Interakcje związków przeciwutleniających występujących w

Transcription

Zeszyty
Naukowe
Uniwersytetu
Rolniczego
im. Hugona
Kołłątaja
w Krakowie
nr 525
ISSN 1899-3486
rozprawy
zeszyt 402
Aleksandra Duda-Chodak
Interakcje związków przeciwutleniających
występujących w roślinach oraz suplementach diety
z bakteriami reprezentującymi
mikrobiotę jelitową człowieka
Praca wykonana
w Katedrze Technologii Fermentacji i Mikrobiologii Technicznej
Uniwersytetu Rolniczego w Krakowie
Wydawnictwo Uniwersytetu Rolniczego w Krakowie
Kraków 2015
Badania zostały sfinansowane ze środków Narodowego Centrum Nauki przyznanych na podstawie
decyzji nr DEC-2011/01/B/NZ9/00226.
Pracę opiniowali:
Prof. dr hab. Zbigniew Czarnecki (Uniwersytet Przyrodniczy w Poznaniu)
Dr hab. inż. Agnieszka Filipiak-Florkiewicz (Uniwersytet Rolniczy w Krakowie)
Redaktor Naczelny Wydawnictwa
Prof. dr hab. inż. Józef Bieniek
Redaktor Naukowy
Prof. dr hab. Genowefa Bonczar
Wydano za zgodą Rektora Uniwersytetu Rolniczego w Krakowie
Copyright © Wydawnictwo Uniwersytetu Rolniczego w Krakowie, Kraków 2015
Projekt okładki: Monika Wojtaszek-Dziadusz
Publikacje Wydawnictwa UR w Krakowie można nabyć w siedzibie Wydawnictwa.
Prowadzona jest również sprzedaż wysyłkowa (tel.: 12 662 51 60).
Księgarnia internetowa: www.wydawnictwo.ur.krakow.pl
Wydawnictwo UR w Krakowie
31-425 Kraków, al. 29 Listopada 46
tel.: (12) 662 51 57, 662 51 59
e-mail: [email protected]
www.wydawnictwo.ur.krakow.pl
Ark. wyd. 14. Ark. druk. 11,75. Nakład 120 egz.
Druk i oprawa: DRUKMAR, 32-080 Zabierzów, ul. Rzemieślnicza 10
ISSN 1899-3486
Spis treści
Wykaz skrótów stosowanych w pracy
List of symbols used in the work..........................................................................................
5
1. Wstęp .................................................................................................................................
7
2. Przegląd literatury ............................................................................................................
11
3. Materiał i metody .............................................................................................................
3.1. Materiał badawczy ...................................................................................................
3.2. Przebieg doświadczeń ..............................................................................................
3.3. Metody analityczne ..................................................................................................
43
43
46
50
4. Wyniki i dyskusja ..............................................................................................................
4.1. Potencjał antyoksydacyjny i skład polifenolowy badanych ekstraktów
i suplementów ..........................................................................................................
4.2. Potencjał antyoksydacyjny związków polifenolowych najczęściej pobieranych
z racjami pokarmowymi . ........................................................................................
4.3. Wpływ związków polifenolowych na bakterie jelitowe ........................................
4.4.Wpływ bakterii jelitowych na potencjał antyoksydacyjny polifenoli zawartych
w diecie .....................................................................................................................
4.5. Zmiany związków polifenolowych pod wpływem bakterii jelitowych ................
60
60
85
95
127
151
5. Wnioski ..............................................................................................................................
162
6. Zalecenia dla przemysłu i konsumentów . .....................................................................
164
Literatura . .............................................................................................................................
166
Summary ................................................................................................................................
187
Wykaz skrótów stosowanych w pracy
List of symbols used in the work
AOX
B
BAC BEZ BF CAT CC CCH CIT CN D
EC EN EUB G
GT H
HR IM KMP LCB M
MIC N
– potencjał antyoksydacyjny / antioxidant potential
– ekstrakt z owoców borówki brusznicy / lingonberry fruit extract
– Bacteroides galacturonicus
– ekstrakt z owoców czarnego bzu / elderberry fruit extract
– Bifidobacterium catenulatum
– (+)-katechina / (+)-catechin
– ekstrakt z owoców czerwonej cebuli / red onion extract
– ekstrakt z owoców cytryńca chińskiego / Schisandra fruit extract
– Citrosept, ekstrakt z pestek i miąższu grejpfruta / grapefruit seed-pulp
extract
– ekstrakt z ziela czosnku niedźwiedziego / bear’s garlic extract
– ekstrakt z owoców derenia jadalnego / cornelian cherry fruit extract
– Escherichia coli
– Enterococcus caccae
– Eubacterium cylindroides
– ekstrakt z jagód goji / goji berries extract
– ekstrakt z zielonej herbaty / green tea extract
– hesperetyna, 3’,5,7-trihydroksy-4’-metoksyflawanon / hesperetin, 3’,5,7-trihydroxy-4’-methoxyflavanone
– hesperydyna, hesperetyno-7-O-rutynozyd (glikozyd hesperetyny) / hesperidin, hesperetin-7-O-rutinoside (hesperetin glycoside)
– mikrobiota jelitowa / intestinal microbiota
– kemferol / kaempferol
– Lactobacillus sp.
– ekstrakt z owoców malin / raspberry fruit extract
– minimalne stężenie hamujące / minimum inhibitory concentration
– naringenina, 4’,5,7-trihydroksyflawanon / naringenin, 4’,5,7-trihydroxyflavanone
6
NO NR P
PF PHL PO Q
RFT RS RUMI
RUT S
SP Ż
Interakcje związków przeciwutleniających występujących w roślinach oraz suplementach diety...
– sok z noni / noni juice
– naringina, naringenino-7-O-ramnozydoglukozyd (glikozyd naringeniny) /
naringin, 7-O-rhamnoglucoside (naringenin glycoside)
– ekstrakt z owoców pigwowca japońskiego / Japanese quince fruit extract
– polifenole / polyphenols
– florydzyna / phloridzin
– ekstrakt z ziela pokrzywy / nettle herb extract
– kwercetyna / quercetin
– reaktywne formy tlenu / reactive oxygen species
– rezweratrol / resveratrol
– Ruminococcus gauvreauii
– rutyna, kwercetyno-3-O-rutynozyd (glikozyd kwercetyny) / rutin, quercetin-3-O-rutinoside (quercetin glycoside)
– ekstrakt z nasion soi / soybean extract
– ekstrakt z preparatu spirulina / spirulina extract
– ekstrakt z owoców żurawiny / cranberry fruit extract
1. Wstęp
Mikrobiota jelitowa (ang. intestinal microbiota, IM) jest wyposażona w bogaty zestaw
enzymów odpowiedzialnych za różnorodne przemiany składników pokarmowych,
które docierają do jelita. Dzięki temu odgrywa ważną, o ile nie kluczową, rolę w metabolizmie substancji chemicznych dostarczanych z pożywieniem. Skład, jak również
proporcje poszczególnych gatunków tworzących IM są bardzo różnorodne. Każdy
człowiek ma swój własny, niepowtarzalny profil gatunkowy mikrobioty, który porównuje się nawet do odcisku palca. Z powodu tej ogromnej różnorodności gatunków
tworzących IM u poszczególnych osobników profil powstających metabolitów oraz
ich końcowy wpływ na organizm są bardzo zmienne w populacji ludzkiej. Część z tych
metabolitów może być wykorzystana jako substancje wzrostowe przez komórki nabłonka jelita gospodarza, ale też przez mikroorganizmy obecne w jelicie. Często
zdarza się, że jedynie produkt bakteryjnego metabolizmu danego składnika może
zostać wchłonięty w jelicie i wpłynąć korzystnie na zdrowie człowieka. Brak odpowiednich gatunków bakterii w mikrobiocie osobnika oznacza, że spożyty związek nie
będzie mógł wywrzeć oczekiwanego efektu. Z drugiej strony, zdarza się też, że – na
skutek metabolizmu bakteryjnego – z obojętnego składnika obecnego w żywności
powstają pochodne niekorzystnie oddziałujące na zdrowie konsumenta. Wykazano,
że etiologia licznych chorób (nieswoiste zapalenia jelit, choroba Crohna, nowotwory
jelita, alergie, otyłość) jest ściśle powiązana z IM. Równowaga między układem immunologicznym gospodarza a komensalnymi gatunkami mikrobioty jest niezbędna
dla zachowania zdrowia, a jej zaburzenia (dysbioza) powodują rozwój chorób.
Wszystkie wymienione kwestie wchodzą w obszar metabolomiki, będącej stosunkowo nową dziedziną nauki. Zgodnie z definicją, metabolomika to systematyczne badanie niepowtarzalnych „odcisków palca” pozostawianych przez swoiste procesy komórkowe, czyli jest to badanie profilu metabolitów. W ostatnich dekadach
ukazało się wiele publikacji na temat korzystnego wpływu przeciwutleniaczy na
zdrowie człowieka, jednak dopiero niedawno wykazano, że znaczenie ma nie ilość
antyoksydantów w diecie, ale ich biodostępność. Biodostępność polifenoli w formie,
w jakiej zwykle występują w diecie, jest raczej mała. Transformacje, które zachodzą
w jelicie pod wpływem enzymów bakteryjnych (np. β-glukozydaz, β-glukuronidaz),
8
zmieniają zarówno biodostępność, jak i aktywność antyoksydacyjną polifenoli. Z tego
też powodu liczne badania z ostatnich lat skupiają się na roli mikrobioty jelitowej
w kształtowaniu biodostępności i bioprzyswajalności tych składników diety.
Dość powszechnie spotyka się doniesienia wskazujące na hamowanie przez
związki polifenolowe i inne przeciwutleniacze wzrostu różnorodnych patogenów,
zarówno występujących w przewodzie pokarmowym człowieka, jak i obecnych w żywności. Ten pożądany efekt działania przeciwutleniaczy, a przede wszystkim wykazywany przez nie potencjał antyrodnikowy sprawiły, że znalazły one wielu zwolenników
i entuzjastów. Jak wykazały liczne badania, dieta bogata w przeciwutleniacze zmniejsza ryzyko zachorowań na wiele chorób, w tym nowotwory, choroby serca i układu
naczyniowego, alergie, choroby neurodegeneracyjne, cukrzycę i wiele innych. Nadmiar
wolnych rodników i reaktywnych form tlenu uważany jest także za przyczynę starzenia się organizmu. Stąd dość powszechne i niejako modne stało się promowanie
„zdrowego” stylu życia rozumianego jako suplementowanie diety przeciwutleniaczami. W wielu krajach na rynku dostępne są różnorodne preparaty, a ich producenci prześcigają się w reklamowaniu cudownych efektów, jakie może zapewnić ich
spożywanie. Rzeczywiście, w wielu przypadkach wzbogacenie diety składnikami
antyoksydacyjnymi pozwala uzupełnić ich niedobór i wspomaga organizm w obronie
przed zanieczyszczeniami środowiska i skutkami stresu oksydacyjnego. Z drugiej
jednak strony, ze względu na brak jakiejkolwiek kontroli nad sprzedażą tych specyfików istnieje ryzyko ich nadmiernego spożycia lub wystąpienia niebezpiecznych dla
zdrowia interakcji, np. z lekami, jakie równocześnie zażywa konsument. Co więcej,
standardową procedurą stało się dodawanie do żywności, na różnych etapach jej
produkcji, substancji o działaniu antyoksydacyjnym, które mają zapobiec procesom
utleniania składników żywności i w ten sposób przedłużyć trwałość produktu. Należy
podkreślić, że wykazano także, iż niektóre polifenole lub ich metabolity mogą działać niekorzystnie na organizm ludzki (np. wywierać wpływ mutagenny, genotoksyczny, hamować aktywność topoizomerazy czy syntezę tyroksyny). Oczywiście, jest mało
prawdopodobne, aby dawki przeciwutleniaczy przyjmowanych ze zbilansowaną dietą mogły negatywnie wpływać na zdrowie, jednakże dostępne bez recepty suplementy diety zawierają te związki w stężeniach nawet 20-krotnie wyższych od występujących w typowej diecie wegetariańskiej. Jak dotąd nie ma naukowo potwierdzonych
danych na temat efektów długotrwałego spożywania zwiększonej ilości polifenoli.
Jest to istotna kwestia, gdyż stosowanie suplementów bogatych w mieszaniny ziołowe i polifenole, które są zalecane w dawkach wyrażanych raczej w gramach niż
miligramach, może powodować ekspozycję na potencjalnie toksyczne stężenia tych
składników. Nie było także badań wyjaśniających, jak składniki przeciwutleniające
obecne w diecie czy tych suplementach wpływają na skład jakościowy i ilościowy
prawidłowej mikrobioty jelitowej.
Biorąc pod uwagę niedostatek wiedzy z zakresu wspomnianych zagadnień, w prezentowanej pracy skoncentrowano się na ocenie wpływu bioaktywnych składników
1. Wstęp
9
żywności o charakterze przeciwutleniaczy na wybrane gatunki bakterii będące przedstawicielami ludzkiej mikrobioty jelitowej. Do badań wybrano rośliny, których właściwości prozdrowotne, lecznicze czy wspomagające są powszechnie uznane, a także
te, które – jako źródło naturalnych antyoksydantów – są dodawane do żywności
w celu jej utrwalenia. Ponadto analizowano czyste związki polifenolowe, które są
najczęściej spożywane wraz z typową dietą, a mogą się także znaleźć w suplementach
diety i preparatach farmaceutycznych. Ostatni etap pracy obejmował ocenę wpływu
bakterii jelitowych na potencjał antyoksydacyjny i stężenie wybranych związków
przeciwutleniających, w tym także składników występujących w badanych surowcach
roślinnych i suplementach.
Cel pracy
Głównym celem pracy było poznanie interakcji między przeciwutleniającymi składnikami roślin i suplementów diety a bakteriami będącymi przedstawicielami mikrobioty jelita ludzkiego.
Oprócz celu głównego sformułowano trzy cele szczegółowe:
1) ocena potencjału antyoksydacyjnego oraz składu polifenolowego wybranych
surowców roślinnych i suplementów diety o deklarowanym prozdrowotnym działaniu na organizm człowieka,
2) określenie wpływu związków polifenolowych zawartych w ekstraktach z surowców
roślinnych i suplementów diety, a także czystych związków polifenolowych na
wybrane gatunki mikrobioty jelitowej,
3) zbadanie wpływu poszczególnych gatunków bakterii jelitowych na potencjał
antyoksydacyjny i stężenie wybranych związków przeciwutleniających występujących w badanych surowcach.
Hipotezy badawcze
Dostępna literatura przedmiotu wskazuje, że polifenole wywierają hamujący wpływ
na różne mikroorganizmy, w tym patogenne gatunki bakterii jelitowych. Z drugiej
strony, stosowanie surowców roślinnych bogatych w te składniki do leczenia rozmaitych
schorzeń oraz wspomagania funkcjonowania organizmu ludzkiego ma wielowiekowe
tradycje, co może przemawiać za ich neutralnością wobec komensalnych gatunków
mikrobioty. Opierając się na tych danych, sformułowano dwie hipotezy badawcze:
1) naturalne składniki przeciwutleniające i związki polifenolowe zawarte w surowcach roślinnych i suplementach diety nie wywierają hamującego wpływu na
bakterie będące przedstawicielami fizjologicznej mikrobioty jelitowej,
10
2) gatunki bakterii stanowiących fizjologiczną mikrobiotę jelita ludzkiego zwiększają na skutek swojego metabolizmu potencjał antyoksydacyjny składników
polifenolowych obecnych w surowcach roślinnych i suplementach diety.
Formułując hipotezy, przyjęto założenie wyjściowe, że badane surowce roślinne
oraz suplementy diety zawierają składniki przeciwutleniające, w tym polifenole,
w znaczących stężeniach. Aby zweryfikować to założenie oraz poszczególne hipotezy, na pierwszym etapie badań określono wyjściowy potencjał antyoksydacyjny oraz
skład polifenolowy surowców roślinnych i komercyjnie dostępnych suplementów
diety o deklarowanym prozdrowotnym działaniu na organizm człowieka. Jako źródło
polifenoli i przeciwutleniaczy wybrano surowce o znanych właściwościach prozdrowotnych i/lub długoletniej tradycji stosowania w medycynie naturalnej różnych krajów: świeże owoce maliny, czarnego bzu, żurawiny, borówki brusznicy, pigwowca
japońskiego i derenia, suszone owoce goji i cytryńca chińskiego, czerwoną cebulę,
czosnek niedźwiedzi, pokrzywę, spirulinę, zieloną herbatę i nasiona soi, a także
suplementy diety Citrosept (ekstrakt z miąższu i pestek grejpfruta) i sok z noni.
Wszystkie wymienione surowce i suplementy zawierają antyoksydanty, w tym różne
polifenole, i są wykorzystywane (często równocześnie) do leczenia rozmaitych schorzeń jako preparaty dostępne bez recepty, a zatem poza wszelką kontrolą. Ponieważ
ich dawkowanie, sposób przyrządzania i stosowania zależą od leczonego schorzenia
oraz od tradycji w danym regionie świata, postanowiono – w celu ujednolicenia
i uproszczenia porównań uzyskanych wyników – przygotować z wszystkich surowców
jednakowe ekstrakty etanolowe (nie dotyczyło to gotowych suplementów, tj. soku
z noni i Citroseptu). W doświadczeniach zostały także zastosowane, w postaci czystych związków, najczęściej spożywane z dietą polifenole: (+)-katechina, kwercetyna, rutyna, naringenina, naringina, hesperydyna, hesperetyna, kemferol i florydzyna,
będące przedstawicielami różnych klas flawonoidów, oraz rezweratrol – reprezentant
stilbenów.
Drugi etap prac miał na celu określenie wpływu badanych surowców oraz poszczególnych związków polifenolowych na wybrane gatunki mikrobioty jelitowej.
Ponieważ najważniejsze i najliczniej reprezentowane w jelicie ludzkim rodzaje bakterii to Bifidobacterium, Eubacterium, Lactobacillus i Bacteroides, gatunki wybrane
do doświadczeń należały przede wszystkim do tych rodzajów i – zgodnie z informacją od dostawcy – wszystkie zostały wyizolowane z jelita ludzkiego. W przypadku
wykazania działania hamującego rozwój bakterii wyznaczano wartość minimalnego
stężenia hamującego (MIC) dla danego składnika.
Ostatni etap prac dotyczył oceny wpływu bakterii jelitowych na związki polifenolowe. W tym celu określono potencjał antyoksydacyjny wybranych polifenoli i/lub
ekstraktów oraz produktów, które z nich powstały na skutek metabolizmu bakteryjnego. Zbadano także zmiany stężeń wybranych związków polifenolowych pod wpływem ekspozycji na poszczególne gatunki bakterii.
2. Przegląd literatury
Reaktywne formy tlenu, wolne rodniki i stres oksydacyjny
Tlen to jeden z najbardziej na Ziemi rozpowszechnionych pierwiastków, bez którego
większość organizmów naszej planety nie mogłaby istnieć. Jest on stosunkowo mało
reaktywny w stanie podstawowym, czyli trypletowym (3O2) [Tarko i in. 2007], ale może
też występować w innych formach. Na skutek dostarczenia energii do 3O2 powstaje
tlen w stanie singletowym (1O2), o znacznie wyższej reaktywności, z łatwością reagujący z innymi, rozpowszechnionymi w przyrodzie pierwiastkami w stanie singletowym.
Alotropową odmianą tlenu i naturalnym składnikiem atmosfery jest ozon (O3). Powstaje
w stratosferze, na wysokości około 30 km, jako wynik działania promieni ultrafioletowych na tlen w stanie trypletowym. Jest bardziej reaktywny niż 3O2, a w wyniku
różnych reakcji tworzy wysoce reaktywne ozonki i nadtlenki oraz rodniki •OH i HO2•.
W komórkach organizmów tlenowych procesy oddychania, czyli utleniania substancji odżywczych przy udziale tlenu z jego jednoczesną redukcją do wody, są podstawowymi przemianami gwarantującymi pozyskanie energii niezbędnej do funkcjonowania organizmu. Całkowita redukcja cząsteczki tlenu oznacza przyłączenie do
niej czterech elektronów i czterech protonów, w wyniku czego powstają dwie cząsteczki wody. Cząsteczka tlenu, ze względu na rozkład elektronów na swych orbitalach,
nie zawsze jednak ulega pełnej redukcji. Podczas niepełnej redukcji tlenu cząsteczkowego zostają uwolnione reaktywne formy tlenu (RFT), z których większość jest
wolnymi rodnikami. Wolny rodnik to zdolna do samodzielnego istnienia cząsteczka
zawierająca jeden lub więcej niesparowanych elektronów na orbitalu walencyjnym.
Rodniki przeważnie są obojętne elektrycznie i bardzo reaktywne, dzięki czemu szybko wchodzą w reakcje z innymi cząsteczkami, „dążąc” do sparowania elektronów
poprzez ich przyłączenie lub oddanie [Beckman i Ames 1998].
W wyniku niepełnej redukcji tlenu (ryc. 1) w komórce (przede wszystkim w mitochondriach) powstają wysoce reaktywne pochodne: anionorodnik ponadtlenkowy
O2•– (ang. superoxide radical anion), nadtlenek wodoru H2O2 (ang. hydrogen perox
ide), rodnik wodoronadtlenkowy HO2• (ang. hydroperoxyl radical) oraz rodnik hydroksylowy •OH (ang. hydroxyl radical) [Tarko i in. 2007, Burton i Jauniaux 2011].
12
Ryc. 1. Powstawanie wolnych rodników i reaktywnych form tlenu w trakcie kolejnych etapów
redukcji tlenu [Tarko i in. 2007]
Fig. 1. Generation of free radicals and reactive oxygen metabolites during successive stages of
oxygen reduction [Tarko et al. 2007]
Powstające w komórce wolne rodniki lub RFT dążą do sparowania elektronów.
Jeśli w pobliżu tworzących się rodników znajdują się inne rodniki, to będą one ze sobą
reagowały. Zwykle jednak stężenie wolnych rodników w komórce jest bardzo niskie,
stąd rodniki reagują z sąsiadującymi cząsteczkami biologicznymi, czyli aminokwasami,
białkami, lipidami. O ile anionorodnik ponadtlenkowy jest zbyt słabym utleniaczem,
by zainicjować reakcję peroksydacji lipidów, o tyle powstający z niego rodnik wodoronadtlenkowy czyni to bez trudu. Nierodnikowa forma tlenu, jaką jest H2O2, charakteryzuje się mniejszą reaktywnością niż inne RFT, jednak ma duże znaczenie biologiczne. Po pierwsze, łatwo przenika przez błony lipidowe, co powoduje, że reaktywne
formy tlenu rozprzestrzeniają się po komórce i organizmie. Po drugie, w obecności
metali przejściowych (Fe i Cu) ulega – w reakcji Fentona – rozkładowi do rodnika
hydroksylowego (•OH) z jednoczesnym utlenieniem jonów żelaza lub miedzi.
Rodnik hydroksylowy, o niezwykle krótkim czasie połowicznego rozkładu (10–9 s),
reaguje z większością struktur komórkowych, jakie występują w jego otoczeniu [Sies
1993], inicjuje łańcuchowe reakcje rodnikowe z lipidami i białkami, a także reaguje
z kwasami nukleinowymi, co często prowadzi do groźnych mutacji. Oprócz reakcji
Fentona, rodnik hydroksylowy może też powstawać w wyniku reakcji Habera-Weissa,
w której jednym z substratów również jest nadtlenek wodoru.
Do reaktywnych form tlenu należą też pochodne azotu, takie jak tlenek azotu
(NO•) – wytwarzany z L-argininy przez kilka izoform syntazy tlenku azotu (NOS)
– oraz jego pochodne [Burton i Jauniaux 2011]. Tlenek azotu jest znakomitym
przykładem rodnika, który pełni wiele ważnych funkcji fizjologicznych u ssaków,
m.in. odgrywa rolę neuromodulatora i neurotransmitera w układzie nerwowym,
reguluje ciśnienie tętnicze i hamuje agregację płytek krwi [Wolin 2009, Kvietys
i Granger 2012]. Ze względu na niewielkie rozmiary cząsteczki i lipofilowość, tlenek
azotu łatwo przenika przez błony biologiczne, bez pośrednictwa układów transportujących. W niskim stężeniu NO• powoduje zazwyczaj przerwanie wolnorodnikowej
reakcji łańcuchowej wielonienasyconych kwasów tłuszczowych, natomiast w wyższym
13
stężeniu przyczynia się do tworzenia rodników nadtlenkowych i alkoksylowych.
W reakcji NO• z anionorodnikiem ponadtlenkowym z kolei powstaje nadtlenoazotan(III) (nadtlenoazotyn), który charakteryzuje się silnymi właściwościami utleniającymi, może reagować z grupami tiolowymi białek i nienasyconymi resztami kwasów
tłuszczowych, a w reakcji z anionem HCO3– tworzyć rodnik wodorowęglanowy
(HCO3•) [Wolin 2009]. Protonowanie nadtlenoazotynu prowadzi zazwyczaj do powstania kwasu nadtlenoazotowego(III) (nadtlenoazotawego), który z kolei ulega
rozkładowi do dwóch rodników zdolnych do dalszych reakcji [Guzik i in. 2003].
Do nierodnikowych związków o silnych właściwościach utleniających należą także
chlorany(I), bromiany(I), podtiocyjaniany (OSCN–) i podjodany (IO–) [Tarko i in. 2007].
Należy podkreślić, że wolne rodniki i reaktywne formy tlenu są niezmiernie
istotne dla prawidłowego funkcjonowania organizmu. Przede wszystkim pełnią rolę
przekaźników sygnału [Bartz i Piantadosi 2010, Finkel 2011, Poljsak i in. 2013],
a zatem regulują procesy metaboliczne [Dröge 2002] i odpowiadają za niektóre
procesy fizjologiczne, jak prawidłowe krążenie krwi [Wolin 2009], za odpowiedź
immunologiczną i stan zapalny [Guzik i in. 2003], starzenie się organizmu czy apoptozę [Beckman i Ames 1998, Tchirkov i Lansdorp 2003].
Z wymienionych względów dla każdego układu (komórki czy całego organizmu)
ważne jest wytworzenie stanu równowagi między procesami, w wyniku których są
generowane RFT, a mechanizmami antyoksydacyjnymi, tak aby działanie tych aktywnych cząstek ograniczało się do funkcji fizjologicznych i nie było destrukcyjne.
Stan naruszenia tej subtelnej równowagi na korzyść RFT nazywa się stresem oksydacyjnym i może być wywołany zarówno przez osłabienie mechanizmów antyoksydacyjnych, jak i przez nadmierną produkcję i/lub wydłużoną ekspozycję na RFT
[Burton i Jauniaux 2011, Poljsak i in. 2013].
Z chwilą gdy ilość reaktywnych form tlenu w komórce (tkance, narządzie lub organizmie) staje się zbyt duża, zaczyna się uwidaczniać ich wysoka reaktywność i destrukcyjny wpływ na inne cząsteczki. Najlepiej poznane są reakcje peroksydacji lipidów
[Niki i in. 2005], zarówno obecnych w błonach komórkowych, jak i zawartych w kompleksach lipoprotein we krwi. Wolnorodnikowa łańcuchowa reakcja utleniania lipidów
tworzących szkielet dwuwarstwy lipidowej prowadzi do upośledzenia funkcji błon,
zwiększenia ich przepuszczalności, zahamowania aktywności enzymów błonowych (co
jest szczególnie istotne w przypadku błon mitochondriów) oraz rozprzężenia fosforylacji oksydacyjnej. W skrajnych przypadkach może nastąpić utrata integralności błony
cytoplazmatycznej i błon wewnątrzkomórkowych, liza organelli i komórek oraz wyciek
ich zawartości [Poljsak i in. 2013]. Wpływ RFT na lipoproteiny o małej gęstości (LDL)
powoduje z kolei modyfikacje apolipoproteiny B (części białkowej), które sprzyjają
agregacji lipoprotein i mogą prowadzić do rozwoju miażdżycy [Levitan i in. 2010].
Zmiany powstające pod wpływem RFT w cząsteczkach białek mogą zachodzić
zarówno w szkielecie węglowym, jak i w bocznych łańcuchach aminokwasowych
[Davies 1987, Davies i Delsignore 1987, Davies i in. 1987a i b, Burton i Jauniaux
14
2011]. Niektóre z tych zmian są odwracalne, inne trwale zmieniają konformację
cząsteczek, powodując utratę właściwości białek (np. enzymów) i zwiększając ich
podatność na rozpad proteolityczny [Grune i in. 1997], co w efekcie prowadzi do
zaburzenia metabolizmu komórki [Burton i Jauniaux 2011].
Destrukcyjnemu wpływowi RFT ulegają także cząsteczki cukrów. Wolne rodniki i RFT uczestniczą w patogenezie m.in. reumatoidalnego zapalenia stawów, gdyż
inicjują i przyspieszają reakcję depolimeryzacji kwasu hialuronowego w stawach
[McNeil i in. 1985].
Nadmierna ekspozycja na RFT prowadzi do uszkodzeń struktury kwasów nukleinowych, co sprzyja sieciowaniu i pękaniu nici oraz powstawaniu mutacji [Olinski i in.
2002]. Nagromadzenie się takich zmian, przy zaburzeniach mechanizmów naprawczych, skutkuje rozwojem nowotworu. Powstające pod wpływem H2O2 produkty,
takie jak np. 8-hydroksyguanina, są uważane za biomarkery oksydacyjnego uszkodzenia DNA i odgrywają znaczącą rolę w procesach skracania telomerów, nowotworzenia i starzenia się komórek [Campisi i in. 2001, Olinski i in. 2002, Tchirkov
i Lansdorp 2003, Liou i Storz 2010, Ríos-Arrabal i in. 2013].
Generalnie przyjmuje się, że wolne rodniki i RFT w stężeniach fizjologicznych
są niezbędne do prawidłowego funkcjonowania organizmu [Dröge 2002, Bartz
i Piantadosi 2010, Burton i Jauniaux 2011, Finkel 2011], jednakże ich nadmiar,
wynikający albo ze zbyt dużej produkcji RFT, albo z niedostatku mechanizmów
obronnych i antyoksydantów, prowadzi do powstania w komórce lub organizmie
stresu oksydacyjnego. Szerokie badania nad wolnymi rodnikami i reaktywnymi formami tlenu dostarczyły wyników, na podstawie których od dawna uważa się stres
oksydacyjny za przyczynę lub mechanizm pośredniczący w rozwoju licznych chorób
i schorzeń. Wśród najważniejszych należy wymienić miażdżycę, cukrzycę, reumatoidalne zapalenie stawów, choroby Alzheimera i Parkinsona, astmę, malarię, chorobę niedokrwienną serca, zawał, chorobę popromienną, kataraktę, jaskrę, nowotwory, choroby autoimmunologiczne, porfirię, stwardnienie zanikowe boczne, zapalenie
jelita grubego i chorobę Crohna, odrzucanie przeszczepu, zespoły przyspieszonego
starzenia się i inne choroby cywilizacyjne [Kloner i in. 1989, Beckman i Ames 1998,
Xu i Touyz 2006, Maiese i in. 2007, Niki 2011, Grahame i Schlesinger 2012, Jeong
i in. 2012, Leuner i in. 2012, Percário i in. 2012, Webster 2012, Alzoghaibi 2013,
Ríos-Arrabal i in. 2013, Yan i in. 2013, Miller i in. 2014, Muchová i in. 2014].
Co ciekawe, niebezpieczna może być również nadmierna ekspresja enzymów
antyoksydacyjnych. Niektórzy badacze uważają nawet, że w organizmie osoby popełniającej błędy dietetyczne i/lub nadużywającej suplementów zawierających związki przeciwutleniające może zaistnieć stres antyoksydacyjny [Poljsak i in. 2013]. W takim przypadku zaburzeniu ulegają mechanizmy i procesy komórkowe będące pod
kontrolą lub zależne od RFT (np. ochrona przed patogenami). Ponadto wiele przeciwutleniaczy w dużych dawkach działa prooksydacyjnie [Cao i in. 1997, Galati i in.
2002]. Jednym z przykładów zaburzonej równowagi antyoksydacyjnej jest zespół
15
Downa, związany z trisomią chromosomu 21, który zawiera m.in. gen kodujący
dysmutazę ponadtlenkową zależną od miedzi i cynku. U chorych z zespołem Downa
następuje 50-procentowy wzrost aktywności tego enzymu, ale bez jednoczesnego
wsparcia ze strony katalazy – enzymu rozkładającego nadtlenek wodoru (geny kodujące katalazę znajdują się na innym chromosomie). Nadtlenek wodoru w dużym
stężeniu powoduje uszkodzenia nerwowo-mięśniowe, wzmaga peroksydację lipidów
w osoczu i mózgu oraz wywołuje objawy typowe dla zespołów przyspieszonego starzenia się organizmu [Lee i in. 2001].
Systemy obronne organizmu przed stresem oksydacyjnym – przeciwutleniacze
Pierwszą linią obrony jest prewencja, czyli zapobieganie powstawaniu wolnych
rodników, polegające na hamowaniu reakcji, w których te cząsteczki są generowane [Sies 1993]. Ponieważ część reakcji syntezy wolnych rodników jest katalizowana
przez jony metali przejściowych, skutecznym sposobem prewencji jest wiązanie tych
metali przez specjalne białka lub związki o zdolności chelatowania, np. polifenole
[Duda-Chodak 2007]. Różne organizmy mają własne systemy ochrony przed wytworzeniem nadmiernej ilości RFT; są to przede wszystkim enzymy antyoksydacyjne, ale
także niektóre cząsteczki wytwarzane w organizmie [Harris 1992].
Do najważniejszych enzymów antyoksydacyjnych należy dysmutaza ponadtlenkowa (oksydoreduktaza ponadtlenek: ponadtlenek, EC 1.15.1.1, ang. superoxide
dismutase (SOD)), która katalizuje reakcję dysmutacji anionorodnika ponadtlenkowego do nadtlenku wodoru. SOD ściśle współpracuje z kolejnym enzymem – katalazą (oksydoreduktaza nadtlenek wodoru: nadtlenek wodoru, EC 1.11.1.6), który
przyspiesza reakcję dysmutacji wytworzonego H2O2, zanim ten przekształci się w bardziej reaktywne formy rodnikowe [Duda-Chodak 2007]. Nadtlenek wodoru stanowi
substrat również dla peroksydaz – grupy enzymów, które redukują go do wody,
utleniając przy okazji różne związki. Wiadomo, że peroksydazy powszechnie występują u roślin, a w przypadku zwierząt najlepiej poznano peroksydazę glutationową
(GPx, oksydoreduktaza glutation: nadtlenek wodoru, EC 1.11.1.9). Jest to enzym
selenozależny, który przy udziale glutationu (GSH) usuwa nadtlenek wodoru, zaś
sam GSH ulega utlenieniu do dwusiarczku glutationu (GSSG). Peroksydaza glutationu we współpracy z fosfolipazą A2 bierze także udział w unieszkodliwianiu nadtlenków kwasów tłuszczowych, hamując peroksydację lipidów, m.in. w wątrobie.
Pośrednio, antyoksydacyjne funkcje enzymów obejmują także redukcję GSSG do
glutationu przez reduktazę GSSG oraz transport i eliminację związków reaktywnych
(w czym uczestniczą S-transferazy glutationu i system transportu S-koniugatów glutationu). Jest to o tyle ważny mechanizm, że utleniona forma glutationu (GSSG) może
tworzyć mieszane dwusiarczki z grupami tiolowymi w białkach lub utleniać te grupy,
co prowadzi do powstawania mostków dwusiarczkowych i unieczynniania białek.
16
Mechanizmy endogenne nie zawsze wystarczają. W takiej sytuacji do organizmu
muszą być dostarczone substancje egzogenne, których głównym zadaniem jest przechwycenie i/lub ustabilizowanie aktywnej cząsteczki, zanim ta dokona zniszczeń
(przeciwutleniacze interwencyjne). Ten proces dezaktywacji polega na oddaniu atomu wodoru lub przyjęciu elektronu przez przeciwutleniacz. Do antyutleniaczy interwencyjnych zalicza się m.in. witaminę C, tokoferole, karotenoidy, hemoproteiny,
polifenole i metaloporfiryny [Duda-Chodak 2007]. Ponieważ w komórce występują
dwie fazy: hydrofilowa (cytoplazma i wnętrze organelli) oraz hydrofobowa (dwuwarstwa lipidowa błon komórkowych), antyoksydanty powinny być przystosowane
do pełnienia funkcji w obu środowiskach.
Bardzo liczną grupę przeciwutleniaczy tworzą związki polifenolowe, które poprzez
grupy funkcyjne mogą tworzyć kompleksy z jonami metali, głównie żelaza i miedzi
[Fernandez i in. 2002, Williams i in. 2004, Galleano i in. 2010], hamując w ten sposób ich zdolność do katalizowania reakcji Fentona i zapobiegając powstawaniu
wolnych rodników. Polifenole działają też na dalszych stadiach ochrony, jako przeciwutleniacze interwencyjne. Zmiatając wolne rodniki (O2•– i •OH), hamują na
etapie inicjacji peroksydację lipidów [Galleano i in. 2010]. Mogą też kończyć łańcuchową reakcję rodnikową, oddając atom wodoru rodnikowi peroksylowemu z wytworzeniem rodnika flawonoidowego.
Ze względu na strukturę podstawowego szkieletu węglowego polifenoli wyróżnia
się kwasy fenolowe, flawonoidy, lignany i stilbeny. Do kwasów fenolowych należą
hydroksylowe pochodne kwasu benzoesowego i kwasu cynamonowego, przy czym
te drugie są silniejszymi antyoksydantami. O ile pochodne tych kwasów z jedną
grupą –OH nie są przeciwutleniaczami, o tyle pochodne dihydroksylowe wykazują
właściwości przeciwutleniające zależne od pozycji grup –OH w pierścieniu, np. kwas
rezorcynowy (3,5-dihydroksybensoesowy) ma dwukrotnie większe zdolności przeciwutleniające niż pochodne 2,3- i 3,4- [Rice-Evans i in. 1996]. Im większa jest
liczba grup hydroksylowych, tym wyższy potencjał antyoksydacyjny. Kwas galusowy,
który ma aż trzy grupy –OH (w pozycji 3, 4 i 5), jest bardzo wydajnym przeciwutleniaczem. Szczególnie bogate źródło kwasu galusowego stanowi herbata, która zawiera dużą ilość hydrolizujących tanin. Do najważniejszych polifenoli w tej grupie
można zaliczyć kwasy kawowy, p-kumarowy, ferulowy i synapinowy oraz ich pochodne estrowe lub glikozydowe, np. kwas chlorogenowy.
Obszerną klasą polifenoli są flawonoidy, zawierające w swej cząsteczce układ
difenylopropanowy, złożony z dwóch pierścieni benzenowych połączonych łańcuchem
trójwęglowym lub pierścieniem heterocyklicznym (ryc. 2). W obrębie tej grupy wyróżniono kilka podklas: flawony, flawonole, flawanony, flawany, antocyjany, izoflawony i chalkony (jako formę pośrednią), różniących się budową oraz wynikającą
z niej aktywnością antyoksydacyjną [Robards i in. 1999]. Wzory najważniejszych
przedstawicieli poszczególnych podklas flawonoidów oraz najobfitsze ich źródła
zostały przedstawione w tabeli 1.
Flawonole
Flavonols
Flawony
Flavones
Podklasa
Subclass
R1 = R3 = R5 = R7 = H, R2 = R4 = R6 = OH  apigenina / apigenin
R3 = R5 = R7 = H, R1 = R2 = R4 = R6 = OH  luteolina / luteolin
R3 = R5 = R7 = H, R1 = R4 = R6 = OH, R2 = OCH3  diosmetyna / diosmetin
R1 = R2 = R3 = R5 = R7 = H, R4 = R6 = OH  chryzyna / chrysin
R1 = R3 = OCH3, R5 = R7 = H, R2 = R4 = R6 = OH  trycyna / tricin
R1 = R2 = R4 = R5 = R6 = OCH3, R3 = R7 = H  synensetyna / sinensetin
R1 = R2 = R4 = R5 = R6 = R7 = OCH3, R3 = H  nobiletyna / nobiletin
R1 = R2 = R3 = R7 = H, R4 = R5 = R6 = OH  bajkaleina / baicalein
Przykładowe związki
Example compounds
Główne źródła: cebula, skórka jabłek, brokuły, herbata
Main sources: onion, apple peel, broccoli, tea
R1 = R4 = R5 = R7 = H, R2 = R3 = R6 = OH  fizetyna / fisetin
R1 = R2 = R4 = R7 = H, R3 = R5 = R6 = OH  kemferol / kaempferol
R2 = R4 = R7 = H, R1 = R3 = R5 = R6 = OH  moryna / morin
R1 = R2 = R4 = H, R3 = R5 = R6 = R7 = OH  herbacetyna / herbacetin
R1 = R4 = R7 = H, R2 = R3 = R5 = R6 = OH  kwercetyna / quercetin
R1 = R5 = R7 = H, R2 = R3 = R4 = R6 = OH  robinetyna / robinetin
R1 = R7 = H, R2 = R3 = R4 = R5 = R6 = OH  myrycetyna / myricetin
Główne źródła: pietruszka, seler, niektóre zboża (szczególnie proso i pszenica)
Main sources: parsley, celery, some cereals (especially millet and wheat)
Wzór szkieletu
Backbone structure
Tabela 1. Budowa strukturalna najważniejszych przedstawicieli poszczególnych podklas flawonoidów oraz najobfitsze ich źródła w żywności
[na podstawie: Rice-Evans i in. 1996, Robards i in. 1999]
Table 1. Structure of major representatives of flavonoid subclasses and their richest sources in food [based on: Rice-Evans et al. 1996,
Robards et al. 1999]
17
Podklasa
Subclass
Wzór szkieletu
Backbone structure
Główne źródła: soja, rośliny strączkowe
Main sources: soybean, legumes
Example compounds
R1 = R3 = R4 = R5 = R6 = H, R2 = OH  naringenina / naringenin
R1 = R3 = R4 = R5 = H, R2 = OH, R6 = neohesperydozyd / neohesperidoside 
 naringina / naringin
R1 = R3 = R4 = R5 = H, R2 = OH, R6 = rutynozyd / rutinoside 
 narirutyna / narirutin
R1 = OH, R2 = OCH3, R3 = R4 = R5 = R6 = H  hesperetyna / hesperetin
R1 = OH, R2 = OCH3, R3 = R4 = R5 = H, R6 = rutynozyd / rutinoside 
 hesperydyna / hesperidin
R1 = R2 = R4 = OH, R3 = R5 = R6 = H  taksifolina / taxifolin
R1 = R2 = H  daidzeina / daidzein
R1 = OH, R2 = H  genisteina / genistein
R1 = OH, R2 = OCH3  glicyteina / glycitein
Główne źródła: owoce cytrusowe, zioła, pomidory
Main sources: citrus fruits, herbs, tomatoes
Tabela 1. cd.
Table 1. cont.
Flawanony
Flavanones
Izoflawony
Isoflavones
18
Flavan-3-ols
Antocyjany
Anthocyanins
Flawan-3-ole
R3 = R4 = H  (-)-katechina / (-)-catechin
R3 = OH, R4 = H  (-)-galokatechina / (-)-gallocatechin
R3 = H, R4 = X  galusan (-)-katechiny / (-)-catechin gallate
R3 = OH, R4 = X  galusan (-)-galokatechiny / (-)-galocatechin gallate
R1 = R2 = H  (-)-epikatechina / (-)-epicatechin
R1 = OH, R2 = H  (-)-epigalokatechina / (-)-epigallocatechin
R1 = H, R2 = X  galusan (-)-epikatechiny / (-)epicatechin gallate
R1 = OH, R2 = X  galusan (-)-epigalokatechiny / (-)-epigallocatechin gallate
Główne źródła: owoce, czerwone wino, zboża, warzywa liściaste i ich jadalne korzenie (fasola, bakłażany, cebula, kabaczki, rzodkiew)
Main sources: fruits, red wine, cereals, leafy vegetables and their edible roots (beans, eggplants, onions, squash, radish)
R1 = R2 = OH, R3 = H  cyjanidyna / cyanidin
R1 = R3 = H, R2 = OH  pelargonidyna / pelargonidin
R1 = R2 = R3 = OH  delfinidyna / delphinidin
R1 = OCH3, R2 = R3 = OH  petunidyna / petunidin
R1 = OCH3, R2 = OH, R3 = H  peonidyna / peonidin
R1 = OCH3, R2 = OH, R3 = OCH3  malwidyna / malvidin
19
Flavan-3-ols
Podklasa
Subclass
Wzór szkieletu
Backbone structure
(+)-epikatechina / (+)-epicatechin
R5 = H  (+)-katechina / (+)-catechin
R5 = OH  (+)-galokatechina / (+)-gallocatechin
Example compounds
Główne źródła: owoce (szczególnie morele, wiśnie, winogrona), herbata, nasiona roślin strączkowych
Main sources: fruits (especially apricots, cherries, grapes), tea, legume seeds
Tabela 1. cd.
Table 1. cont.
Flawan-3-ole
20
Chalcones
Chalkony
Główne źródła: chmiel, kwiatostany kocanek, nasiona jabłek
Main sources: hop, Helichrysum inflorescences, apple seeds
R = H  floretyna / phloretin
R = ramnoza / rhamnose  florydzyna / phloridzin
Dihydrochalkony / Dihydrochalcones:
R = H  izosalipurpol / isosalipurpol
R = glukoza  izosalipurpozyd / isosalipurposide
Chalkony / Chalcones:
21
22
Ryc. 2. Budowa podstawowego szkieletu flawonu wraz z oznaczeniem pierścieni i numeracją
atomów węgla [Fernandez i in. 2002, Galleano i in. 2010]
Fig. 2. Structure of the basic flavone backbone with ring symbols and carbon atom numbers
[Fernandez et al. 2002, Galleano et al. 2010]
Lignany to znacząca grupa polifenoli obecnych w nasionach lnu oraz w soczewicy, czosnku, szparagach, śliwkach i gruszkach [Duda-Chodak i Wojdyło 2007].
Stanowią składnik ścian komórkowych, w związku z czym są zwykle uwalniane dopiero w wyniku działania bakterii jelitowych. Do najważniejszych przedstawicieli tej
klasy polifenoli zalicza się enterodiol, pinorezynol, sekoizolarycyrezynol, enterolakton, matairezynol, sezaminę, sezaminol, sezamolinę, schizandrynę i schizandrol.
Jeden z najlepiej przebadanych związków przeciwutleniających występujących
w winogronach – rezweratrol – należy do grupy stilbenów. Ma on zdolność indukowania apoptozy w komórkach nowotworowych poprzez regulację ekspresji genów bax
i bcl-2, chroni także grupy tiolowe w białkach przed utlenianiem [Shakibaei i in. 2009].
Zastosowanie przeciwutleniaczy
Przeciwutleniacze, jako związki hamujące inicjację lub przerywające już zaczęte
reakcje wolnorodnikowe, znalazły zastosowanie w licznych branżach przemysłowych.
Jako pierwsze na myśl przychodzą antyoksydanty, wykorzystywane w przemyśle
spożywczym jako substancje konserwujące, ale na znacznie większą skalę stosowane
w przemyśle chemicznym. Produkty tej gałęzi przemysłu, takie jak polimery (stabilizatory monomerów, kleje, gumy, elastomery, tworzywa sztuczne), smary, biopaliwa
czy różnego typu powłoki, są podatne na utlenianie podczas wysokotemperaturowych
procesów ich wytwarzania, a później podczas ekspozycji na niekorzystne warunki
środowiska w trakcie użytkowania (promieniowanie UV, tlen, światło).
Co roku na świecie wytwarza się ok. 280 mln ton polimerów (dane wg Fundacji
PlasticsEurope Polska), z których znakomita większość wymaga stosowania różnych
stabilizatorów hamujących ich rozkład w czasie użytkowania. Główną przyczyną
degradacji polimerów, w tym wszelkiego rodzaju tworzyw sztucznych oraz klejów,
jest wolnorodnikowa reakcja łańcuchowa [Al-Malaika 1989], inicjowana przez tlen,
którego działanie może być dodatkowo przyspieszane przez światło słoneczne, wy-
23
soką temperaturę, naprężenia mechaniczne, jony metali czy pozostałości katalizatora lub przez reakcję z zanieczyszczeniami. Zastosowanie antyoksydantów ma tym
procesom zapobiegać lub znacząco je spowalniać [Seguchi i in. 2012]. Przeciwutleniacze
dodawane są również do kosmetyków na bazie tłuszczu, takich jak szminki i kremy
nawilżające, aby zapobiec ich jełczeniu. Zgodnie z raportem IHS Chemicals z 2012 r.
(http://www.ihs.com/products/chemical/planning/scup/antioxidants.aspx), aż 53%
wytworzonych na świecie przeciwutleniaczy wykorzystuje się w produkcji i przetwórstwie gumy oraz lateksu, 36% do produkcji tworzyw sztucznych, 8% w technologii
żywności i pasz i zaledwie 3% do wytwarzania paliw ropopochodnych. Mimo stosunkowo niewielkiego udziału przeciwutleniaczy przeznaczonych dla technologii
żywności w światowej produkcji tych związków, ten rodzaj ich wykorzystania jest
chyba najlepiej przebadanym obszarem. Zastosowanie antyoksydantów jako konserwantów żywności – substancji, które dodane do produktu żywnościowego opóźnią
lub całkowicie zahamują utlenianie zawartych w nim związków organicznych – ogranicza psucie się produktu i znacząco wydłuża okres jego przydatności do spożycia.
Przeciwutleniacze dopuszczone do stosowania w żywności mogą być naturalne
lub syntetyczne. Do pierwszej grupy należy m.in. kwas askorbinowy (E300) oraz
tokoferole (E306), a do drugiej galusan propylu (E310), tert-butylohydrochinon
(TBHQ, E319), butylowany hydroksyanizol (BHA, E320) i butylowany hydroksytoluen (BHT, E321) (Rozporządzenie Parlamentu Europejskiego i Rady (WE)
nr 1333/2008 z dnia 16 grudnia 2008 w sprawie dodatków do żywności). W literaturze
przedmiotu coraz częściej spotyka się jednak doniesienia, że antyoksydanty syntetyczne, także te zatwierdzone do stosowania w żywności, mogą niekorzystnie wpływać
na zdrowie konsumentów. Dodawanie ich w coraz większej ilości do rosnącej liczby
produktów sprawia, że konsumenci są poddani ekspozycji na coraz wyższe dawki tych
związków. Wyniki badań naukowych nie zawsze uspokajają. Na przykład, w doświadczeniach na modelach zwierzęcych obserwowano, że BHT i BHA mają działanie
antykancerogenne [Williams i Iatropoulos 1996, Iverson 1999, Bomhard i in. 2002]
bądź odwrotnie – kancerogenne [Moch 1986, Cantoreggi i in. 1993, Botterweck i in.
2000]. BHA jest zaangażowany w promowanie nowotworzenia, przypuszczalnie poprzez zwiększanie produkcji H2O2, przy czym efekt ten dotyczy głównie przedżołądka – organu występującego jedynie u gryzoni [Iverson 1999]. Z kolei BHT wywiera
efekt kancerogenny na wątrobę u szczurów i myszy [Moch 1986, Botterweck i in.
2000]. Wykazano też, że BHT może zwiększać degranulację komórek tłuszczowych,
tym samym jest „uwikłany” w reakcję alergiczną [Yamaki i in. 2007]. Badania z udziałem populacji ludzkiej nie wykazały istotnego związku między ryzykiem raka żołądka
a spożywaniem zwyczajowych, niskich dawek BHT i BHA [Botterweck i in. 2000].
Niemniej jednak Europejski Urząd ds. Bezpieczeństwa Żywności (EFSA) dowiódł,
że łączna ekspozycja na BHA – jako dodatku do żywności oraz jako dodatku do
materiałów mających kontakt z żywnością – przekracza wartość dopuszczalnego
dziennego spożycia (ADI) dla większości badanych populacji na średnim i wysokim
24
poziomie konsumpcji [Aguilar i in. 2012]. Międzynarodowa Agencja Badań nad
Rakiem zdobyła wystarczające dowody na potwierdzenie kancerogennego działania
BHA wobec zwierząt doświadczalnych, ale w odniesieniu do ludzi takich dowodów
nie znalazła. Wszystko to spowodowało, że stosowanie syntetycznych przeciwutleniaczy zaczęło wzbudzać coraz większy sprzeciw wśród konsumentów. Dlatego też
poszukuje się coraz to nowych źródeł naturalnych przeciwutleniaczy poprzez tzw.
powrót do korzeni, przeszukiwanie tradycyjnych przepisów medycyny naturalnej
oraz wskazówek zielarzy, „szamanów” i uzdrowicieli, a także badanie roślin używanych przez nich w celach leczniczych. Okazuje się, że wiele roślin, dotychczas stosowanych lokalnie, to prawdziwe „bomby antyoksydacyjne”. Wśród nich są egzotyczne jagody açai (euterpy warzywnej), goji (kolcowoju), cytryńca chińskiego czy
owoce noni, ale też bardziej swojskie owoce aronii, czarnego bzu, czarnej porzeczki,
maliny, pigwowca japońskiego, jak również rozmaite zioła i przyprawy.
W ostatnich latach istotnie zwiększyła się świadomość konsumentów w zakresie
negatywnego oddziaływania na zdrowie stosowanych w produkcji żywności syntetycznych dodatków, konserwantów, stabilizatorów i innych substancji „wzbogacających”.
Ponadto wskutek nadmiernego i często niewłaściwego stosowania antybiotyków nastąpił znaczący wzrost odporności drobnoustrojów patogennych oraz powodujących
psucie się żywności nie tylko na znane i dostępne antybiotyki, ale także na procesy
technologiczne do tej pory skuteczne w ich eliminacji. Wszystko to sprawia, że przemysł poszukuje nowych źródeł naturalnych składników, które będą miały właściwości
stabilizujące żywność, a jednocześnie wzbogacały ją o składniki bioaktywne, korzystnie oddziałujące na zdrowie konsumenta.
Typowe techniki stosowane do utrwalania żywności i do zapewniania jej bezpieczeństwa mikrobiologicznego (pakowanie w zmodyfikowanej atmosferze, pakowanie
próżniowe, chłodzenie, wprowadzanie składników antybakteryjnych do opakowań
czy powłok ochronnych) są skuteczne zwykle tylko w odniesieniu do powierzchni
produktu [Mosqueda-Melgar i in. 2008, Gyawali i Ibrahim 2014]. Połączenie tych
technik z dodaniem naturalnych składników przeciwdrobnoustrojowych, czasem we
wręcz śladowych dawkach, może znacząco poprawić jakość (smak, zapach, barwę),
trwałość przechowalniczą i wartość odżywczą produktu (zwiększona zawartość witamin, polifenoli, cennych mikroelementów), zapewniając jednocześnie jego utrwalenie mikrobiologiczne [Mosqueda-Melgar i in. 2008, Ponce i in. 2008, Radha
Krishnan i in. 2014].
Przeciwutleniacze w produkcie żywnościowym pełnią niejako podwójną rolę.
Przede wszystkim konserwują żywność, zabezpieczając jej składniki przed utlenieniem,
a w konsekwencji przed zepsuciem i zmianą walorów smakowo-zapachowych. Wykazują
też działanie utrwalające produkt mikrobiologicznie, gdyż hamują rozwój lub inaktywują drobnoustroje powodujące psucie się produktu oraz mikroorganizmy patogenne. Ze względu na rosnącą świadomość konsumentów oraz wspomniane już nie-
25
zbyt przychylne opinie na temat syntetycznych przeciwutleniaczy, zarówno przemysł
spożywczy, jak i naukowcy poszukują nowych źródeł antyoksydantów i nieznanych
dotąd związków, które mogłyby zostać wykorzystane jako dodatki do żywności o działaniu przeciwutleniającym, utrwalającym i wzbogacającym. Szacuje się, że istnieje
ponad 1300 roślin, które zawierają poznane składniki o działaniu przeciwbakteryjnym.
Jak dotąd udało się wyizolować ponad 30 000 składników z bogatych w polifenole
roślin oleistych stosowanych w przetwórstwie żywności, ale tylko niektóre z nich
zostały scharakteryzowane pod kątem wykorzystania na skalę przemysłową.
Do najwcześniej udokumentowanych i najważniejszych przykładów materiałów
roślinnych, których dualne efekty wykorzystano w praktyce przemysłowej, należą
olejki eteryczne. Z jednej strony, nadają one żywności niepowtarzalne właściwości
sensoryczne, z drugiej zaś zapobiegają namnażaniu się mikroorganizmów odpowiedzialnych za psucie się żywności oraz mikroorganizmów patogennych [Burt 2004,
Gutierrez i in. 2008, Proestos i in. 2008, Weerakkody i in. 2010]. Zastosowanie
przypraw i zawartych w nich olejków eterycznych do utrwalania żywności ma na celu
wydłużenie czasu jej przechowywania i przydatności do spożycia, zredukowanie
liczby lub całkowite wyeliminowanie patogenów oraz polepszenie ogólnej jakości
produktów spożywczych [Burt 2004, Gutierrez i in. 2008, Ponce i in. 2008, Radha
Krishnan i in. 2014].
Zastosowanie w technologii żywności mogą znaleźć nie tylko olejki eteryczne.
Do najważniejszych składników o potencjale antymikrobiologicznym należą polifenole (głównie flawonoidy), terpenoidy, saponiny, tiosulfiniany i glukozynolany.
Szczególną uwagę poświęca się polifenolom. Dzięki swej budowie idealnie nadają się
do pełnienia roli przeciwutleniaczy – mogą zarówno hamować powstawanie, jak
i wygaszać już powstałe wolne rodniki, hamować inicjację i przerywać rozpoczęte
reakcje wolnorodnikowe [Fernandez i in. 2002, Williams i in. 2004, Galleano i in.
2010]. W ten sposób skutecznie hamują peroksydację lipidów, utlenianie białek i cukrów oraz oksydacyjne uszkadzanie kwasów nukleinowych. Związki te zawierają
liczne grupy hydroksylowe, które wywierają działanie hamujące, gdyż mogą reagować
ze ścianą komórkową bakterii, uszkadzać strukturę błon komórkowych i powodować
wyciek składników komórki. Co więcej, jako przeciwutleniacze, hamują powstawanie
i działanie RFT oraz zmiatają wolne rodniki, a w konsekwencji obniżają potencjał
oksydacyjno-redukcyjny środowiska czy medium wzrostowego [Gyawali i Ibrahim
2014]. Dzięki temu oprócz aktywności przeciwutleniającej wykazują działanie bakteriobójcze lub bakteriostatyczne wobec niepożądanych mikroorganizmów.
Wśród wydajnych źródeł naturalnych substancji o działaniu antyoksydacyjnym
i/lub przeciwdrobnoustrojowym znajdują się liczne rośliny lecznicze, zioła i przyprawy (bazylia, goździki, oregano, kolendra, tymianek, cynamon, majeranek, imbir,
kurkuma, szałwia, cebula, czosnek, pietruszka, trawa cytrynowa, rozmaryn) [Burt
2004, Lee i in. 2006, Yano i in. 2006, Shan i in. 2007, Tajkarimi i in. 2010, Weerakkody
i in. 2010, Gyawali i Ibrahim 2014]. Stosowane są pojedynczo lub w kombinacjach,
26
działają na bakterie Gram-dodatnie i Gram-ujemne, a ich skuteczność zależy m.in.
od dawki, pH, temperatury i dostępności tlenu [Burt 2004, Shan i in. 2007, Gutierrez
i in. 2008, Proestos i in. 2008, Tajkarimi i in. 2010].
Przyprawy i zioła są już powszechnie dodawane do różnego typu produktów
żywnościowych. Można je znaleźć w mięsie i jego przetworach, rybach, produktach
przetwórstwa owoców i warzyw, ale także w serach, mleku, jogurtach i maśle
[Tajkarimi i in. 2010], gdzie działają hamująco wobec patogenów (m.in. Staphylococcus
aureus, Escherichia coli O157:H7, Clostridium perfringens, Listeria monocytogenes,
Salmonella sp., Shigella sp., Pseudomonas sp., Vibrio parahaemolyticus) oraz innych
mikroorganizmów powodujących psucie się żywności i związane z tym znaczne straty finansowe (np. Botrytis cinerea, Alicyclobacillus acidoterrestris, pleśnie) [Lee i in.
2006, Yano i in. 2006, Proestos i in. 2008, Bevilacqua i in. 2010, Soylu i in. 2010,
Tajkarimi i in. 2010, Weerakkody i in. 2010].
Wiele olejków eterycznych i ich składników uznano już w Unii Europejskiej za
bezpieczne (m.in. karwakrol, karwon, aldehyd cynamonowy, cytral, eugenol, p-cymen,
limonen, mentol, tymol) i nadal poszukuje się nowych źródeł związków o aktywności przeciwutleniającej i/lub antymikrobiologicznej. Wciąż jednak nie wszystkie odkryte substancje, których dodatek do żywności mógłby przynieść wymierne korzyści,
sprawdzono pod kątem oddziaływania na organizm ludzki, chociażby w kwestiach
toksyczności i alergenności, nie wyznaczono dla nich wartości MIC ani też nie oceniono możliwych reakcji synergistycznych lub antagonistycznych z innymi składnikami żywności. O niezbędności takich badań świadczą wyniki uzyskane przez różnych
autorów [Amezouar i in. 2012, Teke i in. 2013, Martins i in. 2014].
Wpływ budowy związków polifenolowych na ich właściwości antyoksydacyjne
i przeciwmikrobiologiczne
Dotychczasowe badania nad zależnością między budową flawonoidów a ich aktywnością antyoksydacyjną [Cook i Samman 1996] wykazały, że o właściwościach przeciwutleniających decyduje kilka elementów strukturalnych (ryc. 3). Umożliwiają one
delokalizację elektronów, co powoduje zwiększenie stabilności powstających rodników
aryloksylowych [Rice-Evans i in. 1997]. Uważa się, że polifenole mają budowę chemiczną wręcz idealną do pełnienia przez nie roli wygaszaczy wolnych rodników.
Jak wykazano, do elementów kluczowych w zmiataniu wolnych rodników i hamowaniu reakcji peroksydacji lipidów można zaliczyć:
1) obecność wolnej grupy hydroksylowej przyłączonej do atomu węgla C3 w pierścieniu C; aglikony, które mają wolną grupę C3–OH (np. fisetyna, (+)-katechina,
kwercetyna, myrycetyna, moryna), są silniejszymi przeciwutleniaczami i wydajniej
hamują reakcje peroksydacji lipidów w porównaniu z tymi, które mają grupę
C3–OH podstawioną cukrem (jak diosmetyna, apigenina, hesperydyna, naringina),
27
2) podwójne wiązanie między atomami węgla C2 i C3 (C2=C3); redukcja tego
wiązania osłabia działanie antyoksydacyjne,
3) grupę karbonylową (C=O) przy atomie węgla C4,
4) liczbę grup hydroksylowych; im więcej tych grup, tym większe zdolności przeciwutleniające,
5) rozmieszczenie grup hydroksylowych, czyli tzw. wzór hydroksylacji; przyłączone
grupy –OH w pozycji C5 i C7 w pierścieniu A oraz w pozycji C3’ i C4’ w pierścieniu B, jak również przy atomie węgla C3 w pierścieniu C uczestniczą w hamowaniu peroksydacji lipidów,
6) jednoczesne występowanie w cząsteczce grupy karbonylowej w pozycji C4 oraz
grup hydroksylowych w pozycji C3 i C5; umożliwia to tworzenie chelatów z jonami żelaza i hamuje powstawanie wolnych rodników w reakcji Fentona [Cook
i Samman 1996, Rice-Evans i in. 1996, 1997].
Ryc. 3. Elementy struktury szkieletu flawonoidów (na przykładzie kwercetyny reprezentującej
flawonole), szczególnie istotne dla ich klasycznej aktywności antyoksydacyjnej: katechol,
tj. o-dihydroksybenzen (pierścień B z przyłączonymi dwiema grupami –OH) – najważniejszy element – zaznaczony kropkowanym okręgiem; nienasycone wiązanie w pierścieniu C,
między węglem C2 a C3 – zaznaczone pustą elipsą; grupa ketonowa C=O przy węglu C4
– zaznaczona szarym kołem. Układ katecholu wraz z innymi elementami struktury (w tym
grupami –OH przyłączonymi do pierścienia A) – zaznaczone zakreskowanymi elipsami
– uczestniczy także w chelatowaniu jonów metali przejściowych (Fe, Cu), dzięki czemu
flawonoidy hamują reakcję Fentona [na podstawie: Williams i in. 2004]
Fig. 3. Elements in the backbone structure of flavonoids (with quercetin representing flavonols as
an example), particularly relevant to their classical antioxidant activity: catechol, i.e. o-dihydroxybenzene (ring B with two –OH groups attached) – the most important element – marked
with a dotted circle; unsaturated bonds in ring C, between carbons C2 and C3 – marked
with an empty ellipse; keto group C=O at carbon C4 – marked with a grey disk. Catechol
along with other elements of the structure (including –OH groups attached to ring A) –
marked with hatched ellipses – participates also in the chelation of transition metal ions
(Fe, Cu), so flavonoids inhibit the Fenton reaction [based on: Williams et al. 2004]
28
Dowiedziono ponadto, że przyłączenie cząsteczki cukrów zmniejsza potencjał
antyoksydacyjny cząsteczki flawonoidu (aglikony, czyli cząsteczki flawonoidów pozbawione cukrów, są bardziej wydajne w hamowaniu wytwarzania aldehydu malonowego niż ich glikozydowe pochodne). Podobnie jest w przypadku obecności grup
karboksylowych, które obniżają właściwości antyperoksydacyjne z powodu przeszkód
sterycznych.
W wyniku reakcji cząsteczki flawonoidu z wolnym rodnikiem powstaje rodnik
flawonoidowy, który – ze względu na występowanie elektronów π uczestniczących
w delokalizacji elektronów – jest cząsteczką znacznie bardziej stabilną, a co za tym
idzie mniej reaktywną niż wyjściowy wolny rodnik.
Spośród składników pochodzenia roślinnego związki polifenolowe charakteryzują się chyba największą różnorodnością i zmiennością strukturalną, dlatego istnieje szeroki wachlarz mechanizmów odpowiadających za ich właściwości antyoksydacyjne, ale też antymikrobiologiczne. Ze względu na szlaki syntezy flawonoidów
grupy hydroksylowe w tych związkach występują zwykle przy atomach węgla C2’,
C3’, C4’, C5’ w pierścieniu B lub przy atomach C5 i C7 w pierścieniu A, a zatem
w pozycjach zwiększających zdolności antyoksydacyjne. Dzięki obecności licznych
grup hydroksylowych polifenole mają także działanie hamujące wzrost bakterii, gdyż
grupy te mogą oddziaływać ze ścianą i błonami komórkowymi, powodując uszkodzenia i wyciek składników z komórki [Gyawali i Ibrahim 2014]. Należy jednak
podkreślić, że każda, nawet pojedyncza, zmiana ilości bądź rozmieszczenia grup
hydroksylowych i innych grup funkcjonalnych czy podstawienia tych grup lub zmiana konfiguracji cis/trans powoduje, że związki mają odmienne właściwości, w tym
inną skuteczność przeciwbakteryjną. Aktywne grupy w cząsteczce zwiększają bowiem
szanse na delokalizację elektronów, uczestniczą w wymianie protonów i zaburzają
gradient w poprzek błony cytoplazmatycznej [Ultee i in. 2002]. To prowadzi do
zahamowania przepływu protonów, wyczerpania puli ATP i ostatecznie do śmierci
komórki. Podobnie jak w przypadku potencjału antyoksydacyjnego, również dla
właściwości przeciwdrobnoustrojowych duże znaczenie ma położenie grup hydroksylowych. Tymol (2-izopropylo-5-metylofenol) i karwakrol (5-izopropylo-2-metylofenol) są izomerami (ryc. 4), mają podobną strukturę cząsteczki, jednak grupy –OH
w tymolu są zlokalizowane w pozycji meta, a w karwakrolu w pozycji para. Dorman
i Deans [2000] wykazali, że ma to istotny wpływ na efektywność działania wobec
bakterii Gram-dodatnich i Gram-ujemnych, przy czym tymol wykazuje silniejsze
działanie inhibitorowe. Obecność grupy –OH przy atomie węgla C5 ma istotne
znaczenie także dla aktywności flawanonów i flawonów wobec szczepów MRSA
(ang. methicillin-resistant Staphylococcus aureus) [Gyawali i Ibrahim 2014]. Estryfikacja
grupy hydroksylowej (np. w estrze metylowym karwakrolu) powoduje zmiany w chmurze elektronów zdelokalizowanych. Taki związek traci zdolność hamowania wzrostu
Bacillus cereus [Ultee i in. 2002], a jego działanie wobec innych bakterii jest znikome w porównaniu z działaniem karwakrolu [Dorman i Deans 2000]. Istotne jest
29
Ryc. 4. Aktywność antymikrobiologiczna pierścieniowych olejków eterycznych w zależności od
budowy cząsteczki [Ultee i in. 2002]
Fig. 4. Antimicrobial activity of aromatic essential oils as dependent on the structure of their
molecule [Ultee et al. 2002]
tutaj współwystępowanie grup –OH oraz układu delokalizującego elektrony (w postaci wiązań podwójnych w pierścieniu). Brak tego drugiego „elementu” struktury
cząsteczki, jak w mentolu, zapobiega oderwaniu protonu z grupy –OH i sprawia, że
aktywność antymikrobiologiczna jest znacznie mniejsza. Także rozerwanie pierścienia powoduje osłabienie potencjału antybakteryjnego, dlatego geraniol i nerol są
znacznie słabszymi inhibitorami wzrostu bakterii niż karwakrol czy tymol [Dorman
i Deans 2000, Gyawali i Ibrahim 2014].
Dla aktywności przeciwbakteryjnej ważna jest też liczba i konfiguracja wiązań
podwójnych. Cytronelol z jednym wiązaniem podwójnym jest mniej efektywny wobec
B. cereus, E. coli i S. aureus oraz Candida albicans niż pokrewne mu geraniol i nerol z dwoma takimi wiązaniami [Gyawali i Ibrahim 2014]. Z kolei nerol, z konfiguracją cis, jest silniejszym związkiem antybakteryjnym niż geraniol o konfiguracji trans
(ryc. 5) [Dorman i Deans 2000].
Kwas kawowy wykazuje wyższą aktywność przeciwdrobnoustrojową niż kwas
p-kumarowy z powodu dodatkowej grupy –OH przyłączonej do pierścienia fenolowego w cząsteczce [Stojković i in. 2013]. Podobnych obserwacji dokonali Figueiredo
i inni [2008], którzy zademonstrowali, że dodanie dwóch lub więcej grup –OH zwiększa aktywność przeciwbakteryjną pochodnych aldehydu benzoesowego, gdyż mogą
one wtedy skuteczniej działać na powierzchni komórek, łącząc się z grupami sulfhydrylowymi białek [Friedman i in. 2003]. Gyawali i Ibrahim [2014] uważają z kolei,
że wolne grupy –OH mogą się łatwo wiązać do miejsc aktywnych w enzymach, przez
co zmieniają metabolizm drobnoustrojów.
Wysoka aktywność składników fenolowych zależy również od wielkości przyłączonych grup alkilowych lub alkenylowych. Większy wpływ na aktywność związku
wywiera obecność grup alkenylowych niż alkilowych [Dorman i Deans 2000], ze
względu na wiązanie podwójne. W obu jednak przypadkach im dłuższe podstawniki, tym większy potencjał antymikrobiologiczny całego związku [Gyawali i Ibrahim
30
2014]. Grupa aldehydowa sprzężona z wiązaniem podwójnym C=C ma wysoką
elektroujemność, co zwiększa potencjał antybakteryjny. Takie ujemnie naładowane
składniki zakłócają transport elektronów w komórce, a także reagują z białkami
i kwasami nukleinowymi, hamując wzrost mikroorganizmów [Dorman i Deans 2000].
Również reszta kwasu octowego, dołączona do cząsteczki, zwiększa aktywność
przeciwdrobnoustrojową. Octan geranylu jest silniejszym inhibitorem wobec bakterii Gram-dodatnich i Gram-ujemnych niż sam geraniol. Jest to spowodowane
zwiększoną lipofilnością tego związku, łatwiejszym przenikaniem przez błony komórkowe i wydajniejszym ich uszkadzaniem na skutek hamowania transportu elektronów, translokacji białek, fosforylacji czy innej aktywności enzymatycznej. Podobnie
długość łańcucha alkilowego odgrywa rolę w hamowaniu drobnoustrojów; przypuszczalnie także i w tym przypadku znaczenie ma hydrofobowość cząsteczki [Dorman
i Deans 2000].
Ryc. 5. Aktywność antymikrobiologiczna łańcuchowych olejków eterycznych w zależności od
budowy cząsteczki oraz liczby i konfiguracji wiązań podwójnych [na podstawie: Gyawali
i Ibrahim 2014]
Fig. 5. Antimicrobial activity of chain essential oils as dependent on the structure of their molecule and the number and configuration of double bonds [based on: Gyawali and Ibrahim
2014]
Należy podkreślić, że aktywność antymikrobiologiczna może zależeć także od
czynników niezwiązanych z budową badanych związków, takich jak skład medium
hodowlanego, wielkość inokulum czy typ drobnoustroju [Tajkarimi i in. 2010].
Podsumowując można stwierdzić, że naturalne związki polifenolowe izolowane
z roślin zapewniają szeroki, wciąż nie do końca poznany, wachlarz zastosowań.
Obecnie liczne ośrodki badawcze koncentrują się na intensywnym poszukiwaniu
kolejnych, nowych substancji i opracowywaniu wydajniejszych metod izolacji tych
składników. Empirycznie wykazano, że nawet niewielkie modyfikacje strukturalne
cząsteczek (podstawniki) bądź zmiana parametrów środowiska (pH, polarność) mogą
skutkować istotnymi zmianami siły lub mechanizmów oddziaływania tych związków
na organizmy żywe.
31
Wpływ bioaktywnych składników roślin, szczególnie polifenoli,
na mikroorganizmy patogenne i/lub powodujące psucie się żywności
Rośliny odgrywają istotną, wielowymiarową rolę w funkcjonowaniu człowieka.
Przede wszystkim dostarczają one naszym organizmom wszystkich niezbędnych do
życia składników, które pełnią rolę budulcową, energetyczną i regulatorową.
Ostatnio jednak coraz większe zainteresowanie wzbudzają bioaktywne składniki
roślin, które jako ich wtórne metabolity występują w tkankach roślinnych w mniejszych stężeniach, ale mają istotny wpływ na zdrowie i funkcjonowanie człowieka.
W medycynie ludowej na całym świecie znane są gatunki roślin o specjalnym znaczeniu dla przetrwania organizmu, szczególnie w sytuacji choroby zakaźnej, osłabienia, poważnego skaleczenia czy zatrucia. Przez wiele lat medycyna starała się
wyizolować te składniki, oczyścić je i odtworzyć w laboratorium, aby wytworzyć
medykamenty przeciw różnym chorobom. Bioaktywne składniki, w tym polifenole
i przeciwutleniacze, stosowane są od wielu lat zarówno w formie oczyszczonej (jako
czyste związki), jak i w postaci naparów, wywarów, soków, napojów bądź ekstraktów z roślin leczniczych. Możliwości ich zastosowania są ogromne, począwszy od
użycia profilaktycznego [Pandey i Rizvi 2009], poprzez leczenie konkretnych jednostek chorobowych, m.in. zespołu jelita nadwrażliwego [Shapiro i in. 2007], otyłości [Meydani i Hasan 2010], cukrzycy [Bahadoran i in. 2013], choroby popromiennej [Okunieff i in. 2008], chorób układu naczyniowego [Maxwell i Lip 1997],
wątroby [Singal i in. 2011], trzustki [Esrefoglu 2012] i nerek [Palipoch 2013], nadciśnienia [Kizhakekuttu i Widlansky 2010], astmy [Grieger i in. 2013], malarii
[Sannella i in. 2007], nowotworów [Chen i in. 2014], stanów zapalnych [Shapiro
i in. 2007] czy alergii [Chirumbolo 2011], aż po wykorzystanie w leczeniu chorób
neurologicznych i psychicznych [Gomez-Pinilla i Nguyen 2012]. Substancje te działają także przeciw wirusom grypy [Droebner i in. 2007] i HIV [Yamaguchi i in.
2002], antybakteryjnie [Lee i in. 2006, Tajkarimi i in. 2010] i przeciwgrzybiczo
[Herrera i in. 2010]. Do gatunków patogennych dla człowieka, o potwierdzonej
doświadczalnie wrażliwości na hamujące działanie kwasów fenolowych, flawonoidów, tanin i antocyjanów, należą bakterie Gram-dodatnie (Staphylococcus aureus,
Listeria monocytogenes, Micrococcus luteus, Enterococcus faecalis, Clostridium
botulinum, Bacillus subtilis) i Gram-ujemne (Escherichia coli, Salmonella Typhimu
rium, S. enterica, Proteus mirabilis, Yersinia enterocolityca, Shigella dysenteriae i S. flex
neri, Pseudomonas fluorescens i P. aeruginosa, Vibrio cholerae) oraz grzyb chorobotwórczy Candida albicans [Friedman i in. 2003, Lee i in. 2006, Tajkarimi i in. 2010,
Gyawali i Ibrahim 2014].
Wzrastająca świadomość współczesnego konsumenta powoduje odwrót od syntetycznych preparatów w kierunku naturalnych źródeł związków bioaktywnych.
Prowadzi także do zwiększenia popytu na żywność funkcjonalną oraz suplementy
diety bogate w składniki o charakterze przeciwutleniającym. Obserwuje się „wysyp”
32
producentów, dystrybutorów, sklepów z tzw. „zdrową żywnością”, ekologiczną i/lub
naturalną czy witryn internetowych oferujących „cudowne” środki na niemal wszystkie bolączki rodzaju ludzkiego.
Bogate w przeciwutleniacze preparaty i surowce o znanych właściwościach
prozdrowotnych
Jak już wspomniano wcześniej, źródłem przeciwutleniaczy w diecie są nie tylko
spożywane owoce i warzywa oraz związki dodane do żywności jako konserwanty.
Coraz szybszy tryb życia, stres, zapracowanie i zabieganie, a jednocześnie moda na
bycie zdrowym, młodym, sprawnym powoduje, że wielu ludzi ucieka się do wspomagania swojego organizmu i zdrowia rozmaitymi preparatami, specyfikami czy
suplementami diety. W dobie Internetu zakupienie dowolnego preparatu nie stanowi większego problemu. Co więcej, konsumenci są nieustannie bombardowani
ulotkami i reklamami „cudownych” specyfików na nadwagę, stres, zmęczenie, przeciw zmarszczkom, chorobom cywilizacyjnym itp. Wybór tych preparatów jest ogromny – wystarczy wejść na stronę internetową dowolnego sklepu ze „zdrową żywnością”,
z żywnością ekologiczną czy naturalną bądź sklepu oferującego „prozdrowotne”
zioła, suplementy diety czy specyfiki regionalne, nie wspominając o aptekach on-line z równie bogatą ofertą.
Poniżej zaprezentowano w dużym skrócie właściwości i zastosowania, deklarowane przez producentów i/lub dystrybutorów, jedynie kilkunastu takich surowców
roślinnych i suplementów diety – tych, które zostały wykorzystane w niniejszej pracy do doświadczeń ze względu na ich powszechne stosowanie w zapobieganiu różnym
schorzeniom, leczeniu lub wspomaganiu terapii tych schorzeń. Wszystkie one są
w Polsce ogólnie dostępne, pochodzą z przydomowych ogródków lub są sprzedawane na placach targowych, w sklepach z żywnością naturalną i ekologiczną bądź
w aptekach (bez recepty).
Spośród suplementów (preparatów farmaceutycznych) wybrano Citrosept, spirulinę oraz sok z noni. Produkty uznawane za żywność o działaniu prozdrowotnym
reprezentują suszone jagody goji i cytryńca chińskiego oraz zielona herbata. Z owoców o uznanych właściwościach prozdrowotnych lub leczniczych wybrano czarny bez,
borówkę brusznicę, żurawinę, malinę oraz mniej popularne, ale uprawiane w Polsce,
pigwowiec japoński i dereń jadalny, z warzyw – soję i czerwoną cebulę, a z ziół –
czosnek niedźwiedzi oraz ziele pokrzywy.
Suplement diety Citrosept Organic to znany z aktywności antymikrobiologicznej
ekstrakt z pestek i miąższu grejpfruta wzbogacony witaminą C. Liczne prace wykazują, że składniki grejpfruta działają hamująco na bakterie i grzyby [Xu i in. 2007],
zawiera on też cenne przeciwutleniacze, w tym naringinę, narirutynę i hesperydynę
oraz witaminę C [Wu i in. 2007, Kelebek 2010].
33
Sok z noni to świeży sok wyciskany z dojrzałych owoców morwy indyjskiej
(Morinda citrifolia L.; noni). Owoce i liście tej rośliny są od stuleci stosowane na
wyspach Polinezji, a stosunkowo niedawno sok z noni zaczął podbijać rynki zachodnie. Zgodnie z deklaracjami dystrybutorów i producentów, związki bioaktywne zawarte w owocach noni dobroczynnie działają na organizm człowieka, wspomagają pracę układu immunologicznego, zwiększając jego skuteczność w walce
z chorobami wirusowymi, bakteryjnymi i grzybiczymi, ograniczają przyczyny i osłabiają objawy alergii, zalecane są w chorobach nowotworowych i ich profilaktyce,
w stanach depresyjnych i pobudzenia nerwowego, przy zwiększonym stresie, regulują ciśnienie krwi i poziom cholesterolu, pomagają utrzymać prawidłową wagę
[Basar i in. 2010, Singh 2012]. Zainteresowanie tą rośliną wiąże się z jej bogatym
składem fitochemicznym, który jest zróżnicowany w zależności od organu rośliny.
Dotychczas w noni zidentyfikowano około 200 związków. Są to głównie mikroelementy, związki fenolowe i alkaloidy [Pawlus i Kinghorn 2007, Potterat i Hamburger
2007, Singh 2012]. Do najważniejszych składników tej rośliny należą damnakantal,
kseronina, prokseronina i prokseronaza. Choć na temat noni pojawiło się mnóstwo
publikacji, to źródeł stricte naukowych, potwierdzających te wszystkie właściwości,
nie ma zbyt wiele. Mimo to sok z noni uzyskał akceptację Unii Europejskiej jako
tzw. nowa żywność (ang. novel food). Obawy budziły ewentualne skutki uboczne,
jakie mogłyby wywierać działające genotoksycznie antrachinony występujące w korzeniu tej rośliny. Udowodniono jednak, że w owocach noni substancje te nie
występują i w soku z tych owoców nie ma żadnych toksycznych związków. Dzięki
temu produkt handlowy został uznany za bezpieczny i dopuszczono go do obrotu
rynkowego. W obrocie najczęściej spotykany jest jako suplement diety lub składnik
dodatkowy (sproszkowany sok z owoców noni). Nieliczne badania naukowe potwierdziły jak dotąd, że wyciąg z owoców noni zmniejsza wrażliwość na ból, dzięki czemu może znaleźć zastosowanie w łagodzeniu bolesnych stanów zapalnych
w stawach [Basar i in. 2010].
Wiele spośród wybranych do badań roślin to sprawdzone środki stosowane w medycynie ludowej na różne dolegliwości, w tym na grypę i przeziębienia. Z pewnością
należy tu wymienić maliny, czarny bez, czosnek i cebulę, za których wykorzystaniem
przemawia nie tylko tradycja, ale i argumenty naukowe. Cebula (szczególnie jej
odmiany czerwone) jest bardzo bogatym źródłem kwercetyny i jej pochodnych o budowie odmiennej niż w innych owocach i warzywach [Beesk i in. 2010]. Cebula
czerwona zawiera liczne witaminy, m.in. witaminy z grupy B, A, PP i K, a także
wapń, potas, sód, pektyny oraz śluzy [Lanzotti 2006, Singh i in. 2009]. Dzięki zawartości licznych substancji cebula czerwona wykazuje działanie antyseptyczne, poza
tym korzystnie wpływa na pracę żołądka, wzmagając procesy trawienne, zmniejsza
stężenie we krwi lipoprotein o niskiej gęstości i cukru, przyczynia się do spadku
ciśnienia krwi, a także działa wzmacniająco na organizm człowieka [Corzo-Martínez
i in. 2007].
34
Czosnek niedźwiedzi wybrano jako występującą naturalnie roślinę stosowaną od
wieków jako przyprawa, ale także „remedium” na wszelkie dolegliwości, począwszy
od pozbywania się pasożytów, grzybic i chorób bakteryjnych, przez wspomaganie
leczenia anemii, łagodzenie kłopotów z trawieniem, zbyt wysokim ciśnieniem, nadmiernym poziomem cholesterolu czy zakrzepami krwi, aż po zapobieganie niektórym
nowotworom [Reuter 1995, Rahman 2001, Omar i Al-Wabel 2010, Bagiu i in. 2012].
Czosnek niedźwiedzi zawiera mnóstwo witamin (C, E, A), dużo selenu i żelaza,
zwiększa wydzielanie śluzu w oskrzelach, oczyszczając drogi oddechowe (istotne dla
palaczy), oraz pobudza wydzielanie żółci i soku żołądkowego. Jest rośliną najbogatszą na świecie w aktywne związki siarki – zawiera ich siedem razy więcej niż czosnek
pospolity [Sendl 1995, Carotenuto i in. 1996, Błażewicz-Woźniak i Michowska 2011].
Aktywuje wiele enzymów odpowiedzialnych za odtruwanie organizmu z metali ciężkich, chemikaliów, pestycydów i innych związków toksycznych, słusznie więc jest
promowany w sklepach z tzw. zdrową żywnością, szczególnie w krajach wysoko
uprzemysłowionych. W 1992 r. został uznany za „roślinę roku” ze względu na swoje właściwości lecznicze i możliwości zastosowania w kuchni. Czosnek niedźwiedzi
staje się coraz bardziej popularny nie tylko z powodu niezwykłych właściwości i składu, ale także z powodu braku charakterystycznego czosnkowego zapachu. Uważa
się, że ma silne działanie bakteriobójcze, a także jest jednym z najskuteczniejszych
środków stosowanych w zwalczaniu drożdżaka (Candida albicans). Co ciekawe,
w Niemczech wykorzystuje się go zwyczajowo do regeneracji flory bakteryjnej jelit
po kuracjach antybiotykowych [Reuter 1995, Sendl 1995]. Stąd pojawił się pomysł
sprawdzenia, jak czosnek niedźwiedzi wpływa na mikrobiotę jelitową, czyli naukowego zweryfikowania, czy wspomniany zwyczaj jest uzasadniony.
Sok z malin to kolejny „domowy” środek na zimowe przeziębienia. Jego działanie z pewnością ma związek z dużą zawartością witaminy C i polifenoli. Stężenie
witaminy C w malinach zależy od odmiany i wynosi od 16,8–32,4 mg [Pantelidis i in.
2007] do nawet ponad 92 mg [de Souza i in. 2014] na 100 g świeżych owoców.
Elagotaniny stanowią aż 57% oznaczonych w tych owocach związków polifenolowych,
a na drugim miejscu plasują się antocyjany (42%), z dominującym cyjanidyno-3-O-soforozydem (61% antocyjanów) [Mazur i in. 2014]. To właśnie dużej zawartości
elagotanin, a także produktom ich metabolizmu, przypisuje się znaczącą rolę w utrzymaniu prawidłowego stanu naczyń krwionośnych [Larrosa i in. 2010]. Spore zainteresowanie wzbudza też ostatnio olej z pestek (nasion) malin, gdyż stanowią one
bardzo obfity objętościowo odpad z przetwórstwa tych owoców. Olej ten jest bogaty w witaminę E, szczególnie γ-tokoferol, oraz w kwasy: linolowy (54,5%), α-linolenowy
(29,1%), oleinowy (12%) i palmitynowy (2,7%) [Oomah i in. 2000].
Owoce żurawiny, czarnego bzu i brusznicy zaliczane są zwykle do dużej grupy
owoców jagodowych, choć z botanicznego punktu widzenia bez czarny, podobnie
jak dereń, jest pestkowcem. Wszystkie te rośliny jednak należą do kladu astrowych,
a ich owoce wyglądają jak wielobarwne jagody i mają walory prozdrowotne zysku-
35
jące coraz większe uznanie. Z jagód różnych gatunków roślin izoluje się składniki
wspomagające funkcjonowanie narządu wzroku, a bogactwo flawonoidów, antocyjanów i luteiny sprawia, że słowo „jagoda” kojarzy się z wyjątkowo zdrowym owocem.
Potwierdzają to też liczne badania dotyczące owoców jagodowych [Matsumoto i in.
2003, Nohynek i in. 2006, Nile i Park 2014]. Bez czarny znajduje zastosowanie zarówno w postaci kwiatów, jak i owoców, wykazuje działanie moczopędne, przeciwbólowe i napotne oraz wzmacniające naczynia. Z owoców czarnego bzu izoluje się
związki działające antywirusowo, są to m.in. flawonoidy i antocyjany. Składniki te
powodują, że syropy i preparaty z tego owocu skracają czas potrzebny na powrót do
zdrowia, zwiększając odporność organizmu w okresie przeziębień i w sezonie grypowym. Między innymi, poprzez stymulację wydzielania cytokin prozapalnych (IL-1β,
TNF-α, IL-6, IL-8) aktywują układ immunologiczny do walki z patogenem [Barak
i in. 2001]. Proces ekstrakcji bioaktywnych składników z owoców czarnego bzu został
nawet opatentowany (Patent 1976543. Use of elderberry extract: The Sambucol®
preparation (Razei Bar Industries, Israel)), głównie ze względu na sposób izolacji
związku o nazwie Antivirin®, który wykazuje szczególnie silne działanie antywirusowe, blokuje hemaglutyninę i uniemożliwia wirusowi grypy wnikanie do komórek
i namnażanie się w nich [Zakay-Rones i in. 1995].
W przypadku borówki brusznicy głównym surowcem leczniczym są wprawdzie
liście, ale jej owoce są wyśmienitym materiałem do przyrządzania konfitur oraz
służą jako dodatek do mięs. Liście i owoce zawierają liczne flawonoidy, przede
wszystkim glikozydy (hiperozyd, pochodne kwercetyny), arbutynę, metyloarbutynę,
hydrochinon (produkt rozpadu arbutyny o silnym działaniu odkażającym drogi moczowe), garbniki katechinowe (o działaniu ściągającym i przeciwbiegunkowym),
antocyjany, a także witaminy (C, PP, B1, B2), garbniki, sole potasu, wapnia, żelaza,
fosforu i magnezu, kwasy jabłkowy, octowy i cytrynowy [Mane i in. 2011]. Taki skład
zapewnia działanie moczopędne, rozkurczowe i przeciwzapalne. Liście borówki
brusznicy znajdują zastosowanie przede wszystkim w leczeniu chorób przewodu
pokarmowego i moczowego, a owoce także w preparatach odchudzających, gdyż
wspomagają proces trawienia. Wykazano, że bogate w polifenole ekstrakty z owoców
Vaccinium vitis-idaea charakteryzują się znacznym potencjałem inhibitorowym wobec
lipazy trzustkowej [McDougall i in. 2009]. Dzięki temu spowalniają trawienie tłuszczów, zwiększając ich wydalanie z organizmu, zaś mniejsza ilość wolnych kwasów
tłuszczowych powoduje, że mniej ich ulega wchłonięciu i zmagazynowaniu w postaci tkanki tłuszczowej. Arbutyna, oprócz działania wykorzystywanego w leczeniu
układu moczowego, wykazuje działanie antyoksydacyjne, a także rozjaśnia przebarwienia skóry poprzez zahamowanie enzymu tyrozynazy i w efekcie zahamowanie
syntezy melaniny, dzięki czemu znalazła też zastosowanie w dermokosmetykach
[Chakraborty i in. 1998].
Żurawina, zarówno w formie suszonych owoców, soku, jak i gotowych preparatów zawierających ekstrakt z owoców, jest powszechnie stosowana do wspomagania
36
funkcji układu moczowego i zapobiegania infekcjom w jego obrębie, a nawet ich
leczenia [Raz i in. 2009]. Zakażenia dróg moczowych są wywoływane najczęściej
przez E. coli, a zawarte w owocach żurawiny związki hamują adhezję tej bakterii do
komórek nabłonka moczowodów, zarówno tę zależną, jak i niezależną od reszt
mannanu [Rahbar i Diba 2010]. Do składników odpowiedzialnych za ten efekt
ochronny wobec uroepitelium zalicza się kwas hipurowy. Jest to wydzielany z moczem
metabolit polifenoli (m.in. kwasu chlorogenowego [Gonthier i in. 2003], epikatechiny, epigalokatechiny i galusanu epigalokatechiny [Mulder i in. 2005]) zawartych
w żurawinie, ale także w czarnej i zielonej herbacie. Kwas hipurowy działa silnie
bakteriostatycznie i zakwasza mocz [Mulder i in. 2005, Raz i in. 2009, Rahbar i Diba
2010]. Istnieją także badania sugerujące, że kwas hipurowy może rozpuszczać kamienie szczawianów wapnia w moczu [Atanassova i Gutzow 2013].
Opisując specyfiki stosowane do wspomagania funkcjonowania układu moczowego, nie można pominąć pokrzywy, która od wieków używana jest w medycynie
ludowej jako lek wzmagający diurezę wodną, co wykorzystuje się np. w trakcie zakażeń bakteryjnych układu moczowego [Pieszak i Mikołajczak 2010]. Wśród innych
zastosowań ziela pokrzywy należy wymienić wspomaganie leczenia stanów zapalnych,
m.in. w chorobach reumatycznych [Randall i in. 1999], obniżanie ciśnienia krwi,
rozszerzanie naczyń krwionośnych, łagodzenie objawów łagodnego przerostu gruczołu krokowego [Safarinejad 2005], działanie wspomagające przy leczeniu różnego
rodzaju krwawień, działanie przeciwbólowe [Randall i in. 1999] i przeciwalergiczne
[Mittman 1990]. Zwyczajowo używa się jej także w celu przyspieszenia gojenia ran
i ograniczenia wypadania włosów.
Pigwowiec i dereń jadalny wybrano jako rośliny jak dotąd niszowe, choć o wieloletniej tradycji upraw w przydomowych ogródkach. Pigwowiec zwany jest polską
cytryną, ze względu na dużą zawartość witaminy C i podobny smak. Jego owoce
charakteryzują się dość małą zawartością cukrów prostych, ale bardzo wysokim,
w porównaniu z innymi znanymi owocami, potencjałem antyoksydacyjnym [Tarko
i in. 2014].
Herbata i kawa (napoje przyrządzone odpowiednio z liści krzewu herbacianego
i palonych nasion kawowca) są najpopularniejszymi ciepłymi napojami pitymi
w Polsce. Do badań wybrano herbatę, ponieważ napój ten jest bardzo popularny
i spożywany już od najmłodszych lat, a więc także przez osoby, u których mikrobiota jelitowa nie jest jeszcze ostatecznie ukształtowana, czyli jest bardziej podatna na
wpływy zewnętrzne. Ponadto herbata zawiera składniki niespotykane raczej w tak
dużej ilości w innych składnikach diety. Dotyczy to szczególnie herbat zielonych
zawierających taniny, flawanole, flawonoidy i kwasy fenolowe. Około 70% polifenoli w zielonej herbacie stanowią katechiny, wśród których dominują (+)-katechina,
(-)-epikatechina, galusan (-)-epikatechiny (ECG), (-)-epigalokatechina (EGC), galusan (-)-epigalokatechiny (EGCG) oraz kwas galusowy [Gramza i in. 2005, Sang
i in. 2005, Longo i in. 2008, Bansal i in. 2013]. To właśnie ze względu na wysokie
37
stężenie EGCG zieloną herbatę wybrano jako przedstawiciela napojów. Polifenole
zielonej herbaty, z uwagi na swoje właściwości antyoksydacyjne, antybakteryjne,
antywirusowe i przeciwzapalne, znalazły szerokie zastosowanie w przemyśle spożywczym, farmaceutycznym i kosmetycznym. Wykazano także, że zmniejszają ryzyko
zachorowania na choroby układu krążenia i różne nowotwory oraz wspomagają
odchudzanie [Gramza i in. 2005, Hodgson 2008, Chacko i in. 2010, Henning i in.
2011, Bansal i in. 2013].
Jednym z najlepiej przebadanych warzyw o działaniu prozdrowotnym jest soja,
a rynek preparatów sojowych i wyizolowanych z nich fitoestrogenów wciąż rośnie.
Soja jest najbogatszym znanym źródłem izoflawonów (głównie daidzeiny i genisteiny),
których metabolity (przede wszystkim ekwol) wykazują wysokie powinowactwo do
receptorów dla estrogenu [Setchell i in. 2005, Setchell i Clerici 2010b], w związku
z czym w organizmie człowieka działają jak te hormony [Atkinson i in. 2005]. Z tego
też powodu wykorzystywane są w niehormonalnych terapiach mających na celu
złagodzenie objawów menopauzy [Setchell i Clerici 2010a], ale także w celu zmniejszenia zagrożenia osteoporozą [Chang i in. 1995], miażdżycą i niektórymi nowotworami [Yuan i in. 2007, Atkinson i in. 2005].
Spirulina to kolejne odkrycie ostatnich lat w krajach wysoko rozwiniętych.
Nazwą tą obejmuje się preparaty – w postaci tabletek lub ekstraktów – zawierające biomasę różnych gatunków sinic z rodzaju Arthrospira. Oprócz funkcji żywieniowej, co jest istotne w ubogich krajach borykających się z problemem głodu
i niedożywienia, spirulina pełni również rolę farmaceutyku o bardzo szerokim
spektrum działania [Belay 2002]. W licznych badaniach wykazano, że przyjmowanie preparatów sporządzonych na bazie tych bakterii pomaga zahamować rozwój
istniejących nowotworów i zapobiec powstawaniu nowych, przeciwdziała zakażeniu
i wzrostowi pasożytów, działa przeciwbakteryjnie, przeciwwirusowo i antyalergicznie, jest też przydatne w leczeniu anemii i wrzodów [Mathew i in. 1995, Ayehunie
i in. 1998, Kim i in. 1998, Romay i in. 1998]. Farmaceutyki na bazie spiruliny
wykazują zdolność pochłaniania z organizmu metali ciężkich oraz pierwiastków
promieniotwórczych. Dowiedziono również, że skutecznie zmniejszają genotoksyczność mitomycyny, cyklofosfamidu i uretanu oraz ograniczają wywoływane przez
nie uszkodzenia chromosomów [Premkumar i in. 2001, Chamorro-Cevallos i in.
2008]. Preparaty zawierające spirulinę są dostępne i szczególnie polecane w sklepach z tzw. zdrową żywnością, ale także w aptekach czy sklepach internetowych.
Cytryniec chiński jest stosowany w ziołolecznictwie już od wieków, choć do
Europy dotarł dopiero pod koniec lat 50. XIX wieku. Chińczycy uważają go za
drugą, zaraz po żeń-szeniu, spośród najbardziej wartościowych roślin leczniczych,
a oprócz owoców wykorzystują także nasiona, pędy i liście. Owoce cytryńca eliminują zmęczenie fizyczne i psychiczne, wspomagają koncentrację, wykazują działanie
wzmacniające, przeciwszkorbutowe, antyoksydacyjne i przeciwbakteryjne, wspomagają leczenie chorób nerek, wątroby i płuc, działają przeciwnowotworowo [Ip i in.
38
1996, Hancke i in. 1999, Lamer-Zarawska 2001]. Ze względu na swoje wszechstronne działanie często zaliczane są do tzw. superowoców. Do tej elitarnej grupy owoców z pewnością należą też jagody goji, czyli owoce kolcowoju chińskiego i pospolitego (Lycium chinense i L. barbarum), znane także jako jagody tybetańskie lub
jagody długowieczności, od ponad 2000 lat wykorzystywane w medycynie ludowej
Tybetu i Chin. W jagodach wykryto m.in. skopoletynę o działaniu przeciwzakrzepowym [Potterat 2010], sitosterol obniżający stężenie cholesterolu we krwi, cyperon
o korzystnym wpływie na pracę serca i ciśnienie tętnicze krwi i zastosowaniu w leczeniu raka szyjki macicy [Cieślik i Gębusia 2012], kryptoksantynę, która obniża
zachorowalność na stwardnienie rozsiane, oraz fizalinę wykorzystywaną w walce
z nowotworami. Za najcenniejszy i najbardziej charakterystyczny składnik owoców
goji uważa się jednak specyficzny kompleks polisacharydowy, zwany w skrócie LBP
(Lycium barbarum Polysaccharides), którego zawartość w suszonych owocach sięga
5–8% s.m. Jest to kompleks bioaktywny, o działaniu wspomagającym układ immunologiczny, stymulujący makrofagi i limfocyty [Gan i Zhang 2002], aktywujący
splenocyty i limfocyty B [Peng i in. 2001]. Jego potencjał przeciwnowotworowy jest
przypuszczalnie efektem zwiększania ekspresji mRNA dla interleukiny-2 i czynnika martwicy nowotworów TNF-α [Gan i Zhang 2002]. Wykazano także zdolność
LBP do ochrony neuronów przed β-amyloidem [Chang i So 2008] oraz do polepszania funkcji poznawczych poprzez stymulację hipokampu [Peng i in. 2002]. Ze
względu na skład, ogromny potencjał antyoksydacyjny oraz walory smakowe jagody goji cieszą się dużym zainteresowaniem konsumentów oraz producentów żywności prozdrowotnej.
Rola mikrobioty jelitowej w funkcjonowaniu organizmu
Analiza wyników dotychczas przeprowadzonych badań wskazuje, że definitywnie
potwierdzono wysoki potencjał antyoksydacyjny omówionych powyżej surowców
i preparatów. Wykazano też, że z właściwościami przeciwutleniającymi powiązane
jest działanie bójcze lub hamujące w stosunku do różnorodnych patogennych bakterii i grzybów, w tym gatunków jelitowych. Do rzadkości jednak należą (a przeważnie w ogóle nie były prowadzone) doświadczenia oceniające wpływ bioaktywnych
składników o właściwościach antyoksydacyjnych, obecnych w tych preparatach, na
mikroorganizmy stanowiące fizjologiczną, prawidłową, a zatem pożądaną i potrzebną mikrobiotę jelitową.
Wydaje się oczywiste, że mikrobiota jelitowa (IM) pełni ważną, jeśli nie kluczową, rolę w metabolizmie substancji dostarczanych z żywnością. Przez wiele lat jednak
sądzono, że funkcja jelita grubego i zasiedlających go mikroorganizmów ogranicza
się jedynie do resorpcji wody i soli oraz usuwania niewykorzystanych resztek pożywienia. Obecnie przyjmuje się, że ogromna liczba bakterii zajmujących to miejsce
39
tworzy bardzo złożony ekosystem, zwany mikrobiomem jelitowym (ang. intestinal
microbiome). Pojęcie ‘mikrobiom’ zostało wprowadzone po raz pierwszy w 2001 r.
na określenie zbiorowego genomu mikrobioty. Jak się ocenia, mikrobiota jelitowa
dorosłego człowieka składa się z ok. 1014 komórek bakterii, co 10-krotnie przewyższa całkowitą liczbę komórek w ciele człowieka [Dicksved 2008, Zhu i in. 2010,
Hakansson i Molin 2011, Possemiers i in. 2011]. Pojemność metaboliczna IM jest
blisko 100-krotnie większa niż ludzkiej wątroby. Jest to efekt ogromnej różnorodności gatunków bakterii, które wchodzą w skład populacji, a co za tym idzie ogromnej liczby genów, które zawierają [Zhu i in. 2010]. Przez wielu badaczy IM jest
traktowana jak niezależny, samodzielny wielokomórkowy organ, który silnie oddziałuje na zasiedlany organizm gospodarza i z nim współdziała [Possemiers i in. 2011].
Proces kolonizacji przewodu pokarmowego zaczyna się natychmiast po urodzeniu (u płodu jelito jest jałowe) [Sakata i in. 1985, Fanaro i in. 2003]. Mikrobiota
dziecka początkowo wykazuje sporą niestabilność i małe zróżnicowanie, ale rozwija
się i wzbogaca w ciągu kilku pierwszych lat życia. Ostateczny profil mikrobioty jelitowej dorosłego człowieka zależy od wielu czynników środowiskowych na kolejnych
etapach życia. Kluczowe znaczenie zdaje się mieć rodzaj porodu (naturalny, cesarskie cięcie), w okresie niemowlęcym – sposób karmienia (sztuczne, naturalne),
a później – wiek, pochodzenie, nawyki żywieniowe, ekspozycja na ksenobiotyki
i antybiotyki, tryb życia, narażenie na stres, przebyte infekcje, poziom higieny czy
region geograficzny [Sakata i in. 1985, Fanaro i in. 2003, Penders i in. 2006, Turnbaugh
i in. 2009]. Wszystkie te czynniki powodują powstanie u każdego osobnika unikalnej,
pod względem składu gatunkowego i proporcji pomiędzy poszczególnymi przedstawicielami, mikrobioty jelitowej. To ogromne zróżnicowanie osobnicze porównuje się
nawet do odcisku palca, nie ma bowiem dwóch osób o identycznym składzie mikroorganizmów tworzących ten złożony ekosystem [Dicksved 2008, Brown i in. 2012].
W zależności od rodzaju techniki badawczej przyjmuje się, że w skład mikrobioty
jelita ludzkiego wchodzi od 500 do 1200 różnych gatunków bakterii. Mimo ogromnej różnorodności wykrywanych gatunków bakterii, naukowcy zgadzają się, że znakomita większość z nich (98%) należy do czterech typów: Firmicutes (64%),
Bacteroidetes (23%), Proteobacteria (8%) i Actinobacteria (3%) [Zhu i in. 2010,
Hakansson i Molin 2011]. Proporcje między tymi grupami zależą zarówno od odcinka przewodu pokarmowego, jak i od ludzkiej rasy. O ile w jelicie grubym dominują Firmicutes i Bacteroidetes, o tyle w jelicie czczym Proteobacteria są liczebniejsze
niż Bacteroidetes [Hakansson i Molin 2011]. W jelicie krętym dorosłych Japończyków
nie wykrywa się Bacteroidetes, podczas gdy w mikrobiocie zdrowych kobiet ze Szwecji
bakterie te dominują [Hayashi i in. 2005].
Ze względu na liczne, pośrednie i bezpośrednie, interakcje z organizmem gospodarza mikrobiota jelitowa ma istotny wpływ na stan jego zdrowia [Saarela i in.
2002, Hakansson i Molin 2011, Del Rio i in. 2013]. Bardzo ważne dla utrzymania
zdrowia jest zachowanie równowagi między układem immunologicznym gospodarza
40
a komensalną mikrobiotą przewodu pokarmowego. Każde zaburzenie tej równowagi (dysbioza) może prowadzić do rozwoju choroby [Dicksved 2008]. Dysbioza może
być zależna od diety [Turnbaugh i in. 2009, Brown i in. 2012]. Wynika to z faktu, że
gatunki zamieszkujące przewód pokarmowy są wrażliwe na ilość i jakość składników
dostarczanych wraz z dietą, w szczególności na cukry, które stanowią główne źródło
węgla i energii. Każda nieprawidłowa lub wykluczająca dieta będzie prowadziła do
nadmiernego wzrostu jednych gatunków, a zahamowania lub wyeliminowania innych.
W konsekwencji może dojść do nadmiernego namnożenia gatunków oportunistycznych lub patogennych i osłabienia mechanizmów obronnych gospodarza [Brown
i in. 2012]. Wykazano, że u osób przestrzegających rygorystycznej diety bezglutenowej (np. chorych z celiakią) znacząco zwiększa się liczba potencjalnie patogennych
E. coli, Enterobacteriaceae, Staphylococcus, Clostridium i Bacteroides, a maleje liczba Bifidobacterium i Lactobacillus, w porównaniu do osób stosujących tradycyjną
dietę mieszaną [Sanz 2010]. W mikrobiocie jelitowej dzieci z Burkina Faso zanotowano znacząco większą liczebność Bacteroidetes a niższą Firmicutes w porównaniu
z mikrobiotą dzieci europejskich oraz unikatową obecność bakterii z rodzajów
Prevotella, Treponema i Xylanibacter. Są to gatunki zawierające zestawy genów potrzebnych do przeprowadzenia hydrolizy celulozy i ksylanu, a ich występowania nie
stwierdzono w jelicie dzieci z Włoch. Może to świadczyć o koewolucji IM w czasie
długotrwałego stosowania diety bogatej w polisacharydy przez dzieci afrykańskie,
dzięki czemu IM przystosowała się do maksymalnego wykorzystania energii dostarczanej z tą ubogą w składniki energetyczne dietą [De Filippo i in. 2011]. Podobną
adaptację składu mikrobioty jelitowej zaobserwowano u mieszkańców Japonii, którzy jako jedyni mają geny kodujące porfyranazę – enzym zaangażowany w szlak
metaboliczny porfyranu, węglowodanu z czerwonych glonów morskich, stanowiących
pożywienie niektórych ludów Azji. Hehemann i inni [2010] wysunęli przypuszczenie,
że enzym ten został pozyskany przez mikrobiom jelitowy w tej populacji na drodze
transferu horyzontalnego genów od mikroorganizmów morskich, stąd nie jest on
obecny w mikrobiomie Amerykanów, a jedynie Japończyków [Hehemann i in. 2010].
Długotrwałe stosowanie tzw. diety zachodniej, czyli bogatej w cukry i tłuszcze, prowadzi do zwiększenia populacji Clostridium innocuum, Eubacterium dolichum,
Catenibacterium mitsuokai oraz Enterococcus spp., a zmniejszenia liczebności w obrębie Bifidobacteria i Bacteroidetes [Turnbaugh i in. 2009, Brown i in. 2012]. Wu
i inni [2011] wykazali, że enterotyp typu Bacteroides ma istotny związek z dietą bogatą w białka zwierzęce, różne aminokwasy i nasycone tłuszcze (co jest typowe dla
diety zachodniej), podczas gdy enterotyp typu Prevotella jest związany raczej z wysoką zawartością węglowodanów i cukrów prostych, typową dla diety populacji agrarnych.
U osobników otyłych przedstawiciele Firmicutes i Bacteroidetes są istotnie liczniejsi
niż u osobników o prawidłowej masie ciała [Ismail i in. 2011], przy czym wykazano
dodatnią korelację między wysokim spożyciem tłuszczów a obecnością Firmicutes,
jak również między wysokim spożyciem węglowodanów a obecnością Bacteroidetes
41
i Firmicutes. Stosunek liczebności Firmicutes do Bacteroidetes jest wyższy u osób
otyłych niż u szczupłych i zmniejsza się po zastosowaniu niskokalorycznej diety [Ley
i in. 2006, De Filippo i in. 2011]. Wzbogacenie składu mikrobioty jelitowej w Prevotella
w stosunku do Bacteroidetes obserwowano również u wegetarian, potwierdzono
również u nich znacząco mniejszą liczbę bakterii z rodzaju Bifidobacterium niż u osób
stosujących dietę mieszaną [Wu i in. 2011, Jeffery i O’Toole 2013]. Dieta wegetariańska powoduje zwiększenie produkcji krótkołańcuchowych kwasów tłuszczowych
(SCFA), co z kolei wywołuje obniżenie wartości pH w jelicie. Takie środowisko
zapobiega wzrostowi potencjalnie patogennych bakterii, jak E. coli czy inne gatunki z rodziny Enterobacteriaceae [Zimmer i in. 2012].
Mikrobiota jelitowa jest wyposażona w ogromny zestaw różnorodnych enzymów,
którymi nie dysponuje organizm ludzki [Zhu i in. 2010, Possemiers i in. 2011]. Dzięki
temu możliwe są reakcje biotransformacji licznych związków dostarczanych z dietą,
które w przeciwnym razie byłyby biologicznie niedostępne. Enzymy bakterii wchodzących w skład IM, takie jak α-ramnozydazy, β-glukuronidazy, β-glukozydazy,
sulfatazy i esterazy, mogą hydrolizować glikozydy, glukuroniany, siarczany, amidy,
estry i laktony. Inne reakcje z udziałem enzymów mikroorganizmów jelitowych
obejmują rozkład pierścienia aromatycznego oraz procesy katalizowane przez reduktazy, hydrogenazy, dekarboksylazy, demetylazę, izomerazę i dehydroksylazę
[Hervert-Hernández i Goñi 2011, Possemiers i in. 2011].
Dzięki tak różnorodnej i dużej pojemności enzymatycznej bakterie generują
liczne metabolity, które mogą być korzystne bądź szkodliwe dla organizmu gospodarza. Brak odpowiedniego gatunku w składzie IM może spowodować, że dostarczony do organizmu składnik diety nie będzie przez niego wykorzystany. Najbardziej
spektakularny przykład takiej sytuacji dotyczy sojowych izoflawonów, których metabolity działają jak estrogeny, zmniejszając dyskomfort i negatywne objawy menopauzy, jednak samo dostarczenie ich z dietą czy preparatami farmaceutycznymi nie
gwarantuje efektów medycznych. Dzieje się tak dlatego, że tylko nieliczne gatunki
bakterii (np. Eggerthella sp. szczep YY7918, Eggerthella sp. Julong 732, Enterococcus
faecium, Adlercreutzia equolifaciens, Slackia equolifaciens, Lactobacillus mucosae,
Bifidobacterium sp., Slackia isoflavoniconvertens, Bacteroides ovatus) [Yokoyama
i Suzuki 2008, Setchell i Clerici 2010a, b] są zdolne do biotransformacji sojowego
izoflawonu daidzeiny do aktywnych biologicznie metabolitów: ekwolu i/lub
O-desmetylangolensyny (O-DMA). Częstość występowania bakterii zdolnych do
wytworzenia ekwolu i O-DMA w IM szacuje się odpowiednio na 30–50% i 80–90%
populacji ludzkiej [Setchell i Clerici 2010a, b], a efektywność wytwarzania ekwolu
zależy m.in. od nawyków dietetycznych, matrycy żywności, stopnia fermentacji jelitowej, czasu tranzytu jelitowego, a przede wszystkim od składu gatunkowego IM
[Yuan i in. 2007]. Brak odpowiednich gatunków bakterii w jelicie powoduje, że
izoflawony nie zostają przekształcone w aktywne biologicznie cząsteczki i nie ma
oczekiwanych efektów zastosowanej diety czy preparatów.
42
Jak wskazują przytoczone przykłady, w organizmie człowieka mikrobiota jelitowa odgrywa ochronną rolę nie tylko z powodu zajmowania miejsc, które mogłyby
być wykorzystane przez patogeny, oraz wytwarzania środowiska hamującego ich
inwazję (np. poprzez produkcję bakteriocyn czy innych składników antymikrobiologicznych). Dzięki metabolizmowi bakteryjnemu dochodzi do rozpadu składników,
które nie są trawione przez enzymy ludzkie (np. skrobia oporna, roślinne polisacharydy), i wytworzenia SCFA. Bakterie komensalne produkują także witaminy i aminokwasy [Dicksved 2008] oraz umożliwiają metabolizm wielu „nieprzyswajalnych”
składników diety. Powstałe metabolity mogą być następnie wykorzystane zarówno
przez komórki epitelium gospodarza, jak i przez inne mikroorganizmy jelitowe.
Z drugiej strony, stwierdzono, że etiologia licznych chorób jest mocno powiązana
z mikrobiomem jelitowym lub niektórymi jego członkami. Niedawne badania wykazały, że konkretne gatunki mikroorganizmów wchodzących w skład IM odgrywają
ważną rolę w rozwoju takich chorób, jak nieswoiste stany zapalne jelit (IBD, ang.
inflammatory bowel disease), choroba Crohna, nowotwory okrężnicy, alergie czy
otyłość, co może znaleźć zastosowanie kliniczne [Björksten i in. 1999, Saarela i in.
2002, Ley i in. 2006, Dicksved 2008, Zhu i in. 2010, Possemiers i in. 2011].
Wysoce zróżnicowana mikrobiota o ustalonych proporcjach między poszczególnymi jej gatunkami decyduje o przebiegu metabolizmu i efektywnym wykorzystaniu
składników diety, a co za tym idzie o zdrowiu i prawidłowym funkcjonowaniu organizmu. Każde jej zaburzenie może być brzemienne w skutkach. Dlatego też w niniejszej pracy skoncentrowano się na określeniu, jak powszechnie stosowane rośliny
i suplementy diety o uznanych właściwościach prozdrowotnych, bogate w związki
bioaktywne, w tym przeciwutleniacze i polifenole, często stosowane w profilaktyce
oraz do wspomagania leczenia różnych chorób, wpływają na gatunki bakterii będących przedstawicielami komensalnej mikrobioty jelita.
3. Materiał i metody
3.1. Materiał badawczy
Bakterie
Do doświadczeń wykorzystano czyste kultury siedmiu różnych gatunków, będących
przedstawicielami najważniejszych rodzajów bakterii tworzących fizjologiczną mikrobiotę jelitową człowieka. Wszystkie badane szczepy zakupiono w niemieckiej
kolekcji czystych kultur mikroorganizmów i linii komórkowych DSMZ (Deutsche
Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH). Zgodnie z kartami
charakterystyk, zostały one wyizolowane z jelita ludzkiego. W tabeli 2 scharakteryzowano bakterie użyte w doświadczeniach.
Tabela 2. Charakterystyka bakterii wykorzystanych w badaniach
Table 2. Characteristics of bacteria used in the study
Gatunek / Species
Nr szczepu
Strain No.
Charakterystyka / Characteristics
Bacteroides galacturonicus
DSM 3978
Gram-ujemna, beztlenowa, pałeczka
Gram-negative, anaerobe, rod
Eubacterium cylindroides
DSM 3983
Gram-dodatnia, beztlenowa, pałeczka
Gram-positive, anaerobe, rod
Bifidobacterium catenulatum
DSM 16992
Gram-dodatnia, beztlenowa, pałeczka
Gram-positive, anaerobe, rod
Enterococcus caccae
DSM 19114
Gram-dodatnia, względnie beztlenowa, ziarniak
Gram-positive, facultative anaerobe, coccus
Escherichia coli
DSM 1116
Gram-ujemna, względnie beztlenowa, pałeczka
Gram-negative, facultative anaerobe, rod
Lactobacillus sp.
DSM 20059
Gram-dodatnia, względnie tlenowa, laseczka
Gram-positive, facultative aerobe, rod
Ruminococcus gauvreauii
DSM 19829
Gram-dodatnia, beztlenowa, ziarniak
Gram-positive, anaerobe, coccus
44
Czyste kultury bakteryjne, zakupione w formie zliofilizowanej, rozbankowano
w odpowiednim podłożu (zalecanym przez DSMZ dla danego rodzaju bakterii),
a następnie namnożono w tym samym podłożu lub podłożu specjalnie dobranym do
potrzeb doświadczeń (zob. rozdział 3.3) w temperaturze 37°C, w warunkach mikroaerofilowych (Enterococcus caccae, Escherichia coli, Lactobacillus sp.) lub beztlenowych (Bacteroides galacturonicus, Bifidobacterium catenulatum, Ruminococcus
gauvreauii, Eubacterium cylindroides).
Surowce roślinne oraz suplementy
Materiał biologiczny stanowiły świeże owoce:
– derenia jadalnego (Cornus mas L.),
– borówki brusznicy (Vaccinium vitis-idaea L.),
– pigwowca japońskiego (Chaenomeles japonica (Thunb.) Lindl. ex Spach.),
– maliny właściwej (Rubus idaeus L.),
– czarnego bzu (Sambucus nigra L.),
– żurawiny drobnoowocowej (Oxycoccus microcarpus (Turcz. ex Rupr.) Schmalh.).
Owoce pochodziły z sadu pomologicznego Uniwersytetu Rolniczego w Garlicy
Murowanej k. Krakowa lub zostały pozyskane od bezpośrednich producentów, z terenów ekologicznych i upraw prowadzonych na terenach Małopolski i Podkarpacia.
W sklepach z tzw. zdrową żywnością i suplementami diety lub w aptece zakupiono:
– suszone jagody goji, czyli kolcowoju pospolitego (Lycium barbarum Mill.) – sklep
internetowy Natura24 Medycyna naturalna i ekologia, producent: Hanoju NL,
deklarowane pochodzenie: Tybet,
– suszone owoce cytryńca chińskiego (Schisandra chinensis (Turcz.) Baill.) – sklep
internetowy Natura24 Medycyna naturalna i ekologia, producent: Hanoju NL,
– czerwoną cebulę BIO – sklep internetowy z żywnością ekologiczną; dostawca
deklaruje, że warzywa były uprawiane i przechowywane bez użycia środków
chemicznych, pestycydów itp.,
– zieloną herbatę BIO – sklep internetowy Natura24 Medycyna naturalna i ekologia,
– nasiona soi BIO – sklep internetowy BogutynMłyn, producent: BioPlanet,
Polska,
– czosnek niedźwiedzi BIO – sklep internetowy BogutynMłyn, producent:
Lebensbaum, Niemcy,
– biomasę sinic (Spirulina platensis) w tabletkach BIO (Certyfikat Organiczny
UK5) – sklep internetowy BogutynMłyn, producent: Cyanotech Corporation,
deklarowane pochodzenie: Hawaje, USA,
45
– liście pokrzywy (Urticae folium), – apteka, producent: Herbapol, Polska,
– Citrosept Organic (preparat zawierający 84% ekstraktu z miąższu i pestek grejpfruta z upraw ekologicznych oraz witaminę C) – apteka, producent: Cintamani,
Polska, Łódź,
– BIO NONI, Fiji Island (oryginalny 100% sok z indyjskiego drzewa morwowego
(Noni) z Fiji) – sklep internetowy Natura24 Medycyna naturalna i ekologia,
producent Hanoju B.V.
Materiał do badań został wybrany na podstawie dostępnej literatury (zob. rozdział 2, s. 32–38) jako surowce roślinne oraz suplementy diety (preparaty) o znanym
działaniu prozdrowotnym, wspomagającym lub leczniczym, z długą tradycją stosowania w terapii ludowej i medycynie naturalnej różnych stron świata.
Starano się pozyskać surowce z terenów ekologicznych i upraw organicznych,
aby do minimum ograniczyć ewentualny wpływ na bakterie związków chemicznych,
jakie mogły pozostać na roślinach.
Polifenole
W
–
–
–
–
–
–
–
–
–
–
badaniach wykorzystano czyste związki polifenolowe:
naringeninę – 4’,5,7-trihydroksyflawanon,
naringinę – naringenino-7-O-ramnozydoglukozyd, glikozyd naringeniny,
hesperetynę – 3’,5,7-trihydroksy-4’-metoksyflawanon,
hesperydynę – hesperetyno-7-O-rutynozyd, glikozyd hesperetyny,
kwercetynę,
rutynę – kwercetyno-3-O-rutynozyd, glikozyd kwercetyny,
(+)-katechinę,
rezweratrol,
florydzynę,
kemferol.
Wszystkie związki zostały zakupione w firmie SIGMA (Niemcy). Czyste polifenole rozpuszczono w sterylnym dimetylosulfotlenku (DMSO) do uzyskania roztworu wyjściowego o stężeniu 25 mg/ml. Wyjątek stanowiły kwercetyna, która w takim
stężeniu hamowała całkowicie wzrost niektórych bakterii, oraz kemferol, który w tym
stężeniu nie rozpuszczał się całkowicie. W tych dwóch przypadkach sporządzono
roztwór wyjściowy o stężeniu 5 mg/ml. Roztwory wysterylizowano poprzez filtrację
(filtr strzykawkowy PROFILL, ø 0,45 µm, z membraną nylonową), a do czasu analiz przechowywano w warunkach chłodniczych (+4°C).
46
3.2. Przebieg doświadczeń
Ocena potencjału antyoksydacyjnego oraz składu polifenolowego surowców
roślinnych i suplementów diety
Z uwagi na zróżnicowanie materiału badawczego, w doświadczeniach stosowano
10-procentowe ekstrakty etanolowe sporządzone z badanych surowców, z wyjątkiem
gotowych suplementów diety, tj. soku z noni i Citroseptu, które były wykorzystywane
bezpośrednio. W uzyskanych ekstraktach oraz gotowych suplementach określono
profil oraz stężenia związków polifenolowych metodą HPLC. Ponadto w ekstraktach,
suplementach, a także roztworach czystych związków polifenolowych oznaczono
zawartość polifenoli ogółem metodą Folina-Ciocalteu oraz oznaczono potencjał
antyoksydacyjny metodą z rodnikiem ABTS•+.
Przygotowanie ekstraktów
Do ekstrakcji związków polifenolowych z badanych surowców użyto 80-procentowego etanolu (EtOH), jako najwydajniejszego rozpuszczalnika (co potwierdzono
we wcześniejszych badaniach własnych). W tym celu 10 ± 0,001 g surowca zalano
90 ml 80% EtOH, po czym za pomocą homogenizacji wysokoobrotowej (homogenizator wysokoobrotowy T25 Ultra-Turrax, IKA, 5 min, 19 000 obr./min) rozdrobniono materiał w rozpuszczalniku. Homogenizaty przesączono i uzupełniono 80-procentowym etanolem do 100 ml. Preparaty farmaceutyczne (sok z noni i Citrosept)
były stosowane w doświadczeniach bezpośrednio.
Wszystkie przygotowane ekstrakty roślinne, a także gotowe preparaty poddano
sterylizacji poprzez mikrofiltrację (filtr strzykawkowy, membrana nylonowa, ø 0,45 µm)
do jałowych butelek, które szczelnie zamknięte przechowywano w warunkach chłodniczych (+4°C) do czasu analiz.
Ocena wpływu składników bioaktywnych, mających prozdrowotne działanie,
na bakterie jelitowe
Przygotowanie gęstwy bakteryjnej 0,5 MF
Hodowle bakterii (12-godzinne) rozcieńczono odpowiednim medium do uzyskania
gęstwy o mętności większej o 0,5 jednostki McFarlanda (0,5 MF) – co odpowiada
liczebności komórek ok. 1,5 · 108 jtk/ml – od mętności czystego medium dla danej
bakterii.
47
Wpływ ekstraktów z surowców roślinnych i spiruliny na bakterie jelitowe
Zmiany liczebności populacji bakterii pod wpływem związków bioaktywnych zawartych w badanych ekstraktach określono na podstawie pomiarów zmętnienia zawiesiny przy użyciu densytometru wyskalowanego w jednostkach McFarlanda po 24-godzinnej inkubacji (37°C) poszczególnych bakterii z ekstraktami dodanymi do medium
w różnym stężeniu, przeprowadzonej w warunkach anaerobowych (Bifidobacterium
catenulatum, Eubacterium cylindroides, Bacteroides galacturonicus oraz Ruminococcus
gauvreauii) lub mikroaerofilowych (Enterococcus caccae, Escherichia coli, Lactobacillus
sp.). W tym celu wykonano posiewy mikrobiologiczne gęstwy bakteryjnej 0,5 MF
do płynnego, sterylnego medium, odpowiedniego dla danego gatunku bakterii,
z dodatkiem badanego ekstraktu (stężenie końcowe 1,0, 2,5 lub 5,0%). Liczba
zaszczepionych komórek bakterii wynosiła 3 · 106 jtk/ml. Posiewy bakterii tlenowych
wykonano w warunkach jałowych, pod komorą laminarną. Wszelkie czynności z bakteriami gatunków beztlenowych (posiew, przygotowanie gęstwy, pomiary mętności)
przeprowadzono w specjalnie zaprojektowanej do tego celu sterylnej komorze
wypełnionej CO2 doprowadzonym poprzez filtr wyjaławiający.
W przypadku inokulacji bakteriami anaerobowymi kontrolowano beztlenowość
pożywki poprzez ocenę zmian zabarwienia podłoża z resazuryną. Przed zakręceniem
probówek i umieszczeniem ich w anaerostatach przedmuchiwano je dodatkowo CO2.
Natychmiast po dodaniu bakterii oraz po 24 h inkubacji zmierzono mętność medium.
Aby ułatwić porównanie wpływu badanych ekstraktów na poszczególne bakterie,
wyniki przedstawiono w procentach wartości otrzymanych dla kontroli pozytywnej,
którą stanowiły hodowle danego gatunku bakterii w medium bez dodatku ekstraktu, inkubowane dokładnie w tych samych warunkach (czas, temperatura, ten sam
anaerostat). Kontrole negatywne przygotowywano identycznie jak próby właściwe,
z tym że nie zaszczepiano ich bakteriami, a wartość odczytu mętności po 24-godzinnej inkubacji każdorazowo odejmowano od uzyskanego wyniku, z uwzględnieniem
rodzaju i stężenia dodanego ekstraktu. Dzięki temu zniwelowano wpływ ewentualnych zmian barwy medium z dodatkiem badanego ekstraktu w zależności od czasu
i temperatury. Wykonano także kontrole podwójnie negatywne (blank), tzn. czyste
pożywki bez bakterii i bez ekstraktu, inkubowane w tych samych warunkach, co
próby właściwe. W żadnym przypadku nie wykazano zmian zabarwienia ani mętności, które mogłyby wpłynąć na wynik.
Aby zweryfikować toksyczność rozpuszczalnika użytego do przygotowania ekstraktów, wykonano kontrolę rozpuszczalnikową, którą stanowiły hodowle bakterii
inkubowane w odpowiednim medium w obecności czystego ekstrahenta (etanolu)
o stężeniu końcowym identycznym jak jego zawartość w próbach właściwych. Ponieważ
okazało się, że ten rozpuszczalnik ma działanie inhibitorowe, różne w zależności od
gatunku bakterii i stężenia (zob. rozdział 4.3), wykonano odpowiednie obliczenia
mające na celu wykazanie, jak składniki bioaktywne obecne w ekstrakcie wpływają
48
na dany gatunek bakterii. W tym celu, dla każdego stężenia badanego ekstraktu
i dla każdego gatunku bakterii, jako kontrolę pozytywną (100%) przyjęto liczebność
populacji tego drobnoustroju po 24 h hodowli w medium zawierającym jedynie sam
etanol, w stężeniu równym jego zawartości w pożywce z danym stężeniem ekstraktu.
Dla większej czytelności wyników i zaznaczenia, że wyniki uwzględniają już wpływ
rozpuszczalnika, wartość tę oznaczono w tabelach jako KEtOH (kontrolę etanolową).
Wpływ preparatów farmaceutycznych na bakterie jelitowe
W celu określenia wpływu gotowych preparatów farmaceutycznych – suplementów
diety: soku z noni i Citroseptu – wykonano doświadczenie o przebiegu podobnym
do przedstawionego w poprzednim punkcie. Do odpowiedniego dla danej bakterii
sterylnego medium dodano sok z noni lub Citrosept (bezpośrednio, w takiej postaci, w jakiej je zakupiono) w stężeniu końcowym 1,0, 2,5 lub 5,0%. Określenia zmian
liczebności bakterii pod wpływem różnych stężeń związków polifenolowych obecnych
w suplementach dokonano na podstawie pomiarów zmętnienia zawiesiny w jednostkach McFarlanda po 24-godzinnej inkubacji poszczególnych bakterii (37°C, warunki anaerobowe lub mikroaerofilowe). Kontrolę pozytywną stanowiła odpowiednia
pożywka bez dodatku preparatu, zaszczepiona taką samą ilością bakterii i inkubowana w tych samych warunkach. Kontrolą negatywną były podłoża z odpowiednimi
stężeniami danego preparatu bez dodatku bakterii. Odczyty uzyskane z tych prób
każdorazowo odejmowano od wartości zmętnienia próbki właściwej. Aby łatwiej
było porównywać wyniki uzyskane dla różnych mikroorganizmów, wyrażono je jako
procent wartości otrzymanych dla kontroli pozytywnej (%Kpoz).
Wpływ czystych związków polifenolowych na bakterie jelitowe
W celu określenia wpływu najczęściej spotykanych w diecie związków polifenolowych
wykonano doświadczenie o przebiegu podobnym do przedstawionego powyżej. Do
odpowiedniego dla danego gatunku bakterii sterylnego medium dodano roztwory
pojedynczych polifenoli w stężeniu końcowym 20, 100 lub 250 µg/ml. Z uwagi na
wytrącanie się rezweratrolu i kwercetyny z roztworu przy wyższych stężeniach oraz na
całkowite zahamowanie wzrostu niektórych mikroorganizmów przy zastosowaniu
takich stężeń, do doświadczeń z tymi polifenolami zastosowano 5-krotnie niższe stężenia: 4, 20 oraz 50 µg/ml. Określenia zmian liczebności bakterii pod wpływem różnych
stężeń związków polifenolowych dokonano na podstawie pomiarów zmętnienia zawiesiny w jednostkach McFarlanda po 24-godzinnej inkubacji poszczególnych bakterii (37°C, warunki anaerobowe lub mikroaerofilowe). Kontrolę pozytywną stanowiła
odpowiednia pożywka bez dodatku polifenolu, zaszczepiona taką samą ilością bakterii i inkubowana w tych samych warunkach. Kontrolą negatywną były podłoża z odpowiednimi stężeniami danego polifenolu bez dodatku bakterii. Odczyty uzyskane
49
z tych prób każdorazowo odejmowano od wartości zmętnienia próbki właściwej. Aby
ułatwić porównywanie wyników uzyskanych dla różnych mikroorganizmów, wyrażono
je jako procent wartości otrzymanych dla kontroli pozytywnej (%Kpoz).
W celu kontroli toksyczności rozpuszczalnika użytego do rozpuszczenia flawonoidów dokonano oceny wpływu czystego DMSO (w stężeniu 0,08–1,0%) na poszczególne gatunki bakterii.
Ocena wpływu bakterii jelitowych na związki polifenolowe i ich potencjał
antyoksydacyjny
Wiele składników diety podczas procesu trawienia dociera do jelita grubego, gdzie
natrafia na bakterie stanowiące fizjologiczną mikrobiotę jelitową. Tam związki te
mogą oddziaływać na poszczególne gatunki bakterii, ale też mogą ulegać różnorodnym reakcjom biotransformacji na skutek działania enzymów bakteryjnych. Aby
ocenić, jak przedstawiciele mikrobioty jelita ludzkiego wpływają na składniki przeciwutleniające obecne w diecie, oznaczono zmiany potencjału antyoksydacyjnego
(AOX) w podłożach z dodatkiem polifenoli, ekstraktów roślinnych i suplementów
diety po inkubacji z poszczególnymi gatunkami bakterii jelitowych.
W tym celu pożywki z dodatkiem roztworów badanych ekstraktów, suplementów
lub polifenoli w różnym stężeniu zaszczepiano bakteriami danego gatunku i inkubowano w odpowiednich warunkach w temperaturze 37°C. Po 24 h zawartość hodowli w probówkach wirowano (15 min, 5000 obr./min), a supernatant rozporcjowywano do dwóch probówek typu Eppendorf o pojemności 1,5 ml i natychmiast
zamrażano (–20°C) w celu zahamowania reakcji, które mogłyby spowodować rozpad
lub przemiany obecnych tam związków i/lub straty potencjału antyoksydacyjnego.
W jednej porcji supernatantu oznaczono potencjał antyoksydacyjny metodą
z rodnikiem ABTS•+. Wykonano także odpowiednie próby kontrolne, tzn. określono potencjał antyoksydacyjny czystych podłoży (tj. bez dodatków) z bakteriami i bez
bakterii oraz podłoży z dodatkiem różnych stężeń ekstraktów/preparatów/polifenoli, ale bez bakterii.
Dla ułatwienia porównań między poszczególnymi drobnoustrojami oraz badanymi substancjami wprowadzono pojęcie współczynnika interakcji (WI), wyznaczonego według wzoru:
WI =
AOX medium z bakteriami
AOX medium bez bakterii
Stosunek potencjału antyoksydacyjnego medium z bakteriami do potencjału
AOX takiego samego medium (tzn. ta sama pożywka, takie samo stężenie związku polifenolowego/ekstraktu, takie same warunki inkubacji), ale bez dodatku
50
bakterii jest równy 1, jeśli bakterie w żaden sposób nie wpływają na zdolność
zmiatania rodnika ABTS•+ przez obecne w tej pożywce związki. Wartości WI > 1
oznaczają, że pod wpływem dodanego gatunku baterii doszło do zmian w składzie
pożywki, które zwiększyły zdolność wygaszania rodnika przez zawarte w niej związki, a wartości WI < 1 – zmiany pod wpływem bakterii zmniejszyły tę zdolność.
Aby ustalić, czy wykazane zmiany potencjału antyoksydacyjnego zależą od przemian związków polifenolowych obecnych w badanych próbach, zachodzących pod
wpływem bakterii jelitowych, w drugiej porcji supernatantu (z doświadczenia opisanego powyżej) określono metodą HPLC stężenia najważniejszych związków polifenolowych. Zawartość polifenoli wyrażono w µg/ml supernatantu.
3.3. Metody analityczne
Namnażanie i hodowla bakterii
Bakterie zakupiono w postaci zliofilizowanej. Do rozbankowania i wstępnego namnożenia zastosowano odpowiednie dla danego organizmu podłoża, zalecane przez
DSMZ. Jak się jednak okazało, niektóre z tych podłoży, ze względu na swój skład,
uniemożliwiały pomiar gęstości optycznej hodowli. W przypadku Bacteroides galacturonicus podłoże sugerowane jako optymalne (medium 1265, zob. tab. 6, s. 53/54)
było bardzo mętne, a podłoże dla Ruminococcus gauvreauii (medium 104, zob. tab. 7,
s. 54) i Eubacterium cylindroides (medium 78, zob. tab. 8, s. 55) zawierało nierozpuszczalne, zawieszone w objętości medium drobiny (przypuszczalnie heminy), które fałszowały odczyt. W tych przypadkach ocena liczebności populacji metodą densytometryczną była niemożliwa lub obarczona bardzo dużym błędem. Dlatego też
sprawdzono możliwość hodowli poszczególnych gatunków w innych podłożach.
Ostatecznie do doświadczeń z Enterococcus caccae, Eubacterium cylindroides oraz
Ruminococcus gauvreauii wykorzystano podłoże TSYEM (Trypticase Soy Yeast
Extract Medium), które pozwoliło na względnie dobry wzrost tych gatunków, przy
jednoczesnej możliwości obserwacji zmian liczebności populacji bakterii za pomocą
densytometru. Ponieważ Bacteroides galacturonicus słabo rósł w TSYEM, do doświadczeń z tą bakterią wybrano podłoże ST (zob. tab. 3, s. 51). Pożywką zalecaną
przez DSMZ do namnażania Lactobacillus sp. było podłoże MRS (de Man-Rogosa-Sharpe, zob. tab. 4, s. 52) i takie też podłoże zastosowano w doświadczeniach.
W przypadku Escherichia coli stosowanym podłożem był bulion odżywczy, a do
namnażania i doświadczeń z Bifidobacterium catenulatum wykorzystano medium 58
(zob. tab. 5, s. 53) – obydwa podłoża sugerowane przez DSMZ.
Wszystkie pożywki poddawano sterylizacji poprzez autoklawowanie (15 min,
121°C). Pożywki przeznaczone do hodowli w warunkach beztlenowych natychmiast
51
po wyjęciu z autoklawu umieszczano w anaerostatach wypełnionych CO2, gdzie
pozostawiano je do ostygnięcia. Dzięki temu zachowano beztlenowość pożywek do
czasu przeprowadzenia doświadczeń.
Podłoże ST
Po dokładnym rozpuszczeniu składników (tab. 3) w wodzie destylowanej podłoże
sterylizowano w autoklawie.
Tabela 3. Skład podłoża ST (pH 7,0)
Table 3. Composition of ST medium (pH 7.0)
Ilość (na 1 l)
Amount (per l )
Producent
Supplier
Pepton mięsny (produkt trawienia trypsyną)
Meat-derived peptone (tryptic digest)
9,0 g
FLUKA
Glukoza / Glucose
6,0 g
Chempur
Ekstrakt drożdżowy / Yeast extract
4,0 g
Biocorp
Ekstrakt mięsny / Meat extract
3,0 g
Biocorp
NaCl
3,0 g
Chempur
Na2HPO4
2,0 g
Chempur
Pepton proteozowy / Proteose peptone
1,0 g
Biocorp
L-cystyna / L-cystine
0,25 g
SIGMA
L-cysteina · HCl · H2O / L-cystein · HCl · H2O
0,25 g
SIGMA
MgSO4 · 7H2O
0,10 g
Chempur
FeSO4 · 7H2O
5 mg
POCh Gliwice
MnSO4 · 2H2O
3,4 mg
POCh Gliwice
Tween 80
0,5 ml
SIGMA
Składnik / Component
Podłoże MRS (de Man-Rogosa-Sharpe)
Podczas badań użyto gotowej pożywki MRS Broth firmy Biocorp Polska Sp. z o.o.
(nr katalogowy PS 60) o składzie przedstawionym w tabeli 4.
52
Tabela 4. Skład podłoża MRS (pH 6,2–6,5)
Table 4. Composition of MRS medium (pH 6.2–6.5)
Ilość (na 1 l)
Amount (per l)
Glukoza / Glucose
20,0 g
Pepton kazeinowy (produkt trawienia trypsyną)
Casein peptone (tryptic digest)
10,0 g
Ekstrakt wołowy / Beef extract
10,0 g
Octan sodu / Sodium acetate
5,0 g
5,0 g
Cytrynian amonu / Ammonium citrate
2,0 g
K2HPO4
2,0 g
Tween 80
1,0 g
MgSO4 · 7H2O
0,20 g
MnSO4 · H2O
0,05 g
Podłoże TSYEM (Trypticase Soy Yeast Extract Medium)
Podłoże przygotowano poprzez rozpuszczenie 3 g ekstraktu drożdżowego (Biocorp
Polska Sp. z o.o., nr kat. PB06) oraz 30 g bulionu tryptonowo-sojowego (TSB, Biocorp
Polska Sp. z o.o., nr kat. PS23) w 1 litrze wody destylowanej (pH 7,0–7,2).
Bulion odżywczy
Użyto gotowej pożywki firmy Biocorp Polska Sp. z o.o. (nr kat. PS 90) o składzie:
5 g/l peptonu i 3 g/l ekstraktu mięsnego (pH 7,0).
Medium 58
W celu sporządzenia pożywki (skład podany w tabeli 5) wszystkie składniki podłoża,
oprócz cysteiny, rozpuszczono w wodzie destylowanej i całość zagotowano do zmiany barwy. Następnie roztwór schłodzono pod ciekłym azotem, dodano cysteinę,
ponownie zaazotowano i poddano sterylizacji.
53
Tabela 5. Skład medium 58 (pH 6,8)
Table 5. Composition of medium 58 (pH 6.8)
Ilość (na 1 l)
Amount (per l)
Producent
Supplier
Pepton kazeinowy (produkt trawienia trypsyną)
Casein peptone (tryptic digest)
10,0 g
FLUKA
Glukoza / Glucose
10,0 g
Chempur
5,0 g
Biocorp
5,0 g
Biocorp
Pepton sojowy / Soy peptone
5,0 g
Biocorp
NaCl
5,0 g
Chempur
K2HPO4
2,0 g
Chempur
L-cysteina · HCl · H2O / L-cysteine · HCl · H2O
0,50 g
SIGMA
MgSO4 · 7H2O
0,20 g
Chempur
MnSO4 · H2O
0,05 g
Chempur
Tween 80
1,0 ml
SIGMA
Roztwór soli SL-4 / Salt solution SL-4
40,0 ml
–
Resazuryna (25 mg/100 ml) / Resazurin (25 mg/100 ml)
4,0 ml
SIGMA
Medium 1265
Skład pożywki przedstawiono w tabeli 6. NaHCO3 przygotowano jako roztwór o stężeniu 5% (w/v), który poddano sterylizacji przez filtrację (filtr strzykawkowy PROFILL,
ø 0,45 µm, z membraną nylonową) i dodano do medium po autoklawowaniu.
Ilość (na 1 l)
Amount (per l)
Producent
Supplier
Produkt trawienia kazeiny pankreatyną
Trypticase peptone
5,0 g
FLUKA
Poligalakturonian sodu / Sodium polygalacturonate
4,0 g
SIGMA
2,5 g
Biocorp
MgSO4 · 7H2O
2,5 g
Chempur
54
Tabela 6. cd.
Table 6. cont.
Ilość (na 1 l)
Amount (per l)
Producent
Supplier
NaHCO3
2,0 g
Chempur
CaCl2 · 2H2O
0,15 g
Chempur
FeSO4 · 7H2O
20 mg
POCh Gliwice
(NH4)2SO4
1,40 g
POCh Gliwice
1,00 g
SIGMA
4,0 ml
SIGMA
Medium 104
Skład pożywki przedstawiono w tabeli 7. Wszystkie składniki (z wyjątkiem witami
ny K1, heminy i L-cysteiny) rozpuszczono w wodzie destylowanej. Całość zagotowano i schłodzono pod ciekłym azotem. Dodano pozostałe składniki, ponownie zaazotowano i poddano sterylizacji.
Ilość (na 1 l)
Amount (per l)
Producent
Supplier
Trypticase peptone
5,0 g
FLUKA
10,0 g
Biocorp
5,0 g
Biocorp
Pepton / Peptone
5,0 g
Biocorp
Glukoza / Glucose
5,0 g
Chempur
K2HPO4
2,0 g
Chempur
0,5 g
SIGMA
Tween 80
1,0 ml
SIGMA
Roztwór soli SL-4 / Salt solution SL-4
40,0 ml
–
4,0 ml
SIGMA
Roztwór heminy / Haemin solution
10,0 ml
SIGMA
Roztwór witaminy K1 / Vitamin K1 solution
0,2 ml
SIGMA
55
Medium 78
Skład pożywki przedstawiono w tabeli 8. Zmieszano składniki (oprócz cysteiny),
zagotowano, schłodzono pod ciekłym azotem, po czym dodano L-cysteinę. Po sterylizacji dodano 0,2 ml roztworu witaminy K1 (stężenie końcowe 0,1 mg/l).
Ilość (na 1 l)
Amount (per l)
Producent
Supplier
5,0 g
Biocorp
5,0 g
Biocorp
Trypticase peptone
30,0 g
FLUKA
K2HPO4
2,0 g
Chempur
4,0 ml
SIGMA
0,50 g
SIGMA
Roztwór witaminy K1 / Vitamin K1 solution
0,2 ml
SIGMA
Roztwór soli SL-4
Przygotowany roztwór soli SL-4 (skład podany w tabeli 9) przechowywano w warunkach chłodniczych (+4°C).
Tabela 9. Roztwór soli SL-4
Table 9. Salt solution SL-4
Ilość (na 1 l)
Amount (per l)
Producent
Supplier
CaCl2 · 2H2O
0,25 g
Chempur
MgSO4 · 7H2O
0,5 g
Chempur
K2HPO4
1,0 g
Chempur
KH2PO4
1,0 g
Chempur
NaHCO3
10,0 g
Chempur
NaCl
2,0 g
Chempur
56
Roztwór heminy
Rozpuszczono 50 mg heminy w 1 ml 1 M NaOH, po czym rozcieńczono wodą destylowaną do 100 ml. Do czasu doświadczeń roztwór przechowywano w szczelnej
butelce, w temperaturze +4°C.
Roztwór witaminy K1
Rozpuszczono 0,1 ml witaminy K1 w 20 ml 95% etanolu, po czym poddano sterylizacji poprzez mikrofiltrację (filtr strzykawkowy, ø 0,45 µm). Do czasu doświadczeń
roztwór przechowywano w szczelnej butelce z ciemnego szkła, w temperaturze
+4°C.
Pomiar liczebności komórek bakterii
Liczebność komórek bakteryjnych w medium określono na podstawie pomiaru jego
mętności za pomocą densytometru (DEN-1B, Biosan, Łotwa) wyskalowanego w jednostkach McFarlanda i przeliczeniu według skali.
Oznaczanie potencjału antyoksydacyjnego
Potencjał antyoksydacyjny ekstraktów, suplementów i roztworów polifenoli oraz
podłoży bakteryjnych określono z wykorzystaniem syntetycznego wolnego rodnika
ABTS•+ zgodnie z protokołem opisanym w innej publikacji [Duda-Chodak i in.
2011]. Potencjał antyoksydacyjny badanych prób odniesiono do zdolności wygaszania rodnika ABTS•+ przez troloks (kwas (±)-6-hydroksy-2,5,7,8-tetrametylochromano-2-karboksylowy, SIGMA) i wyrażono w milimolach równoważników troloksu
(TEAC, Trolox Equivalent Antioxidant Capacity) na 100 ml lub 100 g wyjściowej
próbki lub związku (mmol TE/100 ml lub mmol TE/100 g).
Oznaczanie zawartości polifenoli ogółem w ekstraktach
Zawartość polifenoli ogółem w badanych ekstraktach oznaczono metodą Folina-Ciocalteu zgodnie z protokołem opisanym w innej publikacji [Duda-Chodak i in.
2011]. Ogólną zawartość polifenoli wyrażono w mg katechiny/100 ml w oparciu
o wykreśloną uprzednio krzywą wzorcową.
57
Analiza profilu najważniejszych polifenoli w badanych próbach metodą HPLC
Do analizy profilu związków polifenolowych w próbach wykorzystano chromatograf
cieczowy FLEXAR (Perkin-Elmer, USA) wyposażony w detektor UV-Vis. Rozdział
przeprowadzono na kolumnie Synergi Fusion RP-80A 200 × 4,6 mm (4 μm)
Phenomenex (Torrance, CA, USA), termostatowanej w temperaturze 30°C. Fazę
ruchomą stanowił kwas octowy o stężeniu 2,5% (roztwór A) oraz acetonitryl (roztwór B).
Program elucji podczas analizy kwasu galusowego, procyjanidyny B1, procyjanidyny B2, (+)-katechiny, (-)-epikatechiny, (-)-epigalokatechiny, galusanu (-)-epigalokatechiny, florydzyny, naringiny, naringeniny, hesperetyny oraz hesperydyny
(detekcja przy λ = 280 nm) był następujący: liniowy wzrost stężenia roztworu B od
5% do 20% w ciągu 30 minut, liniowy wzrost stężenia roztworu B od 20% do 100%
w ciągu 3 minut, izokratyczna elucja 100% roztworem B przez 7 minut i liniowy
spadek stężenia roztworu B do 5% w ciągu 4 minut (przepływ 0,5 ml/min). Na koniec
programu każdorazowo płukano kolumnę roztworem B o stężeniu 5% (4 min).
Program elucji zastosowanej do oznaczania kwasu kawowego, p-kumarowego,
chlorogenowego, ferulowego, witeksyny, izowiteksyny, apigeniny i rezweratrolu (detekcja przy λ = 325 nm, przepływ 0,5 ml/min) był następujący: izokratyczna elucja
roztworem B o stężeniu 20% przez 15 minut, liniowy wzrost stężenia roztworu B
od 20% do 100% w ciągu 30 minut, izokratyczna elucja 100% roztworem B przez
4 minuty, liniowy spadek stężenia roztworu B do 20% w czasie 3 minut. Na zakończenie kolumnę przemyto roztworem B o stężeniu 20%.
W przypadku kwercetyny, glukozydu kwercetyny, rutyny i kemferolu (detekcja
przy λ = 360 nm) oraz kwasu hipurowego, protokatechowego, elagowego, daidzyny,
daidzeiny i genisteiny (detekcja przy λ = 250 nm) zastosowano przepływ 1 ml/min
oraz program elucji: liniowy wzrost stężenia roztworu B od 5% do 20% w ciągu
20 minut, liniowy wzrost stężenia roztworu B od 20% do 100% w ciągu 10 minut,
izokratyczna elucja 100% roztworem B przez 3 minuty i liniowy spadek stężenia
roztworu B do 5% w ciągu 4 minut. Na zakończenie płukano kolumnę 5% roztworem B.
Do analizy antocyjanów zastosowano detekcję przy λ = 520 nm, przepływ
0,5 ml/min oraz program elucji: liniowy wzrost stężenia roztworu B od 5% do 20%
w ciągu 30 minut, liniowy wzrost stężenia roztworu B od 20% do 100% w ciągu 3 minut, izokratyczna elucja 100% roztworem B przez 4 minuty i liniowy spadek stężenia
roztworu B do 5% w ciągu 4 minut. Na koniec płukano kolumnę 5% roztworem B.
Do jakościowego i ilościowego oznaczenia wykrytych polifenoli wykorzystano
czasy retencji i krzywe wzorcowe wyznaczone dla odpowiednich standardów.
Wzorce kwasów fenolowych (ferulowego, hipurowego, kawowego, p-kumarowego, galusowego, chlorogenowego), (+)-katechiny, kwercetyny, izokwercytryny (kwercetyno-3-O-glukozyd), rutyny (kwercetyno-3-O-rutynozyd), hesperetyny, hesperydy-
58
ny (hesperetyno-7-O-rutynozyd), naringiny (naringenino-7-O-ramnoglukozyd) oraz
naringeniny zakupiono w firmie SIGMA.
Wzorce kwasu protokatechowego, kwasu elagowego, florydzyny (floretyno-2’-O-glukozyd), (-)-epikatechiny, (-)-epigalokatechiny, galusanu (-)-epigalokatechiny, witeksyny (apigenino-8-C-glukozyd), izowiteksyny (apigenino-6-C-glukozyd),
apigeniny (4’,5,7-trihydroksyflawon), kemferolu (3,4’,5,7-tetrahydroksyflawon), rez
weratrolu (3,4’,5-trihydroksystilben), daidzeiny (4’,7-dihydroksyizoflawon), daidzyny
(daidzeino-7-O-glukozyd), genisteiny (4’,5,7-trihydroksyizoflawon), procyjanidyny B1
i B2, myrtyliny (delfinidyno-3-O-glukozyd), cyjaniny (cyjanidyno-3,5-di-O-glukozyd),
ideainy (cyjanidyno-3-O-galaktozyd), kuromaniny (cyjanidyno-3-O-glukozyd), keracyjaniny (cyjanidyno-3-O-rutynozyd), cyjanidyno-3-O-arabinozydu, kalistefiny (pelargonidyno-3-O-glukozyd) oraz peonidyno-3-O-glukozydu zakupiono w firmie Extrasyn
these (Francja).
Zawartość antocyjanów (zidentyfikowanych na podstawie czasu retencji dla
wzorców) przedstawiono w równoważnikach (mg) cyjanidyno-3-O-glukozydu.
Wyznaczenie MIC dla preparatów o działaniu hamującym
W przypadku polifenoli, ekstraktów i preparatów, dla których wykazano działanie
hamujące wzrost bakterii, wyznaczono wartość minimalnego stężenia hamującego
(ang. minimum inhibitory concentration; MIC) metodą seryjnych rozcieńczeń składnika hamującego w podłożu płynnym. Za wartość MIC uważa się najniższe stężenie
badanego preparatu, które powoduje zahamowanie widocznego gołym okiem wzrostu bakterii po inkubacji [Mazzola i in. 2009]. W praktyce oznaczało to całkowite
zahamowanie wzrostu (tzn. po 24 h mętność hodowli w podłożu ze składnikiem o tym
stężeniu była równa mętności podłoża z taką samą ilością preparatu, ale bez bakterii)
lub ograniczenie wzrostu drobnoustroju o więcej niż 90% (tj. liczebność populacji,
wyznaczona poprzez pomiar densytometryczny, była w tej próbie mniejsza niż 10%
kontroli, czyli populacji inkubowanej w medium bez żadnych dodatków).
W tabelach przyjęto m.in. następujące oznaczenia: wartość ze znakiem „>” – nie
wyznaczono dokładnej wartości MIC, ale dla danego stężenia obserwowano ograniczenie wzrostu bakterii o 10–90% w stosunku do kontroli pozytywnej (słabe hamowanie); wartość ze znakiem „>>” – jak poprzednio, z tym że obserwowano
ograniczenie liczebności populacji bakterii o mniej niż 10% w stosunku do kontroli pozytywnej (bardzo słabe hamowanie); „NI” – nie było możliwości wyznaczenia
MIC (brak hamowania lub nawet stymulacja wzrostu).
Wyniki wyrażono w µg/ml dla polifenoli lub w % dla pozostałych preparatów.
Dla porównania, określono także siłę hamującą antybiotyku – chloramfenikolu A
– w różnym stężeniu.
59
Analiza statystyczna
Każde oznaczenie w tej pracy wykonano co najmniej w 3 powtórzeniach, a wyniki
przedstawiono jako średnią arytmetyczną ± odchylenie standardowe (SD). W celu
oceny istotności statystycznej różnic przeprowadzono test jednoczynnikowej analizy
wariancji (ANOVA) z testem post hoc Tukeya-Kramera, zaś rozkład normalności
określono za pomocą testu Kołgomorowa-Smirnowa [Łomnicki 2013]. Wszystkie
obliczenia statystyczne zostały wykonane przy użyciu programu GraphPad InStat,
wersja 3.01 dla Windows (GraphPad Software, San Diego, Kalifornia, USA).
Układ niektórych doświadczeń i sposób prezentacji wyników wskazywałyby na
zasadność zastosowania dwuczynnikowej analizy wariancji, uznano jednak, że badane czynniki (zmienne niezależne) są zbyt zróżnicowane, by miało sens ich porównywanie. Przykładowo, w tabeli prezentującej wpływ etanolu na bakterie oceniano jedynie istotność wpływu stężenia alkoholu na dany gatunek bakterii, nie
analizowano natomiast, czy na liczebność populacji przy tym samym stężeniu etanolu miał wpływ także gatunek bakterii. Wynika to z faktu, że do badań celowo
wybrano mikroorganizmy reprezentujące różne grupy bakterii, zarówno przedstawicieli gatunków Gram-dodatnich, jak i Gram-ujemnych, a także typowe beztlenowce lub mikroaerofile. Takie zróżnicowanie implikowało konieczność zastosowania odmiennych podłoży i warunków doświadczenia, co bez wątpienia miało
istotny wpływ na uzyskane wyniki. Dlatego też uznano, że porównywanie między
sobą wyników w zależności od badanego gatunku bakterii byłoby w wielu przypadkach bezzasadne. Podobnie, trudno porównywać między sobą poszczególne surowce roślinne czy preparaty, w sytuacji gdy jedne były stosowane w postaci „gotowej”,
a z innych wykonywano ekstrakty etanolowe; różna była też postać wyjściowa (owoce świeże lub suszone, liście, nasiona czy też suszona biomasa). Dlatego do oceny
statystycznej wykorzystano test jednoczynnikowej analizy wariancji, a nie dwuczynnikowej – jak sugerowałby to układ prezentowanych wyników. Wyniki uzyskane dla
różnych mikroorganizmów czy różnych surowców łączono w zbiorcze tabele – przede
wszystkim w celu zmniejszenia rozmiarów materiału graficznego i ułatwienia czytania pracy.
4. Wyniki i dyskusja
4.1. Potencjał antyoksydacyjny i skład polifenolowy badanych
ekstraktów i suplementów
W prezentowanej pracy wybrano do badań surowce roślinne o długoletniej tradycji
stosowania w medycynie naturalnej i o uznanych właściwościach prozdrowotnych:
świeże owoce maliny, czarnego bzu, żurawiny, borówki brusznicy, pigwowca japońskiego i derenia, suszone owoce goji i cytryńca chińskiego, czerwoną cebulę, czosnek
niedźwiedzi, ziele pokrzywy, zieloną herbatę i nasiona soi, a także suplementy diety,
tj. spirulinę, sok z noni i Citrosept. Wszystkie one są bogatym źródłem przeciwutleniaczy, w tym różnych związków polifenolowych, i są wykorzystywane do leczenia
rozmaitych schorzeń jako preparaty kupowane bez recepty, a zatem pozostające poza
wszelką kontrolą.
Wśród analizowanych surowców na szczególną uwagę zasługuje Citrosept, czyli gotowy, komercyjny ekstrakt z miąższu i pestek grejpfruta. Bardzo wysoka aktywność antyoksydacyjna (21269,7 ± 3601,1 mg troloksu/100 ml ekstraktu) koresponduje z dużą zawartością polifenoli ogółem (2577,2 ± 14,7 mg katechiny/100 ml)
(tab. 10). Uzyskane wartości są kilkukrotnie wyższe niż w przypadku pozostałych
badanych ekstraktów. Z jednej strony, może to wynikać z faktu, że Citrosept, podobnie jak sok z noni, wykorzystywano w badaniach bezpośrednio, w formie, w jakiej został nabyty w aptece, podczas gdy pozostałe surowce były stosowane w postaci 10-procentowych ekstraktów. Jeśli jednak porówna się sok z noni i Citrosept,
dominacja tego drugiego będzie oczywista, co potwierdza, że ekstrakt z miąższu
i pestek grejpfruta jest bardzo bogatym źródłem polifenoli o wysokim potencjale
antyoksydacyjnym.
Jak już wspomniano wcześniej, Citrosept – zgodnie z deklaracją producenta – to
liofilizowany ekstrakt z miąższu, skórek i pestek grejpfruta, zawierający flawonoidy,
głównie flawanony, flawony i flawonole, glicerol, witaminę C oraz SiO2. Za potencjał antyoksydacyjny Citroseptu odpowiadają zatem nie tylko polifenole, ale także
witamina C, która wykazuje właściwości przeciwrodnikowe. Do najważniejszych
polifenoli w owocach grejpfruta należy naringina, której stężenie w 1 litrze soku
61
Tabela 10. Potencjał antyoksydacyjny i zawartość polifenoli ogółem w badanych ekstraktach
i preparatach (średnia ± SD)
Table 10. Antioxidant potential and total polyphenol content of extracts and preparations
under study (mean ± SD)
Ekstrakt (Preparat)
Extract (Preparation)
TEACABTS*
[mmol TE/100 g
materiału
wyjściowego]
TEACABTS*
[mmol TE/100 g
of initial material]
Aktywność
antyoksydacyjna
[mg troloksu/100 ml
ekstraktu]
Antioxidant activity
[mg Trolox/100 ml
of extract]
Zawartość polifenoli
ogółem
[mg katechiny/100 g
materiału wyjściowego]
Total polyphenol content
[mg catechin/100 g
of initial material]
Pokrzywa / Nettle
4,28 ± 0,07
107,1 ± 1,8
618,9 ± 42,6
Spirulina / Spirulina
0,96 ± 0,05
24,1 ± 1,2
157,4 ± 10,9
Sok z noni / Noni juice
1,70 ± 0,16**
424,5 ± 39,5**
108,8 ± 6,4**
84,98 ± 14,39**
21269,7 ± 3601,1**
2577,2 ± 14,7**
Citrosept / Citrosept
Żurawina / Cranberry
7,87 ± 1,51
197,0 ± 37,9
169,4 ± 13,0
Borówka brzusznica
Lingonberry
6,84 ± 1,86
171,2 ± 46,5
392,3 ± 23,1
Dereń
Cornelian cherry
11,3 ± 2,58
283,0 ± 64,5
426,4 ± 67,2
11,15 ± 0,52
279,0 ± 13,0
883,1 ± 119,0
Malina / Raspberry
4,66 ± 1,91
116,6 ± 47,7
157,1 ± 3,9
Jagody goji
Goji berries
7,88 ± 0,11
197,2 ± 2,7
810,6 ± 224,1
Pigwowiec
Japanese quince
11,29 ± 0,08
282,4 ± 2,1
474,1 ± 6,3
Cytryniec chiński
Schisandra
2,16 ± 0,16
54,0 ± 4,1
237,3 ± 23,1
Czerwona cebula
Red onion
1,73 ± 0,12
43,2 ± 2,9
90,5 ± 9,0
10,35 ± 0,41
259,0 ± 10,2
744,6 ± 15,0
2,64 ± 0,36
66,0 ± 9,0
118,6 ± 12,0
439,4 ± 11,3
10998,3 ± 282,3
Czarny bez
Elderberry
Czosnek niedźwiedzi
Bear’s garlic
Soja / Soybean
Zielona herbata
Green tea
9549,0 ± 46,0
TEAC – Trolox Equivalent Antioxidant Capacity (metoda / method ABTS)
* wartości wyliczone z założeniem 100% wydajności ekstrakcji składników przeciwutleniających
values calculated with the assumption of a 100% efficiency of extraction of antioxidant compounds
** w przeliczeniu na 100 ml gotowego preparatu / per 100 ml of the preparation
62
wyciśniętego z grejpfrutów kształtuje się w szerokim zakresie od kilkudziesięciu do
kilkuset miligramów, przez różnych autorów określanym jako: 45–602 mg [Gattuso
i in. 2007], 270–464 mg [Kelebek 2010], 235–372 mg [Vanamala i in. 2006] i 145,6–
–638 mg [Ross i in. 2000], w zależności od odmiany owocu. W mniejszych ilościach
występują pozostałe flawanony (mg/l soku): narirutyna (22,5–170), naringenina
(9,8–80), hesperydyna (0–17,9), neohesperydyna (6,7–24,2), didymina (2,7–12,8)
i poncyryna (8,5–26,0) [Ross i in. 2000, Vanamala i in. 2006, Gattuso i in. 2007,
Kelebek 2010]. Sok zawarty w owocach jest jednak znacznie uboższy w bioaktywne
składniki niż cały owoc, stąd do ekstraktu przechodzą zwykle znacznie większe
ilości polifenoli. Co więcej, zawartość polifenoli w ekstrakcie zależy od proporcji,
w jakich zostały wykorzystane poszczególne części owocu. Jeśli ekstrakt jest wytwarzany z odpadów po produkcji soku grejpfrutowego, to będzie się składał prawie
wyłącznie ze skórek, flawedo i albedo. Nogata i inni [2006] wykazali istotne różnice w zawartości najważniejszych flawonoidów w zależności od części owocu. Najmniej
badanych związków wykryto w tkance łączącej segmenty owocu: 1130 mg naringiny,
118 mg narirutyny, 16,2 mg neohesperydyny, 301 mg poncyryny i 13,6 mg eriocytryny w 100 g świeżej masy. Nieco więcej poszczególnych składników zawierał
oczyszczony miąższ, a szczególnie bogata we flawanony okazała się wewnętrzna
część skórki grejpfruta, czyli albedo: w 100 g ś.m. zawierała ona 2700 mg naringiny,
2321 mg narirutyny, 15,2 mg neohesperydyny i 638 mg poncyryny. Co ciekawe,
eriocytryna w albedo nie występowała w ogóle [Nogata i in. 2006]. Duża zawartość
polifenoli ogółem oznaczona w Citrosepcie może zatem wynikać ze znacznej zawartości albedo.
W tabelach 11 i 12 przedstawiono profil polifenolowy Citroseptu, oznaczony
metodą HPLC w badanym preparacie. Producent preparatu nie podał sposobu przyrządzenia ekstraktu ani odmiany owocu do tego celu wykorzystanej. Trudno więc
odnieść uzyskane rezultaty do wyników z dostępnej literatury. Niemniej jednak potwierdzenie znajduje występowanie naringiny (1018,0 ± 131,1 mg/l) oraz jej aglikonu
– naringeniny (19,8 ± 12,3), które są składnikami charakterystycznymi dla grejpfrutów.
Na uwagę zasługuje natomiast duże stężenie hesperydyny (463,0 ± 96,9 mg/l) i obecność jej aglikonu – hesperetyny (19,9 ± 1,07). Aglikon mógł powstać na skutek
samoistnej hydrolizy podczas przechowywania preparatu lub nawet wcześniej – na
etapie produkcji (przygotowywania ekstraktu). Wiadomo bowiem, że w pewnych
warunkach, np. w środowisku kwaśnym, hesperydyna hydrolizuje do hesperetyny
oraz cząsteczek glukozy i ramnozy [Garg i in. 2001]. Obecność hesperydyny w preparacie z grejpfruta, i to w tak dużym stężeniu, jest jednak trudniejsza do wyjaśnienia. Hesperydynę w sokach grejpfrutowych, w ilości 8,5–10,3 mg/l w zależności
od odmiany wyjściowego owocu, wykrył Kelebek [2010]; nieco szerszy zakres, tj.
2,5–17,9 mg/l soku, podają Gattuso i inni [2007]. Wartości uzyskane w tej pracy
dla preparatu Citrosept są kilkadziesiąt razy wyższe, nawet jeśli się uwzględni, że
do ekstraktu przechodzi więcej hesperydyny niż do soku. Może to świadczyć o za-
63
fałszowaniu produktu, a dokładniej o wykorzystaniu do jego produkcji także składników pomarańczy (np. ich skórek) lub cytryn, dla których ten polifenol jest charakterystyczny [Nogata i in. 2006, Gattuso i in. 2007]. Nie znaleziono informacji
o obecności lub braku hesperydyny i hesperetyny w pestkach grejpfrutów, co mogłoby ewentualnie tłumaczyć wysokie stężenie tych związków w Citrosepcie. W pestkach pomarańczy natomiast są one obecne, choć w mniejszych ilościach niż w skórce [Garg i in. 2001]. Hesperydynę, a także eriocytrynę i mniejszą ilość naringiny
wykryto w pestkach cytryny, istotnym źródłem naringiny i neohesperydyny są pestki bergamotki, zaś naringiny – pestki mandarynek [Tripoli i in. 2007].
Tabela 11. Budowa chemiczna oraz stężenie flawanonów wykrytych w Citrosepcie metodą HPLC
(średnia ± SD)
Table 11. Chemical structure and concentration of flavanones detected in Citrosept by HPLC
method (mean ± SD)
Budowa / Structure
Stężenie
Concentration
[mg/l]
naringenino-7-O-neohesperydozyd
naringenin-7-O-neohesperidoside
1018,0 ± 131,1
Naringenina
Naringenin
aglikon
aglycone
19,8 ± 12,3
Hesperydyna
Hesperidin
hesperetyno-7-O-rutynozyd
hesperetin-7-O-rutinoside
463,0 ± 96,9
Hesperetyna
Hesperetin
aglikon
aglycone
19,9 ± 1,07
Flawanon
Flavanone
Naringina
Naringin
Naringina / Naringin:
R1 = O-neohesperydoza / O-neohesperidose, R2 = H, R3 = OH
Naringenina / Naringenin: R1 = OH, R2 = H, R3 = OH
Hesperydyna / Hesperidin: R1 = O-rutynoza / O-rutinose, R2 = OH, R3 = OMe
Hesperetyna / Hesperetin: R1 = OH, R2 = OH, R3 = OMe
64
Tabela 12. Profil związków polifenolowych w gotowych preparatach farmaceutycznych: soku
z noni (NO) i Citrosepcie (CIT) (średnia ± SD)
Table 12. Profile of polyphenol compounds in ready-to-use pharmaceutical preparations: noni
juice (NO) and Citrosept (CIT) (mean ± SD)
Związek / Compound
NO
CIT
Kwas protokatechowy / Protocatechuic acid
0,74 ± 0,69
n.d.
Kwas chlorogenowy / Chlorogenic acid
0,44 ± 0,07
0,17 ± 0,02
Kwas kawowy / Caffeic acid
0,05 ± 0,00
n.d.
n.d.
37,4 ± 5,12
Kwas galusowy / Gallic acid
3,93 ± 0,01
15,78 ± 2,58
Kwas elagowy / Ellagic acid
0,35 ± 0,05
n.d.
Apigenina / Apigenin
n.d.
0,65 ± 0,04
Apigenino-6-C-glukozyd / Apigenin-6-C-glucoside
n.d.
n.d.
Apigenino-8-C-glukozyd / Apigenin-8-C-glucoside
n.d.
0,03 ± 0,00
1,06 ± 0,10
1,37 ± 0,09
n.d.
n.d.
Daidzeina / Daidzein
n.d.
n.d.
Genisteina / Genistein
0,03 ± 0,01
n.d.
n.d.
5,29 ± 0,31
Procyjanidyna B1 / Procyanidin B1
2,14 ± 0,64
n.d.
Kwercetyno-3-O-rutynozyd
Quercetin-3-O-rutinoside
3,87 ± 1,08
90,36 ± 11,99
Kwercetyna / Quercetin
n.d.
5,71 ± 0,38
Kemferol / Kaempferol
n.d.
0,02 ± 0,02
Delfinidyno-3-O-glukozyd*
Delphinidin-3-O-glucoside
n.d.
21,56 ± 5,67
Cyjanidyno-3-O-glukozyd
Cyanidin-3-O-glucoside
n.d.
30,95 ± 9,68
Kwas p-kumarowy / p-Coumaric acid
Daidzeino-7-O-glukozyd / Daidzein-7-O-glucoside
Rezweratrol / Resveratrol
[mg/l]
Florydzyna / Phloridzin
n.d. – stężenie poniżej progu detekcji / not detected
* w przeliczeniu na cyjanidyno-3-O-glukozyd / expressed as cyanidin-3-O-glucoside equivalents
65
Oprócz omówionych powyżej flawanonów i ich 7-O-glikozydów, w skład grejpfrutów wchodzą także inne związki o wysokim potencjale antyoksydacyjnym, jak
kwercetyna [Vanamala i in. 2006] i kwasy fenolowe (głównie ferulowy, p-kumarowy,
chlorogenowy i galusowy) [Gorinstein i in. 2001, Kelebek 2010]. Uzyskane wyniki
(tab. 12) potwierdzają obecność tych związków (z wyjątkiem kwasu ferulowego)
także w Citrosepcie. Brak kwasu ferulowego może wynikać z faktu, że w grejpfrutach
występuje on głównie w postaci związanej i przede wszystkim we flawedo [Peleg i in.
1991]. Z kolei wykrycie kwercetyno-3-O-rutynozydu (w ilości 90,36 ± 11,99 mg/l)
potwierdza przypuszczenia, że do produkcji preparatu wykorzystano także składniki pomarańczy lub innych owoców cytrusowych, bowiem rutyna w grejpfrutach występuje raczej w niewielkiej ilości (5,1 mg/100 g skórki i 5,4 mg/100 g miąższu [Nogata
i in. 2006]), jest natomiast powszechna w albedo i flawedo kwaśnych pomarańczy
(odpowiednio 31,1 i 63,7 mg/100 g ś.m.) [Nogata i in. 2006]. Znaczna różnica między
sumą stężeń poszczególnych polifenoli oznaczonych metodą HPLC (tab. 11 i 12)
a zawartością polifenoli ogółem w tym preparacie (oznaczoną metodą Folina-Ciocalteu (tab. 10) może sugerować, że w Citrosepcie są obecne także inne, nieoznaczane w tej pracy polifenole, jak np. narirutyna, didymina, poncyryna czy neohesperydyna.
Na tle badanych surowców wyróżnia się ekstrakt z zielonej herbaty, o bardzo
wysokiej aktywności antyoksydacyjnej wynoszącej 10 998,3 ± 282,3 mg troloksu/100 ml, co – przy założeniu 100-procentowej wydajności ekstrakcji składników
przeciwutleniających – odpowiadałoby 439,4 ± 11,3 mmol TE/100 g wyjściowego
surowca (tab. 10). Biorąc pod uwagę potencjał antyoksydacyjny materiału wyjściowego, można byłoby uznać, że zielona herbata stanowiła najsilniejszy przeciwutleniacz
wśród badanych surowców. Należy jednak podkreślić, że porównywanie wyników
w takiej postaci jest niemiarodajne, gdyż wykorzystywany w badaniach surowiec
wyjściowy był bardzo różnorodny (świeże lub suszone warzywa, biomasa sinic, zioła,
owoce, sok z owoców lub ekstrakt), a do dalszych badań brano jednakowe objętości
przygotowanych ekstraktów lub gotowych preparatów. Dlatego bardziej uzasadnione wydaje się porównywanie potencjału antyoksydacyjnego w danej objętości końcowego ekstraktu czy preparatu. Wynik uzyskany dla zielonej herbaty jest z pewnością wyższy od wartości podanych przez takich autorów, jak Rusaczonek i inni [2010]
(142–219 mmol troloksu/100 g liści herbaty) czy Henning i inni [2003] (124–169 mmol
troloksu/100 g), ale znacząco niższy od potencjału antyoksydacyjnego liści herbaty
zbieranych w prowincji Boseong w Korei, wynoszącego 4293–4688 mmol troloksu/g
liści, w zależności od czasu ich zbioru [Lee i in. 2014]. Różnice między właściwościami antyoksydacyjnymi herbat wynikają przede wszystkim z odmiennego kraju
i regionu pochodzenia rośliny, a zatem ze związanych z tym odmiennych warunków
glebowo-klimatycznych.
Całkowita zawartość antyoksydantów (CCA), którą Yashin i inni [2011] oznaczyli metodą amperometryczną, była ogromnie zróżnicowana w zależności od kraju
66
pochodzenia i producenta herbaty. Najniższą CCA miała herbata z Bali (31,2 mg/g)
oraz kilkanaście herbat pochodzących od chińskich producentów (43–60 mg/g).
Największym potencjałem antyoksydacyjnym (190 mg/g w przeliczeniu na kwercetynę) odznaczały się herbaty ze Sri Lanki. Wysoką zawartością antyoksydantów (CCA
ponad 130 mg/g) charakteryzowały się także herbaty z Japonii [Yashin i in. 2011].
Herbaty chińskie pod względem zawartości polifenoli ogółem (11–18 g/100 g s.m.)
plasują się za herbatami z Japonii (19 g/100 g s.m.) czy z Kenii (25–27 g/100 g s.m.)
[Karori i in. 2007]. Co ciekawe, analogiczne wyniki dotyczące herbat czarnych uzyskali Dmowski i inni [2013] – również w tym przypadku herbaty pochodzące z Chin
miały najniższą zawartość polifenoli ogółem i aktywność antyoksydacyjną, a herbaty
ze Sri Lanki cechowały się wyższymi wartościami tych wskaźników.
Potencjał przeciwutleniający herbaty zależy także od parametrów procesu obróbki liści, warunków transportu i przechowywania czy nawet stopnia rozdrobnienia
liści [Gramza i in. 2005]. Bardzo wysokie wartości uzyskane przez Lee i innych [2014]
mogą wynikać z faktu, że skład polifenolowy i potencjał antyoksydacyjny liści Camelia
sinensis był analizowany natychmiast po ich poddaniu minimalnej obróbce technologicznej w celu wytworzenia produktu „herbata zielona”. Nie były one dalej przetwarzane, pakowane, transportowane ani przechowywane, a zatem nie dochodziło
do utraty cennych właściwości. Shrestha i inni [2010] wykazali, że obróbka typu CTC
(cut-tear-curl – ciąć-rozrywać-zwijać) powoduje utratę prawie połowy polifenoli
i aktywności antyoksydacyjnej herbaty, w porównaniu z metodą klasyczną. Komercyjnie
dostępne w Polsce herbaty zielone mają bardzo zróżnicowany potencjał antyoksydacyjny (w zakresie 392,5–1034 mg troloksu/g herbaty, w zależności od producenta
i kraju pochodzenia), który istotnie maleje w trakcie przechowywania [Duda-Chodak
i in. 2008]. Wynik uzyskany dla herbaty użytej w niniejszej pracy (1099,8 mg troloksu/g herbaty) świadczy o jej wysokiej jakości. Jest to herbata „w 100% organiczna”,
z certyfikatem (Bio-Siegel, Demeter). Została zakupiona w sklepie z żywnością
ekologiczną, co potwierdza przekonanie, że zakupu tego typu surowców należy
dokonywać w sklepach specjalizujących się w tej materii, które nie tylko dbają o wysoką jakość oferowanych produktów, ale też zapewniają odpowiednie warunki ich
przechowywania.
Herbata jest jednym z najczęściej spożywanych napojów na świecie. W roku 2010
roczna produkcja herbaty sięgnęła prawie 4,5 mln ton, z czego 20% było przetworzone na herbatę zieloną, spożywaną przede wszystkim w Azji, północnej Afryce,
Stanach Zjednoczonych oraz Europie [Chacko i in. 2010, Bansal i in. 2013]. Ponieważ
aż do 30–40% suchej masy liści herbaty stanowią polifenole, głównie katechiny, to
właśnie herbata stanowi podstawowe źródło takich związków, jak (-)-epikatechina,
(-)-epigalokatechina, galusan (-)-epikatechiny i galusan (-)-epigalokatechiny [Bansal
i in. 2013, Gadkari i Balaraman 2014]. Wysokiej jakości herbaty wykorzystanej w badaniach dowodzą także wyniki dotyczące ogólnej zawartości polifenoli –
9549,0 ± 46,0 mg (w przeliczeniu na katechinę) w 100 g liści herbaty (tab. 10).
67
Zawartość katechin w herbatach zielonych jest bardzo zróżnicowana i – podobnie jak zawartość polifenoli ogółem i potencjał antyoksydacyjny – zależy od
wielu czynników. Należy podkreślić, że z wyjściowej ogromnej zawartości polifenoli w liściu krzewu herbacianego, na skutek obróbki technologicznej prowadzącej
do uzyskania komercyjnej herbaty pozostaje w produkcie tylko nieznaczna jej część.
O tym, jak duże są to różnice, świadczy wysokie stężenie katechin ogółem w liściach
zebranych z 22 odmian krzewu herbacianego rosnącego w różnych regionach Chin,
wynoszące od 1245,9 do 2965,8 mg/g suchej masy liścia, w zależności od odmiany
i regionu [Wang i in. 2008a]. W przypadku katechin analizowanych w cytowanej
pracy najwyższe stężenia zanotowano dla galusanu (-)-epigalokatechiny (EGCG)
oraz (-)-epigalokatechiny (EGC) (odpowiednio 677,3–2198,2 i 94,3–524,6 mg/g s.m.).
Pozostałe katechiny występowały w znacznie mniejszych ilościach. Peterson i inni
[2005] przeanalizowali 90 publikacji naukowych (które spełniały wyznaczone kryteria, m.in. zawierały wiarygodne dane na temat zawartości poszczególnych związków określonej uznanymi metodami badawczymi), oceniających poziom poszczególnych polifenoli w różnych komercyjnych herbatach, i podali wartości średnie
uzyskane na podstawie analizy statystycznej tych wyników. Zawartość EGCG
w komercyjnych herbatach zielonych kształtowała się w szerokim zakresie 11,8–
–188 mg/g s.m., a EGC – w granicach 1–54,4 mg/g, co oznacza aż kilkudziesięciokrotny spadek zawartości tych substancji w suchej masie liścia na skutek obróbki
technologicznej. Podobną prawidłowość wykazano dla innych ważnych polifenoli
– ich stężenie w produkcie znacząco odbiegało od wartości ustalonej dla wyjściowego surowca, jakim jest liść krzewu C. sinensis. Stężenie katechiny mieściło się
w zakresie 0–0,8 mg/g suszu herbacianego wobec 0–12,0 mg/g w liściu wyjściowym,
zaś epikatechiny – w granicach 1,9–20 mg/g wobec 21,3–110 mg/g [Henning i in.
2003, Peterson i in. 2005].
Zawartość polifenoli, a co za tym idzie potencjał antyoksydacyjny herbaty, zależy nie tylko od technologii obróbki liści i rodzaju uzyskanej na końcu herbaty
(czarna, oolong, zielona, czerwona, Pu-Erh), ale także od parametrów charakteryzujących wyjściowy surowiec roślinny, stopnia jego rozdrobnienia, warunków transportu i przechowywania, czasu i krotności zaparzania czy temperatury użytej do tego
wody [Astill i in. 2001, Henning i in. 2003, Labbe i in. 2006, Duda-Chodak i in. 2008,
Dmowski i in. 2013, Pal i in. 2013]. Wang i inni [2008a] wykazali, że dla zawartości
polifenoli i aktywności antyoksydacyjnej ważny jest nie tylko kraj, ale też konkretny
region, ze względu na swoiste warunki glebowe, stopień nasłonecznienia czy ilość
opadów. Co więcej, herbata wyprodukowana z surowca pochodzącego z tego samego miejsca może charakteryzować się odmiennymi właściwościami antyoksydacyjnymi w zależności od pory zbioru liści [Longo i in. 2008, Lee i in. 2014]. Także sposób
suszenia liści może istotnie wpłynąć na potencjał antyoksydacyjny surowca. Longo
i inni [2008] wykazali, że liście herbaty pochodzące z tego samego regionu, z tej
samej odmiany krzewu Camellia sinensis i zbierane w tym samym czasie mogą mieć
68
kilkukrotnie mniej EGCG i galusanu epikatechiny (ECG), jeśli będą suszone na
słońcu zamiast w specjalnym piecu.
Stężenie (+)-katechiny (CAT) wyznaczone metodą HPLC wynosiło
49,39 ± 9,80 mg/l ekstraktu (tab. 13), co – przy założeniu całkowitego przejścia
tego związku z surowca do ekstraktu – odpowiada maksymalnie 0,49 mg/g s.m.
liści zielonej herbaty. W porównaniu do wyników innych autorów są to zatem
wartości przeciętne. Lee i inni [2014] określili zawartość CAT na poziomie 0,99–
–2,48 mg/g liści, natomiast Henning i inni [2003] w niektórych zielonych herbatach
w ogóle nie wykryli katechiny, podobnie jak Peterson i inni (0–0,8 mg/g s.m.)
[2005]. Stężenie (-)-epigalokatechiny (EGC) w herbacie użytej do badań było dość
duże i wynosiło 50,22 mg w przeliczeniu na 1 g s.m. liści, (-)-epikatechiny (ECAT)
– 11,16 mg/g, a EGCG – 28,76 mg/g (w sumie wykryto 90,63 mg flawanoli/g herbaty). W analizowanej zielonej herbacie wykryto ponadto obecność takich związków polifenolowych, jak kwas galusowy (w ilości 2,91 mg/g s.m.), apigenina (0,13),
kemferol (0,25), rutyna (0,31), glukozyd kwercetyny (0,39) i kwercetyna (0,22)
(tab. 13).
Wyniki większości badań wskazują, że dominującym polifenolem zielonej herbaty jest EGCG, a zaraz po nim EGC, choć w przypadku niektórych gatunków
herbat ta kolejność jest odwrotna [Yashin i in. 2011]. Także w herbacie badanej
w niniejszej pracy galusan (-)-epigalokatechiny występował w stężeniu mniejszym
niż (-)-epigalokatechina, co może mieć kilka przyczyn niezależnych od odmiany
i pochodzenia liści herbacianych. Po pierwsze, wynik taki może świadczyć o hydrolizie związku i uwolnieniu kwasu galusowego. Kwas galusowy z łatwością odłącza
się od cząsteczek galusanu (-)-epikatechiny i EGCG w reakcjach enzymatycznych
katalizowanych przez tannazę, β-glukuronidazę typu H-2 lub sulfatazy bądź w reakcjach nieswoistej hydrolizy wiązania estrowego w galusowych pochodnych katechin
[Narumi i in. 2014]. Najbardziej prawdopodobnym źródłem tanazy jest zanieczyszczenie liścia herbacianego mikroorganizmami wytwarzającymi ten enzym. Do najważniejszych należą liczne gatunki pleśni z rodzajów Aspergillus i Penicillium oraz
pojedyncze gatunki z rodzajów Trichoderma i Fusarium, drożdże, np. Candida sp.
i Pichia sp. oraz bakterie, głównie jelitowe z rodzajów Lactobacillus i Bacillus [Belur
i Mugeraya 2011, Lal i Gardner 2012, Mehta i in. 2013].
Katechiny w zielonej herbacie występują w postaci (-)-epiform (2R, 3R):
galusanu (-)-epigalokatechiny (EGCG), galusanu (-)-epikatechiny (ECG) oraz
(-)-epikatechiny (ECAT). Powszechnie wiadomo, że w wysokiej temperaturze oraz
w warunkach beztlenowych zachodzi reakcja epimeryzacji do (-)-epiform (2S,
3R): galusanu (-)-galokatechiny (GCG), galusanu (-)-katechiny (CG) oraz (-)-katechiny (CAT) [Mika i in. 2009]. Choć ekstrakt użyty w doświadczeniach nie był
poddawany działaniu wysokiej temperatury, to takiej reakcji nie można wykluczyć.
Jednoczesny rozpad i epimeryzację EGCG w zakresie temperatur 25–100°C wykryli Wang i inni [2008b]. Poniżej 44°C dominował rozpad (przypuszczalnie przez
69
utlenienie) EGCG i galusanu galokatechiny (GCG), podczas gdy powyżej tej
temperatury przeważała reakcja epimeryzacji GCG do EGCG, z kolei powyżej
98°C epimeryzacja EGCG do GCG była szybsza niż degradacja. Oznacza to, że
w stosowanym w tej pracy ekstrakcie mogło dojść do samoistnego rozpadu EGCG
i GCG.
Potwierdzenia, że katechiny obecne w zielonej herbacie ulegają także przemianom samoistnym, bez udziału mikroorganizmów i ich enzymów, dostarczają wyniki
Friedmana i innych [2009]. Zanotowali oni, że już po 1-miesięcznym przechowywaniu komercyjnych herbat, nawet w korzystnych warunkach (w ciemności, w temperaturze pokojowej), istotnie zmniejszał się poziom katechin, szczególnie najważniejszych pochodnych: EGCG oraz ECG, i malał dalej w trakcie 6-miesięcznego
doświadczenia. Z wcześniejszych badań wiadomo także, że EGCG w buforze TRIS
o pH 7,2 ulega samoistnemu rozpadowi z wytworzeniem różnych pochodnych, m.in.
chinonu EGCG czy dimeru EGCG [Sang i in. 2005]. Prawdopodobny mechanizm
tej reakcji polega na utlenianiu EGCG przez tlen cząsteczkowy z wytworzeniem
rodnika EGCG• oraz O2•– w reakcji katalizowanej przez śladowe ilości jonów Cu2+
i Fe3+. Powstały rodnik reaguje z kolejną cząsteczką EGCG, wytwarzając następne
rodniki i reaktywne formy tlenu (H2O2), co uruchamia reakcję łańcuchową. W jej
efekcie powstają chinon EGCG, chinon dimeru EGCG oraz dimer EGCG. O udziale rodnika ponadtlenkowego w tej reakcji świadczy zahamowanie reakcji w obecności dysmutazy ponadtlenkowej [Sang i in. 2007]. Ponieważ liście zielonej herbaty
zawierają też jony metali, w tym miedzi (11,28–37,6 mg/kg) i żelaza (140–436 mg/kg)
[Street i in. 2006], wydaje się dość prawdopodobne, że reakcja opisana przez Sanga
i innych [2007] zaszła także w badanym ekstrakcie, co tłumaczyłoby stosunkowo
małą zawartość EGCG.
Liczne badania wykazały, że galusowe pochodne katechin (ECG, GCG, EGCG)
mają większą zdolność do zmiatania wolnych rodników niż pochodne niezawierające reszty kwasu galusowego (EGC, GC, ECAT) [Henning i in. 2003, Wang i in.
2008b, Lee i in. 2014], co dowodzi, jak istotną rolę pełni ta grupa w pozycji C3
pierścienia C, w połączeniu z aktywnością grupy hydroksylowej przy C5’ pierście
nia B. Można byłoby zatem przyjąć, że – pod względem siły zmiatania rodników –
ECG > ECAT oraz EGCG > EGC. Ustawiając występujące w herbacie katechiny
zgodnie z malejącym potencjałem antyoksydacyjnym, Henning i inni [2003] otrzymali szereg: ECG > EGCG > ECAT = CAT > EGC. Z drugiej strony wykazano,
że trans-katechiny (GCG, GC i CAT) mają wyższy potencjał zmiatania tlenu singletowego (1O2) niż cis-katechiny (EGCG, EGC i ECAT). Oznacza to, że potencjał
antyoksydacyjny danego związku zależy od cząsteczki, z którą przyjdzie mu reagować
[Wang i in. 2008b]. Również w tej sytuacji kolejność ta może się nieznacznie zmieniać, w zależności od środowiska reakcji (warunki hydrofobowe czy hydrofilowe)
oraz od metody badawczej użytej do ocenienia właściwości antyoksydacyjnych
[Gramza i in. 2005, Wang i in. 2008b].
n.d.
n.d.
4,58 ± 0,97
n.d.
16,27 ± 3,22
n.d.
10,12 ± 1,05
n.d.
9,08 ± 1,09
5,08 ± 0,65
n.d.
n.d.
n.d.
9,17 ± 2,64
n.d.
n.d.
Apigenino-6-C-glukozyd
Apigenin-6-C-glucoside
Daidzeino-7-O-glukozyd
Daidzein-7-O-glucoside
Daidzeina
Daidzein
3,52 ± 2,41
46,19 ± 8,14
11,21 ± 1,96
2,19 ± 0,07
n.d.
0,40 ± 0,23
4,25 ± 0,52
0,72 ± 0,01
n.d.
0,85 ± 0,04
S
CC
Kwas ferulowy / Ferulic acid
Kwas p-kumarowy
p-Coumaric acid
Kwas chlorogenowy
Chlorogenic acid
Kwas protokatechowy
Protocatechuic acid
Związek / Compound
0,02 ± 0,00
n.d.
94,65 ± 8,43
13,72 ± 3,22
14,05 ± 1,69
0,28 ± 0,01
20,15 ± 3,47
84,65 ± 6,59
9,30 ± 0,98
6,51 ± 2,14
11,61 ± 0,96
24,96±1,59
94,23 ± 11,17
CN
0,04 ± 0,00
n.d.
98,20 ± 11,50
33,50 ± 2,87
24,97 ± 1,79
0,09 ± 0,01
n.d.
12,54 ± 0,45
0,17 ± 0,09
0,18 ± 0,01
n.d.
1,58 ± 0,09
2,49 ± 1,08
PO
n.d.
n.d.
6,56 ± 3,24
n.d.
n.d.
n.d.
1,05 ± 0,72
93,67 ± 11,10
n.d.
1,15 ± 0,71
0,49 ± 0,31
0,10 ± 0,05
0,65 ± 0,07
CCH
n.d.
n.d.
n.d.
2,87 ± 0,99
1,57 ± 0,69
12,84 ± 3,39
n.d.
291,1 ± 36,9
n.d.
n.d.
23,48 ± 3,54
n.d.
3,35 ± 2,58
GT
n.d.
n.d.
29,62 ± 4,66
4,38 ± 0,67
0,49 ± 0,04
0,66 ± 0,00
0,24 ± 0,04
1,28 ± 0,05
n.d.
n.d.
n.d.
n.d.
n.d.
SP
Tabela 13. Profil związków polifenolowych w ekstraktach etanolowych z czerwonej cebuli (CC), soi (S), czosnku niedźwiedziego (CN), ziela
pokrzywy (PO), owoców cytryńca chińskiego (CCH), zielonej herbaty (GT) i spiruliny (SP) (średnia ± SD)
Table 13. Profile of polyphenol compounds in ethanolic extracts from red onion (CC), soybean (S), bear’s garlic (CN), nettle herb (PO),
Schisandra fruits (CCH), green tea (GT), and spirulina (SP) (mean ± SD)
[mg/l
70
1,86 ± 0,09
n.d.
1,00 ± 0,03
n.d.
n.d.
n.d.
n.d.
n.d.
n.d.
n.d.
0,08 ± 0,05
n.d.
n.d.
8,68 ± 0,49
n.d.
Delfinidyno-3-O-glukozyd*
Delphinidin-3-O-glucoside
Peonidyno-3-O-glukozyd*
Peonidin-3-O-glucoside
n.d.
n.d.
n.d.
0,12 ± 0,03
0,05 ± 0,00
9,34 ± 1,09
5,23 ± 0,16
n.d.
6,06 ± 0,56
1,33 ± 0,39
0,07 ± 0,00
50,44 ± 7,85
138,4 ± 8,87
24,52 ± 1,78
55,15 ± 3,69
377,0 ± 35,2
1096 ± 152,3
134,8 ± 8,69
403,9 ± 29,9
0,66 ± 0,06
0,19 ± 0,02
n.d.
n.d.
2,98 ± 0,09
1,06 ± 0,01
1,28 ± 0,00
n.d.
47,60 ± 5,28
n.d.
n.d.
3,95 ± 0,68
25,46 ± 1,17
3,36 ± 0,69
73,20 ± 3,67
0,25 ± 0,02
0,24 ± 0,00
0,50 ± 0,22
Kwercetyno-3-O-glukozyd
Quercetin-3-O-glucoside
n.d.
n.d.
0,05 ± 0,00
n.d.
n.d.
2,29 ± 1,89
1,83 ± 0,39
n.d.
[mg/l
Galusan (-)-epigalokatechiny
(-)-Epigallocatechin gallate
(-)-Epikatechina
(-)-Epicatechin
(+)-Katechina
(+)-Catechin
(-)-Epigalokatechina
(-)-Epigallocatechin
Procyjanidyna B2
Procyanidin B2
Procyjanidyna B1
Procyanidin B1
Genisteina / Genistein
n.d.
6,74 ± 0,09
n.d.
0,04 ± 0,02
0,41 ± 0,17
1,00 ± 0,37
0,92 ± 0,77
n.d.
n.d.
n.d.
n.d.
n.d.
n.d.
0,07 ± 0,06
0,07 ± 0,05
n.d.
n.d.
n.d.
24,75 ± 7,33
22,16 ± 4,99
39,36 ± 8,2
31,03 ± 9,14
2876,1 ± 156,1
1116,5 ± 167,8
49,39 ± 9,80
5022,3 ± 125,0
n.d.
n.d.
4,42 ± 0,05
0,94 ± 0,99
n.d.
n.d.
n.d.
3,81 ± 0,68
0,61 ± 0,37
n.d.
n.d.
n.d.
n.d.
n.d.
n.d.
11,91 ± 1,99
26,43 ± 4,28
0,57 ± 0,06
0,02 ± 0,00
71
72
W prezentowanej pracy oznaczono bardzo wysokie wartości potencjału antyoksydacyjnego, co można wyjaśnić wysokim stężeniem EGC i EGCG, a także obecnością innych związków o aktywności przeciwutleniającej. Do polifenoli występujących
w zielonej herbacie należą bowiem również nieoznaczane w tej pracy galusan epikatechiny (ECG), o wysokim potencjale przeciwrodnikowym, oraz galusan katechiny (CG) i galusan galokatechiny (GCG).
Podsumowując uzyskane wyniki można stwierdzić, że zarówno Citrosept, jak
i zielona herbata są szczególnie bogatymi źródłami związków polifenolowych o wysokim potencjale antyoksydacyjnym.
Jako stosunkowo bogate źródło przeciwutleniaczy na uwagę zasługują także sok
z noni (424,5 ± 39,5 mg troloksu/100 ml) oraz ekstrakty z derenia, pigwowca, czarnego bzu i czosnku niedźwiedziego (259–283 mg troloksu/100 ml) (tab. 10). Bardzo
niską aktywnością przeciwrodnikową charakteryzowały się natomiast ekstrakty ze
spiruliny (24,1 ± 1,2), czerwonej cebuli (43,2 ± 2,9), cytryńca chińskiego (54,0 ± 4,1)
i soi (66,0 ± 9,0). Generalnie, siła zmiatania rodnika ABTS była dodatnio skorelowana z ilością polifenoli ogółem (R = 0,9904). Poza zieloną herbatą i Citroseptem,
bardzo dużą zawartością polifenoli odznaczał się ekstrakt z czarnego bzu
(883,1 ± 119 mg katechiny/100 g ś.m.), czemu odpowiadał znaczący potencjał AOX.
W przypadku ekstraktu z jagód goji i ziela pokrzywy duża zawartość polifenoli (odpowiednio 810,6 i 618,9 mg katechiny/100 g) nie korespondowała z aktywnością
antyoksydacyjną (197,2 i 107,1 mg troloksu/100 ml), co sugeruje dominację związków
polifenolowych o niskim potencjale AOX. Z kolei w soku z noni zawartość polifenoli była stosunkowo niewielka, jednak jego potencjał antyoksydacyjny był wysoki,
co – podobnie jak w przypadku derenia i pigwowca – wskazuje na obecność innych
niż polifenole substancji o zdolności zmiatania rodnika ABTS, np. witaminy C,
karotenoidów czy tokoferoli.
W soku z noni zidentyfikowano jedynie nieznaczne ilości kwasów fenolowych,
głównie galusowego i protokatechowego, a także rutynę i procyjanidynę B1 (tab. 12).
Pozostałe polifenole występowały w ilościach śladowych (lub poniżej możliwości
detekcji zastosowanej metody). Zgodnie z danymi literaturowymi, owoce noni
zawierają blisko 200 aktywnych składników, przy czym najważniejsze z nich to
rzadko spotykane w innych roślinach związki fenolowe, przede wszystkim z grupy
antrachinonów (damnakantal, morindon, morindina, aukubina, asperulozyd, skopoletyna, rubiadyna, alizaryna), glikozydy antrachinonów, lignany oraz flawonoidy
i ich glikozydy (głównie kemferol, kwercetyna i rutyna) [Pawlus i Kinghorn 2007,
Singh 2012]. Ponadto noni zawiera kwasy tłuszczowe (głównie ursolowy, linolowy,
kaprylowy i kapronowy) i ich pochodne oraz alkaloidy, irydoidy, sporo białka
(ok. 11% suchej masy) i minerałów (8,4% s.m., głównie potas, siarkę, wapń, fosfor),
witaminę C, E, karotenoidy oraz składniki lotne [Potterat i Hamburger 2007, Singh
2012].
73
Bogactwo związków bioaktywnych przekłada się na duży potencjał antyoksydacyjny. Co ważne, noni zawiera w swym składzie przeciwutleniacze zarówno lipofilowe (antrachinony, karotenoidy, witamina E), jak i hydrofilowe. Może więc oddziaływać na organizm i komórki niejako kompleksowo. W skład owoców noni wchodzą
także enzymy antyoksydacyjne, takie jak SOD, katalaza, peroksydaza czy reduktaza
glutationowa [Srinivasahan i Dubairaj 2014]. Bramorski i inni [2010] oceniali potencjał antyoksydacyjny i zawartość polifenoli ogółem w komercyjnym preparacie
soku z noni, zawierającym w swoim składzie także 5% soku z borówek i winogron,
i stwierdzili, że sok z noni zawiera znacznie mniej polifenoli ogółem (i ma niższy
potencjał antyoksydacyjny) niż czysty sok z borówek i mniej więcej tyle samo, co
czysty sok winogronowy. Z kolei Elizabeth i Murugesan [2012] wykazali, że metanolowe ekstrakty z korzeni noni mają zdolność neutralizacji H2O2 oraz zmiatania
rodników O2•– i NO•. Owoce noni mają przeciętny potencjał antyoksydacyjny, porównywalny z potencjałem pomarańczy lub mandarynek, lecz możliwość ich działania zarówno w fazie hydrofobowej, jak i hydrofilowej komórki jest bezcenna.
Właściwości te próbuje się wykorzystać m.in. w leczeniu nowotworów [Gupta i Patel
2013]. Etanolowy ekstrakt z owoców noni (50%) charakteryzuje się zdolnością zmiatania rodnika ABTS porównywalną ze zdolnością witaminy C (w takim samym
stężeniu), ale ma blisko 4-krotnie większy potencjał redukujący [Srinivasahan
i Dubairaj 2014]. Zdolność do redukcji Fe(III), zależna od możliwości oddania
atomów wodoru, jest znacznie większa w przypadku ekstraktu zawierającego różne
polifenole niż czystego kwasu askorbinowego.
Bramorski i inni [2010] określili zawartość polifenoli ogółem w soku z noni na
poziomie 91 mg (w przeliczeniu na kwas galusowy)/100 ml soku. W prezentowanej
pracy sumaryczna zawartość związków polifenolowych wynosiła prawie 109 mg
(w przeliczeniu na katechinę)/100 ml soku i była wyższa o ok. 20–30% od zawartości polifenoli w ekstraktach z owoców czarnego bzu oraz jagód goji (tab. 10). Należy
przy tym zaznaczyć, że sok z noni, stosowany w badaniach, był gotowym produktem
komercyjnym (zgodnie z deklaracją producenta, był to 100-procentowy sok wyciskany bezpośrednio z owoców, a zatem nierozcieńczany i nieodtwarzany z koncentratu).
Ekstrakty z czarnego bzu i jagód goji natomiast były przygotowywane zgodnie z proporcją 10 g owoców w formie „konsumpcyjnej” (świeży owoc bzu i suszone jagody
goji) na końcową objętość 100 ml ekstraktu. Biorąc te fakty pod uwagę, można
wysnuć wniosek, że zawartość polifenoli w noni była jednak mniejsza niż w jagodach
goji. Zawartość 81 mg polifenoli w 100 ml ekstraktu z suszonych jagód goji odpowiada 8,1 mg polifenoli (w przeliczeniu na katechinę) na 1 g suchej masy. Otrzymany
wynik jest niższy od wartości podanej przez Tarkę i innych [2013], czyli 14,31 mg
katechiny/g s.m., dotyczącej jednak ekstrakcji metanolem. Wpływ rozpuszczalnika
na wydajność ekstrakcji związków polifenolowych z owoców goji opisano już wcześ
niej [Ionică i in. 2012]. Stwierdzono wówczas, że zawartość polifenoli ogółem w 1 g
suszonych jagód goji wynosi między 0,18 a 4,14 równoważników kwasu galusowego
74
(GAE), w zależności od rozpuszczalnika użytego do ekstrakcji, przy czym najmniej
polifenoli wyekstrahowano acetonem, a najwięcej przy użyciu 2-procentowego HCl.
Co ciekawe, inaczej niż w przypadku owoców suszonych, dla świeżych jagód goji
najwydajniejszym rozpuszczalnikiem był 80-procentowy etanol, a zawartość polifenoli ogółem oznaczona w takim ekstrakcie wynosiła 1,74 GAE/g, podczas gdy przy
użyciu acetonu uzyskano 0,09 GAE/g. Widać zatem wyraźnie, że porównywanie
wyników otrzymanych w różnych laboratoriach jest trudne, gdyż (podobnie jak
w przypadku herbaty zielonej) zawartość polifenoli zależy nie tylko od miejsca pochodzenia owoców i sposobu ich przetworzenia (świeże, suszone), ale przede wszystkim od zastosowanej metody ekstrakcji związków polifenolowych. W zależności od
użytego ekstrahenta, do roztworu przechodzą różne związki, co ma wpływ na ich
profil, a co za tym idzie także na ogólną ilość polifenoli oraz na ich aktywność antyoksydacyjną, gdyż każdy związek inaczej reaguje z odczynnikiem Folina-Ciocalteu
i ma inne właściwości przeciwrodnikowe. Świetnie to widać na przykładzie badań
przeprowadzonych przez takie zespoły, jak Chao i inni [2014] oraz Lin i inni [2013].
Ci pierwsi określili zawartość polifenoli ogółem w owocach goji na poziomie 9,24 mg
GAE/g s.m., z kwercetyną jako dominującym flawonolem (12,3 mg/g s.m.) oraz
brakiem myrycetyny, kemferolu i moryny. Drugi zespół wykazał natomiast nie tylko
znacznie wyższą zawartość polifenoli ogółem (25 mg GAE/g liofilizowanych owoców
goji), ale także brak kwercetyny, kemferolu i moryny, za to obecność myrycetyny
w ilości 0,32 mg/g s.m. W suszonych jagodach goji, ocenianych w niniejszej pracy,
wykryto kilkadziesiąt związków, z których zidentyfikowano kilkanaście, głównie
rutynę, glukozyd kwercetyny, procyjanidynę B1, florydzynę i glukozyd apigeniny oraz
kwasy galusowy, chlorogenowy, elagowy, protokatechowy i p-kumarowy (tab. 14).
Inni autorzy stwierdzili, że głównymi polifenolami owoców goji w ekstrakcie wodnym
są rutyna i kwas chlorogenowy, w ekstrakcie uzyskanym za pomocą 50-procentowego etanolu – rutyna i kwas protokatechowy, zaś w 95-procentowym etanolu – rutyna [Qian i in. 2004]. Ilość flawonoidów w tych ekstraktach wynosiła odpowiednio
1154, 1207 i 1497 µg/g. Wspomniani autorzy wykazali także wzrost zdolności zmiatania rodnika DPPH wraz z rosnącą zawartością etanolu. W innym doświadczeniu
uzyskano przeciwne wyniki. Jednym z bardziej popularnych sposobów konsumpcji
jagód goji w Chinach jest jej moczenie w alkoholu; wykazano, że zastosowanie wyższych stężeń alkoholu (55 i 65%) niekoniecznie zwiększa potencjał antyoksydacyjny
uzyskanych nalewów, promuje bowiem przechodzenie do maceratu flawonoidów,
podczas gdy przy niższych stężeniach alkoholu (15 i 25%) przechodzi do niego
głównie betaina (metabolit choliny) [Song i Xu 2012]. Wynik ten może jednak być
efektem zastosowania do oceny potencjału antyoksydacyjnego rodnika DPPH, który pozwala na ocenę jedynie przeciwutleniaczy hydrofobowych, w przeciwieństwie
do rodnika ABTS, który reaguje zarówno z przeciwutleniaczami hydrofobowymi,
jak i hydrofilowymi. Dominująca w nalewach o niskim stężeniu etanolu betaina może
ze względu na swoją strukturę zachowywać się zarówno jak związek hydrofobowy,
75
jak i hydrofilowy, dlatego będzie sztucznie zawyżać wynik. Z kolei flawonoidy, w większości hydrofilowe, nie będą reagowały z DPPH.
Potencjał antyoksydacyjny ekstraktów metanolowych z suszonych owoców goji,
określony przez Tarkę i innych [2013], wynosił 43,73 mg troloksu/g s.m. owocu, co
było wynikiem ponad dwukrotnie wyższym niż uzyskano w tej pracy dla ekstraktu
etanolowego (19,72 mg troloksu/g) (tab. 10). Luo i inni [2004] natomiast otrzymali
inne wyniki i wykazali odwrotną prawidłowość: aktywność antyoksydacyjna ekstraktów metanolowych z suszonych jagód goji wynosiła 1,00 mg troloksu/g s.m. i była
niższa o 25% niż w przypadku ekstraktów etanolowych. Wyraźnie zatem widać, że
trudno jest porównywać wyniki, które uzyskano przy zastosowaniu odmiennych
metod ekstrakcji.
Należy podkreślić, że za potencjał antyoksydacyjny owoców goji odpowiadają
nie tylko polifenole. Jednym z ważniejszych przeciwutleniaczy, obecnych w tych
owocach, jest witamina C, której zawartość w suszonych jagodach goji Ionică i inni
[2012] szacują na 460 µg/g. Badacze ci zanotowali, że etanolowe ekstrakty z suszonych jagód goji zmiatały w ciągu 10 minut ponad 40% rodnika DPPH, natomiast
ekstrakty przygotowane za pomocą 2-procentowego kwasu solnego – aż 90%, co
wskazuje na duże znaczenie witaminy C (która w roztworach etanolowych ulega
szybszemu rozkładowi) dla właściwości antyoksydacyjnych goji. W skład jagód goji
wchodzą także liczne polisacharydy (L. barbarum polysaccharides – LBP), o istotnej aktywności antyoksydacyjnej, radioprotekcyjnej, antynowotworowej, immunomodulującej, przeciwcukrzycowej czy ochronnej względem wątroby, serca i układu
nerwowego [He i in. 2012, Jin i in. 2013]. Do najważniejszych monocukrów budujących LBP należą D-mannoza, L -ramnoza, kwas D-glukuronowy, kwas
D-galakturonowy, D-glukoza, D-ksyloza, D-galaktoza i L-arabinoza, przy czym
ilościowo dominują kwas D-galakturonowy, D-galaktoza i L-arabinoza [He i in.
2012]. Wykazano, że większość z poznanych LBP, w stężeniach w zakresie 500–
–1000 µg/ml, wydajnie zmiata rodniki ponadtlenkowy, hydroksylowy oraz DPPH
i ABTS [Lin i in. 2009, Amagase i Farnsworth 2011, He i in. 2012]. LBP hamuje
także reakcję peroksydacji lipidów i ma znaczący potencjał redukujący [He i in.
2012]. Kolejne ważne składniki bioaktywne w jagodach goji to karotenoidy (głównie dipalmitynian zeaksantyny w stężeniu 1,1 mg/g [Amagase i Farnsworth 2011]),
aminokwasy (głównie glutamina i asparagina), witaminy i minerały (K, Ca, Zn, Fe,
Co, Mn, Se, Mg) [Amagase i Farnsworth 2011, Jin i in. 2013], z których część działa także jako przeciwutleniacze.
Wykazano, że frakcja flawonoidów wyizolowanych z goji jest bardziej wydajna
w zmiataniu rodników DPPH i ABTS oraz chelatowaniu jonów metali, a także
wykazuje silniejszy potencjał redukujący niż frakcje karotenoidów czy polisacharydów,
natomiast frakcje zeaksantynowa oraz polisacharydowa są efektywniejsze w zmiataniu wolnych rodników, odpowiednio hydroksylowego i ponadtlenkowego [Wang i in.
2010].
0,27 ± 0,11
0,03 ± 0,02
n.d.
0,66 ± 0,12
22,73 ± 3,69
0,05 ± 0,01
5,05 ± 0,76
0,76 ± 0,31
0,34 ± 0,13
1,32 ± 0,36
20,88 ± 2,45
0,02 ± 0,02
n.d.
1,04 ± 0,69
Procyjanidyna B1
Procyanidin B1
0,24 ± 0,05
n.d.
n.d.
0,10 ± 0,01
19,53 ± 3,58
1,06 ± 0,47
1,07 ± 0,33
0,09 ± 0,03
0,12 ± 0,02
3,60 ± 0,31
0,49 ± 0,11
3,02 ± 0,09
B
Ż
Kwas ferulowy / Ferulic acid
Kwas p-kumarowy
p-Coumaric acid
Kwas chlorogenowy
Chlorogenic acid
Kwas protokatechowy
Protocatechuic acid
Związek / Compound
31,24 ± 7,44
0,09 ± 0,10
14,2 ± 6,45
0,78 ± 0,06
0,08 ± 0,89
0,09 ± 0,02
0,38 ± 0,08
18,19 ± 6,88
0,02 ± 0,45
n.d.
0,61 ± 0,31
0,04 ± 0,10
n.d.
D
26,61 ± 12,51
0,76 ± 0,56
13,46 ± 8,44
0,21 ± 0,24
2,70 ± 1,32
n.d.
3,55 ± 4,24
11,02 ± 1,81
0,43 ± 0,29
3,91 ± 2,71
n.d.
3,41 ± 2,41
0,26 ± 0,80
BEZ
n.d.
0,12 ± 0,08
15,68 ± 3,65
n.d.
0,37 ± 0,17
n.d.
8,90 ± 1,44
29,9 ± 4,08
n.d.
n.d.
n.d.
0,08 ± 0,03
n.d.
M
20,17 ± 6,69
0,28 ± 0,01
18,26 ± 3,97
n.d.
4,98 ± 1,66
0,08 ± 0,00
2,32 ± 0,00
77,51 ± 9,87
n.d.
0,55 ± 0,02
n.d.
4,69 ± 0,02
2,87 ± 0,31
G
n.d.
n.d.
22,78 ± 3,54
0,01 ± 0,08
3,68 ± 0,03
n.d.
0,74 ± 0,19
13,72 ± 3,33
0,01 ± 0,06
0,24 ± 0,00
0,47 ± 0,36
0,40 ± 0,10
0,09 ± 0,02
P
Tabela 14. Profil związków polifenolowych w ekstraktach etanolowych z owoców żurawiny (Ż), borówki brusznicy (B), derenia jadalnego (D),
czarnego bzu (BEZ), malin (M), goji (G) oraz pigwowca japońskiego (P) (średnia ± SD)
Table 14. Profile of polyphenol compounds in ethanolic extracts from cranberry (Ż), lingonberry (B), cornelian cherry (D), elderberry
(BEZ), raspberry (M), goji (G), and Japanese quince (P) fruits (mean ± SD)
[mg/l]
76
n.d.
1,62 ± 0,66
n.d.
0,18 ± 0,03
n.d.
n.d.
n.d.
n.d.
n.d.
n.d.
Pelargonidyno-3-O-glukozyd*
Pelargonidin-3-O-glucoside
Peonidyno-3-O-glukozyd*
Peonidin-3-O-glucoside
1,80 ± 0,59
n.d.
0,02 ± 0,00
16,42 ± 2,51
n.d.
n.d.
n.d.
n.d.
22,6 ± 1,69
n.d.
0,23 ± 0,03
0,14 ± 0,09
3,17 ± 23,00
n.d.
n.d.
0,02 ± 2,60
n.d.
n.d.
7,64 ± 2,16
218,0 ± 21,10
404,4 ± 25,10
684,3 ± 38,90
0,12 ± 0,05
2,32 ± 1,56
10,29 ± 2,32
89,32 ± 30,14
1,95 ± 0,98
n.d.
n.d.
0,01 ± 0,01
Cyjanidyno-3,5-di-O-glukozyd*
Cyanidin-3,5-di-O-glucoside
n.d.
0,03 ± 0,01
64,72 ± 5,68
2,7 ± 1,24
n.d.
13,77 ± 4,15
n.d.
16,17 ± 0,98
[mg/l]
Cyjanidyno-3-O-sambubiozyd*
Cyanidin-3-O-sambubioside
Kwercetyno-3-O-glukozyd
Quercetin-3-O-glucoside
Galusan (-)-epigalokatechiny
(-)-Epigallocatechin gallate
(+)-Katechina
(+)-Catechin
Procyjanidyna B2
Procyanidin B2
n.d.
n.d.
n.d.
56,11 ± 3,11
n.d.
0,08 ± 0,02
0,07 ± 0,00
1,44 ± 0,23
3,19 ± 0,82
n.d.
n.d.
n.d.
n.d.
n.d.
n.d.
n.d.
n.d.
0,05 ± 0,01
0,04 ± 0,01
7,71 ± 0,79
20,82 ± 2,85
n.d.
n.d.
n.d.
n.d.
n.d.
n.d.
n.d.
n.d.
n.d.
0,06 ± 0,68
12,21 ± 5,93
0,02 ± 0,12
n.d.
n.d.
n.d.
77
78
Ogólna zawartość polifenoli w owocach czarnego bzu, oznaczona w tej pracy,
wyniosła 883,1 ± 119 mg katechiny/100 g ś.m. owocu. Dla gatunku Sambucus nigra
wykazano bardzo dużą sezonową zmienność w obrębie tego parametru [Lee i Finn
2007]. W kolejnych dwóch latach zawartość polifenoli ogółem wahała się w zakresie
387–582 mg GAE/100 g ś.m. dla odmiany Korsør oraz 364–510 mg GAE/100 g ś.m.
dla odmiany Haschberg. Poziom polifenoli jest zatem znacznie mniej zależny od
odmiany rośliny niż od warunków klimatycznych sezonu, w którym dojrzewały owoce [Lee i Finn 2007].
W prezentowanej pracy wykazano, że owoce czarnego bzu były bardzo bogatym
źródłem flawonoidów, w szczególności rutyny (89,32 ± 30,14 mg/l 10% ekstraktu,
co odpowiada 89,32 ± 30,14 mg/100 g ś.m. wyjściowego surowca), procyjanidyny B1
(ok. 26,6), florydzyny (ok. 13,5) i izokwercetyny (ok. 10,3), jak również kwasów fenolowych, przede wszystkim kwasu galusowego (ok. 11 mg/100 g ś.m.) oraz kwasów
p-kumarowego, chlorogenowego i elagowego (każdy na poziomie 3–4 mg/100 g ś.m.)
(tab. 14). Lee i Finn [2007] stwierdzili, że do polifenoli dominujących w pokrewnym
gatunku amerykańskiego bzu (S. canadensis) należą kwasy neochlorogenowy i chlorogenowy oraz rutyna i izoramnetyno-3-O-rutynozyd, natomiast w bzie europejskim
(S. nigra) dominują kwas chlorogenowy (ok. 26–36 mg/100 g ś.m.) i rutyna (43–
–96 mg/100 g ś.m., w zależności od odmiany i sezonu). Wyniki te nieznacznie się
różnią od uzyskanych w tej pracy, co może wynikać z zastosowania innego rozpuszczalnika (kwaśny metanol wobec 80-procentowego etanolu), a także innej odmiany
owocu oraz odmiennych warunków klimatycznych i agrotechnicznych. W owocach
czarnego bzu występują również, nieoznaczane w tej pracy, oligomeryczne proantocyjanidyny (w ilości 1–5 mg/100 g ś.m.) [Määttä-Riihinen i in. 2004], nie spotyka się
w nich natomiast (w przeciwieństwie do innych ciemnych jagód) proantocyjanidyn
wysoko spolimeryzowanych, o zawartości powyżej 7 monomerów [Wu i in. 2004].
Do ważnych składników przeciwutleniających w tych owocach niewątpliwie należą
antocyjany. W niniejszej pracy niektóre z nich zostały zidentyfikowane (na podstawie
czasu retencji), a ich stężenie wyrażono w równoważnikach cyjanidyno-3-O-glukozydu (cy-3-glc). Główne antocyjany wykryte w owocach wykorzystanego do badań
czarnego bzu to cyjanidyno-3-O-glukozyd (występujący w stężeniu 404,4 mg/100 g ś.m.),
cyjanidyno-3-O-sambubiozyd (684,3 mg cy-3-glc/100 g ś.m.), cyjanidyno-3,5-di-O-glukozyd (218,0) i pelargonidyno-3-O-glukozyd (7,64) (tab. 14). Uzyskane wartości
znajdują się w zakresach podawanych we wcześniejszych doniesieniach innych autorów, co więcej, potwierdzają, że wykorzystane w tej pracy owoce należały do
S. nigra, tj. bzu europejskiego. Lee i Finn [2007] wykazali bowiem, że różne odmiany S. nigra charakteryzują się znacznie większym stężeniem cyjanidyno-3-O-sambubiozydu (122–269 mg cy-3-glc/100 g ś.m.) i cyjanidyno-3-O-glukozydu (205–481 mg
cy-3-glc/100 g ś.m.) niż każda z ośmiu badanych przez nich odmian bzu amerykańskiego (S. canadensis) (odpowiednio 1,7–39,4 i 0,3–63 mg cy-3-glc/100 g ś.m.). Oprócz
związków zidentyfikowanych w tej pracy, w odmianach europejskich wykryli oni
79
także cyjanidyno-3-O-rutynozyd, cyjanidyno-3-O-sambubiozyd-5-O-glukozyd oraz
śladowe ilości pelargonidyno-3-O-glukozydu i cyjanidyno-3-O-rutynozydu [Lee i Finn
2007]. Te dwa ostatnie związki nie występowały natomiast w bzie amerykańskim
(S. canadensis), w którym z kolei obecne były acylowane glukozydy antocyjanin,
m.in. cyjanidyno-3-(Z)-p-kumarylo-glukozyd, cyjanidyno-3-p-kumarylo-sambubiozyd,
cyjanidyno-3-(E)-p-kumarylo-sambubiozyd-5-glukozyd [Lee i Finn 2007]. Wyraźnie
więc widać, że rodzaj i stężenie antocyjanów zależą od gatunku i odmiany czarnego
bzu. Wu i inni [2004] stwierdzili, że stężenie cyjanidyno-3-O-glukozydu w S. nigra
jest wyższe niż cyjanidyno-3-O-sambubiozydu i wynosi 740 wobec 546 mg cy-3-glc/100 g ś.m. Ponadto w owocach zidentyfikowali oni nieznaczne ilości cyjanidyno-3-O-rutynozydu, pelargonidyno-3-O-glukozydu i pelargonidyno-3-O-sambubiozydu.
Czarny bez jest jednym z najskuteczniejszych „domowych” farmaceutyków stosowanych w infekcjach grypowych. Metoda wydajnej ekstrakcji aktywnych składników
o działaniu przeciwwirusowym została opatentowana, a gotowy preparat jest sprzedawany pod nazwą Sambucol®. Oprócz właściwości antywirusowych, składniki te –
zarówno flawonoidy i kwasy fenolowe, jak i antocyjany – mają znaczący potencjał
przeciwrodnikowy. Spośród 14 antocyjanów, które analizowali Wang i inni [1997],
najwyższym potencjałem antyoksydacyjnym charakteryzował się cyjanidyno-3-O-glukozyd, wykazując 3,5-krotnie silniejsze działanie przeciwrodnikowe od analogu
witaminy E. W prezentowanej pracy potencjał antyoksydacyjny etanolowego ekstraktu z owoców czarnego bzu wynosił 279,0 ± 13,0 mg troloksu/100 ml (co odpowiada 11,15 ± 0,52 mmol równoważników troloksu w 100 g ś.m. owoców) i był
porównywalny z potencjałem ekstraktów z derenia i pigwowca (tab. 10). Wu i inni
[2004] oznaczyli potencjał antyoksydacyjny przeciwutleniaczy hydrofilowych i hydrofobowych obecnych w czarnym bzie. Ten pierwszy wynosił 14,5 mmol TE/100 g ś.m.
i był porównywalny z potencjałem oznaczonym dla aronii (15,82), natomiast potencjał antyoksydacyjny związków hydrofobowych był znacznie niższy (0,197 i 0,242 mmol
TE/100 g, odpowiednio dla bzu i aronii), przy czym i tak była to jedna z największych
wartości spośród wyznaczonych przez autorów dla badanych przez nich ciemnych
jagód [Wu i in. 2004].
Jak już wspomniano powyżej, potencjał antyoksydacyjny bzu czarnego był porównywalny do potencjału derenia (283,0 ± 64,5 mg troloksu/100 ml) i pigwowca
(282,4 ± 2,1 mg troloksu/100 ml), jednak zawartość polifenoli w tych owocach była
dwukrotnie mniejsza niż w bzie (odpowiednio 426,4 i 474,1 wobec 883,1 mg katechiny/100 g ś.m.). Owoce te znacząco się też różniły składem polifenolowym. Spośród fenolokwasów jedynie kwas galusowy występował w znacznym stężeniu
(18,19 ± 6,88 mg/100 g ś.m. w dereniu i 13,72 ± 3,33 mg/100 g ś.m. w pigwowcu),
natomiast pozostałe kwasy wykrywano w śladowych ilościach (< 1 mg/100 g ś.m.)
lub wcale ich nie wykryto (tab. 14). W grupie flawonoidów, rutyna dominowała
w czarnym bzie, wcale nie występowała w dereniu, a jedynie w śladowej ilości była
obecna w pigwowcu. W dereniu, podobnie jak w czarnym bzie, wykryto znaczną ilość
80
procyjanidyny B1 (31,24 ± 7,44 mg/100 g ś.m.) oraz cyjanidyno-3-O-glukozydu
(22,6 ± 1,69), podczas gdy w pigwowcu nie stwierdzono obecności tych związków.
W obydwu owocach natomiast zidentyfikowano florydzynę i izokwercetynę, w stężeniach odpowiednio około 14,2 i 3,2 mg/100 g ś.m. (dereń) oraz 22,8 i 12,2 mg/100 g
ś.m. (pigwowiec).
Najmniej polifenoli ogółem oznaczono w ekstrakcie z czerwonej cebuli (Allium
cepa), który miał także jedną z najniższych spośród badanych surowców aktywność
antyoksydacyjną (tab. 10), wynoszącą zaledwie 43,2 ± 2,9 mg troloksu/100 ml (co
odpowiadałoby 1,73 mmol TE/100 g ś.m. przy założeniu 100-procentowej wydajności ekstrakcji przeciwutleniaczy z surowca). Wartość ta była też niższa od podawanych
w literaturze. Lu i inni [2011] wyznaczyli wartość TEAC czerwonej cebuli na poziomie 2,82 mmol TE/100 g ś.m. Również zawartość polifenoli na poziomie 90,5 mg
katechiny/100 g ś.m. jest wynikiem zaskakującym. Lu i inni [2011] wykazali, że zawartość polifenoli ogółem w cebuli czerwonej wynosi 428 mg GAE/100 g ś.m.
Generalnie, cebula jest uznawana za bardzo bogate źródło polifenoli. Lanzotti [2006]
stwierdził, że w najwyższych stężeniach występują w niej kwercetyna (149,7 mg/100 g),
kemferol (83,2) i luteolina (39,1). W czerwonej cebuli (zwłaszcza jej zewnętrznych
łuskach) wykrywano też antocyjany. Pochodne cyjanidyny stanowiły zwykle ponad
50% obecnych w cebuli antocyjanów, jednak podczas przechowywania dochodziło
do znacznej straty zawartości tych związków [Gennaro i in. 2002]. Na uwagę zasługuje przede wszystkim brak wykrywalnych ilości antocyjanów w cebuli użytej do
analiz w tej pracy; jedynie w przypadku cyjanidyno-3-O-glukozydu ilość związku
przekroczyła próg detekcji (tab. 13).
Kwercetyna w cebuli występuje głównie w postaci glikozydów, przy czym są to
zwykle niespotykane w innych owocach i warzywach glikozydy kwercetyny.
Występowanie flawonoidów w formie glikozydów może tłumaczyć dość niski potencjał antyoksydacyjny, gdyż powszechnie wiadomo, że glikozydy są słabszymi przeciwutleniaczami niż odpowiadające im aglikony. Ponad 80% flawonoli w cebuli
stanowi kwercetyno-4’-O-glukozyd oraz kwercetyno-3,4’-di-O-glukozyd; w nieznacznych lub śladowych ilościach wykrywano także kwercetyno-3-O-glukozyd, kwercetyno-7,4’-di-O-glukozyd, kwercetyno-3,7,4’-tri-O-glukozyd oraz izoramnetyno-4’-O-glukozyd i izoramnetyno-3,4’-di-O-glukozyd [Rhodes i Price 1996, Lanzotti 2006,
Beesk i in. 2010]. W prezentowanej pracy nie dysponowano standardami pozwalającymi na identyfikację tych flawonoli, niemniej jednak podczas analizy HPLC i detekcji przy λ = 360 nm wykryto kilka związków, których stężenia (w kolejności
wymywania z kolumny) wyrażone w równoważnikach kwercetyny (QE) wynosiły:
18,2, 0,38, 0,22, 28,9, 1,62 i 0,08 mg QE/100 g ś.m. Na podstawie dostępnej literatury [Rhodes i Price 1996, Beesk i in. 2010] można przyjąć, że najwyższe stężenia
reprezentują prawdopodobnie kwercetyno-3,4’-di-O-glukozyd i kwercetyno-4’-O-glukozyd, zaś w niższych stężeniach występują kwercetyno-7,4’-di-O-glukozyd, kwercetyno-3-O-glukozyd, kwercetyna i kemferol. Łączna zawartość flawonoli wynosiła
81
prawie 50 mg QE/100 g ś.m. Beesk i inni [2010] stwierdzili, że w skórce cebuli dominuje monoglukozyd kwercetyny, a w warstwach wewnętrznych głównym flawonoidem jest diglukozyd kwercetyny. Wykazali także duże zróżnicowanie stężeń monoi diglukozydów kwercetyny w zależności od odmiany. W wewnętrznych warstwach
cebuli czerwonej stężenie monoglukozydu kształtowało się w zakresie od niewykrywalnego (w odmianie ‘Vaugirad’) do 560 mg/100 g s.m. (‘Red Baron Eco’), zaś diglukozydu – od 20 (‘Vaugirad’) do 740 mg/100 g s.m. (‘Red Baron’) [Beesk i in. 2010].
W czerwonej cebuli użytej do doświadczeń w tej pracy zidentyfikowano także
kwasy fenolowe, głównie kawowy, ferulowy i galusowy (tab. 13). Nie stwierdzono
natomiast obecności, często wykazywanych w tym warzywie, kwasów protokatechowego i p-kumarowego. Singh i inni [2009] udowodnili, że detekcja i stężenie poszczególnych polifenoli w suchych ekstraktach z cebuli zależy od użytego rozpuszczalnika. Frakcja uzyskana za pomocą dichlorometanu zawierała kwas ferulowy,
kwercetynę i kemferol, podczas gdy we frakcji wodnej wykrywano kwas galusowy,
za to nie wykrywano kwasu ferulowego i protokatechowego ani Q i KMP. Różnice
między wynikami uzyskanymi w tej pracy a przedstawionymi w dostępnych pozycjach
literatury mogą wynikać także z faktu, że przed sporządzeniem ekstraktów z cebuli
usunięto z niej najbardziej wierzchnie łuski. Jak wykazano w innych badaniach, to
właśnie skórka cebuli jest najbogatszym źródłem flawonoidów, zawiera ich 3–5 razy
więcej niż części jadalne [Škerget i in. 2009]. W materiale, który badali Prakash i inni
[2007], wśród flawonoidów obecnych w skórce dominowała kwercetyna, której było
prawie 5-krotnie więcej niż w warstwach wewnętrznych, a kemferolu było aż 74 razy
więcej. Z kolei kwas ferulowy występował w skórce w ilości 4-krotnie mniejszej niż
w częściach wewnętrznych. Wykryte w tej pracy znaczne stężenia kwasów ferulowego i galusowego, przy braku protokatechowego, oraz niskie stężenie Q i KMP potwierdzają, że do ekstraktu wybrano środkowe i wewnętrzne warstwy cebuli. Również
mała zawartość antocyjanów, ze zidentyfikowanym jedynie cyjanidyno-3-O-glukozydem, potwierdza, że bogate w te związki skórki cebuli zostały w większości usunięte przed ekstrakcją. Tłumaczy to także wyjątkowo niską aktywność antyoksydacyjną
i małą zawartość polifenoli ogółem (tab. 10) w otrzymanym ekstrakcie. Prakash
i inni [2007] udowodnili, że aktywność antyoksydacyjna zewnętrznych warstw cebuli jest wyższa prawie 6-krotnie, zaś zawartość polifenoli – ponad 13-krotnie niż warstw
wewnętrznych. Z kolei Gennaro i inni [2002] wykazali, że 6-tygodniowe przechowywanie cebuli w warunkach „domowych” powoduje utratę blisko 3/4 obecnych w tym
warzywie antocyjanów i spadek potencjału antyoksydacyjnego o ponad 30%. Co
więcej, obranie cebuli z zewnętrznych łusek usuwało także ok. 20% obecnego tam
kwercetyno-4’-O-glukozydu oraz aż 83% antocyjanów.
Blisko spokrewniony z cebulą czosnek niedźwiedzi (Allium ursinum) miał ponad
6-krotnie więcej polifenoli i wyższy potencjał antyoksydacyjny (tab. 10). Wyniki te
są zaskakujące i mogą być efektem niezbyt wysokiej jakości cebuli wykorzystanej
w badaniach. Othman i inni [2011] wykazali bowiem mniejszą zawartość polifenoli
82
w czosnku niedźwiedzim niż w czerwonej cebuli (37,6 wobec 53,4 mg GAE/100 g).
Aktywność antyoksydacyjna analizowanego ziela była wyższa od wyznaczonej przez
Ivanišovą i innych [2009] oraz Mihaylovą i innych [2014]. Pierwszy zespół ustalił
zdolność zmiatania rodnika ABTS na poziomie 3,88 mmol TE/100 g ś.m. (co można jednak wyjaśnić wykorzystaniem ekstraktów wodnych), zaś w drugiej pracy wyniki były jeszcze niższe: 0,265 mmol TE/100 g ś.m. Nawet jeśli się uwzględni, że za
potencjał przeciwrodnikowy czosnku odpowiadają także obecne w jego liściach
enzymy antyoksydacyjne (katalaza, peroksydaza glutationowa i SOD [Štajner i in.
2008]), to i tak uzyskany w tej pracy wynik będzie wyjątkowo wysoki.
W ekstrakcie z czosnku niedźwiedziego wykryto znaczne ilości rutyny i izokwercetyny (tab. 13). Carotenuto i inni [1996] oraz Vlase i inni [2013b] wykazali, że
w czosnku niedźwiedzim flawonole to przede wszystkim pochodne glikozydowe
kemferolu. Kwercetyna i jej pochodne, takie jak izokwercetyna i kwercytryna, są
natomiast typowe dla innych gatunków z rodzaju Allium, np. A. obliquum i A. schoe
noprasum, zaś rutyna – dla A. senescens subsp. montanum i A. schoenoprasum
[Carotenuto i in. 1996, Vlase i in. 2013a]. W prezentowanych tutaj badaniach kemferol wykryto w bardzo niskim stężeniu, a kwercetynę w ilościach śladowych. Rozdział
chromatograficzny i detekcja przy λ = 360 nm ujawniły jednak obecność blisko 40
różnych związków, z których część może być pochodnymi glikozydowymi tych flawonoli. Brak aglikonu kemferolu może świadczyć o dobrej jakości surowca, w którym
nie doszło do rozkładu glikozydów kemferolu [Carotenuto i in. 1996]. Dominującymi
w badanym ekstrakcie związkami polifenolowymi były procyjanidyna B1 i katechina.
Oznaczono także znaczące ilości procyjanidyny B2, florydzyny, kwasu galusowego,
protokatechowego i chlorogenowego (tab. 13). Na uwagę zasługuje związek zidentyfikowany na podstawie czasu retencji jako (-)-epigalokatechina (EGC) i występujący w bardzo dużym stężeniu. Ze względu na brak dostępu do detektora masowego nie udało się potwierdzić identyfikacji, gdyby jednak ją potwierdzono, byłoby to
pierwsze wykrycie tej substancji w liściach czosnku niedźwiedziego. Jak dotąd EGC,
poza zieloną herbatą, wykryto jedynie w zielu dziurawca [Wei i in. 2009]. Innym
wyjaśnieniem obecności (-)-epigalokatechiny w czosnku niedźwiedzim, i niestety
bardziej prawdopodobnym, jest nieuczciwość sprzedawcy, który do bardzo drogiego
i trudno dostępnego surowca zielarskiego, jakim są liście czosnku niedźwiedziego,
mógł dodać tańszy, a podobny w wyglądzie zewnętrznym substytut, czyli liście zielonej herbaty. Tę hipotezę potwierdzałaby także wyższa od oczekiwanej aktywność
antyoksydacyjna, stosunkowo wysoka zawartość EGCG (składnika typowego dla
zielonej herbaty) oraz znaczne ilości rutyny, katechiny i kwasu galusowego (tab. 13).
Całkowita zawartość polifenoli wyniosła 744,6 ± 15,0 mg katechiny/100 g świeżej masy (co w tym przypadku odpowiada suszonym liściom czosnku niedźwiedziego). Trzeba jednak wziąć pod uwagę, że podczas wykonywania oznaczenia dochodziło do wytrącania się związków obecnych w próbce, co uniemożliwiało
wiarygodny pomiar. Jedną z przyczyn mógł być spadek rozpuszczalności niektórych
83
związków, wywołany zmianą środowiska reakcji podczas wykonywania oznaczenia
(na bardziej alkaliczne). W konsekwencji doszło do wytrącenia się z roztworu substancji, które w takim środowisku słabiej się rozpuszczają, a przez to ich stężenie
zostało zaniżone. Dlatego też wynik ten z pewnością jest obarczony dużym błędem.
Potwierdza to także wynik uzyskany ze zsumowania stężeń zidentyfikowanych związków polifenolowych – 1670,48 mg polifenoli w 100 g ś.m. Przypuszczalnie istotny
wpływ na wynik pomiaru metodą Folina-Ciocalteu miała jednoczesna obecność
w czosnku, i to w dużym stężeniu, związków siarki oraz jonów metali. W czosnku
występują znaczne ilości magnezu (8 mg/100 g ś.m.), żelaza (2,2, mg), manganu
(1,3 mg), cynku (0,9 mg) i kobaltu (0,9 µg) [Sendl 1995]. Dodanie niezbędnego do
reakcji Na2CO3 powoduje alkalizację środowiska; mogło to spowodować wytrącanie
się siarczków, najpierw kationów grupy II (do których zalicza się Hg2+, Pb2+, Bi3+,
Cu2+, Cd2+, As3+, As5+, Sb3+, Sb5+, Sn2+, Sn4+), a potem kationów grupy III (obejmującej Zn2+, Fe2+, Co2+, Mn2+, Ni2+, Fe3+, Al3+ oraz Cr3+). Siarczki kationów grupy II mają niskie iloczyny rozpuszczalności i wytrącają się już w środowisku kwaśnym.
Kationy trzeciej grupy analitycznej tworzą siarczki nierozpuszczalne w wodzie, ale
rozpuszczalne w kwasach. Dlatego ich strącanie nastąpiło dopiero na skutek alkalizacji środowiska, a do tej doszło podczas reakcji z odczynnikiem Folina-Ciocalteu.
Żeby mogły powstać siarczki metali, w roztworze muszą być obecne odpowiednie
związki siarki. Dla czosnku najbardziej charakterystyczne są takie składniki siarkowe, jak sulfotlenki i inne pochodne cysteiny (alliina, allicyna, γ-glutamylocysteina).
Sulfotlenki łatwo ulegają rozpadowi i przemianom do tiosulfinianów (R-S(O)S-R),
które z kolei dalej przekształcają się w wielosiarczki i ajoeny [Bagiu i in. 2012].
Czyste tiosulfiniany mają bardzo niski potencjał przeciwrodnikowy, gdyż niezwykle
trudno oddać im atom wodoru, łatwo jednak reagują ze związkami redukującymi
(np. polifenolami), dając stabilne pochodne, które nadal są wysoce reaktywne.
Sulfotlenki (R-S(O)-R) łatwo redukują się także do sulfidów (organicznych siarczków;
R-S-R) i wielosiarczków (R-S-S-R), które wychwytują protony. Obecność w czosnku
znaczących ilości siarkowych pochodnych przypuszczalnie spowodowała, że polifenole – także obecne w tej roślinie – oddały swoje protony i nie reagowały z odczynnikiem Folina-Ciocalteu, zaniżając wynik. Co więcej, obecne w czosnku jony metali wytworzyły z sulfidami siarczki metali, które wytrąciły się po alkalizacji środowiska
(w trakcie reakcji oznaczania zawartości polifenoli ogółem).
Należy zatem uznać, że badany czosnek niedźwiedzi zawierał znaczące ilości
związków polifenolowych, co potwierdza wysoki potencjał antyoksydacyjny, jednak
metoda ich oznaczania w oparciu o protokół Folina-Ciocalteu jest nieodpowiednia.
Zawartość polifenoli zidentyfikowanych za pomocą HPLC wynosiła 1670 mg/100 g
suszonych liści czosnku niedźwiedziego, co było jednym z wyższych wyników uzyskanych dla surowców wykorzystanych do badań w tej pracy.
Spośród pozostałych badanych surowców znaczną zawartością polifenoli charakteryzowała się także pokrzywa (618,9 ± 42,6 mg katechiny/100 g ś.m.), jednakże
84
w roślinie tej dominowały związki o niskim potencjale antyoksydacyjnym (tab. 10
i 13). Do najważniejszych flawonoidów zidentyfikowanych w pokrzywie należały
procyjanidyna B1, florydzyna, glikozydy apigeniny i rutyna.
Spokrewnione ze sobą żurawina i borówka brusznica mają podobną zdolność
zmiatania rodnika ABTS (tab. 10), ale różnią się składem i zawartością polifenoli.
Żurawina zawierała ich niecałe 170 mg (w przeliczeniu na katechinę)/100 g świeżych
owoców, podczas gdy w brusznicy polifenoli ogółem było prawie dwukrotnie więcej.
Do najważniejszych polifenoli zidentyfikowanych w żurawinie należą florydzyna
i cyanidyno-3-O-glukozyd oraz kwasy fenolowe z dominującymi kwasami kawowym,
elagowym i galusowym. Borówka brusznica zawierała natomiast znaczne ilości (+)-katechiny, procyjanidyny B2, florydzyny, cyjanidyno-3-O-glukozydu, a z fenolokwasów
głównie kwasu galusowego i protokatechowego; wykryto też peonidyno-3-O-glukozyd (tab. 14). W żurawinie nie wykryto procyjanidyny B1 ani B2. Należy jednak
zaznaczyć, że żurawina zawiera znaczne ilości witamin oraz proantocyjanidyny o specyficznym dla tego owocu wiązaniu typu A, w odróżnieniu do wiązania typu B obecnego w proantocyjanidynach z innych owoców. Za potencjał antyoksydacyjny żurawiny i borówki brusznicy odpowiadają także, nieoznaczane w tej pracy, witaminy
antyoksydacyjne i karotenoidy.
Ekstrakt ze spiruliny był porównywalny z ekstraktem z malin pod względem
ilości polifenoli (zawierał ich 157 mg/100 g ś.m.), przy czym miał prawie 5-krotnie
niższy potencjał antyoksydacyjny (tab. 10), jednak tylko nieliczne z tych związków
udało się zidentyfikować. Spirulina jest wysuszoną biomasą komórek cyjanobakterii,
które zawierają inne związki niż typowe tkanki roślinne. Do najważniejszych przeciwutleniaczy w cyjanobakteriach należą fikocyjaniny, karotenoidy i inne barwniki
fotosyntetyczne. W malinach natomiast dominowały cyjanidyno-3-O-glukozyd, kwasy fenolowe (głównie galusowy i elagowy), florydzyna i rutyna (tab. 14), które są
stosunkowo silnymi przeciwutleniaczami.
Bardzo interesującym owocem jest cytryniec chiński, który w tej pracy został
wykorzystany w postaci suszonych jagód. Nie wykryto w nim katechin, wykazano
natomiast obecność licznych flawonoli, przy czym zidentyfikowano tylko niektóre
(kwercetynę i jej glikozydy). Spośród fenolokwasów większym stężeniem odznaczał
się tylko kwas galusowy (tab. 13), a w grupie antocyjanów zidentyfikowano jedynie
cyjanidyno-3-O-glukozyd oraz śladowe ilości cyjaniny. Obecne w cytryńcu polifenole charakteryzują się jednak dość niskim potencjałem przeciwrodnikowym, na poziomie 54 mg troloksu/100 ml ekstraktu z suszonych jagód (tab. 10). Jest to poziom
zbliżony do potencjału antyoksydacyjnego ekstraktu z nasion soi (ok. 66 mg troloksu/100 ml), w którym wykryto obecność fenolokwasów (głównie galusowego, elagowego i p-kumarowego), izoflawonów (daidzyny, daidzeiny i genisteiny) oraz –
w mniejszym stężeniu – glukozydu kwercetyny (tab. 13).
Podsumowując wyniki można stwierdzić, że wybrane do doświadczeń surowce
prezentowały bardzo zróżnicowany potencjał antyoksydacyjny oraz skład polifeno-
85
lowy. Na uwagę zasługują stosunkowo małe stężenia antocyjanów w badanych roztworach, świadczące o tym, że ekstrakcja etanolem nie była najkorzystniejsza dla tej
grupy związków. Zgodnie z danymi literaturowymi, znacznie wydajniejsze byłoby
zastosowanie mieszanin zawierających kwas oraz aceton lub metanol. Takie rozwiązanie nie mogło jednak być brane pod uwagę ze względu na toksyczne działanie
takich mieszanin w stosunku do bakterii, których użycie zaplanowano w dalszej
części badań.
4.2. Potencjał antyoksydacyjny związków polifenolowych
najczęściej pobieranych z racjami pokarmowymi
Na podstawie wyników przedstawionych powyżej oraz znajomości struktury diety
typowego mieszkańca naszego kraju, wytypowano związki, będące przedstawicielami różnych grup polifenoli, które najczęściej są wprowadzane do organizmu wraz
z dietą. Jednym z najważniejszych związków jest (+)-katechina (CAT). Ten flawan-3-ol jest powszechny w kakao, herbacie zielonej i oolong, owocach (jabłka, morele,
gruszki, śliwki, brzoskwinie, maliny, jeżyny, a zatem typowo polskie gatunki), warzywach (cebula, bób, rabarbar, kapary, szczaw, koper) oraz czerwonym winie. Przed
stawicielem kolejnej ważnej grupy – flawonoli – jest kwercetyna (Q) i jej glikozydowe pochodne. Kwercetyna, rutyna (RUT) i kemferol (KMP) to najczęściej
dostarczane z dietą flawonole, a ich najobfitszymi źródłami są owoce (w tym jabłka,
winogrona, truskawki, aronia, żurawina), warzywa (głównie cebula, brokuł, kapusta,
koper, fasola, cykoria, pomidory, brukselka) i herbata.
Flawanony są szeroko rozpowszechnione szczególnie wśród roślin z rodzin
Compositae i Leguminosae oraz obejmującej owoce cytrusowe rodziny Rutaceae.
Aglikony naringenina (N) i hesperetyna (H) oraz ich glikozydy wzbudzają szczególne
zainteresowanie ze względu na ich dominację w żywności, zwłaszcza w cytrusach.
Naringenina występuje przede wszystkim w grejpfrutach i kwaśnych pomarańczach,
przy czym jej stężenie jest znacznie większe w skórkach niż w świeżym miąższu owoców cytrusowych [Nogata i in. 2006]. W mniejszych ilościach znajduje się także w tymianku, pomidorach i ich przetworach, co czyni ją jednym z ważniejszych flawanonów
w naszej diecie [Khan i in. 2014]. Do najczęściej spotykanych w żywności glikozydów
naringeniny należą naringina (NR) i narirutyna. Narirutyna występuje szczególnie
obficie w grejpfrutach, ale także w słodkich pomarańczach, choć w mniejszym stężeniu
niż naringina [Khan i in. 2014]. Hesperetyna i jej glikozydy również obficie występują
w cytrusach; rutynozyd hesperetyny – hesperydyna (HR) – obecna jest głównie w cytrynach, limonkach, słodkich pomarańczach i mandarynkach, zaś neohesperydyna –
w kwaśnych pomarańczach oraz tangelo (hybryda mandarynki i grejpfruta). Aglikon
hesperetyna znajduje się głównie w grejpfrutach [Khan i in. 2014].
86
Ze względu na odmienną strukturę szkieletu, do badań wybrano także florydzynę (PHL), która jest flawonoidem, ale ma niezamknięty pierścień C, oraz rezweratrol (RS), będący najpowszechniejszym przedstawicielem stilbenów.
Aktywność antyoksydacyjną roztworów polifenoli wykorzystywanych w doświadczeniach przedstawiono w tabeli 15. Spośród badanych związków polifenolowych
najwyższy potencjał antyoksydacyjny wykazały kemferol, naringenina i rezweratrol
(wszystkie powyżej 4000 mmol TE/100 g substancji). Nieco słabszymi zmiataczami
rodnika ABTS okazały się kwercetyna i (+)-katechina. Najniższy potencjał przeciwrodnikowy miały glikozydy: hesperydyna (578,0 ± 3,5 mmol TE/100 g) i naringina
(881,0 ± 12,1 mmol TE/100 g). W tych dwóch przypadkach wyraźnie widać, jak
zablokowanie wolnej grupy –OH, poprzez jej połączenie z cząsteczką cukru, zmniejsza możliwość wygaszania wolnego rodnika. Hesperydyna, będąca rutynozydem
hesperetyny, dwukrotnie słabiej niż aglikon inaktywowała rodnik ABTS, a w przypadku naringiny (neohesperydozydu naringeniny) zmniejszenie potencjału było
Tabela 15. Aktywność antyoksydacyjna roztworów polifenoli
Table 15. Antioxidant activity of polyphenol solutions
Związek
Compound
Stężenie roztworu
Solution concentration
[mg/ml]
Aktywność antyoksydacyjna
[mmol TE/100 ml roztworu]
Antioxidant activity
[mmol TE/100 ml of solution]
TEACABTS*
[mmol TE/100 g]
Kemferol
Kaempferol
5
21,83 ± 1,74
4365,9 ± 248,1
Kwercetyna
Quercetin
5
19,23 ± 1,45
3864,6 ± 290,9
Naringenina
Naringenin
25
101,01 ± 20,93
4040,4 ± 837,4
Naringina
Naringin
25
22,02 ± 0,30
Hesperetyna
Hesperetin
25
30,19 ± 0,88
1207,7 ± 35,2
Hesperydyna
Hesperidin
25
14,45 ± 0,09
Florydzyna
Phloridzin
25
55,96 ± 8,21
2238,5 ± 328,5
Rezweratrol
Resveratrol
25
100,95 ± 9,96
4038,2 ± 398,3
Rutyna
Rutin
25
52,2 ± 5,09
2090,4 ± 203,7
(+)-Katechina
(+)-Catechin
25
83,57 ± 0,05
881,0 ± 12,1
578,0 ± 3,5
3343,4 ± 2,2
* wartości wyliczone z założeniem 100% wydajności ekstrakcji składników przeciwutleniających
values calculated with the assumption of a 100% efficiency of extraction of antioxidant compounds
87
prawie 5-krotne w stosunku do odpowiedniego aglikonu. W doświadczeniach stosowano jednak nie czyste substancje w postaci stałej, ale ich roztwory, które różniły się stężeniem, m.in. ze względu na różnice rozpuszczalności poszczególnych związków (zob. rozdz. 3.1). Dlatego też przygotowane roztwory kemferolu i kwercetyny
miały najniższy potencjał antyrodnikowy wśród roztworów wykorzystywanych do
badań. Potencjał antyoksydacyjny roztworu rutyny (rutynozyd kwercetyny) okazał
się blisko 3-krotnie wyższy niż roztworu kwercetyny, należy jednak podkreślić, że
aglikon był stosowany w 5-krotnie mniejszym stężeniu. Gdy przeliczono potencjał
antyoksydacyjny na 100 gramów wyjściowego flawonoidu, ponownie aglikon (kwercetyna) wykazał silniejszy potencjał antyrodnikowy niż rutynozyd (3864,6 ± 290,9
wobec 2090,4 ± 203,7 mmol TE/100 g). Wyniki te są zgodne z podawanymi przez
innych autorów, którzy także stwierdzali niższy potencjał antyoksydacyjny po
O-glikozydacji flawonoidów, co wskazuje na udział w reakcji zmiatania rodnika
grupy –OH uczestniczącej w tworzeniu wiązania glikozydowego [Khan i in. 2014].
Obecność dodatkowej grupy –OH może znacząco zwiększyć aktywność przeciwrodnikową. Ye i inni [2009] dowiedli, że pochodna naringeniny z dodatkową grupą
–OH przy C3’ (w konfiguracji orto w pierścieniu B) ma blisko 70-krotnie większą
zdolność zmiatania wolnych rodników niż naringenina. Dodanie kolejnej grupy –OH
(3’,5’-dihydroksynaringina) dodatkowo zwiększa potencjał antyoksydacyjny, choć
zaledwie o 13,5% [Ye i in. 2009]. Analizując budowę chemiczną badanych w tej
pracy polifenoli (ryc. 6), można zauważyć, że obecność w pierścieniu B dodatkowej
grupy –OH nie zawsze skutkowała zwiększeniem potencjału antyoksydacyjnego. Dla
hesperetyny oznaczono blisko 4-krotnie słabszą zdolność zmiatania rodnika ABTS
niż dla naringeniny, mimo obecności dodatkowej grupy hydroksylowej. Było to
wywołane sąsiadującą z nią grupą metoksylową (–OCH3), co skutkowało zaburzeniem
układu odpowiedzialnego za oddawanie atomu wodoru i delokalizację wolnego
elektronu. Analogiczna sytuacja miała miejsce w przypadku glikozydów tych flawanonów: hesperydyny i naringiny – ten drugi związek, niezawierający grupy metoksylowej w pierścieniu B, miał większy potencjał przeciwrodnikowy. Nie zawsze jednak
grupa metoksylowa zmniejszała potencjał antyoksydacyjny. Glukozyd i rutynozyd
izoramnetyny, która od kwercetyny różni się jedynie obecnością przy C3’ grupy metoksylowej (–OCH3) zamiast –OH, charakteryzowały się silniejszym potencjałem
zmiatania nadtlenku wodoru niż glukozyd i rutynozyd kwercetyny, jak również glukozyd i rutynozyd kemferolu [Fiorentino i in. 2007]. Kiedy jednak analizowano potencjał zmiatania anionorodnika ponadtlenkowego, potencjał glikozydów izoramnetyny okazał się znacznie mniejszy niż pochodnych kwercetyny i kemferolu. Wyniki te
wskazują na odmienne mechanizmy zmiatania poszczególnych rodników i udział
w nich innych struktur w cząsteczkach przeciwutleniaczy.
Na aktywność antyoksydacyjną związku istotny wpływ może mieć także rodzaj
cząsteczki cukru połączonej z aglikonem. Na przykład, glikozylacja grupy –OH
w hesperetynie przy atomie węgla C7 przez neohesperydozę (neohesperydyna)
88
Hesperydyna / Hesperidin
Hesperetyna / Hesperetin
578,0 ± 3,5 (3529,0 ± 21,2)
1207,7 ± 35,2 (3650,6 ± 106,5)
Naringina / Naringin
Naringenina / Naringein
881,0 ± 12,1 (5114,9 ± 70,5)
4040,4 ± 837,4 (11000,3 ± 2240,7)
Katechina / Catechin
3343,4 ± 2,2 (9705,0 ± 6,4)
2238,5 ± 328,5 (9769,1 ± 1433,8)
4038,2 ± 398,3 (9216,8 ± 909,2)
4365,9 ± 248,1 (12496,9 ± 996,3)
Ryc. 6. / Fig. 6.
89
Rutyna / Rutin
3864,6 ± 290,9 (11680,5 ± 879,3)
2090,4 ± 203,7 (12762,2 ± 1243,8)
Ryc. 6. cd. Budowa chemiczna polifenoli stosowanych w badaniach [na podstawie: Rice-Evans
i in. 1996, Robards i in. 1999] oraz ich aktywność antyoksydacyjna wyrażona
w mmol TE/100 g i mmol TE/mol (w nawiasie)
Fig. 6. cont. Chemical structure of polyphenols used in the study [based on: Rice-Evans et al.
1996, Robards et al. 1999], and their antioxidant activity expressed in mmol TE/100 g
and mmol TE/mol (in parentheses)
zmniejsza potencjał antyoksydacyjny znacznie silniej niż przyłączenie do tej grupy
rutynozy (hesperydyna) [Di Majo i in. 2005]. Podobną prawidłowość zaobserwowano w tej pracy. Rutynozydy (rutyna i hesperydyna) były około dwukrotnie słabszymi
zmiataczami rodnika ABTS niż odpowiadające im aglikony, podczas gdy neohesperydozyd (naringina) – ponad 4-krotnie słabszym. Jak już wspomniano wcześniej,
rutynozyd (wiązanie w cukrze α-1,6) i neohesperydozyd (wiązanie α-1,2) różnią się
jedynie konfiguracją przestrzenną dwucukru, co kolejny raz potwierdza, że przestrzenne ułożenie nie tylko grup –OH, ale i ich podstawników może mieć istotny
wpływ na potencjał antyoksydacyjny związku. Cząsteczka cukru przyłączona do
atomu węgla C7 może – ze względu na zawadę steryczną – zaburzać płaską konfigurację flawanonu i zdolność do delokalizacji elektronu w jego cząsteczce. Cząsteczka
rutynozy w mniejszym stopniu wpływa na destabilizację płaskiej konfiguracji niż
cząsteczka neohesperydozy [Di Majo i in. 2005].
Kolejny czynnik wpływający na potencjał antyoksydacyjny flawanonów to środowisko. W warunkach hydrofilowych flawanony są silnymi przeciwutleniaczami,
natomiast w środowisku lipofilowym niektóre z nich tracą swoje właściwości (neohesperydyna, hesperetyna), a inne zaczynają działać nawet prooksydacyjnie (naringina, narirutyna, naringenina, eriodyktiol) [Khan i in. 2014].
Antyoksydant musi mieć budowę odpowiednią nie tylko do zmiatania rodników
(i delokalizacji elektronu w powstałym rodniku flawonoidowym), ale także do chelatowania metali. Przyjmuje się, że flawonoidy są silnymi przeciwutleniaczami przede
wszystkim ze względu na ich właściwości przeciwrodnikowe. Aktywność ta jest konsekwencją zdolności do oddawania atomu wodoru. Rzeczywiście, fenolowe grupy
90
flawonoidów służą jako łatwo dostępne źródło atomów wodoru, a powstający w efekcie ich oddania rodnik ma stabilny, zdelokalizowany w strukturze pierścieni flawonoidu, elektron [Burda i Oleszek 2001]. Większość naukowców uważa, iż szczególnie
istotne znaczenie ma katecholowa struktura w pierścieniu B (grupy –OH w pozycji
C3’ i C4’), która odpowiada za zwiększenie stabilności rodnika aroksylowego, a także podwójne wiązanie między C2 a C3 oraz grupa 4-okso (grupa ketonowa przy C4),
uczestniczące w delokalizacji elektronu. Potencjał antyoksydacyjny może się także
zwiększyć na skutek obecności grup hydroksylowych w położeniu C3 i C5 w pierścieniu A. Przyjmując takie założenia, dla związków badanych w tej pracy należałoby
oczekiwać wysokiego potencjału antyoksydacyjnego flawonoli, które w swoim szkielecie węglowym łączą wspomniane elementy, tj. wiązanie podwójne między atomami
węgla C2 i C3 oraz grupę C=O przy atomie węgla C4. Rzeczywiście, wśród badanych
związków kwercetyna i kemferol charakteryzują się jedną z najwyższych zdolności
wygaszania rodnika ABTS. Obydwa związki mają też grupy –OH w pierścieniu A na
pozycjach C3 i C5. Interesujące jest jednak, że kemferol, zawierający sumarycznie
mniej grup hydroksylowych (o jedną grupę –OH mniej w pierścieniu B, brak struktury katecholowej) niż kwercetyna, okazał się silniejszym od niej zmiataczem rodnika ABTS. Podobny wynik uzyskali Kirakosyan i inni [2010]. Badając interakcje między poszczególnymi polifenolami, wykazali, że kemferol ma wyższy TEAC niż
kwercetyna. Otrzymane wyniki wskazują, że dla zdolności wygaszania rodnika ABTS
obecność struktury katecholowej w pierścieniu B nie jest istotna.
Porządkując polifenole analizowane w tej pracy w kolejności rosnącego potencjału przeciwrodnikowego (w mmol TE/100 g), uzyskuje się szereg: HR < NR < H < RUT ≤ PHL < CAT < Q < RS ≤ N ≤ KMP (przy czym ≤ oznacza, że uzyskana wartość średnia była niższa, choć nieistotnie statystycznie przy p < 0,05). Związki
te mają jednak bardzo zróżnicowaną masę molową. Różnice są szczególnie duże
w przypadku glikozydów, co sprawia, że ta sama ilość (wagowo) substancji oznacza
znacznie mniejszą liczbę cząsteczek, które mogą uczestniczyć w reakcji. Przeliczając
zatem potencjał antyoksydacyjny na mol badanego polifenolu (wartości podane
w nawiasach na ryc. 6), otrzymujemy szereg, który różni się od poprzedniego, ale
w sposób bardziej adekwatny przedstawia zdolność danej cząsteczki do wygaszania rodnika ABTS: HR < H < NR < RS ≤ CAT < PHL < N ≤ Q ≤ KMP ≤ RUT.
Najbardziej spektakularna wydaje się zmiana pozycji rutyny w tym szeregu. Rutyna
jest glikozydem z resztą dwucukru podstawioną do grupy –OH przy atomie węgla
C3, podczas gdy w przypadku glikozydów flawanonów są to 7-O-pochodne. Na tej
podstawie można wnioskować, że dla zdolności zmiatania rodnika ABTS najważniejsze są trzy elementy: (1) wolna grupa –OH przy atomie węgla C4’, (2) wolne
grupy hydroksylowe przy C5 i C7 oraz (3) grupa ketonowa przy C4. Elementy te
występują w rutynie, kemferolu, kwercetynie i naringeninie – i właśnie te związki
miały niemal identyczny potencjał antyoksydacyjny w przeliczeniu na 1 mol substancji (ryc. 6). Wbrew oczekiwaniom, wolna grupa –OH przy C3 wydaje się nie mieć
91
tak istotnego znaczenia dla zdolności zmiatania rodnika ABTS. Ani jej brak w naringeninie, ani podstawienie w rutynie nie zmniejszyły zdolności tych cząsteczek do
wygaszania ABTS. Spośród badanych związków najwyższy potencjał przeciwrodnikowy (w przeliczeniu na 1 mol substancji) wykazuje rutyna, która ma tę grupę
O-glikozylowaną. Wydaje się wręcz, że cząsteczka rutynozy zwiększa możliwości
oddania atomu wodoru, dzięki czemu rutyna wydajnie redukuje kationorodnik ABTS
(ryc. 7). Przypuszczalnie grupa ta jest istotna w reakcjach chelatowania jonów metali, co postulują niektórzy autorzy [Williams i in. 2004].
Kemferol różni się od kwercetyny brakiem grupy –OH przy atomie węgla C3’,
nie zawiera zatem struktury katecholu w swej cząsteczce. Wiele badań wskazuje, że
z tego powodu ma on mniejszy potencjał antyoksydacyjny niż kwercetyna. Nie jest
to jednak oczywiste. Wartość TEAC wyznaczona dla kemferolu w prezentowanej
pracy była wyższa niż dla kwercetyny. Fiorentino i inni [2007] z kolei stwierdzili, że
aktywność rutynozydu i glukozydu kemferolu w zakresie zmiatania nadtlenku wodoru jest silniejsza niż rutynozydu kwercetyny, ale słabsza niż glukozydu kwercetyny.
Wydaje się zatem, że do zapewnienia zdolności zmiatania nadtlenku wodoru grupa
katecholowa nie jest potrzebna. Potwierdzają to także inne wyniki wspomnianych
autorów. Izoramnetyna od kwercetyny różni się podstawieniem grupy –OH przy C3’
przez resztę metylową, tymczasem jej glukozyd i rutynozyd wydajniej inaktywują
H2O2 niż glukozyd i rutynozyd kwercetyny, jak również glukozyd i rutynozyd kemferolu [Fiorentino i in. 2007].
Kwercetyna, mimo obecności pięciu grup –OH, ma charakter lipofilowy [Materska
2008]. Pochodne kwercetyny mogą być zarówno hydrofilowe, jak i lipofilowe, w zależności od podstawników w cząsteczce. Generalnie, O-metylo- oraz C-metylopochodne flawonoidów są lipofilowe (stąd lepiej się je izoluje przy użyciu np. acetonu). Glikozylacja przynajmniej jednej grupy hydroksylowej w kwercetynie zwiększa hydrofilowość pochodnej, a tym samym skuteczność związku w środowisku
cytoplazmy komórkowej. W warunkach in vitro, jakie najczęściej są wykorzystywane
do oceny aktywności antyoksydacyjnej, te właściwości niekoniecznie znajdą odzwierciedlenie w wynikach.
Udział poszczególnych struktur w kształtowaniu potencjału antyrodnikowego
zależy od rodzaju rodnika, z którym przeciwutleniacz ma reagować. Burda i Oleszek
[2001] wykazali, że dla zmiatania rodnika DPPH kluczowe znaczenie ma obecność
ugrupowania katecholowego (w pierścieniu B). W reakcji z DPPH kwercetyna oddaje dwa atomy wodoru [Materska 2008] i przekształca się w chinon (ryc. 8). Obecność
grupy –OH przy atomie węgla C3 umożliwia regenerację ugrupowania katecholowego, poprzez dodanie protonu z roztworu, pod warunkiem że reakcja zachodzi
w rozpuszczalniku protycznym. W przypadku wygaszania rodnika ABTS grupa katecholowa nie odgrywa tak ważnej roli, a decydujące znaczenie zdają się mieć wolne grupy –OH przy C4’, C5 i C7 oraz grupa ketonowa C=O przy C4. Nie wykazano
w tej pracy istotnej roli grupy –OH przy C3, natomiast metoksypochodne w pozycji
Ryc. 7. Aktywacja (utlenianie) ABTS pod wpływem nadsiarczanu potasu (K2S2O8) prowadząca do powstania kationorodnika ABTS•+ i jego
wygaszanie w reakcji ze związkami przeciwutleniającymi (AOH) [na podstawie: De Oliveira i in. 2014]
Fig. 7. Activation (oxidation) of ABTS by potassium persulfate (K2S2O8) to generate cation-radical ABTS•+ and its scavenging in the reaction
with antioxidant compounds (AOH) [based on: De Oliveira et al. 2014]
92
93
Ryc. 8. Przebieg zmian oksydacyjnych w kwercetynie podczas jej reakcji z rodnikiem DPPH•
w rozpuszczalniku protycznym [na podstawie: Materska 2008]
Fig. 8. Pathway of oxidative changes in quercetin during its reaction with DPPH• radical in protic
solvent [based on: Materska 2008]
C4’ (hesperetyna i hesperydyna) miały istotnie niższy potencjał przeciwrodnikowy
niż niepodstawione naringenina i naringina.
Podwójne wiązanie C2=C3 również nie wydaje się niezbędne dla wydajnego
wygaszania rodnika ABTS. Naringenina, mająca to wiązanie uwodornione, wykazywała znaczną efektywność zmiatania ABTS. Katechina także nie zawiera wiązania
podwójnego, a rezweratrol i florydzyna nie mają nawet pierścienia C. Mimo to
rozmieszczenie grup –OH w tych cząsteczkach umożliwia im wydajne zmiatanie
rodnika ABTS, co jeszcze raz potwierdza szczególnie istotną rolę trzech grup –OH
w pozycji C4’, C5 i C7. Wyniki te są podobne do obserwacji Wanga i innych [2006],
którzy badali zdolność wygaszania anionorodnika ponadtlenkowego przez flawonoidy. Wykazali oni, że największy potencjał redukujący zapewnia obecność grupy
hydroksylowej przy C4’ w pierścieniu B. Jednak, odwrotnie niż w prezentowanych
tutaj wynikach, sama obecność wolnej grupy hydroksylowej nie wystarczała. Jak
zauważyła Materska [2008], w sytuacji podstawienia grupy –OH w pozycji C3 (rutyna, izokwercetyna) potencjał zmiatania rodnika ponadtlenkowego generowanego
w układzie ksantyna/oksydaza ksantynowa znacząco maleje. Możliwe, że występuje
tu typowa zawada steryczna powodująca blokowanie wolnej grupy –OH przez cząsteczkę cukru lub podstawnik alkoksylowy i związany z tym brak możliwości reakcji
z O2•–. Ponadto zwiększona przez podstawienie hydrofilowość pochodnych kwercetyny zmienia współczynniki rozdziału między fazami wodną i lipidową, a to z kolei
ma znaczenie w przebiegu reakcji oznaczania potencjału antyoksydacyjnego [Burda
i Oleszek 2001]. Także Cos i inni [1998] stwierdzili, że do wydajnego zmiatania
anionorodnika ponadtlenkowego niezbędne są wolna grupa hydroksylowa przy C3
oraz grupa –OH przy C3’ w pierścieniu B, tworząca strukturę katecholu. Do podobnych wniosków doszli Sichel i inni [1991], którzy podkreślili również rolę podwójnego wiązania C2=C3 w wygaszaniu anionorodnika ponadtlenkowego przez flawanony i flawony. Jego obecność czyni strukturę flawonoidu bardziej reaktywną,
dlatego apigenina jest przeciętnym antyoksydantem, podczas gdy naringenina nie
•–
wykazuje aktywności wobec O2 . Dla wygaszania rodnika ABTS jednak obecność
podwójnego wiązania nie miała aż tak istotnego znaczenia.
94
O przestrzennych oddziaływaniach cząsteczek cukrów w glikozydach świadczą
również wyniki innych badaczy [Fiorentino i in. 2007]. Zademonstrowali oni, że
glukozyd kwercetyny ma większy potencjał wygaszający – zarówno wobec O2•–, jak
i H2O2 – niż jej rutynozyd. Wskazuje to, że znaczenie ma tutaj nie tylko podstawienie
grupy –OH przy C3, ale także długość glikozydu (jedna cząsteczka cukru czy dwie).
Oczywiście, aktywność antyoksydacyjna związku to nie tylko jego zdolność do
wygaszania rodników, lecz również do zapobiegania ich powstawaniu poprzez chelatowanie jonów metali. Wydaje się, że proces ten wymaga obecności struktury
katecholu oraz wolnej grupy –OH przy C3 [Fernandez i in. 2002, Williams i in. 2004].
Na podstawie dostępnej literatury można przyjąć, że do wiązania jonów metali
niezbędne jest równoczesne występowanie wolnych grup –OH w pozycji C4’ i C3’
(katechol), C3 oraz C5, a także obecność grupy C4=O (ryc. 3) [Cook i Samman
1996, Rice-Evans i in. 1996, Williams i in. 2004]. Jak widać, część z tych elementów
to te same struktury, które są kluczowe dla zdolności wygaszania rodnika ABTS,
jak to przestawiono w tej pracy.
Przeciwutleniacze mogą też wykazywać potencjał antyoksydacyjny dzięki hamowaniu wytwarzania wolnych rodników w organizmie w procesach zależnych od enzymów. Cos i inni [1998] wykazali, że grupy hydroksylowe przy C5 i C7 oraz podwójne wiązanie C2=C3 są elementami kluczowymi dla zdolności związku do
zahamowania aktywności oksydazy ksantynowej – enzymu wytwarzającego anionorodnik ponadtlenkowy. Hämäläinen i inni [2007] z kolei udowodnili, że niektóre
polifenole mogą blokować produkcję rodnika NO• dzięki hamowaniu przez nie
ekspresji enzymu indukowalnej syntazy tlenku azotu (iNOS). W ich badaniach genisteina, kemferol, kwercetyna i daidzeina hamowały indukowaną LPS-em aktywację STAT-1 i NF-κB oraz ekspresję iNOS, natomiast izoramnetyna, naringenina
i pelargonidyna hamowały aktywację NF-κB i ekspresję iNOS, ale nie miały wpływu
na STAT-1. Autorzy wysnuli więc wniosek, że przeciwutleniacze te działają na etapie
kontroli transkrypcji genów dla enzymu odpowiedzialnego za produkcję rodnika
NO•. Biorąc pod uwagę zdolność do zmniejszenia wytwarzania NO• o co najmniej
50%, badane przez autorów flawony można ustawić w szeregu: kwercetyna
(IC50 ≈ 25 μM) ≈ kemferol (IC50 ≈ 25 μM) > genisteina (IC50 ≈ 30 μM) ≈ izoramnetyna (IC50 ≈ 30 μM) > daidzeina (IC50 ≈ 70 μM) > naringenina (IC50 ≈ 80 μM)
> pelargonidyna (IC50 ≈ 90 μM). Wspomniani autorzy na podstawie otrzymanych
wyników wyróżnili kilka elementów struktury, uznając je za kluczowe dla hamowania produkcji NO•: wiązanie podwójne C2=C3, brak podstawników glikozydowych
(ich obecność zmniejszała efekt inhibitorowy) oraz wolne grupy –OH w pozycji C7
i C4’ [Hämäläinen i in. 2007]. Nie są to zatem te same struktury, na które wskazano
w tej pracy jako na niezbędne do inaktywacji rodnika ABTS.
Tripoli i inni [2007] dowiedli, że potencjał przeciwrodnikowy zależy od stężenia
flawonoidu w środowisku reakcji. Istotnym elementem do zmiatania rodnika ponadtlenkowego okazała się obecność niepodstawionej grupy –OH przy atomie węgla C3
95
w pierścieniu C, która to grupa aktywowała podwójne wiązanie między C2 a C3.
Obecność grupy hydroksylowej w pierścieniu B natomiast miała istotny wpływ na
zdolność zmiatania rodnika ponadtlenkowego tylko w sytuacji, gdy stężenie flawonoidu było mniejsze niż 100 mmol/l. Przykładowo, kemferol w stężeniu 10 mmol/l nie
wykazywał aktywności wobec O2•–, ale w stężeniu 60–100 mmol/l już zmiatał ten
rodnik. Cytowani autorzy wykazali, że w zbyt wysokich stężeniach niektóre flawonoidy
mogą nawet działać prooksydacyjnie, aktywując procesy generujące wolne rodniki.
Podsumowując należy zauważyć, że podczas analizy aktywności antyoksydacyjnej związków – w przypadku większości stosowanych metod – tak naprawdę oceniana jest jedynie zdolność antyrodnikowa, i to wobec konkretnego rodnika. Wyniki
takie nie powinny zatem być bezkrytycznie przekładane na zdolność zmiatania
wszystkich rodników, jakie mogą zaistnieć w układach biologicznych, a tym bardziej
na całkowity potencjał antyoksydacyjny cząsteczki. Stosowany powszechnie wyróżnik, jakim jest wartość TEAC, będzie więc zmienny dla tego samego związku w zależności od środowiska, w jakim ów związek się znajdzie. Oznacza to nie tylko
rodzaj rozpuszczalnika, pH czy temperaturę środowiska, ale też rodzaj reaktywnej
formy tlenu, jej stężenie w środowisku, stężenie związku przeciwutleniającego, jak
również obecność innych substancji, które mogą zarówno wspierać proces inaktywacji rodników, jak i mu przeszkadzać. Wartość TEAC odzwierciedla zatem potencjalną zdolność antyoksydacyjną danej cząsteczki. W prezentowanej pracy wykazano, że kluczowe znaczenie dla zdolności do efektywnej inaktywacji rodnika
ABTS przez związek ma obecność wolnej grupy –OH przy C4’, C5 i C7 oraz grupy
ketonowej przy C4.
4.3. Wpływ związków polifenolowych na bakterie jelitowe
Wpływ rozpuszczalnika na bakterie
Związki polifenolowe były stosowane w doświadczeniach w postaci jednoskładnikowych roztworów w dimetylosulfotlenku. W zakresie stężeń 0–250 µg/ml nie stwierdzono żadnego wpływu tego rozpuszczalnika na wzrost badanych gatunków bakterii
jelitowych.
Do ekstrakcji związków polifenolowych z surowców badanych w tej pracy zastosowano 80-procentowy etanol. Wyboru rozpuszczalnika dokonano na podstawie
wyników wcześniejszych badań prowadzonych w Katedrze Technologii Fermentacji
i Mikrobiologii Technicznej UR w Krakowie, które wykazały, że alkohol etylowy
w stężeniu 80% umożliwia uzyskanie ekstraktów o wyższym potencjale antyoksydacyjnym i większej zawartości polifenoli niż użyta w takich samych warunkach woda,
chlorek metylenu czy etanol w innym stężeniu. Skuteczność etanolu była porówny-
96
walna ze skutecznością metanolu, jednak, ze względu na toksyczność tego drugiego,
ostatecznie do badań wybrano alkohol etylowy. Co więcej, jest on także rozpuszczalnikiem dopuszczonym do stosowania w produkcji żywności (Rozporządzenie
Ministra Zdrowia z dnia 4 września 2008 r., Dz. U. Nr 177, poz. 1093), nie spodziewano się zatem negatywnego wpływu jego pozostałości na zdrowie konsumenta. Nie
oczekiwano także negatywnego oddziaływania na badane gatunki mikrobioty jelitowej, gdyż końcowe stężenie rozpuszczalnika w doświadczeniach nie przekraczało
4% (co odpowiada ok. 3,2 g etanolu/100 ml), a istnieją doniesienia, które świadczą
o odporności bakterii jelitowych nawet na trzykrotnie wyższe stężenie etanolu [Ingram
1986, Panesar i in. 2007, Liu i Qureshi 2009, Kopit i in. 2014]. Analiza uzyskanych
wyników wykazała jednak zaskakująco silny, dawkozależny wpływ etanolu na niektóre z badanych w tej pracy gatunków bakterii. Dlatego też wykonano dodatkowe
oznaczenie i sprawdzono dokładniej, jak obecność etanolu w zakresie stężeń od 0,1
do 5% wpływa na wzrost badanych gatunków bakterii. Otrzymane wyniki przedstawiono w tabeli 16.
Wykazano, że etanol ma bardzo zróżnicowany wpływ na drobnoustroje, zależny od ich gatunku. W przypadku większości badanych bakterii niskie stężenia
(0,1–1,0%) lekko stymulowały wzrost drobnoustrojów, choć tylko w przypadku
Eubacterium cylindroides (końcowe stężenie etanolu 0,1–1,0%), Lactobacillus sp.
(1%) oraz Bacteroides galacturonicus (0,4 i 1,0%) efekt ten był statystycznie istotny. Nie były to wyniki zaskakujące, gdyż o możliwości stymulacji przez etanol wzrostu bakterii z rodzaju Acinetobacter, choć nie Escherichia coli, pisali już Smith i inni
[2004]. Przy wyższych stężeniach dodatek etanolu do medium powodował zahamowanie wzrostu wszystkich badanych bakterii, choć w różnym stopniu. Najmocniejszy,
o zupełnie niespodziewanej sile, efekt inhibitorowy zanotowano dla Bifidobacterium
catenulatum – już przy stężeniu 2% EtOH liczebność populacji malała do niespełna 30% wartości kontrolnej, zaś obecność w medium 3% i więcej etanolu powodowała zmniejszenie liczebności populacji tej bakterii o co najmniej 95%. Dość wrażliwe na etanol okazały się także inne pałeczki: Gram-dodatnia Eubacterium
cylindroides, oraz Gram-ujemne Escherichia coli i Bacteroides galacturonicus. W przypadku tej pierwszej obecność 3% etanolu wywołała zmniejszenie liczebności co
prawda „tylko” o nieco ponad 30%, jednak stężenie 5% zahamowało wzrost tego
mikroorganizmu już całkowicie. Zarówno EC, jak i BAC natomiast przeżywały
w stężeniu 5% EtOH, jednak liczebność ich populacji była niższa prawie 10-krotnie
w porównaniu z kontrolą.
Najmniejszą wrażliwością na alkohol etylowy charakteryzował się Enterococcus
caccae – dopiero dodatek 5% etanolu powodował istotne statystycznie zmniejszenie
liczebności populacji, o niecałe 20% w stosunku do kontroli. Podobnie zachowywał
się Ruminococcus gauvreauii.
Uzyskane wyniki są dość zaskakujące. Oczywiście, powszechnie wiadomo, że
alkohol etylowy jest skutecznym środkiem sterylizującym, jednak w tym celu stosu-
100,0 ± 0,7 b, c
100,1 ± 2,1 b, c
101,6 ± 1,3 b, c
104,0 ± 2,7 b
104,2 ± 3,8 b
103,9 ± 7,9 a, b
107,7 ± 1,1 a
97,1 ± 2,3 c
82,0 ± 9,0 d
0
0,1
0,2
0,4
1,0
2,0
3,0
4,0
5,0
81,6 ± 2,1 d
92,0 ± 6,9 c
99,8 ± 7,0 b
105,1 ± 1,3 a
104,3 ± 0,6 a
103,3 ± 1,7 a, b
102,1 ± 0,5 a, b
101,4 ± 1,4 a, b
100,0 ± 1,2 b
RUMI
26,7 ± 5,9 e
66,5 ± 3,4 d
87,4 ± 1,8 c
100,1 ± 13,4 b
109,7 ± 12,4 a
108,2 ± 9,9 a, b
105,9 ± 6,2 a, b
102,2 ± 1,8 a, b
100,0 ± 1,7 b
LCB
12,5 ± 2,3 g
22,6 ± 5,4 f
42,9 ± 7,8 e
61,8 ± 10,3 d
85,3 ± 11,9 c
90,1 ± 4,0 b, c
93,2 ± 2,9 a, b, c
95,4 ± 6,6 a, b
100,0 ± 7,2 a
EC
13,5 ± 2,4 g
46,3 ± 3,9 f
56,3 ± 3,9 e
83,0 ± 0,3 d
104,0 ± 1,6 c
113,3 ± 1,5 a
110,1 ± 2,7 a, b
105,8 ± 11,4 a, b, c
100,0 ± 8,9 b, c
BAC
0,2 ± 0,7 f
20,9 ± 0,9 e
68,1 ± 0,8 d
89,2 ± 1,6 c
101,5 ± 0,6 a
101,9 ± 0,5 a
101,8 ± 0,7 a
101,6 ± 1,1 a
100,0 ± 0,9 b
EUB
2,4 ± 0,3 f
2,6 ± 1,6 f
5,3 ± 0,5 e
28,3 ± 4,6 d
94,9 ± 1,2 c
98,7 ± 0,7 a
99,0 ± 0,6 a
99,5 ± 0,7 a
100,0 ± 0,3 a
BF
Średnie oznaczone tą samą literą w kolumnie nie różnią się istotnie (p < 0,05). Means marked with the same letter in a column are not significantly different (p < 0.05).
EN – Enterococcus caccae, RUMI – Ruminococcus gauvreauii, LCB – Lactobacillus sp., EC – Escherichia coli, BAC – Bacteroides galacturonicus,
EUB – Eubacterium cylindroides, BF – Bifidobacterium catenulatum
EN
Stężenie
etanolu
Ethanol
concentration
[%]
Tabela 16. Wpływ stężenia etanolu na wzrost bakterii jelitowych przedstawiony jako procent w stosunku do liczebności komórek bakterii
danego gatunku w kontroli pozytywnej, tj. hodowli bakterii bez dodatku etanolu (% Kpoz; średnia ± SD, n ≥ 6)
Table 16. Effect of ethanol concentration on the growth of intestinal bacteria expressed as percent relative to bacteria cell count of a given
species in positive control, i.e. bacteria culture in medium without ethanol added (% Kpoz; mean ± SD, n ≥ 6)
97
98
je się go w stężeniu powyżej 70%. Analizując otrzymane wyniki zauważono, że
największy wpływ na podatność bakterii na etanol miał kształt komórki bakteryjnej.
Najbardziej wrażliwe na rosnące stężenia etanolu były pałeczki (Gram-dodatnie
bardziej niż Gram-ujemne), a najmniej – Gram-dodatnie formy kuliste (ziarniaki
i paciorkowce). Nie zaobserwowano natomiast korelacji między podatnością na
etanol a pokrewieństwem filogenetycznym; w obrębie jednego typu Firmicutes występują zarówno odporne gatunki R. gauvreauii i E. caccae, jak i bardziej podatne
Lactobacillus sp. oraz bardzo wrażliwy E. cylindroides. Nie powiązano także tolerancji na etanol z wrażliwością na obecność tlenu w środowisku (względne i bezwzględne beztlenowce), wytwarzaniem katalazy (wszystkie gatunki, z wyjątkiem EC,
są katalazo-ujemne). Najbardziej jednak zaskakujący jest brak zależności między
wrażliwością na etanol a przynależnością do grupy bakterii Gram-dodatnich czy
Gram-ujemnych. Spodziewano się, że bakterie Gram-ujemne będą bardziej podatne na działanie alkoholu, ich ściana komórkowa zawiera bowiem dodatkową warstwę,
błonę zewnętrzną, dzięki czemu zawartość lipidów i lipoprotein u bakterii Gram-ujemnych jest znacznie wyższa niż u Gram-dodatnich (ponad 50% wobec 0–3%).
Dlatego też rosnące stężenie alkoholu powinno szybciej doprowadzić do dezintegracji błon komórkowych i ściany, a w konsekwencji do śmierci komórki.
Odpowiedni skład kwasów tłuszczowych umożliwia utrzymanie prawidłowej
płynności błony i funkcjonowanie związanych z nią enzymów, a co za tym idzie
funkcjonowanie komórki bakteryjnej. Przyjmuje się, że mechanizm uszkadzania błon
komórkowych w obecności długołańcuchowych alkoholi polega na ich wniknięciu
pomiędzy fosfolipidy w dwuwarstwie lipidowej, co powoduje zwiększenie płynności
błon i zaburzenie ich funkcjonowania [Ingram 1976]. W przypadku alkoholi o liczbie atomów węgla wynoszącej 4 i mniej istnieją różne teorie. Jedna z nich mówi, że
cząsteczki tych alkoholi mogą wypierać cząsteczki wody z połączeń z polarnymi
główkami fosfolipidów lub z enzymami, powodując zaburzenia w ich konformacji
i funkcjonowaniu. Dopuszcza się także możliwość inkorporacji cząsteczek etanolu
aż do hydrofobowej części dwuwarstwy lipidowej, gdzie wypełnią one „dziury” pomiędzy ogonkami nienasyconych kwasów tłuszczowych, uszczelniając tym samym
błonę i powodując spadek jej płynności oraz ograniczenie ruchów łańcuchów kwasów
tłuszczowych budujących membranę. Takiego zachowania nie udało się zaobserwować ani dla dłuższych alkoholi (zbyt duże, by wniknąć w te przestrzenie), ani dla
kwasu i aldehydu octowego (bardziej naładowane cząsteczki), których działalność
jest ograniczona do hydrofilowej części dwuwarstwy [Ingram 1976].
Wydaje się jednak, że tolerancja na alkohol nie jest predefiniowana i w dużej
mierze zależy od możliwości adaptacyjnych bakterii lub od właściwości nabytych
w toku ewolucji. Jak wykazał Ingram [1976], Gram-ujemne bakterie E. coli K-12
mogą modyfikować skład lipidów w swoich błonach komórkowych. Autor ten obserwował, że w obecności krótkołańcuchowych alkoholi (metanolu, etanolu, propanolu i butanolu) komórki wytwarzały więcej C18:1 zamiast C16:0, co zwiększało
99
płynność błon i niwelowało zmiany spowodowane przez alkohol. W przypadku obecności wyższych alkoholi (5 do 9 atomów węgla) reakcja była odwrotna – zwiększała
się zawartość C16, a malała C18.
Wiadomo, że niektóre bakterie, w szczególności szczepy termofilne, jak np.
Zymomonas mobilis, Clostridium thermocellum, Lactobacillus homohiochii i L. heterohiochii oraz Ruminococcus albus [Ingram 1986, Panesar i in. 2007, Liu i Qureshi
2009], są zdolne do wytwarzania etanolu. Oznacza to, że muszą być one odporne
na takie stężenia tej substancji, jakie same mogą wytworzyć. Ilości etanolu, jakie
zastosowano w prezentowanych tutaj doświadczeniach, raczej nie przekraczały tej
bezpiecznej granicy, należy bowiem przyjąć, że dodatek 3–5% (v/v) etanolu do medium oznacza wprowadzenie odpowiednio 2,37–3,94 g alkoholu etylowego na każde
100 ml. Zymomonas mobilis, jeden z bardziej wydajnych bakteryjnych producentów
etanolu, charakteryzuje się tolerancją na obecność etanolu w ilości 4 g/100 ml
[Senthilkumar i Gunasekaran 2005]. Z kolei Lactobacillus homohiochii i L. heterohiochii, zaliczane do najbardziej odpornych na etanol bakterii, zdolne są przeżyć
stężenie etanolu do 16%, co sprawia, że stanowią niepożądaną mikrobiotę i powodują psucie się win ryżowych i sake [Ingram 1986]. Tę niezwykłą tolerancję zawdzięczają bardzo dużej zawartości, w swoich błonach, jednonienasyconych kwasów tłuszczowych, głównie cis-C18:1, i obniżonej zawartości nasyconych łańcuchów acylowych.
Paciorkowce kałowe uznawane są za mikroorganizmy oporne na niekorzystne
warunki środowiska, takie jak silnie alkaliczne medium (pH 9,6), duże stężenie soli
(6,5%) i żółci (40%) czy obecność związków, które dla większości bakterii są toksyczne. Wykazano, że E. faecium szczep NRRL B-2354 jest w stanie rosnąć w obecności nawet 8% etanolu, jeśli tylko pH środowiska będzie odpowiednio niskie
(pH 2,4), a temperatura wysoka (60°C) [Kopit i in. 2014]. Heterofermentatywne
gatunki z rodzaju Lactobacillus również mogą wytwarzać nieznaczne ilości etanolu
[Liu i Qureshi 2009], co z kolei mogłoby wyjaśniać stosunkowo dużą odporność
użytego w tej pracy szczepu na stężenie etanolu w zakresie do 2% (tab. 16). Nie
znaleziono natomiast żadnych doniesień o możliwości wytwarzania etanolu przez
Bifidobacterium catenulatum ani o jego tolerancji na ten alkohol.
Wpływ związków polifenolowych na bakterie
W prezentowanej pracy oceniano wpływ różnych stężeń czystych związków polifenolowych (w zakresie 4–250 µg/ml) na badane bakterie. Wybrane związki to: (+)-katechina (CAT), kwercetyna (Q) i jej glikozyd rutyna (RUT), naringenina (N) i jej
glikozyd naringina (NR), hesperetyna (H) i jej glikozyd hesperydyna (HR), rezweratrol (RS), kemferol (KMP) oraz florydzyna (PHL). Związki te zostały wybrane
do badań, gdyż reprezentują polifenole, które można najczęściej znaleźć w wybranych
surowcach (co stwierdzono na podstawie analizy profilu polifenoli w badanych eks-
100
traktach, określonego metodą HPLC, oraz dostępnej literatury przedmiotu). Starano
się ponadto wybrać związki o różnej strukturze szkieletu, aby móc sprawdzić, czy
któryś z jego elementów ma szczególne znaczenie dla antybakteryjnego działania.
Uzyskane wyniki przedstawiono w tabeli 17. Dla związków o aktywności inhibitorowej wyznaczono wartości MIC (tab. 18).
Wykazano, że już w stężeniu 20 µg/ml na wszystkie badane gatunki bakterii
hamująco działały kwercetyna i kemferol, przy czym w przypadku BF i EN siła
hamowania była porównywalna do efektu działania kontrolnego antybiotyku – chloramfenikolu (ChlA) (tab. 17 i 18). Naringenina działała bakteriobójczo wobec EN,
RUMI, LCB, BAC i BF, a bakteriostatycznie na pozostałe bakterie, jednak dopiero
w stężeniu powyżej 100 µg/ml. Hesperetyna w najwyższym stężeniu ograniczała
wzrost wszystkich badanych gatunków z wyjątkiem LCB, przy czym przeważnie było
to zmniejszenie liczebności populacji o kilkanaście procent w stosunku do kontroli
pozytywnej, czyli liczebności bakterii w medium bez polifenolu. Bakteriostatyczny
efekt hesperetyny był wyraźnie widoczny w przypadku Ruminococcus i Enterococcus,
a liczebność populacji tych bakterii po zastosowaniu 250 µg H/ml wynosiła odpowiednio 27% i 38% wartości kontrolnej. Eubacterium cylindroides to jedyna bakteria, spośród badanych, niewrażliwa na rezweratrol. Wobec pozostałych bakterii
związek ten działał bakteriobójczo (EN, RUMI, LCB, BAC) lub bakteriostatycznie
(EC, BF) i to już w stężeniu 100 µg/ml. Ani (+)-katechina, ani rutyna nie wpływały znacząco na badane bakterie, z wyjątkiem EN, którego liczebność była nieznacznie ograniczona w obecności tych związków. Z kolei florydzyna powodowała lekką
stymulację wzrostu LCB, BF, EC i EUB, a efekt inhibitorowy wykazywała jedynie
wobec EN. Wyznaczone wartości MIC dla poszczególnych polifenoli w odniesieniu
do konkretnych gatunków wahały się od 20 do ponad 250 µg/ml i były z reguły
wyższe od MIC dla chloramfenikolu (tab. 18).
Z badanych gatunków bakterii najbardziej podatny na dodatek polifenoli do
medium okazał się Enterococcus caccae – po 24-godzinnej inkubacji w obecności
tych związków w najwyższych badanych stężeniach obserwowano efekty w zakresie
od zmniejszenia się liczebności bakterii o 5% w stosunku do kontroli (w przypadku
rutyny) aż do całkowitego zaniku bakterii (w przypadku rezweratrolu). Niejako na
drugim biegunie wrażliwości znalazła się E. coli, na której wzrost nie miały wpływu
(+)-katechina i rutyna, a hesperydyna, naringina i florydzyna nawet nieznacznie go
stymulowały.
Analizując budowę chemiczną badanych polifenoli, zaobserwowano kilka ciekawych prawidłowości (ryc. 6). Po pierwsze, glikozydy (rutyna, naringenina i hesperydyna) nie wykazywały działania przeciwbakteryjnego lub było ono znikome w porównaniu z działaniem odpowiedniego aglikonu. Wyniki te są zbieżne z rezultatami,
jakie uzyskali Mandalari i inni [2007], którzy wykazali, że deglikozylacja za pomocą
enzymu Pectinase 62L znacząco zwiększa antybakteryjną aktywność flawonoidów
cytrusowych. Oznacza to, że aktywność flawanonów zależy od obecności bądź braku
101
przyłączonego cukru w cząsteczce. Wyniki niniejszej pracy wskazują, że aglikony
także mogą się bardzo różnić aktywnością przeciwbakteryjną. Naringenina, w stężeniu 100 i 250 µg/ml, spowodowała zmniejszenie liczebności poszczególnych bakterii
odpowiednio o 7–99% i o 19–100% w stosunku do kontroli, podczas gdy hesperetyna w tych stężeniach w większości przypadków ograniczała ich liczebność zaledwie
o kilkanaście procent lub wcale nie działała hamująco (LCB). Jak już zademonstrowano wcześniej, naringenina jest blisko 3-krotnie silniejszym przeciwutleniaczem niż
hesperetyna (tab. 15). Naringenina ma o jeden podstawnik mniej (w pierścieniu B
nie zawiera grupy –OH przy atomie węgla C3’), ale jej grupa hydroksylowa w pozycji para- w tym pierścieniu jest wolna, w odróżnieniu od metylowanej grupy –OH
w hesperetynie. Osłabienie właściwości przeciwbakteryjnych wobec Bacillus cereus
i innych bakterii, wywołane metylacją grupy hydroksylowej, wykazali już inni autorzy,
choć w odniesieniu do innych związków [Dorman i Deans 2000, Ultee i in. 2002].
Sugerowali oni, że przyczyną osłabienia właściwości antybakteryjnych jest zmiana
w układzie delokalizacji elektronów. Dwie pozostałe grupy hydroksylowe, w pozycji
C5 i C7 (pierścień C), są identyczne w naringeninie i hesperetynie, i w obu przypadkach są niepodstawione. W niniejszej pracy obserwowano jednak, że glikozylacja
grupy –OH w pozycji C7 znacząco zmniejszała zarówno działanie antybakteryjne
flawanonów, jak i ich potencjał antyoksydacyjny (tab. 15 i 17). Na podstawie omawianych wyników można wysnuć wniosek, że obecność wolnych grup hydroksylowych
w pozycji C7 oraz C4’ odgrywa znaczącą rolę w kształtowaniu aktywności antybakteryjnej flawanonów, o ile nie wszystkich polifenoli.
Struktura katecholu (grupy –OH w pozycji C3’ i C4’ pierścienia B), jak już
wspomniano, ma istotne znaczenie dla aktywności antyoksydacyjnej cząsteczki [Burda
i Oleszek 2001], ale – co wykazano w tej pracy – niekoniecznie dla jej działania
antybakteryjnego. Wprawdzie zarówno (+)-katechina, jak i kwercetyna oraz jej
glikozyd zawierają taki układ w swojej strukturze (ryc. 6.), jednak (+)-katechina
i rutyna praktycznie nie wywierały wpływu na bakterie (poza EN), podczas gdy
kwercetyna działała bardzo silnie (tab. 17). Niska aktywność antybakteryjna rutyny
wynikała prawdopodobnie z połączenia aglikonu z rutynozą. Podobnie jak w przypadku hesperydyny i naringiny, przyłączona cząsteczka cukru mogła stwarzać zawadę steryczną i blokować reakcję glikozydu z odpowiednimi miejscami na ścianie
komórkowej bakterii. W przeciwieństwie do rutyny (+)-katechina nie występuje
w postaci glikozydów, a w porównaniu z kwercetyną brak jej podwójnego wiązania
i grupy ketonowej w pierścieniu A. Podwójne wiązanie wydaje się nie odgrywać
istotnej roli w aktywności antybakteryjnej flawonoidów, gdyż niezawierająca go
naringenina działała hamująco na większość badanych bakterii, choć dopiero w kilkukrotnie wyższym stężeniu niż kwercetyna. Prawdopodobnie mechanizm działania
naringeniny jest zupełnie inny niż kwercetyny.
Postuluje się, że im więcej grup –OH zawierają pochodne, tym większą mają
aktywność przeciwdrobnoustrojową, gdyż mogą skuteczniej działać na powierzchni
N
NR
H
HR
CAT
Polifenol / Polyphenol
55,62 ± 1,33 *b
3,93 ± 0,49 *c
250
81,50 ± 0,84 *a
20
100
89,57 ± 1,60 *a
250
88,57 ± 1,26 *a
20
90,16 ± 2,05 *a
37,75 ± 2,46 *b
250
100
101,02 ± 2,07 a
99,36 ± 1,69 a
20
100
92,48 ± 1,53 a
250
95,66 ± 0,91 a
20
96,50 ± 1,48 a
81,05 ± 1,49 *a
250
100
78,91 ± 1,30 *a
80,41 ± 3,94 *a
20
100
EN
101,48 ± 0,70 b
98,34 ± 3,77 b
103,79 ± 0,99 *a
103,17 ± 0,93 *a
91,41 ± 2,21 *b
101,71 ± 1,73 a
98,19 ± 2,93 a
99,87 ± 1,78 a
100,53 ± 1,59 a
LCB
0,00 ± 0,03 *b
1,19 ± 1,28 *b
46,94 ± 2,24 *a
98,14 ± 0,45 *a
95,72 ± 2,49 *b
96,33 ± 1,99 *a
107,85 ± 1,79 *a
107,90 ± 1,99 *a
108,23 ± 2,54 *a
92,38 ± 1,19 *c
95,82 ± 3,28 *b
106,34 ± 1,22 *a
102,79 ± 3,23 b
108,04 ± 3,26 *a
107,79 ± 2,29 *a
102,32 ± 2,29 b
104,78 ± 6,38 *b
110,78 ± 1,28 *a
EC
1,81 ± 0,43 *c
73,78 ±1,27 *c
64,27 ± 13,89 *b 83,33 ±3,74 *b
102,85 ± 1,29 a
101,67 ± 1,18 a
101,85 ± 0,85 a
96,61 ± 2,07 *a, b 100,58 ± 2,50 a
27,21 ± 0,70 *b
27,25 ± 11,98 *b
84,76 ± 2,77 *a
97,65 ± 0,62 *b
99,89 ± 0,67 a
98,24 ± 0,95 *b
98,94 ± 0,49 *b
99,47 ± 1,20 a, b
100,06 ± 0,51 a
RUMI
0,00 ± 0,08 *c
55,89 ± 5,80 *b
104,82 ± 1,19 *a
95,43 ± 1,05 *a
81,92 ± 2,31 *b
92,59 ± 0,72 *a
93,59 ± 2,83 *c
81,27 ± 8,79 *b
104,44 ± 0,79 a
96,03 ± 0,59 *a
96,28 ± 0,78 *a
95,59 ± 2,88 *a
101,25 ± 1,77 a
101,68 ± 0,98 a
98,43 ± 1,18 a
BAC
81,15 ± 3,20 *c
93,52 ± 1,40 b
114,78 ± 5,07 *a
99,66 ± 1,17 a, b
96,81 ± 4,60 b
106,64 ± 3,86 a
95,23 ± 2,67 a
89,21 ± 4,79 *a
94,68 ± 0,89 a
94,25 ± 5,79 a
101,23 ± 0,84 a
91,49 ± 6,11 *b
95,67 ± 2,41 a
97,47 ± 1,29 a
96,90 ± 1,80 a
EUB
7,49 ± 3,14 *c
47,50 ± 12,49 *b
96,42 ± 4,34 a
87,77 ± 7,68 *b
99,88 ± 2,16 a
102,64 ± 1,01 a
83,54 ± 0,99 *b
84,95 ± 7,47 *b
102,18 ± 7,16 a
84,05 ± 14,78 *b
95,82 ± 4,08 a
94,75 ± 6,51 a, b
99,16 ± 0,87 b
98,56 ± 2,05 b
101,71 ± 1,94 a
BF
Tabela 17. Wpływ dodatku polifenoli na wzrost bakterii jelitowych przedstawiony jako procent w stosunku do liczebności komórek bakterii
danego gatunku w kontroli pozytywnej, tj. hodowli bakterii bez dodatku etanolu (% Kpoz; średnia ± SD, n ≥ 6)
Table 17. Effect of the addition of polyphenols on the growth of intestinal bacteria expressed as percent relative to bacteria cell count of
a given species in positive control, i.e. bacteria culture in medium without ethanol added (% Kpoz; mean ± SD, n ≥ 6)
Stężenie końcowe
Final concentration
[µg/ml]
102
76,46 ± 20,70 *a
48,81 ± 1,65 *b
50
89,07 ± 0,84 a
4
20
69,21 ± 1,71 *a
50
72,21 ± 1,79 *a
4
71,23 ± 1,43 *a
95,18 ± 1,16 a
250
20
94,05 ± 1,18 a
93,81 ± 1,21 a
20
100
0,00 ± 1,78 *c
250
86,62 ± 2,11 *a
20
58,44 ± 2,52 *b
79,41 ± 6,48 *a
250
100
82,25 ± 1,20 *a
100
86,34 ± 1,12 *a
2,80 ± 0,17 *c
4,57 ± 2,86 *b
94,09 ± 1,06 *a
8,19 ± 1,66 *c
5,25 ± 0,76 *b
91,01 ± 3,36 *a
98,92 ± 0,59 *a
96,68 ± 0,42 *b
96,25 ± 0,73 *b
2,39 ± 1,40 *b
1,68 ± 0,53 *b
82,62 ± 3,95 *a
85,08 ± 22,63 *b
97,69 ± 0,69 a, b
99,53 ± 0,68 a
48,23 ± 6,67 *c
78,82 ± 6,40 *b
99,67 ± 2,22 a
58,35 ± 8,54 *c
71,17 ± 7,58 *b
97,09 ± 2,14 a
85,58 ± 7,37 *b
89,40 ± 3,08 *b
97,62 ± 5,08 a
99,93 ± 2,62 b
102,91 ± 1,42 *a
42,79 ± 4,95 *b
52,25 ± 1,33 *a
106,00 ± 1,31 *a
86,23 ± 2,52 *c
89,67 ± 2,30 *b
91,94 ± 3,04 *a
100,78 ± 1,59 b
101,97 ± 1,56 b
95,12 ± 0,77 b
2,44 ± 4,00 *c
66,85 ± 1,07 *b
98,75 ± 2,95 a
68,66 ± 1,34 *c
82,93 ± 2,48 *b
107,82 ± 1,77*a
96,21 ± 0,82 *a
96,70 ± 1,56 a
97,45 ± 1,66 a
1,14 ± 0,79 *c
22,65 ± 9,32 *b
93,32 ± 1,20 *a
87,11 ± 3,59 *b
100,43 ± 2,45 a
108,10 ± 10,08 a
2,57 ± 1,04 *c
48,75 ± 10,50 *b
101,65 ± 12,07 a
94,02 ± 4,28 a
97,49 ± 3,21 a
99,77 ± 2,54 a
107,12 ± 7,47 a
105,11 ± 0,89 a
102,12 ± 6,22 a
105,20 ± 2,62 a
98,32 ± 2,13 a, b 93,27 ± 4,77 b
95,95 ± 1,33 *b
107,56 ± 2,01 *a, b 100,03 ± 2,24 a
105,67 ± 2,06 *b
109,46 ± 1,13 *a
102,46 ± 1,94 a, b 105,42 ± 3,18 *a
0,00 ± 0,05 *b
0,68 ± 0,50 *b
75,02 ± 6,97 *a
105,21 ± 1,19 *a
104,59 ± 2,38 *a
104,51 ± 1,07 *a
10,31 ± 5,69 *c
89,83 ± 4,53 *b
103,72 ± 0,60 a
16,41 ± 9,03 *b
90,38 ± 3,07 *a
96,66 ± 2,87 a
93,74 ± 5,89 *b
100,00 ± 6,23 a
100,46 ± 1,97 a
23,05 ± 4,04 *c
58,04 ± 13,38 *b
102,52 ± 1,68 a
102,07 ± 3,41 b
108,11 ± 1,42 *a
110,29 ± 1,10 *a
Dla danej bakterii i tego samego polifenolu średnie oznaczone tą samą literą nie różnią się istotnie (p < 0,05).
For a given bacteria and the same polyphenol, means marked with the same letter are not significantly different (p < 0.05). Średnie oznaczone gwiazdką (*) różnią się istotnie w stosunku do kontroli pozytywnej (p < 0,05).
Means marked with an asterisk (*) are significantly different in comparison with positive control (p < 0.05).
CAT – (+)-katechina / (+)-catechin, HR – hesperydyna / hesperidin, H – hesperetyna / hesperetin, NR – naringina / naringin, N – naringenina / naringenin, RS – rezweratrol / resveratrol, RUT – rutyna / rutin, Q – kwercetyna / quercetin, KMP – kemferol / kaempferol, PHL – florydzyna / phloridzin
Q
KMP
RUT
RS
PHL
20
103
104
Tabela 18. Stężenia hamujące badanych polifenoli dla bakterii jelitowych (µg/ml)
Table 18. Inhibitory concentrations of study polyphenols for intestinal bacteria (µg/ml)
Polifenol
Polyphenol
EN
RUMI
LCB
EC
BAC
EUB
BF
250*
100
250
> 250**
250
> 250
250
>> 250***
NI
NI
NI
>> 250
NI
> 250
Kemferol
Keampferol
> 50
20
> 50
> 50
> 50
50
> 50
Kwercetyna
Quercetin
> 50
20
> 50
> 50
50
> 50
50
>> 250
>> 250
NI
NI
>> 250
>> 250
>> 250
Rezweratrol
Resveratrol
250
100
100
> 250
250
NI
> 250
Hesperydyna
Hesperidin
>> 250
>> 250
NI
NI
>> 250
>> 250
> 250
Hesperetyna
Hesperetin
> 250
> 250
NI
>> 250
>> 250
>> 250
> 250
(+)-Katechina
(+)-Catechin
> 250
NI
NI
NI
NI
>> 250
NI
Florydzyna
Phloridzin
> 250
> 250
NI
NI
NI
NI
NI
50
12,5
2
10
2
2
50
Naringenina
Naringenin
Naringina
Naringin
Rutyna
Rutin
Chloramfenikol A
Chloramphenicol A
EUB – Eubacterium cylindroides, BAC – Bacteroides galacturonicus, LCB – Lactobacillus sp.,
EN – Enterococcus caccae, BF – Bifidobacterium catenulatum, RUMI – Ruminococcus gauvreauii,
EC – Escherichia coli
*
wartość wyróżniona pogrubioną czcionką – minimalne stężenie hamujące (MIC), tj. najniższe
stężenie powodujące całkowite zahamowanie wzrostu lub zmniejszenie liczebności populacji bakterii o ponad 90% w stosunku do kontroli
value in bold type – minimum inhibitory concentration (MIC), i.e. lowest concentration causing
total inhibition of growth or reduction of bacteria population size by more thant 90% relative to
control
**
wartość ze znakiem „>” – stężenie powodujące zahamowanie wzrostu o 10–90% w stosunku do
kontroli
value with “>” symbol – concentration causing growth inhibition by 10–90% relative to control
*** wartość ze znakiem „>>” – stężenie powodujące bardzo słabe zahamowanie wzrostu (o mniej niż
10% w stosunku do kontroli)
value with “>>”symbol – concentration causing very weak growth inhibition (by less than 10%
relative to control)
NI – brak wpływu hamującego przy zastosowanych stężeniach polifenoli (20, 100 i 250 μg/ml; rezweratrol i kwercetyna: 4, 20 i 50 μg/ml)
no inhibitory effect at polyphenol concentrations applied (20, 100 and 250 μg/ml; resveratrol and
quercetin: 4, 20 and 50 μg/ml)
105
komórek, łącząc się z grupami sulfhydrylowymi białek, oraz łatwiej wiązać się do miejsc
aktywnych w enzymach, przez co zmieniają metabolizm mikroorganizmów [Friedman
i in. 2003, Gyawali i Ibrahim 2014]. Wiadomo również, że jednoczesna obecność
wolnych grup hydroksylowych w pozycjach C3, C5, C3’ i C4’ oraz grupy C=O przy
C4 jest niezbędna do wiązania jonów metali, które w przypadku wielu gatunków
bakterii stanowi czynnik ograniczający ich wzrost. Naringenina nie ma grup –OH
w pozycji C3 i C3’ ani wiązania podwójnego C2=C3, jej struktura jest zatem raczej
mało dostosowana do chelatowania jonów metali. W stężeniu 20 µg/ml naringenina
wywierała tylko słaby efekt bakteriostatyczny wobec RUMI i EN, podczas gdy kwercetyna w takim samym stężeniu hamowała wzrost wszystkich badanych bakterii z wyjątkiem EUB. Z kolei kemferol, o budowie strukturalnej niemal identycznej jak kwercetyna, różniący się od niej tylko brakiem grupy –OH przy C3’, w stężeniu 20 µg/ml
wpływał hamująco na wszystkie badane bakterie, w tym EUB. Co więcej, wszystkie
trzy flawonoidy miały zbliżoną zdolność zmiatania rodnika ABTS (tab. 15).
Przedstawione wyniki sugerują, że mechanizm działania naringeniny prawdopodobnie nie zależy od zdolności chelatowania jonów metali ani zdolności zmiatania
rodników, ale jest raczej efektem właściwości cząsteczki i jej swoistej struktury przestrzennej. Istnieją doniesienia wskazujące, że w środowisku hydrofilowym
naringenina może działać prooksydacyjnie [Tripoli i in. 2007], co mogłoby stanowić
podstawę jej aktywności antybakteryjnej, zwłaszcza w wyższych stężeniach. Z danych
literaturowych wiadomo, że naringenina może oddziaływać z ludzkim cytochromem
P450 (np. CYP3A4) [Ho i in. 2001]. O ile badania nad wpływem flawonoidów na
ludzkie izozymy CYP są powszechne, co wynika z niezmiernie istotnej roli tych
hemoprotein w aktywności enzymów odpowiadających za metabolizm steroidów,
ksenobiotyków, w tym leków, o tyle doświadczeń z bakteryjnymi CYP praktycznie
się nie prowadzi. Jak dotąd stwierdzono jedynie, że wiele gatunków bakterii również
zawiera cytochromy z grupy P450, które uczestniczą w istotnych dla bakterii przemianach kwasów tłuszczowych, detoksykacji olejków eterycznych (np. kamfory,
terpineolu) czy metabolizmie antybiotyków [Lewis i Wiseman 2005]. Zmniejszenie
aktywności enzymów z tej grupy miałoby zatem bardzo poważne konsekwencje dla
funkcjonowania komórki bakteryjnej. Co ciekawe, cytochromów P450 nie wykryto
u E. coli, co mogłoby wyjaśniać niską wrażliwość tej bakterii na badane polifenole
i potwierdzałoby istotność interakcji polifenoli z enzymami pozostałych bakterii dla
ich aktywności antybakteryjnej.
Kemferol i kwercetyna wykazywały bardzo podobne działanie antybakteryjne,
choć w większości przypadków kemferol nieco słabiej hamował wzrost drobnoustrojów (tab. 17). Jedynie wobec Eubacterium cylindroides kemferol działał silnie hamująco (spadek liczebności o 98%); bakteria ta wydaje się natomiast dość odporna na
kwercetynę – związek ten dopiero w najwyższym zastosowanym stężeniu zmniejszał
jej liczebność o 13% w stosunku do kontroli. Różnice w oddziaływaniu omawianych
polifenoli mogą wynikać z nieobecności jednej grupy –OH w pierścieniu B cząstecz-
106
ki kemferolu, co wpływa na interakcje z miejscami aktywnymi w receptorach lub
enzymach. Inni badacze wykazali, że taka struktura przestrzenna kemferolu zapobiega jego idealnemu dopasowaniu do miejsca wiązania w receptorze węglowodorów
arylowych (AhR). Związany KMP może blokować wiązanie innych ligandów dla AhR,
sam zaś nie wykazuje zdolności do aktywacji transkrypcji cytochromu P450 zależnej
od AhR. Z kolei kwercetyna, z grupami hydroksylowymi w konfiguracji orto-, działała silnie aktywująco, co potwierdza jej idealne dopasowanie do miejsca wiązania
w AhR [Moon i in. 2006]. Można zatem przypuszczać, że kemferol przyłączył się do
jakiegoś enzymu obecnego w komórkach Eubacterium i zablokował istotny dla funkcjonowania bakterii proces, podczas gdy kwercetyna nie wykazała takiego wpływu.
Florydzyna – dihydrochalkon szczególnie obficie występujący w jabłkach – zyskuje ostatnio na znaczeniu ze względu na swoją rolę we wspomaganiu leczenia
cukrzycy i otyłości. Wykazano, że jej aglikon (floretyna) aktywnie hamuje wzrost
wielu patogenów, jak np. S. aureus, S. Typhimurium czy L. monocytogenes. O ile
MIC dla florydzyny jest wysokie, przekraczające 1000 µg/ml, o tyle dla floretyny
kształtuje się w zakresie 7,81–125 µg/ml w zależności od szczepu [Barreca i in. 2014].
Wykazano też, że niektóre z bakterii, np. Erwinia herbicola, mają zdolność rozkładania florydzyny do jej aglikonu [Chatterjee i Gibbins 1969], floretyna zaś hamuje
jeden z enzymów kluczowych dla metabolizmu i pozyskiwania energii w warunkach
beztlenowych – dehydrogenazę mleczanową [Barreca i in. 2014]. W prezentowanej
pracy glukozyd floretyny – florydzyna – nie wykazywał działania bakteriobójczego,
nieznacznie hamując jedynie Enterococcus caccae, a w odniesieniu do pozostałych
bakterii działał nawet lekko stymulująco. To może być wynikiem zawady sterycznej
blokującej przeciwdrobnoustrojową aktywność związku oraz braku zdolności badanych bakterii do odcięcia cząsteczki cukru i uwolnienia aktywnego aglikonu.
Podsumowując powyższe rozważania można stwierdzić, że dla właściwości przeciwbakteryjnych badanych związków kluczowa wydaje się jednoczesna obecność
niepodstawionych grup –OH w pozycji C5, C7 i C4’ oraz grupy ketonowej przy C4.
Nie wykazano, by obecność grupy –OH przy C3 oraz wiązania podwójnego C2=C3
znacząco wpływała na aktywność antybakteryjną flawonoidów. Potwierdzono natomiast, że aglikony są silniejszymi inhibitorami niż ich glikozydy, tracące potencjał
antybakteryjny prawdopodobnie na skutek zawady sterycznej, jaka występuje po
przyłączeniu cząsteczek cukru. Tę wzmożoną aktywność aglikonów należy mieć na
uwadze w przypadku przyjmowania związków polifenolowych w postaci preparatów
farmaceutycznych, gdzie związki te występują w wysokich stężeniach i głównie w postaci aglikonów, podczas gdy w surowcach roślinnych dominują formy glikozydowe.
Rezweratrol to jeden z najlepiej poznanych polifenoli wina, jednak w odróżnieniu od wcześniej omawianych związków jest nie flawonoidem, lecz stilbenem, o znacząco odmiennej strukturze. Rezweratrol to 1,2-difenyloeten, w którym pierścienie
aromatyczne mają przyłączone grupy hydroksylowe w pozycji 3, 5 oraz 4’. Stilbeny
107
są wytwarzane przez rośliny w odpowiedzi na atak różnych mikroorganizmów, co
stanowi swoisty mechanizm obrony przed patogenami, z definicji mają więc działanie antybakteryjnie i przeciwgrzybiczne, choć mechanizmy te nie zostały jeszcze
rozpoznane. Z pewnością istotną rolę odgrywa tutaj liczba i rozmieszczenie grup
hydroksylowych. Patrząc na cząsteczkę rezweratrolu (ryc. 6), można zauważyć, że
zawiera ona większość elementów, które uznano za istotne dla aktywności antybakteryjnej. Ma dwie grupy –OH w jednym pierścieniu, i to w konfiguracji odpowiadającej położeniu C5 i C7 z pierścienia A flawonoidów, oraz jedną grupę–OH w pierścieniu drugim, w konfiguracji odpowiadającej położeniu C4’ w pierścieniu B. Nie
zawiera grupy ketonowej, ale ma wiązanie podwójne w łańcuchu łączącym pierścienie fenylowe, które z pewnością odgrywa istotną rolę. Ovesná i Horváthová-Kozics
[2005] wykazały, że potencjał antyoksydacyjny trans-izomerów wiąże się z powstawaniem ich fenoksyrodników o płaskiej konfiguracji semichinonów, która umożliwia
delokalizację niesparowanego elektronu w całej cząsteczce. Przemiana formy trans
w cis, zachodząca pod wpływem promieniowania UV, powoduje znaczące obniżenie
zdolności zmiatania wolnych rodników. Autorki potwierdziły też, że trans-stilbeny
zawierające grupę 4-hydroksylową, podwójne wiązanie oraz grupy w pozycji orto- lub
para- charakteryzują się wysokim potencjałem chemoprotekcyjnym, co świadczy
o istotności tych struktur dla aktywności biologicznej. Chalal i inni [2014] wykazali,
że pochodne rezweratrolu różnią się działaniem antymikrobiologicznym w zależności od liczby grup –OH, ich położenia oraz podstawienia estrem metylowym. Co
więcej, ten sam związek może działać hamująco na Botrytis cinerea (pleśń), a nie
wykazywać takiego działania wobec Plasmopara viticola (lęgniowiec wywołujący
mączniaka rzekomego winorośli). Autorzy twierdzą też, że pochodne metylowe mają
większy potencjał przeciwgrzybiczy niż przeciwbakteryjny [Chalal i in. 2014]. Z kolei Albert i inni [2011] wykazali, że wszystkie badane przez nich pochodne 4-hydroksy-stilbenów działają hamująco wobec Bacillus brevis, a nie działają na Gram-ujemny
Enterobacter, podczas gdy pochodne 3-hydroksy-stilbenów hamują laseczki oraz
Micrococcus luteus. Ponadto stwierdzili, że najwyższą aktywnością antymikrobiologiczną charakteryzują się pochodne z niepodstawioną grupą monohydroksylową
w pierścieniu A oraz wolnymi grupami –OH w pozycji 2’ i 5’ w pierścieniu B.
Zanotowali również, że aktywność pochodnych stilbenowych w stosunku do grzybów
jest bardziej zróżnicowana i zależy zarówno od gatunku grzyba, jak i od rodzaju
podstawników w cząsteczce.
Rosnąca wiedza konsumentów na temat prozdrowotnego wpływu polifenoli prowadzi do zwiększonego spożycia tych składników. Wielu konsumentów sądzi, że
skoro naukowo wykazano, iż kwercetyna jest wydajnym antyoksydantem, który dodatkowo ma właściwości przeciwzapalne, antyproliferacyjne i antynowotworowe, to
jej spożywanie jest bezpieczne i korzystne dla organizmu. W konsekwencji kwercetyna stała się popularnym suplementem diety i składnikiem wielu preparatów, przy
czym jej ilość w 1 tabletce sięga nawet 650 mg. Dzienne spożycie kwercetyny z żyw-
108
nością szacowane jest na 5 do 40 mg, ale może wynieść do 500 mg, kiedy dieta jest
szczególnie bogata w owoce i warzywa spożywane wraz ze skórkami. Należy jednak
zauważyć, że w owocach i warzywach mamy do czynienia głównie z glikozydami
kwercetyny, podczas gdy suplementy zawierają przede wszystkim jej aglikon. Kiedy
jakiś składnik jest dostarczany do organizmu w nadmiarze, osiąga poziom toksyczności. Jak dotąd, toksyczny wpływ kwercetyny był obserwowany jedynie in vitro i przypuszczalnie miał związek z powstawaniem produktów utleniania kwercetyny (chinonów), które zmieniają funkcję kluczowych dla komórki enzymów [Boots i in. 2008].
Oznacza to jednak, że długotrwałe stosowanie suplementów z kwercetyną może
doprowadzić do efektów ubocznych. Podobnie sytuacja wygląda w przypadku rezweratrolu, który coraz częściej można nabyć w postaci suplementów diety mających
przedłużać życie, szczególnie otyłych osób. Rezweratrol, tak jak i niskokaloryczna
dieta, ma zdolność aktywacji sirtuin – enzymów odpowiedzialnych m.in. za deacylację czynników transkrypcyjnych, co w konsekwencji prowadzi do przemian znacząco
wydłużających życie komórki [Siedlecka i Bogusławski 2005]. Stężenie rezweratrolu
w tabletce wynosi 100–500 mg, w zależności od producenta, a zalecana dawka dzienna – aż 500 mg na każde 23 kg masy ciała (dane producenta suplementu podane na
ulotce), co oznacza przyjmowanie nawet 2 g (!) tego stilbenu na dobę. To tylko dwa
przykłady polifenoli, które bez żadnych ograniczeń, zachęcani reklamami, możemy
spożywać w postaci farmaceutyków i suplementów zawierających te związki w stężeniach wielokrotnie wyższych niż naturalnie spotykane w typowej diecie.
Dokładne mechanizmy działania polifenoli na aparat metaboliczny i genetyczny
w komórkach ludzkich są już dość dobrze poznane. To, jak polifenole działają na
poszczególne bakterie, nadal jednak pozostaje zagadką i wymaga dalszych szczegółowych badań. Bakterie zawierają metaloenzymy, a ponieważ flawonoidy silnie wiążą
jony metali, ich działanie może doprowadzić do różnych zaburzeń metabolicznych
(zahamowania enzymów, upośledzenia funkcji kanałów jonowych) lub niedoboru
żelaza w przewodzie pokarmowym, co dotknie wrażliwe populacje bakteryjne i zmieni skład mikrobioty jelitowej. Wśród innych proponowanych mechanizmów aktywności bakteriobójczej flawonoidów należy wymienić zahamowanie aktywności enzymów
i generowanie reaktywnych form tlenu przez EGCG czy zahamowanie aktywności
gyrazy DNA przez kwercetynę [Cushnie i Lamb 2005]. W związku z tym nadmierna
ilość polifenoli, jakie dotrą do jelita, może spowodować zahamowanie wzrostu i zmniejszenie liczebności dobroczynnej, pożytecznej części mikrobioty, która odpowiada za
biokonwersję składników diety, zwiększenie ich biodostępności i bioprzyswajalności.
Z tego powodu suplementacja diety preparatami zawierającymi wysokie stężenia
pojedynczych składników, zwykle w formie aglikonów, może – zamiast pomóc – wywołać efekt niekorzystny dla zdrowia. Szczególnie silny wpływ na pożyteczne bakterie
Lactobacillus i Bifidobacterium wykazano w tej pracy dla rezweratrolu i naringeniny
(LCB) oraz kwercetyny (BF). O negatywnym wpływie polifenoli należy także pamiętać, przyjmując leki, gdyż wiele polifenoli wchodzi w interakcję z enzymami odpowia-
109
dającymi za metabolizm ksenobiotyków, głównie z cytochromem P450 (CYP3A4),
powodując zmniejszenie lub zwiększenie siły oddziaływania leku na organizm, co
w każdym przypadku może być niebezpieczne [Ho i in. 2001].
Wpływ ekstraktów roślinnych i preparatów farmaceutycznych na bakterie
W prezentowanej pracy do przygotowania ekstraktów roślinnych (10% v/v) wykorzystano 80-procentowy etanol, co oznacza, że w medium, do którego dodano ekstrakty w stężeniu 1,0, 2,5 i 5,0%, końcowa zawartość alkoholu etylowego nie przekraczała odpowiednio 0,72, 1,8 oraz 3,6%. Ze względu na opisane uprzednio
działanie inhibitorowe etanolu wobec bakterii, różne w zależności zarówno od gatunku bakterii, jak i stężenia etanolu, uzyskane wyniki przedstawiono jako procent
liczebności kontroli pozytywnej (równej 100%) dla danego gatunku drobnoustroju,
którą w tym przypadku stanowiła populacja tego drobnoustroju po 24-godzinnej
hodowli w medium zawierającym jedynie sam rozpuszczalnik (etanol) w stężeniu
równym jego zawartości w pożywce z danym stężeniem ekstraktu. Dla odróżnienia
jej od kontroli pozytywnej (Kpoz), jaką zastosowano w obliczeniach dla gotowych
preparatów (zob. tab. 21) i czystych polifenoli (tab. 17), czyli hodowli w medium
bez żadnych dodatków, nazwano ją kontrolą etanolową (KEtOH). Przykładowo, w przypadku oceny wpływu dodatku 1,0, 2,5 oraz 5,0% (v/v) ekstraktu z malin na bakterie
Enterococcus caccae, liczbę komórek po inkubacji z tym ekstraktem przedstawiono
jako % KEtOH, czyli procent liczebności EN po 24-godzinnej hodowli w obecności
odpowiednio 0,72, 1,8 oraz 3,6% czystego etanolu. Te stężenia etanolu odpowiadają maksymalnej zawartości alkoholu w medium z dodatkiem odpowiednich dawek
ekstraktu. Dzięki takiemu ujęciu wyników hamujący wpływ składników ekstraktu na
badaną bakterię będzie wyrażony przez wartości niższe od 100% KEtOH, podczas gdy
działanie stymulujące (ewentualnie ochronne) będzie ukazane przez wartości wyższe
od 100% KEtOH. Wpływ poszczególnych ekstraktów na wzrost bakterii jelitowych
zaprezentowano w tabelach 19 i 20. Z uwagi na bardzo silny hamujący wpływ etanolu na Bifidobacterium catenulatum nie przedstawiono wpływu etanolowych ekstraktów roślinnych na ten drobnoustrój. Uzyskane wyniki wskazywały bowiem na
nawet do kilku tysięcy razy większą liczebność tej bakterii w hodowlach z ekstraktami, co niekoniecznie było spowodowane ich potencjałem stymulującym, lecz raczej
wyjątkowo niską liczbą komórek BF na skutek zahamowania ich wzrostu przez alkohol. W tej sytuacji nawet nieznaczne różnice sprawiały, że uzyskiwano wyniki
niejako „wyolbrzymione”, w związku z czym trudno było uznać je za wiarygodne
i zostały one pominięte w prezentacji. W przypadku gotowych preparatów, tj.
Citroseptu i soku z noni, które nie zawierały etanolu, wyniki dla wszystkich gatunków
bakterii przedstawiono jako % Kpoz, czyli procent liczebności bakterii po 24-godzinnej hodowli w medium bez żadnych dodatków (tab. 21).
CCH
Ż
M
P
Ekstrakt
Extract
76,91 ± 3,56 *a
86,99 ± 1,76 *a
105,29 ± 4,79 *b
103,31 ± 0,99 b
99,52 ± 2,01 b
106,02 ± 3,94 *a
93,72 ± 3,28 a
66,85 ± 10,69 *b
44,36 ± 16,89 *c
87,29 ± 6,94 *a
73,37 ± 18,76 *b 112,13 ± 7,55 *a
98,93 ± 1,17 b
95,36 ± 5,34 a
100,92 ± 0,53 a
93,81 ± 1,66 *b
90,21± 0,62 *b
83,75 ± 1,71 *a
55,22 ± 2,96 *b
2,90 ± 1,11 *c
1,0%
2,5%
5,0%
1,0%
2,5%
5,0%
1,0%
2,5%
5,0%
93,68 ± 7,77 c
7,16 ± 1,80 *c
50,40 ± 0,92 *b
100,15 ± 0,75 a
BAC
97,85 ± 13,01 a
45,21 ± 4,85 *c
0,99 ± 0,55 *c
49,86 ± 7,91 *b
95,66 ± 0,70 a
3,43 ± 0,29 *b
11,19 ± 8,04 *c
69,11 ± 2,82 *b
93,15 ± 12,25 a
25,67 ± 9,81 *c
61,91 ± 6,07 *b
91,67 ± 2,09 *a
2,98 ± 0,89 *b
10,52 ± 3,64 *b
89,42 ± 5,47 *a
EUB
85,96 ± 9,33*c
37,07 ± 3,72 *c
45,59 ± 7,59 *b
77,86 ± 0,96 *a
5,07 ± 3,78 *c
75,88 ± 1,98 *b
108,43 ± 3,98 *a
167,63 ± 11,28 *a 0,00 ± 2,09 *c
11,08 ± 2,39 *b
58,72 ± 11,82 *a
167,62 ± 20,21 *a 3,12 ± 1,76 *c
82,11 ± 11,52 *b 118,91 ± 6,19 b
95,26 ± 7,15 a
50,65 ± 7,36 *b
50,58 ± 1,04 *b
122,73 ± 4,60 *a
EC
77,35 ± 11,62 *a 65,00 ± 10,28 *b 110,04 ± 13,20 b
85,75 ± 7,31 *a
81,10 ± 8,89 *a
118,52 ± 1,85 *a
102,97 ± 1,58 a
56,78 ± 1,31 *c
5,0%
91,65 ± 3,51 *b
94,15 ± 2,37 b
104,52 ± 0,54 *a
103,97 ± 0,58 a
LCB
80,28 ± 0,92 *b
88,40 ± 1,37 *a
1,0%
RUMI
2,5%
EN
Stężenie
końcowe
Final
concentration
Tabela 19. Wpływ dodatku ekstraktów etanolowych z owoców pigwowca japońskiego (P), maliny (M), żurawiny (Ż), cytryńca chińskiego
(CCH), derenia jadalnego (D), borówki brusznicy (B), goji (G) i czarnego bzu (BEZ) na wzrost bakterii jelitowych przedstawiony jako procent w stosunku do liczebności komórek bakterii danego gatunku w kontroli etanolowej, tj. hodowli bakterii w medium
z etanolem o odpowiednim stężeniu (% KEtOH; średnia ± SD, n ≥ 3)
Table 19. Effect of the addition of ethanolic extracts from Japanese quince (P), raspberry (M), cranberry (Ż), Schisandra (CCH), cornelian
cherry (D), lingonberry (B), goji (G), and elderberry (BEZ) fruits on the growth of intestinal bacteria expressed as percent relative to bacteria cell count of a given species in ethanolic control, i.e. bacteria culture in medium with ethanol at an appropriate
concentration (% KEtOH; mean ± SD, n ≥ 3)
110
99,79 ± 1,37 a
102,58 ± 1,24 a
102,43 ± 3,47 a
108,40 ± 3,16 *b
110,01 ± 2,32 *a, b 105,63 ± 6,74 b
113,54 ± 8,74 *a
103,84 ± 0,78 b
105,94 ± 0,59 *b
113,27 ± 0,50 *a
98,69 ± 0,98 a
83,49 ± 0,84 *b
64,11 ± 4,75 *c
88,94 ± 4,47 *b
90,61 ± 1,11 *a
58,59 ± 1,89 *c
93,85 ± 1,50 *a
84,28 ± 2,07 *b
70,51 ± 1,44 *c
1,0%
2,5%
5,0%
1,0%
2,5%
5,0%
1,0%
2,5%
5,0%
70,73 ± 8,09 *b
96,41 ± 17,08 a
98,76 ± 8,94 a
105,29 ± 4,93 a
105,36 ± 11,59 a
124,86 ± 3,09 *a
98,43 ± 4,60 b
98,39 ± 4,42 b
135,69 ± 7,31 *a
105,14 ± 5,62 b
76,36 ± 5,51 *c
97,68 ± 1,76 b
115,24 ± 2,80 *a
134,30 ± 32,87 *a
108,34 ± 6,03 b
109,07 ± 2,92 b
139,00 ± 18,73 *a 43,67 ± 6,02 *c
100,67 ± 12,61 b
99,53 ± 7,62 b
54,47 ± 5,11 *b
90,45 ± 9,46 *b
57,12 ± 8,28 *c
5,0%
93,74 ± 3,60 a
97,90 ± 3,17 a
97,23 ± 1,98 a
79,96 ± 1,00 *b
99,66 ± 1,73 a
2,5%
93,08 ± 1,14 *a
96,96 ± 7,12 b
105,74 ± 4,31 b
29,47 ± 2,40 *b
77,73 ± 3,04 *a
1,80 ± 2,40 *c
42,82 ± 1,43 *b
19,46 ± 7,45 *c
103,30 ± 3,63 b
114,50 ± 0,14 *a
79,27 ± 1,79 *b
80,88 ± 8,16 *b
109,29 ± 7,15 *a
156,86 ± 23,46 *a 0,00 ± 2,52 *c
117,34 ± 10,67 b
95,97 ± 5,30 c
114,52 ± 16,63 a
111,10 ± 8,68 a
73,37 ± 11,61 *b 70,38 ± 3,02 *a
155,40 ± 11,56 *a 133,84 ± 33,07 *a
106,34 ± 6,93 b
89,01 ± 5,06 c
Dla danej bakterii i tego samego ekstraktu średnie oznaczone tą samą literą nie różnią się istotnie (p < 0,05).
For a given bacteria and the same extract, means marked with the same letter are not significantly different (p < 0.05).
Średnie oznaczone gwiazdką (*) różnią się istotnie (p < 0,05) w stosunku do kontroli pozytywnej dla tego samego stężenia etanolu.
Means marked with an asterisk (*) are significantly different (p < 0.05) in comparison with positive control for the same ethanol concentration.
EUB – Eubacterium cylindroides
BEZ
G
B
D
1,0%
111
CN
S
SP
PO
Ekstrakt
Extract
100,14 ± 9,64 a
1,0%
104,87 ± 5,28 a
55,75 ± 1,98 *b
92,60 ± 0,85 *a
5,0%
1,0%
104,19 ± 5,36 b
114,00 ± 8,97 *a 128,20 ± 1,99 *a
83,71 ± 0,91 *b
74,44 ± 4,36 *c
5,0%
105,11 ± 4,94 b
106,39 ± 8,25 b
129,76 ± 2,09 *a
111,72 ± 2,32 *b
2,5%
105,29 ± 3,68 b
105,80 ± 6,41 a
93,97 ± 11,13 a
2,5%
111,54 ± 4,16 *b
115,19 ± 3,66 *a 110,63 ± 5,16 a
60,34 ± 5,27 *b
5,0%
103,24 ± 2,66 a
102,29 ± 2,05 b
121,17± 32,33 *a
2,5%
90,40 ± 7,20 *b
96,28 ± 7,81 b
122,46 ± 24,82 *a
1,0%
102,43 ± 1,55 b
107,40 ± 1,01 *a 129,04 ± 4,34 *a
83,19 ± 1,34 *b
5,0%
94,58 ± 1,87 b
94,08 ± 1,81 b
97,12 ± 1,22 b
97,18 ± 1,59 b
LCB
84,29 ± 1,46 *b
90,53 ± 1,77 *a
1,0%
RUMI
2,5%
EN
Stężenie
końcowe
Final
concentration
116,45 ± 0,86 *b
89,42 ± 0,40 *c
BAC
51,87 ± 2,22 *c
39,71 ± 8,09 *b
111,46 ± 3,95 *a
27,85 ± 13,67 *c
56,40 ± 4,96 *b
108,82 ± 9,69 a
30,75 ± 11,45 *c
40,26 ± 4,73 *b
107,84 ± 5,45 a
16,75 ± 3,26 *b
73,85 ± 5,71 *a
5,11 ± 2,33 *c
45,34 ± 0,65 *b
74,54 ± 1,05 *a
181,21 ± 6,76 *a
81,07 ± 10,85 *b
86,23 ± 7,76 *b
EUB
74,61 ± 1,24 *b
110,11 ± 4,62 *a
132,66 ± 20,62 *a 9,96 ± 2,61 *c
99,59 ± 3,74 b
83,33 ± 6,31 *c
142,83 ± 24,96 *a 1,51 ± 1,40 *c
107,93 ± 1,82 b
83,74 ± 7,45 c
45,31 ± 4,99 *b
95,34 ± 6,19 a
87,10 ± 5,03 *a
289,15 ± 12,53 *a 201,59 ± 2,44 *a
169,56 ± 3,11 *b
129,74 ± 3,00 *c
EC
Tabela 20. Wpływ dodatku ekstraktów etanolowych z ziela pokrzywy (PO), spiruliny (SP), soi (S), czosnku niedźwiedziego (CN), cebuli
czerwonej (CC) i zielonej herbaty (GT) na wzrost bakterii jelitowych przedstawiony jako procent w stosunku do liczebności komórek bakterii danego gatunku w kontroli etanolowej, tj. hodowli bakterii w medium z etanolem o danym stężeniu (% KEtOH;
średnia ± SD, n ≥ 3)
Table 20. Effect of the addition of ethanolic extracts from nettle herb (PO), spirulina (SP), soybean (S), bear’s garlic (CN), red onion (CC),
and green tea (GT) on the growth of intestinal bacteria expressed as percent relative to bacteria cell count of a given species in
ethanolic control, i.e. bacteria culture in medium with ethanol at an appropriate concentration (% KEtOH; mean ± SD, n ≥ 3)
112
99,88 ± 8,68 a
1,0%
5,76 ± 2,39 *b
96,28 ± 6,41 b
78,52 ± 2,52 *b
5,0%
138,34 ± 5,07 *a
105,73 ± 1,03 *a 115,89 ± 8,68 *b
94,57 ± 7,68 a
2,5%
105,44 ± 0,71 *a 116,37 ± 4,98 *b
112,48 ± 1,52 *a 65,96 ± 7,77 *c
5,0%
87,59 ± 3,60 *a
99,79 ± 1,01 b
89,27 ± 3,65 *a
86,84 ± 1,53 *b
98,39 ± 0,76 b
2,5%
94,63 ± 6,57 a
40,38 ± 17,14 *c
52,66 ± 7,07 *b
89,28 ± 17,52 a
52,16 ± 5,68 *b
80,31 ± 7,05 *a
79,38 ± 4,80 *a
91,01 ± 10,26 *a
98,69 ± 2,91 a
72,03 ± 5,58 *b
69,61 ± 4,74 *b
85,63 ± 3,74 *a
1,15 ± 0,77 *c
40,92 ± 1,98 *b
93,94 ± 2,81 *a
192,53 ± 11,94 *a 44,09 ± 8,36 *b
121,09 ± 6,19 *b
97,83 ± 1,45 c
Dla danej bakterii i tego samego ekstraktu średnie oznaczone tą samą literą nie różnią się istotnie (p < 0,05).
For a given bacteria and the same extract, means marked with the same letter are not significantly different (p < 0.05).
Średnie oznaczone gwiazdką (*) różnią się istotnie (p < 0,05) w stosunku do kontroli pozytywnej dla tego samego stężenia etanolu.
Means marked with an asterisk (*) are significantly different (p < 0.05) in comparison with positive control for the same ethanol concentration.
EUB – Eubacterium cylindroides
GT
CC
1,0%
113
108,94 ± 2,02 a
EC
104,39 ± 4,41 c
111,79 ± 1,64 *b 113,46 ± 6,55 *a, b 94,79 ± 7,97 b
2,5% 94,89 ± 1,35 *a
5,0% 83,55 ± 1,85 *b 118,18 ± 1,20 *a 118,47 ± 4,78 *a
107,61 ± 3,42 *b
40,97 ± 2,41 *c
141,16 ± 5,02 *a
19,17 ± 4,60 *c
1,0% 95,31 ± 1,00 *a
124,15 ± 6,55 *a
84,71 ± 1,02 *b
5,0% 77,32 ± 17,44 *
122,08 ± 6,17 *a,b 37,55 ± 2,77 *b
116,50 ± 4,30 *b
LCB
102,46 ± 8,74 a
108,52 ± 1,49 *a
RUMI
2,5% 92,20 ± 9,02 a
1,0% 101,45 ± 6,69 a
EN
28,74 ± 8,18*b
41,73 ± 3,12 *b
63,00 ± 1,80 *a
21,84 ± 4,63 *b
37,49 ± 1,20 *a
44,97 ± 2,46 *a
BAC
BF
140,55 ± 4,83 *a, b
135,14 ± 11,71 *b
36,58 ± 1,22 *b 151,69 ± 2,66 *a
99,57 ± 2,40 a
102,11 ± 4,95 a
2,50 ± 1,32 *c 90,74 ± 5,36 b
29,08 ± 3,94 *b 110,19 ± 18,08 a
52,48 ± 1,15 *a 108,62 ± 16,03 a
EUB
Dla danej bakterii i tego samego preparatu średnie oznaczone tą samą literą nie różnią się istotnie (p < 0,05).
For a given bacteria and the same preparation, means marked with the same letter are not significantly different (p < 0.05).
Średnie oznaczone gwiazdką (*) różnią się istotnie w stosunku do kontroli pozytywnej (p < 0,05).
Means marked with an asterisk (*) are significantly different in comparison with positive control (p < 0.05).
NO
CIT
Preparat
Preparation
Tabela 21. Wpływ dodatku Citroseptu (CIT) i soku z noni (N) na wzrost bakterii jelitowych przedstawiony jako procent w stosunku do liczebności komórek bakterii danego gatunku w kontroli pozytywnej, tj. hodowli bakterii w medium bez dodatków (% Kpoz; średnia ± SD, n ≥ 3)
Table 21. Effect of the addition of Citrosept (CIT) and noni juice (NO) on the growth of intestinal bacteria expressed as percent relative
to bacteria cell count of a given species in positive control, i.e. bacteria culture in medium with no additives (% Kpoz; mean ± SD,
n ≥ 3)
Stężenie końcowe
Final concentration
114
115
Jak przewidywano, wpływ ekstraktów był znacznie mniej spektakularny niż oczyszczonych polifenoli, ze względu na złożoną matrycę żywności oraz niższe stężenia
związków w medium. Poszczególne rośliny i preparaty wywierały różnorodny wpływ
– od stymulującego, przez neutralny, bakteriostatyczny, aż po bakteriobójczy – w zależności od gatunku bakterii oraz zastosowanego stężenia. W przypadku stwierdzenia wpływu hamującego starano się wyznaczyć wartość minimalnego stężenia hamującego (MIC) (tab. 22).
Cytryniec chiński (CCH) jako jedyny spośród ocenianych surowców hamował
wzrost wszystkich badanych drobnoustrojów jelitowych, a wyznaczona wartość MIC
była równa lub większa od 5% (tab. 21 i 22). Zgodnie z wynikami opisanymi w poprzednim rozdziale, potencjał antyoksydacyjny tego owocu jest dość niski (2,16 mmol
TE/100 g), podobnie jak ogólna zawartość polifenoli (poniżej 250 mg katechiny/100 g),
wśród których w większej ilości zidentyfikowano jedynie kwas galusowy. Z danych
literaturowych wiadomo jednak, że bardzo ważnymi związkami obecnymi w tych
owocach są lignany, w tym schizandrole, schizandryny, schizanteryny i gomisyny
[Hancke i in. 1999]. Jak dotąd udowodniono, że schizandryna B silnie hamuje
Staphylococcus aureus i Candida albicans (MIC 0,25 mg/ml) oraz Salmonella, E. coli
i Bacillus subtilis. Ponadto owoce cytryńca są bogate w cukry, kwasy organiczne
(głównie cytrynowy, jabłkowy i winowy), witaminy C i E oraz olejki eteryczne, w skład
których wchodzą liczne związki (m.in. cytral, p-cymen, limonen, terpinen, linalol,
cytronelol, geraniol i in.) o potwierdzonej aktywności antybakteryjnej i mykostatycznej [Lamer-Zarawska 2002, Ultee i in. 2002, Burt 2004]. Ze względu na swoje korzystne oddziaływanie na organizm człowieka (antyalergiczne, przeciwzapalne, antywirusowe, adaptogenne) owoce cytryńca są stosowane coraz częściej, dlatego
należy mieć na uwadze ich negatywny wpływ na bakterie stanowiące fizjologiczną
mikrobiotę naszego jelita i brać w rachubę płynące z tego konsekwencje.
Drugim skutecznym inhibitorem okazał się Citrosept. Co prawda, suplement
ten nie wykazywał istotnego wpływu na wzrost B. catenulatum, a w sposób dawkozależny stymulował wzrost Lactobacillus sp., jednak wobec pozostałych badanych
gatunków działał bakteriostatycznie (EN, RUMI, EC, BAC) lub bakteriobójczo
(EUB), powodując ograniczenie liczebności bakterii (do poziomu stanowiącego od
2% kontroli w przypadku EUB do 85% kontroli dla RUMI), a wartość MIC wynosiła ≥ 5%.
Inaczej niż cytryniec chiński, Citrosept charakteryzował się bardzo wysokim
potencjałem antyoksydacyjnym i zawartością polifenoli (tab. 10), wśród których
dominowały naringina, rutyna i hesperydyna, a w mniejszym stężeniu obecne były
także kwasy fenolowe, kwercetyna, rezweratrol, hesperetyna i naringenina (tab. 12).
Jak już wspomniano wcześniej, rezweratrol i naringenina działały bakteriobójczo
na EN, LCB i RUMI, a bakteriostatycznie na BF i EC, natomiast w stosunku do
EUB jedynie naringenina działała lekko hamująco, a rezweratrol nawet stymulował
wzrost tej bakterii (tab. 17). Również kwercetyna, w stężeniu 50 µg/ml, hamowała
> 5%
> 5%
>> 5%
> 5%
5%
Malina / Raspberry
Żurawina / Cranberry
Soja / Soybean
1,25%
> 5%
> 5%
> 5%
> 5%
> 5%
> 5%
5%
Brusznica / Lingonberry
Zielona herbata / Green tea
Citrosept / Citrosept
Jagody goji / Goji berries
Czarny bez / Elderberry
Sok z noni / Noni juice
NI
NI
> 5%
NI
NI
NI
0,2%
NI
NI
NI
NI
NI
NI
1%
> 5%
> 5%
NI
> 5%
> 5%
> 5%
NI
> 5%
5%
> 5%
> 5%
5%
NI
5%
> 5%
> 5%
5%
NI
> 5%
> 5%
NI
> 5%
EC
> 5%
NI
NI
NI
LCB
0,2%
> 5%
> 5%
NI
> 5%
> 5%
NI
NI
NI
NI
> 5%
NI
NI
NI
> 5%
–
>> 5%
–
5%
5%
5%
0,2%
> 5%
5%
NI
–
–
5%
> 5%
–
NI
–
–
5%
> 5%
–
5%
–
5%
–
5%
–
–
5%
5%
–
–
BF
NI
2,5%
5%
NI
EUB
BAC
Pozostałe objaśnienia jak w tabeli 18 / See Table 18 for other explanatory notes
Chloramfenikol A / Chloramphenicol A
NI
> 5%
Dereń / Cornelian cherry
NI
> 5%
Czerwona cebula / Red onion
NI
> 5%
NI
NI
NI
Czosnek niedźwiedzi / Bear’s garlic
Cytryniec chiński / Schisandra
NI
> 5%
Spirulina / Spirulina
NI
> 5%
Pokrzywa / Nettle
NI
RUMI
> 5%
EN
Pigwowiec japoński / Japanese quince
Ekstrakt (Preparat)
Extract (Preparation)
Tabela 22. Stężenia hamujące badanych ekstraktów lub preparatów dla bakterii jelitowych
Table 22. Inhibitory concentrations of study extracts or preparations for intestinal bacteria
116
117
wzrost wszystkich badanych gatunków, przy czym szczególnie silnie działała wobec
RUMI, BAC i BF. Należy jednak podkreślić, że stężenie tych związków w Citrosepcie,
a w konsekwencji w medium, było znacznie mniejsze niż to, przy którym wykazano
działanie hamujące w doświadczeniach in vitro z czystymi polifenolami. Co więcej,
Citrosept najsilniej hamował Eubacterium, a więc bakterię, która była najmniej
wrażliwa na naringeninę i kwercetynę, a którą stymulował rezweratrol. Oznacza to,
że polifenole te nie odpowiadały za inhibitorowy wpływ Citroseptu w stosunku do
EUB. Stymulujący wpływ CIT na Lactobacillus może być interesujący dla producentów żywności, gdyż otwiera szereg możliwości wzbogacania produktów żywnościowych, zawierających te bakterie kwasu mlekowego, ekstraktami z grejpfrutów.
Silne działanie inhibitorowe wykazano także dla ekstraktu z owoców pigwowca
japońskiego wobec Eubacterium i Bacteroides, z wartościami MIC odpowiednio 2,5%
i 5% (tab. 19 i 22). Brak negatywnego wpływu na Lactobacillus oraz bakteriostatyczny wpływ na Escherichia i Enterococcus czyni ten surowiec bardzo interesującym
dla przetwórstwa i przemysłu farmaceutycznego.
Zupełnie inne działanie wykazano w przypadku ekstraktów z jagód goji (tab. 19)
i pokrzywy (tab. 20). Ten pierwszy stymulował wzrost BAC, EC, LCB i RUMI,
i jedynie wobec EUB działał bakteriobójczo, a wobec EN – bakteriostatycznie. Ten
drugi natomiast w najniższym stężeniu działał lekko hamująco wobec EN, BAC
i EUB, ale w najwyższym (dodatek 5% ekstraktu do medium) powodował już znaczący wzrost liczebności wszystkich badanych gatunków, z wyjątkiem Enterococcus.
Szczególnie interesujący jest fakt stymulacji wzrostu E. coli przez pokrzywę.
Zaobserwowane zwiększenie liczebności populacji tej bakterii, w stosunku do kontroli, zależało od stężenia ekstraktu i wynosiło od 30% (dla dodatku 1% ekstraktu)
do niemal 200% (dodatek 5%). Otrzymane wyniki sugerują, że tradycyjne stosowanie preparatów na bazie wyłącznie pokrzywy w leczeniu chorób układu moczowego
[Pieszak i Mikołajczak 2010], mimo moczopędnych właściwości tych preparatów,
nie jest korzystne. O ile preparaty żurawinowe hamują rozwój E. coli, która najczęściej odpowiada za te dolegliwości, o tyle pokrzywa stymuluje namnażanie się tych
bakterii. Optymalne zatem będzie stosowanie preparatów wieloskładnikowych.
Uzyskane wyniki wskazują, że – oprócz żurawiny – hamująco wobec EC działają
wspomniane już cytryniec chiński i Citrosept, ale także spirulina oraz soja, i właśnie
te składniki mogłyby znaleźć zastosowanie w takich farmaceutykach.
Próbując ustalić, które ze składników pokrzywy odpowiadają za stymulację wzrostu bakterii, przeanalizowano uzyskane wyniki. Pokrzywa zawierała dość dużą zawartość polifenoli ogółem (619 mg katechiny/100 g ś.m.), choć dominowały w niej
związki o raczej niskim potencjale antyoksydacyjnym (tab. 10). Do najważniejszych
flawonoidów, jakie w tej pracy zidentyfikowano w pokrzywie, należały florydzyna,
rutyna i procyjanidyna B1 oraz witeksyna i izowiteksyna (tab. 13). Pokrzywę wyróżniało zatem to, że wśród wykrytych polifenoli obecne były glikozydy apigeniny,
których – poza czosnkiem niedźwiedzim – nie stwierdzono w pozostałych badanych
118
surowcach. Jak dotąd nie opublikowano żadnych danych na temat stymulującego
wpływu tych polifenoli na rozwój E. coli ani na żadną inną z badanych bakterii, nie
można więc potwierdzić roli tych składników. Biorąc jednak pod uwagę, że czosnek
niedźwiedzi nie stymulował wzrostu E. coli, należy stwierdzić, że rola witeksyny
i izowiteksyny jako stymulatorów budzi spore wątpliwości. W liściach pokrzywy
obecne są także barwniki (chlorofil, ksantofil, karoten), witaminy K, C i B2, kwas
pantotenowy, garbniki, kwasy organiczne, związki lotne oraz znaczne ilości składników mineralnych (głównie wapń, magnez, żelazo, krzem) [Andersen i Wold 1978].
Dlatego też można się pokusić o hipotezę, że za stymulację wzrostu E. coli przez
ziele pokrzywy odpowiadały właśnie składniki mineralne. Tym bardziej, że takie
wyjaśnienie potwierdzałyby także wyniki uzyskane dla innego ekstraktu. Jagody goji,
które również silnie stymulowały rozwój EC, są bogatym źródłem minerałów, w tym
żelaza, selenu, cynku, miedzi i wapnia, oraz witamin (C, E, B2 i B6) [Potterat 2010,
Cieślik i Gębusia 2012]. O roli tych pierwiastków w namnażaniu się bakterii, w tym
patogennych, wiadomo od dawna [Bullen i in. 2005]. Jony magnezu i wapnia odpowiadają za właściwości powierzchni, a co za tym idzie za zdolność bakterii do adhezji. Z kolei o znaczeniu żelaza w inwazji patogenów świadczą chociażby mechanizmy
obronne, jakie organizmy wyższe wykształciły w toku ewolucji, aby uchronić się przed
infekcją bakteryjną. Przyjmuje się, że stężenie wolnego żelaza, jakie musi być osiąg
nięte we krwi, aby zabezpieczało przed namnażaniem się bakterii, wynosi 10–18 M
[Bullen i in. 2005]. Aby związać całe wolne żelazo w organizmie, zwierzęta wytwarzają białka wiążące ten metal (np. transferryna, laktoferrytyna), dzięki czemu nie
jest on dostępny dla bakterii, które w jakiś sposób wniknęły do organizmu. Nawet
nieznaczne zwiększenie się ilości dostępnych wolnych jonów żelaza powoduje jednak,
że bakterie są bardziej odporne na warunki środowiska, szybciej się namnażają
i wykazują większą wirulencję [Bullen i in. 2005]. Spośród analizowanych surowców
roślinnych szczególnie bogate w jony żelaza są jagody goji i pokrzywa oraz biomasa
cyjanobakterii Spirulina platensis (preparat spirulina). Jednak tylko pokrzywa i jagody goji powodowały zwiększenie liczebności EC, zaś spirulina znacząco hamowała wzrost tej bakterii. Sprawdzono zatem, czy w odniesieniu do innych bakterii
można by postulować istotny udział jonów żelaza w stymulacji ich wzrostu. Analiza
wyników potwierdza, że zarówno pokrzywa, jak i jagody goji działały stymulująco
również wobec BAC, RUMI oraz LCB, a pokrzywa dodatkowo w stosunku do EUB.
Obydwa ekstrakty natomiast działały bakteriostatycznie wobec Enterococcus, a jagody goji nawet bakteriobójczo na EUB. Z kolei spirulina hamowała wzrost wszystkich badanych gatunków, z wyjątkiem Ruminococcus i – w niższych stężeniach –
Enterococcus caccae (tab. 19–21).
Generalnie uznaje się, że bakterie Gram-dodatnie są bardziej wymagające i często same nie potrafią syntetyzować niezbędnych do wzrostu składników. Na przykład,
Staphylococcus aureus wymaga dostarczenia aminokwasów, tiaminy i kwasu nikotynowego; także inne bakterie Gram-dodatnie wymagają obecności w środowisku
119
właśnie tego typu składników, tj. konkretnych aminokwasów oraz witamin, najczęściej
z grupy B. Ich brak w pożywce nie pozwala mikroorganizmom rosnąć bez ograniczeń,
zaś dodanie do podłoża – przyspiesza wzrost i namnażanie się drobnoustrojów.
Bakterie Gram-ujemne natomiast z reguły potrafią zaspokoić swoje podstawowe
potrzeby pokarmowe, korzystając z występujących w żywności lipidów, cukrów i białek oraz minerałów i witamin. W tym miejscu warto przypomnieć, że w prezentowanej pracy, ze względów technicznych, ani Gram-ujemny BAC ani Gram-dodatnie
RUMI i EUB nie były hodowane w optymalnych dla siebie pożywkach. W doświadczeniach z Bacteroides galacturonicus zastosowano podłoże ST, różniące się od zalecanego dla hodowli tej bakterii medium 1265 (tab. 6) stężeniem jonów żelaza
(4-krotnie niższym) oraz brakiem poligalakturonianu sodu, gdyż związek ten uniemożliwiał pomiar liczebności bakterii za pomocą densytometru. Z kolei RUMI
i EUB były hodowane w jeszcze uboższym medium TSYEM, pozbawionym m.in.
heminy i witaminy K. Ten okrojony skład zastosowanych pożywek mógł spowodować,
że bakterie, mimo całkiem dobrego wzrostu w tych mediach, nie osiągały w nich
jednak pełni swoich możliwości, co dało się uzyskać dopiero po odpowiedniej suplementacji podłoża. O ile brak heminy w podłożu dla RUMI wyraźnie wskazuje
na potencjalny niedobór żelaza, który mógł zostać zniwelowany przez dodatek ekstraktu ze spiruliny, pokrzywy czy goji, o tyle w przypadku pozostałych bakterii nie
jest to aż tak oczywiste. Udowodniono co prawda, że niedobory żelaza w diecie
szczurów skutkują znaczącym spadkiem liczebności Bacteroides [Dostal i in. 2012],
jednakże dostępne doniesienia wskazują, że przedstawiciele Bacteroides do wydajnego namnażania biomasy wymagają obecności jonów K+ i Mg2+ oraz żelaza w postaci hemowej, natomiast w formie Fe2+ jest ono znacznie gorzej przyswajalne [Sperry
i in. 1977]. Żaden z wymienionych surowców nie zawiera żelaza hemowego. Można
oczywiście założyć, że w sytuacji niedoboru żelaza w pożywce zwiększenie jego ilości,
poprzez dodanie ekstraktów goji, pokrzywy lub spiruliny, spowodowało wzrost liczebności RUMI i BAC, w porównaniu do medium bez dodatku, mimo że postać
dostarczonego żelaza nie była optymalna. Uzyskane wyniki wskazują jednak, że
spirulina – pomimo znacznej zawartości żelaza – działała na BAC hamująco, a nie
stymulująco (tab. 20). Z pewnością należy przyjąć, że wpływ danego surowca na
bakterie nie jest efektem obecności w nim jednego związku, lecz wypadkową oddziaływań wszystkich jego składowych. Spirulina jest bogatym źródłem żelaza i innych
minerałów, ale zawiera także dużo białka (do 70% s.m.), nienasyconych kwasów
tłuszczowych (do 30% tych kwasów stanowi kwas γ-linolenowy, GLA) oraz barwników (chlorofil a, ksantofile, karotenoidy, fikocyjaniny), jest przy tym raczej uboga
w cukry [Belay 2002]. Wykazano, że niektóre kwasy tłuszczowe z grupy ω-6, ω-7
i ω-9 (jak np. kwas linolowy, GLA, arachidonowy i oleinowy) oraz ich estry mogą
hamować wzrost E. coli oraz drobnoustrojów bytujących w początkowych odcinkach
przewodu pokarmowego, w tym powodujących choroby jamy ustnej, dziąseł i przyzębia, jak Candida albicans, Porphyromonas gingivalis, Prevotella intermedia czy
120
Streptococcus mutans [Choi i in. 2012]. Udowodniono też, że niektóre bakterie,
w tym gatunki występujące w żwaczu, bakterie kwasu mlekowego z rodzajów
Lactobacillus i Bifidobacterium oraz przedstawiciele Enterococcus, są zdolne do
biotransformacji kwasu linolowego (LA) i α-linolenowego (LNA) do form sprzężonych CLA i CLNA [Ogawa i in. 2005]. Na tej podstawie można wysnuć wniosek, że
wysoka zawartość nienasyconych kwasów tłuszczowych odpowiadała za inhibitorowy
wpływ spiruliny na EC, BAC i EUB. Co więcej, wspomniane doniesienia tłumaczyłyby, dlaczego spirulina nie hamowała wzrostu LCB i RUMI, a w niskich stężeniach
działała nawet stymulująco na wzrost EN.
Wracając do jagód goji i pokrzywy, należy zauważyć, że obecne w nich nienasycone kwasy tłuszczowe nie mają wysokiego stężenia, w związku z czym mógł się
uwidocznić stymulujący potencjał tych ekstraktów związany z obecnością składników
mineralnych (Fe, K, Mg, Ca). W skład jagód goji wchodzi także LBP, polisacharyd
złożony z licznych monocukrów, wśród których dominują kwas D-galakturonowy,
D-galaktoza i L-arabinoza [He i in. 2012]. Doświadczenia z BAC prowadzono w medium pozbawionym poligalakturonianu, zatem wzbogacenie go w ekstrakt z jagód
goji, zawierający nie tylko galakturonian, ale także niezbędne minerały (Fe, Mg, K,
Ca), mogło spowodować wzrost liczebności BAC. Wzbogacenie medium w te cukry
mogło także odpowiadać za zaobserwowany intensywniejszy wzrost EC pod wpływem
ekstraktu z goji. Wykazano bowiem, że mannoza, galaktoza, glukozamina, mucyna
oraz kwasy glukonowy, glukuronowy i galakturonowy stymulują wzrost E. coli [Fox
i in. 2009]. Liczne gatunki bakterii jelitowych mają potencjał metaboliczny do wykorzystywania cukrów, tym bardziej że wiele z nich to typowe składniki mucyny
obecnej w przewodzie pokarmowym człowieka. Nie dziwi więc zdolność badanych
bakterii do wykorzystania tych cukrów. Co więcej, wykazano, że Ruminococcus może
wykorzystywać również cukry pięciowęglowe, takie jak arabinoza, ryboza i ksyloza
[Thurston i in. 1994], co mogłoby wyjaśnić stymulowanie przez ekstrakt z jagód goji
wzrostu tej bakterii.
Któryś ze składników obecnych w jagodach goji działa jednak hamująco na
Enterococcus i Eubacterium. Można było przypuszczać, że wśród potencjalnych inhibitorów znajdą się polifenole, gdyż charakteryzują się powszechnie znaną aktywnością antybakteryjną. W jagodach goji oznaczono znaczne ilości kwasu galusowego,
florydzyny, rutyny i procyjanidyny B1 (tab. 14). Za potencjał inhibitorowy nie odpowiadała rutyna, gdyż jej wpływ na badane bakterie, i w to w szerszym zakresie
stężeń, był neutralny (tab. 17). Co więcej, z badanych w tej pracy polifenoli jedynie
kemferol istotnie hamował wzrost EUB. Z kolei na EN hamujący wpływ miały przede
wszystkim rezweratrol, naringenina i kwercetyna oraz w mniejszym stopniu kemferol. Żaden z tych związków nie występował w jagodach goji w ilości, która mogłaby
uzasadniać ich inhibitorowy wpływ na EUB i EN (tab. 14). Wpływu czystych roztworów kwasu galusowego, florydzyny czy procyjanidyny B1 nie badano, jednak te
składniki obecne są także w dużych ilościach w ekstraktach z czosnku niedźwiedzie-
121
go, czarnego bzu i pokrzywy. O ile wszystkie te ekstrakty działały bakteriostatycznie
wobec Enterococcus, o tyle pokrzywa stymulowała wzrost Eubacterium, co podaje
w wątpliwość udział wymienionych polifenoli w hamowaniu, przynajmniej w odniesieniu do EUB. Z pozostałych badanych surowców, kwas galusowy i florydzynę
w znacznych ilościach zawierały także brusznica, malina, cytryniec chiński, pigwowiec,
soja i dereń (tab. 13 i 14). W większości przypadków ekstrakty te działały hamująco
zarówno na EN, jak i na EUB, co mogłoby sugerować, że to kwas galusowy i florydzyna odpowiadają za hamowanie wzrostu tych dwóch gatunków bakterii. Wyniki
przedstawione w tabeli 17 nie potwierdzają jednak tej hipotezy, okazało się bowiem,
że florydzyna w stężeniu 250 µg/ml stymulowała nieznacznie wzrost Eubacterium.
Być może, do inhibitorowego działania potrzebna jest obecność obydwu tych polifenoli. Niestety, w tej pracy nie badano oddziaływania samego kwasu galusowego
ani wpływu florydzyny w połączeniu z kwasem galusowym. Nadal jednak rola kwasu galusowego i florydzyny budzi wątpliwości, tym bardziej że zastanawiający wynik
uzyskano dla ekstraktu z derenia, który jako jedyny poza pokrzywą stymulował wzrost
EUB. Jest to owoc szczególnie bogaty w procyjanidynę B1, cyjanidyno-3-O-glukozyd,
kwas galusowy i florydzynę (ale w przeciwieństwie do pokrzywy nie zawiera glikozydów apigeniny) (tab. 14), ale także w cukry proste (glukozę, fruktozę), kwas linolowy, wapń, magnez, miedź i żelazo. Przyjmując, że kwas galusowy i florydzyna mają
działanie hamujące, należy wnioskować, że to któryś z pozostałych składników tego
owocu znacząco zwiększa liczebność Eubacterium. W swoich badaniach Simmering
i inni [2002] wykazali, co prawda, że namnażanie się Eubacterium ramulus w jelicie
może być stymulowane poprzez suplementację diety rutyną i kwercetyną, zaś flawonoidy te są degradowane przez E. ramulus, ale wyników tych nie można bezkrytycznie odnieść do rezultatów uzyskanych w tej pracy. Wykorzystano w niej bowiem inny
gatunek – Eubacterium cylindroides – i stwierdzono, że obecność 50 µg/ml kwercetyny powodowała raczej zmniejszanie liczebności populacji tej bakterii niż stymulację jej wzrostu, a rutyna nie miała żadnego wpływu w badanym zakresie stężeń
(20–250 µg/ml) (tab. 17).
Wydaje się słuszne kontynuowanie badań w celu znalezienia składnika jagód
goji o wspomnianym silnym działaniu hamującym wobec EUB. Jest to o tyle pożądane, że Eubacterium to dość liczebny rodzaj bakterii jelitowych, które izoluje się
także z jamy ustnej oraz pochwy i moczu zdrowych kobiet. Najpowszechniejsze
gatunki to E. aerofaciens, E. cylindroides, E. lentum (dawniej Eggerthella lenta) oraz
E. rectale. Chociaż jest typowym przedstawicielem mikrobioty jelitowej, to niektóre
gatunki tego rodzaju są patogenami. Dotychczas wykazano powiązanie Eubacterium
z chorobami przyzębia (E. yurii, E. nodatum), stanami zapalnymi stawów i niektórymi nowotworami (E. lentum, E. limosum, E. callanderi), a nawet z bakteriemią
[Margaret i in. 1990, Zhang i in. 2001]. Antygen choriogonadotropinopodobny
(związany z błoną antygen obecny we wszystkich komórkach uznanych za nowotworowe) wykryto u E. lentum wyizolowanego z nowotworu odbytu, ale nie był on
122
obecny u innych, niepowiązanych w nowotworami gatunków. Sugeruje to korelację
między obecnością tego antygenu u bakterii a ich „powiązaniem z rakiem” [Acevedo
i in. 1979]. E. aerofaciens jest typowym przedstawicielem mikrobioty jelitowej.
Obserwowano, że niektóre jego szczepy, mające peptydoglikan o typie A4α, indukowały przewlekłe zapalenie stawów, podczas gdy szczepy o peptydoglikanie typu
A4β wywoływały tylko przejściowy stan zapalny [Zhang i in. 2001]. Ten pierwszy był
znacznie silniejszym induktorem produkcji cytokin prozapalnych, a jednocześnie był
mniej podatny na działanie enzymów degradujących, np. lizozymu. Dlatego poszukiwane są skuteczne sposoby na ograniczenie populacji tych bakterii, zanim doprowadzą do rozwoju choroby.
Należy podkreślić, że Eubacterium cylindroides okazał się najbardziej wrażliwym
gatunkiem spośród badanych bakterii jelitowych. Istotne statystycznie, dawkozależne
zahamowanie namnażania się tej bakterii nastąpiło pod wpływem większości badanych
surowców, przy czym spadek liczebności populacji o co najmniej 95%, w stosunku
do odpowiedniej kontroli, wykazano w przypadku 5% Citroseptu (MIC = 5%) oraz
najwyższych stężeń etanolowych ekstraktów z pigwowca (MIC = 2,5%), żurawiny,
goji, brusznicy, cytryńca chińskiego, maliny, soi, zielonej herbaty i spiruliny (dla tych
ekstraktów wartość MIC wynosiła 5%).
Jak już napisano wcześniej, do najważniejszych polifenoli zidentyfikowanych
w Citrosepcie należały rutyna, kwas p-kumarowy, naringina, hesperydyna, kwas
galusowy oraz – w mniejszych ilościach – procyjanidyna B1, kwercetyna, naringenina, hesperetyna i cyjanidyno-3-O-glukozyd (tab. 12). Ani rutyna, ani hesperydyna i naringina nie wykazywały żadnego wpływu na Eubacterium, podczas gdy kwercetyna, hesperetyna i naringenina, w stężeniu 250 µg/ml, działały nieznacznie
hamująco (tab. 17). Biorąc pod uwagę oznaczoną zawartość tych związków
w Citrosepcie (aglikony flawanonów na poziomie 2 mg/100 ml, kwercetyna
0,6 mg/100 ml) (tab. 11 i 12), trzeba zauważyć, że ich ilość w medium, do którego
dodano Citrosept w stężeniu 5%, była mniejsza od 1 µg/ml. Nie ma zatem możliwości, aby w takim stężeniu odpowiadały za efekt bakteriobójczy Citroseptu.
Zadziwia jednak niska wrażliwość EUB na naringeninę, związek ten bowiem działał silnie bakteriobójczo na większość badanych bakterii jelitowych, a efekt bakteriostatyczny wobec E. coli był silniejszy niż wobec EUB (tab. 17). Co więcej,
Eubacterium wydaje się generalnie dość wrażliwą bakterią, o czym świadczy także
bardzo niska wartość MIC, jaką wyznaczono dla chloramfenikolu A (ChlA), wynosząca zaledwie 0,2% (tab. 18). Podobną wrażliwość na ten antybiotyk wykazywały
jedynie Lactobacillus i Bacteroides, podczas gdy w przypadku pozostałych gatunków
minimalne stężenie hamujące dla ChlA kształtowało się między 1 a 5%.
Zgodnie z oczekiwaniami, potwierdzono hamujące działanie żurawiny wobec
E. coli, choć silniejsze zahamowanie wzrostu wykazano w stosunku do LCB i EUB.
Inni autory wcześniej zauważyli, że ekstrakty z żurawiny hamują wzrost E. coli
(MIC = 1,25 mg/ml), ale także E. aerogenes, S. aureus (MIC = 0,391 mg/ml)
123
i K. pneumoniae (MIC = 0,0195 mg/ml) [Rahbar i Diba 2010]. Wykazali również
hamujący wpływ soku żurawinowego na patogenne mikroorganizmy E. coli i S. aureus, a także Salmonella spp., Listeria monocytogenes i Pseudomonas aeruginosa
[Rahbar i Diba 2010]. Zdolność hamowania E. coli przez żurawinę i jej przetwory
przypisuje się przede wszystkim szczególnej budowie procyjanidyn, które w żurawinie mają wiązania typu A, natomiast w innych owocach – typu B. Prawdopodobnie
obecność tego szczególnego typu związków zapobiega adhezji uropatogennych szczepów E. coli o fimbriach typu P (typu 1 – o powinowactwie do dróg moczowych) do
komórek uroepitelium [Howell i in. 2005]. W tej pracy nie badano procyjanidyn
typu A, zajmowano się tylko związkami typu B. Procyjanidynę B1 wykryto w pokrzywie, czosnku niedźwiedzim, czarnym bzie, dereniu i jagodach goji, a procyjanidy
nę B2 – w borówce brusznicy i czosnku niedźwiedzim. Z tych surowców pokrzywa
i jagody goji, a także w niskich stężeniach czosnek i bez stymulowały wzrost EC,
co raczej wyklucza możliwość hamowania tej bakterii przez procyjanidyny B1 i B2.
W przeprowadzonych badaniach wykazano antybakteryjne działanie ekstraktu
z pigwowca japońskiego wobec EUB, BAC, EN i EC. Inni autorzy, badając efekt
przeciwdrobnoustrojowy ekstraktu ze skórek pigwowca wobec Gram-dodatniej bakterii S. aureus, Gram-ujemnych E. coli i P. aeruginosa oraz grzybów C. albicans,
powiązali go z obecnością kwasu chlorogenowego, który działał synergistycznie
z innymi składnikami ekstraktu [Gyawali i Ibrahim 2014]; mechanizm działania
polegał prawdopodobnie na uszkadzaniu błon komórkowych. Zawartość kwasu
chlorogenowego, oznaczona w ekstrakcie z pigwowca, była znacznie niższa niż w ekstraktach z czosnku czy jagód goji (tab. 13 i 14), które na wiele bakterii działały
stymulująco.
Niektóre ekstrakty zawierają polifenole o niskim potencjale antyoksydacyjnym
i występujące w nieznacznych stężeniach, mimo to kombinacja kilku takich związków
może wywierać synergistyczny efekt antybakteryjny. Udowodniono, że mieszaniny
kwasów galusowego i protokatechowego, galusowego i kawowego lub rutyny z kwercetyną skutecznie hamują Escherichia coli ATCC 35218 w temperaturze 20°C, zaś
najwydajniejsze w temperaturze 4°C są mieszaniny rutyny z kwercetyną oraz kwasów
galusowego z kawowym [Rodríguez Vaquero i in. 2010]. Być może, dopiero synergistyczne działanie kilku polifenoli jest niezbędne do wywarcia efektu inhibitorowego. Kwas galusowy i kawowy w dużych stężeniach zidentyfikowano w ekstrakcie
z zielonej herbaty, który miał bakteriostatyczny wpływ na EC. Z kolei znaczne ilości
kwasu galusowego i protokatechowego oraz kwercetynę i rutynę zawierał ekstrakt
z czosnku niedźwiedziego, również o działaniu inhibitorowym w stosunku do tej
bakterii (tab. 20).
Biorąc pod uwagę wyniki chromatograficzne składu polifenolowego (tab. 12–14)
użytych w doświadczeniach surowców, należy uznać za mało prawdopodobne, by za
efektem działania danego ekstraktu czy preparatu stały wyłącznie związki polifenolowe. W wielu przypadkach bogata w daną substancję roślina hamowała wzrost
124
bakterii, podczas gdy inna, również ją zawierająca, stymulowała ten wzrost. Wyraźnie
więc widać, że liczy się tutaj całościowy skład rośliny oraz oddziaływania synergistyczne i antagonistyczne obecnych w niej związków.
Na przykład, ekstrakt z zielonej herbaty hamował wzrost większości badanych
bakterii, z wyjątkiem R. gauvreauii i Lactobacillus sp. Stymulacja LCB była dawkozależna, co świadczy o obecności w herbacie składnika, który w sposób aktywny
stymulował tę bakterię lub był przez nią wykorzystywany do procesów metabolicznych.
Z punktu widzenia technologów żywności, ale także klinicystów, jest to korzystne
zjawisko, gdyż bakterie z rodzaju Lactobacillus stanowią pożądany element mikrobioty jelitowej. Zielona herbata była szczególnie bogata w katechiny (EGC, ECAT,
EGCG, CAT), kwasy galusowy i kawowy, kwercetynę i jej glikozydy oraz w kemferol, zawierała też stosunkowo dużo rezweratrolu (tab. 13). Jak wykazano, spośród
tych składników (+)-katechina słabo hamowała wzrost EN i EUB, natomiast rez
weratrol, kemferol i kwercetyna miały bardzo silne działanie inhibitorowe (tab. 17),
co może wyjaśniać hamujący wpływ ekstraktu z zielonej herbaty na rozwój BAC,
EUB i EN, ale stoi w sprzeczności z jego oddziaływaniem na LCB i RUMI. Chociaż
sam rezweratrol był bakteriobójczy wobec tych dwóch gatunków, a kwercetyna i kemferol działały bakteriostatycznie (LCB) lub bakteriobójczo (RUMI), to bakterie te
hodowane w obecności ekstraktu z zielonej herbaty były stymulowane, a nie – jak
należałoby oczekiwać – hamowane. Ponieważ nie badano wpływu czystych kwasów
fenolowych ani pozostałych flawan-3-oli na te mikroorganizmy, nie można wykluczyć
ich wpływu. Z danych literaturowych wiadomo jednak, że składniki zielonej herbaty hamują bakterie, głównie gatunki patogenne z rodzajów Staphylococcus,
Streptococcus, Clostridium i Bacillus, a także E. coli, H. pylori, M. tuberculosis i P. aeruginosa [Bansal i in. 2013]. Inni badacze z kolei wykazali, że nie wpływają one na
Escherichia i Eubacterium, a w niskich stężeniach mogą nawet stymulować wzrost
bakterii kwasu mlekowego Lactobacillus i Bifidobacterium [Ahn i in. 1990]. Główną
rolę inhibitorową przypisuje się EGCG, ale bierze się też pod uwagę polimerowe
taniny. Co ciekawe, Lactobacillus może wykorzystywać te związki, gdyż jako jedyny
z testowanych mikroorganizmów wytwarza enzym tanazę [Belur i Mugeraya 2005].
Powstający w wyniku rozpadu tanin kwas galusowy jest potem łatwo rozkładany do
alifatycznych kwasów, które są wykorzystywane przez bakterie do swojego metabolizmu w cyklu kwasu cytrynowego. Bogate w kwas galusowy były także dereń, jagody goji, czarny bez, czosnek niedźwiedzi, soja i pokrzywa. Wszystkie te surowce
stymulowały wzrost LCB. Wydaje się jednak, że obecność kwasu galusowego nie jest
warunkiem wystarczającym do stymulacji, gdyż zawierający znaczne ilości tego kwasu cytryniec chiński hamował LCB.
Jako jeden z nielicznych badanych ekstraktów, ekstrakt z czerwonej cebuli w stężeniu 5% silnie hamował wzrost Lactobacillus, co powinno być brane pod uwagę
w kuracjach antybakteryjnych, do których często wykorzystuje się to warzywo.
Znaczące spożycie cebuli nie tylko ograniczy wzrost patogenu, ale zaburzy delikat-
125
ną równowagę w składzie mikrobioty jelitowej, zmniejszając liczebność bakterii
z rodzajów Lactobacillus, Enterococcus, Escherichia i Eubacterium, a zwiększając
liczebność Bacteroides, co ostatecznie może mieć negatywny wpływ na funkcjonowanie osłabionego infekcją organizmu.
Zaskakujące wyniki uzyskano dla ekstraktu z soi, który bardzo silnie, dawkozależnie hamował wzrost EUB, w mniejszym stopniu także EC i EN, za to stymulował
LCB i BAC. Bardzo specyficzna dla soi jest obecność izoflawonów, głównie daidzyny, daidzeiny i genisteiny. Z uwagi na wysokie stężenia tych związków, różnorodne
preparaty i suplementy wytworzone z soi są dość powszechnie stosowane przez
kobiety pragnące osłabić nieprzyjemne objawy menopauzy. Preparaty te zawierają
fitohormony, które wchodzą w interakcję z niezwykle precyzyjnym w działaniu układem hormonalnym kobiety, należy zatem zachować szczególną ostrożność w ich
stosowaniu i dawkowaniu. Przyjmuje się, że dawka izoflawonów sojowych, jaką
przyjmują Azjatki (u których negatywne objawy menopauzy nie są zbyt silne), to
50–100 mg, jednak suplementacja diety taką ilością tych fitohormonów wcale nie
musi wywoływać fizjologicznych efektów u innych kobiet. Wszystko zależy od składu
ich mikrobioty jelitowej, a dokładniej od obecności bakterii, które z daidzeiny wytworzą aktywne biologicznie metabolity, tj. ekwol i/lub O-desmetylangolensynę. Tylko
nieliczne gatunki bakterii są zdolne do przeprowadzania takiej reakcji (lub jej etapów). Wśród już poznanych znajdują się Eubacterium ramulus, Ruminococcus productus, Enterococcus faecium, Lactobacillus mucosae i Bacteroides ovatus [Atkinson
i in. 2005, Yokoyama i Suzuki 2008, Setchell i Clerici 2010a, b]. Nie oznacza to
jednak, że gatunki bakterii badane w tej pracy, a należące do tych samych rodzajów,
będą zdolne do biotransformacji daidzeiny. Nasiona soi zawierają dużo białka oraz
nienasyconych kwasów tłuszczowych, głównie linolenowego i oleinowego, co również
mogło przyczynić się do zahamowania wzrostu EUB, ale także EC. Silne zahamowanie wzrostu EUB mogło wynikać z obecności w nasionach soi inhibitora trypsyny,
jednego z inhibitorów proteazy serynowej. Wykazano, że inhibitory proteaz działają przeciwdrobnoustrojowo, a aktywność tę przypisuje się zahamowaniu bakteryjnych
proteaz zaangażowanych w różne procesy fizjologiczne. Ponadto inhibitory wchodzą
w interakcje ze ścianami komórkowymi lub białkami błon plazmatycznych, co prowadzi do zmiany przepuszczalności błon i do śmierci komórek [Li i in. 2007, Paiva
i in. 2013].
Warto jeszcze zwrócić uwagę na działanie czosnku niedźwiedziego, który w najwyższym użytym stężeniu silnie hamował Eubacterium cylindroides oraz słabiej
Escherichia coli i Enterococcus caccae, natomiast stymulował wzrost Lactobacillus
sp., Ruminococcus gauvreauii i Bacteroides galacturonicus. Jak już wspomniano
wcześniej, czosnek niedźwiedzi jest zwyczajowo stosowany w Niemczech w celu
regeneracji flory bakteryjnej jelit po kuracjach antybiotykowych [Reuter 1995, Sendl
1995]. Wyniki tej pracy potwierdzają jego skuteczność w promowaniu wzrostu pożytecznych rodzajów bakterii, w tym Lactobacillus.
126
Uzyskane wyniki wskazują, że należy odrzucić pierwszą hipotezę badawczą sformułowaną w tej pracy. Naturalne składniki przeciwutleniające oraz związki polifenolowe zawarte w surowcach roślinnych mogą wywierać silne inhibitorowe działanie na
bakterie będące przedstawicielami fizjologicznej mikrobioty jelitowej. Najmniej wrażliwy na działanie badanych ekstraktów okazał się Ruminococcus gauvreauii. Jedynie
po zastosowaniu ekstraktu z cytryńca chińskiego oraz Citroseptu uzyskano zahamowanie wzrostu tej bakterii. W przypadku RUMI zwiększenie liczebności można uzyskać
poprzez dodatek bioaktywnych składników zawartych w spirulinie, czerwonej cebuli,
jagodach goji, czarnym bzie oraz soku z noni. Z kolei wobec Enterococcus caccae
wszystkie badane ekstrakty, z wyjątkiem spiruliny w stężeniu 1–2,5%, wykazywały
działanie bakteriostatyczne. Dość wrażliwym gatunkiem był także Eubacterium cylindroides, którego wzrost hamowała większość badanych ekstraktów, z wyjątkiem wyciągów z derenia i pokrzywy w stężeniu 5% (stymulacja wzrostu). Tylko ekstrakty
z cytryńca chińskiego znacząco hamowały wzrost wszystkich badanych bakterii jelitowych (MIC ≥ 5%), co stwarza możliwość ich zastosowania do eliminacji niepożądanych
gatunków mikrobioty jelitowej, przed suplementacją gatunkami pożądanymi. Podobne
zastosowanie może również znaleźć ekstrakt z miąższu i pestek grejpfruta (Citrosept),
który hamował wzrost badanych bakterii oprócz LCB, oraz owoce pigwowca, które
działały silnie hamująco na BAC (MIC = 5%) i EUB (MIC = 2,5%). O hamującym
wpływie ekstraktu z grejpfruta warto pamiętać także w kontekście interakcji jego
składników z enzymami odpowiadającymi za metabolizm leków.
Wiele firm farmaceutycznych czyni starania, by w niedalekiej przyszłości wprowadzić na rynek preparaty zaprojektowane tak, by docelowo zmniejszyć lub zwiększyć liczebność konkretnej grupy drobnoustrojów wchodzących w skład naszej mikrobioty. Dzięki temu można będzie skuteczniej prowadzić profilaktykę otyłości,
cukrzycy i niektórych nowotworów czy leczyć choroby metaboliczne lub przewlekłe
w obrębie przewodu pokarmowego (nietolerancje pokarmowe, IBD, chorobę
Crohna). Do wzbogacenia mikrobioty jelitowej w populację Bacteroides galacturonicus można wykorzystać bioaktywne składniki pokrzywy, maliny, żurawiny, derenia,
czerwonej cebuli oraz jagód goji. Liczebność Bifidobacterium catenulatum natomiast
można zwiększyć poprzez suplementację diety sokiem z noni, zaś do stymulacji
wzrostu Lactobacillus można wykorzystać składniki bioaktywne z pigwowca, czosnku niedźwiedziego, pokrzywy, brusznicy, soi, zielonej herbaty, Citroseptu, jagód goji,
czarnego bzu lub noni. Surowce te mogą być zatem z powodzeniem stosowane do
jogurtów jako składniki smakowe, a zarazem wzbogacające te artykuły w naturalne
związki przeciwutleniające. Do produktów zawierających żywe kultury bakterii z rodzaju Lactobacillus nie zaleca się natomiast dodawania ekstraktów z owoców żurawiny i cytryńca chińskiego czy z cebuli ani też tych materiałów roślinnych w postaci
liofilizowanej czy suszonej.
W przeprowadzonych doświadczeniach większość preparatów działała stymulująco wobec LCB, BAC i RUMI. Zwiększenie się liczebności populacji RUMI i BAC
127
może wynikać jednak z faktu, że zastosowane media, umożliwiające ocenę liczebności bakterii przez pomiar densytometryczny, były uboższe w składniki w stosunku
do zalecanych pożywek. Niedobór niektórych składników (np. jonów metali, witamin)
mógł odpowiadać za to, że po ich wprowadzeniu do tego środowiska wraz z ekstraktami stwierdzano znaczący wzrost liczby komórek bakterii. Z pewnością konieczne
będzie przeprowadzenie dodatkowych badań, w których liczebność RUMI i BAC
zostanie oceniona za pomocą innych metod, w optymalnych dla rozwoju tych bakterii mediach.
Zróżnicowany wpływ roślin (hamujący lub stymulujący) na poszczególne gatunki bakterii potwierdza pogląd, że przez dobór odpowiedniej diety można znacząco polepszyć stan zdrowia człowieka. Wskutek promowania wzrostu konkretnych
gatunków bakterii w mikrobiocie jelitowej zmieni się metabolizm mikrobiomu
w sposób pożądany dla konkretnego organizmu, co ułatwi leczenie choroby. Różnice
wpływu związków roślinnych na gatunki bakterii wyjaśniają też zróżnicowanie
składu mikrobioty w zależności od nawyków żywieniowych, co widać na przykładzie
przebadanych populacji z Japonii, Skandynawii, USA czy Afryki. Mikrobioty poszczególnych grup dostosowują się do rodzaju pokarmu najczęściej spożywanego
w danym regionie. Różnice rodzajów przyjmowanego pokarmu implikują też odmienną zapadalność na poszczególne choroby, jako że poszczególni członkowie
mikrobioty promują lub hamują występowanie określonych jednostek chorobowych.
Dlatego na przykład w krajach Dalekiego Wschodu rzadziej niż gdzie indziej mamy
do czynienia z objawami menopauzy (dieta bogata w fitoestrogeny z soi w kombinacji z mikrobiotą zdolną do ich przemian metabolicznych w kierunku składników
aktywnych biologicznie), a w Ameryce Północnej – częściej z otyłością. Te różnice
oczywiście będą się zacierać, ze względu na mieszanie się populacji (podróże,
migracja), jak i globalizację handlu. Dziś w Polsce możemy jeść to samo, co
w Japonii, gdyż sprowadzenie danej potrawy jest tylko kwestią ceny. Być może, za
kilkadziesiąt czy kilkaset lat zróżnicowanie mikrobiomów w ramach populacji
ludzkiej zaniknie lub znacząco się zmniejszy.
4.4. Wpływ bakterii jelitowych na potencjał antyoksydacyjny
polifenoli zawartych w diecie
Kolejny etap badań miał na celu weryfikację hipotezy badawczej mówiącej, że gatunki bakteri stanowiące fizjologiczną mikrobiotę jelita ludzkiego zwiększają, na
skutek swojego metabolizmu, potencjał antyoksydacyjny bioaktywnych składników
obecnych w surowcach roślinnych.
Aby zweryfikować tę hipotezę, poszczególne gatunki bakterii jelitowych inkubowano przez 24 h w medium zawierającym badany składnik (pojedynczy polifenol
128
lub ekstrakt czy preparat) w różnym stężeniu, po czym całość wirowano, a w nadsączu oznaczano potencjał antyoksydacyjny (AOX) metodą z rodnikiem ABTS.
Aby ułatwić porównywanie wyników uzyskanych dla poszczególnych związków pod
wpływem różnych gatunków bakterii, uzyskane wartości potencjału AOX przedstawiano jako procent potencjału AOX odpowiedniej kontroli pozytywnej.
Przygotowano następujące kontrole: czyste medium bez żadnego dodatku (Kpoz),
medium bez dodatku polifenolu/ekstraktu inkubowane w obecności danej bakterii
(Kpoz_b), medium z dodatkiem polifenolu/ekstraktu w danym stężeniu, inkubowane
w takich samych warunkach jak próba właściwa, ale bez bakterii, oraz kontrole
rozpuszczalnikowe. Nie zaobserwowano istotnego wpływu zastosowanych w doświadczeniach stężeń rozpuszczalników, tj. etanolu i DMSO, na zdolność zmiatania rodnika ABTS.
Tak jak się spodziewano, czyste media bardzo się różniły potencjałem antyoksydacyjnym (tab. 23). W skład pożywek wchodzi dużo związków, z których wiele
wykazuje zdolności przeciwrodnikowe, chelatujące lub redukujące (tab. 3–9).
Szczególnie obfite w te substancje są bardzo złożone podłoża dla anaerobów, zawierające rozmaite aminokwasy (w tym tryptofan, tyrozynę, L-cysteinę, metioninę),
resazurynę, ale także ekstrakty (sojowy, drożdżowy, mięsny), witaminy i minerały.
Zaskakujące były jednak różnice zanotowane dla poszczególnych etapów badań.
Doświadczenia nad wpływem bakterii na czyste polifenole przeprowadzano w roku
2012, podczas gdy nad wpływem bakterii na ekstrakty/preparaty – w roku 2013.
Media przygotowywano zgodnie z tymi samymi recepturami i w ten sam sposób,
jednak w wielu przypadkach z nowych partii odczynników. Zaobserwowano znaczące różnice potencjału AOX między podłożami przygotowanymi w kolejnych
latach, a nawet – o czym świadczy duży błąd standardowy – między poszczególnymi partiami odczynników stosowanych w tym samym roku. Dlatego też do obliczeń
jako wartość wyjściową zawsze przyjmowano wartość potencjału AOX dla odpowiedniego medium hodowlanego przygotowanego w tym samym dniu co dana
próba właściwa (kontrola pozytywna – 100%). W wielu przypadkach zaobserwowano, że aktywność metaboliczna bakterii spowodowała zmiany potencjału AOX
czystych pożywek bez dodatków. Mogło to wynikać z wykorzystania przez drobnoustroje niektórych przeciwutleniających składników medium (aminokwasów,
witamin) lub ze zmiany pH spowodowanej metabolizmem bakterii i wytwarzanymi
przez nie metabolitami. Collins i inni [1998] wykazali na przykład, że kationorodnik ABTS może być redukowany, z powrotem do swojej bezbarwnej i nieaktywnej
postaci, przez fizjologicznie występujące kwasy organiczne, w największym stopniu
przez malonowy, szczawiowy i glioksalowy. Wytwarzanie kwasów przez bakterie
spowoduje więc zafałszowanie wyniku, gdyż na skutek zwiększenia się ilości zredukowanych rodników uzyskane wartości potencjału AOX będą wyższe. Aby zmniejszyć wynikający z takich przekłamań błąd, przyjęto osobne kontrole. Dla zbadania
zmian potencjału antyoksydacyjnego poszczególnych pożywek na skutek wzboga-
Warunki / Conditions
486,6 ± 12,3
493,2 ± 27,5
410,3 ± 53,0
505,7 ± 3,4
ENM
163,9 ± 58,5
224,7 ± 57,0
115,3 ± 8,5
171,3 ± 9,2
LCBM
mikroaerofilowe / microaerophilic
8,87 ± 5,9
18,1 ± 6,94
czyste podłoże (M)
pure medium (M)
podłoże + bakterie (M+b)
medium + bacteria (M+b)
24,5 ± 5,9
41,4 ± 7,2
ECM
podłoże + bakterie (M+b)
medium + bacteria (M+b)
czyste podłoże (M)
pure medium (M)
Podłoże / Medium
760,4 ± 153,4
894,6 ± 27,5
357,8 ± 2,6
477,6 ± 3,7
BFM
256,2 ± 86,0
317,2 ± 127,4
388,6 ± 21,9
402,5 ± 80,1
RUMIM
EUBM
anaerobowe / anaerobic
403,2 ± 70,4
384,3 ± 16,7
604,9 ± 19,9
511,7 ± 101,0
BACM
ECM – medium for Escherichia coli (nutrient broth), ENM – medium for Enterococcus (TSYEM, microaerophilic conditions), LCBM – medium for
Lactobacillus (MRS broth), BACM – medium for Bacteroides (ST medium), BFM – medium for Bifidobacterium, RUMIM/EUBM – medium for Ruminococcus
and Eubacterium (TSYEM, anaerobic conditions)
ECM – podłoże dla Escherichia coli (bulion odżywczy), ENM – podłoże dla Enterococcus (TSYEM, warunki mikroaerofilowe), LCBM – podłoże dla
Lactobacillus (MRS), BACM – podłoże dla Bacteroides (ST), BFM – podłoże dla Bifidobacterium, RUMIM/EUBM – podłoże dla Ruminococcus
i Eubacterium (TSYEM, warunki anaerobowe)
2013
2012
Rok badań
Study year
Tabela 23. Potencjał antyoksydacyjny podłoży mikrobiologicznych wykorzystanych w badaniach (mg troloksu/100 ml podłoża; średnia ± SD,
n ≥ 5)
Table 23. Antioxidant potential of bacteriological media used in the study (mg Trolox/100 ml medium; mean ± SD, n ≥ 5)
129
130
cania różnymi dawkami polifenolu/ekstraktu uzyskane wartości odnoszono do
wyniku uzyskanego dla kontroli pozytywnej (Kpoz), czyli tego samego medium bez
żadnych dodatków i nieinokulowanego bakteriami, i wyrażano jako % Kpoz. Z kolei wartości potencjału AOX medium wzbogaconego i poddanego działaniu danego gatunku bakterii odnoszono do wyniku otrzymanego dla medium bez dodatku
polifenolu/ekstraktu, inkubowanego w obecności danej bakterii (Kpoz_b), i wyrażano jako %Kpoz_b.
Wyniki uzyskane dla czystych roztworów polifenoli przedstawiono w tabelach
24–26, a dla ekstraktów i preparatów – w tabelach 27–29. Podano też wyliczone wartości współczynnika interakcji (WI), które świadczą o zwiększeniu (WI > 1) bądź
zmniejszeniu (WI < 1) potencjału antyoksydacyjnego pod wpływem bakterii. Należy
przy tym wyraźnie zaznaczyć, że obniżenie się potencjału antyoksydacyjnego pożywki
pod wpływem bakterii nie jest jednoznaczne z przemianami polifenoli w stronę metabolitów o niższym potencjale antyoksydacyjnym. Taki spadek może wynikać także
z wiązania przeciwutleniaczy do makromolekuł obecnych w medium, z wykorzystania
przez bakterie składników pożywki o potencjale przeciwrodnikowym na potrzeby
własnego metabolizmu oraz ze zmian pH i/lub hydrofobowości pożywki na skutek
metabolizmu bakterii (co zmienia zdolność reagowania polifenoli z rodnikiem ABTS).
Analiza wyników dotyczących potencjału antyoksydacyjnego podłoży wzbogacanych związkami polifenolowymi lub ekstraktami roślinnymi (tab. 24–29) po inkubacji z bakteriami lub bez bakterii pozwoliła na rozpoznanie kilku typów zmian, które
zostały omówione poniżej.
Pierwszy, najbardziej oczywisty i oczekiwany typ zmian występuje wtedy, gdy
dodanie polifenolu lub ekstraktu w rosnącym stężeniu powoduje proporcjonalny
wzrost potencjału AOX medium, w stosunku do czystego podłoża. Jak już wspomniano, wyjściowe medium zawiera składniki, które mają własną zdolność zmiatania
rodnika ABTS (tab. 23), i dodanie polifenoli – związków o właściwościach przeciwutleniających – powoduje zwiększenie tego potencjału. Szczególnie dobrze widać
taki rodzaj zmian w prostym medium, o niskim bazowym potencjale antyoksydacyjnym, jakim jest bulion odżywczy dla Escherichia coli. W zależności od rodzaju dodanego czystego polifenolu i jego stężenia, zanotowane wartości końcowe potencjału AOX kształtowały się w zakresie od ok. 108% do nieco ponad 553% wartości
wyjściowej (tab. 24). W przypadku wzbogacania ekstraktami lub preparatami zwiększenie potencjału antyoksydacyjnego było znacznie większe – uzyskano wartości od
ok. 117% do prawie 1431% wyjściowego potencjału antyoksydacyjnego oznaczonego dla tego medium (tab. 27). Gdy do doświadczeń stosowano bardziej złożone
media, o wyższym bazowym potencjale AOX, różnice wywołane dodatkiem polifenolu lub ekstraktu nie były już tak spektakularne. Nadal, co prawda, następował
wzrost potencjału o kilkanaście do kilkudziesięciu procent, ale wartości końcowe
nie przekraczały więcej niż 2,5- i 3,5-krotnie (odpowiednio dla pojedynczych polifenoli i ekstraktów) wartości bazowej (tab. 24–29).
131
W wielu przypadkach zaobserwowano, że przy niskich stężeniach dodatków
polifenoli (w postaci roztworu czystego związku lub ekstraktu/preparatu) potencjał
antyoksydacyjny medium wzbogaconego był niższy niż kontrolnego. Oznacza to, że
doszło do reakcji między polifenolami a składnikami medium, co doprowadziło do
zablokowania grup uczestniczących w zmiataniu rodnika ABTS. Tego typu zmiany
obserwowano między innymi w doświadczeniach z Enterococcus caccae (tab. 25
i 28), Bifidobacterium catenulatum oraz Eubacterium cylindroides (tab. 26). W miarę wzrostu stężenia polifenolu lub ekstraktu potencjał AOX podłoża zwykle się
zwiększał, co odpowiada reakcjom opisanym w pracy przeglądowej przez Le
Bourvellec i Renard [2012]. Według tych autorek, za polifenole szczególnie zaangażowane w interakcje z makromolekułami można uznać taniny, zarówno hydrolizujące (głównie galotaniny), jak i niehydrolizujące, czyli proantocyjanidyny (oligoi polimery flawan-3-oli). Taniny silnie reagują z białkami, zwłaszcza bogatymi
w prolinę lub całkiem hydrofobowymi. Reakcje wiązania polifenoli z proteinami
mogą być odwracalne lub nieodwracalne. W pierwszym przypadku połączenie zachodzi głównie poprzez niekowalencyjne oddziaływania międzycząsteczkowe, tj.
wiązania wodorowe oraz oddziaływania hydrofobowe i van der Waalsa. Oddziaływania
hydrofobowe zachodzą przede wszystkim między aromatycznymi pierścieniami
polifenoli a miejscami hydrofobowymi białek, zaś wiązania wodorowe powstają
przede wszystkim między grupami hydroksylowymi polifenoli a miejscami akceptorowymi dla wodoru w białkach. Połączenia nieodwracalne to wiązania kowalencyjne między polifenolem a makrocząsteczką. Do reakcji, w których powstają, zalicza się także utlenianie składników fenolowych z wytworzeniem o-chinonów
i o-semichinonów oraz rozerwanie w kwaśnym środowisku wiązania pomiędzy flawanami w proantocyjanidynach z wytworzeniem kationu (który łatwiej reaguje
z białkami) [Le Bourvellec i Renard 2012].
Niekowalencyjne połączenie, mimo swojej słabej siły, może być przyczyną wytrącania białek przez polifenole i zaburzania aktywności enzymów (co z kolei może
prowadzić do hamowania wzrostu bakterii). Skutki interakcji polifenol–makrocząsteczka zależą od proporcji między tymi składnikami. Przy niskiej zawartości polifenoli w stosunku do cząsteczek białek powstają kompleksy rozpuszczalne. Wraz ze
wzrostem zawartości polifenolu zmniejsza się rozpuszczalność kompleksów i początkowo zwiększa się ich rozmiar i złożoność, by ostatecznie z roztworu wytrąciły się
białka niejako opłaszczone polifenolami [Le Bourvellec i Renard 2012]. Wydaje się,
że właśnie początkowe etapy tych interakcji wystąpiły w doświadczeniach wykonywanych w tej pracy. Należy jednak zaznaczyć, że interakcje między cząsteczkami
w roztworze zależą również od siły jonowej, temperatury i pH środowiska reakcji
oraz od składu rozpuszczalnika, gdyż powstawanie kompleksów zależy od tworzenia
wiązań wodorowych i zachodzenia interakcji hydrofobowych. O ile rozpuszczalnik
oraz temperatura we wszystkich doświadczeniach były takie same (DMSO dla polifenoli lub etanol dla ekstraktów, 37°C), o tyle pH było różne i zależne od medium,
PHL
N
NR
H
HR
CAT
–
Ø
186,6 ± 18,1 *†a
182,6 ± 13,2 *†a
250
157,1 ± 30,1 *a
20
100
117,5 ± 2,3 *b
250
112,6 ± 8,0 *†b
20
149,9 ± 0,9 *a
229,1 ± 14,5 *†a
100
137,1 ± 13,4 *†b
135,4 ± 19,1 *†b
20
250
106,1 ± 15,1 a
100
110,7 ± 5,0 †a
250
83,4 ± 4,5 *†b
20
100
115,9 ± 14,4 *†a, b
250
128,3 ± 1,5 *†a
20
104,8 ± 7,5 b
212,0 ± 18,3 *†a
100
159,7 ± 14,9 *b
250
188,0 ± 13,5 *†c
100
BACM
100
20
Stężenie końcowe
Final
concentration
[µg/ml]
Polifenol
Polyphenol
100
85,4 ± 9,7 †b
84,7 ± 3,3 *†b
86,7 ± 3,7 *†b
86,3 ± 9,0 *†a
93,5 ± 3,9 a
84,6 ± 0,9 *†a
88,0 ± 6,2 †b
59,0 ± 6,3 *†a
87,3 ± 13,1 *†c
70,7 ± 9,0 †b
126,5 ± 20,3 †a
125,8 ± 35,0 a
128,0 ± 1,7 *b
150,7 ± 0,5 *a
115,2 ± 5,8 †a
102,5 ± 8,4 a
146,5 ± 8,3 *†a
141,4 ± 13,0 *a
BACM+b
0,69
0,38
0,80
1,09
1,01
0,78
0,50
0,64
0,44
0,97
0,77
1,04
0,74
0,89
0,66
0,69
0,89
0,45
–
WIBAC
474,4 ± 20,8 *†a
282,8 ± 24,8 *†b
130,5 ± 8,9 †c
340,2 ± 20,8 *†a
188,2 ± 11,3 *†b
110,9 ± 11,9 †c
185,5 ± 13,8 *a
165,8 ± 12,4 *†a, b
148,1 ± 12,8 *b
123,0 ± 18,9 †a
132,3 ± 16,2 †a
108,2 ± 22,6 †a
127,1 ± 20,7 *†a, b
158,9 ± 24,0 *†a
131,6 ± 9,2 *b
553,3 ± 37,1 *a
336,4 ± 31,0 *b
288,8 ± 23,0 *†b
100
ECM
385,0 ± 44,9 *†a
333,8 ± 25,8 *†b
277,3 ± 7,7 *†c
531,8 ± 48,9 *†a
384,3 ± 5,2 *†b
232,8 ± 41,2 *†c
169,0 ± 9,9 *a
196,0 ± 8,7 *†a
135,4 ± 33,8 *b
244,2 ± 61,3 *†a
224,3 ± 26,3 *†a
239,2 ± 39,9 *†a
122,2 ± 16,0 *†a
96,7 ± 5,0 †a
116,0 ± 7,1 a
560,5 ± 79,0 *a
357,6 ± 40,7 *b
212,0 ± 26,6 *†c
100
ECM+ b
0,81
1,18
2,13
1,56
2,04
2,10
0,91
1,18
0,91
1,99
1,70
3,47
0,96
0,61
0,88
1,01
1,06
0,73
–
WIEC
Tabela 24. Wpływ dodatku polifenoli oraz obecności Gram-ujemnych bakterii Bacteroides galacturonicus (BAC) i Escherichia coli (EC) na
aktywność antyoksydacyjną podłoży (oznaczoną metodą ABTS po 24-godzinnej inkubacji) przedstawioną jako procent w stosunku do odpowiedniej kontroli (średnia ± SD, n = 3)
Table 24. Effect of the addition of polyphenols and the presence of Gram-negative bacteria Bacteroides galacturonicus (BAC) and Escherichia
coli (EC) on the antioxidant activity of media (as determined by ABTS assay following 24-h incubation) expressed as percent
relative to appropriate control (mean ± SD, n = 3)
132
222,9 ± 2,6 *†a
109,8 ± 9,2 †b
138,0 ± 10,0 *†a
132,1 ± 13,0 *†a
250
20
100
250
92,3 ± 18,8 a
157,5 ± 21,8 *†c
192,3 ± 21,1 *†b
249,9 ± 10,2 *†a
50
4
20
50
96,6 ± 7,7 a, b
94,2 ± 3,6 †a
76,7 ± 8,3 *†b
56,9 ± 9,2 *†a
116,9 ± 0,6 †a
102,1 ± 13,3 †a, b
81,3 ± 12,6 †b
86,7 ± 13,7 b
112,4 ± 5,8 a
94,5 ± 7,8 a
104,3 ± 6,3 a
4
20
152,8 ± 0,7 *†a
129,1 ± 4,7 *†b
193,2 ± 10,2 *†b
100
97,3 ± 5,3 †a
0,47
0,53
0,52
0,93
1,08
1,02
0,71
0,56
0,52
0,69
0,67
0,78
323,5 ± 19,3 *a
280,3 ± 16,0 *†b
262,0 ± 10,7 *b
178,8 ± 11,2 *†a
179,1 ± 5,3 *†a
147,4 ± 21,0 *†b
264,4 ± 18,6 *†a
192,1 ± 9,8 *†b
128,6 ± 7,0 †c
332,7 ± 16,4 *†a
262,3 ± 25,1 *†b
245,0 ± 18,7 *†c
326,3 ± 14,7 *a
350,9 ± 19,4 *†a
254,5 ± 17,9 *b
389,6 ± 2,5 *†a
258,9 ± 7,5 *†b
270,6 ± 9,4 *†b
527,9 ± 13,7 *†a
327,2 ± 56,2 *†b
225,8 ± 12,2 *†c
502,8 ± 10,4 *†a
467,9 ± 11,4 *†b
430,3 ± 4,4 *†c
1,01
1,25
0,97
2,18
1,45
2,14
2,00
1,70
1,76
1,51
1,78
1,76
Dla danego polifenolu średnie oznaczone tą samą literą w kolumnie nie różnią się istotnie (p < 0,05).
For a given polyphenol, means marked with the same letter in a column are not significantly different (p < 0.05).
Dla danej bakterii i tego samego stężenia polifenolu średnie oznaczone symbolem † różnią się istotnie (p < 0,05).
For a given bacteria and the same polyphenol concentration, means marked with symbol † are significantly different (p < 0.05).
Średnie oznaczone gwiazdką (*) różnią się istotnie w stosunku do odpowiedniej kontroli (Ø) (p < 0,05).
Means marked with an asterisk (*) are significantly different in comparison with respective control (Ø) (p < 0.05).
WI – współczynnik interakcji (WI = AOXM+b/AOXM; wartości WI > 1 i WI < 1, odpowiednio, świadczą o wzroście lub spadku potencjału antyoksydacyjnego (AOX) pod wpływem bakterii)
WI – interaction coefficient (WI = AOXM+b/AOXM; values WI > 1 and WI < 1, respectively, testify to an increase or a decrease in antioxidant potential (AOX) due to bacteria)
Ø (kontrola):dla BACM i ECM – Kpoz (podłoże odpowiednie dla danego gatunku bakterii, bez polifenoli i bez bakterii); dla BACM+b i ECM+b –
Kpoz+b (podłoże bez polifenoli, z bakteriami danego gatunku)
Ø (control): for BACM and ECM – Kpoz (medium appropriate for a given bacteria species, without polyphenols and without bacteria); for BACM+b
and ECM+b – Kpoz+b (medium without polyphenols, incubated with bacteria)
CAT, HR, H, NR, N, PHL, RS, RUT, KMP, Q – jak w tabeli 17 / see Table 17
BACM, ECM, BACM+b, ECM+b – jak w tabeli 23 / see Table 23 Q
KMP
RUT
RS
124,8 ± 7,6 *†c
20
133
NR
H
HR
CAT
133,7 ± 1,9 *a
112,7 ± 12,1 b
150,8 ± 13,2 *a
112,0 ± 13,9 b
107,5 ± 1,4 b
123,7 ± 8,9 *a
109,9 ± 2,8 b
135,8 ± 5,2 *a
97,3 ± 9,3 †b
138,2 ± 17,5 *a
113,0 ± 13,8 b
149,5 ± 16,1 *a
125,6 ± 18,3 *b
102,4 ± 2,9 b
110,6 ± 6,1 a, b
123,1 ± 15,5 *a
93,4 ± 18,7 †b
121,9 ± 15,0 *a
133,9 ± 15,7 *†a
250
20
100
250
20
100
250
20
100
250
117,3 ± 13,8 †a, b
108,8 ± 8,3 †b
138,0 ± 4,9 *†a
100
100
118,6 ± 4,5 *a, b
100
RUMIM+b
105,9 ± 6,9 b
–
Ø
RUMIM
20
Stężenie końcowe
Final
concentration
[µg/ml]
Polifenol
Polyphenol
0,73
1,11
1,26
0,89
1,19
1,05
0,89
1,00
1,00
0,97
0,79
1,12
–
WIRUMI
127,2 ± 16,1 *†a
91,8 ± 6,1 †b
88,8 ± 22,5 †b
83,5 ± 10,4 *†a
97,1 ± 7,7 a
98,1 ± 8,1 a
102,1 ± 7,7 †a
94,3 ± 17,3 †a
98,9 ± 12,2 a
115,0 ± 8,3 †a
87,4 ± 9,5 †b
84,0 ± 14,5 b
100
ENM
163,2 ± 23,6 *†a
134,1 ± 1,6 *†b
143,6 ± 2,6 *†a, b
114,4 ± 5,3 *†a
109,4 ± 3,1 a
106,6 ± 13,5 a
131,5 ± 3,2 *†a
117,8 ± 17,2 †b
114,6 ± 12,1 b
139,0 ± 4,1 *†a
137,5 ± 14,5 *†a
128,9 ± 7,3 *†a
100
ENM+b
1,28
1,46
1,62
1,37
1,10
1,09
1,29
1,42
1,16
1,21
1,57
1,53
–
WIEN
Tabela 25. Wpływ dodatku polifenoli oraz obecności bakterii Ruminococcus gauvreauii (RUMI) i Enterococcus caccae (EN) na aktywność
antyoksydacyjną podłoża TSYEM (oznaczoną metodą ABTS po 24-godzinnej inkubacji) przedstawioną jako procent w stosunku
do odpowiedniej kontroli (średnia ± SD, n = 3)
Table 25. Effect of the addition of polyphenols and the presence of bacteria Ruminococcus gauvreauii (RUMI) and Enterococcus caccae
(EN) on the antioxidant activity of TSYEM medium (as determined by ABTS assay following 24-h incubation) expressed as
percent relative to appropriate control (mean ± SD, n = 3)
134
123,3 ± 2,1 *†a
131,2 ± 0,6 *†a
133,0 ± 1,8 *a
132,8 ± 3,5 *a
126,0 ± 0,1 *†b
139,9 ± 8,5 *a, b
96,3 ± 19,9 b
116,5 ± 15,2 b
161,2 ± 0,3 *†a
150,1 ± 11,8 *†a
112,6 ± 13,8 †b
130,8 ± 9,9 *a
141,5 ± 17,6 *a
84,6 ± 6,7 *†b
144,1 ± 8,2 *†a
129,7 ± 10,1 *a
89,1 ± 11,8 b
104,3 ± 17,3 a, b
114,2 ± 10,1 †a
250
20
100
250
20
100
250
20
100
250
101,1 ± 4,6 †a
111,8 ± 13,0 †a
110,3 ± 10,9 †a
115,1 ± 4,8 a
112,0 ± 8,6 a
115,3 ± 11,9 a
80,3 ± 7,3 *†b
131,1 ± 12,0 *†a
145,5 ± 9,7 *†a
123,4 ± 11,0 *a
124,5 ± 8,9 *a
125,1 ± 20,4 *a
4
20
50
4
20
50
146,1 ± 20,5 *†a
120,0 ± 5,7 *a
94,6 ± 1,5 b
111,1 ± 6,0 *b
96,3 ± 5,3 c
100
RUMIM, ENM, RUMIM+b, ENM+b – jak w tabeli 23 / see Table 23
Q
KMP
RUT
RS
PHL
N
20
0,92
0,90
0,93
0,76
1,39
0,77
1,41
1,31
0,92
1,08
0,87
1,73
0,94
1,02
1,17
0,82
1,08
0,98
128,3 ± 4,4 †a
88,9 ± 2,1 †b
80,7 ± 6,4 †c
92,1 ± 6,7 †a
96,0 ± 6,7 †a
97,3 ± 8,2 a
99,6 ± 8,0 †a
107,5 ± 19,0 †a
82,8 ± 13,3 †a
117,2 ± 3,8 *†a
98,8 ± 6,2 †b
87,7 ± 4,6 *†c
99,6 ± 0,6 †a
89,4 ± 5,4 †a
86,3 ± 15,9 †a
109,3 ± 13,4 †a
106,4 ± 15,2 †a
115,2 ± 9,9 a
138,9 ± 3,5 *†a
108,4 ± 0,4 *†b
113,7 ± 3,7 *†b
189,1 ± 49,2 *†a
152,7 ± 36,3 *†a, b
120,6 ± 6,7 b
149,4 ± 6,6 *†a
160,9 ± 32,1 *†a
161,6 ± 11,2 *†a
156,6 ± 5,6 *†a
138,9 ± 2,8 *†b
132,4 ± 3,6 *†b
132,0 ± 0,1 *†b
127,2 ± 1,8 *†b
165,3 ± 19,0 *†a
162,1 ± 1,6 *†a
128,7 ± 11,3 *†b
122,2 ± 4,8 *b
1,08
1,22
1,41
2,05
1,59
1,24
1,50
1,50
1,95
1,34
1,41
1,51
1,32
1,42
1,92
1,48
1,21
1,06
135
NR
H
HR
CAT
Ø
100
BFM+b
70,2 ± 10,5 *c
250
134,3 ± 17,6 *a
20
97,8 ± 12,6 b
66,4 ± 8,7 *†b
250
100
79,7 ± 10,4 *a
100
73,6 ± 1,9 *a, b 70,0 ± 2,8 *b
20
82,2 ± 11,7 b
103,3 ± 13,8 b
142,3 ± 16,7 *a
91,5 ± 1,2 †a
66,9 ± 14,6 *b
101,9 ± 7,5 †a
69,1 ± 5,8 *†b
109,1 ± 0,8 *†a
107,9 ± 6,5 †a
250
47,9 ± 5,8 *†c
20
110,5 ± 6,1 a
81,5 ± 0,7 *†a
106,8 ± 7,9 a
250
126,5 ± 3,0 *†a
100
102,9 ± 6,3 †a
74,7 ± 12,1 *†b 124,4 ± 12,1 *†a
100
BFM
100
20
–
Polyphenol
1,17
1,06
1,06
1,38
0,84
0,95
1,47
1,33
2,25
1,03
1,23
1,67
–
WIBF
154,3 ± 19,2 *a
101,1 ± 3,8 †b
99,6 ± 3,1 b
103,0 ± 15,3 a
115,5 ± 15,0 a
103,7 ± 19,6 a
91,5 ± 9,5 †b
120,2 ± 18,6 *a
102,1 ± 9,1 a, b
202,0 ± 28,2 *†a
168,0 ± 14,6 *†b
155,2 ± 4,2 *†b
100
LCBM
134,1 ± 28,5 *a
126,1 ± 2,4 *†a
96,8 ± 5,8 b
126,3 ± 2,3 *a
141,0 ± 17,3 *a
98,1 ± 20,9 b
137,3 ± 7,8 *†a
112,9 ± 17,0 b
81,5 ± 11,2 c
284,9 ± 5,8 *†a
239,0 ± 13,0 *†b
202,2 ± 2,8 *†c
100
LCBM+b
0,87
1,25
0,97
1,23
1,22
0,95
1,50
0,94
0,80
1,41
1,42
1,30
–
WILCB
102,7 ± 1,9 a
112,2 ± 0,4 †a
142,0 ± 16,0 *†a
132,8 ± 2,0 *†a
109,0 ± 14,2 †b
100
EUBM+b
109,9 ± 6,9 a
85,9 ± 4,9 †b
102,2 ± 6,1 a
99,7 ± 1,2 a
99,0 ± 6,2 †a
145,7 ± 19,4 *†a 106,5 ± 8,2 †a
126,3 ± 7,3 *b
105,4 ± 7,7 †c
109,7 ± 8,3 a
104,0 ± 2,6 a
110,4 ± 8,2 *†a
77,0 ± 15,3 *†b 114,9 ± 12,0 *†a
93,1 ± 5,1 a
77,0 ± 4,7 *†b
107,9 ± 11,7 †a
110,0 ± 4,4 †a
78,8 ± 8,6 *†b
100
EUBM
0,84
1,04
0,59
0,93
0,95
0,90
1,49
1,08
1,46
1,32
1,21
1,38
–
WIEUB
Tabela 26. Wpływ dodatku polifenoli oraz obecności bakterii Bifidobacterium catenulatum (BF), Lactobacillus sp. (LCB) i Eubacterium cylindroides (EUB) na aktywność antyoksydacyjną podłoża (oznaczoną metodą ABTS po 24-godzinnej inkubacji) przedstawioną
jako procent w stosunku do odpowiedniej kontroli (średnia ± SD, n = 3)
Table 26. Effect of the addition of polyphenols and the presence of bacteria Bifidobacterium catenulatum (BF), Lactobacillus sp. (LCB)
and Eubacterium cylindroides (EUB) on the antioxidant activity of medium (as determined by ABTS assay following 24-h incubation) expressed as percent relative to appropriate control (mean ± SD, n = 3)
Stężenie końcowe
Final concentration
[µg/ml]
136
108,0 ± 4,1 †b
20
91,3 ± 11,5 b
91,7 ± 4,3 †b
50
113,4 ± 10,0 a
4
20
90,0 ± 1,6 †b
50
117,3 ± 18,3 *a
4
90,4 ± 5,9 †b
87,8 ± 8,3 †b
250
20
105,2 ± 7,4 a, b
100
123,7 ± 10,8 *†a 102,2 ± 10,0 †a
20
148,9 ± 12,7 *†a
104,7 ± 10,4 b
121,1 ± 6,2 *c
124,4 ± 0,7 *†a
132,5 ± 3,3 *†a
101,4 ± 18,2 b
117,3 ± 23,5 †a
118,8 ± 2,7 *a
167,8 ± 10,2 *†a
113,3 ± 8,0 †b
250
143,6 ± 15,3 *b
138,9 ± 19,0 *a
100
128,2 ± 3,5 *†b
96,3 ± 9,2 †a, b 121,6 ± 6,8 *†a
116,6 ± 12,9 a
134,9 ± 7,6 *†a
250
85,2 ± 18,6 †b
20
120,7 ± 1,9 *†a
105,4 ± 20,7 a
92,8 ± 1,6 †a
250
109,5 ± 9,2 †a
100
76,1 ± 7,4 *†b
100
62,9 ± 10,7 *†b 94,4 ± 7,4 †b
1,62
1,15
1,07
1,38
1,47
0,86
1,33
1,13
0,83
1,48
1,03
1,19
1,26
1,11
1,58
1,30
1,44
1,50
150,5 ± 25,5 *b
115,5 ± 5,5 †b
173,7 ± 13,1 *†a
203,1 ± 29,3 *†a
186,8 ± 15,0 *†a
194,6 ± 10,4 *†a
198,6 ± 13,5 *†a
136,7 ± 12,3 b
125,2 ± 23,5 †b
193,9 ± 37,2 *a
221,6 ± 19,2 *†a
243,2 ± 31,2 *a
168,1 ± 27,8 †a
167,0 ± 12,1 *†a
121,5 ± 9,0 *†b
155,3 ± 14,6 *†a
189,7 ± 11,1 *†a
251,5 ± 10,2 *†b
277,2 ± 18,0 *†b
372,2 ± 30,6 *†a
225,0 ± 10,4 *†a
223,3 ± 11,7 *†a
231,8 ± 6,0 *†a
176,4 ± 3,7 *a
203,5 ± 37,9 *†a
176,6 ± 28,0 *a
395,9 ± 121,5 *†a
246,0 ± 31,2 *b
260,9 ± 50,2 *†b
258,9 ± 9,9 *†a
225,9 ± 12,2 *†b
220,8 ± 15,6 *†b
267,5 ± 28,6 *†a
153,1 ± 16,1 *†a, b 251,3 ± 52,2 *†a
129,9 ± 16,9 b
BFM, LCBM, EUBM, BFM+b, LCBM+b, EUBM+b – jak w tabeli 23 / see Table 23
Q
KMP
RUT
RS
PHL
N
20
2,18
1,60
1,83
1,20
1,15
1,17
1,29
1,62
0,91
1,79
1,01
1,55
1,50
1,86
1,42
1,41
1,64
1,16
131,4 ± 4,1 *a
120,1 ± 4,5 *a, b
99,6 ± 14,6 b
112,9 ± 16,6 †a
106,5 ± 10,1 †a
104,2 ± 13,0 a
138,4 ± 0,0 *†a
125,9 ± 13,4 *†a, b
114,3 ± 3,6 *†b
119,4 ± 1,0 *a
164,7 ± 21,7 *†a 112,5 ± 2,7 †a, b
131,0 ± 8,7 *b
125,0 ± 11,3 *†b 97,0 ± 17,7 †b
93,1 ± 6,3 †a
87,8 ± 6,1 †a
94,2 ± 11,7 a
112,2 ± 12,8 †a
88,0 ± 10,7 †b
77,2 ± 3,9 *†b
165,3 ± 14,4 *†a 131,2 ± 0,1 *†a
157,3 ± 10,9 *†a 107,1 ± 5,7 †b
140,4 ± 12,9 *†b 110,9 ± 5,4 †b
116,4 ± 23,0 a
108,9 ± 5,8 a
87,7 ± 13,2 b
161,9 ± 13,1 *†a 128,7 ± 4,4 *†a
146,7 ± 25,1 *†a 104,7 ± 20,1 †a, b
150,4 ± 11,4 *†a 100,9 ± 4,2 †b
0,90
0,91
0,59
1,21
1,21
0,98
1,23
1,43
1,48
0,79
0,68
0,79
1,16
1,10
1,14
0,79
0,71
0,67
137
M
SP
PO
P
0,67
0,91
101,8 ± 2,3 †a
104,1 ± 7,5 a
110,3 ± 4,3 a
109,6 ± 0,5 a
122,1 ± 10,6 *†a
106,0 ± 4,9 †b
109,6 ± 13,1 a, b
109,8 ± 6,9 a, b
107,0 ± 8,3 a
117,2 ± 8,9 *a
111,7 ± 5,9 a
103,3 ± 2,1 †b
124,9 ± 5,6 *†a
110,0 ± 4,1 a, b
177,3 ± 14,6 *†a 118,9 ± 3,3 *†a
99,5 ± 3,8 b
121,5 ± 5,1 *†a
109,4 ± 9,6 b
99,2 ± 5,0 b
5,0
1,0
2,5
5,0
1,0
2,5
5,0
1,0
2,5
5,0
1,11
1,00
0,85
1,18
0,98
0,94
0,97
0,99
0,83
91,6 ± 1,1 †b
110,7 ± 4,3 *†b
0,67
–
2,5
100
WIBAC
81,3 ± 4,5 *†c
100
BACM+b
103,2 ± 1,4 †b
–
Ø
BACM
1,0
Stężenie końcowe
Final
concentration
[%]
Ekstrakt
(Preparat)
Extract
(Preparation)
526,2 ± 21,9 *†a
395,4 ± 32,5 *†b
248,8 ± 36,9 *†c
173,1 ± 10,1 *†a
131,7 ± 12,3 †a
140,5 ± 15,5 †a
698,1 ± 146,8 *a
494,8 ± 8,9 *†b
433,0 ± 8,0 *†b
381,4 ± 34,6 *†a
388,6 ± 17,9 *†a
288,3 ± 19,5 *†b
100
ECM
873,6 ± 9,3 *†a
724,0 ± 17,6 *†b
618,9 ± 37,3 *†c
588,6 ± 3,6 *†a
376,0 ± 14,6 *†b
271,0 ± 68,4 *†c
777,5 ± 10,7 *b
772,4 ± 74,9 *†b
1082,3 ± 28,8 *†a
455,9 ± 55,1 *†b
624,7 ± 49,6 *†a
409,8 ± 17,5 *†b
100
ECM +b
1,66
1,83
2,49
3,40
2,86
1,93
1,11
1,56
2,50
1,20
1,61
1,42
–
WIEC
Tabela 27. Wpływ dodatku ekstraktów lub preparatów oraz obecności Gram-ujemnych bakterii Bacteroides galacturonicus (BAC) i Escherichia
coli (EC) na aktywność antyoksydacyjną podłoża (oznaczoną metodą ABTS po 24-godzinnej inkubacji) przedstawioną jako procent
w stosunku do odpowiedniej kontroli (średnia ± SD, n = 3)
Table 27. Effect of the addition of extracts or preparations and the presence of Gram-negative bacteria Bacteroides galacturonicus (BAC)
and Escherichia coli (EC) on the antioxidant activity of medium (as determined by ABTS assay following 24-h incubation) expressed as percent relative to appropriate control (mean ± SD, n = 3)
138
B
D
CC
CN
CCH
S
Ż
0,95
0,74
0,76
0,84
0,54
0,75
1,16
82,7 ± 12,5 b
138,1 ± 13,0 *†a 102,2 ± 11,4 †a
127,9 ± 15,7 *†a 97,4 ± 8,2 †a
134,8 ± 14,7 *†a 113,1 ± 5,4 †a
83,9 ± 9,7 †b
103,1 ± 0,3 a
104,5 ± 14,8 †a
106,5 ± 7,5 †a
128,4 ± 12,8 *a
122,9 ± 21,5 †a
100,3 ± 17,8 †a
114,7 ± 3,7 a
115,3 ± 14,5 a
112,0 ± 6,8 a
124,8 ± 4,9 *a
112,4 ± 15,0 a
87,1 ± 14,3 b
156,6 ± 5,2 *†a
95,8 ± 4,2 b
151,4 ± 3,9 *†a
151,6 ± 4,2 *†a
125,2 ± 19,2 b
89,0 ± 11,1 †c
150,8 ± 3,3 *†a
135,4 ± 14,4 *†a 101,0 ± 9,4 †a
120,0 ± 30,5 a
87,4 ± 14,4 b
103,6 ± 1,7 b
108,6 ± 6,8 a
110,5 ± 3,4 a
99,4 ± 4,8 a
110,4 ± 5,0 a, b
125,7 ± 9,5 *a
99,9 ± 5,5 b
5,0
1,0
2,5
5,0
1,0
2,5
5,0
1,0
2,5
5,0
1,0
2,5
5,0
1,0
2,5
5,0
1,0
2,5
5,0
0,87
0,89
1,13
1,13
1,03
1,06
0,67
1,38
1,03
0,70
0,69
1,08
1,03
124,0 ± 16,4 a
120,4 ± 15,1 a
2,5
0,84
115,4 ± 7,6 a
137,6 ± 14,6 *a
1,0
290,1 ± 40,6 *†b
366,8 ± 6,6 *†a
229,4 ± 8,3 *†b
623,8 ± 12,8 *†a
625,8 ± 6,5 *a
585,8 ± 14,2 *†a
296,4 ± 14,8 *†a
244,4 ± 3,1 *†a, b
237,8 ± 13,7 *†b
514,3 ± 52,1 *†a
375,0 ± 17,0 *†b
117,5 ± 2,6 †c
238,6 ± 25,0 *†a
195,6 ± 10,7 *†a
134,9 ± 12,9 *†b
681,4 ± 37,2 *†a
527,2 ± 26,8 *†b
395,9 ± 9,9 *†c
511,0 ± 25,9 *†a
331,0 ± 45,6 *†b
250,6 ± 9,3 *†c
482,4 ± 20,8 *†a
567,5 ± 55,2 *†b
532,4 ± 11,3 *†b
749,0 ± 3,9 *†b
630,8 ± 133,7 *c
938,7 ± 6,2 *†a
237,3 ± 57,9 *†b
420,0 ± 37,7 *†a
103,0 ± 2,2 †c
1025,7 ± 93,1 *†a
745,9 ± 10,5 *†b
386,7 ± 47,0 *†c
176,2 ± 26,5 *†c
275,5 ± 14,7 *†b
469,7 ± 13,1 *†a
923,8 ± 15,2 *†a
826,8 ± 102,3 *†b
779,4 ± 6,5 *†b
819,2 ± 70,0 *†b
924,0 ± 23,9 *†a
960,5 ± 2,7 *†a
1,66
1,55
2,32
1,20
1,01
1,60
0,80
1,72
0,43
1,99
1,99
3,29
0,74
1,41
3,48
1,36
1,57
1,97
1,60
2,79
3,83
139
NO
BEZ
G
CIT
GT
Ekstrakt
(Preparat)
Extract
(Preparation)
Tabela 27. cd.
Table 27. cont.
0,89
0,80
0,99
0,79
0,83
163,5 ± 15,1 *†a 145,0 ± 0,2 *†a
88,4 ± 3,2 †c
128,4 ± 18,4 *†b
176,9 ± 13,8 *a
105,1 ± 1,2 b
138,7 ± 8,7 *†a
120,6 ± 8,8 *†b
122,9 ± 9,4 a
121,3 ± 19,7 a
111,9 ± 10,9 †a
111,0 ± 10,4 †a
150,8 ± 8,8 *†b
189,4 ± 14,0 *a
112,5 ± 4,8 b
114,6 ± 8,5 †b
141,4 ± 7,7 *†a
133,5 ± 10,2 *a
122,0 ± 5,0 a
134,1 ± 15,1 *†a 106,3 ± 2,6 †a
99,7 ± 19,1 †a
111,2 ± 3,4 †c
120,9 ± 4,6 †b
145,7 ± 8,8 *†a
142,5 ± 6,9 *†a
5,0
1,0
2,5
5,0
1,0
2,5
5,0
1,0
2,5
5,0
1,0
2,5
5,0
0,78
0,77
0,92
0,85
1,21
0,93
0,93
0,85
1,16
141,4 ± 5,6 *†a
122,0 ± 5,8 *†b
1,0
0,92
WIBAC
2,5
BACM+b
112,0 ± 7,3 c
BACM
121,6 ± 4,4 *b
Stężenie końcowe
Final
concentration
[%]
308,2 ± 43,9 *†a
278,7 ± 25,9 *†a
200,6 ± 20,8 *b
187,6 ± 18,4 *†a
168,3 ± 9,0 *†a, b
114,1 ± 6,7 †b
400,0 ± 35,2 *†a
398,7 ± 9,0 *†a
376,5 ± 17,5 *†a
1340,4 ± 169,2 *†a
673,0 ± 21,1 *†b
327,1 ± 36,5 *†c
1430,8 ± 124,4 *†a
1031,6 ± 69,4 *†b
734,6 ± 103,4 *†c
ECM
683,2 ± 81,4 *†a
502,2 ± 13,3 *†b
242,9 ± 5,9 *c
516,3 ± 35,6 *†a, b
480,9 ± 73,0 *†b
556,3 ± 21,8 *†a
572,5 ± 16,2 *†a
589,1 ± 86,9 *†a
617,6 ± 15,3 *†a
3109,5 ± 8,4 *†a
2087,7 ± 20,7 *†b
882,6 ± 37,0 *†c
2288,0 ± 27,5 *†a
2013,2 ± 178,1 *†b
970,7 ± 12,0 *†c
ECM +b
2,22
1,80
1,21
2,75
2,86
4,88
1,43
1,48
1,64
2,32
3,10
2,70
1,60
1,95
1,32
WIEC
140
Dla danego ekstraktu lub preparatu średnie oznaczone tą samą literą w kolumnie nie różnią się istotnie (p < 0,05).
For a given extract or preparation, means marked with the same letter in a column are not significantly different (p < 0.05).
Dla danej bakterii i tego samego stężenia ekstraktu lub preparatu średnie oznaczone symbolem † różnią się istotnie (p < 0,05).
For a given bacteria and the same concentration of extract or preparation, means marked with symbol † are significantly different (p < 0.05).
Średnie oznaczone gwiazdką (*) różnią się istotnie w stosunku do odpowiedniej kontroli (Ø) (p < 0,05).
Means marked with an asterisk (*) are significantly different in comparison with respective control (Ø) (p < 0.05).
WI – współczynnik interakcji (WI = AOXM+b/AOXM; wartości WI > 1 i WI < 1, odpowiednio, świadczą o wzroście lub spadku potencjału antyoksydacyjnego (AOX) pod wpływem bakterii)
WI – interaction coefficient (WI = AOXM+b/AOXM; values WI > 1 and WI < 1, respectively, testify to an increase or a decrease in antioxidant potential (AOX) due to bacteria)
Ø (kontrola):dla BACM i ECM – Kpoz (podłoże odpowiednie dla danego gatunku bakterii, bez ekstraktów lub preparatów i bez bakterii); dla BACM+b
i ECM+b – Kpoz+b (podłoże bez polifenoli, z bakteriami danego gatunku)
Ø (control): for BACM and ECM – Kpoz (medium appropriate for a given bacteria species, without extracts or preparations and without bacteria); for
BACM+b and ECM+b – Kpoz+b (medium without polyphenols, incubated with bacteria)
BACM, ECM, BACM+b, ECM+b – jak w tabeli 23 / see Table 23
P – owoce pigwowca japońskiego / Japanese quince fruits, PO – ziele pokrzywy / nettle herb, SP – spirulina, M – owoce maliny / raspberry fruits, Ż – owo
ce żurawiny / cranberry fruits, S – soja / soybean, CCH – owoce cytryńca chińskiego / Schisandra fruits, CN – czosnek niedźwiedzi / bear’s garlic,
CC – czerwona cebula / red onion, D – owoce derenia jadalnego / cornelian cherry fruits, B – owoce borówki brusznicy / lingonberry fruits, GT – zielona herbata / green tea, CIT – Citrosept, G – jagody goji / goji berries, BEZ – owoce czarnego bzu / elderberry fruits, NO – sok z noni / noni juice
141
Ż
M
SP
PO
P
1,38
1,25
1,23
150,0 ± 9,4 *†a
134,4 ± 21,3 *a
139,0 ± 2,2 *†a
151,7 ± 4,6 *†a
148,3 ± 9,6 *†a
151,6 ± 16,8 *†a
147,3 ± 4,2 *†a
146,9 ± 6,8 *†a
114,1 ± 17,7 a
107,6 ± 12,3 †a
103,3 ± 5,9 †a
107,4 ± 11,9 †b
113,1 ± 8,6 †a, b 141,6 ± 7,2 *†a
165,5 ± 30,1 *†a
101,7 ± 6,9 †a
134,1 ± 15,3 *†a
111,8 ± 7,9 †a
104,3 ± 6,4 †a
99,7 ± 1,6 †a
5,0
1,0
2,5
5,0
1,0
2,5
5,0
1,0
2,5
5,0
1,0
123,7 ± 7,1 *†c
149,9 ± 2,6 *†b
175,1 ± 4,3 *†a
143,0 ± 5,6 *†a
112,8 ± 8,2 †b
101,1 ± 4,0 †b
2,5
5,0
1,72
1,33
0,87
1,47
1,41
1,36
1,47
1,29
1,18
1,45
1,44
152,1 ± 22,6 *†a
1,0
1,46
–
105,3 ± 5,5 †a
100
WIRUM
2,5
100
RUMIM+b
146,0 ± 6,5 *†a
–
Ø
RUMIM
99,8 ± 6,9 †a
Stężenie końcowe
Final
concentration
[%]
Ekstrakt
(Preparat)
Extract
(Preparation)
95,2 ± 7,9 a
96,7 ± 8,9 a
104,8 ± 8,0 a
97,5 ± 12,0 b
110,9 ± 10,5 †b
165,7 ± 11,3 *†a
111,9 ± 7,6 *†a
98,2 ± 12,7 b
91,9 ± 7,8 b
87,6 ± 7,5 a
92,2 ± 10,0 a
93,7 ± 10,8 a
112,1 ± 8,1 *a
121,3 ± 13,7 *†a
108,7 ± 7,2 b
100
ENM
82,8 ± 0,2 *b
86,3 ± 4,5 a
96,4 ± 12,2 a
89,2 ± 11,1 a
88,8 ± 9,3 †a, b
93,7 ± 2,5 b
89,7 ± 2,9 †b
82,4 ± 2,2 *b
96,1 ± 2,4 a, b
104,5 ± 14,7 a
112,5 ± 19,4 †a
101,9 ± 2,2 a
102,1 ± 2,6 a
106,1 ± 6,0 †a
114,3 ± 5,4 *a
100
ENM+b
0,87
0,99
1,00
0,96
0,81
0,68
0,79
1,04
0,90
0,99
1,05
0,95
0,91
0,87
1,05
–
WIEN
Tabela 28. Wpływ dodatku ekstraktów lub preparatów oraz obecności bakterii Ruminococcus gauvreauii (RUMI) i Enterococcus caccae (EN)
na aktywność antyoksydacyjną podłoża TSYEM (oznaczoną metodą ABTS po 24-godzinnej inkubacji) przedstawioną jako procent
Table 28. Effect of the addition of extracts or preparations and the presence of bacteria Ruminococcus gauvreauii (RUMI) and Enterococcus
caccae (EN) on the antioxidant activity of medium (as determined by ABTS assay following 24-h incubation) expressed as percent
142
CIT
GT
B
D
CC
CN
CCH
S
152,7 ± 1,4 *†b
158,9 ± 4,5 *†b
138,4 ± 0,4 *†a
114,8 ± 17,2 †b
145,7 ± 11,6 *†a
106,2 ± 5,9 c
160,3 ± 20,8 *†b
188,7 ± 0,4 *†a
157,4 ± 24,0 *†a
166,4 ± 9,4 *†a
154,6 ± 22,9 *†a
106,2 ± 7,4 †a
101,2 ± 4,2 †a
92,5 ± 5,9 †b
137,0 ± 17,2 *†a
106,0 ± 8,1 †b
103,6 ± 9,0 b
109,3 ± 12,2 †b
147,3 ± 10,5 *†a
105,6 ± 5,6 †a
110,2 ± 3,8 †a
120,8 ± 10,3 †a
5,0
1,0
2,5
5,0
1,0
2,5
5,0
1,0
2,5
5,0
1,28
1,51
1,49
1,28
1,47
1,03
1,38
0,84
1,20
1,57
1,44
2,01
2,5
1,41
191,7 ± 9,9 *†a
160,5 ± 1,6 *†a
114,2 ± 17,8 †a
1,0
1,32
95,3 ± 4,3 †a
145,6 ± 2,8 *†a
110,0 ± 11,0 †a
5,0
1,47
1,0
145,6 ± 19,8 *†a
99,1 ± 1,7 †a
2,5
1,38
1,33
151,8 ± 10,5 *†a
109,9 ± 4,8 †a
1,0
1,48
127,0 ± 2,4 *†b
193,8 ± 8,6 *†a
131,0 ± 16,0 *†a
5,0
1,54
95,4 ± 4,4 †b
150,3 ± 3,6 *†b
97,5 ± 11,2 †b
2,5
1,48
5,0
139,8 ± 12,6 *†b
94,3 ± 4,2 †b
1,0
1,02
103,1 ± 5,3 †a, b 146,3 ± 7,0 *†a, b
118,5 ± 1,2 a
116,2 ± 5,7 a
5,0
1,33
1,43
1,42
134,7 ± 9,0 *†a
101,5 ± 4,4 †b
2,5
2,5
139,2 ± 20,4 *†a
97,3 ± 11,2 †b
1,0
86,3 ± 2,7 *b
90,1 ± 0,5 b
93,2 ± 2,2 b
93,5 ± 6,6 b
89,6 ± 9,5 *†c
117,1 ± 5,9 *b
134,4 ± 4,8 *†a
86,6 ± 8,1 b
83,6 ± 97,5 b
123,0 ± 23,3 *a
109,6 ± 7,7 a
107,5 ± 18,4 a
100,9 ± 12,3 a
104,4 ± 11,8 a
129,0 ± 10,8 *b
164,6 ± 16,2 *†a
125,8 ± 7,2 *a
126,3 ± 5,5 *†a
136,5 ± 11,2 *†b 109,9 ± 2,1 †b
116,7 ± 3,6 *a
112,1 ± 6,4 *†a
100,5 ± 2,9 †b
94,9 ± 9,7 b
97,9 ± 7,6 a, b
95,85 ± 6,4 a
111,5 ± 10,5 a
95,2 ± 10,1 a, b 91,5 ± 12,3 b
111,8 ± 7,6 a
89,9 ± 5,3 b
112,9 ± 6,9 *a
84,0 ± 9,5 *b
96,5 ± 7,3 a
98,0 ± 4,8 a
107,3 ± 5,2 a
112,8 ± 8,2 a
108,2 ± 8,6 a
114,0 ± 19,2 a
103,4 ± 2,9 a
88,5 ± 8,2 b
105,5 ± 13,7 a
77,7 ± 10,5 *b
113,7 ± 7,7 a
100,3 ± 16,6 a
93,2 ± 10,4 a, b 106,3 ± 13,4 a
86,5 ± 13,0 b
0,97
0,77
0,80
1,00
0,80
1,34
0,91
0,91
1,10
1,04
0,97
1,03
0,93
0,95
1,00
0,89
0,96
0,84
0,92
1,44
1,06
0,83
1,07
1,16
143
145,2 ± 7,2 *†a
121,1 ± 11,1 *†b
150,1 ± 16,5 *†a
147,1 ± 6,0 *a
138,1 ± 19,4 *a
134,7 ± 22,3 *†a
149,0 ± 23,7 *†a
148,0 ± 9,1 *a
116,1 ± 5,7 †a
95,8 ± 4,3 †b
112,0 ± 2,9 †a
125,5 ± 18,2 a
114,1 ± 17,6 a
100,2 ± 1,6 †b
96,7 ± 8,3 †b
149,3 ± 10,0 *a
5,0
1,0
2,5
5,0
1,0
2,5
5,0
1,0
2,5
RUMIM+b
139,2 ± 8,8 *a, b
RUMIM
130,8 ± 2,4 *a
Stężenie końcowe
Final
concentration
[%]
0,99
1,54
1,35
1,24
1,17
1,35
1,26
1,25
1,06
WIRUM
RUMIM, ENM, RUMIM+b, ENM+b – jak w tabeli 23 / see Table 23
P, PO, SP, M, Ż, S, CCH, CN, CC, D, B, GT, CIT, G, BEZ, NO – jak w tabeli 27 / see Table 27
NO
BEZ
G
Ekstrakt
(Preparat)
Extract
(Preparation)
Tabela 28. cd.
Table 28. cont.
84,2 ± 16,1 †b
98,1 ± 7,5 b
138,5 ± 14,1 *†a
100,6 ± 2,9 †a
96,1 ± 3,4 a
105,7 ± 16,1 a
101,5 ± 13,0 a
105,1 ± 13,9 a
95,8 ± 5,9 a
ENM
91,7 ± 3,7 a
99,3 ± 3,7 a
87,8 ± 3,9 a
78,5 ± 4,9 *†b
92,3 ± 3,6 b
98,2 ± 0,8 a
115,8 ± 15,7 †a
102,4 ± 10,2 †a
113,3 ± 13,5 a
ENM+b
1,38
1,00
0,74
0,78
0,96
1,07
0,90
0,94
0,92
WIEN
144
Ż
M
SP
PO
P
Ø
182,3 ± 2,7 *†a
209,1 ± 3,9 *†b
234,5 ± 0,6 *†a
155,0 ± 9,4 *a
158,3 ± 0,0 *a
158,7 ± 8,4 *†b
174,6 ± 11,8 *†a
216,9 ± 17,5 *†b
136,0 ± 15,2 *†a
168,7 ± 14,8 *†a
174,1 ± 20,7 *†a
176,5 ± 12,3 *†a
141,3 ± 16,1 *a
144,9 ± 7,7 *a
148,4 ± 14,7 *a
151,3 ± 9,6 *†a
129,5 ± 14,1 *†b
120,9 ± 5,2 *†b
147,3 ± 9,6 *†a
171,7 ± 22,4 *†a
161,6 ± 27,5 *†a
5,0
1,0
2,5
5,0
1,0
2,5
5,0
1,0
2,5
5,0
1,0
2,5
5,0
253,6 ± 1,1 *†a
217,3 ± 6,1 *†b
189,4 ± 7,9 *†a
157,0 ± 17,4 *a
214,9 ± 2,1 *†a, b
170,9 ± 11,6 *†a, b
127,4 ± 7,9 *†a
2,5
157,4 ± 3,6 *†b
100
LCBM+b
128,9 ± 6,0 *†a
100
LCBM
1,0
–
Ekstrakt
Stężenie końcowe
(Preparat)
Final
Extract
concentration
(Preparation)
[%]
1,57
1,27
1,47
1,44
1,46
1,05
1,07
1,08
1,10
1,33
1,23
1,24
1,34
1,34
1,22
–
WILCB
97,6 ± 4,6 b
99,8 ± 5,5 †b
131,2 ± 12,1 *a
102,2 ± 5,0 †b
133,2 ± 10,9 *a
122,2 ± 3,7 *a
133,8 ± 10,8 *a
113,3 ± 8,5 a, b
106,1 ± 8,3 †b
115,5 ± 8,5 b
139,5 ± 5,5 *a
124,9 ± 7,0 a, b
118,2 ± 4,2 a
123,4 ± 9,2 *a
108,8 ± 6,9 a
100
EUBM
126,8 ± 15,0 *a
123,3 ± 16,9 †a
132,2 ± 4,0 *a
119,7 ± 12,6 *†a
116,4 ± 1,2 *a
97,9 ± 3,8 b
114,3 ± 7,3 b
102,1 ± 8,7 b
144,5 ± 26,6 *†a
133,2 ± 10,1 *a
136,8 ± 35,5 *a
118,0 ± 5,6 a
117,1 ± 23,1 a
118,5 ± 3,5 a
124,7 ± 5,0 *a
100
EUBM+b
0,97
1,21
0,99
1,20
0,95
1,00
0,85
0,90
1,36
1,15
0,98
0,94
0,99
0,96
1,15
–
WIEUB
Tabela 29. Wpływ dodatku ekstraktów lub preparatów oraz obecności bakterii Lactobacillus sp. (LCB) i Eubacterium cylindroides (EUB) na
aktywność antyoksydacyjną podłoża TSYEM (oznaczoną metodą ABTS po 24-godzinnej inkubacji) przedstawioną jako procent
Table 29. Effect of the addition of extracts or preparations and the presence of bacteria Lactobacillus sp. (LCB) and Eubacterium cylindroides
(EUB) on the antioxidant activity of medium (as determined by ABTS assay following 24-h incubation) expressed as percent
145
B
D
CC
CN
CCH
S
107,7 ± 2,9 †b
5,0
143,4 ± 9,9 *a
1,0
111,6 ± 12,0 †b
193,4 ± 18,1 *†a
5,0
2,5
184,9 ± 19,6 *†a
199,7 ± 20,4 *a
1,0
2,5
88,8 ± 9,8 †b
5,0
109,2 ± 8,3 a
1,0
106,8 ± 3,6 †a
148,0 ± 8,6 *a
5,0
2,5
140,8 ± 29,9 *a
147,8 ± 8,2 *a
1,0
2,5
198,0 ± 8,9 *†a
106,5 ± 6,6 c
1,0
5,0
175,1 ± 1,9 *a
5,0
136,8 ± 9,3 *b
169,0 ± 20,8 *†a
2,5
2,5
141,5 ± 29,2 *†b
LCBM
1,0
Ekstrakt
Stężenie końcowe
(Preparat)
Final
Extract
concentration
(Preparation)
[%]
Tabela 29. cd.
Table 29. cont.
175,5 ± 9,6 *†a
174,8 ± 3,0 *†a
154,6 ± 20,6 *b
233,7 ± 1,9 *†a
226,8 ± 37,0 *†a
221,1 ± 15,8 *a
154,0 ± 2,8 *†a
124,7 ± 2,1 *†b
111,8 ± 12,0 b
162,4 ± 11,9 *a
136,3 ± 23,5 *a
146,5 ± 7,1 *a
160,9 ± 1,3 *†a
147,9 ± 11,0 *a
118,4 ± 0,6 *b
200,0 ± 0,2 *a
203,8 ± 5,6 *†a
226,0 ± 8,2 *†a
LCBM+b
1,63
1,57
1,08
1,21
1,23
1,11
1,74
1,17
1,02
1,10
0,97
0,99
0,81
1,08
1,11
1,14
1,21
1,60
WILCB
62,7 ± 6,5 *†b
78,1 ± 10,7 *†b
92,9 ± 5,2 a
96,9 ± 4,3 a
89,0 ± 11,6 †a
65,2 ± 3,4 *†b
153,9 ± 5,3 *a
133,3 ± 13,7 *†a
144,4 ± 7,8 *a
137,2 ± 11,5 *a
129,4 ± 16,5 *a
129,9 ± 12,5 *a
137,1 ± 13,3 *a
126,0 ± 5,5 *a, b
118,2 ± 5,5 †b
115,2 ± 8,5 †b
129,8 ± 9,0 *a, b
140,0 ± 9,7 *a
EUBM
111,6 ± 21,2 a
110,9 ± 6,9 a
130,2 ± 12,7 *†a
96,9 ± 18,2 †b
146,8 ± 19,4 *a
108,0 ± 12,2 †b
95,2 ± 5,0 †b
130,5 ± 0,6 *†a
133,0 ± 17,3 *a
153,1 ± 1,5 *a
144,4 ± 4,4 *a
140,6 ± 10,4 *a
136,9 ± 13,8 *a
135,6 ± 6,3 *a
135,8 ± 7,5 *†a
144,6 ± 8,2 *†a
145,6 ± 12,3 *a
137,2 ± 3,7 *a
EUBM+b
1,20
1,14
1,46
1,49
0,95
0,81
1,52
1,67
0,92
1,12
1,12
1,08
1,00
1,08
1,15
1,26
1,12
0,98
WIEUB
146
184,7 ± 14,3 *a
5,0
126,7 ± 2,7 †b
1,0
157,5 ± 23,9 *†a,b
123,2 ± 5,0 *a
2,5
90,0 ± 5,1 †b
80,5 ± 13,4 *†b
1,0
5,0
158,9 ± 16,7 *†a
5,0
2,5
150,6 ± 8,8 *†a
144,3 ± 9,1 *†a
1,0
2,5
218,8 ± 32,7 *†a
151,0 ± 21,6 *b
1,0
5,0
222,9 ± 28,5 *†a
5,0
189,7 ± 18,2 *a
207,0 ± 31,1 *†a, b
2,5
2,5
179,9 ± 20,7 *b
1,0
151,3 ± 15,2 *b
191,1 ± 27,3 *†a
179,4 ± 27,5 *†a, b
130,7 ± 5,3 *a
119,5 ± 9,4 *†a
136,3 ± 16,2 *†a
195,6 ± 8,6 *†a
183,9 ± 3,7 *†a, b
176,7 ± 3,6 *†b
285,4 ± 30,4 *†a
208,2 ± 17,4 *b
180,6 ± 5,5 *b
302,1 ± 1,2 *†a
244,5 ± 6,0 *†b
200,6 ± 12,5 *c
0,82
1,21
1,42
1,06
1,33
1,69
1,23
1,22
1,22
1,30
1,10
1,20
1,36
1,18
1,12
147,4 ± 13,2 *a
144,4 ± 15,6 *a
122,1 ± 6,2 b
127,1 ± 15,3 a
128,7 ± 15,6 †a
131,7 ± 14,3 a
124,9 ± 5,7 *a
136,8 ± 15,0 *a
121,2 ± 5,3 a
365,7 ± 30,3 *†a
197,3 ± 17,1 *b
167,5 ± 19,2 *b
262,8 ± 20,8 *†a
168,4 ± 17,7 *†b
128,1 ± 14,9 c
P, PO, SP, M, Ż, S, CCH, CN, CC, D, B, GT, CIT, G, BEZ, NO – jak w tabeli 27 / see Table 27
LCBM, EUBM, LCBM+b, EUBM+b – jak w tabeli 23 / see Table 23
NO
BEZ
G
CIT
GT
126,4 ± 14,4 a
132,1 ± 16,3 *a
130,4 ± 6,0 *a
138,6 ± 13,2 *a, b
166,1 ± 30,6 *†a
133,5 ± 16,4 b
140,6 ± 0,5 *a
139,2 ± 7,5 *a
136,8 ± 24,6 *a
306,3 ± 24,2 *†a
212,6 ± 24,3 *b
164,6 ± 20,1 *c
161,9 ± 4,4 *†a
140,1 ± 20,2 *†a, b
119,1 ± 9,7 b
0,86
0,92
1,07
1,09
1,29
1,01
1,13
1,02
1,13
0,84
1,08
0,98
0,62
0,83
0,93
147
148
ale też od aktywności bakterii. W tabeli 26 zestawiono wyniki dla trzech gatunków
bakterii oraz przeznaczonych dla nich podłoży, które różniły się wartością pH
i – przede wszystkim – składem. Medium dla LCB miało pH 6,2–6,5, dla BF – pH 6,8,
zaś dla EUB – pH 7,0–7,2. Największe spadki potencjału AOX w medium z polifenolami, w stosunku do wartości wyjściowych, wystąpiły w przypadku medium dla
BF. Jest ono lekko kwaśne, ale w porównaniu do pozostałych dwóch podłoży ma
najbogatszy i najbardziej złożony skład. Podłoże TSYEM zawiera ekstrakt drożdżowy i hydrolizat sojowo-kazeinowy, MRS zawiera pepton kazeinowy oraz ekstrakty
wołowy i drożdżowy, zaś BFM – wymienione trzy składniki oraz pepton sojowy,
cysteinę, resazurynę i sole mineralne. Zmniejszenie się potencjału antyoksydacyjnego było szczególnie duże w przypadku zastosowania dodatku hesperydyny i hesperetyny oraz naringeniny, co potwierdza łatwość wchodzenia tych polifenoli w połączenia z macierzą pożywki. Ciekawe różnice zaobserwowano, analizując potencjał
antyoksydacyjny takiego samego medium, ale inkubowanego w różnych warunkach
(tab. 25). Enterococcus caccae (podobnie jak Ruminococcus gauvreauii i Eubacterium
cylindroides) był hodowany w medium TSYEM, które zawiera liczne białka i cukry
pochodzące z ekstraktu drożdżowego oraz z hydrolizatu soi i kazeiny. Jednak tylko
w przypadku doświadczeń z EN spadki potencjału AOX w medium po wzbogaceniu
polifenolami są tak wyraźne; istotne zmniejszenie potencjału AOX (o kilkanaście %
w stosunku do Kpoz) zanotowano dla CAT, H, NR, PHL, RS i Q. Wynika to najprawdopodobniej z faktu, że doświadczenia z EN były prowadzone w warunkach mikroaerofilowych, podczas gdy z RUMI i EUB – w ściśle anaerobowych. Wydaje się, że
niewielkie ilości tlenu, jakie docierały do składników pożywki, spowodowały utlenianie polifenoli, co oprócz interakcji z białkami znacząco zmniejszyło potencjał
antyoksydacyjny podłoża. Wyniki wielu badań potwierdzają, że utlenianie składników
fenolowych może zachodzić nawet bez udziału enzymów, pod wpływem generowanych w środowisku reaktywnych form tlenu, niektórych jonów metali czy zmian
temperatury, szczególnie przy obojętnym lub zasadowym odczynie środowiska [Le
Bourvellec i Renard 2012], a podłoże TSYEM miało pH 7,0–7,2. Powstające w wyniku utleniania o-chinony i o-semichinony tworzą związki addycyjne z tiolami.
O-chinony mogą też reagować z resztami siarkowymi aminokwasów, zarówno tych
wolnych, jak i budujących krótkie peptydy, a więc powszechnych składników pożywek,
do których przyrządzenia wykorzystano hydrolizaty białkowe, peptony i ekstrakty.
Zablokowanie wolnych grup –SH w aminokwasach także spowoduje zmniejszenie
potencjału redukcyjnego pożywki.
Kolejny typ zmian to obniżenie się potencjału antyoksydacyjnego podłoża na
skutek zbyt wysokiego stężenia dodanych związków. Obserwowano, że po początkowym wzroście potencjału AOX następowało – mimo dalszego zwiększania dawki
związku – zatrzymanie wzrostu lub wręcz zmniejszenie się aktywności przeciwrodnikowej medium. Prawdopodobnie w tej sytuacji, oprócz interakcji ze składnikami
medium (matrycą), dochodziło również do polimeryzacji flawonoidów, ich autoutle-
149
niania lub reakcji enzymatycznych powodujących rozpad polifenoli (np. pod wpływem
obecnej w surowcach roślinnych polifenolooksydazy). Takie sytuacje zaobserwowano dla kilku różnych podłoży wzbogacanych hesperydyną i hesperetyną, jak również
ekstraktami z derenia i brusznicy.
Potencjał antyoksydacyjny mediów wzbogaconych związkami polifenolowymi
może pod wpływem bakterii zwiększać się lub zmniejszać bądź też pozostawać bez
zmian. O ile wyjaśnienie tej ostatniej możliwości jest w miarę oczywiste, o tyle wzrost
i spadek potencjału AOX mógł wynikać z przemian związków polifenolowych pod
wpływem bakterii do pochodnych o odpowiednio większych lub mniejszych właściwościach antyoksydacyjnych, jak również z uwalniania polifenoli (bez ich przemian)
z wiązań z matrycą podłoża, powodującego zwiększenie się liczby wolnych cząsteczek
i grup mogących wchodzić w reakcje z rodnikiem. Ponadto, podczas swoich procesów
metabolicznych, bakterie wytwarzają różne związki, np. kwasy organiczne, które
obniżają pH badanego roztworu i wpływają na strukturę cząsteczki przeciwutleniacza. Przy niższym pH roztworu wiele polifenoli jest bardziej stabilnych i przyjmuje
postać uprotonowaną, dzięki czemu mają większy potencjał zmiatania wolnych rodników [Materska 2008]. Wytworzone metabolity mogą także powodować zmianę
polarności środowiska i poprzez wpływ na lipofilność/hydrofilowość polifenoli modyfikować ich potencjał antyoksydacyjny.
W licznych doświadczeniach przeprowadzonych w układach modelowych wykazano, że mogą powstawać wiązania kowalencyjne między różnymi oczyszczonymi
białkami (białka surowicy, serwatki, sojowe, mioglobina, laktoglobulina), enzymami
(α-amylaza, trypsyna, lizozym) lub składnikami pochodzącymi z matrycy żywności
(białka mleka) a związkami polifenolowymi (kwasy ferulowy, kawowy, chlorogenowy, chinowy, galusowy, apigenina, kemferol, kwercetyna, rutyna, myrycetyna, izoflawony). Za najważniejsze reaktywne reszty uznaje się nukleofilowe łańcuchy boczne, jak np. wolne tiolowe grupy cysteiny, wolne aminowe grupy lizyny, reszty
metioniny czy pierścień indolowy w tryptofanie [Le Bourvellec i Renard 2012].
Oznacza to, że stosowane podłoża MRS, TSYEM, ST i BFM stanowią idealne
źródło białek do interakcji z polifenolami.
Szczególnie wysoki przyrost aktywności antyoksydacyjnej nastąpił pod wpływem
E. coli dla podłoży z dodatkiem ekstraktu z czarnego bzu (WI 2,75–4,88), żurawiny
(WI 1,6–3,83), czosnku niedźwiedziego (WI 1,99–3,29) oraz zielonej herbaty
(WI 1,32–1,95). Przy tym, poza ostatnim przykładem, wartość WI malała wraz ze
wzrostem stężenia ekstraktu, co może wynikać z bakteriostatycznego wpływu tych
ekstraktów na EC. W przypadku zielonej herbaty przypuszczalnie zbyt duże stężenie
katechin spowodowało, że część z nich znajdowała się w podłożu w formie niedostępnej, związanej z białkami czy polisacharydami obecnymi w pożywkach.
W skład grejpfrutów wchodzą glikozydy flawanonów o dwóch cząsteczkach cukrów, głównie rutynozydy (np. narirutyna, eriocytryna) i neohesperozydy (np. naringina, neohesperydyna, poncyryna) [Nogata i in. 2006]. Można się zatem spodzie-
150
wać, że produkty ich hydrolizy, czyli aglikony, powstające w przewodzie pokarmowym
pod wpływem enzymów trawiennych i/lub bakteryjnych, będą charakteryzowały się
jeszcze większym potencjałem antyoksydacyjnym. Powszechnie bowiem wiadomo,
że glikozydy są słabszymi zmiataczami wolnych rodników niż odpowiednie aglikony.
Zakładając, że bakterie wykorzystane do doświadczeń w tej pracy mają zdolność
degradowania glikozydów flawanonów, można sądzić, że potencjał antyoksydacyjny
medium z dodatkiem czystych flawanonów lub Citroseptu powinien rosnąć po inkubacji w obecności bakterii. Analiza uzyskanych wyników (tab. 24–29) wskazuje,
że potencjał AOX w przypadku podłoży z dodatkiem hesperydyny zwiększył się pod
wpływem EN, BF i EUB, a z dodatkiem Citroseptu – pod wpływem EC (WI 2,32–
–3,10) i RUMI (WI 1,28–1,51). Znaczący wzrost potencjału AOX pod wpływem
bakterii wykazano też dla innych flawanonów zidentyfikowanych w ekstrakcie z grejpfruta, tj. hesperetyny (EC), naringeniny (EC, w mniejszym stopniu EN, BF, i LCB)
oraz naringiny (EC, EN).
Znaczący wzrost potencjału antyoksydacyjnego mediów z dodatkiem (+)-katechiny nastąpił pod wpływem EN, BF, LCB i EUB (z maksymalną wartością współczynnika interakcji WI wynoszącą 1,67). Przypuszczalnie do przemian metabolicznych
kwercetyny były zdolne Lactobacillus (WI 1,6–2,18) i Enterococcus (WI 1,08–1,41),
podczas gdy rutynozyd kwercetyny mógł być przekształcany do aglikonu lub pochodnych o większym potencjale AOX przez EC (WI 1,7–2,0), EN (1,5–1,95) i EUB
(1,23–1,48). Właściwości przeciwrodnikowe podłoży z dodatkiem florydzyny i rez
weratrolu zwiększały się pod wpływem EN, BF, EC i LCB (maksymalne wartości
WI odpowiednio 2,13 i 1,79), zaś podłoża z kemferolem – pod wpływem wszystkich
bakterii oprócz BAC (maks. WI 2,18).
W doświadczeniach z ekstraktami roślinnymi i suplementami diety wzrost potencjału AOX w obecności E. coli zanotowano praktycznie we wszystkich próbach.
Współczynnik interakcji wynosił od 1,01 do 4,88 (BEZ), co oznacza prawie 5-krotne
zwiększenie potencjału antyoksydacyjnego składników medium z dodatkiem ekstraktu z czarnego bzu pod wpływem tej bakterii. Wyjątkiem były podłoża z dodatkiem
ekstraktu z czerwonej cebuli (WI 0,43, 1,72 i 0,80 dla rosnących stężeń) oraz 5%
ekstraktu z cytryńca chińskiego (0,74), co mogło być spowodowane bardzo silnym
zahamowaniem wzrostu E. coli wywołanym przez te ekstrakty. W przypadku pozostałych gatunków bakterii wyniki były bardziej zróżnicowane. Do najciekawszych
można zaliczyć przypuszczalne przekształcenie związków bioaktywnych zawartych
w ekstrakcie z soi do pochodnych o wyższym potencjale przeciwrodnikowym przez
LCB i RUMI, a o niższym – przez BAC.
Zaskakujący jest również wzrost potencjału antyoksydacyjnego składników medium z największym dodatkiem ekstraktu z czerwonej cebuli pod wpływem LCB
oraz EUB i RUMI (tab. 28 i 29). Zgodnie z wynikami opisanymi w poprzednich
rozdziałach (tab. 20), ekstrakt ten w stężeniu 5% działał bakteriobójczo wobec LCB,
być może zatem wzrost potencjału antyoksydacyjnego należy przypisać przemianom
151
glikozydów kwercetyny do pochodnych o wyższej aktywności antyoksydacyjnej i antymikrobiologicznej.
Znaczący wzrost potencjału AOX zanotowano także w przypadku pożywek z dodatkiem ekstraktu z derenia pod wpływem RUMI (WI 1,44–2,01) i ekstraktu z brusznicy pod wpływem LCB (WI 1,08–1,63). Z kolei spadek aktywności AOX wykazano
dla wszystkich stężeń ekstraktów/preparatów BEZ, PO, S, NO i CIT w obecności
Bacteroides galacturonicus oraz M, CN, G i CIT w obecności Enterococcus caccae.
Możliwe, że za ten spadek odpowiada tu wykorzystanie przez bakterie na swoje
potrzeby związków przeciwutleniających obecnych w pożywce.
Aby zweryfikować, czy za wykazany wzrost bądź spadek potencjału antyoksydacyjnego odpowiada biotransformacja poszczególnych flawonoidów do aglikonu i/lub
innych pochodnych, wykonano analizę HPLC, której wyniki omówiono w następnym
rozdziale.
4.5. Zmiany związków polifenolowych pod wpływem bakterii
jelitowych
Jak już wspomniano, nie każda zmiana potencjału antyoksydacyjnego, zaobserwowana w podłożu po dodaniu bakterii, jest wynikiem metabolizmu polifenoli przez
te bakterie. Aby sprawdzić, czy dany związek polifenolowy ulegał biotransformacji
pod wpływem badanych gatunków bakterii jelitowych (do metabolitów o większym
lub mniejszym potencjale AOX), wykonano dodatkowe oznaczenia. Media hodowlane z dodatkiem lub bez dodatku polifenoli bądź ekstraktów po inkubacji z bakteriami poddano analizie HPLC pod kątem zmian obecności i stężenia wybranych
związków polifenolowych.
Wykazano, że wykorzystane w doświadczeniach gatunki bakterii, poza kilkoma
wyjątkami, nie przejawiały zdolności metabolizowania większości badanych związków
polifenolowych.
Istotne zmiany zanotowano dla rutyny, która częściowo ulegała biotransformacji (tab. 30–33). Pod wpływem Escherichia coli w medium z dodatkiem rutyny nieznacznie malała zawartość rutynozydu (tab. 30), pojawił się też w wykrywalnym
stężeniu kwercetyno-3-O-glukozyd (do 8,61±2,10 µg/ml). Zwiększała się również
aktywność antyoksydacyjna medium (tab. 24), co mogłoby stanowić poparcie tezy
o degradacji rutyny pod wpływem enzymów E. coli.
W obecności Enterococcus caccae rutyna była przekształcana do kwercetyny oraz
innego, niezidentyfikowanego związku (dodatkowy pik na chromatogramie). Wraz
ze wzrostem dawki rutyny zwiększało się jej stężenie w medium, choć przy najniższej
dawce (20 µg/ml) część dodanego polifenolu prawdopodobnie uległa związaniu
z białkami lub cukrami w pożywce (tab. 31). Świadczą o tym wartości potencjału
152
AOX tej próbki (tab. 25), niższe od wartości kontrolnej, co wskazuje na zablokowanie części grup o potencjale redukującym w białkach obecnych w medium. Pod
wpływem bakterii dochodziło do uwolnienia wolnej rutyny z tych połączeń (jej oznaczone stężenie wzrosło), co więcej, część rutyny została przekształcona do kwercetyny, której śladowe ilości wykryto w próbkach zaszczepionych E. caccae (tab. 31).
Tabela 30. Wpływ bakterii Escherichia coli (EC) na stężenie rutyny (RUT) i kwercetyno-3-O-glukozydu (QR) w podłożu oznaczone metodą HPLC (średnia ± SD, n = 3)
Table 30. Effect of bacteria Escherichia coli (EC) on the concentration of rutin (RUT) and
quercetin-3-O-glucoside (QR) in medium as determined by HPLC method (mean ± SD,
n = 3)
Stężenie RUT / RUT concentration
[µg/ml]
Oznaczone / Determined
Teoretyczne
Theoretical
Stężenie QR / QR concentration
[µg/ml]
podłoże
medium
podłoże + EC
medium + EC
podłoże
medium
podłoże + EC
medium + EC
20
15,19 ± 1,32 a
14,45 ± 0,93 a
n.d.
tr
100
103,51 ± 14,49 a
88,75 ± 4,03 b
n.d.
8,61 ± 2,10
250
263,87 ± 36,94 a
273,64 ± 14,36 a
n.d.
0,97 ± 0,19
tr – wykryto ilości śladowe / trace amounts
Średnie oznaczone tą samą literą w wierszu nie różnią się istotnie (p < 0,05).
Means marked with the same letter in a row are not significantly different (p < 0.05).
Tabela 31. Wpływ bakterii Enterococcus caccae (EN) na stężenie rutyny (RUT) i kwercetyny
(Q) w podłożu oznaczone metodą HPLC (średnia ± SD, n = 3)
Table 31. Effect of bacteria Enterococcus caccae (EN) on the concentration of rutin (RUT)
and quercetin (Q) in medium as determined by HPLC method (mean ± SD, n = 3)
[µg/ml]
Teoretyczne
Theoretical
podłoże
medium
Stężenie Q / Q concentration
[µg/ml]
podłoże + EN
medium + EN
podłoże
medium
podłoże + EN
medium + EN
20
9,38 ± 1,22 a
18,81 ± 6,71 b
n.d.
n.d.
100
104,79 ± 9,05 a
96,73 ± 6,90 a
n.d.
tr
250
279,72 ± 39,16 a
280,14 ± 23,02 a
n.d.
tr
tr – wykryto ilości śladowe / trace amounts
153
Bacteroides galacturonicus i Eubacterium cylindroides przekształcały rutynę do
pochodnych, które nie zostały zidentyfikowane, nie były to jednak ani kwercetyna,
ani jej glukozyd. Potencjał antyoksydacyjny medium z dodatkiem rutyny istotnie
wzrastał pod wpływem EUB (tab. 26), co może wskazywać na powstanie metabolitów o wyższym AOX. Wzrost stężenia rutyny w obecności bakterii (wyraźny
szczególnie dla niższych dawek) świadczy o uwalnianiu tego glikozydu z połączeń
z matrycą pożywki (tab. 32 i 33). Metabolity powstałe w reakcjach zachodzących
z udziałem BAC natomiast miały potencjał antyoksydacyjny niższy od wyjścioweTabela 32. Wpływ bakterii Bacteroides galacturonicus (BAC) na stężenie rutyny (RUT) w podłożu oznaczone metodą HPLC (średnia ± SD, n = 3)
Table 32. Effect of bacteria Bacteroides galacturonicus (BAC) on the concentration of rutin
(RUT) in medium as determined by HPLC method (mean ± SD, n = 3)
[µg/ml]
Teoretyczne
Theoretical
podłoże
medium
podłoże + BAC
medium + BAC
20
8,65 ± 0,78 a
13,27 ± 9,06 a
100
56,64 ± 6,34 a
54,81 ± 2,79 a
250
212,22 ± 28,86 a
189,42 ± 32,46 a
Tabela 33. Wpływ bakterii Eubacterium cylindroides (EUB) na stężenie rutyny (RUT) w podłożu
oznaczone metodą HPLC (średnia ± SD, n = 3)
Table 33. Effect of bacteria Eubacterium cylindroides (EUB) on the concentration of rutin (RUT)
in medium as determined by HPLC method (mean ± SD, n = 3)
[µg/ml]
Teoretyczne
Theoretical
podłoże
medium
podłoże + EUB
medium + EUB
20
5,99 ± 1,26 a
7,01 ± 3,76 a
100
33,56 ± 5,34 a
61,08 ± 21,95 b
250
194,26 ± 24,67 a
160,95 ± 22,27 a
154
go (bez bakterii) (tab. 24). Ponieważ rozerwanie pierścienia aromatycznego przez
enzymy bakteryjne powoduje spadek potencjału antyoksydacyjnego związku, można przypuszczać, że BAC dokonał właśnie tego typu przemiany w obrębie cząsteczek rutyny.
Na podstawie zaprezentowanych wyników można sformułować wniosek, że bakterie jelitowe mają zdolność do metabolizowania tego samego związku poprzez
odmienne szlaki metaboliczne i z wytworzeniem odmiennych pochodnych, także
takich o niższym potencjale antyoksydacyjnym.
W medium dla E. coli wzbogacanym (+)-katechiną w rosnącym stężeniu (bez
inokulacji bakteriami) oznaczona zawartość katechiny była 3–4 razy mniejsza niż
dawka dodana do podłoża (tab. 34). Pod wpływem bakterii ilość tego związku malała, co może świadczyć o wykorzystywaniu go przez EC. Jak podano wcześniej,
(+)-katechina nie hamowała wzrostu badanych bakterii, w tym E. coli. Potencjał
antyoksydacyjny medium pod wpływem EC nie zmieniał się istotnie, jedynie w próbach z dodatkiem 20 µg katechiny/ml malał (tab. 24). W przypadku pozostałych
podłoży wzbogacanych (+)-katechiną nie wykryto piku charakterystycznego dla tego
związku, pojawiał się natomiast dodatkowy pik, którego wysokość (i pole powierzchni pod pikiem) zwiększała się wraz z rosnącą dawką dodanej katechiny. Pik ten
prawdopodobnie odpowiadał pochodnej (+)-katechiny. W dostępnej literaturze
można znaleźć informacje o wiązaniu katechin do kazeiny [Haratifar i Corredig
2014]. Ponieważ hydrolizaty kazeiny były składnikiem wszystkich, poza bulionem
odżywczym dla EC, stosowanych w tej pracy mediów, można wnioskować, że wspomniana reakcja zachodziła także w tych podłożach.
Tabela 34. Wpływ bakterii Escherichia coli (EC) na stężenie (+)-katechiny (CAT) w podłożu
oznaczone metodą HPLC (średnia ± SD, n = 3)
Table 34. Effect of bacteria Escherichia coli (EC) on the concentration of (+)-catechin (CAT)
in medium as determined by HPLC method (mean ± SD, n = 3)
Stężenie CAT / CAT concentration
[µg/ml]
Teoretyczne
Theoretical
podłoże
medium
podłoże + EC
medium + EC
20
6,14 ± 0,39
n.d.
100
16,90 ± 2,70 a
14,04 ± 2,01 a
250
89,91 ± 17,80 a
42,73 ± 4,74 b
155
Wzrost potencjału antyoksydacyjnego medium pod wpływem Ruminococcus
gauvreauii dla najniższej dawki naringiny (tab. 25) wynikał prawdopodobnie z przemian tego flawanonu do pochodnych o wyższym potencjale AOX. Spadkowi zawartości naringiny pod wpływem RUMI nie towarzyszyło jednak pojawienie się aglikonu – naringeniny (tab. 35), a zatem przemiany metaboliczne musiały prowadzić do
powstania innych pochodnych, np. kwasów fenolowych. Taki szlak biotransformacji
znany jest dla bakterii Clostridium orbiscindens, która przekształca naringeninę aż
do floroglucyny, poprzez stadium dihydrochalkonu oraz kwasu 3-(4-hydroksyfenylo)-propionowego [Schoefer i in. 2003]. Co ciekawe, bakteria ta nie ma zdolności
metabolizowania naringiny (glikozydu). Podobnie Eubacterium ramulus nie działa
na naringinę, zaś naringeninę przekształca do kwasów fenolowych [Schneider i Blaut
2000]. Zanotowany spadek potencjału antyoksydacyjnego w podłożach z naringiną
w wyniku działania Bacteroides galacturonicus nie wynikał z przemian tego związku
do aglikonu. Nie wykryto naringeniny, a zmiany stężenia naringiny pod wpływem
BAC w większości przypadków nie były istotne statystycznie (tab. 36). Także w pozostałych podłożach nie stwierdzono istotnych zmian stężenia tego glikozydu pod
wpływem innych badanych bakterii.
W przypadku hesperydyny zmiany potencjału antyoksydacyjnego medium nie
znalazły uzasadnienia w przemianach tego związku pod wpływem bakterii – dla
żadnej z nich, z wyjątkiem Ruminococcus gauvreauii, nie zaobserwowano istotnych
statystycznie zmian ani stężenia HR, ani czasu retencji odpowiadającego jej piku na
chromatogramach. W tym przypadku na uwagę zasługuje znacznie mniejsze (niż
wynikałoby to z dodanej dawki) stężenie HR w medium wzbogaconym najwyższą
Tabela 35. Wpływ bakterii Ruminococcus gauvreauii (RUMI) na stężenie naringiny (NR) i jej
aglikonu naringeniny (N) w podłożu oznaczone metodą HPLC (średnia ± SD, n = 3)
Table 35. Effect of bacteria Ruminococcus gauvreauii (RUMI) on the concentration of naringin
(NR) and its aglycone naringenin (N) in medium as determined by HPLC method
(mean ± SD, n = 3)
Stężenie NR / NR concentration
[µg/ml]
Teoretyczne
Theoretical
podłoże
medium
Stężenie N
N concentration
[µg/ml]
podłoże + RUMI
medium + RUMI
podłoże + RUMI
medium + RUMI
20
15,73 ± 2,06 b
n.d.
100
116,67 ± 21,23 a
96,51 ± 11,58 a
n.d.
250
276,65 ± 34,19 a
206,48 ± 35,36 b
n.d.
34,56 ± 2,66 a
156
Tabela 36. Wpływ bakterii Bacteroides galacturonicus (BAC) na stężenie naringiny (NR) i jej
aglikonu naringeniny (N) w podłożu oznaczone metodą HPLC (średnia ± SD, n = 3)
Table 36. Effect of bacteria Bacteroides galacturonicus (BAC) on the concentration of naringin
(NR) and its aglycone niringenin (N) in medium as determined by HPLC method
(mean ± SD, n = 3)
Stężenie NR / NR concentration
[µg/ml]
Teoretyczne
Theoretical
podłoże
medium
Stężenie N
N concentration
[µg/ml]
podłoże + BAC
medium + BAC
podłoże + BAC
medium + BAC
20
24,76 ± 1,39 a
20,39 ± 0,12 b
n.d.
100
105,40 ± 13,96 a
117,85 ± 21,86 a
n.d.
250
269,14 ± 24,76 a
251,90 ± 44,49 a
n.d.
dawką tego glikozydu, co znalazło odzwierciedlenie w niskim potencjale antyoksydacyjnym tej próby (tab. 25). W obecności bakterii doszło do dalszego obniżenia
potencjału AOX, czemu towarzyszył znaczny spadek zawartości hesperydyny, ale
nie przełożyło się to na pojawienie się wykrywalnych stężeń aglikonu – hesperetyny
(tab. 37). Jeśli zatem miałby to być rozpad hesperydyny pod wpływem RUMI, to
należałoby przypuszczać, że proces zachodzi dalej niż tylko do aglikonu i prowadzi
do powstania związków o niższym potencjale antyoksydacyjnym niż potencjał wyjściowego glikozydu.
Wykazano zanik pików dla kwercetyny, kemferolu, rezweratrolu i hesperetyny we
wszystkich badanych pożywkach, niezależnie od stężenia dodanych związków. Z podłoży dla EUB i LCB znikała także florydzyna, a w pozostałych mediach jej stężenie,
oznaczone metodą HPLC, było kilkukrotnie mniejsze niż wynikałoby to z ilości dodanego polifenolu i nie ulegało zmianie pod wpływem bakterii. Z kolei naringeninę
wykryto jedynie w mediach dla EC i EN, choć – podobnie jak w przypadku florydzyny – jej stężenie, oznaczone na podstawie chromatogramów, było kilkukrotnie niższe
niż wynikałoby to z rzeczywiście dodanej do pożywek ilości związku. Również w tych
przypadkach obecność bakterii nie miała istotnego wpływu na stężenie tego związku
w podłożu. Nie wykryto natomiast naringeniny w podłożach dla BAC, RUMI, LCB
i EUB (poza śladowymi ilościami dla najwyższej dodanej dawki 250 µg/ml). Wyniki
te potwierdzają wcześniejsze przypuszczenia o wiązaniu się niektórych polifenoli do
białek czy polisacharydów obecnych w mediach, dlatego też w przypadku Q, KMP,
RS, H, PHL i N zrezygnowano z prezentacji wyników w postaci tabel, gdyż znalazłaby się tam jedynie adnotacja „stężenie poniżej progu detekcji”.
157
Tabela 37. Wpływ bakterii Ruminococcus gauvreauii (RUMI) na stężenie hesperydyny (HR) i jej
aglikonu hesperetyny (H) w podłożu oznaczone metodą HPLC (średnia ± SD, n = 3)
Table 37. Effect of bacteria Ruminococcus gauvreauii (RUMI) on the concentration of hesperidin (HR) and its aglycone hesperetin (H) in medium as determined by HPLC method
(mean ± SD, n = 3)
Stężenie HR / HR concentration
[µg/ml]
Teoretyczne
Theoretical
podłoże
medium
podłoże + RUMI
medium + RUMI
Stężenie H
H concentration
[µg/ml]
podłoże + RUMI
medium + RUMI
20
28,66 ± 4,18 a
19,83 ± 4,74 b
n.d.
100
118,02 ± 13,16 a
91,79 ± 5,31 b
n.d.
250
129,42 ± 17,21 a
60,67 ± 2,84 b
n.d.
W podłożach z dodatkiem ekstraktów końcowe stężenia wykrywanych i identyfikowanych polifenoli były znacznie niższe niż w przypadku dodatku czystych związków, przeważnie poniżej progu detekcji chromatografu. Dla tych związków, które
udało się zidentyfikować, wykazano tylko kilka istotnych statystycznie zmian stężenia pod wpływem badanych gatunków bakterii. Z tego też powodu nie przedstawiono uzyskanych rezultatów w postaci tabelarycznej, a wartości, które wskazywały na
istotne statystycznie zmiany, przedyskutowano poniżej.
W podłożach wzbogaconych ekstraktem z soi (w stężeniu 5%) nastąpił pod
wpływem Eubacterium cylindroides całkowity zanik daidzyny (z wyjściowej wartości
4,12 ± 0,49 µg/ml do 0) z jednoczesnym pojawieniem się jej aglikonu – daidzeiny
(wzrost z 0 do 4,22 ± 2,03 µg/ml) i brakiem zmian poziomu genisteiny. Należy zaznaczyć, że w stężeniu 5% ekstrakt z soi bardzo silnie hamował wzrost EUB; być
może, właśnie te śladowe pozostałości tych bakterii były zdolne do przekształcania
daidzyny w daidzeinę. Pozostałe testowane gatunki bakterii nie wpływały na poziom
izoflawonoidów w medium lub związki te występowały w stężeniu niewykrywalnym.
Warto tutaj podkreślić, że wpływ danej substancji na bakterie zależy nie tylko
od jej budowy, ale także od możliwości metabolicznych bakterii. Niektóre gatunki
wytwarzają bowiem enzymy umożliwiające rozkład poszczególnych związków, np.
Eubacterium ramulus może rozcinać pierścień aromatyczny w cząsteczkach flawonoidów. Dzięki temu bakterie mogą wykorzystywać niektóre flawonoidy na swoje
potrzeby. Rodzaj flawonoidu zależy od gatunku bakterii i wytwarzanych przez nie
enzymów; niektóre gatunki preferują glikozydy, z których odłączają cząsteczki cukrów, wykorzystywane dalej jako źródło węgla i energii (np. Bacteroides [Bokkenheuser
158
i in. 1987]), często jednak nie mają możliwości, by wykorzystać również aglikon. Inne
z kolei, jak np. Clostridium orbiscindens czy E. ramulus, nie potrafią aktywnie korzystać z glikozydów, uzależnione są więc od działania enzymów innych organizmów,
by móc wykorzystać wytworzony przez nie aglikon [Schoefer i in. 2003]. Szlak metaboliczny wielu polifenoli prowadzi do floroglucyny, która następnie może być
przekształcana przez kolejne gatunki bakterii (np. Eubacterium oxidoreducens)
[Krumholz i in. 1987]. Wyraźnie więc widać, że w rozkład danego związku zaangażowanych jest często wiele gatunków bakterii, stąd brak zmian wykazany w warunkach in vitro, przy udziale jednego tylko mikroorganizmu, nie musi być jednoznaczny z brakiem możliwości uczestniczenia tego drobnoustroju w procesach
biotransformacji danego związku. W warunkach rzeczywistych, tzn. w przewodzie
pokarmowym, współistnieją liczne gatunki mikroorganizmów mogące współdziałać
w metabolizmie danej substancji.
W doświadczeniach z dodatkiem ekstraktów wykazano także zachodzenie, pod
wpływem bakterii, nieznacznych zmian stężenia rutyny, stanowiącej składnik niektórych surowców. W podłożu wzbogacanym najwyższą badaną dawką ekstraktu z czosnku niedźwiedziego stężenie rutyny malało pod wpływem Enterococcus caccae
z 0,16 ± 0,02 do 0,08 ± 0,01 µg/ml. Jednocześnie w medium pojawiała się kwercetyna, której stężenie wzrastało z poziomu niewykrywalnego do 0,20 ± 0,00 µg/ml.
Wyniki te są potwierdzeniem rezultatów doświadczeń z czystymi polifenolami, wskazujących na zdolność przekształcania rutyny do kwercetyny przez EN. Z kolei podczas przemian tego samego ekstraktu, ale pod wpływem Ruminococcus gauvreauii,
stężenie rutyny malało z 2,32 ± 0,26 do 1,86 ± 0,02 µg/ml. Nie pojawiły się w wykrywalnych ilościach ani kwercetyna, ani glukozyd kwercetyny, zatem ubytek rutyny
polegał na czymś więcej niż tylko na odszczepieniu cząsteczki monocukru lub dwucukru od aglikonu, tym bardziej że podczas rozdziału chromatograficznego zaobserwowano nowy, niezidentyfikowany związek. Nie zanotowano zmian pod wpływem
EUB, zaś w próbach z EC polifenole miały stężenia poniżej progu detekcji.
Stężenie rutyny w podłożach wzbogaconych ekstraktem z jagód goji (w stężeniu
5%), będących bogatym źródłem tego związku, malało pod wpływem EUB
z 0,43 ± 0,05 do 0,23 ± 0,32 µg/ml, ale nie towarzyszyły temu zmiany stężeń kwercetyno-3-O-glukozydu i kwercetyny. Nie zanotowano żadnych zmian stężenia rutyny
pod wpływem RUMI, a w próbach z EC i EN jej poziom był poniżej możliwości
detekcji aparatu. Co ciekawe, w medium z 5-procentowym dodatkiem ekstraktu
z czarnego bzu stężenie rutyny nie ulegało zmianie pod wpływem EN, podczas gdy
stężenie kwercetyny się zwiększało (z 0,18 ± 0,03 do 2,00 ± 0,01 µg/ml). W przypadku pozostałych bakterii wykazano brak zmian stężenia tych związków lub stwierdzono, że ich poziom mieści się poniżej progu wykrywalności.
Brak istotnych zmian stężenia pod wpływem większości badanych gatunków
bakterii (w tym RUMI) wykazano także dla hesperydyny i naringiny w mediach
z dodatkiem Citroseptu. Wyjątek stanowiły próby inkubowane z EUB, w których
159
poziom naringiny malał z 37,19 ± 2,23 do 21,49 ± 4,33 µg/ml, zaś hesperydyny
pozostawał bez zmian. Potwierdza to wyniki doświadczeń z czystymi polifenolami,
świadczące, że badane bakterie nie metabolizują flawanonów obecnych w grejpfrucie. Niestwierdzenie zmian ilości hesperydyny pod wpływem RUMI może być konsekwencją znacznego błędu wynikającego z faktu, że stężenie tego związku w medium
znajdowało się na progu wykrywalności.
Wykazano, że niektóre badane gatunki bakterii powodują spadek zawartości
kwasów fenolowych w podłożu, co może świadczyć zarówno o procesach rozkładania tych związków przez bakterie, jak i o wykorzystaniu ich jako źródła węgla i energii w procesach metabolicznych mikroorganizmu. W podłożach z 5-procentowym
dodatkiem ekstraktu z czosnku niedźwiedziego stwierdzono spadek stężenia kwasu
protokatechowego (PCA) pod wpływem Enterococcus caccae. Bakteryjny metabolizm
kwasu PCA prowadzi do wytworzenia kwasów pirogronowego, bursztynowego i szczawiowego oraz acetaldehydu i acetyloCoA, które są włączane w cykl kwasów trójkarboksylowych [Karegoudar i Kim 2000].
W mediach wzbogaconych ekstraktem z cytryńca chińskiego w stężeniu 5%
wykazano z kolei spadek stężenia kwasu galusowego (GA) pod wpływem Escherichia
coli i Enterococcus caccae, odpowiednio z 6,51 ± 0,86 do 0,33 ± 0,47 µg/ml oraz
z 23,24 ± 3,78 do 13,84 ± 6,59 µg/ml. Także w podłożach z najwyższą dawką ekstraktu z jagód goji poziom kwasu galusowego malał pod wpływem E. coli
z 1,44 ± 0,19 do 0,17 ± 0,24 µg/ml. W przypadku dodania do pożywki ekstraktu
z zielonej herbaty (w stężeniu 5%) zanotowano wzrost stężenia kwasu galusowego
(z niewykrywalnego do 6,11 ± 4,38 µg/ml) z całkowitym rozkładem (-)-epigalokatechiny (z 5,87 ± 0,65 µg/ml do n.d.) pod wpływem E. caccae, co może wskazywać
na zdolność tej bakterii do odszczepiania reszty kwasu galusowego od cząsteczki
(-)-epigalokatechiny. Odmienne prawidłowości wykazano w doświadczeniach z zieloną herbatą prowadzonych w obecności Eubacterium cylindroides oraz Lactobacillus
sp. – pod wpływem tych bakterii zmniejszało się zarówno stężenie kwasu galusowego, jak i galusanu (-)-epigalokatechiny; odpowiednio z 4,12 ± 0,45 do
2,34 ± 3,50 µg/ml i z 171,86 ± 18,90 do114,86 ± 32,96 µg/ml dla EUB oraz
z 6,61 ±0,73 do 2,97 ± 0,30 µg/ml i z 172,83 ± 19,21 µg/ml do niewykrywalnego
dla LCB. Wykorzystanie kwasu galusowego przez LCB może tłumaczyć sugerowane wcześniej stymulowanie wzrostu tej bakterii przez kwas galusowy.
Stężenie obecnego w ekstrakcie z malin kwasu elagowego malało pod wpływem
EC (z 0,08 ± 0,01 do 0,03 ±0,05 µg/ml), EN (z 0,39 ± 0,06 mg/ml do niewykrywalnego) i LCB (z 0,32 ± 0,02 do 0,17 ± 0,24 µg/ml).
Analizując wyniki uzyskane dla podłoży wzbogacanych ekstraktami roślinnymi
oraz preparatami farmaceutycznymi, należy uwzględnić również obecność dodatkowych składników, zarówno substancji pochodzących z podłoży bakteryjnych, jak
i substancji pochodzenia roślinnego, które przeszły do wyciągów podczas ekstrakcji.
Ta złożona matryca spowodowała, że większość polifenoli pozostała związana z biał-
160
kami i polisacharydami. Prowadząc doświadczenia z ekstraktami z owoców, nie
można także zapominać o występującej w wielu z nich polifenolooksydazie (PPO).
Guyot i inni [1996] stwierdzili bowiem, że w wodnych roztworach katechina w obecności PPO ulega utlenianiu, co prowadzi do wytworzenia szeregu dimerów w wyniku powstania połączenia C–C oraz C–O między flawanami, przy czym typ powstających dimerów zależy od pH środowiska. Przy niskim pH faworyzowane są
produkty bezbarwne, a przy wyższym pH powstają żółte produkty dimeryzacji. Wśród
zidentyfikowanych przez tych autorów dimerów były dehydrodikatechina A i B,
będące izomerami procyjanidyn typu B. W niniejszej pracy wykazano zanik katechiny z podłoży z jednoczesnym pojawieniem się niezidentyfikowanych związków, będących przypuszczalnie produktami utleniania i/lub degradacji katechiny.
Uzyskane wyniki potwierdzają sugerowane wcześniej interakcje związków polifenolowych ze składnikami pożywek. W niektórych przypadkach dochodziło pod
wpływem bakterii do uwalniania tych związków z wytworzonych połączeń, prawdopodobnie na skutek wykorzystywania przez bakterie do swojego metabolizmu aminokwasów czy cukrów albo na skutek zmiany pH medium pod wpływem metabolitów
bakterii. Większość badanych gatunków bakterii w warunkach beztlenowych wytwarza kwasy organiczne, które powodują spadek odczynu podłoża i zmianę siły oddziaływań między cząsteczkami. Zmiana pH podłoża (bakteryjna) powoduje też
zmiany budowy cząsteczek polifenoli. Wykazano, że kwercetyna w bardziej kwaśnym
środowisku staje się mniej lipofilna, co wynika z przybrania formy uprotonowanej
i prowadzi do zwiększenia zdolności oddawania protonu [Materska 2008].
Podsumowując przedstawione rozważania należy stwierdzić, że postawiona na
początku badań hipoteza nr 2 powinna zostać odrzucona, wykazano bowiem, że
bakterie będące przedstawicielami fizjologicznej mikrobioty jelitowej mogą przekształcać związki polifenolowe do pochodnych o niższym potencjale antyoksydacyjnym. Co prawda, w przypadku niektórych składników wykazano wzrost potencjału
antyoksydacyjnego, ale często było to spowodowane nie przemianami metabolicznymi polifenoli, ale ich uwalnianiem z powiązań z białkami czy innymi składnikami
obecnymi w środowisku reakcji. Takie procesy mają jednak istotne znaczenie w warunkach in vivo, gdyż do przewodu pokarmowego związki polifenolowe rzadko
trafiają w postaci wolnej i oczyszczonej (preparaty farmaceutyczne, suplementy
diety), a znacznie częściej – jako składniki żywności, są więc powiązane z matrycą.
Uwalnianie z tych powiązań zwiększa biodostępność polifenoli dla organizmu gospodarza oraz rezydujących w nim przedstawicieli mikrobioty jelitowej. Dzięki temu
składniki polifenolowe mogą być przekształcane przez inne bakterie jelitowe, tym
bardziej że w skład ludzkiej mikrobioty wchodzi kilkaset gatunków, a w tej pracy
przebadano ich zaledwie siedem. Wytworzone metabolity mogą następnie być wykorzystywane przez bakterie lub komórki nabłonka jelitowego w procesach metabolicznych albo zostać wchłonięte, by wywrzeć wpływ na organizm gospodarza.
161
Terapie celowane wobec konkretnego gatunku, który powinien być wyeliminowany albo, odwrotnie, którym planuje się wzbogacić mikrobiotę jelitową, będą jednym z ważniejszych zagadnień badawczych najbliższych lat. Wyjaśnienie, w jaki
sposób można odwrócić stan dysbiozy, którą bakterię „wzmocnić”, a którą „osłabić”,
żeby pomóc choremu wydostać się z zaklętego kręgu choroby, stanowi już dziś temat
wielu projektów badawczych na skalę światową. Wynika to stąd, że dysbiozę uważa
się za jeden z elementów odpowiedzialnych za rozwój licznych poważnych jednostek
chorobowych, takich jak choroby zapalne jelita (IBD, choroba Crohna), astma,
otyłość, cukrzyca typu 1, alergie, celiakia, syndromy metaboliczne i miażdżyca.
Wprowadzenie indywidualnych terapii dostosowanych do wieku osobnika, jego płci,
regionu zamieszkania i współistniejących chorób jest na razie melodią przyszłości,
jednak już dziś stosowane są różne rodzaje takich celowanych interwencji, w tym
antybiotyki, probiotyki, prebiotyki, immunomodulatory czy terapia fagowa.
Wydaje się, że szczególnie cennym wnioskiem wynikającym z tych badań jest to,
że związki polifenolowe obecne w diecie w postaci wieloskładnikowych mieszanin,
a przede wszystkim w formie glikozydów, są mniej „agresywne” w stosunku do gatunków bakterii zasiedlających ludzkie jelito niż te, które można nabyć pod postacią
jednoskładnikowych suplementów. Nasuwa się też druga ważna konkluzja, że zbyt
duże stężenia polifenoli, jakie trafiają do przewodu pokarmowego, mogą wywrzeć
negatywny efekt na organizm, zamiast go wspomóc.
5. Wnioski
Wyniki tej pracy wskazują, że należy odrzucić hipotezę badawczą nr 1, mówiącą, iż
naturalne składniki przeciwutleniające i związki polifenolowe zawarte w surowcach
roślinnych nie wywierają hamującego wpływu na bakterie będące przedstawicielami
fizjologicznej mikrobioty jelitowej. Jak wykazano, mogą one wywierać silne inhibitorowe działanie na te bakterie.
1. Szczególnie silny wpływ hamujący na bakterie Lactobacillus sp., Enterococcus
caccae i Bacteroides galacturonicus wykazano dla rezweratrolu i naringeniny,
a na Bifidobacterium catenulatum – dla kwercetyny. Wzrost Ruminococcus
gauvreauii był silnie hamowany przez wszystkie wymienione polifenole i dodatkowo przez kemferol, który działał bakteriobójczo także wobec Eubacterium
cylindroides.
2. Spośród badanych ekstraktów roślinnych i suplementów diety ekstrakty z cytryńca chińskiego, jako jedyne, znacząco hamowały wzrost wszystkich badanych bakterii jelitowych (MIC ≥ 5%). Ekstrakt z miąższu i pestek grejpfruta (Citrosept)
hamował wzrost badanych bakterii, oprócz LCB, zaś ekstrakt z owoców pigwowca działał silnie hamująco na B. galacturonicus (MIC = 5%) i E. cylindroides
(MIC = 2,5%). Pozostałe ekstrakty wywierały bardziej zróżnicowany wpływ: od
hamującego, przez neutralny, do stymulującego, w zależności od gatunku bakterii.
3. Dla właściwości antyoksydacyjnych i antybakteryjnych badanych związków polifenolowych kluczowa była jednoczesna obecność wolnych grup hydroksylowych
przyłączonych do szkieletu cząsteczki w pozycji C5, C7 i C4’ oraz grupy ketonowej przy C4.
4. Wykazano, że glikozydy flawonoidów są słabszymi inhibitorami niż ich aglikony,
prawdopodobnie na skutek zawady sterycznej, jaka występuje po przyłączeniu
cząsteczek cukrów.
5. Możliwe jest takie dobranie składników polifenolowych, by zwiększyć lub zmniejszyć liczebność wybranej grupy bakterii wchodzących w skład mikrobioty jelitowej. Takie celowane terapie w przyszłości mogą zostać wykorzystane do przywracania równowagi w przewodzie pokarmowym i wspomagania leczenia różnych
chorób wywołanych przez dysbiozę. Zahamowanie wzrostu Ruminococcus gau-
5. Wnioski
163
vreauii uzyskano jedynie po zastosowaniu ekstraktu z cytryńca chińskiego oraz
Citroseptu, natomiast zwiększenie liczebności tej bakterii osiągnięto przez dodatek bioaktywnych składników zawartych w spirulinie, czerwonej cebuli, jagodach goji, czarnym bzie oraz soku z noni. Wobec Enterococcus caccae wszystkie
badane ekstrakty wykazywały działanie bakteriostatyczne, z wyjątkiem spiruliny
w stężeniu 1,0 i 2,5%. Dość wrażliwym gatunkiem był także Eubacterium cylindroides, którego wzrost hamowała większość badanych ekstraktów, z wyjątkiem
ekstraktów z derenia i pokrzywy w stężeniu 5% (stymulacja wzrostu). Do zwiększenia populacji Bacteroides galacturonicus w mikrobiocie jelitowej można wykorzystać bioaktywne składniki pokrzywy, malin, żurawiny, derenia, czerwonej
cebuli oraz jagód goji. Liczebność Bifidobacterium catenulatum można zwiększyć
poprzez suplementację diety sokiem z noni, zaś do stymulacji wzrostu Lactobacillus
sp. można wykorzystać składniki bioaktywne z pigwowca, czosnku niedźwiedziego, pokrzywy, brusznicy, soi, zielonej herbaty, Citroseptu, jagód goji, czarnego
bzu lub soku z noni.
Na podstawie uzyskanych wyników należy również odrzucić hipotezę badawczą
nr 2, mówiącą, że gatunki bakterii stanowiące fizjologiczną mikrobiotę jelita ludzkiego zwiększają, na skutek swojego metabolizmu, potencjał antyoksydacyjny bioaktywnych składników obecnych w surowcach roślinnych. Wykazano bowiem, że
bakterie będące przedstawicielami fizjologicznej mikrobioty jelitowej mogą przekształcać polifenole z wytworzeniem pochodnych o niższym potencjale antyoksydacyjnym. W przypadkach gdy w obecności bakterii rosła aktywność antyoksydacyjna
badanych roztworów, często przyczyną tego były nie przemiany metaboliczne polifenoli, ale prawdopodobnie ich uwalnianie z powiązań z białkami czy innymi składnikami obecnymi w środowisku reakcji. Procesy takie mają istotne znaczenie w warunkach in vivo, gdyż do przewodu pokarmowego związki polifenolowe rzadko
trafiają w postaci wolnej i oczyszczonej, a znacznie częściej jako składniki powiązane z matrycą żywności. Uwalnianie polifenoli z tych powiązań wskutek działania
bakterii zwiększa ich biodostępność dla organizmu gospodarza oraz innych przedstawicieli rezydującej w nim mikrobioty jelitowej. Dzięki temu składniki polifenolowe mogą być dalej przekształcane przez inne drobnoustroje jelitowe, tym bardziej
że w skład ludzkiej mikrobioty wchodzi kilkaset gatunków, a w tej pracy przebadano ich zaledwie siedem. Wytworzone metabolity mogą następnie być wykorzystane
przez bakterie lub komórki nabłonka jelitowego w procesach metabolicznych albo
zostać wchłonięte w jelicie i po przedostaniu się do krwi wywierać wpływ na cały
organizm gospodarza.
6. Zalecenia dla przemysłu i konsumentów
Wyniki przeprowadzonych badań wskazują na pewne ważne prawidłowości dotyczące interakcji związków przeciwutleniających występujących w roślinach oraz suplementach diety z bakteriami reprezentującymi mikrobiotę jelitową człowieka, choć
kwestie te z pewnością wymagają dalszego badania. Przede wszystkim wydaje się
konieczne sprawdzenie, czy prawidłowości podobne do wykazanych w tej pracy na
modelu in vitro występują także w warunkach rzeczywistych, tzn. w przewodzie pokarmowym człowieka (in vivo) lub w gotowych produktach żywnościowych. W obu
przypadkach należy bowiem jeszcze uwzględnić oddziaływania zarówno związków
przeciwutleniających, jak i bakterii z innymi składnikami środowiska (m.in. matrycą
żywności) oraz z pozostałymi gatunkami stanowiącymi mikrobiotę jelita. Niemniej
jednak, nawet na tym etapie badań i przy obecnym stanie wiedzy, wydaje się uzasadnione sformułowanie kilku wskazówek dla konsumentów oraz producentów
żywności.
1. Należy zachować umiar w stosowaniu suplementów diety zawierających pojedyncze związki polifenolowe. Wiele z nich występuje w takich preparatach w dawkach wielokrotnie przekraczających zawartość tych składników w naturalnych
produktach spożywczych, co może prowadzić do osiągnięcia w przewodzie pokarmowym stężenia toksycznego. Wykazano wprawdzie, że niektóre polifenole
mają stymulujący wpływ na mikrobiotę jelitową, jednak dotyczyło to jedynie ich
niskich dawek, natomiast dawki wyższe powodowały znaczące zmniejszenie się
liczebności populacji bakterii.
2. Wykazano, że aglikony polifenoli mają niekorzystny wpływ na większość badanych
gatunków fizjologicznej mikrobioty jelitowej, natomiast glikozydy nie wykazują
takiego działania. Jest to szczególnie istotne, gdyż w suplementach diety polifenole występują przede wszystkim w postaci aglikonów, podczas gdy w żywności
formą dominującą są glikozydy.
3. Ze względu na korzystne oddziaływanie na organizm człowieka (antyalergiczne,
przeciwzapalne, antywirusowe, adaptogenne) owoce cytryńca chińskiego są coraz częściej stosowane w postaci suplementów diety. Wyniki przeprowadzonych
badań sugerują jednak, że trzeba też brać pod uwagę negatywny wpływ, jaki
6. Zalecenia dla przemysłu i konsumentów
165
niektóre składniki obecne w tych owocach wywierają na bakterie stanowiące
fizjologiczną mikroflorę naszego jelita, i uwzględniać płynące stąd konsekwencje.
4. Z uwagi na wykazany silnie hamujący wpływ ekstraktów z czosnku niedźwiedziego i cytryńca chińskiego wydaje się możliwe ich zastosowanie w przemyśle spożywczym jako naturalnych składników hamujących wzrost niepożądanej mikroflory. Podobne zastosowanie mogą znaleźć oczyszczone polifenole: rezweratrol
i naringenina.
5. Znaczący potencjał aplikacyjny w produkcji żywności probiotycznej mogą znaleźć
zielona herbata, soja, czosnek niedźwiedzi, owoce noni, czarnego bzu, borówki
brusznicy i grejpfruta oraz jagody goji. Zastosowane w charakterze dodatków
wzbogacających produkt w składniki smakowe i przeciwutleniające, mogą pomóc
w zahamowaniu wzrostu niepożądanych bakterii, a jednocześnie nie będą wywierały wpływu na bakterie kwasu mlekowego z rodzaju Lactobacillus lub będą
miały efekt stymulujący.
6. Nie zaleca się używania owoców cytryńca chińskiego do wzbogacania produktów
żywnościowych zawierających bakterie Lactobacillus, a ostrożność należy zachować przy wykorzystywaniu w takich produktach czerwonej cebuli i żurawiny.
Literatura
Acevedo H.F., Slifkin M., Pouchet-Melvin G.R., Campbell-Acevedo E.A. 1979.
Choriogonadotropin-like antigen in an anaerobic bacterium, Eubacterium lentum, isolated from a rectal tumor. Infect. Immun., 24(3), 920–924.
Aguilar F., Crebelli R., Dusemund B., Galtier P., Gilbert J., Gott D.M., Gundert-Remy U., König J., Lambré C., Leblanc J.-C., Mortensen A., Mosesso P., Parent-Massin D., Stankovic I., Tobback P., Waalkens-Berendsen D.H., Woutersen R.A.,
Wright M.C. 2012. Statement on the safety assessment of the exposure to butylated
hydroxyanisole E 320 (BHA) by applying a new exposure assessment methodology. EFSA J.,
10(7), 2759.
Ahn Y.-J., Sakanaka S., Kim M.-J., Kawamura T., Fujisawa T., Mitsuoka T. 1990. Effect
of green tea extract on growth of intestinal bacteria. Microb. Ecol. Health Dis., 3, 335–338.
Albert S., Horbach R., Deising H.B., Siewert B., Csuk R. 2011. Synthesis and antimicrobial activity of (E) stilbene derivatives. Bioorg. Med. Chem., 19(17), 5155–5166.
Al-Malaika S. 1989. Antioxidants and stabilizers for hydrocarbon polymers: past, present,
and future. [W:] Handbook of polymer science and technology. Vol. 2. Performance
properties of plastics and elastomers. Red. N.P. Cheremisinoff. CRC Press, Boca Raton,
261–290.
Alzoghaibi M.A. 2013. Concepts of oxidative stress and antioxidant defense in Crohn’s
disease. World J. Gastroenterol., 19(39), 6540–6547.
Amagase H., Farnsworth N.R. 2011. A review of botanical characteristics, phytochemistry,
clinical relevance in efficacy and safety of Lycium barbarum fruit (Goji). Food Res.
Intern., 44, 1702–1717.
Amezouar F., Badri W., Hsaine M., Bourhim N., Fougrach H. 2012. Chemical composition, antioxidant and antibacterial activities of leaves essential oil and ethanolic extract
of Moroccan Warionia saharae Benth. & Coss. J. Appl. Pharmac. Sci., 2(5), 212–217.
Andersen S., Wold J.K. 1978. Water-soluble glycoprotein from Urtica dioica leaves.
Phytochem., 17(11), 1875–1877.
Astill C., Birch M.R., Dacombe C., Humphrey P.G., Martin P.T. 2001. Factors affecting
the caffeine and polyphenol contents of black and green tea infusions. J. Agric. Food
Chem., 49(11), 5340–5347.
Literatura
167
Atanassova S.S., Gutzow I.S. 2013. Hippuric acid as a significant regulator of supersaturation in calcium oxalate lithiasis: the physiological evidence. Biomed. Res. Int., ID 374950
(http://dx. doi.org/10.1155/2013/374950).
Atkinson C., Frankenfeld C.L., Lampe J.W. 2005. Gut bacterial metabolism of the soy
isoflavone daidzein: exploring the relevance to human health. Exp. Biol. Med. (Maywood),
230(3), 155–170.
Ayehunie S., Belay A., Baba T.W., Ruprecht R.M. 1998. Inhibition of HIV-1 replication
by an aqueous extract of Spirulina platensis (Arthrospira platensis). J. Acquir. Immune
Defic. Synd. Hum. Retrovirol., 18(1), 7–12.
Bagiu R.V., Vlaicu B., Butnariu M. 2012. Chemical composition and in vitro antifungal
activity screening of the Allium ursinum L. (Liliaceae). Int. J. Mol. Sci., 13(2), 1426–
–1436.
Bahadoran Z., Mirmiran P., Azizi F. 2013. Dietary polyphenols as potential nutraceuticals
in management of diabetes: a review. J. Diabetes Metab. Disord., 12(1), 43.
Bansal S., Choudhary S., Sharma M., Kumar S.S., Lohan L., Bhardwaj V., Syan N.,
Jyoti S. 2013. Tea: a native source of antimicrobial agents. Food Res. Int., 53, 568–584.
Barak V., Halperin T., Kalickman I. 2001. The effect of Sambucol, a black elderberry-based,
natural product, on the production of human cytokines. I. Inflammatory cytokines. Eur.
Cytokine Netw., 12(2), 290–296.
Barreca D., Bellocco E., Laganà G., Ginestra G., Bisignano C. 2014. Biochemical and
antimicrobial activity of phloretin and its glycosilated derivatives present in apple and
kumquat. Food Chem., 160, 292–297.
Bartz R.R., Piantadosi C.A. 2010. Clinical review: oxygen as a signaling molecule. Crit.
Care, 14(5), 234.
Basar S., Uhlenhut K., Högger P., Schöne F., Westendorf J. 2010. Analgesic and antiinflammatory activity of Morinda citrifolia L. (Noni) fruit. Phytother. Res., 24(1), 38–42.
Beckman K.B., Ames B.N. 1998. The free radical theory of aging matures. Physiol. Rev.,
78(2), 547–581.
Beesk N., Perner H., Schwarz D., George E., Kroh L.W., Rohn S. 2010. Distribution of
quercetin-3,4’-O-diglucoside, quercetin-4’-O-monoglucoside, and quercetin in different
parts of the onion bulb (Allium cepa L.) influenced by genotype. Food Chem., 122,
566–571.
Belay A. 2002. The potential application of Spirulina (Arthrospira) as a nutritional and
therapeutic supplement in health management. J. Am. Nutraceut. Ass., 5, 27–49.
Belur P.D., Mugeraya G. 2011. Microbial production of tannase: state of the art. Res. J.
Micriobiol., 6(1), 25–40.
Bevilacqua A., Corbo M.R., Sinigaglia M. 2010. Combining eugenol and cinnamaldehyde
to control the growth of Alicyclobacillus acidoterrestris. Food Control, 21, 172–177.
Björksten B., Naaber P., Sepp E., Mikelsaar M. 1999. The intestinal microflora in allergic
Estonian and Swedish 2-year-old children. Clin. Exp. Allergy, 29(3), 342–346.
168
Błażewicz-Woźniak M., Michowska A. 2011. The growth, flowering and chemical composition of leaves of three ecotypes of Allium ursinum L. Acta Agrobot., 64(4), 171–180.
Bokkenheuser V.D., Shackleton C.H., Winter J. 1987. Hydrolysis of dietary flavonoid
glycosides by strains of intestinal Bacteroides from humans. Biochem J., 248(3), 953–956.
Bomhard E.M., Bremmer J.N., Herbold B.A. 2002. Review of the mutagenicity/genotoxicity of butylated hydroxytoluene. Mutat. Res., 277, 187–200.
Boots A.W., Haenen G.R., Bast A. 2008. Health effects of quercetin: from antioxidant to
nutraceutical. Eur. J. Pharmacol., 585(2–3), 325–337.
Botterweck A.A., Verhagen H., Goldbohm R.A., Kleinjans J., van den Brandt P.A. 2000.
Intake of butylated hydroxyanisole and butylated hydroxytoluene and stomach cancer
risk: results from analyses in the Netherlands cohort study. Food Chem. Toxicol., 38(7),
599–605.
Bramorski A., da Rosa Cherem A., Marmentini C.P., Torresani J., Mezadri T., Silva
Costa A.A. 2010. Total polyphenol content and antioxidant activity of commercial Noni
juice and its components. Braz. J. Pharm. Sci., 46(4), 651–656.
Brown K., DeCoffe D., Molcan E., Gibson D.L. 2012. Diet-induced dysbiosis of the intestinal microbiota and the effects on immunity and disease. Nutrients, 4(8), 1095–1119.
Bullen J.J., Rogers H.J., Spalding P.B., Ward C.G. 2005. Iron and infection – the heart of
the matter. FEMS Immunol. Med. Microbiol., 43, 325–330.
Burda S., Oleszek W. 2001. Antioxidant and antiradical activities of flavonoids. J. Agric.
Food Chem., 49, 2774–2779.
Burt S. 2004. Essential oils: their antibacterial properties and potential applications in foods
– a review. Int. J. Food Microbiol., 94(3), 223–253.
Burton G.J., Jauniaux E. 2011. Oxidative stress. Best Pract. Res. Clin. Obstet. Gynaecol.,
25(3), 287–299.
Campisi J., Kim S.H., Lim C.S., Rubio M. 2001. Cellular senescence, cancer and aging:
the telomere connection. Exp. Gerontol., 36(10), 1619–1637.
Cantoreggi S., Dietrich D.R., Lutz W.K. 1993. Induction of cell proliferation in the fore
stomach of F344 rats following subchronic administration of styrene 7,8-oxide and butyl
ated hydroxyanisole. Cancer Res., 53, 3505–3508.
Cao G., Sofic E., Prior R.L. 1997. Antioxidant and prooxidant behavior of flavonoids:
structure–activity relationships. Free Radic. Biol. Med., 22(5), 749–760.
Carotenuto A., De Feo V., Fattorusso E., Lanzotti V., Magno S., Cicala C. 1996. The
flavonoids of Allium ursinum. Phytochemistry, 41(2), 531–536.
Chacko S.M., Thambi P.T., Kuttan R., Nishigaki I. 2010. Beneficial effects of green tea:
a literature review. Chin. Med., 5, 13.
Chakraborty A.K., Funasaka Y., Komoto M., Ichihashi M. 1998. Effect of arbutin on
melanogenic proteins in human melanocytes. Pigment Cell Res., 11(4), 206–212.
Chalal M., Klinguer A., Echairi A., Meunier P., Vervandier-Fasseur D., Adrian M. 2014.
Antimicrobial activity of resveratrol analogues. Molecules, 19(6), 7679–7688.
Literatura
169
Chamorro-Cevallos G., Garduño-Siciliano L., Barrón B.L., Madrigal-Bujaidar E.,
Cruz-Vega D.E., Pages N. 2008. Chemoprotective effect of Spirulina (Arthrospira)
against cyclophosphamide-induced mutagenicity in mice. Food Chem. Toxicol., 46,
567–574.
Chang R., So K. 2008. Use of anti-aging herbal medicine, Lycium barbarum, against aging-associated diseases. What do we know so far? Cell. Mol. Neurobiol., 28, 643–652.
Chang Y.C., Nair M.G., Nitiss J.L. 1995. Metabolites of daidzein and genistein and their
biological activities. J. Nat. Prod., 58, 1901–1905.
Chao P.Y., Lin S.Y., Lin K.H., Liu Y.F., Hsu J.I., Yang C.M., Lai J.Y. 2014. Antioxidant
activity in extracts of 27 indigenous Taiwanese vegetables. Nutrients, 6(5), 2115–2130.
Chatterjee A.K., Gibbins L.N. 1969. Metabolism of phloridzin by Erwinia herbicola: nature
of the degradation products, and the purification and properties of phloretin hydrolase.
J. Bacteriol., 100(2), 594–600.
Chen X., Li Y., Lin Q., Wang Y., Sun H., Wang J., Cui G., Cai L., Dong X. 2014. Tea
polyphenols induced apoptosis of breast cancer cells by suppressing the expression of
Survivin. Sci Rep., 4, 4416.
Chirumbolo S. 2011. Quercetin as a potential anti-allergic drug: which perspectives? Iran J.
Allergy Asthma Immunol., 10(2), 139–140.
Choi J.S., Park N.H., Hwang S.Y., Sohn J.H., Kwak I., Cho K.K., Choi I.S. 2012. The
antibacterial activity of various saturated and unsaturated fatty acids against several oral
pathogens. J. Environ. Biol., 34, 673–676.
Cieślik E., Gębusia A. 2012. Charakterystyka właściwości prozdrowotnych owoców roślin
egzotycznych. Post. Fitoter., 2, 93–100.
Collins P.J., Dobson D.W., Field J.A. 1998. Reduction of the 2,2’-azinobis(3-ethylbenzthia
zoline-6-sulfonate)cation radical by physiological organic acids in the absence and presence of manganese. Appl. Environ. Microbiol., 64(6), 2026–2031.
Cook N.C., Samman S. 1996. Flavonoids – chemistry, metabolism, cardioprotective effects,
and dietary sources. J. Nutr. Biochem., 7(2), 66–76.
Corzo-Martínez M., Corzo N., Villamiel M. 2007. Biological properties of onions and
garlic. Trends Food Sci. Technol., 18, 609–625.
Cos P., Ying L., Calomme M., Hu J.P., Cimanga K., Van Poel B., Pieters L., Vlietinck A.J.,
Vanden Berghe D. 1998. Structure–activity relationship and classification of flavonoids
as inhibitors of xanthine oxidase and superoxide scavengers. J. Nat. Prod., 61(1),
71–76.
Cushnie T.P.T., Lamb A.J. 2005. Antimicrobial activity of flavonoids. Int. J. Antimicrob.
Agents, 26, 343–356.
Davies K.J. 1987. Protein damage and degradation by oxygen radicals. I. General aspects.
J. Biol. Chem., 262(20), 9895–9901.
Davies K.J., Delsignore M.E. 1987. Protein damage and degradation by oxygen radicals.
III. Modification of secondary and tertiary structure. J. Biol. Chem., 262(20), 9908–9913.
170
Davies K.J., Delsignore M.E., Lin S.W. 1987a. Protein damage and degradation by oxygen
radicals. II. Modification of amino acids. J. Biol. Chem., 262(20), 9902–9907.
Davies K.J., Lin S.W., Pacifici R.E. 1987b. Protein damage and degradation by oxygen
radicals. IV. Degradation of denatured protein. J. Biol. Chem., 262(20), 9914–9920.
De Filippo C., Cavalieri D., Di Paola M., Ramazzotti M., Poullet J.B., Massart S.,
Collini S., Pieraccini G., Lionetti P. 2011. Impact of diet in shaping gut microbiota
revealed by a comparative study in children from Europe and rural Africa. Proc. Natl.
Acad. Sci. USA, 107(33), 14691–14696.
Del Rio D., Rodriguez-Mateos A., Spencer J.P.E., Tognolini M., Borges G., Crozier A.
2013. Dietary (poly)phenolics in human health: structures, bioavailability, and evidence
of protective effects against chronic diseases. Antioxid. Redox Signal., 18(14), 1818–1892.
De Oliveira S., Alves de Souza G., Rodriguez Eckert C., Alves Silva T., Silva Sobral E.,
Aparecida Fávero O., Pena Ferreira M.J., Romoff P., Baader W.J. 2014. Evaluation
of antiradical assays used in determining the antioxidant capacity of pure compounds
and plant extracts. Quim. Nova, 37(3), 497–503.
de Souza V.R., Pereira P.A., da Silva T.L., de Oliveira Lima L.C., Pio R., Queiroz F. 2014.
Determination of the bioactive compounds, antioxidant activity and chemical composition
of Brazilian blackberry, red raspberry, strawberry, blueberry and sweet cherry fruits. Food
Chem., 156, 362–368.
Dicksved J. 2008. Exploring the human intestinal microbiome in health and disease. Praca
doktorska. Swedish University of Agricultural Sciences, Uppsala. Acta Universitatis
Agriculturae Sueciae, 2008:30.
Di Majo D., Giammanco M., La Guardia M., Tripoli E., Giammanco S., Finotti E. 2005.
Flavanones in Citrus fruit: structure–antioxidant activity relationships. Food Res. Int.,
38, 1161–1166.
Dmowski P., Śmiechowaska M., Tesmar A. 2013.Właściwości przeciwutleniające herbaty
jako czynnik kształtujący jej wartość zdrowotną. Probl. Hig. Epidemiol., 94(2), 309–312.
Dorman H.J., Deans S.G. 2000. Antimicrobial agents from plants: antibacterial activity of
plant volatile oils. J. Appl. Microbiol., 88(2), 308–316.
Dostal A., Chassard C., Hilty F.M., Zimmermann M.B., Jaeggi T., Rossi S., Lacroix C.
2012. Iron depletion and repletion with ferrous sulfate or electrolytic iron modifies the
composition and metabolic activity of the gut microbiota in rats. J. Nutr., 142, 277–277.
Droebner K., Ehrhardt C., Poetter A., Ludwig S., Planz O. 2007. CYSTUS052, a polyphenol-rich plant extract, exerts anti-influenza virus activity in mice. Antiviral Res., 76(1),
1–10.
Dröge W. 2002. Free radicals in the physiological control. Physiol. Rev., 82(1), 47–95.
Duda-Chodak A. 2007. Rola przeciwutleniaczy w mechanizmach obronnych organizmu
przed stresem antyoksydacyjnym. [W:] Przeciwutleniacze w żywności. Aspekty zdrowotne, technologiczne, molekularne i analityczne. Red. W. Grajek. WNT, Warszawa, 245–
–261.
Literatura
171
Duda-Chodak A., Tarko T., Rus M. 2011. Antioxidant activity and total polyphenol content
of selected herbal medicinal products used in Poland. Herba Pol., 57(1), 48–61.
Duda-Chodak A., Tarko T., Sroka P., Satora P. 2008. Antioxidant activity of different kinds
of commercially available teas – diversity and changes during storage. EJPAU, 11(4), # 7
(http://www.ejpau.media.pl/volume11/issue4/art-07.html).
Duda-Chodak A., Wojdyło A. 2007. Charakterystyka chemiczna związków polifenolowych.
[W:] Przeciwutleniacze w żywności. Aspekty zdrowotne, technologiczne, molekularne
i analityczne. Red. W. Grajek. WNT, Warszawa, 141–151.
Elizabeth S.B., Murugesan K. 2012. Evaluation of antioxidant potential of Morinda citrifolia L. root extract. Int. Res. J. Pharmac., 2(4), 106–111.
Esrefoglu M. 2012. Experimental and clinical evidence of antioxidant therapy in acute pancreatitis. World J. Gastroenterol., 18(39), 5533–5541.
Fanaro S., Chierici R., Guerrini P., Vigi V. 2003. Intestinal microflora in early infancy:
composition and development. Acta. Paediatr. Suppl., 91(441), 48–55.
Fernandez M.T., Mira M.L., Florêncio M.H., Jennings K.R. 2002. Iron and copper chelation
by flavonoids: an electrospray mass spectrometry study. J. Inorg. Biochem., 92(2), 105–111.
Figueiredo A.R., Campos F., de Freitas V., Hogg T., Couto J.A. 2008. Effect of phenolic
aldehydes and flavonoids on growth and inactivation of Oenococcus oeni and Lactobacillus
hilgardii. Food Microbiol., 25(1), 105–112.
Finkel T. 2011. Signal transduction by reactive oxygen species. J. Cell Biol., 194(1), 7–15.
Fiorentino A., D’Abrosca B., Pacifico S., Golino A., Mastellone C., Oriano P., Monaco P.
2007. Reactive oxygen species scavenging activity of flavone glycosides from Melilotus
neapolitana. Molecules, 12(2), 263–270.
Fox J.T., Drouillard J.S., Shi X., Nagaraja T.G. 2009. Effects of mucin and its carbohydrate
constituents on Escherichia coli O157 growth in batch culture fermentations with ruminal
or fecal microbial inoculum. J. Anim. Sci., 87(4), 1304–1313.
Friedman M., Henika P.R., Mandrell R.E. 2003. Antibacterial activities of phenolic benz
aldehydes and benzoic acids against Campylobacter jejuni, Escherichia coli, Listeria monocytogenes, and Salmonella enterica. J. Food Prot., 66(10), 1811–1821.
Friedman M., Levin C.E., Lee S.U., Kozukue N. 2009. Stability of green tea catechins in
commercial tea leaves during storage for 6 months. J. Food Sci., 74(2), H47–H51.
Gadkari P.V., Balaraman M. 2014. Catechins: sources, extraction and encapsulation: a review.
Food Bioprod. Process (w druku; http://dx.doi.org/10.1016/j.fbp.2013.12.004).
Galati G., Sabzevari O., Wilson J.X., O’Brien P.J. 2002. Prooxidant activity and cellular
effects of the phenoxyl radicals of dietary flavonoids and other polyphenolics. Toxicology,
177(1), 91–104.
Galleano M., Verstraeten S.V., Oteiza P.I., Fraga C.G. 2010. Antioxidant actions of flavonoids: thermodynamic and kinetic analysis. Arch. Biochem. Biophys., 501(1), 23–30.
Gan L., Zhang S. 2002. Effects of Lycium barbarum polysaccharide on cytokine expression
in human monocytes. Acta Nutr. Sin., 24, 67–69.
172
Garg A., Garg S., Zaneveld L.J., Singla A.K. 2001. Chemistry and pharmacology of the
Citrus bioflavonoid hesperidin. Phytother. Res., 15(8), 655–669.
Gattuso G., Barreca D., Gargiulli C., Leuzzi U., Caristi C. 2007. Flavonoid composition
of Citrus juices. Molecules, 12(8), 1641–1673.
Gennaro L., Leonardi C., Esposito F., Salucci M., Maiani G., Quaglia G., Fogliano V.
2002. Flavonoid and carbohydrate contents in Tropea red onions: effects of homelike
peeling and storage. J. Agric. Food Chem., 50(7), 1904–1910.
Gomez-Pinilla F., Nguyen T.T. 2012. Natural mood foods: the actions of polyphenols against
psychiatric and cognitive disorders. Nutr. Neurosci., 15(3), 127–133.
Gonthier M.P., Verny M.A., Besson C., Rémésy C., Scalbert A. 2003. Chlorogenic acid
bioavailability largely depends on its metabolism by the gut microflora in rats. J. Nutr.,
133(6), 1853–1859.
Gorinstein S., Martín-Belloso O., Park Y.S., Haruenkit R., Lojek A., Ĉíž M., Caspi A.,
Libman I., Trakhtenberg S. 2001. Comparison of some biochemical characteristics of
different citrus fruits. Food Chem., 74, 309–315.
Grahame T.J., Schlesinger R.B. 2012. Oxidative stress-induced telomeric erosion as a mechanism underlying airborne particulate matter-related cardiovascular disease. Part. Fibre
Toxicol., 9, 21.
Gramza A., Korczak J., Amarowicz R. 2005. Tea polyphenols – their antioxidant properties
and biological activity – a review. Pol. J. Food. Nutr. Sci., 14/55(3), 219–235.
Grieger J.A., Wood L.G., Clifton V.L. 2013. Improving asthma during pregnancy with dietary antioxidants: the current evidence. Nutrients, 5(8), 3212–3234.
Grune T., Reinheckel T., Davies K.J. 1997. Degradation of oxidized proteins in mammalian cells. FASEB J., 11(7), 526–534.
Gupta R.K., Patel A.K. 2013. Do the health claims made for Morinda citrifolia (Noni)
harmonize with current scientific knowledge and evaluation of its biological effects. Asian
Pac. J. Cancer Prev., 14(8), 4495–4499.
Gutierrez J., Barry-Ryan C., Bourke P. 2008. The antimicrobial efficacy of plant essential
oil combinations and interactions with food ingredients. Int. J. Food Microbiol., 124(1),
91–97.
Guyot S., Vercauteren J., Cheynier V. 1996. Structural determination of colourless and
yellow dimers resulting from (+)-catechin coupling catalysed by grape polyphenoloxidase.
Phytochemistry, 42(5), 1279–1288.
Guzik T.J., Korbut R., Adamek-Guzik T. 2003. Nitric oxide and superoxide in inflammation
and immune regulation. J. Physiol. Pharmacol., 54(4), 469–487.
Gyawali R., Ibrahim S.A. 2014. Natural products as antimicrobial agents. Food Contr., 46,
412–429.
Hakansson A., Molin G. 2011. Gut microbiota and inflammation. Nutrients, 3(6), 637–682.
Hämäläinen M., Nieminen R., Vuorela P., Heinonen M., Moilanen E. 2007. Antiinflammatory effects of flavonoids: genistein, kaempferol, quercetin, and daidzein in-
Literatura
173
hibit STAT-1 and NF-κB activations, whereas flavone, isorhamnetin, naringenin, and
pelargonidin inhibit only NF-κB activation along with their inhibitory effect on iNOS
expression and NO production in activated macrophages. Mediat. Inflamm., ID 45673
(doi:10.1155/2007/45673).
Hancke J.L., Burgos R.A., Ahumada F. 1999. Schisandra chinensis (Turcz.) Baill. Fitoterapia,
70, 451–471.
Haratifar S., Corredig M. 2014. Interactions between tea catechins and casein micelles and
their impact on renneting functionality. Food Chem., 143, 27–32.
Harris E.D. 1992. Regulation of antioxidant enzymes. FASEB J., 6, 2675–2683.
Hayashi H., Takahashi R., Nishi T., Sakamoto M., Benno Y. 2005. Molecular analysis of
jejunal, ileal, caecal and recto-sigmoidal human colonic microbiota using 16S rRNA gene
libraries and terminal restriction fragment length polymorphism. J. Med. Microbiol., 54,
1093–1101.
He N., Yang X., Jiao Y., Tian L., Zhao Y. 2012. Characterisation of antioxidant and antiproliferative acidic polysaccharides from Chinese wolfberry fruits (goji). Food Chem.,
133, 978–989.
Hehemann J.H., Correc G., Barbeyron T., Helbert W., Czjzek M., Michel G. 2010. Transfer
of carbohydrate-active enzymes from marine bacteria to Japanese gut microbiota. Nature,
464(7290), 908–912.
Henning S.M., Fajardo-Lira C., Lee H.W., Youssefian A.A., Go V.L., Heber D. 2003.
Catechin content of 18 teas and a green tea extract supplement correlates with the antioxidant capacity. Nutr. Cancer., 45(2), 226–235.
Henning S.M., Wang P., Heber D. 2011. Chemopreventive effects of tea in prostate cancer:
green tea versus black tea. Mol. Nutr. Food Res., 55(6), 905–920.
Herrera C.L., Alvear M., Barrientos L., Montenegro G., Salazar L.A. 2010. The antifungal effect of six commercial extracts of Chilean propolis on Candida spp. Cien. Inv. Agr.,
37(1), 75–84.
Hervert-Hernández D., Goñi I. 2011. Dietary polyphenols and human gut microbiota:
a review. Food Rev. Int., 27(2), 154–169.
Ho P.C., Saville D.J., Wanwimolruk S. 2001. Inhibition of human CYP3A4 activity by
grapefruit flavonoids, furanocoumarins and related compounds. J. Pharm. Pharm. Sci.,
4(3), 217–227.
Hodgson J.M. 2008. Tea flavonoids and cardiovascular disease. Asia Pac. J. Clin. Nutr.,
17(S1), 288–290.
Howell A.B., Reed J.D., Krueger C.G., Winterbottom R., Cunningham D.G., Leahy M.
2005. A-type cranberry proanthocyanidins and uropathogenic bacterial anti-adhesion
activity. Phytochemistry, 66(18), 2281–2291.
Ingram L.O. 1976. Adaptation of membrane lipids to alcohols. J. Bacteriol., 125(2), 670–678.
Ingram L.O. 1986. Microbial tolerance to alcohols: the role of the cell membrane. Trends
Biotechnol., 4, 2, 40–44.
174
Ionică M.E., Nour V., Trandafir I. 2012. Polyphenols content and antioxidant capacity of
goji fruits (Lycium chinense) as affected by the extraction solvents. South West. J. Hort.
Biol. Environ., 3(2), 121–129.
Ip S.P., Mak D.H.F., Li P.C., Poon M.K.T., Ko K.M. 1996. Effect of a lignan-enriched
extract of Schisandra chinensis on aflatoxin B1 and cadmium chloride-induced hepatotoxicity in rats. Pharmacol. Toxicol., 78(6), 413–416.
Ismail N.A., Ragab S.H., ElBaky A.A., Shoeib A.R.S., Alhosary Y., Fekry D. 2011.
Frequency of Firmicutes and Bacteroidetes in gut microbiota in obese and normal weight
Egyptian children and adults. Arch. Med. Sci., 7(3), 501–507.
Ivanišová E., Fikselová M., Vietoris V., Mellen M. 2009. Antioxidant effects of herbal
extracts and their food application. Potravinárstvo, 4, 34–37.
Iverson I. 1999. In vivo studies on butylated hydroxyanisole. Food Chem. Toxicol., 37, 993–997.
Jeffery I.B., O’Toole P.W. 2013. Diet–microbiota interactions and their implications for
healthy living. Nutrients, 5(1), 234–252.
Jeong E.M., Liu M., Sturdy M., Gao G., Varghese S.T., Sovari A.A., Dudley S.C. Jr. 2012.
Metabolic stress, reactive oxygen species, and arrhythmia. J. Mol. Cell. Cardiol., 52(2),
454–463.
Jin M., Huang Q., Zhao K., Shang P. 2013. Biological activities and potential health benefit effects of polysaccharides isolated from Lycium barbarum L. Int. J. Biol. Macromol.,
54, 16–23.
Karegoudar T.B., Kim C.K. 2000. Microbial degradation of monohydroxybenzoic acids.
J. Microbiol., 38(2), 53–61.
Karori S.M., Wachira F.N., Wanyoko J.K., Ngure R.M. 2007. Antioxidant capacity of different types of tea products. Afr. J. Biotechnol., 6(19), 2287–2296.
Kelebek H. 2010. Sugars, organic acids, phenolic compositions and antioxidant activity of
grapefruit (Citrus paradisi) cultivars grown in Turkey. Ind. Crops Prod., 32, 269–274.
Khan M.K., Zill-E-Huma, Dangles O. 2014. A comprehensive review on flavanones, the
major citrus. J. Food Comp. Anal., 33, 85–104.
Kim H.M., Lee E.H., Cho H.H., Moon Y.H. 1998. Inhibitory effect of mast cell-mediated
immediate-type allergic reactions in rats by Spirulina. Biochem. Pharmacol., 55, 1071–1076.
Kirakosyan A., Seymour E.M., Noon K.R., Urcuyo Llanes D.E., Kaufman P.B.,
Warber S.L., Bolling S.F. 2010. Interactions of antioxidants isolated from tart cherry
(Prunus cerasus) fruits. Food Chem., 122, 78–83.
Kizhakekuttu T.J., Widlansky M.E. 2010. Natural antioxidants and hypertension: promise
and challenges. Cardiovasc. Ther., 28(4), e20–e32.
Kloner R.A., Przyklenk K., Whittaker P. 1989. Deleterious effects of oxygen radicals in
ischemia/reperfusion. Resolved and unresolved issues. Circulation, 80(5), 1115–1127.
Kopit L.M., Kim E.B., Siezen R.J., Harris L.J., Marco M.L. 2014. Safety of the surrogate
microorganism Enterococcus faecium NRRL B-2354 for use in thermal process validation. Appl. Environ. Microbiol., 80(6), 1899–1909.
Literatura
175
Krumholz L.R., Crawford R.L., Hemling M.E., Bryant M.P. 1987. Metabolism of gallate
and phloroglucinol in Eubacterium oxidoreducens via 3-hydroxy-5-oxohexanoate.
J. Bacteriol., 169(5), 1886–1890.
Kvietys P.R., Granger D.N. 2012. Role of reactive oxygen and nitrogen species in the vascular responses to inflammation. Free Radic. Biol. Med., 52(3), 556–592.
Labbe D., Tremblay A., Bazinet L. 2006. Effect of brewing temperature and duration on
green tea catechin solubilization: basis for production of EGC and EGCG-enriched
fractions. Separ. Purif. Technol., 49, 1–9.
Lal D., Gardner J.J. 2012. Production, characterization and purification of tannase from
Aspergillus niger. Eur. J. Exp. Biol., 2(5), 1430–1438.
Lamer-Zarawska E. 2002. Cytryniec chiński – wartościowa roślina lecznicza. Wiad. Ziel., 2,
18–19.
Lanzotti V. 2006. The analysis of onion and garlic. J. Chromatogr., A, 1112(1–2), 3–22.
Larrosa M., García-Conesa M.T., Espín J.C., Tomás-Barberán F.A. 2010. Ellagitannins,
ellagic acid and vascular health. Mol. Aspects Med., 31(6), 513–539.
Le Bourvellec C., Renard C.M.G.C. 2012. Interactions between polyphenols and macromolecules: quantification methods and mechanisms. Crit. Rev. Food Sci. Nutr., 52(3),
213–248.
Lee J., Finn C.E. 2007. Anthocyanins and other polyphenolics in American elderberry
(Sambucus canadensis) and European elderberry (S. nigra) cultivars. J. Sci. Food Agric.,
87(14), 2665–2675.
Lee L.S., Kim S.H., Kim Y.B., Kim Y.C. 2014. Quantitative analysis of major constituents
in green tea with different plucking periods and their antioxidant activity. Molecules,
19(7), 9173–9186.
Lee M., Hyun D., Jenner P., Halliwell B. 2001. Effect of overexpression of wild-type and
mutant Cu/Zn-superoxide dismutases on oxidative damage and antioxidant defences:
relevance to Down’s syndrome and familial amyotrophic lateral sclerosis. J. Neurochem.,
76(4), 957–965.
Lee M.H., Kwon H.A., Kwon D.Y., Park H., Sohn D.H., Kim Y.C., Eo S.K., Kang H.Y.,
Kim S.W., Lee J.H. 2006. Antibacterial activity of medicinal herb extracts against
Salmonella. Int. J. Food Microbiol., 111(3), 270–275.
Leuner K., Schütt T., Kurz C., Eckert S.H., Schiller C., Occhipinti A., Mai S., Jendrach M.,
Eckert G.P., Kruse S.E., Palmiter R.D., Brandt U., Dröse S., Wittig I., Willem M.,
Haass C., Reichert A.S., Müller W.E. 2012. Mitochondrion-derived reactive oxygen
species lead to enhanced amyloid beta formation. Antioxid. Redox Signal., 16(12), 1421–
–1433.
Levitan I., Volkov S., Subbaiah P.V. 2010. Oxidized LDL: diversity, patterns of recognition,
and pathophysiology. Antioxid. Redox Signal., 13(1), 39–75.
Lewis D.F.V., Wiseman A. 2005. A selective review of bacterial forms of cytochrome P450
enzymes. Enzyme Microb. Technol., 36, 377–384.
176
Ley R.E., Turnbaugh P.J., Klein S., Gordon J.I. 2006. Microbial ecology: human gut microbes associated with obesity. Nature, 444(7122), 1022–1023.
Li J., Zhang C., Xu X., Wang J., Yu H., Lai R., Gong W. 2007. Trypsin inhibitory loop is
an excellent lead structure to design serine protease inhibitors and antimicrobial peptides.
FASEB J., 21, 2466–2473.
Lin C.L., Wang C.C., Chang S.C., Inbaraj B.S., Chen B.H. 2009. Antioxidative activity of
polysaccharide fractions isolated from Lycium barbarum Linnaeus. Int. J. Biol. Macromol.,
45(2), 146–151.
Lin K.H., Yang Y.Y., Yang C.M., Huang M.Y., Lo H.F., Liu K.C., Lin H.S., Chao P.Y.
2013. Antioxidant activity of herbaceous plant extracts protect against hydrogen peroxide-induced DNA damage in human lymphocytes. BMC Res. Notes, 6, 490.
Liou G.Y., Storz P. 2010. Reactive oxygen species in cancer. Free Radic. Res., 44(5), 479–496.
Liu S., Qureshi N. 2009. How microbes tolerate ethanol and butanol. New Biotechnol.,
26(3-4), 117–121.
Longo G., Karan M., Sharma P.D., Rakesh D.D., Vyas S., Vasisht K. 2008. Quantitative
analysis of green tea polyphenols in Indian cultivars. [W:] Economic crisis in tea industry.
Red. N.K. Jain, F. Rahman, P. Baker. Studium Press, Houston, 275–282.
Lu X., Wang J., Al-Qadiri H.M., Ross C.F., Powers J.R., Tang J., Rasco B.A. 2011.
Determination of total phenolic content and antioxidant capacity of onion (Allium
cepa) and shallot (Allium oschaninii) using infrared spectroscopy. Food Chem., 129,
637–644.
Luo Q., Cai Y., Yan J., Sun M., Corke H. 2004. Hypoglycemic and hypolipidemic effects
and antioxidant activity of fruit extracts from Lycium barbarum. Life Sci., 76(2), 137–
–149.
Łomnicki A. 2013. Wprowadzenie do statystyki dla przyrodników. Wyd. Nauk. PWN,
Warszawa.
Määttä-Riihinen K.R., Kamal-Eldin A., Mattila P.H., González-Paramás A.M.,
Törrönen A.R. 2004. Distribution and contents of phenolic compounds in eighteen
Scandinavian berry species. J. Agric. Food Chem., 52(14), 4477–4486.
Maiese K., Morhan S.D., Chong Z.Z. 2007. Oxidative stress biology and cell injury during
type 1 and type 2 diabetes mellitus. Curr. Neurovasc. Res., 4(1), 63–71.
Mandalari G., Bennett R.N., Bisignano G., Trombetta D., Saija A., Faulds C.B.,
Gasson M.J., Narbad A. 2007. Antimicrobial activity of flavonoids extracted from bergamot (Citrus bergamia Risso) peel, a byproduct of the essential oil industry. J. Appl.
Microbiol., 103(6), 2056–2064.
Mane C., Loonis M., Juhel C., Dufour C., Malien-Aubert C. 2011. Food grade lingonberry extract: polyphenolic composition and in vivo protective effect against oxidative
stress. J. Agric. Food Chem., 59(7), 3330–3339.
Margaret B.S., Heath J.R., Krywolap G.N. 1990. Pathogenic potential of Eubacterium yurii
subspecies. J. Med. Microbiol., 31(2), 103–108.
Literatura
177
Martins Mdo R., Arantes S., Candeias F., Tinoco M.T., Cruz-Morais J. 2014. Antioxidant,
antimicrobial and toxicological properties of Schinus molle L. essential oils. J. Ethno
pharmacol., 151(1), 485–492.
Materska M. 2008. Quercetin and its derivatives: chemical structure and bioactivity – a review.
Pol. J. Food Nutr. Sci., 58(4), 407–413.
Mathew B., Sankaranarayanan R., Nair P.P., Varghese C., Somanathan T., Amma B.P.,
Amma N.S., Nair M.K. 1995. Evaluation of chemoprevention of oral cancer with Spirulina
fusiformis. Nutr. Cancer, 24, 197–202.
Matsumoto H., Nakamura Y., Tachibanaki S., Kawamura S., Hirayama M. 2003.
Stimulatory effect of cyanidin 3-glycosides on the regeneration of rhodopsin. J. Agric.
Food Chem., 51(12), 3560–3563.
Maxwell S.R., Lip G.Y. 1997. Free radicals and antioxidants in cardiovascular disease. Br.
J. Clin. Pharmacol., 44(4), 307–317.
Mazur S.P., Nes A., Wold A.B., Remberg S.F., Aaby K. 2014. Quality and chemical composition of ten red raspberry (Rubus idaeus L.) genotypes during three harvest seasons.
Food Chem., 160, 233–240.
Mazzola P.G., Jozala A.F., de Lencastre Novales L.C., Moriel P., Vessoni Penna T.C.
2009. Minimal inhibitory concentration (MIC) determination of disinfectant and/or
sterilizing agents. Braz. J. Pharm. Sci., 45(2), 241–248.
McDougall G.J., Kulkarni N.N., Stewart D. 2009. Berry polyphenols inhibit pancreatic
lipase activity in vitro. Food Chem., 115, 193–199.
McNeil J.D., Wiebkin O.W., Betts W.H., Cleland L.G. 1985. Depolymerisation products
of hyaluronic acid after exposure to oxygen-derived free radicals. Ann. Rheum. Dis.,
44(11), 780–789.
Mehta M., Muddapur U.M., Priya V.G. 2013. Fungal production of tannase. A review. Int.
J. Sci. Eng. Technol., 2(8), 752–755.
Meydani M., Hasan S.T. 2010. Dietary polyphenols and obesity. Nutrients, 2(7), 737–751.
Mihaylova D.S., Lante A., Tinello F., Krastanov A.I. 2014. Study on the antioxidant and
antimicrobial activities of Allium ursinum L. pressurised-liquid extract. Nat. Prod. Res.
(w druku; doi: 10.1080/14786419.2014.923422).
Mika M., Wikiera A., Żyła K. 2009. Effects of thermally modified green tea catechins on
the oxidative and hydrolytic stability of butter. Health, 1(3), 192–196.
Miller A.A., De Silva T.M., Drummond G.R., Sobey C.G., Chrissobolis S. 2014. Reactive
oxygen species and cerebrovascular disease. [W:] Systems biology of free radicals and
antioxidants. Red. I. Laher. Springer-Verlag, Berlin, Heidelberg, 1895–1924.
Mittman P. 1990. Randomized, double-blind study of freeze-dried Urtica dioica in the treatment of allergic rhinitis. Planta Med., 56, 44–47.
Moch R.W. 1986. Pathology of BHA- and BHT-induced lesions. Food Chem. Toxicol., 24(10–
–11), 1167–1169.
Moon Y.J., Wang X., Morris M.E. 2006. Dietary flavonoids: effects on xenobiotic and carcinogen metabolism. Toxicol. In Vitro, 20, 187–210.
178
Mosqueda-Melgar J., Raybaudi-Massilia R.M., Martín-Belloso O. 2008. Combination of
high-intensity pulsed electric fields with natural antimicrobials to inactivate pathogenic
microorganisms and extend the shelf-life of melon and watermelon juices. Food Microbiol.,
25(3), 479–491.
Muchová J., Zitňanová I., Duračková Z. 2014. Oxidative stress and Down syndrome. Do
antioxidants play a role in therapy? Physiol. Res., 63(5), 535–542 (http://www.biomed.
cas.cz/physiolres/pdf/prepress/932722.pdf).
Mulder T.P., Rietveld A.G., van Amelsvoort J.M. 2005. Consumption of both black tea
and green tea results in an increase in the excretion of hippuric acid into urine. Am. J.
Clin. Nutr., 81(1 Suppl), 256S–260S.
Narumi K., Sonoda J., Shiotani K., Shigeru M., Shibata M., Kawachi A., Tomishige E.,
Sato K., Motoya T. 2014. Simultaneous detection of green tea catechins and gallic acid
in human serum after ingestion of green tea tablets using ion-pair high-performance
liquid chromatography with electrochemical detection. J. Chromatogr., B, Analyt. Technol.
Biomed. Life Sci., 945–946, 147–153.
Niki E. 2011. Do free radicals play causal role in atherosclerosis? Low density lipoprotein
oxidation and vitamin E revisited. J. Clin. Biochem. Nutr., 48(1), 3–7.
Niki E., Yoshida Y., Saito Y., Noguchi N. 2005. Lipid peroxidation: mechanisms, inhibition,
and biological effects. Biochem. Biophys. Res. Commun., 338(1), 668–676.
Nile S.H., Park S.W. 2014. Edible berries: bioactive components and their effect on human
health. Nutrition, 30(2), 134–144.
Nogata Y., Sakamoto K., Shiratsuchi H., Ishii T., Yano M., Ohta H. 2006. Flavonoid
composition of fruit tissues of citrus species. Biosci. Biotechnol. Biochem., 70(1), 178–
–192.
Nohynek L.J., Alakomi H.L., Kähkönen M.P., Heinonen M., Helander I.M., Oksman-Caldentey K.M., Puupponen-Pimiä R.H. 2006. Berry phenolics: antimicrobial properties and mechanisms of action against severe human pathogens. Nutr. Cancer., 54(1),
18–32.
Ogawa J., Kishino S., Ando A., Sugimoto S., Mihara K., Shimizu S. 2005. Production of
conjugated fatty acids by lactic acid bacteria. J. Biosci. Bioeng., 100(4), 355–364.
Okunieff P., Swarts S., Keng P., Sun W., Wang W., Kim J., Yang S., Zhang H., Liu C.,
Williams J.P., Huser A.K., Zhang L. 2008. Antioxidants reduce consequences of radiation exposure. Adv. Exp. Med. Biol., 614, 165–178.
Olinski R., Gackowski D., Foksinski M., Rozalski R., Roszkowski K., Jaruga P. 2002.
Oxidative DNA damage: assessment of the role in carcinogenesis, atherosclerosis, and
acquired immunodeficiency syndrome. Free Radic. Biol. Med., 33(2), 192–200.
Omar S.H., Al-Wabel N.A. 2010. Organosulfur compounds and possible mechanism of
garlic in cancer. Saudi Pharm. J., 18(1), 51–58.
Oomah B.D., Ladet S., Godfrey D.V., Liang J., Girard B. 2000. Characteristics of raspberry (Rubus idaeus L.) seed oil. Food Chem., 69, 187–193.
Literatura
179
Othman S.F.C., Idid S.Z., Koya M.S., Rehan A.M., Kamarudin K.R. 2011. Antioxidant
study of garlic and red onion: a comparative study. Pertanika J. Trop. Agric. Sci., 34(2),
253–261.
Ovesná Z., Horváthová-Kozics K. 2005. Structure–activity relationship of trans-resveratrol
and its analogues. Neoplasma, 52(6), 450–455.
Paiva P.M.G., Pontual E.V., Coelho L.C.B.B., Napoleão T.H. 2013. Protease inhibitors
from plants: biotechnological insights with emphasis on their effects on microbial
pathogens. [W:] Microbial pathogens and strategies for combating them: science, technology and education. Red. A. Méndez-Vilas. Formatex Research Center, Badajoz,
641–649.
Pal S., Ghosh D., Dey S.K., Saha C. 2013. Effect of infusion time and consecutive brewing
on antioxidant status of black tea infusion. Int. J. Tea Sci., 9(SI 2–3), 65–68.
Palipoch S. 2013. A review of oxidative stress in acute kidney injury: protective role of medicinal plants-derived antioxidants. Afr. J. Tradit. Complement. Altern. Med., 10(4),
88–93.
Pandey K.B., Rizvi S.I. 2009. Plant polyphenols as dietary antioxidants in human health and
disease. Oxid. Med. Cell Longev., 2(5), 270–278.
Panesar P.S., Marwaha S.S., Kennedy J.F. 2007. Comparison of ethanol and temperature
tolerance of Zymomonas mobilis strain in glucose and molasses medium. Indian J.
Biotechnol., 6, 74–77.
Pantelidis G.E., Vasilakakis M., Manganaris G.A., Diamantidis G.R. 2007. Antioxidant
capacity, phenol, anthocyanin and ascorbic acid contents in raspberries, blackberries, red
currants, gooseberries and Cornelian cherries. Food Chem., 102, 777–783.
Pawlus A.D., Kinghorn D.A. 2007. Review of the ethnobotany, chemistry, biological activ
ity and safety of the botanical dietary supplement Morinda citrifolia (noni). J. Pharm.
Pharmacol., 59(12), 1587–1609.
Peleg H., Naim M., Rouseff R.L., Zehavi U. 1991. Distribution of bound and free phenolic acids in oranges (Citrus sinensis) and grapefruits (Citrus paradisi). J. Sci. Food Agric.,
57, 417–426.
Penders J., Thijs C., Vink C., Stelma F.F., Snijders B., Kummeling I., van den Brandt P.A.,
Stobberingh E.E. 2006. Factors influencing the composition of the intestinal microbiota in early infancy. Pediatrics, 118(2), 511–521.
Peng X.D., Xiu D.Q., Peng J.Z., Liu C.H. 2002. Effects of Lycium barbarum polysaccharide on hippocampal activity in animals. J. Ningxia Medical College, 24, 79–81.
Peng X.M., Huang L.J., Qi C.H., Zhang Y.X., Tian G.Y. 2001. Studies on chemistry and
immunomodulating mechanism of a glycoconjugate from Lycium barbarum L. Chin. J.
Chem., 19, 1990–1997.
Percário S., Moreira D.R., Gomes B.A., Ferreira M.E., Gonçalves A.C., Laurindo P.S.,
Vilhena T.C., Dolabela M.F., Green M.D. 2012. Oxidative stress in malaria. Int. J. Mol.
Sci., 13(12), 16346–16372.
180
Peterson J., Dwyer J., Bhagwat S., Haytowitz D., Holden J., Eldridge A.L., Beecher G.,
Aladesanmi J. 2005. Major flavonoids in dry tea. J. Food Compos. Anal., 18, 487–501.
Pieszak M., Mikołajczak P.Ł. 2010. Właściwości lecznicze pokrzywy zwyczajnej (Urtica
dioica L.). Post. Fitoter., 4, 199–204.
Poljsak B., Šuput D., Milisav I. 2013. Achieving the balance between ROS and antioxidants:
when to use the synthetic antioxidants. Oxid. Med. Cell Longev., ID 956792 (doi:
10.1155/2013/956792).
Ponce A.G., Roura S.I., del Valle C.E., Moreira M.R. 2008. Antimicrobial and antioxidant
activities of edible coatings enriched with natural plant extracts: in vitro and in vivo studies. Postharv. Biol. Technol., 49, 294–300.
Possemiers S., Bolca S., Verstraete W., Heyerick A. 2011. The intestinal microbiome:
a separate organ inside the body with the metabolic potential to influence the bioactivity of botanicals. Fitoterapia, 82, 53–66.
Potterat O. 2010. Goji (Lycium barbarum and L. chinense): phytochemistry, pharmacology and
safety in the perspective of traditional uses and recent popularity. Planta Med., 76, 7–19.
Potterat O., Hamburger M. 2007. Morinda citrifolia (Noni) fruit – phytochemistry, pharmacology, safety. Planta Med., 73(3), 191–199.
Prakash D., Singh B.N., Upadhyay G. 2007. Antioxidant and free radical scavenging activities of phenols from onion (Allium cepa). Food Chem., 102, 1389–1393.
Premkumar K., Pachiappan A., Abraham S.K., Santhiya S.T., Gopinath P.M., Ramesh A.
2001. Effect of Spirulina fusiformis on cyclophosphamide and mitomycin-C induced
genotoxicity and oxidative stress in mice. Fitoterapia, 72, 906–911.
Proestos C., Boziaris I.S., Kapsokefalou M., Komaitis M. 2008. Natural antioxidant constituents from selected aromatic plants and their antimicrobial activity against selected
pathogenic microorganisms. Food Technol. Biotechnol., 46(2), 151–156.
Qian J.Y., Liu D., Huang A.G. 2004. The efficiency of flavonoids in polar extracts of Lycium
chinense Mill. fruits as free radical scavenger. Food Chem., 87, 283–288.
Radha Krishnan K., Babuskin S., Azhagu Saravana Babu P., Sasikala M., Sabina K.,
Archana G., Sivarajan M., Sukumar M. 2014. Antimicrobial and antioxidant effects of
spice extracts on the shelf life extension of raw chicken meat. Int. J. Food Microbiol.,
171, 32–40.
Rahbar M., Diba K. 2010. In vitro activity of cranberry extract against etiological agents of
urinary tract infections. Afr. J. Pharm. Pharmacol., 4(5), 286–288.
Rahman K. 2001. Historical perspective on garlic and cardiovascular disease. J. Nutr.,
131(3 Suppl.), 977S–979S.
Randall C., Meethan K., Randall H., Dobbs F. 1999. Nettle sting of Urtica dioica for joint
pain – an exploratory study of this complementary therapy. Complement. Ther. Med.,
7(3), 126–131.
Raz R., Chazan B., Dan M. 2009. Cranberry juice and urinary tract infection. Clin. Inf. Dis.,
38, 1413–1419.
Literatura
181
Reuter H.D. 1995. Allium sativum and Allium ursinum. Part 2. Pharmacology and medicinal
application. Phytomedicine, 2(1), 73–91.
Rhodes M.J., Price K.R. 1996. Analytical problems in the study of flavonoid compounds in
onions. Food Chem., 57(1), 113–117.
Rice-Evans C.A., Miller N.J., Paganga G. 1996. Structure–antioxidant activity relationships
of flavonoids and phenolic acids. Free Radic. Biol. Med., 20(7), 933–956.
Rice-Evans C.A., Miller N.J., Paganga G. 1997. Antioxidant properties of phenolic compounds. Trends Plant Sci., 4(2), 152–159.
Ríos-Arrabal S., Artacho-Cordón F., León J., Román-Marinetto E., Del Mar Salinas-Asensio M., Calvente I., Núñez M.I. 2013. Involvement of free radicals in breast cancer. SpringerPlus, 2, 404 (doi:10.1186/2193-1801-2-404).
Robards K., Prenzler P.D., Tucker G., Swatsitang P., Glover W. 1999. Phenolic compounds
and their role in oxidative processes in fruits. Food Chem., 69, 401–436.
Rodríguez Vaquero M.J., Aredes Fernández P.A., Manca de Nadra M.C., Strasser de
Saad A.M. 2010. Phenolic compound combinations on Escherichia coli viability in a meat
system. J. Agric. Food Chem., 58(10), 6048–6052.
Romay C., Armesto J., Remirez D., González R., Ledon N., García I. 1998. Antioxidant
and anti-inflammatory properties of C-phycocyanin from blue-green algae. Inflamm.
Res., 47, 36–41.
Ross S.A., Ziska D.S., Zhao K., ElSohly M.A. 2000. Variance of common flavonoids by
brand of grapefruit juice. Fitoterapia, 71(2), 154–161.
Rusaczonek A., Świderski F., Waszkiewicz-Robak B. 2010. Antioxidant properties of tea
and herbal infusions – a short report. Pol. J. Food Nutr. Sci., 60(1), 33–35.
Saarela M., Lähteenmäki L., Crittenden R., Salminen S., Mattila-Sandholm T. 2002. Gut
bacteria and health foods – the European perspective. Int. J. Food Microbiol., 78, 99–117.
Safarinejad M.R. 2005. Urtica dioica for treatment of benign prostatic hyperplasia: a prospective, randomized, double-blind, placebo-controlled, crossover study. J. Herb.
Pharmacother., 5(4), 1–11.
Sakata H., Yoshioka H., Fujita K. 1985. Development of the intestinal flora in very low
birth weight infants compared to normal full-term newborns. Eur. J. Pediatr., 144, 186–
–190.
Sang S., Lee M.J., Hou Z., Ho C.T., Yang C.S. 2005. Stability of tea polyphenol (-)-epigallocatechin-3-gallate and formation of dimers and epimers under common experimental
conditions. J. Agric. Food Chem., 53(24), 9478–9484.
Sang S., Yang I., Buckley B., Ho C.T., Yang C.S. 2007. Autoxidative quinone formation in
vitro and metabolite formation in vivo from tea polyphenol (-)-epigallocatechin-3-gallate:
studied by real-time mass spectrometry combined with tandem mass ion mapping. Free
Radic. Biol. Med., 43(3), 362–371.
Sannella A.R., Messori L., Casini A., Vincieri F.F., Bilia A.R., Majori G., Severini C. 2007.
Antimalarial properties of green tea. Biochem. Biophys. Res. Commun., 353(1), 177–181.
182
Sanz Y. 2010. Effects of a gluten-free diet on gut microbiota and immune function in healthy
adult humans. Gut Microbes, 1(3), 135–137.
Schneider H., Blaut M. 2000. Anaerobic degradation of flavonoids by Eubacterium ramulus.
Arch. Microbiol., 173(1), 71–75.
Schoefer L., Mohan R., Schwiertz A., Braune A., Blaut M. 2003. Anaerobic degradation
of flavonoids by Clostridium orbiscindens. Appl. Environ. Microbiol., 69(10), 5849–5854.
Seguchi T., Tamura K., Shimada A., Sugimoto M., Kudoh H. 2012. Mechanism of antioxidant interaction on polymer oxidation by thermal and radiation ageing. Rad. Phys.
Chem., 81, 1747–1751.
Sendl A. 1995. Allium sativum and Allium ursinum. Part 1. Chemistry, analysis, history,
botany. Phytomedicine, 1(4), 323–339.
Senthilkumar V., Gunasekaran P. 2005. Bioethanol production from cellulosic substrates:
engineered bacteria and process integration challenges. J. Sci. Ind. Res., 64, 845–853.
Setchell K.D., Clerici C. 2010a. Equol: history, chemistry, and formation. J. Nutr., 140(7),
1355S–1362S.
Setchell K.D., Clerici C. 2010b. Equol: pharmacokinetics and biological actions. J. Nutr.,
140(7), 1363S–1368S.
Setchell K.D., Clerici C., Lephart E.D., Cole S.J., Heenan C., Castellani D., Wolfe B.E.,
Nechemias-Zimmer L., Brown N.M., Lund T.D., Handa R.J., Heubi J.E. 2005. S-equol,
a potent ligand for estrogen receptor beta, is the exclusive enantiomeric form of the soy
isoflavone metabolite produced by human intestinal bacterial flora. Am. J. Clin. Nutr.,
81(5), 1072–1079.
Shakibaei M., Harikumar K.B., Aggarwal B.B. 2009. Resveratrol addiction: to die or not
to die. Mol. Nutr. Food Res., 53, 115–128.
Shan B., Cai Y.Z., Brooks J.D., Corke H. 2007. The in vitro antibacterial activity of dietary
spice and medicinal herb extracts. Int. J. Food Microbiol., 117(1), 112–119.
Shapiro H., Singer P., Halpern Z., Bruck R. 2007. Polyphenols in the treatment of inflammatory bowel disease and acute pancreatitis. Gut, 56(3), 426–435.
Shrestha R., Lama J.P., Shrestha K. 2010. Total polyphenols content and antioxidant activity of different tea commercially produced in Nepal. J. Food Sci. Technol. Nepal, 6,
73–79.
Sichel G., Corsaro C., Scalia M., Di Bilio A.J., Bonomo R.P. 1991. In vitro scavenger
activity of some flavonoids and melanins against O2–•. Free Radic. Biol. Med., 11(1),
1–8.
Siedlecka K., Bogusławski W. 2005. Sirtuiny — enzymy długowieczności? Gerontol. Pol.,
13(3), 147–152.
Sies H. 1993. Strategies of antioxidant defense. Eur. J. Biochem., 215, 213–219.
Simmering R., Pforte H., Jacobasch G., Blaut M. 2002. The growth of the flavonoid-degrading intestinal bacterium, Eubacterium ramulus, is stimulated by dietary flavonoids
in vivo. FEMS Microbiol. Ecol., 40(3), 243–248.
Literatura
183
Singal A.K., Jampana S.C., Weinman S.A. 2011. Antioxidants as therapeutic agents for
liver disease. Liver Int., 31(10), 1432–1448.
Singh B.N., Singh B.R., Singh R.L., Prakash D., Singh D.P., Sarma B.K., Upadhyay G.,
Singh H.B. 2009. Polyphenolics from various extracts/fractions of red onion (Allium
cepa) peel with potent antioxidant and antimutagenic activities. Food Chem. Toxicol.,
47(6), 1161–1167.
Singh D.R. 2012. Morinda citrifolia L. (Noni): a review of the scientific validation for its
nutritional and therapeutic properties. J. Diabetes Endocrinol., 3(6), 77–91.
Smith M.G., Des Etages S.G., Snyder M. 2004. Microbial synergy via an ethanol-triggered
pathway. Mol. Cell. Biol., 24(9), 3874–3884.
Song Y., Xu B. 2013. Diffusion profiles of health beneficial components from goji berry
(Lycium barbarum) marinated in alcohol and their antioxidant capacities as affected by
alcohol concentration and steeping time. Food, 2, 32–43.
Soylu E.M., Kurt S., Soylu S. 2010. In vitro and in vivo antifungal activities of the essential
oils of various plants against tomato grey mould disease agent Botrytis cinerea. Int. J.
Food Microbiol., 143(3), 183–189.
Sperry J.F., Appleman M.D., Wilkins T.D. 1977. Requirement of heme for growth of
Bacteroides fragilis. Appl. Environ. Microbiol., 34(4), 386–390.
Srinivasahan V., Dubairaj B. 2014. Antioxidant and free radical scavenging effect of Morinda
citrifolia fruit extract. Int. J. Pharm. Pharm. Sci., 6(4), 55–59.
Stojković D., Petrović J., Soković M., Glamočlija J., Kukić-Marković J., Petrović S.
2013. In situ antioxidant and antimicrobial activities of naturally occurring caffeic
acid, p-coumaric acid and rutin, using food systems. J. Sci. Food Agric., 93(13), 3205–
–3208.
Street R., Száková J., Drábek O., Mládková L. 2006. The status of micronutrients (Cu, Fe,
Mn, Zn) in tea and tea infusions in selected samples imported to the Czech Republic.
Czech J. Food Sci., 24(2), 62–71.
Škerget M., Majhenič L., Bezjak M., Knez Ž. 2009. Antioxidant, radical scavenging and
antimicrobial activities of red onion (Allium cepa L.) skin and edible part extracts. Chem.
Biochem. Eng., Q., 23(4), 435–444.
Štajner D., Popović B.M., Čanadanović-Brunet J., Štajner M. 2008. Antioxidant and
scavenger activities of Allium ursinum. Fitoterapia, 79, 303–305.
Tajkarimi M.M., Ibrahim S.A., Cliver D.O. 2010. Antimicrobial herb and spice compounds
in food. Food Control, 21, 1199–1218.
Tarko T., Duda-Chodak A., Satora P., Sroka P., Pogoń P., Machalica J. 2014. Chaenomeles
japonica, Cornus mas, Morus nigra fruits characteristics and their processing potential.
J. Food Sci. Technol. Mys., 51(12), 3934–3941.
Tarko T., Duda-Chodak A., Satora P., Zając N. 2013. Antioxidant activity of goji berries
and bilberry at particular digestion stages in an in vitro model simulating the human
alimentary tract. Potravinárstvo, 7, 235–238.
184
Tarko T., Sroka P., Duda-Chodak A. 2007. Rodzaje aktywnych rodników i reaktywnych
form tlenu. [W:] Przeciwutleniacze w żywności. Aspekty zdrowotne, technologiczne,
molekularne i analityczne. Red. W. Grajek. WNT, Warszawa, 15–33.
Tchirkov A., Lansdorp P.M. 2003. Role of oxidative stress in telomere shortening in cultured
fibroblasts from normal individuals and patients with ataxia-telangiectasia. Hum. Mol.
Genet., 12(3), 227–232.
Teke G.N., Elisée K.N., Roger K.J. 2013. Chemical composition, antimicrobial properties
and toxicity evaluation of the essential oil of Cupressus lusitanica Mill. leaves from
Cameroon. BMC Complement. Altern. Med., 13(1), 130.
Thurston B., Dawson K.A., Strobel H.J. 1994. Pentose utilization by the ruminal bacterium
Ruminococcus albus. Appl. Environ. Microbiol., 60(4), 1087–1092.
Tripoli E., La Guardia M., Giammanco S., Di Majo D., Giammanco M. 2007. Citrus
flavonoids: molecular structure, biological activity and nutritional properties: a review.
Food Chem., 104, 466–479.
Turnbaugh P.J., Ridaura V.K., Faith J.J., Rey F.E., Knight R., Gordon J.I. 2009. The
effect of diet on the human gut microbiome: a metagenomic analysis in humanized
gnotobiotic mice. Sci. Transl. Med., 1(6), 6–14.
Ultee A., Bennik M.H.J., Moezelaar R. 2002. The phenolic hydroxyl group of carvacrol is
essential for action against the food-borne pathogen Bacillus cereus. Appl. Environ.
Microbiol., 68(4), 1561–1568.
Vanamala J., Reddivari L., Yoo K.S., Pike L.M., Patil B.S. 2006. Variation in the content
of bioactive flavonoids in different brands of orange and grapefruit juices. J. Food Compos.
Anal., 19, 157–166.
Vlase L., Parvu M., Parvu E.A., Toiu A. 2013a. Chemical constituents of three Allium species from Romania. Molecules, 18, 114–127.
Vlase L., Parvu M., Parvu E.A., Toiu A. 2013b. Phytochemical analysis of Allium fistulo
sum L. and A. ursinum L. Dig. J. Nanomater. Biostruct., 8(1), 457–467.
Wang C.C., Chang S.C., Inbaraj B., Chen B.H. 2010. Isolation of carotenoids, flavonoids
and polysaccharides from Lycium barbarum L. and evaluation of antioxidant activity.
Food Chem., 120, 184–192.
Wang D., Lu J., Miao A., Xie Z., Yang D. 2008a. HPLC-DAD-ESI-MS/MS analysis of
polyphenols and purine alkaloids in leaves of 22 tea cultivars in China. J. Food Compos.
Anal., 21, 361–369.
Wang H., Cao G., Prior R.L. 1997. The oxygen radical absorbing capacity of anthocyanins.
J. Agr. Food Chem., 45, 304–309.
Wang L., Tu Y.C., Lian T.W., Hung J.T., Yen J.H., Wu M.J. 2006. Distinctive antioxidant
and antiinflammatory effects of flavonoids. J. Agric. Food Chem., 54(26), 9798–9804.
Wang R., Zhou W., Jiang X. 2008b. Reaction kinetics of degradation and epimerization of
epigallocatechin gallate (EGCG) in aqueous system over a wide temperature range.
J. Agric. Food Chem., 56(8), 2694–2701.
Literatura
185
Webster K.A. 2012. Mitochondrial membrane permeabilization and cell death during myocardial infarction: roles of calcium and reactive oxygen species. Future Cardiol., 8(6), 863–884.
Weerakkody N.S., Caffin N., Turner M.S., Dykes G.A. 2010. In vitro antimicrobial activity of less-utilized spice and herb extracts against selected food-borne bacteria. Food
Contr., 21, 1408–1414.
Wei Y., Xie Q., Dong W., Ito Y. 2009. Separation of epigallocatechin and flavonoids from
Hypericum perforatum L. by high-speed counter-current chromatography and preparative
high-performance liquid chromatography. J. Chromatogr., A, 1216(19), 4313–4318.
Williams G.M., Iatropoulos M.J. 1996. Inhibition of the hepatocarcinogenicity of aflatoxin B in rats by low levels of the phenolic antioxidants butylated hydroxyanisole and
butylated hydroxytoluene. Cancer Lett., 104, 49–53.
Williams R.J., Spencer J.P.E., Rice-Evans C. 2004. Flavonoids: antioxidants or signalling
molecules? Free Rad. Biol. Med., 36(7), 838–849.
Wolin M.S. 2009. Reactive oxygen species and the control of vascular function. Am. J. Physiol.
Heart Circ. Physiol., 296(3), H539–H549.
Wu G.D., Chen J., Hoffmann C., Bittinger K., Chen Y.Y., Keilbaugh S.A., Bewtra M.,
Knights D., Walters W.A., Knight R., Sinha R., Gilroy E., Gupta K., Baldassano R.,
Nessel L., Li H., Bushman F.D., Lewis J.D. 2011. Linking long-term dietary patterns
with gut microbial enterotypes. Science, 334(6052), 105–108.
Wu T., Guan Y., Ye J. 2007. Determination of flavonoids and ascorbic acid in grapefruit
peel and juice by capillary electrophoresis with electrochemical detection. Food Chem.,
100, 1573–1579.
Wu X., Gu L., Prior R.L., McKay S. 2004. Characterization of anthocyanins and proanthocyanidins in some cultivars of Ribes, Aronia, and Sambucus and their antioxidant capacity. J. Agric. Food Chem., 52(26), 7846–7856.
Xu S., Touyz R.M. 2006. Reactive oxygen species and vascular remodelling in hypertension:
still alive. Can. J. Cardiol., 22(11), 947–951.
Xu W., Qu W., Huang K., Guo F., Yang J., Zhao H., Luo Y.B. 2007. Antibacterial effect
of Grapefruit Seed Extract on food-borne pathogens and its application in the preservation of minimally processed vegetables. Postharv. Biol. Technol., 45, 126–133.
Yamaguchi K., Honda M., Ikigai H., Hara Y., Shimamura T. 2002. Inhibitory effects of
(-)-epigallocatechin gallate on the life cycle of human immunodeficiency virus type 1
(HIV-1). Antiviral Res., 53(1), 19–34.
Yamaki K., Taneda S., Yanagisawa R., Inoue K., Takano H., Yoshino S. 2007. Enhancement
of allergic responses in vivo and in vitro by butylated hydroxytoluene. Toxicol. Appl.
Pharmacol., 223, 164–172.
Yan M.H., Wang X., Zhu X. 2013. Mitochondrial defects and oxidative stress in Alzheimer
disease and Parkinson disease. Free Radic. Biol. Med., 62, 90–101.
Yano Y., Satomi M., Oikawa H. 2006. Antimicrobial effect of spices and herbs on Vibrio
parahaemolyticus. Int. J. Food Microbiol., 111(1), 6–11.
186
Yashin A., Yashin Y., Nemzer B. 2011. Determination of antioxidant activity in tea extracts,
and their total antioxidant content. Am. J. Biomed. Sci., 3(4), 322–335.
Ye H., Xu H., Yu C., Dai Y., Liu G., Xu W., Yuan S. 2009. Hydroxylation of naringin by
Trichoderma harzianum to dramatically improve its antioxidative activity. Enzyme Microb.
Technol., 45, 282–287.
Yokoyama S., Suzuki T. 2008. Isolation and characterization of a novel equol-producing
bacterium from human feces. Biosci. Biotechnol. Biochem., 72(10), 2660–2666.
Yuan J.P., Wang J.H., Liu X. 2007. Metabolism of dietary soy isoflavones to equol by human
intestinal microflora – implications for health. Mol. Nutr. Food Res., 51(7), 765–781.
Zakay-Rones Z., Varsano N., Zlotnik M., Manor O., Regev L., Schlesinger M.,
Mumcuoglu M. 1995. Inhibition of several strains of influenza virus in vitro and reduction of symptoms by an elderberry extract (Sambucus nigra L.) during an outbreak of
influenza B Panama. J. Altern. Complem. Med., 1(4), 361–369.
Zhang X., Rimpiläinen M., Simelyte E., Toivanen P. 2001. Enzyme degradation and proinflammatory activity in arthritogenic and nonarthritogenic Eubacterium aerofaciens cell
walls. Infect. Immun., 69(12), 7277–7284.
Zhu B., Wang X., Li L. 2010. Human gut microbiome: the second genome of human body.
Protein Cell., 1(8), 718–725.
Zimmer J., Lange B., Frick J.S., Sauer H., Zimmermann K., Schwiertz A., Rusch K.,
Klosterhalfen S., Enck P. 2012. A vegan or vegetarian diet substantially alters the human colonic faecal microbiota. Eur. J. Clin. Nutr., 66, 53–60.
Interactions between the antioxidant compounds
occurring in plants and dietary supplements
and the bacteria representing the human intestinal
microbiota
Summary
The study aimed at investigating how the antioxidant food components (polyphenols)
interact with the bacteria that represent the human intestinal microbiota. Seven
species of bacteria (isolated from the human intestine, and bought as pure bacterial
cultures in lyophilised form), used in the experiments, were Enterococcus caccae,
Escherichia coli, Lactobacillus sp., Bacteroides galacturonicus, Bifidobacterium
catenulatum, Ruminococcus gauvreauii and Eubacterium cylindroides. Plant material
with known health-promoting properties and a long tradition of use in folk medicine,
such as fresh fruits of raspberry, elderberry, cranberry, lingonberry, Japanese
quince and cornelian cherry, dried goji and Schisandra berries, red onion, bear’s
garlic, nettle, green tea and soybeans, as well as food supplements (commercial
pharmaceutical products: spirulina, noni juice and Citrosept) provided the source
of polyphenols. In addition, solutions of pure polyphenolic compounds (representing
various flavonoid classes and stilbenes) were used. The latter included (+)-catechin,
phloridzin, quercetin, rutin, kaempferol, naringin, naringenin, hesperidin, hesperetin
and resveratrol as polyphenols being the most frequently eaten with human diets.
At the first stage of the study, the material was examined for antioxidant activity,
total polyphenol content, and polyphenolic profile.
At the second stage, the effect exerted on individual bacteria species by pure
polyphenols, plant extracts and food supplements, used in different concentrations,
was evaluated. It was found that the natural antioxidant components and the
polyphenolic compounds present in plant material produce various effects on
intestinal bacteria, from stimulating, through neutral, up to bacteriostatic and
bactericidal, depending on the bacteria species. For extracts showing inhibitory
potential, the minimum inhibitory concentration (MIC) was determined. In search
188
of mechanisms behind the antioxidant and antimicrobial activity of polyphenols, the
role of the structural elements of their molecules was discussed.
The third stage of the research concerned the impact of intestinal bacteria on
the antioxidant potential and the concentration of selected antioxidant components
present in plant material. The changes that occurred due to the influence of
particular bacteria species were assessed. It was demonstrated that bacteria
representing the physiological intestinal microbiota of humans may biotransform
polyphenols through various pathways, producing derivatives of higher or lower
antioxidant potential (which has health implications). The increase in antioxidant
activity, however, may often be caused not by the metabolic changes of polyphenols,
but by their release from the bonds with proteins or other components present in
the reaction medium.
The results of the study provided a basis for formulating practical guidance
for the consumers of polyphenol-rich foods (among them dietary supplements)
and for the food industry.

Interakcje związków przeciwutleniających występujących w

Transcription

Similar documents

pełny tekst

Narzędzia Tools - Cultural Animation

Instrukcja obsługi