Caractérisation et détection par des méthodes génotypiques des

CARACTÉRISATION ET DÉTECTION PAR DES
MÉTHODES GÉNOTYPIQUES DES AGENTS
BACTÉRIENS AÉROPORTÉS ASSOCIÉS AU
BIOTERRORISME
Thèse
SANDRA ISABEL
Doctorat en microbiologie-immunologie
Philosophiae doctor (Ph.D.)
Québec, Canada
© Sandra Isabel, 2013
ii
Résumé
C
ette thèse de doctorat présente quatre études portant sur la détection des
agents bactériens aéroportés associés au bioterrorisme. Tout d‘abord, un
rappel historique des guerres biologiques et du bioterrorisme permettra de mieux
comprendre cette menace. Pour cibler la problématique actuelle, les agents
biologiques, les procédures d‘intervention des organisations de sécurité et de
santé publique ainsi que les méthodes de détection seront ensuite introduites. La
capacité de détection rapide des agents biologiques est une des lacunes
importantes des procédures d‘intervention. La détection et l‘identification de ces
agents biologiques nécessitent plusieurs étapes critiques interreliées. Elles
consistent en l‘échantillonnage, la préparation des analytes contenues dans des
matrices complexes et finalement l‘identification du micro-organisme en décodant
des
macromolécules
signatures,
et
ce,
notamment
par
des
méthodes
génotypiques. Certaines particules peuvent potentiellement être employées pour la
préparation d‘armes biologiques aéroportées. De plus, des poudres inoffensives
(p. ex., farine) peuvent être utilisées pour terroriser certains individus, des
organisations ou la population. Ces composés peuvent toutefois interférer avec les
méthodes de détection moléculaire. C‘est pourquoi la première étude traite de
l‘interférence sur la détection par la PCR de 23 échantillons poudreux ou
environnementaux autres. Cet article présente une méthode séparant des spores
de Bacillus de matrices poudreuses afin d‘enlever ces particules nuisibles à la
détection. La procédure conceptualisée est simple d‘exécution (10 étapes), rapide
(≤ 10 minutes), peu coûteuse (~ 10 $) et permet de traiter une plus grande variété
d‘échantillons par rapport à l‘art antérieur. En second lieu, une lyse de spores
bactériennes basée sur la sonication rapide (45 secondes) a permis d‘extraire
iii
l‘ADN génomique avec des rendements comparables à une autre méthode de lyse
commercialisée performante nécessitant cinq minutes. Le Module fluidique de lyse
ultrasonique a été confectionné pour être décontaminé et transféré d‘une zone
contaminée à une zone sécurisée, ce qui est un avantage important dans le
contexte du bioterrorisme. Le troisième projet concerne le développement d‘un
essai de détection basé sur l‘amplification PCR de type large spectre du gène tuf
et l‘identification sur biopuce de séquences d‘ADN signatures grâce à une
hybridation en microfluidique. Cet essai a permis de détecter rapidement
(75 minutes) 12 des 13 agents bactériens aéroportés associés au bioterrorisme
listés par les CDC. Finalement, les analyses de séquences du gène cible, tuf, chez
le genre Yersinia, ont montré un haut niveau de divergence entre les gènes
dupliqués intragénomiques, tufA et tufB (8,3 à 16,2 %). Ce résultat inattendu
pourrait montrer les circonstances particulières permettant à des gènes dupliqués
d‘acquérir de nouvelles fonctions. De plus, cette étude a permis de faire une
analyse phylogénétique de 14 des 17 espèces décrites du genre Yersinia et
d‘apporter des informations sur leur classification taxonomique. Prochainement, il
serait intéressant de juxtaposer les différentes étapes de détection des agents
biologiques présentées ici dans un système intégré d‘analyse totale. Par
conséquent, l‘automatisation pourrait faciliter leur utilisation sur le terrain pour
détecter et identifier rapidement (~1 h) des agents biologiques associés au
bioterrorisme permettant de prendre en charge les victimes plus efficacement et de
contribuer à enrayer la propagation.
iv
Abstract
T
his doctoral thesis presents four studies regarding the detection of airborne
bacterial biothreat agents. First of all, a historical review of biological warfare
and bioterrorism will allow for better understanding of this threat. To focus on the
current problematic, biological agents, intervention procedures of public security
and health organisations, as well as detection methods will then be introduced. The
lack of systems for the reliable and rapid detection of biological agents is an
important limitation of intervention procedures. Many interrelated steps are
required to detect and identify biological agents. They consist of sampling, sample
matrix processing, and finally, microbial identification by decoding macromolecule
signatures, notably using genotyping methods. Some particles potentially
employed to produce airborne biological weapons could interfere with molecular
detection methods. Moreover, inoffensive powders (e.g. flour) can be used as
hoaxes to terrorise individuals, organisations, or the population. Therefore, the first
article studied the interference on PCR detection of 23 powdery or other
environmental samples. This study presents a method to separate Bacillus spores
from powdery matrices to alleviate the impact of these interfering compounds. The
developed procedure is fast (≤10 minutes), inexpensive (~ 10$), allows easy
handling (10 steps) and treatment of a wider sample variety compared to prior art.
Secondly, a bacterial spore lysis based on rapid sonication (45 seconds) allowed
extraction of genomic DNA in yields comparable to a robust commercialised lysis
procedure requiring 5 minutes. The Fluidic Ultrasonic Lysis Module can be
decontaminated and transferred from a contaminated to a secured area, which is
advantageous in the context of bioterrorism. The third project shows the
development of a detection assay based on a bacterial broad-spectrum PCR
v
amplification of the target gene tuf and the identification of signature DNA
sequences using a microfluidic microarray system. This assay allowed the rapid
(75 minutes) detection of 12 of the 13 airborne bacterial biothreat agents listed by
the CDC. Finally, analyses of tuf gene sequences from the Yersinia genus showed
a high level of divergence between intra-genomic tufA and tufB sequences
(8.3 to 16.2 %). This unexpected result could reveal particular circumstances
allowing duplicated genes to acquire new functions. Moreover, this study allowed a
phylogenetic analysis of 14 of the 17 described Yersinia species and added
information about their taxonomical classification. In the near future, it would be
interesting to combine the different biothreat detection steps presented here into a
total analysis system. Hence, automation could facilitate its utilisation in the field to
detect and identify (~1 h) biothreat agents resulting in more efficient medical
management of victims and contribute to stop propagation.
vi
Avant-propos
Il s‘agit d‘une thèse en version électronique. De ce fait, vous pourrez accéder à
certaines informations par des hyperliens qui vous redirigeront vers les sites
Internet concernés ou bien vers de l‘information contenue ailleurs dans le
document. Chaque type de lien a son propre code de couleur. Voici la liste des
types de lien que vous rencontrerez dans cette thèse :

Références bibliographiques : (Référence 2012).
o Ce lien vous redirigera vers la bibliographie à la fin de la thèse. À cet
endroit, pour les références électroniques, vous retrouverez un
hyperlien vers le site de publication de celles-ci ou du site Internet
concerné. Pour les documents non disponibles électroniquement, le
numéro de référence ISBN sera accessible.

Tableaux et figures inclus dans le document : (Tableau) et (Figure).
o Ce lien vous redirigera vers le tableau ou la figure dont il est question
dans le texte.

Tableaux et figures d‘articles déjà publiés : En ligne : (Tableau) et (Figure).
o Certains tableaux ou certaines figures ont déjà été publiés en haute
définition. Ceux-ci sont disponibles sur le site Internet de publication.
Ce lien vous redirigera à cet endroit.

Redirection vers un site Internet : www.redirection.com
o Certains liens externes seront inclus dans le texte lorsque pertinents.
vii
Information sur les publications
Les informations sur les publications et la contribution de l‘étudiante à ces
publications seront décrites au début de chacun des chapitres correspondants.
Chapitre 3
Rapid Filtration Separation-Based Sample Preparation Method for Bacillus Spores
in Powdery and Environmental Matrices
Chapitre 4
Modular Ultrasonic Lysis System for Rapid Nucleic Acid Extraction and Sample
Transfer of Bacillus spores
Chapitre 5
Rapid Microarray Microfluidic Screening of Twelve Airborne Bacterial Biothreat
Agents
Chapitre 6
Divergence among Genes Encoding the Elongation Factor Tu of Yersinia Species
Les tableaux et les figures d‘articles déjà publiés ont été renumérotés afin d‘en
faciliter le suivi tout au long de cette thèse. Cependant, le numéro original est
indiqué en italique et entre crochets. Par exemple, Tableau 6 [Table 1] signifie qu‘il
s‘agit du sixième tableau inclus dans la thèse et du premier tableau présenté dans
la publication originale.
viii
Remerciements
J
e voudrais tout d‘abord remercier le Dr Michel G. Bergeron pour l‘opportunité
qu‘il m‘a offerte ainsi que la motivation qui l‘anime et qu‘il a su me transmettre.
Je tiens également à remercier mon codirecteur de thèse, le D r Maurice Boissinot,
pour son sens critique ayant grandement amélioré ma formation scientifique.
Je voudrais également exprimer ma gratitude aux Drs Éric Leblanc, Régis Peytavi,
François Picard, Gale Stewart, Luc Bissonnette, Ann Huletsky et Sachiko Sato
pour leur encadrement dans mes projets de recherche.
Je tiens à souligner mon appréciation envers tous les membres de l‘EDM et du
CRI, nos collaborateurs de l‘IMI, du COPL, du CERMA, du DRDC, de la GRC et du
LNM avec qui j‘ai eu des discussions passionnantes et l‘honneur de collaborer.
J‘adresse mes remerciements à plusieurs chercheurs et équipes de recherche qui
m‘ont procuré des ADN génomiques de bonne qualité m‘ayant permis de
compléter mes recherches doctorales, dont les Drs Douglas E. Bader, Robert R.
Brubaker, Louis Bryden, Thomas A. Ficht, Katsuya Hirai, Sharon Peacock,
Didier Raoult, Heidi Wood, Donald E. Woods, Daisy Vanrompay et
Tina Zimmerman.
Je tiens à remercier les Fonds de la recherche en santé du Québec et la Fondation
Dr George Phoenix pour leur support financier m‘ayant permis de réaliser ces
projets de recherche.
Je voudrais également remercier chaleureusement mes parents, Lise et Clément,
et toute ma famille, particulièrement Karel, Manon, Marc, David, Valérie, Lynn et
Paul ainsi que tous mes amis, notamment Isabelle, Faye, Keith et Anne-Renée,
pour leur support et leurs encouragements au cours de ces nombreuses années
d‘études. Vous m‘êtes tous très précieux.
Je tiens finalement à remercier Manon Tétreault qui m‘a aidée à réaliser la mise en
page conviviale et certaines figures présentées dans cette thèse.
ix
À ma mère
pour son soutien et son amour
inconditionnels
Table des matières
Résumé ................................................................................................................... iii
Abstract .................................................................................................................... v
Avant-propos .......................................................................................................... vii
Remerciements ....................................................................................................... ix
Table des matières .................................................................................................. xi
Liste des figures ................................................................................................... xvii
Liste des tableaux ................................................................................................. xix
Liste des abréviations ............................................................................................ xx
Liste des abréviations des espèces bactériennes ................................................ xxii
1. Le bioterrorisme .................................................................................................. 1
1.1 Historique des guerres biologiques et du bioterrorisme ................................. 4
1.1.1 De l‘Antiquité à la théorie des germes ..................................................... 7
1.1.2 Au 20e siècle : guerres, armement et traités ............................................ 8
1.1.3 Au 21e siècle : la menace terroriste et les canulars ............................... 11
1.1.4 Apprentissage des évènements passés ................................................ 12
1.2 Les agents biologiques ................................................................................ 14
1.2.1 La sélection des agents biologiques prioritaires par les autorités .......... 14
1.2.2 Diversité des agents biologiques prioritaires ......................................... 19
1.2.3 Modes de dissémination ........................................................................ 24
1.2.4 Les agents bactériens aéroportés sélectionnés pour cette thèse .......... 28
1.3 La préparation contre le bioterrorisme ......................................................... 32
1.3.1 Procédures d‘intervention à la suite d‘un acte bioterroriste ................... 32
1.4 La détection et l‘identification des agents biologiques ................................. 39
1.4.1 Les critères de performance clinique de tests diagnostiques ................ 40
1.4.2 Les critères analytiques d‘un test de détection des agents biologiques. 42
1.4.3 Les défis particuliers au bioterrorisme ................................................... 43
2 Hypothèses et objectifs de recherche ............................................................... 59
2.1 Problématique de la détection des agents biologiques ................................ 60
xi
2.2 Hypothèses de recherche ............................................................................ 61
2.3 Objectifs de recherche ................................................................................. 63
2.4 Aperçu des résultats et contribution scientifique .......................................... 64
3 Méthode de préparation d‘échantillons de poudres suspectes et autres
échantillons environnementaux basée sur la filtration ....................................... 66
3.1 Résumé ........................................................................................................ 69
3.2 Abstract ........................................................................................................ 70
3.3 Introduction .................................................................................................. 71
3.4 Materials and methods ................................................................................. 74
3.4.1 Samples studied. ................................................................................... 74
3.4.2 Spore and DNA preparations. ................................................................ 75
3.4.3 Real-time PCR assay. ............................................................................ 75
3.4.4 Prefiltration evaluation. .......................................................................... 76
3.4.5 Removal of soluble and insoluble compounds. ...................................... 77
3.4.6 Spore capture and recovery step. .......................................................... 78
3.4.7 DARE procedure. ................................................................................... 78
3.4.8 Spore recovery. ...................................................................................... 79
3.4.9 PCR detection efficiency. ....................................................................... 79
3.4.10
Imaging of spores and filters. ........................................................... 80
3.5 Results ......................................................................................................... 82
3.5.1 Selection of samples for study. .............................................................. 82
3.5.2 Selection of a filter for removal of insoluble particles. ............................ 82
3.5.3 Removal of soluble and insoluble compounds. ...................................... 83
3.5.4 Evaluation of the spore capture and recovery step. ............................... 85
3.5.5 Evaluation of spore recovery.................................................................. 86
3.5.6 Efficiency of spore DNA detection after the DARE procedure................ 86
3.5.7 Spore penetration in filters ..................................................................... 87
3.6 Discussion .................................................................................................... 89
3.7 Acknowledgments ........................................................................................ 93
3.8 References ................................................................................................... 94
3.9 Tables .......................................................................................................... 96
3.10
Figures .................................................................................................... 99
4 Système modulaire de lyse ultrasonique pour l‘extraction rapide d‘acides
nucléiques de spores de Bacillus et le transfert d‘échantillons ........................ 101
4.1 Résumé ...................................................................................................... 104
xii
4.2 Abstract ..................................................................................................... 105
4.3 Introduction ................................................................................................ 106
4.4 Materials and methods .............................................................................. 108
4.4.1 Equipment design and function ........................................................... 108
4.4.2 Preparation of spores .......................................................................... 109
4.4.3 DNA extraction .................................................................................... 109
4.4.4 Analysis of DNA extracts ..................................................................... 110
4.4.5 DNA fragmentation .............................................................................. 110
4.4.6 Fluorescence imaging ......................................................................... 111
4.4.7 Decontamination of the FULM ............................................................. 111
4.4.8 Simulated detection of Bacillus spores in suspect powders ................ 112
4.5 Results....................................................................................................... 113
4.5.1 FULM operation and volume handling ................................................. 113
4.5.2 DNA extraction and fragmentation....................................................... 113
4.5.3 Imaging of disrupted spores ................................................................ 114
4.5.4 Decontamination of the FULM ............................................................. 115
4.5.5 Simulated detection of Bacillus spores in suspect powders ................ 116
4.6 Discussion ................................................................................................. 117
4.6.1 Performance of FULM for spore lysis and DNA extraction .................. 117
4.6.2 Effect of the stainless steel interface ................................................... 117
4.6.3 DNA fragmentation .............................................................................. 119
4.6.4 Simulation of field testing ..................................................................... 119
4.7 Conclusions ............................................................................................... 121
4.8 Acknowledgment ....................................................................................... 122
4.9 References ................................................................................................ 123
4.10
Figures .................................................................................................. 125
5 Développement d‘un essai sur puce à ADN en microfluidique pour la détection
et l‘identification de 12 agents bactériens aéroportés associés au bioterrorisme
........................................................................................................................ 128
5.1 Résumé ..................................................................................................... 132
5.2 Abstract ..................................................................................................... 133
5.3 Introduction ................................................................................................ 134
5.4 Materials and methods .............................................................................. 136
5.4.1 Bacterial isolates and genomic DNA preparation. ............................... 136
xiii
5.4.2 Construction of a tuf gene database from complete genome
sequences............................................................................................ 136
5.4.3 Design of primers and probes. ............................................................. 137
5.4.4 PCR amplification and exonuclease digestion. .................................... 138
5.4.5 Microfluidic-microarray hybridization. ................................................... 139
5.4.6 Microarray data acquisition and analysis. ............................................ 140
5.5 Result ......................................................................................................... 142
5.5.1 Analysis of the tuf gene region, primer and probe selection. ............... 142
5.5.2 Analytical sensitivity of the CABBA assay ............................................ 144
5.5.3 Analytical specificity of the CABBA assay ............................................ 144
5.6 Discusion ................................................................................................... 146
5.6.1 Evolutionary relationships of tuf sequences ......................................... 146
5.6.2 Biased-broad-spectrum amplification ................................................... 146
5.6.3 Limitation of conserved gene targets ................................................... 147
5.6.4 Possible practical application of the CABBA assay. ............................. 148
5.6.5 Comparison to other biothreat agent detection assays. ....................... 149
5.7 Conclusion ................................................................................................. 150
5.8 Ackowledgments ........................................................................................ 151
5.9 References ................................................................................................. 152
5.10
Tables and figures ................................................................................. 156
6 Divergence du gène codant pour le facteur d‘élongation Tu des espèces du
genre Yersinia ................................................................................................. 161
6.1 Résumé ...................................................................................................... 165
6.2 Abstract ...................................................................................................... 166
6.3 Introduction ................................................................................................ 167
6.4 Materials and methods ............................................................................... 170
6.4.1 Bacterial strains ................................................................................... 170
6.4.2 DNA isolation ....................................................................................... 170
6.4.3 Primer design ....................................................................................... 173
6.4.4 Sequencing of tufA and tufB genes...................................................... 173
6.4.5 Phylogenetic analyses ......................................................................... 174
6.4.6 Nucleotide sequence accession numbers ............................................ 176
6.5 Results ....................................................................................................... 177
6.5.1 tufA and tufB gene similarities.............................................................. 177
6.5.2 Phylogenetic tree ................................................................................. 178
xiv
6.5.3 Phylogenetic network .......................................................................... 179
6.5.4 Yersinia species .................................................................................. 186
6.6 Discussion ................................................................................................. 188
6.7 Acknowledgments...................................................................................... 195
6.8 References ................................................................................................ 196
7 Discussion générale........................................................................................ 201
7.1 Retour sur les objectifs de recherche ........................................................ 202
7.2 Méthode de préparation d‘analytes à partir d‘échantillons de poudres
suspectes ou environnementaux ............................................................... 203
7.2.1 Étude des échantillons fréquemment recueillis.................................... 203
7.2.2 Art antérieur et objectifs ....................................................................... 204
7.2.3 Les filtres sélectionnés et perspectives ............................................... 205
7.2.4 Perspectives : traitement d‘autres échantillons.................................... 206
7.2.5 Transportabilité et automatisation........................................................ 207
7.3 Système modulaire de lyse ultrasonique pour l‘extraction d‘acides nucléiques
et le transfert d‘échantillon ......................................................................... 208
7.3.1 Art antérieur et direction du projet ....................................................... 208
7.3.2 L‘interface en acier inoxydable, un avantage ...................................... 208
7.3.3 Transfert sécuritaire du FULM et perspective ...................................... 209
7.4 Développement d‘un essai sur puce à ADN pour la détection et
l‘identification des agents bactériens associés au bioterrorisme ............... 210
7.4.1 Art antérieur et objectifs de recherche ................................................. 210
7.4.2 Défi de design : la diversité biologique ................................................ 211
7.4.3 Les avantages, limitations et perspectives de l‘essai CABBA ............. 212
7.4.4 Puces à ADN, perspectives ................................................................. 214
7.5 Divergence du gène codant pour le facteur d‘élongation Tu des espèces du
genre Yersinia ........................................................................................... 217
7.5.1 Découverte inattendue et objectifs ...................................................... 217
7.5.2 Résultats obtenus à la suite de la publication de l‘article ..................... 217
7.5.3 Analyses phylogénétiques de pointe ................................................... 218
7.5.4 L‘évolution du vivant, perspectives ...................................................... 219
7.5.5 Fonctions de EF-TuA et EF-TuB, perspectives ................................... 219
7.5.6 Tolérance aux antibiotiques, perspectives ........................................... 220
7.6 Perspectives générales du projet doctoral ................................................. 222
8 Conclusion ...................................................................................................... 224
xv
Annexe 1 ............................................................................................................. 226
Historique des guerres biologiques et du bioterrorisme : biohazard ou
psychohazard ? ............................................................................................... 226
De l‘Antiquité à la théorie des germes.............................................................. 227
Au 20e siècle .................................................................................................... 230
Au 21e siècle .................................................................................................... 235
Annexe 2 ............................................................................................................. 238
Figures supplémentaires à l‘article présenté au Chapitre 3 ................................. 238
Annexe 3 ............................................................................................................. 245
Tableaux supplémentaires à l‘article présenté au Chapitre 5 .............................. 245
Annexe 4 ............................................................................................................. 252
Analyses phylogénétiques supplémentaires à l‘article présenté au Chapitre 6 ... 252
Bibliographie ........................................................................................................ 259
xvi
Liste des figures
Figure 1. Ligne du temps d‘évènements marquants au sujet des armes biologiques
de l‘Antiquité à aujourd‘hui. .............................................................................. 6
Figure 2. Modes de dissémination des agents biologiques. .................................. 25
Figure 3. Schéma de l‘arbre pulmonaire, des diamètres (D) des voies respiratoires
et des diamètres (D) approximatifs des micro-organismes y pénétrant. ........ 28
Figure 4. Modèle schématique illustrant les fenêtres d‘utilisation des tests de
détection et diagnostiques lors des procédures à la suite d‘une attaque
bioterroriste. ................................................................................................... 36
Figure 5. Modèle schématique de la propagation des agents biologiques en
fonction de leur détection et de leur contagion............................................... 38
Figure 6. Principes de détection des macromolécules signatures des agents
biologiques. .................................................................................................... 40
Figure 7. Les quatre points cardinaux analytiques d‘un test diagnostique. ........... 42
Figure 8. Principes méthodologiques de la préparation des analytes. ................. 47
Figure 9. Représentation schématique d‘une puce, ou microdamier, à ADN en
deux dimensions. ........................................................................................... 54
Figure 10. Design d‘amorces d‘amplification à large spectre et de sondes de
capture spécifiques utilisant les gènes conservés. ........................................ 56
Figure 11. Représentation schématique de la plateforme pour l‘hybridation rapide
sur puce à ADN en microfluidique. ................................................................. 57
Figure 12. Procédure pour réaliser un essai de détection des agents biologiques
sur puce à ADN.............................................................................................. 61
Figure 13 [Figure 1]. DARE procedure and DNA extraction. ............................... 99
Figure 14 [Figure 2]. Penetration and expulsion of bacterial spores in the 0.45-µmpore-size filters............................................................................................. 100
Figure 15. Design and configuration of the FULM. .............................................. 125
Figure 16. Effect of sonication time on the concentration of genomic DNA extracted
from spores of B. atrophaeus. ...................................................................... 126
Figure 17. Confocal microscopy image revealing the damage inferred to FITClabeled spores of B. atrophaeus upon exposure to ultrasound for 2 × 15 s. 127
xvii
Figure 18. tuf gene sequence variability for 12 CABBA using the SVARAP
program. ....................................................................................................... 157
Figure 19 [Figure 1]. Phylogenetic trees for tufA and tufB nucleic acid sequences
from Yersinia and non-Yersinia enterobacterial strains. ............................... 184
Figure 20 [Figure 2]. Phylogenetic network for tufA and tufB nucleic acid
sequences from Yersinia and non-Yersinia enterobacterial strains. ............. 185
Figure 21. Le nombre de publications au sujet des technologies basées sur
l‘analyse des acides nucléiques. .................................................................. 216
Figure 22. Système intégré d‘analyse totale microfluidique rotatoire permettant le
traitement de a) l‘échantillon (macrovolume), b) la lyse microbienne
(microvolume), c) l‘amplification d‘ADN, d) et l‘hybridation sur puce à ADN. 223
Figure 23. Schéma de la trousse DARE. ............................................................. 239
Figure 24. Protocole des procédures DARE et de lyse et fonction(s) de chaque
étape entre parenthèses............................................................................... 240
Figure 25. Diamètres des micro-organismes aéroportés associés au bioterrorisme,
poudres et autres référentiels en comparaison avec ceux des pores des filtres
sélectionnés. ................................................................................................ 241
Figure 26. Visualisation des filtres sélectionnés en microscopie optique. ........... 242
Figure 27. Représentation virtuelle du positionnement des spores dans les filtres
avec la taille des pores de 0,45 µm. ............................................................. 243
Figure 28. Schéma analytique présentant le nombre d‘échantillons sur les 23
analysés interférant avec la lyse bactérienne ou la PCR. ............................ 244
Figure 29. Arbre phylogénétique des séquences du gène tuf du genre Yersinia de
Paradis et al. (2005) et de génomes. ........................................................... 253
Figure 30. Arbre phylogénétique des séquences d‘acides nucléiques des gènes
tufA et tufB des souches du genre Yersinia, incluant Y. massiliensis, Y. similis
et d‘autres de la famille Enterobacteriaceae................................................. 255
Figure 31. Arbre phylogénétique du programme fastDNAml des séquences en
acides nucléiques de 51 souches de Yersinia, de 8 autres espèces
d‘Enterobacteriaceae et enraciné avec V. cholerae. .................................... 256
Figure 32. Arbre phylogénétique des copies multiples du gène 16S rDNA de
Y. enterocolitica, Y. pestis et E. coli. ............................................................ 257
Figure 33. Arbre phylogénétique des copies multiples du gène 23S rDNA de Y.
enterocolitica, Y. pestis et E. coli. ................................................................. 258
xviii
Liste des tableaux
Tableau 1. Travaux d‘armement biologique de plusieurs pays. ............................ 10
Tableau 2. Agents biologiques prioritaires du bioterrorisme selon les CDC et le
NIAID et leurs pathologies. ............................................................................ 16
Tableau 3. Classification taxonomique des agents biologiques prioritaires du CDC
et du NIAID. ................................................................................................... 21
Tableau 4. Caractéristiques et pathologies des agents bactériens aéroportés. .... 30
Tableau 5. Tableau de contingence pour l‘évaluation des critères cliniques d‘un
test diagnostique. ........................................................................................... 41
Tableau 6 [Table 1]. Interference of powdery and environmental samples, without
treatment or after treatment, with PCR and lysis. ........................................... 96
Tableau 7 [Table 2]. Percentages of bacterial spore recovery after filtration steps.
....................................................................................................................... 97
Tableau 8 [Table 3]. PCR efficiency without treatment and with the DARE
procedure and detection thresholds. .............................................................. 98
Tableau 9. CABBA and diseases. ....................................................................... 156
Tableau 10. Biased-broad-spectrum PCR primers used for amplification of tuf gene
of 12 CABBA. ............................................................................................... 158
Tableau 11. CABBA assay capture probes and hybridization results for each
capture probe using low quantity of gDNA. .................................................. 159
Tableau 12. Specificity of microarray probes, results of hybridization of all CABBA
and 40 other species. ................................................................................... 160
Tableau 13 [Table 1]. Yersinia strains used in this studya. ................................ 171
Tableau 14 [Table 2]. tuf sequence variations in Yersiniaa. ............................... 181
Tableau 15 [Table 3]. Interspecies variations of tuf sequences in Yersinia. ...... 182
Tableau 16. GeneBank Accession numbers from which tuf gene sequences were
retrieved. ...................................................................................................... 246
Tableau 17. Number of strains from which genome sequences were available, and
tuf gene sequences were retreived or not. ................................................... 251
xix
Liste des abréviations
ADN : acide désoxyribonucléique
AN : acide nucléique
ARN : acide ribonucléique
ARNr 16S : Sous-unité 16S de l‘acide ribonucléique ribosomique
ATP : adénosine triphosphate
bp : base pair
BoNT : neurotoxine botulinique
BSL : biosafety level, niveaux de biosécurité de 1 à 4, 1 étant le niveau le plus
faible et 4 le plus élevé1
CDC : Centers for Disease Control and Prevention (Atlanta, Géorgie, États-Unis)
CFU : unité formant des colonies
CMIU : Centre de mesures et d‘interventions d‘urgence de Santé Canada
CLSI : Clinical and Laboratory Standards Institutes
CNS : Center for Nonproliferation Studies, Monterey Institute of International
Studies (Monterey, Californie)
DL50 : dose létale 50 %
FBI : Federal Bureau of Investigation (Washington, D. C., États-Unis)
FITC : isothiocyanate de fluorescéine
FN : faux négatif
FP : faux positif
GRC : Gendarmerie royale du Canada (Ottawa, ON, Canada)
ICTV : International Committee on Taxonomy of Viruses
IMI : Conseil national de recherches Canada - Institut des matériaux industriels
(Boucherville, QC, Canada)
Interpol : Organisation internationale de la police criminelle (Lyon, France)
i.p. : intrapéritonéale
i.v. : intraveineuse
1
http://www.phac-aspc.gc.ca/publicat/lbg-ldmbl-04/
xx
LNM : Laboratoire national de microbiologie, Agence de la santé publique du
Canada (Winnipeg, MA, Canada)
LPM : litre par minute
LRN : Laboratory Response Network dirigé par les CDC (Atlanta, Géorgie, ÉtatsUnis)
LSPQ : Laboratoire de santé publique du Québec, Institut national de santé
publique du Québec (Sainte-Anne-de-Bellevue, QC, Canada)
MCL : Maximum Composite Likelihood
NIAID : National Institute of Allergy and Infectious Diseases, National Institute of
Health (Bethesda, Maryland, États-Unis)
NSABB : National Science Advisory Board for Biosecurity
OMS : Organisation mondiale de la santé (Genève, Suisse)
pb : paire de bases
PCR : Réaction de polymérase en chaîne
Q50 : dose infectieuse nécessaire afin d‘infecter 50 % des humains exposés sur
1 km2 de surface (mesure standard utilisée par l‘agence Biopreparat).
s.c. : sous-cutané
SNA : système nerveux autonome
SNC : système nerveux central
SRAS-CoV : Syndrome respiratoire aigu sévère – Coronavirus
U.R.S.S. : Union des républiques socialistes soviétiques
USAMRIID : United States Army Medical Research Institute of Infectious Diseases
(Fort Detrick, Maryland, États-Unis)
µTAS : Micro Total Analysis System (micro-système d‘analyse totale)
VIH : virus de l‘immunodéficience humain
VN : vrai négatif
VP : vrai positif
VPP : valeur prédictive positive
VPN : valeur prédictive négative
xxi
Liste des abréviations des espèces bactériennes
B. abortus : Brucella abortus
B. anthracis : Bacillus anthracis
B. atrophaeus : Bacillus atrophaeus
B. canis : Brucella canis
B. cepacia : Burkholderia cepacia
B. cereus : Bacillus cereus
B. mallei : Burkholderia mallei
B. melitensis : Brucella melitensis
B. pseudomallei : Burkholderia pseudomallei
B. subtilis : Bacillus subtilis
B. suis : Brucella suis
C. botulinum : Clostridium botulinum
C. burnetii : Coxiella burnetii
C. perfringens : Clostridium perfringens
C. psittaci : Chlamydophila psittaci
C. septicum : Clostridium septicum
C. sporogenes : Clostridium sporogenes
C. tetani : Clostridium tetani
E. agglomerans : Enterobacter agglomerans
E. carotovora : Erwinia carotovora
E. coli : Escherichia coli
E. vulneris : Escherichia vulneris
F. philomiragia : Francisella philomiragia
F. tularensis : Francisella tularensis
H. alvei : Hafnia alvei
K. pneumoniae : Klebsiella pneumoniae
L. pneumophila : Legionella pneumophila
M. avium : Mycobacterium avium
M. kansasii : Mycobacterium kansasii
M. terrae : Mycobacterium terrae
M. tuberculosis : Mycobacterium tuberculosis
N. meningitidis : Neisseria meningitidis
O. anthropi : Ochrobacterium anthropi
O. proteus : Obesumbacterium proteus
xxii
P. aeruginosa : Pseudomonas aeruginosa
P. luminescens : Photorhabdus luminescens
P. shigelloides : Plesiomonas shigelloides
R. akari : Rickettsia akari
R. conorii : Rickettsia conorii
R. felis : Rickettsia felis
R. prowazekii : Rickettsia prowazekii
R. rickettsii : Rickettsia rickettsii
R. typhi : Rickettsia typhi
S. aureus : Staphylococcus aureus
S. enterica : Salmonella enterica
S. fonticola : Serratia fonticola
S. flexneri : Shigella flexneri
S. marcescens : Serratia marcescens
V. cholerae : Vibrio cholerae
W. persica : Wolbachia persica
Y. aldovae : Yersinia aldovae
Y. aleksiciae : Yersinia aleksiciae
Y. bercovieri : Yersinia bercovieri
Y. enterocolitica : Yersinia enterocolitica
Y. frederiksenii : Yersinia frederiksenii
Y. intermedia : Yersinia intermedia
Y. kristensenii : Yersinia kristensenii
Y. massiliensis : Yersinia massiliensis
Y. mollaretii : Yersinia mollaretii
Y. pestis : Yersinia pestis
Y. pseudotuberculosis : Yersinia pseudotuberculosis
Y. regensburgei : Yokenella regensburgei
Y. similis : Yersinia similis
Y. rohdei : Yersinia rohdei
Y. ruckeri : Yersinia ruckeri
xxiii
1. Le bioterrorisme
P
lusieurs romans et films ont abordé les effets dévastateurs de la propagation
accidentelle ou volontaire de souches microbiennes hautement infectieuses
dans
la
population.
Ces
scénarios
catastrophiques fictifs ainsi
que
la
reconnaissance de la subtilité des armes biologiques, souvent invisibles à l‘œil nu
et pernicieuses, ont non seulement conscientisé la population mondiale, mais de
surcroît augmenté sa peur face à ce type d‘armes. Par conséquent, un
questionnement quant à la part de réalité, de propagande et de fiction s‘impose. Le
bioterrorisme et les guerres biologiques ont en commun l‘utilisation d‘agents
biologiques, organismes vivants ou leurs toxines, afin d‘infliger la mort ou bien la
maladie à des êtres humains, des animaux ou des plantes (CDC 2007). Les armes
biologiques sont quant à elles constituées principalement d‘un agent biologique,
d‘une munition (contenant pour la conservation), d‘un système de transport ainsi
que d‘un mécanisme de dissémination (Zilinskas 1997). Le concept de guerre
biologique s‘applique à l‘utilisation d‘armes biologiques à des fins stratégiques
durant un conflit armé entre nations. Commis par des organisations ou des
individus, souvent radicaux, dans le but de faire avancer leur cause, le
bioterrorisme mise davantage sur l‘aspect symbolique que stratégique de l‘acte.
Interpol met d‘ailleurs l‘emphase sur l‘aspect biopsychosocial et politique dans la
définition qu‘elle donne du bioterrorisme :
« Bioterrorism refers to the intentional release of biologic agents or
toxins for the purpose of harming and killing humans, animals or plants
with the intent to intimidate or coerce a government or civilian population
to further political or social objectives » (Interpol 2007).
De plus, selon les Nations Unies,
« Les armes biologiques sont nettement plus faciles à fabriquer que les
armes chimiques ou nucléaires et coûtent beaucoup moins cher. Tout
pays ou tout groupe infraétatique déterminé à fabriquer un agent
biologique peut probablement le faire avec un investissement minimal
et, même si la diffusion des agents biologiques est difficile, certains
moyens de dissémination peuvent être obtenus assez facilement »
(Organisation des Nations Unies (ONU) 2012).
2
Les armes biologiques sont donc classées parmi les armes de destruction massive
accessibles et certains individus, certaines organisations et certains états
pourraient en tirer avantage. C‘est pourquoi il est important de comprendre
comment les armes biologiques ont été utilisées dans le passé, sans glisser dans
la fiction ou la propagande, afin de se protéger à l‘avenir. Je ferai donc un tour
d‘horizon relatant certains faits historiques qui permettront de comprendre
davantage le bioterrorisme et les guerres biologiques ainsi que d‘orienter les
travaux présentés dans cette thèse.
3
1.1 Historique des guerres biologiques et du bioterrorisme
L‘utilisation d‘armes biologiques est survenue plutôt rarement dans les conflits
armés ou lors d‘actes terroristes comparativement à d‘autres types d‘arsenal. En
fait, de 1900 à 2001, 77 « actes » biologiques ont été répertoriés dans la base de
données sur le terrorisme du Center for Nonproliferation Studies (CNS) du
Monterey Institute of International Studies (Carus 2001; Leitenberg 2001; Zilinskas
et al. 2004). En scrutant la littérature historique plus ancienne, on constate que
d‘autres actes utilisant des agents biologiques ont été retracés (Berche 2009;
Christopher et al. 1997; Lutwick et Lutwick 2009; Mayor 2003; Riedel 2004). J‘ai
donc élaboré une ligne du temps permettant de comprendre la chronologie
d‘évènements marquants au sujet des armes biologiques (Figure 1). Certaines
attaques biologiques permettront de comprendre les interrelations entre leurs
quatre composantes principales : le criminel ou l‘organisation responsable, l‘agent
biologique, le moyen de dissémination et les cibles (Radosavljevic et Belojevic
2009). Le lecteur est référé à l‘annexe 1 s‘il désire avoir davantage d‘information
au sujet de certains évènements historiques marquants.
4
5
Figure 1. Ligne du temps d’évènements marquants au sujet des armes biologiques de l’Antiquité à aujourd’hui.
6
1.1.1 De l’Antiquité à la théorie des germes
Bien avant la venue de la microbiologie moderne, l‘humain avait déjà compris qu‘il
était possible de provoquer, par différents vecteurs, la transmission de maladies
afin de gagner un avantage stratégique face à un ennemi. Dès l‘Antiquité, des
animaux malades auraient été dirigés vers les ennemis (Trevisanato 2007). Des
carcasses, des cadavres ou des fèces ont été utilisés à plusieurs reprises pour
contaminer les puits de villages ennemis (Christopher et al. 1997; Mayor 2003). De
plus, des flèches souillées par des enduits de toxines ou des fèces étaient souvent
employées à la guerre (Mayor 2003). Au Moyen Âge, des cadavres de pestiférés
pouvaient être catapultés pour infecter à distance davantage de personnes. Cette
maladie hautement contagieuse pouvait se propager comme une traînée de
poudre (Christopher et al. 1997; Derbes 1966). En 1767, passant d‘une technique
grossière à une technique plus raffinée et imperceptible, un général anglais, Sir
Jeffrey Amherst, ordonna la distribution de couvertures et de mouchoirs de
varioleux aux populations autochtones d‘Amérique du Nord qui aidaient les
Français. Il anticipait la propagation de la maladie sur une population qu‘il savait
fragile (Berche 2009; Christopher et al. 1997). Ces exemples montrent qu‘au fil du
temps, malgré le manque de connaissances scientifiques, l‘humain a su adapter
ses méthodes pour accroître l‘efficacité de ses attaques, laissant moins de place
au hasard.
Dès la Renaissance, les avancées scientifiques ont permis de développer des
outils pour l‘étude de la microbiologie. Les travaux d‘Antonie Van Leeuwenhoek
ont permis d‘observer au microscope des micro-organismes (Ronan 1988; van
Zuylen 1981). Edward Anthony Jenner a ensuite réalisé des travaux montrant
l‘immunisation offerte par la vaccination (Jenner 1801; Ronan 1988). Ses travaux
ont toutefois ouvert une boîte de Pandore puisqu‘on pouvait maintenant
s‘immuniser spécifiquement contre un agent biologique alors que l‘adversaire n‘y
7
était pas protégé. Finalement, la théorie des germes, créditée principalement, mais
non exclusivement, à Louis Pasteur et Robert Koch pour leurs travaux, a amené
un changement de perspective au sujet des maladies infectieuses (Baxter 2001;
Black 2003; Kaufmann et Schaible 2005; King 1952; Nobelprize.org 1967 ; Ronan
1988). De nombreux scientifiques leur ont succédé et ont continué à repousser les
limites du savoir en microbiologie et en infectiologie. Les nombreuses avancées
dans le domaine, principalement la microscopie, l‘immunisation, la culture pure et
les Postulats de Koch, ont ouvert la voie aux programmes d‘armement biologique
plus sophistiqués.
1.1.2 Au 20e siècle : guerres, armement et traités
Le concept d‘armement biologique, de l‘anglais weaponisation, englobe tous les
travaux qui ont servi à développer des armes biologiques d‘autant plus puissantes
que
redoutables.
Pour
ce
faire,
plusieurs
stratégies
ont
été
utilisées,
particulièrement, en augmentant, par exemple, la dissémination et la résistance à
l‘environnement ou aux antibiotiques. L‘objectif était d‘augmenter leur impact :
morbidité, mortalité, chute de l‘économie, état de panique général, etc. (Alibek et
Handelman 2000; Zilinskas 1997). Tel que détaillé au Tableau 1, plusieurs grandes
puissances ont travaillé secrètement par le passé sur des programmes
d‘armement biologique à grande échelle. Les agents biologiques et les modes de
dissémination développés ou utilisés ont été variés (Leitenberg 2001). Ces agents
biologiques encore considérés comme prioritaires seront retrouvés dans le
Tableau 2.
Durant la Première Guerre mondiale, de 1914 à 1918, l‘utilisation d‘armes
chimiques a été plus marquante que celle d‘armes biologiques. En effet, près d‘un
tiers des évacuations de soldats était causé par les armes chimiques (Mauroni
2003). À la suite de la Première Guerre mondiale, l‘utilisation d‘armes chimiques et
biologiques faisait mauvaise figure. C‘est pourquoi le premier traité international
8
interdisant l‘emploi d‘armes biologiques pour faire la guerre, le Protocole de
Genève, a été signé initialement en 1925 et est entré en vigueur en 1928 (Comité
international de la Croix-Rouge 2012). Toutefois, il présentait une portée limitée
puisqu‘il n‘interdisait ni la production, ni le stockage d‘armes chimiques et
biologiques. La Deuxième Guerre mondiale, de 1939 à 1945, a ravivé l‘intérêt pour
le développement d‘armes biologiques. En effet, les Alliés ainsi que le Japon ont
développé et expérimenté plusieurs armes biologiques lors de simulations ou
d‘opérations militaires (Bryden 1989; Frigon 2010; Leitenberg 2001; Lockwood
2009; Lutwick et Lutwick 2009; Riedel 2004).
9
Tableau 1. Travaux d’armement biologique de plusieurs pays.
Dates
Pays
Maladies (Agents
biologiques)
Capacités de production et moyens
de dissémination
19141918
Allemagne
Maladie du charbon
Morve
Animaux
19391945
U.R.S.S.
Typhus
Peste
Développement d‘un dispositif fixé à un
avion pour la dispersion d‘une émulsion de
Y. pestis.
19441945
Alliés
(États-Unis,
Canada,
GrandeBretagne)
Maladie du charbon
Projet pour la production de bombes de
B. anthracis avorté.
Production de tourteaux contaminés par
B. anthracis.
Développement de fines particules de
B. anthracis aéroportées.
19541969/72
États-Unis
Production et/ou recherche
Botulisme
Brucellose
Coxiellose
Encéphalite équine du Venezuela
Fièvre jaune
Fièvre pourprée des montagnes
Rocheuses
Maladie du charbon
Peste
Psittacose
Tularémie
Entérotoxine staphylococcique
Ex. Production de 650 tonnes de
Brucella suis par mois.
Entreposage d‘armes biologiques.
Développement : ogives, vaporisateurs
pour avion, réservoirs pour armes
humides ou sèches.
Tests avec des simulants sur des villes
métropolitaines.
19451993?
U.R.S.S.
Production et/ou recherche
Brucellose
Coxiellose
Encéphalites équines du
Venezuela, japonaise et
transmises par les tiques
Fièvres hémorragiques de Lassa,
d‘Argentine, de Bolivie, Ébola et
Marburg
Maladie du charbon
Mélioïdose
Morve
Peste
Tularémie
Variole
Préparations poudreuses aérosolisées de
B. anthracis.
Capacité de production de B. anthracis de
5 000 tonnes par année.
Réserve de 20 tonnes du virus de la
variole.
Missiles
balistiques
contenant
des
simulants ont été testés.
~19751991?
Irak
Production et/ou recherche
Aflatoxine
Conjonctivite hémorragique
Gastro-entérite
Clostridium perfringens
Maladie du charbon
Ricine
Toxine botulinique
Variole du chameau
Développement :
ogives,
bombes
aériennes, système de vaporisation pour
avion ou hélicoptère.
~19811993
Afrique
Sud
Choléra
Maladie du charbon
Plusieurs espèces de Clostridium
spp.
Production de petites quantités.
Assassinat par la contamination
d‘aliments avec B. anthracis.
Contamination de puits avec V. cholerae.
Développement : systèmes de dispersion.
du
Adapté de : (Alibek et Handelman 2000; Leitenberg 2001).
10
Les travaux d‘armement biologique débutés lors de la Deuxième Guerre mondiale
et poursuivis par la suite ont été précurseurs à un traité de désarmement bien plus
restrictif que le Protocole de Genève. La Convention sur les armes biologiques ou
à toxines a été signée en 1972 et mise en vigueur en 1975 afin d‘interdire la
production et le stockage d‘armes biologiques et de forcer leur destruction
(Biological and Toxin Weapons Convention (BTWC) 1972; US Central Intelligence
Agency 2010). Toutefois, l‘U.R.S.S. a continué ses travaux d‘armement biologique
et l‘accident de Sverdlovsk en 1979 força Moscou à l‘admettre (Alibek et
Handelman 2000; National Security Archive 2001; Steele 2000). L‘Irak et l‘Afrique
du Sud ont également eu des programmes d‘armement biologique par la suite
(Duelfer 2004; Leitenberg 2001; Zilinskas 1997). D‘autres organisations non
étatiques ont également montré la capacité de produire des agents biologiques.
Les sectes Bhagwan Shree Rajneesh et Aum Shinrikyo sont deux exemples plus
connus. La première a contaminé les bars à salade d‘une ville en Oregon avec la
salmonelle pour influencer les résultats d‘un vote municipal (Torok et al. 1997).
Quant à la seconde, elle a, entre autres, dispersé une souche de B. anthracis,
heureusement non virulente, au-dessus de la ville de Kameido au Japon (Fouet et
Mock 1996; Keim et al. 2001; Riedel 2004; Smith 1995).
1.1.3 Au 21e siècle : la menace terroriste et les canulars
Les attaques terroristes de 2001 et les lettres de menace accompagnées de
préparations poudreuses de B. anthracis ont ravivé la peur de la population. En
effet, ces évènements ont montré à quel point la population pouvait être vulnérable
aux actes bioterroristes et l‘importance de s‘y préparer pour diminuer leurs
impacts. Ils allaient de plus initier des changements au sujet des réglementations
en biosécurité et motiver les états à se préparer contre ce type d‘attentat. Depuis,
des mécanismes ont été implantés afin d‘éviter la publication de recherches
pouvant être utilisées à mauvais escient pour le développement d‘armes
biologiques. Même s‘ils sont controversés, ces mécanismes ont montré leur utilité
11
récemment lors d‘études portant sur les modifications géniques augmentant la
virulence de souches de l‘influenza H5N1 (Herfst et al. 2012; Imai et al. 2012;
MacKenzie 2011; Office of Biotechnology Activities 2012; Selgelid et Weir 2010;
Shoham 2012; World Health Organization 2012).
Malgré toutes les mesures mises en œuvre à la suite de l‘automne 2001, d‘autres
incidents utilisant des agents biologiques ont été répertoriés (Lutwick et Lutwick
2009). Depuis, le plus grand fardeau pour les autorités est toutefois le résultat de
canulars. En effet, des milliers d‘enveloppes contenant des poudres inoffensives et
des lettres de menace avertissant le destinataire de la présence d‘agents
biologiques ont été postées par de nombreux individus ou groupes avec des
intentions variées (La Scola et al. 2003; Leask et al. 2003; Santerre 2012;
Tengelsen et al. 2002; Wills et al. 2008). Les autorités de sécurité et de santé
publiques doivent donc fréquemment intervenir afin d‘évaluer ce type de menace
et d‘offrir un support psychologique et médical aux victimes potentielles.
1.1.4 Apprentissage des évènements passés
Cet aperçu historique a montré que les types d‘actes bioterroristes et de guerres
biologiques effectués dans le passé ont été hétéroclites. Les motivations ont été
très variées : criminelles, militaires, politiques ou religieuses. Des attaques utilisant
des armes biologiques ont été planifiées par des individus ou encore
commanditées par certains états ou certaines organisations. Les moyens de
dissémination ont connu une grande évolution au cours de l‘histoire, se
sophistiquant avec les avancées scientifiques (Figure 1). La capacité de cibler de
plus grands nombres de personnes a ainsi augmenté. Qu‘elle soit stratégique
(grande échelle), opérationnelle (moyenne échelle) ou bien tactique (petite
échelle), l‘amplitude des attaques peut varier considérablement (Radosavljevic et
Belojevic 2009). Plusieurs grandes puissances ont secrètement développé un
savoir-faire permettant de produire des armes biologiques de destruction massive
(Tableau 1) (Alibek et Handelman 2000; Leitenberg 2001; Zilinskas 1997).
12
L‘objectif d‘une attaque peut également être la perturbation sociale, telle
qu‘exploitée lors d‘envois de lettres contenant des poudres inoffensives. La grande
biodiversité du monde microbien a été en partie exploitée puisque plusieurs
pathogènes ont été utilisés et que d‘autres ont été étudiés en vue de l‘être
(Tableau 1). La grande variété de types d‘attaques biologiques potentielles et leurs
subtilités complexifient la tâche pour s‘y préparer. Il est maintenant essentiel
d‘acquérir une perspective scientifique des différents éléments du bioterrorisme en
y intégrant les connaissances actuelles. J‘explorerai donc tout d‘abord la
composition de ces armes biologiques ainsi que les modes de dissémination
pouvant potentiellement être exploités. Par la suite, j‘enchaînerai avec la
préparation contre le bioterrorisme, en présentant notamment les procédures
d‘intervention et l‘importance des tests de détection des agents biologiques.
13
1.2 Les agents biologiques
La biodiversité du monde microbien, fruit de l‘évolution de milliards d‘années de
sélection génétique, est aussi vaste qu‘impressionnante. Chaque année, de
nouvelles espèces microbiennes sont découvertes. Parmi celles-ci, certaines
peuvent être pathogènes pour l‘espèce humaine et elles seront alors nommées
pathogènes
émergents.
Dans
les
40 dernières
années,
le
virus
de
l‘immunodéficience humain (VIH) est probablement l‘exemple le plus connu ayant
affligé notre société, d‘un continent à l‘autre. En 2001, une étude a chiffré le
nombre de pathogènes humains à 1 415, dont 538 espèces bactériennes, 307
fongiques, 287 helminthiques, 217 virales ou de prions et 66 de protozoaires
(Taylor et al. 2001). Depuis, plusieurs autres pathogènes humains émergents ont
été rapportés, dont un exemple frappant est le SRAS (Olano et Walker 2011; Woo
et al. 2008; Woolhouse et al. 2005). De ce fait, de nombreux micro-organismes
pourraient donc être utilisés lors d‘actes bioterroristes, mais contrairement à
certaines croyances, il n‘est pas nécessaire qu‘ils infligent un haut taux de
mortalité pour se révéler efficaces (Lindler et al. 2005). En effet, même si les
armes biologiques sont catégorisées comme étant des armes de destruction
massive, le but recherché peut être différent, par exemple, la perturbation sociale.
1.2.1 La sélection des agents biologiques prioritaires par les autorités
Fortes des connaissances modernes en infectiologie ainsi que d‘informations au
sujet de certains programmes d‘armement biologique du passé, plusieurs
organisations nationales et internationales ont établi des listes de pathogènes
humains possiblement employés (Guillemin 2005). Quoique ces listes se
ressemblent beaucoup, une des plus employées est celle des Centers for Disease
Control and Prevention (CDC). C‘est notamment parce qu‘elle classifie les
pathogènes prioritaires par ordre d‘importance en trois catégories, A, B et C, en
évaluant la menace qu‘ils constitueraient pour la santé s‘ils étaient utilisés lors
14
d‘actes bioterroristes (CDC 2000; Rotz et al. 2002). Le NIAID (National Institute of
Allergy and Infectious Diseases) a, pour sa part, défini une liste plus détaillée
d‘agents biologiques sur lesquels il est prioritaire de faire des recherches. Leurs
objectifs sont, de ce fait, d‘augmenter nos connaissances au sujet de ces agents
biologiques ainsi que de développer non seulement des vaccins et des thérapies,
mais également des méthodes diagnostiques à la fine pointe de la technologie
(NIAID 2003). Un autre avantage de cette liste est le fait qu‘elle soit mise à jour
régulièrement par le NIAID (NIAID 2012).
1.2.1.1 Définitions des catégories A, B et C du CDC
Le Tableau 2 présente donc la compilation des agents biologiques listés par les
CDC et le NIAID ainsi que les pathologies qui leur sont associées. J‘y ai également
ajouté d‘autres agents biologiques sur lesquels il y a eu des recherches à des fins
d‘armement (Leitenberg 2001; Zilinskas 1997). Ce tableau permet de constater
rapidement la variété d‘agents biologiques et de pathologies potentielles. Ces
maladies ont un large spectre de dangerosité, cela va des gastro-entérites plus
communes nécessitant rarement des hospitalisations aux fièvres hémorragiques
virales dévastatrices contre lesquelles l‘arsenal prophylactique et thérapeutique est
plus limité (Burnett et al. 2005; Sampath et al. 2011). La séparation des agents
biologiques en trois catégories permet d‘évaluer l‘impact qu‘ils auraient s‘ils étaient
utilisés lors d‘actes bioterroristes. Premièrement, les agents biologiques de la
catégorie A ont le plus haut niveau de dangerosité. Ils peuvent être aisément
disséminés et certains peuvent être transmis de personne à personne; ils
pourraient donc se répandre sur un grand secteur s‘ils étaient utilisés comme
armes biologiques (CDC 2000; Masci et Bass 2005). Ces pathogènes ayant des
taux de mortalité élevés auraient un impact majeur sur la santé publique. C‘est
pourquoi il est nécessaire de prendre des mesures préparatoires pour lutter contre
ces agents biologiques et de nombreuses recherches ont été faites depuis 2001
afin de s‘en protéger. Les agents de la catégorie B présentent un potentiel de
15
dissémination et un taux de morbidité modérés, mais un taux de mortalité faible. Il
est donc nécessaire de surveiller les maladies associées et d‘améliorer leurs
méthodes diagnostiques. Finalement, les agents de la catégorie C incluent les
pathogènes émergents, qui pourraient être relativement facilement produits et
disséminés, et potentiellement impliquer un haut niveau de morbidité et de
mortalité. Ils représentent donc une menace émergente et il est important
d‘améliorer nos connaissances à leurs sujets ainsi que de surveiller ces
pathogènes (CDC 2000; NIAID 2003).
Tableau 2. Agents biologiques prioritaires du bioterrorisme selon les CDC et le NIAID et
leurs pathologies.
Catégorie
Type
Agent infectieux
Maladie
Bacillus anthracis
Maladie du charbon
Francisella tularensis
Tularémie
Yersinia pestis
Peste
Clostridium botulinum (Neurotoxine botulinique)
Botulisme
Virus de la Variole
Variole
Autres Poxviridae
Autre
(p. ex. Virus de la variole du singe et Virus de la
variole du chameau
(Varioles du singe et du
chameau)
Bactérie
Bactérie
ou Toxine
Virus de Guanarito
Virus de Junin
A
Virus de la fièvre de Lassa
Arenavirus
Virus
Virus de la chorioméningite
lymphocytaire
Virus de Machupo
Filoviridae
Flavivirus
Bunyaviridae
16
Virus de l‘Ébola
Virus de Marburg
Virus de la Dengue
Hantavirus spp.
Virus de la fièvre de Rift Valley
Fièvres hémorragiques
virales
Catégorie
Type
Agent infectieux
Maladie
Brucella spp.
Brucellose
Morve (anglais :
Glanders)
Mélioïdose
Burkholderia mallei
Bactérie
Burkholderia pseudomallei
Chlamydophila psittaci
Coxiella burnetii
Bactérie et toxine
Toxine végétale
Rickettsia prowazekii
Clostridium perfringens
(toxine Epsilon)
Staphylococcus aureus (entérotoxine B : SEB)
Ricinus communis (ricine)
Psittacose
Fièvre Q (synonyme
coxiellose)
Typhus épidémique
Maladie de la toxine
epsilon
Intoxication à la SEB
Intoxication à la
ricine
Virus de l‘encéphalite équine de l‘Est (EEE)
Virus
Virus de l‘encéphalite équine de l‘Ouest (WEE)
Virus de l‘encéphalite équine du Venezuela
(VEE)
Virus de l‘encéphalite de Californie
Virus de l‘encéphalite japonaise
Encéphalites
virales
Virus de la maladie de la forêt de Kyasanur
Virus de LaCrosse
Virus du Nil occidental (WNV)
Campylobacter jejuni
B
Pathogènes de l‘eau ou alimentaires
E. coli diarrhégénique
(p. ex. O157 :H7)
Bactérie
Listeria monocytogenes
Salmonella spp.
Shigella spp.
Champignon
Vibrio cholerae
Choléra
Vibrio spp. pathogéniques
Gastro-entérites
Yersinia enterocolitica
Gastro-entérite
Microsporidia
Cryptosporidium parvum
Entamoeba histolytica
Microsporidioses
Cryptosporidiose
Infection à
Cyclospora
Amibiase intestinale
Giardia lamblia
Giardiase
Cyclospora cayatanensis
Protozoaire
Virus
Entérite
Entérite, colite
hémorragique,
syndrome
hémolytique
urémique
Gastro-entérite
Salmonellose/Fièvre
typhoïde
Shigellose
Toxoplasma gondii
Toxoplamose
Calicivirus
Gastro-entérites
Virus de l‘Hépatite A
Hépatite A
17
Catégorie
Type
Bactérie
Champignon
Maladie
Mycobacterium tuberculosis,
souches multirésistantes aux
antibiotiques
Tuberculose
Autres Rickettsia spp.
NA
Rickettsia conorii
Fièvre boutonneuse méditerranéenne
Rickettsia rickettsii
Fièvre pourprée des montagnes
Rocheuses
Rickettsia typhi
Typhus endémique
Coccidioides immitis
Coccidioides posadasii
Chikungunya
Virus de la fièvre jaune
Fièvre jaune
Virus de l‘encéphalite transmis par
les tiques
Encéphalite
Virus de la fièvre hémorragique de
Crimée-Congo
Fièvre hémorragique
Virus de l‘influenza
Grippe
Virus du Nil Occidental
Encéphalite du Nil Occidental
Virus de Nipah
Encéphalite
Autres Hantavirus
Syndrome cardiopulmonaire à
Hantavirus
Virus de la rage
Rage
Virus du syndrome respiratoire aigu
sévère
Syndrome respiratoire aigu sévère
Type
Agent infectieux
Maladie
Champignon
ou toxine
Aspergilus parasiticus (Aflatoxine)
Virus
Aspergillus flavus (Aflatoxine)
Autres
Coccidioïdomycoses
Virus de Chikungunya
C
Catégorie
Agent infectieux
Fusarium spp. et autres genres
(Trichothécènes mycotoxines)
Aflatoxicose
Variable, inflammation du système
digestif, déficit de l‘hématopoïèse, etc.
Adapté de (CDC 2000; Ciottone 2006; Leitenberg 2001; NIAID 2012; Rotz et al. 2002; Zilinskas 1997).
18
1.2.2 Diversité des agents biologiques prioritaires
Les tableaux 3a-3c présentent la classification taxonomique des agents
biologiques afin d‘illustrer leur biodiversité. En effet, quatre des six règnes du
vivant décrits par Cavalier sont représentés (Cavalier-Smith 1998), et ce, sans
compter les virus dont l‘inclusion dans le monde du vivant est débattue (RuizSaenz et Rodas 2010). Quoique les agents biologiques puissent être d‘origine
variée, ils sont principalement représentés par des bactéries (Tableau 3a) ou des
virus (Tableau 3c). En effet, la facilité du nombre de bactéries à croître en culture
axénique explique en partie le fait que plusieurs espèces aient été étudiées lors de
programmes d‘armement biologique. Un second attrait pour les bactéries est le fait
que les antibiotiques pourraient également, la plupart du temps, permettre de
traiter le fabricant au cas où il serait accidentellement infecté. Ceci n‘est pas le cas
pour plusieurs maladies virales puisque des vaccins et des antiviraux ont été
développés seulement contre certaines de ces infections (Burnett et al. 2005;
Sampath et al. 2011). Les difficultés de production de virus sont plus élevées,
entre autres, puisque ces derniers ont nécessairement besoin de l‘appareillage
cellulaire d‘un hôte afin de se reproduire. Ces deux contraintes majeures
pourraient limiter les fabricants souhaitant se protéger et produire des quantités de
virus importantes avec des budgets restreints. Par contre, les faibles doses
infectieuses et la haute contagiosité de certaines maladies virales, dont la variole,
ont tout de même justifié leur inclusion dans les programmes de certains pays
(Tableau 1) (Alibek et Handelman 2000; Leitenberg 2001). D‘autre part, certains
protozoaires (Tableau 3b) ont été inclus dans la catégorie B du CDC et du NIAID
puisqu‘ils pourraient être utilisés pour contaminer l‘eau ou les aliments. Quant au
règne des fungi (Tableau 3b), il est représenté par certaines mycotoxines (Ciottone
2006; Zilinskas 1997) ainsi que l‘embranchement des Microsporidia, dont
l‘appartenance taxonomique controversée a précisément été clarifiée par des
études phylogénétiques plus récemment (Capella-Gutierrez et al. 2012).
19
Finalement, la ricine est le seul agent biologique listé ici qui n‘est pas d‘origine
microbiologique (Tableau 3b). Elle est reconnue comme étant l‘une des toxines les
plus létales sur la planète et est extraite d‘une plante nommée Ricinus communis.
Les agents biologiques listés ici sont si différents qu‘ils ont également des modes
de transmission variés.
20
Tableau 3. Classification taxonomique des agents biologiques prioritaires du CDC et du NIAID.
Tableau 3a. Les procaryotes.
Domaine
Règne
Embranchement
Classe
Ordre
Famille
Genre
Actinobacteria
Actinobacteria
Corynebacteriales
Mycobacteriaceae
Mycobacterium
Chlamydiae
Chlamydiia
Chlamydiales
Bacilli
Bacillales
Chlamydiaceae
Bacillaceae
Listeriaceae
Staphylococcaceae
Chlamydophila
Bacillus
Listeria
Staphylococcus
Clostridia
Clostridiales
Clostridiaceae
Clostridium
Rhizobiales
Brucellaceae
Brucella
Rickettsiales
Rickettsiaceae
Rickettsia
Betaproteobacteria
Burkholderiales
Burkholderiaceae
Burkholderia
Epsilonproteobacteria
Campylobacterales
Campylobacteraceae
Enterobacteriales
Enteroacteriaceae
Campylobacter
Escherichia
Salmonella
Shigella
Firmicutes
Alphaproteobacteria
Bacteria
Bacteria
Protoebacteria
Gammaproteobacteria
Yersinia
Legionellales
Thiotrichales
Coxiellaceae
Francisellaceae
Coxiella
Francisella
Vibrionales
Vibrionaceae
Vibrio
Espèce
tuberculosis
complex
psittaci
anthracis
monocytogenes
aureus
botulinum
perfringens
spp.
prowazekii
spp.
mallei
pseudomallei
jejuni
coli
spp.
spp.
enterocolitica
pestis
burnetii
tularensis
cholerae
Autres Vibrio
pathogènes
Références : (Bergey's Manual Trust 2010; Brenner et al. 2005; Krieg et al. 2010; Vos 2009).
21
Tableau 3 b. Les virus
Domaine
Type d’AN
Ordre
Famille
Arenaviridae
Bunyaviridae
Orthomyxoviridae
Filoviridae
Mononegavirales
Nidovirales
Virus
Paramyxoviridae
Rhabdoviridae
Coronaviridae
Caliciviridae
ARNsb +
22
Orthobunyavirus
Phlebovirus
Influenzavirus A
Ebolavirus
Marburgvirus
Henipavirus
Lyssavirus
Betacoronavirus
Norovirus
Sapovirus
Flaviviridae
Flavivirus
Poxviridae
Orthopoxvirus
Togaviridae
Alphavirus
Picornaviridae
Hepatovirus
NR
Picornavirales
Légende.
Arenavirus
Hantavirus
Nairovirus
NR
ARNsb
Genre
a
Espèce
Guanarito virus
Junín virus
Lassa virus
Lymphocytic choriomeningitis virus
Machupo virus
spp.
Crimean-Congo hemorrhagic fever virus
b
La Crosse virus
California encephalitis virus
Rift Valley fever virus
Influenza A virus
spp.
Marburg marburgvirus
Nipah virus
Rabies virus
Severe acute respiratory syndrome-related coronavirus
Norwalk virus
Sapporo virus
Dengue virus
Japanese encephalitis virus
Kyasanur Forest disease virus
Tick-borne encephalitis virus
West Nile virus
Yellow fever virus
Variola virus
Camelpox virus
Monkeypox virus
Autres
Eastern equine encephalitis virus
Venezuelan equine encephalitis virus
Western equine encephalitis virus
Hepatitis A virus
AN : acide nucléique.
ARNsb + : acide ribonucléique simple brin à polarité positive.
ARNsb - : acide ribonucléique simple brin à polarité négative.
NR : pas de rang attitré.
a
b
: Les noms des espèces de virus sont présentés selon la nomenclature de l‘ICTV (ICVT 2009) ou selon Hollidge et al. (Hollidge et al. 2010).
Tableau 3 c. Les eucaryotes.
Domaine
Règne
Fungi
Eukarya
Protozoa
Embranchement
Ascomycota
Classe
Ordre
Famille
Genre
Eurotiales
Trichocomaceae
Aspergillus
Onygenales
NR
Coccidioides
Nectriaceae
NS
Cryptosporidiidae
Eimeriidae
Sarcocystidae
Fusarium
NS
Cryptosporidium
Cyclospora
Toxoplasma
Giardia
Entamoeba
flavus
parasiticus
immitis
posadasii
spp.
NS
parvum
cayetanensis
gondii
intestinalis*
histolytica
Euphorbiaceae
Ricinus
communis
Eurotiomycetes
Microsporidia
Sordariomycetes
NS
Hypocreales
NS
Apicomplexa
Coccidia
Eucoccidiorida
NR
Viridiplantae
Légende :
Streptophyta
Sous-classe :
rosids
Malpighiales
Espèce
NS : non spécifié.
NR : pas de rang attitré.
* anciennement Giardia lamblia.
Référence : (National Center for Biotechnology Information (NCBI) 2012).
23
1.2.3 Modes de dissémination
La revue historique préalable (Figure 1 et Tableau 1) a montré que plusieurs voies
de transmission ont été exploitées afin de propager les agents biologiques. La
Figure 2 illustre les modes de dissémination possibles des agents biologiques, que
ce soit des micro-organismes ou encore des toxines. Tels que montrés en bleu,
ces agents peuvent être dispersés directement dans l‘environnement ou en
utilisant des véhicules (transporteurs inanimés d‘agents infectieux). D‘autre part,
d‘autres organismes vivants illustrés en vert peuvent transmettre ces agents
biologiques par un contact direct ou encore un contact indirect, ce dernier
nécessitant un transfert dans l‘environnement avant d‘atteindre l‘hôte (Black 2003;
Prescott 2010; Siegel et al. 2007). Les épithéliums constituent généralement une
barrière mécanique efficace contre l‘entrée d‘agents biologiques présents dans
l‘environnement. En plus d‘avoir un rôle de protection, les épithéliums des
muqueuses digestives et respiratoires ont un rôle important à jouer pour
l‘absorption des nutriments ou les échanges gazeux. Ces épithéliums constitués
d‘une seule couche de cellules sont donc plus vulnérables à l‘invasion par des
corps étrangers. Plusieurs agents biologiques ont
donc développé des
mécanismes leur permettant d‘exploiter cette vulnérabilité en pénétrant l‘organisme
par les systèmes digestif ou encore respiratoire (Cotran et al. 2010; Salyers et
Whitt 1994). Je développerai davantage au sujet de cette dernière voie de
transmission puisque mon projet se concentre sur les espèces bactériennes
aéroportées associées au bioterrorisme.
24
MODES DE DISSÉMINATION
Aérosols
Aéroportée
Environnement
ou véhicule
Percutanée
Gouttelettes
Muqueuse
Noyaux de
gouttelettes
Peau
Transmission
verticale
Hommes
Contact direct
Animaux
Contact
indirect
Vivants
Alimentaire
Plantes
(toxines)
Objets
Insectes
Figure 2. Modes de dissémination des agents biologiques.
1.2.3.1 La transmission aéroportée
Theodore Rosebury et Elvin Kabat (1947), deux scientifiques renommés de
Columbia University ont publié, après la Deuxième Guerre mondiale, un rapport
dans lequel ils ont conclu que « The air-borne route of infection seems to be the
most practicable for bacterial warfare […] ». En effet, il a été estimé que dans une
ville métropolitaine, 100 kg de préparation de spores de B. anthracis disséminés
dans l‘air lors de conditions environnementales favorables pourraient causer
jusqu‘à trois millions de décès (Alibek et Handelman 2000; Inglesby et al. 1999).
Plusieurs types de particules permettent la transmission dans l‘air des agents
biologiques : gouttelettes, noyaux de gouttelettes et aérosols. Par définition, la
transmission par gouttelettes nécessite la formation de particules contaminées qui
sont transportées dans l‘air sur une courte distance, historiquement considérée
comme étant moins d‘un mètre. Toutefois, cette distance est controversée puisque
de nombreuses conditions peuvent influencer leur déplacement. Les gouttelettes
peuvent sédimenter ou être transformées rapidement par dessiccation en noyaux
de gouttelettes et pouvant voyager sur une plus grande distance. Quant aux
aérosols, ils sont de fines particules, incluant par exemple les noyaux de
25
gouttelettes et les poudres, qui peuvent rester en suspension dans l‘air, être
transportés aisément sur de plus grandes distances et pénétrer plus profondément
l‘arbre pulmonaire (Siegel et al. 2007). Dans la contexte du bioterrorisme, des
poudres ou poussières extrêmement fines peuvent être utilisées comme additifs
pour créer des aérosols et ainsi augmenter la dispersion et la résistance des
agents biologiques dans l‘environnement (Alibek et Handelman 2000; Duncan et
al. 2009; Shoham et Jacobsen 2007). L‘attaque aux lettres contenant des
préparations poudreuses de B. anthracis en 2001 ainsi que des études
expérimentales ont montré le potentiel dévastateur de ce mode de transmission
(Duncan et al. 2009; Jernigan et al. 2001; Kournikakis et al. 2001).
1.2.3.2 L’anatomie du système respiratoire et ses défenses
Il est important d‘observer l‘anatomie du système respiratoire et ses mécanismes
de défense pour comprendre comment les agents biologiques peuvent y pénétrer
(Figure 3) (Levitzky 2007). D‘autant plus qu‘à chaque minute, environ sept litres
d‘air infiltrent les voies respiratoires pour assurer des échanges gazeux efficaces,
transportant également des particules et des micro-organismes. C‘est pourquoi
plusieurs mécanismes de défense sont à l‘œuvre chaque jour pour protéger nos
voies respiratoires composées de tissus sensibles. L‘air pénètre donc par le nez ou
la bouche pour traverser le pharynx et le larynx, ceci constitue les voies
respiratoires supérieures. Un système de piégeage efficace, grâce entre autres
aux poils nasaux, à la turbulence dans les fosses nasales et au mucus, permet
d‘éliminer nombre de particules, surtout si l‘air est inspiré par le nez. Ensuite, l‘air
pénètre les voies respiratoires inférieures ayant des diamètres se rétrécissant cent
fois. Les cellules ciliées, la toux, les expectorations et la déglutition sont autant de
moyens pour éliminer le mucus contaminé du système respiratoire inférieur. Les
480 millions d‘unités alvéolaires constituent une surface d‘échange gazeux
estimée entre 50 et 100 m2 chez l‘adulte (Levitzky 2007). La Figure 3 illustre
également les diamètres approximatifs des micro-organismes pouvant pénétrer les
26
voies respiratoires (Kowalski et Bahnfleth 1998; Levitzky 2007). Finalement,
lorsque les mécanismes de défense principalement mécaniques ne réussissent
pas à éliminer ces corps étrangers, les macrophages alvéolaires libres patrouillant
la surface de l‘épithélium à la recherche de particules étrangères à phagocyter
prennent la relève. Si les toxines ou micro-organismes réussissent à franchir
toutes ces frontières et à pénétrer l‘espace interstitiel ou le sang, d‘autres
phagocytes pourront prendre en charge leur destruction et activer le système
immunitaire acquis (Levitzky 2007). Une proportion des agents biologiques
dispersés dans l‘air peut toutefois pénétrer plus profondément les voies
respiratoires et trouver des moyens d‘échapper aux défenses immunitaires
causant ainsi des infections ou des toxicoses. C‘est pourquoi je présenterai les
caractéristiques des agents bactériens aéroportés associés au bioterrorisme.
27
Figure 3. Schéma de l’arbre pulmonaire, des diamètres (D) des voies respiratoires et des
diamètres (D) approximatifs des micro-organismes y pénétrant.
1.2.4 Les agents bactériens aéroportés sélectionnés pour cette thèse
Plusieurs notions théoriques d‘épidémiologie des maladies infectieuses sont
essentielles à la compréhension du potentiel dévastateur de chaque agent
biologique : caractéristiques morphologiques, maladies, modes de transmission,
temps d‘incubation, doses infectieuses, traitements curatifs et prophylactiques
disponibles, et résistances dans l‘environnement. Le Tableau 4 expose de façon
succincte ces informations. Les agents bactériens aéroportés sélectionnés pour
cette thèse sont au nombre de 12. Leurs caractéristiques microbiologiques sont
diversifiées : coloration, forme, sporulation et croissance. Les maladies causées
par les agents bactériens aéroportés sélectionnés sont également nombreuses.
Les prodromes de plusieurs de ces maladies se présentent par des symptômes
28
pseudogrippaux et cette similarité complexifie le diagnostic (Masci et Bass 2005).
De plus, les doses infectieuses estimées sont variables, passant de 1 bactérie
pour C. burnetii à 2 500 - 55 000 spores pour B. anthracis (Ciottone 2006; Inglesby
et al. 1999; Lindler et al. 2005). Ceci aura une influence sur le nombre de
personnes pouvant être infectées lors d‘une attaque bioterroriste. Les taux de
mortalité ont également un spectre très étendu et sont modulés par les traitements
prophylactiques et curatifs disponibles. Des vaccins sont disponibles pour
s‘immuniser préventivement ou rapidement à la suite de l‘exposition contre
seulement certains de ces agents biologiques. Des antibiothérapies et des
antitoxines peuvent également être disponibles. Comme vous pouvez constater, la
durée des traitements même prophylactiques, par exemple de 60 jours dans le cas
de la maladie du charbon, peut être longue. De là l‘importance d‘identifier
efficacement les victimes infectées à l‘aide de technique de détection rapide, car
les réserves limitées de certains de ces traitements devront être utilisées de façon
judicieuse. Par ailleurs, la résistance dans l‘environnement peut être également
très différente d‘un agent biologique à un autre. Par exemple, les spores de
B. anthracis peuvent persister dans l‘environnement des années alors que la forme
végétative de Y. pestis y survit moins d‘une heure (Ciottone 2006; Sinclair et al.
2008). Vous comprendrez donc pourquoi les procédures de décontamination
contre B. anthracis en 2001 ont été très complexes et dispendieuses (Campbell et
al. 2012). Toutes ces informations rassemblées permettent de comprendre les
conséquences qu‘aurait un acte bioterroriste utilisant chacun de ces pathogènes
sur la population. Par conséquent, ce tableau permet de comprendre l‘importance
réelle de se préparer en cas d‘acte bioterroriste.
29
Tableau 4. Caractéristiques et pathologies des agents bactériens aéroportés.
Agent
biologique
Morphologie
Maladie
Transmission
aéroportée
Dose
infectieuse
(inhalation)
Incubation
Taux
mortalité
Traitement curatif et
prophylactique
possible
Estimation de la
viabilité dans
l'environnement
B. anthracis
Bacille G+
Maladie du Charborn
(Inhalée)
Inhalation
2 50055 000 spores
1 à 5 jours,
jusqu'à 6
semaines
Tr : 50 %
STr : 95 %
Antibiothérapie 60 jours,
vaccin
Années
Toxine
botulinique
(C.
botulinum)
Bacille G+, sporulant
Botulisme
Inhalation
LD50 : 3ng/kg
2 h à 1 semaine
90 %
Antitoxine
Années (spores)
F. tularensis
Coccobacille G -
Tularémie (Pneumonique,
Septicémique)
Inhalation
Absence de
PàP
10 à 50 CFU
1-10 jours
Tr : 1 %
STr : 30 %
Antibiothérapie 14 jours
Air : <1 à 8 h
Objets inanimés :
4 à 175 h
Résistance
dans les amibes
environnementales
Y. pestis
Coccobacille G
Coloration bipolaire
("safety pin")
Peste (Pneumonique,
Septicémique)
Inhalation
P à P (gouttelettes)
343 bactéries
(grivet)
1 à 6 jours
STr : 100 %
Antibiothérapie 7 jours
Air : < 1 h
Objets inanimés :
< 1 à 47 h
Brucella spp.
Coccobacilles G-
Brucellose
Inhalation
Absence de P à P
DI50 :
10 à 100 CFU
Semaines à mois
2%
Antibiothérapie 6
semaines
Plus de
400 jours
B. mallei
Bacille G-
Morve (Pulmonaire,
Septicémie fulminante)
Inhalation
1 à 10 CFU
(hamster)
10 à 14 jours
Tr : 40-50 %,
STr :
90- >95 %
Antibiothérapie 24
semaines
Attention à la résistance
Qq. mois
B.
pseudomallei
Bacille G-
Mélioïdose (Pneumonie,
Bactériémie,
Infection locale,
Infection chronique
purulente,
Asymptomatique)
Inhalation
Antibiothérapie 22-24
semaines
Années
Toxine
epsilon (C.
perfringens)
Bacille G+ sporulant
Maladie de la toxine
epsilon
Inhalation
Support
Années (spores)
30
100 CFU (modèle
murin d’infection
2 jours à
chronique)
plusieurs années Jusqu'à 40 %
2 500 CFU (modèle
(29 ans)
murin d’infection
aiguë)
LD :
1µg/kg
≤12 heures,
décès possible en
30-60 min
ND
Agent
biologique
Morphologie
Maladie
Transmission
aéroportée
Dose
infectieuse
(inhalation)
Incubation
Taux
mortalité
Traitement curatif et
prophylactique
possible
Estimation de la
viabilité dans
l'environnement
C. psittaci
Bactérie
intracellulaires
obligatoire
Psittacose (Pneumonie
atypique, Bactériémie)
Inhalation
P à P (rare)
Modèle bovin :
106 UFI
1 à 15
jours
Tr : 1 %
STr : 20 %
Antibiothérapie, 10 à 14
jours patient afébrile
Jusqu'à
1 sem
C. burnetii
Anciennement
considérée bactérie
intracellulaire
obligatoire
Maintenant : culture
axénique possible
Coxiellose
Synonyme :
Fièvre Q
(Maladie fébrile,
Pneumonie, Hépatite)
Inhalation
1 UFI
10 à 40 jours
1%
Antibiothérapie : 14 à 21
jours
Si comorbidité ou
complication cardiaque :
tr. 1 à 3 ans
Vaccin
Semaines
à mois
R. prowazekii
Bactérie intracellulaire
obligatoire
Typhus épidémique
Inhalation
< 10 particules
7 à 14 jours,
10-50 ans
STr : 12-20 %
Complication
vasculaires :
15-40 %
Antibiothérapie,
3 jours patient afébrile
Vaccin
100 jours
M.
Bacille acido-alcoolotuberculosis
résistants
multirésistant
Tuberculose (Primaire,
Réactivation, Pulmonaire,
Extrapulmonaire,
Asymptomatique)
Inhalation
PàP
10 CFU
< 1 à > 20 ans
Antibiothérapie
6-9 mois
Forme active Traitement antibiotique en
STr : ≤66 % fonction de la résistance
de la souche.
Vaccin BCG
Plusieurs mois
Références : (Azad 2007; Ciottone 2006; Conejero et al. 2011; Inglesby et al. 1999; Kramer et al. 2006; Lindler et al. 2005; Lutwick et Lutwick 2009; Reinhold et al.
2012; Sinclair et al. 2008; Vynnycky et Fine 2000; World Health Organization 2012).
NB : la majorité des informations présentées dans ce tableau ont été tirées de Ciottone 2006, les références appuyant ces informations n‘ont pas toutes pu être
contre-vérifiées et validées.
Légende :
CFU : unité formant des colonies
DI50 : Dose pouvant infecter 50 % des individus
G - : Gram négatif
G + : Gram positif
LD50 : Dose létale 50 %
LD : Dose létale
ND : non disponible
P à P : tranmission personne à personne
STr : sans traitement
Tr : traitement
UFI : unité formant des inclusions
31
1.3 La préparation contre le bioterrorisme
Les armes biologiques ont des particularités distinctives. Alors que les explosifs et
les armes chimiques peuvent causer des dommages immédiats dans un secteur
délimité, les agents biologiques nécessitent un temps d‘incubation avant de
provoquer des symptômes et certains d‘entre eux, contagieux, peuvent même se
transmettre par la suite de personne à personne. Cette subtilité explique pourquoi
une fois les agents biologiques dispersés dans l‘environnement, les responsables
peuvent perdre eux-mêmes le contrôle de leur arme biologique (Rosebury et Kabat
1947). La préparation des états à ces attaques nécessite donc l‘élaboration et le
perfectionnement de procédures d‘interventions, de méthodes de détection et
diagnostiques ainsi que de traitements prophylactiques et curatifs. Il est
maintenant important de comprendre les procédures d‘intervention contre la
menace biologique.
1.3.1 Procédures d’intervention à la suite d’un acte bioterroriste
Cette section présentera un bref aperçu des procédures d‘intervention à la suite
d‘un acte bioterroriste pour faciliter la compréhension de cette thèse. Je focaliserai
sur celles internationales ainsi que celles du Canada et des États-Unis. Lors d‘une
menace de bioterrorisme, il est important en premier lieu d‘éliminer l‘éventualité de
menaces chimiques, explosives ou radioactives. La sécurité du personnel
d‘intervention est primordiale; les entraînements et équipements appropriés sont
nécessaires. L‘équipe d‘intervention est généralement constituée d‘officiers de
police ou de pompiers arrivant en première ligne, d‘équipes spécialisées, d‘un
conseiller en biosécurité, d‘enquêteurs et de responsables des relations publiques.
La tâche est complexe; ils devront en plus d‘établir un périmètre de sécurité,
évaluer la menace, collecter les échantillons, coordonner les interventions
médicales, recueillir la preuve, procéder à la décontamination du site, enquêter et
32
informer le public (Interpol 2007; Raber et al. 2011). Au Canada, le Centre de
mesures et d‘interventions d‘urgence (CMIU) de l‘Agence de la santé publique du
Canada est l‘organisme gouvernemental en santé autoritaire en ce qui a trait au
bioterrorisme (Santé Canada 2002). En cas d‘urgence, le Système de la réserve
nationale
d‘urgence
peut
faire
parvenir
des
fournitures
médicales
et
pharmaceutiques ainsi que déployer des unités médicales dans un délai de 24
heures (Agence de la santé publique du Canada 2012).
1.3.1.1 Attaques annoncées ou non annoncées
Les procédures d‘intervention varient considérablement selon l‘annonce ou non
d‘une attaque bioterroriste (Figure 4) (CDC 2000; Interpol 2007). En effet, la
sécurité publique peut être informée (attaque annoncée) de l‘imminence d‘une
attaque par, entre autres, des lettres de menace, des dénonciations et la
découverte de matériels ou d‘agissements suspects. Les autorités chercheront
donc à identifier la source de l‘agent infectieux pour procéder aux arrestations et à
la décontamination. Pour ce faire, ils devront recueillir des échantillons afin
d‘effectuer des tests de détection sur le terrain ainsi qu‘en laboratoire suivant les
standards de la preuve microbiologique légale. Les autorités de la sécurité
publique informeront également les responsables de la santé publique de cette
menace afin que les institutions médicales se préparent à offrir des soins
appropriés aux victimes présumées ou identifiées (CDC 2000; Interpol 2007). Ces
dernières pourront recevoir des traitements prophylactiques lorsque disponibles,
tel que décrit au Tableau 4. Des tests diagnostiques seront ensuite réalisés chez
les victimes potentielles ou les patients avec des présentations cliniques pouvant
être expliquées par l‘agent biologique en cause. La panique de la population
engendrée par cette menace peut inciter de nombreuses consultations médicales
et le système de santé devra se préparer à un achalandage grandement augmenté
(Ciottone 2006).
33
Il est plus probable que les attaques bioterroristes ne soient pas annoncées pour
maximiser leurs effets, car à la différence des autres types d‘attentats (p.
ex. explosifs ou chimiques), les délais d‘apparitions des symptômes sont plus
longs (période d‘incubation) (CDC 2000). Dans cette éventualité, la santé publique
sera la première instance à intervenir lorsque les victimes demanderont des
consultations médicales. Plusieurs agents biologiques causeront des prodromes
non spécifiques amenant donc le clinicien vers un vaste diagnostic différentiel
(Masci et Bass 2005). C‘est pourquoi il est important de se référer à des tests
diagnostiques qui permettront d‘identifier l‘agent biologique en cause. De plus, ces
méthodes diagnostiques permettront de distinguer les personnes réellement
affectées des autres présentant des syndromes apparentés. Certains tests
diagnostiques nécessitent toutefois des délais considérables avant d‘identifier
l‘agent causal (Bissonnette et Bergeron 2010; Boissinot et Bergeron 2003; Pingle
et al. 2007). La santé publique émettra l‘alerte à la suite d‘une augmentation ou
d‘une recrudescence dans la population d‘une infection ou d‘une toxicose
particulière. Les soins médicaux des victimes seront retardés comparativement à
une attaque annoncée. Ces délais pourront avoir des répercussions sur la réponse
clinique, la morbité et la mortalité. Les autorités de sécurité et de santé publiques
s‘affaireront conjointement à identifier la source : responsable(s) et lieu(x) grâce à
l‘enquête et à des tests de détection (CDC 2000; Interpol 2007). Selon la
contagiosité des agents biologiques ou la multiplication des attaques, d‘autres
vagues de victimes pourraient arriver dans les centres médicaux (CDC 2000). La
possibilité d‘une attaque non annoncée dans des endroits jugés à haut risque
suscite l‘intérêt pour le développement de systèmes de surveillance permettant la
détection d‘agents biologiques dans l‘air. Le programme américain BioWatch en
est un exemple. Ce type de systèmes permettrait de prévenir plus rapidement les
autorités, de situer le lieu et de connaître le moment de l‘attaque (Burnett et al.
2005; Shea et Lister 2003).
34
Présentement, les organisations de sécurité publique doivent souvent intervenir
pour évaluer les poudres suspectes découvertes ou postées. En effet, le USA
today rapporte que depuis septembre 2001, les autorités ont dû intervenir pour
plus de 30 000 incidents reliées principalement à des poudres, mais également à
des liquides ou d‘autres produits suspects (Hall 2008). C‘est pourquoi nous nous
sommes consacrés au développement de systèmes de détection lors de la
découverte de poudres suspectes (attaque annoncée).
35
A
ATTAQUE
BIOTERRORISTE
Annoncée
Intervention des
autorités
Non annoncée
Dissémination
de l'AB
Tests de
détection
(surveillance)
Malades
Malades
Intervention des
autorités
Tests
diagnostiques
Tests
diagnostiques
Dissémination
de l'AB
Panique
Tests de
détection
Pas de
dissémination
de l'AB
Intervention des
autorités
Intervention des
autorités
Panique
Tests de
détection
B
Intervention des
autorités
Enquête
Tests de
détection
Source
identifiée
Source
non identifiée
Arrestations
Décontamination
Dissémination/
Propagation de
l'AB continue
Arrêt de la
dissémination de
l'AB
Arrêt de la
propagation de
l'AB
Malades
Figure 4. Modèle schématique illustrant les fenêtres d’utilisation des tests de détection et
diagnostiques lors des procédures à la suite d’une attaque bioterroriste.
A) Attaque bioterroriste annoncée ou non annoncée. B) Intervention des autorités de sécurité
publique. AB : Agent biologique.
36
1.3.1.2 Les lacunes des procédures d’intervention
En 2007, Interpol indique dans un rapport : « Hazard assessment in a potential
bioterrorism incident is complicated by the lack of consistently reliable field
detection equipment capable of rapidly identifying biological agents » (Interpol
2007). Une détection et une identification rapides et précises des pathogènes
permettraient de minimiser leurs impacts (Figure 5). En effet, les autorités
concernées pourraient intervenir et identifier rapidement la ou les sources, les
agents biologiques, les lieux et les responsables du crime, afin d‘initier les
procédures de décontamination adéquates autant pour les victimes que
l‘environnement. Il est également important de comprendre les défis distincts pour
enrayer la propagation d‘une maladie non contagieuse et d‘une maladie
contagieuse, celle-ci étant transmissible d‘une personne à une autre même après
la décontamination (Rosebury et Kabat 1947). En effet, si l‘agent infectieux n‘est
pas contagieux, les personnes contaminées pourraient développer la maladie,
mais après avoir été décontaminées, elles ne pourraient plus transmettre
l‘infection. L‘infection serait donc limitée aux individus exposés initialement à des
doses suffisantes de l‘agent biologique. Par contre, une maladie contagieuse
pourrait se propager dans la population après avoir infecté seulement quelques
individus (Prescott 2010). Elle serait donc beaucoup plus difficile à contrôler par les
agences de santé publique. La quarantaine, la vaccination massive et les
traitements prophylactiques seraient les moyens de choix pour limiter la
propagation, s‘ils sont disponibles. Je présenterai donc certains systèmes
commercialisés pour la détection et l‘identification des agents biologiques. De plus,
je discuterai brièvement des analyses en laboratoire permettant de confirmer non
seulement l‘espèce en cause, mais aussi de caractériser le variant afin de porter
des accusations criminelles.
37
Dissémination de l’agent biologique
Détectée
Non détectée
Délai de réponse
Décontamination
Victimes &
Environnement
Contamination &
Infection
Maladie
non contagieuse
Traitement
Décès &
Disposition
appropriée
Maladie
contagieuse
Traitement &
Isolement
Décès &
Disposition
appropriée
Arrêt de la propagation
Figure 5. Modèle schématique de la propagation des agents biologiques en fonction de leur
détection et de leur contagion.
Les cases et flèches rouges signifient que la propagation de l‘agent biologique continue alors que
les vertes montrent l‘arrêt.
38
1.4 La détection et l’identification des agents biologiques
De nombreuses macromolécules constituant les micro-organismes peuvent
comporter une signature propre à un rang taxonomique permettant son
identification. La Figure 6 montre la diversité des techniques de détection et
d‘identification des agents biologiques (Persing 2011). La culture microbienne
nécessite des délais, représentés par les aiguilles d‘une horloge, inhérents aux
temps de multiplication variables d‘une espèce à une autre. Ensuite, des tests
biochimiques peuvent être effectués séparément ou dans des systèmes en
réalisant plusieurs simultanément. La microscopie permet d‘étudier la morphologie
du micro-organisme en cause. Ces trois dernières méthodologies permettent
l‘identification phénotypique. D‘autre part, les toxines peuvent être détectées et
biotypées grâce à des bioessais nécessitant des jours de délais. Les
immunoessais, grâce à des anticorps spécifiques, peuvent identifier des microorganismes, leurs toxines ou les anticorps produits par les patients infectés. Les
séquences
d‘acides
nucléiques
peuvent
être
analysées
par
différentes
méthodes génotypiques : séquençage, hybridation d‘ADN et amplification PCR.
Finalement, la chromatographie peut permettre d‘identifier les signatures
spectrométriques de macromolécules ou de cellules entières (Persing 2011).
Certaines de ces méthodes, plus simples ou automatisées, sont utilisables sur le
terrain et d‘autres, nécessitant des manipulations plus complexes, sont seulement
réalisables en laboratoire. Les méthodes d‘analyse possibles sont si nombreuses
qu‘il est essentiel d‘utiliser des critères standardisés afin de les comparer
objectivement en se basant sur des données probantes. Ces critères de validation
permettent également d‘interpréter le résultat du test utilisé considérant ses
limitations et seront passés en revue brièvement.
39
Figure 6. Principes de détection des macromolécules signatures des agents biologiques.
1.4.1 Les critères de performance clinique de tests diagnostiques
L‘importance des critères de performance cliniques de tests diagnostiques est
reconnue par la communauté médicale. Ces caractéristiques sont évaluées au
départ lors d‘études cliniques en comparant le test diagnostique à valider à celui
de référence pour une maladie donnée. Ceci permet de construire un tableau de
contingence (Tableau 5). En bref, la sensibilité diagnostique (
) est la
capacité d‘un test particulier à donner un résultat positif chez un sujet présentant la
maladie. Quant à la spécificité diagnostique (
), elle permet d‘obtenir un
résultat négatif lorsque la maladie est absente. Les résultats obtenus permettent
d‘évaluer la valeur prédictive positive (VPP) et la valeur prédictive négative (VPN).
La première (
40
) correspond à la probabilité que la maladie soit
présente lorsque le test est positif alors que la seconde (
) estime la
probabilité que la maladie soit absente lorsque le test est négatif. Ces valeurs
(VPP et VPN) sont influencées par la prévalence de la maladie dans la population
cible. Par exemple, si la prévalence d‘une maladie est plus élevée dans la
population à laquelle le patient appartient, la VPP augmente et la VPN diminue
(Beaucage et al. 2009; Saah et Hoover 1997; T. D. R. Diagnostics Evaluation
Expert Panel et al. 2010). Forts de ces données probantes et de cette
compréhension, les cliniciens peuvent prendre des décisions cliniques en
considérant les probabilités qu‘un test particulier procure le bon diagnostic et
ajuster leurs plans de traitement en conséquence. Il est important de distinguer les
critères de performance clinique servant à évaluer un test diagnostique, tels que
présentés ci-haut, de ceux analytiques.
Tableau 5. Tableau de contingence pour l’évaluation des critères cliniques d’un test
diagnostique.
Test de référence
Tests diagnostiques
Test
évalué
Total
Résultat positif
(Malade)
Résultat négatif
(Non-malade)
Résultat positif
Vrai positif (VP)
Faux positif (FP)
VP + FP
Résultat négatif
Faux négatif (FN)
Vrai négatif (VN)
FN + VN
VP + FN
FP + VN
VP + FP + FN + VN
Total
Adapté de (Beaucage et al. 2009; T. D. R. Diagnostics Evaluation Expert Panel et al. 2010).
41
1.4.2 Les critères analytiques d’un test de détection des agents biologiques.
Les critères analytiques d‘un test
diagnostique ou de détection sont
aussi connus comme étant les quatre
points
cardinaux :
la
rapidité,
la
sensibilité, la spécificité et l‘ubiquité
analytiques (Boissinot et Bergeron
2003). Pour certaines maladies et plus
particulièrement dans le contexte du
bioterrorisme, le délai d‘attente des
résultats peut avoir des répercussions
Figure 7. Les quatre points cardinaux
analytiques d’un test diagnostique.
Adaptée de (Boissinot et Bergeron 2003).
importantes. C‘est pourquoi la rapidité
d‘acquisition du résultat est un élément primordial. Toutefois, celle-ci peut être à
contre sens avec la sensibilité analytique, soit la plus petite quantité de la cible
qu‘un essai puisse détecter avec fiabilité (Saah et Hoover 1997). En effet, les tests
rapides sont souvent moins sensibles pour détecter de faibles quantités
d‘échantillons. Quoique les préparations d‘agents biologiques propagées dans
l‘environnement soient réputées pour contenir de fortes charges microbiennes,
l‘échantillon recueilli pourrait contenir de plus faibles quantités après la dispersion.
De plus, tel que montré dans le Tableau 4, certains agents biologiques ont une
dose infectieuse extrêmement faible. De ce fait, une sensibilité analytique élevée
peut donc être un avantage important afin de détecter avec fiabilité même des
traces de l‘agent causal. Quant à la spécificité analytique, elle permet de détecter
seulement la cible sans être affectée par d‘autres composantes ou microorganismes (Saah et Hoover 1997). Ce paramètre est également important
puisque la possibilité d‘obtenir un résultat faussement positif pourrait entraîner des
conséquences néfastes importantes (p. ex. coûts élevés, stress importants dans la
population). Toutefois, puisqu‘on ne peut pas tester en laboratoires toutes les
42
molécules pouvant être présentes dans l‘environnement, certains tests de
détection donnent des résultats faussement positifs difficilement prévisibles sur le
terrain (Lim et al. 2005). L‘ubiquité est un concept moins bien connu dont l‘objectif,
dans le contexte des maladies infectieuses, est de détecter toutes les souches de
la cible microbienne, considérant la variabilité phylogénétique lui étant intrinsèque
(Boissinot et Bergeron 2003). Cette rose des vents permettra de comparer de
façon objective les tests de détection des agents biologiques et de baliser leur
utilisation. Lors du développement et de l‘évaluation d‘un essai diagnostique ou de
détection, il est important de chercher un compromis entre ces quatre paramètres
répondant aux besoins.
1.4.3 Les défis particuliers au bioterrorisme
Dans le contexte du bioterrorisme, il est important de considérer d‘autres critères
se juxtaposant aux quatre points cardinaux. La méthode idéale décrite par Lim et
al. (2005) présente plusieurs de ces critères opérationnels qui indiquent davantage
le potentiel d‘utilisation réel sur le terrain ou en laboratoire. Les plateformes de
détection doivent pouvoir identifier les agents biologiques contenus dans diverses
matrices, par exemple, des poudres, des liquides, des aliments, des écouvillons
nasaux, etc. L‘analyse simultanée de nombreuses cibles est importante puisque,
tel que discuté ci-haut, de nombreux agents biologiques pourraient être utilisés.
Considérant la quantité massive d‘échantillons pouvant être analysés, la capacité
d‘en passer rapidement au crible est aussi très importante. De plus, les tests
développés pour être employés sur le terrain par les premiers répondants doivent
répondre à certains critères supplémentaires : robustesse, facilité d‘utilisation,
transportabilité et résistance aux conditions difficiles
(choc, température,
décontamination, etc.). Finalement, une portion de l‘échantillon doit idéalement
rester intacte afin de protéger la preuve et de permettre d‘autres analyses plus
sophistiquées en laboratoire (Lim et al. 2005). Mon projet de doctorat s‘insère dans
le cadre d‘une demande commune de la Défense nationale et de la GRC visant le
43
développement de nouveaux tests de détection d‘agents biologiques dans des
échantillons poudreux. Les différentes méthodes simples qui peuvent être
exécutées sur le terrain ainsi que les tests de confirmation en laboratoire plus
sophistiqués seront présentées dans un ordre sensiblement chronologique, de
l‘échantillonnage au séquençage du génome.
1.4.3.1 L’échantillonnage
La première étape pour analyser une poudre suspecte est l‘échantillonnage. Les
méthodes d‘échantillonnage comportent de nombreux défis. En effet, dans des
conditions de travail ardues, ces procédures doivent, d‘une part, permettre une
analyse scientifique rigoureuse et, d‘autre part, répondre aux normes légales,
notamment à des fins d‘enquête ou de poursuite judiciaire. L‘équipe responsable
de la collecte des échantillons est en général composée d‘au moins trois
personnes. Deux manipulateurs seront en charge de récupérer les échantillons, un
sera en contact direct avec les échantillons suspects et l‘autre procurera du
nouveau matériel propre. Le troisième membre pourra documenter la procédure en
photographiant et en prenant des notes (Emanuel et al. 2008; Interpol 2007).
La procédure d‘échantillonnage doit être réalisée de façon rigoureuse puisqu‘elle
influencera les résultats des tests. En bref, les quantités doivent être suffisantes
pour atteindre la sensibilité analytique du test choisi (Emanuel et al. 2008; Lim et
al. 2005). De plus, il est important de recueillir des échantillons contrôles dans des
zones similaires non contaminées et de valider les lots du matériel utilisé (Emanuel
et al. 2008; Interpol 2007). Nous retrouvons dans la littérature plusieurs méthodes
d‘échantillonnage qui seront choisies selon les besoins. Lorsque le matériel est
visible, par exemple une poudre suspecte, il peut être écouvillonné ou même
recueilli avec une spatule. Lorsque le matériel est invisible, par exemple sous
forme d‘aérosols, il devra être concentré afin d‘évaluer la présence d‘agents
biologiques dans l‘air (Ryan et al. 2009).
44
1.4.3.2 La préparation des analytes
Les types d‘échantillons suspects recueillis dans l‘environnement peuvent être
variés et contenir de nombreux composants chimiques interférant potentiellement
avec la détection des agents biologiques. Les autorités en sécurité publique
doivent souvent évaluer une menace biologique parce que des poudres ont été
postées ou découvertes à des endroits suspects. Ces poudres sont le plus souvent
composées de substances biologiquement inoffensives, telles que le bicarbonate
de soude ou la farine, mais psychologiquement offensives. Même si elles ne
contiennent pas d‘agent biologique, elles peuvent interférer avec les méthodes de
détection subséquentes. Il a également été rapporté que certains additifs
pourraient être incorporés aux préparations d‘agents biologiques et affecter les
tests (Alibek et Handelman 2000; Lim et al. 2005; Shoham et Jacobsen 2007). De
ce fait, des méthodes de préparation des analytes doivent être adaptées aux tests
de détection et d‘identification utilisés. Plusieurs principes méthodologiques
peuvent être employés pour réaliser la préparation des analytes (Figure 8). Sur le
terrain, lorsque la poudre ou un autre échantillon suspect est visible, des principes
de dilution sont souvent utilisés. Toutefois, si le matériel est invisible, par exemple
aérosolisé, alors la concentration par filtration, par impaction ou par culture,
facilitera la détection ultérieure. La plupart des méthodes de détection sur le terrain
nécessitent de diluer l‘échantillon afin d‘éviter de surcharger le système et ainsi
d‘obtenir des résultats faussement négatifs. D‘ailleurs, le RAZORTM (Idaho
Technology Inc., Utah, USA) utilise ce principe et stipule que certains types
d‘échantillons pourraient nuire à l‘analyse PCR et qu‘un contrôle d‘inhibition
permettant de repérer cette interférence a été intégré (Idaho Technology Inc.
2012).
Plusieurs
macromolécules des agents biologiques peuvent être analysées
(Figure 6) et différentes composantes de la matrice peuvent interférer. C‘est
pourquoi de nombreuses méthodes de séparation (Figure 8) peuvent être
45
employées en utilisant les propriétés intrinsèques de l‘analyte cible. En effet, la
taille, la masse et l‘adsorption peuvent permettre de séparer l‘analyte de la matrice
avec ou sans dissociation préalable ou ultérieure. Toutefois, ces méthodes
souvent plus sophistiquées, doivent être exécutées en laboratoire par du personnel
spécialisé.
Le
système
d‘analyse
total
en
développement
FilmArray®
Biosurveillance System (Idaho Technology Inc. 2011) se démarque par son
intégration d‘une méthode de capture d‘ADN par des billes magnétiques. Il n‘y a
toutefois pas d‘études scientifiques publiées révisées par des pairs permettant
d‘évaluer les critères de validation présentés ci-haut2. Considérant le défi de ces
méthodes de préparation des analytes, deux techniques ont été développées
durant ce projet de doctorat (Chapitres 3 et 4).
2
Recherche : FilmArray et Biosurveillance sur : http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/, consulté le 2012-0729.
46
Filtration
Tailles
Tamissage
Colonne
Time of flight
Éch. visible
Suspensiondilution
Masse /
Charge
Préparation
d'analytes
Séparation
Éch. invisible
Centrifugation
Électrophorèse
Concentration
Chimique
Absorption
(ligand)
Filtration
Impaction
Spécifique
(anticorps)
Culture
Électrostatique
Chimique
Dissociation
Enzymatique
Mécanique
Figure 8. Principes méthodologiques de la préparation des analytes.
1.4.3.3 Les méthodes utilisées sur le terrain
1.4.3.3.1 La détection de protéines
La détection de protéines combinée à la mesure du pH est une méthode facile qui
permet d‘éliminer de l‘équation certains composés inoffensifs utilisés fréquemment
tels que le bicarbonate de soude, la fécule de maïs et le plâtre (Wade et al. 2006).
Il est important de rappeler que la grande majorité des appels placés au 911
concernant une menace biologique sont des canulars (Hall 2008; Leask et al.
2003; Wills et al. 2008). Lorsque ce type de test est effectué sur un échantillon de
qualité et de quantité adéquate et donne un résultat négatif, le risque d‘une
menace réelle est faible. Le BioCheckTM (20/20 GeneSystems Inc., Rockville, MD)
47
coûtant 22,80 $ utilise ce principe. Il est simple d‘utilisation, nécessite 5 minutes et
100 µg de ricine, entre 1 × 107 et 1 × 108 CFU de B. anthracis ou Y. pestis (Poore
et al. 2009). Le manufacturier recommande d‘utiliser 100 µg ou plus d‘échantillon,
donc ce test est adapté pour les échantillons visibles et non le monitoring. Le
BioCheckTM n‘est toutefois pas spécifique pour les agents biologiques, puisque
d‘autres poudres inoffensives peuvent produire un signal positif, par exemple, la
farine ou la levure (20/20 GeneSystems 2012). C‘est pourquoi des tests ont été
développés pour détecter plus spécifiquement les agents biologiques en utilisant
des anticorps monoclonaux.
1.4.3.3.2 Les méthodes utilisant des anticorps
Les tests de grossesse sur bandelettes détectant l‘hormone β-HCG à l‘aide
d‘anticorps sont des examens diagnostiques facilement utilisables, ce qui leur a
conféré une grande popularité (Bernstein et Weinstein 2007). C‘est pourquoi
certaines compagnies ont mis sur le marché des tests de détection d‘agents
biologiques utilisant des principes similaires. Les essais BioThreat Alert®
(TetraCore, Inc., Rockville, MD) sont facilement utilisables sur le terrain puisqu‘ils
ne nécessitent que de resuspendre l‘échantillon dans un solvant aqueux (dilution
1 : 50) et de le déposer sur la carte. Le Plague Biothreat Alert® a montré une limite
de détection de 7 × 103 CFU/ml et était dans un ordre de grandeur comparable à
celles d‘autres immunoessais (103 à 105 CFU/ml) (Sapsford et al. 2008; Tomaso et
al. 2007). Toutefois, 3 des 10 souches de Y. pestis résultaient en des bandes de
faibles intensités, ce qui n‘a pas été rapporté pour les autres essais évalués. Il
serait donc intéressant d‘évaluer davantage l‘ubiquité de ce test. Le Plague
Biothreat Alert® s‘est révélé spécifique contre 10 autres espèces du genre Yersinia
parmi le panel des 45 espèces testées. Ce test peut donc être intéressant à utiliser
sur le terrain puisqu‘il permet la détection de Y. pestis en 25 minutes au coût de
20 $, même si d‘autres tests semblaient montrer des performances comparables
ou supérieures (Tomaso et al. 2007). Le RAID DXTM permet l‘analyse simultanée
48
de huit agents biologiques en quinze minutes : B. anthracis, Brucella, F. tularensis,
Y. pestis, orthopox, ricine, BoNT et entérotoxine staphylococcique (Alexeter
Technologies LLC 2012). Des études évaluées par les pairs n‘ont toutefois pas été
publiées3. De plus, quoique la rapidité et la facilité d‘utilisation de ces tests
semblent intéressantes, le Plague Biothreat Alert® a une sensibilité analytique
équivalente à environ 20 fois la LD50 estimée à 343 bactéries chez le grivet. Dans
les cas où les doses infectieuses sont inférieures à 10 3 bactéries, les systèmes de
détection basés sur les acides nucléiques seraient avantageux puisqu‘ils
présentent généralement des sensibilités analytiques supérieures à celles des
tests utilisant des anticorps (Lim et al. 2005).
1.4.3.3.3 Les méthodes détectant les acides nucléiques
La majorité des macromolécules sont exprimées de façon variable, en fonction des
conditions de culture, à l‘exception du code génétique. De plus, les banques de
données publiques de séquences nucléiques ont eu une croissance importante au
cours de la dernière décennie. Ces deux avantages majeurs ont été des
catalyseurs pour le développement de méthodes de détection génotypiques,
notamment basées sur la PCR (Irenge et Gala 2012; Lim et al. 2005; Persing
2011; Rao et al. 2010; Riehm et al. 2011; Stewart et al. 2008). Les techniques
PCR mises au point ont l‘avantage d‘être rapides et d‘avoir une haute sensibilité,
mais elles sont toutefois extrêmement sensibles aux contaminations extérieures
nécessitant une préparation d‘analytes de qualité suffisante. La PCR en temps réel
est plus rapide que la PCR conventionnelle puisque le niveau d‘amplification est
analysé pendant l‘amplification grâce aux marqueurs fluorescents utilisés, plutôt
qu‘à la fin sur gel d‘électrophorèse (Persing 2011). Parallèlement, elle permet de
déterminer les niveaux d‘interférence initiaux par une courbe d‘étalonnage et peut
cibler de quatre à six séquences d‘ADN systématiquement. Cette technologie
permet de répliquer l‘ADN à des concentrations très élevées résultant
3
Recherches : RAID DX, Tetracore et Alexeter sur http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/, consulté le
2012-07-03.
49
généralement en une excellente sensibilité analytique pouvant même aller jusqu‘à
une molécule.
Aussi,
le
design
rigoureux
d‘amorces
permet
d‘amplifier
spécifiquement et ubiquitairement une cible. Un des avantages principaux de la
PCR en temps réel, en tube fermé, par rapport à la méthode conventionnelle est
d‘éviter la contamination pré-PCR par des amplicons causant des résultats
faussement positifs. De plus, le délai d‘analyse est en général de moins d‘une
heure, un peu plus long que certains tests immunologiques présentés
préalablement, mais bien plus rapide que la culture microbienne. La compagnie
Idaho Technology Inc. s‘est démarquée en commercialisant le RAZOR™ 10
Target, un test PCR en temps réel relativement facile à exécuter sur le terrain
permettant la détection simultanée de 10 agents biologiques, i.e. B. anthracis,
Brucella spp.,
C. botulinum,
C. burnetii,
E. coli O157:H7,
F. tularensis,
R. communis, Salmonella spp., Y. pestis et le virus de la variole, en 30 minutes. Ce
système ne contient toutefois pas d‘étape de préparation d‘échantillon séparant les
analytes de la matrice environnementale. Idaho Technology Inc. a ensuite poussé
les standards de l‘industrie en développant le FilmArray® Biosurveillance, un
système intégré d‘analyse totale incluant les étapes d‘extraction et de purification
d‘ADN, d‘amplification d‘acides nucléiques totaux et de multiples PCR en temps
réel, permettant la détection de 17 pathogènes en parallèle (Idaho Technology Inc.
2011). Il n‘y a actuellement pas d‘études scientifiques publiées et révisées par des
pairs permettant de connaître les quatre points cardinaux du FilmArray®
Biosurveillance4. De nombreux autres tests PCR ont été développés pour être
exécutés en laboratoire et seront énoncés à la section 1.4.3.4.2.
1.4.3.4 Les méthodes utilisées en laboratoire
L‘éventail des analyses possibles en laboratoire est impressionnant, de
l‘identification à l‘espèce par des méthodes diversifiées jusqu‘à l‘identification du
variant par des méthodes phylogénétiques avant-gardistes. Lors d‘une menace
4
Recherche : FilmArray sur http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/ et Web of science, consulté le
2012-07-29.
50
terroriste, selon la juridiction, les premiers répondants seront dirigés sur les lieux.
Aux États-Unis, le Laboratory Response Network (LRN) chapeauté par les CDC
est en charge de diriger un réseau de plus de 150 laboratoires afin de répondre
rapidement aux attaques biologiques ou chimiques et aux crises de santé
publique. En ce qui a trait au bioterrorisme, le LRN a une structure séparée en trois
paliers : les laboratoires sentinelles, de référence et nationaux. Les laboratoires
sentinelles sont les laboratoires cliniques, soit l‘instance de première ligne recevant
des victimes et en charge de poser des diagnostics. Ils doivent transmettre les
échantillons suspects aux laboratoires de référence. Ces derniers peuvent détecter
et confirmer l‘identification des agents biologiques et ainsi enclencher des
procédures pour répondre à un acte bioterroriste. Finalement, les laboratoires
nationaux sont en mesure de réaliser de nombreux tests afin d‘identifier plus
précisément la souche en cause et de manipuler des agents biologiques
hautement infectieux (Centers for Disease Control and Prevention 2012). Au
Canada, certains laboratoires, dont le Laboratoire de santé publique du Québec à
Sainte-Anne-de-Bellevue et le Laboratoire national de microbiologie à Winnipeg
ont les installations, BSL-3 ou BSL-4, ainsi que l‘expertise nécessaires pour
recevoir des échantillons suspects à analyser. Ils pourront procéder à des tests de
détection et d‘identification des agents biologiques dans ces enceintes de
biosécurité. Une étude de performance des laboratoires sentinelles américains a
montré leurs capacités et leurs limitations. Le temps de notification de la
découverte d‘un agent biologique pour certaines évaluations est passé de plus de
10 jours (2007) à 3-4 jours (2008). Malgré cette amélioration, de 4,6 à 7,8 % des
participants ne référaient pas les échantillons de F. tularensis, B. anthracis et
Y. pestis aux paliers supérieurs du LRN (Wagar et al. 2010).
1.4.3.4.1 Les méthodes de microbiologie classique
La mise en culture des micro-organismes est importante lors d‘une attaque
bioterroriste afin de les étudier suffisamment et de constituer la preuve. On doit
51
identifier ou confirmer l‘espèce, évaluer la présence de résistance aux
antibiotiques ou de facteurs de virulence, et même identifier la provenance. Les
méthodes de microbiologie classique demeurent donc celles de référence pour la
détection et l‘identification des agents biologiques. Ces protocoles se basent sur
l‘évaluation des caractéristiques morphologiques et biochimiques et sur la culture
utilisant des milieux sélectifs et différentiels (Lim et al. 2005). Les méthodes de
microbiologie classique sont souvent assez sensibles, spécifiques et ubiquitaires.
Toutefois, ces techniques actuellement employées sont pour la plupart basées sur
les méthodes de culture ayant été développées par les professeurs Pasteur et
Koch à la fin du 19e siècle. Même si certains systèmes ont été mis au point pour
simplifier ces protocoles, comme les Galeries API, les systèmes Microscan, Vitek 2
et Phoenix (Orenga et al. 2009), les délais requis du prélèvement à l‘identification
sont souvent calculables en jours et semblent, à l‘ère de la biologie moléculaire,
trop longs (Bissonnette et Bergeron 2010; Boissinot et Bergeron 2002; Pingle et al.
2007).
De plus, lorsqu‘on se penche sur la problématique des micro-organismes
fastidieux, de la culture virale et parasitaire, on constate les limites de ces
techniques. Des agents biologiques sélectionnés pour ce projet, seules C. psittaci
et Rickettsia prowazekii sont considérés comme des bactéries intracellulaires
obligatoires complexifiant leur culture et leur identification (Beare et al. 2011). En
fait, un milieu et des conditions de culture ont récemment été optimisés par des
études de pointe en transcriptomique pour permettre la croissance axénique de
C. burnetii. Ceci facilitera la recherche sur ce pathogène, toutefois, l‘utilité pour la
détection ou le diagnostic clinique est moins probable considérant les délais de
croissance de six jours (Beare 2012).
Les bioessais utilisant des petits animaux de laboratoire sont encore les méthodes
de référence coûteuses et complexes pour la détection de certaines toxines et leur
typage, par exemple les toxines botuliniques (Persing 2011).
52
1.4.3.4.2 Les méthodes génotypiques de détection et d’identification
moléculaires des agents biologiques
Les avantages et limitations de la technologie de la PCR ont été résumées ci-haut.
De nombreux autres tests utilisant la PCR ont été développés pour la détection et
l‘identification des agents biologiques en laboratoire (Irenge et Gala 2012; Lim et
al. 2005; Persing 2011; Rao et al. 2010; Riehm et al. 2011; Stewart et al. 2008). Ils
permettent l‘identification de l‘espèce, de la sous-espèce, et même de facteurs de
virulence ou de résistances aux antibiotiques (Antonov et al. 2008; Leski et al.
2009). Cette technologie laisse encore place à amélioration quant à la capacité de
passer au crible les nombreux agents biologiques prioritaires en simultané (Lim et
al. 2005).
1.4.3.4.3 Concepts généraux des puces à ADN
Les biopuces, ou microdamiers, peuvent quant à elles permettre de poser des
centaines, voire même des milliers, de questions simultanément. Les puces à ADN
sont constituées de nombreuses sondes apposées à un support solide, par
exemple une lame de verre ou des microbilles. Ces sondes peuvent être de courts
oligonucléotides ou encore des produits d‘amplification PCR plus longs.
Dépendamment de l‘objectif, de l‘ARNm total, de l‘ADN génomique ou plasmidique
ou des amplicons PCR avec ou sans étape de transcriptase inverse peuvent être
analysés. À la suite d‘une étape de marquage avec un fluorophore, leurs
séquences particulières leur permettront d‘être hybridés au brin complémentaire,
leurs sondes de capture spécifiques fixées (Raoult et al. 2004; Tulpan 2010). La
position de ces dernières est connue, par exemple à l‘aide d‘un système cartésien
en deux dimensions sur des lames de verre ou en trois dimensions avec des
microbilles de couleurs différentes. Les puces à ADN permettent d‘analyser
plusieurs centaines, voire même plusieurs milliers de cibles simultanément grâce à
l‘hybridation des séquences d‘acides nucléiques complémentaires aux sondes de
capture. Utilisée seule, cette technologie a toutefois pour inconvénient d‘être moins
53
sensible que les méthodes PCR puisqu‘elle n‘inclut pas l‘amplification des acides
nucléiques et nécessite une étape de marquage. Combiner la technologie de
l‘amplification, du marquage par la PCR et l‘analyse sur les puces à ADN a résolu
ces problèmes (Bissonnette et Bergeron 2010; Miller et Tang 2009; Raoult et al.
2004). C‘est pourquoi les puces à ADN peuvent être utilisées pour détecter et
identifier des micro-organismes (Miller et Tang 2009; Tulpan 2010). La Figure 9
illustre cette approche et montre comment les signaux d‘hybridation sur puce à
ADN peuvent être interprétés.
Figure 9. Représentation schématique d’une puce, ou microdamier, à ADN en deux
dimensions.
Des sondes de capture sont déposées de façon cartésienne sur une surface solide, souvent une
lame de verre, pour former une matrice de points. L‘hybridation des amplicons d‘ADN marqués
avec un fluorophore aux sondes de capture à la surface nous permet d‘identifier la cible. Dans cet
exemple, en jaune, on voit la position d‘une sonde jouant le rôle de contrôle positif d‘hybridation et
de la sonde de Y. pestis produisant des signaux positifs. Ceci confirme ainsi la présence de cette
espèce dans notre échantillon analysé. On voit en vert les positions des sondes ciblant des
espèces non présentes (B. anthracis et F. tularensis) dans l‘échantillon qui sont négatives et
seulement révélées par des sondes de contrôle d‘impression dans une différente longueur d‘onde.
Différentes approches peuvent être employées lors du développement des puces à
ADN dépendamment des besoins. Premièrement, le choix du des gènes est
primordial. Les gènes souvent utilisés sont conservés dans l‘évolution, comme
l‘ARNr 16S. La Figure 10 montre les principes de design des amorces et des
sondes de capture spécifiques pour les gènes conservés. Il est donc possible
54
d‘avoir une seule réaction d‘amplification avec des amorces à large spectre pour
ensuite détecter et identifier spécifiquement la cible grâce à de multiples sondes.
Toutefois, l‘utilisation d‘autres types de gènes, parfois moins conservés, peut être
plus avantageuse, par exemple, pour la détection de résistances aux antibiotiques
ou de facteurs de virulence. Deuxièmement, des règles pour le design des sondes
de capture ont été élaborées pour répondre aux besoins des analyses. Par
exemple, les sondes courtes (~20 nucléotides) permettent un bon compromis entre
la sensibilité et la spécificité analytiques. De plus, la proportion et le
positionnement
des
guanines/cytosines
et
adénines/thymines
influencent
également ces paramètres (Lockhart et al. 1996). Le nombre de mésappariements
et leur distance peuvent également être optimisés in silico pour augmenter leur
spécificité (Hadiwikarta et al. 2012). Finalement, la position des courtes sondes de
capture sur leur amplicon cible affecte la cinétique d‘hybridation, et ce modèle
guide le design afin d‘augmenter la sensibilité analytique (Brinker et al. 2010;
Peytavi et al. 2005). Les bases de données publiques contiennent maintenant des
quantités impressionnantes de séquences de nombreux agents biologiques. Ceci
facilitera certainement le design complexe d‘essais de détection sur puce à ADN.
55
Figure 10. Design d’amorces d’amplification à large spectre et de sondes de capture
spécifiques utilisant les gènes conservés.
Les gènes conservés présentent des régions plus conservées entre des espèces
phylogénétiquement éloignées puisqu‘ils sont souvent d‘importance pour la structure ou la fonction
protéique. Les amorces à large spectre cibleront ces régions afin d‘amplifier un plus grand éventail
de micro-organismes. D‘autres régions des gènes conservés évoluent plus rapidement. Celles-ci
seront utilisées pour le design de sondes de capture spécifiques à un taxon ou à un groupe de taxa
microbiens. Certains logiciels permettent d‘identifier rapidement des régions conservées pour le
design d‘amorces (Colson et al. 2006) ou des régions divergentes pour les sondes (Martel 2011).
D‘autre part, les procédures d‘hybridation sur puces à ADN sont classiquement
longues, 14-16h (Affymetrix Inc. 2012; Walter et al. 2011). Des systèmes
microfluidiques peuvent résoudre ce problème puisqu‘ils permettent d‘accélérer la
procédure d‘hybridation. En effet, une revue de la littérature réalisée par Wang et
Li (2011) présente un panel de 16 systèmes microfluidiques d‘hybridation
d‘amplicons PCR nécessitant des temps d‘hybridation de 2 minutes à 18 h (Wang
et Li 2011). Une des plateformes microfluidique évaluée par Wang et Li (2011) a
été mise au point dans notre laboratoire (Figure 11) et permet l‘hybridation des
amplicons PCR sur des puces à ADN diagnostiques en seulement cinq minutes
(Peytavi et al. 2005).
56
Figure 11. Représentation schématique de la plateforme pour l’hybridation rapide sur puce à
ADN en microfluidique.
A) Les cellules avec chambres et microcanaux en PDMS (polydiméthylsiloxane) sont juxtaposées
sur une lame de verre ayant des sondes imprimées à la surface, formant ainsi des unités
microfluidiques. Les chambres de ces unités sont remplies d‘amplicons (2), de tampon de lavage
(3), ou de tampon de rinçage (4). Ceci permet le déversement séquentiel de ces réactifs à travers
un microcanal afin de rejoindre la chambre d‘hybridation (1). B) Représentation schématique de la
chambre d‘hybridation (1) de 8 500 par 500 µm ayant une capacité de 250 sondes de capture. C)
Jusqu‘à 6 unités microfluidiques peuvent être fixées au support rotatoire. La vitesse de rotation
accélérée de façon séquentielle permet de produire une force centripète augmentant et contrôlant
l‘ouverture des valves entre les chambres d‘amplicons, de lavage et de rinçage. Cette figure a été
adaptée avec la permission de Peytavi et al. (2005).
Outre la rapidité, les systèmes microfluidiques comportent d‘autres avantages.
Premièrement, les volumes des réactifs sont petits, diminuant ainsi les coûts
(Wang et Li 2011). La microfluidique offre également la possibilité de
conceptualiser un système fermé évitant des problèmes de contamination (p. ex.
autres micro-organismes ou amplicons). Finalement, les systèmes microfluidiques
permettent le design de systèmes d‘analyse totale automatisés. Ceux-ci pourraient
donc être portables, autant au chevet du patient que sur le terrain. Cependant,
certains défis restent de taille, particulièrement en ce qui a trait à la préparation
d‘échantillon. Cette étape cruciale est souvent négligée et la concentration de
l‘échantillon représentant un macrovolume (p. ex. 1 ml à 10 ml) à un microvolume
pour l‘analyse est complexe (Siegrist et al. 2009; 2010; 2010). C‘est pourquoi une
partie de mon projet a consisté à simplifier des procédures de préparation
d‘analytes (Chapitres 3 et 4) afin de faciliter leur automatisation future.
57
1.4.3.4.4 Concepts
généraux
phylogénétiques
du
séquençage
et
des
analyses
Le séquençage de nouvelle génération permet d‘obtenir des quantités massives
d‘information (Hu et al. 2011; Torok et Peacock 2012). Le Clinical and Laboratory
Standards Institutes (CLSI) a établi des standards pour l‘identification des microorganismes par l‘analyse de séquences (Petti et CLSI 2008). La validité des
analyses phylogénétiques subséquentes est basée sur plusieurs assomptions
(Baxevanis et Ouellette 2005). Premièrement, le choix du gène cible (ou des gènes
cibles) est important puisque sa diversité doit permettre de résoudre l‘énigme. Par
exemple, plusieurs gènes conservés peuvent être utilisés : ARNr 16S, rpoB, tuf,
gyrA, gyrB, sodA et hsp. Les séquences de l‘ARNr 16S, le gène bactérien le plus
hautement conservé, sera ainsi limité par son pouvoir discriminatoire entre deux
espèces (Petti 2007). En second lieu, la séquence de la souche à identifier doit
être de qualité, provenir du micro-organisme à l‘étude et être alignée
adéquatement avec ses homologues de base de données. D‘autre part, la base de
données doit contenir suffisamment de représentants, ou taxa, et de variabilité
pour assurer l‘identification. Par exemple, Paradis et al. (2005) montrent que les
gènes atpD, tuf et 16S ARNr permettent l‘identification de nombreuses espèces de
la famille des Enterobacteriaceae (Paradis et al. 2005). Finalement, les types
d‘analyses phylogénétiques sont nombreux et ont des avantages et des limitations
particulières. Ils doivent donc être utilisés avec parcimonie afin de répondre aux
questions posées (Baxevanis et Ouellette 2005; Felsenstein 2004; Hall 2011) et
j‘en présenterai certains dans le Chapitre 6.
58
2 Hypothèses et objectifs de recherche
2.1 Problématique de la détection des agents biologiques
Les actes bioterroristes sont difficiles à prévoir et à prévenir. De plus, les canulars
sont fréquents. La difficulté à détecter et identifier rapidement les agents
pathogènes constitue une lacune importante nuisant à la qualité de l‘intervention. Il
est donc nécessaire de développer des systèmes de détection des agents
biologiques, ce qui présente de nombreux défis, tel que discuté préalablement
(Section 1.4.3). Les types d‘échantillons devant être analysés pour détecter la
présence d‘agents biologiques sont variés (Leask et al. 2003; Wills et al. 2008).
Les matrices contenant les agents biologiques peuvent être complexes et interférer
avec les analyses moléculaires (Lim et al. 2005). De plus, la grande diversité de
pathogènes pouvant être employés lors d‘actes bioterroristes représente un défi
lors de la conceptualisation de tests moléculaires. C‘est pourquoi plusieurs des
tests développés ne permettent d‘analyser qu‘un nombre limité de pathogènes
simultanément (Hadjinicolaou et al. 2009; Lim et al. 2005; Matero et al. 2009;
Persing 2011; Tomaso et al. 2007). Toutefois, certaines organisations, dont Idaho
Technology Inc., se sont démarquées en commercialisant des essais de détection
permettant d‘analyser sur le terrain un plus grand nombre d‘agents biologiques
associés au bioterrorisme simultanément (Alexeter Technologies LLC 2012; Idaho
Technology Inc. 2011; 2012).
La mise au point de méthodes rapides de détection moléculaire des agents
biologiques devient donc un enjeu majeur de recherche. Ce projet doctoral a été
réalisé afin de développer des outils de préparation des analytes et de détection
rapide des agents biologiques dans des matrices poudreuses. Ceux-ci pourraient
permettre d‘optimiser la réponse immédiate à un acte bioterroriste et de minimiser
son impact sur la population.
60
2.2 Hypothèses de recherche
Hypothèse générale : Les avancées en génomique et en technologie d‘analyse
des acides nucléiques pourraient permettre de développer des tests de détection
des acides nucléiques plus rapides et efficaces dans le contexte du bioterrorisme.
Les
puces
à
ADN
suscitent
l‘intérêt
puisqu‘elles
permettent
l‘analyse
multiparamétrique de haute envergure (Bryant et al. 2004; Leski et al. 2010; Liu
2008; Miller et Tang 2009). Les avancées en microfluidique ont permis d‘accélérer
les procédures d‘hybridation sur puces à ADN (Wang et Li 2011). Dans notre
laboratoire, une plateforme microfluidique permet une procédure d‘hybridation sur
puces à ADN rapide (15 minutes) (Peytavi et al. 2005). De l‘échantillonnage
jusqu‘à l‘analyse de données, plusieurs étapes sont nécessaires pour réaliser les
tests de détection (Figure 12). L‘optimisation de chacune des étapes est donc
souhaitable afin de développer une plateforme de détection d‘agents biologiques
transportable et performante.
Figure 12. Procédure pour réaliser un essai de détection des agents biologiques sur puce à
ADN.
61
Hypothèse 1 : Il est possible de séparer plus rapidement et simplement les
analytes d‘une grande diversité de poudres, que ce soit des additifs potentiels
d‘aérosolisation ou encore des canulars.
Hypothèse 2 : Il est possible d‘avoir un système efficace, rapide et
décontaminable d‘extraction des acides nucléiques d‘agents biologiques, y compris
pour les formes les plus coriaces : les spores.
Hypothèse 3 : Il est possible d‘utiliser une cible génétique conservée pour
amplifier, détecter et identifier les principaux agents biologiques, soit les agents
bactériens aéroportés.
Hypothèse 4 : On peut utiliser l‘information de la cible génétique afin d‘étudier les
évènements complexes d‘évolution moléculaire du gène cible.
62
2.3 Objectifs de recherche
Objectif général : Développer une famille d‘outils rapides et efficaces pour la
préparation d‘analytes d‘échantillons suspects poudreux et pour la détection des
agents bactériens aéroportés associés au bioterrorisme.
Objectif spécifique 1 : Développer une méthode de filtration différentielle rapide
et simple de préparation d‘analytes contenus dans une variété d‘échantillons
poudreux et environnementaux pour en extraire l‘ADN bactérien présent
(Chapitre 3).
Objectif spécifique 2 : Tester un module d‘extraction et de fragmentation d‘ADN
rapide utilisant les ultrasons pouvant être transféré d‘une zone contaminée à une
enceinte de biosécurité dans une zone sécurisée (Chapitre 4).
Objectif spécifique 3 : Développer une méthode basée sur la PCR à large
spectre et la technologie des puces à ADN dans un système microfluidique
permettant la détection rapide (~1 h) des 12 agents bactériens aéroportés ciblés
(Chapitre 5).
Objectif spécifique 4 : Étudier la divergence du gène cible tuf dupliqué chez le
genre Yersinia et la phylogénie de ses taxa (Chapitre 6).
63
2.4 Aperçu des résultats et contribution scientifique
Le premier volet de mon projet de doctorat a porté sur le développement d‘une
méthode rapide (2 minutes) de séparation par filtration des spores de Bacillus
mélangées à
23 matrices
poudreuses ou
environnementales
différentes
(Chapitre 3). La méthode de préparation des analytes présentée est innovante
puisqu‘elle permet la séparation des spores contenues dans la matrice avant
l‘extraction d‘acides nucléiques. J‘ai conceptualisé et éprouvé la trousse de
traitement d‘échantillons poudreux et environnementaux avec des seringues plus
facilement manipulables et potentiellement utilisables sur le terrain (Figure 23,
Annexe 2). De plus, j‘ai élaboré de concert avec Julie-Christine Lévesque la
méthode d‘imagerie confocale permettant d‘étudier en trois dimensions la
pénétration des spores fluorescentes dans des filtres. Cette technique pourrait
avoir d‘autres utilités en recherche.
En second lieu, mon projet de doctorat a porté sur le développement d‘une
méthode rapide (45 secondes) d‘extraction et de fragmentation de l‘ADN de spores
bactériennes basée sur la sonication donnant des rendements comparables à ceux
d‘une technique commercialisée (Chapitre 4). J‘ai conceptualisé et mis à l‘épreuve
la méthode de transfert sécuritaire de l‘appareillage d‘une zone contaminée à une
zone propre. Ce type de transfert est complexe et important dans le contexte du
bioterrorisme.
Le troisième volet de mon projet de doctorat a porté sur la conceptualisation d‘un
essai moléculaire basé sur les technologies des puces à ADN et de la
microfluidique pour détecter les agents bactériens aéroportés associés au
bioterrorisme (Chapitre 5). Plusieurs tests disponibles ciblent les bactéries de la
catégorie A du CDC seulement (Irenge et Gala 2012; Skottman et al. 2007; Yang
et al. 2008). J‘ai tenu à passer au crible les espèces bactériennes répondant aux
critères de sélection dans les catégories A, B et C du CDC. Mon design complexe
64
de l‘essai moléculaire a permis l‘amplification dans un tube des agents
sélectionnés ayant une grande diversité génétique ainsi que leur identification sur
puce à ADN.
Le quatrième et dernier volet de mon projet de doctorat a porté sur une étude plus
fondamentale; l‘analyse du gène cible de l‘essai de biopuce a montré une
divergence chez le genre Yersinia. Celle-ci était inattendue puisque les gènes
dupliqués sont généralement hautement similaires (Lathe et Bork 2001). Un
nouveau type d‘analyse, les réseaux phylogénétiques, a permis d‘explorer la
divergence du gène dupliqué à l‘étude, un processus évolutif clé. Mes analyses ont
également permis de complémenter les informations phylogénétiques au sujet du
genre Yersinia dans la littérature.
65
3 Méthode de préparation d’échantillons de
poudres suspectes et autres échantillons
environnementaux basée sur la filtration
Avant propos
Rapid Filtration Separation-Based Sample Preparation Method for
Bacillus Spores in Powdery and Environmental Matrices
COURT TITRE:
Powdery and environmental sample preparation
AUTEURS
Sandra Isabel1, Maurice Boissinot1, Isabelle Charlebois1, Chantal M. Fauvel1, Lu-E Shi1,
Julie-Christine Lévesque2, Amélie T. Paquin1, Martine Bastien1, Gale Stewart1, Éric
Leblanc1, Sachiko Sato2, and Michel G. Bergeron1†
1
2
Centre de recherche en infectiologie de l‘Université Laval, Centre de recherche du
CHUQ, Québec City, Québec, Canada.
Bioimaging platform, Centre de recherche en infectiologie de l‘Université Laval, Centre
de recherche du CHUQ, Québec City, Québec, Canada.
† Corresponding author. Mailing address: Centre de recherche en infectiologie de
l‘Université Laval, Centre de recherche du CHUQ, 2705 Laurier Blvd., Québec City,
Québec, Canada G1V 4G2. Phone: (418) 654-2705. Fax: (418) 654-2715.
E-mail: [email protected].
Précisions sur le rôle exact de l’étudiante dans la préparation de l’article.
L‘étudiante a contribué à l‘élaboration du projet de recherche et du schéma
expérimental. Elle a réalisé une partie des expériences ainsi que l‘interprétation
des résultats. L‘étudiante a conceptualisé la trousse de traitement d‘échantillons
environnementaux basée sur la manipulation de seringue et potentiellement
utilisable sur le terrain. De plus, l‘étudiante a élaboré conjointement avec JulieChristine Lévesque la méthode d‘imagerie permettant d‘étudier la pénétration des
spores fluorescentes dans des filtres. L‘étudiante a écrit la première version du
67
manuscrit et a procédé aux modifications suggérées par les coauteurs et les
réviseurs.
Précisions sur le rôle des coauteurs dans la préparation de l’article.
Michel G. Bergeron, Maurice Boissinot, Éric Leblanc et Gale Stewart ont élaboré et
supervisé le projet de recherche. Maurice Boissinot a suivi les avancements de
près. Gale Stewart a, de plus, contribué aux analyses statistiques. Martine Bastien
et Éric Leblanc ont développé le concept préliminaire de préfiltration.
Isabelle Charlebois, Chantal M. Fauvel, Amélie T. Paquin et Lu-E Shi ont montré la
reproductibilité de la technique et ont réalisé une partie importante des
expériences présentées dans cet article. Julie-Christine Lévesque a réalisé les
expériences de microscopie et Sachiko Sato a contribué à l‘analyse de ces
données.
Tous les coauteurs ont révisé et commenté le manuscrit.
Précisions sur le statut de l’article.
L‘article au sujet de la préparation d‘échantillons poudreux ou environnementaux a
été accepté pour publication dans le journal Applied and Environmental
Microbiology le 12 décembre 2011.
Isabel, S., M. Boissinot, I. Charlebois, C.M. Fauvel, L.E. Shi, J.C.
Levesque, A.T. Paquin, M. Bastien, G. Stewart, E. Leblanc, S. Sato
et M.G. Bergeron. 2012. Rapid filtration separation-based sample
preparation method for Bacillus spores in powdery and environmental
matrices. Applied and Environmental Microbiology 78(5): 1505-12.
[En ligne: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/22210204]
Commentaires sur les modifications apportées à l’article inséré dans la thèse
comparativement à l’article publié originalement.
Le chapitre 3 de cette thèse inclut cet article et représente la version finale, telle
que publiée originalement en anglais dans le journal Applied and Environmental
Microbiology.
68
3.1 Résumé
Les autorités doivent analyser fréquemment des poudres suspectes et d‘autres
échantillons afin de détecter des agents biologiques et évaluer la sécurité de
l‘environnement. De nombreuses technologies de détection des acides nucléiques
ont été développées afin de détecter et d‘identifier les agents biologiques dans des
délais raisonnables. L‘extraction d‘acides nucléiques microbiens contenus dans
une grande variété de poudres et d‘échantillons environnementaux demeure un
défi technique. Nous avons développé une méthode rapide et versatile pour
séparer les bactéries de ces échantillons et ensuite en extraire leurs acides
nucléiques. Bacillus atrophaeus sous-espèce globigii a été utilisé à titre de
simulant de Bacillus anthracis. Nous avons étudié les effets sur la détection par la
PCR d‘une grande variété de poudres et d‘échantillons environnementaux et les
étapes nécessaires afin d‘éliminer leurs interférences. En utilisant une méthode
d‘extraction d‘ADN de référence commercialisée, la majorité (17/23) des
échantillons interféraient avec la lyse bactérienne ou la détection par la PCR. C‘est
pourquoi nous avons développé la dual-filter method for applied recovery of
microbial particles from environmental and powdery samples (DARE). La
procédure DARE permet la séparation bactérienne de matrices contaminantes
interférant avec la détection par la PCR. La procédure de séparation bactérienne
développée DARE requiert seulement 2 minutes, alors que la procédure
d‘extraction d‘ADN dure 7 minutes, pour un total de moins de 10 minutes. Cette
procédure de préparation d‘échantillons permet de récupérer des spores
bactériennes nettoyées et de retirer les interférences de détection d‘une grande
variété d‘échantillons. Notre technique a été facilement exécutée en laboratoire et
serait transposable pour des applications sur le terrain ainsi que pour une
automatisation.
69
3.2 Abstract
Authorities frequently need to analyze suspicious powders and other samples for
biothreat agents in order to assess environmental safety. Numerous nucleic acid
detection technologies have been developed to detect and identify biowarfare
agents in a timely fashion. The extraction of microbial nucleic acids from a wide
variety of powdery and environmental samples to obtain a quality level adequate
for these technologies still remains a technical challenge. We aimed to develop a
rapid and versatile method of separating bacteria from these samples and then
extracting their microbial DNA. Bacillus atrophaeus subsp. globigii was used as a
simulant of Bacillus anthracis. We studied the effects of a broad variety of powdery
and environmental samples on PCR detection and the steps required to alleviate
their interference. With a benchmark DNA extraction procedure, 17 of the 23
samples investigated interfered with bacterial lysis and/or PCR-based detection.
Therefore, we developed the dual-filter method for applied recovery of microbial
particles from environmental and powdery samples (DARE). The DARE procedure
allows the separation of bacteria from contaminating matrices that interfere with
PCR detection. This procedure required only 2 min, while the DNA extraction
process lasted 7 min, for a total of <10 min. This sample preparation procedure
allowed the recovery of cleaned bacterial spores and relieved detection
interference caused by a wide variety of samples. Our procedure was easily
completed in a laboratory facility and is amenable to field application and
automation.
70
3.3 Introduction
The Centers for Disease Control and Prevention has classified Bacillus anthracis,
the etiologic agent of anthrax, in category A on the list of high-priority biological
agents, which means it is one of the highest risks to national security (Rotz et al.
2002). In fall 2001, at least five envelopes containing powdery forms of highly
concentrated B. anthracis spore preparations (4.60 × 1010 and 2.10 × 1012 CFU/g)
were mailed through the U.S. Postal Service. As a consequence, close to 120,000
clinical and environmental samples were tested for B. anthracis from October
through December 2001 (U.S. Department of Justice 2010).
The discovery of suspicious powders now often results in evacuation and the
intervention of hazmat teams to collect samples for biothreat agent detection.
These powders may in fact be composed of inoffensive common household
products. Wills and colleagues analyzed a total of 161 samples for anthrax
screening and molecular identification (Wills et al. 2008). The composition of these
samples was diversified. Some were typical household products (e.g., detergent,
sugar, talcum, starch, and coffee creamer), but uncommon chemicals, such as
mercury sulfate, phenolphthalein, phosphoric acid, polyaryl sulfonate, potassium
chlorate, propylamine, and silver nitrate, were also recovered. The five most
frequent samples identified were, in decreasing order, detergents, inorganic salts,
sugars, cellulose, and plastics (Wills et al. 2008). Other common compounds, such
as dust, plaster, and soil, may be sampled in order to assess environmental safety.
It has been reported that additives such as silica and bentonite may be
incorporated into powdery bioweapons (Shoham et Jacobsen 2007). Such samples
may interfere with subsequent analyses. An important limitation in the detection
and identification of biothreat agents is proper sample isolation or purification of
target analytes, which must occur prior to analysis. These techniques are timeconsuming (taking hours or days) and usually are not convenient in the field (Lim et
al. 2005).
71
The tremendous variety of samples that need to be analyzed for biothreat detection
requires the development of versatile sample preparation techniques. Luna and
colleagues have developed a sample preparation method for the detection of
B. anthracis in environmental powders and nasal swabs. Their technique is based
on Roche's MagNaPure extraction, Millipore's Microcon centrifugal filter device
concentration, heat shock, and sonication/autoclaving. This methodology allows
the purification of B. anthracis DNA contained in powders or nasal swabs with PCR
analysis in a turnover time of <6 h and with a limit of detection of <10 spores (Luna
et al. 2003). Dauphin et al. compared the efficiencies of five different extraction
methods for the extraction and purification of B. anthracis DNA from powdery
samples. The time to process an 18-sample run and recover nucleic acids ranged
from 1 h 34 min to 4 h 38 min (Dauphin et al. 2009). Rose et al. studied eight DNA
extraction methods for the detection of biological agents in six powders and other
types of samples under biosafety level 3 (BSL-3) containment conditions. While no
method proved to be the best for all types of samples, many allowed the detection
of B. atrophaeus in the presence of powders. However, all these techniques
required incubation times of 10 to 20 min or multiple centrifugation steps (Rose et
al. 2011). The procedures for B. anthracis DNA extraction discussed above are
time-consuming
and
labor-intensive
and
require
sophisticated
laboratory
equipment.
Different approaches may be used to extract and purify bacterial DNA from diverse
types of samples. Many techniques tend to lyse the samples first and then extract
and purify nucleic acids. Another approach is to collect, concentrate, and clean the
microorganisms first and then to lyse the concentrate to extract nucleic acids. As
an example of the latter approach, Wolffs and colleagues devised a 75 min doublefiltration procedure using a >40 μm pore diameter to remove large particles and a
0.22 μm pore diameter to recover Salmonella bacteria from chicken rinse or spent
irrigation water (Wolffs et al. 2006).
72
Here we developed a filtration procedure to separate bacterial spores from diverse
powdery and environmental samples first and then to proceed to DNA extraction.
In our model, sample matrices may be soluble or insoluble in aqueous solutions,
and we used this solubility property to relieve their interference. We used Bacillus
atrophaeus subsp. globigii as a simulant of B. anthracis in order to evaluate the
effect of each specimen investigated on DNA extraction and PCR and, most
importantly, to determine how to alleviate their interference. The sizes of
B. anthracis spores (0.92 to 2.27 μm by 0.53 to 1.11 μm) are similar to those of the
mostly inoffensive bacterium B. atrophaeus subsp. globigii (1.05 to 1.63 μm by
0.58 to 0.86 μm) (Carrera et al. 2007). We optimized the procedure to make it
compatible with the sampling of suspicious powders in the field by shortening the
process time (<10 min) and facilitating handling.
73
3.4 Materials and methods
3.4.1 Samples studied.
The following 23 selected specimens were obtained from laboratory suppliers or
common stores or by sampling the environment: baking powder (Kraft Canada Inc.,
North York, Ontario, Canada), baking soda (Arm & Hammer; Church & Dwight
Canada Corp., Mississauga, Ontario, Canada), bentonite (Aldrich Chemical
Company Inc., Milwaukee, WI), chalk (white; Crayola, France), cement (Poly Super
Strength Cement Concrete Patch; Henkel Canada Corp, Mississauga, Ontario,
Canada), coffee (instant; Maxwell House Original Blend; Kraft Canada Inc.),
cornstarch (ACH Food Companies Inc., Memphis, TN), dust (swabbed in our
facility using a rayon swab [Copan, Murrieta, CA]), all-purpose flour (Métro Inc.,
Montreal, Québec, Canada), whole-wheat flour (Métro Inc.), laundry detergent
(powdered; Tide; Proctor & Gamble Inc., Toronto, Ontario, Canada), milk powder
(skim; Carnation; Smucker Foods of Canada Co., Markham, Ontario, Canada),
nondairy creamer (Nestle Canada Inc., Trenton, Ontario, Canada), plaster (DAP
Bondex plaster of Paris; DAP Canada, Scarborough, Ontario, Canada), dried
probiotics (10 billion lyophilized bacteria in 2.5 g; Lactibiane Reference; PiLeJe
Micronutrition Inc., Quebec City, Quebec, Canada), salt (sodium chloride;
Mallinckrodt Baker Inc., Phillipsburg, NJ), silica (powdery silicon dioxide; Sigma
Chemical Co., St. Louis, MO), soil (collected in a garden in Quebec City, Quebec,
Canada), granulated sugar (Lantic Inc., Montreal, Quebec, Canada), powdered
sugar (Lantic Inc.), talcum (baby powder; Zellers Inc., Brampton, Ontario, Canada),
tea (Salada orange pekoe; Unilever Canada Inc., Montreal, Quebec, Canada), and
tobacco (Export ‗A‘ [medium]; JTI-Macdonald Corp., Mississauga, Ontario,
Canada).
74
3.4.2 Spore and DNA preparations.
B. atrophaeus
subsp. globigii
strain CCRI-9827 (Collection du Centre de
Recherche en Infectiologie, Quebec City, Quebec, Canada) (http://www.wfcc.info/)
was grown on sporulation agar medium and was conserved at ambient
temperature for more than 3 weeks (Picard et al. 2009). Spore preparations were
purified on a sodium bromide gradient as previously published by Laflamme et al.
(Laflamme et al. 2004). Quality control procedures for the spores were carried out
as described by Picard et al. (2009). The purified B. atrophaeus subsp. globigii
CCRI-9827 spore preparations were stored as aliquots at −20°C, at a
concentration of 104 to 105 spores per μl in 1 X phosphate-buffered saline (PBS)
(137 mM NaCl, 6.4 mM Na2HPO4, 2.7 mM KCl, 0.88 mM KH2PO4 [pH 7.4];
Sigma-Aldrich Canada Ltd., Oakville, Ontario, Canada) with 10% glycerol, and
were diluted in PBS (pH 7.4) to the required concentrations. A rapid microbial DNA
extraction procedure was performed using a standardized glass bead-beating lysis
technique, the BD GeneOhm lysis kit (BD Diagnostics, Quebec City, Quebec,
Canada). Briefly, this required a 5-min bead-beating lysis step and a 2-min heating
step at 95°C. Purified genomic DNA was prepared as described by Picard et al., by
using mid-log-phase cells of B. atrophaeus subsp. globigii CCRI-9827 (Picard et al.
2009).
3.4.3 Real-time PCR assay.
A 212-bp fragment of the atpD gene of B. atrophaeus subsp. globigii was amplified
and detected by the primers and probe described previously (Picard et al. 2009).
The PCR mixtures contained 0.4 μM primers ABgl1158 and ABgl1345a, 0.1 μM
TaqMan
probe
ABgl-T1-B1,
200
μM
deoxyribonucleoside
triphosphates
(Amersham Biosciences, Piscataway, NJ), 10 mM Tris-HCl (pH 9.0), 50 mM KCl,
0.1% Triton X-100, 3.45 mM MgCl2, 3.3 μg/μl bovine serum albumin (Sigma-Aldrich
Canada Ltd.), and 0.025 U/μl Taq DNA polymerase (Promega, Madison, WI)
75
combined with the TaqStart antibody (Clontech Takara Bio, Mountain View, CA)
(Kellogg et al. 1994).
Prepared samples (5 μl) were added to each PCR mixture in duplicate and were
then subjected to thermal cycling with a Rotor-Gene 3000 thermocycler (Corbett
Research, Australia) as follows: 3 min at 94°C, followed by 48 cycles of 5 s at
95°C, 15 s at 60°C, and 20 s at 72°C. PCR efficiency was evaluated by comparing
the cycle threshold (CT) for tested samples to that for positive controls without
samples. JMP statistical software, version 8 (SAS Institute Inc., Cary, NC), was
used to perform 95% confidence interval (95% CI) calculations. Amplicons were
also analyzed using agarose (2%) gel electrophoresis with 0.25 μg/ml of ethidium
bromide in a Tris-borate-EDTA buffer (89 mM Tris, 89 mM boric acid, 2 mM
EDTA), and a 100-bp DNA ladder was used as a molecular weight marker (GE
Healthcare, Baie d'Urfé, Quebec, Canada).
3.4.4 Prefiltration evaluation.
Three different syringe filters for the prefiltration step were tested: a 25-mmdiameter, 5.0-μm-pore-size Millex-SV filter unit (Millipore, Billerica, MA), and two
25-mm-diameter Acrodisc syringe filters with 5-μm or 10-μm-pore-size Versapor
membranes (Pall Corporation, Port Washington, NY). To first evaluate the
percentage of spore recovery, we prepared a B. atrophaeus spore suspension at a
0.5 McFarland standard and diluted it at 10−3 in 0.85% NaCl solution. Spore
dilutions (1 ml) were filtered through each of the three syringe filters, and 100 μl of
the filtrates was diluted 1/10 in 0.85% NaCl. These dilutions (100 μl) were plated
on 5% sheep blood agar in duplicate and were incubated overnight at 35°C under
aerobic conditions for CFU counting. We also investigated whether a subsequent
elution step using 500 μl of 0.85% NaCl would increase the spore recovery rate.
Finally, we determined whether the two filters with higher percentages of spore
recovery (the 5-μm-pore size Millex-SV filter unit and the Acrodisc syringe filter with
76
the 10-μm-pore-size Versapor membrane) would efficiently retain insoluble
interfering particles. We used bentonite (20 mg) as a model powder and performed
filtration as described below, followed by PCR analyses.
3.4.5 Removal of soluble and insoluble compounds.
The interference with PCR assay performance induced by samples was
investigated by studying PCR and lysis inhibition, and the steps required to
alleviate interference were evaluated (Tableau 6 [Table 1]). All tests were
performed in duplicate. Selected specimens (20 mg each) were suspended in 1 ml
of water. Suspensions were centrifuged at 20,000 × g for 1 min. The supernatant
(900 μl) was removed with care, and the remaining 100 μl was used as a notreatment control (Tableau 6 [Table 1], No tr.). We then evaluated the relief of
interference with PCR and lysis resulting from the removal of insoluble matter. For
that purpose, the sample suspension was filtered through the 5-μm-pore-size
Millex-SV syringe filter. Then centrifugation and analyte recovery were performed
in the same way as for the no-treatment control (Tableau 6 [Table 1], PF). The
impact of the removal of soluble compounds was evaluated by washing the
pelleted samples twice with 1 ml of water, repeating centrifugation at 20,000 × g,
and removing only the supernatant. The remaining pellet was suspended in 100 μl
of water prior to real-time PCR analysis for the measurement of PCR inhibition
compared to that with the no-treatment control (Tableau 6 [Table 1], W). Some
samples contained both insoluble and soluble compounds that interfered with
subsequent analyses. We therefore evaluated the effect of a combination of both
treatments: prefiltration and washes (Tableau 6 [Table 1], PF and W). For PCR
inhibition tests, 5-μl aliquots of untreated or treated samples were added to a realtime PCR mixture containing 125 genome copies of purified genomic DNA from
B. atrophaeus CCRI-9827 (Tableau 6 [Table 1], PCR). For tests of inhibition of
lysis and PCR, 104 B. atrophaeus spores were added to 100 μl of the prepared
samples, which were then subjected to the rapid DNA extraction procedure (BD
77
GeneOhm lysis kit), and aliquots (5 μl) of the DNA extracts were added to real-time
PCR mixtures (Tableau 6 [Table 1], Lysis and PCR). Negative controls without
added DNA templates, and with or without samples, were performed. Controls
using intact purified spores were also analyzed. Positive controls with either
purified genomic DNA or lysed spores and without samples were also performed.
3.4.6 Spore capture and recovery step.
We evaluated the recovery of B. atrophaeus subsp. globigii using 103 spores
suspended in a 5-ml solution of 0.6 × PBS. This suspension was aspirated in the
syringe through a 13-mm-diameter, 0.45-μm-pore-size Millex-HV filter (Millipore,
Billerica, MA). Then 300, 500, or 1,000 μl of water or 1 × PBS was flushed through
the filter in the opposite direction to release the spores. Three replicates were
executed for each buffer and elution volume evaluated. Eluates (aliquots of 100 μl)
containing spores were plated in duplicate onto brain heart infusion (BHI) agar and
were incubated overnight at 37°C under aerobic conditions for CFU counting. JMP
statistical software, version 8, was used to perform analysis of variance (ANOVA)
calculations.
3.4.7 DARE procedure.
The dual-filter method for applied recovery of microbial particles from
environmental and powdery samples (DARE) developed in this study can be
executed in 2 min (Figure 13 [Figure 1], steps 1 to 8). Selected specimens (20 mg
each) were suspended in 1 ml of 1 × PBS containing spores in a 15-ml tube (T1;
76 by 20 mm; Sarstedt AG & Co., Nümbrecht, Germany) (Figure 13 [Figure 1],
steps 1 and 2). This suspension was filtered through a 5-μm-pore-size Millex-SV
syringe filter (Figure 13 [Figure 1], steps 3 and 4), followed by the filtration of 2 ml
of 1 × PBS and 2 ml of water (Figure 13 [Figure 1], steps 5 and 6). The 5 ml filtrate
was collected in a 15-ml tube (T2; 76 by 20 mm). The filtrate was mixed briefly and
78
was aspirated through a 0.45-μm-pore-size Millex-HV filter (F2) fixed by a Luer
Lock fitting on a 10-ml syringe (step 7). The 10-ml syringe was discarded and was
replaced by a 1-ml syringe containing 300 μl of water and 700 μl of air. The
contents of this syringe were flushed through the 0.45-μm-pore-size Millex-HV
filter, and the concentrated and cleaned spore suspension was recovered in a
1.5 ml-microtube (Figure 13 [Figure 1], step 8). A 100-μl sample was used to
rapidly extract microbial DNA (BD GeneOhm lysis kit) (Figure 13 [Figure 1], steps 9
and 10).
3.4.8 Spore recovery.
Spores were recovered after the prefiltration step and at the end of the DARE
procedure by using a 1-ml PBS spore suspension (approximately 103 spores/ml)
mixed with 20 mg of the specimen. Monitoring was conducted by CFU counting of
100 μl of the eluates plated onto BHI agar and incubated overnight at 37°C under
aerobic conditions. Three replicates were performed for each specimen and were
plated in duplicate. The percentage of recovery was calculated using the average
CFU counts for each specimen compared to those for the initial spore suspension.
The percentage of spore recovery for the capture filtration step was calculated as
100% minus the difference measured between the recovery rate after prefiltration
and the recovery rate at the end of the DARE procedure. The effect of each
sample tested on spore viability and growth was also evaluated by CFU counts.
The presence of contaminating bacteria in the samples studied was evaluated.
Negative controls without added spores were included in order to determine
whether specimens would produce unrelated colonies.
3.4.9 PCR detection efficiency.
First, we needed to evaluate the effects of the 23 selected specimens (20 mg) on
PCR detection of bacterial spores. A threshold for the complete detection
79
procedure was established at 5 × 103 spores, considering the high spore load in
B. anthracis preparations and the 50% lethal dose (LD50) of B. anthracis, estimated
at 5.5 × 104 CFU in rhesus macaque (LeClaire 2004). We tested the detection of a
high load (5 × 106) and a low load (5 × 103) of B. atrophaeus spores without the
DARE procedure. The selected specimens (20 mg each) were added to 1 ml of a
spore suspension in 1 X PBS. For all samples studied, negative controls without
spores or without the DNA template were performed. Controls without specimens
were performed each time samples were processed. We also proceeded in parallel
to the DARE procedure (Figure 13 [Figure 1]) using 5 × 106 and 5 × 103 spores (in
exceptional cases, we had to increase the number of spores to 10 4, 2.5 × 104, and
3 × 104 in order to allow bacterial detection (Tableau 8 [Table 3]), resulting in a
300 μl volume of cleaned bacterial suspension. Three separate DARE procedures
were performed for each specimen and concentration. An aliquot (100 μl) was
subjected to rapid DNA extraction as described above, and then 5 μl was added in
each PCR.
3.4.10 Imaging of spores and filters.
B. atrophaeus subsp. globigii CCRI-9827 spores (at a 0.5 McFarland standard)
were labeled with 0.02% fluorescein isothiocyanate (FITC) as described previously
(Geissler et al. 2011). The penetration and release of fluorescent B. atrophaeus
spores in 5 μm and 0.45-μm-pore-size filters were evaluated by using an Olympus
FV300 confocal laser scanning microscope (Olympus Canada, Markham, Ontario,
Canada) with an argon-ion laser for excitation at 488 nm. We executed the DARE
procedure four times, twice excluding the bacterial recovery step and twice
including it (Figure 13 [Figure 1], step 8). The filters were then removed from
plastic housings and were observed from the side facing the syringe (female Luer
Lock) or the tube (male taper end). Three and five fields of view (FOVs) (each
176.77 by 176.77 μm) per filter were randomly selected for 5-μm- and 0.45-μmpore-size-filters, respectively. Fluorescence images were acquired through a Plan
80
Apochromat 60× (numerical aperture, 1.4) objective at serial optical sections (258
sections at 0.35 μm intervals) by the FluoView FV300 confocal microscope.
Fluorescence originating from spores was detected based on the intensity and the
size (excluding less than 0.75 μm3) of the emission signals, using Volocity
software, version 4.2 (Quorum Technologies, Guelph, Ontario, Canada) (Figure 14
[Figure 2]). JMP statistical software, version 8, was used to perform frequency
estimates from the distribution of the data for the depth of penetration of bacteria in
the filter.
81
3.5 Results
3.5.1 Selection of samples for study.
In this study, we selected 23 specimens with different colors and textures; white
powders were most frequently represented. Bentonite and silica powders were
selected because they have been reported previously to be potential additives that
may be incorporated into powdery bioweapons (Shoham et Jacobsen 2007).
Baking soda, baking powder, cornstarch, flour (all-purpose and whole wheat),
laundry detergent, milk powder, nondairy creamer, powdered sugar, salt,
granulated sugar, and talcum were chosen because they represent common
powdery household products. Cement, chalk, dust, and plaster may be collected in
a building during assessment of environmental safety. A lyophilized preparation of
probiotics was also tested in order to study the effect of a massive quantity of
background bacteria in samples on recovery and detection. The probiotic brand
used
contained
four
bacterial
species
(Bifidobacterium
longum
LA-101,
Lactobacillus acidophilus LA-102, Lactococcus lactis LA-103, and Streptococcus
thermophilus LA-104), for a total of 80 million lyophilized bacteria in 20 mg. Coffee,
soil, tea, and tobacco were also selected in order to evaluate the efficiency of our
technique for samples with different characteristics (color and texture).
3.5.2 Selection of a filter for removal of insoluble particles.
In our model, specimens were composed of insoluble and soluble molecules that
may interfere with subsequent nucleic acid analyses. First, we decided to perform
a prefiltration step in order to remove most of the insoluble particles and recover
bacterial spores in filtrates. Therefore, we selected filters with pore diameters of 5
and 10 μm, which allow average-size bacteria to pass and retain most of the
insoluble particles. First, we evaluated the percentages of spore recovery by CFU
counting of the B. atrophaeus spore suspension (1 ml) after prefiltration on three
82
different filters: the 5-μm-pore-size Millex-SV filter (spore recovery, 78%), the 5μm-pore-size Versapor filter (58%), and the 10-μm-pore-size Versapor filter (81%).
Then we evaluated the need for a subsequent elution step (0.5 ml) that could
increase the percentages of bacterial recovery with these three filters. This elution
step increased spore recovery for the 5-μm-pore-size Millex-SV (87%) and 10-μmpore-size Versapor (95%) filters but did not for the 5-μm-pore-size Versapor filter
(56%). The 5-μm-pore-size Millex and 10-μm-pore-size Versapor filters allowed
higher spore recovery and therefore needed to be tested for their efficiencies at
removing insoluble particles. Bentonite was used as a model, because it has been
reported as a potential additive to powdery bioweapons and is composed of small
insoluble particles that could interfere with PCR detection (Shoham et Jacobsen
2007). The 5-μm-pore-size Millex filter relieved PCR inhibition from bentonite
samples, while the 10-μm-pore-size Versapor filter did not. The combination of
consecutive 10-μm-pore-size Versapor and 5-μm-pore-size Millex filtrations did not
significantly increase the relief of inhibition from bentonite contamination over that
obtained with the 5-μm-pore-size Millex filter alone. We therefore selected the 5μm-pore-size Millex filter to pursue our experiments, considering its high levels of
spore recovery and relief of PCR inhibition induced by bentonite.
3.5.3 Removal of soluble and insoluble compounds.
To investigate the interference of the 23 samples studied with PCR and with spore
lysis, we separated the results (Tableau 6 [Table 1]). The no-treatment control (No
tr.) results present the interference of samples with PCR alone or with both lysis
and PCR, allowing us to understand which step is disrupted. We performed
numerous negative and positive controls to validate our results. Negative controls
without added DNA templates, and with and without the samples studied, all
showed negative PCR results. These controls showed that neither the reagents nor
the samples studied contained nucleic acids that would produce false-positive
results. When purified spores that were not lysed were used as another control, no
83
positive PCR results were obtained. This indicated that the purified spore
preparations did not contain detectable external DNA. Moreover, positive controls
with either purified genomic DNA or lysed spores and without the study samples all
showed positive PCR results. These results were used as reference positive
controls for study of the interference of selected specimens with bacterial
detection. We compared PCR interference by the 23 selected specimens with and
without the prefiltration procedure. With no treatment, 9 samples did not interfere
with PCR, while 14 samples interfered with PCR, under the conditions tested
(Tableau 6 [Table 1], PCR, No tr.). Selected samples were submitted to a syringe
prefiltration system: the 5-μm-pore-size Millex-SV filter. Insoluble powders
suspended in PBS produced turbid solutions (heterogeneous solutions), while after
the prefiltration step, the solutions became translucent (homogeneous solutions).
The prefiltration step relieved PCR inhibition for six samples: bentonite, flour
(whole wheat), probiotics, silica, tea, and tobacco (Tableau 6 [Table 1], PCR, PF).
We also evaluated the effects of the 23 selected specimens on rapid extraction of
DNA from B. atrophaeus subsp. globigii spores (Tableau 6 [Table 1], Lysis and
PCR). Four samples that did not prevent PCR detection interfered with beadbeating spore lysis: cornstarch, probiotics, soil, and talcum (Tableau 6 [Table 1],
Lysis and PCR, No tr.). However, the prefiltration step removed the lysis
interference produced by all four of these samples (Tableau 6 [Table 1], Lysis and
PCR, PF). These results showed that most insoluble particles were retained in the
prefiltration step and that thus, prefiltration helped alleviate the interference of nine
samples with detection. To evaluate the need for the removal of soluble
compounds, we performed two consecutive washes and centrifugations (Tableau 6
[Table 1], W). Compared to the no-treatment control, this washing procedure
removed PCR inhibition by eight specimens: baking powder, baking soda, coffee,
flour (all purpose), plaster, salt, silica, and tobacco (Tableau 6 [Table 1], PCR, W).
Interestingly, PCR inhibition from silica powder or tobacco was relieved by either
prefiltration or washes (Tableau 6 [Table 1] PCR, PF, or PCR, W). Only two
84
specimens—cement and laundry detergent—required both prefiltration and
washing treatments to remove PCR inhibition (Tableau 6 [Table 1], PCR, PF and
W). However, three more specimens required both treatments for the removal of
interference with PCR and lysis: all-purpose and whole-wheat flours and plaster
(Tableau 6 [Table 1], Lysis and PCR, PF and W). Baking powder was the only
specimen that still interfered with lysis and/or PCR following prefiltration and
washes.
3.5.4 Evaluation of the spore capture and recovery step.
The experimental methodology composed of two steps (filtration first, followed by
washing using centrifugation) was shown to be efficient at the removal of
compounds that interfere with PCR. This procedure, however, involves excessive
handling, requires dexterity and the use of complex instruments, such as a
micropipette and a centrifuge, and is time-consuming (approximately 1 h 30 min for
18 samples). The prefiltration with a syringe filter was attractive because it did not
require complex instrumentation and was simple and fast. We therefore decided to
add a second filtration step with a syringe in order to capture bacteria while
washing soluble compounds away in the filtrate. Captured bacteria can be
recovered afterwards by simply inverting the flow using a clean solution. We
selected a filter with a pore diameter of 0.45 μm, small enough to capture an
average-size bacterium. Then we studied the conditions (volume and buffer) for the
optimization of spore recovery. The prefiltered sample (103 spores in 5 ml) was
aspirated through the 0.45-μm-pore-size capture filter into a syringe, and clean
water or PBS was flushed with a new syringe in order to recover bacterial spores.
All volumes and buffers in the recovery step allowed a spore recovery level of
approximately 60%, with no statistically significant difference (by ANOVA). We
selected the smallest volume tested (300 μl) in order to recover approximately
60 % of the spores and concentrate them in clean water, which is compatible with
PCR and other detection technologies.
85
3.5.5 Evaluation of spore recovery
We evaluated spore recovery after each filtration step by CFU counting (Tableau 7
[Table 2]). Samples without added B. atrophaeus were plated for the evaluation of
initial background microbial loads and colony morphology. Probiotics, soil, and
tobacco produced numerous and diverse contaminating colonies under the culture
conditions used, but the morphology of B. atrophaeus CCRI-9827 was distinctive
enough to allow this bacterium to be counted specifically. B. atrophaeus colonies
on BHI under the specified conditions were approximately 2 mm in diameter,
circular, umbonate, dry, and light pinkish yellow. We tested the viability and the
growth of spores in contact with the 23 samples studied. Salt is the only specimen
that affected the bacterial count, although only minimally (data not shown). After
prefiltration of 20 mg of specimens, the average percentage of spore recovery was
84 % ± 16 %. Positive controls with no sample showed a high recovery rate of
97 %.
The efficiency of spore recovery after the DARE procedure was also evaluated
(Tableau 7 [Table 2]). The average spore recovery rate for the whole procedure for
all samples tested was determined to be 51 % ± 17 %. The spore recovery rate
with no sample (positive control) was determined to be 56 % ± 8 % on average.
The spore recovery rate for the capture filter only was calculated on the basis of
the spore loss between prefiltration and the end of the DARE procedure. The
average recovery rate for the capture filtration step for all samples was 68 %
(range, 40 % to 94 %). Nondairy creamer particles, in contrast to all other samples,
partially clogged the capture filter. The total recuperation volume could not be
recovered, resulting in the lowest spore recovery after capture filtration (40 %).
3.5.6 Efficiency of spore DNA detection after the DARE procedure
The procedure developed was optimized to facilitate handling, enhance spore
recovery, and shorten the duration of the process (Figure 13 [Figure 1]). The
86
filtration procedure allowed us to separate bacteria from sample matrices and
required <2 min per sample to execute. The cell lysis and heating steps added
7 min, for a total of <10 min to prepare nucleic acid extracts appropriate for a realtime PCR assay.
For all samples studied, except the coffee sample, negative controls without spores
or without a DNA template showed negative PCR signals. The direct use of
unprocessed samples interfered with the detection of 5 × 103 spores for 15 of the
23 samples, while 9 samples did not allow the detection of 5 × 106 spores by PCR
(Tableau 8 [Table 3]). Silica, soil, and talcum completely inhibited some PCR
replicates when 5 × 103 spores were used; however, a higher number of spores
(5 × 106) produced positive reactions for all replicates. Bentonite and flours
completely prevented PCR detection when 5 × 103 spores were used, but a higher
quantity of spores (5 × 106) resulted in positive PCR signals, although with CTs that
were statistically delayed relative to those for positive controls with no sample
(95 % CI). Without treatment, the coffee sample emitted fluorescence overlapping
with the fluorophore of the probe in real-time PCR, but no amplification product
was observed using agarose gel analysis. The DARE procedure developed here
allowed us to reach the detection threshold established at 5 × 103 B. atrophaeus
spores for the majority (20/23) of the samples investigated. Cement, chalk, and
plaster increased the detection threshold to 10 4, 2.5 × 104, and 3 × 104 spores,
respectively.
3.5.7 Spore penetration in filters
The penetration of FITC-labeled spores through 5-μm-pore-size Millex filters was
studied. When approximately 5 × 106 fluorescent spores were filtered through the
5-μm pores, only a few spores (0 to 2 spores per FOV) were detected in the filter
(data not shown). In agreement with the results of bacterial culture, this result
confirms that the majority of the spores passed through 5-μm-pore-size filters. To
87
verify the penetration and removal of spores in the 0.45-μm-pore-size filters
(approximately 100 μm thick), approximately 5 × 106 fluorescent spores were used.
Confocal images were captured from both sides of the filters (facing the syringe
and facing the tube) after steps 7 and 8 (Figure 13 [Figure 1]). When the filters
obtained after step 7 were analyzed, the majority of bacterial spores were detected
at the 0 to 16 μm depth of the side facing the tube, where spores entered filters
(Figure 14a [Figure 2a]). Very few, if any, spores were detected on the side facing
the syringe (data not shown). Together, these data showed the shallow penetration
of the B. atrophaeus spores in 0.45 μm pore size filters. Furthermore, only a small
proportion of bacterial spores was detected on the side of the filter facing the tube
when the bacterial recovery step was executed (Figure 13 [Figure 1], step 8),
indicating that the majority of the spores were expulsed by this step (Figure 14b
[Figure 2b]). Comparison of Figure 14a [Figure 2a] and Figure 14b [Figure 2b]
revealed that 16 % of the captured bacteria remained after the bacterial recovery
step. This suggests that 84 % of the spores could be recovered. CFU counts
revealed similar percentages of bacterial recovery for the filtration step, ranging
from 40 to 94 % (Tableau 7 [Table 2]).
88
3.6 Discussion
The variety of sample types that may be harvested for the detection of biological
agents is tremendous. Several of these matrices can hamper detection processes.
Without an efficient sample preparation technique, even common powdery
household products that may be used in hoaxes could interfere with positive
controls included in biothreat agent detection assays and could thus invalidate
results. We need to increase knowledge of the effects of powdery and
environmental samples on detection techniques. Of the 23 sample types
investigated here, only 6 specimens did not initially interfere with bacterial
detection by PCR under all conditions tested: chalk, dust, milk powder, nondairy
creamer, granulated sugar, and powdered sugar. We showed that most (17/23) of
the specimens interfered with bacterial detection to various degrees, depending on
the bacterial load and the specific experimental conditions. Specimen matrices
may interfere at different steps of the complete detection procedure: filtration, lysis,
PCR, and detection. Tableau 6 [Table 1] shows interference with PCR and lysis.
Tableau 7 [Table 2] shows that some specimens modified the rate of spore
recovery during filtration. Tableau 8 [Table 3] shows a realistic scenario where
specimens directly lysed may yield false-negative results, while specimens
processed with the DARE procedure allow bacterial detection. The comparative
analysis of results in Tables 1 to 3 for each specimen allows understanding of the
steps with which they interfered and how to alleviate these interferences. One
limitation of our study is that we tested only a single source for each of the 23
specimens studied. However, the variety of sample types selected in this study
provided useful information for molecular analyses of microorganisms contained in
various specimens. Our results supported the need for the development of a
simple and versatile sample preparation technique.
We answered this need by using the solubility and insolubility properties of sample
matrices and bacteria in aqueous solutions. The selection of the pore diameter of
89
the prefilter, 5 μm, was extremely important. For the prediction of filtration
efficiency, the size of the microorganism is a determining characteristic. Kowalski
and Bahnfleth summarized the relative sizes of airborne pathogens and showed
that their diameters range from 0.2 to 1.3 μm (Kowalski et Bahnfleth 1998). The
prefiltration step (pore diameter, 5 μm) is efficient at letting through spores of the
simulant B. atrophaeus, whose size is comparable to that of B. anthracis (Carrera
et al. 2007). Most importantly, particles in the 1 to 5 μm diameter range tend to
behave like gases and penetrate the pulmonary tree deeply (Lim et al. 2005).
Therefore, these microbial particles are the most dangerous and need to be
detected efficiently.
We optimized a second filtration step with a syringe for the purpose of capturing
B. atrophaeus spores and recovering them in clean water by inverting the flow
within seconds. Confocal microscopy analyses showed the shallow penetration of
the 0.45-μm-pore-size filter by bacterial spores. This may explain why bacteria may
be recovered efficiently simply by inverting the flow. Bacterial recovery
percentages with all samples tested were 84 % ± 16 % on average after
prefiltration (5-μm-pore-size filter) and 51 % ± 17 % after the DARE procedure.
Some powders, such as bentonite, nondairy creamer, and plaster, decreased the
final spore recovery rate to 16, 22, and 21 %, respectively. The spore recovery
rates after prefiltration for bentonite and plaster were noticeably lower. This may be
explained by the possibility that insoluble particles partially clogged the prefilter.
Nondairy creamer partially clogged the capture filter, which may explain why this
sample had the lowest spore recovery rate. We used spores of the simulant
B. atrophaeus subsp. globigii, which is comparable in size and shape to
B. anthracis, although the surface properties of these two organisms may differ.
Recovery of B. anthracis spores using the DARE procedure developed in this study
requires further investigation. In order to assess environmental safety, the
presence of other biothreat agents, such as Brucella spp. (0.5 to 0.7 by 1.5 μm),
Francisella tularensis (0.2 by 0.7 μm), and Yersinia pestis (0.5 by 1 μm), as well as
90
viruses (Gilchrist et American Society for Microbiology. 2000), may need to be
evaluated. The widths of these agents are equivalent to or smaller than that of
B. atrophaeus spores, and they should be efficiently recovered after prefiltration
(pore diameter, 5 μm). However, the capture filtration step may require more
adjustments, including the use of a pore diameter smaller than the 0.45 μm
selected here, such as 0.2 μm, for bacterial capture and recovery.
The detection threshold was set at 5 × 103 spores and represents 1/10 of the LD50
of aerosolized B. anthracis in rhesus macaques (5.5 × 104 CFU), as well as
1.1 × 10−4 and 2.4 × 10−6 mg of the bacterial preparations used during the 2001
anthrax letter attacks (LeClaire 2004; U.S. Department of Justice 2010). Without
the DARE procedure, of the 23 specimens investigated, only 8 did not interfere
with the detection of 5 × 103 spores of B. atrophaeus, while 14 did not interfere with
detection when 5 × 106 spores were used. The DARE procedure allowed the
detection of 5 × 103 spores of B. atrophaeus when they were mixed with 20
specimen types. Cement, chalk, and plaster were exceptions that required higher
numbers of spores for detection (104, 2.5 × 104, and 3 × 104 spores, respectively),
but these numbers were still under the LD50 of B. anthracis in rhesus macaques
(LeClaire 2004). Notably, the DARE procedure proved advantageous for cement
and plaster, since without treatment, these materials prevented the detection of
both 5 × 103 and 5 × 106 B. atrophaeus spores. In contrast to all other results, the
DARE procedure decreased the detection efficiency to 2.5 × 104 spores when they
were mixed with chalk, while 5 × 103 spores were detected without the DARE
procedure.
Lim and colleagues described the characteristics of an ideal method for separating,
concentrating, and purifying a target biothreat agent (Lim et al. 2005). The method
developed in our study meets many of their requirements. The DARE procedure
was developed to facilitate handling and purification steps for samples that may
contain biothreat agents. Our choice of a filtration system with syringes made the
91
steps easy to execute. Intervention time is also a crucial parameter in bioterrorism
response. The DARE procedure required only 2 min to process one sample,
followed by a rapid cell lysis procedure of 7 min. Our technique is considerably
faster, and has been optimized to handle smaller volumes, than the 75 min method
developed by Wolffs and colleagues (Wolffs et al. 2006). Since high-throughput
analyses may be required, the time necessary for one user to process 18 samples
can be calculated at 43 min; this compares favorably with the processing times of
five other techniques evaluated by Dauphin et al., which ranged from 1 h 34 min to
4 h 38 min (Dauphin et al. 2009). Moreover, cell viability is maintained before cell
lysis, and an aliquot could be cultured for further analyses, conservation of the
strains involved, and forensic purposes. Since bacteria are recovered in clean
water, they could also be subjected to various molecular assays based on, for
example, antibodies, proteins, or nucleic acids. The quantities of powders
processed by Rose et al. and Luna et al. were only a 1 μl loopful and 2.5 to 5 mg,
respectively, amounts significantly lower than the 20 mg of specimen processed
here (Luna et al. 2003; Rose et al. 2011). We showed that our procedure is
efficient at separating spores from a relatively large amount of sample and a wide
variety of powdery and environmental samples. This technique should be further
tested using other bacterial species and other types of samples. The DARE
procedure and DNA extraction require only 10 components, 10 steps, and 10 min.
The simplicity of the method developed here shows promise for the preparation of
powdery and environmental samples and the performance of molecular detection
in the field. Its automation and integration into a total-analysis system could further
facilitate handling and high-throughput analysis in the field.
92
3.7 Acknowledgments
This research project was funded by Canada's Chemical, Biological, Radiological,
and Nuclear Research and Technology Initiative under the Portable Biological
Agent Detection System program (06-0187TD). J.-C.L. was supported by the
Infrastructure Operating Fund of the Canadian Foundation for Innovation. S.I. and
A.T.P. received scholarships from the Fonds de la Recherche en Santé du Québec
(Montréal, Canada) and the Canadian Institutes of Health Research (Ottawa,
Canada), respectively.
We are grateful to Ève Bérubé, Luc Bissonnette, Karel Boissinot, Paul Boissinot,
Sébastion Chapdelaine, France Couture, Matthias Geissler, Jean-François Gravel,
Marie-Claude Hélie, Keith Logan, Valérie Milot, Maude Royer, and Manon
Tétreault for technical support and useful discussions.
93
3.8 References
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94
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detection of salmonellae in biological samples without enrichment, using two-step filtration
and real-time PCR. Applied and environmental microbiology 72(6): 3896-3900.
95
3.9 Tables
Tableau 6 [Table 1]. Interference of powdery and environmental samples, without treatment
or after treatment, with PCR and lysis.
Sample
Efficiencya of:
PCR
No tr. PF
Control (no sample) +
+
Baking powder
−
−
Baking soda
−
−
Bentonite
−
+
Cement
−
−
Chalk
+
NT
Coffee
−
−
Cornstarch
+
NT
Dust
+
NT
Flour All purpose
−
−**
Whole wheat −
+
Laundry detergent
−
−
Milk powder (skim)
+
NT
Nondairy creamer
+
NT
Plaster
−
−
Probiotics
+*
+
Salt (NaCl)
−
−
Silica
−**
+
Soil
+
NT
Sugar Granulated
+
NT
Powdered
+
NT
Talcum
+
NT
Tea
−
+
Tobacco
−
+
a
96
W
+
+
+
−
−
NT
+
NT
NT
+
−
−
NT
NT
+
+
+
+
NT
NT
NT
NT
−
+
Lysis and PCR
PF and W No tr. PF W
+
+
+
+
NT
−
NT −
NT
−
NT +
NT
−
+
NT
+
−
NT NT
NT
+
NT NT
NT
−
NT +
NT
−
+
−
NT
+
NT NT
NT
−
NT −
NT
−
+*
NT
+
−
NT NT
NT
+
NT NT
NT
+
NT NT
NT
−
NT −
NT
−
+
+
NT
−
NT +
NT
+
+
+
NT
−
+
−
NT
+
NT NT
NT
+
NT NT
NT
−**
+
NT
NT
−
+
NT
NT
−
+
NT
+, all replicates showed positive PCR signals (<4 CT over the positive control);
−, all replicates showed negative PCR signals;
+*, weak positive PCR signal (≥4 CT over the positive control);
−**, one or more PCR replicates were negative;
NT, not tested;
No tr., no-treatment control (interference by untreated samples);
PF, prefiltration (study of the removal of insoluble compounds);
W, washes (study of the removal of soluble compounds).
PF and W
+
−
NT
NT
+
NT
NT
NT
NT
+
+
+
NT
NT
+
NT
NT
NT
NT
NT
NT
NT
NT
NT
Tableau 7 [Table 2]. Percentages of bacterial spore recovery after filtration steps.
Sample
Control (no sample)
Baking powder
Baking soda
Bentonite
Cement
Chalk
Coffee
Cornstarch
Dust
Flour All purpose
Whole wheat
Laundry detergent
Milk powder (skim)
Nondairy creamer
Plaster
Probiotics
Salt (NaCl)
Silica
Soil
Sugar Granulated
Powdered
Talcum
Tea
Tobacco
Avg ± SD
a
b
c
% spore recovery after:
Prefiltrationa
Capture filtration onlyb
97
59
78
76
93
56
46
70
76
65
70
63
55
94
89
75
78
74
89
74
73
73
87
64
102
50
82
40
66
55
93
77
87
63
91
57
103
49
100
76
105
76
62
75
97
83
89
86
84 ± 16
68 ± 13
DARE procedurec
56
54
49
16
41
33
49
64
52
63
46
51
52
22
21
60
50
48
52
76
81
37
80
75
51 ± 17
With a 5-μm-pore-size Millex-SV filter.
With a 0.45-μm-pore-size Millex-HV filter; calculated as 100% − (% recovery after prefiltration −
% recovery after the DARE procedure).
With 5 μm- and 0.45 μm-pore-size Millex filters.
97
Tableau 8 [Table 3]. PCR efficiency without treatment and with the DARE procedure and
detection thresholds.
Sample
PCR efficiencya with:
No treatment
6
DTb (no. of spores)
DARE
3
5 × 10 spores
Control (no sample) +
Baking powder
−
Baking soda
−
Bentonite
+
5 × 10 spores
+
−
−
−
+
+
+
+
Cement
Chalk
Coffee
Cornstarch
Dust
Flour All purpose
Whole wheat
Laundry detergent
Milk powder (skim)
Nondairy creamer
−
+
−**
+
+
+
+
−
+
+
−*
+
−**
+
+
−
−
−
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
Plaster
Probiotics
Salt
Silica
Soil
Sugar Granulated
Powdered
Talcum
Tea
Tobacco
−
+
−
+
+
+
+
+
−
−
−
+
−
−*
−*
+
+
−*
−
−
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
5 × 103
5 × 103
5 × 103
3
5 × 10
4
1 × 10
4
2.5 × 10
5 × 103
5 × 103
5 × 103
5 × 103
5 × 103
5 × 103
5 × 103
3
5 × 10
4
3 × 10
3
5 × 10
3
5 × 10
5 × 103
5 × 103
5 × 103
5 × 103
5 × 103
5 × 103
5 × 10
3
a
+, all replicates showed positive PCR signals statistically comparable to those for positive
controls;
−, all replicates showed negative PCR signals;
−*, one PCR replicate or more showed a negative PCR signal;
−**, some replicates showed discrepant results (positive real-time PCR signals and negative
results based on agarose gel analysis).
b
DT, detection threshold of B. atrophaeus spores producing positive results with the DARE
procedure.
98
3.10 Figures
Figure 13 [Figure 1]. DARE procedure and DNA extraction.
The complete procedure required 10 steps, 10 tools, and 10 min. Materials are identified as follows: A, swab; F, filter; S, syringe; T, tube. The
DARE procedure is executed in the first eight steps. Steps 9 and 10 represent the standardized technique with the BD GeneOhm lysis kit, which
includes glass bead-beating lysis and a heating step. Red indicates that tubes or syringes contain bacteria.
99
Figure 14 [Figure 2]. Penetration and expulsion of bacterial spores in the 0.45-µm-pore-size
filters.
We studied the penetration and expulsion of FITC-labeled B. atrophaeus spores within the 0.45-μmpore-size Millex-HV filters by using confocal microscopy. The DARE procedure excluding (A) or
including (B) the bacterial recovery step (Figure 13 [Figure 1], step 8) was executed. The filters
were observed from the side facing the tube, and the positions of spores were measured from the
surfaces of the filters. The numbers of spores in five FOVs for each 4 μm-deep stratum were
calculated and are shown per surface unit. Asterisks indicate a <5 % probability of finding a
bacterium at a particular depth interval.
100
4 Système modulaire de lyse ultrasonique pour
l’extraction rapide d’acides nucléiques de
spores de Bacillus et le transfert d’échantillons
Avant propos
Modular Ultrasonic Lysis System for Rapid Nucleic Acid
Extraction and Sample Transfer of Bacillus Spores
AUTEURS
Matthias Geissler,‡a* Sandra Isabel,‡b Benoît Voisin,a Chantal Fauvel,b Maurice
Boissinot,b Michel G. Bergeron,b* and Teodor Veresa, c
a
National Research Council of Canada, 75, boulevard de Mortagne, Boucherville, QC,
J4B 6Y4, Canada. Phone: +1 450 641-5388; Fax: +1 450 641-5105;
E-mail: [email protected]
b
Centre de recherche en infectiologie de l‘Université Laval, Centre de recherche du
CHUQ, 2705, boulevard Laurier, Québec, QC, G1V 4G2, Canada. Phone: +1 418 6542705; Fax: +1 418 654-2715;
E-mail: [email protected]
c
INRS-EMT, Varennes, Qc, J3X 1S2, Canada
‡ These authors contributed equally to this work.
Précisions sur le rôle exact de l’étudiante dans la préparation de l’article.
L‘étudiante a contribué à l‘élaboration du projet de recherche et du schéma
expérimental et a réalisé une partie des expériences. Elle a conceptualisé et mis à
l‘épreuve la méthode de transfert sécuritaire de l‘appareillage de la zone
contaminée à la zone propre. L‘étudiante a étudié de concert avec Chantal Fauvel
la fragmentation de l‘ADN par la sonication. Elle a de plus conçu les expériences
de fragmentation des spores étudiées en microscopie confocale. L‘étudiante a écrit
la première version du manuscrit et a procédé aux modifications suggérées par les
coauteurs en collaboration avec Matthias Geissler.
102
Précisions sur le rôle des coauteurs dans la préparation de l’article.
Matthias Geissler a élaboré et supervisé le projet de recherche. Il a également
participé aux expérimentations et à la rédaction de la première version du
manuscrit, particulièrement la section au sujet du design du système de lyse.
Chantal Fauvel a réalisé une partie considérable des expériences présentées dans
cet article et a prouvé l‘efficacité de l‘interface en acier inoxydable.
Benoît Voisin a réalisé le design du module fluidique de lyse et de la plateforme de
sonication.
Maurice Boissinot, Michel G. Bergeron et Teodor Veres ont élaboré et supervisé le
projet de recherche.
Précisions sur le statut de l’article.
L‘article au sujet de la lyse bactérienne rapide par sonication a été accepté pour
publication dans le Journal of Bioterrorism and Biodefense le 10 novembre 2012.
Geissler, M.†, S. Isabel†, B. Voisin, C. Fauvel, M. Boissinot, M. G.
Bergeron, and T. Veres. 2012. Modular Ultrasonic Lysis System for
Rapid Nucleic Acid Extraction and Sample Transfer of Bacillus Spores.
Journal of Bioterrorism and Biodefense 3:119.
[En ligne: http://www.omicsonline.org/modular-ultrasonic-lysis-systemfor-rapid-nucleic-acid-extraction-and-sample-transfer-of-bacillus-spores2157-2526.1000119.pdf]
†
: Ces auteurs ont contribué également au travail.
Commentaires sur les modifications apportées à l’article inséré dans la thèse
comparativement à l’article publié originalement.
Le chapitre 4 de cette thèse inclut cet article et représente la version finale, telle
que publiée originalement en anglais dans le Journal of Bioterrorism and
Biodefense.
103
4.1 Résumé
Cet article décrit le design, le fonctionnement et l‘utilisation d‘un système modulaire
pour l‘extraction rapide d‘ADN de micro-organismes suite à l‘échantillonnage sur le
terrain. L‘évaluation des extraits d‘ADN par la PCR a révélé que ce système peut
briser les spores bactériennes de Bacillus atrophaeus, un simulant de Bacillus
anthracis, en moins d‘une minute, procurant des rendements d‘ADN comparables
à une méthode commercialisée performante d‘extraction d‘acides nucléiques. La
simulation du transfert d‘une zone contaminée à une zone sécurisée a montré que
l‘échantillon demeurait confiné à l‘intérieur du module alors que la surface
extérieure peut être décontaminée par immersion dans une solution désinfectante.
104
4.2 Abstract
This paper describes the design, functioning and use of an ultrasonic modular
system intended for rapid extraction and fragmentation of DNA from microbial
organisms following sample collection in the field. PCR assessment of the DNA
extracts revealed that the system can disrupt Bacillus atrophaeus spores, a
simulant for Bacillus anthracis, in less than 1 min, providing a DNA yield equivalent
to that of a commercial nucleic acid extraction method. Simulation of the transfer
from a contaminated to a secure area confirmed that the sample remained
confined within the module while the exterior surface can be decontaminated
through immersion in a disinfectant solution.
Keywords
Bacillus spores; Sonication; Spore lysis; PCR; Sample transfer
Abbreviations
DARE: Dual-filter method for applied recovery of microbial particles from
environmental and powdery samples
FITC: Fluorescein isothiocyanate
FULM: Fluidic ultrasonic lysis module
105
4.3 Introduction
Bacillus anthracis is the causative agent of anthrax disease and was classified by
the Centers for Disease Control and Prevention in the category A of high-priority
biological agents (Rotz et al. 2002). B. anthracis forms dormant endospore
structures (spores) to survive in harsh environments over long periods of time. It
has been estimated that the release of 100 kg of aerosolized anthrax spores over a
metropolitan area could cause between 130,000 and 3 million deaths in favorable
environmental conditions (Inglesby et al. 1999). Hence the rapid detection of B.
anthracis spores is crucial to public health or life stock management at a
contaminated site.
Prior to the detection of biothreat agents, a number of steps involving sample
collection, disinfection and transportation as well as concentration and purification
of targeted analyte are typically required (Emanuel et al. 2008; Lim et al. 2005).
These steps can complicate the detection process and render on-site testing
cumbersome. Also, sensitive lysis and detection equiments are often incompatible
with decontamination procedures that follow deployment in the field. For these
reasons, first responders inspecting a potentially contaminated area are commonly
performing risk assessment rather than in-depth analysis, and samples collected at
the scene are preferably transferred to a secured environment equipped with
biological safety cabinets for analysis and follow-up investigation (Emanuel et al.
2008; Wade et al. 2006). The work presented in this paper is responding to this
task: we devised a fluidic ultrasonic lysis module (FULM) for collecting samples in
the field and bringing them to a designated laboratory facility for further processing
with a decontamination step in-between.
Sonication has found increasing attention in the development of portable, point-ofcare instrumentation since it promotes the extraction of nucleic acids from bacterial
spores or other microbial forms in a timely and technologically convenient fashion
106
(Belgrader et al. 1999; Belgrader et al. 2000; Chandler et al. 2001; Marentis et al.
2005; Taylor et al. 2001; Warner et al. 2009). This technology exploits ultrasound
waves (with frequencies typically ranging from ~20 kHz to the MHz regime)
dissipating within a liquid medium. The exerted stress can disrupt cell envelopes,
giving way for intracellular content to be released in the surrounding (mostly
aqueous) buffer solution. Lysis performed in a closed and miniaturized system
typically requires coupling of ultrasound waves into a liquid reservoir via a flexible
interface. Such systems commonly employ polymer materials as the interface in
conjunction with microparticles (e.g., glass beads) in the liquid phase to assist the
lysis process (Belgrader et al. 1999; Belgrader et al. 2000; Taylor et al. 2001;
Warner et al. 2009). However, microbeads render the design of microfluidic
systems more complex. A bench-top sonication instrument that circumvents the
need of micobeads has been devised by Chandler et al. (2001) and Warner et al.
(2009). In their set-up, acoustic energy is transmitted from a piezoelectric
transducer to a water reservoir in which a tubular flow-through system is
embedded that contains the sample. Marentis et al. (2005) have developed a
fluidic device entailing a microfabricated piezoelectric sonicator. The authors have
demonstrated that spores of Bacillus subtilis can be lysed efficiently using
ultrasound without the need of microbeads, though the miniaturized format mainly
suits microvolume analysis. In practice, suspicious powders harvested at a
potentially contaminated site are often suspended in larger volumes, as presented
for eight different DNA extraction methods that have been tested in this context
(e.g., 350 μL–2 mL) (Rose et al. 2011). Herein, we describe an ultrasonic modular
system using a stainless steel interface intended for rapid (<1 min) and efficient
extraction and fragmentation of DNA from a 230 μL suspension of Bacillus spores
to perform PCR analysis. We used spores of Bacillus atrophaeus subsp. globigii
which is mostly inoffensive, yet produces spores similar to those of B. anthracis
(Carrera et al. 2007), making it a suitable candidate for research and development
of detection technologies.
107
4.4 Materials and methods
4.4.1 Equipment design and function
The set-up comprises two principal components –; the FULM and a sonication
platform – whose design and arrangement are depicted in Figure 15. The FULM
constitutes a block (measuring 80 mm in length, 38 mm in height, and 51 as well
as 59 mm in width at the top and bottom, respectively) that was custom-fabricated
from
transparent
polymer
resin
(SLA
11122)
using
high-precision
3D
stereolithography (Axis Prototypes, Saint-Léonard, QC). Internal supply channels
(ranging from 0.5 to 1.0 mm in diameter) connect the lysis chamber with
macroscopic access points located at the periphery of the FULM. Sample inlet and
pressure port are equipped with a check valve connector (Qosina, Edgewood, NY)
for receiving a luer lock tip syringe. The vent and sample outlet both entail luer lock
connectors adapted for mounting a filter unit. We used a 17-mm-diameter, 0.2-μmpore-size PTFE filter unit (Qosina) and a 13-mm-diameter, 0.22-μm-pore-size
Millex-GV filter unit (Millipore, Billerica, MA) for vent and sample outlet,
respectively. The exit of the filter unit was enclosed by a cap to seal the interior of
the FULM. The FULM contains a circular lysis chamber which is enclosed by an
interface punched out of 0.001˝ stainless steel shim stock (corresponding to 25.4
μm in thickness, Daemar Canada, Dorval, QC). The interface is held in place by an
O-ring and a designated locking device fastened to the FULM using four screws.
The locking device provides a vertical through-hole (15 mm in diameter) so that the
interface can be accessed from below by a sonicator probe.
The sonication platform entails a commercial ultrasound generator (Sonics &
Materials, Newtown, CT) and a titanium alloy probe (13 mm in diameter, Sonics &
Materials) fixed inside a free-standing socket. The interior of the socket, customfabricated from aluminum parts, is surrounded with a vibration dampening material
(foam) to reduce noise during sonication. The tip of the sonicator probe extends
108
vertically from the docking station located at the top of the socket destined to
accommodate the FULM. Two flexible clamps (SLA 11122) are placed on opposite
sides of the docking station to interlock with the FULM upon its placement,
preserving contact between the sonicator probe and the stainless steel interface for
the duration of the lysis process. An external power supply (Vibra-Cell ultrasonic
processor, Sonics & Materials) was used as a control unit to regulate the
sonication process.
4.4.2 Preparation of spores
Spores of B. atrophaeus subsp. globigii strain CCRI-9827 (Collection du Centre de
recherche en infectiologie, Québec, QC http://www.wfcc.info) were prepared
according to published procedures (Picard et al. 2009) and diluted in 1X
phosphate-buffered saline (PBS, 137 mM NaCl, 6.4 mM Na2HPO4, 2.7 mM KCl,
0.88 mM KH2PO4, pH=7.4, Sigma-Aldrich Canada, Oakville, ON). Fluorescence
labelling was performed by incubating spores with fluorescein isothiocyanate
(FITC) as described previously (Geissler et al. 2011).
4.4.3 DNA extraction
For DNA extraction, 230 μL of suspension of B. atrophaeus CCRI-9827 (3.0×105
spores mL-1 in PBS) were injected into the FULM using a 1-mL syringe. Lysis
experiments were performed at a frequency of 20 kHz and 30 μm amplitude using
variable exposure times to optimize the yield of extracted nucleic acids (Figure 16).
The BD GeneOhmTM Lysis Kit (BD Diagnostics, Quebec, QC) was used according
to the recommendations provided by the supplier, serving as a DNA extraction
reference method for each series of experiments. Specifically, 100 μL of the diluted
spore suspension were transferred into a designated lysis tube followed by
agitation on a Vortex-Genie 2 (Scientific Industries, Bohemia, NY) at the maximum
adjustable speed for a period of 5 min. For comparison and conservation purposes,
109
all DNA extracts were heated immediately at 95°C for 2 min as recommended by
the supplier of the BD GeneOhmTM Lysis Kit
(BD Diagnostics 2009). Highly
purified genomic DNA serving as a PCR reference sample was prepared from midlog-phase cells of B. atrophaeus strain CCRI-9827 and B. subtilis ATCC 15841
(American Type Culture Collection, Manassas, VA) using MagneSil KF isolation kit
(Promega, Madison, WI) on a KingFisher ML instrument (Thermo Fisher Scientific,
Waltham, MA).
4.4.4 Analysis of DNA extracts
Real-time PCR assays to amplify a 212-bp fragment of the atpD gene of B.
atrophaeus were performed using primers (ABgl158 and ABgl345a) along with a
TaqMan probe (ABgl-T1-B1) as disclosed in previous work (Picard et al. 2009).
PCR reactions were performed with 25-μL mixtures each of which contained 5 μL
of the lysate using conditions (Isabel et al. 2012) and a standard curve of purified
DNA (Geissler et al. 2011) that are described elsewhere. Negative controls
containing no DNA template were included in each series of PCR analysis. For all
purified spore preparations that were used, non-lysed spores were tested as
control samples. ANOVA statistical analysis of PCR data was performed using
JMP statistical software from SAS (Cary, NC).
4.4.5 DNA fragmentation
To study the degree of DNA fragmentation, 230 μL of a solution containing 15 ng
μL-1 purified genomic DNA of B. subtilis ATCC 15841 was sonicated using the
FULM for the duration that provided the highest DNA yield (i.e., 2×15 s). Analyte
solutions (20 μL) were subjected to gel electrophoresis using 0.8% agarose with
0.25 μg mL-1 of ethidium bromide in Tris-borate-EDTA buffer (89 mM Tris, 89 mM
boric acid, 2 mM EDTA). A 1X DNA mass ladder and a 1-kb DNA ladder
110
(Invitrogen, Carlsbad, CA) were used for quantification and estimation of DNA
fragment lengths, respectively.
4.4.6 Fluorescence imaging
Fluorescence imaging was done using an Olympus FV300 confocal laser scanning
microscope (Olympus Canada, Markham, ON) equipped with an argon-ion laser for
excitation at 488 nm. Suspensions of treated (sonication using the FULM for
2×15 s) and untreated spores were diluted 1:1 (v/v) with a warm solution of 1%
agarose (VWR International, West Chester, PA) in 1X PBS and sandwiched
between a glass microscope slide and a cover slip prior to inspection (Geissler et
al. 2011).
4.4.7 Decontamination of the FULM
Following sample injection, the FULM was closed and immersed in a 0.5% solution
of sodium hypochlorite for variable periods of time (i.e., twice for 5, 15 and 60 min)
to evaluate any possible effect on PCR detection. Upon removal from the bath, the
FULM was rinsed twice with sterile water and dried using cotton gauze before
proceeding with the lysis and PCR experiments as described above. In addition,
230 μL of a more concentrated suspension of B. atrophaeus (0.5 McFarland,
~1×107 spores mL-1) were injected in the FULM using a 1-mL syringe. Once
closed, the module was immersed in 0.5% sodium hypochlorite solution for 5 min
with gentle agitation, followed by rinsing with sterile water and drying with sterile
cotton gauze. To evaluate the presence of viable spores on the exterior of the
FULM, we swabbed five selected sites of the FULM - stainless steel interface,
sample inlet, sample outlet, pressure port, and vent - before and after the
decontamination process, as well as after subsequent sonication. The collected
samples were immediately inoculated on brain heart infusion agar and incubated
111
overnight at 37°C under aerobic conditions to monitor the number of colonyforming units (CFU).
4.4.8 Simulated detection of Bacillus spores in suspect powders
In the simulated contaminated area, 20 mg of bentonite (Aldrich Chemical
Company, Inc., Milwaukee, WI) were suspended in 1 mL PBS containing 3.0×10 5
spores mL-1. Recovery of clean bacterial spores from these powdery samples
(DARE procedure) was performed twice as described previously (Isabel et al.
2012). The FULM was decontaminated in 0.5% sodium hypochlorite solution for 5
min and then transferred to a simulated secure area where lysis (using the FULM
and BD GeneOhmTM Lysis Kit) and PCR experiments were performed as
described above.
112
4.5 Results
4.5.1 FULM operation and volume handling
The handy size of the FULM is intended to facilitate transport and manipulation by
first responders wearing bulky rubber gloves as part of their protective gear. The
assembled module shown in Figure 15b requires only few manual steps including
injection of a bacterial spore sample, sonication, and recovery of the lysate. The
sample (230 μL) is inserted to completely fill the lysis chamber with a 1-mL syringe
at the injection port with the vent in the open position, as illustrated in Figure 15c.
During this step, the pressure port and the outlet are closed. The opposite
arrangement of incoming and outgoing supply channels facilitates displacement of
air and promotes uniform filling of the lysis chamber. The shallow reservoir (1.5
mm in depth over 14 mm in diameter) thereby helps distribute the sample evenly in
the acoustic field (without the need for microbeads). Recovery of the sample is
performed by aspirating the lysate through the 0.22-μm-pore-size Millex-GV filter
unit at the sample outlet using a 1-mL syringe while injection port and vent both
remain closed. The recovery process can be assisted by pushing air into the
system using a syringe at the pressure port. Volumes of recovered lysates were
typically 175–185 μL without filtration and 90–125 μL with filtration. Hence, the
dead volumes were estimated to be 55–45 μL in the FULM and 50–95 μL in the
Millex-GV filter.
4.5.2 DNA extraction and fragmentation
We studied the effect of sonication time on the yield of amplifiable DNA (Figure 16)
compared to a high-yield-providing, benchmark DNA extraction process (BD
GeneOhmTM Lysis Kit). Negative controls without added DNA template as well as
non-lysed spores, used as another control, did not produce positive PCR signals.
Continuous sonication ranging from 20 s to 2 min (i.e., 1×20 to 1×120 s) resulted in
113
moderate amounts of DNA, yielding 71.4 ± 13.9% at best when the sample was
treated for 40 s consecutively. Interestingly, the DNA yield increased to 93.7 ±
20.0% when the sample was sonicated twice for 20 s with a 20-s interruption in
between (i.e., 2×20 s). Two intermittent sonication steps of 15 s each with 15 s
interruption time (i.e., 2×15 s) turned out to be the most productive condition,
providing a relative DNA yield of 103.1 ± 16.5%, on average, which is comparable
to that of the BD GeneOhmTM Lysis Kit. Statistical analysis of PCR average cycle
thresholds (Ct) revealed no significant difference between results for DNA extracts
obtained from sonication for 2×15 s (Ct=30.37 ± 1.09) and BD GeneOhmTM Lysis
Kit (Ct=30.52 ± 1.24). Since ultrasounds are known to fragment DNA, longer lysis
durations may lead to higher fragmentation of genomic material (Larguinho et al.
2010) which, in turn, may contribute to the overall decrease in the concentration of
nucleic acids detected by PCR. Independent tests performed with purified nucleic
acids revealed that 95% of the DNA strands were fragmented during sonication for
2×15 s using the FULM. The size range of the DNA fragments was estimated
between 400 and 5,000 bp.
4.5.3 Imaging of disrupted spores
We performed confocal microscopy to visualize FITC-labeled spores in 3D and
monitor possible changes in cell morphology as a result of the lysis process. Prior
to sonication, non-lysed spores are elliptical in shape, measuring 1.2–1.8 μm in
length and 0.9–1.0 μm in width as described previously (Geissler et al. 2011). In
comparison, 21 fluorescent objects observed after sonication for 2×15 s were
classified as such: 3 (14%) half spores, 4 (19%) spores broken in halves, 6 (29%)
small spore fragments and 8 (38%) spores with intact shape. A section entailing an
example of each specimen within relatively close proximity is shown in Figure 17.
114
4.5.4 Decontamination of the FULM
We tested decontamination of the FULM to simulate the transfer from a
contaminated site to a secure area equipped with a biological safety cabinet
containing the sonication platform and other detection equipment. We relied on
immersion in a solution of sodium hypochlorite, which is known to be efficient
against bacterial spores and hence is used for on-site decontamination (Emanuel
et al. 2008). Six immersion tests were performed to evaluate whether or not the
interior of the FULM could be effectively protected from the disinfectant. The
presence of sodium hypochlorite in the lysate, even at relatively low concentration,
following penetration into the FULM is expected to interfere with subsequent DNA
amplification and detection. Statistical analysis of PCR Ct revealed no significant
difference between DNA extracts at each immersion time (Ct 5 min=30.45 ± 0.26,
Ct 15 min=30.56 ± 0.23, Ct 60 min=30.36 ± 0.23), indicating that the interior of the
FULM remained effectively sealed.
We further evaluated the efficiency of the decontamination procedure by testing
viability of bacterial spores recovered from the surface of the FULM. Prior to
immersion of the FULM in the hypochlorite bath, we recovered a significant amount
of viable spores at the sample inlet (i.e., up to a maximum of ~300, and ~200 CFU
on average). In contrast, the quantity of viable spores was negligible after
decontamination had been completed: we found 1 CFU (max. 3 CFU) at the
sample inlet as a statistical average deriving from four independent tests. After
sonication for 2×15 s, an average of 0.5 CFU (max. 1 CFU) was recovered at the
sample inlet, while no CFU was recovered from all other sites that had been
swabbed. Agitation of the FULM during immersion seemed necessary to remove
air bubbles being trapped in small-scale cavities (e.g., at the locking device or
between connected units) which otherwise would prevent access of the disinfectant
to these restrained sections of the module.
115
Dauphin and Bowen (Dauphin et Bowen 2009) have used filtration to remove
viable spores of B. anthracis from lysates and preserve DNA extracts. We
validated this possibility by collecting five different lysates from the FULM through
Millex-GV filter units (0.22 μm pore size). Filtration indeed removed all viable
spores from lysates as confirmed by microbial culture assays. Statistical analysis of
PCR Ct performed with five replicates further revealed no significant difference
between results for filtered (Ct=31.72 ± 0.31) and non-filtered (Ct=31.73 ± 0.44)
lysates, suggesting no (or minimal) loss of DNA during filtration.
4.5.5 Simulated detection of Bacillus spores in suspect powders
We simulated a complete on-site Bacillus detection procedure using 3×105 B.
atrophaeus spores and ~20 mg of bentonite. This powder has been reported as a
potential additive in powdery bioweapons (Shoham et Jacobsen 2007) while
interfering with PCR detection of nucleic acids in lysates without sample
preparation (Isabel et al. 2012). We previously developed a protocol termed dualfilter method for applied recovery of microbial particles from environmental and
powdery samples (DARE) (Isabel et al. 2012). This sample preparation method
allowed for rapid separation of bacteria from 23 different matrices using syringes
and filter units. Using this method, bentonite resulted in the lowest spore recovery
(i.e., 16%), hence we used it as a paradigm for detection simulation. Harvesting
using swab and processing of the powder sample (<2 min) was performed twice
using the DARE procedure. The cleaned spores deriving from this process were
immediately injected into the FULM for spore lysis and DNA extraction (2×15 s).
PCR analysis of the lysates clearly confirmed the presence of DNA from B.
atrophaeus (data not shown), emphasizing the ability to recover cleaned microbial
nucleic acids within 3 min.
116
4.6 Discussion
4.6.1 Performance of FULM for spore lysis and DNA extraction
Our ultrasonic lysis system provided DNA yield extracted from B. atrophaeus
comparable to that of the BD GeneOhmTM Lysis Kit within a lysis time of 45 s (i.e.,
2×15 s of sonication with 15-s interruption) (Figure 16). The BD GeneOhmTM
Lysis Kit served as a benchmark process since it effectively promotes lysis (with
98.8% yield or more) of several microbial species, including B. anthracis and B.
subtilis spores as determined by PCR amplification of genomic DNA in lysates
(Ménard et Picard 2003; Picard et al. 2009). Moreover, this kit has been shown to
provide the highest yield of DNA from Mycobacterium tuberculosis with respect to
five other relatively fast nucleic acid extraction methods (Aldous et al. 2005). Our
ultrasonic system produced DNA extracts with concentrations comparable to those
obtained with a validated commercial DNA extraction method in one fifth of the
time. In addition, the yield is higher than that of a previous bead-based mechanical
lysis performed on a chip under optimized conditions (Geissler et al. 2011).
Furthermore, structural damage to sonicated spores (Figure 17) contrasts with our
previous study that showed only subtle spore modifications after bead-based
mechanical lysis using the same microscopic methodology (Geissler et al. 2011).
These findings also support the capacity of the system to efficiently disrupt
bacterial spores, making it possible to rapidly extract genomic DNA with high yield.
4.6.2 Effect of the stainless steel interface
We equipped the module presented herein with a thin, metallic interface as
opposed to preceding sonication systems which primarily employed flexible,
polymer-based membranes. Stainless steel provided a plausible choice for a
number of reasons. Unlike carbon steel or brass which were both tested in the
course of this study (data not shown), stainless steel does not corrode when
117
coming in contact with aqueous buffer solutions prior to or during sonication.
Chemical stability is important as metal ions or particles contaminating the lysate
could interfere with PCR amplification and detection of extracted nucleic acids
(Alaeddini 2012; Primorac 2004). In addition, stainless steel can effectively
promote propagation and transfer of acoustic energy. The energy flux E can
generally be described as E=4π2f2ZA2T where f is the frequency, Z is the acoustic
impedance, A is the amplitude of vibration, and T is the transmission coefficient of
the interface. Due to its high acoustic impedance (e.g., Z=45.7×106 kg s-1 m-2 as
a standard value) stainless steel can outperform a soft polymer compound such as
polypropylene (e.g., Z=2.4×106 kg s-1 m-2) despite the fact that T is comparatively
small for a stainless steel/water interface as a result of their impedance mismatch.
Stainless steel further is preferable when considering the cost of other highimpedance materials such tungsten, iridium or gold. The lysis experiments
performed in the course of this work suggest that a thickness of 0.001˝ (25.4 μm)
constitutes one (though not the only) possible compromise in the trade-off between
flexibility and robustness. When thin enough, the stainless steel interface can
adapt to the shape of the sonicator probe which is important for effective transfer of
the acoustic energy. On the other hand, an increased ability to conform renders the
interface fragile which can constrain reliable and safe operation. For example, a
stainless steel interface with a reduced thickness of 0.0005˝ (12.7 μm) seems
impractical for it ruptures more easily, especially when performing lysis
experiments in a sequential fashion. An increased thickness of 0.003˝ (76.2 μm),
on the other hand, provides excellent stability during sonication, yet its higher
rigidity hampers smooth adaptation of the interface to the sonicator probe. In our
preliminary experiments, we evaluated a number of polymer-based interfaces and
obtained decent DNA yields (data not shown). However, the yield improved
noticeably when we exchanged the polymer by a stainless steel interface.
Preceding work suggests the use of a polymer interface may need to be
accompanied by the presence of microbeads in the suspension to enhance lysis of
118
Bacillus spores and increase DNA yields (Belgrader et al. 1999; Belgrader et al.
2000; Taylor et al. 2001; Warner et al. 2009). We believe that the absence of
beads is generally preferable for it helps maintain simplicity in the layout and
assembly of microfluidic units.
4.6.3 DNA fragmentation
A certain level of DNA fragmentation can be useful for downstream molecular
detection (Larguinho et al. 2010). Using control experiments with purified nucleic
acids, we estimated that 95% of DNA was fragmented during sonication. The size
range of the DNA fragments was approximatly between 400 and 5,000 bp and
compares well to those achieved by Warner et al. (Warner et al. 2009) (i.e., 100–
600 bp) for subsequent PCR amplification and detection. By contrast, Warner et al.
(Warner et al. 2009) evaluated DNA yields using a relativly short PCR amplicon
(e.g., 66 bp). Short DNA fragments can limit the possibility to detect longer PCR
amplicons. For example, reports on the PCR detection of B. anthracis rely on
amplicon sizes between 91 and 596 bp (Ellerbrok et al. 2002; Kim et al. 2005; Ryu
et al. 2003; Yang et al. 2012). We evaluated the yield of our DNA extracts with a
212-bp PCR amplicon, hence the DNA size range obtained by sonication using the
FULM provides a relatively high flexibility for subsequent PCR assay selection.
4.6.4 Simulation of field testing
A number of requirements need to be taken into account when designing and
evaluating an instrument for the detection of biothreat agents in the field. As
emphasized by Lim et al. (2005), an ideal detection platform should be able to
detect biothreat agents from different environmental matrices (e.g., powder, liquid,
or food) while providing portability, user-friendliness and resistance to unfavorable
conditions in the field (e.g., shock, temperature, and decontamination, among
others) (Lim et al. 2005). We simulated the detection of B. atrophaeus spores from
119
suspect powder under the constraints of a laboratory setting devided into a
contaminated site and a secure area. The primary objectives were to evaluate the
performance of our procedure when using powdery samples and identify any
possible safety issues. Our findings suggest that the module can indeed be used to
transfer a pathogenic sample for further processing in a biological safety cabinet
respecting recommended packing and transportation protocols for hazardous
materials, such as a triple-layer system (Emanuel et al. 2008). Nevertheless, the
instrumental setting may need further improvement to facilitate handling. For
example, it should be desirable to streamline the exterior design of the FULM and
reduce the number of sites where air bubbles can be trapped to facilitate its
decontamination. Modification of the docking mechanism is likely to improve
robustness of the system and prevent interface fracture. Likewise, automation of
sample injection, adjustment of the sonication probe to the interface and recovery
of the lysate would shorten process times, and increase user-friendliness and
safety. Finally, miniaturization of the sonication platform would facilitate its
integration into a portable total-analysis system.
We further used the prototype instrument in complementation to a recently
developed protocol for fast (<2 min) separation of bacterial spores from suspicious
powder samples using two filtration steps (DARE) (Isabel et al. 2012). Combined,
these methodologies allowed for detecting B. atrophaeus processed with 20 mg of
bentonite as a potential aerosolizing additive (Shoham et Jacobsen 2007). This
important aspect had not been covered previously for the development of a
sonication platform to detect B. anthacis spores (Belgrader et al. 1999; Belgrader
et al. 2000; Marentis et al. 2005; Taylor et al. 2001; Warner et al. 2009). Our
analyte preparation from suspect powders (DARE and FULM) could potentially
facilitate on-site detection of B. anthracis and other pathogenic species. While a
combination of the two methods is in itself an appealing possibility, integration in a
single biothreat detection device would reveal their full potential to facilitate sample
preparation in a field setting.
120
4.7 Conclusions
Time, efficiency and safety are crucial parameters while testing for infectious
agents, especially in the event of a bioterrorist attack. The concept presented in
this work is responding to this challenge. First, an ultrasonic lysis modular system
allows for rapid (<1 min) extraction of nucleic acids from bacterial spores, while
providing yields that are equivalent to those obtained using a commercial DNA
extraction method over a 5-min period. This performance is remarkable and
qualifies the tool as one of the fastest and most efficient spore lysis systems
currently available. The implementation of a stainless steel interface was a key
factor in this context, marking a distinction in design with respect to other
sonication systems that typically rely on a polymer membrane as the interface.
Second, the need for safe portability was equally included in the design of the tool
described herein. The interior of the module can be sealed, thus preventing aerosol
production and propagation, while the exterior surface can be decontaminated
without inducing any adverse effect on the tightness of the FULM and the integrity
of the collected sample inside. The FULM, less expensive and more resistant,
could be used in the field and be decontaminated, while the sonication platform,
containing more expensive and sensitive electromechanical parts, could stay in a
secure area.
121
4.8 Acknowledgment
This work was supported in part by Defence Research and Development Canada,
Centre for Security Science, Chemical, Biological, Radiological/ Nuclear, and
Explosives Research and Technology Initiative (CRTI) under the program Portable
Biological Agent Detection System (06-0187TD). Fluorescence micrographs were
acquired through the Bioimaging facility at CRI. We thank our colleagues Jean-Guy
Allard (NRC), Liviu Clime (NRC), Karel Boissinot (CRI), Sébastien Chapdelaine
(CRI), Isabelle Charlebois (CRI), Gale Stewart (CRI), Julie- Christine Lévesque
(CRI) and Manon Tétreault for useful discussion and technical assistance. Ian
Summerell and the first responder team of the Royal Canadian Mounted Police
(Orleans, ON) are acknowledged for conceptual input to this work.
122
4.9 References
Alaeddini, R. 2012. Forensic implications of PCR inhibition--A review. Forensic science
international. Genetics 6(3): 297-305.
Aldous, W.K., J.I. Pounder, J.L. Cloud et G.L. Woods. 2005. Comparison of six methods of
extracting Mycobacterium tuberculosis DNA from processed sputum for testing by
quantitative real-time PCR. Journal of clinical microbiology 43(5): 2471-2473.
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124
4.10 Figures
(a)
5
4
1
6
7
3
2
8
9
10
11
12
17
13
14
16
15
(b)
(c)
Air in
Air
out
Sample
in
Lysate
out
Figure 15. Design and configuration of the FULM.
a) Schematic of the different components and their arrangement: (1) FULM; (2) lysis chamber; (3) sample
inlet with connector; (4) pressure port with connector; (5) vent with connector; (6) syringe filter unit; (7)
sample outlet with connector; (8) syringe filter unit; (9) stainless steel interface; (10) O-ring; (11) locking
device; (12) screw; (13) sonication platform; (14) docking station; (15) sonicator probe; and (16, 17)
clamping units.
b) Photograph of the FULM upon assembly. Scale bar: 1 cm.
c) Sketch of the lysis chamber (top view) along with the operational principles of sample injection and
recovery.
125
120
80
60
40
n=2
n=3
n=3
n=3
n=6
n = 11
n=3
x
x
1
1
x
20
0
0
12
0
2
x
10
2
x
15
2
x
20
2
x
40
2
x
60
3
x
40
4
x
30
n=3
n=3
20
n=3
40
1
rel
[DNA]
[DNA]rel (%)
(%)
100
(?X)
Time of %
sonication
(s)
Figure 16. Effect of sonication time on the concentration of genomic DNA extracted from spores of
B. atrophaeus.
Effect of sonication time on the concentration of genomic DNA extracted from spores of B. atrophaeus.
5
-1
Each experiment was performed with 230 μL of a purified suspension containing 3.0 × 10 spores mL in
PBS. Sonication was performed in continuous (1 × 20 to 1 × 120 s) or intermittent fashion (2 × 10 to
4 × 30 s). For intermittent exposure, sonication and interruption periods were equivalent in time length.
The amplitude of the sonicator probe was maintained at 30 μm. DNA concentrations were evaluated using
TM
real-time PCR and are shown relative to the average yield obtained with the BD GeneOhm Lysis Kit.
The number of replicates (n) for bacterial lysis is indicated for each condition on the bar chart. Error bars
represent standard deviations.
126
4
2
3
1
1 µm
Figure 17. Confocal microscopy image revealing the damage inferred to FITC-labeled spores
of B. atrophaeus upon exposure to ultrasound for 2 × 15 s.
Confocal microscopy image revealing the damage inferred to FITC-labeled spores of B. atrophaeus
upon exposure to ultrasound for 2 × 15 s. The typical morphological pattern obtained under these
conditions includes (1) half spore, (2) spore broken in halves, (3) spore fragment, and (4) spore with
intact shape. To facilitate observation, the sample was immobilized in 0.5% agarose gel.
127
5 Développement d’un essai sur puce à ADN en
microfluidique pour la détection et
l’identification de 12 agents bactériens
aéroportés associés au bioterrorisme
Avant propos
Rapid Microarray-Microfluidic Screening for Twelve Airborne
Bacterial Biothreat Agents
COURT TITRE
Screening for biothreat agents
AUTEURS
Sandra Isabel, Maurice Boissinot, Éric Leblanc, Eric A. Martel, Dominique K. Boudreau,
Vasudha Srivastava, Marie-Jeanne Fiola, Laurie D. Girard, Marilyse Vallée, Émilie FiolaMasson, Martine Bastien, Richard Giroux, François J. Picard, Gale Stewart, Ann Huletsky,
Régis Peytavi, and Michel G. Bergeron†
1. Centre de recherche en infectiologie de l‘Université Laval, Centre hospitalier
universitaire de Québec, Pavillon CHUL, Québec, Québec, Canada.
† Corresponding author. Mailing address: Centre de recherche en infectiologie de
l‘Université Laval, Centre de recherche du CHUQ, 2705 Laurier Blvd., Québec City,
Québec, Canada G1V 4G2. Phone: (418) 654-2705. Fax: (418) 654-2715.
E-mail: [email protected].
CONTRIBUTION DES AUTEURS
Conceived and designed the experiments: SI, EL, MBoissinot, FJP, MGB, VS, RP, AH.
Performed the experiments: SI, MJF, VS, LG, MLV, EFM. Analyzed the data: SI, EAM,
DKB, LG, MLV, GS. Contributed for reagents and materials: MJF, MBastien. Wrote the
manuscript: SI, MBoissinot, EAM.
129
Précisions sur le rôle exact de l’étudiante dans la préparation de l’article.
L‘étudiante a dirigé le projet et contribué considérablement à l‘élaboration du projet
de recherche et du schéma expérimental. Elle a effectué la majorité du design de
l‘essai moléculaire et a réalisé la majorité des expériences. L‘étudiante a écrit la
première version du manuscrit et a procédé aux modifications suggérées des
coauteurs.
Précisions sur le rôle des coauteurs dans la préparation de l’article.
Éric Leblanc, Maurice Boissinot, Régis Peytavi, Michel G. Bergeron, Ann Huletsky,
François J. Picard et Gale Stewart ont participé à l‘élaboration du schéma
expérimental. Régis Peytavi a apporté son expertise en microfluidique pour le
développement de la plateforme et de l‘essai. Maurice Boissinot a révisé et
commenté le manuscrit.
Marie-Jeanne Fiola, Marilyse Vallée, Émilie Fiola-Masson, Laurie Girard et
Vasudha Srivastava ont réalisé une partie des expériences présentées dans cet
article. Vashuda Srivastava et Richard Giroux ont contribué au design de quelques
sondes de détection.
Dominique K. Boudreau et Éric A. Martel ont contribué à l‘élaboration d‘outils
informatiques pour le design des sondes de capture et l‘analyse des données de
biopuces. Gale Stewart a de plus contribué aux analyses statistiques.
Martine Bastien a trouvé des solutions techniques afin de diminuer les niveaux
basaux de contamination par des acides nucléiques bactériens lors de la
réalisation de la PCR à large spectre.
130
Précisions sur le statut de l’article.
L‘article au sujet des biopuces de détection des agents bactériens aéroportés
associés au bioterrorisme sera soumis prochainement au journal PLOS ONE.
Isabel S., M. Boissinot, É. Leblanc, E. A. Martel, D. K. Boudreau, V.
Srivastava, M. J. Fiola, L. D. Girard, M. Vallée, É. Fiola-Masson, M.
Bastien, R. Giroux, F. J. Picard, G. Stewart, A. Huletsky, R. Peytavi,
and M. G. Bergeron. Rapid Microarray Microfluidic Screening for
Twelve Airborne Bacterial Biothreat Agents.
Commentaires sur les modifications apportées à l’article inséré dans la thèse
comparativement à l’article publié originalement.
Le chapitre 5 de cette thèse inclut cet article et représente une version en
préparation pour soumission.
131
5.1 Résumé
Le grand nombre d‘agents biologiques aéroportés pouvant potentiellement être
utilisés comme armes met en évidence le besoin de développer des outils
moléculaires performants pour en détecter plusieurs simultanément. Dans cette
étude, nous décrivons un système de puces à ADN en microfluidique pour cribler
12 des 13 agents bactériens aéroportés associés au bioterrorisme inclus dans les
catégories A, B et C de la liste des CDC (A: Bacillus anthracis, Clostridium
botulinum groupes I et II, Francisella tularensis et Yersinia pestis, B: Brucella spp.,
Burkholderia
mallei,
Burkholderia
Clostridium perfringens,
pseudomallei,
Coxiella burnetii
et
Chlamydophila
Rickettsia
prowazekii
psittaci,
et
C:
Mycobacterium tuberculosis complex). Pour procéder à une amplification à large
spectre biaisée du gène tuf dans un tube (55 minutes) suivi d‘une procédure
d‘hybridation sur puce à ADN en microfluidique (15 minutes), 16 amorces et 36
courtes (20 nucleotides) sondes de capture spécifiques ont été conceptualisées.
Une approche automatisée d‘analyse de données a été développée et un seuil de
positivité a été établi pour chaque sonde selon l‘analyse de courbes ROC. Notre
PCR multiplexe combiné à notre système de puce ADN en microfluidique ainsi
qu‘à notre approche d‘analyse a permis de passer au crible et de détecter de façon
sensible 12 agents bactériens aéroportés associés au bioterrorisme : 102 copies
de génomes, sauf pour R. prowazekii (104 copies de génomes). Le logiciel
développé à l‘interne, Crosshyb, a été utilisé pour prédire in silico la spécificité
théorique des sondes de capture face à d‘autres espèces (1771 souches
procaryotes). La spécificité analytique des sondes de capture a été montrée in vitro
contre un panel de 40 autres espèces représentant d‘autres agents biologiques,
des espèces rapprochées phylogénétiquement et d‘autres pathogènes aéroportés.
Nous avons développé un essai complet couvrant les 12 pathogènes bactériens
aéroportés associés au bioterrorisme pour leur détection rapide (75 minutes).
132
5.2 Abstract
The great number of airborne biological agents that could potentially be used as
weapons emphasizes the need to develop screening technologies for their efficient
simultaneous detection. In this study, we describe a DNA microarray microfluidic
system to screen for and detect 12 of the 13 airborne bacterial biothreat agents
included in the CDC categories A, B, and C (A: Bacillus anthracis, Clostridium
botulinum groups I and II, Francisella tularensis, and Yersinia pestis, B: Brucella
spp., Burkholderia mallei, Burkholderia pseudomallei, Chlamydophila psittaci,
Clostridium perfringens, Coxiella burnetii, and Rickettsia prowazekii, and C:
Mycobacterium tuberculosis complex). Sixteen primers and 36 specific capture
probes were designed to perform a biased-broad-spectrum amplification of the tuf
gene in one tube (55 min) followed by a rapid microfluidic microarray hybridization
procedure (15 min). An automated microarray data analysis approach was
developed and positivity threshold for each probe was based on ROC curve
analysis. Our multiplex PCR combined with our microfluidic microarray system and
analysis approach allowed rapid (75 min) and sensitive detection of 12 airborne
bacterial biothreat agents: 102 genome copies, except for R. prowazekii (104
genome copies). In-house software Crosshyb v.2.0 was used to predict in silico
theoretical specificity of the designed capture probes to other species (1771
prokaryotic strains). The analytical specificity of the capture probes was showed in
vitro based on a panel of 40 other species representing other biothreat agents,
genetically closely related species, and other airborne pathogens. We developed a
comprehensive assay covering the twelve most important bacterial biothreat
airborne pathogens for their rapid (75 min) screening.
133
5.3 Introduction
Detection of biothreat agents is essential for public health preparedness. The
Centers for Disease Control and Prevention (CDC) have listed high-priority
biological agents in three categories, A, B, and, C, according to their ability to
spread, the severity of illnesses they induce, and their anticipated impact on public
health and society (CDC 2000; Rotz et al. 2002). Biological agents which are highly
contagious or potentially widely disseminated via small-particles aerosols are those
that might have the greatest impact on public health (CDC 2000). For example, it
has been reported that up to 3 million deaths could result from the release of 100
kg of aerosolized anthrax spores over a metropolitan area in favorable
environmental conditions (Alibek et Handelman 2000; Inglesby et al. 1999).
Fortunately, for bacterial pathogens, a significant prophylactic and therapeutic
arsenal is available when they can be detected and identified rapidly (Ciottone
2006; Ramasamy et al. 2010). We therefore aimed to develop a screening assay to
detect all CDC categories A, B, and C airborne bacterial biothreat agents (CABBA)
(Tableau 9). The enterotoxin B producing Staphylococcus aureus was excluded
from our assay since this species can be carried intermittently in the anterior nares
of approximately 60 % of the population (Kluytmans et al. 1997). Therefore,
humans may easily contaminate samples to test and its detection could raise false
alarms.
The broad phylogenetic spectrum covered by the 12 CABBA (Tableau 9) (Jolley et
al. 2012) was challenging for the design of a single assay to detect all. Constraints
imposed by PCR multiplexing explain in part why assays developed for CABBA
detection are often limited to the simultaneous detection of one to five biothreat
agents (Deshpande et al. 2010; Janse et al. 2012; Rachwal et al. 2012; Tomioka et
al. 2005; Yang et al. 2012). Microarray technology is not limited by the number of
targets simultaneously detected (Miller et Tang 2009; Raoult et al. 2004). However,
134
since sensitive microarray detection requires prior amplification, this step is the
limiting factor for multiparametric analysis. Evolutionary conserved genes, such as
tuf, have the advantage of presenting highly conserved regions amenable to the
design of broad-sprectrum primers, hence allowing amplification of phylogenetically
diverse targets in a single tube (Hwang et al. 2011; Isabel et al. 2008; Ke et al.
1999; Mignard et Flandrois 2007; Paradis et al. 2005; Picard et al. 2004; Stormer
et al. 2009). Standard microarray protocols have experimental times of
approximately 15 h (Walter et al. 2011). Time-effective hybridization protocols have
been developed. For example, in a recent study by Schnee C et al. (Schnee et al.
2012), the tuf gene was used to amplify the species of the Mycoplasma genus, and
then proceed to species identification using a 1 h microarray hybridization
procedure. Microfluidic hybridization can even be performed in a few minutes
(Peytavi et al. 2005; Wang et Li 2011). We designed biased-broad-spectrum
primers for the tuf gene targeting all CABBA, and then performed rapid (15 min)
microarray hybridization on centripetal microfluidic units (Peytavi et al. 2005). This
new assay has the ability to screen for twelve biological agents in an overall
procedure of 75 min. Recommendations suggest that more than one tests need to
be used to confirm the presence of a biological agent (Lindler et al. 2005).
Combined with confirmation tests, our assay could speed up the analysis of
material suspected of being contaminated with airborne biothreat agents and
hence help to resolve complex issues of medical management and public safety.
135
5.4 Materials and methods
5.4.1 Bacterial isolates and genomic DNA preparation.
A panel of 38 strains (Tableau 12) requiring BSL-2 or BSL-1 facility were obtained from
the American Type Culture Collection (Manassas, VA) (ATCC), the Collection du Centre
de Recherche en Infectiologie (Québec, Canada) (CCRI), the Culture Collection of the
University of Göteborg (Göteborg, Sweden) (CCUG). These strains were grown
overnight at 30 or 37°C under aerobic or anaerobic conditions on Trypticase soy agar
with 5% sheep blood. Purified DNA from strains (BSL-2 or BSL-1) were prepared from
mid-log-phase bacterial cultures of selected strains by using a BioSprint 15 DNA blood
kit (Qiagen, Mississauga, Ontario, Canada) automated with a KingFisher® mL
instrument (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA). Purified genomic DNAs of the
CABBA requiring BSL-3 facility were provided by several researchers (Tableau 11 et
Tableau 12). Purified genomic DNA of Chlamydophila pneumoniae was obtained from
Vircell (Granada, Spain). Human genomic DNA was extracted from human whole blood
using the same procedure. Genomic DNAs were visualized on 0.8% agarose gel
electrophoresis with 0.25 µg/ml of ethidium bromide in Tris-borate-EDTA to evaluate
degradation and concentration. Genomic DNA concentrations were validated using the
NanoDrop 1000 (Thermo Fisher Scientific, Wilmington, MA).
5.4.2 Construction of a tuf gene database from complete genome sequences.
A total of 1890 complete genome sequences of superkingdoms Bacteria and Archae
available on GenBank on 2012-02-14 (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) were downloaded.
We performed non-case sensitive automated requests using regular expressions
―tuf|elongation +factor +tu|ef.tu‖ in the annotations of the CDS (coding sequences)
sections of GenBank files, and then, extracted corresponding sequences. Zero to five
sequences per genome were retained based on their CDS annotated information. After
removal of unrelated hits, zero to three copies of tuf gene per organism were retrieved
136
from 1771 genome sequences for a total database of 2820 sequences. Their accession
numbers are listed in supplemental material Table S1a. The tuf gene of Wolbachia
persica
ATCC
VR-331
(GenBank
Accession
number
KF574042),
a
species
phylogenetically closely related to F. tularensis, was sequenced as described previously
(Paradis et al. 2005), and added to the database.
5.4.3 Design of primers and probes.
Sequences from four to thirty strains per target species were analyzed. The tuf gene
region for PCR amplification was selected to yield amplicons having the following
properties: 1) amplicon length between 100-300 bp (analytical sensitivity and rapid
amplification), 2) amplicons presenting minimal intra-species heterogeneity (ubiquity)
and, 3) amplicons also containing sufficient inter-species variations to allow the design
of species-specific probes (analytical specificity) (Sachse 2004). In addition, two
conserved regions allowing amplification of all target species with A) minimum number
of different primer sequences and B) flanking a more variable region for probe design
must be present (Petti 2007). Sequences of the 12 CABBA targeted species were
assembled into a multiple alignment using the CLUSTAL W software (version 2.1). The
SVARAP program (version 2.1) was used to visualize conserved and more variable
regions of this gene alignment (Figure 18) (Colson et al. 2006). To avoid contamination
problems of broad-spectrum amplification (Corless et al. 2000; Petti 2007), we biased
broad-spectrum primer sequences to preferentially amplify intended targets over other
potentially contaminating species. No degenerate primers were used, but inosines were
incorporated in some primers. In addition, primers were designed to have similar
annealing temperatures and to limit secondary structures and self-priming (Ye et al.
2012). The 3‘ extremities of the primers were adjusted to terminate at the same position
on tuf gene, but 5‘ end positions were different in order to adjust their theoretical
annealing temperature to ~60°C. Primer sequences satisfying these criteria are listed in
Tableau 10.
137
For capture probe design, tuf gene sequences from closely related species were aligned
with the 12 target species. Because of the high number of sequences in the database,
10 multiple alignments regrouping family members of the CABBA targets (Tableau 9)
were created. Regions specific to each targeted species were chosen for probe design.
Five to ten short (20 nucleotides) probes were designed to hybridize within each
different CABBA target amplicon while maximizing base-pair mismatch discrimination of
nucleic acid sequences from other species of the family (Naef et al. 2002; Naef et
Magnasco 2003). Probe sequences were first selected manually as well as with inhouse Unimer software on the basis of specific recognition of the targeted species
compared with other members of the same family. Then, all potential probes were
automatically compared to 2820 tuf gene sequences in the database using the in-house
Crosshyb software version 2.0 (Tableau 16) (Martel 2011). This software calculated
distances between probes and all sequences within the tuf database by attributing a
weighting factor for a destabilizing effect of each mismatch based as a function of their
position (Martel 2011). The 36 retained probes are listed in Tableau 12.
5.4.4 PCR amplification and exonuclease digestion.
Levels of contaminating DNA into PCR reagents were decreased by three types of
methods: filtration, autoclaving, and UV treatment. PCR Milli-Q water was filtered using
0.1 µm pore diameter membranes (PALL Corporation, Port Washington, NY) prior to two
subsequent autoclaving sterilisations. Water, MgCl2, and dNTPS solutions were filtered
through centrifugal filter devices with YM-30, YM-100 or YM-30 membranes (EMD
Millipore, Billerica, MA), respectively. Decontamination of the PCR mixtures prior to PCR
was performed by using a Spectrolinker model XL-1000 UV cross-linker (Spectronics
Corporation, Westbury, NY). Contamination of each reagent lot was assessed without
DNA template control added to PCR reactions and lots yielding amplicon melt curves
with a signal above 40 relative fluorescence units were rejected. A multiplex PCR assay
using a set of sixteen primers (Tableau 10) purified by HPLC (Integrated DNA
Technologies, Inc., Coralville, Iowa) has been optimized to allow sensitive amplification
138
of 100 genome copies of CABBA. The PCR mixtures contained precise concentrations
of each of the 16 TcbaR primers (Tableau 10), 200 µM deoxyribonucleoside
triphosphates (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ), 50 mM Tris-HCl (pH 9.1),
16 mM ammonium sulfate, 4.5 mM MgCl2, 2 µg/µl bovine serum albumin (Sigma-Aldrich
Canada Ltd., Oakville, Ontario, Canada), 1.4X SYBR Green I, 0.13 µg/µl methoxsalen
(Sigma-Aldrich Canada Ltd.), 100 genome copies of B. atrophaeus purified genomic
DNA as an internal amplification and hybridization control, and 0.050 U/µl KlenTaq DNA
polymerase (Ab Peptides, Inc., St. Louis, MO) combined with the TaqStart antibody
(Clontech Takara Bio, Mountain View, CA). Purified genomic DNA (10 2, or exceptionally
104, genome copies for sensitivity tests or 1 ng for specificity tests) was added to each
PCR mixture, which was subjected to thermal cycling with a SmartCycler® System
(Cepheid) as follows: 60 s at 95°C, followed by 40 cycles of 10 s at 95°C, 20 s at 60°C,
and 20 s at 72°C, a final extension for 2 min at 72°C, and a melt from 60 to 95°C (total
cycling duration : 55 min). Amplicons were produced using 5′ Cyanine 3-labeled forward
primers (Cy3-) and 5′ phosphorylated reverse primers (P-). Phosphorylated antisense
strands were digested using a 5 min Lambda exonuclease treatment at 37ºC as
described previously (Boissinot et al. 2007).
5.4.5 Microfluidic-microarray hybridization.
Microarrays were fabricated as described previously (Peytavi et al. 2005) and improved
as followed. Briefly, Super Aldehyde glass slides (Genetix, New Milton, Hampshire,
United
Kingdom)
were
used.
Oligonucleotide
capture
probes
(Tableau 12) synthesized with a hexa (ethylene glycol) spacer (S18) and an aminolinker (AmMC6) at the 5‘ end (Integrated DNA Technologies, Inc.) were suspended in
phosphate-buffered saline (pH 7.4, Sigma-Aldrich) with 1 mM EDTA. Probes were then
diluted two-fold by the addition of Micro Spotting Solution Plus (TeleChem International,
Inc., Sunnyvale, CA) for a final concentration of 30 µM. A printing control probe (bbc2:
5‘-TACATCACGCATCGCAGTGT-3‘) was mixed at 0.5 µM to each probe, to assess the
quality of the printing process. Each probe was spotted in duplicate in two different sub139
arrays with Gene Machines OmniGrid Microarrayer (San Carlos, CA) equiped with four
SMP2 pins (Telechem International, Inc.). Elastomeric flow cells were fabricated as
described previously (Peytavi et al. 2005), but the dimension of the hybridization
chamber was extended (width 500 µm by length 8500 µm) to accommodate more
microarray capture probe spots (~250). We juxtaposed a microfluidic elastomeric flow
cell on a glass slide to form microfluidic-microarray hybridization unit. Up to six of these
units were set on a centripetal support. Five (5) µL of digested PCR mixture was
combined with 15 µL of hybridization buffer (8× SSPE (OmniPur; EMD Millipore,
Billerica, MA), 0.4 g/L polyvinylpyrrolidone, 400 mL/L formamide, hybridization control
target Cy3-bbc1a (5'-Cy3-GAGTATGGTCTGCCTATCCT) at 6.6 nM, and printing control
target Cy5-bbc2b (5'-Cy5-ACACTGCGTAGCGTGATGTA-3') at 0.66 µM). The complete
microfluidic-microarray hybridization procedure was performed at room temperature on a
centrifugation-platform in four consecutive steps (hybridization (5 min), washing (5 min),
rinsing (5 min), and drying). Hybridization control bbc1 (capture probe) and bbc1a (Cy3labeled target) were used as described previously (Boissinot et al. 2007). For each
species tested, 2-7 hybridization experiments, including two or exceptionally three
replicates per strain, were performed.
5.4.6 Microarray data acquisition and analysis.
Fluorescent images were acquired using the Agilent G2505B microarray scanner
(Agilent Technologies, Mississauga, Ontario, Canada) with parameters as follows: PMT
gain at 100 % and 10 % for red and green channels, respectively, and scan resolution to
10 μm. Fluorescence data analysis was performed using GenePix Pro software (version
6.1.0.4; MDS Analytical Technologies, Downingtown, PA). To create a raw data set,
automated grid alignment was performed, followed by a visual inspection, minor manual
alignment if required and bad spots removal (such as obvious stains and other
undesirable artifacts). Resulting raw signals were imported into BASE (Saal et al. 2002)
for data stocking and subsequent batch computation via in-house software called
MINABLE (version 6.0) used to perform all of the following analyses. The raw signal
140
Sraw,s of every spot s was defined as the difference between the foreground raw median
signal Fmed,s of this spot and the background raw median signal Bmed,s around this spot
. Since each scan
as determined by GenePix Pro 6.0
was divided into two independent and spaced sub-arrays, we determined a mean raw
signal Cb for the hybridization control probe control (referred as bbc1 in the text) of each
sub-array b, computed as Cb = S raw,bbc1,b . Prior to computing this mean, we filtered the
control raw signals in the following way. The reference raw signals were filtered by
eliminating outliers via interquartile range (IQR), outliers being defined as distributed
outside the Q2 ± 1.5×IQR interval. In cases where Cb was below the established
threshold (5 × 103), the whole sub-array b was eliminated from further analysis. Within
each valid block b, the relative signal Srel,s,b of each spot s was determined as a
percentage of Cb (
) To calculate the positivity threshold for
each probe, ROC curve analyses (ROCR version 1.0-4 in R version 2.14.1, (R
Development Core Team 2011; Sing et al. 2005), were performed using data from all
spot relative signals Srel,s,b for each specific probe defined as positive when hybridized
with amplicons from the targeted species, and otherwise as negative. IQR filtered mean
relative signal Srel,h,p for each probe p for a given hybridization experiment h was set as
the mean of all its spots relative signal (
̅
). Mean signal over the
positivity threshold for each probe was identified as positive, and otherwise negative.
Probes signals were evaluated when performing sensitivity tests (10 2 genome copies,
except for Rickettsia spp. 104 genome copies) (Tableau 11). Finally, we evaluated crosshybridization with other non-targeted species in order to assess specificity of each probe
and probe combinations.
141
5.5 Result
5.5.1 Analysis of the tuf gene region, primer and probe selection.
Targeting 12 CABBA distributed over four bacterial phyla (Actinobacteria,
Chlamydiae, Firmicutes, and Protoebacteria) (Tableau 9) represents a challenge
for the design of PCR primers and hybridization probes. Analysis of tuf gene
sequences of all CABBA with the SVARAP software (Colson et al. 2006) revealed
two short conserved regions encompassing a more variable region (Figure 18) The
design made in those regions permitted to: 1) minimize the number of primers to
amplify all selected targets, 2) avoid primers having very broad spectrum in order
to limit amplification of unintended targets, and 3) detect a minimum of 100
genome copies of the selected targets. The biased-broad-spectrum amplification of
the tuf gene allowed to preferentially amplify the selected targets. Hence, this
strategy minimized the amplification of contaminants while allowing sensitive
amplification of 12 CABBA.
Two to four short (20 nucleotides) capture probes were selected in silico for each
CABBA, for a total of 35 probes. These probes were designed to optimize the
ubiquity (detect phylogenetic variants within targeted species) and specificity
(divergence with the non-targeted species). Of the sequences from four to thirty
per species analyzed, probes for 11 of 12 target species were ubiquitous even for
the two tuf copies. Gene regions used for probes specific to C. botulinum group I
included one SNP for two (str. 657 and Loch Maree) of the twelve strains used for
design. No probe was added into the microarray to cover this SNP since we did not
have access to DNA from these more phylogenetically distant strains. For C.
perfringens, two probes were designed at the same position to consider a SNP
between the two copies of tuf genes included on two of the strains studied (ATCC
13124 and CCUG 23083). We could not predict if one tuf copy could be amplified
predominantly. For the same reason, design for Y. pestis included probes to target
142
tufA and tufB genes since those two copies present a high level of divergence
(Isabel et al. 2008).
In some cases, only one probe was sufficient to be theoretically species-specific
when compared to tuf gene sequences of 1,771 strains in our database. For
example, probe CburH834 presented at least 6 mismatches with all other species
evaluated. In other cases, probe combinations were required to distinguish the
targeted CABBA from closely related species. Probes designed for Brucella spp.
illustrated well this situation. The probe BruGH819 presented two mismatches
against Ochrobactrum anthropi, but none with one tuf copy of Rhizobium
leguminosarum. Inversely, the probe BruGH842 presented no mismatches against
O. anthropi while four for one tuf copy of R. leguminosarum. In silico analysis
showed that combination of probes allowed theoretical specificity against most
closely related species. However, no mismatch was found between B. anthracis
and some B. cereus/B. thuringiensis strains, as well as between Y. pestis and
Y. pseudotuberculosis. Also, probes designed to detect B. pseudomallei presented
no mismatch against one of four strains of Xanthomonas oryzae (str. BLS256), a
rice plant pathogen, even if they are not genetically closely related species
(Mansfield et al. 2012). All CABBA reverse primers present a mismatch with X.
oryzae BLS256 on the third nucleotide before the 3‘ end. To limit competition with
the 12 CABBA targets, the amplification of the B. atrophaeus amplificationhybridization control has been designed and optimized to be robust without
interfering with the multiplexed PCR. Therefore, one 26-nucleotide capture probe
was designed for the B. atrophaeus control to increase its microarray detection
sensitivity. From in silico analysis, 36 hybridization capture probes were
synthesized for recognition of the 12 CABBA and B. atrophaeus amplicons and
submitted to subsequent in vitro analyses (Tableau 11 and Tableau 12).
143
5.5.2 Analytical sensitivity of the CABBA assay
TcbaR primers (9 forward and 7 reverse), when combined in one tube at specified
concentrations and conditions, allowed the sensitive amplification of 12 CABBA
targets. Concentration of each PCR reagent was optimized to increase its
amplification signal as seen in real-time PCR using SYBR Green. For microarray
result interpretation, a specific threshold was calculated for each probe based on
ROC curve analyses using relative hybridization signals of microarray spots. As a
result, 102 genome copies of all CABBA, except for R. prowazekii (104 genome
copies), allowed positive signals of specific capture probes in 100% of hybridization
experiments (2-7 repeats) (Tableau 12). It should be noted that DNA preparations
of most CABBA strains were provided by other laboratories having BSL-3 facilities.
Therefore, we could not have control over DNA preparation methods or
degradation during transportation. Visualization of genomic DNAs on agarose gels
was used to monitor degradation and only intracellular bacterial agents, C. psittaci,
R. prowazekii and R. typhi, showed extensive degradation. The amplificationhybridization positive control was 100 genome copies of B. atrophaeus included in
all PCR reaction. One to three positive controls were analyzed for each set of
experiment, producing a positive microarray signal in 100% (17/17) of control
hybridization experiments.
5.5.3 Analytical specificity of the CABBA assay
Assay analytical specificity was validated using high quantities of genomic DNA
(1 ng ~105 genome copies) of 12 targeted agents, as well as 40 other
phylogenetically related and clinically relevant bacterial species. As presented in
Tableau 12, most CABBA exhibited specific probe patterns, even when compared
with phylogenetically related species. For example, two of the three probes
designed to detect Brucella spp. allowed discrimination with O. anthropi. Also,
C. psittaci probes did not present positive signals when hybridized with amplicons
144
produced from all 51 other species tested, including closely related Chlamydophila
pneumoniae and Chlamydia trachomatis amplicons. Three Clostridium groups
were CABBA targets: C. botulinum groups I and II, and C. perfringens. These three
groups present distinct probe patterns between themselves. They also produce
distinct patterns with four other different Clostridium species. C. burnetii probes
only produced specific positive signals with its target. The combination of the three
probes for F. tularensis allowed its specific identification even when two closely
related species were tested: Francisella philomiragia and Wolbachia persica. The
three probes designed to detect and identify the M. tuberculosis complex were
specific against three other species of this genus: M. avium, M. kansasii, and
M. terrae. Surprisingly, the two theoretically specific probes for R. prowazekii
detection cross-reacted with the Clostridium septicum amplicon. However, the two
probes for R. prowazekii and R. typhi, did not react with C. septicum. The
combination of these four probes differentiates the Rickettsia typhus group,
R. prowazekii and R. typhi (Brenner et al. 2005), from all other species, but could
not distinguish between these two species. As predicted by our in silico analyses, it
was not possible to distinguish sub-species of two genomospecies: B. anthracis
from B. cereus and Y. pestis from Y. pseudotuberculosis. However, B. mallei and
B. pseudomallei presented distinct patterns even though they are considered as
the same genetic species (Godoy et al. 2003). Finally, when human DNA was
tested, no amplicon was detected by SyBR Green analysis and no crosshybridization
was
observed
with
the
microarray
capture
probes.
145
5.6 Discusion
5.6.1 Evolutionary relationships of tuf sequences
The tuf gene regions used to design primers to amplify the 12 CABBA are highly
conserved among four bacterial phyla (Tableau 9) distributed throughout the
evolutionary tree of the bacterial domain (Jolley et al. 2012). This level of sequence
conservation can be explained by the essential structure and function of the
elongation factor Tu protein. The forward primers were designed in one of the two
domain 2 loops of EF-Tu involved in 16S rRNA binding and interaction with tRNAa.a. (Schmeing et al. 2009; Song et al. 1999). The reverse primers were designed
in another conserved hairpin loop of the EF-Tu domain 3 (Song et al. 1999). The
specificity of the capture probes exploited the variability existing at the junction
between domains 2 and 3 of EF-Tu (Song et al. 1999).
5.6.2 Biased-broad-spectrum amplification
Broad range PCR is limited by possible bacterial DNA contamination of reagents
(Petti 2007). In our study, even though the amplification spectrum of the primers
was biased toward targeted CABBA species, it was still challenging to minimize
amplification of contaminants present in PCR reagents. Therefore, all reagents
underwent
several
meticulous
decontamination
steps,
including
filtration,
autoclaving, and UV treatment, as well as careful handling in laminar flow hoods
within dedicated laboratory spaces, and lot validation. However, as noted by
others, it was not possible to completely eliminate contaminating DNA without
affecting sensitivity (Corless et al. 2000). Our biased-broad-spectrum PCR allowed
sensitive microarray detection of low DNA quantities of 11 of 12 CABBA: 10 2
genome copies, except Rickettsia prowazekii (104 genome copies). One of two
genomic DNA preparations from R. typhi strains tested was detected (102 genome
copies) by the two probes designed for these two species. These rickettsial
146
genomic DNA preparations were highly degraded; the analytical sensitivity for
Rickettsia spp. targets warrants further study.
5.6.3 Limitation of conserved gene targets
A known limitation of conserved gene targets is the inability to discriminate closely
related bacterial taxa (Petti 2007) or bacteria that underwent convergent evolution.
With the tuf gene CABBA assay, 9 of the 12 targets could be specifically identified
both in silico and in vitro. In silico discrimination of B. pseudomallei and one of four
strains of X. oryzae analyzed was not possible. B. pseudomallei and X. oryzae pv.
oryzicola BLS256 may have underwent convergent evolution in the tuf region
targeted by the 2 capture probes. X. oryzae is an important rice pathogen that has
however not established itself in North America (Mansfield et al. 2012). Although it
is unlikely to be found in suspect powders, the design of new probes to increase
theoretical specificity against X. oryzae warrants further study. Discrimination of
B. anthracis from B. cereus / B. thuringiensis as well as discrimination of Y. pestis
from Y. pseudotuberculosis was not possible because they are the same genetic
species and their main differences are the presence of distinct virulence genes.
The fact that virulence genes are often encoded by mobile genetic elements, such
as plasmids, indicates that their evolution is an active process and adds complexity
to pathogen identification (Ch'ng et al. 2011; Derbise et al. 2010; Hoffmaster et al.
2004; Hu et al. 2009; Worsham et Roy 2003). The combination of testing for
housekeeping chromosomal targets together with virulence genes increases the
probability of appropriate identification (Boissinot et Bergeron 2003; Janse et al.
2012; Petti 2007). Numerous molecular detection assays were previously
developed to detect specific virulence factors of B. anthracis and Y. pestis and
allow specific detection of these species (Irenge et Gala 2012; Persing 2011; Rao
et al. 2010; Riehm et al. 2011; Stewart et al. 2008; Wielinga et al. 2011). It is
recommended to perform several tests prior to confirm the presence of a biological
agent (Lindler et al. 2005). In case of a positive result, combination of our
147
screening technology with a subsequent confirmation tests developed previously
would increase efficiency and biological agent identification specificity.
5.6.4 Possible practical application of the CABBA assay.
In the case of a bioterrorist attack, bacterial preparation could be highly
concentrated. As reported for example in fall 2001, B. anthracis spore preparations
contained between 4.60 × 1010 and 2.10 × 1012 CFU per gram of powder (U.S.
Department of Justice 2010). Therefore, excluding DNA preparation, for the lowest
concentrated bacterial preparation, only 2 ng (~100 CFU) of powder would need to
be analyzed to produce a positive detection signal with the CABBA assay.
Considering DNA preparation, for example, the DARE procedure (10 minutes)
enables recovery of microbial particles from 20 mg of powder in 300 µL of which
5 µL can be analyzed by PCR (Isabel et al. 2012). Assuming the published
average recuperation of approximately 50 %, we could expect to submit to PCR
the equivalent of bacterial particles extracted from 165 ng of suspect powder.
Hence, the DARE procedure could provide 80 times the amount of material
required for detection by the CABBA assay. The B. atrophaeus control selected to
monitor amplification and hybridization of the CABBA assay could also be used as
a sample process control (Picard et al. 2009). All 12 CABBA species are human
pathogens, although for C. botulinum and C. perfringens, their botulinic neurotoxin
and epsilon toxin, respectively, are the targeted biological agents of the CDC.
Other nucleic acid based assays, such as the PLEX-ID and the FilmArray
Biosurveillance, also target these species (Idaho Technology Inc. 2012; Sampath
et al. 2012). Toxin preparations may carry traces of their genomic DNA depending
of the method of purification. For example, to produce a highly purified protein
vaccine, a nuclease step must be performed to remove DNA traces (Hagen et al.
1996). The accuracy of a nucleic acid-based assay to detect C. botulinum and
C. perfringens DNA in toxin preparations requires further study.
148
5.6.5 Comparison to other biothreat agent detection assays.
A bead-based array, used for a multiplex oligonucleotide ligation-PCR assay,
analyzed 13 gene targets to detect 103-104 genome copies of three biothreat
agents in less than 4 h (Deshpande et al. 2010). Another bead-based array uses
16 gene targets to identify four biothreat agents (Janse et al. 2012). Although turnaround time for the assay is not explicitly stated, it can be estimated at more than
100 min. Moreover, they calculated their limit of detection to range from 12 to 284
genome copies. The PLEX-ID, a system combining PCR amplification and
characterisation of amplicons by mass spectrometry, demonstrated the detection of
9 biothreat agents, but has the potential for detecting a very large number of
microbial species (Sampath et al. 2012). They detected between 4 × 101 to 103
genome copies per well, but the system requires 16 wells to perform the complete
multiplex. The turn-around time from amplification to identification is slightly over
80 min. The CABBA assay compares favorably since it required approximately 75
min for PCR amplification and microarray detection, and can detect 10 2 genome
copies of 11/12 airborne target species.
149
5.7 Conclusion
We used evolutionary conserved regions of the tuf gene to develop a rapid molecular
assay on microarray to detect 12 CABBA (Bacillus anthracis, Brucella spp., Burkholderia
mallei, Burkholderia pseudomallei, Chlamydophila psittaci, Clostridium botulinum groups
I and II, Clostridium perfringens, Coxiella burnetii, Francisella tularensis, Mycobacterium
tuberculosis
complex,
Rickettsia
prowazekii,
and
Yersinia
pestis).
Microarray
hybridization probe patterns allow specific discrimination of genetic species. The entire
procedure for PCR amplification and microfluidic-microarray detection required
approximately 75 min. This screening assay shows promise to improve immediate
response to real or suspected bioterrorist attacks by minimizing their impact on
populations. In the future, the CABBA assay could be integrated into a portable micrototal analysis system (μTAS) allowing complete automated analysis directly from
suspect specimens in the field.
150
5.8 Ackowledgments
We are grateful to Drs. Robert R. Brubaker, Louis Bryden, Thomas A. Ficht, Sharon
Peacock, Heidi Wood, Katsuya Hirai, Didier Raoult, Donald E. Woods, Daisy
Vanrompay, Tina Zimmerman, Health Canada, and DRDC Suffield, who generously
provided genomic DNA.
We would like to thank all members of the Molecular Diagnostics Team, notably Karel
Boissinot and Marie-Claude Hélie, for technical support. Dr Eric Frost, Keith Logan, and
Manon Tétreault are acknowledged for proof-reading and graphical support. We are
grateful to our collaborators from the University of Irvine, CRTI, DRDC, and RCMP for
key materials and enlightening discussions. This research project was funded by
Genome Canada, Genome Québec, and the Canadian Institutes of Health Research.
S. I. received scholarships from the Fonds de la recherche en santé du Québec
(Montréal, Canada) and the Fondation Dr George Phénix (Montréal, Canada).
151
5.9 References
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155
5.10 Tables and figures
Tableau 9. CABBA and diseases.
Phylum
Family
Genus
Actinobacteria Mycobacteriaceae Mycobacterium
Chlamydiaceae
Chlamydophila
Chlamydiae
Bacillaceae
Bacillus
Firmicutes
Clostridiaceae
Clostridium
Brucella
Protoebacteria Brucellaceae
Rickettsiaceae
Rickettsia
Burkholderiaceae Burkholderia
Enteroacteriaceae Yersinia
Coxiellaceae
Coxiella
Francisellaceae
Francisella
Species
Disease
tuberculosis complex
psittaci
anthracis
botulinum
perfringens
spp.
prowazekii
mallei
pseudomallei
pestis
burnetii
tularensis
Tuberculosis
Psittacosis
Anthrax
Botulism
Epsilon toxin disease
Brucellosis
Epidemic typhus
Meleidosis
Glanders
Plague
Q fever
Tularemia
References: (Bergey's Manual Trust 2010; CDC 2000; Greub 2010; Parsons et al. 2011; Rotz et al. 2002).
156
Figure 18. tuf gene sequence variability for 12 CABBA using the SVARAP program.
Positions of the two highly conserved short regions (~25 bp, position 763 to 791 and 991 to 1017 in Y.
pestis KIM10, AN AE009952.1) separated by a more variable longer region (~200 bp, position 792 to 990
in Y. pestis KIM10) for capture probe (CPR) design are illustrated within the tuf gene.
157
Tableau 10. Biased-broad-spectrum PCR primers used for amplification of tuf gene of 12 CABBA.
Cy3-Forward primers
Cat. Species
A
B
C
B. anthracis
C. botulinum I
C. botulinum II
F. tularensis
Y. pestis
Brucella spp.
B. mallei
B. pseudomallei
C. psittaci
C. perfringens
C. burnetii
R. prowazek ii
M. tuberculosis
Total
Name
TcbaR769e
TcbaR766a
TcbaR766b
TcbaR769f
TcbaR772
TcbaR772
TcbaR772
TcbaR772
TcbaR768
TcbaR766c
TcbaR772a
TcbaR768
TcbaR772b
9 primers
Co.
P-Reverse primers
Sequence (5'→ 3')
0.3
C T GG T G T A GA GA
0.3
T G T A C A GGA A T I GA A A
0.3 G T T G T A A C T G G A A T A G A A A
0.4
C T GG T G T GGA A A
0.2
GGC G T I GA A A
NA
GGC G T I GA A A
NA
GGC G T I GA A A
NA
GGC G T I GA A A
0.3
T A C A GG T G T I GA A A
0.3
G T A A C A GGA A T C GA A A
0.2
GGC G T T GA GA
NA
T A C A GG T G T I GA A A
0.2
GG T G T GGA GA
TGT TCCGTAA
T G T T C A GA A A
T G T T C A GA A A
TGT TCCGTAA
T G T T C C GC A A
T G T T C C GC A A
T G T T C C GC A A
T G T T C C GC A A
T GTTT C A G A A A
T G T T C A GA A A
T G T T T C GC A A
T G T T C A GA A A
T G T T C C GC A A
Name
Co.
Sequence (5'→ 3')
TcbaR991a 0.25
A C G T C I G T I G T A C GGA A G T A GA A
TcbaR991k 0.25
A C G T C T G T T G T T C T GA A G T A GA A
TcbaR991k NA
A C G T C T G T T G T T C T GA A G T A GA A
TcbaR991a NA
A C G T C I G T I G T A C GGA A G T A GA A
TcbaR991a NA
A C G T C I G T I G T A C GGA A G T A GA A
TcbaR991a NA
A C G T C I G T I G T A C GGA A G T A GA A
TcbaR991c 0.4
T C C G T C G T A C GGA A G T A GA A
TcbaR991c NA
T C C G T C G T A C GGA A G T A GA A
TcbaR991g 0.3
A C A T C T G T T G T A C GGA A GA A GA A
TcbaR991k NA
A C G T C T G T T G T T C T GA A G T A GA A
TcbaR991d 0.3
T C C G T C G T GC GGA A A T A A A A
TcbaR991e 0.3 G G T A A C A T C T G T T G T T C T A A A A T A G A A
TcbaR991f 0.3
T C GG T GG T GC GGA A G T A GA A
7 primers
Legend: A: adenosines are in green; C: cytosines are in blue; G: guanines are in purple; I: inosines are in yellow; T: thymines are in red.
Cat.: CDC category.
Co.: primer concentration (µM).
NA: not applicable, redundant primer concentration previously specified.
158
Tableau 11. CABBA assay capture probes and hybridization results for each capture probe using
low quantity of gDNA.
Species (strains)
Probe names
Sequences (5’ → 3’)
LATD
(GC)
B. anthracis
BantBcerH877
ACAGAACCGCTTTTTGCAAG
(Ames, Vollum)
BantBcerH897a
Nb+
10
PT
(%)
9.4
4/4
MPS
(%)
26.7
TGAATTTAGCGTGAGCTTTT
10
2
3.2
4/4
7.0
AGATAATACGAAAACTTCAG
TCTCCTGCCATTGCTTCATC
10
2
C. botulinum group I
BantBcerH920a
CbotH799
3.6
15.6
4/4
4/4
14.1
26.4
(20:1.2, 20:2.1)
CbotH835
TCTCTTTGGATACCTCTTAA
13.5
4/4
18.7
CbotH845
TTGGATTTCGTCTCTTTGGA
10
2
10
20.4
4/4
26.0
C. botulinum group II
CbotH878
TACTGAATTAGGTACTGCTA
10
2
4.4
4/4
6.6
(20:3.1, 20:3.3)
CbotH902
TGACCTACGAACTTAGTGTG
10
2
2.4
4/4
8.0
F. tularensis
(ATCC 29684, ATCC
FtulH793
FtulH834
GCTTCCCCTCTATCTAAAAG
CTCTCTTAAGTCCACGAACT
10
2
1.9
2.7
6/6
6/6
12.9
11.6
15482, T58)
FtulH871
TTGTGGTCTATATCCCTTGA
0.8
6/6
6.6
Y. pestis
YpesYpseH844
TGAACATCGTCACGCTTAGT
10
2
10
2.2
4/4
3.5
(KIM D27, PP2868)
YpesYpseH849
CACGCTGAACATCGTCACGC
10
2
3.3
4/4
5.1
GGTTTGATAGAACCTGGTTT
GGATCAGCGCGCCAATGTTG
10
2
Brucella spp.
YpesYpseH883
BruGH819
10
0.4
0.8
4/4
4/4
0.9
1.3
(S2308, 06-010)
BruGH842
AACGTCTTCACGGCCAACGC
10
2
2.6
4/4
4.4
BruGH925
TCCTTGGTCAGAATATAGGC
2
4/4
6.4
B. mallei
BmalH908a
CACTTCTGCCGTGAAGTGCG
10
2
10
4.4
0.2
5/5
0.5
(ATCC 23344, GB8)
BmalH913
ACGTACACTTCTGCCGTGAA
2
10
1.2
5/5
2.4
BpseH792
BpseH797
CCTGACCCTGATCCAGCAGC
GCCCGCCTGACCCTGATCCA
2
10
5.0
2.6
5/5
5/5
8.0
6.4
B. pseudomallei
BpseH792
CCTGACCCTGATCCAGCAGC
5.0
7/7
23.4
(1026b, 316a, K96243)
BpseH797
GCCCGCCTGACCCTGATCCA
10
2
10
2.6
7/7
20.3
C. psittaci
CpsiH817
AGAAGTAGACCTACGTTTTC
10
2
6.5
2/2
13.5
(84/0055)
CpsiH841
ACATCATTTTTCCCAATACC
10
2
4.1
2/2
9.9
C. perfringens
(ATCC 13124T,
CperH878a
CperH878b
ATTGTTCCAACTTGTGCTAA
ATTGTTCCAACTTGAGCTAA
10
2
8.3
5.1
4/4
4/4
11.1
9.7
CCUG 23083)
CperH883
GGGTTGATTGTTCCAACTTG
7.1
4/4
14.1
C. burnetii
CburH834
CGCGTTTCGTCCCTCTCAAT
10
2
10
4.3
6/6
26.5
(Phase I, Nine Mile phase II, NA) CburH917
CAACACATAAATCTCCGCCT
10
2
2.7
6/6
24.1
R. prowazekii
RproH802
TTATCTCCAGATTGTCCTTC
10
4
2.8
2/2
6.3
(10*07)
RproH810
RproRtypH858
TACCGACATTATCTCCAGAT
GTACTTGTCCTCTTTCTACT
10
4
3.6
0.4
2/2
2/2
6.9
7.4
RproRtypH969
GTGGGCGATAATCATTAGTA
0.1
2/2
3.6
RproRtypH858
GTACTTGTCCTCTTTCTACT
10
2
10
0.4
2/4
0.5
(CDC, NA)
RproRtypH969
GTGGGCGATAATCATTAGTA
10
2
0.1
2/4
0.3
M. tuberculosis
(ATCC 25177, H37rv)
MtbcH817
MtbcH824
CAGCAGCAAACCAACGTTGT
CGCCCCGCAGCAGCAAACCA
10
2
10
1.1
3.2
4/4
4/4
2.3
12.3
MtbcH831
GCTTGACGCCCCGCAGCAGC
CTACACCGCGAAGAAGTGCT
CCAATG
10
2
6.1
4/4
11.6
2
0.4
17/17
1.9
NA
258
/258
100
R. typhi
a
B. atrophaeus [AC&HC]
HC
BgloH822
bbc1a
a
GAGTATGGTCTGCCTATCCT
2
2
10
2
2
10
2
2
2
10
2
2
10
2
4
10
4
2
10
NA
Legend. Rickettsia typhi, a species closely related to R. prowazekii (Brenner et al. 2005), was used to
study the analytical sensitivity of the Rickettsia typhus group. AC: amplification control. HC: hybridization
control. LATD: lowest amount of CABBA genome copies (GC) tested and detected. PT: probe positivity
threshold for each capture probe calculated by ROC curve analyses. Nb+: number of microarray
experiments with positive probe signal/number of microarray experiments performed. MPS: median probe
2
4
signal when using low DNA quantity (10 or 10 genome copies). NA: non available.
159
Probes
A-S-TBantBcerH877
A-S-TBantBcerH897a
A-S-TBantBcerH920a
A-S-TBruGH819
A-S-TBruGH842
A-S-TBruGH925
A-S-TBmalH908a
A-S-TBmalH913
A-S-TBpseH792
A-S-TBpseH797
A-S-TCpsiH817
A-S-TCpsiH841
A-S-TCbotH799
A-S-TCbotH835
A-S-TCbotH845
A-S-TCbotH878
A-S-TCbotH902
A-S-TCperH878a
A-S-TCperH878b
A-S-TCperH883
A-S-TCburH834
A-S-TCburH917
A-S-TFtulH793
A-S-TFtulH834
A-S-TFtulH871
A-S-TMtbcH817
A-S-TMtbcH824
A-S-TMtbcH831
A-S-TRproH802
A-S-TRproH810
A-S-TRproRtypH858
A-S-TRproRtypH969
A-S-TbYpesYpseH844
A-S-TbYpesYpseH849
A-S-TaYpesYpseH883
Tableau 12. Specificity of microarray probes, results of hybridization of all CABBA and 40
other species.
Cat.
Species
Strains
A
B. anthracis
Ames, Vollum
C. botulinum types I
20:1.2, 20:2.1
B
+
-
+
-
+
-
-
-
-
±
-
±
-
-
-
-
+
-
+
-
+
-
+
-
+
-
-
-
-
-
-
+
-
+
-
+
-
-
-
-
-
-
-
±
+
±
±
+
+
-
-
+
+
-
+
+
-
+
+
-
+
±
-
+
-
+
+
-
+
+
-
+
-
+
-
-
+
-
-
-
-
+
-
+
-
+
-
+
-
+
-
-
-
-
-
-
-
+
+
+
+
±
±
±
-
C. botulinum type II
20:3.1, 20:3.3
F. tularensis
ATCC 29684, ATCC 15482, T58
Y. pestis
KIM D27, PP2868
B. abortus
S2308
B. melitensis
06-010
B. mallei
ATCC 23344, GB8
B. pseudomallei
1026b, 316a, K96243
C. psittaci
84/0055
C. perfringens
C. burnetii
ATCC 13124T, CCUG 23083
Phase I, Nine Mile phase II, NA
R. prowazek ii
10*07
-
M. tuberculosis
ATCC 25177, H37rv
- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - + + + - - - - - - -
AC&HC B. atropheus
CCRI-9827
- - - - ± - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - ± - - ± -
OBA
E. coli
ATCC 43894
S. enterica Typhi
ATCC 10749
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
±
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
±
-
-
+
+
-
+
-
+
-
-
+
+
-
-
+
-
±
-
±
+
-
-
-
-
±
+
+
-
±
-
-
-
+
-
-
-
-
-
-
+
-
+
+
-
-
-
-
-
+
+
-
+
+
±
-
±
+
+
+
-
±
+
+
-
±
±
±
+
±
±
±
+
+
+
-
-
-
-
-
-
-
-
-
+
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
±
-
C
SRT
Shigella dysenteriae
ATCC 11835
Staphylococcus aureus a
Vibrio cholerae
ATCC 13301
Y. enterocolitica b
ATCC 9610T
Bacillus cereus
ATCC 14579T
ATCC 6051T
Bacillus subtilis
c
Burk holderia cepacia
Burk holderia thailandensis
Chlamydia trachomatis
Chlamydophila pneumoniae c
Clostridium novyi
ATCC 25416
CCUG 48851T
ATCC VR-902B
ATCC VR-1360
ATCC 19402
ATCC 12464T
CCRI-11128, CCRI-11132
Clostridium tetani
ATCC 19406T
Francisella philomiragia
ATCC 25018T
Mycobacterium avium c
ATCC 25291T
CCRI-5434
Mycobacterium k ansasii c
Mycobacterium terrae
Ochrobactrum anthropi
Rick ettsia ak ari
Rick ettsia conorii
Rick ettsia felis
CCRI-5435
ATCC 49188 T
01-02-08
9-4-08
30-05-08
Rick ettsia rick ettsii a
Rick ettsia typhi
CDC
Wolbachia persica
VR-331
Yersinia k ristensenii
ATCC 33638T
Yersinia pseudotuberculosis
ATCC 29833T
Acinetobacter baumannii
ATCC 19606T
Bordetella pertussis
ATCC 9797T
Corynebacterium diphteriae
HuC
T
Clostridium sporogenes
Clostridium septicum
OAP
ATCC 25870
CDC, NA
T
Haemophilus influenza
ATCC 27010
ATCC 9006
Klebsiella pneumonia
ATCC 27736
Legionella pneumophila
ATCC 33152T
Neisseria meningitidis
Pseudomonas aeruginosa
ATCC 13077T
ATCC 39018
Streptococcus pneumoniae
ATCC 27336
Streptococcus pyogenes
ATCC 12384
Homo sapiens
Hsap-11, Hsap-17
Legend. The horizontal line separates CABBA (above) and other species (below). OBA, other biothreat agents
of the CDC; SRT, species related to targets; OAP, other airborne pathogens; HuC, Human DNA control. Some
a)
b)
c)
species can be classified in more than one category: OBA and OAP, OBA and SRT, and SRT and OAP.
+, all microarray replicates showed positive results; -, all microarray replicates showed negative results; ±,
microarray replicates showed positive and negative results.
160
6 Divergence du gène codant pour le facteur
d’élongation Tu des espèces du genre Yersinia
Avant propos
Divergence Among Genes Encoding the
Elongation Factor Tu of Yersinia Species
COURT TITRE :
tuf gene divergence in Yersinia species
AUTEURS
Sandra Isabel1, Éric Leblanc1, Maurice Boissinot1, Dominique K. Boudreau1, Myrian
Grondin1, François J. Picard1, Eric A. Martel1, Nicholas J. Parham1, Patrick S. G. Chain2,3,4,
Douglas E. Bader5, Michael R. Mulvey6, Louis Bryden6, Paul H. Roy1, Marc Ouellette1 and
Michel G. Bergeron1†
1
Centre de recherche en infectiologie de l‘Université Laval, Centre hospitalier
universitaire de Québec, Pavillon CHUL, Québec, Québec, Canada.
2
Chemistry, Materials, and Life Sciences Directorate, Lawrence Livermore National
Laboratory, Livermore, California.
3
Microbial Program, Joint Genome Institute, Walnut Creek, California.
4
Department of Microbiology and Molecular Genetics, Michigan State University, East
Lansing, Michigan.
5
Defence R&D Canada - Suffield, Medicine Hat, Alberta, Canada.
6
National Microbiology Laboratory, Public Health Agency of Canada, Winnipeg,
Manitoba, Canada.
† Corresponding author. Mailing address: Centre de recherche en infectiologie de
l‘Université Laval, CHUQ (Pavillon CHUL), 2705 Blvd. Laurier, Québec, Québec,
Canada. G1V 4G2. Phone: (418) 654-2705. Fax: (418) 654-2715.
E-mail: [email protected].
162
Précisions sur le rôle exact de l’étudiante dans la préparation de l’article.
L‘étudiante a contribué à l‘élaboration du projet de recherche, a réalisé une partie
des expériences de séquençage ainsi que toutes les analyses phylogénétiques
publiées. L‘étudiante a écrit la première version du manuscrit et a procédé aux
modifications suggérées par les coauteurs et les réviseurs.
Précisions sur le rôle des coauteurs dans la préparation de l’article.
Michel G. Bergeron, Maurice Boissinot, Éric Leblanc et François J. Picard ont
élaboré et supervisé le projet de recherche.
Dominique K. Boudreau a réalisé des analyses phylogénétiques préliminaires et a
supervisé le déroulement des expériences in silico préliminaires.
Myrian Grondin a réalisé le design des amorces de séquençage, une partie des
expériences de séquençage ainsi que des analyses phylogénétiques préliminaires.
Eric A. Martel a apporté une expertise en phylogénie et a trouvé des solutions bioinformatiques permettant de réaliser des analyses avant-gardistes.
Patrick S. G. Chain, Nicholas J. Parham, Michel Ouellette et Paul H. Roy ont
apporté leur expertise en génomique pour l‘élaboration et la réalisation du projet de
recherche.
Douglas E. Bader, Michael R. Mulvey et Louis Bryden ont apporté leur expertise en
microbiologie et ont procuré des souches ainsi que de l‘ADN génomique pour la
réalisation du projet de recherche.
Tous les coauteurs ont révisé et commenté le manuscrit.
163
Précisions sur le statut de l’article.
L‘article au sujet de l‘évolution du gène tuf chez le genre Yersinia a été accepté
pour publication dans le Journal of Bacteriology le 27 août 2008.
Isabel S., E. Leblanc, M. Boissinot, D. K. Boudreau, M. Grondin, F.
J. Picard, E. A. Martel, N. J. Parham, P. S. G. Chain, D. E. Bader, M.
R. Mulvey, L. Bryden, P. H. Roy, M. Ouellette, M. G. Bergeron. 2008.
Divergence among genes encoding the elongation factor Tu of Yersinia
Species. Journal of Bacteriology 190(22):7548-7558.
[En ligne : http://www.ncbi.nlm.nih.gov]
Commentaires sur les modifications apportées à l’article inséré dans la thèse
comparativement à l’article publié originalement.
Le chapitre 8 de cette thèse inclut cet article et représente la version finale, telle
que publiée originalement dans le Journal of Bacteriology.
164
6.1 Résumé
Le facteur d‘élongation Tu (EF-Tu), codé par le gène tuf, transporte les acides
aminés-ARNt aux ribosomes durant la synthèse protéique. Les gènes tuf dupliqués
(tufA et tufB), retrouvés fréquemment chez les espèces d‘Enterobacteriaceae,
coévoluent habituellement par des mécanismes de conversion génique et
présentent donc de grandes similarités entre eux. Toutefois, l‘analyse des gènes
tuf dans notre laboratoire a révélé des copies très divergentes chez 72 souches du
genre
Yersinia
(représentant
12
espèces).
Les
niveaux
de
divergence
intragénomique entre les séquences de tufA et tufB fluctuent de 8,3 à 16,2 % pour
le genre Yersinia, ce qui est significativement plus élevé que les divergences de
0,0 à 3,6 % observées chez les autres espèces d‘Enterobacteriaceae. Nous avons
exploré davantage l‘évolution du gène tuf chez les Yersinia et d‘autres
Enterobacteriaceae en réalisant du séquençage et des analyses phylogénétiques.
Les arbres phylogénétiques construits en utilisant les séquences de tufA et tufB
concaténées ont révélé que le genre Yersinia était monophylétique dans la famille
des Enterobacteriaceae. De plus, les souches des Yersinia forment des clades
dans le genre Yersinia qui corrèlent essentiellement avec leurs classifications
phénotypiques et génotypiques. Ces analyses génétiques ont révélé une
divergence inhabituelle entre les séquences de tufA et tufB des Yersinia, une
caractéristique qui reste unique chez les Enterobacteriaceae séquencés et est
indicative d‘une perte du phénomène de conversion génique chez tout le genre.
Finalement, ces mêmes analyses ont procuré des informations phylogénétiques
utiles pour la reclassification possible et l‘identification des espèces Yersinia.
165
6.2 Abstract
Elongation factor Tu (EF-Tu), encoded by tuf genes, carries aminoacyl-tRNA to the
ribosome during protein synthesis. Duplicated tuf genes (tufA and tufB), which are
commonly found in enterobacterial species, usually coevolve via gene conversion
and are very similar to one another. However, sequence analysis of tuf genes in
our laboratory has revealed highly divergent copies in 72 strains spanning the
genus Yersinia (representing 12 Yersinia species). The levels of intragenomic
divergence between tufA and tufB sequences ranged from 8.3 to 16.2 % for the
genus Yersinia, which is significantly greater than the 0.0 to 3.6 % divergence
observed for other enterobacterial genera. We further explored tuf gene evolution
in Yersinia and other Enterobacteriaceae by performing directed sequencing and
phylogenetic analyses. Phylogenetic trees constructed using concatenated tufA
and tufB sequences revealed a monophyletic genus Yersinia in the family
Enterobacteriaceae. Moreover, Yersinia strains form clades within the genus that
mostly correlate with their phenotypic and genetic classifications. These genetic
analyses revealed an unusual divergence between Yersinia tufA and tufB
sequences, a feature unique among sequenced Enterobacteriaceae and indicative
of a genus-wide loss of gene conversion. Furthermore, they provided valuable
phylogenetic information for possible reclassification and identification of Yersinia
species.
166
6.3 Introduction
The genus Yersinia, a member of the family Enterobacteriaceae, is composed of
14 known species: Y. aldovae, Y. aleksiciae, Y. bercovieri, Y. enterocolitica,
Y. frederiksenii,
Y. intermedia,
Y. kristensenii,
Y. massiliensis,
Y. mollaretii,
Y. pestis, Y. pseudotuberculosis, Y. rohdei, Y. ruckeri, and Y. similis (Merhej et al.
2008; Sprague et Neubauer 2005; Sprague et al. 2008; Sulakvelidze 2000). Three
of these species are important human pathogens. Y. pestis is the etiologic agent of
plague, while Y. enterocolitica and Y. pseudotuberculosis usually cause selflimiting food-borne illnesses.
Interspecies and intraspecies genetic studies of relationships of Yersiniae based
on DNA-DNA hybridization and sequencing of housekeeping genes have provided
additional information not encompassed by the current classification, which is
based mainly on biochemical phenotypes (Demarta et al. 2004; Dolina et al. 1995;
Dolina et Peduzzi 1993; Kotetishvili et al. 2005). Thus, Y. enterocolitica,
Y. frederiksenii, and Y. kristensenii show more genetic diversity than other species
in the genus (Dolina et Peduzzi 1993; Kotetishvili et al. 2005; Neubauer et al.
2000). Indeed, more divergent strains that form their own clades could represent
novel Yersinia species. Neubauer and colleagues (Neubauer et al. 2000)
characterized
two
subspecies of
Y. enterocolitica, Y. enterocolitica
subsp.
enterocolitica and Y. enterocolitica subsp. palearctica, that have distinctive
16S rRNA sequences. Sprague and Neubauer (Sprague et Neubauer 2005)
recently proposed a novel species, Y. aleksiciae, which was differentiated from
Y. kristensenii based on a comparison of a region of the 16S rRNA gene and by
the presence of lysine decarboxylase activity. On the other hand, based on
DNA-DNA hybridization, Y. pestis and Y. pseudotuberculosis are a single
genomospecies, even though they are classified as two distinct nomenspecies
(Bercovier et al. 1980). Previous analyses revealed that Y. pestis emerged within
167
the last 9,000 to 40,000 years from a Y. pseudotuberculosis predecessor (Achtman
et
al.
1999;
Prentice
et
Rahalison
2007).
Although
Y. pestis
and
Y. pseudotuberculosis are members of the same genomospecies, the medical
implications for these organisms preclude establishment of a new nomenclature,
which could endanger laboratory workers and general public health (International
Journal of Systematic Bacteriology 1981; Judicial Commission of the International
Committee on Systematic Bacteriology 1985; Wayne 1986; Williams 1984). Finally,
Y. ruckeri is the most distant Yersinia species, and its inclusion in the genus is still
debated (Ibrahim et al. 1993; Kotetishvili et al. 2005; Sulakvelidze 2000). Clearly,
further genetic studies of the genus Yersinia are required in order to clarify the
phylogeny and reinforce the taxonomy of this group.
Previous studies using 16S rRNA gene sequences exposed this method's limited
ability to resolve the evolutionary history of Yersinia species (Kotetishvili et al.
2005). The high level of sequence conservation among 16S rRNA genes in some
bacteria and the presence of multiple copies with sequence variations in many
other bacteria limit the use of these genes for taxonomic resolution of closely
related microorganisms (Cilia et al. 1996; Coenye et Vandamme 2003). Sequence
analysis of the tuf gene has been proven to be valuable for accurate evaluation of
genetic relationships among closely related microorganisms, such as members of
the genus Enterococcus and the family Enterobacteriaceae (Ke et al. 2000;
Paradis et al. 2005). Elongation factor Tu (EF-Tu), encoded by tuf genes, carries
aminoacyl-tRNA to the programmed ribosome during protein synthesis. The
synteny
of
gammaproteobacterial
tuf
gene
regions
is
conserved.
Most
enterobacterial genomes possess two copies of the tuf gene, tufA and tufB, in
distinct operons, designated str and tRNA-tufB, respectively (Grunberg-Manago
1996; Lathe et Bork 2001). The fusA gene, which encodes elongation factor G, is
located upstream of tufA in the str operon of gammaproteobacteria (Kondrashov et
al. 2007; Lathe et Bork 2001). Four tRNA structural genes are located upstream of
tufB in the tRNA-tufB operon (Grunberg-Manago 1996), and the secE and nusG
168
genes are downstream of tufB in most Enterobacteriaceae (Grunberg-Manago
1996; Kondrashov et al. 2007; Lathe et Bork 2001). The tufA and tufB genes
appear to evolve in concert through gene conversion events that maintain the
sequence homology. A previous analysis of duplicated bacterial tuf genes revealed
identical or very similar nucleic acid sequences that differ by less than 1.4 % (Lathe
et Bork 2001). In contrast, the data presented here show that the tufA and tufB
gene copies in 12 species of the genus Yersinia have a remarkable level of
variability (up to 16 %). Chain and colleagues have observed a similar level of
divergence in Y. pestis and Y. pseudotuberculosis (Chain et al. 2006). In the
current work, we performed an in-depth study of tuf gene sequence variation in the
genus Yersinia. The data obtained were juxtaposed with data for closely related
members of the Enterobacteriaceae, and mechanisms for the remarkable diversity
were examined. As described here, the divergence among the Yersinia
intragenomic tuf gene sequences appears to be unique among sequenced
Enterobacteriaceae, as demonstrated by phylogenetic analyses.
169
6.4 Materials and methods
6.4.1 Bacterial strains
Sixty-six Yersinia strains (Tableau 13 [Table 1]) and 14 Enterobacteriaceae strains
(Enterobacter agglomerans ATCC 27989, Escherichia vulneris ATCC 33821,
Hafnia alvei ATCC 13337, ATCC 25927, ATCC 51873, CCRI-10616, CCRI-11829,
and CCRI-16651, Klebsiella pneumoniae ATCC 13883, Obesumbacterium proteus
ATCC 12841, Plesiomonas shigelloides ATCC 14029, Serratia fonticola DSM
4576, Serratia marcescens ATCC 13880, and Yokenella regensburgei ATCC
35313) were obtained from the American Type Culture Collection (Manassas, VA)
(ATCC), the Belgian Coordinated Collections of Microorganisms (Ghent, Belgium)
(LMG 22254), the Collection du Centre de Recherche en Infectiologie (Québec,
Canada) (CCRI) (http://www.wfcc.info/ccinfo/collection/by_id/861), the Culture
Collection of the University of Göteborg (Göteborg, Sweden) (CCUG), the
Deutsche
Sammlung
von
Mikroorganismen
und
Zellkulturen
GmbH
(Braunschweig, Germany) (DSM 4576), and the Public Health Agency of Canada
(Winnipeg, Canada) (ER 5307, ER 4215, ER, 5271, and 88-0762). All strains were
grown overnight at 30 or 37°C under aerobic conditions on Trypticase soy agar
with 5 % sheep blood.
6.4.2 DNA isolation
Bacterial DNA was isolated from mid-log-phase cultures of selected strains by
using a BioSprint 15 DNA blood kit (Qiagen, Mississauga, Ontario, Canada)
automated with a KingFisher mL instrument (Thermo Fisher Scientific, Waltham,
MA). Alternatively, a GNOME DNA kit (Qbiogene Inc., Carlsbad, CA) was used (Ke
et al. 2000).
170
a
Tableau 13 [Table 1]. Yersinia strains used in this study .
Online: [Table1]
Species or subspecies
Y. aldovae
Y. aleksiciae
Y. bercovieri
Y. enterocolitica subsp.
enterocolitica
Y. enterocolitica subsp.
palearctica
Strain
Abbreviation
ATCC 35236
ATCC 35237
CCUG 26532
CCUG 26915
LMG 22254T
88-0762
ATCC 43970T
CCUG 26330
CCUG 26539
8081
ATCC 9610T
ATCC 23715
ATCC 27729
CCUG 8238
CCRI-905
CCRI-952
CCRI-1044
CCRI-1139
CCRI-9984
CCRI-10035
CCRI-10046
CCRI-10098
CCRI-10461
CCRI-10462
CCRI-10463
CCRI-10464
CCRI-10465
CCRI-10603
CCUG 4586
CCUG 18381
CCUG 21476
CCUG 31436
CCUG 33553
CCUG 46041
T
Yad1
Yad2
Yad3
Yad4
Yak1
Yb1
Yb2
Yb3
Yb4
Ye1
Ye2
Ye3
Ye4
Ye5
Ye6
Ye7
Ye8
Ye9
Ye10
Ye11
Ye12
Ye13
Ye14
Ye15
Ye16
Ye17
Ye18
Ye19
Ye20
Ye21
Ye22
Ye23
Ye24
Ye25
Isolation
Country
Source
Czechoslovakia
Norway
Germany
Germany
Finland
NA
France
France
Germany
United States
United States
United States
Belgium
United States
Canada
Canada
Canada
Canada
Canada
Canada
Canada
Canada
Canada
Canada
Canada
Canada
Canada
Finland
Sweden
Sweden
Sweden
France
Denmark
Sweden
Drinking water
Fish
Feces
Human feces
Human feces
NA
Human feces
Food
Feces
Septicemia
Human tissue
Human blood
Human blood
Human
Human blood
Human feces
Human blood
Human blood
Human feces
Human feces
Human feces
Human feces
Human feces
Human feces
Human feces
Human feces
Human feces
Human feces
Human MLN
Human feces
Human blood
Bovine stools
Chinchilla
Human blood
Accession no.
Year
NA
NA
1983
NA
NA
NA
NA
NA
1986
NA
NA
1968
1972
NA
NA
NA
NA
NA
NA
NA
NA
NA
1976
1976
1976
1976
NA
1981
1963
1986
1987
NA
1960
2002
tufA
EF113985
EF113986
EF113987
EF113988
EF113989
EF113990
EF113991
EF113992
EF113993
AM286415b
EF113994
EF113995
EF113996
EF113998
EU566877
EU566878
EU566875
EU566876
EU566879
EU566872
EU566873
EU566874
EU566881
EU566882
EU566883
EU566884
EU566885
EU566886
EF113997
EF113999
EF114000
EF114001
EF114002
EU566880
tufB
EF114034
EF114035
EF114036
EF114037
EF114038
EF114039
EF114040
EF114041
EF114042
AM286415b
EF114043
EF114044
EF114045
EF114047
EU566908
EU566909
EU566906
EU566907
EU566910
EU566903
EU566904
EU566905
EU566912
EU566913
EU566914
EU566915
EU566916
EU566917
EF114046
EF114048
EF114049
EF114050
EF114051
EU566911
171
a
Tableau 13 [Table 1]. Yersinia strains used in this study (continued).
Species or subspecies
Y. frederiksenii
Y. intermedia
Y. kristensenii
Y. mollaretii
Y. pestis
Y. pseudotuberculosis
Y. rohdei
Y. ruckeri
Legend :
172
Strain
ATCC 29912
ATCC 33641T
CCUG 8246
CCUG 26594
CCUG 26949
CCUG 30114
ER 5307
ATCC 29909T
ATCC 33647
ATCC 33648
ATCC 33638T
CCUG 26582
CCUG 26589
CCUG 46842
ATCC 43969T
CCUG 26536
ER 4215
91001
Antiqua
CO92
KIM
ATCC 13979
ATCC 27802
ATCC 29833T
CCUG 7803
CCUG 17342
CCUG 17345
CCUG 37903
ER 5271
IP 32953
ATCC 43380T
ATCC 43871
ATCC 43873
CCUG 26544
CCUG 26545
ATCC 29473T
CCRI-10643
CCUG 21537
Abbreviation
Yf1
Yf2
Yf3
Yf4
Yf5
Yf6
Yf7
Yi1
Yi2
Yi3
Yk1
Yk2
Yk3
Yk4
Ym1
Ym2
Ym3
Ype1
Ype2
Ype3
Ype4
Yps1
Yps2
Yps3
Yps4
Yps5
Yps6
Yps7
Yps8
Yps9
Yro1
Yro2
Yro3
Yro4
Yro5
Yru1
Yru2
Yru3
Isolation
Country
Belgium
Denmark
NA
Norway
Sweden
Sweden
NA
NA
NA
NA
NA
Germany
Norway
Sweden
United States
Germany
NA
NA
NA
United States
NA
Sweden
Denmark
Turkey
Sweden
Sweden
Japan
NA
NA
NA
Germany
Germany
United States
Germany
Germany
United States
United States
NA
Source
Human
Sewage
Human
Forced pork
Human feces
Human feces
NA
Human urine
Human feces
Human urine
Human urine
Sewage
Forced meat
NA
Soil
Human feces
NA
NA
NA
Human
Human
Hare
Mink
NA
Human blood
Hare
Guinea pig
NA
NA
NA
Dog feces
Dog feces
Human feces
Human feces
Human feces
Rainbow trout
Rainbow trout
NA
Accession no.
Year
NA
NA
NA
1983
1990
1992
NA
NA
NA
NA
NA
1980
1983
2002
NA
1984
NA
NA
NA
NA
NA
1952
1943
1952
1978
1951
1951
1997
NA
NA
NA
NA
NA
1978
1989
NA
NA
NA
a
T = type strain. Abbreviations are those used in Fig. 20 [Fig. 2].
NA, not available;
MLN, mesenteric lymph node.
b
Sequences retrieved from completed genome sequences.
tufA
EF114003
EF114004
EF114005
EF114006
EF114007
EF114008
EF114009
EF114010
EF114011
EF114012
EF114013
EF114014
EF114015
EF114016
EF114017
EF114018
EF114019
AE017042b
CP000308b
AL590842b
AE009952b
EF114020
EF114021
EF114022
EU566890
EU566887
EU566888
EU566888
EU566891
BX936398b
EF114023
EF114024
EF114025
EF114026
EF114027
EF114028
EF114029
EF114030
tufB
EF114052
EF114053
EF114054
EF114055
EF114056
EF114057
EF114058
EF114059
EF114060
EF114061
EF114062
EF114063
EF114064
EF114065
EF114066
EF114067
EF114068
AE017042b
CP000308b
AL590842b
AE009952b
EF114069
EF114070
EF114071
EU566921
EU566919
EU566920
EU566918
EU566922
BX936398b
EF114072
EF114073
EF114074
EF114075
EF114076
EF114077
EF114078
EF114079
6.4.3 Primer design
The organization of the genes surrounding the tufA and tufB genes was used to
design primers for specific amplification of tufA and tufB. The bacterial fusA or
gammaproteobacterial and Deinococcus-Thermus nusG gene sequences in public
databases were assembled in a multiple alignment using the CLUSTAL W software
(version 1.83) (Chenna et al. 2003; Thompson et al. 1994). Conserved regions
were identified at the 3' end of the fusA gene and at the 5' end of the nusG gene.
The
fusA
primer
(primer
F1;
5'-GTICCIYTIKCIGARATGTTYGGITAYGC-3';
positions 1972 to 2000 in the Escherichia coli K-12 GenBank accession number
U00096 sequence) was combined with a previously designed universal primer for
the terminal region of tuf (primer T2; 5'-CCIACIGTICKICCRCCYTCRCG-3';
positions 1132 to 1154 in the E. coli K-12 sequence) (Paradis et al. 2005) to
amplify
tufA
sequences.
The
nusG
primer
(primer
N1;
5'-
AACGCCTGRACGACRTACCA-3'; positions 25 to 44 in the E. coli K-12 sequence)
was used in combination with a second universal primer for the 5' region of tuf
(primer T1; 5'-AAYATGATIACIGGIGCIGCICARATGGA-3'; positions 271 to 299 in
the E. coli K-12 sequence) (Paradis et al. 2005) to amplify tufB sequences.
6.4.4 Sequencing of tufA and tufB genes
A 1,369-bp fragment of the str operon (tufA) was amplified using the F1 and T2
primers. The N1 and T1 primers were used for specific amplification of a 1,594 bp
fragment of the tufB region. The PCR mixtures contained primers F1 and T2 or
primers
T1
and
N1
(each
at
a
concentration
of
1.0 µM),
200 µM
deoxyribonucleoside triphosphates (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ),
10 mM Tris-HCl (pH 9.0), 50 mM KCl, 0.1% Triton X-100, 2.5 mM MgCl2, 3.3 µg/µl
bovine serum albumin (Sigma-Aldrich Canada Ltd., Oakville, Ontario, Canada),
0.06 µg/µl methoxsalen (Sigma-Aldrich Canada Ltd.), and 0.025 U/µl Taq DNA
polymerase (Promega, Madison, WI) combined with the TaqStart antibody
173
(Clontech Takara Bio, Mountain View, CA) (Kellogg et al. 1994). Decontamination
of the PCR mixtures prior to PCR was performed by using a Spectrolinker model
XL-1000 UV cross-linker (Spectronics Corporation, Westbury, NY). Purified
genomic DNA (3 ng) was added to each PCR mixture, which was subjected to
thermal cycling with a PTC-200 DNA Engine thermocycler (Bio-Rad Laboratories,
Inc., Hercules, CA) as follows: 5 min at 94°C, followed by 40 cycles of 1 s at 95°C,
1 min at 60°C (for tufA) or 58°C (for tufB), and 1 min at 72°C and then a final
extension for 7 min at 72°C. Amplicons were detected using 1.2 % agarose gel
electrophoresis with 0.25 µg/ml of ethidium bromide in Tris-borate-EDTA buffer (89
mM Tris, 89 mM boric acid, 2 mM EDTA). Amplicon sizes were verified with a 1-kb
DNA ladder used as a molecular weight marker (Invitrogen, Carlsbad, CA). During
all of these steps, precautions were taken to avoid carryover of amplified DNA, as
previously described (Martineau et al. 2001). Amplification products were purified
using gel electrophoresis (1.2 % agarose at 120 V for 1 h), followed by staining
with methylene blue (Mallinckrodt Baker, Inc., Phillipsburg, NJ) and DNA
purification with a QIAquick gel extraction kit (Qiagen), as previously described (Ke
et al. 2000). Both strands of each amplicon were sequenced using an automated
ABI sequencer (Applied Biosystems, Foster City, CA) with 5 µM sequencing primer
(primer F1, T1, or T2 for tufA and primer T1 or T2 for tufB). Chromatogram
assembly and analysis were performed using the Sequencher 3.1 software (Gene
Codes Corp., Ann Arbor, MI).
6.4.5 Phylogenetic analyses
In order to investigate tuf genetic variability within the genus Yersinia, 72 strains
were chosen to represent 12 species; greater proportions of strains of known
genetically diverse species were used (Tableau 13 [Table 1]). Representative
Enterobacteriaceae other than Yersinia were selected based on their close
relationships at the phylogenetic level as determined by 16S rRNA gene sequence
analysis (Ibrahim et al. 1993; Paradis et al. 2005). Vibrio cholerae N16961 was
174
used as a nonenterobacterial outgroup. The tuf gene sequences of Erwinia
carotovora subsp. atroseptica SCRI1043 (accession number BX950851), E. coli K12 (accession number U00096), Photorhabdus luminescens subsp. laumondii
TTO1 (accession number BX470251), Salmonella enterica subsp. enterica serovar
Typhimurium strain LT2 (accession number AE006468), Shigella flexneri 2a 2457T
(accession number AE014073), V. cholerae O1 biovar El Tor strain N16961
(accession number AE003852), Y. enterocolitica subsp. enterocolitica 8081,
Y. pestis strains 91001, Antiqua, CO92, and KIM, and Y. pseudotuberculosis strain
IP 32953 (Tableau 13 [Table 1]) were retrieved from complete genome sequences
available from the GenBank database (Achtman et al. 1999; Bell et al. 2004; Chain
et al. 2004; Chain et al. 2006; Duchaud et al. 2003; Heidelberg et al. 2000; Liao et
al. 2003; McClelland et al. 2001; Thomson et al. 2006; Welch et al. 2002; Zhou et
al. 2004). A multiple-sequence alignment of the newly generated tuf sequences
and sequences from the GenBank database was constructed using the CLUSTAL
W software. The alignment was verified by visual inspection using the SeqLab
editor (GCG Wisconsin Package, version 10.3; Accelrys Software Inc., San Diego,
CA). A 771-bp region of the tufA and tufB genes (positions 316 to 1086 in Y. pestis
CO92) was analyzed. The nucleic acid sequences were translated into amino acid
sequences (residues 105 to 361) using the Translate function of the GCG
Wisconsin Package and then inspected with the SeqLab editor to identify variations
in residues between Yersinia EF-TuA (encoded by tufA) and EF-TuB (encoded by
tufB). Levels of identity between tufA and tufB nucleic acid sequences and levels of
similarity between the gene products were calculated with the GAP function of the
GCG Wisconsin Package (BLOSUM62 amino acid substitution matrix) (Tableau 14
[Table 2] and Tableau 15 [Table 3]) (Henikoff et Henikoff 1992). Phylogenetic
analyses of comparative (Figure 19A [Figure 1A]) and concatenated (Figure 19B
[Figure 1B]) tufA and tufB nucleic acid sequences were performed with the MEGA4
software (Tamura et al. 2007) in order to compute evolutionary distances using the
maximum composite likelihood method (Tamura et al. 2007; Tamura et al. 2004).
175
The differences in composition bias among sequences were considered in
evolutionary comparisons (Tamura et Kumar 2002). One thousand bootstrap
analyses were performed to estimate the robustness of the phylogenetic inference
(Felsenstein 1985). A split network was computed using SplitsTree 4.8 for Unix,
and genetic distances were calculated using the uncorrected P method (Huson et
Bryant 2006). A split network was also constructed using the Neighbor-Net method
(Bryant et Moulton 2004) and EqualAngle split transformation settings.
6.4.6 Nucleotide sequence accession numbers
Partial tufA and tufB gene sequences have been deposited in the GenBank
database under the following accession numbers: Yersinia strains, EF113985 to
EF114030, EU566872 to EU566891, EF114034 to EF114079, and EU566903 to
EU566922 (Tableau 13 [Table 1]); E. agglomerans ATCC 27989, EU566892 and
EU566923; E. vulneris ATCC 33821, EU566893 and EU566924; H. alvei ATCC
13337, ATCC 25927, ATCC 51873, CCRI-10616, CCRI-11829, and CCRI-16651,
EF114031, EU566894 to EU566898, EF114080, and EU566925 to EU566929; K.
pneumoniae ATCC 13883, EF114032 and EF114081; O. proteus ATCC 12841,
EU566899 and EU566930; P. shigelloides ATCC 14029, EU566900 and
EU566931; S. fonticola DSM 4576, EU566901 and EU566932; S. marcescens
ATCC 13880, EF114033 and EF114082; and Y. regensburgei ATCC 35313,
EU566902 and EU566933.
176
6.5 Results
6.5.1 tufA and tufB gene similarities
All 72 Yersinia strains analyzed in this study possessed two divergent copies of the
tuf gene, tufA and tufB. The levels of intragenomic identity for tufA and tufB nucleic
acid sequences varied from 83.8 to 91.7 % for the 771-bp region studied (Tableau
14 [Table 2]). In contrast, 12 Enterobacteriaceae strains (E. agglomerans ATCC
27989,
E. carotovora
SCRI1043,
E. coli
K-12,
E. vulneris
ATCC
33821,
K. pneumoniae ATCC 13883, P. luminescens TTO1, P. shigelloides ATCC 14029,
S. enterica subsp. enterica serovar Typhimurium LT2, S. fonticola DSM 4576,
S. marcescens ATCC 13880, S. flexneri 2457T, and Y. regensburgei ATCC
35313), as well as a Vibrionaceae strain (V. cholerae N16961), had levels of
intragenomic tufA and tufB identity ranging from 98.8 to 100.0% (Tableau 14 [Table
2]). Interestingly, all six strains of H. alvei (ATCC 13337, ATCC 25927, ATCC
51873, CCRI-10616, CCRI-11829, and CCRI-16651) and O. proteus ATCC 12841
exhibited intermediate levels of identity for tufA and tufB, which ranged from 96.4 to
97.1 %; this distinguished these strains from both Yersinia and other genera of the
Enterobacteriaceae. The levels of intragenomic amino acid similarity for EF-TuA
and EF-TuB exhibited a similar pattern and ranged from 94.9 to 98.1 % for Yersinia
strains, from 97.3 to 98.3 % for H. alvei and O. proteus strains, and from 99.6 to
100 % for other Enterobacteriaceae strains, as well as V. cholerae N16961
(Tableau 14 [Table 2]). Amino acid sequence similarities for all EF-TuA and EFTuB sequences from strains of Yersinia, strains of other Enterobacteriaceae, and
Vibrionaceae strains were also examined (residues 105 to 361). Amino acid
residues in functionally important sites are conserved in Yersinia (Kushiro et al.
1987). However, two amino acid positions that can distinguish all Yersinia tufA
sequences from all tufB sequences were found (at position 167, Ile or Leu in EFTuA and Thr in EF-TuB; at position 361, Thr in EF-TuA and Asn in EF-TuB).
Therefore, these residues can be used as signature residues to discriminate
177
between the tufA and tufB genes in Yersinia strains. Residue 167 is different (Ile,
Leu, or Thr) in the other genera of the Enterobacteriaceae studied, and therefore
the difference between EF-TuA and EF-TuB reported here is not specific to the
genus Yersinia. In contrast, EF-Tu residue 361 is conserved among most of the
Enterobacteriaceae strains (Thr) investigated in this study; the exceptions are the
residues in EF-TuB in the genera Yersinia (Asn), Hafnia (Asn or Ser), and
Obesumbacterium (Asn).
The levels of interspecies similarity for tufA and tufB genes and their products are
shown in Tableau 15 [Table 3]. Most notably, when the EF-TuA amino acid
sequences
of
Y. rohdei
were
compared
to
those
of
Y. pestis
and
Y. pseudotuberculosis, the levels of interspecies similarity were 100 %, even
though the levels of tufA nucleotide sequence identity were 95.9 to 96.4 %
(Tableau 15 [Table 3]). Also, the level of EF-TuB amino acid sequence similarity for
Y. aldovae, Y. enterocolitica, and Y. kristensenii was 100.0 %, while the levels of
tufB nucleic acid sequence identity ranged from 90.8 to 94.7 %. These examples
suggest that there is selective pressure for both the EF-TuA and EF-TuB proteins
to maintain amino acid sequence stability.
6.5.2 Phylogenetic tree
A phylogenetic tree based on tufA and tufB nucleic acid sequences was
constructed to study the evolution of orthologous and paralogous tuf genes in
Yersinia compared to other genera in the family. Non-Yersinia enterobacterial
reference strains were selected based on their relatively close relationships to the
genus Yersinia at the phylogenetic level, based on 16S rRNA gene sequences.
The paralogous genes of most of the non-Yersinia species are very similar and
group together, forming an organismal tufA-tufB clade. On the other hand, the
paralogous tuf genes of Yersinia strains showed the distinctive evolution of these
strains (Figure 19A [Figure 1A]). Based on the data obtained, it is clear that
178
intragenomic tufA and tufB genes in Yersinia have diverged significantly. H. alvei
and O. proteus are minor exceptions within the Enterobacteriaceae, because they
form two other clades with separated tufA and tufB genes. The Yersinia, H. alvei,
and O. proteus tufB interspecies distances (branch lengths) are approximately
twice the interspecies distances for the tufA genes. The topology of the
phylogenetic tree shows that Yersinia tufA gene sequences are monophyletic,
while the tufB sequences are diphyletic. The Yersinia tufA clade branches with the
Y. aldovae Y. enterocolitica Y. kristensenii tufB clade, which is separated from the
tufB sequence cluster of other Yersinia species by other enterobacterial genera.
However, this topology is not supported by the results of the bootstrap analysis.
6.5.3 Phylogenetic network
While phylogenetic trees describe evolutionary relationships based on mutational
events, phylogenetic networks allow incorporation of more complex models of
evolution, such as recombination and gene duplication (Huson et Bryant 2006).
Because the evolution of tuf genes in Enterobacteriaceae was driven not only by
mutation but also by gene conversion events, the Neighbor-Net method was used
to visualize and analyze incompatible phylogenetic signals that are represented by
edges (Bryant et Moulton 2004; Kloepper et Huson 2008). Yersinia tufA and tufB
sequences were analyzed by the Neighbor-Net method implemented in the
SplitsTree software (Figure 20 [Figure 2]). The Neighbor-Net analysis results
support the clustering of Yersinia tufA and tufB sequences previously observed in
the phylogenetic tree (Figure 19A [Figure 1A]) and display the paralogous tufA and
tufB genes in Yersinia as separate clusters linked by edges near the origin. In
contrast, other paralogous enterobacterial tufA and tufB sequences are grouped
and linked by edges at the extremities. This indicates that there was ancestral
divergence of Yersinia tufA from tufB, while in other Enterobacteriaceae the tufA
and tufB genes are still coevolving. The H. alvei-O. proteus group is an exception
in which there are two separate tufA and tufB clusters, which have intermediate
179
distances of the edges to the origin compared to Yersinia strains and the other
Enterobacteriaceae strains. This suggests that there was more recent divergence
compared to the genus Yersinia. There is no evidence that H. alvei and O. proteus
tuf paralogs are still coevolving.
180
a
Tableau 14 [Table 2]. tuf sequence variations in Yersinia .
Online: [Table 2]
Intraspecies variation
Intragenomic variation
Species
n
Nucleic acid identity (%) Amino acid similarity (%)
of tufA and tufB
of EF-TuA and EF-TuB
Y. aldovae
Y. aleksiciae
Y. bercovieri
Y. enterocolitica
Y. frederiksenii
Y. intermedia
Y. kristensenii
Y. mollaretii
Y. pestis
Y. pseudotuberculosis
Y. rohdei
Y. ruckeri
Yersinia
H. alvei
O. proteus
Other Enterobacteriaceae
V. cholerae (outgroup)
4
1
4
25
7
3
4
3
4
9
5
3
72
6
1
12
1
87.4-87.7
83.8
83.9
90.5-91.7
86.0-87.8
84.7-85.2
88.8-89.9
84.7-85.1
85.7-85.9
85.9-86.0
84.7-85.1
85.2
83.8-91.7
96.4-97.0
97.1
98.8-100.0
99.1
96.1
96.1
95.7-96.1
96.1-98.1
95.3-95.7
94.9-95.3
96.1
94.9-95.7
96.5
96.5
96.1
94.9
94.9-98.1
97.7-98.8
97.3
99.6-100.0
99.6
Nucleic acid identity
(%)
Amino acid similarity
(%)
tufA
tufB
EF-TuA
EF-TuB
99.9-100.0
NA
99.6-100.0
93.9-100.0
92.5-100.0
99.7-99.9
100.0
96.9-99.7
100.0
99.7-100.0
99.7-100.0
100.0
92.5-100.0
98.4-100.0
NA
NA
NA
98.8-100.0
NA
99.9-100.0
97.7-100.0
92.0-100.0
98.7-99.6
96.9-100.0
99.9-100.0
99.9-100.0
97.5-100.0
99.2-100.0
100.0
92.0-100.0
95.3-100.0
NA
NA
NA
100.0
NA
100.0
97.7-100.0
96.9-100.0
100.0
100.0
98.8-100.0
100.0
100.0
100.0
100.0
96.9-100.0
100.0
NA
NA
NA
100.0
NA
99.6-100.0
100.0
99.6-100.0
99.6-100.0
100.0
100.0
98.8-100.0
99.6-100.0
100.0
100.0
98.8-100.0
98.4-100.0
NA
NA
NA
a
Legend : n, number of strains;
NA, not applicable.
181
Tableau 15 [Table 3]. Interspecies variations of tuf sequences in Yersinia.
Online: [Table 3]
Species (no. of
strains)
% tuf identity (% EF-Tu similarity)a
Y.
aldovae
Y. aldovae (4)
84.7-85.2
(97.3)
85.2-85.6
Y. bercovieri (4)
(96.9-97.3)
92.3-93.4
Y. enterocolitica (25)
(100.0)
86.3-87.7
Y. frederiksenii (7)
(97.3-97.7)
85.2-86.3
Y. intermedia (3)
(97.3-97.7)
90.8-92.5
Y. kristensenii (4)
(100.0)
87.4-87.9
Y. mollaretii (3)
(96.9)
83.7-84.2
Y. pestis (5)
(96.9)
83.9-84.8
Y. pseudo(96.9)
tuberculosis (4)
86.6-87.3
Y. rohdei (5)
(97.3)
84.8-85.1
Y. ruckeri (3)
(97.3)
Y. aleksiciae (1)
a
Y.
Y.
Y.
Y.
Y.
Y.
Y.
Y.
Y. pseudo
aleksiciae bercovieri enterocolitica frederiksenii intermedia kristensenii mollaretii
pestis tuberculosis Y. rohdei Y. ruckeri
95.7-95.9 95.3-95.6
91.8-93.9
92.1-95.7
96.1-96.4
93.3-93.4
93.5-96.0
92.6-92.7
92.6-92.7
93.3-93.6 93.3-93.4
(100.0)
(100.0)
(97.3-97.7)
(96.9-100.0)
(99.6)
(97.7)
(98.8-100.0)
(97.7)
(97.7)
(97.7)
(97.7)
99.4-99.5
92.6-94.6
93.8-97.8
95.9-96.0
94.0 (97.7)
96.1-97.9 92.6 (97.7)
92.6
92.6-92.9
93.4
(100.0)
(97.3-97.7)
(96.9-100.0)
(99.6)
(98.8-100.0)
(97.7)
(97.7)
(97.7)
94.8-94.9
92.1-94.2
93.3-97.8
95.5-95.7
93.5-93.6
96.0-97.9
92.1-92.2
92.1-92.2
92.1-92.5 92.9-93.0
(99.6-100.0)
(97.3-97.7)
(96.9-100.0)
(99.6)
(97.7)
(98.8-100.0)
(97.7)
(97.7)
(97.7)
(97.7)
84.7-85.1 85.5-85.9
91.6-95.7
91.6-93.7
93.9-98.1
92.1-95.1
94.4-95.3
94.2-95.3
94.0-95.6 94.0-94.9
(97.3)
(96.9-97.3)
(97.3-99.2)
(96.9-98.1) (97.7-100.0) (97.3-98.4) (98.1-99.6) (98.1-99.6) (98.1-99.6) (98.1-98.8)
86.1-87.8 86.5-87.7
87.9-88.8
92.1-95.7
92.5-94.2
93.1-96.1
91.1-96.4
91.1-96.4
91.6-97.4 92.3-95.2
(99.2-99.6) (98.8-99.6) (97.3-97.7)
(96.5-99.6) (97.3-97.7) (96.9-100.0) (97.7-99.6) (97.7-99.6) (97.7-99.6) (97.7-98.8)
85.0-85.2 83.9-84.4
85.9-87.0
89.1-90.8
93.8-94.0
94.0-96.2
92.3-92.5
92.3-92.5
93.0-93.4 93.9-94.0
(99.2-99.6) (98.8-99.6) (97.3-97.7)
(99.2-100.0)
(98.1)
(98.4-99.6)
(97.3)
(97.3)
(97.3)
(97.3)
83.9-84.7 83.7-84.6
92.1-94.7
85.9-87.5
84.6-86.0
93.6-94.4
94.0
93.8-94.0
94.0-94.3
94.3
(97.3)
(96.9-97.3)
(100.0)
(97.3-97.7)
(97.3-97.7)
(97.7-98.4)
(98.1)
(98.1)
(98.1)
(98.1)
87.8
87.7-87.8
88.8-89.4
85.0-86.6
84.8-85.0
86.8-87.9
92.9-94.0
92.9-94.0
92.7-93.6 93.8-94.7
(98.4)
(98.1-98.4)
(98.8)
(98.4-98.8)
(98.4-98.8)
(98.8)
(97.7-98.4) (97.7-98.4) (97.7-98.4) (97.7-98.4)
86.0-86.1 85.5-85.7
83.4-84.6
86.6-86.9
85.6-86.0
83.7-85.0
83.4-83.5
99.7-100.0
96.1-96.4
95.7
(98.8)
(98.4-98.8)
(96.9)
(99.2-99.6)
(98.8-99.2)
(96.9)
(98.1)
(100.0)
(100.0)
(99.2)
86.0-86.3 84.8-85.9
83.5-84.8
86.5-87.7
85.5-86.3
83.7-85.2
83.7-84.0
97.5-99.9
95.9-96.4 95.5-95.7
(98.4-98.8) (98.1-98.8)
(96.9)
(98.8-99.6)
(98.4-99.2)
(96.9)
(98.1)
(99.6(100.0)
(99.2)
100.0)
86.6-87.2 87.2-87.8
86.5-87.2
90.7-91.8
88.6-89.1
84.3-85.5
85.1-85.5
85.1-85.6
85.3-85.9
96.6-96.9
(99.2)
(98.8-99.2)
(97.3)
(99.6-100.0) (99.2-99.6)
(97.3)
(98.4)
(99.6)
(99.2-99.6)
(99.2)
83.5 (98.4) 82.4-82.5
83.9-84.2
85.2-85.6
83.9-84.8
83.8-84.4
81.3 (97.7) 84.0-84.2
84.2-84.6
85.2-85.3
(98.4)
(97.3)
(98.4-98.8)
(98.4-98.8)
(97.3)
(98.4)
(98.1-98.4)
(98.4)
Legend : The data above the diagonal are for tufA and EF-TuA sequences, and the data below the diagonal are for tufB and EF-TuB sequences.
182
A
183
B
Figure 19 [Figure 1]. Phylogenetic trees for tufA and tufB nucleic acid sequences from
Yersinia and non-Yersinia enterobacterial strains.
Online: [Figure 1]
(A) Phylogenetic tree based on a comparison of tufA and tufB nucleic acid sequences. Yersinia tufA
and tufB tree branches are blue and red, respectively. (B) Phylogenetic tree based on concatenated
tufA and tufB nucleic acid sequences. Yersinia concatenated tufA and tufB tree branches are
purple. The tuf gene branches for other enterobacterial species and V. cholerae (outgroup) are
green and black, respectively. Evolutionary distances were computed using the maximum
composite likelihood method of the MEGA4 software. The topological accuracy of the tree was
evaluated using 1,000 bootstrap replicates.
184
Figure 20 [Figure 2]. Phylogenetic network for tufA and tufB nucleic acid sequences from
Yersinia and non-Yersinia enterobacterial strains.
Online: Figure 20 [Figure 2]
The Neighbor-Net graph was computed by using the SplitsTree 4.8 software. Yersinia tufA and tufB
branches are blue and red, respectively. The tuf gene branches of other enterobacterial species
and V. cholerae (outgroup) are green and black, respectively. Abbreviations for Yersinia strains are
shown in Tableau 13 [Table 1]. Abbreviations for non-Yersinia strains are as follows: Ea,
E. agglomerans ATCC 27989; Eca, E. carotovora subsp. atroseptica SCRI1043; Eco, E. coli K-12;
Ev, E. vulneris ATCC 33821; Ha1, H. alvei ATCC 13337; Ha2, H. alvei ATCC 25927; Ha3, H. alvei
ATCC 51873; Ha4, H. alvei CCRI-10616; Ha5, H. alvei CCRI-11829; Ha6, H. alvei CCRI-16651;
Kp, K. pneumoniae ATCC 13883; Op, O. proteus ATCC 12841; Pl, P. uminescens subsp. laumondii
TTO1; Ps, P. shigelloides ATCC 14029; ST, S. enterica subsp. enterica serovar Typhimurium strain
LT2; Sfo, S. fonticola DSM 4576; Sm, S. marcescens ATCC 13880; Sfl, S. flexneri 2a strain 2457T;
Yre, Y. regensburgei ATCC 35313; and Vc, V. cholerae O1 biovar El Tor strain N16961.
185
6.5.4 Yersinia species
The remarkable evolution of tuf genes in Yersinia has resulted in genetic variations
that can be used to infer species clustering. Therefore, phylogenetic analyses of tuf
genes in Yersinia provide information for reclassification and identification of
Yersinia species. In order to enhance the number of sites analyzed simultaneously,
we constructed a phylogenetic tree using concatenated tufA and tufB sequences
(Figure 19B [Figure 1B]). This tree showed the monophyletic nature of the genus
Yersinia, its separation from other genera of the Enterobacteriaceae, and Yersinia
species clustering, all of which were strongly supported by bootstrap analysis.
Based on the analysis of concatenated tufA and tufB sequences, Y. aldovae,
Y. aleksiciae, Y. bercovieri, Y. intermedia, Y. kristensenii, Y. mollaretii, Y. rohdei,
and Y. ruckeri strains form distinct clusters that correlate with the current species
classification (Figure 19B [Figure 1B]). Y. aleksiciae type strain LMG 22254 is
clearly distinct from the Y. kristensenii strain cluster.
Nucleic acid sequences and tree topology showed the genotypic diversity of
Y. enterocolitica (Figure 19B [Figure 1B]). Y. enterocolitica concatenated tufA and
tufB sequences form two distant clades supported by a high bootstrap value (99%).
One clade includes 17 strains of Y. enterocolitica subsp. palearctica, which were
designated group I (CCRI-905, CCRI-952, CCRI-1044, CCRI-1139, CCRI-9984,
CCRI-10035, CCRI-10046, CCRI-10098, CCRI-10461, CCRI-10462, CCRI-10463,
CCRI-10464, CCRI-10465, CCRI-10603, CCUG 4586, CCUG 21476, and CCUG
33553) and were isolated in Canada, Finland, Sweden, and Denmark (Tableau 13
[Table 1]). The other clade contains two subgroups. One subgroup includes five
Y. enterocolitica subsp. enterocolitica strains (8081, ATCC 9610, ATCC 23715,
ATCC 27729, and CCUG 8238) isolated in the United States and Belgium, while
the other subgroup contains two strains of Y. enterocolitica subsp. palearctica
designated group II (CCUG 18381 and CCUG 31436) isolated in France and
Sweden (Neubauer et al. 2000) (Tableau 13 [Table 1]).
186
Y. frederiksenii, which also is known to be a genotypically heterogeneous species,
consists of three concordant clades that correlate with three of the four previously
characterized genomic groups (genomic groups 1a, 1b, and 3; no genomic group 2
reference strain was used in this study) (Ursing et Aleksic 1995). The intraspecies
distances (branch length) of Y. frederiksenii ATCC 33641 (genomic group 1a type
strain) from Y. frederiksenii CCUG 26594 (genomic group 1b) and Y. frederiksenii
ER 5307 (unknown genomic group) are greater than those between strains of other
Yersinia species. Y. frederiksenii strains ATCC 29912, CCUG 26949, and CCUG
30114 (all genomic group 3 strains) cluster with strain CCUG 8246 (unknown
genomic group). The concatenated tuf gene tree clearly separates the genomic
group
3
clade
from
genomic
groups
1a
and
1b.
Y. pestis
and
Y. pseudotuberculosis strains cluster together based on the concatenated tuf gene
tree and thus are presented as a unique genomospecies, as previously revealed
by DNA-DNA hybridization analysis (Bercovier et al. 1980). Finally, although the
taxonomy of Y. ruckeri is controversial, its tuf gene sequences cluster with those of
other Yersinia species and support the conclusion that this species should be
included in the genus (Dolina et Peduzzi 1993; Ibrahim et al. 1993; Kotetishvili et
al. 2005; Sulakvelidze 2000). In addition, the tufA and tufB genes of each Y. ruckeri
strain exhibit a level of identity (85.2%) which is in the range observed for other
Yersinia species (Tableau 14 [Table 2]).
187
6.6 Discussion
In this study, sequence analyses revealed that intragenomic tufA and tufB genes
are
divergent
in
12
Yersinia
species.
In
comparison,
12
non-Yersinia
enterobacterial species investigated contained two intragenomic tuf genes which
were very similar to one another. However, the intragenomic tuf sequences of the
members of the H. alvei-O. proteus clade exhibited an intermediate level of
divergence. The tufA and tufB genes have been described previously as genes
evolving in concert through gene conversion events which maintain their
remarkable level of nucleotide sequence identity (Abdulkarim et Hughes 1996;
Arwidsson et Hughes 2004; Hughes 2000; Lathe et Bork 2001). Gene conversion
driven by homologous recombination mechanisms explains the high levels of
similarity usually observed for duplicated tuf genes of members of the
Enterobacteriaceae, as shown in S. enterica serovar Typhimurium (Abdulkarim et
Hughes 1996). Conversely, the remarkable divergence between the tufA and tufB
genes in Yersinia strains may result from (i) the acquisition of an exogenous tuf
gene by horizontal transfer, (ii) the gradual or spontaneous loss of effective
conversion mechanisms (due either to defects in the mechanism or the level of
dissimilarity of sequences), or (iii) either loss of function or neofunctionalization of
one EF-Tu copy.
High levels of divergence (21 to 32%) of intragenomic tuf gene sequences have
been observed previously for 11 enterococcal species, while six other enterococcal
species contained only one tuf gene (Ke et al. 2000). Acquisition of an exogenous
copy of the tuf gene by the ancestor of the 11 Enterococcus species having two tuf
gene copies was the mechanism proposed to explain the presence of two different
intragenomic tuf genes (Ke et al. 2000). In contrast, the organization of tuf genetic
regions shows that in Enterobacteriaceae containing two tuf gene copies an
ancestral duplication of tuf gene was conserved (Kondrashov et al. 2007; Lathe et
188
Bork 2001). The organization of the tuf genetic regions (fusA-tufA and tufB-secEnusG) in E. coli K-12 is conserved in Yersinia and all of the other
Enterobacteriaceae genomes studied here except the P. uminescens subsp.
laumondii strain TTO1 genome (Huson et Bryant 2006). The latter strain has an
unusual chimeric gene order (fusA-tuf-secE-nusG), whereas the other copy of the
tuf gene is located downstream from tRNA genes. This abnormal arrangement of
the tuf regions in strain P. luminescens subsp. laumondii TTO1 can be explained
by recent homologous recombination between the tufA and tufB genes, resulting in
the observed chimeric configurations. The conserved synteny of the tuf gene
neighborhood in the genus Yersinia, as well as in the other Enterobacteriaceae
studied here, also shows that there was conservation of two ancestral duplicated
copies.
The higher levels of divergence between tufA and tufB sequences in the 12
Yersinia species examined in this study suggest that gene conversion became
inefficient or ceased to function in the ancestor that gave rise to the modern
Yersinia species. This could have been due to loss of specific or general gene
conversion mechanisms or simply to sequence divergence beyond the divergence
that
these
mechanisms
allowed.
Gene
conversion
mechanisms
require
recombination between very similar sequences. It has been proposed that
recombination events played a large role in the evolution and emergence of
Y. pestis from Y. pseudotuberculosis and that active genome rearrangements in
the form of inversions or translocations are responsible for a highly plastic genome
with noticeable strain-to-strain variation (Chain et al. 2004; Deng et al. 2002;
Parkhill et al. 2001). Moreover, multiple copies of the 16S and 23S rRNA genes are
also influenced by gene conversion mechanisms (Hashimoto et al. 2003; Mattatall
et Sanderson 1996). The seven copies of the 16S and 23S rRNA genes in
Y. enterocolitica subsp. enterocolitica 8081, Y. pestis strains 91001, Antiqua,
CO92, and KIM, and Y. pseudotuberculosis IP 32953 have very similar nucleic acid
sequences. Therefore, some gene conversion mechanisms are likely to still be
189
operational in the genus Yersinia. More general models, in which the conversion
frequency gradually declines as genes diverge via the accumulation of point
mutations, have been studied previously (Walsh 1987). The tufA and tufB genes in
the ancestor of the genus Yersinia could have mutated gradually, and thereby
affected conversion mechanisms. The genes would then have evolved
independently in parallel. This mutational evolution model could explain the high
and relatively wide intragenomic tuf nucleic acid sequence divergence in Yersinia
species, which ranges from 8.3 to 16.2%. To our knowledge, this is the first
example of possible tuf gene conversion inefficiency. The intermediate level of
sequence variation between intragenomic tuf genes in the H. alvei-O. proteus
clade could be an attenuated result of the same phenomenon. The 16S rRNA gene
sequence analysis performed by Ibrahim and colleagues (Ibrahim et al. 1993)
showed that H. alvei is the member of the Enterobacteriaceae most closely related
to the genus Yersinia, but it was not included in this genus. However, the number
of non-Yersinia Enterobacteriaceae included in this study was relatively small.
In the tuf mutational evolution model, it is possible that one of the two Yersinia EFTu copies ceased to function or evolved to perform new functions. The levels of
similarity between EF-TuA and EF-TuB amino acid sequences are significantly
lower in Yersinia (94.9 to 98.1%) than in other Enterobacteriaceae (99.6 to 100%).
The H. alvei-O. proteus group exhibits intragenomic tuf nucleic acid sequence
divergence lower than that observed for Yersinia. However, amino acid sequence
divergence is similar for the two groups (97.3 to 98.3% similarity). Thus, the nucleic
acid sequence divergence resulted in significant amino acid sequence changes.
Although evolution of new functions for duplicate genes may be rare (Lynch et
Conery 2000), EF-Tu proteins have been linked to functions other than elongation,
including chaperone properties (Caldas et al. 1998). EF-Tu residue 361 (Thr) is
conserved among all of the Enterobacteriaceae strains investigated here except for
EF-TuB in the genera Yersinia (Asn), Hafnia (Asn or Ser), and Obesumbacterium
(Asn). However, this amino acid residue could not be linked to known functional
190
activities of the protein (Berchtold et al. 1993; Kushiro et al. 1987). Although tuf
DNA sequences are divergent in Yersinia species, it appears that some EF-Tu
proteins have identical or very similar sequences. The tufA nucleic acid sequences
of Y. rohdei and the Y. pseudotuberculosis / Y. pestis genomospecies were clearly
divergent, but the EF-TuA amino acid sequences of these organisms were
identical. Also, the levels of tufB nucleic acid sequence identity for Y. aldovae,
Y. enterocolitica, and Y. kristensenii ranged from 90.8 to 94.7%, while the levels of
EF-TuB amino acid sequence similarity were 100.0%. These observations suggest
that functional convergent evolution occurred in these species for EF-TuA and EFTuB. The recently described genome sequence of Y. pestis Nepal516 revealed a
58-amino-acid C-terminal deletion in EF-TuB that might have led to a nonfunctional
copy of this elongation factor (Chain et al. 2006). However, such a truncated tufB
gene has been found only in this isolate and may be a strain-specific mutation that
occurred since the original isolation. There is no evidence suggesting that a loss of
EF-Tu function occurred in other Yersinia strains. Differential expression studies of
tufA and tufB, as well as gene inactivation mutagenesis analysis, may help
elucidate specific functions of EF-TuA and EF-TuB under different physiological
conditions. Han and colleagues (Han et al. 2007) recently compiled microarray
data from numerous studies investigating the expression of Y. pestis strain 201
genes under 25 different stress conditions in vitro. Cold shock stimulation appears
to downregulate tufB, while the presence of an antibacterial peptide (polymyxin B)
apparently upregulates tufA expression.
This study of the genus Yersinia was performed with a wide diversity of strains
representing 12 Yersinia species. The evolution of tuf genes in Yersinia has
resulted in genetic variations that provide a high level of resolution within the genus
and represent a powerful tool for the classification of the Yersinia genomospecies.
Moreover, the greater divergence between the tufA and tufB genes in Yersinia
species than in other Enterobacteriaceae helps distinguish the genus Yersinia from
other genera. The concatenated tuf gene tree was used to infer species clustering
191
(Figure 19B [Figure 1B]). tuf-based genetic analyses of Y. aldovae, Y. aleksiciae,
Y. bercovieri, Y. intermedia, Y. kristensenii, Y. rohdei, and Y. ruckeri showed that
their distinctive clades correlate with the phenotypic classification.
Y. enterocolitica strains show great diversity genetically as well as phenotypically.
Studies of Y. enterocolitica based on DNA-DNA hybridization, 16S rRNA gene
sequences, and G+C content have subdivided Y. enterocolitica into two
subspecies (Y. enterocolitica subsp. enterocolitica and Y. enterocolitica subsp.
palearctica) (International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology
2000; Neubauer et al. 2000). A more recent study, based on DNA-DNA microarray
hybridization with the genome of strain Y. enterocolitica subsp. enterocolitica 8081,
separated Y. enterocolitica strains into three groups (high-pathogenicity, lowpathogenicity, and nonpathogenic clades) (Howard et al. 2006). Here, the tuf
results also support the biodiversity of Y. enterocolitica strains. Great evolutionary
distances separate Y. enterocolitica subsp. palearctica (group I) strains from
Y. enterocolitica subsp. enterocolitica and Y. enterocolitica subsp. palearctica
(group II) strains. Currently, it is not clear what caused the deviation in tree
topology for these two clades. The divergence could not be completely explained
by geographical biodiversity as both clusters contain strains isolated in North
America and Europe. Based on tuf data, Y. enterocolitica subsp. palearctica strains
were clearly separated into two groups (groups I and II). All 13 Y. enterocolitica
strains isolated in Canada were members of Y. enterocolitica subsp. palearctica
and did not cluster with strains of Y. enterocolitica subsp. enterocolitica isolated in
the United States. Instead, the Canadian isolates clustered with other
Y. enterocolitica subsp. palearctica strains isolated in Europe. Our analyses, based
on tuf genes, showed that there are three groups of Y. enterocolitica, thus
supporting previous findings (Howard et al. 2006).
Y. frederiksenii includes different genomic groups (genomic groups 1a, 1b, 2, 3,
and 4) that are sufficiently different as determined by DNA-DNA hybridization,
192
multilocus enzyme electrophoresis, and 16S rRNA gene and gyrB sequence
analyses to belong to at least three different Yersinia genomospecies (Demarta et
al. 2004; Dolina et al. 1995; Dolina et Peduzzi 1993; Ursing et Aleksic 1995). Our
tufA and tufB phylogenetic analyses also showed that there are three distinct
clades that could represent three distinct genomospecies and thus further support
the need to reevaluate the classification of these organisms.
Finally, inclusion of Y. ruckeri in the genus Yersinia has been controversial ever
since this organism was classified. The Y. ruckeri G+C content is more similar to
those of Yersinia species even though DNA relatedness showed that Y. ruckeri
strains were only 30% related to Yersinia and Serratia species (Sulakvelidze
2000). Analysis based on multilocus sequence typing identified Y. ruckeri as the
most distant species of the genus (Kotetishvili et al. 2005). However, a previous
study based on 16S rRNA gene sequence analysis supported inclusion of
Y. ruckeri in the genus Yersinia (Ibrahim et al. 1993). Phylogenetic trees (Fig. 1)
and a network (Figure 20 [Figure 2]) of tufA and tufB gene sequences, as well as
the level of divergence, showed that Y. ruckeri should be included in the genus
Yersinia and thus supported its current classification.
In summary, to our knowledge, this is the first report of significant divergence
between tufA and tufB genes throughout a genus. The high level of divergence
between tufA and tufB genes in Yersinia strains is a characteristic hallmark of this
genus. Here, the evolution of tuf genes in Yersinia was used to investigate species
clustering, and the results provided information useful for reclassification and
identification. Our analyses suggest that further investigation using a wider
diversity of strains, as well as other genetic analyses, is needed to clarify the
taxonomic classification of Y. enterocolitica, Y. frederiksenii, and Y. ruckeri. tufA
and tufB genes could also be genetic targets that are useful for identification of
Yersinia species for diagnostic purposes. In this study, we provide the first
evidence, to our knowledge, supporting the hypothesis that there may be gene
193
conversion inefficiency for the tuf gene encoding EF-Tu. It is not known whether
the genetic drift seen in duplicated tuf genes in Yersinia resulted in evolution of a
new function or resulted in the nonfunctionalization of the product of one copy of
the gene. Determining the reason for the natural selection of the high level of
divergence between tufA and tufB sequences in Yersinia requires further
investigation and could lead to a better understanding of multigene family evolution
in bacteria.
194
6.7 Acknowledgments
We thank Martine Bastien, France Bégin, Ève Bérubé, Karel Boissinot, Xavier
Bouhy, Gilles Chabot, Natalie Clairoux, Richard Giroux, Marie-Claude Hélie, JeanLuc Simard, Viridiana Sistek, and Mario Vaillancourt for their technical support.
This research project was funded by the CBRN Research and Technology Initiative
under project CRTI-0154RD, Genome Canada, Genome Québec, Infectio
Diagnostic Inc., and the Canadian Institutes of Health Research (grant PA-15586).
S.I. received scholarships from the Fondation Dr George Phénix (Montréal,
Canada) and the Fonds de la Recherche en Santé du Québec (Montréal, Canada).
P.S.G.C. received a scholarship from the Natural Sciences and Engineering
Research Council of Canada (Ottawa, Canada).
195
6.8 References
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200
7 Discussion générale
7.1 Retour sur les objectifs de recherche
Le projet de recherche présenté dans cette thèse doctorale s‘est inscrit dans le
cadre de demandes de la Défense nationale et de la GRC pour optimiser la
réponse au bioterrorisme. Une des lacunes principales est la détection robuste des
agents biologiques, comme discuté dans l‘introduction de cette thèse. L‘objectif
principal de ce projet doctoral était donc de développer des outils rapides et
efficaces pour pallier ces difficultés. Le premier projet avait pour objectif de
développer une méthode de préparation d‘analytes facile à exécuter et
potentiellement utilisable sur le terrain. La seconde phase a porté sur l‘évaluation
d‘un module de lyse utrasonique pouvant être décontaminé et transporté de façon
sécuritaire. Le troisième objectif était de développer une méthode rapide de
détection des 12 principaux agents bactériens aéroportés sur puce à ADN. Le
dernier projet portait sur l‘étude de la divergence inattendue du gène tuf chez le
genre Yersinia. Ce présent chapitre permettra d‘explorer davantage la contribution
scientifique et les perspectives qui découlent de ces projets de recherche.
202
7.2 Méthode de préparation d’analytes à partir d’échantillons de
poudres suspectes ou environnementaux
7.2.1 Étude des échantillons fréquemment recueillis
Depuis les évènements de 2001, les organisations en sécurité publique doivent
fréquemment intervenir lors de la découverte de poudres suspectes (Hall 2008; La
Scola et al. 2003; Leask et al. 2003; Santerre 2012; Tengelsen et al. 2002). De
nombreux types d‘échantillons doivent être analysés pour évaluer s‘ils présentent
une menace réelle (Leask et al. 2003; Wills et al. 2008). Lim et al. (2005) avancent
que les matrices des échantillons poudreux peuvent présenter des défis lors du
développement de techniques de détection sans toutefois avoir de référence à ce
sujet (Lim et al. 2005). Cette affirmation semble basée sur les interférences
documentées causées par certains échantillons cliniques et alimentaires (Garcia et
al. 2002; Morata et al. 1998) ainsi que leurs expériences. En effet, plusieurs
articles documentent l‘efficacité de leurs techniques de préparations d‘analytes à
partir d‘échantillons poudreux sans présenter l‘interférence initiale de ces poudres
sur la PCR (Dauphin et al. 2009; Luna et al. 2003; Rose et al. 2011). Nous avons
donc été les premiers à publier une étude détaillant autant l‘interférence sur la
PCR d‘un éventail d‘échantillons poudreux (23 au total) (Chapitre 3). Dans les
conditions testées, nous avons montré que certains échantillons ne provoquaient
pas d‘interférence avec la lyse bactérienne et/ou PCR alors que d‘autres inhibaient
complètement la détection. Les informations rapportées pourront donc guider les
personnes ayant à analyser ces composés, particulièrement, mais non
exclusivement, dans le contexte du bioterrorisme. Elles montrent de plus la
nécessité d‘effectuer une préparation d‘analytes face à un échantillon poudreux
inconnu pour retirer les composés interférant avec les analyses PCR ultérieures.
203
7.2.2 Art antérieur et objectifs
La plupart des techniques de préparation d‘ADN bactérien débutent par la lyse des
bactéries dans la matrice et ensuite procèdent à la concentration et la purification
de l‘ADN (Luna et al. 2003; Rose et al. 2011). Ces méthodes utilisent en général
de petites quantités d‘échantillons, e.g. ≤ 5 mg (Luna et al. 2003) ou une anse
comble de 1 µl (Rose et al. 2011), et/ou des dilutions (RAZORTM EX, Idaho
Technology Inc.) afin de diminuer l‘impact des contaminants interférant avec la
détection. Nous avons décidé d‘innover en séparant premièrement par filtration les
bactéries de la matrice environnementale, puis en procédant subséquemment à la
lyse bactérienne afin d‘extraire l‘ADN dans de l‘eau propre (Chapitre 3). Dans notre
modèle, les échantillons prélevés dans l‘environnement sont composés de
substances solubles et/ou insolubles lorsqu‘ils sont incorporés dans un tampon
aqueux. Par des principes de filtration différentielle, nous avons récolté les spores
de B. globigii sous-espèce globigii dans de l‘eau propre compatible avec la PCR et
d‘autres types d‘analyses. Un avantage considérable de cette stratégie par rapport
à l‘art antérieur est la possibilité de conserver une fraction de l‘échantillon pour la
mise en culture à des fins judiciaires et de procéder à des analyses plus détaillées,
e.g. spectre de masse et anticorps. Par exemple, le pH du liquide de récupération
du BioCapture et du BioBadge ne permettait pas de remettre en culture le virus de
la fièvre aphteuse (Ryan et al. 2009).
La procédure DARE dans son ensemble permettait de retirer les effets inhibiteurs
sur la PCR amenés par une variété d‘échantillons (23 au total), (Figure 28, Annexe
2), de récupérer en moyenne 51 % des spores et, finalement, d‘en extraire leur
ADN. Nous avons publié l‘étude d‘extraction d‘ADN avec la plus grande variété de
poudres identifiées (Dauphin et al. 2009; Luna et al. 2003; Poore et al. 2009; Rose
et al. 2011; Wielinga et al. 2011). De plus, la quantité de poudre (20 mg) traitée
dans notre étude se compare avantageusement à d‘autres présentées
précédemment dans la littérature (≤5 mg) (Luna et al. 2003; Rose et al. 2011).
204
D‘autre part, la méthode actuellement recommandée par l‘USAMRIID pour le
traitement d‘échantillons cliniques pouvant contenir des agents biologiques est
considérée comme étant complexe d‘utilisation et cet institut a donc cherché une
technique plus simple (Shipley et al. 2012). La méthode de référence, le QIAamp
Mini Purification (Qiagen, Germantown, Maryland, États-Unis), permet la détection
de 5 × 102 CFU/ml de B. anthracis resuspendus dans l‘eau alors que la méthode à
l‘étude, le QuickGene-Mini80 (Fujifilm, Tokyo, Japon), ne permet que la détection
de 5 × 103 CFU/ml. La procédure DARE combinée au BD GenomeTM Lysis Kit a
permis la détection de 5 × 103 CFU/ml avec 20 des 23 types d‘échantillons
poudreux évalués. Ceci nous permet de comparer les performances relatives de
notre méthode à celles rapportées par Shipley et al. (2012), quoique ces derniers
n‘aient toutefois pas évalué l‘effet des poudres qui pourraient diminuer leur
sensibilité (Shipley et al. 2012).
7.2.3 Les filtres sélectionnés et perspectives
Le choix de la taille des pores des filtres servant à la séparation de spores
bactériennes de matrices poudreuses ou autres a été excessivement important.
Ces filtres ont été sélectionnés afin d‘optimiser la récupération de B. anthracis et
ont été évalués avec un simulant, soit B. atrophaeus sous-espèce globigii. De plus,
nous avons montré expérimentalement que plusieurs poudres insolubles utilisées
comme canulars ou additifs sont captées dans le préfiltre. Tel que discuté dans
notre article, les tailles des pores des filtres pourraient bénéficier d‘ajustement pour
détecter d‘autres agents biologiques, ou encore pour traiter d‘autres types
d‘échantillons. La Figure 25 (Annexe 2) montre les diamètres de nombreux
pathogènes aéroportés, de certaines poudres et d‘autres référentiels. Elle permet
donc d‘illustrer les fenêtres d‘utilisation des filtres ayant différents diamètres de
pores. On peut également constater que tel que suggéré dans notre article, un
filtre de 0,22 µm pourrait être plus avantageux pour capter des bactéries de plus
petits diamètres telles que F. tularensis. Un élément qui n‘a toutefois pas été
205
discuté dans notre article est le fait que le filtre de capture (pore = 0,45 µm) ait été
choisi favorablement au filtre de 0,22 µm puisque ce dernier nécessitait une plus
grande force pour l‘aspiration (étape 7, Figure 13, Chapitre 3). L‘automatisation
pourrait permettre d‘utiliser des filtres ayant des pores de plus petits diamètres,
comme 0,22 µm, puisque la pression pourrait être ajustée. L‘automatisation, avec
par exemple un système de pompes à seringue, pourrait également permettre de
réaliser cette méthode plus aisément sur le terrain.
D‘autre part, la microscopie a permis d‘observer les filtres utilisés et la pénétration
des spores bactériennes. Deux figures qui n‘ont pas été présentées dans notre
article permettent de visualiser ces filtres. Tout d‘abord, la structure des filtres a été
étudiée en microscopie optique et la légende de 1 µm, approximant la taille des
spores de B. anthracis, offre un référentiel (Figure 26, Annexe 2). Vous noterez
que cette légende est si difficile à voir que la microscopie optique conventionnelle
ne permettait pas d‘observer directement la pénétration des spores bactériennes
dans les filtres. Par conséquent, nous avons mis au point une stratégie utilisant la
microscopie confocale qui a permis d‘étudier en trois dimensions la pénétration
des spores fluorescentes dans les filtres (Figure 27, Annexe 2). De nombreux
types de filtres sont couramment utilisés pour nous protéger, masques ou
purificateurs d‘air, et leur performance doit être évaluée. Pour les industriels, notre
méthode de microscopie pourrait permettre l‘observation directe des microorganismes dans les filtres plutôt que l‘interprétation des tests fonctionnels.
7.2.4 Perspectives : traitement d’autres échantillons
La technique de préparation d‘analytes présentée par Luna et al. (2003) a
l‘avantage de traiter les échantillons poudreux et les écouvillons nasaux (Luna et
al. 2003). L‘analyse de ces derniers peut permettre d‘identifier les personnes
contaminées. Ceci est avantageux dans le contexte du bioterrorisme afin de
rationner l‘utilisation des traitements prophylactiques. Il serait donc intéressant
206
d‘évaluer si la procédure DARE pourrait être efficace pour faire le traitement d‘un
échantillon clinique, par exemple le mucus nasal.
7.2.5 Transportabilité et automatisation
L‘emploi de filtres fixés sur seringue a permis de grandement simplifier les étapes
de cette procédure afin de faciliter les manipulations. La trousse DARE est
constituée de 10 items commercialement disponibles, totalisant environ 10 $
(Figure 23, Annexe 2). Il n‘a donc pas été nécessaire de concevoir de nouveaux
outils pour gérer les fluides. D‘autres équipes peuvent de ce fait préparer leurs
propres trousses à moindre coût. En plus d‘être transportable, le matériel utilisé est
jetable, ce qui pourrait faciliter le travail en zone contaminée. La procédure DARE
(2 minutes) et l‘extraction d‘ADN (7 minutes) peuvent être exécutées en moins de
10 minutes. Le protocole fourni en annexe (Figure 24, Annexe 2) illustre d‘ailleurs
la simplicité des différentes étapes de cette méthodologie, ce qui accroît
également son potentiel pour une automatisation future.
207
7.3 Système modulaire de lyse ultrasonique pour l’extraction
d’acides nucléiques et le transfert d’échantillon
7.3.1 Art antérieur et direction du projet
Plusieurs méthodes peuvent être utilisées pour lyser les bactéries et se divisent en
trois types : chimique, enzymatique et mécanique (Figure 8). La technique
d‘extraction d‘ADN utilisée dans notre article précédent (Chapitre 3) était basée sur
la lyse aux billes par le BD GeneOhm™ Lysis Kit (BD Diagnostics 2009). Nous
avions sélectionné cette technique puisque, dans une étude antérieure, elle a
produit les meilleurs rendements d‘ADNg comparativement à cinq autres méthodes
rapides (Aldous et al. 2005). Toutefois, lors de la conceptualisation d‘un système
automatisé, l‘ajout de microbilles de verre peut causer des contraintes. En effet, les
valves de sortie et d‘entrée peuvent être bloquées par les billes. D‘autre part,
l‘ajout de réactifs chimiques pour la lyse peut nécessiter des étapes subséquentes
de purification des analytes. De plus, les réactifs enzymatiques pour la lyse
peuvent nécessiter des moyens de conservation, des délais d‘incubation et des
chambres de réaction. Nous avons donc décidé de nous affranchir de ces
contraintes et de développer un système pouvant lyser directement les spores de
Bacillus sans billes ou réactifs. Cette alternative méthodologique devait de plus
permettre un rendement d‘extraction d‘ADNg comparable au BD GeneOhm™
Lysis Kit.
7.3.2 L’interface en acier inoxydable, un avantage
Nous avons décidé de développer un système de lyse par sonication sans utiliser
de billes ou de réactifs chimiques. Il fallait donc trouver une interface qui
permettrait de transmettre efficacement l‘énergie des ultrasons vers la suspension
de spores afin de ne pas utiliser des billes. L‘acier inoxydable semblait un matériel
à considérer puisqu‘il présentait plusieurs propriétés intéressantes : résistance,
208
impédance acoustique, haute température de fusion et antioxydation. Nous avons
donc réussi à obtenir des rendements d‘ADNg comparables à ceux du BD
GeneOhm™ Lysis Kit avec un temps de lyse de seulement 45 secondes, et ce,
sans utiliser de billes. Ceci est un avantage important comparativement à l‘art
antérieur (Belgrader et al. 1999; Belgrader et al. 2000; Geissler et al. 2011; Taylor
et al. 2001; Warner et al. 2009). D‘autre part, l‘ADN est fragmenté entre 400 et 5
000 pb, ce qui est d‘intérêt dans l‘éventualité où des techniques d‘hybridation
d‘ADN ou de séquençage soient par la suite utilisées (Larguinho et al. 2010).
7.3.3 Transfert sécuritaire du FULM et perspective
Le design du FULM a considéré certaines contraintes lors des procédures
d‘intervention dans le contexte du bioterrorisme. Le FULM que nous avons
développé est fermé lors de la sonication afin d‘éviter de produire des aérosols. De
plus, le Module fluidique de lyse ultrasonique développé peut être sorti de la zone
contaminée en respectant les procédures de décontamination et d‘emballage de
sécurité biologique recommandées. C‘est pourquoi le FULM peut ensuite être
transféré vers une enceinte de sécurité biologique. Cette stratégie offre donc la
possibilité de conserver les équipements plus fragiles et plus coûteux dans la zone
sécurisée. Le prototype que nous avons développé pourrait être amélioré à
certains égards : automatisation de l‘injection de l‘échantillon, de la récupération de
l‘analyte et de l‘ajustement de la sonde à l‘interface d‘acier inoxydable. Il serait
donc intéressant de tester la lyse de B. anthracis ainsi que d‘autres pathogènes
dans un prototype amélioré du FULM.
209
7.4 Développement d’un essai sur puce à ADN pour la détection
et l’identification des agents bactériens associés au
bioterrorisme
7.4.1 Art antérieur et objectifs de recherche
Nous nous étions volontairement limités aux agents bactériens aéroportés
associés au bioterrorisme étant pathogènes humains. Ces bactéries, ou leurs
toxines, peuvent pénétrer l‘organisme par les voies respiratoires lorsqu‘inhalées,
causant des maladies graves (Tableau 4). Les méthodes génotypiques alternatives
à la culture des pathogènes dangereux, tels que les agents du bioterrorisme,
peuvent être plus rapides et présentent moins de risques pour le personnel de
laboratoire. Plusieurs essais basés sur l‘analyse d‘acides nucléiques ont déjà été
développés à ces fins. Ces essais sont toutefois souvent limités par le nombre de
cibles microbiennes détectées simultanément (1 à 5) (Deshpande et al. 2010;
Janse et al. 2012; Rachwal et al. 2012; Tomioka et al. 2005; Yang et al. 2012). En
effet, la biodiversité (Tableau 3, Chapitre 1) des agents biologiques constitue un
défi de taille pour développer un test qui en détecte plusieurs. Certaines méthodes,
par exemple le PLEX-ID (Sampath et al. 2012) et le Film Array Surveillance (Idaho
Technology Inc. 2011), se sont toutefois démarquées en détectant davantage de
cibles, respectivement 16 et 17. Ces deux techniques permettent l‘exécution de
nombreuses réactions PCR séparées individuellement en simultané. Ceci divise
donc l‘échantillon diminuant ainsi la capacité de détection de faibles nombres de
copies d‘ADNg des cibles. Pour pallier ce désavantage, le FilmArray Surveillance
réalise une étape d‘amplification spécifique avant la division afin d‘augmenter le
nombre de copies de matériel génétique. Toutefois, tel qu‘expliqué au Chapitre 1, il
n‘y a pas de publication scientifique révisée par des pairs validant cet essai.
Nous avons choisi d‘adopter une approche différente en utilisant un gène conservé
afin d‘amplifier dans un seul tube tous les agents bactériens aéroportés associés
au bioterrorisme. Par la suite, une hybridation entre les amplicons produits et leurs
210
sondes de capture spécifiques sur puces à ADN a été utilisée afin d‘effectuer
l‘identification microbienne (Miller et Tang 2009; Tulpan 2010).
7.4.2 Défi de design : la diversité biologique
La diversité biologique des agents bactériens sélectionnés dans ce projet,
représentant quatre embranchements bactériens, posait un défi de taille. Au début
du projet, nous avons considéré deux stratégies différentes, soit l‘analyse de leurs
gènes de virulence ou de leurs gènes conservés. La seconde approche a été
favorisée puisqu‘elle permettait d‘amplifier les 12 agents bactériens que nous
avons sélectionnés dans un seul tube. Elle a nécessité une étude approfondie de
leurs gènes conservés afin de les détecter simultanément. Pour ce faire, j‘ai
analysé deux gènes conservés au cours de l‘évolution essentielle à leur survie :
atpD et tuf. Le gène atpD encode la sous-unité B de la F-ATP-synthase qui
contient le site catalytique de l‘enzyme servant à produire de l‘ATP. Le gène tuf
encode quant à lui le facteur d‘élongation Tu (EF-Tu) qui a pour fonction principale
le transport des amino-acyl-ARNt au ribosome durant l‘élongation protéique. La
variabilité génétique des gènes tuf et atpD a été étudiée entre les bactéries liées
au bioterrorisme et celles proches phylogénétiquement. Au début du projet, en
2006, le grand nombre de séquences disponibles dans notre base de données
pour le gène tuf, comparativement à celui pour le gène atpD, a penché en sa
faveur. Par la suite, le gène tuf a montré in silico un compromis intéressant entre la
conservation de certaines régions pour le design d‘amorces et la divergence des
séquences orthologues pour le design de sondes d‘identification (Figure 18,
Chapitre 5). Le choix du gène pourrait être différent s‘il était maintenant à refaire,
considérant l‘agrandissement phénoménal des bases de données de séquences
publiques.
L‘amplification de type large spectre présente certains désavantages (Petti 2007).
Premièrement, les amorces dégénérées souvent utilisées peuvent limiter la
211
sensibilité analytique. De plus, des contaminants contenus dans les réactifs ou les
échantillons peuvent être amplifiés au dépend de l‘espèce bactérienne d‘intérêt à
identifier. C‘est pourquoi nous avons fait une adaptation de la stratégie
d‘amplification à large spectre dite biaisée. Celle-ci avait pour objectif d‘amplifier de
façon préférentielle les cibles bactériennes par rapport aux autres espèces
pouvant contaminer les solutions ou les échantillons. Les expériences réalisées in
vitro ont montré l‘amplification de façon sensible (102) des bactéries ciblées étant
membres de quatre embranchements différents, i.e. Actinobacteria, Chlamydiae,
Firmicutes et Proteobacteria (Tableau 11, Chapitre 5). Toutefois, d‘autres espèces
bactériennes pouvaient être amplifiées par notre méthode. Afin de limiter les
niveaux d‘ADN contaminant, nous avons utilisé de hauts standards de préparation
des réactifs et des échantillons ainsi que de manipulation. Malgré ces précautions
et notre stratégie d‘amplification à large spectre biaisée, un certain niveau
d‘amplification de l‘ADN contaminant pouvait être observé. Les préparations
d‘agents biologiques sous forme poudreuse contiennent généralement de grandes
quantités de cet agent (section 5.6.4). Le phénomène de compétition possible
dans notre essai CABBA serait donc en faveur des cibles bactériennes présentent
en quantité 800 fois plus élevées que la sensibilité analytique estimée pour R.
prowazekii.
7.4.3 Les avantages, limitations et perspectives de l’essai CABBA
L‘avantage majeur de l‘essai CABBA est de pouvoir dépister plusieurs agents
biologiques simultanément dans un court délai (75 minutes). La procédure
d‘amplification et de marquage combinée (55 minutes), la production d‘ADNsb (5
minutes) et le protocole d‘hybridation (15 minutes) ont tous été optimisés pour être
les plus efficaces et rapides. Notre essai se compare donc favorablement à cet
égard à d‘autres méthodes nécessitant de 100 à 240 minutes (Deshpande et al.
2010; Janse et al. 2012; Sampath et al. 2012) même si la spécificité est limitée à
l‘espèce génétique. En effet, l‘utilisation du gène tuf ne permettait toutefois pas la
212
distinction
entre
B. anthracis
et
B. cereus
ou
entre
Y. pestis
et
Y. pseudotuberculosis. D‘autres tests PCR plus spécifiques ont déjà été
développés à ces fins (Irenge et Gala 2012; Persing 2011; Wielinga et al. 2011).
Ce type de test de confirmation devrait donc être réalisé à la suite de l‘obtention
d‘un résultat positif. Il est d‘ailleurs recommandé de réaliser plusieurs tests avant
de confirmer la présence d‘un agent biologique (Lindler et al. 2005).
L‘amplification d‘ADN de l‘essai CABBA réalisée par un cyclage thermique pourrait
être adaptée à réaction isotherme. Ce dernier type d‘amplification serait favorable
puisqu‘il simplifierait le design de l‘instrumentation et pourrait accélérer la
procédure. En effet, les récents développements dans les technologies
d‘amplification isotherme rapide (p. ex. 8 minutes pour détecter 19 copies d‘ARN
virale) sont prometteurs et pourraient permettre d‘optimiser grandement les délais
de détection (Euler et al. 2012).
Finalement, il serait intéressant d‘évaluer une procédure de détection complète, de
l‘extraction d‘ADN bactérien contenu dans des poudres à l‘identification. Des
spores de B. atrophaeus, notre contrôle positif d‘amplification et d‘hybridation,
pourraient également être utilisées à titre de contrôle de lyse. Par contre, la
validation future de la détection des agents ciblés devra être effectuée en niveau
de confinement BSL-3, complexifiant grandement l‘expérimentation. L‘essai
CABBA pourrait être transposé dans un système d‘analyse total, ce qui faciliterait
sa validation en BSL-3. Finalement, la détection de nombreux pathogènes du
bioterrorisme simultanément et automatisée pourrait devancer les méthodes
classiques de culture et permettre aux laboratoires de santé publique de répondre
rapidement à une attaque bioterroriste réduisant ainsi considérablement son
impact.
213
7.4.4 Puces à ADN, perspectives
La technologie des puces à ADN a ouvert la voie pour l‘analyse multiparamétrique
à grande échelle. Miller et Tang (Miller et Tang 2009) concluent leur article en
disant que les puces à ADN auront un rôle important pour le diagnostic des
maladies infectieuses. En effet, le clinicien pourrait donc tester simultanément tous
les agents étiologiques connus pour causer un syndrome clinique particulier
(Bissonnette et Bergeron 2010; Raoult et al. 2004). Cette technologie n‘a toutefois
toujours pas pris d‘assaut les laboratoires cliniques de microbiologie. La Figure 21
compare le nombre de publications annuelles au sujet de quatre technologies
différentes d‘analyses des acides nucléiques (microarrays, PCR en temps réel,
séquençage de nouvelle génération et PCR digitale) en lien ou non à la
microbiologie. On peut y voir (Figure 21a) que de 2000 à 2007, le nombre de
publications annuelles au sujet des microarrays augmentait. J‘ai d‘ailleurs
commencé mon projet de recherche (chapitre 5) en 2006 alors que nous étions
emportés par cette vague. À partir de 2007, le nombre de publications au sujet des
microarrays a atteint un plateau. Cette tendance est similaire lorsque l‘on observe
seulement celles liées plus spécifiquement à la microbiologie. Ce plafonnement
pourrait s‘expliquer par le coût élevé, la complexité d‘exécution et d‘analyse de ce
type de procédures, et également par les défis de production (Procop 2007).
Lorsqu‘on compare à la PCR en temps réel (Figure 21b), une technologie plus
simple et éprouvée, on constate que de 2000 à 2011, le nombre annuel de
publications liées ou non à la microbiologie continu à croître de façon linéaire.
Cette technologie est de plus en plus utilisée dans les laboratoires de
microbiologie clinique (Procop 2007)(Bissonnette et al. 2010). Comme présenté au
chapitre 1 (section 1.4.3.3.3), une limitation majeure de la PCR pour la détection
des agents biologiques, et même le diagnostic, est le nombre de cibles pouvant
être analysé simultanément. Une technologie prenant davantage d‘ampleur ces
dernières années est le séquençage de nouvelle génération (Figure 21c). La pente
ascendante abrupte récente (2008 à 2011) montre l‘intérêt et l‘accessibilité
214
croissante pour cette technologie suggérée par plusieurs (Didelot et al. 2012; Hu et
al. 2011). Celle-ci demande toutefois des équipements et des procédures
d‘analyse complexes (Torok et Peacock 2012; Treangen et Salzberg 2012). La
PCR digitale, une nouvelle venue permettant des milliers de réactions PCR
séparées en simultané (microgouttelettes en suspension ou micropuits) (Hindson
et al. 2011), est également en croissance. Toutefois, le nombre de publications à
ce sujet est encore limité. L‘approximation de la proportion des articles en lien à la
microbiologie et la totalité des articles au sujet des trois technologies varient. La
PCR en temps réel (1:6) présente le meilleur ratio alors que les deux autres sont
comparables (microarray (1 :15) et séquençage de nouvelle génération (1 :17)).
Cette observation suggère que la PCR en tempsréel ne s‘est pas encore fait
déclassée en ce qui a trait à la microbiologie par ces autres technologies.
215
Figure 21. Le nombre de publications au sujet des technologies basées sur l’analyse des acides nucléiques.
La technologie a) du microarray, b) de la PCR en temps réel c) du séquençage de nouvelle génération d) et de la PCR digitale (barres bleues). Le
nombre de celles-ci étant lié à la microbiologie ou aux maladies infectieuses (lignes rouges). Figure inspirée de (Miller et Tang 2009).
216
7.5 Divergence du gène codant pour le facteur d’élongation Tu
des espèces du genre Yersinia
7.5.1 Découverte inattendue et objectifs
L‘analyse des données de tuf, notre gène cible pour l‘article présenté au Chapitre
5, nous a permis de découvrir qu‘il avait évolué très différemment chez le genre
Yersinia. En effet, son séquençage en laboratoire a révélé qu‘il existait un niveau
de divergence (8,3 à 14,3%) de ce gène chez toutes les espèces du genre
Yersinia décrites en 2007. Ceci était totalement inattendu puisque les gènes tuf
dupliqués chez les entérobactéries, tufA et tufB, coévoluent généralement et sont
donc très similaires (100 – 98,6 %) grâce à des mécanismes de conversion
génique (Lathe et Bork 2001). De plus, une étude phylogénétique réalisée
préalablement
par
Paradis
et
al.
(2005)
présentait
l‘évolution
des
Enterobactériaceae en se basant sur le gène tuf (Paradis et al. 2005). Cette étude
ne montrait pas la divergence de ce gène chez le genre Yersinia puisque tel
qu‘illustré à la Figure 29 (Annexe 3), seule la copies tufB avait été analysée. La
divergence inattendue m‘a amenée à étudier davantage cette anomalie en
séquençant ces deux gènes chez de nombreuses souches représentant toutes les
espèces de Yersinia décrites jusqu‘en 2007 ainsi que d‘autres membres de la
famille des Enterobacteriaceae à titre de contrôle.
7.5.2 Résultats obtenus à la suite de la publication de l’article
Après ces travaux, cinq nouvelles espèces appartenant au genre Yersinia ont été
décrites : Y. entomophaga, Y. massiliensis, Y. nurmii, Y. pekkaneii et Y. similis
(Hurst et al. 2011; Merhej et al. 2008; Murros-Kontiainen et al. 2011; Souza et al.
2011; Sprague et al. 2008). J‘ai donc refait des analyses phylogénétiques pour
étudier la divergence des gènes tuf intragénomiques chez deux des nouvelles
espèces. Les séquences intragénomiques de tufA et tufB de Y. massiliensis et
217
Y. similis ont divergé de façon similaire à celles des autres espèces du genre
Yersinia (
Figure 30, Annexe 2). Ceci supporte notre conclusion suggérant que cette
divergence, caractéristique du genre Yersinia, s‘est produite avant la spéciation.
7.5.3 Analyses phylogénétiques de pointe
J‘avais recueilli tellement de données qu‘il a fallu modifier des logiciels de bioinformatique pour qu‘ils puissent analyser autant de matériel en les adaptant sur
un super calculateur ayant de multiples processeurs en parallèle. Nous n‘avons
pas discuté dans notre article que nous avions comparé une méthode de
maximum likelihood (ML) (Figure 31, Annexe 3) au maximum composite likelihood
(MCL). Nous avons montré que les MCL donnaient une réponse très similaire au
ML et que ces deux méthodes ne permettaient pas d‘expliquer l‘origine de la
divergence du gène tuf à l‘étude. J‘ai donc décidé d‘investiguer plus en détails les
raisons expliquant le phénomène de divergence des gènes tuf chez le genre
Yersinia. Tel qu‘expliqué dans notre article, d‘autres gènes possédant de multiples
copies ont été analysés. Les Figure 32 et Figure 33 (Annexe 3) montrent que les
séquences intragénomiques des gènes 16S rDNA et 23S rDNA chez le genre
Yersinia sont similaires (Figure 32 et Figure 33, Annexe 3). La divergence du gène
tuf chez ce genre était donc exceptionnelle et les arbres phylogénétiques
conventionnels ne permettaient pas de résoudre cette énigme. Les réseaux
phylogénétiques représentaient en 2007 de nouvelles approches permettant de
visualiser des changements évolutifs plus complexes que l‘acquisition ponctuelle
de mutations. Les réseaux phylogénétiques nous ont permis de visualiser
l‘évolution divergente des gènes tuf paralogues chez les Yersinia et leur
coévolution chez les autres espèces étudiées (contrôles). Notre article de 2008
présente
des
analyses
phylogénétiques
avancées
permettant
de
mieux
comprendre un phénomène rarement observable, la divergence des gènes
218
dupliqués. Nous avons démontré non seulement que les réseaux phylogénétiques,
encore peu utilisés à l‘époque, pouvaient servir à analyser l‘évolution des espèces,
mais aussi à comprendre les évènements sous-jacents régissant l‘évolution de
gènes dupliqués.
7.5.4 L’évolution du vivant, perspectives
La duplication génique est un phénomène très important pour l‘évolution du vivant.
Les gènes dupliqués peuvent acquérir de nouvelles fonctions potentiellement
avantageuses pour leur descendance et la façon dont ils divergent est clé pour
comprendre la façon dont ils évoluent. L‘évolution des gènes dupliqués tuf chez le
genre Yersinia est donc un modèle d‘étude attrayant pour observer et comprendre
ces phénomènes. Notre étude a d‘ailleurs été citée dans un article de revue traitant
de la duplication génique chez les procaryotes intitulée « Genesis, effects and
fates of repeats in prokaryotic genomes » (Treangen et al. 2009). Les auteurs
utilisent notre étude sur l‘évolution du genre Yersinia comme exemple pour
appuyer leur théorie selon laquelle des gènes dupliqués vont s‘effacer puisqu‘ils
acquerront des mutations ponctuelles et perdront leur capacité à se recombiner.
7.5.5 Fonctions de EF-TuA et EF-TuB, perspectives
Toutefois, tel que mentionné dans notre article de 2008 (Chapitre 6), la possibilité
que les protéines EF-TuA et EF-TuB aient un rôle distinct chez le genre Yersinia
nécessitera encore des études. Les données de puces d‘expression de Han et al.
(2007) semblent montrer pour la première fois que certaines conditions affectent
l‘expression différentielle de tufA et tufB chez Yersinia pestis. Les auteurs n‘en
discutent toutefois pas dans leur article (Han et al. 2007). Dans notre étude, nous
avons décidé d‘en discuter et nous avons d‘ailleurs été cités à ce sujet (Massier et
al. 2012). L‘étude de Massier et al. (2012) a d‘ailleurs montré que P. aeruginosa,
lorsque soumise à un traitement de lumière pulsée sous-létale, augmentait la
219
production d‘EF-Tu (Massier et al. 2012). Cette dernière semble donc varier
lorsque les bactéries sont soumises à des conditions environnementales
stressantes. Par contre, ceci n‘est pas surprenant et nous pouvons nous demander
si le fait d‘avoir deux protéines EF-Tu distinctes peut amener un avantage au
genre Yersinia tel que discuté dans notre article. Ce que nous n‘avons pas abordé
dans notre article est le fait que ces bactéries sont des psychrotrophes,
puisqu‘elles peuvent croître de 4 à 42⁰C et également à de larges intervalles de pH
de 5,0 à 9,6 (Brenner et al. 2005). Cette adaptabilité aux conditions
environnementales diverses est un avantage potentiel. Il est intéressant de noter
que les trois espèces pathogènes pour l‘humain, Y. enterocolitca, Y. pestis et
Y. pseudotuberculosis, doivent résister aux grandes variations de pH du système
digestif humain ainsi que de la puce pour infecter l‘hôte. L‘étude de mutants knockout pour les gènes tufA ou tufB permettrait d‘évaluer leur « nécessité » et leurs
fonctions spécifiques sous différentes conditions de culture. D‘ailleurs, il existe une
technique pour inactiver les gènes chromosomiques chez Yersinia (Derbise et al.
2003).
7.5.6 Tolérance aux antibiotiques, perspectives
Le phénomène de tolérance à de multiples antibiotiques a une grande importance
médicale. L‘implication de la phosphorylation d‘EF-Tu par une protéine kinase
nommée HipA pour la résistance bactérienne lors de l‘exposition aux antibiotiques
a été montrée à la suite de la publication de notre article (Schumacher et al. 2009).
Le résidu Thr382 phosphorylable d‘EF-Tu est le même dans E. coli, Y. enterocolitca,
Y. pestis et Y. pseudotuberculosis pour les deux copies des protéines. Toutefois,
tel que mentionné dans notre article, le résidu Thr167 de EF-TuB et Thr361 de EFTuA distinguent les deux copies chez toutes les espèces de Yersinia étudiées
dans notre article. Il serait intéressant d‘étudier l‘importance de ces variations pour
l‘expression différentielle des deux copies d‘EF-Tu chez le genre Yersinia et la
tolérance
220
aux
antibiotiques
ou
à
d‘autres
conditions
environnementales
stressantes. Bien que, sans traitement, le taux de mortalité de la peste
pneumonique chez l‘humain soit estimé à 100 % (Tableau 4, Chapitre 1) (Ciottone
2006), les souches de Y. pestis étaient généralement sensibles aux antibiotiques.
C‘est pourquoi que l‘isolement, en 1995, d‘une souche de Y. pestis multirésistante
aux antibiotiques a marqué la communauté scientifique (Galimand et al. 1997).
Cette multirésistance était causée par un plasmide (IP1202). L‘augmentation de la
résistance aux antibiotiques est un problème de santé publique mondiale. La
résistance antimicrobienne causée par l‘acquisition d‘éléments génétiques mobiles
a été et continue d‘être étudiée. Toutefois, la tendance va maintenant à l‘étude de
l‘adaptation métabolique plus globale permettant une tolérance antimicrobienne
(Belenky et Collins 2011) et le rôle de la protéine EF-Tu pour ces phénomènes
reste encore à explorer.
221
7.6 Perspectives générales du projet doctoral
L‘automatisation des technologies développées durant ce projet de recherche
faciliterait leur utilisation sur le terrain par des organisations en sécurité publique
ou militaires. Le protocole DARE, la méthode d‘extraction d‘ADN bactérien et
l‘essai de détection sur puce à ADN microfluidique des agents biologiques seraient
transposables dans un système d‘analyse totale permettant de réaliser la
procédure complète de façon automatisée. J‘ai modifié une figure originalement
réalisée par le Dr Régis Peytavi présentant un système rotatoire d‘analyse totale
pour l‘adapter au contexte du bioterrorisme. En effet, j‘y ai illustré la transportabilité
et la gestion de macrovolumes, deux éléments cruciaux pour les plateformes de
détection sur le terrain, et également le diagnostic au chevet du patient. Cette
version de la figure a d‘ailleurs fait la page frontispice de la revue IVD technology
en novembre 2009 (Siegrist et al. 2009). La Figure 22 illustre donc le
fonctionnement d‘un système intégré d‘analyse totale contrôlé par un téléphone
intelligent amarré à un « rotacycleur ». L‘accélération de la rotation permet de
procéder séquentiellement aux différentes étapes de l‘analyse grâce à des
systèmes de valves s‘ouvrant à des pressions différentes. Ce téléphone intelligent
pourrait également interpréter les résultats et notifier automatiquement les
autorités de sécurité et de santé publiques concernées. Une telle plateforme
pourrait être portable et ainsi répondre aux besoins des organisations médicales et
militaires sur le terrain. Les techniques de détection développées pourraient
améliorer les procédures de réponse immédiate à un acte bioterroriste, en
minimisant son impact sur la société.
222
Figure 22. Système intégré d’analyse totale microfluidique rotatoire permettant le traitement
de a) l’échantillon (macrovolume), b) la lyse microbienne (microvolume), c) l’amplification
d’ADN, d) et l’hybridation sur puce à ADN.
r
Adaptée avec permission du design du support rotatoire réalisé par le D Régis Peytavi.
223
8 Conclusion
L
a préparation contre les attaques bioterroristes est complexe. Plusieurs
techniques de détection ont été présentées dans cette thèse et elles
possèdent toutes leurs avantages et limitations intrinsèques. Lim et al. spécifient
qu‘aucune plateforme de détection ne satisfaisait tous leurs critères d‘évaluation
dits « idéaux » (Voir section 1.4.3, Chapitre 1) (Lim et al. 2005). Nous avons tenté
lors de ce projet de répondre à plusieurs de ces critères. Premièrement, la
méthode de préparation des analytes permet de séparer rapidement les spores
bactériennes d‘un grand éventail de matrices poudreuses et autres. Sa simplicité
se
compare favorablement par rapport aux autres techniques publiées
antérieurement (Luna et al. 2003; Rose et al. 2011). Elle serait même transportable
sur le terrain (Figure 23, Annexe 2), mais son automatisation simplifierait
davantage son utilisation. Deuxièmement, le module fluidique de lyse microbienne
par sonication permet d‘extraire l‘ADNg en un temps record sans l‘utilisation de
billes (Belgrader et al. 1999; Belgrader et al. 2000; Chandler et al. 2001; Marentis
et al. 2005; Taylor et al. 2001; Warner et al. 2009). Ce module peut même être
décontaminé, sans être endommagé ou affecter l‘extrait d‘ADN qu‘il contenait, pour
être transporté d‘une zone contaminée à une zone sécurisée. Troisièmement,
l‘essai sur puce à ADN permet la détection sensible de 12 agents biologiques
importants en environ 75 minutes. L‘intégration de ces trois procédures dans un
système d‘analyse totale permettrait la détection rapide des pathogènes associés
au bioterrorisme. De plus, tel que discuté préalablement, une telle plate-forme
pourrait être portable et ainsi répondre aux besoins des organisations médicales et
militaires sur le terrain.
225
Annexe 1
Historique des guerres biologiques et du
bioterrorisme : biohazard ou psychohazard ?
Revue historique réalisée pour la préparation d’un manuscrit intitulé «
throughout history ».
Bio-psycho-hasard
Sandra Isabel a rédigé le texte et a réalisé de nombreuses recherches historiques dans la
littérature scientifique.
Marc Isabel, B. A. en histoire et en littérature, a réalisé des recherches de la littérature historique
pour certains évènements biologiques, notamment de l’Antiquité, afin de comprendre leurs
implications considérant les connaissances et la culture de l’époque.
De l’Antiquité à la théorie des germes
Bien avant la venue de la microbiologie moderne, l‘Homme avait déjà compris qu‘il
était possible de provoquer, au moyen de différents véhicules, la transmission de
maladies afin de gagner un avantage stratégique face à un ennemi. Le premier
récit rapportant l‘utilisation de ce principe se retrouve à l‘intérieur de fragments
d‘un texte hittite datant du XIVe siècle avant J.-C. Il y est mentionné qu‘on forçait
des gens escortant des animaux infectés, probablement par la tularémie, à
traverser les territoires ennemis en espérant qu‘ils contamineraient ceux qu‘ils
rencontreraient en chemin (Trevisanato 2007). Au fil du temps, l‘Homme diversifia
ses méthodes pour accroître l‘efficacité de ses attaques, laissant moins de place
au hasard. En contaminant une denrée essentielle d‘une population ennemie, les
responsables forçaient les gens à entrer en contact avec les agents biologiques
dans le but de les affaiblir, facilitant ainsi la victoire. Un exemple fréquent est la
contamination volontaire de sources d‘eau potable par, entre autres, des fèces,
des cadavres et des carcasses (Christopher et al. 1997; Mayor 2003).
L‘efficacité des pointes de flèches souillées par des fèces animales ou du venin de
serpent était relativement connue durant l‘Antiquité. Toutefois, des passages des
écrits d‘auteurs de cette époque présentent certains procédés de fabrication
d‘enduits plus raffinés. Par une technique d‘agitation de nos jours perdue, les
shamans scythes au Ve siècle avant J.C. séparaient le plasma du sang. Ce plasma
était ensuite récupéré pour être mélangé à des fèces et le tout était enterré dans le
227
sol jusqu‘à putréfaction. Par la suite, ils mélangeaient à cette mixture enrichie de
microbes les restes en décomposition de vipères préalablement tuées. L‘enduit
était appliqué sur des flèches munies de barbules permettant une contamination
parentérale efficace et meurtrière. D‘ailleurs, les carquois contenant ces flèches
avaient des insignes notifiant l‘archer du danger, peut-être le premier signe
biohazard (Mayor 2003).
Au Moyen Âge, Gabriel de Mussis rapporte que les Tatars, fortement affligés par la
peste, ont catapulté des corps de pestiférés au-dessus des fortifications de la ville
de Caffa, alors assiégée (Derbes 1966). Il est toutefois difficile, sans étude
épidémiologique
et
phylogénétique,
d‘attribuer
avec
certitude
l‘épidémie
subséquente de peste à Caffa ou encore la deuxième vague de la peste noire en
Europe à cette propagation volontaire de la maladie (Christopher et al. 1997). C‘est
un autre exemple d‘un progrès technique, la catapulte, montrant l‘évolution des
moyens de dissémination utilisés pour propager des agents biologiques à plus
grande échelle et à plus grande distance.
En 1767, passant d‘une technique grossière à une technique plus raffinée et
invisible, un général anglais, Sir Jeffrey Amherst, ordonna la distribution de
couvertures et de mouchoirs de varioleux aux populations autochtones d‘Amérique
du Nord qui aidaient les Français. Il anticipait la propagation de la maladie sur une
population qu‘il savait fragile. Même si une épidémie de variole chez les
autochtones a succédé dans la région, l‘efficacité de cette méthode peut être
remise en doute puisque d‘autres contacts avec les colons pourraient en être la
cause (Berche 2009; Christopher et al. 1997). Cette stratégie montre toutefois une
compréhension de certains principes d‘immunité et de susceptibilité aux infections
des différentes populations.
Dès la Renaissance, les avancées scientifiques ont permis de développer des
outils permettant l‘étude de la microbiologie. Antonie van Leeuwenhoek (16321723), un microscopiste néerlandais, a mis au point des lentilles de qualité avec un
228
pouvoir grossissant jusqu‘à 266 X permettant d‘observer des bactéries (Ronan
1988; van Zuylen 1981). La microscopie facilita l‘étude des micro-organismes et de
leur provenance par l‘observation de leur présence et de leur morphologie.
Edward Anthony Jenner (1749-1823), souvent considéré comme le père
de l‘immunologie, a exploré davantage ce concept en offrant au monde la
possibilité de développer une immunité à des infections à la suite
de la
vaccination. Jenner confirma expérimentalement la croyance populaire voulant que
les personnes ayant contractées la variole des vaches était immunisées contre la
forme humaine (Jenner 1801; Ronan 1988). Ses travaux et ceux qu‘ils ont inspirés
ont permis de sauver de nombreuses vies grâce à des programmes de vaccination
et même de mener à l‘éradication de la variole en 1980. Ils ont toutefois ouvert une
boîte de Pandore puisqu‘on pouvait maintenant s‘immuniser spécifiquement contre
un agent biologique alors que l‘adversaire n‘y était pas protégé.
La théorie des germes, créditée principalement, mais non exclusivement, à Louis
Pasteur et Robert Koch pour leurs travaux, a amené un changement de
perspective au sujet des malades infectieuses. Louis Pasteur (1822–1895) a su
concevoir avec brio ses expériences montrant que les contaminants provenaient
de l‘air, ce qui allait à l‘encontre de la théorie de l‘époque étant la génération
spontanée (Baxter 2001; Black 2003; Ronan 1988). Robert Koch (1843–1910)
réussi à faire croître des micro-organismes en culture pure. Il institue de plus, en
1882, les fondements afin d‘établir, par une méthodologie scientifiquement
rigoureuse, la relation causale entre un micro-organisme et une maladie,
maintenant connus sous l‘appellation des « Postulats de Koch » (Black 2003;
Kaufmann et Schaible 2005; King 1952; Nobelprize.org 1967 ). D‘ailleurs, le
professeur Koch fût le premier à démontrer que Bacillus anthracis, un des plus
importants agents biologiques, était l‘agent causal de la maladie du charbon, et le
professeur Pasteur fût le premier à développer un vaccin contre cette maladie
(Baxter 2001). De nombreux scientifiques leur ont succédé et ont continué à
229
repousser les limites du savoir en microbiologie et en infectiologie. Les
nombreuses
avancées
dans
le
domaine,
principalement
la
microscopie,
l‘immunisation, la culture pure et les Postulats de Koch, ont ouvert la voie aux
programmes d‘armement biologique plus sophistiqués.
Au 20e siècle
Le concept d‘armement biologique, de l‘anglais weaponisation, englobe tous les
travaux qui ont servi à développer des armes biologiques d‘autant plus puissantes
que
redoutables.
Pour
ce
faire,
plusieurs
stratégies
ont
été
utilisées,
particulièrement en augmentant la transmission, la résistance à l‘environnement ou
aux antibiotiques. L‘objectif était d‘augmenter leur impact : morbidité, mortalité,
chute de l‘économie, état de panique général, etc. (Alibek et Handelman 2000).
Plusieurs grandes puissances ont travaillées secrètement par le passé sur des
programmes d‘armement biologique à grande échelle, dont le Canada, les ÉtatsUnis, le Japon, le Royaume-Uni et l‘U.R.S.S. (Leitenberg 2001).
Durant la Première Guerre mondiale, de 1914 à 1918, l‘utilisation d‘armes
chimiques a été plus marquante que celle d‘armes biologiques. En effet, près d‘un
tiers des évacuations de soldats était causé par les armes chimiques (Mauroni
2003). En 1917, les bagages confisqués, lors de l‘arrestation en Norvège du Baron
Otto Karl von Rosen, un aristocrate Suédo-Germano-Finlandais, contenaient 19
fioles en verre camouflées dans des carrés de sucre. Quatre-vingt ans plus tard,
quatre CFU (unités formant des colonies) de B. anthracis ont pu être cultivées
d‘une fiole retrouvée (Redmond et al. 1998). Ceci prouve la capacité de produire
des agents biologiques, de les conserver lors du transport et de les dissimuler
durant la Première Guerre mondiale.
Après Première Guerre mondiale, l‘utilisation d‘armes chimiques et biologiques
faisait mauvaise figure. Le Protocole concernant la prohibition d'emploi à la guerre
de gaz asphyxiants, toxiques ou similaires et de moyens bactériologiques,
230
communément nommé Protocole de Genève, a été signé initialement en 1925 par
37 pays5, et est entré en vigueur en 1928. Ce protocole a été le premier traité
international à interdire l‘emploi d‘armes biologiques pour faire la guerre. Il est
intéressant de noter que La Fédération de Russie n‘était pas signataire en 1925,
mais a toutefois ratifié ce protocole en 1928, alors que les États-Unis et le Japon
étaient signataires et ont attendu respectivement en 1975 et 1970 pour le ratifier.
Depuis 1925, 137 pays ont maintenant ratifié ce protocole (Comité international de
la Croix-Rouge 2012). Toutefois, le Protocole de Genève présentait une portée
limitée puisqu‘il n‘interdisait ni la production, ni le stockage d‘armes chimiques et
biologiques.
La Deuxième Guerre mondiale, de 1939 à 1945, a ravivé l‘intérêt pour le
développement des armes biologiques. À cette époque, un programme de
développement d‘armes biologiques et entomologiques a été dirigé par le Japon.
L‘Unité 731 a attaqué à plusieurs reprises les Chinois avec des puces infectées
par Yersinia pestis, l‘agent causal de la peste, ainsi qu‘un autre vecteur, la mouche
domestique
(Musca domestica), contaminée
par
Vibrio cholerae,
l‘agent
étiologique du choléra. Le choc à l‘atterrissage des bombes en céramique non
explosives, contenant des mouches domestiques dans une section et une culture
de V. cholerae dans une autre, provoquait la contamination des mouches qui se
dispersaient ensuite chaotiquement sur un vaste territoire. Environ 200 000
personnes ont succombé de l‘épidémie de choléra qui s‘ensuivit. Une attaque
aéroportée relarguant des puces infectées par Yersinia pestis a eu des
répercussions à long terme puisque l‘épidémie dura 6 ans et on estime qu‘elle
causa 50 000 décès (Lockwood 2009). Toutefois, les troupes japonaises n‘étaient
pas protégées efficacement contre ces agents biologiques et il a été rapporté que
1 700 décès ont suivi une seule mission alors que les Chinois en avaient subi
5
Liste des 37 pays signataires du Protocole de Genève en 1925: l’Allemagne, l’Autriche, la Belgique, le
Brésil, la Bulgarie, le Canada, le Chili, le Danemark, l’Égypte, le Salvador, l’Espagne, l’Estonie, les ÉtatsUnis, l’Éthiopie, la Finlande, la France, la Grèce, l’Italie, le Japon, la Lettonie, la Lituanie, le Luxembourg, le
Nicaragua, la Norvège, les Pays-Bas, la Pologne, le Portugal, la République Tchèque, la Roumanie, le
Royaume-Unie, la Slovaquie, la Suède, la Suisse, la Thaïlande, la Turquie, l’Uruguay et le Venezuela.
231
10 000. Les attaques de l‘Unité 731 ont entraînées le plus grand nombre de décès
documentés et ont montré à la fois la capacité de déploiement des armes
biologiques à plus grande échelle et les dangers de leur utilisation (Riedel 2004).
Les alliés ont également participé au développement d‘armes biologiques lors de
la Deuxième Guerre mondiale. Le Premier ministre britannique, Winston Churchill,
avait ordonné la fabrication d‘un demi-million de bombes de B. anthracis destinées
aux Allemands (Bryden 1989; Frigon 2010). L‘armée britannique a participé à ces
efforts de guerre. Elle a d‘ailleurs mené des expérimentations pour évaluer la
dispersion de spores de B. anthracis à l‘aide de cheptels de moutons sur l‘île
écossaise Gruinard (Christopher et al. 1997; Lutwick et Lutwick 2009; Riedel
2004). Ces spores se sont propagées sur les côtes et quelques animaux sont
décédés, montrant la perte de contrôle possible des armes biologiques. Une partie
importante des travaux a d‘ailleurs été effectuée par l‘Armée Canadienne à la
Grosse-Île, située dans le Fleuve St-Laurent. Les scientifiques travaillant à cet
endroit isolé avaient développé l‘expertise permettant de produire des quantités
massives de spores de B. anthracis, soit 130 kilogrammes par semaine (Bryden
1989; Frigon 2010). Les États-Unis ont pris part aux recherches et au
développement sur les armes biologiques et ont érigés deux centres d‘envergure
dont le plus connu est Fort Detrick au Maryland, l‘autre se retrouvant à Terre Haute
en Indiana (Lutwick et Lutwick 2009). Bacillus atrophaeus sous-espèce globigii,
une bactérie sporulante considérée inoffensive, a été utilisée comme simulant de
B. anthracis afin d‘évaluer son potentiel de dispersion sur des centres urbains et
d‘autres communautés. En 1966, des scientifiques des Forces Armées des ÉtatsUnis ont utilisé des ampoules incandescentes chacune remplie d‘une préparation
poudreuse de spores B. atropheus de 175 grammes (~5 × 1011 CFU/g) afin
d‘évaluer le potentiel de dissémination du bacille du charbon. Les ampoules étaient
échappées sur les grilles de ventilation du métro de la ville de New York lorsque
les trains passant accéléraient. Ces spores ont été dispersées à travers la ville et
le rapport conclut que « A large portion of the working population in downtown New
232
York City would be exposed to disease if one or more pathogenic agents were
disseminated covertly in several subway lines at a period of peak traffic. » (Daly
1998; US Department of the Army 1968). Le 25 novembre 1969, le Président des
États-Unis, Richard Nixon, annonça une politique nationale empêchant l‘utilisation
d‘armes biologiques et s‘engagea à détruire l‘arsenal Américain. Le New York
Times rapporte que le U.S. Department of Defense a développé, et même pour
certains a entreposé, les agents étiologiques de la peste, la maladie du charbon, la
tularémie, la psittacose, la fièvre Q, le botulisme, la fièvre pourprée des montagnes
Rocheuses, la brucellose et l‘encéphalite équine du Venezuela (New-York Times
1969). Il aura fallu attendre un demi-siècle après la ratification du Protocole de
Genève avant qu‘une autre entente internationale plus restrictive quant au
développement d‘armes biologiques soit mise en vigueur. La Convention sur
l‘interdiction de la mise au point, de la fabrication et du stockage des armes
bactériologiques (biologiques) ou à toxines et sur leur destruction a été signée en
1972 et mise en vigueur en 1975. En 2011, 39 ans plus tard, des 195 pays
répertoriés dans le monde par la CIA, 171 pays avaient signé cette convention
alors que 155 l‘avaient également ratifiée (Biological and Toxin Weapons
Convention (BTWC) 1972; US Central Intelligence Agency 2010). Cet engouement
politique de la part d‘un nombre si élevé de pays montre l‘importance de ces
interdictions pour l‘humanité.
Malgré la rigidité de cette convention et le fait que l‘ex-U.R.S.S. ait été dans les
premiers états à signer et à ratifier cette convention, Moscou a admis avoir
continué son programme de biodéfense et d‘armement biologique (National
Security Archive 2001). Kanatzhan Alibekov, un médecin militaire maintenant
connu sous le nom de Ken Alibek, a été, de 1988 à 1992, le député chef de
l‘agence Biopreparat dont le mandat était de développer et de produire des armes
biologiques. Il a ensuite fuit son pays vers les États-Unis et a témoigné des travaux
des Russes à cette époque et antérieurement. Alibek présente des informations et
des calculs alarmants. Dans une ville métropolitaine, 100 kg de préparation de
233
spores de B. anthracis pourraient causer jusqu‘à trois millions de décès.
Seulement dix à quatorze jours leur auraient été nécessaires pour produire 400 kg
d‘anthrax afin de remplir dix ogives. Les recherches exécutées par l‘agence
Biopreparat ont conduit à la découverte d‘additifs permettant d‘augmenter la
résistance des micro-organismes aux conditions environnementales et de
méthodes pour propager ces armes biologiques afin d‘obtenir une dose infectieuse
permettant d‘infecter 50 % des humains exposés sur 1 km2 de surface (Q50). Les
succès du génie génétique ne passant pas inaperçus, le programme Enzyme sera
lancé avec le mandat de modifier génétiquement des micro-organismes
pathogènes pour les rendre résistants aux antibiotiques ou aux vaccins. Ceux
principalement ciblés ont été B. anthracis, B. mallei, F. tularensis et Y. pestis
puisque les progrès en antibiothérapie contrecarraient leur impact, mais certains
autres virus auraient été à l‘étude. Une épidémie de la maladie du charbon à
Sverdlovsk en 1979 aurait causé 96 victimes, dont 66 décès. Même si, toutefois,
l‘exactitude de ces chiffres est controversée, le lien avec une installation de
production d‘armes biologiques, le Compound 19, a été établi (Steele 2000). Un
filtre colmaté ayant été retiré sans être remplacé immédiatement expliquerait la
libération accidentelle dans la ville de B. anthracis (Alibek et Handelman 2000).
Cet incident montre le danger de ces armes pour les producteurs également.
D‘autres organisations non étatiques ont montré la capacité de produire des
agents biologiques. En effet, en 1984, une éclosion inexpliquée de 751 cas de
gastro-entérites causés par Salmonella Typhimurium sévit en Oregon. L‘enquête
épidémiologique conclue que des membres de la secte Bhagwan Shree Rajneesh
ont volontairement contaminé des bars à salades de 10 restaurants (Torok et al.
1997). Quoique la secte japonaise religieuse Aum Shinrikyo soit plus connue pour
les attaques au gaz sarin dans le métro de Tokyo en 1995, l‘investigation a révélé
qu‘un programme rudimentaire d‘armement biologique avait été entrepris. Par
exemple, la souche vaccinale de B. anthracis a été dispersée dans la ville de
Kameido en 1993. Fort heureusement, les analyses phylogénétiques suggèrent
234
que la souche utilisée ne possédait pas le plasmide pXO2 codant pour les
enzymes synthétisant la capsule et étant essentiel à la pathogénèse humaine
(Fouet et Mock 1996; Keim et al. 2001; Riedel 2004; Smith 1995).
Au 21e siècle
En 2001, au minimum cinq lettres contenant une quantité massive de B. anthracis
ont été postées à deux Sénateurs américains ainsi qu‘à certaines organisations
médiatiques. Des suites de ces envois postaux, 11 personnes ont contracté la
forme cutanée de la maladie du charbon alors que 11 autres ont contracté la forme
pulmonaire résultant malheureusement en cinq décès. Dix milles personnes,
considérées à risque d‘avoir été exposées, ont dû recevoir une antibiothérapie
prophylaxique. Les coûts et les effets psychosociaux reliés à cet acte bioterroriste
ont été considérables. L‘investigation conclut que le Dr Bruce Ivins, employé à
l‘USAMRIID, était responsable de ces attaques même si l‘accusé a commis un
suicide en juillet 2008 avant la fin du procès. Le rapport du FBI, Amerithrax
Investigation Summary, publié en février 2010, permet d‘avoir accès à plus
d‘information officielle au sujet des évènements de l‘automne 2001 (U.S.
Department of Justice 2010). Toutefois, ce sujet reste controversé puisque les
standards de la preuve microbiologique légale obtenue à l‘époque n‘étaient pas
comparables à ceux de la preuve médicolégale plus conventionnelle, e.g. la
balistique, façonnée par des années d‘expertise (Guillemin 2012; Relman 2012).
Les attaques de 2001 ont montré à quel point la population pouvait être vulnérable
aux actes bioterroristes et l‘importance de s‘y préparer pour diminuer leur impact.
Cet évènement allait de plus initier des changements au sujet des réglementations
en biosécurité. Toutefois, la même année, la publication d‘une étude australienne a
été critiquée par la communauté scientifique puisqu‘elle montrait l‘impact du génie
génétique sur la modulation de la réponse immunitaire, même chez une population
vaccinée (Selgelid et Weir 2010). L‘interleukine 4 (IL-4) murine a été transfectée
dans le virus murin ectromelia thymidine kinase positif, agent de la famille des
235
Poxviridae, causant la variole murine. Lorsqu‘exposées à la souche virale modifiée
génétiquement, les souris génétiquement résistantes et immunisées récemment
présentaient un haut taux de mortalité contrairement à celles non immunisées, des
suites d‘une variole murine fulminante (Jackson et al. 2001). Toutefois, le moyen
préventif le plus efficace contre la variole humaine reste la vaccination. Si cette
mesure de protection s‘avérait inefficace, en cas d‘acte bioterroriste utilisant cet
agent biologique,
les conséquences pourraient être dévastatrices.
Cette
controverse a montré que, malgré les avancées des comités de réglementation au
sujet de la recherche clinique, des comités en biosécurité étaient nécessaires pour
évaluer les implications éthiques de ce type de recherche. Ce débat est encore
ouvert puisque récemment le virus virulent de l‘influenza H5N1 aviaire a été
modifié génétiquement par plusieurs équipes de recherche. L‘objectif était d‘étudier
en laboratoire les variations génétiques nécessaires pour créer une souche
transmissible de personne à personne afin d‘élaborer un arsenal prophylactique et
thérapeutique avant la pandémie anticipée (MacKenzie 2011; Shoham 2012).
Certains mécanismes sont maintenant en place afin d‘évaluer les bénéfices et les
désavantages de censurer la littérature pour empêcher la publication de
techniques et de connaissances pouvant être utilisées à mauvais escient. Les
deux publications scrutées à la loupe ont d‘ailleurs été publiées depuis (Herfst et
al. 2012; Imai et al. 2012; Office of Biotechnology Activities 2012; World Health
Organization 2012).
Malgré toutes les mesures mises en œuvre, d‘autres incidents utilisant la ricine,
une toxine de plante, ont été répertoriés à la suite de l‘automne 2001. En 2003,
une lettre de menace signée Fallen Angel, accompagnant un récipient scellé
contenant de la ricine, a été trouvée dans une enveloppe dans un bureau de poste
à Greenville, en Caroline du Sud. L‘enquête réalisée par les autorités n‘a révélé
aucune maladie consistante à l‘exposition à la ricine chez les travailleurs de la
poste ou la population environnante. Le bureau de poste ciblé a dû être fermé pour
effectuer l‘enquête et s‘assurer que l‘environnement n‘était pas contaminé puisque
236
les moyens de détection actuels occasionnent de longs délais (Lutwick et Lutwick
2009).
Malheureusement, après 2001, plusieurs enveloppes contenant des poudres
inoffensives et des lettres de menace avertissant le destinataire de la présence
d‘agents biologiques ont été postés par de nombreuses personnes ou de
nombreux groupes avec des intentions variées. Pour ne citer qu‘un exemple
récent, une cinquantaine d‘enveloppes contenant des poudres suspectes ont été
postées à des élus du Parti Libéral du Québec et à des organisations médiatiques.
Ces lettres proféraient des menaces laissant croire que la poudre contenait en fait
B. anthracis et étaient signées au nom des Forces armées révolutionnaires du
Québec
(« FARQ »).
Elles
étaient
toutefois
inoffensives
biologiquement
puisqu‘elles ne contenaient que du bicarbonate de soude ou de la craie concassée
(Santerre 2012). Certaines nouvelles méthodes de détection des agents
biologiques peuvent permettre d‘évaluer rapidement avec une certaine probabilité
si la menace est réelle. Les autorités ont ainsi été en mesure de désamorcer
rapidement la crise en informant la population de l‘innocuité de ces poudres, ce qui
a évité qu‘un climat de panique ne se propage.
237
Annexe 2
Figures supplémentaires à l’article présenté au
Chapitre 3
Figure 23. Schéma de la trousse DARE.
Liste des composantes :
A : Écouvillon stérile.
T1 : Tube Sarstedt 15 ml contenant 1ml de PBS 1X.
S1 : Seringue 10 ml vide.
F1 : Filtre à seringue Millex-SV (diamètre des pores = 5 µm) de 25 mm.
T2 : Tube Sarstedt 15 ml vide.
S2 : Seringue 10 ml contenant 2 ml de PBS 1X.
S3 : Seringue 10 ml contenant 2 ml d‘eau.
S4 : Seringue 10 ml vide.
F2 : Filtre à seringue Millex-HV (diamètre des pores = 0,45 µm) de 13 mm.
S5 : Seringue 1 ml contenant 300 µl d‘eau et 700 µl d‘air.
T3 : Tube 1,5 ml contenant des billes de verre pour la lyse (BD GeneOhm lysis kit).
239
Figure 24. Protocole des procédures DARE et de lyse et fonction(s) de chaque étape entre
parenthèses.
Étape 1 : Dévisser T1 et écouvillonner l‘échantillon à analyser avec A (recueillir l‘échantillon
contenant potentiellement des bactéries).
Étape 2 : Visser T1 et mélanger (homogénéiser l‘échantillon dans le tampon et dissoudre les
composés solubles).
Étape 3 : Aspirer le contenu de T1 dans S1 (remplir la seringue pour la préfiltration).
Étape 4 : Fixer F1 à S1 et évacuer le contenu de S1 dans T2 (procéder à la préfiltration, retirer la
majorité des composés insolubles et récupérer les bactéries dans le filtrat).
Étape 5 : Fixer F1 à S2 et évacuer le contenu de S2 dans T2 (augmenter la récupération
bactérienne dans le filtrat).
Étape 6 : Fixer F1 à S3 et évacuer le contenu de S3 dans T2 (augmenter la récupération
bactérienne dans le filtrat).
Étape 7 : Aspirer le contenu de T2 dans F2-S4 (retenir les bactéries dans le filtre, retirer la majorité
des composés solubles dans le filtrat).
Étape 8 : Fixer F2 à S5 et évacuer le contenu de S5 dans T3 (récupérer les bactéries dans une
solution propre d‘eau).
Étape 9 : Vortexer le contenu de T3 5 min (procéder à la lyse bactérienne afin d‘en extraire leurs
acides nucléiques).
Étape 10 : Chauffer le contenu de T3 à 95C, 2 min (chauffage pour conservation de l‘échantillon
d‘acides nucléiques).
240
Figure 25. Diamètres des micro-organismes aéroportés associés au bioterrorisme, poudres
et autres référentiels en comparaison avec ceux des pores des filtres sélectionnés.
Les tailles de particules visibles ou invisibles à l‘œil nu ainsi que de certaines poudres évaluées
sont présentées pour faciliter la compréhension. La Figure 25 (Annexe 2) montre que les bactéries,
les virus et même certaines spores fongiques pourraient traverser le préfiltre (PF : pores de 5 µm
de diamètre). Si la détection d‘autres agents biologiques de tailles différentes était évaluée, le filtre
de capture pourrait être modifié. La Figure 25 (Annexe 2) montre les diamètres des pores du filtre
de capture (FC : pores de 0,45 µm) ainsi que les diamètres de bactéries, virus et spores fongiques
associés au bioterrorisme. On y constate donc que ce filtre pourrait être modifié pour certaines
bactéries plus petites, comme F. tularensis.
241
Figure 26. Visualisation des filtres sélectionnés en microscopie optique.
La structure des filtres sélectionnés a été observée avec un microscope épifluorescent Nikon
Eclipse TE300 en champ clair (Nikon Instruments, Melville, NY, USA) (×1000). Les images ont été
analysées avec le logiciel ImageJ (http://rsbweb.nih.gov/ij/). La structure (A) des filtres Millex-SV,
taille des pores de 5 µm et (B) Millex-HV, taille des pores 0,45 µm.
242
A
B
Figure 27. Représentation virtuelle du positionnement des spores dans les filtres avec la
taille des pores de 0,45 µm.
La pénétration (A) et l‘expulsion (B) des spores de B. atrophaeus marqués au FITC dans les filtres
Millex-HV (pores de 0,45 µm) a été évaluée par microscopie confocale (Olympus FV300). Les
coordonnées x, y et z de chaque spore ont été mesurées dans les filtres. Les flèches vertes (x),
rouges (y) et bleues (z) représentent respectivement la longueur, la largeur et l‘épaisseur du champ
optique observé. Le diamètre de chaque carré du grillage mesure 17,75 µm. Les spores ont été
représentées par des sphères colorées. Les filtres ont l‘apparence d‘un nuage blanc. Le côté
supérieur du filtre faisant face au tube correspond au côté où les spores pénètrent.
243
Figure 28. Schéma analytique présentant le nombre d’échantillons sur les 23 analysés
interférant avec la lyse bactérienne ou la PCR.
Sans traitement, un total de 14/23 poudres pouvait nuire à la détection par la PCR alors que 3 autres
pouvaient nuire à la lyse. Ce schéma montre également comment une étape de préfiltration et/ou de
lavage permet d’éliminer ces interférences.
244
Annexe 3
Tableaux supplémentaires à l’article présenté au
Chapitre 5
Tableau 16. GeneBank Accession numbers from which tuf gene sequences were retrieved.
AE000511
AE000512
AE000513
AE000516
AE000520
AE000657
AE000782
AE000783
AE001273
AE001363
AE001437
AE001439
AE002098
AE002160
AE002161
AE003849
AE003852
AE004091
AE004092
AE004439
AE004969
AE005174
AE005176
AE005672
AE005673
AE005674
AE006468
AE006470
AE006641
AE006914
AE007317
AE007869
AE008691
AE008922
AE008923
AE009440
AE009442
AE009948
AE009949
AE009950
AE009952
AE010300
AE013218
AE013598
AE014073
AE014074
AE014075
AE014133
AE014184
AE014291
246
AE014295
AE014299
AE014613
AE015450
AE015451
AE015924
AE015925
AE015927
AE015928
AE015929
AE016795
AE016822
AE016823
AE016825
AE016826
AE016827
AE016828
AE016830
AE016853
AE016879
AE016958
AE017042
AE017125
AE017126
AE017143
AE017180
AE017194
AE017196
AE017197
AE017198
AE017199
AE017220
AE017221
AE017223
AE017225
AE017226
AE017243
AE017244
AE017245
AE017261
AE017262
AE017263
AE017282
AE017283
AE017285
AE017308
AE017321
AE017332
AE017333
AE017334
AE017340
AE017354
AE017355
AF222894
AJ235269
AJ749949
AJ938182
AJ965256
AL009126
AL096836
AL111168
AL123456
AL139299
AL157959
AL445566
AL450380
AL513382
AL590842
AL591688
AL591824
AL592022
AL645882
AL646052
AL732656
AL935263
AL954747
AM039952
AM040264
AM114193
AM167904
AM180252
AM180355
AM181176
AM233362
AM236080
AM260479
AM260522
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CP001892
CP001896
CP001899
CP001900
CP001901
CP001903
CP001905
CP001907
CP001918
CP001921
CP001924
CP001928
CP001930
CP001931
CP001932
CP001936
CP001937
CP001939
CP001940
CP001941
CP001958
CP001959
CP001960
CP001962
CP001964
CP001965
CP001966
CP001968
CP001969
CP001977
CP001978
CP001981
CP001982
CP001983
CP001991
CP001992
CP001993
CP001994
CP001995
CP001996
CP001997
CP001998
CP001999
CP002000
CP002001
CP002002
CP002003
CP002004
CP002005
CP002006
CP002008
CP002009
CP002010
CP002011
CP002013
CP002017
CP002018
CP002021
CP002024
CP002025
CP002026
CP002028
CP002029
CP002031
CP002032
CP002033
CP002034
CP002038
CP002039
CP002042
CP002045
CP002046
CP002047
CP002048
CP002049
CP002050
CP002051
CP002052
CP002054
CP002056
CP002057
CP002059
CP002069
CP002071
CP002073
CP002074
CP002076
CP002077
CP002078
CP002080
CP002083
CP002084
CP002085
CP002086
CP002094
CP002095
CP002096
CP002097
CP002098
CP002100
CP002102
CP002103
CP002104
CP002105
CP002106
CP002107
CP002108
CP002109
CP002110
CP002113
CP002114
CP002116
CP002117
CP002118
CP002120
CP002122
CP002124
CP002130
CP002131
CP002154
CP002156
CP002157
CP002158
CP002159
CP002160
CP002161
CP002162
CP002163
CP002164
CP002165
CP002167
CP002170
CP002171
CP002175
CP002176
CP002177
CP002183
CP002184
CP002185
CP002188
CP002189
CP002198
CP002205
CP002206
CP002207
CP002209
CP002210
CP002211
CP002212
CP002213
CP002215
CP002216
CP002219
CP002220
CP002221
CP002222
CP002224
CP002228
CP002243
CP002244
CP002246
CP002248
CP002251
CP002252
CP002271
CP002272
CP002274
CP002276
CP002277
CP002278
CP002279
CP002280
CP002281
CP002284
CP002286
CP002287
CP002290
CP002292
CP002293
CP002295
CP002297
CP002299
CP002300
CP002302
CP002303
CP002304
CP002305
CP002312
CP002326
CP002329
CP002330
CP002331
CP002332
CP002334
CP002336
CP002338
CP002339
CP002341
CP002343
CP002344
CP002345
CP002346
CP002347
CP002349
CP002351
CP002352
CP002353
CP002355
CP002360
CP002361
CP002363
CP002364
CP002365
CP002371
CP002374
CP002375
CP002376
CP002377
CP002379
CP002382
CP002383
CP002385
CP002394
CP002395
CP002399
CP002400
CP002401
CP002403
CP002409
CP002410
CP002416
CP002417
CP002418
CP002419
CP002420
CP002421
CP002422
CP002423
CP002424
CP002428
CP002429
CP002431
CP002432
CP002433
CP002439
CP002440
CP002442
CP002444
CP002446
CP002447
CP002449
CP002452
CP002453
CP002454
CP002455
CP002456
CP002457
CP002458
CP002459
CP002461
CP002464
CP002465
CP002466
CP002467
CP002468
CP002469
CP002471
CP002472
CP002475
CP002478
CP002479
CP002480
CP002487
CP002491
CP002496
CP002505
CP002508
CP002511
CP002512
CP002513
CP002514
CP002516
CP002519
CP002521
CP002522
CP002525
CP002526
CP002528
CP002530
CP002534
CP002536
CP002541
CP002542
CP002543
CP002544
CP002545
CP002546
CP002547
CP002549
CP002552
CP002555
CP002557
CP002558
CP002559
CP002563
CP002565
CP002568
CP002570
CP002571
CP002572
CP002573
CP002582
CP002583
CP002584
CP002585
CP002586
CP002588
CP002589
CP002593
CP002599
CP002606
CP002607
CP002608
CP002609
CP002614
CP002616
CP002618
CP002620
CP002621
CP002622
CP002623
CP002627
CP002628
CP002629
CP002630
CP002631
CP002633
CP002634
CP002637
CP002638
CP002640
CP002641
CP002643
CP002644
CP002645
CP002648
CP002651
CP002652
CP002657
CP002659
CP002660
CP002663
CP002665
CP002666
CP002667
CP002669
CP002683
CP002689
CP002690
CP002691
CP002695
CP002696
CP002725
CP002727
CP002728
CP002729
CP002735
CP002736
CP002737
CP002738
CP002739
CP002740
CP002743
CP002745
CP002746
CP002764
CP002767
CP002770
CP002771
CP002773
CP002774
CP002775
CP002776
CP002777
CP002780
CP002781
CP002786
CP002789
CP002790
CP002791
CP002792
CP002794
CP002797
CP002798
CP002801
CP002804
CP002805
CP002806
CP002807
CP002808
CP002810
CP002811
CP002815
CP002816
CP002819
CP002821
CP002824
CP002825
CP002826
CP002829
CP002830
CP002835
CP002838
CP002843
CP002850
CP002857
CP002858
CP002859
CP002865
CP002868
CP002869
CP002870
CP002872
CP002874
CP002876
CP002877
CP002881
CP002886
CP002888
CP002896
CP002898
CP002899
CP002901
CP002902
CP002903
CP002904
CP002905
CP002906
CP002910
249
CP002912
CP002913
CP002914
CP002917
CP002918
CP002924
CP002925
CP002927
CP002931
CP002933
CP002955
CP002956
CP002980
CP002982
CP002983
CP002985
CP002986
CP002987
CP002991
CP002992
CP002993
CP002994
CP002999
CP003000
CP003001
CP003015
CP003017
CP003021
CP003022
CP003026
CP003029
CP003033
CP003034
CP003039
CP003040
CP003046
CP003047
CP003056
CP003057
CP003058
CP003059
CP003060
250
CP003061
CP003062
CP003065
CP003068
CP003069
CP003075
CP003082
CP003084
CP003085
CP003087
CP003093
CP003094
CP003096
CP003099
CP003101
CP003107
CP003108
CP003109
CP003115
CP003117
CP003125
CP003126
CP003128
CP003130
CP003132
CP003137
CP003147
CP003150
CP003151
CP003152
CP003153
CP003155
CP003156
CP003166
CP003169
CP003170
CP003171
CP003174
CP003176
CP003178
CP003179
CP003187
CP003191
CP003192
CP003194
CP003195
CP003196
CP003197
CP003199
CP003200
CP003206
CP003207
CP003208
CP003209
CP003210
CP003211
CP003212
CP003213
CP003214
CP003215
CP003216
CP003217
CP003218
CP003219
CP003221
CP003222
CP003231
CP003241
CP003244
CP003257
CP003259
CP003275
CP003278
CP003295
CP003315
CR354531
CR522870
CR543861
CR555306
CR626927
CR628336
CR628337
CR767821
CR848038
CR925677
CR925678
CR931997
CR936503
CR954246
CR954253
CT573213
CT573326
CT971583
CT978603
CU179680
CU207211
CU207366
CU234118
CU458896
CU459141
CU468135
CU468230
CU469464
CU633749
CU651637
CU928145
CU928158
CU928160
CU928161
CU928162
CU928163
CU928164
DQ489736
FM162591
FM177140
FM178379
FM179322
FM179323
FM180568
FM200053
FM204883
FM204884
FM209186
FM211187
FM211192
FM211688
FM242711
FM252031
FM252032
FM864216
FM872306
FM872307
FM872308
FM954972
FM991728
FM999788
FN298497
FN392235
FN424405
FN433596
FN434113
FN538970
FN543093
FN543502
FN545816
FN554766
FN554889
FN555004
FN557490
FN563149
FN568063
FN597254
FN597644
FN598874
FN645454
FN649414
FN650140
FN652779
FN666575
FN667741
FN667742
FN692037
FN822744
FN869568
FN995097
FP103042
FP236530
FP236842
FP236843
FP475956
FP565809
FP671138
FP885897
FP929003
FP929032
FP929033
FP929034
FP929036
FP929037
FP929038
FP929039
FP929042
FP929043
FP929044
FP929045
FP929046
FP929047
FP929049
FP929050
FP929051
FP929053
FP929054
FP929055
FP929058
FP929059
FP929060
FP929061
FP929062
FP929140
FQ311868
FQ311875
FQ312002
FQ312003
FQ312004
FQ312005
FQ312006
FQ312027
FQ312029
FQ312030
FQ377874
FQ482149
FQ670178
FQ670179
FQ670204
FQ790233
FQ859181
FQ859183
FQ859185
FR668087
FR687253
FR687359
FR714927
FR720602
FR729477
FR773153
FR773526
FR774048
FR821777
FR821779
FR824043
FR856862
FR870271
FR871757
FR872580
FR872582
FR873481
FR873482
FR875178
FR877557
FR878060
HE572590
HE576794
HE577327
HE613569
HE616890
HE617159
HE617160
L42023
L43967
U00089
U00096
Tableau 17. Number of strains from which genome sequences were available, and tuf gene
sequences
were
not.genome sequences were available, and tuf gene sequences were retreived or not
Table
S1b. Number
of retreived
strains fromor
which
Available
tuf gene retreived
Groups
Acidobacteria
Actinobacteria
Alphaproteobacteria
Aquificae
Bacteroidetes/Chlorobi
Betaproteobacteria
Chlamydiae/Verrucomicrobia
Chloroflexi
Crenarchaeota
Cyanobacteria
Deinococcus-Thermus
Deltaproteobacteria
Epsilonproteobacteria
Euryarchaeota
Firmicutes
Fusobacteria
Gammaproteobacteria
Nanoarchaeota
Other Archaea
Other Bacteria
Planctomycetes
Spirochaetes
Thermotogae
Qte
7
191
181
10
79
118
39
15
41
42
15
47
63
79
443
5
394
1
2
56
5
44
13
TOTAL
1890
Groups
Acidobacteria
Actinobacteria
Alphaproteobacteria
Aquificae
Bacteroidetes/Chlorobi
Betaproteobacteria
Chlamydiae/Verrucomicrobia
Chloroflexi
Crenarchaeota
Cyanobacteria
Deinococcus-Thermus
Deltaproteobacteria
Epsilonproteobacteria
Euryarchaeota
Firmicutes
Fusobacteria
Gammaproteobacteria
Nanoarchaeota
Other Archaea
Other Bacteria
Planctomycetes
Spirochaetes
Thermotogae
tuf gene not retreived
Qte
7
182
174
10
77
117
38
15
22
38
15
47
61
49
415
4
384
1
1
54
5
42
13
1771
Groups
Acidobacteria
Actinobacteria
Alphaproteobacteria
Aquificae
Bacteroidetes/Chlorobi
Betaproteobacteria
Chlamydiae/Verrucomicrobia
Chloroflexi
Crenarchaeota
Cyanobacteria
Deinococcus-Thermus
Deltaproteobacteria
Epsilonproteobacteria
Euryarchaeota
Firmicutes
Fusobacteria
Gammaproteobacteria
Nanoarchaeota
Other Archaea
Other Bacteria
Planctomycetes
Spirochaetes
Thermotogae
Qte
0
9
7
0
2
1
1
0
19
4
0
0
2
30
28
1
10
0
1
2
0
2
0
119
251
Annexe 4
Analyses phylogénétiques supplémentaires à
l’article présenté au Chapitre 6
100
Y. intermedia ATCC 29909T (AX109504)
Y. intermedia ATCC 29909T tufB
Y. rohdei ATCC 43380T (AX109507)
89
Y. frederiksenii ATCC 33641T (AX109503)
100
Yfrederiksenii ATCC 33641T tufB
Y.
pseudotuberculosis
ATCC
29833T(AX109506)
100 Y. pestis KIM D27 (AX109505)
63
100
Y. pestis 91001 tufB
Y. enterocolitica ATCC 9610T (AX109502)
Y. enterocolitica subsp. enterocolitica 8081 tufB
Y. pestis 91001 tufA
99
Y. enterocolitica subsp. enterocolitica 8081tufA
94
Y. frederiksenii ATCC 33641T tufA
79
99
Y. intermedia ATCC 29909T tufA
0.02 substitution/site
Figure 29. Arbre phylogénétique des séquences du gène tuf du genre Yersinia de Paradis et
al. (2005) et de génomes.
Arbre Maximum Composite Likelihood des positions 309 à 1 116 du gène tuf selon la séquence de
tufB de Y. pestis 91 001, 1 000 analyses bootstraps ont été effectuées. L‘alignement a été fait en
utilisant ClustalW implémenté dans Mega 5.05. Les séquences en caractères gras sont celles de
Paradis et al. (2005) et les identifiants entre parenthèses correspondent aux numéros d‘accession
de Genbank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/). Les gènes dupliqués tufA et tufB des
génomes séquencés (AALE00000000, AALF00000000, AM286415.1, AE017042.1) ont été
identifés en étudiant la synténie des gènes voisins (opéron str, fusA-tufA; opéron tRNA-tufB, tRNAtufB et secE-nusG en aval). Les séquences présentées dans l‘article de Paradis et al.
correspondent à tufB.
253
Y. bercovieri 88-0762, ATCC 43970 and CCUG 26330 tufA
Y. bercovieri CCUG 26539 tufA
Y. aleksiciae LMG 22254 tufA
Y. frederiksenii ATCC 33641 tufA
71
Y. frederiksenii CCUG 26594 tufA
99
99 Y. frederiksenii ER5307 tufA
78
Y. mollaretii ER4215 tufA
100 Y. aldovae ATCC 35236, CCUG 26532 and CCUG 26915 tufA
Y. aldovae ATCC 35237 tufA
98
Y. intermedia ATCC 29909 tufA
70
Y.
intermedia ATCC 33647 tufA
100
Y. intermedia ATCC 33648 tufA
57
90
Y. mollaretii ATCC 43969 tufA
100 Y. mollaretii CCUG 26536 tufA
Y. kristensenii ATCC 33638, CCUG 26582, CCUG 26589 and CCUG 46842 tufA
Y. enterocolitica subsp. palearctica CCUG 31436 tufA
100
Y. enterocolitica subsp. palearctica CCUG 18381 tuA
33
99
Y. enterocolitica subsp. enterocolitica 8081 tufA
73
60 Y. enterocolitica subsp. enterocolitica ATCC 23715, ATCC 27729, ATCC 9610 and CCUG 8238 tufA
100 Y. rohdei ATCC 43380, ATCC 43871, CCUG 26544 and CCUG 26545 tufA
36
Y. rohdei ATCC 43873 tufA
Y. ruckeri ATCC 29473, CCRI-10643 and CCUG 21537 tufA
98
100 Y. frederiksenii ATCC 29912 tufA
24
Y. frederiksenii CCUG 8246, CCUG 26949 and CCUG 30114 tufA
Y. similis CCRI-19282 tufA *
13
Y. pseudotuberculosis ATCC 13979 and CCUG 17342 tufA
100
Y.
pestis
91001, Antiqua, CO92 and KIM and Y. pseudotuberculosis ATCC 27802, ATCC 29833, CCUG 17345, CCUG 37903, etc tufA
88
58
Y. enterocolitica subsp. palearctica CCRI-905, CCRI-952, CCRI-1044, etc tufA
Y.
massiliensis CCRI-19283 tufA *
99
100
Y. aldovae ATCC 35236, CCUG 26532 and CCUG 26915 tufB
Y. aldovae ATCC 35237 tufB
87
Y. kristensenii CCUG 26582 and CCUG 46842 tufB
100
Y. kristensenii CCUG 26589 tufB
97
Y. kristensenii ATCC 33638 tufB
39
Y.
enterocolitica
subsp. enterocolitica 8081, ATCC 23715, ATCC 27729, ATCC 9610 and CCUG 8238 tufB
68
99 Y. enterocolitica subsp. palearctica CCRI-952, CCRI-1139, CCRI-9984, CCRI-10035, etc tufB
Y. enterocolitica subsp. palearctica CCRI-1044, CCRI-905 and CCUG 33553 tufB
100
Y. enterocolitica subsp. palearctica CCUG 18381 tufB
48
91 Y. enterocolitica subsp. palearctica CCUG 31436 tufB
Y. massiliensis CCRI-19283 tufB *
Y. ruckeri ATCC 29473, CCRI-10643 and CCUG 21537 tufB
47 Y. pestis Antiqua, CO92 and KIM tufB
64 Y. pestis Nepal516 tufB
66
52
Y. pestis 91001 tufB
100
Y. pseudotuberculosis ATCC 27802, ATCC 29833, CCUG37903, CCUG 7803, ER5271 and IP32953 tufB
100
Y.
pseudotuberculosis CCUG 17345 tufB
100
34
Y. pseudotuberculosis ATCC 13979 and CCUG 17342 tufB
Y. similis CCRI-19282 tufB *
100 Y. bercovieri 88-0762, ATCC 43970 and CCUG 26330 tufB
100
Y. bercovieri CCUG 26539 tufB
87
Y. aleksiciae LMG 22254 tufB
46
Y. mollaretii ATCC 43969 tufB
100 Y. mollaretii CCUG 26536 and ER4215 tufB
92 Y. rohdei ATCC 43380, ATCC 43871 and CCUG 26544 tufB
100
Y. rohdei ATCC 43873 tufB
39
33
Y. rohdei CCUG 26545 tufB
Y. frederiksenii ATCC 29912, CCUG 8246 and CCUG 26949 tufB
100 Y. frederiksenii CCUG 30114 tufB
100 Y. frederiksenii CCUG 26594 tufB
92
94
Y. frederiksenii ER5307 tufB
Y. frederiksenii ATCC 33641 tufB
Y. intermedia ATCC 33648 tufB
53
Y. intermedia ATCC 29909 tufB
100
100 Y. intermedia ATCC 33647 tufB
97 H. alvei ATCC 25927 tufA
55
O. proteus ATCC 12841 tufA
86
H. alvei ATCC 13337 tufA
H. alvei ATCC 51873, CCRI-11829, CCRI-10616 tufA
78 H. alvei CCRI-16651 tufA
95 H. alvei ATCC 25927 tufB
100 100
O. proteus ATCC 12841 tufB
H. alvei ATCC 13337 tufB
H. alvei CCRI-11829 tufB
52
H. alvei ATCC 51873 and CCRI-10616 tufB
99
H.
alvei CCRI-16651 tufB
99
100 S. fonticola DSM 4576 tufA
96
S. fonticola DSM 4576 tufB
S. marcescens ATCC 13880 tufA
S. marcescens ATCC 13880 tufB
100
100 E. carotovora SCRI1043 tufA
78
E. carotovora SCRI1043 tufB
100 Y. regensburgei ATCC 35313 tufA
Y. regensburgei ATCC 35313 tufB
88
100 E. vulneris ATCC 33821 tufA
E. vulneris ATCC 33821 tufB
98
94
E. agglomerans ATCC 27989 tufA
E. agglomerans ATCC 27989 tufB
95
100 K. pneumoniae ATCC 13883 tufA
K. pneumoniae ATCC 13883 tufB
93
81
S. Typhimurium LT2 tufA
53
S. Typhimurium LT2 tufB
S. flexneri 2457T tufB
99
E. coli K-12 and S. flexneri 2457T tufA
97
61 E. coli K-12 tufB
P. luminescens TTO1 tufA and tufB
100 P. shigelloides ATCC 14029 tufA
P. shigelloides ATCC 14029 tufB
V. cholerae N16961 tufA
V. cholerae N16961 tufB
100
93
97
81
19
64
62
0.02
254
Figure 30. Arbre phylogénétique des séquences d’acides nucléiques des gènes tufA et tufB
des souches du genre Yersinia, incluant Y. massiliensis, Y. similis et d’autres de la famille
Enterobacteriaceae.
Arbre phylogénétique basé sur la comparaison des séquences en acides nucléiques de tufA et
tufB. Les branches des gènes tufA et tufB des Yersinia sont respectivement bleues et rouges. Les
branches du gène tuf des autres espèces d‘Enterobacteriaceae sont vertes alors que celles de
V. cholerae sont noires. La méthodologie utilisée est la même que celle décrite dans l‘article
(Chapitre 6) pour la Figure 19A [Figure 1A], à l‘exception de la longueur du gène tuf analysé
(positions 320 à 1 086 selon Y. pestis CO92) et de la version du logiciel Mega 5.05. Le terme
« etc. » signifie que d‘autres souches sont représentées à ce niveau et le lecteur est référé à la
Figure 19A [Figure 1A] du Chapitre 6. * : séquences de Y. massiliensis et Y. similis.
255
Figure 31. Arbre phylogénétique du programme fastDNAml des séquences en acides
nucléiques de 51 souches de Yersinia, de 8 autres espèces d’Enterobacteriaceae et enraciné
avec V. cholerae.
Des arbres phylogénétiques ont été créés en utilisant une méthode de maximum-likelihood
heuristique du programme fastDNAml (v. 1.2.2.) (Olsen et al. 1994). Le programme fastDNAml a
été éxécuté 100 fois (K=10 et J généré de façon aléatoire à chaque fois). Quatre arbres
phylogénétiquement indistinguables présentant le plus haut Ln likelihood exactement pareil ont été
obtenus. Les branches de tufA et tufB des Yersinia sont respectivement présentées en bleues et
rouges. Les branches du gène tuf des autres espèces d‘Enterobacteriaceae sont présentées en
verts alors que celles de V. cholerae sont en noires.
256
Y. enterocolitica subsp. enterocolitica 8081 (5)
Y. enterocolitica subsp. enterocolitica 8081 (7)
36
Y. enterocolitica subsp. enterocolitica 8081 (4)
66 Y. enterocolitica subsp. enterocolitica 8081 (3)
100
Y. enterocolitica subsp. enterocolitica 8081 (2)
Y. enterocolitica subsp. enterocolitica 8081 (1)
Y. enterocolitica subsp. enterocolitica 8081 (6)
Y. pestis KIM yr005
Y. pestis KIM yr008
Y. pestis KIM yr011
100 Y. pestis KIM yr014
Y. pestis KIM yr020
Y. pestis KIM yr001
66 Y. pestis KIM yr024
E. coli MG1655 K-12 rrsH
66
98
100
E. coli MG1655 K-12 rrsG
E. coli MG1655 K-12 rrsD
E. coli MG1655 K-12 rrsC
99
89
E. coli MG1655 K-12 rrsB
E. coli MG1655 K-12 rrsA
40 E. coli MG1655 K-12 rrsE
0.005
Figure 32. Arbre phylogénétique des copies multiples du gène 16S rDNA de Y. enterocolitica,
Y. pestis et E. coli.
La longueur complète (1 489 pb) des copies du gène 16S rDNA selon les séquences du gènome
annoté de Y. enterocolitica sous-espèce enterocolitica 8 081 a été utilisée. L‘alignement a été fait
en utilisant ClustalW et l‘arbre construit en utilisant le MCL implémenté dans Mega 5.05. L‘analyse
statistique bootstrap a été répétée 1 000 fois. Cette analyse montre la similarité des copies du gène
16S rDNA chez le genre Yersinia en comparaison avec E. coli MG1655 K-12, un autre membre de
la famille des Enterobacteriaceae utilisé à titre de contrôle négatif. La stabilité des copies du gène
16S rDNA suggère donc que le genre Yersinia est toujours sous l‘influence des mécanismes de
conversion.
257
Y. enterocolitica subsp. enterocolitica 8081 (4)
80
Y. enterocolitica subsp. enterocolitica 8081 (5)
38 Y. enterocolitica subsp. enterocolitica 8081 (3)
Y. enterocolitica subsp. enterocolitica 8081 (1)
100
43 Y. enterocolitica subsp. enterocolitica 8081 (6)
Y. enterocolitica subsp. enterocolitica 8081 (2)
66 Y. enterocolitica subsp. enterocolitica 8081 (7)
60
Y. pestis KIM yr006
51 Y. pestis KIM yr009
Y. pestis KIM yr012
Y. pestis KIM yr002
10063
Y. pestis KIM yr023
77
Y. pestis KIM yr015
88 Y. pestis KIM yr019
E. coli MG1655 K-12 rrlC
E. coli MG1655 K-12 rrlH
100
51
E. coli MG1655 K-12 rrlA
E. coli MG1655 K-12 rrlD
48
E. coli MG1655 K-12 rrlE
78
97
E. coli MG1655 K-12 rrlG
98 E. coli MG1655 K-12 rrlB
0.005
Figure 33. Arbre phylogénétique des copies multiples du gène 23S rDNA de Y. enterocolitica,
Y. pestis et E. coli.
La longueur complète (2 996 pb) des copies du gène 23S rDNA selon les séquences du génome
annoté de Y. enterocolitica sous-espèce enterocolitica 8 081 a été utilisée. L‘alignement a été fait
en utilisant ClustalW et l‘arbre construit en utilisant le MCL implémenté dans Mega 5.05. L‘analyse
statistique bootstrap a été répétée 1 000 fois. Cette analyse montre la similarité des copies du gène
23S rDNA chez le genre Yersinia en comparaison avec E. coli MG1655 K-12, un autre membre de
la famille des Enterobacteriaceae utilisé à titre de contrôle négatif. La stabilité des copies du gène
23S rDNA suggère donc également que le genre Yersinia est toujours sous l‘influence des
mécanismes de conversion.
258
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