Lupus Anticoagulant: Diagnostica di laboratorio

Lupus Anticoagulant:
Diagnostica di laboratorio
Agatina Alessandrello Liotta
AOU Careggi- Firenze
SOD Malattie Aterotrombotiche
CRR per lo Studio della Trombosi
Lupus anticoagulant
• Famiglia eterogenea di immunoglobuline
di tipo IgG, IgM, IgA
• In vitro provocano allungamento dei test
fosfolipide dipendenti
• Nel nostro organismo sono responsabili
di trombosi arteriose e/o venose, di
aborti ripetuti, morti fetali
NUOVA DEFINIZIONE DI SINDROME DA aPL
Criteri di laboratorio
(Miyakis S et al, J Thromb Haemost 2006, 4:2954:295-306)
 Presenza di LAC, determinato secondo le linee guida
proposte da SSC
e/o
 Medio/alto titolo di anticorpi anticardiolipina β2
glicoproteina I dipendenti (IgG e/o IgM), misurati
con tecnica ELISA standardizzata
Conferma in 2 o più occasioni ad almeno 12 settimane di
distanza
Intrinsic Pathway
HMWK
F XI
Extrinsic Pathway
Vascular Injury
Surface HMWK
F XII
FXa
Thrombin
F VIIa
F IXa
Tissue Factor
PK
F XIIa
F XIa
F IX
Kallikrein
Ca++ PL
TF-FVIIa
Ca++
F X
F VIII
Ca++ PL
Fibrinogen
FVII
F IX
F X
F Xa
Prothrombin
Centro Trombosi, Firenze
TF-FVII
F IXa
F VIIIa
Ca++ PL
(TF)
F Va
Ca++ PL
F Xa Ca++ PL
F V
Fibrin
F XIII
Ca++
Fibrin
Thrombin F XIIIa
Cross-linked
Fibrin
Antigeni degli aPL
 Beta
Beta2
glicoproteina
1 1
2 glicoproteina

Protrombina
Protrombina

Proteina
C (attivata)
Proteina
C (attivata)

Proteina
Proteina
S S
 Trombomodulina
Trombomodulina
 Annessina
Annessina
V V

Attivatore
tissutale
del plasminogeno
Attivatore
tissutale
del plasminogeno

Chininogeni
a basso
ed a peso
alto peso
molecolare
Chininogeni
a basso
ed a alto
molecolare

Fattore
Fattore
XII XII

Lipoproteine
a bassa
densità
ossidate
(ox-LDL)
Lipoproteine
abassa
densità
ossidate
(ox-LDL)
Centro Trombosi, Firenze
CRITERI PER LA DIAGNOSI
DI LUPUS ANTICOAGULANT
PROPOSTI DAI SSC (1995)
• Prolungamento di 1 o più test di screening
PL dipendenti (aPTT, KCT, dRVVT, dPT o TTI)
• Studi di mixing (1:1) per dimostrare la
presenza di un inibitore ed escludere
eventuali carenze di fattori
• Test di conferma per dimostrare che
l’inibitore è diretto contro i PL
• Esclusione di altre coagulopatie (es.
inibitore del fattore VIII o presenza di
eparina)
DIAGNOSTICA DEL LAC
aPTT
Un aPTT di routine nei limiti della norma, non è sufficiente per
escludere la presenza del LAC
 I reagenti contengono fosfolipidi piuttosto
concentrati, quindi l’aPTT può essere normale nei
pazienti con LAC medio/debole
 Un aumento del fibrinogeno o fattore VIII (fase
acuta, gravidanza) può accorciare l’aPTT e
mascherare la presenza di un LAC debole
Possono però essere utilizzati reagenti diluiti
APTT Responsiveness
APTT Ratio
Tripodi et al, Clin Chem 2003
3
PTT LA Roche
(n=21)
2,5
Actin FSL Dade
(n=6)
Pathromtin SL Dade
(n=8)
2
Synthasil IL (n=5)
1,5
APTT LT Roche
(n=6)
1
0,5
APTT SP IL (n=9)
KPTT Stago (n=5)
A
B
C
Plasmas
D
aPTT REAGENT
Kershaw G Semin Thromb Hemost 2012
DIAGNOSTICA DEL LAC
Kaolin e Silica Clotting Time (KCT, SCT)
• Non contengono PL
• Sono molto sensibili
• Molto influenzati dalla presenza di piastrine residue
• Specificità ridotta dalla presenza di carenza di fattori
• Il SCT è una modificazione del KCT che ne consente
l’impiego su tutti gli strumenti
DIAGNOSTICA DEL LAC
dRVVT
• Il veleno di vipera Russell attiva il fattore X in presenza
di ioni Ca, FV,e PL.
• Esistono molti reagenti commerciali che sono però molto
diversi per sensibilità e specificità
• Molti kit commerciali forniscono anche un reagente di
conferma (fosfolipidi concentrati)
dRVVT Responsiveness
Tripodi et al, Clin Chem 2003
dRVVT Ratio
2,5
2
Am. Diagnostica
(n=23)
LAC Screen IL
(n=27)
LA1 Dade (n=17)
1,5
1
0,5
A
B
C
Plasmas
D
DIAGNOSTICA DEL LAC
Tissue Thromboplastin Inhbition Test ( TTI)
• Il PT è generalmente normale in soggetti con LAC (la
tromboplastina contiene elevate concentrazioni di PL)
• Se però il reagente è diluito, la concentrazione dei PL può
diventare fattore limitante
• Il TTI viene in genere eseguito con due o più diluizioni di
tromboplastina
• Alcune tromboplastine ricombinanti sono particolarmente
sensibili al LAC (Innovin, Dade Behring)
TEST
DI
SCREENING
MODALITA’ DI ESPRESSIONE
DEI RISULTATI
- SECONDI
- RATIO
R = SEC Tempo di coagulazione campione
SEC Tempo di coagulazione pool
plasmi normali
TEST
DI
SCREENING
INTERPRETAZIONE DEI RISULTATI
I risultati sono considerati positivi
quando i tempi di coagulazione sono
più lunghi o la Ratio è maggiore del
valore Cut-off stabilito per il test e
calcolato al 99° percentile della
distribuzione normale ( SSC 2009)
STEP I: TEMPO DEL CAMPIONE
Possibili cause dell’allungamento
del tempo del campione in esame
• Carenza fattoriale o presenza di
terapia farmacologica interferente
(eparina , warfarin)
• Inibitore di tipo anticorpale:
•Lupus anticoagulante
•Inibitore specifico
Studi di “mixing”
(La miscela comunemente non è
incubata a 37°C)
2.4
dRVVT (ratio)
Ripetere il test sulla
miscela:
plasma del paziente e
plasma di un pool di
soggetti sani in rapporto
1:1
2.0
1.6
1.2
Cut-off
0.8
INIBITORE
Carenza fattoriale
Carenza fattoriale
P
P+N
Centro Trombosi Fi
TEST DI “MIXING”
MODALITA’ DI ESPRESSIONE DEI RISULTATI
 RATIO
SEC Tempo di coagulazione miscela (paziente/pool plasmi normali V/V)
R=
SEC Tempo di coagulazione pool plasmi normali
 ICA % =
(sec tempo di miscela-sec tempo pool normale) x 100
sec tempo del paziente
ICA = (Indice di anticoagulante circolante)
TEST DI “MIXING”:
INTERPRETAZIONE DEI RISULTATI
Risultati sono suggestivi per la presenza
di LAC quando ratio o ICA maggiori
del valore Cut-off stabilito per il Test e
calcolato al 99° percentile della
distribuzione normale
STEP II: TEMPO DELLA MISCELA
Cause dell’allungamento del
tempo della miscela in esame
• Inibitore di tipo anticorpale
•Lupus anticoagulante
•Inibitore specifico
• Eparina?
STEP III: TEST DI CONFERMA
Tempo di coagulazione in presenza di fosfolipidi in eccesso:
• PNP
•Triplett, Am J Clin Pathol, 1983
• Fosfolipidi in fase esagonale
•Rauch, Thromb Haemost, 1989
•Triplett, Thromb Haemost, 1993
(Questo tipo di conformazione rende i PL più disponibili a legare il LA : maggiore
specificità)
•
valore assoluto - delta - ratio
Test di conferma
dRVVT (ratio)
2.4
2.0
1.6
1.2
Cut-off
0.8
P
P+fosfolipidi
Centro Trombosi Fi
TEST DI CONFERMA
FALSI POSITIVI
• LISATI PIASTRINICI
• FOSFOLIPIDI ESAGONALI
 Eparina
 Inibitori del fattore VIII
 Inibitori del fattore V
a basso titolo
(rilascio di fattore V dai granuli
piastrinici)
Centro Trombosi Fi
DIAGNOSI DIFFERENZIALE PER LA PRESENZA DI
INIBITORI DELLA COAGULAZIONE
ANAMNESI POSITIVA PER SOSPETTA DIATESI EMORRAGICA




Anti-fattore VIII, II, IX, X, XI
AntiAnti--fibrinogeno/fibrina
Anti
Anticoagulanti eparinoeparino-simili
Anti--fattore V
Anti
ANAMNESI POSITIVA PER EVENTI TROMBOTICI
 Lupus Anticoagulant
 Anti
Anti--fattore XII
Centro Trombosi Fi
DOSAGGIO DEI FATTORI
RIDUZIONE MARCATA
DEL
SINGOLO FATTORE
CHE NON SI MODIFICA CON
LA DILUIZIONE DEL CAMPIONE
RIDUZIONE
APPARENTE
DI
PIU’ FATTORI
CHE
SI
NORMALIZZA CON
LA DILUIZIONE DEL CAMPIONE
INIBITORE SPECIFICO
INIBITORE DI TIPO :
LUPUS
J Thromb Haemost 2009
SCELTA DEI TEST
 L’utilizzo di più di due test fosfolipide
dipendenti aumenta il rischio di risultati
falsamente positivi
 I due test devono basarsi su principi diversi
 I test raccomandati sono : dRVVT, SCT
dRVVT/aPTT
dRVVT/SCT
dRVVT
aPTT
SCT
dRVVT/aPTT
dRVVT/SCT
dRVVT
aPTT
SCT
SC
STANDARDIZZAZIONE
DELLA FASE PREANALITICA
- PRELIEVO
- Tipo : venoso
- Sede : vena cubitale della piega del gomito
- Evitare laccio emostatico o ridurne la presenza, la
stasi ematica provoca:variazioni di pH ed aumenti
della CO2 con perdita del fattore V; danno tissutale
con conseguente liberazione di fattore tissutale e
attivazione del fattore VII
- TRATTAMENTO DEL
CAMPIONE DI SANGUE
- CONSERVAZIONE
- Centrifugazione a 2800 g
per 15 minuti a temp.
ambiente
- Separazione del plasma
- 2 centrifugazione a
12000 rpm per 33-5 minuti
* E’ importante ridurre le
piastrine
9
al di sotto di 1x10 /L
- Congelamento rapido e
conservazione a -80 C
CARATTERISTICHE DEL POOL di PLASMA
NORMALE PER I TEST DI MISCELAZIONE
*
PRIVO DI PIASTRINE
*
NORMALE CONTENUTO DI TUTTI I FATTORI DELLA
COAGULAZIONE
*
NORMALE CONTENUTO DI FIBRINOGENO
( per escludere processi infiammatori o infettivi in atto)
IL POOL DI PLASMA NORMALE DEVE ESSERE
CONGELATO RAPIDAMENTE E CONSERVATO A -70
70°
° C
Centro Trombosi Fi
SOSPETTO DI EPARINA NEL
CAMPIONE
Prima di eseguire test di miscelazione e di
conferma, procedure lunghe e costose
ESEGUIRE TEST TEMPO DI TROMBINA
Effect of Lupus Anticoagulant and Anticoagulant
Therapies on commonly used clinical laboratories
assays
Ortel TL, 2012, mod
LAC nei Pazienti anticoagulati
Terapia eparinica: neutralizzare l’eparina con sostanze
antiepariniche(polibrene o eparinasi) oppure mediante l’uso
di una resina (ecteola) che mescolata al plasma, dopo
idonea incubazione, è capace di adsorbire l’eparina
Anticoagulanti orali:
Esecuzione dei test previa miscela del plasma del paziente
con plasma normale (v/v);
Esecuzione del test di conferma a due diverse concentrazioni
di fosfolipidi, senza preventiva miscelazione con plasma
normale. L’entità della correzione rispetto ai valori di base del
test consente di effettuare la diagnosi (Tripodi A et al )
LAC e Sospensione terapia
anticoagulante
VKA:
1-2 settimane dalla sospensione della terapia
o quando INR < 1.5
LMWH: l’effetto dipende dal tipo di eparina
utilizzata, dal momento in cui viene
eseguito il prelievo
attendere almeno 12 h
dall’ultima somministrazione
SILICA CLOTTING TIME
before surgery
5 days after surgery, 23 hours of rivaroxaban
administration
Normalized Ratio
2.0
1.5
1.16
1.0
0.5
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10 11 12 13 14 15 16 17 18
Patients
Alessandrello Liotta A.
DILUTED RUSSELL VIPER VENOM TEST
before surgery
5 days after surgery ,2-3 hours of rivaroxaban
administration
3.0
Ratio
2.5
2.0
1.5
1.26
1.0
0.5
0
Alessandrello Liotta A.
1
2
3
4
5
6
7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18
Patients
DILUTED RUSSELL VENOM VIPER:
mixing normal plasma (V/V) test five days after surgery
2.5
Ratio
2.0
1.5
1.21
1.0
0.5
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
12
Patients on Rivaroxaban
14 15 16
Alessandrello Liotta A.
18
DILUTED RUSSELL VIPER VENOM TEST:
Confirm Test five days after surgery
2.5
Ratio
2.0
1.5
1.21
1.0
0.5
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
12
Patients on Rivaroxaban
14 15 16
Alessandrello Liotta A.
18
STACLOT® LA test by using
hexagonal phospholipids
After DRVVT confirmation test (by
adding phospholipids) 6 patients were
positive at LA testing, in the other 10
patients the DRVVT confirmation was still
prolonged. For this reason, we performed
STACLOT® LA test by using hexagonal
phospholipids and LA was not confirmed.
Test Integrati per la rilevazione del
LUPUS ANTICOAGULANT
Modalità di espressione dei risultati:
% Correzione =
[(Screening ratio-Confirmation ratio)/Screening
ratio] x 100
Ratio Normalizzata (TR)=
Screening Ratio/ Confirmation Ratio
Lupus Anticoagulant: I test integrati
To Mix or Not To Mix in Lupus Anticoagulant Testing ?
That is the Question
Armando Tripodi
Seminars Thrombosis and Hemostasis, 2012 ; 38: 385-389
Lupus Anticoagulant: I test integrati
L’esperienza del Centro Trombosi- Firenze
Test mix effettuati su campioni negativi: 127
Allungamento del tempo di miscela: 0
L’allungamento del tempo di miscela è stato rilevato
su un solo caso positivo
N.M.
DRVVT –S sec.47,2 R=1,51
DRVVT –C sec.29,7 R= 0,98
DRVVT Mix sec. 47.2 R= 1,51
[DRVVT cut-off TR< 1.12]
TR= 1,55
SCT –S
sec 60,3 R=1,61
SCT-C
sec 26,4 R= 0,86
SCT-Mix sec 84,2 R = 2,21
[SCT cut-off TR< 1.16]
TR= 1.88
TR =2,56
Da fare
aPTT allungato…………….?
Test Integrati
LAC Presente
LAC assente
Test di Miscelazione v/v
dRVVT S R= 1.49 (cut off R <1.16)
dRVVT C R=1.64
(cut off R <1.11)
dRVVT Mix R= 1.07 (cut off R <1.09)
dRVVT S R= 1.21
(cut off R <1.16)
dRVVT C R= 1.23
(cut off R <1.11)
dRVVT Mix R= 1.32 (cut off R <1.09)
SCT S R= 1.58
SCT C R= 1.86
SCT Mix R= 0.98
SCT S R= 2.11
SCT C R= 2.09
SCT Mix R= 1.50
(cut off R <1.33)
(cut off R <1.45)
(cut off R <1.16)
Campione 1 : aPTT 51 sec (V.N.26-38 sec)
Carenza fattoriale: Fatt X = 20%
(cut off R <1.33)
(cut off R <1.45)
(cut off R <1.16)
Campione 2: aPTT 56 sec (V.N.26-38sec)
Inibitore Fatt VIII = 2.8 U/mL
Nuova definizione di Sindrome da aPL
(Miyakis S et al, J Thromb Haemost 2006, 4:2954:295-306)
CRITERI DI LABORATORIO
 Lupus anticoagulant determinato in base a quanto stabilito nelle
linee guida proposte dal SSC, positivo in 2 o più occasioni ad
almeno 12 settimane di distanza
distanza..
 Anticorpi
anticardiolipina-β2 glicoproteina I dipendenti
anticardiolipinaqualificati con tecnica ELISA standardizzata, di classe IgG e/o
IgM, presenti a medio o alto titolo in 2 o più occasioni a distanza
di almeno 12 settimane
settimane..
Centro Trombosi Fi
Schouwers Thrombosis Research 2010
Lupus Anticoagulant
Appropriatezza della richiesta
Alta:
-Tromboembolismo venoso spontaneo
-Tromboembolismo arterioso inspiegabile
in pz. età <50 anni
-Trombosi in sedi inusuali
-Morti fetali
-Trombosi o patologia gravidica in pz. con malattie
autoimmuni
Moderata: -Rilievo casuale di aPTT allungato in pz. asintomatico
-Più aborti spontanei precoci
-Tromboembolismo venoso secondario in pz. giovani
Bassa:
-Tromboembolismo venoso o arterioso in pz. Anziani
Thrombosis Research 2012 Pengo
REFERTO
 Risultati analitici accompagnati da un commento
sulla loro compatibilità con la presenza o meno di
lupus anticoagulant
 Per i casi positivi alla prima determinazione
consigliare di ripetere il test dopo almeno 12
settimane