vaja1 drugi del

Vaja 2: Celična fiziologija
13
Vaja 2: CELIČNA FIZIOLOGIJA
Spoznavanje lastnosti napetostno-odvisnih kanalov
1 UVOD
Informacijo v telesu predstavlja električna aktivnost nevronov. V stanju mirovanja, ko nevron ni
vzdražen, je membrana nevronov polarizirana in za večino ionov slabo prevodna. Polarizacija membrane v stanju mirovanja je predvsem posledica elektrokemijskega gradienta za K+ ione, za katere je
membrana v mirovanju prepustna. Koncentracijske gradiente za specifične ione vzdržujejo aktivni
prenašalci, membranski proteini, ki aktivno (ob porabi energije) prenašajo ione preko membrane.
Primer aktivnega prenašalca je Na+/K+-črpalka, ki pomaga vzdrževati koncentracijski gradient za Na+
ter K+ ione. Ob aktivaciji celice pa je električni signal, bodisi akcijski potencial bodisi drug stopenjski (graduirani) potencial, posledica hitre in selektivne spremembe prevodnosti membrane. Napetost
na membrani se približa vrednosti ravnotežnega potenciala za ion(e), za katerega(e) je membrana
postala prevodna ob aktivaciji celice. Glede na vrednosti ravnotežnih potencialov lahko sprememba
prevodnosti povzroči depolarizacijo ali hiperpolarizacijo membrane. Proteine, ki povzročijo selektivne spremembe prevodnosti membrane, imenujemo ionski kanali. Razlikujemo napetostno-odvisne
kanale in od ligandov odvisne kanale.
1.1 IONSKI KANALI
1.1.1 Napetostno-odvisni ionski kanali
Napetostno-odvisni ionski kanali so transmembranski proteini. Njihova specializirana struktura, imenovana ionska pora, selektivno prepušča ione preko membrane. Napetost na membrani zaznava drug
specializirani del proteina, ki glede na napetost spremeni strukturo (konformacijo) celotnega proteina – pora kanala se odpre ali zapre. Tako se prevodnost membrane spreminja glede na napetost na
membrani.
Napetostno-odvisne kanale razvrščamo glede na ione, za katere so selektivno prepustni:
• družina napetostno-odvisnih Na+ kanalov
• družina napetostno-odvisnih Ca2+ kanalov
• družina napetostno-odvisnih K+ kanalov
Znotraj posameznih družin napetostno-odvisnih kanalov obstaja velika raznolikost v njihovih lastnostih. Izjema so napetostno-odvisni Na+ kanali, ki so si med seboj zelo podobni.
a) Napetostno-odvisni Na+ kanali
Napetostno-odvisni Na+ kanali sodelujejo pri tvorbi akcijskih potencialov. Navadno se aktivirajo (odprejo) pri majhni depolarizaciji membrane. Zaradi pozitivne vrednosti ravnotežnega potenciala za
Na+ ione, odprtje teh kanalov povzroči depolarizacijo membrane celice. Napetostno-odvisni Na+ kanali se v nekaj ms zaprejo kljub temu, da je membrana še vedno depolarizirana. Ta pojav imenujemo
inaktivacija kanalov. Ko so kanali inaktivirani, se mora membrana repolarizirati ali celo hiperpolarizirati, da se odstrani inaktivacija kanalov oz. da se kanali lahko ponovno odprejo.
b) Napetostno-odvisni Ca2+ kanali
Vloga Ca2+ ionov v celici je mnogovrstna. Ko se napetostno-odvisni Ca2+ kanal odpre, vdrejo Ca2+
ioni v celice in zaradi pozitivnega ravnotežnega potenciala za Ca2+ ione neposredno povzroči depolarizacijo membrane. To se dogaja med depolarizacijsko fazo akcijskih potencialov pri celicah srčnega
ritmovnika. Ca2+ ioni lahko poleg prenašanja naboja delujejo tudi kot sekundarni sporočevalci in
preko aktivacije encimov uravnavajo vrsto biokemijskih procesov znotraj celice. Pomembna vloga
14
Vaja 2: Celična fiziologija
Ca2+ ionov je pri procesu eksocitoze, kot je sproščanje nevrotransmitorjev v kemičnih sinapsah, kjer
Ca2+ ioni prav tako delujejo kot sekundarni sporočevalci. Sprememba napetosti presinaptične membrane odpre napetostno-odvisne Ca2+ kanale. Vdor Ca2+ ionov v presinaptični končič sproži zlivanje
sinaptičnih mešičkov, ki vsebujejo nevrotransmitor, s presinaptično membrano in sproščanje nevrotransmitorja v sinaptično špranjo. Nevrotransmitor se veže na receptorje na postsinaptični celici (glej
naslednje poglavje), kar povzroči elektrofiziološki odziv te celice. Ca2+ ioni lahko kot sekundarni sporočevalci neposredno vplivajo tudi na druge ionske kanale tako, da spremenijo njihovo prevodnost
(npr. od Ca2+ odvisni K+ kanali). Glede na lastnosti aktivacije in inaktivacije je poznanih več tipov
napetostno-odvisnih Ca2+ kanalov (L-, T-, P-, N-, Q-tip kanalov).
c) Napetostno-odvisni K+ kanali
Največja in najbolj raznolika družina napetostno-odvisnih kanalov so napetostno-odvisni K+ kanali.
Razlikujejo se v lastnostih aktivacije in inaktivacije. Nekateri kanali se aktivirajo ob depolarizaciji
membrane in inaktivirajo šele po nekaj minutah depolarizacije (ang. »outward rectifier K+ channels«); zaradi močno negativnih vrednosti ravnotežnega potenciala za K+ ione ti kanali povzročijo
repolarizacijsko fazo akcijskih potencialov nevronov. Drugi K+ kanali se inaktivirajo zelo hitro, v
milisekundah (KA kanali). Nekateri kanali pa se aktivirajo, ko je membrana hiperpolarizirana (Kir in
Kh kanali).
1.1.2 Od ligandov odvisni ionski kanali
Ionski kanali, ki jih aktivirajo ligandi (ang. »ligand-gated ion channels«), so transmembranski proteini
z ionsko poro, ki jih aktivirajo zunaj- ali znotrajcelični kemični signali − ligandi. So značilno manj
selektivni kot napetostno-odvisni kanali, saj lahko prepuščajo enega ali več različnih ionov.
Primer zunajceličnega liganda je nevrotransmitor. Ionske kanale, ki jih aktivirajo nevrotransmitorji, imenujemo ionotropni receptorji. Vezava nevrotransmitorja na ionotropne receptorje sproži spremembo potenciala na membrani postsinaptične celice (postsinaptični potencial). Ali je postsinaptični
potencial ekscitatorni (depolarizacija) ali inhibitorni (hiperpolarizacija), določa sprememba ionske
prevodnosti receptorja ob vezavi nevrotransmitorja in elektrokemični gradienti za ione, ki jih prepušča receptor. Depolarizacija postsinaptične membrane sproži povečano frekvenco akcijskih potencialov, hiperpolarizacija pa zmanjšano frekvenco.
Naj omenimo nekatere ionotropne receptorje:
• nikotinski acetilholinski receptorji − so neselektivni kationski kanali, aktivira jih acetilholin.
Fiziološko imajo ekscitatorni učinek;
• receptorji NMDA, AMPA in kainatni receptorji − so neselektivni kationski kanali, aktivira jih
glutamat. Imajo ekscitatorni učinek;
• receptorji GABAA in GABAC − so Cl- kanali, aktivira jih GABA in imajo (praviloma) inhibitorni učinek;
• glicinski receptorji − so Cl- kanali, aktivira jih glicin in imajo (praviloma) inhibitorni učinek;
• skupina serotoninskih receptorjev − so neselektivni kationski kanali, aktivira jih serotonin
(5-HT3) in imajo ekscitatorni učinek;
• skupina purinergičnih receptorjev − so neselektivni kationski kanali, aktivira jih ATP in imajo
ekscitatorni učinek.
Nekatere kanale aktivirajo znotrajcelični ligandi: Ca2+ ioni (npr. od Ca2+ odvisni K+ kanali), cAMP
ali cGMP (npr. CNG kationski kanali) ali protoni. Ti kanali imajo pomembno vlogo pri senzorični
transdukciji (npr. vid, voh in okus), kjer pretvarjajo znotrajcelični kemični signal v električni signal.
Vaja 2: Celična fiziologija
15
1.2 Metoda »PATCH-CLAMP« − orodje za študij ionskih kanalov
Metodo »patch-clamp« slovensko imenujemo tudi »metoda vpete krpice membrane«.
Večina informacij o delovanju ionskih kanalov je posledica odkritja metode »patch-clamp« v 70-tih
letih. Pri tej metodi se s čisto konico steklene pipete z zelo majhno odprtino (~ 1 μm) dotaknemo
membrane celice. Z majhnim podtlakom skozi pipeto naredimo tesen stik (pečat) med membrano
celice in robom pipete, kar loči raztopino v pipeti od zunajcelične raztopine.
(A) Ob odprtju ionskih kanalov na membrani
nastane majhen električni tok, ki teče predvsem
skozi membrano pod pipeto in ga lahko izmerimo z občutljivimi ojačevalci. Ker se s pipeto
le dotaknemo površine celice, takšno meritveno
postavitev imenujemo »cell-attached patchclamp« (slika 2.1, A). Če membrana pod pipeto vsebuje le en ionski kanal ali nekaj ionskih
kanalov, lahko s takšno postavitvijo izmerimo
tokove skozi posamezne ionske kanale.
(B) S sunkom podtlaka skozi pipeto lahko membrano pod pipeto pretrgamo, tako postane notranjost pipete povezana s citoplazmo celice. Ker
je volumen celice zelo majhen glede na volumen
pipete, difuzija povzroči, da je v kratkem času
sestava citoplazme enaka raztopini v pipeti. Ker
s takšno meritveno postavitvijo merimo tokove
celotne celice, jo imenujemo »whole-cell patch-clamp« (slika 2.1, B).
(C) Ko je pečat med pipeto in membrano celice
vzpostavljen, lahko pipeto umaknemo od celice, ne da bi se pečat med membrano in pipeto
razdrl. Umik pipete v postavitvi »cell-attached«
povzroči, da ostane majhna krpica membrane
pritrjena na pipeto, ki ima izpostavljen znotrajcelični del membrane. Z menjavo medija, ki mu
je izpostavljena znotrajcelična membrana, lahko
preučujemo vplive znotrajceličnih molekul (npr.
Ca2+ ionov, ATP) na delovanje ionskih kanalov.
Tako meritveno postavitev imenujemo »insideout patch-clamp« (slika 2.1, C).
Slika 2.1: Shema tipov metode »patch-clamp«.
(D) Če odmaknemo pipeto v »whole-cell« postavitvi, nastane membranska krpica, ki ima izpostavljeno zunajcelično stran. Takšno meritveno konfiguracijo imenujemo »outside-out patch-clamp« (slika
2.1, D) in je primerna za študij vpliva zunajceličnih signalov (npr. nevrotransmitorjev) na delovanje
ionskih kanalov.
Leta 1976 sta Erwin Neher in Bert Sakmann objavila prve posnetke tokov skozi nikotinske acetilholinske receptorje z metodo »patch-clamp« in za to odkritje leta 1991 prejela Nobelovo nagrado za
fiziologijo in medicino.
16
Vaja 2: Celična fiziologija
Vprašanja v razmislek
1. Kaj omogoča lastnost membran, da spreminjajo svojo ionsko prevodnost?
2. Kaj je inaktivacija ionskih kanalov?
3. Kaj omogoča meritev z metodo »patch-clamp«?
4. Kaj je absolutna in kaj relativna refraktarna perioda?
2 NAMEN VAJE
• Spoznavanje z raziskovalnim delom.
• Razumevanje električnih dogodkov na membrani: polarizacije in tokovi.
• Lastnosti napetostno-odvisnih ionskih kanalov: aktivacija in inaktivacija.
3 PRIPOMOČKI
• računalo in ravnilo
4 POTEK VAJE
demonstracijska vaja
Posamezna skupina študentov (4−5 študentov) bo v živo opazovala demonstracijo meritve tokov
skozi ionske kanale.
Tokove in membranske napetosti bomo merili na melanotrofih, celicah srednjega režnja hipofize, ali
β-celicah trebušne slinavke mišk. Hipofiza je nevroendokrini organ in celice srednjega režnja izločajo
MSH (melanocite stimulirajoči hormon). Melanotrofi se v praksi uporabljajo predvsem pri raziskavi
razumevanja molekularnega procesa eksocitoze. β-celice izločajo ob povišani ravni krvnega sladkorja
insulin, hormon, ki pomembno sodeluje pri uravnavanju količine sladkorja v krvi.
Kot metodo bomo uporabili »whole-cell patch-clamp« in opazovali tokove (Na+ ionov) preko membrane.
1) Celice bomo vzdrževali blizu mirovnega membranskega potenciala, pri -80 mV. Nato jih bomo
polarizirali z različnimi napetostmi in opazovali tok (Na+) preko membrane.
2) V naslednji fazi bomo preučevali lastnosti inaktivacije napetostno-odvisnih ionskih kanalov in
ugotavljali, pri kakšni napetosti membrane je večina napetostno-odvisnih Na+ kanalov inaktiviranih.
3) Preučevali bomo tudi, koliko časa je potrebno, da se inaktivacija napetostno-odvisnih Na+ kanalov odstrani po tem, ko membrano ponovno repolariziramo.
5 ANALIZA REZULTATOV
Za analizo tokov bomo uporabili računalniški program WinWCP (Strathclyde Electrophysiology
Software). Tokove boste po demonstraciji analizirali sami, zato imejte s seboj računalo in ravnilo.
Odprite program WinWCP in odprite posnetke meritev, ki so bili predhodno pripravljeni za vas: File
> Open ter odprite shranjeno datoteko.
• Odpre se okno z dvema podoknoma, v katera so shranjeni zapisi meritev (slika 2.2):
ozgornje okno prikazuje tokove;
ospodnje okno prikazuje napetost.
Vaja 2: Celična fiziologija
17
Slika 2.2: Primer meritve in načina odčitavanja Na+ tokov.
• Izmerite velikost Na+ tokov, ki jih povzročijo različne depolarizacije celice.
• Izmerite najmanjši čas med dvema depolarizacijskima pulzema, ko se tudi po drugem draženju pojavi tok.
• Med seboj bomo primerjali morebitne razlike v lastnostih ionskih kanalov melanotrofov in β-celic.