DNA-Analytik

DNA-Analytik
Dr. Holger Klapproth
6. Vorlesungsstunde:
Biochips: Technik und Anwendung
Daten in Fülle ?
Was sind BioChips ?
DO NOT TOUCH
•  BioChips
ermöglichen
hochparalleler Testsysteme
die
Entwicklung
DO NOT TOUCH
•  BioChips sind geeignet, Wechselwirkungen dieser
Biomoleküle mit anderen Molekülen zu detektieren
(z.B. über Fluoreszenz)
DO NOT TOUCH
•  BioChips sind miniaturisierte Träger, auf denen
Biomoleküle in hoher Anzahl und Dichte in
definierter Mikroanordnung (Microarrays) fixiert
sind
DO NOT TOUCH
12252146
NutriChip
Wie ist ein Chip aufgebaut?
DNA-Sonde
Spacer
Wie funktioniert eine ChipHybridisierung?
Biomoleküle und Substrate
• 
• 
• 
• 
• 
• 
• 
Oligonucleotides
PCR products
Plasmids, Cosmids
PACs / BACs
Peptides
Antibodies
Polysaccharides
•  Glass surface
- silanized -
- polymer coated
•  Polymer surface
- direct attachment
- via polymer
chemisty
Wie kommt die DNA auf den Chip ?
1. Printverfahren
Pin-Printing Piezostackprinter (Scienion)
TopSpot (IMTEK)
2. Festphasensynthese
Photolithographische Synthese (Affymetrix)
Phosphoramiditchemie (OGT, Agilent)
Wie bindet DNA auf dem Chip ?
N
O
O
Glas und Siliziumchips:
O
O
Silanisieren von Glas / Siliziumträgern
C11H22
Beschichten mit Poly-L-Lysin
Si
OCH3
Beschichten mit Polymeren (z.B. Polyacrylamid
H3HCO
3CO
NHS-Silan
Polymere
UV-Grafting von reaktiven Gruppen
Plasmadeposition
Chemische Bindung von Polymeren an Oberflächen
Silanisieren der BioChips
H2N
H2N
H2N
H2N
NH
NH
Si
H3CO
H3CO
OCH3
DETA
(Trimethoxysilylpropyldiethylentriamin)
O
NH
NH
HN
H2N
NH
HN
HN
HN
HN
Si
Si
Si
Si
O
O
O
O
Chip
kovalente Kopplung des Silans auf
oberflächenaktiviertes Glas
Funktionalisation of
Aminosilanenes
R
O
Aldehyd activation
N
R
+ NH2
R`
R
N
H
Reduction
R´
R
R´
N
H2
O
+
O
Azlactone
NH2
R`
R
N
H
H
N
R´
O
O
S
R
N
C
Phenylisothiocyanate
S +
NH2
R`
´R
Isothiourea
N
H
N
H
R
Direkt reaktive Silane
z.B. N-Hydroxysuccinimid-Silan (NHS-Silan)
N-Hydroxysuccinimid
DNA
N
O
NH2
O
OH
+
O
N
O
O
+
DNA
O
C11H22
C11H22
Si
H3HCO
CO OCH3
3
NH
O
Si
O
Was ist der Vorteil direkt reaktiver
Silane ?
1. Einfachere Herstellung in nur einem Prozessschritt
2. Bindung der DNA über spezifische Gruppen (z.B. NH2-Gruppen
3. Aminosilane sind schwer zu handhaben (Polymerisation) - daher schwieriges QM
4. Oxidationsempfindlichkeit von Aminosilanen
Vergleich: Silanisierung zu
Polymeroberflächen
H2N
H2N
H2N
H2N
100 nm

NH
NH
NH

NH
1 nm
O
HN
HN
HN
HN
Si
Si
Si
Si
O
O
O




O
Polymer brush
Funktionelle Gruppen für Polymere
O
O
O
Glycidylester als amino- und
thiolreaktive Gruppe
O
OH
Acrylsäure
Plexiglas
O
NH2
Acrylamid
PAA
O
N
O
O
NHS-Ester als aminoreaktive
O
Gruppe
C
N
O
N
O
O
Thymidin als UV reaktive
Gruppe
HO
CH3
Polymer brushes"
functional polymer brush


attachment of
oligonucleotide probes
detection of analyt
DNA via hybridization
polymer brush with oligonucleotide
strands
Polymer brushes"



















H2N-DNA











watersoluble polymer
with reactive groups








coupled oligo-DNA
inactive reactive groups
Advanced Microarray Technology
• There are several applications currently being developed at IMTEK:
–  HPV virus subtyping chip
current state: clinical study with University Hospital Freiburg; Paper: Schenk, T. et. al., JCM (2009), doi:10.1128/JCM.02080-08
–  bacteria identification chip
current state: validation study for veterinary application with customer / VLA
–  breast cancer chip
current state: designed and tested by IMTEK / University Hospital Freiburg –  pneumococcal polysaccharide chip
current state: comparison study with gold standard by Department of
Rheumatology and Clinical Immunology, University Hospital Freiburg;
Paper: Baader, J., et. al., Biosens. Bioelectron. (2010), doi:10.1016/j.bios.
2010.01.021 3D-polymer array on
plastic slide
Technology
3D polymer arrays are a versatile technology platform:
Step1:
Print polymer
mixed with DNA
Printing: polymer is mixed with biomolecule and printed on almost every matrix
– 
suitable for non-contact printers and contact printers
– 
suitable for microtiter plates
Immobilization: photo-crosslinking for 2 minutes
– 
1-step immobilization process: UV crosslinking of probes, polymer and
matrix altogether
– 
can be crosslinked to almost every matrix e.g. plastic substrates
– 
additional functional groups like epoxy or maleinimide possible
– 
immobilization process is patented technology
Hybridization and readout:
– 
readout with different detection methods
(chemiluminescence, fluorescence, dye precipitation)
– 
high signals because of high probe density
– 
extremely low background because of inert surfaces
Step 2:
Photo-crosslinking
via UV irradiation
Photocross
linker
C OH
Step 3:
Hybridization and
readout
Long
oligonucleotides
(DNA probes) give
higher signals and
therefore better
sensitivity
Affy uses solid
phase sythesis
which can only
produce short
oligonucleotide
molecules.
Therefore the
hybridisation is less
strong -> weaker
signals
Source: DNA microarrays for comparison of gene expression profiles between diagnosis and relapse in precursor-B
acute lymphoblastic leukemia: choice of technique and purification influence the identification of potential
diagnostic markersF J T Staal, M van der Burg, L F A Wessels, B H Barendregt, M R M Baert, C M M van den Burg, C Van Huffel,
A W Langerak, V H J van der Velden, M J T Reinders and J J M van Dongen
Production Process Affymetrix
Source: Affymetrix homepage -> 25 mers are short DNA molecules
The synthesis of these oligonucleotides on GeneChip microarrays are based on the concept of photolithography
Light is shined through a mask onto a chip that has initial starting strands where the DNA will be built from
The mask has specific tiny openings that allow the light to come in contact with the wafer at specific sections (in this diagram there are 5 probes only and each could
represent a different feature)
Any place where light hits, removes a “protective” group from the strands
Free nucleotides (the red T) are washed over the chip and the nucleotides will combine with any strand that had lost its’ protective group in the previous step
This is then repeated (shine light through a mask, deprotect the strands, add free nucleotides) numerous times until a each strand built is 25 base pairs long base
pairs long
Was will ich mit Biochips
nachweisen ?
• 
• 
• 
• 
Mutationen des Genoms (Erbkrankheiten, Krebs)
Genexpression
Wirkung von Medikamenten auf die Genexpression
Erregernachweis: z.B. Erkrankungen mit die durch
Viren oder Bakterien verursacht wurden
•  Resistenzen: z.B. Therapieresistenz bei Tumoren,
Antibiotikaresistenz bei Bakterien
•  Transgene Lebewesen
•  Identität von Lebewesen und Spezies
Prozeßphasen bei der BioChipAnalyse
1.
Probenisolation • genomische DNA
• RNA/mRNA
2.
Markierung • direktes PCR-Labelling
& Amplifikation• indirekt post PCR
3.
Hybridisierung • genom. PCR-Produkte
• cDNA - Proben
4.
Detektion mittels Analysator
5.
Datenverarbeitung (Datenbank)
.
Hybridisieren
what the f... is that
•  Die Bindung eines NS-Stranges an einen anderen der
weitgehend komplementär ist
•  Die Bindung eines NS-Stranges an einen anderen wird
durch den Schmelzpunkt definiert
•  Der Schmelzpunkt eines Hybrides heißt TM
•  Beim TM liegt 50% des Hybrides als Einzelstrang vor !
•  Der TM kann berechnet werden TM = 2(AT) + 4(GC)
•  eine DNA mit aus 5 As und 5 Cs hat damit einen TM
von ...
Wiederverwendbarer 3D Chip zur Bestimmung
Vom Bakterien
Ein Polymerchip wurde mit fluoreszenzmarkierter DNA
hybridisiert, gemessen und anschließend durch Spülen mit
heißen Puffer wieder regeneriert. Danach wurde der gleiche
Chip für weitere Experimente gleicher Art benutzt. Der
Chip kann über 10 mal wiederverwendet werden.
Fluorochrome
Anregung [nm]
FITC
Cy 5
Cy3
AMCA
Europium
490
649
575
345
337
Emission [nm]
525
670
605
425
613