vAN p-srTosTERoL rN CHOLESTEROL BIJ DE KAKKERLAK

vAN p-srTosTERoL rN CHOLESTEROL BIJ DE KAKKERLAK

DE OMZETTING
vAN p-srTosTERoL rN CHOLESTEROL
BIJ DE KAKKERLAK
PROEFSCHRIFT
ter verkrüging van de grzad van Docror in de Wiskunde en
Natuuru/etenschappen a¿n de Rijksuniversiteit re Leiden,
op gezas van de Recror Magnificus Dr. W'. R. O. Goslings,
Hoogleraar in de Faculteit der Geneeskunde, volgens be.
sluit van het College van Dekanen te verdedigen op donderdag 25 mei 1972 te klokke 16-15 uur
door
WILHELMUS HENRICUS JOANNES MARIA WIENTJENS
geboren re Den Haag in I93Z
PROMOTOR, PROF. Dr. E. HAVINGA
STELLINGEN
I
uit de door Pichat et aI.
beschreven experinenten
blijkt niet, dat
0-bis-trimethylsilyl-5-li_thi_u:turacil nlet reageert mei
L. Pichat, J. Deschamps, B. Massé, p. Dufay,
COr.
8u11. Soc. Chim. France no.6, Z11A ?gll).
II
31u-hm' ltreinstein en sousa tonen niet aan, dat in rook van sigaren
of pijptabak meer vrije radicalen voorkomen dan in rook van sigaretten.
Blu_h:rr, J. Weinstein, j.A. Sousa,
Nature 229, 5oO (tglt) .
A.L.
III
Een aantal van 250 stations voor een meetnet van de luchtvervui_ling
in NeC,erland is voor het gestelde doel onnodig veel.
F.ïI. van Di- jk, 0.D. Prins, I. Strausz ,
Chem. l,rteekblad nr. 4j, 16 (lgll).
IV
isolatie van gedeeltelijk in de kern gemerkt p-sitosteror-1 4c l.*it
plant safvia officinalÍs na toediening van L-methionine-'1 4cH3 zou
verklaard kunnen worden door een merking via de acetaatpool.
H.J. Nicholas, S. Morlarty, Fed. proc. 22, ]229 (19Ø)
E. Caspi, J.G. Ll. Jones, p. Heidel, G.H. Iriede11,
A.J. Tiltnan, S. Yalciner, Chem. Conmun. 1201 (lgll).
De
de
V
Een routinematige, radioin:mr.urologische bepaling van trijoodthyronine in bloed zolr voor het kh-nisch schirdklierond-erzoek een belangri jke verbetering betekenen.
V]
Het is onjuist te steIlen, dat de Ned.erlandse oppervlaktewateren
toereikend zíjn voor een koelwaterbehoefte van elektricj_teitscentrales met een opgesteld vermogen van 125.ooo MW, zorang de consequenties van een maximale temperatuur van 30 oc van het koelwater
bij
uitlaat niet bekend. zijn.
K.J. Keller, Toekomstbeel_d der techniek nr. T, lT (lgll).
de
Ìl.H.J.M. Wientjens
25 l¡.ei 1972
Ca*
r*f-
A-"*
frc*n
,la.*a,,"n
oudtnzt
'Þ lL J".-¿
Inhoud
Pagina
Inleid-1ng
7
Biosynthese van B-sitosterol-28, Z9-14C met behulp
van kiemende erwten
11 Synthesi. ol B-sir-osterol-rIII
IV
4C
l1
16
Separation of sterofs by vapor-program:ned thinlayer chroma.tooraphy
29
De omzetting van B-sitosterof in cholesterol bij
d-rie soorten kakkerlakken
z-
The inffuence of several sterols on the conversion
of B-sitosterof into cholesterof 1n the cockroach
+7
Samenvatting
54
Summary
56
Inleiding
De jaren zestig hebben een toenemende belangstelling te zien gegeven naar bestrijdingswij zen van insekten, waarbij d_e gevaren
voor mensen, dieren en planten zoveer mogel-ijk geëlimineerd word.en.
Een gebied- d.at m.ogelijkheden voor seleetieve bestrijd_ingsmidde1en kan bieden is dat van de insektenhormonen. Dit gebied omvat
niet
a11een d.e insektenfiormonen
zelf of synthetische analoga daar-
varr' maar ook stoffen d.ie de werking van de hormonen tenietdoen.
Ìfat betreft dit laatste is het sterolmetabolisne van insekten interessant1.2 n vooral ook omdat het vervellingshonroon ecd_yson
een steroid is. Insekten zijn echter niet in staat om zelf Bterolen te s¡mthetisêren uit acetaat of mevalonaat. Sterolen zijn
daardoor ormisbare eomponenten in het voed-seI van insekten.
rn verband met deze sterolbehoefte klm-nen de insekteri in twee
groepen worden inged.eeld: d.e vlees etend.e insekten en d_e planten
etende insekten. De vlees etende insekten verkrijgen het C27sterol- cholesterol in hun voed.sel en zetten dit on in ecd.yson.
De planten etende insekten verkrijgen het C29-sterol p-sitosterol- in hun voedsel en moeten di_t sterol eerst omzetten in cholesterol alvorens de omzetting i_n ecd-yson kan plaatsvinden.
Voor de insekten d-ie uitsluitend" planten eten en geen cholesterol in hwr voedsel vind.en, is de d.ealkyleri_ng van p-sitosterol
van vitaal belang. Rernming van d.eze reactie, welke resulteert in
een gebrek aan cholesterol en ecd_yson, zaa ð,e ontwikkelj_ng van
het insekt verstoren. Aangezien de omzetting van p-sitosterol in
cholesteroJ alleen bekend is bj-j planten etende insekten en niet
bij andere dieren, planten of mensen, is d-e selectiviteit van een
eventueel bestrijdingsmidd.el tegen strikt planten etende insekten'
welke gebaseerd is op een verhind-ering van de dealþlerì-ng van
B-sitosterol in cholesterol, gewaarborgd.
HO
p- sitosterol
sitosterol
cholesterol
De verwijd.eri-ng van koolstofatoom 28 en 29
sitosterol in cholesterol kan in prlncipe
bii de onzetting
van
geschieden door
a) oxydatie en vêrwijderi-ng a1s b.v. COr'
b) directe verwijdering a1s alþ1groep.
In het laatste geval zou d-e d.ealþlering van sitosterol in 1nsekten langs de omgekeerd-e weg van d-e alkylering bij d-e bios¡rnthese
van sitosterol in planten krzu:.en verlopen. Bij d-eze bios¡mthese van
sitosterol (fV) spefen d.esmosterof (f) , 2[-melltyleencholesterof (ff)
2L(28])
t---\ een ro1- a1s intermediairen.
- (III)
en
^-Tr-"r-sitosterol
1*{
II
./
ET
Itr
Een overzicht van c-alkyleringsreacties en de biosynthese varÌ
4.
plantensterofen lvordt gegeven door Heftmur*3 en Lederer
De volgend.e procedure werd. beoogd
bj-i
d.e
hier
beschreverÌ ond.er-
zoekingen.
'1. Ê-Sitosterol radioactief merken op d-e C28- en C2!-plaats' Dit
radioactieve sterol toedienen aan planten etende lnsekten en na-
bliift.
2. p-Sitosterol radioactief merken in
gaan waar d-e radioactiviteit
aan insekten en nagaan
kern. Dlt sterof toed-ienen
welke radioactieve omzettlngsproducten
d.e
van sitosterof worden gevormd.
3. De rermende invfoed op d-e omzetti-ng van p-sitosterof in cholestero1 nagaan van steroid.en met een onnatuurlijke zijstaart'
Biosynthese van p-sitosterol-29,29-ta C met behulp
van kierhende erwten
11
specifieke activlteit van het gebruikte D,L-methior.ir:."-14a"-t t""
O,345 nCi/mM (Centraal Laboratorirm TNO, Delft) en van L-methioni1/,r"-'*CH- 24,6 rr;Cifn]I- (stuaie Centnm voor d-e Kernenergie, Dienst
t
der Rad,iolsotopen, Mo1, België). Voor de inactieve proeven en voor
de verdunning van het radioactieve nethionine l¡erd J,-nethj-onine
van Hoffnann - La Roche gebruikt. Voorts werd gebruik gemaakt van
meval-onzuurlacton (¡'rurn"), desmosterol (cherned) en B-amyrine (K &
\- De honogenisaties van de erwten werden uitgevoerd" met een homoK).
genisator van Salm & Kipp.
Het kie¡ren van de erwten geschiedd.e door 25 gram erwten te verdelen over twee petrischalen (diameter : 1 1 cn). Deze schalen werden in twee grotere petrischalen (dianeter = 20 c¡:) geplaatst,
waarbij de ruinten tussen de kleine en grote schalen werden opgevufd met vochtige watten. Het geheel werd afgesloten met horlogeglazen. Gedurende de eerste dag werd aan de erwten ongeveer 17 nI
water per schaal toegevoegd en 3edurende de volgende ilrie dagen
ongeveer 10 mI water per schaal per dag. Het kiernen gebeurde in een
geconditloneerde ruinte bij 26 oC.
De incubatie ¡ret methionine geschiedde op twee manieren: toevoeging van methionine aan intacte, kiemende erwten of aan homogenisaten van kie¡rende erwten. In het eerste geval werd aan kiemende erwten op d.e 5e dag een oplossing van methionine in water toegevoegd
door op efke erwt 0,02 ml oplossing te leggen. Het kiemen werd na
deze toevoeging nog 24 uur voortgezet, waarna de erwten met water
werden afgespoeld., gehomogeniseerd en opge'brerkt. In het tweede geval werden kiemend.e erwten op de !e dag gehonogeniseerd in een oplossì-ng van natrir¡¡mevalonaat in O,01 M fosfaatbuffer (pH : 7,4).
Het homogenlsaat werd met een oplossing van nethionine in buffer
.bíj 26
-C geîncubeerd.
^- o^
Uitgaande van 25 gram erwten werd- in beide gevallen aan het uit-
eind-elijk verkregen gehonogeniseerde extract 40 nl al-cohof en 4 nlvan een 6$"-tge oplossing van kal-iu¡hydroxyde in water toegevoegd.
12
De oplossing werd onder
ing gekookt.
stikstof
gedurend-e
Na afkoelen werd 200 ml-
2
:u.ur
onder terugvloei-
water toegevoegd en
werd- het
geheel met 3 x 75 nl ether ge'éxtraheerd-. De verzameld-e etherlagen
werden gerrassen net water tot neutraal en drooggedampt bij lO-3 nn
ï{g.
Het resiôu werd ond-er'worpen aan kolonchromatografie over Fforlsil
(AO-tOO nesh, Goudeket). Geëlueerd. werd- met benzeen, mengsels van
benzeen en ether in d.iverse verhoudingen en tenslotte ether. De kolomchromatografische fracties werden onderzoeht door niddel van
d.unnelaagchronatografie. Ad"sorbens silicagel H (Uerct<), loopvloei-
stof tolueen - ethylacetaat (AO + ZO), d-etectie 2 N H2SO4. De sterolfractie werd onder.vrorpen aan gaschromatografie volgens d.e mè10
thode van Clayton -. Gaschromatograaf Research Specialties RSCo
600, argonionj-satiedetectie, stationaire fase 5% DEGS op ChronooC, gassnelheid80 nl/
sorb WAW (eO-gO mesh), kolomteÍrperatuur 193
ml-n.
De
rad-ioactiviteitsmetingen
werd.en
verrlcht net een Packard îri-
vfoeistofscintiflatieteller, model 3575. De sa¡renstefling van
de scintil-latievtoeistof was: 5 gran 2,J-d,tfenyfoxazole (ffO), 0,5
Carb
gran .1,4-bis-(5-fenyl-2-oxazoly1)-benzeen (pOpop) en lOOo m1 ben-
Resultaten
Bij voorbereidende experimenten met niet-radioactj-ef ¡rethj-onine
bleek d-e sterolfractie te bestaan utt94% B-sitostero:-, 5% stigmasterol en 1% campesterof. De hoeveelheden sitosterol welke werd-en
geîsoleerd uit zowel gekiend.e als ongekiemd.e erwten hlaren in over1
eenstemming met de literatrrr"l .
Vervolgens werd een aantal- experimenten uitgevoerd met ¡rethioni1/-
ne-''CH-.
)-
Aan
2J gram kiemend-e erwten werd op de 5e dag 2 rol van
t)
Concl-usie'
a
,.
/ì¿
x
/tf,
nz
>--t--oo 7
t)
i
Journalof Labelled Compounds
of
Synthesis
-
Apr¡l-June
-
Vol. Vl, No.
2
P-Sitosterol-3-taC
P. Ph. H.
L. Orro, A. C.
Beseiuen
and W. H. J. M, WIeNrreNs
Central Laboratory TNO, Delft, The Netherlands.
Received December
I,
1969.
SuÀ¿tø,crv
The synthesís of þ-sitoslerol-3-14C, specifc
activity 5 mCilnM'
purity >98 %, is
slerol, the complete synthesis consisls oJ eleven reaction stepsIt is based on merhods described in the literature. For some of the
sfeps, a considerable improvement in yield ltas been achíeved. The
actual labelling step is the condensation of 4-oxa-As-stigmasten3-one with phenyl acetate-t4C in the presence of sodium hydride.
p-Sitosterol-3-1aC has been obtained with a chemical yield ol 23 /',
based oa 4-oxa-A5-stigmasten-3-one. The radiochemical yield was
t0.3 "Á. Chemical and radiochemical purities of þ-sitosterol-3-1aC
have been deÍermined by means of thin-layer chromaf ography,
described. Starting .from stigma-
radiochemical
gas-liquid cltromatography and mass spectromelry.
INtnopuctloN.
For work in our institute on sterol metabolism of insects, in particular on
the conversion of p-sitosterol into cholesterol and a possible inhibition of this
dealkylation, p-sitosterol labelled with laC in the nucleus was needed. p-Sito-
sterol is a sterol widely occurring in plants; it differs from the zoosterol
cholesterol in having an additional ethyl group attached to carbon
atom 24 (Fig. l). Plant-eating insects are able to remove this ethyl group.
For these insects sitosterol is an important source of cholesterol, which in its
turn is a precursor of the vital moulting hormone ecdysone.
A general method for labelling steroids with laC in ring A of the steroid
nucleus was developed as early as 1947 by Turner (1, 2), who prepared
cholestenone-3-laC from cholestenone. The conversion of cholestenone into
cholesterol has also been described (3' 4''t). An alternative route leading to
laC substitution at the 4-position has been developed by Fujimots t0' z).
Though the method of Fujimoto gives higher radiochemical yields, we chose
the method of Turner, as we had better access to labelled phenyl acetate and
16
p-
Sítosterot
( As
-St igmosten-3
p-
ol
)
/3-Srtosterol
oxr dot
i
on
Àa-
Ftc.
17
2.
Strgmosten-3-one
from ring B to ring A, in conjugation with the keto function (16). Then with
ozone, the double bond is attacked and the ring is opened. By further oxidation
an acid is formed, which looses carbon dioxide and the keto acid shown is
Sti g mo sten-3
:)
-one-3 Jac
^1
O..ç_
lo..tv
ot o
i
f*.",-,.
731"
11"t"
p - Sitostenot-3JaC
Frc.4.
19
16%
.water and carbon dioxide are split off and aa-stigmasten-3-one-3-1ac is
ofthe enol lactone condenses
obtained. In a side reaction, the carbonyl function
condensation product
resulting
The
phenyl
acetate'
the
*ì,h ,n. CH, group of
thus forming
is also hydrolized and spiits off water and carbon dioxide'
unlabelledstigmastenone.Theresultisthatthestigmastenoneobtainedhas
asomewhatlowerspecificactivitythanthephenylacetate-laC..Wefounda by
is formed
ã""r.u.. of ß/', which means túat 82 /' of the stigmastenone by column
twice
o/oby
purified
was
rouÍe II' The stigmastenone
route I, and 18
overall yield was 36 /"' based on enol lactone; the
ttre
chromatograptry.
radiochemical Yield was 16 /"'
Àa-3-keto steroid
Two more alterations aie required for conversion of the
bond from Aa-Position in ring A to
the carbonyl function to a p-hydroxyl
acetate (Fig' a), the enolized ketone is
;,ï,ï.å":f,:ïl'1ïI1iiiåJ.'i::å1:
water); attachment
anion takes up a proton from the solvent (methanol, ether,
(10)' When the À5-3-keto
of the proton to position 4 is kinetically preferred
epimer with thehydroxyl
steroid formed is reduced, it yields p-sitosterol and the
groupinaxialorientation.SomeAa-3-ketosteroidisalsoformed'eitherby
isomerization of the
ãi...t uttu"hment of a proton to position 6, or byunder
the influence of
easily
very
a5-keto steroid, which is known to occur
acidorbase.Byreduction,twomoreisomersofp-sitosterolareformed.
of a series
The deconjugation of Aa-3-keto steroids has been the subject
10, 11, 12, 13, 14). It is possible to obtain the intermediate
of investigationrõ,
potassium
anion directly from the Aa-3-ketone, e'g' by reaction, with
/-butoxide(u).However,theindirectrouteviatheenolacetateistobe
preferred from a preparative point of view'
The conversion of the ãnol acetate into p-sitosterol
by reaction with
sodiumborohydridehasbeendescribedbyFujimotoand.Jacobson(7).
Followingtheirprocedure,weobtainedpredominantlythe.Aa-isomersof
p-sitosteÃI. We have therefore studied the influence of reaction conditions
was carried
more extensively and obtained best results when the hydrolysis
out at
a NaOH-concentration of about 5'10-3 mMiml' in a
-l0oc, at sodium
borohydride so that the ketone formed is reduced
solution containing
immediately.Undertheseconditions'theisomerizationoftheAs-intothe
at moderate
aa-ketone is not yet important, while the enol acetate is hydrolized (15).
Progress
pH
lower
a
at
than
stable
more
is
rate; the sodium borohydride
analysis'
chromatographic
thin-layer
of
means
by
of túe reaction was folláwed
by
p-Sitosterol is formed in 13'/' yield' After purifying the product twice
p-sitosterol-3-1aC is obtained
column chromatography, and ty iecrystallization,
yield.
in 64 /,
20
ExpenlttteNllL.
þ-Sitosterol.
Stigmasterol (Fluka), which, as was found
contained
for the
a
by gas chromatography,
of campesterol besides about 5 /" p-sitosterol, was used
of p-sitosterol. We have followed one of the two methods
Lrace
synthesis
given by Steele and Mosettig (8), viz. the route via i-stigmasteryl methyl ether.
since in this route the amounts are easier to handle than in the route via
i-stigmasterol. The intermediates of the synthesis were thoroughly purified.
p-Sitosterol, after purification by column chromatography, contained, besides
a trace of campesterol, some stigmasterol and stigmastanol. No further
attempt was made to remove stigmasterol and stigmastanol, because impurities
resulting from these compounds could more easily be separated in some of
the subsequent reaction steps. The various reaction steps of the synthesis of
p-sitosterol were carried out in several batches. Their best results gave an
overall yieß of 47 \.
la-Stigmasten-3-one.
p-Sitosterol was oxidized by the Oppenauer method as described by
Barton and Jones (16). The yield after purification by column chromatography
and recrystallization from aqueous methanol was 7l )(.
4-O
xa- A5 - s t i g ntas
te
n- 3 -o
n
e.
The procedure given by Fujimoto and Jacobson(7) has been slightly
modified.
Aa-Stigmasten-3-one (2-4 g, 5.8ó mM) was dissolved in ethyl acetate
(30 ml) and glacial acetic acid (30 ml), and ozonized at l0o C until the
initially formed yellow colour had disappeared. When water (10 ml) and
hydrogen peroxide (30 %, I ml) were added, a white crystalline precipitate
was formed. After the mixture had been standing for l8 hours at 20o C, it
was cooled to 0o C. The crystals (A) were then separated from the mother
liquor (B), and dissolved in a mixture of hydrogen peroxide (30%, 1.5 ml),
ethyl acetate (65 ml) and acetic acid (5 mlì. Efficient stirring for 80 hours was
required. The solution was taken to dryness in vacuo; traces of water were
removed by azeotropic distillation with benzene (during warming up, a gas
was evolved); traces of benzene were removed in vacuo. Then the residue was
dissolved in freshly (!) distilled oxalyl chloride (6 ml) by stirring at -2o C,
under nitrogen. After the solution had been standing at 0o C for 70 hours,
it was taken to dryness in vacuo. The residue was refluxed with acetic
anhydride (50 ml) fot 2.5 hours, after which the solution was concentrated
in vacuo and 4-oxa-Â5-stigmasten-3-one crystallized. It was dried over sodium
¿t
hydroxide and finally sublimed at l50oC and 10-B mm Hg. The yield was
610 mg, m. p. 106.5-1070 C (lit. t7t ¡¡. p. 103-107o C).
The mother liquor (B) was also taken to dryness in vacuo; traces of water
were removed by azeotropic distillation with benzene. The colourless only
residue was treated with oxalyl chloride and acetic anhydride as described
above, yielding a second crop of 4-oxa-45-stigmasten-3-one (730 mg, m.P.
103-l05oC). The total yield was 1.34 g (3.23
sensitive compound was stored in
Aa - S t ig mas
te
n- 3 - on e- 3 -14
mM, 55 /,). This moisture-
vacuum sealed ampoules.
C.
A solution of phenyl acetate-1aC (2.8 mM, 380 mg; spec. act.
in benzene (2 ml) was stirred with 100 mg sodium hydride
6.28 mCi/mM)
for 15 minutes, shortly before use, in order to remove traces of moisture.
The clear solution was separated from the sodium hydride by means of a
pipette. In a 50 ml flask, provided with a magnetic stirrer and connected to a
gas burette, a mixture of 4-oxa-À5-stigmasten-3-one (1.5 mM, 620 mg),
finely powdered sodium hydride (875 mg), the benzene solution of phenyl
acetate-raC and 10 ml of dry benzene, were stirred very well at room ternperature until no more hydrogen was evolved (70 hours). Excess sodium hydride
was decomposed by adding I ml of concentrated hydrochloric acid. The mixture
was extracted with ether, the ether solution washed twice with water, dried
over sodium sulphate and evaporated. Volatile components such as phenol,
phenyl acetoacetate and phenyl acetate, were removed by heating at 80o C
in vacuo (10-s mm Hg). The residue was dissolved in methanol (55 ml) and
water (20 ml), containing potassium hydroxide (700 mg). This solution was
refluxed for l8 hours by heating in an oil bath at 85-900C. After addition of
acetic acid (2 ml), the solution was concentrated to a volume of 5 ml and
extracted with ether. The ether solution was washed with water and evaporated
to dryness in vacuo. The residue was dissolved in n-hexane/benzene (l : l)
and purified by column chromatography on florisil. The column was eluted
with n-hexane/benzene mixtures, varying the benzene concentration from 0
to 100/. in steps of 10/" after each 100 ml. The fractions containing
Àa-stigmastenone-3-1aC were collected and the purification repeated. The
yield was 222 mg: 0.54 mM, i.e. 36 % based on 4-oxa-À5-stigmasten3-one.
3-
A ce
to
xy- A3,5
-s t
i gmas
Íad ie ne-3
-14
C.
Aa-Stigmasten-3-one-3-1aC, (0.5
mM, 207 mg), was dissolved in
iso-
propenyl acetate (40 ml), and refluxed for 2.5 hours after addition of 0.04 ml
of concentrated sulphuric acid (d 1.84). The mixture was concentrated to half
its volume, isopropenyl acetate (20 ml) was added and it was refldxed for
3 hours. Then once again the mixture was concentrated to half its Volume,
¿¿
isopropenyl acetate (20 mt) added and refluxed
taken to dryness in vacuo.
p-
for 3 hours. Finallv it
was
Sitosterol-3-1+C.
The 3-acetoxy-À3'5-stigmastadiene-3-raC was dissolved in a mixture of
ether (100 ml) and methanol (75 ml); a solution of sodium hydroxide
(90 mg:2.3 mM; i.e. 0.8 mM in excess of the amount needed for
neutralizing the sulphuric acid used in the preparation of the enol-acetate)
in water (8 ml) was added. After cooling at
-l0o C, a total of 630 mg sodium
borohydride was added in the course of 100 hours, in portions of 70 mg, each
dissolved in l0 rnl of methanol f water (60: a0). The progress of the reaction
was followed by thin-layer chromatographic analysis. After 140 hours,
conversion was complete. The temperature was raised to 50 C and excess
sodium borohydride decomposed by addition of concentrated hydrochloric
acid (6 ml; d l.l8). The solution was boiled for 45 minutes, concentrated
to 60 ml and extracted with ether (5 x 20 ml). The ether solution was washed
with water (20 ml), dried over sodium sulphate and taken to dryness. The
residue was dissolved in benzene (10 ml), n-hexane (30 ml) was added and it
was purified by column chromatography on deactivated alumina (15 g;
diameter of column I cm; for deactivation a mixture of 250 g AlrOr, according
to Brockmann, and 14 ml of 10 )( acetic acid was agitated for 2 days).
The column was eluted subsequently with 150 ml of n-hexane, 150 ml of
n-hexane/ether (97 :3), 100 ml of n-hexane/ether (94: 6), 100 ml of
n-hexane/ether (91 :9) and 100 ml of n-hexane/ether (88: l2). The eluent
was collected in fractions of 50 ml. Each fraction was analyzed by thinJayer
chromatography. The fractions containing p-sitosterol-3-1aC were combined
and purification by colur¡n chromatography repeated. Finally, the p-sitosterol3-1aC was recrystallized from methanoliwater (9 : 1). The yield was 130.6 mg,
0.32 mM, i.e. 64 /" based on Aa-stigmasten-3-one-3-1aC. The product
was dissolved in benzene/toluene (13 : l) and stored in vacuum-sealed
ampoules.
Specifc activity.
A sample of the p-sitosterol-3-1aC benzene/toluene solution was taken
dryness and the residue sublimed in high vacuum, in order to remove
traces of solvent. A solution of an accurately known p-sitosterol-3-1aC concentration was prepared in a liquid scintillator, to which carrier p-sitosterol was
to
of the liquid scintillator was
in I I toluene. Activity measurements were carried
added (about 0.5 mg/ml). The composition
5 g PPO and 0.5 g POPOP
out with 15 ml solution in a Packard Tri-Carb liquid scintillation spectrometer,
model 3375. The specific activity found was :5.17 L 0.03 mCi/mM.
21
24
I /, probably
about 0.1 /,This is confirmed by the radio-scan: one sharp peak at the Rr
for p-sitosterol, and virtually no activity elsewhere.
even the main impurities are present in amounts much less than
Gas cltromatography.
A gas chromatographic analysis of p-sitosterol-3-laC methyl ether,
according to the method described by Clayton (u), was carried out. Fractions
were collected in glass tubes by cooling the gas stream emerging from the
column. The radioactivity of each fraction was determined after the glass
tubes had been washed with 15 ml scintillation liquid, containing 10 mg
cholesterol, 5 g PPO and 0.5 g POPOP per I I toluene. The radio-histogram
together with the mass peaks are shown in Figure 6. Campesterol is present
in about 0.5 %.
Frc. 6. Gaschromatogram of p-sitosterol-3-1aC methyl ether.
The mass peaks with ¡.r.t. <2 are artefacts of the methylation. The histogram shows
the activities of separate fractions. Radiochemical impurity at r.r.t. 5.3 : < O.5 \ (campesterol methyl ether).
Mass spectromefry.
A
mass spectrum was
run on a Hitachi-Perkin Elmer RMU-6E, with an
electron energy of 70 eV. Part ofthe spectrum and the interpretation are shown
in Table 1. Campesterol might be present in circa 0.7 7"; the presence of
about 1 \ of other molecules with M.W.416 cannot be excluded'
DrscussroN.
Chemical and radiochemical purities have been determined by means of
thin-layer chromatography, gas-liquid chromatography and mass spectrometry.
Thinlayer radio-chromatography showed that a few minor, unidentified
impurities are present in amounts of about 0.1 %. By gasJiquid radiochromatography the presence of 0.5 f campeslerol was shown. The mass,
spectrum shows two values of interest :
(l) the contribution of campesterol is about 0.7 %, which is in excellent
agreement with the value obtained from the radio gas-chrornatogram;
(2) the peak intensity at M/e : 416 indicates the presence of about I I of
an impurity of molecular weight 416, which is not present in pure p-sitosterol'r'.
We have not been able to identify this impurity, but vapour-programmed
thin-layer chromatography {rsl and TLC on argentated silica gel showed
that, if p-sitosterol-3-1aC contains any 5 a-stigmastanol, it must be less than I \.
From these analytical results we may conclude that the p-sitosterol-3-raC
obtained, has a radiochemical purity of >-98 7". Though we have paid much
attention to the purification of ìntermediates, a trace of campesterol present
in the starting material, could not be removed in the course of the synthesis;
it therefore appears in the final product.
AcrNowI-¡ocEMENT.
The authors wish to thank Dr. E. Talman for running mass spectra and
well as Mrs. E. L. Besemer-Blok and
W. 't Jong for their valuable technical assistance.
assisting with their interpretation, as
Mr
REFERENCES
l.
Tunnen, R. B.
Radioactive Cholestenone, J. Am. Chem. Soc.,69 :,726 (194'7).
Steroids Labeled with Isotopic Carbon : Cholestenone and Testo-
2. Tunxen, R. B. -
sterone, J. Am. Chem. Soc.,72: 579 (1950).
The Reduction of Cholestenone Enol Acetate
3. DnuneN, W. G. and Ersrmv, J. F.
- Soc.,73:4a$ Q95l).
by Sodium Borohydride, J. Am. Chem.
Brllrlu, B. and Grr-r-rcnnn, T. F. - The Conversion of Aa-Cholestene-3-one to
Cholesterol, I. Am. Chem. Soc.,73: 4458 (1951).
Preparation of raC-Cholesterol from raC5. Scnw¡Nr, E., Gur, M. and Bnr-rsc¡, J.
Cholestenone, Arch. Biochem. Biophys.,3l -: 456 (1951).
Labeling of Steroids in the 4-Position, J. Am. Chem. Soc.,73 : 1856
6. Fu:uoro, G. I.
4.
(l9sl).
-
* We are indebted to D¡ M. Barbier, Institut de Chimie des Substances Naturelles,
Gif-sur-Yvette, France, for kindly providing a sample of a few mg of absolutely pure
p-sitosterol.
27
JOUBNAL OF
LrPrD
RXSEARCH
L,
37e
,
1970
Separation of sterols by vapor-programmed
thin-layer chromatography
W.H.J.M. WIENTJENS, R.A. DE ZEEU!\I, AND J. WIJSBEEK
central Laboratory TNO, Delft, The Netherlands; and Laboratory for
Pharmaceutical and Anal-ytical Chemistry, State University, Groningen,
The Netherlands
sul.nIARY By vapor-programmed thin-layer chromatography on sifica
gel, it was possible to separate chol-estanof fron cholesterol and
stignastanof from B-sitosterol. The method was applied for the
analysis of B-sitosterol-J-r4ç.
SUPPLEMENTARY
chol-esterol
cholestanol
p-si-tosterol
9-sitosterof-5-1 4C
IGY WOF-DS
stigmastanol
By ordinary thin-J_ayer chromatography, sterols containing one
doubl_e bond are difficul_t to separate from the corresponding
saturated st-erols. Special chromatographic techniques are necessary'
with silver
nitrate (1 ), continuous development (Z), or partltion chromatography with a reversed-phase systet' 3). We wish to report here the
separation oí cholestanol and cholesterof. and- of stlgmastanol- and
B-sitosterol by vapor-progranuoed thin-layer chromatography on sil-ica
such as the use
of silica
ge1
or
al-rrmina impregnated
gel.
sterols used were the following: cholestanof (nfuf<a 4.G.,
Buchs', Switzerland), cholesterof (tinafy supplied by Wed' D'S' van
Schupp-en, Veenendaal, The Netherlands) purified by recrystalLtzaÏion,
The
B-sitosterot (t<inaty supplied by The Upjohn Co., Kalamazoo,
)a
Mì-ch')
^^¿ purity as sho.wn by gas-liquid
ol about, BA/o
chromatography with
stigmastanol and campesterol as the most probable nain impurities,
and stigmastanol' synthesizeô. by reduction of B-sitosterol and
1
purified by recrystal-lizati-on. solvents used were of reagent grade
(E. Merck 4.G., Darmstadt, Germany). The conpositions of solvent
mixtures are given in vol_ume parts. Sifica Gel GI 254 (Merck A.G.)
was used as adsorbent, in O.2J rnn layers on glass plates, 2A x 20
cm. After spreading (Desaga apparatus), tne plates were air dried
for 15 min, heated for 30 mín at l1O oC in an oven wíth a fan, then
cooled and stored in a dessi-ccator. The sterofs ïrere dissolved in
benzene (O.l% r'r/v), and 5-Uf portions liere appJ-ied with a 10 pI
nicropipette (Desaga, Heidelberg, Germany), z.! cm from the botto¡r
edge of the plate. s¡rall bands of adsorbent, approxinately 0"5 cro
wide, were scraped off the side edges and the bottom edges. lfe used
normaf chambers (nesaga) and the za x 20 cm vapor-progranuling chamber
(nesag'a). rn the latter chamber, the troughs .hrere filred with about
5 ¡r1 each of the appropriate solvent mixtures, the plate Ì\ras fixed
in position, and, after allowing 1O rnin for equilibration, the
sol-vent reservoir was fil1ed- wítb, 25 ml of ru¡n.ing solvent. Small
strips , A,J mm thick were used as spacers to prevent the adsorbent
from touching the trough walls. These strips were placed on the
side wal-fs of the chamber and fitted on to the si_de edges of the
plate fron which the adsorbent had been removed. After developnent
the plate ïras sprayed with 2 N H2so4 solutj-on and heated at I o oc
i-n an oven. Detection was carried out under w-light , 35o rnt (canag
universal lanp), and photographs were made in daylight on Agfacolor
CT 8 Diapositive film.
Fig. 1A shows that, with the best system in our hands, tolueneethyl acetate (eo + zo) in an r-r'saturated chamber, cholestanol and
1
'1
cholesterol, and also stlgmastanol and B_sitosterol, are not
1
A sanple of stigmastanol was prepared by Mr. A.c. Besemer, central
Laboratory TNO, De1ft, The Netherfands.
)U
separated by ordinary thin-layer chromatography. However, by using
a vapor-progranming chanber, âs d-escribed by de Zeeuw (4), an¿
diflerent mixtures of carbon tetrachloride and ether in the troughs,
a separation can be achieved between the saturated and unsaturated
sterols, which is shor¡ln in Fig. 1B. Vapor-progranmed TLC is based
on the principle that the roigration of the solute spots is highly
dependent on the ad_sorption of sol_vent vapors by the dry ad-sorbent.
To obtain optinilrn vapoT. influence, a vapor-prograruning chamber has
been designed in which the plate is d.eveloped ln a bLorizontalposition. During development the adsorbent faces a number of troughs
that can be filled with liquids of different conpositions, while
the distance between the adsorbent and the trough walls is kept very
small to prevent vapor diffusions. Thus, optimr.ru vapolr conditions
can be established all- over the plate. tr'or the separation of closely
related substances an accelerating vapor program shoufd be used,
i.e. the polarity of the sol-vent mixtures in the troughs increase
from botton to top. However, in order to prevent tailing of the
spots, interspersing troughs with liquid.s of low polarity
(retarding troughs) have to be used between the acceterating
troughs. Details are described in the legend of lig. 1B. fncreased
proportions of ether are used ln the acceferating troughs from
bottom to top, whereas carbon tetrachforide is useC. as retarding
liquid. Benzene instead of carbon tetrachloride is used in the
solvent reservoir and in the fj-rst trough to give the substances a
suitable starting migration. The R, values for cholestanof andstignastanof are about 0.59, and those for chofesterol and- Bsitosterol about 0,66. À siroll-ar separation r,¡as obtained by Bennett
and Heftnann (Z) for chotestanol and chofesterol with continuous
d-evelopnent, but their developing tine was 6 hr, whereas ours r\ras
2
We
have applied this nethod of vapor-programmed thin-layer
31
A
'l
23456
START]
oC,
Fíg. 1. Thin-layer chromatography of sterols. Temperature 20
relative l:iunið"iT,y {C/". 1 , p-sitosteraJ; 2,stigmastanoli S,mixture
of p-sitosterol and sti gmastanol; {,choÌestetol1, J,cholestanol;
and. 6,mixture of cholesterol and chofestanol.
A: Unsaturated chambe" (D""ag.), solvent system toluene-ethy1 acetate (BO+20), developnent t hr"
)¿
De omzetting van psitosterol in cholesærol bij
drie soorten kakkerlakken
35
Sterol-en
Naast het gesynthetiseerde B-sitosterol--14C *rr"n c.e gebruikte
sterol-en chol-esterof (Wea. D.S. van Schuppen, Veenendaal) en fuco/.sterol- (geTsoleerd
uit zeewier lucus vesiculosus door Dr. F.J.
Extractie en_verzeping
Exemplaren van Bfattella
germanica werden in zijn geheef opge-
werkt, terwijl van de grotere Periplaneta americana en Eurycotis
floridana het maagdarmkanaal en de voortplantingsorganen apart werden geïsoleerd. Na beëlndlging van de proeven werden de kakkerfakken met C0, verdoofd. De intacte Blattella germanica en de organen
van Periplaneta americana en Eurycotis floridana werden bewaard in
ethanol bij 4 oC. li¡ opwerking werden de eerstgenoend,e insekten in
stukjes geknipt, terwijl d-e organen van laatstgenoemde insekten werden gehonogeniseerd. Van beid.e werden extracties uitgevoerd, net
kokende ethanol en kokende aceton. De extracten werden verzameld
door centrifugeren. Na verwljdering van het oplosniddef werd het
residu gedurende de nacht verzeept net 1O mf van een 1úf-ige oplossing van kaliu¡hydroxyde in B("-íge alcohof. Het reactietnengsel- werd verdund met 25 ml- water en ge'éxtraheerd met 5 x 20 ¡rl_
ether. De verzamelde etherlagen werden gewassen met water en gedroogd net natrir.msulfaat. Na fil-tratie van het d-roogmiddef en
verwì-jdering van het oplosni-ddel, werd het residu onderworpen aan
kolomchronatografie en vervolgens gaschromatografie.
Chromatografie
Het residu werd opgenomen in 1 ml benzeen en gechromatografeerd
over 2 gram gedesactiveerd AL2O' (Uerct) in petroler.rnether (60 oC).
BO
le RtrOz was gedesactiváerd door 5OO g te mengen met j5 mI
L)
1(" azijnzuur en ond-er vermind-erde druk droog te dampen. Er werd
geëlueerd- met 50 ml fracties van petrolermether, petroleumether 37
netjes (resp. B 1 en 4, B 2 en 5 en B 3 en 6). Afs blanco werd in
een derde kweekfles gedurend-e d-ezel-fd.e tijdsperiod.e van 6 weken
O,! gram sterolvrij d.ieet plus O,J mg sitosterol-3-14C b"*ru"d,
doch zonder kaldæerlakken. Dit dieet werd. eveneens op rad-ioactÍeve
sterolinhoud geanalyseerd (f Z). De resultaten van de gaschromatografie zijn weergegeven in Tabef 1. De llnkerkofommen geven de relatieve retentietijden t.o.v. cholestaan aan. De rechterkolonmen
geven d.e verhoudingen van de gevond-en radj-oac'i,ieve pieken, waarbij
de grootste piek gesteld wordt op 100. Bij langdurende proeven is
dat de piek van chofesterol.
In soortgelijke langdurende proeven net Blattel1a germanlca werd.
nagegaan wat d-e invloed van fucosterol en cholesterol is op de vorming van de onzettingsproducten van sitosterol. Daartoe werdBlattefla germanica gekweekt op d.iêten met verschillende sterolsamenstel-l-lngen, n1. 1 kweek met 0,1/" sítosteyol-3-14a (u 8-10), 2
kweken nret 0,1/o sitosterol-3-14,
rucosterol (¡ rl-l 3) en 2
"n A,1/o
1L
.¿
kweken met O,1rþ sitosterol-J-'*C en a,1/" chtolesterol (g I+-l0).
Ook hler werd afs blanco een kweek ingezet net 0,1/o sítosterol-31/'*C, doch zonð.er kakkerlakken (l 17). Nu 6-7 weken werden de insekten te hongeren gezet en geschei-den naar nimfen, vrouwtjes en
marinetjes. De sterfte onder de insekten'hras tijdens de proef hoog.
In een enkel geval werden ook dode insekten opgewerkt (l t 5 en t 6).
De resul-taten van B B-17 zijn opgenomen in îabel 2 en zi¡n tot
stand gekomen door mid-del van radiogaschronatografie met d"e
Berthol-d reactor. In tegenstelling tot de and.ere tabellen zijn
van cholesterof en sitosterol- de percentages vermeld. Percentages
kfeiner dan \rt, die ¡ret deze automatische meetopstelling noeilijk
te schatten ztjn, werden buiten beschouwing gelaten.
Periplaneta americana
Van aseptische Peripl-aneta americana werd.en I nimfen en 1 vrou.rr-
tje
vrij
gedurende 3 dagen te hongeren gezet, waarna ze el-k 25 mC sterol-
dieet plus O 3% síLosteroI-3-14, (0,9 p0i) kregen toegediend..
39
d.it radioactief voed-sel T¡Ias opgegeten, kregen de kakkerlakken
nog gelegenheid- on var. sterolvrij dieet te eten. Van deze insekten
r,rerden de maagdarrlkanalen ond"erzocht. IIet resuLtaat is weergegeven
in Tabel 3. Bii deze kortdurende proeven is d-e grootste piek die
van sitosterol.
Nad-at
Eurycotis floridana
Van aseptische Eurycotis
floridana werden nimfen en vrouwtjes
J ð.agen te hongeren gezet, waa¡na ze el-k 25 mg sterol-vrij dieet plus O,lfi g-sitosterol-J-14C (0,5 ¡rC:-) kregen toeged.iend. De ¡aeeste insekten aten dit radioactj-ef dieet binnen 1 dag
op. Enkele ninfeir vervelden echter tijd.ens de proef toi volwasse¡.en
en aten d.it dieet op in 2 tot l0 dagen. Nadat het rad.ioactief d.ieet
op rras, kregen de insekten terrsl-otte sterolvrij dieet, waarvoor ze
2 dagen de gelegenheid kregen om van te eten. Van de kakkerlakken
gêdurende
werden naagdarmkanaal en voortplantingsorganen ontleed. De resultaten van de analyse zijn samengevat j-n Tabel 4.
¿,(')
81
rrt
n
rrt
cPm
2,29
o,7
82v
83m
84n
85v
86m
87 bl.
rnt
rrt
rrt
r'nt
cPm
rFt
cpm
Frt cPm
2P2
o,2
R
o
L
993
100
cPm
cpm
cPm
I
2
3
4
3s2
c
H
100
996
o
100
L
E
S
T
E
396
100
E01
100
3s4
100
5,21
o,2
5,50
o,4
5,5i
O'4
R
9s1
q3
5,3
o,s
6,74
100
5
5,24
5,74
o,2
6
I
T
o
S
T
E
6,64
96
6,73
+o
6,73
33
6,6 7
3,8
6:72
291
o,3
7,42
o,5
eoo
o,2
7,90
o2
7,93
7
I
S
o,2
o
L
6,7C
3.4
7,95
I
10
o39 o,2
11
TABEL
1
Rodiooctíøvø størolinhoud von Blottøllo gørmonico
toødiøning vqn 9-sitostørol -3-14C (n= nimføn,
V = V r^ouw-tjøs, m = mQ n nÇtj 9s, r rt = rø of øv a, lzlz'nliø tijd
cprn=counts pør mlnutøJ.
I
i
sitostøroI-14C
sitostørol- 14C
B
cho løstøro
sitostø¡ ol
TABEL
2
I
I
9
n
ucostø ro
11
V
10
m
V
12
n
95
98
96
86
95
5
2
4
14
5
14C
b
+
+
f
sitostørolcholøstø rol
I
13
14
r
V
88 96
12
4
15
m
16
92
72
I
r
28
Rodioqctieva sterolinhoud von Blottellq germonico
toødiøning von ß - sitostørol- 3-14C en f ucosterol of
lonco
17
bl
100
no
choløstørol (n=nimføn, V=vrouwties , Fr'ì= rrìonnelje,s, r= FØst).
P1 n MDK
rrt
nrt
cPm
P2 n MDK
rrt
cPm
P3 n MDK
Frt
cÞm
P4 n
îrt
MDK
cPm
P5 v MDK
rrt
cPm
1
P6 n MDK
rrt
cPm
1,O
ol
2
3
H
o
L
E
S
T
E
R
o
L
3.41
1oo
3,81
312
3.e7
40.9
3,85
4aa
3.44
6e,7
3,85
5¡e
26
5.29
¿6
51a
1,3
5.14
2þ
5A5
T
o
S
T
E
R
o
L
roo
6,53
100
6.53
'too
6,50
100
E81
100
7,93
12
7.74
21
7.6A
23
ze2
13
I
8,93
'1,O
10
1q25
'to;77
o,3
c
4
17.7
5
6
S
6,46
100
7.67
2,4
I
6.54
z7
7
I
1,1
10.06
o,6
11
omøricono
TABEL3 Rodiooctiøvø størolinhoud von Pøriplonøto
no toødiøning von F -sitostørol- 3-14Ç (¡=nimføn ,
V=Vr ouWtjøs-, rrt =rølqtiøvø røtøntiøtijd,
cpm =counts pør m¡nutø, MDK= mqogdqrmkonqol).
E2
E1
MDK
Frt
rrt
cPm
MDK
rrt
cÞm
E4
n
E5
h
MDK
MDK
MDK
E3
art
cPm
E6
E7
n+m
n
rat cPm
rrt
MDK
cPm
îrt
cPm
oa7
o,7
MDK
rrt
cPm
EA
E9
E10
MDK
VPO
VPO
n+m
n
rrt
cPm
m
rrt
cPm
rrt
cPm
1
2
241
o,3
2,A5 o,4
3
c
4
H
o
3,84 23,7 393 30,6 3,85 648 1e7
5re
5þ2
+
100
6,65 100
S
I
6,5C
100
6/s
zeo
1,8
E
S
3,e6 37,5
T
E
R
o
L
9s4 34J 3,86 5q8 3,44 49,9 3e5 7BA 3,44 68,9
1,4
5;1
3
2,e
5,4e
6
6,41
L
34r
ï
o
S
100 6,50 100
q31
5,57
T
E
R
o
6,6S
100
6,63
100
z8s
2.1
gs
5,e
L
ô,49 100 6Þ8 100
6,5C 100
7
I
265 oo
7,74
22
I
10
.10
1,7
1A
go6
979 3,4
2,O
to,4s
?o
11
TABEL 4 Rodiooctiøvø størolinhoud von Eur
toødiøning von p-sitostørol-3- 1a
Fr'ì = r'fìo]'rrretje,s, MDK = mqoqdormko
ongqqn, rrt = re,lotieve, røló,nbiø,lijd,
z6s
2,O
Discussie
Bij de langdurende proeven ¡ret Bfattella germanica wordt in de
eerste plaats radioactief cholesterol gevonden en slechts weinig
onomgezet sitosterol. Daarnaast vinden we meerdere anclere radioactleve omzettingsproducten van sitosterol in de orde van grootte
a
^.,n
van O,2
Yooral de aanwezigheì_d in alle insekten van een
- A,Vo.
stof ¡net dezel-fde relatieve retentietijd (7,90) a1s die van L24(2s)sitosterol is d.uidel-1 jk. Deze metaboliet van sitost erol-l-1 4C *"rd
door ons ook gevonden bij d-e proeven met Periplaneta americana en
Eurycotis fl-orid-ana. Úeze resul-taten vuflen die van Ritter 4 r"t
Eurycotis florid-ana aan, waarbíj aanwíjzingen werden gevonden voor
de o¡rzetting van si-tosterol in fucosterol, en díe van Svoboda en
zijn ned-ewerkers 5
Alfais en Barbier 6, dr" onlangs fucoste"r,..r.n
roI al-s omzettingsproduct van p-sitosterol_ vonden in resp. de tabakspijlstaart Manduca sexta Johannson en d-e sprinkhaan .Locusta
nigratoria L. A-24(28) -sltostero-L wordt veronderstefd inter¡rediair
te zi¡n bij de biosynthese van sitosterof in planten 7. Ort is ook
het geval ¡ret het in deel V beschreven desmosterol. De gevonden omzettingsproducten suggereren daard-oor, dat Ce dealkylering van sitosterof in lnsekten, althans gedeettelijk, zou kunnen verlopên langs
de ongekeerde weg van de alkylering bij de biosynthese van sitosterof in pl-anten, Het plekje in de bfanco B 7 bij rut = J,J is d.at
van campesterol, dat als gerlnge onzuiverheid in het gebruikte si1/tosterol-5-"C voorkont, terwijl het piekje bij rrt :3,9 zeer
waarschijnlijk cholesterol is, d-at nog van d.e gaschromatografiekol-oro kwam na d.e relatief grote hoeveefheden chofesterol, die op
d-e kol-om lraren geweest. Aangezien insekten in het algemeen in
staat zijn om C28- en C29-sterolen te dealkyleren 4, ," het niet
verbazingwekkend het campesterolpiekje minder of niet meer terug
te vinden in d-e sterolinhoud- van de insekten. Ui_t d-e resultaten
van B 8-17 blijkt dat de invloed van fucosterol en cholesterol
45
opded.ealkyleringvansitosterolvangeenbetekenisis.Erworden
geen íntermed-iairen op deze wiize opgehoopt. fnteressant is' dat
zelfs d-e aanwezigheid van cholesterol de omzetting van sitosterol
in cholesterol niet m-ìnder doet zijn. B 16 bevatte nog slechts dode
insekten, hetgeen ùe reden karL zi-jn van de relatief grote hoeveelheid onongezet sitosterof.
Bij de kortd-urend-e proeven net Periplaneta emericana en
Eurycotis floridana is sitosterol het neest voorkomend.e sterol- in
de insekten. Naast chofesterol komen ook hier rnreer meerd-ere rad-ioactieve Onzettingsprodueten voor erÌ wel in hoeveefheden van ongeveer 2/o. Deze hoeveelheden zijn echter veel te gering voor structuurid.entlficatie.
Li teratuurverwi j z ingen
1. R.B. Clayton
Nature
2. J.L.
@.,
1166 (1959)
Noland-
.A.rch. Biochen. Biophys.
ß., 37o (lg>+)
5. Ã.J. Clark
Thesis Hazvard, p. 5 (1958)
4. f'.J. Ritter
TNo-Nieuws
and W.H.J.M. trtrientjens
4, 3U lgal)
Svoboda, M.J. Thonpson and- W.E. Robbins
Nature New Biology 23o, 57 (lgfl)
5. J.A.
6. J.P. All-ai-s et M. Barbier
ExperientÍ a 4-, 506 (lgll)
7. E. Lederer
Quart. Rev. ä, +57 (tO6l)
46
t.!':
:
EXPERTENTTL
The Influence of Several Sterols on tlte Conversion
B-Sitosterol into Cholesterol in tlre Cockroach
27, 373 (tglt)
of
Although sterol-s are important for them, insects do not possess
the enz¡rmic system necessary for the synthesis of sterols from
acetate or mevalonate. Therefore, sterols are ind-ispensable conponents in the insects' food. Carnivorous insects obtain cholesterol-
fron their food and- they are able to convert it into the noulting
hormones ø- and p-ecdysone. plant-eating insects obtain B-sitosterol
from their food and they can convert it into cholesterol, which
implies a dealkylation of the ethyl group containing c-Zg and, c-2).
For strictly phytophagous insects, whose natural source of nutrition does not contain cholesterol, this ability to dealkylate
is of vltal importance. rnhi-bition of this reaction, resulting
in a depletion of cholesterol, will disturb their developmentl-'.
since knowledge in this field may help in developing selecti-ve
ways of insect control, we decided to try to learn nore about this
¿-
dealkylation' .
lle administered B-sitosterori-14c5, added to a sterolfree diet
6'7
- , to J species of'aseptic
' 8 cockroaches, viz. Blattella germanica
L., Periplaneta americana L. and Eurycotis floridana Tilal-ker. A1- I
though the cockroach is not a strictly phytophagous insect, the
I
said d-ealkylation can also be studied. in this on¡rivorous test
f
\
animal. Besides cholesterol, several radioactive minor ¡retabol-ites
were for.¡¡rd . One of these had. the same gas-chromatographic behavi_our
¡t-(>p.\
as A-''-''-sitosterol.
Ilowever, the anor.urts of the netabofites were
too snal-l for el-uci-dation of their structures.
The present paper reports on the influence of a variety of
sterofs with unnatural sid"e-chains on the conversion of sitosterol
into cholesterol-. 10 ng of sterol-free diet6'7, to which'10 pg
of p-sitos teror-3-14c(o.l 2 ttcí; spec ' act' S nct/nl'I)5 and 1' 10
or OO ¡.rg of the potentlal antimetabol-ite9 had been added' was
ad¡tinistered to 6 nynphs of Bl-attella germanica per test, after
they had. been starved for 5 days. This radioacti-ve diet was eaten
within 1 ox 2 days. Next, the insects obtained 200 mg of sterolfree diet, were killed after 2 d-ays and extracted- with hot ethanol
and acetone. The extract'irras saponified with lØ" (w/v) KOH in 8Úf
(v/v) ethanol at room temperat,re overnight. The reaction mixture
was separated by means of centrifugal co¡m*r chromatogrtphyl0.
(for thin-layer chronatography, Merck); speed:
Sorbent: Af^O-H
¿)
19OO g; fraction 1225 mI benzene, fractíon 2=2J mI ethyl acetatebenzene (lO + gO) and. fraction J: ethyl acetate-benzene (¡O + ZO).
'1
Radioactivity measurements were carried out by means of a
Packard Tri-carb liquid scintillation spectroneter, ¡lod.e] 5380.
Fractions 2 which contained the free sterols, were analyzed by
means of radÍo gaschromatogtuphyll with a flow reactor RGC 170
(Laboratory Prof. Dr. BerthoId, Wildbad, Germany, and Bodenseewerk
perkin-E¡oer & Co. GrobH, Ifberlingen, Gernany). Stationary phage
3% OV-1T on Chromosorb G.AW.DMCS; argon ionization detection;
oC;
reactor filling CuO; reactor temperature
colu¡m temperature 250
-^^ o_u; rror,ù-Ðroportional cor.rrter 80 n1 . In some cases a1so J/o
böu
DEGS on Chromosorb tr{.AI,ti was used with discontinuous radioactivity
measurements of methyl ether derivativesl2.
The results are su¡¡rarized in the Table. The slm of these values
was put at 1OO. Values of radioactive netabolites of less tnan3%
were not taken j-nto a-ccount. The figures in the second colurnn show
the ratio of radioactive sitosterof to sterol under investigation,
as administered.
+8
Administration of sitosterol alone gave alL average ratio of 94
to 6 for cholestero] to sitosterol in the insects. SC-795T and
ergosterol were used as a sort of bfank in the same concentrations
as those of the potential antimetabolites, and only ergosterol
with the highest concentration gave a slight decrease of chol-esterol
and- a slight increase of sitosterof. With use of SC-13775, tne
cholesterol over sitosterol ratio was not only somewhat smaller,
but, noreover, úf of a radioactive compound, A, was found,. SC12937 hað. no infl-uence, but when, as in G-1997, carbon atom 20 was
not replaced by a nitro,3'en atom, there lras an evid_ent infl_uence:
a decrease of cholesterol, an increase of sitosterol and the presence
of radioactive A, also with the mid"dle concentration. Also sc-13817,
with a side-chain which is one C-ato¡r longer than those of the
previous sterofs, did have an evident influence. lñith SC-1j058 in
the hì-ghest concentration a trace of A was found. Again, when
carbon atom 20 was not replaced by nitrogen (C-ZOOI), an accurnulation of A occurred-. The sa¡ie results were obtained with the
free nitrogen compound. 0f the 3 anti-netabolites with a keto
functlon in the sid.e-chain, only C-1996 caúsed accr.mul_at1on of A
in the cockroaches.
The gas chromatographic behaviour of compound A is the same
as that of desmosterol. Svobod,a et ,I .2'15 found desmosterol as
an intermediate of the conversion of B-sitosterol into chofesterol
in the tobacco hornworm u¡der influence of triparanol and 22,2jdiazacholesterol. Desmosterol was afso found by Svoboda et aL.3
as a conversion product of severaf phytosterol_s in the tobacco
hornworm under influence of 2a,25-ð.iazachofesterol and as
conversion product of sitosterol_ under infl_uence of 5 F-hydroxy24-norch.ol-5 -en-23 - oic acid and 3 p-hydroxy-Z3, Z4-d.inorcho 1-!-en1/t
22-oíc acid'-. lnie also tested these 2 compounds with the
cockroaches, but, ,perforning the usual tests, did- not find other
49
5
8
7
9
9
9
9
5
sc-13817
50
AB
10:1 89
1:1 83
1:10 71
10 :1
1:1
1:10
11
74
22
7
95s
96+
946
10 :1
6
16
1:1
1:10
2t
G-1962
I
I
10
10:1 93
1:1 96
1:10 85
7
+
15
61627
10: 1
1:1
1:10
10
G- ì9S 6
5
4
"ì.,-\coon
8
5
R
7
5
10
5
3
Yc00ll
R
7
10:
1
1:1
1
r10
89
91
67
11
9
26
R : chÒlêstetol nucleus. C, S, A and B are respectively: radioaqtive
cholesterol, sitosterol and 2 conversion products of B-sitosterol-3-1{C,
as found in the insects. The figures in the second column show the
ratio of ¡adioactive sitqsterol to stcrol undcr vestigation,
administered.
51
as
conversion products of sitosterof than chofesterol. 0n1y when we
worked with some hrmdred-s of cockroaches, about 2 or Sl, of compor.md
A could be detected..
Àdministration of 28-chloro- L5'2+(28) -ergostadienof in the
highest concentration resul-ted- not only in a change of the
cholesterof over sitosterol ratio, but also in the presence of fl"
of radioaetive metabolite B, which has another gas-chronatographic
behavj-our on OV-1 7 and DEGS than ¡retabolite À. Thj-s would suggest
a possibility to inhlbit, in a more selective way, the dealkylation.
Inhibition of the dealkytation by a method which involves an inhi-
bition of the conversion of desmosterol into cholesterol is not
selective, since this conversion is also inportant in vertebrates.
However, continuous ad-ministration of the chforo compound in longterm experiments did not cause any disturbance in the development
of the
"o"k"o""h""15.
Die Umwandlung von B-Sitosterol in Cholesterol
in der Schabe B1attella germanica L. wird d.urch bestir¡nte Sterine
¡rit unnatürlichen Seitenketten gehenmt. Anhäufung von zwei verschiedenen Metabol-iten wurde festgestellt.
Zusarnmenfassung.
,1
E.N. LAMBR-EMONT, M.L. BURJ{S, B.H. SLATTEN ANd
J. econ. Ent. 60, 291 (lO6l).
J.L. SVOBODA and trti.E. ROBBINS, S"i"t."" 156, 1q7 lsel).
J.A. SVOBODA and W.E. ROBBINS, Experientiä 24, 1131 (lgee).
F.J. RTTTER and lti.H.J.M. I\IIENTJENS, T.N.O.-Nieuws ?, 3g ?g6l)P.Ph.H.L. OTT0, A.C. BESEIIIER and tni.H.J.M. I\IIENTJENS, J. Labe]led
Conds 6,111 (tgZo).
J.L. trol,,tmo, Arch. Biochem. Biophys. ß-, 370 (lg,+).
A.J. CLARK, Thes j-s Harvard (t g¡e), p. 5.
R.B. CLAYTON, Nature 184, 1166 (1959).
3 9-Hydroxy-2[-norchol-5-en-23-otc acid was a gift of Dr. J.A.
SVOBODA, Insect Physiology Laboratory, Entomology Research
Divj-sion, ARS, USDA, Beltsvil-l-e, Mary1and, USA. The sterol-s
encoded- with SC were kindly supplied by G.D. Searle & Co.,
Chicago, Iflinois, USA, and. those encoded with G by Laboratory
. N.W.
A.F.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
B.
9.
EARLE,
BENNETT,
52
of Organic Chenlst¡y, State University Groningen, Netherlands.
28-Chloro- L5 )24\28) -ergostadì-eno1 was s¡rnthesized by Dr. P.Ph.
H.L. OTTO, Mr. A.C. SESEI@R 4ND Mr. Th.J. VAN VEEN (Central
Laboratory T.N.0., Delft, Netherlands) fron 24-keto cholesterol,
whlch rÍas a gift of Dr. B. R1ege1, G.D, Searl-e & Co., 3 !-HVdr oxy -2J, Z4-d.inor ehol-5 - en-22-o i c ac id was f rom Nut ri ti onaf
10.
11.
12,
13,
14.
1
5.
Biochemlcal Corporation, Cleveland, Ohio, USA, and ergosterol
from Chened fnc., Odenton, Marylandr USA.
J.W.À. I,[EYER, H.I.A. EID and P.A. IIERDUTN, Analyt. Õlnem.236,
+26 (1968).
R. TYKVA and H. SIUON, Chrornatographia Z, 5 IOAS).
R.B. CLATTON, Biochemistry !, 357 (1962).
J.L. SVOBODA, M.J. TEOIrySON and i/\I.E. ROBBINS, Life Sci. Á'
3e5 ?e67).
J.A. SVOBODA, M.J. THOMPSON and. 141.8. ROBBINS' Steroid-s L3'
559 ?e68).
This work was supported by a grant fro¡r the National Council
for Agricultural Research T.N.0.
W.H.J.M. ]/üIENTJXNS,
and.
E.P.
BENNETT
Central- Laboratory T.N.0. , P.0.8. 217,
Defft (Netherlanas), zz October 1970.
53
T.
VAN DER MAREL
SAMENVATT]NG
Er bestaat een toenemende behoefte aan sel-ectieve bestrijdingsmiddelen van insekten. Een gebied dat nogelijldreden hiertoe zou
ku¡nen bied.en is d-at van het sterolmetabolisne. Met name de omzetting van B-sitosterol- in chol-esterof is voor strikt planten
etende insekten, d-ie geen cholesterol- in hun voedsel vinden, van
vitaal belang en een blokkering van deze reactie zal ð,e ontwikkeling van deze insekten verstoren. Het d.oel- van het beschreven
onderzoek is een bestud-ering van d.eze dealkyleringsreactie. ÊSitosterol, dat op de J-plaats radioactief gemerkt is net 14C,
werd ges¡mthetiseerd. Aangezien comnercieel B-sitosterol door
d.e grote hoeveelheden campesterol a1s onzuiverheid niet geschikt is a1s uitgangsstof, werd sti-gnasterol als uitgangsstof
van deze s¡mthese gebruikt. Bij d-e analyse van B-sitosterol-J14'C
werd o.a. gebruik gemaakt van gaschronatografie, massaspectrometrie en dampgeprogrammeerde dulnelaagchromatografie. Het
in d.e kern gemerkte sitosterol werd via het d.ieet toegediend aan
drie verschillende soorten kakkerlakken. Naast radioactief cholesterol- kon de aanwezigheid. van meerdere omzettingsproducten
in uiterst kleine hoeveelheden worden aangetoond. Bij zowel
Bl-attel-l-a germanj-ca, Periplaneta americana als Eurycotis
floridana kwam een rad-ioactief o¡rzettingsproduct voor met hetzel-fde gaschromatografische ged.rag a1s dat u^n t24(2a)-sitostero1. Zowef d-eze stof a1s het hieronder genoemde d-esmosterol
5+
zijn tussenprod-ucten bij de biosynthese van B-sitosterol- in planten. Dit suggereert, dat de dealkylering van sitosterol in insekten, althans ged-eelte1ijk, zou ku¡:nen verlopen langs de omgekeerde
'hreg van de alkylering bij d.e bios¡mthese van sitosterol in planten,
zoals d.eze beschreven is in d.e inleiding. Een and-ere nogelijkheid.
van omzetti-ng van sitosterol in cholesterof is een oxydatieve d-ealkylering. 0m deze rnogelijkheid te onderzoeken werd getracht met behulp van kiemende erwten p-sitosterol-28,2g-14C te synthetiseren.
De specifieke radioactiviteit van het verkregen sitosterof bl-eek
echter te laag om bruikbaar te zíjn voor insektenproeven. Van
steroiden met een onnatuurlj-jke zijstaart werd de invloed- a1s potentiële antinetabolieten op d.e onzetting van p-sitosterol- in cholesterol nagegaan. Steroiden, welke stikstof-, zuurstof-, chloorof zwavel-atomen in de zijstaart bevatten, werden tezamen net sito1/-
sterol-5-"C toegediend aan B1atte11a gernani-ca. Verschil-lende van
de sterolanaloga bleken de onzettlng van p-sitosterol- in cholestero1 te remmen. Bij toepassing van stikstofanaloga werd naast afname van de vorming van cholesterol teuens ophoping gevonden van
een radloactief onzettingsproduct, d.at zich gaschromatografisch
gedroeg afs desmosterol-. Bij toed-iening van 28-Cr-A5'24(28) -ersostad-i-enol werd ophoping gevonden van een ander radioactief omzettlngsproduct van sj-tosterol. De renming van de omzetting van psitosterol in cholesterol was echter in geen van d.e gevallen zodanig, dat de ontwikkeling van de lnsekten kon worden verstoord.
55
Dit proefschrift werd bewerkt op het Centraal Laboratoriun TNO
te Delft.
Gaarne wi1 ik mijn dank betuigen aan a1len die aan de totstand.koning van dit proefschrift hebben bijgedragen.
Mijn erkentelijkheid wj-l i-k betuigen aan de Nijverheidsorganisatie voor Toegepast Natuurwetenschappelj-jk Onderzoek en in het bi-jzonder aan Dr. A. Schors, directeur vall het Centraal Laboratorium
TNO, voor de facil-iteiten d.ie mij verleend zíjn bi-j de voorbereiding van dit proefschrift.
Mijn dank gaat uit naar Dr. J.H. Parnentier, hoofd van de Afdeling Organische Chemle, voor zljn stimulerende belangstelling en
aan:noediging. Ik dark Dr. F.J. Ritter, leider van de Werkgroep Biochemi-e van de Afd.eling Organische Chenie, voor d.e waardevolle adviezen en d-i-scussies.
Ook op d.eze plaats wil ik mijn da¡k betuigen aan d.e mede-auteurs
van de in dit proefschrift opgenomen artikefen en de aldaar vermelde medewerkers voor hun belangrijke bijdragen en de prettige sanenwerking.
Speciaal wi1 ik hier Mej. T. van der Marel- en de Heer E.P. Bennett
danken voor hun bekwame assistentie bij d-e in deel IV beschreven experimenten en Mevr. 4..M. van Loon-d-e Lieroa bij de in deel f beschreven experimenten.
De l-eden van de llerkgroep Biochenie van de Afdeling Organische
Che¡oie
wif ik gaarne beda::ken voor de prettige werksfeer en samen-
werking.
J.B.A. Nijssen heeft de Engelse teksten gecorri-geerd.
Mej. A.A.M. Post heeft het manuscript getypt.
Dit onderzoek werd gedeeltelijk gesteund door de Werkgroep Geintegreerde Bestrijding van Plagen van d.e Nationale Raad voor
De Heer
Landbouwkundig Onderzoek
TNO.
De directies van d-e d-esbetreffende tijdschriften
ben ik erken-
telijk voor de verleende toestemrning de artikelen hier opnieuw af
te d.rukken.
58
0p verzoek van de
faculteit
d.er
Wis- en Natuurkund.e volgt hier
kort overzi-cht van mijn acad-e¡rische stud.ie.
Na het behal-en van het einddiplona gymnasium B aan het St.Aloysluscollege te Den Haag in juni 1955, werd- in septenber van
dat jaar een begin gemaakt rnet d.e stuðie in de scheikund-e aan de
Rijksuliversiteit te Leid.en. In december 1960 werd het kand.j-d.aatsexamen f afgelegd-. De studie werd voortgezet ond.er 1ei-d-ing van d-e
hoogleraren Dr. E. Havinga (Organische Chemie), Dr. H. Veldstra
(Biochemie) en Dr. C.J.F. Böttcher (Fysische Chemie). Het doctoraal
exanen werd in januari 1964 afgelegd. Vanaf 1960 vervulde ik een
assÍstentschap op het Laboratorir-m voor Organische Che¡oie, terwi-jI
in 1964 een steroidenond-erzoek werd verricht met steu¡r van de N.V.
Organon. Tevens was ik voor een beperkt aantal uren al-s leraar verbonden aan het Edith-Stei-nlyceum te Den Haag. In januari 1965 trad,
ik in dienst van de Nijverheid.sorganisåtie TNO, waar ik thans werkzaam ben bij de Afdeling Organische Chenie van het Centraal Laboraeen
torium
TNO.
59