Peter Firbas

ZASEBNI LABORATORIJ ZA RASTLINSKO CITOGENETIKO
Uporaba Allium metafaznega testa za določanje kakovosti okolja
ZASEBNI LABORATORIJ
ZA RASTLINSKO CITOGENETIKO
ALLIUM METAFAZNI GENOTOKSIČNI TEST ZA TESTIRANJE PITNE
VODE, OKOLJSKIH VZORCEV IN KEMIKALIJ
Naročnik:
MIK, MEDNARODNO TRGOVSKO IN PROIZVODNJO PODJETJE, d.o.o.
Celjska c. 55; SI – 3212 Vojnik, Slovenija
Energijska okna z vgrajeno energijsko ploščico z informirano celico (IC) po
tehnologiji MOP – Poznik (v nadaljevanju: Energijska okna) za izboljšanje kakovosti
prostora
A: Poslovni prostor, MIK; Arclin; Celjska c. 55, SI – 3212 Vojnik
B:Kabinetni prostor, Ljubljanska c. 74, SI – 1230 Domžale
Raziskani vzorci:
Pitna vodovodna voda; Muretinci 14, 2272 Gorišnica (vzorčenje 01. 11. 2010)
Isto – traktacija z Energijskim oknom
Citogenetske raziskave so potekale od 13. 11 do 19. 11. 2010
DOMŽALE
20. NOVEMBER 2010
TESTNO POROČILO Z REZULTATI RAZISKAV PODAJA
1. Protokol ALLIUM metode
2. Rezultate splošne strupenosti (toksičnosti) in raven genotoksičnosti vzorca
pitne vodovodne traktirane z ENERGIJSKIM OKNOM
3. Traktirani pitni vodovodni vodi se kakovost na obeh lokacijah izboljša. V
poslovnem prostoru v obrtni coni Arclin (p = 0,0325 < 0,05) in v kabinetnem
prostoru Domžale (p = 0,0106 < 0,05).
4. Poročilo obsega 8 strani, 2 preglednici s prilogo 8. fotografij
Raziskave v rastlinski
aplikativni citogenetiki
ALLIUM
PETER FIRBAS s.p.
univ. dipl. biol.
Ljubljanska c. 74
SI – 1230 Domžale
1
ZASEBNI LABORATORIJ ZA RASTLINSKO CITOGENETIKO
Uporaba Allium metafaznega testa za določanje kakovosti okolja
Kako zdrav je prostor
Kako zdrav je prostor je vprašanje, ki ne pušča ravnodušnosti. Njegovo sporočilo
zamotano v biološko znanost, nam odpira svet, da lahko z danes znanim biološkim
opazovanjem razlik v dolžini rasti korenin testne rastline (Allium cepa L.) in
poškodbah kromosomov v njihovih celicah v odvisnosti od okolja določa kakovost
bivalnega prostora.
“Think before you …”
Samo fizikalno-kemične analize ne dajo dovolj zanesljivega odgovora na vprašanje
kako zdrava je voda. Komplementarna raziskava skupno z biološkimi in kemičnimi
raziskavami pa podaja popolnoma drugo sliko, kajti težko je identificirati
najrazličnejše vplive (sevanja) v okolju. Biološka metoda ALLIUM razkriva celosten
vpliv na rast in razvoj živih celic ali organizmov ter zaznava prisotnost škodljivih snovi
v mejah in sposobnosti analitskih metod. Od najrazličnejših ionizirajočih in ne
ionizirajočih sevanj, ki se lahko znajdejo na primer v okolju, jih z običajnimi fizikalnokemijskimi analizami ne moremo povsem in zagotovo utemeljiti posledičnosti na živ
organizem: Think before you… – Pretehtajte preden se “vselite”).
Splošna strupenost - toksičnost
Različna odzivnost rasti korenin testne rastline (Allium cepa L) je splošni pokazatelj
kakovosti okoljskega vzorca. Rast naravnost pokaže v kako za življenje primernem
prostoru zrastejo. Daljše ko so korenine boljša je kakovost okoljskega prostora in
krajše ko so korenine slabša je kakovost okoljskega prostora.
Raven genotoksičnosti
Pogled na celično raven v rastnih vršičkih korenin testne rastline, še bolj pa
pregledovanje celic, ter njihovo razmerje brez poškodovanih kromosomov in celic s
poškodbami kromosomov v njej, pa daje že zelo natančno sliko o kakovosti
okoljskega prostora, oziroma kar odgovor na vprašanje, kako zdrava je prostor.
Ocena tveganja
Ni dovolj le ugotoviti, kaj nas ogroža (različna sevanja v okolju), temveč, kako resno
je (kako prihaja do škodljivih učinkov v bioloških sistemih). S tem nesporno
dokazujejo, da ni varnih doz, torej da so MDD (Mejne Dovoljene Doze) nek sporazum
podrejen praktični uporabi. Na te izzive pa odgovarjajo biološki testi, ki pokažejo
sinergistične in komulativne učinke škodljivih sevanj, mehanizme prenosa in tudi
pretvorb teh škodljivih sevanj v bioloških sistemih.
Soodvisnost ionizacije okolja
Polucija ionizirajočih sevanj dokazana z biološkimi testi je prvi genotoksični
biomarker. Obstajajo tehtni dokazi da nekatera sevanja, ki povzročajo kromosomske
poškodbe; znane kot genotoksična sevanja izkazujejo lastnosti kancerogenosti.
2
ZASEBNI LABORATORIJ ZA RASTLINSKO CITOGENETIKO
Uporaba Allium metafaznega testa za določanje kakovosti okolja
PROTOKOL TESTA
ALLIUM METAFAZNI GENOTOKSIČNI TEST
ZA TESTIRANJE OKOLJSKIH VZORCEV,
KEMIKALIJ IN PITNE VODE
Peter Firbas
Peter Firbas, univ. dipl. biol., Zasebni raziskovalec
Laboratorij za rastlinsko citogenetiko, E-pošta: [email protected]
1. Uvod
ALLIUM metafazni test je test za ugotavljanje splošne celične strupenosti (citotoksičnosti) in
ravni genotoksičnosti v vodnih, kopenskih in zračnih ekosistemih, kjer dokazujemo
potencialne genotoksične snovi. Test je kratkotrajen in pokaže usklajen in celokupen učinek
onesnaževanja in medsebojno delovanje med testno rastlino (Allium cepa L.) in potencialnimi
genotoksiki, nakar se še rezultati statistično ovrednotijo. Rezultate raziskav s statistično
kalkulacijo prikazuje Fisher’s Exact Test. V 2x2 frekvenčnih tabelah dvosmerna p-vrednost
determinira statistično značilnost ali neznačilnost dveh kategoričnih vzorcev.
Biološki test ALLIUM ali čebulni test razkriva celosten vpliv na rast in razvoj živih celic ali
organizmov ter zaznava prisotnost škodljivih snovi v koncentracijah, ki so bistveno nižje od
mejnih sposobnosti analitskih metod. Od približno 700 prepoznavnih toksičnih in
genotoksičnih snovi, ki se lahko znajdejo na primer v pitni vodi, jih z običajnimi fizikalnokemijskimi analizami nadzorujemo le slabih 10 odstotkov (Vir: EU Chemical Bureau, Natural
Resources Defence Council: Think before you drink).
Polucija genotoksičnih snovi dokazana s biološkimi testi je prvi genotoksični biomarker.
Obstajajo tehtni dokazi da kemikalije, ki povzročajo kromosomske poškodbe; znane kot
genotoksične snovi lahko tudi inducirajo kancerogeni učinek, kakor tudi značilnost HDC –
hormone distruptors chemicals (hormonska distruptorska kemizacija ali kemikalije
hormonskih motenj).
Z biološkimi (genotoksičnimi) testi ugotavljamo odzivnost testne rastline navadne čebule
(Allium cepa L), ki se odraža v morebitnih poškodbah genetskega materiala (kromosomov) ne
glede na dopustne meje, ki ga lahko povzročajo razni onesnaženi vzorci v okolju. Glede na
univerzalnost genske kode živih organizmov so rezultati raziskav prenosljivi (aplikatibilen)
tudi na človeka.
Cilj raziskav je nedvomno ta, da ugotovimo, ne le to ali onesnaženje jé ali ga ni, ampak glede
na rezultate raziskav kakšna je ocena tveganja glede na raven genotoksičnosti raziskanih
okoljskih vzorcev npr. podtalnice kot pitnega vira in ostalih površinskih voda. Vsi smo pred
odgovorno nalogo kako reševati problem kakovosti okolja in pitne vode v njem.
3
ZASEBNI LABORATORIJ ZA RASTLINSKO CITOGENETIKO
Uporaba Allium metafaznega testa za določanje kakovosti okolja
2. Material in metode
Test se izvaja po: Tecnical Methods Section 1993, 1994; INVITTOX - Protokol No. 8,
1989, Fiskesjö, 1985, Al-Sabti 1989, Nielsen & Rank 1994, Rank 2003, Firbas 2004,
2006; Kumar P. in Panneerselvam N. (2007); Ragunathan I. in Panneerselvam N.
(2007).
Citogenetske raziskave potekajo na raziskovalnem mikroskopu znamke OLYMPUS – BX 41
Japonska) s samodejnim fotosistemom PM 10 SP, pri povečavi 400X in 1000X.
2.1. Parametri ALLIUM metafaznega testa
Parametri ALLIUM metafaznega testa podajajo: splošno strupenost (toksičnost), raven
genotoksičnosti, metafazni indeks in vzporedno kontrolo testa.
SPLOŠNA STRUPENOST podaja dolžino korenin testnih rastlin mlade čebule (Allium cepa
L.); je obratno sorazmerni z dolžino korenin testnih rastlin. Daljše kot so korenine manjša je
splošna toksičnost in krajše kot so korenine testnih rastlin večja je splošna strupenost ali
toksičnost(Slika 1, 2.).
RAVEN GENOTOKSIČNOSTI podaja poškodbe kromosomov v celicah koreninskih
vršičkov testnih rastlin mlade čebule (Allium cepa L.); je odstotkovno razmerje med vsemi
metafaznimi celicami in s metafaznimi celicami s poškodbami kromosomov (Al-Sabti 1985,
1989; Firbas 2004, 2006). Pregleda se do 200 metafaznih celic, pri visoki raveni
genotoksičnosti pa največ do 100 celic (Slika 3, 4).
METAFAZNI INDEKS: število metafaznih celic na 1000 pregledanih celic. Indeks ima
vrednosti med 20 in 100 ‰ (Promilnih točk).
ALLIUM metafazni test (Firbas 2004, 2006):
1.
2.
3.
4.
5.
6.
Prvi dan: odvzem vzorcev na terenu, ki so namenjeni raziskavi s testom ALLIUM
Drugi dan: nastavitev testnih rastlin na specifične vzorce
Tretji dan: po 24 urah menjava vodnih vzorcev
Četrti in peti dan: testne rastline ostanejo na vodnem mediju še 48 ur.
Šesti dan: potek raziskav splošne toksičnosti in ravni genotoksičnosti
Sedmi dan: statistična kalkulacija (Fišerjev eksaktni test (Fisher’s Exact Test).
Preglednica 1. Primerjava rezultatov ravni genotoksičnosti različnih kakovosti pitnih voda
(Firbas P.)
Raven genotoksičnosti
(izražena v odst. t. – je
razmerje med vsemi
metafaznimi celicami in
celicami s poškodbami
kromosomov; n = 200)
2
3
5
9
12
15
20
23
Raven
Ogroženosti
(ocena tveganja)
naravna mutagenost
testnih organizmov
Ničelna do Nizka
Vzorci pitnih voda in nekaterih
kemikalij
Kakovostna pitna voda
5 mg NO3/l
Srednja
0,01 µg/l biocidov, 25 mg/l nitratov
Visoka
0,1 µg/l biocidov, 40 mg/l nitratov
Kritična
(>0,1 µg/l biocidov, 50 mg/ll nitratov
4
ZASEBNI LABORATORIJ ZA RASTLINSKO CITOGENETIKO
Uporaba Allium metafaznega testa za določanje kakovosti okolja
Za vsak vzorec in obe kontroli se uporabi pet čebulic Allium cepa L. velikosti 16-18 mm in
težke 3-4 g; stare največ do 6 mesecev. Testne rastline mlade čebule se shranjujejo pri
temperaturi 10-14 C0 in zračni vlagi 50 %.
V vodnih vzorcih, kakor tudi v obeh kontrolah se gojijo gomolji testnih rastlin mlade čebule
72 ur pri temperaturi 20-21 C0. Izpostavljanje testnih rastlin v vodni raztopini kolhicina
blokira celične delitve v fazi metafaze, kjer so kromosomi najbolj vidni (metafazne celice).
ALLIUM test podaja rezultate splošne toksičnosti in ravni genotoksičnosti. Po barvanju v
karminocetu (3–4 min., 60 0C), se izdelajo mikroskopski preparati – mečkanci (macerati). V
kromosomskih garniturah opazujemo morebitne kromosomske poškodbe. Preparate po
obdelavi z tekočim CO2 (-70 0C) vključimo v euparal.
2.2. Kariotipizacija kromosomov mlade čebule (Allium cepa L.)
Preden analiziramo poškodbe kromosomov, je potrebno omeniti na splošno začilnost
morfologije kromosomov, saj nam le omogočajo pojasniti mehanizme nastajanja različnih
kromosomskih poškodb. Navadna čebula (Allium cepa L.) ima 16 kromosomov (Slika 3).
Kromosom tvorita dve vzporedno potekajoči in enako dolgi kromatidi, ki vsaka predstavlja
vzdolžno polovico kromosoma. Kromosom še ima primarno zožitev (centromero), ki
kromosom deli v daljši in krajši krak. Kromosomska kraka sta lahko tudi enako dolga.
Razmerje med dolžinama krakov podaja obliko kromosoma in je osnova za kromosomsko
kariotipizacijo (Levan in sod. 1964, Firbas 2004).
2.2.1. KATEGORIJE STRUKTURNIH KROMOSOMSKIH POŠKODB
Strukturna kromosomska poškodba je vsaka sprememba v strukturi kromosoma (Slika 4).
Kromosomske poškodbe so kromatidne in kromosomske. Večina kemičnih mutagenov
povzroči poškodbe kromatidnega tipa in so tudi najpogosteje nastale poškodbe. Centromerne
poškodbe (v primarni zožitvi kromosoma) so tudi poškodbe kromatidnega tipa in so
lokacijsko vezane na centomerno regijo kromosoma. Sploh pa so najpogostejše poškodbe
kromosomov prav v centromerni regiji, oziroma v sami centromeri (LC). V tem predelu je
kromosom tudi najobčutljivejši na poškodbe (Slika 4).
KROMATIDNE POŠKODBE
Enojni lom kromatide (ELK) – Single break chromatide (SBC)
Dvojni lom kromatide (DLK) – Double break chromatide (DBC)
Večkratni lomi kromatide (VLK) – Multiple breake chromatide (MBC)
CENTROMERNE POŠKODBE
Lom v centromeru (LC) – Break centromere (BC)
Špranjasti (gap) lom kromatide (GK) – gap break chromatide (GBC)
KROMOSOMSKE POŠKODBE
Krožni kromosom (KK) – Ring Chromosom (RC)
Dicentrični kromosom (DK) – Dicentric Chromosom (DC)
Poškodbe v kromosomski garnituri prizadenejo enega do dva kromosoma v garnituri, nadalje
3 do 7 ali 8, redkeje tudi do 12. Poškodovani pa so lahko vsi kromosomi v kromosomski
garnituri. Višja kot je raven genotoksičnosti več je poškodovanih tudi kromosomov v
garnituri. Prav tako se pojavlja tudi več različnih poškodb na posamičnem kromosomu v
garnituri.
5
ZASEBNI LABORATORIJ ZA RASTLINSKO CITOGENETIKO
Uporaba Allium metafaznega testa za določanje kakovosti okolja
3. Rezultati raziskav in razprava
Vzorčenje pitne vodovodne vode: 01. 11. 2010
Izpostavljenost testnih rastlin je potekalo na dveh lokacijah: V poslovnih prostorih MIK –
Celje (od 14. 11. 2010 do 17. 11. 2010) in z 24 urnim zamikom v kabinetnih prostorih v
Domžalah (od 15. 11. 2010 do 18. 11. 2010)
Citogenetske raziskave so potekale od 13. 10 do 19. 11. 2010
S testom Allium so bili raziskani naslednji vzorci:
I.
II.
III.
IV.
V.
VI.
Pitna vodovodna voda; Muretinci 14, 2272 Gorišnica
Isto – voda traktirana z Energijskim oknom (kabinet Domžale)
Pitna vodovodna voda; Muretinci 14, 2272 Gorišnica
Isto – voda traktirana z Energijskim oknom (poslovni prostor MIK Celje)
Negativna kontrola (voda filtrirana z reverzno osmozo – R. O.)
Pozitivna kontrola (1 mg/L ali 1 ppm metil metansulfonat – MMS 4016
SIGMA)
Vzorca I. in II. – lokacija Domžale; Vzorca III. In IV. – lokacija MIK, Obrtna cona Arclin (Vojnik)
3. 1. Splošna strupenost in raven genotoksičnosti
(Fisherjev eksaktni test (Fisher’s Exact Test).
Rezultati splošne strupenosti (toksičnosti) in ravni genotoksičnosti so podani v preglednici 2
in fotografijah 5, 6, 7 in 8.
Splošna strupenost (dolžina korenin testnih rastlin) med pitno vodovodno vodo (Vzorec I) in
traktirano pitno vodovodno vodo (Vzorec II,) statistično signifikantno je značilno.
Splošna strupenost (dolžina korenin testnih rastlin) med pitno vodovodno vodo (Vzorec III) in
traktirano pitno vodovodno vodo (Vzorec IV,) statistično signifikantno ni značilno.
Traktirane testne rastline (Vzorec II) imajo daljše korenine od netraktiranih testnih rastlin
(Vzorec I); p < 0,05.
Preglednica 2. Citološki učinki raziskanih vzorcev - raziskava ravni genotoksičnosti in
Povprečna dolžina korenin testne rastline Allium cepa L. – raziskava splošne strupenosti
Vzorec
Metafazni
Indeks
(n/1000 - ‰)
Število
metafaznih
celic
Število celic s
poškodbami
kromosomov
Raven
Genotoksičnosti
(odst. t.)
Povprečna
dolžina
korenin (mm)
I
85
200
37
18,50‫٭‬
36
II
93
200
21
10,50‫٭٭‬
37
III
87
200
39
19,50‫٭‬
34
IV
91
200
20
10,0‫٭٭‬
40
V
92
200
5
2,5
42
VI
27
100
21
21,0
19
6
ZASEBNI LABORATORIJ ZA RASTLINSKO CITOGENETIKO
Uporaba Allium metafaznega testa za določanje kakovosti okolja
Traktirana pitna vodovodna voda (Vzorec II) se statistično značilno razlikuje od vzorca
netraktirane pitne vodovodne vode (vzorec I); s stopnjo značilnosti: p = 0,0325 < 0,05; in
traktirana pitna vodovodna voda (Vzorec IV) od vzorca netraktirane pitne vodovodne vode
(Vzorec III) s stopnjo značilnosti: p = 0,0106 < 0,05.
Traktirana vodna vzorca (Vzorec II, IV) imata zmanjšano raven genotoksičnosti v razmerju
do netraktirane pitne vodovodne vode (Vzorec I, III).
Traktirana pitna vodovodna voda (Vzorec II, IV) statistično signifikantno med seboj ni
značilna; p = 1.
Netraktirana pitna vodovodna voda (Vzorec I, III) statistično signifikantno med seboj ni
značilna; p = 0,8986.
4. Zaključek
Iz rezultatov je razvidno, da je raven genotoksičnosti se pitni vodovodni vodi po
traktaciji z Energijskimi okni z vgrajeno energijsko ploščico z informirano celico (IC)
po tehnologiji MOP – Poznik kakovost izboljša, oziroma iz kakovosti visoke ocene
tveganja (18,50 / 19,50 odst. t.) postane kakovost pitne vodovodne vode z srednjo
oceno tveganja (10,50 / 10,0 odst. t.) (Primerjava preglednic 1 in 2).
Razlika v rasti in razvoju korenin testnih rastlin mlade čebule (Allium cepa L.), kakor
tudi citogenetska raziskava meristemskih celic koreninskih vršičkov testnih rastlin
kažejo: da energijska okna z vgrajeno energijsko ploščico z informirano celico (IC)
izboljšajo kakovost prostora in posledično delujejo na naše počutje in zdravje.
5. Cilji raziskav in statistična značilnost
Cilj raziskav je nedvomno ta, da nam rezultati raziskav pokažejo ali onesnaženje je ali ga ni
ter predvsem kakšno je tudi tveganje za organizme, vključno z ljudmi. Omenjeni ALLIUM
test pa nas tudi pripelje kaj je vzrok onesnaževanju oz. kje je vir. Šele z znanimi izvori lahko
preidemo k ukrepom in tako prispevamo čim večji delež k ohranjanju zdravega okolja.
Vključitev genotoksičnih raziskav za varovanje okolja je velikega pomena, saj omogočajo
spoznanja o vplivu in posledicah genotoksičnih snovi na organizme. Čas je, da odgovorno in
dodatno skrbimo za zdravo okolje in posledično za visoko kakovostno pitno vodo.
Statistično ugotovljeno signifikantno razliko med preiskanimi vzorci potrjuje statistična
kalkulacija analiza parnih podatkov s dvosmernim Fisherjevim eksaktnim testom, ki podaja
lastnost p vrednosti med paroma podatkov in sicer ali sta para (raziskana vzorca) različna
(statistično značilna) ali se ne razlikujeta (statistično neznačilna) in kakšno je tudi tveganje.
Katero tveganje pa je dovolj majhno. Najpogostejše vrednosti so 0,05 nato 0,01 in 0,001.
Glede na te meje govorimo tudi o 5%, 1% in 0,1% stopnji značilnosti rezultatov. Katerega od
teh nivojev izberemo, je precej odvisno od narave podatkov in od problema, ki ga obravnava
osnovna domneva. Statistična značilnost pa naj nebi bila edini odločilni dejavnik pri
vrednotenju rezultatov.
6. Viri in literatura
FISKESJÖ G. (1985). Hereditas, 102.
AL-SABTI K. (1985). Environ. Contam. Toxicol. 34
AGRESTI A. (1992). Statitical Science,7,131-153
LEVAN A. (1964) Hereditas, 52.
ROYAL SWEDISH ACADEMY OF SCIENCE (1973).
Ambio 3.
GRANT W. F. (1982). Mutation Research, 99.
7
ZASEBNI LABORATORIJ ZA RASTLINSKO CITOGENETIKO
Uporaba Allium metafaznega testa za določanje kakovosti okolja
FIRBAS P. (1997). 5th Yugoslav Ecological Congres,
Beograd–YU.
FIRBAS P. (1998). 5. Slovenski Festival Znanosti,
Ljubljana–Slovenija
FIRBAS P. (1999). DELO - Znanost, 08. Dec. 1999.
FIRBAS P. (2003). DELO - Znanost, 7. Apr. 2003.
RANK J. (2003). Ekologija 1, 38-42.
FIRBAS P. (2004). ARA založba, Ljubljana
www.vedež.dzs.si
FIRBAS P. (2007). DELO - Znanost, 04. Jan. 2007
KUMAR P. AND PANNEERSELVAM N. (2007). Facta
Universitatis Series: Medicine and Biology, Vol. 14, No. 2
RAGUNATHAN I. AND PANNEERSELVAM N. (2007).
Journal of Zhejiang University Science B. 8(7).
INVITTOX – PROTOKOL No. 8, IP – 8 ©. (FISKESJÖ
G.,1989)
AL-SABTI K. (1989). Cytobios, 58.
AL-SABTI K. (1992). Cytobios, 70.
AL-SABTI K. (1992). Mutation Research, 280.
NIELSEN M. H., RANK J. (1994). Hereditas 121.
FISKESJÖ G. (1993,). TECHNICAL METHODS
SECTION. Environmental Toxicology and Water Quality © 1993, John Wiley & Sons, Inc.
FISKESJÖ G. (1994,). TECHNICAL METHODS
SECTION. Environmental Toxicology and Water Quality © 1994. John Wiley & Sons, Inc. FIRBAS P. & ALSABTI K. (1995). Archives of Biological Sciences, 47 (12).
FIRBAS P. (1995). II. International Symposium on Exant
and Fosil Charophytes, Madisom–USA.
20. 11. 2010
Peter Firbas
8