Interior Archives_4(2012)_104pag_BT4

Transcription

ROMANIAN ARCHIVES
OF
MICROBIOLOGY
AND
IMMUNOLOGY
Founded by
PROFESSOR ION CANTACUZINO
VOLUME 71 - Issue 4
October - December 2012
Published quarterly
by
CANTACUZINO INSTITUTE BUCHAREST
TOTAL PUBLISHING HOUSE
ROMANIAN ARCHIVes OF MICROBIOLOGY AND IMMUNOLOGY
ROMANIAN ARCHIVES
OF
MICROBIOLOGY
AND
IMMUNOLOGY
ISSN 1222-3891
Editor-in-Chief: Radu IORDĂCHEL
Deputy Editor: Maria DAMIAN
Editorial Board: Viorel ALEXANDRESCU, Antonios ANTONIADIS, Jean-Marc CAVAILLON,
Ana CĂLUGĂRU, Cornelia CEIANU, Carmen CHIFIRIUC, Nicolae CORCIONIVOSCHI,
Angel GALABOV, Steliana HUHULESCU, Luminiţa Smaranda IANCU, Anca ISRAIL,
Emilia LUPULESCU, Roxana MOLDOVAN, Geza MOLNAR; Marian NEGUŢ, Adrian ONU,
Hervé PELLOUX, Graţiela PÎRCĂLĂBIORU, Dorel Lucian RADU, Alexandru RAFILA,
Aurora SĂLĂGEANU, Constantin SPÂNU, Demetrios SPANDIDOS, Dan STERIU,
Cătălina-Suzana STÎNGU, Galina TSENEVA, Codruţa-Romaniţa USEIN, Hans WOLF,
Imola ZIGONEANU
Editorial Staff: Felicia RAPILAT, Monica TRĂISTARU
TOTAL PUBLISHING HOUSE
INDEXED IN MEDLINE
CNCSIS Category B+
Subscription orders:
Orders can be placed directly with the publisher:
„Cantacuzino“ National Institute of Research-Development for Microbiology and Immunology
C.P. 1-525, splaiul Independentei 103, 050096, Bucureºti, România
Fax: (40.21)306.93.07
e-mail: [email protected]
www.roami.ro
Copyright
158
© 2012 CANTACUZINO INsTITUTe Bucharest
CONTeNTs / sUMAR
161
GeORGe eMIL PALADe CeNTeNARY (1912 - 2012) / CeNTeNAR GeORGe eMIL PALADe (1912 - 2012)
Costin Cernescu
MICROBIOLOGY / MICROBIOLOGIe
165
CONsIDeRATIONs ON THe IsOLATION OF Listeria monocytogenes AND OTHeR Listeria sPP. IN FOOD
PRODUCTs / CONsIDeRAÞII AsUPRA TULPINILOR De Listeria monocytogenes ŞI A ALTOR sPeCII De Listeria
IZOLATe DIN PRODUseLe ALIMeNTARe
Alina Maria Borcan and Dana Magdalena Caplan
175
COMPARATIVe ANALYsIs OF BIOFILM DeVeLOPMeNT AMONG MRsA AND MssA sTRAINs / COReLAÞIe îNTRe
BIOFILMUL PRODUs De MRsA ŞI MssA
sobhan Ghafourian, Reza Mohebi, Mitra Rezaei, Mohammad Raftari, Zamberi sekawi, Hosein Kazemian, Aghdas
Mohseni, sajedeh Karimi, Nourkhoda sadeghifard
IMMUNOLOGY / IMUNOLOGIe
183
CORReLATIONs AMONG DIFFeReNT MARKeRs DeTeRMINeD BY IMMUNOCHeMICAL MeTHODs UseD FOR
THe DIAGNOsIs AND MONITORING OF INTACT IMMUNOGLOBULIN MULTIPLe MYeLOMA CAses / COReLAÞII
ALe UNOR MARKeRI, DeTeRMINAÞI PRIN MeTODe IMUNOCHIMICe, UTILIZAÞI PeNTRU DIAGNOsTICUL ŞI
MONITORIZAReA MIeLOMULUI MULTIPLU CU IMUNOGLOBULINÃ INTACTÃ
Monica Dogaru, Veronica Lazãr, Daniel Coriu
201
DOUBLe TRANsGeNIC MICe – A sUITABLe MODeL FOR sTUDYING OXIDATIVe sTRess IN TYPe 1 DIABeTes
MeLLITUs / ŞOAReCII DUBLU TRANsGeNICI – UN MODeL ADeCVAT De sTUDIU AL sTResULUI OXIDATIV îN
DIABeTUL De TIP 1
Adina Daniela Iancu and Crina stãvaru
221
CAPsAICIN sHORT TeRM ADMINIsTRATION eFFeCT ON DIFFeReNT IMMUNe PARAMeTeRs / eFeCTUL
ADMINIsTRÃRII Pe TeRMeN sCURT A CAPsAICINeI AsUPRA DIFeRIÞILOR PARAMeTRI IMUNI
Adina Daniela Iancu, Ileana Petcu, Beatrice Mihaela Radu, Mihai Radu
255
sUBJeCT INDeX / INDeX sUBIeCTe
257
AUTHOR INDeX / INDeX AUTORI
VOLUMe 71
IssUe 4
OCTOBeR - DeCeMBeR 2012
159
INsTRUCTIONs TO AUTHORs
Aims and Scope
romanian archives of microbiology and immunoloy, an international
journal dedicated to original research work, publishes papers focusing
on various aspects of microbiology and immunology. romanian archives
of microbiology and immunology is indexed in MeDLINe. The frequency
of the Journal is currently four issues per year.
Categories of manuscripts
Full-length articles are full-length descriptions of original research (up to
10 printed pages).
reviews are comprehensive appraisals of research in a field of current
interest. All reviews are subject to the normal review process (up to 12
printed pages).
rapid communications are brief, definitive reports of highly significant
and timely findings in the field (up to 5 printed pages).
Submission of manuscripts
Manuscripts and all attached files (tables and illustrations) should be submitted in electronic form to the editorial Office, e-mail address:
[email protected] or by regular mail (address: Redactia Revistei
Romanian Archives of Microbiology and Immunology, spl. Independentei 103, sector 5, 050096, Bucuresti, Romania) on compact disk, preferrably accompanied by three copies of the manuscript, including tables
and figures, printed on one side of A4 paper format, double-spaced, with
2.5 margins.
The preferred software is Microsoft Word. In order to speed up the
process of review, manuscripts should be prepared very carefully.
Cover letter
each manuscript submitted to the Romanian Archives of Microbiology
and Immunology must be accompanied by a Cover letter including an
explicit statement by the corresponding author that:
• the manuscript represents an original work, has not been previously
published, and has not been submitted simultaneously for publication
elsewhere.
• the manuscript, as submitted, has been reviewed and approved by all
named authors and that all authors concur with the submission and are
responsible for its content.
• the Cover letter should be signed by all the authors of a manuscript.
Editorial review and acceptance
All manuscripts are subject to editorial review by professional peer reviewers (at least two). The acceptance criteria for all manuscripts are
based on quality and originality. The corresponding author of a manuscript is informed within 60 working days after submission that the paper
is accepted for publication in the journal, needs revision or is rejected.
Revised manuscripts should be resubmitted as soon as possible but not
later than 14 days.
Ethical considerations
A paper describing any experimental work with humans should include
a statement that the ethics Committee of the institution in which the work
was done has approved it, and that the subjects gave informed consent
to the work.
experiments with animals should be done in accordance with the legal
requirements of the relevant local or national authority. Procedures
should be such that animals used in experiments do not suffer unnecessarily. Papers should include details of the procedures and anaesthetics
used. The editors will not accept papers where the ethical aspects are, in
their opinion, open to doubt.
Preparation of manuscripts
Manuscripts should be submitted in english. American or British spelling
can be used provided that only one spelling style is consistently used
throughout. Manuscripts must be typewritten on A4 format (210x297
mm), with double spacing, margins of 25 mm, on one side only, consecutively numbered. Times New Roman font, 12-point size, is required.
Text headings
All headings in the text should be set over to the left hand margin, and
text should begin on the next line. Type first level (sectional) headings
all in capitals. second level headings should be typed in small (lower
case) letters but with the first letter of each main word a capital. For third
level headings, only the first letter of the first word should be a capital.
Underline first and second level headings.
FIRsT LeVeL TeXT HeADING
second Level Text Heading
Third level text heading
160
Manuscripts should be divided into the following sections and order:
Title page, Abstract and key words, Introduction, Materials and Methods,
Results, Discussion, Acknowledgements, References, Tables, Figure Legends and Figures.
1. Title page contains: title of the paper not longer than 80-100 characters, including spaces and punctuation; full name of the authors and
their affiliation; the author responsible for correspondence will be
marked by an asterisk, and his full address telephone/fax numbers, and
e-mail address will be indicated.
2. Abstract must not exceed 250 words and should reflect the content
of the study. Following the abstract, a list of 3-10 keywords is essential
for indexing purposes.
3. Introduction containing a description of the problem under investigation and a brief survey of the existing literature on the subject.
4. Materials and Methods provide sufficient detail to allow the work to
be reproduced.
5. Results. Results should be clear and concise.
6. Discussion that enriches but does not repeat section 3 or 5.
7. Acknowledgements (if applicable) containing acknowledgement of
technical help and of financial material support.
8. References should be numbered consecutively in the order in which
they are first mentioned in the text. Identify references in text, tables,
and legends by Arabic numerals in square brackets (e.g. [1], [2-6], etc.).
Please note the following examples:
Journals:
Allain F, Vanpouille C, Carpentier M, Slomianny MC, Durieux S, Spik
G. Interaction with glycosaminoglycans is required for cyclophilin B
to trigger integrin-mediated adhesion of peripheral blood T lymphocytes to extracellular matrix. Proc Natl Acad sci U s A 2002. 99: 27142719.
Books:
Theofilopoulos AN. Immune complexes in autoimmunity. In: Bona CA,
siminovitch KA, Zanetti M, Theofilopoulos AN (eds.) The Molecular
Pathology of Autoimmune Diseases. Harwood Academic Publishers,
switzerland 1993, pp 229-244.
9. Tables with suitable captions at the top and numbered with Arabic
numerals should be collected at the end of the text on separate sheets
(one page per Table). Footnotes to tables should be marked with a)
b) c) etc and *, **, *** should be reserved for p values. each table
must be understood independently of the text. All tables must be cited
in the text.
10. Figures (illustrations) Figures should be submitted on separate pages
at the end of the article (new page for each complete figure). They
should be numbered in the order of their appearance with Arabic numerals. Figures should be submitted as TIFF files at a proper resolution
as follows: Graphs at 800-1200 dpi; Photos at 400-800 DPI; Color
300-400 DPI. Text in figures should be 8-10 point in size. each figure
must have a separate legend. The legends should not appear under
the figures, but be gathered in a separate section (Figure legends).
Color figures can only be printed if the author is prepared to pay the
cost incurred.
11. Figure legends should be supplied at the end of the manuscript, double spaced, with relevant figure numbers, labeling symbol and explanation.
Units of measurement, Symbols and abbreviations
symbols for physical units should be those of the système Internationale
(sI) Units.
Alternative or non-sI units may be used, but these must be defined at
their first occurrence in the text.
Nomenclature of Microorganisms
Binary names, consisting of a generic name and a specific epithet (e.g.,
escherichia coli), must be used for all microorganisms.
Genetic Nomenclature
To facilitate accurate communication, it is important that standard genetic nomenclature be used whenever possible and that deviations or
proposals for new naming systems be endorsed by an appropriate authoritative body.
Proofs and reprints
Ten reprints of each article and one copy of the journal will be supplied
free of charge to the corresponding author.
romanian archives of microbiology and immunology
GeORGe eMIL PALADe CeNTeNARY
(1912 - 2012)
Costin Cernescu*
“stefan s. nicolau” institute of Virology, Bucharest, romania
George Emil Palade was the first Nobel Prize
winner born in Romania. He is considered one of the
founding fathers of cell biology and of the American
Society for Cell Biology (www.ascb.org). He established the ultrastructural framework for understanding
how proteins are secreted and membranes are assembled in eukaryotic cells. His ideas about the dynamic
structure of subcellular structures stimulated many
laboratories which dissected the intracellular pathways of protein transport [1].
In the lecture delivered at Stockholm on 12 December 1974 when he received the Nobel Prize for
Medicine and Physiology, a prize he shared with the
Belgian scientists Albert Claude and Christian de
Duve, Palade stated: “I was coming from a medical
school where I had acquired an interest in microscopical anatomy and physiological chemistry and
great respect for the work of Claude Bernard and
Rudolf Heidenhain” [2].
This school was the School of Medicine of the
University of Bucharest (now “Carol Davila” University of Medicine and Pharmacy) where he entered
in 1930. As a young student, he started working in
the Anatomy laboratory being fascinated by Professor Francisc Iosif Rainer (1874-1944), the founder
of anthropology in Romania and the promoter of
functional anatomy. A poster on the fronton of the
dissection room reminded the students that “The
Anatomy is the science of the living body”. Rainer
was convinced that the teaching of anatomy is not
devoted to learning by heart the cadaver’s components but to instruct the students with the role of
these structures in the living humans. Anatomist by
formation, Rainer was in the same time professor at
Bucharest Belle Arte School and at the Higher Institute of Physical Training. He promoted the fundamental bases of the surgical education of many
illustrious surgeons like Ion (Cuti) Juvara, Constan-
tin Vereanu (Palade’s fellow students), Dan Gerota,
and Panait Sârbu [3].
Rainer inspired the subject of Palade’s PhD thesis on the “Microscopic anatomy of the dolphin
(Dolphins Delphi) nephron”. It was an attempt to understand kidney structure in terms of the functional
adaptation of a mammal to marine life [4].
In Bucharest medical school it was a tradition
that good students carried out laboratory works,
which meant that they joined the laboratory of one
of their professors and participated on a voluntary
basis in whatever research was going on. An institution with a major influence on the young generation
of scientists was Cantacuzino Institute (then The Institute for Experimental Medicine) where Palade was
introduced by Professor Boivin. High school education with the rigorous chemistry curriculum prepared
him well to apply later a combination of microscopy
and biochemical techniques to study fundamental
unanswered questions in cell biology at the time.
André Boivin, a biochemist from Strasbourg, was recruited by Prof. Cantacuzino to teach Biochemistry
at the Bucharest School of Medicine. Unfortunately,
in 1932, he was forced to leave the Faculty after
some disrespectful students manifestations. Palade
with other colleagues organized a farewell reunion
and offered him a traditional Romanian carpet as gift
to recall the agreeable lessons. After many years the
two savants got together at an international meeting
and acknowledged each other’s merits.
Despite the qualities of well-known Romanian
professors of Pathology and Clinical Medicine,
Palade realized that most treatments were based on
the idea of “do no harm” and that the understanding
of the underlying biology at the time was elementary
at best.
He graduated in 1940 and, after a short period
as an assistant in internal medicine, went back to the
Anatomy, “since – as Palade wrote later - the dis-
*corresponding author: Costin Cernescu, e-mail: [email protected]
161
CoSTIN CERNESCU
crepancy between knowledge possessed by, and expected from, the medical practitioners of that time
made me rather uneasy” [5]. He started as a young
unpaid assistant at Anatomy Chair and progressed as
assistant professor of Anatomy from 1941 to 1945.
Later, in 1945, he was named associate professor [6].
After Reiner’s retirement (1944), head of the
Anatomy Department at Bucharest School of Medicine was nominated Professor Grigore T. Popa who
advised Palade to continue his studies in the States
[6]. Grigore T. Popa (1892-1948) was a pioneer of
neuroendocrinology and a co-discoverer of the hypothalamo-hyphophysed portal system. Together
with the Australian neuroanatomist Unna Lucy
Fielding (1888-1969), Gr. T. Popa discovered the
vascular link between the hypothalamus and the pituitary gland. Their published joint findings in London medical journals between 1930 and 1935 are
cited in all endocrinology books.
Prof. Popa was at the beginning of his career
visiting lecturer in neuroanatomy as Rockefeller incentive in Chicago. He made aware Palade that it
was better to get as much interdisciplinary training
early in his career than the instant gratification of
curing people. Palade received a 2-year fellowship
as a visiting investigator at the Rockefeller Institute
for Medical Research (now Rockefeller University)
in New York City [6]. Palade joined Albert Claude’s
electron microscopy research group at the Institute.
Expecting to stay just a year or two, Palade ended
up remaining at Rockefeller for 27 years. In 1953,
he was named an associate member of the Rockefeller Institute, and in 1956 he was promoted to full
professor of cell biology [7].
There are numerous testimonies about Palade’s
gift for teaching, and we must admit that the influence of Romanian professors was evident. Bruce Alberts, one of the six authors of the most comprehensive textbook [8] “Molecular Biology of the
Cell” (now at its 6th edition) confessed: “I was mentored in this role by George Palade (a founder of the
ASCB and in 1976 its president), who graciously
read each of my drafts, thereby sparing everyone else
from my naive speculations” [9].
Günter Blöbel, Palade’s assistant professor and
1999 Nobel Prize winner acknowledged [10]
“Palade took considerable interest in the papers that
were published by his lab. Even when he was not
listed as an author, he meticulously edited and corrected each paper with his immaculate handwriting
at the edge or on the opposite empty page of the
typewritten manuscripts. I treasure the corrections
162
he made on all my manuscripts during that time.
David Sabatini, one of his early graduate students at the Rockefeller, wrote of Palade in 2004
[11], “Palade’s personal attributes make him one of
the most admired and beloved figures in today’s scientific scene. Palade not only has a powerful intellect
that allows him quickly to cut to the essence of a scientific problem and propose for it a feasible solution,
but is also a man of great human qualities - warm
and sensitive, polite and gracious”.
Other testimonies can be found at “The Palade
Symposium: Celebrating Cell Biology at Its Best”
held at the University of California, San Diego in
2010 [12]. Video recordings of lectures have been
posted online at http://georgepalade.ucsd.edu.).
REFERENCES
1. Schekman R.W. Retrospective: George E. Palade
(1912-2008). Science 2008, 322, 695
2. Palade, G. 1975. Intracellular aspects of the process of
protein synthesis. Science. 189:347-358.
3. Juvara I. Așa a fost, Editura Du Style, București, 1996.
4. Kresge N., Simoni RD., Hill R.L. 2005 Classics - A
paper in a series reprinted to celebrate the centenary of
the JBC. J Biol Chem 2005, 280, e19, 2005 (This paper
is available on line at http://www.jbc.org e19).
5. Colectiv Centrul de Cercetări Antropologice: Rainer,
Ed. Fundația Anastasia, 2003.
6. Palade G.E., Nobel Prize Autobiography.
Nobelprize.org [Internet] 1974. Available from:
http://nobelprize.org/nobel_prizes/medicine/laureates/1
974/palade-autobio.html/.
7. Iftimovici R. Istoria universală a medicinei și farmaciei. Ed. Academiei Române, 2008.
8. Alberts B., Johnson A., Lewis J., Raff M., Roberts
K., Walter P. (2007) Molecular Biology of the Cell
(Garland Science, New York), 5th ed.
9. Alberts B. Cell biology: the endless frontier. Mol Biol
Cell 2010, 15, 3785.
10. Blöbel G. Obituary: George Emil Palade (19122008) Nature 2008; 456: 52.
11. Sabatini D. University of California, San Diego 2004.
Program for the dedication of the George Palade Laboratories for Cellular and Molecular Medicine.
12. Schmid SL, Farquhar MG. The Palade symposium:
celebrating cell biology at its best. Mol Biol Cell.
2010, 21, 2367-70. Epub 2010 May 26.
CeNTeNAR GeORGe eMIL PALADe
(1912 - 2012)
Costin Cernescu*
institutul de Virusologie „Ştefan s. nicolau”, Bucureºti, românia
George Emil Palade (1912-2008) este primul
laureat al premiului Nobel născut în România. El
este considerat unul dintre fondatorii Biologiei Celulare și ai Societății Americane de Biologie Celulară. Lucrările sale privind ultrastructura citoplasmei
au contribuit la înțelegerea procesului de secreție a
proteinelor și a transportului proteinelor în exocitoză [1].
În alocuțiunea rostită la Stockholm în 12 decembrie 1974, cu prilejul atribuirii premiului Nobel (premiu împărțit cu savanții belgieni Albert Claude
(1899-1983) și Christian de Duve (n. 1919), Palade
menționa: „Provin dintr-o Facultate unde am deprins
interesul pentru histologie și biochimie și un mare
respect pentru opera lui Claude Bernard și Rudolf
Heidenhain” [2] (Heidenhain a fost un neuropatolog
german, profesor al lui Ivan Pavlov”). În această Facultate, cunoscută azi ca Universitatea de Medicină
și Farmacie „Carol Davila” din București, Palade a
intrat în 1930. Din primul an a fost fascinat de
lecțiile profesorului Francisc Iosif Rainer (18741944), personalitate de prestigiu a învățământului
medical românesc, promotorul anatomiei funcționale
și inițiatorul studiilor de antropologie în România.
Deviza înscrisă de Rainer pe frontispiciul sălilor de
disecție „Anatomia este știința formei vii” amintea
studenților că Anatomia nu este destinată învățării
pe de rost a componentelor corpului uman ci
înțelegerii rolului acestora în organismul viu. Personalitate complexă, Rainer a fost simultan profesor la
Facultatea de Medicină, la Facultatea de Belle Arte
și la Institutul Superior de Educație Fizică. Sub
influența lui Rainer, au debutat în carieră chirurgi
care aveau să devină adevărați șefi de școală: Ion
(Cuti) Juvara, Constantin Vereanu (colegi de an cu
Palade), Dan Gerota și Panait Sârbu [3]. Rainer a inspirat subiectul tezei de doctorat a lui Palade: «Anatomia microscopică a nefronului la delfin (Dolphins
Delphi)». Această lucrare a încercat să explice adap-
tarea funcțională a rinichiului la mediul hiperosmotic
marin [4].
În școala medicală din București, a fost o tradiție
ca studenții cei mai buni să lucreze voluntar în laboratoarele profesorilor din anii preclinici. Un astfel de
Laborator, cu mare influență asupra carierei multor
medici distinși, era Institutul Cantacuzino (atunci
Laboratorul de Medicină Experimentală) unde Palade a fost introdus de profesorul de Chimie Biologică, André Boivin. Boivin, biochimist francez din
Strasbourg, fusese chemat de profesorul Ion Cantacuzino să predea Biochimia la Facultatea de Medicină din București. Din nefericire, în 1932, Boivin a
fost nevoit să părăsească România în urma unei manifestări ostile a unor studenți manipulați de veleitari
la postul său. Acest fapt trist din istoria Facultății a
fost estompat de inițiativa lui Palade și a altor colegi
de an de a organiza o reuniune de adio, prilej cu care
profesorului i s-a dăruit spre amintire un frumos
covor oltenesc. Peste ani, profesorul și studentul,
savanți realizați, aveau să se întâlnească la un congres și să-și rememoreze episodul [3].
În ciuda meritelor unor binecunoscuți profesori
de Clinică și Patologie, Palade a realizat, încă student
fiind, că terapia acelor vremuri era bazată mai mult
pe principiul „primum non nocere”, iar înțelegerea
mecanismelor fiziopatologice era, în cel mai bun
caz, elementară. După stagiul de internat (chiar la
Clinica de Neurologie a profesorului Gheorghe
Marinescu, la Colentina) și după absolvire (în 1940),
Palade a revenit la Catedra de Anatomie a lui Rainer
[5]. Palade avea să scrie în autobiografia lui:
„Discrepanța dintre cunoștințele clinicienilor și rezultatele așteptate de la ei era jenantă” [6]. S-a întors
la cercetare, începând ca asistent voluntar și progresând rapid la poziția de șef de lucrări în 1945. După
pensionarea lui Rainer, în 1944, șeful Departamentului de Anatomie a fost numit profesorul Grigore
T. Popa.
*autor corespondent: Costin Cernescu, e-mail: [email protected]
163
CoSTIN CERNESCU
Profesorul Popa (1892-1948) a fost unul dintre
inițiatorii neuroendocrinologiei pe plan mondial. Impreună cu cercetătoarea australiană Unna Lucy Fielding (1888-1969), Popa a descoperit sistemul port
hipotalamo-hipofizar.
Lucrările lor au fost publicate înainte de război,
în prestigioase reviste englezești, fiind citate în toate
manualele de neuroendocrinologie. Specializat în
Statele Unite, ca bursier Rockefeller la Chicago,
Popa considera că pregătirea interdisciplinară la începutul carierei de cercetător este esențială. În acest
sens, l-a sfătuit pe Palade să aplice pentru o bursă în
străinătate, ceea ce s-a și întâmplat în 1946.
Palade a fost primit în laboratorul de microscopie electronică de la Rockefeller Institute for Medical Research, condus de Albert Claude, unde a rămas
peste 20 ani. În 1953, Palade a fost numit profesor
asociat, iar în 1956, profesor de Biologie Celulară la
această prestigioasă instituție [7]. Grupul de la Rockefeller Institute a avut satisfacția să descopere detalii de ultrastructură celulară dar, mai ales, să
coreleze noile structuri cu funcția lor biologică. Palade avea să spună: „multe din barierele care separau
structurile morfologice de datele de fiziologie sau de
biochimie au fost șterse, permițând cercetătorilor din
domenii distincte să contribuie la fondarea unei noi
științe: Biologia celulară [6]”.
Există numeroase mărturii despre talentul didactic al lui Palade, talent preluat cu siguranță de la
mentorii săi din România.
Bruce Alberts, unul din cei șase autori ai celebrului manual “Molecular Biology of the Cell”
(acum la a șasea ediție) scria în introducere [8]: „Am
fost ghidat ca autor de George Palade, care a citit cu
multă grijă schițele mele, debarasându-le de speculațiile naive” [9].
Günter Blöbel, asistent principal al profesorului
și laureat Nobel în 1999, a scris despre mentorul său
[10]: „Palade manifesta un interes semnificativ pentru articolele publicate în laboratorul său. Chiar când
nu se număra printre autori, corecta cu meticulozitate
fiecare articol, făcând observații cu scrisul său caligrafic pe pagina manuscrisului sau adăugând pagini
noi. Păstrez cu mândrie corecturile făcute pe toate
articolele mele din acel timp”.
David Sabatini, unul dintre cei dintâi doctoranzi
ai lui Palade la Rockefeller, scria despre profesor în
2004 [11]: „Calitățile personale ale lui Palade făceau
din el una dintre cele mai admirate și apreciate figuri
ale lumii științifice. Avea o inteligență sclipitoare,
care îi permitea să sesizeze esența problemelor și să
propună soluții fezabile, dar avea, de asemenea,
164
mari calități umane - cald și sensibil, politicos și îndatoritor”.
Alte opinii despre marele savant pot fi consultate
în materialele reuniunii științifice de la Universitatea
California din San Diego “The Palade Symposium:
Celebrating Cell Biology at Its Best” [12]. Toate
intervențiile din simpozion sunt postate și pot fi citite
în întregime pe situl http://georgepalade.ucsd.edu. O
colecție a imaginilor clasice de microscopie electronică obținute de Palade și colaboratorii săi poate fi
consultată la www.ascb.org/cellbase/the-cell.html
sau, mai amănunțit, pe situl universității Yale.
BIBLIoGRAFIE
1. Schekman R.W. Retrospective: George E. Palade
(1912-2008). Science 2008, 322, 695
2. Palade, G. 1975. Intracellular aspects of the process of
protein synthesis. Science. 189:347-358.
3. Juvara I. Așa a fost, Editura Du Style, București, 1996.
4. Kresge N., Simoni RD., Hill R.L. 2005 Classics - A
paper in a series reprinted to celebrate the centenary of
the JBC. J Biol Chem 2005, 280, e19, 2005 (This paper
is available on line at http://www.jbc.org e19).
5. Colectiv Centrul de Cercetări Antropologice: Rainer,
Ed. Fundația Anastasia, 2003.
6. Palade G.E., Nobel Prize Autobiography.
Nobelprize.org [Internet] 1974. Available from:
http://nobelprize.org/nobel_prizes/medicine/laureates/1
974/palade-autobio.html/.
7. Iftimovici R. Istoria universală a medicinei și farmaciei. Ed. Academiei Române, 2008.
8. Alberts B., Johnson A., Lewis J., Raff M., Roberts
K., Walter P. (2007) Molecular Biology of the Cell
(Garland Science, New York), 5th ed.
9. Alberts B. Cell biology: the endless frontier. Mol Biol
Cell 2010, 15, 3785.
10. Blöbel G. Obituary: George Emil Palade (19122008) Nature 2008; 456: 52.
11. Sabatini D. University of California, San Diego 2004.
Program for the dedication of the George Palade Laboratories for Cellular and Molecular Medicine.
12. Schmid SL, Farquhar MG. The Palade symposium:
celebrating cell biology at its best. Mol Biol Cell.
2010, 21, 2367-70. Epub 2010 May 26.
CONsIDeRATIONs ON THe IsOLATION OF Listeria monocytogenes
AND OTHeR Listeria sPP. IN FOOD PRODUCTs
2cantacuzino
1carol
Alina Maria Borcan1* and Dana Magdalena Caplan2
Davila University of medicine and Pharmacy,Bucharest, romania;
national institute of reseach-Development for microbiology and immunology, Bucharest, romania
ABsTRACT
Listeria monocytogenes, a Gram positive bacillus, is well adapted for survival as a saprophyte in soil
and decaying vegetation, but also able to cause serious infections, due to its ability of intracellular
multiplication and meningeal and placental dissemination.
A total number of 43 Listeria spp. strains isolated from food were investigated. Bacterial identification
was performed according to standard methodology, based on: Gram staining affinity, morphology, culture
aspects on blood agar (examined in oblique light), catalase test, beta/hemolysis (on sheep blood agar),
CAMP test and carbohydrates breakdown, i.e., trehalose, mannitol, mannose, rhamnoze, xylose.
Out of the 43 analyzed strains, the biochemical and serological assay evidenced: 10 strains of L.monocytogenes (8 belonging to serotype 1a and 2 strains to the serotype 4 b), 27 of L. innocua, 2 of L.grayi
and 4 of L.welshimeri.
L. innoqua was the most frequently identified species. L.monocytogenes strains typing confirms that
the serotype 1a is most commonly found in food and serotype 4b was detected in imported foods. This
observation has an epidemiological importance for our country.
Keywords: meat, dairy products, serotypes 1a, 4b, listeriosis.
INTRoDUCTIoN
In nature, Listeria species are frequently encountered in soil, decomposed plant materials, animal feed, water, fresh and frozen meat, raw milk,
household waste, human and animal healthy carriers.
L. monocytogenes was frequently isolated from
mammals, birds, fish, crustaceans and insects. It was
found that the primary habitats of L. monocytogenes
are soil and spoiled vegetables where species survive
and live in saprophytic conditions.
As a ubiquitous saprophyte, L. monocytogenes
becomes frequently a contaminant of vegetal and animal food. Due to its capacity to survive and even
multiply at 4oC, it can be transmitted to man through
contaminated food, preserved in the refrigerator.
L. monocytogenes was found in a wide variety
of foods: raw meat, processed fresh meat, fresh milk
and mainly in long processing and maturation
cheese. Listerias become inactive by pasteurization
or thermal processing. In certain fast food prepara-
tions contamination occurs before packaging, due to
hygiene deficiencies of processing and storage.
L. monocytogenes pathogenicity for humans is
due to virulence features enhancing the primary intestinal aggression, by distance dissemination, to
muscular tissue or central nervous system (CNS)
[1, 2]. The ability of L. monocytogenes to survive
and multiply in phagocytes generates the most
frequent secondary localization at the level of the
uterine muscle.
Uterine muscle infection is chronic, asymptomatic, but L. monocytogenes capacity to cross the
placenta has disastrous consequences on the evolution of pregnancy. Fetal placental or amniotic contamination is usually followed by a severe meningoencephalitis, with very high perinatal mortality.
The very rare remission of these cases is followed
by an abnormal brain development, with very severe
sequelae.
Also, contamination of fetus during birth can be
expected. In this situation a severe meningoen-
*corresponding author: Alina Maria Borcan, e-mail: [email protected]
165
BoRCAN and CAPLAN
13%
raw meat
meat products
54%
33%
dairy products
Fig. 1. Source of isolation for L. monocytogenes studied strains
cephalitis is developed in 2-3 weeks, with a reduced
neonatal mortality (approx. 40%), but followed by
irrecoverable sequelae, with a severe social and family impact.
Due to the seriousness of the uterine location,
listeriosis in women generates through the maternalfetal pathology important public health concerns
[1, 2, 3]. The increasing frequency of cases with systemic evolution (detected serologically) and maternal-fetal accidents imposed the bacteriological
investigation of gastroenteritis, and the mandatory
detection of L. monocytogenes in stool samples,
alongside with other recognized enteric pathogens
such as Salmonella sp. Shigella sp., Escherichia coli
(intestinal pathotypes) [4, 5].
MATERIALS AND METHoDS
Studied strains
The origin of strains is shown in Fig. 1. These
strains were isolated according to conventional
methodology [6, 7] in various laboratories of sanitaryveterinary control from the entire country and sent for
confirmation/typing to the National Reference Center for Zoonotic Infections within Cantacuzino
Table 1. Taxonomic classification of Listeria strains (positive reactions)
SPECIES
TESTS
L. monocytogenes
L. innocua
L. grayi
L.welshimeri
Serotype 1a
serotype 4b
no.
%
no.
%
no.
%
no.
%
no.
%
8
18.60
-
-
-
-
-
-
-
-
Staphylococcus aureus
8
18.60
2
4.65
-
-
-
-
-
-
Rhodococcus equi
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
Mobility
8
18.60
2
4.65
-
-
-
-
-
-
Oxidase test
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
Catalase test
8
18.60
2
4.65
27
62.79
2
4.65
4
9.30
Glucose
8
18.60
2
4.65
27
62.79
2
4.65
4
9.30
Trehalose
4
9.30
1
2.32
4
9.30
-
-
-
-
D-Mannitol
-
-
-
-
-
-
2
4.65
-
-
D-Mannose
8
18.60
2
4.65
27
62.79
-
-
4
9.30
L-Rhamnose
8
18.60
2
4.65
2
4.65
-
-
2
4.65
D-Xylose
-
-
-
-
4
9.30
-
-
-
-
L.monocytogenes 1a
8
18.60
-
-
-
-
-
-
-
-
L.monocytogenes 4b
-
-
2
4.65
-
-
-
-
-
-
Beta-haemolysis
Acid from:
CAMP
Test
Serological
identification
166
Considerations on the isolation of Listeria monocytogenes and other Listeria spp. in food products
Table 2. Distribution of the analyzed Listeria strains species in relation to the source products
SPECIES
L. monocytogenes
PRODUCTS
serotype 1a
serotype 4b
L. innocua
L. grayi
L.welshimeri
no.
%
-
-
-
-
-
-
-
16,97
-
-
-
-
-
-
2
4.65
-
-
2.35
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
6.97
-
-
5
11.62
-
-
-
-
-
-
-
-
2
4.65
-
-
-
-
Smoked meat
1
2.35
-
-
-
-
-
-
-
-
Cottage cheese
-
-
-
-
1
2.35
-
-
-
-
Powdered milk
-
-
-
-
-
-
-
-
4
9.30
Raw milk
-
-
-
-
1
2.35
-
-
-
-
TOTAL no. of strains
8
18.60
2
4.65
27
62.79
2
4.65
4
9.30
no.
%
no.
%
no.
%
no.
%
2
4.65
1
2.35
10
23.25
-
Horse
-
-
-
-
1
2.35
Pork
-
-
-
-
7
Beef
1
2.35
-
-
Chicken carcass
-
-
1
Forcemeat balls meat
1
2.35
Fresh sausages
3
Processed ham
Raw ground meat
(pork, beef)
Unprocessed
Fresh meat
National Institute of Research-Development for
Microbiology and Immunology.
Of the 43 strains identified as belonging to
Listeria spp., 23 strains (53.48%) originated from
samples of processed fresh or raw meat (pork, beef
and chicken), 15 strains (34.88%) from meat preparations (mix beef/pork) and 5 strains (11.62%) of
dairy products.
In Table 2, there is a detailed presentation of the
food products from which isolation was made.
Bacteriological identification
Bacterial strains characterization was performed
by phenotypic methods: Gram staining affinity, morphology, culture aspects on blood agar (examined in
oblique light), catalase test, beta/hemolysis (on
sheep blood agar), CAMP test and carbohydrates
breakdown, i.e., trehalose, mannitol, mannose,
rhamnose, xylose [1, 3, 6].
Microscopic examination was performed on
Gram stained smears, assessing the relevant morphological characteristics of Listeria species, i.e. bipolar
stained positive Gram bacilli. The characteristics of
cultivability on the relevant solid media blood agar
and PALCAM were assessed after incubation for
24-48 h at 35oC.
Nutrient agar 3‰ poured in tubes, in right column was used for testing motility after inoculation
by stubbing the tested culture 0.5 cm with the loop.
After incubation for 18 h at 35oC, motility was assessed by migration of culture to the bottom of the
test tube, respectively advancing turbidity.
The aspect of the obtained culture was assessed
on blood agar 5% after incubation for 18-24 hours
at 35oC.
Metabolic tests performed by conventional methods [1, 6, 8] have revealed the following features:
- carbohydrates metabolism/breaking down to
glucose, trehalose D-mannitol, L-rhamnose
and D-xylose;
- production of catalase;
- production of oxidase.
Reagents and commercial media were delivered
by Cantacuzino Institute and Sanimed Bucharest
(Table 1).
CAMP test was performed by a method recommended by Caplan [6] using as positive control the
Staphylococcus aureus ATCC 25923 and Rhodococcus equi ATCC 6939 strains. The Listeria strains
were streaked perpendicularly to the control strains
(at a distance of 1-2 mm). After incubation for 18 h
167
BoRCAN and CAPLAN
at 35oC, the positive reaction was considered as the
enlargement of beta-hemolysis area at the intersection of the test strain and the reference strains.
Serological typing
Serological typing of the studied strains was
performed by the methodology recommended by
Caplan [4, 6] and Rocourt [11], using “in house” test
sera produced by the National Reference Center of
Cantacuzino Institute.
RESULTS AND DISCUSSIoN
Taxonomic classification was made according
to the recommendations of the literature [1, 6, 9],
based on the tests given in Table 1.
Out of the 43 analyzed strains, the biochemical
and serological assay evidenced 10 strains of
L.monocytogenes (8 belonging to serotype 1a and 2
to 4 b), 27 of L. innocua, 2 of L.grayi and 4 of
L.welshimeri.
Table 2 presents the correlation between Listeria spp. and the source of products.
Most strains of Listeria spp., respectively 31 of
43 were isolated from unprocessed pork and pork
preparations. These products, representing about
three quarters of all isolates, exclusively belonged to
the species L. monocytogenes and L. innocua. Of the
27 strains of L. innocua (67.79%), only three were
isolated from other types of products, respectively
horse meat (1), raw milk (1) and cheese (1). L. monocytogenes was identified in various products: minced
meat (2), fresh sausages (3), beef (1), forcemeat balls
(1) and smoked meat (1).
Other two species of Listeria, respectively,
L. grayi were detected only in beef (2 strains) and
L. welshimeri (4 strains) in powdered milk, only.
Isolation of L. welshimeri from powdered milk
was unexpected, on the one hand, due to the nature
of the product (thermally processed product, pasteurized and atomized) and on the other hand, to the fact
that the presence of this species in our country is
very rare.
In many cases, the presence of Listeriae in various products proves major hygiene deficiencies in
their processing – thus the presence of a strain of L.
monocytogenes in horse meat can be explained
through a slaughter contamination only and L.
welshimeri in the powdered milk obviously by failure to comply with manufacturing procedures.
In agreement with many other authors [2, 4, 6,
10, 11] the present investigation confirms that pork
168
and pork derivatives (especially ground meat) are the
most common products contaminated with L. innocua and L. monocytogenes. The risk of human
contamination is however reduced in case of these
products by their consumption only after heat treatment.
Raw milk and milk derivatives present, as in
other reports [2, 3, 10, 12], a relatively frequent
contamination rate, important for the human health
through the epidemiological implications of these
products which are consumed raw.
Outbreaks of L. monocytogenes were recently
reported in many countries of Western Europe
[2, 8], the incriminated foods being the cheese prepared of unpasteurized milk.
By its implications for the human health, L.
monocytogenes remains one of the most important
species from medical point of view.
The serological typing of L. monocytogenes further remains the method of choice in the epidemiological investigation used to establish cases’ affiliation and for identifying the risk points in food processing and handling. Of course, the small number
of typed L. monocytogenes strains in the paper can
be conclusive only in the context of the relation
source - processed product. The two strains belonging to 4b serotype, less circulating in Romania can
be related to the chicken meat imported from Italy,
this serotype being more frequent in the Western Europe [8].
Isolation of a L. monocytogenes strain from
chicken meat from Italy involves special risks,
through the contaminating risk of the product and
through the introduction of new serotypes in our
country.
CoNCLUSIoNS
1. Listeria monocytogenes, the species with the
greatest medical importance among Listeriae was
frequently isolated from meat and meat products:
- Listeria monocytogenes 1a, the serotype circulating in Romania, was identified both in
raw meat and in meat products.
- Listeria monocytogenes 4b, a serotype widespread in Western Europe, was detected in
chicken meat imported from Italy.
2. Listeria innocua was isolated most frequently
from all types of food. The other species of Listeria were less frequent, their detection being considered accidental (L. grayi or L. welshimeri).
3. Involvement in the contamination of food products with Listeria spp. raises increasing medical
Considerations on the isolation of Listeria monocytogenes and other Listeria spp. in food products
concern and economical loss by excluding hygienically contaminated food.
4. The increased incidence of Listeria spp. in meat
and raw derivatives can be attributed to the contamination during slaughtering or to handling of
post-processing storage. The fact that certain
products are consumed thermally unprocessed explains its involvement in extensive epidemic phenomena.
REFERENCES
1. Benenson AS. Listeriosis. In: Control of Communicable Diseases Manual, 16th ed., An Official Report of
the American Public Health Association. 1995, p. 271273.
2. Rocourt J. Listeria and listeriosis (In French), Pasteur
Institute, Paris, 1994.
3. Ivana S, Bogdan AT, Ţogoe I, Câmpeanu Gh. Food
Microbiology (In Romanian), vol. 2, Ed. Asclepius,
Bucharest, 2010.
4. Caplan DM. Listeriosis of Food Origin (In Romanian).
Bacteriol.Virusol. Parazitol. Epidemiol 2001, 46: 79-88.
Microbiology (in Romanian), vol. 3, Ed. Asclepius,
Bucharest, 2010.
6. Caplan DM. Listeria. In: D. Buiuc, M. Negut: Manual
of Clinical Microbiology (in Romanian), IIIth ed., Ed.
Medicală, Bucharest 2009, p. 687-692.
Bucharest, 2010.
8. Swaminathan B, Rocourt J. and Bilie J. Listeria. In
P.R. Murray, E.J. Baron, M.A. Pfaller (Eds.). Manual
of Clinical Microbiology, 6th ed., A.S.M. Press,
Washington D.C., 1995, p. 341-348.
9. Seeliger H.P.R. and Jones D. Listeria, In: P.H.A.
Sneath, N.S. Mair and E. Sharpe (Eds.): Bergey’s Manual of Systematic Bacteriology, 9th ed., vol. 2, Williams and Wilkins Co., Baltimore, 1986, 1235-1245.
10. Ivana S, Bogdan AT, Ipate I, Tudor L, Bărăităreanu S, Tănase A., Popescu AN, Caplan DM,
Daneş M. Food Microbial Contamination, the Main
Danger in the Catering Type Food Industry in Romania. Rom. Biotehnol. Lett., 2009, 2: 1224-5984.
11. Rocourt J. Taxonomy of the genus Listeria and subtyping of Listeria monocytogenes (In French), Pasteur
12. Bogdan AT, Mencinicopschi Gh, Ivana S, Câmpeanu Gh. Food Biotechnologies (In Romanian),
vol. 1, Ed. Asclepius, Bucharest, 2010.
169
CONsIDeRAÞII AsUPRA TULPINILOR De Listeria monocytogenes
ŞI A ALTOR sPeCII De Listeria IZOLATe DIN PRODUseLe ALIMeNTARe
Alina Maria Borcan1*, Dana Magdalena Caplan2
2institutul
1Universitatea
de medicinã şi Farmacie „carol Davila”, Bucureşti, românia;
naþional de cercetare-Dezvoltare pentru microbiologie şi imunologie cantacuzino, Bucureşti, românia
ReZUMAT
Listeria monocytogenes este un bacil Gram pozitiv, bine adaptat pentru supraviețuirea ca saprofit pe
sol şi în vegetația în descompunere, dar care poate produce infecții grave la om şi la multe specii de
animale, îndeosebi prin capacitatea sa de multiplicare intracelulară.
Ingestia de L. monocytogenes a fost asociată cu listerioza cu evoluție sistemică, această ipoteză stabilind că L.monocytogenes este un patogen uman alimentar. Investigații extinse au evidențiat L. monocytogenes şi într-o varietate de alimente neprelucrate termic (vegetale, carne şi derivate şi lactate) sau
în mâncăruri procesate, contaminate în timpul prelucrării (cum ar fi brânzeturile, mezelurile, laptele
praf sau alimentele preparate din lapte nepasteurizat).
În lucrarea de față au fost studiate pentru identificare şi confirmare serologică un număr de 43 tulpini
de Listeria spp.
Toate aceste tulpini au fost izolate din carne crudă tocată, muşchi, cârnați, mezeluri şi alte preparate
din porc si vita, carne de pasare, precum şi produse din lapte.
Identificarea a fost realizată conform metodologiei standard bazată pe: criterii morfologice (colorația
Gram), motilitate, caracteristici de cultivabilitate pe geloza sânge (vizualizată în lumina oblică), testul
catalazei, beta-hemoliza pe geloză 5% sânge de berbec, testul CAMP, descompunerea carbohidraților:
trehaloză, manitol, manoză, rhamnoză, xiloză.
Tulpinile studiate de L. monocytogenes au fost identificate şi tipizate serologic prin încadrarea în serovaruri.
În cadrul studiului au fost identificate: 10 tulpini de L. monocytogenes (8 tulpini cu serotipul 1a şi 2
tulpini cu serotipul 4b), 27 tulpini de L. innocua, 2 tulpini de L. grayi şi 4 tulpini de L. welshimeri.
Cuvinte cheie: produse din carne, produse lactate, serotipuri 1a, 4b, listeriozã.
INTRoDUCERE
L. innoqua a fost specia cea mai frecvent identificată. Tipizarea tulpinilor de L. monocytogenes
confirmă faptul că serotipul 1a este cel mai frecvent
în produse alimentare, iar serotipul 4b a fost detectat
în alimente din import. Această observaţie are importanţă epidemiologică pentru ţara noastră.
În natură, speciile de Listeria sunt frecvent izolate din sol, materii vegetale descompuse, hrană pentru animale, apă, carne proaspătă şi congelată, lapte
nefiert, deşeuri menajere, purtători sănătoşi umani şi
animali. L. monocytogenes a fost frecvent izolată la
speciile de mamifere, păsări, peşti, crustacee şi insecte. S-a constatat că habitatele primare ale speciei
L.monocytogenes sunt reprezentate de sol şi vegetalele degradate, în care specia supravieţuieşte şi trăieşte în condiţii saprofite.
L. monocytogenes este un saprofit ubicuitar, ce
poate contamina frecvent alimentele vegetale şi de
origine animală. Datorită faptului că are capacitatea
de a creşte şi la temperaturi de 4°C, poate determina
boala la persoane care ingeră alimente contaminate,
păstrate prin refrigerare.
L. monocytogenes a fost detectată într-o varietate largă de alimente: carne proaspătă neprelucrată
termic, produse din carne contaminate în timpul prelucrării, lapte proaspăt şi îndeosebi brânzeturi de prelucrare şi maturare îndelungată. Listeriile devin
inactive prin pasteurizare ori prelucrare termică, dar
*autor corespondent: Alina Maria Borcan, e-mail: [email protected]
170
Consideraþii asupra tulpinilor de Listeria monocytogenes şi a altor specii de Listeria izolate din produsele alimentare
în anumite preparate fast-food contaminarea se produce după preparare, înainte de ambalare, acest lucru
depinzând atât de măsurile personale şi generale de
igienă, cât şi de parametrii de procesare.
Patogenitatea pentru om a speciei L. monocytogenes are o serie de particularităţi care amplifică
agresivitatea primară, intestinală prin diseminări la
distanţă, la nivelul ţesutului muscular sau SNC [1, 2].
Aceasta capacitate este imprimată de proprietatea speciei L. monocytogenes de a supravieţui şi de
a se multiplica în fagocite, fapt ce generează localizări secundare predilecte la nivelul muşchiului uterin.
Infecţia muşchiului uterin are un caracter cronic,
asimptomatic, însă capacitatea L. monocytogenes de
a traversa placenta are repercusiuni dezastruoase
asupra evoluţiei sarcinii.
Contaminarea fetală placentară ori amniotică
este urmată de obicei de moartea fătului sau, în stadiile finale ale sarcinii, de naştere prematură urmată
de meningoencefalită severă perinatală cu mortalitate foarte înaltă. Vindecarea rarisimă a acestor cazuri este urmată de o dezvoltare encefalica anormală, cu sechele foarte severe.
De asemenea, se estimează posibilitatea contaminării fătului în timpul naşterii, situaţie în care
acesta dezvoltă în 2-3 săptămâni o meningoencefalită gravă, cu mortalitate mai redusă a nou născuţilor
(aprox. 40%), însă urmată de sechele irecuperabile,
cu impact socio-familial sever.
Datorită gravităţii localizării uterine, listerioza
la femeie generează prin patologia materno-fetală
preocupări importante pentru sănătatea publică
[1, 2, 3]. Semnalarea cu frecvenţă crescândă a evoluţiei sistemice (detectată serologic) şi a accidentelor
materno-fetale a impus investigarea bacteriologică a
gastroenteritelor, obligatorie şi pentru detectarea
L. monocytogenes în scaun, alături de alţi patogeni
enterici Salmonella sp., Shigella sp., Escherichia
coli (patotipurile intestinale) [4, 5].
MATERIALE ªI METoDE
Tulpinile studiate
Provenienţa tulpinilor este ilustrată în Fig. 1.
Aceste tulpini au fost izolate conform normativelor
naţionale [6, 7] în diverse laboratoare de control sanitar-veterinar din ţară şi trimise spre confirmare/tipizare la Centrul Naţional de Referinţă pentru
Infecţii zoonotice din INCDMI Cantacuzino.
Izolatele studiate, în număr total de 43 de tulpini
de Listeria spp. au provenit din:
- carne proaspătă şi carne tocată de porc şi vită şi
carne de pasare - 23 tulpini (53,48%);
- carne procesată (de porc şi vită) în scopul obţinerii
de preparate din carne - 15 tulpini (34,88%);
- din produsele lactate - 5 tulpini (11,62%).
Identificarea bacteriologică
Identificarea bacteriologică s-a efectuat prin
metode fenotipice, pentru evidenţierea caracterelor:
morfologice (coloraţia Gram, tipul morfologic şi
motilitatea), de cultură şi metabolice (catalaza, testul
CAMP şi de metabolizare a carbohidraţilor) după
metodologia recomandată în literatura de specialitate
[1, 3, 6].
Aspectele de cultivabilitate au fost apreciate pe
geloză sânge 5%, după o incubare de 18-24 h la 35°C.
Examinarea microscopică s-a efectuat pe frotiuri colorate Gram, apreciindu-se caracteristicile
morfologice respective: bacili gram pozitivi, decoloraţi bipolar. Caracteristicile de cultivabilitate pe
mediile solide, respectiv geloză sânge şi PALCAM
au fost stabilite după o incubare de 24-48 h la 35°C.
13%
carne proaspătă
54%
33%
produse din carne
produse lactate
Fig. 1. Provenienţa tulpinilor de L. monocytogenes studiate
171
BoRCAN şi CAPLAN
Tabel 1 - Clasificarea taxonomică a speciilor de Listeria (reacţii pozitive)
SPECII
TESTE
DE
IDENTIFICARE
L .monocytogenes
Serotip 1a
serotip 4b
L. innocua
L. grayi
L.welshimeri
nr.
%
nr.
%
nr.
%
nr.
%
nr.
%
8
18,60
-
-
-
-
-
-
-
-
Staphylococcus aureus
8
18,60
2
4,65
-
-
-
-
-
-
Rhodococcus equi
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
Mobilitate
8
18,60
2
4,65
-
-
-
-
-
-
Oxidază
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
Catalază
8
18,60
2
4,65
27
62,79
2
4,65
4
9,30
Glucoză
8
18,60
2
4,65
27
62,79
2
4,65
4
9,30
Trehaloză
4
9,30
1
2,32
4
9,30
-
-
-
-
D-Manitol
-
-
-
-
-
-
2
4,65
-
-
D-Manoză
8
18,60
2
4,65
27
62,79
-
-
4
9,30
L-Ramnoză
8
18,60
2
4,65
2
4,65
-
-
2
4,65
D-Xiloză
-
-
-
-
4
9,30
-
-
-
-
L.monocytogenes 1a
8
18,60
-
-
-
-
-
-
-
-
L.monocytogenes 4b
-
-
2
4,65
-
-
-
-
-
-
Beta-hemoliză
Acid din:
Testul
CAMP
Identificare
serologică
Pentru testarea mobilităţii s-a folosit agar 3‰
turnat în coloană dreaptă în care s-a inoculat prin înţepare, pe o distanţă de 0,5 cm cu ansa, cultura de
testat. După incubare de 18 h la 35°C, motilitatea
s-a evidenţiat prin migrarea culturii spre baza eprubetei, respectiv avansarea turbidităţii.
Testările metabolice realizate prin metode convenţionale [1, 6, 8] au relevat următoarele:
n Metabolizarea carbohidraţilor: glucoză, trehaloză,
D-manitol, L-rhamnoză și D-xiloză.
n Producerea de catalază.
n Producerea de oxidază.
n Reactivii şi mediile comerciale au fost livrate de
Institutul Cantacuzino şi Sanimed Bucureşti (Tabelul 1).
Testul CAMP s-a efectuat după o metodă recomandată de Caplan [6], utilizând ca tulpini control
pozitiv Staphylococcus aureus ATCC 25923 şi Rhodococcus equi ATCC 6939. Aceste tulpini au fost însămânţate în striuri longitudinale pe mediu cu agar
sânge de oaie. Tulpinile de Listeria testate au fost însămânţate perpendicular între cele două tulpini indicatoare, fără a le atinge (la distanţă de 1-2 mm).
După incubare la 18h la 35°C, reacţia pozitivă s-a
considerat a fi reprezentată de zona accentuată de
beta hemoliză la intersecţia dintre tulpina test şi tulpinile de referinţă.
172
Tipizarea serologică
Tipizarea serologică a tulpinilor studiate s-a
efectuat de asemenea după metodologia recomandată de Caplan [4, 6] şi Rocourt [11], utilizând seruri
test preparate “in house” în cadrul Centrului Naţional de Referinţă din Institutul Cantacuzino.
REZULTATE ŞI DISCUÞII
Rezultatele testărilor fenotipice au permis încadrarea celor 43 de tulpini ca Listeria spp., respectiv:
10 tulpini L.monocytogenes (8 tulpini cu serotipul
1a si 2 tulpini cu serotipul 4b), 27 tulpini de L. innocua, 2 tulpini de L.grayi şi 4 tulpini de L. welshimeri.
Încadrarea taxonomică s-a efectuat conform recomandărilor din literatură [1, 6, 9] pe baza testelor
prezentate în tabelul 1.
În tabelul 2 sunt centralizate datele privind distribuţia tulpinilor în raport cu sursele de izolare şi
specia de Listeria identificată.
Cele mai multe tulpini de Listeria spp., respectiv 31 din 43 au fost izolate din carne de porc neprocesată şi din preparate din carne de porc. Aceste
produse, reprezentând aproape trei sferturi din totalul
izolărilor, au aparţinut doar speciilor L. monocytogenes şi L.innocua. Din cele 27 de tulpini de L. innocua (67,79%), numai trei au provenit din alte
Consideraþii asupra tulpinilor de Listeria monocytogenes şi a altor specii de Listeria izolate din produsele alimentare
Tabel 2 - Distribuţia speciilor de Listeria în acord cu sursa de izolare din diferite produse alimentare
tipuri de produse, respectiv carne de cal (1), lapte
crud (1) şi brânză (1). L. monocytogens a fost identificată în produse variate: carne tocată (2), cârnaţi
proaspeţi (3), carne de vită, carne de mici şi carne
afumată, respectiv câte o tulpină.
Alte doua specii de Listeria, respectiv, L. grayi
au fost identificate numai în carne de vită (2 tulpini)
şi L. welshimeri (4 tulpini) numai în lapte praf.
Izolarea L. welshimeri din lapte praf a fost neasteptată, pe de o parte deoarece a fost evidenţiată
într-un produs prelucrat termic (pasteurizat şi atomizat) şi, pe de altă parte, datorită faptului că prezenţa
acestei specii în ţara noastră este foarte rară.
În mai multe cazuri, prezenţa Listeriilor în diverse produse denotă deficienţe igienice majore în
procesarea acestora - astfel, prezenţa unei tulpini de
L. monocytogens în carne de cal nu poate fi explicată
decât printr-o contaminare de abataj, iar a L. welshimerii în laptele praf, în mod evident, prin nerespectarea procedurilor de fabricaţie.
În acord cu mulţi alţi autori [2, 4, 6, 10, 11] investigarea de faţă confirmă următorul aspect: carnea
de porc şi derivatele din carne de porc (în special din
carne tocată) sunt produsele cel mai frecvent contaminate cu L. innocua şi L. monocytogenes. Riscul
contaminării umane este diminuat însă, în cazul
acestor produse, de consumul lor, numai după prelucrare termică.
Laptele crud şi derivatele din lapte prezintă, ca
şi în alte relatări [2, 3, 10, 12], o contaminare relativ
frecventă şi importanţă sanitară prin implicaţiile epidemiologice ale acestor produse consumate crude şi
de un grup larg de contaminări.
Focare de epidemie cu L. monocytogenes au fost
semnalate în ţări din vestul Europei [2, 8] având ca
aliment incriminat, brânzeturile preparate din lapte
nepasteurizat.
Prin implicaţiile sale în sănătate, L. monocytogenes rămâne specia cea mai importantă din punct
de vedere medical.
Tipizarea serologică a speciei L. monocytogenes
rămâne în continuare metoda de elecţie în investigarea epidemiologică pentru stabilirea filiaţiunii cazurilor şi identificarea punctelor de risc în procesarea
şi manipularea alimentelor. Desigur, numărul redus
de tulpini de L. monocytogenes tipizate în această lucrare poate fi concludent numai în contextul relaţiei
sursă-produs procesat. Cele două tulpini aparţinând
serotipului 4b mai puţin circulant în România pot fi
corelate cu importul de carne de pasăre din Italia, serotipul 4b fiind mai frecvent în vestul Europei [8].
Izolarea unei tulpini de L. monocytogenes din
carne de pui din Italia implică riscuri particulare, atât
prin riscul contaminant al acestui produs, cât şi epidemiologic, prin introducerea de noi serotipuri în ţară.
173
BoRCAN şi CAPLAN
CoNCLUZII
1. L. monocytogenes, specia cu cea mai mare importanţă medicală a fost frecvent izolată din carne și
produsele din carne:
- L. monocytogenes 1a, serotipul care circulă în
România, a fost identificat atât în carnea crudă,
cât şi în produsele din carne;
- L. monocytogenes 4b, serotipul larg răspândit
în Europa de Vest, a fost detectată în carnea de
pui importată din Italia.
2. L. innocua a fost identificată cel mai frecvent în
toate tipurile de alimente. Celelalte specii de Listeria au fost mai putin frecvente, detectarea lor
fiind în unele cazuri accidentală (L. grayi sau L.
welshimeri).
3. Listeria spp. rămâne în continuare o problemă majoră de sănătate publică, dar şi o problemă economică importantă, prin excluderea de la consum a
alimentului contaminat şi implicarea accidentală
a acestuia în patologia umană.
4. Incidenţa crescută a Listeriei spp. în carne şi derivatele crude poate fi atribuită contaminării pe parcursul abatajului sau a manipulării stocării
postprocesare. Faptul că unele dintre produse se
consumă neprelucrate termic explică implicarea
L. monocytogenes în fenomene epidemic extinse.
BIBLIoGRAFIE
1. Benenson AS. Listeriosis. In: Control of Communicable Diseases Manual, 16th ed., An Official Report of
the American Public Health Association. 1995, p. 271273.
2. Rocourt J. Listeria and listeriosis (In French), Pasteur
Bucharest, 2010.
4. Caplan DM. Listeriosis of Food Origin (In Romanian).
Bacteriol.Virusol. Parazitol. Epidemiol 2001, 46: 79-88.
Microbiology (in Romanian), vol. 3, Ed. Asclepius,
Bucharest, 2010.
6. Caplan DM. Listeria. In: D. Buiuc, M. Negut: Manual
of Clinical Microbiology (in Romanian), IIIth ed., Ed.
Medicală, Bucharest 2009, p. 687-692.
Bucharest, 2010.
8. Swaminathan B, Rocourt J. and Bilie J. Listeria. In
P.R. Murray, E.J. Baron, M.A. Pfaller (Eds.). Manual
of Clinical Microbiology, 6th ed., A.S.M. Press,
Washington D.C., 1995, p. 341-348.
9. Seeliger H.P.R. and Jones D. Listeria, In: P.H.A.
Sneath, N.S. Mair and E. Sharpe (Eds.): Bergey’s Manual of Systematic Bacteriology, 9th ed., vol. 2, Williams and Wilkins Co., Baltimore, 1986, 1235-1245.
174
10. Ivana S, Bogdan AT, Ipate I, Tudor L, Bărăităreanu S, Tănase A., Popescu AN, Caplan DM,
Daneş M. Food Microbial Contamination, the Main
Danger in the Catering Type Food Industry in Romania. Rom. Biotehnol. Lett., 2009, 2: 1224-5984.
11. Rocourt J. Taxonomy of the genus Listeria and subtyping of Listeria monocytogenes (In French), Pasteur
12. Bogdan AT, Mencinicopschi Gh, Ivana S, Câmpeanu Gh. Food Biotechnologies (In Romanian), vol.
1, Ed. Asclepius, Bucharest, 2010.
COMPARATIVe ANALYsIs OF BIOFILM DeVeLOPMeNT
AMONG MRsA AND MssA sTRAINs
Sobhan Ghafourian1, Reza Mohebi1, Mitra Rezaei1, Mohammad Raftari2,
Zamberi Sekawi3, Hosein Kazemian4, Aghdas Mohseni1, Sajedeh Karimi1, Nourkhoda Sadeghifard1*
1clinical
microbiology research center, ilam University of medical sciences, ilam, iran; 2Faculty of Food science
and technology, University Putra malaysia, serdang, selangor 43400, malaysia; 3Department of medical
microbiology & Parasitology, Faculty of medicine and Health sciences, University Putra malaysia, 43400 serdang,
selangor, malaysia; 4Department of clinical microbiology, tehran University of medical sciences, tehran, iran
ABsTRACT
As the recalcitrance of biofilm-mediated infections to the anti-infective treatment has an adverse
effect on patient’s health, the main objective of this study was to investigate the capacity of clinical
isolates of Staphylococcus aureus with different resistance patterns to form biofilms. S. aureus strains
are among the most representative etiology of infections in the health-care environment of Milad hospital in Iran. The results showed that out of 80 analyzed strains, 27 methicillin resistant S. aureus
(MRSA) and 29 methicillin susceptible S. aureus (MSSA) were positive for biofilm development ability, without any significant correlation observed between MRSA and biofilm production.
Keywords: biofilm, MRsA and MssA strains
INTRoDUCTIoN
The coagulase-positive Staphylococcus aureus
(S. aureus) species is well documented as an important nosocomial pathogen that causes various skin
infections, bacteraemia, pneumonia, osteomyelitis,
endocarditis, meningitis and abscesses at different
sites. Since the 1980s, methicillin-resistant S. aureus
(MRSA) has emerged as a major clinical and epidemiological problem in hospitals [1]. A distinctive
feature of MRSA strains is their resistance not only
to all beta-lactam antibiotics, but also to a wide range
of other antimicrobials, which makes MRSA infections difficult to manage and costly to treat [2].
A biofilm is an aggregate of microorganisms in
which cells adhere to each other on a surface. These
adherent cells are frequently embedded within a selfproduced matrix of extracellular polymeric substance (EPS). Biofilm EPS, which is also referred to
as slime (although not everything described as slime
is a biofilm), is a polymeric conglomeration generally composed of extracellular DNA, proteins, and
polysaccharides. Biofilms may form on living or
non-living surfaces and can be prevalent in natural,
industrial and hospital settings [3]. The microbial
cells growing in a biofilm are physiologically dis-
tinct from planktonic cells of the same organism,
which, by contrast, are single-cells that may float or
swim in a liquid medium.
Biofilms have been found to be involved in a
wide variety of microbial infections in the body, by
one estimate 80% of all infections [4]. Infectious
processes in which biofilms have been implicated include common problems such as urinary tract infections, catheter infections, middle-ear infections,
formation of dental plaque, gingivitis [5], coating
contact lenses [6], and less common but more lethal
processes such as endocarditis, infections in cystic
fibrosis.
Many molecular epidemiology studies clearly
indicate that the massive geographical spread of
MRSA results from the dissemination of relatively
few highly epidemic clones [7]. This resistance severely limits therapeutic options and increases the
already unacceptably high rates of morbidity and
mortality in patients. To compound this problem further, S. aureus has the ability to colonize and form
biofilms on implanted biomaterials. These biofilm
structures are inherently resistant to antimicrobial
challenge and difficult to eradicate from the infected
host, as they can display susceptibilities towards antimicrobials of 10–1000 times less than equivalent
populations of free-floating planktonic cells [8].
*corresponding author: Nourkhoda sadeghifard, e-mail: [email protected]
175
GHAFoURIAN et al.
Biofilms can form on almost any biotic or biological
surface and it is estimated that 65% of all human
bacterial infections involve biofilms [9].
Epidemiological analyses including biofilm formation among clinical isolates of S. aureus strains
with different resistance patterns from different infections have rarely been performed. As the recalcitrance of biofilm-mediated infections has an adverse
effect on patient’s health, the main objective of this
study was to investigate the capacity of clinical isolates of S. aureus to form biofilms. These isolates
were representative of those that cause the majority
of infections in the health-care environment in Milad
hospital in Iran.
Staphylococcal isolates. Eighty clinical isolates
of S. aureus were collected over a six months period
in 2012 from Milad hospital in Tehran. These consisted of 37 MRSA isolates and 43 methicillin-sensitive S. aureus (MSSA) isolates.
The isolates were collected from the blood,
wounds, urine and sputum of patients.
Staphylococcus epidermidis RP62A (ATCC
35984), a well-characterized biofilm-forming strain,
was used as one of two positive controls in biofilm
assays. Isolates from patients were cultured on blood
agar and stored. Isolates were freshly sub-cultured
on brain heart infusion (BHI) agar prior to each
assay.
Biofilm model. One colony from each staphylococcal isolate was used to inoculate 5 ml BHI
broth. The culture was incubated for 18 h at 37 oC
with aeration at 200 r.p.m. Following incubation, the
number of cells in each culture was adjusted to 1.5
X 108 cfu/ml (0.5 McFarland) and 200 µl of each
bacterial suspension were transferred to eight wells
of a 96-well microtitre plate. Eight replicates were
used for each isolate in each biofilm assay. The
biofilm-forming S. epidermidis strain RP62A known
to form fully established biofilms, was added to each
plate as positive control. BHI broth was incorporated
as a negative control. A 96-peg plate was then positioned in the wells of the microtitre plate, allowing
the pegs to be submerged within the bacterial culture. The inoculated peg plate was transferred to a
96-well microtitre plate containing fresh BHI broth
and incubated for 48 h at 37 oC on a rocking platform,
to allow mature biofilms to establish. Each biofilm
assay was repeated on two different occasions.
Semi-quantification of biofilm biomass.
Biofilm biomass was quantified using a modification
176
of a methodology described by Mowat et al. [10].
Following incubation, the peg plate was removed
from the microtitre plate, rinsed twice in PBS to remove loosely attached planktonic cells and dried for
30 min at 37 oC. Each replicate peg was stained with
filtered 0.5% (w/v) crystal violet for 5 min. Excess
crystal violet was removed by gently washing the
peg plate twice with distilled water. Replicate pegs
were detached from the plate using needle-tipped
pliers and added to 1 ml 70% ethanol to leach the
crystal violet from the stained biofilms. The A570
was measured using a microtiter plate reader. As the
polystyrene pegs were suspended in the wells of the
microtitre plate, any biomass that remained bound
to the surface following the washing steps could be
viewed as a genuine biofilm. The wells of the microtiter plate were not sampled for the presence of
biofilm biomass as this may not have been a biofilm
but rather a deposit of planktonic cells.
Analysis of biofilm formation. The capacity of
each strain to form a biofilm was compared with that
of the confluent biofilm-forming S. aureus control
by analyzing the absorbance of the crystal violet
stain obtained for each biofilm. This allowed each
isolate to be assigned a percentage value depending
on the proportion of biofilm biomass it was able to
establish after 48 h in comparison with the control
(taken as 100 %). Eight replicate pegs were included
for each isolate in each biofilm assay and the assay
was carried out three times. Isolates were also divided into three groups depending on whether they
formed fully established biofilms with 75% of the
biomass of the positive control, moderately adherent
biofilms with 25-75% biomass or weak biofilms
with 25% of the biomass of the positive control.
Statistical analysis of biofilm formation.
SPSS version 15.0 was used for statistical analysis.
Chi-square analysis was used for comparison of the
prevalence of biofilm formation and MRSA and
MSSA; also biofilm production in different sites.
RESULTS
The analyzed S. aureus strains were isolated
from different sites of the hospital, and their distribution in MRSA or MSSA phenotypes is shown in
Table 1.
As shown in Table 1, the most isolates were collected from urine cultures and the lowest frequency
occurred in blood samples. Our study showed that
the highest rate of MRSA strains was obtained from
blood samples while in wound samples MSSA were
mostly observed.
Comparative analysis of biofilm development among MRSA and MSSA strains
Table 1. Distribution of MSSA and MRSA in different sites of Milad hospital
Blood
Wound
Urine
Sputum
Total
MRSA
9 (70%)
5 (35.7%)
17 (44.7%)
6 (40%)
37 (46.25%)
MSSA
4 (30%)
9 (64.3%)
21 (55.3%)
9 (60%)
43 (53.75%)
Total
13 (100%)
14 (100%)
38 (100%)
15 (100%)
80 (100%)
Table 2. Frequency of biofilms among MRSA in different sites of Milad hospital
MRSA
Blood
Wound
Urine
Sputum
High
1 (11%)
2 (40%)
5 (29.3%)
0
Moderate
4 (44.5%)
2(40%)
10 (59%)
3 (50%)
Low
4 (44.5%)
1 (10%)
2 (11.7%)
3 (50%)
Total
9 (100%)
5 (100%)
17 (100%)
6 (100%)
Table 3. Frequency of biofilms among MSSA in different sites of Milad hospital
MSSA
Blood
Wound
Urine
Sputum
High
2 (50%)
2 (22%)
3 (14%)
1 (11%)
Moderate
1 (25%)
4 (44%)
14 (67%)
2 (22%)
Low
1 (25%)
3 (34%)
4 (19%)
6 (66.7%)
Total
4 (100%)
9 (100%)
21 (100%)
9 (100%)
The findings showed that 43 MSSA and 37
MRSA were obtained and each one divided into
three groups: those that produced fully established
biofilms (75% of the biofilm biomass formed by the
biofilm forming positive control strain), those that
formed moderately adherent biofilms (25–75%) and
those that formed negligible biofilms (25%).
51.3 % (n = 19) of the 37 MRSA examined isolates formed moderately adherent biofilms. Negligible biofilms were formed by 27% (n= 10) of the
MRSA isolates, whilst 21.7% (n = 8) of isolates produced fully established biofilms. A large proportion
of the 43 MSSA examined isolates 48.8% (n = 21)
also formed moderately adherent biofilms when
compared with the control strain. Non-quantifiable
biofilms were produced by 32.5% (n = 14) of MSSA
isolates, whilst 18.7% (n = 8) of isolates formed fully
established biofilms. When these results were compared using the statistical tests, there was no significant difference in the number of biofilm forming
strains between S. aureus isolates that were susceptible and resistant to methicillin (P = 0.89) respectively. These results suggest that there is no
correlation between methicillin susceptibility and the
ability to form biofilms of S. aureus strains.
When the biofilm-forming capacity of strains
was compared with the site from which they were
collected from the patient, S. aureus isolates that
originated in the urine cultures had a significantly
greater ability to form fully and moderately established biofilms than isolates taken from other body
sites (P = 0.0005) (Tables 2, 3).
DISCUSSIoN
Biofilm-mediated infections in the hospital environment have a significant negative impact onpatient’s health and place an enormous burden on the
resources of the health services [11]. The ability of
nosocomial pathogens, such as S. aureus, to form
biofilms is of significant clinical interest, as biofilm
formation influences the efficacy of the antimicrobial therapy and the subsequent outcome of an infection [12].
O’Neill et al. [13] studied biofilm formation in
114 clinical isolates of MRSA and found that only
9% had the ability to form fully established biofilms.
Our study, which examined a much larger number of
isolates collected consecutively from patients in
Milad hospital, showed that more than twice as many
isolates had the capacity to form biofilms. This difference may relate to the variation in isolation site or
the geographical differences in the most commonly
isolated genotypes of MRSA included in each study.
177
GHAFoURIAN et al.
The ability of a large proportion of MRSA and
MSSA isolates to form moderately adherent and
fully established biofilms may explain why these organisms can facilitate infection of the host and survive in the hospital environment. Studies have
shown that, although there is no significant difference between rates of disseminated infection by
MRSA and MSSA in hospitals, the mortality rate is
significantly higher in infections caused by MRSA
due to the added interference of antimicrobial resistance [14].
This investigation has provided vital information on the capacity of clinical isolates of S. aureus
to form biofilms, the relationship between methicillin resistance and biofilm formation, and the ability of different genotypes of MRSA to utilize the
biofilm mode of growth. Demonstrating the ability
of isolates to form biofilms is the first step towards
understanding the mechanisms employed in biofilm
formation in S. aureus. The ica operon, which encodes
a polysaccharide intercellular adhesin, is currently
the best understood mediator of biofilm development
[15]; however, ica-independent biofilm development, biofilm-associated protein (Bap) and the S. aureus surface protein (SasG) have all been implicated
in biofilm development and regulation [13]. Further
investigation of the genetic mechanisms of biofilm
formation in S. aureus will ultimately help in the
management of biofilm-mediated infections and in
the reduction of morbidity and mortality in patients
suffering from S. aureus infections.
In conclusion, our finding revealed no correlation observed between MRSA and biofilm production, demonstrating that the genetic and phenotypic
resistance are distinct features and are cumulating
mechanisms by which these bacteria survive in the
presence of antimicrobial substances.
REFERENCES
1. Gould, I. M. (2005). The clinical significance of methicillin-resistant Staphylococcus aureus. J Hosp Infect
61, 277–282.
2. Gould, I. M. (2006). Costs of hospital-acquired methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA) and its
control. Int J Antimicrob Agents 28, 379–384.
3. Hall-Stoodley, L., Costerton, J.W., Stoodley, P.
(2004). “Bacterial biofilms: from the natural environment to infectious diseases”. Nature Reviews. Microbiology 2 (2): 95–108.
4. Research on microbial biofilms (PA-03-047)”. NIH,
National Heart, Lung, and Blood Institute. 2002-12178
20. http://grants.nih.gov/grants/guide/pa-files/PA-03047.html.
5. Rogers, A. H. (2008). Molecular Oral Microbiology.
Caister Academic Press. pp. 65–108. ISBN 978-1904455-24-0. http://www.horizonpress.com/oral2.
6. Imamura, Y., Chandra, J., Mukherjee, P. K.( 2008).
“Fusarium and Candida albicans biofilms on soft contact lenses: model development, influence of lens type,
and susceptibility to lens care solutions”. Antimicrobial
Agents and Chemotherapy 52 (1): 171–82.
7. Oliveira, D. C., Tomasz, A. de Lencastre, H. (2001).
The evolution of pandemic clones of methicillin-resistant Staphylococcus aureus: identification of two ancestral genetic backgrounds and the associated mec
elements. Microb Drug Resist 7, 349–361.
8. Parsek, M. R. Fuqua, C. (2004). Biofilms 2003:
emerging themes and challenges in studies of surfaceassociated microbial life. J Bacteriol 186, 4427–4440.
9. Donlan, R. M. (2001). Biofilms and device-associated
infections. Emerg Infect Dis 7, 277–281.
10. Mowat, E., Butcher, J., Lang, S., Williams, C. Ramage, G. (2007). Development of a simple model for
studying the effects of antifungal agents on multicellular communities of Aspergillus fumigatus. J Med
Microbiol 56, 1205–1212.
11. Donlan, R. M. Costerton, J. W. (2002). Biofilms:
survival mechanisms of clinically relevant microorganisms. Clin Microbiol Rev 15, 167–193.
13. O’Neill, E., Pozzi, C., Houston, P., Smyth, D.,
Humphreys, H., Robinson, D. R. O’Gara, J. P.
(2007). Association between methicillin susceptibility
and biofilm regulation in Staphylococcus aureus isolates from device-related infections. J Clin Microbiol
45, 1379–1388.
14. Melzer, M., Eykyn, S. J., Gransden, W. R. Chinn,
S. (2003). Is methicillin-resistant Staphylococcus aureus more virulent than methicillin- susceptible S. aureus? A comparative cohort study of British patients
with nosocomial infection and bacteremia. Clin Infect
Dis 37, 1453–1460.
15. Cramton, S. E., Gerke, C., Schnell, N. F., Nichols,
W. W. Gotz, F. (1999). The intercellular adhesion
(ica) locus is present in Staphylococcus aureus and is
required for biofilm formation. Infect Immun 67,
5427–5433.
COReLAÞIe îNTRe BIOFILMUL PRODUs De MRsA ŞI MssA
Sobhan Ghafourian1, Reza Mohebi1, Mitra Rezaei1, Mohammad Raftari2,
Zamberi Sekawi3, Hosein Kazemian4, Aghdas Mohseni1, Sajedeh Karimi1, Nourkhoda Sadeghifard1*
1centrul
de cercetãri în microbiologie clinicã, Universitatea de Ştiinþe medicale ilam, iran;
de Ştiinþã şi tehnologie alimentarã, Universitatea Putra, malaezia; 3Departamentul de microbiologie
şi Parazitologie medicalã, Facultatea de medicinã şi Ştiinþele sãnãtãþii, Universitatea Putra, malaezia;
4Departamentul de microbiologie clinicã, Universitatea de Ştiinþe medicale,teheran, iran
2Facultatea
ReZUMAT
Întrucât rezistența infecțiilor mediate de biofilm la tratamentul antiinfecțios are un efect negativ asupra
sănătății pacientului, obiectivul principal al acestui studiu a fost acela de a investiga capacitatea izolatelor clinice de S. aureus de a forma biofilme.
Tulpinile de S. aureus sunt reprezentative pentru etiologia majorității infecțiilor nosocomiale din Spitalul
Milad, Iran. Rezultatele au arătat că, din 80 de tulpini studiate, 27 tulpini de MRSA şi 29 MSSA au
produs biofilm, fără a exista vreo corelație semnificativă între MRSA şi producerea de biofilm.
Cuvinte cheie: biofilm, tulpini de MRsA-MssA
INTRoDUCERE
Staphylococcus aureus (S. aureus) coagulazopozitiv este un binecunoscut agent patogen nosocomial, care cauzează diferite infecţii ale pielii, bacteriemie, pneumonie, osteomielită, endocardită, meningită şi abcese cu diferite localizări. Începând din
anii ’80, S. aureus meticilino-rezistent (MRSA) a devenit o problemă clinică şi epidemiologică majoră
pentru spitale [1]. O trăsătură distinctivă a tulpinilor
MRSA este rezistenţa acestora nu numai la antibiotice beta-lactamice, dar şi la o gamă largă de alţi
agenţi antimicrobieni, motiv pentru care tratamentul
infecţiilor cu MRSA este dificil şi costisitor [2].
Un biofilm este un agregat de microorganisme
în care celulele bacteriene aderă unele la altele pe o
suprafaţă. Aceste celule aderente sunt adesea încorporate într-o matrice bacteriană de substanţă polimerică extracelulară (SPE). Biofilmul SPE, cunoscut şi
sub denumirea de slime (deşi nu tot ceea ce este descris ca slime este biofilm), este un conglomerat polimeric, compus, în general, din ADN extracelular,
proteine şi polizaharide. Biofilmele se pot forma pe
suprafeţe vii sau lipsite de viaţă şi pot fi răspândite
în mediul înconjurător, în mediul industrial sau spitalicesc [3]. Celulele microbiene care cresc într-un
biofilm sunt fiziologic distincte de celulele planctonice ale aceleiaşi specii, care sunt celule individuale
ce pot pluti sau înota într-un mediu lichid.
S-a observat că biofilmele sunt implicate într-o
mare varietate de infecţii microbiene, conform unor
estimări, aproximativ 80% dintre infecții [4]. Procesele infecţioase în care sunt implicate biofilmele includ afecţiuni frecvente, cum ar fi infecţiile urinare,
infecţiile de cateter, infecţii ale urechii medii, formarea plăcii dentare, gingivită [5], infecţii asociate cu
lentilele de contact [6], precum şi procese mai puţin
frecvente, dar mai grave, cum ar fi endocardita, fibroza chistică.
Multe studii de epidemiologie moleculară arată
în mod clar că răspândirea geografică masivă a
MRSA este rezultatul diseminării unui număr relativ
mic de clone înalt epidemice [7].
Rezistenţa la antibiotice limitează drastic opţiunile terapeutice şi creşte rata morbidităţii şi a mortalităţii în rândul pacienţilor, care este deja inacceptabil de ridicată. Pentru a complica şi mai mult
această problemă, S. aureus are capacitatea de a coloniza şi a forma biofilme pe biomateriale implantate. Aceste structuri de tip biofilm sunt în mod
natural rezistente la antimicrobiene şi sunt dificil de
îndepărtat din gazda infectată, întrucât sunt de 101000 de ori mai puţin sensibile la acestea decât celulele de tip plancton care plutesc libere [8].
Biofilmele se pot forma pe aproape orice suprafaţă
biotică sau biologică şi se estimează că ele sunt implicate în 65% dintre infecţiile bacteriene umane [9].
*autor corespondent: Nourkhoda sadeghifard, e-mail: [email protected]
179
GHAFoURIAN et al.
Sunt puţine analize epidemiologice referitoare
la izolatele clinice de S. aureus care pot forma biofilm. Întrucât rezistenţa infecţiilor în care este implicată producerea de biofilm are un efect negativ
asupra pacientului, obiectivul principal al acestui
studiu a fost acela de a investiga capacitatea izolatelor clinice de S. aureus de a forma biofilme. Aceste
izolate au fost reprezentative pentru etiologia majorităţii infecţiilor nosocomiale din spitalul Milad,
Iran.
MATERIALE ŞI METoDE
Izolate stafilococice. Într-o perioadă de peste 6
luni din cursul anului 2012, au fost colectate optzeci
de izolate clinice de S. aureus din spitalul Milad, Teheran. Acestea au fost reprezentate de 37 izolate
MRSA şi 43 izolate de S. aureus sensibile la meticilină (MSSA).
Izolatele au fost colectate din sânge, plăgi, urină
şi spută.
Staphylococcus epidermidis RP62A (ATCC
35984), o tulpină bine caracterizată formatoare de
biofilm, a fost unul dintre cei doi martori pozitivi folosiţi în testele de producere de biofilm. Izolatele de
la pacienţi au fost cultivate pe sânge agar şi stocate.
Izolatele au fost subcultivate ulterior înaintea fiecărei
testări pe agar infuzie creier inima (ICI).
Modelul biofilmului. O colonie din fiecare izolat stafilococic a fost folosită pentru a inocula 5 ml
de bulion ICI. Cultura a fost incubată timp de 18 h
la 37 °C, cu agitare la 200 r.p.m. După incubare, numărul de celule din fiecare cultură a fost ajustat la
1,5 x 108 cfu/ml (0,5 McFarland) şi 200 µl din cultură au fost transferate în opt dintre godeurile unei
plăci de microtitrare cu 96 godeuri. Pentru fiecare
izolat au fost folosite opt replici în fiecare dintre testele de producere de biofilm. Tulpina de S. epidermidis RP62A, cunoscută ca formatoare de biofilm,
a fost adăugată pe fiecare placă în calitate de martor
pozitiv. Bulionul ICI a fost încorporat ca martor negativ. La teste s-a folosit o placă peg-96, plasată în
godeurile plăcii de microtitrare, ceea ce a permis
submersia în cultura bacteriană. Placa peg astfel inoculată a fost transferată într-o altă placă de microtitrare cu 96 de godeuri, care conţineau bulion ICI
proaspăt, fiind incubată timp de 48 h la 37° C, pe o
platformă agitatoare, pentru a permite maturarea biofilmelor. Testul pentru producere de biofilm a fost
repetat pentru fiecare tulpină de încă două ori.
Semi-cuantificarea biomasei biofilmului. Biomasa biofilmelor a fost cuantificată folosind o variantă modificată a unei metodologii descrise de
180
Mowat et al. [10]. După incubare, placa peg a fost
scoasă din placa de microtitrare, clătită de două ori
în PBS pentru a elimina celulele planctonice superficial ataşate şi uscată timp de 30 de minute la 37 °C.
Fiecare replicat peg a fost colorat timp de 5 minute
cu cristal violet 0,5% (g / v) filtrat. Excesul de cristal
violet a fost îndepărtat prin spălare uşoara a plăcii
peg de două ori, cu apă distilată. Replicatele peg au
fost desprinse de pe placă cu ajutorul unui cleşte cu
ac în vârf şi au fost puse într-un ml de etanol 70%
pentru a îndepărta cristal violetul din biofilmele colorate. Absorbanţa 570 a fost măsurată folosindu-se
un cititor de plăci de microtitrare. Întrucât peg-urile
de polistiren au fost suspendate în godeurile plăcii
de microtitrare, orice biomasă care a rămas legată de
suprafaţa lor după spălare ar putea fi considerată ca
un veritabil biofilm. Godeurile plăcii de microtitrare
nu au fost analizate pentru prezenţa biomasei biofilmului, întrucât în ele putea să nu fie un biofilm, ci
mai degrabă un depozit de celule planctonice.
Analiza formării biofilmului. Capacitatea fiecărei tulpini de a forma un biofilm a fost comparată
cu aceea a martorului pozitiv de S. aureus, pe baza
absorbanţei colorantului cristal violet din fiecare biofilm. Aceasta a permis ca fiecărui izolat să îi fie atribuită o valoare procentuală, în funcţie de proporţia
biomasei biofilmului pe care a fost în măsură să o
realizeze după 48 h, prin comparaţie cu martorul
(considerat ca 100%). Opt replici peg au fost utilizate pentru fiecare izolat, la fiecare testare a biofilmelor, iar testul a fost efectuat de trei ori. Izolatele
au fost, de asemenea, împărţite în trei grupe, în funcţie de măsura în care acestea au format biofilme pe
deplin stabile, cu 75% din biomasa martorului pozitiv, biofilme moderat aderente cu 25-75% biomasă
sau biofilme slabe, cu 25% din biomasa martorului
pozitiv .
Analiza statistică a formării biofilmului. Versiunea SPSS 15.0 a fost folosită pentru analiza statistică. Analiza chi-pătrat a fost utilizată pentru
compararea prevalenţei formării de biofilm la MRSA
și MSSA şi, de asemenea, la producerea de biofilm
în alte zone.
REZULTATE
Tulpinile de S. aureus analizate au fost izolate
din diferite zone ale spitalului, iar distribuţia lor în
fenotipuri MRSA sau MSSA este prezentată în Tabelul 1.
După cum se arată în Tabelul 1, cele mai multe
tulpini au provenit din urină şi cele mai puţine tulpini
au fost izolate din probe de sânge. Analiza a arătat
Corelație între biofilmul produs de MRSA şi MSSA
Tabelul 1. Distribuţia tulpinilor MSSA şi MRSA în diferite zone din spitalul Milad
Sânge
Plagă
Urină
Spută
Total
MRSA
9 (70%)
5 (35,7%)
17 (44,7%)
6 (40%)
37 (46,25%)
MSSA
4 (30%)
9 (64,3%)
21 (55,3%)
9 (60%)
43 (53,75%)
Total
13 (100%)
14 (100%)
38 (100%)
15 (100%)
80 (100%)
Tabelul 2. Frecvenţa biofilmelor la tulpinile MRSA în diferite zone din spitalul Milad
MRSA
Sânge
Plagă
Urină
Spută
Înaltă
1 (11%)
2 (40%)
5 (29,3%)
0
Moderată
4 (44,5%)
2(40%)
10 (59%)
3 (50%)
Scăzută
4 (44,5%)
1 (10%)
2 (11,7%)
3 (50%)
Total
9 (100%)
5 (100%)
17 (100%)
6 (100%)
Tabelul 3. Frecvenţa biofilmelor la tulpinile MSSA în diferite zone din spitalul Milad
MSSA
Sânge
Plagă
Urină
Spută
Înaltă
2 (50%)
2 (22%)
3 (14%)
1 (11%)
Moderată
1 (25%)
4 (44%)
14 (67%)
2 (22%)
Scăzută
1 (25%)
3 (34%)
4 (19%)
6 (66.7%)
Total
4 (100%)
9 (100%)
21 (100%)
9 (100%)
sugerează că nu există nici o corelaţie între sensibilitatea la meticilină şi capacitatea de a forma biofilme a tulpinilor de S. aureus.
Când capacitatea tulpinilor de a forma biofilm
a fost comparată prin asociere cu zona din care au
fost colectate de la pacient, s-a constatat că izolatele
de S. aureus care proveneau din urină aveau o capacitate semnificativ mai mare de a forma biofilme integrale şi moderate, decât tulpinile provenite din alte
zone ale organismului (P = 0,0005) (Tabelele 2, 3).
că majoritatea tulpinilor de MRSA au fost obţinute
din probe de sânge, în timp ce majoritatea celor de
MSSA proveneau din prelevate din plăgi.
Rezultatele au arătat că au fost obţinute 43 de
tulpini MSSA şi 37 MRSA, fiecare dintre acestea
fiind distribuite în trei grupuri: cele care produc biofilme pe deplin stabile (75% din biomasa biofilmului
formată de tulpina martor pozitivă producătoare de
biofilm), cele care formează biofilme moderat aderente (25-75%), precum şi cele care formează biofilme neglijabile (25%).
51,3%, (19 izolate) din cele 37 de tulpini MRSA
examinate au format biofilme moderat aderente.
Biofilmele neglijabile au fost formate de 27% (10
izolate) dintre izolatele MRSA, în timp ce 21,7% (8
izolate) dintre izolate au produs biofilme pe deplin
stabile. O mare parte dintre cele 43 de tulpini MSSA
examinate 48,8% (n = 21) au format biofilme moderat aderente, în comparaţie cu tulpina martor. Biofilme necuantificabile au fost produse de 32,5% (n
= 14) izolate MSSA, în timp ce 18,7% (n = 8) dintre
izolate au format biofilme stabile. Comparând aceste
rezultate cu ajutorul testelor statistice, s-a observat
că nu a existat nici o diferenţă semnificativă în ceea
ce priveşte numărul tulpinilor producătoare de biofilm între izolatele de S. aureus sensibile şi cele rezistente la meticilină (P = 0,89). Aceste rezultate
DISCUȚII
Infecţiile mediate de biofilm din mediul spitalicesc au un important impact negativ asupra sănătăţii
pacientului şi reprezintă o povară uriaşa pentru resursele de care dispun serviciile de sănătate [11]. Capacitatea agenţilor patogeni nosocomiali, precum S.
aureus, de a forma biofilme are importanţă clinică
semnificativă, deoarece formarea biofilmului influenţează eficacitatea terapiei antimicrobiene şi evoluţia ulterioară a unei infecţii [12].
O’Neill et al. [13] au studiat formarea biofilmelor în 114 izolate clinice de MRSA şi au constatat că
numai 9% au avut capacitatea de a forma biofilme
stabile. Studiul nostru, care a examinat un număr
mult mai mare de izolate colectate consecutiv de la
181
GHAFoURIAN et al.
pacienţi din spitalul Milad, a arătat că un număr de
două ori mai mare de tulpini au avut capacitatea de
a forma biofilme. Această diferenţă poate fi legată
de zonele de izolare a tulpinilor sau de genotipurile
MRSA circulante în diferitele zone geografice din
care au provenit tulpinile de studiu.
Capacitatea unei mari proporţii de izolate
MRSA şi MSSA de a forma biofilme moderat aderente şi pe deplin stabile poate explica de ce aceste
organisme predispun gazda la infecţie şi de ce acestea supravieţuiesc în mediul spitalicesc. Studiile au
arătat că, deşi nu există nici o diferenţă semnificativă
între ratele de infecţie nosocomială invazivă produsă
de MRSA și MSSA, rata mortalităţii este semnificativ mai mare în cazul infecţiilor produse de MRSA
din cauza rezistenţei acestora la tratamentul antimicrobian [14].
Aceasta analiză a furnizat informaţii importante
privind capacitatea izolatelor clinice de S. aureus de
a forma biofilme, relaţia dintre rezistenţa la meticilină şi formarea de biofilm, precum şi capacitatea diferitelor genotipuri de tulpini MRSA de a se dezvolta
sub formă de biofilm. Demonstrarea capacităţii izolatelor de S. aureus de a forma biofilme este un prim
pas în desluşirea mecanismelor implicate în formarea acestora. Operonul ica, care codifică o adezină
polizaharidică intercelulară, este în prezent cel mai
bine cunoscut mediator în dezvoltarea biofilmului
[15]; cu toate acestea, s-a descris şi biofilmul ica independent în a cărui dezvoltare și reglare au fost implicate proteinele Bap și SasG [13]. Studii mai
aprofundate privind mecanismele formării de biofilm la S. aureus vor ajuta în cele din urmă la managementul infecţiilor mediate de biofilm şi la
reducerea morbidităţii si a mortalităţii în rândul pacienţilor cu infecţii produse de această specie.
În concluzie, rezultatele noastre relevă absenţa
unei corelaţii între producerea de biofilm şi tulpinile
MRSA, demonstrând că structura genetică şi fenotipul de rezistenţă sunt trăsături distincte şi mecanisme
cumulate prin care aceste bacterii supravieţuiesc în
prezenţa substanţelor antimicrobiene.
BIBLIoGRAFIE
1. Gould, I. M. (2005). The clinical significance of methicillin-resistant Staphylococcus aureus. J Hosp Infect,
61, 277–282.
2. Gould, I. M. (2006). Costs of hospital-acquired methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA) and
its control. Int J Antimicrob Agents, 28, 379–384.
3. Hall-Stoodley, L., Costerton, J.W., Stoodley, P.
(2004). “Bacterial biofilms: from the natural environ182
ment to infectious diseases”. Nature Reviews. Microbiology 2 (2): 95–108.
4. Research on microbial biofilms (PA-03-047)”. NIH,
National Heart, Lung, and Blood Institute. 2002-1220. http://grants.nih.gov/grants/guide/pa-files/PA-03047.html.
5. Rogers, A. H. (2008). Molecular Oral Microbiology.
Caister Academic Press. pp. 65–108. ISBN 978-1904455-24-0. http://www.horizonpress.com/oral2.
6. Imamura, Y., Chandra, J., Mukherjee, P. K.( 2008).
“Fusarium and Candida albicans biofilms on soft contact lenses: model development, influence of lens type,
and susceptibility to lens care solutions”. Antimicrobial
Agents and Chemotherapy 52 (1): 171–82.
7. Oliveira, D. C., Tomasz, A. de Lencastre, H. (2001).
The evolution of pandemic clones of methicillin-resistant Staphylococcus aureus: identification of two ancestral genetic backgrounds and the associated mec
elements. Microb Drug Resist 7, 349–361.
8. Parsek, M. R. Fuqua, C. (2004). Biofilms 2003: emerging themes and challenges in studies of surface-associated microbial life. J Bacteriol 186, 4427–4440.
9. Donlan, R. M. (2001). Biofilms and device-associated
infections. Emerg Infect Dis 7, 277–281.
10. Mowat, E., Butcher, J., Lang, S., Williams, C. Ramage, G. (2007). Development of a simple model for
studying the effects of antifungal agents on multicellular communities of Aspergillus fumigatus. J Med
Microbiol 56, 1205–1212.
11. Donlan, R. M. Costerton, J. W. (2002). Biofilms:
survival mechanisms of clinically relevant microorganisms. Clin Microbiol Rev 15, 167–193.
13. O’Neill, E., Pozzi, C., Houston, P., Smyth, D.,
Humphreys, H., Robinson, D. R. O’Gara, J. P.
(2007). Association between methicillin susceptibility
and biofilm regulation in Staphylococcus aureus isolates from device-related infections. J Clin Microbiol
45, 1379–1388.
14. Melzer, M., Eykyn, S. J., Gransden, W. R. Chinn,
S. (2003). Is methicillin-resistant Staphylococcus aureus more virulent than methicillin- susceptible S. aureus? A comparative cohort study of British patients
with nosocomial infection and bacteremia. Clin Infect
Dis 37, 1453–1460.
15. Cramton, S. E., Gerke, C., Schnell, N. F., Nichols,
W. W. Gotz, F. (1999). The intercellular adhesion
(ica) locus is present in Staphylococcus aureus and is
required for biofilm formation. Infect Immun 67,
5427–5433.
CORReLATIONs AMONG DIFFeReNT MARKeRs DeTeRMINeD BY
IMMUNOCHeMICAL MeTHODs UseD FOR THe DIAGNOsIs AND
MONITORING OF INTACT IMMUNOGLOBULIN MULTIPLe MYeLOMA CAses
1Fundeni
Monica Dogaru1,2*, Veronica Lazãr2, Daniel Coriu1,3
clinical institute, Bucharest, romania; 2University of Bucharest, Faculty of Biology, microbiology immunology
Department, Bucharest, romania; 3“carol Davila” University of medicine and Pharmacy, Bucharest, romania
ABsTRACT
The purpose of this study was to determine the correlations between the concentration of free light chains
(κ, λ and ratio κ/λ) and two other markers, M- protein and pathological total intact immunoglobulin in
four groups of patients with intact immunoglobulin multiple myeloma (IIMM) at the diagnosis and
during the treatment.
In this study 354 samples coming from 46 patients with IIMM were assayed, out of which: 19, IgGκ;
13, IgGλ; 7, IgAκ; 7, IgAλ. At the diagnosis, immunofixation was positive in all samples and serum
protein electrophoresis quantified M- protein for all patients.
Free light chains concentrations were abnormal in 92.25% of patients with concentrations above the
reference ranges in all patients with IgGκ and IgAκ MM. The intact immunoglobulins were elevated
in 83.12 % of cases.
Pearson correlation coefficient showed correlations among the free light chains serum levels (κ, λ and
ratio κ/λ), M- protein and intact immunoglobulins in two groups with IIMM (IgGλ, IgAλ). Spearman
correlation coefficient values analysis showed that there is a good correlation between M- protein and
FLCs (κ, λ and ratio κ/λ) in three patient groups (IgGκ, IgGλ and IgAλ), excepting IgAκ myeloma group
where the correlation was insignificant. Regarding the intact immunoglobulin, Spearman coefficient
showed significant correlations with FLCs concentrations in two groups (IgGλ and IgAλ) and an insignificant correlation in the group with IgGκ MM. For the group of patients with IgAκ myeloma, the
Spearman coefficient showed that IgA concentrations did not correlate with the concentrations of FLCs.
The individual correlation (for each patient) among FLCs, M- protein and intact immunoglobulins in
8 patients with IgGκ IIMM proved to be more significant as compared with the degree of correlation
established for the entire group of patients among these markers.
Since the values obtained for the studied markers were not homogeneous, we have taken into account
the Spearman coefficient values, which indicated the existence of a correlation between the M- protein,
FLCs and intact immunoglobulin.
Keywords: multiple myeloma (MM), immunoglobulin, free light chains (FLC), immunofixation.
INTRoDUCTIoN
Monoclonal gammopathies are a group of
hematologic malignancies characterized by the excessive synthesis of monoclonal proteins with intact
structure or incomplete proteins (monoclonal free
light chains, monoclonal heavy chains) [1].
Usually, in monoclonal gammopathies, M- protein is identified using serum protein electrophoresis
(PEP), serum immunofixation electrophoresis (IFE)
and intact immunoglobulin quantification by radial
immunodiffusion [1]. Recently the International
Myeloma Working Group guidelines (2006) and
NCCN Guidelines (2011) strongly recommended the
introduction of serum free light chains assays for the
diagnosis, prognosis and monitoring of multiple
myeloma [2, 3].
Some studies emphasize the substantial clinical
*corresponding author: Monica Dogaru, e-mail: [email protected]
183
DoGARU et al.
utility for κ/λ ratio in screening for IIMM [4, 5, 6].
Due to the short serum half life of free light chains
compared with intact immunoglobulin, FLC assay is
more recommended in monitoring patients after induction therapy, especially of those with very low
M- protein [7, 8, 9].
The aim of this study was to determine correlations among three markers: M- protein, total intact
immunoglobulin and FLCs (free κ, free λ and κ/λ
ratio) at diagnosis and during the monitoring of patients with multiple myeloma.
In this study, we analyzed 354 serum samples
from 46 patients with IIMM (intact immunoglobulin
multiple myeloma) (19 - IgGκ; 13 - IgGλ; 7 - IgAκ;
7 - IgAλ) seen by the clinicians in the Division of
Haematology of Fundeni Clinical Institute.
Samples were collected at the time of diagnosis
and during the treatment with VAD and VELCADE
or after autologous PBSCT [10, 11].
For diagnosing and monitoring of multiple
myeloma we used four methods: nephelometric
quantification of FLCs [12, 13], serum protein electrophoresis [14], serum protein immunofixation and
radial immunodifusion. Serum protein electrophoresis and immunofixation were performed with the
SEBIA semiautomated [15] using Hydragel Protein
K20 and Hydragel Double Immunofixation K20 gels
from SEBIA.
To measure the FLC concentrations we used the
FREELITE reagent kits (The Bindingsite Ltd. Birmingham, UK) and BN ProSpec nephelometer [16,
17]. The free light chains reference ranges were established by the manufacturer as follows: Free κ
(3.30-19.40 mg/L); Free λ (5.71-26.30 mg/L); κ/λ
ratio (0.26-1.65) [18].
Total intact immunoglobulin IgG and IgA were
quantified by radial immunodiffusion using Easy
RID kits which consists in immunoplates with polyclonal monospecific antibodies incorporated in
agarose gels.
For the statistical evaluation we used two correlation coefficients: Spearman and Pearson calculated
with the SPSS 17 (Statistical Package for the Social
Sciences) program [19].
We measured the κ and λ FLC concentrations
and calculated the κ/λ ratio for the four groups of patients producing monoclonal immunoglobulin IgGκ,
IgGλ, IgAκ, IgAλ, and compared the results with
those obtained by PEP, IFE and RID (radial immunodiffusion).
184
RESULTS AND DISCUSSIoN
In this study, the patients were grouped according to the type of the synthesized pathological protein, i.e.: IgGκ, IgGλ, IgAκ, IgAλ followed by the
analysis of correlations between the FLC serum levels and the levels of M-protein and pathological
total intact immunoglobulin.
From the group of patients with IgGκ multiple
myeloma we selected 8 patients and for each patient
we made correlations between the following markers: M- protein, IgG, free κ light chains and κ/λ
ratio, whose values were determined both at diagnosis and during monitoring.
At diagnosis, M- protein was identified in all
samples and immunofixation was also positive in all
samples. Free κ light chain and κ/λ ratio were elevated in all patients with IgGκ and IgAκ myeloma, free
λ light chain concentrations being increased in 84.5%
(IgGλ) and 85.7% (IgAλ) respectively. IgG and IgA
concentrations were increased in 80.55 % and respectively 85.7% of the analyzed cases (Fig. 1).
At diagnosis, free light chain concentrations
were abnormal in 92.25 % of cases, with values
above the reference range in all the patients with
IgGκ and IgAκ multiple myeloma. The intact immunoglobulins were elevated in 83.12 % of cases.
Different studies reported elevated FLC concentrations in the individual myeloma serum samples of
89 % (Mead et al.), 86% (Solling et al.), and 92%
(Pika et al.) [20, 21, 22].
By analyzing 148 samples from 19 patients with
IgGκ multiple myeloma, the median concentrations
of the determined markers were: 54.8 mg/L (range
0.107-15700) for free κ light chain, 1.265g/dL
(range 0-15.09) for M- protein, 18.3 g/L (range
1.56-119) for IgG, 12.39 (range 0.15-9607)
for κ/λ ratio (Fig. 2).
By assessing correlations between FLCs, Mprotein and intact IgG we obtained different values
of Pearson and Spearman correlation coefficients indicated in Fig. 3.
According to Pearson coefficient values, there
is a strong correlation between M- protein and IgG,
but FLCs showed no correlation with serum levels
of M- protein (M- protein vs κFLC, r = 0.204) and
intact IgG (IgG vs κFLC, r = 0.133).
Spearman coefficient values showed a highly
significant correlation between protein and IgG
(r = 0.815) also a significant correlation between
M- protein and κFLC (r = 0.507) and between
M- protein and κ/λ ratio (r = 0.699). IgG was slightly
correlated with the free κ light chain (r = 0.351) and
κ/λ ratio (r = 0.481).
Immunological markers in multiple myeloma
Fig. 1. The percentage of patients with abnormal FLCs, M- protein and intact immunoglobulin at the diagnosis
Fig. 2. Distribution and median values of serum concentrations of M- protein, total IgG, κFLCs and FLC κ/λ ratio
in patients with IgGκ multiple myeloma
185
DoGARU et al.
Fig. 3. Pearson and Spearman correlation coefficients determined for patients with IgGκ multiple myeloma
Mead et al. (2004) also reported the lack of correlation between FLCs and IgG with a Pearson coefficient of -0.0145.
From the group of patients with IgGκ multiple
myeloma, eight patients were selected and for each
patient correlations among the tested markers were
established with the SPSS program at diagnosis and
during monitoring (Figs. 4 and 5).
The statistical analysis of the results revealed
the following: according to Pearson coefficient
M- protein correlated with IgG in 6 patients, with
free κ light chain and κ/λ ratio in all patients, IgG
correlated with free κ light chain in all patients and
with κ/λ ratio in 7 patients. The Spearman coefficient
showed that M- protein correlated with IgG in 5 patients, with free κ light chain in all patients, with κ/λ
ratio in 7 patients. IgG correlated with free κ light
chain in 5 patients and with κ/λ ratio in 4 patients.
Spearman correlation coefficient values were
above 0.618 for patients 8, 9, 12 and 14, suggesting
a good correlation between all analyzed markers.
This study showed that correlations among different
markers in individual patients is much better than for
the entire group.
The median serum concentrations of markers
determined by the analysis of 93 samples from
13 patients with IgGλ multiple myeloma, were:
29.1 mg/L (range 0.108 -6900) for free λ light chain,
0.84 g/dL (range 0- 8.67) for M- protein, 15.4 g/L
(range 4.63 – 125) for IgG, 0.067 (range 0.0001 –
5.30) for κ/λ ratio (Fig. 6).
Pearson coefficient values indicated a strong correlation between the M- protein and IgG (r = 0.885)
and a good correlation of M- protein with λ FLC (r
= 0.487). Also IgG correlated with λ FLC (r = 0.510).
Spearman coefficient values analysis indicated the
Fig. 4. Pearson correlation coefficients determined for 8 patients with IgGκ multiple myeloma
186
Fig. 5. Spearman correlation coefficients determined for 8 patients with IgGκ multiple myeloma
existence of good / very good correlations between:
M- protein and IgG (r = 0.822), M- protein and λ
FLC (r = 0.683), M- protein and κ/λ ratio (r = - 0.503)
and between IgG and λ FLC (r = 0.641) (Fig. 7).
Unlike our results, Mead et al. (2004), reported
a Pearson coefficient of 0.0037 (IgG vs λFLC), indicating also the lack of correlations between these
markers.
Fig. 6. Distribution and median values of serum concentrations of M- protein, total IgG, λ FLCs and FLC κ/λ ratio
in patients with IgGλ multiple myeloma.
187
DoGARU et al.
Fig. 7. Pearson and Spearman correlation coefficients determined for patients with IgGλ multiple myeloma
55 serum samples from 7 patients with IgAκ
multiple myeloma were analyzed and the median
concentrations of analyzed markers were: 35.6 mg/L
(range 1.1-18500) for free κ light chain, 0.780 g/dL
(range 0- 6.34) for M- protein, 16.2 g/L (range
0.354-63.4) for IgA, 7.15 (range 0.220-21919) for
κ/λ ratio (Fig. 8). For this group of patients the Pearson coefficient did not show a correlation between
Fig. 8. Distribution and median values of serum concentrations of M- protein, total IgA, κ FLCs and FLC κ/λ ratio
in patients with IgA κ multiple myeloma
188
Fig. 9. Pearson and Spearman correlation coefficients determined for patients with IgAκ multiple myeloma
serum FLC concentrations, M- protein and intact
immunoglobulin (M- protein vs κFLC, r = -0.207;
IgA vs κFLC, r = -0.330). Spearman coefficient
showed a slight correlation of M- protein with κFLC
(r = 0.335) and κ/λ ratio (r = 0.348) (Fig. 9).
The results obtained in this study are similar
Fig. 10. Distribution and median values of serum concentrations of M- protein, total IgA, λ FLCs and FLC κ/λ
ratio in patients with IgA λ multiple myeloma
189
DoGARU et al.
Fig. 11. Pearson and Spearman correlation coefficients determined for patients with IgAλ multiple myeloma
with those presented by Mead et al. (2004), that
show no correlation between the intact IgA and
κ serum free light chains (Pearson coefficient,
r = 0.212).
Median concentrations of the investigated markers determined by the analysis of 58 serum samples
from 7 patients with IgAλ multiple myeloma patients
were: 22.85 mg/L (range 0.99 -1320) for free λ light
chain, 0.180 g/dL (range 0- 4.6) for M- protein,
5.53 g/L (range 0.508-63.4) for IgA, 0.100 (range
0.0002-2.67) for κ/λ ratio (Fig. 10).
Pearson coefficient revealed a very significant
correlation between M- protein and IgA (r = 0.915)
and slight correlations between M- protein, λ FLC
and κ/λ ratio. IgA poorly correlated with λ FLC and
κ/λ ratio. The study made by Mead et al. (2004) revealed no correlations between IgA and λFLC (Pearson coefficient, r = -0.0330). Spearmen coefficient
values indicated a high correlation between M- protein and IgA (r = 0.848) and good correlations between M- protein, λ FLC and κ/λ ratio (M- protein
vs. λ FLC, r = 0.437; M- protein vs. κ/λ ratio, r = 0.665). Also IgA correlated with λ FLC and κ/λ ratio
(IgA vs. λ FLC, r = 0.454; IgA vs. κ/λ ratio, r = 0.644) (Fig. 11).
CoNCLUSIoNS
Upon diagnosis, the immunofixation was positive in all samples and serum protein electrophoresis
quantified M- protein for all patients.
Free light chains concentrations were abnormal
in 92.25 % of samples, with values above the reference ranges in all patients with IgGκ and IgAκ mul190
tiple myeloma. The intact immunoglobulins were
elevated in 83.12 % of cases.
In patients with normal free light chain concentrations at the first presentation, serum protein electrophoresis and serum immunofixation electrophoresis proved to be more sensitive in diagnosis of intact immunoglobulin multiple myeloma.
Pearson correlation coefficient showed correlations between free light chains serum levels (κ, λ and
ratio κ/λ), M- protein and intact immunoglobulins in
two groups with IIMM (IgGλ, IgAλ).
Spearman correlation coefficient values analysis
showed that there is a good correlation between
M- protein and FLCs (κ, λ and ratio κ/λ) in three
groups (IgGκ, IgGλ and Ig λ) except IgAκ myeloma
group where the correlation is insignificant. Regarding the intact immunoglobulin, the Spearman coefficient showed significant correlations with FLCs
concentrations in two groups (IgGλ and IgAλ) and
insignificant correlation in the group with IgGκ MM.
For the group of patients with IgAκ myeloma, Spearman coefficient showed that IgA concentrations did
not correlate with the concentrations of FLCs.
This study showed that individual correlations,
for each patient, among FLCs, M- protein and intact
immunoglobulins are more significant as compared
with those established for the entire group of patients.
Since the values obtained for the studied markers were not homogeneous, we have taken into account the Spearman coefficient values, indicating the
existence of a good correlation among the M protein,
FLCs and intact immunoglobulin markers.
REFERENCES
1. Katzmann JA, Kyle RA, Joanne Benson, Larson DR, Melissa Snyder, Lust JA, Rajkumar SV, Angela Dispenzieri.
Screening Panels for Detection of Monoclonal Gammopathies. Clin Chem 2009. 55: 1517-1522.
2. Dispenzieri A, Kyle R, Merlini G, Miguel JS, Ludwig H,
Hajek R et al. International MyelomaWorking Group guidelines for serum-free light chain analysis in multiple myeloma
and related disorders. Leukemia 2009. 23: 215–24.
3. Kenneth C, Anderson et al. Multiple Myeloma. J Natl
Compr Canc Netw 2011. 9: 1146-1183.
4. Hill PG, Forsyth JM, Rai B, Mayane S. Serum free light
chains: an alternative to the urine Bence Jones proteins
screening tests for monoclonal gammopathies. Clin Chem
2006. 52: 1743-8.
5. Kyrtsonis MC, Vassilakopoulos TP, Kafasi N, Sachanas
S, Tzenou T, Papadgiannis A et al. Prognostic value of
serum free light chain ratio at diagnosis in multiple myeloma.
Br J Haematol 2007. 137: 240-243.
6. Snozek CLH, Katzmann JA, Kyle RA, Dispenzieri A, Larson DR, Clark RJ et al. Prognostic value of the serum free
light chain ratio in patients with newly diagnosed myeloma:
proposed incorporation into the International Staging System.
Leukemia 2008. 22: 1933-1937.
7. Mead GP, Carr-Smith HD, Drayson MT, Morgan GJ,
Child JA, Bradwell AR. Serum free light chains for monitoring multiple myeloma. Br J Haematology 2004. 126: 348354.
8. Kyrtsonis MC, Vassilakopoulos TP, Kafasi N, Sachanas S,
Papadogiannis A et al. Prognostic value of serum free light
chain ratio at diagnosis in multiple myeloma. Br J Haematol
2007. 137: 240-243.
9. Tate JR, Devinder G, Cobcroft R, Hickman PE. Practical
considerations for the measurement of free light chains in
serum. Clin Chem 2003. 49: 1252-1257.
10. Dick LR, Fleming PE. Building on bortezomib: second
generation proteasome inhibitors as anti-cancer therapy.
Drug Discovery Today 2010. 15: 243- 249.
11. Zamagni Elena, Patriarca Francesca, Nanni C et al. Prognostic relevance of 18-F FDG PET/CT in newly diagnosed
multiple myeloma patients treated with up-front autologous
transplantation. Blood 2011. 118 (23): 5989-95.
12. Bradwell AR. Serum free light chains analysis ( plus
Hevylite), 6th edition. The Binding Site Group Ltd. Birmingham, Birmingham 2010, pag 90.
13. Bradwell AR, Carr-Smith HD, Mead GP, Tang LX,
Showell PJ, Drayson MT, Drew R. Highly sensitive automated immunoassay for immunoglobulin free light chains
in serum and urine. Clin Chem 2001. 47: 673–80.
14. Katzmann JA, Stankowski-Drengler TJ, Kyle RA, Lockington Karen S, Snyder Melissa R, Lust JA, Dispenzieri
A. Specificity of serum and urine protein electrophoresis for
the diagnosis of monoclonal gammopathies. Clin Chem
2010. 56: 1899-1900.
15. Bossuyt X, Bogaerts Ann, Schiettekatte G, Blanckaert N.
Serum protein electrophoresis and immunofixation by a
semiautomated electrophoresis system. Clin Chem 1998. 44:
944-949.
16. Jaskowski TD, Litwin Christine M, Hill RH. Detection of
κ and λ light chain monoclonal proteins in human serum:
automated immunoassay versus immunofixation electrophoresis. Clinical and Vaccine Immunology 2006. 13: 277280.
17. Bradwell AR, Carr-Smith HD, Mead GP, Drayson MT.
Serum free light chain immunoassays and their clinical application. Clinical and Applied Immunology Reviews 2002.
3: 17–33.
18. Katzmann JA, Clark RJ, Abraham RS, Bryant S, Lymp
JF, Bradwell AR, Kyle RA. Serum reference intervals and
diagnostic ranges for free κ and free λ immunoglobulin light
chains: relative sensitivity for detection of monoclonal light
chains. Clin Chem 2002. 48: 1437– 44.
19. Landau Sabine, Everitt BS. A Handbook of Statistical
Analyses using SPSS. CRC Press Company, Washington
DC 2004.
20. Mead GP, Carr-Smith HD, Drayson MT, Morgan GJ.,
Child JA, Bradwell AR. Serum free light chains for monitoring multiple myeloma. Br J Haematol 2004. 126: 348- 54.
21. Solling K, Lanng NJ, Solling J, Ellegaard J. Free light
chains of immunoglobulins in serum from patients with
leukaemias and multiple myeloma. Scandinavian Journal of
Haematology 1982. 28: 309–318.
22. Pika T, Jiri MJ, Schneiderkab P et al. The correlation of
serum immunoglobulin free light chain levels and selected
biological markers in multiple myeloma. Biomed Pap Med
Fac Univ Palacky Olomouc Czech Repub 2008. 152(1): 61–
64.
191
COReLAÞII ALe UNOR MARKeRI, DeTeRMINAÞI PRIN MeTODe
IMUNOCHIMICe, UTILIZAÞI PeNTRU DIAGNOsTICUL ŞI MONITORIZAReA
MIeLOMULUI MULTIPLU CU IMUNOGLOBULINÃ INTACTÃ
1institutul
Monica Dogaru1,2*, Veronica Lazãr2, Daniel Coriu1,3
clinic Fundeni, Bucureşti, românia; 2Universitatea Bucureşti, Facultatea de Biologie, Departamentul de
microbiologie şi imunologie, Bucureşti, românia; 3Universitatea de medicinã şi Farmacie „carol Davila”, Bucureşti, românia
ReZUMAT
Scopul acestui studiu este stabilirea unor corelaţii între concentraţia lanţurilor uşoare libere (κ, λ şi
raportul κ/λ) şi alţi doi markeri, proteina M şi imunoglobulina intactă patologică, la patru grupuri de
pacienţi cu mielom multiplu cu imunoglobulină intactă (IIMM), la diagnostic şi pe parcursul tratamentului. În acest studiu, au fost analizate 354 probe provenite de la 46 de pacienţi cu IIMM: 19,
IgGκ; 13, IgGλ; 7, IgAκ; 7, IgAλ. La diagnostic, metoda imunofixării a fost pozitivă pentru toate probele, iar electroforeza proteinelor serice a identificat proteina M pentru toţi pacienţii.
Valorile cantitative ale lanţurilor κ și λ au fost crescute, la 92,25% din cazuri, cu concentraţii peste intervalul de referinţă la toţi pacienţii diagnosticaţi cu mielom multiplu IgGκ şi IgAκ. Imunoglobulinele
intacte, determinate prin metoda IDRS, au avut concentraţii crescute în 83,12% din cazuri.
Coeficientul de corelaţie Pearson a indicat corelaţii între nivelele serice ale lanţurilor uşoare libere (κ,
λ şi raportul κ/λ), proteina M şi imunoglobulina intactă la două grupuri cu IIMM (IgGλ și IgAλ). Analiza
valorilor coeficientului Spearman a evidenţiat corelaţii semnificative între proteina M şi lanţurile uşoare
libere (κ, λ şi raportul κ/λ) la trei grupuri de pacienţi cu IIMM (IgGκ, IgGλ şi IgAλ), cu excepţia grupului
cu mielom IgAκ unde corelaţiile au fost nesemnificative. În ceea ce priveşte concentraţia imunoglobulinei intacte, coeficientul Spearman a evidenţiat corelaţii semnificative cu concentraţiile lanţurilor uşoare
libere la două grupuri de pacienţi (IgGλ şi IgAλ) şi corelaţii nesemnificative la grupul cu mielom IgGκ.
Pentru grupul cu mielom IgAκ, nu au fost observate corelaţii între IgA şi lanţurile uşoare.
Corelaţia individuală a concentraţiilor lanţurilor uşoare, proteinei M şi imunoglobulinei intacte la 8
pacienţi cu mielom a fost semnificativă în comparaţie cu gradul de corelaţie al markerilor pentru întregul grup de pacienţi. Având în vedere că valorile obţinute pentru markerii studiaţi nu au fost omogene, am luat in consideraţie valorile coeficientului Spearman care au indicat existenţa corelaţiilor
între proteina M, lanţurile uşoare şi imunoglobulina intactă.
Cuvinte cheie: mielom multiplu cu imunoglobulină intactă (IIMM), imunoglobulină, lanţuri uşoare libere
(FLC), imunofixare.
INTRoDUCERE
Gamopatiile monoclonale reprezintă un grup de
malignităţi hematologice caracterizate prin sinteza
în exces a proteinelor monoclonale cu structură intactă sau molecule incomplete (lanţuri uşoare monoclonale sau lanţuri grele monoclonale) [1].
În mod obişnuit, în gamopatiile monoclonale,
proteina M este identificată utilizând metoda electroforezei (EF) şi imunofixării (IFE) proteinelor se-
rice, precum şi cuantificarea imunoglobulinei intacte
prin medoda IDRS [1]. Recent, ghidurile Grupului
International de Lucru pentru Mielom (2006) şi ghidurile NCCN (2011) au recomandat introducerea
metodei nefelometrice de cuantificare a lanţurilor
uşoare libere pentru diagnosticul şi monitorizarea
mielomului multiplu [2, 3].
Unele studii au accentuat utilitatea clinică substanţială a raportului κ/λ în screeningul IIMM [4, 5,
6]. Datorită timpului de injumătăţire mai scurt, în
comparaţie cu cel al imunoglobulinelor, determina-
*autor corespondent: Monica Dogaru, e-mail: [email protected]
192
Markeri imunologici în mielomul multiplu
rea cantitativă a lanţurilor uşoare este recomandată
pentru monitorizarea pacienţilor care au beneficiat
de tratament, mai ales a celor care au concentraţii serice mici de proteină M [7, 8, 9].
Obiectivul principal al acestui studiu a fost stabilirea unor corelaţii, la pacienţii cu mielom multiplu
cu imunoglobulină intactă, între următorii markeri:
prezenţa proteinei M detectată la EF; gamaglobulina
intactă (prin metoda IDRS); concentraţia lanţurilor
L libere (κ, λ) şi raportul κ/λ (metoda nefelometrică),
atât la diagnostic, cât şi pe parcursul monitorizării.
MATERIALE ªI METoDE
Au fost analizate 354 de probe de ser provenite
de la 46 de pacienţi cu IIMM (19 - IgGκ; 13 - IgGλ;
7 - IgAκ; 7 - IgAλ), consultaţi la Clinica de Hematologie a Institutului Clinic.
Probele au fost recoltate atât la diagnostic, cât
şi pe parcursul tratamentului cu VAD şi VELCADE
sau transplant autolog de maduvă (PBSCT) [10, 11].
Pentru diagnosticul şi monitorizarea mielomului
multiplu au fost utilizate patru metode: cuantificarea
nefelometrică a lanţurilor uşoare [12, 13], separarea
electroforetică a proteinelor serice [14], urmată de
imunofixare şi IDRS. Electroforeza şi imunofixarea
proteinelor serice au fost realizate cu aparatul semiautomat SEBIA [15], utilizând kit-uri Hydragel Protein
K20 şi Hydragel Double Immunofixation K20.
Cuantificarea lanţurilor uşoare a fost realizată
utilizând kit-ul FREELITE (The Bindingsite Ltd. Birmingham, UK) şi nefelometrul BN ProSpec [16, 17].
Intervalele de referinţă ale lanţurilor uşoare au fost
stabilite de către producător după cum urmează: lanţ
liber Lκ (3,30-19,40 mg/L); lanţ liber Lλ (5,71-26,30
mg/L); raport κ/λ (0,26-1,65) [18].
Concentraţiile imunoglobulinelor intacte IgG şi
IgA au fost determinate prin imunodifuzia radială
simplă utilizând kit-urile Easy RID ce constau din
imunoplăci care au un anticorp monospecific policlonal încorporat în gelul de agaroză.
Pentru interpretarea statistică a valorilor obţinute au fost utilizaţi doi coeficienţi de statistică descriptivă: Pearson şi Spearman, calculaţi cu ajutorul
programului SPSS, varianta numărul 17 [19].
Au fost determinate concentraţiile lanţurilor
uşoare libere (κ și λ) şi a fost calculat raportul κ/λ
pentru patru grupuri de pacienţi cu IIMM: IgGκ,
IgGλ, IgAκ şi IgAλ, şi rezultatele au fost comparate
cu cele obţinute prin electroforeză şi imunofixarea
proteinelor serice şi imunodifuzia radială simplă.
REZULTATE ŞI DISCUÞII
În acest studiu pacienţii au fost grupaţi în funcţie de tipul de proteină patologică pe care o sintetizează: IgGκ, IgGλ, IgAκ, IgAλ. Au fost stabilite
corelaţii între markerii serici detectaţi prin metodele
menţionate: lanţurile Lk şi λ, proteina M şi gamaglobulina intactă patologică.
Din grupul de pacienţi cu mielom IgGκ au fost
selectaţi 8 pacienţi, pentru care s-au stabilit corelaţii
individuale ale următorilor markeri: proteina M,
IgG, lanţurile libere Lκ şi Lλ şi raportul κ/λ, ale căror
valori au fost determinate atât la diagnostic, cât şi pe
parcursul monitorizării.
La diagnostic, proteina M a fost identificată în
toate probele, iar imunofixarea a evidenţiat izotipul
şi tipul imunoglobulinei. Lanţul liber Lκ şi raportul
κ/λ au avut valori crescute la toţi pacienţii cu mielom
IgGκ şi IgAκ, concentraţiile lanţului liber Lλ fiind
crescute în proporţie de 84,5% (IgGλ) şi 85,7%
(IgAλ). Concentraţiile IgG şi IgA au fost crescute în
proporţie de 80,55% şi respectiv, 85,7% din cazuri
(Fig. 1).
La diagnostic, concentraţia lanţurilor libere L a
fost crescută la 92,25% dintre pacienţi, cu valori
peste intervalul de referinţă la toţi pacienţii cu mielom IgGκ şi IgAκ. Concentraţiile imunoglobulinei
intacte au fost crescute la 83,12% dintre cazuri.
Diferite studii realizate pe loturi de pacienţi cu
mielom multiplu, au raportat valori crescute ale lanţurilor uşoare, astfel: 89 % (Mead şi colab.), 86%
(Solling şi colab.) şi 92% (Pika şi colab) [20, 21, 22].
Analizând 148 de probe provenite de la 19 pacienţi cu mielom IgGκ, au fost stabilite următoarele
valori ale medianei concentraţiilor markerilor determinaţi: 54,8 mg/L (intervalul 0,107 -15700) pentru
lanţul uşor liber κ, 1,265g/dL (intervalul 0 - 15,09)
pentru proteina M, 18,3 g/L (intervalul 1,56 - 119)
pentru IgG, 12,39 (intervalul 0,15 - 9607) pentru raportul κ/λ (Fig. 2).
Corelaţiile între lanţul usor κ, raportul κ/λ, proteina M şi IgG, valorile corespunzătoare ale coeficienţilor Pearson şi Spearman sunt indicate în Fig. 3.
Conform valorilor obţinute pentru coeficientul
Pearson, între proteina M şi IgG este o strânsă corelaţie, în schimb lanţul uşor liber κ nu se corelează cu
nivelele serice ale proteinei M (corelaţia proteina
M - lanţ κ, r = 0,204) şi IgG (corelaţia IgG - lanţ uşor
κ, r = 0,133).
Coeficientul Spearman a indicat o corelaţie înalt
semnificativă între proteina M şi IgG (r = 0,815),
de asemenea, o corelaţie semnificativă între proteina
M şi lanţul Lκ liber (r = 0,507) şi proteina M şi
193
DoGARU et al.
Fig. 1. Reprezentarea grafică a procentului pacienţilor cu valori anormale
ale lanţurilor uşoare, proteinei M şi imunoglobulinei intacte la diagnostic
194
Fig. 2. Distribuţia şi mediana valorilor concentraţiilor proteinei M, IgG,
lanţului uşor κ şi raportului κ/λ la pacienţii cu mielom IgGκ
Fig. 3. Coeficienţii de corelaţie Pearson şi Spearman pentru grupul de pacienţi cu mielom IgGκ
raportul κ/λ (r = 0,699). IgG s-a corelat foarte puţin
cu Lk liber (r = 0,351) şi raportul κ/λ (r = 0,481).
Mead si colab. (2004) au raportat, de asemenea,
prin intermediul coeficientului Pearson, lipsa corelaţiei între lanţul uşor κ şi IgG (r = -0,0145).
Din grupul de pacienţi cu mielom IgGκ, au fost
selectaţi 8 pacienţi, iar pentru fiecare pacient au fost
stabilite corelaţii cu ajutorul programului de statistică SPSS, varianta 17, între markerii: proteina M ,
IgG, lanţul Lk liber şi raportul κ/λ, determinaţi atât
la diagnostic, cât şi pe parcursul monitorizării (Fig.
4 şi 5).
Analiza statistică a rezultatelor a evidenţiat următoarele: conform coeficientului Pearson proteina
M s-a corelat cu IgG la 6 pacienţi, iar cu lanţul uşor
liber κ şi raportul κ/λ la toţi pacienţii. IgG s-a corelat
cu lanţul uşor liber κ la toţi pacienţii, iar cu raportul
κ/λ la 7 pacienţi.
Coeficientul Spearman a evidenţiat următoarele:
proteina M s-a corelat cu IgG la 5 pacienţi, cu lanţul
usor liber κ la toţi pacienţii, iar cu raportul κ/λ, la 7
pacienţi. IgG s-a corelat cu lanţul uşor liber κ la 5
pacienţi iar cu raportul κ/λ la 4 pacienţi.
Valorile coeficientului de corelaţie Spearman au
fost peste 0,618 în cazul pacienţilor 8, 9, 12 şi 14,
ceea ce sugerează o foarte bună corelaţie între toţi
markerii analizaţi.
Acest studiu demonstrează că valorile coeficienţilor de corelaţie sunt mult mai bune atunci când se
fac corelaţii individuale, pentru fiecare pacient, între
diverşi markeri, în comparaţie cu cele obţinute prin
analiza întregului grup de pacienţi.
Valorile medianei concentraţiilor markerilor determinate după analiza a 93 de probe provenite de la
13 pacienţi cu mielom IgGλ au fost: 29,1 mg/L
(intervalul 0,108 - 6900) pentru lanţul uşor liber λ,
Fig. 4. Coeficientul de corelaţie Pearson, stabilit pentru 8 pacienţi cu mielom IgGκ
195
DoGARU et al.
Fig. 5. Coeficientul de corelaţie Spearman stabilit pentru 8 pacienţi cu mielom IgGκ
0,84 g/dL (intervalul 0 – 8,67) pentru proteina M,
15,4 g/L (intervalul 4,63 - 125) pentru IgG, 0,067
(intervalul 0,0001 – 5,30) pentru raportul κ/λ
(Fig. 6).
Valorile coeficientului Pearson au evidenţiat o
corelaţie puternică între proteina M şi IgG (r =
0,885) şi o corelaţie bună între proteina M şi lanţul
uşor liber λ (r = 0,487). De asemenea, IgG s-a corelat
Fig. 6. Distribuţia şi mediana valorilor concentraţiilor proteinei M, IgG,
lanţului uşor λ şi raportului κ/λ la pacienţii cu mielom IgGλ
196
Fig. 7. Coeficienţii de corelaţie Pearson şi Spearman stabiliţi pentru grupul de pacienţi cu mielom IgGλ
cu lanţul uşor liber λ (r = 0,510). Analiza valorilor
coeficientului Spearman denotă existenţa unor corelaţii bune şi foarte bune între: proteina M şi IgG
(r = 0,822), proteina M şi lanţul uşor liber λ (r =
0,683), proteina M şi raportul κ/λ (r = -0,503) şi IgG
şi lanţul uşor liber λ (r = 0,641) (Fig. 7).
Spre deosebire de rezultatele obţinute în acest
studiu, Mead şi colab. (2004) au raportat o valoare a
Fig. 8. Distribuţia şi mediana valorilor concentraţiilor proteinei M, IgA,
lanţului uşor κ şi raportului κ/λ la pacienţii cu mielom IgAκ
197
DoGARU et al.
Fig. 9. Coeficienţii de corelaţie Pearson şi Spearman determinaţi pentru grupul de pacienţi cu mielom IgAκ
coeficientului de corelaţie Pearson de 0,0037, între
IgG şi lanţul Lλ liber, indicând lipsa corelaţiei între
aceşti markeri.
Au fost analizate 55 de probe provenite de la 7
pacienţi cu mielom IgAκ, iar mediana concentraţiilor
markerilor analizaţi a fost: 35,6 mg/L (intervalul
Fig. 10. Distribuţia şi mediana valorilor concentraţiilor proteinei M, IgA,
lanţului uşor λ şi raportului κ/λ la pacienţii cu mielom IgAλ
198
Fig. 11. Coeficienţii Pearson şi Spearman determinaţi pentru grupul de pacienţi cu mielom IgAλ
1,1 - 18500) pentru lanţul uşor liber κ, 0,780 g/dL
(intervalul 0 - 6,34) pentru proteina M, 16,2 g/L (intervalul 0,354 - 63,4) pentru IgA, 7,15 (intervalul
0,220 - 21919 ) pentru raportul κ/λ (Fig. 8).
Pentru acest grup de pacienţi, coeficientul Pearson nu a evidenţiat corelaţii între concentraţiile lanţurilor uşoare libere, proteina M şi imunoglobulina
intactă (corelaţia proteina M – lanţ uşor liber κ, r = 0,207; corelaţia IgA – lanţ uşor liber κ, r = -0,330).
Conform coeficientului Spearman, proteina M s-a
corelat într-o mică măsură cu lanţul uşor liber κ şi
raportul κ/λ (corelaţia proteina M – lanţ uşor liber κ,
r = 0,335; corelaţia proteina M - raportul κ/λ, r =
0,348) (Fig. 9).
Rezultatele obţinute în acest studiu sunt asemănătoare cu cele ale lui Mead şi colab. (2004), care
evidenţiază absenţa corelaţiei între IgA şi lanţul uşor
liber κ (coeficientul Pearson, r = 0,212).
Mediana concentraţiilor markerilor determinaţi
după analiza a 58 de probe provenite de la 7 pacienţi
cu mielom IgAλ a fost: 22,85 mg/L (intervalul 0,99
-1320) pentru lanţul uşor λ, 0,180 g/dL (intervalul 0
- 4,6) pentru proteina M, 5,53 g/L (intervalul 0,508
- 63,4) pentru IgA, 0,100 (intervalul 0,0002 - 2,67)
pentru raportul κ/λ (Fig. 10).
Coeficientul Pearson a evidenţiat corelaţii semnificative ale proteinei M cu IgA (r = 0,915) şi corelaţii nesemnificative între proteina M, lanţul uşor
liber λ şi raportul κ/λ. Între IgA, lanţul uşor liber λ
şi raportul κ/λ corelaţiile au fost nesemnificative. De
asemenea, studiul realizat de Mead şi colab. (2004),
a semnalat absenţa corelaţiei între IgA şi lanţul uşor
liber λ ( coeficient Pearson, r = -0,0330). Valoarea
coeficientului Spearman indică o corelaţie înaltă a
proteinei M cu IgA (r = 0,848) şi una semnificativă
cu lanţul uşor liber λ şi raportul κ/λ (corelaţia proteina M – lanţul uşor liber λ, r = 0,437; corelaţia proteina M - raportul κ/λ, r = -0,665), iar între valorile
IgA, lanţul uşor λ şi raportul κ/λ s-au stabilit corelaţii
semnificative (corelaţia IgA - lanţul uşor λ, r = 0,454;
corelaţia IgA raportul κ/λ, r = -0,644) (Fig. 11).
CoNCLUZII
La diagnostic, metodele electroforezei şi imunofixării proteinelor serice au identificat proteina M
pentru toţi pacienţii analizaţi.
Valorile cantitative ale raportului Lκ şi Lλ au
fost situate în afara intervalului de referinţă în
92,25% din cazuri, cu concentraţii peste intervalul
de referinţă la toţi pacienţii cu mielom multiplu IgGκ
şi IgAκ. Imunoglobulinele intacte au avut concentraţii crescute în 83,12% din cazuri.
Pentru pacienţii cu mielom multiplu care sintetizează imunoglobulină intactă şi cu valori normale
ale concentraţiei lanţurilor L, electroforeza şi imunofixarea proteinelor serice au fost metode eficiente de
diagnostic.
Coeficientul de corelaţie Pearson a indicat corelaţii semnificative între nivelele serice ale lanţurilor L libere (κ, λ şi raportul κ/λ), proteina M şi
imunogobulina intactă la două grupuri cu IIMM
(IgGλ si IgAλ). Analiza valorilor coeficientului
Spearman a evidenţiat corelaţii semnificative între
proteina M şi lanţurile L libere (κ, λ şi raportul κ/λ)
la trei grupuri de pacienţi cu IIMM (IgGκ, IgGλ şi
IgAλ), cu excepţia grupului cu mielom IgAκ, la care
corelaţiile au fost nesemnificative. În ceea ce priveşte imunoglobulina intactă, coeficientul Spearman
199
DoGARU et al.
a evidenţiat corelaţii semnificative cu valorile cantitative ale lanţurilor uşoare libere la două grupuri de
pacienţi (IgGλ and IgAλ) şi corelaţii nesemnificative
la grupul cu mielom IgGκ. Pentru grupul de pacienţi
cu mielom IgAκ, valorile concentraţiei IgA nu se corelează cu concentraţia lanţurilor uşoare.
Analiza individuală a parametrilor menţionaţi
(concentraţia lanţurilor Lk, Lλ şi a raportului κ/λ),
precum şi a proteinei M şi imunoglobulinei intacte
patologice, evidenţiază un grad semnificativ de corelaţie, comparativ cu statistica aplicată întregului
grup.
Ţinând cont de faptul că valorile obţinute pentru
markerii studiaţi nu au fost omogene, au fost luate
în consideraţie valorile coeficientului Spearman care
au indicat existenţa corelaţiilor între proteina M, lanţurile uşoare şi imunoglobulinele intacte.
BIBLIoGRAFIE
1. Katzmann JA, Kyle RA, Joanne Benson, Larson
DR, Melissa Snyder, Lust JA, Rajkumar SV, Angela
Dispenzieri. Screening Panels for Detection of Monoclonal Gammopathies. Clin Chem 2009. 55: 15171522.
2. Dispenzieri A, Kyle R, Merlini G, Miguel JS, Ludwig H, Hajek R et al. International MyelomaWorking
Group guidelines for serum-free light chain analysis in
multiple myeloma and related disorders. Leukemia
2009. 23 : 215–24.
3. Kenneth C, Anderson et al. Multiple Myeloma. J Natl
Compr Canc Netw 2011. 9: 1146-1183.
4. Hill PG, Forsyth JM, Rai B, Mayane S. Serum free
light chains: an alternative to the urine Bence Jones
proteins screening tests for monoclonal gammopathies.
Clin Chem 2006. 52: 1743-8.
5. Kyrtsonis MC, Vassilakopoulos TP, Kafasi N, Sachanas S, Tzenou T, Papadgiannis A et al. Prognostic value of serum free light chain ratio at diagnosis in
multiple myeloma. Br J Haematol 2007. 137: 240-243.
6. Snozek CLH, Katzmann JA, Kyle RA, Dispenzieri
A, Larson DR, Clark RJ et al. Prognostic value of the
serum free light chain ratio in patients with newly diagnosed myeloma: proposed incorporation into the International Staging System. Leukemia 2008. 22:
1933-1937.
7. Mead GP, Carr-Smith HD, Drayson MT, Morgan
GJ, Child JA, Bradwell AR. Serum free light chains
for monitoring multiple myeloma. Br J Haematology
2004. 126: 348-354.
8. Kyrtsonis MC, Vassilakopoulos TP, Kafasi N, Sachanas S, Papadogiannis A et al. Prognostic value of
serum free light chain ratio at diagnosis in multiple
myeloma. Br J Haematol 2007. 137: 240-243.
9. Tate JR, Devinder G, Cobcroft R, Hickman PE.
Practical considerations for the measurement of free
light chains in serum. Clin Chem 2003. 49: 1252-1257.
200
10. Dick LR, Fleming PE. Building on bortezomib: second generation proteasome inhibitors as anti-cancer
therapy. Drug Discovery Today 2010. 15: 243- 249.
11. Zamagni Elena, Patriarca Francesca, Nanni C et
al. Prognostic relevance of 18-F FDG PET/CT in
newly diagnosed multiple myeloma patients treated
with up-front autologous transplantation. Blood 2011.
118 (23): 5989-95.
12. Bradwell AR. Serum free light chains analysis (plus
Hevylite), 6th edition . The Binding Site Group Ltd.
Birmingham, Birmingham 2010, pag 90.
13. Bradwell AR, Carr-Smith HD, Mead GP, Tang LX,
Showell PJ, Drayson MT, Drew R. Highly sensitive
automated immunoassay for immunoglobulin free light
chains in serum and urine. Clin Chem 2001. 47: 673–
80.
14. Katzmann JA, Stankowski-Drengler TJ, Kyle RA,
Lockington Karen S, Snyder Melissa R, Lust JA,
Dispenzieri A. Specificity of serum and urine protein
electrophoresis for the diagnosis of monoclonal gammopathies. Clin Chem 2010. 56: 1899-1900.
15. Bossuyt X, Bogaerts Ann, Schiettekatte G, Blanckaert N. Serum protein electrophoresis and immunofixation by a semiautomated electrophoresis system.
Clin Chem 1998. 44: 944-949.
16. Jaskowski TD, Litwin Christine M, Hill RH. Detection of κ and λ light chain monoclonal proteins in
human serum: automated immunoassay versus immunofixation electrophoresis. Clinical and Vaccine Immunology 2006. 13: 277- 280.
17. Bradwell AR, Carr-Smith HD, Mead GP, Drayson
MT. Serum free light chain immunoassays and their
clinical application. Clinical and Applied Immunology
Reviews 2002. 3: 17–33.
18. Katzmann JA, Clark RJ, Abraham RS, Bryant S,
Lymp JF, Bradwell AR, Kyle RA. Serum reference
intervals and diagnostic ranges for free κ and free λ immunoglobulin light chains: relative sensitivity for detection of monoclonal light chains. Clin Chem 2002.
48: 1437– 44.
19. Landau Sabine, Everitt BS. A Handbook of Statistical Analyses using SPSS. CRC Press Company, Washington DC 2004.
20. Mead GP, Carr-Smith HD, Drayson MT, Morgan
GJ.Child JA, Bradwell AR. Serum free light chains
for monitoring multiple myeloma. Br J Haematol
2004. 126: 348- 54.
21. Solling K, Lanng NJ, Solling J, Ellegaard J. Free
light chains of immunoglobulins in serum from patients with leukaemias and multiple myeloma. Scandinavian Journal of Haematology 1982. 28: 309–318.
22. Pika T, Jiri MJ, Schneiderkab P et al. The correlation of serum immunoglobulin free light chain levels
and selected biological markers in multiple myeloma.
Biomed Pap Med Fac Univ Palacky Olomouc Czech
Repub 2008. 152(1): 61–64.
DOUBLe TRANsGeNIC MICe – A sUITABLe MODeL
FOR sTUDYING OXIDATIVe sTRess IN TYPe 1 DIABeTes MeLLITUs
Adina Daniela Iancu* and Crina Stãvaru
“cantacuzino” national institute of research-Development for microbiology and immunology, Bucharest, romania
ABsTRACT
Type 1 diabetes mellitus (T1DM), one of the most prevalent chronic diseases is characterized by the
progressive destruction of pancreatic β cells, leading to insulin deficiency and hyperglycemia. Studies
performed on diabetic subjects with prolonged hyperglycemia showed the oxidative stress occurrence
followed by molecular, cellular and tissue damage. Currently, reducing the oxidative stress represents
a therapeutic target, in order to reduce its complications in diabetic patients. An adequate experimental
model of type 1 diabetes represents a prerequisite in oxidative stress study, therefore, we assessed oxidative status in polymorphonuclear cells (PMNs) and peritoneal macrophages using a double transgenic (dTg) mouse model of type 1 diabetes. Our results revealed the increased production of reactive
oxygen species (superoxide anion and H2O2) and nitrogen (nitric oxide) species in diabetic mice leading to the idea of oxidative stress model for the study of its complications in type 1 diabetes.
Keywords: type 1 diabetes, transgenic mice, oxidative stress, PMN, macrophages
INTRoDUCTIoN
Type 1 diabetes mellitus (T1DM) is an autoimmune disease mediated by autoreactive T lymphocytes, oriented against beta-pancreatic cells, leading
to insulin crash and hyperglycemia. The long term
side effects of hyperglycemia in T1DM lead to
macrovascular (arterial disease and stroke) and microvascular (nephropathy, neuropathy and retinopathy) complications. In oxidative stress the dynamic
balance between oxygen free radicals production and
antioxidant activity is altered. In recent onset type 1
diabetes subjects, based on a possible correlation between oxidative stress and insulin requirements, oxidative injury is considered an important factor of
β-pancreatic cell dysfunction [1]. In the progression
of T1DM the significant increase in catalase activity
of lymphocytes indirectly confirmed the oxidative
stress importance in the pathogenesis development.
[2]. Catalase, an antioxidative enzyme, diminishes
free radical hydrogen-peroxyde, which can be very
toxic to β-pancreatic cells.
Hyperglycemia contributes to impairment of the
antioxidant system and induces an increase of oxidative stress in diabetic patients via non-enzymatic gly-
cation, glucose autoxidation, and alterations in
polyol pathway activity [2-5]. In hyperglycemic conditions and oxidative stress, superoxide anion overproduction has impact on biochemical pathways
leading to endothelial dysfunction, impaired insulin
sensitivity, and other forms of metabolic stress (i.e.,
vascular inflammation, abnormal energy expenditure) [6-8]. An increased oxidative status and a decreased antioxidative activity in diabetic subjects
were confirmed by studies focused on diabetic children; moreover, in non-diabetic relatives, there
seems to be a similar tendency [9-11].
There is a wide spectrum of human disease
characterized by molecular and cellular damage
caused by oxidative stress [12]. Experimental and
clinical studies indicate that oxidative stress plays an
important role in the pathogenesis of diabetes mellitus; lipids, proteins and DNA seem to be among the
first targets of oxidative stress. In children with
T1DM and increased oxidative stress, their oxidative
DNA damage was not substantially increased, but
their capacity to repair DNA was increased. This elevated DNA repairing process demonstrates that it is
most certainly a response to the permanently elevated state of oxidative stress [10].
*corresponding author: Adina Daniela Iancu, email: [email protected]
201
IANCU and STÃVARU
An important way to evaluate oxidative stress
in T1DM is lipid peroxidation estimation and vitamin E effect in oxidative stress and metabolic parameters. In diabetic subjects, vitamin E ameliorates
oxidative stress and improves antioxidant defense
system, but has no advantageous effect on metabolic
parameters [13]. Hsu et al. observed no significant
differences in vitamin E and C levels between diabetic patients and control subjects, but plasma vitamin A level in diabetic patients was significantly
higher than in control subjects [14]. In order to prevent clinical complications in T1DM subjects, a supportive treatment with antioxidants might reduce
toxic effect of free radicals, restore body’s antioxidation capacity and prevent or delay disease development [15].
In diabetic patients there is a high risk of
macrovascular disease [16, 17]. Diabetic subjects
with coronary heart disease have an altered oxidative
status. A study of Marra et al. revealed that in early
stages of T1DM there is a reduced antioxidant activity and an increased oxidative stress, especially in
women, which could partly explain the increased
susceptibility of diabetic women to cardiovascular
complications [18].
Given the prevalence of T1DM and its complications, the evidence of the significant influence of
oxidative stress in disease progression must be taken
into account for a correct therapeutic approach.
Studying oxidative stress in experimental models of
type 1 diabetes could represent a key step towards
gaining a more in depth understanding of the oxidative imbalance behind T1DM and identifying new
therapeutic targets.
The aim of the study was to evaluate the reactive oxygen species (ROS) generation in a dTg mice
model of T1DM which represents a suitable model
to investigate oxidative stress. Therefore, we compared the superoxide anion, hydrogen peroxide
(H2O2) and nitric oxide production in phagocytic
cells harvested from diabetic mice and normal mice.
Mice
In these experiments, 10-12 weeks old Balb/c
mice were used as normal mice (control), and double
transgenic mice which spontaneously developed
T1DM (diabetic mice). Double transgenic (dTg) diabetic mice were obtained by mating two transgenic
strains: TCR-HA transgenic (Tg) mice expressing a
T cell receptor on the surface of CD4+ lymphocytes
for a hemagglutinin (HA) segment (110-120) of
202
A/PR/8/34 influenza virus and Ins-HA Tg mice
(B10.D2 mice), expressing the HA of the same virus
in pancreatic β-cells under a rat insulin promoter.
Double transgenic offsprings (TCR-HA+/-/Ins-HA+/)
develop type 1 diabetes. The presence of both transgenes was identified by PCR using specific primers
[19-21] and the animals were considered diabetic
when blood glucose levels exceeded 200 mg/dL detected by One Touch Ultra glucometer.
The animals were procured from the Cantacuzino NIRDMI animal facility and housed according to the European recommendations (Council
Directive 86/609/EEC), with free access to standard
chow and tap water. All protocols were approved by
the Internal Ethical Committee.
Cells
Polymorphonuclear (PMN) population from peripheral blood was isolated by gradient density separation using Histopaque separating medium with
1.77 relative densities (Sigma) at 2500 rpm for 20
minutes at 20oC. The erythrocytes were lysed by incubation for 30 minutes at 40C with cold lysing solution. After centrifugation, PMN pellet was taken
in RPMI1640 (Biochrom) medium containing 10%
heat inactivated fetal bovine serum (Biochrom).
Thioglycolate-elicited macrophages were collected from mice 3 days after intraperitoneal injection of 0.2 mL of 1 mg/L thioglycolate (Sigma).
Cell viability and density were assessed by
eosin (Sigma) dye exclusion assay (0.5% eosin).
Chemiluminescence assay
PMNs reactive oxygen species (ROS) generation is associated with light emission amplified by
luminol (5-amino 2,3 dihydro 1,4-phthalazindione).
In the experiments were used 2x106 cells/mL (1x106
cells/0.5 mL / system) unstimulated or stimulated
with 10 µL (1.62 mM) of phorbol-12-myristate-13
acetate (PMA) (Sigma) and 1mM luminol.
PMNs ROS release was determined by a LKB
BioOrbit 1251 chemiluminometer coupled with a
special reading program (Phagotest). During 40 minutes for each sample, light emission intensity was
measured the results being expressed as area (sum
of ROS emission in a defined time interval, and expressed in mV).
Flow-cytometry
PMNs intracellular oxidative burst activity
(H2O2 production) was evaluated by flow cytometry
using the commercial kit Bursttest (Phagoburst),
Double transgenic mice – a suitable model for studying oxidative stress in type 1 diabetes mellitus
ORPEGEN Pharma. PMNs from heparinized peripheral blood (100μl/tube) were stimulated with 5
μM fMLP, 8.1 μM PMA, 1x107 inactivated E.coli
and incubated for 10 minutes. Afterwards, dihydrorhodamine (DHR) 123, a fluorogenic substrate
for the oxidation reaction, was added and incubated
for another 10 minutes and then the probes were
fixed and erythrocytes lized with lysing solution and
DNA stained with propidium iodide solution.
Flow cytometric data were acquired on FACSCalibur (Becton-Dickinson, San Jose, USA) using
CellQuest software.
Nitroblue tetrazolium (NBT) assay
Intracellular production of superoxide anion by
NBT assay is a semi-quantitative method used to determine intracellular production of superoxide anion
in phagocytic cells (PMN cells and peritoneal
macrophages). This microscopic assay is based on
counting the cells containing formazan deposits,
which are formed by reduction of the membrane permeable, water-soluble, yellow-colored, nitroblue
tetrazolium salt (Y-NBT) by superoxide anion. Cellular density was established at 2x106 cells/mL, and
50 μL of cell suspension was used in the system. For
stimulation were used 10 μL of N-Formyl-Met-LeuPhe (fMLP) (100 μM) or 10 μL of PMA (1.62 mM).
NBT solution was added (25 µL from 2 mg/mL NBT
solution) and samples were brought to 100 µL final
volume with Hank’s Balanced Salt Solution (HBSS).
Probes were incubated at 370C and at room temperature for 10 minutes at each temperature, then fixed
with 20 μL of 10% formaldehyde solution (Merck)
for another 10 minutes. The samples were centrifuged at 2000 rpm/10 min/4oC, 80 μL of the supernatant was discharged and replaced with 50 μL
HBSS. The cells containing formazan deposits were
counted to microscope.
Cytochrome C (Cyt C) reduction test
An indirect determination of superoxide anion
production using cytochrome C, a small hem protein
associated with the inner membrane of mitochondria, which is an essential component of electron
transport chain. A reversible transformation of iron
from oxidized state (Fe3+) to reduced state (Fe2+)
confers the electron transporter function to cytochromes. The acceptance or release of electrons by
cytochrome oxidase leads to oxidizing or reducing
Cyt C with superoxide anion liberation. This process
is activated by phagocytosis or by some signals arrived to cell membrane, and can be spectrophotometrically observed at 535-540 nm.
In the experiments, 100 μL of 5x106 cells/mL
cell suspension were in vitro stimulated with fMLP
(100 μM) or PMA (1.62mM), and put in contact with
100 μL of cytochrome C (Sigma) solution (9.8 mg/
mL) in 0.5 mL final volume. After sample incubation
(20 minutes at 37oC), cell suspensions were centrifuged (800 RPM/5 min/4oC) and the optical density
(OD) of supernatants was measured at 535-550 nm
by UV-Vis Spectrophotometer. Primary data were expressed as follows: Δ = [(DO550 – DO535) x 1000].
Nitric oxide production in phagocytic cells by
Griess test
In physiological conditions, nitric oxide (NO)
is instable and is rapidly oxidated to its stable products nitrate and nitrite. Nitrite can be detected using
Griess reagent which contains two substances: sulphanylamide (1%) and N-1- naphthylethylenediamine dihydrochloride (NED) (0.1%). In acidic
conditions, sulphanilic acid is converted by nitrite
into a diazolium salt which rapidly couples with
NED and gives a strong color reaction which can be
detected at 540 nm.
PMNs at density of 2x106 cells/mL stimulated
with fMLP (100 μM) (10 µL) and PMA (1.62 mM)
(10 µL) were incubated for 2 hours at 37oC/ 5%CO2
in a 24-wells plate (0.5 mL cell suspension/well).
The macrophages were first left to adhere for two
hours, after non-adherent cells were removed by two
times washing with RPMI1640 without phenol red
medium and then incubated 24hours with fMLP and
PMA. At the end of incubation time, 80 μL/well of
supernatant with 80 μL/well Griess were dispensed
and incubated for 10 minutes at room temperature,
in the dark. Optical density of colour formation was
determined at 540 nm.
Statistical analysis
Data were analyzed using Gnumeric program.
The results are expressed as average ± standard deviations (SD) and significance was determined by
Student t test, p-values of <0.05 were considered statistically significant marked as * in graphs.
RESULTS
PMNs extracellular ROS release evaluation
By chemiluminescence assay, under basal or
stimulated conditions mice PMNs extracellular ROS
release during 40 minutes was evaluated. The results
showed that in resting conditions, isolated PMNs
from diabetic mice presented a higher amount (p =
0.03953) of ROS release (3139.48 ± 1291.47 mV)
203
IANCU and STÃVARU
compared to control (1472.42 ± 191.70 mV) and also
after PMA cell stimulations the values registered in
dTg mice were higher than in Balb/c (p = 0.0108).
It was observed that after PMA cell stimulations
a low increase of ROS release was registered in both
mice strains: in Balb/c mice from 1472.42 mV basal
condition, to 1834.44 ± 206.38 mV PMA stimulated
condition (p = 0.04231) and in dTg mice from
3139.48 ± 1291.47 mV to 5113.09 ± 1869.57mV (p
= 0.08805) (Fig. 1).
Intracellular production of H2O2
The capacity of PMN cells from control and diabetic mice isolated from peripheral blood to produce intracellular H2O2 was performed by flow
cytometry. The percentages of unstimulated PMN
from dTg mice which generate intracellular ROS
were significantly higher (p = 0.22297) compared to
Balb/c mice (23.5 ± 14.33% diabetic mice PMNs vs
8.7 ± 3.64% control PMNs) suggesting a basal status
of activation. PMNs phagocytic activity evaluated
by E. coli stimulation showed clearly in control mice
the increase of PMN percents with intracellular
H2O2 production (22.9 ± 12.51%) compared to unstimulated condition (p = 0.06145). Because in basal
condition diabetic mice present oxidative burst activity, after E. coli stimulation the percents of H2O2
producing granulocytes did not increase significantly
(27.7 ± 16.86%) compared to basal values but the
results were comparable with control (p = 0.51686)
(Fig. 2). In both murine strains, activation through
fMLP receptor of phagocytes cells by its specific
peptide did not induce ROS production. Instead,
PMA, the specific activator of Protein Kinase C
(PKC) enhances intracellular H2O2 production in
granulocytes in both Balb/c (84.3 ± 6.51%) (p <
0.05) and dTg mice (51.1 ± 10.94%) (p = 0.01401)
illustrating a higher stimulation in control than in diabetic mice.
Superoxide anion (O2-) production
In order to evaluate the superoxide anion (O2-)
generation in phagocytic cells the NBT test was performed. The results demonstrated that in diabetic
mice the percent of cells which had formazan deposits after fMLP and PMA activation is higher (p <
0.05) compared to control proof of an oxidative
stress status (Fig. 3 and Table 1).
ROS production by phagocytes was evaluated
also by measuring superoxide dismutase-inhibitable
reduction of cytochrome C (Fig. 4). The results
showed like in NBT test an increased superoxide
anion production in diabetic mice compared to
control after fMLP (87.33 ± 58.29 µM in dTg and
134.40 ± 73.20 µM in Balb/c mice) or PMA (140.33
± 50.86 µM in control and 274.00 ± 165.88 µM
in diabetic mice) stimulation but not statistically
significant.
On basal condition, the results of NBT test or
cytochrome C reduction test did not indicate differences between murine strains.
Fig. 1. PMN ROS release in Balb/c and dTg mice performed by chemiluminescence assay. The results are represented
as area (sum of ROS emission in a 40 minutes time interval, and expressed in mV). Baseline ROS release was significantly
higher in dTg diabetic mice compared to Balb/c (3139.48 ± 1291.47 mV in diabetic conditions vs 1472.42 ± 191.70 mV
in non-diabetic conditions). In both murine strains, the in vitro PMA cell stimulation did not induce a significant ROS release (in Balb/c 1834.44 ± 206.38 mV and dTg mice 5113.09 ± 1869.57 mV). Instead, in dTg mice, the results obtained
following PMA stimulation revealed a significant ROS release compared to non-diabetic mice. n=5 mice for each murine
strain; * p < 0.05.
204
Fig. 2. Intracellular oxidative burst activity in whole blood PMN cells collected from Balb/c and dTg mice using
flowcytometry. For this determination we used Bursttest (Phagoburst) kit. The percentage of H2O2 producing cells was
determined in resting conditions and after E. coli, fMLP and PMA in vitro stimulation. In diabetic mice, baseline H2O2
production (resting conditions) was significantly higher compared to control mice (23.5 ± 14.33% diabetic cells vs 8.7 ±
3.64% control ones). Cell stimulation by E. coli induced an increase in oxidative burst activity only in Balb/c mice (up to
22.9 ± 12.51% of cells produced intracellular H2O2); in dTg mice, the percentage of PMN that responded to bacterial
stimulation was 27.7 ± 16.86%. PMA stimulation significantly increased intracellular H2O2 production in both murine
strains (up to 51.1 ± 10.94% in diabetic PMN and up to 84.3 ± 6.51% in control ones); in normal mice, H2O2 production
had an approximately 10-fold increase following PMA stimulation, while in diabetic mice H2O2 production increased
only by 2 times. n=5 mice for each murine strain; * p < 0.05.
NO production
Nitric oxide is produced by different cells types
and is an important regulator and mediator of numerous processes one of them being murine macrophage mediated cytotoxicity for microbes and tumor
cells. In this study, NO production in PMN cells and
peritoneal macrophages (Fig. 5 and Table 2) was
measured using Griess reagent.
The results, as shown in Table 2, indicate the
presence in diabetic mice of an oxidative stress status in basal condition and slightly augmented after
fMLP or PMA stimulation (p > 0.05). Compared to
control, phagocytes isolated from dTg mice produced a higher amount of NO, which was less generated by activation and more due to basal
oxidative status suggesting impairments of antioxidant mechanisms.
DISCUSSIoN
According to recent studies, besides the autoreactive cellular immune response, oxidative stress
also contributes to the development and maintenance
of type 1 diabetes mellitus.
When reactive oxygen species production is elevated, and antioxidant capacity is impaired, oxygen
and nitrogen toxic radicals accumulation leads to
molecular, cellular and tissue damages. Therefore, it
is very important to study diabetic complications in-
duced by oxidative stress. The best way to counteract
these detrimental effects is represented by developing and administering antioxidant compounds
whose evaluation requires a proper diabetic animal
model. There are different animal models of type 1
diabetes, the most common models among these
using chemical destruction of β-pancreatic cells by
streptozotocin or alloxan administration. These chemical compounds are toxic to β-pancreatic cells,
leading to rapid development of hyperglycemia.
Other models for type 1 diabetes are transgenic mice,
in which the disease is generated by autoimmune destruction of pancreatic β cells, much more similar to
human pathogenesis, which includes our model.
Based on these data, our study aimed to evaluate
the oxidative stress in double transgenic diabetic
mice, and therefore we measured extra- and intracellular production of ROS in phagocyte cells (PMNs
and peritoneal macrophages) compared to Balb/c
mice.
The first line of defense against different pathogens is represented by cells belonging to the innate
immune system, PMN cells and macrophages. PMNs
play an important role in the host defense mechanism against various bacterial infections and it is
suggested that impaired neutrophil function can be
an important cause in diabetic subjects susceptibility
to infections.
205
IANCU and STÃVARU
Table 1. Percentage of phagocytic cells with intracellular formazan deposits determined by NBT reduction test
In PMNs, one of the mechanisms implicated in
pathogen destruction is represented by toxic compound generation, such as reactive oxygen species.
In vitro stimulation of these cells by fMLP peptide,
a powerful chemoattractant, leads to: PMNs chemotaxis at low concentrations and to ROS production
at higher concentration of the peptide. Binding to its
receptor on PMN surface, fMLP leads to protein kinase C (PKC) activation via activating first a G protein-dependent biochemical cascade [22].
PMA can also stimulate PKC in a more direct
manner, by crossing cell membrane. Finally, PKC
Fig 3. Intracellular superoxide anion production by: A – PMN cells and B – peritoneal macrophages collected from
Balb/c and dTg mice using NBT reduction test. A – in resting conditions, intracellular superoxide anion production was
similar for both murine strains (Balb/c: 9.82 ± 1.91%; dTg mice: 11.42 ± 3.01%). fMLP stimulation induced a significant
increase only in the percentage of diabetic formazan producing cells (up to 29.33 ± 9.52%). Also, following PMA in vitro
cell stimulation, we observed an increase in superoxide anion production in Balb/c mice (25.30 ± 3.90%) and respectively
a significant increase in dTg mice (up to 47.58 ± 12.52%). B – in peritoneal macrophages collected from both murine
strains, superoxide anion production obtained in resting conditions was not significantly different (Balb/c: 12.89 ± 2.49%;
dTg: 13.75 ± 2.61%), but, in a hyperglycaemic background, fMLP and PMA cell stimulation induced a higher superoxide
anion production compared to resting conditions (32.10 ± 9.90% of cells responded to fMLP stimulation, and 42.40 ±
2.94% to PMA). n=5 mice for each murine strain; * p < 0.05.
206
Table 2. Nitric oxide concentrations produced by PMN cells and peritoneal macrophages collected
from Balb/c and dTg mice, in resting conditions and after fMLP or PMA in vitro stimulation
induces the activation of nicotinamide adenine dinucleotide phosphate (NADPH) oxidase, a transmembrane electron transport chain involved in reducing
oxygen to reactive oxygen species [23].
In diabetic mice, upon PMA stimulation of
PMN cells, we observed that in resting/basal conditions ROS release was augmented compared to nondiabetic mice being probably due to a less antioxidant efficacy. Our data are very similar to those reported by Delamaire et al., in diabetic patients [24].
Regarding intracellular production of hydrogen
peroxide (H2O2), data obtained in this transgenic
murine diabetic model showed an increased PMN
percentage which under unstimulated condition generated H2O2. Bacterial stimulation with opsonized
E. coli did not increase H2O2 production in PMNs
isolated from diabetic mice compared to control, fact
that may be due to cell exhaustion in a high blood
sugar background. After PMA stimulation, a powerful activator of H2O2 production in phagocyte cells,
the results between dTg and Balb/c mice showed a
percentage close to H2O2 producing cells.
Previous data obtained in humans indicate that
production of H2O2 by unstimulated cells is increased in diabetic patients, while generation of O2by stimulated neutrophils is markedly impaired, suggesting that toxic oxygen species production might
be influenced by disease duration [25, 26].
Another important oxygen free radical with an
impaired production in T1DM is superoxide anion,
which was evaluated by two different assays: NBT
dye reduction and cytochrome C reduction test. In
contrast to increased basal level of H2O2 detected in
diabetic mice compared to control, the superoxide
anion (O2-) generation in phagocytic cells in unstimulated condition was similar in both mice strains.
The fMLP and PMA phagocyte cells stimulation indicated that in diabetic mice superoxide anion (O2-)
production is higher compared to control, suggesting
less effective antioxidant mechanisms. Studies using
experimental models of T1DM indicate that PMN
cells from diabetic animals present some degree of
activation in their basal level [27]. Nurun et al.
(2005) postulated that NBT dye reduction can be
Fig. 4. An indirect evaluation of superoxide anion release, using cytochrome C reduction test, by PMN cells collected
from Balb/c and dTg mice. In resting PMN cells, superoxide anion production showed no significant differences between
both murine strains (88.40 ± 59.42 µM in Balb/c and 115.20 ± 34.77 µM in dTg mice). Superoxide anion level remains
nearly unchanged following fMLP stimulation (87.33 ± 58.29 µM in control, and 134.40 ± 73.20 µM in diabetic mice).
PMA stimulation induces an increasing tendency in superoxide anion production (up to 140.33 ± 50.86 µM in control,
and up to 274.00 ± 165.88 µM in diabetic mice). n=5 mice for each murine strain.
207
IANCU and STÃVARU
considered as an indirect determination of the bactericidal function of neutrophils/phagocytic cells (superoxide anion generation during phagocytosis
reduces the dye). The same authors observed a significant decrease in PMN phagocytic activity using
streptozotocin induced diabetic rats and considered
that it is not yet clear whether these effects are directly due to hyperglycemic effect on C3b- and/or
Fc-receptor mediated neutrophil phagocytosis impairment, or if it may be due to desensitization of
PMN cells. The question arising is whether or not
these differences are due to the experimental model
used to study superoxide anion or free radical production could be affected by streptozotocin itself.
Our results seem to be closer to those obtained in hu-
mans by Zozulińska et al. in 1996, which indicated
that in resting conditions superoxide anion production in diabetic patients is not very different from
control values [25].
An important role in the pathogenesis of type 1
diabetes is played by macrophages. In their study
using diabetes-resistant BioBreeding rats, Mendez
et al. found that inducible NO synthase (iNOS) expression was significantly increased during the early
phase of Kilham virus infection, and iNOS inhibition
led to prevention of diabetes in animals. Our results
showed in diabetic mice a higher amount of NOs in
basal condition (p < 0.05) and little augmented after
fMLP or PMA stimulation (p > 0.05) suggesting impairments of antioxidant mechanisms.
Fig. 5. Nitric oxide production (NO) by: A – PMN cells and B – peritoneal macrophages collected from Balb/c and
dTg mice was determined using Griess reagent. A – in resting conditions, diabetic PMNs NO production was significantly higher compared to non-diabetic ones (20.37 ± 4.73 µM in diabetic and 5.91 ± 1.54 µM in non-diabetic mice), and
in vitro PMN stimulation by fMLP or PMA did not induce changes in NO concentrations (fMLP stimulation: 9.43 ± 4.22
µM in control and 21.66 ± 4.39 µM in diabetic mice; PMA stimulation: 10.54 ± 3.15 µM in control and 22.83 ± 6.66 µM
in diabetic mice). B – NO production in peritoneal macrophages maintains the same tendency as in PMN cells, thus, in
resting conditions, NO production in diabetic macrophages is three times greater than in control ones (13.29 ± 3.91 µM
in control and 41.75 ± 5.85 µM in diabetic cells). In non-diabetic and diabetic mice, in vitro stimulation with fMLP and
PMA did not induce changes of nitric oxide concentration in comparison with resting condition. Compared to PMN cells,
peritoneal macrophages produced a far greater amount of NO. n=5 mice for each murine strain; * p < 0.05.
208
The results, as shown in Table 2, indicate the
presence in diabetic mice of an oxidative stress status in basal condition and slightly augmented after
fMLP or PMA stimulation (p < 0.05). Compared to
control, phagocytic cells isolated from dTg mice had
a higher amount of NOs which were less generated
by upon activation and more due to basal oxidative
status suggesting impairments of antioxidant mechanisms. The fact that NO production is elevated in
type 1 diabetes was demonstrated by other studies
using streptozotocin induced diabetic mice. Catanzaro et al. (2010), used selective antagonists and
agonists of bradykinin B1 receptor to assess the involvement of this peptide in mediating NO release
following LPS-stimulation in the overall development of diabetes. LPS stimulation in diabetic macrophages induced significantly increase in NO
production compared to control. NO release could
be abolished by treating macrophages with bradykinin 1 receptor antagonists and these authors concluded that, at least partially, NO production is due
to activation of B1 receptors [29-32]. Our experiments are consistent with previous studies, indicating that nitric oxide production by peritoneal
macrophages from double transgenic mice was considerably higher than in control mice.
Based on similarities observed between the results obtained in humans and the results revealed in
this study, we considered that the double transgenic
mouse used in our experiments is a suitable model
for studying oxidative stress in type 1 diabetes. The
advantage of using the genetically engineered T1DM
mouse model is that the disease onset and development closely mimics, at least according to current
knowledge, human type 1 diabetes mellitus. If chemically induced diabetes onset requires only a few
days, in dTg mouse, glycemia spikes to abnormal
levels after 4 weeks of life, autoimmune pancreatic
β cells destruction occurring in time.
Based on our study, we can presume the importance of using a suitable experimental model to study
type 1 diabetes mellitus and its complications given
by oxidative stress.
ACKNowLEDGEMENTS
This work was supported by the national grants
PN06150202/2006 and PNII 41-074/2007 from the
Romanian Ministry of Research. We would like to
thank Assoc. Prof. Dorel Lucian Radu for his help
in providing double transgenic mice.
REFERENCES
1. Hoeldtke RD, Bryner KD, McNeill DR, Warehime
SS, van Dyke K, Hobbs G. Oxidative Stress and Insulin Requirements in Patients with Recent-Onset Type
1 Diabetes. J Clin Endocrinol Metab 2003.
88(4):1624–1628.
2. Zivić S, Vlaski J, Kocić G, Pesić M, Cirić V, Durić
Z. The importance of oxidative stress in pathogenesis
of type 1 diabetes - determination of catalase activity
in lymphocytes of diabetic patients. Med Pregl. 2008.
61(9-10):458-63.
3. Hernández MR, Codoner FP, Pons Morales S, Del
Castillo VC, Boix GL, Valls BV. Oxidant/antioxidant
status and hyperfiltration in young patients with type
1 diabetes mellitus. Pediatr. Nephrol. 2009. 24: 121127.
4. Zimmerman MA, Flores SC. Autoimmune-mediated
oxidative stress and endothelial dysfunction: implications of accelerated vascular injury in type I diabetes.
J. Surg. Res. 2009. 155: 173-178.
5. Evans JL, Goldfine ID, Maddux BA, Grodsky GM.
Oxidative stress and stress-activated signaling pathways: A unifying hypothesis of type 2 diabetes. Endocr.
Rev. 2002. 23: 599-622.
6. West IC. Radicals and oxidative stress in diabetes. Diabet Med 2000. 17:171–180.
7. Brownlee M. Biochemistry and molecular cell biology
of diabetic complications. Nature 2001. 414:813–820.
8. Ceriello A. Acute hyperglycaemia and oxidative stress
generation. Diabet Med 1997. 14 (3):S45–S49.
9. Varvarovská J, Racek J, Stozický F, Soucek J, Trefil
L, Pomahacová R. Parameters of oxidative stress in
children with Type 1 diabetes mellitus and their relatives. J Diabetes Complications 2003. 17(1):7-10.
10. Varvařovská J, Racek J, Štětina R, Sýkora J,
Pomahačová R, Rušavý Z, Lacigová S, Trefil L,
Siala K, Stožický F. Aspects of oxidative stress in
children with Type 1 diabetes mellitus. Biomedicine
& Pharmacotherapy 2004. 58(10): 539-545.
11. Matteucci E, Ottavio G. Oxidative Stress in Families
of Type 1 Diabetic Patients. Diabetes Care 2000.
23:1182–1186.
12. Halliwell B. Free radicals, antioxidants, and human
disease: cause or consequence? Lancet 1994. 344:721724.
13. Gupta S, Sharma TK, Kaushik GG, Shekhawat
VP. Vitamin E supplementation may ameliorate oxidative stress in type 1 diabetes mellitus patients. Clin
Lab. 2011. 57(5-6):379-86.
14. Hsu WT, Tsai LY, Lin SK, Hsiao JK, Chen BH. Effects of Diabetes Duration and Glycemic Control on
Free Radicals in Children with Type 1 Diabetes Mellitus. Annals of Clinical & Laboratory Science 2006.
36(2): 174-178.
15. Dominguez C, Ruiz E, Gussinye M, Carrascosa A.
Oxidative Stress at Onset and in Early Stages of Type
1 Diabetes in Children and Adolescents. Diabetes
Care 1998. 21:1736-1742.
16. Harris MI, Hadden WC, Knowler WC, Bennett
PH. Prevalence of diabetes and impaired glucose tolerance and plasma glucose levels in U.S. population
aged 20–74 yr. Diabetes 1987. 36:523–534.
209
IANCU and STÃVARU
17. Haffner SM, Letho S, Ronnamaa T, Pyorala K,
Laakso M. Coronary heart disease mortality in subjects with type 2 diabetes and in non diabetic subjects
with and without previous myocardial infarction. N
Engl J Med 1998. 339:229–234.
18. Marra G, Cotroneo P, Pitocco D, Manto A, Di Leo
MAS, Ruotolo V, Caputo S, Giardina B, Ghirlanda
G, Santini SA. Early Increase of Oxidative Stress and
Reduced Antioxidant Defenses in Patients with Uncomplicated Type 1 Diabetes - A case for gender difference. Diabetes Care 2002. 25: 370–375.
19. Radu DL, Brumeanu TD, McEvoy RC, Bona CA.
Escape from self-tolerance leads to neonatal insulindependent diabetes mellitus. Autoimmmunity 1999.
30: 199-207.
20. Radu DL, Noben-Trauth N, Hu-Li J, Paul WE,
Bona CA. A targeted mutation in the IL-4Ra gene
protects mice against autoimmune diabetes. Proc.
Natl. Acad.Sci. USA 2000. 97: 12700-12704.
21. Radu DL, Georgescu A, Stavaru C, Carale A,
Popov D. Double transgenic mice with Type 1 diabetes mellitus develop somatic, metabolic and vascular disorders. J. Cell. Mol. Med. 2004. 8(3): 349-358.
22. Casimir CM, Teahan CG. The respiratory burst of
neutrophils and its deficiency. In Immunopharmacology of Neutrophils (P. G. Hellewell, W. T. J., eds.),
San Diego, CA, Academic 1994. 27–54.
23. Walrand S, Valeix S, Rodriguez C, Ligot P, Chassagne J, Vasson MP. Flow cytometry study of polymorphonuclear neutrophil oxidative burst: a
comparison of three fluorescent probes. Clin. Chim.
Acta 2003. 331: 103–110.
24. Delamaire M, Maugendre D, Moreno M, LeGoff
MC, Allanic H, Genetet B. Exploration of the various
steps of polymorphonuclear neutrophil function in diabetic patients. J. Mal. Vasc. 1995. 20: 107-112.
25. Zozulińska DA, Wierusz-Wysocka B, Wysocki H,
Majchrzak AE, Wykretowicz A. The influence of insulin-dependent diabetes mellitus (IDDM) duration on
superoxide anion and hydrogen peroxide production
by polymorphonuclear neutrophils. Diabetes Res Clin
Pract. 1996. 33(3):139-44.
26. Inoue S, Lan Y, Muran J, Tsuji M. Reduced hydrogen peroxide production in neutrophils from patients
with diabetes. Diabetes Res Clin Pract. 1996. 33(2):
119-27.
27. Nurun NAHM, Islam LN, Rahman Mohammad
M, Biswas KB. Polymorphonuclear Neutrophil Dysfunctions in Streptozotocin-induced Type 1 Diabetic
Rats. Journal of Biochemistry and Molecular Biology
2005. 38(6): 661-667.
28. Mendez II, Chung YH, Jun HS, Yoon JW. Immunoregulatory Role of Nitric Oxide in Kilham Rat
Virus-Induced Autoimmune Diabetes in DR-BB Rats.
The Journal of Immunology 2004. 173: 1327–1335.
29. Lawson SR, Gabra BH, Nantel F, Battistini B,
Sirois P. Effects of a selective bradykinin B1 receptor
antagonist on increased plasma extravasation in streptozotocin-induced diabetic rats: distinct vaculopathy
profile of major key organs. Eur J Pharmacol 2005.
514: 69–78.
210
30. Gabra BH, Berthiaume N, Sirois P, Nantel F, Battistini B. The kinin system mediates hyperalgesia
through the inductible bradykinin B1 receptor subtype: evidence in various experimental animal models
of type 1 and type 2 diabetic neuropathy. Biol Chem
2006. 387: 127–143.
31. Catanzaro O, Dziubecki D, Obregon E, Rodriguez
RR, Sirois P. Antidiabetic efficacy of bradykinin antagonist R-954 on glucose tolerance test in diabetic
type 1 mice. Neuropeptides 2010. 44: 187–189.
32. Catanzaro O, Dziubeckia D, Labala E, Siroisc P.
Activation of peritoneal macrophages during the evolution of type 1 diabetes (insulitis) in streptozotocintreated mice. Peptides 2010. 31(10): 1884-1887.
ŞOAReCII DUBLU TRANsGeNICI – UN MODeL ADeCVAT
De sTUDIU AL sTResULUI OXIDATIV îN DIABeTUL De TIP 1
Adina Daniela Iancu*, Crina Stãvaru
institutul naþional de cercetare-Dezvoltare pentru microbiologie şi imunologie „cantacuzino”, Bucureşti, românia
ReZUMAT
Diabetul zaharat de tip 1 (DZT1), una dintre bolile cronice cu cea mai mare prevalenţă, este caracterizat
de distrugerea progresivă a celulelor β pancreatice, conducând la deficienţa de insulină şi la hiperglicemie. Studiile efectuate pe subiecţii diabetici cu hiperglicemie prelungită au arătat apariţia ulterioară
a stresului oxidativ, urmată de leziuni moleculare, celulare şi tisulare. La ora actuală, reducerea stresului
oxidativ reprezintă o ţintă terapeutică, pentru a reduce complicaţiile sale la pacienţii diabetici. Un
model experimental adecvat pentru diabetul de tip 1 reprezintă o condiţie prealabilă în studiul stresului
oxidativ, de aceea, am evaluat statusul oxidativ al celulelor polimorfonucleare şi al macrofagelor peritoneale, folosind un model de şoarece dublu transgenic cu diabet de tip 1. La şoarecii diabetici, rezultatele noastre au arătat creşterea producerii speciilor reactive de oxigen (anion superoxid şi H2O2)
şi azot (oxid nitric), conducând la ideea unui model de stres oxidativ pentru studiul complicaţiilor
acestuia în diabetul de tip 1.
Cuvinte cheie: diabet de tip 1, şoareci dublu transgenici, stres oxidativ
INTRoDUCERE
Diabetul zaharat de tip 1 (DZT1) este o boală
autoimună mediată de limfocitele T autoreactive,
orientate împotriva celulelor beta-pancreatice, conducând la prăbuşirea insulinei şi la hiperglicemie. În
DZT1, efectele secundare pe termen lung ale hiperglicemiei conduc la complicaţii macrovasculare (boli
arteriale şi accidente vasculare) şi microvasculare
(nefropatie, neuropatie şi retinopatie). În stresul oxidativ este afectată balanţa dinamică dintre producţia
radicalilor liberi şi activitatea antioxidantă. La subiecţii cu diabet de tip 1 recent instalat, pe baza unei
posibile corelaţii dintre stresul oxidativ şi necesităţile
de insulină, lezarea oxidativă este considerată un factor important în disfuncţia celulei β-pancreatice [1].
În progresul DZT1, creşterea semnificativă a activităţii catalazei limfocitare a confirmat indirect importanţa stresului oxidativ în dezvoltarea patogeniei [2].
Catalaza este o enzimă antioxidantă, care diminuează peroxidul de hidrogen, acesta putând fi foarte
toxic pentru celulele β-pancreatice.
Hiperglicemia contribuie la afectarea sistemului
antioxidant şi induce o creştere a stresului oxidativ
la pacienţii diabetici, pe calea glicărilor non-enzima-
tice, autooxidării glucozei şi a alterărilor în activitatea căii poliolilor [2-5]. În condiţii hiperglicemice şi
de stres oxidativ, supraproducţia anionului superoxid
are impact asupra căilor biochimice conducând la
disfuncţii endoteliale, afectarea sensibilităţii la insulină şi la alte forme de stres metabolic (adică, inflamaţie vasculară, cheltuieli energetice anormale)
[6-8]. La pacienţii diabetici, creşterea statusului oxidativ şi scăderea activităţii antioxidante au fost confirmate de studiile axate pe copii diabetici; mai mult
decât atât, se pare că există o tendinţă similară şi la
rudele non-diabetice [9-11].
Există o gamă largă de afecţiuni umane caracterizate de lezarea moleculară şi celulară produsă de
stresul oxidativ [12]. Studiile experimentale şi cele
clinice indică faptul că stresul oxidativ joacă un rol
important în patogenia diabetului, lipidele, proteinele şi ADN-ul se pare că sunt printre primele ţinte
ale stresului oxidativ. La copiii cu diabet de tip 1 şi
stres oxidativ sporit, lezarea oxidativă a ADN-ului
nu a fost substanţial crescută, însă capacitatea acestora de reparare a ADN-ului a fost crescută. Acest
proces crescut de reparare a ADN-ului demonstrează
faptul că este aproape sigur un răspuns faţă de starea
permanent crescută a stresului oxidativ [10].
*autor corespondent: Adina Daniela Iancu, email: [email protected]
211
IANCU şi STÃVARU
În diabetul de tip 1, o modalitate importantă de
evaluare a stresului oxidativ este reprezentată de estimarea peroxidării lipidice şi a efectului vitaminelor
E în stresul oxidativ şi asupra parametrilor metabolici. La subiecţii diabetici, vitamina E ameliorează
stresul oxidativ şi îmbunătăţeşte sistemul de apărare
antioxidativă, însă fără efecte benefice asupra parametrilor metabolici [13]. Hsu et al nu au observat diferenţe semnificative ale nivelului vitaminelor E şi
C între pacienţii diabetici şi subiecţii control, însă
nivelul plasmatic al vitaminei A a fost semnificativ
mai mare la pacienţii diabetici, comparativ cu subiecţii control [14]. La subiecţii afectaţi de diabetul
de tip 1, pentru a preveni complicaţiile clinice, tratamentul de susţinere cu antioxidanţi poate reduce
efectul toxic al radicalilor liberi, să restabilească capacitatea antioxidantă a organismului şi să prevină
sau să încetinească dezvoltarea bolii [15].
Riscul dezvoltării bolilor macrovasculare la pacienţii diabetici este mare [16, 17]. Subiecţii diabetici cu boli cardiace coronariene au un status oxidativ
modificat. Studiul efectuat de Marra et al. a evidenţiat faptul că, în stadiile timpurii ale diabetului de tip
1, există o reducere a capacităţii antioxidative şi o
creştere a stresului oxidativ, mai ales la femei, fapt
care ar putea explica parţial susceptibilitatea crescută
a femeilor diabetice la complicaţiile cardiovasculare
[18].
Dată fiind prevalenţa diabetului de tip 1 şi a
complicaţiilor sale, dovada unei influenţe semnificative a stresului oxidativ în progresia bolii trebuie
luată în considerare în scopul unei abordări terapeutice corecte. Studierea stresului oxidativ pe modele
experimentale de diabet de tip 1 poate reprezenta un
pas important către dobândirea unei înţelegeri mai
profunde a dezechilibrului oxidativ pe fondul diabetului de tip 1 şi pentru identificarea de noi ţinte terapeutice.
Scopul studiului a fost de a evalua generarea
speciilor reactive de oxigen (SRO) pe un model de
şoareci dTg pentru DZT1, care reprezintă un model
adecvat în investigarea stresului oxidativ. De aceea,
am comparat producţia anionului superoxid, a peroxidului de hidrogen (H2O2) şi a oxidului nitric în celulele fagocitare prelevate de la şoarecii diabetici şi
cei normali.
Şoareci
În aceste experimente, au fost folosiţi şoareci
Balb/c ca şoareci normali (control) şi şoareci dublu
transgenici care dezvoltă spontan DZT1 (şoareci dia212
betici). Şoarecii dublu transgenici (dTg) au fost obţinuţi prin împerecherea altor două linii murine
transgenice: şoarecii transgenici (Tg) TCR-HA ce
exprimă receptorul T pe suprafaţa celulelor CD4+
pentru un segment (110-120) al hemaglutininei (HA)
virusului gripal A/PR/8/34 şi şoarecii Tg Ins-HA
(şoareci B10.D2), care exprimă HA aceluiaşi virus
la nivelul celulelor β-pancreatice sub promoterul
pentru insulină de la şobolan. Progenitorii dublu
transgenici (TCR-HA+/-/Ins-HA+/-) dezvoltă diabetul
de tip 1. Prezenţa ambelor transgene a fost identificată prin PCR, utilizând primeri specifici [19-21],
iar animalele au fost considerate diabetice atunci
când nivelele glucozei plasmatice au depăşit 200
mg/dL, fiind detectate cu ajutorul glucometrului One
Touch Ultra.
Animalele au fost procurate de la biobaza
INCDMI Cantacuzino şi adăpostite în conformitate
cu recomandările europene (Directiva Consiliului
86/609/EEC), cu acces liber la hrană standard şi apă
de la robinet. Toate protocoalele au fost aprobate de
Comisia de Etică Internă.
Celule
Populaţia de celule polimorfonucleare (PMN)
din sângele periferic a fost izolată prin separare în
gradient de densitate, utilizând mediul de separare
Histopaque, cu o densitate relativă de 1.77 (Sigma)
la 2500 RPM, timp de 20 minute, la 20oC. Eritrocitele au fost lizate prin incubarea timp de 30 de minute, la 4oC, cu soluţie de liză rece. După centrifugare, butonul de PMN a fost reluat în mediu
RPMI1640 (Biochrom) care a conţinut ser fetal de
viţel inactivat (Biochrom).
Macrofagele stimulate cu tioglicolat au fost prelevate de la şoareci după 3 zile de la inocularea intraperitoneală a 0,2 mL de tioglicolat 1 mg/L (Sigma).
Viabilitatea şi densitatea celulară au fost evaluate prin testul de excluzie ce utilizează eozina
(Sigma) (0,5% eozină).
Testul de chemiluminiscenţă
Generarea speciilor reactive de oxigen (SRO)
de către celulele PMN este asociată cu emisia luminoasă, amplificată cu ajutorul luminolului (5-amino
2,3 dihidro 1,4-ftalazindionă). În experimente au fost
utilizate 2x106 celule/mL (1x106 celule/0,5 mL/sistem) nestimulate sau stimulate cu 10 µL (1,62 mM)
de forbol-12-miristat-13 acetat (PMA) (Sigma) şi
1 mM luminol.
Eliberarea SRO de către celulele PMN a fost determinată cu ajutorul unui chemiluminometru LKB
Şoarecii dublu transgenici – un model adecvat de studiu al stresului oxidativ în diabetul de tip 1
BioOrbit 1251 cuplat cu un program special de citire
(Phagotest). Pentru fiecare probă, timp de 40 de minute, a fost măsurată intensitatea emisiei luminoase,
rezultatele fiind exprimate ca arie (suma emisiei
SRO într-un interval de timp definit, exprimată în
mV).
Citometrie în flux
Activitatea oxidativă intracelulară (producţia
H2O2) a fost evaluată prin citometrie în flux, folosind kitul comercial Bursttest (Phagoburst), ORPEGEN Pharma. Celulele PMN din sângele periferic
heparinizat (100 µL/tub) au fost stimulate cu fMLP
5 µM, PMA 8.1 µM, E.coli inactivată 1x107 şi incubate timp de 10 minute. După aceea, a fost adăugată
dihidrorodamina (DHR) 123, un substrat fluorogenic
necesar reacţiei de oxidare şi incubate pentru alte 10
minute, apoi probele au fost fixate şi eritrocitele lizate cu soluţie de liză, iar ADN-ul marcat cu soluţie
de iodură de propidiu.
Datele de citometrie în flux au fost achiziţionate
pe un FACSClibur (Becton-Dickinson, San Jose,
USA), folosind softul CellQuest.
Testul reducerii nitroblue tetrazoliumului
(NBT)
Producţia intracelulară a anionului superoxid
determinată prin testul NBT este o metodă semicantitativă utilizată pentru a determina producţia intracelulară a anionului superoxid de către celulele
fagocitare (celulele PMN şi macrofagele peritoneale). Această tehnică de microscopie se bazează
pe numărarea celulelor ce conţin depozite de formazan, care sunt formate prin reducerea unei sări de nitroblue tetrazolium (Y-NBT), de culoare galbenă,
solubilă în apă şi permeabilă prin membrană, de
către anionul superoxid. Densitatea celulară a fost
stabilită la 2x106 celule/mL, iar în sistem s-au folosit
50 µL de suspensie celulară. Pentru stimulare, s-au
utilizat 10 µL de N-Formil-Met-Leu-Phe (fMLP)
(100 μM) sau 10 μL de PMA (1.62 mM). S-a adăugat soluţia de NBT (25 µL din soluţia de NBT 2
mg/mL), iar probele au fost aduse la un volum final
de 100 µL cu soluţie salină echilibrată Hank (HBSS).
Probele au fost incubate la 37oC, la temperatura camerei, timp de 10 minute pentru fiecare temperatură
şi apoi fixate cu 20 µL soluţie formaldehidă 10%
(Merck) pentru alte 10 minute. Probele au fost centrifugate la 2000 rpm/10 min/4oC, iar din supernatant
s-au extras 80 µL şi s-au înlocuit cu 50 µL HBSS.
Citirea celulelor ce conţineau depozite de formazan
s-a efectuat prin microscopie.
Testul reducerii citocromului C (Cit C)
Determinarea indirectă a producţiei anionului
superoxid, folosind citocromul C, o proteină hem
mică asociată de faţa internă a membranei mitocondriale, care este o componentă esenţială a lanţului
transportor de electroni. Transformarea reversibilă a
Fe din starea oxidată (Fe3+) la starea redusă (Fe2+)
conferă citocromilor funcţia de transportori de electroni. Acceptarea sau eliberarea electronilor de către
citocromoxidaze conduce la oxidarea sau reducerea
Cit C odată cu eliberarea anionului superoxid; acest
proces este activat de fagocitoză sau de unele semnale venite la membrana celulară, putând fi observat
spectrofotometric la 535-540 nm.
În experimente, 100 µL de suspensie celulară cu
o densitate de 5x106 celule/mL au fost stimulaţi in
vitro cu fMLP (100 μM) sau PMA (1.62mM) şi puşi
în contact cu 100 µL soluţie de citocrom C (Sigma)
(9,8 mg/mL) într-un volum final de 0,5 mL. După
incubarea probelor (20 minute, la 37oC), suspensiile
celulare au fost centrifugate (800 RPM/5 min/4oC)
într-un volum final de 0,5 mL, iar densitatea optică
(DO) a supernatanţilor a fost măsurată la 535-550
nm cu ajutorul Spectrofotometrului UV-Vis. Datele
primare au fost exprimate după cum urmează:
Δ = [(DO550 – DO535) x 1000].
Producţia oxidului nitric de către celulele fagocitare utilizând testul Griess
În condiţii fiziologice, oxidul nitric (NO) este
instabil şi rapid oxidat la produşii săi stabili nitrat şi
nitrit. Nitritul poate fi detectat cu ajutorul reactivului
Griess, care conţine două substanţe: sulfanil amida
(1%) şi N-1-naftiletilendiamida dihidroclorică (NED)
(0,1%). În condiţii de aciditate, acidul sulfanilic este
transformat de nitrit într-o sare de diazolium care se
cuplează rapid cu NED, dând o puternică reacţie de
culoare, ce poate fi detectată la 540 nm.
Celulele PMN cu o densitate de 2x106 celule/mL
stimulate cu fMLP (100 μM) (10 µL) şi PMA (1,62
mM) (10 µL) au fost incubate timp de 2 ore la 37oC/
5% CO2, în placa de 24 de godeuri (0,5 mL suspensie celulară/godeu). Macrofagele au fost iniţial lăsate
să adere timp de două ore, după care celulele neaderente au fost îndepărtate prin spălarea de două ori cu
mediu RPMI1640 fără roşu fenol şi apoi incubate
timp de 24 ore cu fMLP şi PMA. La sfârşitul timpului de incubare, au fost pipetaţi 80 µL/godeu de supernatant cu 80 µL /godeu de reactive Griess şi
incubate 10 minute la temperatura camerei, în întuneric. Densitatea optică a reacţiei de culoare a fost
determinată la 540 nm.
213
IANCU şi STÃVARU
Analiza statistică
Datele au fost analizate folosind programul
Gnumeric. Rezultatele sunt exprimate ca medie aritmetică ± deviaţia standard (DS), iar semnificaţia a
fost determinată prin testul t-Student, valorile lui p
de < 0,05 au fost considerare semnificative statistic
si marcate în grafice cu *.
REZULTATE
Evaluarea eliberării extracelulare a SRO de
către celulele PMN
Prin chemiluminiscenţă, a fost evaluată eliberarea extracelulară a SRO de către celulele PMN murine, într-un interval de 40 de minute, în condiţii
bazale sau de stimulare. Rezultatele au arătat faptul
că, în condiţii de repaus, celulele izolate de la şoarecii diabetici au prezentat o eliberare mai mare a SRO
(p = 0,03953) (3139,48 ± 1291,47 mV), comparativ
cu controlul (1472,42 ± 191,70 mV) şi, de asemenea,
după stimularea celulelor cu PMA, valorile înregistrate la şoarecii dTg au fost mai mari decât la Balb/c
(p = 0,0108)
S-a observat faptul că, după stimularea celulelor
cu PMA la ambele linii murine, s-a înregistrat o
uşoară creştere a SRO: la şoarecii Balb/c de la
1472,42 mV în condiţii bazale, la 1834,44 ± 206,38
mV în condiţii de stimulare cu PMA (p = 0,04231),
iar la şoarecii dTg de la 3139,48 ± 1291,47 mV la
5113,09 ± 1869,57mV (p = 0,08805) (Fig. 1).
Producţia intracelulară a H2O2
Capacitatea celulelor PMN izolate din sângele
periferic al şoarecilor control şi diabetici de a produce H2O2 intracelular a fost determinată prin citometrie în flux. Procentul celulelor PMN nestimulate
de la şoarecii dTg care au generat intracelular SRO
a fost semnificativ mai mare (p = 0,22297) comparativ cu cel al şoarecilor Balb/c (23,5 ± 14.33% celule PMN de la şoarecii diabetici vs. 8,7 ± 3,64%
celule PMN control), sugerând o stare bazală de activare. Activitatea fagocitară a celulelor PMN a fost
evaluată prin stimularea cu E. coli şi a arătat cert o
creştere a procentului de celule PMN care au produs
intracelular H2O2 (22,9 ± 12,51%), comparativ cu
condiţia de nestimulare (p = 0,06145). Deoarece, la
nivel bazal, şoarecii diabetici prezintă o activitate
oxidativă crescută, în urma stimulării cu E. coli, procentul granulocitelor ce au produs H2O2 nu a crescut
semnificativ (27,7 ± 16,86%) – rezultatele au fost
comparabile cu controlul (p = 0,51686) (Fig. 2). La
ambele linii murine, activarea celulelor fagocitare pe
calea receptorului fMLP de către peptidul său specific nu a indus o producţie a SRO. În schimb, PMA,
activatorul specific al Protein Kinazei C (PKC), a intensificat producţia intracelulară a H2O2 în granulocitele şoarecilor Balb/c (84,3 ± 6,51%) (p < 0.05) şi
dTg (51,1 ± 10,94%) (p = 0,01401) ilustrând o stimulare mai puternică la şoarecii control decât la cei
diabetici.
Fig. 1. Eliberarea extracelulară a SRO de către celulele PMN de la şoarecii Balb/c şi dTg a fost efectuată prin chemiluminiscenţă. Rezultatele sunt exprimate ca arie (suma emisiei SRO într-un interval de 40 de minute şi exprimată în
mV). Eliberarea bazală a SRO a fost semnificativ mai mare la şoarecii diabetici dTg comparativ cu Balb/c (3139,48 ±
1291,47 mV, în condiţii diabetice vs 1472,42 ± 191,70 mV, în condiţii non-diabetice). La ambele linii murine, stimularea
celulară in vitro cu PMA nu a indus o eliberare semnificativă a SRO (la şoarecii Balb/c 1834,44 ± 206,38 mV, iar la cei dTg
5113,09 ± 1869,57 mV). În schimb, la şoarecii dTg, rezultatele obţinute în urma stimulării cu PMA a evidenţiat o eliberare
a SRO semnificativă, comparativ cu cea a şoarecilor non-diabetici. n=5 şoareci pentru fiecare linie murină; * p < 0,05.
214
Fig. 2. Activitatea oxidativă intracelulară a celulelor PMN din sângele total al şoarecilor Balb/c şi dTg folosind citometria în flux. Pentru această determinare, am folosit kitul Bursttest (Phagobutrst). Procentul celulelor producătoare de H2O2
a fost determinat în condiţii de repaus şi după stimularea in vitro cu E. coli, fMLP şi PMA. La şoarecii diabetici, nivelul bazal
al producţiei de H2O2 (condiţii de repaus) a fost semnificativ mai mare comparativ cu cel al şoarecilor control (23,5 ± 14,33%
celule diabetice vs 8,7 ± 3,64% celule control). Stimularea celulară cu E. coli a indus o creştere a activităţii oxidative doar la
şoarecii Balb/c (până la 22,9 ± 12,51% dintre celule au produs H2O2 intracelular); la şoarecii dTg, procentul celulelor PMN
care au răspuns stimulării bacteriene a fost de 27,7 ± 16,86%. La ambele linii murine, stimularea cu PMA a intensificat semnificativ producţia intracelulară a H2O2 (până la 51,1 ± 10,94% în celulele PMN diabetice şi până la 84,3 ± 6,51% în cele
control); la şoarecii normali, producţia H2O2 a avut o creştere de aproximativ 10 ori în urma stimulării cu PMA, în timp ce
la şoarecii diabetici, producţia de H2O2 a crescut doar de 2 ori. n=5 şoareci pentru fiecare linie murină; * p < 0,05.
Producţia anionului superoxid (O2-)
Pentru a evalua generarea anionului superoxid
(O2-) de către celulele fagocitare, a fost efectuat testul NBT. Rezultatele au demonstrat faptul că la şoarecii diabetici procentul celulelor care au prezentat
depozite de formazan după activarea cu fMLP şi
PMA este mai mare (p < 0,05) comparativ cu controlul, dovedind un status al stresului oxidativ
(Fig. 3 şi Tabelul 1).
Produţia SRO de către fagocite a fost evaluat şi
prin măsurarea reducerii superoxid dismutazei-inhibitoare a citocromului C (Fig. 4). Rezultatele au arătat, la fel ca în cazul testului NBT, o creştere a
producţiei anionului superoxid la şoarecii diabetici,
comparativ cu controlul, în urma stimulării cu fMLP
(87,33 ± 58,29 µM la şoarecii dTg şi 134,40 ± 73,20
µM la cei Balb/c) sau cu PMA (140,33 ± 50,86 µM
la şoarecii control şi 274,00 ± 165,88 µM la şoarecii
diabetici), însă nesemnificativă statistic.
În condiţii bazale, la niciunul dintre testele NBT
sau testul reducerii citocromului C, rezultatele nu au
indicat diferenţe semnificative între liniile murine.
Producţia NO
Oxidul nitric este produs de diferite tipuri de celule şi este un factor reglator important, dar şi mediator al numeroase procese, unul dintre acestea fiind
citotoxicitatea mediată de macrofagele murine faţă
de agenţii microbieni sau faţă de celulele tumorale.
În studiul de faţă, producţia NO de către celulele
PMN şi macrofagele peritoneale (Fig. 5 şi Tabelul 2)
a fost determinată folosind reactivul Griess.
După cum se arată în Tabelul 2, la şoarecii diabetici, în condiţii bazale, rezultatele indică prezenţa
unui status al stresului oxidativ şi o uşoară creştere
a acestuia în urma stimulării cu fMLP sau PMA (p >
0,05). Comparativ cu controlul, celulele fagocitare
izolate de la şoarecii dTg au produs o cantitate mai
mare de NO, care a fost mai puţin generat de activare, cât de un status oxidativ bazal, fapt care sugerează deficite ale mecanismelor antioxidante.
DISCUÞII
Conform studiilor recente, în afara răspunsului
imun celular autoreactiv, stresul oxidativ contribuie
şi el la dezvoltarea şi menţinerea diabetului zaharat
de tip 1.
Atunci când producţia speciilor reactive de oxigen este crescută, iar capacitatea antioxidantă este
afectată, acumularea radicalilor toxici de oxigen şi
azot conduce la leziuni moleculare, celulare şi tisulare. De aceea, este foarte important studiul complicaţiilor diabetului induse de stresul oxidativ. Cea mai
bună metodă de contracarare a acestor efecte defavorabile este reprezentată de dezvoltarea şi administrarea compuşilor antioxidativi a căror evaluare
215
IANCU şi STÃVARU
Tabel 1. Procentul celulelor fagocitare cu depozite intracelulare de formazan, determinat prin testul reducerii NBT
necesită un model animal de diabet corespunzător.
Există diferite modele animale pentru diabetul de tip
1, printre acestea, cele mai des întâlnite modele folosesc distrugerea chimică a celulelor β-pancreatice
prin administrarea streptozotocinei sau a aloxanului.
Aceşti compuşi chimici sunt toxici pentru celulele
β-pancreatice, conducând la dezvoltarea rapidă a hiperglicemiei. Alte modele pentru diabetul de tip 1
sunt şoarecii transgenici, la care boala este generată
de distrugerea autoimună a celulelor β-pancreatice,
mult mai asemănător cu patogenia umană, din care
face parte modelul nostru.
Fig. 3. Producţia intracelulară a superoxid anionului de către: A – celulele PMN şi B – macrofagele peritoneale
prelevate de la şoarecii Balb/c şi dTg folosind testul reducerii NBT. A – în condiţii de repaus, producţia intracelulară
a anionului superoxid a fost similară la ambele linii murine (Balb/c: 9,82 ± 1,91%; şoareci dTg: 11,42 ± 3,01%). Stimularea
cu fMLP a indus o creştere semnificativă doar a procentului de celule diabetice formatoare de formazan (până la 29,33 ±
9,52%). De asemenea, în urma stimulării celulare in vitro cu PMA, la şoarecii Balb/c am observat o creştere a producţiei
anionului superoxid (25,30 ± 3,90%) şi, respectiv, o creştere semnificativă la şoarecii dTg (până la 47,58 ± 12,52%).
B – la nivelul macrofagelor peritoneale prelevate de la ambele linii murie, producţia anionului superoxid obţinută în
condiţii de repaus nu a fost semnificativ diferită (Balb/c: 12,89 ± 2,49%; dTg: 13,75 ± 2,61%), dar, pe fond hiperglicemic,
stimularea celulelor cu fMLP şi PMA a indus o producţie mai mare a anionului superoxid, comparativ cu cea din condiţiile
de repaus (32,10 ± 9,90% dintre celule au răspuns la stimularea cu fMLP şi 42,40 ± 2,94% la PMA). n=5 şoareci pentru
fiecare linie murină; * p < 0.05.
216
Tabel 2. Concentraţia oxidului nitric produs de celulele PMN şi de macrofagele peritoneale prelevate
de la şoarecii Balb/c şi dTg, în condiţii de repaus şi după stimularea in vitro cu fMLP sau PMA
Pe baza acestor date, în studiul nostru am dorit
să evaluăm stresul oxidativ la şoarecii dublu transgenici, şi, de aceea, am măsurat producţia extra- şi
intracelulară a SRO, la nivelul celulelor fagocitare
(celule PMN şi macrofage peritoneale), comparativ
cu şoarecii Balb/c.
Prima linie de apărare împotriva diferiţilor patogeni este reprezentată de celulele care aparţin sistemului imun înnăscut, celulele PMN şi macrofagele.
Celulele PMN joacă un rol important în mecanismul
de apărare a gazdei faţă de diferitele infecţii bacteriene şi se sugerează faptul că o funcţionare defectuoasă a neutrofilului poate fi o cauză importantă în
susceptibilitatea subiecţilor diabetici la infecţii.
În celulele PMN, unul dintre mecanismele implicate în distrugerea patogenilor este reprezentat de
generarea compuşilor toxici, cum sunt speciile reactive de oxigen. Stimularea in vitro a acestor celule
cu peptidul fMLP, un chemoatractant puternic, conduce la: chemotaxia celulelor PMN la concentraţii
mici şi la producerea SRO la concentraţii mari ale
peptidului. Prin legarea la receptorul său de pe su-
prafaţa celulei PMN, fMLP duce la activarea protein
kinazei C (PKC) via activarea iniţială a cascadei biochimice dependente de proteina G [22].
PMA poate şi el stimula PKC într-o manieră mai
directă, prin traversarea membranei celulare. În cele
din urmă, PKC induce activarea nicotinamid adenin
dinucleotid fosfat (NADPH) oxidazei, un lanţ transmembranar transportor de electroni, implicat în reducerea oxigenului la speciile reactive de oxigen [23].
La şoarecii diabetici, în urma stimulării cu PMA
a celulelor PMN, am observat faptul că în condiţii
de repaus/bazale eliberarea SRO a fost sporită comparativ cu cea a şoarecii non-diabetici, probabil datorită unei eficacităţi antioxidante mai mici. Datele
noastre sunt foarte asemănătoare cu cele obţinute de
Delamaire et al., la pacienţii diabetici [24].
În ceea ce priveşte producţia intracelulară a peroxidului de hidrogen (H2O2), datele obţinute pe
acest model murin transgenic de diabet au arătat un
procent crescut de celule PMN care, în condiţii de
nestimulare, au generat H2O2. Stimularea bacteriană
cu E. coli nu a intensificat producţia de H2O2 la ni-
Fig. 4. Evaluarea indirectă a eliberării anionului superoxid, folosind testul reducerii citocromului C, de către celulele
PMN prelevate de la şoarecii Balb/c şi dTg. În celulele PMN aflate în repaus, producţia anionului superoxid nu a evidenţiat diferenţe semnificative între cele două linii murine (88,40 ± 59,42 µM la şoarecii Balb/c şi 115,20 ± 34,77 µM la
cei dTg). Nivelul anionului superoxid a rămas aproape neschimbat în urma stimulării cu fMLP (87,33 ± 58,29 µM la şoarecii control şi 134,40 ± 73,20 µM la cei diabetici). Stimularea cu PMA induce o tendinţă crescătoare a producţiei anionului
superoxid (până la 140,33 ± 50,86 µM la şoarecii control şi până la 274,00 ± 165,88 µM la cei diabetici). n=5 şoareci
pentru fiecare linie murină.
217
IANCU şi STÃVARU
velul celulelor PMN izolate de la şoarecii diabetici,
comparativ cu cei control, fapt care ar putea fi datorat epuizării celulare pe fondul hiperglicemiei. În
urma stimulării cu PMA, un activator puternic al
produţiei H2O2 de către fagocite, între şoarecii dTg
şi Balb/c rezultatele au arătat un procent apropiat de
celule producătoare de H2O2.
Datele anterioare obţinute la oameni indică faptul că producţia H2O2 de către celulele nestimulate
este crescută la pacienţii diabetici, în timp ce generarea O2- de către neutrofilele stimulate este semnificativ depreciată, ceea ce sugerează că producţia
speciilor toxice de oxigen poate fi influenţată de durata bolii [25, 26].
Un alt radical liber de oxigen cu o producţie defectuoasă în DZT1 este anionul superoxid, care a fost
evaluat prin două tehnici diferite: reducerea NBT şi
testul reducerii citocromului C. Contrar nivelului
bazal crescut de H2O2, detectat la şoarecii diabetici,
comparativ cu controlul, generarea anionului superoxid (O2-) de către celulele fagocitare aflate în condiţii de nestimulare a fost similar la ambele linii
murine. Stimularea celulelor fagocitare cu fMLP şi
PMA indică faptul că, la şoarecii diabetici, producţia
anionului superoxid (O2-) este mai mare comparativ
cu controlul, sugerând mecanisme antioxidante mai
puţin eficiente. Studiile care utilizează modele de
DZT1 indică faptul că celulele PMN de la animalele
Fig. 5. Producţia de oxid nitric (NO) de către: A – celulele PMN şi B – macrofagele peritoneale prelevate de la şoarecii Balb/c şi dTg a fost determinată utilizând reactivul Griess. A – în condiţii de repaus, producţia de NO de către
celulele PMN diabetice a fost semnificativ mai mare, comparativ cu cele non-diabetice (20,37 ± 4,73 µM la şoarecii diabetici şi 5,91 ± 1,54 µM la cei non-diabetici), iar stimularea in vitro a celulelor PMN cu fMLP sau PMA nu a indus modificări ale concentraţiei NO (stimularea cu fMLP: 9,43 ± 4,22 µM la şoarecii control şi 21.66 ± 4,39 µM la cei diabetici;
stimularea cu PMA: 10,54 ± 3,15 µM la şoarecii control, şi 22,83 ± 6,66 µM la cei diabetici). B – producţia NO de către
macrofagele peritoneale şi-a meţinut aceeaşi tendinţă ca şi în cazul celulelor PMN, deci, în condiţii de repaus, producţia
de NO a macrofagelor diabetice este de trei ori mai mare decât cea din control (13,29 ± 3,91 µM a celulelor control, şi
41,75 ± 5,85 µM a celor diabetice). La şoarecii non-diabetici şi cei diabetici, stimularea in vitro cu fMLP şi PMA nu induce
modificări ale concentraţiei oxidului nitric comparativ cu condiţia de repaus. Comparativ cu celulele PMN, macrofagele
peritoneale au produs mult mai mult NO. n=5 şoareci pentru fiecare linie murină; * p < 0.05.
218
diabetice prezintă un anumit grad de activare la nivel
bazal [27]. În anul 2005, Nurun et al. au postulat faptul că reducerea colorantului NBT poate fi considerată o determinare indirectă a funcţiei bactericide a
neutrofilelor/fagocitelor (generarea anionului superoxid în timpul fagocitozei reduce colorantul). Aceiaşi autori au observat o scădere semnificativă a
activităţii fagocitare a celulelor PMN de la şobolanii
cu diabet indus cu streptozotocină, considerând că
nu este deocamdată clar dacă aceste efecte sunt datorate direct efectului hiperglicemiei asupra afectării
fagocitozei neutrofilului mediate de receptorul C3b
şi/sau Fc, sau pot fi datorate unei desensibilizări a
celulelor PMN. Întrebarea care se naşte este dacă
aceste diferenţe sunt sau nu datorate modelului experimental utilizat în studiul anionului superoxid sau
dacă producţia radicalului liber poate fi afectată chiar
de streptozotocină. Rezultatele noastre par a fi mai
apropiate de cele obţinute de Zozulińska et al. în
1996, care a observat că, la pacienţii diabetici, în
condiţii de repaus, producţia anionului superoxid nu
este foarte diferită de valorile controlului [25].
Un rol important în patogenia diabetului de tip
1 este jucat de macrofage. Mendez et al., în studiile
în care au utilizat şobolani BioBreeding diabeto-rezistenţi, au observat faptul că expresia sintazei NO
inductibile (iNOS) a fost semnificativ mai mare în
timpul fazei timpurii a infecţiei cu virusul Kilham,
iar inhibarea iNOS a condus la prevenţia diabetului
la animale. La şoarecii diabetici, în condiţii bazale,
rezultatele noastre au arătat o cantitate mai mare de
NO (p < 0,05) şi o intensificare uşoară în urma stimulării cu fMLP sau PMA (p < 0,05), ceea ce sugerează o afectare a mecanismelor antioxidante.
După cum se arată în Tabelul 2, rezultatele obţinute la şoarecii diabetici indică prezenţa unui status
al stresului oxidativ în condiţii bazale şi o uşoară intensificare după stimularea cu fMLP sau PMA (p <
0,05). Comparativ cu controlul, celulele fagocitare
izolate de la şoarecii dTg au produs o cantitate mai
mare de NO, care este mai puţin generat în urma activării şi mai mult datorat statusului oxidativ bazal,
ceea ce sugerează alterări ale mecanismelor antioxidante. Faptul că, în diabetul de tip 1, producţia NO
este crescută, a fost demonstrat prin alte studii care
au utilizat şoareci cu diabet indus cu streptozotocină.
Catanzaro et al. (2010), au folosit antagonişti şi agonişti selectivi ai receptorului B1 pentru bradikinină
pentru a evalua implicarea acestui peptid în medierea
eliberării NO, ca urmare a stimulării cu LPS în dezvoltarea de asamblu a diabetului zaharat. Stimularea
cu LPS a macrofagelor diabetice a indus o creştere
semnificativă a producţiei NO comparativ cu controlul. Eliberarea NO poate fi abolită prin tratarea
macrofagelor cu antagonişi ai receptorului pentru
bradikinina 1; aceşti autori au ajuns la concluzia că,
cel puţin parţial, producţia NO este datorată activării
receptorilor B1 [29-32]. Experimentele noastre sunt
în concordanţă cu studiile anterioare, indicând faptul
că producţia oxidului nitric de către macrofagele peritoneale de la şoarecii dublu transgenici a fost considerabil mai are decât cea a şoarecilor control.
Pe baza asemănărilor observate între rezultatele
obţinute la oameni şi rezultatele evidenţiate în acest
studiu, considerăm că şoarecele dublu transgenic utilizat în experimentele noastre este un model adecvat
pentru studiul stresului oxidativ în diabetul de tip 1.
Avantajul utilizării modelului murin de DZT1 modificat genetic este acela că instalarea şi dezvoltarea
bolii mimează îndeaproape, cel puţin din ceea ce se
ştie la ora actuală, diabetul zaharat de tip 1 uman.
Dacă instalarea diabetului indus chimic necesită doar
câteva zile, la şoarecele dTg, glicemia atinge nivele
anormale după 4 săptămâni de viaţă, iar distrugerea
celulelor β-pancreatice are loc în timp.
Pe baza acestui studiu, putem presupune importanţa utilizării unui model experimental adecvat pentru studiul diabetului de tip 1 şi al complicaţiilor sale
produse de stresul oxidativ.
MULÞUMIRI
Această lucrare a fost susţinută de proiectele naţionale PN06150202/2006 şi PNII 41-074/2007 ale
Ministerului Cercetării din România. Dorim să mulţumim Dlui Conf. Univ. Dorel Lucian Radu pentru
ajutorul său în furnizarea şoarecilor dublu transgenici.
BIBLIoGRAFIE
1 Diabetes. J Clin Endocrinol Metab 2003.
88(4):1624–1628.
61(9-10):458-63.
status and hyperfiltration in young patients with type 1
diabetes mellitus. Pediatr. Nephrol. 2009. 24: 121-127.
oxidative stress and endothelial dysfunction: implica219
IANCU şi STÃVARU
tions of accelerated vascular injury in type I diabetes.
J. Surg. Res. 2009. 155: 173-178.
Rev. 2002. 23: 599-622.
6. West IC. Radicals and oxidative stress in diabetes. Diabet Med 2000. 17:171–180.
of diabetic complications. Nature 2001. 414:813–820.
generation. Diabet Med 1997. 14 (3):S45–S49.
9. Varvarovská J, Racek J, Stozický F, Soucek J, Trefil
L, Pomahacová R. Parameters of oxidative stress in
children with Type 1 diabetes mellitus and their relatives. J Diabetes Complications 2003. 17(1):7-10.
10. Varvařovská J, Racek J, Štětina R, Sýkora J,
Pomahačová R, Rušavý Z, Lacigová S, Trefil L,
Siala K, Stožický F. Aspects of oxidative stress in
children with Type 1 diabetes mellitus. Biomedicine
& Pharmacotherapy 2004. 58(10): 539-545.
11. Matteucci E, Ottavio G. Oxidative Stress in Families
of Type 1 Diabetic Patients. Diabetes Care 2000.
23:1182–1186.
12. Halliwell B. Free radicals, antioxidants, and human
disease: cause or consequence? Lancet 1994. 344:721724.
13. Gupta S, Sharma TK, Kaushik GG, Shekhawat
VP. Vitamin E supplementation may ameliorate oxidative stress in type 1 diabetes mellitus patients. Clin
Lab. 2011. 57(5-6):379-86.
14. Hsu WT, Tsai LY, Lin SK, Hsiao JK, Chen BH. Effects of Diabetes Duration and Glycemic Control on
Free Radicals in Children with Type 1 Diabetes Mellitus. Annals of Clinical & Laboratory Science 2006.
36(2): 174-178.
15. Dominguez C, Ruiz E, Gussinye M, Carrascosa A.
Oxidative Stress at Onset and in Early Stages of Type
1 Diabetes in Children and Adolescents. Diabetes
Care 1998. 21:1736-1742.
16. Harris MI, Hadden WC, Knowler WC, Bennett
PH. Prevalence of diabetes and impaired glucose tolerance and plasma glucose levels in U.S. population
aged 20–74 yr. Diabetes 1987. 36:523–534.
17. Haffner SM, Letho S, Ronnamaa T, Pyorala K,
Laakso M. Coronary heart disease mortality in subjects with type 2 diabetes and in non diabetic subjects
with and without previous myocardial infarction. N
Engl J Med 1998. 339:229–234.
18. Marra G, Cotroneo P, Pitocco D, Manto A, Di Leo
MAS, Ruotolo V, Caputo S, Giardina B, Ghirlanda
G, Santini SA. Early Increase of Oxidative Stress and
Reduced Antioxidant Defenses in Patients with Uncomplicated Type 1 Diabetes - A case for gender difference. Diabetes Care 2002. 25: 370–375.
19. Radu DL, Brumeanu TD, McEvoy RC, Bona CA.
Escape from self-tolerance leads to neonatal insulindependent diabetes mellitus. Autoimmmunity 1999.
30: 199-207.
20. Radu DL, Noben-Trauth N, Hu-Li J, Paul WE,
Bona CA. A targeted mutation in the IL-4Ra gene
220
protects mice against autoimmune diabetes. Proc.
Natl. Acad.Sci. USA 2000. 97: 12700-12704.
21. Radu DL, Georgescu A, Stavaru C, Carale A,
Popov D. Double transgenic mice with Type 1 diabetes mellitus develop somatic, metabolic and vascular disorders. J. Cell. Mol. Med. 2004. 8(3): 349-358.
22. Casimir CM, Teahan CG. The respiratory burst of
neutrophils and its deficiency. In Immunopharmacology of Neutrophils (P. G. Hellewell, W. T. J., eds.),
San Diego, CA, Academic 1994. 27–54.
23. Walrand S, Valeix S, Rodriguez C, Ligot P, Chassagne J, Vasson MP. Flow cytometry study of polymorphonuclear neutrophil oxidative burst: a
comparison of three fluorescent probes. Clin. Chim.
Acta 2003. 331: 103–110.
24. Delamaire M, Maugendre D, Moreno M, LeGoff
MC, Allanic H, Genetet B. Exploration of the various
steps of polymorphonuclear neutrophil function in diabetic patients. J. Mal. Vasc. 1995. 20: 107-112.
25. Zozulińska DA, Wierusz-Wysocka B, Wysocki H,
Majchrzak AE, Wykretowicz A. The influence of insulin-dependent diabetes mellitus (IDDM) duration on
superoxide anion and hydrogen peroxide production
by polymorphonuclear neutrophils. Diabetes Res Clin
Pract. 1996. 33(3):139-44.
26. Inoue S, Lan Y, Muran J, Tsuji M. Reduced hydrogen peroxide production in neutrophils from patients
with diabetes. Diabetes Res Clin Pract. 1996. 33(2):
119-27.
27. Nurun NAHM, Islam LN, Rahman Mohammad
M, Biswas KB. Polymorphonuclear Neutrophil Dysfunctions in Streptozotocin-induced Type 1 Diabetic
Rats. Journal of Biochemistry and Molecular Biology
2005. 38(6): 661-667.
28. Mendez II, Chung YH, Jun HS, Yoon JW. Immunoregulatory Role of Nitric Oxide in Kilham Rat
Virus-Induced Autoimmune Diabetes in DR-BB Rats.
The Journal of Immunology 2004. 173: 1327–1335.
29. Lawson SR, Gabra BH, Nantel F, Battistini B,
Sirois P. Effects of a selective bradykinin B1 receptor
antagonist on increased plasma extravasation in streptozotocin-induced diabetic rats: distinct vaculopathy
profile of major key organs. Eur J Pharmacol 2005.
514: 69–78.
30. Gabra BH, Berthiaume N, Sirois P, Nantel F, Battistini B. The kinin system mediates hyperalgesia
through the inductible bradykinin B1 receptor subtype: evidence in various experimental animal models
of type 1 and type 2 diabetic neuropathy. Biol Chem
2006. 387: 127–143.
31. Catanzaro O, Dziubecki D, Obregon E, Rodriguez
RR, Sirois P. Antidiabetic efficacy of bradykinin antagonist R-954 on glucose tolerance test in diabetic
type 1 mice. Neuropeptides 2010. 44: 187–189.
32. Catanzaro O, Dziubeckia D, Labala E, Siroisc P.
Activation of peritoneal macrophages during the evolution of type 1 diabetes (insulitis) in streptozotocintreated mice. Peptides 2010. 31(10): 1884-1887.
CAPsAICIN sHORT TeRM ADMINIsTRATION eFFeCT
ON DIFFeReNT IMMUNe PARAMeTeRs
Adina Daniela Iancu1*, Ileana Petcu2, Beatrice Mihaela Radu3,4, Mihai Radu2,4
1“cantacuzino”
national institute of research-Development for microbiology and immunology, Bucharest, romania;
Hulubei” national institute of Physics and nuclear engineering, Bucharest-magurele, romania;
3University of Bucharest, Faculty of Biology, Bucharest, romania; 4University of Verona, italy
2“Horia
ABsTRACT
Type 1 diabetes is an autoimmune disease affecting a higher and higher number of persons; for this
reason, the study of diabetes, and its complications, has shown a major interest. In order to highlight
the modifications appeared in this disease, it is essential to use a suitable model. In “Cantacuzino”
NIRDMI there is a double transgenic murine model which develops a fulminating form of type 1 diabetes. Previous studies indicate the usefulness of this diabetic murine model in order to study neuropathy. Capsaicin treatment is one method to reduce neuropathic pain. This study was based on the
assumption that intraperitoneal administration of a low dose of capsaicin, on a short period of time,
can decrease pain sensations generation and transmission. If from the neurological point of view, capsaicin effects are known, its effects on the immune system are not clear yet. Therefore, in this study
we have investigated capsaicin effects on oxygen and nitrogen free radicals generation by phagocytic
immune cells, in lymphocyte populations, and also capsaicin effects on plasmatic protein oxidation.
Our results point to minor modifications in oxygen reactive species production, simultaneous with a
significantly decrease in nitric oxide generation, without affecting lymphocyte populations. Therefore,
capsaicin short term administration can be used to reduce pain sensations, without the impairment of
immune parameters.
Keywords: capsaicin, type 1 diabetes, oxidative stress, pain
INTRoDUCTIoN
Type 1 diabetes is a disease that affects more
and more persons all over the world; it is characterized by an autoimmune destruction of pancreatic βcells, by T lymphocytes pathway, followed by
hyperglycemia and low insulin level. Besides the autoimmune character, in type 1 diabetes mellitus an
important role is played by oxidative stress [1], leading to the appearance of various complications; in
type 1 diabetic subjects, hyperglycemia is a contributing factor to increased oxidative stress [2-8]. In
order to highlight changes in this disease, it is essential to use a suitable experimental model. In “Cantacuzino” NIRDMI there is a double transgenic mice
model which develops a fulminating form of type 1
diabetes; this murine model of diabetes was used in
the investigations of electrophysiological parameters
changes occurring in diabetic neuropathy. In 2009,
Radu and colleagues demonstrated the existence of
some changes in electrophysiological parameters of
dorsal root ganglia neurons collected from diabetic
double transgenic mice; the electrophysiological
changes were focused on action potentials (AP) (a
decrease in AP amplitude, decreasing in AP total duration, due to an increase in repolarisation phase) and
hyperpolarization currents characteristics (general
profile of hyperpolarization currents voltage was
shifted towards higher values, increasing of time
constant hyperpolarization currents is shifted towards slow kinetic currents). All these changes in
the electrophysiological parameters suggest that
double transgenic mice are a suitable model for
studying pain mechanisms in type 1 diabetes [9].
Topical capsaicin (8-methyl-N-vanillyl-6-nonenamide) administration is one of the most common
*corresponding author: Adina Daniela Iancu, email: [email protected]
221
IANCU et al.
methods for pain diminishing. The first information
regarding pain-reducing properties of topical capsaicin application appeared in 1850 as a recommendation of an alcoholic hot pepper extract use. Over
time, creams, lotions and patches, containing different capsaicin concentrations, have been developed
being used to reduce neuropathic and musculoskeletal pain. Studies regarding topical capsaicin administration showed some beneficial effects in different
pain syndromes, such as post-herpetic neuralgia, diabetic neuropathy and musculoskeletal pain [10-11].
Some studies performed on brain potential amplitude
recovery time to burning pain induced by laser stimulation following topical capsaicin treatment showed
a functional recovery before the significant cutaneous nerve markers recovery (such as TRPV1 receptors) [12].
There is no evidence that topical capsaicin administration works through a transdermal absorbtion
into tissues, others than skin. Capsaicin is a very
lipophilic, non-water-soluble compound and resists
diffusion into aqueous solutions such as blood, and
shows limited potential for transdermal delivery
across human skin. Even when capsaicin is absorbed
systemically, the exposure time is very short [13].
The longer the half time of topical capsaicin, the
more likely it is to reflect a slower release into the
skin. Capsaicin is rapidly metabolized by several enzymes from human liver, but in vitro studies showed
that its metabolism into human skin is quite slow
[14]. The importance of topical capsaicin-containing
analgesics applying is that capsaicin can reside at the
site of action (i.e. skin) relatively unchanged,
whereas transdermally absorbed capsaicin is rapidly
eliminated.
In vitro application of capsaicin led to a decrease in action potentials amplitude and its generation frequency by sensory neurons. Radu and
colleagues have studied the reduction of pain sensation by in vivo capsaicin administration; the results
of this study are consistent with those obtained in
vitro (unpublished data).
In this study, using a double transgenic mice
model which develops type 1 diabetes, we aimed to
evaluate the effects of in vivo capsaicin administration on different immune parameters.
Murine strains: Balb/c mice used as control,
non-diabetic mice, and double transgenic (dTg) mice
(TCR-HA+/-INS-HA+/-) which develop a fulminating
form of type 1 diabetes. In this study, the age range
222
was of 3-4 months. Mice were housed in standard
size polycarbonate cages, fed with standard pellet diet
and water was given ad libitum. All animal care in
the experiments was in accordance with international
norms in ethical laboratory animals procedures.
Selection criteria of type 1 diabetic mice: The
selection criteria of diabetic aminals used in this experiment were the identification of both transgenes
(TCR-HA and INS-HA) in dTg mice by PCR [1517], and, the plasmatic glucose level determination
(using OneTouch Ultra glucometer strips). dTg mice
were considered diabetic at glycemia values exceeding 200 mg/dL.
Capsaicin and vehicle administration: Both
diabetic and non-diabetic animals were 3 days
treated by capsaicin (0.8 mg/Kg body weight) or its
vehicle, using intraperitoneal inoculation. The biological samples used in our tests (plasma, peripheral
blood or peritoneal macrophages) were collected two
hours after the last administration.
Glycemia was determined before capsaicin administration, and 2 hours after the third one.
Peritoneal macrophages were collected by
peritoneal lavage using 3-4 mL cold RPMI1640
media without phenol red.
Polymorphonuclear (PMN) cells from heparinized peripheral blood were isolated by gradient
density separation using Histopaque separating medium with 1.77 relative density (Sigma). The erythrocytes were removed by lysing solution (30
minutes/4oC). After lysing solution removal and two
times PMN cells washing steps, the cells were kept
in RPMI1640 culture media. We used only cell suspensions with more than 95% cell viability assessed
by eosin (Sigma) dye exclusion assay (0.5% eosin).
Nitroblue tetrazolium (NBT) reduction test
is an assay which allows determining intracellular
superoxide production by phagocytic cells. The percentage of granulocytes containing formazan deposits (blue-violet) was determined by optical
microscopy. Cells were in vitro stimulated by NFormyl-Met-Leu-Phe (fMLP) (100 µM) and phorbol-12-myristate-13 acetate (PMA) (1.62 mM) and
put in contact with the tetrazolium salt (2 mg/mL)
(25 µL/sample), then fixed with 10% formaldehyde,
centrifuged and Hank’s Balanced Salt Solution
(HBSS) resumed. For each sample, at least 100 cells
were read, and then the percentage of cells which incorporated tetrazolium salt and formed specific formazan deposits was determined.
Nitric oxide (NO) determination was performed using Griess reagent (sulphanilamide and
N-1- naphthylethylenediamine dihydrochloride
Capsaicin short term administration effect on different immune parameters
(NED)). Cellular density was 2x106 cells/mL. NO
production by peritoneal macrophages was investigated during 24 hours fMLP and PMA stimulation.
The results are expressed as NO concentration (µM),
and estimated according to the calibration curve of
standard nitrite (100 – 1.56 µM). NO concentration
was detected at 540 nm.
Intracellular hydrogen peroxide production
by peripheral PMN cells. For this determination,
Bursttest (Phagoburst), ORPEGEN Pharma commercial kit was used. Shortly, in order to detect PMN
oxidative burst activity we used 100 µL of whole
blood / sample; cells activation was performed by
fMLP (5 µM), PMA (8.1 µM) and E. coli (~ 1 x 109
bacteria/mL) stimulation and incubated for 10 minutes at 37oC. In order to highlight the oxidative reaction, substrate reaction was added, represented by
dihydrorhodamine 123 (DHR-123) which oxidizes
in contact with reactive oxygen species (H2O2) and
becomes Rhodamin 123 with a fluorescent spectral
emission in first fluorescence channel. Stopping oxidizing reaction, erythrocytes removal and leukocytes
fixation was done using lysing solution (2 mL/sample). After lysing solution removal by centrifugation,
the probes were washed with Washing solution, and
kept in phosphate-buffered saline (PBS), and analyzed using FACSCanto II flowcytometer.
Carbonyl content determination of plasma
oxidative changed proteins. Carbonyl groups determination from plasma proteins represents a free
radical activity marker; by this assay, protein oxidation was evaluated. Plasma samples (100 µL) were
incubated for 60 minutes with 2,4-dinitrophenylhydrazine (DNPH) (1200 µL of 10mM solution). Then,
the protein was precipitated using 30% trichloroacetic acid (700 µL), and washed three times using
an ethanol/ethyl acetate solution, and dissolved in
one milliliter of 6 M guanidine hydrochloride solution. Carbonyl content was determined using a spectrophotometer at 370 nm, and the results were
expressed as µmol/mg protein.
The antioxidant capacity: In order to measure
antioxidant capacity, plasma samples were first centrifuged, then the supernatant was processed. On the
testing day, 7 Trolox standard curves were prepared
using a 0 – 0.33 mM Trolox range and the results
were expressed based on it. The samples (10 µL of
plasma) were tested in duplicate using a 96 wells
plate. 10 µL/well of metmyoglobin and 150 µL/well
of chromogen substrate, represented by ABTS (2.2’
–azino-di (3-ethilbenzthiazoline-6-sulfonic acid)
were added. The initiation of oxidizing reaction was
performed by adding 40 µL/well of H2O2 (441 µM),
and after 7 minutes incubation at room temperature,
the absorbance was determined at 750 nm.
Mice immunophenotypic profile following
capsaicin administration. Peripheral lymphocyte
populations were determined 14 days after the first
vehicle/capsaicin treatment in mice. The peripheral
blood was collected by retroorbital punction, in
EDTA treated tubes. The percentage of B220+,
CD3+, CD4+, CD8+ and NK1.1+ cell populations
was determined in 100 µL of blood using monoclonal antibodies conjugated with FITC (fluorescein
isothiocyanate), PE (phycoerythrin) and PerCP
(Peridinin chlorophyll protein) (Becton Dickinson)
fluorochromes. The erythrocytes were removed by
lysing solution; after its removal (by centrifugation)
cellular pellet was washed with phosphate buffered
saline, and in the end was resuspended in 300 µL 1%
paraformaldehyde solution. Cell populations were
determined using a BD FACSCanto II flowcytometer, and analyzed by BD FACSDiva software.
Lymphocyte apoptosis evaluation by flowcytometry using Annexin V and propidium iodide
(FITC Annexin V kit, BD Pharmingen). In this study,
we have determined apoptosis level in lymphocyte
population from peripheral blood of normal Balb/c
and diabetic dTg mice, in two experimental conditions: during vehicle administration, which represents control, and following capsaicin treatment.
Lymphocytes were collected by peripheral blood
gradient density separation. After two washing steps
with PBS, cells were resuspended in Binding Buffer
at 1x106 cells / mL density; in order to determine
apoptosis level, 100 µL of cell suspension were
stained by FITC AnnexinV and Propidium Iodide
(PI). After 10 minutes incubation at room temperature (25oC) in the dark, 400 µL of Binding Buffer
were added to each tube, and then all probes were
determined using a BD FACSCanto II flowcytometer within one hour, and analyzed by BD FACSDiva
software.
Mitochondrial membrane potential (Δψ) detection using flowcytometry (MitoScreen Flow Cytometry Mitochondrial Membrane Potential
Detection Kit, BD Biosciences). The energy that is
released during the oxidation reactions in the mitochondrial respiratory chain is stored as a negative
electrochemical gradient across the mitochondrial
membrane and the Δψ is referred to as being polarized. The manner in which Δψ is changing may help
to clarify mitochondria’s role in apoptosis.
Peripheral lymphocytes isolated by gradient
density separation and brought to 1x106 cells / mL
cellular density were incubated 10-15 minutes at
223
IANCU et al.
37oC / 5% CO2 with JC-1 solution (5,5’,6,6’-tetrachloro-1,1’,3,3’-tetraethylbenzimidazolcarbocyanine iodide) (0.5 mL/sample), then washed twice
with Assay Buffer (1-2 mL/sample); after supernatant removal by 400 x g for 5 minutes centrifugation, cellular pellet was resuspended in Assay Buffer
(0.5 mL/sample), and the probes were determined by
a BD FACSCanto II Flowcytometer and analyzed by
BD FACSDiva Software.
Statistical analysis. Data were analyzed using
Gnumeric program. The statistical significance between various groups of mice was determined by
Student’s t test. Differences were considered to be
statistically significant when p values were < 0.05,
see the * in graphs; in all the experiments we used 5
mice for each experimental condition.
RESULTS
Glycemic variation during capsaicin treatment. Glycemia was monitored 2 hours after the last
capsaicin administration; all the determinations were
performed compared to control values obtained during vehicle administration. In non-diabetic Balb/c
mice, capsaicin administration did not induce major
changes in glycemic values (p > 0.05) (169.60 ±
13.90 mg/dL in control conditions and 170.00 ±
15.00 mg/dL following capsaicin administration). In
dTg diabetic mice, short term capsaicin administration led to a decrease in glycemic level (from 599.60
± 0.89 mg/dL to 511.20 ± 61.20 mg/dL during capsaicin treatment) (p < 0.05) (Fig. 1) – such a decrease
indicates the contribution of a short term capsaicin
treatment to blood glucose decrease in type 1 diabetes. It will be interesting to see the effect of capsaicin treatment for a longer period of time, maybe
weeks.
Changes in the body weight following capsaicin treatment. In order to evaluate possible capsaicin effects in body weight, mice were monitored
before first administration (D-1), after the second
(D-2) and the third (D-3 – two hours later) administration (Fig. 2). Balb/c mice body weight in control
conditions was: D-1: 20.6 ± 0.20 grams; D-2: 21.32
± 0.33 grams; D-3: 21.52 ± 0.73 grams (Fig. 2A). In
non-diabetic Balb/c mice, capsaicin treatment did
not induce significant changes in body weight (D-1:
22.04 ± 0.46 grams; D-2: 23.9 ± 1.17 grams; D-3:
23.72 ± 1.40 grams) (Fig. 2B) (p > 0.05). The body
weight of diabetic control mice was: 25.26 ± 0.19
grams at D-1 moment; 25.3 ± 1.20 grams at D-2 moment and 25.36 ± 1.46 grams at D-3 moment) (Fig.
2A); following capsaicin treatment, diabetic animals
body weight did not undergo significant changes (D1: 22.96 ± 3.96 grams; D-2: 22.04 ± 4.88 grams; D3: 21.14 ± 5.01 grams) (Fig. 2B) (p > 0.05).
As can be seen, in normal Balb/c mice and dTg
diabetic ones capsaicin did not induce significant
changes in body weight (p > 0.05), confirming that
0.8 mg/Kg dose is not noxious for treated animals.
Intracellular superoxide anion production by
phagocytic cells was determined using nitroblue
tetrazolium reduction test (Fig. 3). In Balb/c non-diabetic mice, capsaicin administration did not induce
significant changes in the percentage of PMN cells
producing superoxide anion, compared to control
Balb/c mice (vehicle treated) (during capsaicin administration, in resting conditions 12.68 ± 4.01% of
cells produced superoxide anion, and the percentage
of superoxide anion forming cells during fMLP was
15.59 ± 3.67%, and 42.37 ± 10.77% upon PMA
stimulation; upon vehicle administration, in resting
conditions 7.67 ± 2.34% of cells produced intracel-
Fig. 1. Plasma glucose level in Balb/c and dTg vehicle and capsaicin treated mice. Glycemia was determined 2 hours
after the last administration.
224
A
B
Fig. 2. The influence of vehicle (A) and capsaicin (B) administration in Balb/c and dTg mice body weight. Body
weight was determined before the inoculation (D-1), after the second (D-2) and the third (D-3) vehicle and capsaicin
administration. (D – day).
lular superoxide anion, and by in vitro stimulation
with fMLP 11.74 ± 2.86% of cells produced superoxide anion; 25.89 ± 13.69% of cells produced superoxide anion upon PMA stimulation) (Fig. 3A). In
both experimental conditions (vehicle and capsaicin
administration), upon PMA stimulation, Balb/c
PMN cells produced significantly more superoxide
anion compared to unstimulated ones (p < 0.05). In
diabetic dTg mice, capsaicin treatment did not induce significant changes in superoxide anion production (p > 0.05). So, in control conditions, the
percentage of superoxide anion producing PMN
cells was 14.54 ± 2.93%, fMLP stimulation induced
an increase in the production up to 23.96 ± 5.97%,
and PMA stimulation up to 45.44 ± 8.03%. In diabetic mice treated by capsaicin, superoxide anion
production basal level was 16.26 ± 6.22%, and following fMLP cells stimulation was 28.80 ± 5.77%,
and 38.91 ± 14.66% upon PMA stimulation. In diabetic vehicle treated mice, the percentage values in
superoxide anion production were not significantly
different from those obtained during capsaicin administration (p > 0.05).
In peritoneal macrophages collected from
Balb/c mice, capsaicin administration induced a significant decrease of intracellular superoxide anion
production. So, if at baseline, the percentage of resting peritoneal macrophages which produced superoxide anion was 12.98 ± 1.63%, upon capsaicin
administration, the percentage of superoxide anion
producing macrophages diminished to 9.78 ± 1.50%
(p < 0.05) (Fig. 4A). Towards the baseline, in vitro
peritoneal macrophages stimulation by fMLP and
PMA stepped up superoxide anion production both
in vehicle (22.72 ± 8.34% superoxide anion producing cells during fMLP stimulation and 36.97 ±
4.31% during PMA stimulation) and capsaicin
(20.75 ± 4.13% superoxide anion producing cells
during fMLP stimulation and 32.87 ± 4.67% to
PMA stimulation) treated mice. By comparing the
values obtained in vehicle treated mice with those
obtained following capsaicin administration, fMLP
225
IANCU et al.
A
B
Fig. 3. Intracellular production of superoxide anion highlighted in PMN cells in: A. Balb/c and B. diabetic dTg mice
and PMA stimulation of peritoneal macrophages collected from Balb/c mice did not induce significant
changes (p > 0.05) (Fig. 4A).
In peritoneal macrophages collected from dTg
diabetic mice, capsaicin administration did not induce significant changes in superoxide anion resting
level (if the percentage of cells following vehicle
administration was 10.70 ± 2.52%, following capsaicin administration it was 9.23 ± 2.92%) (p > 0.05)
(Fig. 4B). Compared to baseline, fMLP and PMA in
vitro stimulation of diabetic peritoneal macrophages
has resulted in an increase of superoxide anion production (fMLP: 26.24 ± 7.75% superoxide anion
producing cells during vehicle treatment and
19.12 ± 4.58% during capsaicin treatment; PMA:
49.84 ± 10.75% for vehicle and 52.09 ± 2.81 % for
capsaicin), this increase was statistically significant
(p < 0.05). However, capsaicin administration did
not induce significant changes in superoxide anion
production by peritoneal macrophages harvested
from type 1 diabetic mice, the comparison was
performed depending on vehicle administration
(p > 0.05) (Fig. 4B).
226
Intracellular production of hydrogen peroxide was determined by flow cytometry using
Bursttest (Phagoburst) commercial kit. The results
were analyzed as the percentage of cells with low,
medium and high fluorescence, but data interpretation was performed for high fluorescence cells.
In Balb/c mice, in vitro PMN stimulation by
E.coli and PMA led to an increase in H2O2 production compared to resting cells; this increase was observed both in control (vehicle treated) and capsaicin
treated mice (p < 0.05) (Table 1). Capsaicin administration tends to lead to a decrease in hydrogen
peroxide intracellular production; this tendency was
observed in resting cells (from 4.2 ± 5.63% H2O2
forming cells in vehicle inoculated mice, to 2.12 ±
1.64% in capsaicin treated ones) (p > 0.05). Following vehicle administration, the percentage of cells
stimulated by E. coli was 11.08 ± 14.79% and 9.06
± 4.88% following capsaicin administration. PMA
stimulation in PMN cells from Balb/c vehicle treated
mice induced H2O2 production in 20.66 ± 16.82%
of cells and in capsaicin treated mice H2O2 production was of 13.78 ± 4.56%. Therefore, in normal
A
B
Fig. 4. Intracellular production of superoxide anion by peritoneal macrophages harvested from: A. Balb/c and B.
diabetic dTg mice
mice, after only 3 days of capsaicin administration
there was a slight decrease in intracellular production of H2O2, both at baseline and after PMN stimulation by E. coli and PMA.
In dTg diabetic mice, capsaicin administration
led to a slight, but insignificant increase in intracellular hydrogen peroxide production (p > 0.05). H2O2
basal production in PMN cells harvested from vehicle treated mice was 37.8 ± 27.37% and in capsaicin
treated ones was 58.94 ± 21.12%. fMLP stimulation
of PMN cells from dTg mice capsaicin administered
induced a higher hydrogen peroxide production
compared to that during vehicle administration
(45.78 ± 19.17% vs 25.16 ± 18.63%). Capsaicin
treatment induced the same increasing tendency in
H2O2 production in diabetic PMN stimulated by E.
coli and PMA (E. coli: 32.72 ± 21.43% of cells produced H2O2 in control conditions, and capsaicin administration induced a 39.64 ± 17.33% peroxide
production; during in vitro PMA stimulation in control mice we observed 28.66 ± 14.88% of hydrogen
peroxide forming cells, and 47.74 ± 18.01% in
capsaicin inoculated ones). This increase in H2O2
production in PMN cells harvested from capsaicin
treated mice was not statistically significant
(p > 0.05) (Table 2).
Nitric oxide production was determined using
Griess reagent. As we expected, in diabetic mice, NO
production by peritoneal macrophages was increased
compared to non-diabetic conditions. Following capsaicin treatment, NO production diminished considerably in both murine strains. In non-diabetic Balb/c
mice, capsaicin administration induced a decrease in
NO basal production (from 2.08 ± 1.52 µM to 0.01 ±
0.02 µM following capsaicin treatment). In control
mice, in vitro stimulation of peritoneal macrophages
using PMA generated 0.29 ± 0.34 µM NO, and in
capsaicin treated mice a total inhibition in NO production (p < 0.05) was observed. fMLP stimulation
of peritoneal macrophages harvested from non-diabetic mice intensified NO production in both experimental conditions (in vehicle treated mice NO
concentration was 4.44 ± 1.61 µM, and in capsaicin
treated mice, 11.90 ± 4.58 µM) (p < 0.05) (Fig. 5A).
227
IANCU et al.
Table 1. H2O2 intracellular production in PMN cells from peripheral blood
of Balb/c mice following Vehicle and Capsaicin administration
In dTg diabetic mice, capsaicin administration
led to a significant decrease in NO production, both
in resting conditions of peritoneal macrophages
(12.70 ± 5.32 µM NO in vehicle treated mice and
0.77 ± 1.42 µM in capsaicin treated mice) and following PMA stimulation (vehicle: 12.29 ± 8.38 µM;
capsaicin: 2.33 ± 3.25 µM) (p < 0.05) (Fig. 5B). An
insignificant downward trend of NO production was
observed during peritoneal macrophages stimulation
using fMLP (in vehicle treated mice NO concentration was 37.37 ± 6.06 µM, and 26.79 ± 12.81 µM in
capsaicin treated mice) (p > 0.05) (Fig. 5B).
The immunophenotypic profile following
capsaicin administration was performed 14 days
after the first inoculation. In the peripheral blood of
dTg diabetic mice, regardless of the experimental
conditions used (control conditions represented by
vehicle administration or capsaicin treatment) a
higher
percentage
of
B
lymphocytes
(CD45R/B220+) was observed (65.92 ± 11.59% in
control conditions and 69.35 ± 7.55% following capsaicin treatment) (Fig. 6B) compared to control
Balb/c mice Balb/c (47.90 ± 7.04% in control mice
228
and 42.80 ± 11.78% in capsaicin treated ones) (Fig.
6A); these values indicate that capsaicin administration did not induce significant changes in the percentage of B cells from the peripheral blood of both
murine strains used in the experiment (p > 0.05).
Both in non-diabetic and diabetic mice, the percentage of Th (CD3+/CD4+) lymphocytes was not
significantly altered following capsaicin administration (control Balb/c mice had 27.50 ± 3.31% Th cells
and capsaicin treated ones had 29.28 ± 10.96%; control diabetic dTg mice had 20.28 ± 8.55% Th lymphocytes vs 19.05 ± 6.43% Th lymphocytes
following capsaicin treatment) (p > 0.05) (Figs. 6 A
and B). The percentage of cytotoxic/suppressor T
lymphocytes (CD3+/CD8+) did not undergo significant changes either following capsaicin administration (control Balb/c mice had 7.80 ± 1.83% Tc/s
lymphocytes and capsaicin treated ones 7.84 ±
2.63%; control diabetic dTg mice had 2.40 ± 1.00%
Tc/s cells and capsaicin treated ones 2.80 ± 1.56%)
(p > 0.05) (Figs. 6 A and B).
NK cells from control Balb/c mice were in proportion of 0.98 ± 0.72%, and in those treated by cap-
Table 2. H2O2 intracellular production in PMN cells from peripheral blood
of dTg mice following Vehicle and Capsaicin administration
saicin the percentage of these cells was 1.40 ± 0.64%;
in capsaicin treated dTg mice a slight, but insignificant, increase in the percentage of NK cells can be
observed following capsaicin administration (in control mice 6.30 ± 1.89% NK cells and 9.55 ± 4.56%
NK cells during capsaicin administration). Therefore, capsaicin did not induce significant changes in
NK cells percentage, which was observed in both
murine strains used (p > 0.05) (Figs. 6 A and B).
Mitochondrial membrane potential (Δψ) detection using flowcytometry. Data from the literature indicate that capsaicin treatment of different cell
types leads to an increase in cell apoptosis. For this
consideration, in this study we aimed to assess lymphocyte populations in terms of apoptosis induction
following in vivo capsaicin administration.
After their isolation, peripheral lymphocytes
were stained by JC-1 solution; data analysis revealed
that in both murine strains capsaicin administration
did not lead to a significant change in the percentage
of apoptotic cells.
In control conditions, represented by vehicle administration, non-diabetic Balb/c mice had a lower
apoptotic lymphocyte percentage than diabetic ones
(4.58 ± 1.95% and 9.75 ± 3.83% respectively)
(p < 0.05). The same tendency was maintained
during capsaicin administration (4.20 ± 1.39% apoptotic lymphocytes observed in normal mice that received capsaicin and 7.85 ± 3.05% apoptotic cells
determined in the peripheral blood of hyperglycemic
mice treated by capsaicin) (p< 0.05) (Figs. 7A and
B). Although in both murine strains, following capsaicin administration there was a slight downward
trend in the percentage of cells with depolarized Δψ
(considered as apoptotic), the differences were not
statistically significant (p > 0.05).
In dTg mice with type 1 diabetes, a higher degree in depolarization of Δψ, which indicates apoptosis degree in lymphocyte population, makes
possible a correlation with a decrease in defense capacity against infections of the organisms affected
by this disease.
Lymphocyte apoptosis level was determined
using Annexin V and propidium iodide; in control
conditions, no significant differences in lymphocyte
apoptosis degree were detected between both murine
229
IANCU et al.
A
B
Fig. 5. Nitric oxide concentration produced by peritoneal macrophages collected from Balb/c (A) and dTg (B) mice
following three consecutive days administration of vehicle and capsaicin (Caps)
strains. In normal and diabetic mice, the percentage
of living cells, of those in early apoptosis or already
dead following capsaicin administration, was very
close to that obtained during vehicle administration
(Fig. 8).
In Balb/c non-diabetic vehicle treated mice, the
percentage of early apoptotic lymphocytes (AnnexinV+/PI- cells) was 20.32 ± 5.95% and that of late
apoptotic cells (Annexin+/PI+ cells) was 7.74 ± 3.03%;
following capsaicin administration, 16.02 ± 1.84%
of cells were early apoptotic and 12.58 ± 10.32% in
late apoptosis. Thus, in non-diabetic Balb/c mice, it
can be observed that capsaicin administration did not
induce significant changes in the percentage of early
or late apoptotic cells (p > 0.05) (Fig. 8A).
In control diabetic mice, the percentage of peripheral lymphocytes in early apoptosis was 18.38 ±
11.83%, and during capsaicin administration the percentage was 18.57 ± 2.80% (p > 0.05). In control
conditions, the percentage of late apoptotic diabetic
lymphocyte was 5.26 ± 1.62% and following capsaicin treatment 3.00 ± 1.95% (p > 0.05) (Fig. 8B).
230
Fig. 9 shows carbonyl groups concentration
level, as a measure of oxidative status of plasma proteins. First, it can be observed that there is no significant difference between plasma protein oxidation
level in diabetic (dTg) mice and normal ones
(Balb/c).
Although no statistically significant changes
were observed, an 20% decrease in the concentration
of oxidized protein from normal vehicle treated mice
compared to control (vehicle) ones (from 0.642 ±
0.095 nM/mg protein, in control conditions, to 0.454
± 0.234 nM/mg protein, following capsaicin administration) (p > 0.05) and a slight increase in capsaicin
treated diabetic mice compared to control (vehicle)
ones (0.542 ± 0.064 nM/mg protein following capsaicin administration vs 0.568 ± 0.122 nM/mg in control conditions) (p > 0.05) could be noticed (Fig. 9).
The results for plasma total antioxidant capacity of non-diabetic Balb/c and diabetic dTg mice,
in both experimental conditions, are presented in
Fig. 10. As expected, type 1 diabetic mice have a significantly lower antioxidant capacity (by 50%) com-
A
B
Fig. 6. The percentage of lymphocyte populations and subpopulations from peripheral blood of control Balb/c (A)
and diabetic dTg (B) mice, the percentage was determined 14 days after the first vehicle or capsaicin administration
pared to non-diabetic Balb/c mice (1.192 ± 0.147
Trolox Equivalent/mM in normal conditions, and
0.522 ± 0.021 Trolox Equivalent/mM in diabetes) (p
< 0.05). In normal mice, capsaicin administration
leads to a slight increase in antioxidant capacity
(from 1.192 ± 0.147 to 1.285 ± 0.109 Trolox Equivalent/mM) (p > 0.05), which correlates with a decreased level in oxidized protein of these mice. By
contrast, in diabetic mice a slight, but significant decrease (p < 0.05) of antioxidant capacity appears
during capsaicin treatment compared to vehicle
treatment (capsaicin: 0.470 ± 0.033 vs vehicle: 0.522
± 0.021 Trolox Equivalent/mM). This result is also
correlated with a change in oxidizied protein level
observed in these mice.
DISCUSSIoN
Type 1 diabetes is a disease that affects a growing number of persons and one of its major complications is represented by diabetic neuropathy. In
order to reduce neuropathic pain, one of the most frequent methods is represented by capsaicin topical
application, which desensitizes sensory afferents engaged in painful stimuli transmission. The current
study was based on the assumptions that double
transgenic mice is a suitable model for diabetic neuropathy study [9]; moreover, studies were performed
that were focused on neurological changes following
capsaicin short term administration (data not shown);
we also aimed to study capsaicin effects on some immune system parameters. In this study, capsaicin was
administered by intraperitoneal inoculation during
three consecutive days.
Glycemic control of type 1 diabetic persons is
achieved by insulin administration; in time, there
have been various attempts to diminish blood glucose levels by other hypoglycemic compounds administration. One of these compounds is represented
by capsaicin. It seems that a regular consumption of
hot pepper, rich in capsaicin, can alleviate post-prandial hyperinsulinemia [18, 19]. Studies performed in
mice showed that lowering glucose level is potentiated by capsaicin administration, without affecting
insulin baseline [19-21]. In rats, capsaicin subcuta231
IANCU et al.
A
B
Fig. 7. Mitochondrial membrane potential (Δψ) of peripheral blood lymphocytes from normal Balb/c (A) and diabetic (B) mice following capsaicin administration
neous administration induced an increase in plasmatic insulin level in a dose depending manner [19,
22]. In dogs, following capsaicin administration, hypoglycemia episodes have been recorded, together
with an increased production of insulin [23]. Studies
performed in humans have shown glycemia decrease, together with insulin level maintenance [24]
or its decrease [25] during capsaicin administration.
In diabetic double transgenic mice, intraperitoneal
administration of capsaicin for a short period of time
leads to an ~ 15% reduction in blood glucose level
in comparison with control, these data being consistent with those specified in literature.
Two weeks of oral capsaicin administration
(10 mg/Kg body weight), apparently leads to fat suppression in treated animals [26, 27]. A similar trend,
although statistically insignificant, was observed in
dTg diabetic mice intraperitoneally inoculated with
a much lower capsaicin dose (0.8 mg/Kg body
weight) for a short period of time (3 days); thus, in
dTg diabetic mice, capsaicin administration leads to
an ~ 8% loss in their body weight. We can say that
232
the capsaicin dose used in this study does not affect
the animal’s health status.
It seems that capsaicin administration affects reactive oxygen and nitrogen species production. In
1994, Joea and Lokesh [28] studied capsaicin effect
in superoxide anion, hydrogen peroxide and nitrite
generation by rat peritoneal macrophages. In vitro
preincubation of peritoneal macrophages with 10 µM
capsaicin completely inhibited the production of
these free radicals, and two weeks in vivo capsaicin
administration by gavage led to its decrease compared to control. Low concentrations of capsaicin enhance PMN cells migration capacity and high
concentrations did not influence luminol chemiluminescence, therefore, it can be said that capsaicin dose
not contribute to superoxide anion generation in
human PMN cells [29]. The active compound from
hot pepper has an antioxidant potential, which has
been studied in rats; higher capsaicin concentrations
induced a decrease in oxidative stress measured as
malondialdehyde from liver, lung and muscle [30].
Capsaicin antioxidant property was studied also in
A
B
Fig. 8. Apoptosis degree in peripheral blood lymphocytes from non-diabetic Balb/c (A) and type 1 diabetic mice
(B) following vehicle and capsaicin administration. Cell apoptosis was determined using Annexin V and propidium
iodide (PI); AnnexinV+/PI- cells were considered early apoptotic cells and AnnexinV+/PI+ cells were considered to
be in a late apoptosis stage, or even death.
humans. In this respect, in 2006 Luqman and Rizvi
showed capsaicin influence in oxidative stress markers: membrane lipid peroxidation (malondialdehyde
formation) and carbonyl groups in human erythrocytes. Thus, erythrocyte incubation with capsaicin
leads to a decrease in membrane lipid peroxidation
and to a decrease in carbonyl proteins. These authors
hypothesized that dietary factor which acts as antioxidant may contribute to the protective effect in cancer and atherosclerosis. The antioxidant effect of
capsaicin may explain, at least partially, the high consumption of chillies in some parts of the world [31].
This study showed that short-term administration of a low capsaicin concentration did not induce
significant changes in reactive oxygen species production, but a decreasing tendency was highlighted
in PMN cells and peritoneal macrophages collected
from non-diabetic Balb/c mice. The fact that in phagocytic cells from diabetic mice there were no
changes in these parameters suggests the necessity
to administer this capsaicin dose for a longer period
of time.
The results obtained in this study highlighted
that in both murine strains, Balb/c and dTg, the baseline of nitric oxide production was significantly reduced following capsaicin administration, results
that are correlated with those obtained by other authors [28, 32]. Also, it seems that capsaicin treatment
does not affect macrophage phagocytic function
[33]. In diabetic mice, the significant reduction in
baseline NO production leads to the assumption that
capsaicin administration for a longer period of time
can inhibit NO secretion by peritoneal macrophages
and thus to a reduction of its harmful effects on pancreatic β-cells that remained unaffected by autoimmune attack.
The fact that in diabetic mice capsaicin administration did not induce significant changes in the
percentage of peripheral lymphocyte populations,
proves that capsaicin has no majore influences in
233
IANCU et al.
Fig. 9. Proteins oxidation state evaluated as carbonyl groups concentration; the determinations were performed
using plasma samples collected from Vehicle or Capsaicin (Caps) treated Balb/c and dTg mice
Fig. 10: Antioxidant capacity evaluation in plasma samples collected from Balb/c and dTg mice following vehicle
and capsaicin administration
adaptive immunity, thus enabling type 1 diabetic animals treatment on a longer period of time, without
side effects risk (an impairment in body ability to defense against pathogens).
Previous research emphasizes an impairment in
immune status following capsaicin administration.
It has been observed that dietary capsaicin long term
administration (for 3 weeks) leads either to an increase in mitogen-induced proliferation of T cells
[33], or to a decrease in proliferative response to mitogen [34], and to an increasing number of B lymphocytes, along with an increased level of IgG and
IgM [33]. In our study, the percentage of B and T
lymphocyte remained unchanged as a result of capsaicin intraperitoneal administration. If capsaicin
short-time administration reveals the maintenance in
the percentage of NK cells from both non-diabetic
Balb/c mice, and diabetic dTg mice, previous studies
have shown an inhibition in peripheral and spleen
234
NK cells cytotoxic activity, correlated with changes
in NK cells number and percentage [35].
Most of the studies that investigated capsaicin
effect were focused on its influence in different
forms of cancer. Capsaicin has an immunomodulating effect in pre-existing tumors treatment. Antitumoral activity of this compound is a T lumphocyte
dependent one, and also tumor specific [36]. Also,
studies performed on tumor cell lines specific for
colon cancer have demonstrated that capsaicin treatment induced their apoptosis in a dose depending
manner, which demonstrates capsaicin beneficial effect in colon cancer treatment [37]. On the other
hand, Pramanik et al., 2011 brought information
about the mechanism by which capsaicin treatment
induces reactive oxygen species generation by mitochondria, and intracellular antioxidants depletion
resulted in mitochondrial damage and apoptosis of
pancreatic cancer cells. At the same time, pancreatic
normal epithelial cells were capsaicin resistant [38].
The apoptotic pathway activated by capsaicin is still
unknown. Many studies showed that apoptosis can
be induced by capsaicin through high levels of calcium ions and reactive oxygen species, and a decreased mitochondrial membrane potential in
different carcinoma cell models as well [39-42].
In type 1 diabetic subjects, lymphocyte apoptosis degree is higher, being accompanied by a reduction in circulating cell number, which could explain
the altered immune function in poor glycemic control sujects. In diabetes, an important role in lymphocyte apoptosis is played by insulin, proven by tests
carried out on insulin treated diabetic rats in which
lymphocyte apoptosis reduction was observed following insulin treatment [43]. In type 2 diabetic patients, a higher polarization was observed in mitochondrial potential of mononuclear cells, suggesting
an increase in apoptosis degree of these cells [44].
Our results, similar to those obtained in diabetic subjects, shows a higher degree in lymphocyte apoptosis
in the peripheral blood of diabetic dTg mice, compared to Balb/c non-diabetic mice. In diabetic mice,
capsaicin treatment tends to reduce the polarizaton
of mitochondrial potential in lymphocyte, emphasizing the importance of capsaicin treatment in type 1
diabetes, in that a decrease in apoptotic peripheral
lymphocyte can lead to an improvement in body defense capacity against different pathogens.
Capsaicin antioxidant property has been demonstrated using oxidative stress markers, such as erythrocytes membrane lipid peroxidation (malonaldehyde formation), and carbonyl groups. Erythrocytes capsaicin treatment showed their protection
against oxidative stress, which was demonstrated by
lowering malondialdehyde and carbonyl groups
level, thus proving antioxidant capsaicin efficacy
[31]. In our study, in Balb/c mice, intraperitoneal administration of capsaicin induced a decrease in
plasma protein peroxidation level, correlated with a
slight increase in antioxidant capacity; instead, dTg
diabetic mice treatment did not induce significant
changes in carbonyl groups and antioxidant capacity
that may be due to a short term treatment.
Short-term capsaicin administration did not induce major changes in reactive oxygen species production by phagocytic cells and did not increase
lymphocyte apopotosis degree; in turn, capsaicin administration had a diminuating effect in nitric oxide
baseline production by peritoneal macrophages. In
consequence, capsaicin administration in diabetic
animals for a longer period of time (minimum a
week) can lead to a significant decrease in nitric
oxide production by macrophages and thus to diminishing its effects on β-pancreatic cells unaffected
by autoimmune attack. Also, after capsaicin treatment, in diabetic mice an improvement in glycemic
level was observed.
In conclusion, our results suggest that shorttime intraperitoneal administration of capsaicin can
be used in reducing pain sensations without a major
impairment in immune parameters.
Acknowledgements
This work was supported by the National Grant
PNII 41-074/2007 from the Romanian Ministry of
Research.
REFERENCES
1 Diabetes. J Clin Endocrinol Metab 2003. 88(4):
1624–1628.
generation. Diabet Med 1997. 14(3): S45–S49.
3. West IC. Radicals and oxidative stress in diabetes. Diabet Med 2000. 17: 171–180.
of diabetic complications. Nature 2001. 414: 813–820.
Rev. 2002. 23: 599-622.
61(9-10): 458-63.
status and hyperfiltration in young patients with type
1 diabetes mellitus. Pediatr. Nephrol. 2009. 24: 121127.
J. Surg. Res. 2009. 155: 173-178.
9. Radu BM, Iancu AD, Marin A, Radu M, Banciu DD,
Stavaru C, Radu DL. Basic features of sensory neurons from dorsal root ganglia in TCR-HA+/–/RIPHA+/– mice. Romanian J. Biophys. 2009. 19(2):
83–95.
10. Derry S, Lloyd R, Moore RA, McQuay HJ. Topical
capsaicin for chronic neuropathic pain in adults.
Cochrane Database Syst Rev 2009. CD007393.
11. Hempenstall K, Nurmikko TJ, Johnson RW,
A’Hern RP, Rice AS. Analgesic therapy in postherpetic neuralgia: a quantitative systematic review. PLoS
Med 2005. 2: e164.
235
IANCU et al.
12. Rage´ M, Van Acker N, Facer P, et al. The time
course of CO2 laser evoked responses and of skin
nerve fibre markers after topical capsaicin in human
volunteers. Clin Neurophysiol 2010. 121: 1256–1266.
13. Chaiyasit K, Khovidhunkit W, Wittayalertpanya
S. Pharmacokinetics and the effect of capsaicin in
Capsicum frutescens on decreasing plasma glucose
level. J Med Assoc Thai 2009. 92: 108–113.
14. Chanda S, Bashir M, Babbar S, Koganti A, Bley K.
In vitro hepatic and skin metabolism of capsaicin.
Drug Metab Dispos 2008. 36: 670–675.
15. Radu D.L., Brumeanu T.D., McEvoy R.C., Bona
C.A., Escape from self-tolerance leads to neonatal insulin-dependent diabetes mellitus, Autoimmmunity
1999. 30: 199-207.
16. Radu D.L., Noben-Trauth N., Hu-Li J., Paul W.E.,
Bona C.A., A targeted mutation in the IL-4Ra gene
protects mice against autoimmune diabetes, Proc.
Natl. Acad.Sci. USA 2000. 97: 12700-12704.
17. Radu D. L., Georgescu Adriana , Stavaru Crina ,
Alina Carale, Doina Popov. Double transgenic mice
with Type 1 diabetes mellitus develop somatic, metabolic and vascular disorders. J. Cell. Mol. Med. 2004.
8(3): 349-358.
18. Ahuja KDK, Robertson IK, Geraghty DP, Ball MJ.
Effects of chili consumption on postprandial glucose,
insulin, and energy metabolism. Am J Clin Nutr 2006.
84: 63–69.
19. Alevizos A, Mihas C, Mariolis A. Insulin secretion
and capsaicin. American Journal of Clinical Nutrition
2007. 85(4): 1165-1166.
20. Karlsson S, Scheurink AJ, Steffens AB, Ahren B.
Involvement of capsaicin-sensitive nerves in regulation of insulin secretion and glucose tolerance in conscious mice. Am J Physiol 1994. 267: 1071–1077.
21. Gram DX, Hansen AJ, Wilken M. Plasma calcitonin
gene-related peptide is increased prior to obesity, and
sensory nerve desensitization by capsaicin improves
oral glucose tolerance in obese Zucker rats. Eur J Endocrinol 2005. 153: 963–969.
22. Akiba Y, Kato S, Katsube K, Nakamura M, Takeuchi K, Ishii H, Hibi T. Transient receptor potential vanilloid subfamily 1 expressed in pancreatic islet
beta cells modulates insulin secretion in rats. Biochem
Biophys Res Commun 2004. 321: 219–225.
23. Tolan I, Ragoobirsingh D, Morrison EY. The effect
of capsaicin on blood glucose, plasma insulin levels
and insulin binding in dog models. Phytother Res.
2001. 15(5): 391-394.
S. Pharmacokinetic and the effect of capsaicin in Capsicum frutescens on decreasing plasma glucose level.
J Med Assoc Thai. 2009. 92(1): 108-113.
25. Domotor A, Szolcsanyi J, Mozsik G. Capsaicin and
glucose absorption and utilization in healthy human
subjects. Eur J Pharmacol 2006. 534: 280–283.
26. Ohnuki K, Haramizu S, Oki K, Watanabe T,
Yazawa S, Fushiki T. Administration of capsiate, a
non-pungent capsaicin analog, promotes energy metabolism and suppresses body fat accumulation in
mice. Biosci Biotechnol Biochem. 2001. 65(12):
2735-40.
236
27. Haramizu S, Kawabata F, Ohnuki K, Inoue N,
Watanabe T, Yazawa S, Fushiki T. Capsiate, a nonpungent capsaicin analog, reduces body fat without
weight rebound like swimming exercise in mice. Biomed Res. 2011. 32(4): 279-284.
28. Joe B, Lokesh BR. Role of capsaicin, curcumin and
dietary n-3 fatty acids in lowering the generation of
reactive oxygen species in rat peritoneal macrophages.
Biochim. Biophys. Acta 1994. 1224(2): 255–263.
29. Partsch G, Matucci-Cerinic M. Capsaicin stimulates
the migration of human polymorphonuclear cells
(PMN) in vitro. Life Sci. 1993. 53(19): PL309-314.
30. Lee CYJ, Kim M, Yoon SW, Lee CH. Short-term
control of capsaicin on blood and oxidative stress of
rats in vivo. Phytotherapy Research 2003. 17(5): 454–
458.
31. Luqman S, Rizvi SI. Protection of lipid peroxidation
and carbonyl formation in proteins by capsaicin in
human erythrocytes subjected to oxidative stress. Phytotherapy Research 2006. 20(4): 303-306.
32. Oh GS, Pae HO, Seo WG, Kim NY, Pyun KH, Kim
IK, Shin MK, Chung HT. Capsazepine, a vanilloid
receptor antagonist, inhibits the expression of inducible nitric oxide synthase gene in lipopolysaccharide-stimulated RAW264.7 macrophages through the
inactivation of nuclear transcription factor-kappa B.
International Immunopharmacology 2001. 1(4): 777–
784.
33. Yu R, Park JW, Kurata T, Erickson KL. Modulation of select immune responses by dietary capsaicin.
Int J Vitam Nutr Res. 1998. 68(2): 114-119.
34. Nilsson G, Ahlstedt S. Altered lymphocyte proliferation of immunized rats after neurological manipulation with capsaicin. Int J Immunopharmacol. (1988)
10(6): 747-751.
35. Santoni G, Perfumi M, Birarelli P, Procaccini A,
Piccoli M. In vivo capsaicin treatment inhibits rat NK
cell cytotoxic functions. Immunopharmacol Immunotoxicol 1995. 17: 511-528.
36. Beltran J, Ghosh AK, Basu S. Immunotherapy of
Tumors with Neuroimmune Ligand Capsaicin. The
Journal of Immunology 2007. 177: 3260–3264.
37. Kim CS, Park WH, Park JY, Kang JH, Kim MO,
Kawada T, Yoo H, Han IS, Yu R. Capsaicin, a Spicy
Component of Hot Pepper, Induces Apoptosis by Activation of the Peroxisome Proliferator-Activated Receptor γ in HT-29 Human Colon Cancer Cells. Journal
of Medicinal Food. Fall 2004. 7(3): 267-273.
38. Pramanik KC, Boreddy SR, Srivastava SK. Role
of Mitochondrial Electron Transport Chain Complexes in Capsaicin Mediated Oxidative Stress Leading to Apoptosis in Pancreatic Cancer Cells. PLoS
ONE 2011. 6(5): e20151.
39. Perego P, Giarola M, Righetti SC, Supino R,
Caserini C, Delia D, Pierotti MA, Miyashita T,
Reed JC and Zunino F. Association between cisplatin resistance and mutation of p53 gene and reduced bax expression in ovarian carcinoma cell
systems. Cancer Res 1996. 56: 556-562.
40. Macho A, Calzado MA, Muñoz-Blanco J, GómezDíaz C, Gajate C, Mollinedo F, Navas P, Muñoz E.
Selective induction of apoptosis by capsaicin in trans-
formed cells: the role of reactive oxygen species and
calcium. Cell Death Differ 1999. 6: 155-165.
41. Kim JA, Kang YS and Lee YS A phospholipase Cdependent intracellular Ca2+ release pathway mediates the capsaicin induced apoptosis in HepG2 human
hepatoma cells. Arch Pharm Res 2005. 28: 73-80.
42. Huang SP, Chen JC, Wu CC, Chen CT, Tang NY,
Ho YT, Lo C, Lin JP, Chung JG, Lin JG. Capsaicininduced Apoptosis in Human Hepatoma HepG2 Cells.
Anticancer Research 2009. 29: 165-174.
43. Otton R, Soriano FG, Verlengia R, Curi R. Diabetes
induces apoptosis in lymphocytes. Journal of Endocrinology 2004. 182: 145–156.
44. Widlansky ME, Wang J, Shenouda SM, Hagen
TM, Smith AR, Kizhakekuttu TJ, Kluge MA,
Weihrauch D, Gutterman DD, Vita JA. Altered mitochondrial membrane potential, mass, and morphology in the mononuclear cells of humans with type 2
diabetes. Transl Res. 2010. 156(1): 15-25.
237
eFeCTUL ADMINIsTRÃRII Pe TeRMeN sCURT
A CAPsAICINeI AsUPRA DIFeRIÞILOR PARAMeTRI IMUNI
1institutul
Adina Daniela Iancu1*, Ileana Petcu2, Beatrice Mihaela Radu3,4, Mihai Radu2,4
naþional de cercetare-Dezvoltare pentru microbiologie şi imunologie „cantacuzino”, Bucureşti, românia;
naþional de Fizicã şi inginerie nuclearã „Horia Hulubei”, Bucureşti-mãgurele, românia;
3Universitatea din Bucureşti, Facultatea de Biologie, Bucureşti, românia; 4Universitatea din Verona, italia
2institutul
ReZUMAT
Diabetul de tip 1 este o boală autoimună ce afectează un număr tot mai mare de persoane; din acest
motiv, studiul diabetului, dar şi al complicaţiilor sale, prezintă la ora actuală un interes major. Pentru
evidenţierea modificărilor apărute în această afecţiune, folosirea modelelor murine adecvate este esenţială. În cadrul INCDMI „Cantacuzino” există un model de şoareci dublu transgenici ce dezvoltă o
formă fulminantă a diabetului de tip 1. Studiile anterioare indică utilitatea acestui model de şoareci
diabetici în studiul neuropatiei. Tratamentul cu capsaicină reprezintă una dintre metodele de diminuare
a durerii neuropatice. Acest studiu a pornit de la premisa că administrarea intraperitoneală a unei doze
mici de capsaicină pe o perioadă scurtă de timp poate diminua generarea şi transmiterea senzaţiilor
dureroase. Dacă din punct de vedere neurologic efectele induse de capsaicină sunt cunoscute, la nivelul
sistemului imun, efectele acesteia nu sunt încă clare. De aceea, în acest studiu am investigat efectele
capsaicinei în generarea radicalilor liberi de oxigen şi azot de către celulele sistemului imun cu funcţie
fagocitară, asupra populaţiilor limfocitare, dar şi efectele capsaicinei asupra gradului de oxidare a proteinelor plasmatice. Rezultatele obţinute indică modificări minore ale producţiei speciilor reactive de
oxigen, concomitent cu diminuarea semnificativă a generării oxidului nitric, fără afectarea populaţiilor
limfocitare. Deci, administrarea pe termen scurt a capsaicinei poate fi utilizată în diminuarea senzaţiilor
dureroase fără o afectare majoră a parametrilor imunologici.
Cuvinte cheie: capsaicina, diabetul de tip 1, stres oxidativ, durere
INTRoDUCERE
Diabetul de tip 1 este o boală care, la nivel mondial, afectează din ce în ce mai multe persoane;
acesta este caracterizat de distrucţia autoimună, pe
calea limfocitelor T, a celulelor β-pancreatice, distrucţie care este urmată de apariţia hiperglicemiei şi
a hipoinsulinemiei. Pe lângă caracterul autoimun, un
rol important în patogenia diabetului este jucat de
stresul oxidativ [1], acesta ducând la apariţia diferitelor complicaţii; hiperglicemia este şi ea un factor
care contribuie la intensificarea stresului oxidativ la
subiecţii afectaţi de diabetul de tip 1 [2-8]. Pentru
evidenţierea modificărilor apărute în această afecţiune, folosirea modelelor murine adecvate este esenţială. În cadrul INCDMI „Cantacuzino” există un
model de şoareci dublu transgenici ce dezvoltă o
formă fulminantă a diabetului de tip 1; acest model
murin de diabet a fost utilizat în investigarea modificărilor parametrilor electrofiziologici ce apar în neuropatia diabetică. În anul 2009, Radu şi colaboratorii au demonstrat existenţa unor modificări ale
parametrilor electrofiziologici ai neuronilor de pe rădăcina dorsală a nervilor spinali prelevaţi de la şoarecii dublu transgenici diabetici; modificările
electrofiziologice au vizat potenţialele de acţiune (reducerea amplitudinii potenţialelor de acţiune, reducerea duratei totale a potenţialelor de acţiune datorită
creşterii fazei de repolarizare) şi caracteristicile curenţilor de hiperpolarizare (profilul general al voltajului curenţilor de hiperpolarizare a fost deplasat
către valori mai mari, creşterea constantei de timp a
curenţilor de hiperpolarizare cu cinetici lente, iar balanţa nivelului de expresie al curentului de hiperpolarizare este înclinată către curenţii cu cinetici lente).
Toate aceste modificări ale parametrilor electrofizio-
*autor corespondent: Adina Daniela Iancu, email: [email protected]
238
Efectul administrãrii pe termen scurt a capsaicinei asupra diferiþilor parametri imuni
logici sugerează faptul că modelul de şoareci dublu
transgenici este unul adecvat pentru studiul mecanismelor dureroase implicate în diabetul de tip 1 [9].
Administrarea locală a capsaicinei (8-metil-Nvanilil-6-nonenamida) este una dintre cele mai des
întâlnite metode de diminuare a durerii. Primele informaţii despre diminuarea senzaţiilor dureroase prin
aplicarea locală a capsaicinei au apărut în anul 1850
sub forma unor recomandări de utilizare a unui extract alcoolic pe bază de ardei iute. În timp, au fost
dezvoltate creme, loţiuni şi plasturi ce conţin capsaicină în diferite concentraţii, acestea fiind utilizate
pentru diminuarea durerii neuropatice şi a celei musculoscheletale. Studiile privind administrarea locală
a capsaicinei au arătat unele efecte benefice în diferite sindroame dureroase, de tipul nevralgiei postherpetice, neuropatiei diabetice şi durerea musculoscheletală [10, 11]. Unele studii asupra timpului necesar pentru recuperarea amplitudinii potenţialelor
de la nivel cerebral faţă de durerea arzătoare indusă
prin stimularea laser în urma tratamentului cu capsaicină topică au arătat o recuperare funcţională înainte de recuperarea semnificativă a markerilor
nervoşi cutanaţi (de tipul receptorilor TRPV1) [12].
Nu există dovezi asupra faptului că administrarea capsaicinei locale acţionează prin absorbţia
transdermică la nivelul ţesuturilor, altele decât pielea. Capsaicina este un compus lipofilic, insolubil în
apă, care rezistă la difuzia în soluţiile apoase cum
este sângele şi prezintă un potenţial limitat pentru
absorbţia transdermică prin pielea umană. Chiar şi
atunci când capsaicina este absorbită sistemic, durata
expunerii este foarte scurtă [13]. Cu cât timpul de înjumătăţire a capsaicinei aplicate local este mai mare,
cu atât este posibil sa reflecte o eliberare mai lentă a
acesteia în piele. Capsaicina este metabolizată rapid
de către enzimele din ficatul uman, însă studiile in
vitro au arătat faptul că metabolismul său în pielea
umană este lent [14]. Importanţa aplicării analgezicelor locale ce conţin capsaicină poate consta în faptul că acest compus rămâne la locul acţiunii (adică
la nivelul pielii) relativ nemodificat, în timp ce capsaicina care este absorbită transdermic este rapid eliminată.
Aplicarea in vitro a capsaicinei a condus la scăderea amplitudinii şi a frecvenţei de generare a potenţialelor de acţiune în neuronii senzitivi. Radu BM
şi colaboratorii au studiat diminuarea senzaţiei dureroase prin administrarea in vivo a capsaicinei, rezultatele acestui studiu fiind în concordanţă cu cele
obţinute in vitro (date nepublicate).
În acest studiu, utilizând modelul de şoareci
dublu transgenici ce dezvoltă diabetul de tip 1, am
dorit să evaluăm efectele administrării in vivo a capsaicinei asupra diferiţilor parametri imuni.
Linii murine: şoarecii Balb/c, utilizaţi ca şoareci control, non-diabetici, şi şoarecii dublu transgenici (dTg) (TCR-HA+/-INS-HA+/-) ce dezvoltă o
formă fulminantă a diabetului de tip 1. În studiul de
faţă, animalele au avut vârste cuprinse între 3 şi 4
luni. Şoarecii au fost cazaţi în cuşti de policarbonat
şi au primit apă şi hrană ad libitum pe toată perioada
de desfăşurare a experimentelor. Toate manevrele
efectuate în cadrul experimentelor au respectat normele internaţionale ale eticii de lucru cu animalele
de laborator.
Criterii de selecţie a şoarecilor dTg cu diabet
de tip 1: Criteriile de selecţie a animalelor diabetice
utilizate în acest studiu au fost identificarea prezenţei
celor două transgene (TCR-HA şi INS-HA) la şoarecii dTg prin tehnica PCR [15-17] şi, pe de altă
parte, determinarea nivelului glucozei plasmatice (cu
ajutorul benzilor indicatoare pentru glucometrul
OneTouch Ultra). Şoarecii dTg au fost consideraţi
hiperglicemici la valori ale glicemiei mai mari de
200 mg/dL.
Administrarea capsaicinei şi a vehiculului:
Atât animalele diabetice, cât şi cele non-diabetice,
au fost tratate cu capsaicină (0,8 mg/Kg corp) sau
vehiculul acesteia, prin inoculare intraperitoneală,
timp de trei zile consecutive. Probele biologice care
au fost utilizate în testări (plasmă, sânge sau macrofage peritoneale) au fost prelevate la două ore după
ultima administrare.
Glicemia a fost determinată înainte de administrarea capsaicinei şi la 24 ore după cea de a treia administrare a acesteia.
Macrofagele peritoneale au fost prelevate prin
lavajul cavităţii peritoneale folosind 3-4 mL mediu
de cultură RPMI1640 rece, fără roşu fenol.
Celulele Polimorfonucleare (PMN) din sângele periferic recoltat pe heparină au fost izolate prin
separare în gradient de densitate folosind Histopaque
cu densitate relativă de 1.077 (Sigma). Eritrocitele
au fost îndepărtate cu ajutorul soluţiei de liză (30 minute/4oC). După îndepărtarea soluţiei de liză şi spălarea de două ori a celulelor PMN, acestea au fost
reluate în mediu de cultură RPMI1640. Au fost utilizate doar suspensiile celulare cu o viabilitate mai
mare de 95%, stabilită prin testul de excluzie ce utilizează eozina (Sigma) (0,5%).
Testul reducerii nitroblue tetrazolium (NBT)
este o metodă ce permite determinarea producţiei in239
IANCU et al.
tracelulare a superoxid anionului în celulele cu funcţie fagocitară. Procentul granulocitelor care conţin
depozite de formazan (de culoare albastru-violet) a
fost determinat prin microscopie optică. Celulele au
fost stimulate in vitro cu N-Formil-Met-Leu-Phe
(fMLP)(100 μM) şi phorbol-12-miristat-13 acetat
(PMA) (1.62 mM) şi puse în contact cu sarea de tetrazolium (2 mg/mL) (câte 25 µL/probă), apoi fixate
cu formaldehidă 10%, centrifugate şi reluate în soluţie salină echilibrată Hank (HBSS). Pentru fiecare
probă au fost citite minim 100 de celule, determinându-se apoi procentul de celule care au încorporat
sarea de tetrazolium şi au format depozitele specifice
de formazan.
Determinarea oxidului nitric (NO) s-a realizat
cu ajutorul reactivului Griess (sulfanilamida şi N-1naptiletilendiamina dihidroclorică (NED). Densitatea celulară a fost de 2x106 celule/mL. Producţia NO
de către macrofagele peritoneale a fost investigată în
urma stimulării acestora cu fMLP şi PMA, timp de
24 ore. Rezultatele sunt exprimate ca şi concentraţie
de NO (µM) şi au fost estimate funcţie de curba de
calibrare a nitritului standard (100 - 1.56 µM). Concentraţia NO a fost detectată la 540 nm.
Producţia intracelulară a peroxidului de hidrogen de către celulele PMN periferice. Pentru
aceste determinări, s-a utilizat kit-ul comercial Bursttest (Phagoburst), ORPEGEN Pharma. Pe scurt,
pentru detectarea activităţii oxidative a celulelor
PMN s-au folosit câte 100 µL sânge integral/probă;
activarea celulelor s-a realizat prin stimularea acestora cu fMLP (5 µM), PMA (8.1 µM) şi E.coli (~ 1
x 109 bacterii/mL) şi incubarea lor timp de 10 minute
la 37oC. Pentru evidenţierea reacţiei oxidative, a fost
adăugat substratul de reacţie reprezentat de dihidrorodamina 123 (DHR-123) care se oxidează în contact cu speciile reactive de oxigen (H2O2) şi se
transformă în Rodamină 123 cu emisie în spectru de
fluorescenţă pe canalul de fluorescenţă 1. Stoparea
reacţiei de oxidare, îndepărtarea hematiilor şi fixarea
leucocitelor s-a realizat cu ajutorul soluţiei de liză (2
mL/probă). După îndepărtarea soluţiei de liză prin
centrifugare, probele au fost spălate cu tamon de spălare, apoi reluate în tampon fosfat salin şi analizate
la citometrul în flux FACSCanto II.
Determinarea conţinutului de carbonil al
proteinelor plasmatice modificate oxidativ. Determinarea grupărilor carbonil aparţinând proteinelor
plasmatice reprezintă un marker al activităţii radicalilor liberi; prin această metodă, a fost evaluată de
fapt oxidarea proteică. Plasma (100 µL) a fost incubată cu 2, 4-dinitrofenilhidrazină (DNPH) (1200 µL
din soluţia de 10 mM) timp de 60 minute. Apoi, pro240
teina a fost precipitată cu acid tricloracetic 30% (700
µL), apoi a fost spălată de trei ori cu soluţie de etanol
şi etilacetat şi dizolvată într-un mililitru de soluţie de
guanidină hidroclorică 6 M. Conţinutul grupărilor
carbonil a fost determinat cu ajutorul unui spectrofotometru la o lungime de undă de 370 nm, iar rezultatele au fost exprimate ca µmol/mg de proteină.
Capacitatea antioxidantă: Pentru măsurarea
capacităţii antioxidante, probele de plasmă au fost
mai întâi centrifugate, iar supernatantul preluat. În
ziua testării, a fost pregătită curba de 7 standarde
Trolox în intervalul 0 – 0,33 mM Trolox, funcţie de
care au fost interpretate rezultatele. Probele (10 µL
plasmă) au fost testate în placa de 96 godeuri şi lucrate în duplicat. Peste acestea, a fost adăugată metmioglobina (10 µL) şi substratul cromogen reprezentat de ABTS (2.2’ –azino-di (3-ethilbenzthiazoline-6-sulfonic acid) (150 µL/godeu). Iniţierea reacţiei de oxidare s-a realizat prin adăugarea a câte 40
µL/godeu de H2O2 (441 µM), iar după o incubare de
7 minute la temperatura camerei, a fost determinată
absorbanţa la 750 nm.
Profilul imunofenotipic al şoarecilor în urma
administrării capsaicinei. Determinarea seturilor şi
a subseturilor limfocitare din sângele periferic al şoarecilor trataţi cu vehicul / capsaicină a fost realizată
la 14 zile de la prima administrare. Sângele periferic
a fost recoltat prin puncţie retroorbitală, în tuburi tratate cu EDTA. Procentul populaţiilor celulare
B220+, CD3+, CD4+, CD8+ şi NK1.1+ a fost determinat în 100 µL sânge folosind anticorpi monoclonali conjugaţi cu FITC (fluorescein isotiocianat), PE
(phicoeritrină) şi PerCP (peridinin clorphil protein)
(Becton Dickinson). Hematiile au fost îndepărtate cu
soluţie de liză; după îndepărtarea acesteia (prin centrifugare), butonul celular a fost spălat cu tampon
fosfat salin, iar la final a fost reluat în 300 µL soluţie
paraformaldehidă 1%. Populaţiile celulare au fost
determinate utilizând un citometru în flux BD FACSCanto II şi analizate prin softul BD FACSDiva.
Evaluarea apoptozei limfocitare prin citometrie în flux utilizând Annexina V şi iodura de propidiu (kit-ul FITC Annexin V, BD Pharmingen). În
acest studiu a fost determinat gradul de apoptoză a
limfocitelor din sângele periferic al şoarecilor normali Balb/c şi diabetici dTg, în două condiţii experimentale: în urma administrării vehiculului,
reprezentând controlul şi în urma tratamentului cu
capsaicină. Limfocitele au fost obţinute prin separarea în gradient de densitate a sângelui periferic. După
două spălari cu TFS, celulele au fost resuspendate în
Binding Buffer la o densitate de 1x106 celule/mL;
pentru determinarea gradului de apoptoză au fost fo-
losiţi 100 µL suspensie celulară care a fost marcată
cu Annexină V cuplată cu FITC şi cu iodură de propidiu (PI). După o incubare de 15 minute la temperatura camerei (25oC) la întuneric, în fiecare tub au
fost adăugaţi câte 400 µL de Binding Buffer, pentru
ca apoi toate probele să fie determinate cu ajutorul
citometrului în flux BD FACSCanto II într-un interval de o oră şi analizate prin softul BD FACSDiva.
Detecţia potenţialului membranar (Δψ) mitocondrial folosind citometria în flux (cu ajutorul
Kit-ului MitoScreen Flow Cytometry Mitochondrial
Membrane Potential Detection Kit, BD Biosciences). Energia eliberată în timpul reacţiilor de oxidare
la nivelul lanţului respirator mitocondrial este stocată
sub formă de gradient electrochimic negativ de-a
lungul membranei mitocondriale, iar Δψ este menţionat ca fiind polarizat. Modul în care Δψ se modifică poate ajuta la clarificarea rolului mitocondriei
în apoptoză.
Limfocitele din sângele periferic izolate prin separare în gradient de densitate şi aduse la o densitate
celulară de 1x106 celule / mL au fost incubate timp
de 10-15 minute la 37oC / 5% CO2 împreună cu soluţia de JC-1 (iodură de 5,5’,6,6’-tetracloro1,1’,3,3’-tetraetilbenzimidazolcarbocianină) (0,5
mL/probă), apoi spălate de două ori cu Assay Buffer
(1-2 mL/probă); după îndepărtarea supernatantului
prin centrifugare la 400 x g timp de 5 minute, butonul celular a fost reluat în Assay Buffer (0,5
mL/probă). Probele au fost determinate cu ajutorul
citometrului în flux BD FACSCanto II şi analizate
prin softul BD FACSDiva.
Analiza statistică. Datele au fost analizate prin
programul Gnumeric. Semnificaţia statistică dintre
diferitele grupuri de şoareci a fost determinată prin
testul t-Student. Diferenţele au fost considerate a fi
statistic semnificative atunci când valorile lui p au
fost < 0,05, a se vedea în grafice *; în toate experimentele am folosit câte 5 şoareci pentru fiecare condiţie experimentală.
REZULTATE
Variaţia glicemiei în urma tratamentului cu
capsaicină. Monitorizarea glicemiei s-a realizat la 2
ore de la ultima administrare a capsaicinei; determinările au fost efectuate comparativ cu valorile control obţinute în urma administrării vehiculului. La
şoarecii Balb/c non-diabetici, administrarea capsaicinei nu a indus modificări semnificative ale valorilor glicemiei (p > 0,05) (169,60 ± 13,90 mg/dL în
condiţii control şi 170,00 ± 15,00 mg/dL după administrarea capsaicinei). La şoarecii diabetici dTg, administrarea pe termen scurt a capsaicinei a condus
la diminuarea nivelului glicemic (de la 599,60 ± 0,89
mg/dL la 511,20 ± 61,20 mg/dL, în urma tratamentului cu capsaicină) (p < 0,05) (Fig. 1) - această diminuare arată contribuţia tratamentului pe termen
scurt cu capsaicină la reducerea nivelului glucozei
plasmatice în diabetul de tip 1. Ceea ce ar fi interesant de observat ar fi efectul administrării capsaicinei
pe perioadă mai îndelungată de timp, poate chiar de
câteva săptămâni.
Modificări ale greutăţii corporale în urma
administrării capsaicinei. Pentru a evidenţia posibilele efecte ale capsaicinei asupra greutăţii corporale, şoarecii au fost cântăriţi înainte de prima
administrare (Z-1), după cea de-a doua (Z-2) şi a
treia administrare (Z-3 – la două ore post-administrare) (Fig. 2). Greutatea corporală a şoarecilor
Balb/c în condiţii control a fost de: Z-1: 20,6 ± 0,20
grame; Z-2: 21,32 ± 0,33 grame; Z-3: 21,52 ± 0,73
grame (Fig. 2A). Tratamentul cu capsaicină nu a
indus modificări semnificative ale greutăţii corporale
Fig. 1. Nivelul glucozei plasmatice la şoarecii Balb/c şi dTg care au fost trataţi cu vehicul şi capsaicină. Glicemia a
fost determinată la 2 ore după ultima administrare.
241
IANCU et al.
A
B
Fig. 2. Influenţa administrării vehiculului (A) şi a capsaicinei (B) asupra greutăţii corporale a şoarecilor Balb/c şi
dTg. Greutatea corporală a fost determinată înainte de inoculare (Z-1), după cea de-a doua (Z-2) şi a treia administrare (Z-3) a vehiculului sau a capsaicinei. (Z – ziua).
la şoarecii non-diabetici Balb/c (Z-1: 22,04 ± 0,46
grame; Z-2: 23,9 ± 1,17 grame; Z-3: 23,72 ± 1,40
grame) (Fig. 2B) (p > 0.05). Greutatea corporală a
şoarecilor diabetici din lotul control a fost de: 25,26
± 0.19 grame la momentul Z-1; 25,3 ± 1,20 grame
la momentul Z-2, şi 25,36 ± 1,46 grame la momentul
Z-3) (Fig. 2A); în urma tratamentului cu capsaicină,
greutatea corporală a animalelor diabetice nu a suferit modificări semnificative (Z-1: 22,96 ± 3,96
grame; Z-2: 22,04 ± 4,88 grame; Z-3: 21,14 ± 5,01
grame) (Fig. 2B) (p > 0,05).
După cum putem observa, atât la şoarecii normali Balb/c, cât şi la cei diabetici dTg, capsaicina nu
a indus modificări semnificative ale greutăţii corporale (p > 0,05), confirmându-se astfel faptul că doza
de 0,8 mg/Kg nu este nocivă pentru animalele tratate.
Producţia intracelulară a superoxid anionului de către celulele cu funcţie fagocitară a fost determinată prin testul reducerii nitroblue tetrazoliumului (Fig. 3). La şoarecii Balb/c non-diabetici,
administrarea capsaicinei nu a indus modificări semnificative ale procentului de celule PMN producă242
toare de superoxid anion, comparativ cu şoarecii
Balb/c control (trataţi cu vehicul) (în urma administrării capsaicinei, în condiţii de nestimulare 12,68 ±
4.01% dintre celule au produs superoxid anion, iar
procentul celulelor formatoare de superoxid anion în
urma stimulării aestora cu fMLP a fost de 15,59 ±
3,67%, şi de 42,37 ± 10,77% după stimularea cu
PMA; la administrarea vehiculului, în condiţii de
nestimulare 7,67 ± 2,34% celule au produs superoxid
anion intracelular, prin stimularea in vitro cu fMLP
11,74 ± 2,86% dintre celule au produs superoxid
anion; 25,89 ± 13,69% dintre celulele PMN au produs superoxid anion în urma stimulării cu PMA)
(Fig. 3A). În ambele condiţii experimentale (administrare de vehicul şi capsaicină), în urma stimulării
cu PMA, celulele PMN de la şoarecii Balb/c au produs semnificativ mai mult superoxid anion comparativ cu celulele nestimulate (p < 0,05). La şoarecii
diabetici dTg, tratamentul cu capsaicină nu a indus
modificări semnificative ale producţiei superoxid
anionului (p > 0,05). Astfel că, în condiţii control,
procentul celulelor PMN producătoare de superoxid
A
B
Fig. 3. Producţia intracelulară a superoxid anionului evidenţiată la nivelul celulelor PMN de la şoarecii: A. Balb/c
şi B. dTg diabetici
anion a fost de 14,54 ± 2,93%, stimularea cu fMLP
a indus o creştere a producţiei de până la 23,96 ±
5,97%, iar stimularea PMA până la 45,44 ± 8,03%.
La şoarecii diabetici trataţi cu capsaicină, nivelul
bazal al producţiei superoxid anionului a fost de
16,26 ± 6,22%, iar în urma stimulării celulelor cu
fMLP a fost de 28,80 ± 5,77%, şi de 38,91 ± 14,66%
după stimularea cu PMA. Valorile procentuale ale
producţiei superoxid anionului la şoarecii diabetici
trataţi cu vehicul nu au fost semnificativ diferite de
cele obţinute în urma administrării capsaicinei (p >
0,05).
La nivelul macrofagelor peritoneale prelevate
de la şoarecii non-diabetici Balb/c, administrarea
capsaicinei a indus o scădere semnificativă a producţiei intracelulare a superoxid anionului. Astfel, dacă
la nivel bazal, procentul macrofagelor peritoneale
nestimulate care au produs superoxid anion a fost de
12,98 ± 1,63%, în urma administrării capsaicinei,
procentul macrofagelor producătoare de superoxid
anion s-a diminuat la 9,78 ± 1,50% (p < 0,05) (Fig.
4A). Faţă de nivelul bazal, stimularea in vitro cu
fMLP şi PMA a macrofagelor peritoneale a intensificat producţia superoxid anionului în aceste celule
atât la şoarecii trataţi cu vehicul (22,72 ± 8,34% celule producătoare de superoxid anion în urma stimulării cu fMLP şi 36,97 ± 4,31% după stimularea cu
PMA), cât şi la cei cu capsaicină (20,75 ± 4,13% celule producătoare de superoxid anion în urma stimulării cu fMLP, iar la stimularea cu PMA 32,87 ±
4,67%). Însă, comparând valorile obţinute la şoarecii
trataţi cu vehicul şi cele obţinute în urma administrării cu capsaicină, stimularea cu fMLP şi PMA a
macrofagelor peritoneale de la şoarecii Balb/c nu a
indus modificări semnificative (p > 0,05) (Fig. 4A).
La nivelul macrofagelor peritoneale prelevate
de la şoarecii diabetici dTg, administrarea capsaicinei nu a indus modificări semnificative ale nivelului
bazal al superoxid anionului (dacă în urma administrării vehiculului procentul celular a fost de 10,70 ±
2,52%, în urma administrării capsaicinei, acesta a
fost de 9,23 ± 2,92%) (p > 0,05) (Fig. 4B). Faţă de
nivelul bazal, stimularea in vitro a macrofagelor peritoneale diabetice cu fMLP şi PMA a dus la o inten243
IANCU et al.
A
B
Fig. 4. Producţia intracelulară a superoxid anionului de către macrofagele peritoneale prelevate de la şoarecii: A.
Balb/c şi B. dTg diabetici
sificare a producţiei superoxid anionului (fMLP:
26,24 ± 7,75% celule producătoare de superoxid
anion după tratarea cu vehicul şi 19,12 ± 4,58% după
tratarea cu capsaicină; PMA: 49,84 ± 10,75% în
cazul vehiculului şi 52,09 ± 2,81 % în cazul capsaicinei), intensificare care a fost semnificativă statistic
(p < 0,05). Însă, administrarea capsaicinei nu a indus
modificări semnificative ale producţiei superoxid
anionului de către macrofagele peritoneale prelevate
de la şoarecii cu diabet de tip 1, comparaţie realizată
funcţie de administrarea vehiculului (p > 0,05)
(Fig. 4B).
Producţia intracelulară a apei oxigenate
(H2O2) a fost determinată prin citomerie în flux cu
ajutorul kit-ului comercial Bursttest(Phagoburst).
Rezultatele au fost analizate ca procent de celule
PMN cu fluorescenţă scăzută, medie şi înaltă, însă
interpretarea datelor s-a realizat la nivelul celulelor
cu fluorescenţă înaltă.
La şoarecii Balb/c, stimularea in vitro a celulelor PMN cu E. coli şi PMA a condus la o intensificare a producţiei H2O2 comparativ cu celulele
244
nestimulate; această intensificare s-a putut observa
atât la şoarecii control (trataţi cu vehicul), cât şi la
cei cărora li s-a administrat capsaicina (p < 0.05)
(Tabel 1). Administrarea capsaicinei tinde să ducă la
o scădere a producţiei intracelulare de peroxid de hidrogen, tendinţă observată în cazul celulelor nestimulate (de la 4,2 ± 5,63% celule formatoare de H2O2
la şoarecii inoculaţi cu vehicul, la 2,12 ± 1,64% la
cei inoculaţi cu capsaicină) (p > 0,05). Procentul celulelor stimulate cu E. coli a fost de 11,08 ± 14,79%
în urma administrării vehiculului şi de 9,06 ± 4,88%
în urma administrării capsaicinei. Stimularea cu
PMA a celulelor PMN de la şoarecii Balb/c trataţi cu
vehicul a indus o producţie H2O2 în 20,66 ± 16,82%
dintre celule, iar la şoarecii trataţi cu capsaicină producţia H2O2 a fost de 13,78 ± 4,56%. Deci, la şoarecii
normali, după numai 3 zile de administrare a capsaicinei, s-a observat o uşoară diminuare a producţiei intracelulare a H2O2, atât la nivel bazal, cât şi în urma
stimulării celulelor PMN cu E. coli şi PMA.
La şoarecii diabetici dTg, administrarea capsaicinei a dus la intensificarea uşoară, dar nesemnifica-
Tabel 1. Producţia intracelulară de H2O2 la nivelul celulelor PMN din sângele periferic
al şoarecilor Balb/c, în urma administrării Vehiculului şi a Capsaicinei
tivă, a producţiei intracelulare de peroxid de hidrogen (p > 0,05). Producţia bazală de H2O2 în celulele
PMN prelevate de la şoarecii trataţi cu vehicul a fost
de 37,8 ± 27,37%, iar la cei trataţi cu capsaicină a
fost de 58.94 ± 21,12%. Stimularea cu fMLP a celulelor PMN de la şoarecii dTg cărora li s-a administrat
capsaicina a indus o producţie de peroxid de hidrogen mai mare decât cea în urma administrării vehiculului (45,78 ± 19,17% vs 25,16 ± 18,63%).
Tratamentul cu capsaicină a indus aceeaşi tendinţă
crescătoare a producţiei de H2O2 şi în cazul stimulării celulelor PMN diabetice cu E.coli şi PMA
(E. coli: 32,72 ± 21,43% celule au produs H2O2 în
condiţii control, iar administrarea capsaicinei a indus
o producţie de peroxid de 39,64 ± 17,33%; la stimularea in vitro cu PMA s-a observat un procent de
28,66 ± 14,88% de celule formatoare de peroxid de
hidrogen la şoarecii control și 47,74 ± 18,01% la cei
inoculaţi cu capsaicină). Această intensificare a producţiei H2O2 la nivelul celulelor PMN prelevate de
la şoarecii diabetici trataţi cu capsaicină, nu a fost
însă semnificativă din punct de vedere statistic (p >
0,05) (Tabel 2).
Producţia oxidului nitric la nivelul macrofagelor peritoneale a fost determinată utilizând Reactivul Griess. La şoarecii diabetici dTg in condiţii
control s-a observat un nivel bazal crescut al producţiei de oxid nitric comparativ cu cel al şoarecilor
non-diabetici Balb/c (p < 0,05) (Fig. 5). Adiministrarea capsaicinei timp de 3 zile consecutive a indus
o scădere semnificativă a producţiei oxidului nitric
atât la şoarecii control, cât şi la cei diabetici (p <
0,05). Administrarea capsaicinei la şoarecii non-diabetici Balb/c a indus o scădere a producţiei de oxid
nitric in condiţii bazale (de la 2,08 ± 1,52 µM la 0,01
± 0,02 µM în urma tratamentului cu capsaicină). Stimularea in vitro cu PMA a macrofagelor peritoneale
de la şoarecii normali control a generat 0,29 ± 0,34
µM NO, iar la animalele tratate cu capsaicină s-a observat inhibarea totală a producţiei de oxid nitric (p
< 0,05). Astfel, tratarea cu capsaicină a macrofagelor
de la şoarecii normali Balb/a dus la o scădere a producţiei NO cu 99,52% în condiţii bazale şi de 100%
la stimularea cu PMA (Fig. 5A). Stimularea cu fMLP
a macrofagelor peritoneale prelevate de la şoarecii
non-diabetici a indus o intensificare a producţiei NO
245
IANCU et al.
Tabel 2. Producţia intracelulară de H2O2 la nivelul celulelor PMN din sângele periferic
al şoarecilor dTg, în urma administrării Vehiculului şi a Capsaicinei
în ambele condiţii experimentale (la şoarecii trataţi
cu vehicul concentraţia NO a fost de 4,44 ± 1,61 µM,
iar la cei trataţi cu capsaicină a fost de 11,90 ± 4,58
µM) (p < 0,05) (Fig. 5A).
La şoarecii diabetici dTg administrarea capsaicinei a dus la scăderea semnificativă a producţiei
NO, atât în condiţii de nestimulare a macrofagelor
peritoneale (12,70 ± 5,32 µM NO la şoarecii trataţi
cu vehicul și 0,77 ± 1,42 µM la cei cărora li s-a administrat capsaicină), cât şi la stimularea acestora cu
PMA (vehicul: 12,29 ± 8,38 µM; capsaicină: 2,33 ±
3,25 µM) (p < 0.05) (Fig. 5B). O tendinţă nesemnificativă de diminuare a producţiei NO a fost înregistrată şi în cazul stimulării macrofagelor cu fMLP (la
şoarecii inoculaţi cu vehicul concentraţia NO a fost
de 37,37 ± 6,06 µM, şi 26,79 ± 12,81 µM la cei trataţi cu capsaicină) (p > 0,05) (Fig. 5B).
Profilul imunofenotipic în urma administrării capsaicinei a fost realizat la 14 zile de la prima
inoculare. În sângele periferic al şoarecilor diabetici
dTg, indiferent de condiţiile experimentale folosite
(condiţii control reprezentate de administrarea vehiculului, sau de tratament cu capsaicină) a fost obser246
vat un procent mai mare de limfocite B
(CD45R/B220+) (65,92 ± 11,59% în condiţii control
şi 69,35 ± 7,55% în urma tratamentului cu capsaicină) (Fig. 6B) comparativ cu şoarecii control,
Balb/c (47,90 ± 7,04% la şoarecii control şi 42,80 ±
11,78% la cei trataţi cu capsaicină) (Fig. 6A); aceste
valori indică faptul că administrarea capsaicinei nu
a indus modificări semnificative ale procentului limfocitelor B în sângele periferic al ambelor linii murine utilizate în experiment (p > 0,05).
Atât la şoarecii non-diabetici, cât şi la cei diabetici, procentul limfocitelor Th (CD3+/CD4+) nu a
fost modificat semnificativ ca urmare a administrării
capsaicinei (şoarecii Balb/c control au avut 27,50 ±
3,31% celule Th, iar cei trataţi cu capsaicină 29,28
± 10,96%; şoarecii diabetici dTg control au avut
20,28 ± 8,55% limfocite Th vs 19,05 ± 6,43% limfocite Th în urma tratamentului cu capsaicină) (p >
0,05) (Fig. 6 A şi B). Nici procentul limfocitelor T
citotoxic/supresoare (CD3+/CD8+) nu a suferit modificări semnificative în urma administrării capsaicinei (şoarecii Balb/c control au avut 7,80 ± 1,83%
limfocite Tc/s, iar cei trataţi cu capsaicină 7,84 ±
A
B
Fig. 5. Concentraţia oxidului nitric produs de macrofagele peritoneale prelevate de la şoarecii Balb/c (A) şi dTg
(B) în urma administrării timp de trei zile consecutive a vehiculului şi a capsaicinei (Caps)
2,63%; şoarecii diabetici dTg control au avut 2,40 ±
1,00% celule Tc/s, iar cei trataţi cu capsaicină 2,80
± 1,56%) (p > 0,05) (Fig. 6 A şi B).
Celulele NK de la şoarecii Balb/c control au fost
în proporţie de 0,98 ± 0,72%, iar la cei trataţi cu capsaicină s-a observat un procent al acestor celule de
1,40 ± 0,64%; la şoarecii dTg trataţi cu capsaicină
se poate observa o uşoară, dar nesemnificativă, creştere a procentului de celule NK în urma administrării
capsaicinei (6,30 ± 1,89% celule NK la şoarecii control şi 9,55 ± 4,56% celule NK la administrarea capsaicinei). Deci, capsaicina nu a indus modificări
semnificative ale procentului de celule NK, fapt observat la ambele linii murine utilizate (p > 0,05) (Fig.
6 A şi B).
Detecţia potenţialului membranar mitocondrial (Δψ) folosind citometria în flux. Datele din
literatura de specialitate indică faptul că tratarea diferitelor tipuri de celule cu capsaicină duce la intensificarea apoptozei celulare. Din acest considerent,
în studiul de faţă am dorit evaluarea populaţiilor limfocitare din punct de vedere al inducerii sau nu a
apoptozei în urma administrării in vivo a capsaicinei.
După izolare, limfocitele din sângele periferic
au fost marcate cu soluţie de JC-1; analiza datelor a
evidenţiat faptul că la ambele linii murine, administrarea capsaicinei nu a condus la modificarea semnificativă a procentului de celule apoptotice.
În condiţii control, reprezentate de administrarea vehiculului, şoarecii Balb/c non-diabetici au avut
un procent de limfocite apoptotice mai mic decât cei
diabetici (4,58 ± 1,95% şi respectiv 9,75 ± 3,83%)
(p< 0,05). Aceeaşi tendinţă a fost păstrată şi în cazul
administrării capsaicinei (4,20 ± 1,39% limfocite
apoptotice observate la şoarecii normali cărora li sa administrat capsaicina şi un procent de 7,85 ±
3,05% celule apoptotice determinate în sângele periferic al şoarecilor hiperglicemici trataţi cu capsaicină) (p< 0,05) (Fig. 7A şi B). Deşi la ambele linii
murine, în urma administrării capsaicinei, se observă
o uşoară tendinţă descrescătoare a procentului de celule cu Δψ depolarizat (considerate a fi apoptotice),
diferenţele nu au fost semnificative statistic (p >
0,05).
247
IANCU et al.
A
B
Fig. 6. Procentul populaţiilor şi subpopulaţiilor limfocitare din sângele periferic al şoarecilor control Balb/c (A) şi
diabetici dTg (B), determinat la 14 zile de la prima administrare a vehiculului sau a capsaicinei
La şoarecii dTg cu diabet de tip 1, gradul mai
mare de depolarizare a Δψ, ce indică nivelul de
apoptoză în populaţia limfocitară, face posibilă o
corelare cu scăderea capacităţii de apărare a organismelor afectate de această boală împotriva infecţiilor.
Nivelul apoptozei limfocitare a fost determinat
cu ajutorul Annexinei V şi a iodurii de propidiu; în
condiţii control, între cele două linii murine nu au
fost detectate diferenţe semnificative ale gradului de
apoptoză limfocitară. La şoarecii normali şi cei diabetici, în urma administrării capsaicinei procentul
celulelor viabile, a celor aflate în apoptoză timpurie
sau care erau deja moarte a fost foarte apropiat de
cel obţinut în urma administrării vehiculului (Fig. 8).
La şoarecii non-diabetici Balb/c trataţi cu vehicul procentul limfocitelor aflate în apoptoză timpurie
(celule Annexin V+/PI-) a fost de 20,32 ± 5,95%, iar
cel al celulelor aflate în apoptoză târzie (celule Annexin+/PI+) a fost de 7,74 ± 3,03%; în urma administrării capsaicinei, 16,02 ± 1,84% dintre celule se
aflau în apoptoză timpurie şi 12,58 ± 10,32% în
248
apoptoză târzie. Astfel, la şoarecii non-diabetici
Balb/c se poate observa faptul că administrarea capsaicinei nu a indus modificări semnificative ale procentului de celule aflate în apoptoză timpurie sau
târzie (p > 0,05) (Fig. 8A).
La şoarecii diabetici control, procentul limfocitelor periferice aflate în apoptoză timpurie a fost de
18,38 ± 11,83%, iar la administrarea capsaicinei a
fost determinat un procent de 18,57 ± 2,80% (p >
0,05). Procentul limfocitelor diabetice aflate în apoptoză târzie a fost de 5,26 ± 1,62% în condiţii control
şi de 3,00 ± 1,95% în urma tratamentului cu capsaicină (p > 0,05) (Fig. 8B).
Nivelul concentraţiei grupărilor carbonil, ca
masură a stării de oxidare a proteinelor plasmatice,
este reprezentat in Fig. 9. Se observă, în primul rând,
că nu există o deosebire semnificativă între nivelul
de oxidare a proteinei plasmatice la şoarecii diabetici
(dTg) şi cei normali (Balb/c).
Deşi nu se evidenţiază modificări semnificative
statistic, totuşi, se poate observa o scădere cu ~ 20%
a concentraţiei proteinei oxidate la şoarecii normali
A
B
Fig. 7. Potenţialul membranar mitocondrial (Δψ) al limfocitelor din sângele periferic al şoarecilor normali Balb/c
(A) şi al celor diabetici (dTg), în urma administrării vehiculului şi a capsaicinei
trataţi cu capsaicină în raport cu cei control (vehicul)
(de la 0,642 ± 0,095 nM/mg proteină, în condiţii
control, la 0,454 ± 0,234 nM/mg proteină, după administrarea capsaicinei) (p > 0,05) şi o uşoară creştere la şoarecii diabetici trataţi cu capsaicină, în
raport cu cei control (vehicul) (0,542 ± 0,064
nM/mg, proteină în urma administrării capsaicinei
vs 0,568 ± 0,122 nM/mg în condiţii control) (p >
0,05) (Fig. 9).
În Fig. 10 sunt reprezentate rezultatele obţinute
pentru capacitatea antioxidantă totală a plasmei
prelevate de la şoarecii non-diabetici Balb/c şi diabetici dTg, în cele două condiţii experimentale. După
cum era de aşteptat, şoarecii afectaţi de diabetul de
tip 1 au o capacitate antioxidantă semnificativ mai
mică (cu ~50%) comparativ cu cea a şoarecilor
Balb/c non-diabetici (1,192 ± 0,147 Echivalent Trolox/mM, în condiţii normale, şi 0,522 ± 0,021 Echivalent Trolox/mM, în diabet) (p < 0,05).
Administrarea capsaicinei conduce la o uşoară
creştere a capacităţii antioxidante la şoarecii normali
(de la 1,192 ± 0,147 la 1,285 ± 0,109 Echivalent Tro-
lox/mM) (p > 0,05), ceea ce se corelează cu scăderea
nivelului de proteină oxidată la aceşti şoareci. În
schimb, la şoarecii diabetici apare o scădere uşoară,
dar semnificativă (p < 0,05), a capacităţii antioxidante în cazul tratamentului cu capsaicină faţă de tratamentul cu vehicul (capsaicină: 0,470 ± 0,033 vs
vehicul: 0,522 ± 0,021 Echivalent Trolox/mM). Şi
acest rezultat se corelează cu modificarea nivelului
de proteină oxidată observată la aceşti şoareci.
DISCUÞII
Diabetul de tip 1 este o boală ce afectează un
număr tot mai mare de persoane, iar una dintre complicaţiile majore ale acestei boli este reprezentată de
neuropatia diabetică. Una dintre metodele cele mai
des întâlnite de diminuare a durerii în neuropatie este
reprezentată de aplicarea locală a capsaicinei, aceasta
având un efect de desensibilizare a aferenţelor senzitive implicate în transmiterea stimulilor dureroşi.
Studiul de faţă a pornit de la premisa conform căreia
şoarecii dublu transgenici reprezintă un model adec249
IANCU et al.
A
B
Fig. 8. Gradul de apoptoză a limfocitelor izolate din sângele periferic al şoarecilor non-diabetici Balb/c (A) şi al
celor afectaţi de diabetul de tip 1 (B), în urma administrării vehiculului şi a capsaicinei. Apoptoza celulară a fost
determinată cu ajutorul Annexinei V şi a iodurii de propidiu (PI); celulele AnnexinV+/PI- au fost considerate aflate
în apoptoză timpurie, iar cele AnnexinV+/PI+ aflate într-o fază târzie a apoptozei, sau chiar moarte.
vat pentru studiul neuropatiei diabetice [9]; mai
mult, au fost efectuate studii ce au vizat modificările
neurologice în urma administrării pe termen scurt a
capsaicinei (date neprezentate) si, pe de altă parte,
s-a dorit studierea efectelor capsaicinei asupra unor
parametri ai sistemului imun. În acest studiu, administrarea capsaicinei s-a realizat prin inoculare intraperitoneală, timp de trei zile consecutive.
Controlul glicemic al persoanelor afectate de
diabetul de tip 1 se realizează prin administrarea insulinei; în timp au existat diferite încercări de diminuare a nivelului glicemic prin administrarea altor
compuşi cu efect hipoglicemiant. Unul dintre aceşti
compuşi este reprezentat de capsaicină. Se pare că
un consum regulat de ardei iute, bogat în capsaicină,
poate atenua hiperinsulinemia post-prandială [18,
19]. Studiile efectuate pe şoareci au arătat că diminuarea nivelului de glucoză este potenţată prin administrarea capsaicinei, fără afectarea nivelului bazal
al insulinei [19-21]. La şobolani, administrarea sub250
cutanată a capsaicinei a indus o creştere a insulinei
plasmatice într-o manieră dependentă de doză [19,
22]. Episoade hipoglicemiante au fost înregistrate în
urma administrării capsaicinei la câini, acestea fiind
însoţite de creşterea producţiei de insulină [23]. Studiile efectuate la om au arătat o scădere a glicemiei,
însoţită de menţinerea [24] sau creşterea [25] nivelului insulinei în urma administrării de capsaicină.
La şoarecii dublu transgenici diabetici, administrarea
intraperitoneală a capsaicinei pe termen scurt a condus la diminuarea nivelului glicemic cu ~ 15% faţă
de control, aceste date fiind în concordanţă cu cele
menţionate în literatura de specialitate.
Administrarea orală a capsaicinei (10 mg/Kg
corp), timp de 2 săptămâni, se pare că duce la o suprimare a acumulării de grăsime la animalele tratate
[26, 27]. O tendinţă asemănătoare, deşi nesemnificativă din punct de vedere statistic, a fost observată
şi la şoarecii dTg diabetici inoculaţi intraperitoneal
cu o doză mult mai mică de capsaicină (0,8 mg/Kg
Fig. 9. Starea de oxidare a proteinelor evaluată ca nivel al concentraţiei de grupări carbonil; determinările
au fost realizate utilizând probe de plasmă prelevate de la şoarecii Balb/c şi dTg care au fost trataţi cu Vehicul sau
Capsaicină (Caps)
Fig. 10. Evaluarea capacităţii antioxidante totale din probele de ser prelevate de la şoarecii Balb/c şi dTg, în urma
administrării vehiculului şi a capsaicinei
corp) pe o perioadă scurtă de timp (3 zile); astfel, la
şoarecii dTg diabetici administrarea capsaicinei a
condus la pierderea a ~ 8% din greutatea lor corporală. Putem spune că doza de capsaicină utilizată în
acest studiu nu influenţează bunăstarea animalelor.
Administrarea capsaicinei pare să aibă efecte şi
asupra producţiei speciilor reactive de oxigen şi de
azot. În anul 1994, Joea şi Lokesh [28] au studiat
efectul capsaicinei asupra generării superoxid anionului, a peroxidului de hidrogen şi a nitritului de
către macrofagele peritoneale prelevate de la şobolani. Preincubarea in vitro a macrofagelor peritoneale cu capsaicină 10 μM a inhibat complet
producţia acestor radicali liberi, iar administrarea in
vivo a capsaicinei prin gavaj, timp de 2 săptămâni, a
condus la o scădere a producţiei acestora comparativ
cu controlul. La nivelul celulelor PMN, concentraţiile mici de capsaicină intensifică capacitatea de migrare a acestora, iar concentraţiile mari nu au
influenţat chemiluminiscenţa determinată prin lumi-
nol şi, de aceea, se poate spune că nu contribuie la
generarea superoxid anionului în celulele PMN
umane [29]. Compusul activ din ardeiul iute are un
potenţial antioxidant, potenţial care a fost studiat pe
şobolani; concentraţiile mari de capsaicină au indus
o reducere a stresului oxidativ măsurat ca şi malondialdehida din ficat, pulmon şi muşchi [30]. Proprietatea antioxidantă a capsaicinei a fost studiată şi la
om. În acest sens, Luqman şi Rizvi, în anul 2006, au
urmărit influenţa capsaicinei asupra unor markeri ai
stresului oxidativ: peroxidarea lipidelor membranare
(formarea malondialdehidei) şi grupările carbonil
membranare din eritrocitele umane. Astfel, incubarea eritrocitelor cu capsaicină a condus la scăderea
peroxidării lipidelor membranare şi la scăderea formării proteinelor carbonilice. Aceşti autori au emis
ipoteza conform căreia factorii din dietă care acţionează ca antioxidanţi pot contribui la efectul protector în cancer şi ateroscleroză. Efectul antioxidant
al capsaicinei poate explica, cel puţin parţial, consu251
IANCU et al.
mul ridicat de ardei iute în anumite regiuni ale globului [31].
Studiul de faţă a arătat faptul că administrarea
pe termen scurt a unei concentraţii mici de capsaicină nu a indus modificări semnificative ale producţiei speciilor reactive de oxigen, însă a fost evidenţiată o tendinţă descrescătoare a acestora la nivelul
celulelor PMN şi a macrofagelor peritoneale prelevate de la şoarecii non-diabetici Balb/c. Faptul că în
celulele cu funcţie fagocitară prelevate de la şoarecii
diabetici nu s-au înregistrat modificări a acestor parametri sugerează necesitatea administrării acestei
doze de capsaicină pe o perioadă mai îndelungată de
timp.
Rezultatele acestui studiu au evidenţiat faptul că
la ambele linii murine, Balb/c şi dTg, nivelul bazal
al producţiei oxidului nitric a fost semnificativ redus
ca urmare a administrării capsaicinei, corelându-se
cu cele obţinute de alţi autori [28, 32]. De asemenea,
se pare că tratamentul cu capsaicină nu afectează
funcţia fagocitară a macrofagelor [33]. Diminuarea
semnificativă a nivelului bazal al producţiei NO la
şoarecii diabetici conduce către emiterea ipotezei
conform căreia, administrarea capsaicinei o perioadă
de timp mai îndelungată poate inhiba secreţia NO la
nivelul macrofagelor peritoneale şi, implicit, la diminuarea efectelor nocive ale acestuia asupra celulelor β-pancreatice care au rămas neafectate de
atacul autoimun.
Faptul că administrarea capsaicinei la şoarecii
diabetici nu a indus modificări semnificative ale procentului populaţiilor limfocitare periferice dovedeşte
că aceasta nu are influenţe majore asupra celulelor
implicate în imunitatea dobândită, permiţând astfel
tratamentul animalelor afectate de diabetul de tip 1
pe o perioadă mai mare de timp, fără riscul apariţiei
unor efecte secundare (scăderea capacităţii de apărare a organismului în faţa agenţilor patogeni).
Studiile efectuate anterior subliniază o afectare
a statusului imun ca urmare a administrării capsaicinei. Astfel, s-a observat că administrarea pe termen
lung (3 săptămâni) a capsaicinei prin dietă a condus
fie la intensificarea proliferării induse de mitogen a
celulelor T [33], fie la o scădere a răspunsului proliferativ faţă de mitogen [34], la o creştere a numărului
de limfocite B, concomitent cu creşterea nivelului
IgG şi IgM [33]. În studiul efectuat de noi, procentul
limfocitelor B şi T a rămas nemodificat în urma administrării intraperitoneale a capsaicinei. Dacă administrarea pe termen scurt a capsaicinei evidenţiază
menţinerea procentului de celule NK atât la şoarecii
non-diabetici Balb/c, cât şi la cei diabetici dTg, stu252
diile efectuate anterior au evidenţiat o inhibare a activităţii citotoxice a celulelor NK din splină şi sângele periferic, care s-a corelat cu modificări ale
numărului şi procentului de celule NK [35].
Cele mai multe dintre studiile care au investigat
efectul capsaicinei s-au axat pe influenţa acesteia în
diferite forme de cancer. Capsaicina are un efect imunomodulator în tratamentul tumorilor pre-existente
(incipiente sau chiar în stadii avansate), activitatea
antitumorală a acestui compus fiind dependentă de
limfocitul T, ca şi de specificitatea tumorală [36]. De
asemenea, studiile efectuate pe linii tumorale pentru
cancerul de colon au arătat faptul că tratamentul cu
capsaicină a indus apoptoza acestora într-o manieră
dependentă de doză, fapt care duce cu gândul la efectul benefic al capsaicinei în tratamentul cancerului
de colon [37]. Pe de altă parte, Pramanik şi colaboratorii, în anul 2011, au adus informaţii despre mecanismul prin care tratamentul cu capsaicină induce
generarea speciilor reactive de oxigen prin intermediul mitocondriei, iar depleţia antioxidanţilor intracelulari a dus la lezarea mitocondrială şi apoptoza
celulelor pancreatice canceroase. A fost evidenţiat
faptul că celulele epiteliale pancreatice normale au
manifestat rezistenţă faţă de efectele capsaicinei
[38]. Calea apoptotică activată de capsaicină este
încă necunoscută. Numeroase studii au arătat inducerea apoptozei cu ajutorul capsaicinei via nivele
crescute ale ionilor de calciu şi specii reactive de
oxigen, precum şi un potenţial membranar mitocondrial redus în diferite modele celulare de carcinom
[39-42].
La subiecţii afectaţi de diabetul de tip 1, gradul
de apoptoză limfocitară este mai mare, fiind însoţit
de o reducere a numărului circulant al acestor celule,
fapt care ar putea să explice alterarea funcţiei imune
a persoanelor cu un control glicemic deficitar. Un rol
important în apoptoza limfocitară în diabet îl are
chiar insulina, fapt dovedit prin determinările efectuate pe şobolanii diabetici trataţi cu insulină, la care
s-a observat reducerea apoptozei limfocitare în urma
tratamentului [43]. La pacienţii afectaţi de diabetul
de tip 2, s-a observat o polarizare mai mare a potenţialului mitocondrial al celulelor mononucleare, polarizare ce sugerează intensificarea gradului de
apoptoză la nivelul acestor celule [44]. Rezultatele
noastre, asemănătoare cu cele obţinute pe subiecţi
diabetici indică un grad mai mare al apoptozei limfocitare la şoarecii diabetici dTg, comparativ cu cel
al şoarecilor non-diabetici Balb/c. Tratarea cu capsaicină a şoarecilor diabetici tinde să reducă polarizarea potenţialului membranar mitocondrial
limfocitar, fapt care sugerează importanţa tratamentului cu capsaicină în diabetul de tip 1, în sensul că
o scădere a procentului limfocitelor periferice aflate
în apoptoză poate duce la o intensificare a capacităţii
organismului de apărare împotriva diferiţilor agenţi
patogeni.
Proprietatea antioxidantă a capsaicinei a fost demonstrată cu ajutorul markerilor stresului oxidativ,
de tipul peroxidării lipidelor membranare (formarea
malonaldehidei), dar şi grupările carbonil de la nivelul membranei eritrocitare. Expunerea eritrocitelor
umane la stres oxidativ a condus la creşterea nivelului de malonaldehidă şi a conţinutului grupărilor carbonil. Tratarea eritrocitelor cu capsaicină a evidenţiat
protecţia acestora faţă de stresul oxidativ, care este
demonstrată prin scăderea nivelului malonaldehidei
şi a conţinutului de grupări carbonil, dovedindu-se
astfel eficacitatea capsaicinei ca şi antioxidant [31].
În studiul de faţă, la şoarecii Balb/c administrarea
intraperitoenală a capsaicinei a indus o diminuare a
nivelului de oxidare a proteinelor plasmatice, care se
corelează cu o uşoară creştere a capacităţii antioxidante; în schimb, tratamentul şoarecilor diabetici
dTg nu a indus modificări semnificative ale grupărilor carbonil şi ale capacităţii antioxidante; acest
fapt ar putea fi datorat perioadei scurte de tratament.
Administrarea pe termen scurt a capsaicinei nu
a indus modificări majore a producţiei speciilor reactive de oxigen de către celulele cu funcţie fagocitară
şi nici nu a intensificat gradul de apoptoză limfocitară; în schimb, administrarea capsaicinei a avut un
efect de diminuare a nivelului bazal al producţiei
oxidului nitric de către macrofagele peritoneale. În
consecinţă, administrarea capsaicinei la animalele
diabetice pe o perioadă mai mare de timp (minimum
o săptămână) poate conduce la reducerea semnificativă a producţiei oxidului nitric de către macrofage
şi, implicit, la diminuarea efectelor nocive ale acestuia asupra celulelor β-pancreatice rămase neafectate
de atacul autoimun. De asemenea, în urma tratamentului cu capsaicină, s-a observat o îmbunătăţire a nivelului glicemic al şoarecilor diabetici.
În concluzie, rezultatele obţinute în acest studiu
indică faptul că administrarea intraperitoneală a capsaicinei pe termen scurt poate fi utilizată în diminuarea senzaţiilor dureroase, fără o afectare majoră a
parametrilor imunologici.
Mulţumiri
Această lucrare a fost susţinută de proiectul naţional PNII 41-074/2007 al Ministerului Cercetării
din România.
BIBLIoGRAFIE
1 Diabetes. J Clin Endocrinol Metab 2003. 88(4):
1624–1628.
generation. Diabet Med 1997. 14(3): S45–S49.
3. West IC. Radicals and oxidative stress in diabetes. Diabet Med 2000. 17: 171–180.
of diabetic complications. Nature 2001. 414: 813–820.
Rev. 2002. 23: 599-622.
61(9-10): 458-63.
status and hyperfiltration in young patients with type 1
diabetes mellitus. Pediatr. Nephrol. 2009. 24: 121-127.
J. Surg. Res. 2009. 155: 173-178.
9. Radu BM, Iancu AD, Marin A, Radu M, Banciu DD,
Stavaru C, Radu DL. Basic features of sensory neurons from dorsal root ganglia in TCR-HA+/–/RIPHA+/– mice. Romanian J. Biophys. 2009. 19(2):
83–95.
10. Derry S, Lloyd R, Moore RA, McQuay HJ. Topical
capsaicin for chronic neuropathic pain in adults.
Cochrane Database Syst Rev 2009. CD007393.
11. Hempenstall K, Nurmikko TJ, Johnson RW, A’Hern RP, Rice AS. Analgesic therapy in postherpetic
neuralgia: a quantitative systematic review. PLoS Med
2005. 2: e164.
12. Rage´ M, Van Acker N, Facer P, et al. The time
course of CO2 laser evoked responses and of skin
nerve fibre markers after topical capsaicin in human
volunteers. Clin Neurophysiol 2010. 121: 1256–1266.
S. Pharmacokinetics and the effect of capsaicin in
Capsicum frutescens on decreasing plasma glucose
level. J Med Assoc Thai 2009. 92: 108–113.
14. Chanda S, Bashir M, Babbar S, Koganti A, Bley K.
In vitro hepatic and skin metabolism of capsaicin.
Drug Metab Dispos 2008. 36: 670–675.
15. Radu D.L., Brumeanu T.D., McEvoy R.C., Bona
C.A., Escape from self-tolerance leads to neonatal insulin-dependent diabetes mellitus, Autoimmmunity
1999. 30: 199-207.
16. Radu D.L., Noben-Trauth N., Hu-Li J., Paul W.E.,
Bona C.A., A targeted mutation in the IL-4Ra gene
protects mice against autoimmune diabetes, Proc.
Natl. Acad.Sci. USA 2000. 97: 12700-12704.
253
IANCU et al.
17. Radu DL, Georgescu Adriana, Stavaru Crina ,
Alina Carale, Doina Popov. Double transgenic mice
with Type 1 diabetes mellitus develop somatic, metabolic and vascular disorders. J. Cell. Mol. Med. 2004.
8(3): 349-358.
18. Ahuja KDK, Robertson IK, Geraghty DP, Ball MJ.
Effects of chili consumption on postprandial glucose,
insulin, and energy metabolism. Am J Clin Nutr 2006.
84: 63–69.
19. Alevizos A, Mihas C, Mariolis A. Insulin secretion
and capsaicin. American Journal of Clinical Nutrition
2007. 85(4): 1165-1166.
20. Karlsson S, Scheurink AJ, Steffens AB, Ahren B.
Involvement of capsaicin-sensitive nerves in regulation of insulin secretion and glucose tolerance in conscious mice. Am J Physiol 1994. 267: 1071–1077.
21. Gram DX, Hansen AJ, Wilken M. Plasma calcitonin
gene-related peptide is increased prior to obesity, and
sensory nerve desensitization by capsaicin improves
oral glucose tolerance in obese Zucker rats. Eur J Endocrinol 2005. 153: 963–969.
22. Akiba Y, Kato S, Katsube K, Nakamura M, Takeuchi K, Ishii H, Hibi T. Transient receptor potential vanilloid subfamily 1 expressed in pancreatic islet
beta cells modulates insulin secretion in rats. Biochem
Biophys Res Commun 2004. 321: 219–225.
23. Tolan I, Ragoobirsingh D, Morrison EY. The effect
of capsaicin on blood glucose, plasma insulin levels
and insulin binding in dog models. Phytother Res.
2001. 15(5): 391-394.
S. Pharmacokinetic and the effect of capsaicin in Capsicum frutescens on decreasing plasma glucose level.
J Med Assoc Thai. 2009. 92(1): 108-113.
25. Domotor A, Szolcsanyi J, Mozsik G. Capsaicin and
glucose absorption and utilization in healthy human
subjects. Eur J Pharmacol 2006. 534: 280–283.
26. Ohnuki K, Haramizu S, Oki K, Watanabe T,
Yazawa S, Fushiki T. Administration of capsiate, a
non-pungent capsaicin analog, promotes energy metabolism and suppresses body fat accumulation in
mice. Biosci Biotechnol Biochem. 2001. 65(12):
2735-40.
27. Haramizu S, Kawabata F, Ohnuki K, Inoue N,
Watanabe T, Yazawa S, Fushiki T. Capsiate, a nonpungent capsaicin analog, reduces body fat without
weight rebound like swimming exercise in mice. Biomed Res. 2011. 32(4): 279-284.
28. Joe B, Lokesh BR. Role of capsaicin, curcumin and
dietary n-3 fatty acids in lowering the generation of
reactive oxygen species in rat peritoneal macrophages.
Biochim. Biophys. Acta 1994. 1224(2): 255–263.
29. Partsch G, Matucci-Cerinic M. Capsaicin stimulates
the migration of human polymorphonuclear cells
(PMN) in vitro. Life Sci. 1993. 53(19): PL309-314.
30. Lee CYJ, Kim M, Yoon SW, Lee CH. Short-term
control of capsaicin on blood and oxidative stress of rats
in vivo. Phytotherapy Research 2003. 17(5): 454–458.
31. Luqman S, Rizvi SI. Protection of lipid peroxidation
and carbonyl formation in proteins by capsaicin in
human erythrocytes subjected to oxidative stress. Phytotherapy Research 2006. 20(4): 303-306.
254
32. Oh GS, Pae HO, Seo WG, Kim NY, Pyun KH, Kim
IK, Shin MK, Chung HT. Capsazepine, a vanilloid
receptor antagonist, inhibits the expression of inducible nitric oxide synthase gene in lipopolysaccharide-stimulated RAW264.7 macrophages through the
inactivation of nuclear transcription factor-kappa B. International Immunopharmacology 2001. 1(4): 777–784.
33. Yu R, Park JW, Kurata T, Erickson KL. Modulation of select immune responses by dietary capsaicin.
Int J Vitam Nutr Res. 1998. 68(2): 114-119.
34. Nilsson G, Ahlstedt S. Altered lymphocyte proliferation of immunized rats after neurological manipulation with capsaicin. Int J Immunopharmacol. (1988)
10(6): 747-751.
35. Santoni G, Perfumi M, Birarelli P, Procaccini A,
Piccoli M. In vivo capsaicin treatment inhibits rat NK
cell cytotoxic functions. Immunopharmacol Immunotoxicol 1995. 17: 511-528.
36. Beltran J, Ghosh AK, Basu S. Immunotherapy of
Tumors with Neuroimmune Ligand Capsaicin. The
Journal of Immunology 2007. 177: 3260–3264.
37. Kim CS, Park WH, Park JY, Kang JH, Kim MO,
Kawada T, Yoo H, Han IS, Yu R. Capsaicin, a Spicy
Component of Hot Pepper, Induces Apoptosis by Activation of the Peroxisome Proliferator-Activated Receptor γ in HT-29 Human Colon Cancer Cells. Journal
of Medicinal Food. Fall 2004. 7(3): 267-273.
38. Pramanik KC, Boreddy SR, Srivastava SK. Role
of Mitochondrial Electron Transport Chain Complexes in Capsaicin Mediated Oxidative Stress Leading to Apoptosis in Pancreatic Cancer Cells. PLoS
ONE 2011. 6(5): e20151.
39. Perego P, Giarola M, Righetti SC, Supino R,
Caserini C, Delia D, Pierotti MA, Miyashita T,
Reed JC and Zunino F. Association between cisplatin resistance and mutation of p53 gene and reduced bax expression in ovarian carcinoma cell
systems. Cancer Res 1996. 56: 556-562.
40. Macho A, Calzado MA, Muñoz-Blanco J, GómezDíaz C, Gajate C, Mollinedo F, Navas P, Muñoz E.
Selective induction of apoptosis by capsaicin in transformed cells: the role of reactive oxygen species and
calcium. Cell Death Differ 1999. 6: 155-165.
41. Kim JA, Kang YS and Lee YS A phospholipase Cdependent intracellular Ca2+ release pathway mediates the capsaicin induced apoptosis in HepG2 human
hepatoma cells. Arch Pharm Res 2005. 28: 73-80.
42. Huang SP, Chen JC, Wu CC, Chen CT, Tang NY,
Ho YT, Lo C, Lin JP, Chung JG, Lin JG. Capsaicininduced Apoptosis in Human Hepatoma HepG2 Cells.
Anticancer Research 2009. 29: 165-174.
43. Otton R, Soriano FG, Verlengia R, Curi R. Diabetes
induces apoptosis in lymphocytes. Journal of Endocrinology 2004. 182: 145–156.
44. Widlansky ME, Wang J, Shenouda SM, Hagen
TM, Smith AR, Kizhakekuttu TJ, Kluge MA,
Weihrauch D, Gutterman DD, Vita JA. Altered mitochondrial membrane potential, mass, and morphology in the mononuclear cells of humans with type 2
diabetes. Transl Res. 2010. 156(1): 15-25.
sUBJeCT INDeX / INDeX sUBIeCTe
MICROBIOLOGY / MICROBIOLOGIE
INFLUENCE OF SALINITY UPON THE PHENOTYPIC EXPRESSION OF ANTIBIOTIC RESISTANCE IN
NONHALOPHILIC AND HALOPHILIC VIBRIOS
5
Anca-Michaela Israil, Mariana-Carmen Balotescu-Chifiriuc, Cristina Delcaru, Mihaela Aramă
GENERATION OF SOME NEW MUTANT XYLITOL PRODUCING YEAST STRAINS
Raluca Ghindea, Andreea Paic and Tatiana Vassu
11
THE TIP OF THE ICEBERG: QUINOLONE-RESISTANCE CONFERRED BY MUTATIONS IN gyrA GENE IN
NON-TYPHOIDAL SALMONELLA STRAINS
17
Alexandra-Maria Năşcuțiu
THE ADENOVIRAL INFECTIONS IN CHILDREN ADMITTED TO HOSPITAL WITH PNEUMONIA, ACUTE
BRONCHIOLITIS OR RESPIRATORY VIRAL INFECTIONS
Cristina Ţecu, Maria E. Mihai, Viorel I. Alexandrescu, Dumitru Orăşanu,
24
Carmen Zapucioiu, Dumitru Matei, M. Craiu, Alexis Cochino
HUMAN MECP2 GENE AT Q28 ARM OF X CHROMOSOME AS A SUITABLE TARGET FOR MONITORING
PCR INHIBITION IN A NESTED, MULTIPLEXED HIV-1 DNA DETECTION PROTOCOL
Arpan Acharya, Yashwant Govind Chavan, Pratap Narayan Mukhopadhyaya, Anju Nagee,
29
Prashant Kunjadia and Rabindra Nath Misra
EVALUATION OF UVB LIGHT EFFICACY FOR INDUCING APOPTOSIS IN CANDIDA ALBICANS CULTURES
39
Payam Behzadi and Elham Behzadi
IDENTIFICATION OF FOUR TREPONEMA SPECIES IN SUBGINGIVAL SAMPLES BY NESTED–PCR AND
THEIR CORRELATION WITH CLINICAL DIAGNOSIS
43
Bogdan Dabu, Magdalena Mironiuc-Cureu, Dumitru Jardan, Camelia Szmal, Silvia Dumitriu
ETIOLOGY OF PNEUMONIA IN CHILDREN IN THE ABSENCE OF PNEUMOCOCCAL AND ANTIHAEMOPHILUS VACCINES
48
Genel Sur, Liana Kudor-Szabadi, Viorica Vidrean, Gabriel Samaşca
IN VITRO ANTIMICROBIAL AND ANTIOXIDANT ACTIVITY OF BLACK THYME (THYMBRA SPICATA L.)
ESSENTIAL OILS
61
Mehdi Saidi, Sobhan Ghafourian, Maryam Zarin-Abaadi, Khaavar Movahedi, Nourkhoda Sadeghifard
IN VITRO ANTIMICROBIAL ACTIVITY OF PERSIAN SHALLOT (ALLIUM HIRTIFOLIUM)
Setareh Soroush, Morovat Taherikalani, Parisa Asadollahi, Khairollah Asadollahi, Mojtaba Taran,
Mohammad Emaneini, Sajjad Alizadeh
70
ANTIBIOTIC RESISTANCE PROFILES OF ACINETOBACTER SP. STRAINS ISOLATED FROM
INTENSIVE-CARE UNIT PATIENTS
75
Elvira Borcan, Camelia Ghiţă, Mariana Carmen Chifiriuc, Veronica Lazăr
CHARACTERIZATION OF KLEBSIELLA PNEUMONIAE STRAINS PRODUCING EXTENDED SPECTRUM
B-LACTAMASES AND AMPC TYPE B-LACTAMASES ISOLATED FROM HOSPITALIZED PATIENTS IN
KERMAN, IRAN
81
Shahla Mansouri, Davood Kalantar, Parisa Asadollahi, Morovat Taherikalani, Mohammad Emaneini
255
BLOODSTREAM INFECTIONS IN IMMUNOCOMPROMISED HOSTS
Raluca Papagheorghe
87
CONSIDERATIONS ON THE ISOLATION OF LISTERIA MONOCYTOgENES AND OTHER LISTERIA SPP. IN
FOOD PRODUCTS
165
Alina Maria Borcan, Dana Magdalena Caplan
COMPARATIVE ANALYSIS OF BIOFILM DEVELOPMENT AMONG MRSA AND MSSA STRAINS
Sobhan Ghafourian, Reza Mohebi, Mitra Rezaei, Mohammad Raftari, Zamberi Sekawi,
Hosein Kazemian, Aghdas Mohseni, Sajedeh Karimi, Nourkhoda Sadeghifard
175
IMMUNOLOGY / IMUNOLOGIE
IMMUNOLOGICAL MANIFESTATIONS IN TYPE 1 DIABETIC CHILDREN
Andreea Liana Răchişan, Bianca Andreea David, Simona Căinap, Nicolae Miu,
Mariana Andreica, Gabriel Samaşca
95
CORRELATIONS AMONG DIFFERENT MARKERS DETERMINED BY IMMUNOCHEMICAL METHODS
USED FOR THE DIAGNOSIS AND MONITORING OF INTACT IMMUNOGLOBULIN MULTIPLE
MYELOMA CASES
183
Monica Dogaru, Veronica Lazăr, Daniel Coriu
DOUBLE TRANSGENIC MICE – A SUITABLE MODEL FOR STUDYING OXIDATIVE STRESS IN TYPE 1
DIABETES MELLITUS
201
Adina Daniela Iancu and Crina Stăvaru
CAPSAICIN SHORT TERM ADMINISTRATION EFFECT ON DIFFERENT IMMUNE PARAMETERS
Adina Daniela Iancu, Ileana Petcu, Beatrice Mihaela Radu, Mihai Radu
221
SHORT COMMUNICATIONS / SCURTE COMUNICĂRI
PREVALENCE OF HEPATITIS B VIRUS IN CHRONIC HEPATITIS B PATIENTS
Nourkhoda Sadeghifard, Reza Mohebi, Zamberi Sekawi, Sobhan Ghafourian,
Hossien Kazemian and Mitra Rezaee
53
IMPACT OF THE MOLECULAR DIAGNOSIS ON THE MANAGEMENT OF PATIENTS WITH ASEPTIC
MENINGITIS
100
Anda Băicuş and Ruxandra Cardaş
CONFERENCE “DIASPORA IN ROMANIAN SCIENTIFIC RESEARCH
AND EDUCATION” / CONFERINŢA „DIASPORA îN CERCETAREA ŞTIINŢIFICĂ
ŞI îNVĂŢĂMâNTUL SUPERIOR DIN ROMâNIA”
Bucharest, September 25-28, 2012 / Bucureşti, 25-28 septembrie 2012
ABSTRACTS
AUTHOR INDEX
113
153
VARIA / DIVERSE
GEORGE EMIL PALADE CENTENARY (1912-2012)
Costin Cernescu
256
161
AUTHOR INDeX / INDEX AUTORI
CONFERENCE “DIASPORA IN ROMANIAN SCIENTIFIC RESEARCH AND EDUCATION” /
CONFERINŢA „DIASPORA ÎN CERCETAREA ŞTIINŢIFICă ŞI ÎNVăŢăMâNTUL SUPERIOR DIN ROMâNIA”
ABSTRACTS / REZUMATE
Aldea, Ioana Mădălina
Allerberger, Franz
Andronescu, Ecaterina
Baltac, Alina
Banu, Otilia
Bălăceanu, Daria
Bilca, Doina
Bleotu, Coralia
Borcan, Alina-Maria
Borcan, Elvira
-A-
-B-
142
124
145
135
131,133
135
123
142
126
127,131
-CCaplan, Dana-Magdalena
126
Caplan, Marius-Eduard
126
Cernescu, Costin Eugen
142
Chifiriuc, Mariana Carmen
117,129,131,
133,135,140,142,145,149,151
Codiţă, Irina
121
Constantinovici, Mariana
147
Cotar, Ani Ioana
131
Croitoru, Cristina
149
Czobor, Ilda
117,131
-DDamian, Maria
Diaconu, Carmen Cristina
Dinu, Sorin
Drǎguşel, Roxana
Dumitriu, Brînduşa
Ecovoiu, Alexandru Al.
Ficai, Anton
-E-F-
113
142
115
142
147
117
145
-G-
Gheorghe, Irina
Ghiţă, Camelia Mihaela
Grumezescu, Alexandru Mihai
Holban, Alina-Maria
Huhulescu, Steliana
133
127
145,149,151
-H-
126,140
124
-IIancu, Luminiţa Smaranda
Ilie, Mădălina
118
135
-KKamerzan (Saviuc), Crina-Maria
Lazăr, Veronica
-L-
Lőrinczi, Lilla
-MMateescu, Andreea Lorena
Măruţescu, Luminiţa Gabriela
Mihăescu, Grigore
Mitache, Mihaela Magdalena
Molnár, Szabolcs
Olariu, Laura
Oprea, Mihaela
Oprişan, Gabriela
Pietzka, Ariane
Pîrcălăbioru, Graţiela
-O-
-P-
145,147
127,131,133,135,
140,142,145,149,151
123
129
129,131,
133,135
131
129
123
147
143
115
124
142
257
Popa, Marcela
Popescu, Iulia
Rațiu, Attila Cristian
Ruppitsch, Werner
Sagel, Ulrich
Stîngu, Cătălina Suzana
Stöger, Anna
Străuţ, Monica
Székely, Edit
Szőcs-Gazdi, Uzonka
258
135
138
-R-S-
117
124
124
120
124
115
123
123
Vas, Krisztina Eszter
Vassu Dimov, Tatiana
-V-
-ZZigoneanu, Imola Gabriela
123
129
137
AUTHOR INDEX / INDEX AUTORI
Acharya Arpan
Alexandrescu Viorel I.
Alizadeh Sajjad
Andreica Mariana
Aramă Mihaela
Asadollahi Khairollah
Asadollahi Parisa
-A-
-B-
Băicuş Anda
Balotescu-Chifiriuc Mariana-Carmen
Behzadi Elham
Behzadi Payam
Borcan Alina Maria
Borcan Elvira
-C-
Căinap Simona
Caplan Dana Magdalena
Cardaş Ruxandra
Cernescu Costin
Chavan Yashwant Govind
Cochino Alexis
Coriu Daniel
Craiu M.
Dabu Bogdan
David Bianca Andreea
Delcaru Cristina
Dogaru Monica
Dumitriu Silvia
Emaneini Mohammad
Ghafourian Sobhan
Ghindea Raluca
Ghiţă Camelia
-D-
-E-G-
29
24
70
95
5
70
70
100
5, 75
39
39
165
75
95
165
100
161
29
24
183
24
43
95
5
183
43
70
53, 61, 175
11
75
Iancu Adina Daniela
Israil Anca-Michaela
Jardan Dumitru
Kalantar Davood
Karimi Sajedeh
Kazemian Hosein
Kudor-Szabadi Liana
Lazăr Veronica
-I-
-J-K-
-L-
-MMansouri Shahla
Matei Dumitru
Mihai Maria E.
Mironiuc-Cureu Magdalena
Misra Rabindra Nath
Miu Nicolae
Mohseni Aghdas
Mohammad Emaneini
Movahedi Khaavar
Mukhopadhyaya Pratap Narayan
-NNagee Anju
Naşcutiu Alexandra-Maria
Orăşanu Dumitru
Paic Andreea
Papagheorghe Raluca
Parisa Asadollahi
Petcu Ileana
Prashant Kunjadia
-O-P-
201, 221
5
43
81
175
53
48
75, 183
81
24
24
43
29
95
175
81
61
29
29
17
24
11
87
81
221
29
259
Raftari Mohammad
Radu Beatrice Mihaela
Radu Mihai
Răchişan Andreea Liana
Reza Mohebi
Rezaei Mitra
Sadeghifard Nourkhoda
Saidi Mehdi
Samaşca Gabriel
Sekawi Zamberi
Soroush Setareh
Stăvaru Crina
Sur Genel
Szmal Camelia
260
R
S
175
221
221
95
53, 175
53, 175
53, 61, 175
61
48, 95
53, 175
70
201
48
43
Taherikalani Morovat
Taran Mojtaba
Ţecu Cristina
Vassu Tatiana
Vidrean Viorica
Zapucioiu Carmen
Zarin-Abaadi Maryam
T
Ţ
V
Z
70, 81
70
24
11
48
24
61

Interior Archives_4(2012)_104pag_BT4

Transcription

Similar documents

Revista de Ştiinţe ale Sănătăţii din Moldova, nr. 1, 2015

Zilele Medicamentului edi ia a XXI-a

Vânzări - Viata Libera

Die BUCHSTAVIER - Das Dosierte Leben

analiza de risc pentru bluetongue