1 - CIAT

IDENTIFICACION
IDENTIFICACION DE
DE GENES
GENES
ANALOGOS
ANALOGOS DE
DE RESISTENCIA
RESISTENCIA A
A
ENFERMEDADES
ENFERMEDADES EN
EN YUCA
YUCA
Germán Llano
Septiembre 27 de 2006
Enfermedades de Yuca
Phytophthora spp. (PRP)
Xanthomonas
axonopodis (Xam)
Genes de Resistencia a
Enfermedades
LRR
LRR
LRR
LRR
Ext
Ext
TM
Citop
Citop
LZ
LZ
TIR
TIR
NBS
NBS
NBS
NBS
LRR
LRR
LRR
LRR
RPS2
RPS2
Arabidopsis
Arabidopsis
L6
L6
Lino
Lino
Proteina
Proteina kinasa
kinasa
serina/treonina
serina/treonina
Carboxi-terminal
Carboxi-terminal
Kinasa
Kinasa
Xa
Xa 21
21
Arroz
Arroz
Pto
Pto
Tomate
Tomate
LZ
LZ :: cierre
cierre de
de leucina
leucina
NBS
NBS :: Sitio
Sitio de
de unión
unión de
de nucleótidos
nucleótidos
LRR
LRR :: Repeticiones
Repeticiones ricas
ricas en
en leucina
leucina
Fuente:
Fuente: Hurtado
Hurtado 2003
2003
TM
TM :: Región
Región transmembrana
transmembrana
Objetivo
Objetivo
Identificar genes análogos de
resistencia asociados a
enfermedades en yuca
RGAs: Secuencias que codifican motivos internos
conservados en proteínas de resistencia
METODOLOGIA
METODOLOGIA
PCR Inespecífico (1)
Evaluación
fenotípica en
en población
población segregante
segregante
Evaluación fenotípica
PCR
PCR con
con cebadores
cebadores degenerados
degenerados
en
en genotipos
genotipos resistentes
resistentes
Clonación
Clonación de
de fragmentos
fragmentos
Secuenciación.
Secuenciación. Análisis
Análisis de
de homologías
homologías
yy ORF
ORF
Diseño
Diseño de
de cebadores
cebadores específicos
específicos
PCR Inespecífico (2)
Análisis
Análisis de
de grupos
grupos segregantes
segregantes
Electroforesis
Electroforesis SSCP
SSCP
Digestión
Digestión de
de los
los productos
productos PCR
PCR
Polimorfismo
Polimorfismo en
en nucleótidos
nucleótidos simples
simples
Asociación
Asociación entre
entre marcadores
marcadores RGA
RGA yy datos
datos
fenotípicos
fenotípicos de
de resistencia
resistencia
1. Evaluación de Resistencia
Dos
Dos poblaciones
poblaciones evaluadas:
evaluadas:
K
K (MNGA
(MNGA 2
2 xx CM
CM 2177-2)
2177-2)
CM
CM 9582
9582 (MBRA
(MBRA 1045
1045 xx MCR
MCR 81)
81)
3 especies de Phytophthora:
P. palmivora (P4)
P. melonis (P12)
P. tropicalis (44)
Slide 4*
Evaluación de Resistencia
Inoculación
Inoculación de
de raíz
raíz entera
entera yy cilindros
cilindros
88 mm
mm
15 mm
•• Evaluación:
Evaluación: 5
5 ddi
ddi
•• Area/volumen
Area/volumen de
de raíz
raíz afectada
afectada
2
2.
2. Cebadores
Cebadores Degenerados
Degenerados
NBS (Yu et al 1998 - R. Nelson – CIP):
5’-GGAATGGGNGGNGTNGGNAARAC5’-GGAATGGGNGGNGTNGGNAARAC- 3’
3’
5’-YCTAGTTGTRAYDATDAYYYTRC5’-YCTAGTTGTRAYDATDAYYYTRC- 3’
3’
N/I:
N/I:
D:
D:
R:
R:
Y:
Y:
A
A –– C
C –– G
G –– T
T
A
A –– G
G –– T
T
A
A –– G
G
C
C –– T
T
NBS (S. Hulbert - KSU):
5’-GGIGGIGTIGGIAAIACIAC-3’
5’-GGIGGIGTIGGIAAIACIAC-3’ (S2
(S2 –– Leister
Leister et
et al
al 1996)
1996)
5’-ARIGCTARIGGIARICC-3’
5’-ARIGCTARIGGIARICC-3’
Resistentes:
Resistentes: MBRA
MBRA 532,
532, MBRA
MBRA 1045,
1045, MCR
MCR 81
81
Temperatura
Temperatura hibridación:
hibridación: 45°C
45°C
2
2
2*
Cebadores
Cebadores específicos
específicos
Pto (Leister et al 1996 - R. Nelson – CIP):
5’-ATGGGAAGCAAGTATTCAA
5’-ATGGGAAGCAAGTATTCAA GGC-3’
GGC-3’
5’-TTGGCACAAAATTCTCATCAAGC-3’
5’-TTGGCACAAAATTCTCATCAAGC-3’
X-LRR: De RPS2
RPS2 y
y Xa
Xa 21
21 (Chen
(Chen et
et al
al 1998)
1998)
Wound-Kinasa: Región conservada de MAK kinasa de perejil,
tabaco, arabidopsis y alfalfa (Ligterink et al 1997)
Temperatura hibridación: 45°C
3.
3. Clonación
Clonación
Amplificado con
PCR inespecífico
Plásmido
Plásmido
Recombinante
Plásmido PGEM-T Easy
E. Coli - DH5-α
Electroporación 2.4 KV/cm2
Bacteria
Secuenciación
Secuenciación de
de Clones
Clones
Fluorescencia
Fluorescencia
dideoxy
dideoxy terminator
terminator
•• ADN
ADN de
de plásmidos
plásmidos
•• T7
T7 yy SP6
SP6
Análisis
Análisis y
y Uso
Uso de
de las
las Secuencias
Secuencias
Base
Base de
de datos
datos GenBank
GenBank (ncbi)
(ncbi)
Homología
Homología con
con genes
genes de
de resistencia
resistencia
(Blast
(Blast xx -- proteínas)
proteínas)
Marco
Marco abierto
abierto de
de lectura
lectura (ORF
(ORF –– ATG/TGA-TAG)
ATG/TGA-TAG)
Slide 4*
Análisis
Análisis y
y Uso
Uso de
de las
las Secuencias
Secuencias
• Alineamiento de secuencias de aminoácidos
• Arbol filogenético, mediante DNAman
parsimonia y bootstrap - 1000 réplicas
Diseño de cebadores (Primer3)
• 18 – 22 bases
• 50% G y C
• Temperatura fusión > 59°C
• Diferencia de T° < 1°C entre cebadores
Slide 6*
Amplificación
Amplificación PCR
PCR Específico
Específico
• Análisis de grupos segregantes
Grupos
10 resistentes
10 susceptibles
•• Temperatura
Temperatura hibridación
hibridación
N-23
57°C
N-23 ::
57°C aa 62°C
62°C
N-33
N-33 yy N-37:
N-37: 54°C
54°C aa 58
58 °C
°C
N-38:
N-38:
60°C
60°C
Identificación
Identificación de
de Polimorfismos
Polimorfismos
• Agarosa 1.8% y Poliacrilamida 6%
• PCR-RFLP: Alu I, Dra I ,Taq I,
EcoR I, Msp I, Hind III
• SSCP:
Gel poliacrilamida 10%
no denaturante
• SNPs (Secuenciación)
RESULTADOS
Evaluación de Resistencia
P. tropicalis (44)
P. melonis (P12)
P. palmivora (P4)
Control
Evaluación de Resistencia
Familia CM 9582
Familia K
MBRA
MBRA 1045
1045
CM
CM 2177-2
2177-2
MNGA
MNGA 22
MCR
MCR 81
81
Frecuencia de Individuos de Acuerdo
a Resistencia a Phytophthora spp.
Familia
Familia K
K (126)
(126)
CM
CM 9582
9582 (84)
(84)
60
60
40
40
30
30
P4
P4
P12
P12
44
44
20
20
10
10
00
RR
MR
II
SS
MR
Nivel
Nivel de
de resistencia
resistencia
Pr
Pr >> F
F == 0.01%
0.01%
AS
AS
Frecuencia %
%
Frecuencia
Frecuencia %
%
Frecuencia
50
50
90
90
80
80
70
70
60
60
50
50
40
40
30
30
20
20
10
10
00
RR
MR
II
SS
MR
Nivel
Nivelde
deresistencia
resistencia
Pr
Pr >> F
F == 0.05%
0.05%
P4:
P4: P.
P. palmivora;
palmivora; P12:
P12: P.
P. melonis;
melonis; 44:
44: P.
P. tropicalis
tropicalis
AS
AS
50
50
100
100
50
50
100
100
rNS347
rNS347
rNS10
rNS10
50
50
SSRY90
SSRY90
σσ22== 7.3%
7.3%
P12
P12
rSSRY3
rSSRY3
SSRY13
SSRY13
rSSRY19
rSSRY19
O
O
cM
cM
00
rNS92
rNS92
SSRY23
SSRY23
50
50
rAM18
rAM18
K16d
K16d
NS384
NS384
NS189
NS189
NS995
NS995
100
100
150
150
GY137
GY137
rAB9a
rAB9a
G
G
P12
P12
rGY220
rGY220
rSSRY22
rSSRY22
CPY79(15)
CPY79(15)
150
150
P4
P4
GLU
GLU
44
44
P4
P4
cM
cM
rP1a
rP1a
rGY156
rGY156
E
E
00
00
rHRGP
rHRGP
rGY118
rGY118
rF19b
rF19b
rS2
rS2
GY217
GY217
rNS74
rNS74
rNS260
rNS260
rNS319
rNS319
rNS217
rNS217
rSSRY319
rSSRY319
rGY176
rGY176
CBB4
CBB4
44
44
00
cM
cM
σσ22== 0.2%
0.2%
σσ22== 8.3%
8.3%
44
44
P4
P4
P12
P12
cM
cM
44
44
P4
P4
P12
P12
QTLs Asociados a Resistencia a PRP
GY8
GY8
GY16
GY16
OJ1
OJ1
SSRY2
SSRY2
NS340
NS340
SSRY4
SSRY4
rGY17
rGY17
rGY104
rGY104
GY12
GY12
rGY211
rGY211
rSSRY32
rSSRY32
SSRY17
SSRY17
SSRY63
SSRY63
SSRY16
SSRY16
SSRY191
SSRY191
GY14
GY14
rGY3
rGY3
rGY135
rGY135
Significancia
Significancia (P)
(P)
<< 0.0010
0.0010
<< 0.0050
0.0050
<< 0.0100
0.0100
<< 0.0500
0.0500
No
Nosignificativo
significativo
Efecto
Efecto adicional
adicional del
del padre
padre
H
H
σσ22== 1.6%
1.6%
QTLs Asociados a Resistencia a PRP
Fuente: Llano 2003; Loke 2004
Especie
Especie
P.
P. palmivora
palmivora
P.
P. melonis
melonis
P.
P. tropicalis
tropicalis
11 Mapa
Mapa
G.
G. ligamiento
ligamiento
O
O11
H
H11
C
C11
E
E11
H
H11
J
J11
J
J11
N
N11
Q
Q11
V
V11
V
V11
A
A22
D
D22
II22
II22
M
M22
N
N22
Marcador
Marcador
rP1a
rP1a
rGY
rGY 170
170
rGY
rGY 172
172
rNS
rNS 217
217
SSRy
SSRy 178
178
CDY
CDY 76
76
K2a
K2a
SSRy
SSRy 13
13
SSRy
SSRy 911
911
NS
NS 911
911
GY
GY 153
153
rGY
rGY 32
32
SSRy
SSRy 313
313
SSRy
SSRy 51
51
GY
GY 88
88
SSRy
SSRy 299
299
SSRy
SSRy 105
105
%
% Varianza
Varianza33
8.3
8.3
1.6
1.6
5.4
5.4
7.3
7.3
1.3
1.3
4.0
4.0
8.6
8.6
4.2
4.2
5.7
5.7
9.0
9.0
4.5
4.5
11.0
11.0
3.4
3.4
5.7
5.7
3.3
3.3
3.4
3.4
4.8
4.8
de
de la
la madre;
madre; 22 Mapa
Mapa del
del padre;
padre; 33 Varianza
Varianza explicada.
explicada.
AMPLIFICACION INESPECIFICA
PCR Cebadores Degenerados
NBS
NBS
11 22 C
C 11 11 22
Pto
XLRR
Pto
XLRR
22 11 11 100
100 pb
pb M
M 33 11 44 A
A
W-Kinasa
W-Kinasa
M
M 33 11 44 A
A
600
600 pb
pb
600
600 pb
pb
1=
1= MCR
MCR 81;
81; 2=
2= MBRA
MBRA 1045;
1045; 3=
3= CM
CM 6438-14;
6438-14; 4=
4= MNGA
MNGA 19;
19;
M=
M= Maíz;
Maíz; A=
A= Arroz,
Arroz, C=
C= Control.
Control.
Clones Aislados
N-23
N-23
400
400 pb
pb
N-33
N-33
390
390 pb
pb
N-37
N-37
380
380 pb
pb
N-38
N-38
K-1
K-1
690
690 pb
pb 480
480 pb
pb
Clonación de Fragmentos NBS y Pto
30
30 clones
clones obtenidos
obtenidos de
de genotipos
genotipos
resistentes
resistentes aa PRP
PRP en
en campo
campo
Cebador
Cebador
NBS
NBS
NBS
NBS
NBS
NBS
NBS
NBS (KSU)
(KSU)
Pto
Pto
Genotipo
Genotipo
MBRA
MBRA 1045
1045
MCR
MCR 81
81
MBRA
MBRA 532
532
MBRA
MBRA 532
532
MBRA
MBRA 1045
1045
Clones
Clones
15
15
11
11
1
1
1
1
2
2
Tamaño
Tamaño de
de insertos:
insertos: 380
380 aa 1200
1200 pb
pb
Clonación de Fragmentos NBS y Pto
72
72 clones
clones obtenidos
obtenidos de
de genotipos
genotipos
resistentes
resistentes aa Xam
Xam en
en campo
campo
Genotipo
Genotipo
CM
CM 3311-4
3311-4
CM
CM 6438-14
6438-14
CM
CM 7772-13
7772-13
M
M NGA
NGA 19
19
GM
GM 315
315
Totales
Totales
Cebador
Cebador
NBS
NBS Pto
Pto LRR
LRR W-Kin
W-Kin
2
10
2
7
2
10
2
7
2
0
7
1
2
0
7
1
1
0
4
1
1
0
4
1
3
4
11
3
3
4
11
3
1
2
8
3
1
2
8
3
9
9
16
16
32
32
15
15
Tamaño
Tamaño de
de insertos:
insertos: 350
350 aa 1200
1200 pb
pb
Fuente:
Fuente: Hurtado
Hurtado 2003
2003
Secuenciación
Selección
Selección por:
por: cebador,
cebador, tamaño
tamaño diferente
diferente
Clon
ClonK-1
K-1(496
(496pb)
pb)
Sequencher
Sequencher 4.1
4.1
11 GGGGGGGTGGGGAAGACGACTTTTATACCAAGGATATATGCGGCCTCCCCCTAGCCCTAG
GGGGGGGTGGGGAAGACGACTTTTATACCAAGGATATATGCGGCCTCCCCCTAGCCCTAG
61
CCTGGGGGGGTGGGGAAGACSACCATTGCAAGAGCTTAATACAATTCCGTATCTTATCAT
61 CCTGGGGGGGTGGGGAAGACSACCATTGCAAGAGCTTAATACAATTCCGTATCTTATCAT
121
121CAGTTTGAGGGTAAGGCCTTCCTTTCCAGTGTTAGAGAAGTTTCATCTAAAGGTGGCCTA
CAGTTTGAGGGTAAGGCCTTCCTTTCCAGTGTTAGAGAAGTTTCATCTAAAGGTGGCCTA
181
GTCTCTTTACAAGAACAACTTCTTTCAGAAATTCTTACGGAGAAAAGGGTTAAAATATGG
181 GTCTCTTTACAAGAACAACTTCTTTCAGAAATTCTTACGGAGAAAAGGGTTAAAATATGG
241
241AATATATATAATGGAATGGACATGATAAAAAGGAAGCTTCGCTTCAAAAGGGTCTTGATT
AATATATATAATGGAATGGACATGATAAAAAGGAAGCTTCGCTTCAAAAGGGTCTTGATT
301
301GTTATGGATGATGTGAATGAACTAAATCAGTTGCAAAAACTAGCCGGAAAAAATGATTGG
GTTATGGATGATGTGAATGAACTAAATCAGTTGCAAAAACTAGCCGGAAAAAATGATTGG
361
361TTTGGCCCAGGGAGTAGAATTCTTATCACTACTAGAGATGAGCATTTGCTTAATGGTCAT
TTTGGCCCAGGGAGTAGAATTCTTATCACTACTAGAGATGAGCATTTGCTTAATGGTCAT
421
GGAGTGGATCAAATATACAAGGCTAAAGGACTAGATGATATTGAAGGCCTTCAACTTTTA
421 GGAGTGGATCAAATATACAAGGCTAAAGGACTAGATGATATTGAAGGCCTTCAACTTTTA
481
481AGTCTAAGGGCCTTCC
AGTCTAAGGGCCTTCC
Homologías en GenBank – NCBI
homólogos
homólogos con
con Proteínas-R:
Proteínas-R:
•• De
De resistentes
resistentes aa PRP:
PRP: 5
5
•• De
De resistentes
resistentes aa Xam:
Xam: 15
15
Secuencias
Secuencias con
con alineamientos
alineamientos significativos:
significativos:
Puntaje
Puntaje
(bits)
(bits)
AF516642
AF516642 putative
putative disease
disease resistance
resistance 146
146
AF325686
AF325686 putative
putative disease
disease resistance
resistance 142
142
Valor
Valor
E
E
1e-34
1e-34
2e-33
2e-33
Marco Abierto de Lectura (ORF)
Codón
Codón inicio:
inicio: atg
atg (metionina)
(metionina) Codones
Codones parada:
parada: tga,
tga, taa,
taa, tag
tag
N-33 (152 aminoácidos)
44 atg
atg gga
gga
MM
GG
49
49 gaa
gaa gcc
gcc
EE
AA
94
94 gat
gat gat
gat
DD
DD
139
139 ttt
ttt ggg
ggg
FF
GG
184
184 aga
aga ttg
ttg
RR
LL
229
229 gat
gat gac
gac
DD
DD
274
274 ggg
ggg ccy
ccy
GG
PP
319
319 mct
mct agr
agr
XX
RR
364
364 tnt
tnt ggg
ggg
XX
GG
409
409 tat
tat atg
atg
YY
MM
454
454 tcy
tcy gtg
gtg
SS
VV
ggg
ggg
GG
aaa
aaa
KK
ttt
ttt
FF
ggr
ggr
GG
aag
aag
KK
ctt
ctt
LL
ttt
ttt
FF
aat
aat
NN
ana
ana
XX
gnc
gnc
XX
tga
tga
**
gtg
gtg
VV
ctg
ctg
LL
gac
gac
DD
rat
rat
XX
gaa
gaa
EE
tgg
tgg
WW
gaa
gaa
EE
cmc
cmc
XX
gcn
gcn
AA
ccy
ccy
PP
462
462
gga
gga
GG
aac
aac
NN
gtt
gtt
VV
ttt
ttt
FF
aag
aag
KK
aat
aat
NN
wwt
wwt
XX
tnt
tnt
XX
ccc
ccc
PP
caa
caa
QQ
aag
aag
KK
ttt
ttt
FF
ttc
ttc
FF
gat
gat
DD
ctk
ctk
LL
gar
gar
EE
ggg
ggg
GG
ttg
ttg
LL
mmc
mmc
XX
wag
wag
XX
aca
aca
TT
gat
gat
DD
ara
ara
XX
ggc
ggc
GG
tcc
tcc
SS
aag
aag
KK
gca
gca
AA
aat
aat
NN
ccs
ccs
PP
ctt
ctt
LL
act
act
TT
tta
tta
LL
atc
atc
II
aaa
aaa
KK
cat
cat
HH
twt
twt
XX
aga
aga
RR
tnn
tnn
XX
gtt
gtt
VV
kgc
kgc
XX
tta
tta
LL
acg
acg
TT
tcc
tcc
SS
rat
rat
XX
aar
aar
KK
gag
gag
EE
gga
gga
GG
cgg
cgg
RR
gga
gga
GG
sta
sta
XX
gct
gct
AA
gct
gct
AA
caa
caa
QQ
ttg
ttg
LL
aaa
aaa
KK
grt
grt
XX
asc
asc
XX
ccn
ccn
PP
tgc
tgc
CC
atc
atc
II
cag
cag
QQ
tgg
tgg
WW
acg
acg
TT
aat
aat
NN
ttt
ttt
FF
tgg
tgg
WW
mgg
mgg
RR
cct
cct
PP
nta
nta
XX
atg
atg
MM
ctt
ctt
LL
gtt
gtt
VV
att
att
II
ttg
ttg
LL
ttg
ttg
LL
aat
aat
NN
gta
gta
VV
gca
gca
AA
nct
nct
XX
ggc
ggc
GG
cty
cty
LL
tta
tta
LL
ttc
ttc
FF
ctt
ctt
LL
att
att
II
cyy
cyy
XX
atc
atc
II
ggt
ggt
GG
nga
nga
XX
ata
ata
II
ttt
ttt
FF
ktt
ktt
XX
cag
cag
QQ
yaa
yaa
XX
gkc
gkc
XX
ttt
ttt
FF
ntt
ntt
XX
cna
cna
XX
gtn
gtn
VV
gct
gct
AA
aat
aat
NN
ggk
ggk
GG
tgg
tgg
WW
gta
gta
VV
cyg
cyg
XX
ygn
ygn
XX
ccm
ccm
PP
cca
cca
PP
tty
tty
FF
gtt
gtt
VV
NCBI:
NCBI: www.ncbi.nlm.nih.gov
www.ncbi.nlm.nih.gov
Análisis de Alineamiento Múltiple
Motivo
Motivo
RGA/gen
RGA/gen
P-loop
P-loop
N33
N33
N37
N37
N38
N38
K1
K1
P-loop*
P-loop*
RNBSA*
RNBSA*
L6
L6
RPP5
RPP5
RPS2
RPS2
Mi
Mi
AA
AA
RNBS-A
RNBS-A
MGGVGKTTLAQLLFNEAKLN..FDLTAW..VLXGDDFDV.
MGGVGKTTLAQLLFNEAKLN..FDLTAW..VLXGDDFDV.
MGGVGKTTLAQLVYNDPMLE..FDLKAW..VSVGEDFDV.
MGGVGKTTLAQLVYNDPMLE..FDLKAW..VSVGEDFDV.
........................................
........................................
........................................
........................................
.GGVGKTTVAQLVYNDPRIV....................
.GGVGKTTVAQLVYNDPRIV....................
....................SKFDVKAWICVSEEFDFNV.
....................SKFDVKAWICVSEEFDFNV.
.GGIGKTTTAKAVYNKISSCFDCCCFIDNIRETQEKDGVV
.GGIGKTTTAKAVYNKISSCFDCCCFIDNIRETQEKDGVV
.SGIGKSTIGRALFSQLSSQFHHRAFLTYKSTSGSDVSGM
.SGIGKSTIGRALFSQLSSQFHHRAFLTYKSTSGSDVSGM
.GGVGKTTLMQSINNELITKGHQYDVLIWVQMSREFGECT
.GGVGKTTLMQSINNELITKGHQYDVLIWVQMSREFGECT
..GSGKTTLAYKVYNDKSVSRHFDLRAW..CTVDQGYDD.
..GSGKTTLAYKVYNDKSVSRHFDLRAW..CTVDQGYDD.
DNAman
DNAman 4.13
4.13
35
35
35
35
00
00
19
19
19
19
38
38
39
39
39
39
35
35
** RGA
RGA de
de soya
soya NBSD-H1
NBSD-H1 (Peñuela
(Peñuela et
et al,
al, 2002)
2002)
Análisis de Alineamiento Múltiple
RGA/gen
RGA/gen
Motivo
Motivo
AA
AA
Kin-2
Kin-2
N33
LIX........XDDLWNEKXEXWNXFXGPFEXGARGXRVI
N33
LIX........XDDLWNEKXEXWNXFXGPFEXGARGXRVI
N37
N37 (no
(no TIR)
TIR) LVV........LDDVWTQNYEEWALFWGPFEAGAPQSKII
LVV........LDDVWTQNYEEWALFWGPFEAGAPQSKII
N38
VMDDVNELNQLQK.LAGKNDWFGPGSRILITTRDEHLLNG
N38 (TIR)
(TIR)
VMDDVNELNQLQK.LAGKNDWFGPGSRILITTRDEHLLNG
K1
VMDDVNELNQLQK.LAGKNDWFGPGSRILITTRDEHLLNG
K1 (TIR)
(TIR)
VMDDVNELNQLQK.LAGKNDWFGPGSRILITTRDEHLLNG
Kin2*
LLV........LDDVWNESRPKWKLCRMLLFAE.......
Kin2*
LLV........LDDVWNESRPKWKLCRMLLFAE.......
L6
V.V........LDDVDEKFKFEDMLGSPKDISQSRFIITS
L6 (TIR)
(TIR)
V.V........LDDVDEKFKFEDMLGSPKDISQSRFIITS
RPP5(TIR)
LLDDVDN.LEFLKTLVGKAEWFGSGSRIIVITQDRQLLKA
RPP5(TIR)
LLDDVDN.LEFLKTLVGKAEWFGSGSRIIVITQDRQLLKA
RPS2(no
RPS2(no TIR)
TIR) RALRQKRFLLLLDDVWEEIDLEKTGVPRPDRENKCKVMFT
RALRQKRFLLLLDDVWEEIDLEKTGVPRPDRENKCKVMFT
Mi
Mi (no
(no TIR)
TIR) LIV........LDDVWDTTTLDELTR..PFPEAKKGSRII
LIV........LDDVWDTTTLDELTR..PFPEAKKGSRII
DNAman
DNAman 4.13
4.13
103
103
103
103
54
54
54
54
46
46
109
109
119
119
106
106
102
102
TIR:
TIR: LDDVD
LDDVD (A.
(A. Aspártico)
Aspártico)
No
No TIR:
TIR: LDDVW
LDDVW (Triptófano)
(Triptófano)
** RGA
RGA de
de soya
soya NBSD-H1
NBSD-H1 (Peñuela
(Peñuela et
et al,
al, 2002)
2002)
Análisis de Alineamiento Múltiple
RGA/gen
RGA/gen
Motivo
Motivo
AA
AA
RNBS-B/Kin3
RNBS-B/Kin3
N38
HGVDQISKAKGLDDIEGLQLLSLRAFQNHHPSKEYMGLSC
N38
HGVDQISKAKGLDDIEGLQLLSLRAFQNHHPSKEYMGLSC
K1
HGVDQIYKAKGLDDIEGLQLLSLRAF..............
K1
HGVDQIYKAKGLDDIEGLQLLSLRAF..............
RNBSB/Kin3*......................LRAVRSLSQHAVRKLLL.
RNBSB/Kin3*......................LRAVRSLSQHAVRKLLL.
L6
RSMRVLGTLNENQCKLYEVGSMSKPRSLELFSKHAFKKNT
L6
RSMRVLGTLNENQCKLYEVGSMSKPRSLELFSKHAFKKNT
RPP5
HEIDLVYEVKLPSQGLALKMISQYAFGKDSPPDDFKELAF
RPP5
HEIDLVYEVKLPSQGLALKMISQYAFGKDSPPDDFKELAF
RPS2
TRSIALCNNMGAEYKLRVEFLEKKHAWELFCSKVWRKDLL
RPS2
TRSIALCNNMGAEYKLRVEFLEKKHAWELFCSKVWRKDLL
Mi
LTTREKEVALHGKLNTDPLDLRLLRPDESWELLDKRTFGN
Mi
LTTREKEVALHGKLNTDPLDLRLLRPDESWELLDKRTFGN
DNAman
DNAman 4.13
4.13
94
94
80
80
17
17
149
149
159
159
146
146
142
142
** RGA
RGA de
de soya
soya NBSD-H1
NBSD-H1 (Peñuela
(Peñuela et
et al,
al, 2002)
2002)
Análisis de Alineamiento Múltiple
RGA/gen
RGA/gen
Motivo
Motivo
AA
AA
RNBS-C/GLPL
RNBS-C/GLPL
N38
N38
RNBSC-GLPL*
RNBSC-GLPL*
L6
L6
RPP5
RPP5
RPS2
RPS2
Mi
Mi
..........KVVDYANGLPLALALALASP...
..........KVVDYANGLPLALALALASP...
LNQECNDIAMKIVEKCRGLPLA..
LNQECNDIAMKIVEKCRGLPLA..
PPSYYETLANDVVDTTAGLPLT..
PPSYYETLANDVVDTTAGLPLT..
EVAEL..........VGSLPLG..
EVAEL..........VGSLPLG..
ESSSIRRLAEIIVSKCGGLPLA..
ESSSIRRLAEIIVSKCGGLPLA..
ESCPDELLDVGKEIAENCKGLPLV
ESCPDELLDVGKEIAENCKGLPLV
DNAman
DNAman 4.13
4.13
114
114
54
54
171
171
171
171
168
168
166
166
** RGA
RGA de
de soya
soya NBSD-H1
NBSD-H1 (Peñuela
(Peñuela et
et al,
al, 2002)
2002)
Arbol Fenológico de RGAs de yuca
0.05
X18
78
99
X19
XLRR
XLRR
X17
X1
93
53
47
X9
Marcador RGA (XLRR) Lycopersicon hirsutum
X5
25
X15
Proteína R (NBS- LRR) Triticum aestivum
84
NBS
NBS
N31
99
99
Proteína R (NBS) Glycine max
W5
72
W9
68
62
99
Wound-Kinase
Wound-Kinase
W10
100
57
W6
100
P32
P41
100
Pto-Kinase
Pto-Kinase
Kinasa serina/treonina (like Pto)
- um
Solanum tuberos
Proteína Kinasa (PtoR) Lycopersicon pimpinellifolium
P36
DNAman
DNAman 4.13.
4.13. Parsimonia
Parsimonia (PAUP).
(PAUP). Bootstrap
Bootstrap 1000
1000 réplicas
réplicas
Arbol Fenológico de RGAs de yuca
Clase NBS
0.05
0.05
NBSD-H1
NBSD-H1 Soya
Soya
N-37
N-37 (no
(no TIR)
TIR)
AF402735-1
AF402735-1 Cacao
Cacao
Mi
Mi
RPS2
RPS2 (no
(no TIR)
TIR)
48
48
98
98
83
83
99
99
99
99
95
95
100
100
77
77
L6
L6 (TIR)
(TIR)
N-38
N-38 (TIR)
(TIR)
100
100
K-1
K-1 (TIR)
(TIR)
AF515627-1
AF515627-1 Manzano
Manzano
RPP5
RPP5 (TIR)
(TIR)
AF487946-1
AF487946-1 Alfalfa
Alfalfa
AF516642-1
AF516642-1 Manzano
Manzano
N-33
N-33
DNAman
DNAman 4.13.
4.13. Parsimonia
Parsimonia (PAUP).
(PAUP). Bootstrap
Bootstrap 1000
1000 réplicas
réplicas
Diseño de Cebadores
Cebador N-38
1
1 AGGGCTAGGGGGAGGCCAGGGCTAGGGCTAGGGCTAGGGGGAGGCCATTGGCGTAATCTA
AGGGCTAGGGGGAGGCCAGGGCTAGGGCTAGGGCTAGGGGGAGGCCATTGGCGTAATCTA
61
61 CCACCTTACATGACAACCCCATATATTCTTTTGAAGGATGGTGATTTTGGAAGGCCCTTA
CCACCTTACATGACAACCCCATATATTCTTTTGAAGGATGGTGATTTTGGAAGGCCCTTA
121
GACTTAAAAGTTGAAGGCCTTCAATATCATCTAGTCCTTTAGCCTTGGATATTTGATCCA
121 GACTTAAAAGTTGAAGGCCTTCAATATCATCTAGTCCTTTAGCCTTGGATATTTGATCCA
181
181 CTCCATGACCATTAAGCAAATGCTCATCTCTAGTAGTGATAAGAATTCTACTCCCTGGGC
CTCCATGACCATTAAGCAAATGCTCATCTCTAGTAGTGATAAGAATTCTACTCCCTGGGC
241
241 CAAACCAATCATTTTTTCCGGCTAGTTTTTGCAACTGATTTAGTTCATTCACATCATCCA
CAAACCAATCATTTTTTCCGGCTAGTTTTTGCAACTGATTTAGTTCATTCACATCATCCA
301
301 TAACAATCAAGACCCTTTTGAGGCGAAGCTTCCTTTTTATCATGTCCATTCCATTATATA
TAACAATCAAGACCCTTTTGAGGCGAAGCTTCCTTTTTATCATGTCCATTCCATTATATA
361
361 TATTCCATATTTTAACCCTTTTCTCCGTAAGAATTTCTGAAAGAAGTTGTTCTTGTAAAG
TATTCCATATTTTAACCCTTTTCTCCGTAAGAATTTCTGAAAGAAGTTGTTCTTGTAAAG
421
AGACTAGGCCACCTTTAGATGAAACTTTCAMTAAACACTGGGAAAGGAAGGCYC
421 AGACTAGGCCACCTTTAGATGAAACTTTCAMTAAACACTGGGAAAGGAAGGCYC
Adelante:
Adelante: 5’–
5’– GCCATTGGCGTAATCTACCA
GCCATTGGCGTAATCTACCA –3’
–3’
Reversa:
Reversa: 5’–
5’– TTCATCTAAAGGTGGCCTAGTCTC
TTCATCTAAAGGTGGCCTAGTCTC –3’
–3’
Análisis de Grupo Segregante
a PRP
Grupo
Grupo de
de resistentes
resistentes
K
K 4
4
K
K 16
16
K
K 17
17
K
K 26
26
K
K 43
43
K
K 55
55
K
K 67
67
K
K 69
69
K
K 74
74
K108
K108
Grupo
Grupo de
de susceptibles
susceptibles
K
K 7
7
K
K 21
21
K
K 31
31
K
K 34
34
K
K 44
44
K
K 52
52
K121
K121
K122
K122
K123
K123
K143
K143
Condiciones
Condiciones del
del PCR:
PCR:
Hibridización:
Hibridización: Para
Para N-23
N-23
Para
Para N-33
N-33 yy N-37
N-37
57°C
57°C
54°C
54°C
Análisis de Grupo Segregante
a PRP
Grupo
Grupo de
de resistentes
resistentes
CM9582CM9582- 8
8
-- 30
30
-- 40
40
-- 47
47
-- 51
51
-- 71
71
Grupo
Grupo de
de susceptibles
susceptibles
CM9582CM9582- 49
49
-- 52
52
-- 81
81
-- 91
91
-- 111
111
-- 113
113
Condiciones
Condiciones del
del PCR:
PCR:
Hibridización:
Hibridización: Para
Para N-37
N-37
Para
Para N-38
N-38
54
54 aa 56°C
56°C
60°C
60°C
Separación de Fragmentos
Familia K
PRP
54°C
54°C
R
R SS C
CN
N 11 22 33 44 M
M
57°C
57°C
11 22 33 44 R
R SS C
C N
N
58°C
58°C
R
R SS C
CN
N
330
330 pb
pb
240
240 pb
pb
R=Grupo
R=Grupo Resistente;
Resistente; S=
S= grupo
grupo Susceptible;
Susceptible;
C=CM
C=CM 2177-2;
2177-2; N=MNGA
N=MNGA 2;
2;
1-2:
1-2: resistentes;
resistentes; 3-4=
3-4= susceptibles
susceptibles
Polimorfismo – Familia GM 315
segregante a Xam
Cebador N 37
11 22 33 44 55 66 77 88 99 10
10 11
11 12
12 13
13 14
14 15
15 16
16 17
17 18
18 19
19 20
20 21
21 22
22 23
23 24
24 25
25 26
26
300
300 pb
pb
Resistentes
Resistentes
Fuente:
Fuente: Hurtado
Hurtado 2003
2003
Susceptibles
Susceptibles
Polimorfismo – Familia GM 315
segregante a Xam
S
R
Fuente:
Fuente: Hurtado
Hurtado 2003
2003
Se detectaron SNPs
en fragmentos
amplificados
con N 37 y N 38
entre individuos R y S
Análisis de Grupo Segregante
a Xam - Familia GM 315
Cebador BAC 66
410
410 pb
pb
390
390 pb
pb
PS BR R1 R2 R3 R4 BS S1 S2 S3
Fuente:
Fuente: Claroz
Claroz 2006
2006
Resistente
Susceptible
Polimorfismo – Familia AR
Segregante a Xam
R
RS
S
R
R S
S
Cebadores BAC:
25 diseñados por
C. López (2003)
5 diseñados por
I. Moreno (2004)
08K23
BAC - 66
Fuente:
Fuente: Claroz
Claroz 2006
2006
Conclusiones
•• Se
Se identificaron
identificaron 15
15 QTLs
QTLs asociados
asociados aa
resistencia
resistencia aa P.
P. tropicalis,
tropicalis, uno
uno aa P.
P. palmivora
palmivora yy
tres
tres QTLs
QTLs de
de menor
menor importancia,
importancia, aa P.
P. melonis
melonis
• Se identificaron QTLs en grupos de ligamiento
E y J, donde previamente no se reportaba.
• Se identificaron 4 clases de RGAs en yuca,
homólogos con genes y RGAs de otras especies.
Conclusiones
• En el genoma de yuca se encontraron RGAs de
las subclases TIR y no TIR, de la clase NBS-LRR.
• No se ha identificado asociación de los RGAs
aislados, con resistencia a Phytophthora spp. en
yuca.
• Se encontró asociación de algunos RGAs con
resistencia a Xanthomonas axonopodis.
Genes Candidatos a Resistencia
Perspectivas
• Evaluar varios cebadores con R y S a diferentes
cepas y otras (FSD, SED y Phytophthora)
• Retrocruzas entre los más resistentes
y el padre susceptible
• Mapeo de RGAs asociados a R
• Evaluar RGAs para asociación de
resistencia a Antracnosis en frutas
• Aplicación de DARTs para identificar
genes de resistencia
Agradecimientos
• Genética de Yuca
Dr. Martin Fregene
Edgard Barrera
Jaime Marín
• Biotecnología
Dr. Joe Tohme
Eliana Gaitán
• Mejoramiento de Yuca
Dr. Hernán Ceballos
Fernando Calle
• Universidad Nacional
Jaime Eduardo Muñoz
• Kansas State University
Dra. Jan Leach
Dr. Scot Hulbert
• CIP
Rebeca Nelson
• Patología de Yuca
Dra. Elizabeth Alvarez
Paula Hurtado
José Luis Claroz