Avtomatizirana analiza - This is abra

Univerza v Ljubljani
Fakulteta za kemijo in kemijsko tehnologijo
Univerzitetni študijski program Kemija
Izbirni sklop analizna in anorganska kemija
Avtomatizirana analiza
Seminar 2011
Predavatelj: prof. dr. Boris Pihlar
Seminarska naloga je izdelana v okviru študijskih obvez dodiplomskega izbirnega predmeta Avtomatizirana analiza
(30-0641). Delo ni lektorirano ali vsebinsko korigirano s strani predavatelja ali drugih univerzitetnih inštitucij. Avtor in
inštitucija ne jamčita za pravilnost podatkov in navedb ter ne izključujeta možnosti, da so v objavljenem gradivu
napake ali druge nepravilnosti.
Gradivo predstavljeno v tem delu je avtorska lastnina, oziroma last navedenih virov, iz katerih je bilo povzeto.
NOVOSTI NA PODROČJU AVTOMATSKE
TRDNO-FAZNE EKSTRAKCIJE (SPE) NA
OBNOVLJIVIH POVRŠINAH V PRETOČNEM
SISTEMU
Seminarska naloga pri predmetu Avtomatizirana analiza
Avtor: Nina Kostevšek
Mentor: prof. dr. Boris Pihlar
Ljubljana, april 2011
KAZALO
1
POVZETEK .................................................................................................................................. 3
2
OSNOVE .................................................................................................................................... 3
3
ON-LINE TRDNO-FAZNA EKSTRAKCIJA (on-line SPE).................................................................... 4
4
KONCEPT DELČNEGA INJICIRANJA ............................................................................................. 5
5
RAZVOJ INSTRUMENTACIJE........................................................................................................ 6
6
7
8
5.1
»JET-RING« CELICA in »ROTATING-ROT« PRETOČNA CELICA ............................................. 6
5.2
LAB-ON-VALVE (laboratorij na ventilu) .............................................................................. 6
5.3
FI-BI z pretočno celico domače izdelave in komercilano pretočno celico ........................... 8
5.4
Magnetna pretočna celica ................................................................................................ 9
ANALITIČNI POSTOPKI PRI DELČNEM INJICIRANJU ................................................................... 11
6.1
Modifikacije delcev.......................................................................................................... 11
6.2
Nalaganje analita............................................................................................................. 12
6.3
Tehnike detekcije ............................................................................................................ 12
APLIKACIJE PRETOČNEGA DELČNEGA INJICIRANJA ................................................................... 13
7.1
Okoljski testi ................................................................................................................... 13
7.2
Celični testi ..................................................................................................................... 13
7.3
Študije afinitet pri kinetiki in afinitetna kromatografija ................................................... 14
7.4
Imunološki testi .............................................................................................................. 14
7.5
Čiščenje in kvantitavtivna analiza DNA in specifičnih biomarkerjev ................................. 14
7.6
Trendi v prihodnosti ....................................................................................................... 15
LITERATURA............................................................................................................................. 16
2
SLOVAR:
SPE- solid-phase extraction - ekstrakcija na trdni fazi
BI- bead-injection - delčno injiciranje
SI- sequential injection - sekvenčno injiciranje
1 POVZETEK
Ekstrakcija na trdni fazi-SPE ( ang. solid-phase extraction) je najbolj vsestranska metoda za
odstranjevanje motečih zvrsti pri pripravi vzorcev. V zadnjih letih je bil narejen velik napredek
pri avtomatizaciji analitskih postopkov, ki vsebujejo SPE v povezavi z pretočnimi injektorskimi
sistemomi. Pri on-line SPE testih se je pojavil problem zanesljivosti kot posledica vedno manjših
izvedb delčnega reaktorja, kontaminacije trdnih površin in možnega puščanja sestavnih delov.
Analiza z delčnim injiciranjem (ang. bead-injection analysis-BI) temelji na avtomatski obnovi
sorbenta (material, ki absorbira tekočine ali pline). V nadaljevanju so predstavljene nove
možnosti za izvedbo delčne injektorske analize in alternativne možnosti za on-line kemijskederivativne reakcije. Opisanih je tudi nekaj najpomembnejših okoljskih in bioanalitskih
aplikacij, ki so bile uporabjene v zadnjih nekaj letih.
2 OSNOVE [1] [2] [3]
Kompleksnost matrik vzorcev na okoljskem, biološkem, industijskem in biotehnološkem
področju, lahko privede do težav pri njihovem direktnem določevanju kljub uporabi modernih
analitskih tehnik. To je posledica odvisnosti analitskih rezultatov od sestave komponent
matriksa, in tudi dejstva, da je koncentracija analita večkrat pod lineranim območjem detektorja.
Zato se je pojavila potreba po razvoju enostavne, robustne in zanesljive predpriprave vzorca, s
katero odstranimo moteče komponente in hkrati izboljšamo detekcijo analita z
predkoncentracijo. Če bi to opravljali ročno, bi bil ta korak zahteven in zamuden, težko bi ga
sistematično kontrolirali in bi veliko doprinesel k napaki (npr. okužba vzorca) in to bi lahko
odločilno vplivalo na točnost in natančnost rezultatov [1].
Pretočna injektorska analiza (ang. FIA - flow-injection analysis) je pripeljala do velikega
napredka pri pripravi vzorca zaradi učinkovtosti, robustnosti, hitrega delovanja in zanesljivosti.
Pri razvoju pretočne injektorske analize govorimo o treh generacijah: (1) pretočno injiciranje
(ang. FI-flow injection), (2) sekvenčno ijniciranje (ang. SI-sequential injection) in (3) t.i.
»laboratorij na ventilu« sistem (ang. LOV – lab-on-valve). Prvi dve generaciji igrata pomebno
vlogo pri miniaturizaciji in avtomatizaciji predpriprave vzorca. Zamenjali sta
3
separacijske/predkoncentracijske tehnike, ki so se prej izvajale ročno. SPE tehnika, ki temelji na
interakcijah tekoče-trdno, je najpogosteje uporabljena on-line tehnika za pripravo vzorca.
Pogosto pride do irreverzibilnih sprememb na reaktivnih površinah trdne faze. Da bi odstranili
to pomanjkljivost, je nastala tretja generacija pretočnih injektorskih tehnik- SI-LOV.
Miniaturiziran LOV sistem omogoča kakršnikoli kemijski ali fizikalni proces, ki vključuje
kontroliranje pretoka, homogene reakcije, tekoče-trdne interakcije na ventilu in hkratno optično
detekcijo številnih procesov z optičnimi vlakni [3] . Sestava LOV obsega monolitično strukturo z
mikrokanali in to omogoča avtomatiziran natančen vnos in transport suspenzij z delci-delčno
injiciranje (BI). BI se uporablja pri izvajanju številnih on-line SPE procesov, ki vključujejo
obnovo površine sorbenta med analizami [2].
Čeprav je na voljo veliko ekstrakcijskih tehnik za izolacijo analita iz kompleksnega vzorca, SPE
igra pomembno vlogo pri pripravi vzorca, zaradi enostavne uporabe, avtomatizacije, nizke cene
in velike izbire komercialno dostopnih sorbentov razlučnih proizvajalcev. Klasični SPE sorbenti
zadržijo analite na podlagi neselektivnih interakcij (hidrofobnih ali hidrofilnih) in to lahko vodi
tudi do vezave motečih zvrsti. Z uporabo »po meri« narejenih sorbentov so se povečale tudi
možnosti za uporabo SPE. Z avtomatizacijo SPE, ki temelji na pretočnem sistemu, lahko dobimo
učinkovo in direktno metodo, ki poveže pripravo vzorca z kromatografijo [2].
3
ON-LINE TRDNO-FAZNA EKSTRAKCIJA (on-line SPE) [1] [6]
Sorbtivna ekstrakcija je prevladujoča avtomatizirana metoda za pripravo vzorca, ki se uporablja
na pretočnih sistemih, zaradi njenega enostavnega delovanja, visoke ločljivosti in sposobnosti
predkoncentriranja in minimalne porabe organskih topil. Najpogosteje se uporablja
mikrokolona, ki je napolnjena z primernim sorbtivnim materialom in postavljena znotraj
pretočnega sistema pred detektor [1].
Cilj je izboljšati občutljivost analitičnega postopka in/ali premagati nizko občutljivost
detektorskega sistema do komponent vzorca z predkoncentriranjem analita ali odstranitvijo
motečih komponent iz težavnih vzorcev (visoka koncentracija soli ali proteinov v matrici), brez
da bi vzorec razredčili. Številni trdno-fazni reaktorji so bili uspešno vgrajeni v pretočni sistem.
Začasno zadržanje nizke koncentracije posameznih kovinskih ionov in nabitih (bio)molekul na
podlagi elektrostatskih interakcij v ionskoizmenjevalni mikrokoloni ali kelatnih reaktorjih je
običajna praksa v pretočnih trdno-faznih ekstrakcijskih sistemih. Derivatizirani nepolarni
kovinski kelati (iminodiacetati, ditiokarbamati, ditiofosfati ali kvinolinati) ali hidrofobne zvrsti
(organski polutanti, barvila in zdravila) so bili predkoncentrirani na reverzno-faznih materialih
(oktadecil-kemijsko modificiran silikagel, politetrafluoroeten-PTFE delci ali drugi polimerni
sorbenti) in ločeni zaradi hidrofobnih ali π-π interakcij. Ciljne spojine se neposredno obdržijo na
reaktivnih površinah ali pa jih po in-line derivatizaciji pretvorimo v primerno obliko. S takšno
ekstrakcijo se lahko izognemo motečim vplivom alkijskih in zemeljsko-alkalijskih elementov pri
določanju sledov kovin s pametno izbiro kelatnega reagenta [1].
Kot je že bilo navedeno, so se pretočni SPE sistemi vgrajevali v trajno zaprte reaktorske kolone.
Na takšnih sorbtivnih kolonah se lahko pojavi problem pri dolgotrajnem delovanju zaradi
zamašitve kolone in posledično se pojavi velik protitlak, ki ga lahko ublažimo z povratnim
4
izpiranjem. Nadaljne slabosti on-line SPE pri večkratni uporabi površin so (ang.carry-over
effect) prenašalni efekt-kar pomeni, da lahko naš analit zaradi predhodne uporabe kolone
drugače reagira, pride do krčenja ali nabrekanja sorbenta, slabega delovanja bistvenih delov,
vključno z izgubo funkcionalnih skupin (to je problem pri materialih,ki so impregnirani z
reagentom) in tudi do deaktivacije površine zaradi ireverzibilne vezave motečih zvrsti. Vsem
tem težavam se da izogniti z uporabo obnovljivih površin ali z uporabo BI, kjer se lahko trdnofazni material obnovi vsak analitičen cikel [1]. Delci z imobiliziranim primernim sorbentom se
injicirajo v pretočni sistem, se zadržijo v pretočni celici, skozi katero potuje analizna raztopina z
kontroliranim pretokom, in tam poteče vezava analita na delce. Po opravljeni meritvi se delci
zavržejo in lahko začnemo z novo meritvijo [6].
4
KONCEPT DELČNEGA INJICIRANJA [1]
Pristop z delčnim injiciranjem je bil sprva prilagojen optičnemu zaznavanju v sekvenčnem
injektorju in je bil uveden kot učinkovito orodje pri avtomatizaciji imunoloških testov z uporabo
razpršitvene reflektometrične detekcije. Miniaturiziran delčni injekcijski senzor porabi zelo
majnhe količine derivatizacijskega reagenta in tako analit postane predkoncentriran in je lahko
detektiran preko optičnih vlaken v posebaj zgrajenih pretočnih celicah, ki zadržijo aktivne
površine, hkrati pa tekočina prosto teče skozi. Po vsaki uporabi se delci sorbenta odstranijo z
reverznim tokom tekočine in površina senzorja se obnovi z injiciranjem sveže raztopine. Tak
koncept optičnega zaznavanja na trdnih površinah, tudi imenovan BI spektroskopija, predstavlja
dobro alternativo on-line SPE postopkom z eluatno detekcijo. BI omogoča sproten nadzor
sorbcijskega procesa. Prednost je tudi v tem, da ni potrebe po popolni reverzibilnosti sorbcije ali
elucije. To velja na primer za vezavo Fe(II)-1,10-fenantrolina na kelatne delce, ker so eluenti kot
dušikova kislina ali EDTA, neučinkoviti za odstranitev kelatov iz delcev. Ne glede na to, da sta
optični poti in reakcijski čas v BI shemi krajši v primerjavi z stacionarno tekočinsko
spektrofotometrijo, ne pride do poslabšanja občutljivosti, ker se analit imobilizira na majhni
površini senzorja, kjer poteka reakcija v presežku trdnega reagenta.
Da bi regenerirali delce brez avtomatizacije, je nujno zagotoviti enako velikost delcev in sferično
obliko reagenta in s tem preprečimo popačitve oblike kanalov. Reverznofazni, kemijsko
modificiran silikagel ni najboljša izbira v tem primeru, zaradi njihove nepravilne oblike in
razporeditve velikosti delcev. Delci z ogrodjem iz polistirena-divinilbenzena, polivinilpirolidona
ali aragoze izpolnjujejo prej opisane zahteve, v kolikor so popolnoma sferični in enakih velikosti.
Uporaba micelarnih medijev ali pomožnih neprekinjenih kanalov za ponovno kroženje
suspenzije z delci je potrebna za zanesljivo delovanje hidrofobnih občutljivih zvrsti z višjo
gostoto kot voda v cevkah.
5
5
5.1
RAZVOJ INSTRUMENTACIJE
»JET-RING« CELICA in »ROTATING-ROT« PRETOČNA CELICA [3] [1]
Pretočna celica je lahko zasnovana tudi kot »jet-ring celica« za izvajanje BI in sprotno zaznavanje
sprememb v optičnih lastnostih delcev po vzpostavitvi interakcij trdno-tekoče (merjenje
absorbance, fluorescence in refleksne spektroskopije). V takšni izvedbi celice lahko potrebujemo
mikroliter ali še manj vzorca in reagenta. Takšen pristop je tudi poznan pod imenom
mikrosekvenčno injiciranje (μ-SI)[3].
Razvoj instrumentacije za BI, ki so ga vpeljali Ruzicka in sodelavci, temelji na mreži SI, ki je
opremljena z tako imenovano jet-ring celico. Ime jet-ring pride iz oblike in delovanja delčne
retencijske celice, ki je bila narejena kot del pretočnega kanala z vstavitvijo trdne palice in tako
se je oblikovala odprtina O-oblike med palico in steno kanala vse okrog palice (slika 1). Samo
raztopine lahko prehajajo skozi to odptino. Delci, ki so preveliki, da bi prešli skozi odprtino se
naberejo nad palico in stalni pritok nove raztopine jih pritiska na palico. Ko se tok tekočine
obrne, jih hitro odplavi vstran [1].
Za zajetje in izpust delcev, ki so veliki 5-7 mikrometrov v SI kanalih je bila oblikovana pretočna
celica z vrtečo se palico (»rotating-rot flow cell«). Mikrokolona z obnovljivim sorbentom je bila
narejena za zajetje večjih delcev (>15 mikrometrov) v pretočni celici , tako se majhni delci s
funkcionalnimi skupinami ujamejo na večjih in s tem večji delci delujejo kot filter [1].
Slika 1: jet-ring celica in delovanje delčnega injiciranja [1]
5.2 LAB-ON-VALVE (laboratorij na ventilu) [3] [4]
[1]
Prvi LOV mikrosistem je bil enotni monolitski ventil iz Perspexa (polimetil metakrilat) s šetimi
vhodi. Povezuje številne laboratorijske naprave za različne analize in vključuje vhode, ki te
naprave povezujejo, delovne kanale in pretočno celico. Cevke so postavljene na treh nivojih, da
čimbolj olajšajo tekočinske operacije. Centralni pretočni kanal, preko katerega so povezani ostali
individualni kanali, se uporablja za komunikacijo s črpalko [3].
Večfunkcijska pretočna celica omogoča več miniaturiziranih operacij, raztapljanje vzorca na
ventilu, dodajanje ali mešanje reagenta in tudi inkubacijo. Opremljena je z optičnimi vlakni, ki so
6
povezana z zunanjim svetlobnim virom in detektorjem in s tem je omogočeno sprotno
zaznavanje poteka reakcij [3].
Tak pristop je sklopljen z SI in predstavlja prednost pri avtomatizaciji in minituarizaciji BI
sistema brez vgrajenih mikrolukenj. Enota z mikrocevkami je narejena v osnovi iz polimetil
metakrilata (Perspex), ampak pogosteje se uporablja polivinklorid, politereterketon (PEEK) ali
politerimid (ULTEM). Sestavljena je iz enojne monolitične strukture, nameščena na vrhu
multipozicijskega ventila (slika 2). LOV je bil zasnovan za različne laboratorijske teste, omogoča
tudi spreminjanje sorbentov, zato je dobil ime laboratorij na ventilu. Izdelan je tako, da združi
mikrokanale, v katerih se zadržujejo delčni reagenti, in točke, kjer pride do mešanja in
derivatizacije analita. Lahko bi ga poimenovali kot multifunkcijsko pretočno celico, ki v realnem
času dostavi analit z vsebujočimi delci[4].
Zaprta reaktorska kolona se generira in situ s črpanjem delcev iz stranskih odprtin na ventilu.
Prednost je v tem, da je sorbent na LOV lahko enako obravnavan kot tekočine. Trdne zvrsti so
lahko avtomatsko transportirane med različnimi pozicijami na koloni . Zadržanje trdnih snovi
znotraj kolone je olajšano z uravnavanjem pozicije kolone z ustreznimi zamaški (palice, ki se
gibljejo navzdol in navzgor ali sama optična vlakna). Detekcija na ventilu bi lahko bila realizirana
pri eluatu enako kot pri običajnem SPE.
V nasprotju z LOC (lab-on-chip = laboratorij na čipu) napravami, odprta sestava SI-LOV
omogoča izvajanje BI po želji, brez potrebe po preoblikovanju enote.
7
Slika 2: SI-LOV sistem. Povečana LOV enota
5.3
FI-BI z pretočno celico domače izdelave in komercilano pretočno
celico [1]
BI je bil prilagojen FI sistemu kot cenejša alternativna možnost bolj prefinjene SI. Spremenili so
jet-ring celico, ki je ponavadi uporabljena v FI sistemih, da ustreza enosmernemu toku. Celico so
opremili z LED virom svetlobe in fototranzistorskim detektorjem na drugi strani celične
odprtine. Podobno kot pri jet-ring celicah in LOV enotah, dvižne palice pustijo prostor med
palico in izhodom kanala, da raztopina teče skozi medtem ko se delci nabirajo na palici.
Mehansko kontrolirana premična palica za blokiranje pretoka se uporablja za zajetje delcev in
njihov izpust namesto reverznega toka. Gibanje usmerja elektromagnetni pogon, ki je priključen
na palico. Po vsaki analizi se palica pomakne daleč nazaj in s tem omogoči dovolj prostora, da
uporabljene delce tok odnese ven.
8
5.4 Magnetna pretočna celica [5] [1]
Ruzicka in sodelavci [5] so predstavili SI imunološke analize z magnetnimi delci z detekcijo
nevezanih označenih protiteles v tekoči fazi, ki omogoča študijo kinetike v imunokemijskih
sistemih z uporabo obnovljive reakcijske površine, ki se tvori z imomagnetnimi delci. Na sliki 3
so prikazani posametni koraki te analize. Ta metoda je bila kasneje razširjena na trdno-fazno
optično detekcijo. Magnetni delci so z aragozo prekrit železov oksihidroksid (FeOOH). Ti so
primerni za večstopenjske teste (npr. imunološke teste). Neodimov magnet ali magnetna žica se
nahaja pod (imunološkim) reaktorjem in se premika navzgor in navzdol in tako zajame
magnetne delce na mestu ali pa jih pusti, jih odnese tok nosilne tekočine.
Slika 4 prikazuje zgradbo magnetne pretočne celice in SI sistema za kemiluminscenčni test, ki
temelji na BI. V tej odprti celici, kjer imamo konstanten tok tekočine, je malo verjetno da bo
prišlo do zgoščevanja ali zlepljaja delcev skozi večstopenjsko inkubacijo in spiranje, ki sta
potrebna pri imunoloških testih. Najpomemnejša omejitev tega pretočnega sitema za BI izvira iz
kovinske narave delcev, kar ovira zasledovanje reakcij pri nizkih pH vrednostih [1]
9
Slika 3: Skica posameznih korakov pri imunološkem testu s sekvenčnim injiciranjem [5]
10
Slika 4: (A) SI sistem za kemiluminescenčno imunološko metodo z uporabo magnetnih mikrodelcev (B)
Pretočna celica za zadržanje protiteles na magnetnih kroglicah [1]
6 ANALITIČNI POSTOPKI PRI DELČNEM INJICIRANJU [1]
6.1
Modifikacije delcev
Čeprav so komercialno dostopni ionski izmejevalci ali polimerni delci lahko direktno uporabni
za BI, moramo osnovne sorbente prilagoditi, da se selektivno vežejo na površino delcev in tako
11
reagirajo z analitom. Ker so delci obnovljivi, je BI zelo primerna za odpravo pomanjkljivosti SPE
(kratka življenjska doba absorbiranega sorbenta zaradi postopnega izpiranja in pronicanja v
vzorec), ki vključuje fizično imobilizacijo reaktantov. V bioloških testih so bila protitelesa in
antigeni imobilizirani na magnetne ali polisaharidne delce. Ti so se prav tako izkazali za
primerne substrate pri gojenju celic. Pri okoljskih testih sledi kovin, so polimerni delci
napolnjeni z ligandi (npr. karbazidi ali azo spojine) off-line, ker je časovni okvir za kvantitativno
impregnacijo površine delcev lahko izbran glede na ligand-sorbent kinetiko. V primerjavi z online postopki, je pri off-line zagotovljena višja koncentracija reagenta na sorbentu in to bi naj
vodilo k izboljšanju obogatitvenih faktorjev (ang. enrichment factor) in volumna analita, ki se
pretoči. Optimizacija imobilizacijskih postopkov (pH in reakcijski čas) z merjenjem stopnje
izkoristka reakcije se lahko izvaja »at-line« v SI-LOV z dodatkom mikroreaktorja, ki meša delce,
na stranskih izhodih na ventilu in sprotnem opazovanju liganda, ki se naloži na površino delcev.
6.2 Nalaganje analita
Sorpcija analita na sam ionsko-izmenjevalni gel je bila pogosta praksa v SI-LOV-BI sistemu za
določevanje sledi kovinskih ionov, čeprav bi jo lahko izkoristili tudi za analizo zdravil in
biomolekul, ki so se naložile in temu bi sledili z UV-VIS ali fluorescenčnimi meritvami. Analit bi
načeloma lahko obdržali na sorbentu pred dodatkom kromogenega reagenta za heterogene
derivatizacije na delcih pri spektrofotometričnih meritvah v trdni fazi. Na primer železo, baker
in živo srebro so bili ločeni od osnovnega vzorca preko absorbcije na kelatni ligand pred
derivatizacijo z amonijevim pirolidin ditiokarbamatom, 1,10-fenatrolinom ali ditiozinom. Tak
pristop je omejen na uporabo pri reakcijah, kjer se barva hitro razvije brez elucije nastalega
kelata.
Za reševnje zgoraj navedenih pomanjkljivosti so raziskovalci razvili homogeno fazno
derivatizacijo, ko analit reagira in-line z ligandom pred absorpcijo dobljenega produkta na delce.
Takšna reakcija lahko vodi do izboljšanja selektivnosti in poveča afiniteto analita do sorbtivnega
materiala. Na primer, kovine v sledovih se po derivatizaciji na nenabitem kelatu ali oborini
selektivno vežejo na reverzno-fazni material (PTFE ali oktadecil kemijsko modificoran
kopolimer). Indirektno določitev zdravil (prometazin ali ftrifluoroperazin) bi lahko opravili z online oksidacijo z Fe(III) z kasnejšim kompleksiranjem in kompleks bi določili z trdno-fazno
spekrofotometrično detekcijo kelata na anionskem izmenjevalcu.
6.3 Tehnike detekcije
Pomebna prednost BI je sposobnost povezave z različnimi instrumenti. Najpogosteje se
uporablja v kombinaciji s spektrofotometrijo. BI spektroskopija ima tudi aplikacije z
fluorometrično in kemiluminescenčno detekcijo. Najpomembnejša zahteva pri BI
spektrofotometriji je optična transparentnost delcev, s tem se prepreči previsoko ozadje in
sipanje svetlobe. Ne samo enoprametrski, ampak tudi dvoparametrski BI spektrofotometrični ali
spektrofluorometrični senzorji so bili narejeni za detekcijo sledov kovin (Zn in Cu ali Al in Be) z
uporabo neselektivnih kelatnih reagentov in selektivno elucijo ali absorbcijo. Potrebni so še
12
nadaljni testi, zaradi omejene kromatografske ločljivosti BI kolone. Sklopitev BI z
elektrotermalno atomsko absorcijsko spektrometrijo (ET-AAS) z neposrednim uvajanjem
sorbenta, ki je napolnjen z kovino, v grafitnih pečeh je možno pri grafitnih delcih zaradi pirolize
pred atomizacijo kovine. (Piroliza je postopek razkroja snovi pri višji temperaturi in za gorljive
snovi tudi brez dostopa zraka, saj sicer pride do sežiga snovi). Poleg prej omenjenih detektorjev,
BI je lahko sklopljen tudi z voltametrično, induktivno sklopljeno plazemsko- masno
spektrometrijo (ICP-MS), atomsko fluorescenčno spektrometrijo (AFS), MS in radiometričnimi
instrumenti, čeprav se v vseh primerih zahteva detekcija eluata.
7 APLIKACIJE PRETOČNEGA DELČNEGA INJICIRANJA
Tukaj dobimo pregled BI aplikacij na okoljskem in bioanalitičnem področju.
7.1 Okoljski testi [1]
Večina analiz, ki potekajo na tem področju, je osredotočena na detekcijo sledov anorganskih
elementov v težavnih okoljskih vzorcih, ki vsebujejo visoke koncentracije razopljenih soli (npr.
morska voda, slanice, vzorci tal). Ločitev osnovnega vzorca z sočasno obogatitvijo kovine je bila
izvedena s pomočjo SI-LOV-BI predkoncentracije in detekcije eluata z ET-AAS ali AFS. SI-BI je
prav tako primerna za separacijo sledov kovin (Cr(III) in Cr(VI)) preko selektivne ohranitve
oksidacijskih stanj na primernih sorbentih (kationski ali anionski izmenjevalci) ali preko
zaporednih določitev posameznih zvrsti in skupne vsebnosti anorganskih kovin z in-line
homogeno/heterogeno redoks reakcijo in predkoncentracijo v dani sorptivni mikrokoloni.
Uporabljajo se tudi hibridni pretočni sistemi ( ang.MSFI-multi-syringe flow injection oz. pretočni
sistem z večkratnim vbrizganjem) v kombinaciji z BI-LOV za razširitev na miniaturizirane
sisteme.
BI v LOV pristopu se ne uporablja zgolj za predkoncentracijo kovinskih zvrsti, ampak tudi
organskih onesnaževalcev pred uporabo separacije z reverzno-fazne tekočinsko kromatogtafijo
(LC). Sklopitev BI-LOV z MSFI se je izkazala za zanesljivo pri kvantitativni eluciji absorbiranih
zdravil, medtem ko se je za učinkovitega izkazal tudi LC trak eluata.
7.2 Celični testi [7] [1]
Pretočna injekcijska analiza na obnovljivih površinah se uporablja za izvajanje farmakoloških
testov na živih celicah. Celični testi so ključnega pomena za študije novih farmacevtskih izdelkov
in njihovih reakcij. Takšni testi ponavadi vključujejo dodajanje veliko različnih zdravil v celice in
opazovanje rakcij in detekcijo odzivov celic. Takšni postopki zahtevajo tehnike, ki ne uničijo
celic, medtem ko zagotovijo ponovljive čase in natančno injiciranje reagentov. BI je imela
pomebno vlogo pri izboljšanju celičnih testov. Leta 1999 sta Hodder in Ruzicka [7] predstavila
novo aplikacijo SI-BI z uporabo delcev kot mikroprenašalcev živih celic za merjenje višine
znotrajceličnega kalcija. Celice so bile nanešene na mikroprenašalne delce, ki služijo kot
enkratno in obnovljiva površina na kateri izvršimo analizo. Visoka gostota celic je tako lahko
nanešena na majhen volumen jet-ring celice, ki je nameščena znotraj fluorescenčnih
13
mikroskobskih objektivnih leč. Prednost tega pristopa je, da so sveže celice izpostaljene dani
koncentraciji kemikalij in so zamenjane pri vsakem testu. Raziskovanje celičnega odziva na
dodano zdravilo ali kemikalijo je bolj natančno kot pri klasičnih pritopih, ker ni prenašalnega
(ang. carry-over) efekta in izgube celične aktivnosti čez določen čas. S stalnim opazovanjem
sprememb v signalu na delcih dobimo vrhove, ki nam dajo informacijo o kinetiki celičnega testa
in mejno koncentracijo reagenta, ki povzroči celični odziv. Podobne uporabe delcev kot
mikropreanašalcev živih celic so bile razširjene na LOV. Na primer, poraba glukoze in nastanek
laktata je možno hitro in občutljivo detektirati zaradi velike koncentracije imobiliziranih celic.
Raziskovali so tudi celičnelice aktivnosti na osnovi sprostitve protonov iz celice v LOV. Delci z
imobiliziranim pH indikatorjem se nahajajo v kolonah. Protoni, ki izhajajo iz celice, so se nalagali
med ustavitvijo pretoka in so reagirali z imobiliziranim indikatorjem. To je povzročilo
spremembo barve na indikatorskih delcih in to se lahko detektira s trdno-fazno
spektrofotometrijo.
7.3
Študije afinitet pri kinetiki in afinitetna kromatografija [1]
BI-LOV sistem je lahko uspešno uporabljen kot avtomatski sistem za raziskovanje kinetike
biomolekul in njihove afinitete do vezave ali sprostitve. Modelna študija je bila izvedena z
nekovalentno vezavo delcev, ki so bile prekrite z strepatvidinom in biotinilatnimi konjugati. To
prikazuje uporabnost LOV pri veliko analitičnih instrumentih poleg optičnih spektrofotometrov.
Podobna minituarizirana naprava je bila tudi razvita za kritično primerjavo BI spektroskopije z
afinitetno kromatografijo, ki vključuje detekcijo eluata. Rezultati, dobljeni iz dveh različnih
načinov detekcije, dopolnjujejo drug drugega in nam dajo celotno sliko biomolekularne aociacije
in disociacije med tarčnimi biomolekulami in bioligandi, ki so imobilizirani na površino delcev.
Medtem ko afinitetna kromatografija nudi izboljšano občutljivost v primerjavi z BI
spektroskopijo (10-krat boljša občutljivost), BI spektroskopija pa nudi unikatne možnosti za
zasledovanje irreverzibilne vezave biomolekul na kromatografsko kolono.
7.4
Imunološki testi [1]
Časovna usklajenost natančnega mikro-tekočinsko delovanja na SI-LOV skupaj s konceptom
obnovljivih trdnih površin omogoča avtomatsko izvedbo večstopenjske metode (npr.
imunoloških testov). Na ventilu se delci zadržijo z uporabo čepov na koncu cevi in optičnih
vlaken, ki so bile že prej narejene za ostale LOV aplikacije. Čeprav je možno analizirati veliko
manj vzorcev v primerjavi s standardno metodo (96-well plate immunoassay), je čas analize
veliko krajši (manj kot 30 min, pri stand. metodi 5-8h) in tudi za rokovanje z aparaturo ne
potrebujemo izkušenih medicinskih tehnikov. Zato je primerna metoda za takojšnje klinične
rezultate in za nizko so srednje veliko število vzorcev. Volumen vzorca, ki je potreben za analizo,
je nekje 50 μL ali manj (stand. metoda 200-400μL).
7.5
Čiščenje in kvantitavtivna analiza DNA in specifičnih biomarkerjev [1]
14
BI-LOV je bil pred kratkim predlagan za temelj pri določevanju nuklinskih kislin. Uporabili so
silikagel kot obnovljiv SPE material za čiščenje DNA iz človeške krvi. Delci so bili stisnjeni v
odprtino LOV, da zadržijo DNA, ki so jo kasneje sprali za polimerazno verižno reakcijo (PCR) in
elektroforetsko ločitev. Čiščenje DNA so opazovali on-line fluorometrično za kolono z uporabo
fluorescenčnega barvila etidijevega fluorida. Nekateri uporabljajo tudi posebaj funcionalizirane
delce za pojasnitev in določitev specifičnega DNA zaporedja. Povečana občutljivost, ki so jo
dosegli z BI-spektroskopsko detekcijo, omogoča določevanje DNA v pmol (pikomol = 10−12
mola). Ta sistem se lahko uporabi v vseh testih, ki vključujejo identifikacijo življenjsko nevarnih
mikroorganizmov.
7.6 Trendi v prihodnosti [7] [1]
Trenuten razvoj mikrotestov gre vedno bolj v smeri analize makromolekul (DNA, imunoglobina
G IgG, proteinov) in vzorcev z neraztopljenimi snovmi (koloidi, celice, delci). Tukaj pa se pojavijo
težave, če mikrokanali postanejo preozki in predolgi. Glavni cilj pri miniaturiciji teh metod je, da
se zmanjša poraba reagentov in s tem nastanek odpada. To lahko dosežemo že, če zmanjšamo
volumen vzorca. Težava ni v izdelavi čim manjših cevk, ampak v meji detekcije vzorca. Pri
spektroskopskih meritvah se to kaže kot najmanjši še sprejemljiv volumen detektorja [7].
Je za pričakovati, da se bo BI še naprej razvijal v različnih oblikah in bo postal analizno orodje, ki
bo omogočalo obdelavo velikega števila vzorcev. Sklopitev LOV z afinitetno kromatografijo s
številnimi detektorskimi sistemi (BI-spektroskopija, MS, amperometrija, fluorometrija) je
uporabna pri bioanalitiki, ki vključuje raziskave naravnih produktov, zdravil, proteinske in DNA
analize, kot tudi v kliničnih analizah za hiter pregled in diagnostiko.
SI-LOV-BI ponuja veliko možnosti na okoljskem področju za odstranjevanje sestavin matriksa v
izcednih vodah in za sočasno reakcijo z analitom v on-line testih tal ali sedimentov. Zaenkrat ni
še nobenih prizadevanj za razložitev sorpcijskih sposobnosti materialov v pretočnih sistemih,ki
so opremljeni z on-line trdnimi kolonskimi reaktorji. Shemi ekstrakcije in sorpcije bi se lahko
razširili na radioizotope kot indikatorjev ali kot bistvene sestavine pri izotopskem redčenju v
geokemijskih analizah in nukleranih raziskavah, ki vključujejo probleme shranjevanja
radioaktivnih odpadkov in ravnanje z njimi. Možne so tudi aplikacije BI sistemov z
radiokemijsko detekcijo za avtomatizacijo dela z radioaktivnimi snovmi v zaprtem sistemu. Kar
zadeva nove sorptivne materiale, je za pričakovati polimerne delce z vtisnjenimi molekulami
(ang. moleculary-imprint), ki se pripravijo z polimerizacijo suspenzije ali obarjalno
polimerizacijo, kar izboljša selektivnost analita in bi se lahko uporabljalo pri BI spektroskopiji ali
za BI sorbente pred separacijo z tekočinsko kromatografijo [1].
15
8 LITERATURA
•
[1] M. Miro´ , S. K. Hartwell, J. Jakmunee, K. Grudpan,E. H. Hansen, Recent developments
in automatic solid-phase extraction with renewable surfaces exploiting flow-based
approaches, Trends in Analytical Chemistry, Vol. 27, No. 9, 2008
•
[2] H.M.Oliveira, M.A.Segundo, J.L.F.C.Lima, M. Miro, V. Cerda, Exploiting automatic online renewable moleculary imprinted solid-phase extraction in lab-on-valve format as
front end to liquid chromatography: application to the determination of riboflavin in
foodstuffs, Anal. Bioanal. Chem. 397, 77-86, 2010
•
[3] J. Wang, E. H. Hansen, Sequential injection lab-on-valve: the third generation of flow
injection analysis, Trends in Analytical Chemistry, Vol. 22, No. 4, 2003
•
[4] M. Miró, E. H. Hansen, Miniaturization of environmental chemical assays in flowing
systems: The lab-on-a-valve approach vis-à-vis lab-on-a-chip microfluidic devices, Anal.
Chim. Acta Vol. 6 0 0, 46–57, 2007
•
[5] H. Pollema, J. Ruzicka, G. D. Christian, Sequential Injection Immunoassay Utilizing
Immunomagnetic Beads, 64, 1356-1361,1992
•
[6] M.J.Ruedas Rama, A. Ruiz Medina, A. Molina Diaz, New contributions of bead-injection
spectroscopy-flow-injection analysis: determination of cobalt, Anal. Bioanal. Chem. 376,
527-533, 2003
•
[7] J. Ruzicka, Lab-on-valve:universal analyzer based on sequential and bead injection,
Analyst, 125, 1053-1060,2000
16