Gebrauchsanleitung Mentype AMLplex

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Mentype® AMLplexQS
Handbuch
Die Multiparameter PCR-Analytik zur
Identifikation chromosomaler Aberrationen
der Akuten Myeloischen Leukämie
In-vitro-diagnostisches Medizinprodukt
25
100
400
Version Januar 2013
45-31220-0025
45-31220-0100
45-31220-0400
Chargenbezeichnung
Biotype Diagnostic GmbH
Moritzburger Weg 67
D-01109 Dresden
Deutschland
Made in Germany
2
Biotype Diagnostic GmbH entwickelt, produziert und vertreibt PCR-basierte
Anwendungen für die medizinische Diagnostik.
Unsere Mentype® Test Kits garantieren höchste Qualitätsstandards
für Klinik und Forschung.
Für Informationen und Anregungen stehen wir Ihnen gerne zur
Verfügung. Kontaktieren Sie uns oder besuchen Sie unsere
Homepage www.biotype.de.
Mentype® AMLplexQS
Januar 2013
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Mentype® AMLplexQS
Produktbeschreibung
Der Nachweis spezifischer chromosomaler Aberrationen ist von großer prognostischer
Bedeutung und daher unerlässlich für die Diagnostik akuter Leukämien. Die
Identifikation der spezifischen genetischen Translokationen erlaubt die Klassifizierung
der Subtypen der Leukämie und unterstützt somit die risikoadaptierte Therapie der
Patienten.
Das Mentype® AMLplexQS Kit erlaubt die robuste, in der Routinediagnositik leicht
durchzuführende, Identifizierung therapierelevanter chromosomaler Aberrationen, die
der Akuten Myeloischen Leukämie (AML) zu Grunde liegen.
Der Mentype® AMLplexQS identifiziert in einem Multiparameteransatz
34 Transkriptvarianten der im Folgenden aufgeführten Fusionsgene:
AML1-ETO, BCR-ABL, CALM-AF10, CBFB-MYH11, DEK-CAN, MLL-AF6, MLL-AF9,
MLL-ELL, MLL-PTD, NPM1-MLF1 und PML-RARA (vlg. auch Tabelle1).
Die Ergebnisse des Mentype® AMLplexQS sind durch zwei interne Kontrollen gesichert.
Die interne PCR-Kontrolle (Quality Sensor “QS-Control”) zeigt den Erfolg der
Amplifikationsreaktion an; eine “cDNA Kontrolle” (ABL-Control) ist dem Kit beigefügt,
um die Qualität der eingesetzen cDNA abzubilden.
Bei diesem Test handelt es sich um eine Fragmentlängenanalyse mittels Kapillargelelektrophorese. Die Primer sind mit den Fluoreszenzfarbstoffen 6-FAM, BTG oder
BTY markiert. Das Kit wurde auf folgenden Geräten validiert: GeneAmp® 9700 Silber
Thermocycler, Eppendorf Mastercycler ep-S, Biometra T1, ABI PRISM® 310
Genetic Analyzer mit POP4® und ABI PRISM® 3130 Genetic Analyzer mit POP4®. Die
Entwicklung, die Herstellung und der Vertrieb der Produkte ist nach DIN EN ISO
9001:2008 zertifiziert.
Mentype® AMLplexQS
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Inhaltsverzeichnis
1. Beschreibung des Mentype® AMLplexQS ......................................................... 5
2. Überblick der Arbeitsschritte bis zur Diagnose ................................................. 8
3. PCR Amplifikation .......................................................................................... 9
3.1 Ansetzen des Master Mixes...................................................................... 9
3.2 PCR-Amplifikationsparameter................................................................. 10
4. Elektrophorese am ABI PRISM® 310 Genetic Analyzer ................................... 11
4.1 Matrixerstellung .................................................................................... 11
4.2 Probenvorbereitung ............................................................................... 14
4.3 Einstellung der Data Collection Software ................................................. 15
4.4 Analyse Parameter / Analyse Methode .................................................... 15
5. Elektrophorese am ABI PRISM® 3100-Avant/3100 Genetic Analyzer .............. 16
5.1 Spektralkalibrierung / Matrixerstellung .................................................... 16
6. Elektrophorese am ABI PRISM® 3130/3130xl Genetic Analyzer ...................... 21
7. Elektrophorese mit ABI PRISM® 3500/3500xL Genetic Analyzer ..................... 27
7.3 Einstellungen für den Run ...................................................................... 31
8. Auswerung .................................................................................................. 33
8.1 Biotype® Auswertevorlagen .................................................................... 34
8.2 Kontrollen ............................................................................................. 35
8.3 Fragmentlängen und Aberrationen .......................................................... 35
9. Interprätation der Ergebnisse ........................................................................ 39
10. Referenzen ................................................................................................ 40
11. Erklärung der Symbole ............................................................................... 41
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1. Beschreibung des Mentype® AMLplexQS
Tabelle 1. Nachgewiesene chromosomale Aberrationen und Varianten
Gen-Fusionen
AML1-ETO
BCR-ABL
Chromosomale
Aberrationen
t(8;21) (q22;q22)
t(9;22) (q34;q11)
Varianten
CALM-AF10
t(10;11) (p13;q14)
CBFB-MYH11
inv(16) (p13;q22)
DEK-CAN
MLL-AF6
MLL-AF9
t(6;9) (p23;q34)
t(6;11) (q27;q23)
t(9;11) (p22;q23)
MLL-ELL
t(11;19) (q23;p13.1)
MLL-PTD
Partial Tandem Duplication
NPM1-MLF1
PML-RARA
t(3;5) (q25.1;q34)
t(15;17) (q22;q21)
e1a3
e1a2
b3a2
b3a3
b2a2
b2a3
AF10_240-CALM_1987
AF10_240-CALM_2092
Type A
Type B
Type C
Type D
Type E
Type F
Type G
Type H
Type I
Type J
6A_(THP-1)
7A_(10A)
8A_(MM6)
6B_(9B)
e10e2
e10e3
e9e3
e10e3
e11e3
bcr1 (PR-L)
bcr2 (PR-V)
bcr3 (PR-S)
Tabelle 2. Interne Qualitätskontrollen des Mentype® AMLplexQS
Qualitätskontolle
Interne PCR-Kontrolle (QS-Control)
cDNA-Kontrolle (ABL-Control)
Bedeutung
Zeigt die Qualität der erfolgten PCR
Zeigt die Qualität des cDNA Templates
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Kit Inhalt
Mentype® AMLplexQS (100 Reaktionen)
Nuklease-freies Wasser / Nuclease-free water
Reaktionsgemisch A / Reaction mix A
Primergemisch / Primer mix
Multi Taq2 DNA Polymerase / Multi Taq2 DNA polymerase
Kontroll cDNA KASUMI-1 / Control cDNA KASUMI-1 (500 ng/µl)
DNA Längenstandard 550 (BTO) / DNA Size Standard 550 (BTO)
Allelleiter / Allelic ladder
3.0 ml
500 µl
250 µl
40 µl
10 µl
50 µl
25 µl
Bestellinformationen
Mentype® AMLplexQS
Mentype® AMLplexQS
Mentype® AMLplexQS
25
100
400
Reaktionen
Reaktionen
Reaktionen
Kat.No.
Kat.No.
Kat.No.
45-31220-0025
45-31220-0100
45-31220-0400
Lagerung
Lagern Sie alle Komponenten bei -20 °C das wiederholte Auftauen und Einfrieren sollte
vermieden werden. Das Primergemisch und die Allelleiter sollten lichtgeschützt
aufbewahrt werden. Die Kontroll-cDNA und die post-PCR Reagenzien (Allelleiter und
DNA-Längenstandard) sollten getrennt von den PCR Reagenzien gelagert werden. Die
Haltbarkeit des Testkits ist auf dem Verpackungsetikett angegeben.
Zusätzliche Reagenzien
Für die PCR-Amplifikation und Probenvorbereitung benötigen Sie neben den im Testkit
enthaltenen Bestandteilen folgende Reagenzien:
Reagenzien
Hi-Di™ Formamide, 25 ml
Matrix Standards BT5
single-capillary instruments (5x25 µl)
multi-capillary instruments (25 µl)
multi-capillary instruments (50 µl)
Mentype® AMLplexQS
Lieferant
Life Technologies
Corporation
Bestellnummer
00-10411-0025
00-10421-0025
00-10421-0050
4311320
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Warnungen und Sicherheitshinweise
Folgende potenziell gefährliche Substanz ist in diesem Testkit enthalten:
Kitbestandteil
Reaktionsgemisch
Chemikalie
Natriumazid NaN3
Gefahr
giftig beim Verschlucken, entwickelt bei
Berührung mit Säure giftige Gase
Bitte beachten Sie das Sicherheitsdatenblatt.
Für Biotype® Kitkomponenten sind die Sicherheitsdatenblätter auf Anfrage erhältlich.
Für Sicherheitsdatenblätter von Reagenzien, die nicht im Testkit enthalten sind,
kontaktieren Sie bitte den jeweiligen Hersteller.
Qualitätssicherung
Der gesamte Inhalt des Testkits wird einer intensiven Qualitätssicherung durch die
Biotype Diagnostic GmbH unterzogen. Die Qualität der Testkits wird kontinuierlich
überprüft, um die uneingeschränkte Verwendbarkeit zu belegen. Bitte kontaktieren Sie
uns in allen Fragen zur Qualitätssicherung.
Warenzeichen und Patente
Mentype® ist eingetragenes Warenzeichen der Biotype Diagnostic GmbH. ABI PRISM®
und GeneScan® sind in Deutschland eingetragene Warenzeichen der Applied
Biosystems LLC, GeneMapper®, GeneAmp® und Applied Biosystems® sind
eingetragene Warenzeichen der Applied Biosystems LLC.
POP-4® ist in Europa eingetragenes Warenzeichen der Applied Biosystems LLC.
Die PCR ist patentrechtlich geschützt. Patentinhaber sind die Firmen Roche Molecular
Systems und F. Hoffmann-La Roche (Roche).
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2. Überblick der Arbeitsschritte bis zur Diagnose
Probennahme
RNA Isolation
cDNA Synthese
Multiplex-PCR Amplifikation
Fragmentlängen Analyse
Mentype® AMLplexQS
Auswertung
Abb. 1 Von der Probennahme bis zur Auswertung - Identifizierung relevanter Fusionsgene mit der Anwendung
Mentype® AMLplexQS.
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3. PCR Amplifikation
3.1 Ansetzen des Master Mixes
Die folgende Tabelle zeigt die Volumina der eingesetzten Kitbestandteile bei 1.0 µl
Probenvolumen (Template-cDNA) in einem Reaktionsvolumen von 25 µl.
Berücksichtigen Sie bei der Anzahl der anzusetzenden Reaktionen die Positiv- und
Negativkontrolle. Fügen Sie der Gesamtanzahl ein oder zwei Reaktionen hinzu, um
Pipettierfehler zu kompensieren.
Komponenten
Nuklease-freies Wasser
Reaktionsgemisch A*
Primergemisch
Multi Taq2 DNA Polymerase (hot start, 2.5 U/µl)
Gesamtmenge des Mastermixes
Menge
16.1 µl
5.0 µl
2.5 µl
0.4 µl
24.0 µl
* enthält Mg2+, dNTPs, BSA
Alle Reagenzien sollten vor dem Ansetzen des Mastermixes gemischt (Vortex) und kurz
zentrifugiert werden (ca. 10 s).
Da der Erfolg der Multiplex-PCR Analyse maßgeblich von der Qualität und Quantität des
eingesetzten cDNA Templates abhängt, empfehlen wir standardisierte und bereits
validierte Methoden bei der Probennahme, der RNA-Isolierung sowie bei der RNA in
cDNA Transkription zum Einsatz zu bringen (z.B. Protokolle des Europe Against Cancer
Programm, EAC). Die Konzentration der cDNA ist von der Qualität und Quantität der
zuvor isolierten RNA abhängig.
Bei Referenzproben aus Zellkulturmaterial ist der Einsatz von 1 µl cDNA ausreichend,
wenn für die cDNA-Synthese 1 µg RNA in einem Gesamtreaktionsvolumen von 20 µl
eingesetzt wurde. Die Menge des cDNA-Templates kann im Falle von kritischen
Patientenproben erhöht werden. Das Volumen an nukleasefreiem Wasser ist so zu
korrigieren, dass das Gesamtvolumen des PCR-Ansatzes immer 25 µl beträgt.
Die Primergemische sind so eingestellt, dass bei 25 PCR-Zyklen in einem
Reaktionsvolumen von 25 µl ausgewogene Peakhöhen erreicht werden. Die Peakhöhe
der internen ABL-Kontrolle sollte dabei den spezifizierten Messbereich des Gerätes
nicht überschreiten.
Positivkontrolle
Für die Positivkontrolle verdünnen Sie die Kontroll-cDNA KASUMI-1 auf 250 ng/µl in
dem entsprechenden Volumen. Pipettieren Sie die verdünnte Kontroll-cDNA anstelle
der Template-cDNA in die Reaktionsgefäße mit dem vorgelegten PCR Master Mix.
Negativkontrolle
Als Negativkontrolle pipettieren Sie Nuklease-freies Wasser an Stelle der TemplatecDNA in die Reaktionsgefäße mit dem vorgelegten PCR Master Mix.
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Template-cDNA
In Abhängigkeit von der angewandten Quantifizierungsmethode kann der Messwert der
cDNA-Konzentration variieren, so dass die optimale cDNA-Menge ggf. anzugleichen ist.
3.2 PCR-Amplifikationsparameter
Um die Multi Taq2 DNA Polymerase zu aktivieren und die Bildung von unspezifischen
Amplifikationsprodukten zu unterdrücken, sollte unbedingt ein „hot start“ durchgeführt
werden.
Die Zyklenzahl ist abhängig von der eingesetzten cDNA-Menge. Für alle Proben werden
25 PCR-Zyklen empfohlen. Für Referenzproben aus Zellkulturmaterial (hohe cDNAKonzentration) empfehlen wir eine Reduzierung der PCR-Zyklen auf 22 Zyklen.
Für kritische Patietenproben (geringe cDNA-Konzentration) werden für eine optimale
Signalintensität bis zu 28 Zyklen empfohlen.
Um die optimale Anzahl der benötigten PCR Zyklen zu ermitteln, kann die intere ABLKontrolle als Referenz verwendet werden. Im Resultat sollte die Peakhöhe den
spezifizierten Messbereich des Gerätes nicht überschreiten (z.B. 500 bis 5000 RFU am
ABI3130).
Aufgrund zu geringer cDNA-Konzentration kann es zu statistischen Ausfällen (Allelic
Dropouts) und unausgewogenen Peakhöhen kommen. Mit zunehmender Zyklenzahl
steigt die Wahrscheinlichkeit unspezifischer Amplifikationsprodukte.
Standard Methode
Empfohlen für alle cDNA Proben
Temperatur
96 °C
96 °C
61 °C
72 °C
68 °C
10 °C
Zeit
4 min (hot start für Aktivierung der Multi Taq2 DNA Polymerase)
30 s
120 s
25 Zyklen
75 s
10 min*
∞
bis zum Ende
Optional
Empfohlen für cDNA positive Kontrollen aus Zellkultur
Temperatur
96 °C
96 °C
61 °C
72 °C
68 °C
10 °C
Zeit
30 s
120 s
22 Zyklen
75 s
10 min*
∞
bis zum Ende
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Optional
Empfohlen für kritische Patietenproben
Temperatur
96 °C
96 °C
61 °C
72 °C
68°C
10°C
Zeit
30 s
120 s
max. 28 Zyklen
75 s
10 min*
∞
bis zum Ende
* Sollten erhöhte Anteile an -Adenin Peaks (-1bp) auftreten, kann dieser Schritt auf max. 60 min ausgedehnt
werden.
4. Elektrophorese am ABI PRISM® 310 Genetic Analyzer
Allgemeine Anweisungen zum Analysegerät, der Matrixerstellung und der Anwendung
der GeneScan® bzw. GeneMapper® ID Software können der entsprechenden Anleitung
ABI PRISM ® 310 Genetic Analyzer User’s Manual entnommen werden. Im Folgenden
wird die Elektrophorese mit der GeneScan® Software beschrieben.
Für den kombinierten Einsatz der fünf Fluoreszenzfarbstoffe 6-FAM, BTG, BTY, BTR
und BT0 ist die Nutzung des virtuellen Filter Sets G5 vorgesehen (der Matrix
Standard wird im Folgenden als BT5 bezeichnet).
Material
Kapillare
Polymer
Puffer
47 cm / 50 µm (grün)
POP-4® for 310 Genetic Analyzer
10 x Genetic Analyzer Buffer with EDTA
4.1 Matrixerstellung
Vor der Durchführung der Fragmentlängenanalyse mit dem Filter Set G5 muss
zunächst eine Matrix mit PCR-Fragmenten der entsprechenden fünf
Fluoreszenzfarbstoffe 6-FAM, BTG, BTY, BTR und BTO für das jeweilige Analysegerät
erstellt werden.
Farbe
Blue (B)
Green (G)
Yellow (Y)
Red (R)
Orange (O)
Matrix Standard
6-FAM
BTG
BTY
BTR
BTO
Zur Erstellung von geeigneten Matrix-Files werden fünf Elektrophoresen unter den
gleichen Bedingungen ausgeführt wie sie auch für Proben und Allelleitern des Testkits
gelten. Für die fünf verschiedenen Fluoreszenzfarbstoffe 6-FAM, BTG, BTY, BTR und
BTO muss jeweils ein eigener Elektrophoreselauf durchgeführt werden.
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Matrix Probe
Matrix Probe 1
Komponenten
Hi-Di™ Formamide
Matrix Standard 6-FAM
Volumen
12.0 µl
1.0 µl
Matrix Probe 2
Hi-Di™ Formamide
Matrix Standard BTG
12.0 µl
1.0 µl
Matrix Probe 3
Hi-Di™ Formamide
Matrix Standard BTY
12.0 µl
1.0 µl
Matrix Probe 4
Hi-Di™ Formamide
Matrix Standard BTR
12.0 µl
1.0 µl
Matrix Probe 5
Hi-Di™ Formamide
Matrix Standard BTO
12.0 µl
1.0 µl
- 3 min denaturieren bei 95 °C
- abkühlen auf 4 °C und zur Analyse in das Gerät stellen
- Probenliste Sample Sheet erstellen, 5 Dyes auswählen und Proben bezeichnen
Injektionsliste für die Matrixerstellung
Parameter
Module File
Matrix File
Size Standard*
Injection [s]
Injection [kV]
Run [kV]
Run [°C]
Run Time [min]
Einstellung
GS STR POP-4 (1 ml) G5
NONE
NONE
5
15.0
15.0
60
24
* Matrix Standards sind immer ohne DNA Längenstandard (BTO) vorzubereiten
Analyse der Matrix Proben
- Starten der GeneScan® Software
- File → New → Project (Ordner des entsprechenden Laufs öffnen)
→ Add Sample Files
- Markieren der Matrix Probe in der Spalte Sample File
- Sample → Raw Data
- Bewerten Sie, ob eine stabile Basislinie vorhanden ist. Wie in der Abbildung gezeigt,
sollten mindestens fünf Peaks mit Peakhöhen von 1000-4000 RFU (Y-Achse) in jeder
Matrix Probe erkennbar sein (optimaler Bereich: 2000-4000 RFU).
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▼ 3200 Data Points (X)
5500▼
Abb. 2 Elektropherogramm der Rohdaten des Matrix Standards 6-FAM
- Auswahl des Analysebereichs mit stabiler, ebener Basislinie
- Falls die Basislinie zu unruhig ist, injizieren Sie die Matrix Probe noch einmal
- Notieren Sie die Anfangs- und Endpunkte (Data Points) des Auswahlbereiches, z.B.
Anfangswert 3200, Endwert 5500
- Berechnen Sie den Differenzwert, z.B. 5500-3200 = 2300 Data Points
Neue Matrix erstellen
- File → New → Matrix
Abb. 3 Matrix Proben auswählen
- Matrix Proben für jede Farbe (B, G, Y, R, O) durch klicken auf das Farbsymbol
importieren
- Den jeweiligen Anfangspunkt bei Start At eintragen, z.B. 3200
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- Errechneten Differenzwert z.B. 2300 bei Points eintragen
- Nach der Bestätigung mit OK wird die neue Matrix berechnet
Abb. 4 Neue Matrix BT5
- Speichern im Matrix Ordner: File → Save As, z.B. Matrix BT5
Matrix prüfen
Bitte überprüfen Sie die neue Matrix mit Ihren aktuellen Proben.
- File → New → Project (Ordner des entsprechenden Laufs öffnen)
→ Add Sample Files
- Markieren Sie die aktuelle Probe in der Spalte Sample File
- Sample → Install New Matrix
(Matrix Ordner öffnen und neue Matrix auswählen)
- Proben neu analysieren
- Mit der neuen Matrix sollten keine Überstrahlungen (Pull-up Peaks) zwischen den
verschiedenen Farbpaneln (B, G, Y, R, O) auftreten.
4.2 Probenvorbereitung
Komponenten
Hi-Di™ Formamide
DNA Size Standard 550 (BTO)
12 µl des Gemisches für alle Proben vorlegen
1 µl PCR-Produkt (ggf. verdünnt) bzw. Allelleiter zugeben
Volumen
12.0 µl
0.5 µl
Signalintensitäten
Möglichkeiten zur Erhöhung der Signalintensitäten:
- Reduzierung der Anteile am DNA Längenstandard 550 (BTO) auf Peakhöhen von
ca. 500 relativen Fluoreszenzeinheiten (RFU)
- Aufreinigung der PCR-Produkte vor der Analyse
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4.3 Einstellung der Data Collection Software
- Probenliste Sample Sheet erstellen und Proben bezeichnen
Injektionsliste
Parameter
Module File
Matrix File
Size Standard
Injection [s]*
Injection [kV]
Run [kV]
Run [°C]
Run Time [min]**
Einstellungen
GS STR POP-4 (1 ml) G5
e.g. Matrix BT5
e.g. SST-BTO_60-550bp
5
15.0
15.0
60
28
* Abweichend von der Standardeinstellung kann die Injektionszeit je nach Probe zwischen 1 und 20 s betragen.
Handelt es sich um Vergleichsproben mit sehr hohen Peakhöhen, kann zur Vermeidung von Überstrahlungen
eine kürzere Injektionszeit gewählt werden. Bei geringen cDNA Mengen bzw. kritischem Patientenmaterial
können bis zu 20 s notwendig sein.
** Abhängig von den Analysebedingungen sollte die Run Time für Mentype® AMLplexQS so angepasst werden,
dass Fragmente bis zu einer Länge von 550 bp analysiert werden können.
4.4 Analyse Parameter / Analyse Methode
Die empfohlenen Analyse Parameter sind:
Analysis Range
Data Processing
Peak Detection
Size Call Range
Size Calling Method
Split Peak Correction
Full Range
Baseline: Checked
Multicomponent: Checked
Smooth Options: Light
Peak Amplitude Thresholds
B:* Y:*
G:* R:*
O:*
Min. Peak Half Width: 2 pts
Polynominal Degree: 3
Peak Window Size: 15 pts**
Min: 60
Max: 550
Local Southern Method
None
* Der Grenzwert der Peakamplituden (threshold) ist die minimale Peakhöhe, welche die GeneScan® bzw.
GeneMapper® ID/ID-X Software als einen Peak erkennt. Für den Mentype® AMLplexQS werden 200 RFU
empfohlen und sollten individuell vom Analyselabor festgelegt werden. Die minimale Peakhöhe sollte
mindestens 3x so hoch sein wie das Grundrauschen der Basislinie.
** Falls notwendig kann die Peak Window Size auf 11 pts verringert werden.
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5. Elektrophorese am ABI PRISM® 3100-Avant/3100 Genetic Analyzer
Allgemeine Anweisungen zum Analysegerät, zur Spektralkalibrierung und der
Anwendung der ABI PRISM® 3100 Data Collection Software Version 1.01 oder 1.1
sowie der GeneScan® Software können dem entsprechenden ABI PRISM ® 3100Avant/3100 Genetic Analyzer User’s Manual entnommen werden. Für Systeme mit der
Data Collection Software 2.0 oder 3.0 siehe Kapitel 6.
Das 4-Kapillarsystem trägt die Bezeichnung ABI 3100-Avant, das 16-Kapillarsystem
heißt ABI 3100.
und BT0 ist die Nutzung des virtuellen Filter Sets G5 vorgesehen (der Matrix Standard
wird im Folgenden als BT5 bezeichnet).
Material
Kapillare*
36 cm Capillary Array for 3100-Avant/3100
Polymer*
POP-4® Polymer for 3100
Puffer
10x Genetic Analyzer Buffer with EDTA
*andere Geräteeinstellungen sind möglich
5.1 Spektralkalibrierung / Matrixerstellung
Vor der Durchführung der Fragmentlängenanalyse muss zunächst eine Spektralkalibrierung am ABI PRISM® 3100-Avant/3100 Genetic Analyzer durchgeführt werden.
Auf diese Weise wird eine Matrix erstellt, die das Überlappen der farbspezifischen
Fluoreszenzemissionsspektren korrigiert.
Die Spektralkalibrierung gliedert sich in die folgenden Abschnitte:
- Vorbereitung des Matrix Standards zur Spektralkalibrierung
- Laden des Standards in die 96-Well Platte (je Kapillare eine Probe)
- Plattenzusammensetzung eingeben
- Durchführung des Laufs zur Spektralkalibrierung und prüfen der Matrix
Vorbereitung des Matrix Standards zur Spektralkalibrierung
Beispiel für 4 Kapillaren/ABI 3100-Avant
Komponenten
Hi-Di™ Formamide
Matrix Standard BT5
- 12 µl des Gemisches in 96-Well Platte laden, z.B. Position A1-D1
Volumen
60.0 µl
5.0 µl
Beispiel für 16 Kapillaren/ABI 3100
Komponenten
Volumen
Hi-Di™ Formamide
204.0 µl
17.0 µl
Matrix Standard BT5
- 12 µl des Gemisches in 96-Well Platte laden, z.B. Position A1-H1 und A2-H2
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17
Durchführung der Spektralkalibrierung
Um eine erfolgreiche Kalibrierung mit der Data Collection Software Version 1.0.1 oder
1.1 durchzuführen, müssen zunächst einmalig die Parameter der Spectral Calibration
für DyeSetG5 verändert werden.
Spectral Parameter
- Änderung der Parametereinstellungen unter dem Pfad:
D:\AppliedBio\Support Files\Data Collection Support Files\ CalibrationData\Spectral
Calibration\ ParamFiles
- MtxStd{Genescan_SetG5} auswählen, um die PAR-Datei zu öffnen
- Änderung des Condition Bounds Range auf [1.0;20.0]. Falls eine Kalibrierung
nicht möglich ist, können im zweiten Schritt zusätzlich die Parameter Sensitivity auf
0.1 und Quality auf 0.8 geändert werden
- File Save As auswählen, um die Parameter Datei unter einem neuen Namen zu
speichern, z.B. MtxStd{Genescan_SetG5_BT5}.par
Verwenden Sie für die Spektralkalibrierung mit dem Biotype® Matrix Standard BT5
immer die soeben erstellte Parameter Datei.
Platteneditor zur Spektralkalibrierung (I)
- Die vorbereitete 96-Well Platte in den Autosampler setzen
- Öffnen der ABI PRISM® 3100 Data Collection Software
- Im Plate View der 3100 Data Collection Software auf New klicken, um den Plate
Editor Dialog zu öffnen
- Name der Platte eingeben
- Spectral Calibration auswählen
- 96-Well als Plattentyp auswählen und Finish wählen
Platteneditor zur Spektralkalibrierung (II)
Parameter
Sample Name
Dye Set
Spectral Run Module
Spectral Parameters
Einstellung
Benennen der Matrixproben
G5
Default (z.B. Spect36_POP4)
MtxStd{GeneScan_SetG5_BT5}.par (Parameter zuvor erstellt)
- In die oberste Zelle der Tabelle klicken, um die gesamte Spalte auszuwählen, über
Edit → Fill Down die Informationen den ausgewählten Matrixproben zufügen und
mit OK bestätigen
- Verknüpfen der 96-Well Platte mit der soeben erstellten Plattenbezeichnung mit dem
Autosampler und den Lauf starten
- Nach dem Lauf unter Spectral Calibration Result prüfen ob alle Kapillaren
erfolgreich kalibriert wurden (Kennzeichnung A). Bei Kennzeichnung X sind die
Anweisungen im ABI PRISM ® Genetic Analyzer User’s Manual zu beachten
- Auf OK klicken, um den Lauf zu bestätigen
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Matrix prüfen
- Wähle Tools → Display Spectral Calibration → Dye Set → G5, um die
Spektralkalibrierung jeder Kapillare zu kontrollieren
- Jede Kapillare sollte einen Qualitätswert (Q Value) von mindestens 0.95 sowie eine
Konditionszahl (C Value) zwischen 1 und 20 haben. Beide Werte müssen im zuvor
festgelegten Bereich liegen
- Bewerten Sie, ob eine stabile Basislinie vorhanden ist. Es müssen fünf Peaks mit
Peakhöhen von 1000-5000 RFU (Y-Achse) in jeder Kapillare erkennbar sein
(optimaler Bereich: 2000-4000 RFU)
- Bitte überprüfen Sie die neue Matrix mit Ihren aktuellen Proben. Mit der neuen Matrix
sollten keine Überstrahlungen (Pull-up Peaks) zwischen den verschiedenen
Farbpanels (B, G, Y, R, O) auftreten
- War die Kalibrierung nicht erfolgreich, ändern Sie bitte die Werte für Sensitivity und
Quality wie zuvor im Abschnitt „Spectral Parameter“ beschrieben
- Haben alle Kapillaren die Kalibrierung erfolgreich durchlaufen, muss die aktuelle
Kalibrierungsdatei für das Dye Set G5 unter Tools → Set Active Spectral
Calibration manuell aktiv gesetzt werden. Eine Umbenennung ist über Set Matrix
Name möglich (z.B. BT5_Datum der Kalibrierung)
Komponenten
Hi-Di™ Formamide
12 µl des Gemisches in 96-Well Platte für alle Proben vorlegen
1 µl PCR-Produkt (ggf. verdünnt) oder Allelleiter zugeben
Volumen
12.0 µl
0.5 µl
Da die Injektion gleichzeitig an allen Kapillaren stattfindet, müssen am
Mehrkapillargerät immer 4 oder 16 Proben auf der Platte pipettiert werden. Falls
weniger Proben zu messen sind, müssen die probenfreien Positionen mit 12 µl Hi-Di™
Formamide aufgefüllt werden.
Um eine sichere Allelzuordnung am Mehrkapillargerät zu gewährleisten, sollten
unabhängig von der Probenanzahl mehrere Allelleitern mitlaufen.
Die Raumtemperatur kann das Laufverhalten der PCR-Produkte an Mehrkapillargeräten
stark beeinflussen und bei zu geringer Temperatur zum Auftreten von Doppelpeaks
(Split Peaks) führen. Unter Umständen nimmt die Temperatur auch Einfluss auf die
Laufgeschwindigkeit der Fragmente. Bitte achten Sie darauf, dass die vom
Gerätehersteller empfohlene Arbeitstemperatur eingehalten wird. Optimal sind stabile
Raumtemperaturen >22 °C.
Signalintensitäten
- Reduzierung des Anteiles am DNA Längenstandard 550 (BTO) auf Peakhöhen von
- Aufreinigung der PCR Produkte vor der Analyse
Mentype® AMLplexQS
Januar 2013
19
Vor dem ersten Lauf muss das voreingestellte Run Modul im Dye Set G5 einmalig editiert
werden:
- Zum Öffnen der Dialog Box auf Module Editor klicken
- Aus der Tabelle GeneScan das entsprechende Run Module als Vorlage auswählen
- Ändern Sie die Spannung (Injection Voltage) auf 3 kV und die Injektionszeit
(Injection Time) auf 10 s
Run Module 3kV_10s_550bp
Parameter
Run Temperature [°C]
Cap Fill Volume
Maximum Current [A]
Current Tolerance [A]
Run Current [A]
Voltage Tolerance [kV]
Pre Run Voltage [kV]
Pre Run Time [s]
Injection Voltage [kV]
Injection Time [s]*
Run Voltage [kV]
Number of Steps
Voltage Step Interval
Data Delay Time [s]
Run Time [min]**
Einstellung
Default
Default
Default
Default
Default
Default
Default
Default
3.0
10
Default
Default
Default
Default
26
dass damit Fragmente bis zu einer Länge von 550 bp analysiert werden können.
- Auf Save As klicken, den Namen des neuen Moduls eingeben (z.B.
3kV_10s_550bp) und mit OK bestätigen
- Zum Verlassen des Run Module Editors auf Close klicken
Run starten
- Öffnen der ABI PRISM® 3100 Data Collection Software
- Im Plate View der 3100 Data Collection Software auf New klicken, um den Plate
Editor Dialog zu öffnen
- GeneScan auswählen
- 96-Well als Plattentyp auswählen und Finish anklicken
Mentype® AMLplexQS
Januar 2013
20
Platteneditor
Parameter
Sample Name
Dyes
Color Info
Project Name
Dye Set
Run Module*
Analysis Module 1
Einstellungen
Benennen der Proben
O
Ladder or sample
e.g. 3100_Project1
G5
3kV_10s_550bp
DefaultAnalysis.gsp
* Parameter siehe oben
- Vervollständigen der Tabelle im Plate Editor und OK wählen
- In die oberste Zelle der Tabelle klicken, um die gesamte Spalte auszuwählen und
Edit → Fill Down wählen, um die Informationen der ausgewählten Probe zuzuordnen
- Verknüpfen der 96-Well Platte mit der soeben erstellten Plattenbezeichnung mit dem
Autosampler und den Lauf starten
- Nach dem Lauf sind die Daten als Color Data in Array View der 3100 Data
Collection Software oder als Analyzed Sample Files unter dem Pfad
D:/AppliedBio/3100/DataExtractor/ExtractRuns vorzufinden
Die empfohlenen Analyseparameter sind:
Analysis Range
Data Processing
Peak Detection
Size Call Range
Size Calling Method
Split Peak Correction
Full range
Baseline: Checked
Multicomponent: Checked
Smooth Options: Light
B:* Y:*
G:* R:*
O:*
Min: 60
Max: 550
None
* Der Grenzwert der Peakamplituden (threshold) ist die minimale Peakhöhe, welche die GeneScan® bzw.
GeneMapper® ID/ID-X Software als einen Peak erkennt. Für den Mentype® AMLplexQS werden 200 RFU
empfohlen und sollten individuell vom Analyselabor festgelegt werden. Empfehlung: Die minimale Peakhöhe
sollte mindestens 3x so hoch sein wie das umgebende Grundrauschen der Basislinie.
Mentype® AMLplexQS
Januar 2013
21
6. Elektrophorese am ABI PRISM® 3130/3130xl Genetic Analyzer
Anwendung der ABI PRISM® Data Collection Software Version 3.0 und der
GeneMapper® ID/ID-X Software können der entsprechenden Anleitung ABI PRISM ®
3130/3130xl Genetic Analyzers Getting Started Guide entnommen werden.
Das 4-Kapillarsystem trägt die Bezeichnung ABI 3130, das 16-Kapillarsystem heißt
ABI 3130xl.
und BT0 ist die Nutzung des virtuellen Filter Sets Any5Dye vorgesehen (der Matrix
Material
Kapillare*
36 cm Capillary Array for 3130/3130xl
Polymer*
POP-4® Polymer for 3130
Buffer
10x Genetic Analyzer Buffer with EDTA
Vor der Durchführung der Fragmentlängenanalyse muss zunächst eine Spektralkalibrierung mit PCR-Fragmenten der entsprechenden fünf Fluoreszenzfarbstoffe
6-FAM, BTG, BTY, BTR und BTO für das jeweilige Analysegerät durchgeführt werden.
- Erstellung des Instrument Protocol zur Spektralkalibrierung (Protocol Manager)
- Plattenzusammensetzung im Platteneditor festlegen (Plate Manager)
Vorbereitung der Matrix Standards zur Spektralkalibrierung
Komponenten
Hi-Di™ Formamide
Matrix standard BT5
- 12 µl des Gemisches in 96-Well Platte laden, z.B. Position A1-D1
Mentype® AMLplexQS
Volumen
60.0 µl
5.0 µl
Januar 2013
22
Beispiel für 16 Kapillaren/ABI 3130xl
Komponenten
Volumen
Hi-Di™ Formamide
204.0 µl
17.0 µl
Matrix standard BT5
- 12 µl des Gemisches in 96-Well Platte laden, z.B. Position A1-H1 und A2-H2
- Im Protocol Manager der Data Collection Software im Fenster Instrument
Protocol auf New klicken, um den Protocol Editor zu öffnen
Instrument-Protocol zur Spektralkalibrierung
Protocol Editor
Name
Type
Dye Set
Polymer*
Array Length*
Chemistry
Run Module*
Einstellungen
User (e.g. Spectral36_POP4_BT5)
SPECTRAL
Any5Dye
User (e.g. POP4)
User (e.g. 36cm)
Matrix Standard
Default (z.B. Spect36_POP4_1)
* Richtet sich nach dem verwendeten Polymertyp und der Kapillarlänge
- OK wählen, um den Protocol Editor zu verlassen
- Im Plate Manager der Data Collection Software auf New klicken, um New Plate
Dialog zu öffnen
Platteneditor zur Spektralkalibrierung (I)
New Plate Dialog
Name
Application
Plate Type
Owner Name / Operator Name
Einstellungen
z.B. Spectral_BT5_date
Spectral Calibration
96-Well
…
- OK wählen. Auf diese Weise öffnet sich automatisch eine neue Tabelle im
Platteneditor
Platteneditor zur Spektralkalibrierung (II)
Parameter
Sample Name
Priority
Instrument Protocol 1
Einstellungen
Benennen der Matrixproben
z.B. 100
Spectral36_POP4_BT5 (Einstellung zuvor beschrieben)
- In die oberste Zelle der Tabelle klicken, um die gesamte Spalte auszuwählen, über
Edit → Fill Down diese Information den ausgewählten Matrixproben zufügen und
mit OK bestätigen
Mentype® AMLplexQS
Januar 2013
23
- In Run Schedule → Find All anklicken, dann Link wählen, um die 96-Well Platte
mit der soeben erstellten Plattenbezeichnung mit dem Autosampler zu verknüpfen
(Position A oder B). Anschließend den Lauf starten
O,
R,
Y,
G,
B
Abb. 5 Elektropherogramm der Spektralkalibrierung mit Matrix Standards BT5 am ABI 3130
Matrix prüfen
- Jede Kapillare sollte einen Qualitätswert (Q Value) von mindestens 0.95 sowie eine
Konditionszahl (Condition number range) zwischen 1 und 20 haben.
- Bewerten Sie ob eine stabile Basislinie vorhanden ist. Es müssen fünf Peaks mit
(optimaler Bereich: 2000-4000 RFU), siehe Abbildung.
- Bitte überprüfen Sie die neue Matrix mit Ihren aktuellen Proben. Mit der neuen Matrix
sollten keine Überstrahlungen (Pull-up Peaks) zwischen den verschiedenen
Farbpanels (B, G, Y, R, O) auftreten.
- Haben alle Kapillaren die Kalibrierung erfolgreich durchlaufen, wird die Kalibrierungsdatei für das Any5Dyes im Spectral Viewer automatisch aktiv gesetzt. Eine
Umbenennung ist über Rename möglich (z.B. BT5_Datum der Kalibrierung).
- War die Kalibrierung nicht erfolgreich, wiederholen Sie die Injektion mit einer
erhöhten Injektionszeit oder einer erhöhten Injektionsspannung. Dafür müssen
Änderungen am Run Module für die Spektralkalibrierung vorgenommen werden. Sie
können die gleichen Proben bis zu drei Mal reinjizieren. Anderenfalls können sie auch
mehr Matrix Standard für eine erneute Spektralkalibrierung verwenden.
Mentype® AMLplexQS
Januar 2013
24
Komponente
Volumen
Hi-Di™ Formamide
12.0 µl
0.5 µl
12 µl des Gemisches (Formamid+ Längenstandard) für alle Proben vorlegen
weniger Proben zu messen sind, müssen die probenfreien Positionen mit 12 µl Hi-Di™
Formamide aufgefüllt werden.
(Split Peaks) führen. Unter Umständen nimmt die Temperatur auch Einfluss auf die
Laufgeschwindigkeit der Fragmente. Bitte achten Sie darauf, dass die vom
Gerätehersteller empfohlene Arbeitstemperatur eingehalten wird. Optimal sind stabile
Raumtemperaturen >22 °C.
Signalintensitäten
Mentype® AMLplexQS
Januar 2013
25
Vor dem ersten Probenlauf muss das Run Modul wie folgt editiert werden:
- Im Module Manager der Data Collection Software auf New klicken, um den Run
Module Editor zu öffnen.
Run Module 3kV_10s_550bp
Parameter
Oven Temperature [°C]
Poly Fill Volume
Current Stability [µA]
PreRun Voltage [kV]
PreRun Time [s]
Injection Time [s]*
Voltage Number of Steps
Voltage Step Interval
Data Delay Time [s]
Run Voltage [kV]
Run Time [s]**
Einstellungen
Default
Default
Default
Default
Default
3.0
10
Default
Default
Default
Default
1560
- Auf Save As klicken, den Namen des neuen Moduls eingeben (z.B. 3kV_10s_550bp)
und mit OK bestätigen
- Zum Verlassen des Run Module Editors auf Close klicken
Run starten
- Im Protocol Manager der Data Collection Software im Fenster Instrument
Protocol auf New klicken, um den Protocol Editor zu öffnen
Instrument-Protocol
Protocol Editor
Name
Type
Run Module*
Dye Set
Einstellungen
z.B. Run36_POP4_BT5_26min
REGULAR
3kV_10s_550bp
Any5Dye
* Parameter siehe oben
- OK wählen, um den Protokolleditor zu verlassen
Mentype® AMLplexQS
Januar 2013
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Vor jedem Probenlauf muss die zu messende Platte wie folgt angelegt werden:
- Im Plate Manager der Data Collection Software auf New klicken, um New Plate
Dialog zu öffnen
Platteneditor (I)
New Plate Dialog
Name
Application
Plate Type
Owner Name / Operator Name
Einstellungen
z.B. Plate_BT5_Date
wählen Sie GeneMapper Application
96-Well
…
- OK wählen. Auf diese Weise öffnet sich automatisch eine neue Tabelle im
Platteneditor
Platteneditor (II)
Parameter
Sample Name
Priority
Sample Type
Size Standard
Panel
Analysis Method
Snp Set
User-defined 1-3
Results Group 1
Instrument Protocol 1
Einstellungen
Benennen der Probe
z.B. 100 (Default)
Sample or allelic ladder
z.B. SST-BTO_60-550bp
z.B. AMLplex_Panels_v1
z.B. AMLplex_HID_3130_200rfu
(Results Group auswählen)
Run36_POP4_BT5_26min (Einstellung zuvor beschreiben)
- In die obersten Zellen der Tabelle klicken, um die gesamte Spalte auszuwählen, über
Edit → Fill Down diese Informationen den ausgewählten Proben zufügen und mit
OK bestätigen.
- In Run Schedule → Find All anklicken, dann auf Link klicken, um die 96-Well
Platte mit der soeben erstellten Plattenbezeichnung mit dem Autosampler zu
verknüpfen (Position A oder B). Anschließend den Lauf starten.
- Die Qualität der Rohdaten kann während des Laufs für jede einzelne Kapillare im
Capillaries Viewer oder Cap/Array Viewer beobachten werden. Mögliche
Fehlermeldungen (Error Status) erscheinen in Event Log.
- Die Daten des Probenlaufs werden unter Run History oder Cap/Array Viewer der
Data Collection Software im Überblick dargestellt. Die Laufdaten der Proben werden
im Run Folder der zuvor gewählten Results Group abgelegt.
Mentype® AMLplexQS
Januar 2013
27
Die empfohlenen Analyse Parameter sind:
Peak Detection Algorithm
Ranges
Smoothing and Baselining
Size Calling Method
Peak Detection
Advanced
Analysis: Full Range
Sizing: All Sizes
Smoothing: Light
Baseline Window: 51 pts
B:* Y:*
G:* R:*
O:*
Slope Thresholds: 0.0
* Der Grenzwert der Peakamplituden (threshold) ist die minimale Peakhöhe, welche die GeneMapper® ID
Software als einen Peak erkennt. Für den Mentype® AMLplexQS werden 200 RFU emphohlen und sollten
individuell vom Analyselabor festgelegt werden. Empfehlung: Die minimale Peakhöhe sollte mindestens 3 x so
hoch sein wie das Grundrauschen der Basislinie.
7. Elektrophorese mit ABI PRISM® 3500/3500xL Genetic Analyzer
Anwendung der Applied Biosystems 3500 Series Data Collection Software Version 1.0
und der GeneMapper® ID-X Software Version 1.2, können dem entsprechenden
Applied Biosystems 3500/3500xL Genetic Analyzers User Guide entnommen werden.
Das 8-Kapillarsystem trägt die Bezeichnung AB 3500, das 24-Kapillarsystem heißt ABI
3500xL.
und BT0 ist die Nutzung des virtuellen Filter Sets Any5Dye vorgesehen (der Matrix
Material
Kapillare*
36 cm Capillary Array for 3500/3500xL
Polymer*
POP-4® Polymer for 3500/3500xL
Puffer
10x Genetic Analyzer Buffer with EDTA for 3500/3500xL
Vor der Durchführung der Fragmentlängenanalyse muss zunächst eine Spektralkalibrierung mit PCR-Fragmenten der entsprechenden fünf Fluoreszenzfarbstoffe
6-FAM, BTG, BTY, BTR und BTO für das jeweilige Analysegerät durchgeführt werden.
Mentype® AMLplexQS
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28
- Vorbereitung des Instruments für die Erstellung Dye Set BT5
Vorbereitung des Matrix Standards zur Spektralkalibrierung
Komponente
Hi-Di™ Formamide
Matrix Standard BT5
-12 µl des Gemisches in eine 96-Well Platte laden, z.B. Position A1-H1
- 3 min bei 95 °C denaturieren
Volumen
108.0 µl
9.0 µl
Beispiel für 24 Kapillaren/ABI 3500xL
Komponente
Volumen
Hi-Di™ Formamide
300.0 µl
25.0 µl
Matrix standard BT5
-12 µl des Gemisches in eine 96-Well Platte laden, z.B. Position A1-H1, A2-H2 and A3-H3*
* Bei Verwendung einer 384-Well Platte sollten 10 µl des Gemisches in die Positionen 1, 3, und 5
der Reihen A, C, E, G, I, K, M, und O gegeben werden.
Vorbereitung des Instruments
Bitte stellen Sie sicher dass vor der Spektralkalibrierung eine Spatial Calibration
erfolgt ist. Dieser Schritt ist nur nach dem Einbau eines neuen Capillary Arrays nötig.
Der Prozess ist detailliert im Applied Biosystems 3500/3500xL Genetic Analyzers User
Guide aufgeführt.
Vorbereitung des Dye Set BT5
Vor der Spektralkalibrierung muss das Dye Set für den Matrix Standard BT5
eingerichtet werden.
1. In Library wählen Sie Analyze und Dye Sets und klicken dann Create.
2. Benennen Sie das Dye Set unter Dye Set Name z.B. BT5.
3. Wählen Sie Matrix Standard als Chemistry und AnyDye Template als Dye Set
Template.
4. Deaktivieren Sie Purple im Feld Arrange Dyes. Vergewissern Sie sich, dass alle
anderen Farben aktiviert sind.
Mentype® AMLplexQS
Januar 2013
29
5. Unter Calibration Peak Order müssen die Farben, wie folgt aufgeführt, zugeordnet
werden: 5 – blue, 4 – green, 3 – yellow, 2 – red, and 1 – orange.
6. Im Feld Parameters müssen keine Änderungen vorgenommen werden.
7. Klicken Sie Save, um die Änderungen zu bestätigen.
Abb. 6 Einstellungen für die Spektralkalibrierung des Dye Set BT5
Geben Sie die Multi-Well Platte nach Beladen mit dem Gemisch für die
Spektralkalibrierung in den Autosampler und starten Sie die Spektralkalibrierung.
1. Wählen Sie Maintenance auf dem Dashboard der 3500 Series Data Collection
Software, um den Spectral Calibration Screen zu öffnen.
2. Die Anzahl der Kavitäten der Multi-Well Platte sowie deren Position im Gerät muss
definiert werden.
3. Wählen Sie Matrix Standard als Chemistry Standard und BT5 für das Dye Set
(zuvor erstellt).
4. Aktivieren sie Allow Borrowing (optional).
5. Klicken Sie Start Run.
Mentype® AMLplexQS
Januar 2013
30
Abb. 7 Elektropherogramm der Spektralkalibrierung mit dem Matrix Standard BT5 auf dem ABI 3500
Instrument.
Matrix prüfen
-Jede Kapillare sollte einen Qualitätswert (Q Value) größer als 0.8 sowie eine
Konditionszahl (Condition number range) zwischen 1 und 20 haben.
- Bewerten Sie, ob eine stabile Basislinie vorhanden ist. Es müssen fünf Peaks mit
(optimaler Bereich: 2000-4000 RFU), siehe Abbildung.
- Eine erfolgreiche Kalibrierung wird für jede Kapillare in Overall in grün angezeigt.
- Wurden alle Kapillaren erfolgreich kalibriert klicken Sie Accept Results
- War die Kalibrierung nicht erfolgreich klicken Sie Reject Results. In diesem Fall
verweisen wir auf das Kapitel “spectral calibration troubleshooting” des Applied
Biosystems 3500/3500xL Genetic Analyzers User Guides.
Komponente
Volumen
Hi-Di™ Formamide
12.0 µl
0.5 µl
12 µl des Gemisches (Formamid + DNA Size Standard) für alle Proben vorlegen
weniger Proben zu messen sind, müssen die entsprechenden Positionen mit 12 µl
Hi-Di™ Formamide aufgefüllt werden.
(Split Peaks) führen.
Mentype® AMLplexQS
Januar 2013
31
Unter Umständen nimmt die Temperatur auch Einfluss auf die Laufgeschwindigkeit der
Fragmente. Bitte achten Sie darauf, dass die vom Gerätehersteller empfohlene
Arbeitstemperatur eingehalten wird. Optimal sind stabile Raumtemperaturen >22 °C.
Signalintensitäten
7.3 Einstellungen für den Run
Für den ersten Run mit der Anwendung Mentype® AMLplexQS müssen spezifische
Protokolle innerhalb der 3500 Series Data Collection Software erstellt werden.
Erstellen des Instrument Protocol
- In Library wählen Sie Analyze / Instrument protocol und klicken Create
- Ändern Sie die Parameter wie in der Tabelle unten aufgeführt:
Instrument Protocol für Mentype® AMLplexQS
Parameter
Application Type
Capillary Length
Polymer
Dye Set
Run Module
Protocol Name
Oven Temperature [°C]
Run Voltage [kV]
Run Time [s]**
PreRun Time [s]
Injection Time [s]*
Data Delay Time [s]
Advanced Options
Einstellung
HID / Microsatellite
Default
Default
BT5
Default
z.B. Mentype AMLplexQS
Default
Default
3.0
1560**
Default
10*
Default
Default
- Klicken Sie Save um die Einstellungen zu bestätigen.
Mentype® AMLplexQS
Januar 2013
32
Einstellungen für den Längenstandard
- In Library wählen Sie Analyze / Size Standards und klicken Create
Parameter
Size Standard
Dye Color
Einstellung
BTO_550
Orange
Der DNA Size Standard 550 (BTO) muss mit folgenden Fragmentlängen angewendet
werden: 60, 80, 90, 100, 120, 140, 160, 180, 200, 220, 240, 250, 260, 280, 300,
320, 340, 360, 380, 400, 425, 450, 475, 500, 525, and 550 bp.
- Klicken Sie Save, um die Einstellungen zu bestätigen.
Einrichten des QC (Size Calling) Protocol
- In Library wählen Sie Analyze / QC (Size Calling) und klicken Create
Parameter
Protocol Name
Size Standard
Sizecaller
Einstellung
Name
BTO_550 (vorher eingerichtet)
Size Caller v.1.1.0
- In Analysis Settings / Peak Amplitude Treshold wählen Sie disable Purple. Alle
anderen Farben müssen aktiviert sein.
- Alle anderen Einstellungen bleiben auf Default.
Erstellen eines Assays
- In Library wählen Sie Manage / Assays und klicken Create
Parameter
Assay Name
Color
Application Type
Instrument Protocol
QC (Size Calling) Protocol
Genemapper Protocol
Einstellung
Default
HID
e.g. BTO_550
could be defined
Starten des Runs
- Die vorbereitete Multi-Well Platte in den Autosampler setzen
- Im Dashboard der Data Collection Software klicken Sie Create New Plate
Mentype® AMLplexQS
Januar 2013
33
- In Define Plate Properties wählen Sie Plate Details
Platten Details
Parameter
Name
Number of Wells
Plate Type*
Capillary Lenght
Polymer
Einstellung
96 or 384
HID
36cm
POP4
- Klicken Sie Assign Plate Contents, um die Einstellungen zu bestätigen
- Definieren Sie die Position jeder mit einer Patientenprobe oder Allelleiter belegten
Kavität für die Data Collection und Auswertung
- Ordnen Sie jeder benannten Kavität ein Assay (erforderlich), File Name
Conventions und eine Result Group zu
- Klicken Sie Link the plate for Run und geben Sie den Name des Runs ein.
- Klicken Sie Start Run
8. Auswerung
Allgemeine Anweisungen zur automatischen Auswertung können der entsprechenden
Anleitung GeneScan ® oder GeneMapper® ID/ID-X Software User’s Manual
entnommen werden.
Anmerkung: Bei der Auswertung des Mentype® AMLplexQS sollte der rote Panel
ausgeblendet werden.
Die Ermittlung der genauen Fragmentlängen der amplifizierten Produkte ist abhängig
vom Gerätetyp, von den Elektrophoresebedingungen sowie von dem verwendeten DNA
Längenstandard. Aufgrund der Komplexität einiger Loci sollten möglichst viele,
gleichmäßig verteilte Referenzpunkte zur Längenbestimmung herangezogen werden.
Hierzu verwenden Sie den DNA Längenstandard 550 (BTO) mit den Fragmentlängen
60, 80, 90, 100, 120, 140, 160, 180, 200, 220, 240, 250, 260, 280, 300, 320,
340, 360, 380, 400, 425, 450, 475, 500, 525 und 550 bp.
Abb. 8 Elektropherogramm des DNA Längenstandard 550 (BTO), Fragmentlängen in bp
Mentype® AMLplexQS
Januar 2013
34
Anmerkung: Für die Auswertung und Analyse des Mentype® AMLplexQS mit der
GeneMapper® ID/ID-X Software kann die bereitgestellte Auswertevorlage des DNALängenstandards SST-BTO_60-550bp verwendet werden.
8.1 Biotype® Auswertevorlagen
Die Allelzuordnungen der aufgetrennten PCR-Produkte (Genotyping) kann mit Hilfe
geeigneter Auswertungssoftware erfolgen, z.B. mit GeneMapper® ID/ID-X Software in
Kombination mit Mentype® AMLplexQS Auswertevorlagen der Biotype. Biotype®
Auswertevorlagen (Template Files) finden Sie auf unserer Homepage (www.biotype.de)
zum Download. Auf Anfrage senden wir Ihnen gerne eine CD-ROM.
Die empfohlenen Biotype® Templates für die GeneMapper® ID/ID-X Software sind:
Panels
BinSets
Size Standard
Analysis Method
Plot Settings
Table Settings
AMLplex_Panels_v1
AMLplex_Bins_v1
SST-BTO_60-550bp
AMLplex_HID_310_200rfu
AMLplex_HID_3130_200rfu
PlotsBT5_4dyes
Table for 10 Alleles
Table for 22 Alleles
oder höhere Version
oder höhere Version
empfohlen
empfohlen
Die Panels und BinSets müssen immer verwendet werden, die weiteren
Auswertevorlagen sind optional.
Wichtiger Hinweis: Der Import und die Allelzuordnung mit Hilfe der angebotenen
Auswertevorlagen kann nur für die GeneMapper® ID/ID-X Software garantiert werden.
Sollten Sie GeneMapper® nutzen können Probleme beim Import einiger
Auswertevorlagen auftreten und Sie müssen gegebenenfalls die Panels und Bins mit
einen oder mehreren Runs der Allelleiter auf Ihrem spezifischen Gerätesetup anpassen.
Kontaktieren Sie unseren Support für Hilfestellungen ([email protected]).
Allgemeine Vorgehensweise bei der Auswertung
1. Prüfen des Längenstandards (Size Standard)
2. Prüfen der Allelleiter (Allelic Ladder)
3. Prüfen der Positivkontrolle
4. Prüfen der Negativkontrolle
5. Probendaten auswerten
Mentype® AMLplexQS
Januar 2013
35
8.2 Kontrollen
Das Mentype® AMLplexQS PCR Amplification Kit enthält eine cDNA Kontrolle, die die
folgende genetische Aberration aufweißt:
Tabelle 3. cDNA-Kontrolle Mentype® AMLplexQS
cDNA aus der Zellkultur*
KASUMI-1 (Asou et al. 1991)
Aberration
AML1-ETO
*Die Zellkultur für die Erstellung der cDNA wurde bezogen von: DSMZ - Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und
Zellkulturen GmbH, Braunschweig, Germany. Die Verwendung dieser cDNA ist ausschließlich für den Mentype® AMLplexQS
vorgesehen.
8.3 Fragmentlängen und Aberrationen
Tabelle 4 zeigt die Fragmentlängen der verschiedenen Varianten in Abhängigkeit des
DNA Size Standards 550 (BTO). Die Analyse erfolgte mit dem
ABI PRISM® 3130 Genetic Analyzer auf POP-4® Polymer. Bei Verwendung anderer
Analysegeräte, DNA Size Standards oder Polymere kann es zur Abweichung der
Fragmentlängen kommen.
Wegen gerätespezifischer Unterschiede wird ein individuelles Einstellen am
verwendenten Gerät (fine tuning) nach Messung der Fragmentlänge empfohlen.
Zusätzlich sollte ein visueller Abgleich mit der Allelleiter vorgenommen werden.
Skalierung
Horizontal: 55-550 bp
Vertical: Abhängig von der Signalintensität
Mentype® AMLplexQS
Januar 2013
39
Abb. 9 Elektropherogramm des Mentype® AMLplexQS bei Einsatz der cDNA Kontrolle KASUMI-1 (250 ng). Die
Ananlyse wurde auf dem ABI PRISM® 3130 Genetic Analyzer unter Verwendung des Size Standard 550 (BTO),
durchgeführt. Die Fragmentzuordnung erfolgte mit der GeneMapper® ID Software sowie dem
Mentype® AMLplexQS Template File.
37
Abb. 10 Elektropherogramm der Mentype® AMLplexQS Allelleiter). Die Ananlyse wurde auf dem ABI PRISM®
3130 Genetic Analyzer unter Verwendung des Size Standard 550 (BTO), durchgeführt. Die Fragmentzuordnung
erfolgte mit der GeneMapper® ID Software sowie dem Mentype® AMLplexQS Template File.
Mentype® AMLplexQS
Januar 2013
38
Tabelle 4. Fragmentlängen der Mentype® AMLplexQS Allelleiter ermittelt mit dem ABI PRISM®
3130 Genetic Analyzer mit POP-4® Polymer
Panel/Varianten
Größe [bp]*
Andere
AMLplex Blue
Panel/Varianten
Größe [bp]*
Andere
AMLplex Green
CBFB-MYH11_TypeG
63
DEK-CAN
CBFB-MYH11_TypeI
66
MLL-PTD_e9e3
78
87
QS-Control
72
MLL-AF9_6A_S‡
113
BCR-ABL_b2a3
110
MLL-AF9_6B
191
CBFB-MYH11_TypeJ
140
MLL-PTD_e10e3
218
CBFB-MYH11_TypeC
146
MLL-ELL_e10e3
242
CBFB-MYH11_TypeD
160
MLL-AF9_7A
245
CBFB_MYH11_TypeH
165
MLL-ELL_e10e2
289
CBFB_MYH11_TypeF
175
MLL-AF6
303
BCR-ABL_b3a3
186
MLL-PTD_e11e3
333
BCR-ABL_e1a3
206
MLL-AF9_8A
360
AF10_240-CALM_2092
265
MLL-AF9_6A_L‡
498
CBFB-MYH11_TypeA
271
BCR-ABL_b2a2
285
AMLplex Yellow
AML1-ETO
301
PML-RARA-bcr1
220
BCR-ABL_b3a2
361
PML-RARA_bcr3
288
CBFB-MYH11_TypeE
365
AF10_240-CALM_1987
371
BCR-ABL_e1a2
380
NPM1-MLF1
389
CBFB-MYH11_TypeB
486
ABL-Control
518
PML-RARA_bcr2**
* auf ganze Zahl gerundet
** Auf Grund der variierenden Amplikonlänge (ca. 173bp) kann die Variante nicht automatisch zugeordnet
werden, ist jedoch mit den Primern des Mentype® AMLplexQS detektierbar.
‡
Zwei Amplikons für die Variante MLL-AF9_6A
Mentype® AMLplexQS
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9. Interprätation der Ergebnisse
Durch die vorher beschriebene Post-PCR Auswertung mit automatischer
Allelzuordnung wird eine genaue und zuverlässige Unterscheidung der
Fusionsgentranskripte und ihrer Varianten gewährleistet.
Detektionslimit
In Versuchen mit Plasmiden wurde ein Detektionslimit von 1000 Kopien ermittelt. Liegt
diese Kopienzahl vor, können Peakhöhen von > 200 RFU erreicht werden.
Es handelt sich bei dieser Anwendung um ein PCR-basiertes Screening-Tool, das für
die Subtypen Klassifizierung der AML entwickelt, validiert und zertifiziert wurde. Diese
Anwendung ist nicht für die Quantifizierung oder das Monitoring Minimaler
Resterkrankung (MRD) geeignet.
Überstrahlungen (Pull-up Peaks)
Es kann zu Überstrahlungen zwischen den Farbpanels kommen, wenn eine
ungeeignete Matrix für die Analyse verwendet wurde oder die Peakhöhen außerhalb
des linearen Detektionsbereiches des Gerätes liegen. Diese erscheinen an der gleichen
Position wie spezifische Peaks in anderen Farbpanels (in der Regel mit niedrigeren
Signalintensitäten).
Template-unabhängige Anheftung von Nukleotiden
Die Multi Taq DNA Polymerase hängt aufgrund ihrer terminalen Transferase-Aktivität
bevorzugt ein Adenosin an das 3’-Ende des amplifizierten DNA-Fragments an. Wenn
dem PCR-System nicht genügend Zeit für die Extension zur Verfügung steht oder wenn
die Primersequenzen die Extension nicht begünstigen, findet diese Anheftung nicht
statt. Dieses Artefakt ist durch das Auftreten eines um eine Base verkürzten Fragments
(-1 bp Peak) erkennbar. Alle Biotype® Primer sind so gestaltet, dass diese
Artefaktbildung minimiert wird. Zusätzlich wird die Bildung des Artefakts durch den
abschließenden Extensionsschritt im PCR-Protokoll (68°C für 10 min) reduziert. Die
Peakhöhe des Artefakts nimmt bei hohen cDNA-Mengen zu. Zur Bewertung der Peaks
sollte jedes Analyselabor hierfür eigene Grenzwerte festlegen.
Artefakte
Die Raumtemperatur kann das Laufverhalten der PCR-Produkte an Kapillargeräten
stark beeinflussen und bei zu geringer Temperatur zum Auftreten von Schultern oder
Doppelpeaks (Split Peaks) führen. Außerdem kann die automatische Allelzuordnung
beeinträchtigt sein. Sollten diese Effekte beobachten werden, empfehlen wir eine
erneute Injektion der Proben eventuell auch mit mehreren Allelleitern pro Run.
Einfluss des Polymertyps
Mentype® AMLplexQS wurde auf POP-4® validiert und zertifiziert. Die Verwendung
eines anderen Polymers (z.B. POP-7™ oder POP-6™) kann das Laufverhalten der
spezifischen PCR-Produkte verändern. Außerdem wurde ein erhöhtes
Hintergrundrauschen durch ein verändertes Verhalten von freien
Fluoreszenzfarbstoffresten beobachtet.
Mentype® AMLplexQS
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10. Referenzen
Asou H, Tashiro S, Hamamoto K, Otsuji A, Kita K, Kamada N (1991)
Establishment of a human acute myeloid leukemia cell line (Kasumi-1) with 8;21
chromosome translocation. Blood 77(9): 2031-2036.
Beillard E, Pallisgaard N, van der Velden VHJ, Bi W, Dee R, van der Schoot E,
Delabesse E, Macintyre E, Gottardi E, Saglio G, Watzinger F, Lion T, van
Dongen JJM, Hokland P, Gabert J (2003) Evaluation of candidate control genes for
diagnosis and residual disease detection in leukemic patients using ‚real-time’
quantitative reverse-transcriptase polymerase chain reaction (RQ-PCR) - a Europe
against cancer program. Leukemia 17:2474-2486.
Van Dongen JJM, Macintyre EA, Gabert JA, Delabesse E, Rossi V, Saglio G,
Gottardi E, Rambaldi A, DOtti G, Griesinger F, Parreira A, Gameiro P, Gonzalez
Diaz M, Malec M, Langerak AW, San Miguel JF, Biondi A (1999) Standardized
RT-PCR analysis of fusion gene transcripts from chromosome aberrations in acute
leukemia for detection of minimal residual disease - Report of the BIOMED-1
Concerted Action: Investigation of minimal residual disease in acute leukemia.
Leukemia 13:1901-1928.
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11. Erklärung der Symbole
Hersteller
Herstellungsdatum
Chargenbezeichnung
Ausreichend für <N> Tests
<N>
Gebrauchsanweisung
(Handbuch) beachten
Verwendbar bis
Temperaturbegrenzung
Bestellnummer
In-vitro-Diagnostika
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Notizen
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Gebrauchsanleitung Mentype AMLplex

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