PDF - Universidade Federal Fluminense

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UNIVERSIDADE FEDERAL FLUMINENSE
INSTITUTO DE BIOLOGIA
PÓS-GRADUAÇÃO EM NEUROIMUNOLOGIA
PAULO EMÍLIO CORRÊA LEITE
INFLUÊNCIA DA ATIVAÇÃO SELETIVA DO
RECEPTOR DE ACETILCOLINA α7, E O EFEITO DO
EXTRATO DE Eugenia punicifolia NA LESÃO E
INFLAMAÇÃO MUSCULAR DO CAMUNDONGO mdx
COM DISTROFIA MUSCULAR DE DUCHENNE
Niterói
2011
ii
Tese submetida à Coordenação do Curso de
Pós-Graduação em Neuroimunologia do
Instituto
de
Biologia
da
Universidade
Federal Fluminense, como requisito parcial
para obtenção do Grau de Doutor em
Neuroimunologia. Área de concentração:
Patologia Celular.
Orientadoras
Prof.a Dr.a Thereza Quirico dos Santos
Prof.a Dr.a Jussara Lagrota-Cândido
iii
X 000
Leite, Paulo Emílio Corrêa
Ativação seletiva da subunidade α7 do receptor nicotínico de
acetilcolina e a utilização do extrato de Eugenia punicifolia
como estratégias antiinflamatórias na lesão muscular do
camundongo mdx com distrofia muscular de Duchenne/ – Paulo
Emílio Corrêa Leite. – Niterói: [s.n.], 2011.
144 f.
Tese – Doutorado em Neuroimunologia – Universidade
Federal Fluminense, 2011.
1. Distrofia Muscular de Duchenne. 2. Miopatia
Inflamatória. 3. Músculo esquelético. 4. Receptor Nicotínico de
Acetilcolina. 5. Inflamação. I. Título.
CDD.: 000.0000
iv
Tese submetida à coordenação do curso de pósgraduação em Neuroimunologia do Instituto de
Biologia da Universidade Federal Fluminense, como
requisito parcial para obtenção do Grau de Doutor
em Neuroimunologia. Área de concentração:
Patologia Celular.
BANCA EXAMINADORA:
Dr.a Claudia Mermelstein (UFRJ)
Dr. Newton G. Castro (UFRJ)
Dr.a Izabel Christina de Palmer Paixão (UFF)
Dr.a Thereza Fonseca Quirico dos Santos (Orientadora - UFF)
Dr.a Claire Fernandes Kubelka (Suplente – FIOCRUZ/RJ)
Dr. Wilson da Costa Santos (Revisor - UFF)
v
Dedico esta tese
À minha família, em especial aos meus pais Emílio
Ramos Leite e Elizia Corrêa Leite, sempre presentes,
apoiando minhas escolhas, me incentivando de forma
incondicional, e por serem essenciais para a minha formação.
vi
AGRADECIMENTOS

A Deus, por ter me concedido uma família maravilhosa e por ter colocado as
pessoas certas em meu caminho.

A meus pais Emílio e Elizia, meus melhores amigos, presentes durante todo o
decorrer do doutorado e em todos os momentos marcantes de minha vida.

Às minhas orientadoras Profas Thereza Quírico e Jussara Lagrota, por terem me
orientado durante esses anos de doutorado.

Aos grandes colaboradores desta tese: Profs Wilson Santos, Luis Gandia e
Ricardo Pascual, por me ajudarem com os experimentos no Brasil e na Espanha.

A Nina, Bartira e Regina, pela amizade e pelo auxílio nas técnicas laboratoriais,
além de serem ótimas companheiras de trabalho.

A todos os meus amigos de laboratório que foram muito importantes tanto na
execução de experimentos quanto na cumplicidade do dia-a-dia: Douglas,
Eustáquio, Rafael, Lian, Angélica, Aline, Camila, Fernanda e Letícia,
companheiros da rotina laboratorial, os quais deram contribuições significativas
para o desenvolvimento desta tese.

Aos amigos de outros laboratórios: Monique, pela paciência nos ensinamentos e
trabalho inicial em experimentos in vitro; Guilherme, pelo companheirismo e
vii
amizade essenciais no trabalho e também para a vida toda; Alexandre Kaled, ou
Kaleidoscópio, pessoa calma até demais, sensato e excelente pra dividir
apartamento; Pablo, muito companheiro de trabalho, conselhos e moradia,
embora dividir apartamento novamente é algo que espero não repetir; Ísis,
amizade fiel e inteligente; Ana Lúcia, sempre me ouvindo e aconselhando
pacientemente; Gustavo, por ser sempre prestativo e amigo; Elisa, por me ajudar
quando tinha dúvidas relacionadas à redação em inglês.

Às minhas alunas de iniciação científica: Juliana, Kessiane, Isabela e Carolina,
por terem me ajudado nas técnicas laboratoriais e sempre me questionarem
fazendo com que eu sempre buscasse respostas.

A todos os meus colegas de pós-graduação e professores da UFF não citados
aqui, mas não menos importantes.

A possibilidade de utilizar camundongos no trabalho, pois sem eles não haveria
pesquisa, e sem pesquisa não haveria desenvolvimento científico e saúde.
viii
"Faça o que você escolheu fazer em sua vida com amor e ética, sempre pensando
no próximo”.
Emílio Ramos Leite
ix
A parte experimental deste trabalho foi executada no Laboratório de
Patologia Celular, Departamento de Biologia Celular e Molecular do Instituto de
Biologia da Universidade Federal Fluminense (UFF); e no Laboratório de
Farmacologia, Departamento de Farmacología y Terapéutica do Instituto Teófilo
Hernando de I+D del Medicamento, Facultad de Medicina da Universidade
Autonoma de Madrid.
x
SUMÁRIO
Página
AGRADECIMENTOS.................................................................................................... vi
LISTA DE ABREVIATURAS....................................................................................... xii
RESUMO....................................................................................................................... xiv
ABSTRACT................................................................................................................... xv
1
INTRODUÇÃO.................................................................................................... 1
1.1
Lesão e inflamação muscular.............................................................................. 1
1.1.1 Participação de macrófagos na regeneração muscular........................................ 1
1.1.2 Envolvimento de metaloproteases de matriz...................................................... 2
1.1.3 Envolvimento do fator de necrose tumoral α...................................................... 4
1.2
Regulação neural autônoma da imunidade......................................................... 5
1.2.1 Mecanismos de comunicação e integração do sistema imune e SNC................ 6
1.2.2 Via colinérgica antinflamatória e o reflexo inflamatório.................................... 8
1.2.3 Modelo hipotético do reflexo inflamatório......................................................... 10
1.2.4 Baço como efetor da via colinérgica antinflamatória......................................... 11
1.3
Características gerais da Distrofia muscular do tipo Duchenne.......................... 12
1.3.1 Distrofina e o complexo de Glicoproteínas........................................................ 14
1.3.2 Modelos animais de distrofinopatia.................................................................... 15
1.3.3 Estratégias terapêuticas para a DMD.................................................................. 17
1.4
Extrato de Eugenia punicifolia como possível modulador da neurotransmissão
nicotínica colinérgica...................................................................................................... 22
2.
OBJETIVOS....................................................................................................... 24
2.1
Gerais.................................................................................................................. 24
2.2
Específicos.......................................................................................................... 24
3
Artigos................................................................................................................. 25
3.1
Artigo 1, publicado: Nicotinic acetylcholine receptor activation reduces skeletal
muscle inflammation of mdx mice….............................................................................. 25
3.2
Artigo 2, a submeter: Selective activation of α7 nicotinic acetylcholine receptor
subunit (nachrα7) as a new anti-inflammatory strategy prevents muscular degeneration
in mdx mice..................................................................................................................... 33
3.3
Artigo 3, a submeter: Eugenia punicifolia (Myrtaceae) dichloromethane fraction
inhibits DNA synthesis and proliferation of C2C12 cells via MAPK signaling
pathway........................................................................................................................... 55
xi
3.4
Artigo 4, publicado: Anti-inflammatory activity of Eugenia punicifolia extract
on muscular lesion of mdx dystrophic mice.................................................................... 79
4
Discussão.......................................................................................................... 88
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS......................................................................... 101
xii
LISTA DE ABREVIATURAS
Bgtx
Alfa-bungarotoxina
Bgtx-AChR
Receptor de acetilcolina sensível à alfa-bungarotoxina
ACh
Acetilcolina
nAChR
Receptor nicotínico de acetilcolina
nAChR7
Subunidade alfa 7 do receptor nicotínico de acetilcolina
AP
Área postrema
ATP
Adenosina tri-fosfato
BBB
Barreira hemato-encefálica
CVOs
Órgãos circunventriculares
DGC
Complexo de glicoproteínas associadas à distrofina
DMD
Distrofia muscular de Duchenne
DMN
Núcleo motor dorsal do nervo vago
HMGB1
Proteína do tipo high mobility group box 1
HPA
Hipotálamo-pituitária-adrenal
IL
Interleucina
LPS
Lipopolissacarídeo
MAPK
Proteína quinase ativada por mitógeno
MMP
Metaloprotease de matriz
mRNA
RNA mensageiro
NA
Núcleo ambíguo
NTS
Núcleo do tracto solitário
PGE2
Prostaglandina E2
SDS
Dodecil sulfato de sódio
xiii
RESUMO
A fisiopatologia da miopatia inflamatória no camundongo mdx com distrofia muscular
de Duchenne é caracterizada em diferentes idades por mionecrose com áreas de
infiltrado inflamatório seguida de regeneração e posterior fibrose persistente com perda
da função muscular. Estudos em modelo de sepse mostraram que a ativação da
subunidade α7 do receptor de acetilcolina reduz a inflamação sendo esta estimulação
dependente do nervo vago e denominada "via colinérgica antiinflamatória". O presente
trabalho teve como objetivo verificar uma suposta participação da função
antiinflamatória dos receptores nicotínicos de acetilcolina (nAChR) na lesão muscular
do mdx. Resultados dos experimentos in vitro e ex vivo mostraram que a atenuação da
mionecrose e produção reduzida de TNFα foi concomitante ao aumento no número de
macrófagos F4/80 expressando nAChRα7. O tratamento in vivo com nicotina diminuiu
a inflamação muscular evidenciada por redução na atividade da metaloprotease -9 e
níveis dos mediadores inflamatórios TNFα e NFkB. A ativação nicotínica reduziu a
inflamação além de favorecer regeneração muscular mesmo na ausência de inervação
vagal parassimpática. A utilização do modelo de lesão muscular com bupivacaína e
administração do agonista seletivo da subunidade α7 PNU282987 mostraram a
incapacidade de camundongos α7-/- knockout de reduzir a inflamação muscular em
contraste ao observado no controle selvagem de camundongos α7+/+. Considerando que
o extrato de E. punicifolia foi capaz de alterar os efeitos de antagonistas competitivos
nicotínicos colinérgicos, e que a ativação de mecanismos colinérgicos pode reduzir a
inflamação, analisamos os efeitos de diferentes frações do extrato de E. punicifolia em
células musculares in vitro e no músculo distrófico. O extrato foi obtido de arbusto da
família Myrtaceae, sendo empregado por habitantes da região Amazônica como agente
antiinflamatório natural. Foram realizados experimentos in vitro com a linhagem C2C12
de mioblasto murino e in vivo no camundongo mdx. A fração diclorometânica do extrato
causou inibição dose-dependente da proliferação e ação citostática nas células C2C12,
efeito que foi reversível depois da retirada do agente. A inibição das proteínas pERK e
ciclina D1 com superexpressão de pAkt e p27kip1 indicam ativação de vias capazes de
afetar a síntese de DNA na fase G1 do ciclo celular. A implantação de polímero
contendo esta fração do estrato na região do músculo gastrocnêmico do camundongo
mdx mostrou importante participação no remodelamento tecidual. Em comparação ao
músculo controle contendo polímero com veículo, o músculo com o polímero contendo
o extrato apresentou redução nos níveis de TNFα, IL-1β bioativa, caspase-3 clivada,
NFkB, MMPs -9 e -2, e aumento nos níveis de miogenina sem afetar a deposição de
colágeno relacionada com fibrose não-funcional. Também foi verificado que as
atividades enzimáticas de colina acetiltransferase e acetilcolinesterase não foram
alteradas após a implantação do polímero com o extrato. Estes dados excluem a
possibilidade de que a fração diclorometânica do extrato esteja inibindo a ação da
acetilcolinesterase e amplificando a interação do receptor de acetilcolina. Em conjunto,
os dados mostram que a ativação seletiva da nAChRα7 via mecanismo colinérgico não
exclusivo à inervação vagal, e que a presença de substâncias bioativas na fração
diclorometânica do extrato de E. punicifolia são capazes de reduzir a inflamação e ativar
mecanismos de regeneração muscular no camundongo mdx com distrofia muscular de
Duchenne. É plausível supor que essas estratégias possam também ser aplicadas em
outras patologias inflamatórias.
xiv
ABSTRACT
The physiopathology of the inflammatory myopathy in the mdx mouse with Duchenne’s
muscle dystrophy is characterized in different ages by myonecrosis with inflammatory
infiltrate areas followed by regeneration and posterior persistent fibrosis with loss of
muscle function. Studies in sepsis model have shown that the activation of nicotinic
acetylcholine receptor α7 subunit reduces inflammation through a vagus nervedependent stimulation termed “anti-inflammatory cholinergic pathway”. The present
study had the objective to verify a putative participation of the anti-inflammatory
function of acetylcholine nicotinic receptors in the mdx muscle lesion. The results of in
vitro and ex vivo experiments showed that attenuation of myonecrosis and reduced
TNFα production was simultaneous to the increase in the number of F4/80 macrophages
expressing nAChRα7. In vivo treatment with nicotine reduced muscle inflammation
evidenced by a reduction in metalloprotease -9 activity and inflammatory mediators
TNFα and NFkB levels. Nicotinic activation reduced inflammation and favored muscle
regeneration even in the absence of parasympathetic vagal innervation. Using the
bupivacaine muscle lesion model and administration of the α7 subunit selective agonist
PNU282987 showed the inability of α7-/- knockout mice to reduce muscle inflammation
in contrast to the effect observed in wild-type α7+/+ mice. Considering that the E.
punicifolia extract was capable of altering the effects of competitive cholinergic
nicotinic antagonists, and that the activation of cholinergic mechanisms may reduce
inflammation, we analyzed the effects of different fractions of E. punicifolia extract in
muscle cells in vitro and in the dystrophic muscle. The extract was obtained from a
shrub of the Myrtaceae family, and is used by inhabitants of the Amazon region as a
natural anti-inflammatory agent. In vitro experiments were conducted with C2C12 cell
lineage from murine myoblasts and in vivo in the mdx mouse. The dichloromethanic
fraction of the extract caused a dose-dependent inhibition of proliferation and had
cytostatic action on C2C12 cells, effect that was reversed after withdrawing the agent.
Inhibition of pERK and cyclin D1 proteins, with overexpression of pAkt and p27kip1
indicate the activation of pathways capable of affecting DNA synthesis during the G1
stage of the cell cycle. The implantation of a polymer containing this same fraction of
the extract in the gastrocnemic muscle of the mdx mouse had an important participation
in tissue remodeling. In comparison to vehicle-containing polymer control muscle, the
muscle with the extract presented reduction in TNFα, bioactive IL-1β, cleaved caspases3, NFkB, MMPs -9 and -2, and increase in myogenin levels without affecting collagen
deposition related to non-functional fibrosis. It was also verified that the enzymatic
activities of choline acetyltransferase and acetylcholinesterase were not altered after the
extract-containing polymer implant. These data exclude the possibility that the
dichloromethanic fraction of the extract might be inhibiting acetylcholinesterase activity
and amplifying acetylcholine receptor interaction. Overall, our data show that selective
activation of nAChRα7 through a cholinergic mechanism not exclusive to vagal
innervation, and that the presence of bioactive substances in the dichloromethanic
fraction of E. punicifolia are capable of reducing inflammation and activating
mechanisms of muscle regeneration in the mdx mouse with Duchenne muscle
dystrophy. It is plausible to suppose that these strategies might also be applied in other
inflammatory pathologies.
1
INTRODUÇÃO
1.1 Lesão e inflamação muscular
1.1.1 Participação de macrófagos na regeneração muscular
Logo após a entrada dos neutrófilos no local de lesão surge a subpopulação de
macrófagos M1 que expressa óxido nítrico sintase induzida (iNOS) e participa na
remoção de restos celulares produzidos por danos oxidativos, mas também pode induzir
lesão porque iNOS converte arginina em citrulina e óxido nítrico (NO) aumentando os
níveis citotóxicos para as células musculares. Contudo, macrófagos M1 também
produzem citocinas da família Th1 capazes de promover a fase proliferativa da
miogênese (Villalta et al., 2009).
Diferentemente de lesões agudas onde macrófagos M2a entram no local da
lesão após os macrófagos M1, no camundongo mdx essas duas subpopulações de
macrófagos já estão presentes na fase inicial da patologia e parecem desempenhar um
papel diferente no músculo distrófico. Macrófagos M2a expressam CD206 e produzem
níveis elevados de interleucina-4 (IL-4) e da enzima arginase que converte arginina em
ornitina e uréia. Arginase e iNOS possuem o mesmo substrato, a arginina, sugerindo a
possibilidade de competição entre essas duas enzimas. Adição de macrófagos M2a em
co-cultura de macrófagos M1 com células musculares reduz a produção de NO e a
citotoxicidade, indicando que macrófagos M2a podem reduzir danos no músculo
distrófico causados por macrófagos M1 (Tidball and Villalta, 2010; Tidball and
Wehling-Henricks, 2004; Villalta et al., 2009). Durante a transição da fase
predominantemente necrótica para a fase regenerativa ocorre a transição do fenótipo M1
e M2a para a população de macrófagos M2c que são maioria no músculo regenerando.
Estes macrófagos produzem altos níveis de IL-4 e IL-10 podendo reduzir a lesão
2
muscular e promover a regeneração. A citocina IL-4 contribui para a mudança do
fenótipo de macrófagos M1 para macrófagos M2c e promove a ativação e diferenciação
de células satélites, ao passo que a IL-10 inibe macrófagos M1 indicando que a
população de macrófagos M2 tem um papel central na regulação da regeneração do
músculo distrófico (Gordon, 2003; Gordon and Taylor, 2005; Villalta et al., 2009).
1.1.2 Envolvimento de metaloproteases de matriz
As metaloproteases (MPs) são uma grande família de enzimas que possuem um
íon de zinco no sítio ativo de seu domínio catalítico. As metaloproteases de matriz
(MMPs) fazem parte de um grupo distinto de MPs, constituído por pelo menos 26
membros o qual inclui: colagenases, gelatinases, estromelisinas, metaloproteases de
membrana, matrilisinas e metaloelastases (Chandler et al., 1996; Frederiks and Mook,
2004; Mannello, 2003). Essa família de endopeptidases dependentes de íons Ca+2 e Zn+2
possuem capacidade de degradação e remodelagem de componentes da matriz
extracelular, desempenhando um papel importante nos processos de degeneração e
regeneração muscular. As MMPs possuem características semelhantes, incluindo o
modo comum de ativação, seqüência de aminoácidos conservados na região de ligação
do sítio ativo, e inibição por proteases inibidoras específicas conhecidas como
inibidores teciduais de metaloproteases (TIMPs) (Carmeli et al., 2004).
As MMPs são sintetizadas como pró-enzimas transmembranares ou como
zimogênios latentes, sendo ativados por fatores como outras proteases. A ativação das
MMPs se dá por duas etapas: primeiramente, ocorre clivagem inicial por ativadores
como citocinas, hormônios, fatores de crescimento e NO em uma região exposta no
peptídeo, desestabilizando a interação entre o Zn2+ e as cisteínas (Zhang et al., 2003);
em seguida ocorre clivagem, geralmente por outra MMP, liberando o radical amino-
3
terminal da enzima madura pelo rompimento da ligação entre o Zn+2 e o resíduo de
cisteína (Johnson et al., 1998), caracterizada pela perda de aproximadamente 10 kDa
(Kherif et al., 1999) referente à seqüência de 80 aminoácidos que sofreu clivagem
(Kumar and Bhatnagar, 2010; Mannello et al., 2006; Page-McCaw et al., 2007).
O músculo esquelético na distrofia muscular de Duchenne apresenta aumento na
atividade da MMP-9 (ou gelatinase A, que possui 72 kDa em humanos e 60 kDa em
camundongos) e MMP-2 (ou gelatinase B, com 92 kDa em humanos e 100 kDa em
camundongos) (Kherif et al., 1999; Li et al., 2009). No modelo de lesão muscular
induzido por cardiotoxina a atividade da MMP-9 está bastante elevada nos três
primeiros dias após a lesão, diminuindo ao final de sete dias e chegando a quantidades
não detectáveis no inicio da segunda semana. Células musculares precursoras produzem
MMP-9 in vivo e as células satélites em cultura após tratamento com forbol éster
(PMA), sugerindo participação da MMP-9 na migração celular durante o processo de
regeneração muscular (Guerin and Holland, 1995; Kherif et al., 1999). A atividade da
MMP-2 aumenta em três a dez dias após a lesão com ativação máxima sendo observada
no sétimo dia, retornando ao nível basal após o fusionamento dos mioblastos indicando
a importância da atividade da MMP-2 no início da regeneração muscular (Kherif et al.,
1999). Na distrofinopatia o papel relevante de cada MMP depende do estágio da
doença, sugerindo que a inibição delas poderia trazer conseqüências tanto positivas
quanto negativas para progressão da lesão (Kumar and Bhatnagar, 2010; Li et al., 2009).
O balanço entre produção e ativação excessiva de MMPs parece ser uma característica
fundamental da patologia de muitas doenças inflamatórias (Chandler et al., 1996; Kherif
et al., 1999).
4
1.1.3 Envolvimento do fator de necrose tumoral α
A produção exacerbada de citocinas pode causar manifestações clínicas de
doenças, como os sinais clínicos cardinais de inflamação, incluindo febre, edema, dor e
vermelhidão. O TNF é uma citocina pleiotrópica com aproximadamente 17kDa,
produzida principalmente por macrófagos em resposta a patógenos e outros estímulos
danosos. Possui funções que podem variar de indução a choque na sepse a necrose de
tumores. Baixos níveis de TNF contribuem para os mecanismos de imunidade inata do
hospedeiro, limitando a resposta inflamatória local, controlando a invasão microbiana e
promovendo o processo de cura. Em uma resposta inflamatória normal, suas atividades
protetoras e benéficas predominam, entretanto a magnitude e duração da liberação de
TNF é limitada, por não ser secretado sistemicamente (Czura and Tracey, 2005;
Pavlov and Tracey, 2005; Peterson et al., 2006; Tracey, 2002).
O aumento sistêmico de TNF promove dano tecidual deprimindo a função
cardíaca, induzindo trombose microvascular e mediando a síndrome sistêmica de
fraqueza vascular (Tracey, 2009). Esta citocina pode também mediar a síndrome de
perda muscular, conhecida como caquexia. A caquexia se manifesta como complicação
secundária, mas é potencialmente letal em doenças crônicas como câncer (Peterson et
al., 2006). TNF induz leucocitose e ativa nas células endoteliais genes de moléculas de
adesão como ICAM-1 (molécula de adesão intercelular -1), VCAM-1 (molécula de
adesão vascular -1) e diversas outras citocinas como MCP-1 (proteína quimioatrativa de
monócitos -1). Essas moléculas contribuem para o aumento da adesão de neutrófilos,
monócitos e macrófagos ao endotélio vascular (Peterson et al., 2006; Saeed et al., 2005),
facilitando o rolamento, adesão, ativação e a migração celular (diapedese) (Figura 9)
(Ransohoff et al., 2003; Saeed et al., 2005). O TNF é capaz de amplificar e prolongar a
resposta inflamatória e dano tecidual ativando outras células a produzir citocinas como
5
IL-1 (interleucina -1) e HMGB1 (high mobility group box 1), além de outros
mediadores como eicosanóides e óxido nítrico (NO), promovendo dessa forma o
aumento da inflamação. Anticorpos anti-TNF têm sido utilizados na clínica no
tratamento de doenças imune-inflamatórias como artrite reumatóide e doença de Crohn
(Pavlov and Tracey, 2006).
Trabalhos recentes indicaram que a expressão de TNF é regulada tanto em
níveis transcricionais quanto traducionais, porém quando sua produção é interrompida,
as células responsáveis por sua síntese se tornam refratárias às estimulações posteriores.
Este é um importante mecanismo de controle que previne a produção exacerbada de
TNF. Outros mecanismos conhecidos também são capazes de impedir a secreção
exagerada de TNF, tais como o eixo hormonal adrenocorticotrópico-glicocorticóide
(ACTH – glicocorticóide), a via anti-inflamatória simpática (dor e Substância P –
adrenalina e noradrenalina) e a atividade de outros fatores anti-inflamatórios produzidos
durante uma resposta inflamatória normal. Também a IL-10 (interleucina-10) e o TGF
(fator de transformação de crescimento ), são capazes de suprimir independentemente
a ativação de macrófagos e liberação de TNF. Descobertas recentes mostraram que a
via colinérgica anti-inflamatória também inibe a produção de TNF em macrófagos
(Czura and Tracey, 2005).
1.2
Regulação neural autônoma da imunidade
O sistema nervoso é composto por sistemas sensitivos, que detectam o estado de
órgãos e outras estruturas do corpo, e sistemas motores, que transmitem sinais para
essas estruturas corporais. O sistema motor somático controla os movimentos
voluntários, enquanto o sistema motor autônomo controla funções involuntárias, tais
como funções viscerais e inervação de glândulas. O sistema nervoso autônomo se
6
subdivide em duas vias: a simpática e a parassimpática, que trabalham em sinergia ou
em oposição para mediar respostas fisiológicas básicas em tempo real, como pressão
sangüínea, batimento cardíaco, freqüência respiratória, mobilidade gastrintestinal e
temperatura corporal (Tracey, 2009; Tracey, 2010).
O sistema nervoso autônomo recebe informações de receptores sensoriais
especializados em detectar o estado fisiológico, como baroceptores que monitoram a
pressão sangüínea e quimioceptores que monitoram a atividade gástrica. O cérebro
primitivo, incluindo o sistema límbico, tronco encefálico e hipotálamo recebem os
sinais desses receptores, coordenando então respostas neurais simpáticas e
parassimpáticas para manter a homeostase e regular a digestão. As funções autônomas
mediadas pelo nervo vago são integradas e reguladas centralmente. Interconexões
neurais recíprocas entre núcleos autônomos do tronco cerebral, incluindo o núcleo do
tracto solitário (NTS), núcleo motor dorsal do vago (DMN) e núcleo ambíguo (NA),
assim como estruturas cerebrais superiores como o hipotálamo, amígdala e córtex
insular, constituem a rede autônoma central. Essa rede regula a atividade eferente do
nervo vago, correspondendo a funções viscerais periféricas (Pavlov and Tracey, 2005).
1.2.1 Mecanismos de comunicação e integração do sistema imune e SNC
A inflamação periférica é detectada pelo SNC por meio de dois importantes
mecanismos de comunicação: rota humoral e rota neural. Na rota humoral (Figura 10), o
TNF e a IL-1 são ativamente transportados através da barreira hemato-encefálica
(BBB), enquanto a IL-1 penetra diretamente no cérebro através dos órgãos
circunventriculares (CVOs) onde a BBB é inexistente ou descontínua, induzindo
cicloxigenase -2 (COX-2) que processa ácido araquidônico e libera prostaglandina E2
(PGE2). Receptores de PGE localizam-se em áreas cerebrais que possuem importantes
7
funções na resposta inflamatória periférica como ativação do eixo hipotálamo-ptuitáriaadrenal (HPA), febre e anorexia. As estruturas do complexo dorsal do nervo vago
respondem ao aumento de TNF circulante, alterando a atividade do nervo, sendo este o
meio predominante para a comunicação do sistema imune com o SNC quando os níveis
de citocinas estão bem elevados (Czura and Tracey, 2005; Tracey, 2002). Os CVOs
quando estimulados por citocinas circulantes também estimulam a produção de
glicocorticóides através do eixo HPA para o controle da inflamação. Entretanto, esta
modalidade de regulação é mais lenta e não-integrada, dependendo de gradientes de
concentração para um controle inflamatório efetivo (Rivest et al., 2000).
Na rota neural (Figura 10), mesmo quando os níveis de citocinas ainda estão
baixos, o SNC é capaz de detectar o nível da inflamação via sinais neurais aferentes.
Esta sinalização é possível devido à inervação vagal nos órgãos-alvo e nas células
próximas a essas terminações nervosas. A rota neural da inflamação funciona em baixos
níveis de detecção, ativando respostas mesmo quando os agentes inflamatórios estão
presentes nos tecidos em níveis não suficientes para alcançar o cérebro pela circulação
sangüínea (Czura and Tracey, 2005; Tracey, 2002). Alguns pesquisadores já
observaram que a secção vagal impede o surgimento de febre em animais expostos a
baixas doses intra-abdominais de IL-1 ou endotoxina (Watkins et al., 1995). Ainda não
está totalmente claro todo o mecanismo de detecção de mediadores inflamatórios, mas
neurônios do nervo vago expressam tanto o mRNA quanto o receptor de IL-1 (Goehler
et al., 2000). Estudos eletrofisiológicos também indicaram que o nervo vago pode ser
ativado por TNF e outras citocinas, mecanoceptores, quimioceptores, sensores de
temperatura e osmolaridade, o qual podem ser ativados no sítio da inflamação
(Berthoud and Neuhuber, 2000; Czura and Tracey, 2005).
8
Os sinais aferentes humorais e neurais são processados ao chegar ao cérebro,
seguido de respostas humorais e neurais coordenadas adequadas. As fibras aferentes
vagais chegam ao NTS e AP, regiões ativadas durante a inflamação periférica (Czura
and Tracey, 2005). Em seguida, há ativação de neurônios de segunda ordem no NTS via
atividade de glutamato (Smith et al., 1998). O NTS forma o ápice no controle vagal que
modula a atividade visceral através de dois mecanismos diferentes. Primeiro, os
neurônios do NTS inibem os neurônios do DMN, que provê sinais excitatórios
colinérgicos para as vísceras. Segundo, os neurônios do NTS também inibem a
atividade visceral ativando outros neurônios eferentes do DMN através de vias nãoadrenérgicas e não-colinérgicas (Rogers et al., 1999).
Tanto o NTS quanto o DMN possuem vasos sangüíneos sem BBB, tornando-se
importantes estruturas que recebem sinalização de mediadores inflamatórios circulantes
e aferências vagais. A comunicação entre o NTS, DMN, hipotálamo e talvez outras
estruturas cerebrais são capazes de coordenar respostas humorais e neurais que
modulam o funcionamento do sistema imune (Czura and Tracey, 2005).
1.2.2 Via colinérgica antinflamatória e o reflexo inflamatório
A via colinérgica antinflamatória é um mecanismo fisiológico que modula as
respostas inflamatórias do hospedeiro através de estimulação do nervo vago (Bernik et
al., 2002; Borovikova et al., 2000; Tracey, 2009). Esta via é chamada de colinérgica
porque a acetilcolina é o principal neurotransmissor, e antinflamatória porque
macrófagos expostos a esse neurotransmissor são eficientemente inibidos em secretar
TNF, IL-1, HMGB1 e uma série de outros mediadores inflamatórios (Figuras 10, 11
e 12) (Tracey, 2010).
9
O nervo vago inerva os principais órgãos do corpo, incluindo fígado, pulmões,
baço, rins e intestino (Figura 11). Fibras aferentes sensoriais vagais, que residem no
gânglio nodoso, são capazes de detectar a inflamação através de suas projeções axonais
que estão no sítio da inflamação, transmitindo esse sinal para estruturas cerebrais
envolvidas na geração do controle neural da inflamação (Figura 10). As fibras aferentes
vagais chegam ao principal local de terminação: o NTS medular, que recebe
principalmente sinais de inflamação local. Os neurônios do NTS se projetam para
neurônios vagais pré-ganglionares no DMN e NA, que se comunicam com a área
postrema (AP), o qual não possui BBB (Pavlov and Tracey, 2005; Pavlov et al., 2003).
Projeções bi-direcionais também ocorrem entre o NTS, o hipotálamo e outras estruturas
anteriores do cérebro dentro da rede central autônoma (Pavlov and Tracey, 2005). A AP
e outros CVOs funcionam como portais para citocinas circulantes sinalizarem para o
cérebro a presença de inflamação periférica (Buller, 2001).
Os sinais aferentes transmitidos pelo nervo vago ativam o reflexo inflamatório
resultando em uma estimulação eferente. A acetilcolina liberada pelas terminações
sinápticas vagais no interior dos órgãos-alvos é capaz de interagir especificamente com
nAChR7 de macrófagos, que se localizam nas proximidades. A interação da
acetilcolina com nAChR7 de macrófagos ocasiona sua desativação, resultando em
inibição de secreção de citocinas. Sinais inflamatórios, portanto, são capazes de ativar
uma resposta antinflamatória que rapidamente previne a produção exacerbada de
citocinas. O controle neural de produção e secreção de citocinas provê uma importante
alternativa para a regulação humoral por ser rápido, integrado, e não dependente de
gradientes de concentração (Czura and Tracey, 2005).
10
1.2.3 Modelo hipotético do reflexo inflamatório
Com base nos trabalhos científicos publicados, é possível considerar o
seguinte modelo hipotético do reflexo inflamatório:
1) mediadores inflamatórios periféricos induzem o surgimento de sinais
sensoriais aferentes para o cérebro através do nervo vago e CVOs;
2) o sinal periférico é processado pelo NTS e outras estruturas que fazem
parte da rede autônoma central, responsáveis pela interpretação das mudanças
internas, produzindo uma resposta integrada enviada aos neurônios vagais eferentes;
3) a via colinérgica antinflamatória é ativada e as fibras nervosas vagais
eferentes encaminham o sinal antinflamatório à periferia;
4) ACh é liberada nas terminações dos axônios colinérgicos e interage com
a nAChR7 das células imunes (macrófagos), resultando na inibição de secreção de
citocinas pró-inflamatórias e restauração da homeostase imunológica (Figura 12)
(Pavlov and Tracey, 2005).
O mecanismo exato pelo qual a ACh liberada nas terminações vagais exerce seu
efeito nos receptores nicotínicos das células imunes ainda precisa ser melhor
pesquisado. É possível considerar o “modelo de difusão”, onde teoricamente a ACh
liberada de neurônios colinérgicos se difunde pelo parênquima dos órgãos inervados
pelo vago antes de interagir com a nAChR7 das células imunes adjacentes às
terminações axonais. Entretanto, neste modelo há uma limitação: o rápido catabolismo
da ACh pela acetilcolinesterase. Por outro lado, a colina, produto da reação mediada
pela acetilcolinesterase, é naturalmente um agonista específico da nAChR7. Torna-se
então possível que a colina se difunda das terminações vagais e ative a nAChR7 das
células imunes. Isto porque anatomicamente, os gânglios vagais parassimpáticos
localizam-se muito próximos ou até mesmo dentro dos órgãos inervados. Isso aumenta a
11
possibilidade de além dos neurônios pós-ganglionares, os neurônios pré-ganglionares
liberarem o “neurotransmissor antinflamatório” ACh ou o seu produto, a colina (Pavlov
and Tracey, 2005).
1.2.4 Baço como efetor da via colinérgica antinflamatória
O nervo vago possui diversos órgãos-alvos, mas o baço exibe propriedades
peculiares no controle da inflamação. Com o conhecimento de que o reflexo
inflamatório inibe a produção de citocinas inflamatórias e que os principais
componentes fisiológicos dessa via como monócitos e macrófagos residem nestes
órgãos, torna-se importante investigar os efeitos da estimulação vagal e administração
de agonistas para nAChRα7 na produção dessas citocinas em diferentes órgãos
inervados pelo nervo vago durante a endotoxemia letal e sepse polimicrobial. Em um
estudo foi observado que a esplenectomia inativou os efeitos antinflamatórios tanto
mediado pelo nervo vago quanto através da administração de agonistas para nAChRα7
no baço e no soro. A anatomia funcional da via antinflamatória vagal para o baço foi
investigada através de vagotomia abdominal seletiva antes da estimulação vagal.
Inferior ao diafragma, o tronco ventral do nervo vago se divide nos ramos gástrico,
hepático e celíaco, enquanto que o tronco dorsal se divide nos ramos gástrico e celíaco.
A estimulação cervical do nervo vago atenua os níveis de TNFα no soro e baço em
animais submetidos à vagotomia ventral subdiafragmática. Entretanto, a vagotomia de
ambos os ramos celíacos anula os efeitos de supressão de TNFα após estimulação
cervical vagal, tanto no soro quanto no baço. Isso indica que a inervação vagal via
ramos celíacos são requeridos para a regulação do TNFα sistêmico e esplênico (Huston
et al., 2006). Essas evidências suportam fortemente que o baço é um alvo específico e
essencial da via colinérgica antinflamatória.
12
1.3
Características gerais da Distrofia muscular do tipo Duchenne
Distrofia muscular constitui um grupo heterogêneo de doenças geneticamente
determinadas apresentando alteração estrutural e funcional das miofibras e destruição
progressiva das fibras musculares esqueléticas (Manzur and Muntoni, 2009). As
distrofias musculares mapeadas em 29 loci diferentes originam 34 doenças distintas que
apresentam heterogeneidade clínica, variam na faixa etária de instalação da doença, no
modo de herança, na morbidade e nos grupos musculares primariamente afetados
(Dalkilic and Kunkel, 2003).
A Distrofia Muscular de Duchenne (DMD) é a mais comum e devastadora
forma de miopatia inflamatória, é uma miopatia hereditária recessiva ligada ao
cromossomo X que afeta 1 a cada 3500 meninos nascidos vivos (Brunelli and RovereQuerini, 2008; Voisin and de la Porte, 2004). A clonagem completa do gene dmd mostra
que mais de 50% da mutação em humanos envolve ampla deleção no locus Xp21
(Kapsa et al., 2003), o que determina ausência ou expressão da molécula truncada nãofuncional da isoforma de 427 kDa da proteína distrofina nas células musculares
esqueléticas estriadas, células endoteliais e células do sistema nervoso central (SNC)
(Mehler, 2000; Mendell et al., 1995; van der Bergh et al., 1995). O gene da distrofina é
extremamente grande (3,4 Mb), contém 79 exons e 2,4 milhões de bases. A sua grande
complexidade propicia uma alta taxa de novas mutações, deleções ou duplicações
gênicas que são evidenciadas em um terço dos pacientes com DMD (Hoffman, 1996).
Alguns pacientes com DMD apresentam retardo mental, porém as principais
alterações clínicas são evidentes ainda na primeira infância, por volta de 2 a 5 anos de
idade, afetando inicialmente os músculos da cintura pélvica e posteriormente os
músculos da cintura escapular. Embora os músculos faciais, faríngeos e extraocular não
13
sejam muito afetados, muitos pacientes apresentam atraso na fala e no desenvolvimento
cognitivo (Essex and Roper, 2001). A substituição do tecido muscular por tecido
conjuntivo e adiposo causa pseudo-hipertrofia dos músculos afetados. A perda da
capacidade de deambular ocorre entre oito a dez anos de idade, havendo a necessidade
do uso de cadeira de rodas. A evolução para o óbito ocorre em torno da segunda década
de vida, geralmente devido à insuficiência cardíaca ou respiratória (Anderson et al.,
2002; Jejurikar and Kuzon, 2003; Nakamura and Takeda, 2009).
Aproximadamente 10% das mulheres portadoras do gene com mutação no
cromossomo X apresentam alguma manifestação da doença afetando quase
exclusivamente as funções cardíacas e/ ou cognitivas. Embora a doença seja mais
branda nas mulheres, em alguns casos raros ela se manifesta com a mesma gravidade.
Além de alguns casos associados com rearranjos cromossômicos, assume-se que a
maioria das meninas é afetada como resultado de um desvio significativo ou distorção
de um padrão médio de inativação do cromossomo X (Hoffman et al., 1992; Richards et
al., 1990).
As características histológicas do músculo distrófico no início da doença são os
inúmeros focos de mionecrose, intenso infiltrado inflamatório, miofibras hipertróficas
com tamanhos variados e altos níveis de creatina quinase no soro. Mecanismos
fibróticos e os ciclos repetidos de degeneração e regeneração causam substituição
progressiva do tecido muscular contrátil por tecido fibroso. As miofibras apresentam
também
sarcoplasma
grosseiramente
granular
e
vacuolizado,
fragmentação e nucleação central (Collins and Morgan, 2003).
apresentando
14
1.3.1 Distrofina e o complexo de Glicoproteínas
A distrofina é uma proteína que pertence à superfamília das espectrinas, sendo
a mais abundante na fibra muscular, correspondendo a aproximadamente 5% do seu
citoesqueleto. Apresenta várias isoformas cuja expressão tecido-específica depende do
controle da transcrição por oito diferentes promotores, resultando na expressão das
isoformas do músculo, coração, cérebro, células de Purkinje, linfócitos, retina, rins e
células de Schwann (Ahn and Kunkel, 1993; Lewis et al., 2009). A distrofina apresenta
localização interna no sarcolema formando uma trama associada a um complexo de
glicoproteínas (DGC) constituído pelas distroglicanas, sarcoglicanas, sintrofinas,
distrobrevinas, sarcospan e actina (Watkins et al., 2000). A isoforma de 427-KDa é
encontrada na célula muscular humana, formando quatro domínios funcionais: um
domínio N-terminal com 336 aminoácidos permite ligação aos filamentos de F-actina na
região do subsarcolema no citoesqueleto; um domínio central inclui 24 domínios tripla
hélice com 88 a 126 aminoácidos, referido como repetição do tipo espectrina e 4
domínios de dobradiça conferindo flexibilidade, uma propriedade importante na
contração muscular; um domínio com 135 aminoácidos rico em cisteína, que interage
com os complexos distroglicana e sarcoglicana, e um domínio C-terminal com 320
aminoácidos e sítios de ligação para sintrofina e distrobrevina (Nakamura and Takeda,
2009; Yeung et al., 2005) (Figura 6).
A formação do complexo distrofina/DGC é crucial para a ligação da matriz
extracelular com o citoesqueleto (Kapsa et al., 2003), sendo a organização desse
complexo essencial para a integridade do sarcolema e também conferindo estabilização
da fibra muscular, de receptores de moléculas sinalizadoras e canais iônicos (Lewis et
al., 2009). Na DMD a expressão das proteínas do DGC também é muito reduzida
(Ervasti and Campbell, 1991; Miyake and McNeil, 2003).
15
A deficiência de distrofina e de outras proteínas do complexo DGC resultam
frequentemente em dano membranar (Miyake and McNeil, 2003), extravasando
proteínas solúveis como a creatina quinase para o plasma, entretanto apresentando
aumento no conteúdo de Ca2+ intracelular o qual ativa proteases como a calpaína. As
alterações da expressão ou função de proteínas associadas à distrofina na membrana
plasmática, tais como óxido nítrico sintase (nNOS), aquaporina-4, canais de Na+, canais
de Ca2+ do tipo L e canais ativados por estiramento estão envolvidas nos mecanismos
moleculares de degeneração muscular (Allen et al., 2010; Yeung et al., 2005).
Diferentes tipos de distrofias musculares em várias espécies animais também
estão associados à mutação, redução ou desorganização de proteínas do complexo DGC
(Lapidos et al., 2004; Nonaka, 1998; Roberts, 1995; van der Bergh et al., 1995).
Mutações nos genes que codificam as sarcoglicanas causam as distrofias musculares da
cintura e membros (LGMD) enquanto que mutações no gene da merosina causam
distrofia muscular congênita (CMD) (Allamand and Campbell, 2000). A perda de
distrobrevinas causa distrofia muscular em camundongos e defeitos em outras proteínas,
incluindo colágeno VI, titina, desmina e caveolina-3, causando miopatias graves
(Martin, 2003).
1.3.2 Modelos animais de distrofinopatia
Alguns animais como o camundongo, gato e o cão são usados como modelos
experimentais da DMD por apresentarem alteração no gene que codifica a proteína
distrofina. Algumas raças de cães, como o labrador golden retriever, rottweiler, fox
terrier, selter e pointer alemão podem também apresentar deficiência de distrofina. A
progressão da doença é acompanhada pelo enfraquecimento e contratura muscular desde
os três meses de idade seguida de morte antes da vida adulta. Nos felinos, a deficiência
16
de distrofina causa uma doença fatal devido à hipertrofia da língua e da parte caudal do
diafragma (Watchko et al., 2002).
O camundongo distrófico mdx mutante de uma colônia de C57BL/10 ScSn,
apresenta uma mutação pontual na região HqBpa do cromossomo X, não expressam
distrofina e apresentam níveis séricos muito elevados da enzima creatina quinase, um
indicativo de extensa destruição muscular (Smith and Schofield, 1994). Contudo o
camundongo mdx apresenta fenótipo benigno da doença com poucos sintomas clínicos
aparentes, sobrevida praticamente normal e regeneração eficiente do tecido muscular
(Bulfield et al., 1984). O músculo do mdx apresenta poucas alterações histológicas no
período pós-natal, porém logo após o desmame, inicia-se uma fase de extensa
mionecrose (Cullen and Mastaglia, 1980) com intenso infiltrado inflamatório
constituído principalmente de macrófagos, linfócitos T e raros linfócitos B (LagrotaCandido et al., 2002; McDouall et al., 1990; Spencer et al., 1997). Na oitava semana de
vida pós-natal, a mionecrose é parcialmente compensada pela regeneração da miofibra,
sendo evidente um número elevado de fibras regeneradas com nucleação central
(Nonaka, 1998). Nos camundongos mdx mais idosos com 24 semanas, ainda ocorre
uma discreta mionecrose com redução na regeneração e aumento na fibrose. Contudo
após 52 semanas de vida pós-natal, os camundongos mdx apresentam um declínio
significativo do peso corporal e da massa muscular (Lefaucheur et al., 1995). As fibras
musculares do mdx idoso apresentam grande variação no tamanho, inclusive com
miofibras atrofiadas, fragmentadas e aumento da fibrose no endomísio (LagrotaCandido et al., 2002; Pastoret and Sebille, 1995).
No diafragma onde a patologia é mais acentuada, ocorre perda de fibra
muscular e alta deposição de colágeno. A degeneração progressiva do diafragma é
semelhante à que ocorre nos músculos de humanos com DMD, não sendo o músculo
17
capaz de manter os ciclos repetidos de degeneração e regeneração e ocorrendo excessiva
produção de tecido conjuntivo com progressiva perda de função e enfraquecimento
muscular (Coirault et al., 2003; Stedman et al., 1991).
1.3.3 Estratégias terapêuticas para a DMD
Ainda não existe um tratamento efetivo para a DMD. Os glicocorticóides são
os únicos medicamentos atualmente disponíveis que retardam o declínio da força e da
função muscular, reduzem a escoliose e estabilizam a função pulmonar (Biggar et al.,
2006; King et al., 2007), porém causam efeitos colaterais significativos (Bushby et al.,
2010). O óbito decorre de complicações relacionadas com fraqueza dos músculos
respiratórios como hipoventilação, distúrbios respiratórios do sono, tosse fraca e
incapacidade de expectoração (Bushby et al., 2010; Eagle, 2002; Wagner, 2008). As
terapias farmacológica, gênica e celular são consideradas estratégias promissoras,
porém a regeneração muscular é um processo complexo que envolve a participação de
vários tipos celulares, componentes da matriz extracelular, além de moléculas
sinalizadoras que participam no recrutamento e ativação de células miogênicas para
restauração da funcionalidade da fibra muscular (Kapsa et al., 2003; Khurana and
Davies, 2003; Partridge, 2003; Skuk et al., 2002).
Dentre as terapias farmacológicas, destaca-se a terapia de Exon Skipping e
oligonucleotídeo antisense, sendo este último ácido desoxirribonucléico de fita simples
quimicamente sintetizado para hibridizar com uma sequência complementar no mRNA,
alterando o processamento deste RNA pela exclusão de um ou mais exons (exon
skipping) durante sua clivagem (splicing) (Guglieri and Bushby, 2010). Mutações no
gene da distrofina levam ao rompimento do quadro de leitura da proteína, resultando na
completa perda da função da distrofina e desenvolvimento da DMD. Contudo algumas
18
mutações não rompem o quadro de leitura, o que resulta em uma proteína parcialmente
funcional causando a forma mais branda da doença, a Distrofia Muscular de Becker
(DMB) (Koenig et al., 1989). É possível que a terapia de exon skipping em paciente
com a DMD, ao gerar a deleção de um exon adicional possa restaurar o quadro de
leitura da distrofina, determinando um resultado clínico similar àquele visto em
pacientes com DMB. Embora resultados promissores tenham sido observados (Guglieri
and Bushby, 2010; van Deutekom et al., 2001; van Deutekom et al., 2007), mais estudos
são necessários para investigar aspectos toxicológicos e o aumento da eficiência na
formação da distrofina. Fatores limitantes desta técnica encontram-se em sua
incapacidade para restaurar a expressão de distrofina no coração, como observado em
estudos no camundongo mdx (Lu et al., 2003), e também devido ao grande tamanho do
gene da distrofina e a grande quantidade de mutações encontradas em pacientes com
DMD, seria necessário produzir e testar individualmente muitas sequências diferentes
de oligonucleotídeos antisense, gerando um processo lento e com custos elevados.
Na última década surgiram alguns trabalhos com antibióticos aminoglicosídeos
sugerindo seu papel terapêutico para o tratamento da DMD. Os aminoglicosídeos são
moléculas capazes de induzir o ribossomo a fazer leitura de códons prematuros de
parada gerados por mutações, mas respeitando a leitura do códon de terminação
normal e permitindo a formação de uma proteína funcional. O primeiro estudo a obter
sucesso in vivo demonstrando o potencial farmacológico da correção do códon de
parada prematuro foi realizado com o antibiótico gentamicina nos camundongos mdx
(Barton-Davis et al., 1999a). Contudo a sua aplicação clínica tem sido limitada devido à
incapacidade da gentamicina reproduzir resultados semelhantes em um grupo de
pacientes com distrofia muscular de Duchenne e Becker.
19
A terapia gênica é o tratamento de doenças baseado na transferência de
material genômico utilizando vetores virais ou não virais. Em sua forma mais simples, a
terapia gênica consiste na inserção de genes funcionais em células com genes
defeituosos para substituir ou complementar os genes causadores da doença. Nos
últimos anos, diferentes tipos de vetores foram utilizados para carrear o gene completo
da distrofina, a minidistrofina, a microdistrofina ou o gene completo da utrofina como
possíveis estratégias terapêuticas para DMD. Entretanto, os adenovírus apresentaram
limitada capacidade de inserção de cDNA de distrofina miniatura em camundongos mdx
(aproximadamente 8-kb) após injeção intramuscular. Devido à capacidade reduzida
deste adenovirus, o cDNA usado produzia uma proteína com deleção de parte
significativa do domínio central (Ragot et al., 1993). Mesmo utilizando vetores
adenovirais dependentes de auxílio (hdAD), que promove redução na resposta imune,
aumento na expressão do transgene e aumento na capacidade de inserção gênica, foram
necessárias grandes doses de vetor para tratar camundongos mdx adultos devido à
ineficiência da infecção no músculo (DelloRusso et al., 2002). A administração de doses
elevadas, tanto de adenovirus de primeira geração quanto de hdAD resultaram na
indução de resposta imune inata e celular com toxicidade muito elevada eventualmente
ocasionando o óbito (Muruve et al., 2004).
Os vetores lentivirais podem transportar entre 7,5 a 9-kb de DNA que são
amplamente suficientes para clonagem de transgenes significativamente grandes tais
como a minidistrofina, os marcadores seletivos e os promotores necessários à expressão.
Podem ser utilizados para correção genética em longo prazo em vários distúrbios
musculares, entretanto, mais estudos precisam ser feitos para avaliar a segurança deste
modelo porque vetores retrovirais estão associados com desenvolvimento de leucemia
em terapias hematopoiéticas (Cavazzana-Calvo and Fischer, 2007). Outro aspecto
20
importante é a eliminação dos vetores devido à ativação de resposta imune e a pobre
dispersão do tecido injetado (Kimura et al., 2010; Li et al., 2005).
Entre os sistemas de vetores virais o que mais tem gerado otimismo para o
eventual tratamento da distrofia muscular é o vírus adeno-associado (AAV). AAV é
um pequeno vírus com DNA de fita simples (~4,7-kb) cujo genoma é flanqueado por
repetições terminais invertidas (ITRs) com aproximadamente 145 nucleotídeos. Os ITRs
são sequências palindrômicas de 145 pares de bases envolvidas na regulação do ciclo
celular do AAV que estão dispostas nas porções terminais 5' e 3' do genoma viral
funcionando como origem e iniciadores para a replicação do DNA. Recentemente foi
mostrado que a injeção intraperitoneal do gene da minidistrofina com AAV promove
melhora das alterações histológicas e na função dos principais músculos esqueléticos de
camundongos mdx neonatos e duplo-deficientes dys-/-utrn-/-, diminuindo a morbidade e
aumentando a sobrevida. Porém a restauração completa da função muscular e o
considerável aumento na sobrevida apenas com a utilização da microdistrofina
continuam a ser um grande desafio (Wang et al., 2009).
A terapia celular é uma esperança para o tratamento da DMD. Durante vários
anos acreditou-se que o transplante de mioblastos e células satélites eram as únicas
responsáveis pela manutenção e crescimento do músculo esquelético, mas recentemente
foram descritas diversas populações de células-tronco com potencial miogênico para
utilização terapêutica em pacientes com DMD. Dentre essas células, incluem-se célulastronco derivadas do músculo (MDSC), células side population (SP), mesoangioblastos,
pericitos, células progenitoras hematopoiéticas /endoteliais circulantes CD133+ e
células-tronco da medula óssea (BMSC). Em geral, apesar da injeção celular de alta
densidade restaurar a expressão de distrofina nas fibras musculares de modo satisfatório,
grandes quantidades de células injetadas aumentam o estresse e a resposta imune do
21
hospedeiro, limitando a disponibilidade de O2, nutrientes e retardando a eliminação dos
metabólitos (Kuang and Rudnicki, 2008). Muitas vezes a restauração na expressão de
distrofina não está associada ao aumento de função e força muscular. A capacidade de
disseminação celular sistêmica e o percentual de fibras formadas são outra barreira para
se atingir níveis considerados terapêuticos (Perez et al., 2009).
As pesquisas para o aperfeiçoamento e desenvolvimento de novas terapias
farmacológica, gênica e celular são necessárias para o tratamento da DMD e outras
distrofias musculares, porém ainda são consideradas estratégias promissoras. Como
relatado anteriormente, a terapia com glicocorticóides ainda exibe os melhores
resultados em relação à espectaviva e qualidade de vida dos pacientes. Como a DMD
possui uma característica inflamatória importante, torna-se necessário asossiar aos
novos tratamentos promissores uma estratégia antinflamatória para se obter resultados
mais satisfatórios.
1.4
Extrato
de
Eugenia
punicifolia
como
possível
modulador
da
neurotransmissão colinérgica
Em muitos países e diferentes comunidades, incluindo no Brasil, os produtos
naturais derivados de plantas constituem fontes tradicionais para o tratamento clínico de
diversas condições fisiopatológicas, onde muitas vezes são as únicas formas de
abordagem terapêutica que esses grupos dispõem para o manejo farmacológico das
doenças que lhe afligem (Leal-Cardoso et al., 2004). Um exemplo é a família
Myrtaceae, que é constituída por mais de 3.000 espécies em pelo menos 130 gêneros,
distribuídos principalmente em regiões tropicais como a Amazônia. Várias espécies
desta família são utilizadas na medicina caseira contra diarréia e problemas estomacais
(goiaba, pitanga). Outras fornecem óleos essenciais e temperos, como o óleo de
22
eucalipto e pimenta, muitas são comestíveis, como araçá-boi (Eugenia stipitata),
pitanga (E. uniflora), araçá-pera (Psidium acutangulum), goiaba (P. guajava),
jabuticaba (Myrciaria cauliflora), e também com alto teor vitamínico, principalmente
vitamina C (ex: camu-camu ou caçari – Myrciaria dubia).
No norte do Brasil, infusões de E. punicifolia (Kunt) DC. (Myrtaceae) são
amplamente empregadas, ainda que de forma empírica, para o tratamento de distúrbios
hiperglicêmicos, como o diabetes mellitus. E. punicifolia, popularmente conhecida
como “pedra-ume caá”, é um arbusto largamente distribuído em toda a Amazônia e sua
aplicação popular menciona o uso de suas folhas frescas em decocção ou infusos. Esta
empregabilidade terapêutica popular da planta já foi reportada para outras espécies do
gênero, como E. jambolana (Grover et al., 2000; Ravi et al., 2004; Sharma et al., 2003).
Adicionalmente, já foi demonstrado que a espécie E. uniflora atua como um agente antihipertensivo (Consolini et al., 1999). Com efeito, E. uniflora parece ser a principal
espécie investigada do gênero Eugenia, pois diversos trabalhos publicados mostraram
seu uso como antidiarréico, diurético, e antireumático (Pio Correa, 1984; Schapoval et
al., 1994). Dentre as principais classes de compostos químicos já isolados de algumas
espécies do gênero, encontram-se flavonóides (miricitrin, quercetin, quercetrin),
esteróides, mono- e triterpenóides, taninos, antraquinonas e óleos essenciais (Consolini
and Sarubbio, 2002).
Em busca por produtos naturais que pudessem interferir na neurotransmissão
colinérgica (Grangeiro et al., 2006), foi observado que extratos de E. punicifolia eram
capazes de modificar o padrão das respostas farmacológicas de alguns antagonistas
nicotínicos no diafragma de ratos. Em sequência, utilizando esta clássica preparação
biológica como modelo experimental (Bulbring, 1946; Oshima-Franco et al., 2004) para
os protocolos de estudos de neurotransmissão autonômica (Garcez-do-Carmo and
23
Santos, 2006; Santos et al., 2001; Santos et al., 2003), foi verificado que o extrato bruto
aquoso (5% p/v das folhas de E. punicifolia) foi capaz de reverter totalmente o efeito
farmacológico de bloqueio das contrações induzidas por estímulo elétrico, produzidos
pelos antagonistas nicotínicos galamina e pancurônio diferentemente da reversão parcial
causada por neostigmina, um clássico inibidor reversível da enzima acetilcolinesterase.
Ademais, E. punicifolia foi também capaz de deslocar para a direita as curvas
concentração-efeito cumulativas dos antagonistas nicotínicos, sugerindo um mecanismo
de ação da planta, mediado possivelmente por receptores nicotínicos (Grangeiro et al.,
2006). Estes resultados sugeriram que a planta E. punicifolia pode ser uma importante
ferramenta para estudos de neurotransmissão colinérgica, bem como nas doenças nas
quais as alterações neste sistema estão envolvidas, como distúrbios do comportamento,
doença de Alzheimer, adicção à nicotina, síndrome de Tourette, doença de Parkinson,
dentre outras, além de
desordens inflamatórias. Considerando que algumas destas
condições ainda não possuem as alterações fisiopatológicas totalmente elucidadas, e que
a interferência no sistema colinérgico é uma das bases clínicas para a abordagem de
algumas destas doenças, é compreensível considerar que a descrição de uma nova e
natural ferramenta para estudo e eventual empregabilidade em distúrbios nos quais a
neurotransmissão colinérgica está implicada, como a E. punicifolia, pode apresentar
interesse experimental e terapêutico. Além disso, uma vez que seus constituintes
químicos possam ser elucidados, novas estratégias terapêuticas para tais doenças
poderão ser desenvolvidas com maior especificidade.
24
2
OBJETIVOS
2.1
Geral
Investigar a participação da função antiinflamatória de receptores nicotínicos
de acetilcolina em camundongos mdx com distrofia muscular de Duchenne.
2.2
Específicos
1.
Analisar a expressão de mRNA e níveis protéicos da nAChRα7 e TNFα nas
células do microambiente do músculo esquelético gastrocnêmio nas diferentes fases
da miopatia do camundongo mdx;
2.
Correlacionar a expressão da nAChRα7 em macrófagos presentes no
microambiente da lesão muscular nas diferentes fases da miopatia do camundongo
mdx com a inflamação e regeneração do músculo esquelético;
3.
Investigar os efeitos da ativação nicotínica colinérgica não-seletiva sobre a
inflamação e regeneração muscular;
4.
Investigar os efeitos da ativação nicotínica colinérgica seletiva da nAChRα7
sobre os mediadores inflamatórios no soro sanguíneo, e na inflamação e regeneração
muscular;
5.
Analisar os efeitos in vitro do extrato de Eugenia punicifolia na linhagem celular
C2C12;
6.
Analisar os efeitos in vivo e ex vivo do extrato de Eugenia punicifolia no
músculo esquelético gastrocnêmio sobre a atividade de colina acetiltransferase,
acetilcolinesterase, inflamação, apoptose e regeneração muscular.
25
26
27
28
29
30
31
32
33
SELECTIVE ACTIVATION OF α7 NICOTINIC ACETYLCHOLINE
RECEPTOR SUBUNIT (nAChRα7) AS A NEW ANTI-INFLAMMATORY
STRATEGY PREVENTS MUSCULAR DEGENERATION IN mdx MICE
Paulo Emílio Corrêa Leite a,b,§, Luís Gandía d, Ricardo de Pascual d, Wilson C. Santos c,
Jussara Lagrota-Candido b, Thereza Quirico-Santos a,§
a
Departamento de Biologia Celular e Molecular, b Departamento de Imunobiologia,
c
Departamento de Farmácia e Administração Farmacêutica; Universidade Federal
Fluminense, Niterói, RJ, 24020-141, Brasil.
d
Departamento de Farmacología y
Terapéutica, Instituto Teófilo Hernando; Universidad Autónoma de Madrid, Madrid,
28029, España.
Competing interest statement: The authors declare no competing financial interests.
Running Title: Activation of cholinergic mechanisms inhibits inflammation in mdx
skeletal muscle
§ Corresponding authors: Laboratory of Cellular Pathology, Institute of Biology,
Federal Fluminense University, Niterói, RJ, 24020-141, Brazil. Tel.: +55 21 2629 2305;
fax: +55 21 2629 2268. Email address: [email protected]; [email protected].
34
ABSTRACT
In the last years it has been shown that activation of α7 nicotinic acetylcholine receptor
subunit (nAChRα7) reduces inflammation. This regulation termed “cholinergic antiinflammatory pathway” consists on an inflammatory reflex activation that is dependent
of parasympathetic vagus nerve stimulation. In the present study we show that
inflammation and lesion in skeletal muscles, which do not displays parasympathetic
vagal innervation, can be attenuated by selective activation of nAChRα7 subunit and
displays a role on muscle regeneration of the mdx model of Duchenne muscular
dystrophy. These data are supported by induced muscle injury nAChRα7-/- mice that
failed to present reduced muscle inflammation, determined by matrix metalloprotease -9
(MMP-9) activity and analysis of areas of inflammatory infiltrate, after administration
of the selective nAChRα7 subunit agonist PNU282987. In contrast, induced muscle
injury nAChRα7+/+ mice showed reduction of these parameters, beyond increased
activity levels of the active-MMP-2 form. Thus, these data suggest that selective
activation of the nAChRα7 subunit may be a novel therapeutic strategy to decrease
muscle inflammation of mdx phenotype and possibly other inflammatory disorders
through a cholinergic mechanism not exclusive to vagal innervation.
Key words: Muscular dystrophy; mdx mice; skeletal muscle; acetylcholine
receptor; nAChRα7.
35
INTRODUCTION
The nervous and immune systems are not fully independent. Both can alter the
physiology of the other in order to maintain homeostasis. The idea that some events of
the immune system can be controlled and modulated by neural circuits is intriguing
(Blalock, 1984) when in the past it was considered that the immune system was largely
autonomous. Besides neurons, acetylcholine may also be produced by immune,
endothelial, amongst others cells (Rosas-Ballina et al., 2008). In addition, cells of the
immune system also express neurotransmitter receptors, and the interaction of these
receptors with ligand can modulate important cellular functions (Junger, 2011; Livnat et
al., 1985; Strom et al., 1974; Tracey, 2009). Today we know that immune system is
widely distributed and coordinated by neural circuits being regulated by neural
principles for maintaining physiological homeostasis in various organs.
An example of this regulation is the participation of the vagus nerve as a
bidirectional connector between brain and immune systems in reducing inflammation
process, and recently many efforts have been raised to understand the mechanisms of
this phenomenon. The vagus nerve is able to detect physiological changes in the
innerved organ because it expresses different types of receptors for molecules released
in these target organs, as baroreceptors that sense pressure caused by edema formation
and local production of cytokines during inflammation, and also chemoreceptors that
detect local changes in pH (Tracey, 2002). After activation of sensory fibers of the
vagus nerve by the immune system, these afferent signals ascend to synapse in the
nucleus tractus solitarius and the information is processed by the brain. In response,
efferent neurons originating in the dorsal motor nucleus of the vagus nerve are activated
releasing acetylcholine in the parenchyma of innervated organs which in turn activates
nAChRα7 of macrophages from these tissues. As a result, the production of pro-
36
inflammatory cytokines is inhibited and the peripheral immune system can be controlled
(Pavlov and Tracey, 2005; Ulloa, 2005).
Many important works have been published showing the importance of the
cholinergic anti-inflammatory pathway stimulation through the vagus nerve and
nAChRs activation, as in a mouse model of septic peritonitis that generates relevant
anti-inflammatory effects (van Westerloo et al., 2005). This bidirectional capability of
the vagus nerve to modulate central nervous and immune system responses provides a
therapeutic mechanism for neurological and immunological disorders (Wang et al.,
2003).
In the context of cholinergic mechanism activation in immune cells in which
inflammation is reduced, some researchers evaluated experiments in other models of
immune disorders to investigate if this mechanism of inflammation control is dependent
of parasympathetic innervations exclusively. In the ultraviolet-induced lesion skin
model, in which parasympathetic innervations are not involved, a local proinflammatory response is induced and it was shown that cytokine responses to UV
radiation in mice were reduced with oral chronic administration of nicotine (OsborneHereford et al., 2008). In other study, a mouse model of collagen-induced rheumatoid
arthritis showed that even after cervical vagotomy procedure, clinical arthritis and
synovial inflammation was ameliorated by oral and intraperitoneal nicotine
administration, and also by intraperitoneal administration of the specific nAChRα7
agonist AR-R17779 (van Maanen et al., 2009). These results were not seen in nAChRα7
knockout control mice, reinforcing that nAChRα7 activation exhibits a relevant role in
modulating local pro-inflammatory response in the absence of parasympathetic
innervation (Osborne-Hereford et al., 2008).
37
In this sense, the objective of our group was to analyze a possible involvement of
nAChRα7 in muscle lesion of mdx mice, the animal model of Duchenne muscular
dystrophy (DMD). Mdx mice develop an inflammatory myopathy characterized at
different ages by myonecrosis with scattered inflammatory infiltrate followed by
muscular regeneration and later persistent fibrosis, caused by a defect in the gene coding
for dystrophin, a large cytoskeletal protein present in skeletal muscles and certain
neurons (Bani et al., 2008a; Brunelli and Rovere-Querini, 2008; Leite et al., 2010a;
Voisin and de la Porte, 2004). We found a correlation between the expression levels of
nAChRα7 and TNFα at different stages of the disease: when nAChRα7 was
upregulated, TNFα cytokine was downregulated. Intraperitoneal administration of
nicotine attenuated muscular inflammation and increased regeneration, showing that
activation of nAChRs can be a new strategy to reduce the effects of the disease (Leite et
al., 2010b).
In spite of the positive effects induced by nicotine, it may also activate different
types of nicotinic receptors leading to undesirable responses and, in high doses, causing
important side effects. Among the side effects, we highlight its oxidation and aperture
of the ring transforming in 4-(n-methyl-n-nitrosamine)-1-(3-pyridyl)-1-butanone and 4(n-methyl-n-nitrosamine)-4-(3-pyridyl)-butanal,
where
nitrosamine
possessing
a
resonance type which a carbocation is easily donated to a nitrogenous base in DNA
(guanine, cytosine, adenine or thymine), causing transcription failure and leading to the
possibility of cancer development. Considering this, our objective was to determine
whether nAChRα7 selective activity in the dystrophic model would generate positive
results concerning inflammation and muscular regeneration, knowing that as this
activation is specific and directed it will probably reduce the activation and alteration of
other mechanisms and undesirable pathways.
38
Accordingly, we reasoned that administration of the selective nAChRα7 agonist
PNU282987, highly selective for nAChRα7 capable of generating responses in neurons
of rats when administered intravenously at a concentration of 1 mg/kg (Hajos et al.,
2005), may have a better role in regulating inflammation in the pathophysiology of
DMD and cause minor side effects, as the current cellular therapies are not effective to
the resolution of the inflammatory disorder (Barton-Davis et al., 1999b; Kimura et al.,
2010; Lu et al., 2003; Muruve et al., 2004; Perez et al., 2009; Wang et al., 2009). For
this purpose we determined the balance of MMP-9, pro-MMP-2 and the active-MMP-2
form activity levels in serum and muscle, areas of inflammatory infiltrate and
regeneration in muscle and TNFα levels in serum.
MATERIAL AND METHODS
Animal care
Male mdx dystrophic and age-matched C57BL/10 control non-dystrophic mice
were maintained at the Cellular Pathology animal house facilities at Universidade
Federal Fluminense, and male nAChRα7-/- and age-matched C57BL/6 control mice at
Universidad Autónoma de Madrid, with a light /dark cycle of 12 hours at constant
temperature (21oC). Each cage housed up to 4 mice of the same age and offspring to
minimize stress. Mdx and control mice were sacrificed in the period of inflammatory
prevalence at 4 weeks, regeneration at 12 weeks, or deposition of non-functional
collagen at 24 weeks; and nAChRα7-/- and control mice at 6 weeks age. All procedures
in Brazil were done within the guidelines established by the Committee of Animal
Experimentation of UFF (CEPA-UFF) and approved by this Institutional Animal Ethics
Board, and in Spain according to the guidance of the Ethics Committee for Handling
Research Animals of Medical School of Universidad Autónoma de Madrid.
39
The induced muscle injury model
nAChRα7-/- and C57BL/6 control mice at 6 weeks age were anesthetized with
ketamine (100 mg/kg) and xylazine (5 mg/kg) by intraperitoneal injection and had their
both gastrocnemius muscles injured with 80 µL of 0.5% bupivacaine hydrochloride
(Neocaína, Cristália, Brazil) in its central region.
In vivo treatment with drugs
Mdx mice at 3 weeks age (21 days postnatal - PN), induced muscle injury
nAChRα7-/- and C57BL/6/nAChRα7+/+ control mice received daily intraperitoneal
injections of 0.3, 1 mg/kg PNU282987 (N-(3R)-1-Azabicyclo[2.2.2]oct-3-yl-4chlorobenzamide) (Tocris Bioscience, Bristol, UK) or vehicle saline solution during 7
days. These three different groups were also treated with the nAChRα7 nicotinic
receptor antagonist Methyllycaconitine citrate (1α,4(S),6β,14α,16β]-20-Ethyl-1,6,14,16tetramethoxy-4-[[[2-(3-methyl-2,5-dioxo-1-pyrrolidinyl)benzoyl]oxy]methyl]aconitane7,8-diol citrate) at 1 mg/kg (MLA 1029, Tocris Bioscience, Bristol, UK) or PNU282987
together with MLA (both at 1 mg/kg). At the end of treatment mice were sacrificed and
blood and tissues collected. At least 4 animals were included in each group to all
experimental procedures.
ELISA (Enzyme-Linked Immuno Sorbent Assay)
Mice serum were separated from blood and frozen in aliquots. TNFα ELISA kit
was obtained from PeproTech (PeproTech Inc., NJ, EUA). The capture and detection
antibodies used were specific for mouse TNFα cytokine. Briefly, 96-well plates were
coated with 100 µl/well of anti-mouse TNFα capture antibodies at 1 µg/mL
concentration and incubated overnight at room temperature. Wells were washed three
40
times with wash buffer (PBS) and plates blocked with blocking solution (PBS with 1%
BSA, pH 7.0) for 1 h and then washed. 100 µl of each respective standard, positive
controls and samples were added and plates incubated overnight at 4ºC. After washes,
100 µl of biotinylated anti-mouse TNFα polyclonal detection antibodies at 0.25 µg/mL
were incubated for 2 h followed by washing steps. Finally, 100 µl of avidin-horseradish
peroxidase diluted as recommended was added for 30 min. After final washes, 100 µl of
ABTS (Sigma, St. Louis, USA) was added and incubated for 30 min in the dark.
Absorbance was read with a main filter at 405 nm and with a correction filter of 650 nm
in an ELISA reader after the addition of the stop solution (1% SDS).
Gelatin zymography
Gastrocnemius muscles were removed, serum separated from blood and
immediately frozen in aliquots preserved in liquid nitrogen (-196ºC). Muscles were
homogenized (1/10 w/v) in Tris-buffered saline (TBS, 100 mM Tris-HCl pH 7.6, 200
mM NaCl, 100 mM CaCl2 and 1% Triton X-100). Protein concentration in supernatant
aliquots was determined (Lowry et al., 1951) and equal amounts of total protein loaded
for zymography (60 g/lane). SDS-PAGE zymography was performed to determine
gelatinase activity (Heussen and Dowdle, 1980). Zymogram gels consisted of 7.5%
polyacrylamide-SDS impregnated with 2 mg/ml type A gelatin from porcine skin
(Sigma, St. Louis, MI) and 4% polyacrylamide-SDS for stacking gels. Gels were further
washed twice for 30 min in 2.5% Triton X-100 solution and incubated at 37ºC for 24 h
in substrate buffer (10 mM Tris-HCl buffer, pH 7.5 with 5 mM CaCl2, 1 M ZnCl2).
Gels were stained with 30% methanol /10% acetic acid solution containing 0.5%
brilliant blue R-250 (Sigma, St Louis, MI) and discolored with the same solution
41
without brilliant blue R-250. Gelatinase activity was visualized as unstained bands on a
blue background representing areas of proteolysis.
Metalloproteases are secreted in a latent form and require cleavage of a NH2
terminus peptide for activation. The exposure of proenzymes to SDS during gel
separation leads to activation without proteolytic cleavage (Talhouk et al., 1992) with
appeareance of bands corresponding to 100-kDa (MMP-9), 66-kDa (pre-pro-MMP-2)
and 60-kDa (pro-MMP-2), and less frequently 55-kDa (active-MMP-2) (Kherif et al.,
1999).
Histological staining and morphometric analysis
Gastrocnemius muscles were removed and fixed in formalin-buffered Millonig
fixative (pH 7.2) for 24 h. Wax-embedded 5 m-thick sections were stained with
hematoxilin-eosin and syrius red. Images of all cross-sections from mice were acquired
with a microdigital camera mounted on a Zeiss Axioplan microscope (Zeiss,
Oberkochen, Germany) using a 20x objective. Images were mounted with the
Photomerge tool of Adobe Photoshop CS5 software. Total surface area, areas occupied
by inflammatory infiltrate and myofibers in regeneration process, as well as area of
collagen deposition were determined with Image-Pro 4.5 software. Regenerating fibers
were identified by strong basophilic sarcoplasma and centrally located nuclei. Results
were expressed as percentage of total area in the cross-section.
Quantitative and statistical analysis
Quantitative analysis was performed using image-analysis software (Scion Image
for Windows, Scion Corporation, National Institutes of Health; Bethesda, MD) for
zymography. GraphPad Prism 5 (GraphPad software Inc.) was used to calculate mean
42
and standard errors. One-way ANOVA and unpaired t test were applied to obtain
statistical significance of means. Differences were considered to be statistically
significant at the 0.05 level of confidence.
RESULTS
Balance of MMPs activity in skeletal muscle is different among the stages of
myopathy
A different pattern of MMPs activity can be observed according to disease
progression. MMP-9 is only induced when a tissue is damaged and the inflammation
occurs, unlike MMP-2 which is constitutively expressed, requiring cleavage of the proMMP-2 form to active-MMP-2 form for mediating its biological properties. For this
reason MMP-9 activity is absent in control C57 and MMP-2 is found in both control
and dystrophic mice.
Mdx at 4 weeks of age, period characterized by myonecrosis and inflammation of
dystrophy, MMP-9 activity was intense, reducing at 12 w (87 ± 20%, P < 0.05) and not
being detected at 24 w. Pro-MMP-2 showed increased activity levels at 4 w compared
to 12 w (132 ± 17%, P < 0.005), and in an inverse pattern the active-MMP-2 form
increased 8.3x (P < 0.0005) from 4 w to 12 w, and was not detected at 24 w. Control
C57 and mdx mice at 2 weeks of age did not show MMP-9 activity or presented
differences among MMP-2 forms (Fig. 1).
Reduction of muscle inflammation after specific activation of nAChRα7 in mdx
mice
In order to investigate the effects of selective nAChRα7 activation on the TNFα
cytokine circulating levels after intraperitoneal administration of the selective agonist
43
PNU282987 in mdx mice, we analyzed the amount of serum TNFα in these mice. Serum
TNFα reduced 21 ± 3.3% (P < 0.005) after 7 daily injections of PNU282987 at 1 mg/kg,
which was blocked after treatment with the competitive antagonist MLA at 1 mg/kg
together with the agonist (Fig. 2A).
Activity of MMP-9, a protease that cleaves TNFα into soluble form and
contributes to systemic inflammation had a drastic reduction of 91 ± 16% (P < 0.005) in
the serum (Fig. 2B) and a less intensive reduction of 54 ± 18% (P < 0.05) in the
gastrocnemius muscle (Fig. 2C) after treatment with the higher dose of the selective
agonist. Only MLA was not able to alter the MMP-9 activity, but this competitive
antagonist reversed the effect of the agonist when administered together with
PNU282987 in both analysis. Pro-MMP-2 activity was not significantly modified in
serum and muscle with the treatments. Active-MMP-2, the cleaved and mature form of
MMP-2 which is an important protease related to increase tissue muscle remodeling,
was not observed in serum (Fig. 2B) but increased 170 ± 35% (P < 0.05) in
gastrocnemius muscle after PNU282987 treatment. This effect was reversed when MLA
was administered concomitantly (Fig. 2C).
nAChRα7 protein is crucial for reduction of muscle inflammation
Aiming to investigate whether nAChRα7 protein and activation is crucial to
reduction of muscle inflammation, we induced muscle injury in nAChRα7+/+ mice and
made daily treatments with the nAChRα7 selective agonist. It was observed a reduction
of 33 ± 11 (P < 0.05) on MMP-9 activity and an increase of 81 ± 13 (P < 0.05) on
active-MMP-2 activity, but not any modulation in pro-MMP-2 (Fig. 3A). The
nAChRα7-/- mice did not show modulation on MMP-9, pro-MMP-2 and active-MMP-2
activities after treatment with the nAChRα7 selective agonist PNU282987 (Fig. 3B).
44
Selective activation of nAChRα7 reduces area of inflammatory infiltrate and
improves regeneration in mdx muscle
Histological analysis of gastrocnemius skeletal muscle showed that selective
nAChRα7 activation reduced inflammatory infiltrate areas in mdx mice (49 ± 13, P <
0.005) displaying reduced number of migrated leukocytes. It was also observed
increased myofiber regeneration (35 ± 12, P < 0.05), assessed by area measurement of
basophilic sarcoplasma and centrally located nuclei, without significant changes upon
collagen production (Fig. 4).
DISCUSSION
Production of inflammatory cytokines displays important roles against tissue
injury and host defense. Moreover, injured tissue can cause a local or systemic
inflammatory imbalance and may result in organ failure or even in lethal systemic
inflammation due to an excessive production of inflammatory cytokines (Dantzer and
Kelley, 2007). In our previous reports, we suggested that endogenous mechanisms
responsible for regulating inflammation are activated and contribute to the regulation of
exacerbated immune response, consequently leading to posterior muscle regeneration in
the inflammatory myopathy of mdx mice (Leite et al., 2010b). Our current results
corroborate this statement, since they show increase MMP-9 activity in dystrophic mice,
which is involved in TNFα, NFkB and MMP-9 induction, during the inflammatory
prevalence stage (4 weeks), and its reduction during the regeneration and tissue repair
stage (12 weeks). Oppositely, the active form of MMP-2, which is involved in
regeneration and tissue repair, is considerably lower in 4 weeks in comparison to 12
weeks.
45
These data suggest a natural control of inflammation. However, so that this occurs
the inflammatory disorder might have to reach a certain activity level, what would
disrupting the homeostasis and demand time to yield a more effective regeneration.
Considering this and previous reports (Osborne-Hereford et al., 2008; van Maanen et
al., 2009; van Westerloo et al., 2005), we have used nicotine to activate nicotinic
receptors including nAChRα7, in the stage that precedes the inflammatory characteristic
period in order to reduce the deleterious effects of this stage which might affect an early
efficient regeneration in the course of the pathology. We observed that muscle
inflammation reduced in the inflammatory prevalence stage when the treatment was
performed soon after weaning, demonstrated by decreased levels of MMP-9, TNFα and
NFkB. Also, treatment increased muscle regeneration without altering non-functional
tissue deposition such as collagen and fibrosis (Leite et al., 2010b).
Our results have shown that intraperitoneal administration of the agonist
PNU282987 at 1 mg/kg for 7 days practically abolished serum MMP-9, also reducing
its activity in the gastrocnemic muscle of mdx mice. The administration of the receptor
antagonist MLA in the same concentration caused a discrete and not statistically
significant increase in muscle MMP-9 activity. When the agonist was administered with
the antagonist at the same time, we did not observe modulation of MMP-9, suggesting
that MLA competed with the agonist for the nAChRα7 binding site. Similar results were
obtained when serum TNFα levels were measured, although these levels in the serum of
mdx mice are naturally low. On the other hand, despite the pro-MMP2 was not altered
in serum and gastrocnemic muscle, active-MMP-2 was increased in animals treated with
the agonist. These data suggest that selective activation of nAChRα7 reduces the
inflammatory signaling mediated by MMP-9, since this enzyme is able to induce the
transcription factor NFkB and its own synthesis, also inducing the production and
46
cleavage of TNFα in its mature form (Kherif et al., 1999). That explains gastrocnemic
MMP-9 and also serum TNFα and MMP-9 reduced levels. With the knowledge that
reduction of inflammation favors muscle regeneration (Messina et al., 2006; RendonMitchell et al., 2003) and that active-MMP-2 activity was increased with the nAChRα7
agonist treatment, it is conceivable to consider that selective nAChRα7 activation may
contribute direct or indirectly for tissue remodeling. This hypothesis is reinforced by the
data showing diminished myonecrosis and inflammatory infiltrate areas, increased
regeneration area and no changes in the non-functional tissue (collagen) in the muscular
tissue after treatment.
It is also possible to consider that minor leukocyte infiltration in muscle tissue
after nAChRα7 activation might be due to reduced NFkB synthesis and nuclear
translocation, which would eventually lead to a reduction in cellular adhesion receptors
and production of molecules important to diapedesis, as ICAM-1 and VCAM-1
(Ransohoff et al., 2003; Saeed et al., 2005).
The hypothesis that nAChRα7 has a relevant involvement as a regulator of
inflammation and muscular tissue remodeling is consistent because induced muscle
injury C57BL6/nAChRα7-/- mice did not present MMP-9 activity reduction or activeMMP-2 modulation after treatment with the agonist PNU282987. In contrast, induced
muscle injury in wild type with the same genetic background (C57BL6/nAChRα7+/+)
treated with the agonist presented reduction of MMP-9 activity without any alterations
on pro-MMP-2. However, the active-MMP-2 was increased as in mdx mice, reinforcing
the hypothesis that this active and mature metalloprotease is important for tissue
remodeling.
As this therapeutic strategy is highly selective for nAChRα7, fewer undesirable
side effects are expected, and the damaging effects that occur during the progression of
47
Duchenne muscular dystrophy are potentially reduced favoring efficient healing. These
data show that nAChRα7 activation mainly expressed by macrophage cells in the
inflammatory infiltrate, which are the main production source of TNFα and MMP-9,
can be considered a potential target of pharmacological strategies to reduce
inflammation and activating mechanisms of muscle remodeling reducing the damaging
effects of Duchenne muscular dystrophy progression and possibly others inflammatory
diseases.
ACKNOWLEDGEMENTS
This study was supported by grants from CAPES (Coordenação de
Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior), FAPERJ (Fundação de Amparo a
Pesquisa do Rio de Janeiro) and Santander Bank.
48
Fig. 1. Different pattern of metalloproteases activity in skeletal muscle of mdx mice.
Zymograms of metalloproteases activity from gastrocnemius muscle of control C57 (C)
and dystrophic mdx mice (M) in different stages of myopathy. One-way ANOVA test
indicates P < 0.005 for graphs showing the activity level of MMP-9, pro-MMP-2 and
active-MMP-2 (mdx). Unpaired t test analysis (* P < 0.05; ** P < 0.005; *** P <
0.0005). 5 mice were included per experimental group. Results are expressed as mean
with standard error of mean (±SEM).
49
Fig. 2. Selective nAChRα7 activation reduces serum and muscle inflammation of mdx
mice. (A) ELISA and (B) zymograms of metalloproteases activity from serum and (C)
gastrocnemius muscle of mdx mice treated with Vehicle saline, PNU282987 at 0.3 and
1.0 mg/kg, MLA at 1.0 mg/kg, or both PNU282987 and MLA at 1.0 mg/kg for 7 days.
The active-MMP-2 activity was not detected in the serum. One-way ANOVA test
indicates P < 0.05 for graphs showing TNFα content and P < 0.005 for MMP-9 activity
in the serum, and P < 0.05 for MMP-9 and active-MMP-2 activity levels in the
gastrocnemius muscle. Unpaired t test analysis (* P < 0.05; ** P < 0.005). 4 mice were
included per experimental group. Results are expressed as mean with standard error of
mean (±SEM).
50
Fig. 3. nAChRα7 activation is crucial for reduced muscle inflammation. Zymograms of
metalloproteases activity from muscle injury-induced (A) C57BL6/nAChRα7+/+ and (B)
C57BL6/nAChRα7-/- mice after a 5 daily treatment with Vehicle saline or PNU282987
at 1.0 mg/kg, or without any treatment (Control). One-way ANOVA test indicates P <
0.05 for graphs of MMP-9 and active-MMP-2 activity levels of C57BL6/nAChRα7+/+
mice. Unpaired t test analysis (* P < 0.05). 4 mice were included per experimental
group. Results are expressed as mean with standard error of mean (±SEM).
51
Fig. 4. nAChRα7 activation reduces inflammatory infiltrate area and improves
regeneration in mdx muscle. Histological analysis of mdx gastrocnemius muscle after
vehicle or PNU282987 treatment, with images from entire cross-section on top. In the
middle, representative micrographs of the inflammatory infiltrate and regeneration area.
Below, graphs showing quantification of inflammatory infiltrate and regeneration areas,
and also collagen production. Unpaired t test analysis (* P < 0.05). 7 mice were
included per experimental group. Results are expressed as mean with standard error of
mean (±SEM).
52
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acetylcholine receptor alpha7 subunit is an essential regulator of inflammation.
Nature 421, 384-388.
55
Eugenia punicifolia (Myrtaceae) dichloromethane fraction inhibits DNA synthesis
and proliferation of C2C12 cells via MAPK signaling pathway
Paulo Emílio Corrêa Leite a,§, Guilherme Rapozeiro b, Jussara Lagrota-Candido d,
Wilson C. Santos c,e, Thereza Quirico-Santos a,§
a
c
Departamento de Biologia Celular e Molecular, bDepartamento de Neurobiologia,
Departamento de Farmácia e Administração Farmacêutica,
d
Departamento de
Imunobiologia, Universidade Federal Fluminense, Niterói, RJ, 24020-141, Brasil;
e
Instituto Teófilo Hernando, Departamento de Farmacología, Facultad de Medicina,
Universidad Autónoma de Madrid, España.
Conflicting interest statement: The authors declare no competing financial interests.
Running Title: Cytostatic effect of Eugenia punicifolia
§ Corresponding authors: Laboratory of Cellular Pathology, Institute of Biology,
Federal Fluminense University, Niteroi, RJ, 24020-141, Brazil. Tel.: +55 21 2629 2305;
fax: +55 21 2629 2268. Email address: [email protected]; [email protected].
Key words: SKELETAL MUSCLE; C2C12; Eugenia punicifolia; CELL
SIGNALING; MAPK.
Number of figures: 6.
56
ABSTRACT
Sustained chronic inflammation induces activation of numerous genes involved in
cellular proliferation and apoptosis thereby causing severe skeletal muscle degeneration
characteristic of inflammatory myopathies. We previously showed that Eugenia
punicifolia dichloromethane (Ep-CM) fraction causes significant reduction of muscular
inflammation and improve skeletal muscle regeneration of dystrophic mdx mouse, the
animal model of Duchenne muscular dystrophy. This work aimed to investigate the in
vitro effect of Ep-CM fraction upon activation of pathways involved in the regulation of
cell proliferation, viability and signaling of C2C12 cell lineage. Ep-CM fraction
inhibited cell proliferation in a dose-dependent manner, confirmed by reduction of [3H]
thymidine uptake without affecting cell viability or inducing apoptosis. The inhibitory
effect was totally reversed after 48 h washout experiment. Expression of pERK and
Cyclin D1 were reduced in a concentration-dependent manner, but pAkt and p27kip1
expression levels were increased. In contrast Ep-CM increased the activity of
metalloproteases -9 and -2 compared to controls. The cytostatic effect of Ep-CM upon
C2C12 cells occurred mainly via inhibition of pERK activation and DNA synthesis
without affecting cell viability or inducing apoptosis but possibly inhibiting the G1
phase of the cell cycle. The increased production of metalloproteases -9 and -2 further
indicates that Ep-CM also exerts an important role in tissue remodeling.
57
1. INTRODUCTION
Natural products from plant extracts often display pharmacological activities and
many efforts have been employed for the development of compounds with possible
therapeutic applications in various pathologies (Rahimi et al., 2010). The Eugenia genus
of Myrtaceae family is largely used for diarrhea and stomach disturbances and as
hypoglycaemic remedy by some communities in the Amazon region (Bopp et al., 2009;
Brito et al., 2007). Flavonoids (myricitrin, quercetin, quercetrin), steroids, terpenoids,
tanines and anthraquinones are among chemical compounds with pharmacological
properties isolated from Eugenia species (Consolini and Sarubbio, 2002). We have
previously shown that aqueous E. punicifolia extract enhanced cholinergic nicotinic
neurotransmission in rat diaphragm (Grangeiro et al., 2006) whereas the
dichloromethane fraction (Ep-CM) exhibited a potent antiinflammatory activity in
skeletal muscles of mdx mice, through a yet unknown mechanism (Leite et al., 2010a).
Likewise, resolution of skeletal muscle inflammation in mdx mice, the animal
model of Duchenne muscular dystrophy was accompanied by increased expression of
non-neuronal nicotinic 7 acetylcholine receptor subunit (nAChR7) in macrophages
located nearby inflammatory foci (Leite et al., 2010b). Activation of nAChR7
receptors inhibits secretion of TNF inflammatory cytokine and also NFκB
translocation towards the nucleus and synthesis of inflammatory proteins (Saeed et al.,
2005; Tracey, 2009). Inasmuch persistently exacerbated levels of inflammatory proteins
as TNF are directly implicated in amplification of mdx skeletal muscle degeneration
(Bani et al., 2008a), it is important to elucidate the mechanisms underlying the
antiinflammatory effect of E. punicifolia as a putative new therapeutic agent for
muscular dystrophy. The present study aimed to investigate the in vitro effects of Ep-
58
CM fraction upon C2C12 myoblast proliferation, viability, activation of signaling
pathways and also production of metaloproteases involved in tissue remodeling.
2. MATERIAL AND METHODS
2.1. Drugs and reagents
Dimethyl sulfoxide (DMSO) was purchased from Sigma Chem. Co., USA; [3H]thymidine
(0.5
μCi)
from
Amersham
Biosciences;
Dapi
(4’,6-diamidino-2-
phenylindole) from Pierce Biotechnology (Rockford, IL, USA); Dulbecco’s modified
Eagle’s medium (DMEM) and the supplement fetal bovine serum from Gibco BRL
(Grand Island, NY, USA); MEK1 specific inhibitor PD98059 was purchased from New
England Biolabs (Beverly, MA, USA). All other reagents were of analytical grade.
2.2. Plant material and extract preparation
E. punicifolia was supplied by the Centro de Instrução de Guerra na Selva (CIGS,
Manaus, AM, Brazil) and identified at the National Museum (Rio de Janeiro Federal
University, Brazil). Official authorization for scientific investigation with plant
components was given by the government environmental institution (IBAMA, Brazil),
registration 16602-1 with a voucher specimen deposited at the National Museum (Rio
de Janeiro, Brazil). The plant was successively extracted at room temperature with
solvents of increasing polarity beginning with hexane, dichloromethane and methanol.
Extracts were evaporated to dryness and the residues stored at 4 ºC. Stock solutions (1
mg /mL) were prepared in 10-2 M DMSO. E. punicifolia crude extract was separated on
three fractions: hexanic, dichloromethanic and methanolic, but results with statistical
relevance were obtained only with the dichloromethanic fraction.
59
2.3. Cell culture
Mouse myoblast cells (C2C12) were maintained as subconfluent monolayer in
DMEM containing 4.5 g /L glucose and L-glutamine supplemented with 10% fetal
bovine serum (FBS), 50 U /ml penicillin, and 50 mg /ml streptomycin and maintained at
37 ºC in a 5% CO2 humidified atmosphere. Cell cultures were performed on 8-wells
slide chamber system for cell morphology, immunofluorescence and TUNEL; 24-wells
culture plates for [3H]-thymidine incorporation, cell membrane and mitochondria
viability and zymography; and in 6-wells culture plates for western blot assays.
2.4. Cell morphology analysis
5 x 104 C2C12 cells were treated with vehicle (DMSO) or 100 μg /mL Ep-CM
during 24 h at 37 ºC in a 5% CO2 incubator. Cells were fixed with 4%
paraformaldehyde and 2% glutaraldehyde in 0.1 M PBS for 30 min, followed by PBS
wash and nuclei staining with Dapi. Phase contrast images were obtained using a Nikon
Eclipse TE2000-U microscope.
2.5. Gelatin zymography
Conditioned medium obtained 24 h after treatment was collected and diluted (1/10
v/v) in a non-reducing sample buffer pH 6.8 (100 mM Tris, 10% glycerol, 4% sodium
dodecyl sulfate, 0.1% bromophenol blue). Equal volumes of conditioned medium from
control (DMSO vehicle) and Ep-CM treated cell cultures were loaded. SDS-PAGE
zymography was performed to determine the gelatinase activity (Heussen and Dowdle,
1980). Briefly, zymogram gels consisted of 7.5% polyacrylamide-SDS impregnated
with 2 mg /mL type A gelatin from porcine skin (Sigma, St. Louis, MI) and 4%
polyacrylamide-SDS for stacking gels. Gels were further washed twice for 30 min in
60
2.5% Triton X-100 solution, then incubated at 37 ºC for 24 h in substrate buffer (10 mM
Tris buffer pH 7.5 with CaCl2 5 mM and ZnCl2 1M). Thereafter gels were stained with
30% methanol /10% acetic acid containing 0.5% brilliant blue R-250 (Sigma, St Louis,
MI). Gelatinase activity was visualized as unstained bands on a blue background,
representing areas of substrate protein proteolysis.
Metalloproteases are secreted in latent form and require cleavage of a NH2
terminus peptide for activation. Exposure of proenzymes of tissue extracts to sodium
dodecyl sulfate during gel separation procedure leads to activation without proteolytic
cleavage (Talhouk et al., 1992).
2.6. [3H]-thymidine incorporation
105 C2C12 cells were treated with different concentrations of Ep-CM extract or
vehicle during 24 hours and next incubated with [3H]-thymidine (0.5 μCi) for 60 min at
37 ºC in 5% CO2 incubator. Cultures were washed three times with 1 mL DMEM
buffered with 25 mM Hepes pH 7.4, dissolved with 0.1 mL of 0.4 N NaOH and further
treated with TCA solution (1.5 mL H2O it was added 0.3 mL of 50% trichloroacetic
acid) and incubated for 30 min at 4 ºC. Samples were filtered through Whatmann GF/B
glass fiber filters and washed three times with 5% TCA. Filters were dried and the
radioactivity determined by scintillation spectroscopy (Packard, model 1600 TR).
2.7. Viability of mitochondria and cell membrane
Mitochondrial viability was determined by the MTT (3-(4,5-Dimethylthiazol-2yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide) reduction method (Mosmann, 1983) in which
tetrazolium salt is converted to a dark-blue formazan by succinate dehydrogenase
complex II located in the inner mitochondrial membrane. 5 x 104 C2C12 cells were
61
treated with crescent concentrations of Ep-CM extract during 24 hours at 37 ºC in a 5%
CO2 incubator. Thereafter cells were washed with PBS pH 7.6 and incubated with 1.5
mg /mL MTT (Sigma, St Louis, MI). After 4 hours, cells were treated with alcoholicacid lyse solution (12N HCl and isopropyl acid 6:1) and soluble formazan product
estimated by the absorbance at 570 nm after subtracting the absorbance at 650 nm.
Membrane viability was determined by live-dead kit according to manufacturer
recommendations (Molecular probes, Eugene, OR). Live cells were distinguished by the
presence of ubiquitous intracellular esterase activity determined by enzymatic
conversion of virtually no fluorescent cell permeate calcein AM to the intensely
fluorescent calcein. The polyanionic dye calcein is well retained within live cells,
producing an intense uniform green fluorescence in live cells (ex /em ~495 nm /~515
nm). Ethidium homodimer-1 (EthD-1) enters cells with damaged membranes and
undergoes a 40-fold fluorescence enhancement upon binding to nucleic acids, thereby
producing a bright red fluorescence in dead cells (ex/em ~495 nm /~635 nm). EthD-1 is
excluded by the intact plasma membrane of live cells. Determination of cell viability
depends on these physical and biochemical properties of cells. Background fluorescence
levels are very low in this assay because both dyes are virtually non-fluorescent before
interacting with cells. Fluorescent images were obtained using a Nikon Eclipse TE2000U microscope and merged on Adobe Photoshop CS5.
2.8. Western blot analysis
Western blot was performed for analysis of proteins involved in apoptosis, cell
signaling and differentiation. 5 x 105 C2C12 cells were plated and after specific
treatment cells were homogenized by a standard procedure with sample buffer pH 6.8
(173 mM Tris, 20% glycerol, 4% sodium dodecyl sulfate, 10% -mercaptoethanol)
62
containing protease inhibitor buffer (Sigma, St Louis, MI). Protein quantification was
determined by Lowry protocol (Lowry et al., 1951). Samples were denatured by boiling
for 5 min and 50 µg of protein loaded on 10% SDS-PAGE for protein detection, further
transferred to PVDF membranes (Immobilon-P; Millipore, MA, USA) and blocked with
5% nonfat dry milk in 0.05% Tween-20 Tris-buffered saline (TBST) pH 7.4 for 2 h on a
rocking platform. Membranes were incubated individually in 5% nonfat dry milk TBST
at 4 ºC overnight with primary polyclonal rabbit antibodies for cleaved caspase-3
(Asp175 at 1:1000) and ERK1/2 (Erk1/2 at 1:2000) both from Cell Signaling
Technology (Beverly, MA, USA); and for Cyclin D1 (sc-717 at 1:1000), NFκB p65 (A
at 1:500) and myogenin (at 1:2000) from Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA,
USA). The following monoclonal antibodies were also used: rabbit anti-Akt (pan
C67E7 at 1:2000) and anti-pAkt (Ser473 D9E at 1:2000) and mouse anti-pERK1/2
(Thr202/Tyr204 E10 at 1:2000 from Cell Signaling Technology, Beverly, MA; antip27kip1 (57/Kip1/p27 at 1:4000) from BD Biosciences (Franklin Lakes, NJ, USA) and
anti-HMGB1 (MAb1690 at 1:500) from R&D Systems (Minneapolis, MN, USA).
Peroxidase-conjugated donkey anti-rabbit at 1:3000 (Zymed, San Francisco, CA,
USA) and goat anti-mouse at 1:3000 (Zymed, San Francisco, CA) were also used.
Bands were identified by chemiluminescence with ECL Plus (Amersham Biosciences,
Fairfield, CT, USA) followed by subsequent film exposure for 5 min. Presence of
proteins were verified by comparison with Molecular Rainbow Weight Marker
(Amersham Biosciences; Fairfield, CT). As negative control, samples were incubated
without primary antibodies. Equal loading of protein was assessed on stripped blots by
immunodetection of β-actin using goat anti-human polyclonal peroxidase-conjugated
antibody at 1:1000 (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA).
63
2.9. TUNEL in situ detection
Terminal deoxynucleotidyl transferase mediated dUTP nick-end labeling
(TUNEL) method was utilized to identify apoptotic cells (Upstate, Temecula, USA). 5 x
104 C2C12 cells were plated and treatments conducted for further TUNEL analysis.
Cells were fixed for 30 min and rinsed for 20 min in PBST. In brief, after incubation of
protein kinase for 30 min at 37 ºC and washing steps, sections were labeled with
biotinylated nucleotides by incubation with Terminal deoxynucleotidyl Transferase
(TdT) enzyme for 1 h in a humidity chamber at 37 ºC. The incorporated nucleotides
were detected using avidin-FITC in the dark for 30 min at 37 ºC. Cells were
counterstained with Dapi and images were randomly obtained with a Nikon Eclipse
TE2000-U microscope with identical time exposure and image settings and merged on
Adobe Photoshop CS5.
2.10. Immunofluorescence
5 x 105 C2C12 cells were fixed for 30 min, washed with PBS and incubated for 1
h with blocking buffer PBST (0.05% Triton X-100 in PBS, containing 5% normal goat
serum). Cells were incubated overnight at 4 ºC with polyclonal rabbit anti-NFκB p65 (at
1:400) and anti-myogenin (at 1:1000) both from Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz,
CA; or monoclonal mouse antibodies anti-pERK1/2 (Thr202/Tyr204 E10; Cell
Signaling Technology, Beverly, MA) and anti-HMGB1 (MAb1690 at 1:500; R&D
Systems, Minneapolis, MN, USA) in blocking buffer at 4 ºC overnight. Thereafter
samples were incubated with secondary antibodies donkey anti-rabbit IgG Alexa 568,
488 or goat anti-mouse IgG Alexa 488-labeled, all at 1:200 (Molecular probes, Eugene,
OR). Cells were counterstained with Dapi and images obtained with a Nikon Eclipse
64
TE2000-U microscope with identical time exposure and image settings and merged on
Adobe Photoshop CS5.
2.11. Quantitative and statistical analysis
All experiments were conducted in quadruplicates. Quantitative analysis for [3H]thymidine incorporation, mitochondria viability, western blot and zymography was
performed using the image-analysis software Scion Image for Windows (Scion
Corporation, National Institutes of Health; Bethesda, MD). GraphPad Prism 5
(GraphPad software Inc.) was used to calculate mean and standard deviations. One-way
ANOVA and unpaired t test were applied to obtain statistical significance of means.
Differences were considered to be statistically significant at the 0.05 level of
confidence.
3. RESULTS
3.1. Effect of Ep-CM extract upon cell proliferation
Addition of Ep-CM at 100 µg /mL in the culture medium, in comparison to
C2C12 control cells treated with DMSO vehicle, reduced cell density with few cells
undergoing mitosis (Fig. 1A). Analysis of different concentrations of Ep-CM upon cell
proliferation showed marked reduction of cell proliferation from 50 to 100 µg /mL (P <
0.0005) in a concentration dependent manner reaching 89% ± 0.6% inhibition at 100 µg
/mL (Fig. 1B). The inhibitory effect on cell proliferation only occurred while the extract
was present. [3H]-thymidine incorporation after medium replacement caused a partial
recovery of C2C12 myoblastoma cell proliferation after 24 h (66 ± 10%, P < 0.0005)
and totally after 48 h (91 ± 5%, P < 0.0005) (Fig. 1C).
65
3.2. Effect of Ep-CM extract upon cell apoptosis and viability
After observation of reduced cell density caused by Ep-CM treatment, it was
important to verify possible induction of apoptosis and /or detachment of treated cells
from the culture plate. C2C12 cells were either treated with 75 and 100 µg /mL of EpCM or DMSO vehicle and supernatants collected, centrifuged and resuspended. It was
observed few cells in the supernatant and the degree of apoptosis assessed by TUNEL
was similar in detached cells from both groups. Regarding the cultured and adhered
cells in the plate, the amount of fragmented nuclei was very low in both groups (images
not shown) and also undetectable levels of cleaved caspase-3 (Fig. 2A). Mitochondrial
viability was assessed by MTT assay (Fig. 2B) and cellular membrane viability by
fluorescent enzymatic reaction of intracellular calcein (viable cells, green) and DNA
intercalation with ethidium bromide EthD-1 for non-viable cells (red nuclei) (Fig. 2C).
Ep-CM treated cells did not show significant difference in mitochondrial and cellular
membrane viability in comparison with control cells treated with vehicle.
3.3. Effect of Ep-CM extract upon metalloproteases production
Matrix metalloproteases (MMPs) are key regulatory molecules in the formation,
remodeling, and degradation of extracellular matrix components in both physiological
and pathological processes. Analysis of metalloproteases secreted by C2C12 cells
treated with 100 µg /mL Ep-CM showed increased activity levels of MMP-9 (128 ±
14%, P < 0.005) and MMP-2 (110 ± 18%, P < 0.005) in comparison with control
groups (Fig. 3).
66
3.4. Ep-CM extract inhibits the MAPKinase signaling pathway
PD98059 was used as a classic specific inhibitor of MEK1 phosphorylation
(Tortorella et al., 2001) to assess if Ep-CM extract could affect the MAPK signaling
pathway considering its importance for cellular proliferation, differentiation and
development. Similarly to the effect produced by Ep-CM extract, the PD98059 inhibitor
reduced C2C12 cell proliferation (86%, ± 1%, P < 0.0005) at 50 µM without affecting
cell viability (Fig. 4A).
Ep-CM treatment also reduced pERK expression in a dose-dependent manner
reaching 72% (± 12%, P< 0.005) at 100 µg /mL (Fig. 4B), supported by reduced
fluorescent signal which confirms the reduced levels of pERK protein detected by
western blot analysis (Fig. 4C).
3.5. Ep-CM extract does not influence NFkB activation, myogenin expression or
HMGB1 production
NFkB is a transcription factor involved in the control of proliferation and cellular
events (Lee et al., 2007), myogenin is a myogenic regulatory protein essential for
terminal differentiation of myoblasts into myotubes (Spassov et al., 2011), and HMGB1
a cellular molecule released from activated macrophage and necrotic cells with intrinsic
proinflammatory activity (Wang et al., 2004). No alterations were observed on nuclear
/cytoplasmic
localization
of
NFkB,
myogenin
and
HMGB1
evidenced
by
immunofluorescence (Fig. 5A, B, C), and neither in the protein expression evidenced by
western blot (Fig. 5D).
67
3.6. Ep-CM extract influences proteins that regulate the cell cycle
The expression levels of pAkt and p27kip1 proteins were assessed on C2C12 cells
after Ep-CM treatment with 75 and 100 µg /mL. It was observed a dose-dependent
increase of pAkt reaching 77% ± 20% (P < 0.05) and 82% ± 10% (P < 0.05) for p27
expression levels at 100 µg /mL (Fig. 6A, B). Conversely, Ep-CM treatment caused a
reduction of cyclin D1 levels reaching 38% ± 9% (P < 0.05) at 100 µg /mL in
comparison a control vehicle (Fig. 6C).
4. DISCUSSION
There is growing interest in natural compounds as major source for development
of new drugs for treatment of many inflammatory disorders. The present work shows
that Ep-CM fraction inhibits C2C12 cell proliferation in a dose-dependent manner with
no effect in the viability or induction of apoptosis. The inhibitory effect upon cell
proliferation only occurred while Ep-CM was available in the culture medium, because
removal and reconstitution by fresh medium completely abolished the effect after 48 h
with C2C12 cells returning to earlier status. In addition 100 µg /mL Ep-CM also
increased production of MMP-9 and MMP-2. Such results indicate that Ep-CM may
also influence adaptive responses of C2C12 cells to produce molecules with important
role in tissue remodeling which favors myofiber regeneration.
MAPK signaling pathway regulates cell cycle via synthesis of cyclin D1 mRNA
through Fos transcription factors family. ERK activation triggers Elk1 stimulation of
immediate genes as c-Fos with subsequent activation of the cyclin D1 gene (Burch et
al., 2004). Conversely, inhibition of MEK1 phosphorylation halts cell proliferation. We
present evidences that Ep-CM extract was capable to inhibit C2C12 proliferation with
similar effect comparable to the classic specific inhibitor of MEK1 phosphorylation
68
PD98059 (Tortorella et al., 2001). In order to ascertain that the inhibitory effect of EpCM on cell proliferation was mediated via inhibition of MAPK signaling pathway, we
further analysed NFkB expression and nuclear translocation since this transcription
factor is also involved in the control of proliferation and cellular events (Lee et al.,
2007). No alterations were observed on nuclear translocation of NFkB, indicating that
the cytostatic effect mediated by Ep-CM may be occurring directly via inhibition of
MAPK signaling pathway upon ERK phosphorylation.
The expression and translocation of HMGB1 to the cytoplasm did not change
after 24 h of treatment further confirming that Ep-CM treatment did not induce C2C12
cell death by necrosis. HMGB1 is a protein important for maintenance of structural
dynamics and DNA repair, and also an inducer of inflammation whenever translocated
to the cytoplasm and secreted into the extracellular medium (Lange and Vasquez, 2009).
It is not ruled out that Ep-CM treatment could have altered the bending of nucleic acids
chain resulting in slower gene transcription.
Cell proliferation is a complex phenomenon involving interaction of several
proteins in a coordinate manner (Stamatakos et al., 2010). The three main members of
this system are the cyclins (A, B, D and E), the cyclin-dependent kinases (Cdks) and the
cyclin-dependent kinase inhibitors (CKIs). The progression of cell cycle requires
increased expression of cyclins but decreased expression of CKIs (Traganos, 2004;
Yang et al., 2006). In our experiments, treatment of C2C12 cells with Ep-CM extract
reduced expression of cyclin D1 and increased levels of p27Kip1 which are essential
proteins to positively and also negatively control the cell cycle, respectively. Cyclin D1
has been linked to cell cycle progression during G1 phase (Favreau et al., 2008; Jones
and Kazlauskas, 2001), and p27Kip1 as an inhibitor of the interaction of cyclin/CDK
preventing progression of cell cycle during G1 phase (Deng et al., 2004). The present
69
results suggest that Ep-CM extract inhibits cellular proliferation during G1 phase due to
increased p27Kip1 and decreased cyclin D1 levels which control the cell cycle in this
phase.
Activation of PI3K/Akt pathway in C2C12 cells acts as a negative regulator of
cell proliferation. The paired-like homeodomain 2 (PITX2) encodes a protein that
controls cell proliferation in a tissue-specific manner possessing key roles in
morphogenesis. PITX2 is phosphorylated by protein kinase Akt2, and it is expressed in
all phases of the cell cycle during embryonic development promoting expansion of
muscle progenitors. A differentiation program in C2C12 cells is initiated when PITX2
phosphorylation by Akt2 reduces the half life of cyclin D1 mRNA, contributing to the
switch of C2C12 cells from a proliferating to a differentiating phenotype (Gherzi et al.,
2010). Furthermore, cyclin D1 ubiquitination followed by proteolysis is accelerated by
activation of Akt pathway in NIH-3T3 (Diehl et al., 1998) and in C2C12 cells (Yang et
al., 2007). In general, the halting of myoblast proliferation coincides with activation of
the differentiation program towards myotube formation.
The effect of Ep-CM treatment increasing pAkt levels and production of
metalloproteinases (MMP-9 and MMP-2) indicates a possible role in the activation of
early C2C12 cell differentiation program, because treatment did not alter expression and
nuclear localization of myogenin which is considered a marker of later differentiation
stage (Spassov et al., 2011). We have previously shown (Leite et al., 2010a) that Ep-CM
in vivo treatment reduced MMPs -9 and -2 activities in the mdx mice but herein we
observed that in vitro treatment of C2C12 muscle cell lineage caused a significant
increase of MMPs. Such paradoxical effect may be due to the fact that in vivo, the tissue
presents an organized structure formed by a mesh of extracellular matrix molecules and
endothelial vascular cells closely associated with different cell types (fibroblasts,
70
stromal, muscular and immunological cells) that are important producers of MMP-9 and
MMP-2. For instance, muscular injury activates migration of immune cells to the lesion
site that respond to the stimulus by producing MMPs and inflammatory cytokines. In
addition, in vivo reduction of MMP-9 and MMP-2 may be attributed to the reduced
number of leukocytes and inflammatory infiltrate in the skeletal muscle, and this is
supported by the evidence that Ep-CM inhibits MAPK pathway, as shown in the present
manuscript. The production of both MMPs by C2C12 myoblast cells was interpreted as
a result of increased tissue remodeling, because in vivo experiments (Leite et al., 2010a)
showed that treatment improved regeneration and increased levels of myogenin which is
a marker of muscle differentiation. Altogether, these data suggest that the effect could
be different in more complex systems, because factors released within the
microenvironment following stimulation of cell-cell and cell-extracellular matrix
interactions would ultimately influence the outcome either cytostatic effect with
increased tissue remodeling and MAPK pathway inhibition, decreasing in vivo
inflammation of mdx dystrophic muscles (Leite et al., 2010a).
Development of strategies that mitigate or halt muscular inflammation will be of
great valuable to improve the quality of life of DMD patients. In this context we are
certain that Ep-CM has a promising future. In fact we find important to characterize the
bioactive fraction and further isolate the molecule responsible for the antiinflammatory
and cytostatic effect.
ACKNOWLEDGEMENTS
This study was supported by grants from CAPES (Coordenação de
Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior), CNPq (Conselho Nacional de Pesquisa
e Desenvolvimento Tecnológico) and FAPERJ (Fundação de Amparo a Pesquisa do Rio
71
de Janeiro). Authors are indebted to Centro de Instrução de Guerra na Selva (CIGS),
Manaus, AM, Brasil for the provision of plants, and Fundación Teófilo Hernando
(Spain) for continued support. We are grateful to Ventura AL from Departmento de
Neurobiologia for providing adequate laboratory facilities. WCS is a member of the
INCT de Processos Redox em Biomedicina funded by CNPq/FAPESP (Brazil).
72
Fig 1. Effect of Ep-CM fraction upon C2C12 proliferation.
(A) Phase contrast images from C2C12 cells merged with Dapi 24 h after treatment with
vehicle DMSO or Ep-CM at 100 µg /mL. Black arrows indicate proliferating cells.
Scale bar 100 m. (B) [3H]-thymidine incorporation following treatment with different
Ep-CM concentrations. (C) [3H]-thymidine incorporation after 24 and 48 h washout
assay. One-way ANOVA test showed P < 0.0005 for [3H]-thymidine incorporation
assays. Unpaired t test analyses (*, P < 0.0005). Results are represented as mean  SD
(n = 3 in quadruplicates for all assays).
73
Fig 2.Effect of Ep-CM fraction in C2C12 viability and apoptosis.
(A) Immunoblot analysis for cleaved Caspase-3 after E. punicifolia treatment. C2C12
positive control cells for apoptosis were previously treated with etoposide. 43-kDa actin was used as loading control (image not shown); (B) C2C12 mitochondrial viability
after Ep-CM treatment with different concentrations;(C) C2C12 cellular membrane
viability of controls (vehicle DMSO) on top or E. punicifolia at 100 µg /mL. Green cells
and red nuclei indicate viable and non-viable cells, respectively. White arrows show red
nuclei and non-viable cells. Scale bar 100 m. Results are represented as mean  SD (n
= 3 in quadruplicates for all assays).
74
Fig 3. Ep-CM increases metalloproteases production.
C2C12 gelatin zymogram of conditioned medium with SBF 10%: Control medium,
cells without treatment; vehicle, cells treated with DMSO; 50 and 100 g /mL, C2C12
cells treated with different concentrations of Ep-CM; reversion 24 and 48 hs,
conditioned medium with the extract discarded after 24 hs and every 24 hs added fresh
medium for analysis. One-way ANOVA test showed P < 0.0005 for both MMP-9 and
MMP-2 analysis. Unpaired t test analyses (*, P < 0.005). Results are represented as
mean  SD (n = 3 in quadruplicates).
Fig 4. Ep-CM extract inhibits the MAPKK signaling pathway.
(A) On top, [3H]-thymidine incorporation and below, mitochondria viability of C2C12
cells after treatment with 20 and 50 µL of PD98059; (B) immunoblot analysis of pERK
expression after Ep-CM treatment with 75 and 100 µg /mL. Total ERK was used as
loading control; (C) pERK immunocytochemistry and merged images with Dapi after
treatment with vehicle or 100 µg /mL Ep-CM. Negative control did not show
immunoreactivity (image not shown). Scale bar 50 m. One-way ANOVA test showed
P < 0.0005 for [3H]-thymidine incorporation and P < 0.005 for immunoblot analysis.
Unpaired t test analyses (*, P < 0.05; **, P < 0.005; ***, P < 0.0005). Results are
represented as mean  SD (n = 3 in quadruplicates for [3H]-thymidine incorporation and
mitochondria viability, and triplicates for immunoblots analysis).
75
Fig 5. Effect of Ep-CM in NFkB activation, myogenin expression and HMGB1
production.
Immunocytochemistry of (A) NFkB, (B) myogenin and (C) HMGB1 on C2C12 cells
and merged images with Dapi after treatment with vehicle or Ep-CM at 100 µg /mL.
White arrows indicate low HMGB1 immunolabeling on cellular nuclei of both groups.
Negative control did not show immunoreactivity (image not shown). Scale bar 50 m.
(D) Immunoblots analysis of NFkB, myogenin and HMGB1 protein expression after
Ep-CM treatment with 75 and 100 µg /mL. 43-kDa -actin was used as loading control
(image not shown), n = 3 in triplicates for all assays.
76
Fig 6. Ep-CM influences C2C12 cell cycle.
Immunoblot analysis of (A) pAkt, (B) p27 and (C) Cyclin D1 protein expression after
Ep-CM. Total Akt or 43-kDa -actin were used as loading controls. One-way ANOVA
test showed P < 0.05 for pAkt and p27, and P < 0.01 for Cyclin D1 immunoblot
analysis. Unpaired t test analyses (*, P < 0.05). Results are represented as mean  SD (n
= 3 in triplicates for all immunoblots).
77
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79
80
81
82
83
84
85
86
87
88
4
DISCUSSÃO
A inflamação excessiva contribui para o aumento da morbidade e mortalidade
em diversas doenças, embora mecanismos endógenos também influenciem na regulação
da resposta imune inata (Akira et al., 2001; O'Neill et al., 2011). Células do sistema
imunológico também possuem receptores de neurotransmissores, e interações desses
receptores com seus ligantes são capazes de modular importantes funções celulares
(Junger, 2011; Livnat et al., 1985; Rosas-Ballina et al., 2008; Strom et al., 1974; Tracey,
2009). De fato, a ativação de mecanismos colinérgicos principalmente via nAChRα7 é
capaz de regular a produção de moléculas envolvidas na resposta inflamatória como
TNFα, IL-1β e HMGB1 (Tracey, 2007; Ulloa, 2005; Wang et al., 2004; Wang et al.,
2003; Wang et al., 2011; Yoshikawa et al., 2006).
O fator de necrose tumoral α (TNFα), considerado um dos maiores indicadores
da inflamação local e sistêmica, é encontrado tanto na forma complexada à membrana
celular apresentando 27-kDa e na forma madura solúvel de 17-kDa produzida pela
clivagem proteolítica da enzima conversora de TNFα (TACE) ou metaloprotease de
matriz -9 (MMP-9) (Kherif et al., 1999; Mullberg et al., 2000). Os resultados
apresentados nesta tese mostram que durante a fase de prevalência de mionecrose do
músculo esquelético do camundongo mdx com 4 semanas de idade, a forma solúvel do
TNFα encontra-se aumentada em oposição à forma membranar que está reduzida,
sugerindo aumento de clivagem proteolítica da citocina. Esses dados são reforçados pela
atividade aumentada da MMP-9 neste estágio da miopatia em comparação aos estágios
seguintes (Bani et al., 2008b), e também devido às fases posteriores exibirem níveis
reduzidos de TNFα solúvel e aumentados da forma membranar. Dado este interpretado
como devido em parte à diminuição na atividade de MMP-9 e das áreas com foco de
89
inflamação no músculo esquelético. O processamento proteolítico e liberação de TNFα
solúvel bem como sua síntese são eventos regulados em nível de tradução e de
transcrição protéica. Nossos resultados mostram que os níveis de mRNA e da proteína
TNFα estão elevados durante o período de mionecrose nos camundongos mdx com 4
semanas (Leite et al., 2010b), sugerindo rápida tradução protéica da citocina e
correlação com o dano e perda de fibras musculares (Rendon-Mitchell et al., 2003).
Nesta fase da doença (pico da mionecrose) ocorre aumento na produção de TNFα e
ativação de NFkB (Messina et al., 2006), moléculas que regulam negativamente o fator
de transcrição miogênico MyoD, essencial para a formação de novas miofibras e para
indução da regeneração muscular (Guttridge et al., 2000). Estes dados indicam que o
controle da produção local de TNFα e ativação de NFkB é essencial para o
favorecimento do reparo e regeneração muscular.
Durante a fase de prevalência de regeneração muscular no camundongo mdx
com 12 semanas foram observados grande aumento na área total do infiltrado
inflamatório com predomínio de macrófagos F4/80+. Também foi observado redução
marcante nos níveis de TNFα solúvel e aumento (3,5 vezes) no número de macrófagos
expressando nAChRα7 no infiltrado inflamatório em comparação com a fase de
prevalência de mionecrose e inflamação. Além disso, os níveis protéicos de nAChRα7
aumentaram 138% enquanto do marcador de regeneração muscular NCAM 3,2 vezes
(Leite et al., 2010b). Neste sentido, é razoável considerar que a lesão muscular ativa
mecanismos endógenos de regulação da inflamação contribuindo com certa eficiência
para ajustar a resposta imune exacerbada e permitindo ativação de mecanismos de
regeneração muscular. Um maior número de macrófagos com atividade inflamatória
reduzida presentes no sítio da lesão sugere alteração no fenótipo dessas células de um
padrão inflamatório para regulatório. É plausível considerar que a ativação da nAChRα7
90
possua papel relevante neste mecanismo, fundamentado pelos níveis aumentados da
nAChRα7 por macrófagos no sítio da lesão.
Além de neurônios, vários tipos celulares incluindo as células do sistema
imunológico, endoteliais e epiteliais, também produzem o neurotransmissor acetilcolina
(Rosas-Ballina et al., 2008). Neste contexto, é concebível considerar que a acetilcolina
derivada dessas fontes possa estar influenciando os processos de mionecrose,
inflamação e regeneração muscular no modelo distrófico mdx. Embora o músculo
esquelético não apresente inervação parassimpática, os resultados desta tese indicam
que macrófagos F4/80+ nAChRα7+ infiltrados no músculo esquelético possuem
importantes funções no controle da lesão muscular. Essa hipótese está em concordância
com publicações que utilizaram outros modelos de desordens imunológicas para
comprovar que o controle da inflamação não é dependente exclusivamente de
inervações parassimpáticas vagais (Osborne-Hereford et al., 2008; van Maanen et al.,
2009; van Westerloo et al., 2005).
Não é descartada a possibilidade de que a ativação local de mecanismos
endógenos reguladores da inflamação possa regular a resposta imune exacerbada
favorecendo a regeneração muscular na miopatia inflamatória do camundongo mdx.
Contudo, é provável que seja necessário atingir um limiar de atividade e/ou tempo capaz
de quebrar esta homeostase permitindo a indução de uma regeneração mais eficiente
(Osborne-Hereford et al., 2008; van Maanen et al., 2009; van Westerloo et al., 2005).
Neste contexto utilizamos tratamento com nicotina para ativar receptores nicotínicos,
incluindo a nAChRα7 num estágio da doença que antecede o período inflamatório
objetivando reduzir os efeitos deletérios dessa fase que eventualmente repercute
negativamente na evolução da doença. Quando o tratamento foi feito logo após o
desmame (21 dias) foi observado no pico da mionecrose uma redução da inflamação
91
muscular do mdx demonstrada pela diminuição na atividade de MMP-9 e redução nos
níveis de TNFα e NFkB. Este tratamento também aumentou a regeneração muscular
sem alterar a deposição de tecido não-funcional tais como colágeno e fibrose (Leite et
al., 2010b).
O aumento na produção de TNFα e outras citocinas inflamatórias induz a
produção de MMP-9 em parte devido aos sítios de ligação dos fatores de transcrição
NFkB e SP-1 estarem presentes na região promotora do gene da MMP-9 porém ausentes
no gene da MMP-2 (Kherif et al., 1999) explicando portanto, a redução nos níveis de
MMP-9 e a manutenção dos níveis de MMP2. Como a indução das proteínas
inflamatórias MMP-9, TNFα e NFkB estão intimamente relacionadas entre si, é possível
considerar que o tratamento com nicotina reduza os níveis desses mediadores de forma
global. Com a redução da inflamação no microambiente muscular, a regeneração e a
formação de novas miofibras são favorecidas ocasionando aumento na ativação de
MyoD e posterior expressão de miogenina, uma proteína característica da fase final do
estágio de regeneração muscular. Esses dados em conjunto sugerem que a ativação de
receptores nicotínicos possa ser uma nova estratégia para minimizar a lesão e
potencializar a regeneração muscular (Leite et al., 2010b).
O tratamento com nicotina reduziu a inflamação e aumentou a regeneração em
nosso modelo de estudo, entretanto a nicotina pode ativar os diferentes tipos de
receptores nicotínicos gerando respostas não desejadas e efeitos colaterais importantes
quando administrada em doses elevadas. Dentre os efeitos colaterais destaca-se a
oxidação da molécula com abertura do anel, formando 4-(n-metil-n-nitrosamino)-1-(3piridil)-1-butanona
(CETONA)
e
4-(n-metil-n-nitrosamino)-4-(3-piridil)-butanal
(ALDEÍDO), possuindo nitrosamino na estrutura sendo portanto uma forma de
ressonância onde um carbocátion é facilmente doado a uma base nitrogenada do DNA
92
(guanina, citosina, adenina ou timina) causando falha na transcrição e eventualmente
desenvolvendo neoplasia. Neste contexto foi importante determinar se a ativação
seletiva da nAChRα7 no modelo distrófico geraria resultados também positivos no que
tange à inflamação e regeneração muscular, sabendo-se a priori que a sinalização é
específica reduzindo consideravelmente a ativação e alteração de outros mecanismos e
vias indesejáveis. Para tanto foi selecionado o agonista PNU282987 (N-(3R)-1Azabicyclo[2.2.2]oct-3-yl-4-chlorobenzamide) altamente seletivo para a nAChRα7 e
capaz de gerar respostas em neurônios de ratos quando administrado por via endovenosa
na concentração de 1 mg/kg (Hajos et al., 2005).
Os resultados mostram que a administração intraperitoneal do agonista
PNU282987 por 7 dias na concentração de 1 mg/kg /animal praticamente aboliu a
atividade da MMP-9 no soro e reduziu os níveis de atividade no músculo gastrocnêmio
de camundongos mdx. A administração do antagonista do receptor, Citrato de
Metilicaconitina (MLA, 1α,4(S),6β,14α,16β]-20-Ethyl-1,6,14,16-tetramethoxy-4-[[[2(3-methyl-2,5-dioxo-1-pyrrolidinyl)benzoyl]oxy]methyl]aconitane-7,8-diol citrate), na
mesma concentração causou um discreto aumento porém não significativo na atividade
da MMP-9 muscular. Quando o agonista foi administrado juntamente com o antagonista
não foi observada modulação da MMP-9. Resultados semelhantes foram obtidos quando
os níveis de TNFα foram medidos no soro sanguíneo, embora esses níveis no soro do
camundongo mdx sejam naturalmente baixos. Por outro lado, apesar da forma não
ativada da MMP-2 (pro-MMP2) não ter sido alterada no soro e no músculo
gastrocnêmio, sua forma ativada (MMP-2 ativa) aumentou nos animais tratados com o
agonista. Esses dados sugerem que a ativação seletiva da nAChRα7 reduz a sinalização
inflamatória mediada pela MMP-9, enzima que além de ativar o fator de transcrição
inflamatório NFkB e induzir sua própria síntese, ainda induz a produção de TNFα e o
93
deixa maduro após clivagem. Isso explica a redução nos níveis de TNFα e MMP-9 no
soro e MMP-9 no músculo esquelético. Com o conhecimento de que a redução da
inflamação favorece a regeneração muscular e que a atividade da forma ativada da
MMP-2 foi aumentada com o tratamento, é concebível considerar que a ativação
seletiva da nAChRα7 esteja contribuindo direta ou indiretamente para o remodelamento
tecidual. Esta conjectura é reforçada pela diminuição na área de mionecrose e de
infiltrado inflamatório, pelo aumento na área de regeneração e a não-modulação no
conteúdo de colágeno característico de fibrose e tecido muscular não-funcional após o
tratamento. É possível também considerar que a menor infiltração de leucócitos no
tecido muscular após ativação da nAChRα7 se deva à redução da translocação nuclear e
síntese de NFkB e consequente redução na produção de moléculas e receptores de
adesão celular, importantes para a ocorrência da diapedese e migração celular
(Ransohoff et al., 2003; Saeed et al., 2005).
A hipótese de que a nAChRα7 tenha participação relevante como regulador da
inflamação e remodelamento do tecido muscular torna-se consistente porque
camundongos C57BL6 nocautes para nAChRα7 (C57BL6/nAChRα7-/-) submetidos a
lesão muscular com substância miotóxica não apresentaram redução na atividade da
MMP-9 ou modulação das formas pró ou ativada da MMP-2 após tratamento com o
agonista PNU282987. Em contraste, os animais selvagens de mesmo fundo genético
(C57BL6/nAChRα7+/+) submetidos a lesão muscular com substância miotóxica e
tratados com o agonista apresentaram redução na atividade da MMP-9 sem alterar a
forma pro-MMP-2. Contudo a forma ativada da MMP-2 estava aumentada como
observado nos animais distróficos. Estes dados mostram que a ativação da nAChRα7
principalmente nos macrófagos do infiltrado inflamatório e principal fonte produtora de
TNFα e MMP-9 pode ser considerado um potencial alvo de estratégias farmacológicas
94
que visem a redução da inflamação e ativação de mecanismos de remodelamento
muscular reduzindo os efeitos danosos decorrentes da progressão da distrofia muscular
de Duchenne.
Seguindo nesta mesma linha de investigação com o conceito de que a ativação
de mecanismos colinérgicos reduz a inflamação, consideramos estudar o extrato de E.
punicifolia devido dados na literatura demonstrarem ser capaz de restaurar totalmente os
efeitos de alguns antagonistas competitivos nicotínicos colinérgicos como pancurônio e
galamina no modelo experimental de ativação da junção neuromuscular do diafragma
de ratos (Grangeiro et al., 2006). Substâncias naturais têm despertado interesse como
importantes fontes para o desenvolvimento de novas drogas e tratamento de doenças
inflamatórias. Neste contexto foi importante investigar os efeitos do extrato de E.
punicifolia sobre a inflamação no músculo de camundongos mdx e também sobre
apenas as células musculares in vitro, utilizando diferentes frações do extrato de E.
punicifolia. Os experimentos-piloto em ambos os sistemas in vivo e in vitro mostraram
resultados com relevância significativa quando utilizada a fração diclorometânica do
extrato bruto (Leite et al., 2010a); (Leite et al., 2011, artigo aceito para publicação).
O tratamento local do músculo gastrocnêmio com esta fração do extrato
impregnado em polímero de liberação lenta (Elvax) durante 7 dias a partir do desmame
(21 dias pós-natal) até o pico de mionecrose (4 semanas) não alterou os níveis de
atividade das enzimas precursora da acetilcolina (ChAT) e da acetilcolinesterase
(AChE). Esses resultados indicaram que o tratamento com essa fração do extrato não
induziu síntese de acetilcolina ou alterou a atividade da AChE (Leite et al., 2010a) em
contraste com o efeito obtido com extrato bruto aquoso da E. punicifolia que pode ter
ação na ativação de receptores nicotínicos colinérgicos pós-sinápticos ou na inibição da
atividade da AChE (Grangeiro et al., 2006).
95
Por outro lado, a fração diclorometânica do extrato reduziu os níveis protéicos
das formas ativas das citocinas inflamatórias TNFα e IL-1β, do fator de transcrição
NFkB e da atividade das MMPs -9 e -2, embora a MMP-2 seja mais relacionada à
regeneração muscular. Proteínas como estas são consideradas grandes indicadores de
inflamação. O aumento nos níveis de TNFα induz cascatas de sinalização que ativam a I
kappa B cinase (IKK) seguido de fosforilação de proteínas como IkB, ativação e
translocação nuclear do NFkB e subsequente ativação de diversos genes resultando em
indução e amplificação de diversas proteínas inflamatórias (Yoshikawa et al., 2006). A
apoptose também foi reduzida durante o estágio de prevalência de mionecrose no
músculo gastrocnêmio. Esses resultados sugerem que o extrato produza ação inibitória
direta em pelo menos um produto da inflamação o qual possui relação de indução ou
redundância com outros mediadores. Esta hipótese se deve ao fato de todos os
marcadores inflamatórios analisados serem passíveis de estimulação mútua e estarem
com os níveis reduzidos. É plausível considerar que quando um importante componente
de uma alça de indução inflamatória é inibido, resulta em incapacidade de manutenção
dos eventos pró-inflamatórios e redução dos níveis protéicos de todos que compõe esta
alça.
Utilizando diferentes concentrações da fração diclorometânica na ordem de
µg/mL em células mioblásticas C2C12 in vitro, observamos que a proliferação celular
foi inibida de maneira dose-dependente sem afetar a viabilidade mitocondrial e
membranar ou induzir apoptose celular. Os níveis protéicos e a translocação
citoplasmática do HMGB1, potente indutor inflamatório se translocado para o
citoplasma e secretado para o meio extracelular (Lange and Vasquez, 2009), não foram
alterados tanto in vitro quanto no músculo gastrocnêmio do camundongo mdx,
sugerindo que esse mediador inflamatório estava presente dentro da faixa de
96
normalidade no núcleo celular para desempenhar atividade normal na facilitação de
transcrição gênica, manutenção da dinâmica estrutural e reparo de DNA em ambos os
sistemas estudados. Esses dados confirmam que o extrato não induziu morte celular por
necrose. No sistema in vitro, o efeito inibitório ocorreu apenas quando o extrato estava
disponível no meio de cultura, porque quando removido as células voltavam a proliferar
atingindo o status anterior em até 48 hs, sugerindo portanto efeito reversível.
Devido o extrato de E. punicifolia ter inibido a proliferação celular in vitro,
consideramos que o tratamento poderia produzir efeitos inibitórios sobre a via de
sinalização da MAPK, muito importante para a progressão da proliferação. Os
resultados mostraram que o extrato (100 µg/mL) inibiu a proliferação de forma
comparável ao inibidor PD98059 (50 µM), seletivo para a MEK1, reduzindo a
fosforilação da ERK e também a atividade proliferativa. A redução da fosforilação da
ERK também resultou em alteração no seu padrão de imunodetecção. Como proteínas
de
citoesqueleto
possuem
importantes
funções
no
controle
da
sinalização
citoplasmática, transcrição gênica e ciclo celular (Mammoto and Ingber, 2009), talvez
esta alteração possa ter envolvimento na regulação dos eventos supracitados. O efeito
citostático e inibitório sobre a proliferação via MAPK torna-se mais consistente porque
o tratamento das células não alterou os níveis totais ou a translocação do NFkB, fator de
transcrição que também pode estar envolvido na proliferação celular.
O tratamento das células musculares C2C12 in vitro com o extrato de E.
punicifolia causou significativo aumento na atividade das MMPs (Leite et al., 2011,
artigo aceito para publicação). Entretanto, o tratamento local no músculo gastrocnêmio
de camundongos mdx com o extrato reduziu a atividade de ambas MMPs (Leite et al.,
2010a). Esses efeitos paradoxais podem ser pelo fato de que in vivo, o tecido apresenta
uma estrutura organizada formada por uma rede de moléculas de matriz extracelular e
97
células endoteliais vasculares intimamente associadas com diferentes tipos celulares,
como células do sistema imunológico, estromais, musculares e fibroblastos. Estas
células são importantes produtores de MMPs -9 e -2. Por exemplo, a lesão muscular
ativa a migração de células do sistema imunológico para o sítio da lesão que respondem
ao estímulo produzindo MMPs e citocinas inflamatórias. A redução das MMPs -9 e -2
in vivo pode ser atribuída à menor migração de leucócitos e formação de infiltrado
inflamatório no músculo esquelético, dado este apoiado pela forte evidência de que o
extrato inibiu a via da MAPK. Cabe aqui ressaltar que a molécula p38 é a efetora final
da via da MAPK em células imunológicas, sendo ativada para a síntese de citocinas
inflamatórias. Portanto, é possível considerar que a inibição da via da MAPK refletiu
em inibição da p38 nessas células ocasionando a redução de citocinas inflamatórias e
consequentemente MMPs, diferente do que ocorre in vitro com as células C2C12 onde a
MAPK está envolvida com a proliferação celular.
A produção aumentada das MMPs -9 e -2 pelas células mioblásticas C2C12
pode ser interpretada como resultado de respostas adaptativas e indução de
remodelamento tecidual in vivo. As principais evidências após 9 semanas de tratamento
são o aumento dos níveis de miogenina e das áreas de regeneração muscular. O
tratamento com o extrato reduziu os níveis de proteínas indutoras de inflamação,
principalmente TNFα e NFkB, o que pode ter favorecido a transcrição do fator
miogênico MyoD, essencial para a formação de novas fibras musculares (Guttridge et
al., 2000) contribuindo também para um reparo eficiente do tecido muscular. Os
diferentes efeitos entre os sistemas estudados ocorrem provavelmente devido à
produção in vivo de diversos fatores que são secretados no microambiente, promovendo
interações entre células e componentes da matriz extracelular que favorecem o
remodelamento tecidual e inibem a via da MAPK com consequente redução da
98
inflamação no músculo distrófico do camundongo mdx sem afetar a deposição de tecido
não-funcional como colágeno ou induzir fibrose (Leite et al., 2010a).
Os resultados discutidos anteriormente nos levam a considerar que o efeito
inibitório, porém citostático sobre a proliferação celular in vitro poderia estar
influenciando proteínas importantes envolvidas na progressão do ciclo celular. Como os
níveis das proteínas ciclina D1 relacionada com a progressão do ciclo na fase G1
diminuíram, e a p27kip1 inibidora da interação ciclina/CDK durante a fase G1
aumentaram, proteínas estas consideradas essenciais respectivamente para o controle
positivo e negativo do ciclo celular, podemos sugerir que o extrato de E. punicifolia
esteja inibindo a proliferação celular na fase G1 do ciclo através da regulação dessas
proteínas. Além do equilíbrio entre essas proteínas no controle do ciclo celular, a
ativação da via PI3K/Akt nas células C2C12 também age como regulador negativo da
proliferação. Os resultados mostraram aumento da forma fosforilada da Akt, estando em
consonância com os dados anteriores. A fosforilação da Akt2 inicia um programa de
diferenciação nas células C2C12 reduzindo a meia vida do mRNA da ciclina D1,
contribuindo para a mudança no fenótipo de proliferação para diferenciação celular
(Gherzi et al., 2010). Além disso, a ubiquitinação da ciclina D1 seguida de proteólise é
acelerada pela ativação da via da Akt em células NIH-3T3 (Diehl et al., 1998) e C2C12
(Yang et al., 2007). Em geral, o bloqueio da proliferação de mioblastos coincide com a
ativação de um programa de diferenciação para a formação do miotubo.
O efeito do aumento nos níveis da pAkt e produção das MMPs -9 e -2 com o
tratamento do extrato de E. punicifolia indica um possível papel na ativação inicial de
um programa de diferenciação das células C2C12. Esta hipótese se deve ao fato do
tratamento não ter alterado os níveis e localização nuclear da miogenina, considerado
um marcador de diferenciação muscular de fase tardia (Spassov et al., 2011). Em suma,
99
esses resultados sugerem que a fração estudada do extrato iniba a via da MAPK sem
induzir apoptose ou necrose celular, produzindo um efeito músculo-protetor ativando
mecanismos relacionados com o remodelamento tecidual.
O desenvolvimento de estratégias que atenuam ou interrompem a inflamação,
seja ela muscular ou não são muito importantes e de grande interesse para aumentar a
expectativa e qualidade de vida de indivíduos acometidos por doenças inflamatórias
degenerativas como a distrofia muscular de Duchenne. Os trabalhos apresentados nesta
tese de doutorado foram desenvolvidos seguindo um objetivo principal: Estudar o
suposto envolvimento da ativação de mecanismos nicotínicos colinérgicos na inibição
da inflamação utilizando estratégias farmacológicas em camundongos mdx com
distrofia muscular de Duchenne. Este propósito nos motivou a investigar a ativação
seletiva da nAChRα7 como estratégia antinflamatória a fim de minimizar os efeitos
deletérios da inflamação muscular. Nossos resultados mostram que não só a inflamação
foi controlada como houve ativação de mecanismos de regeneração e reparo tecidual
mais efetivo.
Seguindo neste racional e buscando utilizar produtos naturais da flora brasileira
que exibissem atividade pró-colinérgica como nova ferramenta para a redução da
inflamação, investigamos os efeitos da fração diclorometânica do extrato de E.
punicifolia. Apesar de não detectarmos efeitos colinérgicos nesta fração do extrato, os
resultados nos indicaram um potente efeito antiinflamatório que favoreceu também a
regeneração muscular e o reparo tecidual através de um mecanismo ainda desconhecido.
Torna-se relevante caracterizar e isolar substâncias bioativas do extrato de E. punicifolia
para que sejam aplicadas futuramente em pacientes com distrofia muscular de
Duchenne ou outras desordens inflamatórias. É possível também considerar que as
estratégias apresentadas possam ser utilizadas com a finalidade de a inflamação ser
100
regulada para que outras terapias associadas, como a terapia celular e gênica sejam
potencializadas visando o restabelecimento da função muscular, qualidade e expectativa
de vida dos pacientes.
101
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