INTRODUCCIÓN A LAS TÉCNICAS NAT

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INTRODUCCIÓN A LAS TÉCNICAS NAT
INTRODUCCIÓN A LAS TÉCNICAS
DE DETECCIÓN DE ÁCIDOS
NUCLÉICOS
(N.A.T.)
BIOQ. LILIANA DI TULLIO BUDASSI
FAC. CS .BIOQUÍMICAS Y FARMACÉUTICAS
UNIVERSIDAD NACIONAL DE ROSARIO
lilian[email protected]
INFECCIONES TRANSMISIBLES POR TRANSFUSIÓN

Patógenos transmisibles por transfusión

Virus

Parásitos

Bacterias

Agentes no convencionales-Priones
Virus de la Hepatitis B (HBV)
Virus de la Hepatitis C (HCV)
Virus de la Inmunodeficiencia Humana 1 y 2 (HIV1/2)
Virus Linfotrópico Humano I/II
(HTLV I/II)
otros: H1N1, virus del Dengue, West Nile Virus
Trypanosoma cruzi (Enf. de Chagas-Mazza)
otros: Plasmodium malariae, Pl falciparum
Treponema pallidum (Sífilis)
Brucella abortus (Brucelosis)
otros
2
TAMIZAJE DE INFECCIONES TRANSMISIBLES POR
TRANSFUSIÓN EN ARGENTINA
(LEY 22.990 - LEY NACIONAL DE SANGRE )

HVB: Enzimoinmunoensayos HBsAg y anti-HBc total

HCV :Enzimoinmunoensayo anti- HCV y Ag HCV

HIV1/2 : Enzimoinmunoensayo ag-p24 y anti-HIV1/2

HTLV I/II: Enzimoinmunoensayo anti-HTLV I/II

Chagas : Enzimoinmunoensayo y Hemaglutinación indirecta, ambos anti-
Tripanosoma cruzi

Sífilis: Test de VDRL anti- Treponema pallidum

Brucelosis: Reacción de Huddlesson, anti-Brucella abortus

3
TAMIZAJE DE INFECCIONES TRANSMISIBLES POR
TRANSFUSIÓN
Métodos indirectos: detección en la sangre (suero o
plasma) del donante de la presencia de una respuesta
inmune contra un patógeno dado


Diagnóstico serológico mediante diferentes técnicas de laboratorio
Ej: análisis en búsqueda de anticuerpos específicos contra HIV en el suero del
donante (EIA anti-HIV 0/1/2)
Métodos directos: detección directa de la presencia
del patógeno (genoma o antígenos) en la sangre del
donante
Ej: EIA para detectar p24 HIV, HBsAg o HCV ag
 Técnicas de biología molecular: buscan el DNA o RNA viral

4
FACTORES DE RIESGO EN LA TRANSMISIÓN DE
INFECCIONES A TRAVÉS DE LAS TRANSFUSIÓN

Errores humanos o de laboratorio
Problemas en los sistemas de análisis/equipos
Insuficiencias en la calidad de los análisis
Entrenamiento deficitario

Seroconversiones atípicas

Variantes o genotipos del patógeno no detectadas

Cambios epidemiológicos

Periodo de “ventana” serológico
5
PERÍODO VENTANA
TIEMPO ENTRE EL MOMENTO DE LA INFECCIÓN Y EL
DESARROLLO DE MARCADORES SEROLÓGICOS
Período
Ventana: NAT
Eclipse
Reacción inmune
Reactivo Serológico
6
Infección
Tiempo
Riesgo de infección por unidad transfundida
EVOLUCIÓN
DEL RIESGO EN LA PROVISIÓN DE SANGRE
1/100
HCV
1/1000
HBV
1/10,000
1/100,000
HIV
1/180,000
1/1.600,000
1/1000,000
1/1.900,000
Ac Anti-HIV
1985
Ac Anti-HCV
1990
p24
1996
Año
NAT
1999
2001
Bacterial Contamination of Blood Components: Risks, Strategies, and Regulation Hillyer et al.
Joint ASH and AABB Educational Session in Transfusion Medicine. Hematology 2003
7
NUCLEIC ACID TESTING
Ventajas de NAT
 Importante avance teconológico en screening de sangre
 Altamente sensible & específico
 dirigido especificamente a las secuencias nucléicas virales
 Detección directa del RNA or DNA viral
 Ayuda a la prevención de
transfusión
enfermedades transmisibles por
 Provee una etapa adicional de seguridad a la provisión de sangre
segura
8
 Reduce el Período Ventana desde la infección hasta la detección
OBJETIVO DE NAT O DGV:
DISMINUCIÓN DEL PERÍODO DE VENTANA
NAT positivo
Eclipse
Período
Ventana
Virus
Reacción inmune
Reactividad Serológica
Infección
Tiempo
Detección más temprana
9
EJ: EVOLUCIÓN CLÍNICA DE HIV: DÓNDE ACTÚA NAT?
10
EVOLUCIÓN EN LA IMPLEMENTACIÓN DE LAS TÉCNICAS NAT
EN LOS BANCOS DE SANGRE

1993 se considera formalmente la utilización de NAT para el tamizaje en bancos de
sangre, luego que la Food and Drug Administration (FDA) reportara diversos casos
de infección por el VHC como consecuencia del uso de inmunoglubulina intravenosa
manufacturada.

1995 Comité Europeo para Productos Medicinales Manufacturados (CPMP) se
adhirió a este lineamiento, haciéndolo extensivo a todos los productos medicinales
derivados del plasma.

1997 Organización Mundial de la Salud (OMS) se establecen estándares para el
ADN del VHB, el ARN del VHI-1, el ARN del VHC y el ADN del Parvovirus B19.

2000-2001 diferentes países incorporan paulatinamente NAT para HCV y HIV en el
tamizaje de donaciones.

2009 OMS en su documento “Recommendations: Screening Donated Blood for
Transfusion-Transmisibles Infection” sugiere que junto a los ensayos de tamizaje
serológicos para VHC, VIH y VHB, dirigidos a los marcadores serológicos de
antígenos y/o anticuerpos, se realice la búsqueda de ácidos nucléicos virales para
11
estos patógenos.
PERÍODO VENTANA
MODEL TESTING DATA
Fuente: Busch et al. Transfusion.2005;45(2):254-264.
Kleinman and Busch. Transfusion. 2006;36:S23-S29 .
12
VENTAJAS NAT
VIRUS
Pruebas
serológicas
NAT MP
NAT ID
(Minipool)
(Individual)
VIH
(incluye p24)
16 días
10 días
7 días
VHC
70 días
9 días
7 días
VHB
59 días
49 días
38 días
Acortamiento del período de ventana inmunológico
Disminución del riesgo residual
13
TÉCNICAS BASADAS EN BIOLOGÍA
MOLECULAR
 Involucran tres etapas:
1. Extracción o captura del genoma viral
2. Amplificación
3. Detección
Ejemplos:


PCR(Polymerase Chain Reaction)
RT-PCR (Real Time PCR)

NASBA (Nucleic Acid Based on Amplification)

TMA (Transcriptional Mediated Amplification)
14
PCR Real
Time
PCR
TMA
NASBA
Nuclisens Easy Q system
TMA: pasos principales del ensayo
Detección
EasyQ Instrument &
Reagents
NucliSens
EasyQ
Incubator
Desktop computer
Strip centrifuge
Amplificación
Captura del blanco
o diana (target)
NucliSens
EasyQ
Analyzer
15
MODELOS DE PROCESAMIENTO DE LAS
TÉCNICAS NAT
Técnicas “in house”
 Técnicas comerciales
 Técnicas Cualitativas
 Técnicas Cuantitativas


Procesamiento de las muestras individuales (ID) o en mini-pools (MP)
POOL
48
POOL
24
UNIDADES
POOL
8
POOL
8
POOL
24
UNIDADES
POOL
8
POOL
8
POOL
8
POOL
8
16
NAT DETECTA INFECCIÓN HCV MÁS TEMPRANO QUE EL
TEST DE ANTICUERPOS
HCV GEq/mL
HCV GEq/mL
10,000,000
10,000,00
S/CO
5
7 días
4
28 días
100,000
3
10,000
2
NAT ID test
1,000
0
10
20
30
0
Días
Fuente: Susan Stramer, Ph.D., American Red Cross, 1999
40
1
NAT pool
HCV Ac 0
50
17
PUNTOS IMPORTANTES A CONSIDERAR EN
CUANTO AL ORIGEN DEL MÉTODO A ELEGIR:
Sensibilidad
Especificidad
Detección de variantes/subtipos
Reproducibilidad
Trazabilidad de reactivos y resultados
Software adecuado
Control Interno
Control de Contaminación
Ensayos discriminatorios/confirmatorios
Identificación de su uso: RUO o IVD
Marca CE, FDA, ANMAT
18
PARA ASEGURAR LA CALIDAD DEL RESULTADO, CADA
SISTEMA NAT DEBE POSEER CONTROLES ADECUADOS
EN SUS DIFERENTES ETAPAS:




Controles de Reactivos: para evaluar la presencia de
ADN/ARN foráneo o productos de amplificaciones
precedentes.
Control Negativo: para evaluar los riesgos de
contaminación (en la organización del espacio físico, en
los métodos de trabajo, posible aerozolización durante
el alicuotado de reactivos)
Control Positivo: para controlar la presencia de
inhibidores y el buen desarrollo de las diferentes etapas.
Control Interno: para verificar la idoneidad de la
amplificación y/o la presencia de inhibidores de la
misma.
19
Marca (s)
COBAS
Ampliscreen HIV-1
Test
Procleix
UltraQual HIV-1
RT-PCR Assay
UltraQual HCV RTPCR Assay
COBAS
AmpliScreen HCV
Test
COBAS
AmpliScreen HBV
Test
Formato
PCR
HIV-1/HCV Nucleic
Acid Test (TMA)
PCR
Muestra
Plasma
Plasma
Uso habilitado
Donor Screen
Expanded Indications Roche Molecular
For Use: Source
Systems, Inc
Plasma donors, other
living donors, and
organ donors
Donor Screen
Expanded Indications
For Use: Source
Plasma donors, living
organ donors and
cadaveric samples
Donor Screen
Plasma
Donor Screen
PCR
Plasma
PCR
Plasma
PCR
Plasma
Procleix WNV Assay
Nucleic Acid Test
(TMA)
ID
Plasma
Fabricante
Gen-Probe
San Diego, CA
92121
National Genetics
Institute
Los Angeles, CA 92121
National Genetics
Institute
Los Angeles, CA
92121
Fecha de
Aprobación
12/20/2002
02/08/2002
09/18/2001
09/18/2001
Donor Screen
Expanded Indications
For Use: Source
Plasma donors, other
living donors, and
organ donors
Donor Screen
Indications For Use:
Source Plasma donors,
other living donors,
and organ donors
Roche Molecular
Systems, Inc
12/3/2002
Roche Molecular
Systems, Inc
04/21/2005
Qualitative detection of
West Nile Virus
(WNV) RNA from
volunteer donors
Gen-Probe
San Diego, CA
92121
20
12/01/2005
COMPARACIÓN DE LA SENSIBILIDAD ANALÍTICA
DE LOS TEST NAT
95% Límite de Detección (95% CI)
HIV
(IU/ml)
HCV
(IU/ml)
HBV
(IU/ml)
WNV**
(Copies/ml)
Procleix TMA*
19.62
(17.15-23.16)
2.78
(2.44-3.37)
7.46
(6.43-8.97)
3.4
AmpliScreen*
Std
preparation
323.4
(284.9-387.3)
41.9
(28.0-111.8)
15.99
(13.78-20.06)
Taq
Screen
AmpliScreen*
Multiprep
78.4
(68.4-94.4)
28.8
(20.5-85.8)
4.41
(3.56-6.13)
Ensayo
15
21
* Roche’s COBAS AmpliScreen US Package Inserts or Procleix Ultrio CE Package Insert
** From Busch et al. 2000.Transfusion 45, 492-499
DISEÑO, ACONDICIONAMIENTO E INFRAESTRUCTURA
DEL LABORATORIO DE BIOLOGÍA MOLECULAR
Metas principales para la instalación:
 Proporcionar
el espacio suficiente para el flujo
de trabajo y mantenimiento de equipos
 Evitar la contaminación
 Mantener la correcta temperatura , humedad y
presión del ambiente
22
CONDICIONES GENERALES
Nivel de seguridad 2 : BSL2
 Paredes con pintura resistente a la descontaminación
(ácidos o álcalis)
 Pisos con bordes sanitarios, antideslizante o de vinilo.
 Presión relativa ambiente: neutra o ligeramente negativa
en área de post-amplificación
 Divisorios: gabinetes modulares a base de metal, con
bordes sanitarios y puertas corredizas
 Mesadas: resistentes a agentes químicos
 Iluminación: compartimiento estanco
 Electricidad: UPS de soporte / grupo electrógeno

23
ÁREAS DEL LABORATORIO DE BIOLOGÍA MOLECULAR
Área de preparación de reactivos y muestras
 Área de pre-amplificación
 Área de post-amplificación y detección

Se definen las diversas áreas mediante barreras físicas o
protocolo de barreras entre un área de trabajo y otra.
Objetivo: evitar la contaminación entre áreas de trabajo
diferentes
24
BIOSEGURIDAD EN EL LABORATORIO DE
BIOLOGIA MOLECULAR
Principal objetivo: minimizar la contaminación a través de…
 Diseño del ensayo
 Disposición del laboratorio
 Control del flujo de trabajo
25
ÁREAS DEL LABORATORIO DE BIOLOGÍA
MOLECULAR
Post-Amplificación
Pre-Amplificación
26
GESTIÓN DE LA CALIDAD EN EL LABORATORIO DE BIOLOGIA
MOLECULAR
Manuales de Gestión de la Calidad
 Manuales de procedimientos
 Manual de Bioseguridad
 Estándares y normativas:


Norma ISO 9001:2000
 Norma ISO /IEC17025 /1999

Estándar Paul Erlich Institute
Organismos internacionales: OMS “Collaborative Study
Group” (provee CCE y establece la unidad de medida:
UI/ml)
 Acreditación

27
CONCLUSIONES (1)
Disminución del período ventana
 Otras
aplicaciones: tests que permiten una
detección directa de otros virus. Ej: WNV, otros
virus emergentes
 Progresar desde analizar mini-pooles a analizar
muestras individuales.
 Lograr la implementación de automatización total
de las técnicas de NAT:
-disminución de los errores del operador.
-mejor estandarización operativa.
-optimización de los tiempos de reacción.
-trazabilidad de los productos liberados.

28
CONCLUSIONES (2)
Necesidad de lograr un consenso nacional acerca de temas
puntuales referentes a la implementación de NAT en
Argentina:

la obligatoriedad de las técnicas NAT en Medicina Transfusional,
creación de comités de expertos que evalúen la necesidad de
legislar el tema

definición de la logística de centralización de muestras para lograr
un tamizaje de manera uniforme y a un costo razonable
evaluación de resultados obtenidos hasta el momento mediante las
técnicas in house y comerciales, en pool o ID, con el objeto de
definir si la sensibilidad de dichas técnicas y su ejecución son
útiles en nuestro sistema de salud
consolidación en la formación de los recursos humanos dedicados
29
a la aplicación de NAT.



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