Status oxidativo e inflamatório em mulheres

FRANCINE RONCOLETA
STATUS OXIDATIVO E INFLAMATÓRIO EM
MULHERES OBESAS: RELAÇÃO COM
VARIÁVEIS ANTROPOMÉTRICAS,
LIPÍDICAS E CLÍNICAS
Belo Horizonte
Hospital Santa Casa de Misericórdia
2012
FRANCINE RONCOLETA
STATUS OXIDATIVO E INFLAMATÓRIO EM
MULHERES OBESAS: RELAÇÃO COM
VARIÁVEIS ANTROPOMÉTRICAS,
LIPÍDICAS E CLÍNICAS
Dissertação apresentada ao Programa de PósGraduação em Medicina/Biomedicina do Hospital
Santa Casa de Misericórdia de Belo Horizonte, como
requisito parcial para a obtenção do título de mestre
em Biomedicina.
Orientadora: Profª Drª Valéria Cristina Sandrim
Belo Horizonte
Hospital Santa Casa de Misericórdia
2012
R769s
Roncoleta, Francine
Status oxidativo e inflamatório em mulheres obesas: relação com
variáveis antropométricas, lipídicas e clínicas. / Francine Roncoleta. –
2012.
112 f.
Orientadora: Valéria Cristina Sandrim.
Dissertação (mestrado) - Santa Casa de Misericórdia de Belo Horizonte.
1. Obesidade. 2. Estresse oxidativo. 3. Interleucina-6. 4.
Antropo-
AGRADECIMENTOS
Agradeço a Deus pela sempre presença e conforto nos momentos de fraqueza,
por me suprir em todas as minhas necessidades e me abençoar para tudo
aquilo que Ele me destina.
À minha orientadora querida Valéria Sandrim, meu sincero muito obrigada pela
disponibilidade, competência, paciência e amizade. Sempre me lembrarei com
carinho de seus conselhos.
Aos meus pais, meus exemplos de força e luta, que em todos os momentos e
decisões me apoiaram de forma incondicinal e com muito amor, dedico essa
vitória a vocês.
Ao hospital Santa Casa, pela oportunidade de ingressar no mestrado e por me
apresentar pessoas que foram fundamentais para meu aprendizado e
caminhada.
À Vanessa Andrade, pela disponibilidade com as análises no laboratório e pela
companhia e risadas na sala de aula.
Ao Adriano, meu amor, pela compreensão nos momentos de ausência, carinho
e paciência nos momentos de incerteza. Obrigada por dividir e vencer tudo isso
comigo.
À Carla Vaz de Lima, minha querida futura mestra, pela amizade, apoio e
companhia em todos os momentos.
A todos que, direta ou indiretamente, contribuiram para realização deste
trabalho e também aqueles que conviveram comigo nestes dois últimos anos.
Compartilho com todos essa minha alegria.
“Para todas as coisas tenho força em virtude
daquele que me confere poder´´
(Filipenses 4:13)
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 - Desequilíbrio entre espécies antioxidantes e pró-oxidantes --------- 08
Figura 2 - Mecanismos de estresse oxidativo induzido pela disfunção endotelial
nas doenças cardiovasculares -------------------------------------------------------------- 11
Figura 3 - Sistemas enzimáticos envolvidos na geração e inativação de
ROS ------------------------------------------------------------------------------------------------ 16
Figura 4 - Critérios utilizados para avaliar o status oxidativo ----------------------- 21
Figura 5 - Níveis plasmáticos de TBARS-MDA (µM) do grupo controle e dos
grupos Ob e Ob-Ht. * p < 0,001 comparado ao grupo controle. Valores
expressos em média ± EP. Análise estatística: ANOVA seguida de teste de
Bonferroni ---------------------------------------------------------------------------------------- 50
Figura 6 - Níveis plasmáticos de FRAP (μM) dos grupos controle, obesas e
obesas hipertensas. Valores expressos em média ± EP. Análise estatística:
ANOVA seguida de teste de Bonferroni. p > 0,05-------------------------------------- 51
Figura 7- Níveis plasmáticos de GSH (mM) dos grupos Ct, Ob e Ob-Ht. * p <
0,001 comparado ao grupo controle. Valores expressos em média ± EP.
Análise estatística: ANOVA seguida de teste de Bonferroni ------------------------ 52
Figura 8 - Níveis plasmáticos de Vit E (μM) dos grupos controle, obesas e
obesas hipertensas. Valores expressos em média ± EP. Análise estatística:
ANOVA seguida de teste de Bonferroni. p > 0,05 ------------------------------------- 53
Figura 09 - Correlação entre IMC (kg/m2) e níveis plasmáticos de TBARS-MDA
(µM) do grupo total de obesas. * p= 0,004; r= coeficiente de correlação de
Pearson -------------------------------------------------------------------------------------------- 55
Figura 10 - Níveis plasmáticos de TBARS-MDA (µM) de acordo com IMC
(kg/m2) do grupo controle e total de obesas. * p < 0,05 comparado ao grupo Ct.
Valores expressos em média ± EP. Análise estatística: ANOVA seguida de
teste de Bonferroni ----------------------------------------------------------------------------- 56
Figura 11 - Níveis plasmáticos de TBARS-MDA (µM) das participantes do
estudo de acordo com níveis lipídicos analisados (mg/dL). * p < 0,05
comparado ao < 150. Análise estatística: Teste t de Student ---------------------- 58
Figura 12 - Correlação entre níveis plasmáticos de TBARS-MDA (µM) e
parâmetros lipídicos (mg/dL) de todas as participantes do estudo ---------------- 59
Figura 13 - Níveis plasmáticos de FRAP (µM) das participantes do estudo
separados de acordo com os pontos de corte dos níveis lipídicos analisados
(mg/dL). p > 0,05. Análise estatística: Teste t de Student -------------------------- 61
Figura 14 - Correlação entre níveis plasmáticos de FRAP (µM) e HDL (mg/dL)
de todos as participantes do estudo. * p < 0,05; r = coeficiente de correlação de
Pearson ------------------------------------------------------------------------------------------- 62
Figura 15 - Níveis plasmáticos de GSH (mM) das participantes do estudo de
acordo com níveis lipídicos analisados (mg/dL). * p < 0,05. Análise estatística:
Teste t de Student ------------------------------------------------------------------------------ 64
Figura 16 - Correlação entre níveis plasmáticos de GSH (µM) e parâmetros
lipídicos (mg/dL) de todas as participantes do estudo ------------------------------- 65
Figura 17- Níveis plasmáticos de vitamina E (µM) das participantes do estudo
de acordo com níveis lipídicos analisados (mg/dL). * p < 0,05 comparado ao <
50. Análise estatística: Teste t de Student ---------------------------------------------- 67
Figura 18 - Correlação entre níveis plasmáticos de vitamina E (µM) e HDL
(mg/dL) de todas as participantes do estudo. * p < 0,05; r = coeficiente de
correlação de Pearson------------------------------------------------------------------------- 68
Figura 19 - Correlação entre níveis plasmáticos de parâmetros de status
oxidativo e idade (anos) de todas as participantes do estudo ---------------------- 69
Figura 20 - Níveis plasmáticos de TBARS-MDA (µM) e GSH (mM) de acordo
com idade ---------------------------------------------------------------------------------------- 70
Figura 21 - Porcentagem de amostras detectáveis e não detectáveis de IL-6
após quantificação plasmática dos grupos controle e total de obesos ---------- 72
Figura 22 - Níveis plasmáticos de IL-6 (pg/mL) dos grupos controle, obesos e
obesos hipertensos. Valores expressos em média ± EP. Análise estatística:
ANOVA seguida de teste de Bonferroni. p > 0,05 ------------------------------------- 72
Figura 23 - Níveis plasmáticos de TBARS-MDA, FRAP, GSH e Vitamina E
divididos de acordo com a mediana inferior e superior de IL-6 do grupo total de
obesos. (p > 0,05). Valores expressos em média ± EP. Análise estatística:
Teste t de Student ----------------------------------------------------------------------------- 73
Figura 24 - Níveis plasmáticos de IL-6 divididos de acordo com a mediana
inferior e superior de TBARS-MDA do grupo total de obesos. (p > 0,05).
Valores expressos em média ± EP. Análise estatística: Teste t de Student --- 74
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 - Classificação de peso através do IMC e risco de comorbidades em
adultos -----------------------------------------------------------------------------------------------4
Tabela 2 - Circunferência abdominal e risco de complicações metabólicas
associadas à obesidade ------------------------------------------------------------------------5
Tabela 3 - Concentrações usadas para curva de calibração, teste TBARSMDA ------------------------------------------------------------------------------------------------ 37
Tabela 4 - Escala de diluições usadas para definir curva padrão, teste
FRAP ----------------------------------------------------------------------------------------------- 38
Tabela 5 - Escala de diluições usadas para definir curva padrão, teste
GSH ------------------------------------------------------------------------------------------------ 40
Tabela 6 - Escala de diluições usadas para definir curva padrão, kit IL-6
EASIA ---------------------------------------------------------------------------------------------- 42
Tabela 7- - Classificação do estado nutricional de acordo com IMC
(OMS/WHO-2000) ------------------------------------------------------------------------------ 43
Tabela 8 - Perfil dos grupos estudados --------------------------------------------------- 49
Tabela 9 - Avaliação da correlação entre TBARS-MDA, FRAP, GSH e Vitamina
E nos grupos controle (Ct) e todos os obesos ------------------------------------------ 54
Tabela 10 - Avaliação da correlação entre TBARS-MDA, FRAP, GSH, Vitamina
E e parâmetros antropométricos IMC, CA e RCQ nos grupos controle (Ct) e
total de obesos ---------------------------------------------------------------------------------- 55
Tabela 11 - Correlações entre níveis de FRAP e parâmetros lipídicos ---------- 60
Tabela 12 - Correlações entre níveis de vitamina E e parâmetros lipídicos ---- 66
Tabela 13 - Correlações entre níveis de biomarcadores de status oxidativo e
parâmetros clínicos ----------------------------------------------------------------------------- 71
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
ABESO
Associação Brasileira para o Estudo da Obesidade e
da Síndrome Metabólica
ANOVA
Análise de variância
AP-1
Proteína ativadora-1
BH4
Tetraidrobiopterina
CA
Circunferência abdominal
CAT
Catalase
CEM
Centro de Especialidade Médica
CEP
Comitê de Ética em Pesquisa
DCV
Doença cardiovascular
DM
Diabetes Mellitus
DNA
Ácido desoxirribonucleico
EDRF
Endothelium-derived relaxing factor
EDTA
Ácido etilenodiaminotetracético
ELISA
Enzyme Linked Immunosorbent Assay
EP
Erro padrão
eNOS
Óxido nítrico sintase endotelial
EO
Estresse oxidativo
EROS
Espécies reativas de oxigênio
FAD
Flavina adenina dinucleotídeo
FMN
Flavina monucleotídeo
FRAP
Ferric Reducing Antioxidant Power
GPx
Glutationa peroxidase
GSH
Glutationa reduzida
GSSGG
Glutationa oxidada
HAS
Hipertensão arterial sistêmica
HDL
Lipoproteína de alta densidade
IBGE
Instituto Brasileiro de Geografia e Estatística
IL-6
Interleucina-6
IMC
Índice de massa corporal
IRC
Insuficiência renal crônica
Kg/m2
Quilogramas por metro quadrado
LDL
Lipoproteína de baixa densidade
LPL
Lipase lipoprotéica
MDA
Malondialdeído
M-I
Mediana inferior
mg/dL
Miligrama por decilitro
MS
Ministério da Saúde
M-S
Mediana superior
NCEP
National Cholesterol Education Program
NF-κB
Fator nuclear kappa B
ng/dL
Nanograma por decilitro
NO
Óxido nítrico
NS
Não significante
OMS
Organização Mundial de Saúde
PAD
Pressão arterial diastólica
PAS
Pressão arterial sistólica
PCR
Proteína C reativa
pg/mL
Picograma por mililitro
POF
Pesquisa de orçamentos familiares
RCQ
Relação cintura quadril
RL
Radicais livres
RNAm
RNA mensageiro
RNM
Ressonância nuclear magnética
ROS
Reactive oxygen species
SM
Síndrome metabólica
SOD
Superóxido dismutase
TBARS
Thiobarbituric acid-reactive substances
TC
Tomografia computadorizada
TCLE
Termo de consentimento livre e esclarecido
TMP
Tetrametoxipropano
TNF- α
Fator de necrose tumoral – afa
US
Ultrassonografia
WHO
World Health Organization
RESUMO
A epidemia global de obesidade está se tornando um grave problema de saúde
pública em virtude de sua intensidade e velocidade de evolução. O prognóstico
de saúde relaciona-se aos graus de obesidade e padrão de distribuição de
gordura corporal, sendo o excesso de gordura visceral associado à morbidade
e mortalidade cardiovascular, desarranjos oxidativos e inflamatórios. O
presente estudo buscou avaliar a relação entre biomarcadores de status
oxidativo e de inflamação com variáveis antropométricas, lipídicas e clínicas em
mulheres obesas. O estudo incluiu 91 participantes distribuídas em 3 grupos:
controle com 21 mulheres sadias eutróficas (Ct), 33 mulheres obesas sem
comorbidades (Ob) e 37 mulheres obesas hipertensas sem tratamento anti
hipertensivo (Ob-Ht), com média de idade de 39,05 ± 11,28 anos. Os grupos
Ob e Ob-Ht apresentaram aumento significativo dos níveis de TBARS-MDA e
redução significativa dos níveis de GSH em relação ao grupo Ct. Níveis de
TBARS-MDA
nas
mulheres
obesas
correlacionaram-se
positiva
e
significantemente com o IMC, inversamente com os níveis de HDL e
diretamente com os níveis de LDL, triglicérides e colesterol total. FRAP, GSH e
vitamina E apresentaram correlação positiva com os níveis de HDL, e níveis de
GSH mostraram correlação negativa com LDL e colesterol total. A idade
correlacionou-se com TBARS-MDA e GSH de forma positiva e negativa
significativa, respectivamente. Em relação à IL-6 e considerando-se o tamanho
amostral do estudo, não foi encontrada diferença de níveis plasmáticos de IL-6
entre os três grupos estudados e não se observou diferença entre os níveis dos
biomarcadores de status oxidativo analisados quando separados de acordo
com a mediana superior e inferior dos níveis de IL-6. Esses resultados
demonstraram que, em relação ao grupo controle, mulheres obesas tendem a
ter níveis estatisticamente diferentes de TBARS-MDA e GSH, observou-se a
presença de correlação entre todos os marcadores de status oxidativo e
parâmetros lipídicos, destacando-se o HDL, sugerindo que o estado de
obesidade é suficiente para o desenvolvimento de estresse oxidativo.
Palavras-chave:
antropométricos.
obesidade,
estresse
oxidativo,
interleucina-6,
índices
ABSTRACT
The global epidemic of obesity is becoming a serious public health problem
because of its intensity and speed of evolution. The prognosis of health relates
to the degree of obesity, as well as the pattern of body fat distribution, and the
excess visceral fat is associated with cardiovascular morbidity and mortality,
also oxidative disorders, metabolic, hemodynamic, inflammatory and hormonal.
This study sought to evaluate the relationship between oxidative status and
inflammation biomarkers with clinical, lipids and anthropometric variables in
obese women. The study included 91 participants distributed into three groups:
control group with 21 non-obese healthy women (Ct), 33 obese women without
comorbidities (Ob) and 37 hypertensive obese women (Ob-Ht), mean age of
39.05 ± 11.28. The groups Ob and Ob-HT showed significantly increased levels
of TBARS-MDA and significant reduction in levels of GSH when compared to
Ct. Levels of TBARS-MDA in obese women, correlated directly and significantly
with the parameters BMI. Regarding to lipid parameters, levels of TBARS-MDA
correlated indirectly and significantly with the HDL levels, and directly with
levels of LDL, triglycerides and total cholesterol. Values of FRAP, GSH and
vitamin E were positively correlated with HDL levels, while levels of GSH
correlated negatively with LDL and total cholesterol. In relation to clinical
parameters, age was not correlated with plasma levels of FRAP and vitamin E,
whereas for the TBARS-MDA and GSH observed significant positive and
negative correlation, respectively. In relation to inflammation biomarker IL-6 and
considering the sample size the study, was observed no difference in plasma
levels of IL-6 among the three groups studied and no difference was observed
between the levels of biomarkers of oxidative status, when analyzed separated
according to the median upper and lower levels of IL-6. These results
demonstrated that in the control group, obese women tend to have significantly
different levels of TBARS, MDA and GSH, in relation to lipid parameters,
observed correlation between all the markers of oxidative status, especially
HDL, suggesting that the obese state is sufficient for the development of
oxidative stress.
Keywords: obesity, oxidative stress, interleukin-6, anthropometric indexes.
SUMÁRIO
1 - INTRODUÇÃO ---------------------------------------------------------------- 1
1.1.- OBESIDADE ---------------------------------------------------------------------------------------------------2
1.1.1.- DISTRIBUIÇÃO DA GORDURA CORPORAL---------------------------------------------------------------- 5
1.2.- ESTRESSE OXIDATIVO -------------------------------------------------------------------------------------- 7
1.2.1- FONTES DE ESPÉCIES REATIVAS DE OXIGÊNIO ---------------- ERRO! INDICADOR NÃO DEFINIDO.
NADPH OXIDASE ------------------------------------------------- ERRO! INDICADOR NÃO DEFINIDO.
XANTINA OXIDASE -------------------------------------------------- ERRO! INDICADOR NÃO DEFINIDO.
NOS ENDOTELIAL DESACOPLADA --------------------------------------------------------------------- 13
ENZIMAS DA CADEIRA RESPIRATÓRIA MITOCONDRIAL --------------------------------------------- 15
1.2.2.- ANTIOXIDANTES ENZIMÁTICOS ------------------------------------------------------------------------- 15
SUPERÓXIDO DISMUTASE (SOD) --------------------------------------------------------------------- 16
GLUTATIONA PEROXIDASE (GPX) --------------------------------------------------------------------- 17
CATALASE ---------------------------------------------------------- ERRO! INDICADOR NÃO DEFINIDO.
1.2.3.- MEDIDASDE AVALIAÇÃO DO ESTRESSE OXIDATIVO ----------- ERRO! INDICADOR NÃO DEFINIDO.
ISOPROSTANOS ---------------------------------------------------- ERRO! INDICADOR NÃO DEFINIDO.
MALONDIALDEÍDO (MDA) ------------------------------------------------------------------------------ 22
FRAP (FERRIC REDUCING ANTIOXIDANT POWER) ---------- ERRO! INDICADOR NÃO DEFINIDO.
GLUTATIONA -------------------------------------------------------- ERRO! INDICADOR NÃO DEFINIDO.
1.3.- INTERLEUCINA-6 ------------------------------------------------------------------------------------------- 24
2 - OBJETIVOS ----------------------------------------------------------------- 28
2.1.- OBJETIVO GERAL ------------------------------------------------------------------------------------------- 29
2.2.- OBJETIVOS ESPECÍFICOS ---------------------------------------------------------------------------------- 29
3 - MATERIAL E MÉTODOS ------------------------------------------------ 31
3.1.- CASUÍSTICA-------------------------------------------------------------------------------------------------- 32
3.1.1.- SELEÇÃO DAS PARTICIPANTES DO ESTUDO---------------------------------------------------------- 32
3.2.- CRITÉRIOS DE INCLUSÃO ---------------------------------------------------------------------------------- 33
3.3.- CRITÉRIOS DE EXCLUSÃO --------------------------------------------------------------------------------- 33
3.4.- AMOSTRAS BIOLÓGICAS ----------------------------------------------------------------------------------- 34
3.5.- DELINEAMENTO EXPERIMENTAL -------------------------------------------------------------------------- 34
3.5.1.- PARÂMETROS BIOQUÍMICOS---------------------------------------------------------------------------- 34
3.5.2.- PARÂMETROS ANTROPOMÉTRICOS ------------------------------------------------------------------- 34
3.5.3.- PARÂMETROS LIPÍDICOS -------------------------------------------------------------------------------- 34
3.5.5.- PARÂMETROS CLÍNICOS -------------------------------------------------------------------------------- 35
3.6.- MÉTODOS ---------------------------------------------------------------------------------------------------- 36
3.7- ANÁLISE ESTATÍSTICA --------------------------------------------------------------------------------------- 44
4 - RESULTADOS ------------------------------------------------------------- 46
4.1.- CARACTERIZAÇÃO DAS PARTICIPANTES DO ESTUDO -------------------------------------------------- 47
4.2.- AVALIAÇÃO DE MARCADORES PLASMÁTICOS DE STATUS OXIDATIVO ------------------------------- 50
4.3.- CORRELAÇÃO ENTRE MARCADORES DE STATUS OXIDATIVO ----------------------------------------- 53
4.4.- CORRELAÇÃO ENTRE PARÂMETROS LIPÍDICOS E DE STATUS OXIDATIVO - ERRO! INDICADOR NÃO
DEFINIDO.
4.5.- CORRELAÇÃO ENTRE PARÂMETROS CLÍNICOS E DE STATUS OXIDATIVO -- ERRO! INDICADOR NÃO
DEFINIDO.
4.6.- AVALIAÇÃO DE MARCADORE IMUNOLÓGICO DE INFLAMAÇÃO ---------------------------------------- 71
5 - DISCUSSÃO ---------------------------------------------------------------- 74
5.1.- CARACTERIZAÇÃO DOS GRUPOS ESTUDADOS ------------------- ERRO! INDICADOR NÃO DEFINIDO.
5.2.- AVALIAÇÃO DE MARCADORES PLASMÁTICOS DE STATUS OXIDATIVO ------------------------------- 78
5.3.- CORRELAÇÃO ENTRE MARCADORES DE STATUS OXIDATIVO -- ERRO! INDICADOR NÃO DEFINIDO.
5.4.- CORRELAÇÃO ENTRE MARCADORES DE STATUS OXIDATIVO E PARÂMETROS
ANTROPOMÉTRICOS -------------------------------------------------------- ERRO! INDICADOR NÃO DEFINIDO.
5.5.- CORRELAÇÃO ENTRE MARCADORES DE STATUS OXIDATIVO E PARÂMETROS LIPÍDICOS --- ERRO!
INDICADOR NÃO DEFINIDO.
5.6.- CORRELAÇÃO ENTRE PARÂMETROS CLÍNICOS E DE STATUS OXIDATIVO -- ERRO! INDICADOR NÃO
DEFINIDO.
5.7.- AVALIAÇÃO DO MARCADOR BIOQUÍMICO DE INFLAMAÇÃO IL-6 ERRO! INDICADOR NÃO DEFINIDO.
6 - CONCLUSÕES ------------------------------------------------------------- 88
7 - REFERÊNCIAS------------------------------------------------------------- 90
8- ANEXOS ------------------------------------------------------------------- 109
1
1. INTRODUÇÃO
2
1.1. Obesidade
A obesidade pode ser compreendida como um agravo de caráter multifatorial
que envolve desde questões biológicas às históricas, econômicas, políticas,
sociais, ambientais e culturais (Ministério da Saúde - MS, 2006).
É definida como o acúmulo anormal ou excessivo de gordura corporal que
pode ser prejudicial à saúde devido as suas várias complicações metabólicas
(World Health Organization – WHO, 2011).
O balanço energético positivo é o determinante mais imediato da obesidade
devido à geração e ao acúmulo de gordura. Ocorre quando a ingestão de
calorias na alimentação excede o somatório das despesas exigidas para as
funções vitais do organismo, crescimento e atividades em geral (COUTINHO,
1999; MS, 2006).
A obesidade relaciona-se às condições efetivas de vida e saúde e às maneiras
de viver de sociedades, classes, grupos e indivíduos. Destaca-se o atual papel
feminino na sociedade associado a sua inserção no mercado de trabalho, à
crescente industrialização de alimentos, à concentração das populações no
meio urbano e à diminuição do esforço físico que condicionam ao declínio do
gasto energético associado ao aumento do consumo de calorias via
alimentação (MOTTA et al., 2004).
A obesidade tem sido diagnosticada como uma pandemia em virtude de sua
intensidade e velocidade de evolução em vários países do mundo (Instituto
Brasileiro de Geografia e Estatística - IBGE, 2004).
Nas últimas duas décadas a evolução nutricional da população brasileira vem
apresentando mudanças em seu padrão, caracterizando-se pelo declínio da
ocorrência de desnutrição em adultos e crianças associado à prevalência de
sobrepeso e obesidade (BATISTA FILHO, 2003). Atualmente no Brasil, a
desnutrição, nos primeiros anos de vida, e o excesso de peso e a obesidade,
em todas as demais idades, são problemas de grande relevância para a saúde
pública (IBGE, 2010).
3
Tanto em países de alta como de baixa renda, a prevalência de obesidade tem
se mostrado aumentada em todas as faixas etárias (GIGANTE, 2009). A
obesidade atinge principalmente a população menos privilegiada em países
desenvolvidos (SOBAL, 2003), e em países em desenvolvimento essa
prevalência está aumentada na população de maior renda, enquanto que na
população brasileira, no período de 1975 a 2003, foi observada maior
ocorrência de obesidade entre aqueles mais pobres (MONTEIRO, 2007).
Entretanto, de acordo com a Pesquisa de Orçamentos Familiares – POF – de
2008/2009, as prevalências de excesso de peso e de obesidade aumentaram
com a renda em todas as faixas etárias.
No Brasil, o excesso de peso foi identificado em cerca de 33% das crianças de
ambos os sexos entre 5 e 9 anos, sendo que a obesidade correspondeu a
aproximadamente metade dos casos de excesso de peso no sexo masculino e
cerca de um terço no sexo feminino. Na população entre 10 e 19 anos o
excesso de peso foi cerca de 20% em ambos os sexos e a obesidade foi
identificada em aproximadamente 25% do total de casos de excesso de peso
também nos dois sexos. Entre adultos acima de 20 anos o sobrepeso foi
encontrado em 48% das mulheres e 50,1% dos homens, sendo que o
diagnóstico de obesidade foi dado em 12,5% dos homens e em 16,9% das
mulheres. O sobrepeso e a obesidade aumentaram proporcionalmente à faixa
etária, declinando nas idades subseqüentes a 54 anos em homens e 64 anos
em mulheres (IBGE, 2010). O excesso de peso poderá alcançar, em cerca de
dez anos, dois terços da população adulta no Brasil, magnitude semelhante à
encontrada na população dos Estados Unidos (VIGITEL, 2010).
As medidas antropométricas têm sido muito utilizadas para avaliar a massa
corporal e distribuição de gordura, apesar de não apresentar a mesma acurácia
de métodos mais dispendiosos como a ultrassonografia (US), tomografia
computadorizada (TC), bioimpedância e ressonância nuclear magnética (RNM)
(RIBEIRO et al., 2001; ABESO, 2009). Uma forma simples, barata e de fácil
obtenção para o diagnóstico da obesidade em pessoas não atletas é o uso do
Índice de Massa Corporal (IMC), que é obtido através da divisão do peso, em
quilogramas, pelo quadrado da altura, em metros. Os valores de referência
4
adotados no Brasil baseiam-se em uma classificação adaptada em padrões
internacionais desenvolvidos para pessoas adultas descendentes de europeus
(Tabela 1) (WHO, 2000).
Tabela 1 - Classificação de peso através do IMC e risco de comorbidades em
adultos
Classificação
IMC (kg/m2)
Risco de comorbidades
Baixo peso
< 18,5
Baixo
Peso normal
18,5-24,9
Médio
Sobrepeso
≥ 25,0
-
Pré-obeso
25,0 a 29,9
Moderado
Obeso I
30,0 a 34,9
Aumentado
Obeso II
35,0 a 39,9
Grave
Obeso III
≥ 40,0
Muito grave
Fonte: World Health Organization (2000).
A medida da circunferência abdominal (CA) pode refletir a quantidade de
gordura abdominal. De acordo com a I Diretriz Brasileira de Diagnóstico e
Tratamento da Síndrome Metabólica (2004), as medidas da CA relacionadas
ao risco cardiovascular aumentado são: maior ou igual a 80 cm para mulheres
e maior ou igual a 94 cm para homens caucasianos (Tabela 2). O risco de
complicações metabólicas aumenta substancialmente quando os valores de CA
ultrapassam 88 cm para mulheres e 102 cm para homens (National Cholesterol
Education Program – NCEP, 2000).
5
Tabela 2 - Circunferência abdominal e risco de complicações metabólicas
associadas à obesidade
Risco de complicações metabólicas
Homem
Mulher
Aumentado
≥ 94
≥ 80
Aumentado substancialmente
≥ 102
≥ 88
Fonte: I Diretriz Brasileira de Diagnóstico e Tratamento da Síndrome Metabólica
(2004).
A circunferência abdominal tem se mostrado como um eficiente índice para
avaliação do risco de doenças cardiovasculares. Entretanto, na obesidade
grave (IMC maior que 40 kg/m2), a CA não é um bom marcador clínico para
avaliar a prevalência de síndrome metabólica ou um perfil metabólico alterado
(DRAPEAU et al., 2007)
1.1.1. Distribuição da gordura corporal
A mortalidade aumenta de forma aguda quando o IMC é maior que 30 kg/m 2 e
especialmente quando aparece associado à distribuição central de gordura.
Dessa forma, o prognóstico de saúde também está relacionado ao padrão de
distribuição de gordura corporal e não somente ao grau de obesidade.
(RANKINEN et al., 1999; MONTAGUE & O`RAHILLY, 2000; MANCINI, 2001;
ASCASO et al., 2002).
Apesar do IMC ser um bom indicador de obesidade, individualmente este
índice não pode ser totalmente correlacionado à gordura corporal, visto que
pode superestimar a gordura corporal em sujeitos musculosos, pois não
distingue massa gordurosa da massa muscular, que pesa mais que a gordura,
além de não fornecer informações sobre o padrão de distribuição corporal, pois
sujeitos com mesmo IMC podem apresentar diferentes distribuições de massa
gordurosa. Dessa forma, para a identificação do padrão de distribuição de
6
gordura corporal, são utilizados em estudos epidemiológicos, o IMC, a
circunferência
da
cintura
(CA)
e
a
relação
cintura
quadril
(RCQ)
(DOBBELSTEYN, 2001; SEIDELL et al. 2001; LI, 2006). Deve-se considerar
que a CA e a RCQ não representam avaliação da adiposidade visceral, embora
possam fornecer uma estimativa da quantidade de gordura abdominal, que por
sua vez, está correlacionada ao conteúdo de tecido adiposo visceral (MARTINS
& MARINHO, 2003)
O padrão de distribuição de gordura corporal do tipo andróide, em que maior
quantidade de gordura concentra-se ao nível do tronco, na região intraabdominal visceral, com depósitos de gordura ao redor de estruturas
anatômicas encontradas na região do retroperitônio e espaços mesentéricos
(KANNEL et al., 1991; MANCINI, 2001) está independentemente associado à
morbidade e mortalidade cardiovascular, assim como desarranjos metabólicos,
hemodinâmicos, inflamatórios e hormonais (BROOK et al., 2001; ABDULRAHIM, 2001; WOO et al., 2002; CARNEIRO et al., 2003; DALTON et al.,
2003). Já no padrão de distribuição de gordura corporal do tipo ginecóide,
maior quantidade de gordura tende a se acumular na parte inferior do corpo,
compreendendo coxas, nádegas e quadris.
Os tecidos adiposo subcutâneo e visceral apresentam diferentes capacidades
metabólicas, podendo portanto, de acordo com sua localização, contribuir de
formas diferentes com a secreção de adipocinas (DUSSERRE, 2000; LINDER
et al., 2004). De acordo com Fried (1998), o tecido adiposo visceral produz e
secreta interleucina-6 em concentrações três vezes maiores que o tecido
subcutâneo. A obesidade abdominal está associada à disfunção endotelial e
resistência à insulina devido à gênese de citocinas, hormônios e produtos
metabólicos derivados de lipídios, já que os ácidos graxos incitam a geração de
superóxido por células vasculares e endoteliais via NADPH oxidase
(CARVALHO, 2006).
7
1.2. Estresse Oxidativo
Radicais livres (RL) são moléculas ou átomos altamente reativos e instáveis,
que possuem elétrons de valência desemparelhados que se ligam de forma
rápida e inespecífica a moléculas próximas.
O processo de transferência de elétrons, ou a absorção de energia, pode levar
o oxigênio a gerar espécies reativas de oxigênio ou ROS (reactive oxygen
species). Este é um termo coletivo freqüentemente usado para incluir não
apenas radicais livres de oxigênio, mas também alguns não radicais derivados
do O2 capazes de gerar radicais livres (HALLIWELL & GUTTERIDGE, 2000).
Em condições fisiológicas, os radicais livres formam-se em proporções
controladas pelos mecanismos defensivos celulares. Entretanto, em situações
patológicas e de estresse, essa produção pode aumentar substancialmente
(SALVADOR, 2004), sendo que nestas condições ocorre uma redução de
eficiência do sistema antioxidante em que se desencadeia o estresse oxidativo
(ROBERTS & SINDHU, 2009).
O estresse oxidativo é o resultado de um desequilíbrio entre espécies reativas
de oxigênio, radicais livres e antioxidantes. Portanto pode resultar de uma
situação em que há uma elevada velocidade de produção de ROS, uma
diminuição nos níveis de antioxidantes ou uma combinação de ambas as
condições (Figura 1).
8
Figura 1 - Desequilíbrio entre espécies antioxidantes e pró-oxidantes
resultando na geração de estresse oxidativo.
A presença de baixas concentrações de radicais livres, ROS e outras espécies
relacionadas são importantes para o status redox normal da célula, para a
função
tecidual
e
processos
de
sinalização
intracelular.
Geralmente,
concentrações normais de antioxidantes são suficientes para combater o
processo oxidativo e proteger o tecido.
Níveis elevados de radicais livres e ROS podem ser responsáveis por danos a
várias estruturas biológicas, entre elas os lipídios, com modificação das
características das membranas biológicas, as proteínas e o DNA (VINCENT,
2007)
Há evidências de que a obesidade humana é acompanhada por um estado de
inflamação e estresse oxidativo crônicos. A inflamação é fonte de estresse
oxidativo, e este pode ser um dos principais mecanismos subjacentes
relacionadas às co-morbidades associadas à obesidade. (HIGDON, 2003).
As defesas antioxidantes dos tecidos estão diminuídas na obesidade. O
consumo inadequado de antioxidantes provenientes da dieta pode ser um dos
fatores contribuintes para a alteração da capacidade antioxidante dos tecidos
em obesos. Alguns estudos indicam que indivíduos obesos consomem menos
alimentos antioxidantes e fitoquímicos, favorecendo dessa forma o estresse
oxidativo (TAYLOR et al., 2006; VINCENT et al., 2007).
9
As modificações nos níveis de lipoproteínas e em sua composição estão
provavelmente relacionadas ao maior risco de doenças cardiovasculares
associadas à obesidade. Estudos têm demonstrado
modificações no
metabolismo lipídico e de lipoproteínas em indivíduos obesos, com aumento do
estresse oxidativo e maior susceptibilidade à peroxidação lipídica de LDL em
comparação com indivíduos saudáveis (FERRETI et al., 2005; MYARA, et al.,
2003; MUTLU-TÜRKOĞLU, et al., 2003).
A obesidade aumenta as cargas mecânicas e metabólicas sobre o miocárdio,
aumentando assim seu consumo de oxigênio e consequentemente a produção
de espécies reativas de oxigênio. Um segundo mecanismo pelo qual a
obesidade pode, de forma independente, causar o aumento da peroxidação
lipídica, é atraves da lesão celular progressiva e cumulativa resultante da
pressão da grande massa corporal, visto que a lesão corporal promove a
liberação de citocinas que geram ROS a partir dos tecidos (OLUSI, 2002).
São mecanismos que geram estresse oxidativo na obesidade: hiperglicemia
(MENON, 2004), elevados níveis lipídicos (FURUKAWA et al., 2004), defesa
antioxidante inadequada (VINCENT, 2001), inflamação crônica (FERNANDEZREAL, 2003), excessiva infiltração e ativação leucocitária (FURUKAWA et al.,
2004; KULLO, 2003), produção de ROS endotelial (WHEATCROFT, 2003),
produção excessiva do hormônio do sistema renina-angiotensina-aldosterona
(SCHIFFRIN, 2002) e hiperleptinemia (HUCKSHORN, 2004). A obesidade
pode envolver alguns ou até todos esses fatores contribuidores para o estresse
oxidativo.
O aumento da produção de espécies reativas de oxigênio também pode
aumentar a resposta inflamatória através da ativação de fatores de transcrição
nuclear redox-sensíveis, como AP-1 e NF-κB. Esses fatores de transcrição são
essenciais para a expressão indutível de genes associados a respostas imunes
e inflamatórias, incluindo citocinas, moléculas de adesão celular e indução da
enzima NO sintase (LAVROVSKY, 2000).
10
Em estudo realizado por Olusi (2002), pode-se afirmar que a obesidade grave
por si só, sem fatores de confusão como hiperlipidemia, diabetes, hipertensão e
tabagismo, é causa significativa de peroxidação lipídica.
A estreita associação da obesidade com outras condições que, potencialmente,
aumentam o estresse oxidativo, deixa em aberto a possibilidade de confusão
residual, pois a associação entre estresse oxidativo e obesidade pode estar
relacionada a outras variáveis não medidas (HIGDON, 2003). A magnitude
relativa com que fatores de risco individuais para aterosclerose contribuem com
marcadores de estresse oxidativo ainda é desconhecida, assim, a contribuição
de forma independente da hipertensão, diabetes e fumo para o estresse
oxidativo sistêmico ainda é também desconhecida (KEANEY, 2003).
1.2.1. Fontes de espécies reativas de oxigênio
As fontes potencialmente produtoras de ROS em mamíferos incluem o
citocromo P450, lipoxigenase, ciclooxigenase e outras hemoproteínas.
Entretanto, as mais estudadas no sistema cardiovascular são NADPH
oxidases, xantina oxigenase, óxido nítrico sintase endotelial (eNOS) e enzimas
da cadeia respiratória mitocondrial (CAI, 2000; FÖRSTERMANN, 2008) (Figura
2).
11
Figura 2 - Mecanismos de estresse oxidativo induzido pela disfunção endotelial
nas doenças cardiovasculares. Figura adaptada Cai & Harrison, 2000.
NADPH oxidase
NADPH oxidases são enzimas presentes nas membranas das células
endoteliais
vasculares,
células
musculares
lisas
e
fibroblastos
(FÖRSTERMANN, 2006). Apresentam produção predominante do radical
superóxido.
A atividade da NADPH oxidase é regulada por citocinas, hormônios e forças
mecânicas que são conhecidas por estarem envolvidas na patogênese da
doença vascular. Diabetes e hipercolesterolemia estão associados com o
12
aumento da produção de superóxido dependente de NADH (CAI & HARRISON,
2000).
Experimentos com NADPH oxidase em animais têm indicado que essa enzima
é uma importante fonte primária de ROS, contribuindo para a formação de
peroxinitrito
e
assim
desencadeando
o
desacoplamento
da
eNOS
(LANDMESSER, 2003).
Furukawa e colaboradores (2004) em seus estudos sugerem que a NADPH
oxidase é a principal fonte de ROS nos adipócitos, e que o aumento da
concentração dessa enzima parece contribuir para o aumento da produção de
ROS no tecido adiposo na obesidade.
Xantina oxidase
A xantina oxido-redutase predomina nos endotélios e catalisa a oxidação de
hipoxantina e xantina no processo do metabolismo de purinas. Essa enzima
rapidamente doa elétrons ao oxigênio molecular e a atividade combinada da
xantina oxidase e xantina desidrogenase produz, respectivamente, O2- e H2O2
(HALLIWELL & GUTTERIDGE, 2000).
Em células endoteliais, a expressão da atividade da xantina oxidase é
aumentada pelo interferon-γ. (CAI, 2000)
A fonte biológica da xantina oxidase não está totalmente clara, mas tem-se
associado o aumento dos níveis de colesterol ao maior estímulo de liberação
dessa enzima para a circulação a partir do fígado (FÖRSTERMANN, 2008).
Evidências experimentais indicam que as próprias células endoteliais podem
expressar xantina desidrogenase, que é convertida a xantina oxidase, sendo
esta expressão regulada por uma via redox-sensível, dependente da atividade
da NADPH oxidase endotelial (MCNALLY, 2003).
Em humanos com hipercolesterolemia, a administração de oxipurinol, um
inibidor da xantina oxidase, melhorou a vasodilatação prejudicada nesses
13
pacientes (CARDILLO, 1997; BUTLER, 2002). No entanto, outros testes não
conseguiram mostrar esse efeito (O’DRISCOLL, 1999).
NOS endotelial (eNOS) desacoplada
A eNOS é uma proteína homodimérica que necessita de oxigênio, flavina
adenina
dinucleotídeo
(FAD),
flavina
monucleotídeo
(FMN),
uma
tetraidrobiopterina (BH4) e um Fe (III)-heme para sintetizar NO.. Na carência de
L-arginina ou BH4, a eNOS pode produzir superóxido e água, sendo referida
nessa situação como eNOS desacoplada. (CAI, 2000)
Dessa forma, se o fluxo de elétrons dentro da NOS é perturbado, a redução de
oxigênio e geração de NO. são desacoplados e o superóxido é gerado
(FÖRSTERMANN, 2008). Portanto, o desacoplamento da eNOS no endotélio
leva ao estresse oxidativo e disfunção endotelial pela diminuição da produção
enzimática de NO. e aumento do radical O2-.
A expressão da NOS é principalmente estimulada por respostas imunológicas,
e portanto várias condições inflamatórias estão associadas à presença de NO..
Em condições inflamatórias, o óxido nítrico pode reagir com O2- e ser
convertido em espécies reativas como peroxinitrito (ONOO-) e dióxido de
nitrogênio (NO.2), que potencializam o dano inflamatório e aumentam o
estresse oxidativo. As moléculas de ONOO- causam dano direto ao DNA
celular e induzem o desacoplamento da eNOS, fato que determina uma
produção adicional de superóxido e perpetuação do dano endotelial (BAHIA et
al., 2006).
Os mecanismos pelos quais eNOS pode tornar-se desacoplada in vivo ainda
não estão claros. Estudos têm sugerido que o peroxinitrito pode oxidar o BH4 e
deste modo levar ao desacoplamento da eNOS in vivo (WERNER, 2003).
Suplementação de BH4 tem melhorado a vasodilatação dependente do
endotélio em fumantes crônicos (HEITZERa, 2000), hipercolesterolêmicos
(STROES, 1997), hipertensos (HIGASHI, 2002) e diabéticos (HEITZERb, 2000)
14
sugerindo que a depleção de BH4 possa ter impacto na transformação de
eNOS em uma enzima geradora de superóxido em humanos.
A diminuição da biodisponibilidade de NO- pode ser causada pela diminuição
da expressão de células endoteliais NO sintase (eNOS), pela falta de substrato
ou co-fatores para eNOS, alterações na sinalização celular com a inapropriada
ativação de eNOS, além da acelerada degradação de eNOS pelas espécies
reativas de oxigênio.
O termo disfunção endotelial refere-se à alteração do relaxamento vascular
devido à diminuição da biodisponibilidade de fatores de relaxamento derivados
do endotélio (EDRF - endothelium-derived relaxing factor), principalmente o
óxido nítrico (NO). Essas respostas vasomotoras anormais ocorrem na
presença de inúmeros fatores de risco para a aterosclerose (BEHRENDT &
GANZ, 2002).
Os primeiros estudos sobre esse assunto mostraram que o fator de
relaxamento derivado do endotélio (EDRF) poderia ser inativado pelo
superóxido e estabilizado pela enzima superóxido dismutase (SOD). Como a
interação entre NO- e O2- é três vezes mais rápida que a taxa de reação entre
O2- e SOD, é provável que exista sempre algum O2 reagindo com NO- nas
células e no espaço extracelular. Em condições fisiológicas, antioxidantes
endógenos minimizam essa interação e mantém um equilíbrio tênue entre as
duas substâncias (CAI, 2002). A ação da SOD, em condições fisiológicas,
mostra-se favorecida em baixas concentrações de O2-, podendo talvez explicar
os fenômenos pró-oxidantes que ocorrem na hipertensão (GRIENDLING &
FITZGERALD, 2003).
Na presença de fatores de risco cardíaco ou doença cardiovascular, a função
endotelial está comprometida. Evidências indicam que o estresse oxidativo
contribui fortemente com a disfunção endotelial (FÖRSTERMANN, 2008).
15
Enzimas da cadeia respiratória mitocondrial
Nas mitocôndrias de mamíferos, o metabolismo oxidativo envolve a redução do
oxigênio molecular por quatro elétrons. Entretanto, aproximadamente 1% do
oxigênio consumido pela mitocôndria é reduzido em apenas um único elétron,
formando dessa forma o radical superóxido.
Este O2- pode ser produzido em pelo menos dois locais na cadeia respiratória:
no complexo I, pelo NADH dehidro oxigenase e no complexo III pela
ubiquinona-citocromo b-c1 (NICHOLLS & FERGUSON, 2001). Deve-se levar
em consideração que a quantidade real de superóxido liberado pela
mitocôndria, depende da atividade da enzima antioxidante superóxido
dismutase 2 (SOD2), localizada na matriz mitocondrial, que dismuta o radical
superóxido a peróxido de hidrogênio, visto que as mitocôndrias são uma
constante fonte de radical superóxido (FÖRSTERMANN, 2008).
Através de uma NOS cálcio dependente localizada na membrana interna da
mitocôndria, essa organela também é capaz de produzir óxido nítrico, que pode
atuar na forma de um mensageiro fisiológico que controla a velocidade do fluxo
de elétrons em condições como a hipóxia. Entretando, o óxido nítrico pode
também reagir com superóxido e formar o peroxinitrito, reagindo dessa forma,
diretamente com hemoproteínas da cadeia respiratória e assim inibindo a
capacidade de transporte de elétrons, o que leva ao aumento da produção de
superóxido, e consequentemente de peroxinitrito e peróxido de hidrogênio.
Como resultado ocorre a oxidação de proteínas e a liberação do citocromo c
para o citoplasma, ocasionando o início da apoptose celular (GHAFOURIFAR
et al., 1999).
1.2.2. Antioxidantes enzimáticos
O sistema de defesa antioxidante enzimático apresenta regulação dependente,
principalmente, de seu substrato, da afinidade, seletividade e especificidade
por esse substrato (SIES, 1993). Em seres humanos, entre as enzimas que são
16
envolvidas com a proteção antioxidante estão: superóxido dismutase (SOD),
glutationa peroxidase (GPx), catalase (CAT), entre outras (Figura 3).
Em estágios precoces da obesidade pode haver uma elevação inicial das
enzimas antioxidantes para combater o estresse oxidativo (ERDEVE et al.,
2004). Com a obesidade crônica essas fontes são depletadas ao longo do
tempo (OLUSI, 2002).
Figura 3 - Sistemas enzimáticos envolvidos na geração e inativação de ROS.
Adaptado de FÖRSTERMANN, 2008.
Superóxido dismutase (SOD)
A SOD é a mais importante enzima antioxidante. Trata-se de uma
metaloenzima abundante em células aeróbias, que dismuta o superóxido a
peróxido de hidrogênio, que é menos reativo e pode ser degradado por outras
enzimas.
17
SOD
2 O2- + 2 H+ 
H2O2 + O2
Existem quatro tipos de enzimas superóxido dismutase que estão bioquímica e
molecularmente caracterizadas, sendo que em humanos encontram-se três
dessas formas: SOD1 ou SODCuZn (homodímero de cobre e zinco localizado
quase que exclusivamente no espaço citoplasmático intracelular); SOD2 ou
SODMn (tetrâmero que contém manganês em seu sítio ativo, encontrada na
mitocôndria) e SOD3 ou ECSOD (tetrâmero que contém cobre e zinco, é a
forma extracelular da SOD1).
No sistema cardiovascular, a SOD3 reduz as concentrações de superóxido e
mantém os níveis de NO. vascular (JUNGO et al., 2007).
Glutationa peroxidase (GPx)
As principais peroxidases em mamíferos são as glutationa dependentes (GPx).
A função bioquímica da enzima glutationa peroxidase (GPx) é reduzir
hidroperóxidos lipídicos aos seus álcoois correspondentes, e reduzir o peróxido
de hidrogênio livre à água (FÖRSTERMANN, 2008).
Há GPx especializadas que agem sobre peróxidos e compartimentos celulares
específicos como citosol, mitocôndrias ou associadas a membranas. A GPx1 é
a versão mais abundante e encontrada no citoplasma de quase todos os
tecidos dos mamíferos. Já na mitocôndria de mamíferos é a principal defesa
contra H2O2, visto que essas organelas, de maneira geral, não apresentam
catalase (FERNANDEZ-CHECA et al., 1998).
A GPx é uma enzima que utiliza selênio como co-fator e tem ação baseada na
oxidação da glutationa (GSH) ao dissulfeto correspondente (GSSG). Em
células normais, a razão entre a glutationa reduzida e oxidada (GSH/GSSGG)
é alta devido a um mecanismo utilizado pela enzima glutationa-redutase (GR)
18
para reduzir GSSG novamente em GSH. Esta reação é catalisada com gasto
de NADPH. Desse modo o ciclo redox é formado. Em condições de estresse
oxidativo severo, a habilidade da célula de reduzir glutationa oxidada para
glutationa pode estar ultrapassada, havendo o acúmulo de glutationa oxidada
dentro do citosol. Assim, para que não ocorra uma alteração no equilíbrio
redox, a glutationa oxidada pode ser ativamente transportada para fora da
célula ou ainda reagir com uma proteína com grupo sulfidril (DICKNSON &
FORMAN, 2002). Para a redução da glutationa oxidada é necessária a
presença de NADPH, cujos níveis são mantidos pela enzima glicose-6-fosfato
desidrogenase (G6PD) (FRIDOVICH, 1998).
GPx
H2O2 + 2 GSH  GSSG + 2 H2O
GR
GSSG + NADPH + H
+
 2 GSH + NADP+
A atuação de GPx está limitada quando os peróxidos de moléculas de ácidos
graxos estiverem esterificados em moléculas de lipídios, em lipoproteínas ou
membranas. Para que a ação da enzima ocorra, aquelas devem ser
primeiramente liberadas pela ação das lípases (MAXWELL, 1995).
Em pacientes com doença arterial coronariana, a atividade da GPx1
eritrocitária é inversamente associada ao risco de eventos cardiovasculares
(BLANKENBERG, 2003)
Três reservatórios principais de glutationa estão presentes nas células
eucarióticas, sendo que a maior parte está no citosol (onde é sintetizada nas
células de mamíferos), e menores quantidades são encontradas no retículo
endoplasmático e nas mitocôndrias (LU, 1999).
19
Catalase
A catalase é uma ferrihemoenzima que promove a decomposição do peróxido
de hidrogênio em água e oxigênio molecular, na presença de NADPH para que
ocorra ativação dos tetrâmeros da enzima.
Cat
2 H2O2  2 H2O + O2
Retículo endoplasmático e mitocôndrias contêm pouca ou nenhuma catalase. A
atividade dessa enzima em animais está presente nos peroxissomos, podendo
agir como enzima antioxidante anteriormente à difusão H2O2 para outras
células (NETO & DE PAULA, 2011).
Em animais, a catalase está presente em todos os órgãos principais do corpo,
principalmente no fígado. Aqueles órgãos que não possuem peroxissomos
(coração, pulmões e cérebro) estão mais expostos aos danos provocados
pelas ROS. Dessa forma, nesses órgãos pode acontecer a difusão do H 2O2
para o sangue, onde reage com a catalase eritrocitária, que é altamente
específica e possui atividade apenas para peróxido de hidrogênio e
hidroperóxido de metila e etila (SALVADOR, 2004).
Em estudo realizado com 30 voluntários em Campinas/SP por Neto & De Paula
(2011) observou-se que indivíduos sedentários e com IMC elevado
apresentaram valores de catalase estatisticamente mais baixos (p < 0,05) em
relação a indivíduos eutróficos e sedentários, sugerindo que a atividade da
catalase pode estar diminuída ou prejudicada na obesidade. Outros estudos
revelam que em obesos a atividade da catalase pode estar aumentada devido
a um ajuste regulador transitório, em que a enzima sofre modulação para
reestabelecer o status oxidativo desses indivíduos (BAUSENWEIN et al.,
2010).
20
1.2.3. Medidas de avaliação do estresse oxidativo
Radicais livres e ROS estão associados a condições relacionadas com a
obesidade, tais como aterosclerose (SCHULZE, 2005) e diabetes tipo 2
(CERIELLO, 2004).
Estabelecer seu papel exato requer a capacidade de sua quantificação e dos
danos oxidativos que causam. A análise em fluidos e tecidos biológicos de
biomarcadores de estresse oxidativo permite a localização e identificação de
seus efeitos. Técnicas que mensuram biomarcadores e produtos finais do
processo oxidativo mediado por radicais livres são usados frequentemente para
estimar o estresse oxidativo, visto que medidas diretas de radicais livres e ROS
são tecnicamente muito difíceis e caras (HALLIWEL & WHITEMAN, 2004). As
espécies reativas de oxigênio são geralmente muito instáveis e/ou tem uma
meia-vida muito curta para que possam ser medidas e avaliadas diretamente in
vivo. Já os produtos formados da reação de ROS com biomoléculas são, em
geral, mais estáveis e os produtos finais de reações redox podem ser usados
na medição indireta de EO (DALLE-DONNE, et al, 2005; HIMMELFARB, 2009).
Biomarcadores podem ser definidos como características que podem ser
objetivamente medidas e avaliadas como indicadores de processos biológicos
normais e patogênicos ou respostas farmacológicas a uma intervenção
terapêutica. Vários marcadores de estresse oxidativo in vitro estão disponíveis,
mas a maioria apresenta valor limitado in vivo devido à falta de sensibilidade
e/ou especificidade (TARPEY, 2004; GIUSTARINIa, 2004).
Para que biomarcadores identifiquem de forma adequada as modificações
oxidativas, possam ser usados como ferramenta de diagnóstico e para
entendimento de processos fisiopatológicos é de suma importância que os
produtos da oxidação se acumulem em concentrações detectáveis, se
correlacionem com a gravidade da doença e reflitam as vias de oxidação
específicas (DALLE-DONNE, et al, 2006).
Medidas de oxidação de proteínas e peroxidação lipídica são largamente
utilizadas como indicadores de estresse oxidativo. Lipídios e proteínas
21
oxidados têm propriedades citotóxicas e mutagênicas e podem causar
disfunção enzimática, rompimento de cascatas de sinalização, ativar processos
de doença como a inflamação, danos à membrana celular, aos receptores de
membrana, ao DNA e ácidos nucléicos e causar a morte celular. (CAI, 2000;
MARITIM et al., 2003, HEALTLHER, 2007).
A peroxidação lipídica gera uma variedade de produtos finais relativamente
estáveis,
principalmente
aldeídos
reativos
α,β-insaturados,
tais
como
malondialdeído (MDA), 4-hidroxi-2-nonenal (HNE), e 2-propenal (acroleína) e
isoprostanos (MONTUSCHI, 2004). A Figura 4 demonstra alguns critérios
utilizados para avaliar o status oxidativo, considerando-se espécies pró e
antioxidantes.
Figura 4 - Critérios utilizados para avaliar o status oxidativo. Adaptado
de DOTAN et al., 2004.
22
Isoprostanos
A caracterização de marcadores de peroxidação lipídica derivados do ácido
aracdônico apresentou importante progresso nos últimos anos. Essa classe de
componentes, conhecida como isoprostanos, foi estabelecida como marcador
de estresse oxidativo em vários estudos. Alguns estudos correlacionaram o
índice de massa corporal (IMC) com isoprostanos plasmáticos e outros
marcadores de estresse oxidativo como a glutationa redutase dos eritrócitos e
a glutationa peroxidase (KEANEY, 2003).
Entre todos os biomarcadores para a peroxidação lipídica, a família dos
isoprostanos é considerada a melhor e mais válida disponível (HALLIWEL,
2004).
A classe mais estudada dos isoprostanos é a F2-IsoPs devido a sua
estabilidade e capacidade de proporcionar mensuração mais precisa do
estresse oxidativo. (DALLE- DONNE et al., 2006)
Malondialdeído (MDA)
Malondialdeído (MDA) é um aldeído produto final formado em quantidade
significativa pela via de peroxidação lipídica tecidual e de biomembranas,
principalmente de ácido araquidônico, eicosapentaenóico e docosahexaenóico
(DOTAN et al., 2004; VINCENT & TAYLOR et al., 2006).
A quantificação de MDA em sistemas biológicos é um parâmetro extensamente
utilizado na avaliação de EO (SIM et al., 2003).
O método mais antigo e
utilizado para medir a peroxidação de membranas, ácidos graxos e alimentos é
o teste do ácido tiobarbitúrico (TBARS - thiobarbituric acid-reactive substances)
que foi introduzido por Yagi em 1976. Nele o MDA, que se forma durante a
peroxidação lipídica, reage com o ácido tiobarbitúrico para gerar um composto
colorido (SALVADOR, 2004).
23
Embora a decomposição de lipídios peroxidados seja a principal fonte de
malondialdeído, esses podem se originar de outras fontes e, portanto, a crítica
ao teste de TBARS está relacionada ao número de substâncias que podem
formar um complexo com essa substância e interferir na reação e posterior
análise (STEGHENS et al., 2001).
Concentrações de MDA e F2-isoprostano estão diretamente relacionadas com
IMC, área de gordura visceral e área de gordura total (FURUKAWA et al.,
2004). Olusi (2002) avaliou os níveis plasmáticos de MDA em indivíduos
obesos e eutróficos e seus achados sugerem que a obesidade por si só é um
fator de risco independente para a peroxidação lipídica.
FRAP (Ferric Reducing Antioxidant Power)
Trata-se do potencial antioxidante redutor do ferro em que se usa ferro férrico
na redução em íon ferroso para detectar a capacidade antioxidante in vitro de
agentes antioxidantes que contenham a ligação S-H. Dessa forma, o FRAP
fornece uma estimativa global de moléculas antioxidantes, ou seja, estima a
capacidade antioxidante total (VINCENT, 2007). O método FRAP analisa a
redução do ferro através de método colorimétrico, em que um oxidante
reduzido é aplicado para avaliar o poder antioxidante (BENZIE & STRAIN,
1996).
Em estudo realizado com homens do oriente médio, os valores de FRAP foram
inversamente associados ao IMC (SHARIFIAN, 2004), sugerindo que o
aumento do tecido adiposo possa estar relacioando com a redução de agentes
antioxidantes e consequente indução do estresse oxidativo.
Glutationa
Na mensuração do marcador bioquímico glutationa faz-se necessária a
medição
sanguínea
da
glutationa
reduzida
(GSH)
e
seu
dissulfeto
24
correspondente (GSSG) para que as concentrações de glutationa no sangue
possam refletir seu status em outros tecidos que estão menos acessíveis.
Dessa forma, esse marcador bioquímico tem sido considerado um indicador útil
do estado de estresse oxidativo em humanos e a queda de sua concentração
pode ser indício de níveis elevados de estresse oxidativo (DALLE-DONNE,
2006). A glutationa é um poderoso antioxidante não enzimático que recicla a
vitamina E e reduz moléculas oxidadas, como hidroperóxidos lipídicos (YU,
1994).
Diminuições
nas concentraçãos de
GSH podem
ser
associadas
ao
envelhecimento, artrite reumatóide, AIDS, doença hepática alcoólica e doença
cardiovascular (DCV) (PASTORE et al., 2003). Entretanto, informações sobre
como
algumas
condições
fisiopatológicas
podem
alterar
e/ou
serem
influenciadas pela homeostase do GSH / GSSG do sangue ainda precisam ser
confirmadas.
1.3. Interleucina-6 (IL-6)
O aumento de marcadores inflamatórios na obesidade pode ser dar através da
secreção de fatores que são estimuladores da produção desses marcadores
pelo tecido adiposo e outros órgãos, como fígado e células imunes, e também
pela produção imediata de um ou mais marcadores pelos próprios adipócitos
(TRAYHURN & WOOD, 2004).
Evidências recentes indicam que a obesidade está associada a um processo
inflamatório subclínico, ou seja, é caracterizada por um baixo grau de
inflamação crônica no tecido adiposo (TRAYHURN & WOOD, 2004). O tecido
adiposo é mais do que um isolante térmico e reservatório de energia. Trata-se
de um órgão endócrino metabolicamente ativo que expressa proteínas de fase
aguda e citocinas pró-inflamatórias, como a interleucina-6 (IL-6), fator de
necrose tumoral - afa (TNF-α) e proteína C reativa (PCR) (ECKEL et al., 2002;
BULLO et al., 2003).
25
A importância de se reconhecer a obesidade como um estado inflamatório
deve-se à possibilidade da inflamação ser uma das ligações entre a resistência
à insulina e a obesidade, a hipertensão arterial sistêmica (HAS) e a doença
cardiovascular (CARVALHO, 2006; BORGES et al., 2007). O aumento das
citocinas e células inflamatórias associadas à obesidade provoca uma
superprodução de ROS que podem alterar proteínas reparadoras do DNA e
induzir mutações.
A IL-6 é secretada por adipócitos, preferencialmente pelo tecido adiposo
visceral, quando em estados não inflamatórios, mas também pode ser
produzida e secretada por monócitos, macrófagos, células musculares lisas e
células endoteliais, podendo assim contribuir para o desenvolvimento da lesão
aterosclerótica pelo seu efeito endócrino, autócrino e parácrino (FANTUZZI ,
2005; FRANCISCO et al., 2006).
Essa citocina está envolvida no desenvolvimento da hiperinsulinemia,
suprimindo a expressão de adiponectina e de receptores e sinalizadores de
insulina, além de exercer importante papel no metabolismo de lipídios e
carboidratos ao inibir a lipase lipoprotéica (LPL), aumentar a lipólise, aumentar
a liberação de glicerol e ácidos graxos livres e dessa forma contribuir para a
progressão da placa de ateroma, e também está relacionada à supressão de
leptina, reduzindo a expressão do substrato do receptor de insulina-1 (IRS-1) e
o transportador de glicose GLUT-4 nos tecidos hepático e muscular
(REXRODE et al., 2003; LYON, 2003).
Trata-se de uma citocina com papel em um conjunto de funções nos processos
imunes humorais e celulares relacionados à inflamação, ao dano tecidual e à
defesa do hospedeiro (FRANCISCO et al., 2006). Entretanto, apesar da IL-6
ser uma citocina altamente pleiotrópica, com efeitos hormonais em muitos
tecidos, os efeitos sobre o endotélio, medula óssea e fígado são os mais
significativos na contribuição para os efeitos metabólicos da obesidade (WISE,
2004).
A IL-6 é mediadora central da resposta de fase aguda, além de ser a principal
citocina pró-coagulante devido à produção e à elevação das concentrações
26
plasmáticas de fibrinogênio estimuladas pelo fígado, proteína amilóide A e em
especial, de PCR. (WILLERSON & RIDKER, 2004).
Em estudos realizados por FONTANA et al. (2007), as concentrações
plasmáticas de IL-6 encontradas na veia porta de pacientes obesos submetidos
à cirurgia de obesidade, foram diretamente correlacionadas com concentrações
sistêmicas de PCR, sugerindo que a IL-6 que chega ao fígado contribui para a
regulação da produção de PCR. Tal observação sustenta a possibilidade de
que a gordura visceral esteja envolvida na regulação da produção hepática de
reagentes de fase aguda que ativam as vias inflamatórias.
Elevações modestas dos níveis de PCR também estão presentes em situações
inflamatórias crônicas, como a aterosclerose (FRANCISCO et al., 2006) e
elevadas concentrações séricas dessa proteína estão consistentemente
associadas ao aumento da incidência de doenças cardiovasculares, sugerindo
um importante papel da inflamação na patologia cardiovascular (DE FERRANTI
& RIFAI, 2002; ABDELLAOUI & AL-KHAFFAF, 2007).
Embora o aumento de PCR seja o mais reconhecido marcador de ação da IL-6,
vários outros fatores dependentes dessa citocina podem contribuir para o risco
cardiovascular, tais como o fibrinogênio, além das células endoteliais e células
musculares lisas que são alvos de ação da IL-6 (WISE, 2004).
Em estudo realizado por Rauchhaus e colaboradores (2000), pacientes
portadores de falência cardíaca crônica, com níveis séricos de IL-6 superiores
a 29,71 pg/mL apresentaram risco relativo de 2,11 para óbito dentro de um
período de 24 meses. Portanto, níveis desta citocina podem predizer
morbidade em pessoas saudáveis e mortalidade naquelas que já apresentaram
algum evento cardiovascular (FRANCISCO et al., 2006).
O tecido adiposo ativamente secreta diversas citocinas pró-inflamatórias e
dessa forma, a associação entre a inflamação e o grau da obesidade é
esperada. Wood et al. (2009) sugerem que a hipertrofia e hiperplasia do tecido
adiposo provoquem um compressão dos vasos sanguíneos que irrigam esse
27
tecido e dessa forma se instale um processo de hipóxia local, desencadeando
o início da angiogênese e da cascata de resposta inflamatória.
28
2. OBJETIVOS
29
2.1. Objetivo geral
Avaliar biomarcadores de status oxidativo e do processo inflamatório em
mulheres obesas atendidas no Ambulatório de Endocrinologia da Santa Casa
de Belo Horizonte e correlacioná-los com variáveis antropométricas, lipídicas e
clínicas.
2.2. Objetivos específicos
•
Avaliar os níveis plasmáticos de Malondialdeído (MDA) através da
detecção de substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBARS) entre
mulheres eutróficas sadias, obesas sem
comorbidades e obesas
hipertensas;
•
Avaliar os níveis do poder antioxidante do plasma pelo método Ferric
Reducing Antioxidant Power (FRAP) entre mulheres eutróficas sadias,
obesas sem comorbidades e obesas hipertensas;
•
Avaliar os níveis plasmáticos de Glutationa reduzida (GSH) entre mulheres
eutróficas sadias, obesas sem comorbidades e obesas hipertensas;
•
Avaliar os níveis plasmáticos de Vitamina E entre mulheres eutróficas
sadias, obesas sem comorbidades e obesas hipertensas;
•
Avaliar os níveis plasmáticos de Interleucina-6 (IL-6) entre mulheres
eutróficas sadias, obesas sem comorbidades e obesas hipertensas;
•
Quantificar os índices antropométricos IMC, CA e RCQ e correlacioná-los
com os biomarcadores de status oxidativo TBARS-MDA, FRAP, GSH e
vitamina E e de inflamação IL-6;
30
•
Quantificar os níveis lipídicos HDL, LDL, triglicérides e colesterol total e
correlacioná-los aos biomarcadores de status oxidativo TBARS-MDA,
FRAP, GSH e vitamina E e de inflamação IL-6;
•
Avaliar os parâmetros clínicos idade e pressão arterial e correlacioná-los a
os biomarcadores de status oxidativo TBARS-MDA, FRAP, GSH e vitamina
E e de inflamação IL-6;
•
Avaliar os níveis de Interleucina-6 em relação aos biomarcadores de status
oxidativo MDA, FRAP, GSH e Vitamina E.
31
3. MATERIAL E MÉTODOS
32
3.1. Casuística
O presente estudo é parte integrante de um projeto maior sobre o tema
obesidade: Comparação do status inflamatório entre os pacientes obesos grau
lII portadores de alteração metabólica e os "metabolicamente saudáveis" e foi
aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa (CEP) do Hospital Santa Casa de
Misericórdia de Belo Horizonte (Anexo 1).
Esclarecimentos sobre os objetivos da pesquisa foram feitos aos indivíduos
selecionados e aqueles que se mostraram de acordo assinaram o Termo de
Consentimento Livre e Esclarecido (TCLE) (Anexo 2).
Os participantes obesos do estudo foram selecionados no serviço público
do Ambulatório de Obesidade do Centro de Especialidade Médica (CEM) de
Belo
Horizonte, Minas Gerais, após a realização
de consulta com
endocrinologista. Uma ficha clínica contendo informações do participante foi
preenchida de forma cuidadosa durante a abordagem do paciente que em
seguida era encaminhado a um local adequado, para realização de coleta de
sangue por um profissional capacitado.
Os participantes do grupo controle foram selecionados a partir da comunidade
em geral e em locais de fácil acesso ao pesquisador, de maneira que
atendessem aos critérios de inclusão do estudo. O grupo foi selecionado com o
objetivo de homogeneidade em relação às variáveis idade, sexo e índice de
massa corporal (IMC).
3.1.1. Seleção das participantes do estudo
O perfil de pacientes que frequentam o Ambulatório de Obesidade do CEM é
predominantemente feminino. Devido a essa particularidade, o presente estudo
se propôs a pesquisar exclusivamente mulheres.
As participantes foram selecionadas no período entre setembro de 2010
e março de 2011. Após validarem sua participação assinando o TCLE, foram
33
incluídas no estudo um total de 91 mulheres, com faixa etária entre 18 e 60
anos de idade, as quais foram distribuídas em 3 grupos:
Grupo Ct (n= 21): grupo controle com mulheres sadias não obesas;
Grupo Ob (n= 33): grupo de mulheres obesas sem comorbidades;
Grupo Ob-Ht (n =37): grupo de mulheres obesas hipertensas sem tratamento
anti hipertensivo.
3.2. Critérios de inclusão
Sexo feminino
Obesidade (IMC ≥ 30 kg/m2) para o grupo caso
Eutrofia (IMC ≥ 18,5 kg/m2 e < 25 kg/m2) para o grupo controle
Faixa etária entre 18 e 60 anos
Concordância em participar do estudo e assinatura do TCLE
3.3. Critérios de exclusão
Sexo masculino
Idade inferior a 18 anos e superior a 60
Existência de gravidez
Mulheres com IMC < 30 kg/m2 para o grupo caso
Mulheres abaixo do peso (IMC < 18,5 Kg/m 2) ou em sobrepeso (IMC ≥ 25
kg/m2 e < 30 kg/m2) para o grupo controle
34
Terapia de reposição hormonal para ambos os grupos
Portadoras de neoplasias, hipertensão arterial sistêmica (HAS) e Diabetes
Mellitus (DM), insuficiência renal crônica (IRC) ou insuficiência hepática para o
grupo controle.
Portadoras de neoplasias, Diabetes Mellitus, doença auto-imune, insuficiência
renal crônica ou insuficiência hepática para os grupos das obesas.
Observação: a exclusão de participantes portadoras de DM fez-se através da
identificação da resistência à insulina utilizando-se valores de glicemia de jejum
e teste de tolerância à glicose.
3.4. Amostras biológicas
As amostras de sangue foram coletadas em 4,5 mL de anticoagulante ácido
etilenodiaminotetracético (EDTA) para obtenção do plasma. A coleta dessas
amostras foi efetuada com o auxílio de tubos do sistema Vacuette®, sendo
rapidamente centrifugadas a 3.000 g por 10 minutos para separação das
amostras de plasma. Em seguida, foram distribuídas em várias alíquotas,
armazenadas em tubos eppendorfs e imediatamente estocadas à - 80º C até o
momento da realização dos testes.
3.5. Delineamento experimental
Os parâmetros avaliados neste estudo foram:
3.5.1. Parâmetros Bioquímicos
Malondialdeído (MDA-TBARS)
Ferric Reducing Antioxidant Power (FRAP)
35
Glutationa reduzida (GSH)
Vitamina E
Interleucina-6 (IL-6)
3.5.2. Parâmetros Antropométricos
Índice de massa corporal (IMC)
Circunferência abdominal (CA)
Relação circunferência quadril (RCQ)
3.5.3. Parâmetros Lipídicos
Lipoproteína de alta densidade (HDL)
Lipoproteína de baixa densidade (LDL)
Colesterol total
Triglicérides
3.5.4. Parâmetros Clínicos
Idade
Pressão arterial sistólica (PAS)
Pressão arterial diastólica (PAD)
36
3.6. Métodos
3.6.1. Fatores de risco
Os participantes foram entrevistados em uma sala de espera do ambulatório de
obesidade, onde foi aplicado um questionário para preenchimento de
informações relacionadas ao estudo: idade, peso, altura.
A avaliação dos fatores de risco foi baseada nas recomendações das III
Diretrizes Brasileiras sobre Dislipidemias e Prevenção de Aterosclerose
(Sociedade Brasileira de Cardiologia, 2007). Os critérios seguem abaixo:
 Hipertensão: pressão arterial sistólica ≥ 140 mmHg e/ou pressão arterial
diastólica ≥ 90 mmHg, ou indivíduos com diagnóstico prévio de
hipertensão arterial em uso regular de medicamentos anti-hipertensivos;
 Obesidade: índice de massa corporal (IMC) ≥ 30 kg/m2. Indivíduos com
IMC < 18,5 kg/m2 foram considerados abaixo do peso e IMC entre 2529,9 kg/m2 foram considerados acima do peso ou sobrepeso (REZENDE
et al., 2006).
3.6.2. Parâmetros bioquímicos
3.6.2.1. Malondialdeído (MDA)
O teste de determinação de MDA no plasma baseia-se na detecção de
substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico – teste TBARS-MDA (COSTA et al.,
2006).
Esse método consiste na medida de um cromógeno róseo formado através da
reação do MDA com duas moléculas de ácido tiobarbitúrico, em meio ácido e
em alta temperatura, sendo essa reação chamada de “teste de substâncias
reativas ao ácido tiobarbitúrico” (TBARS – thio barbituric acid-reactive
substances).
37
Em tubos de ensaio marcados, foram pipetados 100 µL de plasma
homogeneizado em vórtex, branco e padrão. Em cada tubo, foi adicionado 1mL
de reagente de cor TBA-TCA-HCl (TBA: 0,375%,TCA:15%, HCL: 0,25N).
As amostras foram aquecidas a 100º C em banho-maria durante 30 minutos,
em seguida, submetidas a resfriamento através de banho de gelo por 5 minutos
e centrifugadas a 3000 g durante 10minutos.
Para a curva de calibração, foram pipetados em duplicata 200 µL dos padrões
de solução TMP (tetrametoxipropano), de acordo com a Tabela 3 e o branco.
Tabela 3 - Concentrações usadas para a curva de calibração, teste TBARSMDA
Ponto da curva
Concentração (µM)
P1
250,00
P2
125,00
P3
62,50
P4
31,25
P5
15,62
P6
7,82
Para as amostras, foram pipetados 200 µL do sobrenadante em placa de 96
poços. A análise foi feita através de leitura em espectrofotômetro a 535 nm.
Os resultados foram plotados em planilha Excel com os valores de TMP (µM)
no eixo X e as respectivas medidas de absorbância no eixo Y. Foi calculada a
equação da reta da curva padrão e a partir dela, foram calculados os valores
de MDA de cada amostra, expressos em µM (ou µmol/L).
38
3.6.2.2. Ferric Reducing Antioxidant Power (FRAP)
O teste de determinação da atividade antioxidante total do plasma baseia-se no
método de detecção do poder antioxidante de redução do ferro – teste FRAP
(BENZIE et al., 1996)
O ensaio FRAP identifica a capacidade dos antioxidantes da amostra em
reduzir, em meio ácido, o complexo 2,4,6-tripyridyl-s-triazine férrico ([Fe(III)(TPTZ)2]3+ no complexo ferroso de cor azul intensa [Fe(II)-(TPTZ)2]2+.
Previamente, foram preparadas as seguintes soluções:
A - Tampão Acetato 0,3 M, pH 3,6;
B - Solução de TPTZ (2,4,6-tripyridyl-s-triazine, Sigma, nº cat T1253-5G,
PM= 312,34 g/mol) a 10 mM;
C - Solução de cloreto férrico 20 mM (0,02 M);
D - Solução de reagente FRAP, que consiste na mistura das soluções A, B, C
na razão 10:1:1, preparada, exatamente no dia da análise.
Para a curva padrão foi preparada, no dia da análise, uma solução padrão
0,05M de sulfato ferroso em tampão acetato [0,0695 g sulfato ferroso
(FeSO4.7H2O) em 5 mL de tampão acetato 0,3M]. Os pontos da curva padrão
seguiram as diluições demonstradas na Tabela 4.
Tabela 4 - Escala de diluições usadas para definir a curva padrão, teste FRAP
Ponto da curva
Concentração final (µM)
P1
1000,0
P2
500,0
P3
250,0
P4
125,0
P5
62,5
39
Na placa de 96 poços foram pipetados 10 µL de água miliQ e 300 µL de
solução FRAP para o preparado branco; 10 µL em duplicata de cada ponto da
curva padrão adicionados de 300 uL de solução FRAP e 10 µL de plasma
adicionados de 300 uL de solução FRAP.
A placa foi incubada em espectrofotômetro a 37º C por 4 minutos e a leitura
realizada a 593 nm.
Para o cálculo dos resultados foram plotadas em planilha Excel, no eixo X do
gráfico, as concentrações da curva padrão realizada com sulfato ferroso (µM) e
no eixo Y foram dispostas as respectivas médias da duplicata das
absorbâncias. Dessa forma, a equação da reta da curva padrão foi calculada e
partir dela foram extraídos os valores de FRAP da amostra expressos em µM.
3.6.2.3. Glutationa Reduzida (GSH)
O ensaio de determinação da GSH é baseado na reação da glutationa com o
DTNB
[5,
5`-
dithiobis-(2-nitrobenzoic
acid)]
produzindo
TNB
(glutathioneadductof GSH), um reagente de cor amarela. A taxa de formação
do reagente TNB é proporcional à quantidade de glutationa da amostra
(COSTA, 2006).
Previamente, foram preparadas as seguintes soluções:
A - Tampão Tris 0,25 mM – EDTA 20 mM, pH 8,2
B - Solução de DTNB 10 nM (0,01M)
Para a curva padrão foi preparada uma solução glutationa (forma reduzida) a
2M.
Os pontos da curva padrão seguiram as diluições demonstradas na
Tabela 5.
40
Tabela 5 - Escala de diluições usadas para definir a curva padrão, teste GSH
Ponto da curva
Concentração final (µM)
P1
2000
P2
1000
P3
500
P4
250
P5
125
P6
62,5
Foram pipetados no tubo de ensaio 25 µL de água miliq e 1000 µL de tampão
Tris-EDTA para fazer o branco; 25 µL em duplicata no tubo de ensaio de cada
ponto da curva padrão adicionado de 1000 µL de tampão Tris-EDTA e
pipetados na placa 200 µL da solução existente no tubo de ensaio.
A placa teve a leitura realizada a 412 nm e posteriormente em cada tubo de
ensaio, inclusive o branco, foi adicionado 25 µL da solução DTNB.
Os tubos de ensaio foram incubados em temperatura ambiente por 30 minutos
e em seguida foi realizada a leitura a 412 nm.
Para o cálculo dos resultados foram plotadas em planilha Excel, no eixo X do
gráfico, as concentrações da curva padrão realizada com GSH (forma
reduzida) e no eixo Y foram dispostas as respectivas médias da duplicata das
absorbâncias. Dessa forma, a equação da reta da curva padrão foi calculada e
partir dela foram extraídos valores expressos em mM.
3.6.2.4. Vitamina E
Para a determinação da vitamina E (alfa-tocoferol) plasmática (ARNAUD et al,
1991) foram pipetados 0,5 mL de plasma em 1 mL de etanol absoluto. Após
41
agitação em vórtex, foram pipetados 1 mL de n-hexano e novamente agitados
por 2 minutos.
A seguir o conteúdo é centrifugado por 10 minutos a 3000 g e 0,5 mL do
sobrenadante (n-hexano) é retirado e seco cuidadosamente sob nitrogênio. A
amostra foi resuspensa em 0,5 mL de fase móvel, agitada e injetada no HPLC.
Dados em µM.
3.6.2.5. Interleucina-6 (IL-6)
Para a medição quantitativa de IL-6 plasmática foi realizado um ensaio
imunoenzimático (ELISA) usando o kit IL-6 EASIA (Biosource Technologies,
Inc.).
Previamente, foram preparadas as soluções: Padrão (plasma humano),
controle (plasma humano com conservantes), solução B (tampão com
conservantes), solução de lavagem, cromógeno (TMB) e solução de parada.
Foram pipetados 50 μL da solução B nos poços da placa referentes às
amostras padrão e controle. Em seguida foram pipetados 100 μL de cada
controle, padrão e amostra com posterior incubação em temperatura ambiente
durante um hora em agitador horizontal a 700 rpm. Após esse período, o
conteúdo de cada poço foi aspirado e a placa lavada por três vezes com a
solução de lavagem.
Foram pipetados 200 μL de cromógeno em cada poço e a placa foi incubada
por 15 minutos em temperatura ambiente em agitador horizontal a 700 rpm.
Posteriormente foram pipetados 100 μL de solução de parada em cada poço e
realizada a leitura de absorbância em 450 nm. Os pontos da curva padrão
seguiram as diluições demonstradas na Tabela 6.
42
Tabela 6 - Escala de diluições usadas para definir a curva padrão, kit IL-6
EASIA
Padrão (pg/mL)
Densidade Óptica
0
0,036
16
0,102
45
0,241
147
0,744
462
2,237
1690
3,878
Para o cálculo dos resultados foram plotadas em planilha Excel, no eixo X do
gráfico, as concentrações da curva padrão e no eixo Y foram dispostos os
valores das absorbâncias. Dessa forma, a equação da reta da curva padrão foi
calculada e partir dela foram extraídos os valores de IL-6 expressos em pg/mL.
3.6.3. Parâmetros Antropométricos
3.6.3.1. Índice de Massa Corporal (IMC)
Peso e altura dos participantes foram aferidos para a determinação dos
respectivos IMCs. A aferição do peso foi feita através de balança portátil com
precisão de 0,1 kg e a altura através de um estadiômetro graduado em
centímetros. Todas as medidas antropométricas foram realizadas com os
participantes trajando roupas leves e sem calçados, na posição ortostática e
com os pés juntos.
O IMC foi calculado aplicando-se a seguinte fórmula:
IMC =.. peso (kg)___
(altura)2 (m2)
43
A partir dos valores de IMC encontrados, os participantes foram separados em
grupos de acordo com a classificação da Organização Mundial de Saúde
(OMS) (2000) (Tabela 7):
Tabela 7 - Classificação do estado nutricional de acordo com IMC (OMS/WHO2000)
Classificação
Baixo peso
IMC (kg/m2)
< 18,5
Peso normal
18,5 a 24,9
Sobrepeso
25,0 a 29,9
Obeso I
30,0 a 34,9
Obeso II
35,0 a 39,9
Obeso III
≥ 40
3.6.3.2. Circunferência Abdominal (CA)
Para a aferição da circunferência abdominal foi utilizada uma fita métrica de
material inextensível graduada em centímetros, tendo como localização padrão
para a mensuração o ponto entre a última costela e a crista ilíaca, segundo
recomendações da OMS. No momento da aferição os participantes foram
colocados em posição ortostática, com abdômen relaxado, pés unidos e braços
levemente afastados do corpo.
Os valores de circunferência abdominal estabelecidos pela OMS como ponto
de corte para o aumento do risco cardiovascular e complicações metabólicas
são de 80 cm ou mais para mulheres e 94 cm ou mais para homens.
44
3.6.3.3. Relação Cintura Quadril (RCQ)
RCQ é a razão entre a circunferência abdominal e a circunferência do quadril:
RCQ = _circunferência abdominal_
circunferência do quadril
De acordo com o pontos de corte estabelecidos pela OMS, considera-se como
risco para doenças cardiovasculares valores de RCQ ≥ 1 para homens e ≥ 0,85
para mulheres.
3.6.4. Parâmetros lipídicos
Os resultados dos parâmetros lipídicos triglicérides, colesterol total e suas
frações lipoproteína de alta densidade (HDL) e lipoproteína de baixa densidade
(LDL) foram obtidos através de busca aos prontuários e suas dosagens foram
realizadas pelo Serviço de Patologia Clínica que atende o Hospital Santa Casa
de Belo Horizonte.
3.6.5. Parâmetros clínicos
A idade das participantes foi obtida através de um questionário realizado para o
levantamento de informações pertinentes ao estudo. Os valores de PAS e PAD
foram obtidos através de consulta ao prontuário.
3.7. Análise estatística
A análise estatística dos dados e confecções de gráficos foram realizadas
através do programa estatístico PRISM GraphPad Versão 3.0.
Os parâmetros bioquímicos, clínicos, antropométricos e lipídicos foram
primeiramente submetidos ao teste de normalidade. Quando a distribuição se
apresentou normal, foi aplicada estatística paramétrica com realização do teste
45
t de Student; quando os dados não apresentaram distribuição normal foram
utilizados testes estatísticos não paramétricos de Mann- Whitney.
Para realizar a comparação entre três ou mais grupos estudados, em que os
parâmetros apresentaram distribuição normal, foi aplicado o teste de análise de
variância (ANOVA) seguido do teste de Bonferroni. O teste de Kruskal-Wallis
foi empregado em parâmetros que não apresentaram distribuição normal.
A avaliação das correlações entre os diversos parâmetros foi realizada
utilizando Pearson ou Spearman se o teste apresentasse distribuição normal
ou não paramétrica, respectivamente. Foram consideradas como diferenças
significativas valores de p < 0,05.
46
4. RESULTADOS
47
Foram selecionadas, no período entre setembro de 2010 e março de 2011, um
total de 91 mulheres que atenderam aos critérios de inclusão e exclusão para
este estudo e concordaram em participar assinando o TCLE para validar sua
aceitação.
4.1. Caracterização das participantes do estudo
As participantes do estudo foram reunidas em 3 grupos: a) mulhere eutróficas e
sem comorbidades, correspondendo ao grupo controle (Ct) (n= 21), b)
mulheres obesas sem co-morbidades (Ob) (n=33) e c) mulheres obesas
hipertensas (Ob-Ht) (n= 37).
Na Tabela 8 estão apresentadas as informações sobre o perfil clínico das
participantes dos grupos estudados. Não foi observada diferença estatística
entre a idade dos grupos estudados (p > 0,05). Em relação aos parâmetros
antropométricos, a média dos valores de IMC dos grupos Ob e Ob-Ht
apresentou diferença significativa em relação ao grupo Ct (p < 0,001) e os
valores aferidos da circunferência abdominal (CA) e da relação cintura-quadril
(RCQ) dos grupos Ob e Ob-Ht foram significativamente mais altos que aqueles
do grupo Ct (p < 0,001). Como era de se esperar, os valores de pressão arterial
sistólica (PAS) mostraram-se significativamente diferentes em Ob-Ht (p <
0,001) em relação ao grupo Ct, além, de apresentar diferença quando
comparado ao grupo Ob (p < 0,01), não sendo observada diferença estatística
entre os grupos Ct e Ob. Os valores de pressão arterial diastólica (PAD)
apresentaram diferença em relação aos grupos Ct e Ob-Ht (p < 0,05 e p < 0,01
respectivamente). Não foram encontradas diferenças estatísticas de PAS e
PAD entre os grupos Ct e Ob. Em relação aos parâmetros lipídicos, houve
diferença significativa entre os níveis de colesterol dos grupos Ob e Ob-Ht em
relação ao grupo Ct (p < 0,001). Observam-se valores significativamente
diferentes (p < 0,001) de níveis de HDL nos grupos Ob e Ob-Ht em relação ao
grupo Ct, além de diferença (p < 0,01) entre os níveis de LDL dos grupos Ob e
Ob-Ht quando comparado ao grupo Ct. Quanto aos níveis de glicemia,
48
observa-se que apenas o grupo Ob-Ht apresentou valores significativamente
mais altos que o grupo Ct (p < 0,05).
49
Tabela 8 - Perfil dos grupos estudados
Parâmetros
Ct (n=21)
Ob (n=33)
Ob-Ht (n=37)
Idade (anos)
35,38 ± 9,73
40,06 ± 10,40
42,25 ± 10,28
IMC (kg/m2)
21,11 ± 2,11
42,26 ± 6,71*
46,29 ± 9,43*
Circunferência Abdominal (cm)
67,24 ± 3,78
120,90 ± 15,50*
122,30 ± 12,87*
RCQ (cm)
0,74 ± 0,03
0,93 ± 0,10*
0,93 ± 0,08*
PAS (mmHg)
113,57 ± 8,52
123,8 ± 13,07
138,9 ± 24,19*#
PAD (mmHg)
77,14 ± 9,51
77,45 ± 8,55
87,45 ± 13,91*#
Colesterol Total (mg/dL)
122,47 ± 17,29
179,70 ± 40,21*
179,6 ± 39,90*
HDL (mg/dL)
61,60 ± 10,42
46,87 ± 7,65*
48,06 ± 11,78*
LDL (mg/dL)
75,33 ± 9,49
113,10 ± 31,89*
109,70 ± 36,47*
Triglicérides (mg/dL)
92,37 ± 14,14
111,80 ± 63,78
114,10 ± 55,56
Glicemia (mg/dL)
73,26 ± 19,12
85,85 ± 9,28
96,29 ± 21,41*
IMC (índice de massa corporal); RCQ (relação cintura-quadril); PAS (pressão arterial sistólica); PAD (pressão arterial
diastólica); HDL (lipoproteína de alta densidade); LDL (lipoproteína de baixa densidade). Valores expressos em média ±
EP. Análise estatística: ANOVA seguida do teste de Bonferroni. * p < 0,05 quando comparados ao grupo controle. # p <
0,05 quando comparado ao grupo Ob.
50
4.2. Avaliação de marcadores plasmáticos de status oxidativo
Na avaliação dos marcadores plasmáticos de status oxidativo foram realizadas
as quantificações plasmáticas de Malondialdeído (TBARS-MDA), Ferric
Reducing Antioxidant Power (FRAP), Glutationa reduzida (GSH) e Vitamina E.
4.2.1. Malondialdeído (MDA-TBARS)
Diferenças significativas foram observadas nos níveis de TBARS-MDA entre os
grupos das participantes obesas em relação ao grupo controle. Os resultados
demonstraram aumento significativo (p < 0,001) dos níveis de TBARS-MDA nos
grupos Ob (15,33 ± 3,30 μM) e Ob-Ht (14,63 ± 2,86 μM) quando comparados
ao grupo Ct (10,63 ± 2,56 μM). Não houve diferença estatística entre os grupos
Ob e Ob-Ht (p > 0,05) (Figura 5).
T B A R S -M D A (uM )
20
*
*
10
0
Ct
Ob
Ob-Ht
Figura 5 - Níveis plasmáticos de TBARS-MDA (µM) do grupo controle e dos
grupos Ob e Ob-Ht. * p < 0,001 comparado ao grupo controle. Valores
expressos em média ± EP. Análise estatística: ANOVA seguida de teste de
Bonferroni.
51
4.2.2. – Ferric Reducing Antioxidant Power (FRAP)
Os níveis de FRAP não apresentaram diferença estatística (p > 0,05) entre os
três grupos estudados (Figura 6).
F R A P (u M )
750
500
250
0
Ct
Ob
Ob-Ht
Figura 6 - Níveis plasmáticos de FRAP (μM) dos grupos controle, obesas e
obesas hipertensas. Valores expressos em média ± EP. Análise estatística:
ANOVA seguida de teste de Bonferroni. p > 0,05
4.2.3. - Glutationa reduzida (GSH)
Os níveis de GSH apresentaram diferença significativa entre os grupos das
participantes obesas e o grupo controle (p < 0,001). Observa-se que ocorre
diminuição significante dos níveis de GSH (mM) nos grupos Ob (0,21 ±
0,07mM) e Ob-Ht (0,23 ± 0,09 mM) em relação ao grupo controle (0,54 ± 0,01
mM) (Figura 7).
52
G S H (m M )
0 .7 5
0 .5 0
0 .2 5
*
*
Ob
Ob-Ht
0 .0 0
Ct
Figura 7 - Níveis plasmáticos de GSH (mM) dos grupos Ct, Ob e Ob-Ht. * p <
0,001 comparado ao grupo controle. Valores expressos em média ± EP.
Análise estatística: ANOVA seguida de teste de Bonferroni.
4.2.4. - Vitamina E
Não foi observada diferença estatística entre os níveis de Vitamina E dos três
grupos estudados (Figura 8).
53
V itam in a E (u M )
30
20
10
0
Ct
Ob
Ob-Ht
Figura 8 - Níveis plasmáticos de Vit E (μM) dos grupos controle, obesas e
obesas hipertensas. Valores expressos em média ± EP. Análise estatística:
ANOVA seguida de teste de Bonferroni. p > 0,05
4.3. Correlação entre marcadores de status oxidativo
Nesse estudo foram avaliadas as possíveis correlações existentes entre os
marcadores de status oxidativo analisados. Em relação aos níveis de TBARSMDA, FRAP, GSH e vitamina E, a análise estatística realizada pelo teste de
Bonferroni demonstrou que os grupos Ob e Ob-Ht não apresentaram diferença
estatística entre si, portanto, foi possível reuní-los em um único grupo de
obesos para avaliar as correlações entre os marcadores de status oxidativo.
Dessa forma os grupos foram divididos em grupo controle e grupo incluindo
todos os obesos. Nos dois grupos não foi observada correlação significante (p
> 0,05) entre nenhum dos marcadores avaliados (Tabela 9). Todas as análises
apresentaram distribuição normal e foi aplicado o teste de Pearson para as
correlações.
54
Tabela 9 - Avaliação da correlação entre TBARS-MDA, FRAP, GSH e Vitamina
E nos grupos controle (Ct) e todos os obesos
TBARS-MDA
FRAP
GSH
Ct
Todos
Ob
Ct
Todos
Ob
Ct
Todos
Ob
-
-
-
-
-
-
FRAP (µM)
NS
NS
-
-
-
-
GSH (mM)
NS
NS
NS
NS
-
-
Vit E (µM)
NS
NS
NS
NS
NS
NS
TBARS-MDA (μM)
NS – não significante (p > 0,05).
4.3.1. Correlação entre marcadores de status oxidativo e parâmetros
antropométricos
Foram avaliadas as possíveis correlações existentes entre marcadores de
status oxidativo e parâmetros antropométricos dos grupos controle e total de
obesos. Apenas entre TBARS-MDA e IMC do grupo de obesos foi encontrada
correlação positiva significativa (r = 0,43 e p = 0,0004). Todas as análises
apresentaram distribuição normal seguidado teste de Pearson (Tabela 10 e
Figura 9).
55
Tabela 10 - Avaliação da correlação entre TBARS-MDA, FRAP, GSH, Vitamina
E e parâmetros antropométricos IMC, CA e RCQ nos grupos controle (Ct) e
total de obesos
TBARS-MDA
FRAP
GSH
Vit E
(µM)
(µM)
(mM)
(µM)
Ct
2
IMC (kg/m )
NS
Todos
Ob
r = 0,43
Ct
Todos
Ob
Ct
Todos
Ob
Ct
Todos
Ob
NS
NS
NS
NS
NS
NS
p=
0,004
CA (cm)
NS
NS
NS
NS
NS
NS
NS
NS
RCQ
NS
NS
NS
NS
NS
NS
NS
NS
NS – não significante (p > 0,05); r= coeficiente de correlação de Pearson
p = 0 ,0 0 0 4 *
r = 0 ,4 3
2
I M C ( k g /m )
100
75
50
25
0
0
10
20
30
M D A (uM )
Figura 9 - Correlação entre IMC (kg/m2) e níveis plasmáticos de TBARS-MDA
(µM) do grupo total de obesas. * p = 0,004; r = coeficiente de correlação de
Pearson.
56
A Figura 10 apresenta os valores de TBARS-MDA estratificados pelos valores
de IMC. Houve diferença significativa das médias de IMC dos obesos
pertencentes aos grupos IMC 40-49,9 kg/m2 (14,62 ± 2,58 µM) e IMC > 50
kg/m2 (15,19 ± 4,39µM) quando comparados ao grupo controle (10,63 ± 2,56
µM), apresentando (p < 0,001) e (p < 0,01), respectivamente. Não foi
encontrada diferença estatística entre as categorias de IMC dos obesos
hipertensos e sem hipertensão, quando comparados entre si (p > 0,05).
20
T B A R S -M D A ( u M )
*
*
10
0
Ct
30-39,9
40-49,9
> 50
2
IM C ( k g /m )
Figura 10 - Níveis plasmáticos de TBARS-MDA (µM) de acordo com IMC
(kg/m2) do grupo controle e total de obesas. * p < 0,05 comparado ao grupo Ct.
Valores expressos em média ± EP. Análise estatística: ANOVA seguida de
teste de Bonferroni.
57
4.4. Correlação entre parâmetros lipídicos e de status oxidativo
Foram avaliadas as possíveis correlações existentes entre os parâmetros
lipídicos e de estresse oxidativo. As seguintes variáveis bioquímicas foram
consideradas para o estudo: HDL (lipoproteína de alta densidade), LDL
(lipoproteína de baixa densidade), triglicérides e colesterol total. Em todas as
análises foram observadas distribuição normal com aplicação do teste de
Pearson para as correlações e teste t de Student ou ANOVA para as
comparações entres as variáveis.
4.4.1.
Correlação
entre
níveis
plasmáticos
de
Malondialdeído
e
parâmetros lipídicos
Os resultados das análises entre os níveis de TBARS-MDA e parâmetros
lipídicos estão apresentados de uma forma geral na Figura 11, de acordo com
seus respectivos valores de referência. Foi observada diferença quando os
valores de TBARS-MDA foram agrupados em triglicérides abaixo de 150 mg/dL
(14,52 ± 2,35µM) e acima de 150 mg/dL (16,65 ± 3,74µM) (p < 0,05). Os
parâmetros lipídicos HDL, LDL e colesterol total não apresentaram diferença
estatística entre as médias dos resultados de TBARS-MDA agrupados segundo
seu valor de referência (p > 0,05). Todos os valores citados apresentaram
distribuição normal.
58
20
T B A R S -M D A (uM )
*
10
0
<50
>50
HDL
<100
LDL
>100
<150
>150
T r ig lic é r id e s
< 200
> 200
C o le s t e r o l
m g /d L
Figura 11 – Níveis plasmáticos de TBARS-MDA (µM) das participantes do estudo de acordo com níveis
lipídicos analisados (mg/dL). * p < 0,05 comparado ao < 150. Análise estatística: Teste t de Student.
59
A Figura 12 apresenta as correlações entre TBARS-MDA e os parâmetros
lipídicos avaliados no estudo de todos os participantes. Observa-se correlação
negativa com diferença significativa entre os níveis plasmáticos de TBARSMDA e HDL (r = - 0,34 e p = 0,0038). Já a correlação entre TBARS-MDA e os
parâmetros lipídicos LDL, triglicérides e colesterol total apresentaram diferença
significativa positiva (r = 0,29 e p = 0,01), (r = 0,37 e p = 0,0026) e (r = 0,46 e p
< 0,0001), respectivamente.
B
A
30
r = - 0 ,3 4
M D A -TB A R S (uM )
30
20
10
M D A -TB A R S (uM )
p = 0 ,0 0 3 8 *
p = 0 ,0 1 *
r = 0 ,2 9
20
10
0
0
0
25
50
75
0
100
C
100
150
200
250
D
p = 0,0026*
30
20
10
0
p < 0 ,0 0 0 1 *
30
r = 0,37
r = 0 ,4 6
M D A -T B A R S (u M )
M D A -TB A R S (uM )
50
L D L (m g /d L )
H D L (m g /d L )
20
10
0
0
100
200
T r ig lic é r id e s ( m g / d L )
300
0
100
200
300
C o le s t e r o l t o t a l ( m g / d L )
Figura 12 – Correlação entre níveis plasmáticos de TBARS-MDA (µM) e
parâmetros lipídicos (mg/dL) de todas as participantes do estudo. A. correlação
entre TBARS-MDA e HDL (* p < 0,05). B. correlação entre TBARS-MDA e LDL
(* p < 0,05). C. correlação entre TBARS-MDA e triglicérides (* p < 0,05).
D. correlação entre TBARS-MDA e colesterol total (* p < 0,0001). r = coeficiente
de correlação de Pearson.
60
4.4.2. Correlação entre níveis plasmáticos de FRAP (Ferric Reducing
Antioxidant Power) e parâmetros lipídicos
As análises entre níveis plasmáticos de FRAP e parâmetros lipídicos de acordo
com seus respectivos valores de referência de todas as participantes do estudo
estão apresentadas de uma forma geral na Figura 13. Nenhum parâmetro
lipídico apresentou diferença estatística entre as médias dos resultados
(p > 0,05). Todas as análises apresentaram distribuição normal.
A Tabela 11 apresenta as correlações entre os níveis de FRAP e os
parâmetros lipídicos de todas as participantes do estudo. Não houve correlação
entre FRAP e triglicérides, colesterol total e LDL (p > 0,05). Observou-se
correlação com diferença positiva entre FRAP e HDL (* p < 0,05 e r = 0,32)
(Figura 14) e uma tendência à correlação positiva entre FRAP e LDL.
Tabela 11 - Correlações entre níveis de FRAP e parâmetros lipídicos
FRAP (µM)
Parâmetros lipídicos
p
r
HDL (mg/dL)
0,029*
0,32
LDL(mg/dL)
0,057
- 0,26
Triglicérides (mg/dL)
0,236
- 0,18
Colesterol total (mg/dL)
0,187
- 0,18
61
F R A P (u M )
900
600
300
0
< 50
> 50
HDL
<100
LDL
>100
<150
>150
T r ig lic é r id e s
< 200
> 200
C o le s t e r o l
m g /d L
Figura 13 – Níveis plasmáticos de FRAP (µM) das participantes do estudo separados de acordo com os
pontos de corte dos níveis lipídicos analisados (mg/dL). p > 0,05. Análise estatística: Teste t de Studen
62
1250
p = 0 ,0 2 9 *
r = 0 ,3 2
FR A P (uM )
1000
750
500
250
0
0
25
50
75
100
H D L (m g /d L )
Figura 14 - Correlação entre níveis plasmáticos de FRAP (µM) e HDL (mg/dL)
de todos as participantes do estudo. * p < 0,05; r = coeficiente de correlação
de Pearson.
4.4.3. Correlação entre níveis plasmáticos de Glutationa Reduzida (GSH) e
parâmetros lipídicos
Os resultados observados a partir das análises entre os níveis de GSH e os
parâmetros lipídicos separados de acordo com seus valores de referência,
estão representados de uma forma geral na Figura 15. Foi encontrada
diferença estatística quando os níveis de GSH foram separados de acordo com
os valores de HDL abaixo de 50 mg/dL (0,26 ± 0,14 µM) e acima de 50 mg/dL
(0,39 ± 0,17 µM). Também foi observada diferença estatística nos valores de
GSH quando estes foram agrupados de acordo com níveis de LDL menores
que 100 mg/dL (0,40 ± 0,18 µM) e maiores que 100 mg/dL (0,23 ± 0,06 µM). Já
entre os parâmetros lipídicos triglicérides e colesterol total não foi observada
diferença estatística entre as médias dos valores de GSH agrupados segundo
seus valores de referência (p > 0,05). Todas as análises apresentaram
distribuição normal.
63
0 .5
*
*
>50
<100
G S H (m M )
0 .4
0 .3
0 .2
0 .1
0 .0
<50
HDL
LDL
>100
<150
>150
T r ig lic é r id e s
< 200
> 200
C o le s t e r o l
m g /d L
Figura 15 - Níveis plasmáticos de GSH (mM) das participantes do estudo de acordo com níveis
lipídicos analisados (mg/dL). * p < 0,05. Análise estatística: Teste t de Student.
64
A Figura 16 demonstra as correlações entre GSH e os parâmetros lipídicos de
todas as participantes do estudo. Observa-se correlação positiva com diferença
significativa entre os níveis plasmáticos de GSH e HDL (r = 0,52 e p = 0,0003).
Também foi observada correlação negativa com diferença significativa entre
GSH e os parâmetros lipídicos LDL e colesterol total (r = - 0,41 e p = 0,0029; r
= - 0,56 e p = 0,0003, respectivamente). Não foi observada correlação entre
GSH e triglicérides (p > 0,05).
B
A
p = 0 ,0 0 0 3 *
0 .7 5
r = 0 ,5 2
0 .7 5
p = 0 ,0 0 2 9 *
G S H (uM )
G S H (uM )
r = - 0 ,4 1
0 .5 0
0 .5 0
0 .2 5
0 .2 5
0 .0 0
- 0 .2 5
0 .0 0
0
25
50
75
0
100
50
100
150
200
L D L (m g /d L )
H D L (m g /d L )
C
D
p > 0,05
0 .7 5
p = 0 ,0 0 0 3 *
0 .7 5
0 .5 0
G S H (uM )
G S H (uM )
r = - 0 ,5 6
0 .2 5
0 .5 0
0 .2 5
0 .0 0
0 .0 0
- 0 .2 5
0
100
200
T r ig lic é r id e s ( m g / d L )
300
0
100
200
300
C o le s t e r o l t o t a l ( m g / d L )
Figura 16 - Correlação entre níveis plasmáticos de GSH (µM) e parâmetros
lipídicos (mg/dL) de todas as participantes do estudo. A. correlação entre GSH
e HDL (* p < 0,05). B. correlação entre GSH e LDL (* p < 0,05). C. correlação
entre GSH e triglicérides (p > 0,05). D. correlação entre GSH e colesterol total
(* p < 0,05). r = coeficiente de correlação de Pearson.
65
4.4.4. Correlação entre níveis plasmáticos de vitamina E e parâmetros
lipídicos
As análises entre níveis plasmáticos de vitamina E e parâmetros lipídicos, de
acordo com seus respectivos valores de referência, de todas as participantes
do estudo, estão apresentadas de uma forma geral na Figura 17. Foi
encontrada diferença estatística quando os níveis de vitamina E foram
separados de acordo com os valores de HDL abaixo de 50 mg/dL (18,77 ± 1,23
µM) e acima de 50 mg/dL (22,78 ± 0,77 µM). Entre os outros parâmetros
lipídicos não foi encontrada diferença estatística entre as médias dos
resultados (p > 0,05). Todas as análises apresentaram distribuição normal.
A Tabela 12 apresenta as correlações entre os níveis de vitamina E e os
parâmetros lipídicos de todas as participantes do estudo. Não foi observada
correlação entre vitamine E e LDL, triglicérides e colesterol total (p > 0,05).
Entre vitamina E e HDL observou-se correlação com diferença positiva (* p <
0,05 e r = 0,46) (Figura 18).
Tabela 12 - Correlações entre níveis de vitamina E e parâmetros lipídicos
Vitamina E (uM)
Parâmetros lipídicos
p
r
HDL (mg/dL)
0,001*
0,46
LDL (mg/dL)
0,664
0,06
Triglicérides (mg/dL)
0,642
- 0,07
Colestero total (mg/dL)
0,972
- 0,004
66
V itam in a E (u M )
30
*
20
10
0
<50
>50
HDL
<100
LDL
>100
<150
>150
T r ig lic é r id e s
< 200
> 200
C o le s t e r o l
m g /d L
Figura 17 – Níveis plasmáticos de vitamina E (µM) das participantes do estudo de acordo com níveis
lipídicos analisados (mg/dL). * p < 0,05 comparado ao < 50. Análise estatística: Teste t de Student.
67
p = 0 ,0 0 1 *
r = 0 ,4 6
V itam in a E (µ M )
40
30
20
10
0
0
25
50
75
100
H D L (m g /d L )
Figura 18 - Correlação entre níveis plasmáticos de vitamina E (µM) e HDL (mg/dL)
de todas as participantes do estudo. * p < 0,05; r = coeficiente de correlação de
Pearson.
4.5. Correlação entre parâmetros clínicos e de status oxidativo
4.5.1. Correlação entre parâmetros de status oxidativo e idade
Foram avaliadas as correlações entre a idade e os níveis de TBARS-MDA, FRAP,
GSH e vitamina E de todas as participantes do estudo (Figura 19). A análise
demonstra que os níveis plasmáticos de FRAP e vitamina E não apresentaram
correlação com a idade. Foi observada correlação positiva significativa entre
TBARS-MDA e idade (r = 0,29 e p = 0,0068) e correlação negativa significativa entre
GSH e idade (r = - 0,54 e p < 0,0001).
A "Teoria do estresse oxidativo" do envelhecimento afirma que o aumento de
espécies reativas de oxigênio acompanha o envelhecimento, levando a alterações
funcionais, condições patológicas e até mesmo a morte (HAGEN, 2003).
68
B
A
p = 0 ,0 0 6 8 *
FR A P (uM )
M D A (u M )
1500
r = 0 ,2 9
30
20
p > 0 ,0 5
1000
10
500
0
0
0
10
20
30
40
50
60
0
70
10
20
40
50
60
70
Id a d e ( a n o s )
Id a d e ( a n o s )
C
D
p < 0 ,0 0 0 1 *
0 .7 5
0 .5 0
0 .2 5
0 .0 0
p > 0 ,0 5
40
r = - 0 ,5 4
V itam in a E (u M )
G S H (m M )
30
30
20
10
0
0
10
20
30
40
Id a d e ( a n o s )
50
60
70
0
10
20
30
40
50
60
70
Id a d e ( a n o s )
Figura 19 - Correlação entre níveis plasmáticos de parâmetros de status oxidativo e
idade (anos) de todas as participantes do estudo. A. correlação entre TBARS-MDA
(µM) e idade (* p < 0,05). B. correlação entre FRAP (µM) e idade (p > 0,05). C.
correlação entre GSH (mM) e idade (* p < 0,05). D. correlação entre vitamina E (µM)
e idade (p > 0,05). r = coeficiente de correlação de Pearson.
De acordo com o período que é estimado para o início do climatério, estabelecemos
um ponto de corte com a finalidade de auxiliar na compreensão dos limites de idade
estabelecidos pelo estudo.
Verificamos que há correlação significativa entre a idade e os níveis de TBARS-MDA
e GSH. A partir disso, verificamos se existe diferença entre os níveis desses
biomarcadores quando dividimos as participantes em grupos com idade superior e
inferior a 40 anos (Figura 20). A análise mostrou que os valores de TBARS-MDA no
grupo com idade inferior a 40 anos apresentaram média mais baixa (13,30 ± 0,47
µM) que o grupo com idade superior a 40 anos (14,92± 0,58 µM), revelando
69
diferença estatística (p < 0,05). O mesmo observou-se na análise de GSH, em que o
grupo com mais de 40 anos apresentou média superior (0,38 ± 0,02 µM) ao grupo
com idade maior que 40 anos (0,24 ± 0,02 µM), apresentando diferença estatística
(p < 0,05).
B
A
0 .5
*
0 .4
G S H (m M )
TB A R S -M D A (uM )
20
10
*
0 .3
0 .2
0 .1
0
0 .0
< 40
> 40
Id a d e ( a n o s )
< 40
> 40
Id a d e ( a n o s )
Figura 20 - A. Níveis plasmáticos de TBARS-MDA (µM) de acordo com idade. B.
Níveis plasmáticos de GSH (mM) de acordo com idade. * (p < 0,05). Valores
expressos em média ± EP. Análise estatística: Teste t de Student.
4.5.2. Correlação entre parâmetros de status oxidativo e pressão arterial
Foram avaliadas as correlações existentes entre os biomarcadores de status
oxidativo e os dados clínicos referentes aos níveis de pressão arterial sistólica (PAS)
e pressão arterial diastólica (PAD) de todas as participantes do estudo. Não foi
observada correlação (p > 0,05) entre os resultados de todos os biomarcadores
avaliados no estudo, apesar de se observar uma tendência entre PAS e TBARSMDA (Tabela 13).
70
Tabela 13 - Correlações entre níveis de biomarcadores de status oxidativo e
parâmetros clínicos
Parâmetros clínicos
TBARS-
FRAP (µM)
GSH (mM)
Vit E (µM)
p = 0,06
p = 0,66
p = 0,69
p = 0,34
r = 0,21
r = 0,63
r = - 0,25
r = 0,14
p = 0,97
p = 0,24
p = 0,56
p = 0,70
r = - 0,003
r = 0, 17
r = - 0,08
r = - 0,05
MDA (µM)
PAS (mmHg)
PAD (mmHg)
4.6. Avaliação de marcador imunológico de inflamação
Na avaliação dos marcadores de inflamação foi realizada a quantificação plasmática
de interleucina-6 (IL-6).
4.6.1. Interleucina-6
Houve um grande número de amostras com valores de IL-6 que não foram
detectáveis através de nossa análise (85% para grupo controle e 64% para o grupo
total de obesos) (Figura 21). Entre as amostras com valores detectáveis da citocina
não foi identificada diferença significativa entre os grupos Ct, Ob e Ob-Ht (p > 0,05)
(Figura 22).
Devido ao número de amostras com valores não detectáveis de IL-6, optamos por
trabalhar com os níveis de IL-6 das medianas superior e inferior do grupo total de
obesos em relação aos marcadores bioquímicos de status oxidativo TBARS-MDA,
FRAP, GSH e Vitamina E. Entre os parâmetros analisados, não foi encontrada
diferença significativa (p > 0,05) entre as medianas superior e inferior (Figura 23).
71
ND
64%
O besos
Det
36%
ND
85%
C o n t r o le
Det
15%
0
25
50
75
100
(% )
Figura 21 - Porcentagem de amostras detectáveis e não detectáveis de IL-6 após
quantificação plasmática dos grupos controle e total de obesos. ND – não
detectável; Det – detectável.
IL -6 (p g /m L )
1 0 .0
7 .5
5 .0
2 .5
0 .0
Ct
Ob
Ob-Ht
Figura 22 - Níveis plasmáticos de IL-6 (pg/mL) dos grupos controle, obesos e
obesos hipertensos. Valores expressos em média ± EP. Análise estatística: ANOVA
seguida de teste de Bonferroni. p > 0,05.
72
1000
F R A P ( M )
15
(u M )
M D A -T B A R S
20
10
5
800
600
400
200
0
0
M-I
M-I
M-S
30
V it E (u M )
0 .5
G S H (m M )
M-S
0 .4
0 .3
0 .2
20
10
0 .1
0
0 .0
M-I
M-S
M-I
M-S
Figura 23 – Níveis plasmáticos de TBARS-MDA, FRAP, GSH e Vitamina E divididos
de acordo com a mediana inferior e superior de IL-6 do grupo total de obesos.
M-I
– mediana inferior; M-S – mediana superior. (p > 0,05). Valores expressos em média
± EP. Análise estatística: Teste t de Student.
Como é possível que o estresse oxidativo regule a inflamação, optou-se por separar
a mediana superior e inferior de TBARS-MDA do grupo total de obesos e avaliar os
níveis de IL-6 (Figura 24). Não foi encontrada diferença significativa entre as duas
medianas inferior e superior (4,95 ± 1,14 pg/mL) e (4,51 ± 0,95 pg/mL),
respectivamente (p > 0,05).
73
IL -6 (p g /m L )
7 .5
5 .0
2 .5
0 .0
MI
MS
Figura 24 - Níveis plasmáticos de IL-6 divididos de acordo com a mediana inferior e
superior de TBARS-MDA do grupo total de obesos. M-I – mediana inferior; M-S –
mediana superior. (p > 0,05). Valores expressos em média ± EP. Análise estatística:
Teste t de Student.
74
5- DISCUSSÃO
75
5.1. Caracterização dos grupos estudados
O presente trabalho é um estudo caso-controle envolvendo mulheres obesas e
eutróficas. Baseado no efeito do estresse oxidativo sobre o sistema cardiovascular
foram estudados marcadores de estresse oxidativo através da avaliação de fatores
bioquímicos de status oxidativo e inflamação, antropométricos, lipídicos e clínicos.
A estratificação das participantes nos três grupos Ct, Ob e Ob-Ht foi realizada devido
ao interesse em realizar uma análise mais minuciosa dos grupos em relação à
presença de hipertensão arterial nos parâmetros avaliados.
A Tabela 8 demonstra o perfil dos grupos estudados em relação aos fatores de
risco, não sendo observada diferença significativa entre a idade dos grupos Ct, Ob e
Ob-Ht (p > 0,05).
A associação entre hipertensão e obesidade está bem esclarecida, sendo que o
indivíduo obeso tem um risco aumentado de desenvolver hiperglicemia, elevados
níveis lipídicos e pressóricos, inflamação e estresse oxidativo crônicos. Entretanto,
em nosso grupo estudado a presença da hipertensão não parece ser relevante, visto
que as médias dos valores de índice de massa corporal dos grupos Ob e Ob-Ht não
revelaram diferença entre si (p > 0,05). Tal indiferença pode ser devido ao fato dos
pacientes do grupo Ob-Ht não apresentarem médias de PAS e PAD superiores às
estipuladas
como
limítrofe,
identificando
que
esse
grupo
de
hipertensos
provavelmente apresenta bom controle e manutenção pressóricos.
Destaca-se que 75,71% das mulheres obesas estudadas são classificadas como
obesas graves (obesidade grau III). No grupo Ob a obesidade grau III é
representada por 66,66% das participantes, enquanto que no grupo Ob-Ht esse
valor aumenta para 83,78%. A suscetibilidade de indivíduos obesos desenvolveram
HAS relaciona-se com a resistência à insulina e hiperinsulinemia, retenção de sódio
e consequente aumento do volume plasmático e débito cardíaco (PORTO, 1998). A
obesidade grave é fator de risco para várias doenças e/ou comorbidades, entre elas:
diabetes tipo 2, hipertensão arterial, doença arterial coronariana, doença vascular
periférica,
hipercolesterolemia,
hiperlipidemia,
apnéia
do
sono,
insuficiência
respiratória, alguns tipos de neoplasias, distúrbios hormonais, osteoartrite, entre
outras (MELISSA et al., 1998).
76
RCQ e CA são procedimentos antropométricos utilizados na verificação da
distribuição de gordura corporal, porém estudos mostraram que a determinação da
adiposidade central está mais fortemente associada à medida isolada da
circunferência abdominal, tanto em adultos, crianças e adolescentes (MOLARIUS et
al., 1999; TAYLOR et al., 2000) .
Em relação aos parâmetros lipídicos, observou-se que as médias dos níveis de
colesterol total e triglicérides de todos os grupos apresentaram-se em níveis
normais, apesar de haver diferença entre os grupos de obesas e controle em relação
aos níveis de colesterol total. Em outros estudos com obesos também foram
encontrados valores médios normais para colesterol total e triglicérides, além de LDL
e HDL (SILVA & SANCHES, 2006; CARVALHO et al., 2007).
Os valores de HDL dos grupos Ob e Ob-Ht encontraram-se abaixo do valor de
referência, correspondendo a 59,10% e 37,84%, respectivamente, do total de
participantes de cada grupo. Já os valores de LDL nos grupos Ob e Ob-Ht
apresentaram, respectivamente, 73,91% e 52,94% acima dos valores de referência
preconizados pela III Diretrizes Brasileiras Sobre Dislipidemias e Diretriz de
Prevenção da Aterosclerose do Departamento de Aterosclerose da Sociedade
Brasileira de Cardiologia, ou seja, HDL > 50 mg/dL, LDL < 100 mg/dL, triglicérides <
150 mg/dL e colesterol total < 200 mg/dL. Comparando os dados obtidos do nosso
trabalho com um estudo realizado por Araújo et al. (2005), que avaliaram o perfil
sérico de lipídios de 684 indivíduos (sendo 389 mulheres) sem evidências de
cardiopatia, verificaram-se resultados similares em relação ao HDL, com diferença
significante entre eutróficas e obesas (p < 0,01 ) e LDL com valor de p < 0,05 entre
os dois grupos, enquanto que as médias dos níveis plasmáticos de triglicerídeos de
obesas apresentaram-se maiores e estatisticamente diferentes em relação às
mulheres com peso normal, nosso estudo não encontrou diferença estatística entre
esses grupos.
Em estudo com 75 participantes obesos, Myara et al. (2003) não observaram
diferença estatística entre esses indivíduos e o grupo controle com relação a níveis
plasmáticos de colesterol total, triglicérides e LDL, havendo diferença significante (p
= 0,0003) quando avaliados os níveis plasmáticos de HDL.
77
Davi et al. (2002) compararam níveis lipídicos de colesterol total, triglicérides, HDL e
LDL de mulheres eutróficas e com obesidade andróide e ginecóide, encontrando
diferença estatística (p < 0,05) dos níveis de HDL apenas entre o grupo de eutróficas
e obesas com padrão andróide.
Notadamente, 70,69% das obesas do estudo apresentaram níveis de colesterol total
abaixo de 200 mg/dL, sendo que no grupo Ob esse dado foi observado em 72% das
participantes e no grupo Ob-Ht foi representado por 69,70 % das participantes. Em
relação aos níveis de triglicérides, valores abaixo de 150 mg/dL foram observados
em 68,52% do total de obesas, representado por 70,83% das participantes do grupo
Ob e 66,66% das participantes do grupo Ob-Ht. Uma das justificativas para esse
achado talvez esteja no fato de que as participantes obesas do estudo são
acompanhadas por uma equipe multidisciplinar do laboratório de obesidade do
Centro de Especialidades Médicas de Belo Horizonte, sendo orientadas quanto à
reeducação alimentar, hábitos de vida saudáveis, compreensão de seu estado de
saúde, além de receberem apoio psicológico.
Vale lembrar que entre obesos graves a alteração dos valores séricos de lipídios é
muito variável, podendo ser justificado em função de diferentes hábitos alimentares
e grupos raciais (SILVA & SANCHES, 2006).
5.2. Avaliação de marcadores plasmáticos de status oxidativo
O acúmulo de gordura está estreitamente relacionado com o estresse oxidativo e é o
principal fator de desenvolvimento de síndrome metabólica (SM), apesar de ainda
não terem sido completamente elucidados os mecanismos pelos quais o excesso de
tecido adiposo leva à expressão desregulada de adipocitocinas e à SM
(FURUKAWA et al. 2004).
Cabrera et al. (2010) realizaram um estudo com 20 pacientes obesos e observaram
que, no período pré-operatório da cirurgia de obesidade, esses indivíduos
apresentaram níveis mais elevados de marcadores inflamatórios e de estresse
oxidativo, além de índices de defesa antioxidante mais baixos quando comparados à
sujeitos com peso normal. Valezi et al. (2011) avaliaram indicadores de estresse
oxidativo em obesos pré e pós derivação gástrica em Y-de-Roux e observaram que
78
o marcador MDA estava significativamente aumentado (p < 0,001) entre os obesos
em pré-operatório quando comparados ao grupo controle .
Todas as participantes obesas apresentaram aumento significativo (p < 0,001) dos
níveis de TBARS-MDA (Figura 5) e redução significante (p < 0,001) dos níveis de
GSH (Figura 7) quando comparadas ao grupo controle, não havendo diferença
estatística entre os dois grupos de obesas (p > 0,05) e não sendo obsevada
diferença em relação aos níveis de FRAP (Figura 6) e de vitamina E (Figura 8).
Em trabalho realizado por Olusi em 2002, foram encontradas concentrações de MDA
significativamente mais baixas (p < 0,001) em indivíduos com IMC saudável em
comparação com aqueles com IMC acima de 40 kg/m2.
Lopes et al. (2003) compararam os níveis de FRAP entre doze obesos hipertensos e
doze eutróficos normotensos e observaram diferença estatística (p < 0,05) entre os
dois grupos. Após quatro semanas da introdução de uma dieta rica em
antioxidantes, os autores observaram que os níveis de FRAP aumentaram em média
18% no grupo de obesos hipertensos. Em outro estudo, indivíduos obesos
apresentaram níveis estatisticamente mais baixos de FRAP (p < 0,001) em relação
ao grupo controle e após 12 meses de cirurgia gástrica esses níveis não
apresentaram mais diferença significativa entre os dois grupos, possivelmente
indicando que o aumento dos níveis desse biomarcador esteja relacionado à melhor
atividade de agentes antioxidantes e diminuição de marcadores inflamatórios
(VALEZI et al., 2011).
Vale relembrar que as participantes obesas deste estudo foram selecionadas no
Ambulatório de Obesidade do Centro de Especialidade Médicaa (CEM), onde
recebem acompanhamento nutricional visando reeducação alimentar, portanto uma
possível explicação para a não observação de diferença entre os grupos em relação
ao FRAP e vitamina E pode estar relacionada a um maior consumo de alimentos
antioxidantes devido à reeducação alimentar, acompanhamento e orientação
nutricionais periódicos.
Foram observados níveis de GSH mais baixos (p < 0,001) em obesos no préoperatório de derivação gástrica em relação ao grupo controle, sendo que após a
intervenção cirúrgica esses níveis apresentaram aumento significativo (VALEZI et
79
al., 2011). Nesse mesmo estudo observou-se correlação inversa entre os níveis de
GSH e FRAP (r = - 0,484 e p < 0,05), evidenciando que quanto mais altos os níveis
de FRAP, menores são os níveis de GSH.
A vitamina E é encontrada em lipoproteínas, membranas celulares e fluidos
extracelulares. Essa vitamina lipofílica com ação antioxidante converte O2- e OH- em
formas menos reativas, limitando o processo de peroxidação lipídica (VINCENT &
TAYLOR, 2006). Myara et al. (2003) encontraram concentrações mais baixas de
vitamina E (μM) em sujeitos com IMC acima de 35 kg/m 2 em relação ao grupo
controle com indivíduos eutróficos, sendo p = 0,005 quando comparados ao grupo
com IMC entre 35 e 39,9 kg/m2, p = 0,002 quando comparados aos indivíduos com
IMC entre 40 e 50 kg/m2 e p = 0,003 quando o IMC fosse maior que 50 kg/m2. Em
um estudo que avaliou as concentrações séricas de tocoferol em 906 indivíduos
suecos foi encontrada correlação inversamente significativa entre α-tocoferol e a
circunferência abdominal (r = - 0,24 e p = 0,0001) (OHRVALL. 1993).
Os resultados obtidos em nosso estudo demostraram que a presença de
hipertensão arterial, como fator isolado, não influenciou nos níveis plasmáticos dos
marcadores de status oxidativo estudados, visto que a análise estatística revelou
que os grupos Ob e Ob-Ht não apresentaram diferença estatística entre si em
relação aos níveis de MDA, FRAP, GSH e vitamina E. Uma vez que a HAS por si só
pode gerar estresse oxidativo, esperava-se encontrar resultados contrários aos que
foram achados, uma vez que no grupo Ob-Ht os obesos com IMC acima de 40 kg/m2
representam 83,78% dos participantes do grupo.
Em um estudo com 130 indivíduos eutróficos e obesos normotensos e hipertensos,
observou-se que níveis plasmáticos de TBARS estavam significativamente
aumentados nos participantes eutróficos hipertensos quando comparados aos
eutróficos normotensos (p < 0,001) e entre obesos com e sem hipertensão essa
diferença foi de p < 0,01 (KONUKOĞLU, et al., 2003).
Uma das limitações da maioria dos biomarcadores de status oxidativo é seu valor
limitado in vivo devido à falta de sensibilidade e/ou especificidade, sendo que in vitro
podem-se encontrar melhores resultados (TARPEY, 2004; GIUSTARINI, 2004).
Além disso, para que os biomarcadores identifiquem de forma eficaz as alterações
80
oxidativas é imprescindível que o acúmulo dos produtos da oxidação esteja em
concentrações que tornem possível sua detecção (DALLE-DONNE, et al, 2006).
5.3. Correlação entre marcadores de status oxidativo
As participantes pertencentes ao grupo Ob e Ob-Ht foram reunidas em um único
grupo de obesas para se avaliar o efeito dos índices antropométricos sobre os níveis
dos marcadores de status oxidativo. Nos grupos Ct e total de obesos não foi
observada correlação significante (p > 0,05) entre nenhum dos marcadores
avaliados (Tabela 9). Esperava-se encontrar aumento da atividade antioxidante
entre as obesas avaliadas, visto que os níveis de TBARS-MDA nesse grupo estão
aumentados. Entretanto isso não foi observado, sugerindo que possa ter ocorrido
uma possível falência que poderia reequilibrar os níveis de estresse oxidativo.
Block et al. (2002) avaliaram 298 adultos saudáveis, sendo 177 mulheres, e não
encontraram associação entre vitamina E plasmática (α-tocoferol) e MDA. A
atividade antioxidante da vitamina E plasmática está relacionada à prevenção da
peroxidação lipídica induzida por radicais livres, íons férricos e cúpricos ou outros
oxidantes (DEMIRKAYA & KADIOGLU, 2007).
5.4. Correlação entre marcadores de status oxidativo e parâmetros
antropométricos
Foram avaliadas as possíveis correlações existentes entre esses marcadores e
parâmetros antropométricos e apenas entre TBARS-MDA e IMC do grupo de obesos
foi encontrada correlação positiva significativa (r = 0,43 e p = 0,004) (Tabela 10 e
Figura 9).
Devido à correlação positiva significativa encontrada entre TBARS-MDA e IMC,
optou-se por estratificar os valores desse biomarcador de acordo com grupos de
IMC separados em controle (IMC < 25 kg/m2), IMC entre 30-39,9 kg/m2, IMC entre
40 e 49,9 kg/m2 e IMC maior que 50 kg/m2 (Figura 10), observando-se níveis
estatisticamente aumentados de TBARS-MDA entre os pacientes com IMC acima de
40 kg/m2. Achados semelhantes foram encontrados por Olusi (2002) em um estudo
81
com 300 participantes, em que se encontraram diferentes concentrações de MDA
entre indivíduos com peso corporal saudável e aqueles com diferentes graus de
obesidade, em que os participantes com IMC normal apresentaram níveis de MDA
estatisticamente mais baixos que aqueles com IMC entre 35 e 39 kg/m 2, 40 e 44
kg/m2, 45 e 49 kg/m2 e IMC maior que 50 kg/m2, com p < 0,05; p < 0,001; p < 0,001
e p < 0,001, respectivamente. Nesse mesmo estudo observou-se associação
positiva entre IMC e MDA com r = 0,34 e p = 0,01, sugerindo que quanto maior o
IMC, maior é a peroxidação lipídica, visto que o malondialdeído é um produto final
da via de peroxidação lipídica tecidual e de biomembranas.
Furukawa e colaboradores (2004) avaliaram a peroxidação de lipídeos no plasma de
humanos através do marcador MDA e verificaram correlação positiva significante
com IMC (r = 0,31 e p < 0,003) e CA (r = 0,39 e p < 0,001). Em estudo realizado com
35 indivíduos obesos no período pré-operatório de cirurgia de obesidade, foi
observada uma tendência de correlação negativa entre IMC e FRAP, porém sem
diferença estatística (r = - 0,33 e p = 0,06) (NEVES, 2010).
Esses achados indicam que o aumento do tecido adiposo, representado pela
obesidade, relaciona-se com o estresse oxidativo através do aumento da
peroxidação lipídica e redução de agentes antioxidantes.
5.5. Correlação entre marcadores de status oxidativo e parâmetros
lipídicos
Observou-se que as participantes com triglicérides acima de 150 mg/dL
apresentaram 14,67% de aumento significativo dos níveis de MDA quando
comparadas ao grupo com valores menores que 150 mg/dL (Figura 11). Houve
correlação significativa positiva entre MDA e os parâmetros lipídicos LDL,
triglicérides e colesterol total (Figura 12). Entre MDA e HDL a correlação apresentou
diferença significativa negativa. Block et al. (2002) em seus estudos observaram
correlação significativamente positiva entre colesterol plasmático e MDA.
De acordo com Lee & Prasad (2003), um aumento na síntese de prostaglandinas
através da via das ciclooxigenases, pode ser induzido por elevados níveis de
82
colesterol, resultando na liberação de O2- pelas células musculares lisas e endoteliais
com consequente desregulação do status oxidativo.
Houve correlação com diferença positiva entre FRAP e HDL (Tabela 11 e Figura
14), não se observando correlação com outros parâmentros lipídicos estudados.
Entretanto, Ferrari (2010) ressalta que os resultados podem ser variáveis
dependendo da fase em que o FRAP é mensurado, visto que este biomarcador pode
estar aumentado em situações de hiperlipidemia, sugerindo um mecanismo de
defesa contra o estresse oxidativo, ressaltando-se que essa situação não se
mantém em longo prazo.
As participantes com valores de HDL acima de 50 mg/dL apresentaram 50,75% de
aumento significativo dos níveis de GSH comparados ao grupo com valores de HDL
abaixo de 50 mg/dL. As participantes com níveis de LDL menor que 100 mg/dL
demonstraram aumento significativo de 72,58% dos valores de GSH quando
comparado ao grupo com índices maiores que 100 mg/dL (Figura 15). A queda de
concentração de GSH em humanos pode ser indício de níveis elevados de estresse
oxidativo (DALLE-DONNE, 2006).
Houve correlação positiva com diferença significativa entre os níveis plasmáticos de
GSH e HDL, além de correlação negativa com diferença significativa entre GSH e os
parâmetros lipídicos LDL e colesterol total (Figura 16).
A Tabela 12 apresenta as correlações entre níveis de vitamina E e parâmetros
lipídicos de todas as participantes do estudo. Não foi observada correlação entre
vitamine E e LDL, triglicérides e colesterol total. Entre vitamina E e HDL observou-se
correlação com diferença positiva (Figura 18).
Dessa forma com nossos achados podemos sugerir que níveis aumentados de HDL
estão relacionados com fatores protetores do estresse oxidativo e diminuição da
peroxidação lipídica, enquanto que níveis aumentados de lipídicos circulantes
relacionam-se com uma maior taxa de peroxidação lipídica e também maior
predisposição ao EO.
83
5.6. Correlação entre parâmetros clínicos e de status oxidativo
5.6.1. Correlação entre parâmetros de status oxidativo e idade
Na Figura 19 observam-se as correlações entre idade e os níveis de MDA, FRAP,
GSH e vitamina E de todas as participantes do estudo, com correlação positiva
significativa entre MDA e correlação negativa significativa entre GSH e idade. A
partir desta observação, verificou-se a existência de diferença entre os níveis desses
biomarcadores quando dividimos as participantes em grupos com idade superior e
inferior a 40 anos, utilizando-se como ponto de corte o período estimado para o
início do climatério (Figura 20).
A observação do efeito da idade em relação aos parâmetros de status oxidativo
MDA e GSH é consistente com a hipótese de que, enquanto o estresse oxidativo e o
dano ao DNA podem acumular-se com a idade, o dano oxidativo a lipídios não está
relacionado à idade, mas às condições fisiológicas simultâneas ao envelhecimento
como o aumento da gordura corporal e inflamação. Entretanto, a associação entre a
produção de ROS e o envelhecimento ainda não está claramente estabelecida
(KREGEL & ZHANG, 2007).
Diminuições
nas concentraçãos de
GSH
podem
ser
associadas com
o
envelhecimento, AIDS, doença hepática alcoólica e doença cardiovascular (DCV)
(PASTORE et al., 2003). Ratos com envelhecimento acelerado apresentaram, aos
treze meses de idade, concentrações 29% mais baixas de GSH em relação à outra
espécie de mesma idade que apresenta tempo de vida mais prolongado (REBRIN &
SOHAL, 2004).
Block et al. (2002) avaliaram 298 adultos saudáveis com idades entre 19 e 78 anos e
nenhuma associação entre idade e MDA foi observada. Em estudo com 140
indivíduos saudáveis, a idade foi positivamente correlacionada com colesterol, LDL e
MDA (BALKAN et al. 2002).
84
5.6.2. Correlação entre parâmetros de status oxidativo e pressão arterial
Não foi observada correlação entre pressão arterial e todos os biomarcadores de
status oxidativo avaliados no estudo (Tabela 13).
O estresse oxidativo pode ser responsável pelo comprometimento da vasodilatação
dependente do endotélio, causado pela perda de óxido nítrico bioativo na parede do
vaso. Entretanto, maiores níveis de pressão arterial também predispõem ao EO e,
portanto, cada entidade tem capacidade para causar a outra (VAZIRI, 2008). Dessa
forma, a obesidade pode aumentar a pressão arterial (PA) através de mecanismos
sensíveis ao estresse oxidativo ou vice-versa e a adoção de uma dieta equilibrada
pode auxiliar na redução da PA por aumentar a capacidade antioxidante através do
aumento do consumo de antioxidantes dietéticos (LOPES et al., 2003).
Vasconcelos et al. (2011), em estudo realizado com pacientes hipertensos em uma
comunidade na região nordeste do Brasil, observaram que os níveis plasmáticos de
MDA e GSH estavam diminuídos nos indivíduos hipertensos e revelaram correlação
positiva entre PAS e MDA (r = 0,44 e p < 0,05).
5.7. Avaliação do marcador de inflamação IL-6
Não foi observada diferença significativa entre os grupos Ct, Ob e Ob-Ht (Figura 22).
Deve-se levar em consideração que houve um grande número de amostras com
valores de IL-6 que não foram detectáveis através de nosso método (85% para
grupo controle e 64% para o grupo total de obesos).
O tecido adiposo ativamente secreta diversas citocinas pró-inflamatórias e uma
importante fonte de secreção de IL-6 em indivíduos obesos é a gordura visceral
(FONTANA et al. 2007). Dessa forma, a associação entre a inflamação e o grau da
obesidade é esperada.
Em mulheres e homens saudáveis, a concentração de IL-6 aumenta com a
adiposidade (YUDKIN, 2000). Rexrode et al. (2003) avaliaram mulheres com IMC
superior 28,3 kg/m2 e os níveis encontrados desse marcador se apresentaram
quatro vezes mais altos que os de mulheres com valor inferior de IMC, que tanto em
medidas de adiposidade total quanto adiposidade abdominal estiveram fortemente
85
associadas ao aumento significante dos níveis de IL-6 e PCR. Além disso, a
circunferência da cintura e os valores séricos de IL-6 foram fortemente associados,
apontando que pessoas portadoras de obesidade central possuem maiores chances
de desenvolver doenças cardiovasculares e síndrome metabólica.
Em estudo realizado por Neves (2010), com 35 indivíduos obesos no período préoperatório de cirurgia de obesidade, foi observada uma tendência de correlação
positiva entre IMC e massa gorda com a IL-6 sérica, porém sem diferença estatística
(r = 0,339 e p = 0,067) e (r = 0,344 e p = 0,058), respectivamente. Solá et al. (2009)
avaliaram 67 pacientes portadores de obesidade mórbida e severa e observaram
que seus níveis de IL-6 estavam significativamente mais altos (p < 0,001) que
aqueles do grupo controle. Além disso, nos pacientes obesos, os parâmetros
inflamatórios avaliados foram significativamente correlacionados com os parâmetros
antropométricos, não sendo observada diferença entre os pacientes com e sem
síndrome metabólica, sugerindo que a obesidade está associada a um estado
inflamatório crônico não relacionado com a presença de SM.
Optou-se por trabalhar com os níveis de IL-6 das medianas superior e inferior do
grupo total de obesos em relação aos marcadores bioquímicos de status oxidativo
MDA, FRAP, GSH e Vitamina E, não sendo encontrada diferença significativa entre
as duas medianas em nenhum dos parâmetros analisados (Figura 23).
Em cultura de adipócitos, o estresse oxidativo parece suprimir a secreção de
adiponectina e a expressão de RNAm, além de aumentar a expressão de IL-6.
Tratamentos utilizando inibidores da produção de ROS e antioxidantes parecem
restaurar este sistema em modelos animais (FURUKAWA et al. 2004). Esse estudo
conclui que um aumento local do estresse oxidativo no tecido adiposo acumulado
provoca uma produção desregulada de adipocinas e o que o aumento seletivo na
produção de ROS no tecido adiposo leva ao aumento do estresse oxidativo
sistêmico.
Dessa forma, partindo da hipótese de que é possível que o estresse oxidativo regule
a inflamação, optou-se por separar a mediana superior e inferior de MDA do grupo
total de obesos e avaliar os níveis de IL-6 (Figura 24), entretanto, não foi encontrada
diferença significativa entre as duas medianas.
86
A obesidade juntamente com a inflamação sistêmica pode apresentar relevante
papel na produção de espécies reativas de oxigênio. Essa afirmação pode ser
justificada através do impacto metabólico gerado pela expressão aumentada de
interleucina-6 na obesidade, que está relacionada com o estímulo da síntese
hepática de triacilglicerois e dessa forma contribuindo para a instalação de
hipertrigliceridemia (NONOGAKI et al. 1995). Associando essas informações com os
achados de Vasconcelos (2007) que sugerem que, em pacientes hiperlipidêmicos
primários, a geração de espécies reativas de oxigênio mitocondrial através de
monócitos circulantes pode contribuir para o aumento do estresse oxidativo nesses
indivíduos.
87
6. CONCLUSÕES
88
Os resultados obtidos com o desenvolvimento desse estudo refletem o perfil dos
biomarcadores de status oxidativo e do processo inflamatório em mulheres obesas e
suas correlações com os parâmetros clínicos, lipídicos e antropométricos. Dentre os
processos estudados, fica evidente que as mulheres obesas hipertensas não
apresentaram diferença significativamente estatística (p < 0,05) entre os níveis de
TBARS-MDA, FRAP, GSH, e Vitamina E quando comparadas às obesas sem
comorbidades, lembrando que 66,66% e 83,78% das participantes do grupo Ob e
Ob-Ht, respectivamente, foram classificadas com obesidade grau III. Dessa forma
podemos concluir que:
- Níveis de TBARS-MDA estão aumentados em indivíduos obesos quando
comparados aos eutróficos, enquanto que níveis de GSH estão reduzidos;
- Níveis de TBARS-MDA, FRAP, GSH e vitamina E não se alteraram em condições
de obesidade associadas à hipertensão;
- Não foi observada correlação entre os biomarcadores de status oxidativo
estudados, sugerindo a possibilidade de um reequilíbrio entre os níveis de estresse
oxidativo;
- Níveis de TBARS-MDA do grupo total de obesos correlacionaram-se positivamente
com parâmetro antropométrico IMC e parâmetro clínico idade;
- Níveis de TBARS-MDA correlacionaram-se com todos os parâmetros lipídicos HDL,
LDL, triglicérides e colesterol total;
- Níveis de FRAP não apresentaram diferença entre os três grupos estudados e não
tiveram correlação com parâmetros antropométricos e com o parâmetro clínico
idade;
- Níveis de FRAP se correlacionaram positivamente com níveis de HDL;
- Níveis de GSH não apresentaram correlação com parâmetros antropométricos;
- Níveis de GSH correlacionaram-se negativamente com o parâmetro clínico idade e
correlacionaram-se com todos os parâmetros lipídicos analisados, exceto com os
níveis de triglicérides;
89
- Níveis de vitamina E não apresentaram diferença entre os três grupos estudados e
não tiveram correlação com parâmetros antropométricos e com o parâmetro clínico
idade;
- Níveis de vitamina E se correlacionaram negativamente com níveis de HDL;
- Portanto correlacionaram-se com HDL os marcadores TBARS-MDA, FRAP, GSH e
vitamina E, com LDL correlacionaram-se os marcadores TBARS-MDA, GSH,
enquanto que com colesterol total foram TBARS-MDA e GSH, e em relação aos
triglicérides somente observou-se correlação com TBARS-MDA.
- Não se observou diferença entre os níveis dos biomarcadores de status oxidativo
analisados quando separados de acordo com a mediana superior e inferior dos
níveis de IL-6.
90
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8- ANEXOS
110
ANEXO 1
111
ANEXO 2
112
113