Bevorzugte Spaltung der Valin-, Leucin

UNTERSUCHUNGEN ZUR AMINOSÄURESEQUENZ DES MELITTINS II
tuenten am a-C-Atom des Pyryliumringes die L a­
dungsverhältnisse in diesem R ing derart verändern
können, daß die Pyryliumsalze von einer Carbonium- in eine Oxonium-Struktur übergehen. Auch
der Charakter der annulierten aromatischen Systeme
hat einen erheblichen Einfluß auf die Struktur des
Pyryliumringes, dessen Verspannung beim Über­
gang von einer benzoiden zu einer naphthoiden Annellierung abnimmt. Hierbei haben die Naphtho[1.2-b] pyryliumsalze (aN) im allgemeinen einen
benzoideren Charakter als die Naphtho[2.1-b] pyry-
415
liumsalz (/5N). Substituenten am benzoiden Ring in
p-Stellung zum O-Atom des Pyryliumringes beein­
flussen in starkem Maße die Ladungsdichteverteilung und Polarität im Pyryliumring und sind da­
durch von entscheidender Bedeutung für die Stabili­
tät von Benzo-Pyryliumsalzen.
Abschließend möchte ich dem Bundesministerium für
wissenschaftliche Forschung für die Förderung der
Untersuchungen und den Herren Dr. C. S c h i e l e , D.
S t a u d a c h e r und M. S t e p e c für die Darstellung der
Pyryliumperchlorate danken.
Weitere Untersuchungen zur Aminosäuresequenz des Melittins, I I 1
Bevorzugte Spaltung der Valin-, Leucin- und Isoleucinbindungen
durch a-Protease aus Crotalus atrox-G\h
J o a c h im J e n t s c h *
Institut für Pharmakologie und Toxikologie der Universität Würzburg
(Direktor: Prof. Dr. Dr. W. N e u m a n n t )
(Z. Naturforschg. 24 b, 415— 418 [1969] ; eingegangen am 7. Oktober 1968)
Degradation of melittin with a-Protease from Crotalus atrox venom (rattlesnake) confirmed the
amino acid sequence of the toxic main peptide from bee venom. Hydrolysis occured mainly at the
peptide bonds whose amino groups were provided by hydrophobic side chains such as valine, leucine
and isoleucine bonds. However, on the contrary one glutamine bond was cleaved. Neverthelness,
regarding the relatively high specificity, rattlesnake venom protease may be a valuable reagent for
further sequence studies.
Nach wie vor herrscht Mangel an spezifisch spal­
tenden Proteasen. Deshalb wäre es ein großer Ge­
winn, neben Trypsin ein weiteres Enzym mit großer
Wirkungsspezifität zu besitzen. Es ist bekannt, daß
a-Protease 2 aus Crotalus atrox-Gih (Texas-Klapper­
schlange) vorwiegend Peptidbindungen von A m ino­
säuren mit hydrophober Seitenkette spaltet. Die Zahl
der Peptidsubstrate für die a-Protease ist aber noch
zu gering, um endgültige Aussagen über die Sub­
stratspezifität des Enzym machen zu können. Da Me­
littin 3 auf Grund seiner zahlreichen hydrophoben
Aminosäurereste für die a-Protease ein geeignetes
Substrat sein sollte, schienen entsprechende Spal­
tungsversuche aussichtsreich. Außerdem sind bei der
Spaltung des Melittins durch a-Protease neue Bruch­
stücke zu erwarten, welche zur Bestätigung der Se­
quenz dienen können.
Die vorliegende Arbeit befaßt sich daher mit dem
enzymatischen Abbau des Melittins durch die a-Pro­
tease aus Crotalus atrox-Gih sowie die Identifizie­
rung der Bruchstücke.
Herrn Dr. K.-A. F o r s t e r (Fa. Mack, Illertissen)
danke ich sehr für das Bienengiftpräparat, Herrn
Doz. Dr. F a s o l d verdanke ich die quantitativen
Aminosäurenanalysen sowie anregende Diskussio­
nen.
1 I. Mitt.: J . J e n t s c h , Z. Naturforsdig. 23b, 1613 [1968].
* Jetzige Postanschrift: Dr. J. J e n t s c h , Physiologisch-Che­
misches Institut der Universität Tübingen, 74 Tübingen,
Hoppe-Seyler-Straße 1.
Verwendete Abkürzungen: a-Protease = a-Protease aus Crota­
lus atrox-Q'iil (Texas-Klapperschlange) ; A = Spaltprodukte
der a-Protease-Hydrolyse des Melittins.
2 G. P f l e id e r e r u. G. S u m y k , Biochim. biophysica Acta [Am­
sterdam] 51,482 [1961].
3 J . J e n t s c h u . E. H a b e r m a n n , Proc. of the 8. European
Peptide Symposium, Noordwijk, Sept. 1966, North-Ilolland
Publishing Company, Amsterdam 1967, S. 263.
Dieses Werk wurde im Jahr 2013 vom Verlag Zeitschrift für Naturforschung
in Zusammenarbeit mit der Max-Planck-Gesellschaft zur Förderung der
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J. JENTSCH
416
Experimenteller Teil
1. G e w i n n u n g d e r a - P r o t e a s e
aus S c h l a n g e n g i f t
274 mg Crotalus a^rox-Rohgift * werden an einer
2 •25 cm-Säule aus DEAE-Sephadex A-50 (3,5 mÄqu.
pro g) durch Gradientenelution in Fraktion 1, 2
und 3 getrennt (Abb. 1). Das Gift wird in 0,005 M
Tris-Citratpuffer, pH 7,2, unter Zusatz von 0,01 M
Ca2G gelöst und chromatographiert. Dann schließt
sich ein Gradient mit 4 M NaCl an. Die Fraktionen
werden auf proteolytische Aktivität nach der Me­
thode von K u n i t z 4 geprüft5. Die enzymatische Spal­
tung des Melittins wird mit der salzhaltigen a-Protease (Fraktion 1) durchgeführt.
Abb. 2. Säulenchromatographie der nach Inkubation des Me­
littins mit a-Protease erhaltenen Spaltprodukte an phosphorylierter Cellulose. — Säule: 1-19 cm. Das Peptidgemisch wird
in 0,05 M Pyridinacetat-Puffer, pH 3,9, gelöst. 1. Gradient
mit 0,25 M Pyridinacetat, pH 4,0; 2. 0,1 M Ammoniumbicarbonat, pH 8,9 (kein Gradient). Linke Ordinate Extinktion
nach der Ninhydrinreaktion, rechte Ordinate Leitfähigkeit der
Elutionslösung.
Abb. 1. Isolierung von a-Protease aus Crotalus atrox-Gift durch
Ionenaustausch-Chromatographie an DEAE-Sephadex. Säule:
2-25 cm. Das Rohgift wird in 0.005 m Tris-Citrat-Puffer, pH
7,2, unter Zusatz von 0,01 M Ca2® gelöst. Gradient mit 4 M
NaCl. ------- , Absorption bei 280 m / t ; ------- , proteo­
lytische Aktivität der Eluate, gemessen bei 280 m/i gegen
einen Blindwert ohne Enzymzusatz. — Die a-Protease ist in
Gipfel 1 lokalisiert.
2. R e i n i g u n g d e r S p a l t p r o d u k t e n a c h
Hydr ol ys e mit a-Protease
a) Spaltung des Melittins mit a-Protease
31.0 mg a-Protease (salzhaltig) werden als 0,5proz. Lösung in 0,05 M Ammoniumbicarbonat-Puffer
vom pH 9,3 unter Zusatz von 0,01 M CaCL mit 29,0
mg Melittin und einigen Tropfen Toluol 5 Stdn. bei
37 C umgesetzt. Danach wird 5 Min. erhitzt, mit
Essigsäure auf pH 5,0 gebracht und an phosphorylierter Cellulose chromatographiert.
* Das Präparat wurde mir freundlicherweise von Herrn Prof.
G. P f l e i d e r e r vom Institut für Biochemie an der Universi­
tät Frankfurt zur Verfügung gestellt.
b) Ionenaustausch-Chromatographie
und Gelfiltration der Spaltprodukte
Die durch Gradientenelution an phosphorylierter
Cellulose (Abb. 2) erhaltenen ersten 3 Gipfel wer­
den vereinigt, lyophilisiert und papierchromatogra­
phisch weiter gereinigt (Abb. 3). Die am schnellsten
wandernde Fraktion ist chromatographisch nicht ein­
heitlich (s. Fingerprint Abb. 5). Durch Gelfiltration
an Sephadex G-15 in 0,025 M Ammoniumbicarbo­
nat-Puffer, pH 5,7, wird sie in die Peptide A-l/1
und A-l/2 aufgetrennt (Abb. 4).
Die quantitative Aminosäurenanalyse ergibt die
Zusammensetzung der Spaltpeptide (Tab. 1).
Ergebnisse
Melittin wird mit a-Protease gespalten, die aus
Crotalus a/ro.r-Gift durch lonenaustausch-Chromato4 M.
K u n it z ,
J. gen. Physiol. 30, 291 [1946].
UNTERSUCHUNGEN ZUR AMINOSÄURESEQUENZ DES MELITTINS II
Ref.
2
S ta rt +
A m in o ­
säure
0.4 ^Arg
0.8
12
_
©
Arg
417
Olt' A 2/2
($A 2/1
Abb. 3. Chromatographische und elektrophoretische Trennung
der säulenchromatographisch gewonnenen Spaltpeptide des
Melittins nach Inkubation mit a-Protease. Chromatographie
in n-Butanol/Eisessig/Wasser 4 : 1 : 5 (V/V) absteigend. Elek­
trophorese in Pyridin/Acetat/Wasser (40 : 6 : 1000) pH 5,9;
3200 Volt, 60 V/cm, 40 Minuten. Anfärbung mit Ninhydrin.
Sprühreaktion auf Tryptophan; waagerecht schraffiert = pos.
Sprühreaktion auf Arginin; senkrecht schraffiert = pos. A-l
bis A-2: Reihenfolge der Elution der Spaltpeptide aus der
Cellulose-Ionenaustauschersäule. Die Wanderungsgeschwin­
digkeit der Peptide wird auf Leucin bzw. Arginin = 1,0 be­
zogen. Als Referenzaminosäuren dienen Leucin und Arginin.
Abszisse: Ref. = Referenzsubstanz.
Lys
Arg
Thr
Ser
Pro
G ly
Ala
Val
Ileu
Leu
Try
A-l/1
—
—
1,71
—
1,02
1,14
0,81
0,96
—
2.14
—
A-l/2b
—
—
—
0,93
—
—
(0,18)
—
0,98
0,99
+ a
A-1/3C A-l/4d
(0,87)
—
1,54
0.90
1,18
(1.79)
1,18
(1.95)
1,10
2,88
+ a
(0.14)
A-l/5
A-2/1
0.99
1.98
2.10
—
—
—
—
—
—
—
—
—
—
—
—
—
—
—
1.97
0,98
(0,22)
0.96
(0,22)
—
1,00
—
1,00
—
—
0,85
—
—
Tab. 1. Aminosäurenanalysen der Melittinspaltprodukte nach
Inkubation mit a-Protease. a) Nachweis durch Farbreaktion,
b) Enthält geringe Menge Ala (Wert in Klammer), c) Über­
lappendes Peptid für A-l/1 und A-l/2; es tritt nur in gerin­
ger Menge auf und ist sehr schlecht zu reinigen. Es enthält zu­
sätzlich je 1 Gly-, Val- und Lys-Rest (Werte in Klammern),
d) Enthält geringe Menge Val, Leu und Lys (Werte in Klam ­
mern). Wahrscheinlich ist A-l/4 mit geringen Mengen des Tripeptids Val-Leu-Lys verunreinigt.
ist, zeigt die obere Hälfte die normale blaue Fär­
bung. Demnach besteht auch die entsprechende pa­
pierchromatographisch gewonnene Fraktion aus zwei
Komponenten. Sie werden nach Elution aus dem Pa­
pier an einer Säule aus Sephadex G-15 in Ammoniumbicarbonat-Puffer getrennt (Abb. 4).
Abb. 4. Säulenchromatographie der papierchromatographisch
am schnellsten wandernden Fraktion (A 1/1 + A 1/2) an Sephadex G-15. Säule: 1-44 cm. Elution mit 0,025 M Ammoniumbicarbonat-Puffer, pH 5,7.
graphie an DEAE-Sephadex in Tris-Citrat-Puffer3
erhalten wurde (Abb. 1). Das Hydrolysat des Me­
littins wird durch Gradientenelution an phosphorylierter Cellulose in 4 Fraktionen aufgetrennt (Abb.
2). Da die ersten 3 Gipfel nur unvollständig ge­
trennt sind, werden sie zu einer Fraktion zusammen­
gefaßt und chromatographisch gereinigt (Abb. 3).
Gipfel A-2 wird durch Papierelektrophorese in rei­
ner Form erhalten.
Die im Fingerprint (Abb. 5) in n-Butanol-Eisessig-Wasser am schnellsten wandernde Fraktion
wird durch Ninhydrin nicht einheitlich gefärbt.
Während die untere Hälfte grüngelb (später violett)
5 G.
P f l e id e r e r u .
A.
K rauss,
Biochem. Z.
3 4 2 , 85 [1 96 5].
Abb. 5. Fingerprint der Spaltpeptide des Melittins nach In ­
kubation mit a-Protease aus Crotalus atrox-Gih.
Methodik s. Abb. 3.
Gipfel A-l/2 ist Tryptophan-positiv und besteht
aus Leucin, Isoleucin, Serin und Tryptophan. Aus
der quantitativen Aminosäurenanalyse des reinen
Peptids A-l/1 (Tab. 1) sowie der Zusammenstel­
lung der Melittin-Spaltprodukte (Tab. 2) geht außer­
dem hervor, daß A-l/1 die Pos. 8 —15 der Melittinsequenz darstellt. Die verzögerte Elution des Tetra­
peptids Leu-Ileu-Ser-Try ist demnach ein weiteres
Beispiel für die Adsorption von Peptiden mit aro­
matischen Aminosäurenresten an Dextrangel.
418
UNTERSUCHUNGEN ZUR AMINOSÄURESEQUENZ DES MELITTINS II
NH, NH,
I
I
H-Gly-Ileu-Gly-Ala-Val-Leu-Lys-Val-Leu-Thr-Thr-Gly-Leu-Pro -Ala-Leu-Ileu-Ser-Try-Ileu-Lys-Arg-Lys-Arg-Glu-Glu-NH2
1
2
3 4
5 6
7
8 9
10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26
A-l/4 H-Gly-Ileu-Gly-Ala[Val-Leu-Lys]
A-l/5
Yal-Leu-Lys
A-l/1
Val-Leu-Thr-Thr-Gly-Leu-Pro -Ala
A-l/2
[Ala]Leu-Ileu-Ser-Try
A-2/1
Ileu-Lys-Arg-Lys-Arg
Tab. 2. Spaltprodukte des Melittins nach Inkubation mit a-Protease aus Crotalus atrox-Gih.
Die Komponente A-X (Abbn. 5 und 3) stimmt
in der elektrophoretischen und papierchromatogra­
phischen Wanderungsgeschwindigkeit mit dem tryptischen Peptid T-2/3 (Pos. 25 —26) 3 überein, d.h.
a-Protease spaltet Melittin auch an der Aminogruppe
eines Glutaminrestes. Da das Spaltstück nur in ge­
ringer Menge aus der Säule kommt, lohnt sich die
Elution aus dem Papier nicht.
Diskussion
Zur Bestätigung der aus den tryptischen und pep­
tischen Hydrolyseprodukten erhaltenen Melittinsequenz3 sollte die Spaltung mit a-Protease aus
Crotalus atrox-Gih (Texas-Klapperschlange) vorteil­
haft sein, denn sie spaltet bevorzugt Peptidbindun­
gen, deren Aminogruppe hydrophoben Aminosäu­
renresten angehört.
Die proteolytischen Enzyme aus Schlangengiften
sind schon seit etwa 30 Jahren bekannt0, aber erst
1961 gelang P fle id e r e r und Sumyk 2 die Anrei­
cherung der a-, ß- und /-Protease aus Crotalus atroxGih, und 1963 berichteten S a ta k e , M u r a t a und
S u zu k i ' über die Eigenschaften von drei chromato­
graphisch getrennten Schlangengiftproteasen.
Untersuchungen zur Wirkungsspezifität der drei
proteolytischen Fraktionen an definierten Peptid­
substraten liegen heute über Insulin, Glucagon,
ein synthetisches Oligopeptid 5 und Spaltpeptide der
Lactatdehydrogenase8 vor. Dabei wurde gefunden,
daß bezvorzugte Hydrolyse an Leucin-, Phenylala­
nin-, Isoleucin- und Valinbindungen erfolgt. Diese
Beispiele reichen aber nicht aus, um endgültige Aus­
sagen über die Substratspezifität dieser Enzyme ma­
chen zu können. Dazu ist die Zahl der bisher über­
prüften Peptidsubstrate zu klein. Da Melittin meh­
6
H.
J. exp. Medicine 65, 613 [1937] ; H. F. D e u t s c h
J. biol. Chemistry 216,17 [1955].
S a t a k e , Y. M u r a t a u. T. S u z u k i , J. Biochemistry S3,
E agle,
u. C. R.
7
M.
D in iz .
438 [1963].
rere Aminosäurereste mit hydrophober Seitenkette
enthält, sollte es ein geeignetes Untersuchungsobjekt
für die Wirkungsspezifität der Proteasefraktionen
sein.
Die a-Protease aus Klapperschlangengift spaltet
Melittin an der Aminogruppe von Valin-, Leucinund Isoleucinbindungen sowie an der Glutamin­
bindung in Pos. 25. Daneben wird in geringere
Menge ein Alaninspaltprodukt freigesetzt. Während
alle Valinbindungen des Melittins gespalten wer­
den, bleiben überraschenderweise 3 Leucin- und 2
Isoleucinbindungen intakt. Der Grund könnte viel­
leicht darin liegen, daß a-Protease die größte A ffini­
tät zu Valinbindungen in Phenylalanin-freien Poly­
peptiden, wie Melittin, besitzt. Befinden sich die
Leucin- und Isoleucinreste in den Spaltprodukten
in unmittelbarer Nachbarschaft zur N-terminalen
Aminosäure, so werden die Peptide an diesen Stel­
len durch die a-Protease nicht mehr weiter gespal­
ten. Neben dem Enzym-Substratverhältnis ist wahr­
scheinlich auch die Größe der Peptidsubstrate nicht
ohne Einfluß auf die proteolytische A ktiv ität8.
ln Tab. 2 sind die Ergebnisse der Spaltung des
Melittins durch a-Protease zusammengestellt. Sie be­
stätigen, daß die Schlangengift-Protease Peptidbin­
dungen vorwiegend an Aminosäureresten mit hy­
drophoben Seitenketten spaltet. a-Protease hat somit
eine andersartige Spaltungsspezifität als Trypsin. In
diesem Zusammenhang ist auf die Ergebnisse der
peptischen Spaltung 3 des Melittins hinzuweisen, das
von den vier Leucinbindungen drei spaltet. Ein prin­
zipieller Unterschied zur a-Protease besteht darin,
daß Pepsin die Melittinkette nicht an der Amino-,
sondern an der Carboxvlgruppe der hydrophoben
Aminosäurereste hydrolysiert.
8 K. M e l l a , M . V o l z u . G. P f l e i d e r e r , Analyt. Biochem.
[New York] 21,219 [1967].