Zobrazit/otevřít - Univerzita Pardubice

Zobrazit/otevřít - Univerzita Pardubice

UNIVERZITA PARDUBICE
FAKULTA CHEMICKO-TECHNOLOGICKÁ
DISERTAČNÍ PRÁCE
2015
Mgr. Jana Srbová
Univerzita Pardubice
Fakulta chemicko-technologická
Katedra analytické chemie
Biofunkcionalizace moderních materiálů pro afinitní separace
a biokatalýzu
Disertační práce
Autor práce: Mgr. Jana Srbová (roz. Kučerová)
Školitel: prof. RNDr. Zuzana Bílková, Ph. D.
Školitel specialista: Mgr. Marcela Slováková, Ph.D.
2015
Prohlašují:
Tuto práci jsem vypracovala samostatně. Veškeré literární prameny a informace, které jsem
v práci využila, jsou uvedeny v seznamu použité literatury.
Byla jsem seznámena s tím, že se na moji práci vztahují práva a povinnosti vyplývající
ze zákona č. 121/2000 Sb., autorský zákon, zejména se skutečností, že Univerzita Pardubice
má právo na uzavření licenční smlouvy o užití této práce jako školního díla podle § 60 odst. 1
autorského zákona, a s tím, že pokud dojde k užití této práce mnou nebo bude poskytnuta
licence o užití jinému subjektu, je Univerzita Pardubice oprávněna ode mne požadovat
přiměřený příspěvek na úhradu nákladů, které na vytvoření díla vynaložila, a to podle
okolností až do jejich skutečné výše.
Souhlasím s prezenčním zpřístupněním své práce v Univerzitní knihovně.
V Pardubicích dne 16. září 2015
….…………………….
Mgr. Jana Srbová
Poděkování
Na tomto místě bych ráda poděkovala oběma svým vedoucím disertační práce, prof. RNDr.
Zuzaně Bílkové, Ph.D. a Mgr. Marcele Slovákové, Ph.D., za cenné rady, nápady, nadšení
a pomoc při studiu. Dále bych chtěla poděkovat celé skupině imunochemie a všem ostatním
kolegům za vytvoření přátelské atmosféry a příjemného pracovního prostředí. Velký dík patří
rovněž projektovým partnerům, ať už z Ústavu makromolekulární chemie v Praze nebo
z pařížského Institutu Curie. V neposlední řadě děkuji své rodině za dlouhodobou podporu
při studiu a pochopení.
Anotace
Disertační práce se zabývá biofunkcionalizací vybraných materiálů (nanovlákna a magnetické
částice) bioaktivními ligandy a polymery. Takto modifikované nosiče pak byly použity pro
různé aplikace – např. hojení ran, separaci cirkulujících nádorových buněk a selektivní záchyt
bakterií rodu Salmonella z mléka.
Klíčová slova
Biofunkcionalizace; imobilizace; bioafinitní separace; biokatalýza; magnetické částice;
nanovlákna; mikrofluidika
Title
Biofunctionalization of Modern Materials for Affinity Separations and Biocatalysis
Annotation
This dissertation deals with biofunctionalization of chosen materials (nanofibers and magnetic
particles) with bioactive ligands and polymers. Such modified carriers were subsequently
applied for different purposes – wound healing, separation of circulating tumour cells
and selective immunocapturing of Salmonella from milk.
Keywords
Biofunctionalization; immobilization; bioaffinity separation; biocatalysis; magnetic particles;
nanofibers; microfluidics
SOUHRN
Tato disertační práce se zabývá biofunkcionalizací vybraných moderních materiálů
(nanovlákna a magnetické částice) pro účely bioafinitních separací v mikrofluidním
uspořádání nebo pro podporu hojení ran nosičem s imobilizovanými proteolytickými enzymy.
V první části práce je popsána biofunkcionalizace nově připravených magnetických
částic proteolytickým enzymem trypsinem. Vazba trypsinu byla optimalizována a byla
stanovena skladovací i operační stabilita bioaktivního nosiče. Enzym trypsin v tomto případě
sloužil jako modelový biokatalyticky aktivní ligand, jehož přítomnost a aktivitu lze snadno
monitorovat pomocí reakce s nízkomolekulárním chromogenním substrátem. Dále byl enzym
vázán
trypsin
na
nanovlákna
připravená
metodou
elektrospinningu,
která
se po biofunkcionalizaci stala výchozím materiálem pro nový typ bioaktivního krytu ran
vhodného pro proteolytické štěpení nekrotické tkáně a debridementu v ráně.
Druhá část práce se zabývala povrchovou modifikací magnetických mikročástic
polymerem poly(ethylenglykolem) (PEG). Tento inertní polymer zvyšuje biokompatibilitu
nosiče a snižuje nespecifickou adsorpci proteinů a buněk na jeho povrch, zároveň i snižuje
adhezi
částic
na
vnitřní
stěny
mikrofluidních
čipů.
Je-li
navíc
použit
derivát
poly(ethylenglykolu) s vhodnými terminálními skupinami, je možné ho využít jako
tzv. „raménko“ pro imobilizaci bioaktivních látek. Magnetické částice byly PEGylovány
a poté biofunkcionalizovány specifickými anti-EpCAM protilátkami. Tento nosič byl použit
pro imunomagnetický záchyt EpCAM-pozitivních buněčných linií (modelový systém
pro cirkulující nádorové buňky) v mikrofluidním uspořádání. Dosažená účinnost záchytu
buněk byla porovnávána s analogickým komerčně dostupným nosičem.
Poslední
část
práce
byla
směřována
k vývoji
specifického
imunosorbentu
pro mikrofluidní záchyt modelového mikroorganismu, Salmonella Typhimurium, v mléčných
výrobcích. Pro přípravu nosiče byly vybrány vhodné magnetické částice i protilátky. Po vazbě
protilátek byla ve vsádkovém uspořádání ověřena schopnost nosiče selektivně a účinně
separovat
cílové
bakterie
z mléka.
Následně
byla
optimalizována
technika
imunomagnetického záchytu v mikrofluidním čipu – magneticky stabilizovaném fluidním
loži.
SUMMARY
This Ph.D. thesis deals with the biofunctionalization of selected modern materials
(nanofibers and magnetic microspheres) for the purposes of bioaffinity separations
in microfluidic systems or the promotion of wound healing using a carrier with immobilized
proteolytic enzymes.
In the first part of the thesis the magnetic microspheres were biofunctionalized with
proteolytic enzyme trypsin. Method for trypsin immobilization was optimized, and storage
as well as operational stabilities of the prepared bioactive carrier were monitored. Here
the enzyme trypsin served as a model biocatalytic ligand whose presence and activity can be
easily followed by reaction with a low molecular-weight chromogenic substrate. Enzyme
trypsin was also immobilized on the electrospun nanofibers with the aim to prepare a new
type of bioactive wound dressing for enhanced proteolytic cleavage of necrotic tissue,
i.e. enzymatic wound debridement.
The second part of the thesis deals with the surface modification of magnetic
microspheres with the inert polymer poly(ethylene glycol) (PEG). Generally PEG increases
the biocompatibility of carriers and decreases the nonspecific adsorption of proteins and cells.
At the same time, it reduces the carrier´s adhesion on the inner walls of microfluidic chips.
Moreover when a PEG derivative with suitable terminal groups is immobilized it can be also
utilized as a spacer for subsequent binding of bioactive ligands. Here magnetic microspheres
were PEGylated and biofunctionalized with specific anti-EpCAM antibodies. The carrier was
applied for microfluidic immunomagnetic separation of EpCAM-positive cell lines (model
system for circulating tumour cells). The capture efficiency of cells was compared with
the results achieved with the analogous commercial carrier.
The last part of this thesis was intended to the development of specific immunosorbent
for microfluidic immunocapture of a model microorganism, Salmonella Typhimurium,
in dairy products. Both magnetic particles and the anti-Salmonella antibodies were thoroughly
selected. After antibodies´ immobilization the selectivity and the efficiency of the carrier were
tested in milk. Finally, this technique was adapted to microfluidic chip – magnetically
stabilized fluidized bed.
OBSAH
SOUHRN .................................................................................................................................... 5
SUMMARY ............................................................................................................................... 6
OBSAH....................................................................................................................................... 7
SEZNAM ZKRATEK ................................................................................................................ 9
1.
ÚVOD................................................................................................................................ 11
2.
TEORETICKÁ ČÁST ....................................................................................................... 12
2.1. Bioafinitní chromatografie ....................................................................................... 12
2.2
Ligandy pro bioafinitní chromatografii.................................................................... 15
2.3
Nosiče pro bioafinitní chromatografii ...................................................................... 17
2.3.1 Magnetické mikročástice a nanočástice ............................................................. 18
2.3.2 Nanovlákna ......................................................................................................... 22
2.4
Povrchová modifikace nosičů .................................................................................. 26
2.4.1 Modifikace nosičů s cílem zavést vhodné chemické skupiny pro vazbu
ligandů............................................................................................................... 26
2.4.2 Modifikace nosičů s cílem zlepšit jejich povrchové vlastnosti .......................... 27
2.4.3 Víceúčelová modifikace nosičů polymery ......................................................... 27
2.5
Biofunkcionalizace nosičů ....................................................................................... 30
2.5.1 Nekovalentní techniky imobilizace ligandů ....................................................... 31
2.5.2 Kovalentní techniky imobilizace ligandů ........................................................... 32
2.6
Vsádkové a průtokové systémy pro bioafinitní interakce ........................................ 37
2.6.1 Bioafinitní nosiče v mikrofluidních systémech .................................................. 39
2.6.2 Specifika mikrofluidních systémů pro buněčné aplikace ................................... 44
3
SEZNAM LITERATURY................................................................................................. 46
4
CÍLE DISERTAČNÍ PRÁCE............................................................................................ 62
5
EXPERIMENTÁLNÍ ČÁST, VÝSLEDKY A DISKUZE ............................................... 64
5.1
Biofunkcionalizace magnetických mikročástic a nanovláken proteolytickým
enzymem trypsinem ................................................................................................. 64
5.1.1 Článek I .............................................................................................................. 66
5.1.2 Rukopis (manuskript) I ....................................................................................... 76
5.1.3 Užitný vzor ......................................................................................................... 95
5.2
Modifikace magnetických částice poly(ethylenglykolem) a anti-EpCAM
protilátkami pro mikrofluidní separaci EpCAM pozitivních buněk ...................... 104
5.2.1 Článek II ........................................................................................................... 105
5.2.2 Článek III .......................................................................................................... 114
5.3
Vývoj nosiče pro imunomagnetickou separaci salmonel v mikrofluidním
čipu ......................................................................................................................... 122
5.3.1 Rukopis (manuskript) II ................................................................................... 123
5.3.2 Rukopis (manuskript) III .................................................................................. 125
6
ZÁVĚR ............................................................................................................................ 146
7
PŘEHLED PUBLIKAČNÍCH VÝSTUPŮ ..................................................................... 149
SEZNAM ZKRATEK
AFM
mikroskopie atomárních sil (z angl. atomic force microscopy)
APTS
γ-aminopropyltriethoxysilan
BApNA
N-α-benzoyl-D,L-arginine-4-nitroanilid
BET
Brunauer-Emmet-Teller analýza
CDI
N, N´- karbonyldiimidazol (z angl. N, N´- carbonyldiimidazole)
CnBr
kyanbromid (z angl. cyanogen bromide)
COC
kopolymer cyklického olefinu (z angl. cyclic olefin copolymer)
CTC
cirkulující nádorové buňky (z angl. circulating tumor cells)
DMF
digitální mikrofluidika (z angl. digital microfluidics)
dsDNA
dvouvláknová DNA (z angl. double-stranded DNA)
EDC/EDAC
1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) karbodiimid
ELISA
heterogenní enzymo-imunoanalýza (z angl. enzyme-linked
immunosorbent assay)
EpCAM
adhezní molekula epiteliálních buněk (z angl. epithelial cell adhesion
molecule)
IČ
infračervená spektroskopie
LoC
laboratoř na čipu (z angl. Lab-on-a-Chip)
MSFB
magneticky stabilizované fluidní lože (z angl. magnetically stabilized
fluidized bed)
PCL
poly(ɛ-kaprolakton) (z angl. poly(ɛ-caprolactone)
PE
poly(ethylen)
PEG
poly(ethylenglykol)
PEO
poly(ethylenoxid)
PGMA
poly(glycidylmethakrylát)
PHEMA
poly(2-hydroxyethylmethakrylát)
PLA
kyselina polymléčná (z angl. polylactic acid)
PNA
peptidová nukleová kyselina (angl. peptide nucleic acid)
PDMS
poly(dimethylsiloxan)
PMMA
poly(methylmethakrylát)
PS
poly(styren)
PVA
poly(vinylalkohol)
SEM
skenovací elektronová mikroskopie (z angl. scanning electron
microscopy)
ssDNA
jednovláknová DNA (z angl. single-stranded DNA)
SMCC
sukcinimidyl 4-(N-maleiimidomethyl)-cyklohexan-1-karboxylát
sulfo-NHS
sodná sůl N-hydroxysulfosukcinimidu
sulfo-SMCC
sulfosukcinimidyl 4-(N-maleiimidomethyl)-cyklohexan-1-karboxylát
TEM
transmisní elektronová mikroskopie
XRD
rentgenová difrakční analýza (z angl. X-ray diffraction analysis)
1. ÚVOD
Bioafinitní chromatografie je unikátní separační technika založená na specifickém
rozpoznávání a interakci mezi biologicky aktivními látkami a komplementárními molekulami
(afinitní ligandy, afinanty) ukotvenými na stacionární fázi. Od 70. let 20. století, kdy nastal
„boom“ bioafinitní chromatografie, našla tato metoda uplatnění v celé řadě oborů a položila
základy mnoha dalším moderním vědám a technikám (studium protein-proteinových
interakcí, vývoj kombinatorických knihoven, DNA biosenzorů apod.). Princip bioafinitní
chromatografie je tak hojně využíván v mnoha obměnách dodnes, a nejen v akademické
rovině,
ale
i
v klinické
medicíně
nebo
v environmentálních
aplikacích.
Použití
imobilizovaných ligandů se rovněž významně rozšířilo i do biotechnologických oborů
s průmyslovým využitím.
Pro bioafinitní separaci nebo biokatalýzu je klíčová příprava dostatečně kvalitní
stacionární fáze, nosiče s imobilizovaným ligandem (protilátkou, enzymem, nukleovou
kyselinou, aptamerem, apod). Mezi jednotlivé kroky přípravy patří: (i) výběr vhodného nosiče
s odpovídajícími fyzikálně-chemickými vlastnostmi požadovanými dle účelu jeho použití;
(ii) výběr vhodného afinantu, tj. molekuly vykazující afinitu k cílovému analytu; (iii) výběr
takové metody vazby ligandu, aby nedošlo ke snížení nebo ztrátě jeho biologické aktivity;
(iv) důkladná charakterizace připraveného nosiče, tj. stanovení množství navázaného ligandu,
stanovení vazebné kapacity nosiče, koloidální stability v různých podmínkách prostředí
a v neposlední řadě operační a skladovací stability. Takto připravené nosiče pak mohou být
použity pro cílovou aplikaci. Jejich použití je velmi široké, od biotechnologicky významných
enzymů imobilizovaných na stacionárních fázích v reaktorech, přes imunomagnetické čipy
pro izolaci a detekci patogenních mikroorganizmů v potravinách až po bioaktivní kryty ran
využívané v lékařství. Vývoji těchto moderních nosičů a jejich použitím se zabývá i tato
dizertační práce, shrnující na první pohled různorodé, avšak ve své podstatě principiálně
velmi obdobné bioafinitní systémy.
11
2. TEORETICKÁ ČÁST
2.1.
Bioafinitní chromatografie
Bioafinitní chromatografie je separační technika využívající schopnosti biologicky
aktivních látek tvořit stabilní, specifické a reverzibilní biokomplexy. Imobilizací jedné
z reagujících složek (afinitního ligandu, tzv. afinantu) na matrici vznikne specifický nosič.
Ten je poté schopen biospecificky interagovat s komplementární molekulou a vytvořit
biospecifický pár (viz Obrázek 1). Všechny ostatní molekuly, které s ligandem nereagují,
procházejí daným prostředím beze změny. Zachycený analyt (peptid, protein, buňka,
nukleová kyselina, aj.) je v posledním kroku této techniky eluován ve velmi čisté formě
a zakoncentrován. Nosič může být nakonec regenerován a opakovaně používán (Turková
1993).
Obrázek 1: Schéma afinitní chromatografie: (a) specifická vazba analytu na biospecifický nosič, (b) promytí
nosiče s biokomplexem, (c) eluce analytu. Přepracováno podle: (Turková 1993).
Mezi přednosti bioafinitní chromatografie patří nenáročnost, rychlost, výtěžek dosahující
při optimálních podmínkách až 90 %, vysoká čistota eluovaného analytu, izolace analytu
přítomného ve vzorcích ve velmi nízkých koncentracích a možnost jeho zakoncentrování
(Johnstone a Thorpe 1996).
Afinitní interakce je komplexní soubor nekovalentních interakcí zahrnujících
elektrostatické, polární a hydrofobní interakce, vodíkové vazby, dipól-dipól interakce a další.
Sílu vazby mezi ligandem a analytem vyjadřuje tzv. afinitní (asociační) konstanta KA. Pro
efektivní separaci a zároveň účinnou eluci je nutné, aby afinitní konstanta vznikajícího
komplexu dosahovala hodnot od 104 do 108 mol.l-1. Při hodnotách KA větších než 109 mol.l-1
je nutné použít pro eluci velmi drastických podmínek, což může následně ovlivnit
biologickou funkci analytu. Pro biospecifickou vazbu jsou rovněž stěžejní vlastnosti
reakčního prostředí a vhodná geometrie vazebného místa - prostorové uspořádání funkčních
skupin a jejích stérická dostupnost (Turková 1993).
Eluce izolovaného analytu z matrice může probíhat dvěma způsoby. Častěji využívaná je
eluce nespecifická, tj. eluce změnou složení mobilní fáze, často změnou pH nebo iontovou
12
silou. Druhý způsob eluce představuje eluce specifická, při které se do mobilní fáze přidá
látka, která vytvoří s ligandem pevnější komplex než je původní komplex ligand-analyt; jedná
se tedy o vytěsnění analytu z jeho původní vazby s ligandem. Tento druhý způsob eluce je
šetrnější k izolovanému analytu, ale bývá mnohonásobně dražší než první varianta. Dále
rozlišujeme eluce izokratické a gradientové (Turková 1993).
Podle charakteru vázaného ligandu, resp. typu interakce ligand-analyt, lze rozdělit
techniky bioafinitní chromatografie na několik druhů. Je-li interakce založena na
imunoreaktivitě protilátek a příslušného antigenu, nazývá se imunoafinitní chromatografie
(Murphy a kol. 1976). Lektinová chromatografie (LC) je založena na komplexotvornosti mezi
lektiny a oligosacharidovými epitopy různých biomolekul (Gurd a Mahler 1974).
Chromatografie na imobilizovaných iontech kovů (IMAC) využívá schopnosti proteinů tvořit
koordinační vazbu s ionty kovů (Porath a kol. 1975). Boronátová afinitní chromatografie
využívá specifické schopnosti kyseliny borité tvořit komplexy s glykovanými proteinys 1,2cis-diolovou skupinou (Mallia a kol. 1981). Mezi další typy bioafinitní chromatografie patří
chromatografie na imobilizovaných barvivech (DLAC) (Bouriotis a Dean 1981); thiofilní
afinitní chromatografie (TAC) (Porath a kol. 1985); afinitní chromatografie na bázi oxidů
kovů (MOAC) (Pinkse a kol. 2004).
Bioafinitní chromatografie je zpravidla využívána jako nástroj pro izolaci specifického
bioanalytu z komplexního vzorku, tj. pozitivní selekci. Lze ji ovšem aplikovat i opačně, jako
tzv. negativní selekci nebo depleci nežádoucích látek. Toho lze využít jako purifikační krok
před vlastní pozitivní izolací cílového analytu - například k potlačení maskování analytu
abundantními proteiny (albuminy, imunoglobuliny) (Zeng a kol. 2011) nebo buňkami
ve vzorku (Wu a kol. 2014a).
První zmínka o bioafinitní chromatografii pochází již z r. 1910 (Starkenstein 1910), její
koncept byl poté detailně rozpracován v šedesátých letech minulého století týmem
amerického biochemika Pedra Cuatrecasase, Meira Wilcheka a Christiana B. Anfinsena
(Cuatrecasas a kol. 1968). Přestože se jedná o již velmi dobře popsanou a rutinně zavedenou
techniku, vývoj nových nosičů (Chernukhin a kol. 2011, Wu a kol. 2014b), ligandů
(Carredano a Baumann 2011) a analytických platforem (Li a kol. 2012, Ohlson a kol. 2010)
přináší stále nové možnosti využití principu tradiční afinitní chromatografie. Dále se vyvíjí
techniky kombinující bioafinitní interakce s dalšími separačními technikami – např.
afinoforéza (Shimura a Kasai 1987), afinitní kapilární elektroforéza (Guttman a Cooke 1991),
afinitní membránová filtrace (Mattiasson a Ramstorp 1984), afinitní precipitace (Costioli
a kol. 2003, Hilbrig a kol. 2006, Larsson a Mosbach 1979), tandemová afinitní purifikace
13
(Puig a kol. 2001). Základní princip afinitního biologického rozpoznávání (biorekognice) stál
rovněž u zrodu mnoha oblastí současné vědy – studia proteinových interakcí, vývoje metod
kombinatorických knihoven, DNA-biosenzorů nebo proteinových čipů (Wilchek 2004).
14
2.2
Ligandy pro bioafinitní chromatografii
Mezi tradiční biospecifické afinanty a jejich komplementární vazebné partnery patří
protilátka-antigen,
substrát/inhibitor-enzym,
lektin-polysacharid/glykoprotein,
hormon-
receptor, DNA-DNA vazebný protein (Batista-Viera a kol. 2011).
Vedle těchto tradičních přirozených afinantů mohou být použity i ligandy tzv.
biomimetické, které se přirozeně nevyskytují v žádných živých systémech, ale jsou schopny
tvořit komplexy s cílovými analyty. Jedná se především o syntetická triazinová barviva, v čele
s modelovým barvivem Cibacron blue F3G-A (Bouriotis a Dean 1981, Lowe a Pearson 1984,
Scopes 1986), a jejich novější chimérické analogy typu „barvivo-ligand“ (Clonis a kol. 2000,
Labrou 2003). Příkladem je ligand pro L-laktát dehydrogenázu (Labrou a kol. 1999) nebo pro
analogy glutathionu (Melissis a kol. 2001).
V posledních letech stále více nabývá na významu nová generace afinantů (zpravidla
peptidů, funkčních fragmentů protilátek nebo tzv. „scaffold“ proteinů) vyselektovaných
pomocí chemických (Carredano a Baumann 2011) nebo biologických kombinatorických
knihoven (Clonis 2006, Nygren 2011). V případě biologických knihoven je náhodně
syntetizováno velké množství peptidů (zpravidla 107-1013), které jsou poté selektovány
na základě jejich reaktivity s cílovými molekulami. Nejčastějším příkladem těchto
biologických technik jsou fágové peptidové knihovny (Cwirla a kol. 1990, Noren a Noren
2001, Smith 1985) nebo ribozomální display (Hanes a Pluckthun 1997). Úspěšným typem
afinantů
vytypovaným
pomocí
fágové
peptidové
knihovny
a následně
komerčně
produkovaným jsou tzv. „affibodies“ odvozené od proteinu A bakterie Staphylococcus aureus
(Nord a kol. 2000). Pomocí in vitro technologie SELEX (z angl. Systematic Evolution
of Ligands by EXponential enrichment (Tuerk a Gold 1990)) a Cell-SELEX (Morris
a kol. 1998) byly chemicky syntetizovány a následně vyselektovány aptamery (Ellington
a Szostak 1992). Jsou to úseky ssDNA nebo RNA vykazující vysokou specificitu a afinitu
vůči příslušné cílové struktuře - např. iontům, organickým molekulám typu antibiotik
a vitamínů, peptidům, proteinům, nukleotidům, celým buňkám (Famulok 1999, You a kol.
2003). Aptamery začaly být záhy využívány jako ligandy v bioafinitní chromatografii a začaly
nahrazovat tradiční protilátky (Romig a kol. 1999). Další příklady těchto nových, nejčastěji
protein-vázajících, molekul jsou přehledně zpracovány např. v (Bílková 2014, Binz a kol.
2005, Skerra 2007).
V DNA-biosenzorech bývají kromě klasických oligonukleotidových hybridizačních sond
využívány peptidové nukleové kyseliny (PNA) (Briones a Moreno 2012, Orum a kol. 1995),
chemické analogy nukleových kyselin, jejichž páteř netvoří cukr-fosfátová vazba, ale N-(215
aminoethyl) glycinpolyamid (Nielsen a kol. 1991). Takové molekuly jsou schopné rozpoznat
a navázat molekuly DNA, RNA, jiných PNA, nikoliv však proteinů. Další analogy
nukleových kyselin schopných hybridizace s cílovými molekulami, jako například „locked
nucleic acid“ (LNA), “glycerol-derived nucleic acid” (GNA), “pyranosyl-RNA” (p-RNA)
nebo “threose nucleic acid” (TNA) (shrnuty např. v Briones a Moreno 2012), se jako nové
ligandy v bioafinitní chromatografii příliš nerozšířily a jejich použití zůstává víceméně
ojedinělé.
Důvodem hledání nových bioafinitních ligandů je nedostatečná skladovací stabilita
a nízká odolnost přirozených ligandů vůči extrémnímu pH, vůči degradaci (proteolýza,
denaturace, aj.) a jejich relativně vysoká cena (Carredano a Baumann 2011). Nalezení nových
levných, robustních a dostatečně afinitních ligandů by mohlo umožnit další rozšíření
bioafinitní chromatografie (Labrou 2003).
16
2.3
Nosiče pro bioafinitní chromatografii
Ideální nosič pro bioafinitní chromatografii by měl splňovat následující kritéria:
nerozpustnost, nulová reaktivita matrice nosiče s analytem, vysoká chemická i mechanická
odolnost, rezistence vůči mikrobiální a enzymatické degradaci, hydrofilní charakter, vysoký
specifický povrch a vysoký obsah funkčních skupin na nosiči vhodných pro vazbu ligandu
(Turková 1993). Tabulka 1 shrnuje matrice, které bývají nejčastěji pro bioafinitní
chromatografii používány. Jsou běžně komerčně dostupné, některé z nich jsou dostupné s již
navázanými afinanty, např. protein A, protein G, konkanavalin A, oligo (dT) -, Ni2+, Co2+
a další.
Tabulka 1: Tradiční nosiče používané v bioafinitní chromatografii (podle Turková 1993).
Silika a silikagel
Agaróza a její deriváty
Anorganické oxidy Al2O3, TiO2, ZrO2
Polyakrylamid a jeho deriváty
Hydroxyalkylmethakrylát
Dextran (Sephadex)
Celulóza a její deriváty
Polystyren
Za posledních 30 let byla vyvinuta celá řada nových nosičů pro bioafinitní chromatografii
(shrnuto například v Calleri a kol. 2012, Varilova 2005). Cílem této literární rešerše však není
poskytnout jejich kompletní přehled, ale upozornit na nové materiály a vybrané typy
používaných moderních nosičů, zejména magnetické částice a nanovlákna.
Vývoj stacionárních fází pro bioafinitní chromatografii odráží trendy a požadavky
současné analytické chemie. Technika bioafinitní chromatografie ve vysokotlakém uspořádání
přinesla potřebu vytvořit takové nosiče, které by byly schopny odolávat vysokým tlakům.
Rozvoj magnetických separací analogicky přinesl velký zájem o různé typy magnetických
částic. V souladu s miniaturizací analytických systémů se trendem staly nosičové systémy
mikro- až nanometrových rozměrů, nabízející kromě malé velikosti, a tudíž i kompatibility
s mikroprůtokovými systémy, extrémně velký specifický povrch. Mezi ně patří kromě
klasických sférických mikro- a nanočástic (Corman a kol. 2010) i fullereny (Amirshakhi
a kol. 2008), nanotrubky (Assali a kol. 2013), mesoporézní částice (Nakanishi a kol. 2013).
Z planárních struktur se jedná především o nanovlákna (Che a kol. 2011). Další nanostruktury
jsou používány zejména ke značení biomolekul nebo k vývoji nosičů pro doručování léčiv
a jejich využití na poli bioafinitní chromatografie je omezené (kvantové tečky, liposomy,
dendrimery). Mezi další relativně nové stacionární fáze pro bioafinitní chromatografii patří
17
nosiče připravené sol-gel technologií (Haginaka 2008), vtištěné syntetické receptory
(Haginaka 2008, Sellergren 1994) nebo monolitické fáze (Spross a Sinz 2011).
V následující kapitole je pozornost zaměřena na nosiče, které si v oboru bioafinitní
chromatografie vydobyly velmi významné místo – magnetické mikro- a nanočástice.
2.3.1
Magnetické mikročástice a nanočástice
Magnetické mikro- a nanočástice se staly před více než 30 lety předmětem velkého zájmu
a postupně si našly své uplatnění nejen v akademické sféře, ale i v klinické praxi a průmyslu
(Ito a kol. 2005, Pecova a kol. 2011, Šafařík a Šafaříková 2009, Thanh 2012). S rozvojem
nanobiotechnologií se do popředí dostaly zejména magnetické nanočástice, které se
v současnosti intenzivně zkoumají pro svůj obrovský potenciál při medicinálních in vivo
aplikacích (např. (Pankhurst a kol. 2009). Souhrn biologických a biochemických oblastí
a technik, ve kterých se magnetických částic využívá, je schematicky znázorněn na Obrázku
2. Ve většině bioaplikací se používá magnetických částic o velikosti 50 nm až 10 µm (Andrä
a kol. 2007). Magnetické částice o velikosti několika jednotek mikrometrů (1-5 µm) jsou
velice vhodné pro separace v in vitro laboratorní diagnostice, stávají se tak jádrem mnoha
bioanalytických procesů (Basinska 2005). Tato velikost částic je rovněž atraktivní
pro mikrofluidní systémy (Fan a kol. 1999).
Obrázek 2: Oblasti využití magnetických částic.
18
Tyto částice se i v odborné literatuře často označují jako částice magnetické, přestože
se ve skutečnosti jedná o částice superparamagnetické. Magnetické vlastnosti vykazují pouze
po vložení do magnetického pole, po jeho odstranění nevykazují žádný zbytkový
magnetismus. V angličtině jsou označovány jako „magnetic beads“, „magnetic particles“
nebo méně častěji „magnetic spheres“.
Použití magnetických částic v in vitro biologických aplikacích bývá nejčastěji založeno
na následujících principech: imunomagnetická separace, imunoprecipitace a hybridizace nebo
extrakce na pevnou fázi (v případě extrakce nukleových kyselin). V neposlední řadě
se využívá imobilizace bioaktivních látek (nejčastěji enzymů) na magnetické částice a jejich
následné uplatnění v biokatalýze. Výhody používání magnetických částic v těchto technikách
spočívají v rychlé a jednoduché možnosti oddělit izolovaný analyt od zbytku reakční směsi
(a to i z hrubého buněčného lyzátu), tj. bez nutnosti centrifugace (Obrázek 3), dále
v jednoduché manipulaci a nenáročné instrumentaci, minimálním zřeďování analytu, možné
automatizaci a minimálním ztrátám nosiče v průběhu promývání (Šafařík a Šafaříková 1999).
Obrázek 3: Manipulace s magnetickými částicemi ve vsádkovém uspořádání (Lehmann 2008).
Historicky první práce popisující úspěšnou přípravu stabilizovaných magnetických částic
pochází z r. 1938 (Elmore 1938). Rozkvět v technologiích přípravy magnetických mikroa nanočástic nastal až v 60. letech 20. století. Za průlom je v přípravě magnetických částic
považována práce Johna Ugelstada, který v letech 1979 a 1980 popsal přípravu magnetických
vysoce uniformních polystyrenových mikročástic (Ugelstad a Mork 1980). Tento objev byl
během dalších let zdokonalen a v r. 1992 uveden na trh pod komerčním označením
Dynabeads®. V současnosti se jedná o celosvětově nejpoužívanější komerční částice. Vývoj
metod pro výrobu částic ještě zdaleka není u konce, každým rokem přibývá řada prací
popisujících nové postupy jejich výroby a modifikace (Kaewsaneha a kol. 2014, Liu a Choi
2014, Wang a kol. 2013). Novým trendem v přípravě nových magnetických částic se staly
19
vysoce porézní, tzv. hypersíťované částice (Fontanals a kol. 2008, Šálek a kol. 2011)
a mesoporézní silika nanočástice (Knezevic a kol. 2013, Zhang a kol. 2013). Oba typy nosičů
vynikají oproti neporézním částicím velkým specifickým povrchem (> 1000 m2/g) pro vazbu
afinitních ligandů a interakci s cílovými látkami.
Metody přípravy různých typů magnetických nano- a mikročástic byly přehledně shrnuty
v publikacích (Horák a kol. 2007, Laurent a kol. 2008, Roca a kol. 2009). Nejčastěji se jedná
o spolusrážecí (koprecipitační) reakce solí železa, termické rozklady prekurzorů obsahujících
železo, sol-gel reakce, heterogenní polymerizační techniky, sonochemické syntézy aj. Zcela
odlišným způsobem přípravy magnetických částic ve srovnání s výše vyjmenovanými
technikami je jejich biogenní produkce magnetotaktickými bakteriemi (Blakemore 1975)
(Obrázek 4). Ty jsou schopné vytvářet tzv. magnetozómy, krystaly tvořené magnetitem
a/nebo greigitem o velikostech přibližně 35-120 nm (shrnuto v Šafařík a Šafaříková 2009).
Obrázek 4: Produkce magnetických částic magnetotaktickými bakteriemi: (a) TEM snímek Magnetospirillum
gryphiswaldense (Schueler 2008), (b) a (c) TEM snímky magnetozómů (Šafařík a Šafaříková 2002).
V závislosti na volbě metody výroby můžeme připravit částice lišící se svou morfologií
(Obrázek 5), velikostí i uniformitou (monodisperzita vs. polydisperzita). Speciální formou
nanočástic je tzv. „ferrofluid“ neboli magnetický „nanofluid“, koloidální suspenze
magnetických nanočástic ve vhodné nemagnetické kapalině.
Obrázek 5: Morfologické typy magnetických polymerních mikročástic. (a) částice typu jádro-plášť, angl. coreshell, (b) částice s mnohočetným magnetickými jádry obklopenými polymerem, (c) částice s mnohočetnými
magnetickými jádry přítomnými na povrchu částice (d) „vlasaté“ částice tvořené magnetickým jádrem
a jednotlivými řetězci polymeru (Horák a kol. 2007).
20
Magnetickou složkou částic bývají nejčastěji superparamagnetické oxidy kovů – magnetit
(FeO.Fe2O3) nebo maghemit (γ-Fe2O3). Mají nejvyšší saturační magnetizaci, vysokou
magnetickou susceptibilitu, jsou biodegradabilní a přirozeně biokompatibilní. Méně často
se pak setkáváme s ferrity obsahujícími Mn, Co, Zn, Cu nebo Ni (Horák a kol. 2007).
Obaly magnetických částic se skládají z rozličných materiálů – z polymerů,
anorganických látek nebo kovů. Stejně jako v případě klasických stacionárních fází pro
kolonové bioafinitní chromatografie se i obaly magnetických částic nejčastěji připravují
z anorganické siliky (Tada a kol. 2007, Tsang a kol. 2006, Zhang a kol. 2007) nebo z různých
typů syntetických, bio- nebo kopolymerů. Jedná se např. o polystyrenové (latexové) částice
(Gu a kol. 2003, Yanase a kol. 1993), částice z celulózy (Yan a kol. 2013), alginátu (Joshi
a kol. 2011), z poly(methylmethakrylátu) (PMMA) (Qu a kol. 2009), z poly(hydroxyethyl
methakrylátu) (PHEMA) (Horák a kol. 1999) aj. Aby bylo dosaženo požadovaných cílových
vlastností částic (minimální nespecifická adsorpce proteinů a buněk, minimální agregace
částic ve vodném prostředí, přítomnost vhodných skupiny pro vazbu ligandu, atd.), lze jejich
povrch post-synteticky modifikovat. O těchto povrchových modifikacích pojednává kapitola
2.4.
Mezi klíčové parametry, které je nutno zohlednit při výběru částic pro konkrétní aplikaci,
patří: velikost částic, jejich struktura, superparamagnetické vlastnosti, povrchový náboj,
hydrofobicita/hydrofilicita, porozita, typ a hustota funkčních skupin pro následnou
biofunkcionalizaci. Některé z těchto údajů poskytují samotní výrobci magnetických částic,
některé však poskytnuty nebývají, a je tak nutné požadované parametry dodatečně proměřit.
Metody pro charakterizaci magnetických částic se liší v závislosti na velikosti částic. Pro
analýzu struktury a povrchu částic nanometrových rozměrů se dnes stále více používají
mikroskopické metody – transmisní a skenovací elektronová mikroskopie (TEM a SEM),
cryo-TEM a mikroskopie atomárních sil (AFM). Pro stanovení hydrodynamických velikostí
nanočástic se začala masivně používat technika dynamického rozptylu světla (DLS),
pro určení velikosti mikročástic pak metoda laserové difrakce. Měření zeta potenciálu se
rovněž stalo rutinním nástrojem pro stanovení tzv. bodu nulového náboje částic (angl. Point
of Zero Charge, PZC), ekvivalentu izoelektrického bodu u proteinů. Z tradičních metod
analýzy magnetických částic se běžně používá rentgenová difrakce XRD (z angl. X-Ray
Diffraction) a infračervená spektroskopie (IČ) pro analýzu chemického složení částic, SQUID
(z angl. Super-conducting Quantum Interference Device) nebo VSM magnetometrie
(z angl.Vibrating Sample Magnetometer) pro analýzu magnetických vlastností částic. Velikost
povrchu lze kvantifikovat pomocí analýzy BET (angl. Brunauer Emmet Teller). Metody pro
21
charakterizaci magnetických částic byly několikrát přehledně shrnuty, např. v Duguet a kol.
2012 nebo Laurent a kol. 2008.
Vzhledem ke stále rostoucí popularitě magnetických částic roste celosvětově počet
komerčních firem dodávajících částice i spektrum nabízených částic (v současné době nabízí
magnetické částice více než 70 firem (www.magneticmicrospheres.com)). Dostupné jsou jak
částice holé, bez biofunkcionalizace, tak částice s navázanými afinanty – nejčastěji
s univerzálními ligandy typu streptavidin, oligoDT, protein A a G. Lze ale zakoupit
i magnetické částice se specifickými protilátkami, například Dynabeads® Epithelial Enrich
s protilátkami proti lidskému povrchovému antigenu EpCAM. Tabulka 2 shrnuje příklady
komerčních magnetických částic a jejich producenty.
Tabulka 2: Příklady největších světových výrobců magnetických částic (vybráno z Horák a kol. 2007).
Označení
částic
Dynabeads®
SiMAG®
Sera-Mag®
Adembeads®
Biomag® a
Promag®
MicroBeads®
2.3.2
Výrobce, sídlo
Typ částic
Life Technologies, Thermo Fisher Vysoce uniformní polymerní magnetické
Scientific, Spojené státy americké mikročástice (≥1 µm)
Chemicell, Německo
Silika magnetické nano- a mikročástice
(0,5 – 1 µm)
Seradyn, Thermo Fisher
Polystyrenové magnetické částice (1 µm)
Scientific, Spojené státy americké
Ademtech, Francie
Magnetické „core-shell“ částice (200–
500 nm)
Bangs Laboratories, Spojené státy Magnetické monodisperzní polymerní
americké
částice (1 – 12 µm)
Miltenyi Biotec, Německo
Magnetické částice s protilátkami pro
separaci buněk
Nanovlákna
Podle doporučení komise Evropské unie č. 96/2011 jsou nanomateriály materiály, které
mají nejméně jeden rozměr mezi 1 až 100 nm. Nanovlákna v užším slova smyslu tuto definici
splňují a jejich průměr se pohybuje pod 100 nm. V širším slova smyslu jsou však
k nanovláknům běžně řazena všechna vlákna, jejichž průměr je menší než 1 000 nm, a měly
by tedy nést vhodnější označení „submikronová vlákna“.
Nanovlákna vynikají následujícími vlastnostmi: velký specifický povrch, vysoká
porozita, malý rozměr pórů. Díky těmto vlastnostem našly uplatnění především ve filtračních
procesech (Qin a Wang 2006), textilním průmyslu (Schreuder-Gibson a kol. 2002)
a nanoelektronice i optice (Long a kol. 2012). Jejich spojení s biologicky aktivními látkami
22
přináší nové možnosti v tzv. „life science“ oblasti, zejména pak v tkáňovém inženýrství,
kde jsou využívany jako nosné struktury, tzv. „scaffoldy“ (Katsanevakis a kol. 2012), při krytí
ran (Dubsky a kol. 2012) a doručování léčiv nebo genů (tzv. „Drug Delivery Systems“, DDS)
(Sharma a kol. 2014). V biomedicínských aplikacích se navíc k výše uvedeným výhodám
nanovláken využívá následujících vlastností: biokompatibilní nanovlákna dokáží imitovat
přirozenou strukturu extracelulární matrix; nanovlákna podporují proliferaci, diferenciaci
a i migraci buněk; díky vysoké porozitě jsou nanovlákna permeabilní pro plyn i kapaliny
(Kubínová a Syková 2010).
Nanovlákna lze připravit několika různými technikami – dloužením (Ondarcuhu
a Joachim 1998), matricovou syntézou (Che a kol. 1998), fázovou separací (Ma a kol. 2007,
Mu a kol. 2012), samo-organizováním (Hartgerink a kol. 2001) a v neposlední řadě
elektrostatickým zvlákňováním neboli elektrospinningem. Princip elektrospinningu byl
patentován v r. 1934 Formhalsem (Formhals 1934), na kterého navázal počátkem 70. let
minulého století Baumgarten (Baumgarten 1971) a další (Larrondo a Manley 1981, Reneker
a Chun 1996). Zjednodušeně se jedná se o metodu využívající vysokonapěťového
elektrostatického pole, kdy je jedna elektroda umístěna v roztoku polymeru nebo taveniny
a druhá elektroda je spojena s kolektorem tvořeným stacionární nebo rotující deskou.
V důsledku přítomnosti elektrického pole dochází k indukci náboje mezi zvlákňovací tryskou
a kolektorem, což následně vede k přitažení zvlákňovaného roztoku ve formě vláken
ke kolektoru, kde jsou vlákna ukládána. Mechanismus tvorby nanovláken je poměrně složitý,
detailně se mu věnuje celá řada prací (Bhardwaj a Kundu 2010, He a kol. 2005). V roce 2006
byla představena modifikovaná technologie elektrospinningu, ve které se nezvlákňuje
z trysky, ale z povrchu rotační elektrody, zvaná Nanospider® neboli zvlákňování z volné
hladiny (Jirsák a kol. 2006, Petřík a Malý 2008). Tato modifikace přinesla možnost
průmyslové výroby nanovláken o vysoké homogenitě. Nanovlákna připravená touto
technologií byla v rámci této dizertační práce využita jako nosič pro imobilizaci enzymů
při vývoji krytů ran.
Metodou zvlákňování z volné hladiny lze připravit nanovlákna z celé řady materiálů
(Tabulka 3). Zaměříme-li se na biologické použití nanovláken, používají se zejména
organické polymery a biopolymery. Pro vývoj nových krytů ran a tkáňové inženýrství
se nejčastěji využívá nanovláken z chitosanu (Bhattarai a kol. 2005), ze směsi
chitosanu/želatiny (Qian a kol. 2011), chitosanu/polyvinylalkoholu (Kang a kol. 2010),
kolagenu/polykaprolaktamu (Lee a kol. 2009), želatiny/polykaprolaktamu (Chandrasekaran
a kol. 2011) kyseliny polymléčné (Callahan a kol. 2013) a dalších.
23
Nanovlákenné vrstvy mohou mít strukturu monolitických (zvlákněná z homogenního
roztoku polymeru nebo taveniny), dutých (Bognitzki a kol. 2000), helikálních (Kessick
a Tepper 2004), magnetických (Li a kol. 2003) nebo koaxiálních nanovláken (Obrázek 6).
Koaxiální nanovlákna vyrobená metodou koaxiálního elektrospinningu představují slibnou
novinku na poli biomedicínských aplikací. Tato nanovlákna zvlákněná z trysky mají strukturu
typu jádro-plášť (Sun a kol. 2003), lze do nich tak snadno enkapsulovat bioaktivní látky
(Zhang a kol. 2006). Na konci roku 2013 byla představena technologie koaxiálního
elektrospinningu z volné hladiny umožňující průmyslovou produkci těchto nanovláken
(Forward a kol. 2013), čímž se otevírají nové možnosti v regenerativní medicíně a řízeném
uvolňování léčiv.
Tabulka 2: Příklady polymerů a tavenin, které lze zvláknit technologií Nanospider® (www.elmarco.cz).
Organické polymery
PA (polyamid)
PAI (polyamidimid)
PUR (polyurethan)
PES (polyethersulfon)
PVA (polyvinylalkohol)
PEO (polyethyleneoxid)
PS (polystyren)
Stejně
jako
Anorganické
polymery
TiO2
SiO2
SnO2
WO3
Al2O3
Li4Ti5O12
v případě
magnetických
Kovy
Biopolymery
Pt
Cu
Mn
Želatina
Chitosan
Kolagen
PVA (Polyvinylalkohol)
PLA (Kys. polymléčná)
PCL (Polykaprolaktam)
částic
lze
nanovlákna
charakterizovat
mikroskopickými metodami typu SEM, TEM nebo AFM. Stupeň porozity a obecně
specifický povrch lze stanovit metodou BET nebo rtuťovou porozimetrií, povrchové
vlastnosti nanovláken (hydrofilicitu/hydrofobicitu) měřením kontaktních úhlů. Metodou XRD
nebo IČ bývá analyzováno chemické složení nanovláken. Metody pro charakterizaci
nanovláken byly velice dobře shrnuty v (Ramakrishna a kol. 2005).
Obrázek 6: SEM snímky nanovláken: (a) koaxiální nanovlákna typu ze směsi PEO/PEG a PS (převzato
z (Forward a kol. 2013) (b) dutá nanovlákna z PLA/poly(p-xylylenu) (převzato z Bognitzki a kol. 2000)
(c) monolitická nanovlákna z chitosanu (snímek Mgr. Martina Juklíčková, Elmarco, CZ).
24
Povrchová modifikace nanovláken, zvláště těch připravených metodou elektrospinningu,
není tak častá jako v případě magnetických částic. Metodou elektrospinningu lze totiž zvláknit
celou řadu polymerů (a jejich směsí) různých vlastností v závislosti na cílové aplikaci,
následná postsyntetická modifikace tak nebývá nutná. Využívá-li se, pak zpravidla ke zvýšení
hydrofility nanovláken pro biomedicínské aplikace (Nam a kol. 1999, Park a kol. 2007),
nikoliv pro účely bioafinitní chromatografie.
25
2.4
Povrchová modifikace nosičů
Důvody pro povrchovou modifikaci nosičů jsou: absence vhodných chemických skupin
nebo raménka pro následnou vazbu afinitního ligandu (tzv. biofunkcionalizaci), hydrofobní
povrch nebo samovolná agregace nosiče v důsledku špatné koloidální stability, vysoká
nespecifická adsorpce proteinů nebo buněk z komplexního materiálu na nosič a v neposlední
řadě adheze samotného nosiče na vnitřní stěny reakčních nádob. Nosiče lze modifikovat celou
řadou způsobů – chemicky nebo fyzikálně, adsorpcí nebo kovalentně, nízko- nebo
vysokomolekulárními látkami.
2.4.1
Modifikace nosičů s cílem zavést vhodné chemické skupiny pro
vazbu ligandů
Většina nosičů pro bioafinitní chromatografii na svém povrchu přirozeně nese některé
funkční skupiny, jsou tzv. funkcionalizované. Pokud však přítomné skupiny nejsou dostatečně
reaktivní nebo vhodné biofunkcionalizaci, je nezbytné jejich povrch post-synteticky
modifikovat.
Vyhovuje-li materiál nosiče cílové aplikaci a jeho jediným nedostatkem je absence
vhodných skupin pro vazbu ligandu, můžeme povrch nosiče pouze chemicky aktivovat,
tj. zavést požadované funkční skupiny bez nanesení další vrstvy materiálu na jeho povrch.
Toho lze dosáhnout například pomocí hydrolýzy oxiranových skupin PGMA na hydroxylové
(Horák a kol. 2012), oxidace poly(ethylenu) kyselinou chromovou (Rasmussen a kol. 1977)
nebo hydrolýzy PMMA kyselinou sírovou za vzniku karboxylových skupin (Brown a kol.
2006). Polymery typu PCL, PE nebo PMMA je možné funkcionalizovat fyzikálně - plazmou
(argonem, dusíkem, kyslíkem, oxidem uhličitým atd.) (Chan a kol. 1996, Ozdemir a kol.
1999). Jedná se o velmi šetrný a ekologický způsob, jak zavést do svrchní vrstvy polymeru
například karboxylové nebo aminové skupiny. Ošetření povrchů plazmou může být navíc
zkombinováno s dalšími technikami pro modifikaci povrchu, například ultrafialovou
polymerizací (Situma a kol. 2005) nebo silanizací (Long a kol. 2006) vnášející na povrch
nosiče další chemickou vrstvu. Další možností je zavedení nových funkčních skupin
na povrch nosičů pomocí polymerů, tzv. polymerní „coating“ (viz kap. 2.4.3).
Silanizace je častý typ chemické modifikace povrchů s hydroxylovými skupinami (např.
silika, sklo) (např. (Grama a kol. 2014, Huang a kol. 2005). Jedná se o funkcionalizaci
alkoxysloučeninami (mono-, di-, nebo trialkoxysilany) s vhodnou terminální funkční
skupinou (např. –NH2) za vzniku vazby Si-O-Si. Silanizaci je možné provést pomocí
silanizačních činidel jako je γ-aminopropyltriethoxysilan (APTS, APTES) (Obrázek 7),
26
glycidyloxypropyltriethoxysilan (GOPS) nebo tetraethyl orthosilikát (TEOS). Silanizací
zavedená terminální funkční skupina může být poté využita pro následnou vazbu různých
typů biologických afinantů – DNA (Halliwell a Cass 2001, Phaner-Goutorbe a kol. 2011),
protilátek (Joshi a kol. 2007) a podobně.
Obrázek 7: Modifikace povrchu s hydroxylovými skupinami pomocí APTS činidla: (a) strukturní vzorec APTS;
(b) APTS po hydrolýze a kondenzaci silanolových skupin; (c) APTS po vazbě na povrch s hydroxylovými
funkčními skupinami. Převzato z (Hermanson 2008).
2.4.2 Modifikace nosičů s cílem zlepšit jejich povrchové vlastnosti
K potlačení samovolné agregace nosičů ve vodných roztocích a v komplexním
biologickém materiálu stačí často přídavek stabilizačních nízkomolekulárních látek typu
kyseliny citronové (Sahoo a kol. 2005), olejové (Hajdu a kol. 2008) nebo fosforečnanů (Mutin
a kol. 2003). Magnetické nanočástice obalené vrstvou hydrofobních surfaktantů mohou být
stabilizovány na základě hydrofobních interakcí s amfifilními molekulami typu cetyl
triemthylammonium bromid (CTAB), kopolymerů poly(ethylenglykolu) nebo Pluronicu
(shrnuto v Begin-Colin a Felder-Flesch 2012). Magnetické částice lze rovněž povrchově
modifikovat inertními anorganickými materiály, jako zlatem (Lin a kol. 2001) nebo silikou
(van Ewijk a kol. 1999), které částice důkladně obalí a vznikají tak částice s typickou
strukturou jádro-plášť (angl. core-shell). Tyto obaly pak zajistí dobrou koloidální stabilitu
nosičů a znemožní tak jejich agregaci. Dalším častým typem modifikace nosičů s cílem
zlepšit jejich povrchové vlastno sti je modifikace polymery, o které pojednává následující
kapitola.
2.4.3 Víceúčelová modifikace nosičů polymery
Nejčastějším typem funkcionalizace, zvláště u magnetických mikročástic, je modifikace
polymery (Audonnet a kol. 2011). Obecný koncept této modifikace a následné
biofunkcionalizace povrchu nosič znázorňuje Obrázek 8. Polymerní modifikace nosičů je
výhodná v tom, že se částice po modifikaci elektrostaticky odpuzují, což je jev označovaný
jako elektrostatická stabilizace. Polymery jako poly(ethylenglykol) (PEG) nebo cukry typu
27
dextran navíc slouží k tzv. stérické stabilizaci, jelikož řetězce makromolekulárního
stabilizačního činidla slouží jako fyzikální stérická bariéra, která tak potlačuje agregaci částic
(shnuto v Duguet a kol. 2012). Výběrem vhodného polymeru nesoucího vhodné terminální
skupiny na svých řetězcích (za použití tzv. heterobifunkčního polymeru) lze významně
ovlivnit koloidální stabilitu částic a potlačit tak jejich agregaci. Naopak při modifikaci částic
homobifunkčním polymerem (například při funkcionalizaci karboxylových nosičů polymerem
s terminálními aminoskupinami) může docházet k agregaci částic z důvodu chemického
„síťování“ polymerem. Volba polymeru a příslušných terminálních skupin poté určuje
i následnou metodu vazby biologického ligandu, jeho hustotu na nosiči i jeho finální
orientaci. Zároveň polymer slouží jako raménko, které pomáhá imobilizovanému afinantu
v lepší orientaci a stérické dostupnosti pro reakci s izolovaným analytem.
Obrázek 8: Koncept povrchové modifikace polymery a následné biofunkcionalizace povrchů. Přepracováno
podle Goddard a Hotchkiss 2007.
Částice lze funkcionalizovat polymery syntetickými, jako např. PEG (Betancourt a kol.
2009, Gbadamosi a kol. 2002), polyvinylalkoholem (PVA) (Davies a kol. 2008),
polykaprolaktamem (PCL) (Flesch a kol. 2004), poly[D,L-(laktid-ko-glykolidem)] (Pandey
a kol. 2013) aj. nebo přírodními jako např. dextranem (Lacava a kol. 2001), alginátem (Ma
a kol. 2007), chitosanem (Talbert a Hotchkiss 2012) aj. Typ polymeru, jeho struktura
(případné větvení) i hustota na částicích významně ovlivňuje finální vlastnosti i chování
modifikovaných částic.
Ze zmíněných polymerů je povrchová modifikace částic hydrofilním polymerem PEGem,
tzv. PEGylace, zlatým standardem a bývá pro bioaplikace používána nejčastěji (Gong
a Grainger 2007). PEG je polyether složený z opakujících se jednotek ethylenoxidu. Jeho
racionální vzorec je HO-(CH2—CH2-O)n-H, jako monomer má molekulovou hmotnost
44 g/mol. Je nábojově neutrální a vysoce hydrofilní, rozpustný ve vodných roztocích
i v mnoha organických rozpouštědlech. Významně zvyšuje biokompatibilitu povrchů
28
a zvyšuje odolnost vůči nespecifické adsorpci (Goddard a Hotchkiss 2007, Wattendorf
a Merkle 2008). Je vyhledávaným polymerem pro konjugaci s terapeutiky pro in vivo použití,
jelikož je neimunogenní a není toxický pro živé organismy. Bez jakékoliv modifikace je PEG
poměrně málo reaktivní. PEG lze však chemicky modifikovat a v současné době je již
k dispozici široká komerční nabídka lineárních i různě větvených modifikovaných homonebo heterobifunkčních PEGů. PEGylací příslušného nosiče pro bioafinitní chromatografii
tak můžeme na jeho povrch zavést téměř jakoukoliv terminální funkční skupinu,
např. karboxylovou, amino, hydrazidovou, hydroxylovou, thiolovou, epoxidovou a mnoho
dalších. PEG bývá na povrchy nosičů post-synteticky imobilizován analogickými metodami,
které se běžně využívají pro imobilizaci proteinů. Pro kovalentní imobilizaci PEGu bývá
nejčastěji využívána karbodiimidová technika vazby s využitím NHS-esterů (Wattendorf
a Merkle 2008) (viz kap. 2.5.2). Používaná je rovněž kombinace PEGylace s některou z již
uvedených metod – například silanizací.
29
2.5
Biofunkcionalizace nosičů
Mezi nejčastější biospecifické ligandy imobilizované na pevnou fázi patří peptidy,
proteiny (protilátky, enzymy) a nukleové kyseliny. Nosiče s imobilizovanými biomolekulami
je možné použít pro bioafinitní chromatografii často opakovaně, což s sebou přináší nemalé
ekonomické úspory. Imobilizované ligandy nabízí ve srovnání s prací se solubilní formou
zpravidla výhodu v možnosti kontrolovat reakci (např. odstranit ligand z reakční směsi),
zvýšení stability a aktivity biomolekul a v čistotě získaného produktu (shrnuto v Cao
a Schmid 2006, Liese a Hilterhaus 2013).
Ligandy pro bioafinitní interakce je možné na povrch nosičů ukotvit celou řadou metod.
Ty lze rozdělit na metody vedoucí ke vzniku kovalentní nebo nekovalentní vazby – zachycení
v polymeru, enkapsulace, adsorpce a afinitní interakce (Obrázek 9).
Obrázek 9: Hlavní přístupy pro biofunkcionalizaci nosičů biospecifickými ligandy (červeně). Upraveno
a přepracováno podle (Brena a Batista-Viera 2006, Goddard a Hotchkiss 2007).
Při volbě metody vazby je nutné vzít v úvahu požadovanou prostorovou orientaci ligandu
na nosiči, a tudíž i následnou neporušenost a přístupnost vazebných center molekuly
pro biospecifického partnera. Ligandy lze ukotvit na pevný nosič orientovaně nebo
neorientovaně, tj. náhodně. Orientovaná vazba, tedy místně-specifická vazba kotvící ligand
přes selektivní strukturu, je výhodná zejména u protilátek a oligonukleotidů.
Při orientované vazbě protilátek třídy IgG se využívá dvou kvalitativně odlišných
přístupů – přes jejich Fc část nebo přes redukovanou S-S vazbu v pantové oblasti těžkých
řetězců (např. pomocí 2-merkaptoethylaminu). Imobilizace protilátek přes jejich Fc část lze
dosáhnout několika technikami - kovalentní vazbou přes oligosacharidové řetězce
lokalizované právě v Fc části molekuly IgG (více viz kap. 2.5.2), s využitím imunoglobulinvázajících proteinů (např. protein A) nebo pomocí afinitního systému biotin-avidin (viz kap.
2.5.1) (Hermanson a kol. 1992, Turková 1993). Naprosto nezbytná je orientovaná vazba
v případě imobilizace oligonukleotidu, který má následně hybridizovat s komplementárním
řetězcem ssDNA ze vzorku. Orientované imobilizace nukleových kyselin lze docílit například
30
využitím systému biotin-avidin, komplementarity mezi oligo(dT) a polyA konce mRNA,
fosforamidovou metodou vazby nebo s využitím tzv. samoskladných monovrstev (viz kap.
2.5.2).
2.5.1 Nekovalentní techniky imobilizace ligandů
Prostá adsorpce bioligandu na nosič na základě elektrostatických interakcí nevyžaduje
žádnou předchozí chemickou modifikaci ligandu, je tak populární a široce používanou
technikou. V případě amfoterních proteinů může být například využita při pasivní vazbě
protilátek na jamky polystyrenových ELISA destiček. Polystyrenové povrchy jsou přirozeně
hydrofobní, adsorpce protilátek v prostředí blízkému jejich izoelektrickému bodu je tak
důsledkem komplexního působení hydrofobních sil, van der Waalsových, iontových
a vodíkových interakcí (Davies 2013). S ukotvením ligandu na základě elektrostatických
interakcí se rovněž často setkáváme u imobilizace DNA. Jelikož je DNA díky přítomnosti
fosfátových skupin negativně nabitá, nabízí se její adsorpce na pozitivně nabité povrchy.
Obecnými nevýhodami prosté adsorpce je možnost zpětné desorpce navázaného ligandu,
nepředvídatelná orientace ligandu na pevné fázi, možnost nízké účinnosti vazby a rovněž
riziko nespecifické adsorpce balastního materiálu ze vzorku (He 2013).
Zvláštním případem nekovalentní imobilizace bioligandů je afinitní vazba. V případě
afinitního páru avidin-biotin se jedná se o nejsilnější známou nekovalentní interakci - afinitní
konstanta dosahuje hodnot až 1015 mol.l-1. Vazba mezi avidinem a biotinem je odolná i vůči
extrémně chaotropním podmínkám, např. působení 8M guanidin hydrochloridu o pH 5,2
(Hermanson 2013). Tento typ vazby tak tvoří rozhraní mezi kovalentními a nekovalentními
technikami imobilizace. Nejčastějším případem ukotvení biospecifického ligandu pomocí
interakce avidin-biotin je použití stacionární fáze s navázaným avidinem, se kterým následně
interaguje biotinylovaný ligand. V tomto uspořádání je avidin teoreticky schopen interagovat
s až čtyřmi molekulami biotinu (schéma interakce je znázorněno na Obrázku 10). Kromě
avidinu jsou pro tyto interakce využívány i jiné biotin-vázající proteiny. Jedná se o následující
deriváty avidinu lišící se chemickou strukturou a tudíž i fyzikálně chemickými vlastnostmi
(pI, rozpustností ve vodném prostředí, disociační konstantou): streptavidin, neutravidin,
nitroavidin (Morag a kol. 1996) známý pod komerčním názvem jako CaptAvidin, rhizavidin
(Helppolainen a kol. 2007) a další.
31
Obrázek 10: Schéma interakce mezi biotinem konjugovaným s protilátkou třídy IgG a avidinem (převzato
z Johnstone a Thorpe 1996).
Dalším
příkladem
vysokoafinitní
a tzv. imunoglobulin-vázajícími
vazby
proteiny
jsou
interakce
odvozenými
od
mezi
imunoglobuliny
sekrečních
produktů
grampozitivních koků - proteiny A, G, A/G, L, H, aj. (Johnstone a Thorpe 1996). Nejčastější
z nich, Protein A, je 42kDa protein teoreticky schopný afinitní vazby s až čtyřmi molekulami
IgG, které mohou následně sloužit jako biospecifické ligandy pro izolaci analytu. Afinitní
konstanta mezi proteinem A a molekulou IgG dosahuje hodnot až 108 mol.l-1 (Hermanson
a kol. 1992). Vazbu IgG (bioligandu) přes protein A přítomný na nosiči lze ještě dodatečně
posílit vytvořením vazby kovalentní. Příkladem je dodatečné irreverzibilní síťování
homobifunkčními činidly nesoucími terminální -NHS estery (Huang a Kim 2013) nebo
kovalentní provázaní fotoreaktivním analogem aminokyselin (Hui a kol. 2014).
2.5.2 Kovalentní techniky imobilizace ligandů
Kovalentní vazba představuje nejpevnější možné ukotvení ligandu, které odolává
i extrémním podmínkám prostředí, jako např. teplotě, pH, vysokému tlaku, prostředí o vysoké
iontové síle aj. Tento typ vazby je ireverzibilní. Imobilizační techniky, které vedou ke vzniku
kovalentní vazby, jsou tak v současnosti nejčastěji používanými metodami a byly přehledně
shrnuty v publikacích (Hermanson a kol. 1992, Hermanson 2008).
Nejčastěji využívanými skupinami pro vazbu ligandů jsou aldehydové, karboxylové,
thiolové, hydroxylové a aminové skupiny. Pro tyto reakce bylo proto vyvinuto velké množství
konjugačních nebo aktivačních činidel (výběr nejčastějších v Tabulce 4) lišících
se optimálním prostředím, ve kterém působí, a svojí rozpustností. Podmínky vazby musí být
především šetrné ke konjugovanému ligandu, jehož aktivitu je nutné zachovat pro následnou
biospecifickou interakci; výběr těchto činidel je tedy přímo závislý na typu ligandu, který
bude imobilizován.
32
Tabulka 3: Příklady nejpoužívanějších biokonjugačních činidel (výběr z Hermanson 2008).
Reagující
skupiny
karboxylové
a primární aminy
primární aminy
a primární aminy
thioly a primární
aminy
Konjugační/aktivační činidlo
Zkratka
1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) karbodiimid
N,N´-karbonyldiimidazol
1-cyklohexyl-3-(2-morfolinoethyl) karbodiimid
dicyklohexyl karbodiimid
glutaraldehyd
formaldehyd
sulfosukcinimidyl-7-azido-4-methylkumarin-3acetát
dithio bis(sulfosukcinimidyl propionát)
sulfosukcinimidyl 4-(N-maleiimidomethyl)cyklohexan-1-karboxylát
maleimidobenzoyl-N-hydroxysukcinimid ester
EDC/EDAC
CDI
CMC
DCC
GTA
FA
sulfoSAMCA
DSP
sulfo-SMCC
MBS
Biokonjugační činidla mohou zprostředkovat ukotvení ligandu bez nutnosti včlenění
spojovacího článku mezi ligand a nosič (tzv. „činidla s nulovou délkou“, angl. zero-length
crosslinkers; např. EDC, CDI, CMC, DCC) nebo naopak mohou vnést do vazby nové atomy,
a v některých případech tak působit jako raménko. Druhý zmíněný typ činidel můžeme dále
rozdělit na činidla homobifunkční, zpravidla osově souměrná síťovadla nesoucí na obou
svých koncích identické reaktivní skupiny (např. DSP, GTA, FA), a heterobifunkční, nesoucí
skupiny
rozdílné
(např.
sulfo-SMCC,
sulfo-SAMCA,
MBS).
Zajímavými
typy
biokonjugačních činidel jsou tzv. UV světlem aktivovatelné linkery (Brunner 1993,
Hermanson a kol. 1992) a trifunkční činidla obsahující tři reaktivní skupiny, z nichž jedno
bývá obsazeno biotinem (Goddard a Hotchkiss 2007, Hermanson 2008).
2.5.2.1
Vybrané techniky kovalentní imobilizace ligandů
Mezi tradiční metody imobilizace afinitních ligandů na polysacharidové nosiče typu
agarózy patří aktivace kyanbromidem (CNBr) (Axen a kol. 1967). Tato metoda jako
historicky první umožnila ukotvení ligandu na nosič, aniž by došlo ke ztrátě biologické
aktivity ligandu; její objev je tak spjat s velkým pokrokem na poli bioafinitní chromatografie
(Kohn a Wilchek 1984). CNBr aktivuje –OH skupiny nosiče a mění je na reaktivní
imidokarbonáty, které následně reagují s –NH2 skupinami ligandu za vzniku různých derivátů
(deriváty isomočoviny, imidokarbonáty a N-substituované karbamáty). Výhodou metody je
možnost pracovat ve vodném prostředí, nevýhoda naopak spočívá v těkavosti a toxicitě
kyanbromidu a ve snížené stabilitě vazby.
33
V 70. letech 20. století byla rovněž popsána triazinová metoda vyvinutá pro vazbu
enzymů na celulózové nosiče (Kay a Crook 1967). Tato metoda využívá kyanurchloridů
(derivátů 2,4,6-trichloro-s-triazinu), které po reakci s hydroxylovými skupinami nosičů
umožňují kovalentní vazbu molekul s aminoskupinami. Obdobně lze využít i epichlorhydrin,
který po aktivaci nosiče s hydroxylovou skupinou vytváří reaktivní epoxy skupinu schopnou
vytvářet vazbu s nukleofilními sloučeninami obsahujícími amino-, hydroxylové nebo thiolové
skupiny (Matsumoto a kol. 1979). Obdobně jako CNBr jsou však kyanurchlorid
i epichlorhydrin toxické reagencie a jsou-li dnes pro imobilizaci ligandu využívány, pak
zpravidla
již
v podobě
konjugátů
s komerčně
dostupnými
nosiči
(např.
agaróza
aktivovaná CnBr).
V dnešní době nejpoužívanějšími činidly pro biokonjugační reakce je skupina
karbodiimidů. Zprostředkovávají amidovou vazbu mezi karboxylovou a amino funkční
skupinou nebo fosforamidovou vazbu mezi aminem a fosfátem (Chu a Orgel 1988, Ghosh
a kol. 1990, Hoare a Koshland Jr. 1966). Karbodiimidy se osvědčily zejména při imobilizaci
proteinů, peptidů a oligonukleotidů na nejrůznější povrchy a při konjugaci těchto biomolekul
navzájem (mnohokrát shrnuto v (Al-Warhi a kol. 2012, El-Faham a Albericio 2011,
Hermanson 2008, Williams a Ibrahim 1981). Tyto látky se dělí na skupinu ve vodných
roztocích
rozpustných
karbodiimidů
a
skupinu
karbodiimidů
rozpustných
pouze
v organických rozpouštědlech. Nejčastěji používaným karbodiimidem je ve vodě rozpustný
1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) karbodiimid hydrochlorid (EDC, EDAC). Po reakci EDC
s nosičem nebo s biomolekulou, zpravidla proteinem, obsahující karboxylovou funkční
skupinu se vytváří vysoce reaktivní meziprodukt (o-acylisomočovina). Ten následně reaguje
s nukleofilní aminoskupinou a vznikne stabilní amidová vazba. Přídavek sodné soli
N-hydroxysulfosukcinimidu (sulfo-NHS) do reakce zvýší rozpustnost aktivního intermediátu
a zároveň prodlouží jeho stabilitu, čímž zvýší pravděpodobnost kolize s aminoskupinou,
se kterou záhy vytváří amidovou vazbu (Obrázek 11). V případě orientované imobilizace
DNA se využívá reaktivity EDC s 5´ terminální fosfátovou skupinou oligonukleotidu.
Vzniklý reaktivní fosfodiesterový intermediát poté vytváří fosforamidovou vazbu s nosičem
nebo s oddalujícím raménkem nesoucím nukleofilní aminoskupinu. Přídavek imidazolu
do reakce a následná tvorba dalšího meziproduktu (fosforimidazolidu) zajišťuje vyšší
reaktivitu a tudíž i vyšší výtěžky konjugace (Hermanson 2008).
34
Obrázek 11: Mechanismus konjugace molekul s karboxylovou a aminoskupinou pomocí činidel EDC a sulfoNHS. Převzato z (Hermanson 2008).
Konjugační činidla odvozená od imidů kys. maleinové (maleiimidů) patří mezi oblíbená
heterobifunkční činidla nesoucí na jednom konci zpravidla reaktivní ester, který reaguje
nukleofilní substitucí s primárními aminoskupinami, a na svém druhém konci maleiimid
schopný tvořit thioetherovou vazbu s thioly. Příkladem je ve vodě rozpustný sulfo-SMCC
(Obrázek 12a) a ve vodě nerozpustný SMCC. Jedná se o činidla využívaná zejména
pro biokonjugace proteinů.
(A)
(B)
Obrázek 12: (a) Strukturní vzorec sulfo-SMCC (b) Schéma oxidace hydroxylových skupin cukrů protilátky třídy
IgG jodistanem sodným na reaktivní aldehydy. Převzato z (Hermanson 2008).
Častým typem reakce je konjugace vysoce reaktivních aldehydů s hydrazidovými
skupinami nebo aminoskupinami. Těmito konjugacemi vznikne hydrazonová vazba
(v případě reakce s hydrazidy) nebo labilní Schiffova báze (v případě reakce s aminy), kterou
je nutné následně stabilizovat reduktivní aminací. Tohoto chemismu se využívá např.
při orientované imobilizace protilátek třídy IgG nebo jiných glykoproteinů. Protilátky IgG
však ve své struktuře nenesou přirozené aldehydové skupiny pro vazbu, proto je nutné
nejdříve oxidovat hydroxylové skupiny glykoproteinů přítomné na druhé konstantní doméně
těžkého řetězce Fc části IgG. Oxidací (nejčastěji jodistanem sodným, NaIO4) dochází
35
k vytvoření aldehydů (Obrázek 12b), které poté reagují s amino- nebo hydrazidovými
skupinami nosiče.
Další atraktivní možností kovalentní imobilizace ligandů jsou tzv. samoskladné
monovrstvy (angl. Self-Assembled Monolayers, SAM). Jedná se o speciální případ spontánní
chemisorpce, kterou lze imobilizovat organické látky, nejčastěji alkanthioly, na povrchy
složené z kovů, oxidů kovů nebo polovodičů (shrnuto v (Chaki a Vijayamohanan 2002, Love
a kol. 2005). Příkladem bioafinitního „samoskládání“ je spontánní vazba thiolovaných
oligonukleotidů na vzácné kovy, nejčastěji zlato nebo platinu (Sakao a kol. 2005, Wong a kol.
2005).
Po konjugaci bioaktivního ligandu s nosičem je nutné neobsazené reaktivní skupiny
nosiče tzv. zablokovat. Důvodem blokace je potlačení nežádoucích nespecifických interakcí
mezi reaktivními skupinami nosiče a analytem nebo balastními látkami přítomnými
v analyzovaném vzorku v průběhu bioafinitní chromatografie. Blokace se provádí zpravidla
organickými látkami inertní povahy, které nesou takovou funkční skupinu, aby mohly
s reaktivní skupinou nosiče reagovat. K blokaci aldehydových nebo karboxylových skupin
nosičů se využívá nejčastěji Trisu, ethanolaminu, k blokaci aminoskupin pak sulfo-NHS
acetátu, anhydridu kys. octové nebo maleinové. Další možností blokace nosičů je pomocí
inertních proteinů (hovězí sérový albumin, kasein, želatina) nebo komplexním materiálem –
např. nízkotučným sušeným mlékem.
36
2.6
Vsádkové a průtokové systémy pro bioafinitní interakce
Techniku bioafinitní chromatografie lze provádět v závislosti na konkrétní aplikaci
v různém uspořádání – vsádkovém i průtokovém, na tradičních nebo alternativních nosičích,
v reakčních objemech v řádu mikrolitrů až po litry. Masivnímu rozšíření této techniky do
průmyslu brání vysoké pořizovací ceny a nižší stabilita bioaktivních ligandů společně s nižší
robustností metody ve srovnání s jinými technikami kapalinové chromatografie (Clonis 2006,
Labrou 2003).
Ve vsádkovém (diskontinuálním) uspořádání (angl. batch) lze pracovat v různých typech
reakčních nádob, oblíbené jsou polypropylenové mikrozkumavky o objemu 1,5 nebo 2 ml.
Jako stacionární fáze lze ve vsádkovém uspořádání použít různé typy nosičů, největší oblibě
se však těší nosiče magnetické, jelikož je při práci s nimi možné eliminovat centrifugační
kroky, práce s nimi je jednoduchá a rychlá (viz kap. 2.3.1). Pro magnetické bioafinitní
separace se využívají různé typy magnetických separátorů speciálně vyrobených
pro manipulaci částic v mikrozkumavkách (Obrázek 13a), mikrotitračních destičkách
(Obrázek 13b), kyvetách, centrifugačních 15 ml nebo až 50 ml zkumavkách. Pro separaci
z větších objemů jsou konstruovány vysokogradientové separátory (angl. High-GradientMagnetic Separators, HGMS). Pro magnetickou separaci buněk byly vyvinuty separátory
pro MACS technologii (Miltenyi Biotec), kde jsou cílové buňky ve směsi označeny
magnetickými nanočásticemi (o velikosti 50 nm) a směs je poté přivedena na kolonu
obsahující ferromagnetický materiál. Kolona je během separace umístěná v magnetickém
separátoru (Obrázek 13c). Označené buňky zůstanou zadrženy v koloně, zbytek směsi projde
kolonou beze změny. Eluce cílových buněk s magnetickými nanočásticemi probíhá vyjmutím
kolony z magnetického separátoru.
S magnetickými nosiči lze manipulovat i opačně – po proběhnutí reakce lze magnetický
nosič odebrat pomocí magnetických per nesoucích komerční název „PickPen“ (Šafařík
a Šafaříková 2004).
Obrázek 13: Příklady vsádkových magnetických separátorů: (a) separátor na 1,5 ml zkumavky (Life
Technologies); (b) separátor na mikrotitrační destičky (Chemicell); (c) MACS separátor (Miltenyi Biotec).
37
Průtokové (kontinuální) uspořádání bioafinitní chromatografie nabízí ve srovnání
se vsádkovým větší různorodost. Tradičně se tato technika provádí v klasickém sloupcovém
uspořádání ve skleněných nebo plastových kolonách nebo mikrokolonách, ve kterých vytváří
nosič (nejčastěji dextran nebo celulóza, viz Tabulka 1) kompaktní lože (angl. packed bed;
Obrázek 14a). Alternativou k tomuto uspořádání se stala fluidní neboli expandovaná
vrstva/lože (angl. fluidized bed) (Obrázek 14b). Vzorek je v tomto případě přiváděn k nosiči
ze spodní části kolony. Nosič je během reakce se vzorkem neustále ve vznosu, jelikož je
vyrovnána gravitační síla nosiče se silovými účinky proudící kapaliny. Ve srovnání
s kompaktním ložem je tak docíleno rychlejšího přestupu hmoty a nižšího rizika ucpání
kolony při aplikaci komplexního vzorku (Roy a Gupta 2006, Spence a Bailon 2000).
Technika fluidního lože byla poté zdokonalena jeho kombinací s magnetickými nosiči, čímž
vznikla metoda magneticky stabilizovaného fluidního lože (angl. Magnetically Stabilized
Fluidized Beds, MSFB; Obrázek 14c), kde je nosič navíc zafixován magnetickými silami
v reakční komoře (Hristov a Fachikov 2007, Webb a kol. 1996).
Obrázek 14: Kolony pro průtokové uspořádání afinitní chromatografie: schéma náplňové kolony s (a)
kompaktním nosičem (upraveno dle Roy a Gupta 2006); (b) s fluidním ložem (upraveno dle Roy a Gupta 2006);
(c) s magneticky stabilizovaným fluidním ložem (C; převzato z Putnam a kol. 2003).
Miniaturizace v průtokovém uspořádání bylo dosaženo vyvinutím mikroprůtokových
systémů (kapilár, čipů), ve kterých lze analyzovat vzorek o objemu jednotek mikrolitrů
až nanolitrů (více v kap. 2.6.1). Nespornou výhodou všech průtokových systémů je možnost
jejich on-line spojení s další technikou (nejčastěji detekční - spektrofotometrie, fluorescence,
konduktometrie, apod.), nevýhodou je pak ve srovnání se vsádkovými technikami náročnější
provedení a často i potřebná instrumentace (pumpy, regulátory průtoků, apod.).
38
2.6.1 Bioafinitní nosiče v mikrofluidních systémech
Trendem v bioafinitní chromatografii se stejně jako v celé bioanalytické chemii stala
automatizace a miniaturizace (Ríos a kol. 2006). Smysl těchto trendů je zřejmý – snížení
nákladů na analýzu díky snížení objemů používaných reagencií, snížení objemu
analyzovaného vzorku (krve, plazmy, séra, mozkomíšního moku), možnost rychlé a paralelní
analýzy více vzorků (tzv. „high-throughput), kompatibilita s detekčními systémy, rychlejší
reakční časy díky rychlé difúzi,
v nejvyspělejších
zemích
světa
do
rozšíření technologií ze speciálních laboratoří
přenosných
nízkonákladových
systémů
apod.
Miniaturizace a automatizace se stala univerzálním „všelékem“ a ovládla celé odvětví
bioanalýzy, přestože ne vždy je zcela opodstatněná (de Castro a Capote 2008). Většina
vyvíjených mikro- a nanosystémů funguje zatím na ideálních vzorcích (Crevillén a kol. 2007).
Mikrofluidní analytické a separační systémy, neboli mikrofluidní čipy, jsou průtoková
zařízení pracující s kapalinami v kanálcích a rezervoárech o velmi malých rozměrech –
desítkách až stovkách µm (zpravidla do 500 µm). Pomocí takových čipů lze velice přesně
pracovat s kapalinami o objemu několika nanolitrů až attolitrů (Whitesides 2006). Proudění
kapaliny bývá z důvodu nízkých Reynoldsových čísel laminární, čili neturbulentní,
a k míchání dochází pouze vlivem difuze. Rychlosti průtoků dosahují nejčastěji několika
jednotek mikrolitrů za minutu. Z těchto důvodů je možné velmi dobře předvídat pohyb
kapaliny i difuzi látek v mikrofluidním čipu a pomocí speciálních softwarů tyto jevy
počítačově simulovat (softwary COMSOL, FEMM, atd.). Rozměry typického mikrofluidního
kanálku pro elektroforetickou separaci jsou (š x v x d): 50 µm x 15 µm x 5 cm; vnitřní objem
kanálku tak činí 37,5 nl (Nge a kol. 2013). Pracujeme-li pak s čipy, které mají alespoň jeden
rozměr do 100 nm (Abgrall a Nguyen 2008), nehovoříme již o systémech mikrofluidních,
ale nanofluidních. Vrcholem těchto fluidních systémů je tzv. laboratoř na čipu (Lab-on-aChip, LoC), zařízení o velikosti několika čtverečních centimetrů integrující všechny kroky
analýzy od zpracování komplexního vzorku až po detekci analytu za současné maximální
míry automatizace (Reyes a kol. 2002) (Obrázek 15). Do LoC lze včlenit takové procesy jako
například sekvenaci (Paegel a kol. 2003) a PCR nukleových kyselin (Khandurina a kol. 2000),
kapilární elektroforézu (Fang a kol. 2002), 2D-elektroforézu (Chen a Fan 2009), kapalinovou
chromatografii (Lazar a kol. 2006), jejich kombinace a mnoho dalších technik.
39
Obrázek 15: Schématické znázornění Lab-on-a-Chip systému.
Princip bioafinitní chromatografie byl ve spojení s mikrofluidikou využit zejména
pro různé typy imunoanalytických metod (Hayes a kol. 2001, Herrmann a kol. 2007),
separace proteinů (Otieno a kol. 2014), virů (Zhang a kol. 2013) a prokaryotických (Guan
a kol. 2010) nebo eukaryotických buněk (Furdui a Harrison 2004, Saliba a kol. 2010).
Mikrofluidní systémy bývají rovněž často využívány pro extrakci a purifikace DNA.
Techniky její čipové izolace však bývají nejčastěji založeny na principu extrakce na pevné
fázi (Wen a kol. 2008), nejedná se tedy o separaci založenou na biospecifických interakcích,
jako je tomu u bioafinitních separací.
Historicky první mikrofluidní čipy byly vyrobeny z anorganických materiálů – nejdříve
ze silikonu, později i ze skla. Během posledních 15 let získaly v mikrofluidice velkou
pozornost relativně levné organické polymery, elastomery (polydimethylsiloxan, PDMS)
a termoplasty (polymethylmethakrylát, PMMA; kopolymer cyklického olefinu, COC). Velké
oblibě se rovněž těší celulózové čipy, čili papírové, a to zvláště díky své extrémně nízké
výrobní ceně, nenákladné likvidaci, biokompatibilitě, snadné funkcionalizaci a možnosti
vytvoření vzoru (tzv. „patternu“) čipu pomocí vosku. V dnešní době je v akademické sféře
nejpoužívanějším materiálem pro výrobu mikrofluidních čipů PDMS (shrnuto v Nge a kol.
2013, Ren a kol. 2014). Příklady čipů vyrobených z různých materiálů jsou zobrazeny
na Obrázku 16. Jednotlivé materiály se vzájemně odlišují způsobem výroby i fyzikálněchemickými vlastnostmi: ohebností, propustností pro vzduch a další plyny, elektrickou
vodivostí,
povrchovým
nábojem
(elektroendoosmotický
tok,
EOF),
kompatibilitou
s používanými roztoky (zvláště s organickými rozpouštědly), biokompatibilitou nebo
optickou transparentností (Shadpour a kol. 2006). Výrazný rozvoj mikrofluidiky v posledních
20 letech byl přirozeně doprovázen i množstvím společností nabízejícími ve svém portfoliu
výrobu mikrofluidních čipů nebo také hotové přístroje využívající mikrofluidní technologie.
Mezi nejznámější výrobce dnes patří například Abbott, Agilent, Caliper, Dolomite,
Micralyne, Microfluidic Chip Shop, Micrux Technologies a Waters.
40
Obrázek 16: Příklad mikrofluidních čipů z různých materiálů: (a) polystyren (Young a kol. 2011), (b) papír
(Martinez a kol. 2010), (c) kopolymer cyklického olefinu; COC (Miserere a kol. 2012).
Přizpůsobení techniky bioafinitní chromatografie do miniaturizovaného formátu čipů
vyžaduje ukotvení biospecifických ligandů do nitra mikrofluidních systémů. Toho lze
dosáhnout dvěma postupy. Prvním z nich je biofunkcionalizace vnitřní stěny kanálků (Lahann
a kol. 2003), které mohou být navíc tzv. nanostrukturované, čímž je dosaženo jejich vyššího
specifického povrchu pro vazbu ligandů (Malhotra a kol. 2012). Druhou možností je vložení
stacionárních fází s již imobilizovanými ligandy do soustavy kanálků nebo reakčních cel.
Můžeme se setkat s monolitickými fázemi (Celebi a kol. 2012, Ro a kol. 2006) nebo častěji
se sférickými nemagnetickými nebo magnetickými částicemi (Gijs a kol. 2010, Gijs 2004,
Pamme 2012). Jsou-li částice v čipech pouze unášeny tokem proudícího vzorku, je
pravděpodobnost interakce mezi ligandem na nosiči a analytem ze vzorku výrazně snížená.
Z tohoto důvodu se využívá zafixování částic v reakčních komůrkách – v případě
nemagnetických částic zpravidla mechanicky, tj. pomocí filtrů (Moorthy a kol. 2004),
chemicky (Gumpenberger a kol. 2006, Liuni a kol. 2010) nebo například kombinací afinitních
a fyzikálních interakcí (Malmstadt a kol. 2003). Při použití částic magnetických se přirozeně
využívá možnosti jejich jednoduché a efektivní fixace v čipu pomocí externího magnetického
pole.
K zafixování magnetických částic v požadované oblasti čipu se používají silné
permanentní neodymové magnety (neodym-železo-bor, NdFeB) (Otieno a kol. 2014,
Slováková a kol. 2005) nebo elektro- a mikroelektromagnety (cívky) (Choi a kol. 2002).
Magnety bývají v mikrofluidních čipech umísťovány externě - magnetické síly působící
na magnetický nosič uvnitř soustavy kanálků jsou tak nezávislé na pH, iontové síle a teplotě
okolní kapaliny. Výhodou permanentních magnetů je jejich jednoduché použití bez nutnosti
připojení ke zdroji elektrického napětí, jejich dostupnost v mnoha velikostech i tvarech
a vysoká magnetická indukce (v řádku stovek mT až k 1 T). Naproti tomu magnetické pole
generované elektromagnety dosahuje nižších hodnost magnetické indukce a dochází
41
k výraznému zahřívání systémů umístěných uvnitř magnetického pole. Naopak mezi výhody
elektromagnetů patří možnost přesného nastavení intenzity elektrického pole, vytvoření
požadovaného gradientu, integrace elektrod do čipů a podobně. Další velkou výhodou je
možnost magnetické pole zapnout a vypnout bez nutnosti přikládání/odstraňování magnetu,
jako je tomu v případě permanentních magnetů (shrnuto v (Cetin a kol. 2014, Pamme 2006).
Zvolením vhodné geometrie čipu, vzájemné pozice i síly magnetů a umístěním
magnetických „kotev“ pak mohou částice nabývat v čipech mnoha uspořádání. Příkladem je
čip s magnetickými částicemi, které vytvořily nepohyblivou zátku (angl. plug) dobře
prostupnou
pro
analyzovaný
vzorek
(Obrázek
17a)
(Slováková
a
kol.
2005)
nebo samoskladné (angl. self-assembled) řetízky na předem vytvořených magnetických
kotvách (Obrázek 17b) (Saliba a kol. 2010). Novinkou je pak mikrofluidní čip pracující
na principu MSFB, ve kterém jsou magnetické částice neustále ve vznosu a navíc cirkulují,
čímž je dosaženo jejich maximálního možného kontaktu s molekulami analytu (Obrázek 17c)
(Viovy a kol. 2014).
Obrázek 17: Příklady mikrofluidních čipů s magnetickými částicemi. (a) mikrokanálek s magnetickou zátkou
(Slováková a kol. 2005); (b) samoskladné řetízky magnetických částic na prefabrikovaných magnetických
kotvách (Saliba a kol. 2010); (c) mikrofluidní magneticky stabilizované fluidní lože (Pereiro a kol. 2014).
Mezi největší výhodu používání magnetických částic v mikrofluidice patří snadná
manipulace. Částice lze v mikrofluidních systémech cíleně a přesně ovládat - je možné je
zachytit, přepravovat je z místa na místo, promíchat je (Gijs a kol. 2010). V průtoku je lze
separovat
ve
speciálně
větvených
kanálcích
od
balastního
materiálu
pomocí
tzv. magnetoforézy (viz Obrázek 18a) (Lee a kol. 2011). Lze je také využít jako nástroj
k dalším potřebným krokům – k míchání okolní kapaliny, k přenosu analytů navázaných
na jejich povrchu z jednoho prostředí do druhého, ke značení analytů nebo k jejich detekci
a podobně (shrnuto ve van Reenen a kol. 2014). Použití částic v mikrofluidních systémech je
42
výhodné i z důvodu vysoké pravděpodobnosti setkání ligandu navázaného na částicích
s cílovým analytem, a tedy i vyšší účinnosti separace. Vyšší pravděpodobnost setkání je
způsobena malými reakčními objemy, ve kterých separace probíhá, což je spojeno s rychlou
difuzí látek a s minimálními vzdálenostmi, které musí reakční partneři urazit. Naopak mezi
nevýhodu používání magnetických částic v mikrofluidním uspořádání patří velmi vysoké
nároky kladené na jejich kvalitu. Ty bývají zpravidla vyšší než požadavky na částice
pro vsádkové uspořádání. Aby bylo možné částice cíleně a kontrolovaně ovládat, je nutné,
aby navzájem neagregovaly, aby neadsorbovaly na stěny čipů a aby měly povrch ošetřený tak,
aby míra nespecifické adsorpce proteinů, buněk nebo dalších složek komplexního
biologického materiálu byla minimální. Povrch částic je tak často nutné blokovat a povrchově
modifikovat.
Obrázek 18: (a) Mikrofluidní průtoková magnetoforetická separace hemoglobinu (Hb) na PDMS čipu pomocí
magnetických silika částic (SMNC) a permanentního magnetu (Lee a kol. 2011); (b) Manipulace s magnetickými
částicemi v kapce pomocí permanentního magnetu umístěného pod čipem (Shikida a kol. 2004); (c) schématické
znázornění protokolu pro heterogenní imunoanalytickou reakci na DMF platformě: (1) injekování mikrokapky
(1 µL) s vyšetřovaným analytem a mikrokapky (3 µL) s primárními Ab na magnetických částicích, se sekundární
Ab značenou alkalickou fosfatázou a s blokačními proteiny mezi hydrofobní vrstvy skla a obklopení kapek
silikonovým olejem, (2) smíchání kapek metodou „elektrosmáčení“ a promíchání pomocí permanentního
magnetu umístěného pod čipem, vznik imunokomplexu, (3) fixace imunokomplexu magnetem a (4) odmytí
nenavázaných molekul, (5) promytí imunokomplexu a smíchání s 1 µL chemiluminiscenčního substrátu (Sista
a kol. 2008).
43
Mezi nové směry mikrofluidiky patří tzv. digitální mikrofluidika (angl. digital
microfluidics, DMF). Jedná se o techniku založenou na manipulaci s „mikrokapkami“
o objemu pikolitrů až nanolitrů, kde každá taková kapka slouží jako samostatný mikroreaktor.
Kapky se jednotlivě pohybují v hydrofobní kapalině v definovaných mikrokanálcích (poté
se techniky označují častěji jako tzv. „droplet microfluidics“) nebo častěji je směr jejich
pohybu řízen integrovanými elektrodami, které umožňují jejich ovládání – promíchání,
rozdělení i opětovné sloučení. Pohyb mikrokapek podél elektrod funguje nejčastěji
na principu tzv. „elektrosmáčení“ (angl. electrowetting on dielectrics) (shrnuto v Choi a kol.
2012, Kokalj a kol. 2015). Jelikož mohou jednotlivé mikrokapky přenášet i částicový
materiál, nabízí se tak jejich spojení s magnetickými částicemi, které navíc zvyšují
kontrolovatelnost pohybu kapek pomocí magnetických sil a mohou sloužit jako pevná fáze
přenášející mezi jednotlivými kapkami analyty/reagencie nebo jako optický indikátor
(viz Obrázky 18b a 18c). Za pionýrskou práci je v této oblasti považován studie Ulrike
Lehmannové z r. 2006, která publikovala práci o extrakci a purifikaci DNA na magnetických
silika částicích v DMF čipu (Lehmann a kol. 2006).
2.6.2
Specifika mikrofluidních systémů pro buněčné aplikace
Mikrofluidní „boom“ posledního desetiletí zasáhl kromě jiných i celé odvětví
proteomiky, buněčné biologie a mikrobiologie. Pro oblast mikrofluidních systémů
zabývajících se kultivací buněk na čipu, jejich manipulací, tříděním a analýzou se vžil název
„cellomics“ (Andersson a van den Berg 2003). Většina publikací pojednávajících
o mikrofluidní magnetické separaci buněk se zabývá záchytem leukocytů, buněk
asociovaných s rakovinou (jako např. cirkulující nádorové buňky – angl. circulating tumor
cells, CTC) nebo bakterií, a to zpravidla z plné krve nebo séra. Magnetické částice lze
v mikrofluidních systémech pro buněčné aplikace využít buď jako imunoafinitní nosič
pro prekoncentraci a purifikaci buněk nebo jako magnetické značky. Buňky mohou být
magneticky označeny pomocí magnetických částic navázaných na jejich povrchu nebo mohou
být buňkou pohlceny, fagocytovány. Manipulujeme-li s buňkami v mikrofluidních systémech
a chceme-li zachovat jejich viabilitu (a tudíž i exprimaci a stérickou přístupnost povrchových
antigenů), je potřeba ověřit v prvé řadě biokompatibilitu materiálu čipu, všech používaných
pufrů a reagencií. Neméně podstatné je ověřit odolnost používaných buněk vůči tlakům
a teplotám, se kterými buňky při průchodu mikrofluidními systémy přijdou do kontaktu. Lyze
buněk v mikrofluidních systémech může znamenat selhání celé analýzy – může dojít
k uvolnění buněčného obsahu včetně plazmatických proteinů a DNA, což může vést
44
ke snížené průchodnosti až k totálnímu ucpání mikrofluidního systému. Z tohoto důvodu je
výhodnější použití bakteriálních buněk, které mají na svém povrchu buněčnou stěnu. Ta bývá
odolnější než vnější struktury eukaryotických buněk, bakteriím dodává kromě pevnosti
i elasticitu a flexibilitu. Bakteriální buňky mívají rovněž menší rozměry než běžné
eukaryotické buňky; v případě jejich lyze tak většinou k ucpávání kanálků nedochází. Dalším
problematickým aspektem mikrofluidních separací buněk je jejich detekce. Eluce viabilní
buňky, která je imunoafinitně navázaná na magnetický nosič, je značně náročná. Běžná eluční
činidla používaná pro eluci ostatních bioanalytů (proteiny, peptidy) jsou pro buňku zpravidla
neslučitelná se životem (kyselá nebo zásaditá eluce, eluce změnou iontové síly pufru, teploty,
vlivem přídavku detergentů). Slibnou variantou je kompetitivní eluce nadbytkem volné
protilátky, což je v případě specifických protilátek možnost účinná, ale také značně finančně
nákladná. Z tohoto důvodu se vyvíjí např. syntetické peptidy soutěžící o buněčný receptor
s protilátkou imunokomplexu (např. peptid PR34+ Stem Cell Releasing Agent pro eluci
CD34-pozitivních buněk, Baxter). Další možností je použití proteolytických enzymů
(např. chymopapain) narušujících povrchové znaky CD buněk nebo použití polyklonálních
protilátek reagujících s Fab fragmentem protilátky imunokomplexu (komerčně dostupné proti
vybraným CD znakům pod názvem DETACHaBEAD®, Life Technologies) (shrnuto
v Šafařík a Šafaříková 1999). V současné době však není dostupné žádné univerzální
a robustní řešení pro šetrnou a účinnou eluci buněk. Detekce buněk po jejich mikrofluidním
záchytu tak bývá založena na tradičních optických (mikroskopických) metodách, na použití
fluorescenčních značek v kombinaci s fluorimetry nebo příslušnými mikroskopickými
technikami, na molekulárně-biologických (PCR a její varianty) a imunoanalytických
metodách (ELISA). V případě buněk bakteriálních lze buňky po jejich záchytu i vyočkovat
na živná média a vykultivovat pomocí tradičních mikrobiologických metod.
45
3 SEZNAM LITERATURY
Abgrall, P. a Nguyen, N.T., 2008. Nanofluidic devices and their applications. Anal. Chem., 80
(7), 2326-2341.
Al-Warhi, T.I., Al-Hazimi, H.M.A. a El-Faham, A., 2012. Recent development in peptide
coupling reagents. J. Saudi Chem. Soc., 16 (2), 97-116.
Amirshakhi, N., Alyautdin, R.N., Orlov, A.P., Poloznikov, A.A. a Kuznetsov, D.A., 2008.
A fullerene C-60-based ligand in a stationary phase for affine chromatography of membrane
porphyrin-binding proteins. Russ. J. Phys. Chem. A, 82 (11), 1952-1957.
Andersson, H. a van den Berg, A., 2003. Microfluidic devices for cellomics: a review. Sens.
Actuator B-Chem., 92 (3), 315-325.
Andrä, W., Häfeli, U., Hergt, R. a Misri, R., 2007. Application of magnetic particles
in medicine and biology. In: Handbook of magnetism and advanced magnetic materials. John
Wiley & Sons, Ltd ISBN 9780470022184.
Assali, M., Pernia Leal, M., Fernandez, I. a Khiar, N., 2013. Synthesis and non-covalent
functionalization of carbon nanotubes rings: new nanomaterials with lectin affinity.
Nanotechnology, 24 (8), 085604.
Audonnet, V., Malaquin, L. a Viovy, J., 2011. Polymeric coatings on micro- and nanometric
particles for bioapplications. Bioanal. Rev., 3 (2), 41-66.
Axen, R., Porath, J. a Ernback, S., 1967. Chemical coupling of peptides and proteins
to polysaccharides by means of cyanogen halides. Nature, 214 (5095), 1302.
Basinska, T., 2005. Hydrophilic core-shell microspheres: A suitable support for controlled
attachment of proteins and biomedical diagnostics. Macromol. Biosci., 5 (12),1145-1168.
Batista-Viera, F., Janson, J. a Carlsson, J., 2011. Affinity chromatography. In: Protein
purification. John Wiley & Sons, Ltd., pp. 221-258 ISBN 9780470939932.
Baumgarten, P., 1971. Electrostatic spinning of acrylic microfibers. J. Colloid Interface Sci.,
36 (1),71.
Begin-Colin, S. a Felder-Flesch, D., 2012. Functionalisation of magnetic iron oxide
nanoparticles. In: N.T. Thanh ed., Magnetic nanoparticles: from fabrication to clinical
applications. 1st ed. Boca Raton: CRC Press, pp. 151-191 ISBN 978-1-4398-6932-1.
Betancourt, T., Byrne, J.D., Sunaryo, N., Crowder, S.W., Kadapakkam, M., Patel, S.,
Casciato, S. a Brannon-Peppas, L., 2009. PEGylation strategies for active targeting
of PLA/PLGA nanoparticles. J. Biomed. Mater. Res. Part A, 91A (1),263-276.
Bhardwaj, N. a Kundu, S.C., 2010. Electrospinning: A fascinating fiber fabrication technique.
Biotechnol. Adv., 28 (3), 325-347.
Bhattarai, N., Edmondson, D., Veiseh, O., Matsen, F. a Zhang, M., 2005. Electrospun
chitosan-based nanofibers and their cellular compatibility. Biomaterials, 26 (31), 6176-6184.
Bílková, Z., 2014. Nové formáty antigen-vázajících molekul. Chemické Listy, 108, 198-204.
Binz, H., Amstutz, P. a Pluckthun, A., 2005. Engineering novel binding proteins
from nonimmunoglobulin domains. Nat. Biotechnol., 23 (10), 1257-1268.
46
Blakemore, R., 1975. Magnetotactic bacteria. Science, 190 (4212), 377-379.
Bognitzki, M., Hou, H., Ishaque, M., Frese, T., Hellwig, M., Schwarte, C., Schaper, A.,
Wendorff, J. a Greiner, A., 2000. Polymer, metal, and hybrid nano- and mesotubes by coating
degradable polymer template fibers (TUFT process). Adv Mater, 12 (9), 637.
Bouriotis, V. a Dean, P.D.G., 1981. Use of triazine dyes in the affinity chromatographic
purification of alkaline phosphatase from calf intestine. JoJ. Chromatogr. A, 206 (3), 521530.
Brena, B.M. and Batista-Viera, F., 2006. Immobilization of enzymes. In: J.M. Guisán ed.,
Immobilization of enzymes and cells., 03/15, pp. 15-30.
Briones, C. a Moreno, M., 2012. Applications of peptide nucleic acids (PNAs) and locked
nucleic acids (LNAs) in biosensor development. Anal. Bioanal. Chem., 402 (10),3071-3089.
Brown, L., Koerner, T., Horton, J. a Oleschuk, R., 2006. Fabrication and characterization
of poly(methylmethacrylate) microfluidic devices bonded using surface modifications
and solvents. Lab Chip, 6 (1),66-73.
Brunner, J., 1993. New photolabeling and cross-linking methods. Annu.Rev.Biochem., 62,
483-514.
Callahan, L.A.S., Xie, S., Barker, I.A., Zheng, J., Reneker, D.H., Dove, A.P. a Becker, M.L.,
2013. Directed differentiation and neurite extension of mouse embryonic stem cell on aligned
poly(lactide) nanofibers functionalized with YIGSR peptide. Biomaterials, 34 (36), 90899095.
Calleri, E., Ambrosini, S., Temporini, C. a Massolini, G., 2012. New monolithic
chromatographic supports for macromolecules immobilization: Challenges and opportunities.
J. Pharm. Biomed. Anal., 69 (0), 64-76.
Cao, L. a Schmid, R.D., 2006. Carrier-bound immobilized enzymes: principles, application
and design. 1st ed. Weinhein: Wiley-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA.
Carredano, E. a Baumann, H., 2011. Affinity ligands from chemical combinatorial libraries.
In: J. Janson ed., protein purification: principles, high resolution methods and applications,
Third Edition. Hoboken, New Jersey, US: John Wiley & Sons, Inc., pp. 259-267 ISBN
9780470939932.
Celebi, B., Bayraktar, A. a Tuncel, A., 2012. Synthesis of a monolithic, micro-immobilised
enzyme reactor via click-chemistry. Anal. Bioanal. Chem., 403 (9), 2655-2663.
Cetin, B., Ozer, M.B. a Solmaz, M.E., 2014. Microfluidic bio-particle manipulation
for biotechnology. Biochem. Eng. J., 92 , 63-82.
Chaki, N. a Vijayamohanan, K., 2002. Self-assembled monolayers as a tunable platform
for biosensor applications. Biosens. Bioelectron., 17 (1-2), 1-12.
Chan, C., Ko, T. a Hiraoka, H., 1996. Polymer surface modification by plasmas and photons.
Surf. Sci. Rep., 24 (1-2), 3-54.
Chandrasekaran, A.R., Venugopal, J., Sundarrajan, S. a Ramakrishna, S., 2011. Fabrication
of a nanofibrous scaffold with improved bioactivity for culture of human dermal fibroblasts
for skin regeneration. Biomed.Mater., 6 (1), 015001.
47
Che, A., Huang, X. a Xu, Z., 2011. Polyacrylonitrile-based nanofibrous membrane
with glycosylated surface for lectin affinity adsorption. J. Membr. Sci., 366 (1-2), 272-277.
Che, G., Lakshmi, B., Martin, C., Fisher, E. a Ruoff, R., 1998. Chemical vapor deposition
based synthesis of carbon nanotubes and nanofibers using a template method. Chem. Mat., 10
(1), 260-267.
Chen, H. a Fan, Z.H., 2009. Two-dimensional protein separation in microfluidic devices.
Electrophoresis, 30 (5), 758-765.
Chernukhin, I., Kang, S.Y., Brown, S., Gretton, S., Mendez-Catala, C.F., Cowieson, D.
a Klenova, E., 2011. BioVyon Protein A, an alternative solid-phase affinity matrix
for chromatin immunoprecipitation. Anal. Biochem., 412 (2), 183-188.
Choi, J., Oh, K., Thomas, J., Heineman, W., Halsall, H., Nevin, J., Helmicki, A., Henderson,
H. a Ahn, C., 2002. An integrated microfluidic biochemical detection system for protein
analysis with magnetic bead-based sampling capabilities. Lab Chip, 2 (1),27-30.
Choi, K., Ng, A.H.C., Fobel, R. a Wheeler, A.R., 2012. Digital Microfluidics. Annu. Rev.
Anal. Chem, 5 , 413-440.
Chu, B. a Orgel, L., 1988. Ligation of oligonucleotides to nucleic-acids or proteins via
disulfide bonds. Nucleic Acids Res., 16 (9), 3671-3691.
Clonis, Y.D., Labrou, N.E., Kotsira, V.P., Mazitsos, C., Melissis, S. a Gogolas, G., 2000.
Biomimetic dyes as affinity chromatography tools in enzyme purification. J. Chromatogr. A,
891 (1), 33-44.
Clonis, Y., 2006. Affinity chromatography matures as bioinformatic and combinatorial tools
develop. J. Chromatogr.A, 1101 (1-2), 1-24.
Corman, M.E., Ozturk, N., Tuzmen, N., Akgol, S. a Denizli, A., 2010. Magnetic polymeric
nanospheres as an immobilized metal affinity chromatography (IMAC) support for catalase.
Biochem. Eng. J., 49 (2), 159-164.
Costioli, M., Fisch, I., Garret-Flaudy, F., Hilbrig, F. a Freitag, R., 2003. DNA purification
by triple-helix affinity precipitation. Biotechnol. Bioeng., 81 (5), 535-545.
Crevillén, A.G., Hervás, M., López, M.A., González, M.C. a Escarpa, A., 2007. Real sample
analysis on microfluidic devices. Talanta, 74 (3), 342-357.
Cuatrecasas, P., Wilchek, M. a Anfinsen, C., 1968. Selective enzyme purification by affinity
chromatography. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 61 (2), 636.
Cwirla, S., Peters, E., Barrett, R. a Dower, W., 1990. Peptides on phage - a vast library
of peptides for identifying ligands. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 87 (16), 6378-6382.
Davies, C., 2013. Chapter 2.1 - principles of competitive and immunometric assays (Including
ELISA)1. In: D. Wild ed., The Immunoassay Handbook (Fourth Edition). Oxford: Elsevier,
pp. 29-59 ISBN 9780080970370.
Davies, O.R., Head, L., Armitage, D., Pearson, E.A., Davies, M.C., Marlow, M. a Stolnik, S.,
2008. Surface modification of microspheres with steric stabilizing and cationic polymers
for gene delivery. Langmuir, 24 (14), 7138-7146.
48
de Castro, M.D.L. a Capote, F.P., 2008. Miniaturisation of analytical steps: necessity
and snobbism. Anal. Bioanal. Chem., 390 (1), 67-69.
Dubsky, M., Kubinova, S., Sirc, J., Voska, L., Zajicek, R., Zajicova, A., Lesny, P., Jirkovska,
A., Michalek, J., Munzarova, M., Holan, V. a Sykova, E., 2012. Nanofibers prepared
by needleless electrospinning technology as scaffolds for wound healing. J. Mater. Sci.Mater. Med., 23 (4), 931-941.
Duguet, E., Delville M.-H. a Mornet S., 2012. Synthesis and characterisation of iron oxide
ferrite nanoparticles and ferrite-based aqueous fluids. In: N.T. Thanh ed., magnetic
nanoparticles: from fabrication to clinical applications.CRC Press,02/01; 2014/07, pp. 47-72
ISBN 978-1-4398-6932-1.
El-Faham, A. a Albericio, F., 2011. Peptide coupling reagents, more than a letter soup. Chem.
Rev., 111 (11), 6557-6602.
Ellington, A. a Szostak, J., 1992. Selection invitro of single-stranded-dna molecules that fold
into specific ligand-binding structures. Nature, 355 (6363), 850-852.
Elmore, W.C., 1938. Ferromagnetic colloid for studying magnetic structures. Phys. Rev., 54
(4), 309-310.
Famulok, M., 1999. Oligonucleotide aptamers that recognize small molecules. Curr. Opin.
Struct. Biol., 9 (3), 324-329.
Fan, Z., Mangru, S., Granzow, R., Heaney, P., Ho, W., Dong, Q. a Kumar, R., 1999. Dynamic
DNA hybridization on a chip using paramagnetic beads. Anal. Chem., 71 (21), 4851-4859.
Fang, Q., Xu, G. a Fang, Z., 2002. A high-throughput continuous sample introduction
interface for microfluidic chip-based capillary electrophoresis systems. Anal. Chem., 74 (6),
1223-1231.
Flesch, C., Delaite, C., Dumas, P., Bourgeat-Lami, E. a Duguet, E., 2004. Grafting
of poly(epsilon-caprolactone) onto maghemite nanoparticles. J. Polym. Sci. Pol. Chem. 42
(23), 6011-6020.
Fontanals, N., Cormack, P.A.G. a Sherrington, D.C., 2008. Hypercrosslinked polymer
microspheres with weak anion-exchange character Preparation of the microspheres and their
applications in pH-tuneable, selective extractions of analytes from complex environmental
samples. J. Chromatogr. A, 1215 (1-2), 21-29.
Formhals, A., 1934. Process and apparatus for preparing artificial threads. A. Formhals
a Schreiber Gastell R. eds., patent US 1975504 A. 02/10/1934.
Forward, K.M., Flores, A. a Rutledge, G.C., 2013. Production of core/shell fibers
by electrospinning from a free surface. Chem. Eng. Sci., 104 , 250-259.
Furdui, V. a Harrison, D., 2004. Immunomagnetic T cell capture from blood for PCR analysis
using microfluidic systems. Lab Chip, 4 (6), 614-618.
Gbadamosi, J.K., Hunter, A.C. a Moghimi, S.M., 2002. PEGylation of microspheres
generates a heterogeneous population of particles with differential surface characteristics
and biological performance. FEBS Lett., 532 (3), 338-344.
49
Ghosh, S.S., Kao, P.M., McCue, A.W. a Chappelle, H.L., 1990. Use of maleimide-thiol
coupling chemistry for efficient syntheses of oligonucleotide-enzyme conjugate hybridization
probes. Bioconjug. Chem., 1 (1), 71-76.
Gijs, M.A.M., Lacharme, F. a Lehmann, U., 2010. Microfluidic applications of magnetic
particles for biological analysis and catalysis. Chem. Rev., 110 (3), 1518-1563.
Gijs, M.A., 2004. Magnetic bead handling on-chip: new opportunities for analytical
applications. Microfluid. Nanofluid., 1 (1), 22-40.
Goddard, J.M. a Hotchkiss, J.H., 2007. Polymer surface modification for the attachment
of bioactive compounds. Prog. Polym. Sci., 32 (7), 698-725.
Gong, P. and Grainger, D.W., 2007. Nonfouling surfaces. In: J.B. Rampal ed., methods
in molecular biology, vol. 381: Microarrays, 2nd Edition: vol. 1: Synthesis Methods.2nd ed.
Totowa, New Jersey: Humana Press, pp. 59-92 ISBN 978-1-59745-303-5.
Grama, S., Plichta, Z., Trchová, M., Kovářová, J., Beneš, M. a Horák, D., 2014.
Monodisperse macroporous poly(glycidyl methacrylate) microspheres coated with silica:
Design, preparation and characterization. React Funct Polym, 77 (0), 11-17.
Gu, S., Shiratori, T. a Konno, M., 2003. Synthesis of monodisperse, magnetic latex particles
with polystyrene core. Colloid Polym. Sci., 281 (11), 1076-1081.
Guan, X., Zhang, H., Bi, Y., Zhang, L. a Hao, D., 2010. Rapid detection of pathogens using
antibody-coated
microbeads
with
bioluminescence
in
microfluidic
chips.
Biomed.Microdevices, 12 (4), 683-691.
Gumpenberger, T., Sato, T., Narazaki, A., Kawaguchi, Y., Kurosaki, R. a Niino, H., 2006.
Fabrication and characterisation of a microfluidic device for bead-array analysis
by the LIBWE method. J. Laser Micro Nanoeng., 1 (3), 201-206.
Gurd, J. a Mahler, H., 1974. Fractionation of synaptic plasma-membrane glycoproteins
by lectin affinity chromatography. Biochemistry, 13 (25), 5193-5198.
Guttman, A. a Cooke, N., 1991. Capillary gel affinity electrophoresis of DNA fragments.
Anal. Chem., 63 (18), 2038-2042.
Haginaka, J., 2008. Monodispersed, molecularly imprinted polymers as affinity-based
chromatography media. J. Chromatogr. A, 866 (1–2), 3-13.
Hajdu, A., Tombacz, E., Illes, E., Bica, D. a Vekas, L., 2008. Magnetite nanoparticles
stabilized under physiological conditions for biomedical application. Colloids for Nanoand Biotechnology, 135, 29-37.
Halliwell, C. a Cass, A., 2001. A factorial analysis of silanization conditions
for the immobilization of oligonucleotides on glass surfaces. Anal. Chem., 73 (11), 24762483.
Hanes, J. a Pluckthun, A., 1997. In vitro selection and evolution of functional proteins
by using ribosome display. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 94 (10), 4937-4942.
Hartgerink, J., Beniash, E. a Stupp, S., 2001. Self-assembly and mineralization of peptideamphiphile nanofibers. Science, 294 (5547), 1684-1688.
50
Hayes, M., Polson, N., Phayre, A. a Garcia, A., 2001. Flow-based microimmunoassay. Anal.
Chem., 73 (24), 5896-5902.
He, J., Wu, Y. a Zuo, W., 2005. Critical length of straight jet in electrospinning. Polymer, 46
(26), 12637-12640.
He, J., 2013. Chapter 5.1 - Practical Guide to ELISA Development. In: D. Wild ed.,
The Immunoassay Handbook (Fourth Edition). Oxford: Elsevier, pp. 381-393 ISBN
9780080970370.
Helppolainen, S.H., Nurminen, K.P., Maatta, J.A.E., Halling, K.K., Slotte, J.P., Huhtala, T.,
Liimatainen, T., Yla-Herttuala, S., Airenne, K.J., Narvanen, A., Janis, J., Vainiotalo, P.,
Valjakka, J., Kulomaa, M.S. a Nordlund, H.R., 2007. Rhizavidin from Rhizohium etli:
the first natural dimer in the avidin protein family. Biochem. J., 405, 397-405.
Hermanson, G.T., 2013. Chapter 11 - (Strept)avidin–Biotin Systems. In: G.T. Hermanson ed.,
Bioconjugate Techniques (Third edition). Boston: Academic Press, pp. 465-505 ISBN
9780123822390.
Hermanson, G.T., 2008. Bioconjugate techniques. 2nd ed. Amsterdam: Academic Press
Books. ISBN 0123705010.
Hermanson, G.T., Mallia, K.,A and Smith, P.,K., 1992. Immobilized affinity ligand
techniques. San Diego: Academic Press ISBN 0123423309.
Herrmann, M., Roy, E., Veres, T. a Tabrizian, M., 2007. Microfluidic ELISA on nonpassivated PDMS chip using magnetic bead transfer inside dual networks of channels. Lab
Chip, 7 (11), 1546-1552.
Hilbrig, F., Stocker, G., Schlappi, J., Kocher, H. a Freitag, R., 2006. Utilization of group
specific ligands in the downstream processing of proteins by affinity precipitation. Food
Bioprod.Process., 84 (C1), 28-36.
Hoare, D.G. a Koshland Jr., D.E., 1966. A procedure for the selective modification
of carboxyl groups in proteins. J. Am. Chem. Soc., 88 (9), 2057-2058.
Horák, D., Karpíšek, M., Turková, J. a Beneš, M., 1999. Hydrazide-functionalized poly(2hydroxyethyl methacrylate) microspheres for immobilization of horseradish peroxidase.
Biotechnol. Prog., 15 (2), 208-215.
Horák, D., Babič, M., Macková, H. a Beneš, M.J., 2007. Preparation and properties
of magnetic nano- and microsized particles for biological and environmental separations.
J. Sep. Sci., 30 (11), 1751-1772.
Horák, D., Kučerová, J., Korecká, L., Jankovičová, B., Palarčík, J., Mikulášek, P. a Bílková,
Z., 2012. New Monodisperse Magnetic Polymer Microspheres Biofunctionalized for Enzyme
Catalysis and Bioaffinity Separations. Macromol. Biosci., 12 (5), 647-655.
Hristov, J. a Fachikov, L., 2007. An overview of separation by magnetically stabilized beds:
State-of-the-art and potential applications. China Part., 5 (1-2), 11-18.
Huang, B.X. a Kim, H., 2013. Effective Identification of Akt Interacting Proteins by TwoStep Chemical Crosslinking, Co-Immunoprecipitation and Mass Spectrometry. PLoS One, 8
(4), e61430.
51
Huang, S., Chin, W. a Yang, W.P., 2005. Structural characteristics and properties
of silica/poly(2-hydroxyethyl methacrylate) (PHEMA) nanocomposites prepared by mixing
colloidal silica or tetraethyloxysilane (TEOS) with PHEMA. Polymer, 46 (6), 1865-1877.
Hui, J.Z., Zaki, A.A., Cheng, Z., Popik, V., Zhang, H., Luning Prak, E.T. a Tsourkas, A.,
2014. Facile method for the site-specific, covalent attachment of full-length IgG onto
nanoparticles. Small. 10(16), 3354-63.
Ito, A., Shinkai, M., Honda, H. a Kobayashi, T., 2005. Medical application of functionalized
magnetic nanoparticles. J. Biosci. Bioeng., 100 (1), 1-11.
Jirsák, O., Kalinová, K. a Stránská, D., 2006. Nanofibre technologies and Nanospider
applications. Nanofair 2006 New Ideas for Industry, 1940, 41-44.
Johnstone, A., P. aThorpe, R., 1996. Immunochemistry in Practice. 3rd Edition ed.WileyBlackwell ISBN 978-0-86542-633-7.
Joshi, A., Solanki, S., Chaudhari, R., Bahadur, D., Aslam, M. a Srivastava, R., 2011.
Multifunctional alginate microspheres for biosensing, drug delivery and magnetic resonance
imaging. Acta Biomater., 7 (11), 3955-3963.
Joshi, M., Pinto, R., Rao, V.R. a Mukherji, S., 2007. Silanization and antibody immobilization
on SU-8. Appl. Surf. Sci., 253 (6), 3127-3132.
Kaewsaneha, C., Bitar, A., Tangboriboonrat, P., Polpanich, D. a Elaissari, A., 2014.
Fluorescent-magnetic Janus particles prepared via seed emulsion polymerization. J.Colloid
Interface Sci., 424, 98-103.
Kang, Y.O., Yoon, I., Lee, S.Y., Kim, D., Lee, S.J., Park, W.H. a Hudson, S.M., 2010.
Chitosan-Coated Poly(vinyl alcohol) Nanofibers For Wound Dressings. J. Biomed. Mater.
Res. Part B, 92B (2), 568-576.
Katsanevakis, E., Wen, X. a Zhang, N., 2012. Creating Electrospun Nanofiber-Based
Biomimetic Scaffolds for Bone Regeneration. In: R. Jayakumar and S. Nair eds., Biomedical
Applications of Polymeric Nanofibers.Springer Berlin Heidelberg,01/01, pp. 63-100 ISBN
978-3-642-27147-2.
Kay, G. a Crook, E., 1967. Coupling of enzymes to cellulose using chloro-s-triazines. Nature,
216 (5114), 514.
Kessick, R. a Tepper, G., 2004. Microscale polymeric helical structures produced
by electrospinning. Appl. Phys. Lett., 84 (23), 4807-4809.
Khandurina, J., McKnight, T., Jacobson, S., Waters, L., Foote, R. a Ramsey, J., 2000.
Integrated system for rapid PCR-based DNA analysis in microfluidic devices. Anal. Chem.,
72 (13), 2995-3000.
Knezevic, N.Z., Ruiz-Hernandez, E., Hennink, W.E. a Vallet-Regi, M., 2013. Magnetic
mesoporous silica-based core/shell nanoparticles for biomedical applications. RSC Adv., 3
(25), 9584-9593.
Kohn, J. a Wilchek, M., 1984. The use of cyanogen-bromide and other novel cyanylating
agents for the activation of polysaccharide resins. Appl. Biochem. Biotechnol., 9 (3), 285-305.
52
Kokalj, T., Perez-Ruiz, E. a Lammertyn, J., 2015. Building bio-assays with magnetic particles
on a digital microfluidic platform. New Biotech., 32 (5), 485-503.
Kubinova, S. a Sykova, E., 2010. Nanotechnologies in regenerative medicine. Minim.
Invasive Ther. Allied Technol., 19 (3-4), 144-156.
Labrou, N.E., 2003. Design and selection of ligands for affinity chromatography.
J. Chromatogr. B, 790 (1–2), 67-78.
Labrou, N., Eliopoulos, E. a Clonis, Y., 1999. Molecular modeling for the design
of a biomimetic chimeric ligand. Application to the purification of bovine heart L-lactate
dehydrogenase. Biotechnol. Bioeng., 63 (3), 322-332.
Lacava, L.M., Lacava, Z.G.M., Da Silva, M.F., Silva, O., Chaves, S.B., Azevedo, R.B.,
Pelegrini, F., Gansau, C., Buske, N., Sabolovic, D. a Morais, P.C., 2001. Magnetic Resonance
of a Dextran-Coated Magnetic Fluid Intravenously Administered in Mice. Biophys. J., 80 (5),
2483-2486.
Lahann, J., Balcells, M., Lu, H., Rodon, T., Jensen, K. a Langer, R., 2003. Reactive polymer
coatings: A first step toward surface engineering of microfluidic devices. Anal. Chem., 75 (9),
2117-2122.
Larrondo, L. a Manley, R., 1981. Electrostatic fiber spinning from polymer melts.
Experimental-observations on fiber formation and properties. J. Polym. Sci. Pt. BPolym.Phys., 19 (6), 909-920.
Larsson, P. a Mosbach, K., 1979. Affinity precipitation of enzymes. FEBS Lett., 98 (2), 333338.
Laurent, S., Forge, D., Port, M., Roch, A., Robic, C., Elst, L.V. a Muller, R.N., 2008.
Magnetic iron oxide nanoparticles: synthesis, stabilization, vectorization, physicochemical
characterizations, and biological applications. Chem. Rev., 108 (6), 2064-2110.
Lazar, I.M., Trisiripisal, P. a Sarvaiya, H.A., 2006. Microfluidic liquid chromatography
system for proteomic applications and biomarker screening. Anal. Chem., 78 (15), 5513-5524.
Lee, J., Yu, H., Hong, S., Jeong, I., Jang, J. a Kim, H., 2009. Nanofibrous membrane
of collagen-polycaprolactone for cell growth and tissue regeneration. J. Mater. Sci.-Mater.
Med., 20 (9), 1927-1935.
Lee, S.H.S., Hatton, T.A. a Khan, S.A., 2011. Microfluidic continuous magnetophoretic
protein separation using nanoparticle aggregates. Microfluid. Nanofluid., 11 (4), 429-438.
Lehmann, U., 2008. Manipulation of magnetic microparticles in liquid phases for on-chip
biomedical analysis methods. M. Gijs ed., PhD Thesis ed. Lausanne, Switzerland: Thèse
École polytechnique fédérale de Lausanne EPFL, n° 4072 (2008).
Lehmann, U., Vandevyver, C., Parashar, V. a Gijs, M., 2006. Droplet-based DNA purification
in a magnetic lab-on-a-chip. Angew. Chem.- Int. Edit., 45 (19), 3062-3067.
Li, D., Herricks, T. a Xia, Y., 2003. Magnetic nanofibers of nickel ferrite prepared
by electrospinning. Appl. Phys. Lett., 83 (22), 4586-4588.
Li, P., Gao, Y. a Pappas, D., 2012. Multiparameter cell affinity chromatography: separation
and analysis in a single microfluidic channel. Anal. Chem., 84 (19), 8140-8148.
53
Liese, A. a Hilterhaus, L., 2013. Evaluation of immobilized enzymes for industrial
applications. Chem. Soc. Rev., 42 (15), 6236-6249.
Lin, J., Zhou, W., Kumbhar, A., Wiemann, J., Fang, J., Carpenter, E. a O'Connor, C., 2001.
Gold-coated iron (Fe@Au) nanoparticles: Synthesis, characterization, and magnetic fieldinduced self-assembly. J. Solid State Chem., 159 (1), 26-31.
Liu, Y.D. a Choi, H.J., 2014. Fabrication of anisotropic snowman-like magnetic particles
and their magnetorheological response. J. Appl. Phys., 115 (17), 17B529.
Liuni, P., Rob, T. a Wilson, D.J., 2010. A microfluidic reactor for rapid, low-pressure
proteolysis with on-chip electrospray ionization. Rapid Commun. Mass Spectrom., 24 (3),
315-320.
Long, T., Prakash, S., Shannon, M. a Moore, J., 2006. Water-vapor plasma-based surface
activation for trichlorosilane modification of PMMA. Langmuir, 22 (9), 4104-4109.
Long, Y., Yu, M., Sun, B., Gu, C. a Fan, Z., 2012. Recent advances in large-scale assembly
of semiconducting inorganic nanowires and nanofibers for electronics, sensors
and photovoltaics. Chem. Soc. Rev., 41 (12), 4560-4580.
Love, J., Estroff, L., Kriebel, J., Nuzzo, R. a Whitesides, G., 2005. Self-assembled
monolayers of thiolates on metals as a form of nanotechnology. Chem. Rev., 105 (4), 11031169.
Lowe, C. a Pearson, J., 1984. Affinity-chromatography on immobilized dyes. Meth. Enzymol.,
104, 97-113.
Ma, H., Qi, X., Maitani, Y. a Nagai, T., 2007. Preparation and characterization
of superparamagnetic iron oxide nanoparticles stabilized by alginate. Int. J. Pharm., 333 (12), 177-186.
Malhotra, R., Patel, V., Chikkaveeraiah, B.V., Munge, B.S., Cheong, S.C., Zain, R.B.,
Abraham, M.T., Dey, D.K., Gutkind, J.S. a Rusling, J.F., 2012. Ultrasensitive detection
of cancer biomarkers in the clinic by use of a nanostructured microfluidic array. Anal. Chem.,
84 (14), 6249-6255.
Mallia, A., Hermnason, G., Krohn, R., FujimoTO, E. a Smith, P., 1981. Preparation and use
of a boronic acid affinity support for separation and quantitation of glycosylated hemoglobins.
Anal. Lett. Part B, 14 (8), 649-661.
Malmstadt, N., Yager, P., Hoffman, A. a Stayton, P., 2003. A smart microfluidic affinity
chromatography matrix composed of poly(N-isopropylacrylamide)-coated beads. Anal.
Chem., 75 (13), 2943-2949.
Martinez, A.W., Phillips, S.T., Whitesides, G.M. a Carrilho, E., 2010. Diagnostics
for the developing world: microfluidic paper-based analytical devices. Anal. Chem., 82 (1), 310.
Matsumoto, I., Mizuno, Y. a Seno, N., 1979. Activation of sepharose with epichlorohydrin
and subsequent immobilization of ligand for affinity adsorbent. J. Biochem., 85 (4), 10911098.
Mattiasson, B. a Ramstorp, M., 1984. Ultrafiltration Affinity Purification - isolation
of concanavalin a from seeds of canavalia-ensiformis. J. Chromatogr., 283, 323-330.
54
Melissis, S., Rigden, D. a Clonis, Y., 2001. New family of glutathionyl-biomimetic ligands
for affinity chromatography of glutathione-recognising enzymes. J. Chromatogr. A, 917 (1-2),
29-42.
Miserere, S., Mottet, G., Taniga, V., Descroix, S., Viovy, J. a Malaquin, L., 2012. Fabrication
of thermoplastics chips through lamination based techniques. Lab Chip, 12 (10), 1849-1856.
Moorthy, J., Mensing, G., Kim, D., Mohanty, S., Eddington, D., Tepp, W., Johnson, E.
a Beebe, D., 2004. Microfluidic tectonics platform: A colorimetric, disposable botulinum
toxin enzyme-linked immunosorbent assay system. Electrophoresis, 25 (10-11), 1705-1713.
Morag, E., Bayer, E.A. a Wilchek, M., 1996. Immobilized nitro-avidin and nitro-streptavidin
as reusable affinity matrices for application in avidin–biotin technology. Anal. Biochem., 243
(2), 257-263.
Morris, K., Jensen, K., Julin, C., Weil, M. a Gold, L., 1998. High affinity ligands from in vitro
selection: Complex targets. Proc. Natl. Acad. Sci.U.S.A., 95 (6), 2902-2907.
Mu, X., Liu, Y., Fang, D., Wang, Z., Nie, J. a Ma, G., 2012. Electric field induced phase
separation on electrospinning polyelectrolyte based core-shell nanofibers. Carbohydr. Polym.,
90 (4), 1582-1586.
Murphy, R., Imam, A., Hughes, A., McGucken, M., Buchanan, K., Conlon, J. a Elmore, D.,
1976. Avoidance of strongly chaotropic eluents for immunoaffinity chromatography
by chemical modification of immobilized ligand. Biochim. Biophys. Acta, 420 (1), 87-96.
Mutin, P., Guerrero, G. a Vioux, A., 2003. Organic-inorganic hybrid materials based
on organophosphorus coupling molecules: from metal phosphonates to surface modification
of oxides. C.R. Chim., 6 (8-10), 1153-1164.
Nakanishi, K., Tomita, M., Nakamura, H. a Kato, K., 2013. Specific binding
of immunoglobulin G to protein A-mesoporous silica composites for affinity column
chromatography. J. Mat. Chem. B, 1 (45), 6321-6328.
Nam, Y., Yoon, J., Lee, J. a Park, T., 1999. Adhesion behaviours of hepatocytes cultured onto
biodegradable polymer surface modified by alkali hydrolysis process. J. Biomater. Sci.Polym. Ed., 10 (11), 1145-1158.
Nge, P.N., Rogers, C.I. a Woolley, A.T., 2013. Advances in microfluidic materials, functions,
integration, and applications. Chem. Rev., 113 (4), 2550-2583.
Nielsen, P., Egholm, M., Berg, R. a BuchtardT, O., 1991. Sequence-selective recognition
of dna by strand displacement with a thymine-substituted polyamide. Science, 254 (5037),
1497-1500.
Nord, K., Gunneriusson, E., Uhlén, M. a Nygren, P., 2000. Ligands selected
from combinatorial libraries of protein A for use in affinity capture of apolipoprotein A-1M
and Taq DNA polymerase. J. Biotechnol., 80 (1), 45-54.
Noren, K. a Noren, C., 2001. Construction of high-complexity combinatorial phage display
peptide libraries. Methods, 23 (2), 169-178.
Nygren, P., 2011. Affinity ligands from biological combinatorial libraries. In: J. Janson ed.,
Protein Purification: Principles, high resolution methods, and applications.John Wiley
& Sons, Inc., pp. 269-278 ISBN 9780470939932.
55
Ohlson, S., Duong-Thi, M., Bergstrom, M., Fex, T., Hansson, L., Pedersen, L., Guazotti, S.
a Isaksson, R., 2010. Toward high-throughput drug screening on a chip-based parallel affinity
separation platform. J. Sep. Sci., 33 (17-18), 2575-2581.
Ondarcuhu, T. a Joachim, C., 1998. Drawing a single nanofibre over hundreds of microns.
Europhys. Lett., 42 (2), 215-220.
Orum, H., Nielsen, P., Jorgensen, M., Larsson, C., Stanley, C. a Koch, T., 1995. Sequencespecific purification of nucleic-acids by pna-controlled hybrid selection. BioTechniques, 19
(3), 472-480.
Otieno, B.A., Krause, C.E., Latus, A., Chikkaveeraiah, B.V., Faria, R.C. a Rusting, J.F., 2014.
On-line protein capture on magnetic beads for ultrasensitive microfluidic immunoassays
of cancer biomarkers. Biosens. Bioelectron., 53, 268-274.
Ozdemir, M., Yurteri, C. a Sadikoglu, H., 1999. Physical polymer surface modification
methods and applications in food packaging polymers. Crit. Rev. Food Sci. Nutr., 39 (5),
457-477.
Paegel, B., Blazej, R. a Mathies, R., 2003. Microfluidic devices for DNA sequencing: sample
preparation and electrophoretic analysis. Curr. Opin. Biotechnol., 14 (1), 42-50.
Pamme, N., 2006. Magnetism and microfluidics. Lab Chip, 6 (1), 24-38.
Pamme, N., 2012. On-chip bioanalysis with magnetic particles. Curr. Opin. Chem. Biol., 16
(3-4), 436-443.
Pandey, C.M., Sharma, A., Sumana, G., Tiwari, I. a Malhotra, B.D., 2013. Cationic
poly(lactic-co-glycolic acid) iron oxide microspheres for nucleic acid detection. Nanoscale, 5
(9), 3800-3807.
Pankhurst, Q.A., Thanh, N.T.K., Jones, S.K. a Dobson, J., 2009. Progress in applications
of magnetic nanoparticles in biomedicine. J.Phys.D-Appl.Phys., 42 (22), 224001.
Park, K., Ju, Y.M., Son, J.S., Ahn, K. a Han, D.K., 2007. Surface modification
of biodegradable electrospun nanofiber scaffolds and their interaction with fibroblasts.
J. Biomater. Sci.-Polym. Ed., 18 (4), 369-382.
Pečová, M., Zajoncová, L., Poláková, K., Čuda, J., Šafaříková, M., Šebela, M. a Šafařík, I.,
2011. Biologically active compounds immobilized on magnetic carriers and their utilization
in biochemistry and biotechnology. Chem. Listy, 105 (7), 524-530.
Pereiro, I., Kučerová, J., Alexandre, L., Dupuy, B., Bílková, Z., Viovy, J.-L-, Malaquin, L.
a Descroix, S. Microfluidic magnetic fluidized bed for bacteria extraction, growth
and detection. Proceedings of the MicroTAS 2014 Conference, ISBN 978-0-979806426-30-76, San Antonio, Texas, USA, s. 437-439. s. 437-439.
Petřík, S. a Malý, M. Electrospun Nanofiber – The Tiny Layers that add Great Value
to Nonwovens, 2008. In: Proc. of International Nonwoven Symposium, EDANA, Stockholm.
Phaner-Goutorbe, M., Dugas, V., Chevolot, Y. a Souteyrand, E., 2011. Silanization of silica
and glass slides for DNA microarrays by impregnation and gas phase protocols:
A comparative study. Mater. Sci. Eng. C- Mater. Biol. Appl., 31 (2), 384-390.
56
Pinkse, M., Uitto, P., Hilhorst, M., Ooms, B. a Heck, A., 2004. Selective isolation
at the femtomole level of phosphopeptides from proteolytic digests using 2D-nanoLC-ESIMS/MS and titanium oxide precolumns. Anal. Chem., 76 (14), 3935-3943.
Porath, J., Carlsson, J., Olsson, I. a Belfrage, G., 1975. Metal chelate affinity chromatography,
a new approach to protein fractionation. Nature, 258 (5536), 598-599.
Porath, J., Maisano, F. a Belew, M., 1985. Thiophilic Adsorption - a New Method for Protein
Fractionation. FEBS Lett., 185 (2), 306-310.
Puig, O., Caspary, F., Rigaut, G., Rutz, B., Bouveret, E., Bragado-Nilsson, E., Wilm, M.
a Seraphin, B., 2001. The tandem affinity purification (TAP) method: A general procedure
of protein complex purification. Methods, 24 (3), 218-229.
Putnam, D.D., Namasivayam, V. a Burns, M.A., 2003. Cell affinity separations using
magnetically stabilized fluidized beds: Erythrocyte subpopulation fractionation utilizing
a lectin-magnetite support. Biotechnol. Bioeng., 81 (6), 650-665.
Qian, Y., Zhang, K., Chen, F., Ke, Q. a Mo, X., 2011. Cross-linking of gelatin and chitosan
complex nanofibers for tissue-engineering scaffolds. J.Biomater. Sci.-Polym. Ed., 22 (8),
1099-1113.
Qin, X. a Wang, S., 2006. Filtration properties of electrospinning nanofibers. J. Appl. Polym.
Sci., 102 (2), 1285-1290.
Qu, F., Guan, Y., Ma, Z. a Zhang, Q., 2009. Synthesis of Cibacron Blue F3GA-coupled
magnetic PMMA nanospheres and their use for protein affinity separation. Polym. Int., 58 (8),
888-892.
Ramakrishna, S., Fujihara, K., Wee-Eong, T., Teik-Cheng, L. a Zuwei, M., 2005.
An Introduction to Electrospinning and Nanofibers. Singapore: Worl d Scientific Publishing
Co . Pte . Ltd . ISBN 978-981-256-415-3.
Rasmussen, J.,R, Štědronský, E.,R a Whitesides, G.,M., 1977. - Introduction, modification,
and characterization of functional groups on the surface of low-density polyethylene film.
J. Am. Chem. Soc., 14, 4736-4745. ISBN - 0002-7863.
Ren, K., Chen, Y. a Wu, H., 2014. New materials for microfluidics in biology. Curr. Opin.
Biotechnol., 25, 78-85.
Reneker, D. a Chun, I., 1996. Nanometre diameter fibres of polymer, produced
by electrospinning. Nanotechnology, 7 (3), 216-223.
Reyes, D., Iossifidis, D., Auroux, P. a Manz, A., 2002. Micro total analysis systems.
1. Introduction, theory, and technology. Anal. Chem., 74 (12), 2623-2636.
Ríos, A., Escarpa, A., González, M.C. a Crevillén, A.G., 2006. Challenges of analytical
microsystems. TrAC Trends in Analytical Chemistry, 25 (5), 467-479.
Ro, K.W., Nayalk, R. a Knapp, D.R., 2006. Monolithic media in microfluidic devices
for proteomics. Electrophoresis, 27 (18), 3547-3558.
Roca, A.G., Costo, R., Rebolledo, A.F., Veintemillas-Verdaguer, S., Tartaj, P., GonzalezCarreno, T., Morales, M.P. a Serna, C.J., 2009. Progress in the preparation of magnetic
nanoparticles for applications in biomedicine. J. Phys. D-Appl. Phys., 42 (22), 224002.
57
Romig, T.S., Bell, C. a Drolet, D.W., 1999. Aptamer affinity chromatography:: combinatorial
chemistry applied to protein purification. J. Chromatogt. B, 731 (2), 275-284.
Roy, I. and Gupta, M., 2006. Use of Immobilized Biocatalysts in Fluidized Bed Format. In:
J. Guisan ed., Immobilization of Enzymes and Cells, Methods in Biotechnology.Humana
Press, pp. 311-319 ISBN 978-1-58829-290-2.
Šafařík, I. a Šafaříková, M., 2002. Magnetic nanoparticles and biosciences. Mon. Chem., 133
(6), 737-759.
Šafařík, I. a Šafaříková, M., 1999. Use of magnetic techniques for the isolation of cells.
J. Chromatogr. B, 722 (1-2), 33-53.
Šafařík, I. a Šafaříková, M., 2009. Magnetic nano- and microparticles in biotechnology.
Chem. Pap., 63 (5), 497-505.
Šafařík, I. a Šafaříková, M., 2004. Magnetic techniques for the isolation and purification
of proteins and peptides. BioMagnetic Research and Technology, 2 (1),7.
Sahoo, Y., Goodarzi, A., Swihart, M., Ohulchanskyy, T., Kaur, N., Furlani, E. a Prasad, P.,
2005. Aqueous ferrofluid of magnetite nanoparticles: Fluorescence labeling
and magnetophoretic control. J. Phys. Chem. B, 109 (9), 3879-3885.
Sakao, Y., Nakamura, F., Ueno, N. a Hara, M., 2005. Hybridization of oligonucleotide
by using DNA self-assembled monolayer. Colloid Surf.B-Biointerfaces, 40 (3-4), 149-152.
Šálek, P., Korecká, L., Horák, D., Petrovský, E., Kovářová, J., Metelka, R., Čadková, M.
a Bílková, Z., 2011. Immunomagnetic sulfonated hypercrosslinked polystyrene microspheres
for electrochemical detection of proteins. J. Mater. Chem., 21 (38), 14783-14792.
Saliba, A., Saias, L., Psychari, E., Minc, N., Simon, D., Bidard, F., Mathiot, C., Pierga, J.,
Fraisier, V., Salamero, J., Saada, V., Farace, F., Vielh, P., Malaquin, L. a Viovy, J., 2010.
Microfluidic sorting and multimodal typing of cancer cells in self-assembled magnetic arrays.
Proc. Natl. Acad. Sci.U.S.A., 107 (33), 14524-14529.
Schreuder-Gibson, H., Gibson, P., Senecal, K., Sennett, M., Walker, J., Yeomans, W.,
Ziegler, D. a Tsai, P., 2002. Protective textile materials based on electrospun nanofibers.
J. Adv. Mater., 34 (3) ,44-55.
Scopes, R.K., 1986. Strategies for enzyme isolation using dye-ligand and related adsorbents.
J. Chromatogr. B, 376 (0), 131-140.
Sellergren, B., 1994. Imprinted dispersion polymers - a new class of easily accessible affinity
stationary phases. J. Chromatogr. A, 673 (1), 133-141.
Shadpour, H., Musyimi, H., Chen, J.F. a Soper, S.A., 2006. Physiochemical properties
of various polymer substrates and their effects on microchip electrophoresis performance.
J. Chromatogr. A, 1111 (2), 238-251.
Sharma, R., Singh, H., Joshi, M., Sharma, A., Garg, T., Goyal, A.K. a Rath, G., 2014. Recent
advances in polymeric electrospun nanofibers for drug delivery. Crit. Rev. Ther. Drug Carrier
Syst., 31 (3), 187-217.
58
Shikida, M., Inouchi, K., Honda, H. a Sato, K., 2004. Magnetic handling of droplet in micro
chemical analysis system utilizing surface tension and wettability. Mems 2004: 17th Ieee
International Conference on Micro Electro Mechanical Systems, Technical Digest, 359-362.
Shimura, K. a Kasai, K., 1987. Affinophoresis in two-dimensional agarose-gel electrophoresis
- specific separation of biomolecules by a moving affinity ligand. Anal. Biochem., 161 (1),
200-206.
Sista, R.S., Eckhardt, A.E., Srinivasan, V., Pollack, M.G., Palanki, S. a Pamula, V.K., 2008.
Heterogeneous immunoassays using magnetic beads on a digital microfluidic platform. Lab
Chip, 8 (12), 2188-2196.
Situma, C., Wang, Y., Hupert, M., Barany, F., McCarley, R. a Soper, S., 2005. Fabrication
of DNA microarrays onto poly(methyl methacrylate) with ultraviolet patterning
and microfluidics for the detection of low-abundant point mutations. Anal. Biochem., 340 (1),
123-135.
Skerra, A., 2007. Alternative non-antibody scaffolds for molecular recognition. Curr. Opin.
Biotechnol., 18 (4), 295-304.
Slováková, M., Minc, N., Bílková, Z., Smadja, C., Faigle, W., Futterer, C., Taverna, M.
a Viovy, J., 2005. Use of self assembled magnetic beads for on-chip protein digestion. Lab
Chip, 5 (9) , 935-942.
Smith, G., 1985. Filamentous fusion phage - novel expression vectors that display cloned
antigens on the virion surface. Science, 228 (4705), 1315-1317.
Spence, C. a Bailon, P., 2000. Fluidized-Bed Receptor-Affinity Chromatography. In: P.
Bailon, G. Ehrlich K, W. Fung and W. Berthold eds., Methods in Molecular Biology, Methods
and Protocols: Affinity Chromatography,Humana Press, pp. 25-39 ISBN 978-0-89603-694-9.
Spross, J. a Sinz, A., 2011. Monolithic media for applications in affinity chromatography.
J. Sep. Sci., 34 (16-17), 1958-1973.
Starkenstein, E., 1910. Ferment action and the influence upon it of neutral salts. Biochem. Z.,
24, 210-218.
Sun, Z., Zussman, E., Yarin, A., Wendorff, J. a Greiner, A., 2003. Compound core-shell
polymer nanofibers by co-electrospinning. Adv Mater, 15 (22), 1929.
Tada, D.B., Vono, L.L.R., Duarte, E.L., Itri, R., Kiyohara, P.K., Baptista, M.S. a Rossi, L.M.,
2007. Methylene blue-containing silica-coated magnetic particles: A potential magnetic
carrier for photodynamic therapy. Langmuir, 23 (15), 8194-8199.
Talbert, J.N. a Hotchkiss, J.H., 2012. Chitosan-tethered microspheres for lactase
immobilization. J. Mol. Catal. B-Enzym., 78, 78-84.
Thanh, N.T., 2012. Magnetic Nanoparticles: from fabrication to clinical applications. 1st ed.
Boca Raton: CRC Press.
Tsang, S.C., Yu, C.H., Gao, X. a Tam, K., 2006. Silica-encapsulated nanomagnetic particle
as a new recoverable biocatalyst carrier. J. Phys. Chem. B, 110 (34), 16914-16922.
Tuerk, C. a Gold, L., 1990. Systematic evolution of ligands by exponential enrichment – RNA
ligands to bacteriophage-T4 DNA-polymerase. Science, 249 (4968), 505-510.
59
Turková, J., 1993. Bioaffinity Chromatography. Elsevier.
Ugelstad, J. a Mork, P., 1980. Swelling of oligomer-polymer particles - new methods
of preparation of emulsions and polymer dispersions. Adv. Colloid Interface Sci., 13 (1-2),
101-140.
van Ewijk, G., Vroege, G. a Philipse, A., 1999. Convenient preparation methods for magnetic
colloids. J .Magn. Magn. Mater., 201, 31-33.
van Reenen, A., de Jong, A.M., den Toonder, J.M.J. a Prins, M.W.J., 2014. Integrated
lab-on-chip biosensing systems based on magnetic particle actuation - a comprehensive
review. Lab Chip, 14 (12), 1966-1986.
Varilova, T., 2005. Stationary phases for affinity chromatography. Chem. Listy, 99 (8), 570577.
Viovy, J., Tabnaoui, S., Malaquin, L. a Descroix, S., 2014. Systeme microfluidique presentant
un lit de particules magnetiques. Patent WO2014037674 A1. 13.3.2014.
PCT/FR2013/052057.
Wang, Z., Yue, T., Yuan, Y., Cai, R., Niu, C. a Guo, C., 2013. Development and evaluation
of an immunomagnetic separation-ELISA for the detection of Alicyclobacillus spp. in apple
juice. Int. J. Food Microbiol., 166 (1), 28-33.
Wattendorf, U. a Merkle, H.P., 2008. PEGylation as a Tool for the Biomedical Engineering
of Surface Modified Microparticles. J. Pharm. Sci., 97 (11), 4655-4669.
Webb, C., Kang, H., Moffat, G., Williams, R., Estevez, A., Cuellar, J., Jaraiz, E. a Galan, M.,
1996. The magnetically stabilized fluidized bed bioreactor: A tool for improved mass transfer
in immobilized enzyme systems?. Chem. Eng. J. Biochem. Eng. J., 61 (3), 241-246.
Wen, J., Legendre, L.A., Bienvenue, J.M. a Landers, J.P., 2008. Purification of nucleic acids
in microfluidic devices. Anal. Chem., 80 (17), 6472-6479.
Whitesides, G.M., 2006. The origins and the future of microfluidics. Nature, 442 (7101), 368373.
Wilchek, M., 2004. My life with affinity. Protein Sci., 13 (11), 3066-3070.
Williams, A. a Ibrahim, I., 1981. Carbodiimide Chemistry - Recent Advances. Chem. Rev., 81
(6), 589-636.
Wong, E., Mearns, F. a Gooding, J., 2005. Further development of an electrochemical DNA
hybridization biosensor based on long-range electron transfer. Sens. Actuator B-Chem., 111,
515-521.
Wu, S., Liu, Z., Liu, S., Lin, L., Yang, W. a Xu, J., 2014. Enrichment and enumeration
of circulating tumor cells by efficient depletion of leukocyte fractions. Clin. Chem. Lab. Med.,
52 (2), 243-251.
Wu, Y., Chang, G., Zhao, Y. a Zhang, Y., 2014b. Hierarchical Fe3O4@NixSiOy
microspheres for affinity separation of His-tagged proteins. J. Nanopart. Res., 16 (4), 2358.
Yan, J., Horák, D., Lenfeld, J., Hammond, M. a Kamali-Moghaddam, M., 2013. A tosylactivated magnetic bead cellulose as solid support for sensitive protein detection.
J. Biotechnol., 167 (3), 235-240.
60
Yanase, N., Noguchi, H., Asakura, H. a Suzuta, T., 1993. Preparation of magnetic latexparticles by emulsion polymerization of styrene in the presence of a ferrofluid. J. Appl.
Polym. Sci., 50 (5), 765-776.
You, K., Lee, S., Im, A. a Lee, S., 2003. Aptamers as functional nucleic acids: In vitro
selection and biotechnological applications. Biotechnol. Bioprocess Eng., 8 (2), 64-75.
Young, E.W.K., Berthier, E., Guckenberger, D.J., Sackmann, E., Lamers, C., Meyvantsson, I.,
Huttenocher, A. a Beebe, D.J., 2011. Rapid prototyping of arrayed microfluidic systems
in polystyrene for cell-based assays. Anal. Chem., 83 (4), 1408-1417.
Zeng, Z., Hincapie, M., Pitteri, S.J., Hanash, S., Schakwijk, J., Hogan, J.M., Wang, H.
a Hancock, W.S., 2011. A proteomics platform combining depletion, multi-lectin affinity
chromatography (M-LAC), and isoelectric focusing to study the breast cancer proteome. Anal.
Chem., 83 (12), 4845-4854.
Zhang, C., Waengler, B., Morgenstern, B., Zentgraf, H., Eisenhut, M., Untenecker, H.,
Krueger, R., Huss, R., Seliger, C., Semmler, W. a Kiessling, F., 2007. Silica- and
alkoxysilane-coated ultrasmall superparamagnetic iron oxide particles: A promising tool
to label cells for magnetic resonance imaging. Langmuir, 23 (3), 1427-1434.
Zhang, R., Liu, S., Zhao, W., Zhang, W., Yu, X., Li, Y., Li, A., Pang, D. a Zhang, Z., 2013.
A simple point-of-care microfluidic immunomagnetic fluorescence assay for pathogens. Anal.
Chem., 85 (5), 2645-2651.
Zhang, Y., Wang, X., Feng, Y., Li, J., Lim, C. a Ramakrishna, S., 2006. Coaxial
electrospinning of (fluorescein isothiocyanate-conjugated bovine serum albumin)encapsulated poly(epsilon-caprolactone) nanofibers for sustained release. Biomacromolecules,
7 (4), 1049-1057.
61
4
CÍLE DISERTAČNÍ PRÁCE
Cílem dizertační práce bylo navázat vybrané bioaktivní ligandy (enzymy, protilátky)
na moderní nano- a mikromateriály (nanovlákna a magnetické mikročástice). Typ
imobilizovaných ligandů, stacionárních fází, způsobu ukotvení ligandu i finálního použití
nosičů se lišilo v závislosti na konkrétních projektech, v rámci kterých byly nosiče vyvíjeny
(viz Tabulka 5, Obrázek 19).
Tabulka 5: Přehled cílů dizertační práce
Nosič
Ligand
Chitosanová
nanovlákna
Enzym
trypsin
Magnetické
mikročástice
Magnetické
mikročástice
Obr. 18
Číslo a název projektu
Hojení ran
A
MPO FR-TI1/436, Využití
nanovlákenných membrán pro
řízené uvolňování aktivních
látek.
Enzym
trypsin
Potenciální aplikace:
biokatalýza
B
PEG a antiEpCAM
protilátky
Imunomagnetická
separace EpCAM
pozitivních buněk
v mikrofluidním čipu
C, D
AntiSalmonella
protilátky
Imunomagnetická
separace Salmonella
Typhimurium
z mléka
v mikrofluidním čipu
Aplikace
E
CAMINEMS č. projektu
228980, Integrated MicroNano-Opto fluidic systems for
high-content diagnosis and
studies of rare cancer cells.
LOVE-FOOD, č. projektu
317742, Love wave fully
integrated Lab-on-Chip
platform for food pathogen
detection.
Obrázek 19: Přehled připravovaných nosičů v rámci disertační práce: (a) nanovlákna s imobilizovanými enzymy;
(b) magnetické částice s imobilizovanými enzymy; (c) magnetické částice povrchově modifikované PEGem;
(d) magnetické částice povrchově modifikované PEGem a biofunkcionalizované specifickými Ab
(anti-EpCAM); (e) magnetické částice biofunkcionalizované specifickými Ab (anti-Salmonella).
62
Aby bylo možné splnit zadání disertační práce a připravit kvalitní nosiče pro uvedené
bioafinitní separace nebo katalýzu, bylo nutné důkladně vybrat vhodné nosiče, ligandy
i způsoby jejich vazby na nosič. Následující parametry byly zohledňovány při vývoji všech
uvedených nosičových systémů:
Rozhodující parametry při výběr nosičů:

velikost nosiče (v případě částic zpravidla jejich hydrodynamický průměr)
a související specifický povrch,

složení nosiče a s ním související biokompatibilita,

přítomnost a četnost funkčních skupin pro imobilizaci bioligandu,

nízká nespecifická adsorpce komplexního materiálu na povrch nosiče,

v případě částic hustota, jejich koloidální stabilita sledovaná v různých podmínkách
prostředí,

v případě magnetických částic obsah magnetického materiálu a magnetické vlastnosti
částic,

cena nosiče.
Kritéria pro výběr vhodného ligandu:

dostatečná čistota a integrita ligandu,

v případě protilátek klonalita, použitý imunogen a druh imunizovaného zvířete,

dostatečná reaktivita s cílovým analytem (v případě protilátek afinita),

nepřítomnost stabilizačních látek (želatina, albumin, azid sodný, aj.) u komerčně
dostupných ligandů,

cena ligandu a jeho dostupnost na trhu.
Požadavky na metodu vazby ligandu:

orientovaná vs. neorientovaná imobilizace

nekovalentní vs. kovalentní vazba
Parametry sledované po imobilizaci ligandu na nosič:

hustota ligandu na nosiči a s ní související vazebná kapacita nebo aktivita,

stabilita vůči chemickým činidlům (vliv pH, detergentů, molarity pufru aj.)

v případě částic koloidální stabilita

operační a skladovací stabilita nosiče
63
5 EXPERIMENTÁLNÍ ČÁST, VÝSLEDKY A DISKUZE
V této části disertační práce jsou shrnuty výsledky práce publikované v recenzovaných
odborných periodikách doplněné o podíl autorky na publikacích včetně uvedení souvislostí
a pozadí jejich vzniku.
5.1
Biofunkcionalizace magnetických mikročástic a nanovláken proteolytickým
enzymem trypsinem
Práce na téma biofunkcionalizace magnetických mikročástic enzymem trypsinem
vznikla pod záštitou evropského projektu CAMINEMS (2009-2012) ve spolupráci s Ústavem
makromolekulární chemie AV ČR, v.v.i. v Praze (ÚMCH), konkrétně se skupinou vedenou
Ing. Danielem Horákem Ph.D. Této skupině se podařilo připravit nové polymerní magnetické
mikročástice z poly(glycidyl methakrylátu) (PGMA) a poly(2-hydroxyethyl methakrylátu)
(PHEMA). Imobilizace enzymu trypsinu zde sloužila jako modelová aplikace ověřující
vhodnost těchto částic pro biokatalýzu. Na tyto částice byly rovněž imobilizovány protilátky
(nespecifické lidské IgG), avšak pouze jako další z řady testovaných ligandů rozšiřující
spektrum aplikací, pro které mohou být částice použity. Experimentální podíl autorky
na publikaci (Článek I) spočíval ve veškerých imobilizacích trypsinu prezentovaných v článku
(optimalizacích metody imobilizace, sledování skladovací i operační stability enzymu)
a v přípravě vzorků pro měření zeta potenciálu částic včetně optimalizace jeho měření.
Dizertantka je autorkou těch částí článku, které korespondovaly s jejími experimenty,
procentuálně lze podíl na publikaci vyjádřit jako 40 %.
Biofunkcionalizace nanovláken byla zaštítěna MPO projektem s libereckou firmou
Elmarco, s.r.o. (2009-2011, hlavní řešitelka: Ing. Denisa Stránská). Smyslem projektu byl
vývoj biokompatibilních nanovlákenných vrstev a jejich následná biofunkcionalizace enzymy.
V rámci projektu byla testována nanovlákna z různých materiálů (acetylcelulóza, chitosan,
kys. polymléčná, polyvinylalkohol), různé techniky imobilizace (karbodiimidová s EDC
ve vodném a s CDI v organickém prostředí, oxidace hydroxylových skupin nanovláken
jodistanem sodným a následná vazba přes amino-skupiny enzymu, předchozí varianta
s dodatečným síťováním glutaraldehydem) v kombinaci s různými enzymy (trypsin,
chymotrypsin, lysozym). Pravděpodobně největší úskalí přinesla tato práce ve způsobu
manipulace
s nanovlákny,
ve
volbě
reakčních
nádob,
ve
způsobu
sušení
biofunkcionalizovaných vrstev, apod. Projekt byl zakončen in vitro a in vivo testy cytotoxicity
připraveného materiálu (chitosanová nanovlákna s trypsinem), které byly provedeny
na externích pracovištích. Na základě tohoto projektu vznikl národní užitný vzor a posléze
64
i publikace, která je nyní v recenzním řízení. Oba výstupy projektu jsou však pouhým
výběrem nejzajímavějších výsledků, které projekt přinesl. Experimentální podíl autorky
na užitném vzoru i publikaci (Rukopis I) spočíval v imobilizacích enzymů, výběru
a optimalizacích metod vazby, stanovení aktivity imobilizovaných enzymů a přípravě vzorků
pro testy cytotoxicity. Na rutinních dílčích úkolech autorce pomáhaly i studentky
magisterského studijního programu Analýza biologických materiálů Univerzity Pardubice,
které se tak staly spoluautorkami připravené publikace. Podíl autorky na psaní publikace je
většinový, s výjimkou pasáží o přípravě nanovláken, které byly v gesci spolupracujícího
Elmarca; procentuálně vyjádřeno 90%.
65
5.1.1 Článek I
New monodisperse magnetic polymer microspheres biofunctionalized for enzyme
catalysis and bioaffinity separations.
HORÁK D.1, KUČEROVÁ J.2, KORECKÁ L.2, JANKOVIČOVÁ B.2, PALARČÍK J.3,
MIKULÁŠEK P.3 a BÍLKOVÁ Z.2
1 Institute of Macromolecular Chemistry, Academy of Sciences of the Czech Republic,
Prague, Czech Republic
2 Department of Biological and Biochemical Sciences, Faculty of Chemical Technology,
University of Pardubice, Pardubice, Czech Republic
3 Institute of Environmental and Chemical Engineering, Faculty of Chemical Technology,
University of Pardubice, Pardubice, Czech Republic
Macromolecular. Bioscience, 2012, 12, 647-655. DOI 10.1002/mabi.201100393.
IF (2012) 3,742
66
67
68
69
70
71
72
73
74
75
5.1.2 Rukopis (manuskript) I
Covalent Biofunctionalization of Chitosan Nanofibers with Proteolytic Enzyme for
Wound Healing
SRBOVÁ J. 1, SLOVÁKOVÁ M.1, KŘÍPALOVÁ Z.1, ŽÁRSKÁ M.1, ŠPAČKOVÁ M.2,
STRÁNSKÁ D.2 a BÍLKOVÁ Z.1
1Department of Biological and Biochemical Sciences, Faculty of Chemical Technology,
University of Pardubice, Pardubice, Czech Republic
2 Elmarco Ltd Co, Liberec, Czech Republic
Odesláno 1.7.2015 k recenznímu řízení do Journal of Biomedical Materials Research Part B:
Applied Biomaterials.
IF (2014) 2,759
76
77
Covalent Biofunctionalization of Chitosan Nanofibers with Proteolytic Enzyme for
Wound Healing
Running Head: Chitosan nanofibers functionalized with enzymes for wound healing
Jana Srbova1, Marcela Slovakova1, Zuzana Kripalova1, Monika Zarska1, Martina Spackova2,
Denisa Stranska2, Zuzana Bílková1
1
Department of Biological and Biochemical Sciences, Faculty of Chemical Technology,
University of Pardubice, Pardubice, Czech Republic
2
Elmarco Ltd Co, Liberec, Czech Republic
Corresponding author: Mgr. Marcela Slovakova, Ph.D. Department of Biological and
Biochemical Sciences, Faculty of Chemical Technology, University of Pardubice, Studentska
573,
532
10
Pardubice,
Czech
Republic;
telephone:
+420-466-037-721;
fax:
+420-466-037-068; e-mail: [email protected].
Abstract
The electrospun chitosan nanofibers can provide excellent material for immobilized
proteolytic enzymes, particularly in the field of wound healing or tissue engineering, which
demand biocompatible, nontoxic and hydrophilic matrices with large specific area. This paper
deals with an application of electrospun chitosan nanofibers and optimizing conditions for
their biofunctionalization by trypsin, model proteolytic enzyme able to effectively degrade
necrotic debris in wounds. Nanofibers from pure chitosan were prepared using NanospiderTM
technology and covalent immobilization of trypsin followed. Three immobilization techniques
utilizing amine and/or hydroxyl groups of chitosan were optimized to achieve maximum
proteolytic activity per cm2 of the functionalized chitosan nanofibers (Tryp-NF). Significant
differences were observed. Trypsin immobilized by the carbodiimide one-step protocol
demonstrated the highest activity of the three procedures, ranging from 132 to 210 IU/cm2
(i.e., 548 – 874 IU/mg of nanofibers), depending on the initial amount of trypsin used. Longterm storage stability together with high operational stability of Tryp-NF supported the
intended application of this bioactive nanomaterial. Thereafter the preliminary in vitro tests
ruled out the cytotoxicity of Tryp-NF and the in vivo tests for irritation and skin sensitization
78
demonstrated no undesirable skin reactions. All these results demonstrated the potential use of
these newly developed Tryp-NF for wound healing.
Keywords
trypsin; chitosan; electrospun nanofibers; wound healing; biofunctionalization
Introduction
Recently, together with the expanding area of nanotechnologies, increasing interest has been
reported in biofunctionalization of such various nanostructures as carbon nanotubes, metallic
nanoparticles or nanocomposites.1 The utilization of nanofibers as a support for enzymes
immobilization was first reported by Jia et al. in 2002.2 Thus immobilized, the enzymes offer
such benefits vis-à-vis their use in soluble forms as controllability of the reaction, reusability,
and often both enhanced stability and activity.3-6 Electrospun nanofibers have been proven to
provide excellent support for enzyme immobilization7 because of their high specific surface
area-to-volume ratios, mass transfer resistance, and effective loading.8,9 Moreover, because
they can be manufactured in various formats and from different synthetic and natural
polymers, they afford great flexibility in surface functionality.9 In 2005 and 2006, the new
technology for a needle-free, high-voltage electrospinning process known as Nanospider was
introduced.10,11 It enables the production of nanofibers on an industrial scale. Nanofibers
prepared using this revolutionary technique are excellent for their high fiber-diameter
uniformity and layer homogeneity. A joining of these properties with the potential for largescale fabrication makes these nanofibers even more attractive from a commercial point of
view.
Biofunctionalized nanofibers (i.e. modified with biological ligands such as enzymes, growth
factors, antibiotics etc.) have found interesting applications in different environmental12,13 or
scientific areas,14-16 but their significant characteristics and superiority was demonstrated
especially in the expanding area of biomedicine. They can serve as scaffolds or vehicles in
drug delivery systems,17 tissue engineering18 or wound healing.19 We have focused on the
chitosan nanofibers and their biofunctionalization with enzymes for the purpose of wound
healing. Chitosan is a derivative of chitin and is a natural polyaminosaccharide offering a set
of unique characteristics that include (among others) biocompatibility, biodegradability,
nontoxicity, antibacterial properties, and hydrophilicity.20 The nanofibrous form of chitosan
brings additional attractive features like large surface area and porosity leading to good
permeability for oxygen and water.21,22 These properties support cell respiration, skin
regeneration, moisture retention, removal of exudates, and hemostasis.23
79
The idea of using proteolytic enzymes during the treatment of wounds is rather old24-27 and
relies on enzymatic debridement of necrotic tissue in wounds and support of cell migration. It
can be used alone or in combination with other techniques, such as negative pressure
therapy28 or surgical debridement.27 Typical debriding agents are collagenase and papain in
combination with urea; they are commercially available in the form of ointments.29 Here,
trypsin, serine protease cleaving the peptides on the C-terminal side of lysine and arginine
amino acid residues, was selected as a model proteolytic enzyme with a well-understood
mode of action and undemanding colorimetric measurement of its activity. The benefits of
using immobilized proteolytic enzymes for wound healing are the possibility to control the
cleavage of necrotic tissue and also the prolonged enzymatic activity compared to the soluble
form of enzyme.
The goal of this work was to optimize the preparation of enzymatically highly active and
stable nanofibers which have the potential to be used as a bioactive wound dressing.
Electrospun nanofibers from pure chitosan were prepared using the needleless Nanospider
technology and applied as support for immobilization of trypsin. Even though chitosan
nanofibers have tremendous potential for applications in biomedicine,21 techniques for their
biofunctionalization with proteolytic enzymes have been poorly explored to date. In this
study, three different immobilization strategies, carbodiimide one-step and two-step coupling
through the terminal amine and hydroxyl moieties and periodate oxidation targeting hydroxyl
groups of chitosan, were applied. All techniques were optimized from the perspective of
enzyme yields. The operational and storage stabilities of enzyme-functionalized nanofibers
were investigated. Then, both in vitro and in vivo cytotoxicity testing of the trypsinfunctionalized nanofibers followed.
Materials and Methods
Chemicals
Trypsin from bovine pancreas (EC 3.4.21.4; 13,335 IU/mg), sodium cyanoborohydride,
sodium (meta) periodate, benzamidine hydrochloride hydrate, N-(3-Dimethylaminopropyl)N′-ethylcarbodiimide hydrochloride, 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide (EDC),
N-hydroxysulfosuccinimide sodium salt (sulfo-NHS), N-α-benzoyl-DL-arginine 4-nitroanilide
hydrochloride (BApNA), tris (hydroxymethyl) aminomethane, 4-(2-hydroxyethyl) piperazine1-ethanesulfonic acid (HEPES), and 2-(N-morpholino) ethanesulfonic acid (MES) were
purchased from Sigma Aldrich (St. Louis, MO, USA). Chitosan was purchased from AK
80
Biotech (Qianlong, China) and polyethylene oxide from Scientific Polymer Products (New
York, NY, USA). Other chemicals were of analytical grade and obtained from Penta
(Chrudim, Czech Republic) or Lach-Ner (Neratovice, Czech Republic). All buffers and
solutions were prepared from ultrapure water filtered through a TKA Smart2Pure system
(Thermo Scientific TKA, Niederelbert, Germany).
Manufacturing of Chitosan Nanofibers
A solution of chitosan in 66% acetic acid (6 wt%) was stirred at 50°C until a homogeneous
polymer solution was obtained. An aqueous solution of 3% polyethylene oxide was
subsequently added to the cooled chitosan solution. The nanofibers were prepared using the
modified needleless NanospiderTM technology30 on an NS LAB 500 S electrospinning
laboratory device from Elmarco Ltd. (Liberec, Czech Republic). The conditions during the
electrospinning process were as follow: the spinning electrode was cylindrical (rotation speed
4 rpm), electrode distance was 130 mm, and voltage was 60 kV. Polypropylene spunbond (17
g/m2; Pegas Nonwovens, Znojmo, Czech Republic) was used as the substrate, and the speed
depended on the required basis weight. The crosslinking of nanofibers was achieved by heat
treatment (130°C, 1 h). Chitosan nanofibers were cut into squares (1.5 × 1.5 cm). Prior to
biofunctionalization of the nanofibers, polypropylene spunbonds were then torn off and all
squares were weighted.
Scanning Electron Microscopy (SEM)
An FEI Quanta 200 scanning electron microscope (FEI, Hillsboro, OR, USA) was used to
observe the nanofibers’ structure and evaluate their diameters. Fiber diameters were
determined as mean values of 35 measurements on the SEM images at 5,000x magnification.
Immobilization of Trypsin
The enzyme trypsin was immobilized on the 1.5 × 1.5 cm chitosan squares according to the
protocols described below. All measurements were repeated a minimum of three times, the
calculated means and SD values of which are shown in the graphs herein.
Sodium Periodate Oxidation of Chitosan and Trypsin Immobilization
Nanofibrous squares were placed in 2.0 mL polypropylene tubes and rehydrated using 0.5 mL
of 0.01 M phosphate buffer (pH 7.3). A solution of sodium periodate was added (volume of
0.5 mL; 0.05 M periodate in 0.025 M HEPES pH 7.3). This was followed by oxidation in
darkness under rotation (1.5 h) and five washing steps with 0.01 M phosphate buffer (pH 7.3).
A trypsin solution with benzamidine in the volume of 0.9 mL was added to the activated
nanofibers (unless stated otherwise, 3 mg of trypsin with 0.3 mg of benzamidine dissolved in
the 0.01 M phosphate buffer [pH 7.3]). After 10 min of incubation (RT, rotation), 3 mg of
81
sodium cyanoborohydride in 0.1 mL of the 0.1 M phosphate buffer (pH 7.3) was pipetted to
the nanofibers to stabilize the labile Schiff base. Immobilization was carried out at 4°C and
rotation for 16 h. The Tryp-NF were washed three times using 1 mL of 0.1 M phosphate
buffer (pH 7.3), once with 1 mL of the same buffer containing 1M NaCl, and twice with 1 mL
of 0.1 M phosphate buffer (pH 7.3).
Carbodiimide Method of Trypsin Immobilization
One step carbodiimide method: Nanofibrous squares were rehydrated by 1 mL of 0.01 M
phosphate buffer (pH 7.3). The supernatant was removed and the zero-length crosslinker EDC
(7.5 mg) and sulfo-NHS (1.25 mg) reagent (each dissolved in 0.25 mL of 0.01 M phosphate
buffer (pH 7.3)) were quickly added to the nanofibers. Immediate addition of trypsin solution
with benzamidine followed (unless stated otherwise, 3 mg of trypsin with 0.3 mg of
benzamidine dissolved in 0.5 mL of 0.01 M phosphate buffer [pH 7.3]). The immobilization
proceeded at 4°C for 16 h under rotation. Subsequent washing was carried out identically as
in the periodate method. For the in vitro and in vivo experiments Tryp-NF squares with
dimensions of 9x9 cm were prepared with slight modifications. Briefly, the nanofibers were
cut and rehydrated in 15 mL of 0.01 M phosphate buffer (pH 7.3). The addition of EDC (56
mg), sulfo-NHS (9.4 mg) and trypsin with benzamidine (10 mg of trypsin, 1 mg of
benzamidine) followed; the immobilization was performed in the total volume of 15 mL. The
Tryp-NF were washed three times using 15 mL of 0.1 M phosphate buffer (pH 7.3), once with
15 mL of the same buffer containing 1M NaCl, and twice with 15 mL of 0.1 M phosphate
buffer (pH 7.3).
Two-step carbodiimide method: The procedure was similar to the one-step procedure with the
following distinction. The EDC and sulfo-NHS were dissolved in the volume of 0.5 mL and
were added to the washed nanofibers. The activation process continued for 120 min and the
supernatant was then replaced by 1 mL of trypsin solution with benzamidine (unless stated
otherwise, 3 mg of trypsin with 0.3 mg of benzamidine dissolved in 1 mL of the 0.01 M
phosphate buffer [pH 7.3]).
Storage and Desiccation
Tryp-NF were stored in 1 mL of 0.1 M phosphate buffer (pH 7.3) with sodium azide (0.1%
w/v) and benzamidine (0.03 w/v) at 4°C. Desiccation (24 h) and storage of desiccated
nanofibers occurred in the air at laboratory temperature. Prior to determining trypsin activity,
Tryp-NF were rehydrated for 10 min in 2 mL of ultrapure water and then washed with
ultrapure water (3 × 1 mL) and finally with 0.05 M Tris-HCl buffer, pH 7.8 (1 × 1 mL).
82
Determination of Trypsin Activity
Trypsin activity was determined using the low-molecular-weight chromogenic substrate
BApNA according to a method from the literature31 in the final reaction volume of 2 mL.
Using a MultiScan RC spectrophotometric reader (Labsystems, Helsinki, Finland),
absorbance at 405 nm was measured and trypsin activity per cm2 was calculated. The
following formula can be used for recalculating the trypsin activity to IU/mg: (enzyme
activity per cm2) / (weight of 2.25 cm2 of nanofibers of the particular basis weight [i.e., 0.54
mg for 2.4 g/m2 and 0.63 for 2.8 g/m2 nanofibers]).
Tests for in vitro Cytotoxicity
For these experiments squares of Tryp-NF were prepared according to the method described
above (One step carbodiimide method of trypsin immobilization). The cytotoxicity of
prepared Tryp-NF was examined in the Certified Laboratory of Tissue Cultures in Nove
Hrady, Czech Republic, according to the CSN EN ISO 10993-5, Biological evaluation of
medical devices — Tests for in vitro cytotoxicity (8.2 and 8.3). All experiments were
performed with HeLa cells (ECACC 09E047).
Tests for in vivo Irritation and Skin Sensitization
For these experiments squares of Tryp-NF were prepared according to the method described
above (One step carbodiimide method of trypsin immobilization). The intracutaneous
(intradermal) reactivity test after the application of Tryp-NF to the albino rabbits was carried
out in the Certified Laboratory Nr. 1057 of VUOS, Rybitvi, Czech Republic according to the
CSN EN ISO 10993-10, Biological evaluation of medical devices — Tests for irritation and
skin sensitization (6.4).
Results
Preparation of Chitosan Nanofibers
Nanofibers of different basis weight (i.e., fiber weight per area) ranging from 1 to 2.8 g/m2
with diameters between 107.7 and 128.9 nm were prepared and characterized, as summarized
in Table I. The homogeneity and uniformity of the prepared chitosan nanofibers was
evaluated using SEM (Fig. 1A–C). Nanofiber squares with a high degree of homogeneity and
no structural defects were chosen. Unless specified otherwise in the text, nanofibers of 2.4 or
2.8 g/m2 were used for the functionalization.
83
Table I. Characteristics of prepared chitosan nanofibers.
Polymer
Basis weight [g/m2]
Fiber diameter ± SD [nm]
Chitosan
1.0
1.2
1.4
1.7
2.2
2.5
2.4
2.8
128.9 ± 18.9
107.7 ± 18.8
114.3 ± 11.9
Figure 1. Scanning electron microscope images of prepared chitosan nanofibers (basis weight 2.8 g per m2).
Magnification: (A) 150x, (B) 600x, (C) 5,000x.
Trypsin Conjugation to Periodate-Activated Carbohydrates of Chitosan Nanofibers
Nanofibers oxidation was performed in distilled water, 0.1 M borate buffer (pH 10), 0.1 M
carbonate buffer (pH 9.0), 0.1M, 0.01 M phosphate buffer (pH 7.3), 0.025 M HEPES (pH 7.3)
or their mixtures. The only option leading to unmodified appearance of nanofibers after the
oxidation step (evaluated using SEM) consisted in the dissolution of the sodium periodate in
0.025 M HEPES (pH 7.3) and the addition of nanofibers that had previously been hydrated in
0.01 M phosphate buffer (pH 7.3).
The effect of increasing the amount of trypsin (1, 2, 3, 4 and 5 mg) used for the
biofunctionalization of periodate-activated nanofibers on the final activity of immobilized
trypsin was then investigated (see Fig. 2). The maximum achieved enzyme activity was 57.58
IU/cm2 and was attained after the immobilization of 4 mg of trypsin. The immobilization of
higher quantities of trypsin (>4 mg) did not lead to higher enzyme activity and was thus
redundant.
84
Figure 2. Optimization of the amount of trypsin to be immobilized on chitosan nanofibers (1.5 × 1.5 cm) by the
trypsin conjugation to periodate-activated nanofibers.
Trypsin Conjugation to Chitosan Nanofibers by Carbodiimide Method
The suitable pH for immobilization of trypsin using the one-step carbodiimide technique was
investigated with the aim of achieving maximum activity of immobilized trypsin while
maintaining the integrity of chitosan nanofibers. No pronounced influence of pH of phosphate
buffer on trypsin coupling was observed (Fig. 3). Although the highest trypsin activity was
measured after immobilization at pH 6.5 (190.36 IU of trypsin per cm2 of nanofibers), the
structure of nanofibers was in that case slightly disintegrated. Phosphate buffer at pH 7.3 was
selected as a coupling buffer for the subsequent experiments (167.7 IU of trypsin per cm2),
and this provided a good environment to maintain the structural integrity of nanofibers.
Figure 3. Effect of pH of immobilization buffer on activity of immobilized trypsin (carbodiimide one-step
method).
85
In the case of the two-step carbodiimide immobilization method, the extra optimization time
required for the activation of nanofibers with EDC and sulfo-NHS reagents was vital.
Different activation times in the interval from 15 to 120 min were tested in order to achieve
maximum proteolytic activity of the prepared nanofibers. An increasing trend was observed;
the highest trypsin activity was achieved after the longest activation time (i.e., 120 min; Fig.
4). Further prolongation of the activation time has not been tested since it would lead to the
unwanted extension of biofunctionalization time of Tryp-NF. Even after this improvement in
the method, however, enzyme yields did not exceed the trypsin activity achieved after trypsin
immobilization using the previously described one-step carbodiimide method.
Figure 4. Effect of activation time (i.e., activation of nanofibers with EDC plus sulfo-NHS reagents) on activity
of trypsin immobilized by the two-step carbodiimide method on chitosan nanofibers.
To find the optimal amount of trypsin for the biofunctionalization of chitosan nanofibers
using both variants of the carbodiimide protocols, increasing quantities of trypsin were added
to the immobilization mixture (1, 2, 3, 4, and 5 mg of trypsin, see Fig. 5). Significant
differences were observed between the one-step and two-step variants in the final activities of
immobilized trypsin. With increasing amounts of trypsin added into the reaction, the activity
of trypsin-functionalized nanofibers using the one-step protocol increased almost linearly.
Trypsin immobilization using the one-step carbodiimide method was proved as the best
approach resulting in the activity from 131.51 IU/cm2 up to 209.80 IU/cm2 and was applied
for preparation of Tryp-NF for the stability experiments and also for preliminary toxicity
testing.
86
Figure 5. Optimization of the amount of trypsin to be immobilized on chitosan nanofibers (1.5 × 1.5 cm) by
the carbodiimide method.
The effect of different basis weights of chitosan nanofibers on trypsin loading was also
investigated. Electrospun chitosan nanofibers of the same diameter but different weights were
prepared and biofunctionalized using the one-step carbodiimide method as you can see in
Figure 6. There was no unambiguous dependence between the density of nanofibers and the
amount of active trypsin immobilized on them.
Figure 6. Effect of different basis weights of chitosan nanofibers on activity of trypsin immobilized by the
carbodiimide one-step procedure.
87
Storage and Operational Stability of Trypsin-Functionalized Nanofibers
To demonstrate the long-term usability of Tryp-NF, their storage stability was monitored for 4
weeks in dry or hydrated forms. Higher enzyme activity was achieved when the
biofunctionalized nanofibers were desiccated and stored in a dried state. Nevertheless, in both
cases trypsin activity after 4 weeks of storage exceeded 90% compared to the initial activity
measured immediately after immobilization (Fig. 7).
Figure 7. Effect of storage time and conditions on activity of trypsin immobilized on chitosan nanofibers by the
carbodiimide one-step procedure.
The operational stability of trypsin immobilized on nanofibers was determined five
times in a row during 1 day and even after the last run the enzyme activity did not fall under
97% (98.4 ± 1.2).
Preliminary In vitro Evaluation of Cytotoxicity of Tryp-NF and in vivo Tests for
Irriation and Skin Sensitization
The in vitro experiments with Hela Cells showed that Tryp-NF exhibited no cytotoxicity
after the direct contact nor the infusion from Tryp-NF showed no sign of cytotoxicity. The in
vitro tests for intracutaneous (intradermal) reactivity demonstrated that Tryp-NF has not
caused any cutaneous reaction on albino rabbit and no signs of toxicity were observed.
Discussion
In this study a robust strategy for covalent biofunctionalization of chitosan nanofibers with
proteolytic enzymes without altering their mechanical integrity is presented. The work was
carried out with the aim to prepare enzymatically active and stable nanofibers that will be
applied as advanced bioactive wound dressing. Due to proposed application, the following
88
particularities were defined for this study: (i) the enzyme activity per unit area (cm2) was
more relevant than was the usual activity per mass expression (see Materials and Methods for
recalculating activity per unit area to mass); (ii) nanofibers from the biocompatible polymer
chitosan and heat-mediated post-synthetic crosslinking of nanofibers without any additional
chemicals were chosen; (iii) glutaraldehyde, an often used homobifunctional crosslinking
agent for enzyme immobilization, was deliberately omitted from the procedure to assure the
highest possible biocompatibility and minimal irritant effects when coming into contact with
tissues.
For preparation of the nanofibers, we used the modified needleless NanospiderTM
technology,30 in which polymeric jets are spontaneously formed from liquid surfaces on
a rotating spinning electrode. Generally, this technology enables flexibly the formation of
fibers tens of nanometers to tens of micrometers in diameter and the preparation of nanofibers
with masses per unit area ranging from 1 to 100 g/m2. The thinner the nanofibers are the
higher specific surface area is achieved which is advantageous for the immobilization of
enzymes. Here we aimed at chitosan matrices with fibers diameter from 107.7 up to 128.9 nm
and low basis weight supporting the oxygen permeability and thus the breathability of the
nanofibrous layer.
As has been described in numerous reviews, the methods applied for enzyme immobilization
on nanofibers do not differ from standard bioconjugation techniques32 and include adsorption,
covalent immobilization, enzyme entrapment and encapsulation.5,33,34 From this list, covalent
bonding is often preferred because it provides stable linkage between enzymes and
nanofibers. Glutaraldehyde crosslinking35,36 and carbodiimide chemistry37,38 are two covalent
techniques most commonly applied for biofunctionalization of nanofibers and typically result
in high loading yields.
Here, two different immobilization approaches (oxidation of carbohydrates on chitosan and
carbodiimide coupling) were used with various modifications, optimized, and finally
compared from the viewpoint of the immobilized trypsin’s activity achieved.
The first immobilization method applied in this study is based upon mild oxidation of
carbohydrates on chitosan using sodium periodate, which acts on the adjacent hydroxyl
groups. Highly reactive aldehyde groups are thereby created and react with an aminecontaining ligand, in our case trypsin. Reductive amination follows to form a highly stable
covalent linkage and a zero-length crosslink.39 Chitosan is insoluble in water, but the presence
of amine groups makes it soluble in acidic solutions with pH below 6.5.20 Therefore careful
choice of the reaction environment (pH, buffer type and its molarity) during all steps of
89
trypsin conjugation by this approach is a key condition for preserving nanofibers integrity and
thus the development of stable nanofibrous layers with high proteolytic activity. The second
immobilization approach relies on the formation of amide and ester linkages mediated by the
zero-length crosslinker carbodiimide (EDC). The addition of sulfo-NHS to the EDC-mediated
reaction increases the solubility and stability of the active intermediate O-acylisourea
subsequently reacting with the amine and hydroxyl group of chitosan.40 EDC/sulfo-NHScoupled reactions are generally considered as highly efficient39 and can be performed using a
one- or two-step procedure. Here both variants were tried. As written above, the highest
trypsin activity of Tryp-NF was achieved when carbodiimide one-step conjugation protocol
was applied. The reported trypsin loading (expressed as IU/mg) was comparable or even
higher than in the literature describing the immobilization of alpha-chymotrypsin on silk
fibroin nanofibers36 or lipase to poly(acrylonitrile-co-maleic acid) 35.
Storage as well as operational stability are generally important parameters for enzyme carriers
applied in the field of biocatalysis. Enzyme immobilization typically improves the stability of
enzymes,5 as has been reported several times already when nanofibers have been used as
support.41 These parameters are particularly important in case of enzymes with the ability of
autolysis, as trypsin. In our case the storage stability Tryp-NF was excellent. An increase in
trypsin activity recorded after 1 week of storage (particularly evident on dry nanofibers,
Figure 7) is a commonly observed phenomenon caused by the restoration of functional
conformation leading to enzyme reactivation.35 These experiments repeatedly confirmed high
and sufficient proteolytic activity of stored Tryp-NF. Storage of Tryp-NF in a dry form lead to
higher trypsin activity after 4 weeks of storage compared to the hydrated form, indicating
their usability as wound dressings since the dry form is more practical and also strongly
demanded by the potential end users. Dry form of storage also excludes the risk of autolytic
self-degradation of trypsin in time. High operational stability of Tryp-NF determined after the
5th reuse clearly showed its excellent ability to repeatedly cleave the target substrate without
any substantial activity loss. This is extremely beneficial feature from the point of view of the
intended application, since it might prolong the duration of the action of this wound dressing
without the need of redressing.
In the end the preliminary toxicity tests with Tryp-NF were done according to standardized
ISO procedures in the certified laboratories with the appropriate facilities. The in vitro tests
were designed to determine the biological response of mammalian cells (HeLa cells) exposed
directly to Tryp-NF and to extracts of Tryp-NF in EMEM (Eagle's Minimum Essential
Medium). In the in vivo experiments, the Tryp-NF were extracted to sterile water (as a polar
90
solvent) and olive oil (nonpolar solvent) and both extracts were injected intracutaneously at
five sites on one side of each albino rabbit. The appearance of each injection site immediately
after injection and at (24 ± 2) h, (48 ± 2) h and (72 ± 2) h after injection were observed and
possible skin reactions (erythema and/or oedema) were recorded. Results from both in vitro
and in vivo tests showed no cytotoxicity of Tryp-NF, which supported the idea of using of
nanofibers with immobilized proteolytic enzymes as the bioactive wound dressings.
Conclusions
In this work, biocompatible chitosan electrospun nanofibers prepared using a needleless
electrospinning technology were biofunctionalized by the enzyme trypsin. Not only trypsin
activity but also the nanofibers’ integrity were important parameters taken into account in
optimizing all steps during the nanofibers’ biofunctionalization. Maximum trypsin activity
and excellent wholeness of chitosan nanofibers were achieved when the one-step EDC+sulfoNHS method was performed. This resulted in activity up to 209.8 ± 0.6 IU/cm2 of nanofibers.
The two-step EDC+sulfo-NHS protocol yielded activity up to 88.2 ± 8.9 IU/cm2 and the
periodate oxidation method up to 57.6 ± 14.7 IU/cm2. This study confirmed that nanofibers
from pure chitosan can serve as an excellent support for enzyme immobilization, and
especially when each step of biofunctionalization is thoroughly optimized in order to prevent
dissolution or disintegration of the nanofibrous structure. The excellent stability of trypsin
immobilized on chitosan nanofibers together with no toxicity of Tryp-NF reported here
suggests their potential commercial applicability.
Acknowledgement
The authors wish to acknowledge the Ministry of Industry and Trade for financial support of
the research program under grant MPO TIP FR-TI1/0436.
References
1. Kumar C. Biofunctionalization of nanomaterials. 1st ed. Weinheim: Wiley; 2005.
2. Jia H, Zhu G, Vugrinovich B, Kataphinan W, Reneker DH, Wang P. Enzyme-carrying
polymeric nanofibers prepared via electrospinning for use as unique biocatalysts.
Biotechnol Prog 2002;18:1027-1032.
3. Liese A, Hilterhaus L. Evaluation of immobilized enzymes for industrial applications.
Chem Soc Rev 2013;42:6236-6249.
91
4. Katchalski-Katzir E. Immobilized enzymes - learning from past successes and failures.
Trends Biotechnol 1993;11:471-478.
5. Cao L, Schmid RD. Carrier-bound immobilized enzymes: Principles, application and
design. 1st ed. Weinhein: Wiley; 2006.
6. Tischer W, Wedekind F. Immobilized enzymes: Methods and applications. Fessner W,
Archelas A, Demirjian DC, editors. Biocatalysis - from discovery to application, vol 200.
Berlin: Springer; 1999:95-126.
7. Wang Z, Wan L, Liu Z, Huang X, Xu Z. Enzyme immobilization on electrospun polymer
nanofibers: An overview. J Molec Catal B 2009;56:189-195.
8. Jia H. Enzyme-carrying electrospun nanofibers. In: Wang P, editor. Nanoscale biocatalysis:
Methods and protocols, vol 743, New York: Humana Press; 2011:205–212.
9. Huang Z, Zhang Y, Kotaki M, Ramakrishna S. A review on polymer nanofibers by
electrospinning and their applications in nanocomposites. Composites Sci Technol
2003;63:2223-2253.
10. Petrik S, Maly M, Rubacek L, Macak J, Stranska D, Duchoslav J, Coppe A. Electrospun
nanofiber – the tiny layers that add great value to nonwovens. Proceedings of
International Nonwoven Symposium. Stockholm: EDANA, 2008.
11. Jirsak O, Kalinova K, Stranska D. Nanofibre technologies and nanospider applications.
Presented at the 5th International Nanotechnology Symposium “Nanofair - New Ideas for
Industry”, Karlsruhe, November 21-22, 2006.
12. Kim SH, Kim J. COLL 437-highly active and stable enzyme-coated nanofibers for
detection and decontamination. Abstr Pap Am Chem S 2007; 234: U437-U437.
13. Han D, Filocamo S, Kirby R, Steckl AJ. Deactivating chemical agents using enzymecoated nanofibers formed by electrospinning. ACS Appl Mater Interfaces 2011;3:46334639.
14. du Plessis DM, Botes M, Dicks LMT, Cloete TE. Immobilization of commercial
hydrolytic enzymes on poly (acrylonitrile) nanofibers for anti-biofilm activity. J Chem
Technol and Biot 2013;88:585-593.
15. Ren G, Xu X, Liu Q, et al. Electrospun poly(vinyl alcohol)/glucose oxidase biocomposite
membranes for biosensor applications. React Funct Polym 2006;66:1559-1564.
16. Sawicka K, Gouma P, Simon S. Electrospun biocomposite nanofibers for urea biosensing.
Sensor Actuat B-Chem 2005;108:585–588.
17. Buschle-Diller G, Cooper J, Xie Z, Wu Y, Waldrup J, Ren X. Release of antibiotics from
electrospun bicomponent fibers. Cellulose 2007;14:553-562.
18. Sahoo S, Ang LT, Goh JC, Toh S. Growth factor delivery through electrospun nanofibers
in scaffolds for tissue engineering applications. J Biomed Mater Res Part A
2010;93A:1539-1550.
19. Choi JS, Choi SH, Yoo HS. Coaxial electrospun nanofibers for treatment of diabetic
ulcers with binary release of multiple growth factors. J Mater Chem 2011;21:5258-5267.
20. Krajewska B. Application of chitin- and chitosan-based materials for enzyme
immobilizations: A review. Enzyme Microb Technol 2004;35:126-139.
92
21. Ding F, Deng H, Du Y, Shi X, Wang Q. Emerging chitin and chitosan nanofibrous
materials for biomedical applications. Nanoscale 2014;6:9477-9493.
22. Kubinova S, Sykova E. Nanotechnologies in regenerative medicine. Minim Invasive Ther
2010;19:144-156.
23. Rieger KA, Birch NP, Schiffman JD. Designing electrospun nanofiber mats to promote
wound healing - a review. J Mat Chem B 2013;1:4531-4541.
24. Sinclair And RD, Ryan TJ. Proteolytic enzymes in wound healing: The role of enzymatic
debridement. Australas J Dermatol 1994;35:35-41.
25. Mekkes JR, Le Poole IC, Das PK, Bos JD, Westerhof W. Efficient debridement of
necrotic wounds using proteolytic enzymes derived from antarctic krill: A double-blind,
placebo-controlled study in a standardized animal wound model. Wound Repair Regen
1998;6:50-57.
26. Connell J, Rousselot L. The use of enzymatic agents in the debridement of burn and
wound sloughs. Surgery 1951;30:43-55.
27. Ramundo J, Gray M. Enzymatic wound debridement. J Wound Ostomy Cont Nurs
2008;35:273-280.
28. Miller JD, Carter E, Hatch DC, Zhubrak M, Giovinco NA, Armstrong DG. Use of
collagenase ointment in conjunction with negative pressure wound therapy in the care of
diabetic wounds: A case series of six patients. Diabetic Foot & Ankle 2014;6.
29. Ramundo J, Gray M. Collagenase for enzymatic debridement A systematic review. J
Wound Ostomy Cont Nurs 2009;36:S4-S11.
30. Jirsak O, Sanetrnik F, Lukas D, Kotek K, Martinova L, Chaloupek J. U.S. patent No.
WO205024101. 2005.
31. Korecka L, Jezova J, Bílková Z, Horák D, Hradcova O, Slovakova M, Viovy JL.
Magnetic enzyme reactors for isolation and study of heterogeneous glycoproteins. J
Magn Magn Mater 2005;293:349-357.
32. Agarwal S, Wendorff JH, Greiner A. Chemistry on electrospun polymeric nanofibers:
Merely routine chemistry or a real challenge? Macromol Rapid Commun 2010;31:13171331.
33. Brena BM, Batista-Viera F. Immobilization of enzymes. Guisán JM, editor.
Immobilization of enzymes and cells, vol 22, Totowa, NJ: Humana Press;2006:15-30.
34. Sassolas A, Blum LJ, Leca-Bouvier BD. Immobilization strategies to develop enzymatic
biosensors. Biotechnol Adv 2012;30:489-511.
35. Ye P, Xu Z, Wu J, Innocent C, Seta P. Nanofibrous membranes containing reactive
groups: Electrospinning from poly(acrylonitrile-co-maleic acid) for lipase
immobilization. Macromolecules 2006;39:1041-1045.
36. Lee K, Ki C, Baek D, Kang G, Ihm D, Park Y. Application of electrospun silk fibroin
nanofibers as an immobilization support of enzyme. Fiber Polym 2005;6:181-185.
37. Ye P, Xu Z, Wu J, Innocent C, Seta P. Nanofibrous poly(acrylonitrile-co-maleic acid)
membranes functionalized with gelatin and chitosan for lipase immobilization.
Biomaterials 2006;27:4169-4176.
93
38. Huang X, Yu A, Jiang J, Pan C, Qian J, Xu Z. Surface modification of nanofibrous
poly(acrylonitrile-co-acrylic acid) membrane with biomacromolecules for lipase
immobilization. J Mol Catal B-Enzym 2009;57:250-256.
39. Hermanson GT. Bioconjugate techniques. 2nd ed. Amsterdam: Academic Press;
2008:1202.
40. Hermanson GT. Chapter 4 - Zero-length crosslinkers. Hermanson GT, editor.
Bioconjugate techniques. Boston: Academic Press; 2013:259-273.
41. Li Y, Quan J, Branford-White C, Williams GR, Wu J, Zhu L. Electrospun
polyacrylonitrile-glycopolymer nanofibrous membranes for enzyme immobilization. J
Mol Catal B-Enzym 2012;76:15-22.
94
5.1.3 Užitný vzor
Prostředek pro aplikaci proteolytických enzymů na ránu a prostředek ke krytí ran
Národní užitný vzor č. 26861
Číslo přihlášky: 2012-27049
Datum podání přihlášky: 21.11.2012
Datum zápisu užitného vzoru: 28.4.2014
Původci:
STRÁNSKÁ D., SLOVÁKOVÁ M., KUČEROVÁ J., BÍLKOVÁ Z.
Přihlašovatelé: Elmarco, s.r.o., Univerzita Pardubice
95
96
97
98
99
100
101
102
103
5.2
Modifikace magnetických částic poly(ethylenglykolem) a anti-EpCAM
protilátkami pro mikrofluidní separaci EpCAM pozitivních buněk
Tato práce navazovala na Článek I a rovněž vznikla v rámci evropského projektu
CAMINEMS. V tomto projektu byl vyvíjen magnetický imunosorbent pro mikrofluidní
izolaci cirkulujících nádorových buněk (angl. circulating tumor cells, CTC) exprimující
diagnostický povrchový marker – glykoprotein EpCAM. Vyvinuté magnetické PGMA částice
tak byly biofunkcionalizovány specifickými anti-EpCAM protilátkami, avšak po jejich
vložení do mikrofluidního PDMS čipu, nazvaného Ephesia, vyvinutém na spolupracujícím
pracovišti Institutu Curie v Paříži, došlo k masivní agregaci imunosorbentu a k adhezi na
stěny kanálků. Přirozeně tak bylo nutné částice před imobilizací protilátek povrchově
modifikovat, konkrétne polymerem poly(ethylenglykolem), PEGem.
Výsledkem je Článek II zabývající se nejen vazbou PEGu na částice, ale především
metodami jeho průkazu a kvantifikace jeho množství na povrchu částic, což se ukázalo být
poměrně komplikované. Součástí práce je rovněž hodnocení míry nespecifické adsorpce
proteinů a buněk na povrch částic a ověření jejich chování v mikrofluidních systémech. Aby
bylo možné PEG využít jako raménko pro následnou imobilizaci bioaktivních látek, byla
křenová peroxidáza jako modelový enzym imobilizována přes PEG nesoucí terminální
hydroxylovou skupinu. Podíl autorky na experimentální části práce byl většinový, s výjimkou
syntézy částic, SEM mikroskopie, IČ analýzy částic a provedení experimentů s nespecifickou
adhezí buněk. Rovněž sepsání publikace bylo výhradně v gesci autorky, opět s výjimkou
specifických pasáží týkajících se výše zmíněných technik; celkový podíl dizertantky na
publikaci činil 85 %.
PEGylované částice byly následně biofunkcionalizovány specifickými anti-EpCAM
protilátkami
a
tento
imunosorbent
byl
použit
pro
imunomagnetickou
separaci
(homobifunkční hydrazid-PEG-hydrazid a heterobifunkční amin-PEG-karboxyl) a tedy
i metodou imobilizace na magnetické částice byly testovány coby raménko pro následnou
vazbu anti-EpCAM protilátek. Výsledkem této práce je Článek III, ve kterém měla autorka
pouze částečný podíl na experimentech (výběr PEGů, PEGylace částic, případně vazba
protilátek a spolupráce na experimentech v čipu). Sepsání výsledků do formy publikace bylo
dílem prvního autora článku. Procentuálně lze podíl dizertantky na publikaci vyjádřit jako
40%.
104
5.2.1 Článek II
PEGylation of magnetic poly(glycidyl methacrylate) microparticles for microfluidic
bioassays
KUČEROVÁ J.A, SVOBODOVÁ Z.A, KNOTEK P.B, PALARČÍK J.C, VLČEK M.D1,
KINCL M.D1, HORÁK D.D, AUTEBERT J.E, VIOVY J-LE a BÍLKOVÁ ZA*
a Department of Biological and Biochemical Sciences, Faculty of Chemical Technology,
University of Pardubice, Studentska 573, 532 10 Pardubice, Czech Republic.
b Joint Laboratory of Solid State Chemistry of IMC and University of Pardubice, Faculty of
Chemical Technology, University of Pardubice, Studentska 573, 532 10 Pardubice, Czech
Republic.
c Institute of Environmental and Chemical Engineering, Faculty of Chemical Technology,
University of Pardubice, Studentska 573, 532 10 Pardubice, Czech Republic.
d Institute of Macromolecular Chemistry, Academy of Sciences of the Czech Republic,
Heyrovsky Sq. 2, 162 06 Prague 6, Czech Republic.
e Macromolecules and Microsystems in Biology and Medicine, Institute Curie, UMR 168, 26
Rue d′Ulm, 75005 Paris, France.
1 Present address: Joint Laboratory of Solid State Chemistry of Institute of Macromolecular
Chemistry of the Academy of Sciences of the Czech Republic and University of Pardubice,
Studentska 84, 532 10 Pardubice, Czech Republic.
Mater. Sci. Eng. C-Mater. Biol. Appl. C, 40 308–315. DOI 10.1016/j.msec.2014.04.011.
IF (2014) 3,088
105
106
107
108
109
110
111
112
113
5.2.2 Článek III
Application of an improved magnetic immunosorbent in an Ephesia chip designed
for circulating tumor cell capture
SVOBODOVÁ Z.1, KUČEROVÁ J.1, AUTEBERT J.2, HORÁK D.3, BRUČKOVÁ L.1,
VIOVY J.-L.2, BÍLKOVÁ Z.1
1Department of Biological and Biochemical Sciences, Faculty of Chemical Technology,
University of Pardubice, Pardubice, Czech Republic
2Macromolecules and Microsystems in Biology and Medicine, Institute Curie, Paris, France
3Institute of Macromolecular Chemistry, Academy of Sciences of the Czech Republic,
Prague, Czech Republic
Electrophoresis, 35, 323-329. DOI 10.1002/elps.201300196.
IF (2014) 3,028
114
115
116
117
118
119
120
121
5.3
Vývoj nosiče pro imunomagnetickou separaci salmonel v mikrofluidním
čipu
Cílem evropského projektu LOVE-FOOD (2012-2016) je vyvinout mikrofluidní
analyzátor pro průkaz vybraných patogenů (Salmonella Typhimurium, Bacillus cereus)
z mléčných výrobků.
Pro mikrofluidní imunoprecipitace byl v r. 2012 vyvinut na partnerském pracovišti Curie
Institut, Paříž, Francie zcela nový typ čipu inspirovaný kolonovým magneticky
stabilizovaným fluidním ložem (prezentováno formou konferenčního příspěvku: Tabnaoui
a kol. 2012). Tento typ čipu byl v r. 2014 patentován (Viovy a kol. 2014). V rámci projektu
LOVE- FOOD byl čip konstrukčně přizpůsoben konkrétně pro mikrofluidní záchyt bakterií
a byla v něm následně ve spolupráci s naším pracovištěm a s Institutem Pasteur, Paříž,
Francie, optimalizována technika imunomagnetického záchytu buněk a jejich následná
detekce (prezentováno zatím pouze formou konferenčního příspěvku: Pereiro a kol. 2014).
Výsledky z této práce byly sepsány formou publikace, kterou spolupracující pracoviště
aktuálně připravuje pro odeslání do prestižního časopisu Nature Communications (IF 11,470)
(Rukopis II). Podíl dizertantky na tomto rukopisu je 30 %.
Úkolem našeho pracoviště v rámci projektu bylo připravit účinný specifický
imunosorbent pro mikrofluidní magnetickou separaci bakterií Salmonella Typhimurium.
Výsledky této navazující práce byly již rovněž sepsány do podoby rukopisu (Rukopis III),
který však nesmí být odeslán do chvíle, než bude opublikována pilotní práce detailně
popisující mikrofluidní čip (viz prohlášení Stephanie Descroix, Ph.D., str. 126). Poté bude
rukopis odeslán k posouzení do International Journal of Food Microgiology (IF 3,082). Podíl
autorky na experimentech je většinový (s výjimkou vývoje mikrofluidního čipu), stejně tak
jako na psaní publikace; procentuálně vyjádřeno 90 %.
Pereiro, I., Kučerová, J., Alexandre, L., Dupuy, B., Bílková, Z., Viovy, J.-L-, Malaquin, L., Descroix,
S.:Microfluidic magnetic fluidized bed for bacteria extraction, growth and detection. In Proceedings of the
MicroTAS 2014 Conference, ISBN 978-0-979806426-30-7-6, San Antonio, Texas, USA, s. 437-439.
Tabnaoui, S., Malaquin, L., Descroix, S., Viovy J-L.: Integrated microfluidic fluidized bed for sample
preconcentration and immunoextraction. In Proceedings of the MicroTAS 2012 Conference, ISBN 978-09798064-5-2, Okinawa, Japonsko, s. 1408-1410.
Viovy, J., Tabnaoui, S., Malaquin, L. a Descroix, S., 2014. Systeme microfluidique presentant un lit de
particules magnetiques. Patent WO2014037674 A1. 13.3.2014. PCT/FR2013/052057.
122
5.3.1 Rukopis (manuskript) II
Microfluidic fluidized bed: a new microfluidic module for bacteria detection
PEREIRO I.1, TABNANOUI S.1, BENDALI A.1, SRBOVÁ J.2, BÍLKOVÁ Z.2, DUPUY B.3,
DESCROIX S.3
1Macromolecules and Microsystems in Biology and Medicine, Institute Curie, UMR 168, 26
Rue d′Ulm, 75005 Paris, France
2Dept. of Biological and Biochemical Sciences, Faculty of Chemical Technology, University
of Pardubice, Studentska 573, 53210 Pardubice, Czech Republic
3Lab. of Pathogenesis of Bacterial Anaerobes, Dept. Microbiol., Institut Pasteur, 25 rue du
docteur roux, 75724 Paris, France.
Připravováno pro odeslání v listopadu 2015 do Nat. Commun.
IF (2014) 11,470
123
Příprava rukopisu je v gesci spolupracujícího pracoviště, Institutu Curie. Z tohoto
důvodu zde není uveden připravovaný rukopis v celém rozsahu. Na následujících řádcích je
tedy alespoň zjednodušeně popsán princip vyvinutého mikrofluidního systému, aby bylo
možné plné porozumění Rukopisu III.
Obsahem tohoto rukopisu je popis a aplikace vyvinutého mikrofluidního analyzátoru
pracujícího na principu magneticky stabilizovaného fluidního lože. V tomto mikrofluidním
čipu se magnetické částice nachází ve vznosu ve stavu ustálené dynamické rovnováhy.
Tohoto stavu je dosaženo díky následujícím vzájemně se vyrovnávajícím silám působícím
na částice: hydrodynamická síla okolní proudící kapaliny a magnetická síla způsobená
přiloženým permanentním magnetem (Obrázek 1a). Rozměry, geometrie a kónický tvar
hlavní komory čipu jsou přizpůsobeny tomu, aby byly částice ve vznosu stabilní,
aby nedocházelo k jejich ztrátě a zároveň aby probíhala jejich neustálá recirkulace.
Tento mikrofluidní čip může pracovat v režimu aplikovaného konstantního tlaku nebo
průtoku. Při minimálním průtoku kapaliny nebo při jeho úplném zastavení dochází k tzv.
„zavírání“ fluidního lože ve směru k přiloženému magnetu a vytvoření tzv. kompaktního lože,
zátky (angl. packed bed regime) (Obrázek 1b). Naopak při průtoku kapaliny (až do rychlosti
3 µl/min) dochází k vytvoření dynamické rovnováhy a částice vytvoří v čipu tzv. fluidní lože,
vrstvu (angl. fluidized bed regime). Ve fluidním režimu je dosaženo vysoké porozity vrstvy
a recirkulace částic, čímž je zajištěn vysoký specifický povrch částic pro interakci
s analyzovaným
kapalným
vzorkem.
V
tomto
režimu
probíhají
imunoprecipitace
(b)
MAGNET
(a)
MAGNET
Intenzita magnetického pole
nebo imunomagnetické separace cílových analytů.
Obrázek 1: (a) Schématické znázornění principu mikrofluidního magneticky stabilizovaného fluidního lože.
(b) Snímek PDMS mikrofluidního čipu ve dvou různých pracovních režimech: horní snímek znázorňuje
kompaktní lože magnetických částic (stav bez průtoku kapaliny, působí pouze magnetická přitažlivá síla), spodní
snímek znázorňuje stejný čip po spuštění průtoku kapaliny čipem a vytvoření fluidní vrstvy, ve které jsou částice
v dynamické rovnováze a recirkulují.
124
5.3.2 Rukopis (manuskript) III
Advanced specific immunosorbent for microfluidic capturing and pre-concentration
of milkborn pathogens
SRBOVÁ J.1, HOLUBOVÁ L.1, KRULIŠOVÁ P.1, PEREIRO I.2, BENDALI A.2, DUPUY
B.3, HAMIOT A.3, DESCORIX S.2, VIOVY J.-L.2, BÍLKOVÁ Z.1
1Dept. of Biological and Biochemical Sciences, Faculty of Chemical Technology, University
of Pardubice, Studentska 573, 53210 Pardubice, Czech Republic
2Macromolecules and Microsystems in Biology and Medicine, Institute Curie, UMR 168, 26
Rue d′Ulm, 75005 Paris, France
3Lab. of Pathogenesis of Bacterial Anaerobes, Dept. Microbiol., Institut Pasteur, 25 rue du
docteur roux, 75724 Paris, France.
Připraveno k odeslání do Int. J. Food Microbiol.
IF (2014) 3,082.
125
126
Specific Immunosorbent for Advanced Microfluidic Capturing and Pre-Concentration
of Milkborn Pathogens
Jana Srbova1, Lucie Holubova1, Pavla Krulisova1, Iago Pereiro2, Amel Bendali2, Bruno
Dupuy3, Audrey Hamiot3, Stephanie Descroix2, Jean-Louis Viovy2, Zuzana Bilkova1
1
Dept. of Biological and Biochemical Sciences, Faculty of Chemical Technology, University
of Pardubice, Studentska 573, 53210 Pardubice, Czech Republic; Email:
[email protected].
2
Macromolecules and Microsystems in Biology and Medicine, Institute Curie, UMR 168, 26
Rue d′Ulm, 75005 Paris, France
3
Lab. of Pathogenesis of Bacterial Anaerobes, Dept. Microbiol., Institut Pasteur, 25 rue du
docteur roux, 75724 Paris, France.
Abbreviations
Ab
antibodies
CE
capture efficiency
EDC
N-(3-dimethylaminopropyl)-N′-ethylcarbodiimide hydrochloride
HRP
horseradish peroxidase
IMS
immunomagnetic separation
MES
2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid
Promag-KPL Promag microspheres biofunctionalized with the polyclonal anti-Salmonella
Ab
sulfo-NHS
from KPL
sodium salt of N-hydroxysulfosuccinimide
Abstract
Recent outbreaks of food-borne infections even in countries with advanced economics
accelerated the development of highly sensitive biosensors and portable microfluidic devices
for rapid pathogen detection. Therefore, the step-by-step preparation of the efficient antiSalmonella
immunosorbent
for
microfluidic
immunocapture
and
pre-concentration
of Salmonella Typhimurium from whole milk together with immunosorbent´s validation
is presented. Different factors were considered while choosing the suitable antibodies (Ab)
and particles, e.g. clonality and specificity of Ab, particles´ size, their binding capacity
and compatibility with microfluidics. This resulted in the development of the magnetic
127
immunosorbent carrying polyclonal goat anti-Salmonella Ab, further denoted as “PromagKPL”. Depending on the initial concentration of a pure culture of Salmonella (101 up to 105
CFU/mL) 69.2±23.5 % up to 86.2±12.6% capture efficiency (CE) were achieved using our
Promag-KPL microspheres. The selectivity of the immunosorbent was demonstrated
by immunomagnetic separation (IMS) from mixed cultures of Salmonella and E. coli; even
under the hundredfold surplus of E. coli the CE of Salmonella did not decline to less than
76.3±3.0 %. Then the IMS from milk differing in fat content (0.5-3.5%) artificially spiked
with Salmonella followed. The presence of milk globules and micelles neither affected
the behaviour of the prepared immunosorbent nor the achieved CE of Salmonella cells. After
that analogous experiments were performed in a microfluidic chip - magnetically stabilized
fluidized bed; CE from 86.4 up to 99.2 % were achieved. All these results pointed out
the quality of prepared immunosorbent and emphasized the efficiency of the miniaturized
systems compared to the experiments in larger sample volumes (0.5 mL). Magnetically
stabilized fluidized bed showed to be excellent in term of immunosorbents´ recirculation
assuring a high probability of collision with target bacteria which lead to high and specific
CE. Almost 100 % CE achieved during this separation and pre-concentration step is a perfect
springboard for some of the following microfluidic end-detection technique which could lead
to development of highly-sensitive and robust microfluidic device for detection of various
bacteria in liquid food samples.
Keywords: immunomagnetic separation; immobilization; antibodies; microfluidics; capture
efficiency; immunocapturing
Highlights
1.

Magnetic immunosorbent for the microfluidic capture of Salmonella was developed.

Capture rate of Salmonella in batch reached up to 86.2 % in a model buffer.

Immunocapture of Salmonella from milk was demonstrated in a microfluidic chip.

The capture efficiency of Salmonella increased in the microfluidic chip up to 99.3 %.
Introduction
Immunomagnetic separation (IMS) is an effective tool for selective isolation,
purification and pre-concentration of target analyte – peptides, proteins or whole cells like
bacteria – using magnetic beads coated with specific antibodies (e.g., reviewed in Cudjoe,
2014; Olsvik et al., 1994; Safarik and Safarikova, 2004). It can greatly increase the detection
128
probability and thereby the sensitivity of the whole detection or diagnostic assays (Duodu
et al., 2009). This technique is especially advantageous for the isolation of cells due to its
gentleness assuring high viability of captured cells (Safarik and Safarikova, 1999). The IMS
has become a widely applied approach also in the field of food microbiology where IMS
of bacteria from various complex food matrices like meat (Favrin et al., 2003; Hagren et al.,
2008; Zheng et al., 2014), eggs (Mine, 1997; Rijpens et al., 1999), fruit (Najafi et al., 2014;
Wang et al., 2014) or dairy products (Fisher et al., 2009; Liebana et al., 2009; Rijpens et al.,
1999) has been reported.
IMS is not detection method in itself. It is usually connected with the end-detection
methods like plating, PCR/real-time PCR (Metzger-Boddien et al., 2006; Zheng et al., 2014),
ELISA (Wang et al., 2013), lateral flow tests (Fisher et al., 2009) and others (Favrin et al.,
2003; Najafi et al., 2014; Perez et al., 1998). IMS is typically realized in batch – tubes
or flasks - but due to the magnetic properties of the immunosorbents it can be also
automatized and carried out in a microfluidic format. Choice of the detection methods
compatible with microfluidics (such as PCR) enables the development of miniaturized,
automatized and portable platforms integrating the pre-concentration step (IMS) and the final
detection of food pathogens. The need for development of such portable devices for routine
and rapid monitoring of food quality is still emerging in order to prevent massive food
outbreaks (Newell et al., 2010) such as Escherichia coli O104:H4 outbreak in Germany.
This effort is supported by the recent expansion of published papers dealing with rapid
biosensors-based immunocapture and detection of food-borne pathogens (Kim et al., 2015;
Wang et al., 2015; Zhang et al., 2011).
Magnetic immunosorbents, i.e. magnetic microspheres grafted with the antibodies
of desired specificity, applied for IMS of bacteria must meet at least these requirements:
excellent immunoreactivity with target bacteria and minimal nonspecific adsorption of the
abundant food matrices and accompanying non-target bacteria. The advantage of using Ab
immobilized on magnetic beads inserted and held in the particular chamber of microfluidic
chips over the Ab immobilized directly on the inner surface of the chips is potentially higher
specific surface and the possibility to wash away the immunocomplexes of bead-bacteria
for further analysis without the need of drastic disrupting the bead-bacteria bonding. When
inserting the immunosorbent into the microfluidic chips, following additional demands
are placed: (i) high colloidal stability under different conditions; (ii) satisfactory magnetic
response of the immunosorbent enabling rapid operation times; (iii) minimal adhesion of
the immunosorbent on the inner walls of microfluidic devices. However the offer of
129
the commercially available anti-bacterial immunosorbents is limited to selected common
pathogens, such as E. coli O57:H7, Listeria spp., Salmonella spp., Cryptosporidium oocysts
and sometimes they do not meet all the aforementioned criterions.
In this study, we focused on the development of our specific immunosorbent
for microfluidic IMS of a representative of common food-borne pathogens - Salmonella
enterica subsp. enterica ser. Typhimurium from milk. Attention was paid on the choice
of the anti-Salmonella antibodies used for immobilization on magnetic microspheres whose
choice was also discussed. The capture efficiency, CE, of Salmonella Typhimurium achieved
with our Promag-KPL immunosorbent was thoroughly evaluated in a batch-wise arrangement
in a model buffer. The IMS from artificially spiked milk differing in fat content (skimmed
UHT, semi-skimmed UHT, whole UHT, and pasteurized) followed. Finally, the developed
immunosorbent was applied for IMS from the whole milk in a novel microfluidic PDMS chip
(Pereiro et al., 2014; Viovy et al., 2014).
2.
Materials and Methods
2.1. Chemicals and Antibodies (Ab)
Lipopolysaccharides (LPS) from Salmonella enterica serotype Enteritidis, bovine
serum albumin (BSA), Tween 20, NiCl2, 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide
(EDC),
the
sodium
salt
of
N-hydroxysulfosuccinimide
(sulfo-NHS),
2-(N-
morpholino)ethanesulfonic acid (MES) were purchased from Sigma Aldrich (St. Louis, MO,
USA). 3,3’-diaminobenzidine tetrahydrochloride (DAB) and Immuno-Blot PVDF membrane
(0.2µm) were acquired from Bio-Rad (Hercules, CA, USA). Dulbecco's phosphate-buffered
saline (PBS) was from Gibco, Life Technologies (Waltham, MA, USA). Other chemicals
were of analytical grade and obtained from Penta (Chrudim, the Czech Republic). All buffers
were prepared from ultrapure water filtered through a TKA Smart2Pure system (Thermo
Scientific TKA, Niederelbert, Germany). Skimmed UHT (fat content 0.5%), semi-skimmed
UHT (fat content 1.5%), whole UHT milk (fat content 3.5%) as well as high-temperature
pasteurized milk (fat content 1.5%), were bought in a common grocery.
Primary Ab for immobilization and dot blot: (i) Mouse monoclonal Ab: anti-LPS core
IgG2a Clone No M9011222 was acquired from MyBiosource (San Diego, CA, USA)
and anti-LPS core IgG2a with ID GWB-115B3D was produced by GenWay Biotech (San
Diego, CA, USA). (ii) Polyclonal Ab: rabbit anti-Salmonella sp. Ab was provided by Virostat
(Portland, ME, USA), and goat Ab of the same specificity were from KPL (Gaithersburg,
MD, USA). Nonspecific IgG from human serum (huIgG) was purchased from Sigma Aldrich
130
(St. Louis, MO, USA). Secondary antibodies for dot blot: goat anti-mouse IgG
with horseradish peroxidase (HRP) and goat anti-rabbit IgG with HRP were purchased from
Sigma Aldrich (St. Louis, MO, USA). Rabbit anti-goat IgG-HRP were from Dako (Glostrup,
Denmark).
2.2. Magnetic Microspheres
Micromer®-M
-
PEG-COOH
particles
were
purchased
from
Micromod
Partikeltechnologie GmbH (Rostock, Germany), ProMag™ 1 Series COOH Surfactant Free
(further denoted as Promag) were from Bangs Laboratories, Inc. (Fishers, IN, USA), SiMAGCarboxyl particles were from Chemicell (Berlin, Germany), and Dynabeads M-270
Carboxylic Acid, Dynabeads MyOne Carboxylic Acid and Dynabeads® anti-Salmonella were
from Dynabeads, Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA, USA).
2.3. Bacterial Cultures
S. enterica subspecies enterica Le Minor and Popoff serovar Typhimurium ATCC
43971, Escherichia coli (Migula) Castellani and Chalmers ATCC 25922 and Citrobacter
braakii CCM 3393 (from Czech Collection of Microorganisms, Brno, the Czech Republic)
were cultured on nutrient agar No. 2 (HiMedia, Mumbai, India) or Chromocult Coliform Agar
(Merck, Darmstadt, Germany) at 37 °C. For dot blot experiments, 18-24 h cultures of all
tested bacterial strains were suspended in phosphate-buffered saline (PBS) to an optical
density of 1.5 at 600 nm and prior to application on the membrane diluted with PBS in a 1:1
ratio. Various dilutions of the above suspension were tested to optimize the appropriate
concentration of bacteria to be applied to the membrane (from 1:200 up to 2:1 (v/v)).
For immunomagnetic separation, 18-24 h culture of S. Typhimurium or E. coli was
resuspended in a physiological solution to an optical density of 0.5 of McFarland (~1-2x108
CFU/mL) and diluted in PBS containing 0.05% v/v Tween 20 (PBS-T) or milk, respectively,
down to the required concentration (down to 101 CFU/mL).
2.4. Whole Cell Dot blot
The dot blot experiment was performed according to the previously published
method (Svobodova et al., 2013) but omitting the step with the chaotropic agent. For this
experiment, a Dot-blot DHM-96 unit manifold from Scie-Plast (Cambridge, UK) and vacuum
pump rated at 600 mm Hg (0.8 Bar) were used. The suspensions of bacterial cells
(S. Typhimurium, Escherichia coli, and Citrobacter braakii; see 2.3) were spotted
131
on the PVDF membrane in a volume of 100 µL. Lipopolysaccharide was spotted at
a concentration of 5 µg per 100 µL of PBS. Blocking step, incubation with different primary
and secondary Ab with HRP (a dilution factor 1:1000 was used for both Ab; for a list of Ab
used for dot blot see Table 2) followed. For detailed information see (Kucerova et al., 2013).
2.5. Immobilization of Antibodies on Magnetic Microspheres
One milligram of Promag microspheres was five times washed with 0.1M MES
(1 mL; pH 5) and activated with EDC (7.5 mg in 0.25 mL of 0.1M MES pH 5) and sulfo-NHS
(1.25 mg in 0.25 mL of the same buffer), the volume was filled up to 1 mL with the same
buffer and incubation followed (room temperature, rotation, 10 min). The microspheres were
washed with 1 mL of 0.1M MES pH 5, unless stated otherwise 25 µg of the anti-Salmonella
Ab (KPL or MyBiosource; see 2.1) was added to the microspheres, the volume was filled up
to 1 mL and immobilization continued overnight at 4 °C and rotation. The anti-Salmonella
microspheres were two times washed with 0.1M MES pH 5, once with the same buffer
containing 1M NaCl, five times with 0.1M MES pH 5.
To estimate the maximum binding efficiency of Ab on different microspheres with
carboxyl terminal groups (see 2.2), 100 µg of huIgG Ab were immobilized on their surface
(1 mg of each microspheres) using exactly the same protocol as in case of immobilization
of the anti-Salmonella Ab. The binding efficiencies were determined indirectly using SDSPAGE with densitometry. Immobilized IgG was designated from difference of densities
of IgG in the initial solution of huIgG used for immobilization, and the sum of IgG
in the supernatant after immobilization, supernatant after washing with 0.1M MES buffer/
MES buffer with 1M NaCl. Binding efficiencies were expressed as the percentage of huIgG
molecules immobilized on the beads´ surface vs. the initial amount of huIgG used
for immobilization (i.e., 100 µg).
2.6. Batch Immunomagnetic Separation
Prior using 0.5 mg of prepared anti-Salmonella microspheres (with KPL
or MyBiosource Ab) or 20/100 µl of commercial Dynabeads® anti-Salmonella were three
times washed with 1 mL of sterile PBS-T. Washed beads were gently mixed with 1 mL
of PBS-T (unless stated otherwise) or milk spiked with Salmonella or the mixture
of Salmonella + E. coli, 10 min incubation under rotation followed. After that bead-bacteria
complexes were magnetically separated for 3 min and then washed twice with 1 mL of
132
PBS-T, resuspended in 100 µL of the same buffer and spread-plated on nutrient agar No. 2
(after IMS with Salmonella only) or Chromocult Coliform Agar (after IMS from mixed
cultures of E. coli and Salmonella) (Merck, Darmstadt, Germany). Cultivation 18 – 24 h
at 37° C and bacteria enumeration followed.
2.7. Microfluidic Immunomagnetic Separation
The microfluidic IMS was performed exactly according to the literature (Pereiro et al.,
2014; Viovy et al., 2014) except applied immunosorbent. Instead of the commercial
Dynabeads anti-Salmonella, our Promag-KPL immunosorbent was utilized here. Briefly,
50 µg of prepared Promag-KPL immunosorbent was washed with PBS containing 1% w/v
BSA and two times with PBS-T, and introduced to the main chamber of the chip. 50 µL of
whole UHT milk artificially spiked with Salmonella of desired concentration was loaded to
the inlet and made a pass through the fluidized Promag-KPL under the constant flow
1 µL/min. Washing of immunosorbent with 40 µL of PBS-T at a flow rate of 1.5 µL/min
followed. Experiments were observed using a Nikon TI-E inverted microscope (Nikon,
Tokyo, Japan). All unbound bacteria were collected in the tubing which was connected
directly to the chip outlet and were spread-plated. This empty tubing was for the last time
rinsed with 100 µL of PBS-T, and this washing fraction was also plated for bacteria
enumeration. Beads-bacteria complexes were also washed away out from the chip and spreadplated. Cultivation on LB medium or Chromocult Coliform Agar (after IMS from mixed
cultures of E. coli and Salmonella) for 18 – 24 h at 37° C and bacteria enumeration followed.
2.8 Capture efficiency (CE) calculations
Capture efficiency (CE) was calculated using following equation:
CE (%): Nc / N0 x 100
where Nc is an average total number of cells captured with the immunosorbent (CFU/mL)
and N0 is an average total number of cells counted after plating of the initial cell suspension
(CFU/mL). In case of experiments in microfluidic chip, N0 value was calculated as an average
total number of cells recovered from the chip, i.e. the sum of the cells captured using
immunosorbent and cells present in the effluents after immunocapturing and chip washing
(i.e. non-captured cells). All average numbers of CFUs and standard deviations (SD) were
calculated of at least triplicate.
133
3.
Results and Discussion
Quality immunosorbent is a key prerequisite to performing successful IMS. The higher
CE is achieved with IMS, the lower limit of detection can be reached by subsequent
end-detection technique. However the immunosorbents of desired specificity and parameters
are not always commercially available, especially for immunocapturing of foodborne bacteria.
The goal of this study was to develop an efficient magnetic immunosorbent for IMS
of Salmonella Typhimurium from milk in PDMS microfluidic chip and compare it with
the commercial immunosorbent (Dynabeads® anti-Salmonella), as far as we know one of only
two immunosorbents which are available on the market. While there are numerous papers
dealing with the development of different assays for immunodetection of bacteria in food,
works describing the step-by-step development of the immunosorbent compatible
with microfluidic systems still lack. Here we present a workflow which can serve
as a guideline for the preparation of the immunosorbent for microfluidic isolation
and
pre-concentration of any foodborne pathogen from milk.
3.1 Selection of Suitable Magnetic Microspheres
In the beginning, it was necessary to specify criterions for the selection of suitable
magnetic particles for microfluidic systems, as mentioned in section 1. The attention was paid
on microspheres in the size range between 1 to 3 µm which is the size suitable for in vitro
laboratory diagnostics (Basinska, 2005) and at the same time suitable for microfluidics (Fan
et al., 1999). We preferred microspheres with the terminal carboxyl functional groups which
are suitable for covalent biofunctionalization using the carbodiimide (EDC+sulfo-NHS)
chemistry. Five different commercial microspheres from different suppliers were chosen
and compared from the point of view of huIgG binding efficiencies (Table 1). Since the Ab
are usually the most expensive component of the prepared immunosorbent, the binding
capacity of microspheres was at first evaluated using model human IgG. Highest binding
efficiencies were repeatedly achieved with Promag microspheres. Then their behaviour
in microfluidic PDMS chip, i.e. their stability and very low aggregation or adsorption
on the walls of channels was examined and found to be excellent (data not shown). Therefore,
these particles were chosen for the biofunctionalization with the specific anti-Salmonella Ab.
134
Table 1: List of –COOH magnetic microspheres which were compared in this study. Binding efficiency was
determined as a % of immobilized human IgG.
Magnetic Microspheres
Dynabeads MyOne COOH
Dynabeads M270 COOH
SiMAG-Carboxyl
micromer-M - PEG-COOH
ProMag™ 1 Series COOH
Size (µm)
1
2.8
1
2
1
Binding Efficiency (% )
43
55
34
17
82
3.2 Selection of the anti-Salmonella Antibodies
High immunoreactivity between the anti-Salmonella antibodies and Salmonella
Typhimurium was the most important parameter which was taken in account. Next, the purity
and integrity of Ab together with the availability of Ab with the absence of any
high-molecular weight stabilizing agents such as gelatin or albumin, which could interfere
during immobilization, were also considered. Monoclonal Ab used for IMS bears the risk that
the Ab´ specificity will be restricted to bacteria with the common antigenic epitopes which
don´t have to be present for. ex. in old or stressed cultures (Cudjoe, 2014). Therefore,
polyclonal Ab seem to be a better choice for the immunocapturing of bacteria. However,
to the best of our knowledge they are commercially available only as a pool of purified IgG
fraction, not as immunogen affinity purified Ab. When such Ab are used for particles´
biofunctionalization, specific as well as nonspecific Ab will naturally appear on the bead´s
surface which can affect their CE.
Here, four anti-Salmonella antibodies differing in its clonality, host animal,
immunogens as well as manufacturer were chosen for this study (Table 2). In case
of the monoclonal
antibodies,
specificity
against
the
core
oligosaccharide
region
of the lipopolysaccharide (LPS) was sought, since it is a relatively conserved structure.
This should assure the Ab´ reactivity with a broad range of more than 2 500 serotypes
of Salmonella which are currently known (Grimont and Weill, 2007). The quality (i. e.
the purity and wholeness) of all four tested antibodies (summarized in Table 2) was evaluated
using traditional SDS-PAGE (data not shown). Based on the results from electrophoresis, all
tested Ab seemed to be pure, intact and non-aggregated.
135
Table 2: List of primary anti-Salmonella Ab selected for the evaluation of immunoreactivity with core
lipopolysaccharide of Salmonella (LPS) and whole cells of Salmonella Typhimurium using dot blot.
Clonality
polyclonal
monoclonal
ND…
Host
Isotype
Animal
goat
ND
rabbit
ND
mouse
IgG2a
mouse
IgG2a
data not provided
Immunogen
Supplier
various strains of
KPL
Salmonella
mixture of S. Enteritidis, S. Virostat
Typhimurium, S.
Heidelburg
LPS core of Salmonella
GenWay
Biotech
LPS core of Salmonella
MyBiosource
The immunoreactivity between the anti-Salmonella Ab and Salmonella Typhimurium
and respective controls (LPS, E. coli, and C. braakii) was assessed using whole-cell dot blot
method. Scheme of the applied method is presented in Figure 1a. The results from this
method are shown in Figure 1b. The immunoreactivity of both polyclonal Ab to Salmonella
was comparable, but rabbit polyclonal antibodies from Virostat were found to be more
cross-reactive with both C. braakii and E. coli than the goat antibodies from KPL. Surprising
results were achieved with the tested monoclonal Ab. While the Ab from MyBisource proved
to be excellent in terms of their reactivity to both LPS and Salmonella, the immunoreactivity
of GenWay Ab was significantly reduced. Based on these results the monoclonal Ab
from MyBiosource and polyclonal Ab from KPL were selected for immobilization
on magnetic microspheres.
(a)
(b)
Figure 1: (a) Scheme of whole-cell dot blot applied for immunoreactivity evaluation between the anti-Salmonella
Ab and Salmonella Typhimurium. (b) The integrated density of spots as a function of immunoreactivity
of particular antibodies with corresponding antigens. Values are presented as mean ± standard deviations
of three experiments.
136
3.3 Immunomagnetic Separation (IMS) in Batch
Two different conjugation strategies were applied to immobilize both monoclonal
MyBiosource and polyclonal KPL Ab on Promag microspheres. The first strategy was based
on the carbodiimide coupling method with the use of sulfo-NHS which enables direct
but random Ab immobilization, whereas the second method exploited Hydrazide-PEGHydrazide as a homobifunctional spacer through which are the Ab immobilized
in a
site-directed orientation, as in details described here (Svobodova et al., 2014).
Immobilization of the anti-Salmonella Ab was followed by IMS of Salmonella
in batch using the procedure adapted from recommendations from Dynal Thermo Fisher
Scientific (see 2.6). The method applied for the enumeration of captured cells, i.e.
the evaluation of quality of immunosorbent, was standard spread-plate and count method.
Although this method was time consuming and the quantity of captured cells could be
underestimated since more than one bacterium could bind to one bead it was selected as
a convenient and cheap method providing reproducible results in our study. ELISA-based
sandwich assay utilizing secondary anti-Salmonella Ab (polyclonal rabbit anti-SalmonellaAb-HRP from MyBiosource, dilution 1:500) was also tried for quantification of captured
Salmonella cells but turned out to be insufficiently sensitive for low concentrations of cells
(less than approx. 2 x 103 CFU/mL), data not shown.
Monoclonal Ab from MyBiosource immobilized on Promag particles showed to be
inappropriate for Salmonella immunocapturing at all; capture rate has never exceeded more
than 3% (after IMS from both 102 and 103 CFU/mL). On the contrary after
the aforementioned carbodiimide conjugation of KPL Ab on Promag microspheres the CE
was very high (≥ 89.5±3.3 % after IMS from 102 CFU/mL; see Fig. 2). This experiment also
served as an optimization of the quantity of Ab used for biofunctionalization of 1 mg
of microspheres. It is evident that immobilization of 25 µg of Ab is sufficient, and that
binding of higher amounts of Ab does not lead to any further dramatic increase in CE
and is uneconomical (see Fig. 2). Moreover, too dense Ab´ concentration on the surface
of the immunosorbent can lead to unwanted bead-bacteria aggregation (Cudjoe, 2014). For all
remaining experiments, following conditions were kept: 25 µg of KPL Ab/mg of Promag
microspheres, carbodiimide coupling. This immunosorbent is further denoted as PromagKPL.
137
Figure 2: Dependence of quantity of Ab (KPL) applied for biofunctionalization of 1 mg of Promag particles
using the carbodiimide method on the number of captured cells of Salmonella expressed as a capture efficiency.
IMS was performed from 102 CFU/mL, 1.93 x 102.Values are presented as mean±standard deviations of three
experiments.
To compare the CE achieved with our developed Promag-KPL immunosorbent and
with the commercial one, Dynabeads® anti-Salmonella, IMS in PBS-T buffer from 103
CFU/mL (1.76 x 103 CFU/mL) followed. When 100 µL of Dynabeads suspension was used
for IMS and standard protocol suggested by Dynal was followed (see 2.6), CE of 30.0 ± 9.5%
was achieved, while when 20 µL of the same suspension was applied, only 15.3 ± 3.8%
captures were observed. These results were under our expectations since the authors typically
demonstrated much higher capture efficiencies. Recently, (Zheng et al., 2014) achieved
39.5 ± 1.88 % CE after IMS from a pure culture with 20 µL of Dynabeads suspension
and after 10 min of bead-bacteria incubation time. (Brandao et al., 2013) reported the capture
efficiencies from 92 up to 100 %, depending on the initial concentration of Salmonella used
for IMS.
Then the effect of the increasing concentration of Salmonella applied for IMS using
Promag-KPL on the CE was investigated (Figure 3). Following CE were achieved
for particular concentrations of Salmonella (from 101 up to 105 CFU/mL): 69.2 ± 23.5 %,
86.2 ± 12.6 %, 63.2 ± 3.8 %, 64.9 ± 4.5 %, 69.3 ± 3.5 %. These results were in agreement
with the literature (Najafi et al., 2014) where was also demonstrated that higher
concentrations of bacteria are not a limiting factor significantly affecting CE. In parallel,
the immunosorbent carrying huIgG was applied as a control carrier for monitoring
the specificity of the immunocapturing. After IMS from 105 CFU/mL using such
immunosorbent, only 1.0 ± 0.3 % CE was attained (see Fig. 3, note the log scale of the
y-axis).
138
Figure 3: The effect of increasing concentration of Salmonella in 1 mL of suspension applied for IMS using
Promag-KPL and Promag-huIgG immunosorbent, a control of nonspecific adhesion of Salmonella. Values are
presented as mean±standard deviations of three experiments.
After these experiments, the CE of Promag-KPL was investigated under the excess
of competing microbiota (E. coli) (see Fig. 4). Certain immunoreactivity with E. coli was
expected since the Ab are polyclonal and may slightly crossreact with closely related bacteria,
as also demonstrated by dot blot, Figure 2. In case of 1:1 ratio the nonspecific capture
of E. coli using Promag-KPL was 5.1% and with the increasing surplus of E. coli the CE
decreased down to 0.9%. The CE of Salmonella was slightly affected by the abundant
microbiota only when 1:1 000 and 1:10 000 ratios of bacteria were applied for IMS. These
results confirmed the high sensitivity of prepared immunosorbent and low nonspecific
reactivity with non-target microbiota.
Figure 4: The effect of increasing concentration of competing microbiota (E. coli) on capture efficiency
of Salmonella using Promag-KPL. Values are presented as mean±standard deviations of three experiments.
139
Finally after all these experiments the CE of Salmonella was evaluated in real food
samples - milk differing in fat content and type of thermal treatment. Here we demonstrated
that complex milk, i.e. emulsion of a colloid of butterfat globules and water with dissolved
carbohydrates and proteins, does not affect the CE of Salmonella (Table 3). Apparently
the abundant milk protein micelles and lipids did not cover the binding sites of Ab
on Promag-KPL. No correlation was found between fat content in milk and CE of Salmonella.
Fat present in milk can interfere with some detection techniques based on DNA analysis, such
as real-time PCR (Le Drean et al., 2010; Riyaz-Ul-Hassan et al., 2013), so IMS doesn´t serve
only as a tool for pre-concentration of target bacteria but also replaces sample preparation
such as delipidation.
Table 3: The effect of different fat content in milk spiked with Salmonella (103 CFU/mL) on the capture
efficiency ± standard deviation (SD) from three experiments.
Type of milk
UHT milk, skimmed
UHT milk, semi-skimmed
UHT milk, whole
High-temperature pasteurized milk
Fat content (%)
0.5
1.5
3.5
1.5
Capture efficiency ± SD (%)
83.5 ± 4.1
70.1 ± 2.8
72.5 ± 1.0
91.3 ± 11.2
Immunomagnetic Separation (IMS) in Microfluidic Chip
Then the IMS of Salmonella from spiked milk in microfluidic chip without any prior
sample treatment followed. To do that, a newly developed and recently published
magnetically stabilized fluidized bed was prepared (Pereiro et al., 2014; Viovy et al., 2014)
(Fig 5a). This chip was inspired by large fluidized-bed reactors and is based on dynamic
recirculation of magnetic microspheres which are in equilibrium due to the opposing magnetic
and drag forces, leading to a high bed porosity and recirculation. The immunocapturing was
carried out in a cone-shaped chamber specifically dimensioned for bacteria capture
and possible following on-chip cultivation.
Promag-KPL immunosorbent was during capture step homogenously spread across
the chamber (see Fig. 5b) and recirculated. Even if high concentrations of Salmonella (e.g.
106 CFU/mL) were passed through the fluidized bed the immunosorbent did not aggregate
as a result of captured bacteria, as can happen in batch (Cudjoe, 2014). The presence of milk
did not significantly affect the particles´ behaviour; the globules of fat present in milk were
visible under the microscope but did not cause any problems during the bacteria capturing.
140
(b)
(a)
Figure 5: (a) Macrophotography of microfluidic chip with Promag-KPL (50 µg), packed working mode;
(b) Microphotography of the main chip chamber during Salmonella immunocapturing from whole milk using
Promag-KPL (50 µg), fluidized working mode.
For the present study, the spread-plate and count method, as in the case of IMS
in tubes, was applied to assess the CE in the microchip. Nevertheless, in-line IMS with the
on chip-cultivation with the quantification by bed expansion which can be easily followed
with a low-end camera was recently demonstrated in this chip (unpublished data, Viovy´ s
group). Other detection techniques integrated with microfluidic immunocapture of bacteria
were reported during the past few years, such as fluorescent dyes- (Mai et al., 2014; Verbarg
et al., 2013) or quantum dots-based immunoassays (Kim et al., 2015; Wang et al., 2015), light
scattering (Fronczek et al., 2013), surface-plasmon resonance (Tokel et al., 2015) or PCRbased techniques. For the further development of our microfluidic platform, the end-detection
technique will be chosen with respect to short assay time, low limit of detection
and compatibility with the IMS pre-concentration module.
The CE of Salmonella using Promag-KPL immunosorbent in the chip was evaluated
directly in milk. Similarly as in the case of batch IMS, the milk was spiked with
the increasing concentration of Salmonella (from 101 up to 101 CFU/50 µL) and IMS followed
(see Fig. 6a).
To evaluate the effect of small reaction volume and distinguish it from
the effect of microfluidics, parallel experiment under exactly same conditions (50 µg
of immunosorbent in 50 µL of milk, capture time 50 min) was done in batch-wise
arrangement, i.e. in tubes. It is evident from the results that the miniaturized format
of the IMS (both in tubes and chip) significantly improved achieved CE compared to our
standard protocol in batch (0.5 mg of immunosorbent in 1 mL of milk, capture time 10 min),
Fig. 3. Microfluidic immunocapturing seems to work with higher efficiency for denser
bacterial suspensions (104 and 105 CFU/50 µL), compared to IMS in tubes. Other advantages
of microfluidic IMS making it preferable than batch are the possibility to automatize
the protocol, to accurately dose the required sample volumes, control the flow rate and run
the experiments under strictly reproducible conditions.
141
(b)
(a)
Figure 6: (a) The effect of the increasing concentration of Salmonella in milk on CE of Salmonella in microchip
and tubes. 50 µg of Promag-KPL immunosorbent and volume of 50 µL was used for both types of IMS. Values
are presented as mean±standard deviations of three experiments. (b) The capture efficiency of Salmonella
achieved in a microfluidic chip using Promag-KPL immunosorbent from milk spiked with mixed culture of
Salmonella and E. coli. Values are presented as mean±standard deviations of three experiments.
After that an aliquot of milk was artificially spiked with mixed culture of Salmonella
and E. coli in two different ratios (1:1 and 1:100) to confirm the selectivity of Promag-KPL
immunosorbent in microchip (Figure 6b). Both achieved CE were above our expectations;
the surplus (100:1) of competing microbiota increased CE of Salmonella even up to
99.3 ± 0.5 %. The nonspecific capture of E. coli was negligible and reached only 2.1±0.8%.
4
Conclusion
The present study deals with the development of efficient magnetic immunosorbent
for microfluidic immunocapturing and pre-concentration of the model milk-borne pathogen,
namely
Salmonella
Typhimurium. The characteristics of developed
Promag-KPL
immunosorbent were investigated in detail in batchwise arrangement. After that
the immunocapturing was also performed in magnetically stabilized fluidized bed.
The immunosorbent showed to be stable and highly specific towards the cells of Salmonella;
the nonspecific capture proved to be insignificant. It was demonstrated that the use
of miniaturized format of the assay increases the CE of Salmonella which opens possibilities
for
further
development
of
integrated
device
combining
magnetic
beads-based
immuno-pre-concentration of Salmonella followed by its detection.
142
Acknowledgement
This work was supported by the European Union´s LOVE-FOOD project under Contract
No. 317742.
References
Basinska, T., 2005. Hydrophilic core-shell microspheres: A suitable support for controlled
attachment of proteins and biomedical diagnostics. Macromol. Biosci. 5, 1145-1168.
Brandao, D., Liebana, S., Campoy, S., Cortes, P., Alegret, S., Pividori, M.I., 2013.
Electrochemical magneto-immunosensing of Salmonella based on nano and micro-sized
magnetic particles. 8th Ibero-American Congress on Sensors (Ibersensor 2012) 421, 012020.
Cudjoe, K.S., 2014. Immunomagnetic particle-based techniques: overview, In C.A.B.L.
Tortorello (Ed.), Encyclopedia of Food Microbiology (Second Edition). Academic Press,
Oxford, pp. 351-357.
Duodu, S., Mehmeti, I., Holst-Jensen, A., Loncarevic, S., 2009. Improved sample preparation
for real-time pcr detection of listeria monocytogenes in hot-smoked salmon using filtering and
immunomagnetic separation techniques. Food Anal. Meth. 2, 23-29.
Fan, Z., Mangru, S., Granzow, R., Heaney, P., Ho, W., Dong, Q., Kumar, R., 1999. Dynamic
DNA hybridization on a chip using paramagnetic beads. Anal. Chem. 71, 4851-4859.
Favrin, S.J., Jassim, S.A., Griffiths, M.W., 2003. Application of a novel immunomagnetic
separation–bacteriophage assay for the detection of Salmonella enteritidis and Escherichia
coli O157:H7 in food. Int. J. Food Microbiol. 85, 63-71.
Fisher, M., Atiya-Nasagi, Y., Simon, I., Gordin, M., Mechaly, A., Yitzhaki, S., 2009. A
combined immunomagnetic separation and lateral flow method for a sensitive on-site
detection of Bacillus anthracis spores - assessment in water and dairy products. Lett. Appl.
Microbiol. 48, 413-418.
Fronczek, C.F., You, D.J., Yoon, J., 2013. Single-pipetting microfluidic assay device for rapid
detection of Salmonella from poultry package. Biosens. Bioelectron. 40, 342-349.
Grimont, P., A.D., Weill, F., 2007. Antigenic formulae of the Salmonella serovars, 9th
Edition. WHO Collaborating Centre for Reference and Research on Salmonella, 1-167.
Hagren, V., von Lode, P., Syrjälä, A., Korpimäki, T., Tuomola, M., Kauko, O., Nurmi, J.,
2008. An 8-hour system for Salmonella detection with immunomagnetic separation and
homogeneous time-resolved fluorescence PCR. Int. J. Food Microbiol. 125, 158-161.
Kim, G., Moon, J., Moh, C., Lim, J., 2015. A microfluidic nano-biosensor for the detection of
pathogenic Salmonella. Biosens. Bioelectron. 67, 243-247.
Kucerova, J., Holubova, L., Jankovicova, B., Dvorakova, V., Motkova, P., Bilkova, Z., 2013.
Quality evaluation of commercial anti-salmonella antibodies for immunomagnetic separation
using whole-cell dot blot. Scientific Papers of the University of Pardubice, Series A, Faculty
of Chemical Technology, 57-66.
Le Drean, G., Mounier, J., Vasseur, V., Arzur, D., Habrylo, O., Barbier, G., 2010.
Quantification of Penicillium camemberti and P. roqueforti mycelium by real-time PCR to
assess their growth dynamics during ripening cheese. Int. J. Food Microbiol. 138, 100-107.
143
Liebana, S., Lermo, A., Campoy, S., Pilar Cortes, M., Alegret, S., Isabel Pividori, M., 2009.
Rapid detection of Salmonella in milk by electrochemical magneto-immunosensing. Biosens.
Bioelectron. 25, 510-513.
Mai, J., Abhyankar, V.V., Piccini, M.E., Olano, J.P., Willson, R., Hatch, A.V., 2014. Rapid
detection of trace bacteria in biofluids using porous monoliths in microchannels. Biosens.
Bioelectron. 54, 435-441.
Metzger-Boddien, C., Khaschabi, D., Schoenbauer, M., Boddien, S., Schlederer, T., Kehle, J.,
2006. Automated high-throughput immunomagnetic separation-PCR for detection of
Mycobacterium avium subsp paratuberculosis in bovine milk. Int. J. Food Microbiol. 110,
201-208.
Mine, Y., 1997. Separation of Salmonella enteritidis from experimentally contaminated liquid
eggs using a hen IgY immobilized immunomagnetic separation system. J. Agric. Food Chem.
45, 3723-3727.
Najafi, R., Mukherjee, S., Hudson Jr., J., Sharma, A., Banerjee, P., 2014. Development of a
rapid capture-cum-detection method for Escherichia coli O157 from apple juice comprising
nano-immunomagnetic separation in tandem with surface enhanced Raman scattering. Int. J.
Food Microbiol. 189, 89-97.
Newell, D.G., Koopmans, M., Verhoef, L., Duizer, E., Aidara-Kane, A., Sprong, H.,
Opsteegh, M., Langelaar, M., Threfall, J., Scheutz, F., van der Giessen, J., Kruse, H., 2010.
Food-borne diseases - The challenges of 20 years ago still persist while new ones continue to
emerge. Int. J. Food Microbiol. 139, S3-S15.
Olsvik, O., Popovic, T., SkjerveE, E., Cudjoe, K., Hornes, E., Ugelstad, J., Uhlen, M., 1994.
Magnetic separation techniques in diagnostic microbiology. Clin. Microbiol. Rev. 7, 43-54.
Pereiro, I., Kucerova, J., Alexandre, L., Dupuy, B., Bilkova, Z., Viovy, J., Malaquin, L.,
Descroix, S., 2014. Microfluidic magnetic fluidized bed for bacteria extraction, growth and
detection. In: Proceedings of the 18th International conference on miniaturized systems for
chemistry and life sciences, MicroTAS 2014.
Perez, F., Mascini, M., Tothill, I., Turner, A., 1998. Immunomagnetic separation with
mediated flow injection analysis amperometric detection of viable Escherichia coli O157.
Anal. Chem. 70, 2380-2386.
Rijpens, N., Herman, L., Vereccken, F., Jannes, G., De Smedt, J., De Zutter, L., 1999. Rapid
detection of stressed Salmonella spp. in dairy and egg products using immunomagnetic
separation and PCR. Int. J. Food Microbiol. 46, 37-44.
Riyaz-Ul-Hassan, S., Verma, V., Qazi, G.N., 2013. Real-time PCR-based rapid and cultureindependent detection of Salmonella in dairy milk addressing some core issues. Lett. Appl.
Microbiol. 56, 275-282.
Safarik, I., Safarikova, M., 1999. Use of magnetic techniques for the isolation of cells. J.
Chromatogr. B 722, 33-53.
Safarik, I., Safarikova, M., 2004. Magnetic techniques for the isolation and purification of
proteins and peptides. BioMagnetic Res. and Tech. 2, 7.
Svobodova, Z., Jankovicova, B., Horak, D., Bilkova, Z., 2013. Dot-ELISA Affinity Test: An
easy, low-cost method to estimate binding activity of monoclonal antibodies. J. Anal Bioanal
Tech 4 (3), 168.
144
Svobodova, Z., Kucerova, J., Autebert, J., Horak, D., Bruckova, L., Viovy, J., Bilkova, Z.,
2014. Application of an improved magnetic immunosorbent in an Ephesia chip designed for
circulating tumor cell capture. Electrophoresis 35, 323-329.
Tokel, O., Yildiz, U.H., Inci, F., Durmus, N.G., Ekiz, O.O., Turker, B., Cetin, C., Rao, S.,
Sridhar, K., Natarajan, N., Shafiee, H., Dana, A., Demirci, U., 2015. Portable microfluidic
integrated plasmonic platform for pathogen detection. Sci Rep 5, 9152.
Verbarg, J., Plath, W.D., Shriver-Lake, L.C., Howell, P.B., Jr., Erickson, J.S., Golden, J.P.,
Ligler, F.S., 2013. Catch and release: integrated system for multiplexed detection of bacteria.
Anal. Chem. 85, 4944-4950.
Viovy, J., Tabnaoui, S., Malaquin, L., Descroix, S., 2014. Systeme microfluidique presentant
un lit de particules magnetiques. Patent WO2014037674 A1. 13.3.2014.
PCT/FR2013/052057.
Wang, R., Ni, Y., Xu, Y., Jiang, Y., Dong, C., Chuan, N., 2015. Immuno-capture and in situ
detection of Salmonella typhimurium on a novel microfluidic chip. Anal. Chim. Acta 853,
710-717.
Wang, Z., Cai, R., Yuan, Y., Niu, C., Hu, Z., Yue, T., 2014. An immunomagnetic separationreal-time PCR system for the detection of Alicyclobacillus acidoterrestris in fruit products.
Int. J. Food Microbiol. 175, 30-35.
Wang, Z., Yue, T., Yuan, Y., Cai, R., Niu, C., Guo, C., 2013. Development and evaluation of
an immunomagnetic separation-ELISA for the detection of Alicyclobacillus spp. in apple
juice. Int. J. Food Microbiol. 166, 28-33.
Zhang, C., Wang, H., Xing, D., 2011. Multichannel oscillatory-flow multiplex PCR
microfluidics for high-throughput and fast detection of foodborne bacterial pathogens.
Biomed. Microdevices 13, 885-897.
Zheng, Q., Mikš-Krajnik, M., Yang, Y., Xu, W., Yuk, H., 2014. Real-time PCR method
combined with immunomagnetic separation for detecting healthy and heat-injured Salmonella
Typhimurium on raw duck wings. Int. J. Food Microbiol. 186, 6-13.
145
6 ZÁVĚR
Předložená disertační práce se zabývá vývojem bioafinitních a enzymaticky aktivních
nosičových systémů pro afinitní separace nebo biokatalýzu. Vývoj a příprava jednotlivých
nosičů se odvíjely od cílových aplikací, pro které byly určeny.
V rámci
biofunkcionalizace
magnetických
částic
enzymem
trypsinem
byla
optimalizována metoda vazby trypsinu a následně byly připraveny dva typy proteolyticky
aktivních magnetických nosičů, označovaných jako Tryp-PGMA-COOH a Tryp-PHEMACOOH. Trypsin imobilizovaný na nosičích vykazoval vysokou enzymovou aktivitu při reakci
s nízkomolekulárním substrátem BApNA, dosahující 1 021-1 418 IU/mg Tryp-PGMA-COOH
a Tryp-PHEMA-COOH. U obou nosičů byla rovněž prokázána vysoká skladovací stabilita,
po 7 týdnech skladování ve vodném pufru si oba nosiče zachovaly více než 70% aktivitu vůči
hodnotám aktivity naměřenými po imobilizaci. Při sledování operační stability nosičů bylo
lepších výsledků dosaženo v případě Tryp-PHEMA-COOH, při pátém stanovení aktivity
trypsinu v rámci jednoho dne si nosič zachoval 60% aktivitu ve srovnání s aktivitou
naměřenou v prvním stanovení. Dále byly na magnetické částice vázány modelové protilátky
třídy IgG. Všechny získané výsledky potvrdily vhodnost nově připravených částic pro vazbu
biologicky aktivních látek a jejich využití pro účely bioafinitních separací a biokatalýzy.
Další část práce se věnovala možnostem vazby trypsinu na chitosanová nanovlákna
s cílem připravit bioaktivní vrstvu pro vývoj nových krytů ran. Nanovlákna byla připravená
elektrospinningem pomocí technologie Nanospider®. Po důkladných optimalizacích metody
vazby bylo dosaženo aktivity imobilizovaného trypsinu odpovídající 210 IU/cm2,
tj. 874 IU/mg příslušných nanovláken. Po jejich čtyřtýdenním skladování ve vysušeném stavu
byla naměřená aktivita trypsinu vyšší než bezprostředně po imobilizaci, po skladování
v hydratované formě dosahovala aktivita 91 %. Při předběžných testech cytotoxicity
nanovláken s imobilizovaným trypsinem nebyly shledány žádné známky toxicity. Všechny
tyto
výsledky
podpořily
vhodnost
chitosanových
nanovláken
pro
enzymatickou
biofunkcionalizaci a aplikaci na poli hojení ran.
Před přípravou specifického imunosorbentu pro mikrofluidní záchyt cirkulujících
nádorových buněk bylo nutné magnetické částice polymerně modifikovat polymerem PEG.
Toho bylo dosaženo pomocí konjugační reakce založené na karbodiimidu EDC ve vodném
prostředí. Přítomnost PEGu na částicích byla následně ověřena pomocí několika technik:
měřením zeta potenciálu částic před a po modifikaci, dále SEM mikroskopií částic
146
s následnou
analýzou
obrazu,
infračervenou
spektroskopií,
sandwichovou
metodou
využívající afinitních interakcí avidin-biotin (imobilizace biotinylovaného PEGu a jeho
průkaz konjugátem streptavidin-HRP), a v neposlední řadě pomocí komerční anti-PEG
ELISA metody. Z výsledků vyplynulo, že se PEGylací částic zvýšil jejich průměr o cca 100
nm, naznačující přítomnost 50-nm vrstvy PEGu na částicích. Dále byl hodnocen rozdíl
v nespecifické adsorpci modelového proteinu albuminu a eukaryotických buněk na holé
a modifikované částice. V případě sledování adsorpce albuminu došlo k 45% snížení míry
nespecifické adsorpce u částic po PEGylaci, v případě buněk dokonce k 74% úbytku
nespecificky navázaných buněk. Závěrem bylo chování holých a modifikovaných částic
porovnáno v mikrofluidních systémech z PDMS a COC polymerů. V obou čipech byly
zjištěny výhodnější vlastnosti částic po jejich modifikaci polymerem PEG, jelikož klesla míra
adheze částic na stěny kanálků. Tím byla ověřena jejich vhodnost pro separace z komplexního
biologického materiálu a zároveň pro mikrofluidní použití.
Magnetické mikročástice byly povrchově modifikovány polymerem PEG nesoucícím
vhodné terminální skupiny (Hydrazid-PEG-Hydrazid) pro následnou orientovanaou vazbu
anti-EpCAM protilátek. Tyto částice poté sloužily jako výchozí stacionární fáze
pro následnou biofunkcionalizaci specifickými protilátkami pro mikrofluidní záchyt
cirkulujících
nádorových
buněk
exprimujících
povrchový
glykoprotein
EpCAM.
Po imobilizaci protilátek byla sledována účinnost záchytu EpCAM-pozitivních buněk
ve vsádkovém uspořádání. Připravený nosič nesoucí anti-EpCAM protilátky, označený jako
anti-EpCAM-PEG-PGMA,
specificky
interagoval
s EpCAM-pozitivními
buňkami,
na příslušný alikvot částic bylo zachyceno v průměru 331 buněk. Naproti tomu na
PEGylovaný nosič bez protilátek se nespecificky adsorbovalo pouze 10 buněk. Anti-EpCAMPEG-PGMA nosič byl rovněž porovnáván z pohledu účinnosti záchytu s komerčně
dostupnými částicemi Dynabeads Epithelial Enrich firmy Thermo Fisher Scientific; pomocí
obou nosičů bylo dosaženo srovnatelných výsledků. V závěru byl připravený immunosorbent
vložen do mikrofluidního Ephesia čipu, ve kterém byl prokázán 65% specifický záchyt
EpCAM-pozitivních buněk, míra nespecifické adsorpce činila pouze 1,2 %.
Poslední část práce byla zaměřena na vývoj specifického imunosorbentu pro mikrofluidní
záchyt potencionálně patogenních bakterií z mléka. Jako modelový analyt byla vybrána
bakterie Salmonella Typhimurium. V rámci vývoje nosiče byly důkladně vybrány nejen
příslušné magnetické částice, ale i komerčně dostupné anti-Salmonella protilátky. Účinnost
záchytu připraveného imunosorbentu, označovaného jako Promag-KPL, byla poté testována
147
ve vsádkovém uspořádání. V závislosti na koncentraci bakterií v modelovém pufru (101 – 105
CFU/ml) bylo dosaženo účinnosti záchytu od 69,2 do 86,2 %. Nosič Promag-KPL byl rovněž
vysoce selektivní. Po optimalizaci imunomagnetického záchytu ve vsádkovém uspořádání
a v prostředí modelového pufru bylo přikročeno k záchytu z mléka a k přizpůsobení techniky
do mikrofluidního systému, magneticky stabilizovaného fluidního lože. V čipovém
uspořádání bylo dosaženo pomocí Promag-KPL nosiče záchytu až 99,3±0,5 %, účinnosti
záchytů byly reprodukovatelné. Nosič vyvinutý v rámci disertační práce tak splnil veškeré
požadavky, které byly na jeho vlastnosti kladené, a je tak připravený na následnou integraci
do zařízení, na jehož komercionalizaci se bude dále pokračovat.
Uvedené cíle práce tak byly splněny, připravené nosiče se osvědčily pro uvedené cílové
aplikace a dosažené výsledky již byly nebo v nejlibžší době budou publikovány formou
recenzovaných odborných článků.
148
7 PŘEHLED PUBLIKAČNÍCH VÝSTUPŮ
Původní vědecké práce v časopisech s IF, dle WoS zařazeny do kategorie „Article”:
Článek I: HORÁK D., KUČEROVÁ J., KORECKÁ L., JANKOVIČOVÁ B., PALARČÍK
J., MIKULÁŠEK P. a BÍLKOVÁ Z.: New monodisperse magnetic polymer microspheres
biofunctionalized for enzyme catalysis and bioaffinity separations. Macromol. Biosci., 2012,
12, 647-655. IF (2012) 3,742.
Článek II: KUČEROVÁ J., SVOBODOVÁ Z., KNOTEK P., PALARČÍK J., VLČEK M.,
KINCL M., HORÁK D., AUTEBERT J., VIOVY J.-L. a BÍLKOVÁ Z.: PEGylation of
magnetic poly(glycidyl methacrylate) microparticles for microfluidic bioassays. Mater. Sci.
Eng. C-Mater. Biol. Appl. C, 2014, 40, 308–315. IF (2014) 3,088.
Článek III: SVOBODOVÁ Z., KUČEROVÁ J., AUTEBERT J., HORÁK D., BRŮČKOVÁ
L., VIOVY J.-L. a BÍLKOVÁ Z.: Application of an improved magnetic immunosorbent in an
Ephesia chip designed for circulating tumor cell capture. Electrophoresis, 2014, 35, 323-329.
IF (2014) 3,028.
Rukopis (manuskript) I: SRBOVÁ J., SLOVÁKOVÁ M., KŘÍPALOVÁ Z., ŽÁRSKÁ M.,
ŠPAČKOVÁ M., STRÁNSKÁ D. a BÍLKOVÁ Z.: Covalent biofunctionalization of chitosan
nanofibers with proteolytic enzyme for wound healing. Odesláno k recenznímu řízení
1.7.2015 do J. Biomed. Mater. Res. Part B. IF (2014) 2,759.
Rukopis (manuskript) II: PEREIRO I., TABNANOUI S., BENDALI A., SRBOVÁ J.,
BÍLKOVÁ Z., DUPUY B., DESCROIX S.: Microfluidic fluidized bed: a new microfluidic
module for bacteria detection. Připravováno pro odeslání v listopadu 2015 do Nat. Commun.
IF (2014) 11,470.
Rukopis (manuskript) III: SRBOVÁ J., KRULIŠOVÁ P., HOLUBOVÁ L., PEREIRO I.,
BENDALI A., DESCROIX S., VIOVY J-L a BÍLKOVÁ Z.: Development of the specific
immunosorbent for microfluidic capturing and pre-concentration of milkborn pathogens.
Připraveno k odeslání do Int. J. Food Microbiol. IF (2014) 3,082.
Původní práce v recenzovaných sbornících, dle WoS zařazeno do kategorie
„Proceedings Paper”:
SVOBODOVÁ Z., JANKOVIČOVÁ B., KUČEROVÁ J. a BÍLKOVÁ Z.: Magnetic beadsbased immunocapture of clinical biomarkers in microfluidic devices: from peptides to whole
cells. In Sborník CECE 2014: 11th International Interdisciplinary Meeting on Bioanalysis,
2014, ISBN 978-80-904959-2-0, Brno, ČR: Institute of Analytical Chemistry AS CR, s. 7780.
PEREIRO I., KUČEROVÁ J., ALEXANDRE L., DUPUY B., BÍLKOVÁ Z., VIOVY J-L,
MALAQUIN L. a DESCROIX S.: Microfluidic magnetic fluidized bed for bacteria
extraction, growth and detection. In Proceedings of the 18th International Conference on
149
Miniaturized Systems for Chemistry and Life Sciences 2014, MicroTAS, 2014, ISBN
978-0-979806426-30-7-6, San Antonio, Texas, USA, s. 437-439.
Patenty:
STRÁNSKÁ D., SLOVÁKOVÁ M., KUČEROVÁ J. a BÍLKOVÁ Z.: Prostředek pro
aplikaci proteolytických enzymů na ránu a prostředek ke krytí ran. Národní užitný vzor č.
26861. Číslo přihlášky 2012-27049, Datum zápisu užitného vzoru: 28.4.2014.
Aplikované výsledky, funkční vzorek:
STRÁNSKÁ D., SLOVÁKOVÁ M. a KUČEROVÁ J.: Chitosan s imobilizovaným trypsinem
pro kryty ran. 2013. Funkční vzorek. Obor FR - Farmakologie a lékárnická chemie. Vlastník
Elmarco s.r.o.
Abstrakty v časopisech s IF:
KRULIŠOVÁ P., JANKOVIČOVÁ B., KUČEROVÁ J. a BÍLKOVÁ Z.: Optimization
of magnetic bead enzyme-linked immunosorbent assay for detection of specific antibodies
against Amyloid beta representing biomarkers of Alzheimer's disease. Meeting Abstract:
International congress on amino acids, peptides and proteins 2013, 2013, ISSN 0939-4451,
Vídeň, Rakousko: Springer, s. 585.
Články v časopisech ze seznamu recenzovaných neimpaktovaných periodik platných pro
ČR:
KUČEROVÁ J., HOLUBOVÁ L., JANKOVIČOVÁ B., DVOŘÁKOVÁ V., MOŤKOVÁ P.
a BÍLKOVÁ Z.: Quality evaluation of commercial anti-Salmonella antibodies
for immunomagnetic separation using whole-cell dot blot. Scientific Papers of the University
of Pardubice, Series A, Faculty of Chemical Technology, 2013, ISSN 1211-5541, Pardubice,
ČR: Univerzita Pardubice, s. 57-66.
Původní práce ve sbornících s ISBN:
KUČEROVÁ J., PALARČÍK J. a BÍLKOVÁ Z.: Sledování koloidální stability
superparamagnetických částic pro biomedicínu. In Sborník příspěvků 15. ročníku konference
o speciálních anorganických pigmentech a práškových materiálech KSAP-PM 2013, 2013,
ISBN 978-80-7395-604-2, Pardubice, ČR: Univerzita Pardubice, s. 84-87.
PALARČÍK J. a KUČEROVÁ J.: Měření velikosti částic se superparamagnetickým obsahem
metodou dynamického rozptylu světla. In Sborník příspěvků 15. ročníku konference
o speciálních anorganických pigmentech a práškových materiálech KSAP-PM 2013, 2013,
ISBN 978-80-7395-604-2, Pardubice, ČR: Univerzita Pardubice, s. 102-204.
Příspěvky prezentované na mezinárodních vědeckých konferencích (přednášky):
KUČEROVÁ J., SLOVÁKOVÁ M., BÍLKOVÁ Z., JUKLÍČKOVÁ M., KLABANOVÁ A.
a STRÁNSKÁ D.: Enzyme-biofunctionalized nanofibers as a new material for wound
treatment. EWMA 2011, 25. – 27. 5. 2011, Brusel, Belgie. Abstrakt ve sborníku EWMA
150
Journal Supplement, Vol. 11, No 2, 2011, ISSN 1609-2759, Frederiksberg, Holandsko:
EWMA, s. 66.
KUČEROVÁ J., SVOBODOVÁ Z. a BÍLKOVÁ Z.: Biofunctionalization of magnetic
particles: theory and practice. Přednáška na meetingu evropského projektu CAMINEMS, č.
228980, 7. Rámcový program EU. 30. -31. 1. 2012, Mnichov, Německo.
KUČEROVÁ J., HOLUBOVÁ L. a BÍLKOVÁ Z.: Biofunctionalization of magnetic
particles: theory and practice. Přednáška na meetingu evropského projektu CAMINEMS, č.
228980, 7. Rámcový program EU. 28. 2. - 1. 3. 2013, Paříž, Francie.
KUČEROVÁ J., HOLUBOVÁ L. a BÍLKOVÁ Z.: Quality evaluation of commercial antiSalmonella antibodies for immunomagnetic separation of Salmonella. Přednáška na meetingu
evropského projektu LOVE-FOOD č. 317742, 7. Rámcový program EU. 5. - 6. 9. 2013,
Athény, Řecko.
KUČEROVÁ J., HOLUBOVÁ L. a BÍLKOVÁ Z.: Development of the specific antiSalmonella immunosorbent for on-chip immunoextraction of bacteria. Přednáška na meetingu
evropského projektu LOVE-FOOD č. 317742, 7. Rámcový program EU. 28. 2. – 1. 3. 2014,
Freiburg, Německo.
SRBOVÁ J., HOLUBOVÁ L., KRULIŠOVÁ P. a BÍLKOVÁ Z.: Methods for magnetic
beads-based DNA purification. Přednáška na meetingu evropského projektu LOVE-FOOD č.
317742, 7. Rámcový program EU. 1. – 2. 9. 2014, Pardubice, Česká republika.
SRBOVÁ J., KRULIŠOVÁ P. a BÍLKOVÁ Z.: Advances in immunomagnetic separation
of Salmonella Typhimurium and Bacillus cereus. Přednáška na meetingu evropského projektu
LOVE-FOOD č. 317742, 7. Rámcový program EU. 2. - 3. 3.2015, Paříž, Francie.
Příspěvky prezentované na národních vědeckých konferencích (přednášky):
SRBOVÁ J., HOLUBOVÁ L., KRULIŠOVÁ P. a BÍLKOVÁ Z.: Vývoj magnetického
imunosorbentu pro průkaz Salmonella Typhimurium pro mikrofluidní aplikace. XXIV.
Tomáškovy dny mladých mikrobiologů, 5. - 6. 6. 2015, Brno, Česká republika. Sborník ISBN
978-80-210-7851-2, Brno, ČR: Masarykova univerzita, s. 19.
Příspěvky prezentované na mezinárodních vědeckých konferencích (plakátová sdělení):
SLOVÁKOVÁ M., KUČEROVÁ J., JUKLÍČKOVÁ M., STRÁNSKÁ D., KORECKÁ L.,
HOLUBOVÁ L., BÍLKOVÁ Z. a VLČEK M.: Fabrication and enzymatic
biofunctionalization of nanofibers as a new material for wound dressings. Poster
prezentovaný na International Conference on Antimicrobial Research, 3. - 5. 11. 2010,
Valladolid, Španělsko. Abstrakt ve sborníku ICAR 2010 Book of Abstracts bez ISBN, s. 231
BÍLKOVÁ Z., SVOBODOVÁ Z., ESSLEMANN H., JANKOVIČOVÁ B. a KUČEROVÁ J.:
Biofunctionalized magnetic microparticles for efficient biomarkers capturing adapted for
magnetic force-based microfluidic device. Poster prezentovaný na 25th International
Symposium on Microscale Bioseparations MSB 2010, 21. – 25. 3. 2010, Praha, ČR. Abstrakt
151
ve sborníku MSB 2010, ISBN 978-80-254-6631-5, Brno, ČR: Institute of Analytical
Chemistry AS CR, s. 63.
SLOVÁKOVÁ M., KUČEROVÁ J., JUKLÍČKOVÁ M., STRÁNSKÁ D. a BÍLKOVÁ Z.:
Enzymatically-modified nanofibers for biomedical applications. Poster prezentovaný na 2nd
International Conference NANOCON 2010, 12. - 14. 10. 2010, Olomouc, ČR. Abstrakt
ve sborníku NANOCON 2010 Conference proceedings, ISBN 978-80-87294-18-5, Ostrava,
ČR: Tanger Ltd., s. 91.
SVOBODOVÁ Z., KUČEROVÁ J., NOVOTNÁ E., PLICHTA Z., HORÁK D. a BÍLKOVÁ
Z.: First steps in preparation of magnetic immunosorbent for CTC isolation and
characterisation. Poster prezentovaný v rámci CECHTUMA 2010 – X. International
conference on tumor markers, 16. - 18. 5. 2010, Mikulov, ČR. Abstrakt ve sborníku XXXI.
Imunoanalytické dny, ISBN 978-80-7399-953-7, Brno, ČR: CECHTUMA, s. 169.
SVOBODOVÁ Z., HORÁK D., KRÁLOVEC K., KUČEROVÁ J., AUTEBERT J., VIOVY
J.-L. a BÍLKOVÁ Z.: Circulating tumour cell capturing by efficient magnetic
immunosorbent, 19th Biennial meeting of the international society for molecular recognition:
Affinity, 16. – 19. 6. 2011, Tavira, Portugalsko. Abstrakt ve sborníku, sborník bez ISBN.
SVOBODOVÁ Z., KUČEROVÁ J., HORÁK D., AUTEBERT J., VIOVY J.-L. a BÍLKOVÁ
Z.: Development of magnetic immunosorbent for circulating tumour cells immunocapture
in microfluidic device. Bubble Tech to Bio App - "LAB-ON-A-CHIP", 2nd Korea - EU
Workshop on microfluidic technology for chemical, biological and medical applications, 17. –
18. 10. 2011, Saarbrucken, Německo. Abstrakt ve sborníku, sborník bez ISBN.
KUČEROVÁ J., SVOBODOVÁ Z., HORÁK D., AUTEBERT J., PALARČÍK J., BÍLKOVÁ
Z. a VIOVY J.-L.: PEGylation as a tool for enhancing the quality of magnetic
immunosorbents used in microfluidic devices. 9th International conference on the scientific
and clinical applications of magnetic carriers, 22. - 26. 5. 2012, Minneapolis, Minnesota,
USA. Abstrakt ve sborníku, sborník bez ISBN.
SVOBODOVÁ Z., KUČEROVÁ J., HOLUBOVÁ L., HORÁK D., AUTEBERT J., VIOVY
J.-L. a BÍLKOVÁ Z.: Magnetic poly(glycidyl methacrylate) particles with various coatings
for
on-chip immunocapture of rare cells for diagnosis of cancer relapse. NanoBioTech
Montreux 2012, 12. – 14. 11. 2012, Montreux, Švýcarsko. Abstrakt ve sborníku, sborník bez
ISBN.
KUČEROVÁ J., DUPUY B., PAPADAKIS G., KORDAS A., HOLUBOVÁ L., GIZELI E.
a BÍLKOVÁ Z.: Magnetic beads-based DNA extraction: different techniques compatible
with PCR and microfluidic systems. International conference on the scientific and clinical
applications of magnetic carriers, 10. -14. 6. 2014, Drážďany, Německo. Abstrakt ve
sborníku, sborník bez ISBN.
152