez les sujets obèses pourrait de
plus faciliter la mise en place d’un état dépressif chez ces sujets. Très peu d’études chez
l’animal établissent un lien entre anxiété et obésité. L’injection de leptine chez des souris
ob/ob, qui ne possèdent donc pas le gène codant pour la leptine, diminue l’anxiété chez ces
69
souris comme le montrent les résultats obtenus dans l’EPM (Asakawa et al., 2003). Comme
nous l’avons vu précédemment, l’injection de LPS facilite la mise en place de troubles
anxieux (Lacosta et al., 1999). De plus, l’injection chronique intraveineuse d’IL-2 ou d’IFNα
provoque chez l’homme une chute des taux circulants de Trp, corrélée positivement à
l’intensité des symptômes anxieux (Capuron and Dantzer, 2003). Compte tenu de ces
résultats, la possibilité de l’implication des cytokines et de l’IDO dans le développement des
troubles anxieux observé chez les sujets obèses peut être envisagée.
De plus, il a été constaté chez les obèses une augmentation des taux de cortisol. De
même, des dysfonctionnements de l’axe corticotrope ont été observés chez les modèles
animaux obèses qui ont permis de mettre en évidence un lien entre obésité et glucocorticoïdes.
Ainsi, la souris mutante ob/ob manifeste une hypercorticostéronémie et une obésité réversible
par surrénalectomie (Naeser, 1973). Le rat obèse Zucker présente également une
hypercorticostéronémie associée à une diminution de la réactivité de l’axe corticotrope après
stimulation avec de la CRH (Castonguay et al., 1986). Cette hypersécrétion de corticostérone
pourrait être à l’origine des troubles anxieux observés dans des situations d’obésité.
(2) Les troubles dépressifs
L’obésité et la dépression ont une prévalence en augmentation dans nos populations et
sont associées à d’autres complications de santé. Pendant longtemps ces deux pathologies ont
été étudiées de façon totalement dissociée, mais il semblerait qu’il existe une forte relation
entre les deux. Un certain nombre d’explications ont été fournies pour comprendre cette
relation entre obésité et troubles dépressifs, mais les arguments avancés sont néanmoins plus
souvent psychologiques que physiologiques (Faith et al., 2002; McElroy et al., 2004; Ryden
et al., 2004).
Ainsi, la stigmatisation du surpoids et de l’obésité peut conduire à une dévalorisation de
soi, à la création d’une image du corps négative ce qui peut entraîner une dépression
(Anderson et al., 2007; Latner and Stunkard, 2003). La sévérité de l’obésité et de la
dépression semble être corrélée. Chez les personnes les plus obèses, la prévalence des
dépressions majeures augmente de façon significative. La relation entre le poids et le niveau
de dépression dépend donc du degré d’obésité (Stunkard et al., 2003). De même, la présence
d’une dépression clinique prédispose au développement d’une obésité. Des individus
développant des épisodes de type dépressif entre 15 et 19 ans ont significativement plus de
70
chance d’avoir un IMC important à l’âge adulte que les individus n’ayant jamais développé de
dépression (Carpenter et al., 2000). Cette relation est cependant dépendante d’un certain
nombre de facteurs dont le sexe et le statut socio-économique (Carpenter et al., 2000).
Il existerait également des bases biologiques communes aux deux pathologies, parmi
lesquelles la production de cytokines inflammatoires et/ou la perturbation de l’axe HPA et du
métabolisme de la 5-HT semblent être de bons candidats.
Ainsi, l’obésité et la dépression sont deux pathologies comprenant une composante
inflammatoire. La dépression est associée à une production accrue de cytokines
inflammatoires périphériques et centrales, corrélée à la sévérité des troubles de l’humeur,
tandis que l’obésité se caractérise par un état inflammatoire chronique, associé à
l’accumulation des adipocytes et l’infiltration progressive des macrophages sécrétant la
leptine et les cytokines inflammatoires. Ainsi, il a été proposé que cette production excessive
de cytokines et plus largement de molécules inflammatoires sécrétées par le tissu adipeux,
puisse être un lien entre l’obésité et le développement des troubles de l’humeur. En effet, le
TNFα, une des cytokines produites par le tissu adipeux lors d’obésité, participe à l’induction
de l’expression de l’IDO et à la mise en place de troubles de type dépressif evalués par un
FST (Andre et al., 2008b; Moreau et al., 2008b).
L’axe HPA pourrait également être un intermédiaire possible entre l’obésité et la
dépression puisqu’un rétrocontrôle négatif défectueux de l’axe HPA et impliquant les
récepteurs aux glucocorticoïdes est observé dans ces deux pathologies (Jessop et al., 2001;
Pariante, 2004). De plus, les concentrations de glucocorticoïdes, fortement augmentées chez
les sujets obèses, sont capables de réduire les taux de Trp probablement en activant l’IDO et
la TDO, inhibant alors la synthèse de 5-HT (Maes et al., 1990).
Largement impliquée dans le développement des troubles de l’humeur, la 5-HT
cérébrale est également connue pour participer au contrôle de l’appétit en diminuant la prise
alimentaire. Certains de ses récepteurs ont été localisés au niveau de l’hypothalamus, structure
clé du contrôle de la balance énergétique (Romanova et al., 2004). De plus, l’administration
d’antidépresseurs favorisant la neurotransmission serotoninergique, diminue dans un même
temps la prise alimentaire (Sugrue, 1987; Vickers et al., 2000). Ainsi, confortant l’hypothèse
d’une relation physiologique et non uniquement psychologique entre l’obésité et la
dépression, les agents psychotropes sont de plus en plus utilisés dans le traitement de
l’obésité. La plupart des psychostimulants, certains antidépresseurs et de nouveaux
antiépileptiques sont des agents psychotropes favorisant la perte de poids. Bien que les
71
mécanismes d’action des psychotropes sur l’appétit et le poids ne soient pas encore connus,
certaines explications ont été proposées (Appolinario et al., 2004). Les psychotropes
pourraient agir sur des neurotransmetteurs au niveau du système nerveux central pour
contrôler la prise alimentaire et/ou la dépense énergétique. Les psychotropes utilisés sont les
SSRI (selective serotonin reuptake inhibitor) tels que la fluoxetine et la sertraline, un SNRI
(serotonin-noradrenaline reuptake inhibitor) : la venlafaxine, les NDRI (noradrenaline and
dopamine reuptake inhibitor) tels que le bupropion et des antiépileptiques comme le
topiramate.
Une diminution des concentrations cérébrales de 5-HT, du ratio Trp/acides aminés
neutres (tyrosine + phenylalanine + leucine + isoleucine + valine), ainsi que des taux
circulants de Trp a été observée chez des sujets obèses (Ashley et al., 1985; Breum et al.,
2003). De plus, l’insuline, dont l’expression est fortement induite par les régimes riches en
sucre, réduit les taux d’acides aminés neutres, favorisant ainsi l’accès du Trp au cerveau.
Ainsi, le Trp jouerait chez ces personnes un rôle potentiellement important dans le
développement des troubles dépressifs et serait la cible de modulations endocriniennes. Ces
variations des taux plasmatiques de Trp suggèrent une activation soutenue de la voie du
catabolisme du Trp et donc d’un rôle potentiel de l’IDO chez les patients obèses (Brandacher
et al., 2006; Breum et al., 2003). De plus, la suractivation de l’IDO a souvent été proposée
pour sous-tendre la relation entre stress, inflammation et troubles de l’humeur (Leonard,
2005), en particulier au travers des altérations de la transmission sérotoninergique et/ou la
génération des dérivés neurotoxiques de la voie du catabolisme du Trp résultant de son
activation (Capuron and Dantzer, 2003; Myint and Kim, 2003). Ainsi, il serait possible
d’envisager que l’état d’inflammation chronique à bas bruit observé dans l’obésité puisse
avoir des conséquences sur le cerveau et plus particulièrement sur l’IDO, entraînant la mise en
place de troubles dépressifs par des mécanismes semblables à ceux décrits précédemment
dans les modèles d’inflammation d’origine infectieuse. Il a d’ailleurs été montré que l’obésité
favorisait la réponse de type Th1 permettant une production accrue d’IFNγ, cytokine
inflammatoire fortement impliquée dans l’induction de l’IDO (Pacifico et al., 2006). Compte
tenu de ces résultats, la possibilité de l’implication de l’IDO dans le développement des
troubles de l’humeur associés à l’obésité a été proposée chez l’homme (Brandacher et al.,
2007; Brandacher et al., 2006) bien qu’il n’existe à ce jour aucune donnée chez l’animal
permettant de le confirmer.
72
Enfin, un certain nombre d’études a décrit une relation entre leptine et 5-HT,
proposant ainsi la 5-HT comme une des bases biologiques communes à l’obésité et la
dépression. En effet, l’infusion icv de leptine chez le rat induit une réduction de la liaison du
transporteur de la 5-HT dans le cortex frontal (Charnay et al., 2000). Des études
immunohistochimiques ont permis de mettre en évidence la colocalisation du récepteur de la
leptine et des neurones 5-HT, NA, DA chez le rat (Hay-Schmidt et al., 2001). La
colocalisation du récepteur de la leptine et du transporteur de la 5-HT au sein du noyau dorsal
du raphé a également été montrée chez des souris ob/ob (Collin et al., 2000). Enfin, une
atrophie du lobe temporal a été corrélée à une augmentation de l’IMC chez la femme obèse
(Gustafson et al., 2004).
(3) Les troubles cogni
cognitifs
tifs
Différents liens commencent à être mis en évidence entre obésité et démence. Il a tout
d’abord été montré qu’une relation entre la perte de poids et la survenue de démence sénile, et
notamment qu’une perte de poids précède souvent l’apparition de démence chez les personnes
âgées (Barrett-Connor et al., 1998; Franklin and Karkeck, 1989). Mais cette perte de poids
apparaît probablement plus comme un des premiers signes de démence que comme son
origine. Par contre, de plus en plus d’étude démontrent que le surpoids et l’obésité sont des
facteurs de risque de la maladie d’Alzheimer (Gustafson et al., 2003; Kivipelto et al., 2005;
Rosengren et al., 2005). En effet, en augmentant le risque de survenue de pathologies
vasculaires, le surpoids et l’obésité peuvent favoriser le développement de maladie
d’Alzheimer ou de démences vasculaires. De plus en plus d’études rapportent une association
entre les fonctions cognitives, l’IMC et diverses mesures d’adiposité, bien que ces études
soient difficiles à comparer entre elles puisqu’elles n’utilisent pas les mêmes outils de mesure
des troubles cognitifs ou de l’adiposité. Ainsi, l’étude Framingham Heart montre que des
hommes obèses pendant plus de 16 ans présentent des capacités altérées dans les tâches de
reproductions visuelles ou dans les tâches de reconnaissance de séries de chiffres (Elias et al.,
2005). Mais ces études suggèrent un lien entre l'obésité et les démences séniles généralement
à un stade avancé de chacun de ces troubles.
Plus récemment il a été observé une relation linéaire entre l'excès de poids et certaines
capacités cognitives à un stade plus précoce dans une population adulte d'âge moyen en bonne
santé. L’analyse de l’IMC et des performances dans les épreuves de mémoire, d’attention et
de vitesse de traitement des informations ont permis de mettre en évidence que les
performances des personnes d’IMC élevé étaient inférieures à celles des personnes d’IMC
73
faible. De plus, les IMC élevés semblent également associés à un léger déclin de la mémoire
sur 5 ans. Ces résultats ont été obtenus après élimination de nombreux biais potentiels,
notamment le niveau d'éducation des sujets, la présence de diabète ou une pression sanguine
élevée, facteurs susceptibles de modifier les résultats (Cournot et al., 2006).
Des études menées sur le rat ont permis de mettre en évidence l’impact d’un régime
hyperlipidique sur les capacités cognitives. Les animaux ont été testés dans différents
paradigmes afin de mettre en évidence les différents aspects de la cognition : la mémoire
spatiale, la mémoire procédurale, la mémoire à long terme ou à court terme, impliquant
l’hippocampe et le thalamus (Winocur, 1985; Winocur, 1991). Les rats nourris avec un
régime riche en graisse présentent des altérations de leurs capacités dans toutes ces tâches, et
dans certains cas (notamment pour la mémoire à long terme) le déficit est comparable à celui
observé chez les animaux avec des lésions cérébrales ou chez les rats âgés nourris avec un
régime normal (Winocur and Greenwood, 2005). Les déficits cognitifs sont particulièrement
observés chez les animaux ayant reçu un régime riche en acides gras saturés (Winocur and
Greenwood, 1999).
Le lien entre l’IMC et les fonctions cognitives pourrait s’expliquer par les conséquences
vasculaires de l’obésité déjà mises en cause dans certaines démences (Kloppenborg et al.,
2008). Un des autres liens possibles pourrait être le fait que les régimes hypercaloriques
contribuent à augmenter la résistance à l’insuline et diminuer la capture du glucose dans le
cerveau. L’altération de la régulation du glucose est un important facteur de déclin cognitif
associé au diabète de type 2. Ainsi l’administration de glucose à des rats nourris avec un
régime hyperlipidique améliore significativement les capacités cognitives hippocampedépendantes et suggère qu’un des liens entre l’altération des fonctions cognitives et les
régimes alimentaires riches en graisse pourrait être la résistance à l’insuline et/ou l’intolérance
au glucose (Winocur et al., 2005).
Mais le tissu adipeux est un organe endocrine qui, comme nous l’avons vu
précédemment, sécrète des hormones, des cytokines et des facteurs de croissance, induisant
un état inflammatoire à bas bruit. Plusieurs travaux montrent une relation entre les troubles
cognitifs et le statut inflammatoire chez les personnes âgées. Ainsi, l’élévation du taux
plasmatique d’IL-6 a été corrélée aux altérations cognitives dans plusieurs études (Rafnsson et
al., 2007; Weaver et al., 2002). Le rôle de l’IL-6 dans le déclin des fonctions cognitives a été
mis en évidence également par l’utilisation de souris transgéniques, d’une part déficientes
pour le gène de l’IL-6, d’autre part surexprimant l’IL-6 dans les astrocytes. Les souris IL-6
74
KO sont ainsi protégées de la diminution liée à l’âge des performances cognitives (Braida et
al., 2004), tandis que les souris exprimant chroniquement l’IL-6 au niveau cérébral par les
astrocytes développent en vieillissant des déficits d’apprentissage corrélés à des marqueurs de
neurodégénérescence dans le cortex frontal et l’hippocampe (Heyser et al., 1997).
Enfin, dans cette situation d’inflammation à bas bruit qu’est le vieillissment, les
cytokines inflammatoires, et en particulier l’IL-1β entrainerait une diminution de la PLT
associée à l’augmentation d’activation microgliale chez les rats dès l’âge de 15 mois (Griffin
et al., 2006). D’autres expériences menées sur des rongeurs de laboratoire viennent confirmer
l’implication des processus neuroinflammatoires dans le déclin cognitif lié à l’âge. Ainsi, il
serait possible d’envisager que l’inflammation chronique à bas bruit associée à l’obésité
puisse entraîner, via la production de cytokines inflammatoires comme l’IL-6, le TNFα ou
encore bien que moins étudié l’IL-1β, des troubles cognitifs chez les personnes obèses.
Cette inflammation chronique à bas bruit pourrait également être à l’origine des
troubles cognitifs en activant l’IDO. Chez les patients obèses, l’inflammation à bas bruit
entraînant la production de cytokines inflammatoires pourrait être à l’origine de l’activation
de l’IDO et ainsi favoriser la voie de dégradation de la kynurénine. La production des dérivés
neurotoxiques tels que la QUIN ou la 3-OH KYN pourrait alors être impliquée dans la mise
en place des troubles cognitifs observés chez les patients obèses.
Résumé
La survenue fréquente de troubles de l’humeur et de la cognition chez des patients
souffrant d’obésité suggère l’existence d’une relation entre ces différentes pathologies. Même
si des explications psychologiques ont été établies, l’hypothèse d’une implication de bases
biologiques a été avancée.
La perturbation de la réponse inflammatoire et des altérations du système 5-HT, ainsi
que de l’axe HPA, semblent être les dénominateurs biologiques communs de ces différentes
pathologies.
La production chronique de cytokines induite dans l’obésité pourrait participer au
développement des troubles de l’humeur et de la cognition observés chez les patients obèses.
75
76
Objectifs
77
78
Objectifs
De nombreuses études menées chez l’homme ont montré que l’obésité est associée à un
état inflammatoire chronique caractérisé par une augmentation de la sécrétion de nombreuses
molécules dont la leptine, la C-reactive protein (CRP) et des cytokines inflammatoires comme
le TNF-α et l’IL-6 (Clement et al., 2004). Des données récentes suggèrent que cette
inflammation périphérique pourrait également présenter une composante au niveau cérébral.
De Souza et al ont d’ailleurs montré que l’exposition de rats à un régime hypercalorique
particulièrement riche en acides gras, entraîne au niveau hypothalamique une augmentation de
l’expression de différentes cytokines inflammatoires (IL-6, TNF-α, IL-1β…), s’accompagnant
de l’activation de leurs voies de signalisation intracellulaire (notamment une augmentation de
l’activité c-Jun-N-terminal kinase et de NFkB), mais également de l’altération de la voie de
signalisation de l’insuline (De Souza et al., 2005). L’intensité de la situation inflammatoire
semble être liée au degré d’obésité. Ainsi, il est possible de distinguer différentes situations
d’obésité : une obésité modérée qui ne s’accompagne pas forcément de pathologies
comorbides, et une obésité morbide associée à différents types de complications comme des
maladies cardio-vasculaires, de l’hypertension artérielle ou un diabète de type 2.
Notre laboratoire a été un des pionniers dans l’étude de l’expression et de l’action des
cytokines au niveau central et de leurs conséquences, tant comportementales que
neurobiologiques. Cette relation entre système de l'immunité innée et cerveau a
particulièrement été étudiée dans le cadre du comportement de maladie regroupant un
ensemble de symptômes non spécifiques (fièvre, activations neuroendocriniennes, anorexie,
anhédonie, repli sur soi, perte d’intérêt pour l’environnement…) observés chez les individus
malades et pouvant être reproduits chez l’animal en réponse à l’injection d’un inducteur de
cytokines tel que le lipopolysaccharide (LPS) (Dantzer, 2001). Dans le cas d’une exposition
prolongée et non régulée de l’activation du réseau de cytokines, le comportement de maladie
peut laisser place à de véritables troubles de l’humeur (anxiété, dépression) et de la cognition
associés à une chute des taux circulants de tryptophane. Il a été montré que l'indoléamine 2,3dioxygénase (IDO), une enzyme dégradant le tryptophane en réponse aux cytokines (Lestage
et al., 2002; Moreau et al., 2005) est impliquée dans l’induction de la dépression notamment
associée à une injection de LPS, et que cette action serait plus particulièrement dépendante du
catabolisme du tryptophane via la voie da la kynurenine (O'Connor et al., 2008). L’activation
79
de l’IDO en situation inflammatoire aboutit à la production de dérivés neurotoxiques (3-OHkynurénine, acide quinolinique) se comportant comme des agonistes des récepteurs
glutamatergiques de type NMDA (Taylor and Feng, 1991). Ainsi, l’activation de l’IDO suite à
une infection pourrait également jouer un rôle dans l’apparition de troubles cognitifs induits
par les cytokines.
L’ensemble des études réalisées dans ce travail de thèse a donc eu pour objectif général
de déterminer chez la souris si l’inflammation chronique à bas bruit qui est associée à un état
d’obésité entraînait le développement de troubles de l’humeur et de la cognition. De plus, afin
d’identifier au mieux les bases neurobiologiques potentielles à l’origine de ces troubles, nous
avons choisi de nous placer dans deux situations différentes : un état d’obésité modérée
induite par l’administration d’un régime enrichi mais n’entraînant pas le développement de
pathologies co-morbides graves, et un état d’obésité morbide d’origine génétique associée à
d’autres pathologies notamment un diabète de type 2. Dans les deux cas, les conséquences de
cette obésité sur l’état d’activation inflammatoire et les altérations neurochimiques et
comportementales qui en découlent ont été étudiées en détail.
Objectif 1 :
Etude des conséquences de l’obésité induite par la consommation d’un régime
hypercalorique (modèle « Diet Induced Obesity » ou DIO) sur l’inflammation et les troubles
de l’humeur et de la cognition.
Objectif 2 :
Etude des conséquences d’une infection périphérique chez un modèle d’obésité DIO sur
la réponse inflammatoire, l’activation de l’IDO et les troubles du comportement associés.
Objectif 3 :
Etude des conséquences d’une obésité morbide (modèle de souris db/db) sur l’activation
de l’IDO et les troubles du comportement associés.
80
Démarche expérimentale
81
82
Démarche expérimentale
Afin de répondre aux différents objectifs décrits précédemment, nous avons choisi
d’utiliser différentes approches expérimentales complémentaires chez l’animal ; soit deux
modèles d’obésité, l’un induit par l’ingestion d’un régime hypercalorique, l’autre d’origine
génétique. Nous avons également décidé de nous placer dans un contexte de stimulation
périphérique du SI aiguë afin d’évaluer la réponse immunitaire dans une situation déjà établie
d’inflammation chronique.
Nous nous attarderons dans un premier temps à expliquer le choix de ces deux modèles
animaux d’expérimentation puis redéfinirons les différents objectifs de ce travail en décrivant
les expériences mises en œuvre pour y répondre.
A. Le choix des modèles utilisés
L’obésité est caractérisée comme une situation inflammatoire chronique à bas bruit.
Pour reproduire cette situation d’obésité de façon expérimentale, différentes approches
peuvent être envisagées. En effet, dans nos sociétés, la prise de poids est majoritairement due
à une totale dérégulation de la prise alimentaire et à la consommation d’aliments
hypercaloriques. Afin de se placer dans une situation comparable, nous avons dans un premier
temps décidé d’utiliser un modèle animal d’obésité induite par le régime alimentaire. Dans le
modèle animal de DIO (diet-induced obesity), les rongeurs rendus obèses par un excès de
calories dans leur nourriture ne répondent pas à des concentrations de leptine efficaces chez
les animaux minces (Morrison, 2008). Par conséquent, les souris DIO, comme les hommes
obèses sont résistantes à la leptine et de ce fait constituent un modèle animal proche de la
plupart des situations d’obésité rencontrées chez l’homme. Dans notre modèle, nous avons
choisi l’emploi d’un régime hypercalorique réalisé au sein de notre laboratoire à partir d’un
mélange de chips, de lardons, de pâté de jambon, de chocolat, de biscuits et d’aliments pour
souris. La composition énergétique de ce régime est la suivante : lipides, 32% ; glucides,
17,5% ; protéines, 11,3% ; 4,4 Kcal/g. Ce régime est donc hypercalorique quand on le
compare au régime classique administré habituellement aux souris (Régimé Safe A04) dont la
composition est : lipides, 3,1%; glucides, 60%; protéines, 16,1% ; 3,3 Kcal/g. Bien que ce
régime soit hyperlipidique, nous avons choisi de ne pas utiliser un modèle de type « high fat »
dans lequel les concentrations en lipides sont bien plus importantes que dans notre régime. En
83
effet, les régimes hyperlipidiques présentent un pool excédentaire de lipides qui peut entraîner
une inflammation locale de la barrière intestinale (Cabre and Gassull, 2003). L’inflammation
à bas bruit observé alors chez ces animaux peut ne pas être uniquement représentative de
l’état inflammatoire du tissu adipeux.
Les patients obèses présentent également souvent une plus grande susceptibilité devant
les infections, comme par exemple lors de septicémie (Vachharajani et al., 2005). Afin
d’évaluer l’impact d’une sur-inflammation, nous avons également soumis ces animaux à
l’injection de LPS, un fragment de bactérie Gram négatif. Ce modèle d’obésité est donc
proche des situations réelles d’obésité rencontrées dans nos sociétés puisque l’obésité de nos
souris est due à l’augmentation de la charge calorique de la prise alimentaire et à la
consommation d’un régime déséquilibré. Mais, dans ce modèle, l’obésité observée est une
obésité « modérée » qui n’est pas associée à d’autres co-morbidités marquées comme un
diabète de type 2 ou des pathologies cardiovasculiares. Or la prévalence des troubles de
l’humeur et de la cognition observée chez les patients obèses augmente avec la sévérité de
l’obésité.
Afin de se placer dans un contexte plus propice à l’observation de certains troubles,
nous avons également réalisé nos différentes études sur un modèle d’obésité génétique. Les
souris db/db présentent une mutation des récepteurs de la leptine altérant la sensation de
satiété. Bien que ce modèle ne soit pas un reflet de la réalité puisque l’obésité génétique est
une pathologie rare chez l’homme, il présente l’avantage de créer une situation d’obésité
morbide. Les animaux présentent des pathologies associées comme un diabète de type 2, une
insulino-résistance et des problèmes cardio-vasculaires. Ce modèle est souvent utilisé dans le
cadre d’étude sur le diabète de type 2, et cette pathologie associée à l’obésité morbide
participe probablement au développement des troubles étudiées. Mais nous avons choisi dans
cette étude de nous intéresser à l’impact de l’inflammation associée à l’obésité, sans pour
autant éluder le probable impact des médiateurs métaboliques. De plus, chez ces animaux ce
n’est pas le type calorique du régime qui va être responsable de la prise de poids, mais
seulement l’augmentation de la portion alimentaire. Ce contexte pathologique plus avancé
devrait nous permettre de mettre en évidence des troubles non encore mis en place dans le
premier modèle.
Ainsi ces deux modèles, souris DIO et souris db/db apparaissent comme deux approches
complémentaires pour étudier l’impact de l’inflammation sur les troubles du comportement
associés à l’obésité.
84
B. Objectifs et expériences mises en œuvre
1. Objectif 1 :
Etude des conséquences de l’obésité induite par la consommation d’un régime
hypercalorique (modèle DIO) sur l’inflammation et les troubles de l’humeur et de la
cognition
Afin de répondre à ce premier objectif, nous avons choisi d’utiliser un régime enrichi
permettant d’induire une obésité chez la souris.
a)
Régime enrichi entraînant l’obésité: un modèle physiopathologique
d’inflammation chronique.
L’obésité se caractérise par un état inflammatoire à bas bruit et fréquemment associé à
un certain nombre de pathologies ayant en commun cette composante inflammatoire. Il est
proposé que cette inflammation ait pour origine le tissu adipeux où les adipocytes
hypertrophiés, ainsi que les macrophages infiltrés, sécrètent un grand nombre de molécules
inflammatoires dont les cytokines et plus particulièrement le TNFα et l’IL-6 (Bastard et al.,
2000; Laimer et al., 2002). Cette inflammation périphérique a pu être reproduite chez le
rongeur dans des modèles d’obésité induite par manipulations génétiques ou bien par
l’utilisation de régimes enrichis en graisses saturées (Hotamisligil et al., 1993; Mohamed-Ali
et al., 2001). Dans ces modèles animaux, l’obésité est également associée à une
hyperactivation de l’axe HPA. De plus, la présence de glucocorticoïdes est indispensable à
l’induction d’une obésité par un régime enrichi (Mantha et al., 1999). Chez l’homme, de
nombreuses études font état d’une association entre obésité et hyperactivité de l’axe HPA
(Duclos et al., 1999; Duclos et al., 2001; Pasquali et al., 1996; Rosmond and Bjorntorp,
1998).
Dans un premier temps, nous avons choisi d’utiliser un régime enrichi pour induire
l’obésité chez la souris afin de pouvoir mesurer l’impact réel de la prise alimentaire sur la
prise de poids et l’inflammation qui en découle. Ce modèle représente une approche plus
pertinente pour étudier l’obésité qui se développe chez l’homme. En effet, l’incidence de
85
l’obésité chez l’homme a atteint des proportions épidémiques ces dernières années du fait
d’un changement général du style de vie et plus particulièrement d’une augmentation de la
consommation d’aliments riches en graisses et en sucres (Drewnowski, 2007), tandis que les
altérations génétiques ne représentent qu’un faible pourcentage de la population obèse
(Gibson et al., 2004a). Dans notre étude, des souris C57bl/6J mâles ont été soumises à un
régime enrichi précédemment décrit (Berraondo et al., 1997; Groubet et al., 2003). Ce régime
déséquilibré et hypercalorique va nous permettre de nous placer dans une situation d’obésité
modérée. Le groupe témoin a reçu un régime classiquement utilisé chez les rongeurs et
nutritionnellement équilibré.
Du fait de la forte prévalence de troubles de l’humeur et de la cognition chez les sujets
obèses, il a été proposé que l’inflammation à bas bruit associée à l’obésité puisse jouer un rôle
dans l’apparition de ces troubles.
b)
Démarche
Démarche expérimentale
Nous avons vérifié si la mise en place d’une obésité chez la souris s’accompagne d’un
état inflammatoire responsable de l’activation de l’IDO, d’une activation de l’axe HPA, ainsi
que d’altérations comportementales.
Des souris C57bl/6J de 3 semaines ont été soumises à un régime hypercalorique pendant
26 semaines. Au terme de cette période, les souris présentent une masse corporelle de 35%
supérieure à celle du groupe contrôle et sont donc considérées comme obèses. Les groupes
contrôle et obèse ont ensuite été soumis à des tests comportementaux (FST, EPM et Y maze),
suivis d’analyses de biochimie (dosage plasmatique d’hormones et de cytokines associées à
l’obésité et mesure de l’activité enzymatique de l’IDO) et de biologie moléculaire (expression
de l’ARNm de l’IDO et des cytokines).
2. Objectif 2 :
Etude des conséquences d’une infection périphérique chez un modèle d’obésité DIO sur
la réponse inflammatoire, l’activation de l’IDO et les troubles du comportement associés.
Une augmentation de la susceptibilité aux infections a été décrite chez les sujets obèses
(Mannino et al., 2006; Vachharajani et al., 2005) et des modèles d’obésité induite chez le
86
rongeur présentent également une réponse immunitaire perturbée (Plata-Salaman et al., 1998;
Smith et al., 1987a). Pour induire une stimulation périphérique aiguë du SI chez la souris,
nous avons choisi d’utiliser les LPS.
a)
Le LPS : un modèle d’activation aiguë du système immunitaire
Le lipopolysaccharide ou LPS est une endotoxine, composant majeur du feuillet le
plus externe de la paroi des bactéries à Gram négatif. Classiquement utilisé comme modèle
expérimental d’inflammation périphérique, le LPS reproduit les effets d’une infection
bactérienne en induisant une production massive mais transitoire de cytokines en périphérie,
ainsi qu’au niveau central. En effet, l’injection de LPS par voie intrapéritonéale (i.p.) chez le
rongeur entraîne une expression cérébrale précoce de cytokines inflammatoires (Gatti and
Bartfai, 1993; Laye et al., 1994; van Dam et al., 1992). En plus de ces effets physiologiques,
le LPS induit également des modifications comportementales transitoires et réversibles
regroupées sous le terme de comportement de maladie comprenant entre autres la fièvre, des
troubles du sommeil et de l’appétit, un repli sur soi et qui disparaissent en moins de 24 h chez
le rongeur (pour revue Dantzer, 2006). Toutefois, les changements comportementaux
observés à court terme et caractérisant le comportement de maladie peuvent être suivis du
développement d’altérations comportementales plus durables et définies comme troubles
comportementaux de type dépressif à l’aide de tests comportementaux de dépression
fréquemment utilisés et validés pharmacologiquement à l’aide d’antidépresseurs classiques
(Frenois et al., 2007; Yirmiya, 1996). De plus, l’induction de ces changements
comportementaux de type dépressif par l’administration de LPS coïncide avec la stimulation
de l’activité de l’IDO pulmonaire in vitro (Andre et al., 2008b; Hayaishi and Yoshida, 1978;
Yoshida and Hayaishi, 1978) ainsi que son activité périphérique et centrale in vivo (Lestage et
al., 2002).
Le LPS induit la production de cytokines inflammatoires dans un grand nombre de types
cellulaires et en particulier au sein des macrophages. La fixation du LPS sur le récepteur
CD14, présent à la surface des cellules immunitaires, entraîne son interaction avec les toll-like
récepteurs (TLRs) et plus particulièrement avec le TLR4 (Du et al., 1999).
Dans notre étude réalisée chez la souris, la dose de LPS, issu de E.coli (sérotype
0127 :B8), choisie est de 830 µg/kg car il a été montré qu’elle permet de reproduire tous les
symptômes du comportement de maladie, d’induire la mise en place de symptômes de type
dépressif, ainsi que de stimuler l’activité pulmonaire et cérébrale de l’IDO (Frenois et al.,
87
2007; Lestage et al., 2002; Mormede et al., 2004). Dans cette dernière étude réalisée au
laboratoire, les auteurs ont montré que le LPS induisait une production plasmatique d’IFNγ
maximale 6 h après l’injection i.p. de LPS, tandis que l’IDO cérébrale présentait un pic
d’activité enzymatique 24 h après injection de LPS.
b)
Démarche expérimentale
Après 26 semaines de régime hypercalorique, donc quand la prise de poids est
devenue suffisament importante pour entraîner une obésité, les souris C57bl/6J sont soumises
à une stimulation du système immunitaire par le LPS afin de déterminer si l’obésité et les
altérations associées pouvaient perturber la réactivité du système nerveux central à une
infection et favoriser ainsi le développement des troubles comportementaux de type dépressif.
Suite à cette injection, les souris sont soumises à des tests comportementaux (FST et Y maze),
suivis d’analyses de biochimie (dosage plasmatique d’hormones et de cytokines associées à
l’obésité et mesure de l’activité enzymatique de l’IDO) et de biologie moléculaire (expression
de l’ARNm de l’IDO et des cytokines). L’implication potentielle de l’IDO dans le
développement des troubles observés dans de telles conditions a été tout particulièrement
étudiée.
3. Objectif 3 :
Etude des conséquences d’une obésité morbide sur l’activation de l’IDO et les troubles
du comportement associés.
a)
Obésité
Obésité d’origine génétique: une situation d’inflammation chronique
exacerbée
Dans le cas d’une obésité génétiquement induite, les animaux présentent les
caractéristiques d’une obésité morbide. En effet, l’acquisition excessive de masse grasse
s’accompagne de développement d’autres pathologies associées telles qu’une insulinorésistance, un diabète de type 2, une hypertension ou des problèmes cardio-vasculaires.
L’ensemble de ces symptômes constituent le syndrome métabolique associé à une situation
inflammatoire via entre autres la production de protéine C-réactive et d’IL-6. De plus, les
88
modèles d’obésité génétique tels que la souris ob/ob ou le rat Zucker présentent une
hypercorticostéronémie (Castonguay et al., 1986; Naeser, 1973).
Bien que l’obésité d’origine génétique ne représentent qu’une très faible proportion des
causes de l’obésité humaine, ce modèle permet de se placer dans une situation d’obésité
morbide qui est fréquemment rencontré chez l’homme mais qu’il est difficile d’obtenir chez
l’animal avec des régimes hypercaloriques. En se plaçant dans ce contexte extrême, nous
avons cherché à évaluer la réponse inflammatoire observée en conditions non stimulées, c'està-dire sans stimulation périphérique par un agent inflammatogène comme le LPS, et les
troubles du comportement qui peuvent en découler.
b)
Démarche expérimentale
Des souris db/db (C57bl/6J-leprdb/leprdb) de 5 semaines ont reçu pendant 3 semaines un
régime équilibré (régime 5K52 fourni par Charles River). Au terme de cette période, les
souris présentent une masse corporelle de 69% supérieure à celle du groupe contrôle et sont
donc considérées comme obèses. Les groupes contrôle et obèse ont ensuite été soumis à des
tests comportementaux (EPM et Open Field), suivis d’analyses de biochimie (dosage
plasmatique d’hormones et de cytokines associées à l’obésité et mesure de l’activité
enzymatique de l’IDO) et de biologie moléculaire (expression de l’ARNm de l’IDO et des
cytokines). Afin d’évaluer la réponse inflammatoire dans cette situation inflammatoire
extrême, une partie des animaux reçoit une injection de LPS afin d’induire une stimulation
périphérique aigue du SI. Suite à cette injection, les souris sont soumises à des tests
comportementaux (FST, Y maze ou EPM), suivis d’analyses de biochimie (dosage
plasmatique d’hormones et de cytokines associées à l’obésité et mesure de l’activité
enzymatique de l’IDO) et de biologie moléculaire (expression de l’ARNm de l’IDO et des
cytokines).
89
90
Resultats
91
92
Chapitre 1
93
94
Chapitre 1
DIET-INDUCED OBESITY IN MICE EXACERBATES
NEUROINFLAMMATION AND SICKNESS ELICITED BY
SYSTEMIC INFECTION
Caroline André, Anne Laure Dinel, Sophie Layé and Nathalie Castanon
En cours de soumission
95
96
DietDiet-induced obesity in mice exacerbates neuroinflammation and sickness
elicited by systemic infection
Objectifs :
Le but de cette étude était de vérifier si un état d’obésité induit par un régime enrichi
pouvait moduler les réponses comportementales et neurobiologiques induites par
l’administration de LPS.
Matériel et méthodes :
Des souris mâles C57bl/6J de 3 semaines ont été soumises soit au régime standard
pour rongeur soit à un régime enrichi (lipides: 24%, glucides: 34%, protéines: 12%) pendant
26 semaines. Au terme de cette période, l’ensemble des souris a reçu une injection i.p. de LPS
(0,83 mg/kg) ou de solution saline, puis une moitié de ces animaux a été sacrifiée 2 h posttraitement et l’hypothalamus a été rapidement prélevé. L’autre moitié des souris a été soumise
à des tests de comportement (activité locomotrice, FST) 22 h et 24 h post-LPS respectivement
puis sacrifiée tandis que le plasma, les poumons, le tissu adipeux et le cerveau ont été
prélevés. Les concentrations en leptine, résistine, MCP-1, IL-6 et TNFα ont été mesurées dans
le plasma et le tissu adipeux en multiplex selon la technologie Luminex. L’activité
enzymatique de l’IDO pulmonaire a été évaluée par dosage du rapport KYN/Trp par HPLC.
Enfin, l’expression cérébrale des ARNm de l’IL-6, du TNFα, de l’IFNγ, de SOCS-3 et de
l’IDO a été mesurée par PCR en temps réel.
Résultats :
Les souris consommant le régime enrichi présentent une masse corporelle de 35 %
supérieure à celle du groupe contrôle, associée à une augmentation significative des
concentrations de leptine mesurées dans le plasma et le tissu adipeux. En conditions non
stimulées, les taux circulants d’IL-6, de TNFα, de MCP-1, ainsi que la libération de
corticostérone ne sont pas affectés chez les souris obèses, tandis que leur augmentation
induite 24 h post-LPS est potentialisée par le régime enrichi. De plus, la consommation de
régime enrichi exacerbe l’induction de l’activité enzymatique de l’IDO pulmonaire et
cérébrale, ainsi que son expression cérébrale 24 h après l’administration de LPS. De même,
l’induction de l’ARNm de l’IL-6, ainsi que de l’IDO exprimée dans l’hypothalamus 2 h post-
97
LPS est exacerbée chez les souris obèses. Enfin, alors que les animaux ne présentent aucun
déficit locomoteur quelque soit le groupe, la durée d’immobilité mesurée dans le FST est
diminuée chez les souris obèses après LPS.
Conclusion :
L’état d’obésité induit par le régime enrichi interfère avec la capacité du SI à répondre
de façon appropriée à une stimulation aiguë du SI, en exacerbant les réponses
neurobiologiques (plus particulièrement l’expression cérébrale et périphérique de l’IL-6 et
l’IDO, ainsi que l’activation de l’axe HPA), ainsi que leurs conséquences sur la réactivité
comportementale.
98
Diet-induced obesity in mice exacerbates neuroinflammation and sickness
elicited by systemic infection
Caroline André, Anne Laure Dinel, Sophie Layé and Nathalie Castanon1
Author Affiliation : INRA, UMR 1286 PsyNuGen, Université Victor Ségalen Bordeaux 2, CNRS,
UMR 5226, IFR8, F-33076 Bordeaux, France
CA and ALD contributed equally to the work.
Corresponding Author: 1 Nathalie Castanon, Ph.D
INRA, UMR 1286, Laboratory of Psychoneuroimmunology, Nutrition and Genetics, Université Victor
Ségalen Bordeaux 2, Bâtiment UFR Pharmacie, Case courrier 34, 146 rue Léo Saignat, 33076
Bordeaux, France.
E-mail : [email protected]
Phone: 33 557 574 505 Fax: 33 557 571 227
Running Title: Obesity enhances neuroinflammation induced by LPS
Nonstandard abbreviations used: FST, Forced swim test; HPA, hypothalamic-pituitaryadrenal axis; IDO, Indoleamine 2,3-dioxygenase; KYN, Kynurenine; MCP-1, monocytes
chemotactic protein; TRP, Tryptophan.
Abstract
Severe obesity is associated with peripheral chronic low-grade inflammation and a high
prevalence of mood disorders that might constitute aggravating risk factors for the
development of other obesity-related comorbidities. Excessive production of proinflammatory
cytokines by brain microglia during a systemic infection can promote a shift from reversible
sickness responses to neurobehavioral complications including depression. Cytokine-induced
over-activation of the microglial enzyme indoleamine 2,3-dioxygenase (IDO) and
glucocorticoid release might condition increased vulnerability to inflammation-induced
99
depression. The same cascade of events may explain the increased susceptibility of obese
subjects to immune-mediated diseases. Our aim was to investigate in mice whether dietinduced obesity exacerbated neuroinflammation induced by a systemic lipopolysaccharide
(LPS) challenge and the resultant neurobiological and behavioral sickness responses. Here we
show that diet-induced obesity interfered with the ability of the innate immune system to
appropriately respond to LPS by exacerbating the neuroinflammation, as manifested by
amplified hypothalamic interleukin-6 production and IDO activation, and the intensity of the
resultant corticosterone secretion and behavioral reactivity to an emotional challenge (forced
swim test). These results provide the first evidence that obesity-associated over-reactivity of
brain cytokines could play a pathophysiological role in the increased vulnerability to obesityrelated comorbid diseases that share systemic inflammation in their pathology.
Introduction
Over the past decade, obesity has continuously increased at alarming rates throughout
the world, fostering the rise in obesity-related comorbidities, particularly cardiovascular and
metabolic diseases (1). The high prevalence of altered emotional reactivity to adverse
conditions that frequently evolves in neuropsychiatric disorders in severely obese subjects
constitutes an aggravating risk factor for the development of these pathological complications
(2, 3). Psycho-social factors are classically pointed out to explain the association between
obesity and mood disorders, although with inconsistent reliability (4, 5). Recent evidence
suggests however that functional links relying on biological systems shown to be impaired in
both obesity and mood disorders may also exist (6-8). These biological intermediates may
constitute new therapeutic targets to prevent development of mood disorders and their
deleterious effects on other obesity-related comorbidities. In this context, inflammation has
been proposed as a potential key element in the shared biology of obesity and mood disorders,
particularly depression (8-10). Mounting evidence indicates that severe obesity is associated
with a state of peripheral chronic low-grade inflammation characterized by increased plasma
production of cytokines mainly originating from adipose tissue (11, 12) and with immune
dysfunction (13, 14). Moreover, few rodent studies have suggested that signs of
neuroinflammation may also exist (15, 16).
During an infection, cytokines produced by activated innate immune system in the
periphery act on the brain to induce the local production of brain cytokines by activated
100
microglia (17). These molecular signals in turn target neuronal substrates to organize the
behavioral, neuroendocrine and metabolic components of the sickness response that aims to
cope with infectious micro-organisms (18). Effective coping implies that this adaptive
sickness response is strictly tailored to the stimulus and time-limited. However, when immune
activation continues unabated, exacerbation of the sickness response can culminate in the
development of pathological disorders including depressive symptoms (19, 20). This is
particularly true when protracted inflammation occurs in the context of an increased
vulnerability to the negative consequences of immune-mediated events, as observed in aging
(21) or neurological diseases (22), and as recently suggested in obesity (9, 23). Hence, an
increased susceptibility to autoimmune diseases and infection is often reported in obese
subjects (24, 25).
The intensity of cytokine-induced depressive symptoms is correlated to a drastic
increase in the ratio of plasma kynurenine (KYN) to tryptophan (TRP) (26). The indoleamine
2,3-dioxygenase (IDO), an enzyme that catabolizes the essential amino acid TRP along the
KYN pathway, is potently induced by cytokines in activated monocytes, macrophages and
brain microglia (27). Activation of this enzyme has been extensively studied by cellular
immunologists for its role in mediating T-cell proliferation and local immunotolerance.
However, an increase of IDO activity creates immune privilege that can be both beneficial
and deleterious to the host (27). In degrading TRP, IDO reduces its bioavailability for the
synthesis of serotonin (5-HT), a neurotransmitter that is well-known to be involved in mood
regulation. Moreover, brain KYN can be further metabolized to generate neuroactive
glutamatergic compounds and heightened glutamate receptor activity has been recently
evidenced in major depression (28). Therefore, it has been proposed that enhanced IDO
activation may participate in linking inflammation with mood disorders through its impact on
brain serotoninergic and/or glutamatergic neurotransmission (19, 29). Impaired hypothalamicpituitary-adrenal (HPA) axis response to cytokine administration has also been shown to
condition increased vulnerability to inflammation-induced depression (30-32). Interestingly,
severe obesity is associated with increased activity of both the HPA axis (6) and peripheral
IDO (33). It can therefore be hypothesized that in the context of obesity, altered reactivity of
both neurobiological systems might be an important contributing factor to the
pathophysiology of mood disorders that might result from exacerbated sickness response to
immune activation. Mood disorders in turn might contribute to increase the vulnerability to
101
other obesity-related comorbidities, including cardiovascular and metabolic diseases, that
becomes potentially manifest upon subsequent exposure to insults (2, 3).
Conditions in which a deleterious increased inflammatory status that remains silent until
it is challenged by a systemic infection have already been reported in animal models of aging
or chronic neurodegenerative diseases. In these models, peripheral immune activation
facilitates development of cognitive and mood alterations (21, 34) and progression of
neurodegeneration respectively (22). This facilitation has been proposed to be based on an
atypical more “reactive” state of brain microglia referred to as “primed” state (22). In
vulnerable subjects exposed to systemic infection, “primed” microglia switch their silent
phenotype to produce excessive cytokines and IDO (26, 35) that translate in altered
neuroendocrine (HPA axis) and behavioral sickness responses (9, 30, 35). Similarly, obesity
may constitute another situation in which a “primed” state of microglia, potentially revealed
by a systemic inflammatory challenge, would condition vulnerability to comorbidities linked
to chronic inflammation.
In rodents, administration of the cytokine inducer lipopolysaccharide (LPS) is
classically used to mimic the host response to infection (36). The purpose of this study was
therefore to investigate in mice whether innate immune system activation by LPS
administration, as well as the consequent neurobiological and behavioral sickness responses,
was exacerbated in a model of diet-induced obesity. Our data indicate that diet-induced
obesity indeed interfered with the ability of the innate immune system to appropriately
respond to a systemic infection, despite the lack of visible signs of peripheral inflammation
and related-comorbidities in unstimulated conditions. These findings support our hypothesis
that microglia “priming” induced by obesity might mediate the higher prevalence of mood
disorders and related comorbidities in this population.
Results
Sustained exposure to enriched diet induces obesity
As expected, enriched diet induced a significant and sustained increase in body weight
over the 26-week period, whereas body weight of mice fed with standard diet stabilized from
the 16th week (diet: F1-92 = 17.9, P < 0.001, time: F4-92 = 356.9, P < 0.001, diet x time: F4-92 =
42.2, P < 0.001) (Fig. 1).
102
Body weight (g)
45
40
***
Lean
Obese
***
***
35
30
25
20
15
10
0
2
8
16
21
26
Wk
Figure 1
At last, mice on enriched diet gained 35 % more body weight than controls. Moreover, dietinduced obesity led to a marked increase in the proportion of adipose tissue compared to lean
mice (data not shown) that was associated with a significant increase of leptin levels in both
adipose tissue (F1-20 = 14.4, P < 0.001) and plasma (F1-15 = 40.3, P < 0.001) (Table 1). This
result agrees with those showing that plasma release of leptin from adipose tissue is
proportional to adipose tissue mass and correlated with body mass index (37). On the other
hand, diet had no significant effect on insulin plasma levels that remained very low in both
lean and obese mice (data not shown). Taken together, these results show that consumption of
a highly caloric food, even though daily food intake did not significantly differ between both
groups (data not shown), clearly induced the development of a marked obesity.
Table I
lean
Plasma
obese
saline
LPS
saline
LPS
Leptin (ng/ml)
2.0 ± 0.4A
2.2 ± 1.0A
9.8 ± 2.4B
20.2 ± 2.2C
Resistin (ng/ml)
2.8 ± 0.3A
1.8 ± 0.1A
3.3 ± 0.4A
10.9 ± 1.3B
Corticosterone (ng/ml)
24.5 ± 3.0A
48.1 ± 10.8B
25.2 ± 2.7A
124.6 ± 12.3C
MCP-1 (pg/ml)
29.1 ± 2.9A
226.0 ± 48.2B
29.7 ± 2.1A
551.3 ± 126.1B
IL-6 (pg/ml)
62.9 ± 16.0A
275.4 ± 44.3B
29.6 ± 5.7A
3304.0 ± 996.6C
7.6 ± 0.4A
14.0 ± 2.1B
TNFα (pg/ml)
7.3 ± 0.2A
9.0 ± 0.8B
lean
Adipose tissue
obese
saline
LPS
saline
LPS
Leptin (ng/ml)
1.3 ± 0.2
1.1 ± 0.2
2.4 ± 0.4
2.7 ± 0.4
Resistin (ng/ml)
4.1 ± 0.3
4.5 ± 0.4
4.0 ± 0.2
3.7 ± 0.2
MCP-1 (pg/ml)
26.2 ± 0.0A
185.5 ± 22.5B
29.1 ± 2.9A
243.2 ± 61.5B
103
Diet-induced obesity alters immune, neuroendocrine and neurochemical responses to
LPS
Severe obesity has been associated with increased susceptibility to infection (24) that
can potentially facilitate development of inflammation-related comorbidities (21, 22).
Therefore, we studied here the consequences of diet-induced obesity on immune,
neuroendocrine and neurochemical responses to innate immune system activation by the
cytokine inducer LPS. Although TNFα and IL-6 adipose tissue levels remained very low
whatever the group (data not shown), LPS induced 24 h after treatment the expected
significant increase of plasma levels of IL-6 (F1-13 = 10.7, P < 0.01) and TNFα (F1-18 = 4.7, P <
0.05) (Table I). LPS also increased both plasma (F1-17 = 22.2, P < 0.001) and adipose tissue
(F1-19 = 12.2, P < 0.01) levels of the monocytes chemotactic protein (MCP-1) (Table I). As
anticipated, such a peripheral immune activation by LPS resulted in a significant stimulation
of some classical targets of cytokines, namely plasma corticosterone release (F1-19 = 55.5, P <
0.001) (Table I), lung IDO activity (F1-20 = 47.4, P < 0.001) (Fig. 2A), as well as brain IDO
mRNA expression and activity (F1-18 = 6.8, P < 0.05 and F1-20 = 16.5, P < 0.001 respectively)
(Fig. 2B-C).
In unstimulated conditions, neither plasma cytokine and corticosterone levels, nor
expression and activity of IDO, were markedly altered by diet-induced obesity, even if an
overall main effect of diet was observed (P < 0.05) (Table I, Fig. 2). However, as revealed by
the significant diet by LPS interactions reported below, diet-induced obesity clearly
exacerbated LPS-induced increase in plasma concentrations of MCP-1 (F1-17 = 4.5, P < 0.05),
IL-6 (F1-13 = 10.7 P < 0.01) and TNFα (F1-18 = 4.7, P < 0.05) (Table I), as well as the resultant
stimulation of corticosterone release (F1-19 = 21.1, P < 0.001) (Table I), lung IDO activity (F120 =
4.0, P = 0.05), and brain IDO expression (F1-18 = 7.0, P < 0.05) and activity (F1-20 = 7.2, P
< 0.05) (Fig. 2). Indeed, brain IDO mRNA expression was undetectable 24 h after treatment
in both unstimulated lean and obese mice, whereas a huge induction of this expression was
found in obese LPS-treated mice. Finally, the stimulating effect of LPS on circulating levels
of leptin and resistin was restricted to obese mice (diet x treatment: F1-15 = 6.1, P < 0.05 and
F1-17 = 37.2, P < 0.001 respectively) (Table I).
104
§
Lung KYN/TRP
A
***
0.12
0.10
Saline
LPS
0.08
0.06
0.04
0.02
0
lean
obese
#
50
***
0.02
0.01
0
lean
IDO ∆mRNA
Brain KYN/TRP
B
0.03
C
*
40
30
20
10
0
obese
#
nd
nd
lean
nd
obese
Figure 2
Alterations of 5-HT system functioning induced by cytokines either directly or as a
consequence of IDO activation could constitute an important biochemical connection between
inflammation, obesity and related comorbidities, including depression (19). In order to
determine if LPS-induced increase of brain cytokine expression and IDO activity in obese
mice was associated with increased 5-HT turnover, levels of TRP, 5-HT, and their respective
metabolites KYN and 5-HIAA were measured in lean and obese mice 24 h after injection of
saline or LPS (Fig. 3). LPS treatment induced an increase of TRP concentrations in the brain
of both lean and obese mice (F1-20= 6.9, P < 0.05), but brain levels of KYN were significantly
higher in obese LPS-treated mice than in all other groups (treatment: F1-20= 43.3, P < 0.001;
diet: F1-20= 8.9, P < 0.01; treatment x diet: F1-20= 9.9, P < 0.01) (Fig. 3A). In contrast, brain
levels of 5-HT remained unchanged despite a significant increase of 5-HIAA concentrations
by LPS (F1-20= 58.4, P < 0.001) (Fig. 3B). As determined by the 5-HIAA/5-HT ratio
measurement, 5-HT turnover was significantly increased in both lean and obese mice 24 h
after LPS (treatment: F1-20= 36.1, P < 0.001) (Fig. 3C). Moreover, it was also lightly affected
by diet (F1-20= 6.4, P < 0.05) with no interaction between both factors. In summary, activation
of the peripheral immune system by LPS increased 5-HT turnover in the same proportion in
brains of both lean and obese mice despite the higher increase of brain IDO activation in this
last group. On the contrary, this last effect translated in a sustained production of KYN in
obese LPS-treated mice compared to their lean counterparts.
105
A
35
*
ng/mg fo protein
30
25
Saline
LPS
20
15
10
#
5
***
*
0
lean
obese
35
Trp
B
***
***
30
3,0
25
C
§
2,5
5-HIAA/5-HT
ng/mg of protein
obese
lean
KYN
20
15
10
5
2,0
***
***
1,5
1,0
0,5
0
0
lean
obese
5-HT
lean
obese
lean
obese
5-HIAA
Figure 3
Diet-induced obesity alters hypothalamic cytokine and IDO expression induced by LPS
Diet-induced obesity was able to alter LPS-induced plasma release of cytokines, as well
as both peripheral and brain consequences of this induction on corticosterone secretion and
IDO activity. This last effect may be explained by an interference of diet-induced obesity with
the induction of brain cytokines that occurs over the first hours following the peripheral LPS
injection (38, 39). In order to test this possibility, cytokine and IDO mRNA expression was
measured 2 h after LPS in the hypothalamus of both lean and obese mice. This structure is
well known to play a major role in obesity by coordinating food intake and energy
expenditure, particularly via leptin stimulation (40). In the context of inflammation, the
hypothalamus also represents an important site of induction of brain cytokines that allows
coordination of the neurobiochemical, neuroendocrine and behavioral responses to LPS (18).
Two hours after treatment, LPS increased mRNA expression of TNFα (F1-19 = 123.9, P <
0.001) and IFNγ (F1-19 = 5.8, P < 0.05) in the same proportion in both lean and obese mice
(Fig. 4A-B). On the contrary, the increase of IL-6 mRNA expression induced by LPS (F1-19 =
113.2, P < 0.001) was exacerbated in obese mice compared to lean controls, as revealed by
the significant diet effect (F1-19 = 34.7, P < 0.001) and diet by treatment interaction (F1-19 =
37.3, P < 0.001) (Fig. 4C). Interestingly, obese mice also displayed exacerbation of LPS effect
on IDO mRNA expression (treatment: F1-19 = 38.7, P < 0.001; diet: F1-19 = 5.7, P < 0.05, diet x
treatment: F1-19 = 5.8, P < 0.05) 2 h after treatment (Fig. 4D), as it was still observed 24 h later
(see Fig. 2C). Moreover, LPS-induced increase of SOCS-3 mRNA expression (F1-19 = 97.6, P
106
< 0.001), an indicator of cytokine signaling pathway activation and therefore a potential
intermediate between brain cytokines and IDO (41), was also significantly amplified by dietinduced obesity (diet: F1-19 = 10.3, P < 0.01; diet x treatment: F1-19 = 10.5, P < 0.01) (Fig. 4E).
Thus, diet-induced obesity selectively potentiated the LPS-induced increase of brain IL-6,
SOCS-3 and IDO mRNA expression. This effect may therefore underlie the obesity-induced
over-activation of IDO and HPA axis by LPS.
A
***
250
30
IDO ∆mRNA
TNFα
α ∆ mRNA
35
25
20
15
10
***
Saline
LPS
150
100
***
50
0
lean
0
obese
lean
B
5
10
*
4
SOCS-3 ∆mRNA
IFNγγ ∆mRNA
#
200
5
3
2
1
0
lean
obese
obese
E
##
***
8
6
***
4
2
0
lean
obese
###
C
60
IL-6 ∆mRNA
D
***
50
40
30
20
***
10
0
lean
obese
Figure 4
Diet-induced obesity alters physiological and behavioral responses to LPS
Proinflammatory cytokines which are transiently expressed within the brain by
microglia in response to peripherally released cytokines trigger LPS-induced adaptive
sickness responses that allow the organism to cope with the bacterial threat (18). Thus,
obesity-induced exacerbation of innate immune system reactivity to LPS may impair the
consequent physiological and behavioral sickness responses. In order to test this hypothesis,
LPS effects on body weight and behavioral reactivity to an emotional challenge, the forced
swim test (FST), were compared between lean and obese mice. As expected, LPS induced a
progressive and sustained decrease in body weight (treatment: F1,40 = 121.27, P < 0.001, time:
F2,40 = 74.36, P < 0.001, treatment x time: F2-40 = 66.5, P < 0.001) in both lean and obese mice
compared to saline controls (Fig. 5). However, a significant attenuation of body weight loss
107
was observed in LPS-treated obese mice compared to their lean counterparts (diet x time x
treatment: F2-40 = 9.2, P < 0.001).
Body weight loss (%)
2
0
-2
§
***
§§§
**
-4
**
***
-6
-8
***
§§§
Lean-Sal
Lean-LPS
-10
-12
Obese-Sal
Obese-LPS
***
Figure 5
Most of the rodent tests aiming at evaluating behavioral reactivity to an emotional
challenge are based on changes in motor activity (42), whereas LPS-induced motor
retardation is one of the main symptoms of sickness behavior (18). In order to assess the
consequences of LPS treatment on emotional reactivity it is therefore necessary to clearly
dissociate cytokine-induced emotional alterations from locomotor alterations. A solution to
this dilemma is to measure behavioral changes induced by activation of the innate immune
system only when sickness has dissipated, (20, 43). Shortly after LPS treatment, both lean and
obese mice presented most of the classical visual indicators of sickness including piloerection,
curl up body posture, listlessness, and a relative immobility (data not shown). However, by
the time of the FST exposure, i.e. 23 h after treatment, all mice exhibited normal motor
activity as assessed by the number of between-compartment crossings performed in the
activity cage (Fig. 6A). The duration of immobility measured 1 h later in the FST was reduced
by diet-induced obesity (F1-20 = 8.3, P < 0.01) and treatment (F1-20 = 10.9, P < 0.01) (Fig. 6B).
Although the interaction between both factors did not reach statistical significance, it is
noteworthy that the reduction of the duration of immobility was only significant in LPStreated obese mice (Saline-obese versus LPS-obese: P < 0.01). LPS also selectively increased
time spent swimming in obese mice (diet: F1-20 = 16.5, P < 0.001; diet x treatment: F1-20 = 4.1,
P = 0.05) (Fig. 6C), whereas its effect on the duration of climbing was similar in both lean
and obese mice (treatment: F1-20 = 6.0, P < 0.05) (Fig. 6D). Thus, diet-induced obesity altered
108
the adaptive behavioral response to an emotional challenge normally exhibited by lean LPS-
60
A
C
50
160
40
120
30
20
##
*
80
40
10
0
0
lean
lean
obese
§§
B
**
250
50
D
obese
*
40
200
Climbing
FST Immobility (s)
Saline
LPS
Locomotor activity
Swimming
Total number of crossings/6min
treated mice.
150
100
30
20
10
50
0
0
lean
obese
lean
obese
Figure 6
Discussion
Understanding the pathophysiological mechanisms by which biological dysregulations
associated with obesity, particularly low-grade inflammation, could contribute to the
pathogenesis of its related comorbidities, particularly mood disorders, has wide ranging
therapeutic implications. The present findings demonstrate that despite the lack of detectable
illness symptoms in obese mice, diet-induced obesity interfered with the ability of the
organism to appropriately respond to a systemic infection. More specifically, obesity provides
a brain environment promoting an exacerbation of the neuroinflammation induced by a
peripheral immune challenge, as manifested by an excessive brain cytokine production and
activation of the microglial TRP-catabolizing enzyme IDO that translate in altered
neuroendocrine (HPA axis) and behavioral sickness responses. Excessive activation of both
IDO and HPA axis has already been related to the development of psychological disorders
resulting from dysregulated innate immune system activation (19, 29, 44). In rodent models of
aging or neurological diseases, a similar exaggerated neuroinflammatory and sickness
response to innate immune challenge has been related to an atypical over-reactive or “primed”
109
state of brain microglia (22). Moreover, this amplified neuroinflammatory response is a
precursor to important neurobehavioral complications (22, 35). Although the cellular source
of exacerbated neuroinflammation was not directly identified in the present study, our results
strongly suggest that obesity may constitute another situation in which a “primed” microglia
may determine increased vulnerability to the negative consequences of immune-mediated
events.
As genetic alterations only account for a small fraction of obesity in humans (45), dietinduced obesity models constitute a more relevant approach for studying the relationship
between obesity and inflammation than genetically obese animals. Moreover, they allow
following up the progression of obesity and its related comorbidities, whereas the time frame
is much more reduced in the case of genetic obesity models. In the present study, mice fed
with enriched diet became obese, as evidenced by the huge body weight gain and adipose
tissue hypertrophy, as well as the marked increase in plasma and adipose tissue levels of
leptin (37). Nevertheless, mice did not display increased plasma cytokine production in
unstimulated conditions, strongly suggesting therefore the lack of detectable low-grade basal
inflammation by the time it was measured. This finding agrees with recently published data
(24, 46), but it contrasts with what is usually reported in genetic obesity models or in high fat
diet-induced obesity models (15, 47, 48). However, in both cases inflammation is associated
with marked symptoms of obesity-related pathological complications, particularly diabetes or
cardiovascular diseases that can per se induce an inflammation. Similarly, low-grade
inflammation has been mainly reported in humans suffering from extremely severe forms of
obesity (11). Our experimental conditions provide therefore the opportunity of detecting
biological changes preceding the onset of the obesity-related comorbidities that have
important deleterious consequences on health. These biological systems deserve to be
thoroughly studied as promising predictive biomarkers and/or potential therapeutic targets.
Despite the lack of visible signs of basal inflammation, diet-induced obesity resulted in
exacerbated immune and neurobehavioral responses to LPS challenge, suggesting the
development of molecular changes underlying an increased vulnerability to systemic
infection. These findings are consistent with data obtained in genetic obesity models, although
as mentioned before the infection acts, in these models, on a preexistent inflammatory
background (23, 49, 50). Recent studies also report altered immune responses to bacterial (24)
or influenza virus infection (51) in diet-induced obesity models. To our knowledge, this is
however the first report detailing how dietary obesity can interfere with normal host response
110
to bacterial infection at both the peripheral and brain levels. Here we show that diet-induced
obesity selectively exacerbated the increase of hypothalamic IL-6 mRNA expression induced
by LPS, leaving unchanged TNFα and IFNγ expression. These results strongly strengthen the
assumption that IL-6 might play a key role in obesity-related mood disorders (9) and
cardiovascular comorbidities (52). Increased IL-6 production leads to the transcription of
many genes, including those coding for the SOCS inhibitory proteins. Here we show that
hypothalamic IL-6 and SOCS-3 mRNA expression was concomitantly increased 2 h after LPS
and more importantly that this effect was amplified in obese LPS-treated mice. Since it has
been shown that IL-6 is selectively involved in the LPS-induced increase of brain SOCS-3
expression (41), our results argue for a direct link between both activations in diet-induced
obesity. Additionally, increased SOCS-3 mRNA expression could also result from the LPSinduced elevation of plasma leptin levels (53). Hypothalamic SOCS-3 expression has been
proposed as a critical determinant of the leptin resistance classically observed in obesity (54).
Moreover, leptin has been suspected to be involved in cytokine-induced anorexia and body
weight loss (55). Although not directly tested here, development of leptin resistance in our
obese mice, as evidenced by the efficiency of enriched diet in promoting obesity despite
elevated levels of circulating leptin, could therefore explain the attenuation of LPS-induced
body weight loss compared to lean mice.
As shown for IL-6 and SOCS-3, the increase of lung and brain IDO expression and
activity induced by LPS was amplified in obese mice compared to their lean counterparts,
whereas no inter-group differences were observed in basal unstimulated conditions. Increase
of basal serum KYN/TRP ratio in obesity has been recently reported in a clinical study, but
only in morbidly obese patients already presenting therefore a marked peripheral
inflammation (56). Although it is widely accepted that IFNγ is the main IDO inducer in
response to LPS (57, 58), in vitro studies suggest the possibility of a synergistic induction of
IDO by TNFα, IL-6 and IL-1β (59, 60). Since enhanced IDO and IL-6 responses to LPS
coincide in obese LPS-treated mice, it can be reasonably hypothesized that IL-6 is involved in
obesity-induced increased activation of IDO by LPS. In support to this hypothesis, we have
recently shown in aged mice an association between protracted IL-6 production and IDO
activation in response to LPS (21). Furthermore, high concentrations of glucocorticoids have
also been reported in vitro to enhance cytokine-induced IDO activation (61). In the present
study, the exacerbated production of corticosterone observed in obese LPS-treated mice may
similarly participate in the over-activation of IDO.
111
By reducing local bioavailability of TRP, stimulation of IDO activity by cytokines can
ultimately impact on the synthesis of brain 5-HT and therefore serotoninergic
neurotransmission. Alternatively, TRP-neuroactive metabolites such as KYN that are
generated as a result of IDO activation can affect glutamatergic neurotransmission. Through
its potential impact on both brain systems playing a key role in the control of the
physiological, behavioral and emotional reactivity to an external challenge, cytokine-induced
IDO activation may participate in linking inflammation with related neuropsychiatric
disorders (28). In the present study, obese mice exhibited higher LPS-induced increase of
brain IDO activation and KYN production than lean mice, but the same stimulation of brain
5-HT turnover. Therefore, these data suggest that the physiological and behavioral responses
to LPS treatment observed in obese mice together with the exacerbated brain IDO activation
may preferentially be mediated by an increased production of the neuroactive metabolites of
KYN. We acknowledge that more experiments are necessary to thoroughly test this
assumption in the context of obesity, but it is already strengthened by recently published data
(29).
Converging evidence suggests that an amplified inflammatory response in the brain is
associated with exacerbated and/or protracted sickness behavior (62, 63). In some situations
such as aging, this exacerbation can promote development of more severe neurobehavioral
complications (21, 34). Furthermore, we have recently reported that cytokine-induced IDO
activation is important to mediate sustained behavioral alterations in response to innate
immune system stimulation (20, 21, 29). In agreement with these findings, an exacerbated
behavioral response to an emotional challenge (the FST exposure), was found in obese mice
treated with LPS compared to lean LPS-treated mice. In light of previously published data
(29, 43), it can appear somehow puzzling that in the present experimental conditions innate
immune system activation tends to reduce immobility in the FST instead of increasing it.
However, different reasons can explain such an apparent discrepancy. A first reason might be
linked to the different strains of mice used (inbred C57BL/6 here versus outbred CD1 in the
other studies), since strains represent a crucial factor to direct behavioral responses in most of
the tests aiming at evaluating behavioral reactivity to an emotional challenge, including the
FST (64). Secondly, although increased immobility is classically described as a “depressivelike” behavior in mice, reduced immobility may reflect an enhanced reactivity to the
emotional stress caused by the test (42). The increased production of corticosterone reported
in obese LPS-treated mice supports this assumption. It is also akin to the recent study showing
112
that stressed-C57BL/6 mice reduced their immobility in the FST compared to unstressed
controls (65). Interestingly, it has been shown that repeated exposures to the FST after LPS in
mice precipitate the shift from stress-like response (reduced immobility) toward depressivelike response (increased immobility) (66). Moreover, stress-induced brain elevation of
cytokine expression has been recently reported to mediate chronic stress-induced depression
in mice via adrenocortical activation and hippocampal neurogenesis suppression (32). The
present results also fit with data reporting an association between exaggerated HPA axis
response to the initial cytokine injection observed in patients undergoing cytokine
immunotherapy and the delayed development of depressive symptomatology after repeated
injections (30). Similar additive effects between repeated exposures of obese mice to
cytokines and stress may then promote higher vulnerability to the deleterious consequences of
exacerbated sickness response, particularly depressive-like symptoms (31, 67). Thirdly, it is
still possible that longer exposure to diet-induced obesity or exposure to a more drastically
enriched diet (68) would allow detecting “depressive-like” behavior in LPS-treated obese
mice. Although more studies are necessary to discriminate the different hypotheses, all these
data support the idea that obesity-induced dysregulation of the mechanisms that regulate
sickness, particularly the IDO and HPA axis systems, might in turn promote increased
vulnerability to the other obesity-related comorbid diseases that share systemic inflammation
in their pathology.
In summary, the present study indicates that diet-induced obesity interferes with the
ability of the innate immune system to appropriately respond to systemic infection by
exacerbating both the neuroinflammation, as manifested by amplified brain IL-6 production
and microglial IDO activation, and the intensity of the resultant neuroendocrine and
behavioral adaptive sickness responses. Moreover, although only correlative and with the
limitation inherent to the measurement of neurobehavioral consequences of obesity in rodents,
the present findings report alterations of both HPA axis and IDO activation that precede the
actual onset of the severe pathological consequences of obesity on health. Therefore, these
results may stimulate important considerations regarding the predictive and/or causative role
of these biological systems in the increased vulnerability to immune-mediated diseases
associated with obesity. Emerging data on aging and neurological diseases point to
neuroinflammation, which results from microglia over-activation, as a promising new
therapeutic target to improve recovery from sickness and reduce the frequency and/or
113
intensity of the associated neurological and behavioral complications. The present study
suggests that similar therapeutic strategies might be very promising in the context of obesity.
Methods
Animals and treatment: All experimental procedures were carried out in accordance with
institutional and international standards of care and use of laboratory animals. Male C57BL/6
mice 3-week old (Charles River Laboratories) were housed 4 per cage in a controlled
environment (normal 12 h light/dark cycle; 22 ± 1°C), with food and water available ad
libitum. Mice were either fed with a standard chow diet (A04, Safe; 3% Fat, 60 %
Carbohydrate, 16% Protein; 330 Kcal/100 g) or an enriched diet (24% Fat, 34%
Carbohydrate, 12% Protein; 440 Kcal/100 g) freshly prepared by mixing pâté, chips,
chocolate, bacon and biscuits as previously described (69, 70).
LPS from E.coli (serotype 0127:B8, Sigma) was dissolved in sterile endotoxin-free
saline on the test day. The dose of 830 µg/kg i.p. was selected on the basis of its ability to
induce the full spectrum of sickness response (43, 71) and a reliable increase of brain IDO
activity (29, 72).
Experimental procedures: Once diet-induced obesity was clearly established (26 weeks), all
lean and obese mice were injected with saline or LPS and were immediately returned to their
home cage. Half of the mice were killed 2 h later by CO2 asphyxiation and perfused with icecold PBS 1X to remove all traces of blood from tissues. The hypothalamus were immediately
collected and stored at -80°C until essayed for determination of cytokine and IDO mRNA
expression (57). Concurrently, body weight was monitored 3, 6 and 24 h after treatment in the
remaining mice. Their locomotor activity and performances in the FST were respectively
measured 22 and 23 h after treatment. They were killed 1 h later and blood was collected via
cardiac puncture into EDTA-coated (10%) chilled tubes. After centrifugation (10 min, 3000 g,
4°C), plasma was stored at -80°C until assayed for concentrations of cytokines, adipokines
and corticosterone. After perfusion with ice-cold PBS 1X, brains, lungs and adipose tissue
were immediately collected and stored at -80°C.
114
Behavioral measures: As previously described (20, 43), behavioral experiments were
performed under conditions of dim light and low noise. Behavior was scored by a trained
observer blind to drug treatments, using the “Observer Basic” software (Noldus, Netherlands).
Motor activity: The motor effect of LPS was assessed in a cage (30 x 11 x 12 cm)
divided into 2 communicating compartments by counting the total number of betweencompartments crossings performed over the 6-min test. The cage was cleaned thoroughly
between each session.
Forced swim test: Mouse was placed individually in a cylinder (diameter: 16 cm;
height: 31 cm) filled with 25°C water for a 6-min test. Duration of swimming, climbing and
immobility was determined during the 5 last minutes of the test.
Measurements of TRP, KYN, 5-HT and 5-HIAA: Concentrations of TRP, 5-HT, and their
respective metabolites were measured as previously described (21, 73). Briefly, tissues were
homogenized using ice cold potassium 0.14 M KCl, 20 mM phosphate buffer (pH 7.0) and
centrifuged (14,000 g, 30 min at 4°C). Clarified homogenates were precipitated in 2 mM
trichloro-acetic acid. Following centrifugation (13,000 g for 5 min at 4°C), supernatants were
injected onto a 5-µm C18 HPLC column (Lichrospher, Alltech, Deerfield, IL, USA) at a flow
rate of 1.0 ml/min with mobile phase containing 0.1 M ammonium acetate/acetic acid buffer
and 5 % acetonitrile (pH 4.65). Levels of KYN were evaluated by UV absorbency at 360 nm,
whereas TRP was detected by fluorescent detector at 285 nm excitation and 365 nm emission
wavelengths. Concentrations of 5-HT and 5-HIAA were measured with a COULOCHEM II
electrochemical detector. All concentrations were determined in samples by comparison of
the retention time and peak areas with known standards.
Measurements of hormones and cytokines: As previously described (20), leptin, insulin,
resistin, MCP-1, TNFα and IL-6 were measured in plasma and adipose tissue by Luminex
technology with the mouse serum adipokine LINCOplex kit (Linco Research, Inc., USA)
following the manufacturer’s instructions. Plasma corticosterone levels were determined after
ethanol extraction by a radiocompetitive protein binding assay using rhesus monkey serum as
a source of transcortin, tritiated corticosterone as tracer and dextran-coated charcoal to absorb
the unbound fraction of corticosterone (74).
115
Reverse transcription and real-time RT-PCR: Total RNA was isolated from hypothalamus
using RNeasy Mini Kit (Qiagen) according to the manufacturer’s instructions and eluted in 30
µl RNase free water (75). Total RNA from whole brains was extracted into TRIzol (Sigma)
and subjected to a DNase I digestion procedure (Ambion, France) (29). 1 or 2 µg of total
RNA were then reverse transcribed with Moloney Murine Leukemia Virus reverse
transcriptase (200 U/µl) using random primer (150 ng/µl) in a 40 µl reaction volume (5x
First-Strand Buffer, 0,1 M deoxynucleotide triphosphate, 10 mM (each) dNTP mix and 40
U/µl Recombinant Ribonuclease Inhibitor) (Invitrogen). Resultant first-strand cDNA was
amplified by the Taqman® Universal PCR Master Mix with sequence-specific primers and
the FAM-labeled Taqman MBG probe assay mix (Applied Biosystems) as previously
described (29, 57, 63). Results were normalized with the β2-microglobulin endogenous
control and the relative quantitative evaluation of the amplification products was performed
using the comparative threshold cycle method, as described elsewhere (Applied Biosystems
user bulletin n°2).
Statistical Analysis: Data were analyzed using an ANOVA analysis (diet x treatment) with
repeated measurement on the time factor where appropriate, followed by a post-hoc pair wise
multiple comparison procedure using the Student-Newman-Keuls method, if the interaction
was significant.
Acknowledgments
This study was funded by INRA, CNRS, Région Aquitaine. ALD was supported by a doctoral
fellowship from the Institut Danone.
116
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Figure Legends
Figure 1. Long term exposure to enriched diet exacerbates body weight gain. At their arrival,
mice were randomly allocated to standard or enriched diet conditions. They were either fed with a
standard chow diet or a high caloric diet freshly prepared by mixing pâté, chips, chocolate, bacon and
biscuits. Food and water were available ad libitum. Body weight was measured twice a week over the
26-week period of diet exposure. As expected, enriched diet induced a significant and sustained
increase in body weight. At last, mice on enriched diet gained 35 % more body weight than controls.
Data are represented as means ± SEM (n=12). ***P < 0.001, obese versus lean mice.
Figure 2. Diet-induced obesity potentiates peripheral and brain IDO activation following a
systemic injection of LPS. Once obesity was clearly established (26 weeks), mice were randomly
allocated to LPS or saline experimental groups receiving respectively an injection of LPS (830 µg/kg,
i.p.) or saline. Mice were immediately returned to their home cage after treatment and they were
sacrificed 24 h later. Kynurenine (KYN) and tryptophan (TRP) concentrations were determined by
HPLC in both lungs (A) and brains (B) and the KYN/TRP ratio was calculated to assess IDO activity.
Concomitantly, brain steady-state expression of IDO mRNA transcripts was measured by RT-PCR
(C). Basal expression and activity of IDO was similar in all groups, but the effect of LPS was
exacerbated in obese mice. Data represent means ± SEM (n=6). Bars indicate statistical differences
among groups. ***P < 0.001, LPS versus saline-treated mice; §P < 0.05, obese versus lean mice; #P <
0.05, diet x treatment interaction; nd: not detectable.
Figure 3. Serotonin (5-HT) turnover increases in the brain of lean and obese mice in response to
peripheral LPS injection. By the end of the 26 weeks of standard or enriched diet exposure, mice
were randomly allocated to LPS (830 µg/kg, i.p.) or saline experimental groups. Twenty-four hours
after treatment, mice were sacrificed, perfused with ice-cold phosphate-buffered saline and the brains
were immediately collected. (A) Concentrations of kynurenine (KYN), tryptophan (TRP), as well as
(B) 5-HT and its metabolite 5-hydroxyindoleacetic acid (5-HIAA), were determined by HPLC from
clarified brain homogenates. LPS treatment increased brain levels of 5-HIAA, KYN and TRP in all
122
groups. Elevation of brain concentrations of KYN by LPS were significantly higher in obese than in
lean mice, as expected from their exacerbated brain IDO activation. (C) Turnover rate of brain 5-HT,
as measured by the ratio of 5-HIAA to 5-HT, was similarly increased by LPS treatment in both lean
and obese mice. Data represent means ± SEM (n=6). Bars indicate statistical differences among
groups. *P < 0.05, ***P < 0.001, LPS versus saline-treated mice; #P < 0.05, ##P < 0.01,
###
P <0.001,
diet x treatment interaction.
Figure 4. Diet-induced obesity potentiates neuroinflammation following a systemic injection of
LPS. By the end of the 26 weeks of standard or enriched diet exposure, mice were randomly allocated
to LPS (830 µg/kg, i.p.) or saline experimental groups. They were sacrificed 2 h after treatment,
perfused with ice-cold phosphate-buffered saline and the hypothalamus were immediately collected.
Steady-state expression of hypothalamic mRNA transcripts was measured by RT-PCR for (A) TNFα,
(B) IFNγ, (C) IL-6, (D) IDO and (E) SOCS-3. Basal levels of expression were low and similar in both
lean and obese mice. Peripheral LPS administration enhanced expression of proinflammatory
cytokines and IDO in all LPS-treated mice, but this effect was significantly amplified by obesity for
IL-6, SOCS-3 and IDO. Data represent means ± SEM (n=6). Bars indicate statistical differences
among groups. *P < 0.05, ***P < 0.001, LPS versus saline-treated mice; #P < 0.05, ##P < 0.01,
###
P
<0.001, diet x treatment interaction.
Figure 5. Body weight loss induced by a peripheral LPS injection was attenuated in obese mice.
In order to assess one of the classical symptoms of the sickness response to LPS resulting from the
peripheral and brain cytokine production induced by this treatment, changes in body weight were
measured 3, 6 and 24 h after LPS administration (830 µg/kg, i.p.). As expected, LPS-treated mice
exhibited a significant and sustained body weight loss compared to their respective pre-treatment body
weight. However, this effect was attenuated in obese mice. Data represent means ± SEM (n=6). **P
<0.01, ***P <0.001, LPS versus saline-treated mice; §P <0.05, §§§P <0.001, obese versus lean mice.
Figure 6. Behavioral changes induced by a systemic injection of LPS are impaired in obese mice.
Once obesity was clearly established (26 weeks), mice were randomly allocated to LPS or saline
experimental groups receiving respectively an injection of LPS (830 µg/kg, i.p.) or saline. (A) In order
to verify that mice had fully recovered from the short-term LPS-induced motor retardation, they were
first tested in the activity cage 22 h after treatment and their locomotor activity was assessed by
counting the number of between compartment crossings. By that time, neither LPS treatment nor
obesity affected their locomotor performances. One h later, mice were therefore exposed to a FST for
a 6-min test and the time spent immobile (B), swimming (C) or climbing (D) was recorded in the
different groups. The slight decreased duration of immobility induced by LPS in lean mice was
123
exacerbated in obese mice, concomitantly with an increase in their duration of swimming. In contrast,
LPS induced a similar increase of the duration of climbing in both lean and obese mice. Data represent
means ± SEM (n=6). Bars indicate statistical differences among groups. §§P <0.01 obese versus lean
mice and **P <0.01 LPS versus saline-treated mice.
Table I. Diet-induced obesity impaired plasma and adipose tissue adipokines and corticosterone
levels measured 24 h after LPS (830 µg/kg, i.p.) or saline injection. Assays were performed with a
mouse adipokines LINCOplex kit following the manufacturer’s instructions. Values represent means ±
SEM (n=6). Data labelled with different letters (A, B or C) are significantly different from each other
(P < 0.05).
124
Chapitre 2
125
126
Chapitre 2
DIET-INDUCED OBESITY IMPAIRS IN MICE SPATIAL
MEMORY AND EXACERBATES NEUROINFLAMMATION
INDUCED BY SYSTEMIC INFECTION
Anne Laure Dinel, Caroline André, Sophie Layé and Nathalie Castanon
En cours de soumission
127
128
DietDiet-induced obesity impairs in mice spatial memory and exacerbates
neuroinflammation induced by systemic infection
Objectifs :
Le but de cette étude était de vérifier si un état d’obésité induit par un régime enrichi
pouvait entrainer le développement de troubles cognitifs.
Matériel et méthodes :
Des souris mâles C57bl/6J de 3 semaines ont été soumises soit au régime standard
pour rongeur soit à un régime enrichi (lipides: 24%, glucides: 34%, protéines: 12%) pendant
19 semaines. Au bout de 9 semaines de régime, les animaux consommant le régime
hypercalorique sont en surpoids et sont alors soumis à un test de cognition dans un labyrinthe
en Y. Au terme de la période de 19 semaines, l’ensemble des souris a reçu une injection i.p.
de LPS (0,83 mg/kg) ou de solution saline puis a été soumis de nouveau à un test de cognition
(Y maze) 24 h post-LPS. Les animauux ont été sacrifiés 1h après le test et le plasma, les
poumons, le tissu adipeux et le cerveau ont été prélevés. Les concentrations en IL-6, IFNγ,
TNFα et ACTH ont été mesurées dans le plasma et le tissu adipeux en multiplex selon la
technologie Luminex. La concentration de corticostérone plasmatique a été évaluée avec un
kit RIA. L’activité enzymatique de l’IDO pulmonaire a été évaluée par dosage du rapport
KYN/Trp par HPLC. Enfin, l’expression cérébrale des ARNm de l’IL-6, du TNFα, de l’IFNγ,
et de l’IDO a été mesurée par PCR en temps réel.
Résultats :
Les souris en surpoids présentent une altéation de leur capacité dans le test de
mémoire spatial comparativement aux souris minces. Cette altération des capacités cognitives
est maintenue lorsque les souris sont obèses (masse corporelle de 20% supérieure à celle du
groupe contrôle). De plus, l’injection de LPS entraîne l’apparition de troubles chez les
animaux minces et aggravent les troubles préexistants chez les souris obèses.
Confirmant notré étude précédente, en conditions non stimulées, les taux circulants
d’IL-6, de TNFα, de MCP-1, ainsi que la libération de corticostérone ne sont pas affectés chez
les souris obèses, tandis que leur augmentation induite 24 h post-LPS est potentialisée par le
régime enrichi. De plus, la consommation de régime enrichi exacerbe l’induction de l’activité
enzymatique de l’IDO pulmonaire et cérébrale, ainsi que son expression cérébrale 24 h après
129
l’administration de LPS. L’induction de l’ARNm de l’IFNγ et du TNFα, ainsi que de l’IDO
exprimée dans l’hippocampe 2 h post-LPS est exacerbée chez les souris obèses mais pas celle
d’IL-6.
Conclusion :
La prise de poids entraîne l’apparition précoce de troubles de la cognition qui se
maintiennent au cours de l’obésité mais ces altérations ne sont pas associées à la mise en
évidence d’un état inflammatoire en basal. Par contre, l’état d’obésité induit par le régime
enrichi interfère avec la capacité du SI à répondre de façon appropriée à une stimulation aiguë
du SI, en exacerbant les réponses neurobiologiques ainsi que leurs conséquences sur les
capacités cognitives.
130
Diet-induced obesity impairs in mice spatial memory and exacerbates
neuroinflammation induced by systemic infection
Anne-Laure Dinel, Caroline André, Sophie Layé and Nathalie Castanon*
INRA, UMR 1286 PsyNuGen, Université Victor Segalen Bordeaux 2, CNRS, UMR 5226, IFR8, F33076 Bordeaux, France
*Adress all correspondence to:
Nathalie Castanon, Ph.D
INRA, UMR 1286, Laboratory of Psychoneuroimmunology, Nutrition and genetics,
Bâtiment UFR Pharmacie, Case courrier 34,
Université Victor Ségalen Bordeaux 2,
146 rue Léo Saignat, 33076 Bordeaux, France
e-mail : [email protected]
Phone: 33 557 574 505
Fax : 33 557 571 227
Abstract
Rationale: Severe obesity is associated with a peripheral low-grade inflammation. Moreover,
an inverse linear relationship has been reported between weight excess and cognitive abilities
in an adulthood healthy population. Recent evidence suggests however that functional links
relying on biological systems shown to be impaired in both obesity and cognitive disorders
may exist and inflammation has been proposed as a potential key element. Cytokine-induced
over-activation of the microglial enzyme indoleamine 2,3-dioxygenase (IDO) and
glucocorticoid release might condition development of cognitive disorders. The same cascade
of events may explain the increased susceptibility of obese subjects to develop cognitive
deficit.
Objectives: Our aim was to investigate the relationship between inflammation and
development of cognitive alterations related with increased body weight in a murine model of
diet induced obesity and to measure the potential exacerbation of obesity-related cognitive
131
dysfunctions by a systemic inflammatory challenge elicited by peripheral administration of
the cytokine inducer lipopolysaccharide (LPS).
Findings: Here we show that cognitive deficits existed in both overweighed and obese mice
and are exacerbated by LPS-induced innate immune system stimulation. Moreover, such an
exacerbation was paralleled by increased activation of different inflammatory markers
including brain proinflammatory cytokines and IDO enzymatic activity in obese subjects.
Conclusion: This study provides therefore important clues about the neurobiological basis
through which cytokines may have an impact on cognitive behaviors in the context of obesity.
Introduction
Over the last decade, prevalence of obesity has continuously increased to become an
important public health problem, often associated with severe comorbidities, particularly
cardiovascular and metabolic diseases. Moreover, an inverse linear relationship has been
reported between weight excess and cognitive abilities in an adulthood healthy population.
Increase in body mass index appears therefore to be associated with progressive development
of cognitive disorders (Cournot et al., 2006), although the time course of such a development,
as well as their underlying mechanisms are still mainly poorly understood. Recent evidence
suggests however that functional links relying on biological systems shown to be impaired in
both obesity and cognitive disorders may exist. These biological intermediates may constitute
the neurobiological basis of the cognitive deficit associated with obesity. In this context,
inflammation has been proposed as a potential key element in the shared biology of obesity
and cognitive disorders. Indeed, severe obesity is associated with peripheral chronic lowgrade inflammation characterized by an increase in plasma production of cytokines mainly
originating from adipose tissue and with immune dysfunction (Clement et al., 2004; Wadden
et al., 2006). Moreover few rodent studies have suggested that neuroinflammation may also
exist (De Souza et al., 2005).
It is well known that proinflammatory cytokines that are released during a systemic
inflammation can induce brain-mediated behavioral responses known collectively as sickness
behavior (Dantzer et al., 2008; Konsman et al., 2002). This adaptive sickness response is
strictly tailored to the stimulus and time-limited. However, exacerbation of the sickness
response resulting from an amplified or unregulated inflammatory cytokine response can
culminate in the development of pathological disorders including cognitive dysfunction
(Heyser et al., 1997; Vallieres et al., 2002). This is particularly true when protracted
132
inflammation occurs in the context of an increased vulnerability to the negative consequences
of immune-mediated events, as observed in aging (Barrientos et al., 2006; Chen et al., 2008),
neurological diseases (Cunningham et al., 2008; Perry et al., 2007) or in patients undergoing
cytokine immunotherapy for the treatment of viral diseases or certain cancers (Capuron et al.,
2001; Raison et al., 2005). Interestingly, development of cognitive deficits in these patients is
associated with a drastic drop of circulating levels of tryptophan, the essential amino acid
acting as limiting factor for the serotonin synthesis. It has been proposed that these alterations
could be at least partially explained by cytokine-induced peripheral and/or central activation
of the indoleamine 2,3-dioxygenase (IDO), a tryptophan-catabolizing enzyme that is potently
induced in monocytes, macrophages and brain microglia by cytokines. IDO activation can
result in the increase of neurotoxic derivates production (3-OH-kynurenine, quinolinic acid),
together with a reduced bioavailability of tryptophan for the synthesis of serotonin (Dantzer et
al., 2008). Both consequences of cytokine-induced IDO activation may play a role in the
development of the cognitive disorders associated with inflammation, as suggested by recent
animal studies (Ceresoli-Borroni et al., 2007; Guidetti et al., 2006; Olivier et al., 2008; Uchida
et al., 2007). Besides IDO activation, impaired hypothalamic-pituitary-adrenal (HPA) axis
response to cytokine administration has also been shown to condition increased vulnerability
to inflammation-induced cognitive symptoms (Capuron et al., 2003). This result agrees with
the mounting evidence that links increased concentrations of glucocorticoids resulting from
chronic stress exposure or aging with cognitive decline (Chrousos and Kino, 2007; de Kloet et
al., 2008; Lupien et al., 2007). Obesity is associated with increased activity of both the HPA
axis and peripheral IDO. It can therefore be hypothesized that in the context of obesity,
altered reactivity of both IDO and HPA systems might be an important contributing factor to
the cognitive disorders that might result from exacerbated sickness response to systemic
inflammation.
An increased susceptibility to autoimmune diseases and infections is often reported in
obese subjects (Amar et al., 2007a; Mannino et al., 2006). Similarly, systemic infections have
more severe consequences in the elderly (Chen et al., 2008; Rahkonen et al., 2000) and in
animal models of chronic degenerative diseases (Perry et al., 2007). In these models, transient
peripheral immune activation superimposed on low grade inflammation, acutely exacerbates
cognitive symptoms of disease (Cunningham et al., 2008). This effect has been proposed to be
based on an atypical more “reactive” state of brain microglia referred to as “primed” state. In
vulnerable subjects exposed to systemic infection, “primed” microglia switch their silent
133
phenotype to produce excessive cytokines and IDO (Capuron and Dantzer, 2003; Henry et al.,
2008) that translate in altered neuroendocrine (HPA axis) and behavioural sickness response
(Capuron et al., 2003; Henry et al., 2008). Similarly, obesity may constitute another situation
in which chronic low grade inflammation, potentially exacerbated by systemic inflammatory
challenges, would condition increased vulnerability to comorbidities such as cognitive
dysfunctions.
In order to test this hypothesis, we first investigated the relationship between
inflammation and development of cognitive alterations related with increased body weight in
a murine model of diet induced obesity. Cognitive performances were therefore evaluated in a
Y-maze both before (overweighed period) and after establishment of a clear obesity (20 %
increased body weight compared to lean controls). Then, we measured the potential
exacerbation of obesity-related cognitive dysfunctions by a systemic inflammatory challenge
elicited by peripheral administration of the cytokine inducer lipopolysaccharide (LPS). Our
data indicate that cognitive deficits existed in both overweighed and obese mice and are
exacerbated by LPS-induced innate immune system stimulation. Moreover, such an
exacerbation was paralleled by increased activation of different inflammatory markers
including brain proinflammatory cytokines and IDO enzymatic activity in obese subjects.
This study provides therefore important clues about the neurobiological basis through which
cytokines may have an impact on cognitive behaviors in the context of obesity.
Methods
Animals and housing
Male C57BL/6 mice were purchased from Charles River Laboratories and were
maintained under a 12h light/dark cycle (9:00 on) at 23°C with ad libitum consumption of
water and A04 rodent chow (Safe, Villemoisson-sur-Orge, France) or enriched diet prepared
at the laboratory. All animal care and experimental procedures were in accordance with the
European Communities Council Directive of 24 November 1986 (86/609/EEC) and with the
National Institute of Health (NIH) guidelines and were approved by the Institutional Animal
Care and Use Committees.
Diet and treatment
134
At their arrival, mice were randomly divided into two groups, one with free access to
standard rodent chow A04 (Fat, 3,1 %; Carbohydrate, 60 %; Protein, 16,1 %; 3,3 Kcal/g) and
the other one to a fat-rich diet containing pâté, chips, chocolate, bacon and biscuits as
previously published (Berraondo et al., 1997).The composition was Fat, 32 %; Carbohydrate,
17,5 %; Protein, 11,3 %; 4,4 Kcal/g. Body weight and food intake were measured once a
week over a 19-wk period.
Lipopolysaccharide (LPS) from E.coli (serotype 0127:B8) was purchased from Sigma
and dissolved in sterile endotoxin-free isotonic saline on the test day to obtain 0.83 µg/g for
intraperitoneal (i.p.) injection. Endotoxin-free isotonic saline was used as the vehicle control.
Experimental procedures
The aim of the present study was to determine the consequences of chronic fat-rich diet
intake on cognitive troubles and on the activity of the innate immune system, in both
unstimulated (basal level) and stimulated (LPS challenge) conditions. Cognitive ability was
assessed in all animals during the weight gain period and at the end of the 19 wk period of
exposure to a hypercaloric diet. Animals were first submitted to a Y maze to assess the
cognitive performance of the mice after 9 wk of diet.
Peripheral stimulation of the innate immune system with LPS enhanced expression and
release of proinflammatory cytokines, which are responsible of physiological and behavioral
symptoms of sickness (Dantzer, 2006). Therefore, both LPS-induced cytokine production
(mRNA and protein expression) and sickness symptoms (as reflected by body weight loss and
behavioral changes) were assessed at the end of the 19-wk period of standard or fat-rich diet
exposure. By that time, mice were injected i.p. with saline or LPS (0.83 µg/g) and were
immediately returned to their home cage. In order to determine the potential effects of fat-rich
diet on the early phase of the cytokine response to LPS, a first group of lean and obese mice
was killed 2h after treatment by CO2 inhalation. Immediately after, mice were intracardiacally
perfused with PBS 1X at 4°C via the ascending aorta to remove all traces of blood from
tissues. Hippocampus was then collected and immediately stored at -80°C until PCR analysis
of mRNA content.
Concurrently, a second group of lean and obese mice was used to measure the potential
modulation of long-term (24h) LPS-induced alterations by fat-rich diet. LPS-induced body
weight loss was controlled 24h after injection. Twenty two hours after treatment, mice were
tested in a Y maze in order to evaluate potential LPS-induced cognitive alterations.
Concurrently, saline-treated lean and obese mice were tested in the same behavioral
135
paradigms to assess potential alterations induced by obesity. One hour after the end of the Y
maze, mice were killed by CO2 inhalation and blood samples were collected via cardiac
puncture into EDTA-coated tubes. After centrifugation (10 min, 3000 g, 4°C), plasma was
stored at -80°C until assay for concentrations of corticosterone, cytokines and adipokines.
Half mice were perfused with PBS 1X as just described, brain, lungs and adipose tissue were
immediately collected and stored at -80°C for later determination of IDO activity, serotonin
metabolism and/or cytokines mRNA levels. We have previously shown by using similar
experimental procedure that LPS challenge induced, 24h after treatment, an increased IDO
activity (Lestage et al., 2002), associated with behavioral alterations in the FST (Frenois et al.,
2007). The other group was perfused with paraformaldehyde 4% and brains were collected to
realise immunohistochemistry (Gautron et al., 2005).
Behavioral measures
Behavioural experiments were performed 2h before the light off, under conditions of dim
light and low noise. Behaviour was monitored via a video camera and videotaped to be scored
later by a trained observer blind to drug treatments, using the “Observer Basic” software
(Noldus, Netherlands).
The Y-maze was used to assess spatial working memory. This task has been shown to require
cognitive processes involving the hippocampus (Conrad et al., 1996). The apparatus was a Yshaped maze made of gray plastic. Each arm was 34 cm long, 8 cm wide and 14 cm high. The
floor of the maze was covered with corn cob litter which was mixed between each trial in
order to remove olfactory cues. Visual cues were placed in the testing room and kept constant
during the whole test. In the first trial of the test, one arm of the Y-maze was closed with a
guillotine door and mice were allowed to visit two arms of the Y-maze for 5 min. After a 30min inter-trial interval, mice were placed back in the start arm and allowed free access to the
three arms for 5 min. Start and closed arms were randomly assigned for each mouse. Arm
entries were defined as entry of all four paws into the arm. The index of recognition was
calculated as the ratio of the time spent in the novel arm / (novel + adjacent) arms during the
first three minutes of the retrieval phase.
Measurements levels of cytokines and adipokines
IL-6, TNF alpha, IL10, IL12 and IFN gamma were measured in plasma with the mouse serum
cytokine LINCOplex kits (Linco research, Inc., St. Charles, MO, USA) following the
manufacturer’s instructions as previously described (Moreau et al., 2008a). Briefly, the assay
136
is based on the use of carboxylated polystyrene beads with a distinct emitting fluorescence
pattern and coupled covalently with capture antibodies specific for individual target proteins.
A Luminex100 was used to process the data. The service was provided by the “Functional
Exploration Platform” from the Genopole of Toulouse, France.
(http://ifr31.toulouse.inserm.fr/PFT/ExplPhysioPatho/)
HPA axis evaluation
Corticosterone concentrations were measured from plasma using an ImmuChem Double
Antibody Corticosterone RIA Kit from Diasorin (Antony, France). Plasma concentrations of
corticosterone were determined according to the manufacturer’s instructions as previously
described (Apter and Eriksson, 2006).
ACTH is measured using a LINCOplex kit as previously described.
RNA isolation and reverse transcription for IL6, TNF alpha, IFN gamma, IDO.
Total RNA from hippocampus samples was extracted with Trizol. Reverse transcription was
performed using oligo dT primers added 2 µg of hypothalamus RNA. The oligo dT
primer/RNA mix was then inactivated at 65°C for 5 min and chilled on ice. Reverse
transcription was performed at 55°C for 45 min. The reaction was terminated by heat (70°C
for 15 min). To minimize inter-assay variation all RNA samples from a single experimental
group were reverse transcribed simultaneously.
Real-time PCR for IL6, TNF alpha, IFN gamma, IDO.
Resultant first-strand cDNA was amplified by the Taqman Universal PCR Master Mix with
sequence-specific primers and the FAM-labeled Taqman MBG probe assay mix (Applied
Biosystems). The assay IDs for the target genes in the assay mix were: IL-6
(Mm00446190_m1), IL-1β (Mm00434228_m1), TNFα (Mm00443258_m1), IFNgamma
(Mm 00801778_m1), IDO (Mm00492586_m1), and for the house keeping gene β2
microglobulin (Mm00437762_m1) as previously used (O'Connor et al., 2008). Real time PCR
was performed on the ABI Prism 7700 under the following conditions: 50°C for 2 min, 95°C
for 10 min, followed by 40-cycles amplification phase of 95°C for 15 sec and 60°C for 1 min.
Results were normalized with the β2 microglobulin endogenous control and the relative
quantitative evaluation of the amplification products was performed using the comparative
threshold cycle method, as described elsewhere (Applied Biosystems user bulletin n°2).
137
Statistic Analysis
Data (mean ± SEM) were analyzed using a one-way ANOVA (strain) or a two-way (strain x
treatment) ANOVA with repeated measurement on the time factor where appropriate,
followed by a post-hoc pair wise multiple comparison procedure using the Fischer’s LSD
method, if the interaction was significant.
Results
Exposure to enriched diet rapidly induced overweight leading to obesity
As expected (Andre et al., 2008a), enriched diet induced a significant increase in body
weight over the 19-wk period (diet: F1,1198=2606, p<0.001, time: F1,1998=889.38, p<0.001,
diet x time: F1,1998=65.34, p<0.001). Overweighed appeared in animals fed with enriched diet
after 9 wk (p<0.05), whereas a marked obesity (20 % increase in body weight compared to
lean mice) was clearly installed after 15 wk (Fig 1A). These results show that consumption of
a highly caloric food, even though daily food intake did not significantly differ between both
groups (data not shown), clearly induced the development of a marked obesity.
40,0
Lean
35,0
Obese
Body weight (g)
30,0
***
***
***
***
***
*** ***
*** ***
25,0
Figure 1A
Effect of enriched diet on body weight
changes during the 19 wk period of diet
exposure. Data are represented as means ±
SEM (n=56). ***p<0.001, obese versus
lean mice
20,0
15,0
10,0
5,0
0,0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
Wk
Diet-induced obesity induced early cognitive disorders
Severe obesity has been associated with some cognitive disorders but nothing was
known about the time-course of disorders onset (Cournot et al., 2006). We studied here the
early consequences of enriched diet on cognitive abilities. Overweighed mouse presented
alteration of spatial working memory in the Y maze apparatus that requires cognitive
138
processes involving the hippocampus (Conrad et al., 1996). In accordance with the
experimental procedure described for this test (Dellu et al., 2000), mice were submitted to Y
maze test with an inter-trial interval (ITI) of 2 min. In this paradigm, both groups perfectly
recognized the new arm (lean mice: p<0.001, overweighed mice: p<0.001) (Fig 2A). Mice did
not exhibit problem of recognition since the response to novelty is not altered. One week after
this test, spatial memory was evaluated in a Y maze test with an ITI of 30 min. Overweighed
mice fed with enriched diet for 9 wk were not able to recognize the novel arm 30 min after the
first exposure to the maze as shown by the index of recognition which was not different from
chance. On the contrary, lean mice fed with well-balanced diet clearly recognized the new
arm after a retention time of 30 min (lean mice: F1,30=14.32, p<0.001) (Fig 2B).
Taken together, these results confirmed that overweigh mice present alteration of spatial
memory and that the difference of exploration observed in the 30 min ITI test was not due to a
difference of stress reactions to manipulation.
0,70
***
0,70
***
***
0,60
Lean
Obese
0,60
Lean
Obese
0,50
Recognition index
Recognition index
0,50
0,40
0,30
0,40
0,30
0,20
0,20
0,10
0,10
0,00
0,00
Figure 2A
Index of recognition of novelty after a
2min-ITI. Period of the diet was 9 wk.
Data are represented as means ± SEM
(n=8). ***p<0.001, each group is
compared to hazard (0.5)
Figure 2B
Index of recognition of novelty after a
30min-ITI. Period of the diet was 9 wk.
Data are represented as means ± SEM
(n=8). ***p<0.001, each group is
compared to hazard (0.5)
In order to study whether increased body weight gain impaired cognitive deficit already
observed in overweighed mice, their behavioural performances were re-evaluated in the Y
maze once obesity was clearly established, i.e. after 19 wk of enriched diet consumption. The
same paradigm with a 30 min ITI was used to study spatial working memory in both lean and
obese mice. Lean mice still presented good performances in the Y maze test, whereas obese
mice did not discriminate the novel arm from the other ones (lean mouse: F1,9=10.79, p<0.01,
overweighed mouse: NS) (Fig 2C). These data showed that cognitive disorders appeared early
139
in the development of obesity and were maintained over time. No compensation seems to
counterbalance the early effect of enriched diet on cognitive performances.
1,00
0,90
**
0,80
Figure 2C
Index of recognition of novelty after a
30min-ITI. Period of the diet was 19 wk.
Data are represented as means ± SEM
(n=8). **p<0.01, each group is compared
to hazard (0.5)
Recognition index
0,70
Lean-Sal
Lean-LPS
Obese-Sal
Obese-LPS
0,60
0,50
0,40
0,30
0,20
0,10
0,00
LPS exacerbated enriched diet-induced cognitive disorders
Severe obesity has been associated with increased susceptibility to infection (Amar et
al., 2007a) that can potentially facilitate development of inflammation-related comorbidities
(Godbout et al., 2008; Perry et al., 2007). As shown in our previous study (Andre et al), dietinduced obesity altered behavioural responses to LPS in a forced swim test. Moreover, a
challenge with a single high intraperitoneal dose of LPS used to induce a septic shock in
normal weighed mice induces cognitive disorders in the Y maze (Noble et al., 2007), but
interpretation of this last result in such extreme conditions is complicated. We decided
therefore to explore the consequences of a systemic infection induced by a moderate dose of
LPS on cognition by the time where obesity was clearly developed. The Y maze test was
performed 24 h after the LPS injection, i.e. by the time where locomotor impairment
classically observed over the first hours post-treatment has dissipated (data not shown).
As expected, LPS induced a progressive and sustained decrease in body weight
(treatment: F1,29=315.63, p<0.0001) in both lean and obese mice compared to their respective
controls, confirming therefore the efficiency of the host response to LPS. LPS-induced body
weight loss was however progressively attenuated by enriched diet, as shown by the
significant diet by treatment interaction (F1,29=9.24, p<0.005). Indeed, the reduction of body
weight measured 24 h after LPS treatment was significantly smaller (p<0.05) in obese than
lean LPS-treated mice (Fig 1B) .
140
0,5
a
0
Figure 1B
Effect of LPS (830µg:kg, i.p.) in body
weight measures 24h after injection. Data
are represented as means ± SEM (n=8).
Means with different letters are
significantly different from each other.
Body weight loss (g)
1
-0,5
a
Lean-Sal
Lean-LPS
-1
Obese-Sal
Obese-LPS
-1,5
-2
c
-2,5
b
-3
In order to measure the effect of LPS on cognition, performances in a spatial working memory
test, the Y maze, were compared between lean and obese mice. The results obtained revealed a
negative impact of LPS treatment on cognitive abilities in both lean and obese mice (F1,21=7.96,
p<0.01). As expected, LPS induced cognitive disorders in lean mice (lean saline mice: F1,9=10.79,
p<0.01, lean LPS mice: NS) and exacerbated the bad score of recognition index (RI) obtained by
obese mice (saline obese mice: RI=0.56± 0.035, LPS obese mice: RI=0.34± 0.139) (Fig 2C).
1,00
0,90
0,80
Figure 2C
Index of recognition of novelty after a
30min-ITI. Period of the diet was 19 wk.
Data are represented as means ± SEM
(n=8). **p<0.01, each group is compared
to hazard (0.5)
Recognition index
0,70
**
Lean-Sal
Lean-LPS
Obese-Sal
Obese-LPS
0,60
0,50
0,40
0,30
0,20
0,10
0,00
Dietinduced obesity alters immune, neuroendocrine and neurochemical responses to LPS
141
lean
Plasma
IL-6 (pg/ml)
TNFα (pg/ml)
IL-12 (pg/ml)
IFNγ (pg/ml)
Saline
145,02 ± 82,06a
6,09 ± 0,98a
74,55 ± 42,16
ND
obese
LPS
589,85 ± 299,99a
26,94 ± 16,3b
365,04 ± 131,1
ND
Saline
124,68 ± 95,94a
8,86 ± 3,69a
379,99 ± 214,7
ND
LPS
1613,12 ± 346,41b
30,33 ± 9,14b
295,72 ± 155,83
ND
Table 1
Plasma cytokines levels 24h after LPS (830µg/kg, i.p.) or saline injection in lean and obese mice. Values represent means ± SEM
(n=8). Means with different letters are significantly different from each other.
Behavioral responses to peripheral innate immune system stimulation are underlined by
peripheral and brain actions of cytokines that are released in response to LPS (Dantzer, 2001).
The exacerbation of the behavioral responses to LPS treatment observed in obese mice may
therefore be explained by an alteration of peripheral and/or brain induction of cytokines and
their consequences on neuroendocrine and neurochemical activation. As expected, LPS
induced 24 h after treatment a significant increase of plasma levels of IL-6 (F1,11=14.9,
p<0.01) and TNFα (F1,11=4.83, p<0.05) whatever the group (Table 1).
As previously observed in unstimulated conditions, neither plasma cytokine and nor
corticosterone levels were markedly altered by diet-induced obesity. But as shown by the
significant diet by LPS interactions reported below, diet-induced obesity clearly exacerbated
LPS-induced increase in plasma concentrations of IL-6 (F1,11=4.34, p<0.05) and
corticosterone (F1,28=6.46, p<0.05) (Fig 3A) . Moreover, this increased activation of the HPA
axis was confirmed by the exacerbated ACTH plasma release measured 2 h after LPS
injection in obese mice (F1,18=2.98, p<0.05) (Fig 3B).
142
250,00
b
Figure 3A
Effect of diet and LPS (830µg:kg, i.p.) on
corticosterone secretion 24h after
injection. Data are represented as means ±
SEM (n=8). Means with different letters
are significantly different from each other.
Lean-Sal
Lean-LPS
Obese-Sal
Obese-LPS
Corticosterone (ng/ml)
200,00
150,00
100,00
a
a
a
50,00
0,00
1400,00
c
1200,00
Figure 3B
Effect of diet and LPS (830µg:kg, i.p.) on
ACTH secretion 2h after injection. Data
are represented as means ± SEM (n=8).
Means with different letters are
significantly different from each other.
ACTH (pg/ml)
1000,00
Lean-Sal
Lean-LPS
Obese-Sal
Obese-LPS
800,00
b
600,00
400,00
a
200,00
a
0,00
Diet-induced obesity alters cytokine and IDO expression induced by LPS in the
hippocampus.
Considering the potential role of the hippocampus in memory, we decided to investigate
the impact of diet-induced obesity on LPS-induced cytokine expression in this brain area.
Cytokine and IDO mRNA expression was measured 2 h after LPS injection in the
hippocampus of both lean and obese mice. LPS increased 2 h after treatment mRNA
expression of IFNγ in both lean and obese mice (F1,17=18.8, p<0.001), but enriched diet
exacerbated this effect (diet: F1,17=7.7, p<0.05, diet x treatment: F1,17=4, p=0.059) (Fig 4B).
Moreover, obese mice also displayed exacerbation of LPS effect on IDO mRNA expression
(treatment: F1,17=45.4, p<0.001; diet: F1,17=5.5, p<0.05, diet x treatment: F1,17=5.4, p<0.05)
2 h after treatment (Fig 4A). Interestingly, LPS-induced increase of TNFα mRNA expression
(F1,17=105.9, p<0.001), one of the cytokines inducing activation of IDO (Andre et al., 2008b),
was also significantly amplified by diet-induced obesity (diet: F1,17=14.5, p<0.05, diet x
treatment: F1,17=15.1, p=0.05) (Fig 4C). Thus, diet-induced obesity selectively potentiated
the LPS-induced increase of brain TNFα and IDO mRNA expression and IFNγ expression
143
tend to present the same profile. This effect may therefore underlie the obesity-induced overactivation of HPA axis by LPS and the exacerbation of the cognitive symptoms by LPS.
Interestingly, LPS increased 2 h after treatment hippocampus mRNA expression of IL-6
in the same proportion in both lean and obese mice (F1,17=40.5, p<0.001) but we cannot
8
7
6
5
4
3
2
1
0
IDO
35
c
b
a
a
nd
nd
∆ARNm TNFα
A
IFNγ
B
b
a
TNFα
C
c
30
25
b
20
15
10
5
a
a
0
∆ARNm IL-6
140
120
100
80
60
40
20
0
∆ARNm IFNγ
∆ARNm IDO
observed any effect of enriched diet (Fig 4D).
a
a
35
30
25
20
15
10
5
0
IL-6
D
b
b
a
a
Figure 4A
Hippocampic cytokines and IDO mRNA measured 2h after LPS (830µg/kg, i.p.)
or saline injection in lean and obese mice. Bars represent means ± SEM (n=8)
(A) IDO mRNA expression, (B) IFNγ mRNA expression, (C) TNFα mRNA
expression, (D) IL-6 mRNA expression. Means with different letters are
significantly different from each other.
Discussion
Exploring the link between obesity and cognitive symptoms could contribute to better
understand some obesity-related comorbidities and to identify potential underlying
mechanisms. The present findings demonstrate that despite the lack of detectable illness
symptoms in obese mice, diet-induced obesity altered cognitive abilities, as assessed in a
hippocampus-dependant memory maze. Moreover, our results show that this cognitive
alterations appeared early in the development of obesity since overweighed mice already
exhibited impaired performances. Interestingly, the present findings also demonstrate that
144
diet-induced obesity interfered with the ability of the organism to appropriately respond to a
systemic infection. More specifically, obesity provides a brain environment promoting an
exacerbation of the neuroinflammation induced by a peripheral immune challenge, as
manifested by an excessive brain cytokine production and activation of the microglial TRPcatabolizing enzyme IDO that translate in altered neuroendocrine (HPA axis) and behavioral
reactivity. Excessive activation of both IDO and HPA axis has already been related to the
development of cognitive dysfunctions resulting from dysregulated innate immune system
activation (Capuron et al., 2008; Henry et al., 2008). In rodent models of aging or
neurological diseases, a similar exaggerated neuroinflammatory response to innate immune
challenge has been related to an atypical over-reactive or “primed” state of brain microglia
(Perry et al., 2007) and has been shown to accelerate development of important
neurobehavioral complications (Cunningham et al., 2008; Henry et al., 2008). Although the
cellular source of exacerbated neuroinflammation was not directly identified in the present
study, our results strongly suggest that obesity may constitute another situation in which a
“primed” microglia may determine increased vulnerability to the negative consequences of
immune-mediated events.
As genetic alterations only account for a small fraction of obesity in humans(Gibson et
al., 2004a), diet-induced obesity models constitute a more relevant approach for studying the
relationship between obesity and inflammation than genetically obese animals. Moreover,
they allow following up the progression of obesity and its related comorbidities, whereas the
time frame is much more reduced in the case of genetic obesity models. In the present study,
mice fed with enriched diet became obese, as evidenced by the huge body weight gain and
adipose tissue hypertrophy, but they did not display increased plasma cytokine production in
unstimulated conditions, strongly suggesting therefore the lack of detectable low-grade basal
inflammation by the time it was measured. This finding agrees with recently published data
(Amar et al., 2007a; Bedoui et al., 2005), but it contrasts with what is reported in most genetic
obesity models (Ellacott et al., 2007; Hotamisligil et al., 1993; Xu et al., 2003c) or in high fatinduced obesity models (Chen et al., 2005; De Souza et al., 2005; Xu et al., 2003c). However,
in both cases inflammation is associated with marked symptoms of obesity-related
pathological complications, particularly diabetes or cardiovascular diseases that can per se
induce an inflammation. Similarly, low-grade inflammation has been mainly reported in
humans suffering from extremely severe forms of obesity (Cancello and Clement, 2006). Our
experimental conditions provide therefore the opportunity of detecting behavioral alterations
145
preceding the onset of obesity and its related physiological consequences such as
inflammation.
Before the actual development of a clear obesity and in absence of any additional
immune stimulation, exposure to an enriched diet induced cognitive deficits in the Y-maze.
This result suggests the development of molecular changes underlying alterations of the
performances measured in these overweighed mice. The two-trial Y-maze task is a specific
and sensitive test of spatial recognition memory in rodents (Dellu et al., 2000). It is based on
the innate tendency of rodents to explore novel environments (Dellu et al., 2000). This
paradigm does not require the learning of a rule, making it useful for studying memory in
rodents (Dellu et al., 1992). Given that this task is based on exploration of novelty, mice were
first tested for novelty exploration, with a short ITI. After a 2 min ITI, both obese and lean
mice exhibited a normal response to novelty and recognized therefore the novel arm.
Following a 30 min ITI, overweighed and obese mice showed significantly lower novel arm
preference, as assessed by the recognition index. Thus, overweighed and obese mice
presented spatial memory impairment in absence of any visible signs of basal inflammation
compared to lean controls. We have however recently shown that mice exposed to the
enriched diet used in the present experiment exhibit a marked increase in plasma and adipose
tissue levels of leptin (André et al., submitted). Leptin, an adipokine encoded by an obesity
gene and expressed in adipose tissue affects feeding behavior, thermogenesis, and
neuroendocrine status via leptin receptors distributed into the brain, especially in the
hypothalamus, but also the hippocampus (Elmquist et al., 1998). It has been shown that leptin
not only affects hypothalamic functions such as feeding, but also modulates higher nervous
functions, such as behavioural performance related to learning and memory (Oomura et al.,
2006) or emotional reactivity (Lu et al., 2006). Although not directly assessed in the present
experiment, the role played by leptin and/or related adipokines in the cognitive deficits
observed in both overweighed and obese mice deserves to be thoroughly studied. Similarly, it
must be interesting to evaluate brain expression of additional markers of inflammation than
those already measured in the present study including hippocampal expression of IL-1β since
this cytokine has been shown to play a role in complex mechanisms involved in memory
processes such as long term potentiation (Griffin et al., 2006).
As previously shown, diet-induced obesity interfered with the ability of the organism
to appropriately respond to a systemic infection (Amar et al., 2007a); André et al, submitted).
In the present study, enriched diet exposure exacerbated neuroinflammation induced by a
146
systemic immune challenge. Interestingly, the cytokines targeted by the exacerbating effects
of peripheral LPS differ according to the brain structure considered. We have previously
shown that diet-induced obesity selectively potentiates the LPS-induced increase of IL-6 and
IDO mRNA expression in the hypothalamus (André et al, submitted). Although this
exacerbated IDO mRNA expression was also observed in the hippocampus of obese LPStreated mice, the exacerbation of hypothalamic IL-6 mRNA expression was not observed in
the hippocampus. Moreover, if hypothalamic expression of TNFα was not exacerbated by diet
after LPS injection, this expression was exacerbated in the hippocampus of obese LPS-treated
mice compared to their lean counterparts. Finally, LPS-induced increase of IFNγ mRNA
expression, one of the main cytokine involved in IDO activation (Brown et al., 1989; Byrne et
al., 1986), was also significantly amplified by diet in both the hippocampus and
hypothalamus. Such a differential effects of a systemic LPS injection on brain expression of
cytokines and IDO agree with previously published data reporting a time-dependent induction
of IDO expression in both the hippocampus and hypothalamus that was associated with a
specific structure-dependent expression of proinflammatory cytokines, particularly IFN-γ
(Andre et al., 2008b). Taken together, these results suggest that the in vivo mechanisms of
LPS-induced brain IDO mRNA expression could vary in the hippocampus and hypothalamus
especially in terms of the respective importance of the different cytokines. Moreover, the
present findings also suggest that distinct intracellular pathways are probably involved in the
obesity-related induction of specific structure-dependent vulnerability to neuroinflammation.
Furthermore, high concentrations of glucocorticoids have also been reported in vitro to
enhance cytokine-induced IDO activation. In the present study, the exacerbated production of
corticosterone observed in obese-LPS treated mice, linked to the exacerbation of IFNγ and
TNFα expression may participate in the over-activation of IDO.
Although the physiological significance of such structure-dependent differences in the
mechanisms of IDO activation by LPS and modulation of this activation by obesity still needs
to be elucidated, they are consistent with recent data showing that the hypothalamus and
hippocampus also show after LPS a time-dependent differential pattern of cellular activation,
as assessed by the neuroanatomical analysis of c-fos and FosB/∆fosB immunostaining
(Frenois et al., 2007). Interestingly, such a functional dissociation was related to LPS-induced
sickness and depressive-like behaviors (Frenois et al., 2007). Similarly, the possible role of
the present spatial differences of vulnerability to LPS-induced neuroinflammation in the
distinction between sickness behavior and cognitive deficits observed in obese subjects
147
remain to be determined. Interestingly, cognitive dysfunctions reported in cancer patients
treated with cytokines parallel depressive symptoms, but appear to be independent from
sickness symptoms (Capuron and Dantzer, 2003). Moreover, mood and cognitive disorders
are also associated in obese patients with metabolic syndrome (Capuron et al., 2008).
By reducing local bioavailability of tryptophan, stimulation of IDO activity can impact
on the synthesis of serotonin that has been shown to play a key role in memory processes
(Buhot et al., 1999). The kynurenine pathway also results in the generation of three
neuroactive compounds: 3-hydroxykynurenine (3-HK) and quinolinic acid (QA) are generated
in route to NAD production, while kynurenic acid (KA) is formed in a ‘dead end’ branch of
the pathway. 3-HK and QA generate free radicals, and QA also acts as an NMDA receptor
agonist. Therefore, both these kynurenine metabolites are excitotoxic (Schwarcz, 2004).
Intracerebroventricular administration of a high dose QA or L-kynurenine sulfate induced
excitotoxic lesions or seizures (Nemeth et al., 2005). QA induces lipid peroxidation,
superoxide anion generation and decreases cell viability in primary hippocampal neurons
leading to development of spatial memory deficit (Dairam et al., 2007). Moreover, the
elevated concentrations of QA reported in HIV patients have been related with the AIDS
dementia complex (Guillemin et al., 2005a). Through its potential impact on glutamatergic
brain systems, cytokine-induced microglial IDO activation may therefore participate in
linking inflammation with cognitive disorders. Indeed, LPS alters cognitive performances in
healthy normal-weighted mice (Noble et al., 2007) and accelerates cognitive decline in rodent
models of neurodegenerative diseases (Cunningham et al., 2008). Moreover, this acceleration
is associated with exaggerated microglial activation in the hippocampus (Cunningham et al.,
2008). Taken together, these data suggest that the increased production of QA in the
hippocampus, resulting from the exacerbated LPS-induced IDO activation in obese mice, may
underlie the concomitant cognitive deficits observed in the Y-maze. More studies are however
necessary to test this hypothesis and to identify the mechanisms underlying the impairment of
the cognitive performances also observed in overweighed mice or in obese mice
independently of any additional LPS challenge. Interestingly, it has been recently reported
that hippocampal microglial activation and TNFα production mediate altered central nervous
system excitability following peripheral inflammation (Riazi et al., 2008). This microgliadependent TNFα-mediated increase in brain excitability has been proposed as a potential
mechanism to underlie the neurobehavioral changes associated with chronic inflammation.
148
More studies are necessary to check whether a similar mechanism may play a role in the
context of obesity-related cognitive impairment.
In summary, the present study indicates that excessive weight gain altered brain
sensitivity to external stimulations leading to the early development of cognitive deficits,
since impairment of spatial memory appeared in overweighed mice and was maintained when
mice became obese. This study also demonstrates that systemic infection induced cognitive
disorders in lean mice and exacerbated alterations of the performances exhibited by obese
mice, although a more detailed study of their cognitive abilities assessed in different
complementary tests of cognition is obviously needed. Moreover, we confirm that dietinduced obesity interfered with the ability of the innate immune system to appropriately
respond to systemic infection, as shown by amplified TNFα, IFNγ and IDO expression in the
hippocampus, as well as HPA axis activation. This study provides therefore interesting clues
about the neurobiological basis through which cytokines may have an impact on cognitive
behaviors in the context of obesity. This information may help to identify new therapeutic and
nutritional strategies to better understand and prevent behavioral disorders linked to obesity.
Acknowledgments
This study was fundes by INRA, CNRS, Région Aquitaine. ALD was supported by a doctoral
fellowship from the Institut Danone. We thank Dr. F. Dellu for her advices around the Y maze.
149
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153
154
Chapitre 3
155
156
Chapitre 3
ANXIETY-LIKE DISORDERS ARE ASSOCIATED WITH
DIET-INDUCED OBESITY IN MICE
Anne Laure Dinel, Caroline André, Sophie Layé and Nathalie Castanon
En préparation
157
158
AnxietyAnxiety-like disorders are associated with diet
dietiet-induced obesity in mice
Objectifs :
Après avoir identifié la mise en place de troubles cognitifs et de modification de la
réponse émotionnelle chez les souris ayant consommé un régime enrichi, le but de cette étude
était de s’interesser aux symptômes de type anxieux souvent associés à l’obésité.
Matériel et méthodes :
Des souris mâles C57bl/6J de 3 semaines ont été soumises soit au régime standard
pour rongeur soit à un régime enrichi (lipides: 24%, glucides: 34%, protéines: 12%) pendant
19 semaines. Au bout de 9 semaines de régime, les animaux consommant le régime
hypercalorique sont en surpoids et sont alors soumis à un test évaluant les troubles de type
anxieux : le labyrinthe en croix surélevé.
Au terme de la période de 19 semaines, les animaux sont de nouveau placés dans le labyrinthe
en croix surélevé. Les animauux ont été sacrifiés 1h après le test et le plasma, les poumons, le
tissu adipeux et le cerveau ont été prélevés. Les concentrations en IL-6, IFNγ, TNFα et
ACTH ont été mesurées dans le plasma et le tissu adipeux en multiplex selon la technologie
Luminex. La concentration de corticostérone plasmatique est évaluée avec un kit RIA.
L’activité enzymatique de l’IDO pulmonaire a été évaluée par dosage du rapport KYN/Trp
par HPLC. Enfin, l’expression cérébrale des ARNm de l’IL-6, du TNFα, de l’IFNγ, et de
l’IDO a été mesurée par PCR en temps réel.
Résultats :
Les souris en surpoids ne présentent pas de symptômes de type anxieux. Ces
symptômes ne peuvent être mis en évidence que lorsque les souris sont réellement obèses
(masse corporelle de 20% supérieure à celle du groupe contrôle). En condition basale, les taux
circulants ainsi que l’expression cérébrale d’IL-6, de TNFα, d’IFNγ et de MCP-1, ainsi que la
libération de corticostérone ne sont pas affectés chez les souris obèses.
159
Conclusion :
La prise de poids entraîne la mise en place de troubles de type anxieux, mais ces
troubles
n’apparaissent
que
lorsque
l’obésité
est
caractérisée.
Les
mécanismes
neurobiologiques sous-tendant ces troubles restent à préciser.
160
Anxiety-like disorders are associated with diet-induced obesity in mice
Anne-Laure Dinel, Caroline André, Sophie Layé and Nathalie Castanon*
INRA, UMR 1286 PsyNuGen, Université Victor Segalen Bordeaux 2, CNRS, UMR 5226, IFR8, F33076 Bordeaux, France
*Adress all correspondence to:
Nathalie Castanon, Ph.D
INRA, UMR 1286, Laboratory of Psychoneuroimmunology, Nutrition and genetics,
Bâtiment UFR Pharmacie, Case courrier 34,
Université Victor Ségalen Bordeaux 2,
146 rue Léo Saignat, 33076 Bordeaux, France
e-mail : [email protected]
Phone: 33 557 574 505
Fax : 33 557 571 227
Abstract
Introduction: Obesity, one of the major public health problems in the world, is often
associated with anxiety symptoms. Interestingly, both pathologies may present a strong
relationship supported by shared biological systems such as an inflammatory status, an
alteration of HPA axis activity and of tryptophan metabolism. The aim of the present study
was therefore to determine in a murine model of diet induced obesity (DIO) first whether
anxiety-like symptoms are induced in these conditions and second whether these symptoms
are accompanied by inflammation.
Methods: C57Bl/6 mice were fed with enriched diet or with equilibrated diet. Anxiety-like
symptoms of diet-induced obesity mice and their lean counterparts was evaluated using a
classical anxiety test, the elevated plus maze.
Results: Obese mice spent less time in the open arm of the elevated plus maze than lean mice,
reflecting development of anxiety-like symptoms. Obese mice did not present difference of
locomotor activity compared to the lean animals. Neither cytokine nor HPA axis were
exacerbated in obese animals compared to lean ones.
161
Conclusion: Obesity in mice is associated with anxiety disorders. These findings provide
therefore important clues to progress in a better understanding of the neurobiological basis
linking inflammation and neurobehavioral alterations associated with obesity.
Introduction
Obesity and anxiety present an increase of their respective prevalence in our population, and
are often associated with other major health problems (Becker et al., 2001). Both pathologies
have been independently studied for decades however a strong relationship may exist between
them. Some psychological arguments have been proposed, but recent evidence also suggests
that this relationship may rely on biological systems shown to be impaired in both
pathologies, such as an increased proinflammatory cytokine production and altered HPA axis
activity and tryptophan metabolism. Obesity is characterized by a morphological and
functional alteration of secreting function of adipose tissue which synthesize and secrete
numerous adipokines such as leptin and resistin that play a crucial role in the control of
energy homeostasis (Friedman and Halaas, 1998). Moreover it can also release inflammatory
molecules such as chemokines, acute phase proteins and cytokines, particularly tumour
necrosis factor-α (TNFα), interleukin-6 (IL-6) and interferon-γ (IFNγ) (Cancello and Clement,
2006; Mora and Pessin, 2002). It has also been suggested that at least some of these mediators
of inflammation could also be found in the brain, especially in the hypothalamus which is
implicated in the coordination of food intake and energy expenditure and also in emotion and
stress responses (De Souza et al., 2005). This exacerbated production of inflammatory
molecules could be a link between obesity and mood disorders. Indeed chronic injection of
IL-2 or IFNα to cancer patients undergoing immunotherapy is positively correlated with
intensity of anxiety symptoms (Capuron et al., 2003). Moreover, mood disorders associated
with inflammation, particularly depressive symptoms have shown to be at least partly
mediated by cytokine-induced activation of the indoleamine 2,3-dioxygenase (IDO), a
tryptophan catabolizing enzyme acting both at the periphery and within the brain (Dantzer et
al., 2008).
Impaired hypothalamic-pituitary-adrenal (HPA) axis response to stress or cytokine
administration has also been shown to condition increased vulnerability to inflammationinduced mood disorders (Capuron et al., 2003). A defected negative feedback of HPA axis has
been observed in both obesity and anxiety disorders (Jessop et al., 2001). Moreover, the
162
increased glucocorticoid concentrations reported in obese subject could contribute to alter
tryptophan metabolism (Maes et al., 1990).
Although convergent evidence strengthens the hypothesis of a role of inflammation and
related activation of specific brain systems in the high prevalence of anxiety symptoms
reported in obese population (Wadden et al., 2006), little is known about the potential
underlying mechanisms. The aim of the present study was therefore to determine in a murine
model of diet induced obesity first whether anxiety-like symptoms are induced in these
conditions and second whether these symptoms are accompanied by inflammation.
Methods
Male C57BL/6 mice were purchased from Charles River Laboratories and were
maintained under a 12h light/dark cycle (9:00 on) at 23°C with ad libitum consumption of
water and food. All animal care and experimental procedures were in accordance with the
European Communities Council Directive (86/609/EEC) and with the National Institute of
Health (NIH) guidelines and were approved by the Institutional Animal Care and Use
Committees. At their arrival, 3-wk old mice were randomly divided into two groups, one with
free access to standard rodent chow A04 (Fat, 3,1 %; Carbohydrate, 60 %; Protein, 16,1 %;
3,3 Kcal/g) and the other one to an enriched diet (Fat, 32 %; Carbohydrate, 17,5 %; Protein,
11,3 %; 4,4 Kcal/g) freshly prepared in the laboratory as previously described (Berraondo et
al., 1997). Body weight and food intake were measured once a week over the 19-wk period of
the experiment.
Animals were tested in an elevated plus-maze (EPM) at 9 weeks (overweighed period)
and at the end of the 19-wk period, once obesity was clearly established. All behavioural
experiments were performed between 9:00 am and 11:00, under conditions of dim light and
low noise. Behaviour was monitored via a video camera and videotaped to be scored later by
a trained observer, using the “Observer Basic” software (Noldus, Netherlands). The EPM test
is a well-accepted test of anxiety-like behaviour based on a conflicting situation between the
drive to explore a novel environment and the natural aversion for elevated, open spaces
(Belzung and Griebel, 2001). The apparatus was a plus shaped acryl maze with two opposite
open arms (30 cm in length and 8 cm in width) and two opposite closed arms (30 cm in
length, 8 cm width, and 15 cm in height), extending out from a central platform (8
cm × 8 cm). The whole apparatus was elevated 120 cm above the floor. Each mouse was
163
individually placed in the center of the maze, facing an open-arm, and the number of arm
entries, as well as the cumulative time spent in open vs. enclosed arms, was assessed during a
5-min period. An entry was scored as such only when the mouse placed all four limbs into
any given arm. The ratio between open and total arm exploration, as well as the time spent in
the open arms and closed arms, is considered as an “anxiety-like” index, independent of
locomotor activity (Pellow et al., 1985).
Lean and obese mice was killed by CO2 inhalation. Immediately after, mice were
intracardiacally perfused with PBS 1X at 4°C via the ascending aorta to remove all traces of
blood from tissues. Blood samples were collected via cardiac puncture into EDTA-coated
tubes. After centrifugation (10 min, 3000 g, 4°C), plasma was stored at -80°C until assay for
concentrations of corticosterone, cytokines and adipokines. Brains and lungs were
immediately collected and stored at -80°C for later determination of IDO activity and/or
cytokines mRNA levels.
IL-6, TNFα, and IFNγ were measured in plasma with the mouse serum cytokine
LINCOplex kits (Linco research, Inc., St. Charles, MO, USA) following the manufacturer’s
instructions as previously described (Moreau et al., 2008a). Corticosterone concentrations
were measured from plasma using an ImmuChem Double Antibody Corticosterone RIA Kit
from Diasorin (Antony, France)(Apter and Eriksson, 2006).
Total RNA from hippocampus samples was extracted with Trizol. Reverse transcription
was performed using oligo dT primers added 2 µg of hypothalamus RNA. The oligo dT
primer/RNA mix was then inactivated at 65°C for 5 min and chilled on ice. Reverse
transcription was performed at 55°C for 45 min. The reaction was terminated by heat (70°C
for 15 min). To minimize inter-assay variation all RNA samples from a single experimental
group were reverse transcribed simultaneously.
Resultant first-strand cDNA was amplified by the Taqman Universal PCR Master Mix
with sequence-specific primers and the FAM-labeled Taqman MBG probe assay mix
(Applied Biosystems) as previously described (André et al., 2008). The assay IDs for the
target genes in the assay mix were: IL-6 (Mm00446190_m1), , TNFα (Mm00443258_m1),
IFNgamma (Mm 00801778_m1), IDO (Mm00492586_m1), and for the house keeping gene
β2 microglobulin (Mm00437762_m1) as previously used (O'Connor et al., 2008). Real time
PCR was performed on the ABI Prism 7700 under the following conditions: 50°C for 2 min,
95°C for 10 min, followed by 40-cycles amplification phase of 95°C for 15 sec and 60°C for
164
1 min. Results were normalized with the β2 microglobulin endogenous control and the
relative quantitative evaluation of the amplification products was performed using the
comparative threshold cycle method, as described elsewhere (Applied Biosystems user
bulletin n°2).
Measurements of KYN and TRP were determined as described previously (Moreau et
al., 2005). The KYN/TRP ratio was used to assess lung IDO activity. Briefly, lungs and brain
were homogenized using ice cold potassium 0.14 M KCl, 20 mM phosphate buffer pH 7.0
with an UltraTurrax T25 homogenizer at 1000 rpm. Homogenates were then centrifuged at
14,000 g for 30 min at 4°C. 200 µl of supernatants were precipitated in trichloroacetic acid
(2mM) and then centrifugated 15 min at 1300 g, 4°C. After a second centrifugation at 13,000
g, 5 min at 4°C, supernatants were injected onto a 5-µm C18 HPLC column (Lichrospher,
Alltech, Deerfield, IL, USA) at a flow rate of 1.0 ml/min with mobile phase containing 0.1M
ammonium acetate/acetic acid buffer and 5% acetonitrile (pH 4.65). Levels of KYN were
evaluated by UV absorbency at 360 nm. Levels of TRP were detected by fluorescent detector
at 285 nm excitation and 365 nm emission wavelengths.
All results are presented as mean ± SEM. Statistical comparison were analysed using a
one-way (lean vs. obese) ANOVA followed by a post-hoc pair wise multiple comparison
procedure using the Fischer’s LSD method, if the interaction was significant.
Results
As expected (Andre et al., submitted), enriched diet induced a significant increase in
body weight over the 19-wk period (diet: F1,1198=2606, p<0.001, time: F1,1998=889.38,
p<0.001, diet x time: F1,1998=65.34, p<0.001). Overweighed appeared in animals fed with
enriched diet after 9 wk (p<0.05) (Fig 1A). Obesity was clearly installed after 15 wk, their
weight being 20 % above the controls by that time. These results show that consumption of a
highly caloric food, even though daily food intake did not significantly differ between both
groups (data not shown), clearly induced the development of a marked although moderate
obesity.
Anxiety symptoms have been associated with obesity in several human studies
(Becker et al., 2001; Wadden et al., 2006), but only few data exist in animal models. To study
the influence of enriched diet on anxiety-like behavioural changes and the time-course of the
emergence of these symptoms, mice were tested in an EPM at two period of their
165
development, a first time during the overweighed phase (9 weeks of enriched or standard
diet), and the second time when obesity was acquired (19 weeks). In this task which is a wellestablished anxiety test based on the exposure of subjects to unfamiliar aversive places
(Belzung and Griebel, 2001), overweighed mice did not present any anxiety-like symptoms,
as revealed by the similar duration of exploration of the open-arms observed in both lean and
overweighed mice (data not shown). On the contrary, obese mice spent less time exploring the
open arms than lean mice (F1,41=5.02, p<0.05) (Figure 1A). This difference of arm
exploration cannot be attributed to locomotor activity differences since both obese and lean
mice explore in the same proportion the closed and non-anxiogenic arms (F1,41=3.71, NS)
(Figure 1B). Obese but not overweighed mice clearly show therefore anxiety-like behavioral
30
A
Lean
Obese
a
Anxiety index
25
20
15
10
5
b
Time spend in closed arms (min)
changes in the EPM.
250
B
200
Lean
Obese
150
100
50
0
0
Figure 1:
(A) Effect of diet on index of anxiety (time spend in open arms compared to time spend to
explore) (B) Time of exploration in closed arms. Data are represented as means ± SEM (n=8).
Means with different letters are significantly different from each other.
Severe obesity has been associated with a low grade inflammatory status and a
hyperactivation of HPA axis (Dinel et al, in preparation). In our diet-induced obesity model,
mice were fed with an enriched diet aiming at inducing a moderate but not morbid obesity. In
this context, mice did not present increased plasma levels of proinflammatory cytokines (data
not shown). Moreover, mRNA hypothalamic and hippocampic expression of cytokines (IL-6,
TNFα and IFNγ) and IDO were not altered. Similarly, lung and brain IDO activity was not
affected by diet. Finally, corticosterone secretion was not exacerbated in obese mice.
As shown in our previous study, mice fed with our enriched diet presented an increased
plasma level of leptin in both adipose tissue (F1-20 = 14.4, P < 0.001) and plasma (F1-15 = 40.3,
166
P < 0.001). It has been shown in rats that injection of leptin in the hippocampus induces a
decrease of mood disorders (Lu et al., 2006). Leptinoresistance observed in obesity could
explain the emergence of anxiety-like disorders, and the time course of this progressive
development. The potential positive benefit of leptin on mood reported in lean rats could be
blocked by leptinoresistance in obesity.
Conclusion
The results demonstrate that obesity in mice was associated with anxiety-like behavioral
changes and that these symptoms appeared only when obesity was acquired. Moreover, the
inflammatory and neuroendocrine markers that we studied did not seem to be involved in the
development of these mood disorders, but it should be interesting to investigate the role of
this cytokines in others structures, like the amygdala and to study others cytokines, like IL-1β
(Griffin et al., 2006; Lau et al., 2008). Interestingly, we have shown that the experimental
paradigm we used to induce obesity in the present study leads to the development of silent
neurobiochemical changes underlying increased vulnerability to neuroinflammation induced
by a systemic inflammatory challenge and its related behavioral consequences. These
neurobiological changes that probably affect microglial activation as suggested in other
situations such as aging or neurodegenerative diseases (Cunningham et al., 2008; Henry et al.,
2008) still need to be elucidated. However, the present study showing the existence of
anxiety-like disorders in unstimulated conditions in obese mice strongly supports this
hypothesis and may help to identify the mechanisms linking obesity with inflammationrelated
neurobehavioral
alterations.
Furthermore,
data
assessing
only
circulating
corticosterone are not sufficient to definitively discard the potential impact of HPA axis
activity on mood disorders associated with obesity. Based on previously published data (Hay
et al., 2000), it should be particularly interesting to also investigate brain mRNA CRH
(corticotropin releasing hormone) expression. In conclusion, the present preliminary report
demonstrates that diet-induced obesity was associated with development of anxiety-like
symptoms, as shown for cognitive dysfunction (Dinel et al, in preparation) and altered
emotional reactivity (André et al., submitted), but that the respective temporal patterns of
emergence differ between mood and cognitive symptoms. These findings provide therefore
important clues to progress in a better understanding of the neurobiological basis linking
inflammation and neurobehavioral alterations associated with obesity.
167
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168
C hapitre 4
169
170
C hapitre 4
OBESITY-INDUCED INFLAMMATION IS ASSOCIATED
WITH MOOD AND COGNITIVE DISORDERS IN DB/DB
MICE
Anne-Laure Dinel, Caroline André, Sophie Layé and Nathalie Castanon
Soumis à Brain, Behaviour and Immunity
171
172
ObesityObesity-induced inflammation is associated with mood and cognitive
disorders in db/db mice
Objectifs :
Après avoir étudié le statut inflammatoire et les troubles du comportement dans une
situation d’obsité modérée, le but de cette étude était d’évaluer les conséquences d’une
obésité morbide sur ces mêmes paramètres.
Matériel et méthodes :
Des souris mâles C57BL/6J-leprdb/ leprdb de 8 semaines ont été soumises à differents
tests comportementaux afin d’évaluer les symptômes de type anxieux (labyrinthe en croix
surélevé et open-field) et les troubles cognitifs (labyrinthe en Y). Les animaux ont été
sacrifiés à l’issue de ces différents tests et le plasma, les poumons, le tissu adipeux et le
cerveau ont été prélevés. Les concentrations en IL-6, IFNγ, TNFα et ACTH ont été mesurées
dans le plasma et le tissu adipeux en multiplex selon la technologie Luminex. La
concentration de corticostérone plasmatique est évaluée avec un kit RIA. L’activité
enzymatique de l’IDO pulmonaire a été évaluée par dosage du rapport KYN/Trp par HPLC.
Enfin, l’expression cérébrale des ARNm de l’IL-6, du TNFα, de l’IFNγ, et de l’IDO a été
mesurée par PCR en temps réel.
Résultats :
Les souris db/db présentent des troubles de type anxieux ainsi qu’une altération de leur
capacité cognitive. De plus, les taux circulants d’IL-6, de TNFα, d’IFNγ ainsi que ceux de
leptine sont exacerbés en condition basale. De la même facon, la production de corticostérone
est exacerbée. Enfin l’expression cérébrale d’IL-6, de TNFα et d’IL-1β est augmentée chez
les souris obèses.
Conclusion :
L’obésité morbide entraîne la mise en place d’une situation inflammatoire à bas bruit
périphérique et centrale qui s’accompagne de troubles de l’humeur et de la cognition.
173
Obesity-induced inflammation is associated with mood and cognitive
disorders in db/db mice
Anne-Laure Dinel, Caroline André, Agnès Aubert, Sophie Layé and Nathalie Castanon*
INRA, UMR 1286 PsyNuGen, Université Victor Segalen Bordeaux 2, CNRS, UMR 5226, IFR8, F33076 Bordeaux, France
*Adress all correspondence to:
Nathalie Castanon, Ph.D
INRA, UMR 1286, Laboratory of Psychoneuroimmunology, Nutrition and genetics,
Bâtiment UFR Pharmacie, Case courrier 34,
Université Victor Ségalen Bordeaux 2,
146 rue Léo Saignat, 33076 Bordeaux, France
e-mail : [email protected]
Phone: 33 557 574 505
Fax : 33 557 571 227
174
Abstract
Obesity, which became a major public health problem, could be considered as a
chronic inflammatory disease. In some cases, obesity becomes morbid and is associated with
multiple co-morbidities such as astherosclerosis, cardiovascular and metabolic disease.
Moreover, obesity is often associated with neuropsychological disorders like anxiety,
depression and cognitive dysfunctions. Different biological parameters, like alteration of HPA
axis activity and of tryptophan metabolism, could be a link between these neuropsychological
disorders and obesity. The aim of this study was to determine in a model of morbid obesity
whether these both neurobiological systems are implicated in the pathophysiology of mood
and cognitive disorders associated with obesity and whether basal peripheral and low grade
inflammation altered behavioral and neurochemical responses of the innate immune system to
a peripheral stimulation.
To test this hypothesis, behavioral and cognitive disorders of db/db mice and their agematched nondiabetic db/+ littermates were evaluated in different tests in both basal
conditions. Their inflammatory status and their emotional reactivity were assessed after a
peripheral stimulation with a classical cytokine inducer, the lipopolysaccharide or LPS.
Our results showed that
db/db mice presented cognitive deficit and anxiety-like
behavior, but no depressive-like behaviour associated with peripheral and brain inflammation.
Moreover obese db/db mice presented altered behavioral and physiological reactivity to
systemic LPS injection. These findings provide new evidence of the relationship between
inflammation associated with morbid obesity and neurobehavioral alterations observed in this
pathology.
Keywords:
db/db mice, morbid obesity, interleukin-6, inflammation, indoleamine 2,3-
dioxygenase, Y maze, forced swim test, tail suspension test, open field, elevated plus maze.
Introduction
Over the past decade, obesity has reached epidemic proportion throughout the world
(Kim and Popkin, 2006). In the most severe forms, numerous conditions complicate obesity,
such as atherosclerosis, cardiovascular diseases and metabolic dysregulations leading to
development of insulin resistance and type 2 diabetes (Braddon et al., 1986; Toni et al., 2004).
These comorbidities constitute a leading cause of disability and increased mortality observed
175
in morbidly obese individuals (Ogden et al., 2007). In addition to the specific symptoms that
are characteristic of each of these diseases, most patients also experience non-specific
symptoms that include a high prevalence of mood disorders and altered cognition (Cournot et
al., 2006; Ryden et al., 2004; Wadden et al., 2006). These non-specific symptoms may
constitute an aggravating risk factor for the development of obesity-associated severe
comorbidities that significantly increases the cost and complexity of patient care (Fiedorowicz
et al., 2008; Scott et al., 2008). However, only a few studies have addressed the
pathophysiological mechanisms contributing to the development of mood and cognitive
disorders in the context of morbid obesity (Elias et al., 2005; Skilton et al., 2007).
There are reasons to believe that both metabolic dysregulations and inflammatory
processes chronically induced in morbid obesity could participate in mood and cognitive
alterations seen in this disease process (Bornstein et al., 2006; Capuron et al., 2008; Cave et
al., 2008; Emery et al., 2007; Greenwood and Winocur, 2005). Severe obesity is characterized
by morphological and functional alterations of secreting function of adipose tissue which
synthesize and secrete numerous adipokines such as leptin and resistin (Friedman and Halaas,
1998). Concurrently, the insulin resistance that accompanies obesity-related diabetes often
favours the development of a marked hyperinsulinemia (Hotamisligil et al., 1996). Moreover,
mounting evidence indicates that severe obesity and insulin resistance are associated with a
state of peripheral chronic low-grade inflammation characterized by increased plasma
production of cytokines mainly originating from adipose tissue (Cancello and Clement, 2006;
Mora and Pessin, 2002) and with immune dysfunction (Mito et al., 2000; Pacifico et al.,
2006). In addition, few studies have suggested that signs of neuroinflammation may also exist
in rodent models of obesity (De Souza et al., 2005). It is now well-established that these
metabolic
and
inflammatory
mediators
can
influence
brain
functions
including
neurotransmitter metabolism, neuropeptide function, regional brain activity, and, ultimately,
behavior (Calabro and Yeh, 2007; Greenwood and Winocur, 2005). Beyond a point,
exacerbated and/or protracted production of these mediators might therefore culminate in the
development of pathological disorders including mood and cognitive disorders (Dantzer et al.,
2008).
The mechanisms underlying such a development in the context of a marked
inflammation have been particularly well studied in longitudinal clinical studies performed on
patients undergoing cytokine immunotherapy for the treatment of viral diseases or certain
cancers (Capuron et al., 2001; Raison et al., 2005). Whereas sickness symptoms invariably
176
appear in all patients immediately after the first administration of recombinant cytokines, as
many as of 40 % of these patients ultimately develop clinically relevant neuropsychiatric
symptoms (Capuron et al., 2001). Using dimensional analyses, distinct phenomenology and
treatment responsiveness of specific clusters of these symptoms including depressive, anxious
and cognitive symptoms have been demonstrated in these patients based on their
inflammatory status (Capuron et al., 2002). In light of these findings and other
complementary data, different molecules have emerged as potential mediators of the various
behavioral manifestations of increased inflammation, including cytokines themselves and
some of their brain targets (Barrientos et al., 2002; Ben-Menachem et al., 2008; Reichenberg
et al., 2001). In this context, mounting clinical and experimental studies point to the
tryptophan-catabolizing enzyme indoleamine 2,3-dioxygenase (IDO) as a key player in the
development of inflammation-associated depressive symptoms (Capuron et al., 2003). This
enzyme is activated in monocytes, macrophages and brain microglia in conditions of immune
activation and metabolizes tryptophan (TRP) along the kynurenine (KYN) pathway (Fujigaki
et al., 2006; Takikawa et al., 1999). By reducing TRP availability, IDO activation may impact
brain serotoninergic neurotransmission, as TRP is the limiting factor for the synthesis of
serotonin that plays a crucial role in the regulation of mood and cognition (Mattson et al.,
2004). Concurrently, IDO activation results in an increased production of several neuroactive
glutamatergic metabolites (Guillemin et al., 2005) that have been implicated in major
depression (Muller and Schwarz, 2007; Wichers et al., 2005) or Alzheimer’s disease
(Guillemin et al., 2005).
In the context of obesity and/or metabolic syndrome, most studies have focus on the
role played by metabolic (e.g. leptin, insulin) rather than inflammatory mediators in the
development of mood and cognitive symptoms (Gomez-Pinilla et al., 2008; Lu, 2007;
McNay, 2007). However, there are but few reports concerned with the potential consequences
of inflammation, either alone or in interaction with metabolic dysregulations, on the onset of
these non-specific comorbidities. Recent clinical studies report a possible link between these
comorbidities and cytokines or IDO activation in obese individuals (Brandacher et al., 2007;
Capuron et al., 2008), but these emerging findings still need to be completed and extended.
An experimental approach carried out in appropriate animal models of obesity might be very
helpful to provide an in-depth knowledge about this topic.
In the present study, we aimed to determine whether genetically-induced morbid obesity in
mice is associated with depressive-like, anxiety-like and/or cognitive disorders and, if so,
177
whether these associations are underlined by specific neurobiological changes. In order to test
this hypothesis, we used the db/db mice that are homozygous for an inactivating mutation in
the leptin receptor leading to hyperphagia, obesity, insulin resistance, and hyperglycemia
(Chen et al., 1996). These mice have been already used to study the impact of the metabolic
alterations related to diabetes on the molecular mechanisms of innate immune system
activation, in particular in response to a systemic immune challenge (O'Connor et al., 2007;
Sherry et al., 2007) . In terms of behavior, few symptoms classically characterizing infectioninduced sickness behavior such as social exploration have also been studied (O'Connor et al.,
2005), but little is known about depressive-like behaviors, anxiety-like behaviors or cognitive
performances of db/db mice. We first characterized therefore the potential behavioral
dysfunctions associated with morbid obesity in db/db mice. Next, we assessed whether
distinct pattern of metabolic and inflammatory responses in mice made ill by the innate
immune system activator lipopolysaccharide (LPS) may participate in the relationship
between these specific behavioral alterations and morbid obesity. We hypothesized that
emotional reactivity and cognitive performances should be altered in db/db mice and that
these behavioral changes should be temporarily associated to alterations of their inflammatory
status. Using adapted and well-accepted rodent behavioral tests, we present exciting new data
that are consistent with this hypothesis.
Material and methods
Animals and treatments:
All animals care and experimental procedure were in accordance with the European
Communities Council Directive of 24 November 1986 (86/609/EEC) and were approved by
the Institutional Animal Care and Use Committees. Ten- to 14-wk-old male obese db/db
(C57BL/6J-leprdb/leprdb) mice and their age-matched nondiabetic db/+ (C57BL/6J-leprdb/+)
littermates were purchased from Charles River laboratory. They were housed in standard
individual cages with a 12h/12h light-dark cycle (9:00 a.m. to 9:00 p.m.) and free access to
food and water. Body weight was measured weekly and mice were handled daily for at least
one week before the onset of the experiment to minimize stress reactions to manipulation.
LPS was phenol-extracted from Escherichia coli (serotype 0127:B8; RBI/Sigma). On
the test day, it was dissolved in sterile endotoxin-free isotonic saline and administered
intraperitoneally (i.p.). The dose of LPS (5 µg/mouse) was selected on the basis of its ability
to induce the full spectrum of sickness in db/db mice (O'Connor et al., 2005).
178
Experimental procedure:
All behavioral experiments were performed under conditions of dim light and low
noise. Behavior was monitored via a video camera and videotaped to be scored later by a
trained observer blind to drug treatments, using “The Observer Basic” software (Noldus,
Netherlands). In order to avoid possible interferences between the different behavioral tests,
they were performed with an inter-test interval of at least 5 days.
Experiment 1: This experiment was designed to determine a detailed profile of
behavioral reactivity of db/db mice compared to their db/+ littermates as assessed in: 1) a
cognitive test (the Y-maze test), 2) two anxiety-like behavioral tests (the elevated plus-maze
and the open-field) and 3) two tests of depressive-like behavior (the tail suspension test and
the forced swim test). After completion of the whole behavioral tests, mice were killed by
CO2 inhalation and blood samples were immediately collected via cardiac puncture into
EDTA (10%)-coated chilled tubes. After centrifugation (10 min, 3000 g, 4°C), aliquots of
plasma were stored at -80°C until assayed for determination of cytokine and hormone levels.
Mice were perfused with PBS at 4°C via the ascending aorta to remove all traces of blood
from tissues. Brains were also rapidly extracted from the skulls and carefully dissected on
glass plate over ice by a trained person to immediately collect the hippocampus, as previously
described (Dunn, 1988a, b; Glowinski et al., 1966; Glowinski and Iversen, 1966a; Glowinski
and Iversen, 1966b) and routinely performed in our laboratory (Castanon et al., 2004; Laye et
al., 1994). After collection, the hippocampus were immediately dry frozen and stored at -80°C
for subsequent determination of cytokines and IDO mRNA levels.
Test of novelty recognition:
The Y-maze was used to assess novelty recognition as previously described (Palin et al.,
2004). This task has been shown to require cognitive processes involving the hippocampus
(Conrad et al., 1996). The apparatus was a Y-shaped maze made of gray acryl plastic. Each
arm was 34 cm long, 8 cm wide and 14 cm high. The floor was covered with corn cob litter
which was mixed between each trial in order to remove olfactory cues. Visual cues were
placed in the testing room and kept constant during the whole test. In the first trial of the test,
one arm of the Y-maze was closed with a guillotine door and mice were allowed to freely visit
two arms of the Y-maze for 5 min. The position of the closed arm was chosen randomly. At
the end of this first trial, mice returned to their home cages. After a 2-min inter-trial interval
(ITI), mice were placed back in the start arm for the retrieval phase and allowed free access to
179
the three arms for 5 min. The duration of visits to each arm was recorded for each trial. Arm
entries were defined as entry of all four paws into the arm. The index of recognition was
calculated as the ratio of the time spent in the novel arm / (novel + adjacent) arms during the
retrieval phase.
Tests of anxiety-like behavior:
The elevated plus-maze (EPM) test is a well-accepted tests of anxiety-like behavior
based on a conflicting situation between the drive to explore a novel environment and the
natural aversion for elevated, open spaces (Belzung and Griebel, 2001). The apparatus was a
plus shaped acryl maze with two opposite open arms (30 cm in length and 8 cm in width) and
two opposite closed arms (30 cm in length, 8 cm width, and 15 cm in height), extending out
from a central platform (8 cm × 8 cm). The whole apparatus was elevated 120 cm above the
floor. Each mouse was individually placed in the center of the maze, facing an open-arm, and
the number of arm entries, as well as the cumulative time spent in open vs. enclosed arms,
was assessed during a 5-min period. An entry was scored as such only when the mouse placed
all four limbs into any given arm. The time spent in the open arms is considered as an
“anxiety-like” index, independent of locomotor activity (Pellow et al., 1985).
The open-field (OF) was used here as a rodent model of anxiety-like behavior as
previously described (Prut and Belzung, 2003). Mice were exposed to an unknown brightly
illuminated environment from which escape is prevented by surrounding walls. The apparatus
made of wood and colored white was a square area (40 x 40 cm) with 16 cm high walls. The
floor was divided into 16 squares (10 x 10 cm); 4 squares were defined as the central area and
the 12 squares along the walls as the periphery. At the beginning of the test, each mouse was
placed in the central area and allowed to freely explore the OF for 10 min. Parameters
recorded to evaluate anxiety-like behavior were the percent of time spent in the central area.
The total number of squares crossed is an indicator of locomotor activity. The open-field was
thoroughly cleaned with 70% ethanol and dried with paper towels to remove olfactory cues
between each mouse.
Tests of depressive-like behavior:
The tail suspension test (TST) was carried out as previously described (Moreau et al.,
2008a; Steru et al., 1985). Briefly, an adhesive tape was fixed to the mouse tail (distance from
the tip of the tail = 2 cm) and hooked to a horizontal ring stand bar placed 30 cm above the
180
floor. The test was conducted for a period of 6 min in a visually isolated area. The apparatus
was cleaned thoroughly after each mouse. Mice demonstrated several escape attempts
interspersed with immobility periods during which they hung passively and completely
motionless. Depressive-like behavior was inferred from increased duration of immobility
(Steru et al., 1985).
The forced swim test (FST) was conducted as described by Frenois et al (2007). Briefly,
each mouse was placed individually in a cylinder (diameter: 16 cm; height: 31 cm) containing
15 cm of water maintained at 25 ± 1°C. The water was changed and the cylinders were
cleaned thoroughly between testing sessions. Mice were tested for 6 min and then returned to
their home cage. The duration of immobility, swimming and climbing was evaluated during
the 5 last min of the test. A mouse was judged to be immobile when it stopped struggling and
moved only slowly to remain floating in the water, keeping its head above water. Increased
duration of immobility of rodents in the FST has been proposed to reflect a state of
helplessness that is reduced by antidepressants (Porsolt, 2000).
Measurement of plasma levels of hormones and cytokines:
In order to evaluate the consequences of obesity and related comorbidities on hormone
levels and peripheral inflammation, leptin, insulin, resistin, Il-1β, IL-6, TNFα and IFNγ were
measured in plasma with the mouse adipokine and cytokine LINCOplex kits (Linco research,
Inc., St. Charles, MO, USA) following the manufacturer’s instructions as previously
described (Moreau et al., 2008b). Plasma corticosterone concentrations were also measured,
as an index of HPA axis activity, using an ImmuChem Double Antibody Corticosterone RIA
Kit from Diasorin (Antony, France) according to the manufacturer’s instructions (Apter and
Eriksson, 2006). All samples were run in duplicate.
Reverse transcription and real time PCR:
Central inflammation was evaluated in the hippocampus using RT-PCR for cytokines
(IL-6, TNFα, IL1β and IFNγ) and IDO. Total RNA from hippocampus samples was extracted
with Trizol as previously described (O'Connor et al., 2008). Reverse transcription was
performed using oligo dT primers added 2 µg of RNA. The oligo dT primer/RNA mix was
then inactivated at 65°C for 5 min and chilled on ice. Reverse transcription was performed at
55°C for 45 min. The reaction was terminated by heat (70°C for 15 min). To minimize interassay variation all RNA samples from a single experimental group were reverse transcribed
181
simultaneously. Resultant first-strand cDNA was amplified by the Taqman Universal PCR
Master Mix with sequence-specific primers and the FAM-labeled Taqman MBG probe assay
mix (Applied Biosystems). The assay IDs for the target genes in the assay mix were: IL-6
(Mm00446190_m1), IL-1β (Mm00434228_m1), TNFα (Mm00443258_m1), IFNγ (Mm
00801778_m1) and IDO (Mm00492586_m1), and for the house-keeping gene β2
microglobulin (Mm00437762_m1) as previously used (O'Connor et al., 2008). Real time PCR
was performed on the ABI Prism 7700 under the following conditions: 50°C for 2 min, 95°C
for 10 min, followed by 40-cycles amplification phase of 95°C for 15 sec and 60°C for 1 min.
Results were normalized with the β2 microglobulin endogenous control and the relative
quantitative evaluation of the amplification products was performed using the comparative
threshold cycle method, as described elsewhere (Applied Biosystems user bulletin n°2).
Experiment 2: In order to complete results collected in the first experiment, the second
one aimed at assessing, in both db/db and db/+ mice, the reactivity of the innate immune
system to an acute LPS challenge. Peripheral LPS administration enhances production of
proinflammatory cytokines, which are responsible of physiological and behavioral symptoms
of sickness (Dantzer et al., 2008). Therefore, we assessed LPS-induced peripheral cytokine
production and brain IDO activation, as well as the resultant body weight loss and behavioral
alterations in the FST.
Mice were injected i.p. with sterile physiological saline or LPS (5 µg/mouse) and were
immediately returned to their home cage. Body weight loss was assessed by weighing mice
just before the LPS treatment and at 6 and 24 h after, in order to control the efficiency of the
response to LPS. Mice were exposed to the FST 23 h after treatment, as described in the first
experiment. One hour after completion of the FST session, they were sacrificed by CO2
inhalation. Blood samples were immediately collected and processed following the protocol
detailed for the experiment 1. After perfusion with PBS at 4°C via the ascending aorta, brains
were rapidly extracted from the skulls and kept at -80°C until IDO assay.
Measurement of brain concentrations of KYN and TRP:
Brain kynurenine (KYN) and tryptophan (TRP) levels were determined as previously
described (Moreau et al., 2005). The KYN/TRP ratio served to assess brain IDO activity.
Briefly, brains were homogenized using ice cold potassium 0.14 M KCl, 20 mM phosphate
buffer pH 7.0 with an UltraTurrax T25 homogenizer at 1000 rpm. Homogenates were then
182
centrifuged at 14,000 g for 30 min at 4°C. 200 µl of supernatants were precipitated in
trichloroacetic acid (2 mM) and then centrifuged twice (15 and 5 min) at 1300 g at 4°C.
Supernatants were injected onto a 5-µm C18 HPLC column (Lichrospher, Alltech, Deerfield,
IL, USA) at a flow rate of 1.0 ml/min with mobile phase containing 0.1 M ammonium
acetate/acetic acid buffer and 5 % acetonitrile (pH 4.65). Levels of KYN were evaluated by
UV absorbency at 360 nm. Levels of TRP were detected by fluorescent detector at 285 nm
excitation and 365 nm emission wavelengths.
Statistical analysis:
All results are presented as mean ± SEM and were analyzed using a one-way (strain), a
two-way (strain x time) or a three-way (strain x time x treatment) ANOVA followed by a
post-hoc pair wise multiple comparison procedure using the Fischer’s LSD method, if the
interaction was significant.
Results
As expected, db/db mice presented a marked increase in food intake (data not shown)
compared to db/+ mice and were clearly obese, their body weight being 47 % above db/+
controls (F(1,26) = 220.01, p < .0001). Moreover, the significant increase of plasma levels of
leptin (F(1,11) = 266.15, p < .0001) and insulin (F(1,11) = 21.14, p < .001), together with
reduced levels of resistin (F(1,11) = 13.41, p < .01), measured in db/db mice compared to
their db/+ littermates confirmed the presence of a morbid obesity, with diabetic complications
(data not shown). These mice represent therefore a useful model to assess the consequences of
morbid obesity on behavioral reactivity and inflammatory status.
1) Obese db/db mice present cognitive deficit and anxiety-like behavior, but no depressivelike behavior
In order to thoroughly characterize the profile of behavioral reactivity of morbidly obese
db/db mice compared to their db/+ littermates, they were exposed to different wellestablished and validated behavioral tests aiming at evaluating cognitive dysfunction (Ymaze), anxiety-like behavior (EPM and OF) and depressive-like behavior (TST and FST).
Abilities of both db/db and db/+ mice to recognize novelty were tested in the Y maze
apparatus that requires cognitive processes involving the hippocampus (Conrad et al., 1996).
183
In accordance with the experimental procedure described for this test (Dellu et al., 2000),
mice were submitted to the Y-maze with an inter-trial interval (ITI) of 2 min. During the first
session of free exploration of two arms out of three, the number of visits and the time spent in
each open arm did not differ (data not shown), indicating that there was no impairment of
spontaneous alternation and exploration in db/db mice. During the second session (retrieval
phase) carried out 2 min later, discrimination of the new arm was evaluated by measuring the
duration of visits of this arm compared to the time spent exploring the previously seen arms.
An index of recognition was calculated as the ratio of the time spent in [the novel arm x 100 /
(novel + adjacent) arms]. A significant difference between this index of recognition and the
chance level (50 %) attests of novel arm recognition. In the present experiment, db/db mice
were not able to discriminate the new arm from the already observed arms, as shown by their
index of recognition which was not different from chance (Fig. 1). On the contrary, db/+ mice
clearly recognized the new arm, their recognition index being significantly different from
chance (t(11) = 187, p< .001).
Figure 1: Dinel A.L. et al, Evaluation of behavioral performances in Y maze test.
80
db/+
Recognition index %
70
***
db/db
60
50
Random
choice
40
30
20
10
0
The EPM is a very classical test of anxiety-like behavior based on the exposure of
rodents to unfamiliar and therefore anxiogenic aversive places, as represented by the open
arms of the maze (Belzung and Griebel, 2001). Although both db/db and db/+ mice spent the
same proportion of time exploring the closed and non-anxiogenic arms (F(1,23) = 220.01, p>
184
.1), db/db mice spent less time in the open anxiogenic arms (F(1,23) = 20.37, p< .001) (Fig.
2B). Since the general level of locomotor activity did not differ between both groups, as
manifested by similar number of total arm entries (F(1,23) = 2.85, p> .1), db/db mice clearly
exhibited a typical anxiety-like behavior in the EPM.
As a further confirmation that db/db mice exhibited greater anxiety, both db/db and
db/+ mice were subjected to the OF, another test allowing to assess anxiety-like behavior by
measuring the time spent in the central area of the OF (Prut and Belzung, 2003). Whereas no
significant differences of exploration of this anxiogenic area were found between db/db and
db/+ mice during the first 5 min of the test (a period during which stress response to novelty
can interfere with anxiety) (Fig. 2A), db/db mice clearly spent less time in the center of the
OF over the 5 last min of the test than db/+ mice (F(1,23) = 6.53, p< .05). Moreover, when
we analyzed behavior of mice during the course of the entire 10-min session by measuring the
number of entries in the center of the arena, we found that this number progressively
increased over time in db/+ mice (time: F(1,99) = 4.72, p< .001) (Fig. 2A). By contrast, it
was particularly low in db/db mice during the first few minutes and remained unchanged
during the 10-min session. Importantly, our results are not likely to be caused by a decrease in
general locomotor activity of db/db mice since there is no difference in total movement time
between both groups (F(1,23) = 7.79, p> .1). Thus, results obtained from the EMP and OF
paradigms both demonstrated greater anxiety-like behavior in db/db mice.
In the TST and the FST, two classical tests of depressive-like behavior, an increased
duration of immobility is used as an index of depressive-like behavior (Moreau et al., 2008a).
As shown in Fig. 2C, both groups spent the same amount of time immobile in the TST
(F(1,23) = 1.65, p> .1). Importantly, this result was confirmed in the FST, since both db/db
and db/+ mice exhibited similar behavioral reactivity in this test (data not shown). Taken
together, these results show that cognitive dysfunction, anxiety-like behavior, but not
depressive-like behavior, were found in diabetic obese db/db mice in basal conditions.
185
Figure 2: Dinel A.L. et al, Evaluation of mood disorders in OF, EMP and TST.
A: Open Field
Time (s)
60
*
db/+
db/db
a
**
**
*
50
4
3,5
*
*
3
2,5
40
b
30
2
1,5
20
1
10
0,5
0
0
First 5 min
Last 5 min
1
2
3
4
5
c
db/+
db/db
160
Time of immobility (s)
c
250
Time (s)
8
9
10
C: Tail Suspension Test
300
200
150
50
7
Time (min)
B: Elevated Plus Maze
100
6
Number of entry in center area
70
a
b
db/+
db/db
140
120
100
80
60
40
20
0
0
Open arm
Closed arm
2) Altered profile of behavioral reactivity observed in db/db mice is associated with
peripheral and brain inflammation
In order to determine whether the impaired profile of behavioral reactivity observed in
db/db mice was associated with inflammation, we measured in both strains peripheral levels
and brain expression of inflammation markers. Mice from db/db strain presented a peripheral
inflammation, as manifested by exacerbated plasma production of IL-6 (F(1,23) = 7.03, p<
.05) and IFNγ (F(1,23) = 3.72, p< .05) (data not shown). On the contrary, IL-1β levels were
undetectable whatever the group, whereas basal levels of TNFα were detectable but similar in
both strains (data not shown).
Interestingly, this peripheral inflammation was associated with neuroinflammation, as
shown by the elevated mRNA expression of IL-6 (F(1,11) = 7.05, p< .05), IL-1β (F(1,11) =
6.82, p< .05) and TNFα (F(1,11) = 7.43, p< .05) observed in the hippocampus of db/db mice
compared to lean animals (Fig. 3A-C). On the contrary, hippocampus mRNA expression of
IFNγ and IDO was undetectable in both groups (data not shown). In summary, db/db mice
186
exhibited a basal peripheral and central inflammation mostly affecting IL-6 that was
associated with alterations of cognitive performances and anxiety-like behavior, but not
depressive-like behavior.
Figure 3: Dinel A.L. et al, Hippocampic cytokine mRNA in db/db and db/+ mice.
B
A
2,5
2
1,5
1
0,5
2
1,5
1
0,5
0
0
db/+
db/db
2,5
*
*
TNFα ∆ mRNA
*
IL-1β
β ∆ mRNA
IL-6 ∆ mRNA
2,5
C
2
1,5
1
0,5
0
4) Obese db/db mice present altered behavioral and physiological reactivity to
systemic LPS injection
Severe obesity has been associated with increased susceptibility to infection (Amar et al.,
2007a, b). Similarly, db/db mice have been shown to exhibit increased and prolonged sickness
behavior in response to LPS (O’Connor et al., 2005). We have recently shown in aged mice
that protracted sickness behavior can elicit exacerbation of the depressive-like behavioral
changes observed in the FST from 24 h after LPS treatment (Godbout et al., 2008). Altered
susceptibility to infection may therefore potentially facilitate development of inflammationrelated comorbidities, including depressive symptomatology. Taken together, these findings
prompted us to measure the effects of LPS treatment on behavioral reactivity in the FST and
its neurobiochemical correlates in both db/db and db/+ mice. In order to verify the
effectiveness of LPS treatment, we first measured in saline- and LPS-treated mice the time
course of body weight loss compared to pre-treatment body weight (Fig. 4). As expected, LPS
induced a progressive and sustained decrease in body weight in all treated mice compared to
saline-treated controls (treatment: F(1,23) = 36.13, p< .0001; strain: F(1,23) = 8.12, p< .01;
time x treatment: F(1,23) = 12.98, p< .01). These results confirm therefore the full efficacy of
LPS in the present study in both db/db and db/+ mice.
187
Figure 4: Dinel A.L. et al, Effect of LPS on body weight change.
1,00
db/+ - Sal
a'
Body weight change
0,50
db/+ - LPS
a'
db/db - Sal
0,00
db/db - LPS
a
-0,50
a
c
-1,00
c'
b
-1,50
-2,00
b'
-2,50
6h
24h
In accordance with the results found in the first experiment, saline-treated db/db mice
presented higher plasma levels of IL-6 (strain: F(1,23) = 7.03, p< .05) and IFNγ (strain:
F(1,23) = 3.73, p= .06), but similar levels of TNFα, than db/+ mice (Table 1). Moreover, no
circulating IL-1β was detected in unstimulated conditions whatever the strain (data not
shown). By the time of sacrifice 24 h after treatment, the increase of plasma levels of
proinflammatory cytokines classically observed in the few hours post-LPS (Dantzer, 2001)
was not anymore visible for IL-1β that was undetectable in all groups (data not shown).
Similarly, plasma IL-6 levels were not significantly increased 24 h post-LPS treatment
(F(1,23) = .93, p> .1), although they were still higher in db/db than db/+ mice (Table 1). On
the contrary, LPS-induced increase of plasma TNFα concentrations was significant in both
db/db and db/+ mice (treatment: F(1,23) = 8.39, p< .01), whereas the increase of IFNγ was
only significant in db/+ mice (treatment: F(1,23) = 11.9, p< .01; treatment x strain: F(1,23) =
10.44, p< .01) (Table 1). Concerning metabolic mediators (Table 1), circulating levels of
leptin and resistin were again significantly different between db/db and db/+ mice in basal
conditions (p< .001). Moreover, they were selectively increased by LPS in db/db mice
(treatment x strain: F(1,23) = 7.06, p< .05 and F(1,23) = 6.32, p< .05 respectively). Plasma
insulin levels were significantly higher in db/db mice (strain : F(1,23) = 70.36, p< .0001) as
188
shown in the first experiment, irrespective of treatment. Similarly, circulating levels of
corticosterone were drastically increased in db/db compared to db/+ mice (strain: F(1,23) =
17.87, p< .001), independently of their treatment. Although the main effect of LPS treatment
was not significant (F(1,23) = 0.7, p> .1), LPS-treated db/+ mice exhibited higher plasma
concentrations of corticosterone than their saline-treated controls (F(1,23) = 17.87, p< .01),
whereas no difference was observed between saline- and LPS-treated db/db mice. In
summary, the whole peripheral markers of inflammation, including in that case
corticosterone, that are already increased in db/db mice in basal unstimulated conditions are
not affected by the additional LPS challenge. On the contrary, the metabolic mediators leptin
and resistin are still responsive to this innate immune challenge.
Table 1: Dinel A.L. et al, Plasma adipokines and cytokines levels measured 24 h after LPS injection.
db/+
Plasma
db/db
saline
LPS
saline
LPS
Insulin (pg/ml)
971,1 ± 251 a
626,1 ± 102 a
4184,7 ± 393 b
3738,9 ± 582 b
Leptin (pg/ml)
2625,0 ± 332 a
1719,0 ± 356 a
18458,0 ± 988 b
23546,0 ± 1935 c
Resistin (pg/ml)
1988,6 ± 112,1 a
1620,3 ± 272,1 a,b
1265,7 ± 94,9 b
1975,8 ± 276,1 a
11,7 ± 5,3 a
48,8 ± 10,1 b
115,6 ± 53,3 c
155,2 ± 60,2 c
TNFα (pg/ml)
4,2 ± 0,7 a
8,6 ± 1,8 b
3,4 ± 0,7 a
12,2 ± 3,8 b
IFNγ (pg/ml)
0,4 ± 0,15 a
2,8 ± 0,76 b
0,9 ± 0,33 c
0,9 ± 0,3 c
26,2 ± 6,14 a
66,1 ± 8,94 b
148,2 ± 38,61 c
150,5 ± 31,82 c
IL-6 (pg/ml)
Corticosterone (ng/ml)
In the FST, LPS treatment induced a significant increase of the duration of immobility
in db/+ mice compared to their respective saline controls (F(1,23) = 4.8, p< .05) (Fig. 5A).
On the contrary, this treatment did not alter the duration of immobility performed by db/db
mice, suggesting the lack of LPS-induced depressive-like behavior in these mice. We have
recently demonstrated that IDO activation induced by LPS mediates development of
depressive-like behavior in the FST (O’Connor et al 2008). An interference of obesity and/or
related comorbidities, particularly diabetes, with these inductions may therefore explain the
altered effect of LPS on behavioral reactivity of db/db mice to the FST exposure. In order to
test this possibility, LPS-induced brain IDO activity were measured 1 h after completion of
the FST. Brain IDO activity was assessed by calculation of the KYN/TRP ratio as previously
189
described (André et al 2008). The ANOVA analysis reveals a main effect of strain (F(1,23) =
84.56, p< .0001) and treatment (F(1,23) = 84.56, p< .0001), with a significant interaction
between both factors (strain x treatment: F(1,23) = 16.50, p< .001). Basal brain IDO activity
was similar in both strains (Fig. 5B). As expected, LPS treatment induced a significant
increase of brain IDO activity in all treated mice, but this induction was significantly
attenuated in db/db mice compared to db/+ mice (LPS: db/+ vs. db/db, F(1,23) = 16.50, p<
.001). In conclusion, the lack of LPS-induced depressive-like behavior exhibited by db/db
mice was associated with a selective abolishment of the increase of peripheral inflammation
and HPA axis activity, as well as attenuated brain IDO activation.
Figure 5: Dinel A.L. et al, Effect of LPS on behavioral performances in FST and on IDO activity.
A: Forced Swim Test
db/+ - Sal
db/+ - LPS
db/db - Sal
db/db - LPS
250
Time of immobility (s)
b
200
a,b
150
a,b
a
100
50
0
B: IDO activity
db/+ - Sal
db/+ - LPS
db/db - Sal
db/db - LPS
0,35
b
Brain KYN/TRP
0,30
0,25
0,20
c
0,15
0,10
a
a
0,05
0,00
Discussion
Although mounting evidence suggests a functional link between inflammation and
development of mood and cognitive disorders in many medical illnesses that share chronic
inflammation as a common denominator (Raison et al., 2006), the potential involvement of a
similar link in the case of obesity still remains elusive (Brandacher et al., 2007). Similarly,
190
diabetes that has been shown to affect innate immune system reactivity (Shah and Hux, 2003)
is also an important risk factor for mood disorders (Skilton et al., 2007) and cognitive
dysfunctions (Messier, 2005). In the present study, the use of a murine model of morbid
obesity that is associated with important comorbidities, particularly insulin resistance and
diabetes, provides for the first time revealing behavioral and neurochemical data consistent
with an association between metabolic and inflammatory mediators, cognitive dysfunctions
and anxiety-like behavior. More specifically, diabetic obese db/db mice that present an
inherited predisposition to severe obesity-associated metabolic syndrome (Chen et al., 1996)
show here increased peripheral and brain cytokine production, together with anxiety-like
behavior and alterations of immediate novelty recognition. The importance of this study is
that they are the first to report an extensive description of the behavioral profile of these obese
diabetic mice, assessed in complementary and well-validated behavioral tests, with the
concomitant measure of neurobiochemical changes. These findings extend further those
showing that db/db mice have impaired recovery from LPS-induced initiation of the innate
immune response (O'Connor et al., 2005; O'Connor et al., 2007; Sherry et al., 2007).
Importantly, our results show that basal changes of inflammatory status and/or diabetesrelated metabolic impairments already induce behavioral alterations. This findings are
consistent with what is reported in humans suffering from severe forms of obesity (Cancello
and Clement, 2006; Pickup et al., 2000). Morbid obesity is defined in humans by a huge
increase of body mass index, associated with development of comorbid pathologies
collectively referred to as metabolic syndrome (Kopelman, 2004). Although genetic
alterations only account for a small fraction of obesity in humans (Gibson et al., 2004), the
present findings show that db/db mice provides a very useful rodent model to study the
neurobiological basis of mood and cognitive disorders in the context of morbid obesity with
comorbid complications. The temporal association between the occurrence of behavioral
alterations and the increase in brain and peripheral expression of inflammatory markers that is
observed in the present study can be interpreted to suggest that these markers probably
participate in the development of these specific behavioral alterations.
In the present study, genetically obese and diabetic mice show altered cognitive abilities,
as assessed in a hippocampus-dependant memory test, the Y-maze. The two-trial Y-maze task
is a specific and sensitive test of spatial recognition memory in rodents (Dellu et al., 2000). It
is based on the innate tendency of rodents to explore novel environments (Dellu et al., 2000).
This paradigm does not require the learning of a rule, making it useful for studying memory
191
in rodents (Dellu et al., 1992). Given that this task is based on exploration of novelty, mice
were first tested for novelty exploration, with a short ITI of 2 min. Interestingly, db/db mice
already showed, in these conditions, significantly lower novel arm preference, as assessed by
the recognition index, whereas a diet-induced model of moderate obesity only alters
performances of mice in the Y-maze when the test conditions are much more stringent (ITI of
30 min) (Dinel et al, unpublished data). These data confirm clinical studies reporting a linear
relationship between increase in body mass index and progressive development of cognitive
disorders (Cournot et al., 2006).
It is noteworthy that db/db mice also presented anxiety-like behavior in two classical
and well-established tests of anxiety-like behavior. The EPM, based on a procedure used by
Montgomery (Montgomery, 1955), showed that exposure to an elevated open alley evoked an
approach-avoid conflict and that mice prefer the closed arms to the open ones. He postulated
that this preference reflects an aversion towards the open arms likely caused by fear and
anxiety. Consequently, the measure of open arm avoidance remains the primary sign of
anxiety, while total and closed arms entries reflect general motor activity (Hilber et al., 2004).
Therefore, mice spending less time in the open arms of the EPM, as shown here for db/db
mice, are more anxious than those which do not avoid open arms. These results agree with
clinical studies showing that prevalence of anxiety is obese subjects is much higher than in
lean subjects (Becker et al., 2001).
Both behavioral alterations were associated with increased peripheral secretion of IL-6
and brain expression of IL-6, TNFα and IL-1β, as found in the hippocampus, a key structure
in cognitive processes (Winters et al., 2008) and that plays also an important role in the
emotional reactivity. A clear relationship has been reported between neuroinflammation and
development of impaired cognitive abilities (Noble et al., 2007). It has been recently shown
that LPS-induced neuroinflammation participate in the development of cognitive disorders
observed in Alzheimer diseases (Lee et al., 2008). Moreover, several experiments have shown
that brain cytokines can alter synaptic plasticity, particularly in the hippocampus (Lynch,
1998), with obvious consequences on cognitive performances. Similar relationships have been
reported between anxiety and inflammation (Capuron et al., 2001; Yirmiya et al., 2000).
Although the causal role of increased neuroinflammation reported in db/db mice in
development of their cognitive and anxiety-like disorders has not been directly assessed in the
present study, the whole results obtained clearly support this hypothesis.
192
In addition to cytokines, other circulating factors also increased in basal conditions in
db/db mice may play a key role in their cognitive and anxiety-like alterations. Db/db mice
presented high basal levels of corticosterone. This result is confirmed by other findings
obtained in genetically obese mice (Naeser, 1973) and in obese patients showing that a
relationship exists between visceral obesity and hyperactivity of the HPA axis (Bjorntorp and
Rosmond, 2000; Duclos et al., 1999; Pasquali et al., 1996; Rosmond and Bjorntorp, 1998).
Leptin has been shown to inhibit glucocorticoid secretion. However, high levels of leptin are
associated with high levels of glucocorticoid in obesity models. The lack of leptin receptor in
db/db mice and the resulting leptino-resistance (Tataranni et al., 1996), could explain this
hypersecretion of corticosterone. As shown by many studies, glucocorticoids are implicated in
stress, cognition and anxiety disorders (Strohle and Holsboer, 2003). Reciprocal interactions
exist between the amygdala and the hippocampus and the stress system, which stimulates
these elements and is at its turn regulated by them. It has been shown that cytokines and other
circulating mediators of inflammation are potent activators of the central stress response,
constituting the afferent limb of a feedback loop through which the immune/inflammatory
system and the central nervous system communicate (Tsigos and Chrousos, 2002). TNFα, IL1β and IL-6 can cause stimulation of the HPA axis individually, or synergistically (Tsigos et
al., 1997). There is evidence to suggest that IL-6, the main endocrine cytokine, plays the
major role in the immune stimulation of the HPA axis, especially in chronic inflammatory
state (Tsigos and Chrousos, 2002). IL-6 and insulin are inhibitors of corticosterone-binding
globulin (CBG) and their increase induces an elevation of free plasmatic corticosterone (Barat
et al., 2008). Another important neurobiological intermediate between morbid obesity and
alterations of behavioral reactivity may be the elevated levels of insulin since it has recently
been shown that intraperitoneal injection of insulin leads, in mice, to the development of
cognitive alterations (Akanmu et al., 2008).
Although cognitive dysfunctions and anxiety-like behavior were associated with
neuroinflammation in db/db mice, no depressive-like behavior has been detected either in
basal conditions or after an LPS challenge, whereas a classical increase of immobility was
observed in db/+ mice, as previously shown in normal mice (Frenois et al., 2007; O’Connor
et al., 2008). This result suggests that cognition and anxiety on one hand, and depression on
the other hand, may be underlined by distinct neurobiological mechanisms in a context of
inflammation. We have recently shown that LPS-induced depressive like behavior is mediated
by activation of the tryptophan-catabolizing enzyme IDO (O'Connor et al., 2008). The present
193
results associating the lack of induction of depressive-like behavior in the FST with
significantly reduced brain IDO activation agree with these previously published data.
Moreover, these results also suggest that, on the contrary, the role of this enzyme in the
induction of cognitive disorders and anxiety-like behavior in the context of a morbid obesity,
may be probably not much important.
In conclusion, the data presented in the present study showed that morbid obesity
induces, in addition of a peripheral inflammation, a neuroinflammation as manifested by
amplified brain IL-6, IL-1β and TNFα production. Moreover morbid obese mice present
anxiety-like symptoms and develop important cognitive disorders since their short-term
memory was affected. Furthermore, although only correlative and with the limitation inherent
to the measurement of neurobehavioral consequences of obesity in rodents, the present
findings support a role or the neuroinflammation observed in the hippocampus in the
development of anxiety and cognitive disorders. These results may stimulate important
considerations regarding the role of biological systems in mood and cognitive disorders
associated with obesity.
Acknowledgment
ALD was supported by a doctoral fellowship from the Institut Danone. The authors
thank Dr. F Dellu for her advices about the Y maze test.
194
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200
LEGENDS
Figure 1:
Evaluation of cognitive disorders in Y maze test. Index of recognition of novelty after a 2min ITI.
Data are represented as means ± SEM (n=12). ***, p<0.001, each group is compared to hazard (0.5)
Figure 2:
Mood disorders were evaluated in db/db mice.
(A) In the OF, db/db mice explore less the center of the field than db/+ mice. First graph represent
time of exploration of center area during the first 5 min and the last 5 min. Second graph represent
number of entry in center area of db/db mice compared to db/+ mioce. Data are represented as means
± SEM (n=12). Means with different letters are significantly different from each other.
(B) In the EPM, db/db mice present an high anxiety level as shown by the anxiety index. Data are
represented as means ± SEM (n=12). Means with different letters are significantly different from each
other.
(C) In the TST, there is no significative difference of immobility between both group
Figure 3:
Hippocampic cytokines mRNA in db/db and db/+ mice. Bars represent means ± SEM (n=6). (A) IL-6
mRNA expression. * p<0.05 (B) IL-1β mRNA expression. * p<0.05 (C) TNFα mRNA expression. *
p<0.05
Figure 4:
Effect of LPS (5µg/mouse) in body weight measured 24 h after injection. Data represent means ±
SEM (n=6). Means with different letters are significantly different from each other.
Figure 5:
(A) Behavioral reactivity in the forced swim test (FST) measured 24 h after LPS (5µg/mouse) in db/db
and db/+ mice.
(B) Brain IDO activity assessed by KYN/TRP ratio. Bars represent means ± SEM (n=6). Means with
different letters are significantly different from each other.
Table 1:
Plasma adipokines and cytokines levels measured 24 h after LPS (5µg/mouse) or saline injection in
db/db and db/+ mice. Values represent means ± SEM (n=6).
201
202
Discussion générale
203
204
Synthèse des principaux résultats
De nombreuses études menées chez l’homme ont montré que l’obésité est associée à un
état inflammatoire chronique caractérisé par une augmentation de la sécrétion de nombreuses
molécules dont la leptine et des cytokines inflammatoires comme le TNF-α et l’IL-6 (Clement
et al., 2004). Des données récentes suggèrent que cette inflammation périphérique pourrait
également présenter une composante au niveau cérébral se caractérisant notamment par une
augmentation de l’expression de différentes cytokines inflammatoires (IL-6, TNF-α, IL-1β…)
et de l’activation de leurs voies de signalisation intracellulaire (augmentation de l’activité cJun-N-terminal kinase et de NFkB) (De Souza et al., 2005). De plus, l’intensité de la situation
inflammatoire semble être liée au degré d’obésité. Ainsi, il est possible de distinguer
différentes situations d’obésité : une obésité modérée qui ne s’accompagne pas forcément de
pathologies comorbides et une obésité morbide associée à différents types de complications
comme des maladies cardio-vasculaires, de l’hypertension artérielle ou un diabète de type 2.
L’obésité s’accompagne également d’une forte prévalence de troubles de l’humeur (anxiété,
dépression) et de la cognition.
Notre laboratoire a été un des pionniers dans l’étude de l’expression et de l’action des
cytokines au niveau central et de leurs conséquences, tant comportementales que
neurobiologiques. Cette relation entre système de l'immunité innée et cerveau a
particulièrement été étudiée dans le cadre du comportement de maladie regroupant un
ensemble de symptômes non spécifiques (fièvre, activations neuroendocriniennes, anorexie,
anhédonie, repli sur soi, perte d’intérêt pour l’environnement…) observés chez les individus
malades et pouvant être reproduits chez l’animal en réponse à l’injection d’un inducteur de
cytokines tel que le lipopolysaccharide (LPS) (Dantzer, 2001). Dans le cas d’une exposition
prolongée ou non régulée de l’activation du réseau de cytokines, le comportement de maladie
peut laisser place à de véritables troubles de l’humeur et de la cognition associés à une chute
des taux circulants de tryptophane, un acide aminé essentiel servant de précurseur et de
facteur limitant à la synthèse de sérotonine. Il a été montré que l'indoléamine 2,3-dioxygénase
(IDO), une enzyme dégradant le tryptophane en réponse aux cytokines (Lestage et al., 2002;
Moreau et al., 2005) est impliquée dans l’induction des symptômes de type dépressif observés
notamment suite à la production soutenue de cytokines et que cette action serait dépendante
du catabolisme du tryptophane via la voie de la kynurenine (O'Connor et al., 2008).
L’activation de l’IDO en situation inflammatoire aboutit à la production de dérivés
neurotoxiques (3-OH-kynurénine, acide quinolinique) se comportant comme des agonistes
205
des récepteurs glutamatergiques de type NMDA (Taylor and Feng, 1991), au dépend de la
production de sérotonine. Ainsi, l’activation de l’IDO par les cytokines pourrait jouer un rôle
dans l’apparition de troubles cognitifs associés aux états inflammatoires via l’altération de la
neurotransmission sérotoninergique et/ou glutamatergique. Ces mêmes mécanismes
pourraient également sous-tendre le développement des troubles de l’humeur et de la
cognition couramment observés chez les personnes obèses.
L’ensemble des études réalisées dans ce travail de thèse a donc eu pour objectif général
de déterminer chez la souris si l’inflammation chronique à bas bruit qui est associée à un état
d’obésité entraînait le développement de troubles de l’humeur et de la cognition. De plus, afin
d’identifier au mieux les bases neurobiologiques potentielles à l’origine de ces troubles, nous
avons choisi de nous placer dans deux situations différentes : un état d’obésité modérée induit
par l’administration d’un régime enrichi mais n’entraînant pas le développement de
pathologies co-morbides graves, et un état d’obésité morbide d’origine génétique associé à
d’autres pathologies notamment un diabète de type 2. Dans les deux cas, les conséquences de
cette obésité sur l’état d’activation inflammatoire et les altérations neurochimiques et
comportementales qui en découlent ont été étudiées en détail.
Nos résultats montrent que :
1)
l’intensité de la perturbation du système immunitaire est corrélée au degré d’obésité
puisqu’une obésité modérée est associée à une altération de la capacité du système
immunitaire à répondre à une infection, tandis qu’une obésité morbide entraîne la mise en
place d’un état inflammatoire, même en conditions non stimulées.
2)
les modifications physiopathologiques induites par le développement d’un état
d’obésité altèrent le système immunitaire, comme en témoignent l’activation accrue de la
production de cytokines périphériques et cérébrales, en particulier l’IL-6, l’exacerbation des
réponses
neurochimiques
(stimulation
de
l’IDO
pulmonaire
et
cérébrale)
et
neuroendocriniennes (sur-activation de l’axe HPA) et de leurs conséquences sur la réactivité
comportementale.
3)
les souris obèses présentent des altérations de leurs capacités cognitives, des troubles
de type anxieux, ainsi qu’une modulation de leur réponse émotionnelle dont la mise en place
dans le temps semble se faire de façon indépendante, selon des modalités qui restent à
préciser.
206
OBESITE
modérée
Médiateurs
métaboliques
morbide
LPS ip
LPS ip
Leptine
Insuline
Inflammation
périphérique
Inflammation
périphérique
centrale
centrale
centrale
Activation HPA
Activation IDO
Activation HPA
Activation HPA
Atténuation IDO
Inflammation
périphérique
Troubles de type :
cognitifs
Oui
Oui
Oui
Oui
anxieux
Oui
?
Oui
?
dépressif
Non
Non
Non
Non
Figure 10 : Obé
Obésité
sité – Inflammation - Troubles
En conclusion, ces résultats originaux permettent de mettre en évidence le rôle clé de
l’inflammation associée à l’obésité dans le développement des troubles de l’humeur et de la
cognition (figure 10). Ce travail pourrait ainsi contribuer à l’identification de cibles
moléculaires potentielles pour le développement de nouvelles stratégies thérapeutiques ou
nutritionnelles visant à améliorer la qualité de vie des patients obèses et prévenir au mieux le
développement des pathologies co-morbides associées à l’obésité.
Choix des modèles expérimentaux
Dans nos sociétés, l’obésité est le plus souvent le résultat d’interactions entre des
prédispositions génétiques et l’environnement (Archer and Mercer, 2007; Tschop and
Heiman, 2001). En effet, les modes de vie ont changé faisant place à une sédentarité, une
diminution de l’activité physique et surtout une forte augmentation de la consommation de
nourriture très énergétique, à haute teneur en sucres et en graisses. Tout ceci favorise la mise
en place d’une balance énergétique très positive (Drewnowski, 2007; Friedman, 2000). Ainsi,
207
l’utilisation de modèles d’obésité basés sur la consommation de régime enrichi en graisse
et/ou en sucre semble être pertinente pour reproduire l’obésité communément observée chez
l’homme. Afin de reproduire au mieux les habitudes alimentaires humaines occidentales, nous
avons donc choisi d’utiliser un régime de type « cafétéria » qui consiste en un mélange
d’aliments du commerce riche en graisse et en sucre (Berraondo et al., 1997; Groubet et al.,
2003). Nous avons choisi de ne pas utiliser un régime fortement hyperlipidique afin d’éviter le
risque d’une inflammation locale de la barrière intestinale induite par le pool de lipides
excédentaires (Cabre and Gassull, 2003). La consommation du régime hypercalorique
pendant au minimum 20 semaines favorise la mise en place d’une obésité chez la souris se
caractérisant par une forte prise de poids, une hypertrophie de la masse adipeuse, ainsi qu’une
forte induction des taux de leptine dans le plasma et le tissu adipeux (chapitre 1, 2 et 3).
Ce modèle d’obésité est donc proche des situations réelles d’obésité rencontrées dans
nos sociétés puisqu’elle est due à l’augmentation de la charge calorique de la prise
alimentaire, et à la consommation d’un régime déséquilibré. Mais, dans ce modèle, l’obésité
observée est une obésité « modérée » associée à une augmentation de la production de leptine.
L’utilisation de ces régimes enrichies n’entrainent pas classiquement d’insulino-resistance et
de diabète de type 2 chez les animaux (Berraondo et al., 1997) mais l’absence de ces
pathologies comorbides devra être vérifiée, notamment par des mesures d’indice glycémique.
De plus, dans cette situation d’obésité modérée, nous ne mettons pas en place une
inflammation chronique à bas bruit, bien que nous perturbions tout de même la réponse
inflammatoire. En effet, nous avons montré que l’exposition au régime hypercalorique
entraîne l’exacerbation de la réponse inflammatoire induite par une infection systémique,
mais le statut inflammatoire des animaux obèses en situation basale n’est pas
significativement affecté (chapitre 1 et 2).
Or, la prévalence des troubles de l’humeur et de la cognition observés chez les patients
obèses augmente avec la sévérité de l’obésité. Afin de se placer dans un contexte plus propice
à l’observation de certains troubles, nous avons donc également réalisé nos différentes études
sur un modèle d’obésité génétique.
La découverte du gène ob/ob codant pour la leptine, hormone dite de la « satiété »
impliquée dans la régulation de la prise alimentaire, a permis de développer des modèles
génétiques d’obésité dont les plus couramment utilisés sont les souris ob/ob et db/db,
respectivement déficientes pour le gène de la leptine ou de son récepteur (Carroll et al., 2004).
Il a été décrit que la mutation de gènes impliqués dans la régulation de la balance énergétique
et connus pour être essentiels au maintien d’un poids corporel optimal, entraîne le
208
développement d’une obésité chez l’animal de laboratoire, ainsi que chez un petit nombre de
patients (Hebebrand et al., 2003). Ces mutations sont principalement observées sur le gène de
la leptine, la POMC, ainsi que les récepteurs de l’α-MSH dont MC4R (Carroll et al., 2004;
Clement et al., 1998; Krude et al., 1998). Contrairement au modèle ob/ob, la souris db/db
exprime le gène de la leptine. Cette production de leptine présente divers avantages : tout
d’abord, elle limite les phénomènes de compensation qui peuvent apparaître lorsque le gène
de la leptine n’est plus exprimé, et d’autre part, elle est le reflet de l’état sécrétoire du tissu
adipeux et donc de l’intensité de l’obésité. L’utilisation du modèle d’obésité génétique db/db,
bien qu’il ne soit pas un reflet de la réalité puisque l’obésité génétique est une pathologie rare
chez l’homme, présente l’avantage de créer une situation d’obésité morbide (chapitre 4). Les
animaux développent des pathologies associées comme un diabète de type 2, une insulinorésistance et des problèmes cardio-vasculaires. De plus, ce travail a mis en évidence chez ces
animaux une inflammation chronique à bas bruit périphérique et centrale.
Ainsi, l’utilisation de ces deux modèles a permis d’une part de se placer dans une
situation d’obésité modérée et donc avant l’apparition des pathologies co-morbides associées
à l’obésité, et d’autre part dans une situation d’obésité morbide. Ainsi ces modèles, souris
DIO et souris db/db apparaissent comme deux approches parfaitement complémentaires pour
étudier l’impact de l’inflammation sur les troubles de l’humeur (anxiété et dépression) et de la
cognition associés à l’obésité. L’étude de ces deux situations constitue une étape importante
vers l’identification de nouveaux outils de diagnostic et de nouvelles stratégies
pharmacologiques pour la prévention de ces troubles.
Conséquence de l’obésité sur la réaction inflammatoire
Il est désormais bien établi que les formes d’obésité sévères sont associées à un état
inflammatoire chronique caractérisé par la présence de facteurs inflammatoires au sein de la
circulation sanguine et du tissu adipeux, ainsi que l’existence d’une infiltration de
macrophages dans le tissu adipeux (Cancello and Clement, 2006). Quelques études ont
également proposé que l’inflammation périphérique présente une composante centrale et plus
particulièrement dans l’hypothalamus où la consommation d’un régime riche en graisse induit
l’expression de cytokines inflammatoires (IL-1β, TNFα) et l’activation des voies de
signalisation intracellulaires associées (JNK, NFκB) chez le rat (De Souza et al., 2005).
209
Dans le cas de notre modèle DIO, le régime enrichi n’affecte pas les taux d’IL-6, de
TNFα et de MCP-1 mesurés dans le plasma et le tissu adipeux en conditions basales, ainsi que
l’expression du TNFα, de l’IL-6 ou de l’IFNγ dans l’hypothalamus et l’hippocampe des souris
obèses comparée aux animaux consommant la nourriture standard (chapitre 1 et 2). Ce
résultat est en accord avec plusieurs études récentes montrant l’absence de modifications de
taux plasmatiques d’IL-6 et/ou de TNFα chez des rongeurs soumis à un régime enrichi (Amar
et al., 2007a; Bedoui et al., 2005; Huang et al., 2007). Dans notre modèle, la consommation
du régime « cafétéria » n’entraîne pas d’altérations de la sécrétion d’insuline ce qui serait en
relation avec l’absence d’insulinorésistance chez les souris obèses comme précédemment
décrit (Lopez et al., 2003) mais des mesures de glycémie permettant d’évaluer
l’insulinorésistance doivent être réalisées pour confirmer cette donnée. De plus il a été montré
que l’absence d’altérations des taux plasmatiques d’IL-6 et de TNFα chez des souris soumises
à un régime enrichi à 60 % en graisse pendant 16 semaines pouvait être corrélée à l’absence
de diabète (Amar et al., 2007a). Enfin, la plupart des études décrivant le développement d’une
inflammation comme conséquence de la consommation d’un régime enrichi, utilise un régime
à haute teneur en graisse (60 %) (Ellacott et al., 2007; Xu et al., 2003b), tandis que les études
utilisant un régime à teneur plus modérée (35 %) montrent des résultats similaires aux nôtres
(Bedoui et al., 2005).
Ainsi l’avantage de l’utilisation de ce régime enrichi est de pouvoir se placer dans une
situation où l’obésité n’est pas encore associée aux pathologies communément décrites dans
l’obésité morbide. Cependant, cet état d’obésité ne semble pas non plus associé à une
inflammation à bas bruit décelable au travers des mesures que nous avons utilisées. Les
facteurs inflammatoires mesurés dans notre étude, qui sont ceux fortement induits lors d’une
stimulation aiguë du SI, semblent en effet peu sensibles dans ces conditions. Ainsi,
l’évaluation de marqueurs de l’inflammation potentiellement plus sensibles à des stimulations
du SI faibles en amplitude mais soutenues dans le temps apparaît comme une approche plus
adaptée. Une autre mesure pertinente pour évaluer l’effet du régime enrichi sur le
fonctionnement du SI consiste à étudier sa capacité d’activation. Dans cette optique, nous
avons choisi de tester sa réactivité à une stimulation aiguë via l’administration de LPS
(chapitre 1 et 2).
Parallèlement, nous avons également décidé d’évaluer le statut inflammatoire des
animaux dans une situation d’obésité morbide. Dans ce deuxième modèle, la mutation du
210
récepteur du gène de la leptine affecte les taux d’IL-6 et de MCP-1 mesurés en condition
basale au niveau plasmatique mais également dans le tissu adipeux (figure complémentaire).
db/+
Adipose tissue
saline
db/db
LPS
Insulin (pg/ml)
43,7 ± 8,2 a
44,2 ± 7,8 a
Leptin (pg/ml)
948,3 ± 112 a
1046,8 ± 143 a
MCP-1 (pg/ml)
10,8 ± 6,1 a
143,1 ± 24,2 b
Resistin (pg/ml)
3688,3 ± 348,1 a
3378,7 ± 272,3 a
3,6 ± 1 a
6,5 ± 0,8 b
IL-6 (pg/ml)
saline
23,52 ± 0 ± 0,54 a
5228,8 ± 383 b
44,7 ± 8,8 a
1058,8 ± 191 b
3,1 ± 0,4 a
LPS
30,24 ± 6,7 a
5760,2 ± 427 b
167 ± 46,8 b
853,2 ± 107,8 b
8,3 ± 1,7 b
Figure complé
complémentaire
Concentrations en cytokines et adipokines évaluées dans le tissu adipeux par Luminex. Les valeurs
représentées sont les moyennes ± SEM (n=6). Des moyennes avec des lettres différentes sont
significativement différentes les unes des autres.
De plus, l’expression hippocampique d’IL-6, d’IL-1β et de TNFα est exacerbée chez
les souris obèses par rapport à celle des souris minces (chapitre 4). Ces résultats sont en
accord avec les résultats d’études portant sur des souris db/db de 25 semaines et qui montrent
une augmentation de la concentration plasmatique de MCP-1. Mais cette étude, réalisée sur
des souris plus âgées, ne montre pas d’augmentation de la concentration plasmatique d’IL-6 et
de TNFα (Guo et al., 2008). Une autre étude réalisée sur des souris âgées de 12 semaines
comme dans notre protocole confirme l’augmentation des taux plasmatiques d’IL-6 que nous
observons chez les souris db/db (Yang et al., 2008) mais ne montre pas d’augmentation de
MCP-1 et de TNFα. De plus, aucune étude ne semble avoir mis en évidence une inflammation
à bas bruit en central chez les animaux db/db. Une étude menée par O’Connor et al a mis en
évidence l’exacerbation de la réponse inflammatoire des animaux db/db en réponse à une
injection de LPS via l’expression d’IL-1β, d’IL-1ra et la modulation de la réponse
comportementale, mais ces modifications d’expression n’ont pas été mise en évidence en
conditions basales (O'Connor et al., 2005). Ainsi, nos résultats ont permis de mettre en
évidence une inflammation chronique à bas bruit en périphérie mais également en central chez
les animaux db/db. Cette exacerbation de l’expression de cytokines en central peut être la
conséquence de l’augmentation de la production de cytokines inflammatoires périphériques,
mais il est également interessant de s’interroger sur le rôle de l’insuline. En effet, dans notre
modèle d’obésité morbide, les taux plasmatiques d’insuline sont fortement augmentés. Or, il a
été montré que si des augmentations périodiques de concentration en insuline ont un effet
211
bénéfique, la production exacerbée et chronique d’insuline plasmatique entraîne la production
de cytokines pro-inflammatoires (Iwasaki et al., 2008). De plus, il a également été mis en
évidence que la production chronique d’insuline chez des souris db/db inhibe la voie de
signalisation de l’interleukine-4, une cytokine au fort potentiel anti-inflammatoire (Hartman et
al., 2004). Ces données suggèrent que, dans notre modèle d’obésité morbide, l’augmentation
des taux d’insuline et donc le diabète de type 2 qui y est associé, soient impliqués dans
l’inflammation observée.
En conclusion, nous avons mis en évidence que l’intensité de la situation
inflammatoire est corrélée à l’intensité de l’obésité. En effet, un état d’obésité modérée ne
semble pas associé à une inflammation à bas bruit décelable au travers des mesures que nous
avons utilisées. Les facteurs inflammatoires mesurés dans notre étude, fortement induits lors
d’une stimulation aiguë du SI, semblent en effet peu sensibles dans nos conditions. Ainsi, une
mesure pertinente pour évaluer l’effet du régime enrichi sur le fonctionnement du SI consiste
à étudier sa capacité d’activation. Dans cette optique, nous avons choisi de tester sa réactivité
à une stimulation aiguë via l’administration de LPS. Par contre, dans une situation d’obésité
morbide, nous avons mis en évidence une inflammation à bas bruit périphérique et centrale.
Dans cette situation, l’obésité est plus marquée, le développement du tissu adipeux est plus
important et est associé à des pathologies communément décrites dans l’obésité morbide qui
pourraient être impliqués dans la mise en place de l’état inflammatoire observé. Il semble tout
de même intéressant d’étudier la réponse inflammatoire suite à une injection de LPS dans
cette situation d’inflammation à bas bruit.
Obésité et vulnérabilité à une infection
Malgré l’absence de signes visibles d’une inflammation à bas bruit, notre régime
« cafétéria » entraîne une activation exacerbée du SI en réponse au LPS (chapitre 1 et 2),
suggérant la mise en place de modifications responsables d’une plus grande vulnérabilité face
à une infection, comme cela a précédemment été décrit chez l’homme (Mannino et al., 2006;
Tracey et al., 1971). En effet, il a été décrit que l’obésité favoriserait le développement de
l’asthme et en aggraverait la sévérité (Mannino et al., 2006; Shore, 2008). De plus, les sujets
obèses seraient plus sensibles aux septicémies, probablement du fait d’une augmentation de
212
l’inflammation microvasculaire et de l’activation des cellules endothéliales (Vachharajani et
al., 2005). Enfin, quelques études montrent une réponse immunitaire altérée chez des souris
soumises à un régime enrichi en graisse, en réponse à une infection bactérienne par
Porphyromonas gingivalis (Amar et al., 2007a) ou encore au virus de la grippe (Smith et al.,
2007).
Cependant, nous n’observons pas cette exacerbation de la réponse inflammatoire en
périphérie chez les souris db/db, 24 h après l’injection de LPS (chapitre 4). Seule la sécrétion
de leptine plasmatique est exacerbée suite à l’administration de LPS. Mais, bien que le choix
de l’étude des animaux 24 h après l’injection soit justifié pour observer la réponse
comportementale (Frenois et al., 2007), il est probable que la réaction inflammatoire ne soit
plus observable. Il serait intéressant de réaliser de nouveau cette étude 2 h après l’injection de
LPS. En effet, l’utilisation de modèles génétiques d’obésité a permis de mettre en évidence
une augmentation de la réponse immunitaire entraînant un comportement de maladie exacerbé
en réponse au LPS de 2 à 8 h après l’injection chez la souris db/db (O'Connor et al., 2005),
tandis que la microinfusion d’IL-1β provoque une augmentation de la fièvre chez des rats
fa/fa avec un pic 3 h après l’infusion (Plata-Salaman et al., 1998). De plus, la déficience en
leptine observée dans les modèles génétiques d’obésité pourrait également contribuer à la
suppression des défenses de l’organisme lors d’une infection pulmonaire (Mancuso et al.,
2002).
Dans notre étude, nous avons tenté d’identifier par quels mécanismes un régime
enrichi pouvait interférer avec la réponse immunitaire normalement induite lors d’une
infection bactérienne, aussi bien au niveau périphérique que central. Ainsi, nous avons montré
que l’augmentation des taux plasmatiques d’IL-6 et de TNFα induite par l’administration de
LPS est exacerbée par la consommation d’un régime enrichi (Andre et al., 2008b), en accord
avec une étude précédente (Huang et al., 2007). De plus, le régime « cafétéria » potentialise
l’augmentation d’expression hypothalamique de l’ARNm de l’IL-6 induite par le LPS, alors
qu’il est sans effet significatif sur l’expression du TNFα et de l’IFNγ dans cette même
structure cérébrale (chapitre 1). Ces résultats étayent l’hypothèse de l’implication majeure de
l’IL-6 dans le développement de l’obésité (Yudkin et al., 2000) en agissant directement au
niveau hypothalamique où ses récepteurs sont exprimés, afin de moduler les dépenses
énergétiques (Shizuya et al., 1998). De plus, si les souris déficientes pour le gène de l’IL-6
développent une obésité, à l’inverse, l’administration centrale de l’IL-6 modifie cet état en
diminuant la masse adipeuse et augmentant les dépenses énergétiques (Wallenius et al., 2002).
213
Enfin, l’IL-6 agit sur les cellules cibles en activant la voie de transduction du signal
JAK/STAT, permettant ainsi la transcription d’un grand nombre de gènes dont SOCS-3.
L’augmentation de l’expression à la fois de SOCS-3 et de l’IL-6 dans l’hypothalamus 2 h
après l’administration de LPS est exacerbée chez les souris obèses. Etant donné que
l’implication sélective de l’IL-6 dans l’induction cérébrale de SOCS-3 par le LPS a été
démontrée (Lebel et al., 2000), nos résultats sont donc en faveur d’une relation directe entre le
développement de l’obésité induite par un régime enrichi et l’exacerbation de l’induction de
l’IL-6 et de SOCS-3 par le LPS.
Nous avons également mis en évidence que cette neuroinflammation est structuredépendante. En effet, la surexpression d’IL-6 n’est pas visible dans l’hippocampe alors que
dans cette structure, l’injection de LPS entraîne une exacerbation de l’expression du TNFα et
de l’IFNγ (chapitre 2).
En plus de la présence de facteurs inflammatoires dans la circulation sanguine et le
tissu adipeux, l’obésité est associée à une infiltration des macrophages contribuant à la
production de ces molécules inflammatoires (Cancello and Clement, 2006; Wellen and
Hotamisligil, 2003). Ainsi, une augmentation de l’expression de l’ARNm et de la protéine
plasmatique MCP-1 a été décrite dans un modèle d’obésité génétique, la souris ob/ob (Zhou et
al., 2007), ainsi que lors de l’utilisation de régime fortement enrichi en graisse (60 %) (Chen
et al., 2005). Dans notre modèle db/db, la sécrétion de MCP-1 est exacerbée en conditions
basales dans le tissu adipeux et dans le plasma, ce qui confirme les résultats obtenus dans
d’autres études (chapitre 4) (Sartipy and Loskutoff, 2003). Par contre, l’injection de LPS
n’exacerbe pas la production de MCP-1 chez les souris obèses par rapport aux témoins, que ce
soit dans le tissu adipeux ou dans le plasma. Il a pourtant été mis en évidence que le LPS
exacerbe la production de MCP-1 par le tissu adipeux chez les souris obèses ob/ob, mais ces
données ont été obtenues in vitro après addition de LPS sur des cultures de tissu adipeux
(Zhou et al., 2007).
Dans notre modèle DIO, les taux plasmatiques de MCP-1 ne sont pas modulés par le
régime en conditions basales ce qui confirme le statut d’obésité modérée. Par contre, le LPS
entraîne une forte augmentation des concentrations circulantes de MCP-1 24 h posttraitement, en accord avec l’étude de (Bobrowski et al., 2005) et potentialisée par le régime
(chapitre 1 et 2). Nous avons également montré dans les deux modèles (obésité modérée et
obésité morbide) que les taux de leptine plasmatiques sont plus importants chez les animaux
obèses que chez les standards, et dans ces deux situations l’administration de LPS entraîne
214
une augmentation 24 h post-traitement, comme précédemment décrit (Sarraf et al., 1997). De
plus, si le LPS induit une perte de poids d’environ 12 % (3-4 g) chez les animaux
consommant la nourriture standard (Andre et al., 2008b), cette perte est réduite de moitié chez
les souris obèses. Un effet de la leptine a été proposé car en plus de son rôle classiquement
décrit dans la régulation de la prise alimentaire et des dépenses énergétiques (Meyers and
Gokce, 2007), elle serait potentiellement impliquée dans l’anorexie et la perte de poids
consécutive à l’administration de cytokines inflammatoires (Luheshi et al., 1999). De plus, il a
été suggéré que la forte induction d’expression de SOCS-3 pouvait être le résultat d’une
augmentation des taux plasmatiques de leptine induite par le LPS (Howard and Flier, 2006) et
que le taux d’expression de SOCS-3 dans l’hypothalamus était un facteur essentiel à la mise
en place de la leptinorésistance classiquement associée à l’obésité (Howard and Flier, 2006;
Mori et al., 2004; Munzberg et al., 2004). Ainsi, le développement d’une leptinorésistance
dans notre modèle d’obésité modérée pourrait expliquer l’atténuation de la perte de poids
induite par le LPS chez les souris obèses comparées à celles consommant de la nourriture
standard. Cette hypothèse est confirmée par les résultats obtenus chez les souris db/db. En
effet, chez ces animaux qui présentent une leptinorésistance du fait de l’absence de récepteur
à la leptine, le même profil de perte de poids est observé.
Une forte induction de résistine est également observée chez les souris obèses DIO et
db/db 24h post-LPS. Ceci est en accord avec les résultats montrant que l’expression de
résistine est stimulée par les cytokines pro-inflammatoires (Kaser et al., 2003). Mais, si les
souris db/db présentent une diminution des taux plasmatiques de résistine en conditions
basales, ce qui confirme des données déjà obtenues dans d’autres études (Maebuchi et al.,
2003; Way et al., 2001), les souris DIO n’ont pas de diminution des taux de résistine en basal.
Il a été montré chez des souris C57Bl/6 ayant consommé un régime riche en lipides, une
diminution des taux plasmatiques de résistine (Maebuchi et al., 2003). Ces résultats semblent
donc confirmer l’état d’obésité modérée de notre modèle puisque notre régime enrichi
n’entraîne pas de diminution des taux circulants de résistine contrairement au régime
hyperlipidique, mais il entraîne tout de même une augmentation des taux de leptine.
La forte induction des taux plasmatiques de leptine et de résistine observée chez les
souris obèses, quelle que soit l’intensité de leur obésité, 24 h après-LPS, n’est cependant pas
visible au sein du tissu adipeux contrairement à certaines études reportant une induction de
l’expression de leptine 16 h après l’administration de LPS (Berkowitz et al., 1998; Faggioni et
al., 1998). Néanmoins, si ces dernières études montrent un effet du LPS au niveau
215
transcriptionnel, aucune modification au niveau protéique n’a été décrite, suggérant un turnover rapide de la protéine ou encore une sécrétion de la leptine vers la circulation sanguine
plutôt que localisée au sein du tissu adipeux. Il est également envisageable que les
modifications des taux de leptine induites par le LPS soient précoces et donc plus observables
24 h post-traitement.
En résumé, selon l’intensité de l’obésité, la sensibilisation du système de l’immunité
innée, dont les bases neurobiologiques restent à définir, ne se ferait pas de la même façon. En
effet, dans une situation d’obésité modérée, cet état latent particulier ne serait pas visible à
l’état basal, mais favoriserait le développement d’une réponse inflammatoire exacerbée lors
de l’infection de l’organisme par un agent pathogène. Par contre, dans une situation d’obésité
morbide, le système de l’immunité innée est activé en basal. Il est possible que sous l’effet
d’une infection, une exacerbation de la réponse puisse être observée, comme le suggère les
données obtenues avec la leptine et la résistine, mais il faudrait se placer 2 h après l’injection
de LPS pour pouvoir observer une exacerbation de la réponse cytokinergique.
Obésité et troubles du comportement et de la cognition
Ce travail de thèse a permis de mettre en évidence la présence de troubles du
comportement (anxiété) et de la cognition chez les animaux obèses. De plus, la double
approche obésité modérée – obésité morbide nous a permis d’une part d’identifier un schéma
temporel d’apparition des troubles, même si les modalités qui le sous-tendent, restent à
préciser, et d’autre part de corréler l’intensité de l’obésité à l’intensité des troubles.
La prise excessive de poids, et l’obésité qui peut en découler, induisent chez les
animaux étudiés des déficits mnésiques. Le test du labyrinthe en Y a été utilisé afin d’évaluer
la mémoire de travail des animaux. Ce test, qui met en jeu l’hippocampe (Conrad et al., 1996),
est basé sur l’attirance spontanée des souris pour les endroits nouveaux. Il présente divers
avantages dont celui de ne pas nécessiter d’apprentissage de la part des animaux, et celui de
ne pas exposer les souris à des conditions expérimentales trop stressantes. Ce test se
décompose en deux séquences séparées l’une de l’autre par un délai de 1 semaine. Le premier
test permet d’évaluer la capacité de réponse à la nouveauté des animaux (Dellu et al., 2000).
Dans ce paradigme, le délai de rétention entre l’acquisition (première exploration du
216
labyrinthe) et la restitution (retour dans le labyrinthe avec la possibilité d’explorer le bras
nouveau) est de 2 min. Ce délai court permet d’évaluer la motivation à la nouveauté des
animaux. Dans le cas d’une obésité modérée, les animaux obèses ne présentent pas de
troubles lors de la réalisation de ce test, ce qui permet de conclure que les animaux n’ont pas
d’altération de leur capacité de reconnaissance (chapitre 2). Par contre, les souris ayant
développées une obésité morbide ne sont plus capables de reconnaître le bras nouveau après
un délai de rétention de 2 min. L’obésité morbide paraît donc entraîner des troubles cognitifs
plus sévères que ceux associés à une obésité modérée (chapitre 4). En effet, les animaux
ayant obtenu une réponse normale lors du premier test (ITI de 2 min) sont de nouveau placés
dans le labyrinthe en Y, mais cette fois afin d’étudier leur mémoire de travail. Le délai de
rétention dans ce paradigme est alors de 30 min. Dans cette nouvelle situation, les animaux
DIO présentent des troubles de la mémoire de travail (chapitre 2). Ces résultats confirment
les données obtenues dans différentes études. Il a en effet été démontré que des rats recevant
un régime hyperlipidique présentent des altérations de leur capacité cognitive dans des tests
mettant en jeu la mémoire spatiale, mais également la mémoire procédurale et celle à court et
long terme (Winocur and Greenwood, 1999). Plus récemment, des études réalisées chez
l’homme ont montré une relation linéaire entre l'excès de poids et certaines capacités
cognitives (Cournot et al., 2006). Ainsi, notre travail confirme les études reliant obésité et
troubles cognitifs, mais il permet en plus de mettre en évidence une relation entre l’intensité
de l’obésité et l’intensité des troubles cognitifs. Dans une situation d’obésité modérée, nous
n’observons pas de signes visibles d’une inflammation à bas bruit. Seule la concentration
plasmatique de leptine est exacerbée chez les souris ayant consommé un régime enrichi. Il a
été démontré que la leptine n’aurait pas qu’un rôle dans les fonctions de régulation de la prise
alimentaire, mais elle serait également impliquée dans la modulation des performances
comportementales liées à l’apprentissage et à la mémoire (Oomura et al., 2006), ainsi qu’à la
réactivité émotionelle (Lu et al., 2006). De plus, il a récémment été montré que l’injection
intrapéritonéale d’insuline chez des souris entraîne l’apparition de troubles cognitifs (Akanmu
et al., 2008). Par contre, les souris db/db présentent un état inflammatoire à la fois en
périphérie mais également en central, notamment au niveau hippocampique. De plus,
l’altération de leur fonction cognitive est plus importante. L’inflammation hippocampique
observée dans cette situation d’obésité morbide pourrait être à l’origine des troubles cognitifs
comme certaines études l’ont montré. En effet, la neuroinflammation consécutive à
l’administration de LPS participerait à la mise en place de troubles cognitifs dans le cas de la
pathologie d’Alzheimer (Lee et al., 2008). De plus, un des mécanismes pouvant expliquer
217
l’action des cytokines cérébrales sur les performances cognitives est leur action sur la
plasticité synaptique. Ainsi, le TNFα affecte également la plasticité synaptique puisque
l’administration de TNFα au sein d’une tranche d’hippocampe inhibe la PLT au niveau du
champ CA1 (Tancredi et al., 1992) et du gyrus dentelé de façon similaire à l’effet de l’IL-1β
et du LPS (Cunningham et al., 1996). Enfin, il a récemment été montré que l’activation de la
microglie dans l’hippocampe et la production de TNFα induite par une inflammation
périphérique altérent la réactivité du système nerveux central (Riazi et al., 2008). Cette
activation microgliale, sous-tendue par la production de TNFα, et exacerbant l’excitabilité du
cerveau, a été proposé comme un mécanisme potentiel pouvant expliquer les changements
neurobiologiques associées à l’inflammation chronique (Riazi et al., 2008). D’autres études
seraient nécessaires pour vérifier si un mécanisme similaire pourrait expliquer les altérations
cognitives associées à l’obésité.
De plus, une injection de LPS entraîne des déficits mnésiques chez des souris minces
et pourrait aggraver les troubles déjà observés chez les souris obèses, une hypotyhèse qu’il
faudrait confirmer en utilisannt des tests d’ évaluation de la mémoire plus spécifique
(chapitre 2). Or, l’injection de LPS entraîne une neuroinflammation associée à la production
de cytokines inflammatoires notamment au niveau hippocampique. Cette production de
cytokines est exacerbée chez les souris obèses ayant recu une injection de LPS. Ces résultats
vont donc dans le sens de l’hypothèse d’un rôle des cytokines inflammatoires sur l’apparition
des troubles cognitifs. En effet, les cytokines, en activant l’IDO pourraient entraîner la
production de dérivés neurotoxiques, comme l’acide quinolinique, potentiellement impliqués
dans la mise en place d’altérations de la mémoire spatiale (Dairam et al., 2007).
Ainsi, l’excès de poids entraîne le développement de troubles cognitifs de façon
précoce. Ces troubles sont maintenus lors de la mise en place d’une obésité modérée et
s’aggravent lorsque l’intensité de l’obésité, et de la réaction inflammatoire associée,
augmente. Bien que le labyrinthe en Y soit un test efficace, simple, rapide et minimisant les
éventuelles interférences liées à des différences de motivation ou de réactivité émotionelle, il
serait également intéressant de compléter ces études en utilisant d’autres tests cognitifs, par
exemple le labyrinthe aquatique de Morris qui permet d’évaluer différents aspects de la
cognition dont les capacités d’apprentissage (Chen et al., 2000).
Un certain nombre de données convergentes suggère que les modifications
physiologiques induites par l’obésité pourraient contribuer à modifier la réactivité
218
comportementale provoquée par un stimulus émotionnel. En effet, si une forte prévalence des
troubles de l’humeur, ainsi qu’une réduction des taux plasmatiques de Trp, ont été décrites
chez des sujets obèses (Breum et al., 2003; McElroy et al., 2004; Scott et al., 2008), il a été
aussi montré que des modifications des concentrations de Trp altéraient l’état émotionnel des
patients (Sandyk, 1992). De plus, la déplétion aiguë en Trp par ingestion d’une boisson
appauvrie en Trp entraîne d’une part l’apparition d’altérations de l’humeur chez l’homme,
ainsi qu’une plus grande irritabilité ou agressivité (Young and Leyton, 2002), et d’autre part
le développement de troubles cognitifs (Lieben et al., 2004; Uchida et al., 2007).
Notre travail montre qu’en plus de troubles cognitifs, l’obésité participe à
l’instauration de symptômes de type anxieux chez les animaux (chapitre 3 et 4). Un lien entre
obésité et anxiété a récemment été montré via une étude réalisée sur des femmes obèses qui
montre que les sujets présentant une obésité sévère avaient déjà eu au cours de leur vie des
épisodes dépressifs et anxieux (Wadden et al., 2006). De plus, le risque de développer des
troubles de type anxieux est deux fois plus élevé chez des femmes obèses que chez des
femmes avec un faible IMC (Becker et al., 2001). Nos résultats vont donc dans le sens de ces
études puisque nous n’observons pas de symptômes de type anxieux chez les souris en
surpoids, mais seulement chez les animaux obèses. Il est donc intéressant de constater que ces
symptômes semblent se développer plus tardivement que les troubles cognitifs. Néanmoins,
bien que ces épisodes de type anxieux soient présents à la fois dans une situation d’obésité
modérée et d’obésité morbide, ils se mettent en place indépendamment de la présence
concomittante d’une situation inflammatoire à bas bruit. Dans le cadre de l’obésité modérée,
comme dans celle de l’obésité morbide, la leptinoresistance qui se développe chez les sujets
obèses pourrait participer à la mise en place des troubles anxieux. En effet, des études ont
démontré qu’une injection de leptine chez des souris ob/ob, qui ne possèdent donc pas le gène
codant pour la leptine, diminue l’anxiété chez ces souris (Asakawa et al., 2003). De plus,
l’insuline pourait également jouer un rôle dans la mise en place des troubles anxieux puisque
l’injection intrapéritonéale d’insuline chez des souris entraîne l’apparition de troubles de type
anxieux (Akanmu et al., 2008). La neuroinflammation qui apparaît ensuite dans l’obésité
morbide pourrait, via la production de cytokines inflammatoires et l’activation de l’IDO,
faciliter le maintien de ces troubles.
Dans nos deux modèles, nous n’observons pas d’épisodes de type dépressif
contrairement à ce qui est classiquement décrit dans la littérature (chapitre 1 et 4) (Stunkard
et al., 2003). La consommation du régime « cafétéria » n’entraîne pas de troubles
219
locomoteurs, comparé aux souris non obèses lors d’un test d’activité locomotrice effectué
dans un environnement très similaire à leur cage d’hébergement et donc peu stressant. Par
contre, les souris DIO obèses soumises au FST ont tendance à rester moins immobiles que les
animaux contrôles (chapitre 1). Les souris db/db présentent le même profil de réactivité
émotionnel que les souris DIO dans ce test (chapitre 4). L’exposition au FST est un
paradigme stressant pour les animaux (Cryan et al., 2002) et la diminution de l’immobilité des
souris obèses pourraient être le reflet d’une plus grande réactivité au stress induit par le test.
De plus, une hyperactivité similaire dans le FST reportée chez des souris soumises à un
régime carencé en Trp, étaye cette hypothèse (Uchida et al., 2005). L’administration de LPS
chez les animaux consommant la nourriture standard n’induit pas l’augmentation
d’immobilité habituellement décrite 24 h post-traitement et témoignant de la mise en place de
symptômes de type dépressif (Frenois et al., 2007; O'Connor et al., 2008). Puisqu’une
procédure identique a été respectée pour l’ensemble de ces études, une telle divergence
pourrait être due à l’utilisation de souches différentes de souris (souris consanguine :
C57Bl/6J vs souche non consanguine : CD-1), puisqu’il a été démontré que la mise en place
des symptômes de type dépressif dans le FST, ainsi que la sensibilité aux anti-dépresseurs,
dépendaient fortement de la souche utilisée (Lucki et al., 2001). De plus, des souris C57Bl/6J
stressées et exposées au FST présentent une diminution de l’immobilité comparée aux
animaux non stressés (Thoeringer et al., 2007). L’ensemble de ces données conforte
l’hypothèse selon laquelle le comportement particulier des souris dans notre étude reflèterait
plus une altération de la réactivité émotionnelle au stress induit par le test et/ou à la
stimulation immune par le LPS, qu’un comportement de type dépressif qui pourrait apparaître
peut être plus tardivement, après plusieurs expositions au test (Renault and Aubert, 2006).
Cette hypothèse est confortée par le fait que cette souche de souris (C57Bl/6J) possède une
faible sensibilité aux anti-dépresseurs (Lucki et al., 2001). De plus, il a été montré dans le
laboratoire que l’induction d’IDO 24 h post-traitement chez la souris CD-1 était responsable
du développement des symptômes de type dépressif induit par le LPS (O'Connor et al., 2008).
Néanmoins, l’absence d’augmentation de l’activité cérébrale de l’IDO 24 h post-injection
chez la souris C57Bl/6J mince pourrait expliquer que les symptômes de type dépressif ne
soient pas encore mis en place.
Ainsi, l’obésité est associée à un certain nombre de troubles du comportement et de la
cognition qui apparaissent consécutivement, mais qui s’ajoutent les uns aux autres. Ainsi, les
troubles cognitifs, qui se développent avec le surpoids, s’aggravent avec l’intensité de
220
l’obésité et s’accompagnent alors de la mise en place d’épisodes de type anxieux. Bien que
nous n’ayons pas pu mettre en évidence de troubles de type dépressif, mais seulement une
altération de la réactivité émotionnelle dans le protocole expérimental choisi, il se peut que
notre schéma expérimental ne laisse pas le temps aux troubles dépressifs de se mettre en
place. En effet, les épisodes dépressifs, souvent consécutifs aux épisodes anxieux (Capuron et
al., 2001), pourraient apparaître plus tardivement (figure 11).
30
25
Obésité
morbide
Obésité
modérée
Surpoids
IMC
40
Troubles
cognitifs
Troubles
cognitifs
Troubles
cognitifs
altération de la
mémoire
spatiale
altération de la
mémoire spatiale
pas de reconnaissance
immédiate
Troubles
anxieux
Troubles
anxieux
Pas de troubles
anxieux
Troubles
dépressifs ?
Figure 11 : Ciné
Cinétique de l’l’apparition des troubles
Les acteurs biologiques mis en jeu
Implication de l’IDO
Une diminution des taux plasmatiques de Trp, fréquemment décrite chez des patients
souffrant d’un certain nombre d’infections, de maladies autoimmunes ou de cancers
(Schrocksnadel et al., 1996), a également été observée chez des sujets atteints d’obésité
morbide (Breum et al., 2003), suggérant une activation de l’IDO dans la pathologie de
221
l’obésité (Brandacher et al., 2007; Brandacher et al., 2006). Dans notre étude, l’activité
enzymatique périphérique de l’IDO, reflétée par le rapport KYN/Trp mesuré dans le poumon,
n’est pas modifiée chez les souris ayant consommé le régime « cafétéria » comparé aux souris
contrôles, bien qu’on observe néanmoins une réduction non significative des taux de Trp chez
les souris obèses (données non montrées) (chapitre 1). Par contre, chez les souris db/db, le
rapport KYN/Trp évalué dans les poumons est diminué, tandis que ce même rapport mesuré
dans le foie est augmenté (chapitre 4). Ces résultats semblent refléter une diminution de
l’activité enzymatique de l’IDO dans les poumons, mais cette modulation de l’activité de
l’IDO périphérique n’a pas de conséquences centrales, puisque le rapport KYN/Trp mesuré
dans le cerveau est le même chez les souris db/db et chez les souris témoins.
Ainsi, si nos modèles ne permettent pas de mettre en évidence une augmentation de
l’activité de l’IDO en conditions basales, la consommation du régime « cafétéria »
potentialise la forte augmentation de l’activité de l’IDO induite par le LPS et précédemment
décrite dans le poumon et le cerveau (Andre et al., 2008b; O'Connor et al., 2008). Elle
entraîne également une forte expression cérébrale de l’ARNm de l’IDO 24 h post-traitement,
alors que cette expression n’est pas détectable chez les animaux consommant la nourriture
standard (chapitre 1 et 2). Etonnement, cette exacerbation de l’activité de l’IDO dans le
cerveau et le poumon ne se retrouve pas chez les animaux db/db ayant reçu une injection de
LPS (données non montrées), mais il est possible d’envisager que, de façon similaire à la mise
en place de troubles de type dépressifs, l’activation de l’IDO soit plus tardive. Afin de vérifier
cette hypothèse, il serait nécessaire de réaliser une cinétique détaillée d’activation de l’IDO
après une infection systémique chez ces souris db/db. Par contre, chez les souris présentant
une obésité modérée, l’expression de l’IDO est fortement induite 2 h après administration de
LPS dans l’hypothalamus, structure jouant un rôle clé dans la régulation de la balance
énergétique via l’action de la leptine (Friedman, 2002; Shizuya et al., 1998) et important site
de production de cytokines cérébrales lors de l’activation périphérique du SI (Castanon et al.,
2004; Dantzer et al., 2008; Laye et al., 1994), mais également dans l’hippocampe, structure
impliquée dans les processus d’apprentissage et de mémorisation (Gluck et al., 2003; Wirth et
al., 2003).
Des études récentes ont montré que la réponse immunitaire systémique d’enfants obèses
était déviée vers une réponse de type Th1, favorisant la production d’IFNγ et corrélée au
développement d’une insulinorésistance (Pacifico et al., 2006). De même, en plus de son rôle
dans le contrôle du poids, la leptine est capable de moduler le phénotype des cellules T CD4+
222
vers un phénotype Th1 (Farooqi et al., 2002), suggérant l’implication de l’IFNγ dans
l’activation de l’IDO dans l’obésité. Cependant, tandis que l’injection périphérique de LPS
entraîne une forte induction de l’expression de l’ARNm du TNFα, de l’IFNγ et de l’IL-6
comme précédemment décrit (Andre et al., 2008b), cette dernière est la seule cytokine dont
l’expression est exacerbée par le régime « cafétéria » dans l’hypothalamus, suggérant donc un
rôle particulier de l’IL-6 dans l’induction de l’IDO dans cette structure (chapitre 1). Par
contre, ces trois cytokines ont une expression hippocampique exacerbée dans le modèle
d’obésité morbide et ceci en situation non stimulée (chapitre 4). L’étude, au sein du
laboratoire, des profils d’expression de ces différentes cytokines a permis de suggérer un rôle
potentiel de l’IL-1β et du TNFα plutôt que de l’IL-6, dont l’expression très transitoire semble
peu compatible avec son implication dans l’induction de l’IDO par le LPS (Andre et al.,
2008b). Cependant, une association entre les concentrations soutenues d’IL-6 plasmatiques
chez les souris âgées et l’activation cérébrale de l’IDO en réponse au LPS a récemment été
montrée (Godbout et al., 2008), étayant ainsi l’hypothèse de l’implication de cette cytokine
dans l’induction de l’IDO dans certaines conditions d’inflammation chronique. Une action
synergique des cytokines inflammatoires dont l’IL-1β, le TNFα et l’IL-6 dans l’induction de
l’IDO par le LPS ou l’IFNγ a également été proposée in vitro (Fujigaki et al., 2006; Robinson
et al., 2003). Ainsi, dans l’hypothalamus, l’IL-6 semble être la cytokine majoritairement
impliquée dans l’activation de l’IDO par le LPS dans une situation d’obésité modérée
(chapitre 1). Par contre, l’induction de l’IDO dans l’hippocampe serait quant à elle
dépendante d’autres cytokines, puisque l’expression de l’IL-6 dans l’hippocampe n’est pas
exacerbée chez les souris DIO. Si l’IFNγ est considérée comme la principale cytokine
impliquée dans l’activation de l’IDO, des études ont proposé que son induction par le LPS
soit sous-tendue par un mécanisme indépendant de l’IFNγ mais impliquant le TNFα (Fujigaki
et al., 2001; Saito and Heyes, 1996), qui lui a une expression hippocampique exacerbée en
situation d’obésité modérée (chapitre 2). Enfin, dans l’obésité morbide, bien que nous
n’observions pas d’activation exacerbée de l’IDO dans l’hippocampe, il est envisageable
qu’une action synergique des différentes cytokines étudiées puisse activer l’IDO, et cela peut
être dans une autre structure comme l’hypothalamus (chapitre 4).
Ainsi, ce travail a permis de montrer que dans une situation d’obésité modérée, une
infection systémique va entraîner une exacerbation de l’activité et de l’expression de l’IDO
périphérique et central. De plus, bien qu’il ait déjà été démontré l’implication de l’IFNγ et du
TNFα dans l’activation de l’enzyme, notre étude permet d’une part d’identifier une
223
expression différentielle selon les structures, et d’autre part de mettre en évidence le rôle de
l’IL-6 dans l’expression de l’IDO hypothalamique des animaux obèses. Enfin, en situation
d’obésité morbide, l’activité de l’IDO ne semble pas être exacerbée mais il serait nécessaire
d’approfondir les études portant sur la réactivité du système à une infection, notamment en
évaluant la cinétique d’expression de l’IDO après injection.
In vitro, de fortes concentrations de glucocorticoïdes stimulent l’activation de l’IDO
induite par l’IFNγ, favorisant ainsi son activité anti-microbienne (Turck et al., 2005). Chez les
souris ayant une obésité modérée, la forte production plasmatique de corticostérone pourrait,
de façon similaire, être impliquée dans l’induction exacerbée de l’IDO (chapitre 1). Dans la
situation d’obésité morbide, l’hypercorticostéronémie observée n’est pas associée à une
activation exacerbée de l’IDO cérébrale (chapitre 4), mais une étude par structure permettrait
de confirmer ou de moduler ce résultat. Il a été montré que l’administration de LPS entraîne
chez des rats surrénalectomisés, une mortalité supérieure aux animaux sham (Nakano et al.,
1987), suggérant donc l’implication des glucocorticoïdes dans la forte sensibilité aux
infections chez les souris obèses. Ainsi, le régime « cafétéria » semble interférer avec la
capacité du SI à répondre de façon appropriée lors d’une infection bactérienne, mimée par
l’administration de LPS, en entraînant une production centrale et périphérique exacerbée de
cytokines inflammatoires, qui en activant l’IDO pourrait être responsable de la mise en place
des troubles de l’humeur et de la cognition associés à l’obésité (Baran et al., 1999; McElroy et
al., 2004; Scott et al., 2008). En effet, il a été montré que la diminution des concentrations en
tryptophane et donc en 5-HT induisait la mise en place de troubles de type anxieux, de type
dépressifs et de troubles cognitifs (Lieben et al., 2004; Olivier et al., 2008; Uchida et al.,
2007). De plus, les dérivés neurotoxiques produits par l’activation de l’IDO comme la QUIN
pourrait également participer à l’établissement de tels troubles (Baran et al., 1999; Heyes et
al., 1989; Ogawa et al., 1992). Dans notre modèle d’obésité DIO, la diminution de
concentration en 5-HT exacerbe les troubles cognitifs observés en conditions basales,
confirmant les données de la littérature. Mais l’établissement de ces troubles cognitifs, ainsi
que des troubles anxieux, semble indépendant de l’activation de l’IDO, suggérant
l’implication d’autres vois moléculaires comme celle de la leptine. Dans le cas de l’obésité
morbide, la situation inflammatoire qui se met en place en conditions basales, pourrait elle
aussi moduler l’activité de l’IDO, bien que cette action soit moins clairement établie.
224
Implication de l’axe HPA
Chez l’homme, l’obésité est associée à un grand nombre de pathologies co-morbides
dont le syndrome de Cushing, se caractérisant par un excès de sécrétion de glucocorticoïdes
(Fraser et al., 1999; Marin et al., 1992; Salehi et al., 2005). La réduction significative de la
masse adipeuse chez des souris ob/ob surrénalectomisées (Dubuc et al., 1986) suggère une
relation étroite entre l’axe HPA et le développement du tissu adipeux. La consommation du
régime « cafétéria » n’entraîne pas d’altérations des taux plasmatiques de corticostérone en
conditions non stimulées (chapitre 1 et 2), contrairement à ce que l’on observe chez les
souris db/db (chapitre 4). Cette hyperactivation de l’axe HPA dans une situation d’obésité
morbide est confirmée par certaines études précédentes réalisées chez des patients souffrant
d’obésité morbide (Duclos et al., 2005; Marin et al., 1992) ou chez l’animal consommant un
régime enrichi entraînant une obésité associée à une insulinorésistance (Moraes et al., 2003).
Toutefois, la forte sécrétion de glucocorticoïdes induite par une injection de LPS (Wolf, 2002)
est exacerbée chez les souris consommant le régime « cafétéria » (chapitre 1 et 2), suggérant
une plus grande réactivité de l’axe HPA aux infections. Cette plus grande activation de l’axe
HPA pourrait être induite en réponse à la forte augmentation des taux plasmatiques de l’IL-6
observée chez les souris obèses (chapitre 1 et 2). En effet, un certain nombre d’études décrit
une relation étroite entre l’activation de l’axe HPA et la production de cytokines. Il a
notamment été décrit que l’activation chronique de l’axe HPA favoriserait le développement
d’une obésité viscérale, entraînant ainsi la production de cytokines inflammatoires par le tissu
adipeux. Réciproquement, la libération excessive de ces cytokines stimule l’axe HPA,
formant ainsi un cercle vicieux délétère (Kyrou et al., 2006). L’activation de l’axe HPA par
les cytokines inflammatoires résulte en la sécrétion de corticostérone qui réduit les
concentrations plasmatiques d’IL-6 chez l’homme, ainsi que l’expression de son ARNm
induite par le LPS (Schobitz et al., 1993). De plus, la forte production de leptine pourrait
également contribuer à l’hyperactivation de l’axe HPA. En effet, il a été montré que l’ablation
des glandes surrénales réduit les taux plasmatiques de leptine chez le rat, tandis que l’effet est
supprimé
par
l’administration
de
corticostérone
(Spinedi
and
Gaillard,
1998).
Réciproquement, l’hypercortisolémie observée chez des souris ob/ob (Garthwaite et al.,
1980) peut être inhibée par l’administration de leptine (Stephens et al., 1995). Ainsi,
l’ensemble de ces données soutient fortement l’existence d’une relation bidirectionnelle entre
l’axe HPA et le tissu adipeux sécrétant les cytokines et la leptine. Ainsi, la dérégulation du SI
entraînerait une hyperactivation de l’axe HPA, une des cibles d’action des facteurs
225
inflammatoires, et ceci en réponse à une infection dans le cas d’une obésité modérée ou en
situation basale lors d’une obésité morbide.
Ainsi, les souris obèses présentent une production exacerbée de cytokines
inflammatoires et de corticostérone et ceci de façon corrélée à l’intensité de l’obésité. En
effet, dans le cas d’une obésité modérée, cette exacerbation apparaît en réponse au LPS, tandis
que cette situation inflammatoire est observée en situation basale dans le cas d’obésité
morbide. Cet hyperactivation des cytokines et de l’axe HPA pourrait être responsable d’une
plus grande vulnérabilité pouvant aboutir au développement de processus pathologiques tels
que l’apparition de troubles de l’humeur en réponse à un stress ou à une infection
supplémentaire (Bale, 2006; Firk and Markus, 2007) ou de troubles de la cognition (Baran et
al., 1999; King et al., 2008; Pomara et al., 2003).
En conclusion, l’ensemble de ces résultats indique que les modulations immunes et
comportementales observées dans l’obésité sont corrélées à l’intensité de l’obésité, c'est-àdire l’importance de la prise de poids et de ces conséquences neurobiologiques et à
l’apparition de pathologies comorbides (figure 12).
Obésité
modérée
Obésité
morbide
LPS ip
Inflammation
Pas activation HPA
Pas activation IDO
Activation HPA
Activation IDO
LPS ip
Inflammation
Activation HPA
Pas activation IDO
Inflammation
Activation HPA
Atténuation IDO
Figure 12 : L’
L’inflammation est associé
associée à des modifications neuroendocrines
et neurochimiques
226
Malgré l’absence d’inflammation à bas bruit classiquement associée à l’obésité morbide
décrite chez l’homme, l’obésité induite par notre régime enrichi interfère avec la capacité du
SI à répondre de façon appropriée à une infection. Par contre, les souris db/db présentent une
inflammation à bas bruit, confirmant ce que l’on observe habituellement dans les obésités
morbides. Ces données sont à rapprocher des études réalisées sur des modèles animaux de
maladies neurodégénératives telles que la maladie d’Alzheimer ou le prion. Dans de tels
modèles, l’inflammation cérébrale est sous-tendue par l’activation chronique de la microglie
et se caractérise par une expression des cytokines cérébrales faible ou inexistante en
conditions basales (Walsh et al., 2001). Néanmoins, lorsque ces animaux sont soumis à une
injection de LPS, ces cellules induisent une production exacerbée de ces mêmes cytokines
(Cunningham et al., 2005). Ces résultats sont également observés chez des animaux âgés dont
la situation inflammatoire est assez similaire à la situation observée dans le cas de l’obésité
(Cunningham et al., 2008). Ce phénomène est appelé « priming »: lors de l’apparition d’une
pathologie à composante inflammatoire chronique, la microglie cérébrale sensibilisée par la
faible production de cytokines qui en résulte, peut alors basculer dans un état d’inflammation
actif et entraîner la production accrue de cytokines. Afin de déterminer si un tel phénomène a
lieu dans nos deux modèles d’obésité, il serait nécessaire de poursuivre par une étude de l’état
d’activation de la microglie. La mise en évidence de ce phénomène pourrait constituer un
facteur prédictif pour la prévention du développement des pathologies associées à l’obésité.
227
228
Conclusion et perspectives
229
230
Conclusion et perspectives
Au cours de ce travail de thèse, nous avons mis en évidence le rôle clé de
l’inflammation associée à l’obésité dans le développement des troubles de l’humeur et de la
cognition. Nous avons pu montré que l’intensité de la perturbation du système immunitaire est
corrélée au degré d’obésité, puisqu’une obésité modérée est associée à une altération de la
capacité du système immunitaire à répondre à une infection (chapitre 1 et 2), tandis qu’une
obésité morbide entraîne la mise en place d’un état inflammatoire même en conditions non
stimulées (chapitre 4). De plus, les modifications physiopathologiques induites par le
développement d’un état d’obésité altèrent le système immunitaire, comme en témoignent
l’activation accrue de la production de cytokines périphériques et cérébrales, en particulier
l’IL-6, l’exacerbation des réponses neurochimiques (stimulation de l’IDO pulmonaire et
cérébrale) et neuroendocriniennes (sur-activation de l’axe HPA) et de leurs conséquences sur
la réactivité comportementale. Enfin, les souris obèses présentent des altérations de leurs
capacités cognitives (chapitre 2 et 4), des troubles de type anxieux (chapitre 3 et 4), ainsi
qu’une modulation de leur réponse émotionnelle (chapitre 1 et 4) dont la mise en place dans
le temps semble se faire de façon indépendante, selon des modalités qui restent à préciser
(figure 13).
Nous avons montré que l’obésité est associée à une modulation du système
immunitaire. Lorsque l’obésité est modérée, nous n’observons pas d’inflammation à bas bruit
mais le système va répondre de façon exagérée à une infection. Quand la gravité de l’obésité
augmente, comme dans les obésités morbides, l’inflammation à bas bruit est alors visible sans
qu’aucune infection ne soit venue restimuler le système.
231
Troubles de l’humeur
Troubles de la cognition
-
Trp
5-HT
IDO
SNC
QUIN
3OH-KYN
KYN
Cytokines
Inflammatoires
Trp
-
IL-6
IFNγ
TNFα
IDO
Cytokines
Inflammatoires
Périphérie
?
insuline
Surpoids
-
Infection
Obésité modérée
Obésité morbide
TA
Figure 13 : Sché
Schéma ré
récapitulatif
3OH-KYN: 3-hydroxykynurénine, 5-HT: Sérotonine, IDO: Indoléamine 2,3-dioxygénase, QUIN: Acide quinolinique,
TA: Tissu adipeux, Trp: Tryptophane, SI: Système immunitaire, SNC: Système nerveux central
L’inflammation chronique associée aux maladies neurodégénératives telles que la
maladie d’Alzheimer ou du prion, le diabète de type 2, pourrait être responsable du
développement des troubles de l’humeur lors d’une stimulation aiguë périphérique du SI par
un processus de « priming ». En effet, il a été montré que ces pathologies étaient associées à
une augmentation du nombre de cellules microgliales cérébrales (Perry et al., 2007) qui,
sensibilisées par l’inflammation chronique, basculent dans un état d’inflammation actif et
induisent alors une production accrue de cytokines inflammatoires. Par exemple, les
232
macrophages exposés à l’IFNγ seront alors dans un état « latent » se caractérisant par une
exacerbation de l’expression membranaire des récepteurs de la famille des TLRs et de
l’activation des voies de signalisation associées (Dantzer et al., 2008). Ainsi, un second
stimulus tel que le LPS entraînera l’activation des cellules et une réponse inflammatoire
exacerbée. Dans ces conditions inflammatoires chroniques, une décompensation des
mécanismes régulant le comportement de maladie pourrait avoir lieu, entraînant la mise en
place d’une symptomatologie dépressive. Il serait donc intéressant de déterminer si un tel
processus pourrait être envisagé dans notre contexte d’obésité modérée où nous avons mis en
évidence une plus grande vulnérabilité des animaux aux infections, mais également dans notre
modèle d’obésité morbide qui s’accompagne de pathologies comme le diabète de type 2.
L’étude de l’activation microgliale cérébrale chez les souris consommant le régime
enrichi et chez les souris db/db serait une suite logique et nécessaire à l’identification des
mécanismes impliqués dans la sensibilisation du SI. Des premiers résultats portant sur
l’expression hippocampique de TLR4 et TLR2 montrent que dans notre modèle d’obésité
modérée, l’expression des récepteurs est la même chez les souris obèses et chez les souris
minces, que ce soit en basal ou 24 h après l’injection de LPS (chapitre 4), mais il serait
nécessaire de regarder cette expression des récepteurs d’une part dans les 2 h qui suivent
l’infection et d’autre part dans une autre structure comme l’hypothalamus. En situation
d’obésité morbide, nous ne mettons pas en évidence de différence d’expression des récepteurs
en situation basale mais il reste à étudier leur expression après une infection sytémique
induisant une forte activation de la microglie.
De plus, l’inflammation centrale observée peut être le résultat de l’exacerbation de
l’inflammation périphérique et donc de l’augmentation de la production de cytokines
périphériques. Afin d’évaluer l’impact de l’inflammation périphérique sur l’expression
centrale des cytokines, il serait interesser d’évaluer l’expression centrale des récepteurs de
l’IL-6, la cytokine principalement produite dans nos modèles d’obésité.
Enfin, il serait interessant d’évaluer la concentration plasmatique et l’expression du
récepteur p75 soluble du TNF puisque de récentes données montrent qu’il est un des premiers
marqueurs inflammatoires affectés dans une situation d’inflammation chronique (Morlat et
al., 2008). Cette mesure nous permettrait éventuellement d’identifier la mise en place d’un
état inflammatoire dans un contexte d’obésité modérée.
233
Nous avons également montré que ces situations d’obésité s’accompagnent d’une
activation de l’IDO et de l’axe HPA, ainsi que de troubles de l’humeur et de la cognition. Or
l’activation de l’IDO va entraîner d’une part la dégradation du Trp au détriment de la
sérotonine, mais d’autre part la production de composés neuroactifs issus de la dégradation du
Trp tels que le QUIN et le 3OH-KYN. Il a été montré que ces composés neurotoxiques
favoriseraient la libération de radicaux libres entraînant la mort neuronale décrite dans les
pathologies neurodégénératives telles que la maladie d’Alzheimer, la malaria, le VIH (Burudi
et al., 2002; Guillemin et al., 2005b; Hansen et al., 2000). Ainsi, l’administration de KYN
entraîne la mise en place de troubles de l’humeur, de façon dose-dépendante (O'Connor et al.,
2008). De plus, le QUIN est un agoniste des récepteurs glutamatergiques NMDA et un certain
nombre d’études indique une perturbation de la neurotransmission glutamatergique dans la
symptomatologie dépressive (Muller and Schwarz, 2007). Ainsi, l’administration de MK-801,
antagoniste des récepteurs NMDA et connu pour diminuer la durée d’immobilité dans le FST
(Maj et al., 1992), pourrait être envisagée pour vérifier le rôle du QUIN dans l’apparition des
troubles de l’humeur lors d’une stimulation du SI. De plus, il a été montré que les cerveaux
des patients atteints de maladie d’Alzheimer présentent un métabolisme de la kynurénine
élevé. Le blocage des récepteurs NMDA par la KYNA pourrait être responsable de
l’altération de la mémoire, de l’apprentissage et de la cognition chez les patients atteints
d’Alzheimer (Baran et al., 1999). Afin de vérifier l’implication des différents composés
neuroactifs issus de la dégradation du Trp dans le développement des troubles de l’humeur et
de la cognition, il serait intéressant de mesurer l’état d’activation et d’expression des
différentes enzymes impliquées dans la voie de la KYN telles que la kynurenine 3hydroxylase ou la kynurenine aminotransférase dans nos différents modèles, ainsi que les
conséquences potentielles de leur blocage sur la mise en place des différents troubles
comportementaux associés à l’obésité. Des données préliminaires semblent indiquer une
augmentation de l’expression de kynurenine 3-hydroxylase, plutôt neurotoxique, au détriment
de celle de kynurenine aminotransférase, neuroprotectrice (Connor et al., 2008).
Enfin, nous avons montré que l’intensité des troubles du comportement observés était
corrélée à l’intensité de l’obésité et que ces troubles apparaissaient selon un décours temporel
particulier dont les modalités restent à préciser. Afin de mieux appréhender cette évolution
des troubles, il serait intéressant de réaliser une étude cinétique en analysant les paramètres
immunitaires, neuroendocriniens et neurochimiques à différents moments clés du
développement. De plus, comme l’intensité de l’obésité a un impact sur le développement des
234
troubles, l’étude des conséquences de l'obésité et de l'inflammation au cours du
développement pré- et post-natal sur l'humeur et les performances cognitives de la
descendance semble être particulièrement intéressante. En effet, au cours de la période
néonatale, le cerveau du foetus est particulièrement sensible aux infections et surexprime dans
ce cas des cytokines inflammatoires. Ce taux anormalement élevé de cytokines
inflammatoires altère l’activité de nombreux systèmes de neurotransmission jouant un rôle clé
lors du développement (Barkhudaryan and Dunn, 1999). Il a également un effet neurotoxique
(Cai et al., 2000; Hagberg and Mallard, 2005; Urakubo et al., 2001) notamment via
l’établissement d’une boucle d’amplification impliquant les radicaux libres oxygénés (Malek
et al., 2001) auxquels le cerveau est particulièrement sensible puisqu’il est pauvre en enzyme
anti-oxydante (Nishida et al., 1994). De plus, il a été montré que les cerveaux de rats
nouveaux-nés étaient sensibles à l’action d’inhibiteur de la kynurenine 3-hydroxylase
favorisant alors la production d’acide kynurénique (Ceresoli-Borroni et al., 2007).
Les
premiers résultats que nous avons obtenus dans ce type d’expériences montrent que chez des
souris issues de mères obèses ayant reçu un régime enrichi, des troubles cognitifs se mettent
en place précocement chez les souris mâles, mais pas chez les femelles. De plus, dans l’état
actuel de nos résultats, nous n’observons pas de troubles de type anxieux ce qui laisse
suggérer que, comme nous l’avons décrit dans ce travail de thèse, les symptômes de type
anxieux apparaissent plus tardivement.
En conclusion, ces résultats originaux permettent de mettre en évidence le rôle clé de
l’inflammation associée à l’obésité dans le développement des troubles de l’humeur et de la
cognition. L’élargissement de cette étude par les perspectives évoquées précédemment
pourrait ainsi contribuer à l’identification de cibles moléculaires potentielles pour le
développement de nouvelles stratégies thérapeutiques ou nutritionnelles visant à améliorer la
qualité de vie des patients obèses et prévenir au mieux le développement des pathologies
comorbides associées à l’obésité.
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Publications et communications
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Publications
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Dinel A-L, André C, Layé S and Castanon N. “Anxiety-like disorders are associated with
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Dinel A-L, André C, Layé S and Castanon N. “Obesity-induced inflammation is associated
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Communications orales
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Scientific Seminar of Danone Institute, November 2008
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2008
Communications affichées
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282
Abréviations
283
284
3-HK
5-HT
ACTH
AgRP
ATP
AVP
BHE
BMI
COX-2
CRH
CRP
DA
DIO
DSM
EBP
EPM
FST
GC
GHSs
HPA
IDO
IFN
IL
IMC
ITI
JAK
KMO
KYN
KYNA
LPS
MAPK
MCP-1
NA
NAD
NDMA
NDRI
NFkB
NK
NPYP
NTS
OCV
OF
OMS
PAMPS
PGE2
PI3K
PLT
POMC
PPAR
PRR
3-hydroxykynurénine
sérotonine
adrenocorticotropin hormone
agouti-related protein
adénosine triphosphate
arginine vasopressine
barrière hématoencéphalique
Body Mass Index
cyclooxygénase 2
corticotropin releasing hormone
protéine C-réactive
dopamine
diet-induced obesity
diagnostic and statistical manual of mental disorders
enhancer binding proteins
Elevated Plus Maze
forced swim test
glucocorticoïde
sécrétagogues de l'hormone de croissance
axe hypothalamo-hypophyso-corticosurrénalien
indoléamine 2,3-dioxygénase
interferon
interleukine
indice de masse corporelle
interval inter-trial
janus kinase
kynurénine-3-monooxygénase
kynurénine
acide kynurénique
lipopolysaccharide
mitogen-activated protein kinase
monocyte chemoattractant protein-1
noradrénaline
nicotinamide adénine dinucléotide
N-méthyl D-aspartate
noradrenaline and dopamine reuptake inhibitor
nuclear factor kappa B
natural killer
neurones à neuropeptide Y
noyau du tractus solitaire
organes circumventriculaires
open-field
Organisation Mondiale de la Santé
pathogen-associated molecular patterns
prostaglandines E2
phosphatidylinositol 3-kinase
potentialisation à long terme
pro-opiomélanocortine
peroxisome proliferator activated receptor
pattern-recognition receptors
285
PVH
QUIN
SI
SNC
SNRI
SOCS
SSRI
STAT
TDO
TGF
TLR
TNF
Trp
TST
α-MSH
noyau paraventriculaire
acide quinolinique
système immunitaire
système nerveux central
serotonin-noradrenaline reuptake inhibitor
suppressor-of-cytokine signaling
selective serotonin reuptake inhibitor
signal transducer and activator of transcription
tryptophane 2-3-dioxygénase
transforming growth factors
toll-like receptors
tumor necrosis factors
L-tryptophane
tail suspension test
α-melanocyte-stimulating hormone
286
Index des figures
287
288
Figure 1 : La réponse inflammatoire
Figure 2 : L’axe hypothalamo-hypophyso-corticosurrénalien
Figure 3 : Les différents types de mémoire
Figure 4 : Les voies de catabolisme du Tryptophane
Figure 5 : La voie de la Kynurenine
Figure 6 : La répartition de la masse grasse chez la femme et chez ’homme
Figure 7 : La prise alimentaire
Figure 8 : L’obésité, une pathologie inflammatoire chronique
Figure 9 : Voie de signalisation associée à la leptine et à l’IL-6
Figure 10 : Obésité – Inflammation - Troubles
Figure 11 : Cinétique d’apparition des troubles
Figure 12 : L’inflammation est associée à des modifications neuroendocrines et
neurochimiques
Figure 13 : Schéma récapitulatif
Figure complémentaire : Concentrations en cytokines et adipokines évaluées dans le tissu
adipeux par Luminex.
289
290