Bacheloroppgave 2013

Transcription

UTVIKLING AV EN VÆSKEKROMATOGRAFISKTANDEM-MASSESPEKTROMETRISK ANALYSEMETODE FOR SYNTETISKE CANNABINOIDER
BIOIN-112
DET HELSEVITENSKAPELIGE FAKULTET
INSTITUTT FOR MEDISINSK BIOLOGI
BIOINGENIØRUTDANNING
KANDIDATNUMMER: 5 OG 6
2013
1
Forord
Som avsluttende bacheloroppgave ved bioingeniørutdanningen ved Universitetet i
Tromsø (UIT), har vi bidratt til å starte utviklingen av en analysemetode for syntetiske
cannabinoider ved Massespektrometri-laboratoriet (MS-laboratoriet) ved
Universitetssykehuset Nord-Norge (UNN). Metodeutviklingen innebar en modifisering
av laboratoriets analysemetode for Δ9-Tetrahydrocannabinol (THC) og til slutt en
validering av den utviklede metoden.
Vi er veldig takknemlig overfor vår veileder Ole-Martin Fuskevåg for svært god
veiledning, faglig støtte og tilrettelegging av det praktiske arbeidet under
metodeutviklingen. Vi ønsker også å takke de andre ansatte ved MS-laboratoriet for å få
oss til å føle velkomne, og ikke minst hjelpen de har gitt oss med mange praktiske
småting. Til slutt ønsker vi å takke vår skriveveileder Kirsten Raanaas Huseby ved UIT
for den gode skriveveiledningen vi har fått underveis for skrivearbeidet med oppgaven.
Sammendrag
I denne oppgaven ble det utviklet en metode for analysering av syntetiske cannabinoider ved å
bruke væskekromatografi-tandem-massespektrometri(LC-MS/MS), for å undersøke om
metoden kan brukes til å analysere pasientprøver.
For å skape best grunnlag for denne oppgaven ble det samlet inn faglitteratur fra biblioteket
ved UIT, internasjonale forskningsrapporter og dokumenter fra MS-laboratoriet ved UNN.
Forsøket begynte med pilotundersøkelser som gikk ut på å teste tjue organiske løsemidler og
fire bufferløsninger for å se hvilken kombinasjon av disse ekstraksjonsreagensene som ga best
ekstraksjon av oppgavens utvalg av syntetiske cannabinoider. Utvalget av organiske
løsemidler og bufferløsninger var basert på de som brukes i rutineanalysene ved MSlaboratoriet ved UNN og faglitteraturen (14). Pilotundersøkelsen besto av fem
testrunder/eliminasjonsrunder der den femte testrunden i utgangspunktet skulle gi en
avgjørelse på hvilket organisk løsemiddel og bufferløsning som ville gi best ekstraksjon. For å
stå igjen med det beste organiske løsemidlet og den beste bufferløsningen ble det fulgt fire
2
kriterier i de to første testrundene og fem kriterier i den tredje testrunden. Disse kriteriene er
listet opp henholdsvis i tabell 20, 23 og 26. Ved å følge disse kriteriene kom man frem til at
Diklormetan (DCM) og bufferløsning 4 (Ammoniumkarbonat) utgjorde de beste
ekstraksjonsreagensene for analysemetoden.
Ettersom pilotundersøkelsen ga en tilfredsstillende konklusjon angående best egnede
ekstraksjonsreagenser, gikk man videre med å validere metoden. Metoden ble validert etter
valideringsparameterne linearitet, reproduserbarhet, presisjon, gjenvinning, LOQ/LOD (Limit
of Quantification/Limit of Detection) og systempresisjon. Resultatene til valideringen
indikerte at metoden har potensial til å bli en rutineanalyse. Men metoden innfridde ikke flere
av kravene satt for valideringsparameterne, og valideringsprosessen skulle vært gjort på nytt.
Dette ble ikke gjort i denne omgang på grunn av tidsbegrensning.
3
Innholdsfortegnelse
Forord ........................................................................................................................................... 2
Sammendrag .............................................................................................................................. 2
1. Introduksjon .......................................................................................................................... 8
1.1 Formålet med oppgaven .....................................................................................................................................8
2. Teori .......................................................................................................................................... 9
2.1 Effekten av syntetiske cannabinoider........................................................................................................ 10
2.2 LC-MS/MS .............................................................................................................................................................. 11
2.3 Massespektrometri ............................................................................................................................................ 13
2.3.1 Generelt .......................................................................................................................................................................................................... 13
2.3.2 Ionekilder ...................................................................................................................................................................................................... 13
2.3.3 ESI ..................................................................................................................................................................................................................... 13
2.4 Masseanalysator ............................................................................................................................................................................................ 14
2.5 Deteksjon ........................................................................................................................................................................................................... 16
2.5.1 Standardkurver .......................................................................................................................................................................................... 16
2.5.2 Internstandardmetoden ......................................................................................................................................................................... 17
2.5.3 Prøveopparbeidelse ................................................................................................................................................................................. 17
2.6 Validering av metode ........................................................................................................................................ 18
2.6.1 Presisjon......................................................................................................................................................................................................... 19
2.6.2 Nøyaktighet .................................................................................................................................................................................................. 19
2.6.3 Linearitet ....................................................................................................................................................................................................... 19
2.6.4 Gjenvinning................................................................................................................................................................................................... 19
2.6.5 LOD/LOQ ....................................................................................................................................................................................................... 20
3. Materiale og metoder...................................................................................................... 21
3.1 Utstyr ....................................................................................................................................................................... 21
3.2 Serum ...................................................................................................................................................................... 21
3.3 Vann ......................................................................................................................................................................... 21
3.4 Buffer ....................................................................................................................................................................... 21
3.5 Mobilfase ................................................................................................................................................................ 21
4. Fremgangsmåte ................................................................................................................. 24
5. Resultater ......................................................................................................................... 45
5.1 Kromatogrammet til forbindelsens datterioner, ekstrahert fra en spiked urinprøve........... 45
5.2 Pilotundersøkelse av ulike ekstraksjonsreagenser for å finne den beste væske-væske
ekstraksjonsmetoden. .............................................................................................................................................. 46
5.2.1 Testrunde 1. ...................................................................................................................................................... 46
5.2.2 Testrunde 2 ....................................................................................................................................................... 48
5.2.3 Testrunde 3 ....................................................................................................................................................... 50
5.2.4 Testrunde 4 ....................................................................................................................................................... 51
4
5.2.5 Testrunde 5 ....................................................................................................................................................... 51
5.3 Eksempler på lineære standardkurver for forbindelsene JWH-018, 073 og metabolittene
deres ................................................................................................................................................................................ 52
5.4 Validering .............................................................................................................................................................. 54
5.4.1 Aksept kriteria for valideringen ............................................................................................................... 54
5.4.2 Linearitet ............................................................................................................................................................ 54
5.4.3 Presisjon ............................................................................................................................................................. 54
5.4.4 Reproduserbarhet .......................................................................................................................................... 54
5.4.5 Systempresisjon .............................................................................................................................................. 55
5.4.6 LOD og LOQ ....................................................................................................................................................... 55
5.4.7 Gjenvinning ....................................................................................................................................................... 55
5.4.8 Linearitet ............................................................................................................................................................ 56
5.4.9 Presisjon ............................................................................................................................................................. 58
5.4.10 Reproduserbarhet ....................................................................................................................................... 59
5.4.11 Systempresisjon............................................................................................................................................ 61
5.4.12 LOD og LOQ..................................................................................................................................................... 62
5.4.13 Gjenvinning..................................................................................................................................................... 63
6.1 Pilotundersøkelse............................................................................................................................................... 66
6.1.1 Testrunde 1 ....................................................................................................................................................... 66
6.1.2 Testrunde 2 ....................................................................................................................................................... 67
6.1.3 Testrunde 3 ....................................................................................................................................................... 67
6.1.4 Testrunde 4 ....................................................................................................................................................... 67
6.1.5 Testrunde 5 ....................................................................................................................................................... 68
6.2 Feilkilder ................................................................................................................................................................ 68
6.3 Validering .............................................................................................................................................................. 69
6.3.1 Linearitet ............................................................................................................................................................ 69
6.3.2 Nøyaktighet ....................................................................................................................................................... 69
6.3.3 Presisjon ............................................................................................................................................................. 69
6.3.4 Systempresisjon .............................................................................................................................................. 69
6.3.5 Reproduserbarhet .......................................................................................................................................... 69
6.3.6 LOD og LOQ ....................................................................................................................................................... 70
6.3.7 Gjenvinning ....................................................................................................................................................... 70
6.4 Feilkilder ................................................................................................................................................................ 70
6.5 Konklusjon ............................................................................................................................................................ 71
6.5.1 Pilotundersøkelse ........................................................................................................................................... 71
6.5.2 Validering ........................................................................................................................................................... 71
7. Kilder .................................................................................................................................. 72
Vedlegg 1: Analyseprosedyre for THC
5
Forkortelser
ACN
Acetonitril
JWH
John W. Huffman
CV
Coefficient of variation
KV
Konespenning
KE
Kollisjonsenergi
kV
Kilo Volt
ESI
Electrospray ionization
HPLC
High performance Liquid Chromatography
IS
Interstandard
LC
Liquid Chromatography
m/z
masse/ladning ratio
MS/MS
Tandem mass spectrometry
SD
Standardavvik
UPLC
Ultra performance Liquid Chromatography
Mw
Molekylvekt
VVE
Væske-væske ekstraksjon
LOD
Limit of detection
LOQ
Limit of quantitation
MS
Massespektrometri
TBME
Tert-butylmetyleter
MeOH
Metanol
DCM
Diklormetan
D:E
Dietyleter:Etylacetat
n-H:D
n-Heksan: Dietyleter
n-H:D:E
n-Heksan:Dietyleter:Etylacetat
TBME:ETOAC
Tert-butyl metyleter:Etylacetat
THC
Δ9-Tetrahydrocannabinol
n-H:E
n-Heksan:Etylacetat
IPA
Isopropanol
IS
Internstandard
T:IMA
Toluen:Isoamylalkohol
6
n- H
n-Heksan
IMA
Isoamylalkohol
SH
Sykloheksan
KB
Klorbutan
UIT
Universitet i Tromsø
UNN
Universitetssykehuset i Nord-Norge
RSD
Relative Standard Deviation
OFK
Omvendt-Fase-Kromatografi
Q1
Første kvadrupol
Q3
Tredje kvadrupol
Q2
Kvadrupol nummer 2
MRM
Multiple Reaction Monitoring
APPI
Atmospheric-pressure Photo Ionization
APCI
Atmospheric-Pressure Chemical Ionization
IUPAC
International Union of Pure and Applied Chemistry
ICH
International Conference of Harmonization
GJ
Gjenvinning
7
1. Introduksjon
I løpet av 2011 og 2012 er det gjort flere større beslag av syntetiske cannabinoider i Norge
som er klassifisert som narkotika. Men det kommer stadig nye strukturmodifiserte syntetiske
cannabinoider som markedsføres over internett som lovlig cannabis. Derfor er det en
pågående «konkurranse» mellom myndighetene og produsenter, med tanke på å føre disse nye
syntetiske cannabisforbindelsene opp som narkotika og utvikle nye strukturer som ikke
klassifiseres som narkotika. Syntetiske cannabinoider kan medføre alvorlige tilstander som
kan være livstruende. Man får en liknende effekt som cannabisrus men i sterkere grad. (1)
Per dags dato, mai 2013, er det ikke etablert noen rutineanalyse for syntetiske cannabinoider
ved UNN. Derfor er det viktig å få startet utviklingen av en analysemetode for slike
forbindelser, som kan etableres som en del av rutineanalysene på MS-laboratoriet ved UNN.
Det kommer stadig endrede strukturer av syntetiske cannabinoider. Dermed bør metoden
oppdateres i takt med utbredelse i bruk av de nye syntetiske cannabinoider.
1.1 Formålet med oppgaven
Formålet med oppgaven var å utvikle en LC-MS/MS metode for kvantifisering av syntetiske
cannabinoider («Spice») i urin. De mest vanlige syntetiske cannabinoider JWH-018 og JWH073 og deres hovedmetabolitter ble valgt ut.
8
2. Teori
John W. Huffman (JWH) er professor i organisk kjemi ved Clemson University i USA. Han
var den som syntetiserte de første syntetiske cannabinoider i 1990-årene (2), for å bruke dem
som et mulig terapeutisk produkt.
Figur 1. Figuren viser cannabinoidreseptorene (CB1 og CB2) og deres lokalisasjon. (3)
Syntetiske cannabinoider inntas vanligvis ved røyking, men kan også inntas ved inhalasjon
eller peroralt (4). Det finnes to cannabinoidreseptorer (CB1 og CB2) som er de samme
reseptorene som blir stimulert ved å røyke vanlig cannabis. CB1-reseptorene er lokaliser i
sentralnervesystemet, mens CB2-reseptorene er lokalisert i immunsystemet (4). Ved bruk av
THC blir det delvis aktivering ved binding til CB1- og CB2-reseptorene, mens ved å bruke
syntetiske cannabinoider blir CB1-reseptorene aktivert maksimalt, selv ved lav konsentrasjon.
Bortsett fra at syntetiske cannabinoider omdannes av leverenzymer, vet man ikke hvordan
stoffenes absorpsjon, distribusjon, metabolisme og eliminasjon fungerer.
9
Figur 2. Strukturer til et utvalg syntetisk cannabinoider. (5)
2.1 Effekten av syntetiske cannabinoider
Under en internett-undersøkelse som ble gjort rapporterte 87 % av brukerne positive effekter,
mens 40 % rapporterte om uønskede effekter. Negative eller uønskede effekter er blant annet
kramper, koma, hypertensjon, kvalme, depresjon, psykose og i verstefall livstruende effekter
ved langvarig bruk. I tillegg til disse er syntetiske cannabinoider avhengighetsskapende og
man kan fort få en overdose på grunn av at forskjellen mellom doser som gir effekt og doser
som kan være skadelige er liten. (1)
10
2.2 LC-MS/MS
LC-MS/MS er et instrument som består av fire hoveddeler i tillegg til en datamaskin, se figur
3.
Figur 3. Skjematisk fremstilling av et massespektrometer.
Instrumentet er satt sammen av et tandem-massespektrometer som er koblet sammen med en
væskekromatograf. Massespektrometrisk analyse av rusmidler og legemidler i biologiske
prøver er en meget spesifikk og utbredt metode som benyttes både til kvantitative og
kvalitative analyser. Kromatografi er en betegnelse på metoder som brukes til å separere
stoffer fra hverandre. Stoffer som føres inn i en væskekromatograf separeres på grunnlag av
stoffenes kjemisk affinitet til det som kalles mobilfasen og stasjonærfasen. Mobilfasen er en
væske som prøvestoffene suspenderes i etter en prøveopparbeidelse, og som pumpes gjennom
LC-MS/MS systemets kolonne og kapillærrør med en bestemt hastighet. De stoffene i en
prøve som har større affinitet til stasjonærfasen enn mobilfasen vil strømme saktere gjennom
kolonnen enn de stoffene som har større affinitet til mobilfasen. Det forutsettes at mobilfasen
har en jevn hastighet gjennom kolonnen, som ivaretas av pumpesystemet i LC-delen av LCMS/MS instrumentet. På grunnlag av dette kan man separere forskjellige stoffer i en prøve fra
hverandre ved at stasjonærfasen retarderer de ulike stoffene i ulik grad. Stoffene kan på denne
måten separeres fra hverandre og kvantiteres ved at de elueres inn MS detektoren. Den
elektriske detektorresponsen for analyttene bearbeides av en tilkoblet datamaskin som viser
konsentrasjon av analyttmolekylene i form av et kromatogram. (6)
11
Figur 4. Figuren viser et skjematisk oppsett for et LC-MS/MS instrument, modifisert fra (7)
Det finnes forskjellige typer væskekromatografi, men Ultra Performance Liquid
Chromatography (UPLC) med omvendt-fase-kromatografi (OFK) er den som omtales i denne
teksten. UPLC innebærer at stasjonærfasen består av små runde og like store partikler, pakket
uniformt inn i en kolonne. OFK innebærer at stasjonærfasen har hydrofobe grupper som
dekker deres overflate. Mobilfasen som benyttes ved OFK består av en miks av vann og
organiske løsemidler som er blandbare med vann, slik som metanol (MeOH) og acetonitril
(ACN).
Retensjonsmekanismene ved OFK består av et samspill mellom stasjonærfasen og
mobilfasen. Ved OFK retarderes stoffene i en prøve av stasjonærfasen med hydrofobe
bindinger, slik som van der Waals-krefter. I denne bacheloroppgaven ble det og benyttet en
HSS T3 kolonne som er en hybrid, som betyr at den kan retardere både polare og nøytrale
forbindelser med det fabrikanten kaller T3 binding. (6)(8) Konsentrasjonen av organiske
løsemidler i mobilfasen er faktoren som regulerer retensjonen av stoffer i kolonnen. Nøytrale
forbindelsers retensjon minker når konsentrasjonen av organiske løsemidler øker, og motsatt
for polare forbindelser. (6)
12
2.3 Massespektrometri
2.3.1 Generelt
LC-delen eluerer analyttmolekylene fra prøven inn i MS/MS delen av instrumentet.
Prøvemolekylene vil først ankomme ionekilden der de ioniseres. Etter ioniseringen ledes de
ioniserte prøvemolekylene inn i masseanalysatoren ved hjelp av elektriske spenninger. I
masse analysatoren separeres de ioniserte prøvemolekylene basert på deres masse til ladnings
forhold (m/z) og ledes til en detektor som registrerer prøvemolekylene. (6)
2.3.2 Ionekilder
Det finnes flere forskjellige typer ionekilder som anvendes i LC-MS/MS instrumenter som
f.eks. Elektrosprayionisasjon (ESI), Atmospheric - Pressure Chemical Ionization (APCI) og
Atmospheric-pressure Photo Ionization (APPI). I denne teksten vil kun ESI omtales. Dette er
en meget utbredt ioniseringsteknikk for prøvestoffer ved bruk av MS for deteksjon med
væskekromatografi i form av High Performance Liquid Chromatography (HPLC) eller UPLC.
(6)
2.3.3 ESI
ESI er en ioniseringsteknikk som foregår under atmosfærisk trykk og er en såkalt myk
ioniseringsteknikk. Myk ioniseringsteknikk vil si at det for det meste dannes ioniserte
prøve/analyttmolekyler som ikke fragmenteres videre. Ved bruk av ESI føres
analyttmolekylene, som er suspendert i en strøm av mobilfase, inn i MS ved å passere
gjennom et kapillærrør. Når mobilfasen når utgangen av kapillæret forstøves væsken til
aerosoler ved hjelp av nitrogengass og varme. Enden på utgangen av kapillæret er en
elektrode som kan ha en spenning på flere kilovolt (kV) f.eks. 2 kV. Spenningen på
elektroden gir aerosolene en elektrisk ladning som kan være enten positiv eller negativ, dette
avhenger av om instrumentet er stilt inn på positiv eller negativ ioniseringsmodus. Ved positiv
modus oksiderer elektroden aerosolene og ved negativ modus reduserer den.
Mobilfasen som benyttes ved OFK er relativt flyktig og aerosolene vil etter hvert fordampe.
Fordampingsprosessen hjelpes ved at de ladede aerosolene dusjes med en strøm av
nitrogengass som kalles tørkegass. Etter å ha blitt dusjet med tørkegass gjenstår bare de
ioniserte analyttmolekylene som føres videre inn i MS sin masseanalysator ved hjelp av
elektrisk spenning. (6)
13
Figur 5. : Figuren viser en skisse over ioniseringsteknikken ESI. (9)
2.4 Masseanalysator
Masseanalysatoren i de fleste LC-MS/MS instrumenter som benyttes i dag er bygd etter
kvadrupolprinsippet. En kvadrupol masseanalysator består av fire parallelle metall staver der
det pålegges felt av likestrøm (DC) og radiofrekvenser mellom dem. Styrken på likestrømmen
og frekvensen til radiosignalet i det pålagte feltet, bestemmer hvilke ioner som får passere
videre gjennom masseanalysatoren til detektoren, basert på deres m/z. Endring av styrken på
likestrømmen, og frekvensen på radiofrekvensen, regulerer hvilke m/z verdier som skal
slippes gjennom til detektoren. Disse endringene utføres med programvaren til instrumentet
på en datamaskin.
14
Figur 6. Figuren viser en kvadrupol som slipper gjennom ioner med den rette m/z i forhold til styrken på
likestrømmen og radiofrekvensen i feltet mellom stavene. (10)
I LC-MS/MS instrumenter som benyttes til kvantifisering av stoffer, benyttes det
masseanalysatorer bestående av trippel-kvadrupoler. Trippel-kvadrupol analysatorer består av
tre sett kvadrupoler men det er kun første kvadrupol (Q1) og tredje kvadrupol (Q3) som
fungerer som masseanalysator. Kvadrupol nummer 2 (Q2) kalles en kollisjonscelle. Q1
fungerer som et massefilter som akselererer de ionene med valgt m/z videre til Q2, de ionene
som ikke har korrekt m/z filtreres ut ved at de kolliderer med metall stavene og går til grunne.
I Q2 kolliderer analyttionene med en inert gass som for eksempel argon. Resultatet av
kollisjonen er at analyttionene fragmenters til ioner med mindre masse enn utgangspunktet.
Fragment ionene akselereres videre til Q3 hvor det foretas en ny masse filtrering der fragment
ionene med korrekt m/z sendes videre til detektoren. (10)
Figur 7. Skisse av en trippel-kvadrupol, modifisert fra (11)
15
2.5 Deteksjon
For kvantifisering av rusmidler og legemidler benyttes ofte analysemodusen som kalles
Multiple Reaction Monitoring (MRM). MRM analyse modus utføres med triple-kvadrupol
masseanalysatorer og man kan kvantitere flere ulike typer analyttmolekyler samtidig. Dette
utføres ved at man låser Q1 til m/z verdiene for de aktuelle stoffene som skal analyseres. De
ioniserte analyttmolekylene som analyseres omtales som morioner fordi man ved MRM
fragmenterer morioner til datterioner, grunnen til dette omtales senere. Morionene i Q1
akselereres videre til kollisjonscellen Q2 hvor de fragmenteres til datterioner med et bestemt
m/z. (6)(12)
Fragmenteringen av morioner til datterioner med et bestemt m/z kalles en overgang og skrives
ofte som (morion masse -> datterion masse) (12). Fragmenteringen av morioner reguleres av
den kollisjonsenergien som er stilt inn for kollisjonscellen. I Q3 akselereres datterionene til
detektoren som registrerer ionene. Programvaren på datamaskinen som er koblet til
instrumentet lager et plott kalt massekromatogram basert på detektorresponsen og
retensjonstiden til stoffene som kvantiteres. Et massekromatogram er en plotting av
intensiteten til den detekterte massen som funksjon av retensjonstiden for analytten. Et
eksempel på et massekromatogram er vist i figur 14 under resultater.
MRM er en svært følsom og spesifikk analysemodus, fordi datterionene man kan danne med
denne modusen er vanligvis veldig spesifikk for en gitt analytt, dermed vil påvisningen av
datter-ioner med gitte masser gi en sikker identifikasjon av analytten. Dette gir med andre ord
analysemetoden en svært høy selektivitet og sensitivitet. Fordi alle andre stoffer som kan gi
bakgrunnsstøy, på grunn av lik masse med morionene til analytten, blir eliminert når ionene i
kollisjonscellen fragmenteres. (6)
2.5.1 Standardkurver
For å finne den ukjente konsentrasjonen til analytter i en prøve, settes det opp en
standardkurve for hvert stoff som skal kvantifiseres. Standardkurver som benyttes i LCMS/MS består av topparealer (detektorresponsen i massekromatogrammet) fra standarder som
inneholder kjente konsentrasjoner av stoffet som skal kvantifiseres. Når det analyseres samme
volum av standardløsninger og prøveløsninger, kan den ukjente konsentrasjonen til analytten
beregnes. Beregningen av den ukjente konsentrasjonen til analytten skjer på bakgrunn av at
16
dens toppareal i massekromatogrammet plottes som funksjon av konsentrasjonen. Denne
beregningen utføres av programvaren på datamaskinen koblet til LC-MS/MS instrumentet. (6)
2.5.2 Internstandardmetoden
For analyser med prøveopparbeidelser som inkluderer ekstraksjon av analytt fra prøven, kan
analyse uten internstandard (IS) gi utilfredsstillende nøyaktighet og presisjon. Dette er på grunn
av tilfeldige endringer som kan skje under prøveopparbeidelsen og mikroskopiske tap av
prøveløsning ved overføringer fra et reagensrør til et annet.
For slike analyser er det vanlig å benytte en IS i tillegg. En IS består av kjente konsentrasjoner
av samme forbindelse som analytten, som er isotopmerket. Siden internstandarden vil oppføre
seg likt med analytten under prøveopparbeidelsen, vil den korrigere for de tilfeldige endringene
som måtte skje i løpet av den prosessen. (6)
2.5.3 Prøveopparbeidelse
Rusmiddel- og legemiddelanalyser utføres stort sett på prøver med en biologisk matrise som
urin eller blod. Sammensetningen av disse prøvematrisene er for kompleks til at prøvene kan
analyseres direkte, og må opparbeides til løsninger som kan introduseres for LC-MS/MS
instrumenter. En problematikk med de biologiske matrisene blod og urin er at de kan
inneholde ett eller flere stoffer som gir samme detektorrespons som analytten. Dette er en
interferensproblematikk der responsen til analytten ikke kan skilles fra det eller de
interfererende stoffene.
En annen problematikk er at prøvematriser slik som blod og urin inneholder proteiner som
ikke er løselig i mobilfasen. Proteinene kan dermed felles ut i injektoren og kolonnen til LCMS/MS systemet slik at det tettes igjen. For å hindre ødeleggelse av LC-MS/MS instrumenter
er det vanlig prosedyre ved MS-laboratoriet på UNN å ekstrahere analyttene ut fra
prøvematrisen før prøvene analyseres med væske-væske-ekstraksjon (VVE). VVE benytter
seg av egenskapen organiske forbindelser har til å fordele seg mellom en polar (vandig) og
upolar (organisk løsemiddel) væske. Hensikten med VVE er å benytte et organisk løsemiddel
som løser analytten godt og de interfererende stoffene dårlig. Normalt sett er det bare den
nøytrale formen av analytter som vil ekstraheres fra den polare matrisen og over i det
organiske løsemidlet. Dermed vil ekstraksjonsutbyttet man får av en analytt avhenge av pH i
den vandige fasen hvis analytten er en base eller syre. Hvis analytten for eksempel er en svak
base må VVE løsningen tilsettes en basisk buffer for å gjøre analytten nøytral.
17
Den praktiske delen av ekstraksjon innebærer å riste VVE løsningen, som består av prøven og
det organiske løsemidlet som benyttes, slik at analytten løses i løsemidlet. Etter ristingen
sentrifugeres VVE løsningen slik at man får skilt den organiske og vandige fasen. Den
organiske fasen som skal inneholde analytten overfører man til et egnet reagensrør og dampes
inn. Til slutt tilsettes mobilfasen analytten skal løses i og injiseres i LC-MS/MS instrumentet
for analyse. (6)
2.6 Validering av metode
Når det utvikles en ny analysemetode må metoden alltid testes for å sjekke at den gir
resultater som er tilfredsstillende i henhold til dens hensikt. En slik testing av nye metoder
kalles validering. Vanlig prosedyre for validering er å følge et sett av standardiserte tester som
gir data for de ulike testene metoden valideres for. Settet av tester man benytter til
valideringen avhenger av hvilken kategori metoden tilhører. Hvis det er en kvantitativ metode
benyttes ofte testene presentert i figur 8, og gjerne andre tester som ikke er nevnt der, slik som
spesifisitet. Hvis det er en kvalitativ metode benytter man gjerne et sett med færre tester enn
de presentert i figur 8. Linearitet benyttes for eksempel ikke som et valideringsparameter for
kvalitative metoder. Disse settene av tester presenteres gjerne i valideringsveiledere utarbeidet
av ulike internasjonale organisasjoner slik som International Union of Pure and Applied
Chemistry (IUPAC) og International Conference of Harmonization (ICH). (13)
Validering
Presisjon
Nøyaktighet
Gjenvinning
Reproduserbarhet
LOD/LOQ
Systempresisjon
Linearitet
Figur 8. Valideringsparameterne for kvantitative analysemetoder.
18
2.6.1 Presisjon
Presisjon er uttrykk for variasjonen til et sett av analyseresultater som stammer fra målinger
av paralleller fra en homogen prøve, der analyseforholdene er de samme ved hver måling.
Måling av presisjonen til en metode viser graden av tilfeldige feil for metoden. Presisjon kan
deles inn i underkategoriene repeterbarhet og reproduserbarhet. Repeterbarhet måles ved at
prøveparalleller som benyttes for dette formålet analyseres av kun en person, på samme
instrument, samme dag og på det samme laboratoriet. Reproduserbarhet måles når en av
testforholdene som definerer repeterbarhet varierer, som for eksempel at en prøve analyseres
en gang per dag over flere dager, eller måles på to forskjellige instrumenter. Siden presisjon
avhenger av analyttkonsentrasjon måles presisjonen ved forskjellige konsentrasjonsnivå
innenfor måleområdet for metoden. Presisjon oppgis enten som coefficient of variation (CV)
eller Relative Standard Deviation (RSD) fra en serie av analyseresultater. (13)
2.6.2 Nøyaktighet
Nøyaktighet er differansen mellom den målte verdien av analytten i en prøve og dens sanne
verdi eller referanse verdi, og oppgis vanligvis i prosent. For å bestemme nøyaktighet må det
benyttes prøvemateriale i form av kontrollprøver der man vet fasitverdien på prøven, og ideelt
sett benyttes det sertifisert referanse materiale for dette. For rusmidler er det dog sjeldent at
sertifiserte referanse materialer er tilgjengelig men som alternativ kan det benyttes
referansestandarder fra godkjente kommersielle aktører. (13)
2.6.3 Linearitet
Hensikten med å dokumentere lineariteten til en metode er å undersøke om signalresponsene
for målingen av en analytt er proporsjonal med dens konsentrasjon innenfor et definert
måleområde. Lineariteten dokumenteres ved lineær regresjon med regresjonslinjen: y = ax +
b, hvor y er respons, x er konsentrasjonen og b er kurvens skjæringspunkt med y-aksen og
regresjonskoeffisienten r2 regnes ut. En regresjonskoeffisient større eller lik 0,99 brukes
vanligvis som et kriterium for linearitet for kvantitative metoder, og kvalitative metoder med
konsentrasjonsterskelverdi for å rapportere negativt/positivt resultat. (13)
2.6.4 Gjenvinning
Gjenvinning er den andelsprosenten av den opprinnelige mengden analytt i en prøve som
måles etter siste behandlings-steg i metodeprosedyren. En vanlig måte å utføre dette på er å
19
tilsette en kjent mengde analytt til en blank matrise og deretter utføre analyseprosedyren for
metoden. Dette gjøres ofte med triplikater med henholdsvis tre konsentrasjonsnivåer. (13)
2.6.5 LOD/LOQ
LOD er den laveste konsentrasjon som analytten i en prøve kan påvises med en viss grad av
sikkerhet. LOQ er den laveste konsentrasjonen som en analytt i en prøve kan kvantifiseres
med tilfredsstillende nøyaktighet og presisjon. (13)
20
3. Materiale og metoder
3.1 Utstyr
Utstyr
Fabrikant og modell
Fabrikant/sted
Reagensrør
Sarstedt rør
Numbrecht, Tyskland
UPLC hetteglass
Waters. Massachusetts, USA
Eppendorf Research
Eppendorf AG. Tyskland
Eppendorf Reference
Eppendorf AG. Tyskland
Inndampningsinstrument
Organomation Associates Inc
Massachusetts, USA
Sentrifuge
Hettich Zentrifugen
Tyskland
Vortex mikser
Heidolph REAX
Tyskland
Vannrensesystem
Millipore Milli-Q rensesystem
Frankrike
Vekt
Mettler Toledo MT5
Sveits
LC-MS/MS
UPLC iClass Waters TQ-Stepwave
Waters. Massachusetts, USA
Kolonne
Acquity UPLC HSST3 100mm x 2,1mm, 1,8µm Waters. Massachusetts, USA
Pipetter
3.2 Serum
Teknisk serum fra blodbanken ved UNN.
3.3 Vann
Vann som er brukt under hele analysen er fra Milli-Q vann (Millipore Milli-Q-rensesystem,
USA).
3.4 Buffer
Bufferløsning 1 Natriumtetraborat buffer: pH 9,2, mettet. (12)
Bufferløsning 2 Karbonat buffer: pH 11, 0,1 M
Bufferløsning 3 Fosfat buffer: pH 2,5, 0,1 M
Bufferløsning 4 Ammoniumkarbonat buffer: pH 9,2, 0,2 M
3.5 Mobilfase
Mobilfase A: 5 mM NH4oAC (Ammoniumacetat)
Mobilfase B: ACN:MeOH (1:1 v/v) + 5 mM NH4oAC
21
Chiron AS.Trondheim; Norge.
99
98
98
99
12549
9306
12027
9305
1,000 mg/ml
1,0 mg/ml
1,0 mg/ml
1,0 mg/ml
Konsentrasjon
Acetonitrile
Metanol
Metanol
Metanol
Løsemiddel
Kjemikalier/reagenser
JWH-018
98
3.6
JWH-073
9390
12424
0,1 mg/ml
0,1 mg/ml
100 µg/ml
100 µg/ml
Batch nummer
JWH-210
LGC GmbH: Luckenwalde; Tyskland.
11209
11209
Renhet %
JWH-250
99
FN090211-02
Fabrikant:
JWH- 081
99
Reagenser:
RCS-4
Virkestoff/analytt
AM-2201
JWH-073-d9
Cerilliant: Round Rock, Texas; USA
Internstandard/analytt
JWH-018-d11
Cerilliant: Round Rock, Texas; USA
Metabolitt/analytt
JWH-018
JWH-073
Dietyleter
Heksan
n-Klorbutan
Diklormetan
Acetonitrile
SIGMA-ALDRICH Chemie GmbH. Steinheim; Tyskland
Kjemikalier
Metanol
Isopropanol
tert-butyl metyleter
Sykloheksan
Etylacetat
Isoamylalkohol
22
Ammoniumacetat
di-Natriumhydrogenfosfat-Dihydrat
Natriumkarbonat
Ammoniumkarbonat
Natrium tetraborat
Merck. Darmstadt; Tyskland.
Merck. Darmstadt; Tyskland.
23
4. Fremgangsmåte
4.1 Tilvirkning av Stokkløsninger
De syv syntetiske cannabisforbindelsene som denne analysemetoden i utgangspunktet ble
utviklet for å kvantifisere, ble bestilt i tilnærmet ren form (98-99 % ≥) fra to ulike produsenter/leverandører av referansematerialer. Disse syv forbindelsene ble levert i
ampuller, der fem av dem ble levert som konsentrert stokkløsning og to av dem i pulverform.
For forbindelsene, JWH-018 og -073, ble deres hovedmetabolitt bestilt i tillegg til
isotopmerkede forbindelser fra en tredje produsent til bruk for IS.
Stokkløsningene fra produsentene ble videre fortynnet på laboratoriet av praktiske årsaker
som større volumer å arbeide med og reduksjon av effekten avdamping av løsemiddelet
analyttene er løst i. I tillegg til enklere tilvirkning av bruksløsninger med tilfredsstillende
nøyaktighet.
4.2 Fortynning av konsentrerte stokkløsninger
De forbindelsene som ble levert i form av konsentrert stokkløsning ble fortynnet 1:3 (v/v) på
følgende måte:
1. Hele innholdet på 1 ml fra produsentens ampulle overføres til et farget hetteglass med
en pipette. Hetteglasset har nå et totalvolum på 1 ml.
2. 1 ml av et identisk løsemiddel til det forbindelsen er løst i, MeOH eller ACN, tilsettes
produsentens ampulle og overføres til hetteglasset for å vaske med rester av
forbindelsen i ampullen. Hetteglasset har nå et totalvolum på 2 ml.
3. 2 ml identisk løsemiddel tilsettes hetteglasset som nå har et totalvolum på 4 ml, og
produsentens stokkløsning er fortynnet 1:3 (v/v).
24
Tabell 1: Oversikt over forbindelsenes stokkløsning, fortynningen og
sluttkonsentrasjonen deres
Forbindelser
Rent virkestoff og
løsemiddel
Molekylvekt
renhet
Stokkløsningens
startkonsentrasjon
Fortynnet stokkløsnings
sluttkonsentrasjon fortynnet
1:4 (v/v)
Sluttvolum
JWH-018 (MeOH)
341,45 g/mol
99%
1 mg/ml
725 µM
4 ml
JWH-073 (MeOH)
322,42 g/mol
98%
1 mg/ml
760 µM
4 ml
JWH-081 (ACN)
371,47 g/mol
99%
1 mg/ml
666 µM
4 ml
JWH-210 (MeOH)
386,5 g/mol
98%
1 mg/ml
634 µM
4 ml
JWH-250 (MeOH)
335,44 g/mol
99%
1 mg/ml
738 µM
4 ml
JWH-073 N-(3-OH-butyl)
(MeOH)
343,4 g/mol
99%
0,1 mg/ml
72 µM
4 ml
JWH-018 N-(4-OHpentyl) (MeOH)
357,44 g/mol
99%
0,1 mg/ml
69 µM
4 ml
d11-JWH-018 (MeOH)
352,45 g/mol
99,99%
0,1 mg/ml
71 µM
4 ml
d9-JWH-073 (MeOH)
331,42 g/mol
99%
0,1 mg/ml
75 µM
4 ml
Metabolitter
Internstandarder
4.3 Tilvirkning av stokkløsning fra referansemateriale i pulverform
Det ble tilvirket en stokkløsning for hver av de to forbindelsene som ble levert i pulverform
på følgende måte:
1. En nøyaktig mengde av forbindelsen ble veid på vekten MT5 fra Mettler Toledo.
2. Den oppveide mengden av pulveret ble tilsatt et farget hetteglass, deretter ble 4 ml
MeOH tilsatt.
Den nøyaktige mengden av forbindelsene og sluttkonsentrasjonen på stokkløsningene er vist i
tabell 2.
25
Tabell 2: Oversikt over tilvirkning av stokkløsning fra referansemateriale i pulverform
og deres sluttkonsentrasjon
Forbindelser
Molekylvekt
Renhet
Oppveid Mengde
Stokkløsningens konsentrasjon i
hetteglass med 4 ml MeOH
AM-2201
359,436 g/mol
99%
1,294 mg
891 µM
RCS-4
321,413 g/mol
99%
1,114 mg
858 µM
4.4 Tilvirkning av testløsning nummer 1
Testløsningen ble fremstilt for å tilvirke tuningsløsninger. Tuningsløsningene ble brukt til å
stille inn parameterne på MS/MS delen av LC-MS/MS instrumentet for de forbindelsene som
enda ikke hadde blitt lagt inn i apparaturets programvare når metodeutviklingen startet.
Testløsning nummer 1 inneholdt en cirka konsentrasjon av alle de rene virkestoffene JWH018,-073, -081, -210, -250, AM-2201 og RCS-4 og hovedmetabolittene JWH-018 og -073
forbindelsene på henholdsvis 2 µM og 1 µM. Det ble brukt en passende konsentrasjon av
forbindelsene siden det for tuningen sin del bare er viktig at forbindelsene er i løsningen.
Fremgangsmåte:
1. 5 µl fortynnet stokkløsning fra hver av de ni rene virkestoffene og 30 µl fortynnet
stokkløsning fra hver av de to metabolittene, ble tilsatt et Sarstedt rør. Totalt 105 µl.
2. 1,9 ml mobilfase ble til slutt tilsatt Sarstedt røret.
4.5 Tilvirkning av tuningsløsningene
Tuningsløsningene ble tilvirket etter behov i den delen av fasen da MS/MS delen av LCMS/MS instrumentet skulle stilles inn til de ulike analyttene, siden det var vanskelig å forutse
hvor store volum som trengtes. Tuningsløsningene besto av et nøyaktig volum av testløsning
nummer 1 som ble fortynnet en tusendedel (1:1000). De rene virkestoffene fikk da en cirka
konsentrasjon på 2 µM og metabolittene cirka 1 µM.
26
4.6 Tilvirkning av testløsning nummer 2
Testløsningen besto av spiked urin, der et nøyaktig volum av fortynnet stokkløsning fra hver
enkelt forbindelse, både de rene virkestoffene JWH-018,-073, -081, -210, -250, AM-2201,
RCS-4 og metabolittene JWH-018 og 073, ble fortynnet med ett nøyaktig volum urin. Selv
om volumene var nøyaktige var konsentrasjonene av analytter i denne testløsningen bare
omtrentlig nøyaktig siden testløsningen skulle brukes til en kvalitativ pilotundersøkelse av 20
ulike organiske løsemidler og 4 forskjellige buffere for å gi en indikasjon av hvilket
løsemiddel og buffer som ga best ekstraksjon.
Testløsningen ble tilvirket ved å tilsette 5 µl fortynnet stokkløsning av de rene virkestoffene
og 28 µl av metabolittenes fortynnede stokkløsning til ca. 1,9 ml blank urin.
4.6 Tilvirkning av IS-løsning nummer 1
IS-løsningen ble tilvirket av personalet ved MS-laboratoriet ved UNN og hadde en
konsentrasjon på 0,01 µM av internstandardforbindelsene d11-JWH-018 og d9-JWH-073.
4.7 Tilvirkning av IS-løsning nummer 2
IS-løsningen ble tilvirket av personalet ved MS-laboratoriet ved UNN og hadde en
konsentrasjon på 0,02 µM av internstandardforbindelsene d11-JWH-018 og d9-JWH-073.
27
4.8 Tilvirkning av bruksløsninger for standardrekkene og kontrollene
4.8.1 Tilvirkning av bruksløsning nummer 1
Bruksløsningen ble laget for bruk til videre tilvirking av standardrekke 1 og kontrollgruppe 1,
med urin som matrise. Bruksløsningens volum var 1 ml og konsentrasjonen av hver enkelt
forbindelse var 5 µM. Bruksløsningen ble laget ved å tilsette følgende volum av den
fortynnede stokkløsningen til alle de aktuelle forbindelsene listet i tabellen nedenfor.
Tabell 3: Oversikt over tilvirkning av bruksløsning nummer 1, volum på en ml med fem
µM konsentrasjon
Forbindelse fortynnet stokkløsning
Volum fortynnet stokkløsning som tilsettes
JWH-018
6,9 µl
JWH-073
6,6 µl
JWH-081
7,5 µl
JWH-210
7,9 µl
JWH-250
6,8 µl
69,4 µl
JWH-018 N-(4-OH-pentyl)
72,2 µl
Totalt volum av fortynnet stokkløsninger tilsatt
177,3 µl
Volum urin som tilsettes
822,7 µl
4.8.2 Tilvirkning av bruksløsning nummer 2
Bruksløsningen ble laget for bruk til videre tilvirkning av standardrekke 2 og kontrollgruppe 2
med serum som matrise. Bruksløsningens volum var 1 ml og konsentrasjonen av hver enkelt
forbindelse var 5 µM. Bruksløsningen ble laget ved å tilsette følgende volum av den
fortynnede stokkløsningen til alle de aktuelle forbindelsene listet i tabell 4.
Tabell 4: Oversikt over tilvirkning av bruksløsning nummer 2, volum på en ml med fem
µM konsentrasjon
Forbindelse fortynnet stokkløsning
Volum fortynnet stokkløsning som tilsettes
JWH-018
6,9 µl
JWH-073
6,6 µl
69,4 µl
JWH-018 N-(4-OH-pentyl)
72,2 µl
Totalt volum av fortynnet stokkløsninger tilsatt
155,1 µl
Volum serum som tilsettes
844,9 µl
28
4.8.3 Tilvirkning av standardrekke 1 med urin som matrise
Standardrekke 1 består av syv standarder, og tilvirkningen startet med å lage utgangsløsning
nummer 1 der forbindelsene hadde en konsentrasjon på 1000 nM. Utgangsløsning nummer 1
ble brukt til å lage standard 1 ved fortynning, og de neste standardene ble tilvirket ved videre
fortynning av et nøyaktig volum fra de foregående standardene. De to understående tabellene
5 og 6 viser henholdsvis tillagingen skjematisk.
Tabell 5: Oversikt over tilvirkning av utgangsløsning nummer 1, volum på to ml med
1000 nM konsentrasjon
Volum bruksløsning nummer 1 som tilsettes
400 µl
1600 µl
Tabell 6: Oversikt over tilvirkningen av standardrekke 1 med urin som matrise
Tilvirkning av standardrekke nummer 1
Konsentrasjon
S1 = 0,5 ml utgangsløsning nummer 1 + 4,5 ml urin
100 nM
S2 = 0,5 ml S1 + 4,5 ml urin
10 nM
S3 = 1 ml S2 + 9 ml urin
1 nM
S4 = 5 ml S3 + 5 ml urin
0,5 nM
S5 = 0,5 ml S3 + 4,5 ml urin
0,1 nM
S6 = 0,5 ml S4 + 4,5 ml urin
0,05 nM
S7 = 0,5 ml S5 + 4,5 ml urin
0,01 nM
4.8.4 Tilvirkning av kontrollgruppe 1 med urin som matrise
Kontrollgruppe 1 består av tre kontroller, K1, K2 og K3, med henholdsvis tre ulike
konsentrasjonsnivåer av alle forbindelsene fra bruksløsning nummer 1. Tilvirkningen startet
med å lage utgangsløsning nummer 2 fra bruksløsning nummer 1 ved fortynningsforholdet
1:9 (v/v) slik at utgangsløsning nummer 2 hadde en konsentrasjon på 800 nM. Tabellene 7 og
8 nedenfor viser fremstillingen av henholdsvis utgangsløsning nummer 2 og kontrollgruppe 1
skjematisk.
Tabell 7: Oversikt over tilvirkning av utgangsløsning nummer 2, volum på to ml med
800 nM konsentrasjon
Volum bruksløsning nr. 1 som tilsettes
320 µl
1680 µl
29
Tabell 8: Oversikt over tilvirkning av kontrollgruppe 1
Tilvirkning av kontrollgruppe 1
Konsentrasjon
K1 = 0,5 ml utgangsløsning nr. 2 + 4,5 ml urin
80 nM
K2 = 0,5 ml K1 + 4,5 ml urin
8 nM
K3 = 0,5 ml K2 + 4,5 ml urin
0,8 nM
4.8.5 Tilvirkning av standardrekke 2 med serum som matrise
Standardrekke 2 består av syv standarder og tilvirkningen startet med å lage utgangsløsning
nummer 3 der forbindelsene hadde en konsentrasjon på 500 nM. Utgangsløsning nummer 3
ble brukt til å lage standard 1 og 2 ved fortynning og de neste standardene ble tillaget ved
videre fortynning av et nøyaktig volum fra de foregående standardene. De to understående
tabellene 9 og 10 viser tilvirkningen skjematisk.
Tabell 9: Oversikt over tilvirkning av utgangsløsning 3, volum på to ml med 500 nM
konsentrasjon
200 µl
1800 µl
Tabell 10: Oversikt over tilvirkning av standardrekke nummer 2 med serum som
matrise
Tilvirkning av standardrekke nummer 2
Teoretisk Konsentrasjon
Justert konsentrasjon
S1 = 0,2 ml utgangsløsning nummer 3 + 0,8 ml serum
100 nM
60,000 nM
S2 = 0,2 ml utgangsløsning nummer 3 + 1,8 ml serum
50 nM
30,000 nM
S3 = 0,4 ml S2 + 3,6 ml serum
5 nM
3,000 nM
S4 = 1 ml S3 + 1 ml serum
2,5 nM
1,500 nM
S5 = 0,2 ml S3 + 1,8 ml serum
0,5 nM
0,300 nM
S6 = 0,2 ml S4 + 1,8 ml serum
0,25 nM
0,150 nM
S7 = 0,2 ml S5 + 1,8 ml serum
0,05 nM
0,030 nM
30
4.9 Tilvirkning av ekstern kontrollgruppe
Eksterne kontroller var ikke tilgjengelig i det tidsrommet denne bacheloroppgaven ble utført.
Kontrollene i denne kontrollgruppen er tillaget av personal på MS laboratoriet og brukt til å
justere konsentrasjonene i standardrekke 2.
EQ1
66 nM (JWH-018, -073)
33 nM (Metabolittene)
EQ2
6,6 nM (JWH-018, -073)
3,3 nM (Metabolittene)
EQ3
0,66 nM (JWH-018, -073)
0,33 nM (Metabolittene)
4.10 Tilvirkning av Kontrollgruppe 2 med serum som matrise
Kontrollgruppe 2 består av tre kontroller, K1, K2 og K3, med henholdsvis tre ulike
konsentrasjonsnivåer av alle forbindelsene fra bruksløsning nummer 2. Tilvirkningen startet
med fortynning av et nøyaktig volum av bruksløsning nummer 2 slik at utgangsløsning
nummer 4 hadde en konsentrasjon på 800 nM. Tabellene 11 og 12 nedenfor viser
fremstillingen av henholdsvis utgangsløsning nummer 4 og kontrollgruppe 2 skjematisk.
Tabell 11: Oversikt over tilvirkning av utgangsløsning nummer 4, volum på en ml
med konsentrasjon 800 nM
160 µl
840 µl
Tabell 12: Oversikt over tilvirkning av kontrollgruppe 2
Tilvirkning av kontrollgruppe 2
Konsentrasjon
K1 = 0,1 ml utgangsløsning nummer 4 + 0,9 ml serum
80 nM
K2 = 0,1 ml K1 + 0,9 ml serum
8 nM
K3 = 0,1 ml K2 + 0,9 ml serum
0,8 nM
31
4.11 Tilvirkning av kontrollgruppe 3
Kontrollene i denne kontrollgruppen ble tillaget av personal ved MS-laboratoriet.
4.11.1 Labkontroll 1
Målt konsentrasjon av forbindelsene:
JWH-018
1,22 nM
JWH-018 metabolitt
0,93 nM
JWH-073
1,12 nM
JWH-073 metabolitt
0,89 nM
JWH-018
3,56 nM
JWH-018 metabolitt
3,38 nM
JWH-073
3,53 nM
JWH-073 metabolitt
3,34 nM
JWH-018
0,51 nM
JWH-018 metabolitt
0,45 nM
JWH-073
0,43 nM
JWH-073 metabolitt
0,42 nM
32
4.13 Tuning av massespektrometri-parameterne for hver enkelt
analytt og funn av deres datter-ioners spektrum
For å kunne kvantifisere analyttene for metoden ble det utført en tuning av hver enkelt
forbindelse på MS-instrumentet. Dette ble gjort ved å injisere tuningsløsninger som inneholdt
den aktuelle forbindelsen løst i MeOH. De MS-parameterne som ble tunet var
konespenningen og kollisjonsenergien, alle andre parametere ble kjørt i standard modus. MSinnstillingene som ble brukt er gitt i tabell 13, sammen med massen for mor og datterionene
til forbindelsene JWH-018, -073, metabolittene og deres IS. Figur 9 viser massespektrumet
for datterionene til metabolitten JWH-018 og er et representativt eksempel for
massespektraene til de andre forbindelsene og metabolitten.
4.13.1 Konespenning
For å optimalisere ioniseringen av analyttmolekylene ble spenningen i konen justert til den
spenningen som ga mest intenst signal for analytten.
4.13.2 Kollisjonsenergi
For å kvantifisere analyttene ble morionet til disse analyttene fragmentert i instrumentets
kollisjonscelle med kollisjonsgass, til det som kalles datterioner. Det best egnede datterionet
for kvantifisering er det som gir mest intenst responssignal med størst mulig masse. Den
elektronvolt verdien som gir slike datterioner er den mest optimale og den som blir valgt som
innstilling for analytten.
33
Tabell 13:Oversikt over MS innstillingene, massen og fragmentene for virkestoffene
JWH-018, -073 og metabolittene og internstandardene deres
Fordampingstemperatur
550
Kildetemperatur
150
Kapillærspenning
[1,80, 1,95] kV
Kone gass-strøm
[150, 148] L/t
Konespenning
50 V
Ioniseringsmodus
ES+
Fordampings gass-strøm
[1000, 993] L/t
Kollisjons gass-strøm
[0,15, 0,14] ml/min
Aerosol gass-strøm
[7,00, 6,34] bar
Funksjonstype
MRM med 10 kanaler
Kanal
Forbindelse
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
Fragmenteringsreaksjon Mw
Kollisjonsenergi Elektronvolt
342,30 > 127,00
45
342,30 > 155,00
23
358,05 > 126,70
45
358,05 > 154,70
26
328,30 > 127,00
42
328,30 > 155,00
23
344,10 > 126,70
44
344,10 > 154,60
20
JWH-018-d11
353,30 > 155
23
JWH-073-d9
336,30 > 155
23
JWH-018
JWH-018 metabolitt
JWH-073
JWH-073 metabolitt
Figur 9. Massespektrumet for datterionene til JWH-018 metabolitten, med massene 155 og 127 etter fragmentering
når kollisjonsenergien er stilt til 26 EV
34
4.14 Kromatografisk seperasjon
Den kromatografisk seperasjonen som ble utført i løpet av denne bacheloroppgaven ble gjort
med de samme kjemiske seperasjonsforholdene for alle analysene. Det ble benyttet reversert
fase kromatografi, med en HSS T3 kolonne og en mobilfasegradient som er vist i tabell 14.
Figur 14 er et eksempel på hvordan et kromatogram ser ut for alle forbindelsene i tabell 1 med
unntak av IS-forbindelsene.
Tabell 14: Mobilfasegradienten brukt ved kromatografisk seperasjon med HSS T3
kolonne
Tid minutt
Strømhastighet ml/min
Mobilfase A%
Mobilfase B%
1
Initiell
0,4
50
50
2
0,30
0,4
50
50
3
1,50
0,4
1
99
4
3,00
0,4
1
99
5
3,01
0,4
50
50
4.15 Pilotundersøkelse av ulike ekstraksjonsreagenser for å finne den
beste væske-væske ekstraksjonsmetoden
Pilotundersøkelsen startet med et utvalg av 19 ulike organiske løsemidler, både mikser av og
rene løsemidler som er listet opp i tabell 16, i tillegg til fire forskjellige bufferløsninger vist
under materiale og metode. Hensikten med pilotundersøkelsen var å finne et organisk
løsemiddel og en bufferløsning som kunne benyttes i en ekstraksjonsmetode basert på
ekstraksjonsmetoden for THC utviklet ved MS-laboratoriet på UNN. Prosedyren for
ekstraksjon av THC ved MS laboratoriet på UNN er lagt ved som vedlegg 1.
Utvalget av ekstraksjonsreagenser var basert på både faglitteratur, og løsemidler som brukes i
rutineanalysene ved MS-laboratoriet. Undersøkelsen endte opp med fem testrunder der målet
med hver testrunde var å finne de organiske løsemidlene og de bufferløsningene som ga best
ekstraksjon av analyttene. Målet var å til slutt ende opp med det løsemidlet og den
bufferløsningen som ga best ekstraksjon. Testrunde 1 til 3 kan betraktes som rene
eliminasjonsrunder, der de løsemidlene som ikke oppfylte kriteriene satt for den gjeldende
testrunden ble utelatt fra neste testrunde. Kriteriene satt for testrunde 1 til 3 er gitt henholdsvis
i tabell 20, 23 og 26. For testrunde 4 ble det ikke satt noen konkrete kriterier til løsemidlene
35
av grunner oppgitt i diskusjonsdelen av oppgaven. Testrunde 5 var den siste testrunden og det
ble ikke satt noen konkrete kriterier for denne testrunden heller av grunner oppgitt i
diskusjonsdelen av oppgaven.
4.15.1 Generell fremgangsmåte for ekstraksjon i alle testrundene
Som nevnt tidligere tok uttestingen i pilotundersøkelsen utgangspunkt i ekstraksjonsmetoden
for THC. Med dette menes det volumene av prøve/IS/kontroll, bufferløsning og løsemiddel,
som tilsettes reagensrøret ekstraksjonen foregår i. Forskjellen i fremgangsmåten fra testrunde
til testrunde består av hvilke prøver/IS/kontroll, bufferløsning og løsemiddel som ble tilsatt.
Detaljene om hvilke løsninger som ble tilsatt i henhold til volumene og rekkefølgen til den
generelle fremgangsmåten vil bli redegjort for under fremgangsmåten for hver testrunde.
Den generelle fremgangsmåten som har blitt brukt for hver testrunde basert på THC
metoden er listet opp i tabell 15.
Tabell 15: Generell fremgangsmåte for væske-væske ekstraksjon
1.
100 µl standard/kontroll/prøve tilsettes hvert sitt merkede 4 ml Sarstedt rør.
2.
50 µl IS tilsettes alle rør.
3.
50 µl bufferløsning tilsettes alle rør.
4.
1 ml organisk løsemiddel tilsettes alle rør.
5.
Rørene korkes og ristes i ett minutt.
6.
Rørene sentrifugers i 2,5 min ved 3000 g
7.
750 µl av den organiske fasen i rørene overføres til ett nytt, identisk, merket 4 ml Sarstedt rør.
8.
Ekstraktet i rørene inndampes på varmeblokk (40oC) med nitrogengass.
9.
100 µl mobilfase tilsettes Sarstedt røret for å løse opp inndampet standard/kontroll/prøvemateriale ved å bruke
virvelmikser i cirka 5 sekunder.
10.
80 µl av løsningen, bestående av mobilfase og inndampet standard/kontroll/prøvemateriale, overføres til et UPLChetteglass som er merket likt med det Sarstedt røret løsningen ble overført fra.
11.
UPLC-hetteglass settes inn i analyseverktøyet LC-MS/MS for analyse.
36
4.15.2 Testrunde 1
Fremgangsmåte:
Figur 10. Illustrasjon av fremgangsmåten punkt en til fire i testrunde 1
Resten av fremgangsmåten ble utført i henhold til punkt 5-11 i tabell 15.
Tabell 16: Liste over løsemidler brukt i testrunde 1
Løsemiddel/blanding:
Blandingsforhold (v/v)
1.
Tert-butyl metyleter (TBME)
2.
Tert-butyl metyleter:n-Klorbutan (TBME:n-KB)
9:1
3.
n-Klorbutan:Acetonitril (n-KB: ACN)
4:1
4.
n-Heksan: Dietyleter (n-H:D)
1:1
5.
Sykloheksan (SH)
6.
Toluen:Isoamylalkohol (T:IMA)
8:2
7.
n-KB:Etylacetat (n-Klorbutan: ETOAC)
4:1
8.
Dietyleter: n-Heksan:Etylacetat (D:n-H:ETOAC)
9.
n-Klorbutan (n-KB)
10.
Tert-butyl metyleter:Etylacetat (TBME: ETOAC)
1:1
11.
Metanol:Diklormetan (MeOH:DCM)
1:9
12.
n-Heksan (n-H)
13.
Tert-butyl metyleter:Fosforsyre(85%) (TBME:F)
14.
Isoamylalkohol: n-Klorbutan (IMA:n-KB)
9:1
15.
n-Klorbutan: Isopropanol (n-KB:IPA)
9:1
16.
Diklormetan (DCM)
17.
n-Heksan + 2% Isoamylalkohol (n- H + 2% IMA)
18.
Dietyleter:Etylacetat (D:ETOAC)
1:1
19.
n-Heksan:Etylacetat (n-H:E TOAC) (14)
9:1
1:1:1
250:1
37
4.15.3 Testrunde 2
I testrunde 2 ble det brukt samme fremgangsmåte som i testrunde 1, bortsett fra at det i denne
testrunden ble testet kun åtte organiske løsemidler i tillegg til løsemiddel nummer 20, som er
listet opp i tabell 17. Derav kun ni parallell-sett som ble opparbeidet for analyse. De åtte
løsemidlene testet i denne testrunden var de løsemidlene som oppfylte kriteriene satt for
testrunde 1, vist i tabell 20. Løsemiddel nummer 20 skulle i utgangspunktet vært med i
testrunde 1, men dette ble ikke gjort og den ble dermed tatt med i testrunde 2.
Tabell 17: Liste over organiske løsemidler brukt i testrunde 2
Løsemiddel/blanding:
Blandingsforhold (v/v)
4.
n-H:D
1:1
8.
D:n-H:ETOAC
1:1:1
10.
TBME:ETOAC
1:1
11.
MeOH :DCM
1:9
12.
n-H
16.
DCM
18.
D:ETOAC
1:1
19.
n-H:E TOAC (14)
9:1
20.
Etylacetat (ETOAC)
4.15.4 Testrunde 3
Fremgangsmåten er generelt den samme som for testrunde 1 og 2 bortsett fra at det i denne
testrunden ble testet kun to forskjellige løsemidler, D:ETOAC og DCM. I tillegg ble hvert av
de to løsemidlene testet med bufferløsning 1, 2, 3 og 4 i paralleller. De to løsemidlene som ble
undersøkt i denne testrunden var de løsemidlene som oppfylte kriteriene satt for testrunde 2,
vist i tabell 23. I denne testrunden ble det i tillegg satt opp et ytterligere testsett med DCM og
de fire bufferløsningene, der tilsetting av IS ble utelatt for å avklare noen spørsmål som blir
diskutert under diskusjonsdelen for denne testrunden.
38
4.15.5 Testrunde 4
I testrunde 4 ble det satt opp to rekker av standardrekke 1(S1-S7) og to kontrollgrupper (K1K3) av kontrollgruppe 1. I tillegg ble det kjørt en blank prøve med egen urin. I disse rekkene
ble analyttene ekstrahert henholdsvis med løsemidlene DCM og D:ETOAC, og bufferløsning
nummer 4. Hensikten med denne testrunden var å teste ut om standardrekke 1 var lineær og
hvilke av de to løsemidlene som oppfylte kriteriene satt for testrunde 3 i tabell 26, som skulle
benyttes for validering av ekstraksjonsmetoden.
Fremgangsmåte:
1. 100 µl standardløsning fra standardrekke 1, 100 µl kontroll-løsning fra kontrollgruppe
1 og 100 µl egen urin til blank prøve, ble tilsatt hvert sitt merkede 4 ml Sarstedt rør.
2. 50 µl IS-løsning nummer 2 ble tilsatt alle rør.
3. 50 µl bufferløsning 4 ble tilsatt alle rør.
4. 1 ml av de organiske løsemidlene DCM og D:ETOAC ble tilsatt hver sin
standardrekke (S1-S7) av standardrekke 1, og kontrollgruppe (K1-K3) av
kontrollgruppe 1, sine merkede rør.
4.15.6 Testrunde 5
I testrunde 5 ble det satt opp tre rekker av standardrekke 2(S1-S7) og tre kontrollgrupper (K1K3) av kontrollgruppe 2. I tillegg ble det kjørt en blank prøve bestående av serum. I disse
rekkene ble analyttene ekstrahert henholdsvis med løsemidlene DCM, D:ETOAC og D:nH:ETOAC og bufferløsning nummer 4. DCM og D:ETOAC oppfylte kriteriene satt for
testrunde 3 i tabell 26, mens D:n-H:ETOAC ble tatt med av grunner oppgitt i diskusjonsdelen
Fremgangsmåte:
1. 100 µl standardløsning fra standardrekke 2, kontroll-løsning fra kontrollgruppe 2 og
negativt serum ble tilsatt hver sine merkede 4 ml Sarstedt rør.
2. 50 µl IS-løsning nummer 1 ble tilsatt alle rør.
3. 50 µl bufferløsning 4 ble tilsatt alle rør.
4. 1 ml av de organiske løsemidlene DCM, D:ETOAC og D:n-H:ETOAC ble tilsatt hver
sin standardrekke (S1-S7) av standardrekke 1, og kontrollgruppe (K1-K3) av
kontrollgruppe 1, sine merkede rør.
39
4.16 Validering av metoden
Validering av den modifiserte THC metoden, med DCM og bufferløsning 4 som
ekstraksjonsreagenser, ble utført i henhold til International Conference on Harmonisation
(ICH) sine internasjonale retningslinjer (15) for validering av analytiske prosedyrer.
Valideringen innebar å sjekke lineariteten, presisjonen, systempresisjonen,
reproduserbarheten, gjenvinningen, og LOQ og LOD, til den modifiserte THC metoden for
analyttene JWH-018, JWH-073 og metabolittene til disse forbindelsene.
Fremgangsmåten som ble brukt for alle valideringspunktene, bortsett fra gjenvinning og
systempresisjon, er presentert i tabell 18. Hvilket analysemateriell som ble tilsatt for hvert
valideringspunkt i henhold til den generelle fremgangsmåten presentert i tabell 18, blir
redegjort for i detalj senere i teksten.
Tabell 18: Generell fremgangsmåte for validering av metoden.
1.
100 µl standard/kontroll/prøve tilsettes hvert sitt merkede 4 ml Sarstedt rør.
2.
50 µl IS-løsning nummer 2 tilsettes alle rør.
3.
50 µl bufferløsning 4 tilsettes alle rør.
4.
1 ml DCM tilsettes alle rør.
I fremgangsmåten for gjenvinning er det kun punkt 1 i tabell 18 som er gjort annerledes,
fremgangsmåten for dette punktet er redegjort for i tabell 19 senere i teksten. I
fremgangsmåten for systempresisjon ble alle volumene, i henhold til den generelle
fremgangsmåten i tabell 18 og 15, doblet.
Alle analyserundene som ble gjort under valideringen ble analysert med standardrekke 2 og
kontrollgruppe 2.
40
Figur 11. Oppsett for opparbeidelsen av standardrekke 2 og prøver som skal analyseres
4.16.1 Linearitet
For validering av lineariteten til metoden ble det opparbeidet tre paralleller av standardrekke 2
(S1-S7) sammen med tre paralleller av kontrollgruppe 2 (K1-K3) og tre blanke prøver
bestående av negativt serum. Opparbeidelsen av disse parallellene ble utført i henhold til den
generelle fremgangsmåten beskrevet i tabell 18.
Figur 12. Illustrasjon av prøveopparbeidelses prosessen for validering av lineariteten for den modifiserte metoden
4.16.2 Reproduserbarhet
Validering av metodens reproduserbarhet gikk over tre dager. For valideringen ble det
tilvirket ti forskjellige spikede prøver. Disse prøvene bestod av serum der hver prøve ble
spiked med en tilfeldig ukjent mengde av analyttene JWH-018, -073 og metabolittene deres.
Hver dag i løpet av tredagers perioden, ble det opparbeidet ekstrakter fra hver av disse ti
41
prøvene som ble analysert i LC-MS/MS instrumentet. Reproduserbarhet dag 1 ble analysert i
samme analyse runde som ekstraktene fra analysematerialet brukt for validering av presisjon
og gjenvinning. Reproduserbarhet dag 2 ble analysert i egen analyse runde og
reproduserbarhet dag 3 ble analysert i samme analyse runde som ekstraktene for
systempresisjon.
4.16.3 Presisjon
For validering av presisjonen ble det opparbeidet 6 parallelle ekstrakter av henholdsvis
analysematerialet Labkontroll 1og Labkontroll 2, hvis konsentrasjoner er oppgitt i kapittel
4.11. Totalt 12 ekstrakter.
4.16.4 Gjenvinning
For validering av gjenvinning ble det tilvirket 3 analysematerialer kalt GJ A, GJ B og GJ C
som hadde henholdsvis tre ulike teoretiske konsentrasjonsnivåer (høy, mellom og lavt) av
analyttene. Disse analysematerialene ble tilvirket i henhold til generell fremgangsmåte i tabell
18 med unntak av punkt 1. Fremgangsmåten for gjenvinning ved punkt 1 av
analysematerialene GJ- A, -B og –C er vist i tabell 19.
Tabell 19: Tilvirkning av analysematerialene GJ A, GJ B og GJ C under punkt 1 for
valideringens generelle fremgangsmåte, og konsentrasjonene deres.
Analysemateriale:
Teoretisk konsentrasjon av
Tilvirkning:
analyttene
GJ A
15,5 nM
50 µl (Standard 2 av standardrekke 2) + 50 µl Labkontroll 1
GJ B
2,5 nM
GJ C
0,3 nM
For selve analysen ble det opparbeidet 3 paralleller av henholdsvis GJ A, GJ B og GJ C,
totalt 9 ekstrakter.
42
Figur 13.
12:Illustrasjon
Kan slettesav prøveopparbeidelsesprosessen for valideringsparameterne reproduserbarhet dag 1, presisjon og gjenvinning
4.16.5 LOQ/LOD
For å validere LOQ og LOD ble det kjørt seks paralleller av henholdsvis standard 6 og
standard 7 av standardrekke 2 fra et tidligere analyse runde som var oppbevart i en fryseboks.
4.16.6 Systempresisjon
For å validere systempresisjonen ble det utført 10 analyser i samme analyse runde på en
spiked prøve. Serumprøven besto av analyttene JWH-018, JWH-073 og metabolittene deres
med ukjent konsentrasjon.
4.16.7 Beregning av data
For beregning og prosessering av rådata fra både pilotundersøkelsen og valideringstestene ble
programvaren Masslynx 4.1og Excel benyttet.
I pilotundersøkelsens tre første testrunder ble det benyttet en-punkts kalibrering i Masslynx
for beregning av resultatene til prøvene. Alle prøvene ble analysert som standarder med en
målverdi på 100 nM. Målverdien på 100 nM ble benyttet som utgangspunkt for å vurdere
ekstraksjonsegenskapene til de forskjellige løsemidlene som ble testet i pilotundersøkelsen.
43
Dette betyr at det ble beregnet et gjennomsnitt av signalresponsen fra alle forbindelsene i
testløsning nummer 2 i alle prøvene, som ble gitt konsentrasjonsverdien 100 nM. På grunnlag
av dette gjennomsnittet ble det beregnet en konsentrasjon for hver enkelt forbindelses
signalrespons i hver prøve. Konsentrasjonen som ble beregnet var ikke nødvendigvis den
sanne konsentrasjon til forbindelsen i prøven, og er uten betydning siden hensikten var å se
hvilke av løsemidlene som ga best ekstraksjon i forhold til hverandre. Definisjonen på best
ekstraksjon for hver av de tre første testrundene gis henholdsvis av kriteriene i tabell 20, 23
og 26.
For testrunde 4, 5 og valideringstestene ble det satt opp en standardkurve med standardrekke
2 og alle prøvers konsentrasjon ble beregnet på grunnlag av dette med regresjonslinjen
y = ax+b.
44
5.
Resultater
5.1 Kromatogrammet til forbindelsens datterioner, ekstrahert fra en spiked
urinprøve.
Figur 14. Eksempel på et kromatogram for alle forbindelsene i tabell 1 med unntak av internstandard forbindelsene
45
5.2 Pilotundersøkelse av ulike ekstraksjonsreagenser for å finne den beste
væske-væske ekstraksjonsmetoden.
5.2.1 Testrunde 1.
Tabell 20: Kriterier til løsemidlenes ekstraksjonsegenskaper av virkestoffene
Kriterier for
Virkestoffene JWH -018 og -073
Metabolittene JWH-018 og-073
Kriterium 1.
Prosent avvik fra target verdien på 100 nM, større enn 0%>
Kriterium 2.
Areal over 75000>
Areal over 36000>
Kriterium 3.
Paralleller; avvik mindre enn 14 prosentenheter
Kriterium 4.
Symmetriske topper i kromatogrammet
Tabell 21: Oversikt over kriterier som har blitt oppfylt av løsemidlene for
ekstraksjon av virkestoffene og metabolittene JWH-018 og-073 i testrunde 1
Bufferløsning:
1
1
1
1
1
1
1
1
Løsemiddel
n-H:D
n-H:D:ETOAC
TBME:ETOAC
MeOH: D
n-H
DCM
D:ETOAC
n-H:ETOAC
Kriterium 1
Oppfylt
Ikke oppfylt
Oppfylt
Oppfylt
Oppfylt
Oppfylt
Oppfylt
Oppfylt
Kriterium 2
Oppfylt
Ikke oppfylt
Oppfylt
Oppfylt
Oppfylt
Oppfylt
Oppfylt
Oppfylt
Kriterium 3
Oppfylt
Oppfylt
Oppfylt
Oppfylt
Oppfylt
Oppfylt
Oppfylt
Oppfylt
Kriterium 4
Oppfylt
Oppfylt
Oppfylt
Oppfylt
Oppfylt
Oppfylt
Oppfylt
Oppfylt
Tabell 22: Oversikt over resultatene til de løsemidlene som ble vurdert som best i
testrunde 1 utfra testrundens kriterier.
Forbindelse:
JWH-018
JWH-018
JWH-018
JWH-018
Bufferløsning
1
1
1
1
Løsemiddel
H:D
H:D:ETOAC
TBME:ETOAC
MeOH: D
Gjennomsnittlig prosent
15,00%
-4,25%
16,55%
55,80%
Gjennomsnittlig areal
85782
71421
86980
116226
Antall prosentenheter i
13
-0,3
13
13
Forbindelse:
JWH-018
JWH-018
JWH-018
JWH-018
Bufferløsning
1
1
1
1
Løsemiddel
n-H
DCM
D:ETOAC
n-H:ETOAC
15,5,0%
103,55%
21,9,0%
2,75%
86187
151849
90916
76682
13,8
11,3
1,6
5,3
Forbindelse:
JWH-073
JWH-073
JWH-073
JWH-073
Bufferløsning
1
1
1
1
Løsemiddel
n-H
n-H:ETOAC
TBME:ETOAC
MeOH:D
8,00%
2,50%
21,05%
58,85%
avvik fra target
avvik mellom parallellene
avvik fra target
46
avvik fra target
121706
115504
136438
179006
12,2
3
7,9
7,5
Forbindelse:
JWH-073
JWH-073
JWH-073
JWH-073
Bufferløsning
1
1
1
1
Løsemiddel
n-H
DCM
D:ETOAC
n-H:ETOAC
10,60%
105,55%
14,05%
2,45%
124625
231640
128542
115455
7,6
14,9
1,1
13,6
Forbindelse:
JWH-018 metabolitt
JWH-018 metabolitt
JWH-018 metabolitt
JWH-018 metabolitt
Bufferløsning
1
1
1
1
Løsemiddel
n-H:D
n-H:D:ETOAC
TBME:ETOAC
MeOH: D
6,50%
-9,10%
29,75%
5,65%
42148
35986
51340
41808
1,4
7
10,5
6,7
Forbindelse:
JWH-018 metabolitt
JWH-018 metabolitt
JWH-018 metabolitt
JWH-018 metabolitt
Bufferløsning
1
1
1
1
Løsemiddel
n-H
DCM
D:ETOAC
n-H:ETOAC
27,75%
23,45%
-7,10%
18,40%
50557
48883
36780
46848
10,5
11,7
0,2
5,3
Forbindelse:
JWH-073 metabolitt
JWH-073 metabolitt
JWH-073 metabolitt
JWH-073 metabolitt
Bufferløsning
1
1
1
1
Løsemiddel
n-H:D
n-H:D:ETOAC
TBME:ETOAC
MeOH: D
10,85%
-1,35%
19,70%
11,80%
Gjennomsnittlig areal:
38116
33924
41159
38450
0,7
-2,7
5,6
10
Forbindelse:
JWH-073 metabolitt
JWH-073 metabolitt
JWH-073 metabolitt
JWH-073 metabolitt
Bufferløsning:
1
1
1
1
Løsemiddel
n-H
DCM
D:ETOAC
n-H:ETOAC
20,15%
32,30%
21,75%
25,60%
Gjennomsnittlig areal:
41191
44809
41856
43189
5,3
6,8
1,2
8,6
avvik fra target
avvik fra target
avvik fra target
avvik fra target
avvik fra target
47
5.2.2 Testrunde 2
Tabell 23: Kriterier til løsemidlenes ekstraksjonsegenskaper av virkestoffene og
metabolittene JWH-018 og -073
Kriterier for
Kriterium 1.
Prosent avvik fra target verdien på 100 nM, større enn
0%>
Kriterium 2.
Gjennomsnittlig areal over 8500>
Gjennomsnittlig areal over 3000>
Kriterium 3.
Kriterium 4.
Tabell 24: Oversikt over kriterier som har blitt oppfylt av løsemidlene for
ekstraksjon av virkestoffene og metabolittene JWH-018 og-073 i testrunde 2
Bufferløsning:
1
1
1
Løsemiddel
n-H
DCM
D:ETOAC
Kriterium 1
Oppfylt
Oppfylt
Oppfylt
Kriterium 2
Oppfylt
Oppfylt
Oppfylt
Kriterium 3
Oppfylt
Oppfylt
Oppfylt
Kriterium 4
Oppfylt
Oppfylt
Oppfylt
48
Forbindelse:
JWH-018
JWH-018
JWH-018
Bufferløsning
1
1
1
Løsemiddel
n-H
DCM
D:ETOAC
Gjennomsnittlig prosent avvik fra target
10,90%
-8,15%
44,70%
11320,5
9376,5
12489,5
Antall prosentenheter i avvik mellom parallellene
3,2
17,5
11,7
Forbindelse:
JWH-073
JWH-073
JWH-073
Bufferløsning
1
1
1
Løsemiddel
n-H
DCM
D:ETOAC
8,10%
1,65%
19,65%
15420
14499
17061,5
0,8
8,5
4,9
Forbindelse:
JWH-018 metabolitt
JWH-018 metabolitt
JWH-018 metabolitt
Bufferløsning
1
1
1
Løsemiddel
n-H
DCM
D:ETOAC
5,45%
-11,55%
4,10%
9638
8038
9303,5
2,3
1,5
2,85
Forbindelse:
JWH-073 metabolitt
JWH-073 metabolitt
JWH-073 metabolitt
Bufferløsning
1
1
1
Løsemiddel
n-H
DCM
D:ETOAC
6,15%
-15,55%
-14,30%
3901
3095
3138
5,1
5,5
6,4
49
5.2.3 Testrunde 3
Tabell 26: Kriterier til løsemidlenes ekstraksjonsegenskaper av virkestoffene og
metabolittene JWH-018 og -073
Kriterier for
Kriterium 1.
Prosent avvik fra target verdien på 100 nM, større enn
Prosent avvik fra target verdien på
0%>
100 nM, større enn 0%>
Kriterium 2.
Areal over 75000>
Areal over 36000>
Kriterium 3.
Paralleller; avvik mindre enn 14 enheter
Paralleller; avvik mindre enn 12
enheter
Kriterium 4.
Kriterium 5.
Rene prøver
Symmetriske topper i
kromatogrammet
Rene prøver
Tabell 27: Oversikt over kriterier som har blitt oppfylt av løsemidlene for ekstraksjon
av virkestoffene og metabolittene JWH-018 og-073 i testrunde 3
Bufferløsning
4
4
Løsemiddel
DCM
D:ETOAC
Kriterium 1
Oppfylt
Oppfylt
Kriterium 2
Oppfylt
Oppfylt
Kriterium 3
Oppfylt
Oppfylt
Kriterium 4
Oppfylt
Oppfylt
Kriterium 5
Oppfylt
Ikke oppfylt
50
Forbindelse:
JWH-018
JWH-018
Bufferløsning
4
4
Løsemiddel
D:ETOAC
DCM
Gjennomsnittlig prosent avvik fra
17,85%
5,10%
13070
11657,5
Antall prosentenheter i avvik
4,7
21,8
Forbindelse:
JWH-073
JWH-073
Bufferløsning
4
4
Løsemiddel
D:ETOAC
DCM
11,45
5,15
17369,5
16385
1,3
16,5
Forbindelse:
JWH-018 metabolitt
JWH-018 metabolitt
Bufferløsning
4
4
Løsemiddel
D:ETOAC
DCM
6,75%
11,45%
10090,5
10531
0,5
14,3
Forbindelse:
JWH-073 metabolitt
JWH-073 metabolitt
Bufferløsning
4
4
Løsemiddel
D:ETOAC
DCM
7,85%
13,20%
4923,5
5167,5
6,3
25,8
target
mellom parallellene
target
mellom parallellene
target
mellom parallellene
target
mellom parallellene
5.2.4 Testrunde 4
Resultatene for denne testrunden viste en standardkurve som ikke var lineær, grunnen til dette
blir redegjort for senere i oppgaven under diskusjonsdelen.
5.2.5 Testrunde 5
Resultatene fra testrunde 5 har blitt utelat av grunner oppgitt i diskusjonsdelen.
51
5.3 Eksempler på lineære standardkurver for forbindelsene JWH-018, 073
og metabolittene deres
JWH-018
Figur 15. Figuren viser et eksempel på standardkurve og residualplot for forbindelsen JWH-018, fragment 155
JWH-018 metabolitt
Figur 16. Figuren viser et eksempel på standardkurve og residualplot for metabolitten JWH-018, fragment 155
52
JWH-073
Figur 17. Figuren viser et eksempel på standardkurve og residualplot for forbindelsen JWH-073, fragment 155
JWH-073 metabolitt
Figur 18. Figuren viser et eksempel på standardkurve og residualplot for metabolitten JWH-073, fragment 155
53
5.4 Validering
Tabell 29: Aksept kriteria for valideringen (15)
Parameter
Aksept kriteria
Linearitet
R > 0,99
Presisjon
System repeterbarhet
Repeterbarhet
Reproduserbarhet
LOD
≤ 15 % CV
LOQ
≤ 15 % CV
Nøyaktighet
≤ 15 % CV
Gjenvinning
100 ± 15%
2
≤ 15%
≤ 15%
≤ 15%
5.4.1 Aksept kriteria for valideringen
Alle valideringsparameterne som har blitt utført i denne bacheloroppgaven er listet opp i
tabell 29 sammen med valideringskriteriene for hver enkelt parameter. Kriteriene som stilles
kommer fra ICH(16).
Kommentar til resultatene
5.4.2 Linearitet
I figur 19, 20, 21 og 22 kan man se at kriteriene som stilles for linearitet, oppfylles av
henholdsvis forbindelsene, JWH-018, -073 og metabolittene deres.
5.4.3 Presisjon
I tabell 30 kan man se at kriteriene som stilles for presisjon kun oppfylles av kontrollen med
lavt konsentrasjonsnivå (Labkontroll 1) der CV ligger mellom 5,5 og 10,7 %.
I tabell 31 kan man se resultatene for reproduserbarhet for forbindelsene JWH-018, -073 og
metabolittene deres.

Forbindelsen JWH-018 var det kun en av 10 prøver (prøve C) som oppfylte kravet til
reproduserbarhet.
54

Metabolitten til JWH-018 var det to av 10 prøver (prøve D og I) som ikke oppfylte
kravet til reproduserbarhet.

Forbindelsen JWH-073 oppfylte alle prøvene kravet til reproduserbarhet bortsett fra
prøve G og J.

Metabolitten til JWH-073 oppfylte alle prøvene kravet til reproduserbarhet bortsett fra
prøve D og H.
I tabell 32 kan man utfra resultatene se at alle forbindelsene har en CV <3% og dermed
oppfyller kriteriene for systempresisjon.
5.4.6 LOD og LOQ
I tabell 33 kan man se utfra resultatene at alle forbindelsene oppfyller kravet til LOD og LOQ.
5.4.7 Gjenvinning
I tabellene 34, 35 og 36 kan man se resultatene for gjenvinning på henholdsvis høyt, medium
og lavt konsentrasjonsnivå. Av disse konsentrasjonsnivåene er det kun forbindelsene JWH018, JWH-018 metabolitt og JWH-073 metabolitt på lavt konsentrasjonsnivå som oppfyller
kravene for gjenvinning. Forbindelse JWH-073 på lavt nivå oppfyller ikke kriteriene til
gjenvinning.
55
5.4.8 Linearitet
Linearitet for JWH-018 i standardrekke 2
y = 0,9501x + 0,0275
(S1-S7)
R² = 0,9967
70
60
50
Mål40
konsentrasjon
30
(nM)
20
10
0
0
10
20
30
40
50
Målt konsentrasjon (nM)
60
70
Figur 19: Gjennomsnittlig linearitet for forbindelsen JWH-018 av tre paralleller av standardrekke 2 (S1-S7)
Linearitet for JWH-018 metabolitt i
y = 0,9669x - 0,069
standardrekke 2 (S1-S27)
R² = 0,9886
70
60
50
40
Målkonsentrasjon 30
(nM)
20
10
0
-10
0
10
20
30
40
50
60
70
80
Figur 20: Notat: rund av R2 Gjennomsnittlig linearitet for metabolitten JWH-018 av tre paralleller av standardrekke
2 (S1-S7)
56
Linearitet for JWH-073 i standardrekke 2 (S1S7)
y = 0,9487x - 0,1671
R² = 0,994
70
60
50
40
Mål-konsentrasjon
30
(nM)
20
10
0
-10 0
10
20
30
40
50
60
70
Figur 21: Gjennomsnittlig linearitet for forbindelsen JWH-073 av tre paralleller av standardrekke 2 (S1-S7)
Linearitet for JWH-073 metabolitt i
standardrekke 2 (S1-S7)
y = 1,0052x - 0,003
R² = 0,9987
70
60
50
Mål-konsentrasjon 40
(nM)
30
20
10
0
0
10
20
30
40
50
60
70
Figur 22: Gjennomsnittlig linearitet for metabolitten JWH-073 av tre paralleller av standardrekke 2 (S1-S7)
57
5.4.9 Presisjon
Standardavvik
Gjennomsnitt
Parallell 6
Parallell 5
Parallell 4
Parallell 3
Parallell 2
Parallell 1
Parallell
Prøve:
CV (%)
Standardavvik
Gjennomsnitt
Parallell 6
Parallell 5
Parallell 4
Parallell 3
Parallell 2
Parallell 1
Paralleller
Prøve:
Forbindelse:
23,17
1,009
4,35
4,40
5,14
3,51
5,91
3,84
3,32
Labkontroll 2
7,15
0,087
1,22
1,24
1,10
1,28
1,29
1,27
1,11
Labkontroll 1
JWH-018
CV %
Standardavvik
Gjennomsnitt
Parallell 6
Parallell 5
Parallell 4
Parallell 3
Parallell 2
Parallell 1
Parallell
Prøve:
CV (%)
Standardavvik
Gjennomsnitt
Parallell 6
Parallell 5
Parallell 4
Parallell 3
Parallell 2
Parallell 1
Parallell
Prøve:
Forbindelse:
18,2
0,639
3,52
3,80
3,37
3,49
3,77
4,28
2,38
Labkontroll 2
10,7
0,107
1,00
1,09
0,99
1,11
0,86
1,05
0,88
Labkontroll 1
JWH-018 metabolitt
CV %
Standardavvik
Gjennomsnitt
Parallell 6
Parallell 5
Parallell 4
Parallell 3
Parallell 2
Parallell 1
Parallell
Prøve:
CV (%)
Standardavvik
Gjennomsnitt
Parallell 6
Parallell 5
Parallell 4
Parallell 3
Parallell 2
Parallell 1
Parallell
Prøve:
Forbindelse:
17,1
0,685
4,00
3,87
4,56
3,72
4,99
3,82
3,04
Labkontroll 2
5,5
0,0612
1,11
1,18
1,02
1,12
1,15
1,15
1,06
Labkontroll 1
JWH-073
CV %
Standardavvik
Gjennomsnitt
Parallell 6
Parallell 5
Parallell 4
Parallell 3
Parallell 2
Parallell 1
Parallell
Prøve:
CV (%)
Standardavvik
Gjennomsnitt
Parallell 6
Parallell 5
Parallell 4
Parallell 3
Parallell 2
Parallell 1
Parallell
Prøve:
Forbindelse:
16,3
0,565
3,48
3,63
3,38
3,60
3,82
4,02
2,41
Labkontroll 2
9,3
0,088
0,94
0,94
0,98
1,07
0,83
0,98
0,86
Labkontroll 1
JWH-073 metabolitt
Tabell 30: Resultat for validering av metodens presisjon med et høyt og et lavt nivå
CV %
58
Tabell 31: Oversikt over resultatene for reproduserbarheten for ti prøver over tre dager
Forbindelse: JWH-018
F
E
D
C
B
A
Prøve:
3,30
5,11
2,23
6,35
4,93
6,64
6,19
Målt konsentrasjon nM
H
G
F
E
D
C
B
A
Prøve:
2,81
4,50
3,03
7,07
2,55
9,33
4,12
7,92
4,77
J
I
H
G
F
E
D
C
B
A
Prøve:
2,71
2,15
2,85
2,21
4,67
1,66
5,66
4,38
5,70
4,34
5,20
2,84
4,06
2,85
5,62
2,15
7,11
4,48
6,75
5,10
Gjennomsnitt: nM
2,177
0,700
1,064
0,568
1,278
0,451
1,950
0,414
1,114
0,968
Standardavvik nM
41,9
24,7
26,2
19,9
22,7
21,0
27,4
9,2
16,5
19,0
CV (%)
Dag 3
G
4,84
I
6,76
Dag 2
H
3,55
J
Dag 1
I
6,12
Forbindelse: JWH-018 metabolitt
J
F
E
D
C
B
A
Prøve:
3,65
7,05
2,37
7,77
4,82
7,03
5,68
H
G
F
E
D
C
B
A
Prøve:
3,72
5,12
3,49
6,42
2,71
8,40
5,43
7,37
6,71
I
H
G
F
E
D
C
B
A
Prøve:
2,93
5,11
3,36
5,98
2,62
5,53
5,24
6,73
6,15
3,58
5,33
3,50
6,48
2,57
7,23
5,16
7,04
6,18
Gjennomsnitt: nM
0,588
0,372
0,145
0,538
0,176
1,508
0,312
0,320
0,516
Standardavvik nM
16,4
7,0
4,2
8,3
6,9
20,9
6,0
4,5
8,3
CV (%)
Dag 3
G
5,76
I
Dag 2
H
4,08
Dag 1
I
59
A
Prøve:
4,79
6,98
5,85
E
D
C
B
A
Prøve:
3,27
6,26
2,43
8,22
4,37
7,34
5,46
I
H
G
F
E
D
C
B
A
Prøve:
3,65
2,76
3,59
2,58
5,29
1,99
6,75
4,71
6,04
4,88
5,07
3,06
4,24
3,15
5,71
2,23
7,22
4,62
6,79
5,40
Gjennomsnitt: nM
5,90
1,251
0,322
0,561
0,520
0,498
0,224
0,870
0,223
0,671
0,488
Standardavvik nM
0,491
24,7
10,5
13,3
16,5
8,7
10,0
12,1
4,8
9,9
9,0
CV (%)
8,3
5,40
B
6,68
F
4,52
J
J
C
2,28
G
3,02
Dag 3
E
D
C
B
A
Prøve:
6,47
2,30
7,14
4,46
6,56
5,16
G
F
E
D
C
B
A
Prøve:
4,54
3,33
5,73
2,40
7,72
4,85
6,57
6,00
I
H
G
F
E
D
C
B
A
Prøve:
4,69
2,83
4,05
2,98
5,09
2,17
4,00
4,37
5,88
5,38
5,33
3,34
4,75
3,32
5,76
2,29
6,29
4,56
6,34
5,51
Gjennomsnitt: nM
0,635
0,471
0,831
0,340
0,691
0,115
2,001
0,255
0,396
0,436
Standardavvik nM
11,9
14,1
17,5
10,2
12,0
5,0
31,8
5,6
6,2
7,9
CV (%)
5,93
D
5,58
H
6,00
J
E
3,60
I
F
3,66
H
3,42
J
6,38
F
4,60
J
J
G
3,40
H
5,57
Dag 2
I
Dag 1
J
G
5,67
I
5,33
Dag 3
H
3,76
J
Dag 2
I
5,96
Dag 1
J
60
Tabell 32: Resultatene for validering av systempresisjon.
Prøve: K2
Prøve: K2
Injeksjon 1
8,90
Injeksjon 1
8,41
Injeksjon 2
8,65
Injeksjon 2
8,53
Injeksjon 3
8,54
Injeksjon 3
8,60
Injeksjon 4
8,76
Injeksjon 4
8,36
Injeksjon 5
8,76
Injeksjon 5
8,33
Injeksjon 6
8,76
Injeksjon 6
8,55
Injeksjon 7
8,79
Injeksjon 7
8,53
Injeksjon 8
8,83
Injeksjon 8
8,46
Injeksjon 9
8,98
Injeksjon 9
8,39
Injeksjon 10
8,89
Injeksjon 10
8,48
Standardavvik:
0,127
Standardavvik:
0,089
Gjennomsnitt:
8,79
Gjennomsnitt:
8,46
CV %
1,44
CV %
1,06
Prøve: K2
Prøve: K2
Injeksjon 1
6,44
Injeksjon 1
7,32
Injeksjon 2
6,34
Injeksjon 2
7,32
Injeksjon 3
6,49
Injeksjon 3
7,35
Injeksjon 4
6,32
Injeksjon 4
7,31
Injeksjon 5
6,31
Injeksjon 5
7,28
Injeksjon 6
6,24
Injeksjon 6
7,34
Injeksjon 7
6,29
Injeksjon 7
7,26
Injeksjon 8
6,29
Injeksjon 8
7,31
Injeksjon 9
6,38
Injeksjon 9
7,26
Injeksjon 10
6,34
Injeksjon 10
7,29
Standardavvik:
0,075
Standardavvik:
0,031
Gjennomsnitt:
6,344
Gjennomsnitt:
7,304
CV %
1,18
CV %
0,42
61
5.4.12 LOD og LOQ
Tabell 33: Resultat for validering av LOD og LOQ.
Parallell 5
Parallell 4
Parallell 3
Parallell 2
Parallell 1
Parallell
0,17
0,15
0,14
0,13
0,17
0,14
Gjennomsnitt:
Parallell 6
Parallell 5
Parallell 4
Parallell 3
Parallell 2
Parallell 1
Parallell
Intet målbart
Intet målbart
Intet målbart
Intet målbart
Intet målbart
Intet målbart
Standardavvik
Gjennomsnitt:
Parallell 6
Parallell 5
Parallell 4
Parallell 3
Parallell 2
Parallell 1
Parallell
2,88
0,004
0,14
0,14
0,14
0,14
0,15
0,14
0,14
CV (%)
Standardavvik
Gjennomsnitt
Parallell 6
Parallell 5
Parallell 4
Parallell 3
Parallell 2
Parallell 1
Parallell
0,00
0
0,03
0,03
0,03
0,03
0,03
0,03
0,03
Prøve: S7
Parallell 6
0,15
Standardavvik
CV (%)
Prøve: S6
Gjennomsnitt
0,017
CV (%)
Prøve: S7
Standardavvik
11,16
Prøve: S6
CV (%)
Parallell 5
Parallell 4
Parallell 3
Parallell 2
Parallell 1
Parallell
0,16
0,15
0,15
0,14
0,14
0,15
Gjennomsnitt
Parallell 6
Parallell 5
Parallell 4
Parallell 3
Parallell 2
Parallell 1
Parallell
0
0,03
0,03
0,03
0,03
0,03
0,03
0,03
CV (%)
Standardavvik
Gjennomsnitt
Parallell 6
Parallell 5
Parallell 4
Parallell 3
Parallell 2
Parallell 1
Parallell
14,3
0,021
0,15
0,16
0,16
0,15
0,16
0,13
0,11
CV (%)
Standardavvik
Gjennomsnitt:
Parallell 6
Parallell 5
Parallell 4
Parallell 3
Parallell 2
Parallell 1
Parallell
14,1
0,005
0,04
0,03
0,04
0,04
0,04
0,03
0,04
Prøve: S7
Parallell 6
0,15
Standardavvik
0,00
Prøve: S6
Gjennomsnitt:
0,008
CV (%)
Prøve: S7
Standardavvik
5,1
Prøve: S6
CV (%)
62
5.4.13 Gjenvinning
Tabell 34: Resultat av gjenvinning på en prøve med høy konsentrasjon (nivå 1)
Prøve: Labkontroll 1
Prøve : Labkontroll 1
Parallell 1
1,11
Parallell 1
0,88
Parallell 2
1,27
Parallell 2
1,05
Parallell 3
1,29
Parallell 3
0,86
Gjennomsnitt
1,22
Gjennomsnitt
0,93
Prøve: S2
Teoretisk konsentrasjon nM
Prøve: S2
S2
30
S2
30
Prøve GJ A: 50 µl Labkontroll 1
+ 50 µl std2
+ 50 µl std2
Parallell 1
28,53
Parallell 1
23,99
Parallell 2
28,20
Parallell 2
18,63
Parallell 3
24,05
Parallell 3
20,70
Gjennomsnitt
26,93
Gjennomsnitt
21,11
Teoretisk konsentrasjon (nM)
15,61
15,465
Gjenvinning (%)
172,5
Gjenvinning (%)
136,48
Parallell 1
1,06
Parallell 1
0,86
Parallell 2
1,15
Parallell 2
0,98
Parallell 3
1,15
Parallell 3
0,83
Gjennomsnitt
1,12
Gjennomsnitt
0,89
Prøve: S2
Prøve: S2
S2
30
S2
30
+ 50 µl std2
+ 50 µl std2
Parallell 1
24,09
Parallell 1
22,86
Parallell 2
24,26
Parallell 2
19,26
Parallell 3
22,26
Parallell 3
19,79
Gjennomsnitt
23,54
Gjennomsnitt
20,64
15,56
15,445
Gjenvinning (%)
151,26
Gjenvinning (%)
133,61
63
Tabell 35: Resultat av gjenvinning på prøve med medium konsentrasjon (nivå 2)
Prøve:Labkontroll 2
Parallell 1
3,32
Parallell 1
2,38
Parallell 2
3,84
Parallell 2
4,28
Parallell 3
3,51
Parallell 3
3,49
Gjennomsnitt
3,56
Gjennomsnitt
3,38
Prøve: S4
Teoretisk konsentrasjon
Prøve: S4
nM
nM
S4
1,5
S4
1,5
Prøve GJ B: 50 µl Labkontroll 2 + 50
µl std4
µl std4
Parallell 1
4,14
Parallell 1
2,63
Parallell 2
3,89
Parallell 2
3,45
Parallell 3
3,49
Parallell 3
3,35
Gjennomsnitt
3,84
Gjennomsnitt
3,14
2,53
2,44
Gjenvinning (%)
151,9
Gjenvinning (%)
128,74
Parallell 1
3,04
Parallell 1
2,41
Parallell 2
3,82
Parallell 2
4,02
Parallell 3
3,72
Parallell 3
3,60
Gjennomsnitt
3,53
Gjennomsnitt
3,34
Prøve: S4
Prøve: S4
nM
nM
S4
1,5
S4
1,5
µl std4
µl std4
Parallell 1
3,53
Parallell 1
2,60
Parallell 2
3,40
Parallell 2
3,25
Parallell 3
3,22
Parallell 3
3,22
Gjennomsnitt
3,38
Gjennomsnitt
3,02
2,51
2,42
Gjenvinning (%)
134,62
Gjenvinning (%)
124,85
64
Tabell 36: Resultat av gjenvinning på prøve med lav konsentrasjon. (nivå 3)
Parallell 1
0,45
Parallell 1
0,47
Parallell 2
0,55
Parallell 2
0,45
Parallell 3
0,54
Parallell 3
0,43
Gjennomsnitt
0,51
Gjennomsnitt
0,45
Prøve: S6
Prøve: S6
S6
0,15
S6
0,15
Prøve GJ C: 50 µl Labkontroll 3
Prøve GJ C: 50µl Labkontroll 3
+ 50 µl std6
+ 50 µl std6
Parallell 1
0,37
Parallell 1
0,30
Parallell 2
0,35
Parallell 2
0,31
Parallell 3
0,39
Parallell 3
0,32
Gjennomsnitt
0,37
Gjennomsnitt
0,31
0,33
0,30
Gjenvinning (%)
111,6
Gjenvinning (%)
103,3
Parallell 1
0,36
Parallell 1
0,44
Parallell 2
0,46
Parallell 2
0,41
Parallell 3
0,47
Parallell 3
0,41
Gjennomsnitt
0,43
Gjennomsnitt
0,42
Prøve: S6
Prøve: S6
S6
0,15
S6
0,15
PrøveGJ C: 50 µl Labkontroll 3 +
Prøve GJ C: 50 µl Labkontroll 3
50 µl std6
+ 50 µl std6
Parallell 1
0,34
Parallell 1
0,28
Parallell 2
0,35
Parallell 2
0,30
Parallell 3
0,33
Parallell 3
0,32
Gjennomsnitt
0,34
Gjennomsnitt
0,30
0,29
0,29
Gjenvinning (%)
117,2
Gjenvinning (%)
105,3
65
6.
Diskusjon
6.1 Pilotundersøkelse
For alle testrundene har det blitt benyttet kun en type kolonne og en mobilfase på grunn av
tidsbegrensninger for denne bacheloroppgaven.
I utgangspunktet skulle metodeutviklingen finne det løsemidlet og bufferløsningen som ga best
ekstraksjon av alle forbindelsene listet under virkestoff/analytt og metabolitt/analytt i
reagenslisten. Men i det tidsrommet denne bacheloroppgaven ble utført var det liten eller ingen
tilgang til isotopmerkede utgaver av de syntetiske cannabinoidene, bortsett fra JWH-018 og 073. Av denne grunn ble det bestemt at valideringen skulle fokusere på forbindelsene JWH073, JWH-018 og deres metabolitter. I etterkant av denne bestemmelsen ble det enighet om at
pilotundersøkelsen også skulle kun fokusere på forbindelsene JWH-018 og -073. Selv om
fokuset har vært på disse to forbindelsene og deres metabolitter, har valgene av hvilke
løsemidler som skulle gå videre i løpet av testrundene, eller eliminasjonsrundene, også vært
påvirket av løsemidlene og bufferløsningenes evne til å ekstrahere de andre forbindelsene under
kategorien virkestoff/analytt i reagenslisten.
6.1.1 Testrunde 1
For denne testrunden ble det tatt utgangspunkt i de 19 organiske løsemidlene listet opp i tabell
16, og bufferløsning nummer 1. Noen av disse løsemidlene i testutvalget ble valgt ut på
bakgrunn av faglitteratur, mens de fleste av løsemidlene var allerede i bruk i rutineanalysene
ved MS-laboratoriet ved UNN. Siden det i testrunde 1 kun ble fokusert på løsemidlene ble disse
bare testet med bufferløsningen 1 fordi den hadde vært benyttet i faglitteratur (14)
Fokuset for testrunden var å finne de organiske løsemidlene som kunne oppfylle de veiledende
kriteriene som ble stilt til denne testrunden, kriteriene er listet opp i tabell 20.
De løsemidlene som ikke oppfylte kriteriene for ekstraksjon av forbindelsene JWH-018 og-073
og metabolittene deres, stilt for testrunde 1, ble eliminert fra utvalget og ble ikke undersøkt
videre. Resultatene til disse løsemidlene har blitt utelatt siden de ikke oppfylte
minimumskriteriene.
66
7 av de 19 løsemidlene gikk videre til testrunde 2 fordi de oppfylte alle kriteriene for denne
testrunden. Hvilke løsemidler som oppfylte kriteriene er vist i tabell 21 og resultatene deres er
vist i tabell 22. n-H:D:ETOAC, oppfylte bare kriterium 3 og 4 og skulle på grunnlag av dette
ikke blitt tatt med videre i pilotundersøkelsen. Men siden dette løsemidlet hadde blitt benyttet i
en tidligere, lignende undersøkelse ved MS-laboratoriet med gode resultater, ble det undersøkt
videre. Resultatet for dette løsemidlet er tatt med i tabell 22.
6.1.2 Testrunde 2
I denne testrunden ble det i likhet med testrunde 1 kun fokusert på undersøkelse av løsemidlene
for utvikling av en ekstraksjonsmetode, dermed ble kun bufferløsning 1 benyttet.
I denne testrunden ble det satt nye kriterier til løsemidlene, som er listet opp i tabell 23. Av de 9
løsemidlene som ble undersøkt var det kun de tre løsemidlene vist i tabell 24 som oppfylte
kriteriene og følgelig gikk til videre undersøkelse i testrunde 3. Resultatene deres er vist i tabell
25.
6.1.3 Testrunde 3
I testrunde 3 ble hvert av løsemidlene n-H, D:ETOAC og DCM, undersøkt videre med
bufferløsning 1, 2, 3 og 4. DCM ble i tillegg undersøkt med og uten tilsetting av IS for å
undersøke om mengden MeOH i fra IS hadde signifikant betydning for ekstraksjon av
forbindelsene. Av disse to løsemidlene og fire bufferløsningene var det kun DCM kombinert
med bufferløsning 4 som oppfylte kriteriene i tabell 26 satt for denne testrunden. I tabell 27 kan
man se at D:ETOAC kombinert med bufferløsning 4 ikke oppfylte kravet om rene prøver.
6.1.4 Testrunde 4
I testrunde 4 ble standardrekke 1 (S1-S7) og kontrollgruppe 1 satt opp for ekstraksjon med
løsemidlene DCM og D:ETOAC og henholdsvis bufferløsning 4 (K1-K3) for å undersøke
hvilke av disse ekstraksjonsreagensene som ville gi best linearitet. Siden standardrekken var
tillaget med urin som matrise ga den en avbøyd standardkurve. MS-laboratoriet ved UNN har
erfaring fra utviklingen av ekstraksjonsmetoden av THC at polypropylenplastikken i Sarstedtrørene som benyttes for ekstraksjon, holder tilbake en signifikant mengde av THC analyttene.
Grunnen til dette er at THC er meget klebrig og det samme gjelder for de syntetiske
cannabinoidene. I denne runden ble det derfor bestemt at urin ikke passet som matrise for
standardene ved denne analysemetoden. Det ble i stedet besluttet at man skulle benytte serum
som matrise i standardrekken slik som i THC metoden. Dette var fordi serum har bedre
67
egenskaper for å holde syntetiske cannabinoider løst i matrisen enn urin, slik at analyttene ikke
fester seg til polypropylenplastikken i Sarstedt-rørene i like stor grad.
6.1.5 Testrunde 5
I denne testrunden ble standardrekke 2 (S1-S7) og kontroll gruppe 2 (K1-K3) satt opp for
ekstraksjon med løsemidlene DCM, D:ETOAC og n-H:D:ETOAC og bufferløsning 4.
n-H:D:ETOAC ble tatt med i denne testrunden til tross for at den ikke har gitt gode resultater i
noen av de tidligere testrundene, fordi det var ønsket av veileder å se hvordan lineariteten på
standardkurven ville bli i denne pilotundersøkelsen. I utgangspunktet skulle resultatene fra
denne testrunden benyttes til å ta en endelig avgjørelse av hvilket løsemiddel og bufferløsning
som skulle benyttes som ekstraksjonsreagenser av de syntetiske cannabinoidene. Men
resultatene til standardkurvene, ekstrahert med de tre ulike løsemidlene, bidrog ikke til noen
konkret konklusjon. Av denne grunn er resultatene for denne testrunden ikke tatt med i
resultatdelen. Bare noen få av standardkurvene for enkelte forbindelser, ekstrahert med samme
løsemiddel og bufferløsning, var lineær.
6.2 Feilkilder
Generelle feilkilder som kan ha påvirket resultatene er pipetteringsfeil, spesielt med små volum
ved pipettering av prøver/standarder og IS i ekstraksjonsdelen av analysemetoden.
En konkret feil skjedde i testrunde 3 der det ikke ble tatt med en parallell til undersøkelse av
DCM og bufferløsning 3 fordi det ikke var nok prøvemateriale igjen av testløsning 2 (spiked
urinprøve). En annen konkret feilkilde som har hatt stor innvirkning på resultatene for testrunde
5 er standardrekke 2 og kontrollgruppe 2. Denne standardrekken og kontrollgruppen fikk
target-verdiene sine justert til mer korrekte verdier i etterkant av pilotundersøkelsen.
68
6.3 Validering
6.3.1 Linearitet
Lineariteten for forbindelsene JWH-018, -073 og metabolittene deres ble testet på syv ulike
konsentrasjonsnivåer ved å benytte standardrekke 2 med tre paralleller. Alle forbindelsene
innfrir valideringskravet til linearitet listet i tabell 29.
6.3.2 Nøyaktighet
Nøyaktigheten har ikke vært mulig å validere på grunn av dårlig tilgang til referansemateriale
for forbindelsene denne metoden skulle valideres for.
6.3.3 Presisjon
Presisjonen for metoden ble testet ved å analysere to kontroller, en med høy konsentrasjon og
en med lav konsentrasjon, med tre paralleller hver. Utfra resultatene i tabell 30 er det kun
kontrollprøven med lavt nivå som innfrir valideringskravet til presisjon, listet i tabell 29, for
alle forbindelsene. Kontrollprøven med høy konsentrasjon innfrir ikke valideringskravene til
presisjon.
Systempresisjonen ble testet ved å analysere 10 injeksjoner av en spiked prøve, resultatene i
tabell 30 viser at systempresisjonen oppfyller valideringskravene.
Reproduserbarheten for denne metoden ble testet ved å analysere 10 spikede prøver, med
forskjellige konsentrasjoner av analyttene, over tre dager. Resultatene i tabell 31 viser at kravet
til metodens reproduserbarhet for JWH-018 bare innfris for en av de 10 prøvene. Alle prøvene
for JWH-018 sin metabolitt og JWH-073 sin metabolitt innfrir kravet til reproduserbarhet,
bortsett fra en, Forbindelsen JWH-073 innfrir alle prøvene, bortsett fra to, kravet til metodens
reproduserbarhet.
69
6.3.6 LOD og LOQ
I tabell 33 kan man se utfra resultatene at alle forbindelsene oppfyller kravet til LOD og LOQ
JWH-018
LOQ er 0,15 nM
JWH-018 metabolitt
LOQ er 0,03nM
JWH-073
LOQ er 0,03nM
JWH-073 metabolitt
LOQ er 0,03 nM
6.3.7 Gjenvinning
Gjenvinning for denne metoden ble testet med prøver på tre konsentrasjonsnivåer ved å tilsette
standard til en kontroll som inneholder analyttene. Med unntak av resultatene for gjenvinning
på det laveste nivået, nivå 3, gir ingen av resultatene for de to andre konsentrasjonsnivåene
mening hvis den praktiske gjennomføringen ble utført korrekt i henhold til fremgangsmåten.
Resultatene for gjenvinning nivå -1, -2 og -3 er vist henholdsvis i tabell 34, 35 og 36.
Beregningene av gjenvinning viser en gjenvinningsrate for alle forbindelsene som er altfor høy,
det vil si over 115 %. Resultatene for gjenvinning vil omtales videre under feilkilder for
valideringen.
6.4 Feilkilder
Den feilkilden som virker å ha hatt størst innvirkning på valideringsprosessen av denne
metoden er uheldige feilpipetteringer i begynnelsen av gjennomføringen av denne
bacheloroppgaven. Konsekvensen av dette har vært mest tydelig med standardrekke 2.
Ved tilvirkningen av standardrekke 2 ble det begått noen feil. I utgangspunktet skulle det
tilvirkes to bruksløsninger for standardrekke 2. Den ene bruksløsningen på 5000 nM skulle
fortynnes videre til en bruksløsning på 1000 nM. Sistnevnte bruksløsning skulle brukes videre
til å lage standardrekker fra S1 til S7 med konsentrasjonene 100, 10, 1, 0,5, 0,1, 0,05 og 0,01.
Men på grunn av en misforståelse ble det tatt utgangspunkt i den førstnevnte bruksløsningen på
5000 nM. Dermed ble de teoretiske konsentrasjonene på standardrekke 2 i stedet slik som de er
70
beskrevet i tabell 10. Etter tillagingen av standardrekke 2 ble det kjørt en kontroll analyse for å
sjekke konsentrasjonene til standardrekken og det viste seg den teoretiske konsentrasjonen ikke
stemte med den målte konsentrasjonen. Konsentrasjonen til de syv standardene ble derfor
justert ned til konsentrasjonene beskrevet i tabell 10 ved hjelp av referansematerialer tilvirket
av veileder.
En annen feilkilde er IS-løsningen som har blitt benyttet. Ved slutten av valideringen fremsto
det uklart om problemene IS har forårsaket skyldes feilpipetteringer eller andre omstendigheter.
Problemene har artet seg i at IS har gitt mindre god linearitet i noen tilfeller når den har vært
benyttet til å beregne standardkurven, enn når beregningen ble foretatt uten.
6.5 Konklusjon
6.5.1 Pilotundersøkelse
Valget av endelige ekstraksjonsreagenser sto mellom DCM med bufferløsning 4, og D:E med
bufferløsning 4. DCM og bufferløsning 4 ble valgt som ekstraksjonsreagenser fordi de ga de
reneste prøvene etter ekstraksjon. Etter testrunde 4 ble det også bestemt at det skulle benyttes
serum som matrise for standarder og kontrollgrupper av grunner nevnt i diskusjonen. Valget
av de endelige ekstraksjonsreagensenes ble tatt på grunnlag av resultatene fra testrunde 3.
6.5.2 Validering
Arbeidet med å modifisere THC metoden til en metode som kan benyttes som en kvantitativ
analyse for påvisning av inntak av de syntetiske cannabinoidene JWH-018 og -073 er kommet i
gang. Resultatene viser at metoden har potensial selv om den ikke innfrir flere av
valideringskravene som stilles for at den skal kunne benyttes som rutineanalyse. Mye av dette
skyldes feil som ble begått i begynnelsen av denne oppgaven på grunn uerfarenhet, men også
det faktum at dette er en ny metode som ikke er spesielt utbredt i Norge.
71
7.
Kilder
1. Tuv SS et al. Syntetiske cannabinoider – effekt og forekomst. Tidsskrift for den
norske legeforening. 2012; 132: 2285-8.
2. “Synthetic marijuana” chemist John.w.Huffman interviewed on regional NPR program. CENtral science. http://cenblog.org/terrasigillata/2011/01/26/synthetic-marijuana-chemist-john-w-huffman-interviewedon-regional-npr-program/ (29.05.2013)
3. Mode of action. Technische Universitat München. http://www.dopingprevention.sp.tum.de/substances-and-methods/cannabinoids/mode-ofaction.html (25.05.2013)
4. Khiabani HZ og Mørland J. Cannabis og cannabinoider som legemidler. Tidsskrift
for den norske legeforening. 2007;127: 579-82.
5. Gottardo R et al. Micellar electrokinetic chromotography: A new simple tool for the
analysis of synthetic cannabinoids in herbal blends and for the rapid estimation of
their log P values. Journal of Chromatography A. 2012; 1267: 198-205.
6. Bjergaard SP og Rasmussen KE. Legemiddelanalyse (2. utgave).
Bergen: Fagbokforlaget Vigmostad & Bjørke AS; 2010.
7. Retensjonstid. MedTekipedia. http://medtekipedia.wikispaces.com/Retensjonstid
(23.05.2013)
8. Atlantis T3 and Acquity UPLC HSS T3 Columns. Waters Corporation.
http://www.waters.com/webassets/cms/library/docs/720001887en.pdf
(27.05.2013)
9. Electrospray Ionization. National High Magnetic Field Laboratory.
http://www.magnet.fsu.edu/education/tutorials/tools/ionization_esi.html
(25.05.2013)
10. What Types of Instruments Are Used? Waters Corporation.
http://www.waters.com/waters/en_NO/What-Types-of-Instruments-AreUsed%3F/nav.htm?locale=en_NO&cid=10090937 (27.05.2013)
11. Laboratory services Biological mass spectrometry centre Metabolomics. University
College London. http://www.ucl.ac.uk/ich/services/labservices/mass_spectrometry/metabolomics/hplc (28.05.2013)
72
12. Introduction to MS Quantitation and Modes of LC/MS Monitoring. Thermo Fisher
Scientific Inc. http://www.ionsource.com/tutorial/msquan/intro.htm
(28.05.2013)
13. Guidance for the Validation of Analytical Methodology and Calibration of
Equipment used for Testing of Illicit Drugs in Seized Materials and Biological
Specimens. United Nations Publications, Østerrike: 2009.
14. Dresen S et al. Development and validation of a liquid chromatography-tandem
mass spectrometry method for the quantitation of synthetic cannabinoids of the
aminoalkylindole type and methanandamide in serum and its application to
forensic samples. J Mass Spectrom. 2011; 46: 163-71.
15. ICH-Q2A, Guideline for Industry, Test on Validation of Analytical Procedures,
March 1995.
16. ICH-Q2B, Guidance for Industry, Validation of Analytical Procedures: Methodology,
November 1996.
73

Bacheloroppgave 2013

Transcription

Similar documents

bacheloroppgave_kine