FUNDAÇÃO UNIVERSIDADE FEDERAL DE RONDÔNIA

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FUNDAÇÃO UNIVERSIDADE FEDERAL DE RONDÔNIA- UNIR
NÚCLEO DE SAÚDE
CURSO DE PÓS-GRADUAÇÃO EM BIOLOGIA EXPERIMENTAL
Rosely Valéria Rodrigues
“ESTUDO FITOQUÍMICO DOS FRUTOS DE Piper tuberculatum (JACQ.) E
AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE ANTINOCICEPTIVA DOS EXTRATOS E
CONSTITUINTES ISOLADOS”.
Tese de Doutorado
PORTO VELHO
2009
ROSELY VALÉRIA RODRIGUES
Tese apresentada ao Curso de Pós-Graduação
em Biologia Experimental do Núcleo de Saúde
da Universidade Federal de Rondônia, como
requisito parcial para a obtenção do título de
Doutor em Biologia Experimental : sub área
Fitoquímica e Farmacologia de Produtos
Naturais.
Orientador : Prof. Dr. Valdir Alves Facundo.
Co-orientador : Prof. Dr. Adair R. S. Santos
PORTO VELHO
2009
ROSELY VALÉRIA RODRIGUES
Tese apresentada ao Curso de PósGraduação em Biologia Experimental do
Núcleo de Saúde da Universidade
Federal de Rondônia, como requisito
parcial para a obtenção do título de
Doutor em Biologia Experimental sub área
Fitoquímica e Farmacologia de Produtos
Naturais.
Data da Aprovação _____/______/_______
______________________________________________________
Prof. Dra. Vera Engrácia Gama de Oliveira (Coordenadora do Curso)
Universidade Federal de Rondônia -UNIR
_____________________________________________________
Prof. Dr. Valdir Alves Facundo (Orientador)
Universidade Federal de Rondônia - UNIR
_____________________________________________________
Prof. Dr. Adair Roberto Soares dos Santos (Co-Orientador)
Universidade Federal de Santa Catarina -UFSC
_____________________________________________________
Prof. Dr. Anselmo Enriques Ferrer Hernández
Faculdade São Lucas - RO
______________________________________________________
Prof. Dr. Júlio Sancho Linhares Teixeira Militão
_____________________________________________________
Prof. Dra. Juliana Zulini
PORTO VELHO
2009
FICHA CATALOGRÁFICA
Rodrigues, Rosely Valéria
Estudo fitoquímico dos frutos de Piper tuberculatum (Jacq) e
avaliação da atividade antinociceptiva dos extratos e constituintes isolados /
Rosely Valéria Rodrigues – Porto Velho, 2009.
Tese (doutorado) – Núcleo de Saúde da Universidade Federal de
Rondônia.
Área de Concentração : Biologia Experimental.
Sub área: Fitoquímica e Farmacologia de Produtos Naturais.
Orientador: Valdir Alves Facundo
Co-orientador: Adair R.S.Santos
Descritores: 1. Piper tuberculatum
2. ÁCIDO 3,4,5-TRIMETÓXIDIHIDROCINÂMICO 3.NOCICEPÇÃO
4.INFLAMAÇÃO
UNIR - 2009
DEDICATÓRIA
À grande amiga Mabel Torres Ferrer
que esteve presente em todos os
momentos desse trabalho e sempre
me incentivou.
Aos amores maiores da minha vida:
Gustavo e Luciana a quem deixo os
frutos do estudo.
AGRADECIMENTOS
Á Deus, que em sua sabedoria maior, nos impele ao conhecimento, com
paciência e aprendizado.
Ao prof. Dr. Valdir Alves Facundo, como orientador e amigo, que tornou
este trabalho possível e só aumentou minha admiração.
Ao prof. Dr. Adair Santos por gentilmente ceder seus laboratórios para
os ensaios farmacológicos e com quem aprendi muito.
Á prof. Dra. Vera Engrácia Oliveira por estar a frente deste doutorado,
incentivando e acreditando, contribuindo com o desenvolvimento da
Ciência no estado de Rondônia.
Á técnica Sueli Kikuchi pelas idas e vindas na UNIR.
Ao aluno , hoje profissional, Leandro Flores, presente nas inúmeras
coletas e trabalhos de bancada.
Aos alunos de Florianópolis, Débora Lanznaster pelo auxílio durante as
práticas de Farmacologia; Allison e Rodrigo pela acolhida calorosa.
Á minha irmã Fabiana Carreto que me substitui em tantas tarefas
quando me ausentei.
Aos professores e colegas da UNIR : Ana Escobar, Lúcia Rejane, Eulália
de Aquino, Rodrigo Stábile, Eliomar Silva e Berenice Tourinho, pelos
incentivos recebidos.
Á todos os colegas de doutorado: Patrícia Medeiros, Mauro Tada,
Fernando Zandi, Elieth Mesquita, Joana D’Arc, Rosimeire Dalla Marta ,
Almeida Casseb e Adriana Nunes pela convivência,coleguismo e apoio
mútuo.
Á minha mãe, Francisca Carreto pelo incentivo incondicional e meu pai
Eduil Rodrigues pelo gosto em estudar.
Á
um
grande
homem
Emerson
Garcia
de
Mendonça
pelo
companheirismo nesses anos todos.
Aos componentes da banca pelas contribuições valiosas
Á todos os professores do Curso, que nos transmitiram seus
conhecimentos possibilitando essa jornada.
Á Universidade Federal de Rondônia por propiciar o doutorado.
“Eu não tenho filosofia: tenho sentidos...
Se falo na Natureza não é porque saiba o que ela é.
Mas porque a amo, e amo-a por isso,
Porque quem ama nunca sabe o que ama
Nem por que ama, nem o que é amar...”
Alberto Caeiro
RESUMO
O presente estudo isolou e identificou os constituintes químicos
presentes nos frutos da espécie Piper tuberculatum Jacq. A preparação dos
extratos foi feita pela maceração dos frutos em diferentes solventes e o
isolamento químico dos constituintes (Piplartina, Dihidropiplartina e Ácido
3,4,5-trimetóxi-dihidrocinâmico) foi realizado através de métodos
cromatográficos. A identificação estrutural foi realizada mediante
espectroscopia (RMN-1H, RMN-13C e Massa). O composto Ácido 3,4,5trimetóxi-dihidrocinâmico foi isolado e identificado pela primeira vez nesta
planta. Nos ensaios antinociceptivos os extratos: etanólico, hexânico,
diclorometano, acetato de etila e metanólico bem como os compostos
isolados Piplartina, Dihidropiplartina e Ácido 3,4,5-trimetóxi-dihidrocinâmico
foram capazes de reduzir de forma significativa e dependente da dose a
nocicepção visceral induzida pelo ácido acético em camundongos. Além
disso, o Ácido 3,4,5-trimetóxi-dihidrocinâmico foi 7.709,7 vezes mais potente
que a Aspirina em inibir as contorções abdominais. Quando administrado por
via intraperitoneal, o Ácido 3,4,5-trimetóxi-dihidrocinâmico reduziu a
nocicepção induzida pela capsaicina e glutamato e foi capaz de reduzir de
forma dependente da dose a nocicepção de origem neurogênica, mas não a
de origem inflamatória induzida pela formalina. O Ácido 3,4,5-trimetóxidihidrocinâmico não reverteu o efeito hipernociceptivo induzido pela
carragenina e pela prostaglandina E2 porém foi capaz de reverter a
hipernocicepção, tanto térmica quanto mecânica, induzida pela injeção de
BK e PMA. O efeito antinociceptivo do Ácido 3,4,5-trimetóxi-dihidrocinâmico
não foi influenciado pelo pré-tratamento com naloxona e não está
relacionado a efeitos inespecíficos como relaxamento muscular ou sedação,
Além disso, o Ácido 3,4,5-trimetóxi-dihidrocinâmico não foi capaz de inibir a
nocicepção espontânea induzida pela administração de bradicinina na pata
de ratos, mas inibiu a nocicepção induzida pela administração intratecal de
bradicinina em camundongos. Por outra parte, o extrato etanólico (v.o.) e o
Ácido 3,4,5-trimetóxi-dihidrocinâmico (i.p.) foram capazes de inibir a
nocicepção induzida pela injeção intraplantar do veneno de Bothrops
jararaca, embasando seu uso etnofarmacológico. O mecanismo de ação
antinociceptiva do Ácido 3,4,5-trimetóxi-dihidrocinâmico não está
completamente elucidado. Contudo, os dados permitem sugerir que o
mesmo pode interagir com receptores TRPV (sensíveis á capsaicina) e a
resposta mediada pela bradicinina, possivelmente por inibir a ativação da
proteína quinase C sensível ao PMA. Desta forma, o presente trabalho
demonstrou pela primeira vez, que a espécie Piper tuberculatum e seus
compostos isolados apresentaram importante ação antinociceptiva e
antiinflamatória. Assim os resultados obtidos no presente estudo confirmam
em parte a utilização popular dessa planta justificando sua utilização
etnofarmacológica.
Palavras-chave: Piper tuberculatum Jacq., Ácido 3,4,5-trimetóxidihidrocinâmico, nocicepção, inflamação e proteína quinase C.
SUMMARY
The present study has isolated and identified the chemical components
present in the fruits of the species Piper tuberculatum Jacq. The preparation
of the extracts was done by the maceration of the fruits in different solvents
and the chemical isolation of the components (Piplartine, Dihidropiplartina
and Trimethoxy-Dihydrocinnamic 3, 4, 5 acid) were realized by the
cromatographic methods. The structural identification was realized by means
of spectroscopy (RMN-¹H, RMN-¹³C and Mass). The trimethoxydihydrocinnamic 3, 4, 5 acid composition was isolated and identified for the
first time in this plant. At the antinociceptive field trials, the extracts: ethanolic,
hexane, dichloromethane, ethyl acetate and methanolic as well as the
isolated components Piplartine, Dihidropiplartina and trimethoxydihdyrocinnamic 3, 4, 5 acid were capable to reduce significantly and
dependenting on the dose with nonciception viseral induced by acetic acid in
mice. Moreover, the trimethoxydihydrocinnamic 3, 4, 5 acid was 7.709,7
times more powerful than the Aspirin in inhibiting the abdominal writhings.
When administered by via intraperitoneal, the trimethoxydihydrocinnamic 3,
4, 5 acid reduced the nonciception induced by capsiacin and glutamate and
was capable of reducing the dosage dependent with nonciception of
neurogenic origin, but not with the inflamatoria origin induced by formalin.
The trimethoxydihydrocinnamic 3, 4, 5 acid didn´t reverse the
hipernociceptivo effect induced by the carrageenan and the prostalglandina
E2 but it was capable of reversing the hypernociception, both thermal and
mecanica, induced by BK and PMA injection. The antinociceptive effect of
the trimethoxydihydrocinnamic 3, 4, 5 acid was not influenced by pretreatment with naloxone and is not related to nonspecific effects as muscle
relaxation or sedation. Moreover, the trimethoxydihydrocinnamic 3, 4, 5 acid
was not capable of inhibiting the spontaneous nonciception induced by the
administration of bradykinin in the paw of the rat, but inhibited the
nonciception induced by the intrathecal administration of bradykinin in mice.
On the other side, the ethanolic extract (v.o.) and the trimethoxydihydrocinnamic 3, 4, 5 acid (i.p.) were capable of inhibiting the nonciception
induced by the intraplantar injection of the poison of the Bothrops jararaca,
basing on its ethnopharmacology use. The antinociceptive mechanism action
of the trimethoxy-dihidrocinnamic 3, 4, 5 acid is not fully elucidated. However,
the data suggest that the same can interact with TRPV receptors (sensitive
and capsaicin) and the mediated answer by the bradykinin, possibly for
inhibiting the activation of the kinase C protein sensitive to the PMA. So, the
present work shows for the first time, that the Piper tuberculatum species and
their isolated components presented important antinociceptive action and
antinflamatoria. Therefore the results obtained in the present study confirm in
part the utilization popular of this plant justifying its utilization
ethnopharmacology.
Key –words: Piper tuberculatum Jacq, Trimethoxy-dihydrocinnamic 3, 4, 5
acid, nonciception, inflammation and kinase C protein.
LISTA DE FIGURAS
pág.
Figura 1: Estruturas químicas de amidas isoladas do gênero
Piper.
11
Figura 2: Foto do arbusto e ramo de um espécime de Piper
tuberculatum.
12
Figura 3: Estruturas químicas dos compostos isolados do
gênero Piper.
16
Figura 4: Diagrama de fluxo de obtenção dos extratos e
isolamento dos constituintes químicos dos frutos de Piper
tuberculatum Jacq (analise fitoquímica)
31
Figura 5: Fracionamento e isolamento dos metabolitos
presentes nos frutos de Piper tuberculatum Jacq.
43
Figura 6: Espectro de RMN-1H (500 MHz) do composto Pip,
obtido em CDCl3.
44
Figura 7: Espectro de RMN
Pip, obtido em CDCl3.
13
C-BB (125 MHz) do composto
45
Figura 8: O espectro de RMN 13C bidimensional de interação
heteronuclear 1H -13C do composto Pip.
46
Figura 9: Espectro de massa (70 eV) do composto Pip.
47
Figura 10: Estrutura química proposta para o composto Pip.
47
Figura 11: Espectro de RMN 1H (500 MHz) do composto DihPip, obtido em CDCl3.
49
Figura 12: Espectro de RMN-13C-BB (125 MHz) de Dih-Pip,
obtido em CDCl3.
50
Figura 13: Espectro RMN-13C utilizando a técnica DEPT do
composto Dih-Pip, obtido em CDCl3.
51
Figura 14: Estrutura química proposta para o composto DihPip.
51
Figura 15: Espectro de RMN 1H (500 MHz) do composto
TMDC, obtido em CDCl3.
53
13
54
Figura 16: Espectro de RMN
C-BB (125 MHz) de composto
Figura 17: Espectro de RMN-13C – DEPT-135 de TMDC,
obtido em CDCl3.
55
Figura 18: Expansão do Espectro de RMN-1H (500 MHz) de
56
Figura 19: Espectro de massa (70 eV) de TMDC.
57
Figura 20 : Estrutura química proposta do composto TMDC.
57
Figura 21: Efeito do extrato etanólico (extrato bruto) de P.
tuberculatum administrado por via oral, na nocicepção induzida
por ácido acético (0,6%, i.p.) (barras abertas) comparado com
controle C (barra fechada).
59
Figura 22: Efeito dos extratos acetato de etila (A),
diclorometano (B), hexano (C) e metanol (D) obtidos de P.
tuberculatum administrados por via oral, na nocicepção
induzida por ácido acético (0,6%, i.p.) (barras abertas)
comparado com controle C (barras fechadas).
60
Figura 23: Efeito dos compostos Dihidropiplartina (Dih-Pip AB), Piplartina (Pip C-D) e Ácido 3,4,5-trimetóxi-dihidrocinâmico
isolados de P. tuberculatum administrados por via
intraperitoneal (A,C,E) e via oral (B,D,F), na nocicepção
induzida por ácido acético (0,6%, i.p.) (barras abertas)
comparado com controle C (barras fechadas).
61
Figura 24: Efeito dos compostos Dihidropiplartina (Dih-Pip, AB), Piplartina (Pip, C-D) e Ácido 3,4,5-trimetóxi-dihidrocinâmico
isolados de P. tuberculatum administrados por via
intraperitoneal, na nocicepção induzida pela formalina (2,5%,
i.pl.) (barras abertas) comparado com controle C (barras
fechadas).
64
Figura 25: Efeito do Ácido 3,4,5-trimetóxi-dihidrocinâmico
isolado de P. tuberculatum administrado por via intraperitoneal,
na nocicepção induzida pela capsaicina (1,6%, i.pl.) (barras
abertas) comparado com controle C (barra fechada).
65
na nocicepção induzida pelo glutamato (1,6%, i.pl.).
66
nos testes do Rota Rod (A) e campo aberto (B).
67
na hiperalgesia térmica (A,C) e mecânica (B,D) induzidas pela
68
bradicinina (BK; A-B) e PMA (C-D), em ratos.
na hiperalgesia térmica (A,C) e mecânica (B,D) induzidas pela
prostaglandina E2 (PGE2; A-B) e carragenina (Car; C-D), em
ratos.
69
Figura 30: Efeito do pré-tratamento dos animais com naloxona
(1 mg/Kg,i.p.) sobre a atividade antinociceptiva do Ácido 3,4,5trimetóxi-dihidrocinâmico (i.p.) e morfina (5 mg/Kg, s.c.), no
modelo de nocicepção induzida pela injeção de ácido acético
0,6% (i.p.) em camundongos.
70
na nocicepção induzida pela bradicinina (3 nmol, i.pl.).
71
na nocicepção induzida pela bradicinina (i.t.).
72
nos seguintes parâmetros avaliados na pleurisia induzida pela
injeção intrapleural de carragenina (0,1%): extravasamento
plasmático (A), migração total de células (B), migração de
células mononucleares (C) e migração de células
polimorfonucleares (D).
73
Figura 34: Efeito do extrato etanólico (extrato bruto) de P.
tuberculatum administrado por via oral, na nocicepção induzida
pelo veneno de B. jararaca (1 µg, i.pl.).
74
na nocicepção induzida pelo veneno de B. jararaca (1 µg, i.pl.).
75
LISTA DE TABELAS
Pág.
Tabela 1. Rendimento dos extratos obtidos dos frutos de Piper
tuberculatum Jacq
42
Tabela 2. Dados dos deslocamentos químicos dos espectros
RMN de 1H e 13C de Pip e da Piplartina [14]
48
RMN de 1H e 13C do composto Dih-Pip e da Dihidropiplartina
[25]
52
RMN de 1H e 13C de TMDC e do Ácido 3,4,5-trimetóxidihidrocinâmico [34].
58
Tabela 5. Inibição do número de contorções abdominais
induzidas pelo ácido acético e pelos extratos e compostos
isolados dos frutos de Piper tuberculatum Jacq
62
LISTA DE ABREVIATURAS

C
H
ADP
AMPA
AMPc/Ca++
BK
BjV
ATP
Ca+2
CCD
CDCl3
CH2Cl2
COX-2
d
DEPT
dd
Dih-Pip
GLU
GTP
DI50
H
HMQC
Hz
ICAM
IL-1
IL-1
IL- 8
iGluR
i.p.
i.pl.
i.t.
J
KA
m
m/z
mGluR
MHz
NMDA
NO
PGE2
Pip
PKA
PKC
PMA
Deslocamento químico
Deslocamento químico do carbono
Deslocamento químico do hidrogênio
Adenosina difosfato
-amino-3-hidroxi-5-metil-4-isoxalopropionato
Adenosina monofosfato cíclica acoplada ao cálcio
Bradicinina
Veneno de Bothrops jararaca
Adenosina trifosfato
Cátion Cálcio
Cromatografia de camada delgada
Clorofórmio deuterado
Diclorometano
Cicloxigenase-2
Dupleto
Reforço sem distorção por transferência por polarização
duplodupleto
Dihidropiplartina
Glutamato
Guanosina Trifostato
Dose que reduziu a resposta em 50% quando comparado ao grupo
controle
Hidrogênio
Espectro de RMN 13C bidimensional de interação heteronuclear -1H 13
C
Hertz
Molécula celular de adesão 1
Interleucina-1 beta
Interleucina-1 alfa
Interleucina- 8
Receptor glutamatérgico ionotrópico
Intraperitoneal
Intraplantar
Intratecal
Constante de acoplamento
Cainato
Multipleto
Massa/carga
Receptor glutamatérgico metabotrópico
Mega hertz
N-metil-D-aspartato
Óxido nítrico
Prostaglandina E2
Piplartina
Proteína quinase A
Proteína quinase C
Miristato-acetato de Forbol
RMN
RMN 13C-BB
RMN 1H
RMN 13C
Ressonância magnética nuclear
Ressonância magnética nuclear de carbono -13 Broad Band
Ressonância magnética nuclear de hidrogênio-1H
Ressonância magnética nuclear de carbono - 13C
RMN -DEPT
Ressonância magnética nuclear utilizando a técnica DEPT
s
SNC
t
td
TMDC
SP
TNF-
TRP
TRPA1
TRPM8
TRPV1
TRPV2
v.o
VRL1
u.m.a.
Singleto
Sistema nervoso central
tripleto
Triplo dupleto
Ácido 3,4,5-trimetóxi-dihidrocinâmico
Substância P
Fator de necrose tumoral – alfa
Receptor de potencial transitório
Receptor de potencial transitório relacionado a proteína anquirina 1
Receptor de potencial transitório melastatina 8
Receptor de potencial transitório vanilóide 1
Receptor de potencial transitório similar ao vanilóide 1
Via oral
Receptor vanilóide 1
Unidade de massa atômica
SUMÁRIO
1.
INTRODUÇÃO
1.1
Considerações sobre a Família Piperaceae
1.2
Considerações sobre o gênero Piper L.
1.3
Considerações sobre a espécie Piper tuberculatum Jacq.
1.4
Dor e Inflamação
1
4
5
11
16
2.
JUSTIFICATIVA
26
3.
OBJETIVOS
3.1
Objetivo Geral
3.2
Objetivos Específicos
28
28
28
4.
MATERIAL E MÉTODO
4.1
Material Botânico
4.1.1 Coleta e identificação do material botânico
4.1.2 Obtenção dos extratos
4.1.2.1 Obtenção dos extratos e isolamento dos
constituintes químicos para análise fitoquímica
4.1.2.2 Obtenção dos extratos para análise farmacológica
4.1.2.2.1 Extrato hexânico
4.1.2.2.2 Extrato diclorometano
4.1.2.2.3 Extrato acetato de etila
4.1.2.2.4 Extrato metanólico
4.2
Materiais e métodos cromatográficos
4.3
Materiais e métodos espectroscópicos
4.3.1 Espectros de massa
4.3.2 Ressonância magnética nuclear de hidrogênio
H(RMN H) e de carbono C(RMN C)
4.4
Animais
4.5
Preparação das amostras
4.6
Avaliação da atividade antinociceptiva
4.6.1 Testes de contorções abdominais induzidas pelo
ácido acético (0,6%) em camundongos
4.6.2 Nocicepção induzida pela formalina (0,92% de
formaldeído) em camundongos
4.6.3 Nocicepção induzida por capsaicina em
camundongos
4.6.4 Nocicepção induzida por glutamato em
camundongos
4.6.5 Efeito sobre a atividade locomotora em
camundongos
4.6.6 Hipernocicepção mecânica e térmica em ratos
4.6.7 Participação do sistema opióide
4.6.8 Participação do sistema de cininas
4.7
Avaliação do efeito antiinflamatório em camundongos
4.8
Nocicepção induzida pelo veneno extraído de B. jararaca
30
30
30
30
30
32
32
32
32
33
33
34
34
34
35
35
35
35
36
36
37
37
38
38
39
39
40
4.9
5.
Análise Estatística
40
RESULTADOS
5.1
Obtenção dos extratos e dos constituintes químicos para
análise fitoquímica.
5.2
Rendimento dos extratos para análise farmacológica
5.3
Rendimento dos constituintes químicos isolados dos
extratos obtidos para analise farmacologica
5.4
Determinação estrutural da Pip
5.5
Determinação estrutural da Dih-Pip
5.6
Determinação estrutural de TMDC
5.7
Efeito dos extratos e compostos isolados de P.
tuberculatum sobre as contorções abdominais induzidas
pelo ácido acético em camundongos
5.8
Efeito dos compostos isolados de P. tuberculatum sobre
a nocicepção induzida pela formalina
5.9
Efeito do Ácido 3,4,5-trimetóxi- dihidrocinâmico sobre a
nocicepção induzida pela capsaicina
5.10 Efeito do Ácido 3,4,5-trimetóxi- dihidrocinâmico sobre a
nocicepção induzida pelo glutamato
5.11 Efeito do Ácido 3,4,5-trimetóxi- dihidrocinâmico sobre o
desempenho motor no teste de atividade espontânea de
camundongos
hipernocicepção térmica e mecânica
5.13 Participação do sistema opióide sobre a atividade
antinociceptiva do Ácido 3,4,5-trimetóxi- dihidrocinâmico
5.14 Participação do sistema de cininas sobre a
antinocicepção induzida pelo Ácido 3,4,5-trimetóxidihidrocinâmico
5.15 Efeito do Ácido 3,4,5-trimetóxi-dihidrocinâmico sobre
pleurisia induzida pela carragenina
nocicepção induzida pelo veneno de Brothops jararaca
41
41
6.
DISCUSSÃO
76
7.
CONCLUSÕES
91
REFERÊNCIAS
41
42
44
49
53
58
63
65
65
66
67
69
70
72
74
93
APÊNDICE
113
A. Constituintes químicos fixos e voláteis dos talos e frutos de
Piper tuberculatum Jacq. E das raízes de P. hispidum H.B.K..
Revista Acta Amazônica 38(4):733-742, 2008
B. Antinociceptive effect of crude extract, fractions and three
alkaloids obtained from fruits of Piper tuberculatum Biol.
Pharm. Bull. 2009
1. INTRODUÇÃO
A busca por novos fármacos parece ser menor que o mal que acomete a
humanidade, este surpreendente pelas novas formas que toma em cada doença
seja ela de conhecimento novo ou antigo. Assim o homem tem de superar-se a
si mesmo na busca de novos estudos que gerem ciência e minimizem as
aflições humanas. Aliada á esta busca surge a floresta, densa e ainda misteriosa
pela infindável presença de tantos ativos naturais desconhecidos, fonte de
fármacos vegetais dos mais significantes pela imensa biodiversidade que
apresenta (DE SMET, P. A. G.M.,1997).
Os trabalhos de Mendelsohn e Balick publicados em 1995 evidenciam
que existam 375 novos fármacos para serem descobertos nas florestas tropicais,
partindo-se das 250 mil espécies vegetais sendo que dentre estes números 12%
já foram descobertos, porém esse número pode ser aumentado uma vez que
novas espécies vegetais devem estar abrigadas na floresta.
O homem utiliza os recursos fitoterápicos desde os primórdios com
relatos de estudo sistemáticos de plantas medicinais acerca de 2.700 AC,
durante o império Shennung (BALICK, M.J. & COX, P.A,1997). Atualmente, a
OMS afirma que 80% da humanidade depende da medicina tradicional para o
tratamento de doenças envolvendo o uso de extratos vegetais.
Com relação às plantas usadas na medicina tradicional, é de suma
importância a valorização dos aspectos étnicos e culturais para a escolha dos
vegetais a serem pesquisados, visto que a etnofarmacologia aborda, além da
escolha do vegetal, os aspectos culturais cuja probabilidade de princípios ativos
aproveitáveis como medicamentos serão maiores (ELIZABETSKY, 2003). Devese levar em conta quais ações farmacológicas são atribuídas à planta e a
possível atividade biológica a ser explorada (SIMÕES et al, 2001), que poderá
conduzir á produção de fitoterápicos de uso terapêutico de acordo com diversos
procedimentos de controle de qualidade.(DAVID, 2004).
Em 1978, a Organização Mundial de Saúde (OMS) reconheceu o uso de
fitoterápicos com finalidade profilática, curativa, paliativa ou com fins de
diagnóstico, e recomendou a difusão, em nível mundial, dos conhecimentos
necessários para o seu uso. Para os anos de 2004 a 2005 a OMS reforçou o
1
compromisso em estimular o desenvolvimento de políticas públicas com o
objetivo de inseri-las no sistema oficial de saúde dos seus 191 estados
membros. O documento “Política Nacional de Medicina Tradicional e
Regulamentação de Medicamentos Fitoterápicos“ publicado pela OMS (2005)
apresenta a discussão sobre a situação mundial a respeito das políticas de
medicina
tradicional e
medicamentos fitoterápicos,
inclusive
no Brasil,
principalmente ao fato de ser o país com a maior diversidade genética vegetal
do mundo. Cerca de 55.000 espécies catalogadas de um total estimado entre
350.000 e 550.000 espécies e possuir ampla tradição de uso das plantas
medicinais, vinculada ao conhecimento tradicional (popular).
Considerando que a cadeia produtiva de plantas medicinais e fitoterápicos
tem interface com diversas áreas do conhecimento e demanda ações
multidisciplinares, em seu papel institucional, o Ministério da Saúde vem
desenvolvendo diversas ações junto a outros órgãos governamentais e não
governamentais no sentido de elaborar políticas públicas voltadas à inserção de
plantas medicinais e da fitoterapia no SUS e ao desenvolvimento do setor.
Em 2006, foi publicada, a Portaria nº 971/MS que aprova a Política
Nacional de Práticas Integrativas e Complementares (PNPIC) no Sistema Único
de Saúde e prevê a inserção no SUS das Plantas Medicinais e Fitoterapia, além
da Homeopatia, da Medicina Tradicional Chinesa/Acupuntura e do Termalismo
Social. Esse mesmo ano também foi publicado o decreto nº 5.813 que aprova a
Política Nacional de Plantas Medicinais e Fitoterápicos. Garantir qualidade,
eficácia, eficiência e segurança a todos os brasileiros usuários do sistema
público de saúde é o objetivo do Ministério da Saúde ao estabelecer as diretrizes
para
incorporação
e
implementação
dessas
práticas
no
SUS
(portal
saúde.gov.br).
Em dezembro de 2008 foi lançado o Programa Nacional de Plantas
Medicinais e Fitoterápicos onde apresenta ações que visam cumprir as diretrizes
da Política Nacional de Plantas Medicinais e Fitoterápicos. Um de seus objetivos
é inserir, com segurança, eficácia e qualidade, plantas medicinais, fitoterápicos e
serviços relacionados à Fitoterapia no SUS. O Programa busca, também,
promover e reconhecer as práticas populares e tradicionais de uso de plantas
medicinais e remédios caseiros.
2
O Programa prevê a elaboração da Relação Nacional de Plantas
Medicinais e Fitoterápicos (Renafito), que será disponibilizada no âmbito do
SUS. Esta relação apresentará fitoterápicos produzidos com plantas nativas ou
exóticas adaptadas, de uso na atenção básica, com o maior nº de evidências de
segurança e eficácia, com registro na Anvisa, considerando os biomas
brasileiros e as espécies da flora brasileira não ameaçadas de extinção (portal
saúde.gov.br).
Durante o processo de construção da Política Nacional de Plantas
Medicinais e Fitoterápicos, ainda em 2005, a Secretaria de Ciência Tecnologia e
Insumos Estratégicos, por meio do Departamento de Assistência Farmacêutica
(DAF/SCTIE/MS), construiu em parceria com outros ministérios e com a
colaboração de consultores e pesquisadores, uma lista com 237 plantas
medicinais. Para esse trabalho, foram consideradas as espécies vegetais já
utilizadas nos serviços de saúde estaduais, o conhecimento tradicional e popular
e os estudos químicos e farmacológicos disponíveis. Esse documento subsidiou,
em 2008, a construção de uma nova lista, intitulada Relação Nacional de Plantas
Medicinais de Interesse ao SUS (Renisus), constituída de plantas medicinais
que apresentam potencial de avançar nas etapas da cadeia produtiva e de gerar
produtos de interesse ao SUS. A finalidade da Renisus é subsidiar o
desenvolvimento de toda cadeia produtiva, inclusive nas ações que serão
desenvolvidas também pelos outros ministérios participantes do Programa,
relacionadas a regulamentação, cultivo/manejo, produção, comercialização e
dispersão de plantas medicinais fitoterapêuticas. Esta relação nacional de
plantas terá também a função de orientar estudos e pesquisas que possam
subsidiar a elaboração da Renafito, o desenvolvimento e a inovação na área de
plantas medicinais e fitoterápicos.
A Renisus deverá ser revisada e atualizada periodicamente, a critério do
Ministério da Saúde. Desta forma as pesquisas com fitoterápicos ganha, cada
vez, mais o aspecto científico de real importância (portal saúde.gov.br).
Considerando que a fitoterapia é um recurso de prevenção e tratamento
de doenças caracterizado pela utilização de plantas medicinais em suas
diferentes formas farmacêuticas, sem a utilização de substâncias ativas isoladas
(ainda que de origem vegetal), cabe aos pesquisadores e à academia avaliar
esses fitoterápicos, bem como isolar seus ativos na busca de novos fármacos.
3
A utilização da flora para fins medicinais é uma prática tão antiga quanto a
civilização, e compõe um dos principais aspectos da medicina tradicional.
Segundo dados da Organização Mundial da Saúde (OMS), 65 a 80% da
população mundial que reside em países em desenvolvimento e que vivem em
pobreza absoluta, usam correntemente extratos de plantas medicinais para
atendimento de suas necessidades básicas de saúde (FARNSWORTH et al.,
1997; AKERELE, 1993; GRÜNWALD, 1995; GRÜNWALD e BÜTEL, 1996).
Apesar dos grandes avanços da medicina nos últimos 100 anos, os produtos
naturais, principalmente os compostos derivados das plantas medicinais, ainda
têm
papel
fundamental
no
esclarecimento
de
fenômenos
complexos
relacionados à biologia celular e molecular. Estes conhecimentos são
importantes para a descoberta e desenvolvimento de novos fármacos (CALIXTO
et al., 2000).
Nos últimos 10 anos o interesse por plantas medicinais tem crescido
muito. Em algumas áreas, como no tratamento do câncer, cerca de 60% dos
medicamentos disponíveis no mercado ou em fase clínica de desenvolvimento
são derivados de produtos naturais, principalmente de plantas superiores
(CRAGG et al., 1997; FARNSWORTH & BINGEL, 1997; DE SMET, 1997;
CALIXTO, 2000).
1.1 - Considerações sobre a Família Piperaceae
A família Piperaceae é classificada como uma das mais primitivas famílias
entre as angiospermas, é constituída de 10 a 12 gêneros e um grande e incerto
número de espécies, estimado em 1.400 a 2.000 que habitam lugares úmidos e
sombrios das regiões tropicais (CRONQUIST, 1981; JOLY, 1991).
Destacam-se os gêneros Piper e Peperomia, por serem os mais
representativos na flora brasileira, perfazendo um total de 460 espécies
(BARROSO, 1978; MOREIRA et al., 2000; PARMAR et al., 1997)
As Piperaceaes possuem importância econômica, ecológica e medicinal,
sendo que muitas espécies têm sido utilizadas na alimentação e na medicina
popular para o tratamento de muitas patologias, como do trato respiratório
(asma, bronquite e tosse), do aparelho digestivo (dores abdominais, diarréias,
4
digestiva, carminativa), antiinflamatório (reumatismo), antimicrobiana (antibacteriana, antifúngica, tratamento de feridas, vaginites e anti-helmíntica),
antileucêmica, e doenças venéreas (LEAL, 2000). Em virtude destas inúmeras
indicações terapêuticas, as Piperaceaes constituem uma estimulante fonte para
a pesquisa fitoquímica e biológica (BENEVIDES et al., 1999; MOREIRA et al.,
1995).
A família Piperaceae, no Brasil, é representada, praticamente, em todos
os estados do país, principalmente, pela espécie Piper nigrum, a pimenta do
reino, que fora introduzida no século 17 pelos portugueses (EMBRAPA, 2005).
Dentre os estados do nordeste brasileiro, tomando-se apenas o estado do Ceará
como exemplo, além da espécie Piper nigrum, são compreendidos outros 35
taxos da família Piperaceae distribuídos em quatro gêneros: Ottonia,
Pothomorphe, Peperomia e Piper (GUIMARÃES & GIORDANO, 2004).
Muitas destas espécies são utilizadas popularmente como condimento,
principalmente os frutos; como ornamentação; e como medicinais através de
chás, infusão, banhos aromáticos tanto das raízes quanto do caule e dos frutos,
estes, muitas vezes, na forma seca ou moída, são empregados para o
tratamento de um amplo espectro de doenças (GUIMARÃES & GIORDANO,
2004).
1.2 - Considerações sobre o gênero Piper L.
O gênero Piper pertencente à família das Piperáceas tem mais de 1.000
espécies que se distribuem geograficamente pelas regiões subtropicais (DYER
et al., 2004), tropicais e temperadas dos dois hemisférios (GUIMARÃES &
GIORDANO, 2004). Este gênero apresenta uma das maiores diversidades de
táxons nos países neotropicais, em que corresponde a cerca de 2/3 de todas as
espécies neles descritas. Muitas plantas deste gênero crescem em florestas
quentes, úmidas e com alto índice pluviométrico. Aproximadamente, 300
espécies são endêmicas do sudeste da Ásia, incluindo o leste das ilhas da Índia
e o norte da Austrália. Apenas duas espécies são nativas da África. Na América
Central, há ocorrência de cerca de 90 espécies na Península Osa na Costa
Rica, como também em alguns países da América do Sul (DYER et al., 2004).
5
No Brasil, ocorrem cerca de 266 espécies do gênero Piper, das quais 13
espécies e 4 variedades foram descritas apenas no estado do Ceará, embora
praticamente todas também ocorram em outros estados nacionais (GUIMARÃES
& GIORDANO, 2004).
Em geral, são sub-arbustos, arbustos ou arvoretas com 1 a 5 metros,
podendo atingir até 10 metros de altura. Os caules são mais ou menos
lignificados, nodosos e ramosos. As folhas apresentam pecíolo longo e são
alternas ao caule. O limbo é simples e a sua margem é inteira, apresentam
diferentes formas e de tamanho variável, podendo atingir em algumas espécies
até 40 cm de comprimento, consistência membranácea a coriácea. As flores são
sésseis, aperiantadas, dispostas em espigas opostas às folhas que variam de
comprimento e espessura, eretas, subcurvas ou curvas, providas de pedúnculos
delgados ou espessos. 2 a 5 estames e 3 a 4 estigmas, filiformes, curvos,
estilosos ou sésseis. Ovário ovóide ou subovóide. Os frutos são drupas globosas
com pericarpo pouco espessado (MOREIRA et al., 2000; GUIMARÃES &
GIORDANO, 2004; REITZ, 2003).
Os principais agentes polinizadores das sementes de Piperaceae são os
morcegos da família Phyllostomidae, em particular Carollia perspicillata, os quais
demonstram uma distinta preferência pelos frutos de Piper. O morcego é atraído
pelos frutos maduros, alimentando-se dos mesmos e eliminando em seguida as
sementes através de seus excrementos (BIZERRIL et al., 1998).
Muitas espécies de Piper são usadas para fins curativos em diversas
culturas (BEZERRA et al., 2007). O histórico do gênero Piper descrito por
PARMAR et al. (1997, 1998), relata o uso de espécies para o tratamento de
algumas enfermidades em diferentes povos. Na China, algumas prescrições
recomendam o uso das folhas de Piper futokasura no tratamento de arritmias
cardíacas e da asma. Na Jamaica dores estomacais são tratadas com uma
infusão das folhas de Piper aduncum e Piper hispidum. No México e no Brasil,
usam-se as folhas de Piper amalago para aliviar dores estomacais e no combate
a diversas infecções. Folhas e talos de Piper marginatum e Piper tuberculatum
Jack são utilizadas, na Paraíba, contra mordida de cobra e como sedativos
(CHAVES et al., 2006; ARAÚJO-JUNIOR et al., 1999). SILVA et al. (2007)
demonstraram que os extratos das folhas e raízes de Piper aduncum, uma
planta medicinal, apresentaram atividades inseticida sobre adultos de Aetalion
6
sp (cigarrinha). Os óleos essenciais das partes aéreas de plantas dessa espécie,
coletadas em diferentes localidades da região Amazônica, apresentaram
grandes concentrações do fenilpropanóide dilapiol [1], o qual foi considerado o
responsável pelo efeito inseticida relatado por MAIA et al. (1998). Outra espécie
de relevante valor comercial é a Piper hispidinervum por apresentar um óleo
essencial rico em safrol [2], um fenilpropanóide, muito utilizado nas industrias de
cosméticos e inseticidas (BERGO et al., 2005). Recentemente, foi divulgada a
atividade larvicida, contra o Aedes aegypti, do óleo essencial de quatro espécies
de Piper da região Amazônica, Piper gaudichaudianum, Piper permucronatum,
Piper humaytanum e Piper hostmanianum (MORAES et al., 2007).
Os estudos dos representantes do gênero Piper demonstram várias
classes químicas com propriedades inúmeras: as amidas e alcalóides são
depressores do sistema nervoso central, antipiréticas e antiinflamatórias, além
de atividade inseticida, larvicida, vasodilatadora cardíaca, antibacteriana e
citotóxica; os flavonóides; os lignanos possuem uma vasta atividade biológica;
os neolignanos são inibidores da degranulação de neutrófilos, inibidores de
enzimas lisossomais plasmáticas e antagonistas da atividade do fator de
agregação plaquetária; os ésteres de cadeia curta e longa; terpenos; esteróides
possuem atividade antiinflamatória, os propinilfenóis tem atividade fungicida,
nematicida
e
antimicrobiana;
alcalóides;
kawapironas
com
atividade
antidepressiva e inibidora do crescimento de ameba; piperolídeos; chalconas e
dihidrochalconas possuem atividade antibacteriana e citotóxica (PARMAR,1997;
DI STASI, 2002), alguns dos quais tem sido estudados e pesquisados através da
identificação de novos compostos fitoquímicos pelos trabalhos de FACUNDO e
colaboradores na Universidade Federal de Rondônia (FACUNDO & MORAIS,
2003; FACUNDO & BRAZ-FILHO, 2004; FACUNDO et al, 2004).
Entre os compostos químicos, as amidas constituem os metabólitos
característicos da família (FELIPE et al., 2007), além de possuírem uma forte
atividade inseticida e fungicida (BERNARD et al., 1995; CAMPOS et al., 2005;
EVANS et al., 1984; HATAKOSHI et al., 1984; LEE, 2005; MADUELL et al.,
2002; MIYAKADO et al., 1979, 1980, 1981, 1983, 1985a; 1985b; NAVICKIENE
et al., 2003; REIGADA et al., 2007; SCOTT et al., 2003, 2005a; CHAUBEY,
2007; STRUNZ, 2000; WU et al., 2004).
7
Estudos realizados por Hatakoshi (1984) revelaram a ação neurotóxica da
amida pipercida [3] sobre o cordão nervoso central da barata, Periplaneta
americana, conferindo a essa substância um potente efeito toxicológico.
Estudos recentes têm demonstrado que extratos aquosos de folhas e
raízes de Piper aduncum possuem uma forte atividade inseticida contra insetos
que são considerados pragas de importância comercial, como Aetalion sp.
(SILVA et al., 2007). Além disso, vários trabalhos têm sido realizados e tem
atestado a potente atividade inseticida das amidas isoladas de várias espécies
do gênero Piper. Miranda e colaboradores testaram o efeito da amida pelitorina
[4] sobre as larvas de Apis mellifera, mostrando que as abelhas são altamente
susceptíveis a ação tóxica da substância testada (MIRANDA et al. 2003).
Navickiene e colaboradores também obtiveram sucesso ao testarem a atividade
das amidas pelitorina [4] e piperlongumina [5] sobre as larvas de lagartas-dasoja (Anticarsia gemmatalis) (NAVICKIENE et al., 2007).
De acordo com Scott (2004) essas substâncias possuem efeito repelente
e são produzidas pelas plantas como um mecanismo de defesa contra a
herbivoria e a ovoposição de insetos nas folhas.
Ensaios
biológicos
realizados
com
os
fungos
Cladosporium
cladosporioides e Cladosporium sphaerospermum têm demonstrado a atividade
fungicida a partir de amidas isoladas dos talos de Piper hispidum e das
sementes de Piper tuberculatum (NAVICKIENE et al., 2000), de derivados do
ácido benzóico (LAGO et. al., 2004), do óleo essencial das folhas, frutos e
caules de Piper aduncum e de Piper tuberculatum Jacq (NAVICKIENE et al.,
2006.), do extrato bruto das folhas de Piper mollicomm e Piper ihotzkyanum
(LAGO et al., 2007b), que além de possuir uma grande atividade contra os
fungos Candida albicans e Cryptococcus neoformans, também apresentou forte
atividade biológica contra a Leishimania amazonensis (BRAGA et al., 2007).
Quando testadas com outras finalidades, amidas como pelitorina [4],
guinensina [6], brachistamida B [7], sarmentina [8], brachiamida [9], 1-piperetil
pirrolidina [10], 3’,4’,5’-trimetoxicinamoila pirrolidina [11], sarmentosina [12], (+)asarinina [13] exibiram atividade antituberculose, sendo que duas delas
sarmentina [8] e 1-piperetil pirrolidina [10]) mostraram também atividade
antiplasmodial (RUKACHAISIRIKUL et al., 2004).
8
Em seus estudos, Medeiros demonstrou que a amida piplartina [14]
possui atividade antitumoral e vasorelaxante sobre a aorta de ratos (MEDEIROS
et al., 2006). Também Bezerra e colaboradores testaram a atividade antitumoral
de piplartina [14] e piperina [15] a partir de experimentos realizados com ratos
transplantados com células de sarcoma 180 (BEZERRA et al., 2006), onde
ambas apresentaram atividade, embora tenham causado efeitos reversíveis
sobre o fígado e os rins, sendo que a piperina [15] foi mais tóxica sobre o fígado,
causando a degeneração dos hepatócitos, acompanhada por uma “esteatose”
em algumas áreas, enquanto piplartina [14] foi mais tóxica para os rins,
causando pequenas mudanças nos túbulos proximais e no epitélio glomerular e
hemorragia tubular nos animais tratados.
Bezerra demonstrou que a piplartina [14] apresenta efeito citotóxico e
antiproliferativo dose e tempo-dependente, esses efeitos parecem ser seletivos
para células tumorais, embora haja uma pequena toxicidade contra células
normais, como foi demonstrado em ensaios realizados com a proliferação de
linfócitos (BEZERRA et al., 2007). Piplartina [14] possui efeito sobre a síntese
de DNA, que nos experimentos realizados, mostrou ser dose-dependente, além
disso, induz a apoptose da célula pela via mitocondrial e/ou pela via de
sinalização de receptores de morte programada da célula.
Piperina [15] apresenta efeito antinociceptivo, reduz o número de
leucócitos presentes na cavidade peritoneal de camundongos tratados com
carragenina (FELIPE, 2006a), possui efeito hipotensivo, atividade depressiva do
tônus intestinal de cães (MAXWELL & RAMPERSAD, 1991) e efeito ansiolítico
(FELIPE, 2006b), além de atividade depressora do sistema nervoso central
(FELIPE et al., 2007).
Em seus trabalhos, Reddy e colaboradores descreveram a atividade
antibacteriana de isolados puros de Piper longum e Taxus baccata (REDDY et
al.,
2001),
os
quais
foram
ativos
contra
bactérias
gram-positivas
e
moderadamente ativos contra bactérias gram-negativas, entretanto, cada
composto foi altamente ativo pelo menos para uma espécie particular de
bactéria: piperlonguminina [16] contra Bacillus subtilis, piperina [15] contra
Staphylococcus aureus e pellitorina [4] contra Bacillus sphaericus.
Campos e colaboradores também atestaram o efeito antibacteriano do
extrato, das frações e dos compostos, conocarpano, conocarpano metilado,
9
eupomatenóide-3, eupomatenóide-5 e orientina, obtidos das folhas de Piper
solmsinum contra bactérias, principalmente, as gram-positivas (CAMPOS et al.,
2005).
O
O
OCH3
OCH3
O
O
Dilapiol [1]
Safrol [2]
O
O
O
N
H
N
H
O
Pipercida [3]
Pellitorina [4]
O
H
S
O
N
S
N
H
O
H
OH
Piperlongumina [5]
Guinensina [6]
O
H
N
(CH2)6
O
N
O
O
Brachistamida [7]
Sermantina [8]
O
O
O
O
N
N
O
O
Brachiamida [9]
1-Piperetil pirrolidina [10]
10
O
O
O
N
O
N
O
O
O
3’,4’,5’-Trimetoxicinamoila pirrolidina [11]
Sarmentosina [12]
O
O
O
O
H3CO
O
N
O
H3CO
O
OCH3
O
(+)-Asarinina [13]
Piplartina[14]
8(E)-N-12,13,14-trimetóxicinamoilaΔ3piridin-2-ona
O
O
O
O
N
H
N
O
O
Piperina [15]
Piperlongumina [16]
Figura 1: Estruturas químicas de amidas isoladas do gênero Piper
1.3 - Considerações sobre a espécie Piper tuberculatum Jacq.
A espécie Piper tuberculatum Jacq apresenta-se como arbustos com 2 2,5 m de altura, e ramos pubérulos (Figura 2). Folhas com bainha alada; pecíolo
0,5-1cm comprimento, pubérulo; lâmina oblongo-elíptica ou ovado-elíptica, 812,5 x 4-6 cm, base assimétrica, ápice agudo, papiráceomembranácea,
brilhante, glabra na face adaxial, pubérula nas nervuras na face abaxial;
nervuras ascendentes em número de 8 -10 pares, peninérveas, dispostas até o
ápice da lâmina. Espigas eretas, com 4 -7cm comprimento; pedúnculo 1 - 1,5 cm
comprimento; bractéolas triangular-subpeltadas, marginalmente franjadas, 4
11
estames, drupa tetragonal, ovada ou subobovada, lateralmente comprimida,
glabra, 3 estigmas sésseis (GUIMARÃES & GIORDANO, 2004).
(a)
(b)
Figura 2: (a) Foto do arbusto e (b) foto de ramo de um espécime de Piper
tuberculatum Jacq com folhas e frutos.
Sua distribuição geográfica estende-se desde o Continente Americano e
Antilhas. No Brasil, nos estados do Amazonas, Rondônia, Pará, Maranhão,
Piauí, Ceará, Paraíba, Pernambuco, Rio de Janeiro e Mato Grosso. Cresce em
altitudes aproximadas aos 550 m, em encosta úmida, em capoeira e em locais
brejosos.
Piper tuberculatum Jacq é conhecida como pimenta d’ardo, pimenta-demacaco ou pimenta-longa (PEREIRA & SILVA, 2002; GUIMARÃES &
GIORDANO, 2004) e ainda como jamburana (PEREIRA & SILVA, 2002). É uma
planta medicinal utilizada popularmente como estimulante e carminativa
(BRAGA, 1953), além de analgésico, sedativo, dor de dente e antídoto para
veneno de cobra (ARAÚJO-JUNIOR et al., 1999) e como estimulante para
problemas estomacais (CHAVES et al., 2003).
Em estudos fitoquímicos realizados nesta planta visando o isolamento dos
seus metabólicos secundários descreveram a presença dos seguintes
metabólitos: piplartina [14] e seu dímero [17] (BRAZ-FILHO et al., 1981),
12
piperdardina [18], piperetina [19], piperina [15] (ARAÚJO-JÚNIOR et al., 1997),
ácido 3,4-metilenodioxi-cinâmico [20] (SIMMONDS & STEVENS, 1956),
piplaróxido
[21],
demetoxipiplartina
[22] (CAPRON
& WIEMER
1996),
cefaranona B [23] (ARAÚJO-JÚNIOR et al., 1999), Δα;β-dihidropiperina [24],
dihidropiplartina [25], 8(Z)-N-12,13,14-trimetoxicinamoila)-Δ3-piridin-2-ona [26],
5,6-dihidropiperlonguminina [27], pellitorina [4], (NAVICKIENE et al., 2000), N[10-(13,14-metilenodioxidofenil)-7(E)-9(E)-pentadienoila]-pirrolidina [28], N-[10(13,14-metilenodioxifenil)-7(E)-pentadienoila-pirrolidina [29], fagaramida [30],
trans-6,7,8-trimetóxi-dihidrocinamato
de
metila
[31],
6,7,8-trimetóxi-
dihidrocinamato de metila [32] (SILVA et al., 2002), piperina [33] (CHAVES et
al., 2003).
Muitas plantas pertencentes à família Piperaceae têm compostos
químicos como amidas isobutílicas a qual foi encontrada também na espécie
Piper tuberculatum. Estas demonstraram potencial atividade inseticida em broca
de cana-de-açúcar, Diatraea saccharalis e Anticarsia gemmatalis (NAVICKIENE,
2003). Além disso, as amidas mostraram atividades antifúngicas contra fungos
fitopatógenos:
Cladosporium
sphaerospermum
e
C.
cladosporioides
(NAVICKIENE et al., 2000; SILVA et al., 2002; LAGO et al., 2004).
O trabalho realizado por Miranda em 2003 relata o isolamento da amida
pelitorina [4] que foi testada contra larvas de Apis mellifera (Hymenoptera:
Apidae) mostrando-se altamente tóxica.
As substâncias investigadas no presente estudo, dihidropiplartina [25] e
piplartina [14], isoladas dos frutos de Piper tuberculatum, já haviam sido isoladas
nesta planta (NAVICKIENE et al, 2000), e foram encontradas também na
espécie Piper rugosum (MAXWELL & RAMPERSAD, 1991;) e em outras
espécies
de
Piper
(PARMAR
et
al.,
1997).
O
ácido
3,4,5-trimetóxi-
dihidrocinâmico [34] já foi isolado de Piper retrofractum e foi separado por
hidrolisis a partir do composto 3’,4’,5’-trimetóxi-cinamato de etila original, isolado
de Piper longum (KUMAR et al., 2005).
Muitos autores relataram a importância dos diversos compostos químicos
isolados de Piper tuberculatum no que se refere à toxicidade destas substâncias
contra insetos e fungos (NAVICKIENE et al., 2000; CUNHA et al., 2001; SILVA
et al., 2002; SCOTT et al., 2002; CHAVES et al., 2003; MIRANDA et al., 2003),
13
especialmente como inseticida botânico para o controle de praga na agricultura
(SCOTT et al., 2002 & MIRANDA et al., 2003).
Navickiene e colaboradores (2002) realizaram investigações fungicidas
com as substâncias dihidropiplartina [25] e piplartina [14], sendo as amidas do
gênero Piper conhecidas por sua ação inseticida. Para o ácido 3,4,5-trimetóxidihidrocinâmico [34] foi relatada atividade antiinflamatória contra a ação do TNFα sobre liberação de ICAM-1 pelas células (KUMAR et al., 2005). Estudos mais
recentes revelam que o ácido 3,4,5-trimetóxi-dihidrocinâmico [34] possui
moderada ação anti-hemorrágica contra o veneno de Bothrops alternatus e que
também interfere na replicação dos parasitas Leishmania amazonensis na forma
promastigota (FERREIRA, 2006).
H3C
O
O
H3C
O
O
O
N
O
H3C
O
N
O
O
O
N
CH3
O
O
H3C
O
H3C
Dímero da Piplartina [17]
Piperdardina [18]
O
O
O
N
O
O
OH
O
Piperetina [19]
Ácido
3,4-metilenodioxi-
dihidrocinâmico [20]
14
OCH3
H3CO
H3CO
O
N
N
H3CO
O
O
O
O
Piplaróxido [21]
Demetoxipiplartina [22]
OCH3
O
H3CO
O
N
O
NH
O
Δα;β-dihidropiperina [24]
Cefaranona B [23]
O
H3CO
H3CO
O
N
H3CO
H3CO
O
OCH3
N
O
OCH3
DihidroPiplartina [25]
8(Z)-N-12,13,14-trimetóxicinamoila
Δ3-piridin-2-ona [26]
Isômero (Z) Piplartina
O
O
O
O
N
H
N
O
O
5,6-Dihidropiperlonguminina [27]
N-[10-(13,14metilenodioxidofenil)-7(E)9(E)-pentadienoila]-pirrolidina
[28]
15
O
O
O
O
N
N
H
O
O
N-[10-(13,14-metilenodioxifenil)-7(E)
Fagaramida [30]
-pentadienoila-pirrolidina [29]
O
O
H3CO
OCH3
H3CO
H3CO
OCH3
H3CO
OCH3
OCH3
Trans-6,7,8-trimetóxi-dihidrocinamato
de metila [31]
6,7,8-Trimetóxi-dihidrocinamato de metila [32]
O
H3CO
O
O
OH
H3CO
N
OCH3
O
Piperine [33]
Ácido 3,4,5-trimetóxidihidrocinâmico [34]
Figura 3: Estruturas químicas dos compostos isolados do gênero Piper
1.4 - Dor e Inflamação
A dor é uma experiência pessoal e subjetiva, de forma que se aprende
sentindo. Há um amplo conceito definido pela IASP - Associação Internacional
para Estudo da Dor, no qual a dor pode ser definida como uma experiência
sensorial e emocional desagradável, associada a dano tecidual real ou potencial,
16
ou descrita em termos de tal lesão (MELZAC & LOESER, 1999; RAINVILLE,
2002; ALMEIDA et al., 2004). Além de estar envolvida a um estímulo
potencialmente nocivo, a dor tem uma conotação individual e é representada por
uma experiência subjetiva, envolvendo componentes afetivos e emocionais, que
amplificam ou diminuem a sensação dolorosa (MELZACK & LOESER, 1999;
RAINVILLE, 2002; ALMEIDA et al., 2004). Desta forma é absolutamente
essencial para a sobrevivência dos animais e humanos a capacidade de sentir
dor para desenvolver mecanismo de proteção contra perigos potenciais visando
a sobrevivência, evitando lesão tecidual. O nociceptor é estrutura especial
responsável por detectar estímulos nocivos proveniente do meio ambiente.
Esses
nociceptores
correspondem
às
terminações
nervosas
livres
e
representam a parte mais distal dos neurônios aferentes de primeira ordem, que
Aδ e do tipo C,
respectivamente (JULIUS & BASBAUM, 2001; ALMEIDA et al., 2004).
Há ainda o fenômeno doloroso que pode ocorrer espontaneamente, em
decorrência da redução do limiar de sensibilidade para dor, devido a danos no
SNC ou ainda lesão nas fibras sensoriais. A este tipo de dor é atribuído o termo
de dor neuropática (MILLAN, 1999; ALMEIDA et al., 2004)
Existe uma diferença entre os termos nocicepção e dor. O termo
nocicepção refere-se a manifestações neurofisiológicas, geradas por estímulos
nocivos. A dor envolve a percepção de um estímulo aversivo e requer a
capacidade de abstração e elaboração do impulso sensorial (MELZACK &
LOESER, 1999; ALMEIDA et al., 2004). Desta forma o termo dor seria mais
apropriado para o homem, enquanto que nocicepção seria mais indicado para
animais experimentais (WALL & MELZACK, 1999; JULIUS & BASBAUM, 2001)
Em termos de duração, a dor pode ser classificada como aguda ou
crônica. A dor aguda é caracterizada por ser pontual delimitada e desaparecer
com a resolução do processo patológico. A dor crônica persiste por um longo
período de tempo, sendo associada com processos patológicos crônicos e
mudanças no padrão de transmissão neuronal (ALMEIDA et al., 2004, LOESER
& MELZACK, 1999). Há também episódios de dor transitório com duração de
poucos segundos ou minutos que se dissipa naturalmente e na qual o dano real
é quase inexistente.
17
Quanto a origem há quatro tipos principais de dor: a dor tônica ou
“nociceptiva”, que se origina devido á estimulação excessiva dos nociceptores
localizados na pele, vísceras e outros órgãos; a dor “neurogênica” ou fásica e
inflamatória, que reflete o dano de tecido neuronal na periferia ou no sistema
nervoso central (SNC); a dor “neuropática”, que acontece devido a uma
disfunção ou dano de um nervo ou grupo de nervos e a dor “psicogênica”, que
não é oriunda de uma fonte somática identificável e que pode refletir fatores
psicológicos (MILLAN, 1999). Quando ocorre dano tecidual a dor geralmente é
mais persistente devido a influência de mediadores inflamatórios liberados
subjacentes
à
lesão
tecidual,
geralmente
ocorrendo
um
quadro
de
hipersensibilidade pela ativação e sensibilização dos nociceptores periféricos
pelos mediadores químicos liberados pela lesão do tecido (DRAY, 1997). Nos
quadros de hipersensibilidade, pode-se citar a hipernocicepção, que é o
aumento na intensidade da dor, e a alodínia, que ocorre quando um estímulo de
mínima intensidade passa a ser percebido como doloroso (LOESER & TREED,
2008). Demonstra-se assim que os neurônios espinhais apresentam plasticidade
sináptica, pois estímulos nociceptivos repetitivos de baixa freqüência ou lesão
tecidual periférica originam mudanças funcionais na medula espinhal, tais como
redução do limiar nociceptivo, expansão do tamanho do campo receptivo
(hiperalgesia secundária) e descargas neuronais prolongadas, gerando os
quadros de hipersensibilidade (MA & WOOLF, 1996).
É importante mencionar que tanto na dor clínica quanto na dor induzida
em modelos experimentais não há, a princípio, um mediador ou uma via
(ascendente ou descendente) dominante que contribua para a condução e
perpetuação do estímulo nociceptivo. Dependendo do local, tipo e duração do
estímulo, levando-se em conta componentes afetivos e emocionais, ocorrem a
ativação de múltiplos canais sensoriais, que irão convergir e interagir com
estruturas supraespinhais, promovendo a sensação global de dor (MILLAN,
1999).
No processamento neural dos sinais nocivos que levam a experiência de
dor o primeiro estágio compreende a transdução, no qual há a transformação
dos estímulos agressivos em potenciais de ação que, das fibras nervosas
periféricas, são transmitidos para o SNC (BENSOON & PERL, 1969). Os
receptores sensíveis aos estímulos nocivos, amplamente encontrados na pele,
18
membranas, tecidos conectivos de órgãos viscerais, ligamentos, cápsulas
articulares, periósteo, músculos, tendões e vasos sangüíneos são ativados e a
dor se propaga. O segundo estágio no processamento dos sinais nociceptivos é
a transmissão gerada na periferia e conduzida ao núcleo trigeminal caudal ou
para o corno dorsal da medula espinhal, respectivamente, onde são
retransmitidas mensagens através da liberação de mediadores.
Os corpos celulares dos neurônios aferentes primários encontram-se nos
gânglios trigeminais e nos gânglios da raiz dorsal (DRG), situados na coluna
vertebral e dispostos lateralmente ao longo da medula espinhal, que contem
ainda células dendríticas, e macrófagos e uma rede rica de capilares
sanguíneos. O axônio aferente primário bifurca-se e envia prolongamentos à
medula espinhal e aos tecidos corporais.
As fibras Aδ, são fibras pouco mielinizadas, de médio diâmetro que
medeiam a “primeira” dor, representada pela dor pungente, aguda e passageira,
que aparece logo após a lesão tecidual e transmitem a sensação da periferia ao
SNC em uma velocidade entre 12 a 30m/s, neste grupo ainda há um subgrupo
de fibras Aδ do tipo I que respondem a temperaturas inferiores a 53ºC e a fibras
Aδ do tipo II que respondem a temperaturas menores que 43ºC. As fibras C, não
mielinizadas de pequeno diâmetro, medeiam a “segunda” dor, uma dor mais
latente e difusa, que se perpetua por mais tempo e conduzem o estímulo em
uma velocidade entre 0,5 a 2m/s (JULIUS & BASBAUM, 2001; CRAIG, 2003).
As fibras Aβ são mais mielinizadas, de maior diâmetro e apresentam a
maior velocidade de condução e respondem ao toque leve ou movimento, mas
não contribuem para a dor, porém podem aliviar a dor quando são friccionadas
com a mão após alguma lesão. (MILLAN, 1999).
Estas fibras podem ser chamadas de polimodais, pois respondem a
estímulos nocivos térmicos, mecânicos e químicos. Dessa forma, apresentam
receptores termossensíveis ao calor e ao frio, bem como receptores específicos
para substâncias algogênicas (HUNT & MANTYH, 2001; IKEDA et al., 2001;
ALMEIDA et al., 2004; COUTAUX et al., 2005).
Existem também os nociceptores silenciosos, que são normalmente
inativos e irresponsivos ao estímulo nociceptivo agudo, porém tornam-se
ativados e sensibilizados gradualmente durante a resposta nociceptiva e
inflamatória (DRAY, 1997; HUNT & MANTYH, 2001; COUTAUX et al., 2005).
19
As fibras aferentes fazem sinapse em um neurônio de segunda ordem na
camada superficial da medula espinhal. O neurônio de segunda ordem cruza a
medula espinhal até o lado contralateral e ascende pelo trato espinotalâmico até
alcançar o tálamo. No tálamo neurônios de terceira ordem são ativados, levando
a informação do estímulo doloroso até o córtex somatossensorial, onde ocorre a
percepção da dor (VANDERAH, 2007).
Dentro deste contexto, basicamente, os neurônios aferentes primários
podem ser ativados por uma gama de mediadores, liberados no tecido lesado. A
lesão tecidual pode ser desencadeada por estímulos térmicos, traumas
mecânicos, invasão com agentes infecciosos e reações antígeno-anticorpo
(SAWYNOK, 2003). Estes mediadores promovem a despolarização das fibras
aferentes primárias Aδ e C que irão conduzir o impulso doloroso, iniciado em
diferentes tecidos, para o corno dorsal da medula espinhal, principalmente até
suas lâminas mais superficiais, lâminas I/II e profundas V/VI e X (HUNT &
MANTYH, 2001; MILLAN, 2002; CRAIG, 2003).
A partir da integração dos impulsos no corno dorsal, as vias nociceptivas
aferentes dão origem a diferentes modelos de projeção à estruturas corticais e
supracorticais. Neste estágio, os componentes sensoriais; discriminativos e
afetivos, bem como os componentes cognitivos, são atribuídos ao impulso
nociceptivo (WILLIS et al., 1997; MORROW et al., 1999; ALMEIDA et al., 2004).
Diversos neurotransmissores e neuromoduladores com a substância P
(SP), óxido nítrico (NO), prostaglandinas (PGs), neuropeptídeo Y (NPY),
opióides, serotonina (5-HT), adrenalina, adenosina, citocinas, glutamato, entre
outros aminoácidos excitatórios são liberados após um estímulo capaz de gerar
lesão tecidual, promovendo ativação de receptores específicos acoplados a
cascatas de segundos mensageiros intracelulares e canais iônicos que afetam a
excitabilidade da membrana e podem alterar a transcrição gênica, induzindo
alterações em longo prazo, na bioquímica dos neurônios sensoriais, assim
substâncias capazes de causar modificações seletivas destes receptores podem
dar origem a novos agentes analgésicos e antiinflamatórios (DRAY et al.,1994;
GUIRIMAND & LE BASRA, 1996; BENSSON,1997; COGGESHAL & CARLTON,
1997; DRAY, 1997; BESSON, 1999; MILLAN, 1999; RAJA et al., 1999).
Os diferentes feixes ascendentes que se formam devido à interação de
neurônios de primeira ordem com neurônios de segunda ordem no corno dorsal
20
da medula espinhal darão origem a diversas vias ascendentes que podem ser
classificadas em dois grupos: monossinápticas e polissinápticas (MILLAN, 1999;
ALMEIDA et al., 2004).
Muitas destas vias ascendentes fazem conexões com neurônios de
terceira ordem no tálamo, que projetam seus axônios pela cápsula interna do
córtex somatossensorial até o giro pós-central, onde a localização do estímulo
nociceptivo é realizada; e o giro anterior do cingulado, relacionado a
interpretação emocional da dor (RUSSO & BRODE, 1998).
Dentro deste contexto, há uma complexa e integrativa rede neuronal até
estruturas supraespinhais, que constituem as vias ascendentes. Estas regiões
supraespinhais são extensivamente interligadas e também interagem com
mecanismos da modulação descendente, permitindo a ativação rápida de
circuitos envolvidos no controle da dor (MILLAN, 1999).
As vias descendentes originam-se no tronco cerebral e outras estruturas
como hipotálamo, córtex e tálamo, bem como o núcleo magno da rafe (NRM),
substância cinzenta periaquedutal (PAG) e estruturas adjacentes da medula
rostroventromedial (RVM), que exercem um importante papel na modulação e
integração das mensagens nociceptivas no corno dorsal (MILLAN, 1999;
MILLAN, 2002; VANEGAS & SCHAIBLE, 2004). A importância de alguns
mediadores na modulação das vias descendentes ainda não está totalmente
esclarecida, contudo acredita-se que as vias serotoninérgica, noradrenérgica e
em menor extensão a dopaminérgica além do sistema canabinóide endógeno,
contemplam os maiores componentes dos mecanismos descendentes (MILLAN,
1999; MILLAN, 2002). Outros mediadores como a colecistocinina, encefalinas,
glutamato e NO também estão envolvidos neste mecanismo (MILLAN, 1999;
VANEGAS & SCHAIBLE, 2004).
Grandes
evidências
indicam
que
os
aminoácidos
excitatórios,
principalmente o glutamato, que é encontrado primariamente em fibras
sensoriais C, apresentam um papel crítico na transmissão da informação
nociceptiva da medula espinhal até estruturas centrais (MILLAN, 1999; BEIRITH
et al., 2002; BEIRITH et al., 2003).
No nível espinhal, o glutamato está presente nos terminais aferentes
primários, nas lâminas I, III e IV do corno dorsal. Nas fibras C o glutamato
coexiste com peptídeos como a substância P (SP), desta forma um estímulo
21
nocivo liberaria ambos, peptídeos e aminoácidos excitatórios das fibras
nociceptivas aferentes e estes agiriam de maneira sinérgica na transmissão da
dor (DICKENSON, 1997; BEIRITH et al., 2004).
Existem dois grupos distintos de receptores glutamatérgicos denominados
ionotrópicos (iGluR) e metabotrópicos (mGluR). Os receptores N-metil-Daspartato
(NMDA),
cainato
(KA)
α-amino-3-hidroxi-5-metil-4-
e
isoxazolepropionato (AMPA) são canais iônicos permeáveis ao Ca +2, Na+ ou K+.
(DICKENSON, 1997; BEIRITH et al., 2002).
Fortes
evidências
sugerem
que
os
receptores
glutamatérgicos
ionotrópicos, sensíveis ao NMDA (um análogo do glutamato), são receptores
formados por várias subunidades (NR1/NRA2,
NR1/NRB2, NR1/NRC2,
NR1/NRD2) e encontram-se amplamente distribuídos no SNC (OZAWA et al.,
1998; YAMAKURA & SHIMOJI, 1999).
Os receptores glutamatérgicos metabotrópicos (mGluR) são acoplados as
proteínas de ligação ao GTP, conhecidas como proteínas G, e operam tanto
pela liberação de segundos mensageiros intracelulares ou por influenciar canais
iônicos através da interação com as subunidades da proteína G através da
membrana. Dividem-se em oito subtipos classificados em três subgrupos de
acordo com a sua homologia. O grupo I (mGluR 1 e 5) promove ativação da via
da fosfolipase C; o grupo II (mGluR 2 e 3) e o grupo III (mGluR 4, 6 e 7) estão
acoplados negativamente a adenilato ciclase (OZAWA et al., 1998).
Outro importante transmissor associado a transmissão da dor é a
substância P (SP), que interage com receptores da família das taquicininas
(acoplados a proteína G) (VANDERAH, 2007)
Fortes indícios sugerem que os aminoácidos excitatórios e seus
receptores, além de contribuírem com a transmissão dolorosa, estão envolvidos
na patogenia da dor neuropática (hiperalgesia), assim como desordens
neurológicas crônicas, além de participarem de eventos como plasticidade
neuronal e formação do potencial de longa duração (LTP) (OZAWA et al., 1997;
MILLAN, 1999; YAMAKURA e SHIMOJI, 1999).
Estímulos térmicos nocivos podem promover a ativação de canais
específicos nos nociceptores (BEISE et al, 1998), principalmente os canais TRP
(do inglês transiet receptor potencial; receptores de potencial transitório) sendo
os mais estudados os TRPV-1 ou receptor vanilóide (VR1) e o TRPV2 ou
22
receptor similar ao vanilóide 1 (VRL-1) para o calor e o TRPM8 (melastatina) e o
TRPA1 (relacionado à proteína anquirina) para o frio (CALIXTO et al., 2005;
CORTRIGHT et al.; 2007; VENKATACHALAM & MONTELL, 2007; LEVINE e
ALESSANDRI-HARBER, 2007).
O TRPV1 é um canal catiônico não seletivo excitatório presente nos
neurônios sensoriais, ativado por temperaturas acima de 43ºC e pela capsaicina,
e contribui para a sensibilidade ao calor e é essencial ao desenvolvimento da
hipersensibilidade térmica após lesão tecidual O canal iônico VRL-1 não
responde à capsaicina, mas é ativado por temperaturas acima de 50ºC
(McKEMY et al, 2002). O TRPM8 é um canal iônico ativado por baixas
temperaturas (REID & FLONTA, 2001; PEIER et al, 2002).
A modulação é o terceiro aspecto do processamento do estímulo nocivo,
neste evento a resposta a estímulos nocivos representados por alterações
ocorridas no sistema nervoso permitem que sinais nocivos recebidos no corno
dorsal da medula espinhal sejam seletivamente inibidos, modificando a
transmissão do sinal para centros superiores. O sistema de modulação
endógeno da dor consiste de inter-neurônios bem definidos dentro das camadas
superficiais da medula espinhal e tratos neuronais descendentes, que podem
inibir a transmissão do sinal de dor (YAKSH, 2006).
A inflamação possui sinais clínicos clássicos, como eritema, calor,
inchaço e dor, que foram descritos no início da era clássica pelos gregos e
romanos (FANTONE & WARD, 1990). O quinto sinal da inflamação, lesão aguda
dos tecidos com perda da função dos órgãos, foi mencionado mais tarde por
Virchow, no século XIX (ROCHA & SILVA, 1978). Tais sinais estão diretamente
relacionados às várias fases do processo inflamatório, que é caracterizado por
três fases distintas, cada uma delas aparentemente mediada por mecanismos
diferentes: a primeira aguda, uma segunda subaguda relacionada à resposta
imune e migração celular e uma terceira proliferativa, com regeneração tecidual
e fibrose (COTRAN et al., 1996).
A inflamação, então, é geralmente associada a dano tecidual. As células
lesadas liberam enzimas do seu interior, que no ambiente extracelular degradam
ácidos graxos de cadeia longa, atuando sobre os cininogênios e dando origem à
formação das cininas. As cininas são pequenos polipeptídeos da α2-calicreína,
presente no plasma e nos líquidos orgânicos (RANG et al, 2004). A calicreína é
23
uma enzima proteolítica que é ativada pela inflamação e outros efeitos físicos e
químicos sobre o sangue e tecidos. Ao ser ativada, a calicreína atua
imediatamente sobre a α2-globulina, liberando a cinina calidina, que é então
convertida em bradicinina por enzimas teciduais. Uma vez formada, a
bradicinina provoca intensa dilatação arteriolar e aumento da permeabilidade
capilar, contribuindo para a propagação da reação inflamatória (STERANKA et
al., 1988). Através da ação da fosfolipase A sobre a membrana celular, tem-se a
produção e consequente liberação de ácido araquidônico. A reação das
ciclooxigenases sobre o ácido araquidônico culmina com a formação de
prostaglandinas, tromboxanos e prostaciclinas. Essas substâncias, sobretudo as
prostaglandinas E2, promovem diminuição do limiar de excitabilidade dos
nociceptores (ROCHA et al., 2007). Há também o recrutamento de macrófagos,
linfócitos e células migratórias, que liberam substâncias como interleucinas préinflamatórias, fator de necrose tumoral, óxido nítrico e fatores quimiotáticos,
contribuindo com a migração de mais células para o local da lesão.
Dessa forma, a inflamação caracteriza-se por um fenômeno complexo
multimediado geralmente associado à dor. Assim, a dor pode ser desencadeada
por lesões térmicas, traumas mecânicos, invasão com agentes infecciosos e
reações antígeno-anticorpo (KALANT & ROSCHESLAU, 1991). A liberação de
mediadores em tecidos inflamados pode sensibilizar fibras nociceptivas
periféricas, promovendo a facilitação central da transmissão nociceptiva
(SYRIÁTOWICZ et al., 1999; VANEGAS, 2004), levando a uma resposta
dolorosa aumentada a um estímulo nocivo, denominada hiperalgesia (TJØLSEN
& HOLE 1997; VANEGAS, 2004; SOMMER & KRESS, 2004; COUTAUX et al.,
2005). Alterações na percepção sensorial, envolvendo sensibilização central,
pode levar a alodínia, relacionada à dor evocada por um estímulo normalmente
não nocivo (MILLAN, 1999). Moncada e colaboradores (1978) sugeriram que a
dor inflamatória resulta da ação concomitante de dois tipos de estímulos nos
neurônios nociceptores. O 1º estímulo ativaria diretamente o influxo de Na+ e
isso seria responsável pela iniciação da ativação dos nociceptores (bradicinina,
histamina, estimulações mecânica e térmica). O 2º estímulo não geraria a
atividade do nociceptor, mas facilitaria sua ativação, sendo, provavelmente,
associado com um aumento das concentrações do AMPc/Ca ++ (LORENZETTI &
FERREIRA, 1985).
24
Esse estado inflamatório, persistente por horas ou mesmo dias, culmina
com a hipersensibilização dos nociceptores periféricos, levando às sensações
de hiperalgesia e alodínia. Essa sensibilização também pode ocorrer no nível do
corno dorsal, sendo chamada sensibilização central. Assim, mecanismos de
amplificação possibilitam o recrutamento de neurônios periféricos, normalmente
não associados à dor, para que evoquem sensações dolorosas (BROOKS &
TRACEY, 2005).
Os estudos no campo da dor são inúmeros e os conhecimentos cada vez
ganham maior amplitude buscando melhorar as terapias e diminuir o sofrimento
de tantos, neste sintoma que acompanha inúmeras patologias. Entender os
diferentes tipos de dor é acima de tudo entender seus mecanismos fisiológicos,
e a função da pesquisa tem sido o desenvolvimento de novas estratégias
terapêuticas para o controle da dor baseadas no conhecimento dos mecanismos
analgésicos (BESSON, 1997).
O
maior
impacto
da
dor,
especialmente
sobre
a
população
economicamente ativa, é a susceptibilidade a implicações financeiras. Vários
estudos têm demonstrado o impacto das patologias associadas à dor no
trabalho. Dados publicados por Steward e colaboradores (2003) sobre a força de
trabalho nos Estados Unidos, relatam um gasto aproximado de $ 61,2 bilhões de
dólares por ano devido à perda de produtividade relacionada à dor. Além disso,
a perda de performance dos trabalhadores diminui aproximadamente 69,7%
para indivíduos com dores nas costas e 84,4% para indivíduos acometidos de
artrite (STEWART et al, 2003).
A terapia atualmente disponível falha quanto a sua eficácia e efeitos
colaterais relacionados. Entre os indivíduos que possuem enxaquecas nos
Estados Unidos, apenas 41% relata ter recebido alguma prescrição de
medicamentos específicos para o tratamento de enxaqueca, sendo que 29%
destes indivíduos afirmam estar apenas moderadamente satisfeitos com o seu
tratamento (STEWART et al, 2003). No Brasil, a dor está presente em mais de
70% dos pacientes que buscam os consultórios médicos por motivos diversos,
sendo a razão das consultas em um terço dos casos. Esse argumento enfatiza a
importância da busca de elementos que permitam uma melhor abordagem da
dor aguda e crônica (ROCHA et al., 2007).
25
2. JUSTIFICATIVA
A população ao utilizar de forma leiga os seus recursos naturais ao
mesmo tempo em que gera preciosas informações etnofarmacológicas também
apresenta o risco de efeitos indesejáveis e mesmo de intoxicações sérias
advindas do mau uso dos remédios naturais. Assim sendo, cabe à ciência
ordenar esses conhecimentos de maneira que o conhecimento empírico seja
resguardado e transformado em conhecimento real de novos produtos
fitoterápicos, sejam na forma de extratos ou mesmo de substâncias isolados.
Assim, estas substâncias possam ser fármacos com atividade biológica
comprovada e estabelecida, com potencial de ação, biodisponibilidade, uso
clínico e efeitos colaterais conhecidos.
A inserção da Universidade Federal de Rondônia (UNIR) na região
Amazônica torna mais veemente a necessidade de pesquisa com espécies
naturais desta região com potenciais farmacológicos cabendo tanto a pesquisa
de novos fitoterápicos desde o resgate da utilização empírica desses vegetais
pela população,
descoberta de novas estruturas químicas e
estudos
farmacológicos de interesse, quanto contribuindo na formação dos alunos na
área da Saúde pelo vasto campo de pesquisa que representa, interligando
disciplinas e cursos afins, o que culmina na criação atual do laboratório de
farmacologia de produtos naturais, assim a formação de pessoal qualificado bem
como a rotina de trabalho com as técnicas de atividades farmacológicas em
produtos naturais tornar-se-á uma realidade local, fato este que não existe
atualmente, uma vez que temos que enviar nossas amostras para outros centros
especializados.
Assim a determinação da atividade biológica de extratos vegetais através
de métodos farmacológicos e clínicos contemplará vasto trabalho de pesquisa
regional e contribuirá diretamente com a instituição que a realiza de forma
prática e direta.
A importância do conhecimento fitoquímico vai de encontro ao estudo
farmacológico onde se busca um extrato fitoterápico que, acompanhado de
ensaios que determinem a eficácia das frações isoladas, colaboram na
identificação da substância ativa através de um ensaio farmacológico que
26
determinam um procedimento correto, orientado para as etapas de esgotamento
da droga de modo ordenado, até o isolamento do(s) princípio(s) ativo(s)
(SIXEL,P.J. & PECINALLI, N.R.,2005). Os estudos farmacológicos abrangentes
dos
extratos
padronizados
poderão
subsidiar
estudos
farmacológicos
preliminares em modelos experimentais relevantes, relativos á ação terapêutica,
bem como á estudos clínicos posteriores na fase farmacodinâmica in vivo.
Os estudos de obtenção de novos fármacos mostram que há uma maior
probabilidade de encontrar um fármaco com grande valor terapêutico nos países
em desenvolvimento através do estudo de fitoterápicos e das plantas medicinais
do que pela obtenção sintética (LAPA, 1995) e face a nossa imensa
biodiversidade e tradição no uso das plantas medicinais poderíamos disputar
uma parcela significativa dos muitos milhões de dólares que movimenta esse
mercado (CALIXTO, 2003).
A escolha do gênero Piper justifica-se pela grande variedade de espécies
com
relevante
variedade
de
constituintes
químicos
com
propriedades
farmacológicas potenciais para o estudo da farmacologia na possibilidade de
descobertas de novos compostos que ainda não foram estudados sob o ponto
de vista fitoquímico e farmacológico. Ainda pelas elucidações estruturais das
substâncias comuns no gênero Piper que estão sendo realizadas na
Universidade
Federal
de
Rondônia,
contribuindo
também,
com
a
quimiossistemática deste gênero.
Outro fator de grande importância na escolha desta espécie é o fato das
substâncias isoladas piplartina e dihidropiplartina, assim como o ácido 3,4,5trimetóxi-dihidrocinâmico, serem encontradas abundantemente na Região
Amazônica e muito utilizadas pela população local, na forma de produto natural
através do uso de Piper tuberculatum Jacq.
27
3. OBJETIVOS
3.1 - Objetivo Geral
Isolar e identificar os constituintes químicos presentes nos frutos da
espécie Piper tuberculatum Jacq, bem como avaliar e comparar a atividade
antinociceptiva e antiinflamatória dos extratos obtidos em diferentes solventes e
dos constituintes químicos isolados.
3.2 - Objetivos Específicos
- Obter os extratos em diferentes solventes a partir dos frutos de Piper
tuberculatum Jacq;
- Realizar, através de métodos cromatográficos o isolamento dos
constituintes químicos presentes nos frutos de Piper tuberculatum Jacq;
- Identificar as estruturas dos constituintes químicos isolados, através de
métodos espectroscópicos;
- Verificar os efeitos antinociceptivos (analgésicos) dos extratos e
constituintes químicos isolados dos frutos de Piper tuberculatum Jacq em
modelos de nocicepção (dor) química (testes do ácido acético e formalina) em
camundongos.
- Verificar um possível efeito sedativo e músculo-relaxante dos
constituintes químicos isolados.
- Verificar, com o emprego de técnicas farmacológicas in vivo, o(s)
possível(is)
mecanismo(s)
envolvido(s)
no
efeito
antinociceptivo
dos
28
constituintes químicos isolados, em modelos de nocicepção (dor) química (testes
do ac. acético, formalina, capsaicina, glutamato), hipernocicepção térmica e
mecânica, bem como o envolvimento dos sistema opióide e sistema de cininas.
- Avaliar o potencial efeito antiinflamatório dos constituintes químicos
isolados no modelo de pleurisia induzida por carragenina, em camundongos.
- Verificar o efeito antinociceptivo do extrato etanólico de Piper
tuberculatum Jacq e dos compostos isolados no modelo de nocicepção induzida
pelo veneno de Bothrops jararaca.
29
4. MATERIAL E MÉTODO
Os isolamentos e as purificações dos constituintes químicos de Piper
tuberculatum Jacq foram realizados no Laboratório de Pesquisa em Química de
Produtos Naturais - LPQPN na Universidade Federal de Rondônia - UNIR em
Porto Velho - RO.
As
análises
farmacológicas
foram
realizadas
no
Laboratório
da
Neurobiologia da Dor e da Inflamação, da Universidade Federal de Santa
Catarina, sob responsabilidade do professor Dr. Adair Roberto Soares dos
Santos, cujo protocolo do Comitê de Ética é CEUA 23080.003593/200884/UFSC.
4.1- Material Botânico
4.1.1 - Coleta e Identificação do material botânico
Os frutos de Piper tuberculatum Jacq foram coletados no bairro Areal no
município de Porto Velho, Rondônia em Setembro de 2005 (para identificação),
e no período de abril de 2006 a outubro de 2007 (para análise fitoquímica e
farmacológica) A identificação botânica da planta foi realizada pelo Dr. José
Gomes do herbário do Instituto Nacional de Pesquisa da Amazônia (INPA), onde
uma exsicata encontra-se depositada sob o número 211724.
4.1.2 - Obtenção dos extratos
4.1.2.1 - Obtenção dos extratos e isolamento dos constituintes químicos para
análise fitoquímica.
Os frutos de Piper tuberculatum Jacq (1,3 Kg), foram secos em estufa a
60 ºC, sob ventilação, durante 24h e triturados manualmente. A preparação dos
30
Frutos Piper tuberculatum secos
e triturados (1,3 Kg)
Extração com etanol (3L x3) a
temperatura ambiente, durante 3
dias
Destilação sob pressão
reduzida
Extrato etanólico
Sílica gel
Coluna Cromatográfica
1-hexano
2-clorofórmio
3-Acetato Etila
4-Metanol
Eluato hexânico
Eluato clorofórmio
Eluato acetato etila
Eluato metanol
Cromatografia Camada Delgada
(comparação cromatográfica)
Cromatografia Coluna
Ativos isolados
Figura 4: Diagrama de fluxo de obtenção dos extratos e isolamento dos
constituintes químicos dos frutos de Piper tuberculatum Jacq (analise
fitoquímica)
31
extratos foi feita através de maceração, onde os frutos foram extraídos com
etanol (3L x 3) à temperatura ambiente, durante 3 dias. Após a filtragem, o
solvente obtido foi destilado sob pressão reduzida (Figura 4). Parte deste
material foi adsorvida em sílica gel e a mistura, sob a forma de pastilha, foi
colocada em uma coluna cromatográfica e eluída com hexano, clorofórmio,
acetato de etila e metanol. Utilizou-se a cromatografia em camada delgada
(CCD) para comparação cromatográfica e a cromatografia em coluna de sílica
gel para isolamento dos ativos.
4.1.2.2 - Obtenção dos extratos para análise farmacológica.
Os extratos hexânico, diclorometano, acetato de etila e metanólico dos
frutos de espécie Piper tuberculatum Jacq foram preparados conforme a
descrição a seguir:
4.1.2.2.1 - Extrato hexânico
Os frutos de Piper tuberculatum (1,4 Kg) foram submetidos a duas
extrações com hexano (2 x 2,5 litros) por três dias cada, a temperatura ambiente
e posterior evaporação do solvente em evaporador rotativo e a pressão
reduzida.
4.1.2.2.2 - Extrato diclorometano
Os frutos após terem sidos extraídos com hexano (1,3 Kg) foram
submetidos a duas extrações com diclorometano (2 x 2,2 litros) por três dias
cada, a temperatura ambiente e posterior evaporação do solvente em
evaporador rotativo e a pressão reduzida.
4.1.2.2.3 - Extrato acetato de etila
Os frutos após terem sidos extraídos com diclorometano (1,2 Kg) foram
submetidos a duas extrações com acetato de etila (2 x 2,3 litros) por três dias
32
cada, a temperatura ambiente e posterior evaporação do solvente em
evaporador rotativo e a pressão reduzida.
4.1.2.2.4 - Extrato metanólico
Os frutos após terem sidos extraídos com acetato de etila (1,0 Kg) foram
submetidos a duas extrações com hexano (2 x 2,3 litros) por três dias cada, a
temperatura ambiente e posterior evaporação do solvente em evaporador
rotativo e a pressão reduzida.
4.2 - Materiais e métodos cromatográficos
Nas cromatografias de adsorções em colunas foram utilizadas gel de
sílica 60 da Merck e da Vetec (
m 63-200). O comprimento e diâmetro da
coluna variaram de acordo com as quantidades de amostras a serem
cromatografadas e de gel de sílica a serem utilizadas. Para cromatografia em
camada (CCD) utilizou-se cromatoplacas de gel de sílica 60 (
m 2-25) sobre
poliéster T – 6145 da Sigma Chemical CO (com indicador de fluorescência na
faixa de 24 m).
Os solventes utilizados nas eluições cromatográficas foram: hexano,
acetato de etila e metanol, puros ou combinados em gradiente crescente de
polaridade.
As revelações das substâncias cromatografadas em CCD se deram por
exposição das cromatoplacas analíticas à luz ultravioleta (UV), reveladas em um
comprimento de onda (254
m) e por pulverização com revelador universal
(mistura de etanol: ácido acético: ácido sulfúrico – 8:1:1), seguido de
aquecimento em estufa a 100ºC por aproximadamente alguns segundos.
33
4.3 - Materiais e métodos espectroscópicos
Os espectros apresentados neste trabalho foram obtidos em aparelhos
pertencentes ao Instituto de Química da Universidade Federal do Rio de Janeiro,
Central Analítica da Universidade Federal do Ceará e na Universidade Federal
de Rondônia. Os modelos e condições dos aparelhos para a caracterização das
substâncias isoladas estão descritas abaixo:
4.3.1 - Espectros de massas (E.M)
Os espectros de massas foram registrados por impacto eletrônico (70 eV)
em um aparelho GC/MS Hewlett - Packard 5971 usando coluna capilar (30 m x
0,25 mm) dimetilpolisiloxano BD-1, He como gás de arraste e as temperaturas
de 250ºC no injetor, 200oC no detector e na coluna variando 1 º/min entre 35 180º C e 10ºC/min no intervalo de 180 - 250ºC.
4.3.2 - Ressonância magnética nuclear de hidrogênio-1H (RMN 1H) e de
carbono -– 13C (RMN 13C)
Os espectros de RMN unidimensionais e bidimensionais foram registrados
em espectromêtros Bruker AC – 200 e 500, operando a 200 e 500 MHz para
hidrogênio – 1 (RMN 1H) e 50 e 125 MHz para carbono –
13
C (RMN
13
C). As
seqüências de pulsos utilizadas nas experiências bidimensionais estão contidas
nos programas Bruker XHCORREAU, para correlação heteronuclear de
hidrogênio – 1 e carbono –
13
C a uma ligação e a longa distância (1H x
1
13
C –
1
COSY, JCH, n = 1, 2 e 3) e COSY – UA, para correlação homonuclear ( H x H –
COSY). Os espectros de
1
H e
13
C foram referenciados de acordo com o
deslocamento químico do CDCl3. Nos experimentos unidimensionais de DEPT
UA (ângulo de mutação 1350). Os deslocamentos químicos ( ) foram expressos
em partes por milhão (ppm) e as multiplicidades dos deslocamentos indicados
segundo a convenção: s (singleto), sl (singleto largo), d (dubleto), dd (duplo
dubleto), t (tripleto), q (quarteto) e m (multipleto).
34
4.4 - Animais
Foram utilizados camundongos Swiss (30-40g) e ratos Wistar (180-250g)
de ambos os sexos, obtidos do Biotério Central da UFSC, aclimatados a 22 ±
2ºC, em um ciclo/escuro de 12 h (luzes acesas às 7 h), e tratados com água e
ração ad libitum. Os animais foram mantidos no laboratório 1 hora antes da
realização dos experimentos para aclimatação. Todos os experimentos foram
conduzidos de acordo com as normas internacionais para o estudo com animais
de laboratório, e o número de animais e a intensidade do estímulo nocivo
usados foram o mínimo necessário para demonstrar efeitos consistentes nos
tratamentos (ZIMMERMANN, 1983).
4.5 - Preparação das amostras para realização de testes em animais
Os extratos e compostos puros da espécie Piper tuberculatum Jacq foram
dissolvidos em Tween 80 (Merck AG, Darmstadt, Germany) e diluídos antes do
uso em NaCl 0,9%. A concentração final de Tween 80 não excedeu 5% , o que
não apresenta nenhum efeito por si só.
4.6 - Avaliação da atividade antinociceptiva
4.6.1 - Testes de contorções abdominais induzidas pelo ácido acético
(0,6%) em camundongos
Foi analisado o efeito dos extratos etanólico (Et 10 – 300 mg/Kg), acetato
de etila (AcE 10 – 300 mg/Kg), diclorometano (DCM 10 – 300 mg/Kg), metanol
(Met 3 – 100 mg/Kg) e hexano (Hex 30 – 300 mg/Kg) e dos compostos isolados
Dihidropiplartina (Dih-Pip 0,01 – 1 mg/Kg), Piplartina (Pip 1 – 30 mg/Kg) e Ácido
3,4,5-trimetóxi-dihidrocinâmico (TMDC 0,0001 – 1 mg/Kg) no teste de
contorções induzidas por ácido acético de acordo com o método descrito por
Santos et al. (1999). As contorções consistem em uma contração da
musculatura abdominal, acompanhada da extensão das patas posteriores
35
(COLLIER et al., 1968). Os animas receberam o estímulo 60 min após o
tratamento via oral e 30 min após o tratamento via i.p. Após a injeção
intraperitoneal de 450 µl de ácido acético 0,6%, os animais foram colocados
individualmente em funis de vidro, e as contorções contadas cumulativamente
durante 20 min. O grupo controle foi tratado com veículo (10 mg/Kg, i.p. ou v.o.).
4.6.2 - Nocicepção induzida pela formalina (0,92% de formaldeído) em
camundongos
Para confirmação do efeito antinociceptivo dos compostos isolados de
Piper tuberculatum, foi utilizado o teste de nocicepção induzida pela formalina,
que permite avaliar a nocicepção de origem neurogênica (estimulação direta dos
neurônios nociceptivos; 1º fase, 0–5 min) e a nocicepção de origem inflamatória
(caracterizada pela liberação de mediadores envolvidos na inflamação; 2º fase,
15–30 min). O procedimento utilizado foi similar ao descrito anteriormente
(Santos et al., 1999). Os animais receberam 20μl de formalina a 2,5% (0,92% de
formaldeído) na região intraplantar da pata posterior direita. O tempo em que o
animal permaneceu lambendo ou mordendo a pata injetada com formalina foi
cronometrado, sendo este comportamento considerado como indicativo de
nocicepção. Os animas foram tratados pela via intraperitoneal com os
compostos isolados Dih-Pip (0,01 – 1 mg/kg), Pip (1 – 30 mg/kg) ou TMDC
(0,0001 – 1 mg/kg), ou apenas salina (grupo controle, 10 mg/kg), 30 min antes
da injeção irritante.
4.6.3 - Nocicepção induzida por capsaicina em camundongos
A fim de se evidenciar o efeito do composto TMDC sobre a nocicepção
espontânea provocada pela ativação direta de fibras C sensíveis a capsaicina,
os animais receberam uma injeção intraplantar de capsaicina (1,6 µg/pata, 20
µl), e o tempo em que o animal permaneceu lambendo e/ou mordendo a pata
injetada foi considerado como indicativo de nocicepção (SANTOS & CALIXTO,
1997). Os animais foram pré-tratados com o composto TMDC (0,0001 – 1
36
mg/kg) ou salina (grupo controle, 10 mg/kg), 30 min antes da injeção de
capsaicina. Após receberem o estímulo, os animais foram colocados
individualmente em funis de vidro, e a nocicepção foi cronometrada
cumulativamente durante 5 min
4.6.4 - Nocicepção induzida por glutamato em camundongos
Através desse modelo, pretendeu-se analisar a possível ação modulatória
do composto TMDC sobre a nocicepção induzida por glutamato (20 µmol/pata),
sendo que este neurotransmissor é um dos mais importantes na modulação da
nocicepção e antinocicepção (BEIRITH et al., 2002). Os animais foram tratados
com o composto TMDC (0,1 – 30 mg/kg) ou salina (grupo controle, 10 mg/kg) via
intraperitoneal 30 min antes de receberem a injeção de 20 µl de glutamato na
pata posterior direita. O tempo em que o animal permaneceu lambendo e/ou
mordendo a pata injetada foi cronometrado durante 15 min, sendo este tempo
considerado como indicativo de nocicepção. Os procedimentos utilizados foram
similares aos descritos anteriormente (SANTOS & CALIXTO, 1997).
4.6.5 - Efeito sobre a atividade locomotora de camundongos
Visando verificar um possível efeito sedativo ou músculo-relaxante do
composto TMDC, os animais foram submetidos ao teste Rota Rod (SANTOS et
al., 1999) e campo aberto (RODRIGUES et al., 1996). O teste do campo aberto
consiste em uma caixa retangular (40 cm x 50 cm x 60 cm), cujo chão é dividido
em 12 quadrados de mesma área. O número de cruzamentos efetuados com as
quatro patas foi cumulativamente contado durante 6 min. O aparelho Rota Rod
(Ugo Basile, Modelo 7600) consiste numa barra com 2,5 cm de diâmetro,
subdividida em quatro compartimentos por discos de 25 cm de diâmetro. A barra
é dotada de rotação constante (21 rotações/minuto), sendo mensurado o tempo
em que o animal permaneceu na barra por três períodos consecutivos de 60 s.
Em ambos os experimentos, os animais foram pré-tratados com TMDC (0,1 – 10
37
mg/Kg, i.p.) ou salina (10 mg/Kg, i.p.), 30 min antes de serem submetidos aos
testes.
4.6.6 - Hipernocicepção mecânica e térmica em ratos
O possível efeito anti-hipernociceptivo mecânico e térmico do composto
TMDC foi avaliado utilizando os métodos descritos por Randall & Selitto (1957) e
Hargreaves e colaboradores (1988), respectivamente. O peso no analgesímetro
varia de 0 a 750 g e o limiar nociceptivo foi expresso como carga tolerada (em
g). Para o limiar nociceptivo térmico os ratos foram habituados ao ambiente
aproximadamente 10 min antes da realização do teste, e as latências de retirada
da pata foram registradas automaticamente com luz fotossensível. O tempo de
corte utilizado para o experimento foi de 20 s, para evitar possíveis danos
teciduais. Ratos foram tratados com 100 l de carragenina (300 ng/pata), BK (3
nmol/pata), PGE2 (10 nmol/pata), PMA (100 µmol/pata), ou somente salina
(grupo controle, 10 mg/kg), na região intraplantar da pata posterior direita. A
hipernocicepção foi avaliada 4 horas após a injeção de carragenina e 30 min
após a injeção das demais substâncias. No modelo de hipernocicepção induzida
por BK, os animais foram pré-tratados com inibidor da enzima conversora da
angiotensina, captopril (5 mg/Kg, i.p.), 1 hora antes dos experimentos, para
prevenir a degradação da BK (Otuki et al., 2005). Os animais foram pré-tratados
com o TMDC (0,1 – 10 mg/Kg, i.p.) ou salina (grupo controle, 10 mg/Kg, i.p.), 30
min antes da administração dos agentes irritantes.
4.6.7 - Participação do sistema opióide
Com o objetivo de evidenciar uma possível participação do sistema
opióide sobre a atividade antinociceptiva do composto TMDC, os animais
(camundongos) foram pré-tratados com o antagonista não seletivo dos
receptores opióides, naloxona (1 mg/Kg, i.p.), 20 min antes da administração do
TMDC (10 mg/Kg, i.p.) ou de morfina (agonista não seletivo dos receptores
opioides, 5 mg/Kg, s.c.), utilizada como controle positivo. Decorridos 30 minutos
38
após a administração do composto ou da injeção subcutânea de morfina, foi
avaliado o efeito desse tratamento em relação à nocicepção induzida pela
injeção intraperitoneal de ácido acético. O grupo controle foi tratado com salina
(10mg/Kg).
4.6.8 - Participação do sistema de cininas
O possível efeito do composto TMDC sobre a ação periférica de
mediadores inflamatórios, em especial a bradicinina (BK), foi analisado através
da injeção de BK na parte ventral da pata posterior direita (adaptado de Ferreira
et al., 2004). Os animais (ratos Wistar) foram pré-tratados com TMDC (0,1 – 10
mg/Kg, i.p.) ou salina (10 mg/Kg, i.p.) 30 min antes da injeção de 100 µl de BK (3
nmol/pata) na região plantar da pata posterior direita, sendo avaliado o tempo
em que o animal permaneceu lambendo e/ou mordendo a pata injetada durante
10 min. Com o objetivo de se avaliar a ação do composto TMDC nos receptores
BK em nível central, 0,1 μg/sítio de BK foi administrado via i.t., conforme descrito
anteriormente por Savegnago e colaboradores (2007). Os animais foram
previamente tratados com o composto TMDC (0,1 – 10 mg/Kg, i.p.) ou salina (10
mg/Kg, i.p.) (grupo controle).
4.7 - Avaliação do efeito antiinflamatório em camundongos
Através deste modelo, adaptado de Nardi (2007), pretendeu-se verificar a
atividade antiinflamatória do composto TMDC. Os animais foram pré-tratados
com Azul de Evans (usado para mensurar a permeabilidade capilar na cavidade
pleural (adaptado de LUCENA et al., 2007; 2,5 mg/Kg), 30 min antes da
administração do composto isolado TMDC (0,1 – 10 mg/Kg, i.p.) ou salina (grupo
controle; 10 mg/Kg, i.p.). Após 30 min, os animais receberam 0,2 ml de
carragenina 0,1% ou salina 0,9% (grupo controle) na cavidade pleural.
Decorridas 4 horas da injeção de carragenina, o exsudato pleural foi removido,
sendo avaliado o número total e diferencial de células, além do extravasamento
plasmático através da absorbância (600nm) em espectrofotômetro.
39
4.8 - Nocicepção induzida pelo veneno extraído de Bothrops jararaca
A fim de se comprovar um efeito real da espécie Piper tuberculatum Jacq
sobre mordidas de serpentes, seu extrato etanólico, bem como o composto
isolado TMDC, foram testados no modelo de nocicepção espontânea induzida
pelo veneno extraído de Bothrops jararaca (BjV). A padronização do modelo e
as doses utilizadas foram baseadas em estudos previamente encontrados na
literatura (CHACUR et al, 2002), e os resultados comparados com os de outros
modelos experimentais já estabelecidos na comunidade científica. Assim,
padronizou-se a dose de 1 µg/pata para indução da nocicepção espontânea em
camundongos. Os animais receberam uma injeção de 20 µl de solução contendo
1 µg de BjV (diluído em solução salina) na região ventral da pata posterior
direita, e a nocicepção espontânea (tempo em que o animal permaneceu
lambendo e/ou mordendo a pata injetada) foi cronometrada durante 30 min. Os
animais foram pré-tratados com o extrato etanólico (30 – 1000 mg/Kg, v.o., 1 h
antes) e TMDC (0,1 – 100 mg/Kg, via i.p., 30 min antes).
4.9 - Análise estatística
Os resultados estão apresentados como média
erro padrão da média
(EPM), exceto as DI50 (doses dos extratos e compostos isolados capazes de
reduzir 50% da resposta nociceptiva quando comparado com o grupo controle),
que são apresentadas como médias geométricas acompanhadas de seus
respectivos limites de confiança, em nível de 95%. As DI 50 foram estimadas a
partir de experimentos individuais utilizando o método de regressão linear
através do programa “Graph Pad Prism” (2005, San Diego, CA).
A análise estatística dos resultados foi realizada por meio de análise de
variância (ANOVA), seguido pelo teste de múltipla comparação utilizando o
método de Newman Kuels, para os dados paramétricos. Para os dados nãoparamétricos (2 grupos independentes), a diferença estatística foi determinada
através do teste de Mann-Whitney. Valores de p < 0,05 foram indicativos de
significância.
40
5. RESULTADOS
5.1 - Obtenção dos extratos e dos constituintes químicos para análise
fitoquímica.
Os frutos de Piper tuberculatum Jacq (1,3 Kg) foram extraídos com etanol
à temperatura ambiente, durante 3 dias. O solvente foi destilado sob pressão
reduzida e forneceu 41 g (3,2% de rendimento) de uma massa de coloração
marrom (extrato etanólico). Parte deste material (35 g) foi adsorvida em sílica gel
(90 g) e a mistura, sob a forma de pastilha, foi colocada em uma coluna
cromatográfica e eluída com hexano, clorofórmio, acetato de etila e metanol.
O extrato obtido em clorofórmio (9,3 g) foi novamente submetido à
cromatografia em coluna de gel de sílica e eluído com misturas de hexano e
clorofórmio em gradiente de polaridade crescente, obtendo-se 83 frações.
As frações 32 a 54 foram reunidas, após comparação em cromatografia
em camada delgada (CCD), e a fração resultante foi submetida à cromatografia
em coluna de sílica gel, eluída com hexano e acetato de etila em gradiente de
polaridade crescente, obtendo-se 115,8 mg de um sólido chamado Pip
(hexano:acetato de etila, 55:45), 221,5 mg de um sólido chamado Dih-Pip
(hexano:acetato de etila, 45:55) e 54,8 mg de um sólido chamado TMDC
(hexano:acetato de etila, 35:65).
5.2 - Rendimento dos extratos para análise farmacológica
A tabela 1 mostra os valores de rendimentos obtidos dos extratos
hexânico, diclorometano, acetato de etila e metanólico dos frutos de Piper
tuberculatum.
41
Tabela 1. Rendimento dos extratos obtidos dos frutos de Piper tuberculatum
Jacq
Massa
Massa obtida
Rendimento
Coloração do
seca (Kg)
(g)
(%)
extrato
Hexânico
1,4
11,0
0,78
verde
Diclorometano
1,3
7,6
0,35
verde
Acetato Etila
1,2
8,0
0,67
marrom
Metanólico
1,0
6,0
0,6
marrom
Extratos
5.3 - Rendimento dos constituintes químicos isolados dos extratos obtidos
para analise farmacológica.
Os compostos Pip, Dih-Pip e TMDC foram isolados dos frutos de Piper
tuberculatum Jacq e encaminhados para identificação mediante métodos
espectroscópicos. Simultaneamente foram isolados estes mesmos compostos a
partir dos extratos para serem utilizados na analise farmacológica. Por tal motivo
uma parte dos extratos obtidos (Tabela 1) foi utilizada para isolar os compostos
conforme a descrição a seguir:
Parte do extrato hexânico (4,5g) foi submetido a cromatografia em coluna
de sílica gel, eluido com uma mistura de hexano e diclorometano em gradiente
de polaridade crescente, produzindo um total de 83 frações. As frações 32-54
foram reunidas, após comparação em cromatografia em camada delgada (CCD),
combinadas e purificadas por recristalização com clorofórmio, resultando em
206,6 mg (4,58%) de um composto branco amorfo que após análises
espectroscópicas identificou-se como o composto Dih-Pip como se mostra na
figura 5.
Assim como o extrato hexânico, o extrato diclorometano (5,1g) foi
submetido a cromatografia em coluna e eluido com hexano da mesma forma,
resultando em 15 frações. A fração 9 foi ressubmetida em cromatografia em
coluna e eluída no mesmo gradiente acima, obtendo-se 7,1 mg (0,14%) de um
sólido branco amorfo que após análises espectroscópicas identificou-se como o
composto Pip.
42
Material
vegetal
Maceração com etanol
Extrato
hexânico
Extrato
diclorometano
noano
Extrato
acetato etila
Extrato
metanolico
Cromatografia coluna gel de sílica 60 (MERK: 0,063-0,200mm)
(1- 83) Frações
hexânicas/DCM
(polaridade crescente)
1-Reunir frações 32-54,
2-Comparação CCD,
3- Recristalização
clorofórmio
Dih-Pip (206,6mg)
(1- 15) Frações
hexânicas
Fração 9 resubmetida a
cromatografia em coluna e
eluida com hexâno
Pip (7,1mg)
Frações:
Hexânicas
Hexano/Clorofórmio
Clorofórmio
Clorofórmio/metanol
Metanol
TMDC (230,2 mg)
Pip (37mg)
Ensaios Biológicos
Figura 5: Fracionamento e isolamento dos metabolitos presentes nos
frutos de Piper tuberculatum Jacq
43
O extrato acetato de etila (5,1g) foi submetido a cromatografia em coluna
,eluido com hexano, hexano/clorofórmio, clorofórmio, clorofórmio/metanol e
metanol com aumento de polaridade , resultando em 37,0 mg (0,72%) e 230,2
mg
(4,51%),
ambos
sólidos
brancos
amorfos
que
após
análises
espectroscópicas identificou-se, respectivamente como Pip e TMDC.
5.4 - Determinação estrutural do composto Pip
O composto Pip, sólido branco amorfo, com ponto de fusão 123-124ºC e
solúvel em clorofórmio, foi isolado no eluato clorofórmio utilizando como eluente
hexano:acetato de etila, 55:45.
O espectro de ressonância magnética nuclear de hidrogênio-1 (RMN-1H)
(Figura 6), apresentou uma absorção em
6,81 (2H, s) que pode ser atribuído a
dois hidrogênios de um sistema de anel aromático tetra-substituído.
3000
2.458
2.462
2.467
2.471
3.830
3.863
3.878
4.012
4.025
4.038
6.022
6.042
6.794
6.924
6.943
7.398
7.429
7.646
7.677
2500
2000
1500
1000
500
0
8.0
ppm (f1)
7.0
6.0
5.0
4.0
3.0
2.0
Figura 6: Espectro de RMN-1H (500 MHz) do composto Pip, obtido em CDCl3
44
Uma absorção, neste mesmo espectro, em
3,89 (s) que pela integração
corresponde a nove átomos de hidrogênio é compatíveis com a presença de três
grupamentos metoxilas. Duas absorções em
7,68 (1H, d, J=15,8 Hz) e 7,48
(1H, d, J=15,8 Hz) são compatíveis com uma ligação dupla trans-carbonocarbono.
O espectro de ressonância magnética nuclear de carbono -13 - Broad
Band (RMN13C-BB) (Figura 7), revelou a presença de dez absorções
relacionadas a átomos de carbonos olefínicos, sendo dois correlacionados a
dois grupos carbonilas
, -insaturadas em
165,3 e 169,0. Este mesmo
espectro confirmou a presença dos três grupamentos metoxilas, os quais
absorveram em
2 x 56,1 e 60,9.
25000
24.961
41.812
56.340
61.102
76.985
77.239
77.494
105.699
121.259
125.947
130.805
143.934
145.713
153.509
169.025
20000
15000
10000
5000
0
150
100
50
ppm (f1)
Figura 7: Espectro de RMN 13C-BB (125 MHz) do composto Pip, obtido em
CDCl3
O espectro de RMN
13
C bidimensional de interação heteronuclear 1H-13C
(HMQC) (Figura 8), revelou que das dez absorções relacionadas a carbonos
45
olefínicos, observadas no espectro de RMN
13
C-BB, cinco correspondem a
átomos de carbonos mono-hidrogenados (CH) e cinco não-hidrogenados (C).
0
50
100
150
200
ppm (f1)
5.0
0.0
ppm (f2)
Figura 8: O espectro de RMN 13C bidimensional de interação heteronuclear
1
H -13C do composto Pip
A presença de dois átomos de carbonos não-olefínicos, excluindo os
átomos de carbonos dos grupamentos metoxilas, foram observados no espectro
de RMN
13
C-BB em
24,6 e 41,5. Os átomos de hidrogênios ligados a estes
átomos de carbonos são observados no espectro de RMN
13
C (HMQC) em
2,48 (m) correspondente a absorção do átomo de carbono o qual absorveu em
24,6 e em
4,04 (2H, d, J=6,2 Hz) correspondente a absorção do átomo de
carbono o qual absorveu em
41,5. Estas absorções observadas para os
átomos de hidrogênios e de carbonos podem perfeitamente serem atribuídas a
um grupamento etileno (-CH2CH2-) ligado a um átomo de nitrogênio e a um
átomo de carbono olefínico.
46
O espectro de massas do composto Pip (Figura 9) exibiu o pico íon
molecular em M+ em m/z 317 unidades de massa atômica (u.m.a), compatível
com a fórmula molecular C17H19NO5. Esta fórmula, também, é compatível com
uma molécula contendo nove graus de insaturações.
Figura 9: Espectro de massa (70 eV) do composto Pip
Todos estes dados e comparação dos dados de RMN-1H e
com dados de RMN-1H e
13
C de Pip
13
C descrito na literatura para a Piplartina [14]
(Facundo et al., 2008) levaram a propor a estrutura da mesma para Pip.
O
H3CO
1'
1
3
9
8
H3CO
6
4
O
7
2
5
2'
N
3'
5'
4'
OCH3
Figura 10: Estrutura química proposta para o composto Pip
47
Na tabela 2, encontram-se os dados de RMN 1H e
13
C do composto Pip e
da Piplartina [14].
Tabela 2. Dados dos deslocamentos químicos dos espectros RMN de 1H
e 13C de Pip e da Piplartina [14]
Pip*
C
Piplartina [14]**
C
H
1
130,0
3
153,0
4
140,0
5
H
130,6
-
153,3
-
-
140,1
-
153,0
-
153,3
-
9
168,5
-
168,8
-
1’
165,3
-
165,8
-
-
-
-
-
CH
-
C
2
105,6
6,81 (s)
105,4
6,81 (s)
6
105,6
6,81 (s)
105,4
6,81 (s)
7
143, 3 7,68 (d, J = 15,8 Hz)
143,7
7,65 (d)
8
121,0
7,48 (d, J = 15,8 Hz)
121,0
7,68 (d)
2’
125,7
6,05 (dd, J = 9,9; 1,8 Hz)
125,8
6,04 (dd)
3’
145,5
6,95 (td, J = 9,9; 4,8 Hz)
145,5
6,93 (m)
-
-
-
CH2
-
4’
24,6
2,48 (m)
24,7
2,48 (m)
5’
41,5
4,04 (d, J=6,2 Hz)
41,6
4,05 (m)
-
-
-
CH3
-
CH3O-3
56,1
3,89 (s)
56,6
3,85(s)
CH3O-4
60,9
3,89 (s)
61,0
3,85(s)
CH3O-5
56,1
3,89 (s)
56,6
3,85(s)
* obtido em CDCl3
** Facundo (2008)
48
5.5 - Determinação estrutural do composto Dih-Pip
O composto Dih-Pip, sólido branco amorfo, com ponto de fusão 145155ºC e solúvel em clorofórmio, foi isolado no eluato clorofórmio utilizando como
eluente hexano:acetato de etila, 45:55.
O espectro de RMN-1H (Figura 11) apresentou uma absorção em
6,47
(2H, s) que, pela integração, pode ser atribuído a dois hidrogênios de um
sistema de anel aromático tetra-substituído. Uma absorção, neste mesmo
espectro, em
3,85 (s), que pela integração corresponde a nove átomos de
hidrogênios, é compatível com a presença de três grupamentos metoxilas.
Figura 11: Espectro de RMN 1H (500 MHz) do composto Dih-Pip, obtido
em CDCl3
O espectro de RMN-13C-BB, (Figura 12) revelou a presença de oito
absorções relacionadas a átomos de carbonos olefínicos, sendo uma das
49
absorções correlacionada a um grupo carbonila , -insaturadas em
outro a um grupo carbonila não-conjugado absorvendo em
165,1 e a
175,1. Neste
mesmo espectro confirmou-se a presença dos três grupamentos metoxilas, os
quais absorveram em
2 x 55,9 e 60,7.
Figura 12: Espectro de RMN-13C-BB (125 MHz) de Dih-Pip, obtido em CDCl3
O espectro de RMN-13C utilizando a técnica DEPT -135, (Figura 13)
revelou a presença de quatro átomos de carbono di-hidrogenados (CH2). Estes
sinais foram observados em
24,4, 40,7, 31,5 e 40,8. Os átomos de hidrogênios
ligados a estes átomos de carbonos são observados no espectro de RMN-13C
(HMQC), em
3,25 (2H, t, J =7,5 Hz), 2,95 (2H, t, J =7,5 Hz), 2,35 (m) e 3,97
(2H, t, J=6,5 Hz), respectivamente.
Os sinais dos átomos de carbonos em
hidrogênios a eles ligados em
carbonos olefinicos em
31,5 e 40,8 e os sinais dos
2,35 e 3,97, juntamente com os sinais de
125,7 e 145,2 e o sinal atribuído a carbonila
, -
50
insaturada em
165,1, podem perfeitamente serem atribuídos a um anel
piridinona, semelhante ao da piplartina [14].
Figura 13: Espectro RMN-13C utilizando a técnica DEPT do composto
Dih-Pip, obtido em CDCl3
com dados de RMN-1H e
13
C de Dih-Pip
13
C descrito na literatura (Facundo et al., 2008) para a
dihidropiplartina [25] levaram a propor a estrutura da mesma para Dih-Pip.
O
H3CO
1'
1
3
9
8
H3CO
6
4
O
7
2
5
2'
N
3'
5'
4'
OCH3
Figura 14: Estrutura química proposta para o composto Dih-Pip
51
Na tabela 3, encontram-se os dados de RMN-1H e RMN - 13C de Dih-Pip e
da dihidropiplartina [25].
e 13C do composto Dih-Pip e da Dihidropiplartina [25] (Facundo, 2008)
Dih-Pip*
C
Dihidropiplartina [25]**
C
H
C
H
1
136,7
-
136,8
-
3
153,1
-
153,0
-
4
136,0
-
136,2
-
5
153,1
-
153,0
-
9
175,1
-
175,4
-
1’
165,1
-
165,3
-
-
-
-
-
CH
2
105,5
6,47 (s)
105,4
6,48 (s)
6
105,5
6,47 (s)
105,4
6,48 (s)
2’
125,7
5,98 (dd, J = 9,7; 1,6 Hz)
125,8
5,98 (d)
3’
145,2
6,89 (m)
145,5
6,89 (m)
CH2
-
-
-
-
8
40,7
2,95 (t, J = 7,5 Hz
40,8
2,93(t)
7
24,4
3,25 (t, J = 7,5 Hz)
24,5
3,25 (t)
4’
31,5
2,35 (m)
31,7
2,38 (m)
5’
40,8
3,97 (t, J = 6,5 Hz)
40,9
2,97 (t)
CH3
-
-
-
-
CH3O-3
55,9
3,85 (s)
56,0
3,84(s)
CH3O-4
60,7
3,81 (s)
60,7
3,81(s)
CH3O-5
55,9
3,85 (s)
56,0
3,84(s)
* obtido em CDCl3
** Facundo (2008)
52
5.6 - Determinação estrutural de TMDC
O composto TMDC, sólido branco amorfo, com ponto de fusão 104ºC e
solúvel em clorofórmio, foi isolado no extrato de clorofórmio utilizando como
eluente hexano:acetato de etila, 35:65.
espectro de RMN 1H de TMDC (Figura 15) uma absorção em
6,47 (sl),
que levando em consideração a integração, pode ser correlacionado a dois
átomos de hidrogênio ligados a um anel aromático, semelhante ao sistema de
anel
aromático
tetra-substituído
propostos
para
a
Piplartina
[14]
e
Dihidropiplartina [25].
Figura 15: Espectro de RMN 1H (500 MHz) do composto TMDC, obtido
em CDCl3
No mesmo espectro foi possível observar dois singletos em
3,69, que
pela integração corresponde a seis átomos de hidrogênios, e 3,56 de três
átomos de hidrogênios que podem perfeitamente serem atribuídos a três
grupamentos metoxilas. Estes grupamentos foram confirmados através do
espectro de RMN
13
C-BB (Figura 16), através das absorções em
56,0 (pela
53
intensidade corresponde a dois átomos de carbonos) e em
60,1 (pela
intensidade correspondente a um átomo de carbono).
Figura 16: Espectro de RMN 13C-BB (125 MHz) de composto TMDC, obtido
em CDCl3
O espectro de RMN
13
C utilizando a técnica DEPT-135 de TMDC (Figura
17), exibiu cinco absorções, duas de carbonos tri-hidrogenado (CH3) em
56,0 e
60,1, confirmando a presença dos grupamentos metoxilas, uma de carbono
mono-hidrogenado (CH) em
em
105,7 e duas de carbonos di-hidrogenados (CH2)
31,0 e 35,6.
54
Figura 17: Espectro de RMN-13C – DEPT-135 de TMDC, obtido em CDCl3
Uma absorção exibida em uma expansão do espectro de RMN 1H (Figura
18) em
10,24 foi fundamental para propor a presença de uma hidroxila de um
grupamento carboxila em TMDC.
55
Figura 18: Expansão do Espectro de RMN-1H (500 MHz) de TMDC, obtido
em CDCl3
O espectro de massas de TMDC (Figura 19) exibiu o pico do íon
molecular m/z 240 u.m.a., sugerindo uma fórmula molecular C12H1605. Esta
fórmula, também, é compatível com uma molécula contendo cinco graus de
insaturações.
56
Figura 19: Espectro de massa (70 eV) de TMDC
Figura 19: Espectro de massa (70 eV) de TMDC
1
com dados de RMN H e
13
C de TMDC
13
C descrito na literatura (Facundo et al., 2008) para o
Ácido 3,4,5-trimetóxi-dihidrocinâmico [34] levaram a propor a estrutura da
mesma para TMDC.
Na tabela 4, encontram-se os dados de RMN 1H e
13
C de TMDC e do
Ácido 3,4,5-trimetóxi-dihidrocinâmico [34].
O
H3CO
3
2
1
7
9
OH
8
6
H3CO
4
5
OCH3
Figura 20 - Estrutura química proposta do composto TMDC
57
e 13C de TMDC e do Ácido 3,4,5-trimetóxi-dihidrocinâmico [34].
Ácido3,4,5-trimetóxi-dihidrocinâmico [34]**.
TMDC*
C
C
C
H
H
1
135,2
-
135,9
-
3
153,1
-
153,2
-
4
136,0
-
136,5
-
5
153,1
-
153,2
-
9
178,1
-
178,6
-
-
-
-
-
CH
2
105,7
6,47 (s)
105,2
6,43 (s)
6
105,7
6,47 (s)
105,2
6,43 (s)
-
-
-
CH2
-
8
31,0
4,8 (t)
31,0
2,68 (t)
7
35,6
2,71(t)
35,7
2,90 (t)
-
-
-
CH3
-
CH3O-3
56,0
3,69 (s)
56,7
3,84(s)
CH3O-4
60,1
3,56 (s)
60,8
3,83(s)
CH3O-5
56,0
3,69 (s)
56,7
3,84(s)
OH
-
10,24(sl)
-
11,31(sl)
* obtido em CDCl3
** Facundo (2008)
5.7 - Efeito dos extratos e compostos isolados de Piper tuberculatum Jacq
sobre as contorções abdominais induzidas pelo ácido acético em
camundongos
O extrato etanólico (10 – 300 mg/Kg), administrado via oral, inibiu de
forma dose-dependente e significativa o número de contorções abdominais
induzidas pelo ácido acético, alcançando inibição de 89 ± 5% na máxima dose
58
estudada e DI50 (juntamente com intervalo de confiança em 95%) de 46,22
(38,05 – 56,15) mg/Kg, demonstrando o potencial efeito analgésico da espécie
Número de contorções
abdominais
estudada (Figura 21).
50
40
30
20
***
***
10
0
***
C
10
30
100
300
Extrato Bruto (mg/kg, v.o.)
Figura 21: Efeito do extrato etanólico (extrato bruto) de Piper tuberculatum Jacq
administrado por via oral, na nocicepção induzida por ácido acético (0,6%, i.p.)
(barras abertas) comparado com controle C (barra fechada). Os resultados estão
expressos como médias
erro padrão das médias (n= 5 a 9). A comparação
entre os grupos foi realizada através da análise da variância (ANOVA) seguida
do teste de Newman Keuls. Diferente do grupo controle para *** p < 0,001.
Da mesma forma, os extratos acetato de etila (10 – 300 mg/Kg),
diclorometano (10 – 300 mg/Kg), metanol (3 – 100 mg/Kg) e hexano (30 – 300
mg/Kg) inibiram de forma significativa e dependente da dose a nocicepção
induzida pelo ácido acético, alcançando inibição e DI50 (juntamente com intervalo
de confiança em 95%) de 71 ± 7% e 49,85 (35,64 – 69,72) mg/Kg, 77 ± 8% e
(32,60 – 66,70) mg/Kg, 77 ± 7% e 61,50 (48,05 – 77,41) mg/Kg, e 75 ± 8% e
(135,33 – 175,40) mg/Kg, respectivamente (Figura 22).
59
abdominais
A
B
40
40
30
30
**
***
20
20
***
***
***
10
0
C
10
30
100
0
300
C
Fração Acetato de Etila (mg/kg, v.o.)
10
30
100
300
Fração Diclorometano (mg/kg, v.o.)
C
abdominais
***
10
D
50
50
40
40
*
30
*
30
20
20
***
10
0
***
***
10
C
30
100
300
Fração Hexânica (mg/kg, v.o.)
0
C
3
10
30
100
Fração Metanol (mg/kg, v.o.)
Figura 22: Efeito dos extratos acetato de etila (A), diclorometano (B), hexano (C)
e metanol (D) obtidos de Piper tuberculatum Jacq administrados por via oral, na
nocicepção induzida por ácido acético (0,6%, i.p.) (barras abertas) comparado
com controle C (barras fechadas). Os resultados estão expressos como médias
erro padrão das médias (n= 5 a 10). A comparação entre os grupos foi
realizada através da análise da variância (ANOVA) seguida do teste de Newman
Keuls. Diferente do grupo controle para *** p < 0,001, ** p < 0,01 e * p < 0,05.
Quando testado o efeito antinociceptivo dos compostos isolados de Piper
tuberculatum, Dihidro-piplartina (Dih-Pip 0,01 – 1 mg/Kg), Piplartina (Pip 1 – 30
mg/Kg) e Ácido 3,4,5-trimetóxi-dihidrocinâmico (TMDC 0,0001 – 1 mg/Kg),
verificou-se que os mesmos inibiram significativamente e de forma dosedependente o número de contorções abdominais causadas pelo ácido acético
(Figura 23), obtendo DI50 (juntamente com intervalo de confiança em 95%) e
inibição de 5,42 (4,23 –6,94) mg/Kg e 82
6% e 0,0031 (0,0018 – 0,0053) mg/Kg e 81
7%, 0,07 (0,04 – 0,1) mg/Kg e 59
5%, respectivamente. Quando ad-
60
abdominais
A
B
50
40
40
30
30
**
**
20
20
***
10
***
10
0
0
C
1
3
10
C
30
Dih-Pip (mg/kg, i.p.)
abdominais
C
D
40
40
30
30
**
***
20
***
***
10
20
10
0
0
C
0,01
0,03
0,1
C
1
Pip (mg/kg, i.p.)
E
abdominais
Dih-Pip
10 mg/kg v.o.
Pip
1 mg/kg v.o.
F
40
40
30
30
**
***
20
***
10
0
**
20
***
10
0
C
0,0001
0,001
0,01
0,1
1
C
TMDC
1 mg/kg v.o.
TMDC (mg/kg, i.p.)
Figura 23: Efeito dos compostos Dihidropiplartina (Dih-Pip A-B), Piplartina (Pip
C-D) e Ácido 3,4,5-trimetóxi-dihidrocinâmico isolados de P. tuberculatum
administrados por via intraperitoneal (A,C,E) e via oral (B,D,F), na nocicepção
induzida por ácido acético (0,6%, i.p.) (barras abertas) comparado com controle
C (barras fechadas). Os resultados estão expressos como médias
erro padrão
das médias (n= 4 a 10). A comparação entre os grupos foi realizada através da
análise da variância (ANOVA) seguida do teste de Newman Keuls. Para o grupo
tratado pela via oral, a comparação entre os grupos foi realizada através do teste
de Mann Whitney. Diferente do grupo controle para *** p < 0,001 e ** p < 0,01.
61
ministrados por via oral, os compostos também apresentaram significativo efeito
antinociceptivo, obtendo inibições de 41 ± 15% para Dih-Pip na dose de
10mg/Kg, 42 ± 6% para Pip, na dose de 1mg/Kg e 54 ± 6% para TMDC na dose
de 1mg/kg. Devido à pequena quantidade dos compostos, somente foi possível
testar sua dose mais efetiva pela via oral.
O tratamento oral dos animais com os extratos etanólico, hexânico,
diclorometano, acetato de etila e metanol não produziram qualquer irritação
(dados não mostrados), mas causaram uma inibição significativa e dosedependente no número das contorções abdominais induzidas pelo ácido acético
em camundongos. Os valores da Dl50 (limite de confiança de 95%) e os valores
da inibição são mostrados na tabela 5.
Tabela 5. Inibição do número de contorções abdominais induzidas pelo ácido
acético e pelos extratos e compostos isolados dos frutos de Piper tuberculatum.
Dl50 (mg Kg-1) a
Inibição (%)
46,22 (38,05 – 56,15)
89 ± 5
154,07 (135,33 – 175,40)
75 ± 8
Extrato Diclorometano
46,65 (32,60 – 66,70)
77 ± 8
Extrato Acetato de Etila
49,85 (35,64 – 69,72)
71 ± 7
Extrato Metanol
61,50 (48,05 – 77,41)
77 ± 7
Piplartina
5,42 (4,23 – 6,94)
82 ± 7
Dihidropiplartina
0,07 (0,04 – 0,10)
56 ± 7
0,0031 (0,0018 – 0,0053)
81 ± 5
Drogas
Extrato Etanólico
Extrato Hexano
Ácido 3,4,5-trimetóxidihidrocinâmico
23,9 (13,1 – 43,6) (i.p.)
Aspirinab
83 ± 2
108,7 (92,7 – 126,6) (v.o.)
a
Limite de Confiança 95%. b Dados de Campos et al. (1997).
62
5.8 - Efeito dos compostos isolados de Piper tuberculatum Jacq sobre a
nocicepção induzida pela formalina
Na figura 24 pode-se observar a ação dos compostos isolados sobre a
nocicepção induzida pela injeção intraplantar de formalina. O composto Dihidropiplartina (Dih-Pip 0,1 – 3 mg/Kg) não foi capaz de inibir ambas as fases da
nocicepção causada pela formalina (Figuras 24A-B). No mesmo modelo, o
composto Piplartina (Pip 0,01 – 10 mg/Kg) não foi capaz de inibir a primeira fase
da nocicepção (Figura 24C), enquanto que na segunda fase (Figura 24D) foi
inibido em 53 ± 3% na dose de 1 mg/Kg e uma DI50 de 0,50 (0,32 – 0,80) mg/Kg.
O Ácido 3,4,5-trimetoxi-dihidrocinâmio (TMDC 0,03 – 3 mg/Kg) inibiu de forma
dependente da dose a nocicepção de origem neurogênica (Figura 24E), porém
não foi capaz de alterar a fase inflamatória da nocicepção induzida pela
formalina (Figura 24F). A DI50 calculada para a 1a fase foi de 0,20 (0,14 – 0,29)
mg/Kg, com inibição de 72 ± 5% na dose de 3 mg/Kg.
O Ácido 3,4,5-trimetóxi-dihidrocinâmico, por ser considerado o mais
potente entre os três compostos isolados de Piper tuberculatum Jacq testados
no modelo do ácido acético e da formalina, foi testado também em outros
modelos de nocicepção, a fim de avaliar seu possível mecanismo de ação
63
A
Tempo de reação (s)
100
B
300
75
200
50
100
25
0
C
0,1
1
0
3
0,1
C
3
D
300
100
80
200
60
***
40
100
20
0
C
0,01
0,1
1
3
10
0
C
0,01
Pip (mg/kg, i.p.)
1
F
100
400
80
300
60
***
***
40
200
***
***
***
20
0
0,1
Pip (mg/kg, i.p.)
E
1
120
C
C
0,03
0,1
0,3
1
3
100
0
C
0,03
TMDC (mg/kg, i.p.)
0,1
0,3
1
3
TMDC (mg/kg, i.p.)
Figura 24: Efeito dos compostos Dihidropiplartina (Dih-Pip, A-B), Piplartina (Pip,
C-D) e Ácido 3,4,5-trimetóxi-dihidrocinâmico isolados de Piper tuberculatum
Jacq administrados por via intraperitoneal, na nocicepção induzida pela
formalina (2,5%, i.pl.) (barras abertas) comparado com controle C (barras
fechadas). Os resultados estão expressos como médias
erro padrão das
médias (n= 5 a 10). A comparação entre os grupos foi realizada através da
análise da variância (ANOVA) seguida do teste de Newman Keuls. Diferente do
grupo controle para *** p < 0,001.
64
5.9 - Efeito do Ácido 3,4,5-trimetóxi-dihidrocinâmico sobre a nocicepção
induzida pela capsaicina
No teste da capsaicina, o Ácido 3,4,5-trimetóxi-dihidrocinâmico (0,0001 –
1 mg/Kg) apresentou uma inibição de 63 ± 6% na maior dose testada, e DI50
igual a 0,29 (0,17 – 0,49)mg/Kg (Figura 25).
75
50
*
***
25
***
***
0,1
1
0
C
0,0001
0,001
0,01
TMDC (mg/kg, i.p.)
Figura 25: Efeito do Ácido 3,4,5-trimetóxi-dihidrocinâmico isolado de Piper
tuberculatum Jacq administrado por via intraperitoneal, na nocicepção induzida
pela capsaicina (1,6%, i.pl.) (barras abertas) comparado com controle C (barra
fechada). Os resultados estão expressos como médias
erro padrão das
médias (n= 5 a 10). A comparação entre os grupos foi realizada através da
grupo controle para *** p < 0,001 e * p < 0,05.
induzida pelo glutamato
A Figura 26 mostra que o Ácido 3,4,5-trimetóxi-dihidrocinâmico (0,1 – 30
mg/Kg) foi capaz de inibir de maneira significativa a nocicepção induzida pela
injeção intraplantar de glutamato em camundongos, com inibição de 42 + 10%
na dose de 10 mg/Kg quando comparado ao grupo controle C.
65
300
200
**
*
10
30
100
0
C
0,1
1
TMDC (mg/kg, i.p.)
Figura 26: Efeito do Ácido 3,4,5-trimetóxi-dihidrocinâmico isolado de Piper.
tuberculatum administrado por via intraperitoneal, na nocicepção induzida pelo
glutamato (1,6%, i.pl.). Os resultados estão expressos como médias
erro
padrão das médias (n= 5 a 10). A comparação entre os grupos foi realizada
através da análise da variância (ANOVA) seguida do teste de Newman Keuls.
Diferente do grupo controle para ** p < 0,01 e * p < 0,05.
5.11 - Efeito do Ácido 3,4,5-trimetóxi-dihidrocinâmico sobre o desempenho
motor no teste de atividade espontânea de camundongos
O Ácido 3,4,5-trimetóxi-dihidrocinâmico não provocou alterações nos
testes de campo aberto e Rota Rod, demonstrando a ausência de efeito sedativo
ou sobre a performance locomotora. Os resultados estão apresentados na
Figura 27.
66
150
100
50
0
C
0,1
1
10
TMDC (mg/kg, i.p.)
Número de cruzamentos
Tempo de permanência (s)
A
200
B
100
75
50
25
0
C
0,1
1
10
TMDC (mg/kg, i.p.)
Figura 27: Efeito do Ácido 3,4,5-trimetóxi-dihidrocinâmico isolado de Piper.
tuberculatum administrado por via intraperitoneal, nos testes do Rota Rod (A) e
campo aberto (B). Os resultados estão expressos como médias
erro padrão
análise da variância (ANOVA) seguida do teste de Newman Keuls.
5.12
-
Efeito
do
Ácido
3,4,5-trimetóxi-dihidrocinâmico
sobre
a
hipernocicepção térmica e mecânica
Nos testes de hipernocicepção térmica e mecânica, o Ácido 3,4,5trimetóxi-dihidrocinâmico foi capaz apenas de reverter a hipernocicepção
induzida pela injeção de BK (Figura 28A-B), alcançando inibição de 89 ± 11% e
99 ± 1% nas hipernocicepções térmica e mecânica, respectivamente, e de PMA
(Figura 28C-D), obtendo uma inibição de 61 ± 8% na hiperalgesia térmica e 46 ±
10% na hiperalgesia mecânica.
67
B
A
300
***
*
#
10
0
**
Carga tolerada (g)
Latência (s)
20
***
100
0
Salina
BK
0,1
1
***
200
10
#
Salina
BK
C
1
10
D
750
***
10
***
#
Salina
PMA
0,1
1
10
Carga tolerada (g)
20
Latência (s)
0,1
TMDC (mg/kg, i.p.)
TDMC (mg/kg, i.p.)
0
***
500
*
*
1
10
250
#
0
TMDC (mg/kg, i.p.)
Salina
PMA
0,1
TMDC (mg/kg, i.p.)
tuberculatum Jacq administrado por via intraperitoneal, na hiperalgesia térmica
(A,C) e mecânica (B,D) induzidas pela bradicinina (BK; A-B) e PMA (C-D), em
ratos. Os resultados estão expressos como médias
erro padrão das médias
(n= 6). A comparação entre os grupos foi realizada através da análise da
variância (ANOVA) seguida do teste de Newman Keuls. Diferente do grupo
controle para *** p < 0,0001, ** p < 0,01 e * p < 0,05. Diferente do grupo salina
para # p < 0,05.
Contudo, o Ácido 3,4,5-trimetóxi-dihidrocinâmico não reverteu o efeito
hipernociceptivo induzido pela prostaglandina E2 (Figura 29 A-B) e pela
carragenina (Figura 29 C-D).
68
B
A
400
10
0
Carga tolerada (g)
Latência (s)
20
#
Salina
PGE2
0,1
1
300
#
200
100
0
10
Salina
PGE2
1
D
C
200
Carga tolerada (g)
20
10
#
0
150
100
#
50
0
Salina
C ar
TD MC
10 mg/kg, i.p.
Salina
C ar
TD MC
10 mg/kg, i.p.
tuberculatum Jacq administrado por via intraperitoneal, na hiperalgesia térmica
(A,C) e mecânica (B,D) induzidas pela prostaglandina E 2 (PGE2; A-B) e
carragenina (Car; C-D), em ratos. Os resultados estão expressos como médias
erro padrão das médias (n= 6). A comparação entre os grupos foi realizada
Diferente do grupo salina para # p < 0,05.
5.13 - Participação do sistema opióide sobre a atividade antinociceptiva do
Ácido 3,4,5-trimetóxi-dihidrocinâmico
Analisando a participação do sistema opióide no efeito antinociceptivo do
Ácido
3,4,5-trimetóxi-dihidrocinâmico,
10
TMDC (mg/kg, i.p.)
TMDC (mg/kg, i.p.)
Latência (s)
0,1
verificou-se
que
a
naloxona,
um
antagonista opióide não-seletivo, não alterou o efeito antinociceptivo do ácido
(10 mg/Kg, i.p.) no modelo de contorções abdominais induzidas pelo ácido
acético, alterando somente o efeito antinociceptivo da morfina (Figura 30).
69
Controle
Naloxona
40
#
30
***
20
**
10
0
Salina (10 mg/kg, i.p.) Morfina (5 mg/kg, i.p.) TMDC (10 mg/kg, i.p.)
Figura 30: Efeito do pré-tratamento dos animais com naloxona (1 mg/Kg,i.p.)
sobre a atividade antinociceptiva do Ácido 3,4,5-trimetóxi-dihidrocinâmico (i.p.) e
morfina (5 mg/Kg, s.c.), no modelo de nocicepção induzida pela injeção de ácido
acético 0,6% (i.p.) em camundongos. Os resultados estão expressos como
médias
Keuls. Diferente do grupo controle para *** p < 0,001 e ** p < 0,01 e diferente do
grupo morfina para # p < 0,05.
5.14 - Participação do sistema de cininas sobre a antinocicepção induzida
pelo Ácido 3,4,5-trimetóxi-dihidrocinâmico
O Ácido 3,4,5-trimetóxi-dihidrocinâmico não foi capaz de inibir a
nocicepção espontânea induzida pela administração de bradicinina na pata
(Figura 31).
70
500
400
300
200
100
0
BK
0,1
1
10
TMDC (mg/kg, i.p.)
pela bradicinina (3 nmol, i.pl.). Os resultados estão expressos como médias
erro padrão das médias (n= 5 a 10). A comparação entre os grupos foi realizada
Diferente do grupo salina para # p < 0,05.
Complementando estes dados, o Ácido 3,4,5-trimetóxi-dihidrocinâmico
inibiu a resposta nociceptiva induzida pela injeção intratecal de bradicinina,
alcançando inibição de 67 ± 11% na maior dose testada e DI50 de 4,66 (1,58 –
13,75) mg/Kg, sugerindo uma possível ação em nível central (Figura 32).
71
400
300
200
**
100
0
C
0,1
1
10
TMDC (mg/kg i.p.)
pela bradicinina (i.t.). Os resultados estão expressos como médias
erro padrão
grupo controle para ** p < 0,01.
5.15 - Efeito do Ácido 3,4,5-trimetóxi-dihidrocinâmico sobre pleurisia
induzida pela carragenina
O Ácido 3,4,5-trimetóxi-dihidrocinâmico reduziu significativamente o
extravasamento plasmático (Inibição: 48 ± 7%) e a migração total de células
(Inibição: 75 ± 7%) na inflamação induzida pela injeção intrapleural de
carragenina (Figura 33 A-B). No que diz respeito à contagem diferencial de
células, o referido composto reduziu tanto a migração de células mononucleares
[Inibição: 99 ± 6% e DI50: 0,32 (0,02 – 6,76)mg/Kg] quanto à de células
polimorfonucleares (Inibição: 73 ± 4%), como demonstrado na Figura 33 (C-D).
72
B
Células totais (x10 6)
Azul de Evans (µg/ml)
A
1.5
#
1.0
*
*
*
0.5
0.0
Salina
Car
0,1
1
15
#
10
***
0
10
Salina
Car
#
3
2
*
1
0
Salina
Car
0,1
1
10
Células Polimorfonucleares
(x10 6)
Células Mononucleares
(x10 6)
C
0,1
***
1
10
TMDC (mg/kg, i.p.)
TMDC (mg/kg, i.p.)
4
***
5
D
8
#
6
4
***
***
***
2
0
Salina
Car
0,1
1
10
TMDC (mg/kg, i.p.)
TDMC (mg/kg, i.p.)
tuberculatum
Jacq
administrado
por
via
intraperitoneal,
nos
seguintes
parâmetros avaliados na pleurisia induzida pela injeção intrapleural de
carragenina (0,1%): extravasamento plasmático (A), migração total de células
(B), migração de células mononucleares
(C) e migração de células
polimorfonucleares (D). Os resultados estão expressos como médias
erro
padrão das médias (n= 6 a 8). A comparação entre os grupos foi realizada
Diferente do grupo controle para ** p < 0,01 e *** p < 0,001. Diferente do grupo
salina para # p < 0,05.
73
induzida pelo veneno de Bothrops jararaca
Através deste estudo verificou-se também que o extrato etanólico de
Piper tuberculatum, bem como seu composto isolado, o Ácido 3,4,5-trimetóxidihidrocinâmico, foram capazes de inibir a nocicepção induzida pela injeção
intraplantar do veneno de Bothrops jararaca (Figuras 34 e 35, respectivamente).
A inibição alcançada pelo extrato etanólico foi igual a 39 ± 4%, enquanto que o
Ácido 3,4,5-trimetóxi-dihidrocinâmico alcançou uma inibição de 67 ± 9% e DI50
igual a 8,48 (2,44 – 29,45) mg/Kg.
400
*
300
*
***
200
100
0
Controle
30
100
300
1000
Extrato Bruto (mg/kg, v.o.)
Figura 34: Efeito do extrato etanólico (extrato bruto) de Piper tuberculatum
administrado por via oral, na nocicepção induzida pelo veneno de Brothops
jararaca (1 µg, i.pl.) em camundongos. Os resultados estão expressos como
médias
Keuls. Diferente do grupo controle para * p < 0,05 e *** p < 0,001.
74
400
300
***
200
***
***
100
0
Controle
0,1
1
10
100
TMDC (mg/kg, i.p.)
pelo veneno de Brothops jararaca (1 µg, i.pl.) em camundongos. Os resultados
estão expressos como médias
erro padrão das médias (n= 5 a 10). A
comparação entre os grupos foi realizada através da análise da variância
(ANOVA) seguida do teste de Newman Keuls. Diferente do grupo controle para
*** p < 0,001.
75
6. DISCUSSÃO
Os estudos científicos são de suma importância para validar o uso dos
vegetais por parte da população e prover novos fármacos viáveis na busca do
alívio de males que acomete essa mesma população. Desta forma pode-se ter os
novos fitofármacos e seus compostos isolados, avaliados e validados sob o
criterioso padrão de investigação científica até dar aos mesmos o rótulo de
fármaco.
O presente estudo mostrou pela primeira vez a presença do Ácido 3,4,5trimetóxi-dihidrocinâmico nos frutos da espécie Piper tuberculatum Jacq, bem
como o isolamento e identificação dos compostos Dihidropipartina e Piplartina
nos frutos dessa espécie.
Também
mostrou
pela
primeira
vez
que,
quando
administrado
sistemicamente, os extratos etanólico, hexânico, diclorometano, acetato de etila
e metanólico apresentaram atividade antinociceptiva, bem como os compostos
isolados Dihidropiplartina, Piplartina e o Ácido 3,4,5-trimetóxi-dihidrocinâmico,
tendo, este último sido escolhido para continuidade dos trabalhos em função do
seu efeito antinociceptivo ser superior aos outros compostos, em camundongos,
contra dor visceral, através da injeção intraperitoneal de ácido acético em ratos.
Além disso, foi demonstrado que o ácido 3,4,5-trimetóxi-dihidrocinâmico
apresentou importante atividade antinociceptiva induzida pelo veneno de cobra,
como sugerido através do uso popular desta planta como analgésico, sedativo e
antídoto pela mordedura de cobra (ARAUJO-JUNIOR et al., 1999).
Os dados mais relevantes deste trabalho foram: (1) o isolamento pela
primeira vez do Ácido 3,4,5-trimetóxi-dihidrocinâmico dos frutos de Piper
tuberculatum Jacq, tendo em vista que esta mesma planta, coletada em
Manaus, quando pesquisada não levou ao isolamento do mesmo ácido, mais
sim do seu éster metílico (SILVA et al., 2002); (2) os extratos e os compostos
isolados Dihidropipartina, Piplatina e o Ácido 3,4,5-trimetóxi-dihidrocinâmico
obtidos
dos
frutos
de
Piper
tuberculatum
Jacq
apresentarem
ação
antinociceptiva significante no modelo de dor visceral em camundongos, quando
administrado pela via oral, reduzindo de maneira dose-dependente o número de
76
contorções abdominais induzida pelo ácido acético; (3) a ação antinociceptiva do
ácido 3,4,5-trimetóxi-dihidrocinâmico no modelo da capsaicina; (4) a ação
antinociceptiva do Ácido 3,4,5- trimetóxi-dihidrocinâmico não foi revertida pelo
pré-tratamento dos animais com naloxona; (5) apresentação de atividade
antinociceptiva pelo Ácido 3,4,5-trimetóxi-dihidrocinâmico, no modelo de
nocicepção química induzido pela injeção intraplantar de glutamato; (6) a ação
antinociceptiva do Ácido 3,4,5-trimetóxi-dihidrocinâmico induzida pela injeção
intratecal de bradicinina; (7) O Ácido 3,4,5-trimetóxi-dihidrocinâmico apresentou
efeito antiinflamatório no modelo de pleurisia em camundongos; (8) o extrato
etanólico e o Ácido 3,4,5- trimetóxi-dihidrocinâmico também apresentaram
atividade antinoceptiva contra a nocicepçãp pela injeção intraplantar do veneno
de Brothops jararaca.
A análise espectroscópica dos compostos Pip, Dih-Pip e TMDC, mostrou
que os metabolitos isolados dos frutos da planta Piper tuberculatum são
Piplartina,
Dihidropiplartina
e
Ácido
respectivamente.
O
O
O
H3CO
H3CO
O
N
N
H3CO
H3CO
OCH3
OCH3
Pip (Piplartina)
Dih-Pip (Dihidropiplartina)
O
H3CO
OH
H3CO
OCH3
TMDC (Ácido 3,4,5-trimetóxi-dihidrocinâmico)
77
Os espectros de RMN-1H dos três compostos isolados, Pip, Dih-Pip e
TMDC apresentaram absorção em
6,47 para Dih-Pip e TMDC e em
6,81
para o composto Pip, que levando em consideração a integração pode ser
correlacionado a dois átomos de hidrogênio ligados a um anel aromático,
semelhante ao sistema de anel aromático tetra-substituído proposto para
Piplartina 14 , Dihidropiplartina 25 e Ácido 3,4,5-trimetóxi-dihidrocinâmico 34 .
Uma mesma absorção, nestes espectros dos diferentes compostos, em
aproximadamente
3,89, que pela integração corresponde a nove átomos de
hidrogênio, é compatível com a presença de três grupos metoxilas. Somente o
espectro protônico do composto Pip apresentou duas absorções em
7,68 (1H,
d, J=15,8 Hz) e 7,48 (1H, d, J=15,8 Hz) que são compatíveis com uma ligação
dupla trans-carbono-carbono presente na molécula da Piplartina entre os
carbonos C7 e C8 respectivamente. Isso se corrobora quando se compara com
as absorções obtidas para esses mesmos carbonos ( 6,71 (C7) e 7,48 (C8)) do
espectro protônico do isômero Cis (8(Z)-N-12,13,14-trimetóxicinamoila Δ3-piridin2-ona [26]) obtido e caracterizado por Navickiene (2000)
Segundo análise RMN-13C BB, se pode confirmar a presença de uma
dupla ligação nos carbonos 7 e 8 da molécula da Piplartina quando comparado
com a Dihidropiplartina já que os espectros apresentaram 10 e 8 carbonos
olefínicos respectivamente. O estudo destes espectros de ressonância carbono
13 BB, também revelou para a molécula do composto Pip a presença de dois
carbonos (C9 ( 168,50 e C1’ ( 165,3)) de grupos carbonilas
, insaturados
propostos na molécula de Piplartina; no caso da molécula de Dihidropiplatina se
evidenciou um carbono pertencente a um grupo carbonila , -insaturadas em
165,1 (carbono 1’) e a outro a um grupo carbonila não-conjugado absorvendo
em
175,1 (carbono 9), já no composto TMDC observou-se a presença deste
mesmo átomo de carbono de um grupo carbonila não-conjugado (C9)
absorvendo em
178,1. A análise dos espectros RMN
13
C BB confirmou a
presença de três grupamentos metoxilas presentes no anel aromático dos três
compostos.
Os espectros de massa obtidos ratificaram as propostas de estruturas
químicas para Pip e TMDC. O espectro de massa de Pip exibiu um pico íon
molecular em M+ em m/z 317 u.m.a compatível com fórmula molecular
78
C17H19NO5 e com uma molécula contendo nove graus de insaturações como é
caso
da
Piplartina.
O
espectro
de
massa
do
Ácido
3,4,5-trimetóxi-
dihidrocinâmico, fórmula molecular C12H1605 contendo 5 graus de insaturações,
apresenta um pico íon molecular em M+ em m/z 240 u.m.a, compatível com o
espectro obtido para o composto TMDC.
Baseado na estrutura química do Ácido 3,4,5-trimetóxi-dihidrocinâmico, o
mesmo , enzimaticamente, pode ser precursor de Piplatina e Dihidropiplartina
durante o metabolismo secundário da planta.
A estrutura química dos compostos evidencia a diferença entre o
composto Pip e Dih-Pip pela dupla ligação entre o C7 e C8 presente em Pip,
porém o composto TMDC apresenta um grupamento ácido livre. A atividade dos
antiinflamatórios não esteroidais frequentemente não está relacionada do ponto
de vista químico, porém a maioria consiste em ácidos orgânicos (GOODMAN &
GILMAM , 2003). Nota-se que o composto TMDC apresenta quimicamente esta
característica o que poderia sugerir sua melhor resposta farmacológica em
relação aos demais, pois facilita a acetilação irreversível na enzima
ciclooxigenase, característica do mecanismo de ação da aspirina, que promove
inibição na biossíntese das prostaglandinas e dos autacóides envolvidos no
processo inflamatório e de dor.
O interesse pelo estudo de novos fármacos de origem vegetal bem como
o interesse para o uso clínico de novas substâncias com atividade analgésicas,
utilizadas principalmente para o tratamento de vários tipos de dor (tanto de
origem neurogênica quanto inflamatória), vem aumentando significativamente e
vários modelos de nocicepção em animais de laboratório foram desenvolvidos
para verificar a atividade analgésica de extratos e compostos.
Entre os modelos de nocicepção utilizados neste trabalho, o teste das
contorções abdominais, induzidas pelo ácido acético, é descrito como um típico
modelo para avaliar a dor de origem inflamatória, pouco específico, mas com
boa sensibilidade, sendo uma ferramenta de triagem para avaliação da atividade
analgésica e antiinflamatória de novos agentes (IKEDA et al., 2001; LE BARS et
al., 2001).
Neste modelo, a administração de um agente irritante para membrana
serosa, como o ácido acético, provoca comportamentos estereotipados em
camundongos e ratos, que são caracterizados por contorções abdominais,
79
redução e incoordenação da atividade motora. Estes comportamentos são
considerados reflexos e evidenciam a dor visceral (LE BARS et al., 2001).
Os resultados indicaram que o extrato etanólico e os extratos hexânico,
diclorometano, acetato de etila e metanólico obtidos da espécie Piper
tuberculatum Jacq inibiram de modo dependente da dose a resposta provocada
pela injeção do ácido acético. Esta foi a primeira descrição farmacológica deste
tipo na literatura. Quando comparados com a aspirina, um antiinflamatório não
esteroidal bem conhecido, o extrato etanólico e os extratos acetato de etila,
diclorometano, e metanol, foram 1,8 a 2,4 mais potentes em inibir a indução
nociceptiva, enquanto o extrato hexano foi apenas 0,7 vezes menos potente que
a aspirina no modelo de dor visceral.
Entretanto, os compostos isolados foram mais potentes, quando
comparados com a aspirina em inibir as contorções abdominais. O TMDC
apresentou a menor Dl50 sendo 7709,7 vezes mais potente que a aspirina,
enquanto a Dih-Pip e a Pip foram 341,4
e 4,4 vezes mais potentes
respectivamente que o AINES padrão. Este achado pode sugerir que estes
compostos contribuem, em parte, pelo efeito antinociceptivo dos extratos
diclorometano, acetato de etila e hexânico obtidos dos frutos de Piper
tuberculatum, uma vez que os compostos isolados apresentaram maior potencial
em inibir a resposta nociceptiva, até mesmo em doses baixas.
O composto Pip foi o mais efetivo na inibição da resposta nociceptiva,
mas não foi o mais potente entre os compostos testados, sendo o TMDC o mais
potente deles em doses baixas. Desta forma pode-se sugerir que os compostos
isolados contribuem sinergicamente para a ação do extrato etanólico, uma vez
que este extrato foi o mais potente entre os tratamentos orais.
A irritação local, provocada pela administração do ácido acético na
cavidade intraperitoneal desencadeia a liberação de vários mediadores como a
bradicinina, substância P e prostaglandinas, principalmente a PGI2, bem como
algumas citocinas como IL-1 TNF-
-8 (CORREA et al., 1996; RIBEIRO et
al., 2000; IKEDA et al., 2001), modulados por mastócitos e macrófagos. Estes
mediadores ativam nociceptores quimiosensíveis que contribuem com o
desenvolvimento da dor de origem inflamatória, pois irão estimular neurônios
aferentes primários aumentado a liberação de aspartato e glutamato no fluido
cerebroespinhal. Dessa forma, o resultado obtido neste trabalho sugere que o
80
efeito antinociceptivo dos extratos e compostos isolados da espécie Piper
tuberculatum Jacq pode estar relacionado à inibição da liberação de mediadores
pró-inflamatórios, induzida pelo ácido acético. Outra possibilidade é a inibição da
ativação da cascata do glutamato causada pelo ácido acético. Qualquer hipótese
merece maiores estudos futuros.
Recentemente, Fontenele e col, (2009) mostraram que a Piplartina inibiu
significativamente a agregação plaquetária induzida pelo ácido araquidônico,
colágeno ou ADP. O autor sugere que a ação antiplaquetária poderia estar
relacionada com a inibição da atividade da ciclooxigenase. Desta maneira, podese sugerir que os extratos e compostos obtidos da espécie Piper tuberculatum
Jacq promovem efeito antinociceptivo através da inibição da ciclooxigenase.
Entretanto isto é apenas uma especulação e estudos adicionais são necessários
para elucidar as propriedades antinociceptivas dos extratos bem como o
mecanismo de ação dos compostos isolados.
Os resultados obtidos no presente estudo também demonstraram que o
Ácido 3,4,5-trimetóxi-dihidrocinâmico não apresentou qualquer interferência
sobre a atividade locomotora, causando incoordernação motora ou ainda efeitos
relaxantes sobre a musculatura, assegurando que o efeito antinociceptivo
observado não está relacionado a um destes efeitos inespecíficos.
Outro modelo empregado neste trabalho foi o de nocicepção induzida
pela formalina. Este modelo consiste na injeção intraplantar ou subcutânea
desta substância. A resposta provocada pela formalina constitui duas fases de
nocicepção: uma fase inicial e uma tardia, que parecem envolver mediadores
químicos diferentes (TJOLSEN & HOLE, 1997; SANTOS et al., 1999; VANEGAS
& SCHAIBLE, 2004).
A fase inicial é caracterizada pela dor de origem neurogênica causada
pela estimulação química direta dos nociceptores das fibras sensoriais
aferentes, principalmente fibras do tipo C. A fase tardia é representada pela dor
de origem inflamatória que é desencadeada por uma combinação de estímulos
que incluem inflamação nos tecidos periféricos e mecanismos de sensibilização
espinhal e central (TJØSEN et al., 1992; TJØLSEN & HOLE, 1997). Vários
trabalhos têm demonstrado que a administração intraplantar de formalina em
roedores produz significativo aumento dos níveis espinhais de diferentes
mediadores como aminoácidos excitatórios, neuropeptídeos, PGE2, óxido nítrico
81
e cininas (MALMBERG e YARSH, 1995; SANTOS & CALIXTO, 1997; SANTOS
et al., 1998; OMOTE et al., 1998).
Para o estudo da nocicepção induzida pela formalina foram utilizados os
compostos isolados Piplartina, Dihidropiplartina e o Ácido 3,4,5-trimetóxidihidrocinâmico. Com os resultados obtidos neste trabalho foi possível mostrar
que o composto Dihidropiplartina não foi capaz de inibir ambas as fases de
nocicepção causada pela formalina. O composto Piplartina não foi capaz de
inibir a primeira fase da nocicepção e na segunda fase alcançou uma inibição de
53±3% na dose de 1 mg/Kg e uma Dl50 de 0,5(0,32 – 0,80) mg/Kg. O ácido
3,4,5-trimetóxi-dihidrocinâmico (TMDC 0,03 – 3 mg/Kg) inibiu de forma dosedependente a nocicepção de origem neurogênica, porém não foi capaz de
alterar a fase inflamatória da nocicepção induzida pela formalina. A Dl 50
calculada para a 1ª fase foi de 0,20 (0,14 – 0,29) mg/Kg, com inibição de 72 ±
5% na dose de 3mg/Kg. Estes dados reforçam os indícios de que a planta em
questão possui um importante efeito antinociceptivo e antiinflamatório, pois é
nesta fase que ocorre a liberação de mediadores pró-inflamatórios, ocorrendo a
ativação de neurônios aferentes sensibilizados, devido à liberação anterior de
mediadores neuroativos (TJOLSEN & HOLE, 1997; SANTOS & CALIXTO, 1997;
SANTOS et al., 1999; VANEGAS & SCHAIBLE, 2004).
Para dar continuidade aos estudos selecionou-se o ácido 3,4,5-trimetóxidihidrocinâmico por este ser considerado o mais potente entre os três
compostos isolados de Piper tuberculatum Jacq testados no modelo do ácido
ácido acético e da formalina, e pelos escassos estudos na literatura sobre a
ação farmacológica desse composto, para, através de testes em outros modelos
de nocicepção, possibilitar a elucidação de um possível mecanismo de ação.
Apesar de ser mais efetivo na fase inicial da nocicepção evocada pela
injeção de formalina, fase neurogênica, onde ocorre a estimulação direta dos
nociceptores das fibras sensoriais aferentes e não na fase inflamatória da
nocicepção induzida pela formalina, o ácido 3,4,5-trimetóxi-dihidrocinâmico não
foi capaz de reduzir, o edema de pata causado pela administração intraplantar
de formalina.
Este resultado nos sugere que o Ácido 3,4,5-trimetóxi-dihidrocinâmico não
interfere
na
liberação
periférica
dos mediadores
pró-inflamatórios
que
contribuem com a formação do edema, mas sim, seu efeito pode estar
82
relacionado a uma ação inibitória sobre a condução nociceptiva espinhal ou
central.
O efeito do Ácido 3,4,5-trimetóxi-dihidrocinâmico foi avaliado no modelo
de nocicepção neurogênica, induzida pela administração intraplantar de
capsaicina em camundongos. Os dados apresentados neste trabalho indicam
que o Ácido 3,4,5-trimetóxi-dihidrocinâmico, administrado por via intraperitoneal,
foi capaz de reduzir a nocicepção causada pela capsaicina de maneira
significativa em dose baixa a partir de 0,1mg/Kg , corroborando com o resultado
encontrado no teste da nocicepção induzida ácido acético.
A capsaicina (8-metil-N-vanilil-6-nonenamida) é o componente ativo
encontrado
em
pimentas
vermelhas,
sendo
uma
valiosa
ferramenta
farmacológica para o estudo de drogas que atuam modulando a transmissão
nociceptiva em mamíferos através dos neurônios sensoriais primários do tipo C
e Aδ (HOLZER, 1991; JANCSO, 1992).
Sua ação irritante e neurotóxica promove, quando administrada por via
intraplantar, reação dolorosa caracterizada por mordidas e lambidas na pata
(JULIUS & BASBAUM, 2001; LE BARS et al., 2001). Estudos demonstraram que
o estímulo nociceptivo causado pela capsaicina é mediado pela ativação do
receptor vanilóide (TRPV1), um canal iônico não seletivo encontrado nas fibras
sensoriais de pequeno diâmetro presentes nas raízes do corno dorsal e no
gânglio trigêmeo (CATERINA et al., 1997). Estudos indicam que quando
administrada, a capsaicina promove liberação periférica de vários mediadores,
aminoácidos excitatórios, óxido nítrico e taquicininas que contribuem com a
transmissão da informação nociceptiva (SAKURADA et al., 1996; SAKURADA et
al., 1992).
Está bem estabelecido que os aminoácidos excitatórios, principalmente o
glutamato, é o neurotransmissor encontrado na maioria das sinapses
excitatórias rápidas no sistema nervoso de mamíferos e está envolvido em
processos fisiológicos (memória e aprendizado) e em algumas patologias
(neurodegeneração crônica e aguda) (GAVIRAGI, 2000). Além disso, está bem
descrito na literatura que o glutamato exerce um papel crítico no processo de
transmissão da dor até estruturas supraespinhais, sendo liberado na medula
espinhal, após lesão tecidual ou em processos inflamatórios (ZHOU et al., 1996;
DICKENSON, 1997; CARLTON, 2001; BEIRITH et al., 2003).
83
Os receptores glutamatérgicos são categorizados em dois grupos
distintos: os ionotrópicos e os metabotrópicos. Os receptores ionotrópicos são
classificados em três subtipos de acordo com sua permeabilidade a íons e o tipo
de ligante, sendo denominados N-metil-D-aspartato (NMDA), -amino-3-hidroxi5-metil-4-isoxazolepropionato (AMPA) e cainato. Os metabotrópicos são
divididos em oito subtipos, todos acoplados à proteína G (GAVIRAGHI, 2000).
De maneira geral, a ativação de todos os tipos de receptores sensíveis ao
glutamato participam na indução, modulação ou manutenção da dor (BEIRITH et
al., 2003).
Em concordância com essas afirmações, dados da literatura demonstram
que substâncias capazes de bloquear os receptores glutamatérgicos tanto
ionotrópicos
quanto
metabotrópicos,
apresentam
importante
efeito
antinociceptivo em diferentes espécies de mamíferos, inclusive em humanos
(LUTFY et al., 1997; NEUGEBAUER, 2002; WIECH et al., 2004).
Em um estudo, Beirith e colaboradores, em 2002 e 2003, demonstraram
que o glutamato quando administrado por via intraplantar em roedores,
desencadeia um comportamento nociceptivo rápido e de curta duração,
associado à formação de edema de pata, que é desencadeado de maneira
dependente da dose administrada de glutamato. A resposta nociceptiva estava
fortemente relacionada à ativação de receptores NMDA e não-NMDA (AMPA,
cainato e metabotrópico). O edema pareceu ser mediado principalmente por
receptores glutamatérgicos do tipo não–NMDA, pelo NO e taquicininas.
Os resultados obtidos no presente estudo mostraram que o Ácido 3,4,5trimetóxi-dihidrocinâmico, administrado por via intraperitoneal, apresentou
importante atividade antinociceptiva no modelo do glutamato.
Nossos dados também demonstraram que o efeito antinociceptivo do
extrato pode ser explicado, em parte, por uma possível interação de um ou mais
componentes do extrato com receptores glutamatérgicos em nível periférico ou
central, porém esta interação não estaria interferindo com a liberação dos
mediadores envolvidos na formação do edema como as taquicininas e NO.
Os resultados do presente trabalho demonstraram que o Ácido 3,4,5trimetóxi-dihidrocinâmico reduziu, de maneira significativa, a nocicepção
causada tanto pela administração i.p. de glutamato (agonista glutamatérgico).
84
Os resultados obtidos neste teste sugerem que o efeito antinociceptivo
obtido no modelo da administração intraplantar do glutamato seja em parte
devido à interação com receptores glutamatérgicos ionotrópicos sensíveis ao
NMDA.
Estes dados também sugerem que este mecanismo pode ainda estar
envolvido indiretamente no efeito antinociceptivo do Ácido 3,4,5-trimetóxidihidrocinâmico em outros modelos de nocicepção realizados neste trabalho,
como o da formalina e capsaicina, visto que estudos evidenciam que
aminoácidos excitatórios são liberados na medula espinhal ou na pata em
resposta a injeção intraplantar de formalina, capsaicina ou substância P, ou
ainda em processos inflamatórios (BEIRITH et al., 2002).
Citocinas como IL-1
e TNF-
participam ativamente de processos
inflamatórios e da transmissão nociceptiva (IKEDA et al., 2001; ITO et al., 2001;
VANEGAS e SCHAIBLE, 2001).
A citocina inflamatória IL-1
é produzida e secretada sobre condições
patológicas associadas a neuropatias, crescimento tumoral e doenças
inflamatórias crônicas como artrite reumatóide (SOMMER & KRESS, 2004).
O TNF-
é considerado uma citocina inflamatória protótipo, devido seu
papel de iniciar a cascata de ativação de outras citocinas (IL-1 , IL-6 e IL-8),
sendo que o ponto final da cascata resulta na ativação da cicloxigenase-2 (COX2) (SOMMER & KRESS, 2004). A IL-1 e o TNF-
são produzidas e liberadas
durante a inflamação periférica e também, nas mesmas condições, são liberados
por células presentes no SNC, como células de Schwann, mononucleares
(SOMMER & KRESS, 2004; KLEINSCHNITZ et al., 2004) e pela glia (VITKOVIC
et al., 2000; WIESELER-FRANK et al., 2004).
Além
disso,
um
recente
trabalho,
realizado
por
Kleinschnitz
e
colaboradores (2004), demonstrou que os receptores glutamatérgicos NMDA
modulam a expressão de citocinas inflamatórias, como a IL-1 e o TNF-
em
modelos de lesão de nervo periférico, em camundongos. Este resultado fornece
subsídios, indicando que o Ácido 3,4,5-trimetóxi-dihidrocinâmico , pode interferir
direta ou indiretamente com a ação de citocinas, ou ainda inibir a resposta
nociceptiva desencadeada pela IL-1
e TNF- , atuando em receptores
glutamatérgicos ionotrópicos tipo NMDA.
85
O tratamento com Ácido 3,4,5-trimetóxi-dihidrocinâmico em doses que
causaram efeito nociceptivo nos modelos anteriores, não foi capaz de causar
mudança significativa sobre a atividade locomotora dos animais quando
avaliados durante 5 minutos no teste de campo aberto, demonstrando que a
administração de Ácido 3,4,5-trimetóxi-dihidrocinâmico apresenta ausência de
efeito sedativo e/ou não age sobre a performance locomotora, descartando
assim, a hipótese de que a redução do número de contorções abdominais esteja
relacionada a um prejuízo motor induzido pela administração do composto.
A atividade do Ácido 3,4,5-trimetóxi-dihidrocinâmico também foi avaliada
na
hiperalgesia
térmica
e
mecânica
induzida
por
diferentes
agentes
hiperalgésicos. Como relatado anteriormente, a injeção de ácido acético
intraperitoneal e de formalina na pata provoca a liberação de muitos mediadores
relacionados com a reação inflamatória, como citocinas IL-1 , IL-6, TNF- , PGs,
BK, que são responsáveis pelo processo de inflamação tecidual e pela
sensibilização de nociceptores, que leva a hiperalgesia (MILLAN, 1999;
LOESER & TREEDE, 2008). A injeção de BK e PGE2 na pata de ratos causa
hiperalgesia, tanto em modelos térmicos quanto mecânicos (LUCENA et
al.,2007).
Alguns estudos sugerem que a hiperalgesia induzida pela PGE2 poderia
ser mediada pela modulação da corrente dos canais iônicos e ativação direta de
PKA (PORTANOVA et al., 1996; MALMBERG et al., 1997; KHASAR et al.,
1999a). Por outro lado, a hiperalgesia mediada pela BK parece estar associada
a sensibilização periférica através da ativação de PKC e receptores TRPV1,
modulando a liberação de vários mediadores (SZALLASI & BLUMBERG, 1993;
FERREIRA et al., 2004).
O Ácido 3,4,5-trimetóxi-dihidrocinâmico foi capaz apenas de reverter a
hipernocicepção induzida pela injeção de BK e de PMA na hipernocicepção
térmica e mecânica, mas não reverteu o efeito hipernociceptivo induzido pela
prostaglandina e pela carragenina, a partir desses resutados, pode-se sugerir
que um dos mecanismos pelo qual o Ácido 3,4,5-trimetóxi-dihidrocinâmico possa
promover a diminuição da sensação dolorosa seja através da inibição da
ativação de PKC e receptores vanilóides, já que dados da literatura mostram que
a nocicepção promovida pela formalina e pelo ácido acético são sensíveis a
inibidores ou a deleção gênica de PKA e/ou PKC (MALMBERG et al.,1997,
86
KHASAR et al., 1999b). O que é corroborado pela inibição da nocicepção no
modelo da capsaicina descrito anteriormente, onde houve bloqueio da
nocicepção.
Quando administrado bradicinina na pata dos animais, o Ácido 3,4,5trimetóxi-dihidrocinâmico não foi capaz de inibir a nocicepção, mas teve uma
significativa resposta na inibição nociceptiva induzida pela injeção intratecal de
bradicinina, sugerindo uma possível ação central do Ácido 3,4,5-trimetóxidihidrocinâmico .
Outro mecanismo de ação investigado foi o envolvimento do sistema
opióide na atividade antinociceptiva do Ácido 3,4,5-trimetóxi-dihidrocinâmico .
Os efeitos centrais dos opióides na transmissão da dor, por interação com
seus receptores ( ,
,
), no corno dorsal da medula espinhal e regiões
supraespinhais, têm sido reconhecidos por algum tempo. Em adição, os
receptores opióides estão presentes também nos terminais periféricos das fibras
aferentes sensoriais (SAWYNOK, 2003).
Inúmeros estudos comportamentais têm sido utilizados para examinar os
efeitos antinociceptivos dos opióides exógenos, como a morfina e também de
extratos obtidos a partir de plantas medicinais.
Dentro deste contexto, este trabalho também demonstrou que quando
administrada por via subcutânea, a morfina foi capaz de reverter totalmente a
nocicepção causada pela administração intraplantar de naloxona. Este efeito se
deve a sua ligação a receptores opióides localizados em vários níveis de
transmissão.
Durante nossos experimentos, também foi observado que a naloxona, um
antagonista não específico de receptores opióides, reduziu significativamente a
nocicepção causada pela morfina, contudo, não reverteu a nocicepção
promovida pelo Ácido 3,4,5-trimetóxi-dihidrocinâmico .
Estes resultados sugerem que a atividade antinociceptiva do Ácido 3,4,5trimetóxi-dihidrocinâmico parece não estar envolvida com o sistema opióide. Do
ponto de vista farmacológico, este é um método eficiente para verificar a
atividade analgésica de substâncias com características semelhantes aos
opióides (LE BARS et al., 2001), uma vez que a morfina, administrada
sistemicamente, foi capaz de suprimir respostas de neurônios espinhais ao
estímulo térmico nocivo da cauda (DOUGLASS & CARSTENS, 1997).
87
No presente trabalho podemos constatar que o Ácido 3,4,5-trimetóxidihidrocinâmico
apresentou
importante
atividade
antiinflamatória
quando
analisada no modelo de pleurisia induzida pela administração intrapleural de
carragenina reduzindo o extravazamento plasmático e a migração total de
células, também reduziu tanto a migração de células mononucleares quanto a
de células polimorfonucleares para a cavidade pleural.
Trabalhos
descritos
anteriormente
(HENRIQUES
et
al.,
1990;
HENRIQUES, 1993), demonstraram que a administração de carragenina na
cavidade pleural de camundongos induz uma resposta inflamatória, bifásica,
com aumento significativo tanto do número total de células quanto da
exsudação. Dessa forma, foi determinado que este padrão de resposta é
precedido por duas fases, sendo uma precoce (primeira fase) e a outra tardia
(segunda fase) da resposta inflamatória induzida pela carragenina em
camundongos. Além disso, foi observado que a administração de carragenina na
cavidade pleural promoveu um aumento gradual do número total de leucócitos,
principalmente de neutrófilos, cujo pico foi em torno de 4h seguido do
decréscimo por volta de 5h, retornando aos valores basais dentro de 24h.
Paralelamente, também foi observado um aumento da exsudação, avaliada pelo
extravasamento de azul de Evans na cavidade pleural, com picos entre 4 e 5h
da indução da pleurisia.
Deste modo, a carragenina tem sido o agente irritante mais utilizado para
o estudo do processo inflamatório na cavidade pleural, principalmente por induzir
intensa reação inflamatória (DE BRITO, 1989). Alguns estudos mostram que a
resposta inflamatória induzida pela carragenina é, em parte mediada pela
bradicinina (SALEH et al., 1997), sendo que a carragenina também promove a
liberação de outros agentes como os prostanóides, histamina e serotonina (DE
BRITO, 1989), observando-se que a liberação da bradicinina pode estar ligada
com um processo proteolítico produzido pela própria carragenina (DI ROSA &
SORRENTINO, 1968).
Os resultados mostram que o Ácido 3,4,5-trimetóxi-dihidrocinâmico foi
capaz de inibir de forma significativa o influxo de leucócitos (migração),
principalmente de neutrófilos, para a cavidade pleural. Dessa forma, o dado do
presente trabalho sugere que um ou mais componentes do extrato estejam
88
promovendo o efeito observado, principalmente por interferir na atividade dos
mediadores pró-inflamatórios principalmente ligados à migração celular.
O modelo de inflamação, induzido pela injeção intraplantar de
carragenina, é considerado um importante teste para pesquisa de drogas
antiinflamatórias (CRUNKHORN & MEACOCK, 1971; HENRIQUES et al., 1987).
A administração de carragenina na pata promove intensa vasodilação e
extravasamento plasmático mediados pela liberação de substâncias como
cininas, taquicininas, óxido nítrico, prostanóides, bem como a liberação de
serotonina e histamina a partir de mastócitos (CRUNKHORN & MEACOCK,
1971; ALVES et al., 1999). Além de desencadearem a formação do edema,
estes mediadores contribuem fortemente com a migração celular, principalmente
de neutrófilos para o sítio inflamatório, como demonstrado por Henriques e
colaboradores (1987) através da análise histológica de região subplantar da
pata, realizado 4 horas após a administração de carragenina.
Além de ser utilizada como antiinflamatória e analgésica, a espécie Piper
tuberculatum Jacq também apresenta indicação popular para “mordedura de
cobra”. Que envolvem componentes relacionados à dor e inflamação. Desta
forma, foi investigada a antinocicepção induzida pelo extrato etanólico e o Ácido
3,4,5-trimetóxi-dihidrocinâmico sobre a nocicepção induzida pelo veneno de
Brothops jararaca.
Observou-se que tanto o extrato etanólico, quanto o Ácido 3,4,5-trimetóxidihidrocinâmico foram capazes de inibir a nocicepção induzida pela injeção
intraplantar do veneno de Bothrops jararaca , porém a inibição causada pelo
Ácido 3,4,5-trimetóxi-dihidrocinâmico foi mais significativa e em dose menor que
o extrato.
Em síntese, os resultados do presente trabalho, confirmam alguns de
seus usos populares e estendem os dados descritos na literatura, indicando que
o extrato de Piper tuberculatum Jacq apresenta atividade antinociceptiva, em
modelos de nocicepção química induzida pelo ácido acético.
Os resultados apresentados para o Ácido 3,4,5-trimetóxi-dihidrocinâmico ,
indéditos no modelo de dor, mostram que o mesmo apresenta atividade
antinociceptiva em modelos de nocicepção química induzida pelo ácido acético,
formalina, capsaicina e glutamato. Os resultados apresentados são de grande
importância, uma vez que a antinocicepção induzida Ácido 3,4,5-trimetóxi89
dihidrocinâmico
pode ser dependente de uma interação com receptores
ionotrópicos glutamatérgicos tipo NMDA e da inibição da atividade de citocinas
pró-inflamatórias (TNF- e IL-1 ).
Além disso, com este trabalho foi possível confirmar, baseando-se no uso
popular da espécie Piper tuberculatum Jacq, que o a planta possui o composto
Ácido 3,4,5-trimetóxi-dihidrocinâmico, isolado pela primeira vez nos frutos dessa
espécie e que o mesmo possui atividade antiinflamatória parcial no modelo de
pleurisia.
Outro dado relevante aqui demonstrado foi a atividade antinociceptiva na
nocicepção induzida pelo veneno de Brothops jararaca, apresentada pelo extrato
e o Ácido 3,4,5-trimetóxi-dihidrocinâmico. Este dado é particularmente
interessante, uma vez que esta atividade está ligada ao uso popular da planta.
Estudos adicionais devem ser realizados com a finalidade de caracterizar de
forma mais detalhada os mecanismos envolvidos neste efeito.
Estudos adicionais deverão também ser realizados para a confirmação do
preciso mecanismo de ação envolvido na atividade antinociceptiva do ácido
3,4,5-trimetóxi-dihidrocinâmico. Estudos químicos estão em progresso para
caracterizar outros compostos a partir do Ácido 3,4,5-trimetóxi-dihidrocinâmico ,
que talvez possam contribuir ainda mais seu potencial antinociceptivo e
antiinflamatório.
Neste contexto, o resultado obtido neste estudo nos fornece base
farmacológica para utilização da Piper tuberculatum Jacq validando seu uso
popular e indicando seu potencial terapêutico para o desenvolvimento de novos
fitofármacos com propriedades analgésicas e antiinflamatórias.
90
7. CONCLUSÕES
De acordo com os resultados apresentados nesta tese podemos inferir
que:
 Foram isolados e identificados, mediante espectroscopia RMN-1H, RMN
13
Ce
Massa, os compostos Piplartina, Dihidropiplartina e Ácido 3,4,5,-trimetóxidihidrocinâmico dos frutos de Piper tuberculatum Jacq.
Foi isolado e identificado pela primeira vez o Ácido 3,4,5,-trimetóxidihidrocinâmico da espécie Piper tuberculatum.
 É possível especular que o Ácido 3,4,5,-trimetóxi-dihidrocinâmico seja um
precursor biossintético das amidas Piplartina e Dihidropiplartina.
 A administração sistêmica (v.o. e i.p.) dos extratos e compostos isolados de
Piper tuberculatum Jacq causou antinocicepção no modelo das contorções
abdominais induzidas pelo ácido acético.
O Ácido 3,4,5-trimetóxi-dihidrocinâmico foi o mais potente entre os três
compostos isolados de Piper tuberculatum Jacq testados no modelo do ácido
acético e da formalina.
O Ácido 3,4,5-trimetóxi-dihidrocinâmico inibiu de forma dose-dependente a
nocicepção de origem neurogênica, porém não foi capaz de alterar a fase
inflamatória da nocicepção induzida pela formalina.
 O Ácido 3,4,5-trimetóxi-dihidrocinâmico foi capaz de inibir de maneira
significativa a nocicepção induzida pela injeção intraplantar de glutamato e
capsaicina em camundongos.
91
 O Ácido 3,4,5-trimetóxi-dihidrocinâmico não reverteu o efeito hipernociceptivo
induzido pela carragenina e pela prostaglandina E2 , porém foi capaz de reverter
a hipernocicepção, tanto térmica quanto mecânica, induzida pela injeção de
bradicinina e PMA.
 O Ácido 3,4,5-trimetóxi-dihidrocinâmico não exerce seu efeito antinociceptivo
através da interação com o sistema opóide, uma vez que a naloxona
(antagonista opióide) não foi capaz de reverter seu efeito antinociceptivo,
acessado no modelo de contorções abdominais induzidas pelo ácido acético.
 O Ácido 3,4,5-trimetóxi-dihidrocinâmico não induziu alteração nos testes da
barra giratória e campo aberto em camundongos, podendo-se afirmar que seu
efeito antinociceptivo não se deve a algum efeito sedativo ou músculo-relaxante.
 O Ácido 3,4,5-trimetóxi-dihidrocinâmico não foi capaz de inibir a nocicepção
espontânea induzida pela administração de bradicinina na pata, mas inibiu a
nocicepção induzida pela administração central (i.t.) do mesmo agente
algogênico.
O
Ácido
reduziu
significativamente
o
extravasamento plasmático e a migração total de células na inflamação, tanto
mononucleares quanto polimorfonucleares.
 O extrato etanólico e o Ácido 3,4,5-trimetóxi-dihidrocinâmico, foram capazes
de inibir a nocicepção induzida pela injeção intraplantar do veneno de Bothrops
jararaca, embasando seu uso etnofarmacológico.
 Os mecanismos de ação envolvidos na ação antinociceptiva e antiinflamatória
do Ácido 3,4,5-trimetóxi-dihidrocinâmico não estão totalmente esclarecidos, mas
pode-se afirmar que envolvem a interação com receptores TRPV1 (sensíveis à
capsaicina), bradicinina e a sinalização intracelular induzida pela proteína
quinase C.
92
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112
APÊNDICE
Constituintes químicos fixos e voláteis dos talos e
frutos de Piper tuberculatum Jacq. e das raízes de P.
hispidum H. B. K.
Valdir Alves FACUNDO1, Aline Roberta POLLLI2, Rosely Valéria RODRIGUES3,
Júlio S. L Teixeira MILITÃO4, Rodrigo guerino STABELLI5, Cosuelo Tamiris CARDOSO6
RESUMO
Os óleos essenciais dos frutos e talos finos de Piper tuberculatum e das raízes de P. hispidum, coletados no estado de Rondônia,
foram obtidos por hidrodestilação e analisados por GC e GC-MS. Foram identificados como constituintes majoritários,
nos óleos dos frutos e talos finos de P. tuberculatum, o óxido de cariofileno (32,1%) e (26,6%) e o (E)-cariofileno (17,7%) e
(12,3%), respectivamente. No óleo essencial das raízes de P. hispidum, foram identificados, como constituintes majoritários, o
dilapiol (57,5%), a elemicina (24,5%) e o apiol (10,2%). Do extrato etanólico dos frutos de P. tuberculatum, foram isolados
os esteróides β-sitosterol e estigmasterol, as amidas piplartina e dihidropiplartina e um derivado do ácido cinâmico, o ácido
3,4,5-trimetoxi-dihidrocinâmico.
PALAVRAS-CHAVE: Piper
tuberculatum, Piper hispidum, óleo essencial, amidas.
Fixed and volatile chemical constituents from stems and fruits of Piper
tuberculatum Jacq. and from roots of P. hispidum H. B. K.
ABSTRACT
The essential oils of the fruits and fine stems of Piper tuberculatum and of the roots of P. hispidum, collected in the state of
Rondônia, had been gotten by hydrodistillation and analyzed by GC and GC-MS. Caryophyllene oxide - 32,1% in fruits and
26,6% in fine stem, and (E)-caryophyllene - 17,7% in fruits and 12,3% in fine stems, were identified as the major constituents
in such parts of P. tuberculatum. In the essential oil of the roots of P. hispidum, dillapiol (57,5%), elemicine (24,5%) and
apiole (10,2%) were identified as the most abundant constituents. From the ethanolic extract of the fruits of P. tuberculatum,
the steroids β-sitosterol and stigmasterol, the amides piplartine and dihidropiplartine and the derivative of the cinâmico acid
3,4,5-trimethoxy-dihidrocinâmic acid were isolated.
KEY WORDS:
Piperaceae, Piper tuberculatum, Piper hispidum, essential oil, amides.
1
Universidade Federal de Rondônia, [email protected]
2
3
4
5
6
743
vol. 38(4) 2008: 733 - 742
Constituintes químicos fixos e voláteis dos talos e frutos de Piper
tuberculatum Jacq. e das raízes de P. hispidum H. B. K.
INTRODUÇÃO
O gênero Piper pertencente à família Piperaceae, encontrase distribuído nas regiões tropicais e subtropicais de todo
mundo. Muitas espécies de Piper são usadas para fins curativos
em diversas culturas (Bezerra et al., 2007). O histórico do
gênero Piper descrito por Parmar et al. (1997), relata o uso
de espécies para o tratamento de algumas enfermidades em
diferentes povos. Na China, algumas prescrições recomendam
o uso das folhas de P. futokasura no tratamento de arritmias
cardíacas e da asma. Na Jamaica dores estomacais são tratadas
com uma infusão das folhas de P. aduncum e P. hispidum. No
México e no Brasil, usa-se as folhas de P. amalago para aliviar
dores estomacais e no combate a diversas infecções. Folhas
e talos de P. marginatum e P. tuberculatum são utilizadas, na
Paraíba, contra picada de cobra e como sedativos (Chaves
et al., 2006; Araújo-Junior et al., 1999). Silva et al. (2007)
demonstraram que os extratos das folhas e raízes de P.
aduncum, uma planta medicinal, apresentaram atividades
inseticida sobre adultos de Aetalion sp (cigarrinha). Os óleos
essenciais das partes aéreas de plantas dessa espécie, coletadas
em diferentes localidades da região Amazônica, apresentaram
grandes concentrações do fenilpropanóide dilapiol, o qual foi
considerado o responsável pelo efeito inseticida relatado por
Maia et al. (1998). Outra espécie de relevante valor comercial
é a P. hispidinervum por apresentar um óleo essencial rico em
safrol, um fenilpropanóide, muito utilizado nas industrias de
cosméticos e inseticidas (Bergo et al., 2005). Recentemente,
foi divulgada a atividade larvicida, contra o Aedes aegypti, do
óleo essencial de quatro espécies de Piper da região Amazônica,
P. gaudichaudianum, P. permucronatum, P. humaytanum e P.
hostmanianum (Moraes et al., 2007).
P. tuberculatum Jacq e P. hispidum H. B. K, são conhecidas
como pimenta d’ardo e jaborandi ou falso-jaborandi,
respectivamente, (Araújo-Junior et al., 1999; Albiero et
al., 2006). A distribuição geográfica destas duas espécies se
estende pelas Américas, do México à Argentina. No Brasil elas
ocorrem nos estados do Amazonas, Pará, Piauí, Ceará, Paraíba,
Pernambuco, Bahia, Rio de Janeiro, Paraná, Santa Catarina,
Mato Grosso, São Paulo e Mato Grosso do Sul (Guimarães
e Giordano, 2004).
Os estudos da constituição química dos óleos essenciais de
P. tuberculatum e P. hispidum têm revelado que os resultados
nem sempre são uniformes (Machado et al.,1994; Cysne
et al., 2005; Facundo et al., 2005a; Mesquita et al., 2005;
Navickiene et al., 2006; Potzernheim et al., 2006). Isto pode
ser atribuído à diversidade genética das espécies, ocorrendo
uma variedade de quimiotipos. Outros fatores que também
podem ser considerados são: a idade foliar da planta, as
variáveis ambientais e as metodologias utilizadas pelos
diferentes autores.
744
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Entre os constituintes fixos isolados de P. hispidum e P.
tuberculatum destacam-se as amidas do tipo isobutílicas,
pirrolidínicas, dihidropiridonas, piperidinas, derivados
prenilados do acido benzóico, derivados do ácido cinâmico e
flavonóides (Parmar et al. 1997).
Neste trabalho relata-se a composição química dos óleos
essenciais obtidos dos frutos e talos finos de P. tuberculatum
e das raízes de P. hispidum, bem como, o isolamento de
uma mistura de dois esteróides, 1 e 2, duas amidas, 3 e
4, e um derivado do acido cinâmico, 5, dos frutos de P.
tuberculatum.
MATERIAL E MÉTODOS
Coleta do material
As amostras de P. tuberculatum e P. hispidum foram
coletadas em abril de 2005 no campus da Universidade Federal
de Rondônia. A identificação botânica das plantas foi realizada
pelo Dr. José Gomes do herbário do Instituto Nacional de
Pesquisa da Amazônia (INPA), onde excicatas encontram-se
depositadas sob os números 211724, para P. tuberculatum e
216630, para P. hispidum.
Extração dos óleos essenciais
Os frutos (1,0 kg) e talos finos (1,8 kg) frescos de
P. tuberculatum, e raízes (2,7 kg) frescas de P. hispidum,
devidamente triturados foram submetidos a hidrodestilação
por 4 horas, utilizando-se extratores de vidro tipo Clevenger
modificado. Após a obtenção dos óleos essenciais dos frutos
(1,4 mL), talos finos (1,2 mL) de P. tuberculatum e das raízes
(1,0 mL) de P. hispidum, foram tratados com sulfato de sódio
anidrido para a eliminação de água.
Análise dos óleos essenciais
Os óleos essenciais foram analisados usando um aparelho
Hewlett-Packard modelo 5890 A e um instrumento GC/
MS, modelo 5973, equipado com coluna capilar (30 m x
0,25 mm) dimetilpolisiloxano DB-5 (J&W) (25 m x 0,20
mm, 0,20 µm); gás de arraste: He (fluxo de 1,0 mL/min); as
temperaturas do injetor (modelo split): 250º C; detector de
ionização de chama (FID): 270º C; temperatura da coluna:
35–180ºC/3ºC/min, 180–250 ºC/10 ºC/min; O volume
injetado 0,02 µL de óleo puro. Os espectros de massas:
impacto de elétrons a 70 eV. Os diversos constituintes
químicos dos óleos essenciais foram identificados através
dos estudos dos espectros de massas, complementados por
comparação com a biblioteca do aparelho, dados da literatura
e os índices retenção (Adams, 1995).
Isolamentos dos constituintes químicos fixos
Os frutos devidamente secos e triturados de P. tuberculatum
(1,3 kg) foram extraídos com etanol (3L x 3) à temperatura
Silva et al.
ambiente. O solvente foi destilado sob pressão reduzida e
forneceu 41 g de uma massa de coloração marrom. Parte
deste material (35 g) foi adsorvida em sílica gel (90 g) e a
mistura, sob a forma de pastilha, foi colocada em uma coluna
cromatográfica e eluída com hexano, clorofórmio, acetato
de etila e metanol. A fração obtida em clorofórmio (9,3 g)
foi novamente submetida à cromatografia em coluna de gel
de sílica e eluída com misturas de hexano e clorofórmio em
gradiente de polaridade crescente, obtendo-se 83 frações.
As frações de 10 a 19 foram reunidas, após comparação
em cromatografia em camada delgada (CCD), e a fração
resultante foi purificada por recristalização em clorofórmio,
obtendo-se desta forma 35 mg de um sólido branco cristalino,
posteriormente identificado como sendo uma mistura de 1
e 2. As frações 32 a 54 foram reunidas, após comparação em
CCD, e a fração resultante foi submetida à cromatografia em
coluna de sílica gel, eluída com hexano e acetato de etila em
gradiente de polaridade crescente, obtendo-se 115,8 mg de 3
(hexano:acetato de etila, 55:45), 21,5 mg de 4 (hexano:acetato
de etila, 45:55) e 54,8 mg de 5 (hexano:acetato de etila,
35:65).
RESULTADOS E DISCUSSÃO
A relação dos constituintes químicos dos óleos essenciais
extraídos dos talos finos e frutos de P. tuberculatum e das raízes
de P. hispidum, suas quantidades relativas e respectivos índices
de retenção (IR) estão representados na Tabela 1. Foram
identificados 92,7% dos constituintes químicos detectados
do óleo essencial dos talos finos de P. tuberculatum, dos
quais 15,2% são monoterpenos e 77,5% são sesquiterpenos.
Os constituintes majoritários foram o óxido de cariofileno
32,1% e o (E)-cariofileno 17,7%. Do óleo essencial dos frutos
foram identificados 90,4% dos constituintes, sendo 19,4% de
monoterpenos e 71,0% de sesquiterpenos e os constituintes
majoritários foram (E)-cariofileno com 12,3% e o óxido de
cariofileno 26,6%. A identificação dos constituintes químicos
do óleo essencial das raízes de P. hispidum foi de 99,9%, sendo
92,2% representados por fenilpropanóides, correspondendo
aos três componentes majoritários dilapiol 57,5%, elemicina
24,5% e apiol 10,2%.
Do extrato etanólico dos frutos de P. tuberculatum foram
obtidos e identificados dois esteróides, o β-sitosterol 1 e o
stigmasterol 2, em mistura, duas amidas, a piplartina 3 e a
dihidropiplartina 4, e um derivado do acido cinâmico, o ácido
3,4,5-trimetoxi-dihidrocinâmico 5 (Figura 1).
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Tabela 1 - Composição química (%) dos talos finos e frutos de P. tuberculatum
e raízes de P. hispidum.
P. tuberculatum
P. hispidum
Componentes
(IR)
Talos finos Frutos
Raízes
α-pineno
930
4,4
4,9
canfeno
949
0,5
verbeneno
961
0,1
0,2
sabineno
969
3,3
4,7
β-pineno
975
0,1
0,1
α-felandreno
1003
2,8
p-cimeno
1025
0,9
limoneno
1028
2,6
3,6
1,3
canfonelal
1123
1,5
0,6
-
trans-pinocarveol
pinocarvona
mirtenal
mirtenol
verbenona
carvona
Monoterpenos
α-cubebeno
α-copaeno
β-borboneno
β-elemeno
(E)-cariofileno
γ-elemeno
aromadendreno
α-humuleno
allo-aromadendreno
germacreno-D
β-selineno
α-muuroleno
β-bisaboleno
cis-calameneno
δ- cadineno
elemicina
trans-nerolidol
spatchulenol
óxido de cariofileno
óxido de humuleno
dilapiol
α-muurolol
apiol
Sesquiterpenos
Fenilpropanóides
Total
1140
1158
1190
1194
1200
1250
1,7
0,2
0,5
0,2
0,6
15,2
0,5
2,1
0,7
6,0
17,7
0,5
0,3
1,3
0,7
0,6
1,5
0,5
4,3
32,1
3,9
4,8
77,5
92,7
0,9
0,2
1,7
1,3
0,5
0,2
19,4
0,6
4,4
2,8
10,0
12,3
0,1
0,3
1,1
0,3
0,7
0,9
1,7
3,9
5,3
26,6
71,0
90,4
5,0
1,6
1,1
24,5
57,5
10,2
2,7
92,2
99,9
Silva et al.
1354
1380
1388
1395
1415
1430
1437
1450
1457
1483
1490
1503
1513
1523
1530
1557
1567
1580
1584
1610
1621
1644
1678
-
Figura 1 - Estruturas dos compostos 1 - 5, isoladas dos frutos de P. tuberculatum
Estudos fitoquímicos com folhas, sementes, talos e raízes
de P. tuberculatum realizados nos estados do Amazonas,
Ceará, Paraiba e São Paulo, revelaram a presença de 15
amidas (piplartina, dihidropiplartina, piplartina-dimerica
A, pelitorina, piperlonguminina, dihidropiperlonguminina,
piperina, dihidropiperina, piperina S, piperdardina,
piperidina-2E,4E-decadienamida, piperetina, N-(12,13,14trimetoxidihidrocinnamoil)-delta(3)-piperidin-2-ona, cispiplartina, fagaramida), uma aristolactama (cefaranona B), e três
derivados do acido cinâmico (ácido 3,4,5-trimetoxicinâmico,
6,7,8-trimetoxidihidrocinamato de metila e trans-6,7,8trimetoxicinamato de metila) (Braz-Filho et al., 1981; AraújoJúnior et al.,1997; Araújo et al., 1999; Navickiene et al., 2000;
Cunha & Chaves, 2001; Silva et al., 2002; Chaves et al., 2003;
Miranda et al., 2003). Na Costa Rica e no Panamá, foram
isoladas três amidas, duas comuns as encontradas nas espécies
brasileiras, piplartine e dihydropiplartine e uma terceira,
denominada piplaroxide (Capron & Wiemer, 1996; Scout
et al., 2005). Neste estudo com os frutos de P. tuberculatum,
coletados no estado de Rondônia, foram identificados, pela
Tabela 2 - Dados de RMN 1H e 13C dos compostos 1 e 2 (CDCl3).
1
2
δC
δH
δC
δH
C
1
37,2
37,2
2
29,7
29,7
3
71,8
3,51 (m)
71,8
3,51 (m)
4
39,8
39,6
5
140,7
140,7
6
121,7
5,36 (d)
121,7
5,12 (d)
7
31,6
31,6
8
31,9
31,9
9
50,1
50,1
10
36,8
33,9
11
21,1
21,1
12
39,8
39,8
13
42,3
42,3
14
56,8
56,7
15
24,4
24,3
-
746
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
primeira vez, o β-sitosterol 1, o estigmasterol 2 e o ácido
3,4,5-trimetoxi-dihidrocinâmico 5. Com o isolamento de 5, é
possível especular que o mesmo seja um precursor biossintético
das amidas piplartina 3 e dihidropiplartina 4.
As determinações estruturais dos compostos 1-5 foram
realizadas com base em dados de RMN de 1H e 13C, uni e
bidimensionais, espectros de massas e comparação com dados
da literatura (Facundo et al., 2003; 2005b). Os dados de RMN
1
H e 13C das substância 1 e 2 e 3-5, encomtram-se nas tabelas
2 e 3, respectivamente.
O óleo essencial das raízes de P. hispidum, coletadas
no estado de Rondônia, pertence ao quimiotipo dos
fenilpropanóides e pode interessar as indústrias de cosméticos
e inseticidas (Bergo et al., 2005). Além disto, este é o primeiro
relato da composição química do óleo essencial das raízes
dessa espécie e o perfil químico observado é diferente dos
relatados para outras partes da planta (Machado et al., 1994;
Santos et al., 2001; Pinto et al., 2004; Mesquita et al., 2005;
Potzernheim et al., 2006).
1
C
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
27
28
29
-
Silva et al.
δC
28,9
56,1
11,9
18,9
36,1
18,8
33,7
26,1
45,8
29,1
19,4
19,0
23,1
11,8
-
2
δH
0,68 (s)
1,02 (s)
0,93 (s)
0,83 (s)
0,80 (s)
0,81 (s)
-
δC
28,2
56,9
12,1
12,2
40,5
21,2
138,3
129,3
50,1
31,9
21,2
19,8
25,4
11,9
-
δH
0,69 (s)
1,02 (s)
1,03 (s)
5,22-4,95 (m)
5,22-4,95 (m)
0,86 (s)
0,81 (s)
0,83 (s)
-
Tabela 3 - Dados de RMN 1H e 13C dos compostos 3-5 (CDCl3).
3
4
δC
δH
δC
δH
δC
C
1
130,6
136,8
135,9
2
105,4 6,81 (s) 105,4
6,48 (s) 105,2
3
153,3
153,0
153,2
4
140,1
136,2
136,5
5
153,3
153,0
153,2
6
105,4 6,81 (s) 105,4
6,48 (s) 105,2
7
143,7 7,65 (d)
24,5
3,25 (t)
35,7
8
121,0 7,68 (d)
40,8
2,93 (t)
31,0
9
168,8
175,4
178,6
1’
165,8
165,3
2’
125,8 6,04 (dd) 125,8 5,98 (dd)
3’
145,5 6,93 (m) 145,5 6,89 (m)
4’
24,7
2,48 (m)
31,7
2,38 (m)
5’
41,6
4,05 (m)
40,9
3,97 (t)
OCH3-3
56,6
3,88 (s)
56,0
3,84 (s)
56,7
OCH3-4
61,3
3,86 (s)
60,7
3,81 (s)
60,8
OCH3-5
56,6
3,88 (s)
56,0
3,84 (s)
56,7
OH
-
5
δH
6,43 (s)
6,43 (s)
2,90 ( t)
2,68 ( t)
3,84 ( s)
3,83 (s)
3,84 (s)
11,31 (sl)
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Recebido em 06/06/2008
Aceito em 28/08/2008
Silva et al.

FUNDAÇÃO UNIVERSIDADE FEDERAL DE RONDÔNIA

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