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Métodos rápidos para el control microbiológico de alimentos
Métodos Rápidos para el control Microbiológico de Alimentos Vigo, 8 de septiembre del 2011 1 Métodos rápidos para el control microbiológico de alimentos Necesidades en el análisis de alimentos • Contaminación microbiana: principales problemas asociados al consumo • Las toxiinfecciones alimentarias conllevan un elevado impacto económico (patógenos) • Las alteraciones de alimentos también preocupan a las industrias alimentaria (indicadores ( de calidad)) • Sistemas APPCC es la herramienta de seguridad alimentaria más reconocida • Requiere de un gran número de análisis y obtención rápida p de resultados 2 Métodos rápidos para el control microbiológico de alimentos Necesidades en el análisis de alimentos • • • • • • • 3 Métodos Mé d cada d vez más á rápidos á id (industrias, (i d i l b laboratorios) i ) Métodos sencillos Métodos fiables Métodos reconocidos Métodos trazables Métodos sensibles Métodos económicos Métodos rápidos para el control microbiológico de alimentos Métodos tradicionales/oficiales: • Largos Surgen los métodos alternativos (rápidos y/o • Elevada manipulación automatizados) • Tediosos 4 Métodos rápidos para el control microbiológico de alimentos Métodos rápidos: y uno o varios días frente a los • Disminuyen protocolos tradicionales Métodos automatizados: • Utilización de un equipo que realiza una o varias tareas que habitualmente realiza un técnico 5 Métodos rápidos para el control microbiológico de alimentos Métodos Rápidos: Consideraciones generales CARACTERISTICAS DE UN MÉTODO RÁPIDO/AUTOMATIZADO IDEAL ¾Preciso ¾Rápido p yp productivo ¾Económico ¾Aceptable ¾Realización simple ¾Entrenamiento ¾Reactivos comunes ¾R ¾Reputación t ió d de lla compañía ñí ¾Buen servicio técnico ¾Requerimientos de espacio y utilidad óptimos 6 Métodos rápidos para el control microbiológico de alimentos Métodos Rápidos Clasificación en áreas de acuerdo a lo que se busca: ¾Sistemas para facilitar la toma de muestras ¾Métodos para ayudar al procesamiento de las muestras ¾Sistemas de cuantificación microbiológica ¾Métodos para identificación y cuantificación de microorganismos ¾Sistemas especiales para análisis de muestras de aguas, ambientales y superficies ¾Sistemas de identificación mediante métodos moleculares ¾Métodos inmunológicos para detección y/o cuantificación de microorganismos ¾Otros métodos misceláneos 7 Métodos rápidos para el control microbiológico de alimentos Para ay udarle a proteger su priv acidad, PowerPoint ev itó que esta imagen externa se descargara automáticamente. Para descargar y mostrar esta imagen, haga clic en Opciones en la barra de mensajes y , a continuación, haga clic en Habilitar contenido externo. Métodos rápidos para ayudar a la toma de muestras t MUESTREADORES, APLICADORES Muestreo dinámico Estandarización Concepto de trazabilidad 8 Métodos rápidos para el control microbiológico de alimentos Para ay udarle a proteger su priv acidad, PowerPoint ev itó que esta imagen externa se descargara automáticamente. Para descargar y mostrar esta imagen, haga clic en Opciones en la barra de mensajes y , a continuación, haga clic en Habilitar contenido externo. Métodos rápidos para ayudar al procesamiento de la muestra DILUIDORES Estandarización Aumentan productividad Trazabilidad PREPARADORES y DISPENSADORES DE MEDIOS DE CULTIVO 9 Métodos rápidos para el control microbiológico de alimentos Indicadores de calidad Recuentos 10 Métodos rápidos para el control microbiológico de alimentos Métodos rápidos aplicados a Indicadores microbiológicos FILM HIDRATABLE: PETRIFILM: 3M ¾Optimizan el espacio de incubación ¾Manual ¾Algunos protocolos Express Láminas deshidratadas que se rehidratan al inocular la muestra ¾Posibilidad de lector automático ¾Validaciones internacionales Recuento total Enterobacterias E.coli/Coliformes Mohos y levaduras Staph. Aureus Listeria ambiental 11 Métodos rápidos para el control microbiológico de alimentos Métodos rápidos aplicados a Indicadores microbiológicos g SISTEMA TEMPO: bioMerieux •Fácil preparación de muestra Trazabilidad •Trazabilidad •Mismo protocolo para diferentes parámetros •Validaciones internacionales •Recuento Total •Enterobacterias E t b t i Sistema totalmente automatizado NMP miniaturizado i i t i d Lectura por fluorescencia •Coliformes E.coli •E.coli •S. Aureus •Mohos y levaduras •Bacterias Lácticas 12 Métodos rápidos para el control microbiológico de alimentos Protocolo de trabajo dilu ent X g (or ml) 9X ml 10-1 suspension Sample p preparation p p Inoculation Reading & interpretation 13 Métodos rápidos para el control microbiológico de alimentos Incubation Protocolo de trabajo + = dilu ent X g (or ml) 9X ml 10-1 suspension Sample p preparation p p WIFI Reading & interpretation 14 Inoculation Métodos rápidos para el control microbiológico de alimentos Incubation Protocolo de trabajo + = dilu ent X g (or ml) 9X ml 10-1 suspension Sample p preparation p p WIFI Reading & interpretation 15 Inoculation Métodos rápidos para el control microbiológico de alimentos Incubation Protocolo de trabajo + = dilu ent X g (or ml) 9X ml 10-1 suspension Sample p p preparation p WIFI Inoculation RESULTS READING REPORT Reading & interpretation 16 Métodos rápidos para el control microbiológico de alimentos Incubation Métodos rápidos aplicados a Indicadores microbiológicos g SISTEMAS BASADOS EN IMPEDANCIA: BACTRAC •Fácil Fá il preparación ió de d muestra t •Lectura automática Más sencillo cuando es “mono-producto” mono producto •Más •Necesaria calibración para recuento •Esterilidad comercial (pasa/no pasa) Recuento total E t Enterobacterias b t i E.coli/Coliformes Hongos y levaduras Staph. Aureus Ácido Lácticas 17 Mide los cambios que producen los microorganismos de un cultivo que alteran las substratos cambiando su conductividad eléctrica y esto varía la impedancia Métodos rápidos para el control microbiológico de alimentos Métodos rápidos aplicados a Indicadores microbiológicos g SISTEMAS BASADOS EN CITOMETRIA DE FLUJO AES: Bactiflow •Fácil preparación de muestra •Lectura automática •Rápido •Utilidad: Utilid d yogures, champús, h ú cremas, refrescos, zumos de frutas Marcaje de las células, detección una una y contaje R Recuento t ttotal t l Enterobacterias Hongos y levaduras Salmonella 18 Métodos rápidos para el control microbiológico de alimentos Para ay udarle a proteger su priv acidad, PowerPoint ev itó que esta imagen externa se descargara automáticamente. Para descargar y mostrar esta imagen, haga clic en Opciones en la barra de mensajes y , a continuación, haga clic en Habilitar contenido externo. Métodos rápidos aplicados a Indicadores microbiológicos Sembradores en espiral y lectores automáticos de colonias Deposición p automática de la muestra líquida en la superficie de un placa rotatoria de agar •Estandarización •Eliminación de diluciones •Lectura automática Ahorro de tiempo •Ahorro •Trazabilidad Lectores automáticos de colonias 19 Métodos rápidos para el control microbiológico de alimentos Métodos rápidos aplicados a Indicadores microbiológicos SISTEMA SimPlate: Biocontrol . Fácil de leer · Consistente y reproducible · Rápido · Fácil Fá il de d preparar · Menos interferencia · Amplio rango de conteo · Tecnología g innovadora Placa de p plástico circular de 84 pocillos p Lectura por fluorescencia Recuento total El número de positivos se convierten en valores l NMP Coliformes/E.coli Mohos y levaduras Campylobacter 20 Métodos rápidos para el control microbiológico de alimentos Métodos rápidos aplicados a Indicadores microbiológicos g SISTEMAS BASADOS EN ATP •Económico •Rápido Utilización en el entorno lácteo: esterilidad comercial •Utilización •Más utilizado en control de limpieza y desinfección Mide niveles de ATP Lo relaciona con niveles de contaminación 21 Métodos rápidos para el control microbiológico de alimentos Patógenos Ausencia/presencia 22 Métodos rápidos para el control microbiológico de alimentos Métodos rápidos aplicados a la detección de Patógenos g PROTOCOLOS CORTOS Salmonella: •Pre-enriquecimiento y placa •SESAME (BIOSER) •Manuales •IBISA ((AES)) •Medios cromogénicos o semisólidos •Validaciones internacionales •Económicos E ó i •SMS (AES) •SALMONELLA PRECIS (OXOID) •RAPID SALMONELLA (BIORAD) Listeria Monocytogenes: •Salmonella •Listeria spp •Listeria monocytogenes •ALOA ONE DAY (AES) •LISTERIA PRECIS (OXOID) •RAPID LMONO (BIORAD) •COMPASS LISTERIA (BIORAD) •CHROMOID LMONO (BIOMEREIUX) 23 Métodos rápidos para el control microbiológico de alimentos 24 Métodos rápidos para el control microbiológico de alimentos 25 Métodos rápidos para el control microbiológico de alimentos 26 Métodos rápidos para el control microbiológico de alimentos Métodos rápidos aplicados a la detección de Patógenos g SISTEMAS BASADOS EN PRUEBAS ELISA: 27 Métodos rápidos para el control microbiológico de alimentos Métodos rápidos aplicados a la detección de Patógenos g SISTEMAS BASADOS EN PRUEBAS ELISA Si Sistema VIDAS (bi (bioMerieux) M i ) •Salmonella •Listeria Li t i spp/Listeria /Li t i monocytogenes •Equipo automatizado •Campylobacter py spp pp •Tecnología ELFA (elisa+fluorescecia) e inmunoconcentración •E.coli O157:H7 •Resultados en 16-24 horas •Toxina Staph aureus •Validaciones internacionales •Lectura automática, no calibración, no interpretación •Procesado de muestras: 12-30 simultáneamente cada 45 minutos 28 Métodos rápidos para el control microbiológico de alimentos Métodos rápidos aplicados a la detección de Patógenos g 29 Métodos rápidos para el control microbiológico de alimentos Métodos rápidos aplicados a la detección de Patógenos g SISTEMAS BASADOS EN ELISA Sistema TECRA (Biotrace) Salmonella Listeria spp Campylobacter spp •Manual •Desarrollo Desarrollo de color •Resultados : 1-2 días - + •Validaciones internacionales •Posibilidad de realizarlo automáticamente con el UNIQUE PLUS 30 Métodos rápidos para el control microbiológico de alimentos Métodos rápidos aplicados a la detección de Patógenos g SISTEMAS BASADOS EN ELISA Sistema TRANSIA (Biocontrol) Salmonella Listeria Monocytogenes Listeria spp •Automático •Manejo de elevados volúmenes •Procesado de muestras: 93 muestras simultáneamente •Resultados rápidos: 1-2 días •Validaciones internacionales 31 Métodos rápidos para el control microbiológico de alimentos Métodos rápidos aplicados a la detección de Patógenos g SISTEMAS BASADOS EN ELISA L Lateral l fl flow Rapid test (Oxoid) VIP (BioControl) RayAl (Rayal Ltd) REVEAL (Neogen) Rapidcheck (Bioser) •Manual •La L muestra t difunde dif d por capilaridad hacia la zona de Ac •Lectura habitual p por una línea de color •Validaciones internacionales 32 Métodos rápidos para el control microbiológico de alimentos Métodos rápidos aplicados a la detección de Patógenos g SISTEMAS BASADOS EN PCR 33 Métodos rápidos para el control microbiológico de alimentos Métodos rápidos aplicados a la detección de Patógenos g 34 Métodos rápidos para el control microbiológico de alimentos Métodos rápidos aplicados a la detección de Patógenos g SISTEMAS BASADOS EN Real Time PCR (BAX System: Oxoid) •Procotolos diferentes según matriz •Validaciones internacionales Salmonella spp Listeria spp Listeria Monocytogenes •Resultados R lt d en 24-33 24 33 h horas •Sonda Sybr Green Campylobacter E.coli O157:H7 Enterobacter sakazakii Mohos y levaduras S.aureus 35 Métodos rápidos para el control microbiológico de alimentos Métodos rápidos aplicados a la detección de Patógenos g SISTEMAS BASADOS EN REAL TIME PCR (Applied Biosystem): •2 tipos de kits: Taqman y Microseq •Validaciones internacionales Salmonella spp •Resultados en 20-28 horas Salmonella entérica Listeria spp Listeria Monocytogenes E.coli O157:H7 Campylobacter jejuni •Cronobacter sakazakii •E. coli O157:H7 •Listeria monocytogenes •Pseudomonas aeruginosa •Staphylococcus aureus 36 Métodos rápidos para el control microbiológico de alimentos Métodos rápidos aplicados a la detección de Patógenos g SISTEMAS BASADOS EN PCR (Adia food: AES) Salmonella spp •Termociclador: Stratagen Listeria spp •Resultados en 19-21 horas Listeria Monocytogenes E.coli O157:H7 E coli O157:H7 y Salmonella E. 37 Métodos rápidos para el control microbiológico de alimentos Métodos rápidos aplicados a la detección de Patógenos g SISTEMAS BASADOS EN REAL TIME PCR (iQ-CHECK: Biorad) •Sondas: Molecular Beacons Varios termocicladores:iCycler iQ, chrom 4, •Varios iQ 5 y miniOpticon. •En algunos software de interpretación de resultados lt d •Validación 16140 Salmonella spp y g Listeria Monocytogenes Listeria spp Campylobacter E.coli 0157:H7 38 Métodos rápidos para el control microbiológico de alimentos Métodos rápidos aplicados a la detección de Patógenos g SISTEMAS BASADOS EN REAL TIME PCR (Assurance GDS: Biocontrol) •Salmonella •Listeria spp •Listeria monocytogenes •E.coli O157:h7 •Shiga Shiga Toxin To in •Combina concentración de muestra y detección d t ió de d DNA •Termociclador:Assurance GDS Rotor-Gene™. 39 Métodos rápidos para el control microbiológico de alimentos 40 Métodos rápidos para el control microbiológico de alimentos 41 Métodos rápidos para el control microbiológico de alimentos Métodos rápidos aplicados a la detección de Patógenos g SISTEMAS DE DETECCIÓN CON FAGOS Salmonella E.coli 0157:H7 + •Detección rápida y automática de patógenos mediante FAGOS ligada g a fluorescencia. Salmonella + 42 •Detección D t ió rápida á id y manual de patógenos mediante FAGOS (lateral flo ) flow) Métodos rápidos para el control microbiológico de alimentos Food & envt. 225 ml of BPW + supplement (green) 41.5 +/- 1 °C 18-24 h Heat & Go 5 min* min *Except for poultry & egg products VIDAS UP Salmonella 48 min 43 Métodos rápidos para el control microbiológico de alimentos Identificación 44 Métodos rápidos para el control microbiológico de alimentos Para ay udarle a proteger su priv acidad, PowerPoint ev itó que esta imagen externa se descargara automáticamente. Para descargar y mostrar esta imagen, haga clic en Opciones en la barra de mensajes y , a continuación, haga clic en Habilitar contenido externo. Métodos rápidos aplicados a la identificación de microorganismos g IDENTIFICACIÓN CON SISTEMAS MINIATURIZADOS •Manual •Miniaturización de pruebas bioquímicas •Diferentes formatos: galerías, tubos de plástico, •API: bioMerieux •BBL BBL Enterotube: BD •BBL Crystal: BD •RapID™ RapID System: REMEL 45 Métodos rápidos para el control microbiológico de alimentos Métodos rápidos aplicados a la identificación de microorganismos g SISTEMAS AUTOMÁTICOS DE IDENTIFICACIÓN Fenotípica: VITEK: bioMerieux •BIOLOG: AES •PHOENIX: BD •Resultados a partir de 4 horas •Combinan reacciones enzimáticas y bioquímicas Genotípica: •MICROSEQ: C OS Q ABI 46 •Secuenciación del ARN 16 S Métodos rápidos para el control microbiológico de alimentos Métodos rápidos aplicados a la identificación de microorganismos CLASIFICACIÓN FILOGENÉTICA Family VITEK, API, BIOLOG, PHOENIX Genus Species Subspecies Strain DNA sequencing MicroSeq 16S rDNA sequencing ARDRA Riboprinter Riboprinting tRNA PCR tRNA-PCR ITS-PCR BioRad PFGE, LFRFA, RLFP Multilocus Isozyme Whole cell protein profiling ABI AFLP RAPD APPCR Diversilab G Genetic ti Differences: Diff Technique Discrimination: 47 rep-PCR M More F Fewer Low High Métodos rápidos para el control microbiológico de alimentos Métodos rápidos aplicados a la identificación de microorganismos •Genera huellas genéticas únicas y reproducibles para cada una de las muestras •13 muestras en 4 horas 1. Extracción de ADN: Extracción de ADN a partir de cultivos aislados. 2. Amplificación mediante rep-PCR: Amplificación de muestras con la técnica rep-PCR y los correspondientes kits de identificación genética DiversiLab (DiversiLab DNA Fingerprinting kits). 3. Detección: Separación de fragmentos mediante electroforesis de microfluidos en chip (DNA LabChip Kits). 4. Análisis de datos: Análisis de los datos en tiempo real, con informes a los que se puede acceder a través de un sitio web individual y seguro. 48 Métodos rápidos para el control microbiológico de alimentos Métodos rápidos aplicados a la identificación de microorganismos ESPECTROMETRÍA DE MASAS • Técnica analítica para determinar la composición elemental de una muestra • El principio de MS consiste en la ionización de compuestos químicos p q para g generar moléculas cargadas g y medir su relación masa/carga (m/r) • MALDI-TOF MALDI TOF (Matrix (M t i Assisted A i t d Laser L Desorption D ti / Ionisation I i ti Time of Flight), es un tipo de espectrometría de masas que permite el screening de proteínas directamente a partir de bacterias intactas Ionization Mass Ion InletDetector Analyzer System System Sample Under Vacuum 49 Data Analysis S System Métodos rápidos para el control microbiológico de alimentos • Matrix Assisted Laser Desorption Ionization-Time Of Flight. Flight MALDI is the Ionization System-TOF is the Mass Analyzer system. 1 2 3 1 Una muestra en una solución matriz absorbe energía de un haz láser. El resultados es una ionización de la muestra. 2 Todos los iones son acelerados a la misma energía cinética, entran en el tubo y son separados de acuerdo con su masa 3 Detección al final del tubo 50 Métodos rápidos para el control microbiológico de alimentos Métodos rápidos aplicados a la identificación de microorganismos ESPECTROMETRÍA DE MASAS 3775 3 <<C:\Dokumente und Einstellungen\m.erhard\Eigene Dateien\AnagnosTec-dc\Zwischenablage\Dokument Banner.txt>> Spec [BP = 3 5000 7000 10939 11000 11572 11 1906 10226 1 10347 9000 10 0608 9330 10 0 3000 9994 7980 20 8450 8 30 7863 40 6837 7092 7367 7 50 5931 5015 60 3581 % Intensity 70 9654 80 8744 8074 90 9453 1648.1 7075 100 13000 Mass (m/z) 51 Métodos rápidos para el control microbiológico de alimentos Métodos rápidos aplicados a la identificación de microorganismos ESPECTROMETRÍA DE MASAS Fungi, yeast and mycobacteria: On-target extraction addition of 1.0 µL matrix solution di t direct solvent evaporation at room temperature Target slide No selección previa de la colonia Identificación en solo 2 minutos automated MS analysis 52 Métodos rápidos para el control microbiológico de alimentos Métodos rápidos aplicados a la identificación de microorganismos •VITEK MS RUO: bioMerieux •Maldi Biotyper: Bruker Pow e r 53 Ionis ing V a cuum N eg ative Métodos rápidos para el control microbiológico de alimentos MUCHAS GRACIAS POR SU ATENCIÓN Ana María Fuertes Barrio [email protected] 54 Métodos rápidos para el control microbiológico de alimentos
