indução de apoptose em células - Universidade Federal do Ceará

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RENORBIO
Programa de Pós-graduação em Biotecnologia
Potencial biotecnológico de lectinas: indução de
apoptose em células A549, efeito pró-cicatrizante em
feridas experimentais e análise de toxicidade sobre
Artemia sp.
Francisco Vassiliepe Sousa Arruda
Sobral-CE
2011
UNIVERSIDADE FEDERAL DO CEARÁ
PRÓ-REITORIA DE PESQUISA E PÓS-GRADUAÇÃO
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM BIOTECNOLOGIA (RENORBIO – UFC)
FRANCISCO VASSILIEPE SOUSA ARRUDA
POTENCIAL BIOTECNOLÓGICO DE LECTINAS:
INDUÇÃO DE APOPTOSE EM CÉLULAS A549, EFEITO PRÓ-CICATRIZANTE EM
FERIDAS EXPERIMENTAIS E ANÁLISE DE TOXICIDADE SOBRE ARTEMIA SP.
SOBRAL
2011
Tese apresentada ao Programa de PósGraduação em Biotecnologia, da Universidade
Federal do Ceará, como requisito para a
obtenção do título de Doutor em
Biotecnologia. Área de Concentração:
Biotecnologia em Saúde.
Orientador: Prof. Dr. Edson Holanda Teixeira
SOBRAL
2011
Tese apresentada ao Programa de PósGraduação em Biotecnologia, da Universidade
Federal do Ceará, como requisito para a
obtenção do título de Doutor em
Biotecnologia. Área de Concentração:
Biotecnologia em Saúde.
Aprovada em: 29/11/2011.
BANCA EXAMINADORA:
_____________________________________________________
Prof. Dr. Edson Holanda Teixeira (orientador)
Universidade Federal do Ceará (UFC)
_____________________________________________________
Prof. Dr. Benildo Sousa Cavada (co-orientador)
_____________________________________________________
Profa. Dra. Kyria Santiago do Nascimento
_____________________________________________________
Prof. Dr. Jorge Luiz Martins
Universidade Federal de Pelotas (UFPEL)
_____________________________________________________
Prof. Dr. Hélcio Silva dos Santos
Universidade Estadual Vale do Acaraú (UVA)
À minha família, dedico com muito amor e
carinho.
AGRADECIMENTOS
A Deus por me fazer entender que sou apenas pó e ao pó voltarei.
À minha esposa Suli pela compreensão, paciência, amizade, carinho e atenção nas
diversas horas dispensadas nesta pesquisa. Sei que não deve ter sido fácil suportar tanta
ausência, mas assim como diz a canção: é por essa e por tantas razões que eu tanto te amo.
Aos meus pais pela educação, carinho e um monte de coisas boas que apenas
anjos poderiam me propiciar. Pai e Mãe vocês são meu tudo. Estou convencido de que vocês
não são desse mundo.
Aos meus irmãos Wendel e Luciana por sempre estarem presentes na minha vida,
e na maioria das vezes acreditando e me fazendo acreditar que o mundo pode ser melhor.
Ao Eliézio por tantos favores e por tamanha prestatividade e por ser
verdadeiramente uma pessoa do bem.
À família da minha esposa pelo apoio incondicional durante esta caminhada.
Ao meu orientador Prof. Edson Holanda Teixeira pelo apoio incondicional e por
ser tão amigo, preocupado e tão presente. Enfim, por acreditar em mim.
Ao meu também orientador Prof. Benildo Sousa Cavada pelas idéias,
ensinamentos de vida e por acreditar em mim mesmo quando nem eu acreditei.
Aos meus amigos Victor, Cinara, Luiz, Mayron, Bruno, Flávio, Rafaela e Érica
simplesmente pelo o que vocês são: verdadeiros amigos.
Aos demais alunos do Laboratório Integrado de Biomoléculas, pela convivência;
Ao meu professor e amigo Rodrigo Marannguape por sempre ouvir meus anseios
e por ter mostrado o caminho, pelos conselhos epor ser essa pessoa “helpis”.
Ao meu amigo Prof. Luciano Pinto da Universidade Federal de Pelotas por ter me
recebido em sua casa e me tratado como um filho. À Patrícia, Ghilherme e Gabi pela amizade.
Ao Prof. Tiago Collares pelo apoio e em nome do qual eu agradeço a todos do
Centro de Biotecnologia da Universidade Federal de Pelotas.
Ao João Garcia e ao Daniel por fazerem parte dessa história;
Aos Professores André e Ricardo por prestarem suporte e pela amizade.
Às professoras Olívia e Mariana da Universidade do Minho, por me receberem
tão bem em Portugal durante meu estágio de doutorado.
À Rede Nodeste de Biotecnologia, em especial a Profa. Paula Lenz por sempre
estar disposta a ajudar.
À Universidade Federal do Ceará, principalmente à Faculdade de Medicina de
Sobral por abrir suas portas e permitir que eu trabalhasse.
À CAPES e FUNCAP pelos auxílios financeiros recebidos.
"Continue sedento,
(Steve Jobs)
continue
ingênuo”.
RESUMO
Este trabalho avaliou o potencial biotecnológico de lectinas na indução da apoptose de células
neoplásicas, o efeito sobre a cicatrização de feridas em modelo murino (in vivo) e estabeleceu
o nível de toxicidade sobre Artemia sp. Lectinas são proteínas ou glicoproteínas distribuídas
ubiquamente na natureza, sendo encontradas desde bactérias até seres humanos. Tais
proteínas possuem a capacidade de ligar-se seletivamente a carboidratos. Considerando que
carboidratos possam atuar como mediadores da informação biológica, a sua interação com
lectinas pode desencadear algum efeito biológico importante. Para verificar o papel das
lectinas sobre a indução da apoptose, células A549 (carcinoma de pulmão) foram cultivadas
durante 1 hora juntamente com lectinas isoladas das sementes de Canavalia ensiformis
(ConA), C. brasiliensis (ConBr), C. boliviana (ConBol), C. grandiflora (Cgran) e C. gladiata
(CGL) marcadas com FITC. Em adição, a expressão gênica relativa de p53, Bax, BCL-2 e
caspase 9 foi também avaliada quando as células foram cultivadas com ConA, ConBr e
ConBol. Os dados mostraram que todas as lectinas intergiram com as células A549. Não
obstante, p53 e Bax não tiveram nenhuma alteração significativa. Porém, BCL-2 teve sua
expressão diminuída enquanto a da caspase 9 foi aumentada pelo tratamento com as lectinas.
Com relação ao potencial pro-cicatrizante, a lectina isolada da alga vermelha Bryothamnion
seafortii (BS) foi testada através do tratamento tópico de lesões cutâneas. Os dados mostraram
que BS melhora a qualidade da cicatrização, muito possivelmente através da indução da
proliferação de fibroblastos. Por fim, o teste de letalidade sobre Artemia sp. foi utilizado para
verificar a toxicidade de algumas lectinas da subtribo Diocleinae. Os resultados mostraran que
ConBr e ConA são as lectinas mais tóxica e menos tóxica, respectivamente. ConBol, ConM,
Cgran e CGL exibiram níveis intermediários de toxicidade.
Palavras-chave: Lectina. Diocleinae. Apoptose. Cicatrização. Toxicidade. Artemia. A549.
ABSTRACT
This work evaluated the biotechnological potential of lectins in the induction of apoptosis of
neoplastic cells; the effect on wound healing in a murine model (in vivo) and established the
level of toxicity on Artemia sp. Lectins are proteins or glycoproteins ubiquitously distributed
in nature, being found from bacteria to humans. Since carbohydrates can act as mediators of
biological information, the interaction with lectins can trigger some biologically important
effect. To verify the role of lectins in the induction of apoptosis, A549 cells (lung carcinoma)
were grown for 1 hour with lectins isolated from seeds of Canavalia ensiformis (ConA), C.
brasiliensis (ConBr), C. boliviana (ConBol), C. grandiflora (Cgran) and C. gladiata (CGL)
labeled with FITC. In addition, the relative gene expression of p53, Bax, Bcl-2 and caspase 9
was also evaluated when the cells were cultured with ConA, ConBr and ConBol. The data
showed that all lectins interacted with A549 cells. Nevertheless, p53 and Bax had no
significant change. Unlike, the expression of BCL-2 was down-regulated while caspase 9 was
up-regulated by treatment with lectins. Concerning the pro-healing potential, the lectin
isolated from the red alga Bryothamnion seafortii (BS) was tested by topical treatment of skin
lesions. The data showed that BS improved the quality of healing, probably through the
induction of fibroblast proliferation. Finally, the lethality test of Artemia sp. was carried out to
determine the toxicity of some Diocleinae lectins. ConBr is the most toxic lectin against
Artemia, while ConA is the least toxic, and ConBol, ConM, ConGr and CGL exhibit
intermediate levels of toxicity.
Keywords: Lectin. Diocleinae. Apoptosis. Wound healing. Toxicity. Artemia. A549.
SUMÁRIO
1
INTRODUÇÃO .................................................................................................
2
GLICOBIOLOGIA ........................................................................................... 15
2.1
Carboidratos ......................................................................................................
2.2
Lectinas: o início ................................................................................................ 17
2.3
Classificação das lectinas ..................................................................................
2.4
Lectinas vegetais ................................................................................................ 22
2.5
Lectinas da Subtribo Diocleinae ......................................................................
26
REFERÊNCIAS ................................................................................................
29
3
13
15
18
EFEITO DE LECTINAS ISOLADAS DE MEMBROS DA SUBTRIBO
DIOCLEINAE SOBRE A APOPTOSE DE CÉLULAS A549 .................................
37
3.1
Lectinas: moléculas com papéis importantes na apoptose/autofagia .....................
37
3.1.1
Apoptose .............................................................................................................. 37
3.1.2
Autofagia ............................................................................................................. 42
3.2
Objetivos ............................................................................................................
44
3.2.1
Geral ....................................................................................................................
44
3.2.2
Específicos ..........................................................................................................
44
3.3
Materiais e métodos ..........................................................................................
45
3.3.1
Lectinas ...............................................................................................................
45
3.3.2
Células ................................................................................................................. 45
3.3.3
Conjugação das lectinas ao FITC ........................................................................ 45
3.3.4
Cultivo das células ..............................................................................................
3.3.5
Avaliação da interação entre lectinas vegetais e células neoplásicas .................. 46
3.3.6
Avaliação qualitativa da apoptose através do método do iodeto de propídio .....
47
3.3.7
Marcação dos núcleos celulares através da coloração por Hoechst ....................
47
3.3.8
Extração do RNA e síntese do cDNA .................................................................
47
3.3.9
PCR em tempo real .............................................................................................
47
46
3.3.10 Análise dos dados ................................................................................................ 48
3.4
Resultados ..........................................................................................................
49
3.5
Discussão ............................................................................................................
61
REFERÊNCIAS ................................................................................................
64
4
EFEITO DA LECTINA ISOLADA DE Bryothamnion seafortii SOBRE O
PROCESSO CICATRICIAL ......................................................................................
71
4.1
Cicatrização e lectinas ....................................................................................... 71
4.2
Objetivos ............................................................................................................
76
4.2.1
Geral ....................................................................................................................
76
4.2.2
Específicos ..........................................................................................................
76
4.3
Materiais e métodos ..........................................................................................
77
4.3.1
Lectinas ...............................................................................................................
77
4.3.2
Animais ...............................................................................................................
77
4.3.3
Atividade hemaglutinante ...................................................................................
77
4.3.4
Grupos experimentais e formulação dos tratamentos tópicos ............................. 78
4.3.5
Procedimento cirúrgico .......................................................................................
4.3.6
Tratamento e avaliação macroscópica da atividade cicatrizante ......................... 79
4.3.7
Avaliação histopatológica ...................................................................................
4.3.8
Análise estatística ................................................................................................ 80
4.4
Resultados ..........................................................................................................
4.4.1
Avaliação macroscópica do experimento in vivo ................................................ 81
4.4.2
Avaliação histopatológica ...................................................................................
82
4.5
Discussão ............................................................................................................
87
REFERÊNCIAS ................................................................................................
89
5
78
79
81
AVALIAÇÃO DA TOXICIDADE DAS LECTINAS SOBRE NÁUPILOS
DE ARTÊMIA ...................................................................................................
95
5.1
Manuscrito submetido ao periódico Bioresource Technology ......................
95
6
CONCLUSÃO ...................................................................................................
117
ANEXOS ............................................................................................................
118
13
1 INTRODUÇÃO
Produtos
naturais
são,
historicamente,
importantes
ferramentas
no
desenvolvimento de agentes terapêuticos para o tratamento de diversas doenças. Tal
importância pode ser evidenciada pelo fato destes compostos possuírem grande diversidade
estrutural, além de um largo espectro de atividade biológica, podendo servir como verdadeiros
moldes no descobrimento de novas drogas. De fato, aproximadamente metade das drogas
introduzidas entre 1940 e 2006 foram de origem natural ou até mesmo inspiradas em produtos
naturais (SCHWARZENBERG; VOLLMAR, 2010).
Doenças com forte apelo social, como o câncer ou mesmo as frequentemente
causadas por microrganismos, encorajam a busca por terapias alternativas de maior eficiência.
Neste sentido, os produtos naturais estão cada vez mais “na moda” e presentes no rol das
possíveis ferramentas disponíveis para o tratamento destas patologias.
Na terapia contra o câncer, a utilização destes insumos tem papel extremamente
relevante. Diversos produtos utilizados na prática médica são definidamente naturais ou
derivados de produtos naturais, provindos de várias fontes, como plantas, animais e
microrganismos (NOBILI et al., 2009). A busca por produtos naturais com significância no
tratamento de patologias tornou-se tão importante que adentrou os oceanos. No Brasil, por
exemplo, existe um crescente interesse na prospecção de organismos marinhos como fontes
de agentes anticâncer, visto que o ambiente marinho pode ser considerado uma fonte
extremamente rica de potentes compostos bioativos (COSTA-LOTUFO et al., 2006).
Bons exemplos de produtos naturais, largamente utilizados na prática terapêutica
atual, incluem a lovastatina (agente anticolesterolêmico), ciclosporina A e tacrolimo ou
FK506 (imunossupressores), paclitaxel e doxorrubicina (antitumorais), eritromicina
(antibiótico) e anfotericina B (fungicida) (STROHL, 2000).
Outro ramo da prática médica que tem sido diretamente beneficiado com a melhor
caracterização dos efeitos biológicos dos produtos naturais, é o do combate aos microorganismos. Diariamente novas pesquisas tem sido publicadas e diferentes soluções são
propostas para o desenvolvimento de agentes antimicrobianos mais eficazes. Tal prerrogativa
tem também amparo social, uma vez que a terapia antimicrobiana tradicional, realizada
através da antibioticoterapia, apresenta problemas que ainda não foram completamente
solucionados. Um desses entraves faz alusão à perda da eficiência dos antibióticos, através da
aquisição, por parte do agente agressor, de mecanismos capazes de sobrepujar o efeito dos
antimicrobianos (ALANIS, 2005; GRUNDMANN et al., 2011).
14
A partir de tais observações, nota-se claramente que o desafio de encontrar
agentes naturais que hajam de forma especifica e eficaz sobre células neoplásicas e/ou
microrganismos patogênicos, torna-se tarefa bastante árdua, porém igualmente instigante.
Nessa perspectiva, algumas moléculas podem surgir como valorosas ferramentas úteis nas
diversas etapas da doença, tanto para fins de diagnóstico quanto na terapêutica, ou mesmo no
entendimento dos fenômenos moleculares que a cercam. Dentre estas, uma classe de
macromoléculas que possui características especiais certamente destaca-se: as proteínas.
Historicamente, diversas funções biológicas tem sido atribuídas às proteínas. Em
grande parte das vezes, tratam-se de atividades altamente específicas, que exigem
mecanismos de interação entre proteína/ligante ou proteína/substrato frequentemente
complexos. Observe, por exemplo, o que acontece quando um anticorpo específico para um
determinado antígeno, encontra seu respectivo epítopo na superfície deste. A interação entre
ambos se dá a partir da formação de um conjunto de ligações químicas, que individualmente
são fracas, entretanto, quando somadas, determinam um forte mecanismo de interação que é
responsável pelo desenvolvimento de uma resposta imune eficaz. Mecanismo semelhante
ocorre entre uma enzima e seu substrato: a catálise em si somente acontece após ser
estabelecida uma interação. Sendo assim, a etapa da interação entre proteína e ligante
constitui-se como fase primordial para que a atividade biológica de uma determinada proteína
possa ser exercida. Nesse contexto, uma classe de proteínas destaca-se por conseguir
estabelecer um grau de interação bastante específico com ligantes biologicamente
importantes: trata-se das lectinas.
15
2 GLICOBIOLOGIA
2.1 Carboidratos
Carboidratos são, de longe, as mais abundantes moléculas orgânicas encontradas
na natureza, e quase todos os organismos sintetizam e metabolizam carboidratos (WADE,
1999). A complexa heterogeneidade dos carboidratos nos sistemas vivos é resultado direto de
várias características, tais como: a habilidade de diferentes tipos de resíduos de açúcar de
formar pontes uns com os outros, suas características estruturais, o tipo de ligação anomérica,
a posição e a presença ou ausência de ramificações (GORELIK et al., 2001).
Dessa forma, a variabilidade estrutural e a complexidade de glicanos na superfície
das células (Figura 2.1) permite que eles desempenhem várias funções como moléculas
sinalizadoras, de reconhecimento e adesão (OFEK et al., 2003 a,b). Como tal, glicanos na
superfície de células estão envolvidos em muitas funções fisiologicamente importantes, que
incluem o desenvolvimento embrionário normal, diferenciação, crescimento, reconhecimento
célula-célula, sinalização celular, resposta imune do hospedeiro, infecções, metástase, tráfego
intracelular, taxa de degradação e rigidez da membrana (SHARON; LIS, 2003; DISNEY;
SEEBERGER,
2004;
ZACHARA;
HART,
2006;
BLOMME
et
al.,
2009;
MUKHOPADHYAY et al., 2009).
Figura 2.1 − Ilustração esquemática da heterogeneidade de carboidratos encontrados nas membranas celulares.
Açúcares como glicose, manose e fucose são encontrados como constituintes de glicolipídeos e glicoproteínas.
Fonte: retirada de GHAZARIAN et
al., 2011.
16
Carboidratos são igualmente importantes no estabelecimento de vários processos
patológicos, principalmente os relacionados ao desenvolvimento e progressão dos mais
diversos tipos de cânceres. Grandes alterações ocorrem no padrão de glicosilação de células
neoplásicas. Para entender esta questão, deve-se ter em mente que células normais tem que
ultrapassar vários níveis de regulação para transformar-se em células metastáticas malignas,
as quais eventualmente, invadirão tecidos próximos ou distantes. Alterações genéticas fazem
com que células malignas produzam, em grande quantidade, sinais de crescimento, que ao
mesmo tempo as tornam indiferentes para os efeitos inibitórios dos produtos gênicos
supressores de tumores, como é o caso da p53 ou induzem a reativação da atividade da
telomerase, criando um alto potencial replicativo (COULDREY; GREEN, 2000;
GHAZARIAN et al., 2011). Em adição às alterações genéticas, alterações fenotípicas também
fornecem às células malignas a habilidade para escapar da limitação do crescimento imposta
por características do próprio tecido, reagindo através de mecanismos relacionados a invasão
e angiogênese. Outras alterações fenotípicas fornecem às células malignas mecanismos para
escapar da imunovigilância (COULDREY; GREEN, 2000; SCHWARTZ-ALBIEZ et al.,
2008).
As alterações fenotípicas mais importantes para o entendimento do papel dos
carboidratos em muitas doenças, são as relacionadas às superfícies celulares. Quase todos os
tipos de células malignas e células de tecidos danificados demonstram alterações no seu
padrão de glicosilação, quando comparadas com as células normais. (HAKOMORI, 1985,
1989; DENNIS, 1992; MODY et al., 1995; FUKUDA, 1996; ORNTOFT; VESTERGAARD,
1999; OPPENHEIMER et al., 2008; POWLESLAND et al., 2009; SHIDA et al., 2009).
O entendimento do papel dos carboidratos não está restrito apenas ao
desenvolvimento do câncer, pois muitos patógenos humanos utilizam-se de glicanos de
superfície para iniciarem a adesão e subsequente infecção (SHARON; LIS, 1989, 2003; ZEM
et al., 2006; HYUN et al., 2007; OPPENHEIMER et al., 2008; MUKHOPADHYAY et al.,
2009). A bactéria Escherichia coli, por exemplo, liga-se a manosídeos, enquanto muitos vírus
podem ligar-se ao ácido siálico na superfície das células do hospedeiro. Hoje sabe-se que
doenças seculares, como é o caso da gonorreia, são iniciadas pela adesão de seu agente
etiológico (Neisseria gonorrhea) a resíduos de N-acetil-lactosamina presentes na superfície
das célula do trato urogenital. A bactéria patogênica Pseudomonas aeruginosa, por exemplo,
responsável pela maioria das infecções no ambiente hospitalar, liga-se especificamente a Lfucose (BARTHELSON et al., 1998).
17
2.2 Lectinas: o início
Próximo ao final do século XIX, fortes evidências apontavam para a existência na
natureza de proteínas que possuíssem a habilidade de aglutinar eritrócitos. Tais proteínas
foram referidas como sendo hemaglutininas ou fitohemaglutininas, visto que foram de
maneira inicial, encontradas em extratos de plantas. Acredita-se que a descrição mais antiga
relacionada a tais proteínas, tenha sido feita por Peter Hermann Stillmark, na ocasião de sua
defesa de tese de doutorado, apresentada em 1888 para a Universidade de Dorpat (Estonia)
(FRANZ, 1988). A proteína descrita pelo Dr. Stillmark foi isolada das sementes da planta
popularmente conhecida como feijão-castor ou mamona (Ricinus communis L.) e foi nomeada
como ricina. A hemaglunitação não estava restrita somente à ricina, pois H. Hellin,
trabalhando na mesma universidade de Stillmark, demonstrou que nas sementes da planta
feijão-jequiriti ou ervilha-do-rosário (Abrus precatorius L.) havia outra hemaglutinina,
batizada por ele de abrina. Tanto a ricina como a abrina foram rapidamente comercializadas e
de imediato foram solicitadas pelo professor Paul Ehrlich, do Instituto Real de Terapia
Experimental (Frankfurt), para empregá-las em modelos experimentais envolvendo estudos
imunológicos (SHARON; LIS, 2004).
Apesar da demonstração de Stillmark e mais tarde por Hellin, de que extratos
vegetais possuíam atividade hemaglutinante, muitas questões ainda permaneciam obscuras
com relação a tais proteínas. Uma dessas foi resolvida em 1919 por James B. Sumner na
Universidade Cornell (Nova Iorque), seis anos antes do auge de sua fama (que ocorreu pela
cristalização de uma enzima, a urease). Summer isolou pela primeira vez uma hemaglutinina
pura, a partir da semente do feijão-do-porco (Canavalia ensiformis) e a batizou como
Concanavalina A. No entanto, aproximadamente duas décadas se passaram até Summer e
Howell em 1936 relatarem que a proteína isolada por eles conseguia aglutinar células, como
hemácias e leveduras, além de precipitar o glicogênio em solução. A exemplo de Stillmark, os
trabalhos de Summer foram extremamente importantes, principalmente por terem
demonstrado pela primeira vez que as lectinas possuem especificidade por açúcar. Tal fato
aconteceu após a realização de ensaios inibitórios utilizando sacarose (SUMMER; HOWELL,
1936).
Durante os experimentos de Stillmark, ficou evidenciado que a ricina possuía
alguma seletividade na aglutinação de eritrócitos de espécies diferentes. Este fato foi
corroborado pelos estudos de Karl Landsteiner, da Universidade de Viena (o qual em 1900
descobriu os grupos sanguíneos A, B e O). Landsteiner publicou um artigo em 1907,
18
mostrando que a atividade hemaglutinante provinda de extratos de sementes de diversas
espécies era diferente entre os eritrócitos de diferente animais (LANDSTEINER;
RAUBITSCHEK, 1907).
Na década de 1940, Willian C. Boyd, da Universidade de Boston e Karl O.
Renkonen da Universidade Helsinki (Finlândia), pesquisando de maneira independente um do
outro, descobriram a especificidade das hemaglutininas pelos grupos sanguíneos. Os
resultados mostraram que extratos brutos de Phaseolus limensis e Vicia craca aglutinavam
eritrócitos do grupo A e não os dos outros tipos, enquanto o extrato de Lotus tetragonolobus
aglutinava especificamente eritrócitos do grupo O (SHARON; LIS, 2004).
A utilização das fitohemaglutininas específicas para determinado tipo sanguíneo
ganhou força nos anos cinquenta, como importantes ferramentas na caracterização estrutural
da especificidade dos antígenos associados ao sistema ABO. Walter J. T. Morgan e Winifred
M. Watkins, trabalhando no instituto Lister (Londres) observaram que a aglutinação dos
eritrócitos do grupo A pela lectina de Phaseolus limensis era melhor inibida quando
adicionava-se N-acetil-D-galactosamina, e que L-fucose era o melhor inibidor da aglutinação
dos eritrócitos do tipo O. Assim concluíram que os açúcares que determinavam os tipos
sanguíneos A e O eram, N-acetil-D-galactosamina e L-fucose, respectivamente (MORGAN;
WATKINS, 2000).
Movidos pela necessidade da proposição de um termo universalmente aceito e que
refletisse a habilidade dessas hemaglutininas em discriminar entre diferentes açúcares, Boyd e
Shapleigh propuseram, em 1954, a utilização do termo lectina (do latin legere = escolher)
(BOYD; SHAPLEIGH, 1954).
2.3 Classificação das lectinas
O sistema de classificação de lectinas mais aceito na atualidade foi proposto por
Willy J. Peumans e Els Van Damme em 1995, na ocasião da publicação de um artigo bastante
citado pela lectinologia, o qual mostra que tais proteínas podem atuar como agentes de defesa
de plantas (PEUMANS; VAN DAMME, 1995). De acordo com o método proposto, lectinas
podem ser classificadas como merolectinas, hololectinas e quimerolectinas. Posteriormente,
em 1998, os mesmos autores adicionaram mais uma classe ao sistema de classificação outrora
proposto: as superlectinas (PEUMANS; VAN DAMME, 1998).
Segundo os autores, as merolectinas são proteínas constituídas de um único
domínio capaz de estabelecer interações com carboidratos. Tratam-se de proteínas pequenas,
19
de cadeia polipeptídica única, que por sua natureza monovalente não conseguem aglutinar
células ou mesmo precipitar glicoconjugados. A classe das merolectinas pode ser representada
pela heveína, a qual foi isolada a partir do látex da seringueira Hevea brasiliensis (Figura 2.2)
(VAN PARIJS et al., 1991).
Figura 2.2 – Representação da estrutura tridimensional da heveína, lectina isolada de Hevea brasiliensis. A
lectina possui apenas um sítio de ligação a carboidrato (molécula adicional, representada em verde).
Heveína Fonte: Adaptada de LIU et al., 2010.
Hololectinas são caracterizadas pela presença de múltiplos domínios de interação
a carboidratos, sendo estes idênticos ou homólogos. São geralmente proteínas oligoméricas,
que se apresentam em forma de dímeros ou tetrâmeros, sendo bem conhecidas pela
capacidade de aglutinar células e precipitar glicoconjugados. A maior parte das lectinas de
leguminosas é classificada como hololectinas, as quais diferem entre si por pequenas
diferenças estruturais apresentadas em suas formas diméricas e/ou tetraméricas, e incluem as
lectinas de Canavalia brasiliensis (ConBr) (Figura 2.3, p.20),
(Jacalina) e Griffonia simplicifolia.
Artocarpus Integrifolia
20
Figura 2.3 – Representação da estrutura tridimensional de ConBr (lectina isolada das sementes de Canavalia
brasiliensis). O oligômero possui quatro sítios de ligação a carboidratos (representados por moléculas adicionais
apontadas pelas setas).
ConBr Fonte: Adaptada do Protein Data Bank. Código de acesso: 1AZD
As quimerolectinas são proteínas que possuem um ou mais sítios de ligação a
carboidratos, e adicionalmente outro domínio que exerce função distinta daquele de
reconhecimento a açúcar. Dependendo da quantidade de sítios de ligações a carboidrato, as
quimerolectinas podem se comportar como merolectinas ou hololectinas. Como exemplos
citam-se as proteínas inativadoras de ribossomos tipo 2 (RIPs), como a ricina (Figura 2.4).
Figura 2.4 − Representação da estrutura tridimensional da ricina (RIP isolada das sementes de Ricinus
communis). A cadeia polipeptídica representada em azul contém a atividade lectínica, enquanto a verde possui
atividade catalítica. As setas apontam as moléculas de carboidratos que interagem com o domínio lectínico.
Ricina Fonte: Adaptada de LIU et
al., 2010.
21
As superlectinas (Figura 2.5) apresentam pelo menos dois sítios de ligação a
carboidratos. Porém, ao contrário das hololectinas, os sítios presentes reconhecem
carboidratos estruturalmente não-relacionados. São mais dificilmente encontradas quando
comparadas com as hololectinas, entretanto, novas estruturas vêm sendo resolvidas, como
exemplo a da lectina de banana que possui dois sítios distintos de reconhecimento a
laminaribiose e Xyl-beta1,3-Man-alpha-O-Methyl em domínios distintos (MEAGHER et al.,
2005). A lectina isolada do bulbo de um cultivar de tulipa (TxLC-I) é, sem dúvidas, a
representante mais conhecida dessa classe.
Figura 2.5 − Representação da estrutura tridimensional da TXLC-I (lectina isolada de bulbos de tulipas - Tulipa
cv. Apeldoom). As cadeias polipeptídicas possuem sítios que reconhecem carboidratos que não possuem relação
entre suas estruturas.
TXLC-‐I Fonte: Adaptada de LIU et
al., 2010.
É importante salientar que algumas lectinas de plantas, que atualmente possuem
suas estruturas elucidadas, podem não se enquadrar especificamente em nenhuma destas
classificações. Cita-se como exemplo a lectina isolada de sementes de Parkia platycephala,
homóloga da família das hidrolases. Tal lectina possui um domínio com capacidade de reagir
enzimaticamente com o polissacarídeo composto de monômeros de N-acetyl-D-glicosamina
(quitina) e, ao mesmo tempo, dentro deste mesmo domínio, possui outro sítio de
reconhecimento a carboidrato (CAVADA et al., 2006).
22
2.4 Lectinas vegetais
Lectinas vegetais pertencem a uma classe de proteínas de origem não-imune,
distribuídas ubiquamente numa grande variedade de espécies vegetais (GOLDSTEIN et al.,
1980; CAVADA et al., 2001; PEUMANS et al., 2001). Tais proteínas conseguem reconhecer
e ligar-se a carboidratos de maneira específica e assim realizam uma gama de atividades
biologicamente importantes (SHARON; LIS, 1989; SHARON, 2007).
Dentre as lectinas encontradas nos vegetais, certamente as isoladas a partir de
leguminosas (família Leguminosae ou Fabaceae) constituem o grupo mais investigado até
agora. Algumas dezenas já foram caracterizadas com relação às propriedades químicas,
fisico-químicas, estruturais e biológicas (CAVADA et al., 2001). Em sua maioria, são
isoladas de sementes e com relação a proporção proteica dos constituintes da semente,
chegam a representar 10% do total (SOL et al., 2006). As lectinas de leguminosas são
similares entre si com relação às suas estruturas primárias e terciárias, porém diferem quanto
à estrutura quaternária (BRINDA et al., 2005) e em suas especificidades por carboidratos
(CHANDRA et al., 2001). Possivelmente, tais diferenças, apesar de pequenas, acarretem na
diversidade de propriedades biológicas que estas tem apresentado (CAVADA et al., 1993;
2001).
Pelo menos três décadas foram necessárias para que pesquisadores de diversos
grupos espalhados pelo mundo, conseguissem estabelecer padrões estruturais que definissem,
com precisão, quais características são comuns para todos exemplares das lectinas de
leguminosas. A partir de tais estudos, percebeu-se que as lectinas de leguminosas apresentam,
em geral, massa molecular em torno dos 25-30 kDa, 220 a 250 resíduos de aminoácidos,
sendo compostas por duas ou quatro subunidades, cada uma delas apresentando um domínio
de reconhecimento a carboidratos (CRD) único e altamente conservado, bem como sítios de
ligação a metais para cátions divalentes (cálcio e manganês), essenciais para sua estrutura
e/ou função (UETA, 2002).
Estas lectinas apresentam entre si o mesmo tipo de enovelamento em relação a
seus monômeros, que são compostos quase que exclusivamente por fitas-β antiparalelas
(cerca de 60%) arranjadas em duas ou mais folhas β interconectadas por “loops”, mais
conhecido como enovelamento do tipo “β-sanduíche” (HARDMAN; AINSWORTH 1972;
BECKER et al., 1975, BRINDA et al., 2004). A proteína pode ser constituída por tetrâmeros
formados a partir de arranjos espaciais entre dímeros. Cada interação dimérica distinta gera
uma forma tetramérica específica.
23
A estrutura do monômero de tais lectinas é altamente conservada (Figura 2.6, p.
24), sendo uma característica adicional importante, aparentemente comum a todas lectinas de
leguminosas, o fato de que o monômero, em si mesmo, carrega em sua estrutura todas as
características necessárias para o reconhecimento do ligante. Isto significa que a
oligomerização transmite para estas lectinas a especificidade fina necessária para sua
atividade biológica, e ainda fornece a estabilidade estrutural geral para a macromolécula
(REDDY et al., 1999).
O sítio de ligação a carboidratos das lectinas de leguminosas consiste em uma
região na superfície da molécula composta por quatro “loops” que proporcionam a formação
de uma cavidade na superfície da mesma. Nestes “loops” encontram-se três resíduos
altamente conservados, ácido aspártico (Asp), asparagina (Asn) e glicina/arginina (Gly/Arg),
responsáveis pela formação de quatro ligações de hidrogênio com as hidroxilas presentes nos
monossacarídeos. A estabilização dos monossacarídeos ocorre também através de interações
hidrofóbicas com os resíduos de aminoácido fenilalanina (Phe), tirosina (Tyr), triptofano
(Try) ou leucina (Leu). O interessante é que as variações evolutivas observadas nas lectinas
de leguminosas ocorrem especificamente no sítio de ligação a carboidratos e na maneira como
essas proteínas formam oligômeros. Em outras palavras, se existirem variações no sítio
primário de ligação haverá provavelmente mudança na especificidade da lectina pelo seu
respectivo monossacarídeo. Por outro lado, caso essas variações sejam observadas na forma
de oligomerização haverá mudanças na forma em como a proteína interage com
oligossacarídeos complexos presentes nas membranas celulares. Resumindo, lectinas
contendo a mesma especificidade por monossacarídeos podem desempenhar atividades
biológicas distintas (MORENO, 2008).
De fato, isto é o que tem sido observado durante a realização de experimentos que
envolvam a atividade biológica de lectinas de leguminosas. Vários modelos experimentais
mostraram que a mesma proteína pode desempenhar atividades diferentes dentro do mesmo
modelo experimental, dependendo da via pela qual foi administrada. Alterações drásticas na
atividade destas proteínas são também observadas quando submetidas a experimentação
utilizando indivíduos evolutivamente aparentados.
24
Figura 2.6 − Representação tridimensional do monômero de lectinas de Leguminosas. A proteína-modelo
escolhida foi a lectina de Canavalia marítima. No lado direito da imagem encontra-se o desenho esquemático
que denota a posição ocupada pelas folhas β e pela molécula de carboidrato ligante.
Fonte: Adaptada de SINHA et
al., 2007.
Parece ser fato que a conservação estrutural das lectinas de leguminosas
demonstre que estejam evolutivamente relacionadas, podendo ser relatadas como proteínas
homólogas que surgiram a partir de um ancestral comum. Contudo, a principal distinção
destas lectinas, parece residir no que diz respeito à afinidade por açúcares, existindo grupos
com especificidade de ligação a glicose/manose, N-acetil-glicosamina, N-galactosamina, Lfucose e ácido siálico (MOREIRA et al., 1991).
O sítio de ligação a íons é amplamente conservado nas lectinas de leguminosas.
Em adição, vale destacar que o reconhecimento ao ligante depende da presença do íon cálcio
e de um outro íon, geralmente o manganês. Esses metais se localizam a uma distância de
aproximadamente 4,5 Å e ambos são coordenados por cadeias laterais de quatro aminoácidos
e duas moléculas de água. O reconhecimento das lectinas de leguminosas por íons é reversível
e a remoção desses metais resulta em importantes mudanças conformacionais. Tomando-se
como exemplo a ConA, a presença dos íons é necessária para manter a configuração trans da
ligação peptídica Ala207-Asp208, que por sua vez modula a arquitetura do espaço de ligação
ao seu carboidrato específico. Esta isomerização ocorre concomitante à formação do sítio de
ligação a carboidrato, sendo a presença destes íons essencial para o correto empacotamento e
arranjo interno deste, reduzindo os custos entrópicos e restringindo a mobilidade do contato
25
do ligante (Figura 2.7) (RÜDIGER E GABIUS, 2001). Na ausência dos íons cálcio e
manganês, a molécula passa a assumir uma configuração do tipo cis, provocando a perda da
capacidade de reconhecimento a carboidratos (BOUCKAERT et al., 1995). Estes íons,
mesmo não participando diretamente na interação com o ligante, têm o papel de estabilizar as
regiões de ligação ao metal e de ligação ao carboidrato (BOUCKAERT et al., 2000;
GRANGEIRO et al., 2001).
Além dos sítios de ligação ao carboidrato e a metais, tem sido relatado que
algumas lectinas contêm uma cavidade hidrofóbica, primeiramente descrita para a ConA
(BECKER et al., 1975). Esta cavidade consiste, principalmente, de resíduos hidrofóbicos
conservados que se ligam ao aminoácido não-protéico ácido aminobutírico (Abu),
(DELATORRE et al., 2007). A associação de lectinas com o Abu fortalece a proposição do
papel de lectinas na defesa de plantas contra patógenos, bem como a característica de
interação com moléculas diferentes de carboidratos, como ocorre com os hormônios via
domínios hidrofóbicos das lectinas (EDELMAN; WANG, 1978; TON; MAUCH-MANI,
2004).
Figura 2.7 − Sobreposição das estruturas tridimensionais da lectina de Canavalia ensiformis (ConA) na presença
e ausência dos íons cálcio e manganês. Em azul, conformação fechada, com o ácido aspártico 208 voltado para o
sítio de ligação à açúcar. Em verde, na ausência dos ions cálcio e manganês, a molécula assume uma
conformação mais aberta, com o ácido aspártico 208 posicionado para o lado oposto ao sítio de ligação ao
açúcar.
Fonte: BOUCKAERT et
al., 1995.
26
2.5 Lectinas da Subtribo Diocleinae
Dentre as lectinas de leguminosas, as encontradas na subtribo Diocleinae
constituem um grande grupo de proteínas relacionadas, as quais possuem estruturas primárias
e terciárias similares e compartilham de seletividade pelo reconhecimento a carboidratos
(Figura 2.8).
Figura 2.8 – Alinhamento múltiplo das sequências de aminoácidos de ConM, CGL, ConA e ConBr. As referidas
proteínas compartilham de um alto grau de similaridade.
Fonte: Alinhamento realizado no software Clustal W2. As sequências de aminoácidos foram obtidas no Protein
Data Bank. Código de Acesso: ConM (4I30), CGL (2EF6), ConBr (4H55) e ConA (1JBC).
Tais proteínas apresentam especificidade principalmente pelos monossacarídeos
glicose/manose (RAMOS et al., 1996). Uma característica marcante e que distingue as
lectinas da subtribo Diocleinae é que exibem equilíbrio dímero-tetrâmero dependente de pH
(CALVETE et al., 1999).
Quando se realiza a comparação entre as lectinas de Dioclea, Cratylia e
Canavalia, demonstra-se que, apesar de sua elevada homologia, estas lectinas apresentam
importantes variações em algumas atividades biológicas, como proliferação de linfócitos e
produção de interferon-γ (BARRAL-NETO et al., 1992), indução da liberação de histamina
por mastócitos (GOMES et al., 1994), ativação de macrófagos e liberação de peróxido de
hidrogênio (RODRIGUEZ et al., 1992). A tabela 2.1 (p.27) lista os efeitos diferenciados das
lectinas da subtribo Diocleinae em alguns ensaios imunológicos realizados in vitro
(CAVADA et al., 2001).
27
Tabela 2.1 − Atividades imunológicas in vitro relacionadas com as lectinas da subtribo Diocleinae
ATIVIDADES
Ativação de
PMBC humana¹
Síntese de GMCSF
Síntese de IFN-γ¹
ConA
ConBr
CABO
DGF
DVL
DRL
Dvir
DguiL
CFL
50%
100%
20%
80%
70%
75%
90%
35%
75%
7%
38%
ND
86%
12%
100%
6%
29%
ND
35%
70%
30%
60%
60%
100%
30%
60%
75%
Síntese de TNFα¹
Síntese de IL-10¹
34%
100%
ND
14%
14%
27%
45%
43%
ND
100%
83%
ND
51%
36%
26%
17%
79%
ND
Secreção de
Histamina
100%
100%
10%
10%
50%
100%
100%
50%
10%
63%
100%
ND
62%
2%
33%
21%
34%
ND
Produção de NO
Fonte: Adaptado de OLIVEIRA, 2007.
Nota: Dados em porcentagem com relação à maior atividade apresentada por uma lectina no teste. ND:
atividades não determinadas. ConA: lectina de Canavalia ensiformis, ConBr: de C. brasiliensis, CABO: de
C. bonariensis, DGF: de Dioclea grandiflora, DVL: de D. violacea, DRL: de D. rostrata, Dvir: de D.
virgata, DguiL: de D. guianensis, CFL: – de Cratylia floribunda. PBMC: Célula mononucleada de sangue
periférico, GM-CSF: fator estimulante de colônias de macrófagos e granulócitos, IFN-γ: interferon gama,
TNF-α: fator de necrose tumoral alfa, IL-10: interleucina 10, NO: óxido nítrico. 1Testes em modelo humano.
Acredita-se que vários fatores possam contribuir para a diferença na atividade de
lectinas (BRINDA et al., 2004): dentre estes, cita-se a oligomerização dependente de pH, a
posição relativa do sítio de ligação a carboidratos e pequenas mudanças em resíduos de
aminoácidos localizados em posições-chave relacionadas com a associação quaternária.
As lectinas “ConA-like” passam por um processamento estrutural de maturação
que pode ser importante quando se investiga as diferenças nas propriedades biológicas de
lectinas da subtribo Diocleinae. As lectinas de leguminosas são sintetizadas como precursores
glicosilados, que contém um peptídeo sinal para transporte ao retículo endoplasmático (Figura
2.9a, p.29). Após a retirada do peptídeo sinal, a lectina é transportada para o aparelho de
Golgi e posteriormente armazenada em corpos proteicos de origem vacuolar (BOWLES;
PAPIN, 1988). A maturação destas lectinas necessita de um complexo sistema póstraducional (CUNNINGHAM et al., 1979). No interior dos corpos proteicos, o glicopeptídeo
central (o glicano atracado a um peptídeo de 15 resíduos) do precursor da ConA é removido,
originando duas cadeias polipeptídicas distintas (γ e β) correspondendo aos domínios N- e Cdo precursor. A cadeia C-terminal é processada ocorrendo a remoção proteolítica de um
peptídeo de nove resíduos na extensão C-terminal, que é ligada à região N-terminal de
maneira inversa (Figura 2.9b, p.29). Tal reação é conhecida como transpeptidação, que
produz a permutação da sequência de aminoácidos. Uma clivagem subsequente libera 4
resíduos de aminoácidos originando a lectina madura com 237 resíduos (CARRINGTON et
al., 1985; BOWLES et al., 1986; CHRISPEELS et al., 1986; FAYE; CHRISPEELS, 1987;
28
BOWLES; PAPPIN, 1988; SHELDON et al., 1996). A nova ligação peptídica ligando os
terminais N- e C- se localiza entre os resíduos 118 e 119 da proteína madura. Tanto a
hidrólise como o religamento dependem da enzima asparaginil endopeptidase. Sua atividade
transpeptidase não é total porque a lectina madura é composta de uma mistura de 60% da
cadeia polipeptídica α, de 237 aminoácidos e 40% de seus fragmentos β (1 a 118, 14kDa) e γ
(119 a 237, 12kDa), unidos de forma não-covalente na estrutura terciária da proteína.
Portanto, a análise da lectina por SDS-PAGE revela três bandas polipeptídicas (Figura 2.9c, p.
29). O mesmo padrão eletroforético é observado em lectinas isoladas do gênero Canavalia
(MOREIRA; CAVADA, 1984; CAVADA et al. 1996; CECCATO, 2001). Para algumas
das lectinas de Canavalia, foi demonstrado que os dois fragmentos são as duas metades da
cadeia α intacta (YAMAUCHI; MINAMIKAWA, 1990, GRANGEIRO, 1996), indicando que
as lectinas desse gênero são produzidas pelo mesmo mecanismo pós-traducional estabelecido
para ConA. Este processo, chamado de permutação circular de sequência pós-traducional
(CARRINGTON et al., 1985) provavelmente não ocorre em todas as lectinas de leguminosas
(ROCHA et al., 2009).
Figura 2.9 − Modificações pós-traducionais na biossíntese de ConA. (A) O precursor (pro-ConA) é uma Nglicoproteína de 290 aminoácidos. Este precursor é deglicosilado e hidrolisado por uma asparaginil
endopeptidase, liberando um nonapeptídeo C-terminal e um peptídeo interno de 15 aminoácidos. (B) Reação de
transpeptidação que liga o extremo C-terminal da cadeia β com o N-terminal da cadeia γ, produzindo uma cadeia
α, cuja sequência está permutada em relação à codificada pelo gene. A lectina madura é composta de uma
mistura de 60% da cadeia polipeptídica α, de 237 aminoácidos e 40% de seus fragmentos β (1 a 118, 14kDa) e γ
(119 a 237, 12kDa) (C). Tal característica das lectinas de Diocleinae é demonstrada na eletroforese em gel de
poliacrilamida (SDS-PAGE).
Fonte: Adaptada de PEUMANS; VAN DAMME, 1998.
29
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3
37
EFEITO
DE
LECTINAS
ISOLADAS
DE
MEMBROS
DA
SUBTRIBO
DIOCLEINAE SOBRE A APOPTOSE DE CÉLULAS A549
3.1 Lectinas: moléculas com papéis importantes na apoptose/autofagia
3.1.1 Apoptose
Lectinas podem apresentar diferentes atividades biológicas significativas. Um
exemplo disso é sua utilização como ferramentas antineoplásicas. Nesse contexto, tais
proteínas conseguem interagir com alvos celulares específicos e desencadear a apoptose de
células cancerígenas.
Animais multicelulares frequentemente necessitam se livrar de células que estão
em excesso ou mesmo que são potencialmente danosas para o organismo. Para tal fim, um
sistema de reações moleculares está disponível, podendo este ser chamado de apoptose ou
morte celular programada (VAUX; KORSMEYER, 1999). Trata-se de um processo de morte
celular autodestrutivo, geneticamente regulado e muito importante em várias neoplasias (LIU
et al., 2008).
Os mecanismos bioquímicos da apoptose envolvem uma série de reações em
cascata que são orquestradas por proteínas homólogas umas as outras e que fazem parte de
uma grande família chamada de caspases − proteases cisteínicas e aspárticas (ALNEMRI et
al., 1996). Aproximadamente uma dúzia de caspases tem sido encontradas nos seres humanos
e acredita-se que pelo menos dois terços destas estejam relacionados com a apoptose
(THORNBERRY et al., 1998; EARNSHAW et al., 1999).
Todas as caspases descobertas possuem um sítio ativo cisteínico e clivam
substratos quando ocorrem ligações do tipo Asp–Xxx (a clivagem ocorre após resíduos de
ácido aspártico). Os quatro resíduos de aminoácidos localizados de forma N-terminal ao sítio
de clivagem das caspases determinam a especificidade destas por diferentes substratos
(THORNBERRY et al., 1997).
Assim como ocorre na maioria das proteases, as caspases são sintetizadas como
zimogênios enzimaticamente inertes, sendo estes compostos por três domínios: um prodomínio N-terminal e outros dois domínios chamados de p20 e p10, os quais são também
encontrados na enzima madura. A enzima madura, por sua vez, é um heterotetrâmero
contendo dois heterodímeros p20/p10 e dois sítios ativos (EARNSHAW et al., 1999).
A maioria das caspases é ativada através da clivagem proteolítica do zimogênio,
que pode ocorrer entre os domínios p20 e p10 ou entre o pro-domínio e o domínio p20. Três
modelos diferentes são propostos para a ativação das caspases. O primeiro propõe que a
38
ativação ocorra através da exposição de uma procaspase a uma caspase previamente ativada
(upstream) (Figura 3.1a, p.39). Esta estratégia de ativação, através de uma “cascata de
caspases”, é utilizada extensivamente pelas células para a ativação das caspases 3, 6 e 7, as
quais possuem pro-domínios bastante curtos e são as caspases mais abundantes nas células;
conhecidas como caspases efetoras, pois os substratos que estão diretamente envolvidos com
a apoptose são clivados por elas (THORNBERRY et al., 1997).
Apesar deste modelo ser bastante útil, ele não explica como ocorre a ativação da
primeira caspase, ou seja, a iniciadora de todo o processo. A caspase 8 é a iniciadora da via
apoptótica conhecida como “via extrínseca”, a qual recebe o sinal provindo dos domínios
FAS-FASL (domínios de morte). A ativação da caspase 8 inicia-se logo após a interação entre
FAS e FASL, através da formação de complexos sinalizadores ligados a membrana. Tais
complexos recrutam, através de proteínas adaptadoras, várias moléculas de procaspase 8,
resultando numa alta concentração do zimogênio. O segundo modelo ou modelo da
“proximidade induzida” (Figura 3.1b, p.39) propõe que em condições de elevada
concentração do zimogênio, apesar da baixa atividade proteásica intrínseca da procaspase 8,
ocorra a ativação das pro-enzimas através da clivagem mútua resultante da atividade
proteásica intrínseca das procaspases (SALVESEN; DIXIT, 1999).
O terceiro modelo é o mais complexo descrito até agora na literatura. A ativação
da caspase 9, provinda da “via intrínseca” da apoptose, ocorre após interação com um cofator
chamado de APAF-1 (Figura 3.1c, p.39). Este cofator juntamente com o citocromo c são
requeridos para a ativação da caspase 9. Por muito tempo o APAF-1 foi visto apenas como
um cofator transitório, que servia apenas para a inicialização do processo de ativação.
Atualmente sabe-se que APAF-1/caspase 9 representa a forma ativa da enzima, e que está
envolvido em complexos mecanismos de regulação (CAIN et al., 1999; BEERE et al., 2000).
Em síntese, caspases efetoras são geralmente ativadas proteoliticamente através da
clivagem por uma caspase previamente ativada, enquanto caspases iniciadoras são ativadas
através da participação de mecanismos extremamente regulados (HENGARTNER, 2000).
39
Figura 3.1 − Ilustração dos distintos modelos de ativação das caspases. A clivagem proteolítica por uma caspase
previamente ativada está exemplificada em (a). Tal mecanismo pode também ser utilizado por proteases nãocaspases, como ocorre na ativação da granzima B. No modelo mostrado em (b), a ativação da procaspase 8 se dá
a partir do recrutamento e formação de complexos proteicos idênticos, através da ativação cruzada. Na formação
da holoenzima vista em (c) o citocromo c e a oligomerização ATP-dependente de APAF, permitem o
recrutamento da procaspase 9, formando o apoptosoma. A ativação da procaspase 9 se dá através de alterações
conformacionais não relacionadas à proteólise.
Fonte: Retirada de HENGARTNER, 2000.
Como citado anteriormente, a apoptose pode ser iniciada a partir de duas vias já
bastante estudadas, a via extrínseca e a intrínseca. Trata-se de uma tentativa “didática” de
classificar a apoptose a partir do local (ou compartimento) de onde partiu o sinal para que a
célula inicie seu programa de morte.
Na via extrínseca, um complexo proteico conhecido como receptor da morte é
ativado por estímulos provindos do exterior da célula, principalmente pelo acoplamento de
CD95 a CD95L ou pela ação do TNF sobre seu respectivo receptor. Imediatamente após o
estímulo, ocorre o agrupamento de tais receptores e a formação de um complexo proteico, o
qual sinalizará para o início dos mecanismos que direcionarão a célula à morte. Este
complexo recruta, por via da molécula adaptadora FADD (Fas-associated death domain),
40
múltiplas moléculas de procaspase 8. A ativação da caspase 8 pode ser bloqueada pelo
recrutamento da caspase homóloga degenerada c-FLIP (Figura 3.2) (IRMLER et al., 1997).
Figura 3.2 − Ilustração das vias envolvidas na ativação da apoptose. A apoptose pode ser iniciada a partir de
estímulos provenientes de duas vias diferente. O lado esquerdo da figura demonstra a sinalização pela via
extrínseca. Nota-se que múltiplas moléculas de procaspase 8 são recrutadas pelo FADD e ativadas através do
modelo da proximidade induzida (descrito no texto). A proteína C-FLIP pode impedir a ativação da procaspase
8. No lado direito da ilustração está demonstrada a via intrínseca de ativação, que ocorre, principalmente, após
dano irreversível ao DNA. A combinação entre baixa expressão de genes anti-apoptóticos (BCL-2 e BCL-xL) e
alta expressão de genes pró-apoptóticos (Bax e Bad), induz a liberação do citocromo c, o qual servirá de cofator,
juntamente com Apaf-1 para a ativação da procaspase 9 através da formação da holoenzima chamada de
apoptosoma. Ambas as vias convergem para ativar a procaspase 3. As proteínas IAPs podem impedir a ativação
da procaspase 3, entretanto, estão são impedidas pela ação da proteína Smac/DIABLO.
Fonte: Retirada de HENGARTNER, 2000.
41
A via intrínseca é utilizada quando ocorrem danos internos irreversíveis,
principalmente no que se refere aos que são sofridos pelo DNA. Tais danos são refletidos e
convergidos para a mitocôndria, frequentemente através da ativação de genes pró-apoptóticos
da família BCL-2. A família BCL-2 é subdividida em 3 grupos diferentes, sendo os membros
do grupo 1 (BCL-2 e BCL-xL) anti-apoptóticos. Ao contrário do que ocorre com BCL-2, o
qual passa grande parte de sua vida aderido às membranas intracelulares, os membros dos
outros grupos conseguem transitar facilmente ente o citosol e as organelas. As formas
citosólicas representam “pools” de proteínas inativas, entretanto preparadas para ativação a
qualquer momento. Proteínas pro- e anti-apoptóticas se encontrarão na superfície da
mitocôndria, onde irão competir para a regulação da saída do citocromo c. Caso o sinal
proveniente da mitocôndria seja uma “ordem” pro-apoptótica, algumas moléculas serão
liberadas da mitocôndria, dentre as quais o citocromo c. Logo em seguida, o citocromo c se
associará com Apaf-1 e com procaspase 9 para formar o apoptossoma. Após ativação da
procaspase 9, a via convergirá para o nível de ativação da caspase 3 (Figura 3.2, p. 40)
(ADAMS; CORY, 1998; GROSS et al., 1999; PUTHALAKATH et al., 1999;
ANTONSSON; MARTINOU, 2000).
Considerando que as moléculas ou até mesmo as vias apoptóticas necessárias para
a supressão da tumorigênese sejam devidamente identificadas, a modulação da apoptose pode
emergir como um bom alvo para a terapia do câncer (LIU et al., 2010).
Algumas pesquisas sugerem que os mecanismo apoptótico de células tratadas com
lectinas vegetais ocorra tanto através da via mitocondrial quanto pela via do domínio da morte
(Figura 3.3, p. 42) (HEIKE et al., 1999; MICHAEL, 2000; SUEN et al., 2000; KIM et al.,
2001; LYU et al., 2002; HOSTANSKA et al., 2003; KIMA et al., 2003; POLITO et al., 2009;
LIU et al., 2009a,b,c,d,e).
Levando-se em conta a alta complexidade estrutural, bem como a grande
diversidade de moléculas de carboidratos que compõem a superfície da célula, faz sentido
acreditar que a apoptose ocorra após interação direta e/ou indireta de lectinas com
componentes glicosilados que fazem parte de algum dos níveis de iniciação ou maturação da
apoptose, sejam eles de origem superficial ou intracitoplasmática.
42
Figura 3.3 − Ilustração da base molecular da apoptose induzida por lectinas. A apoptose mediada por lectinas
vegetais é principalmente mediada pelas via mitocondrial e/ou de domínio da morte.
Fonte: retirada de LIU et al., 2010.
3.1.2 Autofagia
Desde muito tempo as lectinas tem sido estudadas com relação ao seu potencial
antineoplásico (MODY et al., 1995; GORELIK et al., 2001; MEJIÁ et al., 2003;
SCHUMACHER et al., 2003; VALENTINER et al., 2003; CHOI et al., 2004; MEJIÁ et al.,
2005). Consequentemente, tais estudos mostram que uma grande diversidade de atividade
biológicas foram atribuídos à presença de lectinas. Dentre tais atividades, certamente ganham
destaque a apoptose (anteriormente citada) e os processos de autofagia.
A autofagia pode ser caracterizada como um processo celular que ocorre em
resposta ao estresse que a célula sofre. Durante muito tempo a autofagia tem sido investigada.
Entretanto, nos últimos anos vem ganhando grande destaque no cenário das pesquisas
envolvendo o efeito biológico de lectinas vegetais. Quando as células passam por um estresse,
seja através de limitações nutricionais, calor, estresse oxidativo ou mesmo por organelas em
excesso, a autofagia é ativada como um mecanismo de degradação. O objetivo da autofagia
está claramente delimitado: a eliminação de componentes potencialmente danosos, que pode
ocorrer em conjunto com a reciclagem de nutrientes (LEVINE; KLIONSKY, 2004). Os
43
processos autofágicos podem ser divididos em três tipos principais: macroautofagia,
microautofagia e autofagia mediada por chaperonas (TSUCHIHARA et al., 2009). Além de
ter um papel importante na taxa de crescimento dos componentes celulares, bem como na
reposta à privação nutricional, a autofagia é igualmente importante no suicídio de células
tumorais (RUBINSZTEIN et al., 2007). Além disso, recentes estudos tem demonstrado que é
possível que haja uma espécie de co-regulação entre autofagia e apoptose, e que a autofagia
possa participar da morte celular que ocorre nos mamíferos (LEVINE, 2007; KESSEL;
REINERS et al., 2007). Alguns pesquisadores acreditam, inclusive, que os mecanismos
apoptóticos e autofágicos estejam interconectados e regulados simultaneamente pelo mesmo
mecanismo regulador (HANNIGAN; GORSKI, 2009). Na pesquisa dos efeitos biológicos de
lectinas, a autofagia vem ganhando espaço, pois tem sido evidenciado que a morte celular
induzida por lectinas possa ser realizada também a partir da execução de mecanismos
autofágicos (LEI; CHANG, 2009; LIU et al., 2009b). Tal processo está esquematicamente
ilustrado na figura 3.4.
Figura 3.4 − Ilustração dos mecanismos moleculares envolvidos na autofagia induzida por lectinas vegetais. Nas
células tumorais (hepatócitos) a autofagia induzida por lectina ocorre pelas via mitocondrial mediada por BNIP3
e/ou por ROS−p38−p53. ROS = espécies reativas de oxigênio.
Fonte: Retirada de LIU et al., 2010.
44
3.2 Objetivos
3.2.1 Geral
Avaliar o potencial de lectinas vegetais estruturalmente relacionadas, isoladas de
sementes de leguminosas, sobre a apoptose de células da linhagem A549 (carcinoma de
pulmão humano).
3.2.2 Específicos
• Verificar a interação das lectinas ConA, ConBr, ConBol, Cgran e CGL,
conjugadas ao isotiocianato de fluoresceína, com as células A549;
• Avaliar se tais lectinas são internalizadas ou se exercem seu potencial a partir
da interação direta com a membrana plasmática;
• Determinar o potencial pro ou antiapoptótico das lectinas ConA, ConBr,
ConBol, Cgran e CGL sobre as células neoplásicas A549;
• Analisar a expressão gênica de proteínas intimamente relacionadas com o
processo apoptótico em células A549;
• Contribuir para o entendimento da via envolvida na apoptose de células A549
desencadeada pelas lectinas outrora descritas.
45
3.3 Materiais e métodos
3.3.1 Lectinas
As lectinas utilizadas neste estudo foram gentilmente cedidas pelo Prof. Dr.
Benildo Sousa Cavada, coordenador do Laboratório de Moléculas Biologicamente Ativas
(Biomol-lab) do Departamento de Bioquímica e Biologia Molecular da Universidade Federal
do Ceará. Tratam-se de lectinas isoladas a partir de sementes de leguminosas. A tabela 2.1
apresenta os nomes das espécies das quais as proteínas foram isoladas, seus respectivos
acrônimos, além da referências bibliográficas que contém a metodologia utilizada nas etapas
de purificação.
Tabela 3.1 − Lista de espécies, acrônimos, especificidade por carboidratos e referências de purificação
das lectinas utilizadas no presente estudo
Lectina de
Sigla
Especificidade
Referências
Canavalia ensiformis
ConA
Glicose/Manose
SUMMER; HOWELL, 1936
Canavalia brasiliensis
ConBr
Glicose/Manose
MOREIRA; CAVADA, 1984
Canavalia boliviana
CBol
Glicose/Manose
MOURA et al., 2009
Canavalia gladiata
CGL
Glicose/Manose
KOJIMA et al., 1991
Canavalia grandiflora
Cgran
Glicose/Manose
CECCATTO et al., 2002
Fonte: Ver campo “Referências”.
3.3.2 Células
A linhagem celular utilizada no presente trabalho foi a A549 (carcinoma de
células epiteliais de pulmão humano). Tal linhagem foi gentilmente cedida pelo Prof. Dr.
Tiago Collares do Centro de Biotecnologia da Universidade Federal de Pelotas. A linhagem
A549 foi adquirida junto ao Banco de Células do Rio de Janeiro (Universidade Federal do Rio
de Janeiro).
3.3.3 Conjugação das lectinas ao FITC (isotiocianato de fluoresceína)
Para a conjugação das lectinas ao FITC três diferentes tampões foram preparados
(metodologia adaptada do kit de marcação de proteínas FluoroTag FITC Conjugation Kit,
Sigma Aldrich). O primeiro, conhecido como tampão de inibição (D-manose 0,1 M em
tampão carbonato-bicarbonato de sódio 0,1 M; pH 9,0); o segundo, conhecido como tampão
de conjugação (carbonato/bicarbonato de sódio, 0,1 M; pH 9,0) e o terceiro deles, o tampão
46
de lavagem (salina tamponada com fosfato (PBS): tampão fosfato de sódio 0,01 M; KCl
0,027 M; NaCl 0,15 M; pH 7,4). Inicialmente, as lectinas foram dissolvidas no tampão de
inibição e incubadas a 37 ºC durante 1 hora. Então, 250 µL de isotiocianato de fluoresceína
(FITC) (500 µg/mL, dissolvido em tampão de conjugação) foram adicionados aos poucos à
solução contendo as lectinas. Esta solução foi, então, incubada por 2 h em temperatura
ambiente, sob gentil agitação e ao abrigo da luz. Em seguida, o FITC não conjugado foi
separado das lectinas conjugadas através de cromatografia de gel-filtração realizada em
coluna Sephadex G-25, previamente equilibrada e posteriormente eluída com tampão de
lavagem. Todas as frações provindas do processo cromatográfico foram acompanhadas por
leitura da densidade óptica a 280 e 495 nm. As lectinas conjugadas foram dializadas contra
ácido acético 1 M durante 1 hora para remoção do carboidrato utilizado para proteger seus
CRDs, sendo então dializadas exaustivamente em água destilada e posteriormente liofilizadas
e pesadas.
3.3.4 Cultivo das células
As células utilizadas nos ensaios foram cultivadas em meio DMEM (Dulbecco´s
Modified Eagle´s Media – Vitrocell Embriolife), suplementado com 10% de soro fetal bovino
(Gibco). Tais céulas foram crescidas a 37 ºC numa atmosfera de 95% de humidade e 5% de
CO2. Todos os experimentos foram realizados com as células estando na fase logarítmica de
crescimento.
3.3.5 Avaliação da interação entre lectinas vegetais e células neoplásicas
Células da linhagem A549 foram semeadas em placas de 96 poços com fundo
chato, tendo sua densidade ajustada para 5 x 102 células/mL. Em seguida, foram colocadas
para crescer em meio DMEM suplementado, durante 24 horas a 37 ºC e com atmosfera de 5%
CO2. Para verificar se as lectinas seriam capazes de interagir com tais células, o meio de
cultivo foi aspirado e em seguida as células aderidas foram lavadas com PBS. Adicionou-se
200 µL de lectina-FITC (500 µg/mL), previamente filtradas em membrana de 0,22 µm para os
poços contendo as células. A placa foi então mantida sob gentil agitação durante 1 hora. Logo
em seguida, o sobrenadante foi aspirado e as células lavadas novamente com PBS e
submetidas a visualização em microscópio invertido de fluorescência (Olympus IX71)
acoplado com sistema de aquisição de imagens de alta resolução (Olympus). Para os testes
47
envolvendo PCR em tempo real, as células foram semeadas em placas de 6 poços com fundo
chato com densidade ajustada para 3 x 105 células/mL. As células foram tratadas com 1 mL
de cada lectina (ConA, ConBol e ConBr) nas concentrações de 16 e 32 µg/mL as amostras de
RNAal de Pelotas ConBol e ConBr) nas concentraçensidade ajustada para 3 x 10mpo, as
amostras de RNAal de Pelotas, durante 1, 6 e 12 horas. Após este período, foram lavadas com
PBS estéril e submetidas à extração de RNA.
3.3.6 Avaliação qualitativa da apoptose através do método do iodeto de propídio
Para verificar se as células que interagiram com as lectinas foram direcionadas ao
processo apoptótico, realizou-se coloração destas através do método do iodeto de propídio
(BD Pharmingen) seguindo o protocolo fornecido pelo fabricante. As imagens das células
foram então adquiridas como descrito no item 3.3.5.
3.3.7 Marcação dos núcleos celulares através da coloração por Hoechst
Na tentativa de lançar luz sobre a localização subcelular das lectinas nas células
neoplásicas, a coloração por Hoechst (BD Pharmingen) foi realizada seguindo as instruções
contidas no protocolo do fabricante. Assim, as imagens das células foram capturadas de
acordo com o item 3.3.5.
3.3.8 Extração do RNA e síntese do cDNA
A extração do RNA total e a síntese do cDNA foi realizada de acordo como
previamente descrito (Campos et al., 2010). Segundo o qual, as amostras de RNA foram
isoladas utilizando-se o TRIzol® Reagent (Invitrogen) e tratadas com DNase através do kit
DNA-free® (Ambion) de acordo com o protocolo sugerido pelo fabricante. A síntese do
primeiro cDNA foi realizada com 2 µg de RNA através do kit High Capacity cDNA Reverse
Transcription kit (Applied Biosystems) de acordo com as instruções do fabricante.
3.3.9 PCR em tempo real
A corrida foi realizada em equipamento Mx3005P (Stratagene) utilizando o
SYBR® Green PCR Master Mix (Applied Biosystems). Os iniciadores estão descritos na
48
tabela 3.2. Foram realizados experimentos iniciais de validação para certificar que todos os
pares de iniciadores possuíam eficiências equivalentes. A amplificação foi realizada com os
ciclos nas seguintes condições: 95 ºC por 2 minutos, seguido por 40 ciclos de 95 ºC por 15
segundos, 60 ºC por 60 segundos seguidos por condições para cálculo da melting curve.
Todas as corridas foram realizadas em triplicata. Os dados da PCR foram analisados
utilizando o método do 2-ΔΔCt (LIVAK; SCHMITTGEN, 2001).
Tabela 3.2 – Iniciadores utilizados nas reações de PCR em tempo real. Os
iniciadores estão descritos quanto ao alvo, sequência e referência.
Primers
Sequência 5’→ 3’
Referência
p53 For
AGCGAGCACTGCCCAACA
p53 Rev
CACGCCCACGGATCTGAA
Bcl-2 For
GTGTGGAGAGCGTCAACC
Bcl-2 Rev
CTTCAGAGACAGCCAGGAG
Bax For
ATGCGTCCACCAAGAAGC
Bax Rev
ACGGCGGCAATCATCCTC
Casp9 For
CCAGAGATTCGCAAACCAGAGG
Casp9 Rev
GAGCACCGACATCACCAAATCC
p21 For
CCTAATCCGCCCACAGGAA
p21 Rev
ACCTCCGGGAGAGAGGAAAA
GAPDH For
GGATTTGGTCGTATTGGG
GAPDH Rev
TCGCTCCTGGAAGATGG
Gochhait et al., 2009
Chen et al., 2010
Chen et al., 2010
Huang et al., 2007
Wang et al., 2008
Hu et al., 2010
Fonte: Ver campo “Referência”.
3.3.10 Análise dos dados
Os dados provindos da PCR em tempo real foram analisados utilizando-se
ANOVA fatorial seguida pelo post-hoc de Tukey para as múltiplas comparações. Três fatores
foram considerados: lectina utilizada (3 níveis), concentração da lectina (dois níveis) e tempo
de contato entre lectinas e células (3 níveis). Testes de aderência foram realizados para
verificar se os dados seguiam uma distribuição normal. Os dados foram considerados
significantes quando P<0,05. Todos os dados foram expressos como a Média ± SEM.
49
3.4 Resultados
As células da linhagem A549 são mostradas imediatamente antes de entrarem em
contato com as lectinas (Figura 3.5a e b).
Figura 3.5 – (a) Células A549 observadas através de microscopia óptica em campo claro e com objetiva de
contraste de fases. Notar a morfologia caraterística de células epiteliais. Observa-se inclusive formação de
conexões intracelulares em algumas regiões do poço. Em (b) são mostradas tanto em alta quanto em baixa
densidade.
(a)
(b)
Fonte: Adaptada de http://www.atcc.org/Attachments/1753.jpg Acesso: 14 de novembro de 2011
50
Todas as lectinas testadas conseguiram interagir com as células A549 (Figuras
3.6, 3.7, 3.8, 3.9 e 3.10). A figura 3.6 mostra claramente a interação das células com ConAFITC. Observou-se que após 1 hora de contato prévio, a lectina demarcava os contornos
celulares, permitindo acreditar que estivesse ancorada na membrana das células.
Figura 3.6 – Interação de ConA-FITC com células A549 detectada através de microscopia de fluorescência.
Observa-se que a lectina consegue interagir com os contornos celulares, porém com pouca ou nenhuma
internalização.
Já ConBr-FITC além de interagir com a periferia da célula, como evidenciado por
sua presença nos contornos celulares, após 1 hora de contato prévio, foi internalizada (Figura
3.7, p.51), exibindo perfil diferente de interação daquele de ConA. Observa-se que boa parte
da lectina, após internalização, está disposta no interior do citoplasma.
ConBol-FITC apresentou perfil semelhante ao de ConBr, sendo também
internalizada pelas células. Os pontos mais brilhantes no interior do citoplasma denotam alta
concentração da lectina (Figura 3.8, p.51). O local de acúmulo não pôde ser determinado
através da microscopia óptica.
51
Figura 3.7 – Interação de ConBr-FITC com células A549 detectada através de microscopia de fluorescência.
Observa-se que a lectina consegue interagir com os contornos celulares, sendo inclusive internalizada e
permanecendo disposta no citoplasma da célula.
Fonte: Dados da pesquisa
Figura 3.8 – Interação de ConBol-FITC com células A549 detectada através de microscopia de fluorescência.
Nota-se que a lectina interage com a membrana celular e é internalizada.
52
As figuras 3.9 e 3.10 mostram, respectivamente, os resultados da interação de
Cgran-FITC e CGL-FITC.
Figura 3.9 – Interação de Cgran-FITC com células A549 detectada através de microscopia de fluorescência. A
presença da lectina é caracterizada pela fluorescência ao redor das células.
Figura 3.10 – Interação de CGL-FITC com células A549 detectada através de microscopia de fluorescência. A
intensidade da fluorescência é menor quando visualmente comparada a de ConBr-FITC ou ConBol-FITC.
53
Quando as células foram tratadas com Cgran-FITC, o resultado foi uma fraca
marcação fluorescente (Figura 3.9, p. 52). Tal marcação não evidenciou tão fortemente os
contornos celulares em comparação com as outras lectinas.
Já CGL-FITC, apesar de emitir visualmente um baixo nível de fluorescência,
demonstrou ter interagido com as células, pois mesmo fracamente, permite a visualização dos
contornos celulares. Assim como ConBr e ConBol, houve acúmulo intracitoplasmático de
CGL-FITC (Figura 3.10, p. 52).
Para verificar se a interação ocorrida entre lectinas-FITC e células A549 era
estabelecida via sítio lectínico, os mesmos experimentos foram realizados com os sítios
lectínicos bloqueados pelo seu açúcar específico.
Após aquisição das imagens das lectinas bloqueadas, notou-se que nenhuma delas
apresentou qualquer fluorescência (dados não mostrados). Igualmente, nenhuma fluorescência
intrínseca foi vista.
Apesar dos resultados apontarem para a internalização de algumas lectinas pelas
células A549 e sua disposição na região central do citoplasma ser evidente, algumas dúvidas
foram suscitadas com relação à possibilidade da internalização para o núcleo das células. No
sentido de verificar se as lectinas eram transportadas para o núcleo, uma etapa experimental
foi adicionada, utilizando-se apenas uma das lectinas que foram sabidamente internalizadas.
A proteína escolhida foi a ConBol-FITC.
O ensaio foi realizado através da utilização de um marcador especifico para o
núcleo celular (Figura 3.11, p.54). Logo em seguida, a imagem da lectina marcada com FITC
(Figura 3.12, p.54) foi sobreposta à imagem fluorescente dos núcleos corados com o marcador
seletivo (Figura 3.13, p.55).
Após análise das imagens em sobreposição foi possível concluir que a ConBolFITC, uma das lectinas que de fato estava sendo internalizada, não adentrou o núcleo, ficando
disposta numa região central da célula. Através da coloração do núcleo, constatou-se também
que estes encontravam-se deslocados para a periferia das células. Não obstante, as células
tratadas com as lectinas perderam algumas de suas características morfológicas, dentre as
quais podemos citar a ausência de conexões intracelulares evidentes, fazendo com que
ficassem mais esféricas em comparação com a morfologia mais esparsa adotada pelas células
epiteliais.
54
Figura 3.11 – Fotomicrografia de fluorescência demonstrando o núcleo das células A549. Os núcleos estão
corados de azul pelo método do Hoechst.
Figura 3.12 – Fotomicrografia de fluorescência demonstrando o acúmulo intracitoplasmático de ConBol-FITC.
As regiões em verde brilhante apresentam alta concentração da lectina.
55
Figura 3.13 – Sobreposição das imagens 2.11 e 2.12. Nota-se que a célula apresenta acúmulo da proteína
marcada em região diferente da nuclear. O acúmulo se dá na região central da célula, enquanto o núcleo
encontra-se voltado para um dos polos da mesma.
Considerando que a lectina ConBol, assim como ConBr e CGL, interagiu com as
células e foi consequentemente internalizada, seu papel na indução da apoptose foi analisado.
Figura 3.14 – Efeito de ConBol sobre a apoptose das células A549. As células com os núcleos corados em
vermelho foram incapazes de excluir o iodeto de propídio (PI), caracterizando o evento apoptótico.
56
Os resultados sugerem que as células tratadas com ConBol (Figura 3.14, p.55),
quando comparadas ao controle negativo (Figura 3.15), apresentaram alto índice de apoptose.
Figura 3.15 – Efeito do controle negativo do experimento envolvendo ConBol e células A549. As células com os
núcleos corados em vermelho foram incapazes de excluir o iodeto de propídio (PI), caracterizando o evento
apoptótico.
Na tentativa de caracterizar de maneira mais afinca o efeito das lectinas da
Subtribo Diocleinae sobre as células A549, ensaios de expressão relativa de genes envolvidos
no processo apoptótico foram realizados. Os genes avaliados estão listados na tabela 3.2
(p.48).
Os resultados mostraram que a expressão de alguns genes diretamente
relacionados com o processo apoptótico não foi alterada, como visto para a expressão do gene
supressor de tumores p53 (Figura 3.16, p. 57). Um leve aumento ocorreu na expressão do
referido gene nas células tratadas com ConBr 32 µg/mL (após 1 hora de tratamento). Porém,
tal aumento não foi estatisticamente significante quando comparado ao controle.
57
Figura 3.16 – Expressão relativa do gene p53 nas células A549 tratadas com as lectinas ConBr, ConBol e ConA.
A verificação da expressão foi realizada após 1, 6 e 12 horas de contato prévio entre lectinas e células. Os
ensaios foram feitos em duas concentrações proteicas: 32 e 16 µg/mL. Observa-se leve aumento no grupo ConBr
de 1 h, porém sem significância estatística.
A expressão relativa do gene pro-apoptótico Bax, assim como p53, permaneceu
inalterada quando comparada a do controle negativo (Figura 3.17). Um leve aumento ocorreu
quando a célula foi tratada com ConBr 32 µg/mL. Porém, sem qualquer significância
estatística.
Figura 3.17 – Expressão relativa do gene Bax nas células A549 tratadas com as lectinas ConBr, ConBol e ConA.
A verificação da expressão foi realizada após 1, 6 e 12 horas de contato prévio entre lectinas e células. Os
ensaios foram feitos em duas concentrações proteicas: 32 e 16 µg/mL. Observa-se leve aumento no grupo ConBr
de 1 h, porém sem significância estatística.
Além de Bax, a expressão relativa do gene anti-apoptótico BCL-2 foi igualmente
avaliada (Figura 3.18, p. 58).
58
Figura 3.18 – Expressão relativa do gene BCL-2 nas células A549 tratadas com as lectinas ConBr, ConBol e
ConA. A verificação da expressão foi realizada após 1, 6 e 12 horas de contato prévio entre lectinas e células. Os
ensaios foram feitos em duas concentrações proteicas: 32 e 16 µg/mL. Os níveis de expressão foram diminuídos
após 6 horas de tratamento para todos os testes.
Os dados mostraram que os níveis de expressão foram diminuídos após o
tratamento com as lectinas em ambas as concentrações testadas, sendo significativamente
estatísticos após 6 e 12 horas de tratamento (Figura 3.18).
Para tentar caracterizar melhor o papel de Bax e BCL-2 na apoptose das células
A549, construiu-se um gráfico que relacionasse o nível de expressão dos dois genes (Figuras
3.19a, b e c).
Figura 3.19 (a) – Razão da expressão relativa de Bax e BCL-2 nas células A549 tratadas com as lectinas ConBr,
ConBol e ConA. A verificação foi realizada após 1horas de contato prévio entre lectinas e células. Observa-se
que a maior razão é verificada no grupo ConBr (32 µg/mL) Fonte: Dados da pesquisa
59
(b) Razão da expressão relativa de Bax e BCL-2 nas células A549 tratadas com as lectinas ConBr, ConBol e
ConA. A verificação foi realizada após 6 horas de contato prévio entre lectinas e células. Observa-se que a maior
razão é verificada no grupo tratado por ConBol.
(c) Razão da expressão relativa de Bax e BCL-2 nas células A549 tratadas com as lectinas ConBr, ConBol e
ConA. A verificação foi realizada após 12 horas de contato prévio entre lectinas e células. Observa-se que a
maior razão é verificada no grupo tratado por ConA.
A figura 3.19a (p.58) mostra que a razão da expressão entre Bax e BCL-2 foi
maior quando as células foram tratadas com ConBr (32 µg/mL). O inverso ocorreu na maior
dose de ConA, onde o gene anti-apoptótico foi mais expresso do que o pró-apoptótico.
Após 6 horas de contato prévio, a expressão de Bax nos grupos tratados pelas
lectinas foi sempre maior do que a de BCL-2. ConBol foi a que apresentou maior razão entre
60
Bax e BCL-2 (2,5 vezes). Os controles negativos permaneceram com a expressão de BCL-2
sendo mais proeminente.
Efeito semelhante foi visto após 12 horas de contato prévio. Porém o grupo que
apresentou maior razão entre Bax e BCL-2 foi o tratado por ConA (3 vezes). Assim como
descrito na página anterior, a expressão de BCL-2 foi mais proeminente no controle negativo.
Por fim, estudou-se também a expressão do gene da caspase 9. A parir da análise
dos resultados foi possível observar que a expressão foi aumentada em todos os grupos
tratados com lectinas, principalmente após 12 horas de contato (Figura 3.20), como
evidenciado pelo grupo tratado por ConA (32 µg/mL), visto que a expressão quase triplicou.
Figura 3.20 – Expressão relativa da Caspase 9 nas células A549 tratadas com as lectinas ConBr, ConBol e
ConA. A verificação da expressão foi realizada após 1, 6 e 12 horas de contato prévio entre lectinas e células. Os
ensaios foram feitos em duas concentrações proteicas: 32 e 16 µg/mL. Os níveis de expressão foram aumentados
principalmente após 12 horas de tratamento para todos os testes.
61
3.5 Discussão
De alguns anos para cá tem sido observado que os maiores avanços na pesquisa
com lectinas vegetais estão relacionados com as atividades antineoplásicas exibidas por
lectinas de leguminosas (ORNTOFT; VESTERGAARD, 1999). No presente trabalho
demonstrou-se que lectinas da subtribo Diocleinae podem atuar como agentes indutores da
apoptose em células neoplásicas da linhagem A549.
Como visto anteriormente na seção de resultados, uma hora de contato prévio
entre as células e as lectinas fluoresceinadas foi suficiente para que estas interagissem com a
superfície das células e, em alguns casos, fossem até mesmo internalizadas. Muitos trabalhos
mostram o efeito de lectinas vegetais sobre a apoptose de células neoplásicas, e alguns destes
preocupam-se em determinar com exatidão, a localização destas no interior das células. Em
1980, Virtanen e colaboradores demonstraram que a lectina ConA interagiu com
glicoproteínas da membrana de fibroblastos e foi internalizada para o citoplasma. Uma vez no
interior da célula, a lectina se ligou, muito provavelmente, ao retículo endoplasmático. ConA
conjugada a FITC ou rodamina tem sido utilizada comercialmente como ferramenta para
localização do retículo endoplasmático em trabalhos que desejam apontar a localização
subcelular correta de seus compostos testados (GREWAL et al., 2003).
Os dados do presente trabalho mostraram que as lectinas da Subtribo Diocleinae
após interagirem com alguma glicoproteína ou glicolipídeo presente na superfície das células,
foram internalizadas e concentraram-se em região próxima ao núcleo, muito provavelmente a
do retículo endoplasmático. Essa observação foi confirmada quando utilizou-se marcador
seletivo para o núcleo das células, e a parir da análise das imagens, determinou-se que as
lectinas permanecem no citoplasma, não adentrando o núcleo. Boa parte da fluorescência foi
vista também de maneira difusa no interior das células, sugerindo que outras estruturas
subcelulares possam igualmente interagir com as lectinas. Chang e colaboradores em 2007
mostraram que ConA provavelmente acumula-se também nas mitocôndrias, visto que a
membrana mitocondrial de células hepáticas tratadas com a lectina, tiveram sua
permeabilidade alterada.
O fato das lectinas estudadas aqui terem interagido, atravessado a membrana e se
acumulando no citoplasma das células neoplásicas pode relacioná-las com o possível processo
de apoptose e/ou autofagia. Relatos na literatura mostraram que ConA, a primeira lectina de
leguminosas a ser relatada, apresentou citotoxidade sobre células hepáticas mediada por
mecanismos autofágicos, com comprometimento direto da via mitocondrial (CHANG et al.,
62
2007). Já se sabe que a autofagia pode ser caracterizada como um processo celular que ocorre
em resposta ao estresse, e outras lectinas além da ConA tem sido relacionadas com o
desenvolvimento dos mecanismos característicos da autofagia em células não-hepáticas (LIU
et al., 2009d).
Recentemente foi demonstrado que a lectina de Polygonatum cyrtonema (PCL)
induziu a autofagia e apoptose de células A375 através de uma via mitocondrial mediada por
ROS–p38–p53 (Liu et al., 2009c). Os dados mostraram que nenhuma alteração da expressão
gênica relativa de p53 de células A549 tratadas com as lectinas da subtribo Diocleinae foi
encontrada. A proteína p53 é sem dúvida o supressor tumoral mais estudado e está envolvida
na resposta das células a diversos tipos de estresses (LAPTENKO; PRIVES, 2006;
CHUMAKOV, 2007).
Uma das formas de deflagrar a apoptose se dá a partir da perda da funcionalidade
da membrana mitocondrial, com consequente liberação do citocromo c e formação da
holoenzima juntamente com a procaspase 9 conhecida como apoptosoma (ADRAIN;
MARTIN, 2009; CAIN, 2003; CZERSKI; NUÑEZ; 2004). No presente trabalho analisamos a
expressão gênica de Bax, envolvido na apoptose da via mitocondrial, o qual codifica para uma
proteína pro-apoptótica. Nenhum efeito importante foi visto nas células tratadas com lectinas,
apesar da expressão aparecer um pouco elevada nas células tratadas com ConBr.
Outro gene analisado foi o que codifica para a BCL-2, proteína designadamente
anti-apoptótica. Tanto Bax quanto Bad (outro produto pró-apoptótico) podem transitar entre
as mitocôndrias e o citoplasma. A regulação de tal trânsito é feita, principalmente, por BCL-2,
a qual passa a maior parte de seu tempo integrada à membrana mitocondrial. A literatura
mostra que a lectina de Viscum album, a qual possui especificidade para Nacetilgalactosamina, induz a diminuição na expressão de BCL-2 (BUSSING et al., 1998).
Aqui foi reportado que a expressão do gene BCL-2 encontra-se diminuída quando as células
foram tratadas com as lectinas, principalmente após 6 horas de contato prévio. Apesar de Bax
não ter sofrido alteração em sua expressão gênica, a condição de diminuição da expressão de
BCL-2 é indicativa de sinalização para o desenvolvimento da apoptose pela via mitocondrial,
visto que o que realmente é necessário para desencadear tal evento, é a relação entre a razão
da expressão Bax e BCL-2.
De fato, isto foi observado quando a razão entre tais expressões gênicas foi
calculada. Após 6 horas de contato prévio, as células tratadas com ConBr apresentaram razão
Bax:BCL-2 de 2,5 vezes. Apesar de ConA não ter sido relacionada com a apoptose de
hepatócitos no trabalho de Chang e colaboradores em 2007, aqui ela conseguiu induzir o
63
aumento na razão Bax:BCL-2 de até 3x nas células A549, aparecendo como um possível
agente deflagrador da apoptose pela via mitocondrial. Apesar de ConA ter sido inicialmente
relacionada com a autofagia, tal observação não contraria o que tem sido mostrado em
experimentos mais recentes. Tem sido notado que a mesma lectina pode atuar tanto através da
deflagração dos mecanismos de autofagia quanto pela apoptose (LIU et al., 2009b). De fato,
acredita-se que os mecanismos que regulam a apoptose estejam intimamente relacionados
com os que participam da regulação da autofagia, pois ambas as vias são reguladas pelos
mesmos fatores; compartilham os mesmos componentes; os processos podem sobrepor-se; e
não obstante, uma via pode regular e modificar a atividade da outra (LEVINE, 2007).
Em adição, os resultados da expressão gênica relativa da caspase 9 mostraram que
as lectinas avaliadas conseguem induzir o aumento da expressão de tal proteína. A caspase 9
está diretamente envolvida com o mecanismo apoptótico deflagrado nas mitocôndrias, uma
vez que trata-se do principal componente do apoptosoma, que juntamente com APAF-1 e o
citocromo c, formam a caspase ativadora da procaspase 3, uma das caspases encarregadas de
executar um aparato de eventos que culminam com a morte da célula.
Com relação à aplicabilidade das lectinas no tratamento de neoplasias, tem sido
sugerido que o caráter de malignidade de uma célula está associado a alterações complexas no
padrão de glicosilação (ARENAS et al., 1999; GORELIK et al., 2001). Assim sendo, este
perfil de transformação da célula poderá servir, num futuro próximo, como alvo para terapias
mais seletivas (MODY et al., 1995; WANG et al., 2000). A lectina ConA, por ser uma das
mais estudadas, tem sido apontada como possível recurso no tratamento específico de alguns
tumores invasivos. Porém, já foi relatada presença de anticorpos anti-ConA no soro de
animais que receberam injeções repetidas de tal lectina (LOUIS et al., 2000). Uma estratégia
para ultrapassar tal problema é efetuar a administração de lectinas relacionadas, as quais
possuam efeitos similares (CHANG et al., 2007). Neste cenário, as lectinas da Subtribo
Diocleinae aqui demonstradas poderão servir como potenciais ferramentas para o diagnóstico
e/ou tratamento de neoplasias.
Em tempo, o presente trabalho objetivou a avaliação do potencial exercido pelas
lectinas da subtribo Diocleinae na indução da apoptose. Fortes evidências apontam para o
envolvimento da via mitocondrial.
64
REFERÊNCIAS
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281, n. 5381, p.1322-6, ago. 1998.
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71
4 EFEITO DA LECTINA ISOLADA DE Bryothamnion seafortii SOBRE O PROCESSO
CICATRICIAL
4.1 Cicatrização e lectinas
Os danos que incidem sobre um determinado tecido, iniciam uma cascata de
eventos que podem incluir inflamação e a formação de um novo tecido, o chamado tecido de
granulação. Sua remodelação culmina com a reconstrução parcial da área danificada
(CLARK, 1996; MARTIN, 1997). Considerando que a ferida constitua-se como estratégia de
continuidade anátomo-fisiológica da área lesada, a cicatriz corresponde à tentativa biológica
do organismo de restaurar sua integridade (COHEN et al., 1992). Trata-se de um fenômeno
universalmente conhecido dos organismos vivos (BALBINO et al., 2005). Dessa forma, a
cicatrização de uma determinada lesão, deve ser entendida como resultante de um processo
extremamente complexo e bem regulado, que possui a finalidade de restaurar a integridade
tecidual após o trauma sofrido (SCHREML et al., 2010).
O processo cicatrizante é iniciado imediatamente após a ocorrência da injúria, e
está subdividido nas seguintes etapas: hemostasia e inflamação, proliferação, remodelação da
MEC (matriz extracelular) e formação de cicatriz (maturação) (WILGUS, 2008; KONDO;
ISHIDA, 2010). A figura 4.1 (p.72) ilustra tal processo.
É importante salientar que os eventos do processo cicatricial ocorrem de forma
sequencial e, consequentemente, sobrepostos. Trata-se de um fenômeno harmônico, único e
contínuo (TOGNINI et al., 1998), que envolve a migração de células inflamatórias, a síntese
do tecido de granulação, a deposição e remodelação de colágeno e proteoglicanos (BIONDOSIMÕES, 2000).
72
Figura 4.1 – Representação das fases do processo cicatricial. Após a etapa de inflamação, sendo que esta é
associada à presença de neutrófilos e plaquetas, inicia-se o processo de proliferação, no qual ocorrerá a
angiogênese (formação do tecido de granulação), a partir dos vasos pré-existentes no sítio da área lesionada,
proliferação de fibroblastos (produção de colágeno) e migração de queratinócitos. A fase final é caracterizada
pela maturação da ferida, culminando com a reconstrução do novo epitélio e remodelação das novas fibras
colágenas.
Fonte: adaptada de KONDO; ISHIDA, 2010.
Com relação à cinética inicial do processo cicatricial, nota-se que imediatamente
após a injúria, plaquetas penetram na área da lesão para iniciarem a hemostasia e a inflamação
(FURIE; FURIE, 2008). Uma vez no local, elas se agregam e liberam vários mediadores que
conduzem para o início dos eventos sequencias da coagulação, assim como para a produção
de fatores de crescimento e quimiocinas, que recrutam células inflamatórias (MARTIN, 1997;
SINGER; CLARK, 1999). A perda de integridade estrutural dos vasos lesados inicia o
processo hemostático, responsável pela liberação de colágenos dos tipos V e VII, os quais
servirão como sinalizadores para degranulação de plaquetas e consequente liberação de
citocinas (PDGF-AB, EGF, IGF-1 e TGF-β), PAF (Fator de Ativação Plaquetário),
fibronectina, além da liberação de aminas vasoativas, possibilitando a vasoconstrição, e
posteriormente vasodilatação (ENOCH; LEAPER, 2007).
73
O somatório de tais eventos, principalmente no tocante à agregação plaquetária,
possibilitará à formação de coagulo via tampão plaquetário (este servirá como uma matriz
provisória, compreendida por uma rede cruzada de fibrina; fibronectina; vitronectina;
trombospondina e fator de Von Willebrand) para a migração de células inflamatórias e
imunes (CLARK, 1993, 1996; MARTIN, 1997).
O processo inflamatório acontece logo depois da obtenção da homeostasia
(WERNER; GROSE, 2003). A inflamação envolve vários mecanismos, sendo todos
responsivos à presença de agentes nocivos como microrganismos e células danificadas. Por se
tratar de uma reação que envolve grande diversidade de células e moléculas, sua identidade é
revelada através de sinais flogísticos como eritema, rubor, edema e dor (CONTRAN et al.,
2000). Dependendo da velocidade de instalação, a inflamação está classificada de duas
formas: aguda e crônica. Tal classificação não faz alusão à gravidade do processo.
O sítio inflamatório é marcadamente caracterizado pelo acúmulo de neutrófilos
(FALANGA, 2004). A presença de TNF-α estimula o recrutamento de neutrófilos para o local
da injúria, aproximadamente de 24 a 48 horas após o dano tissular (EFRON et al., 2005;
FURIE; FURIE, 2008; SCHMAIER, 2008).
A chegada dos macrófagos no sítio da lesão ocorre, aproximadamente, de 48 a 96
h após a injúria, os quais participam das últimas etapas da inflamação e do processo de
debridamento (TELLER; WHITE, 2009). Com o auxílio das enzimas colagenase e elastase,
os macrófagos são responsáveis pela continuação da remoção de debris no local da lesão e
degradação dos elementos da MEC. Em adição, fagocitam neutrófilos inertes (MORI et al.,
2006).
Os próximos eventos que ocorrem na progressão do processo cicatricial são
acompanhados pela diminuição gradual e contínua das células inflamatórias. Os eventos
inflamatórios levam ao debridamento da ferida. Uma vez concluído, o processo cicatricial
entra em uma fase construtiva de reparo para a formação tecidual (TELLER; WHITE, 2009).
A fase que constitui a formação tecidual é denominada fibroplásica ou
proliferativa (WILD et al., 2010). É caracterizada pela migração de fibroblastos, deposição de
MEC e formação de tecido de granulação (neoangiogenese). Costuma iniciar-se 3 ou 4 dias
após a injúria tecidual. Durante a progressão da fase proliferativa a matriz provisória de
fibrina é substituída por tecido de granulação neoformado. A epitelização representa o estágio
final dessa fase.
A próxima etapa é a angiogênese, que se caracteriza pela formação de novos
vasos sanguíneos, devido a ruptura dos vasos no local do trauma, e pode se tornar
74
visivelmente evidente aproximadamente 4 dias após a injúria. A neovascularização ocorre
através de vasos pré-existentes no local da injúria (KUMAR et al., 2005).
Um evento de grande importância que ocorre paralelamente a formação do tecido
de granulação é o início da migração de fibroblastos (LI; WANG, 2009). As citocinas
liberadas por plaquetas durante o processo hemostático (PDGF, IGF-1 e TGF-β) são os
primeiros sinais para a ativação de fibroblastos (WERNER; GROSE, 2003; MURPHY et al.,
2011).
Ao chegarem no interior da ferida, fibroblastos se proliferam e são ativados
passando a produzir proteínas da MEC, como fibronectina, colágeno e glicosaminoglicanos
que formarão proteoglicanos (ENOCH; LEAPER, 2007). Durante a deposição de
componentes estruturais da MEC, fibroblastos produzirão TGF-β1 que exercerá importantes
funções como a sustentação da estabilidade estrutural das fibras, além de estimular a
proliferação de queratinócitos e aumento da síntese de glicoproteínas de adesão
(DIEGELMANN, 1997; BROUGHTON et al., 2006).
A fase de maturação ou remodelação tecidual é marcada pela transição do tecido
de granulação para maturação de fibras colágenas e reorganização (KONDO; ISHIDA, 2010).
Caracteriza-se pela deposição, agrupamento e remodelação do colágeno associado à regressão
endotelial, apresentando tecido conjuntivo, fibras colágenas, poucos vasos sanguíneos e
contração da ferida (SCHREMEL et al., 2010; KONDO; ISHIDA, 2010 ).
A remodelação do colágeno é responsável pelo aumento da força de tensão e da
diminuição do tamanho da cicatriz. O resultado normal da fase de remodelação da
cicatrização é uma cicatriz com aproximadamente 80% da força de tensão da pele íntegra
(FAZIK et al., 2000; ROBSON et al., 2001).
Ultimamente tem se observado um grande aquecimento na pesquisa envolvendo
imunopatologia, genética, criação de novos modelos teóricos e experimentais, além da
engenharia tissular na tentativa de obter um melhoramento do processo de cicatrização: com
um menor tempo e maior qualidade (SHERRATT; DALLON, 2002; WILGUS, 2008;
KONDO; ISHIDA, 2010; GROEBER et al., 2011).
A melhor compreensão dos processos envolvidos na cicatrização tem expandido o
conhecimento sobre cura de feridas. Portanto, o entendimento dos fatores que influenciam em
cada uma das etapas do processo de reparo, permite aperfeiçoar a avaliação clínica, definir
rumos para decisões de natureza terapêutica e desenvolver produtos que tragam soluções para
o problema (PAIVA, 2003).
75
A indústria farmacêutica tem apelado cada vez mais para fontes de novos
medicamentos de origem natural (RATNER; BRYANT, 2004). A medicina moderna possui
grandes problemas que possivelmente poderão ser resolvidos com o auxílio de procicatrizantes naturais, uma vez que doenças como a diabetes, ainda carecem de boas soluções
terapêuticas (OBARA et al., 2005; WING TAM et al., 2011).
Uma alternativa que se mostra bastante promissora nesse âmbito são proteínas
conhecidas como lectinas. Chahud e colaboradores (2009) já demonstraram claramente que a
lectina galactose-ligante da espécie Atocarpus integrifolia (KM+) pode induzir uma atividade
pró-cicatrizante pela capacidade de se ligar a receptores CXCR2 e à laminina, possibilitando a
indução da haptotáxia de neutrófilos (GANIKO et al., 2005; PEREIRA-DA-SILVA et al.,
2006). Além disso, a KM+ já demonstrou que ativa a reparação de tecidos lesados por
agressão térmica. Da mesma forma pode-se citar a isoforma recombinante da lectina isolada
de sementes de Bauhinia variegata (rBVL-1) que foi capaz de acelerar o processo cicatricial
em camundongos, provavelmente por um mecanismo que envolve a liberação de fatores de
crescimento por células residentes (NASCIMENTO NETO et al., 2011).
Lectinas de algas marinhas apresentam-se como forte candidatas na aplicação
biotecnológica para cicatrização devido ao baixo peso molecular variando de 4,2 kDa para as
isolectinas de Hypnea japonica (HORI et al., 1986) e 9.3 kDa para Hypnea musciformes
(NAGANO et al., 2005) e possível baixa imunogenicidade. O número de trabalhos
envolvendo lectinas de algas e plantas, e seus efeitos na cicatrização, é ainda pequeno, porém
tem crescido bastante nos últimos anos. Aplicações bastante exploradas incluem a
potencialidade dessas proteínas em inibir os primeiros eventos moleculares na infecção
mediada por vírus, além da própria transmissão da doença (LI et al., 2008; FEIZI et al., 2011;
SATO et al., 2011).
76
4.2 Objetivos
4.2.1 Geral
Investigar e avaliar em modelo experimental murino, o potencial pró-cicatrizante
da lectina isolada de alga marinha vermelha Bryothamnion seafortii (BSL) através de sua
utilização como tratamento tópico.
4.2.2 Específicos
• Avaliar a ação da BSL no processo cicatricial de lesões cutâneas em
camundongos;
• Aprofundar o estudo sobre as fases da cicatrização, avaliando, através de
diagnósticos histopatológicos, as modificações clínicas e imunológicas dos tecidos durante a
evolução do processo cicatricial em camundongos tratados com BSL;
• Divulgar novas abordagens para o tratamento de feridas, avaliando lectinas
como insumos biotecnológicos promissores.
77
4.3 Materiais e métodos
4.3.1 Lectinas
Para a realização do estudo foi utilizada a lectina isolada da alga marinha
vermelha Bryothamnion seafortii (BSL). A metodologia de purificação de tal proteína ocorreu
a através de cromatografia de troca iônica e pode ser encontrada no trabalho de Ainouz e
colaboradores, 1995. As etapas de purificação da BSL utilizada neste estudo foram realizadas
no Laboratório de Moléculas Biologicamente Ativas (BIOMOL) do Departamento de
Bioquímica e Biologia Molecular da UFC - Fortaleza.
4.3.2 Animais
Para a realização do estudo in vivo foram utilizados camundongos albinos (Mus
musculus) Swiss (n= 36), machos, com 8 a 10 semanas de vida, pesando 35,0 ± 5,0 g,
provindos do biotério central (BIOCEN) da Universidade Federal do Ceará - Campus
Fortaleza. Os animais foram mantidos, em gaiolas individuais, na hospedaria para animais de
pequeno porte da Faculdade de Medicina da Universidade Federal do Ceará - Campus Sobral,
durante os procedimentos experimentais, permanecendo em macroambiente controlado
(fotoperíodo de 12 h claro/escuro, temperatura 25±2 °C e umidade 55±10%) com
fornecimento de água e ração específica ad libitum.
4.3.3 Atividade hemaglutinante
Foi realizado ensaio para verificação da atividade hemaglutinante da lectina
utilizada, no sentido de constatar-se que o CRD de tal proteína estivesse hábil a desempenhar
sua função. Para tanto, placas de microtitulação 96 poços foram utilizadas. Um volume final
de 150 µL foi dispensado para cada poço sendo: alíquotas de 50 µL das lectinas foram postas
em 50 µL de tampão TRIS para realização da diluição seriada, após esse procedimento 50 µL
de suspensão de eritrócitos de coelho 2% foram adicionados aos poços, e as placas foram
incubadas 30 min. 37 °C e 30 min. em temperatura ambiente. A atividade hemaglutinante
exercida pelas lectinas foi determinada visualmente.
78
4.3.4 Grupos experimentais e formulação dos tratamentos tópicos
Antes da realização do procedimento cirúrgico, os animais foram aleatoriamente
divididos e organizados em 3 grupos (n= 12), de acordo com o tratamento/tipo solução
aplicada: 1, BSL (lectina de Bryothamnon seafortii 250 µg/mL); 2, BSA (Albumina Sérica
Bovina 250 µg/mL); 3, NaCl 150 mM;. Todas as soluções proteicas utilizadas para o
tratamento das lesões foram diluídas em NaCl 150 mM, levando-se em consideração a
isotonicidade fisiológica celular dos animais.
4.3.5 Procedimento cirúrgico
Para realização do procedimento cirúrgico experimental, os camundongos foram
previamente anestesiados com cloridrato de xilazina 2% e cloridrato de ketamina 10% (10
mg/Kg e 115 mg/Kg, respectivamente), por via subcutânea (HALL e CLARKE, 1991). Após
a anestesia, foram realizadas a tricotomia e a anti-sepsia da região dorsal torácica com
iodopovidona e solução salina estéril NaCl 0,15 M. A pele foi demarcada com caneta
dermográfica, usando-se um molde para delimitar a área (1,00 cm2). A ferida cutânea foi
produzida pela incisão da pele através de lâmina de bisturi número 15. A tela subcutânea foi
divulsionada com tesoura de pontas tipo fina/fina e pinça de dissecção, até sua total ressecção
(Figura 4.2).
Figura 4.2 − Representação do procedimento cirúrgico em camundongos. A: Tricotomia; B: Anti-sepsia; C:
Padronização da área a ser lesionada; D: Demarcação da lesão; E: Ressecção do fragmento de pele; F: Lesão
experimental realizada.
A B C D E F Fonte: Dados da Pesquisa
79
Todos os procedimentos foram realizados de acordo com as normas preconizadas
pelo Colégio Brasileiro de Experimentação Animal – COBEA, de acordo com o guia de
Principios Internacionais de Pesquisas Biomédicas Envolvendo Animais e o estudo foi
conduzido de acordo com as normas do Canadian Council Animal Care (CCAC). Esforços
foram feitos para diminuir ao máximo qualquer incomodo existente por parte do protocolo
experimental.
4.3.6 Tratamento e avaliação macroscópica da atividade cicatrizante
Imediatamente após a realização do procedimento cirúrgico, as lesões de cada
grupo foram tratadas topicamente com suas respectivas soluções-teste, em dose única diária
de 25 µg/100 µL, durante a execução do experimento.
As lesões foram avaliadas diariamente até o 12o dia de pós-cirúrgico (P.C.) sob o
ponto de vista clínico, evidenciando-se alguns sinais flogísticos como: edema, hiperemia,
presença de crosta e tecido cicatricial, além da mensuração da área da lesão. O cálculo da área
das lesões foi avaliado de acordo com a equação descrita por PRATA e colaboradores (1998):
𝑨 = 𝝅 ×𝑹 ×𝒓
Sendo: “A” a área, “R” o raio maior e “r” o raio menor da lesão. De acordo com os valores
das áreas das lesões de cada grupo, foi calculada a proporção de fechamento das lesões
(OBARA et al., 2005). Os dados foram considerados em mm²/dia. A variação das áreas foi
calculada de acordo com as seguintes variações de tempo: 0 - 2 dias P.C.; 2 - 7 dias P.C. e 7 12 dias P.C.
4.3.7 Avaliação histopatológica
Com os camundongos anestesiados, amostras do tecido lesionado foram coletadas
nos tempos 2, 7 e 12 dias P.C., com objetivo de realizar a análise histopatológica. Nestes
tempos, quatro animais foram retirados aleatoriamente dos grupos experimentais e após a
realização das biópsias, foram eutanasiados e submetidos a deslocamento cervical para
sacrifício. As amostras de tecido foram fixadas em formaldeído 10% (v/v) preparado em
tampão PBS 100 mM, pH 7,2. Estas amostras foram submetidas a processamento histológico
de rotina e incluídas em parafina. Após microtomia, os cortes feitos em secções de 5 µm
foram corados pela Hematoxilina-Eosina (HE) e por Tricrômico de Masson (MICHALANY,
1991).
80
O diagnóstico histopatológico foi realizado através de visualização em
microscópio Leica modelo DM 500, utilizando-se campo visual de 4, 10 e 40x.
4.3.8 Análise estatística
Os dados paramétricos (áreas das lesões experimentais) foram expressos em
gráficos, construídos no Pacote Estatístico GraphPad Prism® versão 3.00 para Microsoft
Windows®, como média ± desvio padrão (M ± d), submetidos à análise do Test t de student.
Para comparação entre as médias dos grupos experimentais e as diferenças da porcentagem de
fechamento das lesões nos grupos experimentais, houve a utilização do teste Mann-Whitney
incluso no pacote estatístico Statsoft Statistica® versão 6.0 para Microsoft Windows
95/98/ME/XP/VISTA, considerando-se estatisticamente significantes os valores p< 0,05.
81
4.4 Resultados
4.4.1 Avaliação macroscópica do experimento in vivo
Durante a avaliação da atividade cicatrizante observou-se que o grupo tratado com
BSL desenvolveu um processo inflamatório de maior proporção, sendo este observado
durante as avaliações clínicas e constatado por sinais flogísticos bem evidentes, como edema
e hiperemia nos primeiros dias de tratamento pós-cirúrgico quando comparado aos controles.
Tais sinais são indicativos de um possível efeito pró-inflamatório da lectina testada (dados
não mostrados).
A avaliação das áreas das lesões experimentais foi realizada diariamente para se
observar a evolução do processo cicatricial nos grupos experimentais. Durante as fases
inflamatória e proliferativa, nota-se claramente que o tratamento com BSL induziu uma
diminuição nas áreas das lesões dos animais deste grupo experimental (Figura 4.3).
Figura 4.3 – Evolução das áreas das lesões nos grupos experimentais. As áreas (cm2) são plotadas com relação
ao tempo (dias). (*) p< 0,05
A proporção do fechamento da ferida foi avaliada de acordo com as áreas de cada
lesão exposta em função do tempo. O tratamento com BSL induziu cicatrização mais efetiva e
rápida em comparação aos controles (NaCl 150 mM e BSA). Não obstante, nos dias 2, 7 e 12
P.C. observou-se uma proporção de fechamento maior nos animais tratados com a lectina
(Figura 4.4, p. 82). Assim, a maior efetividade do tratamento com BSL pode ser encontrada
na fase proliferativa e remodelativa do processo cicatricial em comparação aos controles.
82
Entretanto, a mensuração real das áreas pode ser dificultada pela presença da
crosta espessa, que é formada através do contato com o oxigênio atmosférico, caracterizandose pela fibrina seca, no leito da lesão (KUMAR et al., 2005), o que pode dificultar, até
mesmo, a visualização da possível presença de tecido cicatricial. Porém os achados do
presente trabalho mostraram um aumento no percentual de fechamento das áreas das lesões
no grupo tratado com BSL do 1º ao 12º dia P.C. influenciado, possivelmente, pelo processo
de contração nas feridas durante a cicatrização.
Figura 4.4 – Proporção do fechamento das lesões cutâneas experimentais em camundongos. Os animais foram
tratados topicamente com NaCl 150 mM; Albumina Sérica Bovina (BSA); Lectina de Bryothamnion seafortii
(BSL). (*) p< 0,05 em relação a NaCl 150 mM.
4.4.2 Avaliação histopatológica
Para a avaliação histopatológica, amostras do tecido lesionado foram coletadas
nos tempos 2, 7 e 12 dias P.C. (n= 4, para todos os grupos estudados). As amostras de tecido
foram fixadas em formaldeído 10% (v/v) tamponado, e em seguida submetidas a
processamento histológico de rotina (MICHALANY, 1991). Os cortes de 5 µm foram corados
com Hematoxilina-Eosina (HE) e Tricrômico de Masson para análise histopatológica.
O estudo revelou que as feridas tratadas com BSL e BSA apresentavam crosta
selando a abertura no epitélio no 2º dia P.C. O diagnostico histopatológico demonstrou ainda
que as feridas tratadas com BSL mostraram intenso exsudato inflamatório em adiposo, com
discreto infiltrado inflamatório na derme reticular, presença de tecido de granulação em
adiposo reacional (Figura 4.5 C e D, p.83). Nas feridas tratadas com BSA observou-se um
83
intenso exsudato inflamatório, colagenólise e edema de derme reticular com tecido adiposo
degenerativo demonstrando inicio de cicatrização pobre (Figura 4.5 A e B).
Figura 4.5 – Fotomicrografias de secção de pele de camundongos tratada com BSA e BSL em 2 dias P.C.
(Coloração: Hematoxilina-Eosina - C e D; Tricrômico de Masson – A e B). (A) BSA: Notar presença de crosta
(estrela branca) recobrindo leito da ferida e intenso exsudato inflamatório. Abaixo do exsudato observar área de
colagenólise e edema de derme reticular (estrela preta). Imediatamente abaixo da derme notar a tela muscular
subcutânea com vasos congestos (setas). Objetiva de 4x. (B) BSA: Notar presença de crosta espessa (estrela
branca) recobrindo o leito da ferida e exsudato inflamatório menos intenso do que em (A). Abaixo do exsudato
observar área de colagenólise, edema de derme reticular e intenso infiltrado inflamatório (estrela preta) com
tecido adiposo degenerativo (Tad). Imediatamente abaixo da derme notar a tela muscular subcutânea, fibras
musculares espaçadas por tecido conjuntivo e células adiposas com vasos congestos próximas a área de
colagenólise (seta vermelha). Objetiva de 4x. (C) BSL: Crosta espessa cobrindo leito da lesão (estrela branca).
Notar vasos congestos do tecido de granulação (setas) em tecido adiposo reacional (TAR). Detalhe da tela
muscular subcutânea (TMSC) evidenciando células adiposas. Objetiva de 10x. (D) BSL: Detalhe da foto anterior
evidenciando vasos do tecido de granulação em área de intenso infiltrado inflamatório (estrela). Observar
possível diapedese de PMNs para a área inflamada (seta vermelha). Objetiva de 40x.
No 7º dia P.C., o grupo tratado pela lectina mostrou adensamento de fibras
colágenas na derme reticular, principalmente envolto dos vasos do tecido de granulação em
tecido adiposo com presença de discreto exsudato inflamatório (Figura 4.6 C e D, p.84). No
grupo tratado com BSA (Figura 4.6 A e B, p.84) observou-se intenso exsudato inflamatório e
ainda o inicio de proliferação fibroblástica com moderada síntese de colágeno, demonstrando
uma cicatrização menos evoluída quando comparada as feridas tratadas com BSL.
84
Figura 4.6 – Fotomicrografias de secção pele de camundongos tratada com BSA e BSL em 7 dias P.C..
(Coloração: Tricrômico de Masson). (A) BSA: Notar presença de crosta (estrela) recobrindo leito da ferida e
intenso exsudato inflamatório (delimitado por linhas tracejadas amarelas). Abaixo do exsudato observar área de
tecido de granulação com vasos congestos (setas pretas) e intensa proliferação de fibroblastos. Imediatamente
abaixo do exsudato inflamatório, notar faixa azulada decorrente da síntese de colágeno (setas vermelhas).
Objetiva de 4x. (B) BSA: Detalhe do tecido de granulação. Notar proliferação de fibroblastos (seta preta) e
discreto infiltrado inflamatório ao redor dos vasos (seta azul). Observar faixa de colágeno acima do tecido de
granulação (seta vermelha). Vasos do tecido de granulação (estrela) Objetiva de 10x. (C) BSL: Visão geral da
área lesionada. Notar presença de crosta selando a abertura epitelial (estrela branca). Vasos de tecido de
granulação em adiposo reacional (TAR) envoltos por fibras colágenas em adensamento (setas), resultando de
intensa síntese fibroblástica. Área com discreto exsudato inflamatório (estrela preta). Objetiva de 10x. (D) BSL:
Detalhe da foto anterior mostrando área de vasos de tecido de granulação envoltos por colágeno ativo. Notar
fibroblastos ativos na área de colágeno (setas). Objetiva de 40x.
No 12º dia P.C., os animais tratados com BSL apresentaram reestruturação do
epitélio de revestimento com pouca produção de queratina, formação de anexos cutâneos
jovens, colágeno ativo na região reticular da derme com presença de atividade fibroblásica
(Figura 4.7 C e D, p.85). Nas lesões tratadas com BSA no mesmo período, havia presença de
crosta selando a abertura epitelial, discreto infiltrado inflamatório abaixo da crosta e
progressão do epitélio de revestimento (Figuras 4.7 A e B, p.85).
85
Figura 4.7 – Fotomicrografias de secção pele de camundongos tratados com BSA e BSL em 12 dias P.C.
(Coloração: Tricrômico de Masson). (A) BSA: Presença de crosta (estrela branca) e exsudato inflamatório
abaixo da crosta (seta preta). Notar progressão do epitélio de revestimento (setas amarelas) abaixo da crosta e da
camada contendo exsudato inflamatório. Derme com áreas com menor deposição de colágeno e presença de
tecido de granulação ativo (estrela preta) em processo de regressão (fibroplasia). Objetiva 4x. (B) BSA: Detalhe
da foto anterior. Observar tecido de granulação caracterizado pela presença de vasos (setas pretas), colágeno
jovem em matriz extracelular com infiltrado inflamatório. Notar projeção de epitélio abaixo da crosta (setas
amarelas). Objetiva 10x. (C) BSL: Observar epitélio de revestimento neoformado ainda com pouca produção de
queratina (setas pretas). Presença de fragmento de crosta na borda da área antes lesionada (estrela branca),
formação de anexos cutâneos jovens como glândulas sebáceas (GS), vasos remanescentes do tecido de
granulação (setas vermelhas). Notar colágeno ativo na derme reticular (estrela preta). Objetiva de 4x. (D) BSL:
Detalhe da imagem anterior evidenciando a presença de anexos cutâneos jovens em área de epitélio neoformado
(seta preta), fibroblastos em área de derme papilar (seta azul) e vasos característicos de neoangiogenese de tecido
de granulação (seta vermelha). Objetiva de 40x.
No grupo controle tratado com NaCl 150 mM constatou-se atraso no processo
cicatricial. Mesmo no 7º dia P.C. observou-se, ainda, resposta inflamatória aguda, e tecido de
granulação ainda no inicio de sua proliferação (Figura 4.8, p. 86).
86
Figura 4.8 – Fotomicrografias de secção de pele de camundongos submetidos a tratamento tópico com NaCl 150
mM em 7 dias P.C. (Coloração: Hematoxilina-Eosina e Tricrômico de Masson). (A) NaCl: Ferida aberta com
crosta espessa e calcificação distrófica (estrela branca) selando a abertura epitelial (S). Observar inicio de
formação de tecido de granulação originado de tecido adiposo reacional (RAT), notar presença de vasos
congestos (setas) e área de processo inflamatório (estrela). Objetiva de 4x. (B) NaCl: Detalhe de A
demonstrando vasos congestos em adiposo (setas), e infiltrado inflamatório abaxo da crosta (estrela). Objetiva de
10x. (C) NaCl: Detalhe de A mostrando área de inflamação aguda em tecido adiposo em degeneração (estrela) e
vasos do tecido de granulação acima da área inflamada (setas). Objetiva de 10x. (D) NaCl: Observar exsudato
inflamatório abaixo da crosta (estrela branca). Há pobre deposição de colágeno e formação de tecido de
granulação na derme (estrela preta) entre as áreas de tecido adiposo. Objetiva de 10x.
87
4.5 Discussão
A cicatrização cutânea é um processo dinâmico que envolve a ação integrada de
vários tipos celulares, da MEC e mediadores solúveis como citocinas, que tem por finalidade
restaurar a integridade da estrutura anatômica lesada (THOMAS et al., 1995; PARK e
BARBUL, 2004). Consequentemente, o tratamento de uma ferida traz como principal
objetivo sua regeneração no menor intervalo de tempo, com mínima dor e formação de
cicatriz fibrótica (CLARK, 1991).
A utilização de produtos naturais com a finalidade de melhorar a qualidade da
cicatrização e acelerar o processo cicatricial, tem entrado cada vez mais em evidência.
Doenças como diabetes e hanseníase demandam a busca por substâncias que possam
minimizar o sofrimento provindo de seu principal sintoma: o retardamento do processo
cicatricial, fazendo que que os indivíduos portadores de tais patologias, tenham forte
decréscimo na qualidade de vida em decorrência de uma cicatrização cutânea retardada. Tal
fato traduz-se numa das principais implicações econômicas e terapêuticas da medicina
moderna, principalmente devido ao grande volume de gastos com medicamentos, em adição
ao tempo no qual os pacientes que sofrem com feridas crônicas ou úlceras, passam em
internação recebendo tratamento médico (OBARA et al., 2005; BRASIL, 2008; SCHREML
et al., 2010). Dessa forma, parece ser claro que existe certa urgência na pesquisa de agentes
que diminuam o tempo do processo de reparo tecidual, que possam contribuir para um rápido
e mais efetivo processo de cicatrização (SÜNTAR et al., 2010).
Lectinas representam um grupo estruturalmente heterogêneo de proteínas de
origem não imune que possuem a característica de se unir a carboidratos com alta
especificidade (CAVADA et al., 2001). São proteínas versáteis e por isso possuem várias
aplicações diretas na pesquisa biológica e biomédica com potencial biotecnológico (LAM;
NG, 2010).
O presente trabalho reportou a atividade pro-cicatrizante de uma lectina isolada da
alga marinha vermelha Bryothamnion seafortii. Entretanto, após consulta a bases
bibliográficas, rapidamente nota-se que dados referentes a aplicação de lectinas de algas na
pesquisa biotecnológica, são escassos em comparação a lectinas de origem vegetal,
principalmente
porque
estas
foram
descobertas
há
relativamente
pouco
tempo,
aproximadamente 40 anos (BOYD et al., 1966). A aplicação biológica de lectinas de algas
marinhas é interessante, principalmente, porque essas possuem geralmente, massa molecular
baixa em comparação a lectinas de plantas. Dessa forma espera-se que essas moléculas sejam
88
bem menos antigênicas que outras lectinas. Além disso, essas lectinas apresentam uma alta
especificidade por carboidratos complexos e glicoconjugados (NAGANO et al., 2005).
A lectina isolada de alga marinha Bryothamnion seafortii já demonstrou exercer
várias atividades biológicas, dentre elas está a indução da migração de neutrófilos in vivo e in
vitro (NEVES et al., 2001); atividades antinociceptiva e inflamatória (VIEIRA et al., 2004);
anti-biofilme microbiano (TEIXEIRA et al., 2007); ferramentas para diferenciação de células
cancerígenas (PINTO et al., 2009); Envolvimento nas vias do relaxamento vascular do
músculo liso (LIMA et al., 2010).
O campo da aplicação de lectinas no tratamento de feridas é pouco explorado,
entretanto importantes trabalhos já demonstraram que essas biomoléculas possuem potencial
cicatrizante no tratamento de feridas agudas (CHAHUD et al., 2009; NASCIMENTO NETO
et al., 2011).
Os achados apresentados nessa seção demonstram o potencial pró-cicatrizante da
lectina isolada de alga marinha Bryothamnion seafortii, visto que houve aceleração no
processo cicatricial de lesões cutâneas tratadas com esta lectina. Assim sendo, os achados
histopatológicos demonstram que a lectina utilizada no estudo exerce atividade sobre a
migração de polimorfonucleares para o sítio lesionado, corroborando com os dados já
publicados por Chahud e colaboradores em 2009, no qual a lectina de Artocarpus integrifólia
(KM+), induziu a cicatrização mais efetiva do epitélio corneano através de um mecanismo
que também envolve a migração de neutrófilos.
É possível que a BSL também seja capaz de atuar sobre a ativação e proliferação
de fibroblastos, já que a maioria dos animais tratados com a lectina apresentaram colágeno
fortemente ativo na derme.
89
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5 AVALIAÇÃO DA TOXICIDADE DAS LECTINAS SOBRE NÁUPILOS DE ARTEMIA
Elsevier Editorial System(tm) for Bioresource Technology
5.1 Manuscrito Manuscript
submetidoDraft
ao periódico Bioresource Technology
Manuscript Number:
Title: Evaluation of the toxicity and fluorescence profile of some plant lectins to Artemia nauplii
Article Type: Original research paper
Keywords: toxicity; Artemia; lectin; Canavalia; fluorescence.
Corresponding Author: Dr Benildo Sousa Cavada, Ph.D
Corresponding Author's Institution: Federal University of Ceará
First Author: Francisco S Arruda, PhD
Order of Authors: Francisco S Arruda, PhD; Arthur A Melo, Undergraduate; Mayron A Vasconcelos,
M.Sc.; Romulo F Carneiro, Undergraduate; Suzete R Silva, M.Sc.; Francisco N Pereira-Junior, M.Sc.; Celso
S Nagano, PhD; Kyria S Nascimente, PhD; Edson H Teixeira, PhD; Alexandre H Sampaio, PhD; Benildo
Sousa Cavada, Ph.D
Abstract: Lectins are sugar-binding proteins widely distributed in nature with many biological
functions such as toxic and cytotoxic activities. Thus, the aim of this study was to assess the toxicity of
six lectins from the genus Canavalia: Canavalia ensiformis (ConA), C. brasiliensis (ConBr), C. boliviana
(ConBol), C. grandiflora (Cgran), C. gladiata (CGL) and C. maritima (ConM). In order to determine the
toxicity, assays with Artemia nauplii were performed with lectin concentration varying from 12.5 - 100
µg mL-1. The results showed that all lectins exhibited different toxicities. ConBr had highest toxicity
among all lectins (54.38 µg mL-1). In addition, a fluorescence assay was performed to evaluate the
binding of lectins to Artemia nauplii. The images showed that all lectins bound to a similar area in the
digestive tract of Artemia nauplii. Thus, all tested lectins had a toxic effect towards Artemia nauplii and
its main binding site was the digestive tract.
Suggested Reviewers: Jose L Lima-Filho PhD
Professor, Biochemistry, UFPE
[email protected]
Expert in Biotechnology
Jose-Carlos Rodrigues PhD
Professor, University of Puerto Rico
[email protected]
Expert in Crops and Agro-Environmental Sciences
Thiago Collares PhD
Professor, Biotechnology, UFPel
[email protected]
Expert in Biotechnology
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Ricardo P Santos PhD
Professor, Biotechnology, UFC
[email protected]
Expert in Microscopy
Cover Letter
97
Professor Dr. Benildo Sousa Cavada
BioMol-Lab
Universidade Federal do Ceará
Centro de Ciências
Departamento de Bioquímica e Biologia Molecular
Campus do Pici
Caixa Postal 6033
60.440-970, Fortaleza - Ceará - Brasil
Telefone: +55 85 3366 9818
Fax: +55 85 3366 9818
e-mail: [email protected]
www.biomol-lab.org
Fortaleza, November 17th 2011.
Dear Editor,
Could you, please consider the article “Evaluation of the toxicity and fluorescence profile of some
plant lectins to Artemia nauplii” to be published in Bioresource Technology (BITE) with the
Subject classification: Enzymes & other proteins. It is important to say that: (i) this manuscript
represents an original work being submitted only in this journal and was not previously submitted to
BITE, (ii) its citations are fully acknowledged, (iii) is a new approach to establish the toxicity of lectins
against Artemia without using DMSO (toxic per se), (iv) all authors contributed and approved this
manuscript and agree that it should be submitted to BITE and (v) there is not any conflict of interest in this
manuscript.
The correspondence author information is described bellow as requested:
Benildo Sousa Cavada:
[email protected] – Mister Hull Avenue s/n. Campus do Pici, Bloco 907; P.O. Box 6043.
Fortaleza, CE, Brazil. Zip Code: 60440-970. Phone/Fax: +55 (85) 4008-9818
Yours,
Professor Dr. Benildo Sousa Cavada
*Highlights
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*Highlights
Canavalia lectins: cytotoxic proteins on Artemia nauplii.
Effects of Canavalia lectins on Artemia sp.
Toxicity mediated by Canavalia lectins
Canavalia lectins bind and kill Artemia nauplii
Cytotoxic effects of Canavalia lectins: focus in CRD volume
*Manuscript
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Evaluation of the toxicity and fluorescence profile of some plant lectins to Artemia
nauplii
Francisco Vassiliepe Sousa Arrudaa, Arthur Alves Melob, Mayron Alves Vasconcelosb,
Romulo Farias Carneirob, Suzete Roberta Silvac, Francisco Nascimento Pereira-Juniorb;
Celso Shiniti Naganoc, Kyria Santiago Nascimentob, Edson Holanda Teixeiraa,
Alexandre Holanda Sampaioc, and Benildo Sousa Cavada*,b
a
Laboratório de Imunologia e Bioquímica de Sobral (LIBS), Faculdade de Medicina,
Universidade Federal do Ceará, Sobral-CE, 62042-280, Brazil; (RENORBIO)
b
Laboratório de Moléculas Biologicamente Ativas (Biomol-Lab), Departamento de
Bioquímica e Biologia Molecular, Universidade Federal do Ceará, Av. Humberto
Monte s/n, Bloco 907, Lab. 1075, Campus do Pici, Fortaleza-CE, 60440-970, Brazil
c
Laboratório de Biotecnologia Marinha (BioMar-Lab/Biomol-Lab), Departamento de
Engenharia de Pesca, Universidade Federal do Ceará, Av. Humberto Monte s/n, Bloco
825, Campus do Pici, Fortaleza-CE, 60440-970, Brazil
*Corresponding author:
Benildo Sousa Cavada, Phone: +55-85-3366-9818, Fax: +55-85-3366-9818, E-mail
address: [email protected]
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ABSTRACT
Lectins are sugar-binding proteins widely distributed in nature with many
biological functions such as toxic and cytotoxic activities. Thus, the aim of this study
was to assess the toxicity of six lectins from the genus Canavalia: Canavalia ensiformis
(ConA), C. brasiliensis (ConBr), C. boliviana (ConBol), C. grandiflora (Cgran), C.
gladiata (CGL) and C. maritima (ConM). In order to determine the toxicity, assays with
Artemia nauplii were performed with lectin concentration varying from 12.5 - 100 µg
mL-1. The results showed that all lectins exhibited different toxicities. ConBr had
highest toxicity among all lectins (54.38 µg mL-1). In addition, a fluorescence assay
was performed to evaluate the binding of lectins to Artemia nauplii. The images showed
that all lectins bound to a similar area in the digestive tract of Artemia nauplii. Thus, all
tested lectins had a toxic effect towards Artemia nauplii and its main binding site was
the digestive tract.
Keywords: toxicity; Artemia; lectin; Canavalia; fluorescence
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1.
Introduction
Lectins are sugar-binding proteins widely distributed in nature in organisms such
as viruses, bacteria, fungi, plants and animals (Sharon and Lis, 2003). These proteins
bind mono- and oligosaccharides specifically and reversibly, but are devoid of catalytic
activity and, in contrast to antibodies, are not products of an immune response. Lectins
have many biological functions, such as host defense, cell-cell interaction, glycoprotein
folding, symbiosis, regulation of cell growth, apoptosis, fertilization and other functions
(Killpatrick, 2002; Sharon and Lis, 2004). Lectins purified from the Leguminosae
family are the most extensively studied carbohydrate-binding proteins (Van Damme et
al., 1998). The subtribe Diocleinae has lectins that are multimeric structures composed
of identical monomers of 25.5 kDa and exhibit a pH-dependent equilibrium between
dimer and tetramer conformations. Diocleinae lectins also share the same carbohydrate
recognition specificity for D-mannose and D-glucose, require divalent ions such as Ca2+
and Mn2+ to be biologically active and contain a hydrophobic cavity that binds to
phytohormones and other hydrophobic ligands. Despite their high similarity, these
ConA-like lectins induce different responses in biological assays; for example, when
tested for stimulation of human lymphocyte proliferation in vitro, ConBr had a higher
proliferation index than ConA, possibly due to minor changes in binding specificities
(Cavada et al., 2001).
A broad range of lectins have been found to exhibit toxic and cytotoxic activities
in several different assays. These effects include in vitro cytotoxicity in cultured
lymphoid cells (Vose et al., 1983), tumor cells (Urech et al., 1995), and T cells (Alvarez
et al., 1972), in vivo toxicity after injection of the lectin into the peritoneal cavity of
mice and lethality in the brine shrimp Artemia sp. (Ramos et al., 1997). In particular,
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the Artemia lethality test (Persoone, 1980; Sorgeloos et al., 1978) has been used
successfully to determine the toxicity of bioactive compounds that have a variety of
pharmacological activities, including anti-cancer agents, antivirals, insecticides,
pesticides, and anti-HIV compounds (Carballo et al., 2002; Pervin et al., 2006; Ho et al.,
2006). The Artemia nauplii were used because they are highly sensitive. In addition, the
cysts can be easily obtained, hatched and stored at room temperature for several months
without losing their viability (Vanhaecke et al., 2001). In the present work, the toxicity
of six lectins isolated from seeds of the genus Canavalia was compared on the brine
shrimp Artemia sp.
2.
Materials and methods
2.1. Artemia nauplii hatching
The Artemia cysts were hatched in artificial seawater at 28ºC under constant
lighting and strong aeration. The cysts were incubated in a polyethylene cylindroconical
tube with 1 g cysts per liter of artificial seawater. This hatching condition simulates
Artemia’s natural environment, shallow seawater. After a period of 24 h, the aeration
was halted, and the lighting was directed to the bottom of the hatching vessel. Due to
the phototropic nature of the nauplii, they migrate in the direction of the light to the
bottom of the tube, while the unhatched cysts float. The nauplii are then collected and
used for bioassays.
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2.2. Purification of lectins
Lectins from Canavalia ensiformis (ConA), C. brasiliensis (ConBr), C.
boliviana (ConBol), C. grandiflora (Cgran), C. gladiata (CGL) and C. maritma (ConM)
were extracted from air-dried ground seeds collected in Fortaleza-CE, Brazil, and
defatted with n-hexane. The protein extract was obtained by continuous stirring with
0.9% NaCl (1:10 w/v) at 20ºC for 4 h, followed by centrifugation at 10.000 g for 20 min
at 4ºC. The supernatant was applied to a Sephadex G-50 column (5 X 25 mm) that had
been equilibrated with 0.9% NaCl containing 0.005 mol L-1 CaCl2 and 0.005 mol L-1
MnCl2. The column was then washed with equilibration buffer at a flow rate of 45 mL
h-1, and the bound lectin was eluted with 0.1 mol L-1 glycine, pH 2.6, dialyzed
extensively with distilled water and lyophilized.
2.3. Artemia lethality test
Lectins were dissolved in artificial seawater at a concentration of 200 µg mL-1.
The assay was performed boarding 24 well Linbro plates in which each well contained
10 Artemia nauplii in a final volume of 2 mL. Lectin solution was added to the wells at
final concentrations of 12.5, 25, 50 or 100 µg mL-1. The experiments were performed in
triplicate, and negative control wells contained 2 mL of artificial seawater with 10
Artemia nauplii. After 24 h, the number of dead nauplii in each well was counted. From
these data, we calculated the percentage dead at each concentration and the LC50 value
by probit analysis as described by Finney (1971).
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2.4. Incubating ConBr with α-methyl mannoside
A solution of 200 µg mL-1 purified ConBr was incubated in artificial seawater
containing 0.1 mol L-1 α-methyl mannoside for 1 h at 37ºC. That solution was then
assayed in the Artemia lethality test at final concentrations of 12.5, 25, 50 or µg mL-1
ConBr. After 24 h, the number of dead nauplii was counted. The percentage dead and
the LC50 value were calculated by probit analysis as described by Finney (1971).
2.5. FITC-labeled lectin
FITC-labeled lectins were prepared in inhibition buffer (0.1 mol L-1 D-mannose
in 0.1 mol L-1 carbonate-bicarbonate buffer, pH 9.0), conjugation buffer (0.1 mol L-1
carbonate-bicarbonate buffer, pH 9.0) and washing buffer (phosphate-buffered saline:
0.01 mol L-1 sodium phosphate buffer, 0.027 mol L-1 KCl and 0.15 mol L-1 NaCl, pH
7.4). Initially, the lectins were dissolved in inhibition buffer and incubated at 37°C for 1
hour. Then, 250 µL fluorescein isothiocyanate (FITC) (500 µg mL-1 in conjugation
buffer) was added dropwise. The solution was incubated for 2 h at room temperature
under gentle stirring. Subsequently, unconjugated FITC was separated from FITC-lectin
by size exclusion chromatography using a Sephadex G-25 column previously
equilibrated and eluted with washing buffer. The absorbance of all fractions was
determined at 280 nm (protein) and 495 nm (FITC) to verify chromatographic
efficiency. The FITC-labeled lectins were then dialyzed against 1 mol L-1 acetic acid for
1 hour to remove the inhibitor carbohydrate and extensively dialyzed against distilled
water.
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2.6. Lectin fluorescence microscopy
Briefly, the shrimp were incubated with lectins (50 µg mL-1) and kept overnight.
The shrimp were then washed 3 times in phosphate-buffered saline, placed on slides and
observed under a fluorescence microscope (Eclipse E200/epi-fluorescence, Nikon,
Tokyo, Japan) equipped with a digital camera (DS-2Mv, Nikon, Tokyo, Japan). Images
were acquired with NIS-Elements software version 2.3 (Nikon, Tokyo, Japan). The
resolution of all acquired images was 5.0 Mpixel (Media Cybernetics, Silver Spring,
MDI, USA).
3.
Results and discussion
3.1. Artemia lethality test
Canavalia lectins exhibited a range of different toxicities toward Artemia
nauplii. The LC50 values for ConA, ConBr, ConM, ConBol, Cgran and CGL are shown
in Table 1. The least toxic lectin in this assay was Con A, which had a LC50 of 376.48
µg mL-1. The most toxic lectins tested were CGL and ConBr, which exhibited LC50
values of 79.02 µg mL-1 and 54.38 µg mL-1, respectively. When pre-incubated with αmethyl mannoside, the LC50 of ConBr increased from 54.38 µg mL-1 to 337.75 µg mL-1
(Fig. 1).
3.2. Binding of FITC-labeled lectin with Artemia nauplii
Microscopy confirmed that the lectins bound to Artemia nauplii (Fig. 2). All
lectins tested bound to a similar area of the organism despite their different levels of
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toxicity. The area showed fluorescence emission represents the digestive tract of the
nauplii. The binding in this area was probably due to carbohydrate recognition. The
addition of α-methyl mannoside significantly reduced the binding of the FITC-labeled
lectins to the digestive tract of the nauplii.
Toxicity and cytotoxicity studies have been conducted on all kinds of bioactive
molecules and natural extracts (Thompson et al., 1985; Krishnaraju et al., 2005). The
Artemia lethality test has been used as a preliminary toxicity assay commonly
performed before other bioassays that detect anti-cancer, antiviral, insecticide, pesticide
and anti-HIV activity; as such, the Artemia lethality test is very useful for
biotechnological applications and the evaluation of bioactive compounds. Until now,
only a small number of lectins have been evaluated in the Artemia lethality test. In most
instances, lectins such as CSL-2 and PNL-2 have shown high toxicity (Ali et al., 2003;
Santos et al., 2009; Vasconcelos et al., 1991); in contrast, lectins such as SejaBL exhibit
low toxicity (Vaz et al., 2010).
In some cases, the Artemia lethality test was conducted with DMSO (Pervin et
al., 2006; Santos et al., 2010). Although DMSO has been reported to have low toxicity
(Vignes, 2000), this does not exclude the possibility that the Artemia toxicity is not
affected by the addition of DMSO. Ramos et al., (1997) reported that a highly toxic
lectin isolated from Abrus pulchellus had an LC50 of 3.5 µg mL-1 without the addition
of DMSO. In another study of the toxicity of ConA-like lectins (Santos et al., 2010), the
toxic effect of the lectins was studied in the presence of DMSO. They obtained an LC50
for ConBr of 15.4 µg mL-1, while in the present work, we obtained an LC50 of 54.38 µg
mL-1 in an assay that contained no DMSO (Table 1). Increased toxicity of ConBr in the
presence of DMSO may be due to synergy between the two compounds acting together
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in Artemia sp. Pre-incubation of ConBr with α-methyl mannoside showed that the
carbohydrate-recognition domain is involved in the toxic effect of the lectin in brine
shrimp; when pre-incubated with the carbohydrate, the LC50 of ConBr increased from
54.38 µg mL-1 to 337.75 µg mL-1 (Table 1).
Despite similarities in the structures and sugar-binding specificities of ConA-like
lectins, previous studies have shown that their biological activities differ. Cavada et al.,
(2001) reported experimental evidence that these differences arise from changes in three
major physicochemical parameters: binding specificity for complex carbohydrates, the
pH-dependent oligomerization state (dimer-tetramer equilibrium) and the relative
orientation of the carbohydrate-binding sites. We believe that a fourth parameter may
also be important to explain the differences in biological activities of ConA-like lectins:
the volume of the carbohydrate-recognition domain (CRD). By comparing these
Artemia lethality LC50 data with the volume of ConA, ConM, and ConBr binding
domains reported by Bezerra et al., (2011), we found an inversely proportional
relationship between the volume of the CRD and the toxicity of the lectins. In this
analysis, ConA, which has the largest CRD volume (151 Å3) among the lectins studied,
exhibited the lowest toxicity, while ConBr, which has the smallest CRD volume (105
Å3) had the highest toxicity. These observations suggest that as the volume of the CRD
of a ConA-like lectin decreases, the extent of the toxic effect increases.
4.
Conclusion
The data reported here support the conclusion that, among the lectins studied,
ConBr is the most toxic lectin against Artemia, ConA is the least toxic, and ConBol,
ConM, Cgran and CGL exhibit intermediate levels of toxicity. These data suggest that
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ConBr and CGL are more cytotoxic, and thus, further studies should be conducted to
determine if they also exhibit anti-cancer, anti-HIV, insecticide, and pesticide activities.
Concerning the experimental methodology, it is a new approach to establish the toxicity
of lectins against Artemia without using DMSO (sometimes toxic per se).
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Acknowledgments
This study was supported by grants from Conselho Nacional de Desenvolvimento
Científico e Tecnológico (CNPq), Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de
Nível Superior (CAPES), Fundação Cearense de Apoio ao Desenvolvimento Científico
e Tecnológico (FUNCAP). The authors thank the American Journal Experts
(www.journalexperts.com) for helping with the English language editing of the
manuscript. C.S.N., E.H.T., A.H.S., and B.S.C. are senior investigators of CNPq.
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Figure legends
Fig. 1. Graphical representation of the LC50s of the 6 lectins tested in the Artemia
lethality test. The LC50 of ConBr pre-incubated with α-methyl mannoside is also
shown.
Fig. 2. Binding of FITC-labeled lectins to Artemia nauplii detected by fluorescence
microscopy. The green color indicates the presence of FITC-labeled lectins in the
digestive tract of the animal. (a) FITC-ConBr; (b) FITC-ConA; (c) FITC-ConBol; (d)
FITC-Cgran and (e) FITC-CGL. The same images were also acquired in bright field
without fluorescence excitation.
Table 1
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Table 1
LC50 and percentage of dead nauplii in different doses of lectins
Lectins
Dose
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54,38 (±23,48)
110,51 (± 8,79)
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Figure 2
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6 CONCLUSÃO
Os resultados possibilitaram concluir que lectinas podem ser utilizadas no
tratamento de patologias como o câncer, bem como no combate a feridas crônicas causadas
por doenças que causam a diminuição da qualidade de vida da população.
Com relação à indução de apoptose por lectinas da subtribo Diocleinae, o presente
trabalho lançou luz sobre a caracterização parcial do mecanismo utilizado por tais proteínas
na deflagração da apoptose em células A549. Entretanto, estudos adicionais devem ser
realizados para caracterizar melhor os efeitos de uma possível autofagia associada aos
processos apoptóticos, visto que ambas podem co-existir.
Sobre os testes envolvendo a cicatrização, os resultados indicam que a lectina
isolada de alga marinha vermelha Bryothamnion seafortii (BSL) pode estimular o processo
cicatricial de lesões cutâneas em camundongos, possivelmente agindo sobre células do
sistema imune, otimizando a resposta inflamatória por diapedese de neutrófilos e estimulando
a síntese de colágeno por fibroblastos ativos. Tais resultados estimulam o desenvolvimento de
estudos adicionais in vivo, através da utilização de uma composição farmacêutica para uso
tópico, sendo esta baseada na lectina testada.
Apesar das lectinas testadas terem demonstrado grande potencial biotecnológico,
os dados de citotoxicidade sobre Artemia sp. mostraram que tais proteínas podem desencadear
efeitos não desejáveis, como a morte de células sadias. Assim, estratégias para a diminuição
da citotoxidade, como o encapsulamento das lectinas em lipossomas ou mesmo através de
mecanismos como a peguilação de tais proteínas, podem constituir-se como alternativas
atrativas para a pesquisa biotecnológica utilizando-se lectinas.
ANEXOS Alguns artigos publicados durante o doutorado DECLARAÇÃO
Declaro para os devidos fins que o artigo, Lectins as Biomarkers of Oral Cavity Tumors:
Literature Review de autoria de Bruno Rocha da Silva, Francisco Vassiliepe de Sousa Arruda,
Victor Alves Carneiro, Theodora Thays Arruda Cavalcante, Andréa Silvia Walter de Aguiar,
Kyria Santiago do Nascimento, Benildo Sousa Cavada, Edson Holanda Teixeira, está no prelo e
será publicado na Revista Brasileira de Cancerologia (ISSN 0034-7116), número 57, volume 4
correspondente ao trimestre outubro/novembro/dezembro/2011.
Rio de Janeiro, 20 de julho de 2011
Teresa Caldas Camargo
Editor Científico
Revista Brasileira de Cancerologia
Coordenação de Educação
Instituto Nacional de Câncer
Coordenação de Educação
Serviço de Edição e Informação Técnico-Científica
R. Marquês de Pombal, 125
20230-240 – Rio de Janeiro – RJ
Telefone:3207-6009– e-mail: [email protected]
Lectins as Biomarkers of Oral Cavity Tumors: Literature Review
Lectinas como Biomarcadores de Tumores de Cavidade Oral: Uma Revisão de
Literatura
Lectinas como Biomarcadores de Tumores de la Cavidad Oral: Revisión de la
Literatura
Running Title: Lectins as Biomarkers of Oral Cavity Tumors
Bruno Rocha da Silva1, Francisco Vassiliepe de Sousa Arruda2, Victor Alves Carneiro3,
Theodora Thays Arruda Cavalcante4, Andréa Silvia Walter de Aguiar5, Kyria Santiago
do Nascimento6, Benildo Sousa Cavada7, Edson Holanda Teixeira8
Author for Correspondence
Edson Holanda Teixeira, Ph.D.
Medicine School, Federal University of Ceará.
Rua Geraldo Rangel, 100 - Campus do Derby - CEP 62041-040 – Sobral, CE, Brazil.
Tel : +55 88 3611-2202
Fax: +55 88 3611-8000
E-mail: [email protected]
1
Cirurgião-Dentista. Mestrando em Biotecnologia. Programa de Pós-graduação em Biotecnologia da
Universidade Federal do Ceará – Campus Sobral. Sobral, Ceará, Brasil. E-mail:
[email protected]
2
Biólogo. Doutorando em Biotecnologia. Rede Nordestina de Biotecnologia. Universidade Federal do
Ceará. Fortaleza, Ceará, Brasil. E-mail: [email protected]
3
Biólogo. Doutorado em Bioquímica. Departamento de Bioquímica e Biologia Molecular da Universidade
Federal do Ceará. Fortaleza, Ceará, Brasil. E-mail: [email protected]
4
Cirurgiã-Dentista. Doutoranda em Bioquímica. Departamento de Bioquímica e Biologia Molecular da
Universidade Federal do Ceará. Fortaleza, Ceará, Brasil. E-mail: [email protected]
5
Cirurgiã-Dentista. Doutorado em Odontologia. Departamento de Clínica Odontológica da Universidade
Federal do Ceará. Fortaleza, Ceará, Brasil. E-mail: [email protected]
6
Engenheira de Pesca. Pós-Doutorado em Biotecnologia. Departamento de Bioquímica e Biologia
Molecular da Universidade Federal do Ceará. Fortaleza, Ceará, Brasil. E-mail: [email protected]
7
Engenheiro Agrônomo. Pós-Doutorado em Bioquímica. Departamento de Bioquímica e Biologia
Molecular da Universidade Federal do Ceará. Fortaleza, Ceará, Brasil. E-mail: [email protected]
8
Cirurgião-Dentista. Doutorado em Bioquímica. Faculdade de Medicina da Universidade Federal do
Ceará - Campus Sobral. Sobral, Ceará, Brasil. E-mail: [email protected]
Author’s individual contributions
• Bruno Rocha da Silva - from initial idea to final draft of the work;
• Francisco Vassiliepe de Sousa Arruda - initial drafting, assistance in literature
review and translation process of the article;
• Victor Alves Carneiro - assistance in literature review, categorization of studies
found and translation process of the article;
• Theodora Thays Arruda Cavalcante - reading and categorization of studies found,
final editing and translation process of the article;
• Andréa SilviaWalter de Aguiar - from initial idea to final draft of the work;
• Kyria Santiago do Nascimento - statistical analysis, review of final drafting and
translation of the article;
• Benildo Sousa Cavada - review of the methodology, statistical analysis and final
editing and translation of the article;
• Edson Holanda Teixeira - initial idea of the work, review of the methodological
process, reviewing the final draft and the translation process.
Conflicts of Interest Statement
All authors disclose any financial and personal relationships with other people or
organizations that could inappropriately influence (bias) this work.
ABSTRACT: With the development of cancer research, a peculiar group of proteins
has become the subject of great attention, namely the lectins. These proteins have the
ability to bind reversibly to carbohydrates with high specificity. Because of changes in
cell surface glycoprotein patterns during tumor formation, lectins have an important
potential role as biomarkers of neoplastic cells. The present article was designed to
review the literature available on the use of lectins as biomarkers of premalignant and
neoplastic lesions, with a focus on oral cavity tumors, and to assess which groups of
lectins and which groups of oral lesions have been most widely studied, with the final
goal of providing a profile of publications in the field. Articles were searched in the
Science Direct, PubMed, and BVS databases. Inclusion criteria were: a) publication
between 1981 and 2010; b) keywords “lectin” AND “binding” AND “oral” AND
“tumor”; and c) English abstract. A total of 108 articles were selected. Articles were
assessed and classified according to predetermined categories, especially number/types
of lesion and number/types of lectin analyzed. Results were assessed using the chisquare test. An increase throughout the years was observed in the number of articles
studying the use of lectins as tumor biomarkers. Squamous cell carcinoma and Arachis
hypogea (PNA) were the lesion and lectin more frequently assessed, respectively. It is
possible to conclude that the use of lectins as a therapeutic tool in cancer research has
been increasing in importance, probably as a result of its wide applicability, versatility,
and reliability.
Key words: Medical Oncology, Lectins, Mouth Neoplasms.
RESUMO: Com o advento de novas pesquisas abordando o processo neoplásico, um
grupo peculiar de proteínas tem sido amplamente estudado, as lectinas. Estas proteínas
possuem a capacidade de se ligarem de forma reversível a carboidratos com alta
especificidade. Devido às alterações no padrão glicoprotéico de superfície celular
durante o processo neoplásico, as lectinas se tornam uma ferramenta potencial como
biomarcadores de células neoplásicas. O presente trabalho investiga a produção
científica da aplicação lectinas como biomarcadores de lesões neoplásicas e
potencialmente neoplásicas da cavidade oral e analisar quais grupos de lectinas e lesões
orais foram mais extensamente estudados, com o objetivo final de traçar o perfil dessas
publicações. Realizou-se uma pesquisa de artigos científicos integrando periódicos
indexados na base de dados Science Direct, Pubmed e BVS. Os critérios de inclusão
estabelecidos foram: a) Tempo – de 1981 a 2010; b) Descritores – “lectin” AND
“binding” AND “oral” AND “tumor”; c) Resumo/abstract – língua inglesa. Foi obtido
um total de 108 artigos. As publicações foram avaliadas e classificadas em categorias
pré-estabelecidas, como número/tipos de lesões e número/tipos de lectinas analisadas.
As variáveis estudadas foram correlacionadas e o teste Qui-quadrado foi aplicado.
Houve notadamente um crescimento de estudos utilizando lectinas como biomarcadores
tumorais ao longo dos anos, em que a lesão mais amplamente estudada foi o carcinoma
espinocelular e a lectina mais avaliada foi a Arachis hypogea (PNA). Pode-se concluir
que a utilização de lectinas como ferramenta de diagnóstico é de crescente importância
para a pesquisa em cancerologia devido a sua aplicabilidade, versatilidade e
fidedignidade de resultados.
Palavras-chave: Oncologia, Lectina, Neoplasias Bucais.
RESUMEN: Con el desarrollo de la investigación del cáncer, un grupo peculiar de las
proteínas se ha convertido en objeto de gran atención a saber, las lectinas. Estas
proteínas tienen la capacidad de unirse de forma reversible a los carbohidratos con alta
especificidad. Debido a los cambios en los patrones de glicoproteína de superficie
celular durante la formación del tumor, las lectinas tienen un importante papel potencial
como marcadores de las células neoplásicas. El presente artículo fue diseñado para
revisar la literatura disponible sobre el uso de lectinas como marcadores biológicos de
las lesiones premalignas y neoplásicas, con un enfoque en los tumores de cavidad oral,
y evaluar en que los grupos de las lectinas y que los grupos de las lesiones orales han
sido más estudiadas, con el objetivo final de ofrecer un perfil de las publicaciones en el
campo. Se buscaron en las bases de datos Science Direct, PubMed, y BVS. Los criterios
de inclusión fueron: a) la publicación entre 1981 y 2010, b) las palabras clave "lectin"
AND "binding" AND "oral" AND "tumor", y c) Inglés abstracto. Un total de 108
artículos fueron seleccionados. Los artículos fueron evaluados y clasificados de acuerdo
a categorías predeterminadas, especialmente el número y tipos de lesión y el número y
tipos de lectina analizados. Los resultados fueron evaluados mediante el test de chicuadrado. Aumenta a lo largo de los años se observó en el número de artículos
estudiando el uso de lectinas como biomarcadores tumorales. El carcinoma de células
escamosas y Arachis hypogea (PNA) fueron la lesión y la lectina con más frecuencia
evaluados, respectivamente. Es posible concluir que el uso de lectinas como
herramienta terapéutica en la investigación del cáncer ha aumentado en importancia,
probablemente como resultado de su amplia aplicabilidad, versatilidad y fiabilidad.
Palabras clave: Oncología Médica, Lectina, Neoplasias de la Boca.
INTRODUCTION
Malignant tumors of the oral cavity represent a major public health concern,
especially in view of the increasing incidence and prevalence rates observed along the
last few years1. In 1999, Parkin et al. estimated about 210,000 new cases per year
worldwide2. In Brazil, a total of 14,120 new cases of malignant tumors of the oral cavity
have been estimated for the year 20103.
Motivated by this scenario, several studies have been conducted to investigate
oral cavity malignancies, with a particular focus on cell differentiation (formation
process) and cell identification methods. In particular, some studies have shown that the
process of malignancy is associated with a variety of changes in cell surface
carbohydrate expression, not to mention the role played by carbohydrates in
determining the metastatic capabilities of neoplastic cells4-8.
Nangia-Makker et al., in 2002, reported that developing cancer cells use the
functional groups of carbohydrate molecules to avoid being recognized by immune
cells9. During metastasis formation, carbohydrates are involved in interactions between
tumor cells, between tumor cells and the extracellular membrane, or between tumor
cells and endothelial cells4. However, due to the structural complexity of carbohydrates
and the scarce knowledge currently available in the field of glycobiology, a better
understanding of this mechanism is not yet possible6,9,10.
In an attempt to overcome these difficulties and to better understand the process
of malignancy, a unique group of proteins, namely the lectins, has become the subject of
special attention. Lectins are proteins of nonimmune origin comprised by several
structures that have the ability to bind reversibly to carbohydrates, recognizing and
agglutinating specific oligosaccharides or glycoconjugates4. Due to these specific
features, lectins have been widely used in different biological and medical applications.
In immunohistochemical examinations, for example, lectins recognizing different
carbohydrates may provide a detection system sensitive to changes in glycosylation and
carbohydrate expression at different stages of disease onset/progression, including
embryogenesis, growth, and cellular pathology8. In addition, studies in the field of tumor
lectinology have been able to identify differences between normal tissue and tumor cells in
brain11, breast12, and oral cancer13.
The high number of lectins so far submitted to individual investigation has
opened a wide variety of possibilities of studies involving these proteins. In order to
facilitate and guide future studies designed to investigate the role of lectins as
biomarkers of oral cavity tumors, a review of the current literature becomes extremely
useful, with a focus on which lectins have already been studied and which lesions have
already been assessed in association with such lectins.
The objective of this study was to review the relevant scientific literature
published along the last 30 years (1980 to 2010) on the use of lectins as biomarkers of
oral cavity tumors and premalignant lesions.
METHODOLOGY
a) Sample delimitation.
The following Brazilian and international journal databases were reviewed:
Science Direct, PubMed and BVS (Biblioteca Virtual em Saúde). Selection of these
databases was based on the wide range of journals covered by each of them and on our
goal to provide an overview of the scientific production devoted to the topic over the
long time frame under analysis.
The following inclusion criteria were considered during the review: a) articles
published between January 1981 and June 2010; b) presence of the keywords “lectin”
AND “binding” AND “oral” AND “tumor,” entered into the advanced search form; and
c) availability of an abstract in English. A total of 108 articles were selected.
b) Sample classification.
All the 108 abstracts were read and assessed to determine the classification of
articles for subsequent quantitative analysis. In cases where the abstract was not enough
to allow classification, the full article was read. Each article was classified according to
the following attributes: title of article, year of publication (subcategories
[quinquenniums]: first period, 1981 to 1985; second period, 1986 to 1990; third period,
1991 to 1995; fourth period, 1996 to 2000; fifth period, 2001 to 2005; sixth period,
2006 to 2010), journal name, language of publication, number and types of lesion
assessed; and number and types of lectin analyzed in the study. Lesions were classified
according to the World Health Organization (WHO)14 classification for oral cavity
diseases; lectins were classified both in terms of kingdom (animal vs. vegetable) and
family/group, based on the classifications of Peumans and Van Damme15 and Varki16.
c) Statistical analysis.
Data were entered into Microsoft Excel 2007 spreadsheets and systematically
transferred to the Statistical Package for the Social Sciences (SPSS) version 17.0 for
statistical analysis. Frequency distribution calculations were used to assess general
sample characteristics, to investigate possible spelling errors in the raw data, and to
obtain an overview of the use of lectins as biomarkers of oral cavity tumors.
RESULTS
a) Studies distribution over the years.
Analysis of the distribution of publications over the different quinquenniums
revealed a large concentration of studies in the first period (1981 to 1985, 26 studies),
followed by a significant decrease in the second period (1986 to 1990, 10 studies). In
the fifth period (2001 to 2005), a return to early patterns was observed, with a total of
24 publications (Table 1).
Figure 1 shows the same distribution of studies, however divided into plant vs.
animal lectins. It is possible to observe that up to the third period assessed (1981-1995),
100% of the publications focused on plant lectins, whereas studies using animal lectins
started to be conducted as of 1996 and accounted for the majority of studies in the two
last periods assessed (6 animal vs. 11 plant lectins in the fourth period, 17 vs. 9 in the
fifth, and 16 animal vs. 4 plant lectins in the sixth period assessed) (Figure 1).
b) Language of publication.
Most of the articles reviewed were written in English (91 articles, 84.3%),
followed by German (7, 6.5%), Japanese (5, 4.6%), Chinese (4, 3.7%), and French (only
1 article, 0.9%).
c) Number of lesions and lectins analyzed.
Of the total of 108 studies, 47 (43.5%) analyzed only one lectin, 29 (26.9%)
analyzed two, 15 (13.9%) analyzed three, and only 17 studies (15.7%) analyzed four or
more lectins. In addition, 86 articles (79.6%) investigated one type of lesion, 14 (13%)
investigated two lesions, and 8 articles (7.4%) investigated three or more types of
lesions.
d)Evaluation of studied lesions and lectins.
The list of lectins and types of lesions analyzed and the respective absolute and
relative frequencies are shown in Tables 2 and 3. Among the lesions assessed, there was
a predominance of malignant lesions (63.6%), followed by benign lesions (21.4%).
Figure 2 shows the distribution of lesions in the different quinquenniums
assessed. It is possible to observe that malignant and benign neoplasms showed a
similar distribution, whereas premalignant lesions showed an important decline in the
sixth/last period assessed, in which no study was found.
In order to better assess the profile of publications, the distribution of lectins
analyzed was assessed in relation to the three major groups of lesions covered by the
studies (Table 4). This analysis revealed that the two lectins most commonly present in
all three groups of lesions were Arachis hypogea (PNA) and Ulex europaeus 1 (UEA1), both of vegetable origin. Moreover, in the groups of benign and malignant
neoplasms, animal lectin Galectin 3 ranked fourth among the most frequently analyzed
lectins, contrasting with a predominance of plant lectins found in these groups.
Conversely, in the group of premalignant lesions, animal lectins were virtually absent
(only one study analyzing Selectin E).
Finally, the analysis of association between lectins and the most prevalent
lesions in each group (leukoplakia among premalignant lesions, pleomorphic adenoma
among benign neoplasms, and squamous cell carcinoma among malignant neoplasms)
revealed a predominant association between studies assessing pleomorphic adenomas
and analyzing Concanavalin A (ConA) (five studies) rather than PNA, which belongs to
the same group; all other lesions were associated with lectins representative of their
groups of origin (Table 5).
DISCUSSION
Several experimental data on different types of malignancies have been
published in recent years6,8,13,17. These studies have revealed that the process of
malignancy is associated with several changes in cellular glycosylation and that tumor
cells show aberrant patterns in relation to carbohydrates attached to glycoproteins and
glycolipids5. In view of this wide range of studies devoted to the study of malignancies
and lectins, we felt the need for conducting a review of studies published in the field
along the last decades. To the authors’ knowledge, no previous review study has
focused on lectins, and therefore we strongly believe that our results will provide an upto-date overview of the topic and will better guide future efforts to improve our
understanding of the role of lectins as tumor biomarkers.
Our review revealed a peak of studies on the use of lectins as markers of oral
cavity tumors in years 1981-1985, when the first lectins were isolated and their
biological functions had not yet been established. Over subsequent years, the number of
publications in the field decreased due to the belief that lectins did not have an
important biological role6,10,15. Then, in the second half of the 1990s, with the discovery
of animal lectins, a new research field emerged, stimulating authors to investigate the
association between the ability of lectins to bind to carbohydrates and the tumor cell
differentiation process16. This historical movement is illustrated in Figure 1.
The variable characteristics of studies found in our review, especially in terms of
the numbers and types of lesions and lectins analyzed, hinders the possibility to conduct
comparisons across studies. For example, there were very few studies addressing the
role of multiple lectins in one particular type of lesion, or the role of a single lectin in
different lesions. As revealed in our review, most studies addressed the role of one
lectin in one particular type of lesion, probably as a result of limitations regarding lectin
isolation methods, as pointed out by Goto18.
An interesting feature observed in our review was a decrease in the number of
studies assessing premalignant lesions (Figure 2), whereas studies assessing other
groups of lesions maintained a pattern similar to the overall findings of the study (Table
1). Caldeira19 had already emphasized that the search for biomarkers that reflect the
biological behavior of leukoplakias was necessary to identify predictive characteristics
of malignant transformation, thus contributing to a less empirical approach to these
lesions.
Among all lesions assessed in the articles submitted to review, squamous cell
carcinoma was the most prevalent one. According to Oliveira et al.20, this is the most
common type of malignancy of the oral cavity, responsible for 55-75% of all cancers
affecting this region of the face. This finding is in line with the frequencies observed for
premalignant lesions in our review, with leukoplakia being the most frequent lesion.
Finally, with respect to benign tumors, variable prevalence rates were found. According
to Barbosa et al.21, for example, pleomorphic adenomas are the most prevalent type of
benign neoplasm affecting the oral cavity.
Plant lectinology has evolved extensively in recent decades, in great part due to
technological development. In addition, plant lectins are more easy to obtain when
compared to animal lectins, and they can be conveniently purified using simple and
efficient methods such as affinity chromatography8,18. Our study confirmed the wide use
of plant lectins in the study of tumors, as revealed by the high numbers obtained: 78.6%
vs. only 21.4% of animal lectins (Galectin 3 was the animal lectin most frequently
assessed). In the group of plant lectins, PNA, UEA-1, and ConA (all leguminous) were
the lectins most frequently assessed and associated with different types of lesions.
The Leguminosae family of plant lectins has been widely described in the
literature, especially because they contain ions Mn2+ and Ca2+, which are associated
with a series of highly conserved amino acids involved in carbohydrate binding
processes8,9,13,18. Usually the lectins in the Leguminosae family (subfamily
Papilonideae) have similar molecular structures, however they can produce patterns of
affinity for different carbohydrates, which directly contributes to the identification of
tumor biomarkers6,10.
In the study conducted by Sobral et al.8, leguminous lectins ConA and UEA-1
were used as histochemical markers of neoplastic glandular tissue with low,
intermediate, and high grade dysplasia. The authors found that ConA localization in the
cytoplasm and/or plasma membrane was significantly associated with neoplastic cells of
all three grades of severity, whereas UEA-1 was associated with low and intermediate
grade dysplasia. Similar results were obtained by the authors in the analysis of other cell
regions.
In turn, the use of PNA as a tumor biomarker has been the subject of several
studies. In 1996, Pillai et al.13 assessed the patterns of PNA binding in different types of
lesions, including keratinizing and non-keratinizing epithelia of the oral mucosa,
dysplastic and non-dysplastic oral leukoplakias, and squamous cell carcinomas. The
authors found a high intensity of lectin binding in normal keratinizing tissue, erosive
leukoplakias and squamous cell carcinomas at all three differentiation stages assessed.
In 2000, Mori et al.17 assessed the use of several lectins as immunohistochemical
markers of benign lesions affecting the jaws, including ameloblastomas and
dentinogenic ghost cell tumors (GCT). ConA, PNA, and UEA-1 were significantly
more present in ameloblastic cells, whereas GCT showed a high rate of binding for
UEA-1 only (ConA and PNA presented low binding rates in this type of tissue).
Among animal lectins, galectins stand out because they have a permanent
sequence of about 130 amino acids for the recognition of carbohydrates, in addition to a
high affinity for beta-galactosides present in both normal and tumor cells. As a result of
this lectin-cell interaction property, galectins are involved in several biological
processes, such as cell cycle control, immune response, cell adhesion, apoptosis, and
metastasis4,22-24.
Galectin 3 can present both nuclear and cytoplasmic immunohistochemical
staining. Cytoplasmic staining is associated with the antiapoptotic function of this
lectin, thus promoting tumor progression; however, when expressed in the nucleus, the
apoptotic function of Galectin 3 is lost24.
Gillenwater et al.25 analyzed the expression of Galectins 1 and 3 in 35 cases of
primary squamous cell carcinoma of the head and neck and found that Galectin 1 was
usually expressed in the basal layer of adjacent normal tissue, stroma and at the
periphery of invasive tumor islands. Galectin 3, in turn, was found in superficial
mucosal layers and adjacent to keratin pearls in areas of invasion. The authors
concluded that galectins are expressed in the tumor cell surface, where they may
participate in cellular interactions, and that the expression pattern of galectins appears to
be associated with tumor grade, suggesting a role of galectins as biological markers in
squamous cell carcinomas of the head and neck.
The absence of studies investigating the use of animal lectins in leukoplakias
was especially interesting (Table 5). However, this finding can be explained by the
predominance of studies assessing these lesions in the first three time periods assessed
(1981 to 1995), when animal lectins had not yet been discovered.
CONCLUSION
A relatively high number of studies has been conducted to investigate the role of
lectins as biomarkers of oral cavity tumors, covering a variety of lesions and lectins. In
our review, studies assessing squamous cell carcinomas and PNA and UEA-1 lectins
were the most frequent ones, as well as studies focusing on one specific lectin and one
lesion. Further analyses of lectins as biomarkers should be undertaken to improve our
understanding of the processes involved in malignant tumor formation.
ACKNOWLEDGMENTS
The authors thank CNPq for fellowship granted to Bruno Rocha da Silva.
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ILLUSTRATIONS AND TABLES
Nº of Publications
30
Vegetable kingdom
20
Animal kingdom
10
0
1981 to 1985 1986 to 1990 1991 to 1995
1996 to 2000
2001 to 2005 2006 to 2010
Quinquennium
Figure 1: Distribution of publications according to kingdom of the lectin analyzed, by
quinquennium.
20
Nº of Publications
Premalignant lesions
Benign neoplasms
Malignant neoplasms
10
0
1981 to 1985
1986 to 1990
1991 to 1995 1996 to 2000
2001 to 2005 2006 to 2010
Quinquennium
Figure 2: Distribution of the analysed lesions according to the WHO classification, by
quinquennium.
Table 1. Distribution of publications from 1981 to 2010, by quinquennium
1981 to 1985
1986 to 1990
1991 to 1995
1996 to 2000
2001 to 2005
2006 to 2010
Total
Absolute value (n)
Relative value (%)
26
10
12
16
24
20
108
24.1
9.3
11.1
14.8
22.2
18.5
100
Cumulative relative
frequency (%)
24.1
33.3
44.4
59.3
81.5
100
Table 2. Lectins analyzed in the articles reviewed*
Absolute value (n)
Relative value (%)
Cumulative relative
frequency (%)
41
27
16.5
10.9
16.5
27.4
9
3.6
31
24
9.7
40.7
14
3
5.6
1.2
46.3
47.5
3
8
1.2
3.2
48.7
51.9
2
0.8
52.7
1
0.4
53.1
1
0.4
53.5
2
2
0.8
0.8
54.3
55.1
15
6
61.1
1
40
0.4
16.1
61.5
77.6
2
0.8
78.4
3
13
19
8
3
2
4
1
248
1.2
5.2
7.7
3.2
1.2
0.8
1.9
0.4
100
79.6
84.8
92.5
95.7
96.9
97.7
99.6
100
Plant lectins
Arachis hypogea (PNA)
Concanavalina A
(ConA)
Dolichos biflorus
(DBA)
Triticum vulgaris
(WGA)
Glycine max (SBA)
Griffonia simplicifolia
B4 (GS 1 B4)
Helix pomatia (HPA)
Artocarpus
heterophyllus (JFL)
Lotus tetragonolobus
(LTA)
Maackia amurensis
(MAA)
Phaseolus vulgaris
(PHA)
Pisum sativum (PSA)
Psophocarpus
tetragonolobus (WBA)
Ricinus communis
(RCA)
Sambucus nigra (SNA)
Ulex europaeus 1
(UEA-1)
Vicia villosa B4 (VVAB4)
Animal lectins
Aggrecan
Galectin 1
Galectin 3
Galectin 7
Galectin 8
Galectin 9
Selectin E
Versican
Total
* More than one lectin was assessed in some articles, therefore the total number of
lectins analyzed exceeds the total number of studies reviewed.
Table 3. Lesions assessed (WHO classification) in the articles reviewed *
Absolute value (n) Relative value (%)
Cumulative
relative frequency
(%)
Malignant neoplasms
Low-grade
13
9.3
9.3
adenocarcinoma
Adenosquamous carcinoma
1
0.7
10
Adenoid cystic carcinoma
10
7.1
17.1
Squamous cell carcinoma
57
40.7
57.8
Mucoepidermoid
4
2.9
60.7
carcinoma
Verrucous carcinoma
2
1.4
62.1
Osteosarcoma
1
0.7
62.8
Kaposi's sarcoma
1
0.7
63.5
Benign neoplasms
Pleomorphic adenoma
14
10
73.5
Ameloblastoma
2
1.4
74.9
Hemangioma
1
0.7
75.6
Papilloma
5
3.6
79.2
Ghost cell tumor
2
1.4
80.6
Warthin’s tumor
6
4.3
84.9
Premalignant lesions
Oral submucous fibrosis
2
1.4
86.3
Atypical hyperplasia
1
0.7
87
Leukoplakia
18
13
100
140
100
Total
* More than one lesion was assessed in some articles, therefore the total number of
lesions assessed exceeds the total number of studies reviewed.
Table 4. Distribution of lectins according to the type of lesion assessed (WHO classification) in the articles reviewed
Galectin 1
Galectin 3
Galectin 7
Galectin 8
Galectin 9
Triticum vulgaris (WGA)
Glycine max (SBA)
Griffonia simplicifolia B4 (GS
I-B4)
Helix pomatia (HPA)
Artocarpus heterophyllus (JFL)
Lotus tetragonolobus (LTA)
Maackia amurensis (MAA)
Phaseolus vulgaris (PHA)
Pisum sativum (PSA)
Psophocarpus tetragonolobus
(WBA)
Ricinus communis (RCA)
Selectin E
Ulex europaeus 1 (UEA-1)
Vicia Villosa B4 (VVA-B4)
N
0
13
7
2
0
0
0
0
0
9
3
2
2
4
1
0
0
2
3
0
1
12
0
0
61
%
0
3.8
2.1
0.6
0
0
0
0
0
2.7
0.9
0.6
0.6
1.2
0.3
0
0
0.6
0.9
0
0.3
3.6
0
0
18.2
N
1
12
11
4
5
9
3
2
1
7
6
1
2
2
0
0
0
0
6
0
1
12
0
0
85
%
0.3
3.6
3.3
1.2
1.5
2.7
0.9
0.6
0.3
2.1
1.8
0.3
0.6
0.6
0
0
0
0
1.8
0
0.3
3.6
0
0
25.3
N
2
29
19
5
12
17
4
1
1
16
10
3
2
8
2
1
2
3
12
1
4
31
1
2
189
%
0.6
8.7
5.8
1.5
3.6
5.1
1.2
0.3
0.3
4.8
3
0.9
0.6
2.4
0.6
0.3
0.6
0.9
3.6
0.3
1.2
9.3
0.3
0.6
56.5
N
3
54
37
11
17
26
7
3
2
32
19
6
6
14
3
1
2
5
21
1
6
55
1
2
335
%
0.9
16.1
11.0
3.3
5.1
7.8
2.1
0.9
0.6
9.6
5.7
1.8
1.8
4.2
0.9
0.3
0.6
1.5
6.3
0.3
1.8
16.4
0.3
0.6
100.0
Total
Dolichos biflorus (DBA)
Malignant
neoplasms
Concanavalina A (ConA)
Benign
neoplasms
Premalignant
lesions
Aggrecan
Lectins analyzed
Total
Table 5. Distribution of lectins according to the most prevalent lesions in each group
Concanavalina A (ConA)
Dolichos biflorus (DBA)
Galectin 1
Galectin 3
Galectin 7
Galectin 8
Galectin 9
Triticum vulgaris (WGA)
Glycine max (SBA)
Griffonia simplicifolia B4 (GS
I-B4)
Helix pomatia (HPA)
Artocarpus heterophyllus (JFL)
Lotus tetragonolobus (LTA)
Maackia amurensis (MAA)
Phaseolus vulgaris (PHA)
Pisum sativum (PSA)
Psophocarpus tetragonolobus
(WBA)
Ricinus communis (RCA)
Selectin E
Ulex europaeus 1 (UEA-1)
Vicia Villosa B4 (VVA-B4)
N
0
12
6
2
0
0
0
0
0
8
3
2
2
3
1
0
0
0
1
2
0
1
10
0
53
%
0
6.1
3.2
1
0
0
0
0
0
4.1
1.5
1
1
1.5
0.5
0
0
0
0.5
1
0
0.5
5.1
0
27
N
1
3
5
0
3
4
1
0
1
2
1
0
1
1
0
0
0
0
0
2
0
0
5
0
30
%
0.5
1.5
2.6
0
1.5
2.1
0.5
0
0.5
1
0.5
0
0.5
0.5
0
0
0
0
0
1
0
0
2.6
0
15.3
N
2
18
9
2
9
7
3
1
1
9
3
3
2
7
2
1
1
1
2
5
1
3
20
1
113
%
1
9.3
4.6
1
4.6
3.6
1.5
0.5
0.5
4.6
1.5
1.5
1
3.6
1
0.5
0.5
0.5
1
2.6
0.5
1.5
10.3
0.5
57.7
N
3
33
20
4
12
11
4
1
2
19
7
5
5
11
3
1
1
1
3
9
1
4
35
1
196
%
1.5
16.7
10.3
2.1
6.1
5.6
2.1
0.5
1
9.7
3.6
2.6
2.6
5.6
1.5
0.5
0.5
0.5
1.5
4.6
0.5
2.1
17.8
0.5
100.0
Total
Aggrecan
Lectins analyzed
Leukoplakia
Pleomorphic
adenoma
Squamous
cell
carcinoma
Total
Cell Tissue Res (2011) 346:237–244
DOI 10.1007/s00441-011-1239-x
REGULAR ARTICLE
Immunostimulatory activity of ConBr: a focus on splenocyte
proliferation and proliferative cytokine secretion
Flávio de Oliveira Silva & Priscila das Neves Santos &
Cristiane Moutinho Lagos de Melo & Edson Holanda Teixeira &
Benildo de Sousa Cavada & Valéria Alves Rêgo Pereira & Ana Lúcia Figueiredo Porto &
João Batista Cajazeiras & Francisco Vassiliepe Sousa Arruda &
Alysson Chaves Almeida
Received: 16 February 2011 / Accepted: 1 September 2011 / Published online: 19 October 2011
# Springer-Verlag 2011
Abstract Lectins constitute a class of glycoproteins, which
are capable of selectively and reversibly binding to
carbohydrates, distinguishing small structural differences
in complex oligosaccharides. Studies have shown that the
binding of lectins to cell-surface carbohydrates can lead to
various effects such as cellular proliferation, histamine
release and cytokine production. Canavalia brasiliensis
lectin (ConBr) is a (D-mannose) D-glucose lectin. In this
F. de Oliveira Silva : A. L. F. Porto
Departamento de Morfologia e Fisiologia Animal,
Universidade Federal Rural de Pernambuco,
Recife, Pernambuco, Brazil
P. das Neves Santos
Centro de Ciências biológicas,
Universidade Federal de Pernambuco,
C. M. L. de Melo : V. A. R. Pereira
Departamento de Imunologia do Centro de Pesquisas Aggeu
Magalhães - CPqAM/FIOCRUZ-UFPE,
E. H. Teixeira : B. de Sousa Cavada
Departamento de Bioquímica e Biologia Molecular,
Universidade Federal do Ceará,
Fortaleza, Brazil
F. de Oliveira Silva (*)
Setor de Biotecnologia,
Laboratório de Imunopatologia Keizo Asami - LIKA/UFPE,
Av. Moraes Rego s/n, Cidade, Universitária,
50670-420 Recife, PE, Brazil
e-mail: [email protected]
J. B. Cajazeiras : F. V. S. Arruda : A. C. Almeida
Biomol-Lab, Departamento de Bioquímica e Biologia Molecular,
Universidade Federal do Ceará,
Fortaleza, Brazil
study, murine splenocytes were cultured to determine the
effect of ConBr on cell proliferation, nitric oxide (NO)
release and cytokine secretion. In addition, cellular viability
assays were performed to evaluate any mitogenic activity
induced by this lectin. ConBr significantly increased cell
proliferation with minimal cell damage. This lectin was
able to induce an increased production of cytokines such as
IL-2, IL-6 and IFN-γ and a decreased production of IL- 10.
The release of NO was also observed. The results of this
study indicate that ConBr could potentially be used as an
immunomodulator.
Keywords Canavalia brasiliensis . ConBr . Lectins .
Glucose/mannose binding-lectin . Proliferative activity
Introduction
Lectins are ubiquitous proteins of non-immune origin present
in plants, microorganisms, animals and humans; these
proteins specifically bind to defined monosugar or oligosaccharide structures. Significant progress has been made in
recent years in understanding the crucial roles played by
lectins in several biological processes (Wu et al. 2009).
The most thoroughly investigated lectins are derived
from plants, particularly from the Leguminosae family.
Legume lectins are a large group of structurally similar
proteins with distinct carbohydrate specificities. The subtribe Diocleinae (Leguminosae) comprises 13 genera,
mostly from the New World and lectins have been isolated
from plants belonging to three of these genera, i.e.
Canavalia, Cratylia, and Dioclea (Cavada et al. 2001).
Many studies have shown immunological activity
induced by D-mannose (Dglucose) and other specific
238
binding lectins. In fact, a large number of lectins with
distinct characteristics and specificities have been used for
their immunomodulatory activity, lymphoproliferation and
functional activation of monocytes and macrophage-like
cells (Tamma et al. 2003; Lee et al. 2007; Melo et al.
2010a).
ConBr, a lectin isolated from Canavalia brasiliensis seeds,
presents similar homology (99%) and physical properties to
Concanavalin A (Con A), a lectin isolated from Canavalia
ensiformis. Con A was the first lectin to be isolated and
sequenced and to have its three-dimensional structure
determined by X-ray crystallography (Cavada et al. 2001).
ConBr has previously been shown to induce the following
effects: proliferation and IFN-γ production in cultured
peripheral blood mononuclear cells (Barral-Netto et al.
1992); nitric oxide (NO) production by murine macrophages
in vitro and in vivo (Andrade et al. 1999); in vivo lymphocyte
activation and apoptosis (Barbosa et al. 2001); IFN-γ, IL-10,
IL-4, granulocyte macrophage colony-stimulating factor
(GMCSF) and TNF-α production in human peripheral blood
mononuclear cells (Cavada et al. 2001); and histamine
release from mast cells (Lopes et al. 2005).
To investigate the development of the immune response,
the present study analysed, in vitro, the immunostimulatory
response induced by ConBr in murine splenocyte cultures
by measuring the levels of NO, IFN-γ, IL-6, IL-2 and IL-10
produced.
Changes in cell proliferation and cell death induced by
the ConBr lectin were also analysed.
Cell Tissue Res (2011) 346:237–244
obtain a cell pellet. The contaminating red blood cells were
removed by using haemolytic Gey’s solution. Cells were
centrifuged and suspended in complete RPMI1640. The
cell concentration was adjusted to 1×106 cells/ml and the
viability of the splenocytes (tested by trypan blue dye
exclusion) was always over 90%.
Proliferation of murine splenocytes
Mice splenocytes (4×105 cells/well) were cultured (37°C/5%
CO2) in triplicate on 96-well culture plates and incubated
with Con A (2.5 μg/ml) and ConBr (2.5, 5, and 10 μg/ml). A
non-stimulated culture plate was used as a negative control.
After an initial 60 h of incubation, a radioactive precursor,
0.5 μCi [3H]-TdR (Amersham Biosciences), was added to
each well. Cultures were incubated for an additional 12 h
before they were harvested and the incorporated radioactivity
was determined (Wong and Ng 2003).
Cytokine determination
Materials and methods
Splenocytes were cultured on 24-well plates at a density of
106 cells/well.
Cytokines were quantified at 24 h, 48 h, 72 h and 6 days
in the supernatants of cultures stimulated with ConBr at
10 μg/ml, Con A at 2.5 μg/ml, or maintained only in the
culture medium (negative control). Culture supernatants
were collected and the concentrations of the cytokines (IL2, IL-6, IL-10 and IFN-γ) present in the supernatants were
determined using an enzyme-linked immunosorbent assay
from Kit OptEIA (BD Biosciences, San Diego, CA, USA),
according to the manufacturer's instructions.
Animals
Determination of nitric oxide (NO) production
Male BALB/c mice, 6–8 weeks old, were housed in opentop cages and maintained on food and water ad libitum. A
room temperature of 22±2°C and a light/dark cycle of 14/
10 h were maintained.
Mice spleen cells were used to evaluate nitrite concentration after stimulation with Con A (2.5 μg/ml) and ConBr
(10 μg/ml) for 24 h, 48 h, 72 h and 6 days. Culture media
were carefully collected for subsequent analysis using the
colorimetric Griess method (Ding et al. 1988). NO
concentration was estimated using a standard curve (3.12–
100 μmol/ml).
Lectins
The lectin isolated from Canavalia brasiliensis seeds was
purified by affinity chromatography on a Sephadex G-50
column (Moreira and Cavada 1984). Canavalia ensiformis
lectin (Concanavalin A) was purchased from Sigma
Chemical Co. (St Louis, MO, USA).
Splenocytes
A single-cell suspension of spleen from normal mice under
aseptic conditions was prepared by homogenization in
RPMI-1640 medium. The suspension was centrifuged to
Flow cytometry analysis
The levels of apoptosis 24 and 48 h after Con A (2.5 μg/ml)
and ConBr (10 μg/ml) treatments were examined to
monitor cell recovery. Annexin V binding and propidium
iodide staining were determined using flow cytometry. The
cells were washed with ice-cold phosphate-buffered saline
(PBS) and double stained with FITC-coupled Annexin V
protein and propidium iodide for 20 min. Flow cytometry
was performed using a 488-nm laser coupled to a cell sorter
Cell Tissue Res (2011) 346:237–244
239
(FacsCalibur; BD Biosciences, Mountain View, CA, USA).
The results were analysed using dot plots. Double negatives
(Annexin-FITC-/PI-) were considered viable cells. AnnexinFITC+/PI- represented splenocytes in the early stages of
apoptosis. Double positives (Annexin-FITC+/PI+) represented spleen cells in the late stages of apoptosis and PI+
cells were considered to be necrotic.
Statistical analysis
All data were analysed using non-parametric tests. To
detect differences among groups, the Mann-Whitney U test
was used. All results were expressed using mean values ±
standard deviation (SD) and were considered statistically
significant when the p value was <0.05.
Proliferative response was induced by ConBr treatment
through IL-2, IL-6 and cell proliferation stimuli
Fig. 1 Splenocytes proliferation. Murine splenocytes (106 cells/ml)
were stimulated by ConBr (2.5–10 μg/ml) and Con A (2.5 μg/ml) for
72 h at 37°C in a humidified atmosphere of 5% CO2. Non-stimulated
splenocytes cultured under the same conditions were used as a control.
Increases in cell number were measured using the [3H]-thymidine
assay method. Values represent the mean ± SD of three replicates.
Statistical analysis was done using the Prism 5.0 software. Differences
were considered significant at p<0.05 as compared to the control
Carbohydrates can act as the intermediates of biological
communication in biological processes such as differentiation, proliferation and certain cell–cell interactions that are
crucially important in both physiological and pathological
phenomena. The information contained in the enormous
variety of oligosaccharide structures normally conjugated to
proteins or lipids on cell surfaces (glycocodes) is recognized and deciphered by a specialized group of structurally
diverse proteins, the lectins (Sanz-Aparicio et al. 1997).
Lectins find application in a variety of studies, including
blood group and erythrocyte polyagglutination studies,
lymphocyte subpopulation studies, histochemical studies
of healthy and pathological conditions and chromatographic
experiments. Lectins are believed to be dynamic contributors to tumour cell recognition, cell adhesion and
localization, signal transduction across membranes, mitogenic stimulation, potentiation of host immune defence,
cytotoxicity and apoptosis (Wanga et al. 2000).
Several plant lectins, such as the L4 isolectin of PHA,
Con A, the pokeweed mitogen (PWM), Maclura pomifera
agglutinin (MPA) and Pisum sativum agglutinin (PSA), are
potent mitogens for human lymphocytes. The growth
stimulatory effect of lectins corresponds with the observation that certain growth factors/interleukins recognize their
receptors via a lectin-like interaction. Furthermore, some
plant lectins have the capacity to non-specifically augment
the host’s immune defence mechanisms (Mody et al. 1995).
A proliferative assay, using the [3H]-thymidine technique,
was performed to measure ConBr stimulation in cell
cultures. An increase in cell number indicates an effect on
the immune system by the secretion of cytokines and the
activation of accessory cells. Our results showed that ConBr
was able to induce the proliferation of murine splenocytes at
all concentrations; Con A was used as a positive control
(Fig. 1). At the same concentration (2.5 μg/ml), ConBr
stimulated greater proliferation than did Con A. The
maximum proliferation index was observed at 10 μg/ml.
The proliferation indices of both Con A and ConBr were
higher than those of non-stimulated cells.
Mitogenic lectins utilize the capacity of proteincarbohydrate interactions and glycan cross-linking to
stimulate immune parameters. The degree of immune
response depends on the affinity of a lectin for the cellsurface glycans of receptors and coreceptors (Gabius 1994).
Activated proliferating lymphocytes are known to
express a number of molecules on their surfaces, namely,
CD25, CD69, CD71 and HLA-DR, usually expressed
minimally or even absent from resting cells and thus
termed ‘activation antigens’ (Zhang et al. 2002). Of crucial
importance for the delivery of IL-2 signals to regulatory T
cells is the expression of CD25, which, along with CD122
and γ, confers high-affinity binding to IL-2 (Létourneau et
al. 2009). ConBr was found to increase the ex vivo
expression of CD25 on the surfaces of stimulated lymph
node cells. CD25 comprises the chain of the IL-2 receptor
and its expression has also been demonstrated to be upregulated in T lymphocytes upon stimulation with Con A
(Barbosa et al. 2001).
The binding of multivalent lectins to cells results in the
cross-linking of cell- surface receptors, which, in turn, is
associated with a variety of biological signal transduction
processes, including mitogenesis (Cavada et al. 2001).
Results and discussion
240
Many glucose, mannose and galactose-binding proteins
have been demonstrated to stimulate cell proliferation.
There is a strong correlation between a high-binding
capacity and the ability to activate naïve lymphocytes in
vitro. Con A binds to T-cell receptor CD3 and to other cellsurface receptor molecules to induce a strong T-cell
mitogenic response (Pani et al. 2000).
Glucose/mannose-specific lectins obtained from seeds of
the same tribe (Dioclea) had similar structures but were
distinct in their ability to stimulate human lymphocytes.
The diverse molecular forms of these lectins can be
presented in a variety of combinations, which may explain
the subtle differences in their mitogenic activities. These
subtle differences may also be attributed to the amino acid
sequence in the carbohydrate-binding site responsible for
sugar interaction, which may affect the specificity for sugar
in the cell membrane (Barral-Netto et al. 1992). Since
ConBr is largely homologous to Con A, differing from it by
only three residues (Grangeiro et al. 1997), it is believed
that ConBr may produce similar effects through the
recognition of cells by very distinct cell-surface receptors.
Many lectins act as mitogenic compounds. Abrin lectin,
extracted from the Abrus precatorius plant, can induce the
proliferation of splenocytes leading to a Th1 response, NK
cell activation (Bhutia et al. 2009) and the stimulation of
peritoneal macrophages in mice splenocytes (Tripathi and
Maiti 2003). Jacalin, purified lectin from the seeds of the
Artocarpus heterophyllus plant, stimulates T cells, especially TCD4+ lymphocytes (Pineau et al. 1990), promotes the
binding of Con A to T-cell receptor CD3 and other cell
surface co-receptor molecules and induces a strong T-cell
mitogenic response associated with cytokine expression and
secretion (Pani et al. 2000; Tripathi and Maiti 2005).
Protein carbohydrate interactions occur in a number of
biochemical processes in a variety of different cell types
including lymphocytes, mast cells, macrophages and
neutrophils (Barbosa et al. 2001; Lopes et al. 2005; Alencar
et al. 2007; Figueiredo et al. 2009). These interactions are
believed to serve as major signals in these cells, stimulating
the release of proinflammatory mediators such as leukotrienes, NO and cytokines (Benjamin et al. 1997), including
IL-1, IL-6, IL-10, TNF-α and GMCSF (Cavada et al.
2001).
In the present study, we examined the immunostimulatory properties of ConBr on immune cells and attempted to
determine the type of immune response by measuring the
secreted cytokines produced by lectin-stimulated mice
splenocytes.
Both of the lectins tested induced high IL-2 production
(Fig. 2). ConBr was capable of stimulating increased IL-2
at all experimental times as compared to control cultures
and at 48 and 72 h as compared to Con A stimulation
(Fig. 2). Con A also induced a release of IL-2 at all
Cell Tissue Res (2011) 346:237–244
Fig. 2 IL-2 production in cell cultures. Cells cultured, in vitro, with
ConBr and Con A lectins at 24 h, 48 h, 72 h and 6 days, respectively.
ConBr induced higher IL-2 production at all experimental times
relative to control cultures and at 48 and 72 h as compared to Con A
stimulated cultures. Values represent the mean ± SD of six
independent experiments per group. Differences were considered
significant at p<0.05 as compared to control values
experimental times as compared to the control and at 24 h
in relation to ConBr (Fig. 2). The IL-2 cytokine is known to
be a T-cell growth factor, inducing the clonal expansion of
T cells following antigen stimulation and is also important
for the differentiation of CD4+ T cells into Th1 and Th2
effector subsets (Hoyer et al. 2008).
High IL-6 production was also observed for both lectins
at all experimental times (Fig. 3) but no difference was
observed between lectins, except at 48 hours, when Con A
was shown to produce more IL-6 than ConBr (Fig. 3). IL-6
plays important roles in T-cell-mediated immune responses.
Fig. 3 IL-6 production in cells cultured with ConBr and Con A
stimuli. Cells cultured, in vitro, with ConBr and Con A lectins at 24 h,
48 h, 72 h, and 6 days, respectively. Higher IL-6 production was
observed for both lectins relative to the control at all experimental
times. Con A produced higher IL-6 as compared to ConBr at 48 h.
Values represent the mean ± SD of six independent experiments per
group. Differences were considered significant at p<0.05 as compared
to control values
Cell Tissue Res (2011) 346:237–244
241
It is a cofactor for T-cell proliferation and prevents cell
death (Yang et al. 2005). In fact, both of the cytokines
examined can act as proliferative agents with regard to both
T and B lymphocytes.
ConBr induced higher IFN-γ and lower IL-10 production
in cell cultures
ConBr cell cultures produced statistically significant
increases (p <0.05) in IFN-γ production as compared to
control values at all experimental times (Fig. 4). Similar
behaviour was observed for both Con A and ConBr lectins,
showing the similarity of these glucose/mannose lectins
with respect to IFN-γ production. However, a distinct
pattern was observed in IL-10 production (Fig. 5). This
cytokine was produced in lower quantities as compared to
IFN-γ but at 48 and 72 h, ConBr induced an increased
production of IL-10 (Fig. 5). In contrast, Con A produced
higher levels of IL-10 at 24 h and 6 days of culture
(Fig. 5).
IL-10, which is produced by a variety of cells (including
T lymphocytes, B lymphocytes, monocytes and dendritic
cells), has been identified as a cytokine with important antiinflammatory and immunosuppressive properties. IL-10 is
thought to play a major role in the limitation and
termination of inflammatory responses. In addition, it
regulates the growth and/or differentiation of various
immune cells. When extensive IFN-γ secretion occurs,
there is an associated rise in IL-10 production, which could
Fig. 5 IL-10 production in cells cultured with ConBr and Con A
stimuli. Cells cultured, in vitro, with ConBr and Con A lectins at 24 h,
48 h, 72 h and 6 days, respectively. Con A produced significantly
higher IL-10 as compared to control values after 24 h and 6 days of
culture. ConBr also induced higher IL-10 production and was superior
to control and Con A cultures at 48 and 72 h. Values represent the
mean ± SD of six independent experiments per group. Differences
were considered significant at p<0.05 as compared to controls
be viewed as an important self-limiting (negative feedback)
immune response mechanism (Couper et al. 2008).
Crane et al. (1984) used similar assays to those used in
the present study to show that Jacalin-induced T lymphocytes secrete IFN-γ in culture supernatants. In addition,
Melo et al. (2010a) showed that higher IFN-γ and lower IL10 production could be induced by Cramoll 1,4 lectin.
ConBr stimulated higher nitric oxide (NO) release
by splenocytes
Fig. 4 IFN-γ production in splenocytes cultivated with ConBr and
Con A stimuli. Cells cultured, in vitro, with ConBr and Con A lectins
at 24 h, 48 h, 72 h and 6 days, respectively. Non-stimulated
splenocytes cultured under the same conditions were used as the
controls. ConBr and Con A stimuli produced similar levels of IFN-γ
in all experimental groups and produced significantly higher IFN-γ as
compared to control cultures. Only at 24 h did ConBr produce higher
levels of IFN-γ as compared to Con A. Values represent the mean ±
SD of six independent experiments per group. Differences were
considered significant at p<0.05 as compared to control values
Our assays showed an elevated release of NO in ConBr
lectin-stimulated cultures (Fig. 6). In fact, this lectin
showed statistically significant increased NO values at all
experimental times relative to both control and Con A
cultures (Fig. 6).
NO is produced by macrophages and agents that induce
iNOS expression, including various cytokines (IL-1β, TNF-α
and IFN-γ), endotoxins (lipopolysaccharides and LPS) and a
host of other agents (de Vera et al. 1995). NO is a multifaceted molecule with dichotomous regulatory roles in many
areas of biology. The complexity of its biological effects is a
consequence of its numerous potential interactions with other
molecules, such as reactive oxygen species (ROS), metal
ions and proteins. The effects of NO are modulated by both
direct and indirect interactions, which can be dose-dependent
and cell-type specific (Kim et al. 2001).
Welsch and Schumacher (1983) showed that Con A
could bind to macrophages in vivo, this being one of the
mechanisms involved in NO production. In this study, we
demonstrated that ConBr can induce cytokine production.
242
Fig. 6 NO production in Balb/c splenocytes treated with ConBr and
Con A lectins. Splenocytes (106 cells/ml) were stimulated by Con A
(2.5 μg/ml) and ConBr (2.5–10 μg/ml) for 24 h, 48 h, 72 h and
6 days. Non-stimulated cells were used as negative controls. Supernatants were collected and the nitrite (NO) concentration from the
supernatants was determined using the Griess reagent as described in
the Materials and methods. Data represent the means ± SD of two
independent observations performed in triplicate. Differences were
considered significant at p<0.05 as compared to the Con A positive
control and negative control groups
Cell Tissue Res (2011) 346:237–244
activate a built-in death programme over several hours and
necrosis, which is an uncontrolled and rapid process of cell
death (Murphy 1999).
Many stimulatory mechanisms, induced by antigens or
other compounds, can promote increased T-cell activation
through reactive oxygen species and calcium accumulation
(Melo et al. 2010b). However, calcium accumulation can
lead to cell death through oxidative stress (Feske 2007). In
fact, in studies where T-cell stimulation is analysed, cell
death assays are very important for evaluating cell damage
induced by the tested compounds. Our results demonstrated
a minimal level of cell damage, which was similar between
both ConBr and Con A lectins.
Experiments with other lectins have shown their immunostimulatory activities and consequent induction of cell
death. Mistletoe lectin was shown to stimulate increased
apoptosis in neutrophils (Lavastre et al. 2004), Abrus
agglutinin stimulated apoptosis in thymocytes (Hegde et
Thus, ConBr can induce NO production by direct and
indirect mechanisms. Rodriguez et al. (1992) demonstrated
that ConBr has more pronounced effects on macrophage
stimulation than Con A after peritoneal macrophage
stimulation through the intraperitoneal injection of lectins.
Andrade et al. (1999) found that ConBr induced an increase
in NO release in mice resident peritoneal cells.
Other studies have confirmed that NO production can be
induced by lectins such as the pokeweed mitogen lectin
(Dong et al. 1996), banana lectin-BanLec (Wong and Ng
2006) and Cramoll 1,4 (Melo et al. 2010a).
Low cell damage was induced by both ConBr and Con
A lectins
A cell viability assay indicated that lectins induced minimal
damage to cell survival and about 90% of the cells obtained
were viable (Fig. 7). However, the results also demonstrated that at 24 h, ConBr and Con A induced a higher rate of
apoptosis and late apoptosis relative to the control. After
this same period, Con A induced increased necrosis with
respect to ConBr and the control (Fig. 7a). At 48 h, ConBr
induced higher rates of apoptosis as compared to the
control, late apoptosis as compared to the control and Con
A and necrosis as compared to Con A but not to the control.
After the same period, Con A also induced increased
necrosis with respect to the control (Fig. 7b).
Cell death is generally considered to occur by two
distinct pathways: apoptosis, in which cells deliberately
Fig. 7 The effect of lectins on splenocyte viability. Values represent
the mean ± SD of five independent experiments per group. Differences
were considered significant at p<0.05 as compared to the controls. a
Cell death at 24 hours. ConBr and Con A induced increased apoptosis
and late apoptosis as compared to the control. At the same time, Con
A induced higher rates of necrosis as compared to ConBr and the
control. b Cell death at 48 hours. ConBr induced increased apoptosis
as compared to the control, late apoptosis as compared to the control
and Con A and necrosis only with respect to Con A and not the
control, at 48 hours. At the same time, Con A induced higher levels of
necrosis as compared to the control
Cell Tissue Res (2011) 346:237–244
al. 1991) and Con A induced cell death in cultivated
hepatocytes (Leist and Wendel 1996). The decreased cell
viability observed following exposure to lectins may be due
to oxidative damage caused by the NO induced by
cytokines.
During the last 10 years, Canavalia brasiliensis lectin
(ConBr) has been used in various biological models and has
been shown to play an important role in T-cell signalization.
Here, we demonstrated through various techniques, including flow cytometry, ELISA and [3H]-thymidine incorporation, that this lectin has important immunomodulatory and
immunostimulatory potential.
Acknowledgements We are grateful to Lucas Ferreira da Rocha and
Maria da Conceição Batista for their technical assistance. This work
was supported by CAPES (Fundação de Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior), FACEPE (Fundação de Amparo
à Ciência e Tecnologia do Estado de Pernambuco, processo APQ0493-2.11/08), and the Aggeu Magalhães Research Center of the
Oswaldo Cruz Foundation in Recife, Brazil (CPqAM/FIOCRUZ).
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OPEN ACCESS
molecules
ISSN 1420-3049
www.mdpi.com/journal/molecules
Article
Casbane Diterpene as a Promising Natural Antimicrobial Agent
against Biofilm-Associated Infections
Victor Alves Carneiro 1,*, Hélcio Silva dos Santos 2, Francisco Vassiliepe Sousa Arruda 3,
Paulo Nogueira Bandeira 2, Maria Rose Jane Ribeiro Albuquerque 2, Maria Olívia Pereira 4,
Mariana Henriques 4, Benildo Sousa Cavada 1 and Edson Holanda Teixeira 1
1
2
3
4
Department of Biochemistry and Molecular Biology, Faculty of Medicine of Sobral, Federal
University of Ceará, Fortaleza, CE, Brazil; E-Mails: [email protected] (B.S.C.);
[email protected] (E.H.T.)
Centre of the Exact Sciences and Technology, Acaraú Valley State University, 62040-370, Sobral,
CE, Brazil; E-Mails: [email protected] (H.S.S.); [email protected] (P.N.B.);
[email protected] (M.R.J.R.A.)
Northeast Biotechnology Network (RENORBIO), State University of Ceará, 60740-000, Fortaleza,
CE, Brazil; E-Mail: [email protected] (F.V.S.A.)
Centre for Biological Engineering, IBB-Institute for Biotechnology and Bioengineering, University
of Minho, Campus de Gualtar, 4710-057 Braga, Portugal; E-Mails: [email protected]
(M.O.P.); [email protected] (M.H.)
* Author to whom correspondence should be addressed; E-Mail: [email protected];
Tel.: +55-88-3611-8000; Fax: +55-88-3611-2202.
Received: 17 November 2010; in revised form: 29 November 2010 / Accepted: 20 December 2010 /
Published: 30 December 2010
Abstract: Croton nepetaefolius is a native plant from northeastern Brazil that belongs to
the Euphorbiaceae family. The biological action of this plant has been extensively
explored, being the secondary metabolites responsible for its properties alkaloids,
diterpenes, and triterpenes. This study aimed to evaluate the ability of casbane diterpene
(CD), isolated from the ethanolic extract of C. nepetaefolius, to inhibit microbial growth
and biofilm formation of several clinical relevant species (bacteria and yeasts). It was
found that CD possessed biocidal and biostatic activity against the majority of the species
screened, with minimal active concentrations ranging between 125 and 500 µg/mL. In
addition, it was observed that biofilm formation was inhibited even when the planktonic
Molecules 2011, 16
191
growth was not significantly affected. In conclusion, CD showed potential to be a natural
tool for the treatment of diseases caused by different infectious microorganisms.
Keywords: casbane diterpene;
antimicrobials; bacteria and yeast
biofilm-associated
infections
control;
natural
1. Introduction
In Nature, microorganisms often attach to surfaces and embed themselves in a matrix composed of
extracellular polymeric substances, that they properly produce, forming a sessile population called
biofilms [1,2]. Moreover, it is known that surface-associated microorganisms exhibited a distinct
phenotype with respect to gene transcription, growth rate and enhanced resistance to antimicrobials [3,4].
Biofilms are sources of diverse problems in various areas. In dairy industry, biofilms are often
sources of biological contaminants and they also contribute to increased equipment corrosion rates [5].
In the public health sector, the colonization of medical surfaces, such as catheters and other indwelling
devices, by biofilms, plays a decisive role in the problem of healthcare-associated infections [6]. Thus,
over the years, many efforts have been put on the control of microbial adhesion and biofilm
formation [7-11].
Currently, natural products are recognized as important antimicrobial agents with structural and
mode of action diversity. Therefore, natural plant compounds have been used by many research groups
with the intent of discovering new antimicrobial and anti-biofilm drugs or alternatives to antibiotic
therapy [12-14]. Several thousand antimicrobial products have been discovered so far, showing high
potential for therapeutical use [15].
The genus Croton of the plant family Euphorbiaceae is widespread in northeastern Brazil. The use
of this genus in opular medicine includes treatments for cancer, constipation, diabetes, digestive
problems, dysentery, external wounds, fever, hypercholesterolemia, hypertension, inflammation,
intestinal worms, malaria, pain, ulcers, and weight-loss [16]. Previous phytochemical investigations
have shown that plants of this genus produce alkaloids [17,18], flavonoids [19-21], triterpenoids and
steroids [22,23], and a large number of diterpenoids [24-28]. Croton nepetaefolius is an aromatic plant
native of the Northeast of Brazil which is extensively used in folk medicine as a sedative and
antispasmodic agent [29]. Terpenoids are a class of secondary metabolites made of isoprene units.
These molecules are reported as possessing antimicrobial properties [30,31], highlighting the
antimicrobial potential of this important class of compounds.
In the present study, the biostatic and biocidal effects of casbane diterpene, a diterpenoid isolated
from Croton nepetaefolius, was assessed against a wide range of microorganisms, both yeast and
bacteria. Moreover, the effects of this compound on biofilm formation was also evaluated.
2. Results and Discussion
Bacteria and fungi are widely distributed in Nature, being some of them pathogenic and directly
involved in several infectious diseases, such as cystic fibrosis, endocarditis, and periodontitis [32]. The
Molecules 2011, 16
192
casbane diterpene (CD) fraction extracted from Croton nepataefolius showed antimicrobial activity
against some microorganisms tested (Figures 1 and 2). The presence of CD during bacteria growth
clearly interfered with the Gram-positive bacterial planktonic and sessile development, inhibiting or
reducing its growth. Concerning Staphylococcus aureus, 125 µg/mL of CD decreased its planktonic
growth around 74% according to control absorbance, with MIC 250 µg/mL and MMC 500 µg/mL
(Figure 1a). CD also interfered with the establishment of S. aureus biofilms, inhibiting their
development at concentrations above 125 µg/mL (Figure 2a).
Figure 1. Antimicrobial activity of CD on the planktonic growth of bacterial (a-j) and
yeasts (k-m). * p < 0.01 and ** p < 0.001 related to control.
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193
Figure 2. Antibiofilm effect of CD on bacterial (a-j) and yeasts (k-m). *p < 0.01 and
** p < 0.001 related to control.
Regarding Staphylococcus epidermidis strains, CD also showed ability to reduce their planktonic
growth at concentrations above 62.4 µg/mL, with MIC of 500 µg/mL without bactericidal activity
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194
(Figures 1b and 1c). Biofilm formation by S. epidermidis CECT 4183 is clearly disturbed by CD at
doses above 250 µg/mL (Figure 2b). No significant effect was found on S. epidermidis CECT 231
(Figure 2c). So, based on the results it can be concluded that CD exhibited excellent antibacterial
profile on the Gram-positive bacteria tested.
As already reported [33,34], the cell membrane has a great importance in many cellular processes,
including permeability, cell growth and division. Considering the chemical characteristics of the
molecule tested, hidrophobicity and polarity, a non-specific interaction with membrane phospholipids,
destabilizing the non-covalent interactions between the fatty acids of the lipid bilayer, and thus
interfering with the cellular development of the Gram-positive bacteria can be suggested. Molecules
with lipophilic characteristics such as anthraquinones are known antimicrobial substances, which
exhibit such an effect of interaction with cell membrane phospholipids [35,36]. The effect on biofilm
formation by the Gram-positive staphylococcal strains seems to be directly related to the growth
inhibition, showing non-specific action related to the antibiofilm activity.
The effect of CD was different on Gram-negative strains, being able to interfere only in the
development of the biofilm, without affecting the planktonic growth, with the exception of P.
fluorescens ATCC 13525 (Figure 1d). The presence of the outer membrane in Gram-negative bacteria
constitutes a barrier for permeability of hydrophobic molecules [37]. Thus, the interaction of CD with
the cellular membrane was limited, and the antibacterial effect was inhibited. These microorganisms,
when associated in biofilms, are structurally and physiologically different from planktonic bacteria, for
example, in their resistance to antibiotics [38].
In recent years, researchers have explored the activity of natural products possessing the ability to
interfere with the development of biofilms [39,40]. At the lowest concentration (15.6 µg/mL) biofilm
formation by Klebsiella pneumoniae ATCC 11296 was decreased by about 45% (Figure 2d).
Concerning Pseudomonas aeruginosa ATCC 10145, CD at doses ranging between 31.2 and
125 µg/mL induced biofilm mass production, while concentrations above 250 µg/mL strongly
inhibited biofilm development by around 80% (Figure 2f). A similar trend occurred for Pseudomonas
aeruginosa CGCT 111 and Escherichia coli K12 strains, since the highest concentration of CD led to
an inhibition of 86% (Figure 2g and Figure 2i). The increase of biomass observed in the P. aeruginosa
ATCC10145 can be explained by stress induced by the presence of the tested substance that maybe
leads to an extra production of exopolysaccharides (EPS) by the bacterial cell. A similar effect was
observed at sub-inhibitory concentrations of cefotaxime, which significantly induced the production of
biofilm mass as well as EPS of three Salmonella enterica isolates [41]. Against Pseudomonas
fluorescens, CD showed MIC and MMC of 125 µg/mL and 250 µg/mL, respectively (Figure 1d).
Moreover, there was no biofilm formation by this Gram-negative strain at concentrations above
125 µg/mL (Figure 2h). The lipopolysaccharide (LPS) present in the cell surface, placed on outer
leaflet of the outer membrane of all Gram-negative bacteria, forms the first point of contact between
the bacterial cell and any surface that it colonizes or binding to therapeutic agents [42]. Studies
indicate that biofilm formation of P. aeruginosa is directly related to the type of LPS produced by the
cell [43]. Thus, the effect of CD on inhibition of biofilm formation may be related to an interaction
between CD and LPS, which might affect the adherence properties influencing thus biofilm formation
by these strains.
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195
As occurred in Gram-positive bacteria, CD was effective on planktonic growth of the yeasts tested.
On C. albicans and C. tropicalis strains CD, at concentrations of 500 µg/mL, reduced viability of
planktonic growth in 59% and 29%, respectively (Figure 1k and Figure 1l). However, on C. glabrata,
the CD was effective in a lower concentration (15.6 µg/mL) and was able to decrease by 72% the yeast
viability when its concentration was 500 µg/mL (Figure 1m). In the biofilm formation experiments
using yeasts, CD proved to be effective on C. albicans and C. tropicalis strains, showing a doseresponse relationship (Figure 2k and Figure 2l). Regarding C. tropicalis, CD at a concentration of
15.6 µg/mL decreased more than 50% the yeast ability to form biofilm (Figure 2l). When used against
C. albicans, 62.5 µg/mL of the CD was necessary to achieve the same reduction (Figure 2k). On the
other hand, CD increased the biomass production of C. glabrata (Figure 2m). The differences in CD
activity can be explained by differences in phosphoglycerides components and fatty acyl chains of
Candida species [44].
3. Experimental
3.1. Plant material
Stalks from C. nepetaefolius were collected in Caucaia – Ceará (Brazil) in May 2004. The material
was identified by Dr. Edson Paula Nunes at the Herbário Prisco Bezerra (EAC), Departamento de
Biologia, Universidade Federal do Ceará, Fortaleza, CE, Brazil, where the voucher specimens (No.
33.582) were deposited.
3.2. Extraction and isolation of casbane diterpene
The bark (5.0 kg) of C. nepetaefolius was powdered and extracted with ethanol (EtOH), (10 L × 3,
for three days) at room temperature. The solvent was removed under reduced pressure to give an EtOH
extract (58.2 g) that was fractionated coarsely on a silica gel column by elution with hexane (fractions
1-15), hexane/ethyl acetate (EtOAc) (1:1 fractions 16-25), EtOAc (fractions 26-40), and EtOH
(fractions 41-48), affording a total of 48 fractions of 100 mL each. The hexane fractions (22.5 g) were
pooled and fractionated on a silica gel column using hexane (fractions 1'-10'), hexane/EtOAc (1:1 F'
11-16), EtOAc (F' 17-21) and EtOH (F' 22-25), providing 25 fractions of 100 mL each. Fractions
11'-16' (14.0), obtained with hexane/EtOAc (1:1), was fractionated coarsely on a silica gel column by
elution with hexane (F'' 1), hexane/EtOAc (9:1 F'' 2-5; 8:2 F'' 6-15; 7:3 F'' 16-32), EtOAc (F'' 33),
providing 33 fractions of 100 mL each. Fractions 10''-13'', obtained with hexane/EtOAc (8:2), yielded
diterpene named 1,4-dihydroxy-2E,6E,12E-trien-5-one-casbane (3.0 g, 0.06%; Figure 3).
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Figure 3. Structure of casbane diterpene extracted from the stalks of Croton nepetaefolius.
3.3. Preparation of the CD stock solution
The CD was solubilized in dimethyl sulfoxide (DMSO), and then diluted in culture medium
(1 mg/mL), with a maximum percentage of 4% of DMSO. Controls were performed to confirm that
this dose of DMSO did not interfere with microbial growth.
3.4. Microorganisms
In the present study, the microorganisms used in the experiments were: Gram negative bacteria
(Pseudomonas fluorescens ATCC13525, Pseudomonas aeruginosa ATCC10145, P. aeruginosa
CGCT111, Klebsiella oxytoca ATCC13182, Klebsiella pneumoniae ATCC11296, Escherichia coli
K12 MG 1655, and Escherichia coli CECT434), Gram-positive bacteria (Staphylococcus epidermidis
CECT231, S. epidermidis CECT4183, and S. aureus ATCC), and yeasts (Candida albicans
ATCC90028, C. tropicalis ATCC750 and C. glabratta ATCC2001).
3.5. Culture conditions
For each microorganism, a culture stock was prepared on Tryptic Soy broth (TSB) plus 20%
glycerol and preserved at -80 °C. Then, the microorganisms were transferred into Petri dishes
containing TSA and incubated at 37 °C, for 24 h. After growth on the solid medium, an isolated colony
was removed and inoculated into 10 mL of TSB and incubated for 18 h at 37 °C under constant
agitation of 120 rpm. Prior to use, the cell concentration of each inoculum was adjusted to
1 × 106 cells/mL through the use of spectrophotometer and calibration curves, previously determined
for each bacterium. The yeasts were cultured for 24 h in RPMI 1640 buffered with MOPS at pH 7.0 in
constant agitation of 120 rpm. Then, the concentration of each yeast inoculum was adjusted to
1 × 106 cells/mL using a Neubauer chamber.
Molecules 2011, 16
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3.6. Antimicrobial assays
The antimicrobial effects of CD were determined by the broth microdilution method in 96-well
polystyrene plates, according to the guideline Methods for Dilution Antimicrobial Susceptibility Tests
for Bacteria That Grow Aerobically; Approved Standard – Sixth Edition (NCCLS document M7-A6).
CD was diluted in culture medium, RPMI 1640 for yeast or TSB for bacteria, to achieve 15.6 to
500 µg/mL were incubated aerobically with 1 × 106 cells/mL, initial concentration of cells, on a
horizontal shaker (120 rpm/min), at 37 °C, during 24 h. The optical density at 640 nm (OD640) of each
well content was recorded using an automated Elisa Reader (Synergy TM HT Multi-Detection
Microtiter Reader), as a measure of microbial growth.
The minimum inhibitory concentration (MIC) for each microorganism was determined as the lowest
concentration of CD at which there is complete inhibition of visible growth of the organism. To
determine the minimum microbicidal concentration (MMC), 10 μL of the bacteria/yeast planktonic
cultures, where no visible microbial growth was observed, were inoculated in petri dishes with TSA
medium and incubated at 37 °C for 24 h. MMC was considered as being the lowest concentration able
to completely inhibit microbial growth on the plates.
3.7. Antibiofilm activity
The methodology used to grow biofilms was based on the microtiter plate test developed by
Stepanovic et al. [45], with some modifications. Sterile 96-well polypropylene tissue culture plates
(Orange Scientific, Braine-l’Alleud, Belgium) (with flat-bottom) were prepared using a procedure
similar to the one used in the antimicrobial activity tests with same initial concentration of cells. All
the plates were incubated aerobically on a horizontal shaker (120 rpm/min), at 37 °C during 24 h for
biofilm development. After biofilm growth in the presence or absence of same CD concentrations, the
content of each well was removed and the biofilms were washed twice with
200 µL/well of sterilized water, to remove cells weakly adhered, being reserved for posterior analysis.
Biomass quantification: The attached biofilm mass was quantified using crystal violet staining [46].
Briefly, the plates containing the biofilms were let to air dry for 30 min, and 200 µL of absolute
methilic alcohol were transferred to each well, in order to fix the adhered cells, and allowed to contact
during for 15 min. After 15 min, the methanol was removed and 200 µL of crystal violet 1% (Gram
colour-staining set for microscopy; Merck) per well were added for 5 min. After the staining step, the
washing process, with sterile water, was repeated and the plates were placed at room temperature for 1
hour. To re-solubilize the dye bounded to biofilms, 200 µL of 33% (v/v) glacial acetic acid (Merck)
was added to each well and place in agitation for 15 min. The CV solutions obtained were transferred
to a new sterile 96-well plate and the optical density of the content of each well was measured using a
microtiter plate spectrophotometer (Sunrise - Tecam) at 570 nm.
3.8. Statistical analysis
Statistical analyses were performed by GraphPad Prism® version 3.00 from Microsoft Windows®.
The method used was one-way ANOVA with Bonferroni post hoc test. The data were obtained in
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198
triplicates from at least three separate experiments. The graphs were presented as mean ± standard
deviation. The data were considered significant when p < 0.01 or p < 0.001.
4. Conclusions
Biofilm eradication is a crucial step for the treatment of various diseases. In the present work, a
novel and natural agent with a promising antimicrobial activity was described. Casbane diterpene (CD)
showed antimicrobial effect on planktonic forms and biofilm from some bacteria and yeasts. The
results showed that CD can be considered as a promising molecule with potential for the
pharmacological treatment of biofilm-associated infections. Additional toxicological studies need to be
performed to validate its applicability.
Acknowledgements
This study was supported by FUNCAP and CNPq (Brazil) and by FCT (Portugal) through the
project PTDC/SAU-ESA/64609/2006.
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Sample Availability: Contact the authors.
© 2010 by the authors; licensee MDPI, Basel, Switzerland. This article is an open access article
distributed under the terms and conditions of the Creative Commons Attribution license
(http://creativecommons.org/licenses/by/3.0/)
Molecules 2011, 16, 3530-3543; doi:10.3390/molecules16053530
OPEN ACCESS
molecules
ISSN 1420-3049
Article
Effect of Lectins from Diocleinae Subtribe against Oral
Streptococci
Theodora Thays Arruda Cavalcante 1, Bruno Anderson Matias da Rocha 1, Victor Alves Carneiro 1,
Francisco Vassiliepe Sousa Arruda 2, Antônia Sâmia Fernandes do Nascimento 1,
Nairley Cardoso Sá 3, Kyria Santiago do Nascimento 1, Benildo Sousa Cavada 1 and
Edson Holanda Teixeira 3,*
1
2
3
Department of Biochemistry and Molecular Biology, Faculty of Medicine of Sobral, Federal
University of Ceará, Fortaleza, CE, Brazil; E-Mails: [email protected] (T.T.A.C.);
[email protected] (B.A.M.R.); [email protected] (V.A.C.);
[email protected](A.S.F.N.); [email protected] (K.S.N);
[email protected] (B.S.C.)
Northeast Biotechnology Network (RENORBIO), State University of Ceará, 60740-000, Fortaleza,
CE, Brazil; E-Mail: [email protected]
LIBS, Integrate biomolecules Laboratory, Faculty of Medicine of Sobral, Federal University of
Ceará, Fortaleza, CE, Brazil;
E-Mail: [email protected]
Tel.: +55-88-3611-8000; Fax: +55-88-3611-2202.
Received: 30 March 2011; in revised form: 20 April 2011 / Accepted: 25 April 2011 /
Published: 27 April 2011
Abstract: Surface colonization is an essential step in biofilm development. The ability of
oral pathogens to adhere to tooth surfaces is directly linked with the presence of specific
molecules at the bacterial surface that can interact with enamel acquired pellicle ligands.
In light of this, the aim of this study was to verify inhibitory and antibiofilm action of
lectins from the Diocleinaesubtribe against Streptococcus mutans and Streptococcus oralis.
The inhibitory action against planctonic cells was assessed using lectins from
Canavaliaensi formis (ConA), Canavalia brasiliensis (ConBr), Canavalia maritima
(ConM), Canavalia gladiata (CGL) and Canavalia boliviana (ConBol). ConBol, ConBr
and ConM showed inhibitory activity on S. mutans growth. All lectins, except ConA,
stimulated significantly the growth of S. oralis. To evaluate the effect on biofilm
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3531
formation, clarified saliva was added to 96-well, flat-bottomed polystyrene plates, followed
by the addition of solutions containing 100 or 200 µg/mL of the selected lectins. ConBol,
ConM and ConA inhibited the S. mutans biofilms. No effects were found on S. oralis
biofilms. Structure/function analysis were carried out using bioinformatics tools. The
aperture and deepness of the CRD (Carbohydrate Recognition Domain) permit us to
distinguish the two groups of Canavalia lectins in accordance to their actions against S.
mutans and S. oralis. The results found provide a basis for encouraging the use of plant
lectins as biotechnological tools in ecological control and prevention of caries disease.
Keywords: plant lectins; oral Streptococcus; biofilm
1. Introduction
Many bacteria in Nature often adopt a sessile biofilm lifestyle attached on surfaces and forming
matrix-embedded communities called biofilms that differs greatly from that of other free-living
cells [1,2]. Such biological organization provides a sheltered micro environment for the immobilized
bacteria [3,4]. Those communities have been implicated in many chronic diseases, such as chronic
otitis and tonsillitis, in addition to dental caries and periodontal diseases [5]. Microorganisms form a
pathogenic biofilm adhered to dental surfaces, producing acid and cytotoxic products that lead to the
demineralization of dental tissues [6,7]. Dental caries is a multifatorial disease, both infectious and
transmissible, while demineralizing the dental structure [8]. Factors related to diet, host, microbiota,
and time of exposition contributes to caries installation and development. Although the application of
good oral hygiene practices and fluoridation are generally considered to be responsible for the
continuing decline dental caries in industrialized countries, a significant proportion of the population
still suffers from tooth decay [9].
More than 700 bacterial species have been detected in the oral cavity [10], and the presence of
pathogenic bacteria in oral biofilms is a major factor associated with dental diseases such as caries and
periodontitis [11-13]. For biofilm formation, interactions between bacterial cells and the dental surface
have importance for the colonization of the surface at which these communities develop [14]. The first
step in this development is the establishment of an acquired enamel pellicle that consists of saliva
components, such as proteins, glycoproteins and carbohydrates [15]. The bacteria can interact with the
acquired pellicle molecules through a series of specific mechanisms such as lectin interactions
involving adhesion between the bacterial surface and the pellicle receptors [16].
Lectins are proteins of non-immune origin that recognize and bind to specific carbohydrate
structural epitopes without modifying them [17]. Because of their carbohydrate recognition ability,
lectins are involved in several cellular events, beyond symbiotic and pathogenic interaction between
microorganisms and hosts [18-20]. Leguminous lectins constitute a wide family of homologous
proteins, structurally similar and with distinct carbohydrate specificities. They are the most studied and
characterized group of plant lectins [21]. However, leguminous lectins have an essentially similar
three-dimensional structure, and high amino acid sequence correspondence, yet they show
considerable monomer oligomerarization diversity [22,23]. Alterations in the relative orientation of the
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carbohydrate binding sites at the quaternary structure of homologous lectins have been hypothesized as
contributing to the differences in biological activity and potency of Canavaliaensi formis and
Canavalia brasiliensis lectins [24,25].
According with Teixeira and collegues [26] plant lectins are able to inhibit oral bacteria adherence
to enamel acquired pellicles probably through blocking streptococci adhesion. This manner, the aim of
this study was to verify the activity of legume lectins from Diocleinae subtribe on Streptococcus
mutans UA 159 and Streptococcus oralis ATCC 10557 during planktonic growth and experimental
biofilm formation. The results suggest that lectins have anti-adhesion potential and that they can be
explored as a biotechnological tool in studies and also in therapeutics of dental diseases that are closely
related to biofilm formation.
Bacterial growth measurements were made at lectin concentrations ranging from 15.6 to
500 µg/mL and for the control (0.9% NaCl). The concentration of 500 µg/mL was chosen due to
statistical differences from the control. The other concentrations that were assayed, however, did not
demonstrate statistically significant differences compared with the control (data not shown). For
S. mutans, ConBol, ConBr and ConM showed inhibitory activity compared with the control (Figures 1
A, B and C) and CGL and ConA interestingly stimulated the growth of this bacteria compared to the
control (Figures 1 D and E).
Figure 1. Bar graph of S. mutans at different growth time points under the effect of lectins.
(A) ConBol; (B) ConBr; (C) ConM; (D) CGL; (E) ConA.*p < 0.01 related to the 0.9%
NaCl.( ) 0.9% NaCl ( ) Lectin 500 µg/mL.
Tests of the same lectins against S. oralis showed that ConBol, ConBr and CGL (Figures 2 A, B
and D) stimulated bacterial growth compared to the control. ConM showed remarkable growth
stimulation (Figure 2 C). When ConA was evaluated no action was seen (Figure 2 E).
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Figure 2. Bar graph of S. oralis at different growth time points under the effect of lectins.
(A) ConBol; (B) ConBr; (C) ConM; (D) CGL; (E) ConA.*p < 0.01 related to the 0.9%
NaCl. ( ) 0.9% NaCl ( ) Lectin 500 µg/mL.
ConBol and ConA prevented S. mutans biofilm formation when the concentration tested was
100 µg/mL and ConM showed the same effect even at 100 µg/mL as 200 µg/mL (Figures 3 A, C and
E). No effects were found when ConBr and CGL were tested (Figures 3 B and D). No inhibition or
stimulation effects were found on S. oralis biofilms (Figures 4 A to E). All statistical analyses were
made comparing to a BSA control.
Figure 3. Bar graph of S. mutans biofilm content at different growth times under the effect
of lectins. The control was Bovine Serum Albumin (BSA) 200 µg/mL. (A) ConBol; (B)
ConBr; (C) ConM; (D) CGL; (E) ConA.*p < 0.01 related to the BSA 200 µg/mL. Legend:
( ) BSA 200 µg/mL ( ) Lectin 100 µg/mL ( ) Lectin 200 µg/mL.
M
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35334
Figuree 4. Bar graaph of S. orralis biofilm
m content att different growth
g
timees under thee effect
of lecttins.The coontrol was Bovine
B
Seruum Albumiin (BSA) 200
2 µg/mL. (A) ConB
Bol; (B)
ConBrr; (C) ConM
M; (D) CGL
L; (E) ConA
A.*p < 0.01 related to the
t BSA 2000 µg/mL Legend:
L
( ) BS
SA 200 µg//mL ( ) Lecctin 100 µgg/mL ( ) Leectin 200 µgg/mL.
The bacteeria growth inhibition assays
a
revealed that S. mutans waas inhibited by ConBoll, ConBr, annd
C
ConM,
while ConA andd CGL stim
mulated the growth
g
of S. mutans whhen comparred with thee control. Thhe
c
carbohydrate
e binding site of thesee lectins is quite
q
similaar and diverrges slightlyy from Con
nA and CGL
L;
thhis divergeence is maiinly linked to distancees between amino acid side chaiins which compose thhe
c
carbohydrate
e recognitiion domainn. The main
m
differeence observved in thee CRD (C
Carbohydratte
R
Recognition
n Domain) was
w a reducction of the deepness of
o the site (A
Arg228-Tyrr12 and Arg
g228-Asn144)
a of the aperture
and
a
(Tyyr100–Tyr112 and Tyr112–Tyr14) (Figure 5). The apertuure and deeepness of thhe
C
CRD
permitt to distinguuish two grroups of Caanavalia lecctins in acccordance to their actions against S.
S
m
mutans;
thee inhibitoryy group forrmed by ConBol,
C
Co
onBr and ConM
C
and the stimullatory grouup
c
composed
of ConA andd CGL.
Figuree 5. Compaarison betw
ween CGL (stimulatory
(
y lectin for S. mutans - blue) and ConM
(inhibiitory lectin for S. mutaans - green)) carbohydrate binding sites. The distances between
the am
mino acids side chainss can explain the divergent activiity caused by the inteeraction
patternn with surfaace carbohydrates.
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The first report of inhibitory action of peptides against microorganisms dates from 1942, and refers
to a protein obtained from wheat flour [27]. Lectins in higher plants defend against pathogenic bacteria
and fungi by recognizing and immobilizing the infecting microorganisms via binding, thereby
preventing their subsequent growth and multiplication [28]. The inhibition of bacteria and fungi by
lectins, such as those of the herbaceous Amaranthus, has long been known [29].
The present work aimed to assess antibacterial action and inhibition of biofilm formation by
leguminous lectins extracted from the Diocleinae subtribe. Determination of antimicrobial action
following NCCLS guidelines suggested that in the concentrations used and under the conditions stated,
only ConBol, ConBr and ConM had interference at 500 µg/mL diminishing S. mutans growth. CGL
and ConA had a stimulatory effect against this bacterium. However, at the tests of S. oralis all lectins,
except ConA, had a stimulatory effect at the same concentration, 500 µg/mL.
The concentration used is quite high compared to the concentrations used in similar studies [30-33].
However, Liao and collegues [30], testing antimicrobial action of plant and marine algae lectins used
concentrations ranging from 102 to 800 µg/mL and found that Con A and WGA from land plants did
not inhibit any of the vibrios assayed.
Our results showed that ConM was able to interfere in S. mutans growth, what can be attributed to
cellular membrane damage. Santi-Gadelha and collegues [31] showed though electron microscopy the
presence of pores and severe disruption of the Gram-positive bacteria membrane demonstrating strong
antimicrobial activity and pointing a possible mechanism of inhibition of bacterial growth by lectins.
This pores formed at the membrane permit outflowing of cellular contents [33,34].
The carbohydrate-binding site at the bacterial surface, probably plays a key role in this antibacterial
activity, being responsible for the recognition of bacteria. It is important to note that differences in
antimicrobial action between S. mutans and S. oralis may be due to differences in characteristic
carbohydrate surface composition. Almost all microorganisms express surface-exposed carbohydrates.
These carbohydrates may be covalently bound, as in glycosylated teichoic acids to peptidoglycan, or
non-covalently bound, as in capsular polysaccharides [31,35]. Every surface-exposed carbohydrate is a
potential lectin-reactive site. The ability of lectins to form complexes with microbial glycoconjugates
has made it to be employed as probes and sorbents for whole cells, mutants, and numerous cellular
constituents and metabolites. Microbial receptors for concanavalin A have been described. For
example, polyelectrolyte glucosylated teichoic acid found in many Gram-positive bacteria surfaces
[35] and neutral polysaccharides produced by members of the genera Leuconostoc and Streptococcus
[31]. The development of high-affinity ligands capable of selectively recognizing a variety of small
motifs in different oligosaccharides would be of significant interest as experimental and diagnostic
tools for several bacterial infections. The selective binding of certain lectins to bacteria has been
proposed for targeted delivery of antimicrobial agents with C. ensiformis lectin targeting Streptococcus
sanguis and Corynebacterium hofmannii and Triticum vulgarislectin targeting Streptococcus epidermis
“in vitro” [36]. This could be a new perspective area for future studies involving the conjugation of
lectins and other products with known bactericidal action.
The resident microflora benefits the host by acting as part of the host defences and preventing
colonization by exogenous (and often pathogenic) microorganisms, “colonization resistance” [37]. The
concept of microbial ecological change as a mechanism to prevent dental change is an important
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one [38]. Our results showed that the lectins of C. boliviana, C. brasiliensis and C. maritime had
interference effects against S. mutans, and a stimulatory effect on S. oralis growth.
S. mutans, an acidogenic bacterium, has been associated with the development of tooth decay,
through acid production as a result of carbohydrate fermentation [39]. Microorganisms present at the
oral cavity like S. oralis are numerically important members of the oral microbiota, isolated from all
intraoral surfaces and are pioneering organisms involved in primary colonization at dentition [40,41].
Marsh [42], in the “ecological plaque hypothesis”, proposed that changes in environmental factors
trigger a shift in the balance of the resident microbiota, and this could predispose a site to disease.
One of many molecular mechanisms involved in adherence of bacteria and the development of
mixed-species oral biofilms is specific lectin-carbohydrate interactins between bacteria, such as the
interaction involved in lactose-sensitive congregations of Actinomyces spp. and Streptococcus spp.
Because of their role in adhesion and agglutination, lectins are considered to be important in both
symbiotic and pathogenic interactions between microorganisms and hosts [32]. With the new
understanding of oral microbial community interactions, there is now interest in approaches that
selectively inhibit oral pathogens, or modulate the microbial composition of dental plaque to control
community based microbial pathogenesis [43].
Our results indicate an inhibition on S. mutans biofilm formation and not the same effect to
S. oralis. According to Islam and colleagues, this could be attributed to the surface carbohydrate
differences between the bacteria species. Lectins agglutinate bacteria and their presence in the milieu
can be exploited to prevent the long-term attachment of the bacteria on to the tooth surface [44].
Liljemark and collaborators [45] showed the effect of bacterial aggregation on the adherence of oral
streptococci to acquired pellicle using lectins. Their results suggest that the formation of large
aggregates causes a decrease of the number of adherent bacteria and indicates that independent of a
certain lectin concentration, its aggregating activity does not oppose to its blocking effect and even
helps decrease the number of adherent streptococci. Significant inhibition of bacterial biofilm growth
caused by plant lectins was reported before by Islam and colleagues [44], a fact that can be linked to a
surface glycoprotein of S. mutans of 60 kDa (with mannose and N-acetylgalactosamine) that has been
known to be involved in saliva and bacterial interaction [46]. The lesser adherence in the presence of
glucose/mannose specific lectins could be because of the interaction with this protein [44].
The differences in the pathway of lectin antimicrobial action are related to quaternary assembly but
recent crystallographic studies reveal that the specific carbohydrate binding site orientation determines
the biological response of many systems to the presence of the lectin [47,48]. The stimulatory effect of
Canavalia lectins on S. oralis might be due the high frequency of neuraminic acid at cell surface [49],
which is not specific to binding Diocleinae lectins.
The inhibition of S. mutans caused by three lectins out of the five tested is structurally confirmed by
the comparison of amino acid side chain distances at the carbohydrate recognition domain (mainly the
aperture versus the deepness of the site). These aspects also have been reported for ConM and CGL to
increase the selectivity of lectins for disaccharides [47,48,50]. The preference of ConBol, ConBr and
ConM to bind and inhibit specifically S. mutans strain can be explained by the reduction of the primary
carbohydrate binding site and the increase of the specificity of these lectins by specific carbohydrate
epitopes, which form more complex interaction patterns with the tested lectins despite ConA and CGL
presenting larger primary carbohydrate binding sites. Quantitative differences ant interaction path can
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exist between lectins that recognize the same terminal monosaccharide residues [51]. Beside this, the
same lectins can be more specific for complex carbohydrate structures than for monosaccharide
residues [52]. Since the mechanisms of action of leguminous lectins on bacteria cells still remains
unknown, this study provides new insights on the molecular basis of lectin-bacteria interactions.
3. Experimental
3.1. Bacterial Strains and Growth Conditions
Bacterial species Streptococcus mutans UA 159 and Streptococcus oralis ATCC 10557 used in this
study were obtained from the Instituto Oswaldo Cruz–FIOCRUZ collection. The strains were kept in
BHI (Brain Heart Infusion–Difco) and glycerol 20% at −80 °C; for experimental procedures, 100 µL
were inoculated in 10 mL of fresh BHI broth and incubated for 18 h, with CO2 10% at 37 °C. After
initial activation, the culture was renewed in 10 mL of sterile BHI broth adding 100 µL of inoculum
and grown under the same conditions described above.
3.2. Lectin Purification
The lectins from Canavalia ensiformis (ConA) [53], Canavalia brasiliensis (ConBr) [54],
Canavalia maritima (ConM) [55], Canavalia gladiata (CGL) [56] and Canvalia boliviana (ConBol) [57],
were obtained at Biologically Active Molecules Laboratory (Biomol - LAB), Department of
Biochemistry and Molecular Biology, Science Center, Federal University of Ceará-UFC, according to
its respective purification references.
Briefly, mature seeds were collected at Ceará State, Northeast Brazil. The seeds were ground to a
fine powder in a coffee mill and then defatted with n-hexane. Soluble proteins were extracted at 20 °C
for 4 h by continuous stirring with 0.9% NaCl (1:10 w/v), followed by centrifugation at 10,000 g at
4 °C for 20 min. The supernatant was applied to a Sephadex G-50 column (5 × 25 cm), which had been
equilibrated with 0.9% NaCl containing 5 mmol/L CaCl2 and MnCl2. The column was then washed
with equilibration buffer at a flow rate of 45 mL/h until the effluent absorbance at 280 nm was below
0.05. The bound lectin was eluted with 0.1 mol/L glycine, pH 2.6, dialyzed extensively against
distilled water and lyophilized. The affinity chromatography fraction was further purified using an
Äkta chromatographic system and Mono-Q column (5 × 0.5 cm) equilibrated with 20 mmol/L
Tris-HCl pH 7.0, and developed with a linear gradient of 20 mmol/L Tris-HCl pH 7.0, containing
1.0 mol/L NaCl at a flow rate of 1 mL min-1 and a slope of 5% NaCl/min. The lectin preparations,
recovered in the unbound fraction, were exhaustively dialyzed against distilled water and freeze-dried.
The purity of lectins was assessed by SDS-PAGE.
3.3. Effect of Lectins on Bacterial Growth
After cell growth, the culture was centrifuged at 1.500 g for 20 min at 4 °C, washed twice with
0.9% NaCl and then adjusted for a concentration of 108–109 Colony Forming Units (CFU)/mL. The
lectin solutions were prepared by 2-fold serial dilution (concentrations ranging from 15.6 to
500 µg/mL) and incubated together with the selected adjusted bacteria for 6 h with 10% CO2 at 37 °C,
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3538
without culture broth to avoid possible binding of the lectins to available carbohydrate at the medium.
This procedure was based on growth curve experiments with these bacteria on 0.9% NaCl observing
the time point of cell viability decrease through bacterial plating each 30 min (Data not show). The
assay in polystyrene plates was carried out by adding 200 µL of fresh BHI broth to each well and 4 µL
of the lectin/bacteria suspension previously incubated at each concentration. The samples were made
in triplicate with three separated experiments. The control used was 0.9% NaCl, which represents the
normal growth of bacteria using the same procedure for bacteria/lectin incubation. When the plates
were ready, an initial measurement at OD620nm (Biotrak II Plate Reader–Amersham Biosciences) was
carried out to establish a baseline. Other measurements were made after 12, 18 and 24 h of incubation
at 37 °C with 10% CO2.
3.4. Effect of Lectins on S. mutans and S. oralis Biofilm Formation on Saliva-coated Surface
3.4.1. Saliva Processing
Saliva was collected and processed according to the protocol of Guggenheim and colleagues [58].
Briefly, whole unstimulated saliva was collected for 1 h per day during several days from volunteers
that assigned an informed consent term (Ethical Committee Approval number 217-CONEP/CNS/MS)
at least 1.5 h after eating, drinking, or tooth cleaning. Saliva samples were collected in sterile 50 mL
polypropylene tubes, chilled in an ice bath or frozen at −20 °C. After 500 mL saliva had been
collected, it was pooled and centrifuged (30 min, 4 °C, 27.000 g); the supernatant was pasteurized
(60 °C, 30 min) and re-centrifuged in sterile tubes. The resulting supernatant was stored into sterile
50 mL polypropylene tubes at −80 °C. The efficiency of the process was assessed by plating processed
saliva samples onto BHI agar; after 72 h at 37 °C no CFUs were observed on incubated plates.
3.4.2. Biofilm Assay
For plate mounting 200 µL of processed saliva was added to each well for 2 h under agitation
(MA-420-Marconi orbital shaking incubator board) at 37 °C. Then, the saliva was removed and
200 µL of lectins solution at 100 or 200 µg/mL and bovine serum albumin (BSA) control
(200 µg/mL) were added for 2 h at 37 °C. After this period, the solutions were removed from the wells
and 200 µL of a bacterial suspension adjusted to a concentration of 106–108 CFU/mL were placed
remaining for 2 h. In sequence, the bacterial solution was removed and 200 µL of sterile BHI broth
was added and the plate incubated at 37 °C, 10% CO2. Every step of the experimental protocol was
followed by washing procedure with 200 µL of 0.9% NaCl, with up and down movements. As control
it was used BSA [31] to observe the action of a protein without antimicrobial action on the medium.
After incubation for 12, 20 and 24 h at 37 °C with 10% CO2, the media was removed from the
microtitre plates. The remaining planktonic cells were removed by gentle washing with sterile water.
The wells with the adhered biofilms were fixed with formalin (37%, diluted 1:10) plus 2% sodium
acetate for 15 min, and stained with 200 µL of 0.1% crystal violet for 15 min at room temperature.
After two rinses with distilled water, remaining (bound) dye was removed with 100 µL of 95%
ethanol. The plates were then placed in agitation for 5 min to allow full release of the dye. The biofilm
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formation was then quantified by measuring the optical density at 570 nm by ELISA plate reader
(Biotrak II Plate Reader–Amersham Biosciences) [59]. A total of tree plates were mounted for each
bacterium and different concentration (12, 20 ad 24 h of incubation) by experiment. The overall
experiment was repeated three times.
3.5. Structure/Function Analysis
Atomic coordinates for the lectins crystal structures from the Protein Data Bank (PDB) were used to
compare the carbohydrate binding sites design, and relate them to biological activity. The PDB codes
for the proteins used in the analysis were: 1WUV for Canavalia gladiata [47], 2CWM for Canavalia
maritime [50], Canavaliaensi formis (PDB code 1JBC) [53], Canavalia brasiliensis (PDB code 3JU9)
[54] and Canavalia boliviana [57]. The structural analyses were performed using
PyMol [60].
3.6. Statistical Analysis
The data are presented as means ± S.E.M and compared using ANOVA and Bonferroni post hoc
test. p < 0.01 was considered to be statistically significant.
4. Conclusions
Evaluating all plant lectins tested it was observed that ConM was effective in improving S. oralis
growth and diminishing S. mutans biofilm development. This mode of action can led to a new mode of
dental caries control by biological manipulation of dental sites. Substances that can minimize these
communities’ way of life can emerge as a new possibility for biotechnological therapy for patients
with high streptococci numbers by acting as a biological treatment. Our results indicate a new pathway
for prevention of caries disease.
Acknowledgements
We gratefully acknowledgeto CNPq (Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e
Tecnológico) and CAPES (Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Ensino Superior) for
financial support.
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OPEN ACCESS
molecules
ISSN 1420-3049
Article
Effect of the Lectin of Bauhinia variegata and Its Recombinant
Isoform on Surgically Induced Skin Wounds in a Murine Model
Luiz Gonzaga do Nascimento Neto 1, Luciano da Silva Pinto 2, Rafaela Mesquita Bastos 1,
Francisco Flávio Vasconcelos Evaristo 1, Mayron Alves de Vasconcelos 4, Victor Alves Carneiro 1,
Francisco Vassiliepe Sousa Arruda 1, Ana Lúcia Figueiredo Porto 3,†, Rodrigo Bainy Leal 5,†,
Valdemiro Amaro da Silva Júnior 3,†, Benildo Sousa Cavada 4,† and Edson Holanda Teixeira 1,†,*
1
2
3
4
5
†
Integrated Laboratory of Biomolecules (LIBS), School of Medicine of the Federal University of
Ceará, Sobral, Ceará 62042-280, Brazil; E-Mails: [email protected] (L.G.N.N.);
[email protected] (R.M.B.); [email protected] (F.F.V.E.);
[email protected] (V.A.C.); [email protected] (F.V.S.A.)
Center for Technological Development (CDTec), Unidad of Biotecnology, Federal University of
Pelotas, Pelotas, Rio Grande do Sul, 96010-900, Brazil; E-Mail: [email protected] (L.d.S.P.)
Department of Animal Morphology and Physiology, Federal Rural University of Pernambuco,
Recife, Pernambuco 52171-900, Brazil; E-Mails: [email protected] (A.L.F.P.);
[email protected] (V.A.d.S.J.)
Department of Biochemistry and Molecular Biology, Federal University of Ceará, Fortaleza,
Ceará 60451-970, Brazil; E-Mails: [email protected] (M.A.V.);
[email protected] (B.S.C.)
Department of Biochemistry, CBB, Federal University of Santa Catarina, Santa Catarina 88040-970,
Brazil; E-Mail: [email protected] (B.B.L.)
Holder of a scholarship from the CNPq Program for Productivity in Research.
Tel.: +55-88-3611-8000; Fax: +55-88-3611-2202.
Received: 22 September 2011; in revised form: 20 October 2011 / Accepted: 27 October 2011 /
Published: 7 November 2011
Abstract: Lectins are a structurally heterogeneous group of highly specific carbohydratebinding proteins. Due to their great biotechnological potential, lectins are widely used in
biomedical research. The purpose of the present study was to evaluate the healing potential
of the lectin of Bauhinia variegata (nBVL) and its recombinant isoform (rBVL-1).
Molecules 2011, 16
9299
Following surgical creation of dorsal skin wounds, seven groups of mice were submitted to
topical treatment for 12 days with lectin, D-galactose, BSA and saline. The animals were
anesthetized and euthanized on POD 2, 7 and 12 in order to evaluate the healing potential
of each treatment. The parameters considered included wound size, contraction rate,
epithelialization rate and histopathological findings. Wound closure was fastest in animals
treated with rBVL-1 (POD 7). nBVL was more effective than the controls. All skin layers
were reconstructed and keratin deposition increased. Our findings indicate that the lectin of
Bauhinia variegata possesses pro-healing properties and may be employed in the treatment
of acute skin wounds.
Keywords: wound healing; legume lectins; Caesalpinoideae; Bauhinia variegata
1. Introduction
Skin wounds are the result of disruption of tissue integrity [1]. Tissue damage initiates a cascade of
events including inflammation and tissue formation and reshuffle (granulation tissue), eventually
leading to partial or complete reconstruction of the damaged area [2,3]. Thus, if a wound is a
disruption of anatomical and physiological continuity of an organ or tissue, a scar is an attempt of the
body to restore integrity [4].
Skin healing is understood as a dynamic process with a complex cascade of cellular and molecular
events involving the extracellular matrix (ECM) and soluble mediators such as cytokines [5]. The
repair process starts immediately after injury and includes the following phases: Hemostasis,
inflammation, proliferation, ECM remodeling and scar formation (maturation) [6].
A major health concern for many patients, delayed wound healing can significantly reduce quality
of life [1,7]. Consequently, the ability of natural products to speed up the healing process with minimal
pain and scar tissue formation has been extensively investigated for decades [8].
Lectins are proteins that recognize and bind specifically to epitopes of structural carbohydrates
without modifying them [9]. Lectins are mediators in various biological processes, including cell-cell
adhesion of fungi and bacteria to host cells, and have long been employed in the detection and analysis
of carbohydrates, immune response and other processes [10-12]. Due to the participation of lectins in a
range of important biological processes, the possibility of using them as biotechnological tools has
been extensively explored [13-19].
Galactose-specific lectins of the subfamily Caesalpinoideae, such as Bauhinia purpurea (BPA),
Bauhinia monandra (BmoLL) and Griffonia simplicifolia, have been used as insecticidal agents, as
blood group markers, in studies on cancer cells and in several other important biological contexts [20-22].
The lectin of the orchid tree Bauhinia variegata (nBVL) has at least two isoforms (BVL-1 and
BVL-2). Both are galactose ligands with a molecular mass of 32 kDa and structurally similar to other
Caesalpinoideae lectins [23]. Alencar and colleagues [24] have shown that nBVL has pro-inflammatory
properties capable of inducing resident mast cell-dependent neutrophil migration in vivo and in vitro.
Molecules 2011, 16
9300
Plant lectins may also be synthesized with the aid of expression vectors such as bacteria and yeasts,
making large-scale production of biotechnically useful lectins feasible [25-27]. Recently, through
cloning and expression in E. coli, a recombinant isoform of the lectin of B. variegata (rBVL-1) was
obtained, with DNA sequence and amino acids similar to other well-known Caesalpinoideae lectins [23].
The purpose of this study was to investigate the healing potential of topical administration of the lectin
of B. variegata (nBVL) and its recombinant isoform (rBVL-1) on surgically induced skin wounds in a
murine model.
Animals treated with rBVL-1 displayed lower levels of typical inflammatory signs, such as swelling
and redness, in the first days following treatment, compared to controls, indicating a possible antiinflammatory effect. In contrast, nBVL had a pro-inflammatory effect, as shown by the finding of
higher levels of swelling and redness in the wound bed. On postoperative day (POD) 9, scar tissue was
observed in more animals in the rBVL-1 group than in the nBVL group (data not shown). In the
inflammatory stage, healing was faster and more effective in G-I (rBVL-1) than in G-VI (nBVL) and
controls. Total wound closure was observed in the animals treated with nBVL only on POD 12
(Figures 1A–C).
Figure 1. Closure rate of surgically induced skin wounds in mice treated with topical
administration of saline
; nBVL complexed with D-Gal and nBVL
(A); saline
; rBVL-1 complexed with D-Gal
and rBVL-1
(B); * significant in relation
#
to saline; significant in relation to rBVL-1 complexed with D-Gal. BSA
; rBVL-1
#
significant in relation to BSA. Statistical test:
and nBVL
(C); * and
Mann-Whitney (p < 0.05).
The measurement of the actual wound area was hampered by the presence of a thick scab (dry fibrin
in the wound bed) formed through contact with atmospheric oxygen [28]. Despite this difficulty,
reliable measurements were obtained based on the wound borders. Wound epithelization (ER) was
significantly greater in G-I (rBVL-1) than in all other groups due to more efficient wound contraction
(CR) during the inflammatory phase (POD 0-2) (Table 1). Both administration of nBVL and Dgalactose decreased wound size from POD 7 on (data not shown). In the healing period between
proliferation and remodeling (POD 7–12), G-VI (nBVL) displayed greater CR and ER values than the
other groups, though differences were not significant (Table 1).
Molecules 2011, 16
9301
Table 1. Contraction rate (CR) and epithelialization rate (ER) of surgically induced skin
wounds in mice treated with rBVL-1 (Group I), rBVL-1 complexed with D-galactose
(Group II), bovine serum albumin (Group III), D-galactose (Group IV), saline (Group V),
nBVL (Group VI) or nBVL complexed with D-galactose (Group VII). Figures are mean
values ± standard deviation.
POD
Parameter
Group I
Group II
Group III
Group IV
Group V
Group VI
Group VII
0–2
CR
7.708 ± 1.345 *
0.833 ± 0.441
3.667 ± 1.008
2.542 ± 1.532
2.250 ± 1.689
3.958 ± 1.345
2.542 ± 1.167
2–7
ER
3.854 ± 0.672 *
0.416 ± 0.220
1.833 ± 0.504
1.271 ± 0.766
1.125 ± 0.845
1.979 ± 0.672
1.271 ± 0.583
CR
3.800 ± 0.704
5.275 ± 0.915
5.675 ± 0.630
4.775 ± 1.113
4.625 ± 1.375
5.925 ± 0.865
6.125 ± 1.616
ER
1.900 ± 0.352
2.638 ± 0.457
2.838 ± 0.315
2.388 ± 0.556
1.542 ± 0.555
2.963 ± 0.433
3.063 ± 0.808
7–12
CR
48.50 ± 24.13
40.50 ± 9.35
35.50 ± 3.61
69.70 ± 25.37
14.75 ± 1.80
61.00 ± 9.33
52.75 ± 1.93
ER
24.25 ± 12.07
20.25 ± 4.67
17.75 ± 1.80
34.85 ± 12.69
2.458 ± 1.08
30.50 ± 4.66
26.38 ± 0.96
POD = postoperative day. Parameter units: mm2/day. * Statistically significant when compared to Groups II,
IV, V and VII (p < 0.05; ANOVA and post-Tukey test).
Histopathological Assessment
Four samples of injured tissue were collected from each group on POD 2, 7 and 12 and submitted
to histopathological evaluation. Wounds treated with BSA and rBVL-1 had scab sealing the opening
in the epithelium (Figure 2).
Wounds treated with rBVL-1 presented mild inflammatory exudate, but the inflammatory infiltrate
in the reticular dermis was intense (Figure 2B). Wounds treated with BSA had intense inflammatory
exudate (Figure 2A). On the other hand, in wounds treated with rBVL-1, collagen fibers were seen
around the congested vessels irrigating unilocular adipose tissue on POD 2, suggesting collagenproducing cell proliferation and, consequently, faster healing (Figure 2D).
On POD 7, wounds treated with rBVL-1 presented restoration of the epithelial lining, subepithelial
collagen deposition and thickening of collagen fibers in the reticular dermis with restructuring of the
adipose tissue (Figure 3C). Figure 3D shows layers of restructured skin (epidermis, papillary and
reticular dermis) and new skin appendages on animals treated with rBVL-1. This was not observed for
animals treated with BSA (Figures 3A–B). In G-II (rBVL-1 complexed with D-galactose) and G-IV
(D-galactose), tissue regeneration was observed only on POD 12 (Figure 4).
Healing was slow in G-VII (nBVL complexed with D-galactose), even during fibroplasia (POD 7).
The animals in this group presented severe acute inflammation, little reaction of the adipose tissue to
early formation of granulation tissue, hemorrhage, and degeneration of the fatty tissue below the
dermis (Figure 5). On POD 7, development of epidermal hyperplasia for epithelial repair, active
granulation tissue formation with adipose tissue proliferation and active cell clusters were observed in
G-VI (nBVL) (Figure 6).
Molecules 2011, 16
Figure 2. Photomicrographs of surgically induced skin wounds in mice treated with topical
administration of BSA (Group III) and rBVL-1 (Group I); POD 2 (stained with Masson’s
trichrome). A: BSA (Group III; control). See scab (star) covering the wound bed and
intense inflammatory exudate (arrow), area of collagenolysis and reticular dermal edema
under the exudate (between dashed blue lines), and subcutaneous skeletal muscle with
congested vessels immediately below the dermis (blue arrows). Magnification: 4×;
B: rBVL-1 (Group I). See thicker scab (star) over wound bed and less intense
inflammatory exudate (arrow), area of collagenolysis, reticular dermal edema and intense
inflammatory infiltrate under the exudate (between dashed blue lines), subcutaneous
skeletal muscle with fibers separated by connective tissue immediately below the dermis
(blue arrows), and fat cells near the area of collagenolysis (red arrow). Magnification: 4×;
C: detail of subcutaneous skeletal muscle showing fat cells (arrow), congested vessels
(star) and mild inflammatory infiltrate. Magnification: 10×; D: rBVL-1 (Group I).
Congested vessels (star) bounded by collagen fibers embedded in proliferated unilocular
adipose tissue below area of intense inflammatory exudate and scab.
9302
Molecules 2011, 16
administration of BSA (Group III) and rBVL-1 (Group I); POD 7 (stained with Masson’s
trichrome). A: BSA (Group III; control). Observe scab (star) covering the wound bed and
intense inflammatory exudate (between dashed yellow lines), granulation tissue with
congested vessels (arrow) and intense fibroblast proliferation below exudate, and blue band
due to collagen synthesis (red arrows) immediately below the inflammatory exudate.
Magnification 4×; B: BSA (Group III; control). Details of granulation tissue. Observe
fibroblast proliferation (arrow) and mild inflammatory infiltrate around vessels (blue
arrow), collagen band above granulation tissue (red arrow), and vessels in the granulation
tissue (star). Magnification 10×; C: rBVL-1 (Group I). Scab detaching from epithelium
(white star). Observe restructuring of the epithelial lining (arrow), dermis with areas of
reduced subepithelial collagen deposition (star) and reticular dermis characterized by
thickening of collagen fibers (red star). Observe restructured subcutaneous adipose tissue
(SCAT) below the dermis. Magnification 4×; D: Detail of previous photo showing regular
layers of restructured skin: 1) epidermis, 2) papillary dermis, and 3) reticular dermis, and
budding skin appendages (arrow).
9303
Molecules 2011, 16
administration of D-galactose (Group IV) and rBVL-1 complexed with D-galactose (Group
II); POD 12 (stained with Masson’s trichrome and hematoxylin-eosin). A: D-galactose
(Group IV). Observe intact skin with newly formed luminal epithelium (black arrow),
nearly closed wound and reduced keratin production, retracting granulation tissue just
below the epithelium (star), indicating poor tissue reorganization and, further below,
thickening of collagen fibers in the papillary dermis (white star). Magnification: 10×; B:
D-galactose (Group IV). Presence of luminal epithelium (black arrow). Observe the
epidermal hyperplasia with formation of budding skin appendage (blue arrows).
Magnification 10×; C: rBVL-1 complexed with 2.3 mM D-galactose (Group II). Nearly
closed wound with restructuring of the epithelial lining (black arrow). See the formation of
budding skin appendage below the new epithelium (blue arrows). Magnification: 10×; D:
rBVL-1 complexed with 2.3 mM D-galactose (Group II). Congested vessels are seen in the
papillary dermis (arrows). See the epidermal hyperplasia (Ehy) and the presence of
sebaceous glands (SG) as budding skin appendages. Magnification: 10×.
9304
Molecules 2011, 16
administration of nBVLcomplexed with 2.3 mM D-galactose (Group VII); POD 7 (stained
with hematoxylin-eosin). A: Overview of damaged area. Observe scab sealing epithelial
opening (S), early stage of granulation tissue formation (star) with intense acute
inflammation and degenerating adipose tissue (dAT). Magnification: 4×; B: Detail of
previous photo showing area with degenerating adipose tissue (dAT) and unaffected
adipocytes (Ad) in the granulation tissue, vessels in granulation tissue (red arrows), and
congested vessels (black arrow) in area with hemorrhage. Magnification: 10×;
C: Granulation tissue originated from reactional adipose tissue (RAT). The red arrow
shows congested vessels from granulation tissue. Observe area of intense inflammatory
reaction (star). Magnification: 10×; D: Detail of open wound with scab, hemorrhage just
below the scab, and congested vessels (arrows). Magnification: 10×.
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administration of nBVL (Group VI); POD 7 (stained with hematoxylin-eosin). A: Scab
above granulation tissue originating from unilocular adipose tissue proliferating with active
cell clusters (RAT) and congested vessels in granulation tissue (red arrows). Presence of
recently formed epithelium on the board of scab area (black arrows). Magnification: 4×; B:
Detail of previous photo showing epidermal hyperplasia (Ehy) on the border of scab area,
budding skin appendages (black arrows) and sebaceous gland (SG). Observe the
granulation tissue area along the adipose tissue (AT). Magnification: 10×; C: Detail of A
showing area of active granulation tissue (star) with congested vessels (arrows) below the
reactional adipose tissue (RAT). Observe subcutaneous muscle tissue (SCMT).
Magnification: 10×; D: Detail of previous photo showing new vessels (black arrows) in the
granulation tissue, indicating angiogenesis. Observe the presence of reactive fibroblasts on
the granulation tissue (GT) area (blue arrows). Magnification: 40×
On POD 12, the animals in G-VI (nBVL) presented restructuring of the epithelial lining with
increased production of keratin, and dermal deposition of active collagen. Despite the inflammatory
reaction (Figure 7A), bands of collagen were seen to proliferate towards the subcutaneous tissue,
replacing the adipose tissue (Figure 7C), and ridges with dermal papillae and budding skin appendages
were observed (Figure 7B). In G-V (saline), the healing process was delayed, as indicated by the
presence of acute inflammatory response and early-stage granulation tissue on POD 7 (Figure 8).
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administration of nBVL (Group VI); POD 12 (stained with hematoxylin-eosin).
A: Keratin deposition on the epithelial lining (arrows), thickening of subepithelial collagen
fibers deposited in the dermis (star), and fat cells below the dermis (AT). Magnification:
10×; B: Detail showing the formation of epidermal ridges with consequent formation of
dermal papillae (arrows), and newly formed skin appendages. Magnification: 10×; C:
Detail showing bands of active collagen (star) moving towards the retracting adipose
tissue, and congested vessels in granulation tissue (arrows) retracting along with the
adipose tissue; D: Bands of active collagen in adipose tissue in retraction (black star).
Remaining vessels of the granulation tissue can be noted. Magnification: 40×.
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administration of 150 mM NaCl; POD 7 (stained with hematoxylin-eosin and Masson’s
trichrome). A: Open wound with thick scab and dystrophic calcification (white star)
sealing the epithelial opening (S). Observe early formation of granulation tissue originating
from reactional adipose tissue (RAT) along with vessels (arrows), and waning
inflammatory process (black star). Magnification: 4×; B: Granulation tissue with congested
vessels in fat (arrows) immediately below calcified scab. Observe inflammatory exudates
below scab (star). Magnification: 10×; C: Detail of A showing area of acute inflammation
in slightly degenerated adipose tissue (star), and vessels of granulation tissue (arrows) in
adipose tissue (AT) above the inflammation. Magnification: 10×; D: inflammatory exudate
below scab (white star). Observe poor collagen deposition and granulation tissue in the
dermis (black star) between areas of adipose tissue. Magnification: 10×.
The primary function of the skin is to serve as a protective barrier against the environment. The loss
of skin integrity from injury or illness can lead to severe disability or even death [29]. Healing is a
dynamic and well-organized biological process [30] involving cellular and biochemical components
employed in the recovery of tissue morphology and function [31].
The development of technologies based on natural sources for the healing of skin wounds or ulcers
is of major interest to researchers and other stakeholders in the biomedical field [32]. Of special
importance are agents capable of enhancing tissue repair and reducing healing time [33,34].
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9309
Lectins are a structurally heterogeneous group of proteins with several direct biomedical and
biotechnological applications [27]. Galactose-binding lectins are particularly useful because they
interact with several endogenous molecules involved in innate and specific immune responses [13].
The ability of these macromolecules to activate immune cells, neutrophils, macrophages and mast
cells [35,36] indicates a potential for accelerating wound healing and epithelial tissue regeneration [37].
In our study, wounds treated with nBVL presented stronger inflammatory signs characteristic of
inflammatory response, inducing a proinflammatory response, than wounds treated with saline or BSA
(controls). This appears to have contributed to the faster and more effective healing process observed
in G-VI (nBVL).
Macrophages and mast cells are resident cells with surface glycoproteins and glycolipids which
may act as ligands for lectins [13]. When activated, they release mediators capable of initiating
inflammatory response [29,38]. Stimulation of adhesion molecules (VCAM-1, VE-Cadherin, ICAM-1,
VCAM-1 and P-selectin) and chemotaxis (CXC receptors) triggers the migration of inflammatory cells
to the damaged tissues [6,39]. Iordache and colleagues demonstrated that lectins from potatoes
(Solanum tuberosum) and extracts of marigold (Calendula officinalis) are able to increase the
proliferation of endothelial progenitor cells (EPCs) and modulate gene expression of adhesive
molecules and chemotaxis, facilitating the attachment of the EPCs to the injured endothelium. Lopes
and colleagues [40] demonstrated that plant lectins are capable of inducing histamine release by mast
cells of different origins. In another study, lectins were shown to have a mitogenic effect on
lymphocytes and to stimulate the production of proinflammatory cytokines such as IFN-γ and TNF-α,
strongly activating macrophages cultured in vitro [41].
rBVL-1 (G-I) and nBVL (G-VI) induced faster healing than rBVL-1 complexed with D-galactose
(G-II). These findings were confirmed by histopathological assessment (Figures 2–8). The finding in
G-I of regenerated skin layers already on POD 7 suggests rBVL-1 has a greater pro-healing potential
than the other treatments tested in this study. The pro-healing effect was reversed when D-galactose
blocked the CRD (carbohydrate recognition domain), suggesting healing was significantly improved in
the presence of rBVL-1.
The lectin of B. variegata (nBVL) and its recombinant isoform (rBVL-1) appear to stimulate the
mitogenic activity of resident cells, turning them into potent chemotactic agents for the recruitment of
neutrophils through the release of cytokines, as observed in studies on other galactose-binding lectins
such as Vatairea macrocarpa and Artocarpus integrifolia [13,17]. Mast cells are responsible for
secreting large amounts of growth factors, including TGF-β and α [42]. TGF-β is a major growth
factor involved in the regulation or stimulation of tissue repair, angiogenesis, granulation tissue
formation, collagen synthesis by fibroblasts, and fibroplasia [42,43].
In a histological analysis of the effect of monosaccharides (hexoses) on wound healing in rats,
Kössi and colleagues [44] found that treatment with D-galactose caused a considerable increase in the
accumulation of granulation tissue. This may explain the pro-healing effect of D-galactose in relation
to the controls.
Granulation tissue consists of new capillaries generated from pre-existing ones. The growth factors
FGF2 and VEGF are responsible for the development of this tissue [45]. The formation of granulation
tissue in the early postoperative period seems to suggest that nBVL and rBVL-1 induce the release of
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FGF2, VEGF and angiopoietins by endothelial cells modulated by cytokines produced by mast cells
and macrophages.
Epithelialization starts within hours of tissue injury. In this process, the release of TGF-α and FGF
flags are essential for the proliferation of epithelial cells and keratinocytes required for total wound
closure. Moreover, fibroblasts are activated for collagen synthesis mediated by TGF-β released from
mast cells and macrophages [43,46,47]. During tissue remodeling, the old collagen needs to be
degraded by matrix metalloproteinases secreted mainly by macrophages and endothelial cells of the
new vessels in the granulation tissue [48]. The new fibers deposited in the dermis (essentially the
gradual replacement of type III collagen by type I collagen) are structurally more organized and will
eventually form the new ECM [49].
According to Ishihara and colleagues, early healing is characterized by rapid epithelialization and
wound contraction. Consequently, wound tensile strength increases, possibly due to greater deposition
and stabilization of collagen fibers [50].
The CR and ER values observed in the present study strongly indicate nBVL and rBVL-1 stimulate
the differentiation of fibroblasts into myofibroblasts, which is an extremely important event in the
remodeling of connective tissue [51]. When fibroblasts are activated in damaged tissues, they
differentiate into myofibroblasts which in turn exercise physical traction on the wound, stimulating
contraction and helping remodel the collagen synthesized by fibroblasts during healing [43,51,52].
The difference in wound healing observed between animals treated with nBVL and rBVL-1 was
most likely due to structural differences in the CRD of these lectins. rBVL-1 is but one of many
potential isoforms of nBVL [23].
3. Experimental
3.1. Lectin Extraction and Purification
Lectin extracted from the seeds of Bauhinia variegata (nBVL) was purified by affinity
chromatography on a lactose-agarose column (Sigma, St. Louis, MO, USA), then cloned and expressed
in E. coli to produce the recombinant isoform (rBVL-1), following the method described by Pinto and
coworkers [23].
3.2. Induction and Treatment of Skin Wounds
The experimental protocol was approved by the Ethics Committee of Ceará State University
(UECE) under entry #11042434-4 and all animals were treated following the recommendations of the
Brazilian College of Animal Experimentation (COBEA) and the Guide for the Care and Use of
Laboratory Animals of the US Department of Health and Human Services (NIH publication No. 85–23,
revised 1985).
The in vivo study employed eighty-four 10-week-old male Swiss albino mice (Mus musculus)
weighing 35.0 ± 5.0 g, supplied by the laboratory animal facility of the Federal University of Ceará
(BIOCEN/UFC). During the experimental procedures, the animals were kept in individual cages in a
controlled environment (circadian cycle, 25 ± 2 °C, 55 ± 10% humidity, food and water ad libitum) at
the School of Medicine in Sobral (UFC).
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9311
Prior to the surgical procedure, the animals were randomly distributed into seven groups (n = 12)
according to the topical treatment administered: G-I (200 µg/mL rBVL-1); G-II (200 µg/mL rBVL-1
complexed with 2.3 mM D-galactose); G-III (200 µg/mL bovine serum albumin); G-IV (2.3 mM
D-galactose); G-V (150 mMNaCl); G-VI (200 µg/mL nBVL); G-VII (200 µg/mL nBVL complexed
with 2.3 mM D-galactose).
The mice were then anesthetized with subcutaneous administration of 2% xylazine with 10%
ketamine hydrochloride (10 mg/kg and 115 mg/kg, respectively) [53], followed by trichotomy and
antisepsis of the dorsal thoracic region with povidone-iodine and sterile saline solution (150 mM
NaCl). After marking the skin with a sterile mold (1.00 cm2), circular aseptic skin wounds were
created by incision with a scalpel (#15) followed by resection of the subcutaneous tissue with fine
dissection tweezers. Immediately after the surgical procedure, the wounds were treated topically for
12 days according to treatment group. Animals treated with lectins and BSA received a single daily dose
of 20 µg/100 µL; the remainder received 100 µL.
3.3. Evaluation of Healing Potential
Wounds were measured daily for 12 days in order to evaluate the healing potential of each
treatment. The wound area was expressed as mean ± standard deviation, as previously reported [54].
The wound contraction rate (CR) was expressed as change in wound area (mm²) over time (day),
according to the following equation:
CR = ∆ area ÷ ∆ time (day)
The epithelialization rate was expressed as growth of new epithelium (mm²) over time (day),
according to the following equation:
2ER = ∆ area ÷ ∆ time (day)
The animals were anesthetized prior to the collection of histopathological material and subsequently
euthanized [54]. Samples (4 per group) of injured tissue were collected on the 2nd, 7th and 12th
postoperative day (POD), fixed in 10% formaldehyde (v/v) buffered in 0.01 M PBS (pH 7.2), prepared
in 5-mm cuts for routine histological analysis [55] and stained with hematoxylin-eosin (HE) and
Masson’s trichrome. The histopathological assessment included the following parameters: Presence of
scabs, re-epithelialization, collagen deposition, neovascularization and exudate. The analysis was
performed under a Leica light microscope (model DM 500) at 4, 10 and 40× magnification.
3.4. Statistical Assessment
Intergroup differences in CR and ER values were analyzed with one-way ANOVA followed by the
Tukey post-test. Differences between wound area and closure percentage were tested with the
Mann-Whitney test. The data were processed with the statistics software GraphPad Prism v.3.00 for
Windows®. Values are given as mean ± standard deviation. The level of statistical significance was set
at p < 0.05.
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9312
4. Conclusions
Our results indicate that lectin extracted from the seeds of Bauhinia variegata (nBVL) can stimulate
the healing process of skin wounds in mice, possibly by acting on cells of the immune system,
enhancing proinflammatory response, collagen synthesis by fibroblasts and angiogenesis by
modulating the release of inflammatory cytokines and growth factors. The recombinant isoform of the
lectin (rBVL-1) displayed pro-healing effects as well.
The secretion of growth factors and consequent phenotypic change of fibroblasts into
myofibroblasts may explain the observed acceleration in wound closure (faster wound contraction and
increased collagen deposition by fibroblasts, even in the inflammatory phase), with effective healing
accomplished by POD 7.
Acknowledgments
We would like to thank CNPq, CAPES and FUNCAP for financial support, and the School of
Medicine of Sobral, Brazil. We thank Jesper Sampaio, a native English consultant, for the support in
English language.
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indução de apoptose em células - Universidade Federal do Ceará

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