UNIVERSIDADE FEDERAL DO TRIÂNGULO MINEIRO

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UNIVERSIDADE FEDERAL DO TRIÂNGULO MINEIRO
GLÁUCIA APARECIDA DOMINGOS RESENDE
REPRODUTIBILIDADE INTRA E INTEROBSERVACIONAL DOS DIAGNÓSTICOS
MORFOLÓGICOS E CITOQUÍMICOS DAS LEUCEMIAS AGUDAS FRENTE À
IMUNOFENOTIPAGEM
UBERABA – MG
2013
GLÁUCIA APARECIDA DOMINGOS RESENDE
REPRODUTIBILIDADE INTRAO E INTEROBSERVACIONAL DOS
DIAGNÓSTICOS MORFOLÓGICOS E CITOQUÍMICOS DAS LEUCEMIAS
AGUDAS FRENTE À IMUNOFENOTIPAGEM
Dissertação apresentada ao curso de pósgraduação em “Ciências da Saúde-Patologia
Humana” da Universidade Federal do Triângulo
Mineiro, como requisito parcial para obtenção
de Título de Mestre em Ciências da SaúdePatologia – Humana.
Orientador: Prof. Dr. Paulo Roberto Juliano
Martins
Co-orientador: Prof. Dr. Hélio Moraes de Souza
UBERABA – MG
2013
II
Catalogação na fonte: Biblioteca da Universidade Federal do Triângulo Mineiro
Resende, Gláucia Aparecida Domingos
00000 Reprodutibilidade intra e interobservacional dos diagnósticos
morfológicos e citoquímicos das Leucemias agudas frente á imunofenotipagem
/Glaucia Aparecida Domingos Resende. – 2013.
000 f. : tab. ; graf. ; fig.
Tese (Mestrado em Ciências da saúde-Patologia Humana) - Universidade Federal
do Triângulo Mineiro, Uberaba, MG, 2013.
Orientador: Prof. Dr. Paulo Roberto Juliano Martins
1. Leucemia. 2. Diagnóstico citológico. 3. Citoquímica. 4. Imunofenotipagem. I.
Martins, Paulo Roberto Juliano. II. Universidade Federal do Triângulo Mineiro. III.
Título.
CDU 000.00-000.000.0
III
GÁUCIA APARECIDA DOMINGOS RESENDE
REPRODUTIBILIDADE INTRA E INTEROBSERVACIONAL DOS DIAGNÓSTICOS
MORFOLÓGICOS E CITOQUÍMICOS DAS LEUCEMIAS AGUDAS FRENTE À
IMUNOFENOTIPAGEM
BANCA EXAMINADORA
Data da aprovação:
Profa Dr Miriane da Costa Gileno
Prof. Dr Antonio Carlos Oliveira de Menezes
Prof. Dr Paulo Roberto Juliano Martins
IV
5
Dedicatória
V
Aos meus pais,
Vardelício Resende e Vera Lúcia Domingos Resende.
Dedico este trabalho aos meus amados pais, com muito
amor e gratidão, por tudo que fizeram por mim ao longo de
minha vida, pelos ensinamentos, por estarem ao meu lado
durante todos os momentos difíceis, quando não apenas me
amparam,
mas
suportaram
comigo
todas
as
venceram obstáculos.
“Eu tenho tanto pra lhe falar
Mas com palavras não sei dizer
Como é grande o meu amor por você
E não ha nada pra comparar
Para poder lhe explicar
Como é grande o meu amor por você”...
(Roberto Carlos)
VI
dores
e
Ao meu irmão,
Glauber Aparecido Domingos Resende.
Dedico esta dissertação ao meu irmão, com muita
gratidão pelo seu gesto de amor e total desprendimento. Hoje
carrego comigo muito mais do que um pedacinho de você, um
órgão, mas acima de tudo a sua demonstração de eterno
amor.
Obrigada,
Te amo!
VII
A minha irmã,
Glaucimara Aparecida Domingos Resende.
Dedico
esta
dissertação
a
minha
irmã,
pelo
companheirismo, amor, incentivo e pela presença em todos os
momentos que necessitei.
“Uma declaração de amor, eu quero te oferecer
Duas palavras podem expressar... Te Amo!
Tudo o que eu sinto por ti
É um sentimento de Deus
Talvez num gesto possa demonstrar...
Se eu somasse as estrelas às águas do mar”...
(Cassiane)
VIII
A minha sobrinha e cunhada,
Larissa Domingos Resende e Luciney O S Resende.
Dedico esta dissertação a minha sobrinha por trazer
tantos momentos de alegria, pelo seu sorriso que acalma e
aconchego nos momentos de angústia.
A minha cunhada Luciney pelo apoio, incentivo e
carinho.
Obrigada.
IX
Agradecimentos
X
Agradecimentos
Agradeço
a
Deus,
que
nos
fortalece
e
ampara
quando
acreditamos não mais conseguir.
Ao meu orientador, Dr Paulo Roberto Juliano Martins, pelo
apoio, pela dedicação e pela presteza no auxílio às atividades e
discussões, colocando a disposição todos os quesitos necessários para que
este trabalho fosse concluído.
Ao Dr Hélio Moraes de Souza, pela confiança em oferecer
oportunidades que permitiram meu crescimento profissional.
Ao Dr Leonardo, pela colaboração e pela em realizar as coletas de
medula e ceder o material para que este trabalho fosse realizado, pelo
auxílio em fotografar as lâminas e por acreditar que seria possível
incentivando sempre.
Ao funcionário Carlos Humberto Lima, que prontamente cedeu
seu espaço, para que eu pudesse realizar os experimentos, me
auxiliando e me dando suporte sempre que necessário, meu carinho e
respeito.
A Dr Rita Cleide Amorim Coelho do Hemorio, que prontamente
nos forneceu protocolos e orientações, permitindo o aprimoramento de
nossas técnicas.
A Dr Silvia do Hemorio que propiciou o nosso contato com a Dr
Rita.
XI
Ao professor Gilberto de Araújo Pereira, pelas orientações e por
ter realizado a análise dos resultados.
Ao professor Sebastião Tostes pela colaboração e correções do
artigo.
As funcionárias Marise Carvalho Silveira e Maria Célia Bento de
Freitas, que ao longo desta jornada tornaram-se grandes amigas e
companheiras.
As minhas queridas amigas Aline Meneses, Valéria Zeferino e
Alexandra Leal, que ao longo desta jornada compartilharam sorrisos,
lágrimas e angústias, fortalecendo nossos laços de amizade, tornandonos companheiras e parceiras. Obrigada por fazerem parte desta
história.
Ao meu cunhado Eber Alves dos Santos pelo carinho e incentivo.
A amiga Fernanda, Bernadelli pela colaboração e pelas palavras
de apoio e incentivo.
Aos pós-graduandos do grupo de hematologia, Bruna Bereta,
Ranata Volpe, Vitor, Márcia Ferreira, Aline Aparecida, Andreza,
Milena e Ricardo Olivo por compartilharem seus conhecimentos.
A toda equipe da Central de Quimioterapia, Denise Silva da
Cunha, Ana Carolina Rodrigues da Silva, Guaraciaba Silva Pereira e
Tatiana
Penhalver,
pela
gentileza,
prestatividade e
pela
forma
carinhosa com que sempre fui recebida no setor.
A Dr Polliana Valize e Laura Cardoso, pelo carinho, pela presteza
e
por
contribuírem
encaminhando
oncohematologia pediátrica.
amostras
dos
pacientes
da
XII
As doutoras Thais Camargo e Luzia Zago, pela colaboração.
Ao Dr Marcel Mendes, por colaborar cedendo amostras e dados
de seus pacientes, sempre com muita gentileza.
Aos funcionários dos setores técnicos, administrativos, recepção,
vigilância e limpeza do Hemocentro Regional de Uberaba, pela
gentileza e pela colaboração sempre que se fez necessário.
Aos hematologistas do serviço de hematologia e hemotrapia da
Universidade
Federal
de
Uberaba/Hemocentro
Regional
de
Uberaba, pela colaboração.
Agradeço ao fotógrafo Edmundo Alves por colaborar na edição
das fotos.
Enfim,
Agradeço
a
todos
aqueles
que
de
alguma
contribuído para que este trabalho fosse concluído.
XIII
forma
tenham
Epigráfe
“O sucesso nasce do querer, da determinação e persistência
em se chegar a um objetivo. Mesmo não atingindo o alvo,
quem busca e vence obstáculos, no mínimo fará coisas
admiráveis”.
José de Alencar
XIV
SUMÁRIO
LISTA DE FIGURAS
LISTA DE TABELAS
ABREVIATURAS E SÍMBOLOS
1
INTRODUÇÃO ................................................................................................ 25
1.1 Leucemia Mieloide Aguda...............................................................................27
1.2 Leucemia Linfoide Aguda ...............................................................................33
1.3 Leucemia Aguda Bifenotípica .........................................................................35
1.4 Diagnóstico ......................................................................................................36
1.4.1 Diagnóstico Morfológico e Citoquímica ........................................................36
1.4.2 Imunofenotipagem ..........................................................................................41
2
OBJETIVOS.....................................................................................................46
2.1 Objetivos geral .................................................................................................46
2.2 Objetivos específicos ........................................................................................46
3
JUSTIFICATIVA ............................................................................................48
4
MATERIAL E MÉTODO ................................................................................50
4.1 Apectos Éticos ..................................................................................................50
4.2 Critérios de inclusão ........................................................................................50
4.3 Critérios de exclusão ........................................................................................50
4.4 Amostra populacional......................................................................................50
4.5 Coleta das Amostras ........................................................................................51
4.6 Materiais e Preparo dos Reagentes ................................................................ 51
4.6.1 Mieloperoxidase................................................................................................ 52
4.6.2 Coloração de Sudan Black ...............................................................................52
4.6.3 Reação de Ácido Periódico de Schiff (PAS) ....................................................52
4.6.4 Alfa naftil acetato esterase ................................................................................53
4.7 Estudo do sangue periférico e medula óssea .................................................53
XV
4.7.1Estudo das Reações citoquímicas ......................................................................54
4.7.2Imunofenotipagem .............................................................................................54
4.8 Dados clínico-epidemiológicos ........................................................................55
4.9 Análise dos Dados ............................................................................................55
4.10 Normas utilizadas na confecção do manuscrito ...........................................55
5.0 RESULTADOS ................................................................................................ 57
5.1 Distribuições dos pacientes conforme gênero e idade...................................57
5.2 Resultados dos achados clínicos......................................................................57
5.3 Resultados por linhagem .................................................................................59
5.3.1 Concordância intraobservador A ......................................................................59
5.3.2 Concordância intraobservador B ......................................................................59
5.3.3 Avaliação interobservador ................................................................................60
5.3.4 Análise Descritiva intraobservador por subtipo baseada na classificação
FAB ...........................................................................................................................61
5.3.4.1Resultado do observador A .............................................................................61
5.3.4.2Resultado do observador B .............................................................................62
6. Discussão ...............................................................................................................65
6.1 Caracterização clico-epidemiológica ................................................................ 65
6.2 Avaliação intraobservador e interobservador ................................................66
7 CONCLUSÃO .....................................................................................................72
REFERÊNCIAS ..................................................................................................74
ANEXOS ..............................................................................................................81
XVI
LISTA DE FIGURAS
FIGURA 1 LMA-M0 ....................................................................................................... 28
FIGURA 2 LMA-M1 ....................................................................................................... 28
FIGURA 3 LMA-M2 ....................................................................................................... 29
FIGURA 4 LMA-M3 ....................................................................................................... 30
FIGURA 5 LMA-M4 ....................................................................................................... 30
FIGURA 6 LMA- M4-Eo ................................................................................................ 30
FIGURA 7 LMA- M5 ...................................................................................................... 31
FIGURA 8 - LMA- M6...................................................................................................... 32
FIGURA 9 - LMA- M7...................................................................................................... 32
FIGURA 10 - LLA-1 ......................................................................................................... 34
FIGURA 11- LLA-2 .......................................................................................................... 34
FIGURA 12 - LLA-3 ......................................................................................................... 34
FIGURA 13 – Leucemia Aguda Bifenotípica ................................................................... 36
FIGURA 14 – Coloração de mieloperoxidase ................................................................... 38
FIGURA 15 – Coloração de Sudan Black ......................................................................... 40
FIGURA 16 – Coloração de PAS(padrão difuso).............................................................. 40
FIGURA 17 - Coloração de esterase ................................................................................. 40
FIGURA 18 - Acordo intraobservador A de seis categorias, usando a análise morfológica
no primeiro tempo t1. ......................................................................................................... 61
FIGURA 19 -Acordo intraobservador A de seis categorias, usando a análise morfológica
no primeiro tempo t2. .......................................................................................................... 62
FIGURA 20 - Acordo intraobservador A de seis categorias, usando a análise morfológica
no primeiro tempo t3 (morfologia e citoquímica) ............................................................... 62
FIGURA 21- Acordo intraobservador B de seis categorias, usando a análise morfológica
no primeiro tempo t1 ........................................................................................................... 62
XVII
FIGURA 22 -Acordo intraobservador B de seis categorias, usando a análise morfológica
no primeiro tempo t2 ......................................................................................................... 63
FIGURA 23 - Acordo intraobservador B de seis categorias, usando a análise morfológica
no primeiro tempo t3 (Morfologia E Citoquímica) ............................................................. 63
XVIII
LISTA DE TABELAS
TABELA 1: Perfil citoquímico das leucemias agudas quanto a linhagem ...................... 37
TABELA 2: Perfil imunofenotípico das leucemias mieloides agudas ............................ 42
TABELA 3: Perfil imunofenotípico das leucemias linfoides agudas .............................. 43
TABELA 4: Reagentes usados nas colorações citoquímicas .......................................... 51
TABELA 5: Perfil epidemiológico das leucemias agudas .............................................. 57
TABELA 6: Achados clínicos das leucemias agudas .............................................. 58
TABELA 7: Concordância intraobservador A dos casos de leucemias agudas
selecionados no Serviço de Hematologia/UFTM de agosto de 2009 à fevereiro de 2013 .59
TABELA 8: Concordância intraobservador B dos casos de leucemias agudas selecionados
no Serviço de Hematologia/UFTM de agosto de 2009 à fevereiro de 2013....................... 60
TABELA 9: Concordância interbservador dos casos de leucemias agudas selecionados
no Serviço de Hematologia/UFTM de agosto de 2009 à fevereiro de 2013....................... 60
XIX
LISTA DE ABREVIATURAS, SIGLAS E SÍMBOLOS
LMA: Leucemia mieloide aguda
LLA: Leucemia linfoide aguda
BAL: Leucemia aguda bifenotípica
PAS: Ácido Periódico de Shiff
SBB: Sudan Black M
MPO: Mieoperoxidase
FAB: Franco Americano Britânico
WHO: World Health Organization Classification of Tumores
LMA-M0: Leucemia mieloblástica minimamente diferenciada
LMA-M1: Leucemia mieloblástica sem maturação
LMA-M2: Leucemia mieloblástica com maturação
LMA-M3: Leucemia promielocítica aguda
LMA-M3v: Leucemia promielocítica aguda (variante microgranular)
LMA-M4: Leucemia mielomonocítica
LMA-M4 Eo: Leucemia mielomonocítica com eosinófilos anormais
LMA- M5a: Leucemia monocítica aguda pouco diferenciada
LMA-M5b: Leucemia monocítica diferenciada
LMA-M6: Eritroleucemia aguda
LMA-M7:Leucemia megacarioblástica aguda
OMS: Organização Mundial de Saúde
NSE: Esterase não específica
A-EST: α-Naftil Acetato Esteras
PMTs: Fotomultiplicadores
NL: Não linfoide
L: Linfoide
XX
RESUMO
XXI
RESUMO
Introdução e objetivo: As leucemias agudas são doenças clonais do tecido hematopóetico,
caracterizadas pela proliferação de células imaturas na medula óssea. A adequada
caracterização dos tipos linfoides e mieloide é de fundamental importância para um
diagnóstico preciso. Embora apresentem limitações, a morfologia e as reações citoquímicas são
úteis de baixo custo e contribuem para o diagnóstico diferencial entre as linhagens linfoide e
mieloide, imprescindível para o planejamento terapêutico e prognóstico. O objetivo deste
trabalho foi verificar a reprodutibilidade intra e interobservacional citológica e citoquímica
frente à imunofenotípica no diagnóstico das leucemias agudas em um Hospital Universitário.
Materiais e métodos: Foram analisadas amostras de 70 portadores de leucemias agudas, com
idade entre 2 e 93 anos, usando critérios morfológicos, citoquímicos e imunofenotípicos
atendidos no Serviço de Hematologia/Hemoterapia da Universidade Federal do Triângulo
Mineiro, entre agosto de 2009 a fevereiro de 2013.
A reprodutibilidade intra e interobservador foi realizada por dois hematologistas
separadamente, sem conhecimento de informações clínicas. Foram realizadas análise
morfológicas nos tempos t1 e t2 com intervalo de duas semanas e posteriormente uma terceira
análise associada à citoquímica t3. Os resultados foram confrontados com a imunofenotipagem.
Para análise da reprodutibilidade intraobservador e interobservador das linhagens linfoide e
não linfoide foi utilizado o teste de kappa e para os subtipos apenas a análise descritiva.
Resultados: A concordância por linhagem (linfoide e não linfoide) intraobservador A foi de
94,37% no tempo t1, 91,43% no t2 e 88,57% t3 quando foi incluído a citoquímica com kappa
médio de 0,80 (variação de 0,77 a 0,88). A concordância intraobservador B foi de 90% e 81,43
nos tempos (t1 e t2) e 91,43% t3 quando incluído a citoquímica, com kappa médio de 0,74
(variação 0,62 a 0,82). A reprodutibilidade interobservador A e B mostraram concordantes em
88,57 % e 81,43% nos tempos (t1 e t2) respectivamente com coeficiente de kappa de 0,70 e
0,62 respectivamente. Quando associado a citoquímica, a concordância foi de 87,14 % com
coeficiente kappa de 0,82.
XXII
Conclusão: A concordância substancial entre os achados morfológicos e citoquímicos frente à
imunofenotipagem e a identificação de mais de 80% na diferenciação entre as linhagens
linfoides e mieloide agudas, neste estudo evidenciaram a importância da morfologia e da
citoquímica, se não para o diagnóstico definitivo, pelo menos, seguramente, como medida de
triagem e orientação na escolha dos anticorpos a serem empregados na imunofenotipagem.
Fica claro, portanto, que cada metodologia apresenta suas contribuições e limitações,
entretanto acreditamos que estas reações podem ser utilizadas como métodos de primeira linha
em conjunto com imunofenotipagem, citogenética e estudos moleculares, viabilizando o
diagnóstico, a terapêutica e o prognóstico, consolidando a importância da morfologia e
citoquímica de grande valia na diferenciação das leucemias agudas de linhagem linfoide e não
linfoides.
Palavras-chave: Leucemia; diagnóstico; morfologia; citoquímica; imunofenotipagem
XXIII
INTRODUÇÃO
XXIV
25
1. INTRODUÇÃO
Velpeau em 1827 relatou o primeiro caso de leucemia em uma florista de 63
anos com quadro clínico de febre, de esplenomegalia e de hepatomegalia, que no sangue
apresentava características diferentes, assemelhando-se em consistência e cor à levedura
do vinho tinto (SCHUMACHER et al, 2002).
Bennett em 1845 descreveu casos de pacientes que foram a óbito e
apresentavam aumento do baço e sangue alterado. Virchow em 1856 criou o termo
leucemia para descrever o aumento de glóbulos brancos em pacientes com estas
síndromes. (SCHUMACHER et al, 2002).
Ehrlich em 1877 desenvolveu uma coloração citológica que permitiu a distinção
de glóbulos brancos normais e anormais. Ebstein em 1889 obeservou que as leucemias
expressavam
progressões
diferenciadas
com
evoluções
rapidamente
fatais,
denominando-as leucemias agudas. Naegel em 1900 confirmou a obsevação de Ehrlich,
caracterizando o mieloblasto e dividindo a leucemia em mieloide e linfoide
(SCHUMACHER et al, 2002).
A leucemia é a uma neoplasia de células hematopoéticas da medula óssea que,
na maioria dos casos, extravasam para o sangue periférico, podendo infiltrar o fígado, o
baço, os linfonodos e outros órgãos, com predileção por tecidos mais vascularizados
(HAMERSCHLAK, 2005; LORENZI, 2005; LIESNER et al, 1997).
Geralmente estão associadas a fatores ambientais que atuam sobre indivíduos
com maior suscetibilidade (CONKRITE et al, 1987). As radiações, a exposição ao
benzeno, as substâncias tóxicas, as infecções principalmente virais, as condições sócio–
econômicas são consideradas fatores carcinogênicos. As alterações hereditárias e as
influências do meio ambiente, podem também criar condições predisponentes para o
desenvolvimento das leucemias (OLIVEIRA e NETO, 2004 a; LORENZI, 2005;
SILVEIRA et al, 2008).
A hematopoiese é controlada por genes estimuladores e inibidores em constante
equilíbrio. Em determinadas situações pode haver a ruptura deste equilíbrio
ocasionando duas rotas mutacionais que levam ao descontrole do crescimento das
células hematopoiéticas: na primeira o gene está hiperativo e na segunda o gene
supressor está inativo (VIDEIRA et al, 2002).
26
Os fatores carcinogênicos podem causar lesões nos cromossomos, como
quebras, translocações, inversões ou perdas e muitas vezes alterações na sequência de
aminoácidos, com perda do código genético normal. Consequentemente os genes
apresentarão suas funções modificadas, promovendo crescimento celular anormal e
dando origem às leucemias (OLIVEIRA e NETO, 2004 b; LORENZI, 2005).
Elas são classificadas quanto ao tipo celular em mieloide e/ou linfoide e ao
tempo de evolução em agudas e crônicas. Acometem crianças e adultos e são de
progressões rápidas com predomínio de células imaturas, constituindo 20% ou mais da
celularidade
medular
no
diagnóstico,
ocasionando
anemia,
neutropenia
e
trombocitopenia (SILVA et al, 2006; LORENZI, 2005).
As leucemias agudas são classificadas em mieloides (LMA), linfoides (LLA) e
bifenotípicas (BAL) (SILVA et al , 2006). A morfologia e citoquímica (Ácido Periódico
de Shiff (PAS), Sudan Black (SBB), mieloperoxidase (MPO), esterase inespecífica e
específica) do sangue periférico e medula óssea foram a base da classificação FAB
(Franco Americano Britânico) em 1976, que reconheceu três tipos linfoides (L1,L2 e
L3), e seis mieloides (M1 a M6) (BENNETTE et al, 1976, 1985, 1991; KRAUSE,
2000).
Com o surgimento da imunofenotipagem, a classificação FAB foi revisada em
1985, incluindo os subtipos M0 e M7, até então não identificáveis (SILVA et al, 2006).
Em 1986 e 1988 surgiu uma nova classificação denominada MIC (Morfologic,
Immunologic e Cytogenetic), ressaltando as correlações morfológicas, imunológicas e
citogenéticas, com grande valor clínico-prognóstico. (VAN DEN BERGHE, 1988;
CATOVISK et al, 1991).
Posteriormente, buscando maior uniformidade no diagnóstico e classificação, a
WHO (World Health Organization Classification of Tumores) publicou em 2001 uma
nova classificação (JAFFE et al 2001) que baseava em critérios morfológicos e na
fundamentação biológica, incluindo a genética molecular, em especial informações
clínicas (PAES et al,2002).
27
1.1 Leucemia Mieloide Aguda
A leucemia mieloide aguda (LMA) é uma doença clonal do tecido
hematopoiético que se caracteriza pela proliferação anormal de células progenitoras de
linhagem mieloide (LOWENBERG et al, 1999; LIESNER et al, 1997).
As manifestações clínicas decorrem da proliferação neoplásica de blastos na
medula óssea, ocasionando anemia, neutropenia e trombocitopenia (SILVA et al, 2006).
A maioria dos pacientes mostram-se sintomáticos ao diagnóstico. Em geral apresentam
anemia normocítica normocrômica, as plaquetas e hemoglobina geralmente são baixas e
a contagem de leucócitos pode variar de < 1000/µl á 200.000/µl (SILVA et al, 2006).
Ocorrem na infância, na adolescência, nos adultos e nos idosos. Sua incidência
varia de 1/150.000 na adolescência, 1/100.000 entre 30 e 40 anos e aos 70 chega a
1/10.000 (HAMERSCHLAK, 2005; LOWENBERG, 1999). O processo neoplásico pode
ocorrer nas linhagens: eritrocítica, granulocítica, monocítica e megacariocítica. Nesta
leucemia o bloqueio maturativo das células se dá em diferentes etapas, permitindo a
classificação em subtipos (LIESNER et al, 1997; HAMERSCHLAK, 2005; OLIVEIRA
e NETO, 2004 b).
Estas leucemias são classificadas em 8 subtipos, cada qual com características
peculiares, conforme grau de maturação.
A seguir são descritos os diferentes tipos de leucemias mieloides agudas:
 LMA-M0 - Leucemia indiferenciada - blastos indiferenciados, cromatina frouxa
e nucléolo evidente, citoplasma agranular, sem bastonete de Auer; sua morfologia é
similar aos blastos linfoides L2. Citoquímica e marcadores imunológicos linfoides são
negativos. O estudo imunofenotípico é positivo para CD13, CD33 e/ou CD11b. A
mieloperoxidase (MPO) por método imunológico e quimioluminescência é positiva
(BENNETT et al, 1976, BENNETT et al, 1981; OLIVEIRA e NETO, 2004b;
OLIVEIRA e NETO, 2004c; KRAUSE, 2000; SILVA et al, 2008).
28
Figura 1: Distensão de medula óssea, Leucemia Mieloide Aguda -M0.
Fonte: VIVAS, 2008.
 LMA-M1- Leucemia minimamente diferenciada - Os blastos são pouco
diferenciados, cromatina frouxa e nucléolos proeminentes, os bastonetes de Auer são
frequentes; menos de 10% amadurecem até ou além da fase de promielócitos; a
mieloperoxidase e Sudan Black B são positivos em mais de 3% dos blastos.
Apresentam positividade para HLA-DR, CD13, CD33, CD34 (BENNETT et al, 1976;
BENNETT et al, 1981; KRAUSE, 2000; ABDUL-HAMIDE, SILVA et al, 2008).
Figura 2: Distensão de medula óssea, Leucemia Mieloide Aguda –M1
Fonte: Pathology outline.com.br
 LMA-M2 - Os blastos são de tamanhos variados, cromatina frouxa, relação
núcleo citoplasma variada com grande quantidade de grânulos azurófilos, os bastonetes
29
de Auer são frequentes; a diferenciação pode ir até promielócitos; existem até 20% de
células monocitoides; amieloperoxidase e o Sudan Black são fortemente positivos; a
reação de cloroacetatoesterase é positiva. Os marcadores HLA-DR, CD13, CD33 e
CD34 são positivos, o CD15 é positivo ou negativo (BENNETT et al, 1976; BENNETT
et al, 1981; KRAUSE, 2000; OLIVEIRA e NETO 2004c; SILVA et al, 2006).
Figura 3: Distensão de medula óssea, Leucemia Mieloide Aguda – M2.
Fonte: o próprio autor
 LMA-M3 - Leucemia Aguda Promielocítica - Os blastos apresentam núcleo
excêntrico, reniforme ou bilobulado, citoplasma basofílico com intensa granulação e
numerosos bastonetes de Auer. Na variante hipogranular, o núcleo é volumoso e o
citoplasma possui uma granulação escassa; este subtipo é confirmado quando mais de
50% das células blásticas são hipogranulares. As reações de mieloperoxidase e Sudan
Black B são fortemente positivas; a relação FSC/SSC no estudo imunofenotípico é alta;
os CD13 e CD33 são positivos (BENNETT et al, 1976; BENNETT et al, 1981;
KRAUSE, 2000; SILVA et al, 2006, LORENZI, 2005; BASI e REGO, 2012).
30
 LMA-M4 - Leucemia mielomonocítica - Os componentes granulocíticos e
monocíticos estão presentes e pelo menos 20% dos blastos são precursores de
monócitos que predominam no sangue periférico e os bastonetes de Auer podem estar
presentes. A variante M4 – Eo (eosinofílica) apresenta proliferação de eosinófilos em
vários estágios de maturação, constituindo 5 a 30% das células medulares; a reações de
mieloperoxidase e Sudan Black são positivas para a linhagem granulocítica, a esterase é
positiva para os componentes butirato e cloroacetato. Os CD13, CD33, CD14, CD15 e
CD11b geralmente são positivos e também pode ocorrer expressão anômala do antígeno
linfoide CD2 (BENNETT et al, 1976; BENNETT et al, 1981; KRAUSE, 2000;
MARTINS e FALCÃO, 2000).
.
Figura 5: Distensão de medula óssea,
Leucemia Mieloide Aguda M4
Figura 6: Distensão de medula óssea,
Leucemia Mieloide Aguda M4 - Eo
Fonte:VIVAS, 2008
31
 LMA-M5-Leucemia monocítica - as células leucêmicas são predominantemente
monoblastos (M5a) ou promonócitos (M5b); na M5a as células são grandes, o
citoplasma é intensamente basofílico com finos grânulos azurófilos; o núcleo é redondo,
com cromatina frouxa e nucléolos proeminentes; na M5b o núcleo é convoluto e
irregular; o citoplasma é menos basofílico, podendo apresentar grânulos e vacúolos; A
reação de esterase dupla somente é positiva para o componente butirato inibida pelo
fluoreto. Os CD33, CD14 e CD15 são positivos, podendo ocorrer a expressão fraca de
CD4 (BENNETT et al, 1976; KRAUSE, 2000; OLIVEIRA e NETO, 2004a; SILVA et
al, 2006).
Fonte: www.pathologyoutlines.com

LMA-M6 Leucemia eritrocítica - Caracteriza-se por mais de 50% de
eritroblastos com características morfológicas bizarras, de tamanhos grandes,
multilobular ou multinucleados e mais de 30 % de mieloblastos tipo I (agranular) e tipo
II (grânulos azurófilos). Outras características são: fragmentação, corpos de Howell
Jolly, sideroblastos em anel, alterações megalobláticas e deseritropoese são comuns
(PARK et al, 2002; ABDUL-HAMID,2011). As reações citoquímicas são as usuais para
LMA e os mieloblastos podem apresentar bastonetes de Auer. O PAS pode ser
difusamente positivo ou positivo em bloco. O CD13, CD33, glicoforina A, CD34,
32
CD117 e HLA-DR são positivos (LUSIS, 2000; KRAUSE, 2000; PARK et al 2002;
SILVA et al, 2006).
Figura 8: Distensão de medula óssea, Leucemia Mieloide aguda - M6.

LMA-M7 - Leucemia megacariocítica - Morfologia variada desde blastos L1 até
muito grandes, indiferenciados, com citoplasma abundante e projeções citoplasmáticas.
As reações citoquímicas são geralmente negativas e os antígenos CD41 e CD42 são
frequentemente positivos; (BENNETT et al, 1976; BENNETT et al, 1981; KRAUSE,
2000; MARTINS e FALCÃO, 2000; SILVA et al, 2006; FARIAS e BIERMANN, 2007).
Figura 9: Distensão de medula óssea, Leucemia Mieloide Aguda - M7.
33
1.2 Leucemias Linfoide Aguda
É uma proliferação das células linfoides indiferenciadas na medula óssea, timo e
tecidos linfoides, com predomínio da linhagem B em 85% dos casos (BÉNÉ et al, 1995;
FARIAS e CASTRO, 2004). Aproximadamente 70% destas leucemias ocorrem na
infância, entre dois a quatro anos, diminuindo na adolescência, nos adultos jovens e
aumentando a partir dos 40 anos, predominante no sexo masculino de cor branca
(EMERECIANO et al, 2004; OLIVEIRA et al, 2004).
O diagnóstico e classificação são realizados de acordo com as características
citológicas, citoquímicas, fenotípicas e cariotípicas (EMERECIANO et al, 2004;
FARIAS e CASTRO, 2004).
O hemograma geralmente revela anemia, neutropenia e trombocitopenia. A
contagem de leucócitos encontra-se habitualmente elevada com nítido predomíneo de
blastos. A medula óssea apresenta-se com infiltração maciça de linfoblastos e intensa
hipoplasia eritrocítica, granulocítica e megacariocítica (FARIAS e CASTRO, 2004)
O grupo FAB distinguiu os subtipos de LLA em L1, L2, L3 (Figuras 10, 11, 12).
A identificação da L3 tem maior importância devido ao seu pior prognóstico
(LOFFLER et al, 1994).
Na L1 predominam blastos pequenos, homogêneos, cromatina condensada,
nucléolo visível ou pouco evidente, citoplasma moderadamente basofílico e raros
vacúolos (Figura 10). Na L2 os blastos são maiores e heterogêneos, o núcleo é irregular
com um ou mais nucléolos grandes e proeminentes, a relação núcleo-citoplasma é
variável, podendo apresentar clivagem, dobras ou indentações, cromatina variável e o
citoplasma é abundante e basofílico (Figura 11). O subtipo L3 predominam células
grandes, núcleo regular, nucléolos proeminentes e cromatina nuclear fina, o citoplasma
é abundante, vacuolizado e com intensa basofilia (Figura 12) (BENNETT et al,1976,
1981; ARROYO, et al, 1983, FARIAS e BIERMANN, 2007).
34
Figura 10: Distensão de medula,
Linfoide Aguda – L1.
Leucemia
Aguda – L3.
Linfoide Aguda – L2.
Leucemia
Leucemia Linfoide
Fonte:www.pathologyoutline.com.br
Os linfoblastos geralmente apresentam reação citoquímica de PAS fortemente
positiva, com evidente coloração granular em forma de anéis concêntricos, unipolar ou
em blocos. Esta reação é mais frequentemente negativa em LLA -T do que na LLA -B
(OLIVEIRA et al, 2004; FARIAS e CASTRO, 2004).
Quanto à imunofenotipagem, 80% dos casos expressam marcadores de células B
e 15% a 20% T.
35
O tipo B é classificado em: pró-B, pré-B e B maduro. Na LLA pró-B, as células
expressam HLA-DR Terminal Desoxinucleotidil Transferase (TdT), CD34 , CD19 e
CD22. A LLA do tipo comum (Calla) expressa CD10, CD22, CD19, e/ou CD20
(OLIVEIRA et al, 2004; LORENZI, 2005).
A pré-B expressa cadeia μ citoplasmática, CD19, CD20, e CD10 positivos.. O
tipo B-maduro apresenta CD19, CD20, CD22 e CD24 intensamente positivos,
expressão de cadeias leves de imunoglobulina na superfície da membrana (SmIg), que
confirma o diagnóstico e o pior prognóstico (BENNETT et al, 1976, 1981; OLIVEIRA
et al, 2004; FARIAS e CASTRO, 2004; FARIAS e BIERMANN, 2007).
As LLAs T são classificadas em: pré-T, T - intermediária e T - maduro. Na pré-T
expressam CD3 no citoplasma, CD7, CD2, CD5 e TdT. O tipo T intermediário é
fortemente positivo para CD3c, CD2, CD1a, podendo co–expressar CD4 e CD8. A LLA
T maduro expressa CD2, CD5, CD7, CD3 e duplamente positiva para CD4 e CD8
(FARIAS e CASTRO, 2004).
1.3 Leucemia Aguda Bifenotípica/Híbrida
Representa aproximadamente 7% das leucemias agudas, podendo ser de novo ou
secundária a terapias citotóxicas (BATINIC et al, 2008).
A clínica não difere das demais leucemias agudas, acomete em indivíduos nas
diferentes faixas etárias, com maior incidência em adultos (BATINIC et al, 2008;
KILLICK et al, 1999) .
Caracteriza-se por dupla população ou a co-expressão de marcadores linfoides e
mieloides simultaneamente. A morfologia não fornece dados consistentes, podendo
apresentar características tipicamente mieloide, como grânulos azurófilos e bastonetes
de Auer sendo comum os subtipos M1 e M5, concomitante a linfoblatos indiferenciados
(KILLIKC et al, 1999, KILLICK et al, 2002; BATINIC et al, 2008; ZHAO et al, 2010).
O
diagnóstico
definitivo
é
possível
somente
através
de
estudos
imunofenotípicos, citogenéticos e moleculares. (KILLIKC et al, 1999).
O PAS é negativo para a linhagem linfoide aguda com marcador mieloide. A
mieloperoxidase é negativa ou positiva em menos de três por cento dos blastos, onde
poucos destes apresentam Sudam Black positivo para leucemia linfoide com marcador
mieloide (ORNELLAS, 2002; SOUZA, 2006; YAMAMOTO, 2000c).
36
A partir de 2008, a OMS definiu uma nova classificação para leucemias
bifenotípicas, categorizando-as como "leucemias de linhagem ambígua (BENÉ et al,
2012; WEIER et al, 2007; BATINIC et al, 2008; NAGHASHPOUR et al, 2010).
Os principais marcadores da OMS 2008 são a mieloperoxidase, CD19 e CD3,
sendo necessário um amplo painel para confirmação da co–expressão de marcadores
específicos de linhagem ambígua ou dupla população (KILLIKC et al, 1999, KILLICK
et al, 2002; BATINIC et al, 2008; BENÉ et al, 2012)).
O estudo citogenético e
molecular definem a leucemia ambígua pela presença da t(9;22) envolvendo o gene
BCR-ABL e alterações no gene MLL (NAGHASHPOUR et al 2010; BENÉ et al, 1995;
BENÉ et al, 2012; ZHAO et al 2010).
Figura 13: Distensão de medula, Leucemia Aguda Bifenotípica
1.4 Diagnóstico
1.4.1 Morfologia e Citoquímica
A Citologia, denominada na atualidade de Biologia Celular é um dos ramos das
ciências naturais. Sua história está intimamente relacionada com o desenvolvimento das
lentes ópticas e à combinação destas para construir o microscópio composto (do grego
mikros, pequeno; skopein, ato de ver, examinar).
37
Atanásio Kircher em (1601-1680) foi o primeiro a usar a palavra microscopium.
Muitos denotam a descoberta do microscópio a Galileu, mas a história relata que foi
Antonie van Leeuwenhoenk em 1632 que aperfeiçoou o instrumento observando as
primeiras células animais que são: os glóbulos vermelhos do sangue e constatando
também a existência dos espermatozóides (BEHE, 1996).
Robert Hooke, em 1665 fez a observação da primeira célula, descreveu o
microscópio e a descoberta sobre a circulação nos peixes.
Schwann e Matthias Jakob Schleiden em 1839 propuseram que todos os seres
vivos eram formados de células e estas eram os blocos básicos construtores da vida.
Rudolf Virchow, dando continuidade aos trabalhos de Schwann e Matthias, postulou que
todas as células eram geradas por células pré-existentes. A teoria celular clássica foi
aceita em 1858(BEHE, 1996).
Anteriormente ao que havia sido proposto por Schwann, Schleiden e Virchow, a
teoria celular moderna postulou que além de serem unidades estruturais, as células eram
também unidades de reprodução, hereditariedade e função. Todas possuem a mesma
composição química (BEHE, 1996).
Em 1891, Ehrlich descreveu técnicas de coloração das células no sangue
periférico, com intuito de classificar as leucemias. Posteriormente foram desenvolvidas
técnicas de coloração baseadas na composição química destas células, propiciando a
distinção de diferentes linhagens (PAS, Sudan Black, peroxidase, fosfatase ácida e
esterases (HONRUBIA, 2001). ( Ver Tabela 1).
Nos anos 20 foram utilizadas em amostras da medula óssea, nascendo a
citoquímica, permitindo que suas composições químicas celulares específicas fossem
evidenciadas sem alterar suas características morfológicas ( HONRUBIA, 2001).
Tabela 1: Perfil citoquímico das leucemias agudas quanto à linhagem
COLORAÇÕES
LMA
LLA
PAS
-
+
Peroxidase
+
-
Sudan Black
+
-
Fosfatase ácida
-
+
Alfa-naftil-esterase
- ou + (CD34)
-
Fonte: Adaptado de Teixeira. (2004).
38
As citoquímicas que representam importância no diagnóstico das leucemias
agudas são: mieloperoxidase (MPO), Sudan Black (SBB), reação de Ácido Periódico de
Schif (PAS), esterases não específicas (NSE) (α natal acetato esterase , α- naftil butirato
esterase) e específica α-naftil AS-D cloroacetato esterase.
A mieloperoxidase é específica da linhagem mieloide, localiza-se em grânulos
azurófilos primários de neutrófilos e monócitos (BELL et al, 1981; SCOTT et al 1993).
As células granulocíticas expressam positividade crescente conforme maturação,
enquanto as monocíticas expressam granulações menos intensas, apresentando grânulos
finos, dispersos por toda célula. Pode também ser positiva em grânulos específicos de
eosinófilos e basófilos (NAUSEEF et al, 1988; MATSUO et al, 2003). Os blastos da
linhagem mieloide demonstram atividade em áreas como retículo endoplasmático e
região de Golgi (BELL et al, 1981).
A MPO promove a clivagem do peróxido de hidrogênio liberando oxigênio, que
reage com a benzidina, formando um composto de cor castanho esverdeado (Figura 14)
(BELL et al, 1981). Esta reação é útil na diferenciação entre leucemias mieloide e
linfoide aguda que frequentemente acompanha o Sudan. BELL et al, 1981 (NAUSEEF
et al, 1988) OLIVEIRA e NETO, 2004 a; OLIVEIRA e NETO, 2004 c).
Figura 14: Distensão de medula óssea, reação de mieloperoxidase
39
O Sudan Black (Figura 15) cora lipídios, gorduras neutras, fosfolipídios e
ésteres. É específico para células mieloides, geralmente acompanha a MPO.
(KLOBUSICKÁ, 1994; SCHUMACHER et al 2002). A partir dos promielócitos a
coloração é fortemente positiva, aumentando com a maturação (OLIVEIRA e NETO,
2004 a; OLIVEIRA e NETO, 2004 c).
Figura 15: Distensão de medula óssea, reação de sudan black B
O PAS (Figura 16) é importante na citoquímica de carboidratos, o ácido
periódico oxida compostos com grupos hidroxilas livres vicinais que combinam com o
reativo de Schiff obtendo a coloração rósea. Os mieloblastos possuem pouco glicogênio,
aumentando seu teor a partir do promielócito e consequentemente sua positividade,
evidenciando um padrão difuso em todo o citoplasma. Esta reação é intensamente
positiva de 40 – 70% das LLAs, com formação de anéis, unipolar ou blocos (PEREZ
CHACÓN et al, 1998; ; SCHUMACHER et al, 2002; OLIVEIRA e NETO, 2004 a;
OLIVEIRA e NETO, 2004c).
40
Figura 16: Distensão de medula óssea, reação de PAS positiva (granular)
As esterases (Figura 17) são enzimas que hidrolisam ligações éster de álcoois,
fenóis e naftóis. As reações positivas podem ser encontradas na linhagem granulocítica,
nos promonócitos e nos monócitos maduros. As esterases não específicas são usadas
para identificar células de origem monocitica, sendo inibida pelo fluoreto de sódio (LI et
al, 1973; UPHOFF et al, 2000). A reação é fortemente positiva nos monócitos, negativa
em monoblastos e fracamente positiva ou negativa nos granulócitos (UPHOFF et al,
2000; OLIVEIRA e NETO, 2004 a; OLIVEIRA e NETO, 2004 b).
Figura 18: Distensão de medula óssea, reação de Esterase positiva
Fonte: www.pathologyoutline.com.br
41
1.4.2 Imunofenotipagem
Moldavan em 1934 desenvolveu o primeiro contador automático com um capilar
sob um microscópio dotado de um detector fotoelétrico de células. Crosland e Taylor
em 1953 desenvolveram uma câmara de fluxo que permitia a passagem das células no
centro da mesma, caracterizando importante avanço para o desenvolvimento da
citometria de fluxo (BERTHO, 2004).
Katmentsky em 1965 aprimorou a citometria de fluxo, fazendo o uso de
espectrofotometria (luz absorvida) na quantificação de DNA e o uso da medida
multiparamétrica de luz dispersada (BERTHO, 2004).
Os citômetros foram descritos por Van Dila em 1967-69, usando a câmara
descrita por Crosland e Taylor. Desde então várias técnicas foram desenvolvidas no
aprimoramento da citometria de fluxo (MARTINS e FALCÃO, 2000; BERTHO, 2004;
OLIVEIRA R. A. G, 2004).
Os citômetros consistem no emprego de radiação a laser, do fluxo
hidrodinâmico, da ótica, das substâncias fluorescentes e dos recursos de informática que
permitem determinação das características estruturais e funcionais das células
(MARTINS e FALCÃO, 2000; BERTHO, 2004).
O princípio baseia-se na aspiração de células ou partículas de uma suspensão
que passam por uma câmara especial (flow cell) e ficam centralizadas num fluxo
contínuo de líquido (sheath fluid), saindo continuamente uma atrás da outra, onde uma
única célula seja interceptada pelo laser ocorrendo dois tipos de fenômenos físicos que
registram informações específicas das células (BERTHO, 2004).
Ao ser interceptada pelo laser, uma parte da luz é espalhada (scatter) de acordo
com as características morfológicas e estruturais das células. O forwad sacatter (FS) se
relaciona com o tamanho e o side sacatter (SS) com a granularidade da célula ou
partícula (MARTINS e FALCÃO, 2000; BERTHO, 2004; OLIVEIRA et al, 2004).
Em um segundo momento as células coradas com fluorocromos, excitadas pelo
laser, emitem luz compatíveis com seus aspectos bioquímicos, biofísicos e moleculares
(MARTINS e FALCÃO, 2000; BERTHO,2004).
A luz dispersa capitada por lentes é enviada para os tubos fotomultiplicadores
(PMTs), convertendo o sinal luminoso em pulsos elétricos proporcionais à quantidade
42
de luz dispersada ou fluorescente, estes sinais posteriormente são selecionados por
filtros óticos, passando somente a luz de comprimento de onda desejado (MARTINS e
FALCÃO, 2000; BERTHO, 2004).
Os sinais elétricos são amplificados e convertidos em sinais digitais enviados a
um computador, onde através de softwares específicos é realizada a análise de seis
parâmetros específicos como: tamanho celular (FS); granularidade interna das células;
fluorescência verde (FL1); fluorescência amarela (FL2); fluorescência laranja (FL3);
fluorescência vermelha (FL4); fluorescência roxa (FL5) (BERTHO, 2004). As
informações são armazenadas em formas de histogramas monoparamétricas (256 ou
1024 canais), biparamétricos (64X64) ou em List mode
Na hematologia a citometria de fluxo é realizada com o objetivo voltado para a
contagem celular, para a forma leucocitária, para a análise da medula óssea (BERTHO,
2004; OLIVEIRA et al, 2004), para as alterações de sínteses de linfócitos T e B, CD4+ e
CD8+, na seleção de doadores para transplante, para o monitoramento de transplantados
e imprescindível para a classificação das leucemias (Tabelas 3 e 4) através de
marcadores de superfícies específicos (BERTHO, 2004).
Tabela 2: Perfil imunofenotípico das Leucemias Mieloides Agudas
Marcadores
LMA-M0/M1/M2 LMA-M3
LMA-M4/
LMA-M6
LMA-M7
M5a/M5b
CD13/CD33
++
++
++
+
++
CD65
±/+/++
+
++
±
±
MPO
-/+/++
++
++
+
-
CD11c
- ou ±
-
++
-
-
CD14
-
-
+/+/++
-
-
CD15
±/±/++
±
-
-
-
CD36
-
-
+
++
+
Glicoforina A
-
-
-
+
-
CD41/CD61
-
-
-
-
++
CD42
-
-
-
-
+
CD34
++/++/+
±/+/±
±/+/±
+
++
43
Marcadores
LMA-M0/M1/M2 LMA-M3
LMA-M4/
LMA-M6
LMA-M7
M5a/M5b
CD117
++
+
+
+
-
HLA-DR
++/++/+
++
++
+
++
TdT
+
+
+
+
±
-: <10% das leucemias são positivas; ±: 10% - 25% das leucemias são positivas; +: 25 - 75% das
leucemias são positivas; ++: >75% das leucemias são positivas. Fonte: Silva et al (2006).
Tabela 3: Perfil imunofenotípico das Leucemias Mieloides Agudas
Linhagem B
Linhagem T
Marcador
Pró-B
Comum
Pré-B
B
Pré-T
Intermediário
T
HLA-DR
+
+
+
+
+/TdT
+
+
+
+/+
+
+
CD19
+
+
+
+
CD22(c)
-/+
+
+
+
CD10
+
+
-/+
-/+
-/+
+/CD20
-/+
+
+
Cµ
+
SmIg
+
CD7
+
+
+
CD2
+
+
CD3(c)
+/+
+
CD1a
+/CD3
+
CD4/CD8
+/+
TdT= Terminal desoxinucleotidil transferase; CD2(c)= CD22 intracitoplasmático; Cµ= cadeia µ
citoplasmática; SmIg= imunoglobulina de superfície; +: expressão do antígeno; +/-: expressão variável,
freqüentemente positiva; -: ausência de expressão do antígeno; -/+: expressão variável, freqüentemente
negativa. Farias et AL (6). Fonte: Silva et al (2006).
A imunofenotipagem é atualmente indispensável para o diagnóstico específico
dos diferentes subtipos de LMA, principalmente as M0, M7 e bifenotípicas (LUSIS,
2000; YAMAMOTO, 2000).
Nesta diferenciação de LMA os marcadores CD13 e CD33 são de grande
importância, principalmente nas leucemias indiferenciadas, o CD41, CD42 e CD61 são
marcadores megacariocíticos, o CD14 é específico para linhagem monocítica e o CD15
é expresso na maioria das leucemias M2 e M4 (BENÉ, 1999). A M3 pode co-expressar
os antígenos CD9 e CD68. A pesquisa de mieloperoxidase associada aos CD13/CD33
(mieloide), ao CD79 e/ou CD19 (células B), e ao CD3 com CD7 (células T) podem
identificar até 98% das leucemias agudas (SILVEIRA et al, 1998; REGO et al, 2009).
44
A imunofenotipagem é importante não apenas no diagnóstico, mas também para
o prognóstico, pois permite a identificação de leucemias de pior prognóstico como as
indiferenciadas e bifenotípicas (DREXLER et al, 1988; BENÉ et al, 1999; REGO et al
2009).
45
OBJETIVO
46
2. OBJETIVOS
2.1 Objetivos Gerais
Verificar a reprodutibilidade intra e interobservacional citológica e citoquímica frente
à imunofenotipagem para diagnóstico das leucemias agudas.
Realizar a análise da reprodutibilidade intra e interobservacional citológica, citoquímica
e imunofenotípica para diagnóstico das leucemias agudas.
2.2 Objetivos Específicos
1. Descrever o perfil clínico–epidemiológico e laboratorial dos pacientes com
leucemia aguda diagnosticada no Hospital de Clínicas da UFTM.
2. Verificar o perfil de concordância intraobservacional das análises citológicas (com
intervalo de 2 semanas: (Morfologia t1 e Morfologia t2) e morfologia/citoquímicas t3
com a imunofenotipagem considerando a linhagem;
3. Comparar o grau de concordância citológica, citoquímica entre observadores A e B
4.
Descrever o perfil dos subtipos segundo as análises citológicas (com intervalo de 2
semanas: Morfologia t1 e Morfologia t2), e morfologia/citoquímicas t3 e
imunofenotipagem,
47
JUSTIFICATIVA
48
3. JUSTIFICATIVA
O diagnóstico das doenças hematológicas tem evoluído de forma a trazer
grandes avanços na elucidação das leucemias agudas. A inclusão dos estudos
imunológicos, citogenéticos e moleculares tem se tornado cada vez mais acessível, no
entanto a morfologia e citoquímica, bases estas que direcionam para estes novos
recursos, tem sido subestimadas ou mesmo vistas de forma pouco peculiar. Assim,
acreditamos que a morfologia e a citoquímica ainda são métodos úteis, de baixo custo e
que podem contribuir substancialmente na diferenciação entre as linhagens linfoide e
mieloide, importantes para o diagnóstico, terapêutica e para o prognóstico destas
doenças.
49
MATERIAIS E MÉTODOS
50
4. MATERIAL E MÉTODOS
Foi realizado um estudo retrospectivo, prospectivo e observacional de 70 casos
de leucemias agudas atendidos no Serviço de Hematologia/Hemoterapia da
Universidade Federal do Triângulo Mineiro/UFTM. As análises citológicas e
citoquímicas foram realizadas por dois hematologistas em tempos distintos.
4.1 Aspectos éticos
O projeto de pesquisa foi aprovado pelo Comitê de Ética e Pesquisa (CEP) da
UFTM, conforme parecer aprovado em reunião do dia 27 de agosto de 2010, protocolo
1696. (Anexo II) e os casos retrospectivos aprovados pelo comitê de ética do Centro
Universitário de Araraquara, parecer 916/09 (AnexoIII).
4.2 Critérios de inclusão
Todos os casos de leucemia aguda de novo, independente do tipo morfológico,
gênero, idade e cor dos pacientes. Todos os participantes foram submetidos ao termo de
consentimento livre e esclarecido.
4.3 Critérios de exclusão
Os pacientes submetidos ao tratamento quimioterápico, com leucemia aguda
secundária e em recaída.
4.4 Amostra populacional
A amostra foi constituída de 70 pacientes de ambos os sexos com idade entre 0 a
99 anos, atendidos no Serviço de Hematologia da UFTM/Hemocentro Regional de
Uberaba, sendo que destes, 19 eram casos retrospectivos.
51
4.5 Coleta das Amostras
As amostras de sangue periférico foram coletadas em tubo vacutainer através da
punção venosa, por técnicos do laboratório, sendo realizados os esfregaços secos ao ar e
encaminhados para o setor técnico com a finalidade da realização das colorações de
leishaman e citoquímica.
As amostras de medula óssea foram coletadas por médicos hematologistas do
serviço de hematologia da UFTM. O procedimento da coleta foi realizado com o
paciente deitado ou sentado. A antissepsia foi realizada com álcool 70% no local
escolhido para coleta, sendo porção superior do esterno, ou crista ilíaca superior
posterior e ou face externa do terço superior da tíbia em crianças. Foi aplicado o
anestésico (lidocaína 2%) no local da coleta. A agulha para a coleta do mielograma foi
introduzida na pele até a perfuração do periósteo chegando à cavidade medular (menor
consistência ao tato), quando atingido este local foi colocado uma seringa na parte
posterior da agulha e foram aspirados de 0,5 a 1 mL do material para realização do
mielograma. Após o procedimento foi realizado curativo compressivo e confecção dos
esfregaços que foram secos ao ar imediatamente e encaminhados ao setor técnico, sendo
realizadas as colorações de citoquímicas e Leishman. Todo o procedimento de coleta foi
realizado com material descartável e esterilizado. Foi coletado ainda de 2 a 5 mL para
imunofenotipagem com/EDTA, encaminhados para o laboratório de apoio da UFTM.
4.6. Materiais e Preparo dos Reagentes
Tabela 4: Reagentes usados nas colorações citoquímicas
Coloração
Reagente
Peroxidase
Reagentes
Kit
Coloração
Coloração de Leishman
Sudan
Fixador
Vapor de formol 40% a 37º C
Regente
Solução estoque: Sudan Black B e metanol
Contra colaração
Safranina
52
Coloração
PAS
Fixador
Reagentes
Contra coloração
Esterase
Reagente
Reagente
Solução formol:metanol (1:9)
Ácido períodico 1%
Reatio de Shiff: Fuccina básica
Leishman e água destilada (1:9)
kit Alfa - Naphthyl Acetate (Non Specific Esterase) –
Sigma Aldrich
4.6.1 Miloperoxidase (MPO)
A mieloperoxidase foi realizada com o uso do kit DAB Líquido (DBS – Cód.
K047). O esfregaço foi fixado em álcool 70% por 10 minutos, seco ao ar e em seguida
coberto com o reagente de DAB diluído 1:1(DAB+ Tampão) por 7 minutos, depois foi
lavado em água deionizada, secado e contra corado com corante de leishman (a contra
coloração foi realizada cobrindo o esfregaço com 20 gotas do corante por 4 minutos,
foi acrescentada 20 gotas de água destilada e corada por 14 minutos), escorrido o
corante, foi lavado em água corrente e secado em posição vertical. (Diagnostic
Biosotems, Barcelona, 2009).
4.6.2 Coloração de Sudan Black (SBB)
A técnica de Sudan Black B foi realizada pela técnica de Sheehan-Storey
modificada, o esfregaço foi fixado em vapor de formol por 10 minutos e após evaporado
foi incubado em solução de sudan previamente filtrada por uma hora, lavado em água
corrente, secado ao ar e contracorado com safranina por 30 segundos.
4.6.3 Reação de Ácido Periódico de Schiff (PAS)
A técnica foi realizada fixando o esfregaço por imersão em solução de etanolformaldeído (9:1) por 10 minutos, lavado rapidamente em água corrente e mantido
imerso em ácido periódico a 1% por 10 minutos, na jarra de Coplin foi imerso a lâmina
em Reativo de Schiff por 30 minutos, lavado em água sulfurosa por 2 a 3 minutos e
53
após em água corrente por 5 a 10 minutos e deixado secar, sendo realizada a contra
coloração com hematoxilina por 10 minutos. A reação positiva é indicada por cor que
varia de púrpura a magenta brilhante, nos sítios onde se encontram os carboidratos
oxidáveis, seguindo os padrões de interpretação (BELL et al, 1981).
4.6.4 α-Naftil Acetato Esterase (A-EST)
A técnica foi realizada utilizando o kit Alfa - Naphthyl Acetate (Non Specific
Esterase) – Sigma Aldrich. O procedimento consistiu em fixar as lâminas em fixador de
citrato, acetona e metanol durante 1 minuto à temperatura ambiente (18–26°C), lavada
abundantemente com água desionizada e secada ao ar durante, pelo menos, 20 minutos,
foi identificado dois erlenmeyer como (A e B), em cada um foi adicionado 50 mL de
solução de tampão diluído TRIZMALTM 7,6 PRÉ-AQUECIDA A 37°C, mexido
constantemente, o conteúdo de 1 cápsula de sal RR de azul permanente, N.º de Catálogo
91-7, foi dissolvido no tampão e adicionado 2 mL de solução de α-naftil acetato, quando
a solução apresentou uma cor amarela e uma ligeira turvação continuou-se a
homogeneização durante 15 a 20 segundos e em um dos frascos foi adicionado 2 mL de
fluoreto de sódio (não foi filtrado), as amostras foram colocadas na solução de
coloração do passo anterior e incubadas a 37°C durante 30 minutos; NOTA:
PROTEGIDAS DA LUZ; as lâminas foram retiradas da solução de coloração, lavadas
em água deionizada durante 3 minutos eliminando a solução de coloração sendo
realizada a contra coloração com hematoxilina de Mayer. (SIGMA ALDRICH
CHEMIE. Procedimento 90: Alemanha, 2005).
4.7 Estudo do sangue periférico e medula óssea
O estudo citológico do sangue periférico e da medula óssea no tempo t1 foi
realizado por dois hematologistas a partir de esfregaços corados por Leishman sem o
conhecimento prévio dos dados clínico-epidemiológicos. O diagnóstico de leucemia
aguda foi confirmado pela presença de mais de 20% de blastos no sangue periférico
e/ou na medula. A análise morfológica foi utilizada para classificar em LMA (M1–M2–
M3–M4–M5–M6) e LLA (L1/ L2 e L3) e LA (leucemia aguda) para aqueles casos em
54
que apenas a morfologia não permitiu diferenciar a linhagem envolvida (mieloide o
linfoide). Após duas semanas os observadores realizaram um novo estudo citológico t2
leitura.
4.7.1 Estudo das reações citoquímicas
Em um terceiro momento no tempo t3 foi fornecido aos observadores, além da
citologia convencional, as reações citoquímicas.
Foram classificadas como LMA e LLA, de acordo com as reações citoquímicas,
quando 3% ou mais de blastos na medula óssea ou sangue periférico forem positivos
para estas reações, conforme critérios adotados pelo Grupo Franco Americano Britânico
(FAB) (LUSIS, 2000; MMARTINS e FALCÃO et al, 2000; do RÊGO, 2000. Para a
mieloperoxidase a positividade foi definida como presença de grânulos amarelos-pardo
presentes em 3% ou mais de blastos na medula óssea ou sangue periférico (PEFFAULT
DE LATOUR et al, 2003).
Para o PAS, a positividade foi definida como presença de grânulos grosseiros e
finos (cor púrpura ou magenta), representando padrão granular e/ou difuso em blastos
na medula óssea ou sangue periférico (FARIAS E CASTRO, 2004). Para Sudan Black a
positividade foi definida como presença de grânulos negros no citoplasma das células e
para a esterase inespecífica foi considerada positiva a presença de grânulos na cor
marrom no citoplasma das células.
4.7.2 Imunofenotipagem
Os resultados citológicos e citoquímicos nos tempos t1, t2 e t3 realizados pelos
dois observadores foram comparados aos perfis imunofenotípicos, considerados padrão
ouro.
55
4.7.3. Dados clínico-epidemiológicos
Os dados clínico-epidemiológicos dos pacientes foram obtidos através de
informações contidas nos prontuários, sendo analisadas as seguintes variáveis: gênero
(masculino e feminino), cor (branca e não branca), idade (0 a 9; 10 a 19; 20 a 29; 30 a
39; 40 a 49; 50 a 59; 60 a 69 e maiores de 70), presença ou ausência de anemia, febre,
hemorragia, infecção, adenomegalia e esplenomegalia, valor da hemoglobina, contagem
das plaquetas, número de leucócitos e neutrófilos, laudos de mielograma e
imunofenotipagem no diagnóstico inicial.
4.8 Análise dos dados
Foi utilizada a análise do grau de concordância entre os resultados dos achados
morfológicos e citoquímicos frente a imnofenotipagem obtidos pelo cálculo do
coeficiente kappa (k) (VIEIRA et al, 2005). Valores de k iguais ou superiores a 0,6
indicam que as metodologias avaliadas possuem boa e muito boa concordância. Para a
análise de associação dos subtipos entre os observadores foram excluídos 13 casos,
sendo seis de leucemias agudas indiferenciadas, três que não foram realizados por
imunofenotipagem
e
quatro,
cujos
subtipos
não
foram
identificados
pela
imunofenotipagem. A análise dos subtipos mieloides foi realizada apenas de forma
descritiva, devido ao pequeno número de amostras e quantidade de variáveis para
realização dos testes de concordância.
4.9 Normas utilizadas na confecção do manuscrito
Foram
consultadas
as
normas
técnicas ABNT-NBR14724:2011
e
as
recomendações disponibilizadas pelo Curso de Pós-Graduação em Ciências da Saúde da
Universidade Federal do Triângulo Mineiro.
56
RESULTADOS
57
5. RESULTADOS
5.1 Distribuições dos pacientes conforme gênero e idade
A idade dos 70 pacientes variou de dois a 93 anos, mediana de 35,5 com maior
ocorrência entre maiores de 20 anos, havendo predomínio de adultos (72,07%), do
gênero masculino (61,42 %) e de cor branca (62,85%). (Tabela 5).
Tabela 5: Perfil epidemiológico das
leucemias agudas entre agosto de 2009
a fevereiro de 2013.
FAIXA ETÁRIA
No.
%
0 -9
10-19
20-29
30-39
40-49
50-59
60-69
> 70
TOTAL
GÊNERO
Masculino
Feminino
COR
Não branca
Branca
16
12
5
5
8
9
7
8
70
(22,86)
(17,14)
(7,14)
(7,14)
(11,43)
(12,85)
(10,00)
(11,43)
100
43
27
(61,43)
(38,57)
44
26
(62,85)
(37,14)
5.2 Resultados dos achados clínicos
No diagnóstico, 67 (95,71%) apresentavam anemia, 52 (74,28%) febre, 21
(30,0%) infecção, 19 (27,1%) esplenomegalia, 15 (21,42%) adenomegalia e 16
(22,85%) hemorragia. Tabela 6.
58
Tabela 6: Achados clínicos das leucemias agudas,
entre agosto de 2009 a fevereiro de 2013.
Parâmetros
Anemia
Febre
Infecção
Adenomegalia
Esplenomegalia
Hemorragia
Pacientes (n=70)
No.
%
67
52
21
19
15
16
95,71
(74,28)
(30,00)
(27,1)
(21,42)
(22,85)
Em relação aos achados laboratoriais (tabela 7) dos 36 pacientes com leucemia
mieloide, a taxa de hemoglobina variou de 2.9 a 15.2 g/%, mediana de 7.7 g/%, a
contagem de leucócitos de 670 a 112.000/mm3, mediana de 20.500/mm3 e a contagem
de plaquetas de 6.000 a 150.000 com mediana de 20.500. A leucocitose foi observada
em 28/36 (77,77%), a leucopenia em 8/36 (22,22%), 36/36 (100%) apresentaram
plaquetopenia e 1/37 (2,77%) evidenciou a contagem dentro dos parâmetros normais.
Entre os 31 pacientes com leucemia linfoide aguda a taxa de hemoglobina variou
de 3.96 a 14.40 g/% com mediana de 8.2 g/%, a contagem de leucócitos de 1.000/mm3 a
200.000/mm3 mediana de 15.100/mm3 e as plaquetas de 6 mil/mm3 a 413 mil/mm3 com
mediana de 27 mil/mm3, 22/31 (70.96%) apresentaram leucocitose, 9/31 (29.03%)
leucopenia, a plaquetopenia foi observada em 26/31 (83,87), em 1/31 3,22%) a
contagem foi maior que 400.000, caracterizando trombocitemia e 4/31 (12,90%)
encontrava-se dentro dos valores de normalidade.
Quanto àqueles que apresentaram leucemia aguda do tipo bifenotípica, a taxa de
hemoglobina variou de 5.4 a 14.10 g/%, a contagem de leucócitos de 4.400/mm3 a
31.000/mm3 com mediana de 31.000/mm3, as plaquetas de 70 mil/mm3 a 269 mil/mm3
com mediana de 70 mil/mm3. A leucocitose esteve presente em 1/3 (33,33%) e a
plaquetopenia em 2/3 (66, 7%).
59
5.3 Resultados por linhagem
5.3.1 Concordância intraobservador A
Os resultados morfológicos (t1 e t2) por linhagem (NL e L) do observador A em
relação a imunofenotipagem apresentaram concordância no primeiro tempo de 94,37%,
com coeficiente kappa de 0,88 e no segundo tempo a concordância foi de 91,43%,
apresentando coeficiente kappa de 0,77. Associando a morfologia e a citoquímica o grau
de concordância foi de 88,57% e valor do coeficiente kappa de 0,77 (Tabela 7).
Tabela 7: Concordância intraobservador A dos 70 casos de leucemias agudas selecionados no
Serviço de Hematologia/UFTM de agosto de 2009 à fevereiro de 2013.
OBSERVADOR
A
MORFOLOGIA t1
L
NL
TOTAL
No.
32
1
33
IMUNOFENOTIPAGEM
NL
TOTAL
No.
No.
%
%
%
96,97
3
8,11
35
100
3,03
34
91,9
35
100
100
37
100
70
100
MORFOLOGIA t2
L
NL
TOTAL
30
3
33
90,9
9,1
100
L
3
34
37
8,11
91,89
100
33
37
70
100
100
100
Concordância
%
Kappa
94,37
0,88
91.43
0,77
MORFOLOGIA/
CITOQUÍMICA t3
84,85
3
8,11
31
100
88.57
0,77
L
28
15,15
34
91,89
39
100
NL
5
100
37
100
70
100
TOTAL
33
L: linfoide; NL: não linfoide; A: observador A; B: observador B; t1, t2, t3 ( Tempos de leitura nos tempos 0 após 15
e 30 dias).
5.3.2 Concordância intraobservador B
A concordância dos resultados morfológicos (t1 e t2) por linhagem (NL e L) do
observador B frente à imunofenotipagem no primeiro tempo foi de 90% apresentando
coeficiente kappa de 0,79 e no segundo tempo a concordância foi de 81,43%
apresentando coeficiente kappa de 0,62. Associando a morfologia e a citoquímica o grau
de concordância foi de 91,43 % e o valor do coeficiente kappa de 0,82 (Tabela 8).
60
Tabela 8: Concordância intraobservador B dos 70 casos de leucemias agudas selecionados no
Serviço de Hematologia/UFTM de agosto de 2009 à fevereiro de 2013.
OBSERVADOR
B
L
MORFOLOGIA t1
L
NL
TOTAL
No.
26
6
32
MORFOLOGIA t2
L
NL
TOTAL
22
11
33
IMUNOFENOTIPAGEM
NL
TOTAL
No.
No.
%
%
%
81,25
1
2,63
27
100
18,75
37
97,37
43
100
100
38
100
70
100
66,67
33,33
100
2
35
37
5,41
94,59
100
24
46
70
100
100
100
Concordância
%
Kappa
90
0.79
81.43
0.62
MORFOLOGIA
CITOQUÍMICA t3
87,5
2
5,26
30
100
91.43
0.82
L
28
12,5
36
94,74
40
100
NL
4
100
TOTAL
33
L: linfoide; NL: não linfoide; A: observador A; B: observador B; t1, t2, t3 ( Tempos de leitura nos tempos 0 após 15
e 30 dias).
5.3.3 Concordância interobservador
Os resultados morfológicos (t1 e t2) entre os observadores A e B foram
concordantes em 88,57 % no primeiro tempo e 81,43% no segundo, apresentando
coeficiente kappa de 0,70 e 0,62 respectivamente. Quando oferecido a citoquímica
associado à morfologia, a concordância foi de 87,14 % com coeficiente de kappa 0,82
(Tabela 9).
Tabela 9: Concordância interobservador dos 70 casos de leucemias agudas selecionados
no Serviço de Hematologia/UFTM de agosto de 2009 à fevereiro de 2013
B
OBSERVADOR
No.
27
0
27
MORFOLOGIA t1
NL
%
No.
%
100
8
18,6
0
35
81,4
100
43
100
TOTAL
No.
%
35
100
35
100
70
100
Concordância
%
Kappa
88.57
0.77
22
3
25
MORFOLOGIA 2
88
10
22,22
12
35
77,78
100
45
100
32
38
70
81.43
A
MORFOLOGIA t1 L
NL
TOTAL
L
MORFOLOGIA t2
L
NL
TOTAL
100
100
100
MORFOLOGIA+CITOQUÍMICA
MORFOLOGIA
L
26
87,67
5
12,5
31
100
87.14
CITOQUÍMICA t3 NL
4
13,33
35
87,5
39
100
TOTAL
30
100
40
100
70
100
L: linfoide; NL: não linfoide; A: observador A; B: observador B; t1, t2, t3 ( Tempos de leitura nos tempos
0 após 15 e 30 dias).
0.62
0.74
61
5.3.4 Análise descritiva intraobservador por subtipos baseada na classificação
FAB.
Entre os 70 pacientes selecionados a análise intraobservador dos 36 subtipos
mieloides foi realizada em 30, por razões descritas acima. Os resultados estão
demonstrados conforme acerto obtido/número total de cada subtipo.
5.3.4.1 Resultados do observador A
Baseando-se na morfologia no tempo t1 o observador A identificou o subtipo em
4 (13,33%) dos casos, sendo 1/2 M1, 1/7 M2, 1/8 M3 e 1/1 M6 (Figura 18).
Morfologia t1
A
M1
M2
M3
M4
M5
M6
OUTROS
M1
1
0
0
0
0
0
1
Imunofenotipagem
M2
M3
M4
2
1
2
1
2
1
2
1
0
1
0
0
0
0
1
0
0
0
2
3
4
M5
0
0
0
0
0
0
0
M6
0
0
0
0
0
1
0
OUTROS
0
0
0
0
0
0
0
Figura 18: Acertos em destaque do observador A na análise morfológica no tempo (t1).
No tempo t2, novamente utilizando a morfologia, o observador A identificou 7
(23,33%) subtipos sendo 1/2 M1, 3/7 M2, 2/8 M3 e 1/1 M6 e quando associadas a
morfologia à citoquímica o subtipo foi identificado em 5 (16,16 %) onde 1/7 M2 e 4/8
M3 (Figura 19 e 20).
62
Morfologia t2
A
M1
M1
M2
M3
M4
M5
M6
OUTROS
M2
1
0
0
0
0
0
1
1
3
1
0
0
0
0
Imunofenotipagem
M3 M4 M5 M6 OUTROS
1
0
0
0
0
0
1
0
0
0
2
0
0
0
0
1
0
0
0
0
0
1
0
0
0
0
0
0
1
0
0
0
0
0
0
Morfologia +Citoquímica t3
Figura 19: Acertos em destaque do observador A na análise morfológica no tempo (t2).
A
M1
M2
M3
M4
M5
M6
OUTROS
M1
0
0
0
0
0
1
0
Imunofenotipagem
M2
M3
M4
1
3
2
1
2
2
1
4
0
2
0
0
0
0
1
0
0
0
1
0
1
M5
0
0
0
0
0
0
0
M6
1
0
0
0
0
0
0
OUTROS
0
0
0
0
0
0
0
Figura 20: Acertos em destaque do observador A da morfologia e citoquímica tempo (t3).
5.3.4.2 Resultados do observador B
O observador B identificou os subtipos em 10 (33,33%) casos nos tempos (t1, t2
e t3), destes no t1 3/7 eram M2, 4/8 M3, 2/7 M4 e 1/1 M6 (Figura 21), no t2 1/1 eram M1,
4/7 M2, 2/8 M3, 2/7 M4 e 1/1 M6 (Figura 22) e no t3 4/7 eram M2, 3/8 M3, 1/7 M4 e
Morfologia t1
1/1 M6 (Figura 23).
Imunofenotipagem
M3
M4
M5
0
0
0
3
2
0
4
2
0
1
2
0
0
1
0
0
0
0
0
0
0
B
M1
M2
M6
OUTROS
M1
0
1
0
0
M2
0
3
0
0
M3
1
1
0
0
M4
0
1
0
0
M5
0
0
0
0
M6
0
0
1
0
OUTROS
0
0
0
0
Figura 21: Acertos em destaque do observador B da morfologia e citoquímica tempo (t 3).
63
Morfologia t2
B
M1
1
0
0
0
0
0
1
M2
1
4
2
0
0
0
0
Imunofenotipagem
M3
M4
M5
0
0
0
3
5
0
2
1
0
1
2
0
1
0
0
0
0
0
0
0
0
M6
0
0
0
0
0
1
0
OUTROS
0
0
0
0
0
0
0
M6
0
0
0
0
0
1
0
OUTROS
0
0
0
0
0
0
0
M1
M2
M3
M4
M5
M6
OUTROS
Figura 22: Acertos em destaque do observador A da morfologia e citoquímica tempo (t 3).
Morfologia + citoquímica t3
Imunofenotipagem
B
M1
1
0
0
0
0
0
1
M2
1
4
2
0
0
0
0
M3
0
3
3
1
1
0
0
M4
0
3
2
1
0
0
1
M5
0
0
0
0
0
0
0
M1
M2
M3
M4
M5
M6
OUTROS
Figura 23: Acertos em destaque do observador A da morfologia e citoquímica tempo (t 3).
O percentual de acertos entre os observadores A e B nos diferentes tempos
foram pequenos, variando de 13,33 a 33,33%, não sendo possível uma análise mais
apurada pelo pequeno tamanho da amostra e heterogeneidade dos diferentes subtipos
mieloides da classificação FAB de M1 a M6 adotados por nós.
As leucemias linfoides foram agrupadas em L1/L2 e L3, não sendo possível a
diferenciação dos subtipos conforme o grau de maturação. Baseado neste critério, dos
31casos o observador A acertou em 22 (70,96%) nos tempos (t1, t2) e 20 (64,61%) no
tempo t3. O observador B acertou em 23 (74,19%) no t1, 20 (64,61%) no t2 e 26 no t3
(83,87%).
O percentual dos acertos entre os observadores A e B foram bons e similares nos
diferentes tempos do estudo, variando de 64,61% a 83,87%.
64
DISCUSSÃO
65
6. DISCUSSÃO
6.1 Caracterização clinico-epidemiológica e laboratorial
Em relação ao perfil epidemiológico, houve maior frequência de indivíduos
entre as duas primeiras décadas de vida (39,94%), das quais a LLA representou 44,28%,
sendo comum em crianças e adolescentes neste grupo. Estes dados estão de acordo com
outros estudos que demonstraram que este é o tipo mais comum entre crianças
LIESNER et al, 1997; FARIAS e CASTRO, 2004; COUTO et al, 2010) e em relação à
LMA observamos uma maior frequência em indivíduos acima da quinta década de vida
(57,70%), dados estes que corroboram com a literatura, onde segundo o National Cancer
Institute, em um estudo de 2006 a 2010, demoustrou que a média de idade ao diagnóstico de
leucemia mieloide aguda foi de 67 anos (LIENER et al, 1997; ESTEY, 2011; HOWLADER et
al, 2012).
Quanto ao gênero, houve predomínio do sexo masculino (61,43%), semelhante a
outros relatos (FARIAS e CASTRO, 2004), assim como da cor branca (CHAUFFAILLE
et al, 2004).
Quanto aos achados clínicos, a anemia foi o dado mais frequente (95,71%),
seguido de febre (74,28%), na sua quase totalidade os pacientes apresentaram anemia ao
diagnóstico, que se justifica pela substituição maciça de células imaturas na medula
óssea, ocasionado pela citopenia que compromete a produção de glóbulos vermelhos
também observada por (LOWEMBERG et al, 1999).
A frequente presença da febre pode ser creditada principalmente a neutropenia,
tornando o indivíduo susceptível às infecções, tendo em vista que 30,0% dos pacientes
apresentaram algum tipo de infecção ao diagnóstico, não podendo, contudo, afastar a
pirexia relacionada à liberação de citocinas pelas células leucêmicas, assim como em
outros relatos (PEING et al, 1999; FARIAS e CASTRO, 2004).
O encontro de adenomegalia em 21,1% e esplenomegalia em 21,42 % com
maior ocorrência na LLA, são também concordantes com os encontrados por Cortes e
kantarjian (1995).
As taxas de hemoglobina na LMA foram baixas com mediana de 7.7g/% e na
LLA de 8.2%, assim como a contagem de plaquetas, estes achados são concordantes
com relatos de outros estudos que também demonstraram baixos níveis de hemoglobina
66
e contagem de plaquetas variável, podendo ser de normal a baixa (FARIAS E CASTRO,
2004).
O perfil hematológico dos pacientes com LLA foram compatíveis com os
descritos por Farias e Castro (2004); Cortes e Kantarjian (1995), onde a presença de
leucocitose e palquetopenia são comuns, embora possa ocorrer a presença de leucopenia
ou contagem normal de leucócitos e plaquetas ocasionalmente (LIESNER et al,1997;
SCHUMACHER, 2002).
Os pacientes portadores do tipo bifenotípica, assim como os demais com
leucemia aguda apresentaram elevada contagem de leucócitos bem como plaquetas
variando de baixa a normal. Os achados laboratoriais encontrados neste estudo são
semelhantes aos vários encontrados na literatura, tendo em vista que todas as alterações
são decorrentes da proliferação maciça de blastos na medula óssea, ocasionando
citopenia, e também infiltração de órgãos e tecidos.
6.2 Concordância intraobservador e interobservador
É de extrema relevância a distinção das leucemias agudas conforme o tipo de
linhagem, tendo em vista o impacto no prognóstico e escolha terapêutica em primeira
instância. Há anos a classificação morfológica FAB tem sido o sistema de escolha,
fornecendo juntamente com a citoquímica critérios para o diagnóstico diferencial destas
doenças (SILVEIRA et al, 2008).
A avaliação intraobservador A revelou a concordância de 94,37% no tempo t1,
com kappa de 0,88, 91,43% no t2 com kappa de 0.77 e 88,57% com kappa de 0,77
quando foi incluído a citoquímica em t3, havendo discreto aumento do percentual das
análises morfológicas nos tempos t1 e t2 do que quando disponibilizado a citoquímica,
contrário aos encontrados por Browman et al (1986); Chundgar et al (1992) e Kheire et
al (1998), que encontraram maior concordância com a associação da citoquímica.
A concordância intraobservador B foi de 90% com kappa de 0,79 no tempo t1 e
81,43% com kappa de 0,62 no tempo t2, quando incluído a citoquímica a cordordâcia foi
de 91,43%, com kappa de 0,82 evidenciando a maior contribuição da citoquímica do
que os encontrados pelo observador A, similares aos encontrados por Kheire et al
(1998) e Kurien et al (2013) .
67
Quando analisamos os resultados da concordância interobservadores a
concordância foi de 88,57% com kappa de 0,77 e 81,43% com kappa de 0,62 nos
tempos t1 et2 respectivamente, quando associados à citoquímica no tempo t3 a
concordância foi de 87,14% com kappa de 0,74. Estes achados estão de acordo com
aqueles encontrados por Kurien et al (2013); Kheire et al (1998) e Chundgar et al
(1992).
Embora as analises tanto intraobservador quanto interobservador tenham
demonstrado discretas divergências, o estudo morfológico e citoquímico demonstraram
concordância substancial na diferenciação entre as linhagens NL e L, similares aos
encontrados por Chundgar et al (1992), que demonstraram uma concordância
intraobservador e interobservador de 76% no estudo morfológico, que aumentou
substancialmente para 91% quando associado à citoquímica, evidenciando que a
morfologia e a citoquímica na grande maioria dos casos podem distinguir leucemias
biologicamente diferentes.
Os resultados por linhagem, pelos critérios adotados por nós, demonstraram que
a distinção entre os tipos L1/L2, L3 e mieloide foram relevantes e ofereceram subsídios
suficientes para o diagnóstico provável, que foram confirmados pela imunofenotipagem.
A distinção da LLA tem implicações terapêuticas importantes principalmente nas
leucemias pediátricas, onde a morfologia evidenciada por blastos pequenos e
homogêneos do tipo L1, citoquímica característica e faixa etária, praticamente,
fornecem um diagnóstico provável, uma vez que os blastos L2 são mais comuns em
adultos, a probabilidade de erro é mínima (SENGAR et al, 1999, ANGELESCU et al,
2012).
A caracterização morfológica dos mieloblastos, com ou sem bastonetes de Auer,
e a presença de MPO e/ou SBB positiva definem a linhagem mieloide, se fazendo
necessária a distinção da M3, uma vez que a terapêutica e o prognóstico são específicos
e também nos casos de leucemia indiferenciadas com morfologia inespecífica e
citoquímica
negativas
onde
o
diagnóstico
é
confirmado
apenas
com
a
imunofenotipagem (ANGELESCU et al, 2012, KURIEN et al, 2013).
Quanto à classificação por subtipos os observadores identificaram apenas em um
pequeno número de acertos casos mieloides, diferentes daqueles observados por
Browman et al (1986) e kurien et al (2013). Já os subtipos linfoides foram
68
caracterizados somente por imunofenotipagem assim como os outros estudos
evidenciaram que a classificação por subtipos linfoides somente é possível através de
marcadores monoclonais (KURIEN et al 2013). Entretanto, usando os critérios citados
por linhagem L1/L2 e L3, como determinado mais recentemente pela OMS (Foa e
Vitale (2000), foi possível aumentar substancialmente o percentual de acerto dos
observadores A e B, apesar do pequeno tamanho da amostra. Não encontramos na
literatura estudos que tenham agrupado os tipos linfoides baseado nestes critérios.
Alguns fatores podem ser creditados ao fato de termos encontrado menor
concordância das análises de um observador quando a citoquímica foi associada à
morfologia, isto pode ser justificado talvez pela habilidade do observador em realizar as
análises citoquímicas, uma vez que estas não faziam parte da rotina.
Durante o período de avaliação morfológica e citoquímica, os observadores
foram monitorados e foi observada com relativa frequência que a interrupção por
quaisquer fatores, tempo de leitura e critérios adotados, seguramente interferiram na
decisão final de cada observador. Não foi encontrado na literatura nenhum trabalho
demonstrando o monitoramento do comportamento dos observadores durante período o
da análise.
Acreditamos também que o ambiente, a disponibilidade de tempo, juntamente
com a adoção de critérios pré-estabelecidos, podem contribuir ainda mais para a
reprodutibilidade dos testes no diagnóstico das leucemias agudas.
Outro aspecto é que a classificação morfológica e a citoquímica são dependentes
da interpretação humana sendo portanto sujeitas à variações, podendo predispor ao erro,
também observado por Browman et al (1986) , além dos fatores pré-análíticos,
analíticos e pós-analíticos como a qualidade do esfregaço, coloração e decisão do
observador.
Podemos, portanto, assegurar que estas divergências não invalidam este estudo,
visto que, tanto as análises intraobservador como interobservador demonstraram
concordância substancial na identificação das linhagens NL e L, não contribuindo em
apenas seis casos, que foram definidos pela imunofenotipagem como leucemias
indiferenciadas, sendo duas M0, uma M7 e três bifenotípicas.
O diagnóstico das leucemias agudas indiferenciadas permanece ainda um
problema em decorrência da insuficiência dos achados morfológicos e citoquímicos
69
para a caracterização final desta doença. Com a disponibilidade da imunofenotipagem
as dificuldades têm diminuído substancialmente, no entanto Stasi et al (1995) e Silveira
et al, 2008 relatam que estes métodos não são totalmente suficientes para determinar os
subtipos, o uso de anticorpos monoclonais tem sido questionado, pois sua reatividade
não é restrita a uma única linhagem.
Em aproximadamente 3% dos casos de leucemias agudas em adultos e 1% em
crianças, mesmo com o emprego de um amplo painel de marcadores, ainda não é possível
determinar a linhagem celular específica (STASI et al, 1995; SILVEIRA et al, 2008), em
nosso estudo este fato foi documentado em quatro casos de leucemias mieloides agudas,
confirmados pela morfologia e citoquímica, em que a imunofenotipagem não contribuiu
para a definição do subtipo específico.
Segundo klobusická (2000) em determinadas situações a reação de
mileoperoxidase é superior aos marcadores CD13 e CD33 na identificação da linhagem
mieloide, como em alguns casos de LMA-M2 com t(8:21)(q22:q22) em que os
marcadores CD13 e CD33 são negativos, no entanto a reação de MPO foi fortemente
positiva.
Neste mesmo período foi realizado, por nós, um outro trabalho utilizando a
mesma amostra, associando os diagnósticos morfológicos e citoquímicos, com o prévio
conhecimento dos achados clínicos encontramos uma forte contribuição para o
diagnóstico desta doença, onde o estudo morfológico permitiu a identificação da
linhagem em 83,58%, enquanto a citoquímica em 83,80% da linhagem mieloide e 100%
da linhagem linfoide (RESENDE et al, 2013 comunicação verbal).
Os dados clínicos prévios são classicamente valiosos para o diagnóstico
laboratorial, foi documentado por Browman et al (1986) que
demonstrou que as
informações clínicas associadas à morfologia e a citoquímica elevam substancialmente
o nível de acordo entre os observadores, fato este, também decrito por Koran et al em
1975.
Estes dados confirmam a importância destes testes, podendo ser instituídos com
segurança na rotina, principalmente em locais onde não há disponibilidade de recursos
financeiros e de imunofenotipagem. Uma vez que os critérios morfológicos e
citoquímicos estejam bem definidos, o tratamento pode ser iniciado principalmente em
algumas circunstâncias, como urgências em que o quadro clínico exige rápida
70
intervenção terapêutica, sem prejuízos para o paciente até a confirmação diagnóstica
definitiva pela imunofenotipagem (SENGAR et al, 2009).
Neste contexto, a concordância substancial entre os achados morfológicos e
citoquímicos frente à imunofenotipagem e a possibilidade de identificar mais que 80%
das leucemias linfoides e mieloides agudas, evidenciaram a importância destes recursos,
se não para o diagnóstico definitivo, pelo menos, seguramente, como medida de triagem
na escolha dos anticorpos a serem empregados na imunofenotipagem e principalmente
no início da terapêutica específica, crucial mediante circunstâncias de urgências que o
quadro clínico exige.
Este trabalho seguramente tem também implicações pedagógicas, uma vez que a
partir destas conclusões outros critérios têm sido adotados. Sugerimos também o
incentivo ao estudo morfológico, uma vez que este constitui a base do diagnóstico,
contribuindo de forma efetiva na elucidação destas leucemias. Fica nosso
questionamento: podemos abandonar a morfologia?
71
CONCLUSÃO
72
7. CONCLUSÃO
A concordância substancial entre os diagnósticos morfológicos e citoquímicos
frente à imunofenotipagem e a identificação de mais de 80% na diferenciação entre as
linhagens linfoides e mieloides agudas neste estudo evidenciam a importância da
morfologia e da citoquímica, se não para o diagnóstico definitivo, pelo menos,
seguramente, como medida de triagem e orientação na escolha dos anticorpos a serem
empregados na imunofenotipagem.
Por outro lado, este estudo corrobora a idéia de que a imunofenotipagem é um
procedimento indispensável ao diagnóstico, especialmente na caracterização dos
subtipos, das leucemias indiferenciadas como M0, M7 e bifenotípicas, documentadas
por nós em 9% dos casos, em que a morfologia e citoquímica não contribuíram.
Acreditamos que o estudo morfológico e citoquímico no presente trabalho,
embora subestimado por muitos, ainda são de contribuição relevante, principalmente em
determinados serviços, que não dispõem de um amplo painel de anticorpos monoclonais
e início precoce do tratamento específico em algumas emergências clínicas, até a
confirmação definitiva pela imunofenotipagem.
Fica claro, portanto, que cada metodologia apresenta suas contribuições e
limitações, entretanto acreditamos que estas reações podem ser utilizadas como métodos
de primeira linha em conjunto com a imunofenotipagem, a citogenética e os estudos
moleculares, viabilizando o diagnóstico, a terapêutica e o prognóstico, consolidando o
valor da morfologia e citoquímica ainda que como método diagnóstico de triagem, útil e
de grande valia na diferenciação das leucemias agudas de linhagem linfoide e não
linfoides.
73
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81
ANEXOS
82
MINISTÉRIO DA EDUCAÇÃO
UNIVERSIDADE FEDERAL DO TRIÂNGULO MINEIRO - Uberaba-MG
Comitê de Ética em Pesquisa- CEP
ANEXO 1. TERMOS DE CONSENTIMENTO
Título do Projeto: Contribuição das Reações Citoquímicas para o Diagnóstico Final das Leucemias
Agudas.
TERMO DE ESCLARECIMENTO
Você tem um tipo de “anemia” denominada Leucemia aguda e está sendo convidado(a) a participar do
estudo “Contribuição das Reações Citoquímicas para o Diagnóstico Final das Leucemias Agudas.”
Os avanços na área da saúde ocorrem através de estudos como este, por isso a sua participação é
importante. O objetivo deste trabalho foi realizar a análise da reprodutibilidade intra e interobservacional
citológica, citoquímica e imunofenotípica no diagnóstico das leucemias agudas em um Hospital
Universitário.
e caso você participe, não será necessário nenhum procedimento além do previsto, tendo em vista que a
coleta de sangue periférico e punção de medula óssea fazem parte do diagnóstico e condutas de rotina.
Não será feito nenhum procedimento que lhe traga qualquer desconforto ou risco à sua vida, além do
desconforto ocasionado pela coleta de sangue e medula óssea, fundamentais para diagnóstico de sua
doença. Você poderá obter todas as informações que quiser e poderá não participar da pesquisa ou retirar
seu consentimento a qualquer momento, sem prejuízo no seu atendimento. Pela sua participação no
estudo, você não receberá qualquer valor em dinheiro, mas terá a garantia de que todas as despesas
necessárias para a realização da pesquisa não serão de sua responsabilidade. Seu nome não aparecerá em
qualquer momento do estudo, pois você será identificado com um número.
TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE, APÓS ESCLARECIMENTO
Agudas.
Eu, (__________________________________________), li e/ou ouvi o esclarecimento acima e
compreendi para que serve o estudo e qual procedimento a que serei submetido. A explicação que
recebi esclarece os riscos e benefícios do estudo. Eu entendi que sou livre para interromper minha
participação a qualquer momento, sem justificar minha decisão e que isso não afetará meu
tratamento. Sei que meu nome não será divulgado, que não terei despesas e não receberei dinheiro
por participar do estudo. Eu concordo em participar do estudo.
Uberaba, ............./ ................../................
__________________________________________
Assinatura do voluntário ou seu responsável legal
______________________________
Assinatura do pesquisador responsável
_______________________
Documento de identidade
_________________________________
Assinatura do pesquisador orientador
Telefone de contato dos pesquisadores:
Gláucia Aparecida Domingos Resende: (034) 3321-8254
Paulo Roberto Juliano Martins: (034) 3312-507
83
Agudas.
Seu filho(a) tem um tipo de “anemia”denomina Leucemia aguda e está sendo convidado(a) a participar do
estudo “Contribuição das Reações Citoquímicas para o Diagnóstico Final das Leucemias Agudas”.
Os avanços na área da saúde ocorrem através de estudos como este, por isso a participação de
seu filho é importante. O objetivo deste trabalho foi realizar a análise da reprodutibilidade intra e
interobservacional citológica, citoquímica e imunofenotípica no diagnóstico das leucemias agudas em um
Hospital Universitário e caso ele participe, não será necessário nenhum procedimento além do previsto,
tendo em vista que a coleta de sangue periférico e punção de medula óssea fazem parte do diagnóstico e
condutas de rotina. Não será feito nenhum procedimento que traga a ele qualquer
desconforto ou risco à sua vida, além do desconforto ocasionado pela coleta de sangue e medula óssea,
fundamentais para diagnóstico de sua doença. Você poderá obter todas as informações que quiser e poderá
não permitir a participação de seu filho(a) da pesquisa ou retirar seu consentimento a qualquer momento,
sem prejuízo no seu atendimento. Pela participação no estudo, seu filho(a) não receberá qualquer valor
em dinheiro, mas terá a garantia de que todas as despesas necessárias para a realização da pesquisa não
serão de sua responsabilidade. O nome dele não aparecerá em qualquer momento do estudo, pois ele será
identificado com um número.
Agudas.
compreendi para que serve o estudo e qual procedimento o meu filho(a) será submetido. A
explicação que recebi esclarece os riscos e benefícios do estudo. Eu entendi que sou livre para
interromper sua participação a qualquer momento, sem justificar minha decisão e que isso não
afetará seu tratamento. Sei que seu nome não será divulgado, que não terei despesas e não receberei
dinheiro por participar do estudo. Eu concordo que meu filho(a) participe do estudo.
Uberaba, ............./ ................../................
__________________________________________
Assinatura do voluntário ou seu responsável legal
______________________________
_______________________
_________________________________
84
Agudas.
O senhor(a)_____________________________________________ que se encontra sob sua curatela tem
um tipo de “anemia” denominada Leucemia aguda e está sendo convidado(a) a participar do estudo
“Contribuição das Reações Citoquímicas para o Diagnóstico Final das Leucemias Agudas.”.
Os avanços na área da saúde ocorrem através de estudos como este, por isso a participação
dele(a) é importante. O objetivo deste trabalho foi realizar a análise da reprodutibilidade intra e
interobservacional citológica, citoquímica e imunofenotípica no diagnóstico das leucemias agudas em um
Hospital Universitário e caso ele participe, não será necessário nenhum procedimento além do previsto,
tendo em vista que a coleta de sangue periférico e punção de medula óssea fazem parte do diagnóstico e
condutas de rotina. Não será feito nenhum procedimento que traga a ele(a) qualquer desconforto ou risco
à sua vida, além do desconforto ocasionado pela coleta de sangue e medula óssea, fundamentais para
diagnóstico de sua doença. Você poderá obter todas as informações que quiser e poderá não permitir a
participação de dele(a) da pesquisa ou retirar seu consentimento a qualquer momento, sem prejuízo no
seu atendimento. Pela participação no estudo, seu filho(a) não receberá qualquer valor em dinheiro, mas
terá a garantia de que todas as despesas necessárias para a realização da pesquisa não serão de sua
responsabilidade.O nome dele não aparecerá em qualquer momento do estudo, pois ele será identificado
com um número.
Agudas.
compreendi para que serve o estudo e qual procedimento o curatelado(a) será submetido. A explicação
que recebi esclarece os riscos e benefícios do estudo. Eu entendi que sou livre para interromper sua
participação a qualquer momento, sem justificar minha decisão e que isso não afetará seu tratamento.
Sei que seu nome não será divulgado, que não terei despesas e não receberei dinheiro por participar do
estudo. Eu concordo que meu curatelado(a) participe do estudo.
Uberaba, ............./ ................../................
__________________________________________
Assinatura do voluntário ou seu curador legal
______________________________
_______________________
_________________________________
85
ANEXO 2
TERMO DE APROVAÇÃO DO CÔMITE DE ÉTICA EM PESQUISA-UFTM
86
ANEXO 3: TERMO DE APROVAÇÃO DO CÔMITE DE ÉTICA EM PESQUISA DE
ARARAQUARA – REFERENTE AOS CASOS RETROSPECTIVOS

UNIVERSIDADE FEDERAL DO TRIÂNGULO MINEIRO

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