periodische Anregung und intrazelluläre Antwort

Transcription

Fakultät für
Physik
Bachelorarbeit
Mikrofluidik basierende
Untersuchungen der eukaryotischen
Chemotaxis:
periodische Anregung und intrazelluläre Antwort
Microfluidic Study of Eukaryotic
Chemotaxis:
periodic stimulation and intracellular response
angefertigt am Max-Planck-Institut für Dynamik und Selbstorganisation,
Abteilung Hydrodynamik, Strukturbildung und Nanobiokomplexität
von Rabea Sandmann aus Lemgo
Bearbeitungszeit: 24. April 2009 bis 31. Juli 2009
Betreuer:
Christian Westendorf
Erstgutachter:
Prof. Dr. Eberhard Bodenschatz
Zweitgutachterin: Prof. Dr. Sarah Köster
ii
Zusammenfassung
Eukaryotische Zellen können während des Prozesses der Chemotaxis den Konzentrationsgradienten eines Chemoattraktors entlang ihrer Plasmamembran wahrnehmen.
In dieser Bachelorarbeit soll untersucht werden, wie präzise die räumliche Auflösung
bei der Detektion des Konzentrationsgradienten (vor dem Hintergrund einer periodischen Stimulation) in Zellen des phagozytotischen, zellulären Schleimpilzes Dictyostelium discoideum ist. Dazu wird die Mutante LIME-GFP der axenischen Stämme
AX2 und AX3 während der Phase der Aggregation1 durch periodische Stimulation2
mit dem als Chemoattraktor wirkenden cAMP (zyklisches Adenosinmonophosphat)
untersucht. Dabei wird ein zusätzlicher, kurzer, räumlicher Konzentrationsgradient3
entlang der Plasmamembran 4 erzeugt.
Bei Zellen des Stamms AX2 ergibt sich für einen Gradienten von 42 Prozent in
x−Richtung und einen Gradienten von sieben Prozent in y−Richtung folgendes Verhalten: Die Zellen bewegen sich zunächst entgegen der Richtung des y−Gradienten,
ändern dann aber ihre Richtung und bewegen sich in Richtung des y-Gradienten.
Die Richtungsänderung erfolgt durch einen Randeffekt, der durch die finite Länge
des eigentlichen Konzentrationsgradienten erzeugt wird. Dieser Randeffekt erzeugt
ein starkes Konzentrationsgefälle in y−Richtung.
Für einen Gradienten in x−Richtung von 32 Prozent und einen Gradienten in
y−Richtung von zehn Prozent, bewegen sich die Zellen gleich zu Beginn der Stimulation auf den Bereich höherer Konzentration in y−Richtung zu. Die Zellen können
einen zusätzlichen Gradienten in y−Richtung erst wahrnehmen, wenn er im Verhältnis zum Gradienten in x−Richtung stark genug ist. Zusammenfassend kann
man sagen, dass sie den globalen Gradienten wahrnehmen, der sich gleich einer Vektoraddition aus den beiden Gradientenkomponenten (in x− und in y−Richtung)
zusammensetzt.
Bei Zellen des Stamms AX3 ergibt sich für einen Gradienten von etwa sieben
Prozent in y−Richtung und 42 Prozent in x−Richtung ein Verhalten ähnlich dem,
das schon bei AX2-Zellen beobachtet werden kann. Die beiden Stämme unterscheiden sich im Verhalten auf einen zusätzlichen, räumlichen Gradienten entlang ihrer
Plasmamembran nicht.
Die Reaktion auf diese Stimuli erfolgt mit einer Frequenz von 0, 1 Hz. Dieses Verhalten konnte schon in Experimenten selben Typs ohne zusätzlichen, räumlichen
Gradienten beobachtet werden. Die benötigten Zeiträume für die intrazelluläre Antwort 5 , ändern sich durch einen zusätzlichen Gradienten also nicht.
Bei Stimulation durch cAMP-Wellen, die einen fünffach verlängerten Amplitudenbereich aufweisen, zeigen die Zellen folgendes Verhalten: Zunächst erfolgt eine
1
fünf bis acht Stunden nach Beginn des Nahrungsmangels
mit einer Periode von 10 Sekunden
3
Im Folgenden wird der Konzentrationsgradient auch als Gradient bezeichnet.
4
in einem horizontalen Zellquerschnitt, x-y-Ebene
5
zumindest der Prozesse, die indirekt durch LIME-GFP beobachtet werden können, also das
Verhalten des F-Aktins
2
iii
Bewegung auf die Signalquelle zu, die ab dem Eintreffen der zweiten Welle allerdings in eine deutlich reduzierte Bewegung übergeht. Dies zeigt, dass die Zellen zur
Detektion eines Signals den positiven Gradienten in der Wellenfront wahrnehmen.
iv
Vorwort
Der zelluläre phagozytotische Schleimpilz Dictyostelium discoideum wurde von den
’National Institutes of Health’ (U.S.A) als Teil ihrer Modellorganismus-Initiative gewählt, da an diesem Organismus viele zentrale Prozesse, die in eukaryotischen Zellen
stattfinden, unter relativ einfachen Bedingungen beobachtet werden können - unter
anderem werden die Zytokinese, die Beweglichkeit, die Phagozytose, die Chemotaxis,
die Signaltransduktion und verschiedene Aspekte der Entwicklung der Eukaryonten
untersucht.[35]
Die Entwicklung, die zu der Fähigkeit der Wahrnehmung von cAMP führt, wird
durch Nahrungsmangel ausgelöst. Herrscht dieser, so reagieren D. discoideum-Zellen
chemotaktisch auf zyklisches Adenosinmonophosphat (cAMP)6 und bilden im Verlauf der Chemotaxis Aggregate, die zu einer Entwicklung vom Einzeller zum Vielzeller führen. Der Übergang vom Einzeller zum Vielzeller stellt die Basis für eine
Entwicklung höherer Lebewesen dar und seine Grundlagen sind somit ein äußerst
interessantes Forschungsgebiet.
Bei der Beobachtung chemotaktischer Bewegungen ergibt sich das chemotaktische
Paradoxon: Bei einer wellenförmigen Konzentrationsänderung sollte keine effektive Bewegung stattfinden. Die Zellen sollten sich in Richtung der voranschreitenden
Welle bewegen, solange sie sich in der Wellenfront mit einem positiven Gradienten
befinden, und entgegen dieser Richtung, wenn sie in den Bereich eines negativen
Gradienten in der Wellenrückseite gelangen. Diese Reaktion wird jedoch nicht beobachtet: Die Zellen bewegen sich ausschließlich während der Zeit, in der sie sich in der
Wellenfront befinden. Es ist nicht klar, wie die Zellen in ihrer Wahrnehmung negative und positive Gradienten unterscheiden können bzw. welche Art von Gradienten
sie wahrnehmen können. Daher wird unter anderem dieser Aspekt der Chemotaxis
an D. discoideum genauer untersucht und soll Thema dieser Bachelorarbeit sein.
6
Im Folgenden wird das in der Phase der Aggregation als Chemoattraktor wirkende cAMP auch
als ’der Chemoattraktor cAMP’ bezeichnet.
v
Vorwort
Die chemotaktische Reaktion der D. discoideum-Zellen auf cAMP kann in zwei
Bereiche unterteilt werden: Die Reorganisation des Zytoskeletts mit nachfolgender
Bewegung und die Sekretion von cAMP-Pulsen. Daher werden in Kapitel 2 die
Grundlagen des Zytoskeletts und der Beweglichkeit eukaryotischer Zellen, die Eigenschaften der für die Experimente verwendeten Zellen, die Signalübertragung eines cAMP-Pulses sowie die nachfolgende Reaktion der Zellen erläutert. Weiterhin
folgt eine Beschreibung des Mikroskops, mit dem die Zellen während der chemotaktischen Reaktionen beobachtet werden, sowie der Mikrofluidikkanäle, in denen die
Experimente durchgeführt werden und der ’uncaging’-Technik, die zur Freisetzung
des cAMP verwendet wird.
Den Hintergrund der chemotaktischen Bewegung stellt stets die ungerichtete Zufallsbewegung (englisch: ’random motion’) dar, die von den Zellen in Abwesenheit
eines Stimulus durchgeführt wird. Diese ’random motion’ wird in Anwesenheit eines
Stimulus von einer chemotaktische Bewegung überlagert. Modelle, die diese chemotaktische Bewegung beschreiben, werden in Kapitel 3 aufgeführt und dienen in der
Diskussion (Kapitel 6) zur Erklärung der gemessenen chemotaktischen Reaktionen.
Die experimentelle Vorgehensweise sowie die numerische Berechnung des Konzentrationsprofils, das die Reaktion der Zellen beeinflusst, findet sich in Kapitel 4.
Die gemessenen Daten werden mit MATLAB® ausgewertet und mit statistischen
Methoden analysiert (Kapitel 5). Die Resultate werden in chemotaktische Zellbewegung und erfolgende intrazelluläre Antwort auf chemotaktische Stimuli unterteilt
dargestellt.
Zuletzt werden die erhaltenen Resultate im Vergleich mit anderen Daten sowie
mit Hilfe der numerisch berechneten Konzentrationsprofile erklärt (Kapitel 6) und
zusammengefasst (Kapitel 7).
Alle verwendeten biologischen Fachbegriffe, Formelzeichen und Abkürzungen finden sich im Nomenklaturverzeichnis. Die verwendeten Geräte, Materialien und Chemikalien sowie alle Abbildungen und Tabellen sind im Anhang aufgelistet.
vi
Inhaltsverzeichnis
Vorwort
v
Nomenklatur
xi
1 Einleitung
1
2 Grundlagen
3
2.1
Das Zytoskelett und zelluläre Beweglichkeit eukaryotischer Zellen . .
3
2.2
Dictyostelium discoideum . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
5
Die Mutante LIME-GFP . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
6
Zyklisches Adenosinmonophosphat und die Signalübertragungswege .
7
2.3.1
Reaktion der Zellen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
7
2.3.2
Signalweg . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 10
2.2.1
2.3
2.4
Konfokale Laser-Scanning Mikroskopie . . . . . . . . . . . . . . . . . 15
2.4.1
Fluoreszenz . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 15
2.4.2
Aufbau und Funktionsweise eines konfokalen Laser-Scanning
Mikroskops . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 16
3 Theoretische Modelle der chemotaktischen Bewegung
19
3.1
’Random motion’ eukaryotischer Zellen . . . . . . . . . . . . . . . . . 19
3.2
’Gradient sensing’-Modelle . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 20
3.2.1
3.3
LEGI -Modell . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 20
Polarisationsmodelle . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 21
4 Experimentelle Vorgehensweise
4.1
23
Verwendete Materialien . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 23
4.1.1
Wafer . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 23
4.1.2
Mikrofluidikkanäle . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 25
4.1.3
Zellkultur . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 27
vii
Inhaltsverzeichnis
4.1.4
4.2
4.3
Der Fluss im Kanal . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 27
Experimente . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 28
4.2.1
Vorbereitung eines Experiments . . . . . . . . . . . . . . . . . 30
4.2.2
Durchführung eines Experiments . . . . . . . . . . . . . . . . 31
Flussprofil im Kanal . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 32
4.3.1
Numerische Berechnungen mit COMSOL® . . . . . . . . . . . 32
4.3.2
Fehler in der numerischen Berechnung . . . . . . . . . . . . . 34
5 Ergebnisse
5.1
5.2
5.3
39
Auswertung mit MATLAB
®
5.1.1
Kennzeichnung der Zelle . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 39
5.1.2
Intensitätsverläufe und die Zellbewegung . . . . . . . . . . . . 40
5.1.3
Frequenzanalyse der intrazellulären Antwort . . . . . . . . . . 41
5.1.4
Parameter der chemotaktischen Reaktion . . . . . . . . . . . . 41
Analyse der Ergebnisse . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 41
5.2.1
Kontrollen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 42
5.2.2
Histogramme . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 42
Resultate . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 43
5.3.1
Zellbewegung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 44
5.3.2
Intrazelluläre Antwort . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 59
6 Diskussion
61
6.1
Normierte Histogramme . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 61
6.2
Vergleich der Daten . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 67
6.2.1
Experimentreihe Nr.1 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 67
6.2.2
Experimentreihe Nr.2
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 67
6.2.3
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 70
6.2.4
Experimentreihe Nr.4 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 70
6.2.5
Intrazelluläre Antwort . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 70
6.3
6.4
Fehleranalyse . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 72
6.5
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 71
6.4.1
Durch den Experimentaufbau verursachte Fehler . . . . . . . . 72
6.4.2
Durch die Zelleigenheiten verursachte Fehler . . . . . . . . . . 73
6.4.3
Durch die Experimentdurchführung verursachte Fehler . . . . 74
Erklärungsansätze . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 75
6.5.1
viii
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 39
Berechnete Konzentrationsprofile . . . . . . . . . . . . . . . . 75
Inhaltsverzeichnis
6.6
Vergleich mit dem LEGI-Modell . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 84
7 Zusammenfassung
85
7.1 Ergebnisse . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 85
7.2 Ausblick . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 85
A Weitere Grafiken
87
A.1 Histogramme des ’half-population’-Tests . . . . . . . . . . . . . . . . 87
A.2 Frequenzspektren . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 95
B Zellspezifische Konzentrationsprofile für reale Zellen
99
C Vergleichsdaten
103
C.1 Daten ohne Gradient in y−Richtung . . . . . . . . . . . . . . . . . . 103
D Verwendete Geräte und Materialien
D.1 Der Reinraum . . . . . . . . . . .
D.2 Das Weißlichtinterferometer . . .
D.3 Der Plasma-Cleaner . . . . . . . .
D.4 Parameter des Mikroskops . . . .
.
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.
107
. 110
. 111
. 111
. 112
E Verwendete Chemikalien
115
Literaturverzeichnis
119
Abbildungsverzeichnis
125
Tabellenverzeichnis
129
ix
Inhaltsverzeichnis
x
Nomenklatur
Formelzeichen
Symbol
Bedeutung
Einheit
α
α1
c
D
f
F.N.
n
N.A.
λ
P
ys
v
W.D.
ω
Winkel
Winkelbeschleunigung
Konzentration
Diffusionskonstante
Frequenz
F-Zahl
Brechungsindex
Numerische Apertur
Wellenlänge
Leistung
Schiefe (einer Verteilung)
Geschwindigkeit
’working distance’
Umdrehungsgeschwindigkeit
◦
1 1 2
Upm/s =
b 60
/s
1/l
m2/s
Hz
nm
W
µm/s
mm
1 1
b 60
/s
Upm =
Tab. 0.1: Formelzeichen
Abkürzungen
Abkürzung
Bedeutung
Abb.
AC
Abbildung
Adenylylzyklase
xi
Nomenklatur
Abkürzung
Bedeutung
ACA
ADP
ATP
au
bzw.
ca.
cAMP
ccAMP
CCD
cGMP
CMF
D. discoideum
DFT
FFT
GBL
GC
GDP
GFP
GPCR
GTP
i.e. / d.h.
LEGI
m
m (als Präfix)
min
M
µ (als Präfix)
n (als Präfix)
PAKa
PDE
PDI
PDMS
PH-Domänen
PI3K
’adenylyl cyclase of aggregation’
Adenosindiphosphat
Adenosintriphosphat
’arbitrary unit’
beziehungsweise
circa
zyklisches Adenosinmonophosphat
’caged’ Form des zyklischen Adenosinmonophosphats
’charge-coupled device’
zyklisches Guanosinmonophosphat
’conditioned medium factor’
Dictyostelium discoideum
diskrete Fouriertransformation
’fast fourier transformation’
γ-Butyrolacton
Guanylyl Zyklase
Guanosindiphosphat
’green fluorescent protein’
G-Protein-gekoppelte Rezeptoren
Guanosintriphosphat
id est / das heißt
’local excitation, global inhibition’
Meter
Milli-, 10−3
Minute
molar
Mikro-, 10−6
Nano-, 10−9
p21-activated kinase a
Phosphodiesterase
Inhibitor von PDE
Polydimethylsiloxan
’Pleckstrin Homology’-Domänen
Phosphoinositid-3-kinase
xii
Nomenklatur
Abkürzung
Bedeutung
PtdIns(3,4,5)P3
PtdIns(4,5)P2
PTEN
s
sGC
s.u.
Tab.
TORC2
VCA-Domäne
vgl.
WASP/SCAR
WASP
z.B.
Phosphatidylinositol(3,4,5)-triphosphat
Phosphatidylinositol(4,5)-biphosphat
’Phosphatase and Tensin homolog’; 3’-phosphatase
Sekunde
’soluble guanylyl cyclase’
siehe unten
Tabelle
’target of rapamycin complex 2’
’verprolin homology domain’
vergleiche
’supressor of cAMP receptor’
’Wiskott-Aldrich syndrome protein’
zum Beispiel
Tab. 0.2: Abkürzungen
Biologische und chemische Begriffe
Begriff
Erklärung
Adaptor-Protein
Protein, dient zur Verbindung anderer Proteine [10]
ADF/Cofilin
Protein, bindet Aktin und sorgt für die Abbau von AktinFilamenten [48]
Aktin
Protein, Teil des Zytoskeletts, bildet Filamente in eukaryotischen Zellen, monomere Form: G-Aktin (’globular actin’), polymere Form: F-Aktin (’filamentous actin’), Filamentende, an
dem die Polymerisation stattfindet, wird (+)-Ende genannt,
gegenüberliegendes Ende (-)-Ende
Arp2/3Komplex
Proteinkomplex aus den Proteinen Arp2 und Arp3 sowie mehreren Untereinheiten, erzeugt verzweigte Aktinfilamentnetzwerke
axenisch
kultiviert ohne Anwesenheit eines anderen Organismus (z.B.
als Nahrungsquelle) [28]
xiii
Nomenklatur
Begriff
Erklärung
’coiled-coil’Domäne
Domäne mit einer stabförmigen Protein-Struktur, die aus zwei
umeinander gedrehten α-Helizes besteht
’de novo
Nukleation’
neu beginnende Anfangsphase der Aktin-Polymerisation, mehrere Monomere aggregieren in der Form, dass sie ein Polymer
bilden können
Dissoziation,
dissoziieren
Zerfall eines Salzes in seine Ionen
Domäne
Teil eines Proteins, Tertiärstruktur
Doppelzinkfingermotiv
Motiv (s.u.), besteht aus einer Schleife einer Polypeptidkette,
die am Wendepunkt durch zwei Zinkatome fixiert wird
Effektor
Protein, aktiviert ’second messenger’
Endozytose
Aufnahme eines Partikels in die Zelle durch Einstülpung
der Plasmamembran und Lagerung in einem membrangebundenen Vesikel
Enzym
Protein, katalysiert eine bestimmte chemische Reaktion
Eukaryont,
eukaryontisch
Lebewesen, das aus einer oder mehreren Zellen besteht und
einen definierten Kern besitzt, schließt nur Prokaryonten aus
Filamin
Protein, verbindet zwei sich kreuzende Aktin-Filamente an der
Stelle der Überkreuzung
Filopodium
lange Form der microspikes, die aus einem losen Bündel von
etwa 20 Aktinfilamenten bestehen, deren (+)-Ende zum äusseren Rand orientiert ist
Formin
Protein, assoziiert mit dem (+)-Ende von Aktinfilamenten [48]
Fruchtkörper
hier: Zusammenschluss von bis zu 100.000 Zellen als Reaktion auf Nahrungsmangel in Amöben; Chemotaxis, Aggregation
und Zelldifferenzierung in Sporen- und Stielzellen wird benötigt [42]
Glykoprotein
Protein, enthält eine oder mehrere kovalent-vebundene
Oligosaccharid-Ketten
G-Protein
heterotrimeres GTP-bindendes Protein, aktiviert durch die
Bindung eines Liganden an ein Rezeptorprotein mit sieben
Transmembrandomänen / Helizes
’homology’
gleiche Struktur in einem Protein
xiv
Nomenklatur
Begriff
Erklärung
hydrophil
Eigenschaft eines polaren Moleküls / Molekülbestandteils, das
genug Hydrogenbindungen mit Wasser bildet, um sich in Wasser zu lösen
Hydrolyse
Aufbrechen eines kovalenten Bandes unter Zugabe von Wasser
kovalente
Bindung
stabile Bindung zweier Atome, dabei werden ein oder mehrere
Elektronen geteilt
’Knock-Out’Mutanten
Mutanten, bei denen ein bestimmtes Gen ausgeschaltet ist
Lammelipodium
flache, langgezogene Ausstülpung des Aktin-Cortex, deren Inneres aus einem dichten Netzwerk von Aktin-Filamenten besteht
LIM-Domäne
zweifache Zinkfingerstruktur, dient der Protein-Bindung [18]
’messenger,
first’
Molekül, das nur an eine bestimmte Seite eines Proteins oder
anderen Moleküls bindet, im Folgenden auch Ligand genannt
’messenger,
second’
Molekül, im Zytosol gebildet / ins Zytosol befördert als Antwort auf ein extrazelluläres Signal
Mechanotaxis
hier: Reaktion von Zellen auf Scherkräfte im Fluss7
Mitose,
mitotisch
Teilung des Zellkerns in einer eukaryotischen Zelle
Monomer
kleines Molekül, kann mit anderen Monomeren des gleichen
Typs zu einem Polymer verbunden werden
Morphogenese
griechisch: morphê = Gestalt, genesis = Erschaffung, Prozess
der Gestaltbildung in Lebenwesen
Motiv
kleine strukturierte Domäne in Proteinen
Mutagen
Stoff, der eine vererbliche Veränderung in der NucleotidAbfolge eines Chromosoms bewirkt
Myosin II
größere Form der Myosine (Motorproteine), benutzt ATP um
Bewegungen entlang von Aktinfilamenten zu steuern, formt
breite Filamente
N-Ende /
C-Ende
Ende einer Polypeptid-Kette, das eine freie α-Aminogruppe /
α-Carbonylgruppe trägt
Oligomer
Polymer aus wenigen Aminosäuren
7
nicht aus [6] entnommen
xv
Nomenklatur
Begriff
Erklärung
Phagozytose,
phagozytotisch
Prozess der Endozytose
Phosphorylation
Reaktion, bei der eine Phosphatgruppe kovalent an ein anderes
Molekül gebunden wird
pH-Wert
Wert für den Säuregehalt einer Lösung, definiert als negativer
Logarithmus der Konzentration von Hydrogen-Ionen (in Mol)
pro Liter, pH 3 ist sauer, pH 9 ist alkalisch
Plasmamembran Membran, die eine lebende Zelle umgibt, besteht aus einer
Doppellipidschicht
Polymerisation,
polymerisieren
Verbindung von Monomeren durch kovalente Bindungen
’positiv-feedback
loop’
entstehende Produkte einer Reaktion verstärken diese
Profilin
Protein, bindet Aktin-Monomere (G-Aktin)
Protein
ein längliches Polymer aus Aminosäuren, die durch Peptidbindungen verbunden sind
Pseudopodium
breite Ausstülpung des Aktin-Cortex
Rezeptor
Protein, bindet Liganden, initiiert Reaktion der Zelle auf ein
externes Signal
Substrat
Molekül, Reaktionspartner eines Enzyms
Tertiärstruktur
dreidimensionale Struktur eines Proteins
trophische
Phase
griechisch: trophé = Nahrung
Vesikel
kleines, membran-gebundenes, kugelförmiges Organell im Zytoplasma einer eukaryotischen Zelle
Wildtyp
nicht mutierte Form eines Lebewesens, durch natürliche Evolution entstanden
Zellcortex
aktin-reiche Schicht des Zytoplasmas, liegt zwischen Plasmamembran und Zytosol
Zytokinese
Teilung des Zytoplasmas
Zytoplasma
Zellbestandteile innerhalb der Plasmamembran, aber außerhalb des Zellkerns
8
nicht aus [6] entnommen
xvi
8
Nomenklatur
Begriff
Erklärung
Zytoskelett
Komposition aus Protein-Filamenten im Zytoplasma einer eukaryotischen Zelle, bestimmt die Zellgestalt
Zytosol
Inhalt des Zytoplasmas ohne membran-gebundene Organellen
Tab. 0.3: Sofern nicht anders gekennzeichnet, sind alle Definitionen aus [6] entnommen.
xvii
Nomenklatur
xviii
1 Einleitung
Als Chemotaxis (griechisch: ’chêmeia’ = Chemie, ’taxis’ = Ordnung, Aufmarsch)
wird die Beeinflussung der Zellbewegung durch den Konzentrationsgradienten eines
Moleküls bezeichnet. Erfolgt die Bewegung in Richtung des Gradienten, so spricht
man von positiver Chemotaxis und das Molekül wird als Chemoattraktor bezeichnet. Im umgekehrten Fall wird der Prozess als negative Chemotaxis durch einen
Repellor bezeichnet.[25]
Die in dieser Arbeit dargestellten Experimente dienen der Untersuchung der Chemotaxis als Reaktion auf periodische Stimulation mit cAMP während der Phase der
Aggregation und werden in Mikrofluidikkanälen durchgeführt.
Die Mikrofluidik stellt ein wichtiges Mittel zur Untersuchung lebendiger Zellen in
Fluiden dar. Durch die Verwendung von luftdurchlässigen Bestandteilen und Lösungen, die ein geeignetes Milieu für eukaryotische Zellen bilden, können Zellen in vivo
unter kontrollierten Bedingungen beobachtet werden.
Mit Hilfe von Photolyse durch einen Laserstrahl kann die zunächst biologisch inaktive Form (’caged’) des cAMP gezielt periodisch freigesetzt werden, so dass die
äußeren Parameter des chemotaktischen Signals genau reguliert werden können.
Es konnte bereits gezeigt werden, dass D. discoideum-Zellen einen räumlich-zeitlichen
cAMP-Gradienten wahrnehmen können (siehe [7]).
In den durchgeführten Experimenten wird dieser räumlich-zeitliche Gradient um
einen zusätzlichen Gradienten während des Photolyse-Prozesses erweitert. Diese Veränderung dient der Analyse des räumlichen Auflösungsvermögens der Zellen gegenüber einem cAMP-Gradienten und soll den Prozess der Signalübertragung näher
untersuchen.
1
1 Einleitung
2
2 Grundlagen
2.1 Das Zytoskelett und zelluläre Beweglichkeit
eukaryotischer Zellen
Ein wesentlicher Bestandteil der chemotaktischen Reaktion ist die Bewegung der
Zelle. Diese lässt sich in vier Schritte unterteilen: Die Bildung eines Zellfortsatzes,
die Adhäsion am Substrat, die Retraktion des rückseitigen Zellendes und die Ablösung vom Substrat (De-Adhäsion). Diese Möglichkeit der zielgerichteten Bewegung
ist eine Eigenschaft der Lamellipodien. Diese Fortsätze einer eukaryotischen Zelle
sind durch ein verzweigtes Netzwerk an Aktin-Filamenten gekennzeichnet. Die Lamellipodien sind breiter und flacher als die Filopodien, in denen die Aktinfilamente
parallel gebündelt angeordnet sind.
Aktin-Filamente bestehen aus zwei helixförmig angeordneten Polymeren, die aus
Aktin-Monomeren (G-Aktin) zusammengesetzt sind. Diese Monomere sind an Profilin gebunden, befinden sich im Zytosol und werden stets mit gleicher Orientierung
angeordnet, so dass das entstehende Filament polar ist. Das vordere Ende ((+)Ende) wird auch ’barbed end’ genannt, da es aufgrund des angelagerten Myosins
wie ein Pfeilende aussieht. Das hintere Ende ((-)-Ende) wird auch ’pointed end’ genannt. Polymerisation des Aktins und damit Wachstum des Filaments findet am
(+)-Ende des Filaments statt, welches innerhalb der Zelle stets in Richtung der
Zelloberfläche orientiert ist. Die Polymerisation wird durch ’capping’-Proteine beendet. Diese lagern sich an den (+)-Enden der Filamente an und verhindern somit
eine weitere Polymerisation. Durch die Hydrolyse von ATP zu ADP+Pi 1 und der
nachfolgenden Dissoziation des γ-Phosphats2 wird die Depolymerisation eingeleitet.
Daraufhin wird ADF/Cofilin an das Filament gebunden und setzt die Dissoziation
von ADP-Gruppen vom (-)-Ende in Gang. Die abgeschiedenen ADP-Gruppen werden mit Profilin wieder zu ATP-Aktin-Profilin-Komplexen (G-Aktin) kombiniert,
1
2
mit einer Halbwertszeit von zwei Sekunden
mit einer Halbwertszeit von sechs Minuten
3
2 Grundlagen
die erneut an Filamente angelagert werden können.[48]
Damit kontinuierlich neue Aktin-Filamente gebildet werden können, muss genügend
G-Aktin zur Verfügung stehen. Eine zusätzliche Voraussetzung für die Polymerisation stellt die Bereitstellung von genügend neuen (+)-Enden dar. Diese können auf
drei verschiedene Arten erzeugt werden: Indem bestehende Filamente aufgetrennt
werden, (+)-Enden bestehender Filamente geöffnet werden oder eine ’de novo Nukleation’ erfolgt. Die Möglichkeit der ’de novo Nukleation’ ist die Führende und
wird durch Formine oder den Arp2/3-Komplex verursacht. Dieser Komplex, der
verzweigte Aktinfilamentnetzwerke erzeugt, besteht aus den Proteinen Arp2 und
Arp3, sowie fünf zusätzlichen Untereinheiten. Arp2/3 verschließt das (-)-Ende des
Filaments und setzt das Wachstum eines neuen Filaments im 70◦ Winkel3 in Richtung des (+)-Endes in Gang. Die Aktivierung des Arp2/3-Komplexes erfolgt durch
das WASP/SCAR (’supressor of cAMP receptor’)-Protein. Dieses bindet mit einer
VCA-Domäne am C-Ende an den Arp2/3-Komplex. Existierende Aktin-Filamente
fördern die Reaktion von Arp2/3 mit dem WASP/SCAR-Protein, in deren Verlauf
Arp2, Arp3 und das Filament einen stabilen Trimer bilden.[48]
Die Fortbewegung der Zellen erfolgt durch das Vorantreiben der Plasmamembran
in Lamellipodien. Am vorderen Ende dieser Fortsätze befindet sich ein schmaler
Bereich (0, 1 − 0, 2 µm Ausdehnung) aus sehr vielen kurzen, verzweigten AktinFilamenten (die Anzahl liegt bei etwa 100 Filamenten pro µm). Vom Einsetzen
der Polymerisation bis zum Verschließen durch ’capping’-Proteine vergeht etwa eine Sekunde und die Filamente wachsen mit einer Geschwindigkeit von 0, 3 µm/s. Die
Länge der entstehenden Filamente kann allerdings variieren. Die resultierenden kurzen Aktin-Filamente sind gut geeignet, um eine vorwärtstreibende Kraft auf die
Plasmamembran auszuüben, da sie steifer sind als lange Filamente und außerdem
zahlreicher gebildet werden können4 . Die einzelnen Filamente werden sowohl durch
den Arp2/3-Komplex als auch durch Filamin verbunden.[48]
Obwohl sich die (+)-Enden der Filamente so dicht an der Membran befinden, dass
sie bei der Polymerisation direkt auf die Membran treffen und dabei eine Kraft auf
diese ausüben, kann dennoch eine Polymerisation am (+)-Ende stattfinden. Die Filamente sind nicht in Ruhe, sondern vibrieren, so dass sie zu gewissen Zeitpunkten
genügend Abstand von der Membran haben, damit die Polymerisation eines neuen
3
4
4
bezogen auf das anfängliche Filament
aufgrund der beschränkten Anzahl an Monomeren in einer Zelle
2.2 Dictyostelium discoideum
Monomers stattfinden kann.[48]
Das verzweigte Aktin-Filament-Netzwerk stellt nur einen schmalen Bereich direkt hinter der Plasmamembran dar, der von einer Anordnung einzelner AktinFilamente gefolgt wird. Der Umbau der vernetzten Bereiche in Bereiche einzelner
Aktin-Filamente erfolgt durch Phosphat-Dissoziation.[48]
2.2 Dictyostelium discoideum
Der in den Experimenten untersuchte Organismus Dictyostelium discoideum ist ein
zellulärer Schleimpilz. Dieser Eukaryont lebt im Erdboden und teilt sich während
seiner trophischen Phase, in der er sich von Bakterien ernährt, mitotisch. Innerhalb
der trophischen Phase reagieren die Zellen chemotaktisch auf Folsäure. Diese wird als
Nebenprodukt von Bakterien synthetisiert und führt die Zellen des Schleimpilzes somit zu ihrer Nahrungsquelle. Versiegt diese Nahrungsquelle, so bildet der Schleimpilz
Aggregate, die sich zu einem multizellulären Organismus mit typischen Merkmalen
wie Zellteilung, Differentiation und Morphogenese entwickeln. D. discoideum bildet
in diesem Fall Fruchtkörper, die aus Sporen bestehen, welche auf einem Stängel sitzen. Dieses Entwicklungsstadium unterteilt sich in zwei Phasen: die Aggregation und
die Ausbildung des Fruchtkörpers. Der Nahrungsmangel bewirkt die Aktivierung
neuer Gene in den Zellen, die zu einer Änderung des chemotaktischen Verhaltens
führen: die Zellen reagieren nun chemotaktisch auf cAMP. Die Aggregation und die
Bildung des Fruchtkörpers erfolgen mit Hilfe von metabolischen Reserven aus der
trophischen Phase. Nach etwa ein bis zwei Stunden des Nahrungsmangels beginnen
einige Zellen cAMP freizusetzen. Daraufhin reagieren die Zellen im Umfeld ihrerseits
mit Freisetzung von cAMP5 und einer Bewegung entlang des cAMP-Gradienten. Die
Zellen bewegen sich solange die Steigung des cAMP-Gradienten, den sie wahrnehmen, positiv ist und wandern dabei auf das Aggregationszentrum zu.[42] Die Form
der ausgesendeten cAMP-Pulse im extrazellulären Raum hängt dabei von der Zelldichte ab: bei geringer Zelldichte6 bildet sich eine spiralförmige Struktur (’spiral
pattern’), bei hoher Zelldichte7 bildet sich eine zirkuläre Struktur (’target pattern’)
aus.[20] Im Verlaufe der Aggregation geht die ’spiral pattern’ in die ’target pattern’
über.[3] Der Signalweg, der durch den Chemoattraktor aktiviert wird, dient dazu
eine Aggregation zu fördern, die aufgrund ihres Ausmaßes und ihrer Anordnung,
5
in Pulsen mit einer Periode von ca. sechs Minuten
in [20] mit ρ = 21, 8 · 105 Zellen/cm2 angegeben
7
in [20] mit ρ = 7, 3 · 105 Zellen/cm2 angegeben
6
5
2 Grundlagen
die Ausbildung eines Fruchtkörpers erlaubt. Nach etwa acht Stunden8 hat sich ein
loses, sehr flaches Aggregat gebildet. Danach erfolgen die verschiedenen Stufen der
Differentiation zum Fruchtkörper, innerhalb derer sich die Zellen anhand ihrer Art
(’prespore’ oder ’prestalk’-Zellen) in verschiedenen Bereichen anordnen. Die ’prespore’-Zellen bilden später die Sporen des Fruchtkörpers und die ’prestalk’-Zellen den
Stiel des Fruchtkörpers.[42]
In den durchgeführten Experimenten werden ausschließlich Zellen verwandt, die
sich im Stadium der Aggregation befinden (fünf bis acht Stunden nach Beginn des
Nahrungsmangels), um die chemotaktische Reaktion zu untersuchen.
Abb. 2.1: Rasterelektronenmikroskop-Aufnahme der Entwicklungsstadien der
Fruchtkörperbildung bei Dictyostelium discoideum
Die Stadien der Fruchtkörperbildung sind nach Zeitpunkt ihres Vorkommens nummeriert. Die verschiedenen Stadien sind in ein Bild eingefügt.
Adaptiert nach einem Bild von M.J. Grimson & R.L. Blanton, Biological
Sciences Electron Microscopy Laboratory, Texas Tech University
2.2.1 Die Mutante LIME-GFP
Für die Experimente wird die Mutante LIME-GFP der axenischen Kulturen AX2
und AX3 verwendet. AX2 und AX3 unterscheiden sich in der Art und Weise ihrer Züchtung. Der AX2-Stamm wurde ohne Mutagene gezüchtet, wohingegen beim
AX3-Stamm zur Kultivierung das Mutagen N-methyl- N’-nitro- N-nitrosoguanidin
8
6
seit Einsetzen des Nahrungsmangels
2.3 Zyklisches Adenosinmonophosphat und die Signalübertragungswege
verwendet wurde. In diesen Mutanten kann die Verteilung des F-Aktins (indirekt)
durch konfokale Laser-Scanning-Mikroskopie beobachtet werden. Axenische Kulturen sind nicht auf Bakterien als Nahrungsquelle angewiesen, sondern können in Nährmedien wachsen. Die erste dokumentierte axenische Kultur (AX1) von D. discoideum
wurde von Maurice und Raquel Sussman aus dem Stamm DdB (NC-4) kultiviert.
Die Stämme AX2 und AX3 wurden unabhängig voneinander aus dem Stamm AX1
gezüchtet. Diese Stämme haben den Vorteil, dass sie - anders als AX1 - in HL-5 (Formedium, B79 ) wachsen können. Dieses Medium besteht aus 7 g/l Hefeextrakt, 14 g/l
Pepton, 0, 5 g/l KH2 P O4 und 0, 5 g/l N a2 HP O4 , wohingegen für den AX1-Stamm
ein komplexeres Medium aus verschiedenen Nährstoffen benötigt wird. [22]
LIME-GFP
LIM-Domänen bestehen aus einem Peptidring, der von einem DoppelzinkfingerMotiv stabilisiert wird. Proteine, die LIM-Domänen enthalten, wirken als Regulatoren, indem sie Aktin binden. DdLIME in D. discoideum-Zellen enthält eine LIMDomäne am N-Ende, in der Mitte ein Glycerin-reiches-Segment und eine ’coiled-coil’Domäne am C-Ende. In LIME-GFP-Mutanten ist DdLIME am N- Ende mit GFP
(’green fluorescent protein’) verbunden. Experimente mit ’Knock-out’-Mutanten ergaben, dass DdLIME den aktinreichen Zellcortex mit der Mitotischen Spindel verbindet. Das LIME-GFP stellt eine Möglichkeit der indirekten Markierung des FAktins in Zellen dar. Somit kann das Verhalten des F-Aktins in den durchgeführten
Experimenten durch die Beobachtung von GFP gezeigt werden.[31]
2.3 Zyklisches Adenosinmonophosphat und die
Signalübertragungswege
2.3.1 Reaktion der Zellen
Die Chemotaxis der D.discoideum-Zellen erfolgt in der Phase der Aggregation als
Reaktion auf cAMP. cAMP wirkt als ’second messenger’ in Säugetieren, Bakterien
und dem zellulären Schleimpilz D. discoideum. Es wird unter Anwesenheit von M g 2+
durch Adenylylzyklase (AC) aus Adenosintriphosphat (ATP) synthetisiert.[5] In den
durchgeführten Experimenten liegt das cAMP zunächst in der ’caged’ Form vor.
9
Die genauen Artikelnummern und Spezifikationen aller Chemikalien und Geräte finden sich
aufgelistet im Anhang unter den angegebenen Nummern.
7
2 Grundlagen
Abb. 2.2: D. discoideum-Zelle der Mutante LIME-GFP,
aufgenommen mit dem Laser-Scanning Mikroskop Fluoview FV 1000
(Olympus, A6), Objektiv ULSAPO 60XO (Olympus, A8), Bildgebung:
4096 Grauwerte (12 bit)
Die hellen Bereiche sind Bereiche starker sekundärer Fluoreszenz und damit starker Anreicherung von LIME-GFP.
Diese ist durch die Bindung des cAMP an DMNB (4,5-dimethoxy-2-nitrobenzyl)
biologisch inaktiviert (Invitrogen, B3). Durch eine direkte Bestrahlung mit Licht
der Wellenlänge λ = 405 nm setzt die Photolyse ein und das cAMP kann gezielt
freigesetzt werden [5], um so die chemotaktische Reaktion hervorrufen zu können.
Abb. 2.3: Der Verlauf der Photolyse von cAMP
Die DMNB(4,5-dimethoxy-2-nitrobenzyl)-Gruppe wird unter Bestrahlung
mit Licht der Wellenlänge λ = 405 nm abgespalten und das biologisch
aktive cAMP wird freigesetzt.
Die Rezeption von extrazellulärem cAMP führt unter anderem zur Bildung und
Sekretion von cAMP. Dabei können D. discoideum-Zellen extrazelluläre cAMPKonzentrationen zwischen 1 nM und 1 µM mit einem Konzentrationsgradienten von
8
2% wahrnehmen.[38] Reagieren die Zellen auf extrazelluläres cAMP, so ziehen sie sich
zunächst zusammen (’cringing’).[45] Dabei wird F-Aktin innerhalb weniger Sekunden zur Plasmamembran befördert. Danach wird es depolymerisiert und innerhalb
einer Zeitspanne, die ebenso nur wenige Sekunden beträgt, erneut gebunden.[47]
Nachdem das cAMP-Signal die Zelle erreicht hat, wird Calcium über Kanäle in die
Zelle hinein [16] und Protonen sowie Kalium aus der Zelle heraus befördert [46]. Das
Calcium wird für die Funktion vieler Enzyme während der Chemotaxis benötigt. 60
Sekunden nach Eintreffen des Signals wird intrazelluläres cAMP produziert, das von
den Zellen wiederum als Signal ausgesandt, jedoch nicht in den Zellen gespeichert
wird.[30] Allerdings sind noch andere Möglichkeiten der chemotaktischen Bewegung
denkbar. So können z.B. Bläschen an bestimmten Stellen der Plasmamembran gebildet werden. Dazu löst sich die Membran vom Cortex ab und bewegt sich durch den
hydrostatischen Druck vorwärts. Die Zellbewegung resultiert in diesem Fall nicht
aus der gezielten Aktinpolymerisation.[40]
Eine Aggregation von D. discoideum erfolgt erst ab einer bestimmten Zelldichte,
die von den Zellen mit Hilfe von extrazellulärem CMF (’conditioned medium factor’)
gemessen wird.[24] CMF ist ein Glykoprotein [41] und bindet an einen Rezeptor auf
der Zelloberfläche, wodurch es die Reaktion von cAMP mit seinen Rezeptoren (cAR1
- cAR4) erlaubt [37]. Ist die Zelldichte zu gering, wird nicht genügend CMF von den
hungernden Zellen produziert und eine globale Reaktion auf extrazelluläres cAMP
kann nicht stattfinden.[11] Ab einer Zellzahl von ca. 100 Zellen wird ein Aggregat
gebildet. Dazu sind in etwa 20 Abfolgen, der oben beschriebenen Reaktionszyklen
nötig.[42]
Die deutlichste Reaktion zeigen die Zellen bei einem cAMP-Gradienten von 25 nM/mm
mit einem Mittelwert von 25 nM. Bei geringeren cAMP-Konzentrationen wird ein
steilerer Gradient benötigt, damit die Zellen den Gradienten auflösen können.[39]
Die Aggregation wird unter natürlichen Umständen durch Wellen von cAMP reguliert. Die cAMP-Wellen haben im Gegensatz zu einem künstlich erzeugten stabilen Gradienten ein steileres Differential. Diese Wellen zeigen einen Unterschied von
10−6 M − 10−8 M in der Konzentration zwischen Amplitude der Welle und ihrer Sohle. Die Periode der Wellen liegt bei sechs bis acht Minuten.[21] Eine Bewegung der
Zellen bei Stimulation durch cAMP-Wellen findet nur statt, solange sie sich im Bereich eines positiven Gradienten10 befinden. Dabei bewegen sie sich pro eintreffender
Welle in etwa 20 − 30 µm weit. Erreicht der Scheitelpunkt der Welle die Zellen, so
10
für eine Zeitspanne von etwa 150 Sekunden, bei einer Periodendauer von sieben Minuten
9
2 Grundlagen
sinkt der Gradient auf null. Die Zelle bewegt sich während dieser Zeit (in etwa 60
Sekunden) nicht und bildet keinerlei Pseudopoden aus. Trifft die Rückseite der Welle
mit einem negativen Gradienten auf die Zellen11 , so bilden sie zwar Pseudopoden
aus; die Verteilung der Pseudopoden entlang der Membran ist allerdings zufällig, so
dass keine Bewegung stattfindet. Dieses Phänomen wird als chemotaktisches Paradoxon bezeichnet. Ein Lösungsansatz für das chemotaktische Paradoxon könnte die
Phosphorylation der Serinreste in der Carboxyldomäne des cAMP-Rezeptors sein.
Die Phosphorylation erfolgt während der Zeit, in der sich die Zellen in der Wellenfront befinden. Dies könnte dazu führen, dass die Rezeptoren in der Zeit, in der sich
die Zellen in der Wellenrückseite befinden, inaktiv sind und keine Signalübertragung
stattfinden kann.[9]
2.3.2 Signalweg
Während der chemotaktischen Reaktion erfolgt eine Polarisation der Zelle, in deren
Verlauf sich verschiedene Proteine vermehrt in bestimmten Regionen ansammeln.
Der Bereich, in dem eine verstärkte Ansammlung von Phosphoinositid 3-Kinase
(PI3K) stattfindet, wird als vorderes Ende der Zelle definiert. Als hinteres Zellende
wird der Bereich der verstärkten Ansammlung von ’adenylyl cyclase of aggregation’ (ACA) und ’Phosphatase and Tensin homolog’ (PTEN; eine 3’-phosphatase)
definiert.[1] Der Signalweg, der - unter anderem - zu dieser Reaktion führt, soll im
Weiteren näher erläutert werden. Der bisher bekannte Weg der Signaltransduktion
in D. discoideum ist in Abbildung 2.4 schematisch dargestellt.
Im Falle von D. discoideum wirkt extrazelluläres cAMP zunächst als Ligand,
im Verlauf des Signalwegs allerdings auch als ’second messenger’. Im Zuge des
Entwicklungszyklus, der auf den Nahrungsmangel folgt, bildet sich innerhalb von
vier bis fünf Stunden der Mechanismus der Chemotaxis um. Nun wirkt cAMP als
Chemoattraktor.[1]
Die neu gebildeten Rezeptoren gehören zur Familie der G-Protein-gekoppelten Rezeptoren (GPCR). Die GPCR bestehen aus einer extrazellulären N-End-Domäne, gefolgt von sieben Transmembran-Helizes und einem intrazellulären C-End-Abschnitt
und regulieren ihre Effektoren überwiegend über heterotrimere G-Proteine12 .[1]
Als Rezeptor für cAMP wirken cAR1, cAR2, cAR3 und cAR4. Die vier unterschiedlichen cAMP-Rezeptoren kommen in verschiedenen Abschnitten des Über11
12
für eine Zeitspanne von etwa 180 Sekunden, bei einer Periodendauer von sieben Minuten
Allerdings gibt es auch Effektoren, die nicht über G-Proteine reguliert werden.
10
gangs der trophischen Phase zum endgültig ausgebildeten Fruchtkörper zur Wirkung. [19]
Während des - im Folgenden betrachteten - Abschnitts der Chemotaxis und Aggregation ist der Rezeptor cAR1 von entscheidender Bedeutung, während die übrigen
drei Rezeptoren eher in späteren Phasen eine Rolle spielen.[19] cAR1 ist mit dem
trimeren G-Protein Gα2 βγ verbunden13 und gleichmäßig über den gesamten Zellcortex verteilt (Abb. 2.4(a), 1.). Bindet cAMP an cAR1 so dissoziiert Gα2 βγ in α- und
βγ-Untereinheiten (Abb. 2.4(a), 2.). Dabei wird GDP in der α-Untereinheit durch
GTP ersetzt. Der βγ-Heterodimer wird durch die γ-Einheit an die Plasmamembran
gebunden, so dass er auch nach der Dissoziation des G-Proteins mit dieser verbunden bleibt. Die Dissoziation des G-Proteins bewirkt außerdem die Aktivierung von
PI3K am vorderen Ende der Zelle (Abb. 2.4(b), 4a.). Die Aktivierung wird über das
monomere G-Protein Ras gesteuert (Abb. 2.4(a), 3a.).[1]
PI3K überführt PtdIns(4,5)P2 (Phosphatidylinositol(4,5)-biphosphat) in
PtdIns(3,4,5)P3 (Phosphatidylinositol(3,4,5)triphosphat) (Abb. 2.4(b), 5a.).[1]
PtdIns(3,4,5)P3 wird nur am vorderen Ende der Zelle gebildet, da sich an den Seiten und am Ende der Zelle PTEN (’Phosphatase and Tensin homolog’, eine 3’phosphatase) befindet, die eine Bildung verhindert. Am PtdIns(3,4,5)P3 können
die PH(’Pleckstrin Homology’)-Domänen verschiedener Proteine binden (z.B. von
CRAC). Diese Proteine binden somit ausschließlich auf der Seite der Zelle, die der
höheren Konzentration an cAMP ausgesetzt ist. Wenn das extrazelluläre cAMP entfernt wird oder gleichmäßig verteilt ist, erfolgt z.B. keine gerichtete Verteilung von
CRAC. CRAC reguliert die Chemotaxis und ist zusätzlich für die Aktivierung von
ACA zuständig (siehe unten). Es gibt allerdings zusätzliche parallel wirkende Signalwege, die z.B. P LA2 (Phospholipase A2 ), GC (Guanylyl Zyklase) oder Komponenten
von TORC2 (’target of rapamycin complex 2’) als Effektoren enthalten.[1]
Die Bewegung der Zelle wird durch die Reorganisation des Aktinzytoskeletts (siehe Kapitel 2.1) erzeugt. Dabei werden neue (+)-Enden von Arp2/3-Komplexen14
erzeugt (Abb. 2.4(c), 7b.). SCAR/WAVE-Proteine am vorderen Ende der Zelle binden Rac-Proteine (Abb. 2.4(c), 6b.), die wiederum die dortige F-Aktin Ansammlung stimulieren (Abb. 2.4(c), 8.). Die Retraktion am hinteren Zellende wird durch
cGMP (zyklisches Guanosinmonophosphat) bewirkt. Dazu wird sGC (’soluble guanylyl cyclase’) aktiviert (Abb. 2.4(c), 3b) und erzeugt cGMP, das die Myosin II13
14
der Folsäure-Rezeptor hingegen mit G α4 βγ
kontrolliert durch Adaptor-Proteine des WASP (’Wiskott-Aldrich synodrome protein’ und
SCAR/WAVE)
11
2 Grundlagen
Phosphorylation (Abb. 2.4(c), 5b.) verstärkt. Eine Ansammlung von Myosin II erfolgt durch PAKa (’p21-activated kinase a’), das sich am hinteren Ende der Zelle
befindet (Abb. 2.4(c), 4b.).[1]
Die Sekretion von cAMP wird durch ACA bewirkt. Diese Adenylyl-Zyklase befindet sich am hinteren Ende der Zellen und wird durch CRAC und TORC2 aktiviert
(Abb. 2.4(b), 6a.). Die Sekretion von cAMP am hinteren Zellende führt zu einer
Weiterleitung des ersten cAMP-Signals (Abb. 2.4(b), 7a.). Des Weiteren können
sich die Zellen dadurch so anordnen, das jeweils das vordere Ende der nachfolgenden Zelle am hinteren Ende der vorangehenden liegt. So bewegen sie sich während
der Aggregation in Strömen.[1]
(a) Prozess der Rezipierung von
cAMP, sowie der Aktivierung von
RAS
12
(b) Prozess der Produktion und Sekretion von
cAMP
(c) Prozess der Reorganisation des Zytoskeletts
(d) Legende
Abb. 2.4: Schematischer Ablauf der Rezeption eines cAMP-Reizes
Die Zahlen geben die Reihenfolge der Reaktionen an.
Gleiche Zahlen, mit Buchstaben unterteilt, geben simultane Reaktionen an.
Die Proportionen sind nicht massstabsgetreu, die gewählte Form der einzelnen Effektoren dient nur der Skizzierung.
Adaption der Rezeptoren
Die Zellen adaptieren an konstante extrazelluläre cAMP-Konzentrationen. Für die
chemotaktische Reaktion ist daher nur der relative Unterschied15 der aktivierten
cAMP-Rezeptoren entlang der Zelloberfläche entscheidend. Die Adaption erfolgt
durch Phosphorylation der cAMP-Rezeptoren oder Phosphorylation des verbundenen G-Proteins. Die Adaption besteht, sobald das cAMP aus dem extrazellulären
Raum entfernt wird, für weitere 15 Minuten und hängt nicht von der Konzentration
des intrazellulären cAMP ab.[2]
15
dieser hängt vom Konzentrationsgradienten des cAMP ab
13
2 Grundlagen
Die Konzentration an extrazellulärem cAMP wird durch die gezielte Produktion von
PDE (Phosphodiesterase) und ihrem Inhibitor PDI (’phosphodiesterase inhibitor’)
reguliert. Ist die Konzentration an extrazellulärem cAMP hoch, so wird PDE in den
extrazellulären Raum abgesondert [26] oder in Mikrodomänen auf der Zelloberfläche gelagert [49]. Dadurch wird die cAMP-Konzentration reguliert und die Adaption aufgehoben. PDI, das vor allem bei geringer extrazellulärer cAMP-Konzentration
produziert wird, bindet an PDE, so dass die Bindung von cAMP verhindert wird.[43]
14
2.4 Konfokale Laser-Scanning Mikroskopie
Die Reaktion der LIME-GFP-Mutanten während der Chemotaxis wird mit Hilfe
eines konfokalen Laser-Scanning Mikroskops aufgezeichnet, das mit der Aussendung
von Fluoreszenz durch die Probe arbeitet.
2.4.1 Fluoreszenz
Abb. 2.5: Das Reaktionsschema der Fluoreszenz, Jablonski-Schema
Die Übergänge, die zur Fluoreszenz führen, sind in hellblau und die, die
der Phosphoreszenz zugrunde liegen, sind in grün gekennzeichnet.
Die Übergänge zwischen Singulettzuständen (links) und Triplettzuständen
(rechts) sind mit grauen Pfeilen markiert.
Die Ausrichtungen der Spins der äußeren Elektronen sind in Kastenschemaform links und rechts angegeben, wobei ein Kasten je einen Energiezustand bezeichnet.
Treffen Photonen auf ein Molekül eines Fluorophors, so können sie von diesem
absorbiert werden. Je nach Energiebereich der auftreffenden Strahlung wird das
Molekül entweder zur Rotation oder Schwingung angeregt16 oder seine äußeren
Elektronen werden in eins der niedrigsten elektronischen Anregungsniveaus (z.B.
S2) befördert17 . Die äußeren Elektronen werden aus dem Grundzustand S0 in den
Singulett-Anregungszustand S2 befördert (siehe Abb. 2.5, a). Dieser Zustand ist sehr
16
17
bei Strahlung im Mikrowellen- oder Infrarotbereich
bei Strahlung im Bereich von sichtbarem Licht oder im Ultraviolettbereich
15
2 Grundlagen
instabil und geht ohne Aussendung von Strahlung relativ schnell (10−13 − 10−12 s) in
das Anregungsniveau S1 über (siehe Abb. 2.5, b1 bis b3 ). Dieser Singulett-Zustand
ist stabiler als S2 und hat eine Lebensdauer von 10−11 − 10−7 s. Der Übergang in
den Grundzustand S0 erfolgt unter Abgabe von Energie in Form von Strahlung
(als Fluoreszenz bezeichnet) oder Wärme (siehe Abb. 2.5, b3 ). Die Photonen der
ausgesendeten Strahlung haben eine kleinere Energie als die anregenden Photonen
und somit auch eine größere Wellenlänge.[27] Der Übergang zwischen Singulett und
Triplett-Strukturen ist verboten (siehe Abb. 2.5, d), das heißt, dass er nur sehr langsam stattfindet (innerhalb von 10−5 − 10 s). Bei diesem Übergang klappt der Spin
eines Elektrons um und die Multiplizität wird erhöht. Der Übergang vom Triplettzustand T2 in den ersten angeregten Triplettzustand erfolgt ohne Aussendung von
Strahlung. Der nachfolgende Übergang in den Grundzustand (siehe Abb. 2.5, e) ist
mit einer Energieabgabe in Form von Strahlung verbunden, die als Phosphoreszenz
bezeichnet wird. [27]
2.4.2 Aufbau und Funktionsweise eines konfokalen
Laser-Scanning Mikroskops
Ein konfokales Laser-Scanning-Fluoreszenz-Mikroskop besteht aus einem Anregungslaser, einem Detektor, Objektiven, einer Scan-Einheit und einem Computer zur Datensicherung und -verarbeitung.
Die Abtastung der Probe durch den Anregungslaser, sowie die Abtastung zur
Erfassung der ausgesendeten sekundären Fluoreszenz wird durch die Scan-Einheit
gesteuert. Diese Scan-Einheit besteht aus einer Laserquelle, Fluoreszenzfiltern, dichromatischen Spiegeln, einem Raster-Scanning System, variablen Lochblenden und
einem Detektor.[32] Die Laserquelle ist über Glasfasern mit der Scan-Einheit verbunden. Der Laserstrahl wird von einem Strahlaufweiter aufgeweitet, so dass er
die komplette rückwärtige Apertur des Objektivs ausfüllen kann. Der so erzeugte
Laserpunkt tastet die Probe in einem bestimmten Muster ab (’Point-scan’). Kontrolliert wird das Abtasten durch zwei sehr schnell oszillierende Spiegel, die von
Galvanometer-Motoren betrieben werden. Dabei definiert ein Spiegel die x−Position
und der andere die y−Position des Laserpunktes. Kohärentes Licht, das vom Anregungslaser erzeugt wird, tritt durch eine Lochblende, trifft auf einen dichromatischen
Spiegel, wird reflektiert, durch ein Objektiv gebündelt und trifft auf die Probe. Die
Lochblende bildet mit einer definierten fokalen Ebene der Probe und einer zweiten
16
Abb. 2.6: Schematischer Aufbau des Strahlengangs in einem konfokalen LaserScanning Mikroskop
Durch die Verwendung einer Lochblende wird nur der blauen gekennzeichnete Strahl auf dem CCD-Chip abgebildet. Dieser stammt aus sekundärer
Fluoreszenz der markierten fokalen Ebene der Probe.
Die Definition der Raumrichtungen ist im Kasten (unten rechts) dargestellt.
Lochblende vor dem Detektor eine konfokale Ebene. Das auftreffende Laserlicht regt
innerhalb einer definierten fokalen Ebene in der Probe sekundäre Fluoreszenz an,
die durch das Objektiv gebündelt, den dichromatischen Spiegel passiert und durch
die Blende auf den Detektor trifft. Fluoreszenz, die von Punkten der Probe ausgesendet wird, die nicht fokal mit dem Objektiv sind (und daher nicht konfokal mit
der Blende vor dem Detektor), bildet Beugungsringe in der Ebene der Lochblende.
Dadurch tritt kaum Fluoreszenz von diesen Punkten durch die Lochblende und trägt
17
2 Grundlagen
somit nicht zum Bild bei. So entsteht ein scharfes Bild der fokalen Ebene.[32]
Durch die Reduktion der zum Bild beitragenden Fluoreszenz werden zur Bildaufnahme hochsensitive Photonendetektoren benötigt, die schnell und sehr sensibel auf
eine kontinuierliche, veränderliche Lichtintensität reagieren. Diese Detektoren bestehen meist aus Photomultipliern oder CCD(’charge coupled device’)-Chips. In diesen
CCD-Chips werden durch das auftreffende Licht und den photoelektrischen Effekt
innerhalb einer Photokathode Elektronen freigesetzt und eine Spannung erzeugt.
Die Bildgebung kann durch den ’Gain’, den ’Offset’ und die Dynodenspannung (ein
Elektronenverstärker) reguliert werden. Durch Einstellung der Dynodenspannung
kann die allgemeine Empfindlichkeit des Detektors reguliert werden. Mit Hilfe des
’Offsets’ und des ’Gains’ können alle zur Verfügung stehenden Graustufen ausgenutzt werden, so dass der Kontrast verbessert wird. Bei der Einstellung des ’Offsets’
wird ein negativer oder positiver Spannungswert addiert, so dass das kleinste Signal
gerade über dem detektierbaren Grenzwert des Detektors liegt. Die Einstellung des
’Gains’ multipliziert die erzeugte Spannung mit einem konstanten Wert, so dass das
maximale Signal gerade unterhalb der Sättigung des Detektors liegt.[32]
18
3 Theoretische Modelle der
chemotaktischen Bewegung
Ohne direkten externen Stimulus führen die Zellen eine Zufallsbewegung (englisch:
’random walk’) durch. Gelangt die Zelle aufgrund der resultierenden Bewegung in
einen Bereich, in dem sich ein Chemoattraktor befindet, nimmt sie dessen Konzentration wahr. Die während dieses ’temporal sensing’ detektierten Konzentrationsunterschiede beeinflussen ihre weitere Bewegung. Eukaryotische Zellen sind allerdings
auch zu einer weiteren Art der Detektion von externen Stimuli fähig, dem sogenannten ’spatial sensing’. Liegt ein statischer Stimulus an, so werden die Zellen
durch das ’spatial sensing’ polarisiert (siehe auch Kapitel 2.3.1), wobei die Polarisation in Richtung der höchsten Konzentration des Chemoattraktors erfolgt. Erst
wenn der Chemoattraktor aus dem extrazellulären Raum gänzlich entfernt wird, verschwindet die Polarisation, ansonsten bleibt sie bestehen. Bereits polarisierte Zellen,
drehen sich in Richtung des Gradienten, behalten aber die anfängliche Polarisation
bei. Apolare Zellen, die einem Chemoattraktor ausgesetzt werden, reagieren mit der
Ausbildung von Pseudopoden in Richtung des Gradienten. Bei einer uniformen extrazellulären Verteilung des Chemoattraktors reagieren die Zellen zunächst auf das
Signal (innerhalb einer Zeitspanne von fünf bis zehn Sekunden). Danach adaptieren
sie allerdings (siehe Kapitel 2.3.2), so dass die Reaktion innerhalb der nächsten 30
Sekunden abklingt.[36]
3.1 ’Random motion’ eukaryotischer Zellen
Die Größe eukaryotischer Zellen schließt eine passive Bewegung durch ’Brownian
motion’ aus: Sie sind zu groß, um durch die geringen thermisch bewirkten Kräfte
bewegt zu werden. Liegt kein externes Signal vor, so bewegen sich die Zellen des
D. discoideum nicht gerichtet d.h. mit einer ’random motion’. Wird die Bewegung
der Zellen über längere Zeit analysiert, so ergibt sich eine ballistische Bewegung
19
(geradlinig, mit konstanter Geschwindigkeit) während der ersten halben Stunde.
Danach geht die Bewegung in einen ’random walk’ über, bei dem die auftretenden
Geschwindigkeiten einer Gaußverteilung folgen. Die Zellen zeigen dabei eine lange
Persistenzzeit von etwa zehn Minuten bezüglich der groben Bewegungsrichtung und
bewegen sich auf einem ’Zick-Zack’-förmigen Pfad.[23]
Die Zeitentwicklung dieser ’Zick-Zack’-förmigen Bewegung kann durch einen durch
Rauschen getriebenen harmonischen Oszillator beschrieben werden, dessen Resonanzfrequenz f0−1 = 2, 4 (±0, 1) Minuten mit einer Persistenzzeit von acht Minuten beträgt. Das weiße Rauschen stammt aus den verschiedenen externen Signalen,
die von allen Pseudopoden der Zelle ’aufgezeichnet’ werden. Außerdem wird eine
oszillierende Kraft von dem ’führenden’ Pseudopod erzeugt, der die Zelle vorantreibt. Diese oszillierende Kraft bildet zusammen mit dem weißen Rauschen das
farbige Rauschen, das den oben beschriebenen Oszillator betreibt. Durch die Verbindung der beiden Bewegungen - zunächst der gradlinigen Bewegung gefolgt von
der ’Zick-Zack’-förmigen Bewegung - wird eine große Fläche abgedeckt, so dass es
sich als gute Suchstrategie für Nahrungsquellen in Abwesenheit eines externen Stimulus erweist.[23]
3.2 ’Gradient sensing’-Modelle
Die verschiedenen Modelle für die Bewegung von eukaryotischen Zellen in Anwesenheit eines äußeren Signals sind in [36] dargestellt und werden im Folgenden zusammengefasst.
Die ’gradient sensing’-Modelle gehen von einer verstärkten, anhaltenden intrazellulären Antwort auf statische externe Stimuli (eine uniforme Verteilung oder ein
stabiler Gradient des Chemoattraktors) und einer veränderlichen Antwort auf uniforme, nicht statische Stimuli (zeitlich veränderliche Gradienten, die z.B. von propagierenden Wellen des Chemoattraktors erzeugt werden) aus.
3.2.1 LEGI-Modell
Die einfachste Form eines solchen Modells ist das LEGI (lokale Anregung, globale
Hemmung; englisch: ’local excitation, global inhibition’)-Modell: Die Aktivierung der
Rezeptoren durch Moleküle des Chemoattraktors bewirkt ein lokal begrenztes Signal auf einer kurzen Zeitskala, das die nachfolgenden Effektoren anregt. Zusätzlich
20
3.3 Polarisationsmodelle
wird allerdings auch ein globales Signal auf einer langen Zeitskala ausgelöst, das die
Aktivierung der nachfolgenden Effektoren behindert.[36]
Im Falle der D. discoideum-Zellen kann die Reaktion auf cAMP durch ein ’twoLEGI’-Modell beschrieben werden. Dabei werden durch zwei parallel agierende Mechanismen, die dem LEGI -Prinzip folgen, die Bindungsstellen für P I3K und P T EN
reguliert. Die intrazelluläre Verteilung dieser Moleküle auf der Plasmamembran reguliert die Bildung des PI(3,4,5)P3 (siehe Kapitel 2.3.2) und sorgt so für eine polare
Verteilung der PH-Domäne-bindenden Regionen innerhalb der Zelle.[36]
Das LEGI -Modell kann noch durch eine zusätzliche Komponente erweitert werden. Ein membran-gebundener Inaktivator dient dabei zur lokalen Inaktivierung der
Effektor-Proteine.[36]
3.3 Polarisationsmodelle
Die Polarisationsmodelle basieren auf dem LEGI -Modell. Allerdings wird durch die
intrazelluläre Antwort eine positive Rückkopplung (englisch:’positiv-feedback loop’)
erzeugt, die die Umsetzung des Signals erhöht. Die ’positiv-feedback loop’ kann durch
autokatalytische Prozesse, Prozesse der Substratverteilung, sowie durch den verhinderten Abbau der Effektoren erzeugt werden. Durch diese Verstärkung werden
geringe Inhomogenitäten des anfänglichen Signals verstärkt und resultieren in der
Polarisation der Zelle.[36]
Allerdings wurde durch experimentelle Messungen der Rezeptorbesetzung der Zellen
bei uniformen Stimuli eine statistische Fluktuation der Besetzungszahlen festgestellt,
die zu einem Unterschied gegenüber einer uniformen Rezeptorbesetzung von bis zu
11% führt1 . Da die Zellen aber Unterschiede in der Chemoattraktor-Konzentration
ab 2% wahrnehmen können, muss es einen internen Filter geben, der ihnen die
Unterscheidung von statistischen Fluktuationen und einem anliegenden Gradienten
ermöglicht. Tatsächlich benutzen die Zellen eine räumliche und zeitliche Filterung
der Rezeptorbesetzung bei der Signalübertragung. [36]
1
bezogen auf das vordere und hintere Ende der Zelle
21
22
4.1 Verwendete Materialien
4.1.1 Wafer
Die Herstellung der verwendeten Mikrofluidikkanäle, in denen die Experimente durchgeführt werden, erfolgt mit Hilfe einer Negativform - dem strukturierten Wafer.
Herstellung der strukturierten Wafer
Das Aufbringen der Struktur auf die Siliziumwafer (Si-Mat, A27) erfolgt in einem
Reinraum1 der Klasse ISO6. Die Struktur der ’Wafer’ besteht aus SU-8 25 (B12)
der Firma Microchem. Dieser Negativfotolack setzt sich aus drei Bestandteilen zusammen: dem Grundharz EPON-Resin, dem Lösungsmittel γ-Butyrolacton (GBL)
und dem fotoempfindlichen Triarylsulfoniumhexafluoantimonat (Fotoinitiatorsalz).
Etwa 4 g des SU-8 25 werden auf einen Siliziumwafer aufgebracht und mit einer
Belackungsschleuder (englisch: ’spin coater’, Ramgraber GmbH, A4) gleichmäßig
auf diesem verteilt. Die Höhe der Struktur kann mit Hilfe der Winkelgeschwindigkeit und der Radialbeschleunigung reguliert werden, da diese durch die Fliehkraft
die Verteilung des SU-8 25 beeinflussen. Zunächst wird der Drehteller der Belackungsschleuder auf ω = 500 Upm mit α1 = 100 Upm/s beschleunigt und für acht
Sekunden mit dieser Winkelgeschwindigkeit betrieben. Im nächsten Schritt wird der
Drehteller auf ω = 1425 Upm mit α1 = 400 Upm/s für 35 Sekunden beschleunigt. Bei
Verwendung dieser Parameter entsteht eine Schichthöhe von 26, 4 ± 0, 5 µm.
Der beschichtete Wafer wird in zwei Stufen bei 65◦ Celsius und bei 95◦ Celsius
jeweils für fünf Minuten gebacken, so dass das SU-8 25 aushärtet.
Zur Erzeugung der Struktur wird ein ’Maskaligner’ (EVGroup, A12) verwendet.
In diesem wird der Wafer durch eine Chrommaske (A13) mit UV-Licht bestrahlt.
Das Fotoinitiatorsalz initiiert bei Bestrahlung mit UV-Licht eine Kettenreaktion im
1
Eine genauere Beschreibung findet sich im Anhang D.1.
23
Fotolack. Dabei werden Wasserstoffionen vom EPON -Molekül abgetrennt und die
Lackmoleküle werden während des Backens über die freiwerdenden Bindungsstellen
verbunden. Dazu wird der Wafer in kleinen Schritten von 65◦ Celsius auf 95◦ Celsius
über einen Zeitraum von etwa zehn Minuten langsam erwärmt und wieder abgekühlt.
Die unfixierten Reste werden mit Entwickler (MicroChem, B13) und 2-Propanol
(Merck, B8) entfernt.
Abb. 4.1: Foto eines strukturierten Wafers
Die Struktur der Kanäle erscheint dunkel auf dem helleren Hintergrund
des Siliziumwafers. Unterteilt ist die Struktur in sieben Segmente mit je
drei Negativformen der Kanalstrukturen. Die einzelnen Negativformen haben einen breiten Anfangs- und Endpunkt, die die Möglichkeit für spätere
Einströmöffnungen bieten.
Vermessung der Wafer
Um die exakte Höhe der Struktur zu bestimmen wird der strukturierte Wafer in
einem Weißlichtinterferometer (Veeco, Metrology Group, A38)2 vermessen. Diese
Höhe ist wichtig, da sie die Höhe der Kanäle und damit die maximale Flussgeschwindigkeit vmax in diesen bestimmt. Um vergleichbare Daten zu erhalten muss
2
24
die Flussgeschwindigkeit, die zwei unterschiedlichen Datensätzen zu Grund liegt, im
Rahmen der Messfehler identisch sein. Die Kanalstruktur auf dem verwendeten Wafer weist folgende Parameter auf:
Höhe: a = 26, 4 (±0, 5) µm
Breite: b = 500 (±0, 5) µm
Länge: c = 30.000 (±0, 5) µm
Damit hat ein Kanal das Volumen:
V = a · b · c = (3, 96 ± 0, 08) · 10−10 m3 = 3, 96 · 10−4 ml
(4.1)
4.1.2 Mikrofluidikkanäle
Die Herstellung der PDMS-Schicht
Der ’Wafer’ wird vor Gebrauch mit Aceton (Merck, B1), Isopropanol (Merck, B8)
und destilliertem Wasser (B6) gereinigt und mit Stickstoff (Air Liquid, B11) getrocknet. In einem Waageschälchen (Omnilab, A36) werden 60, 0 g PDMS sowie
6, 0 g ’Curing Agent’ (beide Sylgard 184, Dow Corning, B9 & B4) vermischt und
auf dem ’Wafer’ verteilt. Die vorhandenen Luftblasen werden mit Hilfe einer Vakuumkammer (Ilmvac GmBH und Pyrex U.S.A, A34) entfernt. Anschließend wird die
PDMS-Schicht bei 75◦ Celsius für zwei Stunden gebacken, um das PDMS auszuhärten.
Herstellung der Mikrofluidikkanäle
Aus der PDMS-Schicht werden die strukturierten Bereiche ausgeschnitten. Die ’Inlets’ und ’Outlets’ aller drei Kanäle werden mit einer Kanüle (19 gauge × 1 inch,
McMaster, A9) durchstochen, so dass im Nachhinein an diesen Stellen Schläuche
eingeführt werden können.
In einem ’Plasma-Cleaner’ (Harrick Plasma, A24)3 wird sowohl der ausgeschnittene Bereich der PDMS-Schicht als auch ein Deckgläschen ((24 × 60) mm, No. 1,
Gerhard Menzel Glasbearbeitungswerk GmbH & Co. KG, A5) gereinigt und hydrophil gemacht. Dadurch verbindet sich das PDMS bei der Abdeckung durch das
Deckgläschen mit diesem. Einer der drei so hergestellten Kanäle wird befüllt, indem
durch einen Teflonschlauch (Novodirekt, A32) aus einer Spritze (Hamilton, A30a)
Phosphatpuffer (pH-Wert: 6, 0 , B10) in den Kanal überführt wird. Dadurch wird
3
25
eine mögliche Ansammlung von Luftbläschen im Kanal verhindert, die die Strömung später behindern könnte. Der hergestellte Mikrofluidikkanal wird während
des Experiments so auf dem Mikroskoptisch platziert, dass das Deckgläschen auf
dem Immersionsobjektiv aufliegt.
Abb. 4.2: Foto eines hergestellten Mikrofluidikkanals
Die Struktur der drei Kanäle eines Segments erscheint dunkel im helleren
PDMS. Über eine Einströmöffnung (englisch ’inlet’) am Ende des Kanals
können die Kanäle mit Suspensionen befüllt werden.
Abb. 4.3: Aufbau eines Mikrofluidikkanals
Der Bereich des Glases bzw. des Deckgläschens ist in blau gekennzeichnet,
der Bereich des PDMS in grün.
Die Orientierung der Raumrichtungen (rechts), sowie die Kanalgeometrie
(mit Höhe, Breite und Länge) sind gekennzeichnet. Die Methode der Messung der Maximalgeschwindigkeit vmax wird in Kapitel 4.1.4 erklärt.
26
4.1.3 Zellkultur
Die Zellen werden drei Tage in einer mit HL-5 (Formedium, B7) befüllten Petrischale (Falcon, A21) kultiviert. Die Zellen werden aus der Nährlösung (HL-5) entnommen und in Phosphatpuffer in einem Schüttelinkubator (Barnstead, A17) gelagert.
Innerhalb dieser Zeit beginnen die Zellen aufgrund der fehlenden Nahrungsquelle cAMP-Rezeptoren auszubilden und cAMP abzusondern. Um diese Reaktionen zu
verstärken und die Zellen in ihrer chemotaktischen Reaktion zu synchronisieren, werden den Zellen durch eine Peristaltikpumpe (Rainin, A20) alle sechs Minuten 20 µl
cAMP (18 µM) hinzugefügt. Diese Pulsfrequenz entspricht der natürlichen Pulsfrequenz der D. discoideum-Zellen. Nach fünf Stunden des Pulsens werden 10 ml der
Zelllösung entnommen und drei Mal bei 4◦ Celsius und einer Umdrehungsgeschwindigkeit von 1000 Upm für drei Minuten zentrifugiert. Das verbliebene Zellpellet wird
zuletzt in 2 ml Phosphatpuffer gelöst. Somit wird das vorhandene cAMP entfernt.
Die Lösung - mit den enthaltenen Zellen - wird nun mit Hilfe der zuvor verwendeten
Spritze (A30a) aufgezogen und in den Kanal überführt, so dass sie den Phosphatpuffer ersetzt. Die durchschnittliche Zellzahl vor Beginn der Zentrifugation liegt bei
1, 5−2·106 1/ml4 . Da die Flüssigkeit, die die Zellen umgibt von 10 ml auf 2 ml reduziert
wird, befinden sich nach der Überführung in den Kanal 2970(±60) bis 3960(±80)
Zellen im Volumen eines Kanals (vgl. Gleichung (4.1)). Die tatsächliche Zellzahl liegt
deutlich niedriger, da sowohl durch die Schritte der Zentrifugation als auch durch
den im Nachfolgenden eingestellten Fluss im Kanal Zellen ’verloren’ gehen bzw. aus
dem Kanal ’herausgewaschen’ werden. Die im Kanal befindlichen Zellen zeigen nicht
alle fluoreszente Eigenschaften bzw. nicht alle das gleiche Maß an Fluoreszenz, da
diese genetisch bestimmte Eigenschaft einer statistischen Verteilung unterliegt (siehe
auch Kapitel 6.4.2).
4.1.4 Der Fluss im Kanal
Aus 500 µM ’caged’ cAMP (ccAMP) Aliquot (Invitrogen, B3) und Phosphatpuffer
(B10) wird 10 µM ccAMP angesetzt. Das ccAMP kann bei einer Lagertemperatur
von 4◦ Celsius maximal über einen Zeitraum von zehn Tagen für die Experimente verwendet werden, da es selbst bei dieser niedrigen Temperatur relativ instabil
ist. Das 10 µM ccAMP wird unter Ausschluss von Licht in eine mit Aluminium4
ausgezählt mit einer Neubauer-Zählkammer (Optik Labor, A14)
27
folie ummantelte5 Spritze (Hamilton, A30b) aufgezogen. Die Spritze wird in eine
’Syringe Pumpe’ (Harvard Appartus, A31) gespannt und über einen Teflonschlauch
(A32) mit dem Kanal verbunden. Um den Zellen genügend Zeit zur Adherierung
am Deckgläschen zu geben, wird der Fluss erst nach 15 Minuten angestellt. Danach wird der Kanal über etwa 30 Minuten mit 10 µM ccAMP-Lösung bei einer
Flussgeschwindigkeit von 10 µl/h durchflossen, um sicherzustellen, dass der gesamte
Kanal mit ccAMP gefüllt ist. Danach wird der Fluss auf 5 µl/h reduziert und das
Experiment wird gestartet.
Die resultierende maximale Flussgeschwindigkeit6 für die mit dem verwendeten
strukturierten Wafer hergestellten Kanäle wird gemessen, indem ’caged’ Fluorescein
durch einen kurzen Puls von 1 s des ’uncaging’-Lasers freigesetzt wird. Das Flussprofil im Kanal kann durch ein Gaußprofil angenähert werden, so dass durch den
zeitlichen Verlauf des Maximum dieses Profils die maximale Flussgeschwindigkeit
errechnet werden kann. Innerhalb der verwendeten Kanäle beträgt die maximale
Flussgeschwindigkeit in der Mitte des Kanals vmax = 112 (±30) µm/s .
4.2 Experimente
Für die Messungen wird das Mikroskop Fluoview FV 1000 (Olympus, A6) mit dem
Immersionsobjektiv7 ULSAPO 60XO (Olympus, A8)8 verwendet9 , das zwei Laser
enthält, deren Strahlen über Galvanometer unabhängig voneinander bewegt werden
können.[33]
Ein Laser - der ’scanning’-Laser (siehe Tab. D.4) - dient der Aufnahme des Bildes,
nach dem im Kapitel 2.4.2 erläuterten Prinzip. Dabei wird eine Region der Probe
aufgezeichnet, die im Folgenden als ’imaging’-Region bezeichnet wird (vergleiche
Abbildung 4.4). Der zweite Laser - der ’uncaging’-Laser (siehe Tab. D.4) - setzt durch
Photolyse ’caged’ cAMP gezielt frei (siehe Abb. 2.3). Es ist bereits bekannt, dass Zellen auf einen räumlich-zeitlichen Gradienten in x−Richtung10 reagieren können.[8]
Dieser Gradient kann erzeugt werden, indem der Strahl des ’uncaging’-Laser entlang
5
damit nicht durch Lichteinwirkung schon vor Beginn des Experiments cAMP freigesetzt wird
bei einer Flussgeschwindigkeit von 5 µl/h
7
verwendetes Immersionsöl: Immersionsöl Typ F (Olympus, A7), n = 1, 518
8
NA: 1, 35; WD: 0, 15 mm; FN: 26, 5
9
gesteuert über das zugehörige Computer-Programm (Olympus)
10
Die Definition der x−Richtung ist in Abbildung 4.4 zu sehen.
6
28
4.2 Experimente
(a) Konfiguration: ’gerade Linie’
(b) Konfiguration: ’schräge Linie’
Abb. 4.4: Abmessung und Ausrichtung der ’uncaging’-Region bezüglich der
’imaging’-Region im Mikrofluidikkanal
Die Flussrichtung ist in grau gekennzeichnet. Die ’imaging’-Region, die
das Bild bildet ist in schwarz dargestellt. Die Linie, entlang derer sich der
Strahl des ’uncaging’-Laser bewegt, ist in rot gekennzeichnet.
einer ’geraden Linie’ (siehe Abb. 4.4) bewegt wird. In y−Richtung11 liegt in diesem
Fall nahezu kein Gradient vor. Im Weiteren soll untersucht werden, ob die Zellen
des D. discoideum in der Lage sind eine zusätzliche Gradientenkomponente wahrzunehmen, die in y-Richtung orientiert ist. Dieser Gradient kann erzeugt werden,
indem der Strahl des ’uncaging’-Lasers entlang einer ’schrägen’ Linie bewegt wird
(siehe Abb. 4.4).
Dazu werden verschiedene Experimentreihen (siehe Tab. 5.2) durchgeführt, die sich
durch den Winkel α sowie die Abmessungen der bildgebenden ’imaging’-Region unterscheiden.
Über die Veränderung des Winkels α wird die Stärke des Gradienten reguliert. Durch
die Größe der ’imaging’-Region wird die mögliche Beobachtungsdauer der Zellen beschränkt, da diese sich im Mittel mit einer Geschwindigkeit von 10 µm/min bewegen.
Es ist allerdings nicht möglich die y−Abmessung der ’imaging’-Region zu vergrößern ohne gleichzeitig auch die Abmessungen der ’uncaging’-Linie zu verändern: Die
’uncaging’-Linie muss sich stets entlang der gesamten y−Abmessung der ’imaging’Region erstrecken, da ansonsten Randeffekte innerhalb der ’imaging’-Region entste11
Die Definition der y−Richtung ist in Abbildung 4.4 zu sehen.
29
hen. Eine Verlängerung der ’uncaging’-Linie bewirkt aber ebenso eine Veränderung
des Konzentrationsgradienten und ist somit nicht möglich, sofern die Vergleichbarkeit mit zuvor aufgenommenen Daten (siehe Kapitel 6.2) gewahrt werden soll. Aus
diesem Grund können nicht alle Zellen für dieselbe Dauer beobachtet werden. Es
werden allerdings im Folgenden nur Datenreihen zur Auswertung benutzt, die mindestens aus 100 Aufnahmen bestehen. Es wird ein Bild pro Sekunde aufgenommen.
Nr. Stamm
α
1
2
3
4
5
[◦ ]
25
25
41
25
0
AX2
AX2
AX2
AX3
AX2
’imaging’Region
[µm]
48 x 48
48 x 96
48 x 48
48 x 48
48 x 48
Pulslänge
[s]
1
1
1
1
5
Tab. 4.2: Durchnummerierte Experimentreihen
Die zugehörigen Geometrien sind in Abb. 4.4 erläutert. Die verschiedenen
Experimentreihen sind durch die Parameter gekennzeichnet, in denen sie
sich unterscheiden.
Die Dauer des ’uncaging’-Prozesses liegt in den ersten vier Experimentreihen bei
einer Sekunde.
In der letzten Experimentreihe wird sie auf fünf Sekunden verlängert. Die resultierende cAMP-Welle hat bei einer ’uncaging’-Dauer von fünf Sekunden einen deutlich
verlängerten Maximumsbereich. Dieses Experiment dient der Klärung der Frage,
ob die Zellen den positiven Gradienten in der Wellenfront oder den negativen Gradienten in der Wellenrückseite wahrnehmen und wird mit der Konfiguration einer
’geraden’ ’uncaging’-Linie (siehe Abb. 4.4) durchgeführt.
4.2.1 Vorbereitung eines Experiments
Für die Aufnahmen mit dem konfokalen Laser-Scanning-Mikroskop wird der diskontinuierliche Scan-Modus (siehe Abb. 4.5) gewählt. Die Ausrichtung des Bildes
erfolgt so, dass der Kanalrand parallel zum Bildrand liegt, um Winkelfehler in der
Auswertung auszuschließen. Die Intensität des ’scanning’-Lasers (λ = 488 nm) ist
auf 8% der ursprünglichen Laserleistung reguliert (siehe Tab. D.4). Der Durchmesser
der Lochblende beträgt 105 µm.
30
4.2 Experimente
Abb. 4.5: Ausrichtung der Probe bezüglich der ’imaging’-Region sowie der ScanModus.
Der grüne Punkt gibt den Anfangspunkt des Scans an, der rote Punkt
den Endpunkt. Die Ausrichtung der Kanalwand erfolgt parallel zum oberen bzw. unteren Rand der ’imaging’-Region. Das ’scanning’ erfolgt im
diskontinuierlichen Scan-Modus.
Die Zeit zwischen den einzelnen Aufnahme der 340 Bilder beträgt eine Sekunde.
Die Geometrie der ’imaging’ - und ’uncaging’-Region ist in Abb. 4.4 skizziert.
Die Bilder werden in zwei Kanälen aufgenommen: dem Fluoreszenz-Kanal und
dem Durchlichtkanal. Bezüglich des Fluoreszenskanals wird der ’Gain’ (1 x) und
der ’Offset’ (7 %) während des gesamten Experiments konstant gehalten. Der HVWert bzw. die Dynodenspannung wird so eingestellt, dass die gesamte Zelle gut
sichtbar ist12 .
4.2.2 Durchführung eines Experiments
Zu Beginn der Aufnahme wird das Bild am Mikroskoptisch scharf gestellt, so dass ein
Querschnitt13 der zu untersuchenden Zelle in der konfokalen Ebene liegt. Die Zelle
muss ein ausreichendes Maß an sekundärer Fluoreszenz aussenden, um im Bereich
der Dyodenspannung ein klares Bild im Fluoreszenzkanal darzustellen. Zunächst
wird geprüft, ob die Zellen auf eine Freisetzung des cAMP durch den ’uncaging’Laser reagieren. Dazu wird eine Bildsequenz aufgenommen, während derer der ’uncaging’-Laser mehrere Male aktiviert wird. Ist eine Reaktion14 (siehe Kapitel 2.3.1)
zu erkennen, so kann das eigentliche Experiment gestartet werden.
Bei den eigentlichen Messungen wird der ’uncaging’-Laser in festgelegten Inter12
typischerweise Werte zwischen 535 V und 660 V
in etwa in der halben Höhe der Zelle
14
d.h. eine Translokation von LIME-GFP zum Cortex
13
31
vallen für zuvor eingestellte Zeiträume aktiviert. Vor Beginn der ersten Aktivierung
wird die Bewegung der Zelle ohne externes Signal für 30 Bilder und nach der letzten
Aktivierung für 70 Bilder dokumentiert. Dies dient dem Vergleich und der Kategorisierung der Reaktion.
Zusätzlich werden Kontrollen aufgenommen, in denen die Bewegung der Zellen
ohne externe Stimuli aufgezeichnet wird. Es werden Kontrollen in einer Region von
(48 × 48) µm mit 340 Bildern sowie in einer Region von (120 × 120) µm mit 600
Bildern aufgezeichnet.
4.3 Flussprofil im Kanal
Der Fluss im Kanal bestimmt das Konzentrationsprofil, das die Zellen während des
Experiments wahrnehmen und somit ihre Reaktion.
4.3.1 Numerische Berechnungen mit COMSOL®
Mit Hilfe des Softwareprogramms COMSOL® Multiphysik-Simulationen kann die
Entwicklung des Konzentrationsprofils von cAMP innerhalb des Kanals über die
Zeit dargestellt werden15 . In den Berechnungen wird nicht die allgemeinere NavierStokes-Gleichung gelöst, sondern lediglich die Diffusions-Konvektionsgleichung:
∂c
−
= −→
v · ∇c + D · ∇2 c
∂t
(4.2)
Als Randbedingungen werden die Abmessungen der Kanalwände angegeben16 .
Das Konzentrationsprofil wird 1 µm oberhalb des Kanalbodens17 berechnet, als Approximation für den Aufenthaltsort der Zellen. Der Prozess des ’uncaging’ wird
durch eine Quelle berechnet, die der Geometrie der Linie entspricht (siehe Abb.
4.4), entlang derer der Strahl des ’uncaging’-Laser während des Experiments verläuft. An der Position dieser Quelle herrscht von der Zeit t = 0 s bis t = 1 s18 die
auf c = 1 normierte Konzentration c0 (in ’arbitrary units’). Die Geschwindigkeit in
15
Alle hier dargestellten Berechnungen wurden von Christian Westendorf durchgeführt.
In den Berechnungen kann eine Kanalbreite von 300 µm angenommen werden, anstatt des realen
Werts von 500 µm, weil die Experimente stets mit einigem Abstand zum Kanalrand durchgeführt werden.
17
bzw. des Deckgläschens
18
also für die Dauer des ’uncaging’-Prozesses im realen Experiment
16
32
x−Richtung (siehe Abb. 4.3) wird als parabolisches Profil vorgegeben.
Im ersten Teil der Berechnung wird für alle Punkte eines zugrunde gelegten Gitters
im Bereich des Kanals die Konzentration zu verschiedenen Zeiten errechnet (Zeitschritte 0, 01 s, Dauer: 0−1 s). Für die Berechnung in den nachfolgenden Zeiträumen
wird die Randbedingung der Quelle verändert: Die Konzentration an der Position
der Quelle wird auf c = 0 gesetzt, da der Laser im realen Experiment pro Periode
nur eine Sekunde aktiviert ist. So kann berechnet werden wie sich das anfänglich
erzeugte Konzentrationsprofil verändert. Die Güte der Berechnung wurde zuvor getestet, indem diese für eine Berechnung mit der Diffusionskonstante von Fluorescein
durchgeführt und nachfolgend mit experimentellen Ergebnissen19 für Fluorescein
verglichen werden.
Die in Abb. 4.7, 4.8 und 4.9 gezeigten Eigenschaften des Konzentrationsverlaufs
im Mikrofluidikkanal dienen der generellen Einschätzung der Effekte verschiedener Winkel α sowie des Effekts des Abstands von der Signalquelle. Es ist zu erkennen, dass die Konzentrationsdifferenz zwischen den Punkten x = +10 µm und
y = +20 µm sowie y = −20 µm für einen Winkel von α = 41◦ mit 50 Prozent wesentlich höher als für einen Winkel von α = 25◦ (mit 40 Prozent) ist. In der doppelten
Entfernung (i.e. bei x = +20 µm) hat der Unterschied zwischen diesen Punkten auf
26 Prozent abgenommen.
Der Abstand zwischen +20 µm und −20 µm ist für die Betrachtung einzelner
Zellen viel zu ungenau, da diese einen wesentlich geringeren Durchmesser haben.
Deshalb werden die Konzentrationsprofile für Entfernungen, die den Ausdehnungen
einer Zelle entsprechen, ausgewertet. Diese finden sich in der Diskussion. Deshalb
sei für eine weitere Beschreibung der Profile auf diese verwiesen (Kapitel 6.5.1).
19
Die Ergebnisse stammen aus ’uncaging’-Experimenten mit ’caged’ Fluorescein.
33
Abb. 4.6: Definition der Richtungen in den COMSOL® -Berechnungen, bezogen auf
die ’imaging’-Region im Mikrofluidikkanal
Gezeigt sind die positive y−Richtung in grün, die positive x−Richtung in
blau, die ’imaging’-Region in schwarz, die ’uncaging’-Region in rot und
die Flussrichtung in grau.
4.3.2 Fehler in der numerischen Berechnung
Nicht nur die Zellgeometrie stellt potentielle Fehlerquellen in der Berechnung der
Konzentrationsgradienten dar. Die numerischen Berechnungen werden stets mit dem
Modell eines perfekten Kanals ohne die Anwesenheit von Zellen durchgeführt. Die
Zellen verändern das Flussprofil in ihrer Umgebung aber stark. Sie können als impermeable Objekte im Fluss der cAMP-Lösung angesehen werden. Mit Hilfe von
numerischen Berechnungen und theoretischen Betrachtungen, die in [8] beschrieben
sind, kann dieser Effekte abgeschätzt werden. Da sich der Chemoattraktor an der
Seite der Zelle anlagert, die in Richtung der höheren Konzentration weist und die
Konzentration auf der gegenüberliegenden Seite verringert wird, wird der ursprünglich angelegte Konzentrationsgradient verändert.
In [8] wurde berechnet in welchen Bereichen der Flussgeschwindigkeiten20 der angelegte Konzentrationsgradient durch die im Kanal befindlichen Zellen kaum verändert wird. Für die verwendete Kanalhöhe liegt die gemessene Flussgeschwindigkeit
von v = 112 (±30) µm/s in diesem Bereich. In [4] wurde berechnet, dass auch höhere Flussgeschwindigkeiten innerhalb der verwendeten Zeitskalen des ’uncaging’Prozesses und für die verwendete Kanalgeometrie einen angelegten Konzentrationsgradienten nicht verändern.
20
für eine bestimmte Kanalhöhe
34
(a) Konzentrationsverlauf über die Zeit
(b) Differenz der Konzentrationsverläufe an unterschiedlichen Punkten
(c) Zeitlicher Gradient des Konzentrationsverlaufs
Abb. 4.7: COMSOL® -Daten für eine ’imaging’-Region von (48 × 48) µm und einen
Winkel α = 25◦
Die Definition der Richtungen ist in Abbildung 4.6 dargestellt.
a)Der Konzentrationsverlauf über die Zeit mit verschiedenen Entfernungen von der Signalquelle x, für y = 20 µm (oben) und y = −20 µm (unten)
b)Die zeitliche Entwicklung der Differenz der Konzentrationen zwischen
y = 20 µm und y = −20 µm für verschiedene Entfernungen von der Signalquelle x
c) Der zeitliche Gradient der Konzentrationsentwicklung in der Entfernung von x = 20 µm von der Quelle für y = 20 µm und y = −20 µm
35
(c) Zeitlicher Gradient der Konzentrationsverlaufs
Winkel α = 25◦
Gleiche Darstellung wie in Abb. 4.7
36
(c) Zeitlicher Gradient der Konzentrationsverläufe
Winkel α = 41◦
Gleiche Darstellung wie in Abb. 4.7
37
38
5 Ergebnisse
5.1 Auswertung mit MATLAB®
Die Auswertung der Rohdaten erfolgt mit Hilfe von Programmen1 , die unter dem
kommerziellen Programmpaket MATLAB® geschrieben wurden.
5.1.1 Kennzeichnung der Zelle
Um das Hintergrundrauschen aus den Bildern herauszufiltern, wird über die Verteilung der Grauwerte (die Intensitätsverteilung) des ersten aufgenommenen Bildes
eine Summe aus zwei Gaußfunktionen gefittet. Die erste Gaußfunktion stellt den
Intensitätsverlauf der Zelle - typischerweise mit einer höheren Intensität als der Hintergrund selbst - dar. Die zweite Gaußfunktion beschreibt den Intensitätsverlauf des
Hintergrundes. Der Schwellenwert für die Gesamtintensität wird knapp oberhalb des
kleineren Mittelwerts der beiden Gaußfunktionen angesetzt, so dass im Weiteren nur
der Intensitätsverlauf der Zelle betrachtet wird. Mit Hilfe des MATLAB® -internen
Skripts bwlabeln 2 werden zusammenhängende Regionen in den Bildern gekennzeichnet. So werden einzelne Zellen markiert und in einer Zeitreihe weiterverfolgt. Daraus
ergibt sich die Position der Zellen in jedem Bild. Der Rand3 der gekennzeichneten
Region wird als Cortex gekennzeichnet. Das Innere der Region wird als Zytosol
gekennzeichnet und in den weiteren Auswertungen vom Cortex getrennt betrachtet.
1
Diese wurden von Prof.Dr. Carsten Beta, Gabriel Amselem, Albert J. Bae, Matthias Theves und
Christian Westendorf geschrieben und von mir an die speziellen Ansprüche adaptiert.
2
Diesem unterliegt ein der Programmiersprache C entnommener Code. Eine genaue Beschreibung
ist in [44] zu finden.
3
Die Auswertungen werden für einen Durchmesser des ’Randes’ von 4 Pixeln (=1,
ˆ 6 µm) sowie
für einen Durchmesser von 3 Pixeln (=1,
ˆ 2 µm) durchgeführt.
39
5 Ergebnisse
5.1.2 Intensitätsverläufe und die Zellbewegung
Die x− und y−Koordinaten des Massenschwerpunkts der Zelle werden für die Bilder
einer Zeitreihe berechnet. Die Darstellung der Bewegung des Massenschwerpunktes im zeitlichen Verlauf wird im Weiteren als Zelltrack bezeichnet. Die Intensität
(getrennt für Zytosol und Cortex) wird pro Bild gemittelt und in ihrem zeitlichen
Verlauf dargestellt. Die Zeitpunkte der Stimuli werden gekennzeichnet, um eine Korrelation zwischen Intensitätsverlauf und Stimulus feststellen zu können.
Abb. 5.1: Ein typisches Bild der Intensitätsverläufe im Zytosol (rot) und im Cortex
(blau)
Die Intensität ändert sich in den ersten 30 Sekunden im Zytosol nicht,
da kein externer Stimulus anliegt. Während der periodischen Stimulation
hat die Intensität im Zytosol einen kreisperiodischen Verlauf. Die Schwingung der Zytosol-Intensität klingt in den letzten 70 Sekunden ab, da kein
externer Stimulus mehr vorliegt.
Anhand der Intensitätsverläufe kann entschieden werden, welche Zellen eine klare
Reaktion auf die Stimuli zeigen. Bei diesen Zellen zeigt die Intensitätsschwingung
im Zytosol den in Abb. 5.1 gezeigten charakteristischen Verlauf an.
40
5.2 Analyse der Ergebnisse
5.1.3 Frequenzanalyse der intrazellulären Antwort
In der Frequenzanalyse werden nur die Datensätze der reagierenden Zellen weiterverarbeitet. Diese werden zuvor im Bezug auf die speziell verwendeten Parameter der Aufnahme wie z.B. die Dyodenspannung gefittet. Die Anwendung eines
Hochpassfilters entfernt die Fehler, die von langsamen Fluktuationen der Intensität4
hervorgerufen werden. Die so bereinigten Datensätze werden überlagert und einer
schnellen Fouriertransformation (FFT) unterzogen. Diese Transformation ist eine
beschleunigte Variante der diskreten Fouriertransformation (DFT). Die DFT kann
auf zeitdiskrete, periodische Signale angewandt werden, die so als Superposition
eines Gleichwerts, einer Grundschwingung und der Oberschwingungen dargestellt
werden können.[14] Bei der Anwendung auf die Intensitätsverläufe im Zytosol und
im Cortex werden die Frequenzen und die Amplituden der Zellreaktionen errechnet.
Diese Daten können mit bereits bekannten Daten aus anderen Experimenten oder
Literaturdaten zur chemotaktischen Reaktion von eukaryotischen Zellen (siehe Kapitel 2.1) verglichen werden und zeigen auf in welchen Zeiträumen die Zellen auf
cAMP-Signale reagieren.
5.1.4 Parameter der chemotaktischen Reaktion
Es werden Histogramme der Geschwindigkeitskomponenten in x− und y−Richtung
und der Winkel der Bewegungsrichtung erstellt, um die Bewegung der Zellen5 zu
charakterisieren. Diese Bewegung gibt Aufschlüsse über die chemotaktische Reaktion
der Zellen. Die Histogramme werden aus je zwei aufeinanderfolgenden Bildern mit
einem Abstand von je einer Sekunde berechnet6 .
5.2 Analyse der Ergebnisse
Für die Messungen werden LIME-GFP-Mutanten aus zwei unterschiedlichen Stämmen verwendet (siehe Kapitel 2.2.1). Es ist bislang nicht bekannt, in welchen Eigenschaften sich die beiden Stämme unterschieden, da sie auf unterschiedliche Weise
aus dem AX1-Stamm gezüchtet wurden. Daher muss in der Auswertung zwischen
4
Diese Fluktuationen werden vor allem durch das Hintergrundrauschen hervorgerufen.
Genau genommen, wird nicht die Bewegung der Zellen, sondern die Bewegung ihres Massenschwerpunktes verfolgt.Für die potentielle Fehlerquelle, die dieses Vorgehen darstellt siehe Kapitel 6.4.1.
6
Für die potentielle Fehlerquelle, die dieses Vorgehen darstellt siehe Kapitel 6.4.1.
5
41
5 Ergebnisse
den Messungen an verschiedenen Stämmen unterschieden werden und es kann gezeigt werden, inwiefern sich beide Stämme in ihrer Reaktion auf die in Kapitel 4.2.2
dargestellten Stimuli unterscheiden.
5.2.1 Kontrollen
Die Kontrollen (Nr.K1 & Nr.K2)7 kennzeichnen die Bedingungen, die der chemotaktischen Bewegung zugrunde liegen. Damit dienen die Kontrollen einerseits dem
Vergleich der chemotaktischen Bewegung mit der ’random motion’ ohne externen
Stimulus (siehe Kapitel 3.1), andererseits kann aber durch sie auch ein Fehler in
den Daten durch mechanotaktische Reaktionen ausgeschlossen werden. Eine mechanotaktische Reaktion der Zellen erfolgt, wenn die Scherkräfte auf die Zellen durch
den Fluss im Kanal so groß sind, dass die Zellen sich gezielt in oder entgegen der
Richtung der Flussgeschwindigkeit bewegen.
5.2.2 Histogramme
Abb. 5.2: Definition der Geschwindigkeiten und des Winkels im Mikrofluidikkanal
Die ’imaging’-Region ist in blau gekennzeichnet, die Flussrichtung in grau,
die positive Richtung von vx in grün und die positive Richtung von vy in
schwarz (links).
Die Definition der Winkel erfolgt im Uhrzeigersinn (rechts).
Die Definition der Winkel und Geschwindigkeiten ist in Abbildung 5.2 dargestellt.
In den Histogrammen der Winkel ist der Winkel 180◦ in rot besonders hevorgehoben,
in den Histogrammen der Geschwindigkeiten die Geschwindigkeit 0 µm/min. Die Histogramme der Winkel basieren auf einer Unterteilung der Winkel in 10◦ -Abschnitte,
7
Pro Experimenttag werden zwei bis drei Kontrollen (unter gleichen Bedingungen wie die Experimente) aufgenommen und zur Auswertung nur diejenigen Kontrollen verwendet, in deren
zugehörigen Experimenten die Zellen auf externe Stimuli reagiert haben.
42
5.3 Resultate
die Histogramme der Geschwindigkeit auf einer Unterteilung der Geschwindigkeiten
in 1 µm/min-Abschnitte. Um die Verteilung der Winkel bzw. der Geschwindigkeiten zu
kategorisieren, wird die Schiefe (englisch: ’skewness’) der Histogramme, sowie der
Mittelwert berechnet.
Dabei berechnet sich die ’skewness’ (ys ) einer Verteilung wie folgt (Definition aus
[29]):
ys =
E(x − µ)3
σ3
(5.1)
Wobei x die Variable der Verteilung, E(x) der Erwartungswert von x, µ der Mittelwert von x und σ die Standardabweichung von x ist. Ist der Wert für die ’skewness’
positiv, so liegen mehr Werte oberhalb des Mittelwerts als unterhalb, umgekehrtes
gilt für einen negativen Wert der ’skewness’.
’half-population’-Test
Da die Daten ein relativ großes Rauschen enthalten (siehe Kapitel 6.4.1) müssen
die auftretenden Maxima in den folgenden Histogrammen auf ihre statistische Signifikanz geprüft werden. Dazu werden die zugrunde liegenden Daten einem ’halfpopulation’-Test8 unterzogen: Die Daten einer gesamten Experimentreihe werden
zufällig auf zwei Teilmengen verteilt. Zeigen die Histogramme der jeweiligen Teilmengen dieselben Maximumspositionen wie das Histogramm der Gesamtmenge, so
kann davon ausgegangen werden, dass tatsächlich ein Maximum vorliegt9 .
5.3 Resultate
In der Tabelle 5.2 sind noch einmal alle durchgeführten Experimentreihen zusammengefasst, die sich durch den Winkel α der angelegten ’uncaging’-Linie sowie durch
die Abmessungen der ’imaging’-Region unterscheiden. Zusätzlich ist der Anteil der
Zellen, die auf den angelegten Stimulus reagiert haben10 und deren Daten in die Auswertung einfließen, aufgeführt. Die mit der Nummer K1 und K2 gekennzeichneten
Experimentreihen entsprechen den in Kapitel 5.2.1 beschriebenen Kontrollen. Da
8
Dieser Test wurde von Albert J. Bae entwickelt.
Gleiches gilt für ein Minimum.
10
Eine Reaktion ist durch eine Translokation von LIME-GFP zum Cortex gekennzeichnet (wie in
Abb. 5.1 zu sehen).
9
43
5 Ergebnisse
Nr. Stamm
α
1
2
3
4
5
K1
K2
[◦ ]
25
25
41
25
0
-
AX2
AX2
AX2
AX3
AX2
AX2
AX3
’imaging’Region
[µm]
48 x 48
48 x 96
48 x 48
48 x 48
48 x 48
120 x 120
48 x 48
Pulslänge
[s]
1
1
1
1
5
-
Anteil der
reagierenden
Zellen
35/69
26/50
23/28
27/44
15/17
Kontrolle
Kontrolle
Tab. 5.2: Anteil der reagierenden Zellen in den verschiedenen durchnummerierten
Experimentreihen.
Die zugehörigen Geometrien sind in Abb. 4.4 erläutert.
kein ’uncaging’ stattfindet, sind weder der Winkel α noch die Pulslänge angegeben
- beide dienen zur Beschreibung des ’uncaging’.
5.3.1 Zellbewegung
Die Grafiken des ’half-population’-Tests finden sich im Anhang (A.1), da sie nur der
Bestätigung der gezeigten Histogramme dienen.
AX2-Experimente
Anhand der Geschwindigkeitsverteilung (Abb. 5.3) der Kontrolldaten (Nr.K1) in x−
und y−Richtung, kann eine Mechanotaxis in den durchgeführten Experimenten im
Bereich des Messfehlers ausgeschlossen werden, da die Geschwindigkeiten in diesen
nahezu isotrop verteilt sind. Dies kann in Abb. 5.3 an der überlagerten Gaußfunktion
gesehen werden.
Zunächst werden die Experimente mit der Konfiguration ’schräge Linie’ (siehe
Abb. 4.4b) in einer ’imaging’-Region von (48 × 48) µm betrachtet (Nr.1).
Einige Zellen bewegen sich von der Signalquelle weg11 . Es ist allerdings deutlich
zu erkennen, dass sich die reagierenden Zellen im Mittel mit Winkeln im Bereich
zwischen 90◦ und 180◦ bewegen. Einer der besonders langen Zelltracks (hellblau)
zeigt jedoch ein leicht anderes Verhalten. Die Zelle bewegt sich zunächst in diesem
Winkelbereich, ändert dann aber ihre Bewegungsrichtung. Dieses Verhalten wird im
11
i.e. im Winkel von 270◦ bis 90◦
44
5.3 Resultate
(a) normierte vx -Verteilung der Kontrollen
(b) normierte vy -Verteilung der Kontrollen
Abb. 5.3: Die normierten Geschwindigkeitsverteilungen in x− und y−Richtung der
Kontrollen (Nr.K1)
Die rote Kurve stellt eine Gaußverteilung dar. Die zugehörigen Parameter
sind in beiden Fällen ein Mittelwert von 0, 1338 und eine Varianz von
9, 1360 (berechnet mit MATLAB® ). Die rote vertikale Linie zeigt die
Geschwindigkeit 0 µm/min an. Die Unterteilung der x−Achse erfolgt in
1 µm/min Schritten. Anhand der Isotropie der Verteilungen lässt sich eine
mechanotaktische Reaktion ausschließen.
Folgenden weiter untersucht, indem die ’imaging’-Region auf (48×96) µm vergrößert
wird (Nr.2). So kann die Reaktion der Zellen für eine längere Zeit beobachtet werden
(siehe Kapitel 4.2.2). Allerdings befinden sich die Zellen dadurch im Mittel zu Beginn
der Stimulation deutlich weiter von der Signalquelle entfernt.
Um die Bewegungsrichtung der Zellen genau zu untersuchen werden Histogramme der Winkel und der Geschwindigkeiten in x− und y−Richtung betrachtet. Die
45
50
50
40
40
30
30
20
20
10
10
y [µ m]
y [µ m]
5 Ergebnisse
0
0
−10
−10
−20
−20
−30
−30
−40
−40
−50
−50
−40
−30
−20
−10
0
10
x [µ m]
20
30
40
−50
−50
50
−40
(a) Experimentreihe Nr.1
−30
−20
−10
0
10
x [µ m]
20
30
40
50
(b) Experimentreihe Nr.2
100
80
60
40
y [µ m]
20
0
−20
−40
−60
−80
−100
−100 −80
−60
−40
−20
0
20
x [µ m]
40
60
80
100
(c) Experimentreihe Nr.K1, Kontrollen
Abb. 5.4: Überlagerter Zelltrack der Experimentreihen Nr.1, Nr.2 und der zugehörigen Kontrollen ( Nr.K1)
Dargestellt ist die Bewegung des Massenschwerpunktes.
Das ∇-Zeichen zeigt die Endpunkte der Zellbewegungen an, das 4-Zeichen
die Startpunkte, die alle artifiziell auf einen Punkt gelegt werden. Die
Grösse der abgebildeten Region entspricht nicht der Grösse der ’imaging’Region12 . Die uncaging-Region hat eine Länge von 48µm in y-Richtung
(siehe auch Abb. 4.4). Die Zelltracks verschiedener Zellen sind durch unterschiedliche Farben gekennzeichnet und die roten Punkte kennzeichnen
die Zeitpunkte der Stimuli.
46
5.3 Resultate
folgenden Histogramme zeigen die Verteilung der Winkel13 . Auf der y−Achse sind
die Anzahlen der auftretenden Winkel und auf der x−Achse die Winkel abgetragen.
In der Experimentreihe Nr.1 zeigt sich ein Maximum unterhalb von 180◦ ebenso
wie im Bereich von 320◦ . Das erste Maximum deutet auf eine leichten Trend der
Bewegung in negative y−Richtung hin. Das zweite Maximum deutet an, dass einige Zellen in die positive x−Richtung laufen. Der Wert der ’skewness’ liegt bei 0, 1
und der Mittelwert bei 182, 58◦ . Dies zeigt an, dass die Winkelverteilung leicht zu
Winkeln oberhalb von 182, 58◦ verschoben ist. Das deutet im Gegensatz zu der vorherigen Beobachtung eine leichte Bewegung in negative y−Richtung an. Allerdings
liegt das am Einfluss der Zellen, die in positive x−Richtung laufen. Die Zellen, die
auf die Signalquelle zulaufen bewegen sich in negative y−Richtung (vergleiche Abb.
5.4a)
In der Experimentreihe Nr.2 zeigt sich ein Maximum oberhalb von 180◦ . Der
Mittelwert liegt bei 175, 19◦ und die ’skewness’ bei 0, 67. Dieses deutet auf einen
leichten Trend der Bewegung in positive y−Richtung hin.
Diese Trends sind auch in den zugehörigen überlagerten Zelltracks zu erkennen
(Abb. 5.4). Die Kontrolldaten (Nr.K1) hingehen sind nahezu gleichverteilt. Eine
nähere Betrachtung durch den ’half-population’-Test (siehe Kapitel 5.2.2) zeigt, dass
diese Maxima auch in den Teilmengen der Experimentreihen auftreten (siehe Abb.
A.1, Abb. A.2).
Die Verteilung der Geschwindigkeiten in x−Richtung14 zeigt eine leichte Verschiebung zu negativen Geschwindigkeiten in den Experimentreihen Nr.1 & Nr. 2, sowie
eine Gleichverteilung in den Kontrollen Nr. K1.
Der Mittelwert in der Experimentreihe Nr.1 beträgt −2, 58 µm/s mit einer skewness
von 1, 14. Der Mittelwert in der Experimentreihe Nr.2 beträgt −2, 62 µm/s mit einer
skewness von 1, 33. Dies impliziert eine verstärkte Bewegung der Zellen in negative
x−Richtung im Fall der Stimulierung, sowie eine ungerichtete Bewegung im Fall
ohne Stimulierung: Die Zellen bewegen sich in den Experimentreihen Nr.1 & Nr. 2
auf die Signalquelle zu. Gleiches ist im ’half-population’-Test (siehe Abb. A.7, Abb.
A.6) zu sehen, obwohl die Ausprägung in der Experimentreihe Nr.2 deutlich stärker
ist als in der Experimentreihe Nr.1.
Die Verteilung der Geschwindigkeiten in y−Richtung15 zeigt zunächst keine deutliche Abweichung der Experimentreihen Nr.1 & Nr.2 von den Kontrolldaten Nr. K1.
unterteilt in Bereiche von 10◦
unterteilt in Bereiche von 1 µm/min
15
unterteilt in Bereiche von 1 µm/min
13
14
47
5 Ergebnisse
160
250
140
200
120
Anzahl
Anzahl
100
80
150
100
60
40
50
20
0
0
50
100
150
200
250
Winkel [Grad]
300
350
0
0
50
100
150
200
250
Winkel [Grad]
300
350
(c) Kontrollen, Experimentreihe Nr. K1
Abb. 5.5: Vergleich der Winkelverteilung der AX2-Experimente (Nr.1 & 2) und der
zugehörigen Kontrollen (Nr.K1)
Die rote vertikale Linie stellt den Winkel 180◦ dar (zur Definition der Winkel siehe Abb. 5.2). Die Unterteilung der x−Achse erfolgt in 10◦ -Schritten.
In den Daten der Experimentreihe Nr.1 sind aufgrund des starken Rauschens keine
Maxima zu erkennen. Der Mittelwert der Experimentreihe Nr.1 liegt bei −0, 55 µm/s
mit einer skewness von 1, 3. Dies deutet auf eine leichte Bewegung in negative
y−Richtung hin. Der Mittelwert der Experimentreihe Nr.2 liegt bei −0, 48 µm/s mit
48
5.3 Resultate
180
160
250
140
200
Anzahl
number
120
100
80
150
100
60
40
50
20
0
−40
−20
0
vx [µ m/min]
20
40
0
−40
−20
0
vx [µ m/min]
20
40
(c) Kontrollen, Experimentreihe Nr.K1
Abb. 5.6: Vergleich der Geschwindigkeitsverteilung in x−Richtung der AX2Experimente (Nr.1 & Nr.2) und der zugehörigen Kontrollen (Nr.K1).
Die rote vertikale Linie stellt die Geschwindigkeit 0 µm/min dar. Die Unterteilung der x−Achse erfolgt in 1 µm/min- Schritten. Der Geschwindigkeitsverteilung der Kontrollen ist in rot eine Gaußfunktion überlagert, deren
Mittelwert 0, 1338 und Varianz 9, 1360 beträgt. Der Mittelwert des Histogramms der Kontrollen beträgt −0, 58.
einer skewness von 1, 51. Dies deutet ebenso auf eine leichte Bewegung der Zellen in
negative y−Richtung hin.
49
5 Ergebnisse
200
300
250
150
Anzahl
Anzahl
200
100
150
100
50
50
0
−40
−20
0
vy [µ m/min]
20
40
0
−40
−20
0
vy [µ m/min]
20
40
(c) Kontrollen, Experimentreihe Nr.K1
Abb. 5.7: Vergleich der Geschwindigkeitsverteilung in y−Richtung der AX2Experimente (Nr.1 & Nr.2) und der zugehörigen Kontrollen (Nr.K1)
Die rote vertikale Linie stellt die Geschwindigkeit 0 µm/min dar. Die Unterteilung der x−Achse erfolgt in 1 µm/min- Schritten. Der Geschwindigkeitsverteilung der Kontrollen ist in rot eine Gaußfunktion überlagert, deren
Mittelwert 0, 1338 und Varianz 9, 1360 beträgt (ebenso wie in der Verteilung der Geschwindigkeiten in x−Richtung, berechnet mit MATLAB® ).
Der Mittelwert des Histogramms der Kontrollen beträgt −0, 07.
50
5.3 Resultate
Zur weiteren Untersuchung des räumlichen Auflösungsvermögen der Zellen wird
der Winkel α von 25◦ auf 41◦ deutlich vergrößert16 , und somit der Konzentrationsgradient in y-Richtung verstärkt. Die Zellen bewegen sich verstärkt in negative
x−Richtung und präferieren dabei einen Winkel von θ zwischen 180◦ und 210◦ .
50
40
30
20
y [µ m]
10
0
−10
−20
−30
−40
−50
−50
−40
−30
−20
−10
0
10
x [µ m]
20
30
40
50
Abb. 5.8: Überlagerter Zelltrack der Experimentreihe Nr.3
Symbolik analog zu Abb. 5.4
Die Winkelverteilung zeigt ebenso ein Maximum im Bereich zwischen 170◦ und
210◦ , sowie ein zusätzliches Maximum im Bereich von 330◦ bis 360◦ . Das erste Maximum deutet eine leicht in positive y−Richtung verschobene Vorwärtsbewegung
an, das zweite eine Bewegung in negative x−Richtung. Diese Ergebnisse werden
durch den ’half-population’-Test (siehe Abb. A.3) bestätigt. Der Mittelwert liegt bei
183, 73◦ mit einer ’skewness’ von 1, 27. Diese Werte bestätigen die Bewegung in
positive y−Richtung.
Die Geschwindigkeitsverteilung in x−Richtung zeigt eine deutliche Verschiebung
zu negativen Werten an. Der Mittelwert liegt bei −3, 14 µm/min mit einer ’skewness’
von 1, 22. Die Zellen bewegen sich sehr gezielt auf die Signalquelle17 zu. Diese Ergebnisse werden durch den ’half-population’-Test (siehe Abb. A.8) bestätigt.
Die Geschwindigkeitsverteilung in y−Richtung zeigt eine deutliche Verschiebung
zu positiven Geschwindigkeiten. Der Mittelwert liegt bei 0, 05 µm/min mit einer ’skewness’ von 1, 64. Die Zellen bewegen sich in positive y−Richtung. Diese Ergebnisse
werden durch den ’half-population’-Test (siehe Abb. A.13) bestätigt.
16
17
bis nahezu zum maximal möglichen experimentell ansetzbaren Winkel von 45◦
i.e. in negative x−Richtung
51
5 Ergebnisse
In einer weiteren Experimentreihe wird die Dauer des Stimulus bei gleichbleibender Periode erhöht. Dadurch wird die Dauer der konstanten Konzentration im
Scheitelpunkt der Welle fünffach erhöht. Die ’uncaging’-Region entspricht dabei der
Konfiguration der ’geraden Linie’ (siehe Abb. 4.4 a). Die Länge der aufgenommenen
Reaktionen beträgt in etwa 340 Sekunden. Eine direkte Invertierung der Zeiten18
führt dazu, dass die Zellen sich durch die andauernde Stimulation sehr stark zusammenziehen (’cringing’) und somit die Adhäsionsfläche stark verringert wird. Aufgrund dieses Umstandes ist ein Kräftegleichgewicht zwischen Adhäsionskraft und
der Scherkraft, die die strömenden Flüssigkeit auf die Zelle ausübt, nicht mehr gegeben und die Zelle wird fortgespült. Setzt man voraus, dass durch die verwendete
’uncaging’-Technik das gesamte ccAMP freigesetzt wird, so herrscht eine Konzentration von 10 µM cAMP, während der Dauer des ’uncaging’. Diese Konzentration
ist zehn Mal höher als die maximale übliche Konzentration von 1 µM (siehe Kapitel
2.3.1, [38]) und führt vermutlich zu der starken Reaktion der Zellen (dem ’cringing’).
Wird die Aktivierungsdauer allerdings auf fünf Sekunden bei einer Periode von
zehn Sekunden verringert, bleibt das Kräftegleichgewicht erhalten. Anhand des überlagerten Zelltracks (Abb. 5.10) wird deutlich, dass die Zellen auch dieses Signal detektieren können: Sie bewegen sich auf die Signalquelle zu. Außerdem zeigen nahezu
alle beobachteten Zellen eine Reaktion auf das Signal; dies ist bei einer kürzeren Aktivierungsdauer nicht der Fall (siehe Tab. 5.2). Die Zellen bewegen sich insgesamt
deutlich weniger19 als bei der ursprünglichen Aktivierungsdauer von einer Sekunde
(siehe auch Abb. 5.11). Ab der zweiten Aktivierungsperiode bewegen sich die Zellen
sehr langsam.
In den Histogrammen sind keine klaren Maxima zu erkennen.
Die Anwendung des ’half-population’-Tests (siehe Abb. A.5, Abb. A.10 und Abb.
A.15) ist in diesem Fall kritisch, da die Anzahl der Datensätze (siehe Tab. 5.2) sehr
gering ist.
18
19
i.e. eine Aktivierungsdauer von neun Sekunden bei einer Periode von zehn Sekunden
maximal 35 µm in x−Richtung
52
5.3 Resultate
200
160
140
150
100
Anzahl
Anzahl
120
80
100
60
50
40
20
0
−40
−20
0
vx [µ m/min]
20
0
−40
40
(a) Geschwindigkeitsverteilung in x−Richtung
−20
0
vy [µ m/min]
20
40
(b) Geschwindigkeitsverteilung in y−Richtung
180
160
140
Anzahl
120
100
80
60
40
20
0
0
50
100
150
200
250
Winkel [Grad]
300
350
(c) Winkelverteilung
Abb. 5.9: Histogramme der Experimentreihe Nr.3
Die rote vertikale Linie stellt die Geschwindigkeit 0 µm/min bzw. den Winkel 180◦ dar. Die Unterteilung der x−Achse erfolgt in 1 µm/min- bzw. 10◦ Schritten.
53
5 Ergebnisse
50
40
30
20
y [µ m]
10
0
−10
−20
−30
−40
−50
−50
−40
−30
−20
−10
0
10
x [µ m]
20
30
40
50
Abb. 5.10: Überlagerter Zelltrack der Experimentreihe Nr.5
54
5.3 Resultate
(a) Verteilung der totalen Geschwindigkeit
in der Experimentreihe Nr.5
(b) Verteilung der totalen Geschwindigkeit
in den zugehörigen Kontrollen Nr.K1
(c) Differenz der normierten Verteilung der
totalen Geschwindigkeiten der Experimentreihen Nr.5 und Nr.K1
Abb. 5.11: Vergleich der Verteilung der totalen Geschwindigkeiten in der Experimentreihe Nr.5 und der zugehörigen Kontrollen Nr.K1
Die Unterteilung der x−Achse erfolgt in 1 µm/min Schritten.
a) & b) Die Geschwindigkeitsverteilungen in Experimentreihe Nr.5 und
Nr.K1
c) Die Differenz der totalen Geschwindigkeiten, wobei von der normierten Geschwindigkeitsverteilung der Experimentreihe Nr.5 die normierte
Geschwindigkeitsverteilung der Kontrollen Nr.K1 abgezogen wurde.
Es ist zu erkennen, dass die Differenz für Geschwindigkeiten ab 7 µm/min
stark negativ wird. Dies zeigt, dass die Zellen sich relativ langsam
gegenüber ihrer durchschnittlichen Geschwindigkeit in den Kontrollen
(16, 74 µm/min) bewegen.
55
5 Ergebnisse
250
250
200
Anzahl
Anzahl
200
150
150
100
100
50
50
0
−40
−20
0
vx [µ m/min]
20
40
0
−40
−20
0
vy [µ m/min]
20
40
Abb. 5.12: Histogramme der Experimentreihe Nr.5
Die rote vertikale Linie stellt die Geschwindigkeit 0 µm/min bzw. den Winkel 180◦ dar. Die Unterteilung der x−Achse erfolgt in 1 µm/min- bzw. in
10◦ -Schritten.
56
5.3 Resultate
AX3-Experimente
50
50
40
40
30
30
20
20
10
10
y [µ m]
y [µ m]
Im Zelltrack der Kontrolldaten (Nr.K2) lässt sich keine Beeinflussung der Zellbwegung in x−Richtung erkennen. Allerdings findet kaum eine Bewegung in y−Richtung
statt.
0
0
−10
−10
−20
−20
−30
−30
−40
−40
−50
−50
−40
−30
−20
−10
0
10
x [µ m]
20
30
40
50
−50
−50
−40
−30
−20
−10
0
10
x [µ m]
20
30
40
50
(a) Überlagerter Zelltrack der Experimentrei- (b) Überlagerter Zelltrack der Kontrolldaten
he Nr.4
Nr.K2
Abb. 5.13: Überlagerter Zelltrack der Experimentreihe Nr.4 und der zugehörigen
Kontrollen (Nr.K2)
Die Zellen der Experimentreihe Nr.4 bewegen sich im Mittel leicht in negative
y−Richtung. Allerdings ist die x−Richtung der Bewegung nicht eindeutig. Es bewegen sich wesentlich mehr Zellen in positive x−Richtung als bei allen anderen
Experimentreihen.
Die Winkelverteilung der Experimentreihe Nr.4 hat ein leichtes Maximum im
Bereich von 120◦ bis 200◦ . Der Mittelwert liegt bei 176, 75◦ mit einer ’skewness’ von
−0, 72. Dies deutet auf eine Bewegung der Zellen in negative y−Richtung hin, was
sich auch in dem ’half population’-Test (siehe Abb. A.4) der Winkelverteilung zeigt.
Die Kontrolldaten (Nr.K2) zeigen ein Maximum im Bereich von 300◦ bis 340◦ .
Die Geschwindigkeitsverteilungen in x− und y−Richtung zeigen keine klaren Maxima. Der Mittelwert der vx -Verteilung liegt bei −2, 03 µm/min mit einer ’skewness’
von 1, 37. Der Mittelwert der vy -Verteilung liegt bei −0, 34 µm/min mit einer ’skewness’ von 1, 56. Diese Werte deuten eine Bewegung in negative x−Richtung sowie
57
5 Ergebnisse
(b) Kontrollen, Experimentreihe Nr.K2
Abb. 5.14: Der Vergleich der Winkelverteilungen der Experimentreihe Nr.4 und der
zugehörigen Kontrollen (Nr.K2)
Die rote vertikale Linie stellt den Winkel 0◦ dar. Die Unterteilung der
x−Achse erfolgt in 10◦ -Schritten.
eine leichte Bewegung in negative y−Richtung an.
Die Geschwindigkeitsverteilungen der Kontrollen zeigen jeweils eine Präferenz in
positive Richtung.
Abb. 5.15: Vergleich der Geschwindigkeitsverteilungen in x−Richtung der AX3Experimente (Nr.4) und der zugehörigen Kontrollen (Nr.K2)
Die rote vertikale Linie stellt die Geschwindigkeit 0 µm/min bzw. den Winkel 180◦ dar. Die Unterteilung der x−Achse erfolgt in 1 µm/min- bzw. in
10◦ -Schritten. Der Geschwindigkeitsverteilung ist in rot eine Gaußfunktion überlagert, deren Mittelwert 0, 9219 und Varianz 8, 8746 beträgt (berechnet mit MATLAB® ). Der Mittelwert des Histogramms beträgt 0, 92.
58
5.3 Resultate
Abb. 5.16: Vergleich der Geschwindigkeitsverteilung in y−Richtung der AX3Experimente (Nr.4) und der zugehörigen Kontrollen (Nr.K2)
Die rote vertikale Linie stellt die Geschwindigkeit 0 µm/min dar. Die Unterteilung der x−Achse erfolgt in 1 µm/min Schritten. Der Geschwindigkeitsverteilung ist in rot eine Gaußfunktion überlagert, deren Mittelwert
0, 9219 und Varianz 8, 8746 beträgt (ebenso wie in der Verteilung der
Geschwindigkeiten in x−Richtung, berechnet mit MATLAB® ). Der Mittelwert des Histogramms beträgt 0, 55.
5.3.2 Intrazelluläre Antwort
Das Frequenzspektrum, das aus den gemessenen Intensitätsverläufen getrennt für
den Cortex und das Zytosol berechnet wurde, weist stets ein deutliches Maximum
bei der Frequenz f = 0, 1 Hz auf. Der Verlauf im Zytosol und im Cortex unterscheiden sich kaum. Als beispielhaftes Frequenzspektrum sei nur das Frequenzspektrum
der Experimentreihe Nr.1 dargestellt. Alle übrigen Frequenzspektren finden sich im
Anhang (A.2).
59
5 Ergebnisse
(a) Frequenzspektrum der Reaktion des Cortex
(b) Frequenzspektrum der Reaktion des Zytosols
Abb. 5.17: Frequenzspektren der Reaktionen der Experimentreihe Nr.1
Angegeben ist der jeweilige absolute Amplitudenwert zu den auftretenden
Frequenzen der intrazellulären Antwort (getrennt für Cortex und Zytosol). Betrachtet wurde die Zeitspanne von 44 s − 150 s nach Beginn des
Experiments.
60
6 Diskussion
6.1 Normierte Histogramme
Um eine deutlichere Aussage über die Verteilung der Winkel und Geschwindigkeiten treffen zu können, werden von den normierten Histogrammen der Experimente
die normierten Histogramme der Kontrollen abgezogen. Der kleinste Wert der resultierenden Differenz wird auf null gesetzt. Dadurch ergeben sich Histogramme der
chemotaktischen Reaktionen, die um die ’random motion’ ’bereinigt’ sind. Diese
zeichnen sich durch eine deutlich stärkere Ausprägung der Maxima, die jedoch an
denselben Positionen wie in den unnormierten Histogrammen auftreten, aus.
Allein bei der Experimentreihe Nr.2 zeigt sich in den normierten Histogrammen
noch ein zusätzliches Maximum in der Winkelverteilung im Bereich von 90◦ sowie
in den Geschwindigkeitsverteilungen der Experimentreihe Nr.5 ein Maximum im
Bereich von 0◦ .
Für einen Winkel von α = 25◦1 bewegen sich die Zellen zunächst in einem Winkelbereich knapp unterhalb von 180◦ , ändern bei längeren Beobachtungszeiten2 jedoch
ihre Richtung und präferieren Winkel von 160◦ bis 230◦ (siehe Abb. 6.1). Die Verteilung der Geschwindigkeiten zeigt für kürzere Beobachtungsdauern kaum bevorzugte
Geschwindigkeiten - weder in x−, noch in y−Richtung. Für längere Beobachtungszeiten werden deutlich negative x− und y−Geschwindigkeiten bevorzugt (siehe Abb.
6.2 und Abb. 6.3).
Wird der Winkel α auf 41◦3 vergrößert, so bewegen sich die Zellen auch bei kürzeren Beobachtungszeiten im Winkelbereich von 170◦ bis 210◦ (siehe Abb. 6.4c). Die
Geschwindigkeitsverteilungen zeigen eine leichte Bevorzugung der positiven y−Richtung
sowie eine deutliche Bevorzugung der negativen x−Richtung (siehe Abb. 6.4a, b).
Für eine verlängerte Pulsdauer von fünf Sekunden zeigen die Zellen eine Verringerung der Geschwindigkeit, bewegen sich aber dennoch auf das Signal zu. Die Anzahl
1
3
2
61
6 Diskussion
Abb. 6.1: Normierte Winkelverteilung der AX2-Experimente (Nr.1 & Nr.2) abzüglich der Histogramme der zugehörigen Kontrollen (Nr.K1)
Indem die normierten Histogramme der Kontrollen von den Histogrammen
der Winkel abgezogen werden, ergibt sich die Winkelverteilung der chemotaktischen Reaktion ohne die ’random motion’. Der kleinste vorkommende
Wert für den normierten Anteil wird auf 0 gesetzt. Die Unterteilung der
Winkel erfolgt in 10◦ -Abschnitten.
Abb. 6.2: Normierte Geschwindigkeitsverteilung in x−Richtung der AX2Experimente (Nr.1 & Nr.2),
Die rote vertikale Linie stellt die Geschwindigkeit 0 µm/min dar. Die
Unterteilung der x−Achse erfolgt in 1 µm/min Schritten. Für weitere
Angaben siehe Abb. 6.1
der reagierenden Zellen liegt bei nahezu neunzig Prozent (siehe Tab. 5.2).
Die Zellen des Stamms AX3 bewegen sich bevorzugt in Winkelbereichen von 120◦
bis 200◦ (siehe Abb. 6.6c). Dies ist allerdings aufgrund des starken Rauschens in dem
Histogramm der Winkelverteilung nicht eindeutig. Die Geschwindigkeitsverteilungen
62
Abb. 6.3: Normierte Geschwindigkeitsverteilung in y−Richtung der AX2Experimente (Nr.1 & Nr.2).
Die rote vertikale Linie stellt die Geschwindigkeit 0 µm/min dar. Die
Unterteilung der x−Achse erfolgt in 1 µm/min Schritten. Für weitere
Angaben siehe Abb. 6.1
zeigen eine deutliche Bevorzugung der negativen x− und y−Richtung (siehe Abb.
6.6a, b).
63
6 Diskussion
(a)
Geschwindigkeitsverteilung
x−Richtung
in
(b)
y−Richtung
in
Abb. 6.4: Normierte Histogramme der Experimentreihe Nr.3.
Die rote vertikale Linie stellt die Geschwindigkeit 0 µm/min bzw. den Winkel
180◦ dar. Die Unterteilung der x−Achse erfolgt in 1 µm/min Schritten bzw.
in 10◦ -Schritten. Für weitere Angaben siehe Abb. 6.1
64
(a)
x−Richtung
in
(b)
y−Richtung
in
Die rote vertikale Linie stellt die Geschwindigkeit 0 µm/min dar. Die Unterteilung der x−Achse erfolgt in 1 µm/min Schritten. Für weitere Angaben
siehe Abb. 6.1
65
6 Diskussion
(a)
x−Richtung
in
(b)
y−Richtung
in
Die rote vertikale Linie stellt die Geschwindigkeit 0 µm/min dar. Die Unterteilung der x−Achse erfolgt in 1 µm/min Schritten. Für weitere Angaben
siehe Abb. 6.1
66
6.2 Vergleich der Daten
6.2.1 Experimentreihe Nr.1
Die Daten aus der Experimentreihe Nr.1 können mit Daten verglichen werden, die
aus Experimenten mit periodischer Stimulation gleicher Periode4 , gleichen Abmessungen der ’imaging’-Region, gleichem Zellstamm, aber ohne zusätzlichen Gradienten in y-Richtung stammen5 . Dieser Vergleich zeigt direkt die Veränderungen auf,
die sich in der Reaktion durch einen zusätzlichen Gradienten in y−Richtung ergeben.
In Experimenten ohne den zusätzlichen Gradienten in y−Richtung (siehe Anhang
C.1) ergibt sich keine Beeinflussung der Bewegung in y−Richtung. Die Bewegung ist
lediglich in negative x−Richtung beeinflusst, so dass die Zellen auf die Signalquelle
zu wandern. Die Winkelverteilung zeigt ein sehr breites Maximum um den Wert
180◦ . Die Geschwindigkeiten in x−Richtung sind deutlich zu den Bereichen negativer
Geschwindigkeit verschoben, d.h. die Zellen bewegen sich auf die Signalquelle zu. In
y−Richtung ist keine Beeinflussung zu erkennen.
In der Experimentreihe Nr.2 wird die Ausdehnung der ’imaging’-Region verändert,
deshalb werden die Ergebnisse dieser Reihe nur mit denen der Experimentreihe Nr.1
verglichen. Die Zellen können im Mittel länger beobachtet werden. Es tritt eine deutlich verstärke Bevorzugung negativer Geschwindigkeiten in x− und y−Richtung auf.
Der Anteil der reagierenden Zellen ist nahezu gleich dem Anteil in Experimentreihe
Nr.1 (52, 0% im Vergleich zu 50, 7%, siehe Tab. 5.2). Es zeigt sich, dass ein Richtungswechsel im Verlauf der Beobachtung eintritt. Dieser Richtungwechsel erfolgt,
wenn sich die Zellen am äußeren negativen y−Punkt der ’imaging’-Region befinden.
Selbiges Verhalten zeigt sich auch für die Experimente der Experimentreihe Nr.1,
sobald die Zellen in den Bereich des oben genannten Randeffekts kommen6 .
Da die ’uncaging’-Linie aber in y−Richtung die gleiche Ausdehnung wie die ’imaging’-Region hat, treten an diesem Punkt Randeffekte durch laterale Diffusion auf.
Diese Randeffekte erzeugen also einen zusätzlichen Gradienten am Rand der ’imaging’-Region. Diesen scheinen die Zellen deutlich zu spüren, so dass eine Richtungs4
zehn Sekunden
Diese Daten wurden zuvor von Christian Westendorf aufgenommen, siehe Anhang C.1.
6
also sowohl am oberen als auch am unteren horizontalen Rand der ’imaging’-Region
5
67
6 Diskussion
änderung zum Bereich der höheren Konzentration (i.e. in positive y−Richtung) erfolgt.
Um dieses Verhalten näher zu untersuchen, werden Histogramme für die verschiedenen Bewegungsanteile erstellt. Der durchschnittliche Zeitpunkt der Richtungsänderung liegt bei 180 Sekunden nach Beginn des Experiments bzw. 150 Sekunden
nach dem ersten Puls. Daher werden Histogramme für den Zeitraum von 90 − 179
Sekunden, sowie für den Zeitraum von 180 − 270 Sekunden erstellt. Beide Angaben beziehen sich auf den Startpunkt des Experiments. Die Unterteilung wird so
gewählt, dass beide Zeiträume die gleiche Länge haben, damit sie vergleichbar sind.
Allerdings muss erwähnt werden, dass der zweite Zeitraum weniger Datenpunkte
enthält, da nicht alle Zellen für 270 Sekunden beobachtet werden konnten (siehe
Kapitel 4.2).
Dabei zeigt sich, dass die Präferenz für negative x−Geschwindigkeiten vor der
Richtungsänderung der Zellen deutlich größer ist, d.h. sie wandern auf die Signalquelle zu. Nach der Richtungsänderung der Zellen ergibt sich eine Bevorzugung von
positiven x−Geschwindigkeiten, d.h. die Zellen entfernen sich von der Signalquelle.
Die Verteilung der y−Geschwindigkeiten zeigt ein nicht so klares Bild. Allerdings
sind die negativen y−Geschwindigkeiten eher im ersten Zeitraum enthalten, die positiven eher im zweiten Zeitraum, d.h. nach der Richtungsänderung. Spüren die Zellen
also noch keine Randeffekte wandern sie in negative y−Richtung auf die Signalquelle
zu. Der starke Gradient, der durch die Randeffekte erzeugt wird, scheint die Zellen
deutlich zu beeinflussen. Bei der Wanderung in den Bereich der höheren Konzentration ab dem Richtungswechsel, i.e. in positive y−Richtung, scheint kaum eine
Bewegung in negative x−Richtung zu erfolgen. Die Zellen sind also eher bestrebt
in den Bereich zu gelangen, in dem ein Gradient durch die ’uncaging’-Linie erzeugt
wird, als direkt auf die Quelle zuzuwandern. Dies erscheint aufgrund des stärkeren
Gradienten, der durch die Randeffekte erzeugt wird, eine sinnvolle Interpretation zu
sein.
Die Winkelverteilung ist nicht eindeutig, scheint allerdings eine Bevorzugung von
Winkeln zwischen 140◦ und 190◦ sowie zwischen 220◦ und 270◦ im Zeitraum vor der
Umkehr zu zeigen, was einer Bewegung in negative x−Richtung und im ersten Fall in
negative y-Richtung sowie im zweiten Fall in positive y−Richtung zeigt. Die Winkel
zwischen 0◦ bis 40◦ sind stärker ab dem Zeitpunkt der Richtungsumkehr vertreten.
Diese Verteilung deutet auf eine Bewegung in negative x− und y−Richtung ab dem
Zeitpunkt der Richtungsumkehr hin. Da diese Beobachtung aber den Beobachtun-
68
(a) Differenz der Geschwindigkeitsverteilungen in x−Richtung
(b) Differenz der Geschwindigkeitsverteilung in y−Richtung
(c) Differenz der Winkelverteilung
Abb. 6.7: Vergleich der Zeitskalen in Experimentreihe Nr.2
Die rote vertikale Linie stellt die Geschwindigkeit 0 µm/min bzw. den Winkel 180◦ dar. Die Unterteilung der x−Achse erfolgt in 1 µm/min- bzw. 10◦ Schritten.
Die normierten Histogramme des zweiten Zeitraums - i.e. von 180 − 270
Sekunden, also ab dem Umkehrzeitpunkt der Zellen - werden von den normierten Histogrammen des ersten Zeitraums - i.e. von 90 − 179 Sekunden,
also vor dem Umkehrzeitpunkt - abgezogen. Eine positive Differenz zeigt,
dass die jeweiligen Werte vor der Umkehr stärker vertreten waren. Eine
negative Differenz zeigt, dass die Werte nach der Umkehr stärker vertreten
sind.
gen aus den Geschwindigkeitshistogrammen und den Zelltracks widersprechen und
außerdem nicht sehr ausgeprägt in der Winkelverteilung zu sehen sind, sollte eine
Beschreibung der Zellbewegung eher auf der Grundlage der Geschwindigkeitshistogramme erfolgen.
69
6 Diskussion
Die Reaktionen der Zellen in Experimentreihe Nr.3 und Experimentreihe Nr.1 weisen deutliche Unterschiede auf. In Experimentreihe Nr.3 zeigen die Zellen kaum eine
Richtungsänderung in ihrer Bewegung, sondern wandern gleich zu Beginn der Stimulation in leicht positive y-Richtung. Auch die Geschwindigkeitsverteilungen zeigen
wesentlich deutlichere Maxima. Die Anzahl der reagierenden Zellen liegt deutlich
höher (82, 1% im Vergleich zu 50, 7%, siehe Tab. 5.2).
In der Experimentreihe Nr.4 wird ein anderer Stamm (AX3, siehe Kapitel 2.2.1)
verwendet. Die Stämme AX2 und AX3 wurden auf verschiedene Arten aus dem
Stamm AX1 gezüchtet. Daher ist nicht klar, in welchen Eigenschaften sich die beiden Stämme unterscheiden. Die Experimentreihe Nr.4 wird daher nur mit der Experimentreihe Nr.1 verglichen.
Es zeigt sich, dass die Stämme AX2 und AX3 im Bereich des Fehlers keinen Unterschied in ihrem Verhalten gegenüber einem zusätzlichen Gradienten in y-Richtung
aufweisen.
Kontrollen
Die Kontrollen Nr. K2 aus der Experimentreihe Nr.4 scheinen nicht gänzlich isotrop
verteilt zu sein. Allerdings liegen die Bereiche der Beeinflussung innerhalb der Fehlerintervalle, so dass eine mechanotaktische Reaktion unwahrscheinlich erscheint.
Außerdem wird ebenso wie in den Kontrollen Nr. K1 festgestellt, dass die Zellen
sich vermehrt parallel zum Fluss bewegen. Eine tangentiale Bewegung findet in den
Kontrollen kaum statt. Der Grund für dieses Verhalten ist nicht bekannt.
6.2.5 Intrazelluläre Antwort
Eine Frequenzanalyse der intrazellulären Antwort zeigt dasselbe Bild wie in Experimenten mit einer Periode von zehn Sekunden und einem Winkel von α = 0◦ . Die
bevorzugte Frequenz liegt bei 0, 1 Hz.
Wird der Verlauf der gemittelten Intensität des Zytosols und somit die Reaktion
von LIME-GFP7 betrachtet, so ist zu sehen, dass das Maximum nicht zum Zeitpunkt
7
und dadurch indirekt F-Aktin
70
6.3 Experimentreihe Nr.5
Abb. 6.8: Verlauf der zellulären Antwort des Zytosols der Experimentreihe Nr.1
Die ∆-Symbole stellen die Zeit in Sekunden dar. In lila ist der Zeitpunkt
des einsetzenden Pulses gekennzeichnet, der eine Sekunde anhält und mit
einer Periode von zehn Sekunden auftritt.
Die gemittelte Intensität erreicht ihr Maximum nicht zum Zeitpunkt des
Pulses, sondern in etwa zwei Sekunden nach Einsetzen des Signals.
des Pulses, sondern in etwa zwei Sekunden nach Einsetzen des Signals, erreicht wird
(Abb. 6.8). Diese Phasenverschiebung der Antwort wurde ebenso in Experimenten
mit α = 0◦ und einer Periode von zehn Sekunden beobachtet. Allerdings setzt dort
das Maximum erst fünf Sekunden nach dem Puls ein (vergleiche Abb. C.3). Die
Gründe für die Phasenverschiebung der intrazellulären Antwort sind nicht bekannt
und sind Bestandteile der aktuellen Forschung. Den maximalen Absolutwert haben alle durchgeführten Experimentreihen nach einer FFT bei einer Frequenz von
0, 1 Hz. Dies konnte auch bei Experimenten ohne zusätzlichen y−Gradienten beobachtet werden (siehe Abb. C.4). Hierzu ist allerdings anzumerken, dass vor allem die
Frequenzanalyse der Experimentreihe Nr.1 auf einer geringen Datendichte basiert,
da die Zellen in dieser Experimentreihe nur für kurze Zeiträume beobachtet werden
konnten (siehe auch Kapitel 6.4.1).
6.3 Experimentreihe Nr.5
Die Zellen zeigen bei einem verlängerten Puls von fünf Sekunden, d.h. einer deutlich
verlängerten Plateauphase des Konzentrationsgradienten, eine deutliche Reaktion.
Für die Detektion eines Signals scheint daher der positive Gradient der einlaufen-
71
6 Diskussion
den Welle entscheidend zu sein; dieser wird nicht durch eine längere Plateauphase
beeinflusst. Die verminderte Bewegung kann auf die verstärkte Adaption durch die
verlängerten hohen Konzentrationen in der Plateauphase zurückgeführt werden. Die
Rezeptoren befinden sich dadurch beständig in der Refraktionsphase, d.h. sie können kaum neues cAMP binden und die erneuten cAMP-Wellen können nur schlecht
detektiert werden (siehe Kapitel 2.3.1).
6.4 Fehleranalyse
Die Fehler in den numerischen Berechnungen des Konzentrationsprofils wurden schon
in Kapitel 4.3.2 erläutert. Daher sei hier nur auf diese verwiesen.
6.4.1 Durch den Experimentaufbau verursachte Fehler
Rauschen des Massenschwerpunkts
Durch die geringe Zeit von einer Sekunde zwischen zwei Aufnahmen ist die Beeinflussung der Daten durch das Rauschen des Massenschwerpunkts sehr stark. Dieses Rauschen wird dadurch erzeugt, dass die Zellen sich in drei Raumrichtungen bewegen8 ,
die konfokale Laser-Scanning-Mikroskopie aber nur die Bewegung in zwei Raumrichtungen abbilden kann. Durch die zusätzliche Bewegung in der dritten Raumrichtung
verschiebt sich der Massenschwerpunkt in der x-y-Ebene leicht, obwohl in dieser Ebene keine Bewegung stattfindet. Dieses Rauschen zeigt sich deutlich in den erstellten
Histogrammen. Diese wurden erneut mit einer Differenz von fünf Sekunden zwischen
den Bildern berechnet, lieferten allerdings bezüglich der Position der Maxima dieselben Ergebnisse. Größere Abstände zwischen den Bildern erscheinen aufgrund der
geringen Anzahl der Bilder pro Sequenz9 nicht sinnvoll.
Dauer der Aufnahmen
Die geringe Dauer der Aufnahmen (maximal 340 Sekunden) ist nicht lang genug,
um eine eindeutige Reaktion der Zellen beobachten zu können, die nicht von der
anfänglichen Polarisation der Zellen abhängt (siehe auch Kapitel 6.4.2). Außerdem
fließt durch eine kurze Aufnahmezeit das Rauschen des Massenschwerpunktes stark
in die Auswertung ein. Die Dauer der Aufnahmen bildet auch eine Fehlerquelle für
8
9
Sie bewegen sich nur begrenzt in z−Richtung, da sie am Deckgläschen adheriert sind.
während der Stimulation maximal 240
72
6.4 Fehleranalyse
die erstellten Frequenzspektren. Für diese wurden Zeiträume von etwa 100 Sekunden
verwendet.
Dauer des Signals
Die Anregungsperiode von zehn Sekunden liegt an der unteren Grenze, bis zu welcher
periodische Signale für die Zellen auflösbar sind. Eine Periodendauer von acht Sekunden kann von den Zellen noch wahrgenommen werden, kleinere Periodendauern
werden nicht mehr wahrgenommen. Um Effekte auszuschliessen, die sich durch diese
kurzen Perioden ergeben könnten, sollte die Periodendauer erhöht werden. Damit
wird ausgeschlossen, dass den Zellen die Zeit fehlt reagieren zu können.
Randeffekte durch Ausdehnung der ’uncaging’-Region
Die Effekte durch die finite Ausdehnung der ’uncaging’-Region wurden in Kapitel 6.2.2 gezeigt. Um die Effekte des Gradienten, der durch Randeffekte erzeugt
wird und die Effekte des Gradienten in y−Richtung konkret vergleichen zu können
und gegeneinander abzugrenzen, müssten zwei Experimentreihen durchgeführt werden: Eine Experimentreihe ohne Gradienten in y−Richtung, aber mit Randeffekten
und eine Experimentreihe ohne Randeffekte. In der durchgeführten Experimentreihe
kann nur vermutet werden, welche der einzelnen Effekte durch die Randeffekte und
welche durch den y−Gradienten entstanden sind.
6.4.2 Durch die Zelleigenheiten verursachte Fehler
Stochastische GFP-Expression
Die Expression von LIME-GFP ist stochastisch verteilt, d.h. nicht alle Zellen weisen
in den Experimenten das gleiche Maß an sekundärer Fluoreszenz auf. Daher können nicht alle Zellen im konfokalen Laser-Scanning-Mikroskop beobachtet werden.
Es findet eine Beschränkung auf Zellen statt, die genügend sekundäre Fluoreszenz
aussenden. Allerdings kann nicht mit Sicherheit gesagt werden, dass diese Zellen
repräsentativ für die gesamte Population sind. Daher könnte in der Beschränkung
der untersuchbaren Zellen eine Fehlerquelle liegen.
73
6 Diskussion
Stochastische Reaktionsfähigkeit der Zellen
Auch die Reaktionsfähigkeit der Zellen auf cAMP ist stochastisch verteilt. Nicht
alle Zellen reagieren gleich stark auf cAMP. In der Auswertung werden zwar nur
Zellen verwendet, die ein gewisses Maß an Reaktion aufweisen, jedoch ist der Unterschied zwischen diesen Zellen immer noch recht groß. Deshalb entfernen sich stets
einige Zellen von der Signalquelle und wandern nicht, wie man es erwarten würde, auf diese zu. Außerdem führt die unterschiedliche Reaktionsfähigkeit dazu, dass
die Ergebnisse deutlich von den Zellen beeinflusst werden, die eine starke Reaktion zeigen. Diese Zellen müssen aber nicht unbedingt repräsentativ für die gesamte
Population sein. Zudem beeinflusst die Geometrie der Zellen den Konzentrationsgradienten entlang ihrer Plasmamembran sehr stark (siehe B). Da die Zellgeometrien
sehr unterschiedliche Formen haben können - von nahezu einem Kreis bis zu einem
sehr langgestreckten Ellipsoid - und außerdem die Orientierung der Zellen bezüglich
des Flusses unterschiedlich ist, kann die Reaktion der einzelnen Zellen sehr stark
variieren.
Anfängliche Polarisation der Zellen
In der Phase des Nahrungsmangels setzt eine Polarisation der Zellen (siehe Kapitel
2.3.2) ein. Diese Polarisation zeigen die Zellen zu Beginn des Experiments und sie
verändert sich erst allmählich unter der Beeinflussung durch das eingesetzte cAMPSignal. In Experimenten mit verschiedenen Gradienten10 zeigt sich, dass die Zellen
zu Beginn der Beobachtung sehr oft entgegen der Richtung des Gradienten wandern
und erst allmählich ihre Richtung ändern und sich in Richtung der höheren Konzentration bewegen. Da die Aufnahmezeit in den durchgeführten Experimenten jedoch
sehr kurz ist, werden die Messergebnisse stark von dieser anfänglichen Polarisation
beeinflusst.
6.4.3 Durch die Experimentdurchführung verursachte Fehler
Die Zellen werden stets zufällig aus einer Population ausgewählt, so dass diese Auswahl Einfluss auf die Ergebnisse haben könnte. Zusätzlich kann nicht garantiert
werden, dass die ccAMP-Suspension, die in den Kanal eingefüllt wird, stets denselben Gehalt an ccAMP hat. Anteile des ccAMP können schon vor Beginn des
Experiments durch geringe Lichteinwirkungen freigesetzt werden. Zwar adaptieren
10
Diese wurden von Matthias Theves durchgeführt.
74
6.5 Erklärungsansätze
die Zellen an eine konstante cAMP-Konzentration, jedoch kann in diesem Fall nicht
immer die gleiche Menge an ccAMP während des Experiments freigesetzt werden.
Dadurch kann die Reaktion der Zellen beeinflusst werden. Außerdem ist die Position der Zellen zu Beginn der Stimulation nicht immer gleich. Daher nehmen die
Zellen verschiedene Konzentrationsprofile wahr, da die Konzentration in größerer
Entfernung zur Quelle durch laterale Diffusion beeinflusst wird.
6.5.1 Berechnete Konzentrationsprofile
Zellspezifische-Konzentrationsprofile für eine standardisierte Zelle
Die Auswertung der Konzentrationsprofile in Kapitel 4.3.1 mit einem Abstand zwischen 20 µm und −20 µm ist für die Betrachtung einzelner Zellen viel zu ungenau,
da diese einen wesentlich geringeren Durchmesser haben.
Um die numerischen Berechnungen des Konzentrationsgradienten entlang der
Plasmamembran in y−Richtung aussagekräftiger zu gestalten, wird dieser für vier
Position einer repräsentativen Zelle berechnet. Die Berechnungen werden für einen
Kanal durchgeführt, der nur Suspension - d.h. keine Zellen - enthält (siehe auch Kapitel 4.3.2). Die ausgewählte repräsentative Zelle wurde während eines Experiments
beobachtet und die vier gekennzeichneten Positionen entsprechen den Positionen,
die die ’Pole’ der Zelle zu Beginn der Stimulation also 30 Sekunden nach Beginn
der Aufnahme hatten. Für die verschiedenen Experimentreihen wird dieselbe repräsentative Zelle11 mit definiertem Abstand zur Signalquelle für die Berechnung des
Konzentrationsgradienten verwendet. Diese wird im Folgenden als ’Modell’-Zelle bezeichnet, um sie von den unterschiedlichen Zellen in Anhang B abzugrenzen.
Werden die Berechnungen für verschiedene Zellen mit unterschiedlichen Zellgeometrien durchgeführt, so zeigt sich, dass die Positionen der Pole der Zelle einen sehr
starken Einfluss auf den Konzentrationsgradienten entlang ihrer Plasmamembran
haben. Außerdem ist die Entfernung von der Signalquelle für das sich ergebende
Konzentrationsprofil entscheidend, da das Profil durch Diffusionseffekte in größerer Entfernung zur Quelle stark verändert wird. Um einen besseren Vergleich der
Konzentrationsprofile für ein unterschiedliches α zu ermöglichen, wird daher auf eine ’Modell’-Zelle (siehe oben) zurückgegriffen. Allerdings sei hier auf den Anhang
11
Die Parameter dieser Zelle sind in Abbildung 6.9 gekennzeichnet.
75
6 Diskussion
Abb. 6.9: Konturplot einer repräsentativen Zelle während eines Experiments im Mikrofluidikkanal, erstellt mit MATLAB®
Die Position der Zelle und ihr Umriss ist zum Zeitpunkt t = 30 s i.e.
zu Beginn der Stimulation dargestellt. Die ’Pole’ der Zelle sind mit
a = (18, 6/1, 6) µm, b = (29, 1/9, 3) µm, c = (39, 6/6, 9) µm und d =
(29, 1/−2, 4) µm gekennzeichnet, wobei die erste Angabe der x−Koordinate
und die zweite Angabe der y−Koordinate entspricht. Für eine Definition
der Richtungen siehe Abb. 4.6.
verwiesen (B). Dort werden die Berechnungen für je eine real vorgefundene Zelle
aus den einzelnen Experimentreihen durchgeführt, so dass gezeigt werden kann, wie
groß der Einfluss der Position der Polpunkte sowie des Abstands zur Signalquelle
im Vergleich zu α ist.
Es findet für den Winkel α = 0◦ nur ein Vergleich der Konzentrationsgradienten
zwischen den Punkten a und c sowie b und d statt, da der zeitliche Konzentrationsverlauf an den einzelnen Punkten stets eine sehr ähnliche Form für die verschiedenen
Winkel α hat.
Die Form des zeitlichen Verlaufs der cAMP-Konzentration an den einzelnen Polen
(Abb. 6.10a) ist für alle vier Pole sehr ähnlich. Allein die maximale Konzentration
und der Zeitpunkt des einsetzenden Gradientens unterscheidet sich. Die maximale
Konzentration am Pol a ist am größten, da dieser Punkt am nächsten zur Signalquelle liegt, und nimmt von d über b bis hin zu c ab. Selbst in der Phase, in der
eine konstante Konzentration an den Punkten a und c herrscht, ist die Konzentration an diesen beiden Punkten nicht identisch. Dies wird durch laterale Diffusion
bewirkt, die das Konzentrationsprofil mit zunehmender Entfernung zur Quelle stark
aufweitet.
76
Die Steigung an den Punkten a und c (siehe Abb. 6.10c) verläuft unterschiedlich.
Am Punkt a ist die Steigung deutlich höher als am Punkt c, da die Welle dort
schon durch Diffusionseffekte verändert worden ist. Die Steigung am Pol c setzt erst
mit einer Verzögerung von 0, 08 Sekunden ein. Der Verlauf beider Steigungen ist
asymmetrisch bezüglich der Steigung null. Der Steigungsverlauf an den Punkten a
und c ist für die übrigen verwendeten Winkel α ähnlich, deshalb wird er nicht weiter
erläutert. Für eine doppelte Entfernung von der Signalquelle (Abb. 6.12c) ist der
Steigungsverlauf lediglich flacher als in Abbildung 6.10.
Im Folgenden wird der zeitliche Verlauf der Differenz (Abb. 6.10b) zwischen den
Polen a und c bei einem Winkel von α = 25◦ (siehe Abb. 4.4) und einer ’imaging’Region von (48 × 48) µm beschrieben. Zunächst ist die Konzentration am Punkt a
sehr viel größer als am Punkt c und die Differenz steigt bis zu ihrem Maximum von
42 Prozent. Erreicht die Welle nach 0, 3 Sekunden den Pol c so nimmt die Differenz
wieder ab und ein Plateau bildet sich: an beiden Punkten besteht eine konstante
Konzentration. Durch laterale Diffusion ist allerdings die Konzentration am Punkt c
selbst bei diesen stabilen Konzentrationen geringer (siehe Abb. 6.10a). Beginnt die
Welle am Punkt a auszulaufen, so fällt die Differenz bis zum negativen Maximum
von −27 Prozent. Nach 1, 1 Sekunden ist die Welle auch am Punkt c komplett ausgelaufen und die Differenz ist null. Der gesamte Prozess dauert 2, 5 Sekunden. Dieser
Differenzverlauf entlang der Plasmamembran einer Zelle erfolgt in x−Richtung. In
y−Richtung ist die Differenz deutlich geringer. Die maximale positive Differenz beträgt sieben Prozent, ebenso wie die maximale negative Differenz. Läuft die Welle am
Punkt b ein, so steigt die Differenz bis zu ihrem positiven Maximum. Die Steigung
setzt später ein als in x−Richtung und erreicht früher das Maximum. Alle nachfolgenden Phasen werden in y−Richtung ebenso früher erreicht als in x−Richtung.
Beginnt die Welle auch am Punkt d einzulaufen, fällt die Differenz ab. Ist die Welle
an beiden Punkten b und d vollständig eingelaufen, i.e. ist die Konzentration an
beiden Punkten stabil, so ist auch die Differenz nahezu konstant mit −1, 2 Prozent.
Läuft die Welle am Punkt b aus, steigt die Differenz bis auf −7 Prozent an.
Danach beginnt die Welle auch am Punkt d auszulaufen, so dass nach insgesamt
zwei Sekunden keine Differenz mehr vorliegt. Der gesamte Prozess ist asymmetrisch
bezüglich dem Zeitpunkt 0, 8 Sekunden.
Für die Experimente, in denen eine ’gerade’ ’uncaging’-Linie (siehe Abb. 4.4) verwendet wurde, also ohne zusätzlichen Gradienten in y−Richtung, ergeben sich im
Vergleich folgende Unterschiede für den zeitlichen Verlauf der Differenz (Abb. 6.11)
77
6 Diskussion
zwischen den Polen a und c bei einer ’imaging’-Region von (48 × 48) µm: Der Verlauf der Differenz zwischen den Punkten a und c ist relativ ähnlich dem Verlauf in
Abbildung 6.10b, also mit einem Winkel von α = 25◦ . Die maximale positive Konzentrationsdifferenz zwischen a und c liegt allerdings bei 57 Prozent (also 15 Prozent
höher). Die maximale negative Konzentrationsdifferenz liegt bei −37 Prozent (also
10 Prozent höher). Die Tatsache, dass die Unterschiede in den maximalen positiven
und negativen Konzentrationsdifferenzen zwischen der ’geraden’ und um 25◦ verkippten ’uncaging’-Linie nicht identisch sind, kann an den unterschiedlichen Skalen
und somit Ablesefehlern liegen. Insgesamt ist der Konzentrationsunterschied jedoch
für α = 0◦ größer. Dies liegt daran, dass bei einem Winkel von α = 25◦ der Punkt a
bereits weiter von der Quelle entfernt ist als bei einem Winkel von α = 0◦ , so dass die
laterale Diffusion einen stärkeren Effekt hat. Die Differenz zwischen den Punkten b
und d resultiert daraus, dass die y−Koordinate des Punkts d näher am Zentrum der
’uncaging’-Region liegt, also der Effekt der lateralen Diffusion am Punkt d geringer
ist. Ansonsten ist kein Gradient in y−Richtung zu erkennen.
Für eine vergrößerte ’imaging’-Region von (48 × 96) µm wird eine Zellposition
mit verdoppeltem Abstand zur Signalquelle12 angenommen. Hierbei zeigt sich im
Vergleich mit einer ’imaging’-Region von (48 × 48) µm, dass die Gradienten durch
laterale Diffusion kleiner werden, je weiter sich die Zelle von der ’uncaging’-Region
entfernt. Dieser Effekt ist für den Gradienten in y−Richtung wesentlich stärker als
für den Gradienten in x−Richtung. Außerdem scheint der Effekt für die positive
Differenz, also die einlaufende Welle, deutlich stärker zu sein, als für die auslaufende
Welle. Die Dauer der negativen Differenz ist deutlich länger als bei einer kleineren
’imaging’-Region. In größerer Entfernung zur Signalquelle sind die Eigenschaften
der Welle also deutlich verändert.
Für einen Winkel von α = 41◦ (siehe Abb. 4.4) und eine ’imaging’-Region von
(48 × 48) µm weist die Differenz folgende Unterschiede zur Anordnung mit einem
Winkel von α = 25◦ auf. Im Vergleich der Differenzen zwischen den Punkten a
und c sowie b und d bei den verschiedenen Winkeln α zeigt sich, dass die maximale Konzentrationsdifferenz mit 32 Prozent und −20 Prozent zwischen den Polen a
und c in etwa 10 Prozent geringer ist als bei einem Winkel von 25◦ , da bereits der
Punkt a sehr viel weiter von der ’uncaging’-Region entfernt ist (siehe oben). Die generelle Form ist jedoch gleich. Die maximale Konzentrationsdifferenz zwischen den
12
i.e. mit Polpositionen von a = (37, 2/1, 6) µm, b = (58, 2/9, 3) µm, c = (79, 2/6, 9) µm und
d = (58, 2/ − 2, 4) µm
78
Punkten b und d ist allerdings höher (10 Prozent und −8 Prozent). Die Konzentrationsdifferenz ist nicht mehr symmetrisch bezüglich null, dies bedeutet, dass bei einem
Winkel von α = 41◦ wesentlich stärkere Unterschiede zwischen dem Gradienten in
der Wellenfront und dem Gradienten in der Wellenrückseite auftreten.
Anhand dieser Ergebnisse zeigen sich die Unterschiede, die sich für die cAMPKonzentrationsprofile durch Änderung verschiedener Parameter ergeben. Wie im
Anhang B gezeigt, haben die Form der Zelle sowie die Entfernung von der Quelle
einen wesentlich größeren Einfluss als der Winkel α. Daher sollten die Unterschiede
der chemotaktische Reaktion der Experimentreihen Nr.1 und Nr.3 nicht überbewertet werden. Die Zellen scheinen in der Experimentreihe Nr.1 in den Bereich der niedrigeren Konzentration zu laufen. Dies lässt sich allerdings eher mit dem in Kapitel
6.4.2 beschriebenen Verhalten der Zellen erklären, als durch die Reaktion der Zellen
auf Konzentrationsgradienten. Die Zellen scheinen den Konzentrationsgradienten in
Nr.3 deutlicher wahrzunehmen, da sie sich in den Bereich höherer Konzentration
bewegen. Der Gradient in x−Richtung ist in diesem Fall schwächer, der Gradient
in y−Richtung aber stärker. Daher vermute ich, dass das Verhältnis der Gradienten
entscheidend für die Detektionsfähigkeit eines Gradienten in y−Richtung ist. Ist der
Gradient in x−Richtung sehr viel stärker, als der Gradient in y−Richtung, so zeigen
die Zellen keine Reaktion auf den y−Gradienten. Sie werden durch den Gradienten in
x−Richtung zu stark beeinflusst, um den Gradienten in y−Richtung wahrnehmen
zu können. Diese Vermutung lässt sich dadurch bestätigen, dass die Bewegungsrichtung in den Experimenten mit verstärktem y−Gradienten aber schwächerem
x−Gradienten (Experimentreihe Nr.3) sehr viel eindeutiger ist als für die Experimentreihe Nr.1. Der globale Gradient scheint für die Detektion entscheidend zu
sein. Dieser könnte nach dem Prinzip der Vektoraddition beschrieben werden. Dabei addieren sich die beiden Komponenten des Gradienten zu einem resultierenden
Gradienten, der die Bewegung beeinflusst. Die Tatsache, dass der zusätzliche Gradient in y−Richtung sich über die Zeit verändert, hat anscheinend keinen Einfluss auf
die Wahrnehmung durch die Zellen. Dies könnte ein weiterer Hinweis darauf sein,
dass die Zellen nur den Gradienten der positiven Wellenfront wahrnehmen, so dass
die spätere Veränderung keinen Einfluss hat.
79
6 Diskussion
(a) Zeitlicher Konzentrationsverlauf der in Abb. 6.9 gekennzeichneten
Pole
(b) Zeitlicher Verlauf der Differenz zwischen den Polen b und d, sowie
den Polen a und c
(c) Zeitlicher Gradient des Konzentrationsverlaufs an den Polen a
und c
Abb. 6.10: COMSOL® -Daten für eine ’Modell’-Zelle
’imaging’-Region: (48 × 48) µm, α = 25◦
a) Der zeitliche Verlauf der Konzentration an cAMP wird an jedem der
vier Pole dargestellt. Die Form des Verlaufs ist an allen Polen dieselbe,
allein die Amplitude sowie der Zeitpunkt des Nullpunkts der Konzentration unterscheiden sich.
b) Die Differenz der Pole a und c ist deutlich höher als die Differenz der
Pole b und d. Der erste Teil der Kurve wird durch die Welleneigenschaften bestimmt (ca cc , cb cd ). Gefolgt wird dieser von einem Bereich,
der ein Plateau aufweist (ca > cc , cb ≈ cd ). Dieser Bereich wird durch
laterale Diffusion bestimmt. Der letzte Bereich ist erneut durch die Welle
bestimmt (ca cc , cb cd ).
80
c) Die Steigung am Pol a ist deutlich höher als die Steigung am Pol c, da
die Welle am Pol c schon durch Diffusionseffekte verändert worden ist.
Außerdem setzt die Steigung am Pol c erst mit Verzögerung ein, da die
Welle dort erst später ankommt. Die Definition der Pole erfolgt in Tab.
B.2. Die Definition der Raumrichtungen ist in Abbildung 4.6 zu sehen.
Zeitlicher Verlauf der Differenz zwischen den Polen b und d, sowie den
Polen a und c
Für eine nähere Beschreibung siehe Abb. 6.10b
81
6 Diskussion
(a) Zeitlicher Konzentrationsverlauf an den Polen
den Polen a und c
und c
Polpositionen: a = (37, 2/1, 6) µm, b =
(79, 2/6, 9) µm und d = (58, 2/ − 2, 4) µm
Für eine nähere Beschreibung siehe Abb. 6.10
82
(58, 2/9, 3) µm, c
=
(a) Zeitlicher Konzentrationsverlauf der in Abb. 6.9 gekennzeichneten
Pole
den Polen a und c
und c
83
6 Diskussion
6.6 Vergleich mit dem LEGI-Modell
Vor dem Hintergrund des LEGI-Modells erscheint die obige Interpretation sinnvoll. Die chemotaktische Antwort wird in diesem Modell durch den Unterschied der
Besetzungszahlen der Rezeptoren entlang der Plasmamembran ausgelöst. Ist der
Gradient in x−Richtung sehr viel stärker als der Gradient in y−Richtung, so zeigt
der resultierende globale Gradient eher in x−Richtung. Es findet eine sehr starke
Rezeptorbesetzung am vorderen Ende der Zelle statt13 . Dadurch wird eine Diffusion
des Inhibitors zu allen übrigen Stellen der Plasmamembran ausgelöst, so dass dort
die chemotaktischen Reaktionen gehemmt werden. Insgesamt nimmt die Zelle also
nur die Aktivierung der Rezeptoren an ihrem vorderen Ende wahr und bewegt sich
bevorzugt in Richtung des x−Gradienten. Dominiert der Gradient in x−Richtung14
nicht so deutlich, wird der resultierende globale Gradient stärker durch den Gradienten in y−Richtung beeinflusst. Die Aktivierung findet in Richtung des resultierenden
Gradienten statt, so dass die Bewegung auch durch die y−Komponente des Gradienten beeinflusst wird. In den Experimenten der Experimentreihe Nr.2 wird durch die
Randeffekte ein sehr starker Gradient in y−Richtung erzeugt (siehe Kapitel 6.2.2).
Die Zellen reagieren deutlich stärker auf diesen Gradienten als auf den Gradienten
in x−Richtung. Dieses Ergebnis bestätigt die oben beschriebene Theorie.
13
14
Für eine Definition des vorderen Zellendes siehe Kapitel 2.3.2
im Verhältnis zur Stärke des y−Gradienten
84
7 Zusammenfassung
7.1 Ergebnisse
Somit konnte gezeigt werden, dass Zellen auf einen zusätzlichen sehr kurzen, räumlichen Gradienten reagieren können, sofern die Detektion nicht durch einen anderen
zu starken, räumlichen Gradienten behindert wird. Dies legt nahe, dass der globale resultierende Gradient von den Zellen detektiert wird. Dieser kann ähnlich einer
Vektoraddition beschrieben werden. Selbst die Tatsache, dass der zusätzliche Gradient sich über die Zeit verändert, behindert diese Fähigkeit anscheinend nicht. Dies
könnte ein Hinweis darauf sein, dass die Zellen nur den positiven Gradienten der
Wellenfront detektieren, so dass die spätere Veränderung des Gradienten keinen
Einfluss auf die Reaktion hat. Zellen des Stamms AX3 zeigen im Vergleich zu Zellen des Stamms AX2 keinen Unterschied in der oben beschriebenen Fähigkeit der
Signaldetektion eines globalen Gradienten. Experimente mit einer verlängerten Plateauphase der Welle zeigen, dass die Zellen den positiven Gradienten der Wellenfront
für die Detektion eines Signals benötigen. Der negative Gradient in der Wellenrückseite scheint nicht von Bedeutung zu sein. Die Zeitskala der intrazellulären Prozesse1 ,
ändert sich durch einen zusätzlichen Gradienten nicht.
7.2 Ausblick
Um konkrete Aussagen über die chemotaktische Reaktion auf einen zusätzlichen
Gradienten in y−Richtung treffen zu können, müssten Experimente mit einer deutlich vergrößerten ’uncaging’-Region durchgeführt werden. Dadurch könnten die Randeffekte, die durch die finite Ausdehnung der ’uncaging’-Region entstehen, ausgeschlossen werden (Kapitel 6.2.2). Zusätzlich sollte die Aufnahmezeit pro Experiment
erhöht werden, so dass die Bewegungen der Zellen länger beobachtet werden können.
Mit diesem Ansatz könnte die Zeitspanne zwischen den einzelnen Datensätzen für
1
die indirekt durch LIME-GFP beobachtet werden können, also das Verhalten des F-Aktins
85
7 Zusammenfassung
die Berechnung der Histogramme deutlich vergrößert werden, so dass die Fehler, die
durch das Rauschen des Massenschwerpunkts der Zellen erzeugt werden, minimiert
werden können. Durch eine Erhöhung der Datendichte in den Kontrollen könnte die
Persistenzzeit für die ’random motion’ berechnet werden, um diese zu beschreiben.
Die Persistenzzeit wurde für die aufgenommenen Kontrollen mit einer Dauer von
600 Sekunden bereits untersucht. Allerdings war aufgrund der geringen Datendichte
keine Aussage möglich. Anhand einer größeren Datenmenge könnte somit ein Modell
entwickelt werden, um die Reaktion der Zellen und den Prozess der Signaldetektion
für einen zusätzlichen y−Gradienten zu beschreiben. Die Frequenz der Signale sollte
auf Perioden oberhalb von zehn Sekunden erhöht werden. Denn diese Periodendauer liegt nah an der unteren Grenze, ab der die Zellen noch auf periodische Signale
reagieren können. Um eine genauere Erkenntnis zu erhalten, welchen Einfluss die
Form der Zelle (z.B. ihre Länge) auf den resultierenden Gradienten entlang ihrer
Plasmamembran hat, könnten detaillierte numerische Berechnungen durchgeführt
werden. Zusätzlich könnte das Verhältnis zwischen der Stärke des Gradienten in
x−Richtung und in y−Richtung variiert werden, so dass gezeigt werden kann, ob
die Zellen sich tatsächlich in die Richtung bewegen, die durch den resultierenden
globalen Gradienten vorhergesagt wird.
86
A Weitere Grafiken
A.1 Histogramme des ’half-population’-Tests
(a) Experimentreihe Nr.1, Teilmenge 1
(b) Experimentreihe Nr.1, Teilmenge 2
Abb. A.1: ’half-population’-Test der Winkelverteilung der Experimentreihe Nr.1
Die Datensätze werden zufällig auf zwei Teilmengen verteilt und in Histogrammen dargestellt.
Die rote vertikale Linie stellt den Winkel 180◦ dar. Die Unterteilung der
x−Achse erfolgt in 10◦ Schritten.
87
A Weitere Grafiken
Für eine genauere Beschreibung siehe Abb. A.1
88
89
A Weitere Grafiken
Abb. A.6: ’half-population’-Test der Geschwindigkeitsverteilung in x−Richtung der
Die Datensätze werden zufällig auf zwei Teilmengen verteilt und in Histogrammen dargestellt.
Die rote vertikale Linie stellt die Geschwindigkeit 0 µm/min dar. Die Unterteilung der x−Achse erfolgt in 1 µm/min-Schritten.
90
91
A Weitere Grafiken
Abb. A.10: ’half-population’-Test der Geschwindigkeitsverteilung in x−Richtung
der Experimentreihe Nr.5
Abb. A.11: ’half-population’-Test der Geschwindigkeitsverteilung in y−Richtung der
92
93
A Weitere Grafiken
94
A.2 Frequenzspektren
Abb. A.16: Frequenzspektren der Reaktionen der Experimentreihe Nr.2
Betrachtet wurde die Zeitspanne von 44 s − 213 s nach Beginn des Experiments. Für eine genauere Beschreibung siehe Abb. 5.17
95
A Weitere Grafiken
96
97
A Weitere Grafiken
98
B Zellspezifische
Konzentrationsprofile für reale
Zellen
Die Konzentration wird an den in Tabelle B.2 angegebenen Polen der Zelle berechnet. Die Positionen der Zellpole stammen aus den einzelnen Experimentreihen, so
wie sie in den Aufnahmen zum Zeitpunkt t = 30 s - also zu Beginn der Stimulation
- vorgefunden werden. Es zeigt sich im Vergleich mit den Daten einer ’Modell’-Zelle
in Kapitel 6.5.1 für die verschiedenen Winkel α und die unterschiedliche Ausdehnung der ’imaging’-Region, dass die verschiedenen Zellgeometrien und Abstände der
Zelle zur Signalquelle einen sehr großen Einfluss auf den Gradienten in y−Richtung
haben. Die verwendete ’Modell’-Zelle ist eine Zelle, die der Experimentreihe Nr.1
entstammt. Daher werden die Abbildungen für Experimentreihe Nr.1, die sich schon
in Kapitel 6.5.1 finden, nicht erneut aufgeführt. Die maximale negative Differenz
beträgt für die Zelle aus der Experimentreihe Nr.2 −10 Prozent, allerdings gibt es
kein positives Maximum. In Kapitel 6.5.1 konnte für diese Experimentreihe schon
die deutliche Asymmetrie zwischen positiver Differenz und negativer Differenz sowohl in ihrer Dauer als auch in ihrer Ausprägung beobachtet werden. Das Fehlen des
positiven Maximums könnte an der Form der Zelle liegen, da diese nicht parallel zur
Flussrichtung liegt. Die Größenordnung der Differenz ist allerdings dieselbe wie für
die ’Modell’-Zelle in Kapitel 6.5.1. Für die Experimentreihe Nr.3 - also einen Winkel
von α = 41◦ - ist die maximale Differenz zwischen den Punkten b und d mit 5, 5
Prozent deutlich geringer als für die ’Modell’-Zelle und liegt dabei sogar unterhalb
der Differenz, die sich für die ’Modell’-Zelle in Experimentreihe Nr.1 ergibt. Dies
zeigt wie groß die Einflüsse der Zellform und des Abstands zur Signalquelle auf den
Gradienten in y−Richtung sind. Die Unterschiede, die sich für verschiedene Winkel
α ergeben, sind im Gegensatz dazu nicht sehr aussagekräftig.
Es zeigt sich, dass die Position der Polpunkte sowie der Abstand zur Signalquelle
99
Experimentreihe
Nr. 1
Nr. 2
Nr. 3
Pol a [µm]
Pol b [µm]
Pol c [µm]
Pol d [µm]
(18,6 / 1,6)
(37,2 / -11,7)
(12,5 / 8,5)
(29,1 / 9,3)
(50,9 / -14,1)
(26,2 / 6,9)
(39,6 / 6,9)
(64,7 / -2,4)
(40,0 / 2,4)
(29,1 / -2,4)
(50,9 / -0,8)
(25,8 / 0,8)
Tab. B.2: Pole der repräsentativen Zellen für die Experimentreihen Nr.1, Nr.2 und
Nr.3
Die erste Angabe bezeichnet die x−Position, die zweite Angabe die
y−Position. Der Punkt (0 / 0) ist in Abb. 4.6 definiert.
einen wesentlich größeren Einfluss als der Winkel α haben.
100
(a) Zeitlicher Konzentrationsverlauf der in Tab. B.2 aufgeführten Pole
den Polen a und c
und c
Abb. B.1: COMSOL® -Daten für eine repräsentative Zelle der Experimentreihe Nr.2
101
(a) Zeitlicher Konzentrationsverlauf der in Tab. B.2 aufgeführten Pole
(b) Zeitlicher Verlauf der Differenz zwischen den Polen b und d, sowie den Polen a und c
(c) Zeitlicher Gradient des Konzentrationsverlaufs an den Polen a und c
Abb. B.2: COMSOL® -Daten für eine repräsentative Zelle der Experimentreihe Nr.3
102
C Vergleichsdaten
C.1 Daten ohne Gradient in y−Richtung
Abb. C.1: Überlagerter Zelltrack der Experimente ohne zusätzlichen y−Gradienten
103
C Vergleichsdaten
Abb. C.2: Histogramme der Experimente ohne zusätzlichen y-Gradienten
Die rote vertikale Linie stellt die Geschwindigkeit 0 µm/min bzw. den Winkel
180◦ dar. Die Unterteilung der x−Achse erfolgt in 1 µm/min- bzw. in 10◦ Schritten.
104
C.1 Daten ohne Gradient in y−Richtung
Abb. C.3: Verlauf der zellulären Antwort des Zytosols der Experimente ohne zusätzlichen y-Gradienten
Die ∆-Symbole stellen die Zeit in Sekunden dar. In lila ist der Zeitpunkt
des einsetzenden Pulses gekennzeichnet, der eine Sekunde anhält und mit
einer Periode von zehn Sekunden auftritt.
Die gemittelte Intensität erreicht ihr Maximum nicht zum Zeitpunkt des
Pulses, sondern in etwa fünf Sekunden nach Einsetzen des Signals.
Abb. C.4: Frequenzspektren der Reaktionen der Experimente ohne zusätzlichen yGradienten
Für eine genauere Beschreibung siehe Abb. 5.17
105
C Vergleichsdaten
106
D Verwendete Geräte und
Materialien
Nr.
Gerät
Hersteller
A1
A2
A3
15ml-Röhrchen
10ml-Pipettenspitze
Absaugepumpe
A4
Belackungsschleuder
Greiner
Greiner
Integra
Biosciences
Ramgraber GmbH
A5
Deckgläschen
A6
A7
A8
A9
Fluoview FV1000
Immersionsöl
Immersionsobjektiv
Kanüle
A10
Kanüle, spitz
A11
Magic-Klebeband
A12
Maskaligner
Artikelnummer
Spezifikation
Artnr. 188271
Artnr. 607180, Cellstar
Vacuboy Vacusafe
Comfort
Nasschemie
Arbeitsplatz, Artnr. 305018
Gerhard Menzel (24 × 60) mm, N o.1
Glasbearbeitungswerk GmbH &
Co. KG
Olympus
Olympus
Typ F , Artnr. N2673200
Olympus
ULSAPO 60XO
McMaster
19 gauge × 1 inch,
stainless
Heiland
(0, 6 × 25) mm,
Sonderkanüle,
Artnr. 370-224
Scotch
Artnr. 11257,
19 mm × 33 m
EVGroup
EVG620
Automated
Mask Aligner
107
Nr.
Gerät
Hersteller
Artikelnummer
Spezifikation
A13
Maske
Chrommaske
A14
Neubauerzählkammer
CNF, Universität
Cornell,
NY,
U.S.A.
Optik Labor
A15
Nitril-Handschuhe
Microflex
A16
Memmert
A17
Ofen
(Universalschrank)
Open Air Shaker
A18
Optischer Tisch
Barnstead
International
TMC
A19
Pasteurpipetten
Omnilab
A20
A21
A22
Peristaltik-Pumpe
Petridish
Pipetboy
A23a
A23b
A24
A25
A26
A27
Pinzette
Pinzette
Plasma Cleaner
Reaktionsgefäß
Research Pipetts
Silizium-Wafer
Rainin
Falcon
Integra
Biosciences
Granit
EAEM
Harrick
Greiner
Eppendorf
Si-Mat
A28
A29
Sicherheitswerkbank
Skalpell
Sorvall Heraceus
Swann-Morton
108
Tiefe: 0, 100 mm,
0, 0025 mm2
Supreno, Examination
Gloves,
Powder-free,
Artnr. EN 455/
ASTM D6319
UNB200
MaxQ 2000
Vibration Isolation
System
Gesamtlänge: 145 mm,
Spitzenlänge:
45 mm,
Artnr. 5411015
Primaria, Artnr. 353803
Pipetboy Acu
Artnr. 2AB.sa
Artnr. 40CSA, stainless
PDC Artnr. 002051012
1,5 ml, Artnr.616201
Femto Jet Express
Durchmesser: 100 mm,
Dicke: 525(±25) µm ,
einseitig poliert,
Typ: P/Bor
Klasse 2, Typ HS15
stainless, Artnr. BS 2982
Nr.
Gerät
Hersteller
Artikelnummer
Spezifikation
A30a
Spritze
Hamilton
A30b
Spritze
Hamilton
A31
Syringe Pump
A32
Teflonschlauch
Harvard
Apparatus
Novodirekt
250 µl, Artnr. 1725,
Gastight
100 µl, Artnr. 1710,
Gastight
PHD 2000
A33
A34
Temperaturreglergerät
Vakuumpumpe und
Vakuumkammer
WEMA
Ilmvac
GmBH
und Pyrex U.S.A
A35
A36
A37
A38
Waage
Waageschälchen
Wasserbad
Weißlichtinterferometer
A39
Zentrifuge
Acculab
Omnilab
Memmert
Veeco, Metrology
Group
Eppendorf
PTFE Schlauch,
Artnr. 39241
Artnr. WTD-35 M1
Feinvakuum /
Adsorptionsfalle
(Artnr. 700156-2)
Econ, EC-211
(140 × 140) mm
WB/OB 7-45, WBU 45
Wyko NT1100
5810 R
Tab. D.1: Verwendete Geräte und Materialien
109
D.1 Der Reinraum
Der verwendete Reinraum hat die Klasse ISO61 . Dies bedeutet, dass die folgende Anzahl von Partikeln im gesamten Reinraum unterschritten werden muss. Der
direkte Arbeitsbereich hat eine erhöhte Reinraumklasse von ISO5.
Reinraumklassen
ISO 5
ISO 6
0, 1 µm
100000
1000000
Partikel
0, 2 µm
23700
237000
(mit jeweiligem Durchmesser) je m3
0, 3 µm 0, 5 µm 1, 0 µm 1, 5 µm
10200
3520
832
29
102000 35200
8320
293
Tab. D.2: Klassifikation der Reinraumklassen, nach ISO 14644-1
Für die Arbeit im Reinraum sind bestimmte Arbeitsregeln zu beachten. Es wird
versucht, ein Einbringen von Partikeln in den Reinraum bestmöglich zu verhindern,
damit die sehr reine Arbeitsumgebung erhalten bleibt. Die Arbeitskleidung besteht
aus einem Schutzanzug mit Kopfhaube aus eng gewebten Polyesterfasern. Die Stoffstruktur ist so gewählt, dass sie möglichst viele Partikel zurückhält, trotzdem aber eine Wasserdurchlässigkeit des Anzugs ermöglicht. Außerdem werden Mundschutz, Nitrilhandschuhe und Überzieher für die sauberen Laborschuhe verwendet. Mit diesen
Maßnahmen kann der Effekt der großen Partikelquelle, die jeder Mensch darstellt,
minimiert werden. Des Weiteren sollten schnelle Bewegungen vermieden werden,
da ansonsten eine Strömungsschleppe erzeugt wird, in der sich Partikel ansammeln
können.[15]
Der Reinraum, in dem Temperatur, Luftdruck und -feuchtigkeit konstant gehalten
werden, besteht aus einem schalenförmigen Aufbau. Der äußerste Bereich wird als
Schwarzbereich bezeichnet. Im Schwarzbereich befindet sich die Umkleide, die mit
Außenluft gefüllt ist. Dieser Bereich führt durch eine Schleuse in den Graubereich,
der mit Reinstluft gefüllt ist und in dem Schutzkleidung getragen werden muss.
Eine weitere Schleuse führt in den Arbeitsbereich - den Weißbereich. Durch den
Luftdruck wird die Strömung der Luft kontrolliert, so dass diese immer von den
inneren Bereichen nach außen strömt und nicht umgekehrt.[15]
Die Reinstluft wird mit Hilfe von Faserfiltern aus der Außenluft erzeugt und in
den Reinraum geleitet. Die im Reinraum befindlichen Partikel werden mit einem
Fortluftsystem nach außen geleitet und von dort aus umweltgerecht entsorgt. Darüber hinaus wird im Reinraum nur Reinstwasser benutzt, dass nahezu keine anderen
1
nach ISO 14644-1
110
D.2 Das Weißlichtinterferometer
Bestandteile außer H2 0 beinhaltet. Die Lampen im Reinraum sind Gelblichtlampen,
damit eine vorzeitige Aktivierung des verwendeten Fotolacks durch U V -Anteile im
Weißlicht vermieden wird.[15]
Das Gebäude, in dem sich der Reinraum befindet, besteht aus drei Ebenen: Dem
Plenum, in dem die Luftverteilung stattfindet, der Reinraumebene, in der sich die
Arbeitsanlagen befinden und der Rückführebene, die der Rückführung der Reinstluft und des Reinstwassers dient.[15]
Zusätzlich zur turbulenten Verdünnungs- oder Mischströmung, in der die Partikelkonzentration beständig verdünnt wird, gibt es speziell für den Arbeitsbereich
den sogenannten ’laminar flow’. Dieser Luftstrom ist turbulenzarm, erfolgt meist
vertikal und dient der geringen Kontamination von sensiblen Bereichen mit Verunreinigungen aus dem übrigen Reinraum.[15]
D.2 Das Weißlichtinterferometer
Ein Interferometer dient unter anderem zur Vermessung von Oberflächen. Das verwendete Weißlichtinterferometer (A 38) gehört zur Kategorie der ’vertical scanning
white light’-Interferometer. Licht aus einer Glühlampe trifft auf das Objektiv des
integrierten Mikroskops, nachdem es ein Strahlteilerprisma passiert hat. Ein Teil
des Lichtstrahls trifft auf eine Referenzoberfläche, der zweite auf die Probe. Die Reflexionen beider Strahlanteile werden wieder zusammengeführt und treffen auf einen
CCD-Chip, der die resultierende Intensität in ein elektronisches Signal überführt.[34]
Die Besonderheit eines Weißlichtinterferometers gegenüber üblichen Interferometern,
die zumeist stark kohärentes Licht in Form eines Laserstrahls nutzen, ist, dass Interferenzeffekte nur sehr deutlich erscheinen, wenn der Wellenlängenunterschied zwischen beiden Strahlanteilen null ist. Somit kann die Höhe der Probe direkt aus der
Position des Referenzspiegels abgelesen werden.[17]
D.3 Der Plasma-Cleaner
Als Plasma wird ein teilweise ionisiertes Gas bezeichnet, das aus Elektronen, Ionen
und neutralen Atomen bzw. Molekülen besteht. Erzeugt wird es in diesem Fall durch
ein oszillierendes elektrisches Feld mit Frequenzen im Radiobereich. Bei niedrigen
Drücken werden die Elektronen des Gases durch die Beschleunigung im elektrischen
111
Feld und den nachfolgenden elastischen Stößen mit neutralen Atomen oder Feldlinien erhitzt. Die daraufhin ionisierten Elektronen können wiederum neutrale Atome
ionisieren, Bindungen in Molekülen brechen, Atome und Moleküle anregen, sowie
die Oberfläche des Substrats erwärmen. Die Reinigung der Oberfläche erfolgt durch
Ablation. Dabei werden die schwachen kovalenten C-H-Bindungen der verunreinigenden Stoffe Bindung für Bindung durch das Auftreffen hochenergetischer Ionen
oder Elektronen aufgebrochen. Infolgedessen ist das Molekulargewicht der einzelnen
Bestandteile so gering, dass sie im Vakuum verdampfen.[13] Zusätzlich werden die
Oberflächen des PDMS und des Deckgläschens chemisch aktiviert, so dass sie hydrophil werden und sich beim Aufeinanderlegen verbinden.
Die Aktivierung erfolgt durch die Dissoziation des Plasmagases, das Polymergruppen
der Oberfläche durch stark reaktive Carbonyl-,Carboxyl- oder Hydroxy-Gruppen
ersetzt.[13]
D.4 Parameter des Mikroskops
Laser
Ausführung
Eigenschaften
’scanning’-Laser
Multi Argon-Ionen Laser
λ
= 488 nm
P
= 30 mW
Preduziert = 2, 4 mW
’uncaging’-Laser
Dioden-Laser, blau
λ
= 405 nm
P
= 6
mW
Tab. D.4: Verwendete Laser, Fluoview FV1000 (Olympus) [33]
112
D.4 Parameter des Mikroskops
’imaging’-Region
(120 x 120) Pixel
(120 x 240) Pixel
(300 x 300) Pixel
Objekt
Dauer
176
’uncaging’-Linie2
3, 144 ms
207
’uncaging’-Linie
3, 144 ms
526
ms
ms
ms
Tab. D.6: Benötigte Scan-Zeit für verschiedene ’imaging’-Regionen, Fluoview FV
1000 (Olympus)
113
114
Nr.
Chemikalie
Hersteller
Eigenschaften
B1
B2
B3
B4
Aceton
cAMP
ccAMP
Curing Agent
Merck
Sigma
Invitrogen
Dow Corning
B5
Fluorescein
B6
H2 0, destilliert
B7
HL-5
Fisher Scientific
(Acros)
destilliert durch
Ultrapure Watersystem,
Barnstead
Formedium
Artnr. 1.00013.2500
Artnr. A9501
Artnr. D1037
Sylgard 184 Silicone Elastomer
Kit, Härtemittel
Artnr. AC 11924-100
B8
B9
B10
Isopropanol
PDMS
Phosphatpuffer
B11
B12
Stickstoff
SU-8 25
Merck
Dow Corning
nach Sörensen
[35]
Air Liquid
MicroChem
B13
SU-8 Developer
MicroChem
Thermolyne NANOpure Diamond
7 g/l Hefeextrakt, 14 g/l Pepton,
0, 5 g/l KH2 P O4 , 0, 5 g/l N a2 HP O4
Artnr. 1009952500
Sylgard 184
2 g/l KH2 P O4 , 0, 36 g/l N a2 HP O4 ×
2 H2 O, pH-Wert 6, 0
verdichtet, Reinheitsklasse: 5.0
Negativfotolack1 ,
Viskosität: 2500 mm2/s
Tab. E.1: Verwendete Chemikalien
1
Die Zahl 25 ist eine firmeneigene Viskositätsangabe.
115
(a) Aceton
(c)
γButyrolacton
(b) Fluorescein
(d) Isopropanol
(e) Polydimethylsiloxan (PDMS)
116
(f) Triarylsulfoniumhexafluoroantimonat(Fotoinitatorsalz)
(g) zyklisches Adenosinmonophosphat
(h) zyklisches Adenosinmonophosphat, ’caged’ Form
117
118
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Science at a glance 121 (2008), S. 2621 – 2624
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discoideum: adaptation is independent of activation of adenylate cyclase. In:
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123
124
2.1
2.2
2.3
2.4
2.5
2.6
4.1
4.2
4.3
4.4
4.5
4.6
4.7
4.8
4.9
5.1
5.2
5.3
5.4
5.5
Entwicklungszyklus während der Fruchtkörperbildung
adaptiert nach einem Bild von M.J. Grimson & R.L. Blanton, Biological Sciences Electron Microscopy Laboratory, Texas Tech University 6
Aufnahme einer Zelle der Mutante LIME-GFP . . . . . . . . . . . . . 8
Photolyse von cAMP . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 8
Signalweg während der Chemotaxis . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 13
Reaktionsschema der Fluoreszenz, Jablonski-Schema . . . . . . . . . . 15
Strahlengang eines Laser-Scanning-Mikroskops . . . . . . . . . . . . . 17
Foto eines strukturierten Wafers . . . . . . . . . . . . . . .
Foto eines Mikrofluidikkanals . . . . . . . . . . . . . . . .
Schematischer Aufbau eines Mikrofluidikkanals . . . . . . .
Geometrie der ’uncaging’ und ’imaging’-Regionen . . . . .
Scan-Modus . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Definition der Richtungen in den COMSOL® -Berechnungen
COMSOL® -Daten für eine ’imaging’-Region von (48 × 48)
einen Winkel α = 25◦ . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
einen Winkel α = 25◦ . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
einen Winkel α = 41◦ . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
. . . . .
. . . . .
. . . . .
. . . . .
. . . . .
. . . . .
µm und
. . . . .
µm und
. . . . .
µm und
. . . . .
Typischer Intensitätsverlauf einer reagierenden Zelle . . . . . . . . .
Definition der Geschwindigkeiten und des Winkels . . . . . . . . . .
Die normierten Geschwindigkeitsverteilungen in x− und y−Richtung
der Kontrollen (Nr.K1) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Überlagerter Zelltrack der Experimentreihen Nr.1, Nr.2 und der zugehörigen Kontrollen (Nr.K1) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Winkelverteilung der Experimentreihen Nr.1, Nr.2 & Nr.K1 . . . .
.
.
.
.
.
.
24
26
26
29
31
34
. 35
. 36
. 37
. 40
. 42
. 45
. 46
. 48
125
5.6
Geschwindigkeitsverteilung in x−Richtung der Experimentreihen
Nr.1, Nr.2 & Nr.K1 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 49
5.7
Geschwindigkeitsverteilung in y−Richtung der Experimentreihen
Nr.1, Nr.2 & Nr.K1 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 50
5.8
Überlagerter Zelltrack der Experimentreihe Nr.3
5.9
Histogramme der Experimentreihe Nr.3 . . . . . . . . . . . . . . . . . 53
. . . . . . . . . . . 51
5.10 Überlagerter Zelltrack der Experimentreihe Nr.5 . . . . . . . . . . . . 54
5.11 Vergleich der Verteilung der totalen Geschwindigkeiten in der Experimentreihe Nr.5 und den zugehörigen Kontrollen Nr.K1 . . . . . . . 55
5.12 Histogramme der Experimentreihe Nr.5 . . . . . . . . . . . . . . . . . 56
5.13 Überlagerter Zelltrack der AX3-Experimente . . . . . . . . . . . . . . 57
5.14 Winkelverteilung der AX3-Experimente (Nr.4) und der zugehörigen
Kontrollen (Nr.K2) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 58
5.15 Geschwindigkeitsverteilung in x−Richtung der AX3-Experimente (Nr.4)
und der zugehörigen Kontrollen (Nr.K2) . . . . . . . . . . . . . . . . 58
5.16 Geschwindigkeitsverteilung in y−Richtung der AX3-Experimente (Nr.4)
und der zugehörigen Kontrollen (Nr.K2) . . . . . . . . . . . . . . . . 59
5.17 Frequenzspektren der Reaktionen der Experimentreihe Nr.1 . . . . . 60
6.1
Normierte Winkelverteilung der AX2-Experimente
(Nr.1 & Nr.2) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 62
6.2
Normierte Geschwindigkeitsverteilung in x−Richtung der AX2-Experimente
(Nr.1 & Nr.2) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 62
6.3
Normierte Geschwindigkeitsverteilung in y−Richtung der Experimentreihen Nr.1 & Nr.2 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 63
6.4
Normierte Histogramme der Experimentreihe Nr.3
. . . . . . . . . . 64
6.5
Normierte Histogramme der Experimentreihe Nr.5
. . . . . . . . . . 65
6.6
Normierte Histogramme der Experimentreihe Nr.4 . . . . . . . . . . . 66
6.7
Vergleich der Zeitskalen in Experimentreihe Nr.2 . . . . . . . . . . . 69
6.8
Verlauf der zellulären Antwort des Zytosols der Experimentreihe Nr.1 71
6.9
Konturplot einer repräsentativen Zelle, erstellt mit MATLAB® . . . . 76
6.10 COMSOL® -Daten für eine ’Modell’-Zelle
’imaging’-Region: (48 × 48) µm, α = 25◦ . . . . . . . . . . . . . . . . 80
’imaging’-Region: (48 × 48) µm, α = 0◦ . . . . . . . . . . . . . . . . . 81
126
A.1 ’half-population’-Test der Winkelverteilung der Experimentreihe Nr.1
87
88
88
89
89
A.6 ’half-population’-Test der Geschwindigkeitsverteilung in x−Richtung
der Experimentreihe Nr.1 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 90
A.11 ’half-population’-Test der Geschwindigkeitsverteilung in y−Richtung
A.16 Frequenzspektren der Reaktionen der Experimentreihe Nr.2 . . . . . 95
127
B.1 COMSOL® -Daten
Nr.2 . . . . . . .
B.2 COMSOL® -Daten
Nr.3 . . . . . . .
für
. .
für
. .
eine repräsentative
. . . . . . . . . . .
eine repräsentative
. . . . . . . . . . .
Zelle der Experimentreihe
. . . . . . . . . . . . . . . . 101
Zelle der Experimentreihe
. . . . . . . . . . . . . . . . 102
C.1 Überlagerter Zelltrack der Experimente ohne zusätzlichen y−Gradienten103
C.2 Histogramme der Experimente ohne zusätzlichen y-Gradienten . . . . 104
C.3 Verlauf der zellulären Antwort des Zytosols der Experimente ohne
zusätzlichen y-Gradienten . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 105
C.4 Frequenzspektren der Reaktionen der Experimente ohne zusätzlichen
y-Gradienten . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 105
128
Tabellenverzeichnis
0.1
0.2
0.3
Formelzeichen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . xi
Abkürzungen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . xiii
Biologische und chemische Begriffe . . . . . . . . . . . . . . . . . . . xvii
4.2
Durchnummerierte Experimentreihen . . . . . . . . . . . . . . . . . . 30
5.2
Anteil der reagierenden Zellen in den verschiedenen durchnummerierten Experimentreihen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 44
B.2 Pole der repräsentativen Zellen für die Experimentreihen Nr.1, Nr.2
und Nr.3 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 100
D.1
D.2
D.4
D.6
Verwendete Geräte und Materialien . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Klassifikation der Reinraumklassen . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Verwendete Laser, Fluoview FV1000 (Olympus) . . . . . . . . . . .
Benötigte Scan-Zeit für verschiedene ’imaging’-Regionen, Fluoview
FV 1000 (Olympus) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
. 109
. 110
. 112
. 113
E.1 Verwendete Chemikalien . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 115
129
Tabellenverzeichnis
130
Danksagung
Danken möchte ich Herrn Prof. Dr. Eberhard Bodenschatz dafür, dass er die entscheidende Idee zum Thema dieser Bachelorarbeit lieferte, dass er stets bereit war
mir bei der Lösung kleinerer und größerer Probleme zu helfen, für die konstruktiven
Verbesserungsvorschläge sowie für die Hilfe bei der Interpretation einiger Daten.
Weiterhin möchte ich Frau Prof. Dr. Sarah Köster für die Ermutigung meine Ergebnisse herauszustellen und innovative Interpretationen dieser durchzuführen, danken.
Ein besonderer Dank gilt Herrn Christian Westendorf, der mit seinem Einsatz
(selbst an vielen Wochenenden) und der Organisation sowie Koordination der Bachelorarbeit diese erst möglich gemacht hat. Dadurch, dass er seine Messdaten zur Verfügung stellte sowie Simulationen der Konzentrationsgradienten durchführte, konnte
die Erklärung meiner Messergebnisse entscheidend verbessert werden.
Frau Dr. Noriko Oikawa möchte ich für die Erklärung der cAMP-Signalwellen
des D. discoideum danken. Frau Dr. Azam Gholami danke ich für die Erklärung
der Aktin-Netzwerke. Ebenso gilt mein Dank Herrn Albert J. Bae, Herrn Gabriel
Amselem und Herrn Matthias Theves für die Hilfe bei experimentellen Problemen,
die Hilfe bei der Programmierung mit MATLAB® und diverse beratende Gespräche.
Zu allerletzt möchte ich mich noch bei dem gesamten technischen Team und allen
Mitarbeitern und Wissenschaftlern der Abteilung Dynamik und Selbstorganisation,
die ich in der Eile vergessen habe, bedanken. Besonders hervorzuheben ist dabei
Frau Katharina Schneider, die die Zellkulturen verwaltete und mir bei Fragen zu
sämtlichen Geräten stets gerne zur Verfügung stand.
Mein persönlicher Dank gilt meinen Eltern und Freunden. Einerseits für das unermüdliche Korrektur lesen, andererseits aber auch für die Aufheiterung in den Momenten, in denen ich an mir und meiner Arbeit gezweifelt habe. Vielen Dank, dass
ihr mich auch in den letzten sehr arbeitsintensiven Phasen nicht vergessen habt,
ohne euch wäre diese Arbeit nicht möglich gewesen.
131
Erklärung
nach §13(8)der Prüfungsordnung für den Bachelor-Studiengang
Physik und den Master-Studiengang Physik an der Universität
Göttingen:
Hiermit erkläre ich, dass ich diese Abschlussarbeit selbständig
verfasst habe, keine anderen als die angegebenen Quellen und
Hilfsmittel benutzt habe und alle Stellen, die wörtlich oder sinngemäß aus veröffentlichten Schriften entnommen wurden, als solche kenntlich gemacht habe.
Darüberhinaus erkläre ich, dass diese Abschlussarbeit nicht, auch
nicht auszugsweise, im Rahmen einer nichtbestandenen Prüfung
an dieser oder einer anderen Hochschule eingereicht wurde.
Göttingen, den 30. Juli 2009
(Rabea Sandmann)

periodische Anregung und intrazelluläre Antwort

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