PRACTICA 06 - Biología General

Práctica 6 : FOTOSÍNTESIS Y TRANSPIRACIÓN
I.- Objetivos
Al final del laboratorio el estudiante debe ser capaz de:
* Describir el rol de la luz y los pigmentos en la fotosíntesis.
* Identificar la clorofila y otros pigmentos presentes en las hojas por medio de las técnicas de cromatografía.
* Explicar el efecto de la luz sobre la tasa fotosintética con base en la producción de O2 y consumo de CO2
* Cuantificar el efecto de la luz sobre el proceso de transpiración
II.- Introducción
Las células llevan a cabo diversos procesos para mantener su funcionamiento normal, muchos de los cuales
requieren de energía. A través del proceso de la fotosíntesis, los organismos autótrofos (cianobacterias, algas
y plantas) capturan la energía libre del ambiente y en presencia de CO2 y H2O, la convierten en energía
química que se almacena en forma de azúcares u otras moléculas orgánicas. El proceso de fotosíntesis es uno
de los muchos fenómenos de la naturaleza que tiene una influencia directa sobre la mayoría de los seres
vivos ya que la biomasa vegetal obtenida por la fotosíntesis es la única fuente de materia orgánica que pueda
servir de alimento y fuente de energía a todos los organismos vivos.
Desde el punto de vista bioquímico, el proceso de fotosíntesis, es un proceso complejo de reacciones
químicas que se inicia con la captación de energía por parte de pigmentos fotosintéticos que absorben
fotones de luz en un rango de longitudes de onda específicas del espectro visible.
El proceso general de fotosíntesis se puede resumir de la siguiente forma:
12H2O + 6CO2 + luz → C6H12O6 + 6O2 + 6H2O
(1)
En las células eucariotas, la fotosíntesis ocurre en el
interior del cloroplasto, el cual está formado por una
matriz relativamente homogénea (estroma) delimitada por
una doble membrana. En la matriz se observan un
conjunto de sacos aplanados (tilacoides) dispuestos en
forma apilada, que en conjunto se conoce como grana. En
el interior de los tilacoides se encuentran una serie de
pigmentos que tienen la propiedad de absorber fotones de
luz en el espectro de longitudes de onda de la luz visible, y
transfieren esa energía a una serie de moléculas que
participan en las reacciones de la fotosíntesis (fotosistemas).
Se han caracterizado tres grupos principales de pigmentos fotosintéticos: clorofila, ficobilinas y
carotenoides (carotenos y xantofilas) Cada uno de éstos grupos incluyen diferentes tipos de pigmentos que
absorben luz a diferentes longitudes de onda. También difieren en el grado de solubilidad al agua o grado de
polaridad. Aunque la clorofila a (o bacterioclorofila en procariotas) es fundamental para el funcionamiento
del fotosistema, todos los organismos autótrofos contienen una mezcla de más de una clase de pigmento,
cada uno con un espectro de absorción, y función, diferente. La clorofila b, clorofila c, carotenoides y
ficobilinas son pigmentos accesorios cuya función es ampliar el espectro de absorción de los pigmentos
primarios y como sistemas de protección frente a la luz excesiva.
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El siguiente cuadro es un resumen de algunas características de los pigmentos fotosintéticos más comunes
Cuadro 1: Características de los pigmentos fotosintéticos más comunes en los
organismos autótrofos
Pigmento
Clorofila
Clorofila a
Clorofila b
Clorofila c
Carotenoides
caroteno
Xantófilas
Ficobilinas
Ficoeritrina
Ficocianina
Color
Polar
Longitud de onda de absorción
Azul-verde
Amarillo-verde
Verde claro
no
no
no
430 nm; 662 nm
453 nm ; 642 nm
430
Anaranjado
amarillo
no
no
450 nm; 480-485
530 nm
rojo
azul
si
si
590 nm
625 nm
Para que el proceso de la fotosíntesis ocurra, las plantas deben mantener los estomas abiertos con la finalidad
de permitir el intercambio de CO2/O2 desde/hacia la atmósfera. Como una consecuencia de la actividad
fotosintética en las células del mesófilo, existe un componente de pérdida de agua en forma de vapor de
agua.
La transpiración es un proceso biológico en el cual la planta toma agua del suelo hacia las raíces, el tallo y
las hojas, Este proceso comprende la evaporación del agua desde el interior de los espacios intercelulares en
las superficie de la hoja y su difusión fuera del tejido vegetal principalmente a través de los estomas y en
menor medida a través de la cutícula.
Debe existir un balance entre el transporte de CO2 y O2 y la pérdida de agua. Recordemos que las células
guardianas de los estomas participan en la regulación de la apertura y cierre de los estomas en respuesta a
distintas condiciones ambientales. En general, la tasa de transpiración de un determinante primario del
balance energético de la hoja y del estado hídrico de la planta y depende de la temperatura, la humedad y el
área superficial de la hoja.
En esta práctica se pretende hacer un análisis general del complejo e importante proceso de la fotosíntesis.
Para ello se realizarán diferentes procedimientos, empezando con la estimación de la tasa fotosintética,
midiendo tanto la tasa de consumo de CO2 y la tasa de producción de O2 mediante un ensayo de discos
flotantes. Así mismo, identificaremos los pigmentos fotosintéticos presentes en una hoja mediante una
técnica de separación llamada cromatografía de papel. Finalmente, estudiaremos la tasa de transpiración
como una medida del balance energético e hídrico de la planta.
III.- Procedimiento
Durante la sesión de laboratorio se realizarán 4 experimentos que le permitirán conocer algunos aspectos de
los procesos de fotosíntesis y respiración. Para lograr este objetivo, los miembros pares o impares de cada
uno de los subgrupos de laboratorio definidos en la primera sesión de laboratorio, realizarán y analizarán un
experimento, de acuerdo con las indicaciones del instructor.
Al finalizar los experimentos, todos los miembros de cada subgrupo se reúnen para hacer una discusión de
los resultados obtenidos y completar el reporte. Cada subgrupo debe estar preparado para presentar y discutir
sus resultados.
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Antes de iniciar la recolección de datos, para cada experimento plantéese una
pregunta de trabajo, y basándose en ésta, diseñe una hipótesis de trabajo y una
predicción de sus resultados.
Identifique en su hipótesis las variables dependientes e independientes
Diseñe un cuadro completo en donde pueda anotar los datos colectados y el análisis
realizado.
Experimento 1
El papel de la luz en la fotosíntesis.- Absorción del dióxido de carbono
PROBLEMA:
La absorción del dióxido de carbono por las plantas en presencia de luz es una evidencia indirecta del
proceso de fotosíntesis. Uno de los métodos más simples para demostrarlo es estimar cambios en los niveles
de CO2 disuelto en una solución que contiene una planta acuática bajo condiciones de iluminación (Elodea).
El CO2 en solución acuosa se convierte en un ácido (ácido carbónico), cuya concentración se medirá por
medio de una titulación usando un indicador de pH (fenolftaleína). Con este indicador se observará el punto
de cambio en pH, donde se obtiene el equilibrio entre pH ácido y básico. Este cambio en pH sucede al
añadirle una solución básica de NaOH a la muestra ácida, y se observa por un cambio en color; de esta forma
se podrá calcular la producción de CO2 para cada organismo
EQUIPO Y MATERIALES
SOLUCIONES
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


Frascos de vidrio
Lámpara
Pajillas
Rama de Elodea
Beaker de 100 ml
dH2O
Fenolftaleína
Solución de NaOH 2,5 M
PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL
1. Agregue en tres frascos de vidrio etiquetados, 25 ml de dH2O. En el frasco número 1 no agregue
ninguna planta, mientras a los frascos número 2 y 3 agregue en cada uno una rama de Elodea.
2. Sople con una pajilla cada uno de los frascos.
3. Tape herméticamente los frascos, y al frasco 3 cúbralo completamente con papel de aluminio.
4. Coloque los frascos1 y 2 cerca de una fuente de iluminación y espere unos 30 minutos.
5. Al finalizar los 30 minutos, añada 5 gotas de fenolftaleína (éste indicador es incoloro en soluciones
ácidas y se torna rosado en soluciones alcalinas) y mezcle bien.
6.
Llene la bureta de titulación con la solución de 0.0025 mM de NaOH.
7. Mueva el frasco en círculos y añada gotas de la solución de NaOH hasta obtener un color rosado
persistente.
8. Anote en el cuadro de resultados la cantidad de NaOH que utilizó para obtener un cambio en el color del
frasco, mediante la titulación.
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9. Calcule el consumo de CO2 mediante esta ecuación:
[CO2] = ml de NaOH (experimental) – ml de NaOH (control) * [NaOH]
Volumen de la Elodea (ml)
Para determinar el volumen de Elodea, siga el siguiente procedimiento:
a.- Coloque la Elodea en un vaso (beaker) pequeño con 50 ml de agua.
b.- Haga una marca donde queda el menisco.
c.- Remueva cuidadosamente el organismo con la precaución de no derramar agua.
d.- Con una pipeta llena añada agua hasta llegar a la marca.
e.- La diferencia de lectura en la pipeta indicará el volumen del organismo.
10. Repita el proceso con los demás frascos.
11. En el cuadro de datos diseñado por el subgrupo de trabajo, reporte sus datos y discuta las diferencias en
las concentraciones de CO2 en las 3 condiciones experimentales
Experimento 2
El papel de la luz en la fotosíntesis.- Producción de O2
PROBLEMA:
De acuerdo a la ecuación 1 (introducción) la tasa fotosintética de una planta puede ser medida
indirectamente estimando la tasa de liberación de O2 en la planta o en una hoja aislada. Sin embargo, es
importante de recordar que el proceso de respiración ocurre simultáneamente al proceso de fotosíntesis. Por
lo tanto, el consumo del O2 (respiración aeróbica) acumulado en la hojas (mesófilo esponjoso) disminuye la
cantidad de O2 que podría ser liberado como producto de la fotosíntesis por respiración aeróbica. De esta
forma, valores de O2 liberado representan una medida de la tasa neta de fotosíntesis.
Uno de los métodos frecuentemente utilizados para estimar la tasa neta fotosintética se basa en la
eliminación al vacío, de gases (O2 y CO2) acumulados en el mesófilo de una hoja, cortada en forma de
discos, que posteriormente se infiltran con una solución de bicarbonato de sodio como fuente de CO2. En
oscuridad, los discos desgasificados permanecerán en el fondo de la solución de bicarbonato de sodio, pero
en presencia de una fuente de luz, se van acumulando O2 en los espacios intersticiales producto de la
fotosíntesis, haciendo que los discos floten en la solución (si la tasa de producción de O2 por fotosíntesis,
sobrepasa la tasa de de consumo de O2 por respiración aeróbica).
EQUIPO Y MATERIALES
SOLUCIONES
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

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
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
3 Jeringas de 5 ml etiquetadas
(c/CO2+luz, c/CO2+oscuridad y
s/CO2)
Envases plásticos
Lámpara
Hojas de espinaca
Perforador de hoja
cronómetro
regla
Soporte mecánico
Manguera
dH2O
Solución jabonosa
Bicarbonato de sodio (NaHCO3) 0.2%
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


Vaselina
Tapones de hule
Papel toalla
PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL
El siguiente experimento consiste en cuantificar el número de discos de hojas de igual tamaño, que
flotan, en 3 condiciones experimentales: control, en presencia de CO 2 en condiciones de luz, y en
presencia de CO 2 pero en condiciones de oscuridad.
Nota: Las 3 condiciones experimentales pueden ser ejecutadas simultáneamente, participando
todos los compañeros del subgrupo de trabajo, o de forma secuencial. Discuta con sus
compañeros y el instructor, la estrategia que van a seguir en su subgrupo
1. Agregue un volumen de 100 ml de Bicarbonato de Sodio en los dos envases plásticos rotulados como
c/CO2. Al otro frasco (s/CO2), agregue el mismo volumen de dH2O.
2. En cada uno añada una gota de solución jabonosa, evitando la formación de burbujas.
3. Usando un perforador, corte 30 discos de hojas de espinaca, evitando cortar sobre la vena principal de la
hoja. Escoja un área de la hoja lo más uniforme y delgada posible.
4. Remueva el pistón de cada jeringa, y coloque 10 discos en cada jeringa.
5. Cuidadosamente, coloque nuevamente el pistón. Coloque la jeringa en posición vertical y empuje el
pistón hasta un punto en la jeringa donde un volumen pequeño de aire permanece junto a los discos
(aproximadamente 10% del volumen de la jeringa).
6. Succione un volumen pequeño (3-5 ml) del envase rotulado como s/CO2. Manteniendo la jeringa
invertida (la punta dirigida hacia arriba), haga movimientos de la jeringa hasta que todos los discos se
mantengan suspendidos en la solución.
7. Coloque la tapa de la punta de la jeringa y mantenga presión sobre ella con el dedo
índice de su mano izquierda.
Sosteniendo la jeringa hacia arriba, genere un vacío dentro de la jeringa, halando
el pistón hacia afuera con la mano derecha, mientras mantiene cerrada la punta de
la jeringa. (si al soltar el pistón, éste no regresa a su posición inicial, significa que
no está generando un buen vacío). Mantener la presión al menos 10s.
Note que se forman pequeñas burbujas provenientes tanto el aire que estaba
disuelto en el agua como el aire de adentro de la hoja que se juntan para formar
burbujas grandes. Expulse este aire quitando el dedo y empujando el pistón.
8. Repita el paso anterior 2-3 veces, hasta observar que los discos se hunden al fondo
de la jeringa.
Nota: si encuentra dificultad en lograr que los discos se sumerjan en la solución
trate de añadir 1 o más gotas de jabón en la solución prueba. No trate de generar
vacío en la jeringa más de 5 veces ya que puede dañar los discos.
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9.
Coloque la jeringa cerca de la fuente de luz (lámpara), evitando que se caliente
demasiado. Inicie el cronómetro.
10. Cuente el número de discos que flotan, al final de cada minuto (asegúrese de sacudir
muy suavemente la jeringa si algún disco se queda pegado en las paredes de la
jeringa). Continúe midiendo por 10 min o hasta que todos los discos flotan.
12. Para el análisis, haga una gráfica donde se represente el número
de discos que flotan en función del tiempo, para las 3 condiciones
experimentales, control, en presencia de CO2 + luz y en presencia
de CO2 + oscuridad.
En la gráfica, determine el punto en el tiempo en el cuál el 50%
de los discos de hoja están flotando (ET50) el cual representa un
valor confiable de la tasa fotosintética.
13. Compare los valores de ET50
experimentales
Numero de discos flotando
11. Repita el mismo procedimiento, utilizando igual cantidad de discos, pero en presencia
de la solución de bicarbonato y finalmente, en presencia de bicarbonato pero
manteniendo la jeringa en condiciones de oscuridad.
EC50
en las 3 condiciones
Tiempo (min)
Experimento 3
Efecto de la luz en la tasa de transpiración
PROBLEMA:
El método más simple y frecuentemente utilizado en la mayoría
de los laboratorios de enseñanza consiste en un depósito de agua
(tubo o manguera plástica), en el que a un extremo se introduce
rama
una rama, que se ajusta al orificio de un tapón de hule. El
fresca
contacto entre el tallo de la rama-tapón-manguera debe ser
sello
hermético. En el otro extremo de la manguera, se conecta un
hermético
tubo capilar calibrado o pipeta volumétrica, el cual permite
medir directamente la pérdida de agua por parte de la planta por
transpiración. Con ésta técnica se pueden utilizar pedazos de
manguera
ramas, tallos, hojas y otros, pero no plantas completas
Debido a que el agua se evapora a través de los muchos estomas
que se encuentran en la superficie de la hoja de una planta, la
tasa de transpiración está directamente relacionada con el área
superficial de la hoja y se debe expresar como la cantidad de
agua perdida (ml) por metro cuadrado por minuto (m2/min).
llena de agua
pipeta
volumétrica
sello
hermético
Para cuantificar la tasa de transpiración, por lo tanto, debe calcular el área de superficie de las hojas de cada
rama utilizada:
EQUIPO Y MATERIALES
SOLUCIONES
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


Soporte mecánico
Pinza para bureta
Tubo plástico
dH2O
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

Rama de una planta
Pipeta volumétrica de 2 ml
PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL
1.
Obtenga un tubo plástico y llénelo con agua
2.
Coloque en uno de los extremos del tubo una pipeta volumétrica de 2 ml
3.
Tome los dos elementos (manguera + pipeta) y coloque el otro extremo en un envase con agua.
4.
Conecte un pipeteador en el extremo libre de la pipeta y llene la pipeta, a través de la manguera,
evitando la formación de burbuja. Una vez alcance la marca de 0 ml, no succione más. No retire el
pipeteador del extremo de la pipeta.
Si observa alguna burbuja a lo largo de la columna de agua, debe expeler todo el agua, e iniciar de
nuevo.
En los siguientes pasos, el extremo de la rama cortada debe permanecer en contacto con el agua, no
expuesta al aire, para evitar romper la columna de agua en el xilema
5.
Escoja una rama para cortar.
6.
Con un cortador, corte en ángulo el tallo de una rama bajo el agua.
7.
Sin sacar el tallo de la bandeja de agua, inserte la rama en el tapón que sella el terminal de la manguera
+ pipeta. El diámetro de la rama debe ajustar firmemente el diámetro del tapón.
8.
Remueva el combinado rama-manguera-pipeta y rápidamente coloque vaselina alrededor de las zona de
contacto de la manguera con la pipeta y la rama.
9.
Coloque los dos extremos del combinado rama-manguera-pipeta en la pinza
para bureta, formando una U con la manguera, como se muestra en la figura.
Asegúrese que durante esta manipulación la planta siempre se mantiene en
contacto con el agua y que el agua no entre al pipeteador.
10. Con mucho cuidado retire el pipeteador y verifique que el nivel de agua no
cambia, lo que demuestra que los extremos están bien sellados.
11. Coloque su preparación a las condiciones establecidas por el instructor y
mida el nivel de agua en la pipeta cada 2 minutos, por 30 min.
12. Una vez finalizado, remueva la rama de la manguera y limpie su estación de
trabajo.
Recuerde eliminar completamente los restos de vaselina.
13. Calcule la tasa de transpiración de la planta midiendo el volumen de agua consumido por la planta por
unidad de tiempo (min).
14. Para expresar la tasa de transpiración por unidad de área, es necesario
conocer el área superficial de la hoja. Para ello:
29 cm
a. Coloque las hojas a medir en una cuadrícula de 1 cm.
b. Trace el contorno de cada hoja.
c. Cuente un cuadrado parcial si es de al menos la mitad cubierta por
la hoja, no cuente cuadrados parciales que cubren menos de la
mitad). Tampoco incluya el área del tallo (pecíolo) en sus cálculos.
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15. Compare sus resultados con otros grupos
Experimento 4
Separación de los pigmentos vegetales
PROBLEMA:
Los cloroplastos contienen una mezcla de pigmentos fotosintéticos cuya composición varía entre los distintos
organismos autótrofos. Con base en las propiedades químicas individuales y la polaridad relativa de cada
pigmento, éstos pueden ser separados y diferenciados en componentes individuales.
La cromatografía es una técnica físico-química que se usa para separar e identificar sustancias en sus
constituyentes individuales. Consiste en una migración de los componentes de la mezcla entre la fase fija,
que es la fase estacionaria y otra fase móvil. La separación es posible debido a que algunas sustancias se
retienen mejor en la fase estacionaria, mientras que otras se mueven mejor en la fase móvil. Se puede
identificar varios tipos de cromatografía dependiendo del estado físico de las fases que participan: (1)
cromatografía de adsorción en la cual, la fase estacionaria es sólida y la fase móvil es líquida, y (2)
cromatografía de reparto. En este caso, la fase líquida o gaseosa se desplaza sobre una fase líquida
estacionaria colocada en la superficie de un soporte sólido. La cromatografía de papel se fundamenta en una
combinación entre la cromatografía de adsorción y cromatografía de reparto. La partición ocurre entre el
agua que hidrata la celulosa y la fase móvil orgánica.
EQUIPO Y MATERIALES
SOLUCIONES






Extracto de pigmentos
Papel de cromatografía de papel
Tijera
Capilares de vidrio
dH2O
Solución reveladora
PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL
1. Tome una tira de papel de cromatografía y marque con un lápiz, una línea 1,5 cm de distancia del fondo
del papel. Esta línea indicará el área de inicio donde se colocará el extracto de pigmentos
2. Haga un corte en forma de “V” en el extremo donde colocó el extracto
3. En el borde superior de la tira de papel marque una raya a 2 cm. del borde superior, ésta indica el frente,
y será el punto final al que debe llegar la solución reveladora (cuando el frente llegue a este punto, saque
inmediatamente el papel del tubo de ensayo).
papel de
cromatografía
1,5 cm
capilar
4. Con un capilar de vidrio pequeño extraiga una cantidad del
extracto de pigmento. el cual consiste en hojas frescas de
espinacas (Spinacia oleracea, Chenopodiaceae) o güitite
(Solanaceae).
5. Deposite una pequeña cantidad del extracto. Para ello dibuje con
el extremo del capilar que contiene el extracto rápidamente una
línea paralela a la línea de inicio (paso 1)
6. Cuando esta gota esté seca añada mas extracto, siguiendo el
mismo procedimiento, esperando que cada una seque antes de
poner la siguiente.
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7. Suspenda la tira de papel con un gancho dentro de un tubo de ensayo que contenga la solución
reveladora (acetona al 8% y éter de petróleo 92%). Cuide que el papel no haga contacto con las paredes
del tubo de ensayo.
8. Regule la superficie de contacto con el líquido sacando o
introduciendo el gancho dentro del corcho. El papel debe
tocar con la punta la superficie del líquido, pero no debe
introducirse en el mismo.
9. Una vez que el papel ya tocó el solvente, cierre el frasco.
No mueva y golpee el frasco
10. Cuando el frente llegue al punto final (2cm del borde) saque
el papel y póngalo a secar al aire, en un sitio oscuro.
11. Cada una de las bandas coloreadas del extracto de las
plantas es un pigmento diferente. Para cada uno de los
pigmentos que observa aplique la siguiente fórmula:
Rf = distancia recorrida por el pigmento
distancia recorrida por el disolvente
El Rf es un indicador de la afinidad de cada pigmento por las fases sólida y líquida. Se utiliza para
caracterizar pigmentos; por lo tanto, el pigmento que tenga mayor Rf, será el más afín a la fase líquida y
el de menor Rf será el más afín a la fase sólida.
12. Haga un esquema en el reporte de sus resultados.
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