Immunhistochemische Untersuchungen zur Zellproliferation und

Tierärztliche Hochschule Hannover
Immunhistochemische Untersuchungen zur Zellproliferation und
Apoptose bei Synovialitiden des Hundes
INAUGURAL-DISSERTATION
zur Erlangung des Grades einer
Doktorin der Veterinärmedizin
-Doctor medicinae veterinariae(Dr. med. vet.)
vorgelegt von
Eva-Maria Beckold
Lahr
Hannover 2009
Wissenschaftliche Betreuung:
Univ.-Prof. Dr. Marion Hewicker-Trautwein aus dem Institut für Pathologie
1.Gutachter: Univ. Prof. Dr. Marion Hewicker-Trautwein
2. Gutachter: Univ. Prof. Dr. Wilfried Meyer
Tag der mündlichen Prüfung: 29.10.2009
Für
Nike und Björn
Die größte Tragödie in der Wissenschaft
überhaupt
ist der Tod einer wunderschönen Hypothese
durch die Hand einer häßlichen Tatsache.
Thomas Henry Huxley (1825-1895)
I
Inhaltsverzeichnis
Inhaltsverzeichnis
Inhaltsverzeichnis ................................................................................................................................... I
1
Einleitung ...................................................................................................................................... 1
2
Literaturübersicht ........................................................................................................................ 3
2.1 Histologie der Synovialmembran ............................................................................................ 3
2.2 Kreuzbandriss beim Hund ....................................................................................................... 5
2.2.1
Klinik, Ätiologie und Pathogenese ............................................................................... 5
2.2.2
Histologie der Synovialmembran beim Kreuzbandriss ................................................10
2.2.3
Immunhistochemie der Synovialmembran beim Kreuzbandriss des Hundes ..............12
2.3 Histologische und immunhistochemische Befunde an der Synovialmembran von Hunden mit
immunvermittelten Arthritiden ..............................................................................................13
2.3.1
Klassifikation der entzündlichen Gelenkserkrankungen beim Hund ...........................13
2.3.2
Erosive Arthritis ...........................................................................................................13
2.3.3
Pathogenese der rheumatoiden Arthritis ......................................................................16
2.3.4
Pathologie und Pathohistologie bei der rheumatoiden Arthritis ..................................17
2.3.5
Immunhistochemie der rheumatoiden Arthritis ...........................................................18
2.3.6
Das Polyarthritis-Polymyositis-Syndrom.....................................................................19
2.4 Zyklus der Zellproliferation ...................................................................................................20
2.4.1
Ki-67-Protein ...............................................................................................................20
2.5 Allgemeines über die Apoptose .............................................................................................21
2.5.1
Caspase-3 .....................................................................................................................24
2.6 Proliferation und Apoptose in der Synovialmembran und im Kreuzband .............................25
2.6.1
Proliferation der B-Lymphozyten in der Synovialmembran bei der Osteoarthritis und
der rheumatoiden Arthritis des Menschen .....................................................................................25
2.6.2
Proliferation von T-Lymphozyten in der Synovialmembran bei der rheumatoiden
Arthritis des Menschen ..................................................................................................................27
2.6.3
Apoptose von synovialen T- und B-Lymphozyten beim Menschen ............................27
Inhaltsverzeichnis
3
II
2.6.4
Proliferation und Apoptose von Synovialdeckzellen ...................................................28
2.6.5
Apoptose im Kreuzband von Hunden ..........................................................................30
2.6.6
Apoptose bei der Osteoarthrose ...................................................................................31
Material und Methoden ..............................................................................................................33
3.1 Untersuchungsmaterial ...........................................................................................................33
3.1.1
Vergleichstiere .............................................................................................................33
3.1.2
Hunde mit Kreuzbandriss und Synovialitis (Gruppe 1 bis 3) ......................................33
3.1.3
Hunde mit Polyarthritis ................................................................................................34
3.2 Gewinnung und Aufarbeitung der Gewebeproben für die histologischen und
immunhistochemischen Untersuchungen ...............................................................................35
3.3 Physikochemische Färbemethoden ........................................................................................35
3.3.1
Hämatoxylin-Eosin-Übersichtsfärbung ........................................................................35
3.4 Immunhistochemische Färbemethoden .............................................................................36
3.4.1
Einzelfärbungen ...........................................................................................................36
3.4.2
ABC-Methode an formalinfixiertem Paraffinmaterial .................................................36
3.4.3
Primäre und sekundäre Antikörper ..............................................................................36
3.4.4
Tertiärer Antikörper .....................................................................................................36
3.4.5
Nachweis des Ki-67- Antigens in der Synovialmembran ............................................37
3.4.6
Nachweis des aktiven Caspase-3- Antigens in der Synovialmembran ........................38
3.5 Doppelfärbungen ....................................................................................................................40
3.5.1
Nachweis von Ki-67- und CD3- positiven Zellen in der Synovialmembran ...............41
3.5.2
Nachweis von Ki-67- und IgG- positiven Zellen in der Synovialmembran.................43
3.6 Kontrollen ..............................................................................................................................46
3.6.1
Positivkontrollen ..........................................................................................................46
3.6.2
Negativkontrollen.........................................................................................................46
3.7 Befunderhebung, Auswertung und statistische Aufarbeitung der Daten ...............................47
4
Ergebnisse ....................................................................................................................................49
Inhaltsverzeichnis
III
4.1 Histologische Untersuchungen der Synovialisproben ............................................................49
4.1.1
Histologische Befunde bei den Vergleichstieren .........................................................49
4.1.2
Histologische Befunde bei Hunden mit Kreuzbandriss ...............................................51
4.1.3
Histopathologische Befunde bei Hunden mit Polyarthritis ..........................................56
4.2 Immunhistochemische Untersuchungen.................................................................................58
4.2.1
Immunhistochemischer Nachweis des Ki-67-Antigens bei Synovialdeckzellen .........58
4.2.1.1
Nachweis des Ki-67-Antigens bei Synovialdeckzellen der Vergleichstiere ................58
4.2.1.2
Nachweis des Ki-67-Antigens bei Synovialdeckzellen der Hunde mit Kreuzbandriss59
4.2.1.3
Nachweis des Ki-67-Antigens bei Synovialdeckzellen der Hunde mit Polyarthritis
(Gruppe 4) ..................................................................................................................63
4.2.2
Immunhistochemischer Nachweis des Caspase-3- Antigens bei Synovialdeckzellen
und Entzündungszellen .................................................................................................65
4.2.2.1
Nachweis des Caspase-3- Antigens bei Synovialdeckzellen der Vergleichstiere ......65
4.2.2.2
Nachweis des Caspase-3- Antigens bei Synovialdeckzellen der Hunde mit
Kreuzbandriss .............................................................................................................66
4.2.2.3
Nachweis des Caspase-3- Antigens bei Synovialdeckzellen der Hunde mit
Polyarthritis (Gruppe 4) ..............................................................................................67
4.2.2.4
Nachweis des Caspase-3- Antigens bei Entzündungszellen von Vergleichstieren ....69
4.2.2.5
Nachweis des Caspase-3- Antigens bei Entzündungszellen von Hunden mit
Kreuzbandriss .............................................................................................................69
4.2.2.6
Nachweis des Caspase-3- Antigens bei Entzündungszellen von Hunden mit
Polyarthritis (Gruppe 4)..............................................................................................70
4.2.3
Immunhistochemischer Nachweis von IgG- positiven Zellen .....................................72
4.2.3.1
Nachweis von IgG- positiven Zellen bei den Vergleichstieren ..................................73
4.2.3.2
Nachweis von IgG- positiven Zellen bei den Tieren mit Kreuzbandriss ...................73
4.2.3.3
Nachweis von IgG- positiven Zellen bei den Tieren mit Polyarthritis (Gruppe 4) ....74
4.2.4
Immunhistochemischer Nachweis von CD3- positiven Entzündungszellen ................76
4.2.4.1
Nachweis von CD3-positiven Entzündungszellen bei den Vergleichstieren .............76
4.2.4.2
Nachweis von CD3-positiven Entzündungszellen bei den Tieren mit Kreuzbandriss ..
....................................................................................................................................76
4.2.4.3
Nachweis von CD3-positiven Entzündungszellen bei den Hunden mit Polyarthritis
(Gruppe 4) ..................................................................................................................78
4.2.5
Immunhistochemischer Nachweis des Ki-67- Antigens bei Entzündungszellen .........81
Inhaltsverzeichnis
IV
4.2.5.1
Nachweis des Ki-67-Antigens bei Entzündungszellen der Vergleichstiere ...............81
4.2.5.2
Nachweis des Ki-67-Antigens bei Entzündungszellen der Hunde mit Kreuzbandriss
....................................................................................................................................82
4.2.5.3
4.2.6
Immunhistochemischer Nachweis von Ki-67 CD3- positiven Zellen..........................85
4.2.6.1
Nachweis von Ki-67 CD3- positiven Zellen bei den Vergleichstieren ......................85
4.2.6.3
Nachweis von Ki-67 CD3- positiven Zellen bei Hunden mit Polyarthritis ................86
4.2.7
5
Nachweis des Ki-67- Antigens bei Entzündungszellen der Hunde mit Polyarthritis
(Gruppe 4) ..................................................................................................................83
Immunhistochemischer Nachweis von Ki-67 IgG- positiven Zellen ...........................90
4.2.7.1
Nachweis von Ki-67 IgG- positiven Zellen bei den Vergleichstieren........................91
4.2.7.2
Nachweis von Ki-67 IgG- positiven Zellen bei Hunden mit Kreuzbandriss ..............91
4.2.7.3
Nachweis von Ki-67 IgG- positiven Zellen bei Hunden mit Polyarthritis ................92
Diskussion.....................................................................................................................................97
5.1 Histopathologische Befunde an der Synovialmembran .........................................................98
5.2 Proliferation und Apoptose der Synovialdeckzellen ............................................................100
5.2.1
Proliferation der Synovialdeckzellen bei Hunden mit Kreuzbandriss .......................101
5.2.2
Proliferation der Synovialdeckzellen bei Hunden mit Polyarthritis ...........................102
5.2.3
Apoptose der Synovialdeckzellen bei Tieren mit Kreuzbandriss ..............................102
5.2.4
Apoptose der Synovialdeckzellen bei Tieren mit Polyarthritis ..................................103
5.2.5
Schlussfolgerung zur Proliferation und Apoptose der Synovialdeckzellen bei den
KBR-Tieren und den Tieren mit Polyarthritis ............................................................103
5.3 Proliferation und Apoptose von Entzündungszellen ............................................................104
5.3.1
CD3- positive T-Lymphozyten und IgG- positive Plasmazellen in der
Synovialmembran von Hunden mit Kreuzbandriss und mit Polyarthritis ..................105
5.3.2
Proliferation der Entzündungszellen bei den Tieren mit Kreuzbandriss ....................106
5.3.3
Proliferation der Entzündungszellen bei den Tieren mit Polyarthritis .......................107
5.3.4
Apoptose der Entzündungszellen bei Hunden mit Kreuzbandriss und Hunden mit
Polyarthritis ................................................................................................................109
6
Zusammenfassung .....................................................................................................................111
7
Summary ....................................................................................................................................115
Inhaltsverzeichnis
V
8
Literaturverzeichnis ..................................................................................................................117
9
Anhang .......................................................................................................................................129
9.1 Versuchsmaterial ..................................................................................................................129
9.2 Histopathologische Befunde ................................................................................................133
9.3 Statistik .................................................................................................................................138
9.4 Lösungen und Puffer für die immunhistochemischen Untersuchungen...............................142
9.5 Bezugsquellen ......................................................................................................................143
9.5.1
Bezugsquellen für Geräte und Einmalartikel .............................................................144
9.6 Verzeichnis der verwendeten Abkürzungen.........................................................................146
Einleitung
1
1 Einleitung
Nicht nur bei Hunden mit chronischer rheumatoider Polyarthritis, sondern auch bei Hunden
mit Synovialitiden, die mit vorderem Kreuzbandriss assoziiert sind, tritt eine Infiltration der
Synovialis
Plasmazellen
mit
Makrophagen,
auf.
Aufgrund
Lymphozyten
und
histologischer
Immunglobulin-produzierenden
Befunde
und
anderweitiger
Untersuchungsergebnisse wird angenommen, dass nicht nur der chronischen rheumatoiden
Arthritis, sondern auch dem Kreuzbandriss des Hundes eine Immunpathogenese zugrunde
liegt.
Es ist bisher nicht bekannt, ob die Akkumulationen von Lymphozyten und Plasmazellen in
der Synovialmembran bei diesen Hunden auf eine lokale Proliferation von T- bzw. BLymphozyten zurückzuführen sind oder ob bereits aktivierte T- bzw. B-Lymphozyten in die
Synovialmembran einwandern und dort ausreifen.
Über das mögliche Auftreten von Apoptose in der Synovialmembran von Hunden gibt es
keinerlei Untersuchungen; bisher existieren nur Untersuchungen über das Vorkommen von
Apoptose im vorderen Kreuzband von Hunden mit und ohne Kreuzbandriss.
Des weiteren ist bisher nicht bekannt, ob die bei Hunden mit chronischer rheumatoider
Polyarthritis auftretende Synovialishyperplasie auf eine erhöhte Proliferationsrate der
Synovialdeckzellen und/oder auf eine verminderte Apoptose zurückzuführen ist.
In dieser Arbeit wurden in Paraffin eingebettete Synovialgewebeproben von 23 Hunden mit
Kreuzbandriss und von 6 Hunden mit Polyarthritis untersucht.
Ein Ziel der Untersuchungen war es, in den entzündlich veränderten Synovialisproben dieser
Hunde
die
lokale
lymphoplasmazellulären
Proliferationsaktivität
von
Entzündungszellinfiltrates
Synovialdeckzellen
zu
analysieren.
und
Hierfür
des
wurden
immunhistochemische Doppelfärbetechniken und Antikörper gegen T-Lymphozyten (CD3),
gegen Immunglobulin G- haltige Plasmazellen und der Proliferationsmarker Ki-67 eingesetzt.
Des weiteren sollte das Vorkommen von Apoptose bei Entzündungs- und Synovialdeckzellen
charakterisiert werden. Die Auszählung der markierten Zellen erfolgte semiquantitativ. Als
Einleitung
Vergleichsgruppe
2
dienten
gelenkgesunden Hunden.
Synovialgewebeproben
von
8
pathologisch-anatomisch
Literaturübersicht
3
2 Literaturübersicht
2.1 Histologie der Synovialmembran
Die Gelenkkapsel ist eine Fortsetzung des Periosts, sie besitzt ein äußeres straffes
kollagenfaseriges Stratum fibrosum und ein inneres lockergebautes Stratum synoviale. Das
Stratum synoviale schickt Zotten und Falten in den kapillären Spalt des Gelenkes hinein
(LEONHARDT 1990). Das Stratum synoviale oder auch einfach Synovialis genannt, ist reich
an Blut- und Lymphgefässen sowie an Nerven (NICKEL et al. 1992). Die Synovialis ist
mesenchymalen Ursprungs und hat daher keine epitheliale Struktur. Die Synovialis wird in 2
Schichten unterteilt, die Intima (ein- bis mehrreihige Deckzellschicht) und die Subintima. In
der Subintima befinden sich Fibroblasten, Fibrozyten, Fettzellen, Kollagenfasern, elastische
Fasern und mononukleäre Zellen. Entsprechend deren jeweiligen Anteilen kann die Subintima
in verschiedene histologische Typen, wie den fibrösen Typ, den areolären Typ und den
adipösen Typ unterteilt werden, obwohl auch Mischformen wie fibroareoläre und
adipoareoläre Typen vorkommen (BENNETT 1991). WYSOCKI u. BRINKHOUS (1972)
zeigen in ihrer Studie anschaulich die Lokalisation der verschiedenen Typen der
Synovialmembran im Kniegelenk des Hundes. Die Topographie der Synovialis anderer
Spezies wie Mensch, Schwein, Kaninchen und Ratte ist im allgemeinen der des Hundes bis
auf minimale Unterschiede sehr ähnlich. Fibröse Anteile findet man beim Hund vor allem in
den Bereichen um Bänder und Patellaanteile (WYSOCKI u. BRINKHOUS, 1972). In den
durch Beugung und Streckung gespannten bzw. entspannten Kapselabschnitten ist als
Verschiebepolster Fettgewebe eingelagert (adipöser Typ). Die für die Bereitung der Synovia
als Ultrafiltrat und für Resorptionsvorgänge wichtigste Struktur ist der areoläre Bereich mit
einem dichten Netz von Blut- und Lymphkapillaren in einem lockeren Fasergewebe
(DÄMMRICH et al. 1989). WYSOCKI und BRINKHOUS (1972) unterscheiden wie
GREISEN et al. (1982) beim Hund zwischen einem makrophagenähnlichen Typ A und einem
fibroblastenähnlichen Typ B. Die Typ A- Zellen enthalten Lysosomen, Vesikel und
Vakuolen. Die Typ B- Zellen sind durch ein stark entwickeltes raues endoplasmatisches
Retikulum gekennzeichnet. Nicht nur morphologisch, sondern auch funktionell unterscheiden
sich die Typ A- Zellen mit den Aufgaben der Phago- und Pinozytose von den Deckzellen vom
Typ B, die die viskösen sauren Proteoglykane in die Synovia sezernieren (DÄMMRICH et al.
Literaturübersicht
4
1989). Die Untersuchungen von Yasui et al. (2004) zeigen, dass Hyaluronsäure in der
Synovialmembran bei Ziegen von der inneren Seite der Plasmamembran der Typ B- Zellen
synthetisiert wird und von Typ A- Zellen aufgenommen und abgebaut wird. In unveränderter
Synovialis überwiegen beim Hund deutlich die Typ B- Synoviozyten. Eine Untersuchung von
GREISEN et al. (1982) zeigt, dass in der Synovialis eines 24 Wochen alten, gesunden Beagles
17% Typ A- Zellen und 80% Typ B- Zellen vorhanden waren. Bei degenerativen
Knochenerkrankungen fällt die Anzahl der Typ A- Synoviozyten weiter ab. Die Anzahl der
B-Synoviozyten bleibt dagegen konstant (GREISEN et al. 1982) Die Synovia, teils Dialysat
des Blutes, teils Sekret der Synoviazellen, besteht hauptsächlich aus Hyaluronsäure und
Proteinen und enthält reichlich Glukose, sie schmiert das Gelenk und vermittelt die Ernährung
durch Diffusion (LEONHARDT 1990). Die Synovialis bildet zusammen mit dem
Kapillarendothel die Blut-Synovia-Schranke. Sowohl Komponenten der Synovialflüssigkeit,
welche aus dem Blutkreislauf stammen, als auch die Metaboliten der Synovialflüssigkeit
müssen diese Schranke passieren (BENNETT 1991).
Literaturübersicht
5
2.2 Kreuzbandriss beim Hund
2.2.1 Klinik, Ätiologie und Pathogenese
Die Ruptur des cranialen Kreuzbandes ist und bleibt in der Veterinärmedizin das größte
orthopädische Problem beim Hund (HARASEN, 2003). Bei Hunden ist, mit Ausnahme der
akuten traumatischen Form, die genaue Ursache und Pathogenese der Kreuzbandruptur
weiterhin unklar (DOOM et al. 2008). Im Gegensatz zum Menschen fehlt beim Hund oft im
Vorbericht ein akutes Trauma als Auslöser des Kreuzbandrisses (GALLOWAY and LESTER,
1995; BARRETT et al. 2005). Die durch die Kreuzbandruptur bedingte schmerzhafte
Gelenkinstabilität führt zur Lahmheit. Typisch sind wechselnde Perioden von verschiedenen
Lahmheitsgraden (FREUDIGER et al. 1997). In einer Vielzahl von Fällen reißt innerhalb
Jahresfrist auch das kontralaterale Band. Ohne Operation stabilisiert sich das Gelenk partiell
durch die einsetzende Kapselfibrose, damit verringert sich die Lahmheit. Die trotzdem weiter
bestehende, wenn auch verminderte Instabilität, schädigt vor allem den medialen Meniskus
und den Gelenkknorpel und führt zur Osteoarthrose (NIEMAND u. SUTER, 2000). In einer
Studie von GRIFFIN und VASSEUR (1992) zeigen 67% der untersuchten Hunde eine totale
Ruptur und 15% eine partielle Ruptur. Dabei waren die Hunde mit partieller Ruptur
signifikant
jünger
und
zeigten
milde
bis
mittlere
Entzündungsvorgänge
in
der
Synovialflüssigkeit. Jeder dritte Kreuzbandrisspatient erleidet 8 Monate nach der Ruptur eine
weitere Kreuzbandrissruptur im kontralateralen Kniegelenk (POND u. CAMPBELL 1972;
BENNETT et al. 1988; DOVERSPIKE et al. 1993). Radiographisch dokumentiert wurde die
signifikante Zunahme der Osteophytenformation, also der Progression von osteoarthritischen
Prozessen, im kontralateralen Kniegelenk 6 bis 12 Monate nach einer Kreuzbandrissruptur
(DE BRUIN et al. 2007 c). Dabei ist die Theorie umstritten, dass aufgrund des schmerzhaften
instabilen Gelenks eine erhöhte Gewichtsbelastung zu ungunsten des kontralateralen
Kniegelenks erfolgt und letztendlich zu osteoarthritischen Veränderungen führt (RUMPH et
al. 1995). Osteophytäre Zubildungen entlang der femoralen Trochlea und der Area
intercondylaris der Trochlea werden von TIRGARI (1977) als pathognomonisch für einen
Kreuzbandriss angesehen.
Literaturübersicht
6
Laut DOOM et al. (2008) ist es zweifelsfrei, dass der cranialen Kreuzbandruptur beim Hund
eine multifaktorielle Ätiologie und Pathogenese zugrundeliegt.
Alter, Rasse, Gewicht und Geschlecht sind alles Faktoren, die einen Einfluss auf die
Entwicklung eines Kreuzbandrisses haben (GALLOWAY u. LESTER 1995). Nach
BENNETT et al. (1988) sind typischerweise kleine bis mittlere Rassen fortgeschritteneren
Alters (5-7 Jahre) betroffen oder es handelt sich um junge Hunde (1 bis 3 Jahre) der größeren
Rassen (Rottweiler, Bernhardiner, Labrador Retriever, Dogge). HARASEN stellt in seiner
Studie von 2003 in den vergangenen Jahren sogar eine Zunahme der Kreuzbandrisse bei
jungen großen Hunderassen fest. Fortschreitendes Alter ist mit einer Degeneration des
Kreuzbandes verbunden ebenso wie höheres Körpergewicht. Dabei liegen degenerative
Veränderungen des Kreuzbandes bei Hunden über 5 Jahre vor, welche mehr als 15 kg wiegen
(VASSEUR et al. 1985). Eine Rasseprädisposition für eine Kreuzbandruptur liegt vor allem
beim Labrador Retriever und Rottweiler vor (WHITEHAIR et al. 1993). Eine Studie von
COMERFORD et al. (2006) zeigt den histologischen Unterschied der parallel angeordneten
Kollagenfasern beim Labrador Retriever zu der fibrokartilaginösen Formation der
Kollagenfasern des Greyhounds, welche eine Adaption an extreme Bedingungen wie
Hunderennen zu sein scheint. Auffallend ist, dass bei dem für Kreuzbandrisse prädisponierten
Labrador Retriever eine höhere Anzahl von Kollagenfasern kleineren Durchmessers
vorhanden ist als beim Greyhound, wobei letztere Rasse keine Prädisposition für einen
Kreuzbandriss besitzt. Auch das Geschlecht scheint als prädisponierender Faktor für einen
Kreuzbandriss eine Rolle zu spielen: beim Menschen erleiden weibliche Athleten wesentlich
öfter einen Kreuzbandriss als männliche Sportler. Östrogen- Rezeptoren sind in Fibroblasten
bei Kaninchen und Menschen in Kreuzbändern gefunden worden. Der Östrogen- Einfluss auf
Fibroblasten ist nachgewiesen (INNES 2003). Auch bei Hunden ist vorwiegend das weibliche
Geschlecht betroffen, in einer Studie von HARASEN (2003) waren 65% der
Kreuzbandrisspatienten Hündinnen.
BENNETT (1990) hat Kreuzbandrupturen untersucht, welche mit einer Gonitis asssoziiert
sind. Dabei wirkt der entzündliche Prozess so nachteilig auf das Kreuzband ein, dass dieses
durch ein geringes Trauma reissen kann. Immunkomplexe und Antikörper gegen Kollagen 1
und 2, welche im Blut und in der Synovialflüssigkeit gefunden wurden, sind nach BENNETT
(1990) nicht primär immunvermittelt, sondern wahrscheinlich ein sekundäres Phänomen.
Literaturübersicht
7
Diese Vermutung deckt sich mit den Ergebnissen von DE ROOSTER et al. (1999). Deren
These ist, dass die durch die Kreuzbandruptur entstandene Gelenksinstabilität zusammen mit
erhöhtem Gewicht zu einem mechanischen Schaden am Gelenkknorpel führt und daraufhin
Antigene in Form von Enzymen, Kollagen und Knorpel frei werden, welches dem
Immunsystem präsentiert wird, worauf die Produktion von Autoantikörpern eingeleitet wird.
Auch GRIFFIN und VASSEUR (1992) vertreten diese These. So ist für die Autoren die
Kreuzbandruptur bei vielen Hunden ein progressiver Prozess mit einer entzündlichen
Komponente in den frühen Stadien von Band- und Knorpeldegeneration. In einer Studie von
DE BRUIN et al. (2007 a) wurde demonstriert, dass eine zelluläre Reaktivität der TLymphozyten im peripheren Blut gegen Kollagen- Typ 1 sowohl bei Hunden mit
Kreuzbandriss vorhanden ist, aber ebenso bei gesunden schein- operierten Hunden am
Kniegelenk und gesunden Hunden vorkommt. Ein Anstieg der Proliferation der Lymphozyten
lag mehrheitlich bei den Hunden mit Kreuzbandriss vor, jedoch war kein Unterschied
bezüglich der Lymphozyten Reaktivität zu Kollagen- Typ 1 zwischen Hunden, die einen
Kreuzbandriss im kontralateralen Kniegelenk entwickelten und denen, die keine
kontralaterale Ruptur erlitten, zu erkennen. Eine Aussage hinsichtlich einer Initiatorrolle der
zellulären Immunantwort gegen Kollagen- Typ 1 beim Kreuzbandriss des Hundes kann nicht
getroffen werden. Zukünftige Untersuchungen von Synovialflüssigkeit sollen klären, ob lokal
im Kniegelenk eine zelluläre Reaktivität der T-Lymphozyten gegen Kollagen- Typ 1 existiert
(DE BRUIN et al. 2007 a). Häufig ist der Kreuzbandriss mit einer lymphozytär-plasmazytären
Synovitis assoziiert. Entzündungen in der Synovialmembran und entzündliche Veränderungen
in der Synovialflüssigkeit bei Hunden mit Kreuzbandruptur sind schon mehrfach beschrieben
worden (MUIR et al. 2005; GALLOWAY et al. 1995; LAWRENCE et al. 1998;
HEWICKER-TRAUTWEIN et al. 1999; GRIFFIN u. VASSEUR 1992; LEMBURG et al.
2004). Degenerative Gelenkserkrankungen werden nicht mehr als ein rein nicht-entzündlicher
Prozess verstanden (DE ROOSTER et al. 1999). Die Ursache der chronischen Entzündung
und welche Rolle diese Entzündung für den Mechanismus einer Kreuzbandruptur spielt ist
unbekannt. Die Vermutung eines immunvermittelten Geschehens stützt sich auf die Tatsache,
dass in der Synovialmembran IgG- und IgM- Antikörper vorhanden sind und die
Entzündungszellpopulation auch zahlreiche dendritische Zellen enthält, welche das MHC II-
Literaturübersicht
8
Antigen exprimieren (MUIR et al. 2005 b; LAWRENCE et al. 1998; HEWICKERTRAUTWEIN et al. 1999; LEMBURG et al. 2004).
Neuere Untersuchungen zeigen den Nachweis von Bakterien- DNA im Kniegelenk bei
Hunden mit Kreuzbandriss (MUIR et al. 2007). Dieses bakterielle Material könnte als
immunologischer Trigger für die Synovialitis fungieren. Dafür spricht auch der Nachweis
einer erhöhten Expression von TLR-2 (toll-like-rezeptor-2) bei Hunden mit einer bestehenden
Oligoarthritis nach Kreuzbandrissruptur, welcher eine Aktivierung durch bakterielle
Lipoproteine erfährt. Eine Schlüsselrolle des TLR besteht darin, dendritische Zellen zu
aktivieren um Th1 T-Zell Antworten zu unterstützen (MUIR et al. 2007). BARRETT et al.
(2005) untersuchten und verglichen bei caninen Kreuzbandrupturen als auch bei humanen
Kreuzbandrupturen die Dichte Makrophagen-ähnlicher Zellen in der Synovialmembran,
welche kollagenolytische Enzyme wie TRAP (Tartrate-resistant–acid-phosphatase) und
Kathepsin K produzieren. In dieser Studie zeigte sich, dass signifikant mehr TRAP- positive
Zellen und Kathepsin K- positive Zellen beim caninen Kreuzbandriss vorhanden sind als beim
humanen Kreuzbandriss Die Autoren sehen Kreuzbandrisse bei den meisten Hunden als
Endstadium einer immunvermittelten entzündlichen Arthropathie an, bei der Kathepsin K und
TRAP zu einer irreversiblen Zerstörung des Kreuzbandes führen. Auch MUIR et al. (2005)
zeigten, dass bei caninen rupturierten Kreuzbändern die mRNA von Matrixmetalloproteinasen
wie MMP-2 und MMP-9 im Vergleich zu gesunden Kreuzbändern ansteigt. Dabei wurden die
mRNA von TRAP und Kathepsin S nur in rupturierten Kreuzbändern nachgewiesen. Die
Hypothese einer immunvermittelten Entzündung im Synovialgewebe wird durch die Tatsache
gestützt, dass Kathepsin S an der Antigenpräsentation und am Matrixabbau beteiligt ist.
Kathepsin K ist sowohl im intakten Gewebe als auch im rupturierten Kreuzband enthalten.
KLOCKE et al. (2005) vermuten, dass Synovialmakrophagen in der Synovialmembran und
der Gelenkkapsel von Hunden mit rupturierten Kreuzbändern proinflammatorische Zytokine
wie Interleukin-6 und Tumor-Nekrose-Faktor-α produzieren und somit wesentlich beteiligt
sind an der Entstehung von pathologischen Veränderungen wie der sekundären Osteoarthritis
bei Kreuzbandrissen. Die Dichte der Synovialmakrophagen ist dabei positiv korreliert mit der
Schwere der sekundären osteoarthritischen Veränderungen.
Literaturübersicht
9
Nach MUIR et al. (2005) sind immunvermittelte entzündliche Veränderungen wichtige
Faktoren, welche klinische Erscheinungen wie chronische Lahmheit, bilaterale Erkrankung
und die häufig auftretende Osteoarthritis beim Kreuzbandriss erklären könnten.
Die Frage bleibt offen, was sich zuerst entwickelt - die Synovialitis oder die
Gelenksinstabilität und die Kreuzbandruptur. Dabei fehlen weitgehend Untersuchungen am
Kniegelenk vor dem Eintritt einer Kreuzbandruptur (MUIR et al. 2005). Eine aktuelle Studie
von DE BRUIN (2007 b) zeigt beim unilateralen Kreuzbandriss eine signifikante Interleukin8 Expression im verletzten Kniegelenk nach Kreuzbandruptur beim Vergleich mit dem
unversehrten kontralateralen Kniegelenk und bei Hunden mit medialer Patellaluxation. 6
Monate nach der Kreuzbandrissoperation war die Interleukin-8 Expression jedoch auch
signifikant im kontralateralen Kniegelenk verglichen mit dem Schultergelenk angestiegen.
Diese Ergebnisse könnten darauf hindeuten, dass ein Entzündungsgeschehen bereits vor der
Kreuzbandruptur existiert (De BRUIN et al. 2007 b). Die exakte Rolle von proinflammatorischen Zytokinen, anti-inflammatorischen Zytokinen, Wachstumsfaktoren und
Matrix abbauenden Enzymen wie Matrixmetalloproteinasen, Kathepsinen und TRAP bleibt
weiterhin unklar (DOOM et al. 2008)
Stickstoffmonoxid (NO) spielt eine wichtige Rolle in der Initiation und der Progression von
entzündlichen und degenerativen Gelenkerkrankungen (MURELL et al. 1996; EVANS et al.
1995). Stickstoffmonoxid bewirkt einen Knorpelabbau durch Verhinderung der Kollagen- und
Proteoglycanproduktion (PELLETIER et al. 1998).
SPRENG et al. (2000) untersuchten die iNOS- (induzierbare Stickoxid Synthase) Produktion
in der Synovialmembran und im kranialen Kreuzband. Während sich in der Synovialmembran
die iNOS- Konzentration zwischen Hunden mit rupturiertem Kreuzband und gesundem
Kreuzband nicht unterschied, sank die iNOS- Konzentration im rupturiertem Band im
Gegensatz zum gesundem Band deutlich ab. Die Ursache ist den Autoren nach in der
Unterversorgung des Blutkreislaufes im Band bei einer Kreuzbandruptur zu sehen. Aufgrund
des Vorkommens von iNOS im gesunden Kreuzband wird vemutet, dass NO eine
physiologische Rolle spielt. RIITANO et al. (2002) zeigen in ihrer Studie, dass Explantate
von intakten Kreuzbändern iNOS-induziertes NO produzieren. Durch Stimulation der
chondroiden metaplastischen Zellen des Kreuzbandes durch proinflammatorische Zytokine
wie Interleukin-1 und Tumor- Nekrose- Faktor-α steigt die iNOS- Produktion an. Die Autoren
Literaturübersicht
10
gehen davon aus, dass die NO- Produktion eine Rolle im pathophysiologischen Prozess des
Kreuzbandrisses spielt.
Nach BENNETT (1990) kann das Kreuzband außerdem durch andere Gelenksentzündungen
wie rheumatoide, infektiöse und idiopathische Arthritis geschwächt werden. Eine valgoide
Instabilität des Gelenks, welche für gewöhnlich nach Femurfrakturen oder Hüftluxationen
folgt, wirkt sich ebenfalls nachteilig auf das Kreuzband aus. Auch eine Deformation der Tibia
verändert die Biomechanik des Gelenks, woraus eine degenerative Gelenkerkrankung und
eventuell die Ruptur des Kreuzbandes resultiert.
2.2.2 Histologie der Synovialmembran beim Kreuzbandriss
LIPOWITZ et al. (1985) untersuchten die Synovialmembran von Hunden nach
experimenteller Durchtrennung des Kreuzbandes. Bei allen Hunden war dabei eine
Synovialdeckzellhypertrophie und/ oder -hyperplasie und auch eine gesteigerte Hyperämie
und Hyperkapillarität festzustellen. Eine ausgeprägte villöse Proliferation zeigte sich 8
Wochen post operationem. Nach einer Woche p.op. erschienen bereits einige mononukleäre
Zellen als diffus verteilte oder aber auch als perivaskuläre Akkumulationen. Nach 8 bis 13
Wochen p.op. zeigten sich subsynovial hochgradige, meist perivaskuläre Akkumulationen
von Lymphozyten und Plasmazellen. Bei den dominierenden Plasmazellen waren des öfteren
Hämosiderin-haltige Makrophagen zu sehen. Die Autoren diskutieren die Möglichkeit, dass
Hämorrhagien eine Synovialitis produzieren könnten. Wiederholte Injektionen von Blut in
Kniegelenke von Hunden führten zu einer chronischen Entzündung und subsynovialer Fibrose
(CONVERY et al. 1976; HOAGLUND 1967). BRANDT et al. (1991) untersuchten das
Synovialgewebe 54 Monate nach experimenteller Durchtrennung des Kreuzbandes bei
Hunden. Sichtbar wurde dabei eine Synovialdeckzellhyperplasie (bis 10 Reihen), und das
Synovialgewebe aus dem infra- und suprapatellaren Fettgewebe zeigte eine extensive
mononukleäre Zellinfiltration und Fibrose; in der Synovialmembran der medialen
parapatellaren Region war keine mononukleäre Zellinfiltration vorhanden. GALLOWAY und
LESTER (1995) unterteilten in ihrer Studie 2 Gruppen von Hunden mit spontanem
Kreuzbandriss jeweils nach An- oder Abwesenheit subsynovialer, fokaler, nodulärer,
lymphoplasmazytärer Aggregate. In Gruppe 1 war das meist perivaskulär gelegene
Literaturübersicht
11
Lymphozytenaggregat von Plasmazellen umgeben. Diese Hunde wiesen dabei sowohl eine
vermehrte Anzahl an subsynovialen Kapillaren auf, als auch eine erhöhte Zahl der
Synovialdeckzellreihen (2 bis 10). Es handelt sich bei der Gruppe 1 um Hündinnen, welche
öfter schwerer und jünger als die Hunde in Gruppe 2 waren. In Gruppe 2 mit kleineren und
älteren Hunden als in Gruppe 1 wiesen die Bioptate diffuse Infiltrate von Lymphozyten,
Plasmazellen und Makrophagen auf. Auch hier zeigte mehr als die Hälfte der Hunde eine
villöse Hyperplasie mit vielen Kapillaren. Die meisten Synovialdeckzellen waren hypertroph
und hyperplastisch. Die schwereren, jüngeren Hunde aus Gruppe 1 wiesen die gravierenderen
histopathologischen Veränderungen an der Synovialmembran auf. Nur in dieser Gruppe
kamen partielle Bandrisse und beidseitige Kreuzbandrupturen vor. Eventuell ist die
unvollständige Ruptur des Kreuzbandes als möglicher Faktor für die Entstehung schwerer
Entzündungerscheinungen anzusehen. Bei Gruppe 2 vermuteten die Autoren, dass die
altersbedingte Degeneration des Kreuzbandes zur Ruptur führt und die entzündlichen
Veränderungen sekundärer Natur sind. Beim Menschen konnten lymphoplasmazytäre
Ansammlungen bei rheumatoider Arthritis und vielen infektiösen Arthritiden gefunden
werden (HARRIS 1990). Die noduläre Form gilt als histologischer Marker einer
Immunantwort und die vermehrte Zahl an Plasmazellen sind ein Indikator für
Antikörperproduktion. Die histologischen Läsionen der Gruppe 1 sind kompatibel mit einer
immunvermittelten Synovitis (GALLOWAY und LESTER, 1995). Auch LEMBURG et al.
(2004) beobachteten bei der histologischen Untersuchung von Hunden mit Kreuzbandruptur
in der Synovialmembran vielfach perivaskuläre lymphoplasmazelluläre Akkumulationen ohne
vorhandene lymphatische Follikel oder Keimzentren. Die Autoren stellten fest, dass diese
histopathologischen Veränderungen denen beim Menschen mit Osteoarthritis und
lymphoplasmazellulärer Synovialitis gleichen. KRENN et al. (1999) zeigten in ihren
Untersuchungen, dass beim Menschen mit Osteoarthritis und lymphoplamazellulärer
Synovialitis B-Zellen perivaskulär einwandern, akkumulieren und sich direkt, ohne weitere
Proliferation, in Plasmazellen differenzieren. Dies spricht für eine spezifische, nicht lokal
vermittelte Immunantwort dieser degenerativen Erkrankung.
Literaturübersicht
12
2.2.3 Immunhistochemie der Synovialmembran beim Kreuzbandriss des
Hundes
In einer Studie von HEWICKER-TRAUTWEIN et al. (1999) stellte sich heraus, dass bei der
Untersuchung der Synovialmembran von Hunden mit spontanem Kreuzbandriss und sekundär
entwickelter Osteoarthritis vor allen Dingen subsynovial MHC II- positive Zellen vorhanden
sind, welche vorwiegend eine dendritische Morphologie besitzen. Die Zahl der meist diffus
verteilten CD5+, CD4+ und CD8+ Lymphozyten war gering. Die Autoren diskutierten, dass
die Anwesenheit von dendritischen MHC Klasse II- Zellen einen Indikator für die
Präsentation eines unbekannten Antigens für die T-Zellen darstellen könnte. Bei LEMBURG
et al. (2004) bestanden die Hauptzelltypen in untersuchten Synovialisproben aus
Kniegelenken von Hunden mit Kreuzbandriss (und entzündlich verändertem Gewebe) vor
allen Dingen aus B-Lymphozyten und Plasmazellen. Die Plasmazellen waren vorwiegend
dem Isotyp- IgG zugehörig, weniger entsprachen dem Isotyp- IgM und noch weniger dem
IgA- Isotyp. Diese Ergebnisse stehen im Gegensatz zu einer früheren Untersuchung von
LAWRENCE et al. (1998), die nach der immunhistochemischen Untersuchung der Synovialis
von Hunden mit Kreuzbandruptur zu dem Ergebnis kamen, dass vor allem IgM- und dann
nachfolgend IgG- positive Zellen nachgewiesen werden konnten, während IgA- positive
Zellen nicht vorhanden waren. Bei entzündlich verändertem Synovialgewebe des Menschen
mit Osteoarthritis (KRENN et al. 1999) waren es vorwiegend IgG- und IgA- positive
Plasmazellen, welche sich in der Peripherie lymphozytärer Aggregate fanden. Bei der
Untersuchung der T-Lymphozytenpopulation in der Synovialmembran von Hunden mit
Kreuzbandriss von LEMBURG et al. (2004) erwiesen sich die CD4+ T-Lymphozyten als
stärkster Vertreter, gefolgt von den CD8+ T-Lymphozyten. LEMBURG et al. (2004) zeigten
außerdem, dass in stark entzündlich veränderten Synovialisanschnitten die gesamte
Deckzellschicht positiv für MHC II waren, dabei hatten die Deckzellen das Aussehen von
Typ A- Synoviozyten. Übereinstimmend mit den Untersuchungen von HEWICKERTRAUTWEIN et al. (1999) fanden sich überwiegend subsynovial MHC II- positive Zellen
mit dendritischer Morphologie. Weiterhin konnte gezeigt werden, dass 95% der Zellen mit
dendritischer Morphologie in der Synovialmembran von Hunden mit Kreuzbandriss sowohl
MHC II- als auch CD1c- Antigene exprimieren. Diese waren dabei in direkter Nachbarschaft
zu lymphozytären Zellen zu finden. Nach Meinung der Autoren handelt es sich dabei
Literaturübersicht
13
wahrscheinlich um ausgereifte dendritische Zellen. Ausserdem wiesen LEMBURG et al.
(2004) eine positive Korrelation der Expression von Adhäsionsmolekülen (CD11/CD18
Familie) mit dem Schweregrad der entzündlichen Infiltration der Synovialmembran bei
Hunden mit Kreuzbandruptur nach.
2.3 Histologische und immunhistochemische Befunde an der
Synovialmembran von Hunden mit immunvermittelten Arthritiden
2.3.1 Klassifikation der entzündlichen Gelenkserkrankungen beim Hund
Nach BENNETT und MAY (1995) lassen sich entzündliche Gelenkerkrankungen in
infektiöse Formen, die sehr seltenen kristallinduzierten und die immunbedingten
nichtinfektiösen Formen unterteilen. Immunbedingte Arthritiden, die sich meist als Polyseltener auch als Mono- oder Oligoarthritiden präsentieren, können aufgrund des
radiologischen Erscheinungsbildes in erosive und nicht-erosive Formen unterteilt werden
(Tabelle 1).
2.3.2 Erosive Arthritis
Häufigste erosive Arthritisform ist die rheumatoide Arthritis; dabei handelt es sich um eine
autoimmune, progressive, bilateral symmetrische, erosive Polyarthritis (LEWIS 1994). Die
chronische
Polyarthritis
ist
eine
meist
chronische
und
progredient
verlaufende
Systemerkrankung des Bindegewebes, die sich mit destruktiven Veränderungen an den
Gelenken manifestiert und fakultativ auch verschiedene innere Organe befallen kann. Die
chronische Polyarthritis selbst basiert auf einer genetisch determinierten Empfänglichkeit
(SCHWALBACH und SPRENG, 1991). Die Ätiologie der rheumatoiden Arthritis ist
unbekannt, aber sie scheint multifaktoriell zu sein (BENNETT and MAY, 1995). Zur
Diskussion standen in der Vergangenheit Streptokokken, Clostridien, Mykoplasmen,
Corynebakterien und Viren (SCHWALBACH et al. 1993 b). Ergebnisse zweier Studien
deuten auf die Anwesenheit des Staupe-Virus in den erkrankten Gelenken und eine
ätiologische Bedeutung bei der rheumatoiden Arthritis des Hundes hin (BELL et al. 1991;
Literaturübersicht
14
MAY et al. 1994). Beim Hund ist die rheumatoide Arthritis eine seltene Erkrankung
(PEDERSEN et al. 2000). Die rheumatoide Arthritis betrifft junge bis mittelalte Hunde (1-8
Jahre) und zum Teil kleine und Toy Rassen, es liegt keine Geschlechtsdisposition vor
(LEWIS 1994). Bei der rheumatoiden Arthritis sind besonders die Karpal-, Tarsal-,
Ellenbogen- und Kniegelenke betroffen, aber auch Phalangeal-, Schulter- und Hüftgelenke. In
Ausnahmefällen können auch Wirbelsäulengelenke erkranken. Vergesellschaftet ist die
rheumatoide Arthritis im frühen Stadium mit Symptomen wie Fieber, Anorexie und einer
Lymphadenopathie. Die renale Amyloidose kann als Komplikation einer lang andauernden
Erkrankung auftreten. Die ersten radiologischen Veränderungen bestehen in einer
Weichteilschwellung (arthritische Weichteilzeichen) und dem Verlust der Knochendichte.
Kollateralphänomene wie die Entkalkung des Knochens können erst Monate nach
Entzündungsbeginn festgestellt werden. Ein wichtiges röntgenologisches Merkmal der
rheumatoiden Arthritis des Hundes nach wochen- bis monatelanger Erkrankung sind deutliche
Erosionen subchondraler und gelenknaher knöcherner Strukturen. Ein deutlich sichtbar
erweiterter Gelenkspalt ist das Ergebnis von Knorpelerosionen und der Zerstörung des
subchondralen Knochens (PEDERSEN et al. 2000) Diese sogenannten arthritischen
Direktzeichen
kommen
infolge
des
proliferativen
Entzündungsprozesses
zustande
(SCHWALBACH et al. 1993 b). Der Schwerpunkt in der Diagnostik wird auf die
röntgenologischen und histologischen Befunde gelegt (BENNETT, 1987). Nach BENNETT
(1987) gibt es 4 wesentliche Unterschiede zur rheumatoiden Arthritis des Menschen. Beim
Hund gibt es die beim Menschen häufig beobachteten subkutanen Knoten nicht und auch
Lymphfollikel werden sehr selten in der Synovialmembran beobachtet. Ausserdem gibt es
beim Hund keine Augen assozierten Erkrankungen wie z.B. eine Skleritis und auch keine
vaskulären Läsionen (Polyarteriitis). Von PERSON et al. (1991) wurden speziell für den
Hund diagnostische Kriterien entwickelt (Tabelle 2). Sind fünf dieser Kriterien vorhanden, ist
das Vorliegen einer rheumatoiden Arthritis wahrscheinlich, sieben machen die Diagnose
definitiv.
Literaturübersicht
15
Tabelle 1: Einteilung der immunvermittelten Arthritiden beim Hund (modifiziert nach
BENNETT, 2005)
Erosive Polyarthritiden
Rheumatoide Arthritis
Polyarthritis der Greyhounds
Sjögren-Syndrom
Felty-Syndrom
Nichterosive (nicht deformierende) Polyarthritiden
Idiopathische Polyarthritis (IPA)
Typ 1: unkomplizierte IPA
Typ 2: reaktive Arthritis (assoziiert mit extraartikulären Entzündungen bzw. Infektionen: z.B.
Endokarditis, Pyometra, Pneumonie, Rhinitis, Pleuritis)
Typ 3: enteropathische Arthritis (assoziiert mit gastrointestinalen Erkrankungen)
Typ 4: tumorassoziiert (z.B. Mammakarzinom, Plattenepithelkarzinom)
Systemischer Lupus erythematodes
Polyarthritis-Polymyositis-Syndrom
Polyarthritis-Meningitis-Syndrom
Lymphoplasmazelluläre Gonitis
Panarteriitis nodosa
Arzneimittelinduzierte Arthritis
Polyarthritis als Impfreaktion
Literaturübersicht
16
Tabelle 2
KRITERIEN für die Diagnose der rheumatoiden Arthritis beim Hund nach PERSON et al.
(1991)
1. Schmerzen und Probleme beim Aufstehen
2. Symmetrische Deformationen an den distalen Gelenken der Gliedmassen
3. Periartikuläre Weichteilschwellung
4. Bewegungsschmerz an mindestens einem Gelenk
5. Arthritis seit mindestens 3 Monaten
6. Entzündlich veränderte Synovia
7. Typische radiologische Gelenkveränderungen der betroffenen Gelenke
8. Serologischer Nachweis von Rheumafaktoren
9. Charakteristische Veränderungen an der Synovialis
10. Extraartikuläre Symptome (Tendovaginitis, Lymphadenopathie)
2.3.3 Pathogenese der rheumatoiden Arthritis
Die Pathogenese ist bei allen immunbedingten Arthritiden ungeachtet des Arthritistyps
ähnlich und durch Immunkomplexablagerungen in den Gelenken gekennzeichnet. Bei der
Bildung von Immunkomplexen aus IgG- Antikörpern und einem bisher unbekannten Antigen
entsteht im Sinne einer sterischen Konfigurationsänderung eine „Alteration“ am
Immunglobulinmolekül. Das alterierte IgG wird als körperfremd empfunden und der
Organismus reagiert mit der Bildung von Autoantikörpern, welche gegen den Fc- Teil des
IgG- Moleküls gerichtet sind. Diese sogenannten Rheumafaktoren entdeckten WAALER
(1940) und ROSE (1948) unabhängig voneinander. Die so gebildeten Komplexe haben eine
Aktivierung des Komplementsystems zufolge und eine Bildung von leukotaktischen Faktoren.
Zahlreiche Leukozyten dringen in das Gelenk ein und phagozytieren die Immunkomplexe.
Literaturübersicht
17
Lysosomale Enzyme, welche von neutrophilen Granulozyten stammen, verursachen eine
Knorpelschädigung. Die dadurch zerstörten Knorpelzellen setzen proteolytische Enzyme frei,
welche den ganzen Prozess in Gang halten. Versteckte Knorpelantigene, welche durch die
Zerstörung der Zellen freigelegt werden, können eine Autoimmunantwort in die Wege leiten.
Der antigene Stimulus im Gelenk, der den geschilderten Ablauf einleitet, bleibt unentdeckt
(NEWTON et al. 1976; LEWIS 1994; SCHWALBACH et al. 1993 a). Rheumafaktoren
können jedoch bei jedem chronisch-entzündlichen Prozess mit konstanten AntigenAntikörper- Reaktionen vorkommen; deshalb gelten sie zwar als charakteristisch für die
rheumatoide Arthritis, aber nicht als spezifisch. NEWTON et al. (1976) wiesen bei 70% der
erkrankten Tiere, aber auch bei 7% der gesunden Hunde Rheumafaktoren nach. Ein positives
Testergebnis sichert die Diagnose einer rheumatoiden Arthritis ebensowenig, wie ein
negatives Testergebnis diese ausschließt (PERSON et al. 1991). Im Gegensatz zum
Menschen, bei dem die IgM- Rheumafaktoren überwiegen, gehören beim Hund viele der
Rheumafaktoren der IgG- Klasse an (HALLIWELL et al. 1989).
2.3.4 Pathologie und Pathohistologie bei der rheumatoiden Arthritis
Die pathologisch-anatomischen Gelenkveränderungen können in eine reversible exsudativproliferative Synovialitis und eine anschließende irreversible Zerstörung gelenknaher
Knorpel- und Knochenstrukturen unterteilt werden (WOLLENHAUPT u. ZEIDLER, 1993).
Makroskopisch erscheint die Synovialis in frühen Stadien zottenförmig proliferiert.
Histologisch besteht eine Hyperplasie und Hypertrophie der Synovialdeckzellen. Im
oberflächlich und tiefer gelegenen subsynovialen Gewebe befinden sich diffuse und auch
fokale Zellinfiltrate aus teilweise hämosiderinspeichernden Makrophagen, Plasmazellen,
Lymphozyten und einigen neutrophilen Granulozyten. Gelegentlich sind kleine perivaskuläre
lymphozytäre Aggregate vorhanden, jedoch keine lymphoiden Follikel. Die Infiltration mit
Entzündungszellen ist oft assoziiert mit einer Hypervaskularität, einem Ödem, Hämosiderin
und prominenten Fibroblasten (PEDERSEN et al. 1976; HEWICKER-TRAUTWEIN et al.
1999) Die große Anzahl von Lymphozyten und Plasmazellen weist auf die Anwesenheit eines
lokalen antigenen Stimulus und einer Typ IV- Überempfindlichkeitsreaktion hin
(PEDERSEN et al. 2000). Die Oberfläche der Synovialmembran kann mit Fibrin bedeckt
Literaturübersicht
18
sein. In späteren Stadien bildet sich ein gefäßreiches Granulationsgewebe, der sogenannte
Pannus. Der Pannus besteht vorwiegend aus proliferierenden Synoviozyten, Lymphozyten,
Plasmazellen und neutrophilen Granulozyten. Dieser schiebt sich zungenförmig über die
Knorpeloberfäche und auch unter dem Gelenkknorpel in Richtung auf den Markraum vor. Der
„Zangeneffekt“ des Pannus führt zu einer Mikrohöhlenbildung des Knochens, Verlust von
Gelenkknorpel und eventuell einer Fibrose, welche einhergeht mit Gelenksdeformation
(LEWIS 1994). Die Aufnahme von IgG- Rheumafaktoren- Immunkomplexen durch Typ ASynoviozyten führt zur Aktivierung und Proliferation dieser Zellen. Solche aktivierten
Synoviozyten setzen Enzyme und Mediatoren frei. Diese führen zusammen mit dem Einfluss
von Lymphozyten, Monozyten und neutrophilen Granulozyten zu einer Zerstörung von
Knochen und Knorpel. Eine tragende Rolle bei der Zerstörung spielen dabei vor allem
Interleukin- 1, Kollagenasen und Peptidasen, welche von aktivierten Synoviozyten stammen.
Auch Prostaglandin E2, welches von aktivierten Synoviozyten und Leukozyten stammt,
übernimmt durch Osteoklastenaktivierung eine wichtige Rolle in der Gewebezerstörung. Eine
intra- und periartikuläre Fibrose ist letztendlich der Prozess, der zur Deformation und
Subluxationen führt, welche für eine chronisch rheumatoide Arthritis charakteristisch sind
(LEWIS 1994).
2.3.5 Immunhistochemie der rheumatoiden Arthritis
Bei den Fällen mit chronischer Polyarthritis stellen die T-Lymphozyten die dominierende
Zellart dar, während die Beteiligung von Plasmazellen bei unter 25% liegt (LEMBURG et al.
2004; HEWICKER-TRAUTWEIN et al. 1999). Es handelt sich dabei mehrheitlich um
perivaskulär verteilte CD4- und CD5- positive Zellen. In der kaninen rheumatoid veränderten
Synovialis findet sich eine starke Immunglobulinreaktivität in Form vieler IgG- positiver
Zellen und nur weniger IgA- positiver Zellen (MAY et al. 1992; LEMBURG et al. 2004). Das
Vorliegen von sogenannten Lymphfollikel- ähnlichen Aggregaten im Synovialgewebe von
Hunden mit rheumatoider Arthritis (MAY et al. 1992) konnte in den Untersuchungen von
LEMBURG et al. (2004) nicht bestätigt werden. HEWICKER-TRAUTWEIN et al. (1999)
stellten neben einer großen Zahl von perivaskulären CD4- positiven Zellakkumulationen die
Anwesenheit vieler MHC II- positiver Zellen mit dendritischer Morphologie und
Literaturübersicht
19
Makrophagen sowohl in der Synovialdeckzellschicht als auch subsynovial fest. Diese
Ergebnisse könnten, wie bei humaner rheumatoider Arthritis dafür sprechen, dass die CD4positiven T-Zellen, die Makrophagen und die dendritischen Zellen, welche MHC II
exprimieren, auf eine kontinuierliche Präsentation eines unbekannten Antigens zu den
Lymphozyten hindeuten. Dendritische Zellen und Makrophagen gelten bei der rheumatoiden
Arthritis des Menschen als die hauptsächlich vorherrschenden Antigen-präsentierenden Zellen
(KNIGHT 1988) Mittels immunfluoreszenzmikroskopischer Doppelmarkierung konnten
LEMBURG et al. (2004) zeigen, dass in der Synovialmembran von Hunden mit rheumatoider
Arthritis die Zellen mit dendritischer Gestalt sowohl MHC II- als auch CD1c- Antigene
exprimieren und dabei in direkter Nachbarschaft zu lymphozytären Zellen zu finden sind;
hierbei handelt es sich wahrscheinlich um ausgereifte dendritische Zellen.
2.3.6 Das Polyarthritis-Polymyositis-Syndrom
Das Polyarthritis-Polymyositis-Syndrom ist eine sehr seltene Erkrankung, welche durch eine
bilaterale nicht-erosive Polyarthritis und eine Polymyositis gekennzeichnet ist. Die Ätiologie
ist bisher unbekannt. Es existieren nur sehr wenige Studien über diese Erkrankung. Eine
dieser Studien belegt das gehäufte Vorkommen bei Spaniel Rassen (BENNETT u. KELLY
1987) Um die Diagnose Polyarthritis-Polymyositis-Syndrom zu stellen, müssen außer der
Anwesenheit einer nicht-erosiven symmetrischen entzündlichen Polyarthropathie und einer
entzündlichen
Polymyopathie
mit
symmetrischer
Muskelatrophie,
Myalgie
und
Muskelkontrakturen ähnliche Erkrankungen wie die rheumatoide Arthritis, der Systemische
Lupus erythematodes und die subakute bakterielle Endokarditis ausgeschlossen werden
(BENNETT u. KELLY 1987). Die histopathologischen Merkmale in der Synovialmembran
sind eine Fibrinexsudation, eine villöse Proliferation und ein aus Plasmazellen, Makrophagen,
Lymphozyten und neutrophilen Granulozyten bestehendes Entzündungszellinfiltrat. Auch im
Endo- und auch teilweise im Perimysium besteht das Entzündungszellinfiltrat vorwiegend aus
neutrophilen Granulozyten und Makrophagen und fokal aus Aggregaten von Lymphozyten
und Plasmazellen. Die histopathologischen Ergebnisse lassen vermuten, dass es sich bei dem
Polyarthritis-Polymyositis-Syndrom um ein immunvermitteltes Geschehen handelt. Gestützt
wird diese Vermutung durch ein positives Ansprechen auf eine immunsuppressive Therapie
Literaturübersicht
20
bei einem Teil der Patienten. Wahrscheinlich spielen auch hier sich ablagernde
Immunkomplexe und Enzyme, welche durch neutrophile Granulozyten freigesetzt wurden,
eine
wichtige
Rolle
in
der
Pathogenese
des
Polyarthritis-Polymyositis-Syndroms
(HEWICKER-TRAUTWEIN et al. 2008).
2.4 Zyklus der Zellproliferation
Der Zyklus der Zellproliferation ist in 2 Phasen gegliedert. Nach der Mitose kommt die Zelle
in die Interphase. Die Interphase wird in die G 1-, S-, und G 2- Phase unterteilt. In der
Präsynthesephase (G 1- Phase), welche im Anschluss an die Mitose erfolgt, wächst die Zelle,
Zellbestandteile wie das Zytoplasma und Zellorganellen werden ergänzt. Die Zentriolen teilen
sich. Jetzt erfolgt die Proteinbiosynthese. Diese Phase dauert im Durchschnitt 3 Stunden. In
der G 1- Phase liegt ein Satz von Chromosomen mit einem Chromatid vor. Danach findet die
Synthesephase (S- Phase) statt, in welcher sich die DNA redupliziert und die Histone
produziert werden. Danach hat jedes Chromosom 2 Chromatiden. Diese Phase dauert circa 7
Stunden. Im Anschluss folgt die G 2- Phase, auch Postsynthesephase genannt, in der sich die
Zell-Zell-Kontakte lösen und die Zelle sich abrundet und vergrößert. Es werden verstärkt
RNA-Moleküle und zellteilungsspezifische Proteine synthetisiert, um die nachfolgende
Zellteilung vorzubereiten. Die mittlere Dauer beträgt 3 bis 4 Stunden (ALBERTS et al. 2005;
LIEBICH 2004) Die Mitosephase wird in Pro-, Meta-, Ana- und Telophase eingeteilt. Hier
findet die Teilung von Chromosomen, Zellkern und Zelle statt (LIEBICH 2004). In der G 0Phase, auch Ruhephase genannt, verbleiben ausdifferenzierte Zellen, wie beispielsweise
Nervenzellen oder Muskelzellen. Zelltypen wie Hepatozyten oder Lymphozyten befinden sich
nach ihrer Ausdifferenzierung für Wochen oder Monate in der G 0- Phase, können dann aber
wieder in die G 1- Phase zurückkehren und sich teilen (ALBERTS et al. 2005).
2.4.1 Ki-67-Protein
Endeckt wurde dieses Protein in der Stadt Kiel, welche mit der Nummer des Originalklons für
dessen Namen steht (SCHOLZEN u. GERDES 2000). Das Ki-67- Antigen, ein menschliches
nukleäres nicht- Histon- Protein, ist streng assoziiert mit Zellproliferation und wird in der
Literaturübersicht
Routinediagnostik
21
der
Pathologie
als
„Proliferationsmarker“
benutzt,
um
die
Wachstumsfraktion von Zellen in menschlichen Tumoren nachzuweisen. In Immunoblots von
Proteinen
proliferierender
Zellen
detektiert
Ki-67
ein
Doppelband
mit
einem
Molekulargewicht von 395 und 345 kD (SCHLÜTER et al. 1993). Nicht nur beim Menschen,
sondern auch bei verschiedenen Säugetierspezies reagieren Antikörper mit Ki-67. Das Ki-67Protein ist während allen aktiven Phasen des Zellzyklus (späte G 1- Phase, S-, G 2- und
Mitosephase) anwesend, jedoch nicht in ruhenden Zellen (G 0) und der frühen G 1- Phase.
Während der Interphase kann das Antigen ausschließlich im Nukleus detektiert werden,
während es in der Mitose auch im Zytoplasma lokalisiert ist. Durch die biologische
Halbwertszeit von 1 Stunde liegt eine ständige Synthese und Degradation vor (SCHOLZEN
u. GERDES 2000).
2.5 Allgemeines über die Apoptose
Die Apoptose oder der programmierte Tod von Zellen ist ein essentieller physiologischer
Prozess, der wie die Proliferation für die Homöostase eines Organismus unabdingbar ist.
Störungen des geordneten Zusammenwirkens von Zellproliferation und Zelltod kann
beispielsweise zur Tumorbildung führen. (ZIMMERMANN et al. 2001; KUMAR et al.
2005). Der programmierte Zelltod wurde 1842 bei der Beobachtung der Ontogenese von
Wirbeltieren zum ersten Mal beschrieben (VOGT 1842). VOGT beobachtete, dass während
der Entwicklung von Amphibien unerwünschte Gewebe (Schwanz, Schwimmhäute) durch
Zelltod gezielt abgebaut werden. Der Begriff Apoptose taucht erstmals in den
Untersuchungen von KERR et al. im Jahre 1972 auf. Die Apoptose spielt eine wichtige Rolle
in der Embryogenese, bei Hormon-abhängigenen Rückbildungen beim Adulten, als
Verteidigungsmechanismus
in
Immunreaktionen,
bei
Zellschäden,
ausgelöst
durch
Tumorerkrankungen oder virale Infektionen oder andere Stimuli wie Hitze, Strahlung oder
Chemikalien. Glukokortikoide können beispielsweise durch Bindung an intrazelluläre
Rezeptoren Apoptose auslösen. Auch ein Entzug von Überlebens-, Wachstumsfaktoren und
Zytokine, die an Oberflächenrezeptoren binden, können Apoptose induzieren. Beim
Alterungsprozess besitzt die Apoptose eine tragende Rolle (KUMAR et al. 2005).
Literaturübersicht
Apoptotische
Zellen
22
sind
durch
spezifische
morphologische
und
biochemische
Veränderungen charakterisiert (ZIMMERMANN et al. 2001) Die morphologischen
Veränderungen beinhalten das Schrumpfen von Zytoplasma und Zellkern. Ausserdem
kondensiert das Chromatin und zerfällt in Fragmente. Des weiteren bilden sich Ausstülpungen
der Plasma- und der Kernmembran, die sich als sogenannte „apoptotic bodies“ abschnüren.
Diese durch sogenanntes „blebbing“ abgeschnürten Vesikel und die geschrumpften Zellkörper
werden dann von phagozytierenden Zellen beseitigt. (ZIMMERMANN et al. 2001; KUMAR
et al. 2005). Ein wichtiges biochemisches Charakteristikum ist unter anderem die durch
internukleosomale Spaltung der DNA entstandene typische „DNA-Leiter“. In der
Elektrophorese isolierter DNA können die DNA- Fragmente als Leitermuster sichtbar
gemacht werden und sind somit unterscheidbar von der unspezifisch umgebauten DNA
nekrotischer Zellen (SARASTE u. PULKKI 2000). In der Zelle werden durch die
obengenannten Stimuli die Caspasen (Cystein Aspartat-spezifische Proteasen) aktiviert. Diese
liegen im Zytoplasma als Proenzyme vor und werden durch 2 spezifische Spaltungen zu voll
funktionsfähigen Proteasen aktiviert. Prototyp der Caspasen ist das Interleukin-1ß converting
enzyme (ICE; Caspase-1), welches verantwortlich ist für die Maturation der Proform von Il1ß zu seiner biologisch aktiven Form. Das ICE oder die Caspase-1 ist homolog zu einem Gen
namens ced-3 in dem Nematoden Caenorhabditis elegans. Bei den Säugetieren sind
insgesamt 14 Gene der Familie der Caspasen bekannt (ZIMMERMANN et al. 2001). Die
Caspasen gelten als evolutionsbiologisch konserviert und kommen beim Menschen, Insekten,
Nematoden und Hydra vor (HENGARTNER 2000). Bei der sogenannten Caspase- Kaskade
aktivieren Initiator-Caspasen (Caspase-2,-8,-9) dabei nachgeschaltete Effektor-Caspasen
(Caspase-3,-6,-7), die dann durch die Spaltung wichtiger Zellproteine den Tod und die
Degradation der Zelle herbeiführen (ZIMMERMANN et al. 2001).
Es existieren 2 Hauptwege der Caspase- Aktivierung. Der sogenannte intrinsische Weg wird
über die Mitochondrien vermittelt (rezeptorunabhängig). Hier kommt es durch noch nicht
genau bekannte Mechanismen zur Freisetzung von Cytochrom c und anderen proapoptotischen Faktoren wie Smac/DIABLO aus den Mitochondrien in das Zytoplasma
(ZIMMERMANN et al. 2001). Dieser Weg kann ausgelöst werden durch TumorSuppressoren, wie beispielsweise p53, einem Transkriptionsfaktor, der durch Schädigung der
DNA aktiviert wird. p53 stimuliert die Expression pro-apoptotisch wirkender Mitglieder der
Literaturübersicht
23
Bcl-2 Familie (z. B. Bax, Bad). Diese führen dann zur Freisetzung der pro-apoptotischen
Faktoren– wie etwa Cytochrom c – aus dem mitochondrialen Intermembranraum. Es wirken
jedoch viele toxische Substanzen wie z.B. Chemotherapeutika auch direkt auf die
Mitochondrien und können so den intrinsischen Weg der Apoptose induzieren. Durch die
Bindung von Cytochrom c und dATP an Apaf-1 (apoptotischer Protease-Aktivierungsfaktor1)
wird
eine
Konformationsänderung
des
Proteins
verursacht.
Durch
diese
Konformationsänderung wird die Proteinbindedomäne CARD (Caspase-RekrutierungsDomäne) von Apaf-1 zugänglich, so dass sie an die CARD Domäne der Procaspase-9 binden
kann. Die Bildung dieses Heterodimers ist eine Voraussetzung für die autolytische
Aktivierung der Caspase-9. Dieser Komplex wird Apoptosom genannt und stellt die aktive
Form der Caspase-9 dar. Analog zu Caspase-8 beim extrinsischen Weg initiiert aktive
Caspase-9 die Caspase-Kaskade. Eine Signalverstärkung dieses Weges wird innerhalb der
Caspase-Kaskade durch Caspase-7 vermittelt, welche nicht nur Substrate spaltet, die an der
Ausführung der Apoptose beteiligt sind, sondern ihrerseits auch die Caspase-9 aktiviert
(ZIMMERMANN et al. 2001; HENGARTNER 2000; KUMAR et al. 2005).
Der extrinsische Weg wird durch Ligandenbindung an einen Todesrezeptor der TNFRezeptorfamilie z.B. Fas (CD95) eingeleitet. Ferner unterscheidet man zwischen aktiver
(durch Aktivierung von Rezeptoren induziert) und passiver (ausgelöst durch Entzug von
Wachstumsfaktoren z. B. Neurotrophine) Apoptose. Die sogenannten Todesrezeptoren
besitzen in ihrem zytoplasmatischen Teil eine Todesdomäne (DD, „death domain“). Liganden
sind zum Beispiel der Tumornekrosefaktor (TNF) oder Fas-Ligand (FasL) und andere
Zytokine. Durch die induzierte Trimerisierung des Rezeptors bilden die Todesdomänen eine
Struktur, an die nun Adaptermoleküle mit eigener Todesdomäne binden können. In einem
ersten Schritt wird das „TNF-Rezeptor assoziierte Protein“ (TRADD) rekrutiert.
Anschließend bindet an die DD des TRADD das „Fas assoziierte Protein mit Todesdomäne“
(FADD). FADD besitzt neben der DD auch eine Todeseffektordomäne (DED, „death effector
domain“), über welche sich die proCaspase-8 mit ihrer DED an den Komplex bindet. Diese
kann sich nun durch die entstandene hohe lokale Konzentration autokatalytisch aktivieren.
Die aktive Caspase-8 löst ihrerseits die Caspase- Kaskade aus, wodurch in einer
signalverstärkenden Rückkopplung weitere Caspase-8-Moleküle aktiviert werden und es
Literaturübersicht
24
letztendlich zu einer Aktivierung der Caspase-3 kommt (HENGARTNER 2000;
ZIMMERMANN et al. 2001; KUMAR et al. 2005).
2.5.1 Caspase-3
Die häufigste Caspase in der Zelle ist die Caspase-3. Die Caspase-3 ist hauptverantwortlich
für die Mehrheit der apoptotischen Effekte, unterstützt wird sie dabei von der Caspase-6 und 7 (ZIMMERMANN et al. 2001). Diese Effektorcaspasen führen zum apoptotischen Tod der
Zelle. Sie aktivieren einerseits sekundäre Zielproteine (z. B. Caspase- aktivierte DNase, CAD,
oder andere Caspasen) durch limitierte Proteolyse. Andererseits sind sie selbst aktiv am
Abbau von Lamin (in der Zellkernmembran) und Actin (Teil des Zytoskeletts) beteiligt. Ein
weiterer
Aspekt
ist
die
caspasevermittelte
Unterdrückung
der
DNA-Reparatur
(HENGARTNER 2000) Die Wege, die zu einer Aktivierung der Caspase-3 führen, können
von der Cytochrom c Freisetzung aus den Mitochondrien und der Caspase-9 Funktion sowohl
abhängig als auch unabhängig sein (PORTER u. JÄNICKE 1999). Caspase-3 ist essentiell für
die normale Gehirnentwicklung. Caspase-3 knock-out Mäuse werden nur wenige Wochen alt.
Interessanterweise sind bei diesen Mäusen die Folgen des Fehlens von programmiertem
Zelltod in Form einer Hyperplasie nur im Gehirn zu sehen, jedoch nicht in den anderen
Organen. Die obengenannten Autoren sehen dies eventuell als Hinweis, dass die Caspase-3
im Zentrum eines essentiellen neuralen Todeswegs liegt (PORTER u. JÄNICKE 1999).
Caspase-3 ist als Vorstufe im Zytoplasma vorhanden und wird durch autoproteolytische
Spaltung oder durch die Spaltung einer oder mehrerer Proteasen in das aktive
heterotetramerische Enzym überführt. Die nicht-aktive Vorstufe der Caspase-3 besteht aus
einer Prodomäne und einer grossen p17- und einer kleinen p12- Untereinheit. Bei der
Aktivierung der Caspase-3 wird die Prodomäne abgespalten und die zwei Untereinheiten
verbinden sich jeweils zu einem Molekül. So entsteht das (p17/p12)2 Tetramer mit einem
Molekulargewicht von 52 kDa (TAWA et al. 2004).
Literaturübersicht
25
2.6 Proliferation und Apoptose in der Synovialmembran und im
Kreuzband
Beim Menschen gibt es vor allen Dingen bei Patienten mit rheumatoider Arthritis oder
Osteoarthritis
mehrere
Untersuchungen
über
die
Proliferationsaktivität
von
Entzündungszellen wie B- und T-Lymphozyten und der Synovialdeckzellen in der
Synovialmembran.
Bei
Hunden
mit
Synovialitiden
liegen
bisher
keine
Erkenntnisse
über
die
Proliferationsaktivität von B- und T-Lymphozyten vor und ebenso nicht über die
Proliferationsaktivität der Synovialdeckzellen. Die Apoptose wurde bisher beim Hund nur im
Kreuzband untersucht und nicht in der Synovialmembran.
2.6.1 Proliferation der B-Lymphozyten in der Synovialmembran bei der
Osteoarthritis und der rheumatoiden Arthritis des Menschen
Plasmazellen und B-Lymphozyten bilden bei der rheumatoiden Arthritis des Menschen eine
konstante und dominierende Komponente des Entzündungszellinfiltrates (MAGALHĂES et
al. 2002). In einer immunhistochemischen Analyse über proliferierende und Antigenpräsentierende Zellen in der Synovialmembran bei Menschen mit rheumatoider Arthritis
zeigten KRENN et al. (1996), dass proliferierende B-Zellen in Sekundärfollikeln, in kleinen
follikulären Aggregaten mit dendritischen Retikulumzellen und nahe der synovialen Intima
vorhanden sind. Auffallend war dabei, dass die B- und T-Lymphozytenproliferation in
Anwesenheit von follikulären dendritischen Retikulumzellen und interdigitierenden
dendritischen Zellen geschieht. Die Autoren stellten die Vermutung an, dass die
Synovialmembran als Ort für Antigen- abhängige Proliferation und Maturation von B-und TLymphozyten fungieren könnte. In den vergangenen Jahren zeigte sich, dass in der
Synovialmembran bei 10-23% der Fälle mit rheumatoider Arthritis lymphatische Follikel mit
sogenannten Keimzentren vorhanden sind und dass B-Lymphozyten in der Lage sind, eine
lokale Keimzentrumsreaktion zu begehen. Dabei werden in der Synovialmembran naive BZellen von einem unbekannten Antigen aktiviert und differenzieren sich lokal in Plasmazellen
(KIM et al. 1999; MAGALHĂES et al. 2002).
Literaturübersicht
26
Die Osteoarthritis ist im Gegensatz zur rheumatoiden Arthritis durch eine nicht follikuläre
Entzündungsinfiltration und eine charakteristische Anordnung von Lymphozyten und
Plasmazellen gekennzeichnet. Gegenstand der Untersuchungen von KRENN et al. (1999) war
die Klärung der Frage, ob die Akkumulationen von Plasmazellen und B-Lymphozyten auf
lokaler Proliferation oder auf einer hämatogenen Einwanderung bereits aktivierter Zellen
basieren. Die Autoren demonstrierten hochgradig mutierte VH Gene- von B-Lymphozyten aus
der Synovialmembran von Patienten mit Osteoarthritis. Antigen-aktivierte B-Lymphozyten
gehen mit einer somatischen Hypermutation der VH Gene einher. Die somatische Mutation
der VH Gene erfordert eine Keimzentrumsreaktion wie zum Beispiel in Lymphknoten, jedoch
sind bei der Osteoarthritis in der Synovialmembran keine Keimzentrum-ähnlichen Strukturen
vorhanden. KRENN et al. (1999) zeigten zwei charakteristische Anordnungen der BLymphozyten auf. Zum einen wurden perivaskulär lokalisierte CD20 B- und CD4- und CD8T-Lymphozyten von vorwiegend IgG- positiven Plasmazellen umgeben. In diesen Aggregaten
waren sehr wenige proliferierende Zellen und gar keine follikulären dendritischen Zellen
vorhanden. Zum anderen wurden Plasmazellen in der Nähe von Blutgefässen lokalisiert.
Aufgrund der nachgewiesenen hochgradig mutierten VH- Gene der B-Lymphozyten, der
geringen Proliferationsaktivität in den lymphatischen Aggregaten und zugleich der
charakteristischen Anordnung von B-Lymphozyten und Plasmazellen vermuten die Autoren,
dass Aktivierung und Proliferation der Lymphozyten an einem anderen Ort als der
Synovialmembran stattfindet und diese anschließend hämatogen in die Synovialmembran
immigrieren und sich ohne weitere Proliferation direkt zu Plasmazellen differenzieren
(KRENN et al. 1999). MAGALHĂES et al. (2002) unterscheiden eine Keimzentumsreaktion
(maturativer Typ) von einer Nicht-Keimzentrumsreaktion (akkumulativer Typ) in der
Synovialmembran. Die synovialen Keimzentren werden auch als ektopische lymphatische
Follikel bezeichnet. Dabei gilt der maturative Typ als charakteristisch für die rheumatoide
Arthritis, der akkumulative Typ kommt sowohl bei der rheumatoiden Arthritis als auch bei
der Osteoarthritis vor.
Literaturübersicht
27
2.6.2 Proliferation von T-Lymphozyten in der Synovialmembran bei der
rheumatoiden Arthritis des Menschen
KRENN et al. (1996) zeigten in einer immunhistochemischen Analyse über proliferierende
und Antigen-präsentierende Zellen bei der rheumatoiden Arthritis des Menschen, dass
proliferierende T-Zellen in T-Lymphozyten- Aggregaten, perivaskulär und sowohl in als auch
nahe der Synovialdeckzellschicht vorhanden sind. Dabei vermuteten die Autoren, dass die
perivaskuläre Region bei der rheumatoiden Arthritis möglicherweise den Ort der TLymphozytenaktivierung darstellen könnte. Die Tatsache, dass proliferierende TLymphozyten in und nahe der Synovialdeckzellschicht vorhanden sind, weist nach Meinung
der Autoren auf eine Beziehung zwischen Synovialdeckzellen und T-Lymphozyten hin. Da
Synovialdeckzellen charakteristische Eigenschaften von Antigen- präsentierenden Zellen
aufweisen, könnte durch die Produktion von Zytokinen eine lokale Proliferation von den in
die synoviale Intima einwandernden T-Lymphozyten hervorgerufen werden. Außerdem
wiesen die Autoren eine deutliche Korrelation zwischen dem Auftreten proliferierender TLymphozyten und der Anzahl von Antigen- präsentierenden Zellen (interdigitierende
dendritische Retikulumzellen) nach. SCHASER et al. (1996) demonstrierten, dass T-Zellen
von Patienten mit rheumatoider Arthritis kaum Proliferationsaktivität zeigen.
2.6.3 Apoptose von synovialen T- und B-Lymphozyten beim Menschen
Apoptose und auch die Proliferation sind assoziiert mit der Homöostase im Gewebe oder im
Immunsystem, genauso wie mit der Pathophysiologie von Autoimmunerkrankungen wie zum
Beispiel der rheumatoiden Arthritis. Rheumatoide synoviale T-Zellen sind hoch empfänglich
für anti-Fas monoklonale Antikörper (mAB). Dabei sind CD3+, CD4+ und CD45RO+ T-Zellen
hoch sensitiv gegen anti-Fas mAB. Fas gehört zu der TNF- Todesrezeptorfamilie des
extrinsischen Weges der Apoptose. Im Gegensatz dazu gehen bei der Osteoarthrose die
synovialen T-Zellen keine Apoptose durch die Fas-Bindung ein (HASUNUMA et al. 1998).
Bei der rheumatoiden Arthritis des Menschen zeigten SUGIYAMA et al. (1996), dass bcl-2,
ein Inhibitor der Apoptose, hauptsächlich in follikulär angeordneten Lymphozyten auffindbar
ist. Der Phänotyp der Lymphozyten wurde von den Autoren nicht identifiziert. In keinem
ihrer Fälle konnten die Autoren Apoptose bei den infiltrierten Lymphozyten nachweisen.
Literaturübersicht
28
Synoviale Zellen, welche das Protein bcl-2 exprimieren, sind resistent gegenüber dem
Mechanismus der Apoptose. SCHIRMER et al. (1998) zeigten, dass bei Patienten mit
rheumatoider Arthritis CD4+CD28- T-Zellen in der Synovialmembran verstärkt bcl-2
exprimieren. Eine frühere Studie von EDWARDS u. CAMBRIDGE (1995) stellten die
Hypothese auf, dass das Ausbleiben der Apoptose bei B-Zellen ein wichtiger Faktor in der
Pathogenese der rheumatoiden Arthritis ist.
2.6.4 Proliferation und Apoptose von Synovialdeckzellen
Die synoviale Proliferation kann durch proinflammatorische Zytokine wie IL-1ß, IL-6 und
TNF-α induziert werden. HASUNUMA et al. (1998) vermuteten, dass TNF-α auf autokrinem
Weg in den Synovialdeckzellen produziert wird. TNF-α wiederum induziert die Bildung von
Interleukin-6. Zellklone von rheumatoiden Synoviozyten, welche für lange Zeit kultiviert
werden, produzieren spontan IL-1, welches grossen Einfluss auf die synoviale Proliferation
hat (GOTO et al. 1987). Eine neuere Studie von KLOCKE et al. (2005) zeigte, dass die
Dichte von synovialen Makrophagen signifikant assoziiert ist mit dem Schweregrad der
Osteoarthritis bei Hunden und zudem mit der Häufigkeit des Vorkommens von Interleukin-6
und TNF-α. Die Autoren stellen damit die bisher übliche Meinung über die Herkunft von Il-6
und TNF-α aus den Synovialdeckzellen in Frage und vermuten als Quelle dieser
proinflammatorischen Zytokine die synovialen Makrophagen.
Inwieweit die synoviale Hyperplasie bei der rheumatoiden Arthritis des Menschen vorrangig
durch ein Rekruitment von Zellen des mononukleären Phagozytensystems entsteht oder auch
Folge lokaler Proliferationsvorgänge von synovialen Deckzellen ist, bleibt Gegenstand
kontroverser Diskussion (SCHASER et al. 1996). SCHASER et al. (1996) zeigten, dass im
Vergleich zum Synovialsarkom die Zahl der proliferierenden Synovialdeckzellen sowohl bei
Patienten mit Osteoarthritis als auch bei Patienten mit rheumatoider Arthritis niedrig ist. Aus
den Ergebnissen schlossen die Autoren, dass der Hyperplasie in der Synovialmembran der
rheumatoiden Arthritis eher ein Rekruitment von Zellen aus dem Blut, als eine signifikante
lokale Proliferation von Synovialdeckzellen zugrundeliegt. Dieser Meinung schließen sich
KRENN et al. (1996) an, die bei der rheumatoiden Arthritis des Menschen auch nur eine
Literaturübersicht
29
geringe Proliferationsaktivität der Synovialdeckzellen nachweisen können. Auch das Ergebnis
von KINNE et al (1993) zeigte, dass die Synovialdeckzellen zwar stark positiv für die als
Aktivierungsmarker geltenden Protoonkogene c-fos und jun-b sind, aber nur zu 1% das Ki67- Antigen coexprimieren. Einige Studien weisen eine Mutation des p53- TumorsuppressorProteins in Synoviozyten bei der rheumatoiden Arthritis nach (FIRESTEIN et al. 1997;
REME et al. 1998; AUPPERLE et al. 1998). Das Fehlen oder eine Mutation des p53Tumorsuppressor- Proteins ist mit Neoplasien und Zelltransformationen verknüpft. Die
genannten Autoren vermuten, dass die Mutation des p53- Proteins zu einer überschießenden
Proliferationsaktivität in den Synoviozyten führt und letztendlich zur Gelenkszerstörung. In
einer Studie von KAMIMOTO et al. (2003) wird die Proliferationsaktivität von
Synovialdeckzellen bei Ratten in situ im Adjuvans-Arthritis Modell demonstriert. Es stellte
sich heraus, dass jeweils beide Synovialdeckzelltypen zu einem bestimmten Zeitpunkt
proliferieren. Dabei sind die Typ B- Zellen die ersten, welche in der tiefen
Synovialdeckzellschicht
eine
Proliferationsaktivität
zeigen,
während
die
Proliferationsaktivität der Typ A- Zellen während des Entzündungsprozesses in der
oberflächlichen Synovialdeckzellschicht ansteigt. Die Autoren vermuten, dass die synoviale
Hyperplasie ihren Ursprung in proliferierenden Synovialdeckzellen und/oder einwandernden
Stammzellen haben kann.
Eine ausbleibende Aktivierung der Apoptose stellt einen wichtigen Teil der Mechanismen
dar, welche letztendlich zur Progression einer Vielzahl von Erkrankungen wie Krebs,
Autoimmunerkrankungen und degenerativen Erkrankungen führen. Eine Dysregulation des
apoptotischen Prozesses könnte auch eine wichtige Rolle in der Pathogenese der
rheumatoiden Arthritis spielen. Ein Ausbleiben der Apoptose könnte eine abnormale
Proliferation initiieren (SUGIYAMA et al. 1996). SUGIYAMA et al. (1996) wiesen bei
Patienten mit rheumatoider Arthritis nach, dass Synovialdeckzellen zusätzlich zu einer
Proliferationsaktivität auch eine Apoptose in niedriger Frequenz zeigen. Dabei vermuten die
Autoren, dass der apoptotische Prozess durch eine Überexprimierung von Bcl-2, einem
Inhibitor der Apoptose, unterdrückt wird. In einer immunhistochemischen Analyse von
PERLMAN et al. (2000) stellte sich heraus, dass die bcl-2- Expression bei Patienten mit
rheumatoider Arthritis in der Synovialmembran höher ist als bei Patienten mit Osteoarthritis.
Dabei waren hauptsächlich Fibroblasten-ähnliche Deckzellen positiv; die Dicke der
Literaturübersicht
30
Synovialdeckzellschicht und die Entzündung waren positiv korreliert mit der Anzahl der bcl2- positiven Zellen. Die Autoren vermuten, dass bcl-2 die Apoptose bei Fibroblastenähnlichen Deckzellen unterdrückt und letztendlich zu einer Synovialdeckzellhyperplasie führt.
HASANUMA et al. (1998) demonstrierten, dass die Apoptose bei rheumatoiden
Synoviozyten von dem Rezeptor Fas abhängig und charakteristisch für die rheumatoide
Arthritis ist und nicht bei der Osteoarthritis vorkommt.
2.6.5 Apoptose im Kreuzband von Hunden
Über die Apoptose im Kreuzband existieren nur sehr wenige Studien; diese haben
hauptsächlich das kanine Kreuzband zum Gegenstand ihrer Untersuchungen. VASSEUR et al.
(1985) zeigten, dass das rupturierte kanine Kreuzband im Kern ein Defizit an Fibroblasten
aufweist. Als Hintergrund dessen vermuten die Autoren einen erhöhten Zelltod im
Kreuzband. Eine Studie von HAYASHI et al. (2003) demonstrierte eine hohe Anzahl nicht
lebensfähiger Zellen im kaninen rupturierten Kreuzband, jedoch war dabei die Anzahl
apoptotischer Zellen nicht hoch. Aus diesem Grunde vermuteten die Autoren die Nekrose als
Hauptart des Zelltodes der Fibroblasten. Hypoxie, verursacht durch ein Trauma des
Kreuzbandes, soll letztendlich zur Nekrose der Fibroblasten führen. GYGER et al. (2006)
untersuchten in ihrer Studie die Verteilung von apoptotischen Zellen in normalen und in
rupturierten kaninen Kreuzbändern. Dabei stellte sich heraus, dass Apoptose sowohl im
gesunden kaninen Kreuzband als auch im rupturierten kaninen Kreuzband vorhanden ist,
jedoch die Anzahl apoptotischer Zellen im rupturierten Band wesentlich höher ist. Die
Autoren gehen konform mit HAYASHI et al. (2003) in der Meinung, dass die Nekrose die
Hauptform des Zelltodes nach einer Ruptur darstellt. Vor einer Ruptur könnte die Apoptose
möglicherweise eine tragende Rolle hinsichtlich einer erhöhten Matrix- Degeneration im
Band spielen und letztendlich ursächlich für eine Ruptur sein. Um festzustellen, ob Apoptose
im kaninen Kreuzband eine Rolle vor der Ruptur oder nach der Ruptur spielt, untersuchten
KRAYER et al. (2008) Hunde mit partieller Kreuzbandruptur. Besonderes Augenmerk galt
dabei dem intakten Teil des partiell rupturierten Kreuzbandes, welches ebenso wie der
rupturierte Teil eine hohe Anzahl apoptotischer Zellen zeigte. Die Autoren schlossen daraus,
dass Apoptose nicht die Konsequenz eines akuten Traumas des Bandes ist, sondern vorher im
Literaturübersicht
31
Band existiert. Die Apoptose könnte somit eine Rolle in der Pathogenese des Kreuzbandrisses
des Hundes spielen.
2.6.6 Apoptose bei der Osteoarthrose
Die Apoptose ist bei der Osteoarthrose sowohl beim Menschen als auch beim Hund ein
Mechanismus des Zelltodes von Chondrozyten (BOILEAU et al. 2002; CHEN et al. 2005). In
einem
Kreuzband
Transsektionsmodell
bei
Kaninchen
konnte
erfolgreich
eine
Knorpeldegeneration mit einem Caspase- Inhibitor verhindert werden (D`LIMA et al. 2001).
Material und Methoden
33
3 Material und Methoden
3.1 Untersuchungsmaterial
Zur Untersuchung lagen formalinfixierte und paraffineingebettete Synovialisproben aus dem
Kniegelenk von insgesamt 37 Hunden unterschiedlicher Rassen im Alter von 4 Monaten bis
vierzehn Jahren vor. Tier- und Einsendungs- oder Sektionsfallnummer, Alter, Geschlecht,
Rasse und Erkrankungs- bzw. Todesursache der Tiere sind im Anhang unter 9.1 aufgelistet.
Das gesamte Tiermaterial wurde in fünf Gruppen eingeteilt. Diese bestehen aus der
Vergleichstiergruppe, den Kreuzbandrissgruppen 1 bis 3 mit jeweils unterschiedlichem
Entzündungsgrad der Synovialis (KBR-Gruppen) und den Hunden mit Polyarthritis (Gruppe
4).
3.1.1 Vergleichstiere
Die 8 Vergleichstiere stammen aus dem Sektionsgut des Instituts für Pathologie der Stiftung
Tierärztliche Hochschule Hannover und waren zur diagnostischen Sektion eingesandt worden.
Die Vergleichstiere wiesen vorberichtlich und bei der Sektion keinerlei Erkrankungen des
Bewegungsapparates auf. Das Durchschnittsalter der Vergleichstiergruppe betrug 4,9 Jahre
und das Durchschnittsgewicht lag bei 34,3 kg.
3.1.2 Hunde mit Kreuzbandriss und Synovialitis (Gruppe 1 bis 3)
In die KBR-Gruppe 1 wurden zehn Hunde mit Kreuzbandriss und geringgradiger
Synovialitis eingruppiert. 2 Synovialisproben dieser Tiere wurden aus der Tierklinik Greven
zur Verfügung gestellt (Nr. 9, 14), die restlichen 8 Synovialisproben stammen aus der Klinik
für Kleintiere der Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover. Alle Synovialisproben wurden
im Rahmen einer Kreuzbandrissoperation entnommen. Die Tiere waren im Durchschnitt 5,7
Jahre alt und 33,4 kg schwer. Bei 8 Tieren war das linke Knie betroffen und bei 2 Tieren die
rechte Seite. Bei einem Geschlechterverhältnis von 1:1 handelt es sich um 5 Hündinnen
(davon eine kastriert) und 5 Rüden (davon vier kastriert).
Die KBR-Gruppe 2 besteht aus 5 Hunden mit Kreuzbandriss und mittelgradiger Synovialitis.
Eine Synovialisprobe war von extern eingesandt worden (Nr.19), die übrigen Proben wurden
Material und Methoden
34
im Rahmen einer Kreuzbandrissoperation in der Klinik für Kleintiere der Stiftung
Tierärztliche Hochschule Hannover entnommen. Das Durchschnittsalter und -gewicht der
Hunde lag bei 5 Jahren und 38,5 kg. Bei 3 Tieren wurde der Kreuzbandriss auf der linken
Seite diagnostiziert und bei 2 Tieren auf der rechten Seite. In dieser Gruppe überwog der
Anteil der Rüden, wobei 2 von den 3 Rüden und die beiden Hündinnen kastriert waren.
Die KBR-Gruppe 3 setzt sich aus 8 Hunden mit Kreuzbandriss und hochgradiger
Synovialitis zusammen. 3 Synovialisproben stammen aus der Kleintierklinik Greven (Nr. 25,
26, 27), die übrigen Synovialisproben stammen aus der Klinik für Kleintiere der Stiftung
Tierärztliche Hochschule Hannover. Durchschnittlich waren diese Tiere 5,7 Jahre alt und 44,6
kg schwer. Bei 5 von 8 Tieren lag der Kreuzbandriss auf der linken Seite vor. 5 der Tiere
waren Rüden (davon einer kastriert) und 3 Hündinnen.
Von den insgesamt 23 Tieren mit Kreuzbandriss und Synovialitis unterschiedlichen Grades
war bei 16 Tieren die linke Knieseite betroffen und bei 7 Tieren die rechte Seite. Angaben
über einen partiellen oder totalen Kreuzbandriss fehlen, ebenso Hinweise über einen
zusätzlichen Meniskusschaden. 13 Rüden standen 10 Hündinnen gegenüber. Mehr als die
Hälfte der Rüden (7 von 13) war kastriert, bei den Hündinnen waren bei 3 von 10 Tieren die
Keimdrüsen entfernt worden. Das Durchschnittsgewicht aller Gruppen mit Kreuzbandriss
betrug 38,8 kg und die Tiere waren durchschnittlich 5,5 Jahre alt.
3.1.3 Hunde mit Polyarthritis
Gruppe 4 besteht aus 6 Hunden, bei denen aufgrund klinischer und histopathologischer
Befunde eine Polyarthritis diagnostiziert worden war. 2 Fälle mit chronischer rheumatoider
Arthritis stammen aus dem Small Animal Hospital, Faculty of Veterinary Science, University
of Liverpool (Nr. 34, Nr. 36), ein Fall mit Polyarthritis-Polymyositis Syndrom aus der Klinik
für Kleintiere der Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover (Nr. 32). Die übrigen Fälle
waren externe Einsendungen zur diagnostischen Untersuchung an das Institut für Pathologie
der Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover.
Das Durchschnittsalter der Hunde betrug 2,0 Jahre. Ein Durchschnittsgewicht konnte nicht
ermittelt werden, da nur für Nr. 32 eine Angabe von 20,3 kg vorlag. Die Synovialisproben
Material und Methoden
35
wurden in 3 Fällen aus dem rechten Kniegelenk und bei einem Tier aus dem linken
Kniegelenk entnommen. Eine Probenentnahme erfolgte bei einem Tier beidseitig aus den
Kniegelenken (Nr. 32) und bei Nr. 33 aus der Schulter. 4 Tiere der Gruppe waren weiblich
(davon eine Hündin kastriert) und 2 Tiere männlich.
3.2 Gewinnung und Aufarbeitung der Gewebeproben für die
histologischen und immunhistochemischen Untersuchungen
Die Probenentnahme bei den Vergleichstieren wurde in gleicher Weise wie die
Probenentnahme bei den Kreuzbandrissoperationen in der Klinik für Kleintiere der Stiftung
Tierärztliche Hochschule Hannover und der Kleintierklinik Greven vorgenommen. Der
Zugang zum Kniegelenk erfogte von lateral. Die Proben wurden aus einem proximal der
Patella gelegenen Rezessus entnommen. Über die Art und Weise der Probenentnahme bei der
Gruppe der Hunde mit Polyarthritis fehlen Angaben. Die Synovialisproben wurden 24
Stunden in neutralem, gepufferten 4%igen Formalin fixiert. Die formalinfixierten Proben
wurden in Paraplast Plus (Fa. Shandon, Frankfurt) eingebettet. Nach einer dreistündigen
Spülung in Leitungswasser wurden die Proben in einer aufsteigenden Alkoholreihe dehydriert
(70%, 80% und 96% Ethanol, 100% Isopropylalkohol) und nach zwei Bädern in Essigsäuren-Butylester
als
Intermedium
eingebettet.
Die
Paraplast-Blöcke
wurden
bei
Zimmertemperatur und in Dunkelheit gelagert. Auf einem Rotationsmikrotom wurden 1µm
dünne Paraffinschnitte angefertigt. Diese Schnitte wurden in einem Wasserbad bei 40°C
gestreckt und auf Superfrost Plus Objektträger aufgezogen. Die anschliessende Trocknung
erfolgte für 60 Min. in einem Trockenschrank bei 70°C (Fa. Heraeus, Hanau).
3.3 Physikochemische Färbemethoden
3.3.1
Hämatoxylin-Eosin-Übersichtsfärbung
Die Färbung erfolgte automatisiert in einem Färbecenter (Leica ST 4040, Leica Mikrosystems
Nussloch GmbH, Nussloch) nach einem standardisierten Laborprotokoll mit Hämatoxylin und
Eosin.
Material und Methoden
3.4
36
Immunhistochemische Färbemethoden
3.4.1 Einzelfärbungen
3.4.2 ABC-Methode an formalinfixiertem Paraffinmaterial
Zur immunhistochemischen Darstellung der Antigene wurde die Avidin-Biotin-Komplex
Peroxidase- (ABC) Methode angewandt. Der unkonjugierte Primärantikörper bindet sich
spezifisch an das nachzuweisende Antigen. Der Sekundärantikörper, welcher sich an den
ersten Antikörper bindet, ist biotinyliert. Das dritte Reagenz ist der Peroxidase-konjugierte
Avidin-Biotin-Komplex, bei dem die freien Stellen des Avidins und die hohe Affinität zu
Biotin die Bindung an das Biotin des Sekundärantikörpers ermöglichen. Das Enzym
Peroxidase wird mit einem Chromogen sichtbar gemacht und damit gleichzeitig auch das
gesuchte Antigen.
3.4.3 Primäre und sekundäre Antikörper
Alle Primär- und Sekundärantikörper sind kommerziell erhältlich; die benutzten
Verdünnungen der verwendeten Antikörper sind in Tabelle 3 und 4 aufgelistet. Nähere
Angaben zu Herkunft und Herstellern befinden sich am Beginn der jeweiligen Rezepte.
3.4.4 Tertiärer Antikörper
Als tertiärer Antikörper wurden bei Verwendung des DAB-Detektionssystems Peroxidasegekoppelte Avidin-Biotin-Peroxidase-Komplexe (Vector Laboratories, USA; ABC-Standard,
PK-4000 und ABC-Elite, PK-6100) eingesetzt.
Material und Methoden
3.4.5
37
Nachweis des Ki-67- Antigens in der Synovialmembran
Marker für Proliferation:
Monoklonaler Maus- Anti- Mensch- Ki-67- Antigen- Antikörper
Klon MIB-1 (DAKO CYTOMATION, Glostrup, Dänemark)
1.Tag:
1.
Entparaffinierung
der
Schnitte
in
einer
absteigenden
Alkoholreihe:
Essigsäurebutylester (3 x 5 Min.), Isopropylalkohol (5 Min.), 96%iger und 70%iger
Alkohol (jeweils 5 Min.).
2.
30 Min. Hemmung der endogenen Peroxidase in 0,5 % Wasserstoffperoxid
(Merck, Darmstadt).
3.
3 x 5 Min. spülen in PBS-Puffer unter ständigem Rühren auf einem Magnetrührer.
4.
Demaskierung der Antigene 15 Min. in Citratpuffer (Quartett, Berlin) kochend in der
Mikrowelle (Bauknecht, Schorndorf).
5.
3 x 5 Min. spülen in PBS-Puffer unter ständigem Rühren auf einem Magnetrührer.
6.
Objektträger auf Shandon Coverplates™ (Thermo Electron, Dreieich) und in Shandon
Sequenza®-Slide Racks (Thermo Electron, Dreieich) überführen.
7.
Überschichten mit 1:5 verdünntem inaktivierten Ziegen-Normalserum in PBS; 20
Min. Inkubation bei Raumtemperatur.
8.
Erstantikörper: 1:100 in PBS mit 1% bovinem Serumalbumin (BSA, Serva,
Heidelberg) verdünnter
monoklonaler Maus- anti- Mensch- Ki-67- Antigen-
Antikörper (DakoCytomation, Glostrup, Dänemark); Inkubation über Nacht bei 4°
C im Kühlschrank.
2.Tag:
9.
3 x 5 Min. spülen in PBS-Puffer mit 0,05 % Tween (Serva, Heidelberg).
10.
Zweitantikörper: 1:200 in PBS mit 50% Hundeserum (am Vortag angesetzt)
verdünnter biotinylierter Pferd- anti- Maus- IgG (H+L)- Antikörper (Vector,
Burlingame, CA, USA); Inkubation 30 Min. bei Raumtemperatur.
11.
3 x 5 Min. spülen in PBS-Puffer mit 0,05% Tween.
Material und Methoden
12.
38
Überschichten mit ABC-Reagenz (Vector, Burlingame, CA, USA, Zubereitung siehe
Anhang unter 9.4.1.).
13.
3 x 5 Min. spülen in PBS-Puffer.
14.
Überführen der Objektträger aus den Coverplates zurück in Küvetten.
15.
Enzymhistochemische Reaktion: 3,3´-Diaminobenzidin-Tetrahydrochlorid (DAB,
Fluka, Buchs, Schweiz, Zubereitung siehe Anhang); 5 Min. bei Raumtemperatur unter
ständigem Rühren auf einem Magnetrührer.
16.
5 Min. spülen in PBS- Puffer unter ständigem Rühren auf einem Magnetrührer.
17.
Verbringen in fliessendes Leitungswasser und 10 Min. spülen.
18
Gegenfärbung 30 Sekunden in Hämalaun nach Mayer (Roth, Karlsruhe).
19.
15 Min. bläuen in fließendem Leitungswasser.
13.
Entwässern der Schnitte in einer aufsteigenden Alkoholreihe: 50%iger, 70%iger,
96%iger
Alkohol
für
jeweils
3
Min.,
Isopropylalkohol
(2
x
5
Min.),
Essigsäurebutylester (3 x 5 Min.).
14.
Eindecken der Gewebeschnitte mit Roti®-Histokitt (Roth, Karlsruhe).
3.4.6
Nachweis des aktiven Caspase-3- Antigens in der Synovialmembran
Marker für Apoptose:
Polyklonaler Kaninchen- anti-Mensch/Maus/Ratte- aktive Caspase-3 -Antikörper gegen
ein Peptid des p 17 Fragmentes der humanen Caspase-3
(PROMEGA, Madison, WI, USA)
1. Tag:
1.
Entparaffinierung
der
Schnitte
in
einer
absteigenden
Alkoholreihe:
Essigsäurebutylester (3 x 5 Min.), Isopropylalkohol (5 Min.), 96%iger und 70%iger
Alkohol (jeweils 5 Min.).
2.
30 Min. Hemmung der endogenen Peroxidase in 0,5 % Wasserstoffperoxid
(Merck, Darmstadt).
3.
3 x 5 Min. spülen in PBS-Puffer unter ständigem Rühren auf einem Magnetrührer.
Material und Methoden
4.
39
Demaskierung der Antigene 15 Min. in Citratpuffer (Quartett, Berlin) kochen in der
Mikrowelle (Bauknecht, Schorndorf).
5.
3 x 5 Min. spülen in PBS-Puffer unter ständigem Rühren auf einem Magnetrührer
Objektträger auf Shandon Coverplates™ (Thermo Electron, Dreieich) und in Shandon
Sequenza®-Slide Racks (Thermo Electron, Dreieich) überführen.
6.
Überschichten mit 1:5 verdünntem inaktivierten Ziegen-Normalserum in PBS; 20 Min.
Inkubation bei Raumtemperatur.
7.
Erstantikörper: 1:6000 in PBS mit 1% bovinem Serumalbumin (BSA, Serva,
Heidelberg) verdünnter Polyklonaler Kaninchen- anti- Mensch- aktive Caspase-3 Antikörper (PROMEGA, Madison, WI, USA); Inkubation über Nacht bei 4° C im
Kühlschrank.
2. Tag:
8.
3 x 5 Min. spülen in PBS-Puffer mit 0,05 % Tween (Serva, Heidelberg)
9.
Zweitantikörper: 1:200 (mit Adsorption des Zweitantikörpers in PBS mit 50%
Hundeserum am Vortag) verdünnter biotinylierter Ziege- anti- Kaninchen- IgGAntikörper (VECTOR, Burlingame, CA, USA); am nächsten Tag Zentrifugieren des
angesetzten Zweitantikörpers und Pipettieren des Überstandes und Überschichten.
Inkubation 30 Min. bei Raumtemperatur.
10.
3 x 5 Min. spülen in PBS-Puffer mit 0,05% Tween.
11.
Überschichten mit ABC-Reagenz (Vector, Burlingame, CA, USA, Zubereitung siehe
Anhang unter 9.4.1.).
12.
3 x 5 Min. spülen in PBS-Puffer.
13.
Überführen der Objektträger aus den Coverplates zurück in Küvetten.
14.
Enzymhistochemische Reaktion: 3,3´-Diaminobenzidin-Tetrahydrochlorid (DAB,
Fluka, Buchs, Schweiz, Zubereitung siehe Anhang unter 9.4.1.); 5 Min. bei
Raumtemperatur unter ständigem Rühren auf einem Magnetrührer.
15.
5 Min. spülen in PBS- Puffer unter ständigem Rühren auf einem Magnetrührer.
16.
Verbringen in fließendes Leitungswasser und 10 Min. spülen.
17.
Gegenfärbung 30 Sekunden in Hämalaun nach Mayer (Roth, Karlsruhe).
18.
15 Min. bläuen in fließendem Leitungswasser.
Material und Methoden
19.
40
Entwässern der Schnitte in einer aufsteigenden Alkoholreihe: 50%iger, 70%iger,
96%iger
Alkohol
für
jeweils
3
Min.,
Isopropylalkohol
(2
x
5
Min.),
Essigsäurebutylester (3 x 5 Min.).
20.
Eindecken der Gewebeschnitte mit Roti®-Histokitt (Roth, Karlsruhe).
Tabelle 3: Rezepte für die Einfachfärbungen
Antikörper
Ki-67
Caspase-3
Verdünnung
Verdünnung
Erstantikörper
Zweitantikörper
Citratpuffer
Ki-67
Horse-anti-Mouse-b
10 Min. kochen in der
1:100 in PBS mit 1%
1:200 in PBS mit 50%
Mikrowelle
BSA
Hundeserum
Citratpuffer
Caspase-3
Goat-anti-Rabbit-b
10 Min. kochen in der
1:6000 in PBS mit
1:200 in PBS mit 50%
Mikrowelle
1% BSA
Hundeserum
Vorbehandlung
Anmerkung: b=biotinyliert
3.5 Doppelfärbungen
Mit Hilfe einer Doppelfärbung wird die Art der proliferierenden, also Ki-67- positiv
markierten Zelle, spezifiziert. In diesem Falle lassen sich anhand der beiden Doppelfärbungen
proliferierende CD3- positive T-Zellen von proliferierenden IgG- positiven Plasmazellen
unterscheiden. In Tabelle 4 befinden sich die Vorbehandlung und die jeweiligen benötigten
Verdünnungen der Antikörper der Doppelfärbungen.
Material und Methoden
3.5.1 Nachweis
von
41
Ki-67-
und
CD3-
positiven
Zellen
in
der
Synovialmembran
1. Antikörper: monoklonaler Maus- anti- Mensch- Ki-67- Antigen- Antikörper (DAKO
CORPORATION, Carpinteria, CA, USA)
2. Antikörper : biotinylierter Ziege- anti- Maus- Antikörper (VECTOR, Burlingame, CA,
USA)
3. Antikörper: polyklonaler Ratte- anti- Mensch- CD3-T-Zellen- Antikörper (SEROTEC,
MORPHO SYS AG, Martinsried)
4. Antikörper: biotinylierter Ziege- anti-Ratte- IgG (H+L)- Antikörper (VECTOR,
Burlingame, CA, USA)
Erster Tag
1.
Entparaffinierung
der
Schnitte
in
einer
absteigenden
Alkoholreihe:
Essigsäurebutylester (3 x 5 Min.), Isopropylalkohol (5 Min.), 96%iger und 70%iger
Alkohol (jeweils 5 Min.).
2.
30 Min. Hemmung der endogenen Peroxidase in 0,5 % Wasserstoffperoxid
(Merck, Darmstadt).
3.
3 x 5 Min. spülen in PBS-Puffer unter ständigem Rühren auf einem Magnetrührer.
4.
Demaskierung der Antigene 15 Min. in Citratpuffer (Quartett, Berlin) kochend in der
Mikrowelle (Bauknecht, Schorndorf).
5.
3 x 5 Min. spülen in PBS-Puffer unter ständigem Rühren auf einem Magnetrührer.
6.
Objektträger auf Shandon Coverplates™ (Thermo Electron, Dreieich) und in Shandon
Sequenza®-Slide Racks (Thermo Electron, Dreieich ) überführen.
7.
Überschichten mit 1:5 verdünntem inaktivierten Ziegen-Normalserum in PBS; 20 Min.
Inkubation bei Raumtemperatur.
Material und Methoden
8.
42
Erster Antikörper: 1:100 in PBS mit 1% bovinem Serumalbumin (BSA, Serva,
Heidelberg) verdünnter monoklonaler Maus- anti- humanes- Ki-67-AntigenAntikörper (DAKO CORPORATION, Carpinteria,CA, USA). Inkubation über Nacht
bei 4° C im Kühlschrank.
Zweiter Tag:
9.
3 x 5 Min. spülen in PBS-Puffer mit 0,05 % Tween (Serva, Heidelberg).
10.
Zweiter Antikörper: 1:200 in PBS mit 50% Hundeserum (am Vortag angesetzt)
verdünnter biotinylierter Ziege- anti- Maus- Antikörper (VECTOR, Burlingame,
CA, USA) ;
11.
3 x 5 Min. spülen in PBS-Puffer mit 0,05% Tween.
12.
Überschichten mit ABC-Reagenz (Vector, Burlingame, CA, USA, Zubereitung siehe
Anhang unter 9.4.1.).
13.
3 x 5 Min. spülen in PBS-Puffer.
14.
Überführen der Objektträger aus den Coverplates zurück in Küvetten.
15.
Enzymhistochemische Reaktion: 3,3´-Diaminobenzidin-Tetrahydrochlorid (DAB,
Fluka, Buchs, Schweiz, Zubereitung siehe Anhang unter 9.4.1.); 5 Min. bei
Raumtemperatur unter ständigem Rühren auf einem Magnetrührer.
16.
5 Min. spülen in PBS- Puffer unter ständigem Rühren auf einem Magnetrührer.
17.
Verbringen in fließendes Leitungswasser und 10 Min. spülen.
18.
Hemmung der endogenen Peroxidase für 30 Min. in 70% Ethanol mit 0,5 % H2O2
19.
3 x 5 Min. Spülen in PBS.
20.
Überschichten mit 1:5 verdünntem inaktiviertem Ziegen-Normalserum. Inkubation 20
Min.
21.
Dritter Antikörper: 1:200 in PBS mit 1% bovinem Serumalbumin (BSA, Serva,
Heidelberg) verdünnter polyklonaler Ratte- anti- humane- CD3 T-ZellenAntikörper (SEROTEC, MORPHO SYS AG, Martinsried). Überschichten und
Inkubation über Nacht bei 4°C im Kühlschrank.
3. Tag:
22.
3 x 5 Min. spülen in PBS.
23.
Vierter Antikörper: 1:200 in PBS verdünnter biotinylierter Ziege- anti- Ratte- IgG
(H+L)- Antikörper (VECTOR, Burlingame, CA, USA)
Material und Methoden
43
24.
3 x 5 Min. spülen in PBS.
25.
Überschichten mit ABC-Reagenz (VECTOR, Burlingame, CA, USA, Zubereitung
siehe Anhang). 30 Min. vor Gebrauch ansetzen. Inkubation 30 Min. bei
Zimmertemperatur.
26.
3 x 5 Min. spülen in PBS.
27.
4 Tropfen AEC+ pro Coverplate. Inkubation 5 Min..
28.
Spülen der Schnitte in PBS und verbringen in fliessendes Leitungswasser. Insgesamt
15 Min..
29.
Gegenfärbung 30 Sekunden in Hämalaun nach Mayer (Roth, Karlsruhe).
30.
15 Min. bläuen in fließendem Leitungswasser.
31.
Aus dem Wasser mit vorgewärmtem wässrigen Eindeckmittel eindecken.
3.5.2 Nachweis
von
Ki-67-
und
IgG-
positiven
Zellen
in
der
Synovialmembran
1. Antikörper: monoklonaler Maus- anti- Mensch- Ki-67- Antigen- Antikörper (DAKO
CORPORATION, Carpinteria, CA, USA)
2. Antikörper : biotinylierter Ziege- anti- Maus- Antikörper (VECTOR, Burlingame, CA,
USA)
3. Antikörper: FITC konjugierter polyklonaler Schaf- anti- Hunde- IgG- (schwere
Ketten) Antikörper (BETHYL LABORATORIES, Montgomery, TX, USA)
4. Antikörper: biotinylierter Ziege- anti- FITC- Antikörper (VECTOR, Burlingame, CA,
USA)
Erster Tag
1.
Entparaffinierung
der
Schnitte
in
einer
absteigenden
Alkoholreihe:
Essigsäurebutylester (3 x 5 Min.), Isopropylalkohol (5 Min.), 96%iger und 70%iger
Alkohol (jeweils 5 Min.).
Material und Methoden
2.
44
30 Min. Hemmung der endogenen Peroxidase in 0,5 % Wasserstoffperoxid
(Merck, Darmstadt).
3.
3 x 5 Min. spülen in PBS-Puffer unter ständigem Rühren auf einem Magnetrührer.
4.
Demaskierung der Antigene 15 Min. in Citratpuffer (Quartett, Berlin) kochend in der
Mikrowelle (Bauknecht, Schorndorf).
5.
3 x 5 Min. spülen in PBS-Puffer unter ständigem Rühren auf einem Magnetrührer.
Objektträger auf Shandon Coverplates™ (Thermo Electron, Dreieich) und in Shandon
Sequenza®-Slide Racks (Thermo Electron, Dreieich ) überführen.
6.
Überschichten mit 1:5 verdünntem inaktivierten Ziegen-Normalserum in PBS; 20 Min.
Inkubation bei Raumtemperatur.
7.
Erster Antikörper: 1:100 in PBS mit 1% bovinem Serumalbumin (BSA, Serva,
Heidelberg) verdünnter monoklonaler Maus- anti- humanes- Ki-67-Antigen Antikörper (DAKO CORPORATION, Carpinteria, CA, USA). Inkubation über
Nacht bei 4° C im Kühlschrank.
Zweiter Tag
9.
3 x 5 Min. spülen in PBS-Puffer mit 0,05 % Tween (Serva, Heidelberg)
10.
Zweiter Antikörper: 1:200 in PBS mit 50% Hundeserum (am Vortag angesetzt)
verdünnter biotinylierter Ziege- anti-Maus- Antikörper (Vector, Burlingame, CA,
USA).
11.
3 x 5 Min. spülen in PBS-Puffer mit 0,05% Tween.
12.
Überschichten mit ABC-Reagenz (Vector, Burlingame, CA, USA, Zubereitung siehe
Anhang unter 9.4.1.).
13.
3 x 5 Min. spülen in PBS-Puffer.
14.
Überführen der Objektträger aus den Coverplates zurück in Küvetten.
15.
Enzymhistochemische Reaktion: 3,3´-Diaminobenzidin-Tetrahydrochlorid (DAB,
Fluka, Buchs, Schweiz, Zubereitung siehe Anhang unter 9.4.1); 5 Min. bei
Raumtemperatur unter ständigem Rühren auf einem Magnetrührer.
16.
5 Min. spülen in PBS- Puffer unter ständigem Rühren auf einem Magnetrührer.
17.
Verbringen in fließendes Leitungswasser und 10 Min. spülen.
18.
Hemmung der endogenen Peroxidase für 30 Min. in 70% Ethanol mit 0,5 % H2O2.
19.
3 x 5 Min. Spülen in PBS.
Material und Methoden
20.
45
Überschichten mit 1:5 verdünntem inaktiviertem Ziegen-Normalserum. Inkubation 20
Min..
21.
Dritter Antikörper: 1:10.000 in PBS mit 1% BSA verdünnter FITC konjugierter
polyklonaler Schaf- anti- Hunde- IgG- (schwere Ketten) Antikörper (BETHYL
LABORATORIES, Montgomery, TX, USA). Überschichten und Inkubation über
Nacht bei 4°C im Kühlschrank.
3. Tag
22.
3 x 5 Min. spülen in PBS.
23.
Vierter Antikörper: 1:200 in PBS verdünnter biotinylierter Ziege- anti- FITCAntikörper (VECTOR, Burlingame, CA, USA).
24.
3 x 5 Min. spülen in PBS.
25.
Überschichten mit ABC-Reagenz (Vector, Burlingame, CA, USA, ZzzZubereitung
unter 9.4.1.) 30 Min. vor Gebrauch ansetzen. Inkubation 30 Min. bei
Zimmertemperatur.
26
3 x 5 Min. spülen in PBS.
27.
4 Tropfen AEC+ pro Coverplate. Inkubation 5 Min..
28.
Spülen der Schnitte in PBS und Verbringen in fliessendes Leitungswasser. Insgesamt
15 Min..
29.
Gegenfärbung 30 Sekunden in Hämalaun nach Mayer (Roth, Karlsruhe).
30.
15 Min. bläuen in fließendem Leitungswasser.
31.
Aus dem Wasser mit vorgewärmtem wässrigen Eindeckmittel eindecken.
Material und Methoden
46
Tabelle 4: Rezepte zu den Doppelfärbungen
Doppelfärbung
Verdünnung
Verdünnung
Erstantikörper
Zweitantikörper
Verdünnung
Verdünnung
Drittantikörper
Viertantikörper
Ki-67 CD3
Ki- 67
Goat-anti-mouse-b
Rat-anti-human-
Goat-anti-rat-
1:100 in PBS
1:200 in PBS mit
CD3
IgG
mit 1% BSA
50% Hundeserum
1:200 in PBS mit
1:200 in PBS
1% BSA
Ki-67 IgG
Ki-67
Goat-anti-mouse-b
Sheep-anti-dog-
Goat-anti-
1:100 in PBS
1:200 in PBS mit
IgG-FITC
FITC-b
mit 1% BSA
50% Hundeserum
1:10.000 in PBS
1:200 in PBS
mit 1 % BSA
Anmerkung: b=biotinyliert
3.6 Kontrollen
3.6.1 Positivkontrollen
Als positives Kontrollgewebe für den Nachweis von Ki-67 und Caspase-3 und die beiden
Doppelfärbungen wurde ein in 5%igem Formalin fixierter und in Paraffin eingebetteter
Hundelymphknoten verwendet. Ki-67- positive Zellen zeigten eine spezifische Reaktion im
Kern. Caspase-3- positive Zellen zeigten hauptsächlich eine goldbraune Färbung im Kern,
aber auch vereinzelt eine zytoplasmatische Reaktion. Das Kontrollgewebe entstammte dem
Sektionsgut des Institutes für Pathologie. Den Nachweis von T-Lymphozyten mittels des
polyklonalen CD3- Antikörpers im Paraffin eingebetteten Gewebe von Hunden erbrachten die
Autoren FERRER et al. (1992). Das CD3- Antigen ist in allen T-Lymphozyten nachzuweisen
und in anderen Zellen (außer den Purkinje Zellen) nicht vorhanden. Aus diesem Grunde gilt
das CD3- Antigen als ein exzellenter Marker für T-Lymphozyten. Positive Lymphozyten
zeigen eine spezifische zytoplasmatische Reaktion.
3.6.2 Negativkontrollen
Um die Existenz unspezifischer Bindungen beurteilen zu können, wurden Negativkontrollen
durchgeführt. Der Primärantikörper wurde bei der Ki-67- Reaktion durch Balb/c Mäuseaszites
Material und Methoden
47
(BioLogo Dr. Hartmut Schultheiß e.K., Kronshagen) in der Verdünnung 1:1000 in PBS mit
1% BSA ersetzt. Bei der Caspase-3- Reaktion wurde inaktiviertes Kaninchenserum in der
Verdünnung 1:60.000 in PBS mit 1% BSA eingesetzt. Bei den beiden Doppelfärbungen
wurde der Primärantikörper Ki-67 durch Balb/c-Mäuseaszites 1:1000 in PBS mit 1% BSA
ersetzt. Als 3. Antikörper wurde anstelle von Sheep- anti- dog- IgG inaktiviertes Schafserum
in der Verdünnung 1:10.000 in PBS eingesetzt und statt Ratte- anti- CD3 als 3. Antikörper
inaktiviertes Rattenserum in der Verdünnung 1:2000 in PBS.
3.7 Befunderhebung, Auswertung und statistische Aufarbeitung der Daten
Histologisch beurteilt wurden die Hämatoxylin Eosin (H.E.) gefärbten Schnittpräparate mit
Hilfe
eines
Standard-Binokular-Lichtmikroskops
(Fa.
Zeiss,
Oberkochen).
Der
Entzündungsgrad der Synovialitis der Tiere mit Kreuzbandriss wurde anhand der Anzahl von
Lymphozyten und Plasmazellen ermittelt. Bei einer geringgradigen Synovialitis waren > 10
und ≤ 50 lymphoplasmazelluläre Zellen pro HPF in der 400fachen Vergrößerung in der HEFärbung zu sehen. Eine mittelgradige Synovialitis zeigte > 50 und ≤ 200 Zellen und eine
hochgradige Synovialitis > 200 lymphoplasmazelluläre Zellen pro HPF in der 400fachen
Vergrößerung. Die morphometrische Auswertung der immunhistochemischen Präparate
erfolgte mit Hilfe eines semiautomatischen Systems (ASM68k, Leitz, Wetzlar). Hiermit ist
eine Berechnung der markierten Flächen und eine Zählung der gekennzeichneten positiven
Zellen möglich. Dabei wurde die Anzahl positiv gefärbter Zellen in 5 Schnittlokalisationen im
Sichtfeld bei 400facher Vergrößerung ausgewertet. Aus der ermittelten Gesamtzahl positiver
Zellen wurde der Median gebildet. Die Auswertung der proliferierenden und apoptotischen
Synovialdeckzellen konnte aufgrund der jeweils geringen Anzahl betreffender Zellen ohne
morphometrisches System erfolgen.
Die statistische Aufarbeitung der Daten erfolgte in Zusammenarbeit mit dem Institut für
Biometrie,
Epidemiologie
und
Informationsverarbeitung
der
Stiftung
Tierärztliche
Hochschule Hannover. Die Ergebnisse wurden unter Verwendung der Programme SAS
(Statistical Analysis System, Version 8.2, SAS Institute Inc., 1999) und SPSS (Superior
Performing Software Systems, Version 11.0) bearbeitet. Die grafischen Darstellungen wurden
auf einem Personalcomputer mit dem Programm SPSS (Version 11.0) erzeugt. Im
deskriptiven Teil der statistischen Analysen wurden die arithmetischen Mittelwerte, Mediane
Material und Methoden
48
und Quantile der Daten berechnet (Tabelle 15 und 16 im Anhang unter 9.3). Des weiteren
wurden die Daten anhand des Shapiro-Wilks-Testes auf Normalverteilung geprüft. Da die
Daten sich überwiegend als nicht normalverteilt erwiesen, wurden in den weiterführenden
Untersuchungen
nicht-parametrische
Testverfahren
eingesetzt.
Für
den
paarweisen
Gruppenvergleich wurde als nicht-parametrischer Test der Wilcoxon`s two-sample Test
eingesetzt. Bei Benennung der statistischen Signifikanzen wurde ein vergleichsbezogenes
Signifikanzniveau (ohne α-Adjustierung nach Bonferroni) von α = 0,05 zu Grunde gelegt.
Ergebnisse mit p < 0,05 wurden als statistisch signifikant angesehen. p-Werte zwischen 0,05
und 0,10 werden noch als “statistisch auffällig“ bezeichnet. Die p-Werte sind im Anhang
unter 9.3 in Tabelle 17 und 18 einzusehen.
Ergebnisse
49
4 Ergebnisse
4.1 Histologische Untersuchungen der Synovialisproben
4.1.1 Histologische Befunde bei den Vergleichstieren
Die paraffineingebetteten und H.E. gefärbten Synovialisproben der 8 Vergleichstiere zeigen
mehrheitlich eine Synovialdeckzellschicht von 1 bis 2 Reihen, nur bei einem Tier sind fokal
bis zu 3 Reihen vorhanden. Folglich liegt bei keinem Tier eine Synovialdeckzellhyperplasie
vor, jedoch ist bei 6 von 8 Vergleichstieren eine Synovialzellhypertrophie festzustellen. Dabei
ist ein geschätzter Anteil von mindestens 30-50% der Zellen davon betroffen. Das Zytoplasma
hypertrophierter Zellen ist vergrößert und hat ein schaumiges Aussehen, der Kern ist
randständig und chromatinarm. Die Synovialmembran zeigt bei Fall Nr. 3 ausschließlich
fingerförmige Ausstülpungen, während bei den anderen Tieren neben einer geradlinigen
Synovialmembran
immer
wieder
abschnittsweise
kurze
und
auch
fingerförmige
Ausstülpungen vorkommen. Bei dem subsynovialen Gewebe handelt es sich in 5 Fällen um
den adipösen Typ (Abb. 1), in 2 Fällen ist subsynovial erst eine schmale Schicht aus
kollagenem Bindegewebe zu sehen, dann folgt Fettgewebe. Bei Fall Nr. 5 ist zu 50%
Fettgewebe und zu 50% kollagenes Bindegewebe auf einem Schnitt vorhanden. Bei 3 Tieren
sind subsynovial disseminiert einzelne lymphozytäre Zellinfiltrate zu sehen und häufig auch
geringgradige Makrophagenansammlungen (Fall Nr. 1, Fall Nr. 3 und Fall Nr. 6 links). Bei
Fall Nr. 3 sind subysnovial und bei Fall Nr. 2 intravaskulär einzelne neutrophile Granulozyten
zu erkennen. Bei Fall Nr. 1 links zeigen sich subsynovial mittelgradige multifokale
lymphozytäre Herde mit einzelnen Plasmazellen (Abb. 2). Entzündungszellinfiltrate unter
einer Synovialmembran ohne Ausstülpungen kommen nicht vor. Hämosiderinablagerungen
sind in 3 Fällen vorhanden. Nur 3 Tiere zeigen keine Hyperämie und/oder Hyperkapillarität.
Es befinden sich im subsynovialen Gewebe und direkt unter der Synovialdeckzellschicht
Kapillaranschnitte, welche mit Erythrozyten gefüllt sind. In Tabelle 10 im Anhang sind die
histologischen Befunde der Vergleichstiere aufgelistet.
Ergebnisse
50
Abb. 1: Unveränderte kanine Synovialmembran vom adipösen Typ; ein- bis zweireihige
Synovialdeckzellschicht; subsynovial Adipozyten; Fall Nr. 3; H.E. Färbung, 100fache
Vergrößerung.
Abb. 2: Synovialmembran eines Vergleichstieres vom fibrozytären Typ; zweireihige
Synovialdeckzellschicht; hypertrophierte Synovialdeckzellen; Hyperämie; subsynovial ggr.
lymphoplasmazelluläre Infiltration; Fall Nr. 1 links; H.E. Färbung; 200fache Vergrößerung.
Ergebnisse
51
4.1.2 Histologische Befunde bei Hunden mit Kreuzbandriss
Insgesamt sind 23 Proben von Hunden mit Kreuzbandriss in Paraffin eingebettet und H.E.
gefärbt worden. Hierbei zeigen insgesamt 10 Tiere eine geringgradige, 5 Tiere eine
mittelgradige und 8 Tiere eine hochgradige Synovialitis. 8 von 10 Tieren mit einer
geringgradigen Entzündung weisen eine 1- bis höchstens 3- reihige Synovialdeckzellschicht
auf. Die Synovialdeckzelltiefe der Tiere mit mittelgradiger Entzündung stellt sich mit
mindestens 1 Reihe dar und reicht bei einem Tier bis maximal 4 Reihen. Über die Hälfte der
Tiere mit hochgradiger Entzündung weist eine mindestens 4- reihige Synovialdeckzellschicht
auf, bei einem Tier ist sogar eine 6- reihige Synovialdeckzellschicht vorhanden. Der
Mittelwert der Synovialdeckzellreihen dieser Gruppe beträgt 1-4 Reihen. Das bedeutet, dass
eine generelle Synovialdeckzellhyperplasie vorliegt. Der Anstieg der Synovialdeckzelltiefe ist
mit der Zunahme des Entzündungsgrades positiv korreliert. Hyperplastische Abschnitte der
Synovialmembran beschränken sich hierbei immer nur auf einen relativ kurzen Teilbereich
der insgesamt angeschnittenen Synovialmembran und sind nicht unbedingt mit einem
unmittelbar darunter liegenden subsynovialen Entzündungsherd korreliert. Bei der Mehrheit
der Tiere (6 von 10) mit geringgradiger Entzündung liegen kurze bis fingerförmige
Ausstülpungen der Synovialmembran vor. Bei 2 Tieren wechseln gerade Abschnitte mit
kurzen oder fingerförmigen Ausstülpungen ab. Alle Tiere mit mittelgradiger Entzündung
weisen
bis
auf
eines
mindestens
kurze
bis
fingerförmige
Ausstülpungen
der
Synovialmembran auf. Über die Hälfte der Tiere mit hochgradiger Entzündung zeigt eine
fingerförmige villöse Proliferation, wobei man an der Synovialmembran der übrigen Hunde
mindestens kurze Ausstülpungen erkennen kann. Eine villöse Proliferation ist mit
Deckzellmehrreihigkeit
nicht
positiv
korreliert.
Die
Anzahl
hypertrophierter
Synovialdeckzellen ist im Vergleich zu den Vergleichstieren deutlich vermehrt. Betroffen
sind davon sowohl einzelne als auch bis zu 80% der Synoviozyten. Das Zytoplasma ist
schaumig mit chromatinarmem Kern. Hyperkapillarität ist nur bei 3 Tieren von den insgesamt
23 Tieren mit Kreuzbandriss nicht vorhanden und eine Hyperämie ist, abgesehen von einem
Fall, bei allen Tieren zu sehen. Hämosiderin konnte bei 3 von insgesamt 23 Tieren
identifiziert werden. Diffus verteilte lymphozytäre und/oder plasmazelluläre Infiltrate sind bei
4 von 10 Tieren mit geringgradiger Synovialitis und auch bei den Tieren mit mittelgradiger
Synovialitis (2 von 5) vorhanden. Das ändert sich bei der Gruppe der Tiere mit hochgradiger
Ergebnisse
52
Entzündung; hier ist das Verteilungsmuster der Infiltrate ausschließlich multifokal, dabei
erkennt man bei 6 von 8 Tieren eine akzentuierte perivaskuläre Verteilung. Dabei sind die
Entzündungszellinfiltrate überwiegend direkt unterhalb der Deckzellschicht zu finden. Des
öfteren zeigen sich innerhalb des Infiltrates solitär gelegene Makrophagen. Der geschätzte
prozentuale Anteil der am Entzündungsinfiltrat beteiligten Plasmazellen reicht von
vereinzelten Plasmazellen bis zu einem Anteil von 90% Plasmazellen am Gesamtinfiltrat. Es
ist keine Korrelation zwischen Entzündungsgrad und Anzahl der Plasmazellen festzustellen.
Ein Anteil von 80% Plasmazellen am Gesamtinfiltrat kommt beispielsweise in allen 3
Gruppen vor. Im Anhang in Tabelle 11, Tabelle 12, Tabelle 13 sind, jeweils nach dem
Entzündungsgrad der Synovialitis gegliedert, die histopathologischen Befunde der Hunde mit
Kreuzbandriss aufgelistet. In Abb. 3 ist die Synovialmembran eines Hundes mit
Kreuzbandriss und geringgradiger Synovialitis dargestellt. In Abb. 4 und Abb. 5 sind 2 Fälle
von Hunden mit Kreuzbandriss und mittelgradiger Synovialitis zu sehen. Abb. 6, Abb. 7 und
Abb. 8 zeigen jeweils in unterschiedlich starken Vergrößerungen ein hochgradiges
lymphoplasmazelluläres Infiltrat eines Hundes mit Kreuzbandriss.
Ergebnisse
53
Abb. 3: Synovialzotte eines Hundes mit KBR und ggr.Synovialitis; Synovialdeckzellschicht 1bis 3- reihig; Hypertrophie der Synovialdeckzellen; ggr. perivaskuläre lymphoplasmazelluläre
Infiltration; ggr. Hämosiderinablagerungen; Fall Nr. 12; H.E.- Färbung, 200fache
Vergrößerung.
Abb. 4: Synovialzotte eines Hundes mit KBR und mgr. Synovialitis; 1- bis 2- reihige
Synovialdeckzellschicht; mittelgradige perivaskuläre lymphoplasmazelluläre Infiltration;
Hyperämie; Fall Nr. 19, H.E. Färbung, 200fache Vergrößerung.
Ergebnisse
54
Abb. 5: Synovialmembran eines Hundes mit KBR und mgr. Synovialitis; 1- reihige
Synovialdeckzellschicht; mittelgradige disseminierte lymphozytäre Infiltration; Hyperämie; Fall Nr.
20, H.E.- Färbung, 100fache Vergrößerung.
Abb. 6: Synovialmembran eines Hundes mit KBR und hgr. Synovialitis; hgr. villöse
Proliferation; subsynovial multifokale hochgradige perivaskuläre lymphoplasmazelluläre
Infiltration; Fall Nr.31; H.E. Färbung, 40fache Vergrößerung.
Ergebnisse
55
Abb. 7: Ausschnittsvergrößerung aus Abb. 6; Hypertrophie der Synovialdeckzellen; hochgradige
perivaskuläre lymphoplasmazelluläre Infiltration; geschätzter Anteil Plasmazellen am
Gesamtinfiltrat 30%; Fall Nr.31; H.E. Färbung; 200fache Vergrößerung.
Abb. 8: Ausschnittvergrößerung aus Abb. 7, lymphoplasmazelluläres Zellinfiltrat in der
Subsynovialis eines Hundes mit KBR und hgr. Synovialitis, Fall Nr.31; H.E.- Färbung;
400fache Vergrößerung.
Ergebnisse
56
4.1.3 Histopathologische Befunde bei Hunden mit Polyarthritis
Die 6 Tiere, bei denen klinisch eine Polyarthritis diagnostiziert wurde, zeigen im Durchschnitt
eine 2- bis 4- reihige Synovialdeckzellschicht. Hypertrophierte Synovialdeckzellen mit
schaumigem Zytoplasma und chromatinarmem Zellkern sind bei Fall Nr. 32 (über 90% der
SDZ betroffen) und bei Fall Nr. 33. vorhanden. Nur in 2 Fällen sind keine Ausstülpungen der
Synovialmembran zu beobachten (Fall Nr. 34 und Fall Nr. 36); die anderen Tiere besitzen
fingerförmige Ausläufer der Synovialmembran, welche häufig mit abschnittsweise kurzen
Ausstülpungen und/oder fehlenden Ausstülpungen der Synovialmembran wechseln.
Hyperämie tritt bei der Hälfte der Tiere auf, während eine Hyperkapillarität nur bei einem
Tier zu sehen ist. Hämosiderin ist bei 2 Tieren zu erkennen. 50% der Tiere zeigen eine
mittelgradige Entzündungszellinfiltration, es folgen 33,4% mit einer geringgradigen und die
verbleibenden 16,6% mit einer hochgradigen Synovialitis. Der Anteil von Plasmazellen am
Infiltrationsgrad liegt dabei in der Mehrheit der Polyarthritisfälle bei unter 25% (4 von 6
Tieren). Ausser Plasmazellen sind am Infiltrat häufig Lymphozyten, neutrophile Granulozyten
und Makrophagen beteiligt. In einem Fall sind außerdem viele aktivierte Fibroblasten zu
erkennen (Fall Nr. 35) und bei Fall Nr. 32 eine hochgradige Fibrinexsudation. Das
Verteilungsmuster des Infiltrates ist bei der Hälfte der Tiere disseminiert. Nur bei einem Tier
fällt ein ausschließliches multifokales, perivaskuläres Verteilungsmuster auf. Im Anhang in
Tabelle 14 finden sich detaillierte Angaben über die histopathologischen Befunde. Dargestellt
ist Fall Nr. 35 in Abb.9 und Abb. 10.
Ergebnisse
57
Abb. 9: Tangentialanschnitt der Synovialmembran eines Hundes mit Polyarthritis; hochgradige
fokale, vorwiegend plasmazelluläre Infiltration; Fall Nr. 35; H.E-Färbung, 200fache
Vergrößerung.
Abb. 10: Hund mit Polyarthritis; in der fibrösen Subsynovialis sind Hämorrhagien und
Hämosiderin vorhanden; Beteiligung zahlreicher Makrophagen am lymphoplasmazellulären
Infiltrat; Fall Nr.35, H.E.-Färbung, 200fache Vergrößerung
Ergebnisse
58
4.2 Immunhistochemische Untersuchungen
4.2.1 Immunhistochemischer
Nachweis
des
Ki-67-Antigens
bei
Synovialdeckzellen
Bei der immunhistologischen Untersuchung mit dem monoklonalen Ki-67- Antikörper zeigen
proliferierende Synovialdeckzellen dunkelbraun gefärbte Kerne. Das Verteilungsmuster der
positiven
Synoviozyten
in
der
Deckzellschicht
ist
disseminiert.
Positiv gefärbte
Synovialdeckzellen besitzen ein unterschiedliches morphologisches Aussehen: einerseits sind
längliche Zellen vorhanden, andererseits auch runde bis ovale Synovialdeckzellen. Positiv
gefärbt wurden ausserdem Lymphozyten, Plasmazellen, Makrophagen, Fibrozyten und
Endothelzellen. In Abb. 17 ist die Anzahl Ki-67- positiver Synovialdeckzellen bei allen
untersuchten Tiergruppen grafisch dargestellt. Im Anhang unter 9.3 befinden sich in Tabelle
15 ermittelte Mediane und Quantile und in Tabelle 17 die p-Werte aller Tiergruppen.
4.2.1.1 Nachweis des Ki-67-Antigens in Synovialdeckzellen der Vergleichstiere
Bei den Vergleichstieren liegt eine Proliferationsaktivität von 0,2 Ki-67- positiven
Synovialdeckzellen pro HPF in der 400fachen Vergrößerung vor (Median). Damit ist dies der
geringste Wert im Vergleich mit den anderen Gruppen. Eine signifikant größere Anzahl an
Ki-67- positiven Synovialdeckzellen liegt vor bei KBR-Gruppe 1 (p=0,0001), KBR-Gruppe 2
(p=0,0032), KBR-Gruppe 3 (p=0,0004) und bei Gruppe 4 (p=0,0043). In Abb. 11 werden
vereinzelte Ki-67- positive Synovialdeckzellen bei einem Vergleichstier dargestellt.
Ergebnisse
59
Abb. 11: Ki-67- positive Synovialdeckzellen bei einem Vergleichstier; Fall Nr. 1;
Proliferationsmarker Ki-67; 200fache Vergrößerung.
4.2.1.2 Immunhistochemischer Nachweis des Ki-67-Antigens in Synovialdeckzellen
der Hunde mit Kreuzbandriss
KBR-Gruppe 1: Hunde mit Kreuzbandriss und geringgradiger Synovialitis
Bei dieser Gruppe ist eine Proliferationsaktivität von 2,8 Ki-67- positiven Synovialdeckzellen
pro HPF in der 400fachen Vergrößerung festzustellen (Median).
Dabei sind signifikant mehr Ki-67- positive Deckzellen als bei den Vergleichstieren
vorhanden (p=0,0001). Verglichen mit der KBR-Gruppe 3 fanden sich signifikant weniger
positive Synovialdeckzellen (p=0,0097), und auch zur Gruppe 4 waren statistisch auffällig
weniger positive Synovialdeckzellen vorhanden (p-Wert=0,0338). Es besteht kein
signifikanter Unterschied zur KBR-Gruppe 2. Zwei Fälle der KBR-Gruppe 1 werden in Abb.
12 und Abb. 13 dargestellt.
Ergebnisse
60
Abb. 12: Ki-67- Immunreaktivität in der Synovialmembran bei einem Hund mit KBR und ggr.
Synovialitis; vereinzelt proliferierende Synovialdeckzellen; Fall Nr.11; Proliferationsmarker Ki67; 100fache Vergrößerung.
Abb. 13: Proliferierende Synovialdeckzellen bei einem Hund mit KBR und ggr. Synovialitis;
Synovialdeckzellhyperplasie mit bis zu 5 Reihen; Fall Nr. 12; Proliferationsmarker Ki-67;
400fache Vergrößerung.
Ergebnisse
61
KBR-Gruppe 2: Hunde mit Kreuzbandriss und mittelgradiger Synovialitis
In der KBR-Gruppe 2 ist eine Proliferationsaktivität von 2,4 Ki-67- positiven
Synovialdeckzellen pro HPF in der 400fachen Vergrößerung zu beobachten (Median), welche
somit im Vergleich zur Proliferationsaktivität der KBR-Gruppe 1 geringgradig schwächer
ausfällt. Es besteht kein signifikanter Unterschied zur KBR-Gruppe 1. Jedoch sind signifikant
mehr Ki-67- positive Synovialdeckzellen als bei den Vergleichstieren vorhanden (p=0,0032).
Auch gegenüber der KBR-Gruppe 3 zeigen sich signifikant weniger Synovialdeckzellen
(p=0,0233). Verglichen mit der Gruppe 4 waren statistisch auffällig weniger positive
Synovialdeckzellen Ki-67 vorhanden (p=0,0828). Ein Fall der KBR-Gruppe 2 wird in Abb.
14 bildlich dargestellt.
Abb. 14: Ki-67- Immunreaktivität in der Synovialmembran eines Hundes mit KBR und mgr.
Synovialitis; Ki-67- positive Synovialdeckzellen und Entzündungszellen; Fall Nr. 20;
Proliferationsmarker Ki-67; 200fache Vergrößerung.
Ergebnisse
62
KBR-Gruppe 3: Hunde mit Kreuzbandriss und hochgradiger Synovialitis
In dieser Gruppe zeigt sich gegenüber den anderen beiden Kreuzbandrissgruppen eine
deutlich verstärkte Proliferationsaktivität mit 5,6 Deckzellen pro HPF in der 400fachen
Vergrößerung (Median). Die Vergleichstiere weisen signifikant weniger Ki-67- positive
Deckzellen auf (p=0,0004). Auch gegenüber der KBR-Gruppe 1 (p=0,0097) und der KBRGruppe 2 (p=0,0233) zeigen sich signifikant mehr Ki-67- positiv gefärbte Deckzellen. Zur
Gruppe der Tiere mit Polyarthritis (Gruppe 4) besteht kein signifikanter Unterschied. In Abb.
15 sind in der Synovialmembran eines Hundes mit KBR und hochgradiger Synovialitis Ki-67positive Synovialdeck- und Entzündungszellen zu sehen.
Abb. 15: Ki-67- Immunreaktivität in der Synovialmembran eines Hundes mit KBR und hgr.
Synovialitis; Ki-67- positive Zellen sowohl in der Synovialdeckzellschicht als auch unter den
subsynovial perivaskulär proliferierenden Entzündungszellen; Fall Nr. 30; Proliferationsmarker
Ki-67; 100fache Vergrößerung.
Ergebnisse
63
4.2.1.3 Nachweis des Ki-67-Antigens in Synovialdeckzellen der Hunde mit
Polyarthritis (Gruppe 4)
Der Median der Gruppe der Hunde mit Polyarthritis beträgt 6,2 Ki-67- positive Zellen pro
HPF in der 400fachen Vergrößerung. Es sind signifikant mehr Ki-67- positive
Synovialdeckzellen als bei den Vergleichstieren vorhanden (p=0,0043). Verglichen mit der
KBR-Gruppe 1 wurde ein signifikant vermehrtes Vorkommen an Proliferationsaktivität der
Synovialdeckzellen bei den Tieren mit Polyarthritis nachgewiesen. Zur KBR-Gruppe 1 lag
der p-Wert bei 0,0338. Zur KBR-Gruppe 2 liegen statistisch auffällig mehr proliferierende
Synovialdeckzellen vor (p=0,0828). Im Vergleich mit der KBR-Gruppe 3 bestehen keine
Signifikanzen. Die Proliferationsaktivität der Synovialdeckzellen eines Falles mit Polyarthritis
wird in Abb. 16 dargestellt.
Abb. 16: Ki-67- Immunreaktivität in der Synovialmembran eines Hundes mit Polyarthritis;
proliferierende Synovialdeckzellen und Entzündungszellen, Fall Nr. 32; Proliferationsmarker
Ki-67; 200fache Vergrößerung.
Ergebnisse
Abb. 17:
Tiergruppen
64
Darstellung der Ki-67- positiven Synovialdeckzellen bei allen untersuchten
Anmerkung: gezählt wurden die Ki-67- positiven Synovialdeckzellen pro High Power Field (HPF) in
der 400fachen Vergrößerung.
Maximum
Identische Symbole
75%Quartil
Median
25% Quartil
symbolisieren einen statistisch
Minimum
(p≤ 0,05)
signifikanten Unterschied
Ausreißer
Ergebnisse
65
4.2.2 Immunhistochemischer Nachweis des Caspase-3- Antigens bei
Synovialdeckzellen und Entzündungszellen
Die positiv gefärbten Synovialdeckzellen und Entzündungszellen zeigen einen goldbraun
gefärbten Kern oder aber auch vereinzelt ein goldbraun gefärbtes Zytoplasma. Die einzelnen
positiven Zellen liegen disseminiert in der Synovialdeckzellschicht (Synovialdeckzellen) oder
in der Subsynovialis (Entzündungszellen). Vereinzelt können apoptotic bodies mit positivem
immunhistochemischen Nachweis von aktivierter Caspase-3 nachgewiesen werden. Die
Zellmorphologie untersuchter Synovialdeckzellen und Entzündungszellen zeigt teilweise
kondensierte Kerne oder eine Kernwandhyperchromasie. Im subsynovialen Stroma konnten
disseminiert positive Reaktionen ausserdem bei Endothelzellen, Fibrozyten und Makrophagen
beobachtet werden.
In Abb. 19 ist die Anzahl Caspase-3- positiver Synovialdeckzellen bei allen untersuchten
Tiergruppen dargestellt und Abb. 20 zeigt den Vergleich sämtlicher Tiergruppen hinsichtlich
Proliferation und Apoptose der Synovialdeckzellen. Im Anhang unter 9.3 sind in Tabelle 16
die arithmetischen Mittelwerte zu finden.
In Abb. 23 ist die Anzahl der Caspase-3- positiven Entzündungszellen bei allen untersuchten
Tiergruppen grafisch dargestellt. Im Anhang unter 9.3 sind in Tabelle 15 ermittelte Mediane
und Quantile, in Tabelle 16 arithmetische Mittelwerte und in Tabelle 17 die p-Werte aller
Tiergruppen zu sehen.
4.2.2.1
Nachweis des Caspase-3- Antigens bei Synovialdeckzellen der
Vergleichstiere
Die Auswertung der immunhistochemischen Reaktion ergibt bei den Vergleichstieren einen
arithmetischen Mittelwert von 0,17 Caspase-3- positiven Synovialdeckzellen pro HPF in der
400fachen Vergrößerung. Dabei sind ausschliesslich bei den Fällen Nr. 1 rechts, Nr. 2 rechts
und Nr. 7 rechts positive Synovialdeckzellen zu sehen. Bei den Vergleichstieren liegt der
höchste Wert an Caspase-3- positiven Synovialdeckzellen von allen Gruppen vor;
Signifikanzen zu den anderen Gruppen bestehen jedoch nicht. Caspase-3- positive
Synovialdeckzellen sind bei einem Vergleichstier in Abb. 18 dargestellt.
Ergebnisse
66
Abb. 18: Synovialmembran eines Vergleichstieres; Caspase-3- positive Synovialdeckzelle; Fall
Nr.1; 200fache Vergrößerung.
4.2.2.2
Nachweis des Caspase-3- Antigens bei Synovialdeckzellen der Hunde mit
Kreuzbandriss
KBR-Gruppe 1: Hunde mit Kreuzbandriss und geringgradiger Synovialitis
Bei der KBR-Gruppe 1 sind keine Caspase-3- positiven Synovialdeckzellen vorhanden. Der
arithmetische Mittelwert liegt damit bei 0,0 positiven Synovialdeckzellen pro HPF in der
400fachen Vergrößerung. Signifikante Unterschiede zu den übrigen Gruppen sind nicht
vorhanden.
KBR-Gruppe 2: Hunde mit Kreuzbandriss und mittelgradiger Synovialitis
Es zeigen sich keine Caspase-3- positiven Synovialdeckzellen bei KBR-Gruppe 2. Der
arithmetische Mittelwert der KBR-Gruppe 2 beträgt 0,0 positive Synovialdeckzellen pro HPF
in der 400fachen Vergrößerung. Ein signifikanter Unterschied in der Anzahl positiver
Synovialdeckzellen zu den anderen Gruppen ist nicht festzustellen.
Ergebnisse
67
KBR-Gruppe 3: Hund mit Kreuzbandriss und hochgradiger Synovialitis
Bei Fall 31 ist eine Caspase-3- positive Synovialdeckzelle in einem der 5 untersuchten Felder
in der 400fachen Vergrößerung vorhanden. Der arithmetische Mittelwert der gesamten
Gruppe beträgt 0,025 positive Zellen pro HPF in der 400fachen Vergrößerung. Signifikante
Unterschiede zu den anderen Gruppen bestehen nicht.
4.2.2.3 Nachweis des Caspase-3- Antigens bei Synovialdeckzellen der
Hunde mit Polyarthritis (Gruppe 4)
Bei den Hunden mit Polyarthritis konnten keine apoptotischen Synovialdeckzellen
nachgewiesen werden. Der arithmetische Mittelwert dieser Gruppe liegt somit bei 0,0
positiven Synovialdeckzellen pro HPF in der 400fachen Vergrößerung. Im Vergleich mit den
anderen Gruppen liegen keine signifikanten Unterschiede vor.
Ergebnisse
68
Caspase-3- pos. Deckzellen
0,18
0,16
0,14
0,12
0,1
0,08
0,06
0,04
0,02
0
Caspase-3- pos. Deckzellen
Abb. 19 :Darstellung von Apoptose der Synovialdeckzellen bei allen untersuchten Tiergruppen
Anmerkung: Darstellung des arithmetischen Mittelwertes positiver Zellen pro HPF (High
Power Field) in der 400fachen Vergrößerung
Tiere mit Polyarthritis
KBR-Gruppe 3
Ki-67- pos. Deckzellen
KBR-Gruppe 2
Caspase- 3- pos. Deckzellen
KBR-Gruppe 1
Vergleichstiere
0
2
4
6
8
Abb. 20: Darstellung von Apoptose und Proliferation von Synovialdeckzellen bei allen
untersuchten Tiergruppen
Anmerkung zu Abb. 20: Darstellung des arithmetischen Mittelwertes positiver Zellen pro HPF
(High Power Field) in der 400fachen Vergrößerung
Gruppe 1 = KBR-Tiere mit ggr. Synovialitis, Gruppe 2 = KBR-Tiere mit mgr. Synovialitis,
Gruppe 3 = KBR-Tiere mit hgr. Synovialitis, Gruppe 4= Hunde mit Polyarthritis
Ergebnisse
69
4.2.2.4 Nachweis des Caspase-3- Antigens bei Entzündungszellen von
Vergleichstieren
Bei der Auswertung des immunhistochemischen Nachweises des Caspase-3- Antigens beträgt
der
arithmetische
Mittelwert
bei
den
Vergleichstieren
0,2
Caspase-3-
positive
Entzündungszellen pro HPF in der 400fachen Vergrößerung. Der arithmetische Mittelwert
von 0,2 ist dabei größer als der Wert der KBR-Gruppe 1 (0,06) und der KBR-Gruppe 2 (0,04).
Signifikante Unterschiede zu den anderen Gruppen bestehen nicht.
4.2.2.5 Nachweis des Caspase-3- Antigens bei Entzündungszellen von Hunden mit
Kreuzbandriss
KBR-Gruppe 1: Hunde mit Kreuzbandriss und geringgradiger Synovialitis
Der arithmetische Mittelwert von 0,06 Caspase-3- positiven Entzündungszellen pro HPF in
der 400fachen Vergrößerung liegt unter dem Wert der Vergleichstiere. Nur bei Fall Nr. 12 ist
eine Entzündungszelle und bei Fall Nr. 18 sind 2 positive Entzündungszellen in einem Feld in
der 400fachen Vergrößerung vorhanden. Signifikante Unterschiede zu den anderen Gruppen
bestehen nicht.
KBR-Gruppe 2: Hunde mit Kreuzbandriss und mittelgradiger Synovialitis
Die Auswertung der immunhistochemischen Reaktion ergibt einen arithmetischen Mittelwert
von 0,04 Caspase-3- positiven Entzündungszellen pro HPF in der 400fachen Vergrößerung
und stellt damit den geringsten Wert aller Gruppen dar. Es ist nur bei Fall Nr. 20 eine positive
Zelle in einem Feld in der 400fachen Vergrößerung zu sehen. Es bestehen jedoch keinerlei
Signifikanzen zu den anderen Gruppen.
KBR-Gruppe 3: Hund mit Kreuzbandriss und hochgradiger Synovialitis
Der arithmetische Mittelwert von 0,58 Caspase-3- positiven Zellen pro Feld ist im Vergleich
zu den Mittelwerten der KBR-Gruppe 1 und 2 etwas höher. Von den 8 Hunden dieser Gruppe
finden sich in 3 Fällen Caspase-3- positive Entzündungszellen, wobei Fall Nr. 24 mit im
Ergebnisse
70
Durchschnitt 3 positiven Zellen pro Feld die höchste Anzahl an apoptotischen Zellen
aufweist. Signifikante Unterschiede zu den anderen Gruppen bestehen nicht. Abb. 21 und Abb.
22 zeigen Caspase-3- positive Entzündungszellen bei einem Kreuzbandrisspatienten mit
hochgradiger Synovialitis.
4.2.2.6 Nachweis des Caspase-3- Antigens bei Entzündungszellen von Hunden mit
Polyarthritis (Gruppe 4)
Der für diese Gruppe ermittelte arithmetische Mittelwert von 0,7 Caspase-3- positiven
Entzündungszellen pro Feld in der 400fachen Vergrößerung ist höher als der arithmetische
Mittelwert der Vergleichstiere, der KBR-Gruppe 1 und der KBR-Gruppe 2 und der KBRGruppe 3. Es bestehen keine signifikanten Unterschiede.
Ergebnisse
71
Abb. 21: Caspase-3- Immunreaktivität in der Synovialis eines Hund es mit KBR und hgr.
Synovialitis; subsynovial befinden sich Caspase-3- positive Entzündungzellen und apoptotic
bodies; Fall Nr. 24; Apoptose Marker Caspase-3;
200fache Vergrößerung.
Abb. 22: Ausschnittsvergrößerung aus Abb. 21; perivaskuläres Entzündungsinfiltrat mit
vorwiegend Plasmazellen; Caspase-3- positive Entzündungszellen (Pfeile) und apoptotic bodies
(Pfeilspitze); Fall Nr. 24; Caspase-3 Marker; 400fache Vergrößerung.
Ergebnisse
72
Caspase-3pos. Entzündungszellen
Tiere mit Polyarthritis
KBR-Gruppe 3
KBR-Gruppe 2
Caspase- 3- pos.
Entzündungszellen
KBR-Gruppe 1
Vergleichstiere
0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
0,8
Abb. 23: Darstellung von Caspase-3- positiven Entzündungszellen bei allen untersuchten
Tiergruppen
Anmerkung zu Abb.23:
Darstellung des arithmetischen Mittelwertes positiver Zellen pro HPF in der 400fachen
Vergrößerung; Zählung von positven Entzündungszellen (Lymphozyten und Plasmazellen).
Abkürzungen: V = Vergleichstiere, Gruppe 1 = KBR-Tiere mit geringgradiger Entzündung,
Gruppe 2 = KBR-Tiere mit mittelgradiger Entzündung, Gruppe 3 = KBR-Tiere mit hochgradiger
Entzündung, Gruppe 4 = Tiere mit Polyarthritis, HPF=High Power Field.
4.2.3 Immunhistochemischer Nachweis von IgG- positiven Zellen
Bei der immunhistochemischen Reaktion für Immunglobulin G wird das Zytoplasma positiver
Entzündungszellen rot gefärbt. Durch den exzentrisch gelegenen Zellkern lassen sich die
positiven Plasmazellen von den anderen Zellen unterscheiden. Grafisch dargestellt wird die
Anzahl IgG- positiver Zellen bei jeder einzelnen untersuchten Tiergruppe in Abb. 24.
Ermittelte Mediane und Quantile sind in Tabelle 15 im Anhang unter 9.3 zu finden, in Tabelle
18 sind die p-Werte einzusehen.
Ergebnisse
73
4.2.3.1 Nachweis von IgG- positiven Zellen bei den Vergleichstieren
IgG- positive Plasmazellen kommen bei den Vergleichstieren nur vereinzelt vor.
Pro mm² sind in der 400fachen Vergrößerung 43,12 IgG- positive Zellen vorhanden (Median).
Eine signifikant höhere Anzahl an IgG- positiven Zellen als die Gruppe der Vergleichstiere
zeigen die KBR-Gruppe 1 (p=0,0111), die KBR-Gruppe 2 (p=0,019), die KBR-Gruppe 3
(p=0,0002) und die Gruppe 4 (p=0,0436).
4.2.3.2 Nachweis von IgG- positiven Zellen bei den Tieren mit Kreuzbandriss
Bei den Tieren mit Kreuzbandriss und geringgradiger Entzündung erkennt man vereinzelt
positive, disseminiert verteilte IgG- positive Plasmazellen. Die Tendenz zu mittel- bis
hochgradigen multifokalen und auch oft perivaskulären Ansammlungen von IgG- positiven
Zellen nimmt mit steigendem Entzündungsgrad der Synovialmembran zu. Des öfteren können
IgG- positive Zellen auch intravasal beobachtet werden. Besonders auffallend sind dabei die
Fälle Nr. 25, Nr. 27 und Nr. 28. Beim Vorhandensein fingerförmiger Ausläufer der
Synovialmembran befindet sich die Entzündungszellinfiltration stets im subsynovialen
Stroma der Zotte, teilweise unmittelbar unter der Synovialdeckzellschicht.
KBR-Gruppe 1: Tiere mit geringgradiger Synovialitis
Bei der KBR-Gruppe mit geringgradiger Synovialitis sind 143,7 IgG.positive Zellen pro mm²
in der 400fachen Vergrößerung vorhanden (Median). Eine signifikant geringere Anzahl an
IgG- positiven Zellen beim Vergleich mit der KBR-Gruppe 1 ist bei den Vergleichstieren
nachzuweisen (p=0,0111). Einen signifikanten Unterschied in Bezug auf eine höhere Anzahl
an IgG- positiven Zellen gegenüber KBR-Gruppe 1 zeigt die KBR-Gruppe 2 mit einem pWert von 0,0576 und ebenso die KBR-Gruppe 3 mit dem p-Wert 0,0016. Keine signifikanten
Unterschiede bestehen zwischen der KBR-Gruppe 1 und der Gruppe 4. Ein Extremwert von
2944,79 IgG- positiven Zellen pro mm² in der 400fachen Vergrößerung ist bei Fall Nr.13
vorhanden. Ein Ausreißerwert mit 1511,15 IgG- positiven Zellen zeigt sich bei Fall Nr.12.
Ergebnisse
74
KBR-Gruppe 2: Tiere mit mittelgradiger Synovialitis
Der Median der KBR-Gruppe 2 liegt bei 510,1 IgG- positiven Zellen pro mm² in der
400fachen Vergrößerung. Damit liegt die Zahl der IgG- positiven Zellen gegenüber der KBRGruppe 1 um den Faktor 3,5 höher. Die KBR-Gruppe 2 zeigt eine signifikant höhere Anzahl
an IgG- positiven Zellen als die Gruppe der Vergleichstiere (p=0,019) und als die KBRGruppe 1 (p=0,0576). Der Vergleich mit KBR Gruppe 3 ergibt eine signifikant geringere
Anzahl an IgG- positiven Zellen (p=0,0157). Keine signifikanten Unterschiede bezüglich der
Anzahl an IgG- positiven Zellen bestehen zur Gruppe 4.
KBR-Gruppe 3: Tiere mit hochgradiger Synovialitis
Bei den Hunden mit Kreuzbandriss und hochgradiger Synovialitis können 3226,4 IgG
positive Zellen pro mm² in der 400fachen Vergrößerung nachgewiesen werden (Median).
Dies ist die höchste Anzahl an IgG- positiven Zellen aller Gruppen, womit signifikante
Unterschiede zur Gruppe der Vergleichstiere (p=0,0002), zur KBR-Gruppe 1 (p=0.0016), zur
KBR-Gruppe 2 (p=0,0157) und zur Gruppe 4 (p=0,0024) bestehen.
4.2.3.3 Nachweis von IgG- positiven Zellen bei den Tieren mit Polyarthritis
(Gruppe 4)
Hier reicht das Spektrum IgG- positiver Zellen von vereinzelten, disseminierten Zellen bis zu
hochgradigen, vorwiegend perivaskulären Zellinfiltrationen.
In der Gruppe der Hunde mit Polyarthritis sind pro mm² in der 400fachen Vergrößerung 284,4
Zellen IgG- positiv (Median). Diese Gruppe weist eine signifikant höhere Anzahl an IgGpositiven Zellen auf als die Gruppe der Vergleichstiere (p=0,0436). Im Vergleich mit der
KBR-Gruppe 3 zeigt diese Gruppe eine signifikant geringere Anzahl an IgG- positiven Zellen
(p=0,0024). Zur KBR-Gruppe 1 und zur KBR-Gruppe 2 liegen keine signifikanten
Unterschiede vor.
Ergebnisse
75
Abb. 24: Darstellung von IgG- positiven Zellen bei allen untersuchten Tiergruppen
Maximum
Identische Symbole
75%Quartil
Median
25% Quartil
Minimum
symbolisieren einen
statistisch signifikanten
Unterschied (p≤ 0,05)
Ausreißer
Extremwert
Ergebnisse
76
4.2.4 Immunhistochemischer
Nachweis
von
CD3-
positiven
Entzündungszellen
Bei der immunhistologischen Reaktion gegen das Oberflächenantigen CD3 stellen sich runde
bis ovale lymphozytäre Zellen mit rot gefärbtem Zytoplasma dar. In Abb. 25 wird die Anzahl
der CD3- positiven Zellen bei allen untersuchten Tiergruppen grafisch dargestellt. Abb. 26
zeigt die Anzahl der IgG- und CD3- positiven Zellen bei allen Tiergruppen im Vergleich. Im
Anhang unter 9.3 in Tabelle 15 sind die ermittelten Mediane und Quantile aller Tiergruppen
zu finden, in Tabelle 18 sind die p-Werte einzusehen.
4.2.4.1 Nachweis von CD3-positiven Entzündungszellen bei den Vergleichstieren
Die unmittelbar unter der Deckzellschicht gelegenen, vereinzelten CD3- positiven Zellen
zeigen eine disseminierte, oft perivaskuläre Verteilung. Im Fall Nr. 1 links ist eine
geringgradige fokale perivaskuläre Infiltration mit CD3- positiven Zellen zu sehen.
Bei den Vergleichstieren konnten 151,8 CD3- positive Zellen pro mm² in der 400fachen
Vergrösserung nachgewiesen werden (Median). Die Entzündungszellpopulation der
Vergleichstiere wird damit von den CD3- positiven Zellen dominiert, es liegt der 3,5 fache
Wert der IgG- positiven Zellen vor. Eine signifikant größere Anzahl an CD3- positiven Zellen
als bei den Vergleichstieren lag sowohl bei KBR-Gruppe 2 vor (p=0,0098) als auch bei der
KBR-Gruppe 3 (p=0,0116). Keine signifikanten Unterschiede bezüglich der Anzahl an CD3positiven Zellen lagen zwischen den Vergleichstieren und der KBR-Gruppe 1 und zwischen
den Vergleichstieren und den Hunden mit Polyarthritis (Gruppe 4) vor.
4.2.4.2 Nachweis von CD3-positiven Entzündungszellen bei den Tieren mit
Kreuzbandriss
Bei den Tieren mit Kreuzbandriss und Synovialitis zeigen CD3- positive Zellen überwiegend
eine multifokale, subsynoviale, perivaskuläre Verteilung. Mit zunehmenden Grad der
Synovialitis steigt auch die Zahl CD3- positiver Zellen an. Auch der multifokale
Verteilungscharakter nimmt mit steigendem Synovialitisgrad zu.
Ergebnisse
77
KBR-Gruppe 1: Tiere mit geringgradiger Synovialitis
Bei den Tieren mit Kreuzbandriss und geringgradiger Synovialitis zeigten sich 86,71 CD3positive Zellen pro mm² in der 400fachen Vergrößerung (Median). Damit dominieren in der
Entzündungszellpopulation der Gruppe 1 die IgG- positiven Zellen, deren Anzahl um das 1,7fache größer ist als die Anzahl der positiven CD3- Zellen. Die KBR-Gruppe 3 und die KBRGruppe 2 zeigen eine signifikant höhere Anzahl an positiven CD3- Zellen als die KBRGruppe 1. Der erste p-Wert liegt bei 0,0111 und der zweite p-Wert bei 0,0187. Auch die
Gruppe 4 weist eine signifikant höhere Anzahl an CD3- positiven Zellen pro mm² in der
400fachen Vergrößerung auf als die KBR-Gruppe 1 (p=0,0218). Es liegen keine signifikanten
Unterschiede bezüglich der Anzahl an CD3- positiven Zellen zwischen KBR-Gruppe 1 und
den Vergleichstieren vor.
KBR-Gruppe 2: Tiere mit mittelgradiger Synovialitis
Der Median der KBR-Gruppe 2 liegt bei 335,9 CD3- positiven Zellen pro mm² in der
400fachen
Vergrößerung.
Demzufolge
besteht
auch
bei
dieser
Gruppe
die
Entzündungszellpopulation überwiegend aus IgG- positiven Zellen, welche um den Faktor 1,5
stärker vertreten sind als die CD3- positiven Zellen. Die KBR-Gruppe 2 weist eine signifikant
höhere Anzahl an CD3- positiven Zellen auf als die Vergleichstiere (p=0,0098) und die KBRGruppe 1 (p=0,0187). Ein signifikanter Unterschied bezüglich einer niedrigeren Anzahl an
CD3- positiven Zellen liegt zur KBR-Gruppe 3 mit einem p-Wert von 0,0144 vor. Keine
signifikanten Unterschiede bestehen zwischen KBR-Gruppe 2 und der Gruppe 4. Einen
Ausreißerwert von 698,16 CD3- positiven Zellen pro mm² in der 400fachen Vergrößerung
bildet Fall Nr. 22.
KBR-Gruppe 3: Tiere mit hochgradiger Synovialitis
Bei den Hunden mit Kreuzbandriss und hochgradiger Synovialitis wurden 3894,9 CD3positive Zellen pro mm² in der 400fachen Vergrößerung gezählt (Median). Damit dominieren
in dieser Gruppe die CD3- positiven Zellen um den Faktor 1,2 über der Anzahl der IgGpositiven Zellen. Die KBR-Gruppe 3 hat im Vergleich mit den Vergleichstieren und der
KBR-Gruppe 1 einen signifikanten Unterschied bezüglich einer höheren Anzahl an CD3-
Ergebnisse
78
positiven Zellen aufzuweisen (1. p-Wert=0,0116 und 2. p-Wert=0,0111). Auch gegenüber der
KBR-Gruppe 2 (p=0,0144) und der Tiere mit Polyarthritis (Gruppe 4) liegen signifikant mehr
CD3- positive Zellen vor (p=0,0015).
4.2.4.3 Nachweis von CD3-positiven Entzündungszellen bei den Hunden mit
Polyarthritis (Gruppe 4)
Bei der Reaktion gegen das Oberflächenantigen CD3 zeigen sich die subsynovial gelegenen
positiven Lymphozyten vorwiegend disseminiert verteilt.
Die Hunde mit Polyarthritis zeigen im Median 223,96 CD3- positive Zellen pro mm² in der
400fachen Vergrößerung. Dabei überwiegen die IgG- positiven Zellen die CD3- positiven
Zellen um den Faktor 1,3 und stellen damit die dominierende Entzündungszellart bei den
Hunden mit Polyarthritis dar. Die Hunde mit Polyarthritis zeigen eine signifikant größere
Anzahl an CD3- positiven Zellen als KBR-Gruppe 1 (p=0,0218). Die Hunde mit
Kreuzbandriss und hochgradiger Synovialitis (Gruppe 3) zeigen eine signifikant höhere
Anzahl an CD3- positiven Zellen als die Tiere mit Polyarthritis (p=0,0015). Es bestehen keine
signifikanten Unterschiede bezüglich der Anzahl an CD3- positiven Zellen sowohl zwischen
den Tieren mit Polyarthritis und den Vergleichstieren als auch zur KBR-Gruppe 2
Ergebnisse
79
Abb. 25: Darstellung von CD3- positiven Zellen bei allen untersuchten Tiergruppen
Maximum
Identische Symbole
75% Quartil
symbolisieren einen
Median
25% Quartil
statistisch signifikanten
Minimum
Unterschied (p < 0,05)
Ausreißer
Ergebnisse
80
IgG und CD3
4000
3500
3000
Vergleichstiere
Gruppe 1
Gruppe 2
Gruppe 3
Gruppe 4
pos. Zellen 2500
pro
2000
mm²
1500
1000
500
0
IgG
CD3
Abb. 26: IgG- und CD3- positive Entzündungzellen im Vergleich bei allen untersuchten
Tiergruppen
Abkürzung: Gruppe 1 = KBR-Tiere mit geringgradiger Entzündung, Gruppe 2 = KBR-Tiere mit
mittelgradiger Entzündung, Gruppe 3 = KBR-Tiere mit hochgradiger Entzündung, Gruppe 4 = Tiere
mit Polyarthritis.
Darstellung des Medians positiver Zellen pro mm² in der 400fachen Vergrößerung.
Ergebnisse
4.2.5 Immunhistochemischer
81
Nachweis
des
Ki-67-
Antigens
bei
Entzündungszellen
Bei dem immunhistologischen Nachweis des Ki-67- Antigens bei Lymphozyten und
Plasmazellen sind positive Kerne dunkelbraun gefärbt. Bemerkenswert sind dabei die
Nukleoli, welche durch eine tiefere dunkelbraune Färbung besonders auffallen. Zu erwähnen
sind außerdem geringgradig braun gefärbte Zellkerne von Lymphozyten und Plasmazellen,
welche aufgrund ihrer schwach positiven Reaktionsintensität nicht in die Bewertung
miteinbezogen wurden. Gezählt wurden sowohl Zellen mit lymphoidem Aussehen als auch
Zellen mit plasmazytoidem Aussehen. Die Verteilung der Ki-67- positiven Zellen reicht dabei
von disseminiert bis akzentuiert perivaskulär. Außerdem lag im subsynovialen Stroma eine
positive Färbung bei zahlreichen Endothelzellen, Fibrozyten und Makrophagen vor. Abb. 28
stellt die Anzahl der Ki-67- positiven Entzündungszellen wie Lymphozyten und Plasmazellen
bei allen untersuchten Tiergruppen grafisch dar. Im Anhang unter 9.3 in Tabelle 15 sind die
ermittelten Mediane und Quantile aller Tiergruppen zu finden, in Tabelle 17 sind die p-Werte
einzusehen.
4.2.5.1 Nachweis des Ki-67-Antigens bei Entzündungszellen der Vergleichstiere
Die vereinzelten Ki-67- positiv gefärbten Zellkerne liegen disseminiert in der Subsynovialis
vor, bei 4 Tieren sind jeweils auf einer Seite und bei Fall Nr. 3 beidseits keine Ki-67positiven Zellen vorhanden.
Bei den Vergleichstieren liegt eine geringe Proliferationsaktivität von 0,1 positiven Zellen pro
mm² in der 400fachen Vergrößerung vor (Median). Eine signifikant höhere Anzahl an Ki-67positiven Entzündungszellen als bei der Gruppe der Vergleichstiere liegt bei KBR-Gruppe 1
(p=0,0001), KBR-Gruppe 2 (p=0,0015), KBR-Gruppe 3 (p=0,0002) und der Gruppe 4 vor
(p=0,0004). Der Ausreißerwert von 86,32 Ki-67- positiven Zellen pro mm² in der 400fachen
Vergrößerung stammt von Fall Nr. 6 links.
Ergebnisse
82
4.2.5.2 Nachweis des Ki-67-Antigens bei Entzündungszellen der Hunde mit
Kreuzbandriss
Die Verteilung von Ki-67- positiven Lymphozyten und Plasmazellen zeigt bei allen
Kreuzbandrissgruppen mehrheitlich eine disseminierte Verteilung, dabei kommt es auch
gelegentlich zu perivaskulären Zellansammlungen. Die Proliferationsaktivität bei Hunden mit
Kreuzbandriss und Synovialitis ist positiv korreliert mit ansteigendem Entzündungsgrad.
KBR-Gruppe 1: Hunde mit geringgradiger Synovialitis
Bei KBR-Gruppe 1 zeigt sich eine Proliferationsaktivität von 210,6 Entzündungszellen pro
mm² in der 400fachen Vergrößerung (Median). Die KBR-Gruppe 1 weist dabei signifikant
mehr proliferierende Entzündungszellen auf als die Gruppe der Vergleichstiere (p< 0,0001)
und signifikant weniger proliferierende Entzündungszellen als KBR-Gruppe 2 (p=0,0194) und
als KBR-Gruppe 3 (p=0,0043). Kein signifikanter Unterschied besteht zwischen KBR-Gruppe
1 und Gruppe 4.
KBR-Gruppe 2: Hunde mit mittelgradiger Synovialitis
Der Median der Gruppe 2 beträgt 634,3 positive Entzündungszellen pro mm² in der 400fachen
Vergrößerung und hat sich damit um die 3fache Anzahl Ki-67- positiver Entzündungszellen
der KBR-Gruppe 1 gesteigert. Der Wert ist signifikant höher als die Werte der Vergleichstiere
(p=0,0015) und der KBR-Gruppe 1 (p=0,0194). Jedoch sind signifikant weniger Ki-67positive Entzündungszellen vorhanden als bei der KBR-Gruppe 3 (p=0,0412). Es besteht kein
signifikanter Unterschied bezüglich der Anzahl Ki-67- positiver Entzündungszellen zur
Gruppe 4.
KBR-Gruppe 3: Hunde mit hochgradiger Synovialitis
Die stärkste Proliferationsaktivität von 1285,3 positiven Entzündungszellen pro mm²
(Median) wurde bei der KBR-Gruppe 3 ermittelt, wobei gegenüber der KBR-Gruppe 1 eine
Steigerung um den Faktor 6,1 vorliegt und gegenüber der KBR-Gruppe 2 die doppelte Anzahl
von Ki-67- positiven Entzündungszellen existiert. Signifikante Unterschiede sind zu den
Vergleichstieren (p=0,0002), zur KBR-Gruppe 1 (p=0,0043), zur KBR-Gruppe 2 (0,0412)
Ergebnisse
83
und zur Gruppe 4 (p=0,0169) vorhanden. Der Ausreißerwert von 2920,56 Ki-67- positiven
Zellen pro mm² in der 400fachen Vergrößerung stammt von Fall Nr. 31. In Abb. 27 wird die
Proliferationsaktivität von Entzündungszellen eines Falles der KBR-Gruppe 3 dargestellt.
Abb. 27: Ki-67- Immunreaktivität in der Synovialmembran eines Hundes mit KBR und hgr.
Synovialitis; Ki-67- positive Zellen sowohl in der Synovialdeckzellschicht als auch subsynovial
im Entzündungszellinfiltrat; Fall Nr. 30; Proliferationsmarker Ki-67; 100fache Vergrößerung.
4.2.5.3 Nachweis des Ki-67- Antigens bei Hunden mit Polyarthritis (Gruppe 4)
In dieser Gruppe herrscht überwiegend ein disseminiertes Verteilungsmuster mit teilweise
geringgradigen fokalen perivaskulären Infiltraten positiver Zellen vor. Mittelgradige
multifokale perivaskuläre Infiltrate Ki-67- positiver Entzündungszellen sind bei den Fällen
Nr. 34 und Nr. 35 zu sehen.
Die Tiere mit Polyarthritis zeigen eine Proliferationsaktivität von 486,6 Ki-67- positiven
Entzündungszellen pro mm² in der 400fachen Vergrößerung (Median). Der Wert liegt dabei
zwischen dem Wert der KBR-Gruppe 1 und der KBR-Gruppe 2. Es liegen signifikant mehr
positive Entzündungszellen als bei den Vergleichstieren (p=0,0004) vor, und es ist signifikant
weniger Proliferationsaktivität als bei der KBR-Gruppe 3 nachzuweisen (p=0,0169). Keine
signifikanten Unterschiede bestehen zur KBR-Gruppe 1 und KBR-Gruppe 2.
Ergebnisse
84
Abb. 28: Darstellung der Ki-67- positiven Entzündungszellen bei allen untersuchten
Tiergruppen
Maximum
Identische Symbole
75% Quartil
Median
25% Quartil
Minimum
symbolisieren einen
statistisch signifikanten
Unterschied (p < 0,05)
Ausreißer
Ergebnisse
85
4.2.6 Immunhistochemischer Nachweis von Ki-67 CD3- positiven Zellen
Die immunhistochemische Doppelfärbung stellt positive lymphoide Zellen mit einem
dunkelbraunen Kern und rotem Zytoplasma dar. Abb. 29 stellt die Anzahl Ki-67 CD3positiver Zellen bei allen untersuchten Tiergruppen grafisch dar und Abb. 30 zeigt die
Proliferationsaktivität der CD3- Gesamtpopulation jeder einzelnen untersuchten Gruppe in %.
Im Anhang unter 9.3 in Tabelle 15 sind die ermittelten Mediane und Quantile aller
Tiergruppen zu finden, in Tabelle 18 befinden sich die p-Werte.
4.2.6.1 Nachweis von Ki-67 CD3- positiven Zellen bei den Vergleichstieren
Bei keinem der Vergleichstiere konnten Ki-67 CD3- positive Zellen nachgewiesen werden.
Eine signifikant höhere Anzahl an Ki-67 CD3- positiven Zellen als die Gruppe der
Vergleichstiere zeigt die KBR-Gruppe 1 (p=0,0003), die KBR-Gruppe 3 (p=0,0270) und auch
die Gruppe 4 (p=0,0118). Keine signifikanten Differenzen bezüglich der Anzahl Ki-67 CD3positiver Zellen bestehen zwischen den Vergleichstieren und KBR-Gruppe 2.
4.2.6.2 Nachweis von Ki-67 CD3-positiven Zellen bei Tieren mit Kreuzbandriss
Die Ki-67 CD3- positiven Zellen sind subsynovial gelegen und zeigen eine mehrheitlich
disseminierte und teilweise auch perivaskuläre Verteilung.
KBR-Gruppe 1: Hunde mit geringgradiger Synovialitis
Bei den 10 Tieren sind 82,53 Ki-67 CD3- positive Zellen pro mm² vorhanden (Median). Es
proliferieren 50,9 % der CD3- positiven Zellen dieser Gruppe. Der Median der KBR-Gruppe
1 unterscheidet sich in der höheren Anzahl an positiven Zellen signifikant von der Gruppe der
Vergleichstiere (p=0,0003). Keine signifikanten Unterschiede bestehen zu der KBR-Gruppe 2
und KBR-Gruppe 3 und zur Gruppe 4. Fall Nr. 9 zeigt einen Extremwert von 550,12 Ki-67
CD3- positiven Zellen pro mm² in der 400fachen Vergrößerung.
Ergebnisse
86
KBR-Gruppe 2: Hunde mit mittelgradiger Synovialitis
Der ermittelte Median dieser Gruppe beträgt 27,30 positive Zellen pro mm² in der 400fachen
Vergrößerung. Gemessen an der Gesamtpopulation der gezählten CD3- positiven Zellen
dieser Gruppe zeigen 14,4% der Entzündungszellen Proliferationsaktivität. Es bestehen keine
signifikanten Unterschiede zu der Gruppe der Vergleichstiere, der KBR-Gruppe 1, der KBRGruppe 3 sowie zur Gruppe 4.
KBR-Gruppe 3: Hunde mit hochgradiger Synovialitis
Bei den Hunden mit Kreuzbandriss und einer hochgradigen Synovialitis sind 55,06 Zellen pro
mm² Ki-67 CD3- positiv (Median). Demnach proliferieren 1,2% der CD3- positiven Zellen
dieser KBR-Gruppe. Zur Gruppe der Vergleichstiere sind signifikant mehr Ki-67 CD3positive Zellen vorhanden (p=0,0270) Es besteht kein signifikanter Unterschied zur KBRGruppe 1, KBR-Gruppe 2 und zur Gruppe 4.
4.2.6.3 Nachweis von Ki-67 CD3- positiven Zellen bei Hunden mit Polyarthritis
(Gruppe 4)
Bei der Reaktion gegen das Ki-67 CD3- Antigen zeigen sich die vereinzelten positiven
lymphoiden Zellen subsynovial und disseminiert verteilt.
Bei der Gruppe 4 wurden 23,36 Ki-67 CD3- positive Zellen pro mm² gezählt. An der
Gesamtpopulation der CD3- positiven Zellen der Gruppe 4 beträgt der Anteil an
proliferierenden Zellen 9,9%. Es liegt somit eine signifikant größere Anzahl an Ki-67 CD3positiven Zellen als bei den Vergleichstieren vor (p=0,0118). Es bestehen keinerlei
Signifikanzen zu KBR-Gruppe 1, KBR-Gruppe 2 und KBR-Gruppe 3. In. Abb. 31, Abb. 32
und Abb. 33 ist die Immunreaktivität einer Ki-67 CD3- positiven Zelle bei 2 Fällen mit
Polyarthritis dargestellt.
Ergebnisse
87
Abb. 29: Darstellung der Ki-67 CD3- positiven Zellen bei allen untersuchten Tiergruppen
Maximum
Identische Symbole
75% Quartil
symbolisieren einen
Median
25% Quartil
statistisch signifikanten
Minimum
Unterschied (p < 0,05)
Extremwert
Ausreißer
Ergebnisse
88
Proliferationsaktivität Ki-67 CD3
60
40
20
0
Proliferationsaktivität Ki-67 CD 3
Abb. 30: Proliferationsaktivität in % der CD3- Gesamtpopulation bei allen untersuchten
Tiergruppen;
Gruppe 1 = KBR-Tiere mit geringgradiger Entzündung, Gruppe 2 = KBR-Tiere mit
mittelgradiger Entzündung, Gruppe 3 = KBR-Tiere mit hochgradiger Entzündung, Gruppe 4 =
Tiere mit Polyarthritis.
Ergebnisse
89
Abb. 31: Ki-67 CD3- Immunreaktivität in einer hgr. entzündlich veränderten Synovialis; eine
Ki-67 CD3- positive Zelle (Pfeil), zahlreiche CD3- positive Zellen (rotes Zytoplasma) und
einige Ki-67- positive Zellen (brauner Kern); Fall Nr. 32; Ki-67 CD3 Doppelfärbung; 200fache
Vergrößerung.
Abb. 32:
Ausschnittsvergrößerung von Abb.
31; eine
proliferierende
CD3- positive Zelle
(Pfeilspitze) im
Entzündungsinfiltrat
umgeben von
einigen
proliferierenden
Entzündungszellen
(langer Pfeil) und
nicht
proliferierenden
CD3- positiven
Zellen
(kurzer Pfeil); Fall Nr. 32; Ki-67 CD3 Doppelfärbung; 1000fache Vergrößerung.
Ergebnisse
90
Abb. 33: Ki-67 CD3- Immunreaktivität; perivaskuläres Entzündungszellinfiltrat; einzelne
proliferierende CD3- positive Zelle (Pfeilspitze) und zahlreiche nicht proliferierende CD3positive Zellen (lange Pfeile) und proliferierende Entzündungszellen (kurzer Pfeil); Fall Nr. 34;
Ki-67 CD3 Doppelfärbung; 400fache Vergrößerung.
4.2.7 Immunhistochemischer Nachweis von Ki-67 IgG- positiven Zellen
Das Ki-67- Antigen zeigt in der Doppelfärbung dunkelbraun gefärbte Kerne, das IgGAntigen wird durch rot gefärbtes Zytoplasma dargestellt. Positive Plasmazellen sind durch
den exzentrischen Zellkern identifizierbar. Abb. 34 stellt grafisch die Anzahl der Ki-67 IgGpositiven Zellen pro mm² in der 400fachen Vergrößerung dar und Abb. 35 veranschaulicht die
Proliferationsaktivität der IgG- Gesamtpopulation bei allen untersuchten Tiergruppen in %.
Im Anhang unter 9.3 in Tabelle 15 sind die ermittelten Mediane und Quantile aller
Tiergruppen zu finden, in Tabelle 18 sind die p-Werte einzusehen.
Ergebnisse
91
4.2.7.1 Nachweis von Ki-67 IgG- positiven Zellen bei den Vergleichstieren
Bei 2 Fällen liegen Ki-67 IgG- positive Zellen vor (Extremwert von 15,88 positiven Zellen
bei Fall Nr. 1 links und Extremwert von 9,99 Ki-67 IgG- positiven Zellen bei Fall Nr. 7).
Der Median liegt hier bei 0 positiven Zellen pro mm² in der 400fachen Vergrößerung. Ein
Anteil von 0,4% der IgG- positiven Zellen dieser Gruppe zeigt Proliferationsaktivität. Damit
weisen die Vergleichstiere signifikant weniger Ki-67 IgG- positive Zellen auf als die KBRGruppe 3 (p= 0,0095) und als die Hunde mit Polyarthritis (p=0,0128). Statistisch auffällig ist
die geringere Anzahl an positiven Zellen gegenüber der KBR-Gruppe 2 (p=0,1068). Keinerlei
Signifikanzen ergeben sich gegenüber der KBR-Gruppe 1.
4.2.7.2 Nachweis von Ki-67 IgG- positiven Zellen bei Hunden mit Kreuzbandriss
Bei den Tieren mit Kreuzbandriss reicht die Anzahl und Verteilung der Ki-67 IgG- positiven
Zellen von vereinzelten, disseminierten, positiven Zellen bis hin zu geringgradigen, fokalen,
perivaskulären Ansammlungen von Ki-67 IgG- positiven Zellen (Fall Nr. 27). Es besteht eine
positive Korrelation einer höheren Anzahl Ki-67 IgG- positiver Zellen mit steigendem
Entzündungsgrad und auch mit einer zunehmenden fokalen perivaskulären Verteilung.
KBR-Gruppe 1: Tiere mit geringgradiger Synovialitis
Diese 10 Tiere weisen ebenfalls einen Median von 0 positiven Zellen pro mm² auf. Gemessen
an der Gesamtpopulation der IgG- positiven Zellen proliferieren davon 6,8% Zellen. Eine
signifikant größere Anzahl an positiven Zellen zeigt die KBR-Gruppe 3 mit einem p-Wert von
0,0394. Als statistisch auffällig kann man den Unterschied zu der höheren Anzahl an Ki-67
IgG- positiven Zellen der KBR-Gruppe 2 bezeichnen (p=0,0576). Kein signifikanter
Unterschied besteht zu der Gruppe der Vergleichstiere und zur Gruppe 4. Außerdem sind 2
Extremwerte bei Fall Nr.12 mit 139,42 positiven Zellen und bei Fall Nr. 18 mit 239,30 Ki-67
IgG- positiven Zellen pro mm² in der 400fachen Vergrößerung vorhanden.
Ergebnisse
92
KBR-Gruppe 2: Tiere mit mittelgradiger Synovialitis
Hier wird ein Wert von 7,5 positiven Zellen pro mm² in der 400fachen Vergrößerung erreicht
(Median). Damit proliferieren 4,1% der IgG- positiven Zellen dieser Gruppe. Statistisch
auffällig mehr positive Zellen weist die KBR-Gruppe 2 zur KBR- Gruppe 1 auf (p=0,0576)
und auch zur Gruppe der Vergleichstiere (p=0,1068). Kein signifikanter Unterschied ergibt
sich zur KBR-Gruppe 3 und zur Gruppe 4.
KBR-Gruppe 3: Tiere mit hochgradiger Synovialitis
Die KBR-Gruppe 3 zeigt 76,88 Ki-67 IgG- positive Zellen pro mm² in der 400-fachen
Vergrößerung (Median). Dieser Wert ist eine 10,3fache Steigerung des Wertes von KBRGruppe 2. 6,8% der IgG- positiven Zellen dieser Gruppe befinden sich in Proliferation.
Signifikante Unterschiede in der größeren Anzahl an positiven Zellen bestehen zu der KBRGruppe 1 (p=0,0394) und der Gruppe der Vergleichstiere (p=0,0095). Keine Signifikanz
besteht zu der KBR-Gruppe 2 und zur Gruppe 4. In Abb.36 und Abb.37 sind deutlich
proliferierende Plasmazellen bei einem Fall mit Kreuzbandriss und hochgradiger Synovialitis
zu erkennen.
4.2.7.3 Nachweis von Ki-67 IgG- positiven Zellen bei Hunden mit Polyarthritis
(Gruppe 4)
Bei der Reaktion gegen das Ki-67 IgG- Antigen zeigen sich vereinzelte disseminierte Zellen
bis hin zu geringgradigen fokalen perivaskulären Zellansammlungen positiv.
Bei den Hunden mit Polyarthritis sind 49,8 Ki-67 IgG- positive Zellen pro mm² vorhanden
(Median). Die Proliferationsaktivität liegt hier bei 26,27% der Gesamtanzahl IgG- positiver
Zellen und stellt damit von allen Gruppen die stärkste Proliferationsaktivität dar. Ein
signifikanter Unterschied in der höheren Anzahl an positiven Zellen besteht zur Gruppe der
Vergleichstiere (p=0,0128). Ein Ausreißerwert von 312,85 positiven Zellen pro mm² in der
400fachen Vergrößerung liegt bei Fall Nr. 34 vor. In Abb. 38 ist als Beispiel die Ki-67 IgGImmunreaktivität von Fall Nr. 32 dargestellt.
Ergebnisse
93
Abb. 34: Darstellung von Ki-67 IgG- positiven Zellen bei allen untersuchten Tiergruppen
Maximum
Identische Symbole
75%
Quartil
Median
25% Quartil
Minimum
zeigen einen
statistisch signifikanten
Unterschied (p < 0,05)
Ausreißer
Extremwert
Ergebnisse
94
Proliferationsaktivität Ki-67 IgG
30
25
20
15
10
Proliferationsaktivität Ki-67 IgG
5
0
Abb. 35: Proliferationsaktivität der IgG- Gesamtpopulation jeder untersuchten Tiergruppe in %
Anmerkung: Gruppe 1= KBR-Tiere mit geringgradiger Entzündung, Gruppe 2= KBR-Tiere mit
mittelgradiger Entzündung, Gruppe 3= KBR-Tiere mit hochgradiger Entzündung, Gruppe 4= Tiere
mit Polyarthritis.
Ergebnisse
95
Abb. 36: Ki-67 IgG- Immunreaktivität bei einem Hund mit KBR und hgr. Synovialitis; perivaskulär
befinden sich viele proliferierende Entzündungszellen;(braune Kerne), IgG- positive Zellen (rotes
Zytoplasma) und auch proliferierende IgG- positive Zellen (siehe Abb.37); Fall Nr. 27; Ki-67 IgG
Doppelfärbung; 100fache Vergrößerung.
Abb. 37: Ausschnittvergrößerung aus Abb. 36; perivaskuläres Entzündungszellinfiltrat mit vielen
proliferierenden IgG- positiven Plasmazellen (Pfeilspitzen). Des weiteren sind nicht proliferierende
IgG- positive Plasmazellen (langer Pfeil) und proliferierende andersartige Entzündungszellen (kurze
Pfeile) zu sehen; Fall Nr. 27; Ki-67 IgG- Doppelfärbung; 400fache Vergrößerung.
Ergebnisse
96
Abb. 38: Ki-67 IgG- Immunreaktivität in der Synovialmembran eines Hundes mit Polyarthritis;
perivaskuläres Entzündungsinfiltrat; einige proliferierende IgG- positive Plasmazellen (Pfeilspitzen)
und proliferierende andersartige Entzündungszelle (kurzer Pfeil) und nicht proliferierende IgGpositive Zelle (langer Pfeil); Fall Nr.32; Ki-67 IgG- Doppelfärbung; 400fache Vergrößerung.
Diskussion
97
5 Diskussion
In dieser Studie wurden insgesamt 23 Synovialisproben von Hunden mit Kreuzbandruptur
und Synovialitis (eingeteilt nach Entzündungsgrad in 3 Kreuzbandrissgruppen) und 6
Synovialisproben von Hunden mit Polyarthritis histologisch und immunhistochemisch
untersucht. Ziel war dabei das Vorkommen von Proliferationsaktivität und Apoptose sowohl
bei Synovialdeckzellen als auch bei Entzündungszellen wie Lymphozyten und Plasmazellen
in der Synovialmembran zu untersuchen und zu charakterisieren. Eine Gruppe von 8 Hunden
diente als Vergleichsmaterial.
Unbestritten ist, dass Faktoren wie bestimmte Rassen, erhöhtes Gewicht und fortgeschrittenes
Alter prädisponierend für einen Kreuzbandriss sein können. Das Durchschnittsalter und –
gewicht bei der vorliegenden Untersuchung aller 3 KBR-Gruppen lag bei 5,5 Jahren und 38,8
kg. Die Befunde bestätigen die Untersuchungsergebnisse von LEMBURG et al. (2001) und
WHITEHAIR et al. (1993), dass oft Hunde mit höherem Gewicht und mittleren Alters
betroffen sind. Dafür sprechen auch schon die histologischen Untersuchungergebnisse am
Kreuzband von VASSEUR et al. (1985). Diese zeigen, dass degenerative Veränderungen des
Kreuzbandes bei Hunden vorhanden sind, welche über 5 Jahre alt sind und über 15 kg wiegen.
Bei der vorliegenden Studie lag eine deutliche positive Korrelation des Gewichtes mit dem
Entzündungsgrad der Kreuzbandrisspatienten vor. Während in KBR-Gruppe 1 (Kreuzbandriss
und geringgradige Synovialitis) noch ein Durchschnittsgewicht von 33,4 kg vorherrschte, lag
das Durchschnittsgewicht bei der KBR-Gruppe 3 (Kreuzbandriss und hochgradige
Synovialitis) schon bei 44,6 kg. GALLOWAY und LESTER (1995) stellten fest, dass eine
Korrelation von gravierenderen histopathologischen Veränderungen zwischen höherem
Körpergewicht und jüngerem Alter und dem weiblichen Geschlecht besteht. Bei der
vorliegenden
Studie
waren
56,5%
der
Kreuzbandrisspatienten
Rüden;
eine
Geschlechtsdiposition der Hündinnen für einen Kreuzbandriss wie auch von HARASEN
(2003) und VASSEUR et al. (1985) vermutet, ließ sich nicht nachweisen. Denkbar ist, dass
eine größere Belastung durch das erhöhte Gewicht früh zu Knorpeldefekten im Gelenk führen
kann, was die Freisetzung von Antigenmaterial und Enzymen zur Folge hat, die wiederum
destruktiv auf Knochen und Band einwirken können. Als weitere mögliche Ursachen für
unterschiedliche Entzündungsgrade sind Lahmheitsdauer, partielle oder totale Ruptur des
Kreuzbandes und Dauer und Art der medikamentösen Vorbehandlung zu nennen.
Diskussion
98
GALLOWAY und LESTER (1995) beschrieben außerdem, dass Synovialisproben, welche
aus einer medialen Lokalisation entnommen wurden, schwerere entzündliche Veränderungen
aufwiesen als die Proben aus dem lateralen Kniegelenkskompartiment. Das in dieser Arbeit
untersuchte Material wurde einheitlich aus der gleichen Lokalisation von lateral entnommen,
deshalb kann hierzu nicht Stellung genommen werden. Hinsichtlich des Alters bestand kein
Unterschied zwischen den einzelnen KBR-Gruppen; betroffen waren durchschnittlich Hunde
zwischen 5 und 6 Jahren. 40% der Tiere in KBR-Gruppe 1 sind zwischen 1 und 2 Jahren alt.
Sie gehörten den Rassen Boxer, Setter, Labrador und Bulldogge an. DUVAL et al. (1999)
beschrieben eine Altersprädisposition für unter 2 Jahre alte und schwere Hunde.
Übereinstimmend mit den Untersuchungen von WHITEHAIR et al. (1993) und LEMBURG
et al. (2001) zeigte sich auch in dieser Studie bei den Tieren mit Kreuzbandriss, dass
vornehmlich das linke Kniegelenk betroffen war (69,6%).
5.1 Histopathologische Befunde an der Synovialmembran
Viele Studien demonstrierten in der Vergangenheit die häufige Vergesellschaftung des
Kreuzbandrisses
mit
einer
Synovialitis.
Die
Entzündungszellinfiltration
bei
der
Kreuzbandruptur des Hundes besteht häufig aus perivaskulär gelegenen Plasmazellen,
Lymphozyten und Makrophagen. Aufgrund der Art der Zellpopulation und auch der
Anwesenheit von vielen MHCII- positiven Zellen und IgG- und IgM- positiven Plasmazellen
und der oft nodulären Anordnung vermuten einige Autoren einen immunologischen
Hintergrund bei der Pathogenese des Kreuzbandrisses des Hundes (LEMBURG et al. 2001;
HEWICKER-TRAUTWEIN et al. 1999; GALLOWAY und LESTER 1995). Umstritten ist,
ob die Entzündungszellinfiltration in der Synovialmembran schon vor dem Kreuzbandriss
besteht und zusammen mit degenerativen Verschleißerscheinungen letztendlich zum
Kreuzbandriss führt oder ob die Entzündungszellinfiltration als sekundäres Merkmal nach der
Ruptur auftritt. Auffallend war bei den histopathologischen Untersuchungen der
Synovialmembran dieser Studie, dass auch bei einem Vergleichstier eine mittelgradige
Entzündungszellinfiltration
beobachtet
werden
konnte.
Außerdem
waren
bei
3
Vergleichstieren geringgradige lymphozytäre Zellinfiltrate und häufig auch geringgradige
Makrophagenansammlungen zu sehen. Ob dies ein Zufallsbefund ist oder nicht, müsste
Diskussion
99
mittels histopathologischer Untersuchungen einer größeren Anzahl von Vergleichstieren als in
dieser Studie geklärt werden. Der größte Teil der Kreuzbandrisspatienten der vorliegenden
Studie (43,5%) wies eine geringgradige Entzündungszellinfiltration in der Synovialmembran
bei sowohl disseminiertem als auch multifokalem Verteilungsmuster nach. Der Anteil des
Plasmazellinfiltrates variierte dabei von 10 bis 80%. Auch bei den Untersuchungen von
LEMBURG
et
al.
(2001)
traten
überwiegend
(60%)
geringgradige
Entzündungszellinfiltrationen in der Synovialmembran bei Hunden nach Kreuzbandruptur bei
disseminiertem Verteilungsmuster auf. Bei 21,7% des Untersuchungsmaterials der Hunde mit
Kreuzbandriss in der vorliegenden Studie lag eine mittelgradige Entzündungszellinfiltration
vor. Eine hochgradige Entzündungszellinfiltration zeigten 38,4% der Hunde mit
Kreuzbandruptur in dieser Studie. Die Tendenz zu einem multifokalem und weniger
disseminiertem Verteilungsmuster der Entzündungszellen stieg mit dem Grad der Synovialitis
an; so war bei den Hunden der KBR-Gruppe 3 ein ausschließlich multifokales
Verteilungsmuster vorhanden. Bei den vorliegenden Untersuchungen zeigten die Hunde mit
Kreuzbandriss und Synovialitis außerdem eine positive Korrelation des Grades der
Hyperplasie mit dem Entzündungsgrad in der Synovialmembran. In dieser Studie lässt sich
das Vorhandensein von Hämosiderin mit stattgehabten Blutungen in der Synovialmembran
erklären. Dabei stellte sich eine positive Korrelation zwischen dem Vorhandensein von
Hämosiderin und dem Entzündungsgrad heraus. Während in KBR-Gruppe 1 mit
geringgradiger Synovialitis keinerlei Hämosiderin vorhanden war, wiesen 20% der
Synovialgewebeproben in KBR-Gruppe 2 und 25% in KBR-Gruppe 3 Hämosiderin auf. Die
Ergebnisse stehen im Einklang mit den Untersuchungen von FABRY (1989), welcher
demonstrierte, dass nach experimenteller Durchtrennung des Kreuzbandes auftretende
Blutungen zu stärkeren entzündlichen Veränderungen der Synovialmembran führen. Auch bei
LEMBURG et al. (2001) zeigte sich eine positive Korrelation zwischen dem Vorhandensein
von Hämosiderinablagerungen und dem Grad der Entzündung. MAY et al. (1992)
beobachteten bei ihren Untersuchungen, dass in Synovialisproben von Hunden mit
Kreuzbandruptur wesentlich mildere Entzündungszellinfiltrate und Synoviozytenhyperplasien
zu finden waren, als bei Hunden mit chronisch-rheumatoider Arthritis. In der vorliegenden
Studie ist bei 50% der Tiere mit Polyarthritis in der Synovialmembran eine mittelgradige
Entzündungszellinfiltration vorhanden und 16,6% zeigen eine hochgradige Synovialitis. Diese
Diskussion
100
Ergebnisse entsprechen den Beobachtungen von MAY et al. (1992), da bei den Tieren mit
Kreuzbandriss
der
vorliegenden
Studie
überwiegend
eine
geringgradige
Entzündungszellinfiltration vorliegt, diese also eine mildere Synovialitis zeigen als die Tiere
mit Polyarthritis. Auch die Synovialdeckzellhyperplasie aller Tiere mit Kreuzbandriss dieser
Studie fällt mit im Durchschnitt 1-3 Reihen milder aus als bei den Tieren mit Polyarthritis mit
2-4 Reihen. Im Gegensatz zu dem Untersuchungsmaterial von MAY et al. (1992) war nicht
bei allen Tieren mit Polyarthritis dieser Studie eine chronische rheumatoide Arthritis
diagnostiziert worden, deshalb ist ein direkter Vergleich nicht möglich. Der Anteil der
Plasmazellen am Gesamtinfiltrat ist wie bei den Tieren mit Kreuzbandriss nicht mit dem
Entzündungsgrad korreliert. Ebenso wie bei den Tieren mit Kreuzbandriss und Synovialitis
fällt
eine
Tendenz
zum
multifokalem
perivaskulären
Verteilungsmuster
der
Entzündungszellen bei hochgradigen Infiltrationen auf.
5.2 Proliferation und Apoptose der Synovialdeckzellen
Eine Hyperplasie der Synovialmembran wird sowohl beim Menschen als auch beim Hund bei
der rheumatoiden Arthritis und auch bei Fällen mit Kreuzbandrupturen und Synovialitiden
beobachtet.
Bisher
ist
unklar,
ob
die
Hyperplasie
Ursache
einer
gesteigerten
Proliferationsaktivität und/oder einer verminderten Apoptose der Synovialdeckzellen ist. In
der Literatur gibt es hauptsächlich Erkenntnisse über die Proliferationsaktivität der
Synovialdeckzellen beim Menschen und hier auch vorwiegend am Beispiel der rheumatoiden
Arthritis. Dabei stellte sich heraus, dass bei den Synovialdeckzellen von Patienten mit
Osteoarthritis und rheumatoider Arthritis eine Proliferationsaktivität vorhanden ist, diese
jedoch
im
Vergleich
zur
Proliferationsaktivität
der
Synovialdeckzellen
beim
Synovialzellsarkom gering ist (SCHASER et al. 1996). Einige Autoren vermuten, dass nicht
nur eine gesteigerte Proliferationsaktivität der Synovialdeckzellen zu einer Hyperplasie führt,
sondern auch eine Migration von Stammzellen über den Blutweg eine Rolle spielt (HOWAT
et al. 1987; KAMIMOTO et al. 2003). Erkenntnisse über die Proliferation und die Apoptose
der Synovialdeckzellen bei Hunden mit Synovialitiden liegen derzeit nicht vor.
Diskussion
101
In dieser Studie wurde die Synovialmembran sowohl von Hunden mit Kreuzbandruptur und
einer Synovialitis unterschiedlichen Grades als auch von Hunden mit Polyarthritis
immunhistochemisch mit dem Proliferationsmarker Ki-67 und dem Apoptosemarker Caspase3 untersucht.
5.2.1 Proliferation der Synovialdeckzellen bei Hunden mit Kreuzbandriss
und Synovialitis
Zwei Vergleichstiere (Fall 1 und Fall 4) wiesen eine geringgradige Proliferationsaktivität der
Synovialdeckzellen auf, bei den anderen Vergleichstieren war nur vereinzelt oder überhaupt
keine Proliferation zu beobachten. Alle KBR-Gruppen unterschieden sich in der
Proliferationsaktivität der Synovialdeckzellen signifikant von den Vergleichstieren. Bei den
Tieren mit Kreuzbandriss zeigte sich eine positive Korrelation der Proliferationsaktivität der
Synovialdeckzellen
mit
steigendem
Entzündungsgrad
und
der
Hyperplasie
der
Synovialmembran; die stärkste Proliferationsaktivität der Synovialdeckzellen war somit bei
der KBR-Gruppe 3 vorhanden. Die KBR-Gruppe 2 besaß eine geringgradig schwächere
Proliferationsaktivität der Synovialdeckzellen als Gruppe 1. Dieses Ergebnis ist eventuell auf
die kleine Stichprobenzahl (n=5) der Tiere in KBR-Gruppe 2 zurückzuführen.
Die
positive
Beziehung
zwischen
Entzündungsgrad
der
Synovialmembran
und
Proliferationsaktivität der Synovialdeckzellen bei den Hunden mit Kreuzbandriss und
Synovialitis könnte darauf hinweisen, dass proinflammatorische Zytokine wie TNF-α, IL-1ß
und IL-6 Synovialdeckzellen aktivieren. Die Herkunft dieser proinflammatorischen Zytokine
ist umstritten. Während einige Autoren der Meinung sind, dass IL-1ß, IL-6 und TNF-α
autokrin in den Synovialdeckzellen produziert werden (HASANUMA et al. 1998; GOTO et
al. 1987), zeigte eine aktuellere Studie von KLOCKE et al. (2005), dass die Dichte von
synovialen Makrophagen mit dem Schweregrad der Osteoarthritis bei Hunden und der
Anwesenheit von IL-6 und TNF-α assoziiert ist. Die Autoren vermuten dabei, dass diese
Makrophagen die Quelle der proinflammatorischen Zytokine sind. In der vorliegenden Studie
waren Makrophagen nicht Gegenstand der Untersuchungen, deshalb kann keine Aussage über
Diskussion
102
die Anzahl von Makrophagen und den Entzündungsgrad der Synovialmembran und wiederum
über eine Korrelation zur Proliferationsaktivität von Synovialdeckzellen getroffen werden.
5.2.2 Proliferation der Synovialdeckzellen bei Hunden mit Polyarthritis
Die Proliferationsaktivität der Synovialdeckzellen war bei den Hunden mit Polyarthritis im
Vergleich mit den anderen Gruppen am stärksten ausgeprägt. Die Proliferationsaktivität der
Synovialdeckzellen der Tiere mit Polyarthritis unterschied sich signifikant von der
Proliferationsaktivität der Synovialdeckzellen der Vergleichstiere.
Das Vorliegen einer deutlichen Proliferationsaktivität von Synovialdeckzellen bei Hunden mit
Polyarthritis ist vergleichbar mit den Ergebnissen in humanmedizinischen Studien bei
Patienten mit rheumatoider Arthritis. KAMIMOTO et al. (2003) zeigten bei ihrem
Infektionsmodell an der Ratte mit Arthritis, dass eine Proliferationsaktivität bei beiden
Synovialdeckzelltypen zu jeweils unterschiedlichen Zeitpunkten vorhanden ist. In der
vorliegenden Studie wurden die Synovialdeckzellen morphologisch und immunhistochemisch
nicht näher charakterisiert, deshalb kann keine Aussage hinsichtlich der Proliferationsaktivität
eines bestimmten Typs der Synovialdeckzellen gemacht werden.
5.2.3 Apoptose der Synovialdeckzellen bei Tieren mit Kreuzbandriss
In den Untersuchungen mit dem Apoptosemarker Caspase-3 stellte sich heraus, dass bei den
Vergleichstieren nur bei vereinzelten Synovialdeckzellen Apoptose auftrat, während bei
Hunden der KBR-Gruppe 1 und KBR-Gruppe 2 Apoptose von Synovialdeckzellen nicht
nachweisbar war. Nur eine einzige apoptotische Synovialdeckzelle konnte in der KBRGruppe 3 bei einem Tier immunhistochemisch nachgewiesen werden. Signifikanzen waren
bei allen Gruppen sowohl zu den Vergleichstieren als auch zwischen den KBR-Gruppen nicht
vorhanden.
Diskussion
103
5.2.4 Apoptose der Synovialdeckzellen bei Tieren mit Polyarthritis
Bei den Tieren mit Polyarthritis konnte Apoptose von Synovialdeckzellen mit dem Caspase-3
Marker nicht nachgewiesen werden. Bei den Vergleichstieren lag bei vereinzelten
Synovialdeckzellen Apoptose vor. Signifikanzen zu den Vergleichstieren und zu den
einzelnen KBR-Gruppen lagen nicht vor.
5.2.5 Schlussfolgerung
zur
Proliferation
und
Apoptose
der
Synovialdeckzellen bei den KBR-Tieren und den Tieren mit
Polyarthritis
Die Ergebnisse hinsichtlich einer vorhandenen und gegenüber Vergleichstieren signifikant
vermehrten Proliferationsaktivität, sowie einer eventuell zugleich verminderten/nicht
vorhandenen Apoptose von Synovialdeckzellen sowohl bei Tieren mit Kreuzbandriss als auch
Tieren
mit
einer
Polyarthritis,
gehen
konform
mit
den
Ergebnissen
mehrerer
Veröffentlichungen in der Humanmedizin, und zwar zur rheumatoiden Arthritis
(SUGIYAMA et al. 1996; HASUNUMA et al. 1998; PERLMAN et al. 2000). Viele Autoren
vermuten, dass die Apoptose der Synovialdeckzellen bei Patienten mit rheumatoider Arthritis
durch die Expression von bcl-2, einem inhibitorischen Protein der Apoptose, supprimiert
wird. PERLMAN et al. (2000) zeigten in ihrer immunhistochemischen Untersuchung, dass
die bcl-2- Expression nicht nur bei Patienten mit rheumatoider Arthritis höher ist, als bei
Patienten mit Osteoarthrose, sondern dass die Dicke der Synovialdeckzellschicht und der
Entzündungsgrad positiv korreliert waren mit der Anzahl von bcl-2- positiven Zellen. Dabei
waren hauptsächlich Synovialdeckzellen vom Fibroblastentyp bcl-2- positiv.
Die vorliegenden Ergebnisse zeigen sowohl bei den Hunden mit Kreuzbandriss als auch bei
den Tieren mit Polyarthritis eine positive Korrelation des Grades der Hyperplasie der
Synovialmembran mit dem Grad der Proliferationsaktivität. Eine damit einhergehende
verminderte bzw. nicht vorhandene Apoptose der Synovialdeckzellen lässt sich wegen
fehlender Signifikanz der eigenen Daten nicht beweisen. Interessant wären hier
weiterführende immunhistochemische Untersuchungen bezüglich einer Expression des bcl-2Proteins in Synovialdeckzellen bei Hunden mit Synovialitiden. Weiterhin wäre es sinnvoll
Diskussion
104
immunhistochemisch mit Makrophagenmarkern zu arbeiten, um die Frage zu klären, ob
Migration von Stammzellen auch für die Hyperplasie eine Rolle spielen könnte.
5.3 Proliferation und Apoptose von Entzündungszellen
Zahlreiche
histologische
und
immunhistochemische
Untersuchungen
an
der
Synovialmembran des Hundes zeigten, dass die Kreuzbandruptur oft mit einer
lymphoplasmazellulären Entzündungsinfiltration einhergeht (HEWICKER-TRAUTWEIN et
al. 1999; LEMBURG et al. 2001). In den vorliegenden Untersuchungen galt es zu klären, ob
die Akkumulationen von Entzündungszellen durch lokale Proliferation entstehen, oder ob sie
bereits an einem anderen Ort aktiviert wurden und daraufhin hämatogen in die
Synovialmembran einwandern. In der Literatur gibt es hierüber nur Informationen aus der
Humanmedizin. KRENN et al. (1996) wiesen bei der Untersuchung der Synovialmembran
von Menschen mit rheumatoider Arthritis nach, dass proliferierende, reife B-Zellen in
Sekundärfollikeln, in kleinen follikulären Aggregaten mit follikulären dendritischen
Retikulumzellen und nahe der synovialen Intima vorhanden sind. Die Autoren vermuteten,
dass die Synovialmembran ein Ort für Antigen-abhängige Proliferation und Maturation ist.
MAGALHĂES et al. (2002) wiesen nach, dass in der Synovialmembran bei 10-23% der Fälle
von Menschen mit rheumatoider Arthritis lymphatische Follikel mit sogenannten
Keimzentren vorkommen und die B-Lymphozyten in der Lage sind, eine lokale
Keimzentrumsreaktion einzugehen. Die Autoren unterscheiden eine Keimzentrumsreaktion
(maturativer Typ) von einer Nicht-Keimzentrumsreaktion (akkumulativer Typ).
In der vorliegenden Arbeit konnten, wie auch schon bei LEMBURG et al. (2001), sowohl bei
den Hunden mit Kreuzbandriss als auch bei den Hunden mit Polyarthritis teilweise
hochgradige Akkumulationen von Lymphozyten und Plasmazellen beobachtet werden,
welche jedoch keinen Keimzentrums-ähnlichen Aufbau aufwiesen. MAY et al. (1992)
beobachteten dagegen das Vorkommen von Keimzentren in der Synovialmembran bei
Hunden mit rheumatoider Arthritis.
Diskussion
105
5.3.1 CD3- positive T-Lymphozyten und IgG- positive Plasmazellen in der
Synovialmembran
von
Hunden
mit
Kreuzbandriss
und
mit
Polyarthritis
Übereinstimmend mit den Untersuchungen von LEMBURG et al. (2001) kommt es sowohl
bei Hunden mit Kreuzbandriss als auch bei Hunden mit Polyarthritis in entzündlich
verändertem Gewebe zu einer Zunahme IgG- positiver Plasmazellen. In der vorliegenden
Untersuchung bestanden bezüglich der Anzahl IgG- positiver Plasmazellen in den
Kreuzbandrissgruppen signifikante Unterschiede; dabei war die Anzahl IgG- positiver
Plasmazellen positiv mit steigendem Entzündungsgrad korreliert. Alle Gruppen unterschieden
sich signifikant von den Vergleichstieren.
Die Gruppe der Tiere mit Polyarthritis wies im Vergleich mit KBR-Gruppe 3 eine signifikant
geringere Anzahl an IgG- positiven Plasmazellen auf, zu den anderen beiden KBR-Gruppen
bestanden keine signifikanten Unterschiede. Bei den Untersuchungen von LEMBURG et al.
(2001) waren keine signifikanten Unterschiede bezüglich der Anzahl IgG- positiver
Plasmazellen zwischen Tieren mit Polyarthritis und Kreuzbandriss festzustellen, jedoch hatten
die genannten Autoren, anders als in dieser Arbeit, bei Hunden mit KBR keine Unterteilung
nach dem Entzündungsgrad vorgenommen. Die IgG- positiven Zellen stellten in dieser Arbeit
bei den Tieren mit Polyarthritis im Vergleich mit der Anzahl der CD3- positiven TLymphozyten die dominierende Entzündungszellart dar. Dagegen überwogen bei den
Untersuchungen von LEMBURG et al. (2001) in der Synovialmembran von Hunden mit
chronischer Polyarthritis die T-Lymphozyten. Ähnliche Ergebnisse wurden auch von
HEWICKER-TRAUTWEIN et al. (1999) veröffentlicht.
Zu betonen ist, dass CD3- positive T-Lymphozyten durchaus auch in der Synovialmembran
von Vergleichstieren zu finden waren und vereinzelt kamen auch IgG- positive Plasmazellen
vor. Bestätigt wird dieses Ergebnis durch die Untersuchungen von LEMBURG et al. (2001).
Dies könnte darauf hinweisen, dass sich auch in der Synovialmembran von Hunden ohne
Gelenkserkrankungen eine gewisse Entzündungszellpopulation befindet, was damit generell
für die Synovialmembran als ein Ort der Antigenabwehr spricht. Außerdem stellt sich die
Frage, ob die beobachteten Entzündungsinfiltrationen in der Synovialmembran schon vor
einer
Kreuzbandruptur
bestanden
und
möglicherweise
in
der
Pathogenese
des
Diskussion
106
Kreuzbandrisses eine Rolle spielen könnten. Nähere Untersuchungen an einer größeren
Anzahl an für den Kreuzbandriss prädisponierten Vergleichstieren (Faktoren: Rasse, Alter,
Gewicht) wären notwendig, um diese Frage zu klären. In Übereinstimmung mit LEMBURG
et al. (2001) zeigte sich insgesamt ein signifikanter Anstieg von CD3- positiven TLymphozyten
in
den
KBR-Gruppen
gegenüber
den
Vergleichstieren.
In
diesen
Untersuchungen war die Anzahl CD3- positiver Entzündungszellen mit zunehmenden
Entzündungsgrad der Synovialmembran der Kreuzbandrisstiere positiv korreliert und auch
das perivaskuläre multifokale Verteilungsmuster nahm zu. Während in KBR-Gruppe 1 und
KBR-Gruppe
2
dabei
noch
IgG-
positive
Zellen
dominierten,
war
die
CD3-
Lymphozytenpopulation in KBR Gruppe 3 gegenüber den IgG- positiven Zellen um den
Faktor 1,2 stärker vertreten.
5.3.2 Proliferation
der
Entzündungszellen
bei
den
Tieren
mit
Kreuzbandriss
In
den
immunhistochemischen
Untersuchungen
dieser
Arbeit
wurden
mit
dem
Proliferationsmarker Ki-67 zunächst alle proliferierenden Entzündungszellen jeder Gruppe
gezählt und verglichen. Die größte Anzahl proliferierender Entzündungszellen zeigte dabei
die KBR-Gruppe 3 mit einer Signifikanz zu allen Gruppen. Mit steigendem Entzündungsgrad
steigt bei den Tieren mit Kreuzbandriss auch die Proliferation von Entzündungszellen an.
Durch zwei immunhistochemische Doppelfärbungen erfolgte eine Identifikation der
proliferierenden Entzündungszellarten.
Bei der Doppelfärbung Ki-67 CD3 stellte sich heraus, dass sich bei der KBR-Gruppe 1 die
Hälfte der CD3- positiven Zellen in Proliferationsaktivität befanden (50,9%). Die
Proliferationsaktivität
der
CD3-
positiven
T-Lymphozyten
nahm
mit
steigendem
Entzündungsgrad der Synovialitis bei den KBR-Tieren immer weiter ab, bei KBR-Gruppe 2
proliferierten 14,4% und bei KBR-Gruppe 3 nur noch 1,2% der CD3- positiven Zellen. Bei
den Vergleichstieren waren keine proliferierenden CD3- positiven T-Lymphozyten
vorhanden. Signifikanzen zur Gruppe der Vergleichstiere lagen bei KBR-Gruppe 1 und KBRGruppe 3 vor.
Diskussion
107
Die Proliferation von IgG- positiven Plasmazellen bei den Tieren mit Kreuzbandriss und
Synovialitis war insgesamt gering; die Anzahl proliferierender Plasmazellen und eine
multifokale perivaskuläre Verteilung war mit steigendem Entzündungsgrad positiv korreliert.
KBR-Gruppe 1 und KBR-Gruppe 3 wiesen jeweils 6,8% proliferierende IgG- positive
Plasmazellen auf, danach folgte KBR-Gruppe 2 mit 4,1%. Selbst die Vergleichstiere zeigten
eine geringe Proliferationsaktivität von 0,4% der IgG- positiven Zellen auf, dabei bestanden
signifikante Unterschiede zu KBR-Gruppe 3. KBR-Gruppe 3 wies einen signifikanten
Unterschied zur KBR-Gruppe 1 und den Vergleichstieren auf. Auch KBR-Gruppe 2 besaß
signifikant mehr proliferierende IgG- positive Plasmazellen als KBR-Gruppe 1.
Aufgrund der nachgewiesenen geringen Proliferationsaktivität der IgG- positiven
Plasmazellen in der Synovialmembran der Hunde mit Kreuzbandriss werden diese Zellen
vermutlich an einem anderen Ort als in der Synovialmembran aktiviert, um anschließend
hämatogen in die Synovialmembran zu immigrieren. Dafür spricht auch, dass viele
Plasmazellen bei dieser Untersuchung in Gefäßnähe oder auch intravasal beobachtet wurden.
Die starke Proliferationsaktivität der T-Lymphozyten bei den Hunden mit Kreuzbandriss und
geringgradiger Synovialitis könnte für eine Entzündung im Frühstadium sprechen, dies ist
jedoch lediglich eine Vermutung und kann aufgrund fehlender Daten, wie etwa der
Zeitspanne zwischen Erkrankungsbeginn und Operationstermin, nicht bewiesen werden.
5.3.3 Proliferation der Entzündungszellen bei den Tieren mit Polyarthritis
Bei der Einfachfärbung mit dem Proliferationsmarker Ki-67 wiesen die Tiere mit Polyarthritis
eine signifikant größere Anzahl an proliferierenden Entzündungszellen als die Vergleichstiere
auf und eine signifikant geringere Anzahl im Vergleich mit KBR-Gruppe 3.
Auch hier erfolgte durch zwei immunhistochemische Doppelfärbungen eine Identifikation der
proliferierenden Entzündungszellarten.
Bei den Tieren mit Polyarthritis zeigen 9,9% der CD3- positiven T-Lymphozyten
Proliferationsaktivität. Die Vergleichstiere weisen dazu im Vergleich keine proliferierenden
CD3- positiven T-Lymphozyten auf und unterscheiden sich signifikant von der Gruppe der
Tiere mit Polyarthritis. Insgesamt waren Ki-67CD3- positive Zellen vorwiegend disseminiert
Diskussion
108
verteilt und teilweise auch perivaskulär gelegen. Die Auswertung der Summe der insgesamt
proliferierenden undifferenzierten Entzündungszellen ergab nach Abzug der Summe der
proliferierenden CD3- T-Lymphozyten und IgG- positiven Plasmazellen, dass ausserdem
anscheinend eine andere Lymphozytenpopulation proliferierte. Dabei handelte es sich
vermutlich um proliferierende B-Lymphozyten (CD22), welche in dieser Arbeit jedoch nicht
weiter identifiziert worden sind.
Die Proliferationsaktivität gemessen an der Gesamtheit der IgG- positiven Plasmazellen war
bei den Hunden mit Polyarthritis im Vergleich zu den KBR-Gruppen mit 26,3% am höchsten.
Zu den Vergleichstieren bestanden dabei signifikante Unterschiede.
Die vermehrte Proliferationsaktivität von IgG- positiven Plasmazellen bei den Hunden mit
Polyarthritis ist vergleichbar mit Untersuchungsergebnissen aus der Humanmedizin. KRENN
et al. (1996) demonstrierten am Beispiel der rheumatoiden Arthritis des Menschen, dass in der
Synovialmembran proliferierende reife B-Zellen in Sekundärfollikeln, in kleinen follikulären
Aggregaten mit dendritischen Retikulumzellen und nahe der synovialen Intima vorhanden
sind. Auch wiesen die Autoren proliferierende T-Lymphozyten in Aggregaten, perivaskulär
und sowohl in als auch nahe der Synovialdeckzellschicht nach. Die Autoren vermuteten, dass
die Synovialmembran als Ort für Antigen-abhängige Proliferation und Maturation fungieren
könnte. Bei der vorliegenden Untersuchung konnte weder bei den Hunden mit Kreuzbandriss
noch bei den Tieren mit Polyarthritis ein Keimzentrums-ähnlicher Aufbau, wie er in
Sekundärfollikeln vorkommt, gefunden werden, was zunächst gegen eine Antigen-abhängige
Proliferation in der Synovialmembran spricht. Allerdings fiel bei den Untersuchungen von
KRENN et al. (1996) die Anwesenheit follikulärer dendritischer Retikulumzellen in der Nähe
von proliferierenden Lymphozyten auf. Auch bei den Untersuchungen von LEMBURG et al.
(2001) zeigten sich in der Subsynovialis von Hunden mit Kreuzbandriss und Polyarthritis
MHCII- positive Zellen mit dendritischer Morphologie; ebenso wie bei HEWICKERTRAUTWEIN et al. (1999) wurden diese in der Synovialmembran von Hunden mit
rheumatoider Arthritis und degenerativen Arthropathien beschrieben. Denkbar ist eine
Antigenpräsentation durch die dendritischen Zellen in der Synovialmembran mit einer
nachfolgenden Aktivierung und Proliferation von T-Lymphozyten. Die in der vorliegenden
Arbeit nachgewiesene starke Proliferation der CD3- T-Lymphozyten bei KBR-Gruppe 1
Diskussion
109
spricht für diese Theorie. Dendritische Zellen speziell waren nicht Gegenstand der
vorgelegten Arbeit.
5.3.4 Apoptose der Entzündungszellen bei Hunden mit Kreuzbandriss und
Hunden mit Polyarthritis
Apoptotische Entzündungszellen wurden mit Hilfe der Caspase-3 Einfachfärbung dargestellt
und nicht weiter spezifiziert.
Insgesamt zeigte sich sowohl bei den Tieren mit Kreuzbandriss und den Tieren mit
Polyarthritis eine sehr geringe Apoptose-Aktivität der Entzündungszellen, welche bei den
Tieren mit Polyarthritis noch am stärksten ausgeprägt war. Signifikanzen zu den
Vergleichstieren oder auch zwischen den einzelnen Gruppen waren nicht vorhanden. Bei den
Tieren mit Kreuzbandriss wies die KBR-Gruppe 3 die höchste Anzahl an apoptotischen
Zellen auf, die Apoptose der Entzündungszellen bei den beiden anderen KBR-Gruppen fiel
geringer aus als bei den Vergleichstieren.
Mutmaßlich spielt die Apoptose von Entzündungszellen in der Pathogenese von
Kreuzbandrissen und bei Polyarthritiden des Hundes eine untergeordnete Rolle. Die leicht
erhöhte Anzahl apoptotischer Entzündungszellen bei den Tieren mit Polyarthritis deckt sich
mit den Ergebnissen der Untersuchungen von HASUNUMA et al. (1998), die zeigten, dass
bei synovialen T-Zellen bei der rheumatoiden Arthritis des Menschen sehr oft Apoptose
vorhanden ist. Dazu zählen CD3-, CD4- und CD45 RO- positive T-Zellen. Weitere
Untersuchungen bezüglich einer Spezifizierung der apoptotischen Entzündungszellen wären
für eine genauere Aussage von Vorteil.
Zusammenfassung
6
111
Zusammenfassung
Immunhistochemische Untersuchungen zur Zellproliferation und Apoptose bei
Synovialitiden des Hundes
Eva-Maria Beckold
Bei Hunden mit Synovialitiden, die mit vorderem Kreuzbandriss (KBR) assoziiert sind und
bei Hunden mit Polyarthritis (PA) tritt eine Infiltration der Synovialis mit Makrophagen,
Lymphozyten und Plasmazellen auf. Bisher ist nicht bekannt, ob die Akkumulation von
Lymphozyten und Plasmazellen in der Synovialmembran auf eine lokale Proliferation von Toder B-Lymphozyten zurückzuführen ist, oder ob bereits aktivierte T- oder B-Lymphozyten
in die Synovialmembran einwandern und dort zu Plasmazellen ausreifen.
Ein Ziel dieser Arbeit war es, mittels Nachweis des Zellproliferations-assoziierten Antigens
Ki-67 die Proliferationsaktivität im Synovialgewebe von Hunden mit KBR und PA zu
charakterisieren, um zu ermitteln, ob und in welchem Ausmaß Entzündungszellen
(Lymphozyten, Plasmazellen) und Synovialdeckzellen proliferieren. Eine Spezifizierung der
Entzündungszellen erfolgte mit Hilfe von Ki-67-, CD3- und IgG- spezifischen Antikörpern
und immunhistochemischen Doppelfärbetechniken.
Ein weiteres Ziel war es, mit dem Caspase-3- Marker das Vorkommen von Apoptose in der
Synovialmembran zu untersuchen und damit insbesondere die Frage zu klären, ob die bei
Patienten mit PA auftretende Synovialishyperplasie auf eine erhöhte Proliferationsrate der
Synovialdeckzellen und/oder auf eine verminderte Apoptose zurückzuführen ist. Bislang
existieren beim Hund nur Studien über das Vorkommen von Apoptose im Kreuzband, jedoch
nicht in der Synovialmembran. Als Untersuchungsmaterial standen Gewebeproben aus dem
Kniegelenk von Hunden mit KBR (n=23) und Synovialgewebeproben von Hunden mit PA
(n=6) zur Verfügung. Die Hunde mit KBR wurden nach dem Entzündungsgrad der
Synovialmembran in 3 Gruppen eingeteilt (KBR-Gruppe 1: 10 Hunde mit geringgradiger
Synovialitis; KBR-Gruppe 2: 5 Hunde mit mittelgradiger Synovialitis; KBR-Gruppe 3: 8
Hunde mit hochgradiger Synovialitis. Als Vergleichsmaterial dienten Synovialgewebeproben
aus dem Kniegelenk von 8 pathologisch-anatomisch gelenkgesunden Hunden.
Zusammenfassung
112
Aufgrund der Untersuchungsergebnisse ist die Hyperplasie der Synovialmembran sowohl bei
den Hunden mit KBR als auch bei Hunden mit PA auf eine gegenüber den Vergleichstieren
signifikant vermehrte Proliferationsaktivität der Synovialdeckzellen zurückzuführen. Die
Proliferationsaktivität der Synovialdeckzellen war bei den Hunden mit PA am stärksten
ausgeprägt. Ob die Hyperplasie der Synovialmembran darüber hinaus auf eine verminderte
oder fehlende Apoptose der Synovialdeckzellen zurückzuführen ist, bleibt fraglich, da die
ermittelten Werte statistisch nicht signifikant waren.
Bei der immunhistochemischen Einfachfärbung mit dem Ki-67- Marker ergab sich, dass die
Proliferationsaktivität der Entzündungszellen bei den Hunden mit KBR mit steigendem
Entzündungsgrad positiv korreliert war. Die Auswertung der Doppelfärbung Ki-67 CD3
erbrachte bei der KBR Gruppe 1 die stärkste Proliferationsaktivität von CD3- positiven
Zellen, wobei 50,9% der CD3- positiven Zellen proliferierten. Dieser Befund könnte auf ein
frühes Entzündungsstadium in der Synovialmembran der Hunde dieser Gruppe hinweisen.
Bei der KBR-Gruppe 2 proliferierten 14,2% und bei der KBR-Gruppe 3 lediglich 1,2% der
CD3- positiven Zellen. Die Proliferationsaktivität der IgG- positiven Plasmazellen war bei
den Hunden mit KBR insgesamt als gering zu bezeichnen; die Anzahl proliferierender
Plasmazellen
bei
Entzündungsgrad
multifokaler
positiv
perivaskulärer
korreliert.
Aufgrund
Verteilung
der
war
mit
nachgewiesenen
steigendem
geringen
Proliferationsaktivität der IgG- positiven Plasmazellen und der Tatsache, dass sehr viele
Plasmazellen in Gefäßnähe oder intravasal beobachtet wurden, ist anzunehmen, dass diese
vermutlich an einem anderen Ort als der Synovialmembran aktiviert wurden, um anschließend
hämatogen in die Synovialmembran zu immigrieren.
Die stärkste Proliferationsaktivität von IgG- positiven Plasmazellen (26,3%) war bei den
Hunden mit PA vorhanden. 9,9% der CD3- positiven T Lymphozyten der Hunde mit
Polyarthritis befanden sich in Proliferation. Die Untersuchungsergebnisse lassen vermuten,
dass die Synovialmembran bei der Polyarthritis des Hundes als Ort für Antigen-abhängige
Proliferation und Maturation dieser Zellen fungieren könnte.
Das Vorkommen von Apoptose von Entzündungszellen in der Synovialmembran war sowohl
bei den Hunden mit KBR als auch bei den Hunden mit PA als gering zu bezeichnen und spielt
demnach in der Pathogenese dieser Erkrankungen wahrscheinlich eine untergeordnete Rolle.
Zusammenfassung
113
Auffallend war das Vorkommen von Entzündungszellen bei einigen Vergleichstieren in der
Synovialmembran. Dies könnte ein Hinweis für eine bereits vor einer möglichen, späteren
Kreuzbandruptur auftretende Entzündungsinfiltration in der Synovialmembran sein.
Summary
7
115
Summary
Immunohistochemical investigations about cell proliferation and apoptosis in
synovialitis of the dog
Eva-Maria Beckold
In dogs with synovialitis associated with ruptured cranial cruciate ligaments (CCL) and
polyarthritis (PA), infiltration of the synovium with macrophages, lymphocytes and plasma
cells occurs. So far it is unknown, if the accumulation of lymphocytes and plasma cells in the
synovium is due to local proliferation of T and B lymphocytes, or if already activated T or B
lymphocytes immigrate into the synovium and maturate into plasma cells there.
One aim of this project was to characterise the proliferation activity in the synovium of dogs
with CCL rupture and PA by detection of the cell proliferation-associated antigen Ki-67, to
find out if and in which dimensions the inflammatory cells (lymphocytes, plasma cells) and
synovial lining cells are proliferating. The identification of the inflammatory cells was
achieved by using Ki-67-, CD3- and IgG- specific antibodies and immunohistochemical double
labelling techniques.
Another aim was to investigate the occurrence of apoptosis in the synovium with the marker
Caspase-3 to clarify whether the hyperplasia of the synovium is due to an increased
proliferation of the synovial lining cells and/or due to reduced apoptosis.
Until know, studies about the occurrence of apoptosis only exist for the cruciate ligament, but
not for the synovium of dogs. For this study, synovial membrane tissue samples from dogs
with CCL rupture (n=23) and from dogs with PA (n=6) were available. Dogs with CCL
rupture were divided into 3 groups according to the degree of inflammation of the synovium
(CCL rupture group 1: 10 dogs with mild synovialitis; CCL rupture group 2: dogs with
moderate synovialitis; CCL rupture group 3: 8 dogs with severe synovialitis). For comparison,
synovial membrane samples from 8 dogs with macroscopically normal knee joints were used.
On the basis of the results, the hyperplasia of the synovium in dogs with CCL rupture as well
as in dogs with PA is due to a significant increase of proliferation activity. The proliferation
activity of the synovial lining cells was most pominent in dogs with PA. If the hyperplasia of
Summary
116
the synovial membrane, furthermore, is due to reduced or missing apoptosis of synovial lining
cells is questionable, because the data were statistically not significant.
The immunohistochemical single labelling with the Ki-67 marker revealed, that the
proliferation activity of the inflammatory cells in dogs with CCL rupture was positively
correlated with an increase of the degree of inflammation. The evaluation of the double
labelling for Ki-67 CD3 showed that the CCL rupture group 1 had the strongest proliferation
activity of CD3- positive cells with 50.9% of the CD3- positive cells proliferating. This
finding indicates the presence of an early inflammatory stage in the synovium of the dogs of
this group. In the second CCL rupture group, 14.2%, and in the third CCL rupture group only
1.2% of the CD3- positive cells were proliferating. The overall proliferation activity of IgGpositive plasma cells in dogs with CCL rupture was low; the number of proliferating plasma
cells being disseminated multifocally and perivascularly was positively correlated with an
increased grade of inflammation. Because of the low proliferation activity of IgG- positive
plasma cells, and because of the fact that many plasma cells were located in the vicinity of
vessels or intravascularly, it is assumed, that they are probably activated in an other site than
the synovial membrane and thereafter immigrate by the haematogenous route into the
synovial membrane.
The strongest proliferation activity of IgG- positive plasma cells was present in dogs with PA.
9.9% of the CD3- positive T- lymphocytes were in the stage of proliferation. The results
suggest, that the synovial membrane serves as a site for antigen-dependent proliferation and
maturation of these cells.
The occurrence of apoptosis of inflammatory cells in the synovial membrane in dogs with
CCL rupture as well as in dogs with PA was low and probably has a minor role in the
pathogenesis of these diseases.
Remarkable was the occurrence of inflammatory cells in the synovial membrane of several
control animals. This could indicate the presence of an inflammatory infiltration before the
development of a possibly later occurring rupture of the cranial cruciate ligament.
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Anhang
129
9 Anhang
9.1 Versuchsmaterial
Tabelle 5: Vergleichstiere
UnterNr. suchungsnummer
Rasse
Alter(J)
GeGew.(kg)
schlecht
SP
Grundkrankheit
Kniegelenk
1
S878/05
Greyhound
8
m
33,0
beidseits
Rektumruptur
2
S869/05
Dt. Dogge
1,5
mk
44,0
beidseits
HKV infolge Sepsis
3
S381/05
Neufundländer
3,5
m
53,0
beidseits
Magenulkus,eitrige
Peritonitis
4
S185/05
DSH
1,5
m
32,5
links
HKV infolge Sepsis
5
230/05
Kan.Schfhd.
6
w
36,0
rechts
Rückenmarksödem
6
S598/06
WHWT
8
wk
8,2
beidseits
Neurofibrosarkom
7
S665/06
Mischling
1
m
32,0
links
extradurale Fibrose
8
S376/05
DK
10
m
35,5
rechts
Hämangiosarkom in
Milz
Abkürzungen:
SP= Synovialmenbranproben, J= Jahre, Gew.= Gewicht, DSH= Deutscher
Schäferhund, Kan. Schfhd.= Kanadischer Schäferhund, DK= Deutsch Kurzhaar, Dt. Dogge= Deutsche
Dogge, WHWT, West Highland White Terrier, m= männlich, w= weiblich, mk= männlich kastriert,
wk= weiblich kastriert, HKV= Herzkreislaufversagen.
Anhang
130
Tabelle 6:Hunde mit Kreuzbandriss und geringgradiger Synovialitis
UntersuchungsRasse
Nr. nummer
9 V374/04
Alter (Jahre) Geschlecht Gewicht(kg)
Knie
Rottweiler
11
wk
42,5
links
10 V450/04
WHWT
14
w
7,3
links
11 V551/04
Austr.Shep.
3
w
20.0
links
12 V580/04
Labrador
2
mk
35,5
links
13 V742/04 A
Bulldogge
2
mk
44,0
rechts
14 V743/04
Berner S.
8
w
47,0
links
15 V744/04
Mischling
4
w
34,0
links
16 V1372/04
Schnauzer
10
mk
31,5
links
17 V1438/04
Boxer
1
mk
28,0
links
18 V1580/04
Setter
2
m
31,0
rechts
Abkürzungen: WHWT=West Highland White Terrier, Austr. Shep.= Australian
Shepherd, Berner S.= Berner Sennenhund, m=männlich, wk= weiblich kastriert, mk=
männlich kastriert.
Anhang
131
Tabelle 7: Hunde mit Kreuzbandriss und mittelgradiger Synovialitis
UntersuchungsRasse
Nr. nummer
Alter(Jahre) Geschlecht Gewicht(kg)
Knie
19 E2071/03
Hovawart
4
mk
47,0
rechts
20 V581/04
Dt.Schfhd.
8
mk
45,6
links
21 V583/04
Briard
4
wk
37,0
links
22 V1437/04
Mischling
7
wk
23,0
rechts
23 V1669/04
Dt.Langh.
2
m
40,0
links
Abkürzungen: Dt. Schfhd.= Deutscher Schäferhund, Dt. Langh.= Deutsch Langhaar,
m=männlich, wk= weiblich kastriert, mk= männlich kastriert.
Tabelle 8: Hunde mit Kreuzbandriss und hochgradiger Synovialitis
UntersuchungsRasse
Nr. nummer
Alter(Jahre) Geschlecht Gewicht(kg)
Knie
24 V1515/03
Berner S.
5
w
54,0
links
25 E5136/03
Berner S.
6
m
42,0
rechts
26 E34/04
Mischling
4
m
45,0
links
27 E35/04
Berner S.
6
m
48,0
links
28 V71/04
Mischling
6
mk
57,0
rechts
29 V226/04
G.Retr.
6
w
30,0
links
30 V840/04
DSH
7
w
31,0
rechts
31 V950/04
Labrador
6
m
49,5
links
Abkürzungen: Berner S.:= Berner Sennenhund, G. Retr.= Golden Retriever, DSH=
Deutscher Schäferhund, w= weiblich, m=männlich, mk= männlich kastriert.
Anhang
132
Tabelle 9: Hunde mit Polyarthritis
Nr.
Untersuchungsnummer
Rasse
32
S179/04
Dt. Stichelhaar
0,4
w
33
E 5161/03
Berner S.
1
m
Schulter
34
H 356-95
DSH
4
wk
Knie
links
35
E 2192/02
G. Retr.
1
w
Knie
rechts
Bull Terrier
5
w
Knie
rechts
Briard
0,75
m
Knie
rechts
36
37
H 198-95
E1123/99
Alter(J) Geschlecht
Gewicht
SP
20,3
Knie
beidseits
Abkürzungen: SP= Synovialmembranproben, Dt. Stichelhaar= Deutsch Stichelhaar,
Berner S.= Berner Sennenhund, DSH= Deutscher Schäferhund, G. Retr.= Golden
Retriever, w= weiblich, m= männlich, wk= weiblich kastriert.
Anhang
133
9.2 Histopathologische Befunde
Tabelle 10: Histopathologische Befunde bei den Vergleichstieren
Lfd. Nr.
Villi
SDZ-Reihen
Hyperkapillarität/
Hyperämie
Hämosiderin
Infiltrationsgrad/Anteil
Plasmazellen
Verteilungsmuster der
Infiltrate
1
ku bis f
1-2
+/+
-
-
-
ku bis f
1-2
+/+
-
mgr./<25%
fo
ku bis f
1-2
+/+
-
-
-
ku bis f
1-2
+/+
-
-
-
f
1-3
+/+
-
-
-
f
1-2
+/+
-
-
-
4
k bis ku
1-2
+/+
-
-
-
5
k bis ku
1-2
+/+
-
-
-
6
k bis ku
1-2
-/-
-
-
-
k bis ku
1-2
-/-
+
-
-
7
ku bis f
1-2
+/+
+
-
-
8
k bis ku
1-2
-/-
-
-
-
2
3
Abkürzungen: Lfd. Nr. = laufende Nummer, SDZ-Reihen = Synovialdeckzellreihen, ku = kurz,
k=keine, f = fingerförmig, k bis ku= abschnittsweise wechselnd keine und kurze Ausstülpungen der
Synovialmembran, mgr. = mittelgradig, fo=fokal; - = negativ, + = positiv;
Anmerkung: der Anteil an Plasmazellen am Gesamtinfiltrat wurde geschätzt.
Anhang
134
Tabelle 11: Histopathologische Befunde bei den Hunden mit KBR und geringgradiger
Synovialitis
Lfd.
Nr.
SDZ-
Villi
Reihen
Hyperkapillarität/
Hämosiderin
Infiltrationsgrad/ Anteil
Plasmazellen
Verteilungsmuster der
Infiltrate
Hyperämie
9
1-3
ku
bis
f
-/+
-
ggr./< 25%
fo
10
1-3
ku
bis
f
+/+
-
ggr./< 25%
diffus
11
1-3
ku
+/+
-
ggr./ 80%
mf/pv
12
1-3
ku
bis
f
+/+
-
ggr./ 50%
fo/pv
13
1-3
k/ f
+/+
-
ggr./ 40%
diffus
14
1-5
ku
+/+
-
ggr./<10%
fo/pv
15
1-3
ku
bis
f
+/+
-
ggr./ 80%
mf/pv
16
1-2
k
bis
ku
+/+
-
ggr./< 25%
diffus
17
1-3
f
+/+
-
ggr./ <10%
diffus
18
1-3
f
+/+
-
ggr. / 80%
mf
Abkürzungen:
Lfd. Nr.= laufende Nummer, SDZ-Reihen = Synovialdeckzellreihen, ku = kurz,
k=keine, f = fingerförmig, ggr. = geringgradig, mf = multifokal, pv = perivaskulär,
fo=fokal; - = negativ, + = positiv;
Anmerkung: der Anteil an Plasmazellen am Gesamtinfiltrat wurde geschätzt.
Anhang
135
Tabelle 12: Histopathologische Befunde bei den Hunden mit KBR und mittelgradiger
Synovialitis
Lfd.
Nr.
SDZReihen
Villi
Hyperkapillarität/
Hämosiderin
Hyperämie
Infiltrationsgrad/ Anteil
Plasmazellen
Verteilungsmuster der
Infiltrate
19
1-2
f
+/+
-
mgr./ 90%
mf
20
1
f
+/+
+
mgr./ <10%
diffus
21
1-2
ku
bis
f
+/+
-
mgr./ 80%
mf/pv
22
1-3
k
-/-
-
mgr. / 30%
diffus
23
1-4
ku
bis
f
-/+
-
mgr./ 30%
mf
Abkürzungen:
Lfd. Nr.= laufende Nummer, SDZ-Reihen = Synovialdeckzellreihen, ku = kurz, k=keine, f =
fingerförmig, mgr. = mittelgradig, mf = multifokal, pv = perivaskulär; - = negativ, + =
positiv.
Anmerkung: der Anteil an Plasmazellen am Gesamtinfiltrat wurde geschätzt.
Anhang
136
Tabelle 13: Histopathologische Befunde bei Hunden mit KBR und hochgradiger Synovialitis
Lfd.
Nr.
SDZReih
en
Villi
Hyper-
Hämosiderin
Infiltrationsgrad/ Anteil
Plasmazellen
Verteilungsmuster der
Infiltrate
kapillarität/
Hyperämie
24
1-5
f
+/+
-
hgr./ 30%
mf/pv
25
1-4
f
+/+
-
hgr./ 80%
mf/pv
26
1-4
f
+/+
-
hgr./ 20%
mf/pv
27
1-4
f
+/+
+
hgr./ 30%
mf/pv
28
1-2
ku bis
f
+/+
+
hgr./ 60%
mf/diffus
29
1-5
ku bis
f
+/+
-
hgr./ 10%
mf/pv
30
1-6
ku bis
f
+/+
-
hgr./ 20%
mf/pv
31
1-2
f
+/+
-
hgr./ 30%
mf
Abkürzungen:
Lfd. Nr.= laufende Nummer, SDZ-Reihen = Synovialdeckzellreihen, ku = kurz, f =
fingerförmig, hgr. = hochgradig, mf = multifokal, pv = perivaskulär, - = negativ, + = positiv;
Anmerkung: der Anteil an Plasmazellen am Gesamtinfiltrat wurde geschätzt.
Anhang
137
Tabelle 14: Histopathologische Befunde bei Hunden mit Polyarthritis
Lfd
Nr
SDZReihen
Villi
Hyperkapillarität/
Hyperämie
Hämosiderin
Infiltrationsgrad/Anteil
Plasmazellen
Verteilungsmuster der
Infiltrate
32
1-2
ku
bis
f
-/-
-
hgr./<25%
d+fo
33
1-2
f
+/+
-
mgr./25-50%
mf/pv
34
2-5
k
-/+
-
ggr./<25%
d
35
1-2
f
bis
k
-/+
+
mgr./<25%
d
36
3-4
k
-/-
-
ggr./<25%
d
37
2-4
f
-/-
+
mgr./50-75%
d+fo
Abkürzungen:
Lfd. Nr.= laufende Nummer, SDZ-Reihen = Synovialdeckzellreihen, ku = kurz, k=keine, f =
fingerförmig, ggr. = geringgradig, mgr. = mittelgradig, hgr. = hochgradig, mf = multifokal, pv =
perivaskulär,fo=fokal;d=disseminiert, - = negativ, + = positiv;
Anmerkung: der Anteil an Plasmazellen in Prozent wurde geschätzt.
Anhang
138
9.3 Statistik
Tabelle 15: Mediane und Quantile aller Gruppen bei den Einfachfärbungen und
Doppelfärbungen
V
KBR-1
KBR-2
KBR-3
Gruppe 4
Median
0,1
210,59
634,33
1285,37
486,66
Quantil
75%
Quantil
25%
Ki-67 D
26,19
324,09
697,89
1600,97
662,40
0
144,17
448,66
843,17
100,14
Median
0,2
2,8
2,4
5,6
6,2
Quantil
75%
Quantil
25%
Ki-67 IgG
0,6
3,2
2,6
7,4
12,8
0
2,2
2
4,6
5,0
0
0
7,5
76,88
49,807
1,2
0
98,06
678,61
123,85
0,99
0
0
26,56
0,00
Median
0
82,53
27,3
55,06
23,36
Quantil
75%
Quantil
25%
IgG
0
136,46
116,58
105
63,04
0
29,78
7,66
3,5
19,63
Median
43,12
143,78
510,14
3226,39
284,42
Quantil
75%
Quantil
25%
CD3
72,35
420,13
1796,19
7568,67
347,61
20,21
51,85
448,99
2346,08
79,83
Median
151,82
86,71
335,85
3894,87
223,96
Quantil
75%
Quantil
25%
266,02
170,42
412,71
9157,83
525,80
64,44
66,35
312,6
Ki-67 E
Median
Quantil
75%
Quantil
25%
Ki-67 CD3
1519,02
140,73
Anhang
Caspase-3
E
Median
Quantil
75%
Quantil
25%
139
V
KBR-1
KBR-2
KBR-3
Gruppe 4
21,47
3,57
0,00
10,73
14,31
35,79
50,10
35,79
42,94
42,94
10,73
0,00
0,00
0,00
0,00
Fortsetzung von Tabelle 15
Abkürzungen: Ki-67 E= Färbung des Ki-67 Antigens bei den
Entzündungszellen, Ki-67 D=Färbung des Ki-67 Antigens bei den
Synovialdeckzellen, Caspase-3 E= Färbung des Caspase-3 Antigens bei den
Entzündungszellen
Tabelle 16: Arithmetische Mittelwerte (Caspase-3 Färbungen):
Caspase-3 E
V
KBR-1
KBR-2
KBR-3
Gruppe 4
0,2
0,06
0,04
0,58
0,7
Caspase-3 SDZ 0,17
0,0
0,0
0,025
0,0
Abkürzungen: V= Vergleichstiere, Gruppe 4= Tiere mit Polyarthritis; Caspase-3 E=Färbung der
Entzündungszellen mit Caspase-3; Caspase-3 SDZ= Färbung der Synovialdeckzellen mit Caspase-3
Berechnet wurde der arithmetische Mittelwert pro HPF (High Pwer Format) in der 400fachen
Vergrößerung in 5 Lokalisationen.
Anhang
140
Tabelle 17: p-Werte aller Gruppen (Immunhistochemie mit Ki-67 und Caspase-3)
Ki-67 SDZ
p-Werte
V
V
KBR-Gruppe 1
KBR-Gruppe 2
KBR-Gruppe 3
Gruppe 4
0,0001
0,0032
0,0004
0,0043
Ki-67 E
p-Werte
V
V
KBR-Gruppe 1
KBR-Gruppe 2
KBR-Gruppe 3
Gruppe 4
0,0001
0,0015
0,0002
0,0004
Caspase-3 E
p-Werte
V
V
KBR-Gruppe 1
KBR-Gruppe 2
KBR-Gruppe 3
Gruppe 4
0,2161
0,4295
0,3117
0,7015
Caspase-3 SDZ
p-Werte
V
V
KBR-Gruppe 1
0,188
KBR-Gruppe 2
KBR-Gruppe 3
Gruppe 4
0,307
0,611
0,259
KBR-Gruppe 1 KBR-Gruppe 2 KBR-Gruppe 3 Gruppe 4
0,0001
0,0032
0,0004
0,0043
0,4404
0,0097
0,0338
0,4404
0,0233
0,0828
0,0097
0,0233
0,6912
0,0338
0,0828
0,6912
KBR-Gruppe 1 KBR-Gruppe 2 KBR-Gruppe 3 Gruppe 4
0,0001
0,0015
0,0002
0,0004
0,0194
0,0043
0,2548
0,0194
0,0412
0,3153
0,0043
0,0412
0,0169
0,2548
0,3153
0,0169
KBR-Gruppe 1 KBR-Gruppe 2 KBR-Gruppe 3 Gruppe 4
0,2161
0,4295
0,3117
0,7015
0,7397
0,8942
0,6746
0,8942
0,6436
0,6304
0,6746
0,6436
1
0,7397
0,6304
1
KBR-Gruppe 1
0,188
KBR-Gruppe2 KBR-Gruppe 3
0,307
0,611
1
1
0,3816
1
0,5271
1
Gruppe 4
0,259
0,3816
1
0,5271
1
0,4705
0,4705
signifikante Werte: (p≤ 0,05); statistisch auffällige Werte: (p>0,05 <0,1)
Abkürzungen zu Tabelle 16: V= Vergleichstiere, Gruppe 4= Tiere mit Polyarthritis; KiSDZ: Färbung der Synovialdeckzellen mit Ki-67, Ki-67 E: Färbung der Entzündungszellen
mit Ki-67, Caspase-3 E=Färbung der Entzündungszellen mit Caspase-3, Caspase-3 SDZ=
Färbung der Synovialdeckzellen mit Caspase-3
Anhang
141
Tabelle 18: p-Werte aller Gruppen (Immunhistochemie IgG, Ki-67IgG, CD3, KI-67 CD3)
IgG
p-Werte
V
KBR-Gruppe 1
KBR-Gruppe 2
KBR-Gruppe 3
Gruppe 4
Ki-67 IgG
p-Werte
V
KBR-Gruppe 1
KBR-Gruppe 2
KBR-Gruppe 3
Gruppe 4
CD3
p-Werte
V
KBR-Gruppe 1
KBR-Gruppe 2
KBR-Gruppe 3
Gruppe 4
Ki-67 CD3
p-Werte
V
KBR-Gruppe 1
KBR-Gruppe 2
KBR-Gruppe 3
Gruppe 4
Anmerkung:
V
0,0111
0,019
0,0002
0,0436
V
0,3157
0,1068
0,0095
0,0128
V
0,2507
0,0098
0,0116
0,1369
V
0,0003
0,1358
0,027
0,0118
KBR-Gruppe 1 KBR-Gruppe 2 KBR-Gruppe 3 Gruppe 4
0,0111
0,019
0,0002
0,0436
0,8708
0,0576
0,0016
0,0576
0,0157
0,0828
0,0016
0,0157
0,0024
0,8708
0,0828
0,0024
KBR-Gruppe 1 KBR-Gruppe 2 KBR-Gruppe 3 Gruppe 4
0,3157
0,1068
0,0095
0,0128
0,0576
0,0394
0,3247
0,0576
0,2696
0,6404
0,0394
0,2696
0,3993
0,3247
0,6404
0,3993
KBR-Gruppe 1 KBR-Gruppe 2 KBR-Gruppe 3 Gruppe 4
0,2507
0,0098
0,0116
0,1369
0,0187
0,0111
0,0218
0,0187
0,0144
0,1939
0,0111
0,0144
0,0015
0,0218
0,1939
0,0015
KBR-Gruppe 1 KBR-Gruppe 2 KBR-Gruppe 3 Gruppe 4
0,0003
0,1358
0,027
0,0118
0,6671
0,5615
0,1294
0,6671
0,9338
0,8072
0,5615
0,9338
0,6012
0,1294
0,8072
0,6012
signifikante Werte: (p≤ 0,05); statistisch auffällige Werte: (p>0,05 <0,1)
V= Vergleichstiere, Gruppe 4= Tiere mit Polyarthritis; Ki-SDZ: Färbung der Synovialdeckzellen mit
Ki-67, Ki-67 E: Färbung der Entzündungszellen mit Ki-67;
Anhang
142
9.4 Lösungen und Puffer für die immunhistochemischen Untersuchungen
Methylenblau
0,25 g Methylenblau (Merck, Darmstadt), 1ml Eisessig und 99 ml Aqua dest.
Citratpuffer (pH 6,0)
2,1 g Citronensäuremonohydrat in einem Liter Aqua dest. lösen und den pH-Wert der
Lösung mit 1 N NaOH auf 6,0 einstellen.
Avidin-Biotin-Komplex Reagenz (ABC-Reagenz)
15µl Reagenz A in 1000µl PBS lösen; 15µl Reagenz B hinzufügen, mischen; Lösung 30 Min.
vor Gebrauch ansetzen; Inkubation 30 Min. bei Raumtemperatur.
3,3’-Diaminobenzidin-tetrahydrochloridlösung (DAB)
Stammlösung: 100 mg 3,3'-DAB (Fluka, Buchs, Schweiz) in 50 ml PBS-Puffer unter
Lichtausschluss lösen; Lösung 20 Min. lang rühren und bei -2 C° einfrieren.
Gebrauchslösung: 50 ml DAB Stammlösung in 150 ml PBS (pH 7,2) lösen; durch zwei
Filterpapiere filtrieren; Zugabe von 2ml 3% H2O2 Lösung; Endkonzentration 0,05% DAB.
0,5 %iges H2O2 in Methanol für Paraffinschnitte
3 ml 30%iges H2O2 in 200 ml Methanol geben und auf dem Magnetrührer mischen.
Gewinnung von Pferde- und Schweine-Normalserum
Frisches Vollblut einige Stunden im Kühlschrank lagern. Danach Serum abpipettieren
und 30 Minuten bei 190 x g zentrifugieren. Überstehendes Serum erneut abpipettieren und in einem geeigneten Gefäß für 30 Minuten ins 56° C heiße
Wasserbad geben. Danach portionieren und bis zum Gebrauch bei -20°C einfrieren.
Anhang
143
9.5 Bezugsquellen
Bethyl Laboratories, Montgomery,TX, USA
FITC konjugierter polyklonaler Schaf-anti-Hunde-IgG-Antikörper, A40-118F
Biologo, Dr. Hartmut Schultheiß e.K., Immunbiologische Produkte, Kronshagen
Peroxidase Substratkit AEC, AE002-3
DakoCytomation , Glostrup, Dänemark
Monoklonaler Maus-anti-Mensch-Ki-67, Klon MIB-1, M7240
Dako®Glycergel, Eindeckmedium C0563
Novocastra Laboratories Ltd., Newcastle upon Tyne, Großbritannien, über Medac Diagnostica,
Hamburg
Promega, Madison, Wisconsin, USA
Polyklonaler Kaninchen-anti-Mensch-aktive Caspase-3-Antikörper, G7481
Roth C. GmbH & Co. KG, Karlsruhe
Essigsäure-n-butylester (EBE), 4600.7
Ethanol, vergällt, K928.2
Hämalaunlösung sauer nach Mayer, T865.2
Methanol, Rotipuran®, 99,9%, p.a., 4627.6
Natriumchlorid (NaCl), P029.2
2-Propanol (Isopropanol) 9866.4
Roticlear®, A538.3
Roti®-Histokitt II, T160.2
Roti®-Plast, Gewebeeinbettungsmedium, 6642.6
Rotiprotect®-Nitrilhandschuhe, P777.1
Salzsäure Rotipuran® 25% p.a., 6331.3
Serotec, Morpho Sys AG, Martinsried
Ratte-anti-Mensch-CD3, MCA 1477
Anhang
144
Serva Electrophoresis GmbH, Heidelberg
Bovines Serumalbumin, BSA, 11930
Tween®20,37470
Vector Laboratories Inc., Burlingame, CA, USA, über Biologo, Kronshagen
Biotinylierter Ziege-anti-FITC-Antikörper, BA-0601
Biotinylierter Pferd-anti-Maus-IgG (H+L)-Antikörper, BA-2000
Biotinylierter Ziege-anti-Ratte-IgG (H+L)-Antikörper, BA-9400
Vectastain Standard ABC-Kit, PK-4000
Vectastain Elite ABC-Kit, PK-6100
9.5.1 Bezugsquellen für Geräte und Einmalartikel
Bauknecht Hausgeräte GmbH, Schorndorf
Mikrowelle, MWS 2924
IKA-Werke GmbH&Co.KG, Staufen
Magnetrührer, Typ Reo
Kendo Laboratory Products GmbH, Hanau
Brutschrank Heraeus, Typ B5042
Brutschrank Heraeus, Typ 6060
Köttermann Labortechnik, Uetze-Hänigsen
Wasserbad, Typ 3047
Leica Microsystems GmbH ,Wetzlar
Mikroskop, semiautomatisches System, ASM68k
Menzel-Gläser, Glasbearbeitungswerk GmbH & Co. KG, Braunschweig
SuperFrost®Plus Objektträger, 041300
Microm, Heidelberg
Schlittenmikrotom, Modell HM 400
Anhang
145
Gesellschaft für Labortechnik GmbH, Burgwedel
Paraffinstreckbad 1052
Heraeus Sepatech GmbH, Osterode
Zentrifuge Labofuge®A, 2500
Leica Microsystems Nussloch GmbH, Nussloch
Färbegerät Leica ST 4040
Medite Medizintechnik, Burgdorf
Objektträger-Eindeckautomat Promounter RCM 2000
Sartorius AG, Göttingen
Elektronische Präzisionswaage L310, WL-6006-m88091
Papierfaltenfilter 270 mm Durchmesser, FT-4-303-270
Schleicher & Schuell, Dassel
Papierfilter, S&S Rundfilter 150 mm Durchmesser, 311612
Thermo Electron GmbH, Dreieich
Shandon CoverplatesTM, 72110013
Shandon Sequenza® Slide Racks (Einsätze für Coverplates), 7331017
W. Knittel Glasbearbeitungs GmbH, Braunschweig
Deckgläser (24 x 50 mm)
Zeiss, Oberkochen
Mikroskop, Axiophot
Anhang
9.6
146
Verzeichnis der verwendeten Abkürzungen
AP
Alkalische Phosphatase
ABC
Avidin-Biotin-Peroxidase-Komplex
Austr. Shep.
Australian Shepherd
Aqua dest.
Aqua destillata
Abb.
Abbildung
Berner S.
Berner Sennenhund
BSA
Bovines Serumalbumin
bzw.
beziehungsweise
DAB
3,3’-Diaminobenzidin-tetrahydrochlorid
d
disseminiert
DK
Deutsch Kurzhaar
DSH
Deutscher Schäferhund
Dt. Dogge
Deutsche Dogge
Dt. Langhaar
Deutsch Langhaar
Dt. Stichelhaar
Deutsch Stichelhaar
f
fingerförmig
fo
fokal
g
Gramm
Gew.
Gewicht
ggr.
Geringgradig
G. Retr.
Golden Retriever
hgr.
hochgradig
HE
Hämatoxylin-Eosin
HCl
Salzsäure
HKV
Herzkreislaufversagen
IHC
Immunhistochemie
IPA
Idiopathische Polyarthritis
J
Jahre
k
keine
Kan. Schfhd.
Kanadischer Schäferhund
KBR
Kreuzbandriss
kDa
Kilo Dalton
ku
kurz
Anhang
147
Lfd. Nr.
laufende Nummer
m
männlich
mf
multifokal
mgr.
mittelgradig
mk
männlich-kastriert
Min.
Minuten
MW
Mikrowelle
NaCl
Natriumchlorid
PA
Polyarthritis
pv
perivaskulär
SDZ-Reihen
Synovialdeckzellreihen
Tab.
Tabelle
u.a.
unter anderem
w
weiblich
WHWT
West Highland White Terrier
wk
weiblich-kastriert
z.B.
zum Beispiel
Danksagung
Als erstes gilt mein Dank Frau Prof. Dr. Hewicker Trautwein für die Bereitstellung des Themas, die
jederzeit gewährte immer freundliche Betreuung und Unterstützung der Arbeit und auch der Geduld
und dem Verständnis für die Langwierigkeit einer Doktorarbeit mit Kind.
Herzlichen Dank Frau Dr. Meyer-Lindenberg und der Tierklinik Greven für die Bereitstellung des
Probenmaterials.
Bedanken möchte ich mich bei sämtlichen Mitarbeitern im Institut für Pathologie, die mir jederzeit
freundlich Hilfe gewährten,
insbesondere gilt der Dank:
Klaus Kuhlmann und Kerstin Rohn für viele nützliche Tipps im Labor und für die Anleitung zur
Immunhistologie, ausserdem Claudia Herrmann und Bettina Buck für das Anlernen am
Rotationsmikrotom und viele nette gemeinsame Stunden beim Schneiden der Parraffinblöcke.
Sven Kleinschmidt für so manchen fachmännischen Rat und nicht zuletzt für die Hilfe beim
Statistikprogramm, Verena Haist für die lebensnotwendige Verwandlung der Doktorarbeit in ein
aktives Dokument und immer nette Abende, Dirk Schaudien für anregende Diskussionen über Ki-67
und Caspase-3, Vanessa Herder für die Hilfe beim Erstellen der Box Plots und ihr Strahlen, Vanessa
Harder für nette Stunden beim Zellen zählen und durchdiskutieren verschiedener
Dissertationsproblematiken.
Nicht zu vergessen ist der notwendige Spaß bei der Arbeit, der in meinem Großraumbüro immer zu
finden war: danke für unzählige lustige Stunden liebe Frauke, Verena, Katharina, Doris, Vanessa,
Björn und Dirk. Ihr wart das Salz in der Suppe!
Ein großes Dankeschön gilt Ulf Bartsch für den Notdienst bei den regelmäßig auftretenden
Computerdisastern!
Bedanken möchte ich mich bei meinen Eltern für die finanzielle und moralische Unterstützung der
Doktorarbeit, besonderer Dank gilt meinem Vater für seine immerwährende Motivation und seine
Zuversicht, welche seiner Tochter zuweilen abhanden gekommen war.
Außerdem möchte ich meinem Vater für die genaue Durchsicht und das gemeinsame Durcharbeiten
des Manuskriptes danken.
Unseren Hunden Julchen und Berry für die erholsamen Spaziergänge nach getaner wissenschaftlicher
Arbeit.
Meinem Mann Björn und meiner Tochter Nike gebührt der größte Dank.
Björn für seine Geduld, den notwendigen Halt und Liebe. Letztendlich haben diese Faktoren
wesentlich zum Erfolg der Dissertation beigetragen.
Nike für Nike.