EVALUACIÓN DE LA ACTIVIDAD ANTIMICROBIANA DE

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EVALUACIÓN DE LA ACTIVIDAD ANTIMICROBIANA DE
EVALUACIÓN DE LA ACTIVIDAD ANTIMICROBIANA DE FRACCIONES Y
SUBFRACCIONES OBTENIDAS A PARTIR DE HOJAS DE Elaeagia utilis SOBRE
Streptococcus mutans, Streptococcus sobrinus y Lactobacillus acidophilus
JENNYFER ANDREA ALDANA MEJÍA
TRABAJO DE GRADO
Presentado como requisito para optar por al título de
BIÓLOGA
PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA
FACULTAD DE CIENCIAS
CARRERA DE BIOLOGÍA
2.010
I
EVALUACIÓN DE LA ACTIVIDAD ANTIMICROBIANA DE FRACCIONES Y
SUBFRACCIONES OBTENIDAS A PARTIR DE HOJAS DE Elaeagia utilis SOBRE
Streptococcus mutans, Streptococcus sobrinus y Lactobacillus acidophilus
JENNYFER ANDREA ALDANA MEJÍA
___________________________
INGRID SCHULER Ph.D.
Decana Académica
Facultad de Ciencias
______________________________
ANDREA FORERO
Directora Carera de Biología
Facultad de Ciencias
II
EVALUACIÓN DE LA ACTIVIDAD ANTIMICROBIANA DE FRACCIONES Y
SUBFRACCIONES OBTENIDAS A PARTIR DE HOJAS DE Elaeagia utilis SOBRE
Streptococcus mutans, Streptococcus sobrinus y Lactobacillus acidophilus
JENNYFER ANDREA ALDANA MEJÍA
APROBADO
_____________________________
_______________________________
FREDY GAMBOA Ph.D.
NOHEMÍ TÉLLEZ ALFONSO Dr. Sc.
DIRECTOR
PAR ACADÉMICO
III
NOTA DE ADVERTENCIA
Artículo 23 de la resolución No 13 de Julio de 1946
“La Universidad no se hace responsable por los conceptos emitidos por sus alumnos en sus
trabajos de tesis. Sólo velará por que no se publique nada contrario al dogma y a la moral
católica y por que las tesis no contengan ataques personales contra persona alguna, antes bien se
vea en ellas el anhelo de buscar la verdad y la justicia”.
IV
AGRADECIMIENTOS
A la Doctora Nohemí Téllez y al Doctor Fredy Gamboa, por su asesoría y apoyo.
Al Grupo de Investigación en Fitoquímica de la Pontificia Universidad Javeriana (GIFUJ), y al
Centro de Investigaciones Odontológicas por permitir el desarrollo de este trabajo en sus
laboratorios.
A la Pontificia Universidad Javeriana, por la financiación de este proyecto.
A Andrea Alvarado por su orientación e interés en el trabajo.
A la profesora Elizabeth Gil, por su gran colaboración.
A mi familia por su gran apoyo.
V
TABLA DE CONTENIDO
1. INTRODUCCIÓN ..................................................................................................................... 2
2. JUSTIFICACIÓN Y PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA ................................................. 3
3. MARCO TEÓRICO .................................................................................................................... 4
3.1 Salud pública: El problema de acceso a los servicios ............................................................ 4
3.2 Caries dental .......................................................................................................................... 5
3.3 Fármacos sintéticos para el tratamiento de la caries ............................................................... 7
3.4 Productos naturales como nuevas alternativas en el tratamiento de enfermedades ................ 8
3.5 Extractos vegetales, aceites esenciales y actividad antimicrobiana........................................ 8
3.6 Extractos vegetales y microorganismos de cavidad oral ........................................................ 9
4. OBJETIVOS.............................................................................................................................. 11
4.1 Objetivo general ..................................................................................................................... 11
4.1 Objetivos específicos ............................................................................................................. 11
5. METODOLOGÍA ..................................................................................................................... 12
5.1 Sujeto de estudio: Elaeagia utilis ......................................................................................... 12
5.2 Obtención de fracciones ......................................................................................................... 12
5.2.1 Material vegetal .......................................................................................................... 12
5.2.2 Obtención de aceites esenciales, extractos y fracciones ............................................. 13
5.3 Métodos de caracterización química de subfracciones activas ........................................... 15
5.3.1 Pruebas cualitativas...................................................................................................... 15
5.3.2 Cromatografía de Gases acoplada a Espectometria de Masas ..................................... 16
5.4 Evaluación de la actividad antimicrobiana de las fracciones................................................. 16
5.4.1 Cepas a evaluar .............................................................................................................. 16
5.4.2 Evaluación de la actividad antimicrobiana: método de difusión en pozo ...................... 16
5.4.3 Evaluación del efecto antimicrobiano de la subfracción activa sobre el crecimiento de
las cepas de interés por Bioautografía ........................................................................... 17
6. RESULTADOS ........................................................................................................................ 17
6.1 Aceite esencial ..................................................................................................................... 17
VI
6.1.1 Evaluación microbiológica............................................................................................. 17
6.1.2 Caracterización por Cromatografía de Gases acoplada a Espectrometría de Masas ..... 18
6.2 Fracciones del extracto en éter de petróleo ........................................................................... 19
6.3. Fracciones floculo extracto etanólico ................................................................................... 19
6.4 Fracciones obtenidas del fraccionamiento líquido/líquido del extracto etanólico ................. 20
6.5 Rastreo de la fracción CH2Cl2 en un segundo ejemplar de E. utilis....................................... 21
6.6 Fraccionamiento de los extractos CH2Cl2 de EU1 y EU2 ..................................................... 23
6.7 Concentración mínima inhibitoria ......................................................................................... 26
6.8 Bioautografías ........................................................................................................................ 27
6.9 Estudio químico de las subfracciones activas ....................................................................... 28
6.9.1 Cromatografía en capa delgada ..................................................................................... 28
6.9.2 Estudio químico cualitativo de las subfracciones activas .............................................. 28
6.9.3 Cromatografía de Gases acoplada a Espectrometría de Masas ..................................... 29
7. DISCUSIÓN.............................................................................................................................. 31
8. CONCLUSIONES .................................................................................................................... 36
9. RECOMENDACIONES ........................................................................................................... 37
10. BIBLIOGRAFÍA ..................................................................................................................... 37
ANEXOS
VII
ÍNDICE DE FIGURAS
Figura 1. Marcha fitoquímica E. utilis (EU2) ............................................................................... 14
Figura 2. . Halo de inhibición del aceite esencial .......................................................................... 18
Figura 3. Acción antimicrobiana de las fracciones obtenidas a partir del fraccionamiento
líquido/líquido del extracto etanólico, a una concentración de 20mg/pozo .............................. 21
Figura 4. Acción antimicrobiana de las fracciones obtenidas a partir del fraccionamiento
líquido/líquido del extracto etanólico de EU2, a una concentración de 20mg/pozo ................. 22
Figura 5. Halos de susceptibilidad presentados por L. acidophilus al ser enfrentado a las
fracciones CH2CL2 de EU1 (a) y EU2 (b), a una concentración de 20mg/pozo ....................... 22
Figura 6. Esquema de separación de clorofilas realizado a las fracciones de CH2Cl2 de EU1 y
EU2 ............................................................................................................................................ 23
Figura 7. Acción antimicrobiana de las subfracciones obtenidas a partir de la fracción CH2Cl2 de
EU1 ............................................................................................................................................ 24
Figura 8. Acción antimicrobiana de las subfracciones obtenidas a partir de la fracción CH2Cl2 de
EU1 ............................................................................................................................................ 25
Figura 9. Halos de susceptibilidad presentados por (a) S. mutans, (b) S. sobrinus y (c) L.
acidophilus, al ser enfrentados a las Subfraccion No. 4 de CH2CL2 de EU1 ............................ 26
Figura 10. CCD (FE: Sílica gel, FM: CH2Cl2:MeOH (10:1)) revelada con vainillina, de las
subfracciones activas, obtenidas del fraccionamiento con Sephadex de la fracción CH2Cl2 de
EU2. Los recuadros indican los compuestos comunes entre las Sf. 2 y 3 ................................ 26
Figura 11. Halos de inhibición sobre S. mutans producidos por la MeOH:H2Ob de EU1 (a), y la
Sf. 3 de EU2 (b), bajo concentraciones de 1mg/pozo, 0.5mg/pozo y 0.1mg/pozo ................... 27
Figura 12. Bioautografía de la Sf. MeOH:H2Ob de EU1, con FE: Sílica gel, FM: CH2Cl2:MeOH
(9:1). A) Cromatografía revelada con Vainillina. B) Placa cromatográfica con indicador de
fluorescencia (254) bajo luz UV de onda larga, con los Rf de los compuestos fluorescentes. C
y D) Bioautografía de S. mutans y L. acidophilus, reveladas con MTT ................................... 28
Figura 13. CCD: A) Sfs. MeOH:H2Ob(s) (1) y MeOH:H2Ob (2) y Sf. 3 (3) (FE: RP-18, FM:
MeOH:H2O 10:1). B) Sfs. 3 (1) de EU2 y MeOH:H2Ob (2) de EU1 (FE: Sílica gel, FM:
CH2Cl2:MeOH 10:1), revelada con vainillina. C) Sfs. 3 (1) y MeOH:H2Ob (2) (FE: Sílica gel
F254, FM: CH2Cl2:MeOH 9:1), bajo luz UV de onda larga ...................................................... 29
VIII
ÍNDICE DE TABLAS
Tabla 1. Compuestos mayoritarios encontrados dentro del Aceite esencial ................................. 18
Tabla 2 Halos de susceptibilidad en mm, presentados por S. mutans, S. sobrinus y L. acidophilus
al ser enfrentados a las fracciones obtenidas por CCV del extracto Éter de Petróleo, a una
concentración de 10mg/pozo................................................................................................... 19
Tabla 3. Halos de susceptibilidad en mm, presentados por S. mutans, S. sobrinus y L. acidophilus
al ser enfrentados a las fracciones obtenidas por CCV del flóculo del extracto etanólico ..... 20
Tabla 4. Halos de susceptibilidad en mm (promedio de dos pruebas) presentados por S. mutans,
S. sobrinus y L. acidophilus al ser enfrentados a las fracciones Éter de Petróleo, CH2CL2,
AcOEt, AcOet(p), BuOH y BuOH(p), obtenidas del fraccionamiento líquido/líquido del
extracto Etanólico.................................................................................................................... 20
Tabla 5. Halos de susceptibilidad en mm (promedio de dos pruebas) presentados por S. mutans,
S. sobrinus y L. acidophilus al ser enfrentados a las fracciones Éter de Petróleo, CH2CL2,
AcOEt y BuOH, de EU2 obtenidas del fraccionamiento líquido/líquido del extracto
Etanólico ................................................................................................................................. 22
Tabla 6. Halos de susceptibilidad en mm, presentados por S. mutans, S. sobrinus y L. acidophilus
al ser enfrentados a las subfracciones de CH2CL2 de EU1, a una concentración de 10mg/pozo
................................................................................................................................................. 24
Tabla 7. Halos de susceptibilidad en mm, presentados por S. mutans, S. sobrinus y L. acidophilus
al ser enfrentados a las subfracciones de CH2CL2 de EU2, a una concentración de
20mg/pozo, exceptuando a la Sf. 3, la cual fue evaluada a 10mg/pozo .................................. 25
Tabla 8. Halos de susceptibilidad presentadas por las cepas de interés, al ser evaluadas las
fracciones activas a diferentes concentraciones ...................................................................... 27
Tabla 9. Pruebas químicas cualitativas de las subfracciones activas de EU1 y EU2 .................... 29
Tabla 10. Compuestos de la Sf MeOH:H2Ob de EU1 .................................................................. 30
Tabla 11. Compuestos identificados en la Sf 3 de EU1 ................................................................ 31
IX
ÍNDICE DE ABREVIATURAS
μl
Microlitros
ºC
Grados Celsius
AcOEt
Acetato de Etilo
ATCC
American Type Cultur Collection
BuOH
Butanol
CC
Cromatografía en Columna
CCD
Cromatografía en Capa Delgada
CCV
Cromatografia en Columna al Vacío
CH2Cl2
Diclorometano
DMSO
Dimetilsulfóxido
EtOH
Etanol
FE
Fase Estacionaria
FM
Fase Móvil
Fr.
Fracción
CG-EM
Cromatografía de Gases acoplada a Espectrómetro de Masas
MeOH
Metanol
m.s.n.m
Metros sobre el nivel de mar
mg.
Miligramos
ml
Mililitros
MTT
Sal de Tetrazolium
Rf
Factor de retención
Sf.
Subfracción
UV
Ultravioleta
X
RESUMEN
Este estudio, enmarcado dentro de la investigación realizada por el Grupo de Investigación en
Fitoquímica (GIFUJ) y el Centro de Investigaciones Odontológicas (CIO), titulado “Evaluación
de la actividad antibacteriana de extractos y fracciones obtenidos de dos especies de la familia
Rubiaceae: Isertia laevis y Elaeagia utilis”, se evaluó la actividad antimicrobiana de extractos
obtenidos a partir de hojas de la especie Elaeagia utilis, colectadas en Albán (Cundinamarca).
La especie mostró actividad biológica del aceite esencial sobre S. mutans, del extracto petrol, del
floculo del extracto etanólico y de las fracciones del extracto etanólico obtenidas por
fraccionamiento líquido/líquido, sobre cepas relacionadas con la caries dental (Streptococcus
mutans ATCC 25175, S. sobrinus y L. acidophilus 903 ATCC 4365). La fracción CH2Cl2 del
extracto etanólico fue la más activa biológicamente, por lo que fue rastreada en un segundo
individuo de la misma especie, colectado en otra localidad (Fusagasugá, Cundinamarca). A partir
de las fracciones CH2Cl2 del extracto etanólico de cada individuo de E. utilis, se llevaron a cabo
dos métodos diferentes de separación de clorofilas (uno para cada fracción), CCV con RP-18
(EU1), y Cromatografía en Columna con Sephadex LH-20 (EU2), obteniendo como resultado
una subfracción con actividad inhibitoria de cada individuo sobre las cepas de interés. Las
fracciones activas denominadas Sf. MeOH:H2Ob de EU1 y Sf. 3 de EU2, evidenciaron gran
similitud al ser monitoreadas con Cromatografía de Capa Delgada, y actividad biológica a
concentraciones hasta de 0.1mg/pozo. Por medio de técnicas químicas cualitativas se determinó
la presencia principalmente de terpenos y sesquiterpenlactonas en ambas fracciones, que también
fueron analizadas por CG-EM, encontrándose además la presencia de fenoles en la Sf.
MeOH:H2Ob.
PALABRAS CLAVE: Actividad antimicrobiana, Aceites esenciales, Caries dental, Extractos
vegetales, Rubiaceae.
1
1.
INTRODUCCIÓN
El interés por la utilización de productos naturales para el tratamiento de enfermedades de
importancia pública ha sufrido un incremento en la actualidad, lo que en gran medida se sustenta
en la tendencia al desarrollo de tratamientos no convencionales que presenten resultados
efectivos a un menor costo, para que éstos puedan ser usados por la población que por barreras
económicas y geográficas, se ve seriamente afectada en el acceso a los servicios de salud.
Dentro de las enfermedades de mayor importancia tanto a nivel internacional como local, se
encuentra la caries dental, un proceso mediante el cual la microbiota (especialmente asociada a
los microorganismos de los géneros Streptococcus y Lactobacillus) como principal agente
etiológico, en interacción con el huésped y la dieta, generan la producción de ácidos que llevan a
la desmineralización de los dientes, y por tanto a la destrucción de los tejidos duros dentales
(Rodríguez & González, 2000).
Varios agentes antisépticos entre los que se incluyen la
clorhexidina, los fluoruros y los derivados del fenol, se han utilizado extensamente en
odontología para inhibir crecimiento bacteriano, sin embargo en algunas ocasiones estas
sustancias acarrean efectos secundarios entre los que se incluyen diarrea, vomito y coloración de
mucosas y dientes, además del desarrollo de cepas resistentes a estos tratamientos (Aliviano &
Aliviano, 2009).
Una de las alternativas en la lucha contra la resistencia, es el desarrollo de nuevos compuestos
antimicrobianos a través de la obtención de principios activos o de compuestos de plantas que
puedan servir como antimicrobianos, brindando además de especificidad contra el patógeno, la
seguridad para el consumidor. De allí que el desarrollo a nivel científico que se ha dado en los
últimos años en la extracción y el estudio de fracciones vegetales, además de ser una potencial
fuente de desarrollo de nuevos agentes efectivos, produce una alta receptividad del público hacia
el posible uso de drogas o productos antimicrobianos derivados de plantas (Machado et al.,
2005).
Teniendo en cuenta la diversidad vegetal de nuestro país, y la utilización y reconocimiento de
algunas especies por parte de las comunidades, este proyecto plantea la evaluación
2
antimicrobiana de extractos, fracciones y subfracciones a través de la técnica de difusión en pozo,
de la especie Elaegia utilis, sobre los principales microorganismos envueltos en el desarrollo de
la caries dental, así como el estudio químico preliminar de la(s) fracción(es) activa(s), como un
preámbulo al reconocimiento de los metabolitos secundarios responsables de dicha actividad.
2. JUSTIFICACIÓN Y PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA
En la actualidad se ha venido presentando una tendencia creciente en la utilización de productos
naturales para el tratamiento de enfermedades de importancia pública. Esta preferencia según
Hamburger y Hostettmann (1991), proviene de básicamente tres razones fundamentales: la
exploración y conocimiento de la naturaleza como fuente de una amplia variedad de moléculas
bioactivas, el interés en terapias no convencionales que dejen a un lado los productos sintéticos y
la eficacia demostrada de un gran número de preparaciones fitofarmacéuticas.
Una de las enfermedades públicas más comunes dentro de nuestro país es la caries dental, la cual
Rodríguez y González (2000) definen como un proceso patológico infecciosos localizado y
transmisible que resulta de la interacción de cuatro factores principales: la dieta, el huésped
(diente), la saliva y la microbiota bucal, siendo esta última de gran importancia; en particular,
para el desarrollo de esta enfermedad la microbiota se asocia a la presencia de especies de
estreptococos y Lactobacillus orales. Aunque existen productos químicamente sintéticos de gran
efectividad para la eliminación de los microorganismos mencionados, es conocido que su uso
excesivo puede llevar a la alteración de la flora oral benéfica, a alteración de la flora intestinal,
así como a procesos de resistencia bacteriana (Alvarado et al., 2008).
Los efectos negativos que se reconocen del tratamiento de la caries con productos sintéticos, ha
impulsado la necesidad de buscar nuevas alternativas provenientes de plantas, que presenten la
misma efectividad de los antibióticos comerciales. Precisamente, la realización de estudios
fitoquímicos ha permitido determinar la presencia de compuestos con actividad antimicrobiana en
algunas especies de la familia Rubiaceae contra microorganismos relacionados con la caries
(Alvarado et al., 2008). Aún cuando el género Elaeagia que pertenece a la familia Rubiaceae,
3
está ampliamente distribuido en nuestro país y es de fácil acceso para las comunidades quienes lo
reconocen por la generación de resinas que son utilizadas en actividades artesanales, no ha sido
corroborado bajo estudios fitoquímicos si sus especies tienen principios activos contra
microorganismos de importancia patológica.
El primer paso para el reconocimiento de la actividad biológica de moléculas o compuestos de
origen vegetal, está en la ejecución de estudios biodirigidos, en los cuales se utilizan extractos y
fracciones obtenidos del material vegetal con solventes orgánicos, para la evaluación biológica y
la posterior identificación de la presencia de metabolitos secundarios, que sean capaces de inhibir
el crecimiento de los patógenos de interés. Es por esto que en este proyecto se plantea evaluar la
actividad antimicrobiana de la especie Elaeagia utilis sobre los principales microorganismos
causantes de caries dental (Streptococcus mutans, Streptococcus sobrinus y Lactobacillus
acidophilus), para reconocer si esta especie presenta sustancias o compuestos químicos con dicha
propiedad, y siendo este el caso, para identificar cuál es la fracción activa y así caracterizarla
químicamente, lo cual contribuirá para el avance en la búsqueda de principios que tengan
actividad farmacológica y para la posterior generación de beneficios sociales y económicos para
la comunidad, a través del acercamiento a nuevas alternativas de tratamiento.
3. MARCO TEÓRICO
3.1 Salud pública: El problema de acceso a los servicios
Son muchas las enfermedades de salud pública que afectan seriamente a las poblaciones
humanas, no solo desde el punto de vista de la salud, sino también desde el contexto económico y
social. Las consideraciones de equidad han estado presentes frecuentemente en las discusiones
sobre salud y en los avances en los indicadores de los sistemas de seguridad social, ya que sin
duda en nuestro país persisten desigualdades entre muchos grupos de la población, siendo el
acceso a servicios, una de las dimensiones en las cuales se observan mayores discrepancias
(Mejía-Mejía et al., 2007).
4
En el régimen subsidiado uno de los mayores causantes de la inequidad para el acceso a servicios
de salud, son las barreras económicas y geográficas que suponen un obstáculo importante, de
modo que aunque la persona pueda llegar a consulta médica, tiene dificultades para continuar y
finalizar de forma adecuada el proceso (Céspedes et al. 2000, Mejía-Mejía et al. 2007).
Esta problemática es evidente en los servicios de salud oral, en donde los indicadores sociales
muestran tener una asociación positiva y significativa con la frecuencia de lesiones severas de
caries; así, la caries es más frecuente en los grupos socioeconómicos bajos, mientras que los
niveles sociales más altos registran los valores más bajos de prevalencia (López et al., 2005).
Esta problemática se da por la dificultad en el acceso a la atención dental, servicio normalmente
de alto costo si no se dispone de un servicio asistencial brindado por alguna institución (Céspedes
et al., 2000), además por el bajo acceso a los fármacos tradicionalmente utilizados para el control
de la caries de origen sintético, como lo son las aplicaciones tópicas fluoruradas (Batellino et al.,
1997), o el uso constante de colutorios y demás productos orales que reduzcan la placa
bacteriana.
3.2 Caries dental
La caries dental se define como un proceso patológico infeccioso, localizado, poseruptivo y
transmisible, que termina con la destrucción de los tejidos duros dentales y que se origina como
resultado de cuatro factores principales como lo son la microbiota, el substrato (dieta), el huésped
(diente) y el medio ambiente (saliva) (Rodríguez & González, 2000). La destrucción del tejido
dental esta medida por ácidos que son producto de la fermentación de los carbohidratos de la
dieta por parte de los microorganismos de la placa bacteriana (Chaves et al., 2000).
Los microorganismos implicados en el proceso de la caries dental están localizados en un biofilm
complejo que cubre la superficie del diente, y de acuerdo a su potencial cariogénico, las bacterias
que ocupan esta capa pueden ser clasificadas, siendo los Estreptococos, los microorganismos más
estrechamente ligados con esta patología, especialmente Streptococcus mutans y Streptococcus
sobrinus, aunque también bacterias de tipo Lactobacillus spp y Actinomyces spp, juegan un papel
importante en el desarrollo de esta enfermedad (Chaves et al., 2000).
5
Se reconoce que dentro del grupo de estreptococos la especie mutans (especialmente el serotipo
c), y en menor proporción sobrinus, son las más relacionadas con caries (se ha demostrado que la
relación de S. mutans con caries dental en humanos está entre el 74% al 100%) (Chaves et al.,
2000). Los Streptococcus son microorganismos no móviles y esféricos, Gram positivos que
tienen un diámetro de 0.5 a 0.75μm y presentan formas variables entre coco y bacilo (Chaves et
al. 2000). Los factores de virulencia mas involucrados en la producción de caries por parte de
estas bacterias son: acidogenicidad (capacidad de producción de ácidos), acidofilicidad (apetencia
a los ácidos), aciduridad (tolerancia a los ácidos), síntesis de glucanos y fructanos, síntesis de
polisacáridos intracelulares, producción de dextranasa y fructanasa, y presencia de
glucosiltransferasas, proteínas de adhesión celular y proteínas fijadoras de glucano (Chaves et al.
2000, Delgado 2000). El poder cariógeno de los estreptococos del grupo mutans es, aunque con
algunas diferencias, muy similar en todas las especies y está ligado a la sacarosa, ya que tiene la
capacidad de metabolizarla mucho más rápidamente que cualquier otro microorganismo de la
cavidad oral (Liébana, 2000), desarrollando rápidamente la patología.
El grupo de los Lactobacillus, se constituye por microorganismos bacilares Gram positivos no
espolurados (Chaves et al., 2000), y aun cuando no es claro su papel en la iniciación de la caries,
se reconoce que son colonizadores primarios de las mucosas orales; para estas bacterias se
reconoce que los factores de cariogenicidad que relacionados son el poder acidogénico
(producción de acido láctico), el acidofílico y el acidúrico (Delgado, 2000).
La caries es una de las diez primeras causas de consulta, siendo la primera causa de morbilidad
entre las enfermedades de los dientes y tejidos de los niños de 5 a 14 años Gamboa (2000). En
Colombia el 60.4% de los niños de 5 años tiene historia de caries, acrecentando la proporción a
medida que la edad aumenta (a los 7 años es de 73.3%, a los 12 se presenta una ligera
disminución -71.9%-, y de los 15 a los 19 años aumenta hasta un 89.5%) (Gamboa, 2000).
Estos resultados muestran una alta prevalencia de caries en la población colombiana,
especialmente en estratos bajos (los mayores índices son en los estratos comprendidos entre 2.7 y
2.3), lo cual se constituye en un grave problema de salud pública, en la medida en que la
6
rehabilitación de estos pacientes constituye un costo económico muy grande para el país,
especialmente cuando no se brinda una cobertura total de asistencia (Gamboa, 2000).
3.3 Fármacos sintéticos para el tratamiento de la caries
La formación de la placa bacteriana es el inicio de una serie de acontecimientos que pueden
llevar a la aparición de la caries dental, así como de otras patologías bucales de importancia
(Rodríguez & González, 2000); existen múltiples grupos de sustancias químicas utilizadas en el
control de la placa bacteriana, a través de la detención o retraso de la proliferación bacteriana con
antimicrobianos; entre ellos los más utilizados son los antibióticos (penicilina, vancomicina,
espiramicina, etc.), compuestos de amonio cuaternario (cloruro de cetilpiridinio, cloruro de
benzalconio), el triclosán, los fluoruros, la hexetidina, la clorhexidina, los compuestos fluorados,
y los fenoles y aceites esenciales (Bascones & Morantes, 2006). Sin embargo, el uso de estas
sustancias químicas puede generar una serie de efectos colaterales indeseados en los pacientes.
Los antibióticos tradicionales como vancomicina y penicilina, que aunque son efectivos en el
control de placa bacteriana, debido a la tendencia hacia la automedicación y por tanto a una
terapia mal dirigida, han demostrado tener efectos que van desde diarreas y reacciones alérgicas,
hasta la muerte (Macín-Cabrera et al., 2006). El efecto adverso más común asociado al mal uso
de los medicamentos, es el aumento en las cepas resistentes de la flora endógena así como
alteración de la composición de la flora normal, con lo que se favorece la implantación de los
microorganismos patógenos (Macín-Cabrera et al., 2006).
Por su parte otro tipo de compuestos químicos para el tratamiento de la placa bacteriana también
presentan efectos negativos, como la tinción de los dientes (compuestos de amoniaco cuaternario,
clorhexidina, fenoles y aceites esenciales) o de las mucosas bucales (clorhexidina), sensación de
quemazón en la mucosa bucal (compuestos de amoniaco cuaternario), lesiones ulcerosas
(hexedetina), bajo efecto inhibitorio de la placa (triclosán, fluoruros), y efectos erosivos sobre el
esmalte (fenoles y aceites esenciales) (Enrile & Santos-Alemany 2005, Macín-Cabrera et al.
2006).
7
3.4 Productos naturales como nuevas alternativas en el tratamiento de enfermedades
El uso tradicional de plantas para tratar ciertas enfermedades es bastante reconocido en la historia
de la humanidad, y aún hoy las especies vegetales son la fuente más frecuente de medicamentos
para la mayoría de la población mundial (Hamburger & Hostettmann, 1991). Luego de décadas
de uso empírico de las preparaciones herbales, en el siglo XIX comienza el interés por aislar los
principios activos de ciertas especies de plantas, creando una nueva línea de investigación
fitoquímica que causó gran impacto, pero que fue reemplazado en los años 30 por el desarrollo de
una industria farmacéutica sintética (Phillipson, 2001).
Históricamente los productos de origen vegetal han pasado de tener un papel hegemónico en el
arsenal terapéutico occidental a un discreto segundo plano, para volver a tener, en las últimas
décadas, una presencia cada vez mayor (Cañigueral et al., 2003). Este nuevo auge en parte se ha
dado por el reconocimiento de una gran variedad de especies que proveen sustancias que
tradicionalmente se han usado para determinados fines, así como también por la demanda de
terapias no convencionales que se basan en la igualdad de efectividad y menor cantidad de
efectos colaterales, de los productos naturales (como la valeriana o el ginkgo) respecto a los
sintéticos, lo que originó que las compañías farmacéuticas mostraran un renovado interés en las
plantas como fuente de nuevas estructuras (Hamburger & Hostettmann, 1991), que puedan
utilizarse o al menos proveer guías para análogos sintéticos o semisintéticos (Phillipson, 2007).
3.5 Extractos vegetales, aceites esenciales y actividad antimicrobiana
Se reconoce que las plantas producen más de 100.000 productos naturales de bajo peso
molecular, también conocidos como metabolitos secundarios, que se diferencias de los primarios
en que no son esenciales para la vida del organismo (Domingo & López-Brea, 2003), y los cuales
han sido estudiados en busca de funciones particulares que puedan ser aplicadas en la industria
farmacológica.
Los estudios biodirigidos, son una fuente útil de reconocimiento de fracciones activas en las
cuales se reconocen metabolitos secundarios con actividad biológica; en éstos, el uso de
fracciones o extractos obtenidos del material vegetal (obtenidos a través del tratamiento o
contacto con solventes orgánicos de diferentes polaridades), permiten el fraccionamiento de
8
compuestos de acuerdo a la polaridad del solvente, para la posterior evaluación biológica y la
identificación de metabolitos secundarios de interés (Cos et al., 2006).
A la fecha han sido reportados muchos casos en los que se les atribuye a determinados
compuestos de origen vegetal una acción antimicrobiana, entre ellos los aceites esenciales, como
mezclas de compuestos naturales volátiles, que además de antifúngicos y antibacterianos,
también se han reportado como antiinflamatorios, antiespasmódicos y relajantes en humanos y
animales (Aliviano & Aliviano, 2009). Así mismo, compuestos particulares son reconocidos por
sus actividades biológicas, entre ellos las catequinas presentes en el té verde (Camellia sinensis),
que ejercen actividad frente a Vibrio cholereae, Streptococcus mutans entre otros
microorganismos, el mentol que se obtiene de la menta (Menta piperita), la capsaicina del chile
(Capsicumm annuum), ambos compuestos fenólicos simples, y los taninos presente en el
eucalipto (Eucalyptus globulus) quienes también puede inhibir bacterias y hongos (Domingo y
López-Brea, 2003).
El descubrimiento de una acción antimicrobiana de sustancias o moléculas de origen vegetal, ha
impulsado una industria farmacéutica natural que cada vez tiene más seguidores; entre 1983 y
1984, de las 520 nuevas drogas aprobadas el 39% fueron productos naturales o sus derivados, y
además se reconoce que del 60 a 80% de drogas antibacterianas como la sinvastatina, lovastatina,
enalapril, ciprofloxacina y ciclosporina, y de anticancerígenos como el taxol y el docetaxol, son
derivados de productos naturales (Araújo & Salas, 2008).
3.6 Extractos vegetales y microorganismos de cavidad oral
Muchas sustancias obtenidas a partir de especies vegetales ya han demostrado su alta actividad
antimicrobiana y son actualmente comercializadas en forma masiva, entre estas están la
sanguinarina, mentol y timol, sustancias que forman parte de productos para el cuidado bucal; sin
embargo para el caso de la sanguinarina, el uso industrial se ha reducido ya que esta sustancia ha
sido asociada con la lesiones precancerosas orales, por lo que definitivamente se ha hecho
necesaria la búsqueda de otros agentes antibacterianos naturales que a su vez sean seguros para
los humanos y específicos para los patógenos orales (Chung et al., 2006)
9
La búsqueda de sustancias que cumplan los criterios antes mencionados, es la principal razón
para el continuo estudio de especies vegetales relacionadas con la inhibición de patógenos orales,
fijando la atención especialmente en las plantas del “Nuevo mundo”, particularmente las de las
regiones tropicales, debido a la alta diversidad biológica presente en ellas y al hecho de que aún
hoy permanezcan en parte desconocidas (Lapenna et al., 2003).
A nivel latinoamericano con base en antecedentes etnobotánicos, se han realizado varios estudios
con especies nativas, entre ellos se encuentra el caso de Rubus urticaefolius (mora), de la cual se
evaluaron extractos hidroalcohólicos de frutos, hojas y tallos para tratamiento de afecciones
orales en centro y Suramérica (De Paula & Martínez, 2005). En el estudio antes mencionado se
demostró que el fruto en especial, produce halos de inhibición en cultivos de Bacillus subtillis,
Escherichia coli, Proteus mirabilis, Pseudomonas aeruginosa y Staphylococcus.
En Brasil
estudios fitoquímicos de las especies Mikania laevigata y Mikania glomerata, evidenciaron
inhibición del crecimiento y adherencia celular de Streptococcus mutans, S. sobrinus y S.
cricetus, debido a la presencia de los ácidos coumárico, curpesénico, diterpénico y kaurenoico, en
la fracción hexano (Yatsuda et al., 2005).
En Colombia, también se han efectuado estudios para evaluar fracciones vegetales contra
microorganismos orales, uno de estos es el de Alvarado et al. (2008), quienes a partir de
fracciones de Isertia laevis (Rubiaceae), realizaron una evaluación fitoquímica y microbiológica
contra 18 cepas bacterianas pertenecientes a los géneros Streptococcus, Lactobacillus y
Actinomyces, encontrando actividad en la fracción Metanol-Agua sobre todas las cepas, tanto con
métodos de difusión como de dilución lo que es un buen indicador de actividad in vivo. Estos
resultados indican la presencia de compuestos presentes en diferentes especies vegetales que
tienen efecto antimicrobiano contra microorganismos orales, abriendo la puerta hacia el estudio
de alternativas naturales para el tratamiento de patologías bucales de importancia, como lo es la
caries dental.
10
4. OBJETIVOS
4.1 OBJETIVO GENERAL
Evaluar la actividad antimicrobiana de extractos, fracciones y subfracciones obtenidas a partir de
hojas de Elaeagia utilis sobre las cepas bacterianas de cavidad oral Streptococcus mutans ATCC
25175, S. sobrinus y L. acidophilus 903 ATCC 4365, la cuales se encuentran asociadas a la caries
dental.
4.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS
Obtener extractos y fracciones a partir de las hojas de dos individuos de la especie Elaeagia
utilis, colectadas en dos localidades del departamento de Cundinamarca, Albán y Fusagasugá.
Obtener el aceite esencial, a partir de hojas de uno de los individuos de la especie de estudio.
Evaluar el efecto antimicrobiano sobre Streptococcus mutans ATCC 25175, S. sobrinus y L.
acidophilus 903 ATCC 4365, de las fracciones obtenidas a partir de hojas de Elaeagia utilis.
Evaluar el efecto antimicrobiano sobre Streptococcus mutans ATCC 25175 de los aceites
esenciales obtenidos a partir de hojas de Elaeagia utilis.
Realizar un estudio químico cualitativo preliminar a la fracción o fracciones que resulten activas
contra S. mutans ATCC 25175, S. sobrinus y L. acidophilus 903 ATCC 4365, para reconocer los
tipos de metabolitos secundarios presentes en los mismos.
Determinar la concentración mínima inhibitoria de la fracción(es) activa(s), contra Streptococcus
mutans ATCC 25175, S. sobrinus y L. acidophilus 903 ATCC 4365.
11
5. METODOLOGÍA
5.1 Sujeto de estudio: Elaeagia utilis
Esta especie pertenece a la familia Rubiaceae, una de las familias más diversas ecológica y
taxonómicamente a nivel mundial, lo cual implica una alta riqueza de especies y presencia en
diversidad de ecosistemas, especialmente en los bosques andinos y húmedos tropicales (Mendoza
et al., 2004).
El género se distribuye a lo largo de Centro América, Cuba, Colombia, Venezuela, Guyana,
Suriname, Ecuador, Perú, Brasil y Bolivia, con alrededor de 19 especies, de las cuales se hallan
unas 11 en Colombia, la mayoría de ellas en la región Andina, aunque también se encuentran en
la Amazonía y el Chocó biogeográfico, creciendo entre los 100 y los 2.600 m de altitud (Taylor
& Steyermark 2004, Mendoza et al. 2004).
La especie Elaeagia utilis, en nuestro país se distribuye ampliamente desde los 100 a los 3000m,
en los departamentos de Antioquia, Boyacá, Chocó, Cundinamarca, Huila, Meta, Nariño,
Putumayo, Risaralda, Santander, Tolima y Valle del Cauca (Jiménez, 2002). En el sur de
Colombia se le conoce como “Barniz” o “Mopa-mopa”, por su particularidad de producir resina;
según Mendoza et al. (2004) esta especie es utilizada como maderable para construcciones o
postes.
5.2 Obtención de fracciones
5.2.1. Material vegetal
Se colectaron en campo muestras de hojas de Elaeagia utilis, en el Departamento de
Cundinamarca, Municipio de Albán, Verdeda Java, en la Fundación Granjas Infantiles del Padre
Luna. La determinación taxonómica para este ejemplar fue realizada por N. García del Herbario
de la Pontificia Universidad Javeriana como Elaeagia utilis (Goudot) Wedd, encontrándose un
ejemplar depositado en el Herbario de esta institución, con el No. HPUJ 27413. El material de
hojas fue secado a temperatura ambiente, y posteriormente molido y pulverizado con la ayuda de
un molino de cuchillas.
12
5.2.2 Obtención de aceites esenciales, extractos y fracciones
El aceite esencial, extractos y fracciones a partir de las hojas de Elaeagia utilis se obtuvieron en
el Laboratorio de Fitoquímica de Facultad de Ciencias Básicas de la Pontificia Universidad
Javeriana, de acuerdo al siguiente protocolo:
- Obtención del aceite esencial: A partir de 200g de hojas secas y molidas de E. utilis, se realizó
el montaje de destilación en corriente de vapor, para la extracción del aceite esencial.
Obteniéndose aproximadamente 2.4 mg en peso seco del mismo.
- Obtención de extracto éter de petróleo: Del material vegetal seco y molido por maceración en
frio con éter de petróleo, se obtuvo un extracto en éter de petróleo para ambos individuos, que se
concentró en un rotavapor a presión reducida para posteriormente ser llevado a sequedad. El
extracto seco fue pesado y disuelto en éter de petróleo para ser floculado con EtOH durante 24
horas, luego de las cuales fue filtrado y concentrado en rotavapor hasta llevar a sequedad.
- Obtención de extracto etanólico: Del marco desengrasado, por maceración en frío con Etanol
(EtOH), se obtuvo un extracto etanólico, el cual fue concentrado a presión reducida en rotavapor
para conocer el peso seco del mismo. El extracto seco fue disuelto en etanol y fue floculado con
agua destilada durante 24 h, para posteriormente ser filtrado y concentrado en rotavapor hasta
sequedad.
- Obtención de las fracciones:
a) A partir del extracto en éter de petróleo, se tomó 1g que se pasó por una columna
cromatográfica al vacío con fase estacionaria sílica gel H-60, en proporción 30:1 de Fase
Estacionaria:Muestra, eluyéndose con solventes de diferentes polaridades, Éter de petróleo
(Petrol,
100ml),
CH2CL2:Acetato
Petrol:Diclorometano
de
Etilo
(Petrol:CH2CL2,
(CH2CL2:AcOEt,
100ml),
150ml),
AcOEt
CH2CL2
(100ml),
(200ml),
AcOEt:Etanol
(AcOEt:EtOH, 150ml) y EtOH (150ml) (Figura 1).
b) El flóculo obtenido a partir del extracto etanólico, también fue fraccionado por columna
cromatográfica al vacío con fase estacionaria sílica gel H-60, en proporción 30:1 de Fase
13
Estacionaria:Muestra, eluyéndose con Petrol (100ml), Petrol: CH2CL2 (200ml), CH2CL2 (100ml),
CH2CL2:AcOEt (100ml), AcOEt (150ml), AcOEt:EtOH (100ml) y EtOH (100ml), para la
obtención final de las fracciones Petrol, Petrol: CH2CL2 , CH2CL2:AcOEt, AcOEt, AcOEt:EtOH
y EtOH.
Figura 1. Marcha fitoquímica E. utilis.
c) A partir del extracto etanólico obtenido, se realizó fraccionamiento líquido/líquido continuo
(Figura 1), con Éter de petróleo, CH2CL2, AcOEt y Butanol (BuOH). Cada una de las fracciones
fue concentrada a 40ºC, bajo presión reducida en rotavapor hasta llevarlas a sequedad.
14
5.3 Métodos de caracterización química de subfracciones activas
5.3.1. Pruebas cualitativas
A la subfracción activa se le realizaron las siguientes pruebas químicas cualitativas:
a) Prueba de Baljet (terpenos y esteroles): 3 o 4 gotas de una mezcla de dos soluciones (A: 1g
ácido pícrico y 100ml de etanol y B: 10g NaOH en 100ml de H2O), fueron agregadas a las
fracciones a evaluar. Se presenta un cambio de coloración que varía de naranja a rojo oscuro
cuando la detección resulta positiva (Domínguez, 1973).
b) Lieberman – Burchard (Esteroides y esteroles): El reactivo compuesto por 1ml de Anhídrido
acético y 1ml de cloroformo, fue agregado junto con una gota de H2SO4. De ser positiva se
producen cambios de coloración (rosa, violeta, azul y verde) (Domínguez, 1973).
c) Salkowsky (Terpenos): 1-2 mg de muestra se disolvieron en 1 ml de cloroformo. A la solución
se le agregó 1ml de H2SO4. La prueba positiva evidencia cambios de color amarillo o rojo
(Domínguez, 1973).
d) Molibdato de amonio (Diterpenos): Se preparó un reactivo con 10g de Molibdato de Amonio
en 100ml de H2SO4, con el cual se reveló una placa cromatográfica con la muestra. El cambio
a coloración azul indica la presencia de diterpenos.
e) Cloruro Férrico (FeCl3) (Flavonoides y fenoles): a 1-2mg de muestra en etanol, se agregaron
entre 3 y 4 gotas de FeCl3. Se debe producir un cambio a color verde intenso cuando el
resultado es positivo.
f) Dragendorff (Alcaloides): se disolvieron 8 g de Bi(NO3)3 5H2O en 20ml de HNO3 al 30% y
27.2g de KI en 50ml de agua. Se mezclaron las dos soluciones y se dejan reposar 24 horas. De
ser positivo se presenta un precipitado naranja a rojizo (Domínguez, 1973).
g) Prueba de espuma (Saponinas): En un tubo de ensayo se disolvió extracto en 10ml de agua
destilada; se agitó por 30 segundos. La aparición de espuma mayor por más de 15 minutos
luego de la agitación indica la presencia de estos compuestos en la muestra.
h) Antrona (Glicósidos): En un tubo de ensayo con extracto se deja resbalar una solución de no
más de 24 horas de Antrona al 0.01% en ácido sulfúrico concentrado. La presencia de
glicósidos se evidencia por un anillo azul verdoso en la interfase.
i) Hidroxamato férrico (Sesquiterpenlactonas): A la solución o extracto se añadió una gota de
una solución metanólica 2N de clorhidrato de hidroxilamina y una gota de solución metanólica
2N de hidróxido de potasio. La mezcla se calentó a baño de María, y se aciduló con ácido
15
clorhídrico 0.5N, añadiéndose una gota de cloruro férrico al 1%. Se presenta un cambio a
color café o violeta cuando se detectan estos compuestos (Domínguez, 1973).
5.3.2. Cromatografía de Gases acoplada a Espectrometría de Masas
La subfracción activa así como el aceite esencial obtenido a partir de hojas de E. utilis, se
analizaron en un cromatógrafo de gases Agilent Technology 6850 serie II acoplado a un
espectrómetro de masas Agilent 5975B, empleando un método de inyección manual con
temperatura inicial de 800C durante 2 minutos, seguido de una rampa de calentamiento de 100C
por minuto hasta 2800C donde se mantuvo durante 5 minutos. Modo de inyección Split 15:1,
columna capilar de sílice fundida, TR-50MS de 30 m x 0,25 mm (d.i.) x 0,25 μm (df) con fase
estacionaria 0%fenilpolisilfenilenesiloxano. Gas de arrastre: Helio 99% Aga Fano, S.A. flujo
constante 1ml/min. Espectros de masas se obtuvieron por impacto de electrones (EI) de energía
de 70eV. Reconocimiento de compuestos por comparación con los registrados en la base de
datos Willey7
5.4 Evaluación de la actividad antimicrobiana de las fracciones
5.4.1 Cepas a evaluar
Tres cepas de cavidad oral (Streptococcus mutans ATCC 25175, S. sobrinus y L. acidophilus 903
ATCC 4365), suministradas por el Centro de Investigaciones Odontológicas (CIO) de la
Pontificia Universidad Javeriana fueron evaluadas.
5.4.2 Evaluación de la actividad antimicrobiana: método de difusión en pozo
La actividad antimicrobiana de los extractos, fracciones y subfracciones así como de los aceites
esenciales frente a las bacterias, se realizó de acuerdo al método de difusión en pozo descrito por
Dobner et al. (2003), en el cual a partir de un cultivo puro de cada una de las bacterias a evaluar,
se realizó una suspensión ajustada por turbidimetría a la escala 0.5 de Mac Farland. De esta
suspensión se tomaron 100 ul que se agregaron a 20 ml de agar Mueller Hinton (líquido), que se
mezcló y se sirvió en cajas de Petri. Luego de solidificar y después de esperar un lapso de 20 30 minutos, se realizaron pozos de 0.5 cm de diámetro sobre el agar usando una pipeta de Pasteur
de vidrio previamente esterilizada. En cada pozo en forma independiente se aplicaron 50 µl del
extracto, fracción o subfracción disuelto en dimetilsulfóxido (DMSO), utilizando como control
16
positivo 50 µl de Vancomicina y como control negativo 50 µl DMSO. Seguidamente, las cajas
se incubaron a 37º C durante 24 horas, tiempo después del cual se revelaron las cajas, agregando
a su superficie sal de tetrazolium (MTT) como indicador de viabilidad de las bacterias (Thorn et.
al, 1993), preparada con solución acuosa a una concentración de 2.5mg/ml, dejándose incubar
durante seis horas más. Después de la incubación, se determinó la presencia o ausencia de zonas
de inhibición y el tamaño de las mismas. Cada ensayo se realizó por duplicado.
5.4.3 Evaluación del efecto antimicrobiano de la subfracción activa sobre el crecimiento de las
cepas de interés por Bioautografía
La subfracción que resultó positiva para la actividad antimicrobiana por el método de difusión en
pozo, también fue evaluada mediante Inmersión de Bioautografía, método descrito por Cos et. al
(2006) y Valgas et al. (2007) en donde se siembran placas cromatográficas de 7,5 cm de largo x
2,5 cm de ancho, con la fracción de interés. Se utilizó como FE: sílica gel y como FM:
CH2Cl2:MeOH (9:1). Las placas cromatográficas fueron expuestas a radiación U.V (λ 260nm)
durante 30 minutos, como método de esterilización.
Se siguió el mismo método de suspensión e inoculación bacteriana en el medio, que el ya
descrito. Se sirvieron 10 ml del agar inoculado en cada caja de petri, en donde previamente se
colocaron las placas cromatográficas. Posterior a 24 horas de incubación, se revelaron las
bioautografías con MTT, incubando durante 6 horas más. Finalmente a las zonas de inhibición
de la placa cromatográfica que no presentaban coloración por el MTT, les fue medido el Rf
(distancia recorrida por el soluto/distancia recorrida por el solvente).
6. RESULTADOS
6.1 Aceite esencial
6.1.1 Evaluación microbiológica
La evaluación microbiológica del aceite esencial extraído a partir de hojas de E. utilis, fue
realizada solamente sobre S. mutans, a una concentración final de 1mg/pozo, debido al bajo
17
rendimiento obtenido en la extracción. El aceite esencial mostró un halo de inhibición que
alcanzaba los 9mm de diámetro (Figura 2).
Figura 2. Halo de inhibición del aceite esencial, a una concentración de 1mg/pozo.
6.1.2 Caracterización por Cromatografía de Gases acoplada a Espectrometría de Masas
Se analizó por CG-EM, una muestra de 1μL del aceite esencial de E. utilis, cuyos cromatograma
y espectros de masas de los compuestos mayoritarios identificados se encuentran en el Anexo 2.
La Tabla 1 relaciona los trece compuestos mayoritarios, con un porcentaje de coincidencia mayor
al 90%, identificados por CG-EM en dichas mezcla.
Tabla 1. Compuestos mayoritarios encontrados dentro del Aceite esencial de E. utilis.
% del
área
total
Coincidencia
Ácido 2-hidroxibenzoico, metil ester
7.666
96
47
47
47
3-Alil-6-metoxifenol
Eugenol
2 metoxi-4-(1-propenil)fenol (isoeugenol)
4.403
4.403
4.403
98
97
97
19.439
105
Ácido 2-hidroxi benzoico, fenilmetil ester
4.247
94
12.437
81
17-Octadecenal
3.685
91
12.437
81
Hexadecanal
3.685
95
8.884
5.039
48
6
Ionona
Linalol
2.874
2.596
91
8.614
45
1-(2,6,6-Trimetil-1,3-ciclohexadien-1-il)2-buten-1-ona
2.482
98
Cetona
8.427
9.970
4.158
43
60
1
Betaionona
Irisona
Acido hexanoico
2.420
2.113
2.048
94
93
90
Terpeno
Terpeno
Ácido graso
TR
Pico
No.
6.786
25
8.824
8.824
8.824
Nombre
18
Tipo de
compuesto
Ester
aromático
Fenol
Fenol
Fenol
Ester
aromático
Aldehído
Aldehído
graso
Terpeno
Terpeno
6.2 Fracciones del extracto en éter de petróleo
Se realizó la evaluación microbiológica del extracto en éter de petróleo, así como de las
fracciones obtenidas por CCV del mismo (Petrol:CH2CL2, CH2CL2, CH2CL2:AcOEt, AcOEt,
AcOEt: EtOH y EtOH) (Cromatografías en el Anexo 5, Figura 1), sobre tres microorganismos de
referencia Gram-positivos de cavidad oral asociados con caries dental, S. mutans ATCC 25175,
S. sobrinus y L. acidophilus 903 ATCC 4365, a una concentración de 10mg/pozo (Tabla 2),
encontrándose actividad en el extracto total, así como en las fracciones obtenidas con solventes
de mediana a alta polaridad.
Tabla 2 Halos de susceptibilidad en mm, presentados por S. mutans, S. sobrinus y L. acidophilus
al ser enfrentados a las fracciones obtenidas por CCV del extracto Éter de Petróleo, a una
concentración de 10mg/pozo.
Fracción
Extracto total
Fracciones
Control positivo
Control negativo
S. mutans
ATCC 25175
S. sobrinus
9,5
0
0
11
8,5
15
11
19
0
9
0
0
9
9
8,5
8,5
17
0
Extracto Éter de Petróleo
Petrol:CH2CL2
CH2CL2
CH2CL2:AcOEt
AcOEt
AcOEt: EtOH
EtOH
Vancomicina
DMSO
L. acidophilus
903 ATCC
4365
9
0
0
9
7
8
8,5
19
0
6.3. Fracciones floculo extracto etanólico
Se realizó el ensayo microbiológico al flóculo del extracto etanólico, y a las fracciones obtenidas
del mismo por CCV (Petrol, Petrol: CH2CL2 , CH2CL2:AcOEt, AcOEt, AcOEt:EtOH y EtOH)
(Cromatografías en el Anexo 5, Figura 2), a una concentración final de 10mg/pozo (Tabla 3). Se
encontró actividad en el flóculo total, así como en las fracciones de polaridad baja a media,
19
siendo la fracción CH2CL2:AcOEt a,
la que presentó una mayor actividad contra los tres
microorganismos.
Tabla 3. Halos de susceptibilidad en mm, presentados por S. mutans, S. sobrinus y L. acidophilus
al ser enfrentados a las fracciones obtenidas por CCV del flóculo del extracto etanólico.
Fracción
Extracto total
Fracciones
Control positivo
Control negativo
S. mutans
ATCC 25175
S. sobrinus
9
10
15,5
9
9,5
0
0
9
21,5
0
9,5
10
15,5
10,5
10
0
0
9
20,5
0
Flóculo
Petrol:CH2CL2
CH2CL2:AcOEt a
CH2CL2:AcOEt b
AcOEt
AcOEt: EtOH a
AcOEt: EtOH b
EtOH
Van
DMSO
L. acidophilus
903 ATCC
4365
9,5
9
15
9,5
9,5
0
0
8,5
19,5
0
6.4 Fracciones obtenidas del fraccionamiento líquido/líquido del extracto etanólico
Del fraccionamiento líquido/líquido realizado al extracto etanólico, se obtuvieron las fracciones
de Éter de petróleo, CH2Cl2, AcOEt y BuOH, además de unos precipitados obtenidos con el
fraccionamiento con AcOEt y BuOH, a los cuales se denominaron AcOEt(p) y BuOH(p). Se
realizó la evaluación, a una concentración final de 20 mg por pozo (Tabla 4, Figura 3).
Tabla 4. Halos de susceptibilidad en mm (promedio de dos pruebas) presentados por S. mutans,
S. sobrinus y L. acidophilus al ser enfrentados a las fracciones Éter de Petróleo, CH2CL2, AcOEt,
AcOet(p), BuOH y BuOH(p), obtenidas del fraccionamiento líquido/líquido del extracto
Etanólico.
Fracción
S. mutans
ATCC 25175
S. sobrinus
L. acidophilus
903 ATCC 4365
Frac. Éter de Petróleo
Frac. CH2CL2
Frac. AcOEt
Precipitado AcOEt
11,5
15
13,5
15,5
12
17
11
12
12
20
13
15,5
20
Halos de inhibición (mm)
Frac. BuOH
Precipitado BuOH
Vancomicina
DMSO
13,5
0
19
0
11
0
17
0
12
0
18
0
20
15
10
S. mutans
5
S. sobrinus
0
L. acidophilus
Fracciones evaluadas
Figura 3. Acción antimicrobiana de las fracciones obtenidas a partir del fraccionamiento
líquido/líquido del extracto etanólico, a una concentración de 20mg/pozo.
6.5 Rastreo de la fracción CH2Cl2 en un segundo ejemplar de E. utilis
Debido a la actividad antimicrobiana presentada por las fracciones Éter de petróleo, CH 2Cl2,
AcOEt y BuOH del extracto etanólico de E. utilis, se decidió realizar una comparación de las
mismas con fracciones obtenidas a partir de un segundo individuo de la misma especie,
colectado en una localidad diferente, Corregimiento La Aguadita, Fusagasugá, Cundinamarca.
La clasificación taxonómica de este segundo ejemplar fue realizada por J. Aguirre-Santoro del
Instituto de Ciencias Naturales de la Universidad Nacional de Colombia como Elaeagia utilis
(Goudot) Wedd, encontrándose una muestra depositada en el Herbario Nacional Colombiano con
el No. COL: 512351. Para este segundo individuo, se siguió una marcha fitoquímica similar,
para la obtención de cuatro fracciones a partir del extracto etanólico (Éter de petróleo, CH2Cl2,
AcOEt y BuOH).
Debido a que se trabajó con dos ejemplares de la misma especie, se denominó
al colectado en Albán como EU1, y al colectado en Fusagasugá EU2.
Posteriormente, se realizó el montaje para evaluar la acción antimicrobiana de las cuatro
fracciones del fraccionamiento líquido/líquido del extracto etanólico de EU2, sobre los mismos
21
microorganismos, bajo la misma concentración (20mg/pozo) (Tabla 5, Figura 4). La Figura 5
muestra los halos de inhibición de la fracción CH2Cl2, de EU1 y EU2 sobre L. acidophilus, luego
de ser revelados con MTT.
Tabla 5. Halos de susceptibilidad en mm (promedio de dos pruebas) presentados por S. mutans,
S. sobrinus y L. acidophilus al ser enfrentados a las fracciones Éter de Petróleo, CH2CL2, AcOEt
y BuOH, de EU2 obtenidas del fraccionamiento líquido/líquido del extracto Etanólico.
Fracción
Halos de inhibición
Frac. Éter de Petroleo
Frac. CH2CL2
Frac. AcOEt
Frac. BuOH
Vancomicina
DMSO
S. mutans
ATCC 25175
12,5
11
16
10
18
0
L. acidophilus
903 ATCC 4365
10,5
9
13
9
19
0
S. sobrinus
13
8,5
12
10
19
0
20
15
S. mutans
10
S. sobrinus
5
L. acidophilus
0
Petrol CH2CL2 AcOEt
BuOH
Van
DMSO
Fracciones evaluadas
Figura 4. Acción antimicrobiana de las fracciones obtenidas a partir del fraccionamiento
líquido/líquido del extracto etanólico de EU2, a una concentración de 20mg/pozo.
(a)
22
(b)
Figura 5. Halos de susceptibilidad presentados por L. acidophilus al ser enfrentado a las
fracciones CH2CL2 de EU1 (a) y EU2 (b), a una concentración de 20mg/pozo.
6.6 Fraccionamiento de los extractos CH2Cl2 de EU1 y EU2
Debido a la actividad antimicrobiana presentada por las fracciones CH2Cl2 tanto de EU1 como de
EU2, se procedió a efectuar la separación de clorofilas de ambas, para reconocer si éstas eran las
responsables de la actividad. Se llevaron a cabo bajo dos métodos de separación, uno para cada
ejemplar; EU1 fue tratado con el método de retención por CCV con RP-18, y EU2 con el método
de exclusión por Cromatografía en Columna con Sephadex (Figura 6).
Elaeagia utilis
EU1
EU2
Fraccionamiento
L/L
Fraccionamiento
L/L
Fracción
CH2Cl2
Fracción
CH2Cl2
CCV
FE: RP-18
FM: MeOH:H2O,
MeOH: CH2Cl2
Cromatografía en
Columna
FE: Sephadex LH-20
FM: MeOH
MeOH: H2O a
MeOH: H2O b
MeOH: H2O b (sobrenadante)
MeOH: H2O c
MeOH: H2O d
MeOH: H2O e
MeOH: H2O f
MeOH: CH2Cl2
Fr. 0
Fr. 1
Fr. 2
Fr. 3
Figura 6. Esquema de separación de clorofilas realizado a las fracciones de CH2Cl2 de EU1 y
EU2.
La fracción CH2Cl2 de EU1 fue tratada por CCV, con FE: RP-18 y FM: MeOH:H2O (1500ml),
MeOH (100ml) y MeOH:CH2Cl2 (40ml), bajo una proporción 30:1, FE:Muestra.
23
De esta
columna se obtuvieron ocho subfracciones (MeOH:H2Oa, MeOH:H2Ob, MeOH:H2Oc,
MeOH:H2Od, MeOH:H2Oe, MeOH:H2Of y MeOH:CH2Cl2), que a pesar de ser en su mayoría
eluídas con el mismo solvente, bajo monitoreo en CCD, demostraron ser diferentes y se dejaron
como independientes (Cromatografías en el Anexo 5, Figura 3). Todas estas subfracciones
también fueron evaluadas microbiológicamente (Tabla 6, Figura 7).
Se encontró una gran
actividad en las Sf. MeOH:H2Ob, la cual fue dividida en un precipitado (denominado
MeOH:H2Ob), y un sobrenadante llamado MeOH:H2O b(sobrenadante).
Tabla 6. Halos de susceptibilidad en mm, presentados por S. mutans, S. sobrinus y L. acidophilus
al ser enfrentados a las subfracciones de CH2CL2 de EU1, a una concentración de 10mg/pozo.
Subfracción
Halos de inhibición (mm)
MeOH:H2O a
MeOH:H2O b
MeOH:H2O b(s)
MeOH:H2O c
MeOH:H2O d
MeOH:H2O e
MeOH:H2O f
MeOH:CH2Cl2
Van
DMSO
S. mutans
ATCC 25175
11,5
15
17,5
0
0
0
0
0
21,5
0
S. sobrinus
11,5
20
16,5
0
0
0
0
0
19,5
0
L. acidophilus
903 ATCC 4365
11,5
19,5
16
0
0
0
0
0
18
0
20
15
10
S. mutans
S. sobrinus
5
L. acidophilus
0
Subfracciones evaluadas
24
Figura 7. Acción antimicrobiana de las subfracciones obtenidas a partir de la fracción CH2Cl2 de
EU1.
Para la fracción CH2Cl2 de EU2, se separaron las clorofilas por medio de Cromatografía en
Columna con FE: Sephadex LH- 20 y FM: MeOH, con una proporción 30:1, FE:Muestra. De
este fraccionamiento se obtuvieron 4 subfracciones (denominadas 0, 1, 2 y 3), que fueron
evaluadas sobre S. mutans ATCC 25175, S. sobrinus y L. acidophilus 903 ATCC 4365, a una
concentración de 20mg/pozo, exceptuando la Sf. 3, la cual debido a la cantidad obtenida tuvo que
ser ensayada a 10mg/pozo (Tabla 7, Figura 8 y 9). Los resultados arrojaron buena actividad para
la subfraccion 3 a pesar de que esta se ensayó a una concentración más baja, sin embargo debido
a la actividad biológica que también presentaron las Sfs. 1 y 2, éstas fueron monitoreadas por
CCD (Sílica gel, CH2Cl2:MeOH 10:1), y reveladas con vainillina (Figura 10), evidenciándose la
presencia de compuestos con Rf similares en las Sfs. 2 y 3, siendo la última una fracción libre de
clorofilas y otros componentes.
Tabla 7. Halos de susceptibilidad en mm, presentados por S. mutans, S. sobrinus y L. acidophilus
al ser enfrentados a las subfracciones de CH2CL2 de EU2, a una concentración de 20mg/pozo,
exceptuando a la Sf. 3, la cual fue evaluada a 10mg/pozo.
Subfracción No.
0
1
2
3
Vancomicina
DMSO
S. mutans
ATCC 25175
0
9,5
14,5
16
20
0
S. sobrinus
0
9,0
13
17
22
0
25
L. acidophilus
903 ATCC 4365
0
8,0
14
15
21
0
Halos de inhibición (mm)
20
15
S. mutans
S. sobrinus
L. acidophilus
10
5
0
Sf 0
Sf 1
Sf 2
Sf 3
Van
DMSO
Subfracciones probadas
Figura 8. Acción antimicrobiana de las subfracciones obtenidas a partir de la fracción CH2Cl2 de
EU1.
(a)
(b)
(c)
Figura 9. Halos de susceptibilidad presentados por (a) S. mutans, (b) S. sobrinus y (c) L.
acidophilus, al ser enfrentados a las Subfraccion No. 4 de CH2CL2 de EU1.
1
2
3
Figura 10. CCD (FE: Sílica gel, FM: CH2Cl2:MeOH (10:1)) revelada con vainillina, de las
subfracciones activas, obtenidas del fraccionamiento con Sephadex de la fracción CH2Cl2 de
EU2. Los recuadros indican los compuestos comunes entre las Sf. 2 y 3.
26
6.7 Concentración mínima inhibitoria
Luego de reconocer la actividad antimicrobiana de las subfracciones MeOH:H2Ob de EU1 y Sf. 3
de EU2, sobre S. mutans ATCC 25175, S. sobrinus y L. acidophilus 903 ATCC 4365, se continuo
haciendo un tamizaje de la mismas fracciones a concentraciones de 1mg/pozo, 0.5mg/pozo y
0.1mg/pozo. En la tabla 8 y la figura 9 se observan los resultados de esta evaluación.
Tabla 8. Halos de susceptibilidad presentadas por las cepas de interés, al ser evaluadas las
fracciones activas a diferentes concentraciones.
Concentración
(mg/pozo)
1
0.5
0.1
EU1
EU2
EU1
EU2
EU1
EU2
S. mutans
16
13
15
11,5
12
9,5
S. sobrinus
17
12
12
10
10
9
L. acidophilus
18
12,5
10
9,5
9
8
(a)
(b)
Figura 11. Halos de inhibición sobre S. mutans producidos por la MeOH:H2Ob de EU1 (a), y la
Sf. 3 de EU2 (b), bajo concentraciones de 1mg/pozo, 0.5mg/pozo y 0.1mg/pozo.
27
6.8 Bioautografías
La fracción MeOH:H2Ob de EU1, fue sembrada en placas de sílica gel, con FM: CH2Cl2:MeOH
(9:1), para la realización de pruebas bioautográficas contra S. mutans ATCC 25175, S. sobrinus y
L. acidophilus 903 ATCC 4365. Se logró observar un halo de inhibición, alrededor de los
compuestos que bajo UV de onda larga fluorecen con colores amarillo y rosado, y que poseen Rf
de 0,44 y 0,49 respectivamente (Figura 10).
Rf: 0,63
Rf: 0,49
Rf: 0,44
Rf: 0,40
Rf: 0,12
A
B
C
D
Figura 12. Bioautografía de la Sf. MeOH:H2Ob de EU1, con FE: Sílica gel, FM: CH2Cl2:MeOH
(9:1). A) Cromatografía revelada con Vainillina. B) Placa cromatográfica con indicador de
fluorescencia (254) bajo luz UV de onda larga, con los Rf de los compuestos fluorescentes. C y
D) Bioautografía de S. mutans y L. acidophilus, reveladas con MTT
6.9 Estudio químico de las subfracciones activas
6.9.1 Cromatografía en capa delgada
Las subfracciones de CH2Cl2 más activas de EU1 (MeOH:H2Ob y MeOH:H2Ob(s)) y EU2 (Sf. 4)
fueron comparadas mediante CCD (Figura 11), evidenciándose una gran similaridad entre las
subfracciones MeOH:H2Ob de EU1 y la Sf. 3 de EU2.
6.9.2 Estudio químico cualitativo de las subfracciones activas
En la tabla 9 se presenta el análisis químico cualitativo realizado a las subfracciones activas de
EU1 y EU2 (correspondiente a MeOH:H2Ob y Sf. 3 respectivamente). En este se evidencia la
28
presencia de terpenos y sesquiterpenlactonas para Sf 3, y de diterpenos, saponinas y
sesquiterpenlactonas para MeOH:H2Ob (Registros fotográficos en Anexo 5, Figuras 4 y 5).
1
2 3
A
1
2
B
1
2
C
Figura 13. CCD: A) Sfs. MeOH:H2Ob(s) (1) y MeOH:H2Ob (2) y Sf. 3 (3) (FE: RP-18, FM:
MeOH:H2O 10:1). B) Sfs. 3 (1) de EU2 y MeOH:H2Ob (2) de EU1 (FE: Sílica gel, FM:
CH2Cl2:MeOH 10:1), revelada con vainillina. C) Sfs. 3 (1) y MeOH:H2Ob (2) (FE: Sílica gel
F254, FM: CH2Cl2:MeOH 9:1), bajo luz UV de onda larga.
Tabla 9. Pruebas químicas cualitativas de las subfracciones activas de EU1 y EU2.
Prueba
Baljet (terpenos y esteroles)
Lieberman-Burchard (esteroides y terpenos)
Salkowski (terpenos)
Molibdato de amonio (diterpenos)
Cloruro férrico (FeCl3) (flavonoides y fenoles)
Dragendroff (Alcaloides)
Prueba de la espuma (Saponinas)
Antrona (Glicósidos)
Hidroxamato férrico (Sesquiterpenlactonas)
6.9.3 Cromatografía de Gases acoplada a Espectrometría de Masas
29
Resultado
EU1 EU2
+
+
+
+
+
+
+
+
La Tabla 10, muestra los compuestos encontrados en la Sf. MeOH:H2Ob de EU1 por CG-EM;
solo aquellos con más de un 90% de coincidencia fueron identificados. El cromatograma y los
espectros de masas de algunos compuestos identificados se encuentran en el Anexo 3.
Tabla 10. Compuestos de la Sf MeOH:H2Ob de EU1, hallados mediante CG-EM.
%
del
área
total
Coincidencia
Tipo de
compuesto
9.443
97
Fenol
96
90
Fenol
Trieno
1.846
91
Ácido
1.793
1.441
97
Alcohol
94
Acido
carboxílico
91
90
Fenol
Benzofurano
90
Benzoquinona
TR
Pico
No.
2.427
66
15.096
15.759
25.148
9.807
16.483
26.117
18.955
24.702
25.877
25.422
57
63
110
14
69
114
80
107
112
111
16.973
73
5.885
12.484
4
34
4-((1E)-3-Hidroxi-1-propenil)-2metoxifenol
No identificado
No identificado
No identificado
2-metoxi-4-vinilfenol
1,Z-5,E-7-Dodecatrieno
No identificado
No identificado
No identificado
No identificado
No identificado
Acido benzoico, 2-hidroxi-fenil metil
ester
Benzyl alcohol
No identificado
7.475
7
Acido benzoico
1.409
24.456
21.808
20.838
23.906
17.900
22.609
11.162
8.491
8.504
10.886
21.297
103
93
87
103
77
96
24
8
8
21
89
1.366
1.350
1.254
1.240
1.207
1.203
1.199
1.186
1.186
1.180
1.138
13.483
42
9.973
19.455
15
82
No identificado
No identificado
No identificado
No identificado
No identificado
No identificado
No identificado
4-vinilfenol
2,3-dihidrobenzofurano
No identificado
No identificado
2,5-dimetil-(3-methoximetil)-pbenzoquinona
No identificado
No identificado
Nombre
30
5.111
4.181
3.234
2.427
2.344
2.244
2.212
2.106
2.086
2.083
1.116
1.033
1.064
16.662
13.732
70
46
11.775
30
Loliolido
2,6-dimetoxi-4-(2-propenil) fenol
3-metoxi-4-hidroxi- benzaldehído
(vainillina)
0.808
0.553
97
97
Lactona
Fenol
0.430
94
Aldehído
De la Sf. 3 de EU2, los compuestos identificados con más de un 90% de coincidencia fueron los
relacionados en la Tabla 11.
Los demás picos del cromatograma se clasificaron como no
identificados por su bajo porcentaje de coincidencia con la librería del equipo (Anexo 4).
Tabla 11. Compuestos identificados en la Sf 3 de EU1 bajo análisis con CG-EM.
TR
Nombre
% del
área Coincidencia
total
Tipo de
compuesto
99
Amina
heterocíclica
94
Ácido graso
2.351
N-Benzoil-3(hidroximetil)piperidina
38.191
45.472
44.442
44.134
44.880
42.270
44.075
42.317
15.579
No identificado
No identificado
No identificado
No identificado
No identificado
No identificado
No identificado
Acido hexanoico
15.862
13.553
8.663
6.895
6.604
4.710
4.152
7. DISCUSIÓN
Entre el 60 y el 90% de los niños en edad escolar y de adultos de los países industrializados, se
ven seriamente afectados por la prevalencia de caries dental (Petersen, 2003). La Organización
Panamericana de la Salud (1997), asegura que la salud oral es un aspecto fundamental de las
condiciones generales de salud debido a la importancia que tiene la morbilidad oral, los costos
relacionados con su tratamiento y la posibilidad de aplicar medidas eficaces de prevención. Sin
embargo, en los países en desarrollo a pesar de la alta incidencia de esta enfermedad, el acceso a
los servicios de salud oral es limitado, lo que a largo plazo genera en los pacientes perdida de los
dientes, y por tanto un decremento en la calidad de vida de los mismos (Petersen, 2003).
31
La caries se define como un proceso o enfermedad dinámica que ocurre en la estructura dentaria
en contacto con los depósitos microbianos, debido al desequilibrio entre la sustancia dental y el
fluido de placa circundante, lo que da como resultado una pérdida de mineral de la superficie
dental y por tanto la destrucción localizada de tejidos duros (Sosa, 2003). Aunque la etiología de
la caries es multifactorial, los microorganismos organizados en una biopelícula, denominada
placa dental, constituyen un factor determinante en el desarrollo de la lesión de caries (FigueroaGordón et al., 2009).
Los principales microorganismos asociados a la producción de caries dental son en orden de
frecuencia: S. mutans y en menor proporción S. sobrinus y S. gordonii, y especies de
Lactobacillus y Actinomyces; el reconocimiento de la importancia de estos microorganismos en la
iniciación y progresión de la caries, conduce a diseñar medidas dirigidas hacia la eliminación o
disminución de estas bacterias en la cavidad oral (Alvarado et al., 2008). Aunque en su mayoría
el control y prevención de la aparición de la flora patógena bucal, se realiza mediante el
tratamiento con productos químicos, existe un elevado índice de resistencia, además de la
consecución de efectos no deseados que afectan la seguridad de los pacientes (diarreas, vómitos,
coloración de mucosas, irritaciones, etc.), de allí la importancia de explorar nuevas alternativas de
control.
Los compuestos naturales con efectos antimicrobianos, son la base de una línea de investigación
dedicada al descubrimiento de componentes estructurales y funcionales, también llamados
principios activos, que en su mayor parte son metabolitos secundarios (Araújo & Salas, 2008).
La investigación de estos compuestos se encamina como una opción para el desarrollo de
medicamentos eficaces y accesibles, para el tratamiento de enfermedades de importancia pública.
Extractos o fracciones vegetales de diversas familias, han mostrado actividad antimicrobiana
frente a patógenos bucales como S. mutans, S. sobrinus y L. acidophilus. Miembros de las
familias Myristicaceae (Chung et al., 2006), Amaryllidaceae (Bakri & Douglas, 2005),
Asteraceae (Yatsuda et al., 2005), han demostrado actividad biológica de sus extractos, así como
otros ejemplares muestran actividad antimicrobiana de sus aceites esenciales, como sucede las
familias Verbenaceae (Botelho et al., 2007) y Euphorbiaceae (Alviano et al., 2005). Una de las
32
familias botánicas más ampliamente distribuidas en nuestra región es la Rubiaceae, de la cual se
ha demostrado actividad antimicrobiana ante patógenos bucales de algunos individuos como
Isertia laevis (Alvarado et al., 2008), lo que hace de los ejemplares de esta familia una fuente
interesante de estudio.
Este trabajo que hace parte del proyecto de investigación titulado “Evaluación de la actividad
antibacteriana de extractos y fracciones obtenidos de dos especies de la familia Rubiaceae: Isertia
laevis y Elaeagia utilis”, llevado a cabo por el esfuerzo conjunto de GIFUJ y el CIO, financiado
por la Pontificia Universidad Javeriana, evaluó la actividad antimicrobiana de la especie Elaeagia
utilis, sobre cepas de patógenos orales. Se evaluaron microbiológicamente contra cepas de S.
mutans, S. sobrinus y L. acidophilus, el aceite esencial y las fracciones obtenidas a partir del
extracto en éter de petróleo, y del floculo del extracto etanólico.
El aceite esencial extraído a partir de hojas de E. utilis, fue evaluado tan solo contra S. mutans
debido al bajo rendimiento de la extracción, sin embargo se evidenció actividad antimicrobiana a
una baja concentración (1mg/pozo). El análisis por CG-EM, reveló que entre los compuestos
mayoritarios de esta mezcla se encuentran algunos reportados para los aceites esenciales de otros
individuos de la familia como el linalol, la ionona, la Betaionona y el ácido hexanoico (Baser et.
al, 2004). Además, también se encontraron fenilpropenos como el Eugenol, Isoeugenol y 3-Alil6-metoxifenol, compuestos que se conoce son producidos por las plantas como mecanismos de
defensa antibacteriana y como toxina para predadores (Koeduka et. al, 2006).
El Eugenol, se reconoce por ser un compuesto con propiedades analgésicas y antimicrobianas, así
mismo se reconoce el uso de este como integrante del cemento dental (Dai-Chian et. al 2008,
Koeduka et. al 2006). Se ha comprobado que el eugenol, presenta actividad biológica contra
bacterias transmitidas mediante los alimentos como Salmonella typhimurium, Staphylococcus
aureus and Vibrio parahaemolyticus (Karapinar & Esen, 1987); Hemaiswarya & Doble (2009),
reportan daño de la membrana celular bacteriana al contacto con el eugenol. Sin embargo se
reconoce que tanto eugenol como isoeugenol, tienen actividad pro y antioxidante, y que sus
efectos secundarios como alergias y reacciones inflamatorias se deben precisamente a su
actividad pro-oxidante (Atsumi et. al, 2005).
33
Además, algunos estudios demuestran que a
concentraciones de 1.25 y 2.5 mmol/L, el eugenol interfiere con la actividad bactericida de los
neutrófilos, contra patógenos orales como S. mutans y Actinobacillus actinomycetemcomitans
(Chian et. al, 2008).
Por su parte, las fracciones de mediana a alta polaridad del extracto en éter de petróleo,
presentaron actividad antimicrobiana, mientras que para las del floculo las de polaridad baja a
media evidenciaron halos de inhibición. Los cuatro extractos obtenidos mediante extracción
líquido/líquido (Petrol, CH2Cl2, AcOEt y BuOH), a partir del extracto etanólico también
presentaron actividad antimicrobiana, sin embargo la alta actividad biológica presentada por la
fracción CH2Cl2, dirigió la investigación hacia el rastreo de la misma, en otro individuo de la
misma especie colectado en otra localidad. Para el segundo ejemplar de E. utilis (EU2), se siguió
una marcha similar para la obtención y evaluación de los cuatro extractos del fraccionamiento
líquido/líquido (Petrol, CH2Cl2, AcOEt y BuOH), corroborándose la actividad biológica de los
mismos aún cuando la fracción CH2Cl2, no presentó la mayor actividad antimicrobiana de las
fracciones evaluadas, como si fue el caso de EU1.
A la fracción CH2Cl2 de cada individuo, se le realizó un método diferente de separación de
clorofilas. Para el individuo EU1, se elaboró una CCV con FE: RP-18, F: MeOH:H2O, para la
obtención de ocho subfracciones. La Sf. MeOH:H2Ob fue divida en un precipitado al que se le
dio el mismo nombre, y un sobrenadante que fue denominado MeOH:H2Ob(s); fueron estas
subfracciones las que presentaron una actividad antimicrobiana considerable, aunque la Sf.
MeOH:H2Ob presentó halos de inhibición mayores. Bajo monitoreo por CCD (FE: RP-18, FM:
MeOH:H2O) de las subfracciones
MeOH:H2Ob y MeOH:H2Ob(s), se encontró una gran
similitud, aunque la primera se mostraba con una menor cantidad de componentes, por lo que fue
seleccionada como la subfracción activa de EU1.
La separación de clorofilas de la fracción CH2Cl2 de EU2, se llevó a cabo con Sephadex LH-20;
se obtuvieron cuatro subfracciones (Sf. 0, 1, 2 y 3), tres de ellas con actividad contra las cepas de
estudio (Sf. 1, 2 y 3). El monitoreo con CCD demostró similitud entre las Sfs. 2 y 3, siendo la 2,
la fracción poseedora de clorofila. Debido a que la Sf. 3 pesar de ser probada a la mitad de la
34
concentración de las otras tres, presentó la mayor actividad antimicrobiana, se infiere que la
presencia de clorofila en la Sf. 3, es un interferente de la actividad biológica.
Las Sfs activas encontradas para EU1 y EU2, fueron comparadas bajo CCD (FE: RP-18, FM:
MeOH:H2O), mostrando gran semejanza, aún cuando la Sf MeOH:H2Ob presenta una mayor
mezcla de compuestos.
Además, ambas subfracciones presentan una alta actividad
antimicrobiana a bajas concentraciones, presentándose halos de inhibición a 0.1mg/pozo, por lo
que la CMI de estas fracciones activas debe estar por debajo de este valor.
Las bioautografías realizadas con la Sf MeOH:H2Ob, mostraron que los compuestos que bajo luz
UV presentaban Rf de 0,44 y 0,49, son los causantes de la actividad; es importante recalcar que
al ser revelados con vainillina, no se diferencia la presencia de dos compuestos, por el contrario
se muestra una sola marca amarrilla en la placa.
El estudio químico cualitativo determinó la presencia principalmente de terpenos y
sesquiterpenlactonas en ambas fracciones, pero además de saponinas para la Sf MeOH:H2Ob de
EU1, que presentó halos de inhibición un poco más grandes que la Sf. 3 de EU2, lo que tal vez
indique sinergismo en la mezcla ante la presencia de este tipo de compuestos. De Rosa et al.
(2000) y Zhao et al. (1997), reportan la presencia de saponinas triterpénicas en especies
pertenecientes a esta familia, mientras que Kloucek et al. (2005), afirman que especies
pertenecientes a la familia Rubiaceae con actividad antimicrobiana frente a microorganismos
patógenos presentan triterpenos como componente mayoritario.
El análisis por CG-EM para la Sf. 3 de EU2, tan solo detectó la presencia de N-Benzoil3(hidroximetil)piperidina (amina) y de ácido hexanoico (ácido graso), mientras que para la Sf.
MeOH:H2Ob de EU1, reveló la presencia de varias clases de compuestos entre los que se
destacan fenoles (4-((1E)-3-Hidroxi-1-propenil)-2-; 2-metoxi-4-vinilfenol; 4-vinilfenol; 2,6dimetoxi-4-(2-propenil) fenol), ácidos (Acido benzoico, 2-hidroxi-fenil metil ester y ácido
benzoico), y otros compuestos derivados de benceno (2,5-dimetil-(3-methoximetil)-pbenzoquinona y 2,3-dihidrobenzofurano). Friedman et. al (2006), reportan que benzaldehídos
benzoicos (4-hidroxi-3-metoxi benzaldehído) y ácidos benzoicos (Acido benzoico, 2-hidroxi35
fenil metil ester) muestran actividad antimicrobiana de cepas transmitidas por alimentos como
Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus y Escherichia coli. Sin embargo, existe en la
muestra una serie de compuestos no identificados por CG-EM, que pueden estar relacionados con
la actividad biológica de esta subfraccion.
8. CONCLUSIONES
Los extractos y fracciones totales aislados de hojas de ambos individuos de Elaeagia utilis,
evidenciaron actividad antimicrobiana contra las cepas de Streptococcus mutans, Streptococcus
sobrinus y Lactobacillus acidophilus, lo que hace de esta especie una importante fuente de
compuestos con actividad antimicrobiana frente a patógenos orales.
Se lograron obtener subfracciones activas altamente similares de ambos individuos de E. utilis, a
partir de la fracción CH2Cl2 del extracto etanólico. Esto mediante la ejecución de dos métodos
diferentes: Cromatografía en Columna al Vacío con RP-18 y Cromatografía en Columna con
Sephadex LH-20.
Se comprobó la similitud química y antimicrobiana de las subfracción de la fracción CH2Cl2, de
dos individuos de E. utilis, colectados en localidades diferentes.
La Separación de clorofilas mediante Cromatografía en Columna con Sephadex LH-20, resultó el
método más eficaz para la obtención de la Subfracción activa contra S. mutans, S. sobrinus y L.
acidophilus, debido a que la retención de los compuestos no clorofílicos en esta Fase
Estacionaria, permitió la obtención de los compuestos activos en un menor grado de mezcla que
el proporcionado por la Cromatografía en Columna al Vacío con RP-18.
Las subfracciones activas de la fracción CH2Cl2 de ambos individuos poseen una concentración
mínima inhibitoria por debajo de los 0.1mg/pozo.
Los compuestos con Rf de 0,44 y 0,49 son probablemente los responsables de la actividad
inhibitoria presentada por las subfracciones activas de la fracción CH2Cl2 de EU1 y EU2.
36
El Aceite Esencial extraído a partir de hojas de E. utilis, evidenció actividad antimicrobiana en
contra de S. mutans, a una baja concentración. Se destaca la presencia de fenilpropenos a los
cuales se les ha demostrado actividad bactericida, dentro del aceite esencial, sin embargo el alto
grado de mezcla de la fracción no permite aseverar que estos compuestos sean los únicos
responsables de la actividad biológica.
9. RECOMENDACIONES
Aislar, purificar e identificar los componentes activos de la mezcla de las fracciones activas, para
la elucidación y cuantificación final de los compuestos responsables de la actividad biológica.
Evaluar microbiológicamente las subfracciones activas, contra otras cepas bacterianas patógenas
orales.
Someter a las subfracciones activas a un estudio in vivo, donde se ponga a prueba la actividad
antimicrobiana contra el biofilm o placa bacteriana.
Evaluar el efecto toxicológico que las subfracciones activas halladas puedan tener sobre células
humanas sanas.
Fraccionar y evaluar biológicamente, los extractos y fracciones totales que también presentaron
actividad antimicrobiana y que no fueron analizados en este estudio.
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41
ANEXOS
ANEXO 1
ANÁLISIS ESTADÍSTICO
Tabla 1. Análisis estadístico de la actividad antimicrobiana de las fracciones del extracto en éter
de petróleo.
Eter de Petrol:
CH2Cl2:
CH2Cl2
AcOEt AcoEt:EtOH EtOH Vancomicina DMSO
Petróleo CH2Cl2
AcOEt
10
0
0
10
8
15
11
18
0
9
0
0
12
9
15
11
20
0
Media
Desviación
estándar
Varianza de la
muestra
9,50
0,00
0,00
11,00
8,50
15,00
11,00
19,00
0,00
0,71
0,00
0,00
1,41
0,71
0,00
0,00
1,41
0,00
0,50
0,00
0,00
2,00
0,50
0,00
0,00
2,00
0,00
% Inhibición
50,00
0,00
0,00
57,89
44,74
78,95
57,89
100,00
0,00
S. sobrinus
9
0
0
9
9
9
8
19
0
9
0
0
9
9
8
9
15
0
Media
Desviación
estándar
Varianza de la
muestra
9,00
0,00
0,00
9,00
9,00
8,50
8,50
17,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,71
0,71
2,83
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,50
0,50
8,00
0,00
% Inhibición
52,94
0,00
0,00
52,94
52,94
50,00
50,00
100,00
0,00
L. acidophilus
9,00
0,00
0,00
8,00
7,00
7,00
8,00
20,00
0
9,00
0,00
0,00
10,00
7,00
9,00
9,00
18,00
0
9,00
0,00
0,00
9,00
7,00
8,00
8,50
19,00
0,00
0,00
0,00
0,00
1,41
0,00
1,41
0,71
1,41
0,00
0,00
47,37
0,00
0,00
0,00
0,00
2,00
47,37
0,00
36,84
2,00
42,11
0,50
44,74
2,00
100,00
0,00
0,00
S. mutans
Media
Desviación
estándar
Varianza de la
muestra
% Inhibición
1
Tabla 2. Análisis estadístico de la actividad antimicrobiana de las fracciones del flóculo del
extracto etanólico.
Flóculo
S. mutans
Media
Desviación
estándar
Varianza de la
muestra
% Inhibición
S. sobrinus
9
Petrol: CH2Cl2: CH2Cl2:
AcOEt
CH2Cl2 AcOEt a AcOEt b
10
16
10
10
AcoEt:
AcoEt:
EtOH
EtOH Vancomicina DMSO
EtOH b
a
0
0
9
21
0
9
10
15
8
9
0
0
9
22
0
9,00
10,00
15,50
9,00
9,50
0,00
0,00
9,00
21,50
0,00
0,00
0,00
0,71
1,41
0,71
0,00
0,00
0,00
0,71
0,00
0,00
0,00
0,50
2,00
0,50
0,00
0,00
0,00
0,50
0,00
41,86
46,51
72,09
41,86
44,19
0,00
0,00
41,86
100,00
0,00
10
10
16
11
10
0
0
9
22
0
9
10
15
10
10
0
0
9
19
0
9,50
10,00
15,50
10,50
10,00
0,00
0,00
9,00
20,50
0,00
0,71
0,00
0,71
0,71
0,00
0,00
0,00
0,00
2,12
0,00
Media
Desviación
estándar
Varianza de la
muestra
% Inhibición
0,50
0,00
0,50
0,50
0,00
0,00
0,00
0,00
4,50
0,00
46,34
48,78
75,61
51,22
48,78
0,00
0,00
43,90
100,00
0,00
L. acidophilus
9
10
15
10
9
0
0
9
20
0
10
8
15
9
10
0
0
8
19
0
9,50
9,00
15,00
9,50
9,50
0,00
0,00
8,50
19,50
0,00
0,71
1,41
0,00
0,71
0,71
0,00
0,00
0,71
0,71
0,00
0,50
2,00
0,00
0,50
0,50
0,00
0,00
0,50
0,50
0,00
48,72
46,15
76,92
48,72
48,72
0,00
0,00
43,59
100,00
0,00
Media
Desviación
estándar
Varianza de la
muestra
% Inhibición
Tabla 3. Análisis estadístico de la actividad antimicrobiana de las fracciones del fraccionamiento
líquido/líquido del extracto etanólico de EU1.
S. mutans
Éter de
Precipitado
Precipitado
CH2Cl2 AcOEt
BuOH
Vancomicina DMSO
Petróleo
AcOEt
BuOH
13
10
13
16
13
0
18
0
10
20
14
15
14
0
20
0
Media
11,50
15,00
13,50
15,50
13,50
0,00
19,00
0,00
Desviación estándar
2,12
7,07
0,71
0,71
0,71
0,00
1,41
0,00
Varianza de la muestra
4,50
50,00
0,50
0,50
0,50
0,00
2,00
0,00
% Inhibición
S. sobrinus
60,53
78,95
71,05
81,58
71,05
0,00
100,00
0,00
13
16
11
12
10
0
17
0
11
18
11
12
9
0
15
0
2
12
17
11
12,00
9,5
0,00
16
0,00
Desviación estándar
1,41
1,41
0,00
0,00
0,71
0,00
1,41
0,00
Varianza de la muestra
2,00
2,00
0,00
0,00
0,50
0,00
2,00
0,00
% Inhibición
75,00
106,25
68,75
70,59
59,38
0,00
100,00
0,00
10
20
13
16
12
0
17
0
14
20
13
15
12
0
19
0
Media
12,00
20,00
13,00
15,50
12,00
0,00
18,00
0,00
Desviación estándar
2,83
0,00
0,00
0,71
0,00
0,00
1,41
0,00
Varianza de la muestra
8,00
0,00
0,00
0,50
0,00
0,00
2,00
0,00
% Inhibición
66,67
111,11
72,22
86,11
66,67
0,00
100,00
0,00
Media
L. acidophilus
Tabla 4. Análisis estadístico de la actividad antimicrobiana de las fracciones del
fraccionamiento líquido/líquido del extracto etanólico de EU2.
S. mutans
Petrol
CH2Cl2
AcOET
Butanol
Vancomicina
DMSO
12
11
16
10
17
0
13
11
16
10
19
0
Media
12,50
11,00
16,00
10,00
18,00
0,00
Desviación estándar
Varianza de la
muestra
0,07
0,00
0,00
0,00
1,41
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
2,00
0,00
% Inhibición
S. sobrinus
69,44
61,11
88,89
55,56
100,00
0,00
13
9
12
10
19
0
13
8
12
10
19
0
Media
13,00
8,50
12,00
10,00
19,00
0,00
Desviación estándar
Varianza de la
muestra
0,00
0,71
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
68,42
0,50
44,74
0,00
63,16
0,00
52,63
0,00
100,00
0,00
0,00
10
9
13
9
19
0
11
9
13
9
19
Media
10,50
9,00
13,00
9,00
19,00
0
0,00
Desviación estándar
Varianza de la
muestra
0,71
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,50
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
% Inhibición
55,26
47,37
68,42
47,37
100,00
0,00
% Inhibición
L. acidophilus
3
Tabla 6. Análisis estadístico de la actividad antimicrobiana de las subfracciones de CH2Cl2 de
EU1.
S. mutans
MeOH: MeOH: MeOH:
H2O a
H2O b H2O b(s)
12
16
17
MeOH: MeOH: MeOH: MeOH:
H2O c
H2O d H2O e
H2O f
0
0
0
0
MeOH:
Vancomicina DMSO
CH2Cl2
0
21
0
11
14
18
0
0
0
0
0
22
0
Media
Desviación
estándar
Varianza de la
muestra
11,50
15,00
17,50
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
21,50
0,00
0,71
1,41
0,71
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,71
0,00
0,50
2,00
0,50
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,50
0,00
% Inhibición
S. sobrinus
53,49
69,77
81,40
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
100,00
0,00
11
20
16
0
0
0
0
0
20
0
12
20
17
0
0
0
0
0
19
0
Media
Desviación
estándar
Varianza de la
muestra
11,50
20,00
16,50
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
19,50
0,00
0,71
0,00
0,71
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,71
0,00
0,50
0,00
0,50
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,50
0,00
% Inhibición
L. acidophilus
58,97
102,56
84,62
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
100,00
0,00
12
20
17
0
0
0
0
0
16
0
11
19
15
0
0
0
0
0
20
0
Media
Desviación
estándar
Varianza de la
muestra
11,50
19,50
16,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
18,00
0,00
0,71
0,71
1,41
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
2,83
0,00
0,50
0,50
2,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
8,00
0,00
% Inhibición
63,89
108,33
88,89
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
100,00
0,00
Tabla 7. Análisis estadístico de la actividad antimicrobiana de las subfracciones de CH2Cl2 de
EU2.
Sf 0
Sf 1
Sf 2
Sf 3
Vancomicina
DMSO
0
10
14
16
20
0
0
9
15
16
20
0
Media
0,00
9,50
14,50
16,00
20,00
0,00
Desviación estándar
Varianza de la
muestra
% Inhibición
0,00
0,71
0,71
0,00
0,00
0,00
0,00
0,50
0,50
0,00
0,00
0,00
0,00
47,50
72,50
80,00
100,00
0,00
0
9
12
16
22
0
0
9
14
18
22
0
S. mutans
S. sobrinus
4
Media
0,0
9,0
13,0
17,0
22,0
0,0
Desviación estándar
Varianza de la
muestra
% Inhibición
0,0
0,0
1,4
1,4
0,0
0,0
0,0
0,0
2,0
2,0
0,0
0,0
0,0
40,9
59,1
77,3
100,0
0,0
0
8
15
15
22
0
0
8
13
15
20
0
Media
0,00
8,00
14,00
15,00
21,00
0,00
Desviación estándar
Varianza de la
muestra
% Inhibición
0,00
0,00
1,41
0,00
1,41
0,00
0,00
0,00
2,00
0,00
2,00
0,00
0,00
38,10
66,67
71,43
100,00
0,00
L. acidophilus
ANEXO 2
ESTUDIO QUÍMICO
COMPUESTOS DEL ACEITE ESENCIAL IDENTIFICADOS POR CG-EM
%
del
area
total
7.666
4.403
4.403
4.403
4.247
3.685
3.685
2.874
2.596
TR
Pico
No.
6.786
8.824
8.824
8.824
19.439
12.437
12.437
8.884
5.039
25
47
47
47
105
81
81
48
6
Ácido 2-hidroxibenzoico, metil ester
3-Alil-6-metoxifenol
Eugenol
2 metoxi-4-(1-propenil)fenol (isoeugenol)
Ácido 2-hidroxi benzoico, fenilmetil ester
17-Octadecenal
Hexadecanal
Ionona
Linalol
8.614
45
1-(2,6,6-Trimetil-1,3-ciclohexadien-1-il)-2-buten1-ona
2.482
97
8.427
9.970
4.158
5.452
5.452
15.285
15.285
15.285
15.285
15.285
15.285
15.285
43
60
1
8
8
91
91
91
91
91
91
91
Betaionona
Irisona
Ácido hexanoico
Bencil alcohol
p-nitrofenil ester N-Cbz-glicilglicina
Ciclohexadecano
1-Nonadecanol
Ciclotetradecano
Ácido acético, cloro-, octadecil ester
Ácido 2 cloropropionico, pentadecil ester
Ácido tricloroacetico, pentadecil ester
Ácido tricloroacetico, tetradecil ester
2.420
2.113
2.048
1.613
1.613
1.601
1.601
1.601
1.601
1.601
1.601
1.601
94
93
90
96
90
98
95
94
94
94
94
94
Sustancia
5
Coincidencia
96
98
97
97
94
91
95
91
93
15.285
15.285
15.285
15.285
15.285
15.285
15.285
10.239
6.604
6.196
7.513
22.865
91
91
91
91
91
91
91
64
23
18
34
110
22.865
110
14.222
7.672
13.335
10.752
10.752
6.158
11.837
4.874
4.880
4.874
4.880
7.739
7.739
13.732
20.508
20.508
20.508
20.508
20.508
20.508
20.508
10.328
10.328
10.328
10.328
10.328
10.328
10.328
10.328
10.328
88
36
83
69
69
17
78
6,10,14-trimetil-2-pentadecanona
5
12.845
82
17.147
14.096
98
87
5
37
37
86
107
107
107
107
107
107
107
65
65
65
65
65
65
65
65
65
2-Tetradeceno, (E)1,2-octadecadeniol
Ácido heptafluorobutirico, n-pentadecil ester
Ácido cloroacetico, pentadecil ester
Ácido heptafluorobutirico, n-octadecil ester
Ácido acético, cloro-, hexadecil ester
Ácido dicloroacetico, heptadecil ester
Heptadecano
2-Decenal, (E)-
1.601
1.601
1.601
1.601
1.601
1.601
1.601
1.501
1.486
1.338
1.264
1.259
93
92
91
91
91
91
90
95
90
96
95
96
1.259
91
Megastigma-4,6 (E), 8 (E) -trieno
n-hexil salicilato
Tridecanal
Tetradecanal
Feniletil alcohol
Octadecano
1.075
0.923
0.888
0.884
0.884
0.854
0.668
91
98
94
91
91
91
95
cis-linaloloxido
0.574
90
0.574
90
0.517
0.517
0.514
0.503
0.503
0.503
0.503
0.503
0.503
0.503
0.451
0.451
0.451
0.451
0.451
0.451
0.451
0.451
0.451
97
93
95
91
91
91
91
91
91
91
99
91
91
91
91
91
91
91
91
0.443
94
0.439
0.438
90
98
octen-1-ol 3,7-dimetil-6
2,4-decadienal, (E, E)Heptacosano
Acido 1,2-Bencenodicarboxílico, mono(2-etilhexil)
ester
5-etiltetrahidro-2-furanmetanol, alfa.,.alfa., 5-trimetril-,
cis1-metoxi-4-(propenil)-Benceno
Estragol
Dietil ftalato
Octacosano
Eicosano
11-(1-ethylpropyl)-Heneicosano
Tetracosano
Tetratetracontano
9-octyl-Heptadecano
Nonacosano
3-Heptadeceno, (z)
4-Heptafluorobutiriloxihexadecano
1-Heptadeceno
3-Hexadeceno, (z)4-Trifluoroacetoxihexadecano
9-Eicoseno, (E)9-Octadeceno, (E)Ácido bromoacetico, hexadecil ester
1-Hexadecanol
5,6,7,7a-tetrahidro-4,4,7a-trimetil-2 (4H)Benzofuranona,
6,10,14-trimetil-5,9,13-pentadecatrien-2-ona
1,6-dimetil-4-(1-metiletil)-Naftaleno
6
11.198
28.765
30.798
71
114
117
30.798
117
11.765
13.539
9.614
6.565
4.632
4.637
10.036
10.036
10.036
22.447
22.447
22.447
17.059
20.508
77
84
56
22
3
3
61
61
61
109
109
109
97
107
20.789
108
18.029
17.654
101
100
2-metoxi-Naftaleno
Ácido 6-etiloct-3-il 2-etilhexil ester ftálico
Escualeno
2,6,10,14,18,22-Tetracosahexaeno, 2,6,10,15,19,23hexametil-, (all-E)Ácido hexil ester benzoico
Nonadecano
2,7-dimetil-Naftaleno
Tetradecano
Ácido 3-hexanoico (E)
Ácido 2-hexanoico
1,6-dimetil-Naftaleno
2,7-dimetil-Naftaleno
1,5-dimetil-Naftaleno
Acido 2,2,2-tricloro etil ester octadecyl Carbonico
Bacteriochlorofil-c-estearil
9-Eicoseno, (E)Heneicoseno
1,2,3,4,4a,9,10,10a-octahidro-1,1,4a-trimetil-7-(1metiletil)-, (4aS-trans)-Fenantreno
Ácido decil isobutil ester ftálico
Bencil benzoato
7
0.404
0.396
0.395
93
91
95
0.395
98
0.363
0.357
0.341
0.332
0.331
0.331
0.282
0.282
0.282
0.274
0.274
0.274
0.170
0.503
93
97
91
97
95
90
94
93
93
91
91
91
98
91
0.164
97
0.154
0.117
90
93
ESTUDIO QUÍMICO
CG-EM ACEITE ESENCIAL DE EU1
8
1. Espectro de masas del Ácido 2-hidroxi benzoico, metil ester
9
2. Espectro de masas de 3-Alil-6-metoxifenol
10
2. Espectro de masas del Eugenol
11
2. Espectro de masas de 2 metoxi-4-(1-propenil)fenol
12
3.
Espectro de masas de 17 Octadecenal
13
4. Espectro de masas del Ácido 2-hidroxi benzoico, fenilmetil ester
14
ANEXO 3
ESTUDIO QUÍMICO
CG-EM Sf MeOH:H2Ob de EU1
6. Acido benzoico, 2-hidroxi-fenil metil ester
15
1. Espectro de masas de Benzyl alcohol
16
2.
Espectro de masas del Ácido benzoico
17
3.
Espectro de masas de 2,3-dihidrobenzofurano
18
3. Espectro de masas de 4-vinilfenol
19
4. Espectro de masas de 2-metoxi-4-vinilfenol
20
5. Espectro de masas de 4-((1E)-3-Hidroxi-1-propenil)-2-metoxifenol
21
ANEXO 4
ESTUDIO QUÍMICO
CG-EM Sf. 3 EU2
22
1. N-Benzoil-3(hidroximetil)piperidina
23
2.
Espectro de masas del Ácido hexanóico
24
ANEXO 5
REGISTROS FOTOGRÁFICOS
1
2
3
4
5
6
Figura 1. Fracciones obtenidas por CCV del extracto Éter de Petróleo: 1) Petrol:CH2CL2, 2)
CH2CL2, 3) CH2CL2:AcOEt, 4) AcOEt, 5) AcOEt: EtOH y 6) EtOH. FE: Sílica gel H60.
1 2
3
4
5
6
7
Figura 2. Fracciones obtenidas por CCV del extracto Éter de Petróleo: 1) Petrol:CH2CL2, 2)
CH2CL2:AcOEta 3) CH2CL2:AcOEtb, 4) AcOEt, 5) AcOEt: EtOHa, 6) AcOEt: EtOHb y 7)
EtOH. FE: Sílica gel H60
25
1 2
3 4
5 6
7
Figura 3. Subfracciones de CH2CL2 de EU1: 1) MeOH:H2Oa, 2) MeOH:H2Ob, 3) MeOH:H2Oc,
4) MeOH:H2Od, 5) MeOH:H2Oe, 6) MeOH:H2Of y 7) MeOH:CH2Cl2. FE: RP-18
Originales
Baljet
Salkowski
FeCl3
Dragendroff
Molibdato
de amonio
EU1
EU2
EU2 EU1
Figura 4. Pruebas químicas cualitativas preliminares, realizadas a las subfracciones activas de
EU1 y EU2.
Originales
EU1
EU2
Antrona
Hidroxamato férrico
EU2
EU1
EU1
EU2
Figura 5. Pruebas químicas cualitativas preliminares, Antrona e Hidroxamato férrico, realizadas
a las subfracciones activas de EU1 y EU2
26

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