performance et capacité métabolique des spermatozoïdes

UNIVERSITÉ DU QUÉBEC
PERFORMANCE ET CAPACITÉ MÉTABOLIQUE DES
SPERMATOZOÏDES ASSOCIÉES AUX DIFFÉRENTES TACTIQUES DE
REPRODUCTION CHEZ L'ÉPINOCHE À TROIS ÉPINES
(GA S TER OS TE US ACULEATUS)
MÉMOIRE
PRÉSENTÉ À
UNIVERSITÉ DU QUÉBEC À RIMOUSKI
Comme exigence partielle du programme de
Gestion de la Faune et de ses Habitats
PAR
Jonathan Côté
Décembre 2004
UNIVERSITÉ DU QUÉBEC À RIMOUSKI
Service de la bibliothèque
Avertissement
La diffusion de ce mémoire ou de cette thèse se fait dans le respect des droits de son
auteur, qui a signé le formulaire « Autorisation de reproduire et de diffuser un rapport,
un mémoire ou une thèse ». En signant ce formulaire, l’auteur concède à l’Université du
Québec à Rimouski une licence non exclusive d’utilisation et de publication de la totalité
ou d’une partie importante de son travail de recherche pour des fins pédagogiques et non
commerciales. Plus précisément, l’auteur autorise l’Université du Québec à Rimouski à
reproduire, diffuser, prêter, distribuer ou vendre des copies de son travail de recherche à
des fins non commerciales sur quelque support que ce soit, y compris l’Internet. Cette
licence et cette autorisation n’entraînent pas une renonciation de la part de l’auteur à ses
droits moraux ni à ses droits de propriété intellectuelle. Sauf entente contraire, l’auteur
conserve la liberté de diffuser et de commercialiser ou non ce travail dont il possède un
exemplaire.
11
TABLE DES MATIÈRES
TABLE DES MA TIÈRES ............................................................................................................................... II
LISTE DES TABLEAUX ............................................................................................................................... V
LISTE DES FIGURES .............................................................................................. ..................................... VI
RÉSUMÉ ...................................................................................................................................................... VIII
INTRODUCTION GÉNÉRALE ..................................................................................................................... 1
STRATÉGIE ET TACTIQUES DE REPRODUCTION ...................... ... ........... .. ................ ......... ...... ........... ... .... .....
1
COÛT DE LA REPRODUCTION ........................... .. ................................................. ...... ................ ..... .............. .. 1
DIFFÉRENTES TACTIQUES DE REPRODUCTION .. ..... .. .. ...... .. ............... .. ........................ ............................ .. ...
2
COMPÉTITION SPERMATIQUE ............... .............. .................................... .. ...... .. ...... ... ....... .... ... ...................... 2
VOIE D'AMÉLIORATION DU POTENTIEL REPRODUCTEUR ....................... ..... .................... ..... .................. .......
3
COMPROMIS ENTRE LES CARACTÉRISTIQUES DES SPERMATOZoïDES .............. .... .. .... .. ... ... .. ......... .. .. .. .. ..... 4
MODEl « SNEAK-GUARD
» ......................................................................................................................... 4
EXEMPLES DE lA COMPÉTITION SPERMATIQUE ........ ... ........ ..... ......... .. ................................. .... .. ... ......... .... .. 5
SPERMATOzoïDE .. ... ........ .................. ...... .... .... .. ... .. ............ ........ .. .......... ...... ....... .. ...... .... .. .... .. .... ...... ............
6
MÉTABOLISME DES SPERMATOZoïDES ......... .. ... .. ....... .. ............ .. ......................... .... ............ ............. .... ........ 7
L'ÉPINOCHE, UN BON MODÈLE .... ............. .... ................................................ .. .......... ... ........................ ...... .. ..
7
L'ÉVALUATION DU COMPORTEMENT REPRODUCTEUR CHEZ L'ÉPiNOCHE .... ...... ........................................ ..
9
OBJECTIFS SPÉCIFIQUES ... .. .... ..... ..... ............................................................ .. ................................... ... ..... 11
ARTICLE ........................................................................................................................................................ 16
ABSTRACT ......... ........................................................................................................................................... 17
INTRODUCTION ........................................................... .................... .... .......... ............................................. 18
111
METHODS ...................................................................................................................................................... 21
FISH SAMPLING .. ... .. ... ................. ..... .. ... ... ....... ... ......... .. .. .. ... ... ... .. ... .... ....... .. .... ... ......... .. ....... ....... ............. ... 21
ASSESSMENT OF TERRITORIALITY ... ... ....... ... .... ........ ... ....... ............. ..... ........... ... ......... .... .... ... .... .... ...... ... ... 22
MORPHOLOGICAL MEASUREMENTS .............. ...... ................ ... .. ..... ........ .. ......... ......... ... ......... ... .. ... .... ..... ..... 23
SPERM MOTILITY MEASUREMENTS .. .. .... .... .. ................... .............. .... .............. ........ ..................................... 24
SPERM METABOLISM ANALYSES ... ... ..... ..................... .. ...... ... ......... ... ... ....... .... .. .......... ...... ..... .. ..... .. .. ... ... .... 27
STATISTICAL ANALYSIS ....... .. .... .. ... .. ......... ....... ...... .... .. .... .. ..... ... ......... .. ... .......... ....... ... ... .. ....... ... .... ............ 28
RESULTS ........................................................................................................................................................ 29
TERRITORIALITY ASSESSMENT .... ... ..... ... .... .... ... .. .... ..... ........ .. .... .. ... .... ............... ..... .... ....... .... ...... ... ............ 29
MATING TACTIC DISCRIMINATION ... .. ....... .. .. ..... ...... ............ .. ............... .. .. ...... ...... ... .. ...... ............... .. .... ... .. ... 30
TERRITORIAL SPERMATIC INDEX ....... ..... ...... .. .......... .. ... ... .. ......... .. .... ... ......... ........ .... ... .......... .. .... .... ..... ... ... 31
SPERM LONGEVITY ......... ........... ..... .. .... ........ .. .... ............ ..... .... .... ................................................................ 3 1
SPERM METABOLISM .. .. .... .. ....... ...... ... .. ..... ..... ......... ... .. .. .. ... ...... ..... .. ........ .. .......... .................................. ..... 32
DISCUSSION .................................................................................................................................................. 33
SPERM MOTILITY AND LONGEVITY ............. ... .... .. ........... .. .................. ... .. ... ... ....... ... ..... ........... ....... ... ........... 33
SPERM PRODUCTION .. .. .. .. .............. .. ....... .. .. .... .... .. .......... ... .... .... .... ......... ....... ... .... ... ..... .. ...... ..... .. ......... ..... . 34
SPERM DURATION .. ...... .. .... ............ .... .... .. ..... ... .......... .... ....... ........... .... .. .. ..... .. ..... ... ................... .. ........ ... ..... 35
INTERACTIONS BETWEEN SPERM TRAITS .. ... .... ....... ....... ... .. ... ...... ... .... .... ........... .... ....... ......... ....... .............. 36
REPRODUCTIVE TACTIC DETERMINATION ... .......... ..... .................................................. .. ... .... .. ... .... ..... ..... ... 37
SPERM METABOLISM ... ....... .... .. ................. .... .. .............. ....... ...... .. ... .......... ........ ... .... ...... .. .. .......... ... ............ 37
COMPUTER-ASSISTED SPERM PRODUCTION ................. .... .... ... .. .............. .... .... ....... ... .... .. .... ....... ..... .... ....... 40
CONCLUSION ............................................................................................................................................... 40
CONCLUSION GÉNÉRALE ........................................................................................................................ 46
CONCLUSION GÉNÉRALE ........................................................................................................................ 47
IV
BIBLIOGRAPHIE ......................................................................................................................................... 50
v
LISTE DES TABLEAUX
TABLE 1. Morphologic, spermatic and physiological characteristics for non-territorial
(NTM, n=44), facultative-territorial (TFM, n=38) and territorial (TM, n=31) males
three-spined stickleback. Values are presented as means and standard deviations . .... .44
VI
LISTE DES FIGURES
FIG. 1. Dicriminant function analysis of the three different reproductive tactics (NTM =
non-territorial males, n=30; FTM= facultative-territorial males, n=20; and TM =
territorial males, n=19) based on 10 out of 30 parameters available (Wilks' lambda =
0.452, P<O.OOl). Parameters: ALH = lateral amplitude, BCF = beat frequency, STR =
straightness, RAP = rapid percentage, SCPG = sperm concentration per gram of
gonad, RL V AP = lost of path velocity, LF = total lenght, GSI = gonado-somatic index,
COL = fish coloration, and CS = CS activity in sperm .. ......... ...... ... ..... ... .................. ..42
FIG. 2. Relationship between condition index and gonado-somatic index for each male
stickleback (r=0.398, P <0.001, n=l13). Non-territorial males (NTM, r=0.579,
P<O.OOl, n=44) are shown with open squares, facultative-territorial males (FTM,
r=0.261, P=NS, n=38) with grey triangles and territorial males (TM, r=0.085 , P=NS ,
n=31) with close squares . ................. ................ .. ...... .... ........ .... ........ .. .... .... ........ ....... .. . 43
FIG. 3. Mean (± SD) of A sperm path velocity (V AP), B percentage of motile sperm
,
(MOT) and C percentage of rapid sperm (RAP) at different time post activation for
territorial males and non territorial males. Between tactics, the rate 10st of sperm
velocity is nearly significant (RLV AP, F 1,54=3.5, P=0.067, NTM > TM), non
significant for the rate 10st of the percentage of motile sperm (RLMOT, F 1,54=1.3 ,
P=0.256) and significant for the rate lost of the percentage of rapid sperm (RLRAP,
F1,3 8=7.5, P=0.009, NTM > TM). FIG. 4. Relationship between spermatie enzyme
activity and A total sperm number (TOTSPERM: PK; r= -0.732, P <O.OOl, and CS; r=
vu
-0.687, P<O.OOl), and B speml concentration per gram of gonad (SCPG: PK; r= 0.707, P<O.OOl, and CS; r= -0.740, P<O.OOl), C and gonado-somatic index (GSI: PK;
r= -0.476, P<O.OOl, and CS; rs= -0.332, P<O.Ol). PK activity in sperm (n=77) are
shown with close squares and CS activity in sperm (n=80) with open squares for each
three-spined stickleback male ... ...... ..... .. .. .... .................... ........ ... ....... ...... .. .................. .45
FIG. 4. Relationship between spermatic enzyme activity and A total sperm number
(TOTSPERM: PK; r= -0.732, P<O.OOl, and CS; r= -0.687, P<O.OOl), and B sperm
concentration per gram of gonad (SCPG: PK; r= -0.707, P<O.OOl, and CS; r= -0.740,
P<O.OOI), C and gonado-somatic index (GSI: PK; r= -0.476, P<O.OOI, and CS; rs= 0.332, P<O.Ol). PK activity in sperm (n=77) are shown with close squares and CS
activity in sperm (n=80) with open squares for each three-spined stickleback male .. .46
VIII
Résumé
Différentes tactiques de reproduction peuvent coexister au sein d'une même espèce.
L'Épinoche à trois épines (Gasterosteus aculeatus) est un exemple type de ce phénomène.
Lors de la reproduction, certains mâles manifestent des comportements de territorialité
(MT) qui favorisent leur chance d'être choisis par les femelles, alors que d'autres
n'exhibent pas ces traits comportementaux (MNT) et optent pour des tactiques de
reproduction furtives. Cette stratégie de reproduction induit une dépense énergétique qui
diffère d'une tactique à l'autre. Afin de connaître l'impact des forces sélectives de la
sélection sexuelle et de la compétition spermatique sur les caractéristiques des
spermatozoïdes de chacune des tactiques, différents paramètres ont été mesurés sur le
sperme de 120 individus (motilité, vélocité, longévité, production relative et capacité
métabolique). Le comportement des mâles a été évalué par groupe de 10 individus disposés
dans des petits bassins spécialement aménagés. Le statut de territorialité a été attribué aux
mâles ayant construit un nid. Les mâles des différents bassins ont été re-mélangés une
seconde fois afin d'évaluer la récurrence du statut de territorialité. Un nouveau statut, mâle
à territorialité facultative (MTF), a pu ainsi être attribué aux mâles n'ayant pas adopté la
même tactique lors des deux évaluations. Une analyse discriminante a permis de
différencier significativement chacune des tactiques et de démontrer que l'indice gonadosomatique (plus élevé chez les MT) était le paramètre le plus discriminant. Cette analyse a
également présenté les MTF comme étant un groupe intermédiaire entre les MT et les
MNT. Aucune différence significative n'a été trouvée sur des caractéristiques spermatiques
favorisant le potentiel reproducteur des males non territoriaux. Suivant les concepts de la
compétition spermatique, la sélection aurait dû moduler, par exemple, une vitesse de nage
des spermatozoïdes et une production relative en spermatozoïdes avantageuses pour les
individus à reproduction furtive . En moyenne, le sperme est resté actif au-delà de 20 heures
en perdant 30% de sa vélocité initiale et 50% du pourcentage de spermatozoïdes motile.
L'absence de relation entre la performance des spermatozoïdes et l'activité enzymatique de
la citrate synthase et celle négative avec la pyruvate kynase suggèrent que l'activité aérobie
et la capacité glycolytique sont deux voies métaboliques qui ne sont pas associées à une
meilleure vélocité et motilité du sperme de cette espèce. D'autre part, les résultats obtenus
avec l'indice de territorialité, basé sur plusieurs caractéristiques spermatiques, semblent
démontrer que l'interaction entre différents paramètres est peut-être plus importante que
l'effet d'un seul paramètre. Ces interactions pourraient de ce fait intervenir comme facteur
venant aider le maintien des tactiques alternatives qui ont un succès de reproduction
inférieur à celui des mâles territoriaux.
Introduction générale
Stratégie et tactiques de reproduction
Diverses pressions de sélection sont responsables de l'apparition et du maintient de
plusieurs comportements de reproduction au sein d'une même espèce ou d ' une population
(Birkhead and Moller, 1998). La stratégie de reproduction regroupe l'ensemble de ces
phénotypes alternatifs (tactiques de reproduction) et chaque individu possède le bagage
génétique pour exprimer les différentes tactiques (Gross and Repka, 1998). Chaque tactique
possède des caractéristiques comportementales, morphologiques et autres composantes qui
leur sont propres et chaque mâle adopte une seule d ' entre elles dans le but d'avoir le
meilleur succès reproducteur possible. Par cette tactique, il tente d'optimiser le nombre ou
la qualité de ses partenaires. Les principales variables qui déterminent la tactique de
reproduction touchent la condition de l'individu, l'intensité de la compétition intrasexuelle, la densité de la population locale, la séquence de résidence et les conditions
environnementales (telle la prédation). Ces différentes variables caractérisent en partie le
coût qui sera associé à la reproduction (Taborsky, 2001).
Coût de la reproduction
Il est reconnu que la reproduction représente un investissement énergétique très
important (Chellappa et al., 1989; Jobling, 1994). Même la production des spermatozoïdes
constitue à elle seule une dépense substantielle (Jobling, 1994; Scharer and Robertson,
2
1999; Wedell et al., 2002). Ainsi, considérant l'ampleur du coût associé à la reproduction et
à la disponibilité des ressources énergiques qui peut être limitante, beaucoup de compromis
sont réalisables en terme d'investissement énergétique et de tactiques à adopter.
Différentes tactiques de reproduction
La sélection des mâles par les femelles lors de la reproduction a pour effet
d'accentuer la compétition entre ces derniers. Afin d'avoir accès à plus de fertilisations que
ses rivaux, un mâle peut adopter quatre tactiques différentes (Taborsky, 2001): 1- être plus
rapide, 2- monopoliser les ressources (aire de reproduction, d'élevage et matériaux de
nidification) et les femelles, 3- exploiter la monopolisation des ressources et des femelles
des autres (parasitisme reproductif) et 4- faire de la coopération avec des monopolisateurs
de ressources. Dans les cas où la force décide du vainqueur, les individus les plus gros et en
meilleure condition auront l'avantage pour bénéficier des ressources, d'un territoire et des
partenaires. Toutefois, la compétition entre les mâles peut se jouer à un tout autre niveau
que celui de la force.
Compétition spermatique
La compétition spermatique survient lorsque le sperme de plus d'un mâle entre en
compétition pour fertiliser les œufs d'une femelle (Parker, 1970). Ce phénomène est
commun lorsque la fertilisation est externe et que les femelles ont très peu de contrôle sur
la paternité. Elle permet donc à des individus, qui ont moins de chance de bénéficier de
ressources et d'un accès plus facile aux femelles, en raison de leur condition ou d 'autres
3
facteurs environnementaux (mâles satellites), d'améliorer leur succès de reproduction
(Leach and Montgomerie, 2000).
Voie dJamélioration du potentiel reproducteur
Le potentiel reproducteur peut être amélioré de différentes façons au nIveau
gamétique (Leach and Montgomerie, 2000). 1- La rapidité des spermatozoïdes favorise le
potentiel reproducteur lorsque le sperme doit franchir une certaine distance pour fertiliser
les œufs. La vitesse des spermatozoïdes peut être influencée tant par la capacité
métabolique qui fournie l'énergie nécessaire que par leur longueur. En effet, la longueur du
flagelle peut influencer les forces propulsives suffisamment pour en faciliter le déplacement
(Balshine et al. , 2001). 2- La vitalité du sperme peut être caractérisée par la proportion de
spermatozoïdes qui est viable et par l'endurance de ces derniers . Plus la proportion de
spennatozoïdes viables sera grande et plus ils seront endurants, plus le nombre d'œufs
fécondés pourra être grand pour un volume d'éjaculât donné. 3- En ayant un plus grand
nombre total de spermatozoïdes, un individu peut relâcher de plus gros éjaculâts lors d' un
événement de reproduction ou encore en relâcher un plus grand nombre au cours de la
saison de reproduction. 4- Toutefois, si l'espace d'emmagasinage du sperme est limité ou
que le volume de l'éjaculât reste relativement fixe, la concentration du sperme en
spermatozoïdes devient un paramètre très important. Dans ce cas, un plus petit volume de
sperme est nécessaire pour obtenir une quantité totale de spermatozoïdes donnés.
4
Compromis entre les caractéristiques des spermatozoïdes
Toutes ces caractéristiques peuvent être avantageuses au niveau du potentiel
reproducteur. Toutefois, elles ne peuvent pas toutes être optimisées à la fois . Un compromis
doit être fait lors de la production des spermatozoïdes en raison de l'investissement
énergétique que nécessite la production des gamètes. Par exemple, des spermatozoïdes
longs ont l' avantage d'être plus rapides, mais leur longueur peut être inversement corrélés à
leur longévité (Stockley et al., 1997). La vitesse peut être avantageuse pour arriver le
premier à fertiliser les œufs, mais la longévité peut être également un très bon atout. Surtout
lorsque la distance à parcourir n'est pas fixe comme dans le cas de la fertilisation externe
(Taborsky, 1998).
Model « Sneak-Guard »
Différents modèles théoriques présentent les différentes stratégies de reproduction.
Un des modèles les plus répandus est celui décrit par Parker et ses collègues (Parker, 1990;
Parker, 1998; Parker et al., 1997); le « Sneak and Guard model». Ce modèle présente deux
tactiques de reproduction dans lesquelles les «Sneakers» sont des mâles dont le
comportement de reproduction est dit furtif et les « Guardians » dont le comportement est
dit gardien. La tactique des mâles gardiens implique la défense d'un territoire qui servira à
l'accouplement. C'est généralement les individus en meilleure condition et les plus gros. Ils
cherchent également à monopoliser les femelles . Quant aux mâles furtifs , ils sont
généralement plus petits et plus jeunes. Par faufilage opportuniste ou en restant près des
5
sites de reproduction grâce à leur apparence de femelle, ils tentent de voler des fertilisations
à des mâles gardiens qui se reproduisent.
Le risque et l'intensité de la compétition spermatique vont jouer un rôle très important
sur l'évolution des caractéristiques spermatiques d'une population (Parker, 1998). Le risque
est défini comme la probabilité moyenne qu'une femelle puisse rencontrer un autre mâle
pour se reproduire. Quant à l'intensité, elle représente le nombre moyen de mâles qui
peuvent entrer en compétition pour un amas d'œufs donné ou le nombre d'éjaculâts avec
lequel un mâle devra rivaliser. Ainsi, plus ces deux composantes du système sont
importantes, plus les pressions de sélection sont grandes. Ce qui résulte dans le
développement de différences au niveau gamétique entre les différents phénotypes
comportementaux (Simmons and Kotiaho, 2002). Des variations des caractéristiques
spermatiques devraient donc être associées aux différentes tactiques de reproduction
lorsqu'elles suivent des modifications du niveau de risque ou de l'intensité de la
compétition spermatique.
Exemples de la compétition spermatique
Différents exemples illustrent bien comment la compétition spermatique peut arriver à
moduler certains paramètres de la reproduction. Chez une espèce d'oiseau, Riparia riparia,
lorsqu'un mâle se reproduit en présence d'un autre mâle (un rival), ce dernier va laisser
plus de semence que lors d'une fertilisation sans rival (Nicholls et al., 2001). L'épinoche à
trois épines, Gasterosteus aculeatus, présente également le même phénomène (Zbinden et
6
aL, 2004). Chez Viviparus ater, une espèce de gastéropode, il a été démontré que plus les
spermatozoïdes étaient gros, meilleur était le succès de fertilisation pendant la compétition
spermatique (Oppliger et al., 2003). De plus, ils ont montré qu'une plus grande
concentration du sperme était favorable pour faire face à la compétition spermatique. Une
étude portant sur des espèces de cichlidés (espèces à fertilisation externe) a montré que la
polygamie était corrélée à la compétition spermatique (Balshine et al., 2001). Les espèces
les plus polygames posséderaient des spermatozoïdes plus longs que leurs plus proches
parents monogames. Ainsi, la grandeur des spermatozoïdes pourrait par le fait même être
reliée à la compétition spermatique. Chez une autre espèce de poisson, le Crapet arlequin
(L epomis macrochirus), les mâles furtifs ont une semence qui est presque 50% fois plus
concentrée (Leach and Montgomerie, 2000).
Spermatozoïde
La motilité des spermatozoïdes est cruciale pour la fertilisation et particulièrement
lorsqu'une certaine distance doit être franchie pour rejoindre les oeufs. Le flagelle du
spermatozoïde est la pièce mécanique qui permet au spermatozoïde de se propulser. Cette
pièce, particulièrement complexe, est principalement composée de l'axonème. Il est formé
d'un complexe de microtubules qui sont articulés autour du centriole, la pièce qui permet la
jonction entre la tête et la queue. Ainsi, l'énergie qui est transmise à ce complexe peut
générer le mouvement propulseur du spermatozoïde. Cette énergie est principalement issue
des mitochondries qui sont situées au niveau de la pièce intermédiaire du spermatozoïde
(Gilbert, 1996).
7
Métabolisme des spermatozoïdes
Des études récentes (Gronczewska et al., 2003; Lahnsteiner et al., 1999) ont permis
d'identifier les principales voies métaboliques chez quelques espèces de téléostéens. La
voie qui semble la plus sollicitée est la glycolyse aérobie. Mansour et al. (2003) suggèrent
toutefois que l'importance des différentes voies du métabolisme énergétique des
spermatozoïdes de poisson varie selon les espèces. La motilité des spermatozoïdes peut être
affectée par une altération du système mécanique locomoteur, des membranes des
mitochondries, ainsi que par une altération chimique affectant les processus enzymatiques
(O'Connell et al. , 2002).
La capacité métabolique des spermatozoïdes devrait donc traduire de façon juste la
performance de ceux-ci. Le développement et la maturation des spermatozoïdes sont
également très importants pour que tous les processus physiologiques et métaboliques se
mettent correctement en place. Ainsi, encore une fois l'allocation en énergie doit être bien
acheminée au cours de la production des spermatozoïdes, et ce, jusqu'à la toute fin pour
veiller à ce que leur qualité soit adéquate.
L'épinoche, un bon modèle
L'épinoche à trois épines constitue un excellent modèle pour l'étude des stratégies de
reproduction. Ce petit téléostéen, de la famille des Gastérostéidés, a été fort étudié au cours
des 20 dernières années. Plusieurs équipes de chercheurs se sont non seulement penchées
8
sur leurs comportements reproducteurs particuliers (Blouw, 1996; Bronseth and Folstad,
1997; Dufresne et al., 1990; Fitzgerald, 1983; Ridgway and McPhail, 1988), mais
également sur leur diversification (Kraak et al., 2001; Kristjansson et al., 2002; Taylor and
McPhail, 1999). Ainsi, une somme importante d'information est aujourd'hui disponible sur
la biologie, l'écologie et l'évolution de cette espèce.
La stratégie de reproduction des épinoches se rapproche fortement du modèle de
Parker et collaborateurs puisqu'elle renferme deux tactiques de reproduction similaires.
Ainsi, les mâles gardiens vont établir et protéger agressivement un territoire (mâles
territoriaux). Ils construisent également un nid avec des algues afin que les femelles
viennent y laisser leurs œufs suite à des efforts de séduction. Ces mâles offriront des soins
parentaux jusqu'à ce que les jeunes atteignent le stade d' alevin. Ils adoptent également une
forte coloration rouge au niveau de la gorge et bleue au niveau des yeux. Quant aux mâles
furtifs (mâles non territoriaux), ils vont errer près du nid d'un mâle gardien et relâcher leur
semence de façon furtive.
Un des grands avantages à travailler avec cette espèce est la facilité avec laquelle elle
se reproduit en laboratoire. De plus, leurs spermatozoïdes restent actifs pendant plusieurs
heures (Elofsson et al., 2003a; Elofsson et al., 2003b), ce qui facilite les manipulations et la
prise de mesures sur la cinématique des spermatozoïdes.
9
La population étudiée est anadrôme et se reproduit dans les marelles du marais salé de
l'Île Verte (située dans la réserve faunique nationale de la Baie de l'Île Verte à près de 200
km à J'est de la ville de Québec, Canada). En se reproduisant dans ce système de marelles
(petits étangs remplis par les hautes marées printanières), les individus se retrouvent
confinés par petits groupes isolés les uns des autres. Malgré ce petit nombre, les individus
d'une marelle se trouvent en contact avec leurs rivaux, et ce, dans un espace restreint. Cet
espace limité favorise les interactions et la compétition entre les mâles.
L'évaluation du comportement reproducteur chez l'épinoche
La plupart des études sur les tactiques de reproduction des épinoches n'évaluent ce
comportement qu'une fois et le jugent généralement fixe et stable chez chaque individu.
Dans certaines études, la détermination de la tactique de reproduction est effectuée par
l'observation d'un mâle isolé ou d'un mâle confronté à une feme lle ou encore à un seul
autre mâle pour déterminer si le mâle est territorial ou non (Barber and Amott, 2000;
Barber et al., 2000; Whoriskey, 1991). Un individu isolé devient plus facilement territorial
qu'un individu qui doit faire face à plusieurs mâles lors de la construction de son nid et la
défense de son territoire en milieu naturel. Ainsi, bien des mâles pourraient être territoriaux
dans une situation isolée en laboratoire et ne pas l'être en milieu naturel. L' étude de ces
comportements et la détermination de critères fiables discriminant les deux comportements
reproducteurs deviennent donc plus difficile. Par exemple, FitzGerald et Kedney (1987) ne
sont pas arrivés à mettre en relation l'agressivité, l'aptitude au combat et la capacité à
10
obtenir un territoire. Ils expliquent leur insuccès par la difficulté à quantifier ces
comportements.
D'autres études ont fait l'évaluation des comportements reproducteurs en laboratoi re
par petits groupes d'individus (Cubillos and Guderley, 2000; Dufresne et al., 1990), ou
l'ont observé en milieu naturel (Guderley and Guevara, 1998; Largiader et al., 2001). Cette
approche est plus réaliste, mais ne représente qu'un événement ponctuel qui pourrait être
modulé par d'autres facteurs.
Bien que plusieurs études se soient questionnées sur le comportement reproducteur de
cette espèce, à notre connaissance, aucune étude ne semble s'être interrogée sur la
récurrence de la tactique adoptée par un individu. Pour savoir si les individus sont
strictement territoriaux ou non territoriaux, chacun des individus devrait être soumis à
différents groupes sociaux. Ainsi, si le comportement reproducteur est conditionnel à
l'environnement social, certains individus ne devraient pas conserver la même tactique de
reproduction dans les différents groupes sociaux rencontrés.
En étudiant la récurrence de la tactique adoptée par un individu, plusieurs éléments
doivent être pris en considération. En essayant de provoquer à plusieurs reprises un cycle
de reproduction, il serait difficile d'évaluer ou de quantifier l'effort qui serait associé d' un
cycle à l'autre. Il serait également difficile de comparer l'investissement des individus qui
auraient obtenu des œufs de ceux qui n'en auraient pas eu. En plus, parmi ceux ayant
11
obtenu des œufs, il serait difficile d ' identifier ceux qui pourraient avoir mangé de leurs
œufs, ce qui constitue une excellente source alimentaire.
Objectifs spécifiques
1- Déterminer si les mâles gardiens, malgré un investissement énergétique substantiel
dans les caractères sexuels secondaires (construction d'un nid, défense d'un territoire,
efforts de séduction, coloration nuptiale, soins parentaux), ont une semence d'aussi bonne
qualité que les mâles furtifs qui n'investissent pas dans ces caractères.
Dans la population à l'étude, la reproduction s'effectue dans une eau généralement
stagnante. La motilité des spermatozoïdes prend ainsi une place extrêmement importante
(Balshine et al., 2001). Au niveau de l'investissement énergétique associé à la reproduction,
les mâles territoriaux sembleraient investir davantage d'énergie dans les caractères sexuels
secondaires que les non territoriaux. Ainsi, par l'énergie non investie dans les traits sexuels
secondaires, les mâles non territoriaux pourraient investir plus d'énergie dans la
spermatogenèse. La qualité de leurs gamètes pourrait être un moyen pour eux de compenser
leur faible accessibilité aux femelles. La stratégie de reproduction de l'épinoche mène donc
les mâles non territoriaux à toujours faire face à la compétition spermatique, alors que les
mâles territoriaux n'auront pas nécessairement à y faire face.
Plus l'intensité de la compétition spermatique est forte, plus les forces sélectives
favorisent le développement de différences au niveau des caractéristiques spermatiques
12
entre les stratégies de reproduction (Balshine et al., 2001; Leach and Montgomerie, 2000;
Simmons and Kotiaho, 2002). Il a également été reporté qu'il y avait une importante
variation des paramètres spermatiques lié à une forte et rapide diversité de la morphologie
et du comportement des spermatozoïdes, et ce, tant à l'échelle inter- qu'intraspécifique
(Snook, 2005). Pourtant, peu d'adaptations au niveau de l'éjaculât et des spermatozoïdes
sont connues pour les mâles gardiens et elles sont surtout connues chez les salmonidés
(Taborsky, 1998). Les différences les plus observées ne concernent que l'éjaculât et
l'investissement dans les gonades, alors que plusieurs paramètres de la compétition
spermatique
peuvent
être
déterminants.
En
effet,
d'autres
caractéristiques
des
spermatozoïdes, telle que la vitesse de nage, la viabilité et l'endurance des spermatozoïdes,
peuvent être très importantes lors de la fertilisation et varier selon les espèces (Snook,
2005) ou encore selon les tactiques .
Hypothèse:
La quantité d'énergie pour la reproduction étant limitée, les mâles furtifs qUI
n'investissent pas autant que les mâles territoriaux dans les caractéristiques sexuelles
secondaires auront plus d'énergie à investir au niveau de leurs gamètes (cinématique des
spermatozoïdes, indice gonado-somatique, concentration du sperme et nombre total de
spermatozoïdes ).
Prédiction:
Les mâles furtifs possèderont des caractéristiques spermatiques favorisant leur
potentiel reproducteur face à celles que possèdent les mâles territoriaux.
13
2- Évaluer dans quelle mesure la capacité métabolique des spermatozoïdes est
corrélée avec leur motilité.
Les connaissances sur le métabolisme des spermatozoïdes des téléostéens sont
principalement basées et limitées à quelques espèces de cyprinidés et de salmonidés
(Gronczewska et al., 2003). Elles sont également orientées vers le suivi des paramètres des
spermatozoïdes (motilité et viabilité) ou de marqueurs métaboliques (consommation en O 2,
la production d'ATP, et la métabolisation de différents éléments phosphatés) suite à
différentes modifications du milieu dans lequel ils évoluent (inhibiteurs métaboliques, des
substrats, des coenzymes et en modifiant la concentration en oxygène) (Dreanno et al. ,
1999; Gronczewska et al., 2003; Lahnsteiner et al., 1999). Peu de mesures de la capacité
métabolique des spermatozoïdes ont été réalisées chez les poissons.
À
l'heure actuelle, peu de travaux ont utilisé l' activité enzymatique des
spermatozoïdes comme indicateur de leur capacité métabolique (Ruiz-Pesini et al., 1998;
Rui z-Pesini et al., 2000). Ruiz-Pesini et al. (2000) ont trouvé que plus l' activité
enzymatique mitochondriale au niveau des différents complexes de la respiration cellulaire
était grande, meilleure était les caractéristiques spermatiques des hommes étudiés (motilité,
viabilité et concentration du sperme). Dans une autre étude portant sur la Truie arc-en-ciel,
il a été démontré que l'activité enzymatique spermatique de la malate déhydrogenase et de
l'aspartate aminotransférase était relié à la capacité de fertilisation (Lahnsteiner et al. ,
14
1998a). Un lien indirect peut donc être fait entre la motilité et l'activité enzymatique
puisqu'ils ont également trouvé que la motilité des spennatozoïdes était aussi associée à la
capacité de fertilisation.
Bien que les connaIssances sur le métabolisme des spermatozoïdes permettent de
décrire les différentes voies métaboliques, peu d'infonnation sont disponible sur leur
importance, leur efficacité et leur fonctionnement (Gronczewska et al., 2003; Lahnsteiner et
al., 1999; Mansour et al., 2003). L'importance de la relation entre le métabolisme et la
performance des spermatozoïdes reste donc à documenter et devient particulièrement
intéressante dans un système où d'importantes forces sélectives (compétition spermatique
et sélection sexuelle) sont présentes.
Hypothèse:
La performance des spermatozoïdes est limitée par leur potentiel énergétique estimé
par l'activité enzymatique des différentes voies métaboliques.
Prédiction :
La capacité métabolique des spermatozoïdes devrait être positivement corrélée à la
motilité des spermatozoïdes.
Ce projet vise une approche multidisciplinaire intégrant l'étude du comportement, de
la physiologie et de l'évolution dans le but de répondre à des questions traitant du lien qui
peut exister entre les capacités reproductrices d'un individu et la tactique de reproduction
15
que ce dernier adopte. Cette étude semble d'ailleurs être parmi les premières à se pencher à
la fois sur les caractéristiques des spernlatozoïdes et leur capacité métabolique en relation
avec le concept de la compétition spermatiques, et ce, peut importe le genre animal. De
plus, elle compte parmi les rares études à considérer l'importance du comportement
reproducteur dans l'interprétation des différents traits spermatiques.
16
ARTICLE
Sperm traits and sperm metabolic capacity in three-spined
stickJeback males showing alternative mating tactics.
Côté, J., F. Dufresne and P .u. Blier
Département de Biologie, University du Québec à Rimouski, 300 allée des Ursulines,
Rimouski, Québec, Canada G5L 3Al. Tél: (418) 723-1986 ext. 1612, Fax: (418) 724-1849
Corresponding author: Côté, J. Cjonathan [email protected])
Keywords : Three-spined stickleback, Sperm competition, Reproduction, Behaviour,
Metabolism, CASA, Gasterosteus aculeatus.
17
Abstract
Male three-spined sticklebacks (Gasterosteus aculeatus) show unequal energetic
expenditure upon reproduction as sorne males become territorial (TM) and spawn singly
with females whereas other males are non territorial (NTM) and attempt to steal
fertilisations from territorial males. We examined the possible influence of sperm
competition on various sperm parameters (motility, velocity, % rapid, production,
longevity, and metabolic capacity) in 120 males showing alternative mating tactics.
Territorial status was assessed by introducing groups of 10 males in small wading pools
and recording the number of males with and without nests. Males [Tom aIl four wading
pools were remixed and territorial status was re-assessed. This allowed us to discriminate a
group of males with a 'facultative' mating tactic i.e. those that had failed to nest the fi rst
time and that renested in the second trial and those that nested in the fist trial but failed to
nest in the second trial (FTM). A discriminant function analysis on 10 selected variables
revealed significant differences among each tactic and showed that the gonado-somatic
index (GSI) was globally the most discriminant variable and was associated with the TM
tactic. Interestingly, FTM were an intermediate group between TM and NTM. No
differences in sperm motility and velo city were found among males with alternative tactics.
Sperm stayed active for more than 20 hours and lost about 30% of its initial velo city and
50% of motility. TM tended to lose more sperm velocity and a significantly higher
percentage of rapid sperm over time than non territorial males. There were no differences in
citrate synthase (CS) and pyruvate kinase (PK) activities among males with alternative
mating tactics. Curiously, we found no relationship between sperm velocity and CS activity
and an unpredicted significant negative relationship between sperm veJocity and PK
activity. This suggests that mitochondrial content may not be limiting for sperm motility
and that endurance rather than high power performance (fast motility) is a key parameter of
sperm physiology to optimize fertilization success in this species.
18
Introduction
Spenn competition, defined as spenn or ejaculate of more than one male competing
for the fertilisation of a given set of ova (Parker, 1970; Parker, 1990), is recognized as
being responsible for an important variation in spenn parameters (Snook, 2005). This
variation can be described as a high and rapid diversity in spenn morphology and
behaviour, both between and within species. Fish species with alternative reproductive
tactics represent good models to examine the effects of selection on sperm parameters
because the unequal somatic energetic expenditures associated with each tactic could
translate into differential gonadal investment. As the intensity of sperm competition
increase the selective forces of sperm competition should result in differences in spenn
characteristics between tactics.
Sperm number is one of the most common traits found to be sensitive to sperm
competition pressure (Parker, 1998), although it do es not al ways translate into higher
fertilization success (Simmons et al. 2003 in Snook 2005). The gonado-somatic index is
assumed to represent a relative measure of sperm investment and is commonly found to be
higher in sneaker than in territorial males (Taborsky, 1998). Even if sperm quantity is an
important parameter in tenns of fertilisation success, sneakers should invest more in sperm
quality to raise their reproductive potential (Fu et al., 2001; Taborsky, 2001). Sperm quality
can be defined as spenn swimming speed, spenn motility and longevity. For example,
spenn velocity has been shown to be the primary detenninant of fertilisation success in
19
Atlantic salmon (Gage et al., 2004). Empirical results on Atlantic salmon reveal that parr
males invested more in sperm motility and sperm number than parental males relative to
their body size (Vladic and Jarvi, 2001). In bluegill sunfish, sneakers had a 50% more
concentrated sperm but a lower total sperm number compared to parental males (Leach and
Montgomerie, 2000). Further investigations in this species have also shown that sneakers
possessed faster initial sperm swimming speed (Bumess et al., 2004). They also confirmed
the existence of a trade-off between sperm motility and longevity with sneaker males
having a shorter duration of sperm motility.
Energetic metabohsm of spermatozoids should be tightly related to sperm
performance since the metabolic apparatus is limited by the cellular volume available.
Energetic pathways have been described in sorne studies (see Lahnsteiner et al., 1999) and
used as an indicator of sperm quality (Gronczewska et al., 2003) but these studies have
been performed on a limited number ofteleost species (mostly cyprinids and salmonids). In
the context of sperm competition, very few studies have examined sperm metabolism (but
see Bumess et al., 2004). In a research on the determination of sperm quality of rainbow
trout, sperm metabolism parameters (malate dehydrogenase activity and aspartate
aminotransferase activity) and sperm motility parameters (motility rate and total swimming
velocity) have been related to fertilization success (Lahnsteiner et al., 1998a). Although
many measurements on sperm metabolism have been performed, very few studies have
directly correlated sperm enzymatic activity with sperm quality. Moreover, to our
20
knowledge only few studies on fish had directly linked the sperrn performance to their
metabolic capacity (Lahnsteiner et al., 1998a).
The three-spined stickleback (Gasterosteus aculeatus) is an excellent model to
examine the impact of natural selection on sperrn characteristics. The reproductive
behaviour of this teleost species has been intensively studied during the past 20 years
(Blouw, 1996; Bronseth and Folstad, 1997; Dufresne et al., 1990; Fitzgerald, 1983 ;
Ridgway and McPhail, 1988). The reproductive strategy of three-spined stickleback is
similar to the Sneak-Guard model (Parker, 1970; Parker, 1990) but showed less differenc ed
phenotypes associated to each tactics compared to other model species. During the
reproductive season, sorne males defend a territory, build a ne st in which the female deposit
her eggs, and provide parental care (TM). Other males are unable to defend a territory and
attempt to steal TM fertilizations (Non-Territorial Males; NTM). Therefore the intensity of
sperrn competition should be lower for TM and higher for NTM since the latter always
compete with TM but the TM will sometimes spawn singly with females. Reproduction
likely represents a substantial energetic expenditure in TM considering sexual secondary
traits and behaviours involved in reproduction (red coloration, aggressiveness fanning,
courtship effort, territory defence, and nest construction). If the energy available for
reproduction is limited, we expect a trade-off between somatic and gonadal investments.
Hence, we predict that NTM will invest more in sperrn quality and quantity than TM.
21
The principal objectives of this study were to detennine 1) if male sticklebacks with
altemate reproductive tactics possess sperm with different characteristics (motility and
longevity) and 2) if spenn metabolic capacity is a significant determinant of sperm
performance and how natural and sexual selection has modulated basic processes of sperm
motility. The three-spined stickleback is unusual among fish species in that its sperm has
been shown to last for over 10 hours (Elofsson et al. , 2003a). Thus our study will be one of
the first to examine the effects of selection on sperm traits and perfonnance in a species
with long-lasting sperm. It is also one of the first studies to look at sperm traits and enzyme
activities with respect to spenn competition in any animal. In addition sperm traits and their
interactions will be interpreted considering the reproductive constraints of each tactics.
Methods
Fish sampling
The sticklebacks were coUected in the saltmarsh of the Baie de l'Isle-Verte National
Wildlife Area, about 200 km northeast of Quebec City along the south shore of the
St.Lawrence Estuary. This anadromous population spends most of the year in the estuary
and migrates to small tidal pools following flooding of the marsh area at each high spring
tide. Sampling took place on four occasions, from the end of May until the middle of July
2002, immediately following a high spring tide to ensure that the fish were newcomers to
the marsh and had not yet spawned.
22
Fish were trapped by leaving small box traps ovemight in various pools. They were
sorted in the field and brought to the aquaculture station of the university and kept in
continued circulation basins until the beginning of the experiments. They were fed
periodically ad libitum with blood worms (Hikari).
We only selected males that showed sorne breeding colors (blue eyes and red throat)
to avoid misidentification with non-gravid females . AU males were identified by inserting
small pieces of colored plastic wires on their dorsal and pel vic spines. The femal es were
not tagged and were chosen only if they were gravid.
Assessment of territoriality
Fort y males were selected at each period of the reproductive season; May 29 1h , June
1h
l6 and 28
1h
,
1h
and July 19 2002. We had to omit the fourth cohort from the middle of July
as these males no longer built nests in the laboratory. Ten males of various sizes and
coloration were each introduced into four plastic wading pools measuring 1.S2m in
diameter fiUed with water of similar salinity to water from tide pools. Sand, algae and rocks
were added to the pools to mimic their natural environrnent. The light cycle was adjusted to
16 ho urs daylight and 8 hours of darkness and the water temperature was maintained at
room temperature (25°C). Eight females were added in each of the four pools to stimulate
the nesting behaviour of the males.
23
The nesting behaviour of the males was assessed 48 hours following the introduction
since a previous study showed that no further territories were built after this time period
(Dufresne et al., 1990). Males with nests were assigned territorial status (TM) and those
without were assigned the non territorial status (NTM).
In order to better define the reproductive status of each male, we remixed the fort Y
males and reintroduced them in new groups of ten males and reassessed their nesting
behaviour. Females were not reintroduced the second time around. We re-assigned males
according to three tactics: males that re-nested a second time were assigned the territorial
male (TM) status, males that failed to re-nest were assigned the facultative territorial (FTM)
status and those that failed to nest two times in a row or switch from non territorial to
territorial males were assigned a non territorial male (NTM) status.
Morphological measurements
Prior to the re-nesting experiments, the intensity of red coloration (COL) was
assessed independently by two evaluators on a scale of 1 (individu al without red or blue
coloration) to 5 (dark red that spread over the throat and bright blue eyes). The score was
calculated by averaging the value obtained by the two evaluators.
The fish were sacrificed to obtain the sperm directly from their gonads as it was not
possible to ob tain sperm from rubbing their abdomens (Largiader et al., 2001 ; Elofsson et
al., 2003a and 2003b; but see Defraipont et al., 1993). Length (LF), total wet mass and
24
gonad mass were measured. The condition index (CI) was estimated following Fulton's
condition factor: total weight x LF 3 . The gonado-somatic index (GSI) was ca1culated from:
gonad mass / total mass. The age was estimated following Dufresne et al. (1990), with
males measuring less than 6.5cm were aged 1+ and more than 6.5cm were aged 2+.
Sperm motility measurements
Fifteen to twenty-five microlitters of sperm activation solution was pipetted on the
gonads and these were crushed with fine capillaries to release as much sperm as possible.
We didn't use an inactivating solution because the sperm of stickleback is already activated
in the gonads in comparison to other species (Kime et al., 2001). Time of sperm post
activation was th en estimated from the moment when the sperm activating solution was
added on the gonads and the sperm analysis was made as quickly as possible.
From the extracted volume of sperm, 3.5 III was diluted in five volumes fo r
kinematics measurements and the remained volume was cryopreserved for further
metabolic analysis. The sperm activation solution was qui te similar to the Cold extender (4
OC) used in Lahnsteiner et al. (1998b) for salmonid fishes (NaCI 103mM, KCI 40mM,
CaCh ImM, MgS0 4 0.8mM, Hepes 20mM (pH 7.8), Sucrose 15mM, Methanol 10% and
bovine serum albumine 1.5%) but without eggyolk.
Spermatozoa kinematics were determined using a ceU Computer Assisted Sperm
Analysis (CASA) system from Hamilton-Thome Biosciences (CEROS 12.1). The settings
25
used to measure sperm motility were: 50 frames at 60Hz of acquisition rate; photometer,
50-55; minimum contrast, 30; minimum cell size, 2 pixels; static intensity gates, 0.17 min
and 2.28 max; static size gates, 0.38 min and 3.00 max; static elongation gates, 38 min and
100 max; and magnification factor, 2.04. The microscope stage was cooled at 12±0.1°C and
the frosted slides were also cooled before the analyses.
The parameters recorded for each sample were:
path velocity (V AP as the average path velocity of sperm, j.!m/s); progressive velocity
(VSL as the straight line distance from beginning to end of a sperm track divided by the
time taken, j.!m/s); curvilinear velocity (VCL as a measure of the total distance traveled by
a given spem1 divided by the time elapsed, j.!m/s); laterai amplitude (ALH as the mean
width of sperm head oscillation, j.!m); beat frequency (BCF as the frequency of the sperm
head crossing the sperm average path, Hz); and straightness (STR as VSLlV AP x 100, %).
To describe sperm velocity distribution we considered that motile sperm had a path
velocity higher than 7.4j.!m/s. Slow cells were added to static category because sorne
immobile cells moved with the drift into the analyzed fields. The percentage of motile
sperm (MOT) has been split into two categories to create a class of really rapid sperm.
Spermatozoids were attributed a rapid status (RAP) wh en their path velocity was higher
than 40j.!m/s (swimming speed that a low percentage of spermatozoids were able to reach in
preliminary analysis). The remained percentage of motile sperm (40.0 < V AP < 7.4j.!m/s)
were considered as medium sperm (MED).
26
To estimate spenn kinematics, 10 fields per slide were arbitrary chosen to cover the
extent of the slide. The average cell per frame was adjusted to be around 100 cells by doing
further dilution if necessary, so an average of 1100 individual spennatozoa were tracked
per individual.
Spenn longevity (index of spenn duration) was determined by lost of motility and
velocity. Sperm analyses were performed at three different times (new slide at each time)
for up to 24 ho urs and the semen was conserved at 4°C between each analysis. We could
not set a fixed time period for ail slides because of logistic constraints but the y have been
regrouped in three ranges of time (Time 1 Oh15±Oh10; Time 2 10h08± lh56 ; Time 3
20h23±lh49). Regression analyses allowed the measurements of the rate of lost on path
velocity (RL VAP), rapid percentage (RLRAP) and motile percentage (RLMOT). These
values were attributed to each individual.
An estimated total nurnber of sperm (TOTSPERM) was calculated UStng sperm
concentration as estimated from the spennogramm analysis multiplied by the sum of the
mass of gonads expressed as a volume and the volume of sperm activation solution put on
the gonads.
We also preferred to express sperm concentration per gram of gonad (SCPG) because
we did not have a precise value for the total amount of spenn that the gonads contained.
27
Therefore we used the estimated total number of spermatozoids and the mass of the gonads
to calculate the sperm concentration.
Sperm metabolism analyses
The extracted semen was diluted in three volumes of sperm activation solution and
incubated for 15-20min on ice before freezing in liquid nitrogen. The samples were frozen
in 2ml cryopreservation vials to allow a large air space between the sperm sample and the
lid, (Waymann and Tiersch, 2000). After incubation, the samples were suspended between
lcm (-130°C) to 2cm (-100°C) above the level ofliquid nitrogen for at least 10min before
immersion. For thawing, the vials were left at room temperature for exactly 30sec before
being put on ice (modified from Lahnsteiner et al., 1998b).
Enzyme activities were assayed using a UVNis spectrophotometer (Perkin Elmer,
Lamda Il). The temperature of the cell holder was controlled with a circulating
refrigerating water bath at 25°C. The assays for Pyruvate kynase (PK) followed the
disappearance ofNADH at 340nm. Citrate synthase (CS) was monitored at 412nm to detect
the transfer of sylphydryl groups to the 5,5' dithiobis-2-nitrobenzoic acid (DTNB). The
extinction coefficients for NADH and DTNB were respectively 6.22 and 13.6 ml cm- 1
Ilmor1 . The sample of the extracted sperm solution (thawed from cryopreservation) was
homogenated with a Wheaton micro tissue grinder for 2 min on ice. The sample volume
have been adjusted to provide a response which was linear for at least 2 min, but reactions
were followed for 5 min. Multisubstrate reactions were started by the addition of the
28
substrate which was omitted for the control. The reaction medium contained DNTB (0.1
mM), Acetyl-CoA (0.1 mM), Oxaloacetate (0.15 mM) and Tris-HCl (100 mM, pH=8.0) for
CS analyses and NADH (0.15 mM), Phospho(enol)puruvic acid (5 mM), LDH (0.6 U /ml),
MgCh (10 mM), KCI (100 mM), ADP (5 mM) and Tris-HCl (50 mM, pH=7.0) for PK
analyses. The concentrations have been optimized so that the activity was directly
proportional to the quantity of enzyme added to the reaction medium. AlI assays were run
in duplicate. The activities are expressed in units (!lmol substrate transformed to product
. -1) 106 spermatozoa-1 .
mm
Statistical analysis
Analyses were performed usmg SYSTAT verSiOn 10 (SPSS Ine, 2000). The
assumptions for parametric tests were verified prior to each test. If transformation proved
impossible non-parametric statistics were used.
Discriminant function analyses (DF A) were performed to determine which variables
predieted the tactics used by sticklebacks. We discarded every variable that had co-linearity
except those that were biologicalIy relevant. A high tolerance (over 0.50) was required for
each variable. The homogeneity of within-group variance-covariance was graphically
checked by plotting the scores and looking if the spread of points of each group was similar
(Tabachnick & Fidell, 1996 in Quinn and Keough, 2002).
29
Four factor ANOV A were also performed to test for differences in morphologie traits
and sperm parameters among reproductive tactics, age, sampling time and experimental
pools (nested in period of sampling). These tests were also performed excluding FTM to
examine differenees between TM and NTM.
A Territorial Spermatie Index (TSI) was constructed by ehoosing various sperm
parameters favoring one or the other tactic (eq. 1). This index included key parameters that
may have an influence on sperm competition taking in consideration the reproductive
eontext of each tactics. The numerator of this funetion was estimated by the product of the
parameters that favored TM and the ones that favored NTM were included in the
denominator.
(Equation 1)
TSf
= Parameter favoring
TM => PTM , * PTM2 •• .
Parameter favoring NTM
PNTM , * PNTM 2 •.•
... * PTMi
... * PNTMj
Results
Territoria/ityassessment
After the first nesting trial, 55 males exhibited the territorial reproductive tactic (TR)
and 58 did not nest (NTM) with an average of 4.5±1.3 (from 2 to 7 territorial males per
pool) territorial males per pool. Twenty five territorial males were 1+ males (45 %) and the
30 other were 2+ males (55%). In the second nesting trial, 44% of the TM became non
30
territorial and 24% of the NTM became territorial. Twenty seven percent of the males
remained territorial twice in a row and 39% of the non territorial males remained non
territorial.
Mating tactic discrimination
We perforrned discriminant function analyses to deterrnine which variables allowed
us to distinguish males on the basis of their mating tactics. We selected 10 variables from
the 32 available ones to build the model of discriminant function analysis (fig. 1). The
following variables (lateral amplitude, ALH; beat frequency, BeF; straightness, STR;
percentage of rapid sperrn, RAP ; sperrn concentration per gram of gonad, SCPG; rate of
lost on path velocity, RL VAP; totallength, LF; gonado-somatic index, GSI; fish coloration,
COL; citrate synthase activity, CS) discriminated significantly each reproductive tactic
(P<O .OOl ; Wilk's lambda = 0.446).
The gonado-somatic index was globally the most discriminant variable and was
associated with the TM tactic. The other variables only revealed very small differences
among the three tactics. However, sperrn concentration and fish coloration also showed
some power at discriminating respectively the NTM and the FTM. This discriminant
function analysis revealed that the FTM was a middle group between NTM and TM males.
The TM had a significantly higher gonado-somatic index (FZ•86= 26.8, P <0.001) than
NTM and FTM (TM > FTM > NTM). Despite an overall significant relationship between
31
condition index and gonado-somatic index (r=0.521, df=54, P<O.OOI, fig.2) , the condition
index did not discriminate males on the basis of their mating tactics (F2 ,86=1.78, P=0.175) .
The relationship between the condition and the gonado-somatic index was only significant
in NT males (r=0.579, P<O.OO l , n=44).
Territorial spermatie index
We designed a territorial spermatic index (TSI) by taking into account sperm traits
that showed significant or nearly significant differences among tactics (TOTSPERM:
F 2 ,86=3,8, P=0.026; RAP: F t ,36=3.8, P=0.059; RLV AP: F 1,54=3.5, P=0.067) and other key
parameters involved in sperm competition. Our reasoning was that it may be more relevant
to examine a suite of sperm traits rather than single ones to discrimate mating tactics. We
deliberately decided to oppose parameters that were favourable to TM against the ones that
favoured NTM (tab. 1). The characteristics chosen to build the TSI were; sperm path
velocity (V AP), percentage of rapid sperm (RAP) and estimated total sperm number
(TOTSPERM) advantaging TM and lost of path velo city (RLV AP), percentage of motile
sperm (MOT) and sperm concentration per gram of gonad (SCPG) advantaging NTM.
Using these parameters as a who le, there was a significant difference between the TM and
NTM (F2 ,86=6.8 , P=0 .002; Tuckey test, P=0 .005).
Sperm longe vity
The stickleback's sperm stayed active for more than 20 ho urs under our experimental
conditions (fig. 3). During this time frame, it lost about 30% of its initial velo city (28.1 to
32
18.8 Ilm/sec). The Joss of the velocity seemed to follow a logarithmic function but the
percentage of motile sperm appeared to decrease in a linear fashion. After 20 hours, over
50% of motile sperm was lost as the percentage dropped from 20.1 to 8.8%. The sperm of
TM tended to loose sperm velocity at a faster rate than NTM (RLV AP, F 1,54=3. 5, P=0.067).
The percentage of rapid sperm decreased significantly faster in TM as compared to NTM
(RLRAP, F I,38=7.5 , P=0.009). However, there was no difference in the rate Joss of the
percentage ofmotile sperm between the reproductive tactics (RLMOT, F 1,54=1.3, P=0.256).
Sperm metabolism
There was no difference
ln
the activity of citrate synthase and pyruvate kinase
between the TM and NTM (PK; F 2 ,41=0.08, P=0.921 and CS; F 1,29=1.7, P=0.201). We
expected to see a correlation between enzyme activity and sperm motility. In contrast, the
performance in term of path velocity (V AP) was negatively related to the enzyme activity
of pyruvate kynase (PK; r= -0.332, P=0.003, n=77) but not with the activity of citrate
synthase (CS ; rs= -0.199, P=NS , n=80). From the present study it appeared that sperm with
a lower swimming speed have higher PK activity than sperm with higher velocity.
Furthem10re, both PK and CS were negatively related to relative sperm production
(TOTSPERM: PK; r= -0.732, P<0.001, n=77 and CS; r= -0.687, P<O.OOI , n=80) , sperm
concentration per gram of gonad (SCPG: PK; r= -0.707, P<0.001, n=77 and CS ; r= -0.740,
P<O.OOI, n=80), and gonado-somatic index (GSI: PK; r= -0.476, P<O.OOI , n=77 and CS;
rs= -0.332, P<O.OI , n=80) (fig. 4).
33
Discussion
Sperm motility and longevity
Theoretical and empiricaJ studies have revealed that sperm competition can be
powerful at selecting characteristics that help maximise reproductive success in males wi th
alternative reproductive tactics (Parker, 1990). Fast sperm (here defined in terms ofvelocity
and motility), has been shown to be an important factor in reproductive success (Snook,
2005). Results from our study failed to reveal differences in sperm velocity and motility
among males with different reproductive tactics but showed that TM tended to Jose more
sperm velocity and a significantly higher percentage of rapid sperm over time than non
territorial males. It is not clear whether the differences in motility loss are biologically
meaningful since sticklebacks eggs can be fertilised for roughly 3 hours (Thomopoulos,
1953) and most of the differences appear to take place after 10 hours. The lower decline in
rapid sperm in non territorial males may translate into higher fertilization success. Previous
work on Atlantic salmon (Vladic and J arvi, 2001) has shown that parr (NTM) sperm have a
higher percent motility than sperm from anadromous males. In bluegill sunfish, sneakers
had initially faster swimming spem1 than parental males (Bumess et al., 2004). Faster
motility is assumed to be under selection in sneakers because they always spawn in
presence of territorial males whereas the latter often have unique access to females. In the
Atlantic salmon, the sneaker males also have a longer duration of sperm motility (Vladic
and Jarvi, 2001). Each reproductive strategy has its particular constraints and the sperm
34
characteristics that are important for fertilisation are likely to vary among species (Snook,
2005). In bluegill sunfish, the majority of female's eggs are fertilized within 5 to lOs after
ejaculation (Bumess et al., 2004) so it is likely that small initial motility differences may
translate into differential fertilization success. By contras t, the fact that sticklebacks eggs
can be fertilized for a much longer time frame suggest that, long-lived sperm may be
favoured in this species. Species that reproduce in still water typically have long-lived
sperm whereas species that reproduce in turbulent water often have short-lived sperm
(Balshine et al., 2001; Taborsky, 1998). The anadromous population studied here spawn in
sm ail ponds. Therefore motility, velo city and sperm longevity should be key parameters for
fertilization success in three-spined sticklebacks.
Sperm production
Territorial males invested significantly more in their gonads (gonado-somatic index)
and produced a greater relative number of spermatozoa than non territorial males. OSI was
the most significant factor discriminating stickleback males with different reproductive
tactics. There were no significant differences in sperm concentration among males showing
different reproductive tactics. Our results are at odds with what is found in the literature. It
has been reported that sneakers in bluegills and Atlantic salmons invest more than parental
males in sperm production relatively to their body size and also in sperm concentration
(Leach and Montgomerie, 2000; Vladic and Jarvi, 2001). These studies also revealed that
the relative investment in gonads (OSI) and sperm production is higher for sneakers in
35
accordance with theory. It could be that sperm longevity is a more important factor than
sperm number for fertilization success in sneakers three-spined sticklebacks.
Sperm duration
The three-spined stickleback is unusual in that its sperm can swim for up to 24 hours
(Elofsson et al., 2003a). As explained above, species living in static water often have
longer-lived sperm than species living in fast flowing water. Laboratory conditions also
play an important role in determining sperm duration. The ionic composition of the
artificial medium required for the laboratory analyses can also affect sperm kinematics
(Lahnsteiner et al., 1999) and can extend considerably the duration of sperm motility from
a few minutes to several hours (Elofsson et al. , 2003a). A previous study on stickleback
sperm revealed a higher percentage of motile sperm and more motile sperm than what was
found in our study. The differences between our results and the ones from Elofsson et al.
(2003a), VSL around 42 vs 25)lm/s, are probably associated with temperature at which the
analyses were performed (12°C in our case as opposed to 20°C), the sample storage
temperature used between each analysis, and the medium (activation sperm solution). In
fact, the sperm velo city is higher and has a shorter duration at 20°C than at 12°C
(unpublished data). Threshold values used to define motile sperm may vary among studies
making difficult the comparison of this parameter. The technique we used to extract the
sperm may also have increased contamination with interstitial and intracellular fluid and
included more immature spermatozoa (Lahnsteiner et al., 1998b). The other study
perfoffi1ed on three-spined sticklebacks from the same population report a sperm longevity
36
of 440 sec (Defraipont et al. , 1993) but these results must be interpreted with caution since
the sperm was obtained from stripping and di luted solely with water. Our preliminary
analysis showed that without adding buffer, mostly sperm were rapidly fixed on the slide.
Interactions between sperm traits
Taking together the most important characteristics involved in sperm competition, we
built a territorial spermatic index (TSI). We suggest that the interactions of two or more
sperm characteristics may be more important than single parameters wh en considering
selection on sperm parameters. For example, the velocity of a spermatozoa may not matter
if it do es not stay active long enough to fertilize the eggs. It is also important to consider
sperm traits in function of the different constraints faced by each tactic. Female three-spine
sticklebacks spawn in a nest in close contact with TM whereas NTM always face sperm
competition and often release sperm at sorne distance from the nest. Therefore a TM could
benefit of a sperm that will be fast (RAP, VAP) and the NTM could take advantage of a
sperm that will stay active for a longer period (MOT, RLV AP). The relative total sperm
nurnber was higher in TM, so NTM should benefit by having more concentrated sperm as
seen in bluegills (Bumess et al. , 2004). The significant difference in the index value of each
tactic reveals that such an integrative index is a good approach to investigate the
interactions among different sperm traits.
37
Reproductive tactic determination
Our results suggest that reproductive behaviour is not fixed in three-spined
stickleback. Many males that were classified as non territorial in the first trial became
territorial in the second trial and other males switch from territorial to non territorial. Thus
the social environment alone can induce a switch in the reproductive tactic of a single male.
These results are highly relevant since all previous studies that have attempted to correlate
sorne factors with territorial status have defined territorial males on the basis of a single
trial. Furthermore, most studies have examined territorial status by competing males in
pairs (Barber et al. , 2001; Barber et al. , 2000; Whoriskey, 1991; Zbinden et al., 2004). Our
results also revealed that the facultative territorial group of males (FTM) was a middle
group between non territorial and territorial males, therefore reflecting differences in
relative reproductive investment. This facultative behaviour in three-spined sticklebacks
may help explain why so little differences in sperm performance were found between males
with alternate reproductive tactics. lndeed territorial salmon and bluegill sunfish males
invest considerably more energy than sneakers in reproduction as they delay maturity for
many years, and hence selection on sperm characters should be stronger in these species
than in three-spined sticklebacks where the sneaking tactic is flexible and where there is no
delay in maturity in territorial males.
Sperm metabolism
Few studies have used spenn enzymatic activities as an indicator of sperm metabolic
capacity. In recent studies on human spenn, Ruiz-Pesini et al. (1998 ; 2000) found a positive
38
relationship between aerobic capacity and sperm motility. Lahnsteiner et al. (1998a) found
a relationship between semen fertility capacity and malate dehydrogenase activity and
aspartate aminotransferase activity in rainbow trout. In the same study, they found that
sperm motility is also related to semen fertilization capacity. With the extreme and rapid
diversity of speml traits generated by the selective forces of sperm competition (Snook,
2005), we expected to find differences between tactics as the metabolic capacity may
determine the energetic flux available for sperm motility. A recent study of bluegill has
found that initial sperm velocity was correlated with starting ATP level in spermatozoa,
suggesting that sperm competition has selected energetic capacity in the faster sperm of
sneaker males (Bureness et al. , 2004). Our results show that there is no difference in the
enzymatic activity of CS (indicator of aerobic capacity and of mitochondrial volume) and
PK (indicator of glycolytic capacity) between reproductive tactics. Moreover, we found no
relationship between speml velocity (V AP) and CS activity and an unpredicted relationship
with PK activity. Surprisingly, slow sperm with low motility have the highest level of PK
activity. We were expecting glycolytic capacity to be related to fast initial velocity. The
relationship found between sperm production and metabolism is the same as the one with
PK activity. We detected a highly significant negative relationship between sperm
metabolic capacity as expressed by PK and CS activity and three sperm investment
parameters (estimated total sperm number, sperm concentration per gram of gonad and
gonado-somatic index). These relationships indicated that the metabolic capacity of CS and
PK rapidly dropped as the sperm investment increased.
39
Most studies on fish sperm metabolism have been performed on either cyprinids or
salmonids to develop cryopreservation techniques for the aquaculture industry. In our
study, we investigated the relationship between sperm performance and enzymatic activity
in a different model species, that allowed us to look at potential metabolic adaptations
associated to different reproductive tactics. The relative importance of the different
metabolic pathways is likely to vary between species (Dreanno et al., 1999). For example,
the sperm metabolism of the Danube bleak and the rainbow trout rely on glycolytic and
aerobic pathways (Lahnsteiner et al., 1999) while African catfish spermatozoids depend on
glucid and lipid oxidation (Mansour et al., 2003). In Atlantic salmon and bluegill, initial
ATP level favour spenn motility and swimming speed (Bumess et al., 2004; Vladic and
Jarvi, 2001), but intuitively lipid catabolism and
~-oxidation
offatty acid could be potential
sources of energy for the long-term request in three-spined stickleback sperm. This
indicates that different energy-supplying pathways can be involved in motility of fish
spermatozoa.
In our study the lack of relationship between CS activity and sperm performance
suggest that there is an excess of mitochondrial content to fuI fill the energetic requirements
for motility. Considering the long duration of sperm motility, it is quite likely that
endurance instead of high power performance (fast motility) is a key parameter of sperm
physiology to optimize fertilization success in three-spined sticklebacks. Endurance
metabolism in animaIs usually relies, at least partly, on lipid oxidation and its rate may be
set by the rate of substrate mobilisation. The reverse correlation between PK activity and
40
motility could therefore reflect space competition between lipid and glucid catabolic
pathways. Speml respirometry analyses and the use of metabolic inhibitors would further
help to obtain a global idea of the major metabolic pro cesses related to the spermatic
perfomlance of this species.
Computer-assisted sperm production
The utilisation of a computer-assisted speml analysis (CASA) has become
increasingly popular to examine speml quality in fish (Bumess et al., 2004; Dreanno et al. ,
1999; Elofsson et al., 2003a; Elofsson et al., 2003b; Jobling et al., 2002; Lahnsteiner et al. ,
1999; Q'Connell et al., 2002). This new technology allows an objective and precise
investigation of sperm traits (Kime et al., 2001). The use of this system does not alleviate
comparison prob lems among studies. Rigorous details of different parameters (e.g. rapid,
medium and slow cells) as weIl as temperature of the stage or working room should be
provided. Sperm velocity should be expressed in sperm length per sec rather than absolute
value (Ilmls) to facilitate comparisons among species.
Conclusion
In conclusion, we showed that male three-spined sticklebacks with varying levels of
reproductive investment (NTM, FTM, TM) had no significant differences in sperm velocity
or percentage of motile sperm. These results are at odds with sperm competition theory that
predicts a greater speml swimming speed and relative sperm production for NTM. NTM
lost a significantly smaller percentage of rapid sperm than TM over time thus it is possible
41
that spenn duration may be an important factor for fertilization success in this species.
However further investigations are needed to verify if sperm can still fertilised eggs after
being active for as long as 10 hours.
The results obtained with the territorial spermatic index suggest that the interaction of
two or more sperm characteristics may be more important than considering the effect of
only one parameter at a time. It also revealed that the reproductive constraints should be
taking into account when evaluating the significance of sperm traits.
There was no relationship between sperm performance and the enzymatic activityof
CS and a negative exponential relationship with the enzymatic activity of PK. With the
limited knowledge in fish sperm metabolism, further work should shed light on how
metabolic pathways are involved in sperm motility.
42
4 .5 ,--------,. ------,------,-----,
~
1.5
B
\
\
N
W
~
-1.5
.
TACTIC
FTM
NTM
• TM
0
-4.5
-4.5
-1.5
AXE 1
1.5
4.5
1.0
STR
0.5
SI
BCF
N
W
~
0.0 - --- -------
_&:'>P_----- - -
SCPG
-0.5
COL
-1.0
-1 .0
-0.5
0.0
AXE 1
0.5
1.0
FIG. 1. Dicriminant function analysis of the three different reproductive tactics (NTM = nonterritorial males, n=30; FTM= facultative-territorial males, n=20; and TM = territorial
males, n=19) based on 10 out of 30 parameters available (Wilks' lambda = 0.452,
P<O.OOl) . Parameters: ALH = lateral amplitude, BCF = beat frequency, STR =
straightness, RAP = rapid percentage, SCPG = sperm concentration per gram of gonad,
RL VAP = lost of path velocity, LF = totallenght, GSI = gonado-somatic index, COL = fish
coloration, and CS = CS activity in sperm.
43
1.2
><
4)0
""Co
C ~
c ><
•
0.8
oE
._ M
;t::
o
""C 0
0, 0.4
o_
C
U
o
FIG.
+---------~--------~----------~--------~
o
2
4
6
Gonado-somatie index x 100
8
2. Relationship between condition index and gonado-somatic index for each male
stickleback (r=0.398 , P <O.OOl, n=113). Non-territorial males (NTM, r=0.579, P <O.OOl ,
n=44) are shown with open squares, facultative-territorial males (FTM, r=0.261, P=NS ,
n=38) with grey triangles and territorial males (TM, r=0.085, P=NS , n=31) with close
squares.
44
TABLE 1. Morphologic, spermatic and physiological characteristics for non-territorial
(NTM, n=44), facultative-territorial (TFM, n=38) and territorial (TM, n=31) males threespined stickleback. Values are presented as means and standard deviations.
Parameter
Non-te r ritorial males
X± S.D.
Facultative-territorial males
X± S.D.
Territorial males
X± S.D.
Morph%gy traits
Total mass (g)
2.55 ± 0.80
2.47 ± 0.78
Gonads mass (g)
0.09 ± 0.04'
0.11 ± 0.04
6.65 ± 0.63
6.55 ± 0.61
Totallenght (cm)
Condition index (g 1 cm
3
x 100
b
2.70 ± 0. 77
0.14 ± 0.05
6.69 ± 0.60
0.84 ± 0. 10
0.85 ± 0.08
Gonado-somatic index x 100
3.48 ± 1.06'
4.44 ± 0.95
VisaI coloration score
1.34 ± 0.53
2. 18 ± 0.90
2. 13 ± 1.06
)
e
b
0.88 ± 0.08
5.29 ± 0.8g
e
Sperm traits
Path velocity (flm 1 s)
27.73 ± 6. 10
28. 56 ± 8.34
28.93 ± 8.01
Progressive velocity (flm 1 s)
23 .94 ± 6.98
25.31 ± 8.51
25 .86 ± 8. 14
Speed track ( flm 1 s)
49.58 ± 7.50
46.95 ± 10.72
47. 14 ±8. 51
3.35 ± \.80
2.97 ± 2.44
3.48 ± 3.58
Beat frequency (Hz)
31 .55 ± 6.49
3 \.54 ± 7.32
32.40 ±6.87
Straightness (%)
84.07 ± 9.03
84. 16 ± 15.34
87.03 ± 5.09
Motile percentage (%)
20.50 ± 13 .39
20.74 ± 17.54
18.68 ± 17. 62
6.00 ± 8.52
6.55 ± 1 \.83
Lateral amplitude (flm)
4.50 ± 7.75
Rapid percentage (%)
6
Estimated total sperm number (10 spz)
6
Sperm concentration (10 spz 1 g gonad)
Lost of path velocity (flm 1 S2)
65 .91 ±55 . 12'
705.49 ± 455 .68
86 .91 ± 91.79,b
81.32 ± 66.70
740.79 ± 586.79
55 8.90 ± 362.65
-0.38 ± 0.45
-0.50 ± 0.44
-0.59 ± 0.39
Lost of speed track (!lm 1 S2)
-0.33 ± 0.72
-0.41 ± 0.59
-0.57 ± 0.65
Lost of motile percentage (% 1 s)
-0.62 ± 0.55
-0.48 ± 0.67
-0.54 ± 0.71
-0.22 ± 0.39'
-0.35 ± 0.45,b
-0.47 ± 0.67
0.30 ±0.38
0.13 ± 0.07
0.15 ± 0.06
0.07 ± 0. 11
0.06 ± 0.09
Lost of rapid percent age (% 1 s)
6
PK activity in sperm (U 1 10 spz)
6
CS activity in sperm (UI 10 spz)
Territori al spermatie index (s
* g)
0. 12 ± 0. 16'
b
0.22 ± 0.29
b
0.05 ± 0.05
b
0.28 ± 0.43
b
45
A
Ci)
1-TM
0NTM I
40
§, 30
>~ 20
................... 0
.Q
CIl
> 10
-
.:
l'Il
Il.
8
~
~
0
Oh 00
5 h 00
10 h 00
15 h 00
20 h 00
5 h 00
10 h 00
15 h 00
20 h 00
30
CIl
CI
.fl
20
c:
...0
CIl
& 10
~
;;
0
:!:
C
0
Oh 00
.g-... ~ 10
"0
~
o
....
l'Il
CIl
N
0
ClS
l'Il l'Il
5
1:
E
CIl ...
o a.
CIl
...
CIl
Il.
FIG.
fi)
0
Oh 00
.... . .....
10 h 00 15 h 00 20 h 00
5 h 00
Time post activation (h)
3. Mean (± SD) of A spenn path velo city (VAP), B percentage ofmotile spenn (MOT)
and C percentage ofrapid spenn (RAP) at different time post activation for territorial males
and non territorial males. Between tactics, the rate lost of spenn velocity is nearly
significant (RLV AP, F I ,54=3.5, P=O.067, NTM > TM), non significant for the rate 10st of
the percentage of motile spenn (RLMOT, F 1,54=1.3, P=O.256) and significant for the rate
lost of the percentage of rapid spenn (RLRAP, F1,3s=7.5, P=O.009, NTM > TM).
46
A
2
~
">
n li
lU
C-
G>
III
ai
:J
•
0
E
"'o
N
>- _.... -2
E
... ~-4
G>
C-
C/)
-6
0
2
4
6
8
6
Total sperm number (In 10 spz)
B
2
~
:~
ü li 0
lU CG>
III
E "'0
>- .... -2
N
c:
G>
:J
E
... ~-4
G>
C-
C/)
-6
3
0
c
9
6
Sperm c oncentration per gram of gonad
6
(I n 10 , g )
-6 +-----~-----.------,-----,
o
0.5
1.5
2
Gonado-somatic index (In)
FIG.
4. Relationship between spermatic enzyme activity and A total sperm number
(TOTSPERM: PK; r= -0.732, P<O.OOl, and CS; r= -0.687, P<O.OOl), and B sperm
concentration per gram of gonad (SCPG: PK; r= -0.707, P<O.OOl, and CS; r= -0. 740,
P<O.OOl), C and gonado-somatic index (GSI: PK; r= -0.476, P<O.OO l , and CS; rs= -0.332,
P<O.Ol) . PK activity in sperm (n=77) are shown with close squares and CS activity in
sperm (n=80) with open squares for each three-spined stickleback male.
47
Conclusion générale
La présente recherche avait pour objectif principal de déterminer dans un premier
temps si les mâles gardiens, malgré un investissement énergétique substantiel dans les
caractères sexuels secondaires, ont une semence d'aussi bonne qualité que les mâles furtifs
qui n'investissent pas dans ces caractères. Cette question s'insère dans un domaine où
l'étude de la variation intraspécifique des caractéristiques spermatiques a été très peu faite
jusqu'à présent. L'utilisation d'un autre model, comme l'Épinoche à trois épines, a permis
de découvrir que cette espèce ayant un sperme à grande longévité possédait des
caractéristiques spermatiques différentes des prédictions suggérées par la compétition
spennatique. En effet, nos résultats ne démontrent aucune différence significative
favorisant le potentiel reproducteur des males non-territoriaux quant à la vitesse de nage, la
motilité et la concentration en spermatozoïdes. Ce manque de différence ne peut pas être
relié à un manque de discrimination entre les tactiques de reproduction, puisque celle-ci a
été validée à l'aide d'une analyse multivariée. Toutefois, les caractéristiques déterminantes
de la paternité et la direction de la sélection de ces traits sont sujettes à varier entre les
espèces.
L'Épinoche à trois épines est marquée par des phénotypes très similaires entre les
différentes tactiques de reproduction. Ceci pourrait témoigner d'un phénomène évolutif
récent en cours de spéciation. Dans cette éventualité, cette espèce constituerait un excellent
modèle pour la compréhension des pressions sélectives agissant sur les paramètres
descripteurs du potentiel reproducteur. Ainsi, nos résultats présentent la production relative
48
en spermatozoïdes (indice gonado-somatique favorisant les mâles territoriaux) parmi les
premiers paramètres discriminant les différentes tactiques. Les mâles n'ayant pas atteint
une certaine production pourraient opter pour une tactique de reproduction furtive. Nos
résultats semblent également indiquer que l'interaction de plusieurs paramètres des
spermatozoïdes pourrait avoir un effet amplificateur sur le potentiel reproducteur d ' un
individu. Ces interactions permettraient aux mâles non territoriaux d'avoir des traits
spermatiques leur donnant la possibilité de rivaliser avec les mâles territoriaux lors d 'une
fertilisation furtive. D ' autres analyses devraient donc être réalisées pour connaître l'impact
réel de ces interactions sur le succès de fertilisation en milieu naturel .
Dans un deuxième temps, cette étude a cherché à déterminer dans quelle mesure la
capacité métabolique des spermatozoïdes est en relation avec la performance des
spermatozoïdes. En se basant sur le fait que l'activité enzymatique est à la base des
processus biochimiques fournissant l'énergie nécessaire à la motilité des spermatozoïdes,
une forte relation était attendue entre celle-ci et la performance des spermatozoïdes. Le lien
obtenu entre ces deux paramètres suggère plutôt que l'activité de la citrate synthase
(indicateur de cycle du citrate et du volume de mitochondrie) et la pyruvate kinase
(indicateur de la glycolyse) ne sont pas associées à la performance des spermatozoïdes.
Aucune relation n'a été décelée entre la citrate synthase et la performance des
spermatozoïdes alors qu'une relation négative a étonnamment été observée pour la pyruvate
kinase. Les semences avec peu de spermatozoïdes motiles et avec une faible vélocité sont
donc celles ayant la plus grande capacité glycolytique. Ceci va à l'encontre de nos
49
prédictions stipulant que la capacité glycolytique serait plus importante pour des
spennatozoïdes ayant une vitesse initiale de nage élevée. Suivant le manque d'infonnation
sur l'importance, l'efficacité et le fonctionnement des différentes voies métaboliques des
spennatozoïdes, d'autres études seraient justifiées pour déterminer l'importance relative des
voies investiguées face à d'autres. Par exemple, la p-oxydation des acides gras serait une
excellente avenue d'approfondissement compte tenu que le spenne de l'Épinoche à trois
épines possède une très longue durée.
Parallèlement, notre étude a également démontré l'importance des facteurs
environnementaux et comportementaux lors de la reproduction . L'évaluation du
comportement reproducteur à deux reprises a pennis d ' identifier un groupe intermédiaire
au deux tactiques de reproduction, soit des individus à territorialité facultative. Ces
individus ont changé de tactique suite à une exposition à un environnement social différent.
Cette méthode expérimentale pourrait faciliter la recherche de critères discriminant les
différentes tactiques de reproduction au sein d'autres espèces.
50
Bibliographie
Balshine, S., BJ. Leach, F. Neat, N.Y. Werner, R. Montgomerie. 2001. Sperm size of
african cichlids in relation to sperm competition. Behavioral Ecology, volume 12:
numéro 6, pp. 726-731
Barber, 1., S.A. Amott. 2000. Split-clutch ivf: A technique to examine indirect fitness
consequences of mate preferences in sticklebacks. Behaviour, volume l37: numéro
pp. 1129-1140
Barber, 1., S.A. Am ott, V.A. Braithwaite, l. Andrew, F.A. Huntingford. 2001. Indirect
fitness consequences of mate choice in sticklebacks: Offspring of brighter males
grow slowly but resist parasitic infections. Proceedings of the Royal Society of
London Series B-Biological Sciences, volume 268: numéro 1462, pp. 71-76
Barber, 1., S.A. Amott, V.A. Braithwaite, J. Andrew, W. Mullen, F.A. Huntingford. 2000.
Carotenoid-based sexual coloration and body condition in nesting male
sticklebacks. Journal of Fish Biology, volume 57: numéro 3, pp. 777-790
Birkhead, T.R., A.P. Moller. 1998. Sperm èompetition and sexual selection . London,
Academic Press, 826 p.
Blouw, D.M. 1996. Evolution of offspring desertion in a stickleback fish. Ecoscience.
Sainte-Foy, volume 3: numéro 1, pp. 18-24
Bronseth, T., 1. Foistad. 1997. The effect of parasites on courtship dance in threespine
sticklebacks: More than meets the eye? Canadian Journal of Zoology., volume 75 :
numéro 4, pp. 589-594
Burness, G., S.l. Casselman, A.1. Schulte-Hostedde, C.D. Moyes, R Montgomerie. 2004.
Sperm swimming speed and energetics vary with sperm competition risk in bluegill
(Lepomis macrochirus). Behavioral Ecology and Sociobiology, volume 56 :
numéro 1, pp. 65-70
Chellappa, S., F.A. Huntingford, RH.C. Strang, RY. Thomson. 1989. Annual variation in
energy reserves in male three-spined stickleback, Gasterosteus aculeatus L. (pisces,
Gasterosteidae). Journal of Fish Biology, volume 35: numéro 2, pp. 275-286
Cubillos, E.R, H.E. Guderley. 2000. Analysis of the factors related with mate choice and
reproductive success in male three-spined sticklebacks. Journal of Fish Biology,
volume 56: numéro 5, pp. 1201-1216
51
Defraipont, M., G.J. Fitzgerald, H. Guderley. 1993. Age-related differences in reproductive
tactics in the 3-spined stickleback, Gasterosteus-aculeatus. Animal Behaviour,
volume 46: numéro 5, pp. 961-968
Dreanno, c., J. Cosson, M. Suquet, F. Seguin, G. Dorange, R Billard. 1999. Nucleotide
content, oxydative phosphorylation, morphology, and fertilizing capacity of turbot
(Psetta maxima) spermatozoa during the motility period. Molecular Reproduction
and Development, volume 53: numéro 2, pp. 230-243
Dufresne, F., G.J. FitzGerald, S. Lachance. 1990. Age and size-related differences in
reproductive success and reproductive costs in threespine sticklebacks (Gasterosteus
aculeatus). Behavioral Ecology, volume 1: numéro 2, pp. 140-147
Elofsson, H., B.G. McAllister, D.E. Kime, I. Mayer, B. Borg. 2003a. Long lasting
stickleback sperm; is ovarian fluid a key to success in fresh water? Journal of Fish
Biology, volume 63: numéro 1, pp. 240-253
Elofsson, H., K. Van Look, B. Borg, I. Mayer. 2003b. Influence of salinity and ovarian
fluid on sperm motility in the fifteen-spined stickleback. Journal of Fish Biology,
volume 63: numéro 6, pp. 1429-1438
Fitzgerald, G. 1983. The reproductive ecology and behaviour of three sympatric
sticklebacks (Gasterosteidae) In a saltmarsh. Biology of behaviour, volume 8:
numéro l,pp . 67-79
FitzGerald, G.J., G.I. Kedney. 1987. Aggression, fighting, and territoriality in sticklebacks:
Three different phenomena? Biology of Behaviour, volume 12: numéro 4, pp. 186195
Fu, P., B.D. Neff, M.R Gross. 2001. Tactic-specific success in sperm competItIon.
Proceedings of the Royal Society of London Series B-Biological Sciences,
volume 268: numéro 1472, pp. 1105-1112
Gage, M.J.G., C.P. Macfarlane, S. Yeates, RG. Ward, 1.B. Searle, G.A. Parker. 2004.
Spermatozoal traits and sperm competition in atlantic salmon: Relative sperm
velo city is the primary determinant of fertilization success. Current Biology,
volume 14: numéro 1, pp. 44-47
Gilbert, S.F. 1996. Biologie du développement. 4e éd., Paris, De Boeck & Larcier, 891 p.
Gronczewska, 1., M.S. Zietara, A. Biegniewska, E.E. Skorkowski. 2003 . Enzyme activities
in fish sperrnatozoa with focus on lactate dehydrogenase isoenzymes from herring
Clupea harengus. Comparative Biochemistry and Physiology B-Biochemistry &
Molecular Biology, volume 134: numéro 3, pp. 399-406
52
Gross, M.R., l Repka. 1998. Stability with inheritance in the conditional strategy. Journal
of Theoretical Biology, volume 192: numéro 4, pp. 445-453
Guderley, H., RC. Guevara. 1998. Physiological correlates of patemal care
threespine stickleback. Ecoscience, volume 5: numéro 4, pp. 438-447
III
male
Jobling, M. 1994. Fish bioenergetics. Vol l3, London, Chapman & Hall, 309 p.
Jobling, S., S. Coey, lG. Whitmore, D.E. Kime, K.lW. Van Look, B.G. McAllister, N.
Beresford, A.c. Henshaw, G. Bright y, C.R Tyler, J.P. Sumpter. 2002. Wild
inters ex roach (Rutilus rutilus) have reduced fertility. Biology of Reproduction ,
volume 67: numéro 2, pp. 515-524
Kime, D.E., K.J.W. Van Look, B.G. McAIlister, G. Huyskens, E. Rurangwa, F. Ollevier.
200l. Computer-assisted sperm analysis (casa) as a tool for monitoring sperm
quality in fish. Comparative Biochemistry and Physiology C-Toxicology &
Pharmacology, volume 130: numéro 4, pp. 425-433
Kraak, S.B.M., B. Mundwiler, P.J.B. Hart. 2001. Increased number of hybrids between
benthic and limnetic three-spined sticklebacks in Enos lake, Canada; the collapse of
a species pair? Journal of Fish Biology, volume 58: numéro 5, pp. 1458-1464
Kristjansson, B.K., S. Skulason, D.L.G. Noakes. 2002. Rapid divergence in a recently
isolated population of threespine stickleback (Gasterosteus aculeatus L.).
Evolutionary Ecology Research, volume 4: numéro 5, pp . 659-672
Lahnsteiner, F., B. Berger, T. Weismann. 1999. Sperm metabolism of the teleost fishes
Chalcalbumus chalcoides and Oncorhynchus mykiss and its relation to motility and
viability. Journal of Experimental Zoology, volume 284: numéro 4, pp. 454-465
Lahnsteiner, F. , B. Berger, T. Weismann, RA. Patzner. 1998a. Determination of semen
quality of the rainbow trout, Oncorhynchus mykiss, by sperm motility, seminal
plasma parameters, and spermatozoal metabolism. Aquaculture, volume 163:
numéro 1-2, pp. 163-181
Lahnsteiner, F., T. Weismann, RA. Patzner. 1998b. An efficient method for
cryopreservation of testicular sperm from the northem pike, Esox lucius 1.
Aquaculture Research, volume 29 : numéro 5, pp. 341-347
Largiader, C.R., V. Fries, T.C.M. Bakker. 2001. Genetic analysis of sneaking and eggthievery in a natural population of the three-spined stickleback (Gasterosteus
aculeatus L.). Heredity, volume 86: numéro pp. 459-468
53
Leach, B. , R. Montgomerie. 2000. Spenn characteristics associated with different male
reproductive tactics in bluegills (Lepomis macrochirus) . Behavioral Ecology and
Sociobiology, volume 49: numéro 1, pp. 31-37
Mansour, N ., F. Lahnsteiner, B. Berger. 2003. Metabolism of intratesticular spennatozoa of
a tropical teleost fish (Clarias gariepinus). Comparative Biochemistry and
Physiology B-Biochemistry & Molecular Biology, volume 135: numéro 2, pp.
285-296
Nicholls, E.H., T. Burke, T.R. Birkhead. 2001. Ejaculate allocation by male sand martins,
riparia riparia. Proceedings of the Royal Society of London Series B-Biological
Sciences, volume 268: numéro 1473, pp. 1265-1270
O'Connell, M., N. McClure, S.E.M. Lewis. 2002. The effects of cryopreservation on spenn
morphology, motility and mitochondrial function. Human Reproduction , volume
17: numéro 3, pp. 704-709
Oppliger, A., Y. Naciri-Graven, G. Ribi, DJ. Hosken. 2003. Spenn length influences
fertilization success during spenn competition in the snail viviparus ater. Molecular
Ecology, vo lume 12: numéro 2, pp. 485-492
Parker, G.A. 1970. Spenn competition and its evolutionary consequences in the insect.
Biological Reviews, volume 45 , pp. 525-567
Parker, G.A. 1990. Spenn competition games: Sneaks and extra-pair copulations.
Proceedings of the Royal Society of London, Series B: Biological Sciences,
volume 242, pp. 127-133
Parker, G.A. 1998. Sperm competition and the evolution of ejaculates; towards a
theory base. Dans: Spenn competition and sexual selection Birkhead, T.R., A.P.
Moller. London, Academic Press, pp 3-54
Parker, G.A., M.A. B aU, P. Stockley, MJ.G. Gage. 1997. Sperm competition games : A
prospective analysis of risk assessment. Proceedings of the Royal Society of
London, Series B: Biological Sciences, volume 264: numéro 1389, pp. 1793-1802
Quinn, G.P., M.J. Keough. 2002. Experimental design and data analysis for biologists.
Cambridge, Cambridge University Press, 537 p.
Ridgway, M.S., J.D. McPhail. 1988. Raiding shoal size and a distraction displ ay in male
sticklebacks (Gasterosteus aculeatus) . Canadian Journal of Zoology., volume 66:
numéro 1, pp. 201-205
54
Rui z-Pesini, E., C. Diez, A.c. Lapena, A. Perez-Martos, J. Montoya, E. Alvarez, J. Arenas,
M.J. Lopez-Perez. 1998. Correlation of sperrn motility with mitochondrial
enzymatic activities. Clinical Chemistry, volume 44: numéro 8, pp. 1616-1620
Ruiz-Pesini, E., A.C. Lapena, C. Diez, E. Alvarez, J.A. Enriquez, M .J. Lopez-Perez. 2000.
Seminal quality correlates with mitochondrial functionality. Clinica Chimica Acta,
volume 300: numéro 1-2, pp. 97-105
Scharer, L., D.R. Robertson. 1999. Sperrn and milt characteristics and male v. Femal e
gametic investment in the Caribbean reef fish, Thalassoma bifasciatum. Journal of
Fish Biology, volume 55: numéro 2, pp. 329-343
Simmons, L. W. , J.S. Kotiaho. 2002. Evolution of ejaculates: Patterns of phenotypic and
genotypic variation and condition dependence in sperrn competition traits .
Evolution, volume 56: numéro 8, pp. 1622-1631
Snook, R .R. 2005. Sperrn in competition: Not playing by the numbers. Trends in Ecology
& Evolution , volume 20: numéro 1, pp. 46-53
SPSS Inc. 2000. Systat. Version 10
Stockley, P., M.J.G. Gage, G.A. Parker, A.P. Moller. 1997. Sperrn competition in fishes:
The evolution of testis size and ejaculate characteristics. American Naturalist,
volume 149: numéro 5, pp. 933-954
Taborsky, M . 1998. Sperrn competition in fish : 'bourgeois' males and parasitic spawning.
Trends in Ecology & Evolution, volume 13 : numéro 6, pp. 222-227
Taborsky, M. 2001. The evolution of bourgeois, parasitic, and cooperative reproductive
behaviors in fishes . Journal of Heredity, volume 92: numéro 2, pp. 100-110
Taylor, E.B., J.D. McPhail. 1999. Evolutionary history of an adaptive radiation in species
pairs of threespine sticklebacks (Gasterosteus aculeatus): Insights from
mitochondrial DNA. Biological Journal of the Linnean Society, volume 66 :
numéro 3, pp. 271-291
Thomopoulos, A. 1953. Sur l'oeuf de l'epinoche (Gasterosteus aculeatus). Bulletin de la
Société Zoologique France, volume 78, pp. 142-149
Vladic, T.V. , T. Jarvi . 2001. Sperrn quality in the alternative reproductive tactics of atlantic
salmon: The importance of the loaded raffle mechanism. Proceedings of the Royal
Society of London Series B-Biological Sciences, volume 268: numéro 1483, pp.
2375-2381
55
Waymann, W.R., T.R. Tiersch. 2000. Research methods for cryopreservation of sperm.
Dans: Cryopreservation in aquatic species Tiersch, T.R., P.M. Mazik. Baton Rouge,
Louisiana, World Aquaculture Society, pp 264-275
WedeU, N., M.J.G. Gage, G.A. Parker. 2002. Sperm competition, male prudence and
sperm-limited females. Trends in Ecology & Evolution, volume 17: numéro 7, pp.
313-320
Whoriskey, F.G. 1991. Stickleback distraction displays: Sexual or foraging deception
against egg cannibalism? Animal Behaviour, volume 41: numéro 6, pp. 989-995
Zbinden, M. , c.R. Largiader, T.C.M. Bakker. 2004. Body size of virtual rivais affects
ejaculate size in sticklebacks. Behavioral Ecology, volume 15 : numéro 1, pp. 137140
AUTORISATION DE REPRODUIRE
ET DE DIFFUSER UN RAPPORT,
UN MÉMOIRE OU UNE THÈSE
" , Université du Québec à Rimouski
S.V.P. DACTYLOGRAPHIER
(Compléter autant d'autorisation qu'il y a d 'auteures, d'auteurs)
RENSEIGNEMENTS CONCERNANT L'AUTEURE, L'AUTEUR
Nometprénom :
Code permanent:
Côft."')
( t) '1)
JonAMtln
CPI () f
l1jJ{)
Téléphone:
Adresse permanente :
J()G- IwO
RENSEIGNEMENTS CONCERNANT LA PRESENTATION DU DOCUMENT
o
o
Rapport
Thèse
TITRE :
Année du dépôt fina l du document: --~----~=---------------~~-------------r-'---------------------
Nomdu~~rnmme :_~~~f~~~Ç~t~;~o~n~~~~~~~_~~\Z~W~h~e~1~·~f~t_~~·~_~=~~·~h=~=·i~,·_Z~6_j'_________
Code de progrnmme: ___
(J
O--______
-
Appellation du grade: ___~
/--'.1
' .:...._5_·'--_".::,.._ _ _ _ _ _ _ _ __
?"L...,'Z,--,&I.::
· ...
",=
__
r
_n.:.,,{'-'e~--"-~-=-,1.:. r': _f'.'- "'.eJ" Î2·CLJ,(~___________________._____________
Nom de la directrice ou directeur de recherche : ____h--'.Y2.::,!1.t.::.
'
Nom de la codi rectrice , cod irecteur de recherche: __-<E_''-/o:::t..:..rY
--'--'f
=--__'_
S _''-.J...:e=-.r_______________________________________
RISATION
J'autorise l'Université du Québec à Rimouski à reproduire et à diffuser, soit par photocopie, microfilm ou microfi che, s upport
informatique ou par internet, en totalité ou en partie, à prêter ou à vendre, à des fms de diffusion acad émiques et non lucratives,
des copies de ce rapport, ce mémoire ou cette thèse. Il est entendu que l'UQAR ne peut aucunement se serv ir d e ce travail
pour publication ou à des fins commerciales. Sauf entente contraire, je demeure propriétaire des droits d ' aute urs de mon
rapport, de mon mémoire ou de ma thèse et je conserve la liberté de diffuser et d 'utiliser commercialement ou non ce travail dont
je possède un exemplaire.
o
Je n ' autorise pas l'Un iversité du Québec à Rimouski à reproduire et/ou microfilmer mon rapport, mon mémoire ou ma thèse .
Signature de l' auteure/ l'auteur :
Remettre une copie à : Biblioth èque nati
DEAR . septe mbre 2004
du Canada, Bibli oth èq ue UQAR , Bureau des études avancées et de la recherc he (UQAR), auteure/auteur.
.
. . , Université du Québec à Rimouski
Bureau du doyen des études
avancées et de la recherche
Fiche-résumé de travail
de recherche de 2e cycle
ou de 3e cycle soumise lors
du dépôt final
~
Thèse
o
Travail dirigé
o
o
NOJll du candidat
Code perJllanent
PrograJllJlle
Code de prograJllJlle
Grade
NOJll du directeur de recherche
NOJll du co-directeur de recherche
(s'il y a lieu)
Titre du travail de recherche
NOJllbre de pages
5' S
O I\. C
1
!J
cf
MéJlloire
Rapport de recherche
Rapport
,,---1
~.
1
," ~ _ Il ..
1
Signature du directeur de recherche
Date:
tq lo~/os-
Signature du co-directeur de recherche
Date:
J~
/.
"> 7