docÇUKUROVA ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ
download 
Report Transcription
ÇUKUROVA ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ
ÇUKUROVA ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ DOKTORA TEZİ Esin ARI TÜRKİYE’DE DOĞAL OLARAK YETİŞEN Anemone coronaria var. coccinea’da ANTER KÜLTÜRÜ ÇALIŞMALARI BAHÇE BİTKİLERİ ANABİLİM DALI ADANA, 2006 ÇUKUROVA ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ TÜRKİYE’DE DOĞAL OLARAK YETİŞEN Anemone coronaria var. coccinea’da ANTER KÜLTÜRÜ ÇALIŞMALARI Esin ARI DOKTORA TEZİ BAHÇE BİTKİLERİ ANABİLİM DALI Bu tez 27 / 01 / 2006 Tarihinde Aşağıdaki Jüri Üyeleri Tarafından Oybirliği / Oyçokluğu İle Kabul Edilmiştir. İmza............…………… İmza...................…. ….. Prof. Dr. Saadet BÜYÜKALACA Prof. Dr. Kazım ABAK DANIŞMAN ÜYE İmza............…………… İmza...................…. ….. Prof. Dr. Selim ÇETİNER Prof. Dr. Osman KARAGÜZEL ÜYE ÜYE İmza............…………… Doç. Dr. Yeşim YALÇIN-MENDİ ÜYE Bu tez Enstitümüz Bahçe Bitkileri Anabilim Dalında hazırlanmıştır. Kod No: Prof. Dr. Aziz ERTUNÇ Enstitü Müdürü Bu Çalışma Ç.Ü. Bilimsel Araştırma Projeleri Birimi Tarafından Desteklenmiştir. Proje No: FBE 2002- D200 • Not: Bu tezde kullanılan özgün ve başka kaynaktan yapılan bildirişlerin, çizelge, şekil ve fotoğrafların kaynak gösterilmeden kullanımı, 5846 sayılı Fikir ve Sanat Eserleri Kanunundaki hükümlere tabidir. ÖZ DOKTORA TEZİ TÜRKİYE’DE DOĞAL OLARAK YETİŞEN Anemone coronaria var. coccinea’da ANTER KÜLTÜRÜ ÇALIŞMALARI ESİN ARI ÇUKUROVA ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ BAHÇE BİTKİLERİ ANABİLİM DALI Danışman : Prof. Dr. Saadet BÜYÜKALACA Yıl: 2006, Sayfa: 169 Jüri : Prof. Dr. Saadet BÜYÜKALACA Prof. Dr. Kazım ABAK Prof. Dr. Selim ÇETİNER Prof. Dr. Osman KARAGÜZEL Doç. Dr. Yeşim YALÇIN-MENDİ Araştırmada, Manisa lalesi olarak bilinen doğal Anemone coronaria var. coccinea’da anter kültürü yöntemiyle haploid bitki elde edilmesi üzerine çalışılmıştır. Bu amaçla, Adana’da doğal yayılış gösteren bir populasyondan sağlanan eksplantlar, farklı temel besin ortamları ile farklı hormon konsantrasyonları ve ön uygulamalara tabii tutulmuşlardır. Ortam denemelerinde; NN ve B5 temel besin ortamlarına, farklı konsantrasyonlardaki hormonların tek başlarına veya farklı dozlardaki aktif karbon, gümüş nitrat, L-glutamin ile bunların karışımına eklenmesiyle oluşturulan farklı uygulamaların embriyo oluşturma performansları saptanmıştır. Hormon denemelerinde, IAA (0, 0.1, 0.5, 1 ve 2 mg/l) tek başına veya 0.1 mg/l BAP ile birlikte kombinasyon halinde kullanılmıştır. NN ve B5 ortamlarında gerçekleştirilen bu uygulamalar arasında en yüksek embriyo oluşum oranı % 12.7 ile NN ortamındaki 1 mg/l IAA + 0.1 mg/l BAP hormon kombinasyonundan sağlanırken, bunu % 9.3 oran ile B5 ortamındaki 0.5 mg/l IAA + 0.1 mg/l BAP kombinasyonu takip etmiştir. Gümüş nitrat denemeleri (kontrol, 2.5, 5, 10 ve 15 mg/l) içerisinde en yüksek embriyo oluşumu, % 3.3 ile B5 ortamındaki 5 mg/l gümüş nitrat + 0.5 mg/l IAA + 0.1 mg/l BAP içerikli uygulamadan elde edilmiş olup, aynı içerikli NN ortamındaki anterlerden meydana gelen embriyo oluşumu % 2.5 oran ile ikinci sırada yer almıştır. L-Glutamin denemelerindeki (800 mg/l) tek olumlu tepki, oldukça düşük bir oran (% 0.7) ile B5 ortamındaki 800 mg/l L-glutamin + 2 mg/l IAA + 0.1 mg/l BAP uygulamasından elde edilmiştir. Aktif karbon denemelerinin (kontrol, % 0.1, % 0.5 ve % 1) hiçbirisinden olumlu cevap alınamamış, bununla birlikte ortama girdiği aktif karbon + gümüş nitrat + L-glutamin karışım denemelerinde de yine tüm ortamlarda polen embriyogenesisine olumsuz etkide bulunmuştur. Çalışmanın başlangıcında uygulanan soğuk muameleleri (kontrol, + 7 0C’de 2, 7 ve 21 gün) arasında fark bulunamamıştır. Yapılan sitolojik incelemelerde ise embriyojenik bölünmelerin simetrik, generatif ve vejetatif çekirdek bölünmelerinden kaynaklandığı tespit edilmiştir. Direkt polen embriyogenesisinin amaçlandığı bu araştırmada ayrıca, organogenesis ve oldukça yüksek oranlarda kallus oluşumu meydana gelmiştir. Anahtar Kelimeler: Manisa Lalesi, Haploid Bitki, Polen Embryogenesisi, Aktif Karbon, Gümüş Nitrat I ABSTRACT Ph.D. THESIS ANTHER CULTURE STUDIES on Anemone coronaria var. coccinea NATIVE TO TURKEY Esin ARI DEPARTMENT OF HORTICULTURE INSTITUTE OF NATURAL AND APPLIED SCIENCES UNIVERSITY OF ÇUKUROVA Supervisor : Prof. Dr. Saadet BÜYÜKALACA Year: 2006, Pages: 169 Jury : Prof. Dr. Saadet BÜYÜKALACA : Prof. Dr. Kazım ABAK : Prof. Dr. Selim ÇETİNER : Prof. Dr. Osman KARAGÜZEL : Assoc. Prof. Yeşim YALÇIN-MENDİ Anther culture method was used in Anemone coronaria var. coccinea, known as poppy anemone, in order to obtain haploid embryo production in this study. For this aim, the effect of different media and cold treatments on the explants picked from a red-flowered wild population in Adana were investigated. In culture media experiments, NN and B5 media were used as basic medium. Different hormone concentrations were added to these media either alone or accompanied with activated charcoal, silver nitrate, L-glutamine and their mixture in different concentrations. Then, pollen embryogenesis performances of these treatments were evaluated. In hormone experiments, IAA (0, 0.1, 0.5, 1 and 2 mg/l) was used either alone or together with BAP (0.1 mg/l). Among the treatments in NN and B5 media, the highest pollen embryogenesis with 12.7 % was obtained from 1 mg/l IAA + 0.1 mg/l BAP combination in NN medium. This treatment was followed by 0.5 mg/l IAA + 0.1 mg/l BAP combination in B5 medium with 9.3 %. Among silver nitrate treatments (0, 2.5, 5, 10, 15 mg/l), the highest embryo formation (3.3 %) was acquired from a treatment in B5 medium containing 5 mg/l silver nitrate + 1 mg/l IAA + 0.1 mg/l BAP while the second best treatment (2.5 %) had the same content but in NN medium. In L-glutamine experiments, the single positive reaction was obtained from a treatment in B5 medium containing 800 mg/l L-glutamine + 2 mg/l IAA + 0.1 mg/l BAP with quite low ratio (0.7 %). None of activated charcoal treatments (control, 0.1 %, 0.5 % and 1 %) gave positive result. However, activated charcoal has negatively affected pollen embryogenesis performances in the mixture media in which it was included. It could not be found any difference among the cold treatments (control, 2,7 and 21 days in + 7 0C) tested in the beginning of the study. In the cytological observations, it was determined that embryogenic divisions had derived from simetric, generative and vegetative nucleus divisions. Additionally, organogenesis and callus formations were realized apart from direct pollen embryogenesis in this study. Key Words: Poppy Anemone, Haploid Plant, Pollen Embryogenesis, Activated Carbon, Silver Nitrate II TEŞEKKÜR Süs bitkilerindeki ıslah açığımızın kapatılmasında büyük önemi olduğunu düşündüğüm haploidizasyon tekniklerinin kullanımıyla ilgili olarak Manisa Lalesi’nde anter kültürü çalışmasını tez konusu olarak öneren danışman hocam Sayın Prof. Dr. Saadet BÜYÜKALACA’ya, çalışmam süresince gördüğüm değerli yardımları ve her türlü desteği için yürekten teşekkür ediyor, saygı ve sevgilerimi sunuyorum. Tez aşamasına kadar danışmanlığımı yürüten, sonra da Tez İzleme Komitesinde bulunarak özellikle pratik önerileri ile sağladığı değerli yardımları için Sabancı Üniversitesi öğretim üyesi Sayın hocam Prof. Dr. Selim ÇETİNER’e içtenlikle teşekkür ederim. Tez İzleme Komitesinde yer alan ve tezimin şekillenmesinden başlayarak sonuna kadar her aşamasında, engin bilimsel tecrübelerini büyük bir içtenlikle paylaşan değerli hocam Sayın Prof. Dr. Kazım ABAK’a bilimsel ve sosyal tüm katkıları ve desteği için şükranlarımı sunuyorum. Tez Savunma Jürisinde yer alarak, tezime son şeklin verilmesindeki değerli katkıları için Akdeniz Üniv. Peyzaj Mimarlığı Bölüm Başkanı Prof. Dr. Osman KARAGÜZEL’e çok teşekkür ederim. Yüksek lisanstan 7 yıl sonra, doktora yapmam konusunda beni cesaretlendiren sevgili arkadaşım Dr. Serpil GÖK-TANGOLAR’a ve Sayın eşi Prof. Dr. Semih TANGOLAR’a, doktoraya başladığım tarihten itibaren gösterdikleri yakın ilgi, dostluk ve tüm katkıları için ne kadar teşekkür etsem azdır. Sitolojik çalışmalarım için sağladıkları bilimsel katkıları ve sürekli hissettiğim manevi destekleri için değerli hocalarım Prof. Dr. Sinan ETİ ve Prof. Dr. Sevgi PAYDAŞ’a, özellikle laboratuvarlarında sağladıkları yardımlar ve sıcak dostlukları için Doç. Dr. Yeşim YALÇIN-MENDİ ve Yrd. Doç. Dr. Yıldız AKA KAÇAR’a, derslerine dışarıdan katılmama izin vererek haploidizasyon konusundaki bilgilerinden yararlanmama fırsat veren Prof. Dr. Nebahat SARI’ya, özel dostluk ve tüm destekleri için Prof. Dr. Nurgül TÜREMİŞ ve Doç. Dr. Nuray ÇÖMLEKÇİOĞLU’na, özellikle zor zamanlarımdaki her türlü katkı ve eşsiz III yardımları için değerli arkadaşım Zir. Yük .Müh. Pakize GÖK’e, sitoloji çalışmalarımdaki yorum ve katkıları için Zir. Yük. Müh. Davut KELEŞ ve Zir. Yük. Müh. Muzaffer İPEK’e, doktora yazışmalarımdaki yardımları için Bahçe Bitkileri bölüm sekreteri Yasemin YAVUZDEĞER’e ve materyal toplamadaki değerli yardımları için Bahçe Bitkileri Bölümü elemanı Nazmi AKBAŞ’a çok teşekkür ederim. Tez çalışmam sırasında, sitoloji alanındaki kıymetli tecrübelerini paylaşan Trakya Üniv. Bahçe Bitkileri Bölümü öğretim üyesi Yrd. Doç. Dr. Uğur BAL’a, Çukurova Üniv. Tarla Bitkileri Bölümü öğretim üyesi Prof. Dr. Rüştü HATİPOĞLU’na, Gazi Üniv. Biyoloji Bölümü öğretim üyesi Prof. Dr. Fatma ÜNAL’a, Ankara Üniv. Bahçe Bitkileri Bölümü öğretim üyeleri Prof. Dr. Şebnem ELLİALTIOĞLU ve Prof. Dr. Birhan MARASALI’ya, literatür sağlamadaki çok değerli ve anlamlı yardımları için sevgili kardeşlerim Bilgisayar Yük. Müh. Ercüment ARI ve Kimya Öğretmeni Ümmühan ARI’ya, Clemson Üniv.’nden arkadaşlarım Dr. Muharrem KESKİN’e, Maria DELGADO’ya, Zuna MANSOOR’a, sevgili Magdalena BARTZ’a, mesai arkadaşlarım Zir. Yük. Müh. Zübeyir DEVRAN’a, Zir. Yük. Müh. Emine TOPUZ’a, Harran Üniv. öğretim üyesi Doç. Dr. Hasan AKAN’a, Balıkesir Üniv. öğretim üyesi Yrd. Doç. Dr. Fatih SATIL’a ve İstanbul Üniv. öğretim üyesi Dr. Narin SADIKOĞLU’na içten teşekkürlerimi sunuyorum. Tezimi destekleyen Ç.Ü. Bilimsel Araştırmalar Merkezi, Araştırma Fonu’na da ayrıca teşekkür ederim. Tüm yaşamımda olduğu gibi doktoram boyunca da sonsuz anlayış ve maddimanevi desteklerini hiçbir zaman esirgemeyen sevgili aileme ve özellikle dünyanın en fedakar annesi, canım annem Fazilet ARI’ya olan minnet borcumu, kelimelerle ifade edemeyeceğimi bilsem de sonsuz şükranlarımı sunuyorum. IV İÇİNDEKİLER SAYFA ÖZ ……………………………………………………………………………… I ABSTRACT ……….…………………………………………………………... II TEŞEKKÜR ……………………………………………………………………. III SİMGELER ve KISALTMALAR …………………….…….………………….. IX ÇİZELGELER DİZİNİ ……………………………………………………....... XI ŞEKİLLER DİZİNİ ……………………………………………………………. XV 1. GİRİŞ ………………………………………………………………………… 1 1.1. Anemone coronaria L. ......................................................................... 1 1.2. Haploidizasyon .................................................................................. 5 2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR …………………………………………………… 9 2.1. Androgenesis ile İlgili Kuramsal Bilgiler.......................................... 9 2.1.1. Haploid Ontolojisi ............................................................... 10 2.1.2. Androjenik Oluşumu Etkileyen Faktörler ......................... 16 2.1.3. Haploid Bitkilerde Kromozom Katlanması ....................... 28 2.1.4. Ploidi Belirleme .................................................................. 30 2.2. Anemone coronaria’da Yapılan Çalışmalar ...................................... 31 2.2.1. Taksonomik ve Sitolojik Çalışmalar.................................... 31 2.2.2. Islah Çalışmaları ................................................................. 32 2.2.3. Haploidizasyon Çalışmaları ................................................ 36 2.2.4. Diğer Anemone Türlerindeki Haploidizasyon Çalışmaları ... 38 3. MATERYAL VE METOD …………………………………………………... 41 3.1. Materyal ……………………………………………………………. 41 3.2. Metod .................................................................................................. 42 3.2.1. Sitolojik Çalışmalar ................................................................ 42 3.2.1.1. Çiçek Tomurcuklarının Gruplandırılması ................ 42 3.2.1.2. Uygun Tomurcuk Safhasının Tespiti ....................... 43 3.2.1.3. Periyodik Anter Gelişiminin İncelenmesi ................ 47 3.2.2. Anterlerin Kültüre Alınması ................................................... 48 V 3.2.3. Anterlere Yapılan Ön Uygulama ............................................. 48 3.2.4. Kullanılan Besin Ortamları ve Kurulan Denemeler ..….... 49 3.2.4.1. I.Yıl Denemeleri .................................................... 49 3.2.4.1.(1). Aktif Karbon Denemeleri (AK) ............ 52 3.2.4.1.(2). Gümüş Nitrat (GN) Denemeleri ............ 52 3.2.4.2. II.Yıl Denemeleri ...................................................... 54 3.2.4.2.(1). Farklı Hormon Konsantrasyonu Denemeleri ............................................. 55 3.2.4.2.(2). Aktif Karbon (AK) Denemeleri ............ 56 3.2.4.2.(3). Gümüş Nitrat (GN) Denemeleri ............ 56 3.2.4.2.(4). L-Glutamin (LG) Denemeleri ............... 57 3.2.4.2.(5). Aktif Karbon (AK), Gümüş Nitrat (GN) ve L-Glutamin (LG) Karışımı Denemeleri 57 3.2.4.2.(6). Embriyo Çimlendirme - Kallus Çoğaltma Çalışmaları ............................. 58 3.2.4.2.(7). İndirekt Embriyogenesis Çalışmaları ..... 59 3.2.4.3. III. Yıl Denemeleri .................................................. 59 3.2.4.3.(1). Farklı Hormon Konsantrasyonu Denemeleri ............................................. 60 3.2.4.3.(2). Gümüş Nitrat (GN) Denemeleri ............ 61 3.2.5. Kültür Koşulları ...................................................................... 61 3.2.6. İncelenen Özellikler .................................................................61 3.2.7. Deneme Deseni ....................................................................... 62 4. BULGULAR VE TARTIŞMA ………………………………………………... 64 4.1. Sitolojik Çalışma Bulguları ve Tartışma.............................................. 64 4.1.1. Uygun Tomurcuk Safhasının Tespiti ................................... 64 4.1.2. Periyodik Anter Gelişimi ........................................................ 69 4.2. I. Yıl Deneme Bulguları ve Tartışma………………….............……... . 73 4.2.1. Aktif Karbon (AK) Deneme Bulguları ................................... 73 4.2.2. Gümüş Nitrat (GN) Deneme Bulguları................................... 73 4.2.3. I. Yıl Deneme Bulgularının Tartışılması ................................ 74 VI 4.3. II. Yıl Deneme Bulguları ve Tartışma …..…………............……....... 77 4.3.1. B5 Ortamına Ait Bulgular ..................................................... 77 4.3.1.1. Farklı Hormon Konsantrasyonlarının Etkilerine Ait Deneme Bulguları .............................................. 77 4.3.1.2. Aktif Karbon (AK) Deneme Bulguları .................... 79 4.3.1.3. Gümüş Nitrat (GN) Deneme Bulguları .................... 79 4.3.1.4. L-Glutamin (LG) Deneme Bulguları ....................... 81 4.3.1.5. Aktif Karbon (AK) Gümüş Nitrat (GN) ve L-Glutamin (LG) Karışım Denemesi Bulguları .......................... 81 4.3.1.6. Embriyo Çimlendirme - Kallus Çoğaltma Bulguları 83 4.3.1.7. İndirekt Embriyogenesis Bulguları .......................... 84 4.3.2. NN Ortamına Ait Bulgular ...................................................... 84 4.3.2.1. Farklı Hormon Konsantrasyonlarının Etkilerine Ait Deneme Bulguları ............................................... 85 4.3.2.2. Aktif Karbon (AK) Deneme Bulguları ..................... 87 4.3.2.3. Gümüş Nitrat (GN) Deneme Bulguları .................. 87 4.3.2.4. L-Glutamin (LG) Deneme Bulguları ........................ 90 4.3.2.5. Aktif Karbon (AK), Gümüş Nitrat (GN) ve LGlutamin (LG) Karışım Denemesi Bulguları ............ 90 4.3.2.6. Embriyo Çimlendirme - Kallus Çoğaltma Bulguları 93 4.3.2.7. İndirekt Embriyogenesis Bulguları .......................... 93 4.3.3. II. Yıl Deneme Bulgularının Tartışılması .............................. 94 4.4. III. Yıl Deneme Bulguları ve Tartışma ………………….................. 107 4.4.1. B5 Ortamına Ait Bulgular .................................................... .107 4.4.1.1. Farklı Hormon Konsantrasyonlarının Etkilerine Ait Deneme Bulguları................................................107 4.4.1.2. Gümüş Nitrat (GN) Deneme Bulguları ................ 109 4.4.1.2.(1). 2.5 mg/l Gümüş Nitrat (GN) Denemesi 109 4.4.1.2.(2). 5 mg/l Gümüş Nitrat (GN) Denemesi .. 111 4.4.1.2.(3). 10 mg/l Gümüş Nitrat (GN) Denemesi 111 4.4.1.2.(4). 15 mg/l Gümüş Nitrat (GN) Denemesi 111 VII 4.4.2. NN Ortamına Ait Bulgular .....................................................115 4.4.2.1. Farklı Hormon Konsantrasyonlarının Etkilerine Ait Deneme Bulguları .............................................. 115 4.4.2.2. Gümüş Nitrat (GN) Deneme Bulguları .................. 115 4.4.2.2.(1). 2.5 mg/l Gümüş Nitrat (GN) Denemesi 117 4.4.2.2.(2). 5 mg/l Gümüş Nitrat (GN) Denemesi 117 4.4.2.2.(3). 10 mg/l Gümüş Nitrat (GN) Denemesi 117 4.4.2.2.(4). 15 mg/l Gümüş Nitrat (GN) Denemesi 121 4.4.3. III. Yıl Deneme Bulgularının Tartışılması ............................ 121 4.5. Genel Tartışma .................................................................................. 127 5. SONUÇ VE ÖNERİLER ……………………………………………………... 146 KAYNAKLAR ………………………………………………………………… 150 ÖZGEÇMİŞ ……………………………………………………………………... 169 VIII SİMGELER VE KISALTMALAR DİZİNİ µ Mikron M Mol µM Mikro-mol mM Mili-mol N Normalite g/l gram/litre mg/l miligram/litre ml mili-litre 0 Santigrad derece C sa Saat A. coranaria Anemone coranaria NN Nitsch ve Nitsch (1969) B5 Gamborg ve ark. (1968) MS Murashige ve Skoog (1962) AK Aktif Karbon GN Gümüş Nitrat LG L-Glutamine Uyg. Uygulama BAP Benzil Amino Purin IAA İndol Asetik Asit IBA İndol Butirik Asit NAA Naftalen Asetik Asit 2ip 2-izopenten adenin 2,4-D 2,4–Dichlorophenoxyaceticacid AVG Aminoethoxy-vinylglycine ACC 1-aminocyclopropane-1-carboxylic acid K2S2O5 Potasyum-meta-bisülfit O:S Oksin:Sitokinin Oranı An. K Anter Kallusu IX FK Flament Kallusu ABA Absizik Asit CM Hindistan cevizi sütü NO3- Nitrat NH4+ Amonyum X ÇİZELGELER DİZİNİ Çizelge 2.1. Sayfa No Ranunculaceae familyasında yürütülen bazı anter kültürü çalışmaları ................................................................................ Çizelge 3.1. Farklı büyüklükteki A. coronaria var. 40 coccinea tomurcuklarının morfolojik özellikleri ..................................... 43 Çizelge 3.2. Johansen karışımları ................................................................. 47 Çizelge 3.3. NN temel besin ortamının içeriği ............................................. 50 Çizelge 3.4. B5 temel besin ortamının içeriği .............................................. 51 Çizelge 3.5. A. coronaria var. coccinea anter kültürü çalışmalarındaki I. 52 yıl denemeleri Çizelge 3.6. A. coronaria var. coccinea anter kültürü çalışmalarındaki I. yıl, II. grup denemeleri ............................................................. Çizelge 3.7. A. coronaria var. coccinea anter kültürü çalışmalarındaki II. yıl hormon denemeleri ............................................................. Çizelge 3.8. 55 A. coronaria var. coccinea anter kültürü çalışmalarındaki II. yıl aktif karbon (AK) denemeleri ............................................. Çizelge 3.9. 53 56 A. coronaria var. coccinea anter kültürü çalışmalarındaki II. yıl gümüş nitrat (GN) denemeleri ............................................ 56 Çizelge 3.10. A. coronaria var. coccinea anter kültürü çalışmalarındaki II. yıl L-glutamin (LG) denemeleri .............................................. 57 Çizelge 3.11. A. coronaria var. coccinea anter kültürü çalışmalarındaki II. yıl aktif karbon (AK) + gümüş nitrat (GN) + L-glutamin (LG) karışımı denemeleri ......................................................... 57 Çizelge 3.12. B5 hormon uygulamalarında oluşan embriyoları çimlendirme ve anter kalluslarını çoğaltma ortamları ................................... Çizelge 3.13. NN hormon uygulamalarında oluşan 58 embriyoları çimlendirme ve kallusları çoğaltma ortamları ......................... 58 Çizelge 3.14. Farklı B5 ve NN ortamlarından elde edilen anter kalluslarının indirekt embriyogenesis amacıyla aktarıldığı ortamlar ……… Çizelge 3.15. A. coronaria var. coccinea anter kültürü çalışmalarındaki III. XI 59 yıl denemeleri ........................................................................... 60 Çizelge 3.16. Çalışmadaki deneme düzenleri ................................................ 63 Çizelge 4.1. II. yıl denemelerinde B5 ortamına eklenen farklı konsantrasyonlardaki IAA ve BAP’in anter kültürü üzerine etkileri ...................................................................................... Çizelge 4.2. 78 II. yıl denemelerinde 5 mg/l gümüş nitrat (GN) içeren B5 ortamına eklenen farklı konsantrasyonlardaki IAA ve BAP’in anter kültürü üzerine etkileri .................................................... Çizelge 4.3. 80 II. yıl denemelerinde 800 mg/l L-glutamin (LG) içeren B5 ortamına eklenen farklı konsantrasyonlardaki IAA ve BAP’in anter kültürü üzerine etkileri .................................................... Çizelge 4.4. II. yıl denemelerinde NN ortamına eklenen 82 farklı konsantrasyonlardaki IAA ve BAP’in anter kültürü üzerine etkileri ...................................................................................... Çizelge 4.5. 86 II. yıl denemelerinde % 1 aktif karbon (AK) içeren NN ortamına eklenen farklı konsantrasyonlardaki IAA ve BAP’in anter kültürü üzerine etkileri .................................................... Çizelge 4.6. 88 II. yıl denemelerinde 5 mg/l gümüş nitrat (GN) içeren NN ortamına eklenen farklı konsantrasyonlardaki IAA ve BAP’in anter kültürü üzerine etkileri .................................................... Çizelge 4.7. 89 II. yıl denemelerinde 800 mg/l L-glutamin (LG) içeren NN ortamına eklenen farklı konsantrasyonlardaki IAA ve BAP’in anter kültürü üzerine etkileri .................................................... Çizelge 4.8. 91 II. yıl denemelerinde % 1 aktif karbon (AK) + 5 mg/l gümüş nitrat (GN) + 800 mg/l L-glutamin (LG) içeren NN ortamına eklenen farklı konsantrasyonlardaki IAA ve BAP’in anter kültürü üzerine etkileri ............................................................. Çizelge 4.9. III. yıl denemelerinde B5 ortamına eklenen 92 farklı konsantrasyonlardaki IAA ve BAP’in anter kültürü üzerine etkileri ...................................................................................... Çizelge 4.10. III. yıl denemelerinde 2.5 mg/l gümüş nitrat (GN) içeren B5 XII 108 ortamına eklenen farklı konsantrasyonlardaki IAA ve BAP’in anter kültürü üzerine etkileri anter kültürü üzerine etkileri ..... 110 Çizelge 4.11. III. yıl denemelerinde 5 mg/l gümüş nitrat (GN) içeren B5 ortamına eklenen farklı konsantrasyonlardaki IAA ve BAP’in anter kültürü üzerine etkileri anter kültürü üzerine etkileri ..... 112 Çizelge 4.12. III. yıl denemelerinde 10 mg/l gümüş nitrat (GN) içeren B5 ortamına eklenen farklı konsantrasyonlardaki IAA ve BAP’in anter kültürü üzerine etkileri anter kültürü üzerine etkileri ..... 113 Çizelge 4.13. III. yıl denemelerinde 15 mg/l gümüş nitrat (GN) içeren B5 ortamına eklenen farklı konsantrasyonlardaki IAA ve BAP’in anter kültürü üzerine etkileri anter kültürü üzerine etkileri ..... Çizelge 4.14. III. yıl denemelerinde NN ortamına eklenen 114 farklı konsantrasyonlardaki IAA ve BAP’in anter kültürü üzerine etkileri ...................................................................................... 116 Çizelge 4.15. III. yıl denemelerinde 2.5 mg/l gümüş nitrat (GN) içeren NN ortamına eklenen farklı konsantrasyonlardaki IAA ve BAP’in anter kültürü üzerine etkileri anter kültürü üzerine etkileri ..... 118 Çizelge 4.16. III. yıl denemelerinde 5 mg/l gümüş nitrat (GN) içeren NN ortamına eklenen farklı konsantrasyonlardaki IAA ve BAP’in anter kültürü üzerine etkileri anter kültürü üzerine etkileri ..... 119 Çizelge 4.17. III. yıl denemelerinde 10 mg/l gümüş nitrat (GN) içeren NN ortamına eklenen farklı konsantrasyonlardaki IAA ve BAP’in anter kültürü üzerine etkileri anter kültürü üzerine etkileri ..... 120 Çizelge 4.18. III. yıl denemelerinde 15 mg/l gümüş nitrat (GN) içeren NN ortamına eklenen farklı konsantrasyonlardaki IAA ve BAP’in anter kültürü üzerine etkileri anter kültürü üzerine etkileri ..... 122 Çizelge 4.19. A. coronaria var. coccinea için III. yıl kurulan tüm denemelerin organogenesis, en yüksek anterden ve polen flamentten embriyogenesisi, oluşan kallus performansları (%) ve oluştukları ortamın oksin: sitokinin oranları ..................................................................................... XIII 126 Çizelge 4.20. A. coronaria var. coccinea için kurulan tüm anter kültürü denemelerinin polen embriyogenesisi performansları (%) ve oluştukları ortamın oksin: sitokinin oranları ............................ XIV 132 ŞEKİLLER DİZİNİ Sayfa No Şekil 1.1. Türkiye’deki A. coronaria varyeteleri ............................................. 2 Şekil 1.2. Doğal Anemone coronaria’nın genel bitki yapısı ............................ 3 Şekil 1.3. Doğal A. coronaria’da protogeny yapısı ve üreme organlarının gelişimi ............................................................................................. Şekil 2.1. Mikrospor taneciklerinden oluşan sporofitlerin orijinini gösteren diyagram ........................................................................................... Şekil 2.2. 4 13 Büyüme ve morfogenesis için gerekli oksin - sitokinin göreceli konsantrasyonları ............................................................................. 24 Şekil 2.3. A. coronaria’nın karyotip analizi ..................................................... 32 Şekil 3.1. Çalışma alanındaki doğal A. coronaria var. coccinea populasyonu 41 Şekil 3.2. Sitolojik inceleme yapılan farklı büyüklükteki doğal A. coronaria var. coccinea tomurcukları ............................................................... 42 Şekil 3.3. Bir tomurcuktaki uygun anter sıraları ve kültüre alınan anterler ..... 48 Şekil 4.1. In vivo mikrospor gelişimleri ........................................................... 65 Şekil 4.2. 2 nolu tomurcukta tespit edilen farklı gelişim aşamasındaki anterler ............................................................................................. 66 Şekil 4.3. In vitro mikrospor gelişimleri .......................................................... 70 Şekil 4.4. Androjenik bir yapıya ait enine kesitler ........................................... 72 Şekil 4.5. Anterlerin sıvı ortamda oluşturduğu farklı anormal yapılar ............ 74 Şekil 4.6. B5 (+ 0.5 mg/l IAA + 0.1 mg/l BAP) sıvı ortamında çoğaltılan bir kallus ................................................................................................ Şekil 4.7. 83 B5 ortamındaki bir GN uygulamasından elde edilen oluşumlar: a) globular embriyolar, b) anter kallus kümesi ve bundan oluşturulan sürgün benzeri adventif yapılar ..................................... Şekil 4.8. 84 B5 ortamındaki bir GN uygulamasından elde edilen oluşumlar: a) globular embriyolar, b) anter kallusu ve bundan oluşturulan adventif sürgünler ............................................................................ Şekil 4.9. 85 NN (+ 0.5 mg/l IAA + 0.1 mg/l BAP) sıvı ortamında çoğaltılan bir kallus ................................................................................................ XV 93 Şekil 4.10. B5 ve NN ortamlarında II. yıl gerçekleştirilen farklı uygulamaların polen embriyogenesisi performansları (%) ............. 95 Şekil 4.11. Embriygenesise tepki veren bazı NN ve B5 uygulamaları .............. 97 Şekil 4.12. Kallus oluşumuna tepki veren bazı NN ve B5 uygulamaları............ 100 Şekil 4.13. B5 ve NN ortamlarında II. yıl gerçekleştirilen farklı uygulamaların kallus oluşturma performansları (%) ............................................... 102 Şekil 4.14. Organogenesise tepki veren bazı NN ve B5 uygulamaları .............. 104 Şekil 4.15. B5 ve NN ortamlarında II. yıl gerçekleştirilen farklı uygulamaların organogenesis performansları (%) ................................................... Şekil 4.16. B5 ve NN ortamlarında III. yıl gerçekleştirilen farklı uygulamaların embriyogenesis performansları (%) ....................... Şekil 4.17. 123 III. yıl çalışmalarındaki bazı B5 ve NN uygulamalarında oluşan tepkiler ............................................................................................. Şekil 4.18. 106 125 A. coronaria var. coccinea’da rastlanan mayoz bölünme düzensizliklerine örnek gösterilebilecek bir kromozom köprüsü … 130 Şekil 4.19. A. coronaria’da in vitro ve in vivo çiçeklenme başlangıcı .............. 141 Şekil 4.20. A. coronaria’da adventif kök yapıları .............................................. 141 Şekil 4.21. Dört Akdeniz Anemone türünün morfolojik, biyokimyasal, karyotipik karakter ve türler arası hibritlerinin mayotik davranışlarına göre belirlenmiş türler arası melezlenme durumunu gösteren diyagram ............................................................................ XVI 142 1. GİRİŞ Esin ARI 1. GİRİŞ Dünyada 50’den fazla ülkede 400.000 ha alanda gerçekleştirilen süs bitkileri üretim ve ticareti pek çok ülkede ekonomiye katkı sağlayan etkili bir sektör olarak kabul edilmektedir. Yaklaşık 50 milyar dolarlık ticari hacme sahip olan bu sektörünün % 49.4’ünü kesme çiçekler oluşturmaktadır. Türkiye’de ise 850 milyon dolarlık bahçe bitkileri ihracatı içinde 2004 yılı itibariyle yaklaşık 38 milyon dolarlık gelir süs bitkileri ihracatından elde edilmiştir. Toplam 25.200 da alanda yapılan süs bitkileri üretiminin % 48’ini kesme çiçek, % 47’sini dış mekan bitkileri, % 3’ünü iç mekan bitkileri, % 2’sini soğanlı-yumrulu bitkiler oluşturmaktadır. Kesme çiçekçiliğe dayalı Türkiye süs bitkileri sektöründe 20 milyon dolar kesme çiçek, 2.85 milyon dolarlık gelir de soğanlı-yumrulu bitkilerin ihracatından sağlanmıştır (Gürsan, 2002; Anonymous, 2005a, b). Ülkemiz florasında doğal olarak yetişen ve ekonomik öneme sahip soğanlıyumrulu bitkiler içerisinde salep (Orchis spp), kardelen (Galanthus spp), sıklamen (Cyclamen spp), göl soğanı (Leucojum spp) ve anemon (Anemone spp) ilk akla gelen türler arasındadır. Bu türlerden; yurtdışında ticari çeşitleri geliştirilen, ancak yurdumuzda farklı türlere ait farklı varyetelerinin yaygın şekilde yetişmesine ve doğal görünümleriyle bile kesme çiçek ve saksı bitkisi potansiyeline sahip olmasına rağmen Anemon türlerinde şimdiye kadar herhangi bir ıslah çalışması yapılmamıştır. Özellikle kesme çiçek değeri nedeniyle yurtdışında yoğun ıslah çalışmalarının yapıldığı Anemone coronaria türünde diploid, triploid ve tetraploid hibrit çeşitleri geliştirilmiştir. Ülkemizdeki Anemone coronaria varyetelerinin de ıslah çalışmalarıyla geliştirilmesi durumunda, kesme çiçek ürün çeşitlendirmesine katkıda bulunacağı ve zamanla önemli pazar değerine ulaşabileceği düşünülmektedir. 1.1. Anemone coronaria L. İlk kez 1596’da teşhis edilen Anemone coronaria L. (A. coronaria)’nın yaklaşık 400 yıldır kültürü yapılmaktadır (Johnstone, 1963: Horovitz ve ark., 1975a’dan). Üretimi Hollanda, Fransa, İngiltere, İtalya, ABD ve İsrail’de 1 1. GİRİŞ Esin ARI yoğunlaşmıştır. 2003 yılında kesme çiçek üretimi için İsrail’den ihraç edilen korm miktarı 4.5 milyon adettir (Kamenetsky, 2005). İtalya’da yıllık 80, Fransa’da ise 60 ha’lık alanda üretim yapılırken (Meynet, 1993), ülkemizde ithal yumrularla gerçekleştirilen üretim 31 da alanda gerçekleştirilen soğanlı-yumrulu kesme çiçek yetiştiriciliğinin %2’sini oluşturmaktadır (Akkaya ve Çakıroğlu, 2000). Ranunculaceae familyasına ait olan Anemone cinsinin dünyada yaklaşık 120 türü mevcuttur (Hobbs ve Hatch, 1994). Ülkemizde 8 türü bulunan Anemone cinsinin ekonomik öneme sahip 2 türünden, ‘Yoğurtçuk’ olarak bilinen A. blanda’nın yumruları ihraç edilirken, ‘Manisa Lalesi’ olarak bilinen A. coronaria ise bazı çiçekçilerde süs bitkisi olarak değerlendirilmektedir (Seçmen ve ark., 1995). Tepallerindeki renk varyasyonuna göre Türkiye’de 4 A. coronaria varyetesi yayılış göstermektedir (Davis, 1965). Bunlar, A. coranaria var. alba (beyaz), A.coranaria var. rosea (pembe), A.coranaria var. coccinea (kırmızı) ve A.coranaria var. cyanea (mor renkli) olup Şekil 1.1. de sunulmuştur: 1 2 3 4 Şekil 1.1. Türkiye’deki A. coronaria varyeteleri (1. var. rosea, 2. var. cyanea, 3. var. alba, 4. var. coccinea) Yaz sıcaklık ve kuraklığına adapte olan A. coronaria, yıllık hayat döngüsü süresinde 5-6 ay dormansiye girer ve hava sıcaklığı düştükçe bitkide aktif büyüme 2 1. GİRİŞ Esin ARI başlar (Kamenetsky, 2005). Ortalama 60 gün çiçeklenme süresine sahip doğal A. coronaria’da çiçeklerin yaşam süresi 5-12 gün arasındadır (Dafni ve ark., 1990). 4-9 cm çaplı çiçeklerin tepal sayısı genellikle 5-6, nadiren 9 hatta 15’e kadar çıkabilmektedir. Bir çiçek 400-800 arasında pistil ve ortalama 2.000.000 polen taşıyan çok sayıda stamene sahiptir (Horovitz, 1991). Stamenler 7 veya daha fazla sıra halinde dizilirler ve bunlardan ortadaki 2 veya 3 sıra diğerlerinden daha önce gelişir. Anterler dıştan açılır ve anterlerin patlaması, stigma olgunluğundan yaklaşık 10 gün sonra, filamentler gerçek uzunluklarına erişince başlar (Horovitz ve ark., 1975b). Çok yıllık otsu ve kormlu bitkiler olan Anemonlarda kormlar; hipokotil ve radisilin birleşme yerinin şişkinleşmesiyle oluşur (Jones, 1986). Bir periant parçası olan kaliks tamamen körelmiş, sadece korolla kalmıştır. Tek sıralı bu perigon yapraklara tepal adı verilir. Çiçekler genellikle erken ilkbaharda açar. Çiçek sapında, çiçek tomurcuğunu korumakla görevli involukrum, genellikle 3 parçalı yapraktan oluşur. A. coronaria’nın genel bitki yapısı Şekil 1.2.’de verilmiştir. 1 2 3 Şekil 1.2. Doğal Anemone coronaria’nın genel bitki yapısı (1. bitkinin genel görünüşü, 2. çiçek yapısı; S: stigma, O: ovül, K: kapitillum, A: anter, F: flament, T: tepal, 3. genç bitki gelişimi (Horovitz ve ark., 1975b; Horovitz, 1985) A. coronaria genellikle yabancı tozlanır ve çiçekleri belirgin şekilde protogeny yani anterleri ovaryumdan daha sonra gelişen bir yapı gösterir (Şekil 1.3.). Anemone cinsi içinde yoğun ıslah çalışmalarının yapıldığı tek tür A. coranaria dır. Kültürü yapılan anemonların gerçek atası Akdeniz ülkelerinde doğal olarak yetişen A. coronaria’nın çeşitli varyeteleridir (Meynet, 1993). 3 1. GİRİŞ Esin ARI Şekil 1.3. Doğal A. coronaria’da protogeny yapısı ve üreme organlarının gelişimi Dünyada 400 yıldır kültürü yapılan bu bitkideki ıslah çalışmaları büyük oranda klasik ıslah yöntemleri ile yürütülmüştür. Ancak bu türün klasik ıslahı oldukça uzun zaman gerektirmektedir. Nitekim, John Innes Enstitüsü’nde 1969’da başlayan ve 1980’lerin başlarına kadar devam eden A. coronaria ıslah programında, özellikle uniform hatlara ulaşmada problem yaşanmıştır. Kendileme programında, kendileme depresyonu şiddetini son derece açık bir şekilde ortaya koymuş ve birçok orijinal hattın kaybolmasına neden olmuştur. Daha 5. kendilemede, başlangıç hatlarından 3/4’ü kaybolmuştur. Her bir generasyonun en az 1 yıl zaman gerektirdiği kendileme programında 8-10 kez kendilenmiş A. coronaria hatlarının tam olmasa da, birçok amaç için yeterince homozigot olduğu kabul edilmiş, en azından ebeveynlerin tohumla üretimi mümkün olabilmiştir (Arthur, 1971; Arthur ve Hosier, 1980) Ülkemize gelince, süs bitkileri ıslah çalışmalarının çok sınırlı olduğu Türkiye’de, A. coronaria’da ticari bir çeşit mevcut değildir. Transgenik çiçeklerin pazarlandığı dünyada, ülkemizdeki kesme çiçek ıslah açığı ancak, kendi doğal materyallerimiz ve modern ıslah yöntemleri ile kapatılmaya çalışılabilir. Islahta, özellikle F1 hibrit çeşit geliştirme çalışmalarında haploid safhatların önemi son yıllarda çok daha iyi anlaşılmış ve bu hatların türden türe 5-12 generasyon arasında değişen kendilenme sürelerini, bir generasyona indiren haploidi tekniklerinden faydalanabilmek ıslahçı ve genetikçilerin en önemli aracı olmuştur. 4 1. GİRİŞ Esin ARI 1.2. Haploidizasyon Genetik kromozom sayısını (n) taşıyan bitki haploid bitki, haploid bitki elde etme işlemi de haploidizasyon olarak tanımlanmaktadır. Haploid bir bitkinin kromozom sayısının (n) bazı kimyasal maddelerle katlanması yoluyla, türün normal kromozom sayısına (2n) yeniden kavuşturulması ve mutlak homozigot bitkilerin elde edilmesi işlemine ise dihaploidizasyon adı verilmektedir (Ellialtıoğlu ve ark., 2001). Haploid bitkiler, diploid bir bitkideki tüm organlara sahiptirler ancak hücreleri daha küçük olduğundan morfolojik olarak zayıf, güçsüz, bodur ve daha küçük yapılı bitkiler olup gelişimleri daha yavaştır. Yaprakları dar ve küçük, gövde ve dallarda boğum araları kısa iken, çiçeklenme süresi daha uzundur. Küçük çiçek açarlar ancak sterildirler ve tohum bağlamazlar. Polenleri küçük, anormal şekilli ve içleri boş olup, bu polenlere sahip anterler çatlamaz. Plastid sayıları azdır. Ayrıca stomaları daha küçüktür ve birim alanda daha fazla stoma taşırlar (Emiroğlu, 1982; Er, 1992; Ellialtıoğlu ve ark.,2001). Bu özelliklerinden dolayı normalde hiç bir tarımsal değer taşımayan haploid bitkiler; bitki ıslahı genetik, sitolojik, fizyolojik, biyolojik ve biyokimyasal çalışmalar için son derece önemli ve değerli materyallerdir Haploidi teknikleri özellikle ıslah çalışmalarında, yabancı döllenen türlerdeki 10-12, kendine döllenen türlerdeki 5-7 generasyonluk kendileme süresini tek generasyona indirerek mutlak homozigotluğu sağlar. Dioik türlerde veya kendileme depresyonu nedeniyle klasik yöntemlerle homozigotluğa ulaşmanın zor olduğu lahana, çilek, anemon gibi türlerde, bu sorun tek bir generasyonda çözülebilirken, uzun gençlik kısırlığına sahip çok yıllık meyve ağaçları ve orman bitkilerinde homozigotluk elde etmede çok büyük avantajdır. F1 hibrit çeşit ıslahında, dihaploid bitkilerden elde edilen safhatlar ebeveyn olarak kullanılabilir. Mikrosporlardan oluşan embriyolar yüksek rejenerasyon kapasitesine sahip oldukları için direkt DNA transferi ve gen transferi çalışmalarında etkin şekilde faydalanılabilmektedir. Ayrıca, haploid hücre veya protoplastlar sayesinde farklı patojenler ve bunların fizyolojik ırklarına, antibiyotiklere, toksinlere, herbisitlere, tuza, soğuğa veya sıcağa dayanıklı mutantlar in vitro seleksiyon imkanı ile küçük bir alanda çok kısa sürede, ekonomik şekilde seçilebilmektedir. Bunların dışında; ıslah etkinliğinin arttırılmasında, saf 5 1. GİRİŞ Esin ARI süper erkek bireyler elde edilmesinde, mutasyon ıslahında, süs bitkilerinin bodurlaştırılmasında, genom haritalarının çıkartılmasında, QTL analizlerinde polijenik karakterlerin haritalanmasında haploid bitkiler özellikle ıslahçı ve genetikçiler için sonsuz avantajlar sunmaktadır (Abak, 1986; Wenzel ve Foroughi Wehr, 1994; Ferrie ve Keller, 1997; Hatipoğlu, 1999; Ellialtıoğlu ve ark., 2001). Bu çalışmaların etkin şekilde yürütülebilmesi için yeterli miktarda ve kolayca elde edilebilmeleri gereken haploidler 3 yolla meydana gelmektedir: 1. Spontan yolla: İlk doğal haploid, Blakeslee ve ark. (1922: Er 1992’den) tarafından Datura gynogenesis, keşfedilmiştir. stramonium’da semigami, polyembriyoni veya Doğada androgenesis, kromozom eliminasyonu yollarından birisi ile oluşan spontan haploidlerin oluşum frekansı % 0.001–0.01 gibi çok düşük düzeydedir ve bugüne kadar ancak 100 kadar türde rastlanmıştır 2. In situ uyartımla: Uzak akrabalar arası melezlemeler, tozlamanın geciktirilmesi, abortif veya ışınlanmış polenlerle tozlama, sıcaklık şokları, değişik kimyasallar, hormon uygulamaları, “X” veya “UV” ışınları ile haploid bitki elde edilebilir. 3. In vitro uyartımla: Androgenesis (anter veya mikrospor kültürü) veya gynogenesis (ovül kültürü, ovaryum kültürü veya embriyo kurtarma) yöntemleri ile laboratuvar koşullarında da haploid bitki elde edilebilmektedir. In vitro uyartım metodlarından androgenesiste bitkinin erkek üreme organları (anter veya mikrospor), gynogenesiste ise bitkinin dişi üreme organları (ovül veya ovaryum) yapay ortamlarda kültüre alınmaktadır. Her iki yöntemde de temel prensip; normal koşullarda mikrospor veya megaspor hücresinin gametofitik gelişimini durdurarak, çeşitli uyartılar yardımıyla embriyojenik gelişmeye zorlamaktır. Androgenesis ve gynogenesisten başka, uzak akraba türleri arasındaki melezlemeler ve özel uygulamalara tabi tutulmuş polenlerin tozlamada kullanılması sonucunda embriyo kurtarma tekniği ile de haploidler elde edilmektedir (Bal, 2002). Haploidi tekniklerinin kullanımı ile 37 familyanın 88 cinsine ait 247 türde haploid uyartımının sağlandığı bildirilmektedir (Pierik, 1987). Ancak bu teknikler arasında en yaygın olarak kullanılan ve en fazla başarının sağlandığı yöntem anter kültürü olup, bu yöntemle 25 familyanın 134 türünden olumlu cevap alındığı kaydedilmiştir (Bhojwani ve Razdan, 1996). Totipotent özellikteki binlerce 6 1. GİRİŞ Esin ARI mikrospora sahip bir anterden, uygun in vitro koşullarda çok sayıda haploid bitkinin elde edilebildiği bu teknikte; elde edilen bitkilerin kromozom sayılarının katlanmasıyla dihaploid hale getirilen bitkiler %100 homozigot karakter kazanmakta ve F1 hibrit çeşit ıslahında ebeveyn olarak kullanılabilme şansına sahip olmaktadır (Ellialtıoğlu ve ark., 2001). Daha önce belirtildiği gibi Türkiye’de, A. coronaria’da herhangi bir ticari çeşit geliştirilmemiştir. Bu bitkinin ıslahı ile ilgili yapılan çalışmalar, Akdeniz ve Ege Bölgelerinde yürütülen 2 seleksiyon çalışması sonucu kesme çiçek potansiyeline sahip bazı genotiplerin belirlenmesi ile sınırlıdır. Oysa ıslah çalışmalarına ivme kazandırılarak çeşit geliştirilmesi, özellikle kesme çiçekçilik sektörü için ele alınması gereken en acil konulardan bir tanesidir. Çünkü kesme çiçek ihracatının % 80’ini karşılayan Antalya’da, başlangıçtan bugüne kadar tek ürün (% 92 ile karanfil) ve tek pazar (% 72 ile İngiltere’ye) (Anonymous, 2005a,b) üzerine kurulmuş yanlış üretim ve pazarlama stratejileri sonucu sektör ciddi sorunlar içine girmiştir. Ayrıca üretim masrafları içinde % 30 payla ikinci sırada yer alan ithalata dayalı üretim materyali (Özkan ve ark., 1997), sektörün başka önemli bir sorunudur. Üretim materyalindeki dışa bağımlılık; ya süs bitkisi üretim alanlarının farklı ürünlere kaymasına neden olmakta ya da yurt içindeki birçok üreticinin, üretim materyalini yasal olmayan yollarla kendisinin sağlamasını teşvik etmektedir. Bunun sonucu, üretim büyük ölçüde kalitesiz fide ile gerçekleşmekte, dolayısıyla da ürün buna göre fiyatlandırılmaktadır. Bu durumun bir başka dezavantajı ise; AB’ne tam üye olunması durumunda, patent hakları ile ilgili yasalara uyum zorunluluğu nedeniyle üretim materyali bakımından sektör tamamıyla dışa bağımlı duruma gelecek ve bu da girdi fiyatlarını daha fazla arttıracaktır. Bu sorunlar karşısında her platformda öne sürülen çözüm önerisi, ürün ve pazar çeşitlendirmesidir. Dolayısıyla ıslah çalışmalarına başlanılması artık kaçınılmazdır. Ürün çeşitlendirmede; yüksek yaylalardan deniz kenarlarına kadar geniş bir alanda yetişebilme yeteneğine sahip olmaları, iyi bir üretim planlaması ve üretim materyalinin programlanabilmesi ile pazara sürekli arzın mümkün olması, Osmanlı bahçe süslemelerinde kullanılan arpa çiçeği, Manisa lalesi, sümbül ve bir döneme adını veren lale gibi birçok soğanlı-yumrulu süs bitkilerini Türk halkının çok uzun 7 1. GİRİŞ Esin ARI zamandır tanıması ve sevmesi, ayrıca bazı ülkeler (Hollanda, ABD) tarafından özellikle talep edilmeleri gibi nedenlerle kesme çiçek olarak kullanılabilecek doğal soğanlı-yumrulu süs bitkilerinden faydalanılabilir (Akkaya ve Çakıroğlu, 2000). Bu bitkilerden yararlanılması, Türkiye’nin sahip olduğu çok zengin bitki genetik kaynaklarının değerlendirilmesi açısından ayrıca önemlidir. Nitekim, “Türkiye’de Bitki Biyoteknolojisi Öncelikleri” adlı çalışmada (Anonymous, 1995) doğal soğanlıyumrulu bitkilerin çoğaltılıp, kültüre alınması ve bunların biyoteknolojik yöntemlerle geliştirilmesi; nesli tükenmekte olan bu bitkilerin hem korunmaları açısından, hem de dış satımlarını arttırmak bakımından öncelikli olarak ele alınmıştır. Günümüzdeki ıslah çalışmalarının hızla, daha çabuk sonuçlar veren biyoteknolojik yöntemlere yöneldiği dünyada, süs bitkileri ıslahı açısından hiçbir çalışmanın yapılmadığı ülkemizde artık, mutlaka ve hızla kendi gen kaynaklarımızın temel alınacağı biyoteknolojik yöntemlere dayalı ıslah programları başlatılmalıdır. Daha önce yapılan çalışmalarda, A. coronaria’nın doğal varyeteleri ile kültür çeşitlerinin melezlenmesinden elde edilen F1 hibritlerindeki büyük çap ve çiçek boyutu, heterosis ıslahının önemini ortaya koymuştur (Horovitz, 1977). Bu çalışmanın asıl hedefi ileride A. coronaria’da F1 hibrit çeşit geliştirmektir. Bu hedef göz önünde tutulursa ve Anemonun büyük oranda yabancı tozlanan bir tür olması nedeniyle heterozigotinin yüksek oranda olması ve homozigot hatlara ulaşmanın 810 yıl gibi oldukça uzun zaman aldığı düşünülürse, haploid bitki elde etmeye yönelik bu çalışmada anter kültürü tekniğinin kullanımı bir avantaj olarak görülmüştür. Ancak bu konuda literatürde yararlanılabilecek bir kaynak bulunamadığı için öncelikle pratik kullanılabilirliği olan bir protokolün geliştirilmesi gerekmektedir. Bu çalışmada, Manisa lalesi olarak bilinen doğal A. coronaria’nın kırmızı çiçekli varyetesi olan A. coronaria var. coccinea’da anter kültürü yoluyla haploid bitki elde edilmesini sağlayacak bir protokol ortaya konulmak istenmiştir. Bu amaçla, öncelikle kültüre alınacak anterleri içeren uygun tomurcuk safhası tespit edilmeye çalışılmıştır. Daha sonra bu tomurcuklardan alınan anterlerde, farklı temel besin ortamalarına ilave edilen hormonlar ve diğer bazı katkı maddeleri ile soğuklatma uygulamalarının polen embriyogenesisi araştırılmıştır. 8 üzerine olan etkileri 2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Esin ARI 2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Anemone coronaria’daki androgenesis çalışmalarının sayısı yok denilecek kadar azdır. Tezin başladığı 2002 yılında, bu konuda yapılan tek çalışmanın, literatüre tam anlamıyla yansımayan Sunderland’ın 1970’lerde yaptığı bir anter çalışması olduğu öğrenilmiştir. Ancak kendisinin başka bir çalışmasından (Sunderland, 1977: Sunderland ve Dunwell, 1977’den) ve diğer bazı araştırıcılardan (Arthur, 1973; Meynet, 1993), bu çalışmadan sadece küçük proembriyo oluşumu şeklinde bir androjenik sonuç alındığı bilgisine ulaşılmıştır. Dolayısıyla bu tezin başlangıcında yararlanılabilecek herhangi bir protokol olmadığı için Anemone cinsinin diğer türlerinde rastlanan birkaç çalışmadan faydalanılmıştır. Bu çalışmaların sayısının da oldukça az olması ve bu tezden yararlanabilecek araştırıcılar için konunun daha geniş bir çerçevede ortaya konulması gerektiği düşüncesiyle önceki çalışmalar bölümü 2 kısımda incelenmiştir: 2.1. Androgenesis ile İlgili Kuramsal Bilgiler Bitkilerdeki doku kültürü çalışmalarının temeli, ilk olarak Schwann ve Schleiden’in 1838 yılında totipotensi teorisini öne sürmeleri ile atılmıştır (Pierik, 1987). Genel olarak bitkiler, hücresel totipotensi için olağanüstü bir potansiyele sahiptir. Aslında, çekirdeğini muhafaza ettiği sürece herhangi farklılaşmış bir bitki hücresi, embriyojenik şartlara dönme ve tam olarak yeni bir bitki oluşturma yeteneğindedir. Hücresel totipotensinin en çarpıcı örneklerinden birisi androgenesis fenomenidir (Reynolds, 1997). Bitkinin erkek üreme organları olan anter veya mikrosporların yapay ortamlarda kültüre alındığı androgenesiste ilk başarı Er (1992)’in bildirdiğine göre, Guha ve Maheswari (1964)’nin Datura innoxia’nın anter kültüründen embriyo benzeri yapılar elde etmeleri ve iki yıl sonra bu embriyoidlerin polenlerden meydana geldiğini bulmaları ile sağlanmış olup, daha sonra Nitsch ve Bourgin (1967) Nicotiana sylvestris ve N. tabacum anterlerinden ilk haploid bitkileri elde etmiştir. 9 2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Esin ARI Başlangıçta anter kültürü ile tanımlanmış androgenesis çalışmalarında daha sonra, uygulanabilirliği ilk kez Nitsch ve Norrel (1973: Smykal, 2000’den) tarafından ortaya konulan mikrospor kültürü kullanılmaya başlanmıştır. Otuz yılı aşkın bir süredir devam eden androgenesis çalışmaları sonucu bugün haploid embriyo oluşumunun sağlandığı bitkilerin uzun bir listesi oluşturulmuştur. Nicotiana tabacum, Brassica napus, Hordeum vulgare, Oryza sativa, Triticum aestivum ve Zea mays bunlar arasında üzerinde en fazla çalışılan türlerdir Androgenesis tekniklerinden olan anter kültürünün aşamaları tez konusu ile olan ilgisi nedeniyle kısaca şöyle özetlenebilir: • Tek çekirdekli mikrospor safhası ve uygun tomurcuk büyüklüğünün tespiti, • Uygun büyüklükte tomurcuk toplanması ve sterilizasyonu, • Anterlerin steril koşullar altında kültüre alınması, • Kültüre alınan anterlere farklı koşullardaki inkübatörlerde farklı sürelerde ön muamele (termal şok, açlık uygulaması vb gibi) uygulanması, • Kültür kaplarının iklim odasına taşınarak kültür süresinin tamamlanması, • Oluşan embriyoların çimlendirilmesi, • Bitkiye dönüştürülen haploid bireylerin kromozom sayısının katlanması ve ploidi testlerinin yapılması anter kültürünün aşamalarını oluşturmaktadır. Androgenesisin daha iyi açıklanabilmesi için bu olay daha önce yapılan bazı çalışmalarla çeşitli yönleri ile aşağıda ele alınmaya çalışılmıştır: 2.1.1. Haploid Ontolojisi Androgenesisin temel esası; haploid hücre kaynağının (mikrospor) varlığına dayanmaktadır. Temel prensip; normal koşullarda erkek gameti oluşturacak olan mikrospor hücresinin gametofitik gelişimini durdurarak, çeşitli uyartılar yardımıyla embriyojenik modda gelişmesini zorlamaktır. Polen gelişimindeki bu farklı modun daha iyi anlaşılması için öncelikle kısaca normal polen ontolojsini gözden geçirmek gerekir. Normal polen gelişimi iki aşamalıdır: Mikrosporogenesis ve mikrogametogenesis. Mikrospor ana hücresinin oluşumu ve bunu izleyen mayoz bölünme sonucunda haploid mikrosporların 10 oluşmasına mikrosporogenesis, 2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Esin ARI mikrospordan çekirdek ve hücre bölünmeleri ile sperm hücrelerinin oluşumuna da mikrogametogenesis adı verilmektedir (Emiroğlu, 1982). Haploid ontolojisini detaylı olarak inceleyen ilk araştırıcılardan olan Sunderland ve Dunwell (1977)’in bildirdiğine göre, mikrosporogenesiste; anter lokusu içindeki diploid bir mikrospor ana hücresi, mikrospor tetradı oluşturmak üzere mayoza girer. Mikrospor ana hücresine ait kalloz duvarının dağılmasıyla serbest hale gelen tetrat sporları; az çok küresel şekilli, ince duvarlı ve çekirdek oranı sitoplazma oranından daha fazla olan bir yapıya sahiptirler. Serbest hale geçen mikrosporlar, vakuolleşme nedeniyle hızlı bir şekilde büyür ve her biri dıştan eksin, içten ise intin adı verilen duvarla çevrilir. Vakuol büyüdükçe, merkezde bulunan çekirdek spor duvarına doğru itilir. Çekirdek bu pozisyonda iken DNA replikasyonuna girer ve büyüklüğünde artış olur. Çekirdek büyüdükçe RNA ve protein sentezi de gerçekleşir. Mikrogametogenesiste ise, her bir mikrosporun devam eden gelişimi ile asimetrik bölünmeye (I. polen mitozu = I. haploid mitoz) giren hücre içindeki tek çekirdek, hücrenin periferal yönüne doğru hareket eder. İki hücreli polen taneciğinin oluşumuyla sonuçlanan bu bölünme sayesinde her biri haploid çekirdeğe sahip ve farklı görevlerden sorumlu küçük bir generatif hücre ile büyük bir vejetatif hücre meydana gelir. Bunlardan vejetatif hücre içerisinde protein, karbonhidrat, lipid ve RNA birikimi gerçekleşerek hücrenin enerji deposu oluşturulur. Bu hücre polen tüpünün çimlenmesi ile uzamasını sağlayarak, erkek gametleri embriyo kesesine taşımakla görevlidir. Generatif hücre ise az miktarda depo maddesi taşır, ancak sitoplazması çoğunlukla yoğundur ve birçok çiçekli bitkide elipsoid veya biraz daha uzun şekilli olabilir. Bir tarafı intin tabakasına bitişik olan generatif hücre, diğer taraftan kavisli bir duvar ile vejetatif hücreden ayrılır. Vejetatif hücredeki gelişim sonucu bu duvarın kalınlığının azalması ile birlikte, generatif hücre intin tabakasından ayrılarak tamamen vejetatif hücre içerisine gömülür. Böylece ‘cell within a cell’ adı verilen eşsiz ‘hücre içinde hücre’ yapısı oluşur. Vejetatif hücre içindeki generatif hücre, 2 erkek gameti oluşturmak üzere bir kez daha bölünür (II. polen mitozu = II. haploid mitoz) (Bhojwani ve ark., 1973; Sunderland ve Dunwell, 1977; Emiroğlu, 1982; Eady ve ark., 1995; Bhojwani ve Razdan, 1996; 11 2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Esin ARI Reynolds, 1997; Tanaka, 1997; Touraev ve ark., 1997; Anonymous, 2004). II. polen mitozu Gramineae ve Cruciferae gibi familyalarda, I. polen mitozundan hemen sonra gerçekleşirken, Solanaceae ve Ranunculaceae gibi bazı familyalarda ise gecikir ve polen stigma üzerinde çimlenmedikçe bölünme gerçekleşmez. Bundan dolayı polenler, anterden ya iki-hücreli ya da üç-hücreli durumdayken saçılmaktadır (Brewbaker, 1957: Sunderland ve Dunwell, 1977’den). Mascarenhas (1990), normal polen gelişiminin mikrosporogenesis aşamasında en az iki gen setinin aktive olduğunu bildirmiştir. Birinci ya da ‘erkenci’ gen seti mayozdan hemen sonra aktif duruma geçer ve daha sonra polen gelişimi boyunca aktivitesi düşer. ‘Erkenci’ genlerin ekspresyon yapısı, polen taneciğinin başlangıç gelişimi için bu genlerin gerekli olduğunu ortaya koymuştur. İkinci ya da ‘geçci’ genler ise I. polen mitozu aşamasında aktive olur ve bunlara ait mRNA lar antesis döneminde maksimum seviyeye ulaşır. Bu genlerin polen olgunlaşması ve çimlenmesinde görev aldıkları düşünülmektedir. Ancak I. polen mitozundan hemen öncesi ile hemen sonrası arasındaki bir zaman diliminde, mikrosporlar potansiyel gametofitik gelişimleri yönünden kararsızdırlar. Polen taneciğinin bu kararsız gelişim peryodu sırasında uygulanacak çeşitli stres faktörleri gametofitik programı engelleyip, sporofitik genlerin ekspresyonunu başlatabilir. Dolayısıyla, polen tanecikleri gametofitik moddan, sporofitik (Mascarenhas 1989; Reynolds, 1997). gelişim moduna geçebilirler Emriyojenik gelişim için bu modda mikrosporların takip edebileceği 4 farklı yol mevcuttur (Şekil 2.1.): I.Yol: Mikrosporlar eşit şekilde (simetrik) bölünür ve oluşan benzer 2 kardeş hücre sporofitik gelişime katkıda bulunur. Bu gelişim modu, birçok araştırıcı (Rashid ve Street, 1973; Wilson ve ark., 1978; Fan ve ark., 1988; Zaki ve Dickinson, 1990) tarafından haploid embriyo veya kallus oluşumu için takip edilen ana yollardan birisi olarak kabul edilmiştir. En çok Brassica napus’da incelenmekle beraber soya fasulyesi (Kaltchuk-Santos ve ark., 1997) ve biberde (Kim ve ark, 2004) de tespit edilmiştir. II. Yol: Tek çekirdekli mikrosporlar normal yolla, eşit olmayan şekilde bölünür ve sporofitler vejetatif hücre bölünmelerinden oluşur. Bhojwani ve Razdan (1996)’ın bildirdiğine göre, bu gelişim moduna Nicotiana tabacum (Horner ve Street, 1978; 12 2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Esin ARI Touraev ve ark., 1996), Hordeum vulgare (Clapham, 1971), Capsicum annuum (Kuo ve ark., 1973) Triticale (Wang ve ark., 1973), Triticum aestivum (Ouyang ve ark.,1973; Rybczynski ve ark., 1991; Reynolds, 1993), Zea mays (Pesticelli ve Petolino, 1988) ve Brassica napus (Binarova ve ark., 1993) türlerinde rastlanmıştır. Mikrospor Vejetatif Hücre Generatif Hücre Normal Polen I. II. III. IV. Y O L Y O L Y O L Y O L Generatif Hücre Çok Hücreli Polen Taneciği Direkt Embriyogenesis Polen Duvarı Sporofit Polen Kallusu İndirekt Embriyogenesis Şekil 2.1. Mikrosporlardan oluşan sporofitlerin orijinini gösteren diyagram (Bhojwani ve Razdan, 1996) 13 2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Esin ARI III. Yol: Hyoscyamus niger gibi bazı bitkilerde mikrospor embriyoları generatif hücreden oluşmaktadır. Bu yolda vejetatif hücre ya hiç bölünmez yada belirli bir oranda bölünür. Her 2 durumda da generatif hücre kaynaklı embriyonun radisil kısmında suspensor benzeri bir yapı oluşur. (Raghavan, 1978; Reynolds, 1984). Raghavan (1984), bu gelişim moduna çeltik (Sun, 1978), mısır (Miao ve ark., 1978) ve arpada (Sunderland, 1979) da rastlandığını bildirmiştir. IV. Yol: II. Yoldaki gibi vejetatif ve generatif hücreler oluşur. Bu kez hücrelerin her ikisi de bölünmeye devam eder ve sporofit oluşumuna katılır. Bu mod özellikle Datura innoxia (Sunderland, 1974) da incelenmiştir. Buna göre bir mikrospor, çok hücreli embriyojenik tanecikleri oluşturabilmek için 4 yoldan birisini takip etmektedir. Mikrospor daha sonra doğrudan embriyo oluşturabilmekte (direkt embriyogenesis) veya kallus yardımıyla dolaylı şekilde sporofitleri meydana getirebilmektedir (indirekt embriyogenesis). Androjenik embriyoların vejetatif hücreden kaynaklandığı N. tabacum’da, I. polen mitozundan sonraki belirli bir sürede büyüklüklerinde artış görülen, asetokarminle daha yoğun boyanan ve vejetatif hücresinde nişasta tanecikleri biriken normal polen taneciklerinden başka daha küçük, çekirdekleri daha az belirgin ve sitoplazmaları çok açık renkte boyanan az sayıda (% 0.7) farklı taneciklere rastlanmıştır. ‘Androgenetik tanecikler’, p-tanecikleri veya s-tanecikleri olarak adlandırılan bu taneciklerin sitoplazmaları ribozomlar yönünden fakir ancak mitokondrilerce zengindir. Bir anter içindeki mikrospor taneciklerinin bu şekilde 2 farklı gelişme yapısı göstermesi “polen çift-durumluluğu” olarak adlandırılmaktadır. Herhangi bir polen canlılık testinde canlı sayılamayacak ve normalde fonksiyonel olmayan erkek gametofitler şeklinde gelişmesi gereken bu tanecikler, uygun in vitro şartların sağlanması durumunda embriyo oluşturmaktadır (Horner ve Street, 1978; Maheswari ve ark., 1980, 1982; Heberle-Bors, 1985; Bal, 2002). İlk olarak Nicotiana’da saptanmış olan polen çift-durumluluğu Paeonia hybrida, Hordeum (Sunderland, 1974), buğday ve çeltikte (Cho ve Zapata, 1988) de tespit edilmiştir. Bununla birlikte, bazı bitkilerin in vivo olgunlaşmış anterlerindeki mikrosporlarda bile bu duruma rastlanırken, Datura innoxia ve Hyoscyamus niger gibi bazı bitkilerde ise polen embriyogenesisi 14 gerçekleşmesine rağmen polen çift- 2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Esin ARI durumluluğunun mevcut olmadığı bilinmektedir. Ancak Bal (2002)’a göre, söz konusu bu durumun göstergesi olan sitoplazmadaki zayıflama anlamına gelebilecek değişimin bu türlerde görülmemesi, polen çift-durumluluğunun meydana gelmediği şeklinde yorumlanmamalı, bunun yerine bu türlerde oluşan değişimler tespit edilmeyen türden değişimler olarak düşünülmelidir. Raghavan (1978) Hyoscyamus niger’de, embriyoid ve anter kalluslarının orijinlerini ve bunların gelişimini incelediği çalışmasında, embriyojenik polen tanelerinin anter lokusu içindeki tapetum çevresinde yer aldığını, buna karşılık embriyojenik olmayan taneciklerin ise genellikle lokusun iç tarafında toplandığını tespit etmiştir. Ayrıca, tapetum hücrelerinin sahip oldukları bazı teşvik edici maddeler ve özellikler sayesinde gelişmekte olan embriyojenik polen taneciklerinin beslenmesinde ve hücre bölünmesinde çok önemli role sahip olduklarını bildirmiştir. Kim ve ark. (2004) biber anter kültüründe yaptıkları sitoloji çalışmasında, hem çok hücreli polen tanecikleri ile embriyoların orijinlerini hem de en uygun mikrospor safhasını belirlemişlerdir. Çalışma ile embriyojenik oluşum için iki gelişim modunu takip eden mikrosporların ya simetrik bölündüğü ya da vejetatif hücre kaynaklı bölünmeler geçirdiği kaydedilmiştir. Ayrıca, biberde bir anter içindeki mikrospor gelişim aşamalarının güçlü bir asenkronizasyon gösterdiği, bununla birlikte optimum embriyo üretimi için en uygun anter safhasının, % 75’den fazla oranda erken-çift çekirdekli mikrosporları içeren safha olduğu tespit edilmiştir. Biyoteknoloji alanındaki gelişmeler özellikle moleküler markör teknolojileri, haploid ontoloji çalışmalarına da yansımıştır. Örneğin Rodrigues ve ark. (2004), soya fasulyesinde anter kültüründen elde ettikleri embriyo-benzeri yapıların orijinlerini belirlemek için yaptıkları çalışmada, 114 embriyo-benzeri yapıdan geliştirilen kallus yığınları Satt418 mikrosatelit lokusu için taranmıştır. Çalışmada hem heterozigot hem de homozigot yapıların tespit edilmiş olması androgenesis yanında somatik embriyogenesis oluşumunu da ortaya koymuştur. Ontoloji konusundaki son çalışmalardan olan Pulido ve ark. (2005) arpada anter ve izole edilmiş mikrospor kültürlerindeki sitolojik ve ultra strüktürel değişimleri mikrosporlar kıyaslamak sitolojik amacıyla yaptıkları incelemelerde benzer 15 çalışmada, davranışlar her iki kültürdeki sergilerken, TEM 2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Esin ARI (transmission elektron mikroskobu) incelemelerinde önemli bir farklılık tespit edilmiştir. Buna göre, izole edilmiş mikrospor kültüründeki embriyojenik polen taneciklerinin intin duvarında elektronca yoğun depoların varlığı tespit edilmesine rağmen, anter kültüründe bu depoların olmadığı saptanmıştır. Bu depoların kaynağını tespit etmek için ultra ince segmentlere proteinase-K ve EDTA uygulamaları yapılmıştır. Ayrıca söz konusu depolar X-ışını mikroanalizine tabi tutulmuş ve sonuçta bu depoların demir içerdiği bulunmuştur. Ayrıca anter kültüründeki hiçbir FeNa2EDTA konsantrasyonunda demir depolarının oluşmadığı, buna karşılık mikrospor kültüründe ise 40 mg/l lik konsantrasyonun üzerinde demir depolarının oluştuğu tespit edilmiştir. Intin duvarındaki Fe depolarının, mikrospor kültür ortamındaki Fe fazlalığından kaynaklandığı sanılmaktadır. Mikrospor kültür ortamındaki Fe fazlalığı bir noktaya kadar intin duvarında biriktirilebilirken, demir fazlalığının aşırı düzeye çıkması durumunda, Fe hücre duvarından içeri geçebilir ve mikrosporların embriyojenik gelişimine toksik etkide bulunabilir. Oysa anter kültüründe, anter kültürünün avantajlarından bir tanesi olarak, anter duvarı bir filtre görevi görmekte ve demir fazlalığının anter içindeki mikrosporlar etrafında birikimini önlemektedir. 2.1.2. Androjenik Oluşumu Etkileyen Faktörler Genotip Androgenesisi etkileyen belki de en önemli faktör donör bitkinin genotipidir. Aynı türe ait farklı genotiplerin, androgenesise farklı tepki verdiği ve androgenesisin farklı aşamalarındaki genetik kontrol birçok çalışmada ortaya konmuştur. Bhojwani ve Razdan (1996)’ın bildirdiğine göre; doğadaki haploidinin, ‘haploid önleyici gen’olarak da bilinen tek bir gen (hap) tarafından kontrol edildiği (Kasha ve Sequin-Swartz, 1983) bilinmekle birlikte, in vitro androgenesisin de genetik kontrol altında olduğuna ve bu özelliğin androjenik klonlardan androjenik olmayan klonlara aktarılabileceğine dair yeterli kanıt bulunmuştur. Nitekim, Bullock ve ark. (1982: Ellialtıoğlu, 2000’den), buğdayda anter kültürüne cevap vermeyen 16 2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Esin ARI bir seri çeşidin, iyi bir rejenerasyon kapasitesine sahip olan ‘Centurk’ çeşidi ile melezlendikten sonra; bu olumlu özelliğin F1 döllerine aktarılabildiğini ispatlamıştır. Hatipoğlu (1999), buğdayda anterlerden haploid oluşumunun; embriyoid oluşumu, bitki rejenerasyonu ve yeşil/albino bitki oranı gibi birbirinden bağımsız üç kalıtsal karakterin etkisinde olduğunu bildirmiştir. Solanum tuberosum’da yapılan çalışmalar ise androgenesise giriş özelliğinin en az 3 bağımsız gen tarafından kontrol edildiğini ve bu genlerin resesif olduğunu ortaya koymuştur (Chupeau ve ark, 1998). Mityko ve ark. (1995), androjenik bitki oluşum sıklığının genotipe bağlı olduğunu ve bunun % 0.5-75 arasında değişen oranlarda gerçekleştiğini, bununla birlikte gelişme koşullarının optimize edilmesinin genotip etkisini ortadan kaldırmadığını bildirmiştir. Hibritlerin, ebeveynlerinden daha fazla androjenik kapasiteye sahip olduğu birçok çalışma (Chen ve ark., 1998b; Achar 2002) ile kanıtlanırken, Maheswari ve ark. (1982) ise poliploid türlerin diploidlerden daha yüksek performans gösterdiğini bildirmiştir. Donör Bitkinin Yetişme Koşulları ve Fizyolojik Durumu Donör bitkilerin yetişme şartları mikrosporların verimi üzerinde büyük etkiye sahiptir ve başarılı sonuçlar ancak, sıcaklığı, fotoperiyodu ve ışık intensitesi uygun ortamlardan elde edilebilir (Dunwell 1991: Alpsoy, 1999’dan). Wenzel ve Foroughi-Wehr (1994) buğdayda, Shtereva ve ark. (1998) domateste, Büyükalaca ve ark. (2004) ise biberde yaptıkları anter kültürü çalışmalarında; serada yetiştirilen bitkilerin, açıkta yetiştirilen bitkilere göre daha yüksek androgenetik performans gösterdiğini kaydetmişlerdir. Hatipoğlu (1999), donör bitkilerin anterlerin alındığı döneme kadar çok iyi beslenmesi ve optimum ışık koşullarında muhafaza edilmesi gerektiğini ve suni ışığın güneş ışığının yerini alamayacağını belirtmiştir. Ayrıca polen gelişimi sırasında donör bitkilerin herhangi bir strese maruz kalmamaları ve anterlerin alınmasından 3-4 hafta öncesinden itibaren pestisid uygulamasından kaçınılması gerektiği kaydedilmiştir. 17 2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Esin ARI Yapılan araştırmalar, erken çiçeklenen genç çiçek tomurcuklarının en fazla androjenik kapasiteye sahip polen taneciklerini içerdiğini ve tomurcukların çiçeklenme periyodunu başında toplanması gerektiğini göstermiştir (Smykal, 2000). Mikrosporların Gelişim Safhası Androgenesisi etkileyen faktörlerin en önemlilerinden birisi mikrosporların gelişim safhasıdır. Çünkü uygun safhadaki mikrosporlar kültüre alınmadıkça, diğer kültür şartları mükemmel dahi olsa polen embriyogenesisi gerçekleşmeyecektir. En uygun mikrospor safhasını belirlemek için Nicotiana tabacum (Sunderland ve Wicks, 1971; Sunderland ve Dunwell 1977), Hycscyamus niger (Reynolds, 1984), Solanum melongena (Karakullukçu, 1991), Secale cereale (Immonen ve Anttila, 1998), Phleum pratense (Guo ve ark., 1999), Capsicum annuum (Abak, 1983; Kim ve ark., 2004) gibi birçok bitkide mikrosporların ayrıntılı şekilde incelenerek gelişim aşamalarına göre gruplandırıldığı çalışmalar yapılmıştır. Birçok türde bu uygun safha her ne kadar ‘tek çekirdekli mikrospor safhası’ olarak genelleştirilmişse de farklı türlerde yapılan detaylı çalışmalar bu kritik noktanın; mayoz sonrası tetratların oluşumundan başlayan ve I. mitoz bölünme sonrasındaki nişasta depolanmasından hemen önceki döneme kadar süren bir zaman dilimi içinde olduğunu göstermiştir (Sunderland ve Dunwell, 1977). Anter safhasını belirlemek için genellikle tomurcuk şekli ve büyüklüğü ile anterin gelişme safhası arasında bir ilişki kurulmaktadır. Zamir ve ark. (1980)’na göre, mikrospor safhaları ile tomurcuk uzunluğu arasındaki ilişki, bazı bitkilerde bir anter içindeki mikrosporların aynı gelişim safhasında olmaması nedeniyle her zaman doğru olmayabilir. ‘Asenkronize’ mikrospor gelişimi olarak adlandırılabilecek bu yapıyı gösteren türlerde daha ileri dönemde bulunan mikrosporlar ortama toksik madde salgılayarak genç mikrosporların adrogenik gelişimlerini baskı altına alabilir (Kott ve ark., 1988; Kim ve ark., 2004). Nitekim, Kott ve arkadaşlarının (1988) Brassica napus’da değişik mikrospor safhalarını aynı ortamda 24, 48 ve 72 saatten fazla süreyle birlikte kültüre aldıkları çalışmada, embriyojenik ve embriyojenik olmayan mikrosporların birlikte kültüre alımasının, ortamda toksik etki oluşturduğu 18 2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Esin ARI ve embriyo oluşumuna olumsuz etkide bulunduğu açıklanmıştır. Ayrıca, bu durumda mikrospor izolasyonundan 24 saat sonra ortamın yenilenmesi önerilmiştir. Ancak yine Brassica napus’da yapılan bir çalışmada, Percoll kullanımının mikrospor senkronizasyonunu sağlamada çok başarılı olduğu belirtilmiştir (Fan ve ark., 1988). Summers ve ark. (1992) domates anter kültüründe yaptıkları bir çalışmada, anter uzunluğu ve farklı mikrospor gelişim safhalarının (leptotene, zygotene, metaphase-I, tek çekirdekli ve çift çekirdekli) 3 ayrı genotipteki anter kallus oluşumuna etkilerini incelemişlerdir. Çalışmada, anter içindeki mikrosporlar ne kadar erken safhada bulunurlarsa (profaz gibi), o kadar fazla oranda kallus oluştuğu bulunmuştur. Ayrıca, anter alım zamanının androjenik kallusların çap veya sayısına önemli bir etkide bulunmazken, anter veya tomurcuk uzunluğunun bu değerlerler üzerine önemli etkisi olduğu ve uygun mikrospor safhasını belirlemede, anter uzunluğunun tomurcuk uzunluğuna göre daha önemli bir kriter olduğu bildirilmiştir. Testillano ve ark. (1995), Capsicum annuum’da yaptıkları in situ hibridizasyon çalışmaları ile embriyogenesis için en uygun dönemin çekirdeğin aktif transkripsiyon özelliklerini gösterdiği zaman olduğunu bulmuşlardır. Tütünde yapılan bir çalışma, polen taneciklerinin uygulanan ön muameleye göre farklı mikrospor safhalarında embriyogenesise yönlendirilebildiğini ortaya koymuştur. Örneğin, açlığa maruz bırakıldıklarında çift hücreli polen tanecikleri, sıcaklık şoku uygulandığında ise tek hücreli polen tanecikleri en yüksek androgenesis oranını vermiştir (Touraev ve ark., 1997). Optimum mikrospor safhası türe, genotipe, donör bitkinin yetişme koşullarına veya kullanılan androgenesis tekniğine göre değişiklik gösterdiğinden (Ferrie ve Keller, 1997), her genotip için bu konuda bir ön çalışma yapılmalıdır. Bu çalışmalarda kullanılabilecek en basit yöntem, ezme preparatların aseto-karmen ile boyanması (Nitsch, 1981) yöntemidir. Bu yöntemin verimli olmaması durumunda ise feulgen yöntemi (Darlington ve La Cour, 1963), parafinle kesit alma yöntemi (Stösser ve ark., 1985; Eti, 1987) veya DNA çekirdek boyama yöntemleri olan DAPI (4’,6-diamidino-2-phenylindole) (Vergne ve ark., 1987) veya EtBr (Etidium Bromide) ile boyama (Samancı ve ark., 1998) yöntemlerinden herhangi birisi de denenebilir. 19 2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Esin ARI Kültür Öncesi Uygulanan Ön Uygulamalar Polen embriyogenesisinin başlatılabilmesi için farklı türlerde birçok temel mekanizma ortaya konmuştur. Yapılan çalışmalara göre bunlar arasından stres uygulamaları, embriyogenesisi başlatmada tetikleyici faktör olarak gözükmektedir (Touraev ve ark., 1997). Bazı türlerde anterlerin tomurcuklarından ayrılması ve kültür ortamına yerleştirilmesi bile bu olayı başlatmak için yeterlidir. Bazı türlerde ise anter veya polen taneciklerinin kültüre alınmadan önce farklı sürelerde ısı şokları, santrifüjleme, γ-ışınlaması, düşük atmosfer basıncı, yüksek ozmotik basınç, açlık uygulamaları vb. gibi fiziksel veya antimikrotubül ajanları, hormonlar, herbisitler, ethanol uygulaması vb. gibi kimyasal stres faktörlerine maruz bırakılmasının, in vitro androgenesis için teşvik edici hatta bazen zorunlu olduğu ispatlanmıştır. Bunlar arasında en yaygın uygulamalar sıcaklık şokları olup farklı sürelerde düşük veya yüksek sıcaklıkların uygulandığı pekçok çalışma mevcuttur. Bazı bitkilerde düşük (3-7 0C), bazı bitkilerde yüksek sıcaklıklar (28-32 0C) etkili olurken bazı bitkilerde ise hem sıcak hem de soğuk uygulaması sporofitik bölünmeyi başlatabilir. Heberle-Bors (1985)’un bildirdiğine göre, soğuk muamelesinin anter yaşlanmasını geciktirdiği (Pelletier ve Henry, 1974) ve anterlerdeki total serbest amino asitleri arttırdığı (Sangwan ve Camefort, 1978) ortaya konmuştur. Bu tür değişiklikler muhtemelen anter duvarı içinde polenler için bir tür mikroklima ortamı sağlamaktadır. Nitekim Bajaj (1983) da soğuk uygulamasının dolaylı etkiye sahip olduğunu ve androgenesisdeki artışın; yaşlanmayı geciktirmesinden, düşük sıcaklığın polen canlılığını daha uzun süre korumasından ve polenin aborsiyonunu engelleyerek embriyo oluşturabilecek olan canlı polen sayısını arttırmasından kaynaklandığını belirtmiştir. Sunderland ve Roberts (1979)’ın tütünde yaptıkları çalışmada, anterlere uygulanan 10-20 günlük 5-7 0C soğuk uygulamaları ile vejetatif çekirdek bölünmesi 24 saat içinde gerçekleşirken, soğuk uygulanmayan anterlerde 6. günde başlamıştır. Rashid ve Reinert (1980), 8 gün boyunca 10 0C soğuk muamelesi uyguladıkları tütün tomurcukları içerisindeki embriyojenik polen taneciklerini belirlemek için yoğunluk gradyantı santrifüjleme (density gradient centrifugation) 20 2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Esin ARI yöntemini kullanmışlardır. ‘Ab initio polen kültürü’adı verilen bu yöntemin ilk kez kullanımı ile % 2 oranında bir embriyogenesis başarısı elde edilmiştir. Yüksek sıcaklık şoku uygulamaları konusunda Bhojwani ve Razdan (1996)’ın bildirdiğine göre Pechan ve ark. (1991) ile Fabijanski ve ark. (1991), Brassica oleracea ve B. napus mikrosporlarında sıcaklık uygulaması sırasında ortaya çıkan ve androgenenesisin başlatılması ile ilgili olduklarını düşündükleri bazı yüksek moleküler ağırlıklı proteinler tespit etmişlerdir. Hamaoka ve ark. (1991) ise 35 0C de 24 saat bekletilen B. campestris anterlerindeki polen embriyogenesisi etkinliğinin, uygulama yapılmayan kontrol ortamından 20 kat fazla olduğunu ortaya koymuştur. Bazı bitkilerde düşük doz ışınlama uygulamalarının androgenesisi teşvik ettiği bilinmektedir. Bu konuda Shtereva ve ark. (1998)’nın domateste, sıcaklığın tek başına veya düşük doz (2-8 Gy) gama ışını ile birlikte uygulamasının etkilerini görmek için yaptıkları çalışmada, 4 Gy gama ışını ile birlikte 10 0C de 9 gün sıcaklık uygulaması kombinasyonunun anterlerde en yüksek kallus oluşumunu (% 72.7) sağladığı bildirilmiştir. Mikrotubüllerin mitoz sırasında oynadıkları rolün öneminin anlaşılması üzerine androgenesis çalışmalarında 1990’lı yıllardan itibaren antimitotik etkili kimyasallar kullanılmaya başlanmıştır. Eady ve ark. (1995)’na göre, bir mikrotubül inhibitörü olan kolhisinle muamele edilmiş mikrosporlardaki generatif hücre farklılaşması bloke edilebilir. Düşük konsantrasyonda (% 0.001) kolhisinle muamele edilen polen taneciklerinde, türlere göre farklı oranlarda birbirinin aynı büyüklükte, merkezde 2 kardeş hücrenin oluştuğu ve bunların farkedilir bir hücre duvarı ile ikiye ayrıldıkları simetrik bölünme teşvik edilmiştir. Ancak, yüksek konsantrasyondaki (% 0.05) kolhisin uygulaması ise I. polen mitozunun karakteristiği olan karyokinesis ve sitokinesisi etkili şekilde bloke ederek, generatif hücre oluşumu ve hareketini engellemiştir. Bunun sonucu olarak, merkezde bölünmemiş tek bir büyük çekirdek ortaya çıkmıştır. Açlık stresi konusunda yapılan başka bir çalışmada Kyo ve Harada (1985), tütün polen taneciklerini ilk 24-48 saat glutamine açlığına maruz bırakarak daha sonra glutamine içeren ortama transfer ettiklerinde androgenetik gelişimin 21 2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Esin ARI başladığını görmüşlerdir. Polen taneciklerinin glutamin içeren bazal ortamda, direkt olarak kültüre alınması durumunda ise gametofitik gelişim desteklenmiştir. Besin Ortamının İçeriği ve Yapısı Normal bir mikrospor polen olma yolunda sadece 2 mitotik bölünme geçirirken, androgenetik mikrosporlarda tekrarlanan bölünmeler söz konusudur. Bu nedenle, ilave bölünmeleri teşvik etmek için besin ortamına eklenen çok sayıdaki bileşen ve bunların miktarı büyük önem taşımaktadır. Besin ortamındaki karbonhidrat ve nitrojen kaynakları ve bunların konsantrasyonları, büyüme düzenleyiciler, katılaştırıcı maddenin tipi yanında ortamın tipi (katı, sıvı veya 2 fazlı) ve pH’sı, üzerinde önemle durulması gereken konulardır. Besin ortamıyla ilgili en önemli faktörlerden biri ortamın ozmotik basıncıdır. In vitro androgenesis için besin ortamına eklenecek şekerin zorunlu olduğu, ilk kez Nitsch (1969)’in tütünde, daha sonra da Sunderland (1974)’ın Datura innoxia’da yaptıkları çalışmalarla ortaya konmuştur. Bu nedenle bütün ortamlarda şekere yer verilirken, bunun oranı çoğunlukla bazı grup bitkilerde % 2-4, bazılarında ise % 8-12 dir. Türlerin bu ayrımının, bunların olgun polenlerinin Solanaceae ve Liliaceae’deki gibi iki hücreli veya Gramineae ve Cruciferae’daki gibi üç hücreli olmasına bağlı olduğu düşünülmektedir. İlk grup düşük ozmotik basınca, ikinci grup ise yüksek ozmotik basınca gerek duymaktadır (Dunwell, 1991: Alpsoy, 1999’dan). Androgenesis çalışmalarındaki besin ortamlarında, sakkarozdan başka galaktoz (Kyo ve Harada, 1985), mannitol (Cistue ve ark., 1994), maltoz (DolcetSanjuan ve ark., 1997; Kiviharju ve Pehu, 1998; Guo ve ark., 1999; Holme ve ark., 1999), laktoz (Rihova ve Tupy, 1999), glukoz (Saji ve Sujatha, 1998; Guo ve Pulli, 2000), pikloram (Bishnoi ve ark., 2000) gibi maddeler de kullanılmaktadır Nicotiana tabacum ve Datura innoxia’da yapılan çalışmalarla, globular embriyo safhasına kadar sadece şeker ve agardan oluşan bir ortamın bile yeterli olabileceği (bu aşamaya kadar gerekli besin elementleri ve hormonların muhtemelen anter duvarı veya polen taneciğinin kendisi tarafından sağlandığı), ancak embriyoların daha ileri gelişimi için besin ortamında mutlaka mineral tuzların bulunması gerektiği ispatlanmıştır. Bu tuzlar içinden demirin embriyo gelişimi için 22 2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Esin ARI hayati öneme sahip olduğu Nitsch (1972: Bhojwani ve Razdan, 1996’dan) tarafından tütün anter kültüründe ortaya konmuştur. Bu çalışmada hiç demir içermeyen veya sınır değerin (40 µM fe-EDTA) altında demir içeren ortamlarda, embriyo gelişiminin globular safhada durduğu tespit edilmiştir. Ayrıca, Fe-EDTA (Nitsch, 1969) ve Fe-EDDHA (Rashid ve Street, 1973)’nın ferrik sitrattan daha etkili olduğu kaydedilmiştir. Ozias-Akins ve Vasil (1985)’e göre, besin ortamlarındaki mineral maddeler arasında, hücre büyümesi ve morfogenesisi üzerinde en önemli etkiye sahip element muhtemelen azottur. Besin ortamındaki özellikle amonyum formundaki düşük inorganik nitrojenin androgenesisi ve bazı tahıllarda ise yeşil bitki oluşumunu teşvik ettiği bilinmektedir (Chu ve ark., 1975). Son yıllarda rastlanan androgenesis çalışmalarına göre kültür ortamlarının - NO3 / NH4+ oranları embriyogenesis üzerinde çok önemli role sahiptir. Ancak bu noktada öncelikle; bitkiler açısından hayati öneme sahip olan azotun, bitkiler tarafından NH4+ (amonyum) formunda kullanılmasına rağmen, doku kültürü çalışmalarında niçin NO3- (nitrat) kullanımından vazgeçilemiyor sorusunun cevaplandırılması gerekir ki bunun 2 nedeni bulunmaktadır: Birincisi; ortamdaki fazla NH4+ iyon konsantrasyonu eksplanta toksik etki yapmaktadır. İkincisi ise NO3iyonu ortamın pH’sını kontrol etmektedir. Dolayısıyla besin ortamlarında dengeli bir NO3- ve NH4+ kullanımı gereklidir (George, 1996). Bu nedenle birçok androgenesis çalışmasında, temel besin ortamlarındaki azot bileşiklerinde farklı modifikasyonlar yapılarak N6 (Chu ve ark., 1975), P2 (Chuang ve ark., 1978), BPTG (De Buyser ve Herry, 1980), 190-2 (Wang ve Hu, 1984), Heh5 (Reddy ve ark., 1985), C17 (Wang ve Chen, 1986), PG-96 (Guo ve ark, 1999), RZ (Raina ve Zapata, 1997), RZM (Bishnoi ve ark., 2000) gibi farklı bitki türlerinde embriyo teşviği ve rejenerasyonu için son derece başarılı ortamlar geliştirilmiştir. Daha sonra bu ortamlarda da modifikasyonlara gidilerek androgenesiste başarılar sağlanmıştır. Örneğin, Chu ve Hill (1988), Triticum aestivum’da yaptıkları anter kültürü çalışmasında geliştirdikleri MN6 (modifiye edilmiş N6 ortamı) ortamında, kontrol ortamı olan N6 ortamına göre % 23-76 oranında embriyogenesis artışı sağlamışlardır. Hatta 100 anter başına düşen embriyo oranı % 62’den % 105’e çıkartılmıştır. 23 2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Esin ARI Ortam modifikasyonlarından başka, temel besin ortamlarındaki belirli azot bileşiklerinin sadece belirli bir orana yükseltildiği veya düşürüldüğü birçok çalışma da mevcuttur. Bu konuyla ilgili olarak, Bante ve ark. (1990)’nın Lolium perenne ve L. multiflorum’da yaptıkları çalışmada, LS ortamındaki NH4NO3 konsantrasyonunun 1/10’a düşürülmesi sonucu, kültürdeki tüm eksplantlardan androjenik cevap aldıkları bildirilmiştir. Anter kültürü çalışmalarının büyük çoğunluğunda kültür ortamlarına ilave edilen hormonların, anterlerden embriyo oluşumunu teşvik ettiği bilinmektedir. Hormonların bu etkisi; anterlerin içerisinde bulunan mikrosporların gametofitik safhadan sporofitik safhaya yönlendirilmeleri şeklinde gelişmektedir. Anter kültürünün ilk çalışılmaya başlandığı yıllarda embriyo uyartımı için ortamlara sadece oksin ilave edilirken, zamanla ‘recalcitrant’ olarak da tanımlanan ‘inatçı’ türlerde yapılan çalışmaların olumsuz sonuçları, araştırmacıları oksinlerle beraber sitokinin kullanımına yöneltmiştir. Çünkü hücresel farklılaşma birçok yönden bu iki grup büyüme düzenleyiciler arasındaki interaksiyonla kontrol edilmektedir. Nitekim George (1996)’un da bildirdiğine göre embriyogenesis başlangıcı için oksinlere ilave olarak sitokinin kullanımı da gerekmektedir (Şekil 2.2.). Şekil 2.2. Büyüme ve morfogenesis için gerekli oksin - sitokinin göreceli konsantrasyonları (George, 1996) 24 2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Esin ARI Kültür ortamlarında bazen yer verilen diğer bir madde aktif kömürdür. Alpsoy (1999)’un aktardığına göre Dunwell (1991), bu maddenin kültür ortamını birçok yolla değiştirdiğini, özellikle de hormonları, vitaminleri, demiri ve kültürdeki yaşlanan dokular tarafından salınan fenolik bileşikleri adsorbe ettiğini bildirmiştir. Etki tarzı tam olarak bilinmeyen bu bileşiğin anter başına bitkicik sayısını arttırdığını ve anterlerden bitkiciklerin rejenerasyonunu hızlandırdığını bildiren araştırıcılar olduğu gibi (Bajaj, 1983), aktif kömürlü ortamdaki anterlerin kararıp canlılığını yitirdiğini (Karakullukçu, 1991) belirten araştırıcılar da vardır. Mensuali-Sodi ve ark. (1993) ise Anemone coronaria’ nın gelişimi ve Lavantin’in axillary kardeşlenmesi üzerinde aktif karbonun (AK) etilen düzeyini etkileme durumuyla ilgili yaptıkları çalışmada, kültür ortamındaki AK’un axillary tomurcuk kardeşlenmesini arttırırken, kök oluşumunu negatif yönde etkilediğini saptamışlardır. Bu çalışmada ayrıca AK’un pozitif etkisinin etilen adsorbsiyonu ile ilgili olmayıp, muhtemelen kültür ortamındaki tanımlanmamış inhibitör maddelerin ortamdan uzaklaştırılması ile ilgili olduğu belirtilmiştir. Ellialtıoğlu ve Tıpırdamaz (2000), Kemer patlıcan çeşidinde tomurcuklara uygulanan soğuk şoku ve besin ortamına katılan aktif kömürün, anterlerdeki içsel absizik asit (ABA) miktarı üzerine etkilerini inceledikleri çalışmada; uygulanan soğuk şokları (+ 4 0C de 80 saat ve + 9 0C de 9 gün) ve aktif kömürün (% 0.1, 1 ve 2), patlıcan anterlerindeki ABA miktarını azaltırken, embriyogenesise olumlu etki yapmadığını ve embriyoların sadece kontrol ortamlarından elde edildiğini rapor etmişlerdir. Ayrıca, anterlerdeki ABA miktarının az veya çok olmasının anter kültüründeki başarı üzerinde tek başına etkili bir faktör olmadığı da ifade edilmiştir. Kösali (2000) ise elmada androgenesis üzerine aktif kömürün etkilerini belirlemek üzere yaptığı çalışmasında, aktif kömürün % 0.1, % 0.15, % 0.3 lük konsantrasyonlarını denemiştir. Çalışmanın sonucunda elde edilen 2 embriyoidden birinin aktif kömürsüz ortamda, diğerinin de % 0.1 dozunda elde edildiği, bununla birlikte % 0.3 gibi nisbeten daha yüksek dozda ise embriyoid oluşmadığı ve kallus oluşturan anter oranının düşük bulunduğu açıklanmıştır. Son yıllarda anter kültürü çalışmalarında olumlu etkisi nedeniyle kullanımı yaygınlaşan bir diğer katkı maddesi bir etilen inhibitörü olarak bilinen gümüş 25 2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Esin ARI nitrattır. Bilindiği gibi bitki doku kültürleri eksplantın kesilip çıkartılması sırasındaki stres koşulları ve ortamda oksin bulunması nedeniyle etilen üretirler ve üretilen bu etilen somatik embriyogenesis, sürgün oluşumu ve kallus gelişimi gibi farklı oluşumları engellemektedir (Çömlekçioğlu, 2001). Besin ortamlarına eklendiğinde tıpkı başka bir etilen inhibitörü olan AVG (aminoethoxy-vinylglycine) gibi hareket eden gümüş nitratın bu etki mekanizması, etilen biyosentezinde rol oynayan ACC (1aminocyclopropane-1-carboxylic acid) sentezini bloke etmesine dayanmaktadır (Heidstra ve ark., 1997). Dias ve Martins (1999)’in Brassica oleracea’da yaptıkları çalışmada, gümüş nitrat embriyo oluşumunu arttırmış, diğer bazı Brassica türlerinde ise gümüş nitratın kullanılmadığı ortamlarda haploid embriyo oluşumu gerçekleşmemiştir. Malik ve ark. (2001), Brassica juncea’nın 2 hibrit çeşidine, bunların sitoplazmik erkek kısır hatları (CMS) ve ebeveynlerine ait anterleri kültüre aldıkları çalışmada, 30, 60 ve 70 µM gümüş nitrat dozlarına 30 mg/l glutathione eklemişlerdir. Çalışmada özellikle CMS hatları için gümüş nitrat kullanımının zorunlu olduğu bulunmuştur. Nitekim gümüş nitratsız ortamlarda, hiç embriyo oluşmazken, en fazla başarının elde edildiği 60 µM gümüş nitrat dozunda % 22.8’e kadar androgenesis elde edilmiştir. Gümüş niratın bir etkisi de kullanıldığı tüm ortamlarda kallus oluşumuna izin vermemiş olmasıdır. Ortamlara ilave edilen glutathione ise, anter başına embriyo sayısını arttırmakla kalmamış aynı zamanda CMS hatlarında da hücre bölünmesini arttırmıştır. Kabakta yapılan bir anter kültürü çalışmasında Achar (2002), 4 ayrı genotip için 0, 0.02, 0.01, 1, 1.1, 1.5 ve 2 mg/l gümüş nitratın embriyogenesis üzerine etkisini incelemiştir. Çalışmada en yüksek başarı 2 mg/l lik dozdan elde edilmekle birlikte diğer tüm dozlardan da embriyo elde edilmiştir. Embriyo verimi yönünden, en yüksek doz en düşük dozdan 3-4 kat daha fazla artış sağlamıştır. Ancak kontrol ortamından da embriyo elde edilmesi, gümüş nitratın kabak embriyogenesisi için zorunlu olmadığını fakat embriyo verimi üzerine yüksek oranda etkisini ispatlamıştır. Çömlekçioğlu ve ark. (2001) Şanlıurfa ve Kahramanmaraş yerel biber populasyonunda yaptıkları anter kültüründe, gümüş nitratın embriyo oluşumuna etkisini araştırmışlardır. MS temel besin ortamına 30 mg/l sakkaroz, 4 mg/l NAA, 26 2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Esin ARI 0.1 mg/l BAP, % 0.25 aktif kömür ve 10 mg/l gümüş nitratın eklendiği denemede, Şanlıurfa çeşidinden % 51.6, Kahramanmaraş çeşidinden ise % 35.7 oranında embriyo oluşumu sağlanırken, gümüş nitratsız ortamdan embriyo elde edilememiştir. Yine biberdeki başka bir çalışmada Büyükalaca ve ark. (2004), gümüş nitratın farklı konsantrasyonlarının (5, 10, 15 ve 20 mg/l) embriyo verimi üzerine etkilerini incelemişlerdir. Test edilen tüm gümüş nitrat dozlarından farklı oranlarda embriyo oluşumu sağlanmakla birlikte en yüksek embriyo verimi (45.7 embriyo / 100 anter) 15 mg/l dozundan elde edilmiştir. Androgenesis çalışmalarında özellikle hücre bölünmesinde olumlu etkisi tespit edilen bir diğer grup madde organik asitlerdir. Bu konuyla ilgili olarak, Svensson ve Johansson (1994)’ın Fragaria x ananassa’da yaptıkları anter kültürü çalışmasında, glutaminin (500 mg/l) hem mikrospor bölünmesinde, hem de kallus oluşumunda çok etkili olduğu, buna karşılık soğuk uygulamasının (5 0C’de 4 gün) kallus oluşumunda olumsuz etkide bulunduğu bildirilmiştir. Bazı genotiplerin içsel olarak bazı aminoasitleri içerdikleri ve bu aminoasitler yardımıyla embriyojenik gelişimin ortaya çıktığı düşünülebilir. Embriyogenesis esnasında aminoasit düzeyleri değişmekte ve bu düzeylerin manipulasyonu embriyo oluşumu için önem taşımaktadır (Collins ve Genovesi, 1982: Bal, 2002’den). Bal (2002)’ın domateste yaptığı çalışmada ise tek çekirdekli mikrosporları içeren tomurcuklar 10 0C de 7 gün 0.3 M mannitol içeren kültür ortamında ön muameleye tabi tutulduktan sonra, mikrosporlar izole edilmiş ve sıvı NLN kültür ortamında, BAP ve NAA varlığındaki 2 ve 4 ml/l lactalbumine hydrolysate ile 5 ve 10 g/l casein hydrolysate içeren ortamlarda kültüre alınmıştır. Denemelerde simetrik çekirdek bölünmesi ve çok çekirdekli yapıların oluşumu uyartılırken, hiçbir ortam ve koşulda mikrosporlardan rejenerasyon gerçekleştirilememiştir. Androgenesis oluşumunu sağlamak için ön uygulamalarda veya normal besin ortamlarında yukarıdaki katkı maddelerinden başka; patates ekstraktı, hindistan cevizi sütü, asparagin (Nitsch ve Nitsch, 1969), serin (Keller ve Armstrong, 1976; Zhang ve ark., 1994), prolin (Cho ve Zapata, 1988; Chu ve Hill, 1988; Wan ve ark., 1989), thiamin hydrochloride (Chen ve ark., 1998a, b), askorbik asit (Guo ve Pulli, 2000), phenylaseticacid (PAA) (Ingram ve ark., 2000), Ficoll (Charmet ve 27 2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Esin ARI Bernard, 1984; Cistue ve ark., 1994; Kiviharju ve Pehu, 1998; Castillo ve ark., 2000), Percoll (Fan ve ark., 1998; Herrera ve ark., 2002), polyethyleneglycol (PEG) (Ilic-Grubor ve ark., 1998) gibi pekçok katkı maddesi de kullanılmaktadır. Kültür Koşulları Anter veya mikrospor kültürlerinin inkübe edildiği ortamın ışık tipi ve değeri ile sıcaklığı kallus veya embriyo oluşumu üzerinde büyük öneme sahiptir. Abak (1983), biber anterlerine kültür öncesi düşük sıcaklık uygulaması yerine, 8 günlük kültürleri karanlıkta ve 35 0C de bekletmenin embriyo ve bitki oluşumunu yüksek düzeyde teşvik ettiğini ve bu şekilde 100 anterden elde edilen bitki sayısının bazı genotiplerde 50’ye kadar yükseltildiğini bildirmiştir. Todorovic ve ark. (1991), şeftalide yaptıkları anter kültürü çalışmasında farklı hormon konsantrasyonlarının etkisini 20 0C’de sürekli karanlık koşullarda incelemişlerdir. Çalışmada karanlıkta inkübasyonun kallus oluşumunda önemli başarı sağladığı bildirilmiş ve en yüksek kallus oranı (% 95) karanlıkta kültüre alınan 1 mg/l 2,4-D ve 1 mg/l Zeatin kombinasyonuna sahip ortamdan elde edilmiştir. Mythili ve Thomas (1995)’ın biber anter kültüründe kallus oluşumunu etkileyen faktörler üzerine yaptıkları çalışmada, sürekli karanlıkta bekletilen kültürlerde, fotoperiyotta bekletilenlere oranla kallus oluşum yüzdesi önemli ölçüde artış göstermiştir. Anterler genellikle karanlıkta ve 20-30 0C ler arasında kültüre alınmakta, rejenere olan bitkiler ise 3000-10000 lux yoğunlukta ışıklandırılan koşullara aktarılmaktadır (Ellialtıoğlu, 2000). 2.1.3. Haploid Bitkilerde Kromozom Katlanması Haploid bitkilerin kromozom sayıları 2 yolla diploid hale getirilebilir: • Spontan Olarak: Nicotiana tabacum gibi bazı türlerde, vejetatif çekirdeğin ilk bölünmesi sonrasında, sitoplazmik organellerde dejenerasyon oluşabilir (Hu ve Zeng, 1984). Böyle durumlarda haploid hücreler genellikle kültür sırasında ‘endomitozis’ yoluyla yani ‘hücre bölünmesi olmaksızın çekirdek bölünmesi ile 28 2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Esin ARI hücredeki kromozom sayısının iki katına çıkması’ yoluyla kromozom sayılarını iki katına çıkartma eğilimindedir. Spontan katlanmanın bir diğer yolu ‘polen çekirdeklerinin füzyonu’dur. Mikrospor içindeki vejetatif ve generatif çekirdekler bazen birleşerek diploid bir çekirdek oluştururlar ve bu yolla da diploid bitkiler meydana gelebilmektedir (Hatipoğlu, 1999). Bu hücrelerden oluşan bitkilerin gövde parçalarının kültüre alınması ile spontan diploid bitkileri çoğaltmak mümkündür (Alpsoy, 1999). Bu yöntemle tütün, kolza, çeltik, Datura ve Atropa anter kültürlerinden doğrudan doğruya katlanmış bitkiler elde edilebilmiştir (Er, 1992). • Antimitotik Özellikli Kimyasal Maddeler Kullanılarak: Mitoz bölünmenin metafaz safhasında iğ ipliklerinin oluşumunu engelleyen ve dolayısıyla replikasyona uğramış kromozomların kutuplara çekilmesini önleyerek kromozom sayısının 2 katına çıkmasını sağlayan antimitotik etkili kimyasalların, haploid kültür veya bitkiciklere göre değişen süre ve dozlarda uygulanması ile de haploidlerin kromozom sayısı 2n’e katlanabilmektedir. Bu amaçla kullanılan en yaygın kimyasal kolhisin (1937’den itibaren poliploid bitki üretiminde kullanılmaktadır) olmakla birlikte, kafein, kloral hidrat, asenaften, sulfinilamid, etil merkuriklorid, azot protoksit, hekzaklorosiklohekzan, amiprophos-methyl (APM), pronamid, fenridazonpottasium, 2-hydroxynicotinic asit, trifluralin ve oryzalin gibi mutagenler ve herbisitler ile 2,4-D ile NAA gibi hormonlar da kullanılabilmektedir (Picard ve ark., 1987; Bouvier ve ark., 1994; Ellialtıoğlu ve ark., 2001; Zheng ve ark., 2001; Rey ve ark., 2002; Han ve ark., 2003). Antimitotik etkili bu kimyasalların uygulama şekli ise hücre süspansiyonuna, besin ortamına (Barnabas ve ark., 1999), veya eksplantın içinde bulunduğu ön besin ortamı gibi farklı ortamlara (Nitsch, 1981; Zhao ve ark., 1996; Rudolf ve ark., 1999; Köksal, 1999; Zheng ve ark., 2001; Zamani ve ark., 2000; Herrera ve ark., 2002), kallus dokusuna (Wan ve ark., 1989), aksiller tomurcuğa (Abak, 1986), tepe tomurcuğuna ya da in vitro bitkicik (Sarı ve ark., 1994; Abak ve ark., 1996) veya çeliklere (Bouvier ve ark., 1994; Sarı ve Abak, 1995;), bitki köküne (Arzani ve Darvey, 2001) gibi bitkinin çeşitli organlarına göre değişmektedir. Bu yöntemlerin birbirlerine göre üstünlüklerini belirlemek için yapılan bir çalışmada Chen ve ark.(1994), Brassica napus mikrospor kültürlerinde 3 kromozom 29 2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Esin ARI katlama yöntemini kıyaslamışlardır. Mikrospordan oluşan bitkilerin, mikrospordan oluşan embriyoların ve izole edilmiş mikrosporların farklı doz ve sürelerde kolhisine tabi tutulduğu denemede en iyi sonuç, izole edilmiş mikrosporların doğrudan kolhisinle muamelesinden elde edilmiştir. Kromozom katlanma etkinliğinin % 70’e çıkartıldığı bu yöntem aynı zamanda mikrospor embriyogenesisini de uyartmıştır. Hansen ve Andersen (1998) ise buğdayda yaptıkları çalışmada, kromozom katlaması amacıyla trifluralin ve amiprophos-methyl (APM) kullanmışlardır. Çalışmada bu iki kimyasal maddenin kolhisinden daha etkili olduğu bulunmuştur. Daha önceki çalışmalarda kolhisinle % 53 fertilite sağlanırken, bu oran bu kimyasallar ile % 74’e çıkartılmıştır. Trifluralin ve APM’in molar konsantrasyon şeklindeki kullanımları, kolhisinden 300 kat daha düşük dozdadır. Dolayısıyla bu yüksek etkinliğe rağmen, insan ve çevre sağlığına çok daha az zararlıdır. Ayrıca, farelerde yapılan bir çalışmada kolhisin, APM ve Trifluralinin LD50 değerlerinin sırasıyla; 1.6 mg/kg, 609 mg/kg ve 3700 mg/kg olduğu belirtilmiştir. 2.1.4. Ploidi Belirleme Haploidi teknikleri sonucu elde edilen haploid bitkilerin ploidi düzeylerini yani kromozom seviyelerini tespit etmek için şu yöntemlerden yararlanılmaktadır (Emiroğlu, 1982; Abak ve ark., 1996; Ellialtıoğlu ve ark., 2001). • Fenotipik Gözlemler: Haploid bitkilerin fenotipik özelliklerine daha önce Bölüm 1.2.’de yer verilmişti. Bu özelliklerin gözlemlenmesi hızlı ve masrafsız olmasına karşılık, güvenilirliği azdır. Bu nedenle, fenotipik gözlemlerin mutlaka farklı ploidi belirleme yöntemlerinden birisi ile de desteklenmesi gerekir. • Flow Sitometri: Hücrelerin tek tek flouresans dedektörden geçerken emdikleri ışının analizine dayanan bu yöntemde, flouresans boyalarla boyanan hücre çekirdeklerinde çekirdeksel DNA miktarı belirlenmektedir. Her bitki türü için yöntemin optimize edilmesi bir dezavantaj olsa da, kolay, hızlı ve güvenilir sonuçlar vermesi, bu yöntemi en fazla tercih edilen yöntem haline getirmiştir. • Kromozom Sayımları: Özellikle kök uçları gibi hızlı büyüyen doku ve organlarda yapılan kromozom sayımları en güvenililir yöntem olarak kabul 30 2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Esin ARI edilmektedir. Bununla birlikte, preparat hazırlığı sırasındaki hidroliz veya boyamaların zaman alması ve tecrübe gerektirmesi, yöntemin dezavantajlarıdır. • Stomatal İncelemeler: Haploid bitkilerin stoma yoğunluğu ve bu stomalardaki plastidlerin sayısı diploid veya poliploid bitkilerden farklıdır. Ploidi düzeyi arttıkça, stoma uzunluğu ve plastid sayısı da artmaktadır Farklı bitki türlerinde stomaların iriliği, dolayısıyla birim alanda bulunan stoma sayısı ile ploidi düzeyi arasında güvenilir ilişkilerin saptanması üzerine, bu yöntem ploidi tespitinde kullanılmaya başlanmıştır. Ancak çeşitli çalışmalar, bu gözlemlerin kesinlikle kromozom sayımı ile de desteklenmesi gerektiğini ortaya koymuştur. 2.2. Anemone coronaria’da Yapılan Çalışmalar 2.2.1. Taksonomik ve Sitolojik Çalışmalar Altmışaltı cins ve yaklaşık 2000 türden oluşan Ranunculaceae familyası için farklı sınıflandırmalar yapılmıştır. Hoot (1991)’un bildirdiğine göre, Langlet (1932) ve Gregory (1941) yaptıkları karyolojik çalışmalarda bu familya üyelerinde görülen 2 tip kromozom yapısına göre familyayı 2 ana gruba ayırmışlardır: R-tipi (büyük kromozomlu Ranunculus tipi) ve T-tipi (küçük kromozomlu Thalictrum tipi). R-tipi kromozom taşıyan Anemone cinsine ait türler, uzun kromozomları ve hücrelerindeki bölünme düzensizlikleri nedeniyle çeşitli karyolojik, sitolojik ve sitotaksonomik çalışmalara konu olmuşlardır. Sitolojik araştırmalarla ilgili olarak Karaca ve Seğmen (1970)’in yaptıkları çalışmada; Ege bölgesinden toplanan farklı A. coronaria varyetelerindeki polen ana hücrelerinin mayoz-I.anafaz safhasında, normal anafaz safhasındaki hücrelerin yanında birçok hücrelerde bazı anormalliklere rastlanılmış, özellikle var. coccinea ve var. cyanea’da ‘laggard’ (tembel) kromozomlar, kromozom köprüsü ve mikropallen oluşumu gibi mayoz anormallikleri saptanmıştır. Ayrıca Guinochet (1936)’in steril olduğunu belirttiği bazı cyanea ve coccinea varyetelerindeki kısırlığın sebebinin bu anormallikler olabileceği ifade edilmiştir. Söz konusu kromozom köprülerinin oluşum nedenini; Ünal (1992), mitoz bölünmesindeki anafazda, kutuplara çekilen bir 31 2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Esin ARI veya daha fazla kromozomun birbirinden ayrılmaması ile açıklamakta, oluşuma katılan kromozom sayısına bağlı olarak ince veya kalın olabilen köprülerin telofaz hatta dinlenme evresinde de kopmayarak 2 kromozom grubunun birleşmesine ve sonuçta tetraploid bir çekirdek oluşumuna neden olduğunu bildirmektedir. Maia ve Venard (1976), Anemonun Akdeniz türleri ve bunların hibritleri arasında yaptıkları sitotaksonomik çalışmalarında A. coronaria, A. palmata, A. pavonina ve A. hortensis’in karyotiplerini karşılaştırmışlardır. Çalışmada türler arası hibritlerde kromozom farklılığı gözlenmiştir. A. pavonina X A. hortensis den oluşan F1 hibridi bazı mayotik anormallikler gösterse de fertil bulunmuştur. A. pavonina X A. coronaria’dan oluşan F1 hibridinde ise kromozom eşleşmesinden kaynaklanan sterilitenin kolhisinle giderilerek hibritlerde yeniden fertilliğin sağlandığı bildirilen çalışmada, özellikle A. coronaria ile diğer türler arasında yapılan melezlemelerde ortaya çıkan sterilliklerin giderilmesi üzerinde durulmuştur. Ünal (1984)’ın A.coronaria’nın generatif embriyolojisini ortaya koymak üzere yaptığı çalışmada, megaspor ana hücresinde mayoz bölünmenin düzenli olduğu ve embriyo kesesi gelişiminin polygonum tipinde olduğu, ayrıca Angiospermler için tipik olan çifte döllenme olayının bu türde normal cereyan ettiği bildirilmiştir. Tak ve Wafai (1996)’nin yaptıkları karyolojik çalışmada, A. coronaria’nın 2n=16 olan diploid kromozom sayısının 4:1:3 oranındaki meta, sub-meta ve akrosentrik (8m+2sm+6ac) kromozomlardan oluştuğu (Şekil 2.3.), ayrıca kromozom uzunluklarının 6.3-12.5 µm arasında değiştiği bildirilmektedir. Şekil 2.3. A. coronaria’nın karyotip analizi (Tak ve Wafai, 1976) 2.2 2. Islah Çalışmaları 32 2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Esin ARI A. coronaria’daki ıslah çalışmalarına geçmeden önce bu bitkinin döllenme biyolojisi ve bazı karakterlerinin kalıtımı konusunda yapılan çalışmalardan kısaca bahsetmek yararlı olacaktır. A. coronaria genellikle yabancı tozlanır ve çiçekleri belirgin şekilde protogeny yani anterleri ovaryumdan daha sonra gelişen bir yapı gösterir. Bunun açık kanıtı, en erken açan çiçeklerde meyve tutumu görülmemesidir. Bu nedenle kendine tozlanma bitkinin ikinci çiçeklerinin açmasından sonra mümkündür (Watts, 1980). Büyük ölçüde yabancı tozlanan A. coronaria, böcek ziyareti olmadan da tohum bağlayabilir. Fakat ziyarete izin verildiğinde tohum sayısı yaklaşık 3 kat artar (Roy, 1996). Ancak rüzgarla tozlanma da A. coronaria için oldukça yaygındır ve rüzgarla tozlanmanın bazı karakteristik özellikleri bu bitkide de toplanmıştır. Örneğin polenler kurudur, nişasta depolar, 40 nm’den az genişliktedir ve zar ornate yapı eksikliği gösterir (Horovitz, 1991). Çiçek renginin belirlenmesinde; populasyon yapısı ve ekolojik koşulların yanısıra toprak tipi ile doğal tozlayıcıların da etkili olduğu saptanmış; buna göre doğada normal tozlanma ile % 50 kırmızı, % 25 mor, ve % 25 pembe çiçekli bitkiler meydana gelirken, açık renklilerin ise % 5’in üzerine çıkamadığı tespit edilmiştir (Horovitz, 1976). Antosiyanin ve flavonollerin karışımı tepal, stamen ve pistil rengini belirlerken, araştırmalarla tepal rengini belirleyen 4 major loci bulunmuştur. Buna göre; beyaz renk = Sc-ww B- veya Sc-ww bb, mor renk = Sc- W- bb, pembe renk = Sc-W- B- ve kırmızı renk = scsc ---- genleri ile kontrol edilmektedir (Horovitz, 1977). A. coronaria’da çiçek büyüklüğü, çiçek sayısı, tepal rengi gibi birçok karakter epistatik genler tarafından kontrol edilmektedir (Horovitz, 1985). Bazı locilerdeki nadir resesiflik, antosiyanin pigmentasyonunu bloke ettiği için belirli bir rengin stabilizasyonu önlenmektedir. Örneğin koyu mavi renk birçok dominant ve epistatik genlerce kontrol edildiğinden bu rengin stabilizasyonu çok zordur. Pigmentasyon karakteri dışında katlı çiçeklilik, periant parçalarının bölünme durumu, erkek kısırlık, çiçek sapında ek renklenme gibi özellikler 1 veya 2 resesif gen tarafından kontrol edilmektedir (Horovitz, 1995). Erken çiçeklenme geç çiçeklenme üzerinde aşırı 33 2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Esin ARI dominans gösterirken, uzun ve kalın saplılık da dominant karakterlerdir (Arthur ve Ellis, 1972; Kostak ve Köse, 1998). Islaha gelince; A. coranaria, yoğun ıslah çalışmalarının yapıldığı tek Anemon türüdür. Doğal popülasyonları kesme çiçek ıslahı için uzun yıllar materyal sağlamıştır. Islah çalışmalarında asıl amaç, bitkinin sahip olduğu varyasyondan yararlanarak homojenite ile gücü birleştirmek ve saf renklere ulaşmaktır. Ancak, yabancı döllenmesine rağmen kendine de döllenebilmesi, fakat kendilemeye karşı hassas olması nedeniyle (Meynet, 1993) klasik ıslahı oldukça uzun zaman gerektirir. A. coronaria’nın 400 yıldır kültürünün yapıldığı bilinmektedir. Bu süre içinde birçok çeşit geliştirilmiştir. Fakat bu çeşitlerin ıslahında takip edilen yöntemler literatüre pek yansımamıştır. Bu konuda ayrıntılı bilgi edinilebilen tek çalışma, İngiltere’de John Innes Enstitüsü’nde Arthur ve arkadaşlarının 1969-1980 yılları arasında yürüttükleri klasik ıslah çalışmasıdır. 1969 yılında kesme çiçek olarak kullanılabilecek A. coronaria hat ve çeşitlerinin verim, kalite ve uniformitesini arttırmaya ve ticari öneme sahip kriterlerin genetik kontrolünü anlamaya yönelik olarak başlatılan ıslah programı 1980 yılına kadar devam etmiştir. Islah programı öncelikle populasyon oluşturmak amacıyla 1969 yılında Rosewarne Bahçe Kültürleri Araştırma İstasyonu’ndan temin edilen 87 orijinal Rosewarne hattının tohumlarının ekimi ile başlatılmış ve 40 hattın tohumları ile 1400 bitkiden oluşan bir başlangıç populasyonu oluşturulmuştur. Yine başlangıçta ıslah kriteri olarak ekonomik önemi olan 12 bitki karakteri seçilmiştir. Ön denemelerde karşılaşılan bazı problemler ve zorluklar (özellikle tek generasyon içinde bile oldukça büyük varyasyona rastlanması ve ticari öneme sahip birçok karakterin poligenik kontol altında olduğu) nedeniyle ıslah programının 2 ayrı yaklaşımla sürdürülmesine karar verilmiştir. Birincisi F1 hibrit çeşitlerinin üretiminde kullanılabilecek kendilenmiş hatların oluşturulmasıdır. Diğeri ise heterozigot populasyon içerisinden istenilen genlerin frekansını arttırmayı amaçlayan tekrarlamalı bir seleksiyon programının açılmasıdır. Kendileme programı içerisinde, kendileme depresyonu etkisini son derece açık bir şekilde ortaya koymuş ve birçok orijinal hattın kaybolmasına neden olmuştur. Daha 5. kendileme sonucunda, başlangıç hatlarından ancak dörtte biri hayatta kalabilmiştir. Programda en büyük 34 2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Esin ARI sorun, ebeveyn bitkilerde kendileme depresyonu sonucu görülen güç kaybı olmuştur. Ayrıca, melezleme programının devamı için yeterli sayıda çiçek elde edebilmek için genetik olarak birbirinin aynı ebeveynlerin çoğaltılması gerekmektedir. Yeterince saflaşmayan ebeveynlerde, bu işlem ancak vegetatif yöntemle, yani yumru çoğaltma ile yapılabilirdi ki; bu da oldukça uzun zaman almaktadır. Tohumdan tohuma her bir generasyonun en az 1 yıl zaman gerektirdiği kendileme programında, 8-10 kez kendilenmiş A. coronaria hatlarının tam olmasa da, birçok amaç için yeterince homozigot olduğu kabul edilmiştir. En azından artık ebeveynlerin vejetatif yumru üretimi ile çoğaltılması yerine tohumla üretim mümkün olabilmiş, ayrıca F1, F2, geriye ve diallel melezlemeler başlatılmıştır. Sonuç olarak 1980’e gelindiğinde, 100 adet kendilenmiş hattın döl testleri sonucu ticari öneme sahip olabileceği düşünülen 20 F1 hibrit bitki seçilmiş ve bunların arazi denemeleri ve hala devam eden tohum çimlenme güçlüğünü aşmaya yönelik yeni denemeler kurulmuştur (Arthur, 1971; Arthur ve Ellis, 1972; Arthur, 1973; Arthur ve Ellis, 1974; Arthur ve Perry, 1975; Arthur ve Perry, 1976; Arthur ve Hosier, 1977; Arthur ve Hosier, 1978; Artur ve Hosier, 1979; Arthur ve Hosier, 1980). A. coronaria’da geliştirilen kültür çeşitleri genelde 2 ana grupta toplanmıştır. Yalın katlı çiçekliler “de Caen”, katlı çiçekliler ise “St. Brigid” ismi ile anılmaktadır (Rees, 1982). Bryan (1989)’ın aktardığına göre Johnstone (1972), birçok kültür çeşidinin orijinalinin ‘de Caen’ olduğunu ve bu grubun A. coranaria’nın doğal varyetelerinden geliştirilerek iki yüzyıl boyunca çiçekçilik sektörüne egemen olduğunu bildirmiştir. ‘His Excellency’ (parlak iri kırmızı), ‘Mr.Fokker’ (mavi), ‘Sylpide’ (menekşe), ‘The Bride’ (beyaz), ‘Blue Poppy’ (koyu mavi) “de Caen” grubunun, ‘Lord Lieutenant’ (parlak mavi), ‘The Admiral’ (menekşe), ‘The Governor’ (kırmızı) ise “St.Brigid” grubunun önemli kültür çeşitleridir Bazı çalışmalarda ‘St. Piran’ adı verilen bir ara gruba daha rastlanmaktadır. İngiltere’de geliştirilerek soğuğa dayanıklılık özelliği kazandırılan bu grupta ise hem yalın, hem de katlı çiçek açan çeşitler vardır (Rees, 1992; Armitage, 1993). ‘Mona Lisa’ ve ‘Cleopatra’ serileri serada kesme çiçek üretimi için uygun olup (Nau, 1993), ‘Mona Lisa’ en uzun saplı ve vazo ömrü uzun olan çeşittir (Armitage, 1993). Son zamanlardaki ıslah çalışmalarının özellikle İsrail, Fransa, Hollanda ve İtalya’da 35 2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Esin ARI yoğunlaştığı ve bu amaçla biyoteknolojik yöntemlerin kullanıldığı görülmektedir. İsrail’de geliştirilen diploid ‘Jerusalem F1’ ve triploid ‘Galil F1’in nasıl geliştirildiği hakkında ayrıntılı bilgi edinilememekle birlikte biyoteknolojiden yararlanıldığı bilinmektedir. Fransa’da ise tetraploid hibritler geliştirilmiştir (Jacob ve ark., 1997). Frejus - INRA’da gerçekleştirilen bu çalışmada, daha önce aynı yerde sentetik olarak geliştirilen Tetranemones® ile normalde bir diploid olan ‘Mona Lisa’ çeşidinde kolhisin uygulamasıyla elde edilen tetraploid bitkiler arasında yapılan melezlemeler sonucu A. coronaria’nın tetraploid hibritleri elde edilmiştir. Ancak yapılan bir generasyon kendilemede yüksek düzeyde heterosis görülmüştür. Bu durumda hibritleri çok sayıda üretmek için başlangıçta mikroüretim yöntemi düşünülmüş, ancak mikroçoğaltılan bitkilerdeki düşük köklenme oranı ve endojen bakteriler sebebiyle vazgeçilmiştir. Hollanda ve İtalya’da ise, İnternetten takip edilebildiği kadarıyla Hollanda’da mikrospor kültürü (Anonymous, 2003), İtalya’da ise anter kültürü ile (Laura ve ark., 2003) haploid bitki elde edildiği öğrenilmiştir. Ülkemize gelince, A. coronaria’da herhangi bir çeşit geliştirilmemiştir. Bu konudaki çalışmalar, sadece 2 seleksiyon çalışması ile sınırlıdır. Bunlardan birinci çalışma (Kostak ve Köse, 1998) Ege bölgesinde, ikinci çalışma (Çakıroğlu ve ark., 1999) ise Batı Akdeniz bölgesinde doğal A. coronaria’nın seleksiyon çalışması şeklinde yürütülmüştür. Çalışmalar sonucunda; kesme çiçek olarak kullanılabilecek verim ve kalitede birinci bölgeden 8 klon, ikinci bölgeden ise 11 tip belirlenmiştir. 2.2.3. Haploidizasyon Çalışmaları Yukarıda belirtildiği gibi A. coronaria’nın klasik yöntemlerle ıslahı oldukça uzun zaman gerektirmektedir. Özellikle uniform hatlara ulaşmadaki problem, araştırıcıları başka alternatifler düşünmeye zorlamıştır. Haploidizasyon bu konuda büyük bir avantaj olarak görünmesine karşılık, bu tez çalışmasının III. yılına kadar A. coronaria’da androgenesis konusunda yapılan tek çalışmanın, literatüre tam anlamıyla yansımayan Sunderland’ın 1970’lerde yaptığı bir anter çalışması olduğu öğrenilmiştir. Ancak kendisinin başka bir çalışmasından (Sunderland, 1977: Sunderland ve Dunwell, 1977’den) ve diğer bazı araştırıcılardan (Arthur, 1973; 36 2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Esin ARI Meynet, 1993), bu çalışmadan embriyo değil ancak globular embriyo aşamasına kadar birkaç polen bölünmesinin gerçekleştiği embriyoid oluşumu şeklinde bir androjenik sonuç alındığı bilgisine ulaşılmıştır. Bununla birlikte, ticari değerleri nedeniyle yapılan her çalışmanın bilim dünyasıyla paylaşılmadığı bir gerçektir. Örneğin, İsrail’de yıllardır A. coronaria ıslahı ile ilgili çalışarak ‘Jerusalem F1’in geliştirilmesinde rol oynayan ve ilk ticari triploid çeşit olan ‘Galil F1’i geliştiren Dr. Nakdimon UMIEL* ile yapılan yazılı görüşmede; kendilerinin de anter kültürü üzerinde çalıştıkları, hatta yaklaşık 300.000 anter kültüründen ancak birkaç haploid bitki elde ettikleri, bunların da zamanla bitkilerde görülen kendileme depresyonu sonucu kaybedildiği öğrenilmiştir. Çalışmanın III. yılında Internette rastlanan bir literatür özetine göre ise Laura ve ark. (2003), A. coronaria çeşitlerinden anter kültürü yoluyla embriyo elde etmeyi ve bunları bitki haline dönüştürmeyi başarmışlardır. Çalışmada A. coronaria’ nın Cristina, Monalisa, Tetranemone ve Wicabri kültür çeşitlerine ait anterler, daha önce Johansson ve Eriksson (1977)’un kullandıkları 2 fazlı ortamda kültüre alınmıştır. Ortam olarak NN (Nitsch ve Nitsch, 1969) ile yarı doz MS (Murashige ve Skoog, 1962) ortamlarına ilave olarak sadece %1 aktif karbon veya aktif karbonla birlikte 0.1 mg/l IAA (Indol Asetik Asit) kullanılmıştır. 12-14 hafta sonra anterlerin yan taraflarından globular şekilli emriyo-benzeri yapılar gelişmiştir. Bu yapılar hızla küçük kökçükler geliştirmiş ve nihayet bitkicik oluşturmak üzere çimlenmiştir. Hatta bu gelişimin, zigotik tohumdan bitki oluşumu ile benzerlik gösterdiği vurgulanmıştır. 100 anter başına en yüksek globular şekilli embriyo-benzeri yapı frekansı (11.3) hormonsuz NN ortamında mavi renkli Christina kültür çeşidinden elde edilmiştir. Ayrıca yarı dozdaki MS ortamında da emriyo-benzeri yapılara rastlanmıştır. Araştırıcıların bildirdiğine göre bu yapılardan oluşan bitkiciklerin mikrospor orijinli olup olmadıkları ve haploid / dihaploid kromozom sayısına sahip olma durumları üzerine araştırmalar devam etmektedir. (UMIEL, 2001)*: Yazılı Görüşme (ARO, Volcani Center, Bet Dagan, Israil) 37 2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Esin ARI 2.2.4. Diğer Anemone Türlerindeki Haploidizasyon Çalışmaları Anemonun farklı türlerinde yüksek oranlarda haploid bitki elde etmenin mümkün olduğu yapılan bazı çalışmalarla ortaya konmuştur. Bunlardan Johansson ve Eriksson’un 1977’de yaptıkları çalışmanın 1. aşamasında; A. virginiana’nın tek çekirdekli mikrosporlara sahip tomurcuklarına +7 0C de 48 saat soğuk muamelesi uygulanmış, daha sonra %1 AK içeren H ortamında (Nitsch ve Nitsch, 1969) kültüre alınan petrilerdeki anterler karanlıkta 20, 25 ve 30 0C, aydınlıkta ise 15, 20, 25 ve 30 0 C de inkübe edilmiştir. Denemede en fazla embriyo (% 32), 25 0C deki sürekli karanlık koşullardan elde edilmiş ve sonraki çalışmalarda bu koşullar sağlanmıştır. 2. Aşamada; farklı AK konsantrasyonlarının (% 0.01, % 0.1, % 1, % 2 ve % 5) embriyogenesis üzerindeki etkileri incelenmiş, sonuçta % 0.1’den daha yüksek konsantrasyonların hemen hemen aynı etkiyi gösterdiği saptandığı için bundan sonraki çalışmalarda ölçüm kolaylığı nedeniyle %1 AK kullanılmıştır. Sitokininlerin, anterler tarafından üretilen absizik asitin (ABA) inhibe etkisini antogonize ettiği ispatlanmıştır (Van Overbeek ve ark., 1967: Johansson ve Eriksson, 1977’den). Bu nedenle anterlerin içerdiği ABA, AK yerine bir sitokinin kullanımıyla elimine edilebilir ve böylece embriyo elde etmek mümkün olabilir fikriyle, 3. aşamada; yine A. virginiana’da, farklı 2ip konsantrasyonlarının (10-4, 106 , 10-8 ve 10-10), embriyogenesis üzerine etkileri araştırılmış ve 10-6 2ip konsantrasyonunun en yüksek embriyo oluşumunu sağladığı bulunmuştur. A. virginiana’dan alınan bu başarılı sonuçlar üzerine 4. aşamada; Anemonun farklı türleri olan A. hupehensis, A. canadensis, A. multifida, A. rupicula ve A. fasciculata’nın embriyo oluşturma kapasiteleri incelenmiş, ancak bu 5 türün üçünden embriyo elde edilebilmiştir. Bunlardan A. canadensis en verimli tür olup (% 30), neredeyse A. virginiana ile aynı oranda (% 32) embriyo üretirken, A. multifida % 3 oranında embriyo vermiş, A. rupicula ise sadece 1 embriyo üretmiştir. Johansson ve ark. (1982), Anemone spp. (A. canadensis, A. dichotama, A. vitifolia, A. baicaliensis, A. hupehensis), Clematis spp., Papaver spp. ve Nicotiana spp.’de anter kültürü tekniğinin geliştirilmesi amacıyla birçok deneme yapmışlardır. 38 2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Esin ARI Bunlardan Anemone spp ile ilgili yapılan denemelerin 1. aşamasında, A. canadensis, A. dichotama ve A. vitifolia’da farklı kültür yöntemlerini kıyaslamak amacıyla; 1) 2 fazlı ortam ( altta % 1 AK ve % 0.8 agar katkılı 5 ml katı H ortamı, üstte 4 ml sıvı H ortamından oluşan toplam 9 ml ortam / 5cm Ø petri) 2) 24 saat çalkalayıcıda çalkalanan % 10 AK katkılı sıvı H ortamından, AK’un filtrasyonla uzaklaştırıldığı sıvı ortam (9 ml / 5cm Ø petri) ve 3) özel imal edilmiş ek bölmeli 125 ml’lik E-erlenmayerlerin, ek bölmesinde AK, erlenmayer kısmında ise yine 2 fazlı H ortamının kullanıldığı 3 farklı ortam denenmiştir. Bunlardan 1. yöntemde 6. haftada embriyolar oluşmaya başlamış ve 10. hafta sonunda özellikle A. canadensis’de çok yüksek embriyogenesis gözlenmiştir. Çalışmanın 2. aşamasında, A. canadensis’de inokulasyon öncesi ve sonrası uygulanan soğuk muamelesinin (7 0 C de 7 gün) karşılaştırıldığı denemede inokulasyon sonrası uygulamanın biraz daha başarı gösterdiği saptanmıştır. 3. aşamada, CO2’in embriyogensis üzerindeki etkisini gözlemek için A. canadensis ve A. vitifolia’nın % 1 AK içeren katı H ortamında 7 0C’de farklı sürelerde soğuklatılan anterleri; ya normal hava koşullarında veya % 2 CO2 içeren ortamda inoküle edilmiştir. Sonuçta % 2 CO2’in embriyogenesisi inhibe ettiği, buna karşılık normal hava şartlarında 20 gün soğuklatılan anterlerin en yüksek embriyogenesis düzeyine ulaştıkları tespit edilmiştir. 4. aşamada ise; soğuk muamelesinin (7 0C de 7 gün) anterlerdeki ABA miktarına olan etkisi incelenmiştir. Soğuklatma uygulanmamış 1 g A. canadensis anterinde 2.2x10-6 g ABA, soğuklatılmışlarda ise 0.6x10-6 g ABA saptanmıştır. Johansson (1983) başka bir çalışmada, A. canadensis ve A. hupehensis’de AK un ABA üzerindeki etkisini incelemek için % 1 AK içeren 2 fazlı H ortamında ABA’in farklı konsantrasyonlarını (10-3, 10-4, 10-5, 10-6, 10-7, 10-8 ve 10-9 M) denemiştir. Çalışmada, AK yokluğunda A. hupehensis’de 10-7’den, A. canadensis’de ise 10-6 dan yüksek konsantrasyonlarda embryogenesis tamamen önlenmiştir. Johansson ve Eriksson (1984)’un yaptıkları başka bir çalışmada, A. canadensis, A. hupehensis ve A. dichotoma’da CO2 ile embriyogenesis arasındaki ilişkiyi gözlemek için, tek çekirdekli mikrospor içeren anterleri önce % 1 AK içeren 2 fazlı H ortama aktardıktan sonra 7 0C de soğuklatma uygulamışlar, sonra % 0.004, 39 2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Esin ARI % 2 veya % 5 CO2 içeren inkübatörlerden birinde inkübe etmişlerdir. En fazla embriyogenesis, A. canadensis ve A. hupehensis’de % 5 CO2 , A. dichotoma’da ise % 2 CO2 oranından sağlanmıştır. Ayrıca, A. hupehensis’de 21 gün soğuk muamelesi ile proembriyo sayısı ciddi oranda artarken, daha sonra uygulanan % 2 CO2 inkübasyonu bu embriyoların gelişmesine de katkıda bulunmuştur. Johansson ve ark., 1990’da yaptıkları çalışmada ise A. canadensis’de AK ve organik maddelerin embriyogenesise etkilerini ortaya koymuşlardır. Buna göre embriyogenesis; glisin, nikotinik asit, pyridoxine, thiamin, folik asit, D-biotin veya myo-inositolden etkilenmezken, Fe-EDTA’nın yokluğu embriyogenesisi tamamen önlemektedir. 2 fazlı H ortamındaki AK, 24 saat içinde hemen hemen tüm Fe-EDTA, pyridoxine, folik asit ve nikotinik asiti adsorbe etmiştir ve petri kaplarının bir gece bu şekilde bekletilmesi durumunda embriyogenesis muhtemelen, Fe-EDTA’nın AK tarafından adsorbsiyonu nedeniyle tamamen önlenmektedir. Anemonun bağlı bulunduğu Ranunculaceae familyasında yürütülen diğer çalışmalar incelendiğinde ise George (1993)’un bildirdiğine göre; Konar ve Nataraja (1965a,b) ile Nataraja ve Konar (1970) Ranunculus scleratus, Nataraja (1971) Delphinium bounonianum ile Consolida orientalis ve Johansson ve ark. (1982) Clematis’de anter kültürü çalışmaları yapmışlardır (Çizelge 2.1). Çizelge 2.1. Ranunculaceae familyasında yürütülen bazı anter kültürü çalışmaları (George, 1993) Tür Anter Kullanılan Adı Kültürü Ortam pH Sonucu Delphinium bounanianum Kallus uyartımı, Kök Rejeneras. Consolida orientalis Kallus, Kök ve Sürgün Gelişimi Clematis spp. Yüksek Oranda Embriyogenesis Ranunculus scleratus Konnektif Doku, Kallus Ranunculus scleratus Kallus ve Embriyogenesis Sak- Agar Hormon Referans karoz (g/l) (mg/l) Araştırıcı (g/l) Ranga Swamy (1961) Ranga Swamy (1961) Nitsch and Nitsch (1969) Ranga Swamy (1961) Ranga Swamy (1961) 5.8 20 7 (1) IAA + % 10 CM Nataraja (1971) 5.8 20 7 (2) IAA + % 10 CM Nataraja (1971) 5.8 20 2 Fazlı Ortam 5.8 20 7 5.8 20 7 40 ----(0.5-2) 2,4-D + % 10 CM (1) 2,4-D + % 10 CM Johansson ve ark. (1982) Konar ve Nataraja (1965a,b) Nataraja ve Konar (1970) 3. MATERYAL ve METOD Esin ARI 3. MATERYAL ve METOD Bu araştırma, 2002–2005 yıllarında Çukurova Üniversitesi, Ziraat Fakültesi, Bahçe Bitkileri Bölümüne ait Doku Kültürü Laboratuvarında yürütülmüştür. 3.1. Materyal Bu çalışmada bitkisel materyal olarak, Türkiye florasında yaygın olarak bulunan ve “Manisa Lalesi” olarak da bilinen Anemone coronaria türünün Adana’da doğal yayılış gösteren bir A. coronaria var. coccinea (kırmızı çiçekli varyete) populasyonuna (Şekil 3.1.) ait bitkilerden alınan anterler kullanılmıştır. Yıldırım Beyazıt Mahallesi mevkiinde bulunan söz konusu populasyon, Adana – Osmaniye Karayolu girişi çevresinde yayılış göstermektedir. Şekil 3.1. Çalışma alanındaki doğal A. coronaria var. coccinea populasyonu 2002–2005 yılları arasında sürdürülen denemelerde uygun mikrospor safhasını içerdiği düşünülen çiçek tomurcukları, yukarıda belirtilen alandan sabah saat 6–7 arasında toplanmıştır. Tomurcuk toplama tarihleri denemeler boyunca Şubat 41 3. MATERYAL ve METOD Esin ARI - Mart ayları arasında değişmiştir. Bu tarihlerde alınmış olan uygun anter büyüklüğünü içerdiği düşünülen çiçek tomurcukları genellikle çalı altlarında yetişen, uzun boylu, kalın saplı ve gösterişli çiçeklere sahip genotiplerden toplanarak cam kavanozlar içerisinde biriktirilmiş ve vakit kaybetmeden laboratuvara getirilmiştir. Laboratuvarda, hemen tomurcuk sterilizasyonu işlemlerine başlanmış ve daha sonra da içerisindeki anterler farklı içeriğe sahip yapay besin ortamlarında kültüre alınmıştır. 3. 2. Metod 3.2.1 . Sitolojik Çalışmalar 3.2.1.1. Çiçek Tomurcuklarının Gruplandırılması Doğal A. coronaria var. coccinea tomurcukları içerisindeki mikrosporların in vivo gelişim aşamalarını belirlemek ve buna göre genel bir uygun tomurcuk tanımlaması yapabilmek amacıyla farklı büyüklükteki tomurcuklar, morfolojilerine göre 10 gruba ayrılmıştır. Tomurcuklar yaklaşık 2 aylık vejetasyon süresinin 2. haftasında alınmıştır. Şekil 3.2.’de sitolojik incelemeye alınan farklı büyüklükteki 10 tomurcuktan, tomurcuk büyüklüklerini daha yakından gösterebilmek amacıyla ilk 6 tomurcuğun görüntüsü, Çizelge 3.1.’de ise bu tomurcukların morfolojik özellikleri verilmiştir. c b a 1 2 3 4 5 6 Şekil 3.2. Sitolojik inceleme yapılan farklı büyüklükteki doğal A. coronaria var. coccinea tomurcukları 42 3. MATERYAL ve METOD Esin ARI Çizelge 3.1. Farklı büyüklükteki A. coronaria var. coccinea tomurcuklarının morfolojik özellikleri (a: tomurcuk eni, b: alt involukrum yaprak ucundan boğuma kadar olan tomurcuk uzunluğu, c: boğum eni, d: üst involukrum yaprak kaldırılınca tomurcuğun dip kısmı ile boğum arasındaki uzaklık) İnvolukrum Tepal Yaprak Görünüm Durumu Durumu (A=Açık) (+:Görünüyor ) (K=Kapalı) (:Görünmüyor) 1 4.30 / 4.80 7.40 4.6 1.07 K 2 4.70 / 5.64 7.73 5.47 1.20 K 3 5.10 / 5.84 10.70 6.91 1.88 K 4 5.30 / 6.20 12.75 7.04 1.61 K 5 5.80 / 6.25 14.80 8.13 1.45 A + 6 6.30 / 6.30 15.38 7.77 2.10 A + 7 7.22 / 7.96 17.00 10.18 2.10 A + 8 7.85 / 8.94 16.25 9.10 1.95 A + 9 8.80 / 9.41 19.87 9.82 3.20 A + 10 9.82 / 10.67 23.75 11.42 3.45 A + *, **: İnvolukrum yapraklar kaldırıldıktan sonra ölçülen bir değer ve gözlem Tom. No a (mm) içten*/dıştan b (mm) c (mm) d (mm) Antosiyanin Başlangıcı** (+: Var) (-: Yok) + + + + + + + 3.2.1.2. Uygun Tomurcuk Safhasının Tespiti Anter kültürü çalışmalarında uygun tomurcuk safhasını belirlemek için tomurcuk şekli ve büyüklüğü ile mikrosporların gelişme safhası arasında bir ilişki kurulmaktadır. A. coronaria’da en uygun mikrospor ve tomurcuk safhasının ne olduğu ve nasıl tespit edildiğine ilişkin herhangi bir literatür olmadığı için bu çalışmaya, uygun mikrospor ve tomurcuk safhasının belirlenmesi de dahil edilmiştir. Çalışmada androgenesis çalışmalarında genel kabul gören tek çekirdekli mikrospor safhasını içeren tomurcuk morfolojisi belirlenmeye çalışılmıştır. Ancak bunu belirleyebilmek için in vivo mikrospor gelişiminin tüm aşamalarının tespit edilmesi gerekmektedir. Bu aşamaların belirlenebilmesi için kullanılan farklı sitolojik yöntemler aşağıda açıklanmıştır: Asetokarmin ile Boyama: Tek çekirdekli mikrospor safhasını tespit etmek amacıyla kullanılan yöntemler arasında en pratik yöntem olarak bilinen bu yöntemde, farklı büyüklükteki canlı tomurcuklardan alınan anterler lam üzerine yerleştirilmiş ve bisturi ucu yardımıyla anterlerin içerisindeki mikrosporlar serbest hale getirilmiştir. 43 3. MATERYAL ve METOD Esin ARI Üzerine 1-2 damla asetokarmin damlatıldıktan sonra üstü lamelle kapatılan ezme preparatlar ışık mikroskobunda incelenmiştir. Asetokarmin Hazırlanışı: 55 ml saf su içerisine 45 ml glasiyel asetik asit ilave edilerek kaynatılmış ve sonra bu karışıma 1 g karmin eklenerek filtre edilmiştir. Feulgen ile Boyama: Ç.Ü. Fen-Edebiyat Fakültesi, Biyoloji Bölümü Sitoloji laboratuvarında gerçekleştirilen bu yöntem için Darlington ve La Cour (1963)’un metodundan faydalanılmış ancak yöntemin boyamada yetersiz kalması nedeniyle asetokarmin yöntemiyle kombine edilmiştir. Bunun için involukrum yaprakları ve tepalleri soyulmuş farklı büyüklükteki canlı A. coronaria tomurcukları 1 N HCl içinde 60 0C deki su banyosunda 10-12 dakika süreyle hidrolize edilmiştir. Hidroliz sonrası tomurcuklar oda sıcaklığında yine 1 N HCl ile bir kez durulanıp bu solüsyondan çıkartılmıştır. Tomurcuklar daha sonra Feulgen çözeltisi içerisinde oda sıcaklığındaki karanlık bir ortamda 2 saat bekletilmiş ve boyama işlemine geçilmiştir. Bunun için Feulgen çözeltisinde bekletilen tomurcuklardan pens yardımıyla alınıp lamlara yerleştirilen anterlerin üzerine 1-2 damla asetokarmin damlatılmış ve anterler çizilerek içerisindeki mikrosporların serbest hale gelmesi sağlanmıştır. Lamelleri kapatılan ezme preparatlara daha sonra ışık mikroskobunda gözlem yapılmıştır. Feulgen Hazırlanışı: 200 ml kaynamış saf su içine 1 g Fuchin Basic eklenmiş ve daha sonra karışımın sıcaklığı 50 0C ye düşürülmüştür. Karışım filtre kağıdı ile süzüldükten sonra soğutulup üzerine 25 ml 1 N HCl ilave edilmiştir. Çözelti oda sıcaklığına geldiğinde 1.5 g K2S2O5 (potasyum-meta-bisülfit) eklenip karıştırılmış, bunun da üzerine 0.5 g aktif karbon ilave edilmiştir. Daha sonra bu çözelti iyice karıştırılıp filtre kağıdıyla tekrar süzülmüş ve sonuçta saydam renkli bir sıvı elde edilmiştir. Ethidium Bromide ile Boyama: Bu yöntemde Samancı ve ark. (1998)’nın kullandıkları metoddan yararlanılmıştır. Son zamanlardaki bazı sitoloji çalışmalarında hem canlı hem de fikse edilmiş materyallerdeki kullanım kolaylığı ve hızlı sonuçlar vermesi nedeniyle DNA 44 3. MATERYAL ve METOD Esin ARI florkrom boyama yöntemleri tercih edilmektedir. Bu çalışmada ise Ethidium Bromide (3,8-diamino-5-ethyl-6-phenyl phenanthridium bromide) (EtBr)’in saf suyla hazırlandığı % 0.1 lik stok solüsyonu kullanılmıştır. Bu solüsyon 0, 10 ve 50 kez sulandırılmıştır. Ayrıca canlı materyallerle çalışıldığı için geçirgenliğin daha fazla arttırılması amacıyla, her 50 ml lik EtBr çözeltisine 2 damla % 0.1 lik Triton-100 solüsyonundan ilave edilerek karıştırılmıştır. Farklı büyüklükteki canlı tomurcuklardan alınan anterler lamlar üzerine yerleştirilip mikrosporları serbest hale getirildikten sonra üzerlerine 1-2 damla yukarıda bahsedilen EtBr çözeltilerinden damlatılmıştır. Lamelleri kapatılan ezme preparatlara daha sonra floresan mikroskobunda gözlem yapılmıştır. Lakto-Propionik-Orsein ile Boyama: Çalışmanın bu aşaması Gazi Üniversitesi, Fen-Edebiyat Fakültesi, Biyoloji Bölümü, Sitoloji Laboratuvarında yürütülmüştür. Uzaklık nedeniyle canlı materyalde çalışılamayacağı için farklı büyüklükteki tomurcuklar, ayrı kavanozlar içinde FPA (fenol-propionikasit-alkol) fiksasyon sıvısında oda sıcaklığında beklemeye alınmıştır. Sitolojik çalışma başlangıcında kavozdaki tomurcuklar önce % 70 etil alkol sıvısında yıkanmış ve daha sonra pens yardımıyla tomurcuklardan alınan anterler lam üzerine yerleştirilmiştir. Anterlerin mikrosporları serbest hale getirildikten sonra üzerine 1-2 damla lakto-propionikorsein damlatılmıştır. Üstü lamelle kapatılan ezme preparatlar daha sonra ışık mikroskobunda incelenmiştir. FPA Hazırlanışı: Eşit orandaki formaldehit ve propionik asitten oluşan 100 ml lik karışımın üzeri % 70 lik alkol ile 1 lt ye tamamlanmıştır. Lacto-Propionik-Orsein Hazırlanışı: Eşit orandaki laktik asit ve propionik asitten oluşan 100 ml lik karışıma 2 g orsein eklenerek filtre edilmiş, daha sonra çözelti % 45 lik olacak şekilde sulandırılmıştır. Kesit Alma Yöntemi: FPA fiksasyon sıvısı içinde muhafaza edilen farklı büyüklükteki tomurcuklardan, kesit alma yöntemi kullanılarak mikrotomda ince kesitler alınmıştır. Bunun için Stösser ve ark. (1985) ile Eti (1987)’nin yaptıkları çalışmalar kombine edilmiştir. 45 3. MATERYAL ve METOD Esin ARI Yöntemin ilk aşamasında, tomurcuklar Stösser ve ark. (1985)’na göre % 70, % 85, % 95 ve % 100 lük Johansen karışımları içinde üçer saat bekletilmiştir. Yöntemin bundan sonraki aşamaları Eti (1987)’ye göre gerçekleştirilmiştir: % 95 lik Johansen karışımı içindeki tomurcukların havası 30 dakika vakum pompası kullanılarak alınmıştır. Tomurcuk örnekleri, bu işlemden sonra TBA-1 (Tersiyer Butil Alkol) sıvısı içinde bir gece bekletilmiştir. Ertesi gün TBA-2 ve TBA-3 sıvılarında üçer saat bekletilen örnekler, daha önceden petriler içerisinde eritilen sıvı parafine aktarılmıştır. 60-65 0C sıcaklıktaki etüvde petriler içerisinde 2 gün bekletilen tomurcuklar, petrileri ile birlikte daha önceden hazırlanan buz kutusu düzeneği üzerine yerleştirilmiş ve böylece parafinin sertleşmesi sağlanmıştır. Daha sonra her bir örneği çevreleyen yaklaşık 1-2 cm2 lik alan bisturi ucu ile kesilip çıkartılmış ve bu parafinli örnekler tahta blokların üzerine yine parafin yardımıyla monte edilmiştir. Rotasyon mikrotomu kullanılarak bu örneklerden 10 µ kalınlığında kesitler elde edilmiştir. Daha önceden etiketleri yazılan lamlar üzerine yine daha önceden hazırlanmış olan 1:1 oranındaki gliserin ve yumurta akı karışımından oluşan yapıştırıcıdan çok az miktarda sürülüp yayılarak, alınan kesitler parçalar halinde lamların üzerine yerleştirilmiştir. Bu lamlar 35-40 0C sıcaklıktaki ısı masalarının üzerine bırakıldıktan sonra kesitlerin üzerlerine kurumamaları için 1-2 damla saf su damlatılmıştır. Böylece sıcaklığın etkisi ve yumurta akı karışımının da yardımıyla kesitin lama iyice yapışması ve lam üstündeki suyun buharlaşıp uçması sağlanmıştır. Daha sonra bu lamlar 30-35 0C deki etüvde 1 gece bekletilmiştir. Ertesi gün, lamlar lam taşıyıcılarına yerleştirilmiş ve bundan sonra Ksilol-1 ve Ksilol-2 küvetlerinde 10 ar dakika bekletilmiştir. Böylece parafinin eriyip örneklerden uzaklaşması sağlanmıştır. Buradan çıkartılan lamlar izopropil alkol-1 ve izopropil alkol-2 küvetlerinde 5 er dakika, daha sonra da % 96 dan başlayarak % 70, % 40 ve % 20 şeklinde sırayla konsantrasyonları azalan alkol küvetlerinin her birisinde ve son olarak saf su küvetinde 3 er dakika bekletilmiştir. Bu işlemlerden sonra boyama aşamasına geçilmiştir. Bunun için daha önceden hazırlanan Hematoksilin boya çözeltisinin bulunduğu küvetteki lamlar 2530 dakika boyunca boyanmıştır. Daha sonra örnekler, hafif akan çeşme altındaki su dolu bir küvette 15 dakika durulanmıştır. Durulamayı takiben, lamlar bu kez boyama 46 3. MATERYAL ve METOD Esin ARI öncesi kullanılan alkol serisinden ters yönde geçirilmiştir. Bu amaçla lamlar; % 20, % 40, % 70 ve % 96 lık alkol küvetlerinde 3 er dakika, izopropil-2 ve izopropil-1 de 5 er dakika bekletildikten sonra yeni bir ksilol küvetine aktarılarak bu sıvıda muhafazaya alınmıştır. Buradan pens yardımıyla alınan lamların üzerindeki ksilolün süzülmesi sağlanmıştır. Daha sonra ‘Entellan’adı verilen özel bir şeffaf yapıştırıcıdan her lamın üzerine eşit aralıkta 3 damla damlatılmış ve üstleri lamelle kapatılmıştır. Bu şekilde devamlı preparat haline getirilen örnekler 30 0C deki etüvde 3 gün bekletilip kurutularak, mikroskop incelemelerine hazır duruma getirilmiştir. Johansen Karışımları: Bu karışımlar Çizelge 3.2.’ye göre hazırlanmıştır Hematoksilin Hazırlanışı: 1 g Hematoksilin % 96 lık 6 ml etil alkol içerisinde eritilmiştir. Başka bir kapta 12.5 g potasyum aluminyum sülfat 100 ml suda eritilmiş ve bu karışıma 0.18 g KMnO4, 25 ml gliserin ile 25 ml metanol eklendikten sonra, diğer kaptaki hematoksilin de ilave edilerek stok boya çözeltisi hazırlanmıştır. Boyama için 1 birim stok çözelti, 10 birim saf suyla seyreltilerek kullanılmıştır. Çizelge 3.2. Johansen karışımları (Stösser ve ark., 1985) Alkol Karışım Saf Su % 96 lık Konsantrasyonu (%) (ml) Etil Alkol (ml) 70 85 95 100 300 150 - 500 500 450 200 Tersiyer Butil Alkol (ml) 200 350 550 800 3.2.1.3. Periyodik Anter Gelişiminin İncelenmesi Anterlerin haftalık gelişimlerini incelemek amacıyla çalışmanın III. yılında hem B5 hem de NN ortamında daha önce en yüksek embriyogenesis performansının elde edildiği uygulamalardan yeni, küçük histolojik gözlem denemeleri kurulmuştur. Buna göre B5 (+ 0.5 mg/l IAA + 0.1 mg/l BAP) ve NN (+ 1 mg/l IAA + 0.1 mg/l BAP) ortamlarında 8 hafta kültüre alınan anterlerden, her hafta sonunda birer petri içindeki 10 ar adet anter FPA fiksasyon sıvısına alınmıştır. Sekizinci hafta sonunda FPA’daki anterlerden kesit alma yöntemi kullanılarak mikrotomda ince kesitler alınmıştır. Bölüm 3.2.1.2.’de belirtilen yönteme göre kesitlerden preparat hazırlanmış ve daha sonra ışık mikroskobunda incelemeler yapılmıştır. 47 3. MATERYAL ve METOD Esin ARI 3.2.2. Anterlerin Kültüre Alınması Uygun safhada yani tek çekirdekli mikrosporlara sahip anterleri içeren tomurcuklar; önce % 70 etil alkolde 2 dakika, sonra % 20 sodyum hipoklorit ve 1-2 damla Tween-20 içeren çözeltide 10 dakika bekletilerek yüzey sterilizasyonu işlemlerinden geçirilmiştir. Sterilize edilmiş tomurcuklardaki genelde 6-7 sıra halinde dizilmiş anterlerin ilk ve son 2 sıraları haricindeki anterler, steril kabinde ve mikroskop altında çıkartılıp I. yıl flamentlerinden uzaklaştırılarak, II., ve III. yıllarda ise flamentleri ile birlikte farklı besin ortamlarında kültüre alınmıştır (Şekil 3.3.). Şekil 3.3. Bir tomurcuktaki uygun anter sıraları ve kültüre alınan anterler Anterlerin I. yıldan sonra flamentleri ile birlikte kültüre alınmasının sebebi; I. yıl çalışmalarının gözlemleri sırasında, kültüre alınan anterlerin bazılarının yaralanmış oldukları ve bu durumun anterlerin kültüre alınma öncesinde flamentlerinden uzaklaştırılmaya çalışılırken çok keskin bisturi uçlarından kaynaklandığının farkedilmiş olmasıdır. 3.2.3. Anterlere Yapılan Ön Uygulama Dört yıl boyunca sürdürülen çalışmanın I. yılındaki anterlere, besin ortamına yerleştirildikten sonra kontrol, +7 0C de 2, 7, 21 gün soğuk uygulaması yapılmıştır. 48 3. MATERYAL ve METOD Esin ARI Bu uygulamalar arasında fark bulunamamasına rağmen genel anter kültürü çalışmaları ve diğer Anemone türlerinde yapılan araştırmalara dayanarak, çalışmanın II., ve III. yıllarında kültüre alınan tüm anterlere +7 0C’de 7 gün soğuklatma uygulanmıştır. Bu uygulamalar, NÜVE-ID501 marka iklim dolabında yapılmıştır. 3.2.4. Kullanılan Besin Ortamları ve Kurulan Denemeler Çalışmada temel besin ortamı olarak; I. yıl NN (Nitsch ve Nitsch, 1969), II., ve III. yıllar ise NN ortamının yanı sıra B5 (Gamborg ve ark., 1968) ortamı kullanılmıştır. Bu ortamlar için öncelikle stok solüsyonlar (Çizelge 3.3. ve Çizelge 3.4.) hazırlanmış ve ortamlar hazırlanırken bu çözeltiler kullanılmıştır. Myo-inositol, sakkaroz ve agar ortam hazırlığı sırasında eklenmiştir. Ortamların tümünün pH’sı, 1N NaOH veya 1N HCl kullanılarak 5.8’e ayarlanmış, sterilizasyon işlemi ise 121 0 C’de 1 atmosfer basınca sahip otoklavda 15 dakika sürede gerçekleştirilmiştir. Ana denemelerdeki anterlerin tümü % 0.8 agar (SİGMA A-4550) ile katılaştırılmış ortamlarda kültüre alınmış olup, kültürde meydana gelen değişikliklerden dolayı, anterlerin bazıları daha sonra sıvı ortamda kültüre alınmıştır. 3.2.4.1. I. Yıl Denemeleri Çalışmanın I. yılı olan 2002 yılında A. coronaria’da anter kültürü ile ilgili herhangi bir literatür bilgisine rastlanmadığı için diğer Anemone türlerinde yapılan çalışmalar dikkate alındığında; hormon katkısız NN ortamına eklenen aktif karbonun (AK) embriyogenesisi yüksek oranda teşvik ettiği ve bu oranın % 32’ye kadar çıktığı bilgisine rastlanmıştır (Johansson ve Eriksson, 1977). Ayrıca son yıllardaki bazı anter kültürü çalışmalarında (Dias ve Martins, 1999: Çömlekçioğlu, 2001’den; Çömlekçioğlu ve ark., 2001; Malik ve ark., 2001; Achar, 2002; Büyükalaca ve ark. 2004) olumlu etkisi nedeniyle gümüş nitrat (GN) kullanımının yaygınlaştığı bilinmektedir. Bu bilgilere dayanarak 2002 yılında kurulan I. yıl denemelerinde temel besin ortamı olarak NN ortamı kullanılmıştır. Hormon kullanılmayan denemelerde katkı maddesi olarak AK ve GN’ın etkileri incelenmiştir. 49 3. MATERYAL ve METOD Esin ARI Çizelge 3.3. NN temel besin ortamının içeriği Standart Ortam Stok Çözelti Kimyasallar Konsantrasyonu Hazırlama (mg/l) Katsayısı Stok Çözelti Konsantrasyonu (g/l) MAKRO ELEMENTLER KH2PO4 MgSO4.7H2O CaCl2.2H2O NH4NO3 KNO3 68 188 220 720 950 (x 20) 1.36 3.7 4.4 14.4 19 MİKRO ELEMENTLER CuSO4.5H2O Na2MoO4.2H2O ZnSO4.7H2O H3BO3 MnSO4.4H2O 0.025 0.25 10 10 25 (x 100) 0.0025 0.025 1 1 2.5 Fe EDTA FeSO4.7H2O Na2EDTA.2H2O 27.8 37.3 (x 100) 2.78 3.73 VİTAMİNLER d-Biotin Folic Acid Pyridoxine-HCl Thiamine-HCl Glycine Nicotinic Acid 0.05 0.50 0.50 0.50 2.00 5.00 (x 100) mg / l Myo-Inositol 100 g/l Sakkaroz Agar 20 8 50 0.005 0.050 0.050 0.050 0.200 0.500 3. MATERYAL ve METOD Esin ARI Çizelge 3.4. B5 temel besin ortamının içeriği Standart Ortam Stok Çözelti Kimyasallar Konsantrasyonu Hazırlama (mg/l) Katsayısı Stok Çözelti Konsantrasyonu (g/l) MAKRO ELEMENTLER CaCl2.2H2O NaH2PO4 (NH4)2SO4 MgSO4.7H2O KNO3 150 130 134 250 2500 (x 20) 3.00 2.60 2.68 5.00 50.0 MİKRO ELEMENTLER CoCl2.6H2O CuSO4.5H2O Na2MoO4.2H2O KI ZnSO4.7H2O H3BO3 MnSO4. H2O 0.025 0.025 0.25 0.75 2 3 10 (x 100) 0.0025 0.0025 0.025 0.075 0.2 0.3 1.0 Fe EDTA FeSO4.7H2O Na2EDTA.2H2O 27.8 37.3 (x 100) 2.78 3.73 VİTAMİNLER Pyridoxine-HCl Nicotinic Acid Thiamine-HCl 1 1 10 (x 100) mg / l Myo-Inositol 100 g/l Sakkaroz Agar 20 8 51 0.1 0.1 1.0 3. MATERYAL ve METOD Esin ARI 3.2.4.1.(1). Aktif Karbon (AK) Denemeleri AK Denemelerinde 0 (kontrol), % 0.1 ve % 0.5 lik konsantrasyonların (Çizelge 3.5.) A. coronaria’nın anter kültürüne etkisi araştırılmıştır. 3.2.4.1.(2). Gümüş Nitrat (GN) Denemeleri GN denemelerinde 0 (kontrol), 5 mg ve 10 mg lık konsantrasyonların (Çizelge 3.5.) A. coronaria var. coccinea’nın anter kültürüne etkisi araştırılmıştır. Çizelge 3.5. A. coronaria var. coccinea anter kültürü çalışmalarındaki I. yıl denemeleri Uygulama No 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 Temel Uygulamalar Kontrol Uygulamaları % 0.1 lik AK Uygulamaları % 0.5 lik AK Uygulamaları 5 mg/l GN Uygulamaları 10 mg/l GN Uygulamaları Uygulama Ortamları NN NN NN NN NN + % 0.1 AK NN + % 0.1 AK NN + % 0.1 AK NN + % 0.1 AK NN + % 0.5 AK NN + % 0.5 AK NN + % 0.5 AK NN + % 0.5 AK NN + 5 mg/l GN NN + 5 mg/l GN NN + 5 mg/l GN NN + 5 mg/l GN NN + 10 mg/l GN NN + 10 mg/l GN NN + 10 mg/l GN NN + 10 mg/l GN Soğuklatma Uygulamaları KONTROL +7 0C de 2 GÜN +7 0C de 7 GÜN +7 0C de 21 GÜN KONTROL +7 0C de 2 GÜN +7 0C de 7 GÜN +7 0C de 21 GÜN KONTROL +7 0C de 2 GÜN +7 0C de 7 GÜN +7 0C de 21 GÜN KONTROL +7 0C de 2 GÜN +7 0C de 7 GÜN +7 0C de 21 GÜN KONTROL +7 0C de 2 GÜN +7 0C de 7 GÜN +7 0C de 21 GÜN Ancak on haftalık kültür süresi sonunda, uygulamaların hiç birisinden anter kaynaklı kallus veya embriyo elde edilememesine rağmen anterlerin hala % 98–100 oranında canlı kaldıkları gözlenmiştir. Zayıf bir ihtimal de olsa, bu canlı anterlerin 52 3. MATERYAL ve METOD Esin ARI bir sonraki aşamaya geçişini uyartmak amacıyla II. grup denemeler kurulmuştur. Bu amaçla, 5 tekerrürden oluşan I. grup denemelerin her tekerrüründe kültüre alınan anterlerin ortamları bazıları için taze ortama (tekerrür 1 ve 2), bazıları için ise farklı ortamlara (tekerrür 3, 4 ve 5) aktarma şeklinde değiştirilmiştir. Yeni ortamların içerikleri Çizelge 3.6.’da verilmiştir. Çizelge 3.6. A. coronaria var. coccinea anter kültürü çalışmalarındaki I. yıl, II. grup denemeleri Tek. No 1 II. GRUP DENEME ORTAMLARININ İÇERİKLERİ 1. Taze Ortam (Çizelge 3.4.’deki Uygulama Ortamlarının Aynısı) 2 2. Taze Ortam (Çizelge 3.4.’deki Uygulama Ortamlarının Aynısı) 3 3. NN + %3 Sak. + 1 mg/l 2,4-D + 0.1 mg/l BA + 2 mg/l Glisin + %0.8 Agar 3a. Kontrol ( 3 Nolu Ortamın Aynısı) 3b. Kontrol + % 0.1 AK 3c. Kontrol + % 0.5 AK 3d. Kontrol + 5 mg/l GN 3e. Kontrol +10 mg/l GN 4 4. NN + %3 Sak. + 1.5 mg/l 2,4-D + 0.5 mg/l Kinetin + 2 mg/l Glisin + 500 mg/l L-Glutamin + 10 mg/l L-Alanin + 10 mg/l L-Prolin + 10 mg L-Serin 4a. Kontrol ( 4 Nolu Ortamın Aynısı) 4b. Kontrol + % 0.1 AK 4c. Kontrol + % 0.5 AK 4d. Kontrol + 5 mg/l GN 4e. Kontrol +10 mg/l GN 5 5. NN+ %3 Sak. + 4 mg/l NAA + 0.1 mg/l BAP + 2 mg/l Glisin + %0.8 Agar 5a. Kontrol ( 5 Nolu Ortamın Aynısı) 5b. Kontrol + % 0.1 AK 5c. Kontrol + % 0.5 AK 5d. Kontrol + 5 mg/l GN 5e. Kontrol +10 mg/l GN Çizelge 3.6.’daki 1.,2.,3. ve 5. grup ortamlar katı, 4. grup ortamlar ise sıvı olarak hazırlanmıştır. “Float Culture” olarak da adlandırılan bu yönteme göre sıvı ortamdaki anterler 80 devir/dk hızda çalışan çalkalayıcıda kültüre alınmıştır. 53 3. MATERYAL ve METOD Esin ARI 3.2.4.2. II. Yıl Denemeleri Birinci yıl denemelerinden embriyogenesis açısından herhangi bir olumlu cevap alınamadığı için farklı bitkilerde yapılan androgenesis çalışmalarının genel bir değerlendirilmesi sonucu II. yıl (2003) denemelerinde öncelikle farklı besin ortamlarına ilave edilecek hormonların etkilerinin araştırılmasına karar verilmiştir. Kullanılan Temel Besin Ortamları: Androgenesis çalışmalarında kültür ortamlarının NO3- / NH4+ oranları embriyogenesis üzerinde çok önemli role sahiptir ve bu nedenle besin ortamlarındaki NO3- ve NH4+ kullanımı dengeli olmalıdır (George, 1996). Bu önem sebebiyle farklı bitki türlerinde gerçekleştirilen androgenesis çalışmalarında embriyo teşviği ve rejenerasyonu için, temel besin ortamlarındaki azot bileşiklerinde farklı modifikasyonlar yapılarak birçok başarılı ortamlar geliştirilmiş, daha sonra bu ortamlardan da modifikasyonlara gidilerek androjenik başarılar sağlanmıştır. Bu nedenle II. yıl denemelerinde kullanılabilecek ortamlar araştırılırken, anter kültürü çalışmalarında kullanılan belli başlı besin ortamlarının NO3 / NH4 oranları dikkate alınmıştır. Bunlar arasından bir seçim yapmak gerektiğinde; öncelikle ortamların oran bakımından birbirinden farklı olmaları istenmiş ve bu kriteri sağlayanlar içinden anter kültüründe en fazla kullanılan genel ortamlar seçilmiştir. Buna göre II. yıl denemelerinde kullanılacak ortamlar NN ve B5 ortamları olarak belirlenmiş, ancak ortamlarda herhangi bir modifikasyona gidilmemiştir. Bu ortamlardan NN ortamında NO3 / NH4 oranı 4:1 iken, B5 ortamında 20:1 dir. Kullanılan Hormonlar: I. yıl çalışmalarında hiç hormon kullanılmamış ve anterlerde herhangi bir embriyo oluşumu veya embriyoid gelişimi gözlenmemiştir. Ancak yapılan anter kültürü çalışmalarının büyük çoğunluğunda kültür ortamlarına ilave edilen hormonlar, anterlerden embriyo oluşumunu teşvik etmiştir. Hormonların bu etkisi; mikrosporların gametofitik safhadan sporofitik safhaya yönlendirilmeleri şeklinde gelişmektedir. Bu nedenle II. yıl çalışmalarında öncelikle temel besin ortamlarına ilave edilecek hormonların anterler üzerindeki etkisinin araştırılmasına 54 3. MATERYAL ve METOD Esin ARI karar verilmiştir. Hangi hormonların kullanılması gerektiğine gelince; yine yapılan çalışmalara göre anter kültürünün ilk çalışılmaya başlandığı yıllarda embriyo uyartımı için ortamlara sadece oksin ilave edilirken, zamanla “recalcitrant” olarak da tanımlanan “inatçı” türlerde yapılan çalışmaların olumsuz sonuçları, araştırmacıları oksinlerle beraber sitokinin kullanımına yöneltmiştir. Çünkü hücresel farklılaşma birçok yönden bu iki grup hormon arasındaki interaksiyonla kontrol edilmektedir. Bu yaklaşımdan yola çıkarak; hem diğer Anemone türlerinde hem de son yıllarda farklı bitkilerdeki anter kültürü çalışmalarında kullanılan hormonların genel bir değerlendirilmesi sonucu; B5 ve NN ortamlarında, indol asetik asitin (IAA) tek başına farklı dozları ile farklı oksin : sitokinin oranlarına sahip IAA ve benzil amino purin (BAP) kombinasyonları kullanılmıştır. Kullanılan Diğer Katkı Maddeleri: Katkı maddesi olarak, hormonların dışında AK, GN, L-glutamin (LG) ve bunların karışımının etkileri incelenmiştir. 3.2.4.2. (1). Farklı Hormon Konsantrasyonu Denemeleri II. yıl çalışmalarında; temel besin ortamları olan B5 ve NN ortamlarına, IAA’in 0.1, 0.5, 1 ve 2 mg/l lık dozları eklenmiştir. Ayrıca bu farklı IAA dozlarına 0.1 mg/l BAP ilave edilmiştir. Böylece farklı oksin:sitokinin (O:S) oranlarına sahip (1:1, 5:1, 10:1, ve 20:1) 4 kombinasyon oluşturulmuştur. Kontrol ortamı ile birlikte toplam 9 uygulamadan oluşan hormon konsantrasyonları Çizelge 3.7.’de verilmiştir. Çizelge 3.7. A. coronaria var. coccinea anter kültürü çalışmalarındaki II. yıl hormon denemeleri UYG. NO 1 2 3 4 5 6 7 8 9 UYGULAMA ORTAMLARI B5 / NN (Kontrol) B5 / NN + 0.1 mg IAA B5 / NN + 0.5 mg IAA B5 / NN + 1 mg IAA B5 / NN + 2 mg IAA B5 / NN + 0.1 mg IAA + 0.1 mg BAP B5 / NN + 0.5 mg IAA + 0.1 mg BAP B5 / NN + 1 mg IAA + 0.1 mg BAP B5 / NN + 2 mg IAA + 0.1 mg BAP 55 0 : S ORANI 1 5 10 20 ÖN MUAMELE + 7 0C de 7 GÜN + 7 0C de 7 GÜN + 7 0C de 7 GÜN + 7 0C de 7 GÜN + 7 0C de 7 GÜN + 7 0C de 7 GÜN + 7 0C de 7 GÜN + 7 0C de 7 GÜN + 7 0C de 7 GÜN 3. MATERYAL ve METOD Esin ARI 3.2.4.2.(2). Aktif Karbon (AK) Denemeleri Temel besin ortamları olan B5 ve NN ortamlarına % 1 AK ilave edilmiş ve bu ortamlara Çizelge 3.7.’de belirtilen 9 farklı hormon konsantrasyonu eklenmiştir. Toplam 9 uygulamadan oluşan AK uygulamaları Çizelge 3.8.’de verilmiştir. Çizelge 3.8. A. coronaria var. coccinea anter kültürü çalışmalarındaki II. yıl aktif karbon (AK) denemeleri UYGULAMA NO 1 2 3 4 5 6 7 8 9 UYGULAMA ORTAMLARI B5 / NN + %1 AK(Kontrol) B5 / NN + %1 AK + 0.1 mg IAA B5 / NN + %1 AK + 0.5 mg IAA B5 / NN + %1 AK + 1 mg IAA B5 / NN + %1 AK + 2 mg IAA B5 / NN + %1 AK + 0.1 mg IAA + 0.1 mg BAP B5 / NN + %1 AK + 0.5 mg IAA + 0.1 mg BAP B5 / NN + %1 AK + 1 mg IAA + 0.1 mg BAP B5 / NN + %1 AK + 2 mg IAA + 0.1 mg BAP ÖN MUAMELE + 7 0C de + 7 0C de + 7 0C de + 7 0C de + 7 0C de + 7 0C de + 7 0C de + 7 0C de + 7 0C de 7 GÜN 7 GÜN 7 GÜN 7 GÜN 7 GÜN 7 GÜN 7 GÜN 7 GÜN 7 GÜN 3.2.4.2.(3). Gümüş Nitrat (GN) Denemeleri B5 ve NN ortamlarına 5 mg/l GN ilave edilmiş ve bu ortamlara hormon denemelerinde kullanılan 9 farklı hormon konsantrasyonu eklenmiştir. Toplam 9 uygulamadan oluşan GN uygulamaları Çizelge 3.9.’da gösterilmiştir. Çizelge 3.9. A. coronaria var. coccinea anter kültürü çalışmalarındaki II. yıl gümüş nitrat (GN) denemeleri UYGULAMA NO 1 2 3 4 5 6 7 8 9 UYGULAMA ORTAMLARI B5 / NN + 5 mg/l GN (Kontrol) B5 / NN + 5 mg/l GN + 0.1 mg IAA B5 / NN + 5 mg/l GN + 0.5 mg IAA B5 / NN + 5 mg/l GN + 1 mg IAA B5 / NN + 5 mg/l GN + 2 mg IAA B5 / NN + 5 mg/l GN + 0.1 mg IAA + 0.1 mg BAP B5 / NN + 5 mg/l GN + 0.5 mg IAA + 0.1 mg BAP B5 / NN + 5 mg/l GN + 1 mg IAA + 0.1 mg BAP B5 / NN + 5 mg/l GN + 2 mg IAA + 0.1 mg BAP 56 ÖN MUAMELE + 7 0C de 7 GÜN + 7 0C de 7 GÜN + 7 0C de 7 GÜN + 7 0C de 7 GÜN + 7 0C de 7 GÜN + 7 0C de 7 GÜN + 7 0C de 7 GÜN + 7 0C de 7 GÜN + 7 0C de 7 GÜN 3. MATERYAL ve METOD Esin ARI 3.2.4.2.(4). L-Glutamin (LG) Denemeleri Temel besin ortamları olan B5 ve NN ortamlarına, bir amino asit olarak androgenesiste olumlu etkisi bilinen LG, 800 mg/l ilave edilmiş ve bu ortamlara hormon denemelerindeki 9 farklı hormon konsantrasyonu eklenmiştir. Toplam 9 uygulamadan oluşan LG uygulamaları Çizelge 3.10.’da verilmiştir. Çizelge 3.10. A. coronaria var. coccinea anter kültürü çalışmalarında II. yıl L-glutamin (LG) denemeleri UYGULAMA NO 1 2 3 4 5 6 7 8 9 UYGULAMA ORTAMLARI B5 / NN + 800 mg/l LG (Kontrol) B5 / NN + 800 mg/l LG + 0.1 mg IAA B5 / NN + 800 mg/l LG + 0.5 mg IAA B5 / NN + 800 mg/l LG + 1 mg IAA B5 / NN + 800 mg/l LG + 2 mg IAA B5 / NN + 800 mg/l LG + 0.1 mg IAA + 0.1 mg BAP B5 / NN + 800 mg/l LG + 0.5 mg IAA + 0.1 mg BAP B5 / NN + 800 mg/l LG + 1 mg IAA + 0.1 mg BAP B5 / NN + 800 mg/l LG + 2 mg IAA + 0.1 mg BAP ÖN MUAMELE + 7 0C de + 7 0C de + 7 0C de + 7 0C de + 7 0C de + 7 0C de + 7 0C de + 7 0C de + 7 0C de 7 GÜN 7 GÜN 7 GÜN 7 GÜN 7 GÜN 7 GÜN 7 GÜN 7 GÜN 7 GÜN 3.2.4.2.(5). Aktif Karbon (AK), Gümüş Nitrat (GN) ve L-Glutamin (LG) Karışımı Denemeleri Hormon denemelerinde kullanılan 9 farklı hormon konsantrasyonunun eklendiği temel besin ortamları B5 ve NN ortamlarına, %1 AK, 5 mg/l GN ve 800 mg/l LG hep birlikte ilave edilmiştir. Toplam 9 uygulamadan oluşan AK + GN + LG uygulamaları Çizelge 3.11.’de verilmiştir. Çizelge 3.11. A. coronaria var. coccinea anter kültürü çalışmalarındaki II. yıl aktif karbon(AK)+ gümüş nitrat (GN)+ L-glutamin (LG) karışımı denemeleri UYG NO UYGULAMA ORTAMLARI ÖN MUAMELE 1 2 3 4 5 6 7 8 9 B5 / NN + %1 AK + 5 mg/l GN + 800 mg/l LG (Kontrol) B5 / NN + %1 AK + 5 mg/l GN + 800 mg/l LG + 0.1 mg IAA B5 / NN + %1 AK + 5 mg/l GN + 800 mg/l LG + 0.5 mg IAA B5 / NN + %1 AK + 5 mg/l GN + 800 mg/l LG + 1 mg IAA B5 / NN + %1 AK + 5 mg/l GN + 800 mg/l LG + 2 mg IAA B5 / NN + %1 AK + 5 mg/l GN + 800 mg/l LG + 0.1 mg IAA + 0.1 mg BAP B5 / NN + %1 AK + 5 mg/l GN + 800 mg/l LG + 0.5 mg IAA + 0.1 mg BAP B5 / NN + %1 AK + 5 mg/l GN + 800 mg/l LG + 1 mg IAA + 0.1 mg BAP B5 / NN + %1 AK + 5 mg/l GN + 800 mg/l LG + 2 mg IAA + 0.1 mg BAP + 7 0C de 7 GÜN + 7 0C de 7 GÜN + 7 0C de 7 GÜN + 7 0C de 7 GÜN + 7 0C de 7 GÜN + 7 0C de 7 GÜN + 7 0C de 7 GÜN + 7 0C de 7 GÜN + 7 0C de 7 GÜN 57 3. MATERYAL ve METOD Esin ARI 3.2.4.2.(6). Embriyo Çimlendirme - Kallus Çoğaltma Çalışmaları B5 ve NN ortamlarında gerçekleştirilen uygulamalar sırasında, bazı hormon konsantrasyolarının embriyo oluşumunu teşvik ederken, hem anterden hem de flamentten meydana gelen kallus oluşumunu da yüksek oranlarda teşvik ettiği görülmüştür. Yapılan sitolojik incelemeler sonucu meydana gelen kallusların embriyojenik oldukları belirlenmiştir. Bunun üzerine denemelerde oluşan embriyolar çimlendirilmek üzere hormonsuz ortamlara aktarılırken, anterlerden meydana gelen kalluslar ise indirekt embriyogenesise teşvik edilebilmeleri için öncelikle çoğaltılmaya çalışılmıştır. Bu amaçla B5 uygulamalarından elde edilen embriyoları çimlendirmek ve bu uygulamalarda oluşan anter kalluslarını çoğaltmak için Çizelge 3.12.’de belirtilen uygulamalar gerçekleştirilmiştir. Çizelgedeki 1. uygulama embriyo çimlendirme, diğer uygulamalar ise kallus çoğaltma uygulamalarıdır. Çizelge 3.12. B5 uygulamalarında oluşan embriyoları çimlendirme ve anter kalluslarını çoğaltma ortamları UYG. NO UYGULAMA ORTAMLARI ORTAM TİPİ 1 B5 (Kontrol) KATI 2 B5 + 0.5 mg IAA + 0.1 mg BAP KATI 3 B5 + 0.5 mg IAA + 0.1 mg BAP SIVI 4 B5 + 1 mg IAA + 0.1 mg BAP KATI 5 B5 + 1 mg IAA + 0.1 mg BAP SIVI 6 B5 + 2 mg IAA + 0.1 mg BAP KATI 7 B5 + 2 mg IAA + 0.1 mg BAP SIVI NN uygulamalarından elde edilen embriyoları çimlendirmek ve oluşan anter kalluslarını çoğaltmak içinse Çizelge 3.13.’de verilen uygulamalar gerçekleştirilmiştir. Çizelgedeki 1. uygulama embriyo çimlendirme, 2. ve 3. uygulamalar ise kallus çoğaltma uygulamalarıdır. Çizelge 3.13. NN uygulamalarında oluşan embriyoları çimlendirme ve anter kalluslarını çoğaltma ortamları UYG. NO UYGULAMA ORTAMLARI ORTAM TİPİ 1 NN (Kontrol) KATI 2 NN + 1 mg IAA + 0.1 mg BAP KATI 3 NN + 1 mg IAA + 0.1 mg BAP SIVI 58 3. MATERYAL ve METOD Esin ARI Anter kalluslarının çoğalmaları için kültüre alındıkları Çizelge 3.12. ve Çizelge 3.13.’de belirtilen ortamların hormon içerikleri, kallusların oluştukları ortam ile aynı içerikte olup tek farkları katı ve sıvı formda hazırlanmış olmalarıdır. Böylece aynı içerikli 2 farklı ortam tipinin çoğalma üzerindeki etkisi incelenmek istenmiştir. Çimlendirilmek üzere kültüre alınan embriyolar 25+1 0C sıcaklık ve 16 saat aydınlık, 8 saat karanlık fotoperiyod koşullarına sahip büyütme odasına aktarılırken, büyütülüp çoğaltılmak üzere kültüre alınan anter kallusları ise yine eski oluştukları ortam olan 25+1 0C sıcaklıktaki karanlık koşullarda bekletilmeye devam etmiştir. 3.2.4.2.(7). İndirekt Embriyogenesis Çalışmaları Bir önceki bölümde bahsedildiği gibi, anterlerden meydana gelen kalluslar Çizelge 3.12. ve Çizelge 3.13.’de belirtilen ortamlarda çoğaltılmaya çalışılmıştır. Hem bu ortamlarda çoğaltılabilen kallusları hem de çoğaltmak için farklı bir ortama aktarılmayıp oluştukları ortamlarında büyümeye bırakılan kallusları indirekt embriyogenesise yönlendirmek için Çizelge 3.14.’de belirtilen katı ortamlar hazırlanmıştır. Bu ortamlarda kültüre alınan kalluslara, 25+1 0C sıcaklık ve 16 saat aydınlık, 8 saat karanlık fotoperiyoddan oluşan kültür koşulları sağlanmıştır. Çizelge 3.14. Farklı B5 ve NN ortamlarından elde edilen anter kalluslarının indirekt embriyogenesis amacıyla aktarıldığı ortamlar UYGULAMA NO UYGULAMA ORTAMLARI 1 B5* / NN** + 0.1 mg IAA + 0.5 mg BAP + 0.25 mg 2ip 2 B5* / NN** + 0.1 mg IAA + 1 mg BAP + 0.50 mg 2ip 3 B5* / NN** + 0.1 mg IAA + 2 mg BAP + 1 mg 2ip * : B5 ortamının makro tuzları 1/2 kuvvette, **: NN ortamının makro tuzları 1/2 kuvvette hazırlanmıştır. 3.2.4.3. III. Yıl Denemeleri 2005 yılında kurulan III. yıl denemelerinde; II. yıl denemeleri içerisinde embriyogenesis yönünden olumlu tepki veren ortamların değerlendirilmesi sonucu, 59 3. MATERYAL ve METOD Esin ARI bu ortamlardan hormon denemeleri ile hormon + GN denemeleri üzerinde durulmuştur. B5 ve NN temel besin ortamlarının kullanıldığı denemelere, hormon olarak II. yıl kullanılanlarla kısmen aynı dozlarda ve aynı oksin : sitokinin oranlarına sahip IAA ve BAP eklenmiştir. Hormon dışında katkı maddesi olarak sadece GN’ın farklı dozlarının etkisi incelenmiştir. Toplam 40 uygulamadan (20 uygulama B5, 20 uygulama ise NN ortamı için) oluşan III. yıl denemeleri Çizelge 3.15.’de verilmiştir. Çizelge 3.15. A. coronaria var. coccinea anter kültürü çalışmalarındaki III. yıl denemeleri UYG. NO 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 UYGULAMA ORTAMLARI B5 / NN (Kontrol) B5 / NN + 0.5 mg IAA + 0.1 mg BAP B5 / NN + 1 mg IAA + 0.1 mg BAP B5 / NN + 2 mg IAA + 0.1 mg BAP B5 / NN + 2.5 mg/l GN (Kontrol) B5 / NN + 2.5 mg/l GN + 0.5 mg IAA + 0.1 mg BAP B5 / NN + 2.5 mg/l GN + 1 mg IAA + 0.1 mg BAP B5 / NN + 2.5 mg/l GN + 2 mg IAA + 0.1 mg BAP B5 / NN + 5 mg/l GN (Kontrol) B5 / NN + 5 mg/l GN + 0.5 mg IAA + 0.1 mg BAP B5 / NN + 5 mg/l GN + 1 mg IAA + 0.1 mg BAP B5 / NN + 5 mg/l GN + 2 mg IAA + 0.1 mg BAP B5 / NN + 10 mg/l GN (Kontrol) B5 / NN + 10 mg/l GN + 0.5 mg IAA + 0.1 mg BAP B5 / NN + 10 mg/l GN + 1 mg IAA + 0.1 mg BAP B5 / NN + 10 mg/l GN + 2 mg IAA + 0.1 mg BAP B5 / NN + 15 mg/l GN (Kontrol) B5 / NN + 15 mg/l GN + 0.5 mg IAA + 0.1 mg BAP B5 / NN + 15 mg/l GN + 1 mg IAA + 0.1 mg BAP B5 / NN + 15 mg/l GN + 2 mg IAA + 0.1 mg BAP ÖN MUAMELE + 7 0C de 7 GÜN + 7 0C de 7 GÜN + 7 0C de 7 GÜN + 7 0C de 7 GÜN + 7 0C de 7 GÜN + 7 0C de 7 GÜN + 7 0C de 7 GÜN + 7 0C de 7 GÜN + 7 0C de 7 GÜN + 7 0C de 7 GÜN + 7 0C de 7 GÜN + 7 0C de 7 GÜN + 7 0C de 7 GÜN + 7 0C de 7 GÜN + 7 0C de 7 GÜN + 7 0C de 7 GÜN + 7 0C de 7 GÜN + 7 0C de 7 GÜN + 7 0C de 7 GÜN + 7 0C de 7 GÜN 3.2.4.3.(1). Farklı Hormon Konsantrasyonu Denemeleri Temel besin ortamları olan B5 ve NN ortamlarında, IAA in 0.5, 1 ve 2 mg/l lik dozlarına 0.1 mg/l BAP ilave edilmiştir. Böylece farklı oksin : sitokinin oranlarına sahip (5:1, 10:1, ve 20:1) 3 hormon kombinasyonu oluşturulmuştur. Çizelge 3.15.’deki ilk 4 uygulama, hormon denemelerini göstermektedir. 60 3. MATERYAL ve METOD Esin ARI 3.2.4.3.(2). Gümüş Nitrat (GN) Denemeleri B5 ve NN temel besin ortamlarına 0 (kontrol), 2.5, 5, 10 ve 15 mg/l olmak üzere GN ın farklı konsantrasyonları ilave edilmiş ve bu uygulamalara yukarıda belirtilen 3 farklı hormon kombinasyonları eklenmiştir. Çizelge 3.15.’deki ilk 4 uygulama, hormon denemeleri olmakla beraber, aynı zamanda GN denemelerinin kontrol uygulamalarını oluşturmaktadır. Çizelgedeki 58 nolu uygulamalar 2.5 mg/l konsantrasyonlu GN denemelerini, 9-12 nolu uygulamalar 5 mg/l konsantrasyonlu GN denemelerini, 13-16 nolu uygulamalar 10 mg/l konsantrasyonlu GN denemelerini ve 17-20 nolu uygulamalar ise 15 mg/l konsantrasyonlu GN denemelerini oluşturmuştur. 3.2.5. Kültür Koşulları Çalışma boyunca ana denemelerde kültüre alınan tüm anterler 10 haftalık kültür süresince 25+1 0C ve sürekli karanlık koşullara sahip büyütme odasında muhafaza edilmiştir. 3.2.6. İncelenen Özellikler Çalışmanın I.yılında gerçekleştirilen uygulamalarda şu özellikler incelenmiştir: Anter Canlılığı (%): Canlı kalan anter sayısının, kültüre alınan toplam anter sayısına oranlanması ile elde edilmiştir. Farklı Anter Büyümesi (%): Embriyo veya kallus oluşturmaksızın, normalin dışında farklı şekilde büyüme gösteren anter sayısının, kültüre alınan toplam anter sayısına oranlanması ile elde edilmiştir. Polen Embriyogenesisi (Embriyo Oluşumu) (%): Globular embriyo veya embriyo benzeri oluşum gösteren anter sayısının, kültüre alınan toplam anter sayısına oranlanması ile elde edilmiştir. Kallus Oluşumu (%): Kallus oluşumu gösteren anter sayısının, kültüre alınan toplam anter sayısına oranlanması ile elde edilmiştir. 61 3. MATERYAL ve METOD Esin ARI Anterde Açılma Durumu (%): Anter duvarlarından açılma gösteren anter sayısının, kültüre alınan toplam anter sayısına oranlanması ile elde edilmiştir. Çalışmanın II., ve III. yılında gerçekleştirilen uygulamalarda embriyogenesis yanında adventif sürgün, kök ve çiçek taslağı ile anter ve flamentlerden çok sayıda kallus elde edilmiştir. Bu nedenle bu yıllar ait uygulamalarda anter canlılığı, farklı anter büyümesi ve polen embriyogenesisinin yanında oluşan globular embriyo benzeri yapı, globular embriyo benzeri yapı/100 anter, organogenesis, anterden kallus oluşumu ve flament kallus oluşumu özellikleri de incelenmiştir. Bu özelliklere ait gözlemler şu şekilde tespit edilmiştir: Oluşan Globular Embriyo Benzeri Yapı (adet): Bir anterde meydana gelen globular embriyo veya embriyo benzeri yapıların sayımıyla bulunmuştur. Globular Embriyo Benzeri Yapı/100 Anter: 100 Anter başına oluşan globular embriyo veya embriyo benzeri yapı sayısını ifade eden bu özellik, kültüre alınan anterlerden oluşan globular embriyo veya embriyo benzeri yapıların sayısının 100 antere oranlanmasıyla hesaplanmıştır. Organogenesis (%): Sürgün, kök gibi herhangi bir organ oluşumu gösteren anter sayısının, kültüre alınan toplam anter sayısına oranlanması ile elde edilmiştir. Anter Kallusu (%): Anter yan duvarlarından veya anter omuz başlarından kallus oluşumu gösteren anter sayısının, kültüre alınan toplam anter sayısına oranlanması ile elde edilmiştir. Flament Kallusu (%): Flamentten kallus oluşumu gösteren anter sayısının, kültüre alınan toplam anter sayısına oranlanması ile elde edilmiştir. 3.2.7. Deneme Deseni Dört yıl boyunca sürdürülen çalışmadaki tüm ortam denemeleri, tesadüf parselleri deneme desenine göre kurulmuştur. Çalışmanın I. yıl denemelerinde kurulan 20 uygulamanın her biri; 5 tekerrürlü olarak dizayn edilmiş, her tekerrürde 8 petri kullanılmış ve her petride 5 adet anter kültüre alınmıştır. Toplam 800 petride 4.000 anter kültüre alınmıştır (Çizelge 3.16.). 62 3. MATERYAL ve METOD Esin ARI Çizelge 3.16. Çalışmadaki deneme düzenleri Bir Bir Bir Yıllık Yıllık Uyg. Tekerrür Tek.’deki Petrideki Uyg.’daki Kullanılan Sayısı Sayısı Kültüre Petri Anter Anter Petri Alınan Anter Sayısı Sayısı Sayısı Sayısı Sayısı I. Yıl 20 5 8 5 200 800 4.000 II. Yıl 90 3 5 10 150 1.350 13.500 III. Yıl 40 4 10 10 400 1.600 16.000 Toplam 150 - - - - 3.750 33.500 Çizelge 3.16.’ya göre, çalışmanın II. yıl denemelerinde; B5 ortamı için 45, NN ortamı için de 45 olmak üzere toplam 90 uygulama gerçekleştirilmiştir. Bu uygulamaların her biri 3 tekerrürlü olarak kurulmuştur. Her tekerrürde 5 petri, her petride ise 10 anter kültüre alınmıştır. Dolayısıyla toplam 1350 petride 13.500 anter kültüre alınmıştır. Bu uygulamalarda elde edilen embriyogenesis, 100 anter başına düşen embriyo sayısı (embriyo/100 anter), organogenesis, anter kallusu ve flament kallusuna ait veriler istatistik analize tabi tutulmuştur. Bunun için açı transformasyonları alınan verilere Tukey testi uygulanmıştır. III. yıl çalışmalarının her birinde ise B5 ortamı için 20, NN ortamı için de 20 olmak üzere toplam 40 deneme gerçekleştirilmiştir. Bu denemelerin her birisi 4 tekerrürlü olarak düzenlenmiştir. Her tekerrürde 10 petri, her petride ise 10 anter kültüre alınmıştır. Böylece toplam 1600 petride 16.000 anter kültüre alınmıştır. Böylece 3 yıl süren çalışma boyunca ana denemelerde, toplam 150 uygulama yapılmış, bu uygulamalarda 3.750 petri içerisinde 33.500 anter kültüre alınmıştır. Ayrıca, anterlerin haftalık gelişimlerini sitolojik olarak inceleyebilmek amacıyla da anterler kültüre alınmıştır. Çalışmada kurulan deneme sayısı aslında yukarıdakilerle sınırlı değildir. Örneğin, ön gözlemlerde umut görülen uygulamaların başarısını teyit etmek için yeni denemeler kurulmuştur. Bununla birlikte, çalışmada oluşan embriyoları çimlendirme, anter kalluslarını çoğaltma ve bu kallusları indirekt embriyogenesise yönlendirmek üzere de çalışmalar yapılmıştır. 63 4. BULGULAR ve TARTIŞMA Esin ARI 4. BULGULAR ve TARTIŞMA 4.1. Sitolojik Çalışma Bulguları ve Tartışma 4.1.1. Uygun Tomurcuk Safhasının Tespiti A. coronaria var. coccinea’da tek çekirdekli mikrospor ve uygun tomurcuk safhasının tespiti için öncelikle, farklı büyüklükteki tomurcuklar içerisinde bulunan mikrosporların in vivo gelişim aşamaları ortaya konulmuştur (Şekil 4.1.). Mikrospor gelişim aşamalarına geçmeden önce, doğal A. coronaria var. coccinea tomurcukları ile ilgili vurgulanması gereken önemli bir nokta; bir tomurcuk içindeki anterlerin büyüklük ve gelişim yönünden homojen olmadıklarıdır. Horovitz ve ark. (1975b), A. coronaria’da her bir çiçekte ortalama 2.000.000 polen taşıyan çok sayıda stamen bulunduğunu, bunların 7 veya daha fazla sıra halinde dizildiğini ve bunlardan ortadaki 2 veya 3 sıranın diğerlerinden daha önce geliştiğini kaydetmiştir. Bir tomurcuk içerisindeki bu asenkronik anter gelişimleri bu çalışmada yapılan histolojik analiz ile de ortaya konulmuştur. Şekil 4.2., sitolojik incelemeye alınan 2 nolu tomurcuk içerisindeki anterlerde, görülen 3 farklı mikrospor gelişim aşamasını göstermektedir. Bununla birlikte yapılan incelemeler sonucunda dikkat çeken diğer önemli nokta ise bir tomurcuk içerisindeki anterlerin gelişimi homojen olmamasına rağmen bir anter içerisindeki mikrosporların homojen gelişim gösterdiklerinin belirlenmesidir. Çalışmada kullanılan doğal A. coronaria var. coccinea tomurcuklarındaki anterlerin asenkronize gelişim yapısı göstermesi nedeniyle tomurcuk büyüklüklerine göre bir gelişim dönemi sınıflandırması yapmanın ve buna göre kesin bir tomurcuk büyüklüğü önerisinde bulunmanın zor olduğu düşünülmekle birlikte, vurgulanmak istenen konunun daha iyi anlaşılabilmesi için morfolojilerine göre gruplandırılan tomurcuklarda tespit edilen in vivo mikrospor gelişim aşamalarına aşağıda yer verilmiştir. Buna göre; 64 4. BULGULAR ve TARTIŞMA Esin ARI b a c d e vç v gç g f h Şekil 4.1. In vivo mikrospor gelişimleri (a, c, g lakto-propionik-orsein, b, e hematoksilin, d ethidium bromid, f, h resimleri feulgen yöntemi ile boyanmıştır) a. Mikrospor ana hücreleri b. Tetrat safhasındaki mikrosporları içeren anter c. Geç tetratta kalloz duvarından yeni dağılan profazdaki mikrosporlar d. Anter kültürü için uygun aşamadaki tek çekirdekli mikrospor e. Tek çekirdekli mikrosporlara sahip uygun aşamadaki anter f. Geç aşamadaki tek çekirdekli mikrospor (v: vakuol) g. Mitoz geçirmiş 2 çekirdekli mikrospor (vç:vejetatif çek., gç:generatif çek.) h. Olgun polen tanesi 65 4. BULGULAR ve TARTIŞMA Esin ARI c a b Şekil 4.2. 2 nolu tomurcukta tespit edilen farklı gelişim aşamasındaki anterler; a) tetrat aşaması, b) tek çekirdekli mikrospor aşaması, c) olgun polen aşaması 1 nolu tomurcuğa ait anterlerde yapılan gözlemlerde; mikrospor ana hücrelerine (Şekil 4.1.a), erken ve geç tetrat safhasında (Şekil 4.1.b., c.), tek çekirdekli safhada (Şekil 4.1.d., e.) ve çift çekirdekli safhadaki (Şekil 4.1.g) mikrosporlara rastlanmakla birlikte, en fazla erken tetrat safhası gözlemlenmiştir. 2 nolu tomurcukta; mikrospor ana hücreleri, tetrat, erken - geç tek çekirdekli (Şekil 4.1.f), çift çekirdekli safhalardaki mikrosporların yanısıra olgun polen taneleri (Şekil 4.1.h) de tespit edilmiş, ancak tetrat ve erken tek çekirdekli aşamadaki mikrosporlara daha yaygın rastlanmıştır. 3 nolu tomurcukta; erken ve geç tetrat, tek çekirdekli, geç tek çekirdekli, çift çekirdekli safhalardaki mikrosporlardan başka olgun polen taneleri (Şekil 4.1.h) de gözlenmiş, bununla birlikte en fazla tek çekirdekli mikrospor safhasına rastlanmıştır. 4 nolu tomurcukta; tetrat, tek çekirdekli, geç tek çekirdekli, çift çekirdekli safhalardaki mikrosporlar ile olgun polen taneleri tespit edilmiş, ancak çoğunlukla geç tek çekirdekli ve erken çift çekirdekli mikrosporlar gözlemlenmiştir. 66 4. BULGULAR ve TARTIŞMA Esin ARI 5 nolu tomurcukta; tek çekirdekliden başlayıp olgun polen tanelerine kadar olan safhalar izlenmekle beraber çoğunlukla olgun polen tanelerine rastlanmıştır. Bu nedenle bu ve bundan sonraki tomurcuklar, anter kültüründe kullanılamayacak geç aşamadaki tomurcuklar olarak değerlendirilmiştir. Anter kültürü denemelerinde, en azından A. coronaria var. coccinea örneğinde; kültüre alınacak her anter veya tomurcuk için ayrı sitolojik gözlem yaparak, uygun bulunan anterlerin kültüre alınması mümkün ve pratik olmadığı için, tomurcuklardaki asenkronize anter gelişimine rağmen yine de genel bir tomurcuk tanımlamasının verilmesi gerektiği düşünülmektedir. Özellikle doğal türler için hava sıcaklığı ve ışıklanma durumu başta olmak üzere çeşitli çevre faktörlerinin etkisiyle tomurcuk toplama zamanın, vejetasyonun farklı dönemlerine göre değişebileceği bilinmektedir. Farklı vejetasyon dönemlerinde alınan tomurcuklardaki mikrosporların gelişim safhaları değişkenlik gösterdiği gibi mikrospor canlılık oranları da değişmektedir. Nitekim Menemen’den selekte edilmiş doğal A. coronaria var. cyanea populasyonu ile Jerusalem F1 hibrit çeşidinde daha önceden yaptığımız aynı tip çalışmalar ile bu çalışma kıyaslandığında 3 ayrı tomurcuk morfolojisi belirlenmiştir. Dolayısıyla, materyal olarak özellikle doğal türlerin kullanıldığı çalışmalarda uygun tomurcuk safhası ön denemelerle tespit edilmelidir. Buna göre bu çalışmada; sitolojik gözlem amacıyla morfolojilerine göre gruplandırılan tomurcuklar arasından, anter kültürü için en uygun safha olduğu düşünülen geç tetrat safhasındaki veya tetrat safhasından yeni çıkmış tek çekirdekli safhadaki mikrosporları, genellikle 2-3 nolu tomurcukların içerdiği tespit edilmiştir. Bu sitolojik gözlemlerin dış morfolojik göstergesi ise bir geofit olması dolayısıyla eğik duran genç tomurcukların genellikle toprak yüzeyinde yeni gözükmeye başlamış olması ve çiçek sapı ile neredeyse paralele yakın şekilde oldukça dar bir açı oluşturması, ortalama olarak 6x9 mm büyüklükte olmaları ve involukrum yaprakların henüz açılmaması nedeniyle tepallerin dışarıdan görünmemesi olarak tespit edilmiştir. Mikrosporların gelişim aşamalarının belirlenmesi için kullanılan yöntemlerin değerlendirilmesine gelince; ilk etapta, tek çekirdekli mikrospor safhasını tespit etmek amacıyla en pratik yöntem olarak bilinen asetokarmin yöntemi kullanılmış, 67 4. BULGULAR ve TARTIŞMA Esin ARI ancak bu yöntemle hazırlanan ezme preparatlar mikrospor gelişim safhalarını izlemek için yetersiz kalmıştır. Diğer aşamalara göre daha kolay seçilebileceği düşünülen tetrat veya tek çekirdekli mikrospor safhaları bile bazı preparatlarda ancak ek işlemlerden (preparatın ısıtılması, damlatılan boya içerisine demir çivi değdirilmesi gibi) sonra kısmen izlenebilmiş, ancak daha ileri aşamaları görüntülemek için yeterli netlik elde edilememiştir. Farklı polen yapılarından dolayı pamuk gibi bazı türlerde de sitoloji çalışmalarının zor olduğu bilinmektedir. Çalışmada denenen farklı metodlardan sonra A. coronaria var. coccinea’nın da bu grup içerisinde yer aldığı düşünülmektedir. Bu nedenle en azından bu türün doğal varyeteleri ile çalışırken asetokarmin yönteminin, tüm mikrospor aşamalarını izlemek için yetersiz olduğu sonucuna ulaşılmıştır. Asetokarmin yönteminin yetersiz kalması nedeniyle başvurulan feulgen yöntemiyle, geç tek çekirdekli mikrospor safhası ve olgun polen aşamalarının tespit edilebilmesine rağmen hidroliz aşamasından kaynaklandığı düşünülen bazı olumsuzluklar nedeniyle farkı gelişim aşamalarının takibi mümkün olmamış, dolayısıyla bu yöntem de yetersiz bulunmuştur. Feulgen yönteminde hidroliz sırasındaki ilave veya eksik 1 dakikalık süre bile yöntemin etkinliği açısından türden türe büyük önem taşıdığı için bu aşamanın süresinin çok iyi tespit edilmesi gerekmektedir. A. coronaria var. coccinea’da bu sürenin ne olması gerektiği konusunda bilgi edinilemediği için, kapsamlı denemelere ihtiyaç duyulmakla birlikte, çalışmanın bu aşamasında ancak belirli sayıda deneme yapılabilmiştir. Feulgen yönteminde metod iyi bir şekilde oturtulmuş olsa bile, pratik olmadığı için en azından bu tür için kısa sürede, tekrarlanabilir sonuçların alınabileceği farklı yöntemlerlerin denenmesi gerektiği düşünülmektedir. In vivo ve in vitro mikrospor gelişim aşamalarını pratik şekilde tespit edebilecek bir yöntem arayışıyla kullanılan ethidium bromide yöntemindeki farklı konsantrasyon denemelerinden en iyi sonuç, Triton-100 katkılı seyreltilmemiş % 0.1’lik stok solüsyondan elde edilmiştir. Bu denemede, in vivo mikrospor gelişiminin tetrat ve tek çekirdekli mikrospor aşamaları çok net görüntülenirken, diğer aşamaların aynı netlikte tespit edilememesine rağmen yöntemin geliştirilebileceği düşünülmektedir. Oldukça pratik olan bu yöntemin kullanımı ile ilgili hatırlatılması 68 4. BULGULAR ve TARTIŞMA Esin ARI gereken iki önemli nokta bulunmaktadır. Bunlardan birincisi ethidium bromidin kanserojen madde olması nedeniyle dikkatli kullanılması gerektiği, diğeri ise bu maddenin ışıktan etkilenmesi nedeniyle gerek stokları hazırlarken, gerekse preparatları hazırlarken ve incelerken ışıktan mümkün olduğunca kaçınılmasıdır. Lakto-propionik-orsein boyama yönteminde yapılan incelemeler sonucu, in vivo mikrospor gelişiminin tüm aşamaları izlenebilmiştir. Dolayısıyla bu yöntem oldukça pratik bulunmuş ve in vitro mikrospor gelişim aşamalarının takibi için de kullanılabileceğine karar verilmiştir. Nitekim bazı kaynaklarda (Anonymous, 1997) da bu yöntemin çok etkili olduğu ve asetokarmin veya aseto-orsein yöntemlerinin çalışmadığı türlerde denenmesi gerektiği bildirilmiştir In vitro mikrospor gelişimini tespit etmek için kullanılan kesit alma yöntemine aynı zamanda in vivo mikrospor gelişimlerinin tespiti için de başvurulmuş ve bu gelişiminin tüm aşamaları tespit edilebilmiştir. Oldukça uzun zaman alan ve hiç de pratik olmayan bu metod, yine de; sitolojik düzeyde tespit edilemeyen bazı görüntüleri histolojik düzeyde daha geniş bir çerçevede ortaya koyabilmesi özelliği ile son derece yararlı bulunmuştur. 4.1.2. Periyodik Anter Gelişimi Anterlerin 8 haftalık embriyolojik gelişimlerini incelemek amacıyla daha önce en yüksek polen embriyogenesisi performansının elde edildiği uygulamalardan [B5 (+ 0.5 mg/l IAA + 0.1 mg/l BAP) ve NN (+ 1 mg/l IAA + 0.1 mg/l BAP)], çalışmanın III. yılında küçük sitoloji denemeleri kurulmuştur. Bu denemelerde haftalık olarak fiksasyon sıvısına alınan anterlerin daha sonra kesitleri alınarak hazırlanan preparatlarda in vitro mikrospor gelişimleri incelenmiştir (Şekil 4.3.). Bu denemelerde kültüre alınan anterlerin genel embriyojenik gelişimleri III. yılın diğer uygulama bulgularında olduğu gibi beklendiği oranda gerçekleşmemiştir. Bununla birlikte, haftalık olarak fiksasyon sıvısına atılıncaya kadar yapılan gözlemlerde, B5 ve NN ortamları içerisinde bazı anterlerin omuz başında kaynağı belli olmayan embriyo-benzeri androjenik oluşumlara rastlanmıştır. 69 4. BULGULAR ve TARTIŞMA Esin ARI a b 1 2 3 a b 4 5 c 6 7 8 Şekil 4.3. In vitro mikrospor gelişimleri (parafin yöntemiyle belirlenmiştir) 1. Henüz kültüre alınmamış bir anterdeki tek çekirdekli mikrosporlar, 2. B5 (+0.5 mg/l IAA+0.1 mg/l BAP) ortamında kültüre alınan 1 haftalık anterdeki vejetatif çekirdek kaynaklı simetrik bölünme, 3a. NN (+1 mg/l IAA+0.1 mg/l BAP) ortamında kültüre alınan 2 haftalık anterdeki generatif çekirdek kaynaklı simetrik bölünme, 4. B5 ortamında kültüre alınan 3 haftalık anterdeki vejetatif çekirdek kaynaklı simetrik bölünme 70 4. BULGULAR ve TARTIŞMA Esin ARI 5. NN ortamında kültüre alınan 3 haftalık anterdeki; a) 3 çekirdekli yapı, b) vejetatif çekirdek kaynaklı embriyojenik bölünme 6. B5 ortamında kültüre alınan 4 haftalık anterdeki asimetrik çekirdek bölünmesi 7. B5 ortamında kültüre alınan 5 haftalık anterdeki vejetatif çekirdek kaynaklı simetrik bölünme 8. NN ortamında kültüre alınan 6 haftalık anterdeki simetrik bölünme Kaynağı belli olmayan embriyo-benzeri bu androjenik yapılardan Şekil 4.4.’de kesiti görülen yapı, B5 + 0.5 mg/l IAA + 0.1 mg/l BAP ortamında kültüre alınan bir anterden oluşmuştur. Şekil 4.4.b., c., d.’de bu anterden alınan kesitin farklı büyüklükteki görüntülerine yer verilmiştir. Şekil 4.4.a.’da ise kesiti alınan anterin, kesit alınmadan önceki görüntüsü mevcut olmadığından, kesitteki görüntünün daha iyi anlaşılması amacıyla aynı oluşuma sahip başka bir anterin görüntüsü sunulmuştur. Kültüre alınan diğer anterlerde, kesitlerin alınmasından sonra anterlerdeki mikrosporlarda farklı çekirdek bölünmelerinin uyartılabildiği görülmüştür. Bu incelemelerde, bazı türlerin polen embriyogenesisi yolunda vejetatif, generatif veya simetrik bölünme gibi embriyojenik mikrospor gelişim yollarından sadece birini takip ederken, A. coronaria var. coccinea’da mikrosporların embriyojenik bölünme için farklı gelişim yollarını takip ettiği belirlenmiştir. Şekil 4.3.’de görülebileceği gibi; normal polen gelişiminde takip edilen asimetrik bölünmenin (6) yanısıra farklı anterlerde, vejetatif çekirdek kaynaklı embriyojenik bölünme (2, 4, 5b, 7), generatif çekirdek kaynaklı embriyojenik bölünme (3a), simetrik çekirdek bölünmesi (8) ve çok çekirdekli yapı (5a) uyartımları gerçekleşmiştir. Şekil 4.3.’de dikkat çeken bir nokta; Karaca ve Seğmen (1970)’in mayoz aşamasında rastladıkları mikropallen oluşumu gibi çekirdek bölünme düzensizliklerinin, mikrosporların kültüre alınması sonrasında da kaybolmadıkları (3b), çekirdek bölünmelerinin teşhisini zorlaştırdıkları ve embriyojenik bölünme üzerine muhtemelen olumsuz etkide bulunmalarıdır. Literatürde, A. coronaria’daki polen embriyogenesisinde takip edilen mikrospor bölünmesine ilişkin şimdiye kadar herhangi bir bilgiye rastlanmaması nedeniyle yukarıda saptanan çekirdek bölünmelerinin, bu türdeki androgenesis çalışmalarının geliştirilmesine katkı sağlayacağı düşünülmektedir. 71 4. BULGULAR ve TARTIŞMA Esin ARI a b b b Şekil 4.4. Androjenik bir yapıya ait enine kesitler: a) NN+1 mg/l IAA+0.1mg/l BAP ortamında oluşan embriyo, b) B5+0.5 mg/l IAA+0.1 mg/l BAP ortamında 4. haftada oluşan androjenik bir yapının parafin yöntemiyle elde edilmiş farklı büyüklükteki kesitleri 72 4. BULGULAR ve TARTIŞMA Esin ARI 4.2. I. Yıl Deneme Bulguları ve Tartışma 4.2.1. Aktif Karbon (AK) Deneme Bulguları Kontrol, % 0.1 ve % 0.5 lik konsantrasyonlardan oluşan AK denemelerinde, besin ortamına yerleştirilen anterlere uygulanan kontrol, +7 0C de 2, 7 ve 21 gün soğuk muameleleri ile hem AK’un hem de soğuk uygulamasının A. coronaria var. coccinea’da polen embriyogenesisi üzerine etkileri araştırılmıştır. Toplam 12 uygulamadan oluşan AK denemelerine (Çizelge 3.4.) ait 10 haftalık kültür süresi sonunda yapılan gözlemlerde herhangi bir embriyo veya kallus oluşumuna rastlanmazken, ortamlara olan tepki sadece normalin dışında farklı şekilde büyüme olmuştur. AK denemelerinde soğuk uygulamalarının embriyo oluşumunu teşvik edici herhangi bir etkisi bulunamamıştır. Bununla birlikte anterlerin 10 haftalık kültür süresi sonunda, hala % 98-100 oranında canlı kaldıkları gözlenmiştir. 4.2.2. Gümüş Nitrat (GN) Deneme Bulguları Kontrol, 5 mg/l ve 10 mg/l lik konsantrasyonlardan oluşan GN denemelerinde, besin ortamına yerleştirilen anterlere uygulanan kontrol, +7 0C de 2, 7 ve 21 gün soğuk muameleleri ile hem GN’ın hem de soğuk uygulamasının A. coronaria’da polen embriyogenesisi üzerine etkileri incelenmiştir. Toplam 12 uygulamadan oluşan GN denemelerine ait 10 haftalık kültür süresi sonunda yapılan gözlemlerde anterlerden yine herhangi bir embriyo veya kallus oluşumuna rastlanmazken, soğuklatma uygulamalarının da embriyogenesis üzerinde olumlu etkisi bulunmamıştır. GN denemelerinin 10 haftalık kültür süresi sonunda ise anterlerin % 99.50-100 oranında canlı kaldıkları gözlenmiştir. I. yıl denemeleri sonucunda anterlerin hiç birisinden anter kaynaklı embriyo veya kallus elde edilememesine rağmen 10 haftalık kültür süresi sonunda anterlerin hala % 98–100 oranında canlı kaldıkları gözlenmiştir. Zayıf bir ihtimal de olsa, bu canlı anterlerin bir sonraki aşamaya geçişini uyartmak amacıyla Çizelge 3.6.’da belirtilen ortamlar kullanılarak denemeler kurulmuştur. 73 4. BULGULAR ve TARTIŞMA Esin ARI Bu ortam değişiklikleri sonucu da yine embriyo elde edilememiştir. Kallus oluşumuna gelince, katı ortamlarda anter kaynaklı herhangi bir kallus oluşumu gözlenmezken, 4. tekerrürün aktarıldığı sıvı ortam içinde yoğun şekilde irili ufaklı, gevşek veya çoğunlukla sık yapılı, anterlerden bağımsız, beyaz anormal oluşumlar meydana gelmiştir (Şekil 4.5.). Şekil 4.5. Anterlerin sıvı ortamda oluşturduğu farklı anormal yapılar Bu oluşumların; sıvı ortamdaki hareket (60 rpm/dk) ile anterlerin açılması sonucu ortama dökülen mikrospordan kaynaklandığı düşünülmektedir. Özellikle 4a ortamında (NN + % 3 sakkaroz + 1.5 mg/l 2,4-D + 0.5 mg/l Kinetin + 2 mg/l glisin + 500 mg/l L-glutamin + 10 mg/l L-alanin + 10 mg/l L-prolin + 10 mg L-serin) meydana gelen bu oluşumlar öncelikle alt kültüre alınmak üzere, 4 hafta sonra taze ortama aktarılmıştır. Taze ortamda çoğalan bu kitlelerin rejenerasyonunu sağlamak için kitleler bu kez, 2 mg/l BA ilave edilmiş sıvı NN ortamı içeren 4 erlenmayere aktarılmıştır. Ancak elde edilen bu kitlelerden herhangi bir rejenerasyon sağlanamamıştır. 4.2.3. I. Yıl Deneme Bulgularının Tartışılması Çalışmanın I. yılı olan 2002 yılında A. coronaria’da adrogenesis çalışmaları ile ilgili herhangi bir literatür bilgisine rastlanmadığı için öncelikle diğer Anemone türlerinde yapılan anter kültürü çalışmaları (Johansson ve Eriksson, 1977, 1982, 1984, 1990) dikkate alınmıştır. Bu çalışmalar incelendiğinde, hormonsuz NN ortamına eklenen AK’un polen embriyogenesisini yüksek oranda teşvik ettiği bilgisine ulaşılmıştır. Ayrıca bir etilen 74 4. BULGULAR ve TARTIŞMA Esin ARI inhibitörü olan GN’ın embriyogenesis üzerindeki olumlu etkisinin belirlenmesinden sonra özellikle son yıllardaki anter kültürü çalışmalarında (Dias ve Martins, 1999: Çömlekçioğlu, 2001’den; Çömlekçioğlu ve ark., 2001; Malik ve ark., 2001; Achar, 2002; Büyükalaca ve ark. 2004) kullanımının yaygınlaştığı gözlenmiştir. Bu bilgi ve gelişmelere dayanarak kurulan I. yıl denemelerinde temel besin ortamı olarak NN ortamı kullanılmıştır. Hormon kullanılmayan denemelerde AK ve GN’ın farklı dozları ile kontrol, +7 0C de 0, 2, 7 ve 21 günlük soğuk uygulamalarının A. coronaria var. coccinea’da embriyogenesis üzerindeki etkileri incelenmiştir. Johansson ve Eriksson (1977) başka bir Anemone türü olan A. virginiana’da yaptıkları anter kültürü çalışmasında, hormonsuz NN ortamına ekledikleri % 1 oranındaki AK’un % 32 gibi çok yüksek bir oranda haploid embriyo oluşumunu teşvik ettiğini bildirmişlerdir. Oysa, yine hormonsuz NN ortamında fakat % 0.1 ve % 0.5 oranlarında AK’un kullanıldığı I. yıl denemelerinin sonucunda, hiç bir uygulamadan embriyo, embriyogenesisinin proembriyo başlangıcı kabul veya kallus edilebilecek elde edilemezken, proembriyo polen oluşumu da sağlanamamıştır. AK’un, anterden veya ortamdan kaynaklanan ABA veya daha farklı fenolik bileşikleri olduğu kadar kullanıldığı besin ortamlarındaki vitamin, demir ve hormonları da adsorbe ederek kültür ortamlarının yapısını değiştirdiği bilinmektedir. Alpsoy (1999)’un da bildirdiği gibi etki tarzı tam olarak bilinmeyen bu bileşiği androgenesis çalışmalarında kullananlar arasında, AK’un embriyo rejenerasyonunu hızlandırdığını bildiren araştırıcılar olduğu gibi (Bajaj, 1983), kültürdeki anterlerin kararıp canlılığını yitirmesine neden olduğunu (Karakullukçu, 1991) belirten araştırıcılar da vardır. Bu çalışmada ise AK’un embriyo oluşumunu teşvik edici herhangi bir etkisi sağlanamamış olsa da anterlerde AK’dan kaynaklanan kararma veya canlılık kaybı gibi olumsuzluklara rastlanmamıştır. Çünkü özellikle bu denemelerin kültür süresi olan 10 hafta sonunda bile anterlerin embriyo oluşumuna tepkisiz kalmakla birlikte % 98-100 oranında canlı kaldıkları tespit edilmiştir. I. yıl etkisi araştırılan diğer bir madde olan GN’ın kullanıldığı denemelerde ise yine herhangi bir embriyo, proembriyo veya kallus elde edilemezken, 10 haftalık 75 4. BULGULAR ve TARTIŞMA Esin ARI kültür süresi sonunda anterlerde gözlenen canlılık oranı % 99.5-100 olarak tespit edilmiştir. Besin ortamı ve stres uygulamasının dışında anter kültürünü etkileyebilecek diğer faktörler dikkate alındığında, bu sonuçları doğurabilecek en önemli sebeplerin öncelikle uygun safhada olmayan anterlerin kültüre alınmış olabileceği, daha sonra da genotip ve donör bitkinin yetişme koşullarının A. coronaria var. coccinea anter kültürü başarısını olumsuz yönde etkilemiş olabileceği düşünülmektedir. Doğal populasyondan toplanan bitki materyali ile çalışıldığı düşünülürse, son iki faktörün etkisi zaten baştan kabul edilmektedir. Bu durumda, I. yıl denemelerindeki olumsuz sonuçların kültüre alınan anterlerdeki mikrosporların uygun safhada bulunmamasından kaynaklanmış olabileceği tahmin edilmektedir. Söz konusu denemelerin başlangıcında A. coronaria anter kültürü için en uygun mikrospor, anter veya tomurcuk safhasının ne olduğu ve nasıl tespit edildiğine ilişkin herhangi bir literatür olmadığı için, bu safhanın tespiti için o dönemde, en pratik yöntem olarak bilinen asetokarmin yöntemi kullanılmıştır. Bu sırada tezin yeni başlatılmış olması, buna karşılık A. coronaria var. coccinea’daki vejetasyon döneminin sonlarına yaklaşılıyor olmasından dolayı, sitolojik çalışmalar çok fazla detaylandırılamamış, mümkün olabildiği kadar uygun safha olduğu düşünülen ve tek çekirdekli mikrosporları içerdiği tahmin edilen anterler kültüre alınmıştır. Ayrıca Smykal (2000)’ın da ifade ettiği gibi yapılan birçok çalışma, erken çiçeklenen genç çiçek tomurcuklarının en fazla androjenik kapasiteye sahip polen taneciklerini içerdiğini ve tomurcukların çiçeklenme periyodunun başında toplanması gerektiğini göstermiştir. Karakullukçu (1991) da bu konuda; donör olarak yaşlı bitkiler kullanıldığında, morfolojik görünümleri uygun gibi görünmekle birlikte, anterlerin izole edilmesi amacıyla tomurcuklar açıldığında her zaman istenen anter dönemiyle karşılaşılmayabildiğini belirtmiştir. Yukarıda değinildiği gibi, I. yıl denemeleri vejetasyon döneminin sonlarına doğru kurulduğu için, uygun mikrospor safhası ve bu mikrosporları içerdiği düşünülen tomurcuk morfolojisi de özellikle hava sıcaklığı gibi çevre faktörleri ve bitkinin gelişim durumuna göre değişkenlik göstermiş olabilir. Bu nedenle, daha sonraki yıllarda yapılan çalışmalarda sitoloji 76 4. BULGULAR ve TARTIŞMA Esin ARI çalışmalarına daha fazla ağırlık verilerek, materyalin toplandığı döneme göre tomurcuk morfolojisi belirlenmeye çalışılmış ve anterler buna göre kültüre alınmıştır. I. yıl, II. grup çalışmalarına gelince, özellikle sıvı kültüre alınan anterlerden sürekli hareketin etkisiyle ortama dağılan mikrosporlardan kaynaklandığı düşünülen ve belki anormal embriyo benzeri yapı olarak adlandırılabilecek oluşumların, anter kültürü tekniğinin gelişimine katkısı olmasa da A. coronaria’da mikrospor kültürünün uygulanabirliğine ışık tutabileceği düşünülmektedir. 4.3. II. Yıl Deneme Bulguları ve Tartışma I. yıl çalışmalarının sonuçlarının değerlendirilmesi üzerine, II. yıl çalışmalarında NN besin ortamının yanında B5 ortamı da denemeye alınmış ve bu ortamlara eklenen farklı hormon konsantrasyonlarının tek başlarına veya AK, GN, LG ve bunların karışımları ile birlikte anter kültürü üzerine olan etkileri araştırılmıştır. Bu çalışmaların bulguları aşağıda sunulmuştur: 4.3.1. B5 Ortamına Ait Bulgular 4.3.1.1. Farklı Hormon Konsantrasyonlarının Etkilerine Ait Deneme Bulguları B5 ortamına Çizelge 3.7.’de belirtilen 9 farklı hormon konsantrasyonunun eklenmesiyle oluşturulan uygulamaların sonuçları Çizelge 4.1.’de verilmiştir. Çizelgeye göre, en yüksek polen embriyogenesisi oranı % 9.3 ile 7. uygulamadan (B5 + 0.5 mg/l IAA + 0.1 mg/l BAP) elde edilmiştir. 150 anterin kültüre alındığı bu uygulamadan 16 globular şekilli embriyo-benzeri yapı elde edilmiş ve bununla ilgili 100 anter başına düşen embriyo sayısı 10.7 olarak belirlenmiştir. Bu uygulamayı % 6.7 ile 8. uygulama (B5 + 1 mg/l IAA + 0.1 mg/l BAP) ve % 2 ile 9. uygulama (B5 + 2 mg/l IAA + 0.1 mg/l BAP) takip etmiştir. İstatistiksel yönden 7. ve 8. uygulamaların diğer uygulamalardan farkı önemli bulunmuştur. 77 4. BULGULAR ve TARTIŞMA Esin ARI Polen Embriyogenesisi (%) Organogenesis (%) Anterde (%) Flamentte (%) 1:1 5:1 10:1 20:1 Globular Embriyo Benzeri Yapı / 100 Anter Oksin : Sitokinin Oranı Konsantrasyon (mg/l) 0 0.1 0.5 IAA 1 2 0.1 + 0.1 IAA 0.5 + 0.1 + 1 + 0.1 BAP 2 + 0.1 D (% 5) Uygulama Oluşan Globular Embriyo Benzeri Yapı (adet) Kontrol Kallus Oluşumu Anter Canlılığı (%) 1 2 3 4 5 6 7 8 9 Hormonlar Uygulama No Çizelge 4.1. II. yıl denemelerinde B5 ortamına eklenen farklı konsantrasyonlardaki IAA ve BAP’in anter kültürü üzerine etkileri* İncelenen Özellik 92.0 91.3 97.3 94.7 86.7 87.3 42.7 35.3 30.0 - 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 16.0 10.0 3.0 - 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 10.7 6.7 2.0 - 0.0 b 0.0 b 0.0 b 0.0 b 0.0 b 0.0 b 9.3 a 6.7 a 2.0 b 6.6 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 2.7 2.0 0.0 Ö.D. 0.0 b 0.0 b 0.0 b 0.0 b 0.7 b 0.0 b 18.0 a 23.3 a 21.3 a 6.1 0.0 b 2.0 b 0.0 b 2.0 b 6.0 b 2.0 b 36.7 a 43.3 a 43.3 a 17.0 *: Yüzde bulgulara ait istatistiksel analizlerde açı transformasyon değerleri kullanılmıştır 78 4. BULGULAR ve TARTIŞMA Esin ARI Çizelge 4.1.’e göre, sürgün ve kök benzeri oluşumlardan meydana gelen organogenesis yönünden, % 2.7 ile 7. uygulama en yüksek tepkiyi vermesine karşılık, uygulamalar arasında istatistiki anlamda fark bulunamamıştır. Kallus oluşturmaya gelince; anterden oluşan kalluslar yönünden en yüksek kallus oranı % 23.3 ile 7. uygulamadan elde edilmiş ve istatistiki anlamda 7., 8. ve 9. uygulamalar aynı gurupta yer almıştır. Flamentden oluşan kalluslar yönünden ise yine 7., 8. ve 9. uygulamalar istatistiksel olarak diğer uygulamalara göre önemli bulunurken, en yüksek kallus oranı % 43.3 ile 8. ve 9. uygulamalardan sağlanmıştır. 4.3.1.2. Aktif Karbon (AK) Deneme Bulguları Hormon denemelerinde kullanılan 9 farklı hormon konsantrasyonunun eklendiği B5 ortamlarına % 1 AK ilave edilmesiyle oluşturulan uygulamaların hiçbirisinden ne embriyo oluşumu, ne organogenesis ne de kallus oluşturma yönünden olumlu tepki alınamamıştır. Bununla birlikte anterlerin % 61.3 - 86.7 arasında değişen oldukça yüksek canlılık oranlarına sahip oldukları tespit edilmiştir. 4.3.1.3. Gümüş Nitrat (GN) Deneme Bulguları Farklı konsantrasyonlarda IAA ve BAP içeren B5 ortamlarına 5 mg/l GN ilave edilmesiyle oluşturulan yeni besin ortamlarında A. coronaria var. coccinea anterlerinin oluşturdukları tepkiler Çizelge 4.2.’de verilmiştir. Çizelgeye göre, en yüksek embriyogenesis oranı % 3.3 ile 7. uygulamadan (B5 + 5 mg/l GN + 0.5 mg/l IAA + 0.1 mg/l BAP) sağlanmış olup 100 anter başına düşen globular şekilli embriyo-benzeri yapı sayısı 5.3 olarak belirlenmiştir. İstatistiksel anlamda da 7. uygulama diğer uygulamalara göre daha önemli bulunmuştur. Bununla birlikte, istatistiki anlamda önemli olmasa da % 0.7 oranında 8. uygulamadan (B5 + 5 mg/l GN + 1 mg/l IAA + 0.1 mg/l BAP), ve yine % 0.7 oranında 1. (B5 + 5 mg/l GN) ve 2. (B5 + 5 mg/l GN + 0.1 mg/l IAA) uygulamalardan embriyogenesis elde edilmiştir. Özellikle 1. ortam olan kontrol ortamında embriyogenesis oluşumu, GN’ın hormon yokluğunda bile uyartıcı etkisini ortaya koyması yönünden önemlidir. 79 4. BULGULAR ve TARTIŞMA Esin ARI 1.0 1.0 0.0 0.0 0.0 0.0 8.0 1.0 0.0 - 0.7 0.7 0.0 0.0 0.0 0.0 5.3 0.7 0.0 - 0.7ab 0.7ab 0.0 b 0.0 b 0.0 b 0.0 b 3.3 a 0.7 ab 0.0 b 8.4 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 2.0 0.7 2.0 Ö.D. *: Yüzde bulgulara ait istatistiksel analizlerde açı transformasyon değerleri kullanılmıştır 80 Flamentte (%) Organogenesis (%) 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 16.0 10.0 3.0 - Anterde (%) Polen Embriyogenesisi (%) 1:1 5:1 10:1 20:1 Globular Embriyo Benzeri Yapı / 100 Anter Oksin : Sitokinin Oranı Konsantrasyon (mg/l) 0 0.1 0.5 IAA 1 2 0.1 + 0.1 IAA 0.5 + 0.1 + 1 + 0.1 BAP 2 + 0.1 D (% 5) Uygulama Oluşan Globular Embriyo Benzeri Yapı (adet) Kontrol Kallus Oluşumu Anter Canlılığı (%) 1 2 3 4 5 6 7 8 9 Hormonlar Uygulama No Çizelge 4.2. II. yıl denemelerinde 5 mg/l gümüş nitrat (GN) içeren B5 ortamına eklenen farklı konsantrasyonlardaki IAA ve BAP’in anter kültürü üzerine etkileri* İncelenen Özellik 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.7 4.0 0.0 4.0 Ö.D. 0.0 c 0.0 c 1.3 c 4.7 bc 9.3 abc 9.3 abc 20.7 ab 23.3 a 24.7 a 18.4 4. BULGULAR ve TARTIŞMA Esin ARI Çizelge 4.2.’ye göre sürgün benzeri oluşumlar ve çiçek taslağından meydana gelen organogenesis yönünden, 7. ve 9. uygulamalardan % 2, 8. uygulamadan % 0.7 oranında tepki alınmasına rağmen uygulamalar arasında istatistiki anlamda fark bulunamamıştır. Kallus oluşturma bakımından; anterden oluşan kalluslar yönünden 7. ve 9. uygulamalardan % 4 oranında kallus elde edilmesine rağmen istatistiksel yönden uygulamalar arasında fark bulunamamıştır. Flamentden oluşan kalluslar yönünden ise % 24.7 ile 9. ve % 23.3 ile 8. uygulamalar, hem en yüksek kallus oranlarını vermişler hem de istatistiksel anlamda diğer uygulamalara göre daha önemli bulunmuşlardır. 4.3.1.4. L-Glutamin (LG) Deneme Bulguları 800 mg/l L-G ilave edilmiş B5 ortamına hormon denemelerindeki 9 farklı konsantrasyonunun eklenmesiyle oluşturulan uygulamaların sonuçları Çizelge 4.3.’ de verilmiştir. Çizelgeye göre, polen embriyogenesisi yönünden tek tepki % 0.7 ile 9. uygulamadan (B5 + 800 mg/l LG + 2 mg/l IAA + 0.1 mg/l BAP) elde edilmesine rağmen istatistiksel anlamda farklı bulunmamıştır. Organogenesis yönünden uygulamaların hiçbirisinden olumlu cevap alınamamıştır. Kallus oluşturmaya gelince; anter kallusları yönünden en yüksek oran % 10 ile 9. uygulamadan elde edilmiş olup, istatistiksel olarak da bu uygulama diğerlerine göre önemli bulunmuştur. Flament kallusu yönünden ise yine 9. uygulama en yüksek değeri (% 26.7) vermiş ve istatistiki anlamda farkı diğer uygulamalardan önemli bulunmuştur. 4.3.1.5. Aktif Karbon (AK), Gümüş Nitrat (GN) ve L-Glutamin (LG) Karışım Denemesi Bulguları Hormon denemelerinde kullanılan 9 farklı hormon konsantrasyonunun eklendiği temel besin ortamı olan B5 ortamına, %1 AK, 5 mg/l GN ve 800 mg/l LG’ in hep birlikte ilave edilmesiyle oluşturulan uygulamaların hiçbirisinden, % 60 - 79.3 arasında değişen anter canlılık oranlarına rağmen yine ne embriyo oluşumu, ne organogenesis ne de kallus oluşturma yönünden olumlu tepki alınamamıştır. 81 4. BULGULAR ve TARTIŞMA Esin ARI 72.7 66.0 68.7 64.7 60.0 66.0 52.7 69.3 69.3 - 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.7 Ö.D. *: Yüzde bulgulara ait istatistiksel analizlerde açı transformasyon değerleri kullanılmıştır 82 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 - 0.0 b 0.0 b 0.0 b 0.0 b 0.0 b 0.0 b 0.0 b 2.0 b 10.0 a 10.2 Flamentte (%) 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 1.3 - Anterde (%) 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 2.0 - Organogenesis (%) Polen Embriyogenesisi (%) 1:1 5:1 10:1 20:1 Anter Canlılığı (%) Oksin : Sitokinin Oranı Konsantrasyon (mg/l) 0 0.1 0.5 IAA 1 2 0.1 + 0.1 IAA 0.5 + 0.1 + 1 + 0.1 BAP 2 + 0.1 D (% 5) Uygulama Globular Embriyo Benzeri Yapı / 100 Anter Kontrol Kallus Oluşumu Oluşan Globular Embriyo Benzeri Yapı (adet) 1 2 3 4 5 6 7 8 9 Hormonlar Uygulama No Çizelge 4.3. II. yıl denemelerinde 800 mg/l L-glutamin (LG) içeren B5 ortamına eklenen farklı konsantrasyonlardaki IAA ve BAP’in anter kültürü üzerine etkileri* İncelenen Özellik 0.0 c 4.0 bc 4.0 bc 5.3 abc 6.0 bc 4.7 bc 12.0 abc 20.7 ab 26.7 a 18.9 4. BULGULAR ve TARTIŞMA Esin ARI Bu sonuçlar üzerine ortamlara ilave edilen AK’un etkili olduğu düşünülmektedir. Çünkü farklı hormon konsantrasyonlarının tek başlarına yada GN veya LG ile birlikte denendiği uygulamalarda polen embriyogenesisi, organogenesis ve kallus oluşturma yönünden oldukça yüksek olumlu tepkiler alınmasına rağmen bu ortamlara AK eklendiği durumlarda, anterler kullanılan ortamlara tamamen tepkisiz kalmaktadır. 4.3.1.6. Embriyo Çimlendirme - Kallus Çoğaltma Bulguları B5 uygulamaları sonucu elde edilen embriyo benzeri yapıları çimlendirmek ve bu uygulamalarda oluşan embriyojenik anter kalluslarını çoğaltmak için daha önce Çizelge 3.12.’de belirtilen uygulamalar gerçekleştirilmiştir. Çimlenmeleri için hormonsuz B5 ortamına aktarılan embriyo benzeri yapıların hiçbirisi bu hormonsuz bazal ortama tepki vermemiş, dolayısıyla çimlendirilip bitkiye dönüştürülememiştir. Çoğalmaları için yeni ortamlara transfer edilen anter kalluslarına gelince; kalluslardan katı ortamlara aktarılanlar kararıp ölmüşler, sıvı ortamlara aktarılanlar ise küçük kümelerden oluşan daha büyük kalluslar oluşturmuşlardır (Şekil 4.6.). Şekil 4.6. B5 (+ 0.5 mg/l IAA + 0.1 mg/l BAP) sıvı ortamında çoğaltılan bir kallus 83 4. BULGULAR ve TARTIŞMA Esin ARI 4.3.1.7. İndirekt Embriyogenesis Bulguları İndirekt polen embriyogenesisi için gerçekleştirilen Çizelge 3.14.’deki uygulamalar sonucu kalluslardan embriyo oluşumu meydana gelmemiş ancak adventif sürgün veya sürgün benzeri yapılar gerçekleşmiştir. Sürgün oluşturma yönünden, uygulamalar arasında en iyi tepki 3. ortamdan (B5 + 0.1 mg/l IAA + 2 mg/l BAP + 1 mg/l 2ip) elde edilmiştir. Şekil 4.7. ve 4.8.’de, B5 ortamı GN denemeleri arasındaki 7. uygulamadan (B5 + 5 mg/l GN + 0.5 mg/l IAA + 0.1 mg/l BAP) elde edilen anter kalluslarının bu ortamda kültüre alınması sonucu oluşturduğu adventif sürgünler gösterilmiştir. b a a a Şekil 4.7. B5 ortamındaki bir GN uygulamasından elde edilen oluşumlar: a) globular embriyolar, b) anter kallus kümesi ve bundan oluşturulan sürgün benzeri adventif yapılar 4.3.2. NN Ortamına Ait Bulgular 84 4. BULGULAR ve TARTIŞMA a a Esin ARI a b Şekil 4.8. B5 ortamındaki bir GN uygulamasından elde edilen oluşumlar: a) globular embriyolar, b) anter kallusu ve bundan oluşturulan adventif sürgünler 4.3.2.1. Farklı Hormon Konsantrasyonlarının Etkilerine Ait Deneme Bulguları 9 farklı IAA ve BAP konsantrasyonunun NN temel besin ortamına ilave edilmesiyle oluşturulan uygulamaların A. coranaria var. coccinea anterleri üzerinde oluşturdukları etkileri Çizelge 4.4.’de verilmiştir. Çizelgeden de görüldüğü gibi, polen embriyogenesisi yönünden tek tepki % 12.7 gibi oldukça yüksek bir oranla 8. uygulamadan (NN + 1 mg/l IAA + 0.1 mg/l BAP) sağlanmış olup, istatistiksel anlamda da bu uygulama önemli bulunmuştur. 150 anterin kültüre alındığı bu uygulamadan 24 embriyo elde edilmiş ve 100 anter başına düşen embriyo sayısı 16 olarak belirlenmiştir. Sürgün benzeri yapıdan oluşan organogenesis yönünden tek tepki % 0.7 gibi oldukça düşük bir oranla 9. uygulamadan (NN + 2 mg/l IAA + 0.1 mg/l BAP) sağlanmasına rağmen, istatistiksel anlamda uygulamalar arasında fark bulunamamıştır. Kallus oluşturmaya gelince; anter kallusu yönünden farklı uygulamalardan olumlu cevap alınmıştır. Bunlar arasında % 24 ile 8. uygulamadan en yüksek anter kallusu oranı elde edilmesine rağmen uygulamalar arasında fark bulunamamıştır. 85 4. BULGULAR ve TARTIŞMA Esin ARI 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 16.0 0.0 - 0.0 b 0.0 b 0.0 b 0.0 b 0.0 b 0.0 b 0.0 b 12.7a 0.0 b 14.4 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.7 Ö.D. *: Yüzde bulgulara ait istatistiksel analizlerde açı transformasyon değerleri kullanılmıştır 86 0.0 0.0 0.0 12.7 7.3 15.3 7.3 24.0 4.7 Ö.D. Flamentte (%) 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 24.0 0.0 - Anterde (%) Organogenesis (%) 74.7 31.3 78.7 25.3 23.3 24.7 32.7 16.7 53.3 - Polen Embriyogenesisi (%) 1:1 5:1 10:1 20:1 Anter Canlılığı (%) Oksin : Sitokinin Oranı Konsantrasyon (mg/l) 0 0.1 0.5 IAA 1 2 0.1 + 0.1 IAA 0.5 + 0.1 + 1 + 0.1 BAP 2 + 0.1 D (% 5) Uygulama Globular Embriyo Benzeri Yapı / 100 Anter Kontrol Kallus Oluşumu Oluşan Globular Embriyo Benzeri Yapı (adet) 1 2 3 4 5 6 7 8 9 Hormonlar Uygulama No Çizelge 4.4. II. yıl denemelerinde NN ortamına eklenen farklı konsantrasyonlardaki IAA ve BAP’in anter kültürü üzerine etkileri* İncelenen Özellik 0.0 c 0.0 c 3.3 bc 0.7 bc 5.3 bc 26.0 ab 14.0 abc 50.0 a 12.7 abc 28.4 4. BULGULAR ve TARTIŞMA Esin ARI Flament kallusu yönünden ise yine farklı uygulamalardan oldukça yüksek kallus oranları elde edilmiştir. Bunlardan yine 8. uygulama en yüksek kallus oranını oluşturmuş ve istatistiksel anlamda da diğer uygulamalara göre farklı bulunmuştur. 4.3.2.2. Aktif Karbon (AK) Deneme Bulguları % 1 AK ilave edilmiş NN ortamına, hormon denemelerinde belirtilen 9 farklı hormon konsantrasyonunun eklenmesiyle oluşturulan uygulamaların sonuçları Çizelge 4.5.’de verilmiştir. Çizelgeye göre, embriyo oluşturma, organogenesis ve anterden kallus oluşturma yönünden uygulamaların hiçbirisinden olumlu cevap alınamamıştır. Flamentten kallus oluşturma yönünden ise farklı uygulamalardan olumlu tepkiler alınmasına rağmen, bu uygulamalar arasında istatistiki anlamda fark bulunamamıştır. 4.3.2.3. Gümüş Nitrat (GN) Deneme Bulguları Farklı konsantrasyonlarda IAA ve BAP içeren NN ortamlarına 5 mg/l GN ilave edilmesiyle oluşturulan yeni besin ortamlarında A. coronaria var. coccinea anterlerinin oluşturdukları tepkiler Çizelge 4.6.’da verilmiştir. Çizelgeden de görüleceği gibi, 7. (NN + 5 mg/l GN + 0.5 mg/l IAA + 0.1 mg/l BAP) ve 9. (NN + 5 mg/l GN + 2 mg/l IAA + 0.1 mg/l BAP) uygulamalardan % 0.7 oranında polen embriyogenesisi elde edilmesine rağmen, istatistiki anlamda uygulamalar arasında fark bulunamamıştır. Sürgün ve kök benzeri yapılardan oluşan organogenesis yönünden ise 7. uygulamadan % 1.3 oranında tepki alınmasına rağmen, yine uygulamalar arasında istatistiki fark gözlenememiştir. Kallus oluşturma bakımından, anter kallusu yönünden % 2.7 ile 9. uygulama, flament kallusu yönünden ise % 27.3 ile 8. (NN + 5 mg/l GN + 1 mg/l IAA + 0.1 mg/l BAP) uygulama istatistiki anlamda diğer uygulamalardan daha önemli bulunmuştur. 87 4. BULGULAR ve TARTIŞMA Esin ARI 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 - 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 - 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 - *: Yüzde bulgulara ait istatistiksel analizlerde açı transformasyon değerleri kullanılmıştır 88 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 - Flamentte (%) 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 - Anterde (%) Organogenesis (%) 68.0 70.0 67.3 75.3 63.3 86.7 80.7 78.0 90.0 - Polen Embriyogenesisi (%) 1:1 5:1 10:1 20:1 Anter Canlılığı (%) Oksin : Sitokinin Oranı Konsantrasyon (mg/l) 0 0.1 0.5 IAA 1 2 0.1 + 0.1 IAA 0.5 + 0.1 + 1 + 0.1 BAP 2 + 0.1 D (% 5) Uygulama Globular Embriyo Benzeri Yapı / 100 Anter Kontrol Kallus Oluşumu Oluşan Globular Embriyo Benzeri Yapı (adet) 1 2 3 4 5 6 7 8 9 Hormonlar Uygulama No Çizelge 4.5. II. yıl denemelerinde % 1 aktif karbon (AK) içeren NN ortamına eklenen farklı konsantrasyonlardaki IAA ve BAP’in anter kültürü üzerine etkileri* İncelenen Özellik 0.0 2.0 4.0 0.0 1.3 0.7 2.0 1.3 0.0 Ö.D. 4. BULGULAR ve TARTIŞMA Esin ARI 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.7 0.0 0.7 - 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.7 0.0 0.7 Ö.D. 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 1.3 0.0 0.0 Ö.D. *: Yüzde bulgulara ait istatistiksel analizlerde açı transformasyon değerleri kullanılmıştır 89 0.0 b 0.0 b 0.0 b 0.0 b 0.0 b 0.7ab 2.7ab 0.0 b 2.7 a 8.3 Flamentte (%) 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 1.0 0.0 1.0 - Anterde (%) Organogenesis (%) 44.0 57.3 51.3 56.7 56.0 56.0 53.3 55.3 61.3 - Polen Embriyogenesisi (%) 1:1 5:1 10:1 20:1 Anter Canlılığı (%) Oksin : Sitokinin Oranı Konsantrasyon (mg/l) 0 0.1 0.5 IAA 1 2 0.1 + 0.1 IAA 0.5 + 0.1 + 1 + 0.1 BAP 2 + 0.1 D (% 5) Uygulama Globular Embriyo Benzeri Yapı / 100 Anter Kontrol Kallus Oluşumu Oluşan Globular Embriyo Benzeri Yapı (adet) 1 2 3 4 5 6 7 8 9 Hormonlar Uygulama No Çizelge 4.6. II. yıl denemelerinde 5 mg/l gümüş nitrat (GN) içeren NN ortamına eklenen farklı konsantrasyonlardaki IAA ve BAP’in anter kültürü üzerine etkileri* İncelenen Özellik 0.0 d 1.3 cd 2.7 bcd 4.0 abcd 6.0 abcd 13.3 abcd 22.0 abc 27.3 a 24.0 ab 23.5 4. BULGULAR ve TARTIŞMA Esin ARI 4.3.2.4. L-Glutamin (LG) Deneme Bulguları Çizelge 4.7.’de, farklı konsantrasyonlarda IAA ve BAP içeren NN temel besin ortamlarına 800 mg/l LG ilave edilmesiyle oluşturulan uygulamaların sonuçları görülmektedir. Çizelgeye göre, embriyo oluşturma ve organogenesis yönünden uygulamaların hiçbirisinden olumlu cevap alınamamıştır. Kallus oluşturmaya gelince, anter kallusu yönünden % 4 oranında 9. uygulamadan (NN + 800 mg/l LG + 2 mg/l IAA + 0.1 mg/l BAP) ve % 2.7 oranında 8. uygulamadan (NN + 800 mg/l LG + 1 mg/l IAA + 0.1 mg/l BAP) olumlu tepki alınmasına rağmen, uygulamalar arasında istatistiksel fark bulunamamıştır. Flament kallusu yönünden ise kontrol hariç diğer 8. uygulamadan tepki alınmış, bunlar arasında 7., 8. ve 9. uygulamaların istatistiksel farkı diğerlerine göre daha önemli bulunmuştur. 4.3.2.5. Aktif Karbon (AK), Gümüş Nitrat (GN) ve L-Glutamin (LG) Karışım Denemesi Bulguları NN temel besin ortamına, hormon denemelerinde kullanılan 9 farklı hormon konsantrasyonunun eklenmesiyle meydana getirilen ortamlara %1 AK, 5 mg/l GN ve 800 mg/l LG karışımının ilave edilmesiyle oluşturulan uygulamaların sonuçları Çizelge 4.8.’de verilmiştir. Çizelgeye göre polen embriyogenesisi, organogenesis ve anterden kallus oluşturma yönünden uygulamaların hiçbirisinden olumlu cevap alınamamıştır. Flamentden kallus oluşturma yönünden ise farklı uygulamalardan tepkiler alınmasına rağmen, uygulamalar arasında istatistiksel fark bulunamamıştır. Bu sonuçlar üzerine de ortamlara eklenen AK’un etkili olduğu düşünülmektedir. Nedenine gelince, farklı hormon konsantrasyonlarının tek başlarına yada GN veya LG ile birlikte denendiği uygulamalarda embriyo oluşturma, organogenesis ve anter kallusu oluşturma yönünden olumlu cevap alınmasına karşılık AK’un bu ortamlara eklendiği durumlarda anterler, flamentten kallus oluşumu hariç kullanılan ortamlara hiçbir tepki vermemiştir. 90 4. BULGULAR ve TARTIŞMA Esin ARI Anterde (%) 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 - 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 - 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 - 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 - 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 2.7 4.0 Ö.D. *: Yüzde bulgulara ait istatistiksel analizlerde açı transformasyon değerleri kullanılmıştır 91 Flamentte (%) Organogenesis (%) 66.7 53.3 49.3 41.3 37.3 42.7 44.7 49.3 48.7 - Polen Embriyogenesisi (%) 1:1 5:1 10:1 20:1 Anter Canlılığı (%) Oksin : Sitokinin Oranı Konsantrasyon (mg/l) 0 0.1 0.5 IAA 1 2 0.1 + 0.1 IAA 0.5 + 0.1 + 1 + 0.1 BAP 2 + 0.1 D (% 5) Uygulama Globular Embriyo Benzeri Yapı / 100 Anter Kontrol Kallus Oluşumu Oluşan Globular Embriyo Benzeri Yapı (adet) 1 2 3 4 5 6 7 8 9 Hormonlar Uygulama No Çizelge 4.7. II. yıl denemelerinde 800 mg/l L-glutamin (LG) içeren NN ortamına eklenen farklı konsantrasyonlardaki IAA ve BAP’in anter kültürü üzerine etkileri* İncelenen Özellik 0.0 b 2.0 ab 4.0 ab 8.7 ab 5.3 ab 11.3 ab 20.0 a 24.0 a 22.7 a 23.3 4. BULGULAR ve TARTIŞMA Esin ARI 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 - 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 - 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 - *: Yüzde bulgulara ait istatistiksel analizlerde açı transformasyon değerleri kullanılmıştır 92 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 - Flamentte (%) 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 - Anterde (%) Organogenesis (%) 89.3 77.3 76.0 68.7 70.7 73.3 70.0 75.3 75.3 - Polen Embriyogenesisi (%) 1:1 5:1 10:1 20:1 Anter Canlılığı (%) Oksin : Sitokinin Oranı Konsantrasyon (mg/l) 0 0.1 0.5 IAA 1 2 0.1 + 0.1 IAA 0.5 + 0.1 + 1 + 0.1 BAP 2 + 0.1 D (% 5) Uygulama Globular Embriyo Benzeri Yapı / 100 Anter Kontrol Kallus Oluşumu Oluşan Globular Embriyo Benzeri Yapı (adet) 1 2 3 4 5 6 7 8 9 Hormonlar Uygulama No Çizelge 4.8. II. yıl denemelerinde % 1 aktif karbon (AK) + 5 mg/l gümüş nitrat (GN) + 800 mg/l L-glutamin (LG) içeren NN ortamına eklenen farklı konsantrasyonlardaki IAA ve BAP’in anter kültürü üzerine etkileri* İncelenen Özellik 0.0 0.0 2.7 0.0 0.0 2.7 2.7 0.7 2.7 Ö.D. 4. BULGULAR ve TARTIŞMA Esin ARI 4.3.2.6. Embriyo Çimlendirme - Kallus Çoğaltma Bulguları NN uygulamaları sonucu elde edilen embriyo benzeri yapıları çimlendirmek ve bu uygulamalarda oluşan embriyojenik anter kalluslarını çoğaltmak için daha önce Çizelge 3.13.’de belirtilen uygulamalar gerçekleştirilmiştir. Çimlenmeleri için hormonsuz NN ortamına aktarılan embriyo benzeri yapıların hiçbirisi bu yeni ortama tepki vermemiş, dolayısıyla çimlendirilip bitkiye dönüştürülememiştir. Çoğalmaları amacıyla yeni ortamlara transfer edilen anter kalluslarına gelince; bu kalluslardan katı ortamlara aktarılanlar kararıp ölmüşler, sıvı ortamlara aktarılanlar ise küçük kümelerden oluşan daha büyük kalluslar oluşturmuşlardır (Şekil 4.9). Şekil 4.9. NN (+ 0.5 mg/l IAA + 0.1 mg/l BAP) sıvı ortamında çoğaltılan bir kallus 4.3.2.7. İndirekt Embriyogenesis Bulguları İndirekt polen embriyogenesisi için gerçekleştirilen Çizelge 3.14.’deki uygulamalar sonucu kalluslardan embriyo oluşumu meydana gelmemiştir. 93 4. BULGULAR ve TARTIŞMA Esin ARI 4.3.3. II. Yıl Deneme Bulgularının Tartışılması II. Yıl çalışmaları sonucu elde edilen polen embriyogenesisi, organogenesis ve kallus oluşumları aşağıda genel olarak değerlendirilmiştir. Polen Embriyogenesisi Yönünden Polen embriyogenesisi verilerinin yer aldığı Çizelge 4.1., Çizelge 4.2., Çizelge 4.3., Çizelge 4.4., Çizelge 4.5., Çizelge 4.6., Çizelge 4.7., Çizelge 4.8.’in değerlendirilmesi sonucu, B5 ve NN ortamlarına farklı hormon ve diğer katkı maddeleri eklenerek gerçekleştirilen uygulamalar içerisinden embriyo oluşumuna olumlu tepki verenler Şekil 4.10.’da gösterilirken, bunların bazılarından elde edilen embriyogenesis görüntüleri ise Şekil 4.11.’de sunulmuştur. Yukarıda bahsedilen çizelgeler incelendiğinde, B5 ve NN ortamlarında gerçekleştirilen birbirinden farklı uygulamalar arasında sadece belirli uygulamaların embriyo oluşumuna tepki verdiği görülmektedir. Bu uygulamaların ortak özellikleri; oksin yanında belirli oranlarda sitokinin içermeleridir. Bu noktada bir istisnayı belirtmek gerekirse; B5 ortamı için gerçekleştirilen GN uygulamaları içinde 1. uygulama olan kontrol ortamında ve 2. uygulamada çok düşük bir oranla da olsa (% 0.7) embriyogenesise rastlanması, özellikle kontrol ortamı için hormonsuz B5 ortamındaki GN’ın etkisini ortaya koymaktadır. GN denemeleri dışındaki denemelerde, hiç hormonsuz yada sadece oksin içeren ortamların hiçbirisinden embriyo oluşumu sağlanamamıştır. Polen embriyogenesisi elde edilen ortamlar ise sadece bu bölümde tartışılmak üzere, bundan sonra genel bir ifade ile 7., 8. ve 9. uygulamalar olarak ifade edilecektir. Kısa bir hatırlatma yapmak gerekirse; 7. Uygulama = 0.5 mg IAA + 0.1 mg BAP (O : S Oranı = 5:1) 8. Uygulama = 1 mg IAA + 0.1 mg BAP (O : S Oranı = 10:1) 9. Uygulama = 2 mg IAA + 0.1 mg BAP (O : S Oranı = 20:1) içeriklidir. Doku kültüründe hücresel farklılaşma birçok yönden, ortamlardaki oksin ile sitokininler arasındaki interaksiyonla kontrol edilmekte ve embriyogenesis başlangıcı için oksinlere ek olarak sitokinin kullanımı da gerekmektedir (George, 1996). 94 4. BULGULAR ve TARTIŞMA Esin ARI 7. Ortamdaki Embriyogenesis 8. Ortamdaki Embriyogenesis 9. Ortamdaki Embriyogenesis (%) 9 8 14 12 10 8 6 4 2 0 7 8 9 7 B5 8 NN HORMON 9 7 8 9 B5 7 8 NN AK + HORMON 7 8 9 B5 7 8 NN GN + HORMON 9 7 9 B5 7 8 NN LG + HORMON 9 7 8 9 B5 8 NN AK + GN + LG + HORMON Şekil 4.10. B5 ve NN ortamlarında II. yıl gerçekleştirilen farklı uygulamaların polen embriyogenesisi performansları (%) 95 7 9 4. BULGULAR ve TARTIŞMA Esin ARI a b c d f e 96 4. BULGULAR ve TARTIŞMA Esin ARI g h Şekil 4.11. Polen embriygenesisine tepki veren bazı NN ve B5 uygulamaları: a. B5 hormon uygulamaları içindeki 7. ortamda oluşan embriyogenesis b. NN hormon uygulamaları içindeki 8. ortamda oluşan embriyogenesis c. NN hormon uygulamaları içindeki 8. ortamda oluşan embriyogenesis d. B5 GN uygulamaları içindeki 1. ortamda embriyogenesis e. B5 GN uygulamaları içindeki 7. ortamda oluşan bir embriyodan uzayan kotiledon yapraklarının 2 yönlü görüntüsü f. B5 GN uygulamaları içindeki 7. ortamda oluşan bir embriyodan uzayan kotiledon yaprakları ve bir anter kallusundan meydana gelen in vitro çiçeklenme g. B5 GN uygulamaları içindeki 7. ortamda embryogenesis ve anterden kallus oluşumu h.B5 GN uygulamaları içindeki 7. ortamda embryogenesis ve anterden kallus oluşumu Nitekim Chen ve ark. (1998b)’nın bildirdiğine göre Lichter (1981), Brassica napus anter kültüründe oksinle birlikte az oranda sitokinin kullanımının embriyoid verimini arttırdığını kaydetmiştir. Ortamda sitokinin olarak kullanılan BAP miktarının oksin olarak kullanılan NAA ile eşit miktarda veya daha fazla kullanılması halinde ise ancak çok düşük embriyoid verimi elde edilebilmiştir. Chen ve ark. (1998a,b)’nın keten anter kültüründe, hormonların kallus oluşumu ve sürgün rejenerasyonu üzerine etkisini belirlemek üzere yaptıkları çalışmada ise yine hormonların oksin + sitokinin kombinasyonu ile kullanılmasının anterlerden oluşan kallusların organogenetik kapasitelerini ve daha sonra da bunlardan oluşan rejenerasyonu dramatik şekilde arttırdığı ortaya konmuştur. Şekil 4.10.’a göre en yüksek polen embriyogenesisi oranı % 12.6 ile NN ortamı hormon uygulamaları arasındaki 8. uygulamadan elde edilmiştir. Bunu, % 9.3 97 4. BULGULAR ve TARTIŞMA Esin ARI ve % 6.7 polen embriyogenesisi oranları ile B5 ortamında gerçekleştirilen hormon uygulamaları içindeki sırasıyla 7. ve 8. uygulamalar takip etmiştir. Hormon uygulamalarından başka GN uygulamaları da embriyo oluşumuna olumlu tepki vermiştir. Bu uygulamalardan en yüksek performansı, % 3.3 ile 5 mg/l GN katkılı B5 ortamındaki 7. uygulama göstermiştir. GN denemeleri ile ilgili önemli olduğu düşünülen bir saptama; en yüksek embriyogenesis oranları hormon uygulamalarından elde edilmiş olsa da, embriyo kalitesi açısından GN uygulamalarının daha başarılı sonuç verdikleridir. Bu durum görüntülerle belki daha iyi ifade edilebilir. Buna göre Şekil 4.11. içerisindeki a., b. ve c. harfli resimler hormon uygulamaları, d., e., f. g. ve h. harfli resimler ise GN uygulamalarından elde edilen embriyogenesis görüntülerini oluşturmaktadır. Hormon uygulamalarında; elde edilen embriyo veya embriyoidlerin başlangıç formu olan globular embriyolar ilk görünmeye başladıklarında bireysel yapıda olmalarına karşılık kültürün ilerleyen günlerinde embriyoların etrafındaki kallus hücrelerinin çoğalmaya başlaması ile birlikte embriyo veya embriyoidler çoğunlukla kallus hücreleri tarafından sarılmış görüntüler oluşturmaktadır. Oysa, GN uygulamalarından elde edilen embriyo, embriyoid veya kalluslar ise genellikle sınırları daha net ayırd edilebilen teksel yapılar sergilemektedir. GN’ın kallus oluşumuna etkisi ile ilgili olarak, Malik ve ark. (2001)’nın Brassica juncea’da yaptıkları anter kültürü çalışmasında 30, 60 ve 70 µM dozları test edilen GN’ ın; özellikle CMS hatlarında embriyo oluşumu için zorunlu olduğu, bununla birlikte GN’ın kullanıldığı tüm ortamlarda kallus oluşumunun meydana gelmediği bildirilmektedir. Bizim çalışmamızdaki GN uygulamalarında ise hormon uygulamalarına göre daha az oranda da olsa kallus oluşumu gerçekleşmiştir. Bu nedenle çalışmanın bundan sonraki uygulamalarında ağırlıkla GN’ın farklı dozlarının polen embriyogenesisi üzerine olan etkileri araştırılmıştır. LG uygulamaları içinde tek tepki, % 0.7 gibi oldukça düşük bir oran ile B5 ortamındaki 9. uygulamadan elde edilmiştir. B5 ve NN ortamlarındaki AK uygulamalarının hiçbirisi ne embriyo oluşumuna ne de organogenesis ve kallus oluşumuna olumlu tepki vermemiş, bunun yanında AK’un ilave edildiği diğer uygulamalarda (hormon + AK+ GN + LG ) polen 98 4. BULGULAR ve TARTIŞMA embriyogenesisi, organogenesis Esin ARI ve anter kallusu üzerine olumsuz etkide bulunmuştur. Çünkü hormon, GN ve LG denemelerinde bu özellikler yönünden farklı oranlarda başarılar elde edilmesine rağmen AK bu kimyasalların bulunduğu ortamlara ilave edildiğinde negatif etki yaratmıştır. Bu noktada, I. yıl denemelerinin AK üzerine kurulduğu ve embriyo oluşum yönünden hiçbir başarının sağlanamadığını hatırlatmak gerekirse; II. yıldaki AK denemelerinin de başarısızlıkla sonuçlanması nedeniyle AK’un bu aşamasına kadar kullanılan ortam ve hormon kombinasyolarında A. coronaria var. coccinea bitkisindeki polen embriyogenesisine olumlu cevap vermediği sonucuna varılmış ve çalışmada bundan sonra gerçekleştirilen uygulamalarda AK’a yer verilmemiştir. Kallus Oluşturma Yönünden Direkt embriyo oluşumunun amaçlandığı bu çalışmada, globular embriyo oluşumunun yanında oldukça yüksek oranlarda kallus oluşumuna da rastlanmıştır. Kallus gözlemlerinin ortaya konduğu Çizelge 4.1. - Çizelge 4.8. incelendiğinde, birçok uygulamada az yada çok 2 çeşit kallus oluşumunun gerçekleştiği gözükmektedir. Bunlardan haploid olma potansiyeline sahip olup anter yan açıklıklarında ve omuz başlarında oluşan kalluslar “anter kallusu” ( Şekil 4.11. g., h., Şekil 4.12. h., i., k.), flamentlerde oluşan diploid kalluslar ise “flament kallusu” (Şekil 4.12. a., b., c., d., e., f., g.) olarak adlandırılmıştır. Mikroskopta yapılan incelemelerde, gerek anter kallusları gerekse flament kalluslarındaki hücrelerin genellikle düzgün şekilli, küçük, yuvarlak, yoğun sitoplazmalı olduğu, dolayısıyla embriyojenik kapasiteye sahip oldukları tespit edilmiştir (Şekil 4.12). Bunlardan flament kallusları, anterlerin kültüre alınması sırasında flamentlerin anterlerden uzaklaştırılmaması sonucu oluşabilmiştir. Anterlerin flamentleriyle birlikte kültüre alınmasının sebebi daha önce açıklandığı gibi I. yıl çalışmaları sırasında bu işlem ile anterlerin zarar gördüklerinin farkedilmesi ve bunun üzerine sonraki çalışmalarda anterlerin flamentleriyle birlikte kültüre alınmasıdır. Ancak hem anter hem de flament kalluslarının asıl oluşum sebebi hormon kullanımından kaynaklanmaktadır. Nitekim hormon kullanılmayan kontrol ortamlarının hiçbirisinde kallus oluşmamıştır 99 4. BULGULAR ve TARTIŞMA Esin ARI a b c d f h g i Şekil 4.12. Kallus oluşumuna tepki veren bazı NN ve B5 uygulamaları: 100 e k 4. BULGULAR ve TARTIŞMA Esin ARI a. B5 hormon uygulamaları içindeki 8. ortamda oluşan flament kallusu b. B5 hormon uygulamaları içindeki 9. ortamda oluşan flament kallusu c. NN GN uygulamaları içindeki 8.ortamda oluşan flament kallusu d. B5 GN uygulamaları içindeki 8.ortamda oluşan flament kallusu e. B5 GN uygulamaları içindeki 8.ortamda oluşan flament kallusu f. NN GN uygulamaları içindeki 7.ortamda oluşan flament kallusu g. NN hormon uygulamaları içindeki 8.ortamda oluşan flament kallusu h. B5 hormon uygulamaları içindeki 9. ortamda oluşan anter ve flament kallusu i. B5 hormon uygulamaları içindeki 9. ortamda oluşan anter kallusu k. NN hormon uygulamaları içindeki 8.ortamda oluşan anter kallusu Hormonlardan oksinin tek başına kullanıldığı ortamlarda genellikle oksin dozu arttıkça kallus oluşumu da artış göstermiş, ancak asıl büyük etki, oksinin yanında ortama sitokinin de eklenmesiyle gerçekleşmiştir. Örneğin sadece oksinin kullanıldığı uygulamalarda en fazla kallus oranı % 9.3 olup B5 + 5 mg/l GN + 2 mg/l IAA ortamından elde edilirken, oksin + sitokinin kullanılan uygulamalarda NN + 1 mg/l IAA + 0.1 mg/l BAP ortamında bu oran % 50’ye ulaşmıştır. Ancak bahsedilen her iki kallus oluşumu da flamentlerde gerçekleşmiştir. Anter kallus oluşumuna gelince, sadece oksinin kullanıldığı uygulamalarda en yüksek başarı % 12.7 ile NN + 1 mg/l IAA ortamından, oksin + sitokinin kullanılan uygulamalarda ise en yüksek kallus oluşumu % 24 ile yine en yüksek flament kallusunun oluştuğu NN + 1 mg/l IAA + 0.1 mg/l BAP ortamından elde edilmiştir. Yukarıda bahsedilen 10 çizelge incelendiğinde, birçok uygulamada az yada çok kallus oluşumu gözlenmekte, ancak bunlar arasında en yüksek performansların yine 7., 8. ve 9. uygulamalardan sağlandığı görülmektedir. Bu nedenle, B5 ve NN ortamlarına farklı hormon ve diğer katkı maddeleri eklenerek gerçekleştirilen uygulamalar içerisinden, kallus oluşturma yönünden en fazla tepki veren uygulamalar Şekil 4.13.’de toplu olarak sunulmuştur. Şekilden de görülebileceği gibi flament kallusları anter kalluslarından daha fazla oranda gerçekleşmiştir. Gerek anter gerekse flament kallusları sırasıyla en fazla hormon, GN ve LG uygulamalarından elde edilmiştir. 101 4. BULGULAR ve TARTIŞMA Esin ARI Anter Kallusu Flament Kallusu (%) 60 50 40 30 20 10 B5 NN HORMON 7 B5 NN AK + HORMON 7 B5 NN GN + HORMON 7 B5 NN LG + HORMON 8 B5 NN Şekil 4.13. B5 ve NN ortamlarında II. yıl gerçekleştirilen farklı uygulamaların kallus oluşturma performansları (%) FK FK 8 An.K An.K FK FK 7 AK + GN + LG + HORMON UYGULAMALAR 102 9 An.K FK An.K FK 7 An.K FK 9 An.K FK 8 An.K FK An.K FK 9 An.K FK 8 An.K FK 7 An.K FK 9 An.K FK 8 An.K FK An.K FK 9 An.K FK 8 An.K FK 7 An.K FK 9 An.K FK 8 An.K FK An.K FK 9 An.K FK 8 An.K FK 7 An.K FK 9 An.K FK 8 An.K FK 7 An.K FK 9 An.K FK 8 An.K FK 7 An.K An.K 0 9 4. BULGULAR ve TARTIŞMA Esin ARI Şekil 4.13.’e göre en yüksek flament kallusu oranı % 50 ile NN hormon uygulamaları içindeki 8. uygulamadan sağlanırken, 2. (% 43.3) ve 3. (% 43.3) en yüksek flament kallusu sırasıyla B5 hormon uygulamaları içindeki 8. ve 9. uygulamalardan elde edilmiştir. En yüksek anter kallusu oranı (% 24) ise flament kallusunda olduğu gibi yine NN hormon uygulamaları içindeki 8. uygulamada oluşurken, bunu yine B5 hormon uygulamaları içindeki 8. (% 23.3) ve 9. (% 21.3) uygulamalar takip etmiştir. Dolayısıyla hem B5 hem de NN ortamına ilave edilen 1 mg IAA + 0.1 mg BAP konsantrasyonlu (oksin : sitokinin = 10:1) hormon kombinasyonu, hem anter hem de flament kallusu oluşturma yönünden en başarılı ortam olarak belirlenmiştir. Genel bir değerlendirmeyle hem B5 hem de NN ortamlarındaki 7., 8. ve 9. uygulamaların kallus oluşturmadaki başarıları; A. coronaria var. coccinea için polen embriyogenesisinde olduğu gibi kallus oluşturmada da ortamda oksin varlığının yanında, belirli oranlarda sitokinin de bulundurulması gerektiği sonucuna ulaştırmaktadır. Ayrıca bu tür bir hormon ilavesinin oluşacak kallusa embriyojenik özellik kazandırdığı son yıllardaki birçok çalışma (Chen ve ark., 1998a,b; Torregrossa ve ark., 1995; Gök-Tangolar, 2002) ile de ortaya konulmuştur. Direkt polen embriyogenesisinin amaçlandığı II. yıl çalışmalarında, bazı uygulamalar sonucu yüksek sayılabilecek embriyogenesis oranlarına (% 12, % 9.3, % 6.6 vb) rağmen, oluşan embriyo benzeri yapıların hiçbirisi tam bir bitkiye dönüştürülememiştir. Ancak bu uygulamalar sırasında yüksek oranlarda anter ve flament kallusu oluşumlarının gerçekleşmesi, ileride yapılabilecek indirekt embriyogenesis ve organogenesis çalışmaları için kalluslardan faydalanılabileceğini ortaya koymuştur. Bu nedenle, bundan sonra yapılabilecek kallusa dayalı çalışmalarda; kallus oranını ve kallus kalitesini arttırmaya yönelik olarak, farklı hormonların değişik oksin : sitokinin oranlarında incelenmesi yararlı olacaktır. Organogenesis Yönünden Direkt polen embriyogenesisinin amaçlandığı bu çalışmada, globular şekilli embriyo oluşumu ve kallus oluşumunun yanında çeşitli adventif organ veya organ benzeri oluşumlar da gerçekleşmiştir (Şekil 4.14.). 103 4. BULGULAR ve TARTIŞMA Esin ARI a b c d e f g h Şekil 4.14. Organogenesise tepki veren bazı NN ve B5 uygulamaları 104 4. BULGULAR ve TARTIŞMA Esin ARI a. NN hormon uygulamaları içinde 8. ortamdaki organogenesis b. B5 hormon uygulamaları içinde 7. ortamdaki organogenesis c. B5 hormon uygulamaları içinde 7. ortamdaki organogenesis d. B5 GN uygulamaları içinde 7. ortamdaki organogenesis e. NN hormon uygulamaları içinde 8. ortamdaki organogenesis f. NN hormon uygulamaları içinde 8. ortamdaki organogenesis g. B5 hormon uygulamaları içinde 8. ortamdaki organogenesis h. B5 GN uygulamaları içinde 9. ortamdaki organogenesis Organogenesis gözlemlerinin yer aldığı Çizelge 4.1. – Çizelge 4.8.’in değerlendirilmesi sonucu, B5 ve NN ortamlarına farklı hormon ve diğer katkı maddeleri eklenerek gerçekleştirilen uygulamalar içerisinden yine 7., 8. ve 9. ortamlarda organogenesis oluştuğu görülmüş ve bunlar toplu halde Şekil 4.15.’de verilmiştir. Şekle göre B5 ortamları NN ortamlarına kıyasla organogenesisi daha fazla teşvik etmiştir ve bunlar arasında sürgün ve kök benzeri oluşumlardan meydana gelen en yüksek organogenesis oranı % 2.7 ile B5 hormon uygulamaları içindeki 7. ortamdan (B5 + 0.5 mg/l IAA + 0.1 mg/l BAP) elde edilmiştir. Şekil 4.15.’e göre hormon uygulamalarından başka sadece GN uygulamaları organogenesisi teşvik etmektedir. AK, LG ve AK + GN + LG karışım uygulamaları ise organogenesis yönünden hiçbir tepki vermemiştir. Hormon ve GN uygulamaları sırasında rastlanan organların çoğunun sürgün benzeri yapılar (Şekil 4.14.a.,b.,c.,d.,e.,f.) şeklinde ve genelde flament kalluslarından oluştuğu saptanmıştır. Bu adventif sürgünlerin yanında adventif çiçeklenme (Şekil 4. 14. g.) ve adventif kök (Şekil 4.14.h.) oluşumuna da rastlanmıştır. II. yıl çalışmalarında meydana gelen embriyo benzeri yapıların bitkiye dönüştürülememiş olması ve çalışmalarda anterlerin flamentleriyle birlikte kültüre alınma zorunluluğu sonucu tesadüfen rastlanan çoğu flament kallusu kaynaklı organ benzeri yapıların varlığı, organogenesis ve somatik embriyogenesis potansiyelini ortaya koyması bakımından önem taşımaktadır. İster sürgün, ister kök benzeri yapılar olsun, çalışmada elde edilen tüm bu tepkiler uygulamalarda yine oksinle birlikte belirli oranda sitokinin kullanılmasından kaynaklanmıştır. Bu nedenle, bundan sonra yapılabilecek çalışmalarda farklı oranlardaki değişik hormonlar ile birlikte GN’ın farklı dozlarının da denenmesi önerilmektedir. 105 4. BULGULAR ve TARTIŞMA Esin ARI 7.Ortamdaki Organogenesis 8. Ortamdaki Organogenesis 9. Ortamdaki Organogenesis 3 2,5 2 1,5 1 0,5 0 7 8 9 7 B5 8 NN HORMON 9 7 8 B5 9 7 8 NN AK + HORMON 9 7 8 9 B5 7 8 NN GN + HORMON 9 7 8 B5 9 7 8 9 7 NN LG + HORMON Şekil 4.15. B5 ve NN ortamlarında II. yıl gerçekleştirilen farklı uygulamaların organogenesis performansları (%) 106 8 B5 9 7 8 NN AK + GN + LG + HORMON 9 4. BULGULAR ve TARTIŞMA Esin ARI 4.4. III. Yıl Deneme Bulguları ve Tartışma II. yıl denemeleri içerisinde globular şekilli embriyo oluşumu yönünden olumlu tepki veren ortamların değerlendirilmesi sonucu, bir sonraki yıl yapılacak çalışmalarda hormon denemeleri ile hormon + GN denemeleri üzerinde durulmasına karar verilmiştir. Bu amaçla gerçekleştirilen III. yıl denemelerinde B5 ve NN besin ortamlarının kullanıldığı denemelere hormon olarak yine aynı oksin : sitokinin oranlarına sahip IAA ve BAP eklenmiştir. Hormon dışında katkı maddesi olarak sadece GN’ın farklı dozlarının etkisi incelenmiştir. Toplam 40 uygulamadan (20 uygulama B5, 20 uygulama ise NN ortamı için) oluşan III. yıl denemelerinin sonuçları aşağıda verilmiştir. 4.4.1. B5 Ortamına Ait Bulgular 4.4.1.1. Farklı Hormon Konsantrasyonlarının Etkilerine Ait Deneme Bulguları B5 ortamına 3 farklı oksin : sitokinin oranlarına sahip (5:1, 10:1, ve 20:1) hormon kombinasyonlarının eklenmesiyle oluşturulan hormon denemelerine ait bulgular Çizelge 4.9.’da gösterilmiştir. Çizelgeye göre, polen embriyogenesisi yönünden en iyi tepki % 0.8 gibi oldukça düşük bir oranla 2. (B5 + 0.5 mg/l IAA + 0.1 mg/l BAP) ve 3. (B5 + 1 mg/l IAA + 0.1 mg/l BAP) uygulamalardan elde edilmiştir. Sürgün ve kök benzeri yapılardan meydana gelen organogenesis yönünden tek tepki sadece % 1 oranında 4. (B5 + 2 mg/l IAA + 0.1 mg/l BAP) uygulamadan sağlanmıştır. Kallus oluşturmaya gelince; anterden oluşan kalluslar yönünden % 0.5 ile 2. uygulama, flamentden oluşan kalluslar yönünden ise % 18.4 ile 4. uygulama diğer uygulamalara göre daha olumlu tepki vermiştir. Denemede anter kallusu oluşumu % 0.3 - 0.5 gibi düşük oranlarda gerçekleşirken, flament kallusu oluşumu % 6.8 - 18.4 arasında değişmiştir. 107 4. BULGULAR ve TARTIŞMA Esin ARI Çizelge 4.9. III. yıl denemelerinde B5 ortamına eklenen farklı konsantrasyonlardaki IAA ve BAP’in anter kültürü üzerine etkileri 0.0 0.8 0.8 0.3 0.0 0.8 0.8 0.3 0.0 0.0 0.0 1.0 108 0.0 0.5 0.3 0.3 Flamentte (%) Organogenesis (%) 0.0 3.0 3.0 1.0 Anterde (%) Polen Embriyogenesisi (%) 40.5 28.3 24.5 24.0 Globular Embriyo Benzeri Yapı / 100 Anter 5:1 10:1 20:1 Kallus Oluşumu Oluşan Globular Embriyo Benzeri Yapı (adet) Kontrol 0.5 + 0.1 1 + 0.1 2 + 0.1 Anter Canlılığı (%) Oksin : Sitokinin Oranı IAA + BAP Konsantrasyon (mg/l) 1 2 3 4 Hormonlar Uygulama No İncelenen Özellik 0.0 6.8 15.8 18.4 4. BULGULAR ve TARTIŞMA Esin ARI 4.4.1.2. Gümüş Nitrat (GN) Deneme Bulguları Üç farklı hormon kombinasyonuna sahip B5 ortamlarına 0 (kontrol), 2.5, 5, 10 ve 15 mg/l GN ilavesiyle oluşturulan GN denemeleri daha önce Çizelge 3.15.’de belirtilmiştir. Çizelgedeki ilk 4 ortam, hormon denemeleri olmakla beraber, aynı zamanda GN denemelerinin kontrol ortamlarını oluşturmaktadır. Çizelgedeki 5-8 nolu ortamlar 2.5 mg/l konsantrasyonlu GN denemelerini, 9-12 nolu ortamlar 5 mg/l konsantrasyonlu GN denemelerini, 13-16 nolu ortamlar 10 mg/l konsantrasyonlu GN denemelerini ve 17-20 nolu ortamlar ise 15 mg/l konsantrasyonlu GN denemelerini oluşturmuştur. 4.4.1.2.(1). 2.5 mg/l Gümüş Nitrat (GN) Denemesi B5 ortamındaki 2.5 mg/l konsantrasyonlu GN denemelerine ait bulgular Çizelge 4.10.’da verilmiştir. Çizelgeden de görüldüğü gibi, en yüksek globular şekilli embriyo benzeri oluşum oranı % 1.3 ile 7. uygulamadan (B5 + 2.5 mg/l GN + 1 mg/l IAA + 0.1 mg/l BAP) elde edilmiştir. Bu uygulamayı, daha düşük oranlarda % 0.5 ile 6. uygulama (B5 + 2.5 mg/l GN + 0.5 mg/l IAA + 0.1 mg/l BAP) ve % 0.3 ile kontol ortamı olan 5. uygulama (B5 + 2.5 mg/l GN) takip etmiştir. Uygulamalar arasındaki 5. uygulama, hormonun kullanılmadığı bir ortamda GN’ın uyartıcı etkisini ortaya koyması yönünden önemli bulunmuştur. Uygulamaların hiçbirisi organogenesise olumlu tepki verememiştir. Kallus oluşturma bakımından, anterden oluşan kalluslar yönünden % 3.5 ile 8. uygulama (B5 + 2.5 mg/l GN + 2 mg/l IAA + 0.1 mg/l BAP), flamentden oluşan kalluslar yönünden ise % 21.5 ile yine 8. uygulama en başarılı uygulama olarak belirlenmiştir. Denemedeki anter ve flament kalluslarının oluşum oranlarını kıyaslamak gerekirse; anter kallusları % 0.3 - 3.5, flament kallusları ise % 9 - 21.5 oranları arasında gerçekleşmiştir. 109 4. BULGULAR ve TARTIŞMA Esin ARI Çizelge 4.10. III. yıl denemelerinde 2.5 mg/l gümüş nitrat (GN) içeren B5 ortamına eklenen farklı konsantrasyonlardaki IAA ve BAP’in anter kültürü üzerine etkileri 0.3 0.8 1.5 0.0 0.3 0.5 1.3 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 110 0.0 0.3 3.0 3.5 Flamentte (%) Organogenesis (%) 1.0 3.0 6.0 0.0 Anterde (%) Polen Embriyogenesisi (%) 37.0 20.0 24.8 41.3 Globular Embriyo Benzeri Yapı / 100 Anter 5:1 10:1 20:1 Kallus Oluşumu Oluşan Globular Embriyo Benzeri Yapı (adet) Kontrol 0.5 + 0.1 1 + 0.1 2 + 0.1 Anter Canlılığı (%) Oksin : Sitokinin Oranı IAA + BAP Konsantrasyon (mg/l) 5 6 7 8 Hormonlar Uygulama No İncelenen Özellik 0.0 9.0 9.8 21.5 4. BULGULAR ve TARTIŞMA Esin ARI 4.4.1.2.(2). 5 mg/l Gümüş Nitrat (GN) Denemesi 5 mg/l GN içeren B5 ortamındaki uygulamalara ait bulgular Çizelge 4.11.’de gösterilmiştir. Çizelgeye göre, en yüksek polen embriyogenesisi oranı % 1.5 ile 12. uygulamadan (B5 + 5 mg/l GN + 2 mg/l IAA + 0.1 mg/l BAP) elde edilmiştir. Sürgün ve çiçek taslağı benzeri yapılardan meydana gelen organogenesis yönünden ise 11. (B5 + 2.5 mg/l GN + 1 mg/l IAA + 0.1 mg/l BAP) ve 12. uygulamalardan % 0.8 oranında tepki alınabilmiştir. Kallus oluşturmaya gelince; yine 12. uygulama anter kallusları yönünden % 8.3, flament kallusları yönünden ise % 20.5 ile en yüksek kallus performansını göstermiştir. 5 mg/l GN denemesinde anter kallusu oluşumu % 5.5 - 8.3, flament kallusu oluşumu ise % 8.5 - 20.5 arasında değişmiştir. 4.4.1.2.(3). 10 mg/l Gümüş Nitrat (GN) Denemesi B5 ortamındaki 10 mg/l konsantrasyonlu GN denemelerine ait bulgular Çizelge 4.12.’de verilmiştir. Çizelgeden de izlenebileceği gibi, en yüksek globular şekilli embriyo benzeri oluşum oranı % 2.3 ile 15. uygulamadan (B5 + 10 mg/l GN + 1 mg/l IAA + 0.1 mg/l BAP) elde edilmiştir. Organogenesis yönünden uygulamaların hiçbirisinden tepki alınamamıştır. Kallus oluşturma bakımından, anterden oluşan kalluslar yönünden % 8.5 ile 14. uygulama (B5 + 10 mg/l GN + 0.5 mg/l IAA + 0.1 mg/l BAP), flamentden oluşan kalluslar yönünden ise % 25.8 ile yine 14. uygulama en yüksek kallus oranını oluşturmuştur. Denemedeki anterden kallus oluşumları % 4.3 - 8.5, flamentten kallus oluşumu ise % 15.3 - 25.8 arasında gerçekleşmiştir. 4.4.1.2.(4). 15 mg/l Gümüş Nitrat (GN) Denemesi 15 mg/l GN konsantrasyonuna sahip B5 ortamındaki uygulamalara ait bulgular Çizelge 4.13.’de gösterilmiştir. 111 4. BULGULAR ve TARTIŞMA Esin ARI Çizelge 4.11. III. yıl denemelerinde 5 mg/l gümüş nitrat (GN) içeren B5 ortamına eklenen farklı konsantrasyonlardaki IAA ve BAP’in anter kültürü üzerine etkileri 0.0 1.0 0.8 1.5 0.0 0.8 0.8 1.5 0.0 0.0 0.8 0.8 112 0.0 6.5 5.5 8.3 Flamentte (%) Organogenesis (%) 0.0 4.0 3.0 6.0 Anterde (%) Polen Embriyogenesisi (%) 22.8 15.3 26.3 18.5 Globular Embriyo Benzeri Yapı / 100 Anter 5:1 10:1 20:1 Kallus Oluşumu Oluşan Globular Embriyo Benzeri Yapı (adet) Kontrol 0.5 + 0.1 1 + 0.1 2 + 0.1 Anter Canlılığı (%) Oksin : Sitokinin Oranı IAA + BAP Konsantrasyon (mg/l) 9 10 11 12 Hormonlar Uygulama No İncelenen Özellik 0.0 8.5 10.5 20.5 4. BULGULAR ve TARTIŞMA Esin ARI Çizelge 4.12. III. yıl denemelerinde 10 mg/l gümüş nitrat (GN) içeren B5 ortamına eklenen farklı konsantrasyonlardaki IAA ve BAP’in anter kültürü üzerine etkileri 0.0 2.0 2.5 0.3 0.0 1.8 2.3 0.3 0.0 0.0 0.0 0.0 113 0.0 8.5 5.5 4.3 Flamentte (%) Organogenesis (%) 0.0 8.0 10.0 1.0 Anterde (%) Polen Embriyogenesisi (%) 22.3 8.5 12.5 15.0 Globular Embriyo Benzeri Yapı / 100 Anter 5:1 10:1 20:1 Kallus Oluşumu Oluşan Globular Embriyo Benzeri Yapı (adet) Kontrol 0.5 + 0.1 1 + 0.1 2 + 0.1 Anter Canlılığı (%) Oksin : Sitokinin Oranı IAA + BAP Konsantrasyon (mg/l) 13 14 15 16 Hormonlar Uygulama No İncelenen Özellik 0.0 25.8 15.3 21.0 4. BULGULAR ve TARTIŞMA Esin ARI Çizelge 4.13. III. yıl denemelerinde 15 mg/l gümüş nitrat (GN) içeren B5 ortamına eklenen farklı konsantrasyonlardaki IAA ve BAP’in anter kültürü üzerine etkileri 0.0 0.0 1.8 0.0 0.0 0.0 1.5 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 114 0.0 2.0 2.5 1.0 Flamentte (%) Organogenesis (%) 0.0 0.0 7.0 0.0 Anterde (%) Polen Embriyogenesisi (%) 70.0 36.5 41.0 40.5 Globular Embriyo Benzeri Yapı / 100 Anter 5:1 10:1 20:1 Kallus Oluşumu Oluşan Globular Embriyo Benzeri Yapı (adet) Kontrol 0.5 + 0.1 1 + 0.1 2 + 0.1 Anter Canlılığı (%) Oksin : Sitokinin Oranı IAA + BAP Konsantrasyon (mg/l) 17 18 19 20 Hormonlar Uygulama No İncelenen Özellik 0.0 5.5 12.0 13.5 4. BULGULAR ve TARTIŞMA Esin ARI Çizelge 4.13.’e göre, polen embriyogenesisi yönünden tek tepki % 1.5 ile 19. uygulamadan (B5 + 15 mg/l GN + 1 mg/l IAA + 0.1 mg/l BAP) elde edilmiştir. Organogenesis yönünden, uygulamaların hiçbirisinden olumlu tepki alınamamıştır. Kallus oluşturmaya gelince; anterden oluşan kalluslar yönünden % 2.5 ile yine 19. uygulama, flamentden oluşan kalluslar yönünden ise % 13.5 ile 20. uygulama (B5 + 15 mg/l GN + 2 mg/l IAA + 0.1 mg/l BAP) daha başarılı bulunmuştur. 15 mg/l GN denemesinde anterden kallus oluşumu % 1 - 2.5 oranlarında gerçekleşirken, flamentden kallus oluşumu ise % 5.5 - 13.5 arasında değişmiştir. 4.4.2. NN Ortamına Ait Bulgular 4.4.2.1. Farklı Hormon Konsantrasyonlarının Etkilerine Ait Deneme Bulguları NN ortamına 3 farklı oksin : sitokinin oranlarına sahip (5:1, 10:1, ve 20:1) hormon kombinasyonlarının eklenmesiyle oluşturulan hormon denemelerine ait bulgular Çizelge 4.14.’de verilmiştir. Çizelgeye göre, en yüksek globular embriyo benzeri oluşum oranı % 2.3 ile 3. uygulamadan (NN + 1 mg/l IAA + 0.1 mg/l BAP) elde edilmiştir. Sürgün ve kök benzeri yapılardan meydana gelen organogenesis yönünden en yüksek tepki % 0.5 ile 4. uygulamadan (NN + 2 mg/l IAA + 0.1 mg/l BAP) alınmıştır. Kallus oluşturma bakımından; yine 4.uygulama hem anter kallusları yönünden % 1.6, hem de flamentden oluşan kalluslar yönünden % 24.9 kallus oranı ile en yüksek kallus performansını göstermiştir. Denemedeki anter kallusu oranları % 0.5 - 1.6, flament kallusu oranları ise % 15.9 - 24.9 arasında meydana gelmiştir. 4.4.2.2. Gümüş Nitrat (GN) Deneme Bulguları Üç farklı hormon kombinasyonuna sahip NN ortamlarına 0 (kontrol), 2.5, 5, 10 ve 15 mg/l GN ilavesiyle oluşturulan GN denemeleri daha önce Çizelge 3.15.’de belirtilmiştir. Çizelgedeki ilk 4 ortam, hormon denemeleri olmakla beraber, aynı zamanda GN denemelerinin kontrol ortamlarını oluşturmaktadır. 115 4. BULGULAR ve TARTIŞMA Esin ARI Çizelge 4.14. III. yıl denemelerinde NN ortamına eklenen farklı konsantrasyonlardaki IAA ve BAP’in anter kültürü üzerine etkileri 0.0 1.5 2.5 1.3 0.0 1.5 2.3 1.3 0.0 0.3 0.0 0.5 116 0.0 1.0 0.5 1.6 Flamentte (%) Organogenesis (%) 0.0 6.0 10.0 5.0 Anterde (%) Polen Embriyogenesisi (%) 47.3 43.8 35.0 34.3 Globular Embriyo Benzeri Yapı / 100 Anter 5:1 10:1 20:1 Kallus Oluşumu Oluşan Globular Embriyo Benzeri Yapı (adet) Kontrol 0.5 + 0.1 1 + 0.1 2 + 0.1 Anter Canlılığı (%) Oksin : Sitokinin Oranı IAA + BAP Konsantrasyon (mg/l) 1 2 3 4 Hormonlar Uygulama No İncelenen Özellik 0.0 15.9 20.1 24.9 4. BULGULAR ve TARTIŞMA Esin ARI 4.4.2.2.(1). 2.5 mg/l Gümüş Nitrat (GN) Denemesi NN ortamındaki 2.5 mg/l konsantrasyonlu GN denemelerine ait bulgular Çizelge 4.15.’de gösterilmiştir. Çizelgeye göre, en yüksek polen embriyogenesisi oranı % 1.0 ile 8. uygulamadan (NN + 2.5 mg/l GN + 2 mg/l IAA + 0.1 mg/l BAP) elde edilmiştir. Uygulamaların hiçbirisi organogenesise olumlu tepki vermemiştir. Kallus oluşturmaya gelince; anterden oluşan kalluslar yönünden % 0.8 ile 6. uygulama (NN + 2.5 mg/l GN + 0.5 mg/l IAA + 0.1 mg/l BAP), flamentden oluşan kalluslar yönünden ise % 23.3 ile 8. uygulama diğer uygulamalara göre daha olumlu tepki vermiştir. 2.5 mg/l GN denemesinde anterden kallus oluşumu % 0.5 - 0.8 oranlarında gerçekleşirken, flamentden kallus oluşumu ise % 14.1 - 23.3 arasında değişmiştir. 4.4.2.2.(2). 5 mg/l Gümüş Nitrat (GN) Denemesi 5 mg/l GN içeren NN ortamındaki uygulamalara ait bulgular Çizelge 4.16.’da verilmiştir. Çizelgeden görüleceği gibi, O:S oranı sırasıyla 5:1, 10:1 ve 20:1 olan 10., 11. ve 12. uygulamaların tümünden % 0.3 gibi düşük bir oranda globular embriyo benzeri oluşum elde edilmiş, dolayısıyla kontrol dışındaki uygulamalar arasında fark bulunamamıştır. Organogenesis yönünden ise uygulamaların hiçbirisi olumlu tepki vermemiştir. Kallus oluşturmaya gelince; anterden oluşan kalluslar yönünden % 1 ile 11. uygulama (NN + 5 mg/l GN + 1 mg/l IAA + 0.1 mg/l BAP), flamentden oluşan kalluslar yönünden ise % 8.8 ile 12. uygulama (NN + 5 mg/l GN + 2 mg/l IAA + 0.1 mg/l BAP) diğer uygulamalara göre daha olumlu tepki vermiştir. Denemedeki anter ve flament kalluslarının oluşum oranlarını kıyaslamak gerekirse; anter kallusları % 0.3 - 1, flament kallusları ise % 4 - 8.8 oranlarında oluşmuştur. 4.4.2.2.(3). 10 mg/l Gümüş Nitrat (GN) Denemesi NN ortamındaki 10 mg/l konsantrasyonlu GN uygulamalarına ait bulgular Çizelge 4.17.’de sunulmuştur. 117 4. BULGULAR ve TARTIŞMA Esin ARI Çizelge 4.15. III. yıl denemelerinde 2.5 mg/l gümüş nitrat (GN) içeren NN ortamına eklenen farklı konsantrasyonlardaki IAA ve BAP’in anter kültürü üzerine etkileri 0.0 0.3 0.5 1.0 0.0 0.3 0.3 1.0 0.0 0.0 0.0 0.0 118 0.0 0.8 0.5 0.5 Flamentte (%) Organogenesis (%) 0.0 1.0 2.0 4.0 Anterde (%) Polen Embriyogenesisi (%) 44.8 28.8 28.5 25.8 Globular Embriyo Benzeri Yapı / 100 Anter 5:1 10:1 20:1 Kallus Oluşumu Oluşan Globular Embriyo Benzeri Yapı (adet) Kontrol 0.5 + 0.1 1 + 0.1 2 + 0.1 Anter Canlılığı (%) Oksin : Sitokinin Oranı IAA + BAP Konsantrasyon (mg/l) 5 6 7 8 Hormonlar Uygulama No İncelenen Özellik 0.0 14.1 20.5 23.3 4. BULGULAR ve TARTIŞMA Esin ARI Çizelge 4.16. III. yıl denemelerinde 5 mg/l gümüş nitrat (GN) içeren NN ortamına eklenen farklı konsantrasyonlardaki IAA ve BAP’in anter kültürü üzerine etkileri 0.0 0.3 0.5 0.3 0.0 0.3 0.3 0.3 0.0 0.0 0.0 0.0 119 0.0 0.3 1.0 0.8 Flamentte (%) Organogenesis (%) 0.0 1.0 2.0 1.0 Anterde (%) Polen Embriyogenesisi (%) 24.3 37.0 32.0 27.3 Globular Embriyo Benzeri Yapı / 100 Anter 5:1 10:1 20:1 Kallus Oluşumu Oluşan Globular Embriyo Benzeri Yapı (adet) Kontrol 0.5 + 0.1 1 + 0.1 2 + 0.1 Anter Canlılığı (%) Oksin : Sitokinin Oranı IAA + BAP Konsantrasyon (mg/l) 9 10 11 12 Hormonlar Uygulama No İncelenen Özellik 0.0 4.3 4.0 8.8 4. BULGULAR ve TARTIŞMA Esin ARI Çizelge 4.17. III. yıl denemelerinde 10 mg/l gümüş nitrat (GN) içeren NN ortamına eklenen farklı konsantrasyonlardaki IAA ve BAP’in anter kültürü üzerine etkileri Polen Embriyogenesisi (%) Organogenesis (%) Anterde (%) Flamentte (%) 22.8 13.0 12.5 13.5 Globular Embriyo Benzeri Yapı / 100 Anter 5:1 10:1 20:1 Kallus Oluşumu Oluşan Globular Embriyo Benzeri Yapı (adet) Kontrol 0.5 + 0.1 1 + 0.1 2 + 0.1 Anter Canlılığı (%) Oksin : Sitokinin Oranı IAA + BAP Konsantrasyon (mg/l) 13 14 15 16 Hormonlar Uygulama No İncelenen Özellik 1.0 0.0 4.0 3.0 0.3 0.0 1.0 0.8 0.3 0.0 0.8 0.8 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 1.3 1.0 1.5 0.0 18.0 16.3 13.8 120 4. BULGULAR ve TARTIŞMA Esin ARI Çizelge 4.17.’ye göre, 15. (NN + 10 mg/l GN + 1 mg/l IAA + 0.1 mg/l BAP) ve 16. uygulamadan (NN + 10 mg/l GN + 2 mg/l IAA + 0.1 mg/l BAP), % 0.8 oranında polen embriyogenesisi elde edilmiştir. Ayrıca aynı zamanda kontrol ortamı olup, hormon içermeyen 13. uygulamadan (NN + 10 mg/l GN) da % 0.3 oranında tepki alınmıştır. Uygulamaların hiçbirisinden organogenesis yönünden olumlu tepki elde edilememiştir. Kallus oluşturmaya gelince; anterden oluşan kalluslar yönünden % 1.5 ile 16. uygulama, flamentden oluşan kalluslar yönünden ise % 18 kallus oranı ile 14. uygulama (NN + 10 mg/l GN + 0.5 mg/l IAA + 0.1 mg/l BAP), diğer uygulamalara göre daha olumlu cevap vermiştir. 10 mg/l GN denemesinde anterden kallus oluşumu % 1 - 1.5 oranlarında gerçekleşirken, flamentden kallus oluşumu ise % 13.8 - 18 arasında değişmiştir. 4.4.2.2.(4). 15 mg/l Gümüş Nitrat (GN) Denemesi 15 mg/l GN içeren NN ortamındaki uygulamalara ait bulgular Çizelge 4.18.’de verilmiştir. Çizelgeden de takip edilebileceği gibi, en yüksek globular embriyo benzeri oluşum oranı % 1 ile 19. uygulamadan (NN + 15 mg/l GN + 1 mg/l IAA + 0.1 mg/l BAP) elde edilmiştir. Organogenesis bakımından, uygulamaların hiçbirisinden olumlu cevap alınamamıştır. Kallus oluşturmaya gelince, 20. uygulama (NN + 15 mg/l GN + 2 mg/l IAA + 0.1 mg/l BAP) hem % 2.5 ile anterden oluşan kalluslar yönünden, hem de % 15.5 ile flamentden oluşan kalluslar yönünden en yüksek kallus performansını göstermiştir. Denemedeki anterden kallus oluşumu % 0.8 - 2.5 oranlarında gerçekleşirken, flamentden kallus oluşumu ise % 6.3 - 15.5 arasında değişmiştir. 4.4.3. III. Yıl Deneme Bulgularının Tartışılması III. yıl verilerinin yer aldığı Çizelge 4.9. - Çizelge 4.18.’in değerlendirilmesi sonucu, B5 ve NN ortamlarında gerçekleştirilen hormon ve GN uygulamalarının polen embriyogenesisi yönünden verdikleri tepkiler kontol ortamları hariç toplu halde Şekil 4.16.’da sunulmuştur. 121 4. BULGULAR ve TARTIŞMA Esin ARI Çizelge 4.18. III. yıl denemelerinde 15 mg/l gümüş nitrat (GN) içeren NN ortamına eklenen farklı konsantrasyonlardaki IAA ve BAP’in anter kültürü üzerine etkileri 0.0 0.8 1.0 0.0 0.0 0.5 1.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 122 0.0 0.8 1.3 2.5 Flamentte (%) Organogenesis (%) 0.0 3.0 4.0 0.0 Anterde (%) Polen Embriyogenesisi (%) 16.5 21.3 18.3 20.5 Globular Embriyo Benzeri Yapı / 100 Anter 5:1 10:1 20:1 Kallus Oluşumu Oluşan Globular Embriyo Benzeri Yapı (adet) Kontrol 0.5 + 0.1 1 + 0.1 2 + 0.1 Anter Canlılığı (%) Oksin : Sitokinin Oranı IAA + BAP Konsantrasyon (mg/l) 17 18 19 20 Hormonlar Uygulama No İncelenen Özellik 0.0 6.3 10.0 15.5 4. BULGULAR ve TARTIŞMA Esin ARI B5 - 5:1 Ortamında Embriyogenesis B5 -10:1 Ortamında Embriyogenesis B5 - 20:1 Ortamında Embriyogenesis NN - 5:1 Ortamında Embriyogenesis NN - 10:1 Ortamında Embriyogenesis NN - 20:1 Ortamında Embriyogenesis 2,5 2 1,5 1 0,5 B5 NN HORMON B5 NN 2.5 mg/l GN + HORMON B5 NN 5 mg/l GN + HORMON B5 NN 10 mg/l GN + HORMON B5 NN 15 mg/l GN + HORMON Şekil 4.16. B5 ve NN ortamlarında III. yıl gerçekleştirilen farklı uygulamaların polen embriyogenesisi performansları (%) 123 NN - 20:1 NN - 10:1 NN - 5:1 B5 - 20:1 B5 - 10:1 B5 - 5:1 NN - 20:1 NN - 10:1 NN - 5:1 B5 - 20:1 B5 - 10:1 B5 - 5:1 NN - 20:1 NN - 10:1 NN - 5:1 B5 - 20:1 B5 - 10:1 B5 - 5:1 NN - 20:1 NN - 10:1 NN - 5:1 B5 - 20:1 B5 - 10:1 B5 - 5:1 NN - 20:1 NN - 10:1 NN - 5:1 B5 - 20:1 B5 - 10:1 B5 - 5:1 0 4. BULGULAR ve TARTIŞMA Esin ARI Söz konusu çizelgeler incelendiğinde; B5 ve NN ortamlarında gerçekleştirilen 40 uygulamanın 25 uygulamasından düşük oranlarda da olsa polen embriyogenesisi gerçekleştiği görülmektedir. Şekil 4.16.’da ise 30 uygulamanın 25’inde olumlu tepki sağlanabilmiştir. Şekle göre en yüksek polen embriyogenesisi oranı % 2.3 olup, bu oran hem NN ortamındaki 1 mg/l IAA + 0.1 mg/l BAP içerikli hormon uygulamasından hem de B5 ortamındaki 10 mg/l GN + 1 mg/l IAA + 0.1 mg/l BAP GN uygulamasından sağlanmıştır. III. yıl GN denemeleri ile ilgili vurgulanması gereken önemli bir nokta; kontrol uygulamalarından olan B5 + 2.5 mg/l GN ve NN + 10 mg/l GN ortamlarından, tıpkı tek dozluk (5 mg/l) II. yıl B5 ortamı GN denemelerinin kontrol ortamında olduğu gibi polen embriyogenesisi elde edilebilmiş olması GN’ın hormon yokluğunda bile embriyo uyartım etkisini tekrar ortaya koyması yönünden önemlidir. GN’a yer verilmeyen hormon denemelerini kendi aralarında değerlendirmek gerekirse; NN + 1 mg/l IAA + 0.1 mg/l BAP uygulaması % 2.3 ile en yüksek embriyogenesis oranını verirken, bunu % 1.5 ile NN + 0.5 mg/l IAA + 0.1 mg/l BAP uygulaması takip etmiştir. III. yıl çalışmalarında da embriyo benzeri oluşumların yanında adventif organ veya organ benzeri oluşumlar şeklinde organogenesis ile hem anterden hem de flamentten kallus oluşumları meydana gelmiştir (Şekil 4.17.). A. coronaria var. coccinea için III. yıl kurulan tüm denemelerde polen embriyogenesisi, organogenesis, anterden ve flamentten oluşan kallus performansları yönünden en başarılı bulunan oranlar ve bunların oluştukları ortamın oksin: sitokinin oranları Çizelge 4.19.’da toplu olarak verilmiştir. Polen embriyogenesisi hakkında zaten Şekil 4.16.’ya göre yorum yapıldığı için konuya organogenesis ile devam edilecektir. Organogenesis yönünden en başarılı uygulama düşük bir oranla da olsa % 1 ile B5 hormon uygulamaları arasındaki 2 mg/l IAA + 0.1 mg/l BAP hormon uygulaması olarak belirlenmiş ve bu uygulamada sürgün ve kök benzeri yapılar gözlenmiştir. NN ortamındaki en başarılı sonuç ise % 0.5 ile aynı hormon konsantrasyonlarına sahip uygulamadan elde edilmiştir. 124 4. BULGULAR ve TARTIŞMA Esin ARI a b c d e f g h i Şekil 4.17. III. yıl çalışmalarındaki bazı B5 ve NN uygulamalarında oluşan tepkiler: a. NN ortamındaki 3. uygulamada oluşan embriyogenesis b. B5 ortamındaki 15. uygulamada oluşan embriyogenesis 125 4. BULGULAR ve TARTIŞMA Esin ARI c. d. e. f. B5 ortamındaki 19. uygulamada oluşan embriyogenesis NN ortamındaki 13. uygulamada oluşan embriyogenesis NN ortamındaki 8. uygulamada oluşan anter kallusu NN ortamındaki 16. uygulamada oluşan flament kallusu ve bu kallustan meydana gelen rejenerasyon g. B5 ortamındaki 15. uygulamada oluşan flament kallusu ve bu kallustan meydana gelen rejenerasyon h. B5 ortamındaki 11. uygulamada oluşan anter kallusu ve bu kallustan meydana gelen çiçek taslağı benzeri yapı i. NN ortamındaki 4. uygulamada meydana gelen bir flament kallusundan rejenere olan adventif kök oluşumu Çizelge 4.19. A. coronaria var. coccinea için III. yıl kurulan tüm denemelerin en yüksek polen embriyogenesisi, organogenesis, anterden ve flamentten oluşan kallus performansları (%) ve oluştukları ortamın oksin: sitokinin oranları DENEMELER Polen Embriyogenesisi Organogenesis Kallus Oluşumu Anterden Flamentten B5 ORTAMINDA GN Denemeleri Hormon Denemeleri 2.5 mg/l 5 mg/l 10 mg/l 15 mg/l % 0.8 (5:1 ve 10:1)z % 1.3 (10:1) % 1.5 (20:1) % 2.3 (10:1) % 1.5 (10:1) % 1y (20:1) %0 % 0.8 (10:1 ve 20:1) %0 %0 % 0.5 (5:1) % 3.5 (20:1) % 8.3 (20:1) % 8.5 (5:1) % 2.5 (10:1) % 18.4 (20:1) % 21.5 (20:1) % 20.5 (20:1) % 25.8 (5:1) % 13.5 (20:1) % 1.6 (20:1) % 0.8 (5:1) %1 (10:1) % 1.5 (20:1) % 2.5 (20:1) % 24.9 (20:1) % 23.3 (20:1) % 8.8 (20:1) % 18 (5:1) % 15.5 (20:1) NN ORTAMINDA GN Denemeleri Hormon Denemeleri 2.5 mg/l 5 mg/l 10 mg/l 15 mg/l % 2.3 (10:1) %1 (20:1) % 0.3 (5:1, 10:1 ve 20:1) % 0.8 (10:1 ve 20:1) % 2.3 (10:1) % 0.5 (20:1) %0 %0 %0 %0 Z: Oksin : Sitokinin Oranı Y: Koyu yazılmış değerler en yüksek oranları göstermektedir. 126 4. BULGULAR ve TARTIŞMA Esin ARI Anterden oluşan kalluslar yönünden, en başarılı tepki % 8.5 ile B5 ortamındaki 10 mg/l GN + 0.5 mg/l IAA + 0.1 mg/l BAP uygulamasından elde edilirken, NN ortamında ise % 2.5 ile 15 mg/l GN + 2 mg/l IAA + 0.1 mg/l BAP uygulamasından en yüksek performans sağlanmıştır. Flamentten oluşan kalluslara gelince, en yüksek kallus oranı % 25.8 ile B5 ortamındaki 10 mg/l GN + 0.5 mg/l IAA + 0.1 mg/l BAP içerikli uygulamadan, NN ortamında ise % 24.9 ile 2 mg/l IAA + 0.1 mg/l BAP içeriğindeki GN’sız hormon uygulamasından elde edilmiştir. Bu sonuçlara göre her iki kallus çeşidinin oluşumunda B5 ortamı daha başarılı bulunurken, B5 ortamındaki denemeler arasında 10 mg/l GN katkılı denemelerin, bu denemelerdeki uygulamalar arasında ise 5:1 oksin:sitokinin oranına sahip uygulamanın, hem anterden hem de flamentten kallus oluşturmada en yüksek performansı gösterdiği belirlenmiştir. 4.5. Genel Tartışma Üç yıl boyunca yürütülen çalışmalar sonucu, anter kültürünü etkileyen faktörlerden en önemlisinin muhtemelen mikrosporların gelişim safhası olduğu düşünülmektedir. Çünkü uygun safhadaki mikrosporlar kültüre alınmadıkça, diğer kültür şartları mükemmel dahi olsa polen embriyogenesisi gerçekleşmeyecektir. Optimum mikrospor safhası türe, genotipe, donör bitkinin yetişme koşullarına veya kullanılan androgenesis tekniğine göre değişiklik gösterdiğinden (Ferrie ve Keller, 1997), her genotip için bu konuda bir ön çalışma yapılması ve çalışmanın pratikliğini sağlama yönünden optimum mikrospor safhasını içeren tomurcuk morfolojisinin tanımının yapılması gerekmektedir. Bu tezde, uygun tomurcuk safhasını tespit etmek amacıyla yapılan sitolojik çalışmalarda, Adana’da doğal yayılış gösteren bir A. coronaria var. coccinea populasyonundan toplanan farklı büyüklükteki tomurcuklar, büyüklükleri ve gelişim durumları göz önüne alınarak 10 gruba ayrılmıştır. Her bir gruba ait tomurcukların gelişim aşamaları farklı yöntemler kullanılarak belirlenmiş olup, kültüre almak için 127 4. BULGULAR ve TARTIŞMA Esin ARI en uygun safhalar oldukları düşünülen geç tetrat ve tek çekirdekli safhadaki mikrosporları, genellikle 2 ve 3 numaralı tomurcukların içerdikleri gözlenmiştir. Bu tomurcuklara ait makroskobik göstergeler ise; genç tomurcukların özellikle toprak yüzeyinde yeni gözükmeye başladığı sıralarda eğik durması ve çiçek sapı ile neredeyse paralele yakın şekilde oldukça dar bir açı oluşturması, ortalama olarak 6x9 mm büyüklükte olmaları ve involukrum yaprakların henüz açılmaması nedeniyle tepallerin dışarıdan görünmemesi tanımlamalarından oluşmaktadır. A. coronaria’da diğer birçok bitki türünde olduğu gibi androgenesis çalışmaları ile farklı mikrospor safhalarındaki anter veya mikrosporların kültüre alınması sonucu belirlenen ve tavsiye edilen herhangi bir mikrospor safhası olmadığı için bu tezde, genel anter kültürü çalışmaları için kabul gören tek çekirdekli aşamadaki mikrosporlara sahip anterler kültüre alınmaya çalışılmıştır. Anter kültürü çalışmaları için 2 ve 3 numaralı tomurcuklar uygun görülmekle birlikte, A. coronaria’da düzensizlikleri mayoz bölünme nedeniyle, safhalarında özellikle rastlanan anterlerden çekirdek kallus yoluyla bölünmesi indirekt embriyogenesis veya mikrospor kültürü çalışmaları içinse daha erken aşamadaki tomurcuların kullanılmasının belki daha yararlı olabileceği düşüncesiyle, 2 numaralı tomurcuk büyüklüğünün üzerinde durulması tavsiye edilebilir. Bu konuyla ilgili olarak Summers ve ark. (1992)’nın domateste yaptıkları anter kültürü çalışmasında; profaz-I, zigoten-diyakinez, metafaz-I, telofaz-II, tek çekirdekli ve iki çekirdekli mikrospor safhalarına sahip anterlerden kallus oluşturan anter sayısı ve kallus çapı belirlenmiştir. Mikrospor gelişim safhaları leptotenden tek çekirdekli safhaya doğru ilerleyen anterlerde, kallus oluşumu ve gelişimi her bir çeşit için önemli oranda düşüş göstermiştir. Leptoten safhasındaki mikrosporlara sahip anterler % 84 oranında kallus oluştururken, tek çekirdekli safhadaki mikrosporları içeren anterlerde ise sadece % 4 oranında kallus meydana gelmiştir. Yine domateste, Bal (2002)’ın bildirdiğine göre Gresshoff ve Doy (1972) erken mayoz bölünme ile tetrat safhalarında mikrosporları taşıyan anterlerin kültüre almada en uygun dönem olduğu kaydetmiştir. Dolayısıyla elverişli mikrospor safhasını kaçırmamak için tomurcuğun biraz daha erken aşamalarının kullanılmasının yararlı olabileceği düşünülmektedir. 128 4. BULGULAR ve TARTIŞMA Esin ARI Bununla birlikte Zamir ve ark. (1980), mikrospor gelişim aşamaları ile tomurcuk boyu arasındaki ilişkinin her zaman geçerli kabul edilemeyeceğini kaydetmiştir. Fan ve ark. (1988) da aynı görüşü paylaşmış ve tomurcuk boyu ile mikrospor gelişimi arasındaki bağlantının, çevre koşulları ve genotip tarafından kolayca değiştirilebileceğini bildirmiştir. Çevresel faktörler içerisinde hava sıcaklığı çok önemli yere sahiptir. Nitekim bizim çalışmamızda yapılan farklı dönemlerdeki sitolojik incelemelerde de bu faktörün, mikrospor gelişim aşamaları üzerine doğrudan etkide bulunduğu tespit edilmiştir. Bu nedenle özellikle doğal bitkilerde, çiçek tomurcuklarının toplandığı dönemdeki hava sıcaklığının mikrospor gelişim aşamalarını ve buna bağlı olarak haploid embriyo oluşumunu etkileyeceği kabul edilirse, materyalin toplandığı döneme göre uygun tomurcuk morfolojisi tekrar gözden geçirilmeli ve anterler buna göre kültüre alınmalıdır. Karakullukçu (1991)’nun bildirdiğine göre kültüre alınan anterlerin şişerek gelişmeleri, hücre bölünmesinin işareti kabul edilmekte ve bölünme meydana geliyorsa androgenesis için bir ümit bulunduğu varsayılmaktadır. Bizim çalışmamızın I. yılında da anterler çoğunlukla şişerek gelişme göstermişler ancak daha ileri aşamaya geçememişlerdir. Çalışmada daha sonraki yıllarda yürütülen denemelerde embriyoid, globular şekilli embriyo ve anter kallusları meydana gelmiş, dolayısıyla farklı denemelerden farklı oranlarda androgenetik olumlu tepkiler alınmıştır. Ayrıca, normal mikroskobik incelemelerde şişerek geliştiği gözlenen anterlerin, haftalık embriyolojik gelişimlerini izlemek amacıyla yapılan kesit alma çalışmasında ise embriyo oluşturma yolunda ilerleyen mikrosporlarda simetrik, generatif ve vejetatif çekirdek bölünmelerinin uyartılabildiği ve çok çekirdekli yapıların oluşumunun gerçekleştiği tespit edilmiştir. A. coronaria var. coccinea’daki bölünme düzensizlikleri ile ilgili olarak Karaca ve Seğmen (1970) yaptıkları çalışmada, farklı A. coronaria varyetelerindeki mikrospor ana hücrelerinin mayoz - I. anafaz safhasında, normal anafaz safhasındaki hücrelerin yanında birçok hücrelerde bazı anormalliklere rastlamışlar, özellikle coccinea ve cyanea varyetelerinde ‘laggard’ (tembel) kromozomlar, kromozom köprüsü ve mikropallen oluşumu gibi mayoz anormallikleri saptamışlardır. Söz 129 4. BULGULAR ve TARTIŞMA Esin ARI konusu anormallikler bu tezde yapılan sitolojik çalışmalarla da ortaya konmuş ve çalışmalar sırasında rastlanan bir kromozom köprüsüne Şekil 4.18.’de yer verilmiştir. Şekil 4.18. A. coronaria var. coccinea’da rastlanan mayoz bölünme düzensizliklerine örnek gösterilebilecek bir kromozom köprüsü (lakto-propionik-orsein ile tespit edilmiştir) Bahsi geçen kromozom köprülerinin oluşum nedenini; Ünal (1992), mitoz bölünmesindeki anafazda, kutuplara çekilen bir veya daha fazla kromozomun birbirinden ayrılmaması ile açıklamakta, oluşuma katılan kromozom sayısına bağlı olarak ince veya kalın olabilen köprülerin telofaz hatta dinlenme evresinde de kopmayarak 2 kromozom grubunun birleşmesine neden olduğunu bildirmektedir. Anter kültürü çalışmalarını olumsuz etkileyen birçok faktör arasında, bir petri içerisinde farklı gelişim aşamalarındaki anterlerin kültüre alınması sonucu ileri aşamadaki anterlerin ortama yaydıkları fenolik bileşiklerin genç anterlere toksik etkide bulunabildiği bilinmektedir. Bu çalışmada yapılan sitolojik incelemelerde ise bir A. coronaria tomurcuğu içerisindeki anterler büyüklük ve gelişim yönünden asenkronizasyon gösterirken, bir anter içerisindeki mikrosporların homojen olarak geliştikleri tespit edilmiştir. Özellikle birinci durum, çalışmada kullanılacak tomurcuk materyali ve dolayısıyla kültüre alınacak anter seçimini oldukça 130 4. BULGULAR ve TARTIŞMA Esin ARI güçleştirmiştir. Çalışmamızda kültüre alınan anterlerin safhaları aynı tutulmaya çalışılmış olmakla birlikte yine de ileri gelişim aşamalarına sahip bazı anterler kültüre alınmış ve dolayısıyla daha genç anterler için toksik olabilecek bazı fenolik bileşikleri bu anterler ortama salgılamış olabilirler. Üç yıl boyunca sürdürülen çalışmada, A. coronaria için kurulan tüm anter kültürü denemelerinin polen embriyogenesisi performansları ve bu denemelerde oluşan globular şekilli embriyo ve embriyo benzeri yapıların oluştukları ortamların oksin : sitokinin oranları toplu halde Çizelge 4.20.’de verilmiştir. Bu tablonun değerlendirmesine geçmeden; daha önce belirtildiği gibi III. yıl denemeleri, II. yıl başarılı bulunan denemelerin geliştirilmesi doğrultusunda gerçekleştirilmiştir. Bu durumda III. yıla ait başta polen embriyogenesisi olmak üzere, organogenesis veya kallus oluşum bulgularının, en azından II. yıl bulgularına yakın değerler vermesi beklenmiştir. Ancak ne tekrarlanan uygulamalarda, ne de yeni GN doz uygulamalarında, uygulamaların çoğundan globular embriyo ve kallus oluşumu, bir kısmından da organogenesis elde edilmiş olmasına rağmen, özellikle ne embriyo kalitesi, ne de başarı oranı yönünden II. yıl değerleri yakalanamamıştır. Bu sonuçlar üzerinde saf suyun etkisi olduğu düşünülmektedir. II. ve III. yıl çalışmalarındaki kültür ortam ve şartları arasında kıyaslama yapıldığında; farkın, iki ayrı yılda kullanılan saf suların elde edildiği sistemlerin farklılığı olduğu görülmüştür. Çünkü I. ve II. yıl çalışmalarında kullanılan saf su, çift-destile saf su üreten cihazdan elde edilirken, III. yıl çalışmalarında laboratuvarda yeni kurulan saf su sisteminden gelen de-iyonize saf sular kullanılmıştır. Çizelge 4.20.’ye göre, çalışmada elde edilen en yüksek polen embriyogenesisi başarısı % 12.7 ile II. yıl NN ortamı hormon denemeleri içerisindeki 10:1 oksin:sitokinin (1 mg/l IAA: 0.1 mg BAP) oranına sahip uygulamadan elde edilmiştir. B5 ortamında bu başarı % 9.3 oran ile yine II. yıl hormon denemeleri içerisindeki 5:1 oksin : sitokinin (0.5 mg/l IAA: 0.1 mg BAP) oranına sahip uygulamada gerçekleşmiştir. 131 4. BULGULAR ve TARTIŞMA Esin ARI Çizelge 4.20. A. coronaria var. coccinea için kurulan tüm anter kültürü denemelerinin polen embriyogenesisi performansları (%) ve oluştukları ortamın oksin: sitokinin oranları DENEMELER I. YIL II. YIL III. YIL Hormon Denemeleri 2.5 mg/l B5 ORTAMINDA % 9.3 (5:1) - 5 mg/l - 10 mg/l - % 3.3 (5:1) - 15 mg/l - - % 0.1 % 0.5 % 1 800 mg/l LG - % 0.0 % 0.7 (20:1) AK (%1) Karışım + GN (5 mg/l) Denemesi + LG (800 mg/l) - % 0.0 GN Denemeleri AK Denemeleri Amino Asit Denemesi 5 mg/l % 0.0 10 mg/l % 0.0 % 0.7 (5:1 ve 20:1) - 15 mg/l - - % 0.1 % 0.5 % 1 800 mg/l LG % 0.0 % 0.0 - % 0.0 % 0.0 - % 0.0 - 2.5 mg/l AK Denemeleri Amino Asit Denemesi - % 2.3 (10:1) % 1.0 (20:1) % 0.3 (5:1, 10:1, 20:1) % 0.8 (10:1 ve 20:1) % 1.0 (10:1) - Hormon Denemeleri GN Denemeleri NN ORTAMINDA % 12.7 (10:1) - % 0.8 (5:1 ve 10:1) % 1.3 (10:1) % 1.5 (20:1) % 2.3 (10:1) % 1.5 (10:1) - AK (%1) Karışım + GN (5 mg/l) Denemesi + LG (800 mg/l) 132 4. BULGULAR ve TARTIŞMA Esin ARI GN denemeleri içerisindeki en başarılı uygulamaya gelince; % 3.3 ile II. yıl gerçekleştirilen B5 ortamı 5 mg/ GN denemeleri içerisindeki 5:1 oksin:sitokinin (0.1 mg/l IAA: 0.1 mg BAP) oranına sahip uygulama en yüksek performansı göstermiştir. NN ortamında ise % 1 ile 2.5 mg/l GN denemeleri içerisindeki 20:1 oksin : sitokinin (2 mg/l IAA: 0.1 mg BAP) oranına sahip uygulama ile 15 mg/l GN denemeleri içerisindeki 10:1 oksin : sitokinin (1 mg/l IAA: 0.1 mg BAP) oranına sahip uygulama en yüksek polen embriyogenesisi oranını vermiştir. Yukarıda belirtildiği gibi III. yıl verilerinin aslında II. yıl verilerinden daha yüksek gerçekleşmesi beklenirken, de-iyonize saf sudan kaynaklandığı düşünülen III. yılın düşük polen embriyogenesis oranları Çizelge 4.20.’ye göre, II. yıl verilerine yaklaşamamış olsa da en yüksek polen embriyogenesisi oranlarının, genelde aynı oksin : sitokinin oranlarına sahip uygulamalardan elde edilmesi nedeniyle II. yıl verilerini desteklemektedir. Ayrıca yine çizelgeye göre, çalışmaya III. yıl dahil edilen yeni GN doz uygulamalarından düşük de olsa bazen II. yıl verilerine yaklaşan, bazen de II. yıl verilerini aşan oranlarda embriyogenesis elde edilmiş olması; aslında, III. yıl denemelerinin çift-destile saf su ile kurulması durumunda muhtemelen daha yüksek polen embriyogenesisi verilerinin elde edilebileceğini ortaya koymaktadır. Bu nedenle, bundan sonra yapılacak çalışmalarda de-iyonize saf su yerine kesinlikle çift-destile saf su kullanılması önerilmektedir. Literatürde A. coronaria için ortaya konmuş herhangi başarılı bir androgenesis protokolü olmayıp bu konuda şimdiye kadar sadece 2 anter kültürü çalışmasına rastlanabilmiştir. Bu çalışmaların birincisinde, Sunderland ve Dunwell (1977)’in bildirdiğine göre Sunderland (1977), embriyo değil sadece birkaç bölünmenin gerçekleştiği embriyoid elde edebilmiştir. Sunderland ve Dunwell, anter kültürlerinde karşılaşılan bazı anormal polen gelişimlerini 3 grupta toplamıştır. Sunderland (1977) tarafından tanımlanan 224 A. coronaria hattı, A, B ve C tipi olarak gruplandırılan bu anormal polen gelişimlerinden, B tipi polenlere iyi bir örnektir. Bu tip polenlerde, birinci polen mitozunda polarizasyon bozulabilmekte, böylece iğ iplikçikleri mikrospor duvarına normalde olduğu gibi dikey değil, paralel şekilde gelişebilmektedir. Hücre duvarı ise daha sonra kardeş çekirdeklerden birisi etrafında kıvrılmak yerine sporun uzun ekseni bakımından çekirdeğin pozisyonuna 133 4. BULGULAR ve TARTIŞMA Esin ARI göre eşit veya eşit olmayan şekilde, sporun karşısına doğru gelişmektedir. Tıpkı A polenlerindeki gibi, B tipi polenlerde de embriyogenesis başlangıcında meydana gelen olaylar, bir türden diğerine farklılık göstermektedir. Her 2 hücre veya tek bir hücrenin başlangıç bölünmelerinde rol oynayabildiği B tipi polenlerde, A. coronaria’da her 2 hücre de bu sürece katılmakta ve bölünmeler oldukça düzenli şekilde oluşmaktadır. Bu tespit, bizim çalışmamızda da gözlemlenen vejetatif ve generatif çekirdek kaynaklı embriyojenik bölünmeler ile uyum içerisindedir. Yine aynı araştırıcının bildirdiğine göre, A. coronaria’da, B tipi polenler büyüyebilmekte ve tıpkı tipik bir vejetatif hücre gelişiminde olduğu gibi, 2 hücre sitoplazmik senteze girebilmektedir. Fakat bunların büyümeleri çoğunlukla önlendiği için aktif sitoplazmik sentez oluşmamakta ve hücreler 3-5 çekirdekli sporlar vermek üzere bölünmektedir. Dolayısıyla Sunderland (1977)’ın araştırma bulgusunun sebebi, yine Sunderland ve Dunwell (1977)’in tanımladığı B tip polen olgusu ile açıklanabilir. A. coronaria ile ilgili diğer anter kültürü çalışması ise çalışmanın III. yılında İnternette rastlanan bir literatür özetine dayanmaktadır. Buna göre, Laura ve ark. (2003), A. coronaria kültivarlarından anter kültürü yoluyla embriyo elde etmeyi ve bunları bitki haline dönüştürmeyi başardıklarını bildirmektedir. Çalışmada A. coronaria’ nın Cristina, Monalisa, Tetranemone ve Wicabri kültür çeşitlerine ait anterler, Johansson ve Eriksson (1977)’un daha önce kullandıkları 2 fazlı ortamda kültüre alınmıştır. Ortam olarak NN ile yarı doz MS ortamlarına ilave olarak sadece % 1 AK veya AK ile birlikte 0.1 mg/l IAA kullanılmıştır. 12-14 hafta sonra anterlerin iç dokularından globular şekilli emriyo-benzeri yapılar gelişmiştir. Bu yapılar hızla küçük kökçükler geliştirmiş ve nihayet bitkicik oluşturmak üzere çimlenmiştir. Hatta bu gelişimin, zigotik tohumdan bitki oluşumu ile benzerlik gösterdiği vurgulanmıştır. 100 anter başına en yüksek globular şekilli embriyobenzeri yapı frekansı hormonsuz NN ortamında mavi renkli Christina kültür çeşidinden (11.3) elde edilmiştir. Ayrıca yarı dozdaki MS ortamında da emriyobenzeri yapılara rastlanmıştır. Araştırıcıların bildirdiğine göre bu yapılardan oluşan bitkiciklerin mikrospor orijinli olup olmadıkları ve haploid / dihaploid kromozom sayısına sahip olma durumları üzerine araştırmalar devam etmektedir. 134 4. BULGULAR ve TARTIŞMA Esin ARI A. coronaria’ da anter kültürü ile ilgili neredeyse tek literatür olan Laura ve ark. (2003)’nın çalışması hakkındaki bilgi, İnternetteki bu özetten ibarettir. Kendilerinden daha ayrıntılı bilgi edinmek için bağlantı kurulmaya çalışılmış ancak herhangi bir cevap alınamamıştır. Söz konusu literatüre göre çeşitli A. coronaria çeşitlerine ait anterler, Johansson ve Eriksson (1977)’un daha önce farklı doğal Anemone türleri için kullandıkları 2 fazlı NN ortamında aynı AK dozu ile kültüre alınmıştır. Çalışmamızın III. yılında rastlanılan bu çalışmada, dolayısıyla aslında yeni bir metod geliştirilmemiştir. Daha önce de belirtildiği gibi çalışmanın başlangıcında referans alınabilecek başka bir literatür olmadığı için bizim çalışmamızın temelleri de Johansson ve ark. (1977, 1982, 1983, 1984, 1990)’nın A. coronaria hariç, diğer bazı doğal Anemone türleri üzerine yaptıkları çeşitli anter kültürü çalışmalarına dayanmıştır. Buna göre başlangıçta NN ortamı ve farklı AK dozları kullanılmış olup, Johansson ve Eriksson (1977)’un çalışmasından tek fark olarak, ortamlar 2 fazlı değil, katı halde hazırlanmıştır. Çalışmamızda 2 fazlı ortam başlangıçtan itibaren özellikle kullanılmamıştır. Nedenine gelince, bu çalışmanın ileriye dönük ıslah amaçlı olması nedeniyle pratik kullanılabilirliği olan bir protokol ortaya konulmak istenmiştir. Ana uygulamalar dışında başlangıçta sadece deneme amacıyla az sayıda petride aslında bu yöntem de denenmiş, ancak kontaminasyon nedeniyle kültürlerin tümü kaybedilmiştir. Fazla sayıda petrinin (I. yıl: 800, II. yıl: 1350, III. yıl: 1600 adet) karanlıkta muhafaza edilebilmesi için petrilerin üst üste yerleştirilme zorunluluğu ve bu petrilerde zaman zaman ön gözlemler yapmak gerektiği düşünüldüğünde, hareketin etkisiyle petrilerin kontaminasyona çok açık olması yüzünden pratik ve güvenilir bir yöntem olmayan 2 fazlı ortam yerine katı ortamlar tercih edilmiştir. Laura ve ark. (2003)’nın çalışması ile bizim çalışmamız arasında kıyaslama yapılması gereken diğer önemli bir konu; kullanılan materyalin yetiştiği şartlardır. Bizim çalışmamızda doğal populasyonlar kullanılmışken, söz konusu çalışmayı yürüten araştırıcılar kültür çeşitleri ile çalıştıkları için muhtemelen serada yetişen bitkileri kullanmıştır ki; anter kültürü çalışmalarında kültür çeşitlerinin doğal bitkilere göre üstünlüğü birçok çalışmada ortaya konulmuştur. Örneğin Wenzel ve Foroughi-Wehr (1994) buğdayda, Shtereva ve ark. (1998) domateste, Büyükalaca 135 4. BULGULAR ve TARTIŞMA Esin ARI ve ark. (2004) ise biberde yaptıkları anter kültürü çalışmalarında; serada yetiştirilen bitkilerin, açıkta yetiştirilen bitkilere göre daha yüksek androgenetik performans gösterdiğini kaydetmişlerdir. Öte yandan, söz konusu çalışmada 100 anter başına en yüksek globular şekilli embriyo-benzeri yapı frekansı, hormonsuz NN ortamında mavi renkli Christina kültür çeşidinden 11.3 olarak elde edilmiştir. Bizim çalışmamıza gelince; bu değer NN ortamında (+ 1 mg/l IAA + 0.1 mg/l BAP) 16, B5 ortamında ise (+ 0.5 mg/l IAA + 0.1 mg/l BAP) 10.7 olarak belirlenmiştir. Polen embriyogenesisi yönünden kıyaslama yapılabilecek tek çalışma olan Laura ve ark. (2003)’nın çalışmasına göre bizim çalışmamızda 100 anter başına düşen globular şekilli embriyo sayısının daha fazla gerçekleşmiş olmasına karşılık bu embriyoların hiçbirisi tam bir bitkiye dönüştürülememiştir. Ayrıca uygulamalar sırasında globular embriyo oluşumunun yanısıra hem anterden, hem de flamentten kallus oluşumları ile organogenesisin de meydana gelmiş olması; kullanılan ortamların aslında polen embriyogenesisi açısından etkin olduğunu ancak sadece direkt polen embriyogenesisinin sağlanabilmesi ve embriyoların çimlendirilerek bitkiye dönüştürülebilmesi için kullanılan hormonların optimize edilmesi gerektiğini göstermektedir. Bunun için de öncelikle aynı oksin ve sitokininlerin farklı doz ve oranlarda kombine edilerek test edilmesi gerektiği düşünülmektedir. Sitolojik çalışmalarda rastlanılan çekirdek bölünme düzensizlikleri ile uygun aşamadaki mikrosporları taşıyan doğru anterlerin tespit edilerek bunların kültüre alınmasındaki güçlük, bu çalışmadaki A. coronaria anter kültürü başarısını etkileyen en önemli etkenler olarak tespit edilmiştir. Ayrıca yukarıda bahsedildiği gibi bu çalışmada elde edilen globular embriyoların hiçbirisi bitkiye dönüştürülememiştir. Benzer bir sonuca göre, Karakullukçu (1991)’nun patlıcanda yaptığı anter kültürü çalışmasında da özellikle başlangıçtaki globüler oluşumlardan çoğunun gelişimleri sonradan bloke olmuş, bazıları kök oluşturup sürgün ucu vermemiştir. Bu duruma bizim çalışmamızda da rastlanmıştır. Bu sonuç üzerine, elde edilen globular embriyoların çoğunlukla diğer bazı türlerdeki embriyolar gibi anter içerisinde serbest halde gelişmemiş olmasının etkili olduğu düşünülmektedir. Çünkü oluşan embriyo veya embriyoidlerin başlangıç aşaması olan globular embriyolar, ilk görünmeye 136 4. BULGULAR ve TARTIŞMA Esin ARI başladıklarında teksel yapıda olmalarına rağmen daha sonra globular embriyolarla birlikte bunların çevresindeki kallus hücrelerinin de aynı anda çoğalmaya başlaması sonucu, embriyo veya embriyoidler genellikle kallus içerisine gömülü hale gelmiştir. Bu gözlemlerin tespit edildiği II. yıl çalışmalarında, meydana gelen globular embriyoların sayısının az olması, bir embriyo olgunlaştırma veya embriyo çimlendirme denemesi kurulmasına izin vermemiştir. Bununla birlikte elde edilen globular embriyolar yine de oluştukları ortamın bazal ortamına aktarılarak çimlendirilmeye çalışılmış, ancak sonuç alınamamıştır. Bunun üzerine II. yıl başarı elde edilen ortamlar ve bunların modifiye edilmiş formlarında, bir sonraki yıl daha fazla sayıda anterin kültüre alınarak, elde edilecek embriyolarla embriyo kalitesinin arttırılmasına da yönelik uygulamalar yapılması planlanmıştır. Fakat, etkisi denemeler sonucunda ortaya çıkan de-iyonize saf su kullanımının neden olduğu III. yıldaki yetersiz sonuçlar sebebiyle embriyo kalitesini arttırmaya yönelik denemeler kurulması yine mümkün olmamıştır. Bununla birlikte bundan sonra yapılabilecek çalışmalar için, globular embriyoların görülmeye başlandığı dönemde, embriyoların hemen hormonsuz ortamlara aktarılması da dahil, embriyo kalitesini ve çimlendirme yüzdesini arttırmaya yönelik ABA veya diğer farklı kimyasallar ile kurulacak denemelerin yararlı olacağı düşünülmektedir. Çalışmada, kültüre alınan anterlere uygulanan farklı sürelerdeki soğuklatma muameleleri (+7 0C’de 2, 7, 21 gün) arasında herhangi bir fark bulunmamış ve soğuklatmanın embriyo oluşumu üzerine olumlu katkısı tespit edilmemiştir. Bu çalışmada bu tür bir olumlu etki elde edilemese de Heberle-Bors (1985)’un bildirdiğine göre, soğuk muamelesi; anter yaşlanmasını geciktirmekte (Pelletier ve Henry, 1974; Sunderland ve Roberts, 1979) ve anterlerdeki total serbest amino asitleri arttırmaktadır (Sangwan ve Camefort, 1978). Bu tür değişiklikler muhtemelen anter duvarı içinde mikrospor için bir tür mikroklima ortamı sağlamaktadır. Bajaj (1983) da bu konuda, soğuk uygulamasının dolaylı etkiye sahip olduğunu ve androgenesisdeki artışın; yaşlanmayı geciktirmesinden, düşük sıcaklığın mikrospor canlılığını daha uzun süre korumasından ve mikrosporun aborsiyonunu engelleyerek embriyo oluşturabilecek olan canlı mikrospor sayısını arttırmasından kaynaklandığını belirtmiştir. Ayrıca, diğer birçok araştırmada olduğu gibi 137 4. BULGULAR ve TARTIŞMA Esin ARI Sunderland ve Roberts (1979) ile Rashid ve Reinert (1980)’ın tütünde, Kösali (2000)’nin ise elmada yaptığı anter kültürü çalışmalarında, soğuklatma uygulanmış tomurcuklardan kültüre alınan anterlerde meydana gelen embriyoid ve kallus oluşumunun soğuklatılmamış olanlardan çok daha yüksek olduğu ortaya konmuştur. Soğuklatma uygulamasının bu olumlu sonuçları ile birlikte, termal şokların amacının bitkide stres oluşturmak olduğu ve stresin normal koşulların dışındaki etkilerden oluştuğu kabul edilirse; bitkilere, normal gelişim sıcaklıklarına zıt uygulamaların yapılması muhtemelen asıl şoku sağlayabilir. Soğukta yetişen bitkilere sıcak şoku, sıcakta yetişen bitkilere ise soğuk şoku uygulanması belki gerçekten bir şok etkisi oluşturabilir. A. coronaria’nın Şubat-Mart aylarındaki düşük sıcaklıklarda çiçeklendiği hatırlanacak olursa, anterlere uygulanacak ön muamelenin soğuk uygulaması olması durumunda, aslında belki de mikrosporlarda şok yaratacak bir etki beklememek gerekir. Bu nedenle bundan sonraki çalışmalarda (Brassica örneğindeki gibi) farklı sürelerde yüksek derecelerdeki sıcaklık şoklarının da denenmesi gerektiği düşünülmektedir. AK’un diğer Anemone türlerinde % 32’lere varan oranlarda polen embriyogenesisini teşvik ettiği bildirilmesine rağmen bu çalışmada kullanılan % 0.1, % 0.5 ve % 1’lik AK uygulamalarında kültüre alınan anterlerde hiçbir embriyo, embriyoid veya herhangi bir kallus oluşumu meydana gelmemiştir. Bununla birlikte, AK’suz hormon ve GN uygulamalarından farklı oranlarda embriyo, organogenesis ve kallus oluşumu elde edilirken, AK’un bu uygulamalara dahil edildiği durumlarda embriyo, organogenesis ve kallus oluşumu önlenmiştir. Dolayısıyla AK’un, A. coronaria anter kültürü için bu çalışmada denenen ortam ve hormon konsantrasyonları üzerine olumsuz etkide bulunduğu sonucuna ulaşılmıştır. Bununla birlikte bundan sonraki çalışmalarda, AK’un besin ortamlarında özellikle hormonları, vitaminleri ve demiri adsorbe ettiği hatırlanarak, daha yüksek dozlardaki hormon ve daha yüksek tuz içeriğine sahip ortamların (MS ortamı gibi) kullanılması durumunda ortama eklenmesi tavsiye edilebilir. Anterlerin sadece haploid bitki elde etme amacıyla değil, diploid klonal üretim veya somatik embriyogenesis amacıyla da kullanıldığı bilinmektedir. Bu amaçlarla yapılan çalışmalarda, çoğunlukla flamentler veya mikrosporları geç 138 4. BULGULAR ve TARTIŞMA Esin ARI aşamada olan anter eksplantları kullanılarak; flamentler, tepetum hücreleri, konnektif doku gibi anterlerin diploid karakerli hücrelerinden rejenerasyon oluşturulmaya çalışılmaktadır. Bu konuda Niimi ve ark. (2001), zambak anter kültürü ile anter dokusundan meydana gelen kalluslardan rejenerasyon sağlayarak TBV (tulip breaking virus)’den ari diploid klonal bitkiler üretmiştir. Anter kültürünün somatik embriyogenesis elde etmek amacıyla kullanıldığı çalışmalara gelince; örneğin bu tezin gerçekleştirildiği aynı laboratuvarda GökTangolar (2002)’ın asmada, Abak ve ark. (2005)*’nın havuçta yürüttükleri çalışmalarda, somatik embriyogenesis elde etmek amacıyla kullanılan eksplantlardan bir bölümü de anterler olmuştur. Bizim çalışmamızda ise meydana gelen kallus oluşumları içinden, flamentlerden oluşan oldukça yüksek oranlardaki kalluslar ve bunların bazılarından oluşan sürgün, kök, çiçek taslağı benzeri organojenik yapılar; flament kalluslarının somatik embriyogenesise teşvik edilebilme potansiyelini ortaya koymuştur. Bu tekniğin geliştirilmesi durumunda, rejenerasyon sistemi henüz tam anlamıyla oturtulamamış olan A. coronaria’da doku kültürü ile klonal üretimin mümkün olabileceği düşünülmektedir. Direkt embriyo oluşumunun amaçlandığı bu çalışmada, kallusların; AK denemeleri hariç diğer çeşitli ortamlarda % 50’ye varan oldukça yüksek oranlarda meydana gelmiş olmasında, ortamlarda bulunan hormon konsantrasyonlarından başka anterlere uygulanan soğuklatma uygulaması ile kültür koşullarındaki ışıklanma durumu gibi faktörler de etkide bulunmuş olabilir. Çalışmanın I. yılında farklı sürelerdeki soğuklatma uygulamalarının embriyogenesis üzerine herhangi bir etkisi belirlenmemiş olmakla birlikte daha sonraki uygulamaların tümüne, yine de +7 0C’de 7 gün soğuklatma uygulanmış, ayrıca kültürlerin tümü hem soğuklatma süresince hem de daha sonraki kültür süresi boyunca sürekli karanlık koşullarda inkübe edilmiştir. Bu uygulamaların kallus oluşumunu teşvik ettiği düşünülmektedir. Nitekim karanlık koşulların kallus oluşumunu teşvik ettiği çeşitli çalışmalarla ortaya konmuştur. Bunlardan Jaramillo ve Summers (1991)’ın domateste anter kallusu oluşumu üzerine karanlık-ışık uygulamalarının etkilerini belirlemek üzere yaptıkları çalışmada, 3 farklı çeşidin (Abak ve ark., 2005)*. Kişisel Görüşme (Ç.Ü.Z.F. Bahçe Bitkileri Bölümü, Adana) 139 4. BULGULAR ve TARTIŞMA Esin ARI leptoten safhasındaki anterlerini 2 haftadan 9 haftaya kadar sürelerde karanlık koşullarda, daha sonra da bu uygulamaların her birisinden çıkan anterleri 16/8 sa gündüz/gece fotoperiyoduna aktararak toplam 10 haftanın sonunda kallus oluşturan anter sayısı ve kallus çapları kaydedilmiştir. Çalışmada her 2 değerin de karanlıkta kültüre alınma süresinin artışıyla doğru orantı gösterdiği ve hatta 9. hafta karanlıkta bekletmenin % 400’e ulaşan oranda kallus oluşumunu teşvik ettiği tespit edilmiştir. Todorovic ve ark. (1991)’nın şeftalide yaptıkları anter kültürü çalışmasında ise farklı hormon konsantrasyonlarının etkisi 20 0C’de sürekli karanlık koşullarda incelenmiştir. Çalışmada karanlıkta inkübasyonun kallus oluşumunda önemli başarı sağladığı bildirilmiş ve en yüksek kallus oranı (% 95) karanlıkta kültüre alınan 1 mg/l 2,4-D ve 1 mg/l Zeatin kombinasyonuna sahip ortamdan elde edilmiştir. Yine aynı konuda Mythili ve Thomas (1995)’ın biber anter kültüründe kallus oluşumunu etkileyen faktörler üzerine yaptıkları çalışmalarında, kültürleri sürekli karanlıkta bekletmenin, fotoperiyotta bekletmeye oranla kallus oluşum yüzdesini önemli derecede arttırdığı kaydedilmiştir. Karanlık koşulların olumlu etkisi sadece androgenesis çalışmalarında değil, somatik embriyogenesis çalışmalarında da tespit edilmiştir. Örneğin Gök-Tangolar (2002)’ın yaptığı çalışmada, 41 B Amerikan asma anacı ile Yalova İncisi üzüm çeşidine ait farklı eksplantlar, farklı besin ortamları ve hormonlar ile farklı kültür koşullarında kültüre alınmıştır. Çalışma sonunda en yüksek oranda somatik embriyo oluşumu 0.5 ve 1 mg/l 2,4-D içeren B5 ortamının karanlık kültürlerinde sırasıyla % 30 ve % 28.9 olarak saptanmıştır. Çalışmada, hormon ve GN uygulamaları sırasında polen embriyogenesisi ve kallus oluşumunun yanında çeşitli organ benzeri oluşumlara da rastlanmıştır. Bu oluşumlar adventif sürgünlerin yanı sıra, in vitro çiçek taslağı (Şekil 4.19.) ve adventif kök (Şekil 4.20.) şeklinde meydana gelmiştir. Bu çalışmada elde edilen in vitro çiçek taslağı in vitro çiçeklenmenin başlangıcı olarak kabul edilebilir. In vitro çiçeklenmenin, normal koşullarda bazı tozlanma ve döllenme problemlerine sahip olan bitkilerin bu problemlerini aşmak için başvurulan modern bir doku kültürü yöntemi olduğu bilinmektedir. In vitro çiçeklenme sayesinde bu tür bitkilerde in vitro tozlama ve in vitro dölleme fenomenleri gerçekleştirilebilmektedir. 140 4. BULGULAR ve TARTIŞMA a Esin ARI b c Şekil 4. 19. A. coronaria’da in vitro ve in vivo çiçeklenme başlangıcı. a, b: B5+1 mg/ IAA+0.1 mg BAP ortamında oluşan bir anter kallusundan elde edilen in vitro çiçek taslağı, c: in vivo çiçeklenme (Ben-Hod ve ark., 1988) a b Şekil 4. 20. A. coronaria’da adventif kök yapıları: a) B5 + 5 mg/l GN + 2 mg/ IAA + 0.1 mg BAP ortamında, b) B5 + 2 mg/ IAA + 0.1 mg BAP ortamında oluşan flament kalluslarından elde edilen kök benzeri yapılar Bu olay ile A. coronaria arasında nasıl bir ilişki kurulabileceğine gelince; A. coronaria kesme çiçek olarak, geliştirilmiş varyetelerine rağmen birçok özellik yönünden pekçok kesme çiçeğe göre oldukça hassas bir türdür. Ayrıca, ticari çeşitleri incelendiğinde özellikle renk yönünden fazla varyasyonun yakalanamadığı göze çarpmaktadır. Oysa doğada, A. coronaria’nın varyetelerindeki renk çeşitliliği oldukça sınırlı iken bu türde rastlanmayan farklı renklere diğer Anemone türlerinde rastlamak mümkün olduğu gibi bu türlerde kesme çiçek kalite kriterleri ile ilgili bazı güçlü karakterleri yakalamak da mümkündür. Ancak Maia ve Venard (1976), A. coronaria ile diğer türler arasında yapılan melezlemelerde sterilliklerin ortaya çıktığını bildirmiştir (Şekil 4.21.). İşte tam da bu noktada, in vitro çiçeklenme protokolünün geliştirilmesi durumunda; melezleme uyuşmazlığı gösteren bazı 141 4. BULGULAR ve TARTIŞMA Esin ARI türlerde başarıldığı gibi, A. coronaria’da da in vitro tozlama ve dölleme olaylarının gerçekleştirilebileceği düşünülmektedir. Şekil 4.21. Dört Akdeniz Anemone türünün morfolojik, biyokimyasal, karyotipik karakter ve türler arası hibritlerinin mayotik davranışlarına göre belirlenmiş türler arası melezlenme durumunu gösteren diyagram (Maia ve Venard, 1976) Ayrıca, şu an için marjinal bir yaklaşım olsa da in vitro çiçeklenme sisteminin rutine dönüştürülmesi ile A. coronaria’da haploid bitki elde etmek için farklı bir metod kullanımını geliştirmek mümkün olabilir. Nitekim, Hatipoğlu (1999)’nun bildirdiğine göre Mimulus luteus bitkisinin Torenia fournieri ile in vitro melezlenmesi sonucu haploid Mimulus bitkileri elde edilmiştir. A. coronaria’da doku kültürü ile rejenerasyon sistemi henüz tam anlamıyla oturtulamamıştır. Bu konuda çalışan araştırıcılardan Sutter ve Langhans (1978), Meynet (1993) ve Sutter (1998) bu bitkinin in vitro köklenme problemine sahip olduğunu bildirmişlerdir. Bu araştırıcılardan Meynet (1983), farklı organlarda kallus rejenerasyonu sağladığını, kültürleri ayda 2 kez alt kültüre aldığını ancak köklenmeyi kontrol edemediğini vurgulamıştır. Bu çalışmada çoğunluğu 20:1 oksin:sitokinin oranına sahip uygulamalardan meydana gelen 6 adventif kök veya kök benzeri yapıya rastlanmıştır. Anormal olarak nitelendirilebilecek ‘hairy root development’ adı verilen saçaklı kök yapısına benzeyen bu oluşumların, bu haliyle A. coronaria’daki köklenme probleminin çözümüne doğrudan bir katkısının olması 142 4. BULGULAR ve TARTIŞMA Esin ARI beklenemez. Ancak elde edilen bu tip kök sistemlerinin geliştirilmesi, doku kültüründeki rejenerasyon çalışmalarına yarar sağlayabilir. Bu nedenle, bundan sonra yapılabilecek organogenesis çalışmalarında farklı oranlardaki farklı oksin + sitokininlerle birlikte GN’ın farklı dozları da denenmelidir. George (1996) ile Raina ve Zapata (1997)’nın bildirdiğine göre, birçok çalışma ile (Halparin ve Witherell, 1965; Gamborg, 1970; Grimes ve Hodges, 1990; Mordhorst ve Lörz, 1993) nitrojen kaynağı olarak sadece NH4’un bulunduğu ortamların toksisiteye sebep olduğu ve çok zayıf gelişim sağladığı, ancak NO3’un bulunduğu ortamlara az miktarda eklenmesi durumunda ise büyüme ile rejenerasyon üzerine önemli katkıda bulunduğu ve dolayısıyla ortamdaki NO3 : NH4 oranının büyük önem taşıdığı ispatlanmıştır. Bu nedenle bu çalışmada, II. yıldan itibaren NO3 : NH4 oranları birbirinden oldukça farklı besin ortamları özellikle tercih edilmiştir. Bu amaçla, mM cinsinden NO3 : NH4 oranları yaklaşık 20:1 olan B5 ortamı ile 4:1 olan NN ortamı denemeye alınmıştır. Şekil 4.15 ve Çizelge 4.19. incelendiğinde, bu yaklaşımın organogenesis açısından doğru olduğu kabul edilebilir. Çünkü hem II. yıl (Şekil 4.15) hem de III. yıl (Çizelge 4.19.) olmak üzere her iki yılın en yüksek organogenesis performansları NO3 : NH4 oranı 20:1 olan B5 ortamından elde edilmiştir. Aynı şekilde, kallus oluşturma bakımından özellikle de anter kallusu oluşumu yönünden II. yıl (Şekil 4.13) ve III. yılda (Çizelge 4.19.) da yine B5 ortamının daha başarılı olduğu söylenebilir. Polen embriyogenesisine gelince; II. yıl (Şekil 4.10) en yüksek globular embriyo oluşum değerinin NN ortamında gerçekleşmesine rağmen, genel anlamda B5 ortamı daha yüksek performans sergilemiştir. III. yıl (Şekil 4.16.) meydana gelen embriyo benzeri oluşum oranlarının belirli bir ortamda daha yüksek başarı gösterdiğini söylemek ise güçtür. Dolayısıyla polen embriyogenesisi yönünden, herhangi bir besin ortamına ait NO3 : NH4 oranının farklılık oluşturabileceğine dair bir genelleme yapmak mümkün değildir. Daha önce de belirtildiği gibi A. coronaria’da tomurcuklar içerisindeki anterlerin asenkronik gelişim modu gösterdiği yapılan sitolojik incelemelerde ortaya konmuştur. Bu durumda, her ne kadar uygun safhadaki benzer anterler kültüre alınmaya çalışıldıysa da her anter içerisindeki mikrosporların aynı gelişim aşamasında olduğu garanti edilemez. Dolayısıyla, çalışmada materyal olarak 143 4. BULGULAR ve TARTIŞMA Esin ARI kullanılan tüm anterlerin doğru aşamada kültüre alındığını söylemek güçtür. Türün özelliğinden kaynaklanan bu olumsuzluğun anter kültürü başarısını doğrudan etkilediği kabul edildiğinde, haploid bitki elde etmek amacıyla diğer androgenesis yöntemi olan mikrospor kültürüne yönelmek belki bir şans olabilir. Nitekim, literatüre yansımamış olsa da Hollanda’daki Wageningen Üniversitesi’nde A. coronaria’da mikrospor embriyogenesisi elde edilmiştir (Anonymous, 2003). Bu çalışmanın ayrıntıları bilinmese de, mikrospor kültürü tekniğinde kullanılabilen yoğunluk gradyantı santrifüjleme yöntemi birçok araştırıcı (Nitsch ve Norreel, 1973; Rashid ve Reinert, 1980; Fan ve ark., 1988; Guo ve Pulli, 2000) tarafından uygulanmıştır. Bu tekniğin, aynı gelişim safhasındaki homojen mikrospor populasyonlarını kültüre almaya olanak sağlaması; mikrospor kültürünü, doğal bir A. coronaria var. coccinea tomurcuğundaki yaklaşık 150-180 anter (Arı ve ark., 2003, 2005) için söz konusu olan asenkronize anter gelişiminden kaynaklanan olumsuzluğu bertaraf etmede avantajlı bir duruma getirmektedir. Bu yöntemin, bu türde kullanılabilirliğini destekleyen başka bir nokta; materyal bolluğu olarak ifade edilebilir. Çünkü A. coronaria türündeki bir çiçek tomurcuğunda Horovitz (1991)’e göre 2.000.000 den fazla, Arı ve ark. (2003, 2005)’na göre ise yaklaşık 1.5006.000.000 arasında çiçek tozu taşınmaktadır. Bir anterdeki çiçek tozu miktarı ise 2 ayrı yıl, farklı bölgelerden farklı dönemlerde alınan çiçek tomurcuklarında yapılan çalışmalarda 11.000-33.000 arasında hesaplanmıştır. Ülkemizdeki anter kültürü çalışmaları 80’li yılların başlarından itibaren tahıllar, sebze ve meyvelerde gerçekleştirilmektedir. Süs bitkilerinde ise bugüne kadar herhangi bir çalışma yapılmamıştır. Ülkemizdeki kesme çiçek ıslah açığının kısa sürede kapatılmasına yönelik olarak başlatılan bu ilk biyoteknolojik çalışmada, Manisa lalesinde haploid bitki elde etme amacıyla anter kültürü yöntemi kullanılmış ve % 12.7 gibi oldukça yüksek oranda polen embriyogenesisi elde edilmiştir. Bu tez çalışması, oluşan globular embriyoların tam bir bitkiye dönüştürülememesine rağmen literatürde bu konuda neredeyse yok denecek sayıdaki kaynak nedeniyle konusunda öncü bir çalışma olarak yöntemin geliştirilmesi için bir başlangıç niteliğindedir. Bununla birlikte, direkt embriyo oluşumunu sağlamaya yönelik bundan sonra yapılacak çalışmalarda; çift-destile saf sular ile hazırlanması tavsiye edilen farklı 144 4. BULGULAR ve TARTIŞMA temel besin ortamlarında, IAA Esin ARI ve BAP’ın farklı konsantrasyonlardaki kombinasyonları tek başlarına veya gümüş nitratın farklı dozları ile birlikte denemeye alınmalıdır. Ön muamele olarak ise farklı derece ve sürelerde, soğuk veya sıcak şoku uygulamaları gerçekleştirilmelidir. 145 5. SONUÇ ve ÖNERİLER ESİN ARI 5. SONUÇ VE ÖNERİLER Türkiye’de Manisa lalesi olarak bilinen doğal Anemone coronaria’nın kırmızı çiçekli varyetesi olan Anemone coronaria var. coccinea’da haploid bitki elde etmek amacıyla yapılan anter kültürü çalışmasında elde edilen sonuçlar ve bazı sonuçlara karşılık getirilen öneriler aşağıda maddeler halinde sıralanmıştır: • Morfolojilerine göre 10 gruba ayrılan farklı büyüklükteki tomurcuklar arasından, uygun tomurcuk safhasını tespit etmek için yapılan sitolojik çalışmada; kültüre almak için en uygun safhalar oldukları düşünülen geç tetrat ve tek çekirdekli safhadaki mikrosporları genellikle 2 ve 3 numaralı tomurcukların içerdiği tespit edilmiştir. Bu tomurcuklara ait morfolojik özellikler; ortalama olarak 6x9 mm büyüklükte olmaları, bir geofit olması dolayısıyla eğik duran genç tomurcukların genellikle toprak yüzeyinde yeni gözükmeye başlamış olması ve çiçek sapı ile neredeyse paralele yakın şekilde oldukça dar bir açı oluşturması ile involukrum yaprakların henüz açılmaması nedeniyle tepallerin dışarıdan görünmemesi olarak tanımlanabilir. • Yapılan sitolojik incelemelerde, bir tomurcuk içerisindeki anterlerin asenkronik gelişim modu gösterirken, bir anter içerisindeki mikrosporların homojen olarak geliştikleri tespit edilmiştir. • Literatürde daha önce bildirilen çekirdek bölünmesi düzensizlikleri, bu çalışmada da gözlenmiştir. • Embriyojenik bölünmelerin simetrik, generatif ve vejetatif çekirdek bölünmelerinden kaynaklanabildiği tespit edilmiştir. • Kültüre alınan anterlere uygulanan farklı sürelerdeki soğuklatma muameleleri (+7 0 C’de 2, 7, 21 gün) arasında herhangi bir fark bulunmamış ve soğuklatmanın embriyo oluşumu üzerine olumlu katkısı belirlenememiştir. Bununla birlikte bundan sonraki çalışmalarda, farklı soğuklatma süre ve derecelerinin yanında sıcaklık şoklarının da denenmesinin yararlı olacacağı düşünülmektedir. 146 5. SONUÇ ve ÖNERİLER • ESİN ARI Çalışmada en yüksek polen embriyogenesisi başarısı % 12.7 ile NN ortamı hormon denemeleri içerisindeki 10:1 oksin:sitokinin (1 mg/l IAA: 0.1 mg BAP) oranına sahip uygulamadan elde edilmiştir. B5 ortamında bu başarı % 9.3 oran ile yine hormon denemeleri içerisindeki 5:1 oksin : sitokinin (0.5 mg/l IAA: 0.1 mg BAP) oranına sahip uygulamada gerçekleşmiştir. • GN denemeleri içerisindeki en yüksek polen embriyogenesis performansını, % 3.3 ile B5 ortamı 5 mg/ GN denemeleri içerisindeki 5:1 oksin:sitokinin (0.5 mg/l IAA: 0.1 mg BAP) oranına sahip uygulama göstermiştir. Bunu, % 2.5 oran ile NN ortamındaki yine 5 mg/l GN denemeleri içerisindeki 5:1 oksin : sitokinin (0.5 mg/l IAA: 0.1 mg BAP) oranına sahip uygulama takip etmiştir. • Gümüş nitrat denemeleri ile ilgili vurgulanması gereken önemli bir nokta; hormonsuz kontrol uygulamaları olan B5 + 2.5 mg/l GN, B5 + 5 mg/l GN ve NN + 10 mg/l GN uygulamalarından polen embriyogenesisi elde edilebilmiş olması gümüş nitratın hormon yokluğunda bile uyartıcı etkisini ortaya koyması yönünden önemlidir. • % 0.1, % 0.5 ve % 1’lik aktif karbon uygulamalarında kültüre alınan anterlerin hiçbirisinde embriyo, embriyoid veya herhangi bir kallus oluşumu gerçekleşmemiştir. Bununla birlikte, aktif karbonsuz hormon ve gümüş nitrat uygulamalarından farklı oranlarda globular embriyo, organogenesis ve kallus oluşumu elde edilirken, aktif karbonun bu uygulamalara dahil edildiği durumlarda polen embriyogenesisi, organogenesis ve anterden kallus oluşumu tamamen önlenmiştir. Dolayısıyla aktif karbonun, bu çalışmada kullanılan ortam ve hormon konsantrasyonlarında Anemone coronaria anter kültürü üzerine olumsuz etkide bulunduğu sonucuna ulaşılmıştır. Bununla birlikte bundan sonraki çalışmalar için aktif karbonun, daha yüksek dozlardaki hormon ve MS gibi daha yüksek tuz içeriğine sahip ortamların kullanılması durumunda ortama ilave edilmesi önerilmektedir. • Direkt embriyo oluşumunun amaçlandığı bu çalışmada oldukça yüksek oranlarda kallus oluşumu meydana gelmiştir. Bu kallus oluşumları içinden, flamentlerden oluşan yüksek orandaki kallus ve bunların bazılarından oluşan 147 5. SONUÇ ve ÖNERİLER ESİN ARI sürgün, kök, çiçek taslağı benzeri organojenik yapılar; flament kalluslarının somatik embriyogenesise teşvik edilebilme potansiyelini ortaya koymuştur. Bu tekniğin geliştirilmesi durumunda, rejenerasyon problemi çözülememiş Anemone coronaria’da doku kültürü ile klonal üretim mümkün gözükmektedir. • Çalışmada, hormon ve GN uygulamaları sırasında globular embriyo ve kallus oluşumunun yanında çeşitli organ benzeri oluşumlara da rastlanmıştır. Bunlar adventif sürgünlerin yanı sıra, in vitro çiçek taslağı ve adventif kök şeklinde meydana gelmiştir. Bu oluşumlardan in vitro çiçeklenme protokolünün geliştirilmesinin, Anemone coronaria’da yapılabilecek ıslah çalışmalarına katkı sağlayabileceği düşünülmektedir. Ayrıca, şu an için ütopik görünse de bu sistemin rutine dönüştürülmesi ile Anemone coronaria’da haploid bitki etmek için farklı bir metod kullanımını geliştirmek mümkün olabilir. Yine çalışmada elde edilen anormal sayılabilecek adventif kök sistemlerinin geliştirilmesi ise özellikle in vitro köklendirme problemi nedeniyle doku kültürü ile rejenerasyon sisteminin henüz tam anlamıyla oturtulamadığı Anemone coronaria’da, hem doku kültürü hem de gen transferleri için yapılacak rejenerasyon çalışmalarına katkı sağlayabileceği düşünülmektedir. • Çalışmada elde edilen polen embriyogenesisi, organogenesis ve kallus oluşumlarının hemen hemen tümünün, uygulamalarda oksinle birlikte belirli oranda sitokinin kullanılmasından kaynaklandığı tespit edilmiştir. • Türün özelliği olduğu düşünülen bölünme düzensizlikleri, uygun aşamadaki mikrosporları taşıyan doğru anterlerin tespit edilerek bunların kültüre alınmasındaki güçlük ve araştırmanın farklı dönemlerinde farklı sistemlerden elde edilen saf suların kullanılmış olması bu çalışmanın başarısını etkileyen en önemli etkenler olarak tespit edilmiştir. • Anemone coronaria için söz konusu olan asenkronik anter gelişiminin, anter kültürü başarısını doğrudan etkilediği kabul edildiğinde, bu olumsuzluğun bertaraf edilmesinde haploid bitki elde etmek amacıyla diğer androgenesis yöntemi olan mikrospor kültürünün avantajlı olabileceği düşünülmekte ve ileride denenmesi önerilmektedir. 148 5. SONUÇ ve ÖNERİLER • ESİN ARI Çalışmada globular embriyo ve anterlerden kallus oluşumu sağlanmasına karşılık, bu yapıların hiç biri tam bir bitkiye dönüştürülememiştir. Bundan sonra yapılacak çalışmalarda, globular embriyolardan başlamak üzere farklı aşamadaki embriyoların, oluştukları ortamdan farklı ortamlara aktarılma denemelerinin yanısıra embriyo kalite ve çimlenmesini arttırmaya yönelik farklı uygulamalar yapılmalıdır. • Literatürde Anemone coronaria’da haploid bitki elde edilmesine yönelik neredeyse yok denecek sayıdaki kaynak nedeniyle öncü olarak kabul edilebilecek bu anter kültürü çalışmasında; elde edilen çok sayıdaki globular embriyo veya anter kalluslarına rağmen, bunların tam bir bitkiye dönüştürülememiş olması, çalışmada kullanılan protokollerin geliştirilmesini gerektirmektedir. Bu nedenle, direkt embriyo oluşumunu sağlamaya yönelik bundan sonra yapılacak çalışmalarda; farklı derece ve sürelerdeki soğuk veya sıcak şoku uygulamalarının yanında, hormon olarak öncelikle IAA ve BAP’ın farklı konsantrasyonlardaki kombinasyonları tek başlarına veya gümüş nitratın farklı dozları ile birlikte denenmelidir. 149 KAYNAKLAR ABAK, K., 1983. Biberde (Capsicum annuum L.) Anter Kültürü Yoluyla Haploid Bitki Elde Etme Üzerinde Araştırma. Ankara Ü. Ziraat F. Yıllığı. Cilt:33: 155-163. ABAK, K., 1986. Biber Islahında Anter Kültüründen Yararlanma. TUBITAK Bitki Islahı Simpozyumu Bildiri Özetleri. 15-17 Ekim, İzmir. Sayfa:64. ABAK, K., SARI, N., PAKSOY, M., YILMAZ, H., AKTAŞ, H., ve TUNALI, C., 1996. Kavunda Işınlanmış Polen Tozlamaları ile Haploid Embriyo Uyartımında Genotip Etkisi, Dihaploid Hatların Oluşturulması, Haploid ve Diploid Bitkilerin Değişik Yöntemlerle Ayrımı. Türk Tarım ve Ormancılık Dergisi, 20: 425-430. ACHAR, P.N. 2002. A Study of Factors Affecting Embryo Yields from Anther Culture of Cabbage. Plant Cell, Tissue and Organ Culture, 69: 183-188. AKKAYA, F. ve ÇAKIROĞLU, N. 2000. Antalya İlinde Soğanlı Kesme Çiçek Yetiştiriciliğinin Mevcut Durumu ve Geliştirme Olanakları Üzerine Araştırma. Derim: 17(2): 54-65. ALPSOY, H.C., 1999. Bazı Patlıcan Genotiplerinde in vitro Androgenesis ve Haploid Bitki Elde Edilmesi Üzerinde Araştırmalar. Uludağ Ü. Fen Bilimleri Enstitüsü (Doktora Tezi), Bursa. 78 Sayfa ANONYMOUS, 1995. Türkiye’de Bitki Biyoteknolojisi Öncelikleri. Türkiye Teknoloji Geliştirme Vakfı Yayını. Temmuz 1995. ANONYMOUS, 1997. Lacto-Propionic-Orcein Staining. Wheat Genetic Resource Center. http://www.k-state.edu/wgrc/Protocols/Cytogenetics/ acetoorcein.html ANONYMOUS, 2003. OUTPUT 4: Developing new approaches for cassava breeding integrating biotechnolgy tools and quantitative genetics principles. http://www.cgiar.org/publications/annual/pub_ar2003.html ANONYMOUS, 2004. Pathways of pollen development. www.le.ac.uk/biology/ research/pollen/poldev.html 150 ANONYMOUS, 2005a. AB Ortak Piyasa Düzenine Uyum Kapsamında Canlı Bitkiler ve Süs Bitkileri Sektör Raporu. TKB, APK Kurulu Başkanlığı, Ankara, 57 s. ANONYMOUS, 2005b. Vizyon Dergisi. Antalya Ticaret ve Sanayi Odası Yayını, 19 (210): 22-25. ARI, E., BUYUKALACA, S., GOK, P., and ETI, S., 2005. Some Cytologic Observations on Pollen Grains of Wild Poppy Anemone Varieties of Turkey. IXth International Symposium on Flower Bulbs (19-22 April 2004). Niigata, Japan. ARI, E., BÜYÜKALACA, S., GÖK, P., ve ETİ, S., 2003. İki Manisa Lalesi Varyetesinde Çiçek Tozu Canlılık ve Çimlenme Oranları ile Üretim Miktarlarının Belirlenmesi. Türkiye IV. Ulusal Bahçe Bitkileri Kongresi (0812 Eylül 2003). Antalya, s: 509-511. ARMITAGE, A.M., 1993. Speciality Cut Flowers. Varsity Press. 375 p. ARTHUR, A.E., 1971. Studies of Variation in Anemone coronaria. 62nd Annual Report of John Innes Institute. P: 47-49. ARTHUR, A.E., 1973. The Programme of Anemone Breeding at the John Innes Institute. 64 th Annual Report of John Innes Institute. P: 12-16. ARTHUR, A.E., and ELLIS, C. S., 1972. Studies of Variation in Anemone coronaria. 63 rd Annual Report of John Innes Institute. P: 50-51. ARTHUR, A.E., and ELLIS, C., 1974. Studies of Variation in Anemone coronaria. 65 th Annual Report of John Innes Institute. P: 43-44. ARTHUR, A.E., and HOSIER, J., 1977. Anemone Breeding. 68 th Annual Report of John Innes Institute. P: 35. ARTHUR, A.E., and HOSIER, J., 1978. Anemone Breeding. 69 th Annual Report of John Innes Institute. P: 39-40. ARTHUR, A.E., and HOSIER, J., 1979. Anemone Breeding. 70 th Annual Report of John Innes Institute. P: 48-49. ARTHUR, A.E., and HOSIER, J., 1980. Anemone Breeding. 71 st Annual Report of John Innes Institute. P: 48-49. 151 ARTHUR, A.E., and PERRY, E., 1975. Anemone Breeding. 66 th Annual Report of John Innes Institute. P: 40-41. ARTHUR, A.E., and PERRY, E., 1976. Anemone Breeding. 67 th Annual Report of John Innes Institute. P: 48. ARZANI, A., and DARVEY, N.L., 2001. The Effect of Colchicine on Triticale Anther –Derived Plants: Microspore Pre-Treatment and Haploid-Plant Tretment Using a Hydroponic Recovery System. Euphytica, 122: 235-241. BAJAJ, Y.P.S., 1983. In vitro Production of Haploids (D.A. EVANS, W.R.SHARP, P.V. AMMIRATO, Y. YAMADA, editors). Handbook of Plant Cell Culture Techniques of Propagation and Breeding, Vol.1, Collier Macmillan Publishers, London, 228-287. BAL, U., 2002. Domateste (Lycopersicon esculentum Mill.) İzole Edilmiş Mikrospor Kültürü, Ovaryum Kültürü ve Solanum sisymriifolium Lam. İle Tozlama Yöntemleri ile Haploid Embriyo Oluşumunun Uyartılması. Doktora Tezi. Trakya Üniversitesi, Fen Bilimleri Enstitüsü, Tekirdağ. 157 Sayfa. BANTE, I., SONKE, T., TANDLER, R.F., VAN DEN BRUEL, A.M.R., and MEYER, E.M., 1990. Anther culture of Lolium perenne and Lolium multiflorum. (R.S. Sangwan, B.S. Sangwan-Norreel, eds.),The impact of Biotechnology in Agriculture. Kluwer Acad. Dordrect. pp.105-127 BARNABAS, B., OBERT, B., and KOVACS, G., 1999. Colchicine, an Efficient Genome-Doubling Agent for Maize (Zea mays L.) Microspores Cultured in Anthero. Plant Cell Reports, 18: 858-862. BEN-HOD, G., KIGEL, J., and STEINITZ, B., 1998. Dormancy and Flowering in Anemone coronaria L. as Affected by Photoperiod and Temperature. Annals of Botany, 61: 623-633. BHOJWANI, S.S., DUNWELL, J.M., and SUNDERLAND, N., 1973. NucleicAcid and Protein Contents of Embryogenic Tobacco Pollen. Journal of Experimental Botany, 24 (82): 863-871. BHOJWANI, S.S., and RAZDAN, M.K., 1996. Haploid Production. Studies in Plant Science,5. Plant Tissue Culture: Theory and Practice, A Revised Edition. Elsevier. 152 BISHNOI, U.S., JAIN, R.K., GUPTA, K.R., CHOWDHURY, V.K., and CHOWDHURY, J.B., 2000. High Frequency Androgenesis in Indica x Basmati Rice Hybrids Using Liquid Culture Media. Plant cell, Tissue and Organ Culture, 61: 153-159. BOUVIER, L., FILLON, F.R., and LESPINASSE, Y., 1994. Oryzalin as an Effiecient Agent for Chromosome Doubling of Haploid Apple Shoots in vitro. Plant Breeding, 113: 343-346. BRYAN, J.E. 1989. Bulbs. Vol:I (A-H).Timber Press, p:80. BÜYÜKALACA, S., ÇÖMLEKÇİOĞLU, N., ABAK, K., EKBİÇ, E., and KILIÇ, N., 2004. Effect of Silver Nitrate and Donor Plant Growting Conditions on Production of Pepper (Capsicum annuum L.) Haploid Embryos via Anther Culture. Europ. J. Hort. Sci., 69 (5): 206-209. CASTILLO, A.M., VALLES, M.P., and CISTUE, L., 2000. Comparison of Anther and Isolated Microspore Cultures in Barley: Effect of Culture Density and Regeneration Medium. Euphytica, 113: 1-8. CHARMET, G., and BERNARD, S., 1984. Diallel Analysis of Androgenetic Plant Production in Hexaploid Triticale (X. Triticosecale, Wittmack). Theor. Appl. Genet., 69: 55-61. CHEN, Z.Z., SYNDER, S., FAN, Z.G. and LOH, W.H., 1994. Efficient Production of Doubled Haploid Plants through Chromosome Doubling of Isolated Microspores in Brassica napus. Plant Brreeding. 113: 217-221. CHEN, Y., KENASCHUK, E., and DRIBNENKI, P., 1998a. High Frequency of Plant Regeneration from Anther Culture in Flax, Linum usitatissimum L. Plant Breeding. 117: 463-467. CHEN, Y., KENASCHUK, E., and PROCUNIER, J.D., 1998b. Plant Regeneration from Anther Culture in Canadian cultivars of Flax (Linum usitatissimum L.). Euphytica, 102: 183-189. CHO, M.S., and ZAPATA, F.J., 1988. Callus Formation and Plant Regeneration in Isolated Pollen Culture of Rice (Oryza sativa L. cv. Taipei 309). Plant Science, 58: 239-244. 153 CHU, C.C., WANG, C.C., SUN, C.S., HSU, C., YIN, K.C., CHU, C.Y., and BI, F.Y., 1975. Establishment of an Efficient Medium for Anther Cultures of Rice through Comparative Experiments on the Nitrogen Sources. Sci. Ein., 16: 659-668. CHU, C.C., and HILL, R.D., 1988. An Improved Anther Culture Method for Obtaining Higher Frequency of Pollen Embryoids in Titicum aestivum L. Plant Science, 55: 175-181. CHUANG, C.C., OUYANG, J.W., CHIA, H., CHOU, S.M., and CHING, C.K., 1978. A Set of Potato Media for Wheat Anther Culture. Proceedings of symposium on Plant Tissue Culture, Beijing, pp 51-56. CHUPEAU, Y., CABOCHE, M. and HENRY, Y. , 1998. Androgenesis and Haploid Plants.-Springer, Berlin 1998. CISTUE, L., RAMOS, A., CASTILLO, A.M., and ROMAGOSA, I., 1994. Production of Large Number of Doubled Haploid Plants from Barley Anthers Pretreated with High Concentrations of Mannitol. Plant Cell Reports, 13: 709-712. ÇAKIROĞLU, N., DEMİR, Ş., ve ÖZÇELİK, A., 1999. Batı Akdeniz Bölgesi Doğal Bitki Örtüsündeki A. coronaria L. Varyeteleri. III.Ulusal Bahçe Bitkileri Kongresi (14-17 Eylül 1999), Ankara, s:182-185. ÇÖMLEKÇİOĞLU, N., 2001. Güneydoğu Anadolu Biber Populasyonlarının Dihaploidizasyon Yöntemiyle Islahı ve Geleneksel Yöntemlerle Karşılaştırılması. Çukurova Ü. Fen Bilimleri Enstitüsü (Doktora tezi),349 syf. ÇÖMLEKÇİOĞLU, N., BÜYÜKALACA, S., and N., ABAK, 2001. Effect of Silver Nitrate on Haploid Embryo Induction by Anther Culture in Pepper (Capsicum annuum). XIth EUCARPIA Meeting on Genetics and Breeding of Capsicum and Eggplant. 9-13 April 2001, Antalya. P: 133-136 DAFNI, A., BERNHARDT, P., SHMIDA, A., IVRI. Y., GREENBAUM, S., O’TOOLE, C. and LOSITO,L. 1990. Red Bowl-Shaped Flowers: Convergence For Beetle Pollination In The Mediterranean Region. Israel Journal of Botany. Vol:39: 81-92. 154 DARLINGTON, C.D., and LA COUR, L.F., Chromosomen Untersuchungten. Frankische 1963. Methoden Verlagshandlung. der W. Kellerund Ca. Stutgard. DAVIS, P.H. 1965. Anemone. Flora of Turkey. Edinburg Univ. Press, p:134- 138 DE BUYSER, J., and HENRY, Y., 1980. Induction of Haploid and Diploid Plants through in vitro Anther Culture of Haploid Wheat. Theor. Appl. Genet., 57: 57-58. DIAS, J.S. and MARTINS, M.G., 1999. Effect of siver nitrate on anther culture embryo production of different Brassica oleracea morphotypes. Scientia Hort. 82 (299-307). DOLCET-SANJUAN, R., CLAVERIA, E., and HUERTA, A., 1997. Androgenesis in Capsicum annuum L.- Effect of Carcohydrate and Carbon Dioxide Enrichment. J. Amer. Soc. Hort. Sci., 122 (4): 468-475. EADY, C., LINDSEY, K., and TWELL, D., 1995. The Significance of Microspor Division and Division Symmetry for Vegetatif Cell-Specific Transcription and Generatif Cell Differentation. The Plant Cell. Vol: 7: 65-74. ELLİALTIOĞLU, Ş. 2000. Androgenzis Yoluyla Haploid Bitki Rejenerasyonunda Başarıyı Etkileyen Faktörler. Biyoteknoloji(KÜKEM) Dergisi.24(1):11-22. ELLİALTIOĞLU, Ş. ve TIPIRDAMAZ, R. 2000. Patlıcan Anter Kültüründe İçsel Absizik Asit Miktarını Azaltıcı Uygulamaların Androgenetik Embriyo Oluşumuna Etkisi. Biyoteknoloji(KÜKEM) Dergisi.24(1):23-32 ELLİALTIOĞLU, Ş., SARI, N. ve ABAK, K. 2001. Haploid Bitki Üretimi (M. BABAOĞLU, E. GÜREL, S. ÖZCAN, editörler), Bitki Biyoteknolojisi-I Doku Kültürü ve Uygulamaları. S.Ü.Vakfı Yayınları, Konya,syf:137-189. EMİROĞLU, Ü., 1982. Haploidi ve Bitki Islahındaki Önemi. Ege Ü.Z.F. Yayınları, Yardımcı Ders Kitabı. Yayın No: 450. Bornova, İzmir.38 Sayfa. ER, C., 1992. Bitki Islahında Doku Kültürleri. Tarım ve Köyişleri Bakanlığı Yayını, Ankara. 83 syf. ETİ, S., 1987. Über das Pollenschlauchwachstum und die Entwicklung der Samenanlagen in Beziehung zum Frauchtansatz und zur Fruchtqualitaet 155 bei der Mandarinensorte “Clemantine” (Citrus reticulata Blanco). Dissertation Univ. Hohenheim. 127 s. FAN, Z., ARMSTRONG, K.C., and KELLER, W.A., 1988. Development of Microspores in vivo and in vitro in Brassica napus. Protoplasma,147:191-199 FERRIE, A.M.R. and KELLER, W.A., 1997. Production of Haploids in Brassica spp. via Microspor Culture. Plant Tissue Culture Manuel, E6: 117. Kluwer Academic Publishers, The Netherlands. GAMBORG, O.L., MILLER, R.A. and ORJIMA, K. 1968. Nutrient Requirement of Suspension Cultures of Soybean Root Cells. Experimental Cell Research, 50: 150-158. GEORGE, E. 1993. Plant Propagation by Tissue Culture. Part 1: The Technology. 2. Edition. Exegetics Limited. GEORGE, E. 1996. Plant Propagation by Tissue Culture. Part 2: In Practice. 2. Edition. Exegetics Limited. GÖK-TANGOLAR, S., 2002. Asmalarda Somatik Embriyogenesis ve Organogenesis Yoluyla Bitki Elde Edilmesi. Çukurova Ü. Fen Bilimleri Enstitüsü (Doktora tezi),166 syf. GUO, Y.-D., SEWON, P., and PULLI, S., 1999. Improved Embriyogenesis from Anther Culture and Plant Regeneration in Timothy. Plant Cell, Tissue and Organ Culture, 57: 85-93. GUO, Y.-D., and PULLI, S., 2000. Isolated Microspore Culture and Plant Regeneration in Rye (Secale cereale L.). Plant Cell Reports, 19: 875-880. GÜRSAN, K. 2002. Türkiye Süs Bitkileri Sektörünün (Kesme Çiçekler, Dış Mekan Süsü Bitkileri ve İç Mekan-saksılı Salon-Süs Bitkileri) Genel Durumu. II. Ulusal Süs Bitkileri Kongresi, Antalya, s:1-11. HAN, D.S., NIIMI, Y. and NAKANO, M., 2003. Production of In vitro Haploid and Doubled Haploid Plants in Lilium Species. Recent Res. Devel. Plant Sci. 1: 21-30. ISBN: 81-271-0047-1. HANSEN , N.J.P., and ANDERSEN, S.B., 1998. Efficient production of Doubled Haploid Wheat Plants by in vitro Treatment of Microspores with Trifluralin or APM. Plant Breeding, 117: 401-405. 156 HATİPOĞLU, R., 1999. Bitki Biyoteknolojisi. Ç.Ü.Z.F. Genel Yayın No:190, Ders Kitapları Yayın No: A-58, Adana. 178 Sayfa. HEBERLE-BORS, E., 1985. In vitro Haploid Formation From Pollen: A Critical Review. Theoretical and Applied Genetics. 71: 361-374. HEIDSTRA, R., YANG, W.C., YALCIN, Y., PECK, S., EMONS, A., KAMMEN, A. and BISSELING, T., 1997. Ethylene provides positional information on cortical cell division but is not involved in Nod factorinduced root hair tip growth in Rhizobium-legume interaction. Development (127): 1781-1787. HERRERA, J.C.,MORENO, L.G., ACUNA, J.R., DE PENA, M., and OSORIO, D., 2002. Colchicine-Induced Microspore Embryogenesis in Coffee. Plant Cell, Tissue and Organ Culture, 71: 89-92. HOLME, I.B., OLESEN, A., HANSEN, N.J.P., and ANDERSEN, S.B., 1999. Anther and Microspore Culture Response of Wheat Lines from Northwestern and Eastern Europe. Plant Breeding, 118: 111-117. HOBBS, J. and HATCH, T., 1994. Best Bulbs for Temperate Climates.Timber Press. HOOT, S.B., 1991. Phlogeny of the Ranunculaceae Based on Epidermal Microcharacters and Macromorphology. Systematic Botany. Vol: 16(4):741-755. HORNER, M, and STREET, E., 1978. Pollen Dimorphism-origin and significance in pollen plant formation by anther culture. Annual Botany, 42: 763-777. HOROVITZ, A., 1976. Edaphic Factors and Flower Colour Distribution in the Anemone (Ranunculaceae). Plant. Syst. Vol:126: 239-242. HOROVITZ, A., 1977. Variable traits in wild Anemone coronaria L. in Israel and their potential valus to floriculture. Israel Journal of Botany. Vol:26:43 (Abstract of the paper presented at ‘The Meeting of The Botanical Society of Israel’in Tel Aviv in December 16-17, 1976). 157 HOROVITZ, A., 1985. Anemone coronaria and Related Species.”Handbook of Flowering” Vol:I. Editor:A.H. Halevy. CRC Press, Buca Raton, Florida, p:455-465. HOROVITZ, A., 1991. The Pollination Syndrome of Anemone coronaria L.:An Insect-Biased Mutualism. Acta Horticulturae 288:283-287. HOROVITZ, A., 1995. The Local Gene Pool of Anemone coronaria. Acta Horticulturae 420:144-146. HOROVITZ, A., BULLOWA, S. and NEGRI, M. 1975a. Germination Characters in Wild and Cultivated Anemone coronaria. Euphytica,24: 213-220. HOROVITZ, A., GALIL, J. and ZOHARY, D., 1975b. Biological Flora of Israel:6: Anemone coronaria L. Israel Journal of Botany, Vol:24: 26-41. HU, H., and ZENG, J.Z., 1984. Development of New Varieties via Anther Culture (AMMIRATO, EVANS, SHARP and YAMADA, editors). Handbook of Plant Cell Culture, Crop Species. Vol:3. Mc Millan Publishing Company. P: 65-89. ILIC-GRUBOR, K., ATTREE, S.M., and FOWKE, L.C., 1998. Induction of Microspore-Derived Embryos of Brassica napus L. with Polyethylene Glycol (PEG) as Osmoticum in a low Sucrose Medium. Plant Cell Reports, 17: 329-333. IMMONEN, S., and ANTTILA, H., 1998. Impact of Microspore Developmental Stage on Induction and Plant Regeneration in Rye Anther Culture. Plant Science, 139: 213-222. INGRAM, H.M., POWER, J.B., LOWE, K.C., and DAVEY, M.R., 2000. Microspore –Derived Embriyo Induction from Cultured Anthers of Wheat. Plant Cell, Tissue and Organ Culture, 60: 235-238. JACOB, Y., BARRADE, R., MARQUİER, M.J. and BOTTON, E. 1997. Breeding of Anemone coronaria. Tetraploid Hybrids. Acta Horticulturae 430: 503-508. JARAMILLO, J. and SUMMERS, W.L., 1991. Dark-Light Treatments Influence Induction of Tomato Anther Callus. Hortscience, 26: 915-916. 158 JOHANSSON,L. 1983. Effects of Activated Charcoal in Anther Cultures. Physiol. Plant. 59:397-403. JOHANSSON,L. and ERIKSSON,T. 1977. Induced Embryo Formation in Anther Cultures of Several Anemone Species. Physiol. Plant. 40:172- 174 JOHANSSON,L. and ERIKSSON,T. 1984. Effects of Carbon Dioxide in Anther Cultures. Physiol. Plant. 60: 26-30. JOHANSSON,L., ANDERSSON,B. and ERIKSSON,T. 1982. Improvment of anther culture technique: Activated Charcoal bound in agar medium in combination with liquid medium and elevated CO2 concentration. Physiol. Plant. 54: 24-30. JOHANSSON,L., CALLEBERG,E. and GEDIN, A. 1990. Correlations between Activated Charcoal, Fe-EDTA and Other Organic Media Ingredients in Cultured Anters of Anemone canadensis. Physiol. Plant. 80: 243-249. JONES, S.K. 1986. The Germination of Anemone coronaria ‘St. Piran’Seed and Corms. Acta Horticulturae 177: 675-679. KALTCHUK-SANTOS, E., MARIATH, J.E., MUNDSTOCK, E., HU, C. and BODANESE-ZANETTINI, M.H., 1997. Cytological Analysis of Early Microspor Divisions and Embryo Formation in Cultured Soybean Anthers. Plant Cell, Tissue and Organ Culture. 49: 107-115. KAMENETSKY, R., 2005. Production of Flower Bulbs in Regions with Warm Climates. Proceedings of The Ninth International Symposium on Flower Bulbs. Niigata, Japan, April 19-22, 2004. Acta Horticulturae: 673 (1): 59-66. KARACA, T. ve SEĞMEN, Y., 1970. İzmir Yöresinde Manisa Lalesi (Anemone coronaria L.) İle İlgili Araştırmalar. Ege Üniv. Ziraat Fak. Dergisi: 7(2): 3-23. KARAKULLUKÇU, Ş., 1991. Değişik Patlıcan Genotiplerinde in vitro Androgenesis ve Haploid Bitki Oluşumunu Uyarıcı Bazı Etmenler Üzerinde Araştırmalar. Ankara Ü. Fen Bilimleri Enstitüsü (Doktora Tezi). 136 Sayfa. 159 KELLER, W.A. and ARMSTRONG, K.C., 1976. Embryogenesis and Plant Regeneration in Brassica napus Anther Cultures. Canadian Journal of Botany, 55: 1383-1388. KIM, M., KIM, J., YOON, M., CHOI, D-II., and LEE, K-M., 2004. Origin of Multicellular Pollen and Pollen Embryos in Cultured Anthers of Pepper (Capsicum annuum). Plant Cell, Tissue and Organ Culture, 77: 63-72. KIVIHARJU, E., and PEHU, E., 1998. The Effect of Cold and Heat Pretreatments on Anther Culture Response of Avena sativa and A. sterilis. Plant Cell, Tissue and Organ Culture. 54 (2): 97-104. KONAR, R.N. and NATARAJA, K., 1965a. Experimental studies in Ranunculus sceleratus L. Plantlets from truly suspended cells and cell groups. Phytomorphology, 15: 206-211. KONAR, R.N. and NATARAJA, K., 1965b. Experimental studies in Ranunculus sceleratus L. Development of embryos from the stem epidermis. Phytomorphology, 15: 132-237. KOSTAK, S. ve KÖSE, H., 1998. Ege Bölgesi Doğal Bitki Örtüsünde Bulunan Kır Lalesi (A.coronaria) Yayılışı ve Varyasyonu. I. Ulusal Süs Bitkileri Kongresi (6-9 Ekim 1998), Yalova, 285-291. KOTT, L.S., POLSONI, L., ELLIS, B., and BEVERDORF, W.D., 1988. Autotoxicity in Isolated Microspore Cultures of Brassica napus. Canadian Journal of Botany, 66: 1665-1670. KÖKSAL, N., 1999. Haploid Kavun Bitkilerinde in vitro ve in vivo Yöntemlerle Diploidizasyon. Ç.Ü. Fen Bilimleri Enst. (Yüksek Lisans Tezi), Adana, 116 s. KÖSALİ, N., 2000. Starkspur Golden Delicious Elma Çeşidinde Şeker, Aktif Kömür ve Işığın in vitro Androgenesis Üzerine Etkleri. Ankara Üniv. Fen Bilimleri Enstitüsü (Yüksek Lisans Tezi), Ankara, 43 syf. KYO, M., and HARADA, H., 1985. Studies on Conditions for Cell Division and Embryogenesis in Isolated Pollen Culture of Nicotiana rustica. Plant Physiology, 79: 90-94. LAURA, M., SAFAVERDI, G., DOVERI, S., RUFFONI, B., and ALLAVENA, A., 2003. Embriyo Formation From Anther Cultures of Anemone coronaria 160 Cultivars. Proceedings of the XLVII Italian Society of Agricultural Genetics – SIGA Annual Congress, Verona, Italy – 24-27 September, 2003. Poster Abstract: 3.07. MAHESWARI, S.C., RASHID, A. ve TYAGI, A.K.,1982. Haploids from Pollen Grains-Retrospect and Prospect. American Journal of Botany. 69 (5):865-879. MAHESWARI, S.C., TYAGI, A.K., and MALHOTRA, K., 1980. Induction of Haploidy from Pollen Grains in Angiosperms – The Current Status. Theoretical and Applied Genetics. 58: 193-206. MAIA, N. and VENARD, P., 1976. A Contribution to the Cytotaxonomic Study of Mediterranean Species of Anemone and Their Hybrids. Canadian Journal of Genetics and Cytology. 18(1):151-168. MALIK, M.R., RANGASWAMY, N.S., and SHIVANNA, K.R., 2001. Induction of Microspor Embryos in a CMS Line of Brassica juncea and Formation of the Androgenic Plantlets. Euphytica, 120: 195-203. MASCARENHAS, J.P., 1989. The Male Gametophyte of Flowering Plants. The Plant Cell, Vol:1: 657-664. MASCARENHAS, J.P., 1990. Gene activity during pollen development. Annu. Rev. Plant Physiol. Plant. Mol. Biol., 41: 317–338. MENSUALI-SODI, A., PANIZZA, M., SERRA, G. and TAGNONI, F. 1993. Involvement of Activated Charcoal in the Modulation of Abiotic and Biotic Ethylene Levels in Tissue Cultures. Scientia Horticulturae, 54: 49-57. MEYNET, J., 1993. Anemone The Physiology of Flower Bulbs (A.Hertogh and M. Le Nard, editors). Elsevier. Chapter: 14: 211-218. MITYKO, J., ANDRASFALVY, A., CSILLERY, G. and FARI, M., 1995. Anther culture response in different genotypes and F1 hybrids of pepper (Capsicum annuum L.). Plant Brreding, 114: 78-80. MYTHILI, J.B. and THOMAS, P., 1995. Some factors influencing in vitro establisment and callusing of anthers in capsicum (Capsicum annuum L. var. grossum Sendt.). Indian Journal of Plant Physiology, 38(2): 126-130. 161 MURASHIGE, T. and SKOOG, F., 1962. A Revised Medium for Rapid Growth and Bioassays with Tobaacco Tissue Cultures. Physiol. Plant.15:473- 497. NATARAJA, K.,1971. Morphogenic variations in callus cultures derived from floral buds and anthers of some members of Ranunculaceae. Phhytomorph., 21: 290-296. NATARAJA, K. and KONAR, R.N., 1970. Induction of embryoids in reproductive and vegetative tissues of Ranunculus sceleratus L. in vitro. Acta Bot. Neerl., 19: 707-716. NAU, J., 1993. Ball Culture Guide. The Encylclopedia of Seed Germination, II.Edition. Ball Publishing, Ilinois, USA. NIIMI, Y., HAN, D-S., MAKOTO, F., 2001. Production of Virus-Free Plantlets by Anther Culture of Lilium X‘Enchantment’. Scientia Horticulturae.90:325-334 NITSCH, C., 1981. Production of Isogenic Lines: Basic Technical Aspects of Androgenesis (E. and A. THORPE, editors). Plant Tissue Culture, Methods and Applications in Agriculture. Academic Press. P: 241-252. NITSCH, J.P., 1969. Experimental androgenesis in Nicotiana. Phytomorphology, 19:389-404. NITSCH, J. and NITSCH, C., 1969. Haploid Plants From Pollen Grains. Science,163:85-87. OZIAS-AKINS, P. And VASIL, I.K., 1985. Nutrition of plant tissue culture. In: Cell culture and somatic cell genetics of plants. Vol:2, IK VASIL, ed. Academic Press Inc. ÖZKAN, B., ÇELİKYURT, M.A., KARAGÜZEL, O. and AKKAYA, F. , 1997. Production Structure and Main Marketing Problems of Export Oriented Cut Flower Industry In Turkey. Acta Horticulturae (ISHS Congress, Charlott, NC). PICARD, E., HOUR, L., GREGOIRE, S., PHAN, T.H. and MEUNIER, J.P., 1987. Significant Improvement of Androgenic Haploid and Doubled Haploid Induction from Wheat Plants Treated with a Chemical Hybridization Agent. Theoretical and Applied Genetics. 74: 289-297. 162 PIERIK, R.L.M., 1987. In Vitro Culture of Higher Plants. Martinus Nijhoff Publishers, Dordrecht, The Netherlands, 344 pages. PULIDO, A., BAKOS, F., CASTILLO, A., VALLES, M.P., BARNABAS, B. and OLMEDILLA, A., 2005. Cytological and Ultrastructural Changes Induced in Anther and Isolated-Microspor Cultures in Barley: Fe Deposits in Isolated-Microspore Cultures. Journal of Structural Biology, 149: 170-181. RAGHAVAN, V., 1978. Origin and Development of Pollen Embryoids and Pollen Calluses in Cultured Anther Segments of Hyoscyamus niger (Henbane). Amer. J. of Botany, 65 (9): 984-1002. RAGHAVAN, V., 1984. Protein Synthetic Activity During Normal Pollen Development and During Induced Pollen Embryogenesis in Hyocscyamus niger. Canadian Journal of Botany. Vol:62:2493-2513. RAINA, S.K. and ZAPATA, F.J., 1997. Enhanced Anther Culture Efficiency in Indica Rice (Oryza sativa L.) through Modification of the Culture Media. Plant Breeding, 116: 305-315. RANGA-SWAMY, N.S., 1961. Experimental Studies on female reproductive structures of Citrus microcarpa Bunge. Phytomorp.:11: 109-127 RASHID, A., and REINERT, J., 1980. Selection of Embryogenic Pollen from Cold-Treated Buds of Nicotiana tabacum var. Badischer Burley and Their Development into Embryos in Cultures. Protoplasma, 105: 161-167. RASHID, A. and STREET, H.E., 1973. The development of haploid embryoids from anther culture Atropa belladonna L., Planta,113:263-270 REDDY, V.S., LEELAVATHI, S., and SEN, S.K., 1985. Influence of Genotype and Culture Medium on Microspor Callus Induction and Green Plant Regeneration in Anthers of Oryza sativa L. Physiol. Plant., 63: 309-314. REES, A.R., 1992. Ornamental Bulbs, Corms and Tubers. C.A.B. International. REY, H.Y., SANSBERRO, P.A., COLLAVINO, M.M., DAVINA, J.R., GONZALES, A.M., and MROGINSKI, L.A., 2002. Colchicine, Trifluralin and Oryzalin Promoted Development of Somatic Embryos in Ilex paraguariensis (Aquifoliaceae). Euphytica, 123: 49-56. 163 REYNOLDS, T.L., 1984. An Ultrastructural and Stereological Analysis of Pollen Grains of Hyoscyamus niger During Normal Ontogeny and Induced Embriyogenic Development. American Journal of Botany. 7(4):490-504 REYNOLDS, T.L., 1997. Pollen Embriyogenesis (Review). Plant Molecular Biology. 33: 1-10. RIHOVA, L., and TUPY, J., 1999. Manipulation of Division Symmetry and Developmental Fate in Cultures of Potato Microspores. Plant Cell, Tissue and OrganCulture, 59: 135-145. RODRIGUES, L.R., TERRA, T.F., BERED, F., and BODANESE-ZANETTINI, M..H., 2004. Origin of Embryo-Like Structures in Soybean Anther Culture Investigated Using SSR Marker. Plant Cell, Tissue and Oragn Culture, 77: 287-289. ROY, B.A., 1996. A Plant Pathogen Influences Pollinator Behavior and May Influence Reproduction of Nonhosts. Ecology: 77(8): 2445-2457. RUDOLF, K., BOHANCE, B., and HANSEN, M., 1999. Microspore Culture of White Cabbage, Brassica oleracea var. capitata L.: Genetic Improvement of Non-Responsive Cultivars and Effect of Genome Doubling Agents. Plant Breeding, 118: 237-241. SAJI, K.V., ve SUJATHA, M., 1998. Embriyogenesis and Plant Regeneration in Anther Culture of Sunflower (Helianthus annuus L.). Euphytica, 103: 1-7. SAMANCI, N., KURUM, R., BOYACI, F., ve BİNER, B., 1998. Anter Kültürü Çalışmaları için Elverişli Tomurcuk Safhasının Saptanmasında Kullanılabilecek Boyama Yöntemi. 2. Sebze Tarımı Sempozyumu, 28-30 Eylül 1998, Tokat. 157-162. SARI, N., ABAK, K., PITRAT, M., RODE, J.C., and DUMAS DE VAULX, R., 1994. Induction of Parthenogenetic Haploid Embryos after Pollination by Irradiated Pollen in Watermelon. Hortscience, 29 (10): 1189-1190. SARI, N. ve ABAK, K., 1995. Haploid Karpuzda in vitro Kromozom Katlanması Amacıyla Değişik Doz ve Sürelerde Uygulanan Kolhisinin Etkisi. Tr. J. of Agriculture and Forestry, 20 (1996): 555-559. 164 SEÇMEN, Ö., GEMİCİ, Y., GÖRK, G. ve BEKAT, L., 1995. Tohumlu Bitkiler Sistematiği. Ege Üniv. Fen Fak. Kitaplar Serisi No:116 (Ders Kitabı),İzmir. SHTEREVA, L.A., ZAGORSKA, N.A., DIMITROV, B.D., KRULEVA, M.M., AND OANH, H.K., 1998. Induced Androgenesis in Tomato (Lycopersicon esculentum Mill.). II. Factors Affecting Induction of Androgenesis. Plant Cell Reports. 18: 312-317. SMYKAL, P., 2000. Pollen Embriyogenesis – The Stress Mediated Switch From Gametophytic to Sporophytic Development. Current Status and Future Prospects. Biologia Plantarum, 43 (4): 481-489. STÖSSER, R., KAŞKA, N., ANVARI, S.F., and ETİ, S., 1985. Bahçe Bitkilerinde Döllenme Biyolojisi Uygulamalı Kurs Notları, 18-22 Mart 1985, Adana (Yayınlanmamış). SUMMERS, W.L., JARAMILLO, J., and BAILEY, T., 1992. Microspore Developmental Stage and Anther Length Influence the Induction of Tomato Anther Callus. Hortscience, 27 (7): 838-840. SUNDERLAND, N., 1974. Anther culture as a means of haploid production. (K. J. H. KASHA, editor). Haploids in higher plants. Advances and Potential. Univ. of Guelph, Guelph. pp. 91-122. SUNDERLAND, N., and DUNWELL, J.M., 1977. Anther and Pollen Culture (H.E. STREET editor). Botanical Monographs, Volume:11: Plant Tissue and Cell Culture, Second Edition. Blackwell Scientific Publications, Oxford. P: 223-266. SUNDERLAND, N., and ROBERTS, M., 1979. Cold-Pretreatment of Excised Flower Buds in Float Culture of Tobacco Anthers. Annual Botany 43:405-414 SUNDERLAND, N., and WICKS, F.M., 1971. Embryoid Formation in Pollen Grains of Nicotiana tabacum. J.Exp. Bot., 22:213-226. SUTTER, E. and LANGHANS, R.W., 1978. Tissue Culture Propagation of Anemone coronaria L. Hortscience. Vol:13(3):348 (Abst:74). SUTTER, E., 1998. Re: Micropropagation Anemones. http://www.agro.agri.umn.edu/plant-tc/listserv/1998/log9802/msg00173.html 165 SVENSSON, M., and JOHANSSON, L.B., 1994. Anther culture of Fragaria x ananassa: Environmental Factors and Medium Components Affecting Microspore Divisions and Callus Production. Journal of Horticultural Science, 69 (3): 417-426. TAK, M.A. and WAFAI, B.A., 1996. Somatic Chromosome Structure and Nucleolar Organization In Anemone coronaria L.,Ranunculus asiaticus L. and Eranthis hyemalis Salisb. (Ranunculaceae). Phytomorphology: 4(4):377-385. TANAKA, I., 1997. Differentation of Generative and Vegetative Cells in Angiosperm Pollen. Sexual Plant Reproduction. 10 (1): 1-7. TESTILLANO, P.S., GONZALES-MELENDI, P., AHMADIAN, P., FADON, B., and RISUENO, M.C., 1995. The immunolocalization of nuclear antigens during the pollen developmental program and the induction of pollen embryogenesis. Exp. Cell Res. 221: 41-54, 1995. TODOROVIC, R.R., MISIC, P.D., PETROVIC, D.M., and MIRKOVIC, M.A., 1991. Anther Culture of Peach Cultivars ‘Cresthaven’and ‘Vesna’. Acta Horticulturae, 300: 331-333. TORREGROSSA, L., TORRES-VIALS, M. and BOUQUET, A., 1995. Somatic Embryogenesis from Leaves of Vitis x muscadinia Hybrids. Vitis, 34 (4): 239-240. TOURAEV, A., VICENTE, O., and HEBERLE-BORS, E., 1997. Initiation of Microspor Embryogenesis by Stress. Trends in Plant Science Vol:2 (8): 297302. ÜNAL, M., 1992. Bitki (Angiosperm) Embriyolojisi. Marmara Üniv. Yayın No: 495, Fen-Edebiyat Fak. Yayın No: 11. İstanbul. ISBN: 975-400-040-9. ÜNAL, M., 1984. Embriyological Studies in Anemone coronaria. İstanbul Üniv., Fen Fakültesi Mec. Serisi, B (49): 89-97. VERGNE, P., DELVALLEE, I. and DUMAS, C., 1987. Rapid Assessment of Microspor and Pollen Development Stage in Wheat and Maize Using DAPI and Membrane Permeabilization. Stain Technology, 62: 299-304. 166 WAN, Y., PETELINO, J.F., and WIDHOLM, J.M., 1989. Efficient Production of Doubled Haploid Plants through Colchicine Treatment of Anther –Derived Maize Callus. Theor. Appl. Genet., 77: 889-892. WANG, X., and HU, H., 1984. The Effect of Potato II Medium for Triticale Anther Culture. Plant Sci. Letters, 36: 237-239. WANG, P., and CHEN, Y.R., 1986. A Study on the Application of C17 Medium for Anther Culture. Acta Bot. Sin.: 28-45. WATTS, L., 1980. Flower and Vegetable Plant Breeding. Grower Books, p:197 WENZEL, G., and FOROUGHI-WEHR, B., 1994. Production and Use of Isogenic Lines (I.K. VASIL ve T.A.THORPE, editör). Plant Cell and Tissue Culture. Kluwer Academic Publishers, Dordrecht, Hollanda, P:153-172. WILSON, H.M., MIX, G. and FOROUGHI-WEHR, B., 1978. Early microspore division and subsequent formation of microspore calluses at high frequency in anthers of Hordeum vulgare L., J. Exp. Bot., 29: 227-238. ZAKI, M. and DICKINSON, H., 1990. Structural changes during the first divisions of embryos resulting from anther and free microspore culture in Brassica napus. Protoplasma, 156: 149-162. ZAMANI, I., KOVACS, G., GOULI-VAVDINOUDI, E., ROUPAKIAS, D.G., and BARNABAS, B., 2000. Regeneration of Fertile Doubled Haploid Plants from Colchicine-Supplemented Media in Wheat Anther Culture. Plant Breeding, 119: 461-165. ZAMIR, D., JONES, R.A., and KEDAR, N., 1980. Anther Culture of Male-Sterile Tomato (Lycopersicon esculentum Mill.) Mutants. Plant Science Letters 17: 353-361. ZHANG, C.-J., WANG, H.-L., MA, Y., and KANG, Y.-Q., 1994. Regeneration of Haploid Plants from Isolated Microspores of Asparagus (Asparagus officinalis L.). Plant Cell Reports, 13: 637-640. ZHAO, J-P., SIMMONDS, D.H., and NEWCOMB, W., 1996. Induction of Embryogenesis with Colchicine Instead of Heat in Microspores of Brassica napus L. cv. Topas. Planta, 198: 433-439. 167 ZHENG, M.Y., LIU, W., WENG, Y., POLLE, E., and KONZAK, C.F., 2001. Culture of Freshly Isolated Wheat (Triticum aestivum L.) Microspores Treated with Inducer Chemicals. Cell Biology and Morphogenesis. 168 ÖZGEÇMİŞ 1968 Yılında Antalya’nın Korkuteli ilçesinde doğdum. 1985 Yılında Adana Kız Lisesi, 1989 yılında ise Ç.Ü. Ziraat Fakültesi, Peyzaj Mimarlığı Bölümü’nden mezun oldum. Aynı yıl Ç.Ü. Fen Bilimleri Enstitüsü, Peyzaj Mimarlığı Anabilim Dalı’nda Yüksek Lisans Programına kaydoldum ve 1991 yılında Eğirdir Belediyesi’nde Peyzaj Mimarı olarak çalışmaya başladım. Bu sırada sürdürdüğüm “Eğirdir Gölü Barla – Eğirdir - Şaraphane Kıyı Şeridinin Alan Kullanım Yönünden Değerlendirilmesi” başlıklı yüksek lisans tez çalışmamı 1993 yılında tamamladım. 1994-1996 yılları arasında Isparta Tarım İl Müdürlüğü’ne bağlı olarak geçici görevle Eğirdir Bahçe Kültürleri Araştırma Enstitüsü’nde çalıştıktan sonra Antalya Narenciye ve Seracılık Araştırma Enstitüsü’ne geçiş yaptım. Tarımsal Araştırmalar Genel Müdürlüğü’nün, Dünya Bankası destekli Tarımsal Araştırmalar Projesi’nden kazandığım burs sayesinde, 1998 - 1999 yılları arasında Clemson Üniversitesi (South Carolina, ABD)’nde doku kültürü ve moleküler biyoloji konularında 2 projede görev aldım. 2004 Yılından itibaren adı, “Batı Akdeniz Tarımsal Araştırma Enstitüsü” olarak değiştirilen aynı kurumun Süs ve Tıbbi Bitkileri Bölümü’nde araştırıcı olarak çalışmaya devam etmekteyim. 169
