Detección de Vibrio cholerae en Muestras Ambientales

Detección de Vibrio cholerae en
Muestras Ambientales
Metodología de Análisis
TM. Lic Fabiola Rojas C.
Enero 2011
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Muestras para análisis
• Matriz Alimento



Pescados y mariscos
Vegetales
Alimentos en general
• Matriz Agua



Mar
Pozo
Aguas servidas
2
2
Metodología
 Microbiología tradicional
Referencias
–
Standard Methods for Examination of Water and Wastewater, 21 Ed. 2005.
–
Bacteriological Analytical Manual Online, BAM Chapter 9 January 2004.
–
Microbiology of food and animal feeding stuffs -- Horizontal method for the
detection of potentially enteropathogenic Vibrio spp. -- Part 1: Detection of Vibrio
parahaemolyticus and Vibrio cholerae
ISO/TS 21872-1:2007
–
NCh 2640 Of 2001:Productos hidrobiológicos- Detección de Vibrio cholerae.
–
Compendium of Methods for the Microbiological Examination of Food, 4 Ed. 2001.
–
Laboratory Methods for the Diagnosis of Vibrio cholerae Centers for Disease
Control and Prevention. V. Examination of Food and Environmental Samples.
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Metodología
 Microbiología tradicional
•
•
•
•
Detección
Aislamiento
Identificación
Confirmación
4
4
Etapas
• Detección
 Enriquecimiento
 Aislamiento en agar selectivo
5
5
Etapas
• Identificación
 Pruebas bioquímicas
 Serología
6
6
Etapas
• Confirmación
Envío al Centro de Referencia
7
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Consideraciones analíticas para
matrices de alimento
•
Aún no se ha desarrollado un buen caldo de enriquecimiento selectivo
para V. cholerae.
•
Debido a su rápido tiempo de generación, cortos períodos de
incubación son efectivos.
•
APA es un buen medio de enriquecimiento para períodos cortos de
incubación, pero en ciertos tipos de muestras la flora competitiva de
V. cholerae puede crecer en exceso por períodos más largos de
incubación.
•
Incubación de 18 a 24 h no es deseable pero se han aplicado para
compatibilizar el análisis de las muestras con el horario de trabajo.
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Consideraciones analíticas para
matrices de alimento
•
Si el producto ha sido sometido a etapas de proceso como: calentamiento,
congelación, deshidratación o bien una baja densidad del microorganismo es
esperada, una incubación prolongada es recomendada para una buena
resucitación de las células dañadas.
•
Se recomienda la incubación de ostras crudas a 42ºC por ser efectiva para
aislar V. cholerae.
•
Algunos autores como Hwang y DePaola encontraron que la incubación del
enriquecimiento por 18 a 21 h en lugar de 6 a 8 h permite una mayor
recuperación de V. cholerae O1 cuando bajos inóculos son usados. Lo
recomendado para ostras crudas es utilizar una proporción 1:100 de
muestra:APA.
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Consideraciones analíticas para
matrices de agua
•
Vibrio cholerae serogrupo O1 y O139 colerágenos están asociados a los
brotes epidémicos. Los serogrupos no O1 y no O139 no producen toxina,
causan una forma leve de gastroenteritis, se asocian a casos esporádicos y
se aislan normalmente de agua de estuarios y en muestras de mariscos y
pescados.
•
El aislamiento e identificación de V. cholerae en agua se basa en su rápido
crecimiento en condiciones alcalinas en presencia de oxigeno. Normalmente
en matrices de agua este microorganismo se encuentra en bajos niveles por
lo que se recomienda utilizar técnicas de concentración.
•
Se ha indicado que , en medio acuático, V. cholerae adopta un estado viable
pero no cultivable, debido sobre todo a las bajas temperaturas.
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Consideraciones analíticas para
matrices de agua
•
La selección del método depende de la naturaleza de la muestra.
•
Muestras de origen marino y estuario que contienen numerosos otros Vibrios
se recomienda diluir y utilizar la técnica del Número Más Probable
incubándose la muestra a 42ºC.
•
Para muestras de agua claras, sin lodo o sedimento y que contienen una baja
densidad de Vibrios se recomienda la técnica de Filtración por Membrana
•
Un método para el aislamiento del Vibrio cholerae O1 a partir de aguas
contaminadas es mediante el uso de una Tórula de Moore en un torrente de
aguas servidas por un periodo de hasta 1 semana, seguido por una etapa de
enriquecimiento y posterior identificación.
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Procedimiento Detección en Alimentos
BAM online
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Procedimiento Detección V. cholerae en aguas residuales:
Tórula de Moore
Esquema confección Tórula de Moore
Argolla de alambre
Base 10 cm
Forma final de gasa
Largo total 36 cm
(doblado 5 veces)
Ancho 24 cm
Cortes de 4 cm
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Técnica aislamiento V. cholerae en matriz agua :
Tórula de Moore y Tórula de Spira
•
Tórula de Moore ( aguas residuales)
Tórula de Spira
(filtrar gran volumen de agua)
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Procedimiento Detección V. cholerae en aguas
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Medio de cultivo de Enriquecimiento y de Aislamiento
MEDIOS DE ENRIQUECIMIENTO
Agua Peptonada Alcalina
•La viabilidad de Vibrio spp. se mantiene intacta a pH alcalino y el uso de agua peptonada
alcalina ha sido recomendado para incrementar la recuperación de Vibrio spp. de materia
fecal y de otras muestras.
•El medio contiene peptona de carne, cloruro de sodio y el pH final es de 8.6 ± 0.2 a 25ºC.
Se incuba 6 a 8 horas y se siembra en los medios de cultivo.
Formulación
Peptona
10 g
NaCl
10 g
Agua destilada
l liter
Ajustar pH de manera de obtener 8.5 ± 0.2 después de de esterilizar.
Dispensar en tubos/frascos tapa rosca
Autoclavar por 10 min a 121ºC
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Medio de cultivo de Enriquecimiento y de Aislamiento
MEDIOS DE CULTIVO DE AISLAMIENTO
Agar TCBS ( Tiosulfato-citrato-bilis-sacarosa-agar)
•Es un medio selectivo para el aislamiento de Vibrio cholerae.
•El medio contiene: peptona de caseína, peptona de carne, extracto de levadura , citrato de
sodio, citrato de fierro, cloruro de sodio, tiosulfato de sodio, sales biliares y sacarosa y está
disponible comercialmente.
•Se prepara según las indicaciones del fabricante. No se debe autoclavar.
•pH 8,6± 0,2 a 25ºC
•Por su doble indicador (azul de timol y azul de brotimotimol) vira al amarillo con pequeñas
variaciones de pH por la acidificación de la sacarosa.
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Medio de cultivo de Enriquecimiento y de Aislamiento
MEDIOS DE CULTIVO DE AISLAMIENTO ADICIONAL
Agar CHROMagar Vibrio
Alcance: detección y aislamiento de V. parahaemolyticus, V. vulnificus, V. cholerae
Apariencia en el agar:
V.parahaemolyticus → malva
V.vulnificus / V.cholerae → verde-azul; azul- turquesa
V.alginolyticus → sin color
Formulación en g/L
Agar
Peptona y extracto de levadura
Sales
Mezcla cromogénica
pH : 9,0 ± 0,2
15,0
8,0
51,4
0,3
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18
Medio de cultivo de Enriquecimiento y de Aislamiento
Agar TCBS
Apariencia de
colonias
Microorganismos
Desarrollo
Planas 2 a 3 mm de diámetro ,
amarillas
Vibrio cholerae
Muy Bueno
Pequeñas, azul-verdoso
Vibrio parahahemolyticus
Muy Bueno
Largas y amarillas
Vibrio alginolyticus
Muy Bueno
Azules
Pseudomonas, Aeromonas y otros
Pobre/ ninguno
Muy pequeñas y translúcidas
Enterobacterias y otros
Pobre/ ninguno
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Confirmación bioquímica
• Batería tradicional
• Kit identificación rápida
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Confirmación bioquímica
Batería tradicional:
 Perfil bioquímico
•
•
•
•
•
•
•
•
Oxidasa
String test
AGS
Tolerancia escala de sal
MIO
TSI
LIA
Indol
 Serología
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Confirmación bioquímica
Oxidasa +
String test +
22
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Confirmación bioquímica
KIA K/K -,- / TSI A/A -,-
Tolerancia sal 1% +, 3% +, 6%-
LIA K/K -,-
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Confirmación bioquímica Kit comercial
API 20 E
Reacción negativa
PRUEBAS NEGATIVAS
Reacción positiva
PRUEBAS POSITIVAS
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Confirmación bioquímica
25
25
Confirmación bioquímica Kit comercial test
suplementarios
26
26
Confirmación bioquímica Kit comercial
IDENTIFICACION PRESUNTIVA
Galería
API 20 E V4.1
Perfil
534612457
Nota
Taxón
significativo
Vibrio
cholerae
Taxón
siguiente
Vibrio
mimicus
% ID
T
99.6
0.98
% ID
T
0.2
0.5
Pruebas en contra
Pruebas en contra
SAC
0%
Nota. Suspender la cepa sospechosa de Vibrio en solución salina al 0,85%
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Caracterización bioquímica
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Ref: BAM online
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Caracterización bioquímica
Número mínimo de características necesarias para identificar cepas V. cholerae
Reacción positiva
Porcentaje
Bacilo Gram-negativo, no esporulado
+
100
Oxidasa
+
100
String test
+
100
KIA
K/A, no gas, no H2S
100
TSI
A/A, no gas, no H2S
100
Glucosa (producción de ácido)
+
100
Glucosa (producción de gas)
-
0
Sacarosa (producción de ácido)
+
100
L-lisina decarboxilasa a
+
100
L-arginina dehidrolasa a
-
0
L-ornitina decarboxilasa a
+
98.9
Desarrollo en caldo triptona al 1% b
+
99.1c /0d
Desarrollo en NaCl 0%
+
100
+
100
+/-
75 e
Desarrollo en NaCl 1%
Voges Proskauer
a
Con NaCl 1%
Sin NaCl
V. cholerae (y V. mimicus)
d V. parahaemolyticus
e La mayoría de V. cholerae O1 biotipo El Tor son positivas a VP, mientras que las cepas del biotipo Clásico son negativas.
a
b
c
Ref: Laboratory Methods for the Diagnosis of Vibrio cholerae Centers for Disease Control and Prevention
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Caracterización bioquímica
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Ref: Laboratory Methods for the Diagnosis of Vibrio cholerae Centers for Disease Control and Prevention
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Confirmación Serológica
Flujograma de Serotipificación para Vibrio cholerae
Cepa con características bioquímicas de Vibrio cholerae
Estría en T1N1
Aglutinación con solución salina 0,85%
Negativa
Positiva
Aglutinación con Polivalente O1
Negativa
Vibrio cholerae no O1
Aglutinación con O139
Negativa
V. cholerae no O1,no O139
Positiva
V. cholerae O139
Cepa rugosa
Positiva
Vibrio cholerae O1
Aglutinación con Inaba
Positiva
V.cholerae O1, Inaba
Aglutinación con Ogawa
Positiva
V. cholerae O1,Ogawa
31
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Confirmación Serológica
Aglutinación antisuero polivalente O1
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Clasificación general
Clasificación
Asociado a Epidemia
No asociado a epidemia
Serogrupos
O1
No –O1
Biotipos
Clásico, El Tor (más frecuente)
No aplicable para cepas No O1
Serotipos
Inaba, Ogawa, Hikojima (raro)
Los 3 serotipos no son aplicable para
cepa No O1
Toxina
Productor toxina de cólera CT (factor
de virulencia)
A veces produce otro tipo de toxina
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Ref: Laboratory Methods for the Diagnosis of Vibrio cholerae Centers for Disease Control and Prevention
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Clasificación general
Características de los serotipos de V. cholerae O1
Serotipo
Principales
Factores O
presentes
Aglutinación
Ogawa
Inaba
Ogawa
A,B
+
-
Inaba
A,C
-
+
Hikojima
A,B,C
+
+
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Ref: Laboratory Methods for the Diagnosis of Vibrio cholerae Centers for Disease Control and Prevention
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DIFERENCIACIÓN ENTRE LOS BIOTIPOS
EL TOR Y CLÁSICO
•El biotipo Clásico es raramente encontrado, los siguientes ensayos
opcionales son para diferenciarlo del biotipo El Tor:
Beta- hemólisis:
El medio más común de diferenciar los biotipos del V. cholerae O1 y
tal vez la más fácil es determinar la capacidad de producir β- hemólisis
sobre placa de agar sangre de cordero.
Las cepas del biotipo El Tor son β- hemolíticas, mientras que el
biotipo Clásico no produce una hemolisina.
Sembrar el cultivo a ensayar en cuña y superficie en placas de agar
sangre de cordero incubar a 18-24 horas a 35 ºC± 2ºC. La β- hemólisis
puede ser determinada por una zona clara alrededor del cultivo.
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DIFERENCIACIÓN ENTRE LOS BIOTIPOS
EL TOR Y CLÁSICO
Sensibilidad a la Polimixina B:
Sembrar profusamente un cultivo sospechoso en una placa
seca de agar T1N1.
Poner un disco de 50 unidades de polimixina B sobre la
superficie.
Las cepas del biotipo Clásico son sensibles (una zona de >12
mm); las cepas del biotipo El Tor son resistentes. Si el cultivo
sospechoso crece sobre agar mCPC, el cual contiene
polimixina B, se considera que se trata del biotipo El Tor.
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http://www.ispch.cl/colera
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Gracias
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