RIUT-AAA-spa-2014-Evaluacion del deterioro cognitivo en un

RIUT-AAA-spa-2014-Evaluacion del deterioro cognitivo en un

EVALUACIÓN DEL DETERIORO COGNITIVO EN UN MODELO DE ENFERMEDAD
DE PARKINSON EN RATA WISTAR
JHONNATTAN ANDREY QUINTERO FALLA
Trabajo de grado presentado como requisito parcial para optar por el título de
Biólogo
Director(a)
JÉSSICA PAOLA ALCÁZAR ARZUZA
Lic. Ciencias Naturales y Educación Ambiental. Aspirante a MSc
UNIVERSIDAD DEL TOLIMA
FACULTAD DE CIENCIAS
PROGRAMA BIOLOGÍA
IBAGUÉ, COLOMBIA
2014
1
2
3
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4
“Cada día sabemos más y entendemos menos”
Albert Einstein
5
A mi madre
Nohora Edith Falla
A mis hermanos
Fabián Andrés, Yeis Danilo y Julián
Andrés
A María Camila Jiménez
Comentado [F1]: TODO DEBE DE IR EN ARIAL 12
6
AGRADECIMIENTOS
Dios gracias por permitirme salir adelante y alcanzar mis metas.
A mi madre por enseñarme las cosas buenas de la vida, darme fortaleza para seguir
adelante, nunca desfallecer así la situación no sea la mejor, por todo su amor
incondicional, tolerancia, paciencia y verraquera que me impulsa a salir adelante.
A María Camila Jiménez por estar a mi lado durante el mayor tiempo de mi carrera
brindándome su amor y amistad, pese a las adversidades siempre estuvo conmigo.
A Jéssica Alcázar que más que mi maestra fue una amiga que día a día me fue abriendo
las puertas al mundo de las neurociencias y aparte de lo académico con sus concejos
me permitió convertirme en una mejor persona.
A la Doctora Liliana ya que es la mejor docente de la Universidad Del Tolima y una gran
persona, la cual se ha ganado mi respeto y admiración.
Al GME-CZH por permitirme utilizar sus instalaciones y personal en el desarrollo de mi
trabajo de grado.
7
CONTENIDO
INTRODUCCIÓN ............................................................................................................ 17
1.
OBJETIVOS .......................................................................................................... 19
1.1 OBJETIVO GENERAL .............................................................................................. 19
1.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS ..................................................................................... 19
2.
MARCO TEÓRICO................................................................................................ 20
2.1 ENFERMEDAD DE PARKINSON ............................................................................. 20
2.1.1 Historia. .................................................................................................................. 20
2.1.2 Incidencia. .............................................................................................................. 21
2.1.3 Prevalencia............................................................................................................. 22
2.1.4 Descripción............................................................................................................. 23
2.2 GANGLIOS BASALES .............................................................................................. 25
2.2.1 Déficit dopaminérgico y su influencia a ganglios basales. .................................... 29
2.3 DETERIORO MOTOR .............................................................................................. 30
2.4 PARKINSONISMO EXPERIMENTAL POR INTOXICACIÓN CON 6-OHDA .......... 32
2.4.1 Lesiones histológicas, bioquímicas y estrategias terapéuticas. ............................ 32
2.4.2 Validación del parkinsonismo por 6-OHDA. .......................................................... 33
2.5 Deterioro cognitivo .................................................................................................... 34
2.6 Memoria de trabajo ................................................................................................... 37
2.7 Laberinto circular de Barnes.....................................................................................39
3. METODOLOGIA .......................................................................................................... 41
3.1 ANIMALES DE EXPERIMENTACIÓN ...................................................................... 42
3.1.1 Manutención de Ratas Wistar. ............................................................................... 42
3.1.2 Características de las Ratas Wistar. ...................................................................... 42
3.1.3 Conducta exploratoria en la Rata Wistar.. ............................................................. 43
3.1.4 Universo experimental . ......................................................................................... 43
3.1.5 Grupos experimentales. ......................................................................................... 44
3.2 PRUEBAS CONDUCTUALES .................................................................................. 46
3.2.1Actividad Rotatoria. ................................................................................................. 46
3.2.2 Test Neurológico. ................................................................................................... 47
8
3.2.3 Test De Barnes Modificado. ................................................................................... 48
3.3 TÉCNICAS HISTOLÓGICAS .................................................................................... 49
3.3.1 Tinción de Nissl ...................................................................................................... 52
3.4 ANÁLISIS DE DATOS ............................................................................................... 53
4. RESULTADOS ............................................................................................................ 55
4.1 GENERALIDADES .................................................................................................... 55
4.2 TINCIÓN DE NISSL .................................................................................................. 55
4.3 Actividad rotatoria inducida por Apomorfina ............................................................. 56
4.4 Test neurológico y pole test ...................................................................................... 57
4.4.1 Resultados test neurológico ................................................................................... 57
4.4.2 Resultados pole test ............................................................................................... 58
4.4.3 Resultados test de Barnes ..................................................................................... 60
5. DISCUSIÓN ................................................................................................................ 66
6 CONCLUSIONES......................................................................................................... 78
7. RECOMENDACIONES ............................................................................................... 80
8. BIBLIOGRAFIA ........................................................................................................... 81
9.ANEXOS..................................................................................................................... 102
9
LISTA DE TABLAS
Tabla 1. Grupos experimentales utilizados en el estudio ............................................... 44
Tabla 2. Descripción de pruebas realizadas en el Test neurológico y Pole test ............ 47
Tabla 3.Variables tenidas en cuenta en el laberinto de Barnes modificado ................... 53
Tabla 4 Disminución neuronal entre los grupos experimentales .................................... 56
Tabla 5. Porcentaje de ejecución de las pruebas en el test neurológico ....................... 57
Tabla 6. Resultados prueba de Normalidad Shapiro - Wilks (P) para las variables
evaluadas en el Test de Barnes modificado ................................................................... 60
Tabla 7. Resultados Test de Kruskal Wallis (p) para las variables evaluadas en el Test
de Barnes modificado...................................................................................................... 61
Tabla 8. Resultados Test de Friedman (p) para las variables evaluadas en el Test de
Barnes modificado........................................................................................................... 62
10
LISTA DE FIGURAS
Figura 1. Circuito entre los ganglios basales .................................................................. 29
Figura 2. Efecto de apomorfina y anfetamina en ratas lesionadas ................................ 34
Figura 3. Laberinto de Barnes......................................................................................... 39
Figura 4. Organigrama de metodología .......................................................................... 41
Figura 5. Inyección intracerebral ..................................................................................... 44
Figura 6. Coordenadas estereotáxicas de lesión para el modelo de SNpc ................... 45
Figura 7. Test de actividad rotatoria ............................................................................... 46
Figura 8. Test neurológico .............................................................................................. 47
Figura 9. Test de Barnes modificado .............................................................................. 48
Figura 10. Vibrátomo ....................................................................................................... 50
Figura 11. Bregmas utilizados en el análisis histológico ................................................ 51
Figura 12.Cortes histológicos.......................................................................................... 52
Figura 13. Comparación histológica de los grupos experimentales ............................... 56
Figura 14. Latencia de escape en el Pole Test............................................................... 58
Figura 15. Número de errores en el Pole Test por grupo ............................................... 59
Figura 16. Latencia del primer agujero en el Test de Barnes modificado ...................... 63
Figura 17. Numero de aciertos en el Test de Barnes modificado .................................. 63
Figura 18. Distancia recorrida en el Test de Barnes modificado .................................... 64
Figura 19. Numero de errores en el Test de Barnes modificado .................................... 64
Figura 20. Latencia de escape en el Test de Barnes modificado................................... 65
Figura 21. Curva de aprendizaje de los tres grupos en los días de prueba ................... 65
Figura 22. Esquema de organización motora ................................................................. 72
Figura 23.Hipotesis esquema de organización motora en ausencia y presencia de
déficit dopaminérgico ...................................................................................................... 73
11
LISTA DE ANEXOS
Anexo a. Mantenimiento de una colonia de ratas en el bioterio de experimentación
animal de la universidad del Tolima – PNT
Anexo b. Inyección intraperitoneal (ip) – PNT
Anexo c. Lesión con 6OHDA en sustancia nigra pars compacta –
Anexo d. Perfusión de tejido cerebral – PNT
Anexo e. Tinción de Nills – PNT
Anexo f. Protocolo Test Neurológico y Pole Test – PNT
Anexo g. Protocolo Test de Barnes Modificado – PNT
Anexo h. Protocolo anestésico para rata- PNT
12
Comentado [F2]: HIPERVINCULAR
LISTA DE ABREVIATURAS

AMPA: Acido alfa- amino-3-hidroxi-5-metil-4-isoxazolpropionico

D1: Receptor de Dopamina 1

D2: Receptor de Dopamina 2

DA: Dopamina

DAT: Transportadores catecolaminérgicos de membrana de dopamina

DC: Después de Cristo

DSM-IV: Manual diagnóstico y estadístico de desórdenes mentales

EP: Enfermedad de Parkinson

EST: Estriado

GABA: Acido gama aminobutirico

GB: Ganglios basales

GPe: Globo pálido externo

GPi: Globo pálido interno

GPv: Globo pálido ventral

Me-CZH: Grupo modelos experimentales para las ciencias zoohumanas

MPTP: 1-metil-4-fenil-1, 2, 3, 6-tetra hidropirimidina

MSA: Síndrome de atrofia

NET: Transportadores catecolaminérgicos de membrana de noradrenalina

NMDA: N-metil-D-aspartato

NST: Núcleo Subtalámico

PSP: Parálisis supranuclear progresiva

PUFAs: Ácidos grasos poliinsaturados

RNS: Especies reactivas de nitrógeno

ROS: Especies reactivas de oxigeno

SNC: Sistema nervioso central

SNpc: Sustancia nigra pars compacta

SNr: Sustancia nigra reticulata

SOD: Súper oxido dismutasa
13

6-OHDA: 6 Hidroxi-dopamina
14
RESUMEN
La enfermedad de Parkinson (EP), se distingue por disfunción motora y neuropsiquiátrica
caracterizada por resolución de problemas y planeación, alteraciones en asociaciones
estímulo-respuesta, entre otras. Intentar desarrollar estos síntomas es difícil, puesto que
los modelos basados en neurotoxinas traen consigo daños motores que impiden la
normal movilidad requerida para ejecutar test cognitivos en animales. Objetivo: evaluar
el daño cognitivo en un modelo de EP en rata Wistar. Metodología: se usaron 27 ratas
Wistar macho repartidas así: INT: n=9, SHAM: n=9, LES: n=9. Se realizó una prueba
sensoriomotora mediante Test neurológico y se evaluó la memoria ejecutiva con la
prueba del Test de Barnes Modificado de la siguiente manera: Sesiones de aclimatación,
habituación y adquisición. Mediante un Anova se encontraron diferencias significativas
(p=0,05) en prueba sensoriomotora y aciertos, distancia recorrida y latencia de escape
(Test de Barnes). Resultados: los resultados indican que las pruebas comportamentales
usadas comprueban el esquema de organización motora que posiciona a los ganglios
basales como fuente de facilitación selectiva de la concentración, atención y energizante
del circuito de realización de una tarea.
15
ABSTRAC
Parkinson's disease (PD) is characterized by motor and neuropsychiatric dysfunction
characterized by problem solving and planning, changes in stimulus-response
associations, among others. Attempting to develop these symptoms is difficult, since the
models based on motor impairments bring neurotoxins which prevent normal motion
required to perform cognitive tests in animals. Objective: To assess cognitive damage in
a rat model of PD in Wistar. Methodology: INT: n = 9, SHAM: n = 9, SLE: n = 9, 27 male
Wistar rats were used and distributed. One sensorimotor testing was performed by Test
neurological and executive memory test Test Modified Barnes was assessed as follows:
Sessions acclimation, habituation and acquisition. Using an ANOVA significant
differences (p = 0.05) and sensorimotor testing successes, distance and escape latency
(Test of Barnes) were found. Results: The results indicate that the behavioral tests used
to check the motor organization scheme that positions the basal ganglia as a source of
selective facilitation of concentration, attention and energizing circuit performing a task.
16
INTRODUCCIÓN
La EP es un trastorno neurodegenerativo del cual, sus síntomas principales resultan de
la degeneración de las neuronas dopaminérgicas en la sustancia nigra pars compacta
(SNpc). En los cerebros normales, las células de la sustancia nigra son reducidas de un
4.7 a 6% por década entre la quinta y la novena década de la vida, pero no es suficiente
para producir la EP, mientras que en pacientes con EP existe una subsecuente pérdida
del 80-90% de dopamina en el estriado y el núcleo caudado (Kuteret al, 2007 y DinisOliveira et al, 2006). La EP afecta al 1% de las personas de 65 años de edad y en los
últimos 180 años desde el descubrimiento de la EP, la etiología de la enfermedad
permanece aún desconocida (Zhang et al, 2000). Se caracteriza por síntomas motores
en primera instancia. Son clásicos: temblor, rigidez, acinesia e inestabilidad postural.
Junto con ellos, son cada día más importantes los síntomas no motores. Los pacientes
pueden presentar disfunción neuropsiquiátrica, trastornos del sueño, disfunción
autónoma, síntomas sensitivos, dolor y alteraciones dermatológicas. Otros síntomas
menores, pero no despreciables, son pérdida de peso, alteraciones olfatorias, fatiga y
alteraciones respiratorias. (Chacón, 2010). Aunque se conoce que en etapas posteriores,
la EP se asocia a demencia. Existe una creciente evidencia de los efectos cognitivos
incluso en las etapas tempranas de la progresión de la enfermedad. Los cambios
cognitivos en EP reflejan cambios funcionales en los circuitos de ganglios basales y
áreas corticales. (Poliakoff & Smith-Spark, 2008). Los problemas neuropsiquiátricos y
cognitivos varían de la ansiedad, apatía, depresión y demencia. Existen reportes de
altas tasas de pacientes de EP con demencia. Del 24-31% de los pacientes revisados
presentan demencia y del 3-4% de la demencia de la población en general se debe a la
EP
(Chen & Tsai, 2010).
Una proporción considerable de Pacientes con EP no
dementes tienen daño cognitivo en las etapas tempranas de la enfermedad.
Por eso el uso de modelos animales de deterioro neuronal es de vital importancia y se
han estandarizado una serie de modelos comportamentales.Modelos animales de
trastornos cognitivos se han basado mayoritariamente en primates, ratas y ratones,
17
cuyos procesos neuronales son similares a los de la función cognitiva humana. Se
pueden distinguir varios tipos de modelos experimentales:
– Modelos farmacológicos: permiten la evaluación de fármacos.
– Modelos genéticos: basados en animales manipulados genéticamente (Transgénicos
y knock-out).
– Modelos toxicológicos: para determinar la toxicidad de metales pesados, tóxicos y
neurotoxinas.
Hay modelos animales que simulan síndromes específicos de déficit cognitivo en los
cuales
el
factor
desencadenante
es
el
envejecimiento
o
los
traumatismos
craneoencefálicos.
Recientemente, se han empleado también otros modelos complementarios que se
realizan con animales no mamíferos, como peces cebra (Danio reiro), moscas del vinagre
(Drosophila melanogaster) y gusanos (Caenorhabditis elegans), para cribar compuestos
potencialmente
tóxicos
o
terapéuticos,
y
determinar
alguna
de
las
bases
neuromoleculares de la función cognitiva (Navarrete, 2008) A continuación se nombraran
algunas de las pruebas de conducta para la evaluación de trastornos cognitivos en
modelos animales: Evaluación de la atención (inhibición prepulso, inhibición latente,
Prueba go / no go y orientación y habituación),Evaluación del aprendizaje y la memoria
(Memoria no espacial(prueba de reconocimiento de objetos, prueba de reconocimiento
social)),(Memoria
espacial
(Laberinto
acuático
de
Morris
y
laberinto
de
Barnes),(aprendizaje asociativo (prueba de evitación pasiva y prueba de evitación
activa)) y (memoria emocional (condicionamiento aversivo al sabor y sobresalto
potenciado por el miedo)). El modelo de 6OHDA en rata Wistar ha sido probado con
infinidad de pruebas comportamentales a la hora de estudiar la función cognitiva se
tienen en cuenta múltiples sus dimensiones y decidir cuales variables vamos a medir
para elegir la prueba específica apropiada; sin embrago la creación de pruebas
específicas para la medición de daño cognitivo en modelos animales son de vital
importancia en la ciencia para la asociación de baterías comportamentales que me den
como resultado datos más sensibles sobre las interacciones organismo - tratamiento.
18
1. OBJETIVOS
1.1 OBJETIVO GENERAL
Evaluar el deterioro cognitivo en un modelo experimental de Enfermedad de Parkinson
en Rata Wistar.
1.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS
 Desarrollar la lesión neurotóxica de 6-OHDA como modelo de enfermedad de
Parkinson en ratas.

Valorar la efectividad del modelo inducido a través de la prueba de rotación inducida
por anfetamina, agonista dopaminérgico.

Estandarizar la prueba de laberinto de Barnes modificado, de manera que pueda
emplearse para evaluar el daño cognitivo producido en la Enfermedad de Parkinson
en el modelo animal usado.

Comprobar el déficit cognitivo (memoria de trabajo y aprendizaje de hábitos)
producido por la lesión dopaminergica a través de la prueba de Laberinto de Barnes
Modificado.
19
2. MARCO TEÓRICO
2.1 ENFERMEDAD DE PARKINSON
2.1.1 Historia. Desde los primeros decenios posteriores al final de la segunda Guerra
Mundial se advirtió una contundente transformación epidemiológica en las naciones
industrializadas, lo que a finales del siglo XX se extendió a los países en vías de
desarrollo. Este cambio se debió al abatimiento de las causas de muerte que aquejaron
a la humanidad entre finales del siglo XIX y principios del XX, fundamentalmente
procesos infecciosos y contagiosos, y fallecimientos por lesiones de combate en las
guerras, con ello aumentó la esperanza de vida y emergieron problemas de salud hasta
entonces poco comunes, denominados crónico-degenerativos, y que en los albores del
nuevo milenio representan el principal reto para los sistemas de salud del mundo, entre
ellos la enfermedad de Parkinson.(Castillo,2008, pág. 28)
Los primeros bosquejos de su descripción los hizo el célebre médico y escritor griego
Galeno, en el siglo II dC; Sylvius de le Boe, en el siglo XVII, realizó varios estudios de los
diferentes temblores y distinguió dos tipos: uno que aparecía en reposo (tremor coactus)
y otro cuando el paciente realizaba movimientos voluntarios (motustremulous). François
Boissier de Sauvages, un siglo después, añadió que los temblores de reposo, a los que
llamó palpitaciones, desaparecían cuando el paciente intentaba hacer algún movimiento
(Castillo, 2008, pág.28).
La primera descripción de la EP la realizo el médico James Parkinson en el año 1817,
quien la detallo y denomino parálisis agitante, en ese momento no pensó que su
descripción realizada como una sugerencia precipitada con la cual utilizo conjeturas y no
una investigación metódicamente científica tuviese tal trascendencia. Aunque su
descripción fue incompleta la relación de síntomas aislados a una sola enfermedad fue
su gran logro.
El padre de la neurología clínica Jean-Martin Charcot, a finales del siglo XIX denominó a
la parálisis agitante de James Parkinson, Enfermedad de Parkinson en su honor. En
20
1919, Tretiakoff relacionó la EP con las anomalías de la sustancia nigra. En 1958
Carlsson y Hornikyewicz descubrieron que los portadores del padecimiento poseían
niveles bajos de dopamina.
Las posibilidades de vida aumentaron los últimos cien años ya que las personas que
nacían en el siglo anterior tenían menos posibilidades de prevalecer en el tiempo, lo cual
hizo que el panorama de salud cambiara y la distribución poblacional de las edades fuera
diferente, las personas mayores de 40 años son bastante numerosas y aunque
disminuyen cada 10 años después de los 60 años, son mucho más que en los tiempos
pasados.
Por lo tanto se abre un nuevo horizonte epidemiológico, las enfermedades como el
cáncer, cardiovasculares y degenerativas son de gran importancia, los
sistemas de
salud toman mayores medidas de prevención por la frecuencia con que aparecen y su
larga evolución ocasiona mayor número de casos los cuales en el tiempo representan
grandes costos. Este es el gran círculo de la Enfermedad de Parkinson padecimiento de
personas mayores las cuales mejoran su calidad de vida y logran vivir por más tiempo
gracias a los progresos de la ciencia.
2.1.2 Incidencia. Es el segundo desorden neurodegenerativo más frecuente. Países
europeos tienen una prevalencia de 65.6 por cada 100,000 a 12,500 por 100,000, y la
incidencia de 5 por 100,000 a 346 por cada 100,000; y más baja en Asia, con una
prevalencia de 15 por cada 100,000 y una incidencia de 328 por cada 100,000. (Chen &
Tsai, 2010).
La enfermedad de Parkinson afecta a todos los grupos étnicos y a uno y otro sexo, con
ligera predilección por los varones. La incidencia es menor entre individuos de raza negra
de Asia y África, en comparación con los de raza blanca, donde su frecuencia es
claramente mayor. Si se compara la incidencia entre las personas de raza negra que
residen en África y las de América, es menor en las primeras. (Jendroska K, Olasode BJ,
Daniel SE, et al., 1994).
21
Sus causas son inciertas, la inexistencia de marcadores biológicos para su diagnóstico
y su relación sintomatología con otros padecimientos hace que sea difícil la estimación
de nuevos casos. Sin embargo hay que tener en cuenta los estudios que estiman su
incidencia (como grupo de edad, tipo de población, etc.) Estas variables tienen impacto
en los resultados de diversas series de diagnósticos.
2.1.3 Prevalencia. El cálculo de la prevalencia de la EP se ve afectado por un numeró
de elementos: La aparición de casos nuevos que se suman a los ya diagnosticados,
padecimiento crónico con duración de muchos años dado que su tasa de mortalidad ha
disminuido a consecuencia de los avances terapéuticos, con la introducción de la
Levodopa, se da a los pacientes una esperanza de vida casi normal (Minsal 2010). Lo
cual incide directamente en los resultados al sacarlos en un determinado momento.
Como la expectativa de vida ha aumentado, con el pasar del tiempo los casos se pueden
ver en los grupos de individuos con mayor edad y aquellos que poseen la enfermedad y
no son atendidos por los especialistas (subdiagnosticados) pueden alcanzar el 50%.
Otros padecimientos neurodegenerativos que imitan fácilmente a la enfermedad de
Parkinson, y que confunden sobre todo a clínicos poco diestros en el tema, son
pobremente estudiados desde el punto de vista epidemiológico. La prevalencia de la
enfermedad de Parkinson en la población general se estima en 0.3%, aunque entre
personas con 65 a 90 años se incrementa exponencialmente hasta 3%(Castillo, 2008).
En cuanto al binomio Parkinson-Demencia, es un hecho reconocido por diversos
investigadores que la incidencia de demencia asociada a la enfermedad de Parkinson,
es superior a lo esperado, existiendo muchas discrepancias respecto a los datos
estadísticos. Así, los porcentajes referidos van desde un 10,9% hasta un 40%,
dependiendo en general de los criterios utilizados para la definición de demencia. En
concreto, en el DSM-IV se manejan cifras que sugieren que la demencia se presenta en
aproximadamente el 20-60% de los sujetos con enfermedad de Parkinson, siendo más
frecuente en personas mayores o en las que presentan una enfermedad más grave o
avanzada, y todos los pacientes con EP presentan deterioro cognitivo leve con la
evolución de la enfermedad. (Minsal, 2010).
22
Sólo 10% de todos los pacientes con la enfermedad la manifiestan antes de los 40 años,
esta variedad tiene características peculiares y quizá lo más relevante es que es una
forma familiar del padecimiento, lo que plantea aristas genéticas y epidemiológicas
distintas (Castillo, 2008).
2.1.4 Descripción. La EP es una entidad polimorfa con multitud de síntomas y signos que
pueden aparecer ya al inicio de la enfermedad o bien en su evolución. Son clásicos los
síntomas motores, temblor, rigidez, acinesia e inestabilidad postural. Junto con ellos, son
cada día más importantes los síntomas no motores. Los pacientes pueden presentar
disfunción
neuropsiquiátrica, trastornos del sueño, disfunción autónoma, síntomas
sensitivos y dolor, y alteraciones dermatológicas. Otros síntomas menores, pero no
despreciables, son pérdida de peso, alteraciones olfatorias, fatiga y alteraciones
respiratorias. (Chacón, 2010). La EP es un trastorno neurodegenerativo que ocurre
después de la mitad de la vida, y es caracterizado por la degeneración selectiva de
neuronas dopaminérgicas de la sustancia nigra. Aunque la patogénesis permanece
indeterminada, la disfunción mitocondrial, el estrés oxidativo y la apoptosis son los
mayores factores contribuyentes. Recientemente, evidencia acumulada sugiere que la
inflamación que ha sido objeto de estudio, juega un importante rol en la progresión de la
EP. (Jin et al, 2008). Evidencia clínica, patológica y fisiológica indica que la EP en primera
instancia es un desorden motor relacionado a la disfunción de los ganglios basales.
Aunque déficits autonómicos, problemas cognitivos y síntomas sensoriales positivos son
frecuentemente asociados a la EP, la impresión clínica en general aún apoya el
comentario inicial de la EP de que la participación de peso nace en el sistema motor, con
mayores defectos cognitivos y perceptuales casi siempre indicando un diagnóstico
diferente,
como uno de los llamados "Parkinson Plus" síndromes de atrofia
multisistémica (MSA), demencia con cuerpos de Lewy, la degeneración corticobasal
(CDB) o parálisis supranuclear progresiva (PSP). (Mc Auley, 2003).
23
Cerda M, Borrego O y Sáez T, (2010), establece que:
“Tanto las formas familiar como la esporádica de la enfermedad de
Parkinson (EP) son indistinguibles y comparten la misma característica
bioquímica que es el déficit de dopamina cerebral, una reducción en la
transmisión dopaminérgica dentro de los ganglios basales. En el examen
microscópico hay degeneración de las células dopaminérgicas y
presencia de cuerpos de Lewy en las neuronas de la sustancia negra
mesencefálica que se proyectan hasta el cuerpo estriado (vía
nigroestriada) pero la extensión de la pérdida neuronal no sólo se centra
en el sistema dopaminérgico sino que afecta a otros neurotransmisores
clásicos como el catecolaminérgicos (acetilcolina) y los núcleos no
catecolaminérgicos.
De esta manera, los síntomas motores de la enfermedad están
relacionados con los sistemas dopaminérgicos y las manifestaciones no
motoras están relacionadas con las vías no dopaminérgicas En un estudio
reciente sobre la relación de la EP con el estrés oxidativo se ha procedido
a establecer los siguientes mecanismos causales entre ambas entidades.
El cerebro es rico en fosfolípidos y ácidos grasos libres poliinsaturados
(PUFAs) y ambos son muy susceptibles a los oxidantes.
A consecuencia del daño oxidativo a los fosfolípidos y PUFAs, la doble
membrana lipídica puede resultar afectada en la EP en la que la
concentración de substancia negra está disminuida y la concentración de
malonildialdehido,
un
producto
de
la
oxidación
lipídica,
está
incrementada. Otra evidencia de la oxidación lipídica en esta enfermedad
es el incremento de 4-hidroxi-2-nonenal, producto lipofílico de la
peroxidación de la membrana unido al ácido araquidónico. Los tipos de
variante de sinucleína, la mutante y la natural, forman fibrillas de amiloide
semejantes a las observadas en los cuerpos de Lewy así como
oligómeros no fibrilares denominados protofibrillas a las que se ha
propuesto como formas tóxicas de sinucleína. Los productos como 8-oxo-
24
dG se han encontrado aumentados en muestras postmortem de
substancia negra procedentes de cerebros con EP.
En las neuronas es necesario un equilibrio entre la cantidad producida y
la eliminada de oxidantes y este equilibrio es el que mantendrá con niveles
constantes a las especies ROS (especies reactivas de oxigeno)y RNS
(especies reactivas de nitrógeno) en concentraciones no tóxicas. Entre
las enzimas captadores de ROS, la súper oxido dismutasa (SOD),
considerada como la más importante, en la isoforma citosólica SOD1 no
se han encontrado cambios pero sí en la isoforma mitocondrial SOD2 que
muestra actividad aumentada al parecer en respuesta al exceso de ROS
en la Enfermedad de Parkinson.
En relación al resto de enzimas antioxidantes, catalasa, glutatión
peroxidasa, muestran actividad reducida en cerebros con EP.”
En una situación fisiológica, en las mitocondrias se produce el mayor consumo de
oxígeno y como resultado una mayor producción de radicales superoxido al ser reducido
el oxígeno a ROS; los enzimas antioxidantes como SOD2 descienden los niveles de ROS
al mínimo, pero en el caso de defectos en la mitocondria, como se supone en el caso de
la EP, este equilibrio se rompe y la cantidad de ROS generado por la cadena de
transporte de electrones, cuya actividad está disminuida, se incrementa(Zhou, Huang Y
Przedborski, 2008)
2.2 GANGLIOS BASALES
Los mamíferos poseen una corteza cerebral que se encuentra masivamente
interconectada con 2 estructuras subcorticales que son los ganglios basales y el
cerebelo. Los ganglios basales son un grupo de estructuras subcorticales que intervienen
en el movimiento voluntario; en la integración de información sensoriomotora; en
procesos asociativos, cognitivos y emocionales; y en el comportamiento relacionado con
los hábitos (conductas que se realizan “casi sin pensar”).
Están localizados en la parte ventral de los hemisferios cerebrales y estrechamente
interrelacionados con la corteza cerebral en circuitos secuenciales segregados
25
topográficamente (Romanelli y cols., 2005) y funcionalmente, organizados en paralelo,
pero con un alto nivel de convergencia e integración (Alexander y cols., 1986). Los
ganglios basales incluyen: 1) el estriado, compuesto por el núcleo caudado, el putamen
y el núcleo accumbens; 2) el globo pálido, en sus dos divisiones (externo e interno), con
un componente ventral (GPv); 3) la sustancia negra, en sus dos regiones (compacta y
reticulada); 4) el área tegmental ventral; y 5) el núcleo Subtalámico. En algunas
denominaciones, con un componente funcional extendido, se incluyen también los
núcleos talámicos (tanto los ventrolaterales como los intralaminares) y el núcleo
pedúnculopontino, junto con el área motora mesopontina.
La actividad de cada componente de los ganglios basales está modulada por diferentes
núcleos y áreas que, por impulsos neuroquímicos, pueden inhibir o facilitar el flujo de
información desde la corteza cerebral a través de los ganglios basales hasta el tálamo y
de ahí de regreso a la corteza cerebral (para finalizar en el bucle donde se originó el
impulso). Todos estos circuitos dependen funcionalmente del área cerebral de la que
surjan los impulsos y están modulados por el concurso de las proyecciones
dopaminérgicas originadas en la parte ventral del mesencéfalo (la sustancia negra
compacta, el área tegmental ventral). Esta organización se conserva a lo largo de la
escala filogenética con muy pequeñas variaciones (Parent, 1997; Smeets y cols., 2000;
Doupe y cols., 2005).
Las aferencias a todos los núcleos de los ganglios basales son muy numerosas, pero el
estriado es el área que recibe la proporción más elevada. Existe un patrón topográfico
de conexiones que se mantiene en toda la extensión de los ganglios basales (Alexander
y Crutcher, 1990). La mayor parte de las aferencias proceden de la corteza cerebral, de
los núcleos talámicos intralaminares y de la sustancia negra compacta/área tegmental
ventral. Las proyecciones corticoestriales son excitadoras y utilizan glutamato como
neurotransmisor; por ello, la presencia de receptores glutamatérgicos (ionotrópicos,
NMDA y AMPA, y metabotrópicos) en el estriado es de gran importancia al ser la
aferencia más densa. Estas proyecciones corticoestriales se originan en las capas
26
corticales supragranulares (capas II y III) y en las infragranulares (V y VI) (Jones y cols.,
1977; Parent y cols., 1995; Parent y Hazrati 1995a).
Otras proyecciones excitadoras aferentes al estriado proceden de los núcleos talámicos
intralaminares (el núcleo centromediano con un componente motor proyecta al putamen
y el núcleo parafascicular con un componente emocional proyecta al estriado ventral) y,
en menor grado, proceden de los núcleos ventral-anterior, ventral-lateral, dorsal-medial
y de los núcleos asociativos posteriores (Sadikot y cols., 1992; McFarland y Haber,
2001). La actividad de esta vía excitadora talámica está modulada por diferentes
neuropéptidos, como la sustancia P, la colecistocinina, el péptido vaso activo intestinal y
la proteína ligadora de calcio: calcitonina. Las proyecciones tálamo estriatales podrían
tener gran importancia funcional, ya que constituyen un flujo importante (y rápido) de
información hacia áreas sensitivo motoras estriatales, y modularían su actividad, directa
y previamente, sin necesidad de cerrar el bucle (loop) tálamo-corteza- estriado (Herrero
et al., 2011).
El estriado comprende el caudado, el putamen y el núcleo accumbens. El caudado es la
parte del estriado que controla las funciones asociativas y cognitivas; el putamen es
responsable del componente motor; y el accumbens integra y modula las funciones
emocionales, de la motivación y de los mecanismos de recompensa (por lo que se lo
incluye en los circuitos de la adicción) (Wheeler y Carelli, 2008).
Sin embargo, aunque existe una predisposición mayoritaria que permite generalizar y
simplificar en este sentido, lo cierto es que el estriado no es homogéneo en sus
conexiones, en la segregación estricta de sus funciones, en la distribución de sus
neuronas ni en sus neurotransmisores y neuromoduladores (Graybiel, 1990). Existe un
entrecruzamiento funcional que, en virtud de la integración simultánea de diversas
funciones, produce un fenómeno de convergencia de información manteniendo el
paralelismo funcional. Si se analizan cuantitativamente las fibras aferentes y eferentes
de los ganglios basales se evidencia que las eferencias desde los núcleos de salida son
mínimas en comparación con el volumen de aferencias al estriado, ya que se produce
27
una “convergencia de conexiones” (Percheron y Filion, 1991), donde se integra
información de diferentes orígenes para realizar la acción de forma pertinente.
La manera en que los ganglios basales procesan la información ha sido aceptada desde
su descripción en los 80, como “Modelo actual de organización de los ganglios basales”
(Alexander 1987).Se trata de un modelo no definitivo con muchos puntos por aclarar y
más aún un modelo que no puede explicar completamente muchos de los nuevos
fenómenos descriptos (Parent 1998)
El Núcleo Estriado (EST) constituye la entrada al circuito de los Ganglios Basales (GB).
El mismo recibe múltiples aferencias, la mayoría de ellas glutamatérgicas de la corteza
cerebral. A su vez el segmento interno del globo pálido (GPi) y la sustancia nigra pars
reticulata (SNr) representan los principales núcleos de salida del circuito. Estas dos
últimas estructuras ejercen una exigencia inhibitoria tónica mediada por el sistema GABA
sobre las neuronas premotoras excitatorias localizadas en la lámina ventral del tálamo.
Entre el núcleo de entrada (EST) y las estructuras de salida (GPi y SNr) existen dos
sistemas paralelos de proyección originados en diferentes poblaciones neuronales del
EST denominados como “vía directa” y “vía indirecta”. La vía directa originada en
neuronas gabaérgicas y peptidérgicas estriatales proyecta monosinápticamente sobre el
complejo GPi/SNr La vía indirecta originada en subpoblaciones gabaérgicas y
encefalinergicas estriatales proyecta polisinápticamente sobre el complejo GPi/SNr
pasando previamente por el segmento externo del globo pálido (GPe) y núcleo
subtalámico (STN).Esta secuencia indirecta está dada inicialmente por eferencias
inhibitorias gabaérgicas del EST sobre el GPe, de este último sobre el STN y una
aferencia final excitatoria glutamatérgica sobre el complejo GPi/SNr (Albín G, 1989)
(Figura 1).
28
Figura 1. Circuito entre los ganglios basales
El tálamo y la corteza señalando las vías directas e indirectas, teniendo en cuenta la influencia de la
dopamina
Fuente: autor.
2.2.1 Déficit dopaminérgico y su influencia a ganglios basales. “El déficit dopaminérgico
provoca una serie de modificaciones en los procesos de excitación-inhibición de los
ganglios basales que producen un aumento excesivo en la actividad del núcleo
subtalámico (NST) y su proyección glutamatérgica excitadora, principalmente al globo
pálido externo, globo pálido interno, Sustancia negra pars reticulata y sustancia negra
pars compacta. (Lúe L.F., et al. 1999). La hiperactividad del núcleo subtalámico y el
consecuente aumento en la actividad inhibitoria eferente desde el globo pálido interno y
sustancia negra reticulata, que provoca una hipoactividad de las proyecciones motoras
tálamo-cortical y del tronco encefálico, es la característica fisiopatológica principal del
estado parkinsoniano(Martínez Lage J., Martínez Lage P. y Moya. 2001)
29
Esta afirmación descansa en numerosos hallazgos experimentales, demostrando la
existencia de aumento en la actividad mitocondrial y enzimática del núcleo subtalámico,
registro de la actividad neuronal y mejoría muy significativa en los síntomas motores en
monos con parkinsonismo inducido por MPTP tras lesión del núcleo subtalámico. Sin
embargo, los mecanismos intermedios que median el aumento en la actividad neuronal
del núcleo subtalámico como consecuencia del déficit dopaminérgico no están del todo
claros. (Martínez Lage J., Martínez Lage P. y Moya. 2001)
El modelo original de la organización funcional y fisiopatología de los ganglios basales
(Morgan, et al. 2000) sugirió que la pérdida del tono dopaminérgico sobre el estriado
provocaba un estado de hipoactividad del globo pálido externo que, a su vez, conllevaba
a la desinhibición del núcleo subtalámico. Recientemente, sin embargo, se ha mostrado
que la hiperactividad del núcleo subtalámico precede la pérdida de terminales
dopaminérgicas en el estriado y, sobre todo, los cambios en la actividad neuronal del
globo pálido externo. Por ello, está cobrando creciente interés el estudio del control
dopaminérgico directo del globo pálido y del núcleo subtalámico, así como otras fuentes
de excitación al núcleo subtalámico, tales como el complejo parafascicular-centro
mediano del tálamo o el núcleo pedúnculo pontino del tronco encefálico (Prusiner.2001)
2.3 DETERIORO MOTOR
El estudio del sistema motor y de sus trastornos ha sido un tema importante para la
neurofisiología. Uno de los objetivos de la neurofisiología es intentar comprender los
mecanismos fisiopatológicos que subyacen a las disfunciones del sistema motor. Los
trastornos del control motor proceden de disfunciones en uno o varios de los circuitos
excitadores o inhibidores que actúan en paralelo para alcanzar el objetivo final de un
movimiento fino. Dichos trastornos pueden estar producidos por una enfermedad
degenerativa que afecta específica o predominantemente a estructuras relacionadas con
el movimiento como por ejemplo la enfermedad de Parkinson (EP), o por trastornos
sistémicos, traumáticos o vasculares. Probablemente, los ganglios de la base poseen los
circuitos promotores más apropiados para el control inhibitorio y excitatorio de otros
circuitos cerebrales. En lo que concierne a la función motora, se ha hipotetizado la
30
existencia de una vía directa y otra indirecta que modulan la excitabilidad de los núcleos
de salida de la información desde los ganglios basales hacia el tálamo motor (globo
pálido interno y parte reticular de la sustancia negra). Las conexiones eferentes de los
ganglios basales no se limitan a la vía talamocortical, sino que incluyen los núcleos
motores del tronco cerebral, siguiendo principalmente dos vías: la del colículo superior,
que regula movimientos faciales, y la del núcleo pedúnculopontino, por la que se regula
la excitabilidad de las vías motoras subcorticales(Santos-García et al.,2012).La evidencia
clínica, fisiológica y patológica indica PD que es principalmente un trastorno motor en
relación con disfunción ganglionar basal (Mc Auley, 2003).
Algunos de los síntomas típicos de la EP y su deterioro motor son:
 Temblor: Consiste en un movimiento rítmico hacia atrás y hacia adelante.
Generalmente comienza en la mano aunque en ocasiones afecta primero a un pie
o a la mandíbula. Se agudiza en reposo o bajo situaciones tensas y tiende a
desaparecer durante el sueño. Puede afectar sólo a un lado o a una parte del
cuerpo.
 Rigidez: Se manifiesta como una resistencia o falta de flexibilidad muscular. Todos
los músculos tienen un músculo opuesto, y el movimiento es posible porque, al
activarse un músculo, el opuesto se relaja. Cuando se rompe este equilibrio los
músculos se tensan y contraen causando inflexibilidad y debilidad.
 Bradicinesia: Se trata de la pérdida de movimiento espontáneo y automático y
conlleva la lentitud en todas las acciones. Esta lentitud es impredecible y es el
síntoma más incapacitante, porque el paciente no puede realizar con rapidez
movimientos habituales que antes eran casi mecánicos.
 Inestabilidad: La inestabilidad de la postura hace que los enfermos se inclinen
hacia adelante o hacia atrás y se caigan con facilidad. La cabeza y los hombros
caen hacia delante y la forma de andar empeora. El enfermo da pasos cortos y
rápidos para mantener el equilibrio; o se queda literalmente "plantado" a mitad de
camino, sin poder moverse. Existen una serie de síntomas secundarios que,
aunque no afectan a todos los enfermos, provocan trastornos importantes ya que
31
empeoran los síntomas principales y agravan las condiciones físicas y
psicológicas del paciente
2.4 PARKINSONISMO EXPERIMENTAL POR INTOXICACIÓN CON 6-OHDA
El análogo noradrenérgico 6-hidroxidopamina (6-OHDA) se ha utilizado durante más de
30 años como neurotoxina catecolaminérgica en el estudio del sistema nervioso
(Jonsson. 1983). Por cuestiones prácticas, se ha empleado principalmente en roedores,
sobre todo ratas (Ungerstedt. 1971). La 6-OHDA presenta una gran afinidad a numerosos
transportadores catecolaminérgicos de membrana, entre ellos el de dopamina (DAT) y el
de noradrenalina (NET). Por tanto, la 6-OHDA puede afectar tanto a neuronas
dopaminérgicas
como
noradrenérgicas
y
causar
alteraciones
en
las
vías
catecolaminérgicas del sistema nervioso central y periférico. Aunque, a diferencia del
MPTP, la rotenona o el paraquat, la 6-OHDA puede administrarse por inyección
sistémica, esta vía no reproduce la lesión nigroestriatal de la EP porque la 6-OHDA no
atraviesa la barrera hematoencefálica ni se acumula en el parénquima cerebral (Jonsson.
1983). Por tanto, la 6-OHDA debe inyectarse intracerebralmente por estereotaxia en el
haz prosencefálico medial o directamente en el estriado o la SNpc (Javoy et al. 1976). Al
inyectar 6-OHDA en la SNpc o en el haz prosencefálico medial, las neuronas
dopaminérgicas comienzan a morir en las 24 horas siguientes, sin que muestren una
morfología apoptótica (Jeon, et al., 1995). La máxima reducción de las concentraciones
de dopamina se produce entre el tercer y el cuarto día tras la inyección (Faull y Laverty,
1969). Cuando se inyecta en el estriado, la 6-OHDA produce una degeneración
retrógrada del sistema nigroestriatal más prolongada, que se mantiene entre una y tres
semanas tras la lesión (Przedborski et al.,1995), y las neuronas degeneradas presentan
una morfología variada con características de apoptosis (Marti et al., 1997.).
2.4.1 Lesiones histológicas, bioquímicas y estrategias terapéuticas. La 6-OHDA penetra
en el interior de la neurona, donde forma radicales libres hasta causar la muerte de las
neuronas dopaminérgicas de la SNpc (Méndez y
Finn, 1975)y la consiguiente
denervación nigroestriatal (Simola, Morelli y Carta, 2007), así como una disminución de
la dopamina y sus metabolitos. Desde el punto de vista histológico, la muerte neuronal
32
dopaminérgica se asocia a un aumento de las células astrogliales (Stromberg et al.,
1989) y un incremento significativo de la microglía activada en la zona de la lesión
(Akiyama y McGee, 1989). La lesión en la SNpc induce cambios en la actividad
electroquímica de los circuitos de los ganglios basales. Estas alteraciones son análogas
a las que se observan en los pacientes con EP, pero el modelo en roedores es
incompleto, ya que en sus ganglios basales no hay división del estriado, ni existe el globo
pálido medial. Con todo, este modelo ha sido y sigue siendo de gran utilidad para la
comprensión de la EP y una plataforma excelente para ensayar nuevas terapias. Son
muy numerosos los trabajos de investigación que se han llevado a cabo con este modelo,
como el ensayo de implantes celulares o la inyección de vectores para terapia génica,
tanto para restaurar el sistema dopaminérgico (Connor, 2001) como para restablecer el
equilibrio de alteraciones funcionales en los ganglios basales (Luo et al., 2002).
Actualmente cualquier método dirigido a conocer el perfil fármaco dinámico de un
producto bioactivo se realiza mediante métodos alternativos in vitro basados en las
acciones moleculares del mismo, sin embargo, todavía e útil el uso de técnicas in vivo
no solo para confirmar en animales los hallazgos previamente obtenidos sino además
para lograr extrapolar estos en los seres humanos como herramienta complementaria a
la terapia médica. A pesar que no existen modelos animales que reproduzcan con
fidelidad la etiopatogenia de la EP
2.4.2 Validación del parkinsonismo por 6-OHDA. La medición del grado de parkinsonismo
obtenido en animales inyectados unilateralmente con 6-OHDA se realiza con el test de
rotación inducido por anfetamina o apomorfina (Feger et al., 2002). La inyección de
anfetamina provoca rotación ipsilateral al lado de la lesión. La inyección de un agonista
de la dopamina, como la apomorfina, produce el efecto contrario: rotación hacia el lado
contralateral a la lesión (Marshall y Ungerstedt, 1977). La rotación contralateral inducida
por apomorfina se debe al incremento del número de receptores dopaminérgicas
postsinápticos en el estriado ipsilateral a la lesión como consecuencia de la denervación.
Por el contrario, la anfetamina inhibe la recaptación de dopamina, lo que produce un
aumento de la dopamina únicamente en el estriado contralateral a la lesión y un
33
desequilibrio funcional a favor de éste (Figura 2). Hay pruebas de mayor precisión para
medir el parkinsonismo en las ratas lesionadas, que consisten en la medición de la
actividad espontánea, la velocidad de la marcha, la fuerza de agarre, etc. (Mokry, 1995).
Estos test pueden servir para hacer una valoración más fina del parkinsonismo inducido
por 6-OHDA. En animales lesionados unilateralmente se comparan el lado ipsilateral y
contralateral a la lesión, pero en animales lesionados bilateralmente es necesaria la
comparación con animales a los que se haya inyectado suero salino en las mismas
coordenadas que a los lesionados.
Figura 2. Efecto de apomorfina y anfetamina en ratas lesionadas
(A) Cuando reciben anfetamina, rotan hacia el lado de la lesión (La anfetamina induce el aumento de
dopamina (DA) en el estriado y actúa sobre los receptores D2, que aumentan en el lado lesionado.
(B). Se observa el efecto de la apomorfina que se une a los receptores D2, con lo que la dopamina no
puede actuar sobre ellos.
Fuente Sociedad Española de Neurología, (2009).
2.5 DETERIORO COGNITIVO
En medicina, los trastornos de las funciones cognitivas se asocian generalmente con las
llamadas ‘demencias degenerativas primarias’, de especial importancia por su alta
frecuencia y prevalencia en las poblaciones con un índice de envejecimiento creciente,
típicas de los países desarrollados. Se trata de un grupo heterogéneo de enfermedades
34
caracterizadas por un deterioro mental progresivo que incluye combinaciones variables
de pérdida de memoria, alteraciones del juicio, el cálculo, el lenguaje, la orientación, las
habilidades y la conducta, y trastornos psiquiátricos. Los hallazgos anatomopatológicos
de este grupo de enfermedades consisten en la pérdida de neuronas, localizada
preferentemente en la corteza cerebral, junto con cambios degenerativos de las
neuronas supervivientes, inclusiones proteicas y alteración vascular y de la glía. La
localización de la pérdida neuronal y la naturaleza de los cambios degenerativos y de las
inclusiones son los factores que diferencian a las distintas afecciones (Bird y Miller,
2005). Ejemplos de este grupo de enfermedades degenerativas serían las demencias
frontotemporales, la demencia con cuerpos de Lewy difusos y la enfermedad de
Alzheimer (Navarrete et al., 2008). Esta última es el prototipo de enfermedad
demenciante neurodegenerativa por excelencia, al ser la más frecuente y la mejor
estudiada (Sarasa, 2006).
Sin embargo, a medida que el interés por el estudio de las funciones intelectuales ha ido
aumentando, se ha comprobado que existen alteraciones cognitivas en otras
enfermedades neurológicas degenerativas cuyas manifestaciones cardinales consisten
en un trastorno del movimiento, como las ataxias cerebelosas, las enfermedades de las
motoneuronas o las distrofias musculares, y que engloban a la enfermedad de Parkinson
(Campos Romo, 2008), el temblor esencial , la enfermedad de Huntington , la parálisis
supranuclear progresiva , las ataxias hereditarias, la esclerosis lateral amiotrófica y las
miopatías (Navarrete et al., 2008).
El deterioro cognitivo se presenta aproximadamente en el 20 - 60% de los pacientes y
es más frecuente en personas mayores, en quienes se encuentran en etapas más
avanzadas, o sufren de depresión. Los trastornos depresivos poseen un impacto
negativo en la cognición (particularmente en la memoria) en la EP. Se lo ha implicado
como el síntoma psicopatológico no cognitivo más frecuente, pues alcanza
prácticamente al 50 % de los pacientes (Goldman et al., 1998) ;( Murat, 2003); (Noéet
al., 2001); (Errea y Ara, 1999).
Además de los desequilibrios motores, otros síntomas se presentan en pacientes con EP
que incluyen déficits cognitivos. La demencia -como se denomina a este tipo de daños
35
en los pacientes con EP-, es una degeneración global de la función cognitiva y se
encuentra dentro de las más temibles complicaciones de la EP. Los pacientes con EP
que desarrollen este tipo de demencia, tienen de 2 a 5 veces más riesgo de morir.
(Lieberman, 1997). Existe evidencia de que los síntomas cognitivos encontrados en
pacientes con EP, están relacionados con disfunción ejecutiva, en particular, memoria
de trabajo e incluso planeación y solución de problemas. (Fernándes et al, 2008). El
síndrome de mala ejecución representa el centro de los daños cognitivos y demencia
observados en la EP, y aparece incluso durante las etapas tempranas de la enfermedad.
La función ejecutiva describe un amplio rango de funciones cognitivas requeridas para
los objetivos dirigidos, comportamiento adaptativo en respuesta a lo nuevo, situaciones
de cambio medioambiental que incluye planeación, manejo de tareas, atención,
inhibición, monitoreo y codificación. Todas estas funciones están atribuidas al Córtex
prefrontal y además, las inhabilidades cognitivas de la EP son parecidas a las que
presentan los pacientes de córtex prefrontal. (Da cunhaet al, 2006).
Las habilidades verbales, como la lectura, la escritura y la utilización de palabras, tienden
a conservarse cuando han sido bien aprendidas. Algo similar ocurre con las habilidades
matemáticas y la inteligencia en general. (Kramer y Jarvik, 1979) Y (Benton et al., 1981).
También, se ha afirmado que el envejecimiento normal conlleva disminución en la
velocidad de procesamiento de información compleja, demoras en la solución de
problemas (Craik, 1977), dificultades en la adaptación a situaciones nuevas (Kramer y
Jarvik, 1979), dificultades en los procesos de abstracción y en el desarrollo de
conceptualizaciones complejas y dificultades para sostener la potenciación a largo plazo
(Lezak, 2004), en la percepción, en la atención y en la memoria de trabajo, cuando la
tarea excede la capacidad de almacenamiento inmediato o cuando el nivel de exigencia
se incrementa (Craik,1977). Esta variedad de cambios puede deberse a factores de
confusión, que han comenzado a dilucidarse recientemente. Entre ellos están las
variaciones de los ritmos biológicos asociados al envejecimiento (Winocur G, Hasher L,
2004) y (Buckley y Schatzberg, 2005.), las variables anatómicas, fisiológicas y
emocionales, los cambios sensoriales y motores, las condiciones sociales y el nivel de
desarrollo cognitivo previo (Nishizuka et al., 1991). Otras variables de confusión pueden
ser el modelo experimental y los métodos y modelos de evaluación cognitiva (Savage et
36
al., 1999). El reconocer los cambios cognitivos asociados al envejecimiento es, por tanto
de gran importancia actual, debido a que la problemática va más allá de un desequilibrio
motor.
Estos pacientes presentan también inercia psíquica la cual lentifica la actividad mental
de los enfermos, sin que exista, en los casos puros, un verdadero deterioro de su
psiquismo. Esta inercia psíquica viene a ser para la actividad mental lo que la rigidez y
la acinesia son para la actividad motriz; representaría un bloqueo de la personalidad
mental del paciente, similar al bloqueo que la rigidez y acinesia ejercen sobre los
músculos (Green et al., 2002) ;(Pata y Margolin, 1994).
Pese al espectacular avance de las técnicas y los conocimientos en neuroimagen,
neuroquímica, neurogenética, neuropsicología, neurofisiología y neurofarmacología, la
investigación con pacientes presenta importantes limitaciones que hace imprescindibles
los estudios experimentales con modelos animales de los distintos tipos de disfunción
cognitiva. Hay una gran variedad de modelos animales de deterioro cognitivo,
clasificados en función del mecanismo por el que éste se produce, sea selección o
manipulación genética, utilización de agentes ambientales durante el desarrollo o la edad
adulta, o manipulación farmacológica de la respuesta cognitiva del animal. Aunque los
estudios in vitro de tejido cerebral tienen su interés, en el campo de la farmacología
cognitiva es necesario utilizar uno o varios modelos animales para determinar la utilidad
de un nuevo fármaco y su posología, debido a la complejidad de la función cognitiva, en
la que intervienen múltiples estructuras cerebrales interconectadas (Navarrete,
2008).Por esto vale la pena recalcar la importancia del desarrollo de una batería
comportamental, que sea sensible a los cambios cognitivos en animales lesionados y
controles, ya que los buenos resultados histológicos no describen la evolución y
respuesta positiva del organismo.
2.6 MEMORIA DE TRABAJO
La memoria de trabajo constituye un proceso cognitivo fundamental para el desarrollo de
procesos psicológicos más complejos, tales como el control ejecutivo (Isawa, 2001), la
adaptación social (lezak, 2004), las demencias, la esquizofrenia (Castner et al., 2004;
Marshuetz, 2005) y el abuso de sustancias (Santi y Weise ,1995).
37
Los sistemas anatómicos relacionados con la memoria de trabajo son, principalmente: la
corteza prefrontal dorso-lateral, el campo visual frontal, las regiones rostrales y caudales
de la corteza dorsal (Shintaro y Kazuyoshi, 2003; Srimel y Curtis, 2007), las cortezas
parietal y visotemporal (Fuster y Alexander, 1971; Dalley,2004) y el lóbulo
temporalmedial, particularmente la formación del hipocampo (Squire, 1992; Ruchkin,
2003), el diencéfalo medial, especialmente el núcleo dorso-medial del tálamo, que
mantiene la información durante los períodos de ausencia de estimulación visual o
actividad motora y el núcleo caudado (Gazzaley et al., 2004; Pessoa y Ungerleider, 2004;
Squire,1992; Byatt y Dalrymple-Alford, 2001), la región medial del lóbulo cortical VII del
cerebelo y sus conexiones con la corteza prefrontal del cerebro en la manipulación,
control del movimiento y mantenimiento de la memoria (Pessoa y Ungerleider, 2004;
Hayter, 2007).
La memoria de trabajo es fundamental para realizar un análisis y síntesis de la
información, retener datos necesarios para la consecución de un determinado proceso
mental, participar del priming (impresión mnésica de algo vivido, como por ejemplo
palabras, objetos o eventos), realizar una actividad tutora perfuncional y las
monitorizaciones posfuncionales. La afectación de los mecanismos básicos propios de
la memoria de trabajo provocará una disfunción que influirá en un sin número de
procesos de aprendizaje formal académico: dificultad en el manejo de la dirección de la
atención, dificultad en inhibir estímulos irrelevantes, dificultad en el reconocimiento de
los patrones de prioridad, falta de reconocimiento de las jerarquías y significado de los
estímulos (análisis y síntesis),impedimento en formular una intención, dificultad en
reconocer y seleccionar las metas adecuadas para la resolución de un problema;
imposibilidad de establecer un plan de consecución de logros, falta de análisis sobre las
actividades necesarias para la consecución de un fin y dificultades para la ejecución de
un plan, no logrando la monitorización ni la posible modificación de la tarea según lo
planificado (Etchepareborda y Abad-Mas, 2005). Por lo tanto, es fácil entender cómo el
agotamiento anormal de los niveles de dopamina en estas regiones del cerebro como se
observa en la EP puede afectar de trabajo memoria. De la misma manera, la atención y
38
otras funciones ejecutivas de la corteza prefrontal se verá afectado por la disminución de
dopamina en el cuerpo estriado y corteza prefrontal (Dubois y Pillon 1997; Owen 2004)
2.7 LABERINTO CIRCULAR DE BARNES
Es una prueba que permite estudiar el aprendizaje y la memoria espacial, trabajo y de
referencia, y la memoria a corto y largo plazo así como otras tareas más complejas en
ratas y ratones.
“Fue diseñada por Barnes en la Universidad de Arizona (Barnes, 1979) y consiste en un
laberinto seco donde se utilizan luz y ruido como estímulos aversivos. El refuerzo que
recibe el animal es escapar de estos estímulos. El laberinto está constituido por un disco
de plástico opaco elevado del suelo mediante un trípode (Fig. 3). A lo largo del perímetro
del disco se distribuyen 20 agujeros de 5 cm de diámetro y debajo de uno de ellos se
coloca un cajón de escape de plástico opaco.
Figura 3. Laberinto de Barnes
El animal se sitúa primero en el centro de aparato en una cámara de inicio y a continuación se le deja que
explore los diversos orificios ante la exposición a estímulos aversivos, como luces y sonidos. Se evalúa el
tiempo que emplea en encontrar la salida que conduce al cajón refugio.
Fuente: Navarrete et al., (2008)
Se pueden situar diversas pistas espaciales alrededor del cilindro, que permanecerán
constantes durante todo el estudio, y también se pueden colocar debajo de algunos
agujeros cajones falsos en los que parece posible introducirse, pero cuyo espacio
disponible es en realidad tan pequeño que impide que el animal se pueda esconder. Un
39
foco de luz (de unos 150 W) y un generador de ruido (sobre 80 dB) constituyen los
estímulos aversivos. El procedimiento comienza con un entrenamiento que consiste en
colocar el animal en la caja de escape y dejarlo allí durante un minuto, para continuar un
minuto más tarde con las diversas sesiones de exploración. Todas las sesiones
empiezan colocando el animal en el centro del laberinto en el interior de una ‘cámara de
inicio’, que consiste en un cilindro opaco de unos10 cm de alto. Al cabo de 10 segundos,
se retira la cámara de inicio, se conectan la luz y el zumbido, y se deja que el animal
explore el laberinto. El estrés producido por estos estímulos inducirá al animal a buscar
un espacio cerrado donde esconderse.
La sesión termina cuando el animal encuentra el túnel de escapeo cuando transcurren
cinco minutos, momento en el que se le introduciría manualmente en dicho túnel. Cuando
el animal entra en la cámara de escape, los estímulos aversivos cesan y se le deja en la
oscuridad un minuto antes de devolverlo a su jaula. El túnel de escape está situado
siempre debajo del mismo agujero, que se elige de forma aleatoria para cada animal. La
prueba se realiza durante varios días hasta que en siete u ocho pruebas consecutivas
se produzcan menos de tres errores. Se valoran el aprendizaje espacial y la memoria
midiendo el tiempo que invierte el animal en encontrar el cajón refugio y el número de
errores que comete antes de encontrarlo. Se considerará un error cada vez que intente
introducirse en un agujero que no es el correcto. Los intentos sucesivos en un mismo
agujero equivocándose consideran el mismo error” (Navarrete et al., 2008).
40
3. METODOLOGIA
Se estableció un diseño metodológico (Figura 4), el cual contempla la selección de
organismos, tratamientos y análisis.
Figura 4. Organigrama de metodología
El diseño experimental tiene una duración de 3 meses.
Fuente: autor.
41
3.1 ANIMALES DE EXPERIMENTACIÓN
3.1.1 Manutención de Ratas Wistar. La investigación desde sus orígenes ha requerido la
utilización de animales de laboratorio desde sus primeros estudios anatómicos
comparados, hasta la utilización de ellos como reactivo biológico. En la búsqueda
constante de la verdad y de mejorar las condiciones de salud y bienestar de la sociedad,
el hombre se apoya en el uso de animales, sin olvidar que su naturaleza sintiente y el
debido respeto que merecen.
Los modelos animales de trastornos cognitivos desempeñan un papel clave en la
comprensión de las bases neuroquímicas de la función/disfunción cognitiva. Con su
utilización podemos profundizar en las bases fisiopatológicas del deterioro que se
produce por el simple hecho de envejecer o el que aparece asociado a diferentes
situaciones patológicas, como la enfermedad de Alzheimer, la enfermedad de Parkinson,
las demencias vasculares, la gangliopatía amiloide cerebral, las enfermedades priónicas,
la esclerosis lateral amiotrófica, la enfermedad de Huntington, la esquizofrenia y otras
enfermedades neurodegenerativas.
Además, los modelos animales nos permiten comprobar la eficacia de nuevos fármacos
e identificar posibles dianas terapéuticas (Navarrete et al., 2008)
3.1.2 Características de las Ratas Wistar. La rata (Rattus norvegicus, variedad albina,
cepa Wistar). Es comúnmente utilizada en estudios de comportamiento por diversas
razones. En primer lugar, su pequeño tamaño posibilita que puedan ser almacenadas en
pequeños espacios. También presenta una gran capacidad de exploración, lo cual es
importante porque estas virtudes la hacen apta para ser sometidas a pruebas de
actividad espontánea y aprendizaje.
Favorablemente, posee cortos periodos de gestación y cría de 20 a 22 días permiten
disponer de sucesivas generaciones de manera muy fácil.
Hoy en día existen numerosas pruebas que permiten al investigador registrar una serie
de variables indicativas de actividad motora, emotividad y exploración. Por lo tanto, es
42
necesario tener claro que la rata es un animal de costumbres nocturnas que forma
colonias en madrigueras estrechas. Este modo de vida hace que la rata presente una
marcada fotofobia y tendencia a desplazarse con su cuerpo en contacto físico con
paredes y objetos (tigmotaxia).
3.1.3 Conducta exploratoria en la Rata Wistar. El comportamiento es un mundo de
respuestas a estímulos externos los cuales implican el intercambio regulatorio entre
diversas zonas del sistema nervioso central (SNC), estas zonas están a cargo del control
de diferentes aspectos de la conducta.
Por lo tanto la medición y valoración de cualquier tipo de tratamiento experimental solo
conseguirá con la medición de parámetros indicativos de diversos tipos de
comportamiento, tanto en ausencia como en presencia de estrés y los cuales puedan ser
reproducibles a igualdad de condiciones.
3.1.4 Universo experimental .Para los ensayos experimentales y el proyecto mismo, Se
tuvieron en cuenta 27 ratas Wistar macho proporcionados y mantenidos en el bioterio
de Experimentación Animal del Grupo Modelos Experimentales para las Ciencias Zoohumanas (Me-CZH) adscrito a la Facultad de Ciencias de la Universidad del Tolima, con
peso entre 250 y 300g respetando los requerimientos estadísticos, exigidos, la especie
y línea apropiada. Se mantuvieron en cajas tipo T-4 en la proporción de 4 animales por
cajas. Se respetaron las condiciones de mantenimiento según las normas establecidas
para la manutención de roedores en un Bioterio; humedad 50-80%, temperatura de 21°
+/- 1C, fotoperiodo de 12:12 luz/oscuridad. Atendiendo parámetros zootécnicos para la
especie, una alimentación controlada 15g/día/animal de concentrado para roedores
peletizado de LabDiet y agua ad-libitum.
El personal que manejo los animales de estudio está entrenado y calificado en el manejo
de animales de laboratorio para evitar la generación de niveles altos de stress, Se tuvo
como principal premisa el cumplimiento de las BPL (Buenas Practicas De Laboratorio)
para el mantenimiento y experimentación con animales de laboratorios, las 3Rs (Rusell
& Burch, 1959, en Zúñiga, Tur, Milocco & Piñero, 2001).
43
3.1.5 Grupos experimentales. Fueron distribuidos 27 individuos en tres grupos
experimentales (Tabla1). A los individuos se les realizó un test neurológico y pole test a
cada uno, garantizando un estado óptimo a nivel del sistema nervioso.
Tabla 1. Grupos experimentales utilizados en el estudio
Lesión
Sustancia
Nº de
animales
Función dentro del
estudio
Ninguna
ningunaa
9
Animal sano, con
capacidades cognitivas
en buen estado.
Sham
SNpc
Solución salina
b
9
Animal con
manipulación
quirúrgica sin
neurotoxina
Lesionado
SNpc
6OHDA- HCl - c
9
Animal con
neurotoxina 6-OHDA
Grupo
Control
A los organismos se les inyecto intracerebralmente: a Ninguna solución; b A una concentración de 0.9%
con 0.2 mg/ml de ácido ascórbico; y c A una concentración de 8 µg /3 µL de solución salina
Fuente: autor
3.1.6 Inducción del hemiparkinsonismo. Los animales se anestesiarán con una dosis
conjunta Ketamina/xilaxina (Ketamina 50 µg/ kg/ Xilacina 20 µg/kg de peso corporal) de
manera intraperitoneal, y serán colocados en el aparato esterotáxico para roedores. Una
lesión unilateral de la SNpc se realizará por medio de una inyección de un volumen de
3µl de una solución de 6OHDA- HCl- 8µg/3µl de solución salina, en el hemisferio derecho
con la ayuda de una jeringuilla Hamilton de 10µl, y a una velocidad de 1µl/min (Figura 5).
Figura 5. Inyección intracerebral
Procedimiento quirúrgico de inyección intracerebral de 6OHDA en los sujetos de estudio.
Fuente: autor
44
La inyeccion fue realizada en las coordenadas esterotáxicas: AP (antero-posterior)= 4.4
mm posterior de Bregma, ML (medio-lateral)= 1.2 mm a la derecha de la línea media y
DV(dorso-ventral)=7.8 mm por debajo de la duramadre (Paxinos & Watson, 2005) (Figura
6).
Figura 6. Coordenadas estereotáxicas de lesión para el modelo de SNpc
La zona marcada con rojo señala el punto de inyección de la 6-OHDA en la SNpc
Fuente: George P & Charles W. (2005).
En este trabajo se utilizaron como Sham, animales a los cuales se les aplicó
intracerebralmente el vehículo (Solución salina 0.9% con 0.2 mg/ml de ácido ascórbico)
en los puntos de lesión, pues es el control más utilizado en estudios experimentales de
enfermedad de Parkinson (Sherman y Moody, 1995; Pavón et al, 1998; Rojo et al, 2002).
45
3.2 PRUEBAS CONDUCTUALES
Las pruebas conductuales mencionadas a continuación se realizaron un mes después
de realizada la lesión cerebral con 6-OHDA, con el propósito de evaluar la evolución de
los animales en el desempeño de las pruebas como también para realizar la correlación
con los estudios histológicos.
3.2.1 Actividad Rotatoria. Para evaluar la lesión se llevó a cabo la prueba de actividad
rotatoria inducida por inyección intraperitoneal de apomorfina (0.5mg/kg de peso), 1 mes
después de producida la lesión. La conducta rotatoria se evaluó por el número de vueltas
completas (360º) ipsilateral a la lesión en 15 minutos luego de la inyección de apomorfina
con la cual se miden total de vueltas por minuto. (Figura.7)
Figura 7. Test de actividad rotatoria
Test de actividad rotatoria que muestra la dirrecion de rotacion de los individuos al administrarsele el
agonista dopaminergico
46
3.2.2 Test Neurológico. El Test neurológico consiste en una serie de pruebas que
permiten determinar que los animales estén en condiciones normales. Los animales de
los 3 grupos experimentales, se les realizarón diferentes pruebas y el pole test para
evaluar el estado de su actividad sensoriomotora (Tabla 2 y Figura 8 ).
Tabla 2. Descripción de pruebas realizadas en el Test neurológico y Pole test
Pruebas
Descripción
Reflejo de caida
Reflejo que corrige la orientación del cuerpo cuando se
toma fuera de su posición vertical normal.
Reflejo de flexiontension
Reflejo de
corrección
Reacción de apoyo
(Tactismo y vibrisas)
Es un reflejo de las extremidades el cual cuando estas son
estiradas tienden a recogerse.
Cuando el animal es dispuesto boca arriba en una
superficie plana el tiende a corregir posición.
Suspensión de la rata a partir de la cola y se acerca a una
superficie plana. Por lo cual ella busca equilibrarse.
Localización visual
Se suspende la rata horizontalmente de tal manera que las
patas anteriores alcancen la superficie.
pole test.
El animal se coloca en la cima de un tubo de 60 cm de
largo por 3 cm de diámetro. Por el que deberá descender
en un tiempo Max. de 60 seg.se tendrán en cuenta la
corrección de la posición, numero de extremidades usadas
y el uso de la cola.
Fuente: Tomado de Bures & Buresova, (1983) y modificado por el autor.
Figura 8. Test neurológico
Pruebas del Test Neurologico: A.reflejo de caida, B.reflejo flexion-tension, C.reflejo de corrección,
D.reaccion de apoyo, E.localizacion visual y F.Pole Test.
Fuente: Autor
47
3.2.3 Test De Barnes Modificado. El test (Figura 9) consta de una superficie plana y
circular con agujeros alrededor que permite al animal huir del laberinto a una caja de
escape. El color de la plataforma, la luz sobre la misma y el ruido, crearon un efecto
aversivo en los animales a evaluar. Al ejecutar el test se utilizaron las siguientes claves:

Claves Extra-laberínticas: Planteadas en el test original pero eliminadas en este
estudio, el test será realizado en un cuarto acortinado de color oscuro.

Claves intra-laberínticas: Sobre la superficie del test se colocó 1 bandera de color
blanco la cual contrasta con el salón oscuro e indica el sitio de la caja de escape.
Estos objetos se cambiaron de lugar de manera aleatoria para que el animal
aprenda los movimientos por asociación agujero de escape-bandera.
Figura 9. Test de Barnes modificado
La superficie tiene 1,22 metros de diámetro, hecha en triplex y forrada con fórmica de color blanco. Tiene
18 agujeros de 9,5cm de diámetro cada uno, espaciado a 30° uno de otro y forrado con fórmica de color
negro y la base tiene 90cm de alto. La caja de escape tiene 38,7cm de largo, 12,1 cm de alto y 14,2cm
de ancho, está hecha de acrílico de color negro. Diecisiete de los dieciocho agujeros están tapados con
plástico de color oscuro. De esta manera se aseguró un ambiente similar en todos los agujeros. Sólo se
encuentra destapado, el agujero escape, que está señalizado con la clave extralaberíntica, de la que se
hablará más adelante. A la altura de la caja de arranque, estará una fuente lumínica de 150W, y un parlante
que emitirá un sonido blanco de 90 db.
Fuente: Autor.
48
La ejecución del test de Barnes modificado se realizó en varios periodos:

Período de aclimatación: Las pruebas fueron realizadas durante las horas de la
mañana para evitar que los picos de cortisol que se elevan en las horas de la tarde,
influyeran en el comportamiento de los animales. Los animales de los 3 grupos se
manipularon durante 5 minutos antes de la prueba para reducir los niveles de estrés
y su influencia en los ensayos de la prueba. (V. Vargas-López et al, 2011).

Período de Habituación: Se realizó 1 sesión de habituación al laberinto, en la que se
colocaron
indistintamente a los sujetos experimentales en la caja de arranque,
plataforma y la caja de escape durante 5 minutos en cada uno.

Periodo de adquisición: Luego de las sesiones de habituación, se empezó con la
evaluación del daño cognitivo: Se realizaron 8 ensayos cada uno de 1 minuto por 3
días. Luego de que los animales estuviesen dentro de la caja se esperaron 5
segundos y luego se dispuso al animal para el siguiente ensayo. Entre cada ensayo,
la caja de escape y la plataforma se limpiaron con alcohol al 70% para evitar que
exista un rastro fijado por la orina y las heces fecales. Cada ensayo al igual que las
sesiones fueron grabadas en una video cámara, las distancias fueron registradas en
un tabla digital y estandarizadas de acuerdo al diámetro de la plataforma de Barnes
Modificado.
3.3 TÉCNICAS HISTOLÓGICAS
El procesamiento histológico de los tejidos cerebrales fue llevado a cabo en el
Laboratorio de Biotecnología Aplicada de la Universidad del Tolima (LABIOA-UT)
Para el análisis histológico 3 animales de cada uno de los grupos se anestesiaron con
sobredosis de Pentobarbital y se perfundierón por el método de gravedad utilizando
250ml de solución salina 0.9% y 250ml de paraformaldehído al 4% por cada animal; los
cerebros fueron extraídos y post fijados en paraformaldehído al 4% por un intervalo de
24 a 48 horas a 4ºC, posteriormente sometidos a un gradiente ascendente de sacarosa
(7%, 25% y 30%) a 4ºC y luego fueron criopreservados a -20ºC, hasta la realización de
los cortes.
49
/RV FHUHEURV IXHURQ FRUWDGRV HQ VHFFLRQHV FRURQDOHV GH ȝP GH JURVRU HQ XQ
9LEUiWRPR /HLFD 97 6 )LJXUD SUHYLR DO FRUWH VH UHDOL]y XQD PDUFD HQ HO
KHPLVIHULRL]TXLHUGRKHPLVIHULRLQWDFWRDQLYHOGHFRUWH]DFRQHOSURSyVLWRGHQRSHUGHU
ODRULHQWDFLyQGHORVWHMLGRVSDUDHOOOHYDUDFDERODWLQFLyQGH1LVVOVHHVFRJLHURQORV
FRUWHVFRUUHVSRQGLHQWHVDORV%UHJPDVVHJ~Q3D[LQRV:DWVRQ
)LJXUD ORV FXDOHV IXHURQ PRQWDGRV VREUH SODFDV JHODWLQL]DGDV JHODWLQD SRUFLQD
)LJXUDRSXHVWRVHQFDMDVPXOWLSR]RSDUDODWLQFLyQGH1LVVOUHVSHFWLYDPHQWH
)LJXUD9LEUiWRPR
9LEUiWRPR/HLFD976XWLOL]DGRHQODUHDOL]DFLyQGHFRUWHVFRURQDOHVGHFHUHEUR
50
Figura 11. Bregmas utilizados en el análisis histológico
Fuente: Paxinos G & Watson C.( The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates).
51
3.3.1 Tinción de Nissl
La tinción de Nissl es una de las técnicas clásicas más utilizadas actualmente, en ella se
emplean colorantes derivados de anilina como el violeta de cresilo, rojo neutro o azul de
toluidina, que debido a su carácter básico poseen alta afinidad por los ácidos nucleicos
de las neuronas, dado que el soma neuronal posee grandes concentraciones de ácidos
nucleicos en el núcleo, el nucléolo y los ribosomas, en particular los adheridos al retículo
endoplásmico rugoso o sustancia de Nissl (Rodríguez et al, 2005), mediante esta técnica
se buscó tincionar los somas de todas las neuronas de la muestra de tejido y de esta
manera se determinó despoblamiento neuronal un mes de transcurrida la lesión y de
aplicar las pruebas a los animales, para el desarrollo de esta técnica se siguió el protocolo
utilizado en el Laboratorio de Modelos Experimentales para las Ciencias Zoohumanas
(ME-CZH) de la Universidad Del Tolima.
Una vez los cortes montados en las placas estaban secos fueron hidratados en agua
durante 1 minuto y luego llevados al colorante básico (azul de toluidina, 1%, pH: 4)
durante 17 minutos, seguidamente el exceso de colorante fue eliminado a través de un
lavado activo en agua durante 1 minuto y los tejidos fueron sometidos a deshidratación
creciente en alcoholes del 70% durante 2 minutos, posteriormente del 96% por 2 minutos
y finalmente del 100% durante 4 minutos.
Para terminar las láminas de embebieron en xileno por un periodo de 10 minutos y se
sellaron con Cónsul-Mount. Las placas fueron analizadas a través de microscopio de luz
Advanced Optical y las imágenes fueron tomadas con cámara digital.
Figura 12.Cortes histológicos
Cortes de cerebro de rata listos para pasar a tinción y posteriormente ser observados al microscopio.
Fuente: autor
52
3.4 ANÁLISIS DE DATOS
Prueba rotacional inducida con apomorfina. Para evaluar la lesión en SNpc con 6OHDA
y de esta manera determinar la eficacia del modelo, se contaron como mínimo siete
vueltas por minuto como indicador positivo de lesión.
Test neurológico. El Test Neurológico es una prueba cualitativa sin embargo se ajustó la
valoración de la prueba de cualitativo a cuantitativa donde el valor cero (0) corresponde
a error o prueba no realizada y el valor uno (1) corresponde a acierto en la prueba; Se
realizó una comparación entre los tres grupos (Control, Sham y Lesionado) con una
anova.
Pole Test. Se tuvo en cuenta para valorar esta prueba el número de extremidades y cola
utilizados por el animal en la ejecución de la misma, se dio valor cero (0) a prueba
perfecta si el animal usa las 4 extremidades y la cola, valor uno (1) 4 extremidades sin la
cola, valor dos (2) 3 extremidades y la cola, valor tres (3) 2 extremidades sin la cola y
valor cuatro (4) 1 extremidad sin la cola.
Test de Barnes Modificado. Para determinar el daño cognitivo en los grupos
experimentales se utilizaron las siguientes variables cuantitativas: lateralidad, latencia de
exploración, distancia recorrida, número de errores y un mero de aciertos (tabla 3).
Tabla 3.Variables tenidas en cuenta en el laberinto de Barnes modificado
Variable
Latencia del
Distancia
Numero
Numero de
Latencia de
primer
recorrida
de
aciertos
escape
agujero
Descripción
errores
Tiempo en
Distancia
Numero
Número de veces
Tiempo en que el
que el animal
recorrida en
de
que el animal
animal ingresa al
llega y
60 segundos.
agujeros
encuentra el
agujero de
explora el
erróneos
agujero de escape
escape.
primer
que
en un día de
agujero.
explora.
prueba.
Fuente: autor.
53
Estudios Histológicos. Se midió la densidad de cuerpos celulares con el programa
ImageJ, versión 1.42.
Los test estadísticos utilizados en el análisis de los datos se realizaron a través del
programa Infostat para Windows y los resultados serán evaluados en un análisis de
varianza paramétrico o no paramétrico de acuerdo a la distribución de los datos y
análisis post hoc cuando corresponda. Los resultados histológicos se correlacionarán
con los comportamentales.
54
4. RESULTADOS
4.1 GENERALIDADES
Cirugía y post operatorio
La cirugía estereotáxica de lesión dopaminérgica, tuvo una duración promedio de 45
minutos por animal, después de ser anestesiado. Los animales mostraron un
comportamiento dócil principalmente observado al momento de la manipulación. La
supervivencia pos-operatoria fue del 100%, Sin embargo, un animal del grupo lesionado
falleció antes de empezar la cirugía, debido al exceso de anestésicos usados para tal fin.
Pruebas comportamentales
Las pruebas comportamentales se realizaron bajo las condiciones controladas de ruido
y iluminación en las horas de la mañana, los animales se aclimatizaban a la persona
encargada de la manipulación durante la ejecución de las pruebas.
4.2 TINCIÓN DE NISSL
La tinción básica de Nissl permitió observar de manera general la disminución celular a
nivel de SNpc, (ver Figura 13 y Tabla 4) Los cortes realizados se estudiaron en las zonas
-4.92 y -5.40 coordenadas estereotáxicas tomadas del libro (The Rat Brain in Stereotaxic
Coordinates) las cuales nos permiten apreciar el lugar exacto de la lesión estereotáxica,
estas denotan su afección por la pérdida de cuerpos neuronales y fibras, característica
que se encuentra principalmente en el modelo de SNpc.
4.2.1 Comparación histológica de modelo y grupo control. La comparación de los cortes
cerebrales de los modelos tanto a nivel de hemisferio lesionado (derecho) como no
lesionado (izquierdo), con su correspondiente control de lesión reveló que a nivel de
hemisferio lesionado se produce pérdida neuronal únicamente en el punto de lesión por
inyección de la toxina , pero esta no se difunde dentro de la estructura, pues no se
presenta en otros cortes donde se observa la misma estructura falso lesionada; y en
cuanto al hemisferio no lesionado (izq.), no se halló diferencia en la población neuronal
entre los modelos y sus controles de lesión
55
Figura 13. Comparación histológica de los grupos experimentales
A. SNpc hemisferio Lesionado 1 mes (10x) B. SNpc hemisferio Control 1 mes (10x)
Tabla 4 Disminución neuronal entre los grupos experimentales
GRUPOS
CONTROL
SHAM
LESIONADO
DISMINUCIÓN
Ausente Ausente Presente
4.3 ACTIVIDAD ROTATORIA INDUCIDA POR APOMORFINA
El grupo lesionado cumplió con el número mínimo de vueltas 7 contralaterales a la lesión
reportada para el establecimiento de los modelos de 6OHDA, Aunque el promedio de
vueltas por minuto varía entre los animales del grupo lesionado, todos los animales
mostraron un máximo de rotaciones equiparable. Los Animales del grupo Control y Sham
no presentaron rotación solo movimiento de vaivén.
56
4.4 TEST NEUROLÓGICO Y POLE TEST
La batería sensoriomotora que comprende las pruebas del Test Neurológico y el Pole
Test permitió establecer el estado Neurológico a nivel motriz y sensorial en los grupos
evaluados.
4.4.1 Resultados test neurológico
Tabla 5. Porcentaje de ejecución de las pruebas en el test neurológico
% De ejecución de la prueba
Prueba
R. caída
R. flex-ret extr der
R. flex-ret extr. Izq.
R. enderez. tren anterior.
R. enderez. tren posterior.
R. acercamiento plano arriba
derecho
R. acercamiento plano arriba
izq.
R. acercamiento plano
horizontal derecho
R. acercamiento plano
horizontal izq.
CONTROL
Acierto
Fracaso
100%
100%
100%
100%
100%
100%
100%
100%
SHAM
Acierto
Fracaso
Acierto
LESIONADO
Fracaso
0
100%
0
77%
22%
0
100%
0
100%
0
0
88%
12%
55%
44%
0
100%
0
100%
0
0
88%
12%
33%
66%
0
100%
0
55%
44%
0
100%
0
22%
77%
0
100%
0
44%
55%
0
100%
0
22%
77%
100%
Porcentaje de acierto y fracaso en la ejecución de reflejo caída, reflejo flexión retracción extremidad
derecha, reflejo flexión retracción extremidad izquierda, reflejo enderezamiento tren anterior, reflejo
enderezamiento tren posterior, reflejo acercamiento plano arriba derecho, reflejo acercamiento plano de
arriba izquierdo, reflejo acercamiento plano horizontal derecho y reflejo acercamiento plano horizontal
izquierdo.
Fuente: autor
57
5HVXOWDGRVSROHWHVW
/$7(1&,$'((6&$3(32/(7(67
)LJXUD/DWHQFLDGHHVFDSHHQHO3ROH7HVW
/DWHQFLDGHHVFDSHPHGLGDHQVHJXQGRVSDUDODSUXHEDGH3ROH7HVW/DSUXHEDGHQRUPDOLGDGGH6KDSLUR
:LONVPRVWUyTXHORVDQLPDOHVGHORVJUXSRVH[SHULPHQWDOHVVHFRPSRUWDURQGHODVLJXLHQWHPDQHUD
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DUURMDGRVSRUHVWDSUXHEDQRVRQQRUPDOHV 8QDYH]UHDOL]DGDODSUXHEDGHQRUPDOLGDG VHHMHFXWyXQ
DQiOLVLVGHYDULDQ]DQRSDUDPpWULFDPHGLDQWHHO7HVWGH.UXVNDO:DOOLVHOFXDODUURMRXQS ORFXDO
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WHQGHQFLDDODGLIHUHQFLDFLyQHQWUHORVJUXSRV6KDPPHGLD\/HVPHGLD
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58
180(52'((5525(632/(7(67
)LJXUD1~PHURGHHUURUHVHQHO3ROH7HVWSRUJUXSR
1XPHURGHHUURUHVUHDOL]DGRVSDUDODSUXHEDGHSROHWHVW/DSUXHEDGHQRUPDOLGDGGH6KDSLUR:LONV
DUURMy TXH ORV DQLPDOHV GH ORV JUXSRV H[SHULPHQWDOHV VH FRPSRUWDURQ GH OD VLJXLHQWH PDQHUD &RQWURO
S 6KDPS \/HV (VWRVUHVXOWDGRVLQGLFDQTXHORVLQGLYLGXRVSHUWHQHFLHQWHVD
ORVJUXSRVVHFRPSRUWDURQGHPDQHUDQRUPDO8QDYH]UHDOL]DGDODSUXHEDGHQRUPDOLGDGVHHMHFXWyXQ
$QRYDHOFXDODUURMRXQS VHJXLGRGHXQDQiOLVLVSRVKRFFRQHOWHVWGH7XNH\GRQGHVHHQFRQWUy
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59
5HVXOWDGRVWHVWGH%DUQHV
7DEOD 5HVXOWDGRV SUXHED GH 1RUPDOLGDG 6KDSLUR :LONV 3 SDUD ODV YDULDEOHV
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)XHQWHDXWRU
60
7DEOD5HVXOWDGRV7HVWGH.UXVNDO:DOOLVSSDUDODVYDULDEOHVHYDOXDGDVHQHO7HVW
GH%DUQHVPRGLILFDGR
7HVWGH.UXVNDO:DOOLVSHUPLWHFRPSDUDUORVJUXSRVHQVXGHVHPSHxRSRUGtDVGHSUXHED*FRQ*UXSR
&RQWURO*VKDP*UXSR6KDP*OHV*UXSR/HVLRQDGRS!QRHVVLJQLILFDWLYR
)XHQWHDXWRU
61
Tabla 8. Resultados Test de Friedman (p) para las variables evaluadas en el Test de
Barnes modificado.
Test de Friedman me analiza la evolución de los grupos en los días de prueba. Dia1 (primer día de prueba),
Dia2 (segundo día de prueba), Dia3 (tercer día de prueba) ; significancia simbólica : grupos con letra en
común no son significativamente diferentes.
Fuente: autor
62
)LJXUD/DWHQFLDGHOSULPHUDJXMHURHQHO7HVWGH%DUQHVPRGLILFDGR
)XHQWHDXWRU
)LJXUD1XPHURGHDFLHUWRVHQHO7HVWGH%DUQHVPRGLILFDGR
)XHQWHDXWRU
63
)LJXUD'LVWDQFLDUHFRUULGDHQHO7HVWGH%DUQHVPRGLILFDGR
)XHQWHDXWRU
)LJXUD1XPHURGHHUURUHVHQHO7HVWGH%DUQHVPRGLILFDGR
)XHQWHDXWRU
64
)LJXUD/DWHQFLDGHHVFDSHHQHO7HVWGH%DUQHVPRGLILFDGR
)XHQWHDXWRU
)LJXUD&XUYDGHDSUHQGL]DMHGHORVWUHVJUXSRVHQORVGtDVGHSUXHED
(OJUDILFRPXHVWUDODDVLQWyWLDGHODVFXUYDVORFXDOOOHYDDREVHUYDUHODSUHQGL]DMHGLVPLQX\HODODWHQFLD
GtDDGtDGHPDQHUDHILFLHQWHHQORVJUXSR&21752/\6+$0DXQTXHHOJUXSROHVLRQDGRWDPELpQ
GHPXHVWUDDSUHQGL]DMHVXWLHPSRGHHMHFXFLyQHVODUJR
)8(17(DXWRU
65
5. DISCUSIÓN
La enfermedad de Parkinson ha sido ampliamente estudiada a través de diferentes
modelos, dentro de los cuales el más utilizado es el modelo de lesión con 6-OHDA en
SNpc o MFB en ratas (Jin y Lacouitti, 1995; Jeon et al, 1995;Sherman y Moody, 1995;
Pavón et al, 1998; Rojo et al, 2002; Reum et al,2002), las fibras dopaminérgicas son
destruidas por la inyección unilateral de la neurotoxina 6-hidroxidopamina (6-OHDA) en
el striatum, la sustancia nigra pars compacta (SNpc) o su principal eferencia, el haz
prosencefálico conocido como vía nigroestriatal (VNE) (Schober, 2004).Al realizarse las
pruebas comportamentales que direccionan este ensayo, el test Neurológico mostró
diferencias en los porcentajes de ejecución por cada prueba entre los grupos. Los
individuos del grupo control tuvieron un éxito del 100% de ejecución en las pruebas lo
que indica que las condiciones sensoriomotoras de los animales son aptas y fiables para
ser comparados con individuos de los grupos Sham y Lesionado; el grupo Sham realizó
la mayoría de las pruebas con un 100% de acierto a excepción de las pruebas de reflejo
flexión y retracción pata posterior izquierda y reflejo de enderezamiento tren posterior las
cuales tuvieron un 88% de acierto en el desempeño de las pruebas lo cual muestra que
un animal del grupo Sham pudo haber sido afectado en la ejecución de la cirugía
estereotáxica comprometiendo zonas cerebrales encargadas de la ejecución motora.
Sin embargo, cuando se compara la ejecución del grupo lesionado en esta prueba con
el Sham, (correspondiente al 12% -ver tabla Nº5) no es alto por lo que puede decir que
la cirugía no tiene influencia significativa en el desempeño motor-cognitivo que pueda
afectar los resultados del presente estudio, incluso en animal del grupo Sham. Como se
esperaba los animales del grupo Lesionado mostraron un deterioro motor severo que se
comprobó mediante la prueba de rotación con apomorfina la cual dio como resultado un
número mayor a 7 vueltas/min. El test neurológico arrojó los siguientes porcentajes de
acierto: reflejo flexión- retracción inferior -izquierda 56% ,reflejo de enderezamiento tren
posterior 66%,reflejo de acercamiento plano arriba derecho 56%, reflejo de acercamiento
plano de arriba izquierdo 23%, reflejo de acercamiento plano horizontal derecho 45% y
reflejo de
acercamiento plano horizontal izquierdo 23%. Los anteriores resultados
permiten inferir que la lesión con 6OHDA en la SNpc ocasionó una disminución de
66
aproximadamente el 90% de la población celular de esa zona. En ese orden de ideas,
es apropiado decir que debido a esta lesión, los animales mostraron fallas en la ejecución
de movimientos con una tendencia mayor en las extremidades izquierdas y en el tren
posterior, como lo menciona Zigmond et al., 2002 & Woodlee y Schallert, 2004: La lesión
puede resultar en una disminución drástica de las concentraciones de dopamina (DA)
causando una asimetría funcional de moderada a severa. Lo cual indica que los animales
a los que se les practicase dicha lesión tendrán déficit motor y cognitivo, ya que la
sustancia nigra es uno de los núcleos moduladores de dichos procesos integrados en la
ejecución de movimientos y de tareas programadas. El predominio de una de las dos
vías nigroestriatales se manifiesta en asimetría postural y de movimientos, cuya dirección
refleja, contralateralmente, el hemisferio dominante.
Así mismo, los datos obtenidos en la ejecución del pole test se analizaron con una
Análisis de varianza para datos no paramétricos Kruskall Walis, el cual mostró una
diferencia significativa entre los grupos control y Sham con respecto al lesionado, los
animales del grupo lesionado expusieron serias disfunciones motoras debido a la lesión
unilateral con 6-OHDA . Dichos animales presentaban dificultad o simplemente no
corregían posición, extremidades izquierdas retraídas y el uso de la cola era limitado lo
cual no permitía que el animal coordinara sus 4 extremidades más la posición de la cola
en pro de facilitar el descenso de la barra y lograr su objetivo, esta serie de
anormalidades sensoriomotoras caracterizó al grupo lesionado como
el grupo con la
mayor cantidad de errores ; H(2; 27)= 18,5877; p= 0.001,Como lo confirman Schallert et
al., 2000; Metz et al., 2004; Woodle et al., 2008.,Whishaw et al., 1997; Johnston et al.,
1999 y Stein, 2009,las ratas no pueden usar con efectividad sus extremidades
contralaterales a la lesión para iniciar el movimiento, alternar el centro de masa del
cuerpo durante la locomoción o mantener el control postural. El modelo de
hemiparkinsonismo en ratas se caracteriza por acinesia en la extremidad anterior
contralateral a la lesión.
Adicionalmente, los animales de los grupos Control y Sham desempeñaban la prueba
con un número de errores mínimo, corrección de posición perfecta, utilización de
extremidades y cola con agarre perfecto; salvo algunos animales que reducían su
67
capacidad de ejecución debido posiblemente a una reacción exacerbada de aversión
frente a la posición de inclinación en el Pole Test.
En cuanto a la evaluación del deterioro cognitivo, en Algunas de las pruebas de
conducta que se emplean en especial, para la evaluación del aprendizaje y la memoria
no espacial es la prueba de reconocimiento de objetos. Esta prueba es tendiente al
aprovechamiento de la facultad de los roedores por la exploración de nuevos objetos y
ambientes y compararlos con otros que le son familiares, como lo soportan. Baker KB y
Kim JJ.,2002 y Tang YP.et al, 1999, se ha incrementado su uso como modelo de
investigación y poderosa herramienta experimental para valorar los efectos de los
fármacos sobre la memoria y los mecanismos neurobiológicos relacionados con el
aprendizaje; al hablar de memoria hay que tener en cuenta que la ella se divide en dos
tipos la implícita y la explícita, para este estudio se utiliza el recurso de memoria explicita
ya que
el Test de Barnes utilizara el reconocimiento de acontecimientos, lugares,
hechos, situaciones nuevas, asociación de lugares de resguardo y señales de
localización . (Kandel ER, 2000).La memoria explícita o declarativa engloba la retención
del conocimiento de determinados acontecimientos, lugares o hechos, y en ella toma
parte el lóbulo medio temporal del diencéfalo. Esta información se retiene mediante un
esfuerzo consciente y a través de asociaciones nuevas. Para la evaluación del
aprendizaje y la memoria espacial se ha utilizado el Laberinto acuático de Morris. Es la
prueba comúnmente utilizada para el estudio de la memoria espacial, En esta prueba se
evalúa el tiempo de latencia que emplea el animal en alcanzar la plataforma sumergida,
que representa un estímulo reforzante de escape. Si la plataforma permanece en el
mismo lugar, se evalúa la memoria espacial de referencia, y si varía, se analiza la
memoria espacial de trabajo (F. Navarrete a, J.M., 2008).esta prueba hubiera servido
para desarrollar el objetivo Premium de este estudio, pero, la naturaleza acuática del test,
causa un efecto de estrés en la rata que puede alterar el estado de sistema nervioso
desencadenando efectos adversos en la memoria (Olton, 1977). La memoria es el
proceso mediante el cual el organismo adquiere, retiene y recupera información relevante
acerca de su entorno y se fundamenta en cambios duraderos en el cerebro; se ha
demostrado que el estrés puede alterar los procesos de memoria en función de su
68
intensidad, duración y el momento en que ocurre. Otra limitante es la actividad natatoria
que principalmente caracteriza esta prueba. La particularidad del modelo animal que
representa la EP, es asimétrico, debido a que la lesión se realiza sobre uno de los
hemisferios del animal, con disfunciones motoras severas que dificultarían el análisis sin
sesgo de la actividad neta de los animales para llegar a la plataforma, puesto que la
variable reina de este test, es la latencia de escape. (Schallert et al., 2000; Metz et al.,
2004; Woodle et al., 2008). El modelo de hemiparkinsonismo en ratas se caracteriza por
acinesia en la extremidad anterior contralateral a la lesión demostrado a través del test
de los pasos y de la prueba de habilidades motoras de las extremidades anteriores
comúnmente conocido como “Prueba de la Escalera” (Whishaw et al., 1997; Johnston et
al., 1999; Stein, 2009). Adicionalmente las ratas no pueden usar con efectividad sus
extremidades contralaterales a la lesión para iniciar el movimiento, alternar el centro de
masa del cuerpo durante la locomoción o mantener el control postural (Schallert et al.,
2000; Metz et al., 2004; Woodle et al., 2008). Lo expuesto anteriormente nos permitió
realizar la selección del test de Barnes para realizarle las modificaciones convenientes
para convertirlo en un Test que mida el daño cognitivo, es una prueba que evitaráa que
los animales alcancen estados de estrés altos y el daño motor no sea una limitante para
realizar comparaciones entre los grupos Control y Lesionado.
Por otro lado, en el Test de Barnes la eficiencia de ejecución de la prueba por los sujetos
experimentales durante la adquisición debe mejorar progresivamente durante todo el
experimento aumentando la precisión para ingresar a la caja de escape. La latencia del
primer agujero, número de aciertos, distancia recorrida, el número de errores y latencia
de escape son las variables tenidas en cuenta para la medición del daño cognitivo-motor
causado por la 6-OHDA en Rata Wistar. Con la modificación realizada sobre el diseño
original en cual se eliminaron las pistas extralaberínticas y la bandera fue cambiada de
posición en cada ensayo (8 veces/día/animal) lo cual contribuye a la no utilización de la
memoria espacial hipocampal la cual es empleada por el animal para aprender y recordar
un lugar en un espacio definido por las señales visuales distales,( O'Keefe et al , 1975 ;
Morris et al, 1982. ; Sutherland et al, 1982; .Barnes, 1988; Poucet y Benhamou, 1997)
Numerosas teorías de la función del hipocampo han ido avanzado en los últimos
decenios, y un acuerdo general se ha llegado a que esta estructura juega un papel en la
69
memoria y sobre todo en la memoria espacial. Evidencias clínicas y experimentales
indican que múltiples áreas cerebrales intervienen en los procesos de memoria y
aprendizaje. Una de estas áreas, el hipocampo, es crucial para la adquisición de
memorias declarativas, particularmente para la adquisición de memorias espaciales
(Mishkin, 1978).
.Los animales perciben del espacio el esquema de información correspondiente a su
comportamiento espacial con el uso de dos tipos de información sensorial: las señales
externas suministradas por el medio ambiente y los estímulos internos suministrados por
sus propios movimientos. Existen numerosas estrategias de navegación que son base
de las señales internas ( ruta de integración o tigmotaxia ), las señales externas
(navegación taxón ) , o una combinación de ambos ( la navegación local) (O'Keefe y
Nadel , 1978 ; Gallistel , 1990 ; . Trullier et al, 1997) eliminando dichas pistas los animales
se ven forzados a: organizar el mapa de ejecución del movimiento donde el primer paso
es saber que la bandera conduce a la caja de escape (se explicó con anterioridad) y que
ella los alejara de la luz y hará que el ruido blanco cese, de esta manera podrán estar
tranquilos.
Con respecto a la latencia del primer agujero el grupo control mostró diferencia
significativa en el D1 y D2 de ejecución de la prueba, el grupo Sham no tuvo diferencias
significativas en los días de prueba y el grupo Lesionado presentó una diferencia
significativa entre el D1 y D3, lo que concuerda con lo planteado por Posner MI., 1995:
El sistema de cognición en general se compone de procesos de funcionalidad y de
aprendizaje y memoria. Entre los de funcionalidad, se incluyen, por una parte, procesos
de ‘preatención’, en los que se realiza el filtrado de la información sensoriomotora para
centrar la atención en los elementos más relevantes del entorno. El grupo Sham se
desenvolvió de manera similar aunque no presenta diferencia significativa pero tiene
una latencia de primer agujero con valores intermedios entre los grupo Control y grupo
Lesionado, el grupo Lesionado
tiene una latencia de primer agujero
alta y una
disminución de la latencia en el Dia3 de prueba, la presencia de lesión en GB a nivel de
SNpc hace que se vea disminuída la presencia de neuronas dopaminérgicas lo cual
causa el mal funcionamiento del circuito GB y se dificulté percibir la señal de la bandera.
70
Aunque el grupo Lesionado puede desempeñar la tarea, las latencias que registran sus
individuos son más altas infiriendo a la vez que su aprendizaje es lento con respecto al
grupo control y grupo Sham o el animal aprende pero se le dificulta el recordar como lo
hizo con anterioridad Pacientes con EP en general no se ven afectados en la codificación
y almacenamiento de nueva información consolidada , pero presentan dificultades en la
recuperación de esta información, especialmente cuando tienen que iniciar una tarea
recordando las estrategias (Dujardin &Laurent, 2003 ).; la comparación entre los grupos
por día no mostró diferencia significativa aunque se observó una media mayor en el
tiempo (segundos) del grupo lesionado con respecto al grupo Control y grupo Sham.
El número de aciertos varió con respecto a los grupos, el grupo control reveló diferencias
significativas en el D1 y D2 esto se debe a que el animal posee todas las facultades del
mapa de ejecución del movimiento (ver Figura 22 y 23): donde la facilidad selectiva
mediada por GB contribuye con la concentración para poder percibir la señal de la
bandera y así seleccionar la estrategia , permitiendo la programación del movimiento,
para ejecutar la tarea mediada por las neuronas eferentes periféricas que contribuyen
con el aprendizaje del movimiento y la vuelta cerrada de retroalimentación la cual
almacenará la información de la ejecución del movimiento permitiendo que en otras
ocasiones sea mucho más fácil realizarlo, por tal razón un animal sano realiza los
movimientos con mayor acierto.(McAuley, 2003). Por consiguiente el grupo Sham no
mostró diferencia significativa pero se comportó similar al grupo Control. Para el caso del
grupo Lesionado, la lesión con 6OHDA en la SNpc causa fallas en el funcionamiento de
la facilidad selectiva mediada por el circuito de GB. Todo el proceso del mapa de
ejecución del movimiento se ve alterado en la percepción, atención y energización del
movimiento lo cual hace que el grupo lesionado aprenda, pero el daño cognitivo hace
que no recuerde las habilidades motoras y ejecutivas necesarias para realizar la tarea
de escape. En otras palabras, el concepto de memoria de trabajo implica la integración
y mantenimiento de la información para su uso respectivo en la selección del
comportamiento adecuado. (Baddeley, 2003). Todo lo anterior se corrobora en la
comparación de los grupos por día de prueba donde el Grupo Lesionado presenta una
diferencia significativa en los D1 y D2 con respecto los Grupo Sham y Grupo Control,
pero en el Día 3 esta diferencia desaparece entre los grupos y por otra parte la curva
71
GHDSUHQGL]DMHSDUDORVJUXSRVPXHVWUDTXHORVWUHVJUXSRVH[SHULPHQWDOHVDSUHQGLHURQ
SHURHOJUXSR/HVLRQDGRORKL]RGHPDQHUDOHQWDHLQHILFLHQWHPLHQWUDVODYHORFLGDGGH
DSUHQGL]DMH GH ORV JUXSRV &RQWURO \ 6KDP IXH UiSLGD \ HILFLHQWH VH SXHGH REVHUYDU
DVLQWyWLDHQWUHHOJUXSROHVLRQDGRFRQUHVSHFWRDORVJUXSRV6KDP\&RQWURO9HUILJXUD
)LJXUD(VTXHPDGHRUJDQL]DFLyQPRWRUD
(VTXHPDGHRUJDQL]DFLyQPRWRUDGHVFULWRSRU0F$XOH\HOFXDOPXHVWUDORVJDQJOLRVEDVDOHVFRPR
IDFLOLWDGRUHVVHOHFWLYRVGHOSURFHVRGHFRQFHQWUDFLyQVHOHFFLyQGHODHVWUDWHJLD\HMHFXFLyQGHOPRYLPLHQWR
HQHOGHVHPSHxRGHXQDWDUHD
)XHQWH0F$XOH\
72
)LJXUD+LSRWHVLVHVTXHPDGHRUJDQL]DFLyQPRWRUDHQDXVHQFLD\SUHVHQFLDGH
GpILFLWGRSDPLQpUJLFR
+LSyWHVLVDXWRUGHOHVTXHPDGHRUJDQL]DFLyQPRWRUDFRQYtDGLUHFWDHLQGLUHFWDGHHMHFXFLyQGHO
PRYLPLHQWRODILJXUD$PXHVWUDHOFRPSRUWDPLHQWRQRUPDOGHXQVXMHWRVDQR\ODILJXUD%PXHVWUDXQ
VXMHWRFRQDIHFFLyQDQLYHOGH61SF
Comentado [F3]: FALTA LA FUENTE EN LAS FIGURAS
73
La distancia recorrida es una variable difícil de interpretar, con respecto a la evaluación
intergrupal de los resultados obtenidos, ya que ninguno de ellos presentó diferencia
significativa pero los animales del grupo control tenían una tendencia inversamente
proporcional a disminuir la distancia recorrida a medida que aumentaban los días de
prueba, en cuanto al grupo Sham se tiende a disminuir la distancia recorrida el D2 al
igual que el grupo lesionado, aclarando que los animales lesionados por lo general
poseen problemas motores severos y se quedan inmóviles lo cual hace que recorran
menos distancia. Para el caso de la comparación de los grupos por día de prueba, se
observa en el D1 diferencia significativa entre el grupo Lesionado y los grupos Control y
Sham, en el cual el grupo Lesionado realizó un recorrido menor sobre la plataforma, la
lesión a nivel GB está interfiriendo con la organización del mapa de ejecución del
movimiento interfiriendo en la secuencia en que se desempeña la tarea. La capacidad
de realizar una tarea exige la actividad coordinada de grupos musculares de diferentes
partes del cuerpo, la integración contínua de la información sobre el estado de
contracción muscular y el seguimiento visual del movimiento con el fin de hacer un ajuste
adecuado de los movimientos. Los hábitos de aprendizaje consisten en aumentar la
probabilidad de que un estímulo sensorial desencadena un programa de motor diseñado
para una respuesta de comportamiento en particular ( Blanco & McDonald 2002 ) .; para
el D2 no hay diferencias significativas entre los grupos ya que los animales de los grupos
Control y Sham aprendieron y ejecutaron la prueba con un menor recorrido en cm sobre
la plataforma y para el D3 el grupo Sham presentó diferencia significativa con respecto
a los grupos Lesionado y Control ,ya que el grupo Control aprendió de tal manera que
para encontrar la caja de escape no debía recorrer toda la plataforma, solo corregía su
dirección de arranque hacia la bandera y se dirigiría a ella en línea recta de esta manera
se podía comparar con el grupo lesionado que simplemente se quedaba inmóvil o la
confusión lo hacía girar o alcanzar un agujero errado en donde esperaba sin moverse
con la cabeza retraída, hasta pasar los 60 segundos que dura la prueba. Esto hizo que
las distancias en cm se parecieran entre los grupos.
En cuanto al número de errores, los grupos Control y Sham muestran una diferencia
significativa entre los D1 y D3 lo cual indica que estos grupos aumentan el número de
errores por día de prueba porque a medida que avanzan las pruebas se familiarizan y se
74
comportan de manera más exploratoria pueden ir directamente a un agujero y hacer
contacto con los siguientes hasta encontrar el agujero con la caja de escape a diferencia
del grupo lesionado que no muestra diferencia significativa por lo que no explora ; la
comparación de los días entre los grupos no mostró diferencia significativa pero se pudo
ver una tendencia del el grupo lesionado a cometer menos errores ya que por lo general
estos animales se quedan inmóviles al no poder organizar el mapa de ejecución del
movimiento. Por otra parte, el número de errores no arroja un resultado sobre el estado
cognitivo del animal, ya que el grupo Control y el grupo Sham pueden cometer mayor
cantidad de errores realizando la tarea de escape y el grupo Lesionado cometer menos
cantidad de errores sin cumplir la tarea de escape como lo mencionó en su estudio
O’Leary et al, 2010: La medida de error es engañosa en este caso, ya que no puede
diferenciar un ratón que hace 3 errores y entra en el agujero de escape, de un ratón que
comete 3 errores y nunca entra en el orificio de escape. Por lo tanto, la latencia para
entrar en el hueco de escape es una medida más precisa del rendimiento para
129S1/SvImJ y las cepas A / J que el número de errores cometidos en el laberinto de
Barnes.
Latencia de escape se observa el grupo Control y el grupo Lesionado presentan una
diferencia muy significativa de D1 con los D2 y D3. El grupo Sham no mostró diferencia
significativa en los días pero mostró una tendencia a la diferenciación. Los tiempos de
ejecución varían, el grupo Control es muy rápido con respecto al grupo lesionado pero la
disminución de los tiempos en los días es inversamente proporcional (entre más ensayos
realiza el tiempo de latencia es menor) esta variable es de analizarse minuciosamente
ya que el grupo Lesionado posee deficiencias motoras que limitan o impiden el
desempeño en la ejecución de la prueba y los grupos no se encontrarían en igualdad
de condiciones que puedan evidenciar unos resultados robustos para esta variable ,la
facilitación selectiva se ve afectada en la energización de la ejecución del movimiento (
ver Figura 23) .Debido a la falla que se presenta en la función motora a causa de la
lesión con 6-OHDA, Como lo expresan Lúe L.F., et al. 1999 y Martínez Lage J., Martínez
Lage P. y Moya. 2001: “El déficit dopaminérgico provoca una serie de modificaciones en
los procesos de excitación-inhibición de los ganglios basales que producen un aumento
excesivo en la actividad del núcleo subtalámico (NST) y su proyección glutamatérgica
75
excitadora, principalmente al globo pálido externo, globo pálido interno, Sustancia negra
pars reticulata y sustancia negra pars compacta. La hiperactividad del núcleo
subtalámico y el consecuente aumento en la actividad inhibitoria eferente desde el globo
pálido interno y sustancia negra reticulata, que provoca una hipoactividad de las
proyecciones motoras tálamo-cortical y del tronco encefálico, es la característica
fisiopatológica principal del estado parkinsoniano. Lo cual infiere que un déficit motor
marcado tiene efecto en el grupo Lesionado.
En el siguiente orden de ideas se plantea la siguiente hipótesis: La disfunción ejecutiva
se produce por la dificultad de percibir, procesar, discriminar y actuar con respecto a la
información del entorno. La interacción entre los sentidos y el uso de ellos en PD dificulta
la recepción de estímulos externos, el que posea los sentidos intactos no significa que
se tenga la facilidad de discriminar, para lograrlo, se necesita realizar acciones
sincronizadas con el fin de interpretar las señales del medio en el que se encuentra; el
movimiento está directamente relacionado con la percepción, la anterior es la parte inicial
del proceso aprendizaje por lo cual la afección de esta influye en que un enfermo de PD
no pueda iniciar el proceso cognitivo de manera fluida.(ver figura 23) Como lo dicho por
McAuley, 2003 los déficits motores de la EP indican claramente el papel de
los
ganglios
basales
en
la
ejecución
del
movimiento,
así
como
en el nivel más alto de percepción y los procesos de toma de decisiones y lo dicho por
Etchepareborda y Abad-Mas, 2005 ,la afectación de los mecanismos básicos propios de
la memoria de trabajo provocará una disfunción que influirá en un sin número de
procesos de aprendizaje formal académico: dificultad en el manejo de la dirección de la
atención, dificultad en inhibir estímulos irrelevantes, dificultad en el reconocimiento de
los patrones de prioridad, falta de reconocimiento de las jerarquías y significado de los
estímulos (análisis y síntesis),impedimento en formular una intención, dificultad en
reconocer y seleccionar las metas adecuadas para la resolución de un problema;
imposibilidad de establecer un plan de consecución de logros, falta de análisis sobre las
actividades necesarias para la consecución de un fin y dificultades para la ejecución de
un plan, no logrando la monitorización ni la posible modificación de la tarea según lo
planificado y por otra parte Blanco y McDonald 2002 mencionan que el Hábito de
aprendizaje consiste en aumentar la probabilidad de que un estímulo sensorial
76
desencadena un programa motor diseñado para una respuesta de comportamiento en
particular, al encontrarse alterado el sistema sensorial se hace difícil ejecutar la tarea
memorizada con anterioridad. Por lo cual el Test de Barnes modificado permite evaluar
los síntomas de disfunción cognitiva presentes en la enfermedad de Parkinson en sus
estadios avanzados, es sensible a los síntomas de falta de percepción, procesamiento y
discriminación, ya que su base se fundamenta en el mapa de ejecución del movimiento
para el desempeño de una tarea aprendida con anterioridad.
77
6 CONCLUSIONES
El modelo de 6-OHDA implementado en este trabajo es efectivo para semejar un
deterioro cognitivo en la EP en su etapa más avanzada, por su porcentaje de
degeneración a nivel SNpc, disminución de aproximadamente el 90% de la población
celular de la zona.
Los resultados obtenidos a través de la evaluación de la conducta rotacional inducida por
apomorfina realizada al mes de ser inducida la lesión; los animales sanos presentaron
un comportamiento estereotipado de vaivén, luego de la inyección del agonista
dopaminérgico directo, esta conducta es normal en animales sanos (sin asimetría) en los
niveles de dopamina estriatal.
Mediante el análisis histológico con tinción de Nills, se pudo comparar entre los grupos
control y el lesionado, la degeneración de las estructuras involucradas en la lesión con
6OHDA; una disfunción motora y un deterioro cognitivo mostrados por el estudio
conductual. Desde esta perspectiva es posible plantear que este modelo se asemeja a
la enfermedad humana y permite evaluar estrategias de tratamiento protectoras y
restaurativas.
El test neurológico mostró diferencias en los porcentajes de ejecución por cada prueba
entre los grupos. Los individuos de los grupos control y Sham tuvieron un éxito del 100%
de ejecución en las pruebas lo que indica que las condiciones sensoriomotoras de los
animales son aptas, en el grupo Lesionado los porcentajes de éxito no superaron el 56%,
es apropiado decir que debido a la lesión con 6OHDA, los animales mostraron fallas en
la ejecución de movimientos con una tendencia mayor en las extremidades izquierdas y
en el tren posterior.
78
El Pole Test permitió evidenciar diferencia entre los grupos control y Sham con respecto
al lesionado, los animales del grupo lesionado mostraban serias disfunciones motoras,
el lado del cuerpo contralateral a la lesión con 6OHDA fue el más afectado. Los animales
presentaban dificultad o simplemente no corregían posición, extremidades izquierdas
retraídas y el uso de la cola era limitado lo cual no permitía que el animal pudiese tener
un buen agarre para descender de la barra y lograr su objetivo de escape.
El Test de Barnes modificado es un test sensible para la evaluación del deterioro
causado por la EP y evidente en el deterioro del esquema de organización motora
(McAuley, 2003) el cual posiciona a los ganglios basales como fuente de facilitación
selectiva de la concentración, atención y energizante del circuito de realización de una
tarea, haciendo referencia a la medición del daño cognitivo en Ratas Wistar
hemiparkinsonizadas.
La disfunción ejecutiva se ve alterada por la dificultad al percibir, procesar, discriminar y
actuar con respecto a la información del entorno, la interacción entre los sentidos y el
uso de ellos en PD dificulta la recepción de estímulos externos, el que se posea los
sentido no significa que se tenga la facilidad de discriminar.
79
7. RECOMENDACIONES
Es necesario integrar un estudio completo de la función cognitiva a través de la utilización
de una batería de pruebas comportamentales como la desarrollada en el estudio
realizado anteriormente, ya que la integración de diversas pruebas en un estudio daría
más sensibilidad y una posición clara sobre el deterioro cognitivo. Además es un tema
de interés científico, ya que no ha sido ampliamente estudiado en los modelos de
Enfermedad de Parkinson.
80
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2. Organización funcional de los ganglios basales Capítulo 3. Semiología y
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101
ANEXOS
102
Anexo A. MANTENIMIENTO DE UNA COLONIA DE RATAS EN EL BIOTERIO DE
EXPERIMENTACIÓN ANIMAL DE LA UNIVERSIDAD DEL TOLIMA - PNT
OBJETIVO
Garantizar el bienestar de los animales mediante el desarrollo de las actividades de
mantenimiento de la colonia de ratas en el BE-UT que aseguren el bienestar animal
(cumplimiento de las 3Rs), la calidad genética e higiénico-sanitarias estatus convencional
y el macroambiente de un bioterio convencional de producción, mantenimiento y
experimentación de pequeños roedores de la Universidad del Tolima.
CONDICIONES DE SEGURIDAD
Es necesario llevar ropa cómoda y portar los elementos básicos de seguridad como
bata, gorro y polainas o zapatos de laboratorio. El uso de guantes de látex puede ser
restringido a la manipulación de tipo experimental ya que este material causa malestar
al animal al contacto con su pelaje.
No usar perfumes, lociones, cremas o cualquier sustancia que tenga olor fuerte, debido
a que estos olores afectan el microambiente de las colonias.
El cambio de camas debe ser realizado por una sola persona con el fin de garantizar un
control zootécnico verídico y permitir un seguimiento constante de las colonias que se
tienen en el bioterio, así como disminuir al máximo el estrés de los animales. Se
recomienda que la manipulación sea mínima ya que esta causa estrés en el animal y
puede llegar a alterar los resultados experimentales y la salud de las colonias
103
EQUIPAMIENTO, LOCALES, MATERIALES Y REACTIVOS

Cajas

Cisco estéril

Solución de hipoclorito

Detergente

Toallas

Escoba

Baldes

Traperos
OPERACIONES PRELIMINARES
Cerciorarse que el extractor esté funcionando correctamente y que los accesos a
diferentes áreas estén abiertos para que los recambios de aire sean completos, los
únicos accesos que deben estar cerrados son el transfer hacia quirófano y la puerta de
acceso al laboratorio de conducta.
La preparación del agua y la esterilización del cisco previamente garantizan que su
tiempo en el bioterio va a ser solo el necesario y al realizar estas actividades
simultáneamente ganara tiempo y eficiencia en el proceso.
PROCEDIMIENTO
1. Se hace un escaneo general de la sala de mantenimiento para detectar, por ejemplo
animales fuera de sus jaulas o cualquier anomalía en dicho recinto.
2. Se sigue al área de lavado en donde se deben servir las cajas de cambio con el
material de cama estéril (cisco de arroz) en medidas que se han especificado de acuerdo
a las condiciones del bioterio, se deben servir en este lugar debido a que el cisco genera
partículas pequeñas que pueden provocar enfermedades respiratorias y dérmicas en los
animales.
104
3. Las cajas servidas con el cisco estéril se llevan a la sala de mantenimiento y se
comienza con el cambio de camas. Se ubican las cajas de cada entrepaño de los
estantes de mantenimiento en la mesa de cambio.
4. Se limpia la superficie y esquinas del entrepaño con solución limpiadora (aún los
entrepaños donde no hay animales).
5. Se abre la caja que contiene los animales, con el cuidado mantenerlos dentro de la
caja para evitar fugas, así mismo estar atentos para evitar accidentes que incluyan
mordeduras o rasguños.
6. Suavemente sujetar al animal por el tronco y pasarlo a la caja donde se encuentra el
cisco limpio.
7. Se ajusta la tapa y se acomoda nuevamente en su estante. Es necesario en este paso
verificar la información de las fichas de mantenimiento como número de individuos y sexo
y en caso del banco genético número de crías, fecha de nacimiento y destete, así como
observaciones adicionales como aspecto del individuo y si presenta alguna alteración de
cualquier tipo.
8. Se limpia la tapa, la botella y se verifica el agua de bebida (si se llena o se cambia).
9. El proceso se repite con cada caja e individuo de las colonias
10. Una vez terminado el cambio las cajas sucias se llevan a la zona de lavado.
11. Se barren TODAS las áreas del bioterio, se limpian TODAS las superficies, se
eliminan telarañas se mueven los estantes del área de mantenimiento y del banco
genético, se limpia las mesas de cambio y se trapea con solución limpiadora dos veces.
105
12. Se cierran los accesos y el trabajo se concentra en el área de lavado.
13. Con guantes domésticos se retira el cisco de todas las cajas y se deposita en la
caneca de riesgo biológico.
14. Se procede al lavado de cajas.
15. Terminado este proceso se debe barrer y trapear el área de lavado, así como limpiar
las superficies de los mesones que se ubican en esta área.
16. En este momento se pueden llenar los teteros que se necesitan y ubicarlos en las
cajas.
17. El cisco que se ha estado esterilizando se almacena en el recipiente destinado para
tal fin.
18. Las bolsas rojas con el cisco sucio que resultan del cambio se deben sacar del
Bioterio antes de las 10:30 am, deben ser debidamente marcadas con la procedencia y
la fecha para que puedan ser llevadas hasta el cuarto frío por
el operario de la
Universidad y posteriormente sean recogidas por la empresa encargada de su
incineración.
19. Si los chupos de los teteros están en mal estado es necesario cambiarlos y/o
fabricarlos en caso de que no hayan.
CÁLCULO E INTERPRETACIÓN DE LOS RESULTADOS
106
El Jefe del Bioterio de Experimentación Animal de la Universidad del Tolima, evaluará la
ejecución del protocolo, aprobando, corrigiendo y tomando las medidas correctivas
necesarias de acuerdo con la condiciones del bioterio.
CONTROL
El aseo permanente del laboratorio, el bueno estado higiénico – sanitario y la calidad
genética del estatus convencional de los animales son la garantía de buenas prácticas
en el mantenimiento de la colonia.
REQUISITOS DE DOCUMENTACIÓN
Para la producción y mantenimiento de pequeños roedores en un bioterio, es necesario
primero conocer la biología, genética y fisiología del animal, mantener un micro y
macroambiente adecuado, que garanticen la calidad del reactivo biológico, que consiste
en:

Un estatus genético acorde con los intereses de los estudios, para lo que es
necesario utilizar sistemas de cruzamiento isogénicos o no isogénicos según
correspondan con las líneas o colonias que se mantienen.

El estatus higiénico-sanitario esperado, que aseguren la no presencia de
gérmenes patógenos o zoonóticos que interfieran en los resultados de
experimentos o proyectos de investigación o que afecten el bienestar de
animales, cuidadores e investigadores.

Estatus de bienestar animal que asegure la calidad de los reactivos biológicos,
que debe ser inversamente proporcional con los niveles de estrés.

Control zootécnico de la colonia que nos permitirá entrelazar los diferentes
estatus y comprobar el estado real del Banco genético, banco de expansión y
experimentación.
107
A continuación se describen cuáles son las actividades que deben realizar para
asegurar estos tres estatus.
El bioterio de experimentación de la UT tiene un área de, divido en las siguientes áreas:
1. Almacén de alimento y encamado
2. Sala de mantenimiento del Banco genético y banco de expansión
3. Área de Lavado y esterilización.
4. Sala de mantenimiento de animales de Experimentación.
El tamaño de las jaulas elegidas debe ser apropiado para cada especie mantenida. Las
jaulas no deben permitir solamente alojar los animales de una manera segura, sino
también asegurar su comodidad y seguridad, permitiendo ajustes de postura y de
comportamiento normales, y por contribuir al enriquecimiento ambiental. Las jaulas
deben ser adecuadamente ventiladas, permitir un campo visual satisfactorio y un acceso
fácil a los animales. Los sistemas de bebederos y de distribución de alimentos deben ser
planificados y ubicados para permitir su acceso fácil, sin que se contaminen con
excrementos. El diseño de las jaulas debe facilitar su limpieza y desinfección.
Tipo de caja y cantidad de animales que se pueden alojar
La cama de las jaulas de los animales deberá ser de un material no tóxico, absorbente,
pero que no provoque la deshidratación de los neonatos, entre los materiales que se
pueden usar como encamando para pequeños roedores tenemos: viruta de madera
(pino), bagazo de azúcar (desmollado y presecado) cisco de arroz, todos los materiales
para encamado deben ser seleccionados, que están libres de otras sustancias y
contaminantes y deben ser esterilizados por calor húmedo (121º C o 1,5 at, durante 30
minutos o sistema de irradiación).
La cama debe ser cambiada tan frecuentemente como sea necesario para mantener los
animales limpios, secos, y relativamente sin mal olor, y para mantener el nivel de
amoníaco en las jaulas en niveles aceptables. En ratas, este nivel es de 25 ppm y para
los animales menores de laboratorio, se debe cambiar la cama de las jaulas de una a
tres veces por semana según variables tales como el tamaño de los animales, la
densidad de la población, el tipo de jaula y el grado de producción de excrementos.
108
De la misma forma deberán ser tratadas y cambiada el agua de bebida y los materiales
que tengan contacto con los animales.
REFERENCIAS/DOCUMENTOS APLICABLES
Bonilla A., Bonilla L. 2006. Ciencia del animal de laboratorio: El primer peldaño hacia la
neurociencia y la experimentación animal.
109
Anexo B. INYECCIÓN INTRAPERITONEAL (IP)
OBJETIVO
Descripción general del proceso de aplicación de sustancias vía intraperitoneal en ratas
Wistar, con un manejo adecuado de los animales.
CONDICIONES DE SEGURIDAD

Uso de bata, polainas y gorro

De ser necesario, usar de guantes para la manipulación del animal

Utilizar una aguja diferente por cada animal que se inyecta

Eliminar los elementos corto punzantes en un guardián

Evitar los pinchazos en la piel del investigador
EQUIPAMIENTO, LOCALES, MATERIALES Y REACTIVOS

Animal de experimentación

Jeringa y Aguja

Sustancia a Inocular
OPERACIONES PRELIMINARES

Limpiar el área de trabajo

Preparar la solución a inocular y tenerla preferiblemente a temperatura corporal
o ambiente

Tener al alcance de la mano todos los elementos a utilizar
PROCEDIMIENTO
1. La jaula debe ser abierta con cuidado evitando incomodar los animales
110
2. Permitir que el animal se habitúe a la presencia del investigador
3. Tomar el animal cuidadosamente de la base de la cola y sacarlo de la jaula
4. Sujetar con firmeza el animal desde detrás, rodeando debajo de las patas delanteras
con los dedos índices y pulgar evitando apretar el cuerpo, los demás dedos se usan de
sujeción. Asegura una de sus patas traseras con la cola para facilitar la inyección.
5. Se divide imaginariamente la cavidad abdominal en cuatro secciones, aplicando la
inyección en las regiones posteriores, inclinando el animal hacia el cráneo, introduciendo
la aguja en ángulo de 35° aproximadamente para no tocar las vísceras.
6. Aplicar la solución y retirar cuidadosamente la aguja
7. Regresar el animal a su jaula
8. Desechar la aguja
CÁLCULO E INTERPRETACIÓN DE LOS RESULTADOS
El animal debe quedar en perfectas condiciones inmediatamente después del
procedimiento. Dependiendo de qué tipo de solución se aplica en el animal, su efecto se
verá posteriormente.
CONTROL
Cuando se ve el efecto de la solución aplicada puede comprobarse la correcta aplicación
de la inyección. Cualquier otra anomalía, paro cardíaco, peritonitis u otra reacción
adversa, puede deberse a una mala aplicación.
REQUISITOS DE DOCUMENTACIÓN
En la manipulación, cuando el animal es pequeño se permitir que se agarre de la tapa
de la jaula sujetando bien su cola con una mano para poder sujetar la piel suelta de la
nuca con los dedos índice y pulgar de la otra mano, se debe procurar hacer esto en un
111
solo movimiento rápido. Una vez sujetado firme pero sin apretar demasiado, el animal
puede sujetarse sobre la palma de la mano con los dedos restantes.
REFERENCIAS/DOCUMENTOS APLICABLES
Centro de Investigación, Hospital General Universitario de Valencia. (1990). Anestesia
en el animal de laboratorio. Roedores. Research in surgery. Recuperado de:
http://www.oc.lm.ehu.es/Fundamentos/Doctorado/cursos/CirExp/015.pdf
Muñoz, J.,
Saldivar, S., Maldonado, C., Muñoz, C., & Moreno, M. (2010). La habilidad para sujetar
y manejar animales de laboratorio no se adquiere fácilmente. Revista electrónica de
Veterinaria.
12
(5B),
1695
-
7504.
http://www.veterinaria.org/revistas/redvet/n050511B/051116.pdf.
112
Recuperado
de:
Anexo C. Lesión con 6OHDA en sustancia nigra pars compacta
OBJETIVO
Realizar la aplicación Intracerebroventricular de 6OHDA mediante cirugía
estereotáxica, permitiendo acceder directamente al cerebro evitando la barrera
hematoencefálica.
CONDICIONES DE SEGURIDAD

Uso de bata, polainas y gorro

Mantener el área de trabajo limpia

Tener precaución con los elementos corto punzantes que se utilizan

Dejar al alcance de la mano todos los elementos a utilizar

Permitir una buena iluminación del área de trabajo
EQUIPAMIENTO, LOCALES, MATERIALES Y REACTIVOS

Estereotáxico

Lámpara

Fresa

Material quirúrgico (Bisturí, pinzas, tijeras, etc)

Jeringa Hamilton

Jeringa de Insulina

Solución a Inyectar

Thimerosal

Peróxido de Hidrógeno

Anestésicos

Gasa
113

Aguja de sutura

Hilo de sutura

Marcador

Solución salina
OPERACIONES PRELIMINARES

Definir las coordenadas de trabajo. Éstas medidas se establecen con un Atlas
de coordenadas esterotáxicas para rata, por ser una inyección bilateral en
ventrículo las medidas son: Antero-Posterior (AP): -4,4, Medio Lateral (ML): +1,2
y Dorso Ventral (DV): -7.8. Se debe tener en cuenta las conversiones para que
las unidades del Atlas y el Aparato Estereotáxico sean las mismas.

Preparar la solución a inyectar.

Preparar la mesa de cirugía con el montaje del aparato estereotáxico con la
aguja Hamilton, la fresa, y una lámpara
PROCEDIMIENTO
1. Anestesiar el animal mediante la aplicación intraperitoneal de Ketamina y Xilacina en
las proporciones requeridas para el peso del animal
2. Esperar que el animal este completamente dormido, verificando la ausencia de
respuesta a estímulos externos o ausencia de reflejos (pellizcar pata, la nariz, tirar de las
vibrisas, ausencia de reflejo corneal y palpebral, etc), ritmo respiratorio regular y relajado,
sin apnea respiratoria
3. Cortar al rape el pelo del animal sobre la zona en que se va a realizar la cirugía
4. Posicionar el animal en el estreotáxico ajustando bien el cráneo en las estructuras del
oído y los dientes en la parte anterior del aparato
114
5. Esterilizar la zona en la que se realiza la disección con Timerosal
6. Realizar la disección del animal desde la parte anterior de la cabeza, cuidando de no
acercarse mucho a los ojos hasta la parte posterior del cráneo, pretendiendo abarcar
desde bregma hasta lambda
Figura 1. Esquema del cráneo de rata
Fuente: Murcia, E. 2010
7. Limpiar el área de disección con Peróxido de Hidrógeno para facilitar la visibilidad
8. Colocar la aguja Hamilton sobre el bregma y tomar las coordenadas Antero posterior
y Medio Lateral que marca el aparato para este animal
9. Sumar las coordenadas de trabajo a las coordenadas del aparato y se obtienen las
coordenadas reales, son éstas últimas las que se deben ajustar en el estereotáxico para
realizar la cirugía
10. se marca el punto en que se realizará la inyección
115
11. Realizar trepanado al cráneo para acceder al cerebro del animal. Los trépanos deben
realizarse cuidadosa y precisamente para no dañar el cerebro, pero acertando
correctamente al lugar en que se realiza la inyección
12. Ubicar la punta de la aguja justo sobre el cerebro y tomar la coordenada Dorso ventral
del aparato
13. Sumar la coordenada de trabajo a la coordenada del aparato para obtener la
coordenada dorso ventral real
14. Cargar la jeringa con 3μl de 6OHDA
15. Inyectar el animal hasta la coordenada real, se debe ser muy cuidadoso en no pasar
de esta medida
16. Aplicar lentamente la 6OHDA y en ausencia de luz ya que la toxina es fotosensible ,
la aplicación completa del 6OHDA debe durar alrededor de 5 minutos, esto permite a la
solución implantarse en el tejido
17. Dejar la aguja insertada unos minutos más para evitar que la solución de 6OHDA
ascienda al sacarla
18. Sacar lentamente la aguja para evitar que la toxina suba por capilaridad
19. Suturar la herida
20. Desinfectar con timerosal la sutura
21. Desmontar el animal del estereotáxico
116
22. Colocar el animal cuidadosamente de regreso a su caja y vigilar su recuperación
CÁLCULO E INTERPRETACIÓN DE LOS RESULTADOS
El éxito del procedimiento se puede ver posteriormente con el revelado del marcaje.
Posterior a la cirugía, el animal debe recuperarse del procedimiento.
REQUISITOS DE DOCUMENTACIÓN
Para una mejor preservación de la 6OHDA, ésta debe ser mantenido a -20°C, por lo que
se recomienda sacarlo de congelación solo unos minutos antes de la aplicación en la
rata, teniendo el tiempo suficiente para que se descongele y quede a temperatura
corporal justo antes de su inyección.
REFERENCIAS/DOCUMENTOS APLICABLES
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117
Anexo D. PERFUSIÓN DE TEJIDO CEREBRAL
OBJETIVO
Fijación del tejido cerebral con Paraformaldehído a través de la perfusión.
CONDICIONES DE SEGURIDAD

Uso de guantes quirúrgicos, gorro, tapabocas y gafas

Realizar procedimiento en Campana de extracción
EQUIPAMIENTO, LOCALES, MATERIALES Y REACTIVOS

Anestésicos (Ketamina/Xilacina, Pentobarbital, etc)

Solución Salina

Solución de fijado (Paraformaldehído 4%)

Agujas

Jeringas

Equipo de disección

Guillotina

Superficie de apoyo para el animal

Sistema de Perfusión
OPERACIONES PRELIMINARES
Preparar la solución de fijado, Paraformaldehído al 4% que para un litro consta de:

750ml de agua desionizada
118

250ml de PB 0.4M

40gr de Paraformaldehído
Para preparar el Paraformaldehído se debe calentar 400 de agua desionizada a 65°C,
adicionar lentamente el paraformaldehído y agitar permanentemente hasta que se
disuelva completamente. Posteriormente se adicionan 250ml de PB 0.4M al
paraformaldehído y completa el volumen con el agua desionizada.
PROCEDIMIENTO
1. Anestesiar de acuerdo a las proporciones requeridas para el peso del animal
2. Esperar que el animal este completamente dormido, verificando la ausencia de
respuesta a estímulos externos o ausencia de reflejos (pellizcar pata, la nariz, tirar de
las vibrisas, ausencia de reflejo corneal y palpebral, etc), ritmo respiratorio regular y
relajado, sin apnea respiratoria
3. Colocar el animal en posición decúbito supino sobre una superficie adecuada para la
recolección de los tejidos de lavado y fijación, se debe sujetar el animal con cinta en sus
patas para garantizar que este no se mueva durante el procedimiento
4. Realizar un corte en la parte superior del abdomen, en su esternón, separa la piel y
cortar las costillas en paralelo hasta exponer el corazón y los pulmones
5. Insertar la aguja del sistema de perfusión por el ventrículo izquierdo y llegar hasta
alcanzar la aorta ajustando la aguja a este nivel
119
FIGURA 1. Inserción de la aguja en el corazón de la rata
Fuente: Ministerio de Ciencia e Innovación. 2012
6. Hacer una incisión en la aurícula derecha que permita la salida de la circulación
7. Comenzar a circular la solución de lavado a una velocidad moderada, agregando
200ml de solución salina de a 50ml por vez
8. Circular la solución de fijado que debe estar a temperatura ambiente. Se agregan
150ml de solución (aunque esta cantidad puede variar dependiendo del tamaño del
animal). Cuando el Paraformaldehído entra en el animal, usualmente sufre una serie de
contracciones musculares que es un indicativo de una correcta fijación
9. Retirar la aguja del animal y extraer el cerebro separando inicialmente la cabeza con
la guillotina y posteriormente separando el tejido cuidadosamente para no dañar el
cerebro
10. Los cerebros se almacenan en recipientes con paraformaldehído, por separado y
debidamente marcados.
11. Los cerebros permanecen hasta un día en paraformaldehído, después de esto son
lavados 3 veces en PB al 0.1% por 5 minutos y posteriormente puede ser almacenados
en PB para su uso.
120
CÁLCULO E INTERPRETACIÓN DE LOS RESULTADOS
Cuando el procedimiento se realizó adecuadamente el animal no expulsa líquidos por la
nariz, el cuerpo del animal sufre de contracciones musculares y toma dureza durante la
aplicación de la solución fijadora, finalmente al extraer el cerebro, este debe tener una
consistencia dura y sin rastro de sangre, de otra forma se dificulta la preservación y
manipulación del tejido.
REQUISITOS DE DOCUMENTACIÓN
Para una preservación prolongada de los cerebros deben almacenarse en
criopreservante a -20°C.
Para criopreservar los cerebros, deben someterse a gradientes de sacarosa al 7, 15 y
30% por un día cada uno o hasta que se precipite el cerebro, posteriormente se
sumergen en un criopreservante que consta de:

200ml de PB 0.4M

300ml de Etilenglicol

300ml de Glicerol

150ml de Agua destilada
REFERENCIAS/DOCUMENTOS APLICABLES
Ministerio de Ciencia e Innovación. (2012). Técnicas de obtención e inoculación de
muestras. Consejo superior de investigaciones científicas. Centro Nacional de
Biotecnología.
Universidad
Autónoma
de
www.cnb.csic.es/.../CEEA/CEEA_Tecnicas61_2.doc
121
Madrid.
Recuperado
de:
Anexo E Normalización de la preparación y uso de 6OHDA
OBJETIVO
Normar la metodología de la preparación y el uso de la 6-hidroxidopamina(Sigma,
Chemical Co. USA, H-4381);(Neurotoxina utilizada para inducir un síndrome
parkinsoniano en roedores).
CONDICIONES DE SEGURIDAD

Uso de guantes quirúrgicos, gorro, tapabocas y gafas

Realizar procedimiento en Campana de extracción

Lavado de materiales al finalizar con agua destilada
EQUIPAMIENTO, LOCALES, MATERIALES Y REACTIVOS

Balanza analítica

Volumetrico 5ml

Pipetas 1 ml, 875µl y 40µl

Viales eppendorf

Acido ascórbico

Solución salina 0.9%

6-hidroxidopamina(Sigma, Chemical Co. USA, H-4381)

1.3 mg acido ascorbico
OPERACIONES PRELIMINARES
122
Conservar a -20ºC el producto procedente de la firma Sigma, Chemical Co. USA, H4381 en el momento en que se recibe. Acotar su entrada en el file de control de
productos almacenados en el refrigerador de -20 ºC.
PROCEDIMIENTO
1. Tomar el frasco con 6-OHDA del refrigerador -20ºC y dar baja a la cantidad que
se pesará distribuyéndose en soluciones alicuotadas en una gradilla con tubos
Eppendorf.
2. Pesar en balanza analítica 1 mg de Ácido ascórbico.
3. Enrasara a 5 ml con solución salina en un volumétrico.
4. Pesar 0.5 mg de 6-OHDA en la balanza analítica. Registrar el empleo del equipo
en el registro correspondiente.
5. Completar hasta 1.875ml con la solución salina de ácido ascórbico
6. Pipetear alícuotas de 40µl por vial. Cada vial debe estar protegido con papel
metálico para evitar la descomposición de la sustancia por la iluminación
7. Conservar en el refrigerador a -20ºC el frasco de 6OHDA, acotar la entrada y
almacenamiento de este producto al refrigerador.
8. Descontar cada vez se utilice un vial de solución.
9. Inyectar estereotáxicamente en cada animal, según los pasos normados, un
volumen de 3 µl, que contienen según la preparación 8µg de 6OHDA.
CONTROLES
Comprobar por parte del técnico del grupo de trastornos del movimiento que la
preparación de esta sustancia sigue estrictamente los pasos normados en este
PNT, lo cual es muy importante para el éxito de la lesión. Antes de utilizar un vial
de esta disolución chequear cuidadosamente la coloración del mismo.
REFERENCIAS
Comunicación personal con Brundi P.
123
Anexo E Protocolo para la preparación y tinción de Nills
OBJETIVO
Normar la metodología de la preparación y el uso de la tinción de Nills para la
coloración de cuerpos celulares.
CONDICIONES DE SEGURIDAD

Uso de guantes quirúrgicos, gorro, tapabocas y gafas

Realizar procedimiento en Campana de extracción

Lavado de materiales al finalizar con agua destilada
EQUIPAMIENTO, LOCALES, MATERIALES Y REACTIVOS

Azul de toluidina 1g en 100ml de alcohol al 70%

Cloruro de sodio al 1%

Medidor de pH

HCl
OPERACIONES PRELIMINARES

Preparación de la solución Stock 1g de de Azul de Toluidina en 100ml de alcohol
al 70%.
124

Preparación solución de trabajo de Azul de Toluidina 10ml de solución stock +
40 ml de cloruro de sodio.
PROCEDIMIENTO
Tinción.
1. Sumergir los cortes en la solución de trabajo de Azul de Toluidina durante 17
minutos
2. Lavar con H2O desionizada por 3 veces ( inmersión )
3. Deshidratar rápidamente

Alcohol 95% por 2 minutos (1 vez)

Etanol 100% por 2 minutos ( 2 veces)
4. Aclaramiento con Xileno 3 minutos (2 veces)
5. Cubrir con medio para montaje
REFERENCIAS
Protocolo modificado
125
Anexo F. Protocolo Test Neurologico y Pole Test
OBJETIVO
CONDICIONES DE SEGURIDAD
EQUIPAMIENTO, LOCALES, MATERIALES Y REACTIVOS

Plataforma lisa.

Tubo metálico con superficie abrasiva de 60 cm de largo por 3 cm de diámetro.

Cámara o formato de registro de datos

Animal de experimentación

temporizador

alcohol al 70% y toalla
OPERACIONES PRELIMINARES

Limpiar plataforma con alcohol al 70%

Aclimatación del animal
126
PROCEDIMIENTO
1. Reflejo de caída: es el reflejo que corrige la orientación del cuerpo cuando se toma
fuera de su posición vertical normal al animal.
2. Reflejo de flexión- retención : es el reflejo de las extremidades el cual cuando
estas son estiradas tiende a recogerse
3. Reflejo de corrección: cuando el animal es dispuesto boca arriba en una superficie
plana el tiende a corregir posición
4. Reacción de apoyo o localización por contacto: Se suspende la rata de la cola y
se acerca a una superficie plana. Cuando las vibrizas hacen contacto con la
superficie ella tiende a estirar sus extremidades para equilibrarse.
5. Localización visual: Se suspende la rata horizontalmente de tal manera que las
patas anteriores alcancen la superficie.
6. Pole Test: El animal se coloca en la cima de un tubo de 60 cm de largo por 3 cm
de diámetro. Por el que deberá descender en un tiempo max de 60 seg.se tendrán
en cuenta la corrección de la posición, numero de extremidades usadas y el uso
de la cola
Los puntos del 1 al 5 serán tenidos en cuenta como 0(cero) si no se realizó y 1
(uno) si se realizó. Los animales con un estado neurológico normal mostraran
comportamientos completamente afirmativos para las pruebas.
REFERENCIAS
Bures, J., & Buresova, O. (1983).Techniques and basic experiments for the study
of brain and behavior. 2nd ed. Amsterdam: Elsevier Science Publishers B. V.
127
Anexo G. Protocolo Test de Barnes Modificado
OBJETIVO
Descripción de la metodología que permite evaluar la memoria y deterioro cognitivo en
rata Wistar.
CONDICIONES DE SEGURIDAD
después del uso con cada animal
EQUIPAMIENTO, LOCALES, MATERIALES Y REACTIVOS

Cuarto oscuro con paredes oscuras y de mismo tono.

Cámara o formato de registro de datos

Plataforma circular de Barnes con 1,22 metros de diámetro, hecha en triplex y
forrada con fórmica de color blanco, con 18 agujeros de 9,5cm de diámetro cada
uno, espaciado a 30° uno de otro y forrado con fórmica de color negro y la base
tiene 90cm de alto.

Señal intralaberintica (Bandera blanca)

Estímulos aversivos de luz (Bombillo 150Watt) y sonido (Blanco 90 Db).

Animal de experimentación

temporizador

alcohol al 70% y toalla
128
OPERACIONES PRELIMINARES

Limpiar plataforma con alcohol al 70%

Revisar la posición de la bandera y

caja de escape

Verificar el funcionamiento de los estímulos aversivos (luz y sonido).

Preparar la cámara de vídeo o el formato de registro de los datos.

Se realiza 1 sesión de aclimatación donde el animal se manipulará por la persona
encargada del desarrollo de la prueba de manera que este se familiarice con dicha
persona.

Se realiza 1 sesión de habituación al laberinto,
en la que se colocaran
indistintamente a los sujetos experimentales en la caja de arranque, plataforma y
la caja de escape, en ausencia de ruido y en presencia de luz tenue con un
bombillo de luz roja de 25 watts.
PROCEDIMIENTO
1. Sujetar gentilmente al animal a evaluar y extraerlo de su caja.
2. Ubicar el animal en la caja de escape cuidando de que no observe la posición de
la bandera
3. Levantar la caja de arranque al mismo tiempo que se encienden las aversiones,
el temporizador y la cámara de video
4. Luego de 60sg guiar el animal hacia la bandera e introducirlo al agujero de escape
si no la ha encontrado
5. Tomar el tiempo que le toma al animal en encontrar el agujero de escape
6. Repetir los pasos 1, 2, 3, 4 y 5 en los 7 ensayos restantes limpiando la plataforma
antes de comenzar cada prueba.
129
Figura 1. Test de Barnes modificado y sus especificaciones
VARIABLES A MEDIR E INTERPRETACIÓN DE LOS RESULTADOS
Variable
Descripción
Latencia del
primer
agujero
Tiempo
en
que el animal
llega
y
explora
el
primer
agujero.
Distancia
recorrida
Distancia
recorrida en
60 segundos.
Numero
de
errores
Numero
de
agujeros
erróneos
que
explora.
CONTROL
130
Numero
aciertos
de
Número
de
veces que el
animal
encuentra
el
agujero
de
escape en un
día de prueba.
Latencia
escape
de
Tiempo en que
el
animal
ingresa
al
agujero
de
escape.
Por ser una prueba de aprendizaje, una animal en condiciones normales, debe aprender
a asociar la bandera con la posición de la caja de escape por lo cual en los ensayos tiene
que ir disminuyendo en errores y latencia de escape.
REFERENCIAS/DOCUMENTOS APLICABLES
Navarrete, F., Pérez-ortiz, J. M., Femenía, T., & García-gutiérrez, M. S. (2008). Métodos
de evaluación de trastornos cognitivos en modelos animales, RevNeurol 2008; 47(3),
137–145.
Barnes, C.A., 1988. Spatial learning and memory processes: the search for their
neurobiological mechanisms in the rat.
MODIFICACION POR AUTOR.
131
Anexo H. Protocolo anestésico para ratas
OBJETIVO
La prevención y alivio del dolor deben estar en estrecha relación con los procedimientos
y protocolos quirúrgicos en animales de experimentación. Las lesiones inducidas durante
una cirugía sin una adecuada analgesia o anestesia, constituyen un estímulo doloroso
inapropiado con niveles inaceptables de stress y diestress, lo cual afecta la respuesta
orgánica y puede modificar los resultados de un experimento; además, el practicar
intervenciones quirúrgicas en animales sin un adecuado nivel anestésico, es una práctica
totalmente inaceptable desde el punto de vista ético y humanitario.
Los anestésicos pueden ser fijo (inyectables) o inhalatorios (líquidos volátiles o gases)
siendo los más utilizados el Isoflirane y el enflurane dentro de los
halógenos, el
Pentobarbital entre los barbitúricos, Ketamina como disociativo y el Hidartocloral
(esferoidal). Casi todos se pueden asociar con tranquilizantes, sedantes (acepromacina
o Xilacina) analgésicos narcóticos y no narcóticos, además de los vagolíticos (atropina).
Los analgésicos más eficientes suelen ser los narcóticos opioides como la morfina,
meperidina y fentanilo.
Es así como el determinar la cantidad necesaria para prevenir y aliviar el dolor en
procedimientos quirúrgicos en ratas de experimentación se hace un procedimiento de
suma importancia a la hora de realizar cualquier procedimiento quirúrgico.
132
RESPONSABILIDADES:
Implementación: responsables del área de quirófano y Bioterio.
Ejecución: todos los estudiantes de pregrado y posgrado pertenecientes a el grupo MECZH.
Control: Jefe de Quirófano y Bioterio.
ALCANCE
Aplicación en áreas de fisiología, Neuroanatomía, Biología celular, Bioquímica y
Experimentación animal.
CONDICIONES DE SEGURIDAD

Uso de bata, polainas y gorro

Limpiar superficie de apoyo después del uso con cada animal
EQUIPOS, MATERIALES Y REACTIVOS

Jeringas de insulina U-100 X 1 ml 27 GX1/2”

Pesa

Atropina Sulfato 1:1000 Inyectable.

Xilacina monoclorhidrato 2% Inyectable.

Ketamina Clorohidrato 100 mg/2 ml inyectable.

Meperidina Clorohidrato 100 mg/ 2 ml inyectable.

Formato de protocolo técnico (ver anexo 1)
133
PROCEDIMIENTO
1. Pesar la rata y diligenciar el formato del protocolo técnico (Anexo 1).
2. Premedicación y preanestesia (Atropina SO4) a una posología de 0.04 a 1.0
mg/Kg de peso vía subcutánea (SC).
3. Anestesia general disociativa (Ketamina 5%+ Xilacina 2%) a posológia de 90:10
mg/Kg de peso respectivamente por vía Intraperitoneal (IP) en la misma jeringa
(Tabla 1). Para procedimientos prolongados (>45 min) en los cuales se requiere
más de una aplicación, pueden usarse posología más bajas 70 mg/Kg p.v.
(Ketamina + 5mg/Kg p.v. (Xilacina) mezcladas en la misma jeringa.
4. El efecto anestésico logrado es de 30-45 minutos. Para procedimientos superiores
a 45 minutos se deberá aplicar una segunda dosis de la mezcla anteriormente
descrita y dosis sucesivas según la respuesta individual.
5. El refuerzo de la dosis de la mezcla (2° dosis), permitirá un tiempo quirúrgico
aproximado de 45 – 60 minutos adicionales y un tiempo de recuperación de
aproximadamente 1-3 horas.
6. Analgesia (Mepridina), Una vez finalizado el procedimiento quirúrgico, se deberá
administrar Meperidina a posología de 10-20 mg/Kg vía
134
GRUPO : Modelos Experimentales para las PNT N°
Ciencias Zoohumanas
Hoja 3 de 4
Aprobado por : Doris Eelna Navarro C
Emisión N° 1
Firma :
Fecha : 20-05-2008
TITULO: PROTOCOLO ANESTESICO PARA RATAS
Intramuscular o (IM) o subcutánea. La dosis puede ajustarse a 10 mg/Kg para la
mayoría de procedimientos y repetirse cada 2-4 horas de ser necesario.
7. Las soluciones Stock pueden permanecer a temperatura ambiente. Una vez
preparada la mezcla Ketamina / Xilacina, que debe ser preparada en la cantidad
mínima necesaria. En caso de sobrar está mezcla debe ser refrigerada a 4 C y
ser usada máximo en las 24 horas siguientes.
Tabla 1: Dosificación de la asociación anestésica Ketamina / Xilacina según el peso
Ketamina 5%
Xilacina 2%
Peso
90 mg/Kg
(gramos)
miligramos Mililitros
miligramos Mililitros
(mililitros)
50
4.50
0.090
0.50
0.03
0.120
100
9.00
0.180
1.00
0.05
0.230
Volumen
10 mg/Kg
135
Volumen
Total
150
13.50
0.270
1.50
0.08
0.350
200
18.00
0.360
2.00
0.10
0.460
250
22.50
0.450
2.50
0.130
0.580
300
27.00
0.540
3.00
0.150
0.690
350
31.50
0.630
3.50
0.180
0.810
400
36.00
0.720
4.00
0.200
0.920
450
40.50
0.810
4.50
0.230
1.040
500
45.00
0.900
5.00
0.250
1.500
NOTA: La Ketamina se clasifica como un anestésico disociativo selectivo con poco
poder depresor de los centros cerebrales (cardiovascular y respiratorio); sin embargo,
puede producir Sialorrea, hipertonicidad muscular y en algunos casos puede sobrevenir
un paro respiratorio, por lo cual es recomendable asociarlo con atropina.
La Meperidina (peptidina) es un derivado opioide, de gran poder analgésico. A corto
plazo puede producir somnolencia y depresión respiratoria dependiendo de la dosis por
lo cual debe administrarse con precaución y a dosis bajas. Aunque la dosis
recomendada en ratas es de 10-20 mg /Kg cada 2-3 hora es suficiente con una dosis
de 5 mg / Kg p.v. vía IP o SC.
Estos dos medicamentos tienen control especial por parte del fondo nacional de
estupefacientes.
136
BIBLIOGRAFIA

PROTOCOLO ANESTESICO EN RATAS WISTAR. Grupo de Neurociencias de
Antioquia. Versión 001.
Protocolo Técnico
Fecha:
Código:
Peso:
Sexo
Espacie:
M:
H:
Edad:
PREANESTESIA
Ayuno
Si
No
Atropina
Si
No
Dosis:
Ref 1/Vía Hora
Ref.
ANESTESIA
Medicamento
Dosis/Ví
Hora
a
2/Vía
ANALGESIA
137
Hora
PORCEDIMIENTO
Temperatura C
Hora de registro
Hora de Inicio
Hora de
finalización
Hora de sutura
Elaborado por : Doris Elena Navarro
Firma:
Cl
Fecha:
20-05-2008
Cargo: Investigador Asociado MECZH
Revisado por:
Firma:
Fecha:
Firma:
Fecha:
Cargo:
Aprobado por :
Cargo
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