Molekulargenetik – Praktikum WS2014/2015 Detection of regulation of gene

Molekulargenetik – Praktikum
WS2014/2015
Detection of regulation of gene
expression by miRNAs in plants
Andrea Hoffmeier
Dajana Lobbes
Lydia Gramzow
What are microRNAs?
•
•
•
•
Short (20-24nt), non-coding RNAs
Negatively regulate gene expression
Identified in plants, animals and viruses
Plant and animal miRNAs are key regulators of a variety of
developmental processes
Antirrhinum majus
wild type and fistulata mutant
Cartolano, 2007
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Characteristics of miRNAs
• pre-miRNA structure
potential exonexon junction
(mature) miRNA
pre-miRNA
• Complementarity to target mRNA
(mature) miRNA
target mRNA
• Often regulate transcription factors
3
miRNA biosynthesis
MADS-domain proteins
• Key regulators of plant
development
• Conserved domain structure
• About a dozen ancient clades
which control different aspects
of plant development
M
I
K
C
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Major Goal
Identification and
verification of miRNAs
regulating MADSdomain proteins
miRNAs regulating genes in monocots
Wikipedia.org
Hedges, 2002
Special features of the miR444 family
•
Intron is separating parts coding for miR and miR*
Sunkar et al., 2005
•
Only identified in Poaceae so far
8
Special features of the mi444 family
•
•
miR444 genes are natural antisense (nat) to their target genes
other identified miR444 genes from other grasses and banana are
mostly nat-miRNAs
Lu et al., 2008
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Analysis of presence of miRNA444
Basal
angiosperms
Northern
blot
Transcriptome
Pre-miRNA444
Transcriptome
AGL17-like gene
eudicots
Acorus
americanus
Triglochin maritimum
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Dioscorea villosa
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Verification of gene
regulation by miRNA
wikipedia.org
Dioscorea bulbifera - air potato
Dioscorea bulbifera – complementarity of AGL17-like
gene and miR444
exon 1
exon 2
exon 3
AGL17-like gene
nat-miR444
mature miRNA
267 bp
miRNA*
473 bp
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DNA isolation from Dioscorea bulbifera
PCR for pre-miRNA and target gene AGL17
Cloning into plasmid pGREEN+35S or pGREEN+35SmGFP5ER
Transformation of E.coli
Plasmid DNA preparation
Transformation of Agrobacterium tumefaciens
Transformation of Nicotiana benthamiana
Analysis of GFP expression
Establishment of an in vivo-system
Target gene – GFP fusion
Target gene – GFP and miRNA
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Questions?
Was wird benötigt?
• DinA4 Laborheft – direkt am Praktikumstag zu
führen
• Kittel
• Dünner “Edding”
• Namensschild
• Gute Vorbereitung auf den jeweiligen
Praktikumstag:
Skript http://www.uni-jena.de/Genetics.html
Was wird erwartet?
• Anwesenheit und Mitarbeit
• Nachweis von Krankheit
• Antestat: Vor jedem Praktikumstag
– Fragen zum jeweiligen Versuch müssen
beantwortet werden
– In Summe muss mindestens 50 % der Punkte
erreicht werden: Zulassung zum Testat
Was wird erwartet?
• Protokollheft während des Praktikums
• Protokoll am Ende des Praktikums
• Erfolgreiche Teilnahme am Testat (02.02.15)
Protokoll
Abgabe am 02.02.15
1 Protokoll pro Gruppe
Name, Datum, Gruppe
Studiengang, Matrikelnummer
Kurze Einleitung (3 - 5 Sätze) zu den einzelnen
Versuchsteilen
• Material und Methoden (nur falls
abweichend vom Skript!!)
•
•
•
•
•
Protokoll
• Ergebnisse: enthält Messwerte in Form von
Tabellen und Abbildungen selbsterklärend
beschriftet und eine Textbeschreibung der
Ergebnisse
• Diskussion: enthält Bewertung der Ergebnisse,
Vergleich mit Literaturdaten (sofern
vorhanden) bzw. mit zu erwartenden
Ergebnissen, Fehlerbetrachtung)
Protokoll
• Einheit von Einleitung, Ergebnisse und
Diskussion pro Versuchsteil
Hinweise zur Beschriftung
• Beschriftung von Tabellen: über der Tabelle
• Beschriftung von Abbildungen: unter der
Abbildung
• Beschriftung von Graphen:
Achsenbeschriftung nicht vergessen
• Mit der Beschriftung ist eine Abb/Tabelle
selbsterklärend
Beispiel Bildunterschrift
Beispiel Tabellenbeschriftung
Fragen?
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