Präsentation zum Vortrag

Einsatz von Antifreeze-Proteinen
in der Lebensmittelproduktion
Klaus Lösche / Julien Huen
11. September 2013
Bäckerei- und Getreidetechnologie
Was sind Antifreeze-Proteine?
• Antifreeze-Proteine AFP
= Eis strukturierende Proteine ISP
BSA 5 µM
fcAFP 12 µM
@ -4°C
Quelle: M. Bayer-Giraldi (2011): Antifreeze proteins from the see ice diatom Fragilariopsis cylindrus
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Was sind Antifreeze-Proteine?
Langsames
Gefrieren
Rekristallisation
Ostwald-Reifung
Bildung von
Kristallkeimen
Wachstum der
Kristalle
Schnelles
Gefrieren
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Was sind Antifreeze-Proteine?
Langsames
AFP interagiert mit der
Oberfläche der Eiskristalle Gefrieren
Rekristallisation
Ostwald-Reifung
Bildung von
Kristallkeimen
Wachstum der
Kristalle
Schnelles
Gefrieren
• Antifreeze-Proteine sind bereits bei sehr niedrigen
Konzentrationen wirksam (1 - 100 ppm)
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Quellen von Antifreeze-Proteinen
• Kältetolerante Organismen
–
–
–
–
Fische
Insekten
Algen (Schneealgen, Kieselalgen)
Getreide, Gemüse
Macrozoarces americanus
Choristoneura fumiferana
Rote Schneealgen
Winterweizen
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(Potentielle) Anwendungen von AFP
• TK-Lebensmittel
–
–
–
–
–
Speiseeis
Bäckereiprodukte
Fleisch und Fisch
Gemüse
Fertiggerichte
• Biotechnologie
Quellen: www.breyers.com; www.popsicle.com
– Kryokonservierung von Zellen
• Frostschutz für technische Oberflächen
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Fragilariopsis cylindrus
Expedition Polarstern ANT XVI/3,
Weddellmeer, Antarktis, 1999
Temperatur
bis -20°C
Salinität bis
200 PSU
Bilder: D. Thomas,
H. Lange u. F. Hinz,
AWI
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Vom Eismeer ins Lebensmittel
Isolierung aus
kälteresistenten
Organismen
Feststellung der
anwendungsbezogenen Vorteile
Charakterisierung
der Eis
strukturierenden
Eigenschaften
Toxikologische
Bewertung
Herstellung im
Labor- und
Pilotmaßstab
Herstellung im
industriellen
Maßstab
Untersuchung der
Wirkung auf die
Eiskristallstrukturen im
Lebensmittel
Zulassung
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Wie überleben die Kieselalgen im Eismeer?
+ Kälte
RNA-Isolierung
= Welche Gene sind aktiv?
+ Salz
Klonierung
Sequenzierung
Antifreeze-Gen
Genomische
Bibliothek
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Folie: M. Bayer-Giraldi, AWI
Eigenschaften von fcAFP
• 25,9 kDa
• Gefrierpunktserniedrigung
(thermale Hysterese)
• Inhibierung der
Rekristallisation
@ -4°C
Quelle: M. Bayer-Giraldi, I. Weikusat, H. Besir, G. Dieckmann (2011): Characterization of an antifreeze protein from the polar diatom
Fragilariopsis cylindrus and its relevance in sea ice, Cryobiology 63 (201) 210-219, doi:10.1016/j.cryobiol.2011.08.00
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Rekombinante Herstellung von fcAFP
DNA-Konstrukt
AWI-PROTOKOLL:
1) DNA-Konstrukt: AFP-Gen
+ Tag in Vektor
2) Klonierung in E. coli
3) Fermentation und Expression
4) Ernte
5) Erste Affinitätschromatographie
6) Trennung des Tags mit eigener
Protease
AWI
7) Zweite Affinitätschromatographie
Aufgereinigtes Protein
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Folie: M. Bayer-Giraldi, AWI
Qualitätsverluste bei TK-Teig: Ursachen
Gefrieren
TK-Lagerung
Auftauen
Zerstörung von Gluten und
Hefezellen durch
entstehende Eiskristalle
Wachstum der Eiskristalle
(Rekristallisation)
Rekristallisation bei
langsamem Auftauen
Kryokonzentration
Austrocknung an der
Oberfläche (Sublimation)
Kondensation an der
Oberfläche
Bildung neuer Poren
(Freisetzung bisher
gelöster Gase)
Migration von Eis zu den
Poren
Wasser aus den Kristallen
wird teilweise reabsorbiert
Gasdruck innerhalb der
Poren sinkt, Teigling fällt in
sich zusammen
Enzymatische Reaktionen
Druck innerhalb der Poren
steigt
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Backversuche
• Modellrezeptur
Bestandteil
Mehl Type 550
Zucker
Salz
Hefe
Backmittel
Wasser
Masse
[Teile bezogen auf Mehl]
100
2
2
3
ohne
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→ 50g-Teiglinge
• Prozess 1 (Industrie): Grün oder vorgegart, Schockfrosten
des Teiges bei -40°C, Lagern bei -18°C im verpackten
Zustand
• Prozess 2 (Handwerk – Gärunterbrechung): Gefrieren des
Teiges bei -18°C, Lagern bei -10°C über 1 bis 3 Tage
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Backversuche
direkt
= Referenz
2,7
Spezifisches Volumen [L/kg]
1 Tag
14 Tage
1 Tag
14 Tage
grün
2,5
2,2
2,7
2,5
vorgegart
2,9
2,7
2,9
2,5
Schockfrosten
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Kein Schockfrosten
Durchlichtmikroskopie bei -15°C
20 mL Destilliertes Wasser
+ 3,5 % Kochsalz + 3,5 % Saccharose
@ -15°C
20 mL Destilliertes Wasser
+ 3,5 % Kochsalz + 3,5 % Saccharose
+ 735 ppm fcAFP
@ -15°C
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Durchlichtmikroskopie bei -15°C
20 mL Destilliertes Wasser
+ 3,5 % Kochsalz + 3,5 % Saccharose
+ 10 % Mehl
@ -15°C
20 mL Destilliertes Wasser
+ 3,5 % Kochsalz + 3,5 % Saccharose
+ 10 % Mehl
+ 735 ppm fcAFP
@ -15°C
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Computertomographie bei -15°C
grün
vorgegart
Quelle: AWI, ttz Bremerhaven
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Raman-Spektroskopie: Messprinzip
Quelle: Dr. Bernd Dippel, www.raman.de
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Konfokale Raman-Mikroskopie
Quelle: WITec GmbH
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Referenzspektren Raman
Eis
Gluten
Eis
Hefe
Gluten, feste Fraktion
Wasser
Stärke
Gluten
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Quelle: AWI, ttz Bremerhaven
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Raman-Bilder gefrorenen Teigs bei -15°C
Eis
Stärke
Stärke + Eis
Gluten
Stärke + Eis + Gluten
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Quelle: AWI, ttz Bremerhaven
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Vergleich Raman / Cryo REM
• Cryo REM
– 3D-Bilder
– Hohe Auflösung
– Eiskristalle nur in den Poren gut sichtbar
Bildquelle: Baier-Schenk, Astrid. Freezing of bread
dough - An investigation on water and ice properties
in relation to dough structure (2005).
• Konfokale Raman-Mikroskopie
–
–
–
–
Minimale Probenvorbereitung
Sichere Identifikation der Phasen
Eis auch in der Teigmatrix sichtbar
2D-Bilder
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Lebensmittelrechtlicher Status von AFP
Novel Food
Nur Speiseeis
Max. 100 ppm
Deklaration als
„Eis-strukturierendes
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Protein“
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Zusammenfassung
• AFP haben Potential für eine Vielzahl von Anwendungen innerhalb und
Untersuchung der
außerhalb
der
Lebensmittelbranche.
Charakterisierung
Isolierung aus
Herstellung im
Wirkung auf die
kälteresistenten
Organismen
der Eis
strukturierenden
Eigenschaften
Labor- und
Pilotmaßstab
• Die großtechnische Herstellung zu akzeptablen Preisen ist
Voraussetzung für die Etablierung der AFP-Technologie.
Eiskristallstrukturen im
Lebensmittel
• Die benötigte Konzentration und die produktbezogenen Vorteile
müssen für jede Anwendung individuell ermittelt werden.
• Die konfokale Raman-Mikroskopie stellt eine neuartige Möglichkeit zur
Charakterisierung
der Mikrostruktur gefrorener
Lebensmittel dar und
Feststellung der
Herstellung im
Toxikologische
anwendungsindustriellen werden.
Zulassung
kann
bei der Anwendungsentwicklung
eingesetzt
Beurteilung
bezogenen Vorteile
Maßstab
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Förderhinweise
Das Forschungsvorhaben AiF 17181 N1 wird im Programm zur Förderung
der „Industriellen Gemeinschaftsforschung (IGF)” vom
Bundesministerium für Wirtschaft und Technologie (via AiF) über den
Forschungskreis der Ernährungsindustrie e.V. (FEI) gefördert.
Die Messungen am Kryo-Ramanmikroskop wurden über die
Nachwuchsgruppe VH-NG-802 der Helmholtz-Gemeinschaft ermöglicht.
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Vielen Dank für Ihre Aufmerksamkeit!
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Klaus Lösche / Julien Huen
ttz Bremerhaven
Am Lunedeich 12
27572 Bremerhaven
Tel. : +49 471 80934-200
Fax.: +49 471 80934-299
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