Aula centrifugação e armazenamento de amostras [Modo de

Curso de Boas Práticas Laboratoriais
Preparo,
Identificação e
Armazenamento
de amostras
biológicas
Silene Peres Keusseyan
Maio/2011
Centrifugas
Poucos experimentos são realizados sem pelo menos uma
passagem pela centrífuga
Usadas para separar partículas de uma solução
Em laboratórios de pesquisa biológica:
Sangue
Células
Separação de fases
Organelas
Isolamento de macromoléculas (DNA, RNA, vírus,
proteínas)
Centrifugação
Qual velocidade? rpm x rfc (g) ?
Qual o tipo de separação desejado?
Qual centrífuga usar?
Que temperatura?
Qual o tubo apropriado?
Qual o rotor?
Como centrifugar
Força centrífuga
A força centrífuga relativa (Rcf) cuja unidade é o g é gerada quando
uma partícula ou conjunto de partículas é sujeito a um movimento
circular de aceleração
Rcf (g) = 1,12 x 10-5 x R x N2
R = raio em centímetros
N = velocidade de centrifugação em rpm
1 g equivalente à aceleração da gravidade na superfície da Terra
Força centrífuga
Tipos de centrifugação
Centrifugação diferencial (separação de fases)
Amostras centrifugadas a certa velocidade resultam em sobrenadante
e pélete (baseada no tamanho das partículas)
Tamanho maior sedimenta mais rápido
Ex: separação do sangue em elementos figurados e plasma / soro,
Tipos de centrifugação
Centrifugação por gradiente de densidade
Centrifugação de escala zonal
Separação de partículas com diferentes densidades
Ex: separação de mononucleares por Ficoll-Hypaque
Hemácias:1095 densidade, mononucleares 1065 e Ficoll 1077
Utiliza gradiente de meio viscoso
Sangue
diluído
soro
plaquetas
Mononucleares “nuvem”
Ficoll-Hypaque
FicollHypaque
eritrócitos
granulócitos
Centrífugas
Centrífuga de bancada
Centrífuga de bancada refrigerada
Centrífuga de alta velocidade
Ultracentrífuga
Microcentrífuga
Citocentrífuga
Centrífuga de bancada
Múltiplos fins: peletizar células e bactérias, sedimentação de soro,
urina, células e sangue
Suporte oscilante: até 3.800g ou 6.000 rpm
Capacidade:
normalmente 32 x 5mL ou 16 x 10mL
Com ou sem tacometro
Controle de tempo
Sem freio
Fanem Excelsa
Baby mod 206
Centrífuga de bancada
refrigerada
Múltiplos fins: peletizar células e bactérias, sedimentação de soro,
urina,células e sangue
Ângulo fixo
2 tipos de rotores:
28 x 2 mL – máx 14500rpm – 17400rcf (g)
10 x 10 mL – máx 13500rpm – 16900rcf (g)
Refrigeração : -8°C até +40°C
Controle de aceleração/desaceleração
(alta para peletização, baixa para gradientes)
Memória para programas
Sensor tampa fechada
Jouan MR 18.22
Centrífuga de alta velocidade
refrigerada
Precipitações de grandes volumes
2 tipos de rotor (R24A e R12A3)
Ângulo fixo
R24A: 8 x 50mL – máx 24000rpm – 68900rcf (g)
R12A3: 6 x 300mL – máx 12000rpm – 23800rcf (g)
Refrigeração: -20°C até +40°C
Controle de aceleração/desaceleração
Controle de tempo
Sensor tampa fechada
Hitachi Himac CR21
Ultracentrífuga
Sedimentação de macromoléculas, ribossomos, vírus...
Ângulo fixo ou suporte oscilante
Até 100.000rpm - 800000rcf (g)
Tubos tamanhos variáveis ,
Chão ou bancada
Programável
Sorvall WX
Sempre refrigerada
Câmara fechada à vácuo (atrito com ar eleva temperatura
e diminui velocidade)
Programável
Microcentrífuga
Volumes pequenos, precipitação de células (baixa
velocidade), retirada de “debris”, extrações com etanol e
minifenol
Ângulo fixo: máx 14000rpm
Capacidade :tubos eppendorf 20 x 2mL
Sensor tampa
Sem refrigeração
Jouan A14
Citocentrífuga
Produção de monocamada de células em área definida
Ex: lâminas para detecção de Anca
Cytofunnel saída única ou dupla
Programável
Capacidade até 12 câmaras
Suporte oscilante:200 a 2000rpm
Sensor tampa fechada + tampa de segurança
Cytospin 2 Shandon
Rotor
Tubos
Seleção do tubo adequado:
De acordo com o tipo de rotor
Evitar vazamento ou perda da amostra (mecanismo de lacre)
Assegura compatibilidade química (resistência)
Permite fácil recuperação da amostra (transparência)
Como centrifugar
Conheça as limitações de velocidade da centrífuga e dos
rotores
Equilibre todos os tubos com seus suportes, tampas,
proteção e pinos
Se usar um tubo para equilibrar, encha-o com material
similar ao que vai centrifugar - água = contrabalancear fora
do meio
Utilize tubos, tampas e suportes apropriados (filme
plástico)
Preencha os tubos até 1 ou 2 cm da borda
Tubos íntegros ( sem rachaduras)
Como centrifugar
Suportes não utilizados podem desequilibrar a centrífuga
Materiais infecciosos SOMENTE EM TUBO FECHADO
Retire as amostras da centrífuga assim que terminar amostras paradas = pélete disperso
Centrífugas refrigeradas: feche a tampa no intervalo das
centrifugações (evitar queda de temperatura e
condensação) e deixe aberta quando terminar (secar)
Limpe com pano macio e hipoclorito/álcool 70% quando
acabar de usar
Como equilibrar os tubos
Tubos frente a frente = mesmo peso
Microcentrífuga – ajuste por volume, não por peso
Alta velocidade ou ultra centrífuga – pesar tubos em duplas
com balança de pratos
Suportes de 4 tubos ou mais – equilibrar dois conjuntos em
balança de pratos e colocá-los frente a frente
Suportes não completos = equilibre na diagonal
Amostras estéreis – equilibre o volume dos pares “a olho”,
se necessário ajustar suportes use álcool 70% fora do tubo
Use o mesmo meio que sua amostra para ajustar tubos
sem par
Armazenamento de
amostras
Tubos e caixas apropriados e identificados
Identificação
Canetas permanentes e durex sobre o escrito para tubos e caixas
NUNCA identifique amostras de pacientes pelas iniciais
Ex: MCO = Maria Cristina Oliveira – quantas ?
Todo material coletado pela disciplina, pertence à disciplina , não ao
pós-graduando
Material devidamente identificado pode ser utilizado no futuro
001
LESa
SPK 03/05/11
Caixa 1
De 001 a xxx
LESa ou
protocolo YY
NPS
ano 2011
Banco de dados
001
LESa
SPK 20/07/2004
data coleta Nº ENSAIO
20/07/2004 1
27/09/2004 2
17/08/2004 3
14/09/2004 4
28/09/2004 5
19/10/2004 6
15/07/2004 7
16/08/2004 8
19/04/2005 9
RG HSP Nome
1058511 Bruna Suzuki Donoso
1485459 Helen Micaela A Aguiar
10068367 Fernando de Souza
10070001 Liliam Bruna O Magalhães
1061544 Juliane B de Oliveira
10099595 Paula Ferreira
10052027 Thiago L de Oliveira
1134111 Isabela C de Souza
10104632 Jaqueline R S Albuquerque
SEXO Idade Sledai ETNIA ACR FAN
DNAifi DNA EIA CH100/C2
F 14
6 NC 4 PF 1:320 NEG 101 182U/>100%
F
6
6 C 9 PF>1:320 NEG 94
161U/67
NEG 50
150
M 16
8 C 5 NEG
F 17a 11m 8 C 6 PF 1:80
NEG 81 263/88%
F 18a 11m 12 C 7 PF 1:80
NEG 173 234/>100%
F 16 13 C 6 PF1:640
NEG 74 <30/43%
M 14 16 C 9 PF 1:320 NEG 81
203/100
F 18 14 NC 6 HO >1:640 1/40 505 239/>100%
F 11
8 C 5 PG >1:640 NEG 173 277/>100%
Entregue ao orientador ao final da tese
Conservação de amostras
Conservação de amostras
Geladeira: material biológico temporariamente, reagentes e
soluções pelo prazo de validade dos mesmos
Sangue total: utilização imediata para ensaios
hemodinâmicos e dosagens bioquímicas, geladeira por 1
semana* ou -20ºC somente para futura extração de DNA
Soro ou plasma: -20ºC por tempo indeterminado (selado)
Células sempre em solução de tamponamento para morte
celular
-70ºC por tempo limitado, nitrogênio líquido (-196°C ) por
tempo indeterminado
Tecidos ou orgãos: -70ºC
Conservação de amostras
Alíquotas
Por que fazer?
Prevenir decomposição por congelamentos e
descongelamentos repetidos
Prevenir contaminação por múltiplos usos
Por conveniência física
Para economizar tempo no preparo de uma solução ou
tempo de descongelamento
Freezers -20º e -70ºC
Só abra a porta quando necessário e por pouco tempo
Se precisar manipular alguns tubos, retire a caixa do freezer
e coloque no gelo enquanto procura
Todas caixas ou recipientes colocados no freezer devem
estar devidamente ROTULADOS e TAMPADOS
Periodicamente descarte material que não for mais utilizar
Mantenha um registro da localização de seus materiais
Respeite os espaços
Não altere localização de material alheio
Providencie descongelamento quando necessário (só -20ºC)
UNIFESP
Disciplina de Reumatologia
“Na Bancada - Manual de iniciação científica em laboratório de pesquisas
biomédicas”, Kathy Baker, Editora Artmed, 2002
“Boas Práticas de Laboratório” , Maria de Fátima da Costa Almeida, Editora
Difusão, 2008
“Centrifugation: Essential Data”, by David Rickwood et al, 1994