MICROBIOLOGÍA INDUSTRIAL

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MICROBIOLOGÍA INDUSTRIAL
PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA
FACULTAD DE CIENCIAS
MICROBIOLOGÍA INDUSTRIAL
AISLAMIENTO DE BACTERIAS LIPOLÍTICAS Y DETERMINACIÓN DE PATÓGENOS
HUMANO Escherichia coli y Salmonella sp. A PARTIR DE RESIDUOS ORGÁNICOS
DOMICILIARIOS EN COMPOSTAJE
LEIDY ANDREA CEPEDA PATIÑO
SANDRA PATRICIA VALENCIA CÁRDENAS
Directora:
ADRIANA MATIZ VILLAMIL
BACTERIOLOGA M. Sc.
Codirectora:
MARÍA MERCEDES MARTÍNEZ
MICROBIÓLOGA M. Sc.
PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA
FACULTAD DE CIENCIAS
CARRERA MICROBIOLOGÍA INDUSTRIAL
BOGOTÁ D.C.
DICIEMBRE DE 2007
NOTA DE ADVERTENCIA
Artículo 23 de la resolución No. 13 de julio de 1946
“La Universidad no se hace responsable por los conceptos emitidos por sus alumnos en
sus trabajos de tesis. Solo velará porque no se publique nada contrario al dogma y la
moral católica y porque la tesis no contenga ataques personales contra persona alguna,
antes bien se vea en ellas el anhelo por buscar verdad y justicia”.
PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA
FACULTAD DE CIENCIAS
MICROBIOLOGÍA INDUSTRIAL
AISLAMIENTO DE BACTERIAS LIPOLÍTICAS Y DETERMINACIÓN DE PATÓGENOS
HUMANOS Escherichia coli y Salmonella sp. A PARTIR DE RESIDUOS ORGÁNICOS
DOMICILIARIOS EN COMPOSTAJE
LEIDY ANDREA CEPEDA PATIÑO
SANDRA PATRICIA VALENCIA CÁRDENAS
Aprobado:
___________________________
_______________________
Dra. Adriana Matiz Villamil
Directora
Dra. María Mercedes Martínez
Coodirectora
__________________________
_______________________
Dra. Andrea Aguirre
Jurado
Dr. David Gómez
Jurado
PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA
FACULTAD DE CIENCIAS
MICROBIOLOGÍA INDUSTRIAL
AISLAMIENTO DE BACTERIAS LIPOLÍTICAS Y DETERMINACIÓN DE PATÓGENOS
HUMANOS Escherichia coli y Salmonella sp. A PARTIR DE RESIDUOS ORGÁNICOS
DOMICILIARIOS EN COMPOSTAJE
LEIDY ANDREA CEPEDA PATIÑO
SANDRA PATRICIA VALENCIA CÁRDENAS
Aprobado:
_________________________________
____________________________
Dra. ANGELA UMAÑA MUÑOZ.,M.Phil
Decano Académico Facultad de Ciencias
Dra. Janeth Arias
Directora Carrera de Microbiología
A Dios por brindarme apoyo para alcanzar todas mis metas….
A mi mama por ser compañera y amiga por su apoyo y compañía durante
la elaboración de este trabajo de grado
A mi papa por ser la inspiración de todo lo que hago
A mis tios por la confianza y apoyo constante a pesar de la distancia
A mis amigas por su amistad y por compartir conmigo esta gran
experiencia
Leidy Andrea Cepeda Patiño
A Dios por haberme acompañado en el transcurso de mi carrera. A mi
mami por darme apoyo en los momentos mas difíciles y por infundirme
paciencia cuando creí que esto no sería posible. A mi papi por darme
ejemplo de no desfallecer y luchar por lo que se quiere. A mis amigos que
me brindaron una sonrisa y sus palabras en el momento justo. Por último
a mis compañeros de laboratorio por su ayuda incondicional en los
momentos de desesperación.
Sandra Patricia Valencia Cãrdenas.
AGRADECIMIENTOS
A Bioagrícola del Llano S.A. E.S.P., empresa de aseo de Villavicencio por la colaboración
prestada durante el desarrollo de este proyecto.
A la Dra. Adriana Matiz directora del presente proyecto, por su dedicación e infinita
paciencia, aportando sus conocimientos para el desarrollo de este trabajo.
A la Dra. Maria Mercedes Martínez codirectora del presente proyecto, por el aporte de sus
conocimientos y su paciencia para concluir con éxito este trabajo.
A todos aquellos que de una u otra forma colaboraron con nuestro trabajo e hicieron
posible que este se llevara a cabo.
DICIEMBRE DE 2007
TABLA DE CONTENIDO
Pág.
1.-INTRODUCCIÓN
1
2.- MARCO TEÓRICO
2
COMPOSTAJE
2
2.1.1 Beneficios del Uso del Compost
2
2.1.2 Factores de Importancia
3
•
Equilibrio carbono/nitrógeno
3
•
Temperatura
4
•
Humedad
5
•
pH
6
•
Aireación
6
•
Tamaño de partícula
7
•
Ambiente
7
•
Porcentaje de líquido efectivo (% LE)
7
2.2 PROPIEDADES FÍSICO QUÍMICAS DE LOS RESIDUOS COMPOSTABLES
8
2.2.1 Propiedades Físicas.
8
2.2.2 Propiedades Químicas.
8
2.3 ESTRUCTURA DE LÍPIDOS Y GENERALIDADES DE LAS LIPASAS
8
•
Lípidos simples
9
•
Lípidos complejos
9
2.4 LIPASAS
10
2.4.1 Métodos de Determinación de Lipasas
12
2.4.2 Enzimas Termoestables
12
2.4.3 Enzimas en el Tratamiento de Residuos
14
2.4.4 Importancia Industrial de las Enzimas Lipolíticas
14
2.4.5 Microorganismos reconocidos Biotecnológicamente como Productores de
Lipasas
16
2.5 IMPORTANCIA DE LOS INOCULANTES BIOLÓGICOS.
17
2.6
19
MICROORGANISMOS
PATÓGENOS
3.- JUSTIFICACIÓN
21
4.- OBJETIVOS
23
4.1 Objetivo General.
23
4.2 Objetivos Específicos.
23
5.- METODOLOGÍA
24
5.1 REACTIVACIÓN DE CEPAS
24
5.2 FASE DE LABORATORIO
24
5.2.1 MUESTREO
24
5.2.2 PROCESAMIENTO DE LAS MUESTRAS
25
5.2.2.1 Aislamiento de bacterias con actividad lipolítica
25
5.2.2.2 Identificación microscópica y macroscópica de las colonias
26
5.3 BANCO DE CÉLULAS PRIMARIO (Conservación de Cepas)
26
5.4 PRUEBAS DE ANTAGONISMO
26
5.5 CURVAS DE CRECIMIENTO
28
5.5.1 Producción del inóculo
28
5.5.2 Fermentación Discontinua
28
5.6 TÉCNICA COLORIMÉTRICA P-NITROFENIL PALMITATO PARA ACTIVIDAD
LIPOLÍTICA
28
5.6.1 Curva Patrón de p-nitrofenol
28
5.6.1.1 Evaluación y estandarización cuantitativa de actividad lipolítica
29
5.6.1.2 Prueba preliminar de actividad enzimática
29
5.7 DETERMINACIÓN DE MICROORGANISMOS PATÓGENOS Escherichia coli y
Salmonella sp
31
5.7.1 Determinación de microorganismos patógenos Salmonella sp
32
5.7.2 Determinación de Escherichia coli
33
5.8
FASE
DE
CAMPO
34
5.8.1 Determinación de pH y Temperatura
34
5.8.2 Análisis Físico Químico de las muestras
34
6. RESULTADOS Y DISCUSIÓN
36
6.1. Procesamiento de las muestras
36
6.1.1 Aislamiento de bacterias con actividad lipolítica
36
6.1.2 Identificación macroscópica y microscópica de las cepas
38
6.1.3 Criopreservación de cepas
40
6.1.4 PRUEBAS DE ANTAGONISMO
40
6.2 CURVAS DE CRECIMIENTO
42
6.3 CURVA DE CALIBRACIÓN
45
6.3.1 Actividad Lipolítica
45
6.3.1.1 Estandarización del tiempo de contacto entre sustrato y extracto crudo
45
6.3.1.2 Estandarización de diferentes concentraciones de sustrato
46
6.3.1.3 Estandarización con diferentes volúmenes de extracto crudo 20 ul, 500 ul y 700 ul
49
6.4 Toma de muestras
51
6.4.1 Determinación de pH y temperatura
52
6.5 ANÁLISIS DE MICROORGANISMOS PATÓGENOS Escherichia coli y Salmonella sp
55
6.5.1 NMP de Salmonella sp con medio Rappaport Vassiliadis semisólido modificado
56
6.5.2 NMP Escherichia coli
59
6.6 ANÁLISIS FÍSICO QUÍMICOS
61
7.- CONCLUSIONES
64
8.- RECOMENDACIONES
65
9.- REFERENCIAS
66
Anexos
75
LISTA DE TABLAS
Pág.
Tabla 1. Tiempo y temperatura de eliminación de patógenos comunes en
materiales orgánicos.
5
Tabla 2. Microorganismos productores de lipasas
17
Tabla 3.Tabla guía para la lectura indicadores de Presencia de Salmonella sp
32
Tabla 4 Cepas presuntivas lipolíticas
37
Tabla 5. Identificación macroscópica y microscópica de las colonias
39
Tabla 6. Promedio de resultados de las pruebas antagónicas
41
Tabla 7 a,b,c Promedio de No de colonias características en medio XLT4 y BS
57
Tabla 8. Promedio de resultados de Escherichia coli materias primas
60
Tabla 9. Promedio de resultados de Escherichia coli muestras finales
60
LISTA DE FIGURAS
Pág.
Figura 1. Mecanismos de acción de las lipasas (Arpigny y Jaeger, 2000).
11
Figura 2 a. Cepa aislada L1
38
Figura 2 b. Cepa aislada L2
38
Figura 2 c. Cepa aislada L3
38
Figura 3 a. Cepa L1 Bacilos Gram negativos
39
Figura 3 b. Cepa L2 Bacilos Gram negativos filamentosos
39
Figura 3 c. Cepa L3 Bacilos Gram negativos
40
Figura 4. Enfrentamiento de cepas lipolíticas sin halo de inhibición
41
Figura 5. Enfrentamiento de cepas lipolíticas con las cepas del inóculo
42
Figura 6. Curva de producción de biomasa en función del tiempo Cepa L3
43
Figura 7. Curva de crecimiento Cepa L2
44
Figura 8. Tiempo de Contacto
46
Figura 9. Evaluación de las diferentes concentraciones de sustrato
47
Figura 10. Curva de UL al 1 ٪ y producción de biomasa en función del tiempo
47
Figura 11. Segunda evaluación de diferentes concentraciones de sustrato
48
Figura 12 Curva UL al 1.5 ٪ y producción de biomasa en función del tiempo
48
Figura 13. Estandarización de los diferentes volumenes de extracto crudo
50
Figura 14. Estandarización de los diferentes volumenes de extracto crudo
50
Figura 15. Conformación de las pilas
52
Figura 16. Medición de temperatura
52
Figura 17. Resultados de pH y temperatura vs tiempo durante el proceso de compostaje
de residuos orgánicos
53
Figura 18. Medio semisólido Rappaport V con halo de aclaramiento
56
Figura 19. Medio XLT4 con colonias presuntivas.
57
Figura 20. Medio BS con colonias presuntivas
57
Figura 21. Resultados de bioquímicas para identificación de Salmonella sp
58
Figura 22. Turbidez e indol positivo
59
Figura 23. Fluorescencia positiva
60
LISTA DE ANEXOS
Pág.
Anexo 1. Medio Leche- Almidón al 1%
77
Medio Líquido TSB
77
Medio Rappaport Vassiliadis Modificado
77
Medio Lecitina
78
Anexo 2. Promedios de Temperatura y pH de las 3 réplicas
79
Anexo 3. Preparación de Buffer Fosfato Concentración 1 M
83
Anexo 4. Curva Patrón p-nitrofenol
84
Anexo 5. Promedio de absorbancias de actividad enzimática
85
Anexo 6. Recuentos de las cepas aisladas
89
Anexo 7. Resultados pruebas de antagonismo
90
Anexo 8. Pruebas Bioquímicas de las Colonias Positivas para Salmonellla sp
91
Anexo 9. Requisitos específicos de fertilizantes o abonos orgánicos minerales
Y enmiendas orgánicas según NTC 5167 (Icontec 2004)
92
Anexo 10. Análisis estadístico
97
Anexo 11. Metodología
98
RESUMEN
La Empresa “Bioagrícola del Llano S.A E.S.P” ubicada en Villavicencio (Meta) ha venido
desarrollando desde el 2003 un plan integral en cuanto a la disposición de residuos
sólidos urbanos (RSU) generados en esta región, como residuos de plaza, industria
pecuaria, cocinas, entre otros. Es por esto que, actualmente se llevan a cabo procesos de
transformación de estos residuos mediante el compostaje aeróbico, produciendo un
bioabono rico en nutrientes y de buenas condiciones según la norma NTC 5167. Esta
empresa ha venido desarrollando un importante proyecto de aprovechamiento y
transformación de residuos urbanos sólidos mediante el proceso de compostaje
enriquecido con inoculantes microbianos termófilos, compuestos por 14 cepas amilolíticas
y proteolíticas.
Este proyecto de investigación se fundamenta en el aislamiento de microorganismos
lipolíticos, a partir de 3 replicas de pilas de compostaje de residuos orgánicos (plaza 55%,
poda, contenido ruminal y cascarilla de arroz). Igualmente se estandarizó la técnica que
permitió la evaluación y determinación de la actividad lipolítica generada por la cepa 3,
mediante el manejo de diferentes tiempos de contacto entre la enzima producida y el
sustrato (p-nitrofenil), como fueron 30 minutos y 60 minutos, así como también fueron
utilizados diferentes concentraciones de sustrato 0.08% (p/v), 0.5% (p/v), 1% (p/v), 1.5%
(p/v) y 2%(p/v).
Los resultados determinaron como tiempo óptimo de contacto 30 minutos pero en las
diferentes concentraciones de sustrato y volumen demuestra, no se presentaron
diferencias significativas. De la misma manera, la cepa 3 obtuvo UL del orden de 30.73UL
corroborando una actividad muy baja relacionada con su biomasa que fue de 30*10 9
UFC/ml. Así mismo se llevó a cabo un análisis de microorganismos patógenos humanos
Escherichia coli y Salmonella sp al inicio y al final del proceso arrojando resultados
positivos al inicio y al final y un NMP de Salmonella sp < a 0.006473 NMP/4g.
Igualmente se hizo una caracterización fisicoquímica al producto obtenido (bioabono) en
Agrilab, el cual arrojo resultados de relación C/N de 8 %, humedad de 42.03%, N 1.86%,
P 1.32%, K 2.53%; N orgánico 1.59% y metales pesados como Cobre 28.6 ppm y Zinc
118.3 ppm valores cercanos a lo exigido a la norma Icontec.
ABSTRACT
"Bioagrícola del Llano SA ESP" located in Villavicencio (Meta) has been developing since
2003 a comprehensive plan regarding the provision of municipal solid waste (MSW)
generated in this region, such as waste plaza, livestock industry, kitchens , among others.
That is why, now being carried out processing of this waste through aerobic composting,
producing a bioabono rich in nutrients and good conditions under the rule NTC 5176. The
company has been carrying out a major project for the use and conversion of municipal
solid waste through composting process enriched inoculators microbial thermophilic,
composed of 14 strains amilolityc and proteolityc.
This research project is based on the isolation of microorganisms lipollitycs, from the
assembly of 3 replicas of bacteria composting of organic waste (plaza 55%, pruning,
rumen contents and cascarilla). They also standardized technique that permitted the
evaluation and determination of the activity lipolityc generated by the strain 3, through
handling different times of contact between the enzyme and substrate produced (pnitrofenil), as were 30 minutes and 60 minutes, they were used as well as different
concentrations of substrate 0.08% (w / v), 0.5% (w / v), 1% (w / v), 1.5% (w / v) and 2% (w
/ v).
The results identified as optimum time to contact 30 minutes but in different concentrations
of substrate and volume shows there was no significant difference. In the same way, the
strain 3 obtained UL order 30.73 UL corroborating a very low related to biomass that was
30 * 109 CFU / ml. It also took out an analysis of human pathogens Escherichia coli and
Salmonella sp at the beginning and end of the process yielding positive results at the
beginning and end and an MPN Salmonella sp <a 0.006473 NMP/4g.
They also made a physicochemical characterization on the product (bioabono) Agrilab,
which results daring relationship C / N 8% moisture 42.03%, N 1.86%, P 1.32% K 2.53%,
organic N 1.59% heavy metals such as copper 28.6 ppm and zinc 118.3 ppm values near
what is required by Icontec.
1.-INTRODUCCIÓN
La generación de residuos sólidos municipales, varía en función de diferentes factores
asociados a los niveles de ingreso, hábitos de consumo, desarrollo tecnológico y calidad
de vida de determinada población, es por esto, que en la actualidad se busca una
eliminación segura de dichos residuos para evitar problemas de salud pública y ambiental.
La Empresa “Bioagrícola del Llano S.A E.S.P.” ubicada en Villavicencio (Meta) ha venido
desarrollando desde el 2003 un plan integral en cuanto a la disposición de residuos
sólidos urbanos (RSU) generados en esta región, como residuos de plaza, industria
pecuaria, cocinas, entre otros. Es por esto que, actualmente se llevan a cabo procesos de
transformación de estos residuos mediante el compostaje aeróbico, produciendo un
bioabono rico en nutrientes y de buenas condiciones según la norma NTC 5176 (Anexo
10). Este sistema ha sido optimizado, mediante el uso de un inoculante biológico
acelerante, compuesto por 14 cepas nativas termofílicas con actividad proteolítica y
amilolítica (Galindo et al., 2005). Este inoculante ha sido evaluado con diferentes
porcentajes de materias primas utilizadas, en la búsqueda de la optimización del proceso
y por ende, en la calidad del producto obtenido (bioabono), gracias a la actividad
enzimática proteolítica y amilolítica de los microorganismos del inoculante.
Teniendo en cuenta lo anterior, el objetivo de este proyecto de investigación, fue aislar
microorganismos nativos con actividad lipolítica, con el fin de potencializar la eficiencia del
inoculante utilizado en la “Empresa Bioagrícola del Llano”, identificando así mismo
patógenos humanos, para que de esta manera se logre obtener un compost con mejores
características fisicoquímicas, libre de patógenos, que pueda ser utilizado en cultivos
propios de la región, contribuyendo de esta manera al desarrollo agroindustrial.
2.- MARCO TEÓRICO
2.1 COMPOSTAJE
El compostaje es la descomposición biológica y la estabilización de sustratos orgánicos,
bajo condiciones controladas que desarrollan temperaturas termófilas como un resultado
del calor producido biológicamente, y genera un producto final que es estable, libre de
patógenos y semillas de plantas y puede ser aplicado benéficamente al suelo (Stefan et
al., 2006). En el compostaje la fase sólida del material orgánico sirve de soporte físico,
matriz de intercambio de gases, fuente de nutrientes orgánicos e inorgánicos, vertederos
para los productos residuales metabólicos y aislamiento térmico (Sylvia et al., 1998).
Los principales objetivos del proceso son estabilizar materia orgánica putrescible,
conservar la mayor cantidad de nutrientes y materia orgánica como sea posible, y generar
un producto uniforme y relativamente seco conveniente para usar como acondicionador
de suelo y suplemento para jardines o para disponer en tierra.
2.1.1
Beneficios del Uso del Compost
El compost se obtiene industrialmente por la transformación biológica de la materia
orgánica. De esta transformación resulta un bioabono o acondicionador de suelos, apto
según las características fisicoquímicas y microbiológicas, para la fertilización, tanto por la
mejora del suelo como soporte fisicoquímico, como en relación con la capacidad de
retención de agua, y presencia de agregados y microorganismos (MacGregor et al.,
2001).
Los ácidos resultantes de los procesos de degradación de la materia orgánica disuelven
parte de los productos minerales del suelo y los hacen aprovechables para la nutrición de
las plantas. Los organismos actúan como promotores de crecimiento, controladores
biológicos y remediadores de suelo.
El nitrógeno contenido en el compost se encuentra en forma asimilable por las raíces y
puede ser retenido en el horizonte A - B (capa cultivable del suelo), evitando ser
arrastrado por las aguas de lluvia o de riego a capas más profundas fuera del alcance del
sistema radicular (Macgregor et al., 2001).
Igualmente, la modificación de las características físico - químicas del terreno hace que se
incremente el grado de disponibilidad del fósforo y potasio para la planta.
El compost incorpora al terreno micro y oligo elementos (cobre, magnesio, zinc,
manganeso, hierro, boro, etc.) que son muy necesarios para la actividad y desarrollo
vegetativo de las plantas. Otra característica importante es que reduce la necesidad de
pesticidas químicos al producir plantas saludables que son menos atacables por plagas
de insectos, enfermedades y heladas (Trautmann y Olynciw, 1999).
Físicamente, la aplicación de compost reduce la erosión y mejora la estructura del suelo,
la retención de agua y el drenaje (Vásquez, 2003).
2.1.2
Factores de Importancia
Hay varias condiciones críticas para la elaboración óptima de compost. Debe haber una
humedad adecuada (50-60% de contenido de agua), evitando el exceso (70% o superior),
puesto que interfiere con la aireación y reduce el autocalentamiento. La relación carbononitrógeno no debería ser mayor de 40:1(Atlas y Bartha, 2001).
•
Equilibrio carbono/nitrógeno
En la composición elemental del sustrato, se encuentra la cantidad relativa de carbono,
nitrógeno, fósforo, azufre y otros nutrientes. Además de la composición, es necesario
conocer la calidad de los sustratos para determinar el rango de descomposición (Silvya,
et al 1998).
Conviene mezclar materiales de origen vegetal y animal para procurar un contenido
aceptable de todos los nutrientes esenciales. Es importante mantener un buen equilibrio
entre los materiales ricos en carbono y los ricos en nitrógeno, para que la relación C/N se
mantenga entre 25 y 35. Una relación elevada retrasa la velocidad de humificación y un
exceso de N ocasiona fermentaciones no deseables. La mezcla debe ser rica en celulosa,
lignina (restos de poda, pajas y hojas muertas) y en azúcares (hierba verde, restos de
hortalizas y orujos de frutas). El nitrógeno será aportado por el estiércol, el purín, las
leguminosas verdes y los restos de animales de mataderos. Todo se debe mezclar de
manera tan homogénea como sea posible materiales pobres y ricos en nitrógeno, y
materiales secos y húmedos (Vásquez, 2003).
Un contenido menor de nitrógeno no permite la formación de biomasa microbiana
suficiente. Una proporción excesiva de nitrógeno (C:N= 25:1 o menos) causa la
volatilización del amonio, produce malos olores, y baja el valor fertilizante del compost
resultante (Atlas y Bartha, 2001).
•
Temperatura
Al inicio del proceso de desprende gran cantidad de calor, etapa termófila, la temperatura
en el material a compostar puede subir hasta los 60 ó 70ºC, la actividad bacteriana
aumenta rápidamente. Debido al aumento de temperaturas, una gran cantidad de agua
del material se evapora. El oxígeno tiene que llegar a todo el material, por lo que el
material requiere de una buena ventilación. En esta etapa los microorganismos atacan la
materia más fácilmente biodegradable (Roder, 1998).
La actividad metabólica de los microorganismos, al actuar sobre los sustratos orgánicos,
libera energía. Parte de la energía generada al interior de la pila de compostaje es
utilizada por los microorganismos, y otra parte es liberada al ambiente en forma de calor,
es por esto que el incremento de la temperatura es reflejo de la actividad microbiana
sobre la materia orgánica. Uno de los efectos de la temperatura sobre la pila de
compostaje es la eliminación de microorganismos patógenos (Fundases, 2006).
Es importante tener en cuenta que para determinado grupo de microorganismos existen
rangos de temperatura y tiempos de exposición (tabla 1).
Tabla 1. Tiempo y temperatura de eliminación de patógenos comunes en materiales
orgánicos.
Microorganismo
Salmonella sp.
Escherichia coli
Brucela Abortus
Corynebacterium diphtheriae
Tiempo
1 hora
1 hora
1 hora
1 hora
Temperatura
55ºC
55ºC
55ºC
55ºC
Fuente: EPA, 1992
El diseño de un proceso de compostaje debe tener en cuenta la destrucción de
patógenos, ya que la presencia de ellos afecta los cambios normales de temperatura.
Estos organismos prefieren temperaturas por debajo de los 42ºC, ya que normalmente
viven a la temperatura corporal del hombre y animales, o a la temperatura ambiental de
las plantas. En la fase termofílica del compostaje se busca eliminar patógenos con el fin
de minimizar focos de contaminación y establecer un bioabono óptimo para ser aplicado a
cultivos de consumo directo.
Las técnicas para la preparación de compost se les señalan como muy efectivas para el
control de microorganismos patógenos y la tasa de mortalidad de estos microorganismos
esta en función del tiempo y de la temperatura. Cuando el proceso de compostaje
funciona correctamente se pone de manifiesto que la mayoría de los organismos
patógenos mueren cuando se exponen todas las partes de la pila a temperaturas de 55 ºC
(Luque, 1997).
•
Humedad
El agua es requerida por los microorganismos para desarrollar sus funciones metabólicas,
además, es utilizada como vehículo de trasporte de nutrientes y productos de desecho.
En la pila de compostaje, el balance de la humedad es importante, ya que bajos valores
afectan el metabolismo microbiano, mientras que altos valores de humedad, conllevan a
la acumulación de agua en las cavidades intersticiales, dificultando la difusión de O2 y
favoreciendo las condiciones de anaerobiosis.
Así pues, la humedad de la pila de compostaje debe oscilar entre el 60 al 70% (Fundases,
2006).
•
pH
El valor del pH no sólo determina la existencia de una ecología microbiana particular sino
que su nivel y sus variaciones pueden inhibir fuertemente la actividad de las bacterias.
Un pH entre 5.5 y 8.5 es óptimo a los microorganismos del compost. En las fases
tempranas del proceso los ácidos orgánicos excretados por los hongos y bacterias
aumentan, hay un crecimiento fúngico y se empieza la degradación de lignina y celulosa.
Si el sistema se vuelve anaeróbico la acumulación ácida puede bajar el pH hasta 4.5 y
limitar la actividad microbiana; en estos casos la aireación es importante para volver el pH
hasta sus rangos óptimos (Trautmann y Olynciw, 1999).
Así mismo es importante resaltar como se menciona en estudios recientes que la
actividad enzimática lipolítica se ve afectada por factores como el pH, la temperatura, la
composición del medio y la aireación, mostrando mayor afinidad por pHs alcalinos debido
a que se presenta una mejor solubilización de los productos de hidrólisis formados
(Chahinian et al., 2005).
•
Aireación
Se trata de un proceso aerobio (requiere oxígeno) por lo que es importante mantener una
aireación adecuada. Para ello, se han de mezclar materiales pastosos (lodos de
depuradora, estiércol) con otros que aumenten la porosidad (paja, virutas, etc). Los
materiales de excesivo tamaño (restos de poda), es conveniente triturarlos previamente
para que descompongan más fácilmente. Una forma de mantener una adecuada aireación
durante el compostaje es mediante volteos periódicos o con aireación forzada. El material
de los materiales a compostar debe variar entre los 35 y los 75 mm (Trautmann y Olynciw,
1999).
Otra forma de oxigenar las pilas de compost son los métodos de aireación directa, ya sea
por succión o por presión (Roder, 1998).
•
Tamaño de partícula
La actividad microbiana generalmente ocurre en la superficie de las partículas orgánicas.
Por consiguiente, el tamaño de la partícula menor, con mayor área de superficie,
aumentará la actividad y sucesivamente la proporción de descomposición. Por otro lado
cuando la partícula es demasiado pequeña se unen inhibiendo la circulación de aire en el
compost, y por ende el oxígeno disponible para los microorganismos, minimizando su
actividad (Trautmann y Olynciw, 1999).
Es importante tener en cuenta el tamaño de las partículas, todos los tipos de residuos
verdes con excepción del pasto deben ser triturados para optimizar el proceso de
degradación ya que ésta otorga propiedades como agrandar la superficie para que el
microorganismo pueda actuar, reduciendo el material original a un volumen del 30 %
(Stock, 2002).
•
Ambiente
En climas fríos y húmedos conviene situarlo al sol y al abrigo del viento, protegiéndolo de
la lluvia con una lámina de plástico o similar que permita la oxigenación. En zonas más
calurosas es mejor situarlo en un lugar sombreado para evitar la desecación (Vásquez,
2003).
•
Porcentaje de líquido efectivo (% LE)
Este parámetro se utiliza cuando hay presencia de lípidos (grasas y aceites) en los
materiales a compostar debido a que ellos son líquidos a las temperaturas de tratamiento
y causan interferencia en la medición de humedad. Se ha encontrado que el porcentaje
LE debe estar entre el 68% y el 70 % de acuerdo con diversos estudios (Pérez, 1999).
2.2 PROPIEDADES FÍSICO QUÍMICAS DE LOS RESIDUOS COMPOSTABLES
2.2.1 Propiedades Físicas.
La descomposición es llevada a cabo esencialmente en un ambiente acuoso. Los
componentes solubles de los sustratos sólidos y residuos del metabolismo microbiano se
difunden a través de una película de humedad sobre el compost sólido, el contenido de
humedad óptimo para el compostaje, está generalmente entre 40 y 60%, es decir, se sitúa
en el orden del 15 al 35% (Sztem y Pravia, 1999). Además es importante para mejorar la
estructura y estabilidad del suelo, la textura y su permeabilidad ya que regula el balance
hídrico del suelo y reduce el riesgo de erosión porque los suelos compactos se sueltan y
los arenosos se compactan por la acción de la materia orgánica (Vásquez, 2003).
2.2.2 Propiedades Químicas.
La aplicación de residuos orgánicos y desechos de una amplia variedad de actividades
humanas a suelos arables ha recibido atención alrededor del mundo por una potencial
mejora en la fertilidad del suelo e incremento en el contenido de materia orgánica. Los
residuos orgánicos son raramente aplicados al suelo en estado fresco o crudo.
Generalmente, ellos son procesados para obtener materia orgánica estabilizada, madura,
con producción de sustancias húmicas (Gigliotti et al., 2002).
En la materia orgánica procesada, una parte de las sustancias orgánicas es soluble en
agua, por esta razón, un impacto inmediato de la aplicación de materiales orgánicos sobre
los suelos agrícolas es la liberación de materia orgánica dentro de la solución del suelo
(Gigliotti et al., 2002).
2.3 ESTRUCTURA DE LÍPIDOS Y GENERALIDADES DE LAS LIPASAS
Los lípidos (del griego, lipos, grasa) se encuentran en todos los organismos vivos y
desempeñan un papel indispensable en el mantenimiento de la vida. Sin embargo a
diferencia de las proteínas y los carbohidratos, los lípidos son en extremo polimórficos y
difíciles de definir estructuralmente (Horton, 2003).
Aunque las estructuras de los lípidos son con frecuencia complejas, comparten en su
estructura partes similares. Los lípidos más sencillos son los ácidos grasos, ácidos
monocarboxílicos de la fórmula general R-COOH, en donde R representa una cola de
hidrocarburo.
Los lípidos se pueden clasificar de diferentes maneras, aunque en general se dividen en:
● Lípidos simples: son los que contienen uno o dos tipos de moléculas diferentes, e
incluyen, entre otros, a los hidrocarburos, los alcoholes, aldehídos y ácidos grasos, los
eicosanoides, los polihidroxialcanoatos, las cutinas, las suberinas, los cianolípidos, los
acilgliceroles (o acilglicéridos), las ceras, las ceramidas, los lipoaminoácidos y
lipopéptidos, los lípidos fenólicos, los terpenos, los alcaloides isoprenicos, las quinonas
lipidicas y los esteroides (Rivera y García, 2007).
● Lípidos complejos: son aquellos que contienen glúcidos en su estructura, y los que
están formados por tres o más tipos de moléculas diferentes. Incluyen a los
gliceroglicolípidos, los glicerofosfolípidos, las esfingomielinas, los gangliósidos, los
cerebrósidos, los lipoaminoácidos glicosídicos, los acilglicósidos, los lipopolisacáridos y
los proteolípidos, entre otros (Rivera y García, 2007).
De los lípidos mencionados, los ácidos grasos y los acilglicéridos son de especial interés.
Los ácidos grasos están formados por cadenas hidrocarbonadas saturadas o insaturadas
que contienen al menos un grupo carboxílico en uno de sus extremos. Estas moléculas
intervienen en múltiples funciones biológicas, y están en la base de la biosíntesis del resto
de lípidos (Rivera y García, 2007). Una variedad de lípidos anfipáticos, que incluyen los
glicerofosfolípidos y los esfingolípidos, son componentes de importantes de todas las
membranas biológicas (Horton, 2003).
Los acilglicéridos están formados por uno, dos o tres ácidos grasos esterificados a una
molécula de glicerol (mono, di y triacilglicéridos, respectivamente), y están, implicados en
varias funciones biológicas: reserva energética, aislamiento, señalización intra e
intercelular, etc. Estos compuestos pueden ser hidrolizados mediante soluciones alcalinas
(saponificación), o mediante la actividad de unas enzimas llamadas lipasas que liberan un
ácido graso (Cheetham, 2005).
Por otra parte, los lípidos están envueltos en diferentes procesos biológicos. La estructura
de la membrana celular depende de la combinación de ciertas proteínas y lípidos
específicos.
Las enzimas lipolíticas juegan un rol importante en la movilización de lípidos entre células
individuales de los organismos como también en la transferencia de los lípidos de un
organismo a otro (Beisson et al., 2000). Los microorganismos han sido la principal fuente
de extracción de diversas enzimas.
Las lipasas son parte de la familia de las hidrolasas, catalizan la hidrólisis de
triacilglicéridos en la interfase lípido-agua. Además de su rol fisiológico en la hidrólisis de
grasas neutras, las lipasas catalizan la hidrólisis o síntesis enantio- y regio-selectiva de
una amplia variedad de sustratos naturales tales como soya, aceite de pescado, ricino y
frutas cítricas (Björkling et al., 1991), así mismo pueden llevar a cabo la esterificación,
interesterificación y transesterificación en medios no acuosos (Houde et al., 2004).
Estas enzimas presentan su pH óptimo entre 8 y 9, también se han reportado lipasas con
pH óptimo ácido. En cuanto a la temperatura, la mayoría trabaja apropiadamente en el
rango de 30-40ºC, algunas son activas a temperaturas bajas como 29ºC. El calcio parece
estimular la actividad de la mayoría de las lipasas, mientras que los agentes quelantes y
los iones de metales pesados las inhibe (López, 1999).
2.4 LIPASAS
Son usadas para hidrolizar lípidos produciendo ácidos grasos y glicerol, las reacciones
más importantes en las cuales las lipasas están implicadas son reacciones quirales
debido a la posibilidad de resolver mezclas racémicas (Sánchez, 1999).
El mecanismo de acción de las lipasas consiste en la hidrólisis de un ácido graso en
presencia de alcohol obteniendo un éster y liberando agua (Figura 1). Así mismo el
mecanismo catalítico de las lipasas se basa en un sistema de intercambio de cargas que
consta de 4 etapas. Tras la unión del sustrato, se produce el ataque nucleofílico por parte
del grupo hidroxilo de la serina catalítica sobre enlace éster del lípido, lo que lleva a la
rotura del enlace y a la formación de un intermediario entre el ácido graso y la serina
nucleofílica. Posteriormente se libera el alcohol y se produce un segundo ataque
nucleofílico por parte de una molécula de agua que ataca el enlace éster del intermediario
transitorio, lo que produce la liberación del ácido graso y la regeneración del centro
catalítico (Bornscheuer, 2002).
En algunos organismos, las grasas y los aceites (triacilgliceroles) funcionan como
depósitos de reserva de energía metabólica. En algunos casos, los lípidos llevan a cabo
funciones biológicas como moléculas individuales; en otros interactúan con otras
biomoléculas para realizar una función como parte de un complejo o a un agregado. Los
complejos lipídicos comprenden las lipoproteínas (partículas compuestas de lípidos y
proteína), y los agregados lipídicos incluyen las membranas biológicas (capas delgadas
compuestos de lípidos, proteínas y algunas veces carbohidratos) (Horton, 2003).
Las lipasas son una clase de enzimas de rápida producción, poseen actualmente nuevas
aplicaciones en la industria de hidrocarburos en síntesis orgánica y han expandido su
penetración en la producción farmacéutica. El primer objetivo son las lipasas bacterianas
y fúngicas porque éstas son más fáciles de producir, modificar por tecnología de DNA
recombinante (Snellman y Cowell, 2004).
Ambientalmente las lipasas son utilizadas en inoculantes como depurador de tratamientos
cloacales y como tratamiento para hidrolizar grasa en residuos sólidos y líquidos como
una alternativa de sustitución de productos de origen químico (Sánchez, 1999).
O
O
R1C------ OR 2 + H2O----------------- R1C-------OH----R2OH
Figura 1. Mecanismos de acción de las lipasas (Arpigny y Jaeger, 2000).
2.4.1 Métodos de determinación de lipasas
Las dificultades que conlleva el hecho de que las lipasas sean enzimas solubles en medio
acuoso que actúan sobre sustratos hidrofóbicos ha llevado al desarrollo de una gran
cantidad de métodos para determinar la actividad de estas enzimas y su inhibición, como
ensayos en placas con triacilglicéridos, ensayos espectrofotométricos con sustratos
naturales,
derivados
del
p-nitrofenol
o
ésteres
de
resorufina,
ensayos
espectrofluorimétricos con análogos de acilglicéridos que contienen fluoróforos como la 4metilumbeliferona (MUF) o la resorufina, ensayos cromatográficos para la detección de
moléculas como los ácidos grasos, el β-naftol o el p-nitrofenol liberados por las lipasas al
hidrolizar los acilglicéridos o sus correspondientes análogos, métodos, basados en la
neutralización de la acidez generada por los ácidos grasos libres, métodos tensiométricos
que miden cambios en la tensión superficial de las monocapas lipídicas, métodos
radiométricos que utilizan sustratos marcados radiactivamente, y otros métodos para la
detección de la actividad lipolítica o de las propiedades fisicoquímicas de estas enzimas
tales como ensayos conductimétricos, turbidimétricos, resonancia magnética nuclear,
microscopia de fuerzas atómicas, cristalografía, etc. (Beisson et al., 2000).
Por otro lado, estas enzimas son caracterizadas por tener una amplia actividad ya que
catalizan un gran rango de reacciones, usando así para ser evaluadas la técnica de pnitrofenil laurato (sustrato), la cual en estudios recientes ha demostrado que dichas
enzimas lipolíticas tienen en su mayoría un alto contenido de ácidos hidrofóbicos (60.2%)
(Neerupmaa y Jagdeep, 2006).
Así mismo, la mayoría de las enzimas lipolíticas han sido estudiadas según sus
propiedades químicas. Entre estas se encuentran la dependencia a la actividad de los
iones Ca2+, pH y temperatura (Arpigny y Jaeger, 2000).
2.4.2 Enzimas Termoestables
Las enzimas son los catalizadores de las reacciones de los sistemas biológicos cuyas dos
principales características son la extrema especificidad y la óptima velocidad de reacción.
La estructura de la membrana celular depende de la combinación de ciertas proteínas y
lípidos específicos (Rivera y García, 2007).
Las enzimas estables se encuentran generalmente en organismos adaptados a vivir en
condiciones hostiles. Actualmente, hay un gran interés en las enzimas de organismos ya
que se han realizado gran cantidad de estudios sobre la relación estructura-estabilidad de
las enzimas provenientes de dichos microorganismos (Hubble, 1990).
En cuanto al crecimiento microbiano a temperaturas elevadas se pueden destacar las
adaptaciones que estas han venido desarrollando a lo largo de la evolución. Estos
microorganismos para sobrevivir a temperaturas elevadas comprenden, entre otras, una
gran proporción de lípidos saturados en las membranas, lo cual impide la fusión a esas
temperaturas (Atlas y Bartha, 2001). Muchos microorganismos termófilos producen
enzimas que no se desnaturalizan a altas temperaturas. A veces, las proteínas de los
termófilos presentan secuencias de aminoácidos poco frecuentes que estabilizan dichas
proteínas a temperaturas elevadas. Cuando se sobrepasa el máximo de temperatura de
crecimiento, los ribosomas se funden y cesa la síntesis de proteínas. Muchos termófilos
tienen proporciones muy altas de guanina y citosina en su ADN, que eleva el punto de
fusión y añade estabilidad a la molécula de ácido nucléico del organismo (Atlas y Bartha,
2001).
Las termoenzimas son aquellas que se producen a temperaturas aproximadas de 60ºC y
80ºC (hipertermófilos). Son resistentes a la denaturación irreversible y óptimamente
activas a altas temperaturas (60-120ºC), por lo cual son usadas en muchos procesos
industriales (Zeikus et al., 1998).
Estas formas termófilas de vida son de interés, no solo desde el punto de vista biológico
sino porque poseen ventajas industriales y biotecnológicas. Las enzimas de termófilos son
capaces de catalizar reacciones bioquímicas a altas temperaturas y son generalmente
más estables; esto se debe a la presencia de los puentes de hidrógeno, interacciones
hidrofóbicas, intercambio iónico, unión a metales y puentes disulfuro; lo que prolonga la
vida útil de las enzimas (Páez et al., 2000).
De la misma manera, los microorganismos extremófilos han despertado un gran interés
durante los últimos años, debido a la elevada estabilidad térmica, resistencia a
desnaturalizantes químicos y pHs extremos de sus enzimas, que las hacen especialmente
adecuadas para su uso en procesos de biotransformación en condiciones extremas de
pH, salinidad y temperatura. Los microorganismos termófilos crecen a temperaturas
superiores a 45ºC, y en algunos casos (hipertermófilos) incluso por encima de 90ºC. La
disponibilidad de lipasas termofílicas permitiría operar a altas temperaturas, con el lógico
incremento de la velocidad de reacción y una más fácil solubilización de los sustratos,
aspecto que constituye con frecuencia un factor limitante en algunas aplicaciones de este
tipo de enzimas, por ejemplo reacciones de síntesis en medios con bajo contenido en
agua ( Rivera y García, 2007).
2.4.3
Enzimas en el tratamiento de residuos
La aplicabilidad de grupos enzimáticos depende de la capacidad de hidrolizar polímeros
complejos para incrementar su posterior degradación microbiana. Dentro de éstas se
incluyen empleo de lipasas asociados a cultivos bacterianos para eliminar depósitos de
grasa procedentes de diversas industrias, como embutidos o láctea, entre otras. Así
mismo en estudios recientes se ha demostrado que combinando microorganismos
aislados del agua residual de una industria de alimentos con microorganismos lipolíticos
termófilos se acelera el proceso de compostaje al ser utilizados éstos, mezclados en un
inoculante (Tsai et al., 2006).
Otras enzimas degradadoras de polímeros utilizadas en forma similar son las celulasas,
amilasas y proteasas. Además de esta hidrólisis de materiales poliméricos existen
también aplicaciones de enzimas capaces de degradar compuestos tóxicos que podrían
ocasionar la inhibición de procesos fundamentados en el desempeño microbiológico.
2.4.4 Importancia industrial de las enzimas lipolíticas
Pocas enzimas lipolíticas son las que han sido aisladas en forma pura y cristalizada, y
poco se conoce acerca de su estructura y función. Las enzimas lipolíticas han cobrado
gran atención por su potencial aplicación en biotecnología (Benjamín y Pandey,1998).
Muchas son las aplicaciones que se han encontrado para las lipasas, en la industria del
aceite, la producción de farmacéuticos, agroquímicos y componentes aromáticos (Jaeger,
1999).
Las lipasas son usadas en dos distintos ámbitos. Ellas son usadas en la catálisis para la
manufactura de otros productos (como ingredientes alimentarios) y por sus aplicaciones
(producción de químicos). Todas ellas presentan una gran eficiencia cuando son
empleadas en la industria (Cheetham, 2005).
Las lipasas han pasado a ser una parte integral en la actual industria alimentaria. Se ha
potenciado el uso de enzimas para mejorar procesos químicos tradicionales en la
manufactura alimentaria y, las lipasas, se usan actualmente en la producción de una
variedad de productos como quesos y alimentos preparados (Ashok et al., 1999)
En la mayor parte de los casos la producción de enzimas debe ser inducida por la adición
de aceites y grasas. Aunque se reconocen casos en que las grasas no tienen efecto sobre
la producción de estas. Las lipasas están generalmente unidas a las células por tanto
inhiben la superproducción pero mediante la adición de un catión como magnesio; las
lipasas se liberan y esto conduce a un título mayor de enzimas en el proceso de
producción (Sánchez, 1999).
Entre otras aplicaciones, estas enzimas se utilizan en la industria alimentaria (producción
de aromas, emulgentes, etc.), en química orgánica (síntesis de antibióticos, pesticidas,
producción de compuestos enantiopuros, etc.), en detergencia (aditivos en detergentes,
producción de surfactantes para jabones y productos de limpieza, etc.), en la industria
papelera (eliminación del “pitch”, de tintas, etc.), así como en el tratamiento de productos
residuales o tóxicos, en biosensores, en la producción de biodiesel, etc (Bornscheuer,
2002).
La importancia de estas aplicaciones ha llevado a la optimización de las reacciones
catalizadas por las lipasas, a mejoras en la producción y purificación de estas enzimas,
así como a la obtención de lipasas con nuevas propiedades catalíticas o una mayor
estabilidad, lo que se ha conseguido mediante la modificación de enzimas ya existentes, o
mediante el aislamiento de nuevas lipasas (Wiseman, 1995).
2.4.5 Microorganismos reconocidos biotecnológicamente como productores de
lipasas
Las lipasas han sido aisladas de una gran variedad de microorganismos pero una de las
primeras fuentes ha sido la especie Bacillus, la cual además de la producción de lipasas,
produce otras enzimas de interés industrial como son las celulasas, amilasas, elastasas,
etc.
Las lipasas difieren en varias de sus propiedades, éstas dependen de su origen (el cual
puede ser fúngico, bacteriano, de mamíferos, etc.), ellas catalizan la hidrólisis o síntesis
de una gran variedad de esteres carboxílicos y liberan ácidos orgánicos y glicerol. Todas
ellas muestran una alta especificidad sobre los sustratos (Rivera y García, 2007).
En años recientes, más de 30 lipasas fueron asiladas de cepas de Rhizopus y muchas de
ellas han sido caracterizadas (Rivera y García, 2007). Las lipasas de Rhizopus están
relacionadas con las lipasas de Rhizomucor miehei (existe una homología >55%), éstas
tienen una alta especificidad en la posición 1,3 de triglicéridos, las cuales las hacen muy
versátiles en la modificación de lípidos.
En estudios recientes en la ciudad de Suiza se determinó en la fase termofílica del
compost el gen Thermus
perteneciente a Bacillus stearothermophillus, aislado de un
proceso de compostaje con residuos de cocina y de poda. Este compost alcanzó una
temperatura máxima reportada de 80°C la cual es óptima para el crecimiento de este
microorganismo (Beffa et al., 2006).
Las enzimas termoestables pueden ser obtenidas de organismo mesofílicos y termofílicos;
se han obtenido algunas enzimas termofílicas a partir de organismos psicrófilos (Imamura
y Kitaura, 2000). Los principales organismos de los cuales se han extraído enzimas de
interés industrial son hipertermófilos Pyrococcus furiosus y Thermotoga sp (Adams et al.,
1995). Otros organismos como hongos son productores de lipasas termoestables (Tabla
2).
Tabla 2. Microorganismos productores de lipasas
Organismo
Candida Antarctica
Candida curvata
Mucor miehei
Temperatura óptima ºC
70
50-60
40
pH Óptimo
6.5
6.5
7.0
Fuente: (Rivera y García, 2007).
Así mismo, las lipasas son producidas por muchos microorganismos, siendo las fuentes
tradicionales para la producción comercial: Pseudomonas sp, Serratia sp, Rhizopus sp,
Mucor sp, Aspergillus spp y Candida. Algunos de los microorganismos producen varias
lipasas cuya especificidad varía con respecto a los ácidos grasos y a la posición en el
triglicérido (López 1999).
Entre los microorganismos reportados como mayores productores de enzimas lipasas
termofílicas se encuentra el género de Bacillus sp, siendo la especie mas destacada B.
thermocatenolatus, éstos producen dos lipasas extracelulares termoestables las cuales
dependen de la edad del cultivo (Nerupmaa y Jagdeep, 2006).
Se han encontrado estudios recientes de levaduras productoras de lipasas como:
Candida rugosa la cual produce lipasa extracelularmente y es ampliamente utilizada para
propósitos industriales. Una preparación comercial de lipasa de esta levadura puede
separase en varias izoenzimas, con varios mecanismos como: diferente contenido de
carbohidratos, punto isoeléctrico, substrato específico y secuencia primaria (Neerupma,
2006).
2.5 IMPORTANCIA DE LOS INOCULANTES BIOLÓGICOS.
Los inoculantes biológicos están clasificados como: biofertilizantes, biocontroladores y
acelerantes.
Los biofertilizantes o abonos biológicos tienen como principio activo microorganismos
vivos (bacterias y hongos) que promueven y benefician la nutrición y el crecimiento de las
plantas. Desde el punto de vista de una agricultura sostenible, el uso de biofertilizantes
representa una importante alternativa para limitar el uso de abonos químicos, reduciendo
su negativo impacto ambiental y económico, y mejorando la productividad de los cultivos
enfocado al óptimo crecimiento vegetal permitiendo así un mejor aprovechamiento de los
recursos naturales del suelo, por estas razones la producción de bio-insumos agrícolas ha
cobrado importancia (Cuevas et al., 2000).
Es evidente que un desarrollo exitoso de esta tecnología debe ir ligado a la generación de
conocimiento básico que conduzca a una mayor comprensión de los fenómenos
asociados al proceso de nutrición vegetal promovidos por los inoculantes (Lozano, 2005).
En la actualidad la implementación de inoculantes termofílicos es una alternativa viable en
el tratamiento de residuos sólidos orgánicos. La gran estabilidad que presentan las
enzimas de estos microorganismos, frente a temperaturas extremas, garantiza una
capacidad de degradación mayor que la obtenida por géneros microbianos mesofílicos. La
utilización de inoculantes biológicos a partir de microorganismos mesófilo - termófilos ha
traído grandes beneficios en compostación de residuos domésticos, industriales y
hospitalarios.
En estudios recientes en una industria láctea, se realizó una prueba de compostaje de
campo, comparando un inoculante comercial con un inoculante que tenía cepas nativas,
observando al final del proceso, la eficiencia de las bacterias nativas y la óptima utilización
de estas en la degradación de diversos desechos producidos por la industria en estudio
(Moreno et al.,2001).
De la misma forma, otro proyecto de investigación fue el realizado en la ciudad de
Sogamoso (Boyacá), donde se evaluó la acción de un inóculo termofílico con actividad
enzimática proteolítica, amilolítica, lipolítica y celulolítica, acelerador del proceso de
compostaje en residuos sólidos municipales. En la prueba de campo se verificó la
eficiencia del inoculante aplicado sobre la pila experimental, se evidenció la reducción del
tiempo de degradación a ocho semanas, ya que el tiempo del proceso de compostaje era
de 16 semanas. Por otra parte, este proceso garantizó el mejoramiento de las
características fisicoquímicas y la eliminación de patógenos en el producto final (Palomino
et al., 2002).
En diversos proyectos se ha obtenido un rendimiento óptimo a partir de inoculantes
correspondiente a la tasa de degradación de cada tipo de residuo a tratar, sin alterar de
modo alguno la calidad del producto final; por el contrario se ha logrado la producción de
un compost con alto contenido de elementos como nitrógeno, fósforo y potasio, que
ayudan a aumentar la viabilidad de los suelos (Moreno et al., 2001).
2.6 MICROORGANISMOS PATÓGENOS
El control sanitario del compost es de vital importancia, éste debe ser tratado de manera
adecuada debido a que será utilizado como biofertilizante o nutriente del suelo, ya sea en
agricultura orgánica o inorgánica, dando lugar a la contaminación de los productos y/o de
las fuentes de aguas, por lo que su aplicación descontrolada constituye un peligro para la
salud pública y una amenaza para el medio ambiente por la exposición a
microorganismos patógenos que esto representa (Fundases, 2006).
Los patógenos son causantes de enfermedades y pueden pertenecer a cualquiera de las
clases de microorganismos, bacterias, hongos, virus, ricketsias y protozoos. El diseño de
un proceso de compostaje debe tener en cuenta la destrucción de patógenos, ya que la
presencia de ellos afecta los cambios normales de temperatura (Islam et al., 2004).
A lo largo del proceso de compostaje, se espera una reducción total de los agentes
patógenos por acción de diferentes condiciones como pH, temperatura, humedad,
sustancias antibióticas, entre otros.
Salmonella sp. es una bacteria Gram negativa, predominantemente móvil, anaerobia
facultativa, que al ser un microorganismo patogénico de tipo entérico causa salmonellosis
en animales y humanos (EPA Método 1682, 2006). De igual manera Salmonella sp.
puede causar una deshidratación crónica y muerte en los niños mientras que en el
ganado puede causar abortos. Una vez la vaca es infectada con Salmonella su
erradicación es difícil ya que hay cepas resistentes a antibióticos. Además, puede
transmitirse por contacto directo de animales (Islam et al., 2004) Así mismo, Salmonella
sp, es uno de los patógenos entéricos más estudiados encontrados en el compost. Es
conocido que la temperatura de 55°C por 15 días es letal para los miembros de este
grupo (EPA, 1682).
Por otra parte Escherichia coli, es una bacteria Gram negativa, que causa infecciones de
tipo intestinal, es por esto que la presencia de este microorganismo patógeno en el
compost y su diseminación en el medio ambiente (suelo, agua, superficie de las plantas)
merece especial atención por las severas consecuencias que puede traer un mal manejo
de este producto para la salud y la higiene ambiental, por lo que es necesario que los
productores apliquen buenas prácticas agrícolas para manipular estos fertilizantes
naturales con el fin de reducir al mínimo los peligros microbiológicos ( Islam et al., 2004).
3.- JUSTIFICACIÓN.
Bioagrícola del Llano S. A. E.S.P ubicada en el Departamento del Meta (Villavicencio); es
una empresa creada a través del Acuerdo 004 de 1995 del Concejo Municipal y
constituida el 17 de agosto de 1995, a fin de atender a la necesidad surgida de la Ley 142
de 1994, que aplica a aquellas entidades que realizan actividades prestadoras de
servicios públicos domiciliarios, alcantarillado, aseo, entre otros.
De ésta manera la empresa se ha orientado en una gestión que promueve el
mejoramiento continuo de los procesos y la satisfacción de los usuarios. Por esta razón,
se han obtenido reconocimientos por los avances efectuados en materia de disposición
final y compensación ambiental efectuada en el relleno sanitario “Don Juanito”, el cual en
la actualidad es el Parque Ecológico Reciclante en esta ciudad.
Así mismo, esta empresa es la encargada de realizar la recolección y transporte de
residuos sólidos domiciliarios y comerciales. En la actualidad se reciben 308 toneladas/día
de residuos de la cuales aproximadamente 285 toneladas corresponden a la disposición
de Villavicencio y 23 toneladas corresponden a la disposición de otros municipios. En
cuanto a los residuos orgánicos generados se utilizarán como recurso para eliminar focos
de contaminación y optimizar la higiene pública.
Actualmente, se ha venido desarrollando un inoculante biológico acelerante compuesto
por 14 cepas nativas termofílicas con actividad proteolítica y amilolítica (Galindo et al.,
2005) el cual ha contribuido a la reducción del tiempo de producción y a la obtención de
un compost de buena calidad.
Por lo anterior, se buscará potencializar la eficiencia del inóculo ya existente compuesto
por cepas termofílicas amilolíticas y proteolíticas, aislando microorganismos nativos con
actividad lipolítica que serán adicionados al inoculante microbiano termofílico con el fin de
optimizar su acción en el proceso de degradación de residuos orgánicos. Así mismo,
debido a la importancia que ha alcanzado este compost producido (bioabono) se plantea
el análisis de patógenos humanos E.coli y Salmonella sp. al inicio y al final del proceso
para garantizar su calidad.
Por ultimo, la finalidad de este proyecto es poder obtener resultados favorables mediante
el aislamiento de las bacterias anteriormente mencionadas, para mejorar la eficiencia del
inóculo con el que se ha venido trabajando en la Empresa Bioagrícola del Llano, el cual
aportará óptimos resultados al momento de obtener el bioabono producido.
4.- OBJETIVOS
4.1 Objetivo General.
Aislar bacterias lipolíticas y determinar patógenos humanos Escherichia coli y Salmonella
sp. a partir de residuos orgánicos domiciliarios en compostaje.
4.2 Objetivos Específicos.
•
Aislar bacterias con actividad lipolítica a partir de los residuos orgánicos a
compostar.
•
Evaluar la capacidad antagónica de las cepas en estudio.
•
Evaluar cualitativamente y cuantitativamente actividad enzimática lipolítica de las
cepas seleccionadas.
•
Estandarizar la técnica de p-nitrofenol para la evaluación cuantitativa de las cepas.
•
Determinar patógenos humanos Escherichia coli y Salmonella sp. en compost, al
inicio y final del proceso de compostaje.
5.- METODOLOGÍA
Este proyecto fue realizado en el relleno sanitario “Don Juanito” en la ciudad de
Villavicencio manejado por la empresa Bioagrícola del Llano S.A. E.S.P, en donde se llevó
a cabo el montaje de tres replicas de compostaje, utilizando 55% de residuos de plaza,
contenido ruminal, poda y cascarilla de arroz, para el aislamiento de bacterias lipolíticas y
para llevar a cabo la determinación de patógenos humanos Escherichia coli y Salmonella
sp. Las muestras fueron procesadas y analizadas en los laboratorios de Microbiología
Ambiental y Biotecnología Aplicada de la Pontificia Universidad Javeriana. La
determinación de los parámetros fisicoquímicos del producto inicial y final se realizó en
AGRILAB, laboratorio certificado por el ICA (Anexo 12).
5.1 REACTIVACIÓN DE CEPAS
Se llevó a cabo la reactivación de 14 cepas nativas termofilicas, con actividad proteolítica
y amilolítica provenientes de residuos orgánicos domiciliarios del relleno sanitario “Don
Juanito” de la ciudad de Villavicencio, las cuales fueron conservadas en glicerol al
25%(v/v), en el banco de células del laboratorio de Biotecnología Aplicada de la Pontificia
Universidad Javeriana (Galindo et al; 2005).
El proceso de reactivación de las 14 cepas se llevó a cabo en medio líquido leche-almidón
al 1%(p/v) (Anexo1) hasta obtener una concentración de 1020 UFC/mL a una temperatura
de 55°C. A partir de estas, se produjo la cantidad de inoculante necesaria para aplicar a
las pilas de compostaje. Para comprobar la producción de biomasa de las cepas
reactivadas se determinó mediante técnicas cualitativas (formación de halos de hidrólisis)
en agares específicos (leche-almidón al 1%), se realizaron recuentos en placa para
determinar biomasa, fueron incubadas a 55°C por 24 horas. La cantidad de inoculante a
preparar se calculó de acuerdo a los metros cúbicos de residuos orgánicos que se
compostaron y a la concentración final deseada de 1020 UFC/mL, siendo 2.5 litros por
metro cúbico la cantidad destinada para cada tonelada (Galindo et al., 2005).
5.2 FASE DE LABORATORIO
5.2.1 MUESTREO
A partir de las 3 réplicas de compostaje, se tomaron de las materias primas y del compost
final 5 muestras de 100 g cada una para completar 500 g, utilizando un tubo de PVC de
70 cm de largo por 3 de diámetro, para esto se retiró el material de tal forma que la
materia quedó al descubierto, de dicha pared se tomaron las 5 muestras de diferentes
alturas y distancias (Universidad de los Andes, 2003).
Posteriormente, se trasladaron en bolsas plásticas de cierre hermético dentro de una
nevera plástica al laboratorio de Biotecnología Aplicada de la Pontificia Universidad
Javeriana. El análisis realizado a estas muestras primero fueron análisis físico químico y
segundo “screening” de bacterias lipolíticas y patógenos.
5.2.2 PROCESAMIENTO DE LAS MUESTRAS
5.2.2.1 Aislamiento de bacterias con actividad lipolítica
A partir de 500g de muestra homogenizada se tomaron 10 gramos y se realizaron
diluciones seriadas en agua peptonada al 1% (p/v) de 10-1 a 10-8. Luego se sembró en
superficie y por duplicado 0.1 mL de las diluciones, en medio lecitina (Ramírez et al.,
2004) (Anexo 1) se utilizó como control medio de cultivo tributirina.
Algunos de los
microorganismos aislados hidrolizaron el ácido graso presente en el
medio, generando una zona de hidrólisis o aclaramiento alrededor de las colonias que se
evidenció después del tiempo de incubación a 55°C por 24 horas. Se tuvo como
parámetro de selección, las cepas con halos ≥ 1mm de diámetro (Jaeger et al., 1999,
citado por Moreno et al., 2001)
Las siembras realizadas fueron sucesivas, mediante la técnica de parcheo para purificar
cada colonia, en donde se observó la actividad enzimática, la cual se determinó de forma
cualitativa en mm de diámetro con la siguiente ecuación (1):
C = A – B (ecuación 1)
En donde:
A: Diámetro de la colonia más el halo de hidrólisis en mm.
B: Diámetro de la colonia en mm.
C: Diámetro del halo de hidrólisis (Rodríguez et al., 2002)
5.2.2.2 Identificación microscópica y macroscópica de las colonias
Para llevar a cabo la identificación microscópica se realizaron montajes en láminas de
cada una de las colonias seleccionadas y se realizaron tinciones de Gram para evidenciar
morfología celular (Madigan, 1997).
En la identificación macroscópica se tuvieron en cuenta características de las colonias
como halos de hidrólisis, color, textura, tamaño y elevación de las colonias bacterianas.
5.3 BANCO DE CÉLULAS PRIMARIO (Conservación De Cepas).
La conservación de las cepas seleccionadas se realizó mediante la técnica de
criopreservación con glicerol al 30% (v/v).
Para alcanzar la concentración óptima de 108 UFC/mL del banco fue necesario realizar
recuentos en placa en medio lecitina para confirmar la concentración inicial. Cada cepa
fue cultivada en 25 mL de caldo lecitina por 12 horas a 55ºC. Posteriormente se añadieron
25 mL de caldo lecitina más glicerol al 60% (v/v).
Finalmente se tomó 1 mL de dicha suspensión y se almacenó en tubos eppendorf a -70°C
(Poutou et al., 1994). Este procedimiento se llevó a cabo con cada una de las cepas
aisladas.
5.4 PRUEBAS DE ANTAGONISMO
Las 14 cepas existentes correspondientes al inóculo utilizado en La Empresa “Bioagrícola
del Llano S.A
E.S.P.” se llevaron a cultivar de 48 horas a 55°C en el medio
correspondiente a cada cepa, para determinar el tiempo óptimo de crecimiento del
microorganismo. (Galindo et al., 2005).
Se realizó un inóculo con una concentración de 108UFC/mL en un erlenmeyer relación 1/5
en caldo Almidón-leche al 1% (p/v) y lecitina bajo las siguientes condiciones 55ºC por 12
horas, después de este tiempo se realizaron las pruebas de antagonismo para cada una
de las cepas.
Para la prueba se sembraron masivamente cada uno de los microorganismos en medio
almidón-leche al 1%(p/v) y lecitina. A partir de la suspensión anterior se tomaron 20µl y se
dispusieron en pozos, como control se tomó el microorganismo que se sembró
masivamente, esta técnica se realizó por triplicado enfrentando las 14 cepas existentes
con las cepas lipolíticas aisladas. Este antagonismo se evaluó con el fin de evidenciar si
las cepas lipolíticas pueden ser adicionadas al inóculo ya existente .Las 14 cepas ya
existentes no presentan antagonismo entre ellas comprobado en estudios anteriores.
(Galindo et al.,2005)
El efecto antagónico se evaluó midiendo el diámetro de los halos de inhibición, tomando
como antagonismo positivo a las cepas que enfrentándose entre sí, inhibieron el
crecimiento de las otras en ≥ 5mm de diámetro (Gauze, 1967).
Adicionalmente, se realizaron pruebas antagónicas de las cepas lipolíticas enfrentadas
entre si obtenidas del screening, sembrando masivamente cada cepa lipolitica. De igual
manera al iniciar las pruebas fue necesario que los microorganismos alcanzaran la misma
concentración (108UFC/mL) para evitar falsos positivos. Para esto se llevaron a cabo
nuevamente recuentos en placa en medio lecitina, lo cual permitió determinar la
concentración inicial de cada microorganismo, posteriormente se realizó la metodología
anteriormente mencionada.
5.5 CURVAS DE CRECIMIENTO
Esta prueba se realizó con el fin de determinar el tiempo de la fase de crecimiento de
cada una de las cepas aisladas y de esta manera saber, el tiempo óptimo para la
producción del inóculo nativo termofílico, en el cual se genera mayor actividad enzimática.
5.5.1 Producción del inóculo
Se preparó un inóculo de 100mL de caldo lecitina, inoculando un vial obtenido del banco
primario de cada una de las cepas en un erlenmeyer de 500 mL (1/5), el cual duró en
incubación un tiempo aproximado de 24 horas. Transcurrido este tiempo para la
fermentación se transfirió a un erlenmeyer de 1000mL con 500 mL de medio lecitina,
relación (1/2) adicionalmente se realizó coloración de Gram para corroborar pureza
(Moreno et al., 2001).
5.5.2 Fermentación Discontinua
Se tomó del inóculo preparado en el numeral anterior la cantidad correspondiente a 0.5
mL para realizar diluciones de 10-1 a 10-10 para luego determinar biomasa mediante la
técnica de recuento en placa (UFC/mL) por triplicado, por un periodo de incubación de 18
horas a 55ºC. Para la determinación de biomasa de los diferentes tiempos de muestreo se
leyó absorbancia utilizando la técnica de lavado con buffer Fosfato 1 M a pH 7 (K 2HPO
4
+ KH2 PO4) y adición de Triton X-100 al 1%, debido a la turbidez del medio. Esta técnica
se leyó a 540 nm (Otálora et al., 2003) la metodología anterior se uso para bacterias, para
actinomycetes utilizó únicamente la técnica de recuento en placa.
5.6 TÉCNICA COLORIMÉTRICA P-NITROFENIL PALMITATO PARA
ACTIVIDAD
LIPOLÍTICA
5.6.1 Curva patrón de p-nitrofenol
La curva de p-nitrofenol se realizó en tubos 13 x 100mm, utilizando una solución buffer
fosfato 1M (Anexo 3), el cual fue utilizado como blanco y como solución buffer del pnitrofenil (Otálora et al., 2003).
Para realizar la curva patrón (Anexo 4), se preparó una solución stock de p-nitrofenil de
1umol/mL en buffer fosfato pH 7.0, a partir de esta solución se determinaron las diferentes
concentraciones para la construcción de la curva de p-nitrofenol, las cuales fueron leídas
por duplicado en un espectrofotómetro Spectronic 21D Milton Roy a 450nm (Beltrán et
al., 2006).
Las concentraciones de p-nitrofenol que arrojaron valores de absorbancias entre 0.1 y 0.9
fueron escogidos para realizar el trabajo de acuerdo con la Ley de Beer-Bouguer-Lambert
(Otálora et al., 2003).
5.6.1.1 Evaluación y estandarización cuantitativa de actividad lipolítica
Para determinar la actividad lipolítica se preparó una solución buffer fosfato 1M a pH 7 + o
– 2 (Na2HPO4
+ NaH2PO4) con diferentes concentraciones de p-nitrofenil palmitato
(0,08%(p/v), 0,5%(p/v), 1%(p/v), 1,5%(p/v) y 2%(p/v)) + 1% de TRITON X-100 (Shuen et
al., 1996). A partir de esta solución se tomó 900µl en tubos 16*150 y se le adicionó
diferentes volúmenes de extracto crudo (20µl, 500µl y 700µl). La solución se incubó por
30 y 60 minutos a 55 °C. Transcurrido este tiempo se frenó la reacción con NaOH.
Posteriormente cada una de las mezclas fue llevada a centrifugación a 10000 rpm por 10
minutos, a partir del sobrenadante se tomó 1mL y fue depositado en las celdas de cuarzo,
para luego realizar la lectura usando como blanco la solución buffer sin extracto crudo de
la enzima en espectrofotómetro Spectronic 21D Milton Roy a 450nm (Beltrán et al.,
2006). Las unidades lipolíticas fueron determinadas a través de la curva patrón de
calibración donde una unidad de p-nitrofenol liberada corresponde a una unidad lipolítica
por minuto (UL). (Kampen, 1999).
5.6.1.2 Prueba preliminar de actividad enzimática
Se realizaron pruebas preliminares de actividad enzimática de las cepas escogidas,
llevando a cabo una fermentación discontinua, para lo cual se llevó a cabo la producción
de un inóculo en 100mL de caldo lecitina, inoculando un vial de cada cepa obtenido del
banco primario en un erlemmeyer de 500mL para alcanzar una relación (1/5) con un pH
inicial 7.5 y un tiempo de incubación de 24h a 55°C.
Pasado el tiempo de incubación se trasladaron 100mL del inóculo a un erlenmeyer de
1000mL que contenía 400 mL de caldo lecitina relación (1/2) con pH 7.5 inicial, éstos se
cultivaron durante 12 horas, a 55°C, posteriormente se retiró el erlenmeyer, iniciando el
muestreo en la hora 0, luego se realizaron muestreos cada media hora hasta llegar a la
hora y media, a partir de aquí se realizaron muestreos cada 2 horas de fermentación
hasta la hora 18, para corroborar pureza del cultivo se realizaron coloraciones de Gram en
cada hora de muestreo (Otálora et al.,2003).
En cada muestreo se tomaron del erlenmeyer 5mL de muestra, esta se centrifugó a 150
rpm durante 15 minutos para obtener el sobrenadante, es decir, el extracto crudo que
contiene la enzima lipolítica como se mencionó el numeral anterior.
Por otro lado, se preparó una solución de Buffer Fosfato 1 M a pH 7 (K 2HPO 4 + KH2 PO4),
el cual fue mezclado con el p-nitrofenil palmitato mas Triton X – 100 a una concentración
del 1% (Beltrán et al.,2006). A partir de esta solución se tomaron las cantidades
especificadas anteriormente de p-nitrofenil palmitato y extracto crudo en tubos 13*100.
La solución se incubó por 30 y 60 minutos a 55ºC transcurrido este tiempo se frenó la
reacción con 1575 ul de NaOH (Otálora et al., 2003).
Luego se realizó la lectura usando como blanco la solución de Buffer sin el extracto crudo
de la enzima (Beltrán et al., 2006). Para realizar la técnica de cuantificación de la actividad
enzimática, se formula que una unidad lipolítica se define como la cantidad de enzima
capaz de liberar una micromol de p- nitrofenol por minuto por litro (Moreno et al., 2001).
5.7 DETERMINACIÓN DE MICROORGANISMOS PATÓGENOS. Escherichia.coli y
Salmonella sp.
5.7.1 Determinación de microorganismos patógenos. Salmonella sp.
Las muestras iniciales fueron tomadas de la primera y última semana de residuos del
proceso de compostaje, éstas fueron recolectadas en bolsas plásticas de cierre hermético
y llevadas a refrigeración a 4°C hasta el momento de su análisis.
Para la presencia de Salmonella sp se usó el método de NMP (número más probable).
A partir de 500g de muestra se tomaron 25g para diluirlo en 225mL de agua peptonada al
0.1%(p/v), enseguida se homogenizo por inmersión (EPA, 1682, 2005). Seguido a esto se
realizaron tres diluciones: el primer juego se realizó con frascos de vidrio, con 10mL de
medio líquido TSB (Anexo 1) mas 20mL de muestra homogenizada, el segundo juego se
realizó en tubos tapa rosca (16x150mm) con 5mL de medio líquido TSB más 5mL de
muestra homogenizada y finalmente el tercer juego con tubos tapa rosca (16x150mm)
con 10mL de medio liquido TSB mas 1mL de muestra homogenizada. Cada juego
correspondió a las diluciones 10-1, 10-2 y 10-3 respectivamente. Se incubó 24h a 36°C (EPA,
1682-2006), para cada una de las diluciones (10-1, 10-2 y 10-3) se preparó el medio
Rappaport Vassiliadis (semisólido) (Anexo 1). Sobre cada caja se distribuyeron cinco
puntos equidistantes y se depositaron 30µl de cada juego de diluciones. Esto se llevó a
incubar a 42°C por 24h. De cada una de las gotas depositadas (5) en el medio semisólido
Rappaport Vassiliadis correspondiente a cada dilución, se repicaron a medios selectivos
XLD y Sulfito Bismuto (EPA, 1682-2006).
De los aislamientos se escogieron colonias características de Salmonella sp y de estas
se hicieron pases a: TSI, LIA y UREA (Tabla 3), seguido de esto se escogieron las
colonias que presentaron reacción metabólica positiva, y se realizó la prueba serológica
con solución salina y antisuero polivalente ´´o``, esta prueba consiste en obtener una
muestra de la superficie inclinada del tubo de cada una de las bioquímicas, emulsionando
sobre una lámina con suero fisiológico estéril, evidenciando aglutinación en caso de un
resultado positivo (EPA, 1682-2006).
Tabla 3.Tabla guía para la lectura indicadores de Presencia de Salmonella sp
Medio
Resultados
Salmonella
Método 1682
Reacción Positiva
Tripticasa soya
Medio Rappaport
Vassialiadis
modificado
Positivo
Positivo
XLT4
Positivo
Turbidez
Células que migran
en el medio
alrededor del halo
donde se realizó la
inoculación de color
blanco grisáceo
rosado a rojo con
colonias
que
presentan
centro
negro
TSI
Positivo
Viraje de rojo a
Método 1682
Reacción
Negativa
No turbidez
Medio de color
igual al inicial sin
halo
Otro
color
con
centro negro ejm:
E.coli:
colonias
amarillas con el
centro negro
Otro tipo de color
amarillo con o sin
producción de H2S
Columna vertical y
superficie inclinada
color violeta,
formación de H2S
LIA
Positivo
ÚREA
Negativo
Color Rosado
Polivalente “O”
Positivo
Aglutinación
Otra combinación
de colores ejm:
E.coli presenta
color rojo o
variación entre rojo
y morado sin
producción de H2S
No hay cambio de
color ( Salmonella
es ureasa negativo)
No Aglutinación
Fuente: EPA 2006 United States Enviromental Protection Agency Method 1682:
Salmonella in Sewage Sludge (Biosolids) by Modified Semisolid Rappaport-Vassiliadis
(MSRV) Medium
La determinación de NMP se realizó a partir de los tubos originales de TSB con resultados
positivos para Salmonella sp en MSRV, XLD, Hecktoen, Sulfito Bismuto, TSI, LIA, urea
negativo y antisuero polivalente positivo, se leyeron en la tabla de NMP.
Para la determinación de sólidos totales se tomaron 15g de la muestra a 100°C por 24
horas. El porcentaje de peso seco se calculó utilizando la siguiente ecuación (1)
g de la muestra seca
(1) % peso seco
=
* 100%
g de la muestra
Para la determinación de Salmonella sp como NMP/15g peso seco se utilizó la siguiente
ecuación (2):
NMP/ ml (peso húmedo) * 15
(2) NMP/15g (peso seco) =
Porcentaje de sólidos totales
5.7.2 Determinación de Escherichia coli.
Las muestras para el análisis fueron tomadas de la primera y última semana de la mezcla
del compost, éstas fueron recolectadas en bolsas plásticas de cierre hermético y llevadas
a refrigeración a 4°C hasta el momento de su análisis.
Para la presencia de Escherichia coli se usó el método de NMP (número más probable).
A partir de 500g de muestra se tomaron 10g para diluirlo en 90ml de agua peptonada al
0.1%(p/v), enseguida se homogenizó por inmersión (EPA, 1680, 2006). Seguido a esto se
realizan tres diluciones 10-1, 10-2 y 10-3. Alternamente se preparan 9 tubos, cada uno con
9ml de caldo LMX ,los cuales cada serie de tres serán inoculados con 1ml de las
diluciones ya preparadas, que corresponderán la primera serie de tres a la dilución 10 -1, la
segunda serie de tres ala dilución 10-2, y la ultima serie de tres a la dilución 10-3.
Se tomó como resultados positivos para Escherichia coli aquellos tubos que presentaran
tres reacciones positivas como lo son: Indol positivo, fluorescencia y presencia de
glucoronidasa (EPA, 1680, 2006).
Para la determinación de NMP/4g se revisó en la tabla establecida por la EPA, 1680,
2006.
5.8 FASE DE CAMPO
5.8.1 Determinación de pH y Temperatura
La temperatura fue analizada mediante un termómetro de punzón de 70 cm de largo con
receptor digital, las mediciones se realizaron diariamente. Estas temperaturas se
registraron de las 3 replicas de compostaje para luego ser promediadas y encontrar el
valor medio. Este procedimiento se realizó diariamente los resultados fueron registrados
para su posterior análisis.
El pH se determinó semanalmente en el laboratorio de Biotecnología Aplicada por medio
del método de pasta de saturación, que consiste en tomar cinco submuestras de cada pila
hasta completar 500g y agregar 500mL de agua destilada; se debe mezclar y pasados de
5 a 10 minutos, se toma el valor del pH sobre el extracto liquido superficial (Galindo et al.,
2005).
Finalmente se calibra el potenciómetro con las soluciones reguladoras de pH 7.0 y 4.0
(soluciones buffer) y se introduce el electrodo de vidrio en la pasta saturada y se registra
la lectura (ICONTEC, 2004).
5.8.2 Análisis Fisicoquímico De Las Muestras
Se tomaron 500 g del compost final y fueron destinadas para el análisis de los parámetros
fisicoquímicos realizados por AGRILAB, laboratorio registrado ante el ICA, con el fin de
establecer parámetros fisicoquímicos: Relación C/N Humedad, Cenizas. Carbobo
orgánico oxidable, Capacidad de Intercambio Catiónico, Nitrógeno orgánico, Fósforo total,
Potasio total, Calcio total, Magnesio Total, Azufre total, Hierro total, Manganeso total,
Cobre total, Zinc total.
5.9 ANÁLISIS ESTADÍSTICO
De acuerdo a los registros de actividad enzimática se que se obtendrán, con las diferentes
cantidades de sustrato y de extracto crudo, se llevara a cabo un análisis de ANOVA, para
el posterior análisis en el programa JUMP.
Planteamiento de Hipótesis.
Ho: No existen diferencias entre la actividad lipolítica obtenida a partir de
microorganismos nativos de compost en los tiempos de contacto, los volúmenes de
extracto y las diferentes concentraciones de sustrato.
Ho: H1 = H2 = H3
Hi: Al menos una de las variables analizadas presenta diferencias significativas.
Hi: H1 ≠ H2≠ H3
Por otra parte, según los resultados obtenidos en las pruebas de antagonismo se realizó
un estudio de tipo descriptivo en el que se plantearon las siguientes hipótesis
Ho: Las cepas enfrentadas presentan antagonismo
Hi: Las cepas enfrentadas no presentan antagonismo
6. RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Bioagrícola del Llano S.A. E.S.P, ubicada en Villavicencio (Meta) se ha convertido en un
puente entre la civilización y la biodiversidad, debido al Parque Ecológico Reciclante, en el
que se encuentra ubicado el Relleno Sanitario “Don Juanito”. Este parque a través del
tiempo ha dado respuesta a la necesidad de brindar una nueva imagen a la comunidad
demostrando una excelente gestión ya que brinda un adecuado manejo de los residuos
sólidos logrando así un ecosistema benéfico ( Galindo et al., 2005).
Por lo anterior, se demuestra la importancia de la obtención de estos resultados ya que se
le proporcionará a Bioagrícola del Llano avances en cuanto a las posibilidades del
inoculante acelerante ya desarrollado con cepas amilolíticas y proteolíticas con una
actividad de 114.5 UA y 98.5 UP respectivamente (Rodríguez et al., 2005) las cuales
permitirán un mejoramiento continuo para optimizar la calidad del bioabono que se
comercializa en cultivos de la región.
6.1 PROCESAMIENTO DE MUESTRAS
6.1.1 Aislamiento de Bacterias con Actividad Lipolítica
Las materias primas utilizadas para el aislamiento fueron: poda, residuos de plaza,
contenido ruminal y cascarilla de arroz.
A partir del “screening” inicial en medio lecitina después de realizar las respectivas
diluciones, siembras en superficie e incubación a 55ºC por 48 horas, se obtuvo un total de
9 cepas presuntivas (Tabla 4) debido a la presencia de un halo de hidrólisis, como
consecuencia de la utilización de la fuente de carbono del medio (ácidos grasos
contenidos en la lecitina) estas se les realizo técnicas de agotamiento para obtener cepas
purificadas. Luego de las siembras sucesivas se obtuvieron 3 cepas denominadas: L1, L2
y L3 (Figura 2a, b y c). Se debe tener en cuenta que la lecitina es el nombre común para
un determinado tipo de fosfolípidos, estos son componentes importantes que se
encuentran en la estructura de todas las membranas celulares. De la misma manera la
lecitina, es una importante fuente de fosfolípidos, la cual es necesaria para todas las
células vivas. Las membranas de las células que regulan los nutrientes que pueden
penetrar o no en la célula, están compuestas en gran medida de lecitina (Rivera y García,
2007).
Tabla 4. Cepas presuntivas lipolíticas
Halo de
hidrólisis en mm
Cepa Lipolítica
de diámetro
1L
1,5
2L
1,3
3L
1,2
4L
1,0
5L
1,0
6L
1,1
7L
1,0
8L
0,5
9L
0,8
Fuente: Autores, 2007
Cabe anotar que de las cepas aisladas únicamente tres presentaron un halo > de 1 mm
de diámetro se seleccionaron aquellas cepas que tenían un halo de hidrólisis entre 1.2mm
y 1.5 mm ya que estos fueron los mayores diámetros.
Sin embargo, en los mismos procesos algunas lipasas son reportadas con una alta
especificidad por ácidos grasos. El más amplio ejemplo es la lipasa extracelular aislada de
la cepa Geotrichum candidum, la cual es reportada por poseer una alta especificidad por
los ácidos grasos insaturados (Stránský et al., 2006). En la preparación del inóculo para
Geotrichum se utilizaron medios de cultivo que tenían al igual que el lecitina MgSO 4 y KCL
lo que otorga al microorganismo un sustrato favorable para su desarrollo, diferenciándose
únicamente en la fuente de carbono (Aceite de Oliva), utilizado como inductor de lipasas
(Stránský et al., 2006).
Figura 2a. Cepa aislada L1.
Medio lecitina
Figura 2b. Cepa aislada L2.
Medio lecitina
Figura 2c. Cepa aislada L3.
Medio lecitina
Fuente: Autores, 2007
Figuras 2. a,b,c Cepas Purificada con un tiempo de incubación de 48 horas a 55ºC.
En estudios recientes se ha encontrado que la mayoría de microorganismos lipolíticos y
sus enzimas se obtienen del suelo, donde se encuentran bacterias muy activas en el
reciclaje de nutrientes como las pertenecientes al género Bacillus y otros géneros
relacionados. Estos géneros están considerados como una de las mayores fuentes de
enzimas con aplicación industrial debido a que, en general, son microorganismos no
patógenos, bien estudiados y fáciles de manipular, que producen y secretan grandes
cantidades de enzimas como lipasas, celulasas, entre otros ( Snellman, 2004).
6.1.2 Identificación macro y microscópica de las cepas
De acuerdo al aislamiento, se identificaron morfologías macro y microscópicas de las 3
cepas, siendo 1 actinomycete y 2 bacterias (Tabla 5). Al realizar coloraciones de Gram, se
determino la presencia de bacilos gram positivos filamentosos para el actinomycete y
bacilos Gram negativos para las dos bacterias (Figura 3 a,b y c)
Tabla 5. Identificación Macro y Microscópica de las colonias
Cepa
Origen
Morfología
Microscópica
Morfología
Macroscópica
Cepa L1
Pila No 3
Cepa L2
Pila No 3
Bacilos Gram
negativos
Bacilos Gram
negativos
Colonias cremosas
de color amarillo
Colonias rugosas
de color blanco
Cepa L3
Pila No 3
filamentosos
Bacilos Gram
negativos
Colonias cremosas
de color amarillo
Fuente: Autores 2007.
Cepa L1. Bacilos Gram negativos
Cepa L2. Bacilos Gram negativos
filamentosos
Cepa L3. Bacilos Gram
negativos
Fuente: Autores, 2007.
Figura 3 a,b,c . Coloraciones
de Gram
6.1.3 Criopreservación
Cepas
de
En total fueron criopreservadas 3 cepas con glicerol al 30 %(v/v). Cada cepa fue
almacenada en 35 viales a -70ºC para un total de 105 viales.
6.1.4 Pruebas de Antagonismo
Esta prueba se realizó con las 3 cepas seleccionadas como lipolíticas, con el fin de
evaluar la posible inhibición en el crecimiento. Se llevo acabo enfrentando las tres cepas
entre sí. Los resultados no evidencian antagonismo entre las cepas seleccionadas (Figura
4), lo que favorecería su actividad en el inoculante, ya que estas pruebas tienen como
propósito evaluar la ausencia de inhibición de crecimiento entre las cepas. El hecho de no
presentar inhibición de crecimiento entre los microorganismos puede atribuirse a que
probablemente no liberan sustancias que impida el crecimiento de la cepa enfrentada o
las liberan en cantidades que no alcanzan a afectar su desarrollo. También puede
deberse a que la producción de sustancias inhibitorias se vea estimulada por condiciones
de estrés, como falta de nutrientes y en este caso el medio en el cual se desarrollaron
(agar lecitina) contenía los nutrientes en cantidades necesarias para su crecimiento.
(Duran, 1996). Así mismo cabe destacar que estas cepas posiblemente no presentan
antagonismo al ser aisladas de la misma fuente (residuos orgánicos) donde conviven sin
presentar ningún tipo de competencia por sustrato debido a que esta fuente muy
posiblemente cuenta con todos los requerimientos óptimos para su desarrollo.
Las pruebas se realizaron en agar lecitina, por triplicado; los resultados reflejan un posible
efecto de sinergismo que podría acelerar la degradación de los residuos sólidos presentes
en el compost, constituidos por lípidos, disminuyendo el tiempo del compostaje. (Tabla 6).
Tabla 6. Promedio de Resultados de las pruebas antagónicas.
(Diámetro de Halos en mm)
Cepa No
L1(R1)
L2(R1)
L3(R1)
L1
0
0
L2
0
0
Fuente: Autores, 2007.
L3
0
0
-
Figura 4. Enfrentamiento de cepas lipolíticas sin halo de inhibición
Fuente: Autores, 2007
Las pruebas antagónicas también se realizaron enfrentando las cepas aisladas lipolíticas
con las cepas del inóculo, para evaluar si las cepas seleccionadas como lipolíticas, tienen
efecto antagónico frente a las cepas del inóculo. La cepa L1 (Figura 5) presentó efectos
antagónicos con las cepas 3P (Proteolítica), 4 A (Amilolítica), 5AP ( Actividad compartida:
Amilolítica y Proteolítica), 8AP ( Actividad compartida: Amilolítica y Proteolítica) y 14AP
(Actividad compartida: Amilolítica y Proteolítica)
. Se tomo como diámetro de halo
representativo o inhibitorio (> 5mm). Los resultados reflejan que la cepa L1 tiene efecto
antagónico. Las pruebas antagónicas fueron realizadas en un medio que contenía tres
fuentes de carbono para cumplir con las exigencias nutricionales de los microorganismos
evaluados. El medio contenía 1%(p/v) leche, 1%(p/v) almidón y lecitina (Anexo1). La
pequeña inhibición presentada por la cepa 1 (Anexo 7) muy seguramente se presentó
debido a que en este caso si hubo una competencia por sustrato, ó también se puede
deber a que esta bacteria Gram negativa secreta sustancias que inhiben el crecimiento de
las cepas 3 P, 5AP, 8 AP y 14P es por esto necesario que en futuros estudios se realice
una identificación bioquímica de dicho microorganismo para descartar una cepa patógena,
ya que sería perjudicial si se tuviera en cuenta al momento de ser adicionado en el inóculo
debido a que este compost como ya se ha mencionado anteriormente es utilizado en
cultivos propios de la región.
Figura 5. Enfrentamiento de cepas lipolíticas con cepas de inóculo
Fuente: Autores, 2007
6.2 CURVAS DE CRECIMIENTO
Cabe resaltar que se hizo un estudio preliminar realizando una curva de 12 horas, y al
observar que el microorganismo, correspondiente a la cepa L3 no llegó a su fase de
muerte, se decidió realizar una curva de 18 horas. Así mismo, en la curva de 12 horas se
tomó como medio control el medio tributirina, para realizar los respectivos recuentos
(Anexo 6), arrojando resultados de ausencia de crecimiento en las primeras horas de la 0
a la 1 y ½ , demostrando que el medio óptimo para su crecimiento es el medio lecitina.
Este medio contiene ácidos grasos simples los cuales son de fácil asimilación por los
microorganismos. De la misma manera se debe tener en cuenta que estos
microorganismos se encontraban en caldo lecitina, y es probable que al momento de
realizar la siembra a medio tributirina este pudo haber presentado estrés.
Para esto se determinó un recuento inicial el cual reportó un recuento inicial de 10*10 5
UFC/ml en caldo lecitina y se evaluó su crecimiento, producción de biomasa en función
del tiempo (Figura 6).
Es importante resaltar que el microorganismo no presenta una fase de adaptación debido
a lo mencionado anteriormente, presentando la fase exponencial desde la hora 0 a la 5
aproximadamente, observando luego su fase estacionaria hasta la hora 13, descendiendo
así hasta su fase de muerte en la hora 18.
12
Log UFC/mL
10
8
6
4
2
0
0
5
10
15
20
Tiempo (Horas)
Figura 6. Curva Producción de biomasa en función del tiempo
Cepa L3.
La cepa L3 no presentó fase de adaptación, sino que el microorganismo comienza la fase
exponencial aproximadamente a la hora 0 de fermentación debido al pre inóculo
realizado, alcanzando su máximo punto en la hora 8, evidenciándose una pequeña fase
estacionaria, para luego comenzar a descender hasta llegar a fase de muerte en la hora
18. Según microscopia se observaron bacilos Gram negativos, este tipo de morfología se
evidencia en gran parte de las bacterias aisladas del suelo ya que están involucradas en
el reciclaje de nutrientes, es por esto que en el presente proyecto se obtuvieron dos cepas
con estas características.
Posteriormente se realizó una curva de crecimiento en caldo lecitina en donde se
determinó la formación de biomasa (Anexo 6) por un tiempo de
18 horas del
actinomycete aislado, para este al igual que la bacteria se realizó un inóculo en 100 ml de
caldo lecitina bajo las siguientes condiciones 55ºC, 12 horas a 150 rpm, para esto se
determinó un recuento inicial que reportó un valor de 25*107 UFC/ml.
14
12
Log UFC/mL
10
8
6
4
2
0
0
5
10
15
20
Tiempo (Horas)
Figura 7. Curva de crecimiento cepa L2. Actinomycete
Fuente: Autores: 2007.
Como se observa en la figura 7 de la hora 0 a la 8 se observa la fase de crecimiento
denominada trofofase que es donde se producen metabolitos secundarios, en este caso
lipasas. La ideofase se evidencia desde la hora 10 hasta la muerte que se da a la hora 18.
Por ultimo, la producción de biomasa de los dos microorganismos evaluados presentó un
comportamiento ascendente en la producción de biomasa. El descenso durante las curvas
de crecimiento puede deberse al agotamiento gradual de nutrientes presentes en el medio
lecitina (Ramírez et al., 2004). De la misma manera se debe tener en cuenta que en
procesos de fermentación el crecimiento de los microorganismos se ve relacionado con el
tipo del medio, la temperatura, el pH, la composición del medio, el volumen de
inoculación, la aireación entre otros ( Snellman, 2004).
6.3 CURVA DE CALIBRACIÓN
La curva de calibración (Anexo 4) reporto un factor de correlación (r2) de 0,996 indicando
la estrecha relación entre los valores del eje X y los de Y, que finalmente se ve
representada en la distribución lineal de la curva y por ende el comportamiento normal de
los datos. Sabiendo que el valor de r2, en los casos de la curva de calibración, debe estar
cercano a 1 (Otálora et al., 2003).
6.3.1 ACTIVIDAD LIPOLÍTICA
La fermentación de la cepa 3 tuvo un período inicial de 12 horas, bajo las siguientes
condiciones 150rpm a 55ºC, luego al observarse que el microorganismo no llegó a su fase
total de muerte se realizaron pruebas de 18 horas, en total se tomaron14 muestras, las
cuales fueron puestas a evaluación enzimática lipolítica por la técnica de p-nitrofenol,
reportando los valores en el Anexo 5.
6.3.1.1 Estandarización del tiempo de contacto entre el sustrato y el extracto crudo
La primera evaluación realizada fue la evaluación del tiempo de contacto, en el cual se
cuantificaran más unidades lipolíticas, esto se hizo evaluando 30 y 60 minutos. En los
datos arrojados en la figura 14 si existen diferencias significativas entre estos dos tiempos
de contacto con un p<0,05 aceptando la hipótesis nula. Sugiriendo que el mejor tiempo de
contacto es el de 30 minutos pues es en este donde se ve mas la cuantificación de la
actividad lipolítica (Figura 8). Así mismo cabe resaltar que según estudios reportados por
Gessesse et al., 2003, se tomó un tiempo de contacto de 10 minutos, porque es en este
tiempo donde se presenta una mayor actividad enzimática. Aunque, Neerupma y
Jagdeep, 2006 reportan un tiempo óptimo de 45 minutos.
30
25
UL
20
15
10
5
0
30
60
T. contacto
Figura 8. Tiempo de contacto
6.3.1.2 Estandarización de diferentes concentraciones de sustrato
La estandarización de la técnica, se realizó probando diferentes concentraciones de pnitrofenil palmitato (0,08%(p/v), 0,5%(p/v) ,1%(p/v), 1,5%(p/v) y 2%(p/v)).
Transcurrido el tiempo de fermentación 24h/55°C/150 rpm de las cepas seleccionadas, la
enzima se obtuvo por centrifugación, para la evaluación cuantitativa de la actividad
enzimática de cada una de las cepas, utilizando las diferentes concentraciones de
sustrato anteriormente mencionadas con el fin de determinar la concentración óptima en
relación con la máxima actividad lipolítica. Para llegar a encontrar la concentración en la
cual se obtienen más unidades lipolíticas, primero se hizo un ensayo con las siguientes
concentraciones 0,08%(p/v),0.5%(p/v),1%(p/v) y de este primer ensayo se obtuvo que no
hay diferencias significativas (Anexo 10) entre las concentraciones de sustrato utilizadas,
rechazando la hipótesis nula con un p > 0,05.(Figura 9). Sin embargo la concentración del
1% se acerca más al valor de la media por lo tanto, se decidió probar concentraciones
más altas para observar si así se logra encontrar la concentración de sustrato en la cual
cuantifique mas la actividad enzimática. Así mismo durante estas evaluaciones se realizó
la evaluación de la producción de biomasa en función del tiempo (Figura 10).
18
16
14
UL
12
10
8
6
4
2
0
0,08
0,5
1
C. sustrato
Figura 9. Evaluación de las diferentes concentraciones de sustrato.
14
14
12
12
10
10
8
8
6
6
4
4
2
2
0
UL
Log 10 UFC/ml
Biomasa L3 vs UL al 1%
Log 10 UFC/ml
UL
0
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13
Tiempo (horas)
Figura 10. Curva de UL al 1% y producción de biomasa en función del tiempo.
La producción de enzima se lleva a cabo desde la hora 0 hasta la hora 8, se observa de la
misma manera un aumento en la producción de biomasa, lo cual indica que esta se
encuentra asociada con la producción de enzima, como ya se ha reportado (Rúa et al.,
1997). De la misma manera la alta producción de lipasa fue observada en la fase
logarítmica en estudios presentados por Stránsky, 2006.
Por otra parte, en estudios realizados por Moreno et al., 2001 se evidencia una alta
producción enzimática asociada a la fase de crecimiento de los microorganismos.
Observando que este crecimiento es directamente proporcional a la producción
enzimatica, según los estudios realizados por Janny en el 2001.
En el segundo ensayo se evaluaron las concentraciones de 1%(p/v), 1,5%(p/v) y 2%(p/v),
y en esta segunda evaluación tampoco se encontraron diferencias significativas entre
estas concentraciones con un p>0,05 rechazando la hipótesis nula (Figura 11). De la
misma manera se evaluó la producción de biomasa en función del tiempo (Figura 12).
30
25
UL
20
15
10
5
0
1
1,5
2
C.Sustrato
Figura 11. Segunda evaluación de diferentes concentraciones de sustrato al 1%,
1.5% y 2%.
>
14
35
12
30
10
25
8
20
6
15
4
10
2
5
0
UL
Log 10 UFC/ml
Biomasa L3 vs UL al 1,5%
Log 10 UFC/ml
UL
0
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13
Tiempo (horas)
Figura 12. Curva de UL al 1.5% y producción de biomasa en función del tiempo
Según lo observado, al igual que en la figura 14 hay un incremento en la producción
enzimática conforme aumenta su biomasa, observando la óptima producción en la hora
10 aproximadamente. Es importante tener en cuenta que en estudios recientes se ha
demostrado que la producción de las lipasas es afectada por el tipo del medio, la
temperatura, el pH, la composición del medio, el volumen de inoculación, la aireación
entre otros. La composición del medio de cultivo en particular la incorporación de
diferentes sustancias lipídicas, pueden resultar de diferentes fuentes de producción de
isoenzimas.
Reportando en otros estudios que las lipasas y la especificidad por la
estereasa pueden ser modificadas variando las condiciones operacionales durante el
crecimiento (Arpigny y Jaeger, 2000).
6.3.1.3 Estandarización con diferentes volúmenes de extracto crudo 20µl, 500µl y
700µl
Además de probar diferentes concentraciones de sustrato también se probaron diferentes
volúmenes de extracto crudo para ver cual volumen cuantificaba más enzima.
Transcurrido el tiempo de fermentación 24h/55°C/150 rpm de la cepa seleccionada, la
enzima se obtuvo por centrifugación, para la cuantificación de la actividad enzimática, así
mismo en otros estudios para la extracción de la enzima se manejaron parámetros
similares al de este estudio; se centrifuga a 5000 g por 10 minutos a 4°C , de aquí se
obtiene el sobrenadante que es la fuente de la enzima, para determinar la actividad
lipolítica utilizaron al igual que p-nitrofenil palmitato como sustrato y una solución stock de
p- nitrofenil a 20 mM fue preparada usando isopropanol. Trabajando con la solución de
sustrato la cual fue preparada diluyendo el p-nitrofenil con la solución stock 1:20 utilizando
20 mM Tris HCL buffer (Gessese, 2003). Se utilizaron diferentes volúmenes de extracto
crudo (20µl, 500µl y 700µl) con el fin de determinar el volumen óptimo en relación con la
máxima actividad lipolítica, encontrando que existen evidencias significativas (Anexo 10)
entre los tres volúmenes evaluados aceptando la hipótesis nula con un valor de p < 0,05
(Figura 13). Con este resultado los siguientes experimentos fueron realizados sin el
volumen de 20 µl. Ésta diferencia estadísticamente significativa demuestra que la cantidad
de extracto es demasiado pequeña para llevar a cabo la hidrólisis del éster p- nitrofenilo
de propionato (sustrato) (Jenny, 2001).
30
25
UL
20
15
10
5
0
20
500
700
V. de extracto
Figura 13. Estandarización de los diferentes volúmenes de extracto crudo.
Luego de descartar el volumen de 20µl, se realizó otro análisis para ver si existían
diferencias significativas entre las concentraciones de 500µl y 700µl, encontrando, que
entre estos dos volúmenes no existe diferencia significativa, rechazando la hipótesis nula
con un valor de p >0,05 (Figura 14). Es así que con estos resultados para trabajos futuros
se aconsejaría utilizar el volumen de extracto crudo de 500µl, ya que arroja resultados
confiables y se disminuiría volumen de extracto.
30
25
UL
20
15
10
5
0
500
700
V. de extracto
Figura 14. Estandarización de los diferentes volúmenes de extracto crudo.
Como se observa en la figura 16, no existen diferencias significativas entre los volúmenes
evaluados. Confirmando los estudios de Neerupmaa Nawani y Jagdeep Kaur, 2006, que
usaron un volumen de trabajo entre 500µl y 700µl para sus estudios de cuantificación de
lipasas extracelulares de Bacillus sp.
La adición de Triton-x100 al buffer y al nitrofenil palmitato, hace que en el momento de la
cuantificación de la actividad enzimática, permita que la molécula de la enzima se
disperse cuando entra en contacto con esta solución, lo que facilita la degradación de los
lípidos (Shuen et al., 1996).
Según un estudio de Moreno et al., 2001 la producción de unidades lipolíticas en
microorganismos aislados de una industria láctea arrojan valores entre 86,91-91,35 UL,
comparando con los resultados del presente estudio las unidades lipolíticas obtenidas
oscilaron entre los valores de 28 y 31 UL, observando un nivel bajo de producción de
enzima. Puede deberse a que el sitio de aislamiento de microorganismos lipolíticos del
presente estudio no contiene niveles altos de grasa.
Por otra parte en estudios realizados por Janny et al., 2001 se observan valores
enzimáticos mucho mas bajos (0.26 UL y 0.21UL) que los obtenidos en el presente
estudio, debido a que su fuente de aislamiento fue la caña de azúcar.
Según lo anterior, se corrobora que hay una relación directa entre las características del
halo de hidrólisis y la actividad enzimática, ya que los halos obtenidos por Moreno et al.,
2001 fueron de 9 mm de diámetro, a diferencia de este estudio que fueron de 1.5 mm.
6.4 Toma de muestras
Las materias primas utilizadas para el aislamiento fueron: poda, residuos de plaza,
contenido ruminal y cascarilla de arroz (Figura 15). Así mismo, se llevo a cabo la toma de
muestras, correspondiente para el análisis de patógenos humanos Escherichia coli y
Salmonella sp. Sin reportes de temperatura al momento del montaje, debido a que estos
se comenzaron a evaluar desde el día 3.
Figura 15. Conformación de las pilas. Fuente: Autores 2007.
6.4.1 Determinación de pH y Temperatura
Durante las 8 semanas que duró el proceso de compostaje, se determinó pH y
temperatura a las 3 replicas (Figura 16). La temperatura se determinó diariamente y el pH
semanalmente.
El proceso de compostaje, se describe comúnmente como un proceso aeróbico de
degradación de materia orgánica, donde el calor esta relacionado con el consumo de
oxígeno debido al metabolismo microbiano, dando como resultado un incremento en la
temperatura (MacGregor et al., 2001).
Figura 16. Medición de Temperatura. Fuente: Autores 2007.
Un sistema de compostaje es dinámico cuando hay una intensa actividad biológica,
debido a los cambios en el sistema y a las condiciones del medio ambiente, en especial el
incremento en la temperatura (Sundberg, 2005). De la misma manera el valor de pH varía
en el compost con el tiempo durante el proceso, en este el pH inicial de la fracción
orgánica de los residuos sólidos urbanos se encuentran en valores de 5 y 7.
Se debe tener en cuenta que durante el proceso de compostaje se presentan tres fases
de acuerdo a la temperatura y a su efecto sobre los microorganismos; la primera
mesofílica o fase de temperatura moderada; hace que la temperatura se eleve
rápidamente hasta los 40ºC; segunda, la termofílica, donde se alcanzan temperaturas de
65ºC, la cual puede durar pocos días o semanas y finalmente la fase de maduración y de
enfriamiento que tiene una duración de semanas, obteniendo valores de temperatura de
40ºC hasta alcanzar la temperatura ambiente que indica que alcanzó la fase de
maduración. Por lo anterior, fue importante llevar a cabo un monitoreo de la temperatura,
cabe anotar que los resultados obtenidos son de los promedios alcanzados por las tres
70
60
50
40
30
20
10
0
10
8
6
4
pH
Temperatura ºC
pilas, ya que estas corresponden a un solo tratamiento (Anexo 2) (Figura 17).
Temperatura (°C)
pH
2
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
Semanas
Figura 17. Resultados de pH y Temperatura vs. Tiempo durante el proceso de
compostaje de residuos orgánicos, Fuente: Autores, 2007
De la misma manera, la energía liberada al inicio del proceso se emplea para elevar la
temperatura de la masa en el proceso secando el material por evaporación
(Gómez, 1998), lo que permite el paso a la degradación de diversos compuestos ya que a
medida que aumenta la temperatura se transformaron en moléculas más sencillas para
que microorganismos presentes en bajas temperaturas sinteticen completamente hasta
obtener compost.
Teniendo en cuenta los resultados observados en la figura 4, se puede decir que las pilas
comienzan a salir de la etapa mesofílica al tercer día, ya que se registra un valor de 50.21
ºC. En cuanto al pH, se observa un valor neutro lo cual indica que va en aumento para
alcanzar la etapa termofílica. A partir de la segunda semana se evidencia igualmente un
aumento de ambas variables, observando que el punto máximo se obtiene en la semana
6 cuando alcanza la etapa termofílica, encontrando una temperatura de 65.2ºC y un pH
entre 8 y 9 debido a que se presenta un consumo de ácidos orgánicos por parte de los
microorganismos, además en esta fase forman esporas a manera de resistencia
(Trautmann et al., 1999).
Por otro lado, el pH sufre cambios durante el proceso de compostaje, debido a los
cambios en la composición química. En general el pH cae por debajo de la neutralidad en
el comienzo, durante la formación de ácidos orgánicos y mas adelante sube alrededor de
la neutralidad porque los ácidos orgánicos son consumidos y hay producción de amonio,
es por esto que durante el monitoreo se observó un aumento a medida que pasaban las
semanas, hasta que se alcanzó un pH cercano a la neutralidad. Sin embargo, mientras
ocurre este cambio de acidez a neutralidad, se presentan alrededor de la semana 4
valores cercanos a la alcalinidad, esto debido a la adición de cal (10 Kg/T de residuos)
que corrigió la acidificación (Galindo et al., 2005); esto a su vez evita presencia de
vectores así como malos olores. De la misma manera se sabe que al adicionar cal o
hidróxido de calcio se aumenta la velocidad de degradación de materiales orgánicos,
debido a la activación de enzimas termófilas, que actúan principalmente en pHs
comprendidos entre 7 y 9; este uso a su vez tiene una desventaja ya que se presentan
pérdidas de nitrógeno en forma de amoniaco, debido al pH ligeramente básico que
favorece su formación (Gómez, 1998).
Finalmente en la semana 9 los resultados arrojados denotan una caída poco notoria tanto
del pH como de la temperatura, alcanzando valores de 6,5 y 52.45ºC respectivamente. Lo
anterior puede atribuirse a que probablemente hubo un largo período de termofilia (5
semanas) debido a que quizá ocurrieron desigualdades en la homogenización de los
residuos en el momento del volteo (Galindo et al., 2005) ó se presentó un alto porcentaje
en la fuente de carbono, en este caso Residuos de Plaza (55%) (Sylvia et al., 1999).
De la misma manera cabe resaltar que el pH en el proceso de compostaje es influenciado
por el CO2, el cual se forma durante el proceso de descomposición, el cual puede
evaporarse como gas o disolverse en forma líquida como ácido carbónico (H2CO3),
bicarbonato (HCO3) y carbonato (CO3 -2). Este sistema tiene dos constantes de disociación
(pKa) 6.35 y 10.33 a 25°C, las cuales tienden a neutralizar el pH en el compost,
aumentando un pH bajo y reduciendo un pH alto (Sundberg, 2005).
El amonio es formado cuando hay una descomposición de las proteínas durante la fase
inicial del compostaje gran parte del nitrógeno es metabolizado y retenido por
microorganismos que se encuentran en etapa de crecimiento (Sundberg, 2003).
El
amoniaco tiene un pKa de 9.24 a 25°C, lo que hace que haya un incremento en los
valores de pH. Así mismo, como ya se mencionó anteriormente, otro de los factores que
afectan dichos valores son los ácidos orgánicos, donde predominan el acido acético y el
láctico, estos se han demostrado en estudios recientes que pueden disminuir el pH hasta
valores de 4.14 (Sundberg, 2005).
6.5 ANÁLISIS DE MICROORGANISMOS PATÓGENOS Escherichia.coli y Salmonella
sp.
El control sanitario del compost es de vital importancia, éste debe ser tratado de manera
adecuada debido a que será utilizado como biofertilizante o nutriente del suelo, ya sea en
agricultura orgánica o inorgánica, dando lugar a la contaminación de los productos y/o de
las fuentes de aguas, por lo que su aplicación descontrolada constituye un peligro para la
salud pública y una amenaza para el medio ambiente por la exposición a
microorganismos patógenos que esto representa (Fundases, 2006).
6.5.1 NMP de Salmonella con medio Rappaport Vassiliadis semisólido modificado
A lo largo del proceso se espera una reducción de los agentes patógenos por acción de
diferentes condiciones como pH, temperatura, humedad, sustancias antibióticas, entre
otras (Turner, 2001).
En cuanto a la técnica después del tiempo de incubación de cada juego se tomaron los
tubos con medio TSB que presentaron turbidez para llevar a cabo una siembra en
microgota (30ul), en medio Rappaport Vassiliadis semisólido modificado (Figura 18), el
cual busca aislar cepas móviles de Salmonella sp.,detectando alrededor de la zona de
inoculación un halo de crecimiento.
Después del tiempo de incubación, únicamente para las muestras iniciales, se repicaron
en medios selectivos XLT4 y Sulfito Bismuto (Figuras 19 y 20) (EPA, 1682).
Figura 18. Medio semisólido Rappaport modificado con halo
Fuente: Autores, 2007
Figura 19. Medio XLT4 con colonias
presuntivas
Fuente: Autores, 2007
Figura 20. Medio BS. Con colonias
presuntivas
Fuente: Autores, 2007
Teniendo en cuenta el fundamento del medio, para XLT4 se seleccionaron aquellas cajas
que presentaron colonias rosadas o rojas con centro negro y para Sulfito Bismuto,
colonias del color del medio con centro negro (Tabla 7), para posteriormente llevar a cabo
la realización de las respectivas bioquímicas TSI, LIA y Úrea (Anexo 8) (EPA Método
1682, 1996).
Tabla 7 a, b,c Medios XLT4 y Sulfito Bismuto (Muestras Iniciales)
Pila No 1
Promedio del No
de Colonias
Características
Medio XLT4
Medio B.S
2
2
1
1
1
1
1. Juego serie
de cinco tubos
2. Juego
serie de cinco
tubos
3. Juego
serie de cinco
tubos
Fuente: Autores, 2007
Pila No 2
Promedio del No
de Colonias
Características
Medio XLT4
Medio B.S
2
2
2
1
1
1
1. Juego
serie de cinco
tubos
2. Juego
serie de cinco
tubos
3. Juego
serie de cinco
tubos
Fuente: Autores, 2007
Pila 3
Promedio del No
de Colonias
Características
Medio XLT4
Medio B.S
1
2
1
1
1
1
1. Juego serie
de cinco tubos
2. Juego serie
de cinco tubos
3. Juego serie
de cinco tubos
Fuente: Autores, 2007
Luego de realizar las bioquímicas (Figura 21) estas tres arrojaron para algunos resultados
negativos y para otros positivos para Salmonella sp, es por esto que se debe tener en
cuenta que estas tres bioquímicas deben ser positivas (Anexo 9), informando tanto para
muestras iniciales como finales: < 0,006473 NMP/4g, resultado óptimo y adecuado al
comparar con el reportado por la NTC 5167 (< 1 NMP/4g).
Figura 21. Resultados de Bioquímicas para identificación
de Salmonella sp. (TSI, LIA y Úrea positiva)
Fuente: Autores, 2007
Considerando los resultados anteriores, es importante tener en cuenta la relación de los
microorganismos patógenos con la temperatura de exposición a la cual se presentará su
respectiva destrucción. Debido a esto importante enlazar los resultados de temperatura
obtenidos en las pilas para poder analizar la eliminación de éste patógeno. Para llevar a
cabo la destrucción de Salmonella sp. es necesario exponerla a temperaturas entre 55ºC
y 60ºC temperaturas que se evidenciaron entre las semanas 2 y 4 del proceso de
compostaje. Así mismo, en algunos estudios se ha demostrado que organismos fecales
son destruidos en el propio proceso, si las temperaturas en el rango termofílico se
mantienen por un tiempo suficiente y todo el material es sujeto a dichas temperaturas. Las
bacterias patógenas se destruyen rápidamente cuando todas las partes de la pila de
compost están sujetas a temperaturas de 60°C durante 30 a 60 minutos (Islam et al.,
2004). Cabe resaltar que este microoranismo a diferencia de Escherichia coli es
termosensible, es por esto que probablemente se obtuvo una total eliminación del
patógeno (Turner, 2001).
La norma ICONTEC 5167, 2004, especifica la ausencia de Salmonella sp., y de acuerdo a
los resultados se indica que los materiales con los que se elaboraron las pilas en ningún
momento presentaron este indicador, por lo que el producto cumple con la norma
colombiana en materia de patógenos humanos (Anexo 9).
6.5.2 NMP Escherichia coli
Posterior a la incubación a 37°C por 24 horas, se tomaron como positivos (Tabla 8 y 9)
aquellos tubos que presentaron turbidez, fluorescencia con Luz UV a 365 nm y prueba de
indol positiva al adicionar reactivo de Kovac’s (Figuras 22 y 23).
Figura 22. Turbidez e indol positivo
Figura 23. Fluorescencia Positivo
Tabla 8. Promedios Resultados Materias Primas
MATERIA
PRIMA
Rumen
Poda
RESULTADO
NMP/ 4 g
>2400
1100
Cascarilla
1100
Residuos de
plaza
4
Fuente: Autores, 2007.
Tabla 9. Promedios Muestras Finales
RESULTADO
Réplica
NMP/ 4 g
Pila 1
4
Pila 2
180
Pila 3
8
Fuente: Autores, 2007.
Los resultados finales evidencian en la pila 2 que hubo una diferencia en el muestreo, ya
que se observa un valor alto a diferencia de las otras dos pilas. De la misma manera los
resultados arrojados muestran una disminución al relacionar las muestras iniciales con
respecto a las finales, aunque es importante resaltar que en estudios se ha demostrado
que el tratamiento térmico provoca la reducción de los indicadores fecales a niveles
comparables a muchos patógenos, particularmente bacterias patógenas, pero la
concentración inicial de los indicadores es normalmente mayor en factores de 10 que la
de los patógenos, por lo que aunque su número disminuya siempre sobrevivirá una
cantidad apreciable de estos microorganismos (EPA, 1992). Esto se debe a diferentes
factores como el origen de los materiales de elaboración de las pilas, el comportamiento,
el tiempo de duración de las fases, el pH, la humedad, la temperatura y la frecuencia de
los volteos, entre otros. De igual forma, se puede considerar que la adición inicial de cal
en grandes proporciones durante la conformación de las pilas, generó alcalinidad en el
medio facilitando el crecimiento microbiano y estimulando su actividad enzimática (Turner,
2001).
Así pues, se ha demostrado que en algunos casos se puede inducir la proliferación de
agentes patógenos, los cuales pueden emerger y causar infecciones por el manejo del
material orgánico de uso agrícola. De igual forma, se ha encontrado resistencia y
supervivencia de Escherichia coli a temperaturas termofílicas de 60ºC de 2 a 21 meses,
debido a que este microorganismo se mantiene en fase de latencia y al final se expresa
nuevamente ( Lemunier et al., 2005).
En la degradación llevada a cabo en termofilia 60-70ºC se estimula el crecimiento de
hongos y bacterias, los cuales sintetizan compuestos complejos, en este transcurso de
degradación se generan mezclas de antibióticos y sustancias tóxicas (Ciemat, 2000). De
esta manera, la acidificación del pH durante el proceso de compostaje depende de la
producción de sustancias antibióticas, ácidos o fitotoxinas, que pueden llegar a destruir
una gran parte de la población patógena.
6.6 ANALISIS FISICOQUÍMICOS
A partir de estos resultados se determinó la calidad del bioabono obtenido. Los
resultados fueron determinados por el laboratorio de referencia AGRILAB expresados en
base seca (Tabla 10).
ANÁLISIS DE MATERIALES ORGÁNICOS
-Composición nutricional
IDENTIFICACIÓN
ANÁLISIS
Humedad DE MATERIALES ORGÁNICOS –
CARACTERIZACIÓN
Nitrógeno (Norg)
IDENTIFICACIÓN
Fósroro total
Humedad
(%)
Potasio total
Cenizas
(%)
Calcio total
Perdidas por volatilización (%)
Magnesio total
Carbono Orgánico Oxidable (%)
Azufre total
Ph
Hierro total
Densidad (g/c.c)
Manganeso total
Conductividad Eléctrica (Ds/m)
Cobre total
Capacidad Retención Humedad (%)
Zinc total
Capacidad Intercambio Catiónico
Boro
total (Norg) (%)
Nitrógeno
Sodio
C/N total
Residuo insoluble en ácido
(Promedio de tres replicas de pilas de compostaje)
(Promedio
de tres
de pilas de
RESULTADOS
ENreplicas
BASE SECA
compostaje)
RESULTADOS EN BASE SECA
Fuente: AGRILAB, 2007
INICIAL
66,9
1,86
INICIAL
1,126
66,9
2,1
38,9
3,37
61,1
1,01
25,36
0,3
8,13
0,77
0,45
43,13
7,16
30
231
127
55,9
30,33
1,86
4350
13,6
29,26
FINAL
42,03
1,62
FINAL
1,03
42,06
2,01
56,86
3,31
43,13
1,04
13,2
0,28
7,57
0,84
0,67
431
11,9
28,6
103
118,3
49,1
31
1,62
4516,6
8
48,76
La humedad es uno de los factores más importantes en el proceso de compostaje. Si su
contenido es muy bajo, se detiene la actividad microbiológica del proceso; y si es muy alto
se dan condiciones anóxicas porque el agua desplaza al aire de los espacios libres
existentes (Soto, 2003). Para que un proceso de compostaje sea exitoso es necesario que
la humedad de la materia orgánica inicial se encuentre entre el 40 y 60%(Sylvia et
al.,1999) , sin embargo este parámetro comparado con la humedad inicial de las replicas
de pilas de compostaje se acerca poco a la norma, observándose que durante el
transcurso del proceso este disminuyó considerablemente.
El porcentaje de humedad al finalizar el proceso fué alto (42,3%) de acuerdo al límite
establecido en la NTC 5167, 2004 reportando que el límite máximo de humedad es 35%
este hecho evidencia la necesidad de alargar el tiempo de la etapa de maduración. Según
otros reportes para que un compost sea comercialmente aceptable debe tener una
humedad < 40%. (Paúl et al., 1996). Esto hace pensar que la humedad se pudo ver
influenciada por las materias primas empleadas, sabiendo que los residuos de plaza y el
contenido ruminal son los que presentan cantidades altas de humedad.
Por otra parte la densidad (g/c.c) se encuentra asociado a la porosidad, el cual se define
como el espacio del material orgánico que no es ocupado por la matriz sólida, que
permitirá el flujo de aire y de agua. Según los resultados obtenidos (0.67%), este valor se
acerca considerablemente a la norma ICONTEC (0.6%). Las altas porosidades (mas del
50 %) se consideran favorables para el adecuado desarrollo de las especies vegetales
(Gómez, 1998).
El carbono orgánico oxidable determina el contenido de materia orgánica, y la materia
orgánica da ciertas propiedades al suelo, este valor debe aumentar mínimo al 15% para
cumplir con lo establecido en la norma ICONTEC 5167 del 2004. El valor obtenido en este
estudio cumple con lo que se establece en la norma puesto que se obtuvo un valor final
de 13,2%.
La
capacidad de intercambio catiónico (C.I.C) es la capacidad que tiene la materia
orgánica de extraer cationes del suelo como K+, Ca++, Mg++ aportándole nutrientes a la
planta. Para abonos orgánicos esta debe ser mínimo de 30% .Se encontró un valor final
de 49,1% obteniendo un resultado óptimo para lo que establece la norma ICONTEC 5167
del 2004. Este valor obtenido indica una alta capacidad de atraer cationes de la solución
de suelo, evitando su lixiviación o pérdida y manteniéndolos para que la planta pueda
tomarlos (Galindo et al., 2005)
Por otra parte están los parámetros que están directamente influenciados por elementos
como el carbono y el nitrógeno. La relación C/N, obtuvo un resultado final de 8 .Este
resultado, comparado con otros estudios realizados en un compost producido a partir de
residuos urbanos sólidos en la cuidad de Sogamoso de 4,26 es bajo , determinando que
el origen de las materias primas usadas está directamente relacionado con la fuente de
nitrógeno que es este caso es elevada, permitiendole a las bacterias que lo agoten
rapidamente dejando el nitrógeno no utilizado en forma de amonio.
De igual forma, se expresó el porcentaje de nitrógeno total, dentro del cual se encuentra
el nitrógeno mineral y orgánico. El orgánico es el elemento que forma parte considerable
del suelo ya que supera el 98%. Por esta razón un abono de buena calidad debe estar
reportado entre el 2% y 3% (Gómez, 2000). Es por esto que según los resultados
obtenidos (1.63%) se observa un valor relativamente bajo lo cual puede deberse como un
consumo excesivo de la fuente de nitrógeno para la síntesis de compuestos de carbono.
También se tuvo en cuenta el análisis inicial y final de dos metales pesados cobre y zinc,
la evaluación de estos metales pesados en el compost es importante puesto que estos
pueden aumentar su concentración en las cosechas y ser tóxicos para los seres
humanos. Estos dos metales no están contemplados en NTC 5167, 2004. Sin embargo
según Labrador, 2001 el límite permisible de estos metales son para cobre 450 ppm y zinc
1.100 ppm. Se observó que en los resultados obtenidos por el laboratorio de referencia se
obtuvieron valores que están en los rangos permisibles para estos metales en el
tratamiento evaluado.
En cuanto al contenido de macro y micronutrientes estos deberían aumentar al finalizar el
proceso. Se espera que estos lleguen a valores superiores del 1% según lo establecido
en la norma ICONTEC 5167, muchos de estos nutrientes cumplieron este parámetro.
El compost obtenido se clasifica según la NTC 5167, 2004 en abono orgánico que es un
producto solido obtenido a partir de la estabilización de residuos animales o vegetales.
7.- CONCLUSIONES
•
Se aislaron 3 cepas L1, L2 y L3, de las cuales L1 presentó antagonismo.
•
A partir de la cepa L3 con actividad enzimática lipolítica se logró estandarizar una
técnica cuantitativa para detectar lipasas utilizando como sustrato principal el pnitrofenil palmitato utilizando concentraciones de sustrato desde 0.08% y un
volumen de extracto crudo desde 500ul.
•
La cepa lipolítica L3 presentó una actividad máxima entre 29 y 30 UL definiendo
una UL como la cantidad necesaria para liberar una una umol/min/L.
•
El compost obtenido resultó con N orgánico1.59%, P 1.32%, K 2.53% y respecto a
Escherichia coli
y Salmonella sp presentaron una disminución en la cantidad
probablemente porque las replicas alcanzaron una temperatura máxima de
65.2 en la semana 6.
de
8.- RECOMENDACIONES
•
Producir un inoculante biológico con las 14 cepas que se han manejado en la
empresa Bioagrícola del Llano adicionando las dos cepas lipolíticas aisladas, con
el fin de evaluar su actividad llevando a cabo un nuevo montaje de pilas.
•
Realizar curvas de actividad enzimática manejando volúmenes de extracto crudo
entre 20 ul y 500 ul y tiempo de contacto entre 10 y 30 minutos.
•
Caracterizar bioquímicamente las cepas aisladas y evaluar otras características
como promoción de crecimiento vegetal y actividad enzimática.
•
Realizar estudios alternos para el aislamiento de microorganismos pectinolíticos
para potencializar la efectividad del inóculo.
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Anexo 1
Medio Leche- Almidón al 1%
Componentes
g/l
Leche en polvo descremada
10
Almidón
10
Extracto de Levadura
2.5
Peptona Universal
2.5
Sulfato de Amonio
0.5
Cloruro de calcio
0.5
Fosfato monobásico de potasio
0.1
Fosfato dibásico de potasio
0.1
Agar
15
Medio Líquido TSB
Componentes en
g/l
Peptona pancreática de caseína
17g
Peptona de harina de soya
3.0
Cloruro de sodio
5
Fosfato dipotásico
2.5
Dextrosa
2.5
Medio Rappaport Vassiliadis Modificado
Componentes en
g/l
Triptosa
4.59
Cloruro de sodio
7.34
Fosfato monopotásico
1.4
Cloruro de Magnesio
10.93
Verde Malaquita
0.037
Agar
2.7
Medio Lecitina
Componentes
g/100ml
Fosfato de amonio dibásico
0,10
Cloruro de potasio
0.02
Sulfato de Magnesio* 7 H2O
0.02
Extracto de levadura
0.3
Agar
2
Adición de Yema de huevo: 1 yema en 100 ml de NaCl al 0.85% (p/v).
Anexo 2
Temperatura y pH de las 3 réplicas
REPLICA 1
DIAS
T °C
3
47.3
1
4
48.5
2
N.R
5
50.1
3
55.6
6
51.3
4
50.3
7
51.8
5
52.8
8
52.4
6
54.5
57.3
N.R
9
53.6
7
10
N.R
8
N.R
11
N.R
9
61.7
12
54.6
10
64.2
13
55.4
11
63.1
14
56.2
12
60.7
15
57.5
13
58.5
16
58.4
14
58.6
17
N.R
15
N.R
18
N.R
16
60.2
19
60.9
17
59.3
20
59.2
18
60.5
21
54.8
19
61.2
22
50.9
20
N.R
23
52.3
21
60.7
24
N.R
22
N.R
25
52.8
23
N.R
26
53.1
24
58.9
27
53.4
25
58.0
28
53.9
26
57.1
29
54.7
27
N.R
30
54.9
28
54.3
29
N.R
30
N.R
31
51.2
1
50.7
FUENTE: BIOAGRICOLA,
2007
REPLICA 2
DIAS
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
27
28
29
30
T°C
46.4
47.1
47.9
48.3
49.2
50.6
51.2
N.R
N.R
53.8
54.5
55.9
56.7
58.7
N.R
N.R
60.2
59.3
55.1
50.4
52.6
N.R
52.8
53.5
53.7
54.6
55.8
56.1
31
N.R
N.R
57.9
56.6
57.3
58.1
58.5
N.R
59.5
60.2
58.7
58.4
58.2
N.R
N.R
58.7
60.3
60.3
60.7
60.5
60.2
N.R
N.R
60.1
58.2
56.1
N.R
N.R
N.R
N.R
52.1
1
50.3
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
27
28
29
30
FUENTE:BIOAGRICOLA,
2007
REPLICA 3
DIAS
T°C
3
49.2
49.7
50.3
50.8
51.7
52.4
N.R
N.R
54.8
55.9
60.8
61.9
63.2
N.R
N.R
67.8
67.3
64.1
62.4
67.2
N.R
65.2
65.8
64.2
63.4
63.0
62.3
N.R
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
27
28
29
30
31
N.R
59.7
48.0
51.4
54.7
56.3
N.R
58.1
58.1
58.4
58.6
58.8
N.R
N.R
60.3
61.5
62.4
62.0
60.1
60.1
N.R
N.R
59.3
57.8
57.1
56.0
55.6
N.R
50.9
50.8
50.6
1
50
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
27
28
29
30
FUENTE: BIOAGRICOLA,
2007
Semana
Junio 3
Junio 27
Julio 4
Julio 11
Julio 18
Julio 25
Agosto 9
Pila 1
7.3
8.06
8.17
8.16
8.4
8.32
6.8
Valores de pH
Pila 2
7.2
8.07
8.35
8.41
8.4
8.1
7.04
Pila 3
7.5
8.0
8.0
8.25
8.17
7.75
6.96
Anexo 3
Preparación de Buffer Fosfato Concentración 1 M
1. Preparar 57.7 ml de Na2HPO4 concentración 1M
2. Preparar 42.3 ml de NaH2PO4 concentración 1M
3. Mezclar lentamente las dos soluciones
4. Ajustar pH a +- 7
Anexo 4
Curva Patrón p-nitrofenol
Fueron elaboradas dos réplicas de la misma solución stock de p-nitrofenil, con el fin de
obtener datos significativos
Concentración (u mol/ ml)
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
0.7
0.8
0.9
Promedio de Absorbancias
0.175
0.267
0.346
0.486
0.577
0.717
0.829
0.918
Ecuación: Y: mx+b
X: y-b/m
m: 1.09
b:-0.06
r:0.99
Curva de calibración p-nitrofenol. Fuente: Autores, 2007
Anexo 5
TABLAS DE DATOS DE LAS PRUEBAS REALIZADAS
Promedio de absorbancias de actividad enzimática en curva de 12 horas de la cepa
3 con P-nitrofenil a concentraciones de sustrato 0.08%, 0.5% y 1%, en medio
lecitina .Con 500 ul de extracto crudo con tiempo de contacto 30 minutos y
Unidades Lipoliticas (umol/min/l)
Hora
Absorbancia
0.08%
UL
(umol/m
in/l)
Absorbancia
0.5%
UL
(umol/mi
n/l)
Absorbancia
1%
UL
(umol/mi
n/l)
0
½
1
1½
2
4
6
8
10
12
0.037
0.138
0.180
0.196
0.251
0.272
0.342
0.305
0.292
0.281
2.9
6
7.3
7.8
9.53
10.16
12.3
11.16
10.66
10.43
0.044
0.128
0.222
0.313
0.354
0.364
0.388
0.378
0.364
0.351
3.2
5.8
8.6
11.33
12.66
12.96
13.7
13.4
12.96
12.56
0.052
0.082
0.122
0.151
0.261
0.276
0.373
0.473
0.452
0.425
3.4
4.4
5.6
6.5
9.83
10.2
13.23
16.26
15.58
14.8
Promedio de absorbancias de actividad enzimática en curva de 12 horas de la cepa
3 con P- nitrofenil a concentraciones de sustrato 0.08%, 0.5% y 1%, en medio
lecitina
con 700 ul de extracto crudo con tiempo de contacto 30 minutos
Hora
Absorbancia
0.08%
0
½
1
1½
2
4
6
8
10
12
0.112
0.167
0.246
0.255
0.275
0.304
0.320
0.313
0.282
0.271
UL
(umol/
min/l)
5.3
5.3
9.6
9.6
10.26
11.2
11.63
11.4
10.46
10.13
Absorbancia
0.5%
0.261
0.304
0.305
0.321
0.352
0.364
0.355
0.343
0.343
0.333
UL
(umol/m
in/l)
9.8
10
11.16
11.93
12.6
12.96
12.7
12.33
12.33
12
Absorbancia
1%
0.124
0.138
0.146
0.159
0.191
0.275
0.375
0.361
0.324
0.305
UL
(umol/mi
n/l)
5.6
6
6.2
6.73
7.7
10.26
13.3
12.86
11.73
11.16
Promedio de absorbancias de actividad enzimática en curva de 18 horas de la cepa
3 con P- nitrofenil a concentraciones de sustrato 1%, 1.5% y 2%, en medio lecitina
con 500 ul de extracto crudo con tiempo de contacto 30 minutos
Hora
Absorbancia
1%
0
½
1
1½
2
4
6
8
10
12
14
16
18
0.213
0.409
0.490
0.498
0.515
0.558
0.701
0.725
0.700
0.658
0.639
0.498
0.215
UL
(umol/m
in/l)
8,3
14.33
16.83
17.06
17.6
18.9
23.26
24
23.23
21.96
21.36
17.06
8.4
Absorbancia
1.5%
0.493
0.539
0.685
0.702
0.724
0.757
1.151
0.945
0.902
0.896
0.723
0.501
0.325
UL
(umol/m
in/l)
16.9
18.33
22.76
23.3
23.96
26.83
30.5
30.73
29.43
25.26
22
17.16
11.76
Absorbancia
2%
0.524
0.560
0.639
0.679
0.698
0.712
0.951
0.930
0.885
0.802
0.793
0.413
0.301
UL
(umol/mi
n/l)
17.86
18.96
21.36
22.6
23.16
23.6
30.93
29.43
28.9
26.36
26.1
14.46
11.3
Promedio de absorbancias de actividad enzimática en curva de 18 horas de la cepa
3 con P- nitrofenil a concentraciones de sustrato 1%, 1.5% y 2%, en medio lecitina
con 700 ul de extracto crudo con tiempo de contacto 30 minutos
Hora
Absorbancia
1%
0
½
1
1½
2
4
6
8
10
12
14
16
18
0.513
0.654
0.702
0.785
0.801
0.823
0.898
0.900
0.855
0.705
0.527
0.462
0.102
UL
(umol/
min/l)
17.53
21.83
23.3
25.83
26.33
27
29.3
29.36
27.96
23.4
17.96
14.13
14.4
Absorbanci
a 1.5%
0.637
0.750
0.778
0.785
0.793
0.824
1.155
0.906
0.899
0.878
0.756
0.585
0.398
UL
(umol/min/
l)
21.3
23.16
25.63
26.13
26.93
28.26
29.33
29.53
29.33
28.7
23.13
19.73
11.76
Absorbancia
2%
0.542
0.650
0.679
0.702
0.750
0.785
0.998
0.899
0.795
0.755
0.746
0.520
0.415
UL
(umol/mi
n/l)
18.4
21.7
22.6
23.3
24.76
25.83
32.36
29.33
27.43
2.93
24.63
17.73
14.53
Promedio de absorbancias de actividad enzimática en curva de 18 horas de la cepa
3 con P- nitrofenil a concentraciones de sustrato 1%, 1.5% y 2%, en medio lecitina
con 500 ul de extracto crudo con tiempo de contacto 60 minutos
Hora
Absorban
cia 1%
0
½
1
1½
2
4
6
8
10
12
14
16
18
0.541
0.560
0.585
0.602
0.689
0.791
0.802
0.850
0.799
0.658
0.499
0.205
0.125
UL
(umol/min/
l)
9.18
9.48
9.86
10.11
11.45
13.01
13.18
13.91
13.13
10.98
8.55
4.05
2.83
Absorbancia
1.5%
0.610
0.650
0.692
0.701
0.710
0.761
0.787
0.859
0.865
0.899
0.823
0.639
0.539
UL
(umol/mi
n/l)
10.23
10.35
11.51
12.5
12.93
14.63
16.16
17.18
17.31
16.1
11.93
10.68
8.86
Absorbancia
2%
UL
(umol/mi
n/l)
10.78
11.2
10.11
11.61
11.75
12.38
16.23
16.2
14.11
13.06
11.96
10.28
7.61
0.646
0.673
0.676
0.700
0.708
0.750
1.002
0.999
0.863
0.795
0.723
0.612
0.438
Promedio de absorbancias de actividad enzimática en curva de 18 horas de la cepa
3 con P- nitrofenil a concentraciones de sustrato 1%, 1.5% y 2%, en medio lecitina
con 700 ul de extracto crudo con tiempo de contacto 60 minutos
Hora
0
½
1
1½
2
4
6
8
10
12
14
16
18
UL
(umol/mi
n/l)
10.08
10.85
11.45
11.6
12.43
13.18
14.05
14.66
13.15
11.65
7.26
5.51
3.98
Absorbancia
1%
0.600
0.650
0.689
0.699
0.753
0.802
0.859
0.899
0.900
0.702
0.415
0.301
0.201
UL
(umol/mi
n/l)
11.15
12.68
12.95
13.21
13.4
15.7
18.33
17.83
16.33
14.33
11.55
9.85
5.88
Absorbancia
1.5%
0.670
0.770
0.787
0.805
0.817
0.867
0.878
0.889
0.893
0.895
0.855
0.620
0.598
UL
(umol/
min/l)
10.78
12.01
10.93
11.85
13.18
13.58
17.78
16.38
14.7
14.63
13.38
10.38
8.41
Absorbancia
2%
0.605
0.726
0.655
0.782
0.802
0.827
1.103
1.012
0.901
0.897
0.815
0.619
0.490
Anexo 6
Recuentos de las cepas aisladas
CEPA L3 B
HORA
0
30
1
1 y 30
2
4
6
8
10
12
14
16
18
RECUENTO
UFC/ml
8,0E+05
3,00E+06
1,50E+07
2,00E+07
9,00E+08
1,20E+10
4,00E+10
1,80E+10
3,00E+10
2,10E+09
2,30E+08
8,00E+07
5,00E+05
CEPA L2
HORA
0
30
1
1 y 30
2
4
6
8
10
12
14
16
18
RECUENTO
UFC/ml
3,0E+07
8,00E+07
5,00E+08
1,30E+09
2,80E+09
1,50E+10
2,30E+10
1,80E+12
1,50E+10
3,00E+09
1,00E+08
5,00E+06
2,00E+06
Anexo 7
Resultados pruebas de antagonismo en mm
Fuente: Autores, 2007
Cepa No
L1(R1)
L1 (R2)
L1(R3)
L2(R1)
L2(R2)
L2(R3)
L3(R1)
L3(R2)
L3(R3)
2P
0
0
0
0
0
0
0
0
0
3P
1,0
0
1,6
0
0
0
0
0
0
4A
0
0
1,5
0
0
0
0
0
0
5AP
1,3
1,5
1,0
0
0
0
0
0
0
6P
0
0
0
0
0
0
0
0
0
7ª
0
0
0
0
0
0
0
0
0
8AP
1,5
1,3
1,0
0
0
0
0
0
0
9AP
0
0
0
0
0
0
0
0
0
10AP
0
0
0
0
0
0
0
0
0
11P
0
0
0
0
0
0
0
0
0
12AP
0
0
0
0
0
0
0
0
0
Anexo 8
Pruebas Bioquímicas de las Colonias Positivas
Pila 1
Colonias presutivas
Sulfito Bismuto y XLT4
Bioquímica
1
Urea:Negativo
TSI: Posititivo
LIA: Positivo
Replica
Negativo
Positivo
Positivo
13P
0
0
0
0
0
0
0
0
0
14P
1,4
1,2
1,5
0
0
0
0
0
0
2
3
4
5
Pila 2
1
2
3
4
Pila 3
1
2
3
4
5
6
Fuente: Autores, 2007
Urea:Negativo
TSI: Posititivo
LIA: Positivo
Urea: Negativo
TSI: Negativo
LIA: Negativo
Urea: Negativo
TSI: Negativo
LIA: Positivo
Urea:Negativo
TSI:Positivo
LIA:Negativo
Urea:Negativo
TSI: Posititivo
LIA:Positivo
Urea: Negativo
TSI:Negativo
LIA:Negativo
Urea:Negativo
TSI:Negativo
LIA:Negativo
Urea:Negativo
TSI:Negativo
LIA:Positivo
Urea:Negativo
TSI: Posititivo
LIA: Positivo
Urea:Negativo
TSI: Posititivo
LIA: Positivo
Urea:Negativo
TSI: Posititivo
LIA: Positivo
Urea:Negativo
TSI: Posititivo
LIA: Positivo
Urea:Negativo
TSI: Posititivo
LIA:Negativo
Urea: Negativo
TSI: Posititivo
LIA:Positivo
Negativo
Positivo
Positivo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Positivo
Negativo
Positivo
Negativo
Negativo
Positivo
Positivo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Positivo
Negativo
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