Statusbericht 2015 - Klinisch-Experimentelle Forschungseinrichtung

Transcription

Statusbericht 2015
Klinisch-Experimentellen Forschungseinrichtung (KEF)
Universität zu Lübeck
Dr. D. Alvarez- Fischer
Institut für Neurogenetik
Prof. Dr. med. L. Bertram
LIGA, Institut für Neurogenetik und Institut für
Integrative und Experimentelle Genomik
Prof. Dr. med. K. Dalhoff und
PD Dr. med. J. Rupp
Medizinische Klinik III und Klinik Infektiologie
und Mikrobiologie
Prof. Dr. med. J. Erdmann und
Dr. hum. biol. Z. Aherrahrou
Institut für Integrative und Experimentelle
Genomik
PD Dr. med. T. Fischer
Klinik für Dermatologie, Allergologie und
Venerologie
Prof. Dr. med. O. Hiort
Klinik für Kinder- und Jugendmedizin
Prof. Dr. med. S. Ibrahim
LIED, Klinik für Dermatologie, Allergologie und
Venerologie
PD Dr. med. Kasperkiewicz
Venerologie
Prof. Dr. med. T. Keck und
Prof. Dr. J. Habermann
Klinik für Allgemeine Chirurgie
Prof. Dr. med. M. Kopp
Prof. Dr. med. H. Lehnert
Medizinische Klinik I
Prof. Dr. med. R. Ludwig
LIED, Klinik für Dermatologie, Allergologie und
Venerologie
Prof. Dr. rer. medic. L. Marshall
Institut für experimentelle und klinische
Pharmakologie und Toxikologie
PD Dr. S.A. Mohamed
Klinik für Herz- und thorakale Gefäßchirurgie
Prof. Dr. med. G. Riemekasten und
Prof. Dr. med. P. Lamprecht
Poliklinik für Rheumatologie
Dr.med. C. Sadik
Venerologie
Prof. Dr. med. B. Wollenberg
Klinik für Hals-, Nasen- und Ohrenheilkunde
Für den Inhalt der Berichte sind Antragsteller bzw. Projektleiter verantwortlich
Inhaltsverzeichnis
Struktur
1
Gebäude
2-7
Antragsteller und Projekte
8 - 12
Forschungsberichte und Drittmittel 2015
13 - 112
Infrastruktur der KEF
Klinisch- Experimentelle Forschungseinrichtung (KEF)
Die KEF ist eine zentrale Einrichtung der Universität zu Lübeck im Bereich der Sektion
Medizin. Sie dient Infrastruktur- gebend und koordinierend der Durchführung medizinischer
Forschungsvorhaben, insbesondere im Bereich der klinischen Forschung. Die KEF stellt
Forschungsflächen, Grundausstattungen an Laborinfrastruktur und Geräten sowie
projektübergreifende Mittel für Strukturmaßnahmen zur Verfügung.
A) Leitung der KEF 2015 (Stand November 2015)
Präsidiumsbeauftragter der KEF
Herr Prof. Dr. G. Sczakiel
Mitglieder des Beirates der KEF
Herr Prof. Dr. Buzug
Herr Prof. Dr. Münte
Herr Prof. Dr. Zillikens
Herr Prof. Dr. Rupp
Herr Prof. Dr. Solbach
Homepage der KEF
www.kef.uni-luebeck.de
B) Mitarbeiter der KEF
Frau P. Höltig (Sekretariat)
Tel. 500 2731
Email: [email protected]
Dr. R. Kretschmer-Kazemir-Far
Tel. 500 2741
Email: [email protected]
Herr M. Schütt
Tel. 2865
Email: schü[email protected]
1
KEF-Haus 30 b, Stand Oktober 2015
Labor 1
Geräteraum
Prof. Dr. P. Lamprecht
Prof. Dr. G. Riemekasten
Labor 2
29,3 m2
15,0 m2
36,6 m2
Flurbereich
Labor 3
WC
Garderobe
Lagerraum
Eingang
Teeküche
36,4 m2
WC
2
Haus 32, Possehlhaus, EG, Stand
Oktober 2015
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
Prof. Dr. H. Gehring
Prof. Dr. B. Wollenberg
Geräteraum
52,98 m2
17,36 m2
Prof. Dr.
H.Lehnert
Prof. Dr.
H.Lehnert
Prof. Dr.
H.Lehnert
23,23 m2
17,36 m2
22,91 m2
0.14
0.15
0.16
0.17
Technik
Prof. Dr.
H.Lehnert
Zellkultur
Zellkultur
17,36 m2
22,91 m2
49,24
m2
Flurbereich
0.8
0.11
0.12
WC
Eingang
0.9
WC
KEF-Raum
14,23 m2
0.13
Prof. Dr.
B.Wollenberg
20,1 m2
16,73 m2
23,23 m2
0.9
Biobank
75,18 m2
101.4
Haus 32, Posselhaus, 1 OG, Stand Oktober 2015
101.2
101.1
Spülküche
Personal
20,11 m2
8,54 m2
102
101.3
103
Prof. H. Lehnert
Prof. Dr. R. Ludwig
Prof. Dr.
PD Dr. C. Kasperkiewicz
R. Ludwig
Prof. Dr.
Dr. C. Sadik
Dr. C.
S. Mohamed
Kaperkiewicz
30,1 m2
21,6 m2
17,4 m2
104
105
106
Prof. Dr.
R. Ludwig
Dr.C.
Kasperkiewicz
Prof. Ludwig
Allgemein
je 50%
Prof. Dr.
K. Hartmann
23,3 m2
17,4 m2
20,9 m2
Flurbereich
108
111
WC
Eingang
107
WC
Reinigung
2. OG
109
113
Prof. Dr.
R. Ludwig
Prof. Dr.
T. Fischer
14,2 m2
20,3 m2
114
Serverraum
16 m2
115
Prof. Dr. J.
Habermann
23,2 m2
116
117
Prof. Dr.
R. Ludwig
Prof. Dr. H. Lehnert
17,4 m2
23,0 m2
3
MFC 1, 4. Stock, rot markierte Räume Stand Oktober 2015
Prof. Dr. J.
Erdmann
Prof. Dr. C.
Klein
Prof. Dr. J.
Mittag
Prof. Dr.
med. L.
Bertram
4
Haus 50, EG und 2.OG, Stand
Oktober 2015
E 213
Prof. Dr.
D. Taçi
20,7 m2
E 214
E 215
E 216
Dr.
Prof. Dr.
Prof. Dr.
D. Alvarez
L. Marshall
M. Kopp
13,3 m2
20,7 m2
34,6 m2
E 217
Zellkultur
13,5 m2
E 218
E 219
Prof. Dr.
Prof. Dr.
O. Hiort
K. Dalhoff
20,3 m2
41,6 m2
Flurbereich
Allgemein
E 212
E 211
Prof. Dr.
Geräteraum für alle
AG´s
O. Hiort
28,17 m2
Funktionsräume, Lagerraum, Damen und Herren WC
10,9 m2
20,93 m2
301 S1 Labor
302 S2-Labor
303 L abor
Prof. Dr.
O. Hiort
34,6 m2
Prof. Dr.
M. Kopp
20,4 m2
Prof. Dr.
H. Oster
20,6 m2
304 S1 Labor
Prof. Dr. H. Oster
306
Prof. Dr. H. Oster
Prof. Dr.
H. Oster
20,2 m2
20,7 m2
20,3 m2
Durchgang
Laborbereich
305 S1 Labor
Funktionsräume- Spülküche, Zentrifugen, KühlGefrierschränke,
Waagen, Lagerraum, Damen und Herren WC
Flurbereich
318
Sozialr.
321
322
323
324
Prof. Dr.
M. Kopp
Prof. Dr.
O. Hiort
Prof. Dr.
S. Ibrahim
Prof. Dr.
K. Dalhoff
10,8 m2
10,8 m2
10,8m2
10,8 m2
16,2 m2
5
KEF-Haus 33a, Stand Oktober 2015
Lagerraum
Dunkel
kammer
Flur
3,11m2
Flur
7,72m2
5,37m2
Herren
WC
5,14m2
Damen
WC
3,11m2
Flurbereich
Zugang Keller
und Haus33
Flur
Flurbereich
73,43m2
Labor 4.1
Büro 3.1
Labor 2.1
Labor 1.1
Prof. Dr.
S. Ibrahim
Prof. Dr.
S. Ibrahim
Prof. Dr.
S. Ibrahim
Prof. Dr.
S. Ibrahim
17,05m2
15,73m2
16,42m2
33,90m2
6
Arbeitsgruppe Dr. D. Alvarez
Institut für Neurogenetik
a) Epigenetic factors in an MPTP mouse model
b) Primary Familial Brain calcification (PFBC): Pathophysiology and molecular
mechanisms modifying deseases expression
c) Collaboration with the “AG Chronophysiologie” of Prof. Dr. H. Oster
Arbeitsgruppe Prof. Dr. med. L.Bertram
LIGA, Institut für Neurogenetik & Institut für Integrative und Experimentelle Genomik
a) Indentification and characterization of complex disease genes
b) The Berlin Aging Study II (BASE-II) – Molecular Genetics
c) Development of novel statistical and bioinformatics pipelines and databases for the
analysis, annotation and interpretation of multidimensional genomics data
d)The role of micro-RNAs in disease susceptibility
Arbeitsgruppe Prof. Dr. med. K. Dalhoff und PD Dr. med. J. Rupp
Medizinische Klinik III und Klinik für Infektiologie und Mikrobiologie
Mechanismen der körpereigenen Abwehr im pulmonalen Kompartiment
Arbeitsgruppe Prof. Dr. med. J. Erdmann und Dr. hum. biol. Z. Aherrahrou
Institut für Integrative und Experimentelle Genomik
Funktionelle Charakterisierung von Herzinfarkt Risiko Gene
Arbeitsgruppe PD Dr. med. T. Fischer
Experimentelle Dermatologie
a) Gen-Mapping von humanen Haarfollikeln als Targeting-Strategie zur Identifizierung
von spezifischen intrafollikluären Matabolismen
b) Untersuchungen der UV-protektiven Potenz von Melatonin und Melatonin-Metaboliten
im humanen Keratinozyten- (HaCaT. NHEK)-und Fibroblasten (HDF)- Zellmodell
c) Melatonin und Melatonin-Metabolite (AFMK, AMK) als protektiver Faktor gegen UVinduzierte Schäden im humanen Vollhaut-Modell
d) Prävention von UV-induzierter Beeinträchtigung der Homöostase von
Hautdifferenzierung und Barrierefunktion durch Melatonin und Melatonin-Metabolite
(AFMK, AMK) in humaner Haut
e) Aktivierung von antioxidativen Enyzmen via “nuclear erythroid 2-related factor (Nrf2)
in UVbestrahlten humanen Keratinozyten durch Melantonin
7
f) Modulierung von UV-induzierter Hochregulierung von Hsp 70 in humaner
Keratinozytenkultur und in ex vivo humaner Vollhaut
g) Untersuchung eines Anti-Androgens zur Prävention von androgenetischer Alopezie
im Haarorgankulturmodell
h) Untersuchung von Einzelkomponenten in Zweier-und Dreier-Kombinationen zur
Stimulation humanen Haarwachstums im Haarorgankulturmodell
i) Untersuchung zur Detektion von Einzelkomponenten in anatomischen Strukturen des
humanen Haarfolikels nach Inkubation im Haarorgankulturmodell durch RAMANSpektroskopie
j) Untersuchung der Haardurchmesser von organkultivierten humanen Haarfolikeln
nach Inkubation mit Einzelkomponenten im Haarorgankulturmodell
k) Untersuchung von Phytotherapeutika zur Stimulation humanen Haarwuchstums im
Haarorgankulturmodell
l) Protektive Wirkung von 17-AAG auf verschiedene Parameter der Entzündung und
Blasenbildung im Epidermolysis bullosa aquisita Maus-Modell
Arbeitsgruppe Prof. Dr. med. T. Keck/ Prof. Dr. Dr. med. J. Habermann
Klinik für Chirurgie
Prof. Dr. Gemoll, Dr. Meyer, Dr. ,Dr. Böckmann,
a) Charakterisierung von Zelllinien und Tumor-Stroma-Interaktion beim Apullenkarzinom
b) Rolle von Gli1 beim Pankreaskarzinom
c) Rolle von Exosomen beim Pankreaskarzinom
d) Auswirkungen des Silencings der Pseudokinase TRIB3 auf die genomische Stabilität
von kolorektalen Tumorzellen
e) Etablierung primärer Zelllinienpaare aus Kolon- bw. Lungenkarzinom und
korrespondierendem Normalgewebe
f) Isolierung und Kultivierung von Zirkulierenden Tumorzellen (CTCs)
g) Evaluierung und funktionelle Charakterisierung potentieller prognostischer Marker für
Brustkrebs
Arbeitsgruppe Prof. Dr. med. O. Hiort
a: Funktionelle Analyse von 46,XY DSD-assoziierten Mutationen in Kandidatengenen
der Geschlechtsentwicklung
b) Medizinische Genetik: Von seltenen Varianten zur Krankheitsentstehung:
Untersuchung von Kandidatengenen bei Störungen der Geschlechtsentwicklung
8
mittels DSD Gene Panel und screening neuer Kandidatengene durch ExomSequenzierung
c) Pathologien des Parathormonstoffwechselwegs: Klinische, biochemische und
molekulargenetische Veränderungen
d) Comparison of clinical and metabolic effects of testosterone and estrogens in adult
gonadectomized patients with 46, XY DSD due to complete androgen insensitiviy
syndrome (CAIS)
e) European conterted research action designated as COST Action BM 103: A
systematic
elucidation of differences of sex development (DSDnet)
Arbeitsgruppe Prof. Dr. med. S. Ibrahim
LIED, Klinik für Dermatologie und Venerologie
a) Genes, Environment an Inflammation, TP 3 Mouse genetics, genetics of inflammatory
skin deseases
b) From primary gene defect (s) to molecular mechanisms leading to
hypergammaglobulnemia and therapy resistance of antibody-secreting plasma cells in
Systemic lupus erythematososous
c) Theorectical Biology CL IX
d) Mouse model systems of inflammation CL XII
e) Genetische Grundlagen der Autoimmunpankreatitis
f) Inflammatory bowel disease, systemic lupus erythematosus, T cell repertoire, B cell
receptor/immunoglobulin repertoire
g) Medizinische Sytembiologie
h) Genetics of pemphigoid deseases in humanes (KFO 303)
Arbeitsgruppe PD Dr. med. M. Kasperkiewicz
Klinik für Dermatologie, Allergologie und Venerologie
a) Plasma cell depletion via activation of the unfolded protein response: Role of heat
shock Protein 90 inhibitors in a mouse model of autoantibody-mediated epidermolysis
bullosa aquisita
b) Investigation of the impact of heat shock protein 90 inhibition of neutrophil
granulocytes in experimental epidermolysis bullosa aquisita
c) Preclinical studies of the effects of heat shock protein 90 inhibition on the adaptive
immune response in autoimmunity
9
d) In vivo investigation of topical application of heat shock protein 90 inhibitors and a
heat shock protein 90 fragment for therapy of autoimmune mediated blister and
wound formation
Arbeitsgruppe Prof. Dr. med. M. Kopp
a) Epigenetische Modifikation epithelialer DNA durch virale Infektion und ihre
Auswirkung auf die Prädisposition für allergisches Asthma
b) Rolle des Matrikins CP17 bei neutrophilem Asthma
c) Hypertone Salzlösung als präventive Inhalationstherapie bei neugeborenen CF
Patienten
d) Deutsche kollaborative Asthmakohorte (KIRA Studie)
e) Verbesserte klinisch-immunologische Phänotypisierung zur Therapieoptimierung
bei Kindern und Jugendlichen mit Asthma
Arbeitsgruppe Prof. Dr. med. G. Riemekasten und Prof. Dr. med. P. Lamprecht
Poliklinik für Rheumatologie
a) Chronische Entzündung, Toleranzdurchbrechung sowie humorale (z.B. funktionelle
und/oder pathogenetisch relevante Autoantikörper) und zelluläre Mechanismen (z.B.
Effektor-Gedächtnis–T-Zellen und regulatorische T-Zellen) bei chronischentzündlichen Autoimmunerkrankungen
b) Frühpathogenese der Wegenerischen Granulomatose: von der natürlichen Abwehr
mit Granulombildung zur Autoimmunität
c) Modulation von Autoimmunität
Arbeitsgruppe Prof. Dr. med. H. Lehnert
a) The interactive effects of hedonic and hormonal stimuli on the central regulation of
energy and glucose metabolism
b: Delay Discounting – Entscheidungsverhalten in Abhängigkeit von Körpergewicht und
Blutzuckerspiegel
c) Liraglutide effects on memory in healthy subjects
d)
Vergleichende Studie zum Effekt von intranasalem Insulin auf
Gedächtnisleistungen bei Patienten mit Typ2-Diabetes und bei Patienten mit früher
Alzheimer Demenz (INSULA)
e) Dissecting the role of the nesfatin-oxytocin-axis in the reward system
f) Central nervous an peripheral actions of nesfatin-1 on thermogenesis and lipid
storage in brown and white adipose tissue
10
Arbeitsgruppe Prof. Dr. med. R. Ludwig
LIED, Klinik für Dermatologie, Allergologie und Venerologie
Untersuchung zur Pathogenese blasenbildender Autoimmundermatosen
Arbeitsgruppe Prof. Dr. medic L. Marshall
a) Weak electric current stimulation and optogenics to investigate sleepdepent memory
consolidation and ensemble reactivation
b) Auswirkung von schwacher elektrischer oszillierender transkranialer Stimulation (SOtDCA) bei schlafabhängiger Gedächtniskonsolidierung auf kortikale Glutamat- und dSerin-Konentration
Arbeitsgruppe Prof. Dr. med. SA. Mohamed
Mechanismen der Aortopathie bei Patienten mit Bikuspider Aortenklappe
Arbeitsgruppe Dr. med. C. Sadik
a) Pemphigoid Diseases Molecular Pathways and their therapeutic potential Klinische
Forschergruppe 303 (Sadik)
b) Die Rolle lang- und kurzkettiger Fettsäuren in Pemphigoid-Erkrankungen (Anne
Braun)
c) Der PUFA-Rezeptor GPR120 in der Psoriasis und der Rheumatoiden Arthritis
(Melanie Wannick)
d) Leukotriene B4 und sein Rezeptor BLT1 in der Pathogenese der Pemphigoide
e) Die Rolle der 15-Lipoxygenase-1 in Pemphigoid-Erkrankungen (Tanya Sezin)
f) Die Rolle der Dipeptidyl-Peptidase IV in Pemphigoiden sowie in der Psoriasis
Arbeitsgruppe Prof. Dr. med. D. Taçi
Bericht erscheint in 2016
Arbeitsgruppe Frau Prof. med. Dr. B. Wollenberg
a) Die Expression der Komponenten des Komplementsystems in der chronischen
Rhinosinusitis mit nasalen Polypen
b) TLR abhängige miRNA Modulation in HNSCC
c) Einfluss von TLR3 auf die EMT in HNSCC
11
d) Dysregulation der Leukozyten-Adhäsionskaskade bei chronischer Rhinosinusitis mit
nasalen Polypenl
e)Modulation Dendritischer Zellen
f) Charakterisierung von GSK3 in HNSCC
g) WNT-Regulation in HPV+HNSCC
h) Cineol als EMT Inhibitor
i) Visualisierung von Tumoren mittels MPI
12
Dr. med. D. Alvarez-Fischer
Dr. med. D. Alvarez Fischer
Institute of Neurogenetics and Department of Psychiatry and Psychotherapy
Rodent models of movement and neuropsychiatric disorders
Projekt
a-c
a) Epigenetic factors in an MPTP mouse model
b) Primary Familial Brain Calcification (PFBC): Pathophysiology and molecular
mechanisms modifying disease expression
c) Collaboration with the “AG Chronophysiologie” of Professor Henrik Oster
Ad 1)
1.
Fragestellung:
Hypothesis
The exposure of the F0 generation of C57Bl/6 mice to MPTP renders the F1 generation
more susceptible to intoxication.
Aim:
The aim of the present proposal is to investigate whether an exposition of the parent
generation (F0) to environmental toxins that compromise complex I of the respiratory
chain renders their offspring more susceptible for neurodegeneration of the nigro-striatal
pathway. It is designed as a ‘proof-of-principle’ study for a larger follow-up investigation.
A possible follow-up project will utilize the biological material generated in the present
proposal to correlate potential changes in the methylation pattern with a pathological
phenotype.
Study:
We used 10 breeder pairs (C57Bl/6, 7 weeks old; F0 generation) that were divided into
two groups, i.e. “exposed” and “naïve”. In the first part of the experiment one week after
arrival they roduced offspring (F1). The F1 generation was kept until the age of 15
weeks. At this time they have been killed, their brains have been divided into both
hemispheres, and the left hemisphere was snap-frozen in liquid nitrogen. The striata of
the right hemisphere have been dissected and processed for neurochemical analysis as
previously described. Midbrains have been taken and processed for
immunohistochemistry.
Four weeks after giving birth to the F1 generation the F0 breeders of the “exposed” arm
has been intoxicated using the so called “chronic” MPTP/p paradigm (25 g/kg MPTP-HCl
with a co-treatment of probenecid (250 mg/kg)) for 5 weeks every 3.5 days (10 injections
in total). The “naïve”, control arm has been treated with the corresponding volume of
saline.
After intoxication (or saline treatment), the F0 mice bred together again for the
generation of another cohort of male offspring (F1'). To yet unknown reason mortality of
MPTP treatment was unexpected high so that we were unable to generate enough F1’
off-spring for another splitting and new intoxication as originally project plan (see report
2014).
Readout of the experiment was the striatal content of DA and its metabolites and several
behavioral tests.
13
2.
Methodik:
1) HPLC
2) Behavior
3) Immunohistochemistry
4) Measurement of striatal Complex I activity
3.
Ergebnisse:
We were able to generate the following sample size:
Group
F0
F0
Treatment arm
Saline arm (yellow)
MPTP arm (blue)
n
12
2
F1
F1
F1’
F1’
Saline arm (yellow)
MPTP arm (blue)
Saline arm (yellow)
MPTP arm (blue)
23
21
19
8
Table 1. Number of animals analyzed. The table gives the number per each group.
1) Intoxication of the F0 generation does not lead to an alteration in striatal content of
catecholamines and metabolites
The analysis of the striatal tissue homogenates showed a tendency to reduced level of
striatal dopamine in the striata of the F1’ generation compared to the F1’ of the naïve
arm as well as to the F1 in both arms (Fig 1). However, differences failed to reach
significant levels most likely due to small sample size (n=8-23, see table above). This
was also true for the quotient of HVA and DA that was slightly but not significantly
increased in the F1’ mice from the MPTP arm. In contrast, no differ censes were
observable in striatal norepiniephrine and serotonine levels (Fig 2, 3).
Figure 1. Striatal dopamine and dopamine metabolism. The graph shows the content of striatal dopamine (left) and
the quotient HVA/DA (right) in the different F1 groups. Data are expressed as mean ± S.E.M. (n=8-23 per group).
Differences failed to reach significant levels (one-way ANOVA and post-hoc Holm-Sidak’s test).
14
Figure 2. Striatal serotonine and serotonine turn over. The graph shows the content of striatal serotonine (5HT)(left)
and the quotient of metabolites (5HIAA) and serotonine (right) in the different F1 groups. Data are expressed as mean ±
S.E.M. (n=8-23 per group). No differences were observable (one-way ANOVA and post-hoc Holm-Sidak’s test).
Figure 3. Striatal norepinephrine and epinephrine. The graph shows the content of striatal norepinephrine (NE)(left)
and epinephrine (right) in the different F1 groups. Data are expressed as mean ± S.E.M. (n=8-23 per group). No
differences were observable (one-way ANOVA and post-hoc Holm-Sidak’s test).
2) Intoxication of the F0 generation does not lead to an alteration in striatal complex I
activity in the offspring
The analysis of striatal complex I acitivity did not reveal any alteration among the
different treatments groups (Figure 4).
Figure 4. Striatal complex I acitivity. The
graph shows the activity of complex I of
striatal tissue homogenates. Data are
expressed as mean ± S.E.M. (n=8-23 per
group). No differences were observable
(one-way ANOVA and post-hoc HolmSidak’s test).
3) Intoxication of the F0 generation leads to alteration of motor activity in the offspring
The analysis of behavior using both open field motor activity and cylinder test revealed
alterations in total track length of offspring of mice treated with MPTP compared to
earlier born littermates and offspring of saline treated mice (Fig 5).
15
Figure 5. Total track length in the open
field test. The graph shows the motor
activity in the open field test. According to
the hypothesis, offspring of MPTP treated
mice show alteration in motor activity
compared to both, earlier born littermates
and offspring of naïve mice. Data are
expressed as mean ± S.E.M. (n=8-23 per
group). One-way ANOVA and post-hoc
Holm-Sidak’s test).
The same trend was observable in the cylinder test, however, the data failed to reach
significant levels, again, most likely due to small sample size (Fig 6).
Figure 6. Vertical motor activity. The graph shows results of the cylinder test. Time spent on the hind paws (left) and the
number of rearings (right) in the F1’ generation of saline (yellow) and MPTP (blue) treated parents is given. Differences in
the number of rearings go in the same direction as total motor activity measured in the open field test. However, data
failed to reach significant levels, most likely due to small sample size. Data are expressed as mean ± S.E.M. (n=8-19 per
group). No differences were observable (one-way ANOVA and post-hoc Holm-Sidak’s test).
16
Ad 2)
1.
Fragestellung:
There is good evidence to hypothesize that a disturbance of monocyte/macrophage
maturation is involved in PFBC pathology. Given that inflammation plays an important
role in neurodegeneration, alterations in this system could render PFBC patients more
susceptible to loss of neuronal function. The adaptive immune system is an attractive
candidate to explain differences in the development of movement disorders in PFBC
patients according to environmental influences. Thus, the present proposal focuses on
mechanisms by which individuals with a genetic predisposition for a disease can cope
with disadvantageous circumstances.
Premise 1:
Clearance of calcification requires osteoclasts that in turn develop from
macrophages regulated by PDGFB-depending signaling. Given the fact that calcification
occurs in almost all mutation carriers and does not correlate with the development of
movement disorders, we expect differences between mutation and non-mutation carriers
but not between affected and unaffected mutation carriers.
Hypothesis 1: In PFBC patients, as well as in the murine model, the maturation of
osteoclasts from monocytes/macrophages is disturbed leading to basal ganglia
calcification.
Aim 1a: To investigate whether mutations in PDGFB lead to an altered
osteoclastogenesis and whether this is also seen using murine monocytes.
and
Aim 1b: To investigate monocyte/microglia activation and to correlate osteoclast
activity in the striatum and midbrain of one-year-old PDGFbret/ret mice.
Premise 2:
Neuroinflammation is seen in the area of calcification in the brain of
PFBC patients and knock-out mice. However, at least under basal conditions, the nigrostriatal pathway is unaffected. We expect the PDGFbret/ret mice to be more susceptible
to MPTP and to show higher levels of activated microglia.
Hypotheses 2: Disturbed microglial function and/or leakage of the blood brain barrier
(BBB) lead to altered and deleterious neuroinflammation and degeneration of the nigrostriatal pathway upon stress.
Aim 2: To investigate whether PDGFbret/ret mice are more susceptible in a toxinbased model of Parkinson disease due to altered neuroinflammation
Premise 3:
Basal ganglia calcification is a common feature in mitochondriopathies
and PDGF treatment has shown to render vessel cells more resistant to apoptosis by
increasing the mitochondrial transmembrane potential (∆Ψm). We expect differences in
∆Ψm not only between mutation carriers and non-mutation carriers but also among
mutation carriers between those who are affected and those who are not.
Hypotheses 3: PDGF increases the mitochondrial transmembrane potential (∆Ψm),
the disturbed PDGF-signaling pathway leads to depolarization of ∆Ψm and by that
facilitates apoptosis.
Aim 3: To investigate whether mitochondria of iPS cell-derived neurons and
osteoclasts of affected and unaffected mutation carriers and family controls as well as
osteoclasts of PDGFbret/ret mice differ regarding ∆Ψm, respiration, and complex I
activity as well as markers for apoptosis (TUNEL and cytochrome C).
17
2.
Methoden:
1) human and murine Osteoclasenassay
2) human Fibroblasts
3) Measurement of mitochondrial Membranpotential
4) HPLC
5) Immunohistochemistry
6) Behavioral analysis
3.
Ergebnisse:
PDGFB and PFBC
To date, mutations in four genes i) SLC20A2 encoding inorganic phosphate transporter
PIT2, ii) PDGFRB encoding for PDGF-Rβ, iii) PDGFB encoding PDGFB, the main ligand
of PDGF-Rβ, and XPR1, a gene encoding a retroviral receptor with phosphate export
function (Legati et al., 2015) have been identified as causes of PFBC. In their recent
Nature Genetics publication, researchers from our Institute were the first to describe the
role of the nonsense and missense mutations in PDGFB, the third reported PFBC gene,
in six families of different ancestry.
Furthermore, we analyzed mice with hypomorphic Pdgfb alleles and detected the
presence of alizarin red-stained clusters of calcified nodules in the midbrain and
thalamus of 4-month-old homozygous PDGFB retention-motif knockouts (Pdgfbret/ret) but
not in their control littermates (Keller et al., 2013). At 2 months, smaller laminated
nodules were detected in the midbrain and thalamus of Pdgfbret/ret mice, but they were
few in number and not positive for staining with alizarin red, indicating lack of calcium
deposits at this age (Keller et al., 2013).
Given that PFBC is progressive with age in humans, 1-year-old Pdgfbret/ret mice and
controls were also assessed. At this time, Pdgfbret/ret mice showed abundant
calcifications at multiple locations in the basal forebrain, thalamus, midbrain, and pons,
as detected by histological staining and micro-CT scan (Fig 7). Micro-CT scans showed
bilateral punctate hyperdense lesions (Fig 7) with a mean density of 1,460 ± 260
Hounsfield units, indicating structures with bone density. Immunohistochemistry showed
that these lesions were surrounded by reactive astrocytes and strongly CD45-positive
microglia.
The mineral content of the mouse lesions was assessed by scanning electron
microscopy combined with energy-dispersive X-ray spectroscopy analysis and showed
that calcium and phosphorus were the main constituent elements of the lesions,
indicating that the majority of their content was calcium phosphate. Taken together,
these data suggest that the histological appearance, anatomical location and chemical
composition of calcified lesions are highly similar in Pdgfb hypomorphic mice and
humans with PFBC. In the brain, PDGFB is expressed in endothelial cells, microglia, and
neurons (Bethel-Brown, Yao, Hu, & Buch, 2012; Enge et al., 2003; Reis et al., 2012;
Sasahara et al., 1998; Xiyang et al., 2009). To clarify whether any of these sources are
specifically relevant for PFBC pathology, Pdgfb-null mice rescued to adulthood by
transgenic re-expression of PDGFB in the endothelium were analyzed. These mice lack
neuronal PDGFB expression but express endothelial PDGFB at levels that depend on
the copy number of the rescue allele (R26P). The Pdgfb−/− mice with two copies of the
rescue allele (Pdgfb−/−; R26P+/+) failed to develop calcifications altogether. However,
Pdgfb−/− mice with one copy of the rescue allele (Pdgfb−/−; R26P+/0), hence expressing
50% less endothelial PDGFB, developed substantial brain calcification at 1 year of age
(Keller et al., 2013).
18
In comparison with Pdgfbret/ret mice, Pdgfb−/−; R26P+/0 mice developed smaller, fewer and
more variable lesions but with similar anatomical location and histological appearance
(data not shown). These data exclude a role for neuronal PDGFB and correlate levels of
endothelial PDGFB with brain calcifications in mice (Keller et al., 2013).
Figure 7: Progressive brain calcification in 1‐year‐old Pdgfbret/ret mice. (a) Sagittal brain sections of a 1‐year‐old ret/ret
mouse show calcified nodules in four distinct anatomical regions: basal forebrain (BF), thalamus (T), Pdgfb
midbrain (MB) and pons (P) that are absent in the littermate control. Scale bars, 1 mm (100 μm in insets). (b) Micro‐
CT scan of the brain of a 1‐year‐old Pdgfbret/ret mouse. Coronal (left), sagittal (upper right) and axial (lower right) maximum‐intensity projections are shown. Note the bilaterally visible punctiform bone‐dense structures within the midbrain‐thalamus region (arrows). (c) Axial views of T1‐weighted manganese‐enhanced MRI scans of a 1‐year‐old ret/ret
mouse and a littermate control. Images are representative of analyses performed on three mice per Pdgfb
genotype. Postmortem analysis of each individual verified that hypointense areas corresponded with calcifications visualized by the histostains shown in (a). Taken from (Keller et al., 2013) PDGFB, calcification, and the nigro-striatal system
As demonstrated in the preceding paragraph one-year-old Pdgfbret/ret mice develop
severe calcifications. We therefore wondered whether this is accompanied by alteration
in the DA system as a marker for the nigro-striatal integrity. To this end we killed oneyear-old male Pdgfbret/ret mice (n=5 per group), separated the hemispheres and after
snap-freezing the left hemisphere, dissected the striatum and post-fixed the midbrain in
4% formaline. HPLC analysis of the striatum revealed that there is neither a decrease of
striatal dopamine content comparing Pdgfbret/ret and their wild-type littermates (Fig 8a)
nor an altered dopamine turnover as verified by DOPAC+HVA / DA quotient (Fig 8b). To
gain first insight into the relationship between the extent of calcification and its impact on
the nigro-striatal pathway, we also analyzed the striatal dopamine content of Rag1+/Pdgfbret/ret mice. These animals develop even much more severe calcifications. However,
also in these animals we did not detect any alteration in the DA system under basal
conditions (Fig 8a, b).
Although analysis of midbrain is not yet complete, it seems highly unlikely based on
these neurochemical data that we will detect midbrain DA cell loss in these animals. The
left hemisphere will be processed for immunohistochemistry to investigate the calcified
region for i) post-synaptic integrity (DRD1 and DRD2), ii) activation of microglia (that has
been shown to be upregulated) and to correlate this activation with osteogenic cells
expressing bone markers such as osteopontin, osteocalcin, and alkaline phosphatase
(Sowa et al., 2013).
19
ret/ret
mice. Analysis of the striatal content of dopamine and metabolites Figure 8: Striatal dopamine content of PDGFb
to determine dopamine turnover in the right hemisphere is shown. Data are expressed as mean ± SEM. Statistical analysis was performed by one‐way ANOVA showing no significant difference between groups (n=5 per group). As further control we included Rag1+/‐ PDGFbret/ret mice with a higher striatal calcification burden. Also these animals did not show significant alterations in pre‐synaptic nigro‐striatal system. Monocytes and maturation of osteoclasts
We have successfully established a previously published assay (Chabbi-Achengli et al.,
2012) to analyze monocyte/macrophage-derived osteoclasts from human blood samples
and optimized the conditions so that we are able to delay the processing to 24 hours (Fig
9, 10). Using our established protocol, there is no disadvantageous difference in
osteoclastogenesis referring to cell size (Fig 9b, 10b) and cell number (Fig 7a) compared
to freshly processed blood samples. This will be necessary to deliver blood sample from
patients to the institute. We already contacted the previously published German family
with mutations in the PDGFB gene (Keller et al., 2013; Oliveira et al., 2004) who agreed
to donate blood sample for further analysis.
a
b
Figure 9: In vitro analysis of osteocalstogenesis from human blood samples. (a) Osteoclastogenesis assay from
human blood samples after stimulation with M-CSF for 4 d and M-CSF/ RANKL for a further 5 d. Osteoclasts are TRAPpositive and contain more than 3 nuclei. (b) We compared the maturation with respect to osteoclast cell number and
osteoclast size. To determine cell size we analyzed systematic randomly chosen osteoclasts using stereology software
(MicroBrightField). The graph shows the box plot of 402 (red) - 578 (green) analyzed cells in 4 independent preparations
per condition from the same sample. The boxes represent the first and third quartiles, and the band inside the box the
median. The whiskers represent the upper and lower quartile. There was no difference between fresh blood (red) and
blood that was processed 24h either immediately stimulated (green) or stimulated after 24h (yellow, picture in a). Scale:
200µm.
20
a
b
Figure 10: In vitro of osteocalstogenesis from human blood samples of two male and two female healthy
controls. (a) The number of osteoclasts derived from human blood sample does not differ between males and femals and
is not disadvantageous altered after 24hours. The graph shows the mean ± SEM of two independent preparations of two
different healthy volunteers per sex. Cell counting was performed using stereology. (b) We also compared cell size in
these conditions and found no significant alteration in any condition. Cell size was analyzed by systematic randomly
sampling of 21-94 cells. Again, graph shows the mean ± SEM. Note the small standard deviation between in the different
conditions (n=2 per condition).
Figure 11: In vivo staining of striatal sections of one-year
ret/ret
mouse. The photograph shows a striatal section
old. Pdgfb
ret/ret
of a one year old Pdgfb
mouse stained with DAPI (blue) and
anti-CD68 antibody (green). The dotted circle indicates area of
calcification, white arrows point to CD68-positive cells. Note, the
CD68 staining is near the areas of calcification.
According to our hypothesis we were able to detect CD68-positive cells in the vicinity of
calcification deposits (Fig 11).
We also started to analyze osteoclastogenesis from monocytes derived from control and
Pdgfb mice. Our preliminary data support our hypothesis that the maturation of
osteoclasts is affected in Pdgfbret/ret mice both with respect to cell number per well (Fig
12a) and cell size (Fig 12b, n=4-5 per group). However, regarding cell number,
differences failed to be statistically significant most likely due to low sample number.
Apart from morphology, we did not yet analyze the function of osteoclasts. Thus, we aim
to increase sample number to n=8-10 per group and to perform functional assays.
ret/ret
21
a
b
ret/ret
Figure 12: In vitro analysis of osteocalstogenesis from samples one-year old. Pdgfb
mouse.
Osteoclastogenesis assay was performed using the protocol for human blood samples (Fig 6). We compared the
ret/ret
maturation with respect to (b) osteoclast cell number and (b) osteoclast size from wild-type and Pdgfb
mice (n=4-5 per
ret/ret
) and 5 (WT)
group). Cell counting was performed using stereology in eight different wells per animal with 4 (Pdgfb
animals per group.To determine cell size we analyzed systematic randomly chosen osteoclasts using stereology software
(MicroBrightField). The graph shows the mean ± SEM. # p<0.05, ANOVA, post-hoc Holm-Sidak test.
PDGFB, mitochondria, and apoptosis
Mitochondrial dysfunction has been shown to be involved in the induction of apoptosis
and has even been suggested to be central to the apoptotic pathway (Deuse et al.,
2014; Ly, Grubb, & Lawen, 2003). Indeed, opening of the mitochondrial permeability
transition pore has been demonstrated to induce depolarization of the transmembrane
potential (∆Ψm), release of apoptogenic factors, and loss of oxidative phosphorylation.
In some apoptotic systems, loss of ∆Ψm may be an early event in the apoptotic process
(Ly et al., 2003; Tatton, Chalmers-redman, Brown, & Tatton, 2003). Of interest in this
context is the work very recently published in Nature and involving researchers from the
Institute of Neurogenetics in Lübeck, showing that PDGFB treatment of cell cultures can
induce ∆Ψm hyperpolarization and by this render cultured vessel cells more resistant to
apoptosis (Deuse et al., 2014). We therefore concluded that limited mitochondrial
hyperpolarization via the PDGFB pathway leads to altered apoptosis. Preliminary results
seem to support our hypothesis. Although we were unable to replicate that PDGF
treatment induces hyperpolarization (data not shown) which is most likely due to the
different cell type used (fibroblasts vs. vessel cells), we show that fibroblasts from
patients suffering from PFBC caused by mutations in the PDGF gene show a decrease
in ∆Ψm after PDGF treatment, whereas the same treatment was without significant
effect on fibroblasts obtained from healthy controls (Fig 13a, c).
a
b
c
Figure 13: Measurement of the membrane potential in fibroblasts from healthy controls (a) and mutation carriers
(b) in the PDGFB gene. (a) The mean of the depolarization potential (∆Ψm) of four different fibroblast cell lines from
different PDGFB mutation carriers upon treatment with PDGF, the PDGFRB antagonist imatinib and both. The graph
gives the mean from three independent replication of the experiment. Basal conditions were set as 100%. (b) Direct
comparison between fibroblasts from healthy controls (n=2) and mutation carriers (n=2) under basal condition. The basic
values seems to differ between controls and mutation carriers. (c) The same cells in direct comparison upon PDGFB
treatment. Again, PDGFB treatment seems to decrease the ∆Ψm in cells obtained from mutation carriers possibly
indicating that those cells harbor energy failure and leading these cells towards apoptosis. Control conditions were set as
100%. Further analysis and increase in n will be necessary to reproduce and elucidate the underlying mechanism. All
experiments have been performed in triplicate.
22
This is surprising and unexpected since PDGF substitutes the mutated protein and the
receptor should be unaffected. One possible explanation is that the constitutional loss of
PDGFB function leads to a basal alteration in mitochondrial function and cell survival.
This is in line with our preliminary result showing that already under basal conditions,
∆Ψm is altered in fibroblasts when comparing cells from healthy controls and mutation
carriers (Fig 13b) and indicating that indeed, maturation of osteoclasts differs between
control and Pdgfbret/ret mice (Fig 13). Since treatment with the receptor antagonist
imatinib is able to block this effect it is also unlikely that the effect is not transmitted
through the receptor signaling pathway (Fig 13).
However, these results need further validation. First, we investigated cell lines from only
two controls and mutation carriers and an increase in sample number is necessary to
confirm our finding. Second, the fibroblasts are not the tissue of interest. Thus, we aim to
investigate, under the same protocol, osteoclasts derived from humans and mice
(mutants and controls) to verify whether the results found in fibroblasts hold up in
osteoclast-like cells. Finally, we aim to further investigate consequences of ∆Ψm
alterations and will thus investigate i) cell respiration and complex I activity as previously
described (Alvarez-Fischer, Noelker, Grünewald, et al., 2013; Alvarez-Fischer, Noelker,
Vulinović, et al., 2013; Noelker, Morel, et al., 2013; Noelker, Stuckenholz, et al., 2013)
and ii) perform TUNEL (terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated biotinylated UTP
nick end labeling) and cytochrome C staining as apoptotic markers and markers that are
released from mitochondria after decrease of mitochondrial membrane potential.
Zeitraum
01.01.2015-31.12.2015
Drittmittel
Projektträger
University of Lübeck
Förderzeitraum 2015
Fördervolumen 100,000 €
Sachmittel/Stellen
1.
2.
Ausgegebene Drittmittel in 2015
Sachmittel/Stellen
100,000 €
Neu eingeworbene Drittmittel in 2015
Application Package to the University of Lübeck, “Molecular mechanisms modifying
disease expression”, 100,000 € for 2015
Submitted and still pending funding
1) PDGF-Projekt, Thyssen-Foundation, funding volume: 130,222 €
2) MJFF, Rapid Response, funding volume: 60,000 US $
1.
Publikationen aus dem laufenden KEF-Projekt mit IF
Originalarbeiten
a) erschienen /bzw. im Druck im Jahr 2015
b) eingereicht
a)
1: Noelker C, Lu L, Höllerhage M, Vulinovic F, Sturn A, Roscher R, Höglinger GU, Hirsch
EC, Oertel WH, Alvarez-Fischer D*, Andreas H*. Glucocerebrosidase deficiency and
mitochondrial impairment in experimental Parkinson disease. J Neurol Sci. 2015 Jun 17.
pii: S0022-510X(15)00371-8. doi: 10.1016/j.jns.2015.06.030. [Epub ahead of print]
PubMed PMID: 26104567. [IF 2.474],
 equal contribution
23
2: Höglinger GU*, Alvarez-Fischer D*, Arias-Carrión O*, Djufri M, Windolph A, Keber U,
Borta A, Ries V, Schwarting RK, Scheller D, Oertel WH. A new dopaminergic nigroolfactory projection. Acta Neuropathol. 2015 Sep;130(3):333-48 PubMed PMID:
26072303. [IF 10.762]
*equal contribution
3: Tadic V, Westenberger A, Domingo A, Alvarez-Fischer D, Klein C, Kasten M. Primary
familial brain calcification with known gene mutations: a systematic review and
challenges of phenotypic characterization. JAMA Neurol. 2015 Apr;72(4):460-7. doi:
10.1001/jamaneurol.2014.3889. PubMed PMID: 25686319. [IF 7.271]
b)
1. Wagner J, Vulinović F, Grünewald A, Unger MM, Möller JC, Klein C, Oertel WH,
Michel PP, Ries V, Alvarez-Fischer D. Acylated and unacylated ghrelin confers
neuroprotection to mesencephalic neurons. Mov Disorders under review
2.
Buchbeiträge
keine
3.
Anderes
Dissertationen und andere Abschlüsse
Bachelorthesis Philipp Seide, abgeschlossen mit der Gesamtnote „gut“
Bachelorthesis Kerstin Tanzer, abgeschlossen mit der Gesamtnote „sehr gut“
Ongoing Dissertation Georg Mahlke
Ongoing Dissertation Tamara Vernik, awarded with scholarship
Invited talk, Brain and Plasticity, Paris 14./15. April 2015
Poster, guided Poster-Tour MDS in San Diego, June 2015
Poster with Abtract DGN in Bonn, September 2015
Vortrag with Abstract DGPPN in Berlin, November 2015
Participation in the group of expert meeting “ADHD in adulthood”
24
Alvarez-Fischer, D., Noelker, C., Grünewald, A., Vulinović, F., Guerreiro, S., Fuchs, J., …
Hartmann, A. (2013). Probenecid potentiates MPTP/MPP(+) toxicity by interference with cellular
energy metabolism. Journal of Neurochemistry, Epup ahead. http://doi.org/10.1111/jnc.12343
Alvarez-Fischer, D., Noelker, C., Vulinović, F., Grünewald, A., Chevarin, C., Klein, C., …
Hartmann, A. (2013). Bee venom and its component apamin as neuroprotective agents in a
Parkinson
disease
mouse
model.
PloS
One,
8(4),
e61700.
http://doi.org/10.1371/journal.pone.0061700
Bethel-Brown, C., Yao, H., Hu, G., & Buch, S. (2012). Platelet-derived growth factor (PDGF)-BBmediated induction of monocyte chemoattractant protein 1 in human astrocytes: implications for
HIV-associated
neuroinflammation.
Journal
of
Neuroinflammation,
9,
262.
http://doi.org/10.1186/1742-2094-9-262
Chabbi-Achengli, Y., Coudert, A. E., Callebert, J., Geoffroy, V., Côté, F., Collet, C., & de
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of the National Academy of Sciences of the United States of America, 109(7), 2567–72.
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Legati, A., Giovannini, D., Nicolas, G., López-Sánchez, U., Quintáns, B., Oliveira, J., … Coppola,
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Oliveira, J. R. M., Spiteri, E., Sobrido, M. J., Hopfer, S., Klepper, J., Voit, T., … Geschwind, D. H.
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Reis, M., Czupalla, C. J., Ziegler, N., Devraj, K., Zinke, J., Seidel, S., … Liebner, S. (2012).
Endothelial Wnt/β-catenin signaling inhibits glioma angiogenesis and normalizes tumor blood
vessels by inducing PDGF-B expression. The Journal of Experimental Medicine, 209(9), 1611–
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Sasahara, M., Amano, S., Sato, H., Yang, J. G., Hayase, Y., Kaneko, M., … Hazama, F. (1998).
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truncated at the 5’ end. Oncogene, 16(12), 1571–8. http://doi.org/10.1038/sj.onc.1201679
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Tatton, W. G., Chalmers-redman, R., Brown, D., & Tatton, N. (2003). Apoptosis in Parkinson ’ s
Disease : Signals for Neuronal Degradation, 61–72. http://doi.org/10.1002/ana.10489.balance
Xiyang, Y.-B., Liu, S., Liu, J., Hao, C.-G., Wang, Z.-J., Ni, W., … Wang, T.-H. (2009). Roles of
platelet-derived growth factor-B expression in the ventral horn and motor cortex in the spinal
cord-hemisected
rhesus
monkey.
Journal
of
Neurotrauma,
26(2),
275–87.
http://doi.org/10.1089/neu.2007.0374
25
LIGA, Institut für Neurogenetik & Institut für Integrative und Experimentelle Genomik)
a) Projekttitel:
Projekt 1 ”Identification and characterization of complex disease genes”
1.
Fragestellung:
The etiology of many adult-onset disorders (such as Alzheimer’s disease, Parkinson’s
disease, and multiple sclerosis) is multifactorial and likely the result of the complex
interplay between independent genetic and non-genetic susceptibility factors. A
particular distinction must be made between ‟monogenic“ and ‟polygenic“ (a.k.a.
gentically complex) forms of these diseases. The goal of this ongoing project was and is
the identification and characterization of novel genetic factors underlying these
conditions using a range of state-of-the-art genomics approaches.
2.
Methodik:
Successful gene identification in human / medical genetics relies on the combination of
three methodological steps that are typically applied sequenctially: i) identifcation of
suitable individuals, e.g. a sufficiently sized collection of case and control individuals or
multiplex families with samples from both affected and unaffected individuals, ii)
experimental determination of DNA sequence features (polymorphisms, mutations, copy
number variants, etc), e.g. using high-throughput or targeted sequencing and genotyping
methodologies, iii) application of a dedicated genome analytics pipeline for the
processing, analysis and interpretation of the resulting genetic data. For the projects
listed in this section of the progress report, the involvement of the LIGA group was
mostly restricted to domains ii) and iii). Domain i), i.e. sample recruitment, was
accomplished by our clinical project partners although out team was typically involved in
advising on study design and recruitment paradigms. For the functional characterizations
performed in this project, we also applied a combination of in silico modelling as well as
in vitro and in vivo experiments (using human cell lines and animal models,
respectively).
3.
Ergebnisse:
In the reporting period, we were able to complete and publish a total ofeleven projects
(cumulative impact factor: 125.2; see list below). In Hooli et al, 2015, we utilized
whole-genome sequencing to assess previously reported evidence suggesting that rare
variants in PLD3 represent novel genetic determinants of Alzheimer’s disease but failed
to replicate the original reports. In Lill et al, 2015c, we used a combination of highthroughput techniques to assess the association evidence of an amino-acid changing
variant (R47H) in the TREM2 locus in a total of four neurodegenerative diseases (AD,
ALS, FTLD, PD). Ultimately, the R47H TREM2 variant only showed compelling evidence
of association with AD, but not with the other diseases. In Lill et al, 2015a, we used
targeted SNP genotyping in the PASIDA cohor and identified two novel loci significantly
correlating with age at onset in PD. In Nalls et al, 2015, we describe the development
and successful application of a novel genome-wide SNP genotyping array (‟NeuroX“),
specifically designed for the assessment of genetic factors in neurodegenerative
disorders. In Domingo et al, 2015, we used genome-wide SNP genotyping to exclude
the presence of copy-number-variants in a region on chromosome X harboring the
obligate XDP interval. In Wilkcox et al, 2015, we identified a novel, likely diseasecausing, three base-pair deletion (c.443_445delGAG, p.Ser148del) in ATP1A3 in a large
dystonia family from New Zealand by combining genome and exome sequencing. In
Schrewe et al, 2015, and Hoppmann et al, 2015, we used a number of in silico, in vitro,
and in vivo tools to characterize the effects of MS candidate genes identified by us and
others in previous work. In Lill et al, 2015b, we used targeted genotyping in over 20,000
individuals from Europe and Russia to pinpoint seven novel genes showing genomewide association with MS. In Dankowski et al, 2015, we utilized a exome-wide
genotyping in a sample of German MS patients and controls and were able to extend our
26
currently knowledge on MS genetics with a particular focus on rare coding variants.
Finally, Moutsianas et al, 2015, represents a consortium effort within the International
MS Genetics Consortium (IMSGC) where we used a combination of high-throughput
genotyping and sequencing to fine-map the well established MS association signal in the
HLA region on chromosome 6.
Zeitraum
Jan 1st 2015 – Dec 31st 2015
Drittmittel
Institution: IMI_GA_EMIF-11537
Budget: € 809.110 Funding period: 1/1/1331/12/18
Project: "EMIF-AD: Identification of predictors of Alzheimer’s Disease in the preclinical
and prodromal phase"
Role: Leader for subproject (WP3) "Genomics"
1.
EUR70.000 (personnel [shared with project d)] and other expenditures).
2.
Institution: DFG (BE 2287/4-1) Budget: € 290,950 Funding period: 1/1/16-12/31/17
Project: “Genetic modifiers of disease expression in X-linked dystonia-parkinsonism"
Role: Co-Principal Investigator (with Dr. A. Westenberger)
An application for funding of a Research Unit (‟Forschergruppe‟) at the DFG is currently
pending (Coordinator: Profs. Klein and Kaiser from UzL); Prof. Bertram is PI or Co-PI on
a total of 3 out of 10 of the Research Unit’s projects, two of which revolve around the
identification of novel genes predisposing to forms of dystonia.
1.
Originalarbeiten
Dankowski T, Buck D, Andlauer TF, Antony G, Bayas A, Bechmann L, Berthele A,
Bettecken T, Chan A, Franke A, Gold R, Graetz C, Haas J, Hecker M, Herms S, InfanteDuarte C, Jöckel KH, Kieseier BC, Knier B, Knop M [...] Lill CM [...] et al. (2015)
Successful Replication of GWAS Hits for Multiple Sclerosis in 10,000 Germans Using
the Exome Array. Genet. Epidemiol. 39 (8):601-8. doi: 10.1002/gepi.21933 [IF: 2.597]
Domingo A, Westenberger A, Lee LV, Brænne I, Liu T, Vater I, Rosales R, Jamora RD,
Pasco PM, Cutiongco-Dela Paz EM, Freimann K, Schmidt TG, Dressler D, Kaiser FJ,
Bertram L, Erdmann J, Lohmann K, Klein C. (2015) New insights into the genetics of Xlinked dystonia-parkinsonism (XDP, DYT3). Eur. J. Hum. Genet. 23 (10):1334-40. doi:
10.1038/ejhg.2014.292 [IF: 4.349]
Hooli BV, Lill CM, Mullin K, Qiao D, Lange C, Bertram L, Tanzi RE. (2015) PLD3 gene
variants and Alzheimer's disease. Nature. 520 (7545):E7-8. doi: 10.1038/nature14040
[IF: 41.456 ]
Hoppmann N, Graetz C, Paterka M, Poisa-Beiro L, Larochelle C, Hasan M, Lill CM, Zipp
F, Siffrin V. (2015) New candidates for CD4 T cell pathogenicity in experimental
neuroinflammation and multiple sclerosis. Brain. 138 (Pt 4):902-17. doi:
10.1093/brain/awu408 [IF: 9.196]
27
Lill CM, Hansen J, Olsen JH, Binder H, Ritz B, Bertram L. (2015a) Impact of
Parkinson'sdisease risk loci on age at onset. Mov. Disord. 30 (6):847-50. doi:
10.1002/mds.26237 [IF: 5.680]
Lill CM, Luessi F, Alcina A, Sokolova EA, Ugidos N, de la Hera B, Guillot-Noël L,
Malhotra S, Reinthaler E, Schjeide BM, Mescheriakova JY, Mashychev A, Wohlers I,
Akkad DA, Aktas O, Alloza I, Antigüedad A, Arroyo R, Astobiza I, Blaschke P [...]
Bertram L (2015b) Genome-wide significant association with seven novel multiple
sclerosis risk loci. J. Med. Genet. 52 (12):848-55. doi: 10.1136/jmedgenet-2015-103442
[IF: 6.335]
Lill CM, Rengmark A, Pihlstrøm L, Fogh I, Shatunov A, Sleiman PM, Wang LS, Liu T,
Lassen CF, Meissner E, Alexopoulos P, Calvo A, Chio A, Dizdar N, Faltraco F, Forsgren
L, Kirchheiner J, Kurz A, Larsen JP, Liebsch M et al. [...] Bertram L (2015c) The role of
TREM2 R47H as a risk factor for Alzheimer's disease, frontotemporal lobar
degeneration, amyotrophic lateral sclerosis, and Parkinson's disease. Alzheimers
Dement. 11 (12):1407-16. doi: 10.1016/j.jalz.2014.12.009 [IF: 12.407]
Moutsianas L, Jostins L, Beecham AH, Dilthey AT, Xifara DK, Ban M, Shah TS,
Patsopoulos NA, Alfredsson L, Anderson CA, Attfield KE, Baranzini SE, Barrett J, Binder
TM, Booth D, Buck D, Celius EG, Cotsapas C, D'Alfonso S, Dendrou CA [...] Lill CM [...]
et al. (2015) Class II HLA interactions modulate genetic risk for multiple sclerosis. Nat.
Genet. 47 (10):1107-13. doi: 10.1038/ng.3395 [IF: 29.352]
Nalls MA, Bras J, Hernandez DG, Keller MF, Majounie E, Renton AE, Saad M, Jansen I,
Guerreiro R, Lubbe S, Plagnol V, Gibbs JR, Schulte C, Pankratz N, Sutherland M,
Bertram L, Lill CM, DeStefano AL, Faroud T, Eriksson N et al. (2015) NeuroX, a fast
and efficient genotyping platform for investigation of neurodegenerative diseases.
Neurobiol. Aging. 36 (3):1605.e7-12. doi: 10.1016/j.neurobiolaging.2014.07.028 [IF:
5.013]
Schrewe L, Lill CM, Liu T, Salmen A, Gerdes LA, Guillot-Noel L, Akkad DA, Blaschke P,
Graetz C, Hoffjan S, Kroner A, Demir S, Böhme A, Rieckmann P, ElAli A, Hagemann N,
Hermann DM, Cournu-Rebeix I, Zipp F, Kümpfel T [...] Bertram L [...] et al. (2015)
Investigation of sex-specific effects of apolipoprotein E on severity of EAE and MS. J
Neuroinflammation. 12 (1):234. doi: 10.1186/s12974-015-0429-y [IF: 5.408]
Wilcox R, Brænne I, Brüggemann N, Winkler S, Wiegers K, Bertram L, Anderson T,
Lohmann K. (2015) Genome sequencing identifies a novel mutation in ATP1A3 in a
family with dystonia in females only. J. Neurol. 262 (1):187-93. doi: 10.1007/s00415-0147547-9 [IF: 3.377]
b) eingereicht
None
1.
Buchbeiträge
Bertram L. (2016) Next Generation Sequencing in Alzheimer's Disease. Methods Mol.
Biol. 1303 :281-97. doi: 10.1007/978-1-4939-2627-5_17
2. Anderes
None
28
Projekt 2 “The Berlin Aging Study II (BASE-II) – Molecular Genetics”
1.
Fragestellung:
BASE-II is a multidisciplinary and multi-institutional project that ascertains a large
number of ageing-related variables with the aim to identify and characterize the factors
associated with ‘healthy’ vs. ‘unhealthy’ ageing. BASE-II is a collaboration between
University of Lübeck, Max Planck Institute for Human Development, the German Institute
for Economical Research, Charite University Medicine, Humboldt University Berlin, Free
University Berlin, and the University of Tübingen. In BASE-II, LIGA is in charge of all
molecular genetic and epigenetic experiments with the overall aim to identify novel
determinants of ‟healthy“ aging.
2.
Methodik:
For this project, we have completed genome-wide SNP genotyping in all 2,200 BASE-II
probands (using the Genome-Wide Human SNP Array 6.0 by Affymetrix, Inc.). The last
batch of genotyping (n~290) was completed in 2015. Data processing includes standard
QC and imputation (using the phase 3 release of whole-genome sequencing data
generated by the 1000 Genomes project). Statistical analysis is based on linear and
logistic regression models correlating the traits of interest (mostly quantitative, e.g.
neurocognitive performance, levels of blood parameters, socioeconomic variables) to the
imputed genotypes.
3.
Ergebnisse:
In the reporting period, we were able to complete and publish a total of five projects
(cumulative impact factor: 91.6; see list below). In Lill et al, in press, we utilized the
available genome-wide SNP genotype data in BASE-II to assess the role of previously
described genetics factors in bone mineral density, body mass index, and relative
telomere length using a weighted genetic phenotype score. In Bellander et al, 2015, we
extended our previous work on the role of a variant in the COMT gene (Val¹⁵⁸Met) which
we found to result in a lower baseline performance but greater plasticity of working
memory in carriers of the val allele. The remaining three publications represent
consortium efforts to which we contributed the specific BASE-II association results which
were integrated with equivalent results from other groups in forms of meta-analyses. In
Nikpay et al, 2015, this led to the identification of several rare variants in novel genes
predisposing to cardiovascular disease. Joshi et al, 2015, applied a relatively novel
analysis technique to pinpoint runs of homozygosity in several chromosomal regions
suggesting the presence of directional dominance on stature and cognition. In Davies et
al, 2015, we were part of the hitherto largest GWAS on cognitive performance which
identified 3 novel regions in addition to the well-established locus near APOE on
chromosome 19.
Zeitraum
Jan 1st 2015 – Dec 31st 2015
Drittmittel
Institution: BMBF (16SV5538) Budget: €1.200.845 Funding period: 1/12/11-05/31/15
Project: “ Die Berliner Altersstudie II (BASE-II): Subprojekt Molekulargenetik"
Role: Principal Investigator
1.
EUR90,000 (genome-wide genotyping).
2.
None.
Several applications for extension of BASE-II are pending with Prof. Bertram as PI or
Co-PI.
29
1.
Originalarbeiten
Lill CM, Liu T, Norman K, Meyer A, Steinhagen-Thiessen E, Demuth I, Bertram L. (in
press) Genetic Burden Analyses of Phenotypes Relevant to Aging in the Berlin Aging
Study II (BASE-II). Gerontology. doi: 10.1159/000438900 [IF: 3.059]
Bellander M, Bäckman L, Liu T, Schjeide BM, Bertram L, Schmiedek F, Lindenberger
U, Lövdén M. (2015) Lower baseline performance but greater plasticity of working
memory for carriers of the val allele of the COMT Val¹⁵⁸Met polymorphism.
Neuropsychology. 29 (2):247-54. doi: 10.1037/neu0000088 [IF: 3.269]
Nikpay M, Goel A, Won HH, Hall LM, Willenborg C, Kanoni S, Saleheen D, Kyriakou T,
Nelson CP, Hopewell JC, Webb TR, Zeng L, Dehghan A, Alver M, Armasu SM, Auro K,
Bjonnes A, Chasman DI, Chen S, Ford I, [...] Liu, T, Bertram L, [...] et al. (2015) A
comprehensive 1,000 Genomes-based genome-wide association meta-analysis of
coronary artery disease. Nat. Genet. 47 (10):1121-30. doi: 10.1038/ng.3396 [IF: 29.352]
Joshi PK, Esko T, Mattsson H, Eklund N, Gandin I, Nutile T, Jackson AU, Schurmann C,
Smith AV, Zhang W, Okada Y, Stančáková A, Faul JD, Zhao W, Bartz TM, Concas MP,
Franceschini N, Enroth S, Vitart V, Trompet S [...] Liu, T, Bertram L, [...] et al. (2015)
Directional dominance on stature and cognition in diverse human populations. Nature.
523 (7561):459-62. doi: 10.1038/nature14618 [IF: 41.456]
Davies G, Armstrong N, Bis JC, Bressler J, Chouraki V, Giddaluru S, Hofer E, IbrahimVerbaas CA, Kirin M, Lahti J, van der Lee SJ, Le Hellard S, Liu T, Marioni RE,
Oldmeadow C, Postmus I, Smith AV, Smith JA, Thalamuthu A, Thomson R [...] Bertram
L, [...] et al. (2015) Genetic contributions to variation in general cognitive function: a
meta-analysis of genome-wide association studies in the CHARGE consortium
(N=53949). Mol. Psychiatry. 20 (2):183-92. doi: 10.1038/mp.2014.188 [IF: 14.496]
b) eingereicht
None
2.
Buchbeiträge
None
3.
Anderes
None
Projekt 3 “Development of novel statistical and bioinformatic pipelines and
databases for the analysis, annotation and interpretation of
multidimensional genomics data”
1.
Fragestellung:
Genomic research in common disorders becomes increasingly complex owing to a
rapidly growing amount of data that is generated across multiple ‟-omics“ domains. This
inrease in data is mostly due to the recent advent of very powerful new genotyping and
sequencing technologies, e.g. ‟next-generation sequencing“. This project adheres to the
overarching aim of LIGA, which is to excel genome research on the UzL campus to
improve our understanding of the genetic and epigenetic foundations of genetically
complex human diseases. To this end, we are constantly developing novel pipelines and
databases for the systematic analysis, annotation and interpretation of multidimensional
‟-omics“ data.
30
2.
Methodik:
The methods applied in this project build on our group’s long-standing and established
experience in analyzing and annotating large-scale genomics data. This includes
extending our existing in silico pipeline(s) for the assessment of the role of microRNAs in
human disease (see also summary of Project d), below), and novel applications of our
genetics database approach.
3.
Ergebnisse:
In the reporting period, we were able to complete and publish a total of three projects
(cumulative impact factor: 9.3; see list below). In Andonov et al, 2015, we extended
previous work by developing a method for the automatic classification of protein
structure using the maximum contact map overlap metric. In Antonopoulou et al, 2015,
we extended our previous work on the genetic architecture of melanoma by updating the
„MelGene“ database that we helped to build and bring online in 2014. In Park et al,
2015, we developed a new statistical method allowing to adjust for heterogeneous
ascertainment bias in the context of genetic association analyses using extended
families. In addition to these published results, we started the implementation of the
MDSGene (Movement Disorders Society Genetics) database, a collaboration project
between researchers from LIGA and the Institute of Neurogenetics. The anticipated
launch date of MDSGene is mid 2016.
Zeitraum
Jan 1st 2015 – Dec 31st 2015
Drittmittel
Our participation in these projects was made possible via University funding (to Prof.
Bertram), no external grants (Drittmittel) were utilized.
1.
None
2.
None.
An application for funding of a Research Unit (‟Forschergruppe‟) at the DFG is currently
pending (Coordinator: Profs. Klein and Kaiser from UzL); Prof. Bertram is PI or Co-PI on
a total of 3 out of 10 of the Research Unit’s projects, one of which revolves around
establishing a ‟Genome Data Analysis Core“ for other projects within the consortium.
1. Originalarbeiten
Andonov R, Djidjev H, Klau GW, Le Boudic-Jamin M, Wohlers I. (2015) Automatic
classification of protein structure using the maximum contact map overlap metric.
Algorithms 8(4):850-869. doi: 10.3390/a8040850 [IF: pending]
Antonopoulou K, Stefanaki I, Lill CM, Chatzinasiou F, Kypreou KP, Karagianni F,
Athanasiadis E, Spyrou GM, Ioannidis JP, Bertram L, Evangelou E, Stratigos AJ. (2015)
Updated field synopsis and systematic meta-analyses of genetic association studies in
cutaneous melanoma: the MelGene database. J. Invest. Dermatol. 135 (4):1074-9. doi:
10.1038/jid.2014.491 [IF: 7.216]
Park S, Lee S, Lee Y, Herold C, Hooli B, Mullin K, Park T, Park C, Bertram L, Lange C,
Tanzi R, Won S. (2015) Adjusting heterogeneous ascertainment bias for genetic
association analysis with extended families. BMC Med. Genet. 16 :62. doi:
10.1186/s12881-015-0198-6 [IF: 2.083]
31
b) eingereicht
None
2.
Buchbeiträge
None
3.
Anderes
None.
Projekt 4 „The role of micro-RNAs in disease susceptibility”
1.
Fragestellung:
Micro-RNAs (miRNAs) are small RNAs that regulate gene expression by binding to
mRNAs and triggering their decay. LIGA is involved in two projects investigating the role
of miRNAs in disease susceptibility. The first project (supported in part by the Peter und
Traudl Engelhorn Foundation) assesses the effect of genomic variants on miRNA-tomRNA binding. To this end, we have developed an in silico tool to predict the effect of
DNA sequence variants on the strength of miRNA-to-mRNA binding which is currently
being validated using data from large transcriptomics data sets. The second project
(conducted in collaboration with our colleagues at the Neuroepidemiology and Aging
Research Unit at Imperial College in London) will provide a systematic assessment of
miRNA expression studies in Alzheimer’s and Parkinson’s diseases.
2.
Methodik:
In the first project we aim to assess the effect of genomic variants on miRNA-to-mRNA
binding. To this end, we have developed an in silico tool to predict the effect of DNA
sequence variants on the strength of miRNA-to-mRNA binding which is currently being
validated using data from large next-generation sequencing based transcriptomics data
sets. In the second project (conducted in collaboration with our colleagues at the
Neuroepidemiology and Aging Research Unit at Imperial College in London) we will
provide a systematic assessment of miRNA expression studies in Alzheimer’s and
Parkinson’s disease, highlighting those miRNAs (if any) that hold promise as potential
biomarkers for the respective (or both) disorders.
3.
Ergebnisse:
None in the reporting period.
Zeitraum
Jan 1st 2015 – Dec 31st 2015
Drittmittel
Institution: IMI_GA_EMIF-11537
Budget: € 809.110 Funding period: 1/1/1331/12/18
Project: "EMIF-AD: Identification of predictors of Alzheimer’s Disease in the preclinical
and
prodromal phase"
Role: Leader for subproject (WP3) "Genomics"
1.
EUR70.000 (personnel [shared with project a)], and other expenditures).
32
2.
Institution: Engelhorn Foundation
Budget: € 140,000 Funding period: 1/7/1530/6/17
Project: ‟The role of micro-RNAs in disease susceptibility“ (postdoctoral scholarship to
LIGA researcher Dr. Inken Wohlers)
Role: Mentor of Dr. Wohlers
1.
Originalarbeiten
None in current funding period.
b) eingereicht
None
2.
Buchbeiträge
None
3.
Anderes
None
33
Prof. Dr. med. K. Dalhoff und Prof. Dr. med. K- Rupp
Prof. Dr. med. K. Dalhoff und Prof. Dr. med. J. Rupp
Dalhoff* / Rupp*,** / Droemann* / Zabel*
Medizinische Klinik III*, Klinik für Infektiologie und Mikrobiologie**
Projekt
„Mechanismen der körpereigenen Abwehr im pulmonalen Kompartiment“
1.
Fragestellung:
Infektion und Kolonisation der unteren Atemwege spielen eine zentrale Rolle in der
Pathogenese und Progression chronischer Atemwegserkrankungen. Im Rahmen dieses
Projekts wird die Rolle von intra- und extrazellulären Erkennungsrezeptoren und
Molekülen der Signaltransduktion bei Infektionen mit respiratorischen Pathogenen in der
humanen Lunge charakterisiert. Der Hauptfokus liegt auf der Bedeutung mikrobieller
Stimuli für die Entzündungsreaktion und das pulmonale Remodeling. Eine neue Technik
hierzu ist die Sequenzierung des pulmonalen Mikrobioms, die einen unselektiven
Zugang auch zu nicht bzw. noch nicht kultivierbarenErregern erlaubt. Die Bedeutung des
aus methodischen Gründen im Vergleich zu anderen Regionen deutlich schwieriger zu
evaluierenden pulmonalen Mikrobioms wird zunehmend erkannt, ist aber bislang nur
unzureichend charakterisiert.
2.
Methodik:
Humane Lungengewebsproben werden aus im Rahmen von chirurgischen Eingriffen
entnommenen Lungenresektaten gewonnen. Nach in vitro Infektion wird die Expression
von Rezeptoren der TLR- und NLRP Familien, Wachstumsfaktorrezeptoren (EGFR,
VEGF), MAP-Kinasen und proinflammatorischen Zytokinen im Gewebe und auf mittels
bronchoalveolärer Lavage gewonnener Alveolarmakrophagen mittels in situ
Hybridisierung, RT-PCR und Immunhistochemie untersucht. Eine Erregerbank mit
molekular und klinisch gut charakterisierten Isolaten von Hämophilus influenzae steht
zur Verfügung, um die Rolle von bakteriellen Virulenzfaktoren genauer evaluieren zu
können. Für die Gewebsuntersuchungen steht das für molekulare Fragestellungen
besonders geeignete Fixierungsverfahren HOPE zur Verfügung ( Kooperation mit PD
Dr. T. Goldmann, Klinische und experimentelle Pathologie am Forschungszentrum
Borstel). Die Analyse des 16S Mikrobioms aus Proben der oberen und unteren
Atemwege sowie aus dem kontaminationsfrei gewonnenen humanen Lungengewebes
bei Patienten mit COPD und lungengesunden Kontrollen wird in Kooperation mit Prof.
S. Niemann, FZ Borstel, durchgeführt. Ziel ist der intraindividuelle (Mikrobiom in
unterschiedlichen Kompartimenten des Respirationstrakts) und interindividuelle
(Vergleich unterschiedlicher COPD Stadien) Vergleich der Diversität und Abundanz des
pulmonalen Mikrobioms..
3.
Ergebnisse:
In einer 2015 publizierten Studie wurde erstmals die Modulation des pulmonalen
Immunsystems während Infektion mit H. influenzae unter dem Einfluss inhalativer
Corticosteroide im humanen Lungengewebsmodell charakterisiert (siehe Publikation
Wagner et al).
Die Patientenrekrutierung und Materialentnahme der Studie zur Evaluation des
pulmonalen Mikrobioms bei COPD ist inzwischen abgeschlossen. Die Sequenzierung
und Mikrobiomanalyse beim ersten Drittel der Patienten zeigte methodisch verlässliche
Resultate, die weiteren Ergebnisse bei den insgesamt 32 Patienten werden im 1.
Quartal 2016 erwartet.
34
Zeitraum
2015
Drittmittel
Projektträger
1. DFG: GRK 1743 (Rupp)
2. DFG/ International Research Training Grant 1911 ”Immunoregulation of Inflammation
in Allergy and Infection” (Rupp)
3. BMBF / DZIF: Clinical-Trial-Unit (Rupp)
4. DFG: Rolle des TGF-beta Pseudorezeptors Bambi bei der Lungenfibrose (Drömann)
5. BMBF /DZL: German Centre for Lung Research, Projekt AA-1 (Zabel)
6. BMBF /DZL: German Centre for Lung Research, Projekt ALI-3.2 (Dalhoff)
Förderzeitraum
Ad1 : 2015-2018
Ad 2: 2016-2019
Ad 3: 2016-2018
Ad 4: 2014-2016
Ad 5.:2012-2015
Ad 6: 2014-2015
Fördervolumen
Sachmittel/Stellen
Ad 1:
125.000€
Ad 2:
165.000€
Ad 3:
332.000€
Ad 4
210.000€
Ad 5:
254.000€
Ad 6:
60.000€
1.
Ausgegebene Drittmittel in 200x
Sachmittel/Stellen
2.
Die Projekte des Deutschen Zentrums für Lungenforschung (DZL; Zabel, Dalhoff)
werden in der 2. Förderperiode (2016-2020) weiter in vergleichbarer Höhe gefördert,
eine zusätzliche Förderung wurde für PD Dr. D. Drömann bewilligt.
1. Originalarbeiten
Wagner C, Goldmann T, Rohmann K, Rupp J, Marwitz S, Rotta detto Loria J, Zabel P,
Dalhoff K, Drömann D. Inhaled corticosteroids inhibit intracellular infection with nontypeable Haemophilus influenzae despite antiinflammatory effects in respiratory cells
and human lung tissue. Respiration 2015;90:416-425
Dumke R, Schnee C, Pletz MW, Rupp J, Jacobs E, Sachse K, Rohde G; Capnetz Study
Group. Mycoplasma pneumoniae and Chlamydia spp. infection in community-acquired
pneumonia, Germany, 2011-2012.
Emerg Infect Dis. 2015;21:426-34
35
Kolditz M, Ewig S, Klapdor B, Schütte H, Winning J, Rupp J, Suttorp N, Welte T, Rohde
G; CAPNETZ study group. Community-acquired pneumonia as medical emergency:
predictors of early deterioration.Thorax 2015;70:551-8
Knobloch J, Chikosi SJ, Yanik S, Rupp J, Jungck D, Koch A. A systemic defect in toll-like
receptor 4 signaling increases lipopolysaccharide-induced suppression of IL-2-dependent
T-cell proliferation in COPD. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol 2015; in press
Bollinger T, Bollinger A, Gies S, Feldhoff L, Solbach W, Rupp J. Transcription regulates
HIF-1α expression in CD4+ T cells. Immunol Cell Biol 2015; in press
Sarkar A, Möller S, Bhattacharyya A, Behnen M, Rupp J, van Zandbergen G, Solbach
W, Laskay T. Mechanisms of apoptosis inhibition in Chlamydia pneumoniae-infected
neutrophils. Int J Med Microbiol 2015; 305(6):493-500.
Weinmaier T, Hoser J, Eck S, Kaufhold I, Shima K, Strom TM, Rattei T, Rupp J.
Genomic factors related to tissue tropism in Chlamydia pneumoniae infection. BMC
Genomics 2015;16(1):268.
Shima K, Klinger M, Schuetze S, Kaufhold I, Solbach W, Reiling N, Rupp J. The role of
ER-related BiP/GRP78 in IFN-γ induced persistent Chlamydia pneumoniae infection. Cell
Microbiol 2015; 17(7):923-34.
b) eingereicht
Kaufhold I, Osbahr S, Shima K, Marwitz S, Rohmann K, Drömann D,
Goldmann T,Dalhoff K, and Rupp J. Nontypeable Haemophilus infuenzae (NTHI)directly
interfere with the regulation of E-cadherin in lung epithelial cells (IAI01415-15)
2. Buchbeiträge
Dalhoff K, Lode H, Stahlmann R. Atemwegsinfektionen. In: Van Aken H, Reinhart K,
Welte T, Weigand M: Intensivmedizin. Thieme Verlag, Stuttgart, 3. Auflage 2014
3.
Anderes
Medizinische Promotionen
2015 Benedikt Wilke
Naturwissenschaftliche Promotionen
2015 Nadja Käding
Masterarbeiten
2015 Nele Twisselmann
36
Prof. Dr. med. J. Erdmann und Dr. hum. biol. Z. Aherrahrou
Prof. Dr.med. J. Erdmann und Dr. hum.biol Z. Aherrahrou
Institut für Integrative und Experimentelle Genomik)
Projekt
“ Funktionelle Charakterisierung von Herzinfarkt Risiko Gene“
1.
Fragestellung:
In Deutschland erleiden etwa 280.000 Personen pro Jahr einen akuten Herzinfarkt (HI).
Neben die klassischen Faktoren wie Rauchen, erhöhtes Lebensalter, unzureichende
körperliche Bewegung und eine ungesunde Ernährung zählen genetische Faktoren zu
den wesentlichsten Ursachen der HI.
Unsere Arbeitsgruppe konnte einen wesentlichen Beitrag zur Identifikation einer Vielzahl
häufiger genetischer Varianten in den letzten Jahre leisten, die mit genomweiter
Signifikanz das Risiko des HI erhöhen und somit entsprechende Risiko Gene für HI
festgestellt.
Die funktionelle Rolle der meisten identifizierten HI Risiko Gene bleiben weitestgehend
unbekannt. Um die funktionelle Rolle dieser Gene besser zu verstehen hat sich
zunächst unsere Arbeitsgruppe auf insgesamt acht Kandidatengene fokussiert. Ziel des
Projektes ist funktionell dieser Identifizierten 8 Kandidatengene mittels in-vitro und invivo Analysen auf Atherosklerose zu untersuchen.
2.
Methodik:
Zunächst wurden KO-Mauslinien für die 8 HI Risiko Gene hergestellt und auf einen proatherogenen genetischen Hintergrund (Apoe-/- bzw. Ldlr-/-) gekreuzt. Verschiedene
Molekulare biologische Methoden wie PCR, RT-PCR, Western Blot und
Immunfluoreszenzen werden verwendet. Der Zusammenhang der Gene in Bezug auf HI
wird mit Hilfe der KO Linien auf einen pro-atherogenen genetischen Hintergrund (Apoe-/bzw. Ldlr-/-) in-vivo und in vitro auf Atherosklerose analysiert. Bei der in-vivo Analyse
sollen die hergestellten HI double Knock Out-Modelle durch Fütterung mit SpezialDiäten die Atherosklerose induziert und analysiert. Außerdem werden die Mausmodelle
auf Neo-intima Bildung im Vergleich zu WT-Tieren auch untersucht. In den in vitro
Modellen werden in Zellkultur einzelne Faktoren einer HI nachgebildet, wie z.B. die
Analyse von Adhäsions- und Migrationsverhalten oder der Verkalkung.
3.
Ergebnisse:
Verschiedene Mausmodelle wurden basierend auf den Assoziationsbefunden der
erfolgreichen GWA-Studien hergestellt. Folgende KO-Mausmodelle für folgende Gene
sind erfolgreich hergestellt: Adamts7, Gucy1a3, Cyp17a1, Mras, Phactr1, Zc3hc1,
Ppap2b, und Cxcl12. Eine standardisierte Phänotypisierung und funktionelle
Charakterisierung der Tiere wurde etabliert, hierbei werden nun folgende Methoden
eingesetzt: Atherosklerosestudien, Knochenmark-transplantation und Karotis- bzw.
Koronarligation. Weiterhin wurden auch Proliferation bzw. Migration Assays etabliert und
verwendet. Die Ergebnisse diese Arbeiten zu den ersten Risiko Gene wurden bereits
publiziert oder im Rahmen internationale Kongressen vorgestellt.
Zeitraum
Drittmittel
Projektträger
Förderzeitraum
37
Fördervolumen
Sachmittel/Stellen
1.
Ausgegebene Drittmittel in 200x
Sachmittel/Stellen
2.
Neu eingeworbene Drittmittel in 200x
1.
Originalarbeiten (2015)
a) erschienen /bzw. im Druck im Jahr 200x
b) eingereicht
Aherrahrou Z, Schlossarek S, Stoelting S, Klinger M, Geertz B, Weinberger F, Kessler T,
Aherrahrou R, Moreth K, Bekeredjian R, Hrabě de Angelis M, Just S, Rottbauer W,
Eschenhagen T, Schunkert H, Carrier L, Erdmann J. Knock-out of nexilin in mice leads
to dilated cardiomyopathy and endomyocardialfibroelastosis. Basic Res Cardiol. 2016
Jan;111(1)
Trenkwalder T, Kessler T, Schunkert H, Erdmann J. Genetics of coronary artery disease:
Short people at risk? Expert Rev Cardiovasc Ther. 2015 Nov;13(11):1169-72
Aherrahrou R, Aherrahrou Z, Erdmann J, Moumni M. Identification of a novel ovine LHbeta promoter region, which dramatically enhances its promoter activity. Springerplus.
2015 Sep 1;4:466
CARDIoGRAMplusC4D Consortium. A comprehensive 1000 Genomes-based genomewide association meta-analysis of coronary artery disease. Nat Genet. 2015
Oct;47(10):1121-30
Aherrahrou R, Aherrahrou Z, Kaiser FJ, Braunholz D, Erdmann J, Moumni M.
Identification of a single SNP that affects the promoter activity in the Moroccan prolific
D'man breed. J Anim Sci. 2015 May;93(5):2064-73
Kessler T et al., ADAMTS-7 inhibits re-endothelialization of injured arteries and promotes
vascular remodeling through cleavage of thrombospondin-1. Circulation. 2015 Mar
31;131(13):1191-201.
2. Buchbeiträge
keine
3.
Anderes
Kongressbeiträge, Dissertationen und andere Abschlüsse
Phactr1 determines the severity of calcification in murine embryonic stem cells. 2015. R.
Aherrahrou, Z. Aherrahrou, H. Shunkert, J. Erdmann. 2015. 81. Jahrestagung DGK,
Mannheim, Germany
The Functional Role of the CAD-Risk Gene ZC3HC1 in Atherosclerosis. J. Al-Hasani, Z.
Aherrahrou, M. Segura Puimedon, R. Aherrahrou, J. Freyer, H. Schunkert, J. Erdmann.
2015. 81. Jahrestagung DGK, Mannheim, Germany
38
Reduction of Atherosclerosis in Gucy1a3 Deficient Mice. Maria Segura Puimedon;
Evanthia Mergia; Jaafar Al-Hasani; Redouane Aherrahrou; Jennifer Freyer; Cor de Wit;
Doris Kösling; Heribert Schunkert; Jeanette Erdmann1; Zouhair Aherrahrou. Reduction
of Atherosclerosis in Gucy1a3 Deficient Mice. Orlando, USA. Circulation. 2015; 132:
A14092
1 Doktorarbeit
1 Bachelor (MLS)
39
PD Dr. T.Fischer
PD Dr. Tobias Fischer
Nathalie Kruse, Dr. Konrad Kleszczynski
Haarbiologie, Melatonin, Photodermatologie (HaMePhoD
Projekt 1 "Gen-Mapping von humanen Haarfollikeln als Targeting-Strategie zur
Identifizierung von spezifischen intrafollikulären Metabolismen“
1.
Fragestellung:
Voruntersuchungen zeigten sowohl auf männliche als auch weibliche humane
Haarfollikel eine wachstumsstimulierende Wirkung von bestimmten den HaarMetabolismus fördernden Substanzen. Das aktuelle Projekt hat zum Ziel, Gene zu
untersuchen, die durch diese Substanzen induziert werden.
2.
Methodik:
Gewinnung von Haarfollikel-tragenden Kopfhautgewebeproben von Männern und
Frauen mit androgenetischer Alopezie
Mikrodissektion und Kultivierung der Einzelhaarfollikel im
zu 120 Std.
Haarorgankulturmodell bis
Funktionelle Untersuchungen: Haarschaftelongation, Proliferations-/ApoptoseAssays, Immunohistochemie/-fluoreszenz
Gen-Mapping mit DNA-Chip/Micro-Array-Analyse
Gen-Profiling mit Pathway-Analyse
Q-PCR
Funktionelle Untersuchungen von identifizierten Target-Pathways
3.
Ergebnisse:
In den behandelten, humanen Haarfollikeln von Männern und Frauen wurden über 2.000
regulierte Gene identifiziert. Die Gene wurden hinsichtlich der regulierenden
Stoffwechselprozesse geordnet. Weiterhin wurden geschlechtsspezifische Unterschiede
im Umfang der Gen-Expression festgestellt. Im Projektjahr 2010 wurde ein Haarspezifisches Zellmodell entwickelt, welches im Projektjahr 2011 vollständig hinsichtlich
relevanter „read-out“-Parameter und „Responsiveness to Intervention“ validiert wurde.
Somit konnte ein Screening-Modell entwickelt werden, welches in Kombination mit dem
etablierten Haarorgankulturmodell geeignet ist, neue Mechanismen und Targets der
Haarbiologie zu untersuchen. Im Projektjahr 2012 wurden neu identifizierte Substanzen
funktionell im Haarorgankulturmodell getestet und per ELISA untersucht, ob
Schlüsselregulatoren des Haarwachstums vom Haarfollikel produziert und sezerniert
werden. Im Projektjahr 2013 wurden abschließende Untersuchungen durchgeführt. Ein
Teil der Ergebnisse wurde im Jahr 2014 publiziert.
Zeitraum:
April 2008 – Dezember 2015
Drittmittel
Projektträger:
Industrie-Sponsor A (aus vertraglichen Gründen nicht genannt)
Förderzeitraum:
April 2008 bis Dezember 2011 (3,5 Jahre)
Fördervolumen:
Jahresbudget
Gesamtvolumen: 422.191,77 EUR inkl. Overhead + MwSt.
2008: 107 000.- EUR
40
PD Dr. T.Fischer
Jahresbudget 2009: 123.059.- EUR
Jahresbudget 2010: 105.000.- EUR
Projektbudget 2011: 50.000.- EUR
Sachmittel/Stellen
1.
Sachmittel/Stellen
2.
1.
2/5 der Gesamtjahresbudgets / 3/5 der Gesamtjahresbudgets
keine / keine
keine
Originalarbeiten:
T. W. Fischer, E. Herczeg-Lisztes, Wolfgang Funk, D. Zillikens, T. Bíró, R. Paus
Differential effects of caffeine on hair shaft elongation, matrix and outer root sheath
keratinocyte proliferation, and TGF-β2-/IGF-1-mediated regulation of hair cycle in male
and female human hair follicles in vitro. Br J Dermatol, 2014, 171:1031-43 (Epub 2014
Oct 30) (IF: 4,100)
in Vorbereitung:
Fischer TW, Biro T, Kruse N, Zillikens D, Paus R.
Novel caffeine target genes identified in male and female human hair follicles.
2.
Buchbeiträge
keine
3.
Anderes
Patent angemeldet: Purine zur Stimulation antimikrobieller Peptide. Patent-Anmeldung
vom 13.1.2012
Projekt 2 „Untersuchung der UV-protektiven Potenz von Melatonin und MelatoninMetaboliten im humanen Keratinozyten (HaCaT, NHEK)- und Fibroblasten
(HDF)-Zellmodell“
1.
Fragestellung:
UV-induzierter oxidativer Stress ist einer der wesentlichen Faktoren für Hautalterung und
Photokarzinogenese, welche in der immer älter werdenden Bevölkerung zunehmende
individual- und bevölkerungsmedizinische Probleme darstellen. Auch zunehmende
Zahlen von organtransplantierten Patienten unter Immunsuppression sind einem
deutlich erhöhten Risiko von Hautkrebs ausgesetzt. Im Rahmen des
Forschungsprojektes sollen die in humaner Haut gezeigten UV-protektiven Effekte von
Melatonin in humanen Keratinozyten (HaCaT, NHEK) und Fibroblasten (HDF) mit denen
von Melatonin-Metaboliten verglichen werden. Ziel ist, die wesentlichen Mechanismen
der komplexen Melatonin- und Melatonin-Metaboliten-vermittelten protektiven Wirkung in
UV-bestrahlten Zellen zu analysieren, um zelluläre und molekulare Targets zu
identifizieren, die spezifisch blockiert werden können. Dies würde eine sinnvolle und
effektive Präventiv-Strategie darstellen, um der Hautalterung und Photokarzinogenese
vorzubeugen. Das Projekt verfolgt damit einen grundlagenwissenschaftlichen
Forschungsansatz mit translationalem Bezug auf die klinische Dermatologie.
41
PD Dr. T.Fischer
2.
Methodik:
Zellkultur von humanen primären Keratinozyten (NHEK), HaCaT
humanen dermalen Fibroblasten
Keratinozyten und
Präinkubation mit Melatonin und Melatonin-Metaboliten in verschiedenen
Konzentrationen (10–3, 10–4, 10–6 M)
UV-Exposition in ansteigenden Dosen (0 mJ/cm² bis 50 mJ/cm²)
UV-Dosis-Dynamik)
(Untersuchung der
Entnahme der Zellpopulationen aus der Kultur zu verschiedenen Zeitpunkten
UV-Exposition (Untersuchung der Zeit-Dynamik).
nach
Immunfluoreszenz
Western Blot
Real-time PCR
FACS-Analyse
ELISA
Untersuchungsparameter:
Zellvitalität, -proliferation; antioxidative Enzyme; Photoprodukte; mitochondrialer
Schaden; oxidativer Stress; oxidativer DNA-Schaden;
3.
Ergebnisse:
Es wurden bisher Untersuchungen zu allen ausgewählten UV-Dosen zum Zeitpunkt 0,
24 und 48 Std. nach UV-Exposition durchgeführt. Es zeigten sich indirekt-proportionale
Dosis-Wirkungsbeziehungen zwischen ansteigenden UV-Dosen und supprimierten
Zellproliferationsraten. Antioxidative Enzyme wurden unter ansteigenden UV-Dosen
verbraucht und zeigten darin ebenfalls eine indirekt-proportionale Beziehung. Die
Melatonin-Metaboliten (AFMK, AMK) zeigten in hohen Konzentrationen von 10-4 und 10-3
M eine signifikant weniger ausgeprägte Suppression der Proliferation. Auch die Toxizität
war unter den Melatonin-Metaboliten weniger ausgeprägt. Die Stabilität der
mitochondrialen Homöostase (ATP Synthese, Calcium-Aufnahme) wurde durch
Melatonin, AFMK, AMK angehoben.
Zeitraum:
Oktober 2010 – Dezember 2015
Drittmittel
Projektträger:
Mittel für Forschung und Lehre
AG Fischer (Quer-Finanzierung durch Industrie-Mittel; aus
Vertraglichen Gründen nicht genannt)
Else-Kröner-Fresenius-Stiftung (seit 1/2015)
Förderzeitraum: Oktober 2010 bis Dezember 2016
1.
Fördervolumen:
148.000.- EUR
Sachmittel/Stellen
50.000.- EUR / 98.000.- EUR
Sachmittel/Stellen
25.000.- EUR / 49.000.- EUR
42
PD Dr. T.Fischer
2.
1.
keine
Originalarbeiten
erstellt, in Korrektur und Vorbereitung für Einreichung
Kleszczyński K, Stegmann M, Kruse N, Zillikens D, Fischer TW.
Melatonin and its metabolites AFMK and AMK counteract UVR-mediated oxidative
stress and functional disturbances within mitochondria in keratinocytes and fibroblasts.
Ziel-Journal: Journal of Pineal Research (IF: 9,600)
2.
Buchbeiträge:
keine
3.
Andere:
keine
Projekt 3 „Melatonin und Melatonin-Metabolite (AFMK, AMK) als protektive Faktoren
gegen UV-induzierte Schäden im humanen Vollhaut-Modell“
1.
Fragestellung:
Für Melatonin und Metabolite (AFMK, AMK) sind in den letzten Jahren eine wesentliche
Bedeutung als protektive Substanz gegen UV-induzierte Schäden in humaner Haut
belegt worden. Bisherige Untersuchungen wurden überwiegend in humanen Zell- oder
Tiermodellen durchgeführt, jedoch nicht an dem dem Menschen am nächsten stehenden
Modell, dem humanen Vollhautmodell. Ziel war, ein solches Modell mit humaner
Vollhaut zu etablierenden und validierenden in Bezug auf UV-vermittelten Schaden auf
Lipid-, Protein-, Mitochondrien- und DNA-Ebene. Die relevanten UV-Expositions-Dosen
sollen ebenso wie verschiedene Mechanismen der UV-Reaktion der Haut untersucht
werden. Schließlich sollen protektive Melatonin-Effekte und die wirksamsten
Konzentrationen identifiziert werden, die eine Reduktion von Zellschäden, Anhebung
antioxidativer Enzyme, Reduktion von freien Sauerstoffradikalen und oxidativen DNASchäden bewirken. Weiterhin soll untersucht werden, wie sich das MelatoninRezeptorprofil der Haut unter UV-Exposition verändert und ob Präinkubation durch
Melatonin selbst das Rezeptorprofil moduliert.
2.
Methodik:
Gewinnung von humanen Hautbiopsien aus plastischer Chirurgie, Dermato-Chirurgie
Präparation und Kultivierung unter air-liquid-interface Kulturbedingungen
Präinkubation mit Melatonin und Metaboliten (10–3 M) in verschiedenen Konzentrationen
UV-Exposition in ansteigenden Dosen (0 mJ/cm² bis 300 mJ/cm²)(Untersuchung der UVDosis-Dynamik)
Entnahme der Hautgewebestücke aus Kultur zu verschiedenen Zeitpunkten nachUVExposition (Untersuchung der Zeit-Dynamik: 0 Std., 24 Std., 48 Std. nach UV
Bestrahlung).
Immunfluoreszenz
Western Blot
43
PD Dr. T.Fischer
Real-time PCR
Sunburn Cells und Morphologie (Hämatoxylin-Eosin-Färbung); Pigmentierung (MassonFontana); Entzündungsfaktor (Hsp70); Apoptose (cleaved Casp-3, cleaved Casp-9);
DNA-Schaden (Cyclobutan-Pyrimidin-Dimere, CPDs); antioxidative Enzyme (SOD, CAT,
GPx);
2.
Ergebnisse:
In dem UV-Dosis-Bereich (0 bis 300 mJ/cm²) wurden die relevanten UV-Dosen, die
signifikante Schäden in der Haut induzieren können, direkt nach ÛV Bestrahlung mit 300
mJ/cm² identifiziert. Diese Schäden wurden bei den Zeitpunkten 24 und 48 Std. nach
UV-Exposition festgestellt. Diese UV-Dosis liegt deutlich höher als im Keratinozyten-ZellModell, in welchem initiale Schäden bereits bei 25 mJ/cm² induziert werden und z.B. die
IC50 Suppression bei 50 mJ/cm² liegt. Dies ist durch die physikalisch und biologisch
gegen UV-Strahlung resistentere Haut mit allen intakten Hautschichten einschließlich
des Stratum corneums begründet. Durch diese Untersuchung konnte der relevante UVBereich im humanen Vollhautmodell identifiziert werden. Weiterführende
Untersuchungen zur Charakterisierung der UV-Antwort im humanen Vollhautmodell
wurden mit der UV-Dosis 300 mJ/cm² durchgeführt und zeigten in den meisten bisher
untersuchten Parametern bereits nach 24 Std. eine UV-induzierte Aktivierung (sunburn
cells, Hsp70, cleaved Casp-3, cleaved Casp-9, Catalase) mit teilweise Zunahme aber
auch Abnahme der Dynamik bis 48 Std. nach UV-Exposition. Es konnte gezeigt werden,
daß Melatonin und Metabolite eine signifikante protektive Wirkung gegen UV-induzierte
Schäden ausübt.
Im laufenden Forschungsjahr konnten weitere Parameter wie direkter DNA-Schaden
(Cyclobutan-Pyrimidin-Dimere) DNA-Schaden (CPDs) und weitere antioxidative Enzyme
(SOD, GPx) untersucht werden und sowohl im HaCaT-Keratinozytenmodell als auch in
normalen epidermalen Keratinozyten re-evaluiert werden. Auch bei diesen Parametern
zeigten sich deutliche UV-abhängige Veränderungen und protektive Effekte durch
Melatonin, AFMK und AMK.
Zeitraum:
Januar 2008 – Dezember 2015
Drittmittel
Projektträger:
vertraglichen Gründen nicht genannt)
Else-Kröner-Fresenius-Stiftung (siehe auch Projekt 2)
Förderzeitraum: Januar 2008 bis Dezember 2016
1.
Fördervolumen:
148.000.- EUR
Sachmittel/Stellen
50.000.- EUR / 98.000.- EUR
Sachmittel/Stellen
2.
1.
25.000.- EUR / 49.000.- EUR
keine
Originalarbeiten
44
PD Dr. T.Fischer
Fischer TW, Kleszczyński K, Stegmann M, Kruse N, Zillikens D
UVR-induced structural and functional alterations are attenuated by the melatonin
metabolites AFMK and AMK in human ex vivo full skin.
2.
Buchbeiträge
keine
3.
Andere
Dr. med. Lena Ellebrecht
(Promotion abgeschlossen; Bewertung: Summa cum laude)
Masterarbeit:
Marieke Stegmann
(experimentelle Phase der Master-Arbeit abgeschlossen; schriftlicher in Bearbeitung)
Projekt 4 „Prävention von UV-induzierter Beeinträchtigung der Homöostase von
Hautdifferenzierung und Barrierefunktion durch Melatonin und MelatoninMetabolite (AFMK, AMK) in humaner Haut“
1.
Fragestellung:
Melatonin wird in humaner Haut synthetisiert und sowohl unter Stressbedingungen wie
UV-Bestrahlung als auch unter Normalbedingungen innerhalb des melatoninergen
Systems metabolisiert. Hierbei existieren zwei Abbauwege, der a) indolische und der b)
kynurenische. Bislang ist nicht bekannt, unter welchen Bedingungen und in welchen
Hautzellen welcher Metabolisierungsweg eingeschlagen wird. Über die Funktion der
Metabolite des indolischen Abbauwegs ist bisher wenig bekannt, wohingegen zumindest
unter UV-Bestrahlung bekannt ist, daß Melatonin über die Zwischenmetaboliten 2-OHund 4-OH-Melatonin zum größten Teil in den kynurenischen Metaboliten N1-acetyl-N2(AMK)
formyl-5-methoxykynuramine
(AFMK),
N1-acetyl-5-methoxykynurenamine
umgewandelt wird, welcher viermal stärker
antioxidativ wirkt als Melatonin selbst. Ziel des Projektes war, in den Hauptzelllinien
der Haut (humane Keratinozyten, Melanozyten, Fibroblasten) und einer malignen
Zelllinie (Melanomzellen) nach Inkubation mit Melatonin die Metabolite 6-OH-Melatonin
(6(OH)M),
N1-Acetyl-N2-Formyl-5-Methoxykynuramine
(AFMK),
N1-acetyl-5methoxykynurenamine
(AMK)
und
5-Methoxytryptamine
(5MTT)
mittels
Flüssigkeitschromatographie-Massenspektroskopie zu detektieren und sowohl deren
quantitative Bildung als auch zell-abhängige qualitative Zusammensetzung im
melatoninergen System zu analysieren. Der zweite Teil des Projektes sollte dann
verschiedene Funktionen von Melatonin und dessen Metaboliten AFMK und AMK
untersuchen. Diese Untersuchungen wurden im im humanen Vollhautmodell
durchgeführt.
2.
Methodik:
Zellkultur (Keratinozyten, Melanozyten, Fibroblasten; Melanomzellen)
Präparation und Kultivierung unter air-liquid-interface Kulturbedingungen
Präinkubation mit Melatonin und Metaboliten in verschiedenen Konzentrationen
über verschiedene Inkubationszeiten
und
45
PD Dr. T.Fischer
Analyse von Melatonin und seiner Metaboliten mittels FlüssigkeitschromatographieMassenspektroskopie
Zellproliferations-Assays
Proliferations- und Differenzierungs-Marker mittels Immunfluoreszenz im Vollhautmodell
Melatonin-Metabolite, Zellproliferation, Keratin-10 und Involucrin (Differenzierung),
Keratin-14 (Proliferation), Fillagrin (Barriere), p63 (Differenzierung), IGF-1 Proliferation)
3.
Ergebnisse:
Haupmetabolite
waren
6-OH-Melatonin
(6(OH)M),
N1-Acetyl-N2-Formyl-51
Methoxykynuramine (AFMK), N -acetyl-5-methoxykynurenamine (AMK) und 5Methoxytryptamine (5MTT), wobei 6(OH)M, die höchsten Detektionsraten zeigte.
6(OH)M und AFMK konnte in allen untersuchten Zelllinien nachgewiesen werden,
wohingegen 5MTT nur in einzelnen detektiert wurde. Funktionell konnten im
Keratinzytenzellmodell antiproliferative Effekte beobachtet werden, während im
Vollhautmodell vor allem die UV-abhängige Differenzierung in einer Inkubationszeit- und
Konzentrations-abhängigen Weise nachgewiesen werden konnte. Dies wurde konsistent
in den fünf relevanten Parametern Keratin 14, Keratin 10, Involucrin, p63 und IGF-1
gezeigt.
Zeitraum:
Mai 2012 – Dezember 2015
Drittmittel
1.
Projektträger:
Else Kröner-Fresenius Stiftung (siehe auch Projekt 1 und 2)
Förderzeitraum:
Januar 2013 bis Dezember 2016
Fördervolumen:
148.000.- EUR
Sachmittel/Stellen
50.000.- EUR / 98.000 EUR
Sachmittel/Stellen
2.
1.
25.000.- EUR / 49.000.- EUR
Neu eingeworbene Drittmittel in 2015:
keine
Originalarbeiten:
Fischer TW, Kleszczyński K, Stegmann M, Kruse N, Zillikens D
UVR-induced differentiation and barrier-function disturbance are counteracted
bymelatonin and the melatonin metabolites AFMK and AMK in human ex vivo full skin.
Ziel-Journal: Journal of Investigative Dermatology (IF: 7,216)
2.
Buchbeiträge
keine
3.
Andere
46
PD Dr. T.Fischer
Projekt 5 „Aktivierung von antioxidativen Enzymen via „nuclear erythroid 2-related
factor (Nrf2) in UV-bestrahlten humanen Keratinozyten durch Melatonin“
1.
Fragestellung:
Melatonin ist eine stark lipophile Substanz, die dadurch sehr leicht zelluläre Membranen
bis in subzelluläre Organellen durchdringt und daher auch Mitochondrien erreicht. Die
Schutzfunktion von Melatonin für Mitochondrien wurde bereits durch unsere Gruppe
gezeigt (Fischer et al., J Pineal Res, 2008, 44:307–407). Diese Organellen sind jedoch
Orte von Überproduktion von reaktiven Sauerstoffspezies, welche von Melatonin
abgefangen werden können. Die genauen Mechanismen von differenzierten
antioxidativen Signalwegen wurde jedoch bisher nicht analysiert, v.a nicht in humaner
Haut. Ziel des Projektes war, in UV-exponierten humanen Keratinozyten reaktive
Sauerstoffspezies in Zusammenhang mit dem klassischen antioxidativen Enzym
Catalase (CAT) sowie „nuclear erythroid 2-related factor“ (Nrf2) und seinen konsekutiven
Phase-2 antioxidativen Enzymen γ-Glutamat-Cystein-Synthetase (γ-GCS), HemeOxygenase-1 (HO-1), NADPH-Quinon-Oxidoreductase 1 (NQO1)) zu untersuchen.
2.
Methodik:
Zellkultur (normalen humanen epidermalen Keratinozyten (NHEK))
Präinkubation mit Melatonin in verschiedenen Konzentrationen und über verschiedene
Inkubationszeiten
Analyse ROS mittels FACS-Analyse
Analyse von enzymatischer CAT-Aktivität mittels Activity-Assay
Analyse von ATP-Synthese (ATP-Assay)
Gene-Expression von γ-GCS, HO-1, NQO1 und CAT mittels PCR
Untersuchung von nukleärer NRF2-Translokation mittels ELISA
Aktivierung der Enzymsysteme und NRF2
1.
Ergebnisse:
In direkt proportionaler Abhängigkeit von steigenden UV-Dosen (0, 10, 25, 50 mJ/cm2)
und Kulturzeiten nach UV-Exposition (0, 4, 24, 48 Std. post-UV) wurde eine Zunahme
von reaktiven Sauerstoffspezies (ROS) gemessen. Zum Zeitpunkt 4 Std. und länger
nach UV konnte eine signifikante Reduktion der ROS-Bildung durch Melatonin (10–3 M)
festgestellt werden. Melatonin induzierte die Translokation von NRF2 in den Zellkern
und regulierte die Gen-Expression der antioxidativen Enzyme hoch (CAT, γ-GCS, HO-1,
NQO1).
Zeitraum:
Drittmittel
Projektträger:
Einzelförderung durch die Medizinische Fakultät Universität zu Lübeck
vertraglichen Gründen nicht genannt) Else-Kröner-Fresenius-Stiftung
(seit 1/2015)
Förderzeitraum: Januar 2013 bis Dezember 2016
Fördervolumen: 148.000.- EUR
47
PD Dr. T.Fischer
Sachmittel/Stellen
1.
Sachmittel/Stellen
2.
1.
50.000.- EUR / 98.000.- EUR
25.000.- EUR / 49.000.- EUR
keine
Originalarbeiten
Kleszczyński K, Stegmann M, Kruse N, Zillikens D, Fischer TW.
Melatonin mediates translocation of the nuclear erythroid 2-related factor 2 and induces
activation of phase-2 antioxidant enzymes in UVR-treated human keratinocytes.
2.
Buchbeiträge
keine
3.
Andere
Projekt 6 „Modulierung von UV-induzierter Hochregulierung von Hsp70 in humaner
Keratinozytenkultur und in ex vivo humaner Vollhaut“
Kooperation mit nationalem Partner Priv. Doz. Dr. med. Ronald Wolf, Klinik für
Dermatologie, Ludwig-Maximilians-Universität München
1.
Fragestellung:
Melatonin übt seine starken UV-protektiven Effekte über das melatoninerge antioxidative
System der Haut aus und vermag daruch oxidativen Stress signifikant zu reduzieren, mit
folglicher Reduktion von oxidativem Gewebeschaden, Inflammation, mitochondrialem
und DNA-Schaden. Ein weiterer Stressfaktor, der durch UV-Licht aktiviert wird, ist das
Stressprotein „heat shock protein 70“ (Hsp70), welches stark in humanen Keratinozyten
exprimiert ist. Das Zusammenspiel des starken Antioxidanz Melatonin und Hsp70 wurde
bisher noch nicht im Rahmen von UV-Bestrahlungsexperimenten mit human
Keratinozyten und humaner Vollhaut untersucht. Ziel des Projektes war, die Regulation
von Hsp70 unter UV-Exposition und paralleler Melatonin-Inkubation zu untersuchen und
gleichzeitig relevante read-out-parameter für oxidativ-induzierte Apoptose (Caspase-3)
und Inflammation (IL-1beta, IL-6, Casp1) zu analysieren.
2.
Methodik:
Zellkultur (normale humane epidermale Keratinozyten)
Präparation und Kultivierung der Vollhaut unter air-liquid-interface
Kulturbedingungen
Präinkubation mit Melatonin in verschiedenen Konzentrationen und über verschiedene
Inkubationszeiten
Untersuchung von Gen- und Protein-Expression von Hsp70 in humaner Vollhaut
time PCR, ELISA)
(real-
48
PD Dr. T.Fischer
Detektion der Protein-Expression von Hsp70 in humaner Vollhaut
(Immunfluoreszenz)
Untersuchung der Gen-Expression von Casp-3, IL-1beta, IL-6 und Casp-1
Analyse der Gen-Expression von Casp-3, IL-1beta, IL-6 und Casp-1 in Hsp70silenced Keratinozyten
Modulation von Hsp70 unter UV und Melatonin; Expression von Casp-3, IL-1beta, IL-6
und Casp-1 unter Normalbedingungen und silenced Hsp70.
3.
Ergebnisse:
Es konnte gezeigt werden, daß die Hsp70 Gen-Expression direkt nach UV-Exposition
hoch-reguliert wurde und UV-Dosis und Zeitabhängig zunahm. Prä-Inkubation mit
Melatonin verhinderte die Hochregulation der Hsp70 Gen-Expression. Diese Ergebnisse
wurden auch auf Proteinebene, sowohl in Hautlysaten als auch in situ in
Vollhautgewebeschnitten per Immunfluoreszenz bestätigt. Silencing von Hsp70 Gen
führte zu einer kompensatorischen Hochregulation der Gen-Expression für antioxidative
oder inflammatorische Enzyme. Die Zugabe von Melatonin unter dieser experimentellen
Bedingung führte erneut zu einer Herunterregulation der betreffenden Gene.
Zeitraum:
Mai 2012 – Februar 2015
Drittmittel
1.
Projektträger:
Förderzeitraum:
Mai 2012 bis Februar 2015
Fördervolumen:
3.000.- EUR
Sachmittel/Stellen
3.000.- EUR / keine
Sachmittel/Stellen
2.
1.
3.000.- EUR / keine
keine
Originalarbeiten
Kleszczyński K, Zwicker S, Tukaj S, Kasperkiewicz M, Zillikens D, Wolf R, FischerTW.
Melatonin compensates silencing of heat shock protein 70 and suppresses ultraviolet
radiation-induced inflammation in human skin ex vivo and cultured keratinocytes.
J Pineal Res 2015: 58:117–126. (Impact Factor: 9,600)
2.
Buchbeiträge
keine
3.
Anderes
Präsentation
Kleszczyński K, Zwicker S, Tukaj S, Zillikens D, Kasperkiewicz M, Wolf R,Fischer
TW.
49
PD Dr. T.Fischer
Melatonin counteracts UVR-induced up-regulation of Hsp70 expression in human ex
vivo skin.
14. Treffen der Arbeitsgruppe Dermato-Endokrinologie (ADE), Ulm (4. März 2015)
Projekt 7 „Untersuchung eines Anti-Androgens zur Prävention von androgenetischer
Alopezie im Haarorgankulturmodell“
1.
Fragestellung:
Die Androgenetische Alopezie des Mannes beruht auf einer Hemmung der
achstumszyklen und Haarwachstumsgeschwindigkeit durch Testosteron, welches in
genetisch prädispnierten Haarfollikeln der Schläfen- und Hinterkopfregion in
Dihydrotestosteron (DHT), dem Effektor-Hormon der Androgenetischen Alopezie,
umgewandelt wird. Daher ist die Suche nach einem effektiven Hemmstoff der
Testosteron/DHT-Wirkung immer noch im Fokus der Forschung auf diesem Gebiet. Vor
diesem
Hintergrund
sollte
eine
anti-androgene
Proto-Typ-Substanz
im
Haarorgankulturmodell in Ko-Kultivierung mit Testosteron untersucht werden. Hierzu
werden von Männern mit androgenetischer Alopezie nach Aufklärung und
Einverständniserklärung elektiv Kopfhautbiopsien entnommen, die Einzelhaarfollikel
extrahiert und im Haarorgankulturmodell über 6 Tage kultiviert. Für die zu testende
Substanz werden Dosis-Findungsstudien durchgeführt und dann im Anschluß diese in
der optimal wirksamen Konzentration gegenüber Testosteron alleine untersucht.
2.
Methodik:
Gewinnung von elektiv entnommenen Haarfollikel-tragenden Kopfhautgewebeproben
von männlichen Patienten mit androgenetischer Alopezie (Hamilton Stadium II – VI)
durch Mikrodissektion von Einzelhaarfolliklen und Kultivierung unter etablierten
Standardbedingungen Messung des täglichen Haarschaftlängenwachstums
Haarschaftelongation
3.
Ergebnisse:
Es konnten keine effektiven Konzentrationen gefunden werden, die den anti-androgenen
Effekt von Testosteron im Haarorgankulturmodell hinsichtlich der Haarschaftelongation
aufheben konnte.
Zeitraum:
Juli 2015 – November 2015
Drittmittel
1.
Projektträger:
Industrie-Sponsor C (aus vertraglichen Gründen nicht genannt)
Förderzeitraum:
Juli 2015 – November 2015
Fördervolumen:
12.000.- EUR
Sachmittel/Stellen
2.000.- EUR / 10.000.- EUR
Sachmittel/Stellen
2.
2.000.- EUR / 7.400.- EUR
keine
50
PD Dr. T.Fischer
1.
Originalarbeiten
keine
2.
Buchbeiträge
keine
3.
Andere
Projekt 8 „Untersuchung von Einzelkomponenten in Zweier- und DreierKombinationen zur Stimulation humanen Haarwachstums im
Haarorgankulturmodell“
1.
Fragestellung:
In Pilot-Experimenten zeigte sich für 2 von 3 zu testenden Einzelkomponenten eine
Stimulation auf das humane Haarwachstum im Haarorgankulturmodell. Diese Effekte
sollten in größeren Konzentrationsbereichen untersucht werden, um die optimale
Konzentration auf das humane Haarwachstum zu ermitteln. Hierzu wurden von
Schläfenhaut von Patienten mit face-lift-Operationen
Haare
extrahiert
und
im
Haarorgankulturmodell über 6 Tage kultiviert. Für die einzelnen Substanzen wurden
Dosis-Findungsstudien durchgeführt mit der Zielsetzung, die Einzelsubstanzen dann in
Zweier- und Dreier-Kombinationen auf optimale Wirksamkeit zu untersuchen.
2.
Methodik:
Gewinnung von face-lift-Op Hautstücken von der Schläfe und Extraktion von
Einzelhaarfolliklen durch Mikrodissektion und Kultivierung unter etablierten
Standardbedingungen
Messung des täglichen Haarschaftlängenwachstums
Anfertigung von Kryoschnitten der Haarfollikel nach 6-tägiger Kultivierung und
anschließenden histologischen Färbungen und Immunfluoreszenz
Haarschaftelongation
Hämatoxylin-Eosin-Färbung (Morphologie)
Haarfollikelzyklus-Analyse
Apoptose (TUNEL-Assay)
Keratinozytenproliferation (Ki-67)
Haarwachstumsfaktor IGF-1
Katagen-induzierender Faktor TGF-beta2
Zytotoxizität (LDH-Assay)
Stammzellmarker (Cytokeratin 15)
3.
Ergebnisse:
Effektive
Konzentrationen
mit
statistisch
signifikanter
Erhöhung
der
Haarschaftelongation, der Matrix-Keratinozyten-Proliferation und des Anteils der
Anagen-Haare gegenüber unbehandelter Kontrolle konnten für 3 getestete
Vergleichssubsanzen in Zweier- und Dreier-Kombinationen gefunden werden. Ebenso
zeigten sich in bestimmten Kombinationen Stimulation des Wachstumsfaktors IGF-1,
eine Suppression des Katagen-Induktors TGFbeta2 und der Zytotoxizität sowie eine leichte Stimulation des Stammzellmarkers
Cytokeratin 15.
51
PD Dr. T.Fischer
Zeitraum:
September 2013 – März 2015
Drittmittel
1.
Projektträger:
Industrie-Sponsor D (aus vertraglichen Gründen nicht genannt)
Förderzeitraum:
September 2013 – März 2015
Fördervolumen:
56.000.- EUR
Sachmittel/Stellen
10.000.- EUR / 46.000.- EUR
Sachmittel/Stellen
2.
1.
2.000.- EUR / 8.000.- EUR
keine
Originalarbeiten
keine
2.
Buchbeiträge
keine
3.
Andere
Projekt 9 „Untersuchung zur Detektion von Einzelkomponenten in anatomischen
Strukturen des humanen Haarfollikels nach Inkubation im
Haarorgankulturmodell durch RAMAN-Spektroskopie“
1.
Fragestellung:
Auf der Suche nach möglichen Wirkmechanismen von 3 bereits in vorangehenden
Studien untersuchten Einzelkomponenten wurde eine Fragestellung erarbeitet, mit der
die Antwort auf die Frage, in welchen anatomischen Strukturen des humanen
Haarfollikels die aktiven Einzelsubstanzen wirken könnten, beantwortet werden sollte.
Nach eingehenden theoretischen Recherchen wurde zunächst ein Modell mit
Fluorescenz-markierten Stoffen entwickelt, dann jedoch wegen der besseren zu
erwartenden Durchführbarkeit und Ergebnis-Generierung die RAMAN-Spektroskopie als
Untersuchungstechnik festgelegt. Diese wurde in Kooperation mit dem Institut für
Physikalische Chemie der Friedrich-Schiller-Universität Jena durchgeführt. Nach
Inkubation der humanen Haarfollikel mit deuterierten Einzelsubstanzen wurden in einer
neu entwickelten Kryo-Schneidetechnik Gefriertropfen-Schnitte angefertigt, die
anschließend mit RAMAN-Spektroskopie auf die Präsenz und Lokalisation der
deuterieten Substanzen untersucht wurden. Die Haarfollikel stammten von
Schläfenhaut von Patienten mit face-lift-Operationen, die nach Extraktion im
Haarorgankulturmodell für 48 Stunden kultiviert wurden.
2.
Methodik:
Gewinnung von face-lift-OP Hautstücken von der Schläfe und Extraktion von
Standardbedingungen
52
PD Dr. T.Fischer
Inkubation mit deuterierten und nicht-deuterierten Einzelsubstanzen
Haarschaftlängenmessung
Anfertigung von Kryoschnitten der Haarfollikel nach 48-stündiger Kultivierung und
anschließende Übersendung in das Institut für Physikalische Chemie, Jena
Durchführung und Analyse der RAMAN-Spektroskop)
3.
Ergebnisse:
Zunächst konnten keine Spektren der deuterierten Substanzen in den anatomischen
Strukturen des humanen Haarfollikels nachgewiesen werden. Der Pigmentierungsgrad
des humanen Haares beeinflußte massiv die Spektrums-Analyse. In weiteren
Experimenten wurde versucht, wenig pigmentierte oder weisse/graue Haarfollikel für die
Untersuchung zu gewinnen. Die weiteren Ergebnisse stehen noch aus.
Zeitraum:
Februar 2015 – Dezember 2015
Drittmittel
1.
Projektträger:
Förderzeitraum:
Februar 2015 – April 2016
Fördervolumen:
18.000.- EUR
Sachmittel/Stellen
2.000.- EUR / 16.000.- EUR
Sachmittel/Stellen
1.500.- EUR / 11.000.- EUR
2.
1.
Originalarbeiten
keine
2.
Buchbeiträge
keine
3.
Andere
Projekt 10„Untersuchung der Haardurchmesser von organkultivierten humanen
Haarfollikeln nach Inkubation mit Einzelkomponenten im
Haarorgankulturmodell“
1.
Fragestellung:
Auf der Suche nach weiteren biologischen Parametern des humanen
Haarfollikelwachstums in vitro sollten die Haardurchmesser des Haarbulbus gemessen
werden. Hierfür wurde auf Haarfollikel-Kryoschnitte aus dem Vorprojekt zurückgegriffen.
Die Haarfollikel waren von Schläfenhaut von Patienten mit face-lift-Operationen
extrahiert worden und anschließend im Haarorgankulturmodell für 6 Tage mit
verschiedenen Einzelkomponenten alleine oder in 2-er und 3-er-Kombinationen kultiviert
worden.
53
PD Dr. T.Fischer
2.
Methodik:
Standardbedingungen
Inkubation mit Einzelkomponenten alleine oder in 2-er, 3-er-Kombinationen
Messung des Haardurchmessers unter dem Mikroskop mittels skaliertem Okular auf der
Höhe der Auber´schen Linie (größter Haarbulbusdurchmesser)
3.
Ergebnisse:
Es konnten keine signifikanten Unterschiede der Haarbulbusdurchmesser in
Abhängigkeit von Inkubation mit den verschiedenen Einzelsubstanzen gegenüber den
unbehandelten Kontrollen festgestellt werden.
Zeitraum:
Drittmittel
1.
Projektträger:
Förderzeitraum:
Januar 2015 – April 2016
Fördervolumen:
7.000.- EUR
Sachmittel/Stellen
keine / 7.000.- EUR
Sachmittel/Stellen
2.
1.
keine / 7.000.- EUR
keine
Originalarbeiten
keine
2.
Buchbeiträge
keine
3.
Andere
Projekt 11„Untersuchung von Phytotherapeutika zur Stimulation humanen
Haarwachstums im Haarorgankulturmodell“
1.
Fragestellung:
Im Haarorgankulturmodell sollte die Wirkung von 2 phytotherapeutischen Substanzen
auf das Haarschaflängenwachstum untersucht werden. Hierzu wurden von Schläfenhaut
von Patienten mit face-lift-Operationen Haare extrahiert und im Haarorgankulturmodell
über 6 Tage kultiviert. Für die einzelnen Substanzen wurden Dosis-Findungsstudien
durchgeführt, um die optimale Wirkdosis zu identifizieren.
54
PD Dr. T.Fischer
2.
Methodik:
Standardbedingungen
Inkubation mit Phytotherapeutika
Messung des Haarschaftlängenwachstums unter dem Mikroskop mittels skaliertem
Okular
2.
Ergebnisse:
Es konnten keine signifikanten Stimulationen des Haarschaftlängenwachstums der
untersuchten Phytotherapeutika gebenüber der unbehandelten Kontrolle festgestellt
werden.
Zeitraum:
Drittmittel
1.
Projektträger:
Industrie-Sponsor E (aus vertraglichen Gründen nicht genannt)
Förderzeitraum:
Mai 2015 – Februar 2016
Fördervolumen:
9.000.- EUR
Sachmittel/Stellen
1.000 / 8.000.- EUR
Sachmittel/Stellen
2.
1.
1.000 / 7.000.- EUR
keine
Originalarbeiten
keine
2.
Buchbeiträge
keine
3.
Andere
keine
55
PD Dr. T.Fischer
Projekt 12 „Protektive Wirkung von 17-AAG auf verschiedene Parameter der
Entzündung und Blasenbildung im Epidermolysis bullosa acquisita MausModell“
Kooperation mit in-house Partner Priv. Doz. Dr. Michael Kasperkiewicz, Klinik für
Dermatologie, Allergologie und Venerologie
1.
Fragestellung:
In einer Pilot-Studie konnte gezeigt werden, daß 17-AAG im Mausmodell der
Epidermolysis bullosa acquisita (EBA) die Entzündungsreaktion, die klinisch zu
Blasenbildung führen würde, supprimiert. In einem größeren Folgeprojekt sollte nun die
Wirkung von 17-AAG auf verschiedene Parameter der Entzündung und Blasenbildung in
diesem Modell untersucht werden. Hierzu wurden in einem lokalen, passiven und
aktiven Modell experimentelle Behandlungen zur Blasenbildung durchgeführt und dann
aus Hautproben Kryoschnitte gefertigt zur Bestimmung der Parameter per ImmunFluoreszenz und Hautlysate gebildet, um per real-time PCR die Parameter auf GenEbene zu untersuchen.
2.
Methodik:
Untersuchung von Hautproben von EBA-Mäusen
Untersuchung der folgenden Parameter per Immunfluoreszenz und real-time PCR:
Flightless I
Hsp-70
IкB
MMP-2, MMP-9, MMP-12
Stat3
3.
Ergebnisse:
Die protektive Substanz 17-AAG konnte in allen Model-Typen und allen Parametern eine
Suppression der Entzündungsreaktion induzieren.
Zeitraum:
Drittmittel
1.
Projektträger:
Mittel für Forschung und Lehre AG Fischer
Förderzeitraum:
Januar 2015 bis Februar 2016
Fördervolumen:
2.500.- EUR
Sachmittel/Stellen
2.500.- EUR / keine
Sachmittel/Stellen
2.
1.
1.500.- EUR / keine
keine
Originalarbeiten
In Erstellung und Vorbereitung für Einreichung
Bieber K, Tukaj S, Kleszczyński K, Ludwig RJ, Zillikens D, Schmidt E, Fischer TW,
Kasperkiewicz M (2016) Protective effects of 17-AAG on different parameters of
inflammation and blister formation in a local, passive and active mouse model.
Ziel-Journal: PLOS One (IF 2012: 3,730)
56
PD Dr. T.Fischer
2.
Buchbeiträge
3.
Andere
57
Prof. Dr. med. T. Keck und Prof. Dr. Dr. med. J. Habermann
PD Dr. Bausch/PD Dr. Wellner
Klinik für Chirurgie
Projekt:
a-c
a) Charakterisierung von Zellinien und Tumor-Stroma-Interaktion beim
Ampullenkarzinom
b) Rolle von Gli1 beim Pankreaskarzinom
c) Rolle von Exosomen beim Pankreaskarzinom
1.
Fragestellung:
Korrelation zwischen in-vitro Eigenschaften von Zellinien des Ampullenkarzinoms mit
klinischen Subtypen
Proteomische Charakterisierung der Tumor-Stroma-Interaktion
Isolation aus Zellkultur und Serum, FACS
2.
Methodik:
Zellkultur, Matrigel-Transmigration, Wachstum und Chemosensitivität, RT-PCR,
Xenograftiim Mausmodell, Shotgun-Proteomics, Gene Set Enrichment Analysis, Protein
Interaction Networks, Cluster-Analyse
3.
Ergebnisse:
Die meisten Zellinien widerspiegeln einen mesenchymalen / undifferenzierten Subtyp mit
hoher Aggressivität
Es zeigte sich eine starke Wachstumsinhibition von Pankreaskarzinom-Zellen in vitro
und in vivo, verbunden mit einer Inhibition des Gli1-Signalweges. Weitere
Untersuchungen laufen.
Hier beginnt gerade die Etablierung der Methode.
Zeitraum
2015
Drittmittel
Projektträger
DFG
Förderzeitraum
03/2012-03/2015
Fördervolumen
Sachmittel/Stellen
160.000 Euro
1 Stelle TA + ca. 15.000 Euro Sachmittel/Mo
1.
Sachmittel
29.000 Euro
Stellen
34.000 Euro
2.
keine
1.
Originalarbeiten
Kohler I, Bronsert P, Timme S, Werner M, Brabletz T, Hopt UT, Schilling O, Bausch
D,KeckT, Wellner UF (2015) Detailed analysis of epithelial-mesenchymal transition and
58
tumor budding identifies predictors of long-term survival in pancreatic ductal
adenocarcinoma: EMT in pancreatic cancer. Journal of Gastroenterology and
Hepatology IF 3.63
Bolm L, Janssen S, Käsmann L, Wellner U, Bartscht T, Schild SE, Rades D (2015)
Predicting Survival After Irradiation of Metastases from Pancreatic Cancer. Anticancer
Res IF1.87
b) eingereicht
Cell lines reflect ampullary cancer subtypes. BMC Cancer in revision IF 3.36
2.
Buchbeiträge
keine
3.
Anderes
diverse Kongressbeiträge national und international
Arbeitsgruppe Prof. Dr. Dr. med. J. Habermann,
Sektion für Translationale Chirurgische Onkologie und Biomaterialbanken
Projekt 1 „Auswirkung des Silencings der Pseudokinase TRIB3 auf die genomische
Stabilität von kolorektalen Tumorzellen“
AG Dr. Meyer
1.
Fragestellung:
Im Zusammenhang mit der Entstehung von Aneuploidie im Colits-assoziierten Karzinom
wurde bei einer Screening-Studie an klinischem Material eine verringerte Expression der
Pseudo-Kinase TRIB3 gefunden. Ziel dieser Arbeit ist, mögliche funktionelle
Zusammenhänge zwischen der TRIB3 Expression und Entstehung von Aneuploidie im
kolorektalen Zellkulturmodell aufzuklären.
2.
Methodik:
Silencing von TRIB3 mittels siRNA und shRNA
Knock-out von TRIB3 mittels CRISPR/Cas9
Überexpression von TRIB3
Klonierung verschiedener Konstrukte zum Knock-out und Überexpression
Nachweis des Silencings mittels qRT-PCR und Westernblot
Untersuchung von Proliferations- und Migrationsverhalten (MTT-Assay, TranswellMigrationsassay)
Bestimmung des Ploidiestatus (Image-Cytometrie)
Karyotypisierung mittels Array-CGH und Spektral Karyotyping (SKY)
3.
Ergebnisse:
Es konnte ein erfolgreiches Silencing in kolorektalen Zelllinien mittels siRNA sowie ein
stabiles Silencing mittels shRNA erreicht werden. Erste funktionelle Analysen zur
Proliferation und Auswirkung auf den Ploidiestatus sind abgeschlossen. Zum Knock-out
wurden unterschiedliche CRISPR/Cas9 Konstrukte kloniert, welche einen erfolgreichen
Knock-out des TRIB3 Gens in humanen Zellen bewirken.
59
Zeitraum
Drittmittel
Förderung durch die Werner und Klara-Kreitz Stiftung (5.000 Euro)
Projekt 2 „Etablierung primärer Zelllinienpaare aus Kolon- bzw. Lungenkarzinomen
und korrespondierendem Normalgewebe“
AG Dr. Meyer/Dr. Böckmann
1.
Fragestellung:
Das Ziel dieser Arbeit ist es ein Protokoll zur Kultivierung primärer Zelllinien aus
chirurgischen Resektaten von Lungen- und Kolonkarzinomen und von
korrespondierenden Normalgeweben zu etablieren und zu optimieren.
2.
Methodik:
Routinekultur und Bestrahlung von murinen Fibroblasten zur Gewinnung von
konditioniertem Medium
Einzelzellgewinnung aus chirurgischen Resektaten von primären Tumorund Normalgewebe
Kultivierung primärer Zellen aus Tumor- und Normalgewebe
Morphologische Charakterisierung mittels Durchlichtmikroskopie
Immunfluoreszenz zur Differenzierung von epithelialen Zellen und Fibroblasten
Isolierung von Fibroblasten aus Kolonzelllinien
Bestimmung des Ploidiestatus (Cytospin, Feulgen-Färbung, Auswertung mit Ahrens ICM
Cytometrie)
3.
Ergebnisse:
Es konnten erfolgreich primäre Zelllinien und Zelllinienpaare aus Tumor- und
Normalgewebe der Lunge etabliert werden. Dabei wurden Unterschiede bei den
verwendeten Methoden zur Einzelzellgewinnung beobachtet. Verschiedene
Kulturprotokolle sowie der Einfluss verschiedener Medien und Mediumzusätze werden
getestet, um ein optimiertes Protokoll zu erstellen. Die Differenzierung von Fibroblasten
und epithelialen Zellen mittels Immunfluoreszenz konnte erfolgreich etabliert werden.
Zeitraum
Projekt 3 „Isolierung und Kultivierung von Zirkulierenden Tumorzellen (CTCs)“
AG Dr. Böckmann
1.
Fragestellung:
In dieser Arbeit soll eine Kultivierungsmethode etabliert werden, die es erlaubt,
zirkulierende Tumorzellen (CTCs) in vitro zu expandieren, um im Folgenden deren
Zellmorphologie und genetisches Profil analysieren und mit Zellen des Primärtumors
vergleichen zu können. Dadurch sollen CTCs besser charakterisiert und diagnostische,
prognostische sowie prädiktive Biomarker identifiziert werden können.
60
2.
Methodik:
Routinekultur und Bestrahlung von murinen Fibroblasten zur Gewinnung von
konditioniertem Medium
Spiking-Modell: Zellen einer Lungenmetastasen- bzw. einer Kolonmetastasen-Zelllinie
werden in Vollblut eines gesunden Spenders „gespikt“Isolierung von CTCs oder
„gespikten“ Zellen mittels:MACS (Magnetic Activated Cell Sorting)-System
a. RosetteSep™ CTC Enrichment Cocktail
Immunfluoreszenz-Mikroskopie zur Charakterisierung der isolierten CTCs
Kultivierung von isolierten CTCs in konditioniertem Medium
3.
Ergebnisse:
Ein Vergleich von zwei Methoden zur Isolierung von CTCs zeigte, dass sowohl mit dem
MACS-System als auch mit dem RosetteSep die „gespikten“ Lungenmetastasen-Zellen
isoliert werden können. Dabei zeigte sich eine der beiden Methoden mit Bezug auf
Reinheit der isolierten Zellen überlegen. Mittels Immunfluoreszenz-Mikroskopie wird der
Zelltyp der Isolierten Zellen bestimmt, um sicherzustellen, dass es sich tatsächlich um
epitheliale bzw. um Zellen in der Epithelial-Mesenchymalen Transition (EMT) handelt.
Weiter werden derzeit unterschiedliche Kulturbedingungen, unter anderem die
Verwendung von konditioniertem Medium, getestet, um optimale Bedingungen für die
Kultivierung von CTCs zu schaffen.
Zeitraum
Projekt 4 „Evaluierung
und
funktionelle
prognostischer Marker für Brustkrebs“
Charakterisierung
potentieller
AG Prof. Dr. Gemoll, AG Dr. Böckmann
1.
Fragestellung:
Bekannte Genexpressionssignaturen für das Mammakarzinom sollten verglichen werden
um sich überschneidende Gene zu identifizieren. Diese Gene sollen funktionell weiter
untersucht und ihre Tauglichkeit als therapeutische Targets analysiert werden. Hierzu
sollen Auswirkungen eines Knockouts mittels CRISPS/Cas9-Systems in der
Mammakarzinom-Metastasen-Zelllinie T-47D, besonders im Hinblick auf den
Ploidiestatus und die genomische Stabilität bzw. Instabilität analysiert werden.
2.
Methodik:
Gen-Knockout in Mammakarzinom-Metastasen-Zelllinie mittels CRISPS/Cas9-Systems
Zellselektion + Enrichment + Mismatch Detection Assay
qPCR und Western Blot vor und nach Knockout
Bestimmung des Ploidiestatus (Cytospin, Feulgen-Färbung, Auswertung mit Ahrens ICM
Cytometrie)
3.
Ergebnisse:
Aus zehn systematisch ausgewählten prognostischen Genexpressionssignaturen für das
Mammakarzinom wurden drei Gene identifiziert, die mindestens in drei
Geneexpressionssignaturen vorkommen. Von diesen Genen wiederum wurde ein Gen
ausgewählt, dass sowohl bei der Gen- als auch Proteinexpression signifikant mit ERPositivität assoziiert ist und bisher nur in einer Publikation näher charakterisiert wurde.
Die funktionelle Charakterisierung dieses Gens ist Gegenstand aktueller
Untersuchungen.
Zeitraum
61
Drittmittel (Sektion für Translationale Chirurgische Onkologie und Biomaterialbanken)
DFG
Nr
Titel
Organisation
Laufzeit
Förderun
g
eigene AG
1
Identification
of
exosomal
genetic,
epigenetic
and
inflammatory protein markers
in sera of patients with IBD
and IBD-associated diseases
DFG Exzellenzcluster
Inflammation at
Interfaces
(Q TP3)
2014
bis 2016
€
135.000,-
€ 397.840,-
Total:
€
135.000,-
€ 397.840,-
Förderung
gesamt
BMBF und andere Ministerien
Nr
Titel
Organisation
Laufzeit
Förderung
eigene AG
Förderung
gesamt
1
Entwicklung einer mobilen
Snap-Freezing Einheit
für
Krankenhaus
integriertes
Biobanking
BMWi
(ZIM / AiF)
2015
bis 2017
€ 129.350,-
€ 129.350,-
Total:
€ 129.350,-
€ 129.350,-
Organisation
Laufzeit
Förderung
eigene AG
Förderung
gesamt
EU
Regional
Develop. Fund /
Invest Northern
Ireland
2015
bis 2017
€ 366.500,-
€ 2.675.197,-
Interreg
DeutschlandDanmark
2015
2018
€ 450.000,-
€ 1.369.141,-
€ 816.500,-
€ 4.044.338,-
EU
Nr
Titel
Development of Improved and
Novel Biomarker Tests to
Enhance
Current
Tumor
Screening/Monitoring
Approaches
Danish-German Biobank and
Innovation platform for bone
marrow
stem
cells
(BONEBANK)
1
2
Total:
Total:
bis
€1.080.850,-
€4.571.528,-
1.Originalarbeiten
a)erschienen/bzw.im Druck im Jahr 2015
b) eingereicht
a) Manuskript in Vorbereitung: Common dominators in gene expression signatures of
poor prognosis for breast cancer
2.
Buchbeiträge
keine
3.
Anderes
Christian Schiemenz: Experimenteller Teil der Bachelorarbeit abgeschlossen.
62
Sektion für Experimentelle Pädiatrische Endokrinologie und Diabetologie
Projekte a - e
a) Funktionelle
Analyse
von
46,XY
DSD-assoziierten
Kandidatengenen der Geschlechtsentwicklung
Mutationen
in
b) Medizinische Genetik:
Von seltenen Varianten zur Krankheitsentstehung:Untersuchung von
Kandidatengenen bei Störungen der Geschlechtsentwicklung mittels DSD Gene
Panel und screening neuer Kandidatengene durch Exom-Sequenzierung
c) Pathologien des Parathormonstoffwechselwegs: Klinische, biochemische und
molekulargenetische Veränderungen.
d) Comparison of clinical and metabolic effects of testosterone and estrogens in
adult gonadectomized patients with 46,XY DSD due to complete androgen
insensitivity syndrome (CAIS).
e) European concerted research action designated as COST Action BM1303: A
systematic elucidation of differences of sex development (DSDnet).
1.
Fragestellung:
a) Klärung der funktionellen Relevanz von neuen Mutationen in DSD-assoziierten
Kandidatengenen durch in-vitro und in vivo Modelsysteme.
b) Auffinden seltener Mutationen und neuer Kandidatengene in Patienten mit Störungen
der Geschlechtsentwicklung und bisher ungeklärter Diagnose durch Next Generation
Sequencing.
c) Genetische und epigenetische Veränderungen im GNAS Locus und ihre Korrelation
mit den klinischen Zeichen.
d) Gibt es Unterschiede in den Effekten von Estradiol und Testosteron auf die
allgemeine Lebensqualität und klinisch und metabolisch messbare Parameter in 46,XY
Frauen mit kompletter Androgenresistenz (CAIS)?
e) Die COST Action DSDnet wird ein internationales Netzwerk von Wissenschaftlern,
Klinikern und anderen Interessierten aufbauen, um eine Diagnose für alle Menschen mit
DSD zu ermöglichen und ein strukturiertes, gegebenenfalls personalisiertes
Management und eine Therapie zu ermöglichen. Ziel ist es, ein Europäisches
Referenznetzwerk auf wissenschaftlicher und Versorgungsebene aufzubauen.
2.
Methodik:
Zellkultur primärer Zellen und Zellinien, Mutationsnachweis, Western Blot, Q-RT-PCR,
Inkubationsversuche und Nachweis von Steroidmetaboliten (RIA, TandemMassenspektroskopie), Transfektionen, Reportergenassays, Mutagenese, SangerSequenzierung, Pyro-Sequenzierung, Next Generation Sequencing, GFP-tagging,
Fluoreszenzmikroskopie, Kinase-Assays, Analyse posttranslationaler Modifikationen,
Liganden-Bindungsassay,
Hefe
und
Mammalia-2-Hybrid-Systeme,
Co-IP,
Zellfraktionierung, EMSA, MLPA, GST-Pull down, In-vitro Transkription-Translation,
cAMP-RIA, DNA-Methylierungsanalyse, RNAi, Immunhistologie.
63
3.
Ergebnisse:
a) In diesem Projekt wurden 46,XY DSD assoziierte Mutationen, die in unseren
Screenings durch Next Generation Sequencing oder zielgerichtete (verdachtsorientierte)
Sanger-Sequenzierung gefunden wurden, funktionell untersucht. Hierzu wurden die
Mutationen in Expressionsklone der entsprechenden Kandidatengene eingeführt und im
Falle von Transkriptionsfaktoren hinsichtlich ihres Transaktivierungspotentials, der DNA
Bindung oder der Kooperation mit anderen Faktoren anhand von Reportergenen,
Immunpräzipitationen oder Electrophoretic mobility shift assays (EMSAs) untersucht.
Ein Einfluss auf die Lokalisation wurde immunhistochemisch oder durch
Zellfraktionierung analysiert. Erste Ergebnisse wurden in Werner et al., Sex Dev 2015
veröffentlicht.
b) In diesem Projekt wurden SRY positive Patientinnen mit kompletter 46,XY
Gonadendysgenesie und mit unauffälligem CGH-Array, postpubertäre Patientinnen mit
kompletter und partieller Androgenresistenz ohne Mutation im AR-Gen sowie eine große
Familie mit genitaler Fehlbildung ohne nachweisbare Ursache durch ExomSequenzierung untersucht. In 4 von 8 durch Exomsequenzierung untersuchten Familien
konnte die vermutliche Ursache der 46,XY DSD gefunden werden. In einem der Fälle
wurde eine Compound heterozygote Mutation im LH/CG-Rezeptor gefunden, deren
Funktion zurzeit durch cAMP RIA, Reportergen-Assays und immunhistochemische
Färbungen analysiert werden. In einem weiteren Fall konnte eine Mutation in einem
Androgenrezeptor-Kofaktor als mögliche Ursache einer partiellen Androgenresistenz
(PAIS) gefunden werden, die zurzeit noch funktionell untersucht wird. In einer Familie
mit 2 betroffenen Geschwistern und weiblichem Phänotyp wurde eine homozygote
Mutation im Desert Hedgehog (DHH) Gen gefunden. Die immunhistologische
Reevaluation der Gonaden bestätigte bei beiden Schwestern die Entwicklung eines
Seminoms. Obwohl in beiden Schwestern kein Uterus vorhanden ist, waren Teile einer
Tube direkt neben epididymalen Gewebe nachweisbar, welches auf eine unvollständige
Wirkung des Anti-Müller-Hormons hindeutet. In Bereichen mit Carcinoma in situ waren
keine funktionstüchtigen Leydigzellen nachweisbar. In dysplastischen Bereichen der
Gonade konnte eine Hyperplasie Leydigzell-ähnlicher Zellen gefunden werden. DHh ist
ein für die Leydigzelldifferenzierung wichtiges morphogen und die gefundene Mutation
im DHH-Gen vermutlich ursächlich für die 46,XY Gonadendysgenesie.
Interessanterweise konnte in diesen beiden Patientinnen, wie auch in der ersten
beschriebenen Patientin, eine erst im Erwachsenenalter sich manifestierende
minifaszikuläre Polyneuropathie diagnostiziert werden. Dies deutet auf eine funktionelle
Rolle von DHh im Erhalt peripherer Nerven hin. Die Ergebnisse wurden in Werner et al.
im JCEM 2015 veröffentlicht. Weiterhin wurde in diesem Projekt ein Panel für die
erweiterte Diagnostik von 46,XY DSD entwickelt, welches 83 Kandidatengene enthält.
Hintergrund hierfür ist, dass zwar von den meisten Patienten eine gezielte DSD
Diagnostik zur Abklärung der Äthiologie und Pathogenese gewünscht, eine alle Gene
umfassende Gendiagnostik wie die Exom- oder gar Genomsequenzierung jedoch
abgelehnt wird. Zudem erlaubt diese Technik eine höhere Abdeckung der Zielgene um
auch Mosaike sicher zu diagnostizieren und ist auf dem Campus Lübeck in Kooperation
mit dem Institut für Humangenetik verfügbar. Mit Hilfe des neuen DSD Panel konnten in
einigen Patienten neue Mutationen in DSD assoziierten Genen gefunden werden, die in
das Projekt A) eingeschleust und jetzt funktionell charakterisiert werden.
c) Genetische und epigenetische Veränderungen im GNAS Locus und ihre Korrelation
mit den klinischen Zeichen der Albright´schen hereditären Osteodystrophie: Der GNAS
Genlokus ist einer der komplexesten Genloci des humanen Genoms. Durch Mutationen
in den kodierenden Regionen für Gsalpha, der alpha-Untereinheit stimulierender G
Proteine kommt es bei maternaler Vererbung durch ein vorliegendes Imprinting im
Nierentubulus und einigen wenigen anderen endokrinologischen Geweben zur
Resistenz gegenüber Parathormon und anderen G Protein vermittelten Peptidhormonen
und
damit
zum
Krankheitsbild
des
Pseudohypoparathyreoidismus.
Eine
Haploinsuffizienz in den nicht-geprägten Geweben führt zu den klinischen Zeichen der
64
Albright´schen hereditären Osteodystrophie mit den klinischen Zeichen Kleinwuchs,
Brachymetakarpie und –tarsie insbesondere des 4. und 5. Strahls, subkutanen
Kalzifikationen und mentaler Retardierung. Diese phänotypischen Zeichen treten jedoch
bei den Patienten in einer großen Variationsbreite und auch in unterschiedlichem Alter
auf. Zudem gelang es bisher nicht, eine Genotyp-Phänotyp-Korrelation nachzuweisen.
Wir sequenzierten einen großen Teil der Patienten unseres Patientenkollektivs von 88
Patienten mit PHP durch Sanger Sequenzierung und werteten die Ergebnisse der
Mutationsanalyse unseres Kollektivs der letzten 10 Jahre aus. Dabei konnten wir 33 in
der Literatur noch nicht beschriebene Mutationen und zwei neue Hot-spots in dem
bisher größten beschriebenen
Patientenkollektiv nachweisen. Darüber hinaus gelang es erstmals eine statistisch
hochsignifikante Korrelation zwischen der vermuteten Schwere der Mutation und dem
phänotypischen Zeichen „subkutane Verkalkungen“ nachzuweisen. Die Ergebnisse
wurden in Thiele et al., Molecular Genetics & Genomic Medicine 2015 publiziert.
Aufgrund unserer (Thiele et al., 2011; Brix et al. 2014; Turan, Thiele et. al., 2015) und
anderer neuer wissenschaftlicher Erkenntnisse wurde zudem deutlich, dass die
historisch gewachsene Klassifikation der heterogenen Gruppe der Erkrankungen des
PTH/PTHrP-Stoffwechsels nicht mehr geeignet ist, den betroffenen Patienten eine
eindeutige Diagnose zuzuordnen. Deshalb wurde im Rahmen des europäischen
Konsortiums „EuroPHP-net“ die Limitationen der alten und die Erfordernisse an eine
neue Klassifikation definiert und eine neue Terminologie/Klassifikation erarbeitet. Die
Ergebnisse wurden beim European Journal of Endocrinology zur Publikation eingereicht.
d) In dieser randomisierten klinischen Doppelblind-Crossover Studie soll geklärt werden,
ob in erwachsenen gonadektomierten Patienten mit kompletter Androgenresistenz
positive Effekte auf Lebensqualität und klinisch-metabolische Parameter nachweisbar
sind. Die Ergebnisse dieser Studie sollen mit funktionellen Analysen der jeweiligen ARMutation korreliert werden um zu klären, ob evtl. Restaktivitäten oder Spleißvarianten zu
solchen Effekten beitragen. Die Studie hat im Juli 2014 die Rekrutierungsphase
beendet. Die letzte Probandin befand sich 2015 noch in der klinischen Durchführung.
Die Zusammenstellung der erhobenen Daten wurde 2015 begonnen und die AbschlussMonitorings in einigen Prüfzentren, u.a. in Lübeck durchgeführt. Im Februar 2015 fand
ein Studientreffen mit allen beteiligten Prüfzentren in Lübeck statt.
e) Die COST Action BM1303 wurde im Jahr 2015 in das EU Forschungsprogramm
Horizon 2020 überführt. Es fanden mehrere Treffen statt, die einerseits den
Arbeitsgruppen zur Erstellung definierter Arbeitsaufträge zur wissenschaftlichen
Zusammenarbeit dienten, andererseits wurden Fördermaßnahmen zur Ausbildung
initiiert. Ein allgemeines Arbeitstreffen fand im September 2015 in Poznan, Polen statt.
Im Zusammenhang mit dem I-DSD Kongress in Ghent wurde eine Training School
organisiert, an der 31 internationale Fellows verschiedener Spezialisierung (Arzt, Biologe
und Psychologe) teilnahmen.
Zeitraum
a) 01.01.2015 – 31.12.2015
b) 01.01.2015 – 31.12.2015
c) 01.01.2015 – 31.12.2015
d) 01.01.2015 – 31.12.2015
e) 01.01.2015 – 31.12.2015
Drittmittel
Projektträger
a) Universität zu Lübeck – Schwerpunktprogramm Medizinische Genetik: Von seltenen
Varianten zur Krankheitsentstehung
b) Universität zu Lübeck – Schwerpunktprogramm Medizinische Genetik: Von seltenen
Varianten zur Krankheitsentstehung
c) Universität zu Lübeck – Habilitationsförderung
65
d) BMBF
e) Horizon 2020 – COST
Förderzeitraum
a) 01.01.2015 – 31.12.2015
b) 01.01.2015 – 31.12.2015
c) 01.01.2015 – 31.12.2015
d) 01.01.2015 – 31.12.2015
e) 01.01.2015 – 31.12.2015
1.
Sachmittel/Stellen
a)
c)
d)
e)
2.
und b) ca. 40.000 Euro
ca. 7.000 Euro
68.740,80 Euro
99.328,11 Euro
a) Kindness for Kids Stiftung Förderpreis: 40.000 Euro
b) Kinderdiabeteslotse DAMP-Stiftung: 136.000 Euro
c) Weiterbildungsstipendium DGKED: 60.000 Euro
1.
Originalarbeiten
Thiele S, Werner R, Grötzinger J, Brix B, Staedt P, Struve D, Reiz B, Farida
J, Hiort O. A positive genotype-phenotype correlation in a large cohort of
patients with Pseudohypoparathyroidism Type Ia and
Pseudo-pseudohypoparathyroidism and 33 newly identified mutations in the GNAS
gene. Mol Genet Genomic Med. 2015 Mar;3(2):111-20.
Werner R, Merz H, Birnbaum W, Marshall L, Schröder T, Reiz B, Kavran JM,
Bäumer T, Capetian P, Hiort O. 46,XY Gonadal Dysgenesis due to a Homozygous
Mutation in Desert Hedgehog (DHH) Identified by Exome Sequencing. J Clin
Endocrinol Metab. 2015 Jul;100(7):E1022-9. IF: 6.209
.
Serra A, Denzer F, Hiort O, Barth TF, Henne-Bruns D, Barbi G, Rettenberger G,
Wabitsch M, Just W, Leriche C. Uniparental Disomy in Somatic Mosaicism
45,X/46,XY/46,XX Associated with Ambiguous Genitalia. Sex Dev. 2015;9(3):136-43.
IF: 2.288
Pritchard-Jones K, Bergeron C, de Camargo B, van den Heuvel-Eibrink MM, Acha
T, Godzinski J, Oldenburger F, Boccon-Gibod L, Leuschner I, Vujanic G, Sandstedt
B, de Kraker J, van Tinteren H, Graf N; SIOP Renal Tumours Study Group. Omission
of doxorubicin from the treatment of stage II-III, intermediate-risk Wilms'
tumour (SIOP WT 2001): an open-label, non-inferiority, randomised controlled
trial. Lancet. 2015 Sep 19;386(9999):1156-64. IF: 45.217
Werner R, Mönig I, August J, Freiberg C, Lünstedt R, Reiz B, Wünsch L,
Holterhus PM, Kulle A, Döhnert U, Wudy SA, Richter-Unruh A, Thorns C, Hiort O.
Novel Insights into 46,XY Disorders of Sex Development due to NR5A1 Gene
66
Mutation. Sex Dev. 2015 Dec 18. [Epub ahead of print] PubMed PMID: 26681172.
IF: 2.288
Doehnert U, Bertelloni S, Werner R, Dati E, Hiort O. Characteristic features
of reproductive hormone profiles in late adolescent and adult females with
complete androgen insensitivity syndrome. Sex Dev. 2015;9(2):69-74.
Erratum in: Sex Dev. 2015;9(2). IF: 2.288
Kim GJ, Sock E, Buchberger A, Just W, Denzer F, Hoepffner W, German J, Cole T,
Mann J, Seguin JH, Zipf W, Costigan C, Schmiady H, Rostásy M, Kramer M,
Kaltenbach S, Rösler B, Georg I, Troppmann E, Teichmann AC, Salfelder A, Widholz
SA, Wieacker P, Hiort O, Camerino G, Radi O, Wegner M, Arnold HH, Scherer G. Copy
number variation of two separate regulatory regions upstream of SOX9 causes
isolated 46,XY or 46,XX disorder of sex development. J Med Genet. 2015
Apr;52(4):240-7. IF: 6.335
Parenti I, Gervasini C, Pozojevic J, Wendt KS, Watrin E, Azzollini J,
Braunholz D, Buiting K, Cereda A, Engels H, Garavelli L, Glazar R, Graffmann B,
Larizza L, Lüdecke HJ, Mariani M, Masciadri M, Pié J, Ramos FJ, Russo S,
Selicorni A, Stefanova M, Strom TM, Werner R, Wierzba J, Zampino G,
Gillessen-Kaesbach G, Wieczorek D, Kaiser FJ. Expanding the clinical spectrum of
the "HDAC8-phenotype" - Implications for molecular diagnostics, counselling and
risk prediction. Clin Genet. 2015 Dec 16. doi: 10.1111/cge.12717. [Epub ahead of
print] PubMed PMID: 26671848. IF: 3.931
Parenti I, Gervasini C, Pozojevic J, Graul-Neumann L, Azzollini J, Braunholz
D, Watrin E, Wendt KS, Cereda A, Cittaro D, Gillessen-Kaesbach G, Lazarevic D,
Mariani M, Russo S, Werner R, Krawitz P, Larizza L, Selicorni A, Kaiser FJ.
Broadening of cohesinopathies: exome sequencing identifies mutations in ANKRD11
in two patients with Cornelia de Lange-overlapping phenotype. Clin Genet. 2015
Feb 4. doi: 10.1111/cge.12564. [Epub ahead of print] PubMed PMID: 25652421.
IF: 3.931
Turan S, Thiele S, Tafaj O, Brix B, Atay Z, Abali S, Haliloglu B, Bereket A,
Bastepe M. Evidence of hormone resistance in a pseudo-pseudohypoparathyroidism
patient with a novel paternal mutation in GNAS. Bone. 2015 Feb;71:53-7. IF: 3.973
b) eingereicht
Susanne Thiele*, Giovanna Mantovani*, Anne Barlier, Valentina Boldrin, Paolo
Bordogna, Francesca M Elli, Intza Garin, Virginie Grybek, Patrick Hanna, Olaf Hiort,
Beatriz Lecumberri, Luisa de Sanctis, Caroline Silve, Alessia Usardi, Ralf Werner,
Guiomar Perez de Nanclares*, Agnès Linglart*: From Pseudohypoparathyroidism to
Inactivating PTH/PTHrP Signaling Disorders (iPPSD), a novel classification proposed by
the European EuroPHP network. European Journal of Endocrinology.
Rochtus A, Martin-Trujillo A, Izzi B, Elli F, Garin I, Linglart A, Mantovani G, Perez de
Nanclares G, Thiele S, Decallonnne B, Van Geet C, Monk D, Freson K. Genome wide
DNA methylation analysis of pseudohypoparathyroidism patients with GNAS imprinting
defects. Clinical Epigenetics.
2.
Buchbeiträge
Agnes Linlart, Susanne Thiele: Genetic testing in pseudohypoparathyroidism, Buch:
Hypoparathyroidim, Herausgeber: Brandi, Maria Luisa, Brown, Edward Meigs, Springer
Verlag 2015; pp 373-388
67
3.
Anderes
Juliana Gabriel Ribeiro de Andrade: Clinical and molecular cytogenetic evaluation of XY
partial gonadal dysgenesis. (Dissertation in Kooperation mit der Universidade Estadual
de Campinas, Brasilien, Prof. Dr. Andrea Trevas Maciel-Guerra).
Ulla Döhnert: Charakteristika von Hormonprofilen bei Adoleszenten und Erwachsenen
mit kompletter Androgenresistenz.
Marlene Kunert: Identifikation von Koregulatoren des Androgenrezeptors aus dem
Genitalhöcker männlicher Mausembryonen. Ein Hefe-2-Hybrid-Ansatz.
Bettina Brix: Einfluss von genetischen und epigenetischen Veränderungen im GNASGen auf die Gs-Aktivität und GHRH Funktion.
Christine Brandebusemeyer : Differenzialdiagnose des Pseudohypoparathyreoidismus
an Hand klinischer, laborchemischer und molekulargenetischer Befunde.
Ralf Lünstedt: Mutationen
Geschlechtsentwicklung
in
SF-1
ursächlich
für
Besonderheiten
der
Jaqueline Köhler: Differenzialdiagnose von Besonderheiten der Geschlechtsentwicklung
an Hand klinischer, laborchemischer und molekulargenetischer Befunde.
Hanna Mallmann: Definition laborchemischer Untersuchungen zur Diagnose und
Relevanz eines Vitamin-D-Mangels.
Isabel Mönig: Funktionelle Analyse
Steroidogenen Faktor 1 (SF-1).
von
46,XY
assoziierten
Mutationen
im
Susanne Flieger: Nachweis und Charakterisierung von genetischen Veränderungen bei
„Disorders of Sex Development (DSD)“ mittels neuer Sequenzierverfahren.
Helena Campos Fabbri: Functional analysis of NR5A1 mutations associated with 46,XY
DSD. (Dissertation in Kooperation mit der Universidade Estadual de Campinas,
Brasilien)
68
Projekt 1: “Genes, Environment and Inflammation, TP 3 Mouse genetics, genetics of
inflammatory skin diseases”
1.
Fragestellung:
The human skin is known to have defense mechanisms against bacteria, and have been
reported to influence the development of skin disease. We are interested to learn about
the bacterial strains contributing most to the clinical phenotype and the genetics of the
host that influence the bacterial population.
2.
Methodik:
Molecular genetics, animal model
3.
Ergebnisse:
Genetic control of microbiome in skin has previously been studied in skin G4 generation
x of a mouse advanced intercross line, AIL, cohorts. The outcome of this study was the
identification of genomic loci controlling the microbiota skin abundance and skin
inflammation. The goal of the next phase of the project was to further fine map known qtl
in G16 generation. The DNA was isolated from 302 mice from the AIL (G16) population
and sequenced using 16s rRNA 454 pyrosequencing. Primary analysis was performed
by Mothur and Qiime softwares. For species level OTU, clustering was done using uclust
software at 97% similarity. Same mice were genotyped using for ~77000 markers using
MegaMUGA SNP chip. Haplotype reconstruction was performed using HAPPY software.
The logarithmic read count across each taxon was treated as quantitative trait for QTL
analysis. The cage effect was estimated using QTRel software. Kinship matrix was
calculated using DOQTL R package. A in-house modified version of DOQTL was using
for QTL mapping where both cage and kinship was treated as random effect and sex as
fixed effect. Our analysis shows that unlike G4 generation Proteobacteria is most
abundant ~44% phylum in G16 population. The other phylum that showed dominance
was Firmicutes (20 %), Cyanobacteria (18%) and Actinobacteria (8%). At genre level
Streptophyta (18 %) was highest amongst all. The QTL mapping results shows that QTL
identified for Nisseria on chromosome 14 in G4 could be replicated in G16 between (~
64 Mb).
Zeitraum
01.01.2015 – 30.09.2015
Drittmittel
Projektträger
GRK 1743
Förderzeitraum
01.10.2012-30.09.2015
Fördervolumen
Sachmittel/Stellen
Stellen (Gesamt: 125.150)
1.
Sachmittel/Stellen 50.900 €
2.
keine
69
1.
2.
3.
Originalarbeiten
a) erschienen /bzw. im Druck im Jahr 2014-2015
b) eingereicht
Wang J, Kalyan S, Steck N, Turner LM, Harr B, Künzel S, Vallier M, Häsler R, Franke A,
Oberg HH, Ibrahim SM, Grassl GA, Kabelitz D, Baines JF. Analysis of intestinal
microbiota in hybrid house mice reveals evolutionary divergence in a vertebrate
hologenome. Nat Commun. 2015 Mar 4; IF 11,47
Buchbeiträge
keine
Anderes
Projekt 2: “From primary gene defect(s) to molecular mechanisms leading to
hypergammaglobulnemia and therapy resistance of antibody-secreting
plasma cells in Systemic lupus erythematosous”
1.
Fragestellung:
Hypergammaglobulia is a hall mark of Systemic lupus erythematosus (SLE) in patient
and in mice. Aim of this project is the identification of gene(s) that are responsible for
expanded plasma cell population and hypergammaglobulinia in BcN mice and SLE
patient.
2.
Methodik:
Molekulargenetik
3.
Ergebnisse:
In the first months of the project we identified a novel mutation in gene, “cMPL”, that lead
to increased megakaryopoiesis and IL-6 production, expanded plasma cell niches and
finally results in hypergammaglobulinemia. The gene is located within the SLE2
quantitative trait locus, QTL, that control lupus in the BcN mice. We are currently
crossing the gene Knock out onto the BcN mice using speed congenic approach.
Concurrently we are testing our human lupus and Anti-nuclear antibody (ANA) positive
cohorts for association with the “cMPL” gene polymorphisms. Preliminary results from
the human study involving 225 cases and 450 controls showed weak association with
ANA and a known cMPL SNP (p= 0,02548 & OR 2,54). We are also extending the
association studies by genotyping additional SNPs and taking the IgG levels as an
additional phenotype. German and Egyptian Lupus cohorts will also be genotyped.
Zeitraum
01.03.2015-31.12.2015
Drittmittel
DGF/Exc. Cluster J TP2
Förderzeitraum
01.03.2013 - 28.02.2016
Fördervolumen
Sachmittel/Stellen
1.
70
2.
1.
Keine
Originalarbeiten
b) eingereicht
Kunz M, König IR, Schillert A, Kruppa J, Ziegler A, Grallert H, Müller-Nurasyid M, Lieb
W, Franke A, Ranki A, Panelius J, Koskenmies S, Hasan T, Kere J, Rönn AC, Simon
JC, Schmidt E, Wenzel J, Tüting T, Landsberg J, Zeller T, Blankenberg S, Gläser R,
Patsinakidis N, Kuhn A, Ibrahim SM. Genome-wide association study identifies new
susceptibility loci for cutaneous lupus erythematosus. Exp Dermatol. 2015 Jul;24(7):5105. IF: 3,8
Elghzaly AA, Metwally SS, El-Chennawi FA, Elgayaar MA, Mosaad YM, El-Toraby EE,
Hegab MM, Ibrahim SM. IRF5, PTPN22, CD28, IL2RA, KIF5A, BLK and TNFAIP3
genes polymorphisms and lupus susceptibility in a cohort from the Egypt Delta; relation
to other ethnic groups. Hum Immunol. 2015 Jul;76(7):525-31 IF: 2,1
2.
Buchbeiträge
keine
3.
Anderes
Projekt 3 „Theoretical Biology CL IX“
1.
Fragestellung:
With many loci identified for many disease phenotypes, we aim at understanding more.
In continuation of project 1, this project aims at further developing the previously
developed infrastructure from single to interacting loci across species, integrating data
from rat and human.
The cluster integrates many scientific disciplines, all with its specialized biological
databases. Prior analyses are to be extended for structural data to derive biochemical
insights in our statistical interactions.
2.
Methodik:
Integrating human SNP data with consensus expression QTL from mouse and rat
Gain structural insights for antibody binding
Rosetta Antibody structure prediction together with Protein-Protein docking
Linear models for structural epitopes (mimotopes)
3.
Ergebnisse:
Earlier work that incorporated QTL analyses identified the transcription factor RORa as a
modulator in autoimmune diseases. The self-adapted IT infrastructure for distributed
computing with AutoDock for was completed by a DAAD student and a ligand screen
performed across species. The findings are currently under experimental validation.
The UKSH became a formal contributor to the Rosetta Commons community, to allow
best-possible communication with the developers. The software Rosetta Antibody is a
moving target, i.e. under steady development. The team has been extended and
embraces now Dr Christoph Hammers, who retrieves novel antibody sequences from
our patients. Combined with the next-generation sequencing of antibody repertoires, the
71
technology develops towards a pipeline for individualized medicine. This integration of
novel techniques is a result per se.
The docking platform was extended for the docking on antibodies; the generation of
ligands improved, molecular dynamics and the retrieval of snapshots are established. A
master student supports the screening for interacting oligopeptides to connect in silico
analyses with in vitro confirmations. The paper describing results from TiQS was
rewritten and is about to be submitted. Another paper on differential analyses with TiQS
is under preparation.
Zeitraum
01.01.2015 -31.12.2015
Drittmittel
DGF/Exc. Cluster CL IX
Förderzeitraum
01.11.2012 - 31.12.2015
Fördervolumen
Sachmittel/Stellen
1.
Sachmittel/Stellen 72.000 € Stellen (Gesamt: 228.000)
2.
1.
Originalarbeiten
b) eingereicht
Chauhan A, Weiss H, Koch F, Ibrahim SM, Vera J, Wolkenhauer O, Tiedge M.
Dissecting Long-Term Glucose Metabolism Identifies New Susceptibility Period for
Metabolic Dysfunction in Aged Mice. PLoS One. 2015 Nov 5;10(11)
2.
Buchbeiträge
keine
3.
Anderes
Projekt 4 “Mouse model systems of inflammation CL XII”
1.
Fragestellung:
The Genetics group offers the following services to research groups within the
Excellence cluster ExC306 (inflammation at interfaces):
Quantitative trait locus (QTL) mapping
Marker assisted backcrossing (speed congenics)
Genetic quality control
Development of new mouse models of inflammation
2.
Methodik:
Bioinformatics, animal models
3.
Ergebnisse:
72
Many groups used the services in 2015. In particular QTL mapping and genetic quality
controls e.g. Ibrahim, Ludwig, Manz, Köhl, Sina (all UzL), Baines (MPI-Plön,
Hubbe/Rimbach (Kiel).
Zeitraum
01.01.2015-31.12.2015
Drittmittel
Förderzeitraum
01.11.2012 - 31.12.2015
Fördervolumen
Sachmittel/Stellen
1.
2.
1.
Originalarbeiten
b) eingereicht
Lemcke S, Müller S, Möller S, Schillert A, Ziegler A, Cepok-Kauffeld S, Comabella M,
Montalban X, Rülicke T, Nandakumar KS, Hemmer B, Holmdahl R, Pahnke J, Ibrahim
SM. (2014) Nerve conduction velocity is regulated by the inositol polyphosphate-4phosphatase II gene. Am J Pathol. Sep;184(9):2420-9. IF 5.2
Fröhlich C, Zschiebsch K, Gröger V, Paarmann K, Steffen J, Thurm C, Schropp EM,
Brüning T, Gellerich F, Radloff M, Schwabe R, Lachmann I, Krohn M, Ibrahim S, Pahnke
J. Activation of Mitochondrial Complex II-Dependent Respiration Is Beneficial for αSynucleinopathies. Mol Neurobiol. 2015 Aug 29. [Epub ahead of print]
Huebbe P, Dose J, Schloesser A, Campbell G, Glüer CC, Gupta Y, Ibrahim S, Minihane
AM, Baines JF, Nebel A, Rimbach G. Apolipoprotein E (APOE) genotype regulates body
weight and fatty acid utilization-Studies in gene-targeted replacement mice. Mol Nutr
Food Res. 2015 Feb;59(2):334-43. doi: 10.1002/mnfr.201400636.
2.
Buchbeiträge
keine
3.
Anderes
Projekt 5 „Genetische Grundlagen der Autoimmunpankreatitis“
1.
Fragestellung:
Autoimmune pancreatitis (AIP) represents a rare but clinically important variant of
chronic pancreatitis. From a clinical point of view, research on AIP is motivated by both
the diagnostic difficulties to distinguish between AIP and pancreatic cancer, and the
specific therapeutic consequences for AIP patients. In addition, the immunological
mechanisms involved in AIP pathogenesis are of basic interest, e. g. since
73
immunological processes play a role in the progression of more frequent forms of
pancreatitis as well. The principle goal of the project is a systematic analysis of the
genetic basis of AIP in a murine model of the disease. In previous work, the applicants
have established a stable mouse breeding line (termed advanced intercross line; AIL) by
crossbreeding an AIP susceptible mouse strain with AIP resistant lines. By means of
genotyping and phenotyping, quantitative trait loci were mapped that are associated with
the disease.
2.
Methodik:
Molecular genetics, animal model
3.
Ergebnisse:
The project aims at the identification of candidate genes of AIP in mouse models of
diseases and their validation in functional studies ex-vivo and in vivo experiments. The
first set of experiments was performed and we identified novel loci controlling AIP and
the potential cells involved. Additional ongoing experiments include studies with dendritic
cells (cultured alone and together with T-cells) and the characterization of autoreactive
T-cells subpopulations. Currently we are proceeding with exome sequencing of an AIP
patient cohort. By combining both datasets the results of the project should contribute to
the establishment of novel markers for AIP diagnostics.
Zeitraum
01.05.2015 - 31.12.2015
Drittmittel
Förderzeitraum
01.05.2014-30.04.2017
Fördervolumen
Sachmittel/Stellen
1.
2.
1.
keine
Originalarbeiten
b) eingereicht
Bischof J, Müller S, Borufka L, Asghari F, Möller S, Holzhüter SA, Nizze H, Ibrahim SM,
Jaster R. Quantitative Trait Locus Analysis Implicates CD4+/CD44high Memory T Cells
in the Pathogenesis of Murine Autoimmune Pancreatitis. PLoS One. 2015 Sep 1;10(9)
IF 3,2
Müller S, Krüger B, Lange F, Bock CN, Nizze H, Glass Ä, Ibrahim SM, Jaster R. The
mtDNA nt7778 G/T polymorphism augments formation of lymphocytic foci but does not
aggravate cerulein-induced acute pancreatitis in mice. PLoS One. 2014 Jul 10;9(7)
IF 3,2
2.
Buchbeiträge
keine
74
3.
Anderes
Projekt 6 „Inflammatory bowel disease, systemic lupus erythematosus, T cell
repertoire, B cell receptor/immunglobulin repertoire”
1.
Fragestellung:
Despite the importance of T and b cells in inflammation, comprehensive data about the
changes of the T and B cell repertoire in inflammatory diseases are scare. This is mainly
due to technical limitations, which did not allow such studies until recently. The goal of
this project is the characterization of disease associated T and B cell repertoires in
peripheral blood of patient with pemphigus vulgaris, systemic lupus erythematosus,
inflammatory bowel disease and ulcerative colitis. This study will provide novel insight
into disease-associated antigen-receptor repertoires and their therapeutic modulation
and may reveal new diagnostic markers.
2.
Methodik:
Immungenetik, Tiermodell
3.
Ergebnisse:
The first phase of the project included the established of the methods to isolate T and B
cell subpopulations and the NGS-based V gene repertoire sequencing and
Bioinformatics analysis. We are now recruiting patients and proceeding with the planned
study.
Zeitraum
01.01.2015 - 31.12.2015
Drittmittel
Förderzeitraum
01.01.2015-31.10.2017
Fördervolumen
Sachmittel/Stellen
1.
2.
Keine
1.
Originalarbeiten
b) eingereicht
2.
Buchbeiträge
keine
3.
Anderes
75
Projekt 7 „Medizinische Systembiologie“
1.
Fragestellung:
The aim of the project is to establish a Bioinformatics/System Biology platform offering
support to active groups within the ExC 306 and the University of Lübeck. Two scientists
were recruited and an IT Cluster bought and made available to users. The scientists
offered support to many groups for projects dealing with Microbiota studies, Exome and
mtDNA NGS-based sequence analysis.
Zeitraum
01.05.2015 - 31.12.2015
Drittmittel
Förderzeitraum
01.05.2014-30.04.2017
Fördervolumen
Sachmittel/Stellen
Stellen (Gesamt:)
1.
Sachmittel/Stellen € 105.000
2.
Keine
1.
Originalarbeiten
b) eingereicht
2.
Buchbeiträge
keine
3.
Anderes
Projekt 8 “Genetics of pemphigoid diseases in humans (KFO 303)”
1.
Fragestellung:
Although ample evidence suggests that pemphigoid diseases (PD) are partially
genetically determined, among others, by certain HLA haplotypes, IL-1β gene variants,
and copy number variations of Fcγ receptor genes, a systematic and comprehensive
genetic study of PD patients, including a genome-wide association study (GWAS), has
never been conducted. A major reason for this has been the paucity in wellcharacterized PD patient cohorts of sufficient size. Our aim is therefore the
establishment of a cohort of 500 bullous pemphigus patients, to perform GWAS in this
cohort and the replication by targeted sequencing of prioritized genes. Functional studies
of identified genes will be performed in collaboration with other groups within the CRU.
2.
Methodik:
Genetik, GWAS
76
3.
Ergebnisse:
The project has just started. In the next month we will recruit samples of patient with
bullous pemphigus as well as age and sex matched controls for the establishment of a
well-characterized cohort of sufficient size.
Zeitraum
01.10.2015 - 31.12.2015
Drittmittel
Förderzeitraum
01.10.2015 - 30.09.2018
Fördervolumen
Sachmittel/Stellen
1.
2.
Keine
1.
Originalarbeiten
b) eingereicht
Hirose M, Schilf P, Benoit S, Eming R, Gläser R, Homey B, Kunz M, Nebel A, Peitsch
WK, Pföhler C, Sárdy M, Schreiber S, Zillikens D, Schmidt E, Ibrahim SM; German
AIBD Genetic Study Group Polymorphisms in the mitochondrially encoded ATP
synthase 8 gene are associated with susceptibility to bullous pemphigoid in the German
population. Exp. Dermatol. 2015 Sep; 24(9):715-7, IF3,8
Recke A, Vidarsson G, Ludwig RJ, Freitag M, Möller S, Vonthein R, Schellenberger J,
Haase O, Görg S, Nebel A, Flachsbart F, Schreiber S, Lieb W, Gläser R, Benoit S,
Sárdy M, Eming R, Hertl M, Zillikens D, König IR, Schmidt E, Ibrahim S; German AIBD
Genetic Study Group. Allelic and copy-number variations of FcγRs affect granulocyte
function and susceptibility for autoimmune blistering diseases. J. Autoimmun. 2015 Jul;
61:36-44. IF 8,4
van Beek N, Patsatsi A, Gupta Y, Möller S, Freitag M, Lemcke S, Recke A, Zillikens D,
Schmidt E, Ibrahim S. A family with atypical Hailey Hailey disease--is there more to the
underlying genetics than ATP2C1? PLoS One. 2015 Apr 2;10(4)
2.
Buchbeiträge
keine
3.
Anderes
77
PD Dr. med. M. Kasperkiewicz
PD. Dr. med. M. Kasperkiewicz
Projekte a-d
a) Plasma cell depletion via activation of the unfolded protein response: Role of heat
shockprotein 90 inhibitors in a mouse model of autoantibody-mediated epidermolysis
bullosa acquisita
b) Investigation of the impact of heat shock protein 90 inhibition on neutrophil
granulocytes in experimental epidermolysis bullosa acquisita
c) Preclinical studies of the effects of heat shock protein 90 inhibition on the adaptive
immune response in autoimmunity
d) In vivo investigation of topical application of heat shock protein 90 inhibitors and a
heat shock protein 90 fragment for therapy of autoimmune mediated blister and wound
formation
1.
Fragestellung:
Die übergeordnete Fragestellung ist die Rolle von Hitzeschockprotein 90 (Hsp90; als
pathophysiologischer Faktor und therapeutisches Targetmolekül) bei blasenbildenden
Autoimmundermatosen.
2.
Methodik:
In vitro und in vivo Modelle (murin/human) blasenbildender Autoimmundermatosen, vor
allem der Epidermolysis bullosa acquisita. Analyse von Patientenmaterial.
3.
Ergebnisse:
Unsere Arbeiten ergaben wichtige Hinweise auf eine pathophysiologische Rolle von
Hsp90 bei der Epidermolysis bullosa acquisita, dem bullösen Pemphigoid und der
Dermatitis herpetiformis. Insbesondere konnten wir im Mausmodell der Epidermolysis
bullosa acquisita zeigen, dass mit einer pharmakologischen Hsp90-Inhibition günstige
klinische Effekte (sowohl prophylaktischer als auch therapeutischer Art) erzielt werden
können. Als Wirkmechanismus wurden suppressive Effekte auf T-Zellen, B-Zellen und
neutrophile Granulozyten sowie auf die Produktion von Autoantikörpern,
proinflammatorischen Zytokinen und reaktiven Sauerstoffspezies identifiziert; zudem
fand sich ein positiver Einfluss auf regulatorische B-Zellen. In 2015 lag der Fokus
insbesondere auf noch andauernden Untersuchungen zu klinischen und
immunologischen Effekten einer topischen (und nicht - wie bisher - systemischen)
Applikation von Hsp90-Inhibitoren im Mausmodell der Epidermolysis bullosa acquisita.
Zeitraum
01.01.2015-31.12.2015
Drittmittel
Projektträger:
Ad (a) DFG (DFG KA 3438/1-1)
Ad (b) Universität zu Lübeck (E16-2012)
Ad (c) Universität zu Lübeck (E22-2013)
Ad (d) Else Kröner-Fresenius-Stiftung (2013_A117)
78
Förderzeitraum:
Ad (a) 2011-2015
Ad (b) 2012-2014
Ad (c) 2013-2015
Ad (d) 2014-2016
Fördervolumen
Sachmittel/Stellen:
Ad (a) 52.940,00 € / 84.500,00 €
Ad (b) 15.928,00 € / 35.071,98 €
Ad (c) 18.900,00 € / 56.100,00 €
Ad (d) 47.800,00 € / 165.000,00 €
1.
Sachmittel/Stellen
Ad (a) 0,00 € / 7.532,72 €
Ad (b) 0,00 € / 0,00 €
Ad (c) 483,85 € / 0,00 €
Ad (d) 18.661,98 € / 81.030,24 €
2.
keine
Originalarbeiten
a)erschienen /bzw. im Druck im Jahr 2011-2015
b) eingereicht
a)
Kasperkiewicz M, Müller R, Manz R, Magens M, Hammers CM, Somlai C, Westermann
J, Schmidt E, Zillikens D, Ludwig RJ, Orosz A. Heat-shock protein 90 inhibition in
autoimmunity to type VII collagen: evidence that nonmalignant plasma cells are not
therapeutic targets. Blood 2011;117:6135-42I F 9.78
Tukaj S, Kleszczyński K, Vafia K, Groth S, Meyersburg D, Trzonkowski P, Ludwig RJ,
Zillikens D, Schmidt E, Fischer TW, Kasperkiewicz M. Aberrant expression and secretion
of heat shock protein 90 in patients with bullous pemphigoid. PLoS One 2013;8:e70496
IF 3,53
Tukaj S, Tiburzy B, Manz R, de Castro Marques A, Orosz A, Ludwig RJ, Zillikens D,
Kasperkiewicz M. Immunomodulatory effects of heat shock protein 90 inhibition on
humoral immune responses. Exp Dermatol 2014;23:585-90 IF 4.12
Kasperkiewicz M, Tukaj S, Gembicki AJ, Silló P, Görög A, Zillikens D, Kárpáti S.
Evidence for a role of autoantibodies to heat shock protein 60, 70, and 90 in patients
with dermatitis herpetiformis. Cell Stress Chaperones 2014;19:837-43IF 2.54
79
Tukaj S, Grüner D, Zillikens D, Kasperkiewicz M. Hsp90 blockade modulates bullous
pemphigoid IgG-induced IL-8 production by keratinocytes. Cell Stress Chaperones
2014;19:887-94 IF 2.54
Tukaj S, Zillikens D, Kasperkiewicz M. Inhibitory effects of heat shock protein 90
blockade on proinflammatory human Th1 and Th17 cell subpopulations. J Inflamm
(Lond) 2014;11:10 IF 2.22
Tukaj S, Hellberg L, Ueck C, Hänsel M, Samavedam U, Zillikens D, Ludwig RJ, Laskay
T, Kasperkiewicz M. Heat shock protein 90 is required for ex vivo neutrophil-driven
autoantibody-induced tissue damage in experimental epidermolysis bullosa acquisita.
Exp Dermatol 2015;24:471-3 IF 4.12
2.
Buchbeiträge
keine
3.
Anderes
Tukaj S, Zillikens D, Kasperkiewicz M. Heat shock protein 90: a pathophysiological
factor and novel treatment target in autoimmune bullous skin diseases. Exp Dermatol
2015;24:567-71 IF 4.12
Kasperkiewicz M, Płatkowska A, Zalewska A, Zillikens D. Heat shock protein 90
inhibition: A potential double- or triple-edged sword in the treatment of mucous
membrane pemphigoid. Med Hypotheses. 2015;85:412-4 IF 1.07
Kasperkiewicz M, Sadik CD, Bieber K, Ibrahim SM, Manz RA, Schmidt E, Zillikens D,
Ludwig RA. Epidermolysis bullosa acquisita: From pathophysiology to novel therapeutic
options. J Invest Dermatol 2016; in press IF 7.22
80
Prof. Dr. med. M. V. Kopp
Klinik für Kinder- und Jugendmedizin, Pädiatrische Pneumologie und Allergologie
Projekte a-e
a) Epigenetische Modifikation epithelialer DNA durch virale Infektion und ihre
Auswirkung auf die Prädisposition für allergisches Asthma
b) Rolle des Matrikins CP17 bei neutrophilem Asthma
c) Hypertone Salzlösung als präventive Inhalationstherapie bei neugeborenen CF
Patienten
d) Deutsche kollaborative Asthmakohorte (KIRA Studie)
e) Verbesserte klinisch-immunlogische Phänotypisierung zur Therapieoptimierung in
Kindern und Jugendlichen mit Asthma
1.
Fragestellung:
Sind Rhinoviren und Respiratorische Synzytische Viren in der Lage, die epigenetische
Information im Bronchialepithel zu modifizieren? Resultiert daraus eine Prädisposition für
die Entwicklung von allergischem Asthma/Sensibilisierung?
Welche Rolle spielt das Matrikin CP17 in der Entstehung von neutrophilem Asthma?
Randomized, double-blind, controlled pilot study on safety of hypertonic saline as
preventive inhalation therapy in newborn patients with CF.
Erfassung distinktiver Asthmaphänotypen im Kleinkindesalter durch genetische und
andere Biomarker, sowie klinischer Befunde zur Individualisierung der Asthmatherapie.
Ansprechverhalten von Asthmatherapien in Korrelation mit distinkten klinischimmunologischen Phänotypen (CD39+-Tregs/IL-17) im akuten Anfall.
2.
Methodiken:
Aktivitätsmessungen von Chitinasen
Dichtegradientenzentrifugation und Separation von neutrophilen Granulozyten/PBMCs
ELISA
exhaliertes NO
Fluoreszenzmikroskopie
IBIDI 3D Migration
Immunhistologie
klassische Histologie
Lungenfunktionsmessungen
Lungenfunktionsprüfung mittels Gasauswaschverfahren (Multiple Breath Washout)
Messungen unter Normoxie und Hypoxie
Multiplex-ELISA (Luminex)
Quantifizierung von NETs
Transwell-Assays
Western Blot
Zellkultur primärer Zellen und Zelllinien
Zilienfunktionsanalysen
Zilienfunktionsmessung
81
3.
Ergebnisse:
a) Im Rahmen des Deutschen Zentrums für Lungenforschung (Airway Research Center
North) soll die epigenetische Modifikation von epithelialer DNA durch respiratorische
Viren untersucht werden. Es wurden humane bronchiale Epithelzellen (Beas-2Bs) mittels
unterschiedlicher Dosen Rhinoviren (RV) einfach und wiederholt infiziert und Proben der
zellulären DNA, RNA und Proteine zu unterschiedlichen Zeitpunkten gesammelt.
Modifikationen der DNA-Methylierung wurden mittels Affymetrix 450K Illumina Chips
analysiert. Einfache Infektionen resultieren in der Veränderung von mehr als 5000
CpGs. Nach wiederholten RV-Infektionen konnten mehr als 20000 CpGs mit viral
modifizierter Methylierung detektiert werden. Zusätzlich wurde die Genomweite RNAExpression mittels RNA-Sequenzierung aus diesen Experimenten analysiert und mit den
DNA-Methylierungsdaten verglichen. Nach Einfachinfektion zeigen 468 Gene und nach
wiederholten Infektionen 4266 Gene Modifikationen in der DNA-Methylierung und RNAExpression. Zusätzlich konnten bei einer Vielzahl viral modifizierter Zytokine auch
veränderte Proteinkonzentrationen nachgewiesen werden. Zur Verifikation der in vivo
Experimente wurden nasale Epithelzellen von Probanden der KIRA-Kohorte kultiviert
und infiziert. Die Auswertung der nasalen DNA-Methylierungs- und RNA-ExprtessionsAnalysen sowie der Vergleich mit dem Modellsystem wird in naher Zukunft
abgeschlossen sein.
b) In Lungen von Patienten mit Asthma konnte gezeigt werden, dass die nicht-kollagene
Domäne der Isoform 3 des Kollagen IV als Protein nicht aufzufinden ist. Vorherige
Untersuchungen in Kooperationslaboren zeigten, dass diese nicht-kollagene Domäne
als
proof-of-principle
Therapie
in
einem
Mausmodell
der
allergischen
Atemwegsinflammation zu signifikanter Reduktion der bronchialen Hyperreagibilität und
zur Abnahme von Mukusproduktion und Zellinflux führt. CP17 führt in einem Mausmodell
der exazerbierten allergischen Atemwegsinfektion zu einer sign. Reduktion des
neutrophilen Influx.
c) Durchführung einer randomisierten, doppel-blinden, kontrollierten Pilotstudie zur
Sicherheit der Wirksamkeit von hypertoner Kochsalzlösung als präventive
Inhalationstherapie
bei
Neugeborenen
und
Säuglingen
mit
CF.
Lungenfunktionsparameter sowie Marker der CF werden in mehreren Studienzentren
über
einen
Zeitraum
von
3
Jahren
erfasst. Nach bereits
erfreulichen
Rekrutierungszahlen im Vorjahr konnte in diesem Jahr das Zentrumsziel von 10
Patienteneinschlüssen erreicht und die Datenerhebung in 6 Fällen abgeschlossen
werden. Die Babylungenfunktion mittels Gasauswaschverfahren (Mutliple Breath
Washout) wird vermehrt auch zur Messung außerhalb der Studie im klinischen Alltag in
Anspruch genommen.
d) Etablierung einer deutschlandweiten nationalen Kohorte asthmatischer Kinder und
Jugendlicher zur Identifikation von Asthmaphänotypen anhand von Biomarkern aus
Genetik, klinischen Befunden und molekularen Befunden. Es wurde das
Blutverarbeitungsmodul inklusive der zugehörigen SOPs etabliert. Die Lungenfunktion
mittels Gasauswaschverfahrens (N2-MBW) wurde erfolgreich im Rahmen der
Studienvisite eingefügt. Die Vernetzung mit der Biobank Nord (DZL) wurde insbesondere
durch die Einführung elektronischer SOPs der Probenarchivierungssoftware AURORA
herbeigeführt. Es wurden unter Standardrekrutierungsbedingungen mittlerweile n=80
Probanden erfolgreich eingeschlossen, zudem wurden bereits 25 gesunde
Kontrollprobanden rekrutiert. Sputumsampling, Probenversand und das eNOSE
Verfahren zur Erstellung eines digitalen Profils flüchtiger organischen Substanzen in der
Ausatemluft befinden sich zur Zeit im Aufbau. In der Kohorte wurden bereits die ersten
Verlaufsvisiten nach 1 bzw. 2 Jahren durchgeführt.
82
e) Die Etablierung der notwendigen SOPs für Blutabnahme wurden durchgeführt und
erste Probanden (n=4, Asthmatiker) eingeschlossen. Die Konstruktion eines
Oberflächen-Marker-Panels basierend auf der CytoSafe-Chip-Technologie wurde
begonnen. Ein Multiplex-Zytokin-Bead-ELISA (Luminex u. 27-plex BioRad) wurde
etabliert.
Zeitraum
01.01.2015 - 31.12.2015
01.01.2015 - 31.12.2015
01.01.2015 - 31.12.2015
01.01.2015 - 31.12.2015
01.01.2015 - 31.07.2015
Drittmittel
Projektträger
BMBF (DZL)
BMBF (DZL)
BMBF (DZL)
BMBF (DZL)
PINA e.V.
Förderzeitraum
01.11.2011 - 31.12.2015
01.08.2015 - 31.12.2015
01.01.2013 - 31.12.2016
01.01.2013 - 31.12.2015
31.08.2014 - 31.07.2015
Fördervolumen
Sachmittel/Stellen
a), b) und d) 517.000 EUR / 1 biol. Doktorand, 1 Study Nurse, 1 Arzt, 1 Biologe, 1 MTA
c) 35.000 EUR / 0,5 Study Nurse
e) 7.500 EUR
1.
Sachmittel/Stellen
a), b) und d) 178.251,85 EUR Verbrauchsmittel, 266.799,64 EUR Personalmittel
c) 30.4960,16 EUR Personal- und Sachmittel
e) 2.500 EUR Verbrauchsmittel
2.
Stipendium der Gesellschaft Pädiatrische Pneumologie (GPP): „Evaluation von
Lipoxinen als neue Biomarker für Patienten mit schwerem/bronchialem Asthma
bronchiale“
Fördervolumen: 30.000 EUR
Deutsches Zentrum für Lungenforschung 2016-2020: „Translationale Bekämpfung
weitverbreiteter Lungenerkrankungen “Fördervolumen: 2.529.644,71 EUR
Start: Förderung beginnt 2016
Juniorförderung der Forschungskommission Medizin, Universität zu Lübeck: „Viralinduced, epigenetic modification of bronchial epithelium: Targeting the chronoinflammatory network of neutrophil recruitment
Fördervolumen: 47.500 EUR
83
Start: Förderung beginnt 2016
1.
Originalarbeiten
Rose K, Kopp MV. Pediatric investigation plans for specific immunotherapy:
Questionable contributions to childhood health. Pediatr Allergy Immunol. 2015
Dec;26(8):695-701. doi: 10.1111/pai.12500.
2.
Buchbeiträge
Allergologie. Hrsg.Tilo Biedermann, Werner Heppt, Harald Renz, Martin Röcken.
Springer-Verlag 2015, Kapitel: "Besonderheiten allergischer Erkrankungen im Säuglingsund Kindesalter" Seite 395 - 412
3.
Anderes
Dissertation und andere Abschlüsse
Christiane Schultheiß, Lübeck – Promotionsgutachten: „Einfluss von Medikamenten in
der Therapie der Cystischen Fibrose auf die Aktivität von Chitotriosidase in humanen
Neutrophilen Granulozyten“
Dissertation Josephleeng Schmauck-Gómez, Lübeck – Promotionsgutachten:
„Einschränkung der Lungenfunktion und fraktioniertes exhaliertes Stickstoffmonoxid
(FeNO) bei Kindern und Jugendlichen mit Übergewicht und Adipositas in Deutschland“
84
Projekt 1 “The interactive effects of hedonic and hormonal stimuli on the central
regulation of energy and glucose metabolism”
1.
Fragestellung:
Die Studie „GlucoxyA“ untersucht den Einfluss intranasalen Oxytocins auf die Regulation
des Glukosestoffwechsels bei adipösen Probanden; die Studie „VisCue“ untersucht den
Einfluss von visuellen Nahrungsstimuli auf die Nahrungsaufnahme und den
Hormonhaushalt bei normalgewichtigen und adipösen Probanden
2.
Methodik:
intranasale Applikation von Oxytocin, oraler Glukosetoleranztest (GlucoxyA),
Präsentation eines validierten Bildersets von Nahrungsstimuli, Testbuffet (VisCue),
Snack Test, Fragebögen zur Befindlichkeit, Hormonanalysen, kognitive Tests (beide
Projekte)
3.
Ergebnisse:
Beide Studien befinden sich in der Endphase des praktischen Teils und werden im
Februar 2016 abgeschlossen sein.
Projektleitung
Durchführung
Dr. Volker Ott, Dr. Johanna Klement
Sebastian Fehr (Doktorand, GlucoxyA-Studie), Annika Sputh,
Ann-Christin Hartmann (Doktoranden, VisCue-Studie)
Projektträger
DFG, Transregio 134 „Ingestive Behaviour: Homeostasis and
Reward“
Förderzeitraum
04/2014 – 12/2017
Fördervolumen
Sachmittel/Stellen
247.600 Euro
143.300 Euro / 1 x Doktorand 65% (104.300 Euro)
Projekt 2 „Delay Discounting – Entscheidungsverhalten in Abhängigkeit von
Körpergewicht und Blutzuckerspiegel“
1.
Fragestellung:
Korrelieren Unterschiede im Delay Discounting (ein Maß für Impulsivität) zwischen
adipösen und normalgewichtigen Probanden mit der Nahrungsaufnahme? Wird dieser
Effekt durch den Blutzuckerspiegel beeinflusst?
2.
Methodik:
Hypoglykämer und euglykämer Glukose-Clamp bei 20 normalgewichtigen und 20
adipösen Probanden, laufende Erhebung von kognitiven Parametern, Fragebögen,
Blutparametern, Delay Discounting Task
3.
Ergebnisse:
Der praktische Teil der Studie ist beendet, die letzten Hormonanalysen stehen noch aus,
danach erfolgt die gesamte Auswertung.
Projektleitung
Dr. Johanna Klement
Durchführung
Jonas Eggeling (Doktorand), Christin Wagner (Doktorandin),
Christin Rädel (Doktorandin)
85
Projektträger
Universität Lübeck, Einzelförderung
Förderzeitraum
01/2014 – 12/2015
Fördervolumen
74.815 Euro; davon 55.000 Euro Personalmittel
Projekt 3 “Liraglutide effects on memory in healthy subjects”
1.
Fragestellung:
In Tierversuchen zeigt die systemische Applikation von Glucagon-like-peptide-1 (GLP1)-Agonisten eine neuroprotektive und gedächtnissteigernde Wirkung in gesunden
Tieren und Morbus Alzheimer-Modellen.
2.
Methodik:
In 2 Gruppen à 20 gesunden, normgewichtigen Männern wird über einen Zeitraum von 5
Wochen 1,2 mg Liraglutid vs. Placebo täglich subkutan verabreicht. Zu diesem Zwecke
werden die Probanden an 6 Visiten über insgesamt 6 Wochen im Haus 32 untersucht.
Das angewandte Methodenspektrum besteht aus computer-gestützten und Fragebögenbasierten kognitiven Testungen inkl. Prüfung der Aufmerksamkeit und des deklarativen
Lernens, indirekter Kalorimetrie sowie Blutentnahmen.
3.
Ergebnisse:
Ergebnisse liegen noch nicht vor, da eine Zwischenauswertung im Rahmen dieser AMGPhase I-Studie nicht vorgesehen ist. Der praktische Teil der Studie ist abgeschlossen,
momentan erfolgt die Dateneingabe im Zentrum für klinische Studien.
Projektleitung:
Dr. Volker Ott
Durchführung:
Tabea Podszus (Doktorandin), Sonja Kupfer (Doktorandin)
Projektträger:
Novo Nordisk
Förderzeitraum:
05/2013-05/2014
Fördervolumen:
82.000 Euro
Projekt 4 „Vergleichende Studie zum Effekt von intranasalem Insulin auf
Gedächtnisleitungen bei Patienten mit Typ2-Diabetes und bei Patienten mit
früher Alzheimer Demenz (INSULA)“
1.
Fragestellung:
Bei gesunden Probanden konnte eine Verbesserung der kognitiven Leistungen unter der
Verabreichung intranasalen Insulins beobachtet werden. In dieser Studie soll geklärt
werden, ob eine intranasale Gabe von Insulin bei Patienten mit Diabetes Typ2 und bei
Patienten mit Alzheimer Demenz ebenfalls zu einer Verbesserung der
Gedächtnisleistung führen kann.
2.
Methodik:
Es werden drei Probandengruppen untersucht (Patienten mit Diabetes mellitus,
Alzheimer Demenz und Kontrollprobanden). In 14 Visiten erfolgt die regelmäßige
86
Erhebung von Fragebögen, kognitiven Tests und Blutuntersuchungen unter
Verabreichung intranasalen Insulins oder Placebo.
3.
Ergebnisse:
Die Studie wurde vom Sponsor in Essen im April 2015 aufgrund von
Rekrutierungsschwierigkeiten der Probanden abgebrochen.
Projektleiter:
Prof. Dr. Hendrik Lehnert
Durchführung:
Dr. Felix Machleidt
Projektträger:
LVR-Klinikum Essen
Förderzeitraum:
01/2013 – 12/2014
Fördervolumen:
113.000 Euro
Projekt 5 “Dissecting the role of the nesfatin-oxytocin-axis in the reward system”
1.
Fragestellung:
Thema dieses Projektes ist die Bedeutung des Adipokins Nesfatin-1 für das
nahrungsassoziierte Belohnungssystem. Schmackhafte Nahrung aktiviert das
Belohnungssystem und trägt auf diese Weise zu einer Überernährung und damit letztlich
der Entstehung einer Adipositas bei; es gibt erste Hinweise, dass Nesfatin-1 in diesem
Zusammenhang eine modulierende Wirkung ausüben kann.
Speziell werden im Projekt zwei wesentliche Aspekte der Motivation untersucht, eine
Belohung (hier: schmackhaftes Nahrungsmittel) zu erhalten: ‚liking‘ bzw. ‚wanting‘ (das
Geniessen einer Belohnung bzw. der Willen, eine Belohnung zu erhalten).
2.
Methodik:
Optogenetik, stereotaktische Implantation, Verhaltensexperimente, pharmakokologische
Interventionen; Tiermodell: Maus
3.
Ergebnisse:
Erste Ergebnisse der Studie weisen darauf hin, dass durch die zentralnervöse Gabe von
Nesfatin-1 die Motivation im Bezug auf die Nahrungsaufnahme beeinflusst werden kann.
Weiterhin können dopaminerge Neurone mit Hilfe der Optogenetik manipuliert werden.
Projektleitung
Prof. Hendrik Lehnert, Dr. Carla Schulz
Durchführung
Dr. Riccardo Dore
Projektträger
Reward“
DFG, Transregio 134 „Ingestive Behaviour: Homeostasis and
Förderzeitraum
04/2014 – 12/2017
Fördervolumen
Sachmittel/Stellen
326.700 Euro
88.200 / 1 x E13 für 48 Monate (238.500 Euro)
87
Projekt 6 “Central nervous and peripheral actions of nesfatin-1 on thermogenesis
and lipid storage in brown and white adipose tissue”
1.
Fragestellung:
Wie wir in früheren Versuchen zeigen konnten, besitzt das Adipokin im zentralen
Nervensystem eine wichtige Funktion in der Regulation der Thermogenese,
wahrscheinlich vermittelt über eine Aktivierung des braunen Fettgewebes. Im Rahmen
dieses Projektes untersuchen wir nun die Effekte einer zentralnervösen Gabe von
Nesfatin-1 auf die sympathische Aktivierung des braunen und weissen Fettgewebes als
möglichen Vermittlungsmechanismus.
2.
Methodik:
Mikrodialyse, stereotaktische Implantation, HPLC mit elektrochemischer Detektion
3.
Ergebnisse:
Mit Hilfe der Mikrodialyse konnte die Noradrenalin-Freisetzung im braunen Fettgewebe
nachgewiesen werden und wir konnten eine Erhöhung der Thermogenese mit Hilfe der
direkten Kalorimetrie zeigen.
Projektleitung
Dr. Carla Schulz, Prof. Hendrik Lehnert
Durchführung
Luka Levata, MSc
Projektträger
DFG, Graduiertenkolleg “Adipocyte-Brain Crosstalk”
Förderzeitraum
05/2014 – 10/2018
Fördervolumen
244.440 Euro
Sachmittel/Stellen
62.500 Euro / 1 x 65% E13 für 54 Monate (171.900 Euro), 1 x
Fellowship für 12 Monate (8.040 Euro)
1.
Projekt 1-4:
ca. 140.000 Euro
Projekt 5-6:
ca. 128.250 Euro (2015 Projekt 5: 74.300 Euro, Projekt 6: 53.950 Euro)
Gesamt: ca. 268.250 Euro
2.
keine
1. Originalarbeiten
b) eingereicht
Okun JG, Conway S, Schmidt KV, Schumacher J, Wang X, de Guia R, Zota A, Klement
J, Seibert O, Peters A, Maida A, Herzig S, Rose AJ: Molecular regulation of urea cycle
function by the liver glucocorticoid receptor. Mol Metab, 4 (10): 732-40 (2015); new
journal, no IF yet
Ott V, Lehnert H, Staub J, Wönne K, Born J, Hallschmid M: Central nervous insulin
administration does not potentiate the acute glucoregulatory impact of concurrent mild
hyperinsulinemia. Diabetes 64 (3): 760-5 (2015); IF 8,095
Leliavski A, Dumbell R, Ott V, Oster H: Adrenal clocks and the role of adrenal hormones
in the regulation of circadian physiology. J Biol Rhythms 30 (1): 20-34 (2015); IF 3.374
88
2. Buchbeiträge
keine
3. Anderes
Sophia Zug: Zerebraler Energiestoffwechsel unter psychosozialem Stress bei adipösen
jungen Männern (2015)
Anna-Maria Wilz: Experimentelle Untersuchungen zum Einfluss von Nesfatin-1 und dem
melanocortinergen System auf die Energiehomöostase (2015)
89
Prof. Dr. med. R. Ludwig,
LIED, Klinik für Dermatologie, Allergologie und Venerologie
Projekttitel „Untersuchung zur Pathogenese blasenbildender Autoimmundermatosen“
1.
Fragestellung:
Die übergeordnete Fragestellung ist die Modulation der fehlgeleiteten Immunantwort bei
blasenbildenden Autoimmundermatosen.
2.
Methodik:
In vitro und in vivo (Maus) Modelle blasenbildender Autoimmundermatosen,
insbesondere der Epidermolysis bullosa acquisita. Analyse von Patientenmaterialien.
3.
Ergebnisse:
2015 lag weiterhin der Fokus des wissenschaftlichen Arbeitens auf der Antragstellung
für die Fortsetzungsbegutachtung des GRK 1727. Wir konnten in 2015 insgesamt 7
eigene Originalarbeiten der Arbeitsgruppe veröffentlichen (siehe auch Publikationsliste):
Zeitraum
01.01.-31.12.2015
Drittmittel
1.
Sachmittel: ca. 250.000 €
Stellen
3x E13 50%
1x E13 67%
1x E13 100%
1x E8 50%
6x Stipendien
Über die folgenden Drittmittel:
DFG GRK 1743/1, TP6, 2012-2016
Project #6
E13 67% und 60.000 € Sachmittel
DFG LU 877/8-1, 2013-15
Bedeutung der Keratinozyten für die Autoantikörper-induzierte Gewebssschädigung
E13 67% Stelle und 40.000 € Sachmittel
DFG LU 877/9-1, 2013-16
Untersuchung zur Bedeutung von T Zellen bei Autoantikörper-induzierte
Gewebeschädigung
E13 67% Stelle und 70.000 € Sachmittel
DFG LU 877/10-1, 2014-17
Bedeutung der spleen tarosine kinase (SYK) für die Pathogenese der Epidermolysis
bullosa acquisita
199.000 € (E8 Stelle 100% für 36 Monate)
EXC306/2 (zusammen mit Kathrin Kalies, Sebastian Zeising und Rudolf Manz), 2014-17
Defining disease-associated T and B cell repertoires in chronic inflammatory diseases
201.000 € (E13 67% Stelle für 34 Monate)
90
UCB Pharma (zusammen mit Enno Schmidt und Detlef Zillikens), 2014-16
Sponsored research agreement
150.000 € (flexible Mittel)
Immungenetics AG, 2014-16
Sponsored research agreement
25.000 € (flexible Mittel)
2.
DFG GRK 1727/2, TPA2, 2015-20
Project A2 und 4 Stipendien für Mediziner
E13 100%, 6 Stipendien für Medizinstudenten und 50.000 € Sachmittel
ArGEN-X Zusammen mit Enno Schmidt), 2015-16
Sponsored Research Agreement
Frei verfügbare Mittel in Höhe von 450.000
KFO303/1 Projekte LU877/11- und 12-1, 2015-18
TP6 und 7
2xE13 (65%), Sachmittel, ca. 150.00 €
1. Originalarbeiten
Kemmer A*, Bieber K*, Abadpour A, Xinhua Y, Mitschker N, Roth S, Kauderer C, Ludwig
RJ, Seeger K, Köhl J, Zillikens D, Recke A - *equal contributors. Drugs from bugs:
recombinant neutrophil inhibitory factor (NIF) impairs activation of human neutrophils.
Exp Derm (2015) 24:872-8. IF 3,76
Iwata H, Witte M, Samavedam UK, Gupta Y, Shimizu A, Ishiko A, Schröder T, Seeger K,
Dahlke M, Rades D, Zillikens D, Ludwig RJ. Radiosensitive hematopoietic cells
determine the extent of skin inflammation in experimental epidermolysis bullosa
acquisita. J Immunol (2015) 195:1945-54. IF 4,92
Recke A, Vidarsson G, Ludwig RJ, Freitag M, Möller S, Vonthein R, Schellenberger J,
Haase O, Görg S, Nebel A, Flachsbart F, Schreiber S, Lieb W, Gläser R, Benoit S,
Sárdy M, Eming R, Hertl M, Zillikens D, König IR, Schmidt E, Ibrahim S and the German
AIBD Genetic Study Group. Allelic and copy-number variations of FcγRs affect
granulocyte function and susceptibility for autoimmune blistering diseases. J
Autoimmun (2015) 61:36-44. IF 8,41
Prüßmann W*, Prüßmann J*, Koga H*, Recke A, Iwata H, Juhl D, Görg S, Henschler R,
Schmidt E, Zillikens D, Ibrahim SM, Ludwig RJ - *equal contributors. Prevalence of
pemphigus and pemphigoid autoantibodies in the general population. Orphanet J Rare
Dis (2015) 10:63. IF 3,36
Sadeghi H, Gupta Y, Möller M, Samavedam UK, Behnen M, Kasprick A, Bieber K, Müller
S, Kalies K, de Castro Marques A, Recke A, Schmidt E, Zillikens D, Laskay T, Mariani J,
Ibrahim SM*, Ludwig RJ* - *equal contributors. The retinoid-related orphan receptor
alpha is essential for the end-stage effector phase of experimental epidermolysis bullosa
acquisita. J Pathol (2015) 237:111-22. IF 7,43
Tukaj S, Hellberg L, Ueck C, Hänsel M, Samavedam UK, Zillikens D, Ludwig RJ, Laskay
T, Kasperkiewicz M. Heat shock protein 90 is required for ex vivo neutrophil-driven
autoantibody-induced tissue damage in experimental epidermolysis bullosa acquisita.
Exp Derm (2015) 24:471-3. IF 3,76
91
Sadeghi H, Lockmann A, Hund AC, Samavedam UKSRL, Pipi E, Vafia K, Hauenschild
E, Kalies K, Pas HH, Jonkman MF, Iwata H, Recke AR, Schön MP, Zillikens D, Schmidt
E*, Ludwig RJ* - *equal contributors. Caspase-1-independent IL-1 release mediates
blister formation in autoantibody-induced tissue injury through modulation of endothelial
adhesion molecules. J Immunol (2015) 194:3656-63. IF 4,92
Kasprick A, Yu X, Scholten J, Hartmann K, Zillikens D, Ludwig RL, Petersen F.
Conditional depletion of mast cells clarifies their role in experimental epidermolysis
bullosa acquisita. Eur J Immunol (2015) 45:1462-70. IF 4,03
Vorobyev A, Ujiie H, Recke A, Buijsrogge JJA, Jonkman MF, Iwata H, Hashimoto T, Kim
SC, Kim JH, Groves R, Samavedam UK, Gupta Y, Schmidt E, Zillikens D, Shimizu H,
Ludwig RJ. Autoantibodies to multiple epitopes on the non-collagenous-1 domain of type
VII collagen induce blisters. J Invest Derm (2015) 135:1565-73. IF 7,21
Hirose M, Tiburzy B, Ishii N, Pipi E, Wende S, Rentz E, Nimmerjahn F, Zillikens D, Manz
RA, Ludwig RJ*, Kasperkiewicz M* - *equal contributors. Effects of intravenous
immunoglobulins on mice with experimental epidermolysis bullosa acquisita. J Invest
Derm (2015) 135:768-75. IF 7,21
Iwata H, Pipi E, Möckel N, Sondermann P, Vorobyev A, van Beek N, Zillikens D, Ludwig
RJ. Recombinant soluble CD32 suppresses disease progression in experimental
epidermolysis bullosa acquisita. J Invest Derm (2015) 135:916-9. IF 7,21
2.
Buchbeiträge
keine
3.
Anderes, Übersichtsartikel
Ludwig RJ. Immune mechanism-targeted treatment of experimental epidermolysis
bullosa acquisita. Expert Rev Clin Immunol (2015) 11:1365-78. IF 2,18#
Iwata H, Bieber K, Hirose M, Ludwig RJ. Animal models to investigate pathomechanisms
and evaluate novel treatments for autoimmune bullous dermatoses. Curr Pharm Des
(2015) 21:2422-39. IF 3,45
Trog LM, Kahle B, Schindewolf M, Jappe U, Ludwig RJ. Tolerance of fondaparinux in
immediate type hypersensitivity to heparins. Am J Med (2015) 128:e21-2. IF 5,00
Hengameh Sadegi (Dr. rer. nat)
Elana Pipi (Dr. rer. nat)
Wiebke Prüßmann (Dr. med)
Jasper Prüßmann (Dr. med)
Andre Luntz (Dr. med)
92
Institut für experimentelle und klinische Pharmakologie und Toxikologie
Projekt
„Weak electric current stimulation and optogenetics to investigate sleepdependent memory consolidation and ensemble reactivation”
1.
Fragestellung:
The cortical sleep slow oscillation is attributed a role in memory consolidation. It has
been shown to reveal a tight temporal correlation to brain electric events such as sleep
spindles and sharp wave ripples, with these events occurring predominantly at a specific
phase of the cortical slow oscillation. Boosting the sleep slow oscillation by oscillatory
weak electric currents in humans and rats during non-rapid eye movement (NREM)
sleep has improved memory performance, and enhanced dominant NREM sleep
rhythms. Hippocampal reactivation is one mechanism of neurons and local neuronal
networks through which post-experience information processing can occur. Here we aim
firstly, to identify the causal contribution of neurons and oscillatory networks in
hippocampus and prefrontal cortex to sleep-dependent memory consolidation in
behaving mice. Moreover, we investigate in parallel the causal bi-directional relationship
between the sleep slow oscillation and neuronal ensemble activity in hippocampus and
mPFC by manipulating the slow oscillatory field during NREM sleep.
2.
Methodik:
To fulfill these aims we develop and combine usage of optogenetics, multi-electrode
recordings (EEG, LFP) and hippocampus-dependent tasks closely comparable to tasks
used in human subjects. Additionally, a stimulator to apply weak electric currents
transcranially in small rodents is developed in cooperation with the Institute for Robotics
& Cognitive Systems/University of Luebeck.
3.
Ergebnisse:
Protocols for electrode montage, stimulation procedure and behavioral paradigms were
successfully adapted from rats to mice. A stimulator for application of closed-loop
transcranial weak electric stimulation in small rodents has been developed and used in
these experiments. Preliminary results indicate entrainment of slow oscillatory activity in
NREM sleep to external weak electric stimulation. In-depth analysis of recorded
hippocampal activity in response to stimulation is pending.
Furthermore, viral transfection of hippocampal projections with a recently developed
inhibitory opsin resulted in sufficient opsin expression, so that this model will be used for
upcoming optogenetic experiments.
Zeitraum
2015
Drittmittel
Projektträger
DFG SPP1665
Förderzeitraum 2014-2016
Fördervolumen 359 560 €
Sachmittel/Stellen
61 780€/ 191000 €.
1.
Sachmittel/Stellen
61 780€/ 63 600 €.
2.
93
1. Originalarbeiten
Conference contributions:
Wilde, C., Bruder, R., Binder, S., Marshall, L. & Schweikard, A. (2015). Closed-loop
transcranial alternating current stimulation of slow oscillations.
DGBMT Annual
Conference, Luebeck, Germany, Volume: 49
Bruder, R., Wilde, C., Trillenberg, P., Binder, S., Marshall, L. & Schweikard, A. (2015). An
Electronically Configurable Multi-Channel tACS Device. Conference of the German
Society of Neurology, At Düsseldorf, Volume: 88.
Wilde, C., Bruder, R., Binder, S., Marshall, L., Trillenberg, P. & Schweikard, A. (2015).
Modeling Electric Fields for Focal Transcranial Electrical Stimulation. Conference of the
German Society of Neurology, At Düsseldorf, Volume: 88.
Wilde, C., Bruder, R., Binder, S., Marshall, L. & Schweikard, A. (2015). Towards ClosedLoop Transcranial Alternating Current Stimulation. Conference of the German Society of
Neurology, At Munich, Volume: 87
L. Marshall, S. Binder, P. Koo, D. Campos-Beltran, A. Weigenand, T. Martinetz (2015)
Sleep, Memory, and Weak Electric Stimulation. 49th DGBMT Annual Conference in
Lübeck. FS: New Developments in the Analysis and Modification of Central Nervous
Rhythms. Sept. 16.
Original articles:
Wilde C, Bruder R, Binder S, Marshall L, Schweikard A (2015). Closed-loop transcranial
alternating current stimulation of slow oscillations. Current Directions in Biomedical
Engineering, 1:85-88. doi:10.1515/cdbme-2015-0022.
b) eingereicht
2. Buchbeiträge
Marshall, L (in press) A role for neuronal oscillations of sleep in memory and cognition.
In: Thien Thanh Dang-Vu, Richard Courtemanche (Eds.) Neuronal Oscillations of
Wakefulness and Sleep: Windows on Spontaneous Activity of the Brain.
3. Anderes
Workshop lecture: Modulation of cortical network activity during sleep and learning
@ Analysis and Modulation of Brain Networks Time: 23.--‐25. October 2015, UKE
Hamburg; Organizers: A.K. Engel, C.S. Herrmann, G. Nolte, C. Gerloff, I. HanganuOpatz, S. A. Trautmann-Lengsfeld
Projekt
1.
“Auswirkung von schwacher elektrischer oszillierender transkranialer
Stimulation (SO-tDCS) bei schlafabhängiger Gedächtniskonsolidierung auf
kortikale Glutamat- und d-Serin-Konzentrationen“
Fragestellung:
Slow wave sleep is characterized with slow oscillations (SOs). Transcranial direct
current stimulation at the frequency of the slow oscillations (SO-tDCs) during slow wave
94
sleep (SWS) improves both memory consolidation and learning capacity as well as
promoting the occurrence of endogenous SOs as demonstrated by our group in previous
studies in both healthy humans and rats (Marshall et al., 2006; Binder et al., 2014a;
Binder et al., 2014b).
It has been demonstrated that both endogenous and exogenous electrically stimulated
SOs promote cortical plasticity processes that are dependent on NMDA and AMPA
receptors (Chauvette et al., 2012). Transcranial direct current stimulation is also able to
change the neurotransmitter activity (Stagg et al., 2009). For that reason, changes in the
glutamate and D-serine concentrations in the extracellular space are expected during
memory consolidation promoted by the SO-tDCs.
Amperometric high temporal resolution measurements of glutamate and D-serine are
necessary to record the neurochemical concentration changes after brief 30 second SOtDCs trains. Our aim is to combine both techniques to measure changes in glutamate
and the D-serine concentrations after SO-tDCs in the rat prefrontal cortex during
anesthesia, during the sleep-wake cycle and in relation to learning. We start with
glutamate as an already stablished method and develop the system for measuring Dserine
2.
Methodik:
Stereotaxic surgery: Implantation of the EEG, EMG, SO-tDCS and Amperometry
electrodes in the rat brain.
Amperometric detection of neurotransmitters/gliotransmitter: Glutamate and D-serine
electrodes development, calibration, implantation, measurements of the rat prefrontal
cortex using the FAST 16mkIII potentiostat and Microelectrode Arrays from Quanteon,
LLC and data analysis (FAST analysis software). Manufacturing and plating of the
Ag/AgCl reference electrodes.
Electrophysiological activity recordings of the rat prefrontal cortex using EEG
measurements (ME16 from MultiChannel Systems), electrode building and data analysis.
Transcranial direct current stimulation at the frequency of the slow waves (SO-tDCs) and
stimulation electrodes manufacture.
Sleep scoring of the EEG and EMG data to determine the sleep stages (Sleep analysis
software, SleepSign for Animal).
Behavioral tests: study of the learning capacity of the rats.
3.
Ergebnisse:
Glutamate electrodes with a great sensitivity to glutamate have been produced using the
already stablished methods. They fulfilled the parameters during the in vitro calibration
(i.e. sensitivity, selectivity, limit of detection and linearity) and were good for posterior
implantation and recordings. In vitro calibration of the used electrodes revealed a good
stability of the glutamate electrodes after implantation.
Our first experiments on anesthetized rats demonstrated some interference between the
SO-tDCs and the amperometric recordings of glutamate and probably between
isoflurane and glutamate release.
D-serine electrodes are being produced and tested at the moment using in vitro
calibration with very promising results.
Zeitraum
2015
Drittmittel
95
Projektträger
DFG SFB/TR654
Förderzeitraum
2013/2(2015)-2017/1
Fördervolumen
Sachmittel/Stellen
474 000
ab 2015
1.
Sachmittel/Stellen
16 400 €/ 37 200€
2.
1.
2.
Originalarbeiten
a)erschienen /bzw. im Druck im Jahr 200xb) eingereicht
Buchbeiträge
Marshall, L (in press) A role for neuronal oscillations of sleep in memory and cognition.
In: Thien Thanh Dang-Vu, Richard Courtemanche (Eds.) Neuronal Oscillations of
Wakefulness and Sleep: Windows on Spontaneous Activity of the Brain.
3.
Anderes
96
PD. Dr. SA. Mohamed
PD Dr. SA. Mohamed
Klinik für Herz- und thorakale Gefäßchirurgie
Projekt
1.
„Mechanismen der Aortopathie bei Patienten mit Bikuspider Aortenklappe“
Fragestellung:
Die Bikuspide Aortenklappe (BAV) ist mit einer Prävalenz von 0,5-2 % der häufigste
kongenitale Herzfehler und mit Aortenaneurysma und Dissektion assoziiert. BAV tritt
sowohl spontan als auch erblich bedingt auf. Vermutet wird eine autosomal-dominante
Vererbung mit reduzierter Penetranz. Im Gegensatz zur Trikuspiden Aortenklappe (TAV)
besitzt die Aorta der Patienten mit BAV nur zwei Klappen anstatt drei. Daraus resultieren
Komplikationen wie arterielle Stenose, Klappeninsufiziens und Aortopathy (Dilatation
eines oder mehrerer Bereiche der Aorta -auch Aneurysma genannt-) mit einhergehender
Aortendissektion und -ruptur. Die Aortopathy und die Aortendissektion stellen die größte
Komplikation bei BAV dar und sind bei später Behandlung letal.
Die Aortopathy wird bei ca. 50% aller BAV-Patienten nachgewiesen und tritt im
Durchschnitt 10 Jahre früher auf als Patienten mit TAV. Daher sind viele junge
Menschen von den Komplikationen, welche diese Malformation mit sich bringt, betroffen.
Bisherige Untersuchungen zeigten eine veränderte Ausdifferenzierung und einen Verlust
von glatten Muskelzellen -sogenannte VSMCs- bei dem Apoptose eine Rolle spielen
könnte. Außerdem scheinen Proteine wie die der TGFß-Familie, der Krüppel-Like-Factor
(KLF)-15, Fibrilin-1, NOS3 und deren Regulatoren wie miRNA-195, die bei der Reifung
der Gefäßwand wichtig sind, im dilatierten Gewebe anders exprimiert zu werden.
Ziel unserer Forschung ist:
Ziel unserer Forschung ist:
Besseres Verständnis der Mechanismen, die bei der Entstehung von BAV eine Rolle
spielen (spontane Mutation, Vererbung, verantwortliche Gene)
Welche Rolle spielen die VSMC bei der Aortopathy in BAV?
Untersuchung einiger Faktoren wie miRNA-195, KLF-15, TGFß-Familie im Gewebe und
in der Zellkultur der BAV-Patienten, die an der Aortopathy beteiligt sein könnten
2.
Methodik
Isolierung und Kultivierung von glatten Muskelzellen aus aneurysmatischem und
gesundem Aortengewebe (VSMCs)
Etablierung einer Zelllinie der VSMCs
Charakterisierung der isolierten Zellen mittels Durchflusszytometer
Genexpressionsanalysen der Zellkultur zur Untersuchung des Expressionsmuster der
TGFß-Familie mit Hilfe von real time RT-PCR
Isolierung und Kultivierung von Endothelzellen aus der Aorta
Nachweis von TGF-ß in der Zellkultur und im Aortengewebe
Proteinisolierung aus dem Zellkultur- und Gewebematerial
Messung der Proteinexpression mit Hilfe von Bioplex- und Ciraplex-Assay
Nachweis von Endoglin in der Zellkultur und im Aortengewebe
Proteinisolierung aus dem Zellkultur- und Gewebematerial
Messung der Proteinexpression mit Hilfe von Bioplex- und Ciraplex-Assay
97
PD. Dr. SA. Mohamed
Untersuchung der Expression von KLF-15 im Aorten-und Aortenklappen Gewebe von
BAV-Patienten
RNA-Isolierung aus dem Gewebematerial
Messung der KLF-15-Expression mit TaqMan-Sonden und SYBRGreen
Analyse zur Aktivierung des Smad-Signalweges in dilatierten Aortengewebe mittels PLA
als Nachweismethode
3.
Ergebnisse:
Die Isolierung von VSMCs aus aneurysmatischem Gewebe gab uns die Möglichkeit der
Durchführung von Genexpressionsanalysen und Proteinassays dieser Zellen und des
Vergleiches
zwischen
gesundem
und
aneurysmatischem
Gewebe
und
Zellkulturmaterial. Die Messung von TGF-ß-Proteinen 1, 2 und 3 im aneurysmatischen
Aortengewebe und in den VSMCs zeigte keinen signifikanten Unterschied zwischen
erkrankter und gesunder Aorta. Es konnte jedoch eine signifikante Herunterregulation
von Endoglin-Expression im aneurysmatischem Material festgestellt werden. Die
Mutation von Endoglin-Gen, ein Corezeptor von TGFß-1 führt zu Hereditäre
hämorrhagische Teleangiektasie, bei der Blutgefäße verschiedener Organe stark
erweitert sind. Die Genexpressionsanalysen der Zellkultur zur Untersuchung des
Expressionsmuster anderer Gene der TGFß-Familie werden derzeit noch durchgeführt.
Die in-situ-Hybridisierung vom microRNA-195 erfolgte zunächst auf aneurysmatischem
Gewebe von Patienten mit TAV. Derzeit laufen noch die Versuche für den Vergleich der
Expression und Lokalisation der microRNA im Gewebe von BAV- und TAV-Patienten.
Darüberhinaus wird eine Quantifizierung der Signale angestrebt.
Bei der Genexpressionanalyse von KLF-15 wurden die Versuche mit dem Material aus
Aortenklappen- und Aortengewebe bei Patienten mit einer TAV und BAV durchgeführt
und
miteinander
verglichen.
Die
Ergebnisse
zeigten
eine
signifikante
Herunterregulierung der KLF-15-Expression im Bereich der proximalen Aorta bei
Patienten mit BAV im Vergleich zu TAV-Patienten. Aus diesem Grund könnte KLF-15
bei der Ausbildung von Dilatation der Aorta ascendens eine wichtige Rolle spielen.
Frühere Veröffentlichungen haben bereits gezeigt, dass das Fehlen von Klf-15 in
Mäusen zu Kardiomyopathy und Aorthopathy führt. Weitere Untersuchungen wie der
Vergleich der KLF-15 Expression im TAV und „gene silencing“ im gesunden Material
könnten die Funktion dieses Transkriptionsfaktors, dessen Expression in der
Anwesenheit von TGFß-1 stark herunterreguliert wird, verdeutlichen.
Der Nachweis der Smad Proteine im BAV-Patientenmaterial erfolgte mit Hilfe der
proximity-ligation- assay (PLA). Dabei werden aktivierte Smad-proteine sowohl im Kern
als auch im Zytoplasma der Zellen nachgewiesen. Somit kann verglichen werden, ob die
Smads nach der Aktivierung aus dem Zytoplasma in den Nukleus eingewandert sind.
Dabei werden Proben der Patienten mit BAV mit denen der Patienten mit TAV
verglichen. Diese Versuche laufen noch.
Zeitraum
2014-2015
Drittmittel
Projektträger
Fondation Leducq
Förderzeitraum
2013-2018
Fördervolumen
676.500 Euro
98
PD. Dr. SA. Mohamed
Sachmittel/Stellen
1.
Sachmittel/Stellen
110.895,00 Euro
2.
1. Originalarbeiten
Patel V, Carrion K, Hollands A, Hinton A, Gallegos T, Dyo J, Sasik R, Leire E, Hardiman
G, Mohamed SA, Nigam S, King CC, Nizet V, Nigam V. The Stretch Responsive
microRNA miR-148a is a Novel Repressor of IKBKB, NF-κB Signaling, and Inflammatory
Gene Expression in Human Aortic Valve Cells. The FASEB J. [IF 5,48]
Paloschi V, Gådin JR, Khan S, Björck HM, Du L, Maleki S, Roy J, Lindeman JHM,
Mohamed SA, Tsuda T, Franco-Cereceda A, and Eriksson P. Aneurysm development in
patients with a bicuspid aortic valve is not associated with transforming growth factor-β
activation. ATVB [IF 6,36]
Klein O, Hanke T, Yan J, Nebrich G, Krause S, Thiele H, Mohamed SA. Detection and
Determination of Protein Network Associated With Atrial Fibrillation Phenotypes. J Clin
Exp Cardiolog 2015, 6: 411 [IF 1,22]
Doyle JJ, Doyle AJ, Wilson NK, Habashi JP, Bedja D, Whitworth RE, Lindsay ME,
Schoenhoff F, Myers L, Huso N, Bachir S, Squires O, Rusholme B, Ehsan H, Huso D,
Thomas CJ, Caulfield MJ, Van Eyk JE, Judge DP, Dietz HC; GenTAC Registry
Consortium; MIBAVA Leducq Consortium. A deleterious gene-by-environment
interaction imposed by calcium channel blockers in Marfan syndrome. Elife. 2015 Oct
27;4. [IF 9,30]
b) eingereicht
Lazar-Karsten P, Belge G, Schult-Badusche D, Focken T, Radtke A, Yan J, Mohamed
SA. Generation and characterisation of vascular smooth muscle cell lines.
2.
Buchbeiträge
Junfeng Yan, Ann-Cathrin Lehsau, Pamela Lazar-Karsten, Detlev Schult-Badusche, Luc
Mertens, Bart L. Loeys, Salah A. Mohamed. Genetic basis, Pathogenesis and
Histopathology of Aortopathy in Bicuspid Aortic Valve and Marfan syndrome. NOVA
Scientific Publishers, INC. New York, USA, 2015 in 'Bicuspid Aortic Valve: Diagnosis,
Surgical Treatment and Complications''.
Preise und Auszeichnungen:
Preis: Treatment of Elderly Patients: The challenge of the future (im Rahmen der alten
Patient in der Herzchirurgie; Meeting in Halle (Saale) 25. – 27.09.2015)
Co-Chairman: BIT’s 7th Annual International Congress of Cardiology -2015, Shangahi,
China Late Breaking News: American Heart Association 2015, Orlando, USA
99
PD. Dr. SA. Mohamed
3.
Anderes
Inauguraldissertation: “Evaluation of Hydrodynamic Effects of the Sinus of
Valsalva on the Native Aortic Valve”. Vorgelegt von Junfeng Yan
Bachelorarbeit: „Expressionsanalysen von KLF-15 an Klappen- und dilatierten
Aortengewebe von Patienten mit bikuspider- und trikuspider Aortenklappe mittels RealTime PCR“. Vorgelegt von Björn Wieschendorf
Bachelorarbeit: „Analysen zur Aktivierung des Smad-Signalweges in dilatiertem
Aortengewebe mittels PLA als Nachweismethode“. Vorgelegt von Heidi Tackenberg
Bachelorarbeit: „Entwicklung einer Methode zur semi-autonomen, adaptiven
Annotation von Biopsie-Bildern der Aorta ascendens“. Vorgelegt von Carolin
Baumgart
100
Prof. Dr. med. G. RIemekasten und Prof. Dr. med. P. Lamprecht
Prof. Dr. med. G. Riemekasten und Prof. Dr. med. P. Lamprecht
Klinik für Rheumatologie
Projekt
a-c
a) Chronische Entzündung, Toleranzdurchbrechung sowie humorale (z.B.
funktionelle und/oder pathogenetisch relevante Autoantikörper) und zelluläre
Mechanismen (z.B. Effektor-Gedächtnis-T-Zellen und regulatorische T-Zellen) bei
chronisch-entzündlichen Autoimmunerkrankungen
Vaskulitiszentrum / Klinische Forschergruppe 170:
b) Frühpathogenese der Granulomatose mit Polyangiitis: von der natürlichen
Abwehr mit Granulombildung zur Autoimmunität
c) Graduiertenkolleg 1727: Modulation von Autoimmunität (TPB4, TPB6)
Vasculitis Foundation: „miRNA pattern in GPA“
1.
Fragestellung:
Die Ätiologie von verschiedenen chronisch-entzündlichen Autoimmunerkrankungen, z.B.
ANCA-assoziierte Vaskulitiden (AAV), systemischer Lupus Erythematodes (SLE),
systemische Sklerose, ist bisher nur partiell verstanden. Autoantikörper gegen
körpereigene Moleküle stellen vermutlich einen der pathogenetisch relevanten Faktoren
bei einer Reihe von Autoimmunerkrankungen dar. Allerdings kann man davon
ausgehen, dass Autoantikörper per se nicht pathogenetisch wirken, sondern dass
pathogenetische Funktionen z.B. Epitop-abhängig sind. Daher wird postuliert, dass es
sowohl physiologisch als auch pathogenetisch wirksame Autoantikörper gibt, wobei
letztere z.B. Ausdruck einer sich mittels sogenanntem „epitope spreading“
entwickelnden aktiven Autoimmunerkrankung sein können. Diesem Postulat wird bei
o.g. Erkrankungen nachgegangen, z.B. bei der Granulomatose mit Polyangiitis (GPA)
mit dem Ziel des Nachweises einer pathogenetisch relevanten PR3-ANCA-Produktion
mittels rekombinanter Expression von gewebsständigen IgG. Im Hinblick auf die GPA
geht es weiterhin darum, herauszufinden, warum (und wo) die PR3 zum exklusiven
Zielautoantigen wird und ob Gefahrsignale dabei eine zentrale Rolle spielen. Wir
postulieren, dass dieser Prozess mit der Granulombildung in der lokalisierten GPA
beginnt und letztlich zur Induktion von letztlich pathogenetisch relevanten PR3-ANCA in
der frühen Generalisation führt und untersuchen diese Hypothese. Zahlreiche Studien
belegen zudem, dass quantitative und qualitative Abweichungen (vom Normalen) im
Immunzellrepertoire einen weiteren pathogenetisch relevanten Faktor für die
Entwicklung von Autoimmunerkrankungen wie z.B. der systemischen Sklerose
darstellen. Die Arbeitsgruppe untersucht die Präsenz und die Wirkung solcher
Abweichungen, z.B. bei T-Lymphozyten und mit dem Ziel erfolgreicher therapeutischer
Interventionen.
2.
Methodik:
Phänotypisierung von Lymphozyten mittels Durchflußzytometrie
Erstellung von Zytokinprofilen mittels Durchflußzytometrie
Zellkulturversuche (Stimulation mit Zytokinen, Peptiden etc.)
mRNA-Analysen verschiedener Mediatoren mittels real-time PCR
Gewebsanalysen
(Immunhistochemie,
Immunfluoreszenz,
Einzelzell-PCR
Immunglobulingene)
Western blot, Co-Immunpräzipitation
miRNA-Analyse mittels real-time PCR
3.
für
Ergebnisse:
Eine auf tierexperimentellen Ansätzen, in vitro Experimenten und der Analyse von
Patientenmaterialien beruhende Studie, die zusammen mit einer französischen
Arbeitsgruppe unternommen wurde, ergab, dass die gestörte Efferozytose bei der GPA
signifikant zur Aufrechterhaltung der granulomatösen Entzündung beiträgt. Diese
101
Störung der Efferozytose wird dabei wesentlich durch die Membranexpression des
Hauptautoantigens Proteinase 3 auf apoptotischen Zellen verursacht. Des Weiteren
wurde in einer an der Charite in Berlin durchgeführten Studie demonstriert, dass die
verminderte Produktion von Interleukin-2 (IL-2) zum Verlust an regulatorischen T-Zellen
beim SLE beiträgt und, vor allem, dass diese Fehlregulation durch die Gabe von
rekombinantem IL-2 in niedriger Dosis bei Patienten korrigiert werden kann. Im Hinblick
auf die Suche nach spezifischen Biomarkern für rheumatische Erkrankungen zeigt sich
(wiederum in Kooperation mit der Charite, Berlin), dass die mittels Durchflußzytometrie
bestimmte zelluläre Signatur und insbesondere zirkulierende T-Zellen im Urin dafür
geeignet sind. Letztere weisen zudem (zumindest bei der GPA) eine erhöhte Expression
von Rezeptoren auf, die charakteristisch sind für Natürliche Killerzellen.
Zeitraum
01.01.-31.12.2015
Drittmittel
Projektträger
a) DFG: GRK1727; SFB 650 (TP10)
b) Universität zu Lübeck: KFO 170
c) Vasculitis Foundation, USA
d) Deutsches Zentrum für Lungenforschung (Kooperation mit dem FZB)
e) Industrie
Förderzeitraum
a) 20.11.2014-20.11.2017 bzw. 01.01.2013-31.12.2016
b) 01.01.2016-31.12.2018
c) 01.06.2013-01.06.2014 (verlängert bis 30.06.2016)
d) 01.01.2015-31.12.2019
e) 01.01.2012-31.12.2018
Fördervolumen
Sachmittel/Stellen
a) € 11.690,- / 0,5 x E13
b) € 27.500,- / 1 x E13
c) € 20.000,- / keine
d) € 30.000,- / keine
e) keine / 1 X E5
1.
2.
1.
Sachmittel/Stellen
a) € 27.500,- / 1,5 x E13
b) € 11.690,- / 0,5 x E13
c) keine
d) € 30.000,e) 1 X E5
DFG: GRK1727 (TPB4, TPB6)
Originalarbeiten
a) erschienen/bzw. im Druck im Jahr 2015 b) eingereicht
a)
Millet A, Martin K, Bonnefoy F, Saas P, Mocek J, Alkan M, Terrier B, Kerstein A,
Tamassia N, Sathyanarayanan SK, Ariel A, Ribeil JA, Guillevin L, Cassatella
MA,Müller A, Thieblemont N, Lamprecht P, Mouthon L, Perruche S, Witko-Sarsat V.
102
Proteinase 3 on apoptotic cells disrupts immune silencing in autoimmune vasculitis. J
Clin Invest 2015;125:4107-21 IF: 13.261
Schüler S, Wolters S, Pitann S, Kabelitz D, Lamprecht P. Increased co-expression of
the natural killer cell receptor NKG2D and further natural killer cell receptors on CD4+
T cells in granulomatosis with polyangiitis. Clin Exp Rheumatol 33(2) S183 2015;
IF: 2.724
von Spee-Mayer C, Siegert E, Abdirama D, Rose A, Klaus A, Alexander T, Enghard
P, Sawitzki B, Hiepe F, Radbruch A, Burmester GR, Riemekasten G, Humrich JY.
Low-dose interleukin-2 selectively corrects regulatory T cell defects in patients with
systemic lupus erythematosus. Ann Rheum Dis epub doi: 10.1136/ARD207776 2015;
IF: 10.377
Kopetschke K, Klocke J, Grießbach AS, Humrich JY, Biesen R, Dragun D, Burmester
GR, Enghard P, Riemekasten G. The cellular signature of urinary immune cells in
lupus nephritis: new insights into potential biomarkers. Arthritis Res Ther 17:94 2015;
IF: 3.753
2.
3.
Buchbeiträge
keine
Anderes
Günther J, Rademacher J, van Laar JM, Siegert E, Riemekasten G. Functional
autoantibodies in systemic sclerosis. Sem Immunopathol epub doi:10.1007/s00281015-0513-5 2015
Dr. rer. nat. Anja Kerstein „Zur Rolle von High-Mobility Group Box 1 Protein in der
Granulomatose mit Polyangiitis.“, Universität zu Lübeck 2015
103
PD Dr. med. C. Sadik
PD Dr. med. C. Sadik,
Projekttitel a – f
a) Klinischen Forschergruppe 303 – Pemphigoid Diseases Molecular Pathways
and their therapeutic potential (Sadik)
b) Die Rolle lang- und kurzkettiger Fettsäuren in Pemphigoid-Erkrankungen (Anne
Braun)
c) Der PUFA-Rezeptor GPR120 in der Psoriasis und der Rheumatoiden Arthritis
(Melanie Wannick)
d) Leukotriene B4 und sein Rezeptor BLT1 in der Pathogenese der Pemphigoide
e Die Rolle der 15-Lipoxygenase-1 in Pemphigoid-Erkrankungen (Tanya Sezin)
f) Die Rolle der Dipeptidyl-Peptidase IV in Pemphigoid-Erkrankungen (Iosefina
Doxastakis)
1.
Fragestellung:
Unsere Arbeitsgruppe arbeitet insgesamt an der Rolle des angeborenen Immunsystems
und Autoimmunerkrankungen, insbesondere in Pemphigoiden sowie in der Psoriasis.
2.
Methodik:Methoden: Tierexperimente, FACS, Western blots, ELISAs, ROS ReleaseAssays, PCRs, Immunohistologie, -fluoreszenzen und –histochemien
3.
Ergebnisse:
Wir konnten im letzten Jahr herausabeiten, dass der BLT1-Rezeptor auf Neutrophilen in
Pemphgoid-Erkrankungen gebraucht wird, jedoch nicht auf Eosinophilen, die ebenfalls
im Rahmen der Erkrankung in die Haut rekrutiert werden. Wir konnten ebenfalls zeigen,
dass die 15-Lipoxygenase-1 wichtig für die Resolution der Entzündung bei PemphigoidErkankungen ist, während sie in der Psoriasis in der Etablierung der Hautentzündung
eine Rolle spielt und hierbei insbesondere die typische Keratinozyten-Hyperplasie
fördert. Weiteres Ergebnis aus dem letzten Jahr ist, dass eine pharmalogische
Inhibierung der Dipeptidyl-Peptidase IV nicht den Verlauf der Pemphigoid-Erkrankungen
im Mausmodell moduliert.
Zeitraum
Klinischen Forschergruppe 303 – Pemphigoid Diseases Molecular Pathways and
their therapeutic potential 10/2015 – 09/2018
Die Rolle lang- und kurzkettiger Fettsäuren in Pemphigoid-Erkrankungen 09/2015 –
08/2018
Der PUFA-Rezeptor GPR120 in der Psoriasis und der Rheumatoiden Arthritis 01/2015 –
10/2017
Leukotriene B4 und sein Rezeptor BLT1 in der Pathogenese der Pemphigoide
(07/2013 – 09/2018
Die Rolle der 15-Lipoxygenase-1 in Pemphigoid-Erkrankungen 01/2015 – 12/2016
Die Rolle der Dipeptidyl-Peptidase IV in Pemphigoid-Erkrankungen (09/2014 – 08/2015)
Drittmittel
Projektträger
DFG
Förderzeitraum siehe oben
Fördervolumen insgesamt: 1,9 Mio €
104
PD Dr. med. C. Sadik
Sachmittel/Stellen
1,4 Mio. €/500.000€
1.
Sachmittel/Stellen
2.
1,5 Mio €
1. Originalarbeiten
a) erschienen /bzw. im Druck im Jahr 2015b) eingereicht
a)
Automated direct immunofluorescence analyses of skin biopsies. Lemcke S, Sokolowski
S, Rieckhoff N, Buschtez M, Kaffka C, Winter-Keil A, Schaller C, Rottmann N, Sadik CD,
Stöcker W, Zillikens D, Schmidt E. J Cutan Pathol. 2015 Oct 10. doi:
10.1111/cup.12637.
IF = 1,6
Dissecting genetics of cutaneous miRNA in a mouse model of an autoimmune
blisteringdisease. Gupta Y, Möller S, Witte M, Belheouane M, Sezin T, Hirose M,
Vorobyev A, Niesar F, Bischof J, Ludwig RJ, Zillikens D, Sadik CD, Restle T, Häsler R,
Baines JF, Ibrahim SM.
BMC Genomics. 2016 Feb 16;17(1):112. doi: 10.1186/s12864-016-2455-2.
IF = 4
b)
BIOCHIP technology identifies pemphigoid gestationis patients by detection of antiBP180 IgG autoantibodies, but simultaneous detection of anti-BP230 IgG autoantibodies
does not improve diagnosis
IF = 3,8
2. Buchbeiträge
keine
3.
Anderes
105
Prof. Dr. B. Wollenberg
Projekt 1 „Die Expression der Komponenten des Komplementsystems in der
Chronischen Rhinosinusitis mit nasalen Polypen“
Ulrike Werner
1.
Fragestellung:
Die chronische Rhinosinusitis mit nasalen Polypen (CRSwNP) ist überwiegend
charakterisiert durch eine chronische Entzündung der Schleimhaut im Nasen- und
Nasennebenhöhlenbereich. Das Komplementsystem stellt einen zentralen Bereich des
Immunsystems dar. Eine unkontrollierte Aktivierung kann zu Entzündungsreaktionen
und Krankheiten führen. Ob die Komplementkaskade eine Rolle bei den chronischen
Entzündungsprozessen in CRSwNP hat, ist bisher ungeklärt. Das Ziel dieser Arbeit war
es die Bedeutung der verschiedenen Komplementfaktoren in nasalen Polypen und
unterer Nasenmuschel von CRSwNP Patienten und gesunden Patienten zu ermitteln.
2.
Methodik:
Das Gewebe der nasalen Polypen und der korrespondierenden unteren Nasenmuschel
von CRSwNP Patienten und ebenso der unteren Nasenmuschel von gesunden
Patienten wurde chirurgisch entfernt. Zur Beurteilung der Verteilung verschiedener
Komponenten des Komplementsystems wurden molekularbiologische (Microarray,
qPCR), biochemische (Western Blot) und immunhistologische Methoden
(Immunfluoreszenz, LSAB) verwendet.
3.
Ergebnisse:
Die Untersuchungen zeigten Veränderungen in der Expression verschiedener
Komponenten der Komplementkaskade im Gewebe von CRSwNP Patienten verglichen
mit gesunden Patienten. Dabei zeigten vor allem die Schlüsselfaktoren C3, C5 und die
Anaphylatoxinrezeptoren signifikante Hochregulationen in nasalen Polypen.
Diskussion: Die vorliegenden Resultate unterstützen eine mögliche Assoziation des
chronisch-entzündlichen Milieus in der CRSwNP und mit der veränderten Aktivierung
des Komplementsystems. Die detaillierte Charakterisierung des Komplementsystems
bezogen auf CRSwNP kann zukünftig als Grundlage zur Entschlüsselung der
Pathogenese dienen.
Projekt 2 „TLR abhängige miRNA Modulation in HNSCC“
Dr.rer. nat. Regina Maushagen
1.
Fragestellung:
MicroRNAs (miRNAs) sind nichtcodierende RNA und fungieren als negative
Regulatoren bei der Expression von Genen. miRNAs wurden im gesunden wie in
karzinogenen Gewebe gefunden. In vielen Krebsentitäten sind miRNA jedoch
dereguliert und beeinflussen viele unterschiedliche biologische Prozesse. miRNA
werden auch durch Aktivierung von Rezeptoren beeinflusst wie z.B. durch den
TLR3 (Toll-like Rezeptor 3).
2.
Methodik:
Für die Änderung der miRNA Expression wurden verschiedene humane
permanente HNSCC-Zelllinien mit PolyI:C (Polyinosinic:polycytidylic acid)
106
behandelt und die Änderung der miRNA Expression wurde unter PolyI:C auf
mRNA Ebene untersucht.
3.
Ergebnisse:
Der Vergleich der unbehandelten Zellen mit der synthetischen TLR3 Stimulanz
PolyI:C behandelten Zellen zeigte, dass durch die Aktivierung von TLR3 einige
miRNA hoch- wie auch runterreguliert wurden.
Schlussfolgerung:
Die genaue Wirkweise von miRNA und ihre Regulationsmechanismen, sind bisher
unklar. Die Identifizierung der miRNA, welche unter PolyI:C Stimulation in den
humanen permanenten HNSCC-Zelllinien beeinflusst werden ist essentiell, um die
Tumorbiologie wie die dysregulierten Signalkaskaden zu verstehen.
Projekt 3 „Einfluss von TLR3 auf die EMT in HNSCC“
Henrike Hell
1.
Fragestellung:
Das Plattenepithelkarzinom des Kopf-Hals-Bereiches (head and neck squamous cell
carcinoma, HNSCC) ist die sechsthäufigste Tumormanifestation weltweit und zählt zu
den Tumoren mit einer äußerst schlechten Prognose. Da Kopf-Hals-Tumore häufig spät
erkannt werden, befinden sich viele Patienten bei Diagnosestellung im Stadium einer
Metastasierung. Die Epithelial-Mesenchymale Transition (EMT) beeinflusst bei
Dysregulation verschiedene Prozesse wie die Zellmigration (Metastasierung),
Therapieresistenz (Apoptosedysregulation) und Gewebsneubildung. Wir untersuchen
den Einfluss von Toll-Like-Rezeptor 3 (TLR3) auf die regulation der EMT in HNSCC.
2.
Methodik:
Um die Rolle des TLR3 in der EMT festzustellen wurden zwei etablierte Zelllinien aus
HNSCC-Zellen eines Primärtumors einer Tonsille sowie aus der zugehörigen
Lymphknotenmetastase mit einem selektiven TLR3-Stimulans behandelt. Anschließend
wurde mittels qPCR ein Screening von Genen, die in der EMT eine entscheidende Rolle
spielen, vorgenommen. Um die Ergebnisse als Resultat selektiver TLR3-Stimulation zu
verifizieren, wurden die Zellen daraufhin mit einem TLR3-Inhibitor stimuliert und ein
erneutes Screening mittels qPCR durchgeführt.
3.
Ergebnisse:
Die Expressionsanalyse der im Screening getesteten Gene zeigte eine Hochregulation
einiger EMT-assoziierter Gene verschiedener funktioneller Bereiche sowie eine
verminderte Genexpression einiger Gene aus dem Wnt-Signalweg bei Stimulation von
TLR3.
Schlussfolgerung:
Die Expressionsanalyse der im Screening getesteten Gene weist klar auf einen
vielseitigen Zusammenhang zwischen TLR3-Stimulation und EMT hin. Dieser
Zusammenhang kann zukünftig genutzt werden, um die EMT durch selektive Stimulation
oder Inhibierung von TLR3 zu beeinflussen. Beispielweise, um Gene mit
metastasierungsfördernder Wirkung zu inhibieren, sodass auch eine therapeutische
Konsequenz der TLR3-Beeinflussung denkbar wäre.
107
Projekt 4
„Dysregulation der Leukozyten-Adhäsionskaskade bei chronischer
Rhinosinusitis mit nasalen Polypen“
Michael Könnecke
1.
Fragestellung:
Die chronische Rhinosinusitis ist eine heterogene Gruppe entzündlicher Erkrankungen und
verursacht jährlich erhebliche Kosten für das jeweilige Gesundheitssystem. Unterteilt in
CRSsNP und CRSwNP wird die CRS immer noch als multifaktorielle Erkrankung
beschrieben, bei der bislang die Bemühungen fehlschlugen die eine Behandlung zu finden.
Allgemein zeigen nasale Polypen von westlichen Individuen vorwiegend eine Th2Entzündung mit einem hauptsächlich eosinophil-dominierten entzündlichen Infiltrat. Für ein
besseres Verständnis der Mechanismen, die für die Rekrutierung und Aktivierung von
Leukozyten in Polypengewebe verantwortlich sind, wurden in weiterführenden
Untersuchungen die Expressionsprofile von Adhäsionsmolekülen und Chemokinen der
Leukozyten-Adhäsionskaskade analysiert.
2.
Methodik:
Im Verlauf einer Nasennebenhöhlensanierung wurden nasale Polypen und die
dazugehörige untere Nasenmuschel chirurgisch entfernt. Zur Analyse der LeukozytenAdhäsionskaskade, wurden molekularbiologische, biochemische und immunhistologische
Methoden verwendet.
3.
Ergebnisse:
Expressionsanalysen ergaben eine Dysregulation der Leukozyten-Adhäsionskaskade in
nasalen Polypen, wobei es zu einer signifikant erhöhten Expression von P-Selektin und zu
einer signifikanten Verringerung der Expression von E-Selektin, CXCL4 und CXCL5 im
Polypengewebe kam, mit gleichzeitigem Immunungleichgewicht zwischen Th1 und Th2
Zytokinen sowie zwischen Eosinophilen und Neutrophilen.
Schlussfolgerung:
Ein Ungleichgewicht zwischen Th1- und Th2-Reaktion führt zu einer chronisch
entzündlichen Antwort. Unterschiedliche therapeutische Verbesserungen, wie die
Reduktion des Influx von Eosinophilen, erhöhter Neutrophil Influx oder Regulation der
Thrombozyten-Aktivierungs-signalwege, könnten in der Zukunft eine vielversprechende
Strategie darstellen, um das Immungleichgewicht zwischen Th1 und Th2 und somit eine
Balance zwischen Eosinophilen und Neutrophilen wiederherzustellen.
Projekt 5 „Modulation Dendritischer Zellen“
Dr. med. Sabrina Heinrichs
1.
Fragestellung:
Die funktionelle Beeinflussung humaner plasmazytoider dendritischer Zellen durch
HNSCC Patienten mit Plattenepithelkarzinomen des Kopf-Hals Bereiches (HNSCC)
zeigen eine deutliche Verminderung der zellvermittelten Immunantwort. Untersuchungen
hierzu zeigten, dass plasmazytoide dendritische Zellen (pDC) als Teil des angeborenen
Immunsystems zwar HNSCC infiltrieren, jedoch anstelle einer adäquaten gegen den
Tumor gerichteten TH1-Antwort eine TH2-Antwort und somit eine Toleranzentwicklung
unterstützen.
Im Fokus dieses Forschungsprojektes steht daher die Frage, inwiefern die EMT in
malignen Kopf-Hals Tumoren durch die Toll-like Rezeptoren 3, 4, 7 und 9 beeinflusst
und reguliert wird und welche Mediatorproteine in diese Prozesse involviert sind.
2.
Methodik:
PDCs wurden mittels spezifischer magnetisch gekoppelter Antikörper aus peripherem
Blut isoliert und weiterführend untersucht. Mittels Durchflusszytometer und MTT-Assays
108
wurden die zellulären Nekrose- und Apoptose-Charakteristika und Zellvitalität
charakterisiert, mittels Proteome Profiler Human Apoptosis Antibody Array, Zellkultur mit
verschiedenen HNSCC Zelllinien, Immunhistochemie / Fluoreszenzmikroskopie,
Durchflusszytometzrie,
RT-PCR,
Western-Hybridisierung,
Analyse
der
immunmodulatorischen Zytokinsekretion wurde mittels Cytometric Bead Array (CBA) im
FACS Canto, durchgeführt, RNA-Ebene mittels Genome-Wide GeneChips.
3.
Ergebnisse:
Wir konnten zeigen, dass lösliche Faktoren des Tumormilieus die Immunmodulation und
letztendlich die Minderung der IFN-α Sekretion bewirken. Für das Interleukin-10 (IL-10)
konnte diese Eigenschaft nachgewiesen werden. Jedoch zeigte sich, dass es sich nicht
nur um einen einzelnen Faktor handelt. Diese inhibitorische Wirkung ist teilweise durch
einen IL-10 Rezeptorblocker antagonisierbar. Für mindestens einen weiteren Faktor,
dem Interleukin-6, konnte eine IL-10-abhängige synergistische, hemmende Wirkung
nachgewiesen werden. Auch dieser Pathomechanismus korreliert ebenfalls mit der Zeit
und Konzentration und ist durch die unterschiedlichen Charakterisika verschiedener
Zelllinien und Tumoren unterschiedlich ausgeprägt.
Projekt 6 „Charakterisierung von GSK3 in HNSCC“
Lisa Schulz
1.
Fragestellung:
Die Proteinkinase GSK-3 ist in letzter Zeit häufig als mögliches Target zur Therapie von
diversen Tumorentitäten diskutiert worden. Sie ist Bestandteil verschiedenster
Signalwege und an der Regulierung von Zellfunktionen wie Apoptose, Zellmigration und
Interleukinbildung beteiligt. Zu den zahlreichen Substraten der GSK-3 gehören neben
Strukturproteinen u.a. auch die Transkriptionsfaktoren Snail und NF-κB. Es gibt
Hinweise, dass eine veränderte Aktivität der GSK-3 (v.a. durch Phosphorylierung an
Aminosäureresten) das Entstehen von Krebs begünstigen kann. Dabei ist es von der
Tumorart abhängig, ob die vermehrte oder verminderte Aktivität der Kinase zur
Krebsentstehung führt. Welche Rolle die GSK-3 in HNSCC spielt und welchen Einfluss
eine Inhibition der GSK-3 auf HNSCC-Zellen hat, soll in diesem Forschungsprojekt
geklärt werden.
2.
Methodik:
Expression, subzelluläre Lokalisation und Aktivität der GSK-3α/ß wurden vor und nach
der Behandlung mit verschiedenen Konzentrationen des spezifischen GSK-3α/ß
Inhibitors SB216763 in HNSCC-Zelllinien mittels Western Blot und Immunhistologie
untersucht. Die gleichen Methoden wurden für die Expressionanalyse von
Primärmaterialien verwendet. Die Messung der Zellmigration unter Inhibitor-Einfluss
erfolgte durch RTC-Assays. Änderungen der Interleukin-Sekretion durch Inhibition der
GSK-3 wurden mit Hilfe von BD™ CBA Flex Sets untersucht.
3.
Ergebnisse:
Unsere Untersuchungen zeigen eine individuelle Expression der GSK-3α/ß in Zelllinien
und Primärmaterialien. Aktive GSK-3α/ß (phospho Y216/279) und inaktive GSK-3α/ß
(phospho S21/9) liegen stets parallel vor. LSAB-Färbungen von Primärmaterial zeigen
eine deutliche Überexpression der inaktiven GSK-3α/ß. Nach der Inhibitor-Behandlung
kommt es vor allem zu einer zeit- und konzentrationsabhängigen Reduktion der aktiven
GSK-3. Es konnte weiterhin gezeigt werden, dass die Zellmigration unter
Inhibitoreinfluss vermindert ist. Dieser Effekt ist konzentrationsabhängig. Die Bildung der
Interleukine IL-1ß und IL-6 sowie VEGF und TNF wurde unter Inhibitoreinfluss
konzentrationsabhängig induziert.
109
Projekt 7 „WNT-Regulation in HPV+ HNSCC”
Henrike Zech
1.
Fragestellung:
Humane Papillomaviren (HPV) werden zunehmend als Risikofaktor für die Entstehung
von Kopf-Hals-Tumoren wahrgenommen. Betroffene Patienten mit positivem HPVStatus zeigen veränderte klinische Parameter gegenüber Patienten ohne
vorrausgegangener HPV-Infektion. Die derzeitige Forschung weist auf ein verändertes
Mikromilieu HPV-positiver Tumoren hin und stellt die Modulation klassischer
Therapieschemata für HPV-positive Kopf-Hals-Tumore zur Diskussion. In diesem
Projekt wird die Wirkung von Cetuximab auf das Mikromillieu von HPV-positiven und
negativen Plattenepithelkarzinomen des Kopf-Hals-Bereichs (HNSCC) untersucht.
2.
Methodik:
Durchflusszytometer, MTT-Assays Proteome Profiler Human Apoptosis Antibody Array,
Zellkultur
mit
verschiedenen
HNSCC
Zelllinien,
Immunhistochemie
/
Fluoreszenzmikroskopie,
RT-PCR,
Western-Hybridisierung,
Analyse
der
immunmodulatorischen Zytokinsekretion wurde mittels Cytometric Bead Array (CBA) im
FACS Canto,
3.
Ergebnisse:
Im Fokus dieses neuen Projektes stehen dabei (Trans-)aktivierungsprozesse der EGFRund Wnt-Signaltransduktionswege.
Projekt 8 “Cineol als EMT Inhibitor“
Dr. med. Karl Ludwig Bruchhage
1.
Fragestellung:
Im kanonischen, β-Catenin-abhängigen Signalweg führt die Abwesenheit des WntSignals zu einer Degradation des β-Catenin-Proteins im Cytoplasma. In Anwesenheit
des Wnt- Signals wird β-Catenin in den Kern transloziert, wo es mit Hilfe von Tcf/LefTranskriptionsfaktoren die Transkription der Wnt-Zielgene (z.B. Cyclin D1, MT1-MMP,
Dkk-1, Fzd7) induziert und proliferationsinduzierend wirkt.
2.
Methodik:
Mittels Durchflusszytometer und MTT-Assays wurden die zellulären Nekrose- und
Apoptose-Charakteristika und Zellvitalität charakterisiert, Immunhistochemie /
Fluoreszenzmikroskopie, Durchflusszytometzrie, RT-PCR, Western-Hybridisierung.
3.
Ergebnisse:
Unsere Untersuchungen zeigen eine massiv erhöhte Phosphorylierung und somit
Inhibierung des ß-Catenin Abbau-Proteins GSK3 in Polyposis nasi im Vergleich zu
gesunder Nasenschleimhaut des gleichen Patienten und auch im Vergleich zur
Nasenschleimhaut Polyposis-freier Patienten. Somit liegt eine konstitutive proliferationsinduzierende ß-Catenin Aktivität in Polyposis nasi vor. Überraschenderweise führt die
Verabreichung von Cineol bei Polyposis nasi zu einer massiven Verminderung der ßCatenin Aktivität und somit zu einer verminderten Proliferation.
Die momentan laufenden Versuche fokussieren auf die Aktivitätsprofile weitere
Komponenten des WNT-Signaltransduktionsweges um die genaue wirkweise von
Cineol zu verstehen, sowie auf die Zeit- und Konzentrationsfenster des Einflusses von
Cineol auf diese Proliferations-induzierende Signalkaskade.
110
Projekt 9 “Visualisierung von Tumoren mittels MPI“
Dr. rer. nat. Ralph Pries
1.
Fragestellung:
Dieses Forschungsprojekt ist Teil des Forschungsschwerpunktes ‚Bildgebung bei
Krankheitsprozessen’ unter dem Titel „Peptidvermittelte intra- oder extrazelluläre
Akkumulation magnetischer Nanopartikel zur Visualisierung von Tumoren und
tumorassoziierter Stammzellmigration mit Hilfe des Magnetic-Particle-Imaging (MPI)“.
2.
Methodik:
Verschiedene HNSCC Zelllinien wurden für die Experimente verwendet. Dabei wurden
jeweils der Primärtumor sowie die dazugehörige Metastase kultiviert. Die Zytotoxizität
der Nanopartikel auf das Überleben der Zellen wurde mikroskopisch sowie
durchflusszytometrisch durch Färbung mit Propidiumiodid sowie Annexin studiert. Die
Aufnahme der Nanopartikel durch die Zellen wurde mikroskopisch durch FITC- Dextran
Nanopartikel untersucht. Die Messung der Nanopartikel erfolgte im Magnetic Particle –
Spektrometer.
3.
Ergebnisse:
Die speziell als MPI Tracer entwickelten superparamagnetischen Eisenoxidnanopartikel
UL-D werden in vitro unspezifisch von Kopf-Hals Tumorzellen ins Zytoplasma
aufgenommen und zeigen eine sehr gute Biokompatibilität. Die UL-D Nanopartikel
weisen keine Zytotoxität und keine Einflüsse auf das Zellwachstum oder die
Zellmigration auf. Die Bildung von reaktiven Sauerstoffspezies und die Ausschüttung
von Zytokinen werden, im Gegensatz zum etablierten Kontrastmittel Resovist, nicht
beeinflusst. Eine Testung von UL-D für in vivo Versuche kann befürwortet werden.
Drittmittel
Projektträger
seit 2009
Cassella med GmbH
Thema:
„Klinische
und
Molekularbiologische
Studie
therapeutischen Einsatz von CINEOL bei Polyposis nasi“
2009/2010
2011/2012
2013/2014
2015/2016
zum
Mittel: 138 000.- Euro
Bereits eingeworben für 2016/2017
„Einfluss von Cineol auf die Progression und die WNT Signalkaskade
in Polyposis nasi“
„Einfluss von Cineol auf die WNT-Aktivität, Progression und
Metastasierung maligner Kopf-Hals Tumore“
Publikationen aus den laufenden KEF-Projekten mit IF
1. Originalarbeiten
a) erschienen /bzw. im Druck
Chemotherapy with paclitaxel leads to microRNA release.
Maushagen R, Pries R, Wollenberg B.
HNO. 2015 Oct 13. [Epub ahead of print] PMID: 26464363 IF: 1,58
111
Increased phosphorylation of STAT5b, but not STAT5a, in nasal polyps.
Linke R, Pries R, Könnecke M, Bruchhage KL, Böscke R, Gebhard M, Wollenberg B.
Am J Rhinol Allergy. 2015 May-Jun;29(3):182-7. doi: 10.2500/ajra.2015.29.4170.IF: 2,18
NOD-Like Receptor Signaling in Cholesteatoma.
Leichtle A, Klenke C, Ebmeyer J, Daerr M, Bruchhage KL, Hoffmann AS, Ryan AF,
Wollenberg B, Sudhoff H.
Biomed Res Int. 2015;2015:408169. doi: 10.1155/2015/408169.
IF: 1,58
Nuclear expression of p65 (RelA) in patients receiving post-operative radiotherapy for
locally advanced squamous cell carcinoma of the head and neck.
Rades D, Huttenlocher S, Seibold ND, Gebhard MP, Thorns C, Hasselbacher K,
Wollenberg B, Schild SE. BMC Cancer. 2015 Mar 6;15:102. doi: 10.1186/s12885-0151107-2. IF: 3,36
Lindemann, A., Priesm R,m Lüdtke-Buzug, K., and Wollenberg B (2015) Biological
properties of Superparamagnetic Iron Oxide Nanoparticles
IEEE Transactions on Magnetics, accepted for publication. IF: 1,36
b) eingereicht
Heinrichs, S., Pries, R., and B. Wollenberg (2015) IL-10 in the Microenvironment of
HNSCC Inhibits the CpG ODN Induced IFN-α Secretion of pDCs – a Functional Analysis.
Submitted for publication.
Maushagen, R. Pries, R., Reers, S., Stauber, R., and B. Wollenberg (2015)
Identification of anti-apoptotic caspase 9b in Head and Neck Sqaumous cell Carcinoma.
Schulz, L., Sree Lanka A., Pries, R., and Wollenberg, B. (2015) The finely tuned
balance between inactive and active GSK-3 ensures the progression of HNSCC.
Dysregulation of Wnt-Signalling is a potential driver of inflammation in Chronic
Rhinosinusitis with nasal Polyps (2015) Robert Böscke1, Michael Koennecke1, KarlLudwig Bruchhage, Robert Linke1, Ralph Pries1, and Barbara Wollenberg1 . Submitted
for publication.
Cineol acts as an inhibitor of ß-catenin activity within the WNT signalling cascade
in Polyposis nasi (2015) Karl-Ludwig Bruchhage, Robert Linke1, Ralph Pries1, Michael
Koennecke1, Robert Böscke1, and Barbara Wollenberg1 . Submitted for publication.
Epithelial-to-mesenchymal transition in nasal epithelial cells from nasal polyps and
inferior turbinates (2015) Michael Könnecke MSc1, Maike Burmeister MSc1, Ralph Pries
PhD1, Robert Böscke MD1, Karl-Ludwig Bruchhage1, Ludger Klimek MD2 and Barbara
Wollenberg PhD MD1 Submitted for publication.
Alterations of EMT characteristics in HPV associated head and neck cancer cell
lines (2015)
Anna Oberle, Anna Hoffmann, Ralph Pries, and Barbara Wollenberg. Submitted for
publication.
2. Buchbeiträge
3.
Anderes
Patentanmeldungen aus laufenden KEF-Projekten:
112
Aktenzeichen: 15.6176.6 ro
Neue deutsche Patentanmeldung mit der Bezeichnung "Monoterpenhaltige Zusammensetzung zur Behandlung von Erkrankungen der Nase" im Namen der Maria Clementine
Martin Klosterfrau Vertriebsgesellschaft mbH, Kennwort: "Cineol gegen Nasenpolypen
(Polyposis nasi)"
Aktenzeichen: 15.6178.6 ro
Neue deutsche Patentanmeldung mit der Bezeichnung "Monoterpenhaltige
Zusammensetzung zur Behandlung von Tumor- und/oder Krebserkrankungen" im
Namen der Maria Clementine Martin Klosterfrau Vertriebsgesellschaft mbH, Kennwort:
"Cineol als Antitumormittel"
Einwerbung von DFG-Drittmitteln in Höhe von 25.000,- EUR zur Durchführung eines
internationalen onkologischen Symposiums in Lübeck.
Promotionen
Medizinische Doktoranden 2014
2015
in Arbeit
2015
in Arbeit
2015
in Arbeit
2015
in Arbeit
2015
in Arbeit
Regulation des Komplementsystems in HNSCC
2015
in Arbeit
Induktion von Apoptose und Autophagy durch
TLR3 in HNSCC
Zelladhäsion und EMT in Polyposis nasi
2015
magna
cum laude
2015
eingereicht
Monir
Charakterisierung des Komplementfaktors H in
Jalilpour
HNSCC
Ulrike
Charakterisierung von Komplementfaktoren in
Werner
Polyposis nasi
Bachelorarbeiten 2015
2015
magna
cum laude
magna
cum laude
Franzika
Wendt
Anna Clara
2015
in Arbeit
2015
summa
Lisa Schulz
Regulation der GSK3 Kinase in HNSCC
Aktivierung des WNT-Signalweges in HPV
Henrike
assoziierten
HNSCC
Zech
Phosphokinasen Aktivierung in Polyposis nasi
Frederick
Benecke
Toll-like Rezeptor vermittelte EMT-Induktion in
Henrieke
HNSCC
Hell
Einfluss von Cineol auf den WNT-Signalweg in
Anna
HNSCC
Röttger
Naturwissenschaftliche Doktoranden 2014
Ulrike
Werner
Aruna Sree
Lanka
Michael
Könnecke
Masterarbeiten 2015
Franke
Komplementregulationsfaktoren ins Kopf-Hals
Karzinomen
Charakterisierung von hsa-miR222 und
hsa-miR221*in Kopf-Hals-Karzinomen
2015
cum laude
113

Statusbericht 2015 - Klinisch-Experimentelle Forschungseinrichtung

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