doczastosowanie hydrolizy enzymatycznej do ustalania struktury
download 
Report Transcription
zastosowanie hydrolizy enzymatycznej do ustalania struktury
Grzegorz Kiełbowicz ZASTOSOWANIE HYDROLIZY ENZYMATYCZNEJ DO USTALANIA STRUKTURY NATURALNYCH FOSFOLIPIDÓW Praca doktorska wykonana w Katedrze Chemii Uniwersytetu Przyrodniczego we Wrocławiu pod kierunkiem prof. dr. hab. Czesława Wawrzeńczyka Praca naukowa wykonana w ramach projektu nr POIG.01.03.01-00-133/08 – pt.”Innowacyjne technologie produkcji biopreparatów na bazie nowej generacji jaj (OVOCURA)”. Projekt współfinansowany ze środków Europejskiego Funduszu Regionalnego realizowanego w ramach Programu Operacyjnego Innowacyjna Gospodarka 2007-2013. WROCŁAW 2012 1 Składam serdeczne podziękowania Panu prof. dr. hab. Czesławowi Wawrzeńczykowi za opiekę naukowa, przyjazną atmosferę i wszelkie rady, które otrzymałem w trakcie realizacji pracy doktorskiej. 2 Dziękuje dr. inż. Damianowi Smudze za syntezę fosfolipidów oraz cenne sugestie i uwagi w trakcie realizacji tej pracy. 3 W szczególności dziękuję moim Rodzicom za wsparcie, cierpliwość i zaufanie. Wam w całości dedykuję tę pracę. 4 SPIS TREŚCI WYKAZ STOSOWANYCH SKRÓTÓW I SYMBOLI…...……………………………………………………………………………………9 STRESZCZENIE………………………………………………………………………………………………………………………………………….13 1 WPROWADZENIE I CELE PRACY .............................................................................................................. 16 2 PRZEGLĄD LITERATURY .......................................................................................................................... 19 2.1 OGÓLNA CHARAKTERYSTYKA I KLASYFIKACJA LIPIDÓW ...................................................................... 19 2.2 METODY EKSTRAKCJI LIPIDÓW ............................................................................................................ 22 2.2.1 Metody ekstrakcji rozpuszczalnikami organicznymi ................................................................................... 23 2.2.1.1 Metody ekstrakcji ciągłej lipidów rozpuszczalnikami ......................................................................... 24 2.2.1.2 Otrzymywanie lecytyny jako przykład frakcjonowania lipidów rozpuszczalnikami ........................... 24 2.2.2 Ekstrakcja do fazy stałej (SPE)..................................................................................................................... 26 2.3 ROZDZIAŁ LIPIDÓW ZA POMOCĄ TECHNIK CHROMATOGRAFICZNYCH ................................................ 28 2.3.1 Chromatografia cieczowa ........................................................................................................................... 28 2.3.1.1 Chromatografia cienkowarstwowa .................................................................................................... 28 2.3.1.2 Chromatografia kolumnowa niskociśnieniowa .................................................................................. 30 2.3.1.3 Wysokosprawna chromatografia cieczowa ....................................................................................... 31 2.3.1.3.1 Chromatografia cieczowa w normalnym układzie faz (NP-LC) ..................................................... 31 2.3.1.3.2 Chromatografia cieczowa w odwróconym układzie faz (RP-LC) ................................................... 32 2.3.1.3.3 Chromatografia cieczowa oddziaływań hydrofilowych (HILIC) .................................................... 34 2.3.1.3.4 Chromatografia cieczowa z chiralnymi fazami stałymi ................................................................. 35 2.3.1.3.5 Wielowymiarowa chromatografia cieczowa (MDLC) ................................................................... 37 2.3.1.3.6 Fosfolipidy i liposomy w chromatografii cieczowej ...................................................................... 40 2.3.1.4 Chromatografia gazowa (GC) ............................................................................................................. 40 2.3.1.5 Chromatografia z fazą ruchomą w stanie nadkrytycznym (SFC) ........................................................ 42 2.3.1.6 Chromatografia wykluczania (SEC)..................................................................................................... 44 2.4 TECHNIKI ELEKTROMIGRACYJNE A LIPIDY ............................................................................................ 46 2.5 METODY DETEKCJI LIPIDÓW W CHROMATOGRAFII CIECZOWEJ ........................................................... 49 2.5.1 Detektory refraktometryczne (RI) .............................................................................................................. 49 2.5.2 Detektory spektrofotometryczne UV ......................................................................................................... 50 2.5.3 Detektory fluorescencyjne ......................................................................................................................... 50 2.5.4 Detektory aerozolowe ................................................................................................................................ 51 2.5.4.1 Zasada działania detektorów aerozolowych ...................................................................................... 52 2.5.4.2 Wpływ różnych warunków detekcji na odpowiedź detektorów aerozolowych ................................ 55 2.5.4.2.1 Stężenie analitu ............................................................................................................................ 55 2.5.4.2.2 Ciśnienie gazu oraz natężenie przepływu fazy ruchomej ............................................................. 58 2.5.4.2.3 Temperatura tuby osuszającej i nebulizatora .............................................................................. 60 2.5.4.2.4 Skład fazy ruchomej...................................................................................................................... 61 5 2.6 3 METODY ANALIZY POZYCYJNEJ FOSFOLIPDÓW .................................................................................... 62 OMÓWIENIE WYNIKÓW BADAŃ WŁASNYCH.......................................................................................... 64 3.1 OZNACZENIE PROFILU TŁUSZCZOWEGO ŻÓŁTKA JAJA KURZEGO ......................................................... 64 3.1.1 Ekstrakcja lipidów z żółtka jaja kurzego metodą Folcha ............................................................................. 64 3.1.2 Bezpośrednia analiza frakcji lipidowej z żółtka jaja kurzego za pomocą HPLC (metoda 1) ........................ 65 3.1.3 Rozdział frakcji lipidowej za pomocą SPE oraz ich analiza z zastosowaniem HPLC (metoda 2) ................. 68 3.1.3.1 Rozdział lipidów polarnych i niepolarnych za pomocą ekstrakcji do fazy stałej (SPE) ....................... 69 3.1.3.2 Opracowanie metod analizy fosfolipidów żółtka jaja kurzego za pomocą HPLC ............................... 72 3.1.3.2.1 Analiza fosfolipidów z żółtka jaja kurzego za pomocą HPLC z zastosowaniem kolumny z krzemionkową fazą stałą (metoda 2.1) ...................................................................................... 73 3.1.3.2.2 Analiza fosfolipidów z żółtka jaja kurzego za pomocą HPLC z diolową fazą stałą (Metoda 2.2) .. 80 3.1.3.2.3 Opracowanie metody analizy lipidów niepolarnych z żółtka jaja kurzego za pomocą HPLC (metoda 2.3) ................................................................................................................................. 84 3.1.4 Określenie profilu lipidowego żółtka jaja kurzego ...................................................................................... 87 3.1.5 Analiza fosfolipidów w mleku i produktach mlecznych za pomocą HPLC (metoda 3)................................ 88 3.1.5.1 Analiza ilościowa fosfolipidów w mleku krowim................................................................................ 98 3.2 OKREŚLENIE PROFILU KWASÓW TŁUSZCZOWYCH LIPIDÓW ŻÓŁTKA JAJA KURZEGO ........................... 99 3.2.1 Rozdział lipidów żółtka jaja kurzego na poszczególne grupy za pomocą SPE ........................................... 100 3.2.2 Analiza wolnych kwasów tłuszczowych za pomocą HPLC z detektorem CAD .......................................... 102 3.2.2.1 Metoda analizy wolnych kwasów tłuszczowych za pomocą HPLC ................................................... 103 3.2.2.1.1 Wpływ długości łańcucha węglowego nasyconych kwasów tłuszczowych na współczynnik retencji (k) .................................................................................................................................. 105 3.2.2.1.2 Wpływ rozpuszczalnika organicznego na wartości współczynnika retencji (k) oraz ECL kwasów tłuszczowych............................................................................................................................... 106 3.2.2.1.3 Wpływ temperatury na wartości współczynnika retencji (k) oraz ECL kwasów tłuszczowych ... 110 3.2.2.1.4 Opracowanie końcowej metody rozdziału kwasów tłuszczowych ............................................. 114 3.2.2.1.5 Oznaczenie profilu kwasów tłuszczowych lipidów żółtka jaja kurzego ...................................... 118 3.3 3.3.1 3.3.2 3.3.3 ANALIZA POZYCYJNA FOSFOLIPIDÓW Z ŻÓŁTKA JAJA KURZEGO ........................................................ 119 Analiza pozycyjna fosfatydylocholiny (metoda i oraz II) ........................................................................... 120 Analiza pozycyjna fosfatydylocholiny (metoda III) ................................................................................... 124 Analiza pozycyjna fosfatydylocholiny (metoda IV) ................................................................................... 128 3.4 ANALIZA PROCESU MIGRACJI RESZT ACYLOWYCH W LIZOFOSFATYDYLOCHOLINIE ........................... 132 3.4.1 Opracowanie metody analizy fosfatydylocholiny i produktów jej hydrolizy za pomocą HPLC ................ 132 3.4.2 Hydroliza enzymatyczna DPPC oraz metoda oczyszczania produktów reakcji ......................................... 139 3.4.3 Stabilność izomerów lizoglicerofosfatydylocholiny .................................................................................. 141 3.4.3.1 1-Palmitoilo-LPC ............................................................................................................................... 142 3.4.3.2 2-Palmitoilo-LPC ............................................................................................................................... 143 3.5 IZOLOWANIE FOSFOLIPIDÓW Z ŻÓŁTEK JAJ ŚWIEŻYCH I LIOFILIZOWANYCH ...................................... 146 4 PODSUMOWANIE I WOLNE WNIOSKI ................................................................................................... 150 5 CZĘŚĆ DOŚWIADCZALNA ...................................................................................................................... 153 6 5.1 5.1.1 5.1.2 5.1.3 5.1.4 5.1.5 Metody ekstrakcji lipidów z żółtka jaja kurzego ................................................................................. 153 Metoda ekstrakcji frakcji lipidowej z surowego żółtka jaja kurzego (metoda Folcha) ............................. 153 Metoda ekstrakcji frakcji lipidowej mleka (metoda Folcha) ..................................................................... 153 Metoda ekstrakcji fosfolipidów z surowego żółtka jaja kurzego .............................................................. 153 Metoda liofilizacji żółtek jaja kurzego ...................................................................................................... 154 Metoda ekstrakcji fosfolipidów ze zliofilizowanego żółtka jaja kurzego .................................................. 154 5.2 5.2.1 5.2.2 5.2.3 5.2.4 Metody ekstrakcji lipidów z żółtka jaja kurzego za pomocą ekstrakcji do fazy stałej (SPE) ................. 154 Metoda rozdziału lipidów z żółtka jaja kurzego na frakcje lipidów niepolarnych i polarnych.................. 154 Metoda rozdziału lipidów mleka na frakcje lipidów niepolarnych i polarnych ........................................ 155 Metoda rozdziału lipidów z żółtka z dodatkowym podziałem lipidów polarnych .................................... 155 Metoda rozdziału produktów enzymatycznej hydrolizy fosfatydyloetanoloaminy (PE) oraz fosfatydylocholiny (PC) ............................................................................................................................. 155 5.3 Metody analityczne ........................................................................................................................... 156 5.3.1 Analiza lipidów z żółtka jaja kurzego za pomocą chromatografii cienkowarstwowej (TLC) ..................... 156 5.3.2 Rozdział fosfolipidów z żółtka jaja kurzego za pomocą chromatografii kolumnowej .............................. 156 5.3.3 Analiza estrów kwasów tłuszczowych za pomocą chromatografii gazowej (GC) ..................................... 156 5.3.4 Wysokosprawna chromatografia cieczowa (HPLC) .................................................................................. 157 5.3.4.1 System HPLC ..................................................................................................................................... 157 5.3.4.2 Analiza fosfolipidów w normalnym układzie faz z krzemionkową fazą stałą ................................... 157 5.3.4.3 Analiza fosfolipidów z żółtka jaja kurzego w normalnym układzie faz z diolową fazą stałą ............ 157 5.3.4.4 Analiza fosfolipidów mleka w normalnym układzie faz z diolową fazą stałą ................................... 158 5.3.4.5 Analiza lipidów niepolarnych w normalnym układzie faz z diolową fazą stałą ................................ 158 5.3.4.6 Analiza produktów hydrolizy fosfatydylocholiny ............................................................................. 158 5.3.4.7 Analiza kwasów tłuszczowych w odwróconym układzie faz (RP-HPLC) ........................................... 159 1 13 31 5.3.5 Spektroskopia magnetycznego rezonansu jądrowego ( H NMR, C NMR, P NMR) .............................. 159 5.3.6 Spektrometria mas ................................................................................................................................... 160 5.4 Metody chemicznej i enzymatycznej hydrolizy lipidów oraz syntezy estrów kwasów tłuszczowych .. 160 5.4.1 Synteza wzorców estrów etylowych kwasów tłuszczowych .................................................................... 160 5.4.2 Hydroliza chemiczna fosfolipidów i triacylogliceroli oraz synteza estrów metylowych uwolnionych kwasów tłuszczowych ............................................................................................................................... 160 5.4.3 Hydroliza chemiczna fosfolipidów oraz synteza estrów etylowych uwolnionych kwasów tłuszczowych 161 5.4.4 Hydroliza chemiczna triacylogliceroli oraz fosfolipidów w celu uzyskania kwasów tłuszczowych ........... 161 5.4.5 Enzymatyczna regioselektywna hydroliza fosfolipidów w surowym żółtku jaja kurzego za pomocą fosfolipazy A2 ............................................................................................................................................ 161 5.4.6 Enzymatyczna regioselektywna etanoliza fosfatydylocholiny (PC) za pomocą sn-1,3 specyficznej lipazy z Mucor miehei ......................................................................................................................................... 162 5.4.7 Enzymatyczna regioselektywna hydroliza fosfatydylocholiny i fosfatydyloetanoloaminy za pomocą fosfolipazy A1 oraz fosfolipazy A2 .............................................................................................................. 162 5.5 Dwuenzymatyczne metody pozycyjnej analizy fosfatydylocholiny .................................................... 163 5.5.1 Analiza składu kwasów tłuszczowych w pozycji sn-1 oraz sn-2 fosfatydylocholiny z żółtka jaja kurzego (metoda I) ................................................................................................................................................. 163 5.5.2 Analiza składu kwasów tłuszczowych w pozycji sn-1 oraz sn-2 fosfatydylocholiny z soi oraz żółtka jaja kurzego (metoda II) .................................................................................................................................. 164 5.6 Jednoenzymatyczne metody pozycyjnej analizy fosfatydylocholiny .................................................. 165 7 5.6.1 Pozycyjna analiza fosfatydylocholiny (metoda III) .................................................................................... 165 5.6.2 Pozycyjna analiza fosfatydylocholiny oraz fosfatydyloetanoloaminy (metoda IV)................................... 166 5.7 5.7.1 5.7.2 5.7.3 Fosfolipidy syntetyczne ..................................................................................................................... 167 Przygotowanie kompleksu sn-glicero-3-fosfocholiny i chlorku kadmu (GPC x CdCl2) .............................. 167 Synteza 1,2-dipalmitoilo-sn-glicero-3-fosfocholiny (DPPC) ...................................................................... 167 Enzymatyczna etanoliza 1,2-dipalmitoilo-sn-glicero-3-fosfocholina (DPPC) do 1- hydroksy-2-palmitoilosn-glicero-3-fosfocholiny (2-palmitoilo-LPC) ............................................................................................ 168 5.7.4 Enzymatyczna hydroliza 1,2-dipalmitoilo-sn-glicero-3-fosfocholiny (DPPC) do 1- palmitoilo-2-hydroksysn-glicero-3-fosfocholiny (1-palmitoilo-LPC) ............................................................................................ 170 5.8 6 Badanie procesu migracji reszt acylowych w cząsteczce 1-palmitoilo-LPC oraz 2-palmitoilo-LPC ....... 171 LITERATURA ......................................................................................................................................... 172 8 WYKAZ STOSOWANYCH SKRÓTÓW I SYMBOLI AIC kryterium informacyjne Akaikego AICc skorygowane kryterium Akaikego AOT sól sodowa sulfoburszynianiu dioktylu APCI chemiczna jonizacja pod ciśnieniem atmosferycznym CAD detektor naładowanego aerozolu CE elektroforeza kapilarna CEC elektrochromatografia kapilarna Chol cholesterol CNLSD kondensacyjny detektor światła rozproszonego DAD detektor z matrycą fotodiodową DAG diacyloglicerole DESI desorpcyjna jonizacja przez rozpylanie w polu elektrycznym DHA kwas dokozaheksaenowy DHEA dehydroepiandrosteron DLPC 1,2-dilauroilo-sn-glicerofosfatydylocholina DMPC 1,2-dimirystoilo-sn-glicero-fosfatydylocholina DPPA kwas dipalmitoilofosfatydowy DPPC 1,2-dipalmitoilo-sn-glicero-3-fosfocholina DPPS dipalmitoilofosfatydyloseryna ECL równoważnik długości łańcucha (ang. equivalent chain lenght) ECN równoważnik liczby atomów węgla (ang. equivalent carbon number) EDTA kwas etylenodiaminotetraoctowy EKC chromatografia elektrokinetyczna ELSD detektor aerozolowy promieniowania rozproszonego 9 EOF przepływ elektroosmotyczny ESI jonizacja poprzez rozpylanie w polu elektrycznym FA kwasy tłuszczowe FAEE estry etylowe kwasów tłuszczowych FAME estry metylowe kwasów tłuszczowych FID detektor płomieniowo-jonizacyjny GC chromatografia gazowa GL glicerolipidy GLC chromatografia gazowa z fazą stałą w postaci cieczy osadzonej na nośniku stałym GPC glicerofosfocholina GSC chromatografia gazowa z fazą stałą w postaci ciała stałego – adsorbent HILIC chromatografia cieczowa oddziaływań hydrofilowych HPCE wysokosprawna elektroforeza kapilarna HPLC wysokosprawna chromatografia cieczowa HPSEC wysokosprawna chromatografia wykluczania HPTLC wysokosprawna chromatografia cienkowarstwowa ICH Międzynarodowa Konferencja do spraw Harmonizacji ILCNC Międzynarodowy Komitet Klasyfikacji i Nazewnictwa Lipidów IUPAC Międzynarodowa Unia Chemii Czystej i Stosowanej LEKS liposomowa elektrokinetyczna chromatografia kapilarna LOD granica wykrywalności LOQ granica oznaczalności LPC lizofosfatydylocholina LPE lizofosfatydyloetanoloamina 10 LPG lizofosfatydyloglicerol Lut luteina MAG monoacyloglicerole MALDI jonizacja przez desorpcję laserem wspomaganą matrycą MDGC wielowymiarowa chromatografia gazowa MDLC wielowymiarowa chromatografia cieczowa MEKS micelarna elektrokinetyczna chromatografia kapilarna MS spektrometria mas NARP-LC bezwodna chromatografia cieczowa w odwróconym układzie faz NNKT niezbędne nienasycone kwasy tłuszczowe NP-LC chromatografia cieczowa w normalnym układzie faz NQAD detektor nano-ilości analitu PA kwas fosfatydowy PC fosfatydylocholina PE fosfatydyloetanoloamina PEG poli(glikol etylenowy) PG fosfatydyloglicerol PI fosfatydyloinozytol PLA1 fosfolipaza A1 PLA2 fosfolipaza A2 POPC 1-palmitoilo-2-oleilo-sn-glicero-fosfocholina PS fosfatydyloseryna PS/DVB kopolimer styrenu i diwinylobenzenu RI detektor refraktometryczny RP-LC chromatografia cieczowa w odwróconym układzie faz 11 SD odchylenie standardowe SEC chromatografia wykluczania SFC chromatografia z fazą ruchomą w stanie nadkrytycznym SM sfingomielina SPE ekstrakcja do fazy stałej TAG triacyloglicerole TEA trietyloamina TLC chromatografia cienkowarstwowa TriPal tripalmitynian gliceryny UHPLC ultra wysokociśnieniowa chromatografia cieczowa UPLC ultra sprawna chromatografia cieczowa UTLC chromatografia ultra cienkowarstwowa 12 STRESZCZENIE Głównym celem rozprawy doktorskiej było opracowanie metod ekstrakcji i analizy frakcji lipidowej żółtka jaja kurzego ze szczególnym uwzględnieniem lipidów polarnych – fosfolipidów. Do ekstrakcji lipidów z surowego żółtka jaja kurzego zastosowałem metodę zaproponowaną przez Folcha i wsp. [1]. Opiera się ona na ekstrakcji mieszaniną chloroform : metanol (2:1, v/v) oraz przepłukiwaniu otrzymanego ekstraktu 0,05 M roztworem NaCl. Uzyskane w ten sposób surowe frakcje lipidowe analizowałem jakościowo i ilościowo za pomocą wysokosprawnej chromatografii cieczowej (HPLC) z detektorem CAD. W tym celu opracowałem dwie różne metody analityczne. Pierwsza umożliwiała analizę wszystkich grup lipidów (fosfolipidy, triacyloglicerole, cholesterol) w pojedynczym procesie elucji z zastosowaniem mieszaniny heksan : propan-2ol : woda, jako fazy ruchomej, oraz kolumny z wypełnieniem diolowym jako fazy stałej. Jednak ze względu na bardzo długi czas potrzebny do przeprowadzenia pełnej analizy z zastosowaniem tej procedury opracowałem metodę alternatywną. Początkowym etapem drugiej metody był wstępny rozdział surowej mieszaniny lipidowej na frakcje lipidów polarnych i niepolarnych za pomocą ekstrakcji do fazy stałej (SPE), a następnie osobna analiza każdej z frakcji za pomocą różnych metod HPLC. Uzyskałem w ten sposób ilościowy skład frakcji lipidowej żółtka jaja kurzego składającej się z: triacylogliceroli, cholesterolu oraz fosfolipidów (fosfatydylocholiny, fosfatydyloetanoloaminy oraz sfingomieliny). Dodatkowo metodę tą po niewielkiej modyfikacji zastosowałem również do ilościowego oznaczenia fosfolipidów w mleku. Po oznaczeniu ilościowym lipidów żółtka jaja kurzego, kolejnym zadaniem było określenie profilu kwasów tłuszczowych wchodzących w skład danego lipidu oraz określenie jakie pozycje w cząsteczce zajmują poszczególne kwasy tłuszczowe. W tym celu konieczne okazały się metody otrzymywania czystych frakcji poszczególnych lipidów. Rozdział przeprowadziłem stosując ekstrakcję do fazy stałej (SPE) z użyciem kolumienek krzemionkowych oraz eluentu w postaci mieszaniny chloroform : metanol. Uzyskane lipidy hydrolizowałem chemicznie do wolnych kwasów tłuszczowych 13 i analizowałem je bezpośrednio za pomocą opracowanej metody HPLC lub, po przeprowadzeniu w estry metylowe, stosując chromatografię gazową (GC). Jednak do pełnego obrazu budowy cząsteczki potrzebne są bardziej szczegółowe informacje na temat rodzaju reszt acylowych występujących w poszczególnych pozycjach (sn-1 oraz sn-2) analizowanych związków. Istotne jest to szczególnie w przypadku określania profilu kwasów tłuszczowych fosfatydylocholiny modyfikowanej zarówno w reakcjach chemicznych jak i enzymatycznych. W tym celu opracowałem cztery różne metody analizy pozycyjnej. Cechą wspólną przedstawionych procedur jest wykorzystanie, w reakcji regioselektywnej hydrolizy, biokatalizatorów w postaci lipaz oraz fosfolipaz. W metodzie pierwszej stosowałem reakcje hydrolizy wiązania estrowego w pozycji sn-2 fosfatydylocholiny bezpośrednio w surowym żółtku jaja kurzego za pomocą fosfolipazy A2 (PLA2) oraz natywnej fosfatydylocholiny w pozycji sn-1 stosując jako biokatalizator fosfolipazę A1 (PLA1). W celu analizy pozycyjnej fosfatydylocholiny z żółtka jaja kurzego oraz soi w czystej postaci ponownie zastosowałem PLA1 i PLA2. W tym przypadku obie reakcje hydrolizy prowadziłem w izooktanie w obecności soli sodowej sulfoburszynianiu dioktylu (AOT). W układzie tym fosfatydylocholina formowała micele co znacznie przyspieszało proces hydrolizy. Produkty reakcji tj. regioizomery lizofosfatydylocholiny oczyszczałem za pomocą chromatografii kolumnowej, hydrolizowałem chemicznie, a uwolnione kwasy tłuszczowe analizowałem bezpośrednio za pomocą HPLC lub po procesie estryfikacji do estrów metylowych za pomocą GC. Kolejna metoda polegała na enzymatycznej etanolizie fosfatydylocholiny. Zastosowałem tu mieszaninę reakcyjną charakteryzującą się bardzo prostym składem w porównaniu do pozostałych prezentowanych metod. W początkowej fazie mieszanina ta zawierała trzy składniki: 95% etanol, fosfatydylocholinę oraz immobilizowany enzym (sn-1,3 specyficzna lipaza z Mucor miehei). Całkowitą hydrolizę fosfatydylocholiny odnotowałem po 8 godzinach prowadzenia procesu. Produkty reakcji tj. 2-acylo-LPC oraz kwasy tłuszczowe uwolnione z pozycji sn-2 cząsteczki rozdzielałem stosując prostą ekstrakcję w układzie woda : heksan oraz wytrącanie 2-acylo-LPC ze zmrożonego acetonu. Kwasy tłuszczowe z pozycji sn-1 przeprowadzałem w estry etylowe i analizowałem za pomocą GC, uzyskując profil kwasów tłuszczowych obecnych w pozycji sn-1 fosfatydylocholiny. Z kolei otrzymaną 14 lizofosfatydylocholinę hydrolizowałem chemicznie, uwolnione kwasy również przeprowadziłem w estry etylowe i analizowałem za pomocą GC. Otrzymałem w ten sposób skład kwasów tłuszczowych w pozycji sn-2 fosfatydylocholiny. Ostatnia metodologia została zoptymalizowana pod kątem szybkości przeprowadzania analiz, gdyż w porównaniu ze znanymi z literatury i opracowanymi przez mnie procedurami umożliwia bardzo szybką analizę pozycyjną cząsteczki fosfolipidu. W metodzie tej jako biokatalizator stosowałem jedynie fosfolipazę A2 (PLA2), a jako medium reakcyjne izooktan z dodatkiem AOT. Całkowitą hydrolizę substratu obserwowałem już po 10 minutach. Produkty reakcji (kwasy tłuszczowe uwolnione z pozycji sn-2 oraz 1-acylo- lizofosfatydylocholiny) dzieliłem za pomocą SPE. Stosując bezpośrednią analizę (za pomocą HPLC) uwolnionych na drodze hydrolizy enzymatycznej kwasów tłuszczowych z pozycji sn-2 oraz kwasów tłuszczowych otrzymanych poprzez hydrolizę chemiczną 1-acylo- lizofosfatydylocholiny określiłem skład pozycyjny kwasów tłuszczowych wyjściowej cząsteczki fosfatydylocholiny. Ważnym celem prowadzonych badań było opracowanie metody umożliwiającej analizę procesu migracji reszt acylowych w lizoglicerofosfatydylocholinie oraz oznaczanie produktów enzymatycznej hydrolizy fosfatydylocholiny. W tym celu zastosowałem wysokosprawną chromatografię cieczową, a opracowana metoda znalazła zastosowanie do badania procesu migracji reszt acylowych w 17 rozpuszczalnikach najczęściej stosowanych w chemicznej i enzymatycznej syntezie lub modyfikacji fosfatydylocholiny. Istotnym zagadnieniem badawczym było także opracowanie wydajnej metody ekstrakcji czystej frakcji fosfolipidów z żółtka jaja kurzego. Opisana procedura oparta jest na: liofilizacji żółtka jaja kurzego, odtłuszczeniu acetonem, ekstrakcji fosfolipidów alkoholem oraz ich dodatkowym oczyszczeniu poprzez wytrącanie ze zmrożonego acetonu. Stosując tę metodę otrzymałem frakcję fosfolipidową o czystości 97,6% z wysoką wydajnością 7,7% i niską zawartością cholesterolu 0,15%. 15 1 WPROWADZENIE ICELE PRACY Fosfolipidy są to lipidy złożone zawierające w swej strukturze zestryfikowaną grupę fosforanową. Są to cząsteczki o amfifilowym charakterze szeroko rozpowszechnione w przyrodzie. Występują we wszystkich komórkowych strukturach błonowych zapewniając ich integralność i funkcjonalność. Biorą udział w regulacji podstawowych procesów biologicznych jako cząsteczki sygnalizacyjne. Dodatkowo wchodzą one w skład lipoprotein, kompleksów żółciowych oraz surfaktantów płucnych. w ostatnich latach gwałtowny postęp w biochemii lipidów przyczynił się do rozwoju dziedzin pokrewnych takich jak biochemia fosfolipidów [2]. Zsyntetyzowano wiele biologicznie ważnych ale rzadko występujących w przyrodzie fosfolipidów oraz opracowano wiele nowych metod syntez. Jednym z najszerzej badanych oraz stosowanych w przemyśle fosfolipidów jest fosfatydylocholina (PC). Jest to pochodna sn-glicero-3-fosforanu, w którym dwie grupy hydroksylowe gliceryny zestryfikowane są kwasami tłuszczowymi, a reszta kwasu fosforowego (V) dodatkowo choliną. Głównym jej źródłem są mieszaniny fosfolipidowe (tzw. lecytyny) pozyskiwane z nasion niektórych roślin m.in. soi, słonecznika lub rzepaku oraz w świecie zwierząt z żółtka jaja kurzego. Fosfolipidy znalazły szerokie zastosowanie w przemyśle spożywczym głównie jako emulgatory [3], a w przemyśle kosmetycznym i farmaceutycznym do tworzenia struktur liposomowych [4]. Właściwości fosfolipidów zależą od składu kwasów tłuszczowych oraz charakteru części polarnej cząsteczki. Produkty z nowo wbudowanymi resztami acylowymi i/lub zmodyfikowaną częścią polarną często charakteryzują się atrakcyjnymi właściwościami funkcjonalnymi w stosunku do fosfolipidów naturalnych. Dlatego duże zainteresowanie zarówno świata nauki jak i przemysłu wzbudzają fosfolipidy modyfikowane. Jedną z możliwych modyfikacji jest zwiększenie wartości odżywczej i zdrowotnej lecytyny poprzez wzbogacenie jej w wielonienasycone kwasy tłuszczowe [5]. Kwasy te stanowią materiał wyjściowy do biosyntezy eikozanoidów, prostaglandyn, prostacyklin, tromboksanów, leukotrienów. Powszechnie znaną właściwością wielonienasyconych kwasów tłuszczowych jest również ich wpływ na układ krążenia, obniżanie poziomu cholesterolu, zmniejszanie syntezy triacylogliceroli oraz hamowanie agregacji płytek krwi. Najnowsze doniesienia literaturowe podkreślają istotny wpływ kwasów omega-3, szczególnie DHA – kwasu 16 dokozaheksaenowego, na rozwój mózgu oraz wzroku zarówno w okresie płodowym jak i pourodzeniowym [3]. Drugim sposobem modyfikacji fosfolipidów jest ich wzbogacanie w nasycone kwasy tłuszczowe, co znacznie poprawia trwałość oksydacyjną tworzonych przez nie struktur liposomowych [6]. Również odpowiedni dobór kwasów tłuszczowych np. długość łańcucha węglowego może wpływać na takie parametry jak płynność i sztywność liposomów. Nowym podejściem w procesach modyfikacji fosfolipidów jest ich wykorzystanie jako nośników cząsteczek biologicznie aktywnych. Badania prowadzone w naszym zespole ukierunkowane są na modyfikacje zarówno czystych fosfolipidów jak i lecytyny z żółtka jaja kurzego. Głównym celem badań jest poprawa właściwości powierzchniowo czynnych fosfolipidów oraz opracowanie technologii produkcji nowej generacji suplementów diety na bazie lipidów polarnych z żółtka jaja kurzego. Modyfikacje prowadzone są głównie poprzez wymianę grup acylowych cząsteczki fosfatydylocholiny pod kątem zwiększania zawartości niezbędnych nienasyconych kwasów tłuszczowych (NNKT) [7] czy sprzężonego kwasu linolowego (CLA) [8]. Stosowane są również procesy transestryfikacji lecytyny z wykorzystaniem olejów roślinnych jako taniego źródła nienasyconych kwasów tłuszczowych. Fosfatydylocholina stosowana jest również jako nośnik związków biologicznie aktywnych takich jak dehydroepiandrosteron (DHEA) [9] czy betulina [10]. Dodatkowym aspektem badań jest wymiana części polarnej fosfatydylocholiny m.in. na L-serynę oraz jej liczne pochodne w celu zmiany i podnoszenia aktywności biologicznych wyjściowego fosfolipidu. Tak obszerny zakres badań wymagał opracowania licznych metod analitycznych umożliwiających zarówno pozyskiwanie czystych frakcji fosfolipidowych jak i metod zapewniających kontrole prowadzonych procesów syntezy oraz modyfikacji lipidów polarnych. Głównymi celami niniejszej pracy było więc opracowanie metod izolowania fosfolipidów o wysokiej czystości z żółtka jaja kurzego oraz pełna analiza frakcji lipidowej żółtka, ze szczególnym uwzględnieniem fosfolipidów. Zamierzałem również przeprowadzić analizę poszczególnych grup fosfolipidów pod względem składu kwasów tłuszczowych 17 z rozróżnieniem pozycji sn-1 i sn-2. Do tego celu niezbędne okazało się zastosowanie enzymów w postaci fosfolipaz A1 oraz A2 jak i sn-1,3-specyficznych lipaz. Niezwykle ważnym celem było również zbadanie wpływu rozpuszczalników stosowanych podczas syntezy i modyfikacji fosfatydylocholiny na proces migracji reszt acylowych w regioizomerach lizofosfatydylocholiny. Jako główną technikę analityczną planowałem zastosować wysokosprawną chromatografię cieczową (HPLC) z detektorem naładowanego aerozolu (Corona CAD). 18 2 PRZEGLĄD LITERATURY 2.1 OGÓLNA CHARAKTERYSTYKA I KLASYFIKACJA LIPIDÓW Lipidy stanowią złożoną i liczną grupę związków występujących we wszystkich organizmach żywych jako składniki błon biologicznych oraz skondensowany materiał energetyczny i zapasowy [11]. Pełnią one również ważną role w przekazywaniu informacji biologicznej zarówno wewnątrz komórki jak i w obrębie organizmu [12-14]. Kluczową rolę w tych procesach odgrywają fosfatydyloinozytole, których produkty hydrolizy (np. 1,4,5trifosforan fosfatydyloinozytolu) klasyfikuje się jako wtórne wewnątrzkomórkowe przekaźniki sygnału [15-17]. Dlatego lipidy stanowią bardzo ważny element diety, wpływając w dużym stopniu na stan zdrowia organizmów ludzkich. Wiele lipidów jest wręcz niezbędnych do życia. Przykładem są niektóre kwasy tłuszczowe (np. kwas linolowy (ω-6) i αlinolenowy (ω-3)), które nie są syntezowane w organizmie ludzkim i muszą być dostarczane wraz z pożywieniem. Jednocześnie podwyższone stężenie niektórych lipidów (np. cholesterolu czy też trans kwasów tłuszczowych) we krwi jest czynnikiem ryzyka niektórych chorób serca [18]. Obecnie brak jest w pełni satysfakcjonującej i uniwersalnej definicji charakteryzującej tę grupę związków [18]. Najbardziej ogólna definicja opisuje je jako grupę związków organicznych nierozpuszczalnych w wodzie, ale rozpuszczalnych w rozpuszczalnikach organicznych m.in. takich jak chloroform, eter, toluen [19, 20]. Na podstawie tej definicji do lipidów zaliczamy takie grupy związków jak np. kwasy tłuszczowe i ich pochodne, karotenoidy, fosfolipidy, sfingolipidy, steroidy, terpeny i wiele innych. Jednak nie wszystkie znane obecnie lipidy mogą być opisane za pomocą tej definicji. Przykładem są sacharolipidy, w których cząsteczce reszty kwasowe łączą się bezpośrednio z hydrofilowymi cukrami powodując brak rozpuszczalności tej grupy lipidów w przedstawionych rozpuszczalnikach organicznych [19]. Ze względu na ogromną różnorodność strukturalną i funkcjonalną cząsteczek lipidów bardzo ważnym zagadnieniem stała się ich prawidłowa klasyfikacja obejmująca wszystkie lipidy występujące w naturze. Ze względu na złożoność tego zagadnienia obecnie dostępnych jest kilka głównych schematów klasyfikacji tej grupy związków. Wiele źródeł m.in. Lipid Library [21] oraz Cyberlipids [22] dzielą lipidy na „proste” oraz „złożone”. Do grupy lipidów 19 prostych należą związki z których w wyniki hydrolizy otrzymuje się najwyżej dwa rodzaje głównych produktów, przykładem mogą być acyloglicerole, których hydroliza prowadzi do kwasów tłuszczowych oraz glicerolu. Natomiast lipidy złożone hydrolizowane są do co najmniej trzech produktów. Do grupy tej należą m.in. glicerofosfolipidy z których w wyniku hydrolizy można otrzymać kwasy tłuszczowe, glicerol oraz polarną „głowę” wyjściowej cząsteczki [23]. Dodatkowa trzecia główna grupa została zdefiniowana w japońskiej bazie lipidowej LipidBank [24] i obejmuje ona tzw. lipidy „pochodne” takie jak np. alkohole i kwasy tłuszczowe uzyskane w wyniku hydrolizy lipidów prostych. Przedstawione bazy, oprócz klasyfikacji, dostarczają wielu informacji dotyczących struktury oraz chemicznych i biologicznych właściwości lipidów. W ostatnich latach ze względu na ogromny rozwój lipidomiki czyli dziedziny nauki zajmującej się badaniem lipidów w systemach biologicznych, wymusił opracowanie nowego systemu klasyfikacji lipidów. Kompleksowy System Klasyfikacji Lipidów (ang. Comprehensive Classification System for Lipids) został opracowany z inicjatywy konsorcjum LIPID MAPS [20] przez Międzynarodowy Komitet Klasyfikacji i Nazewnictwa Lipidów (ILCNC) (ang. International Lipid Classification and Nomenclature Committee) i opublikowany w 2005 roku [25]. System ten oparty jest na dobrze zdefiniowanych chemicznych i biochemicznych założeniach. Celem opracowanego systemu była również łatwość klasyfikacji nowych związków, jak również zgodność z nowoczesnymi technologiami informatycznymi w celu przeszukiwania baz danych na podstawie struktury lub nazwy lipidu [15, 23, 25, 26]. System ten oparty jest na koncepcji dwóch podstawowych „cegiełek budulcowych” (ang. building blocks): grupy ketoacylowej oraz izoprenowej (Rys. 1). Rys. 1. Lipidowe „cegiełki budulcowe”. System klasyfikacji lipidów LIPID MAPS oparty jest na koncepcji dwóch głównych „cegiełek budulcowych”: ketoacylowej oraz izoprenowej [23]. 20 W konsekwencji lipidy zdefiniowane zostały jako hydrofobowe lub amfifilowe cząsteczki otrzymane w całości lub częściowo poprzez kondensacje karboanionu ketoacylotioestrów lub poprzez karbokationową kondensacje jednostek izoprenowych. W oparciu o ten system klasyfikacji lipidy podzielono na osiem kategorii: kwasy tłuszczowe i ich pochodne (ang. fatty acyls), glicerolipidy, glicerofosfolipidy, sfingolipidy, sacharolipidy i poliketydy (powstałe w wyniku kondensacji ketoacylowych podjednostek) oraz steroidy i prenole (powstałe w wyniku kondensacji podjednostek izoprenowych). Przykładowe struktury każdej kategorii lipidów wg systematyki LIPID MAPS zostały przedstawione na Rys. 2. Kategorie te dzielą się z kolei na klasy i podklasy. Każdy lipid oznaczony jest również unikatowym 12 lub 14znakowym identyfikatorem (LIPID MAPS ID lub „LM ID”). 21 Rys. 2. Przykładowe struktury każdej kategorii lipidów wg systematyki LIPID MAPS. 2.2 METODY EKSTRAKCJI LIPIDÓW Lipidy zwykle nie występują w postaci wolnej lecz są silnie związane z matrycą. W celu późniejszej analizy niezbędny więc staje się etap ich ekstrakcji. Proces separacji lipidów można podzielić na trzy podstawowe etapy: ekstrakcja lipidów z matrycy, usunięcie nielipidowych zanieczyszczeń oraz rozdział lipidów na poszczególne grupy. W przypadku gdy analiza polega na określeniu tylko zawartości frakcji lipidowej w danej próbce dwa pierwsze 22 etapy separacji są wystarczające do przeprowadzenia właściwej analizy [18]. Metody klasyczne jak również najnowsze metody ekstrakcji tej bardzo zróżnicowanej grupy związków przedstawiono w dalszej części tego rozdziału. 2.2.1 Metody ekstrakcji rozpuszczalnikami organicznymi Ekstrakcja rozpuszczalnikami organicznymi lub ich mieszaninami jest najczęściej stosowaną techniką izolowania lipidów. W celu wydzielania różnych grup tych związków stosuje się zróżnicowane warunki procesu. Zastosowanie rozpuszczalników niepolarnych takich jak heksan czy eter naftowy umożliwia ekstrakcje lipidów niepolarnych np. acylogliceroli. Natomiast w celu ekstrakcji lipidów polarnych (np. glicerofosfolipidów) niezbędne staje się zastosowanie rozpuszczalników polarnych takich jak etanol lub metanol [27-29]. Metody te stosowane są głównie do izolowania konkretnej grupy lipidów [29]. Jednak w wielu badaniach biochemicznych, fizjologicznych czy też żywieniowych niezwykle istotne jest ilościowe oznaczanie zawartości frakcji lipidowej w próbkach biologicznych [30]. Dlatego też ważne okazało się opracowanie metody umożliwiającej ekstrakcję wszystkich lipidów z danej próbki. Metoda ta musiałaby zapewniać możliwość izolowania jednocześnie lipidów niepolarnych i polarnych oraz ułatwiać uwalnianie tych związków ze struktur komórkowych takich jak np. błony czy kompleksy białkowo-lipidowe. W tym celu najczęściej stosowaną metodą ekstrakcji jest procedura zaproponowana w 1957 roku przez Folcha i wsp. [1]. Jako ekstrahent stosuje się tu mieszaninę chloroform : metanol (2:1, v/v) oraz wodny roztwór soli w celu wymywania składników polarnych. Obecnie występuje wiele modyfikacji tej metody, które opracowano w celu zwiększenia efektywności izolowania lipidów w konkretnych przypadkach [28]. Wadą tej metodologii jest jednak duże zużycie rozpuszczalników. Dlatego głównie ze względów ekonomicznych zaproponowano kilka alternatywnych metod. Najlepszą z nich okazała się metoda Blighta i Dyera [31]. Metoda ta jest obecnie obok metody Folcha najczęściej stosowaną procedurą ekstrakcji lipidów. Dużą zaletą jest w tym przypadku znacząca redukcja ilości użytej mieszaniny chloroform : metanol (1:2). Skutkiem tego jest jednak spadek odzysku lipidów, który nie przekracza zazwyczaj wartości 95% [30]. Obecnie metoda Folcha stosowana jest głównie do ekstrakcji lipidów z tkanek natomiast metoda Blighta i Dyera z płynów biologicznych [32]. 23 2.2.1.1 Metody ekstrakcji ciągłej lipidów rozpuszczalnikami W przypadku niektórych lipidów czy próbek możliwe jest zastosowanie procesów ekstrakcji ciągłej. Klasyczna metoda ekstrakcji ciągłej próbek stałych przeprowadzana jest za pomocą rozpuszczalnika w aparacie Soxhleta. Metoda ta została po raz pierwszy zaproponowana w 1879 przez Franza Rittera von Soxhleta i początkowo stosowana wyłącznie do ekstrakcji tłuszczy z próbek stałych [33]. Ekstrakcja w aparacie Soxhleta jest połączeniem ekstrakcji i destylacji, a oba procesy odbywają się w obiegu zamkniętym [34]. Mimo, iż proces ekstrakcji trwa długo i zwykle wynosi od 6 do 48 godzin metoda ta cieszy się dużym uznaniem w laboratoriach analitycznych. Obecnie technika ta została znacznie udoskonalona i zautomatyzowana prowadząc do znacznego skrócenia czasu oraz podniesienia wydajności procesu ekstrakcji. Komercyjnie dostępne są automatyczne ekstraktory np. Soxtec™ umożliwiający dwuetapową ekstrakcję tłuszczów [34, 35]. Ekstrakcja właściwa zachodzi we wrzącym rozpuszczalniku po którym następuje ekstrakcja dodatkowa kondensatem rozpuszczalnika [36]. Izolowanie tłuszczy w aparacie Soxhleta może być dodatkowo wspomagane promieniowaniem mikrofalowym (ang. microwave assisted soxhlet extraction, MASE) lub ultradźwiękami (ang. ultrasound-assisted extraction, UAE) [18, 33, 37]. 2.2.1.2 Otrzymywanie lecytyny jako przykład frakcjonowania lipidów rozpuszczalnikami Metody ekstrakcji rozpuszczalnikami są nie tylko stosowane w celach analitycznych ale również do otrzymywania grup lipidów o konkretnym zastosowaniu przemysłowym. Przykładem może być produkcja lecytyny. W literaturze zarówno popularnonaukowej jak i naukowej termin lecytyna przyjmuje wiele różnych znaczeń. W znaczeniu komercyjnym jest to naturalna mieszanina niepolarnych i polarnych lipidów izolowanych z surowców roślinnych lub zwierzęcych. Lipidy niepolarne to głównie triacyloglicerole natomiast do grupy lipidów polarnych zalicza się sacharolipidy oraz fosfolipidy. Istnieją również dwie dodatkowe definicje lecytyny: historyczna oraz definicja naukowa. Z historycznego punktu widzenia lecytyna definiowana jest jako mieszanina lipidów zawierających fosfor i wyizolowanych z jaj lub mózgu. Naukowa definicja natomiast określa lecytynę jako synonim fosfatydylocholiny (PC), która jest głównym składnikiem lecytyny komercyjnej [38]. Jednak obecnie przyjmuje się dwie definicje, które bardziej precyzyjnie określają czym tak naprawdę jest lecytyna. Pierwsza definiuje ją jako złożoną 24 mieszaninę nierozpuszczalnych z fosfatydylocholiny, w acetonie fosfatydyloetanoloaminy fosfatydów (PE), składających się fosfatydyloseryny głównie (PS) i fosfatydyloinozytolu (PI) w połączeniu z dodatkowymi substancjami takimi jak triacyloglicerole, kwasy tłuszczowe, cukry i steroidy. Druga określa ją jako mieszaniny lub frakcje fosfolipidowe uzyskane ze zwierzęcych lub roślinnych produktów żywnościowych na drodze procesów fizycznych [38]. Mimo iż lecytyna może być uzyskiwana z wielu surowców naturalnych takich jak np. mleko [39], organizmy morskie (kryl, jaja rybie, mięso rybie) [40] czy biomasa mikroorganizmów to jednak dwa surowce obecnie dominują jako źródła fosfolipidów, należą do nich soja oraz jaja kurze. Ze względu na fakt, iż każdy z surowców wymaga innej procedury ekstrakcji fosfolipidów i ze względu na obszerność tej tematyki w dalszej części rozdziału przedstawione zostaną jedynie podstawowe procesy izolowania lecytyny z jaj. Znanych jest kilka metod izolowania i oczyszczania fosfolipidów żółtek jaj kurzych. Jedna z nich polega na wstępnej ekstrakcji fosfolipidów etanolem, a następnie usunięciu obojętnych lipidów z ekstraktu przez krystalizację w niskiej temperaturze [41]. w procesie izolowania fosfolipidów stosuje się także proces ultrafiltracji [42]. Inna metoda polega na frakcjonowaniu lipidów z żółtka etanolem oraz heksanem. Surową frakcję fosfolipidów oczyszcza się przez wytrącenie w układzie heksan : aceton [29, 43]. W przemysłowym otrzymywaniu lecytyny dominują jednak dwie metody. W obu przypadkach otrzymywanie lecytyny polega na zastosowaniu frakcjonowania poprzez wykorzystanie różnych warunków ekstrakcji (różne rozpuszczalniki, temperatura oraz czas prowadzenia procesu). Pierwsza metoda oparta jest na fakcie ograniczonej rozpuszczalności lipidów polarnych w acetonie [43]. Ekstrakcja wyjściowego surowca prowadzi do uzyskania dwóch frakcji lipidowych: acetonowej, zawierającej głównie triacyloglicerole i cholesterol, oraz frakcji białkowo-fosfolipidowej. Uzyskaną frakcję białkowo-fosfolipidową poddaje się następnie ekstrakcji etanolem uzyskując lecytynę o wysokiej czystości. W metodzie drugiej stosuje się nowe technologie oparte na izolowaniu lipidów za pomocą gazów i ich mieszanin w stanie nadkrytycznym. Najczęściej w tym celu wykorzystuje się CO2, który w temperaturze 40°C i ciśnieniu ok. 300 barów wykazuje właściwości 25 ekstrakcyjne zbliżone do acetonu. Rozpuszcza lipidy niepolarne powodując tzw. odtłuszczenie fosfolipidów. Ditlenek węgla i wyekstrahowany olej mogą być następnie łatwo rozdzielone, a odzyskany gaz może być ponownie zastosowany w procesie izolowania [4448]. Jednak w celu ekstrakcji fosfolipidów z żółtka, oprócz dwutlenku węgla wymagany jest dodatek 5-10% etanolu. Zastosowanie CO2 w procesach ekstrakcji lipidów zostało szeroko opisane przez Sahena [49]. 2.2.2 Ekstrakcja do fazy stałej (SPE) Klasyczna ekstrakcja ciecz-ciecz jest łatwa, niewymagająca specjalistycznego sprzętu, ale czasochłonna i wymagająca dużej ilości czystych rozpuszczalników. Do celów analitycznych stosuję się metodę ekstrakcji do fazy stałej (ang. solid phase extraction, SPE) umożliwiającą redukcję czasu analizy, objętości używanych rozpuszczalników i związanego z tym zmniejszenia ilości szkodliwych odpadów [34]. Izolowanie analitu następuje w układzie ciecz–ciało stałe. Fazą stałą jest tu kolumienka wypełniona odpowiednim adsorbentem, zazwyczaj w postaci żelu krzemionkowego lub krzemionki modyfikowanej. Pierwsze zastosowanie tej techniki do rozdziału lipidów zostało zaproponowane w 1980 roku przez Williamsa, McCluera [50] oraz Powella [51]. Kolejne wykorzystanie tej techniki do izolowania i rozdziału lipidów występujących w matrycach biologicznych i żywności zostały opisane przez Wachoba [52], Christiego [53] oraz Ebelera i Shibamoto [54]. Obecnie metoda ta jest rutynową techniką ekstrakcji stosowaną w większości laboratoriów analitycznych. W procesie izolowania stosuje się zazwyczaj komercyjnie dostępne sorbenty w postaci upakowanych polimerowych lub szklanych kolumienek oraz dysków ekstrakcyjnych umożliwiających oczyszczanie i zatężanie próbek oraz usuwanie matrycy. Obecnie proponowanych jest wiele udoskonaleń tej techniki. Dostępne są np. 96-dołkowe płytki (ang. 96-Well SPE Plates) zwiększające znacznie wydajność procesu ekstrakcji oraz końcówki do pipet SPE redukujące znacznie czas i ilość zużytego rozpuszczalnika [55]. Stosuje się również ekstraktory umożliwiające automatyzację procesu izolowania. Zasada rozdzielania metodą SPE zależy głównie od natury sorbentu. Najczęściej stosowaną fazą stałą w przypadku izolowania lipidów jest żel krzemionkowy [56-58]. Kolumienki z tym sorbentem stosuje się zarówno do ekstrakcji lipidów polarnych jak i oczyszczania niepolarnych lipidów z polarnych zanieczyszczeń [59]. Głównymi siłami 26 warunkującymi oddziaływania między analitem, a stałym adsorbentem polarnym są wiązania wodorowe, oddziaływania dipol-dipol, dipol indukowany-dipol oraz siły dyspersyjne [34]. Jednak w przypadku krzemionki aby zapewnić wysoką powtarzalność procesu izolowania, przez niektórych autorów zalecane jest osuszanie kolumienek przed analizą lub stosownie rozpuszczalników o kontrolowanej zawartości wody [59]. Wpływ wilgotności sorbentu na adsorpcję jest znacznie mniejszy, gdy jako fazę stałą stosuje się polarny sorbent w postaci modyfikowanej krzemionki np. sorbenty aminowe [60] czy diolowe [61]. W przypadku ekstrakcji lipidów polarnych spotkać można również metody, w których stosuje się sorbenty hydrofobowe takie jak np. C8 lub C18 [56, 62, 63]. Bardzo ciekawe zastosowanie tzw. ekstrakcji do fazy stałej in situ (in situ SPE) w celu izolowania konkretnych grup lipidów z żółtka jaja kurzego zostało przedstawione przez Nielsena [64-66]. Umieścił on zdenaturowane termicznie lub wysuszone rozpyłowo żółtka jaja kurzego w kolumnie chromatograficznej, a następnie prowadził ekstrakcję lipidów poprzez przemywanie materiału biologicznego rozpuszczalnikami organicznymi. W metodzie tej matrycą, w której prowadzono ekstrakcje były zdenaturowane białka. Triacyloglicerole oraz cholesterol były następnie eluowane za pomocą acetonu, natomiast lipidy polarne za pomocą etanolu. Uzyskano w ten sposób frakcje lipidowe o wysokiej czystości. Zaprezentowano również możliwość zastosowania przedstawionej metody w przemysłowym procesie pozyskiwania fosfolipidów z żółtek jaj kurzych. Metoda ta jest alternatywą dla klasycznych metod izolowania fosfolipidów stosowanych w przemyśle (patrz rozdział 1.2.1.1). W wielu przypadkach rozdział lipidów za pomocą SPE poprzedzony jest wstępną ekstrakcją rozpuszczalnikami organicznymi w celu usunięcia składników matrycy, które mogłyby negatywnie wpływać na rozdział lipidów za pomocą tej techniki. Wybór procedury zależy w dużej mierze od złożoności matrycy z której ekstrahuje się lipidy [59]. W przypadku złożonych matryc (np. tkanki zwierzęce lub roślinne), w których lipidy mogą tworzyć silne kompleksy z innymi makromolekułami, często wymagane są procesy hydrolizy („trawienia”) kwasowej czy zasadowej umożliwiające oznaczenie ilości lipidów. Najczęściej stosowane metody ekstrakcji przedstawiono w rozdziale 1.2.1. 27 2.3 ROZDZIAŁ LIPIDÓW ZA POMOCĄ TECHNIK CHROMATOGRAFICZNYCH Chromatografia jest metodą rozdzielania mieszanin, w której rozdzielane składniki ulegają podziałowi pomiędzy dwie fazy, z których jedna jest fazą nieruchomą (stacjonarną), a druga fazą ruchomą (mobilną) układu chromatograficznego. Fazą stacjonarną może być ciało stałe, ciecz na nośniku lub żel, a fazą ruchomą – gaz, ciecz i gaz lub ciecz w stanie nadkrytycznym (fluid) [67]. Chromatografia jest zarówno metodą analityczną jak i preparatywną służącą do izolowania czystych substancji. Jest obecnie najbardziej rozpowszechnioną i jednocześnie wszechstronną techniką separacyjną, dostępną powszechnie, a nie tylko w nowoczesnych laboratoriach [34]. W dalszej części rozdziału omówione będą najważniejsze techniki chromatograficzne stosowane obecnie do rozdziału lipidów. 2.3.1 Chromatografia cieczowa 2.3.1.1 Chromatografia cienkowarstwowa Chromatografia cienkowarstwowa (ang. thin-layer chromatography, TLC) jest techniką stosowaną rutynowo do podziałów, identyfikacji oraz analizy ilościowej poszczególnych lipidów [68-70]. Głównymi zaletami tej techniki są prostota i niska cena sprzętu, niewymagającego dostępu do elektryczności, łatwość modyfikacji warunków analizy oraz łatwość detekcji, dzięki której wszystkie składniki próbki mogą być monitorowane [34]. Posiada ona jednak dwie znaczące wady tj. niską rozdzielczość oraz niską czułość [18]. Najbardziej popularnymi fazami stałymi w tej technice są żel krzemionkowy, tlenek glinu oraz ziemia okrzemkowa. Wśród nich zdecydowany prym wiedzie jednak żel krzemionkowy. Sorbent ten dodatkowo może być modyfikowany chemicznie, np. grupami NH 2 (normalny układ faz) lub oktadecylosilanowymi C-18 (odwrócony układ faz). Chromatografia TLC w normalnym układzie faz jest najczęściej stosowana do rozdziału lipidów różniących się polarnością. Dlatego też wykorzystywana jest do rozdziału fosfolipidów posiadających w cząsteczce różne polarne „głowy” [71]. W przypadku chromatografii odwróconych faz obserwuje sie dodatkowy podział cząsteczek lipidów należących do tej samej klasy ale różniących się m.in. składem kwasów tłuszczowych [72]. Innymi fazami stałymi są sorbenty impregnowane azotanem (V) srebra (AgNO3), kwasem borowym (H3BO3) czy kwasem etylenodiaminotetraoctowym (EDTA). Azotan (V) srebra 28 stosowany jest głównie w celu rozdziału lipidów na grupy związków posiadające tę samą liczbę i konfigurację wiązań podwójnych. Podział polega na kompleksowaniu elektronów wiązania podwójnego z jonami Ag+ i zmniejszaniu mobilności rozdzielanych lipidów podczas procesu chromatograficznego [73, 74]. Kwas borowy stosowany jest głównie do podziału izomerów diacylogliceroli jak również izomerów fosfolipidów. Kwas ten tworzy kompleksy m.in. Ze związkami posiadającymi wicynalne grupy hydroksylowe ograniczając proces izomeryzacji tych cząsteczek podczas rozdziału [72, 75]. Trzeci rodzaj modyfikatora tj. EDTA znacznie polepsza rozdział fosfolipidów kwasowych takich jak np. fosfatydyloseryna (PS) [76]. Obok tradycyjnej chromatografii cienkowarstwowej obecnie coraz częściej stosowane są jej modyfikacje zwiększające możliwości rozdzielcze tej techniki. Jedną z nich jest tzw. Wysokosprawna chromatografia cienkowarstwowa (ang. high-performance thin-layer chromatography, HPTLC). HPTLC charakteryzuje się znacznie mniejszym rozmiarem cząstek złoża fazy stałej (≤10 µm) oraz jej mniejszą grubością (≤150 µm). Wpływa to m.in. na zwiększenie zdolności rozdzielczej, znacznie krótszy czas rozwijania płytki oraz redukcje zużycia rozpuszczalników. Dalsze usprawnienia tej techniki doprowadziły do powstania tzw. UTLC (ang. ultra-thin-layer chromatography), w której stosuje się bardzo cienkie płytki monolityczne zwiększające 10-100 razy czułość metody [77]. Końcowym procesem analizy TLC jest zawsze detekcja rozdzielonych lipidów czyli analiza jakościowa. Polega ona na wywoływaniu chromatogramów odczynnikami chemicznymi tworzącymi barwne związki z analitami oraz na porównywaniu współczynnika retencji Rf wzorca i badanej próbki. Szczegółowy opis wywoływaczy stosowanych w przypadku lipidów został przedstawiony przez Fuchsa i wsp. [72]. W przypadku TLC możliwa jest również analiza ilościowa polegająca zazwyczaj na densytometrycznym porównaniu intensywności zabarwienia plamek z analogicznymi parametrami plamek wzorców [78]. Czasami jednak wiarygodna identyfikacja plamek poprzez porównanie z plamkami wzorca jest niemożliwa i dalsze techniki analityczne są wymagane w celu identyfikacji nieznanego lipidu. W tym celu stosuje się obecnie spektrometrię masową. Najnowsze metody umożliwiają przeprowadzenie analizy bezpośrednio z płytki TLC bez konieczności dodatkowej ekstrakcji [72]. Przeprowadzenie tych 29 analiz możliwe jest między innymi za pomocą spektrometrów masowych z metodami jonizacji przez: rozpylanie w polu elektrycznym (ESI ang. electrospray ionization) [79], desorpcyjną jonizacje przez rozpylanie w polu elektrycznym (DESI ang. desorption electrospray ionization) [80], chemiczną jonizację pod ciśnieniem atmosferycznym (APCI ang. atmospheric pressure chemical ionization) [81] oraz desorpcję laserem wspomaganą matrycą (MALDI ang. matrix assisted laser desorption ionization) [72, 77]. Rozwój techniki TLC doprowadził do opracowania metod całkowicie zautomatyzowanych. Głównym producentem tego typu analizatorów jest obecnie szwajcarska firma CAMAG. W urządzeniach tych wykorzystuje się tzw. technikę zautomatyzowanego wielokrotnego rozwijania (ang. automated multiple development, AMD) w której cały proces analityczny od mieszania eluentów, rozwijania chromatogramu, do suszenia płytki jest całkowicie zautomatyzowany. Technologia AMD-HPTLC umożliwia zastosowanie wieloetapowego gradientu podczas rozwijania chromatogramu. Wykorzystanie tego systemu do rozdziału i analizy ilościowej lipidów zostało przedstawione m.in. przez Zellmera i wsp. [82] oraz Bonte i wsp. [83]. 2.3.1.2 Chromatografia kolumnowa niskociśnieniowa Kolumnowa chromatografia niskociśnieniowa stosowana jest jako technika chromatografii preparatywnej wykorzystywana głównie do rozdzielania dużych ilości próbki. W metodzie tej stosowane są zarówno sorbenty polarne (normalny układ faz) jak i złoża niepolarne (odwrócony układ faz). Jednak ze względów na znacznie niższą cenę najczęściej stosowane są polarne fazy stałe. Do rozdziału lipidów stosuje się głównie żel krzemionkowy [9, 84-86] i trójskładnikowy eluent, chloroform : metanol : woda. W przypadku tej metody kolejność elucji lipidów z kolumny zależy od ich polarności [34]. Jednak stosowane są również inne złoża, Sephadex G-25 oraz Fluorosil, do oczyszczania ekstraktów lipidowych uzyskanych metodą Folcha [87] czy też krzemionka modyfikowana grupami oktadecylosilanowymi (C18) zastosowana do usuwania polarnych zanieczyszczeń oraz frakcjonowania lipidów z ekstraktu mózgowego [88]. 30 2.3.1.3 Wysokosprawna chromatografia cieczowa Wysokosprawna chromatografia cieczowa (HPLC) jest najprężniej rozwijającą się i bardzo szeroko stosowaną nowoczesną techniką separacji [34]. Określenie HPLC uwypukla najistotniejsze cechy tej techniki, którymi są: wysoka sprawność, dobra rozdzielczość, duża szybkość procesu i stosowanie wysokich ciśnień. Te korzystne parametry współczesnej chromatografii cieczowej (HPLC) osiągnięto dzięki instrumentacji metody i wprowadzeniu nowych faz stacjonarnych [67]. Zasadniczą różnicą pomiędzy chromatografią kolumnową niskociśnieniową, a chromatografią wysokosprawną jest rozmiar cząstek wypełnienia. W tej drugiej stosuje się wypełnienie o wymiarach cząstek rzędu 5µm lub mniejsze. Wymusza to jednak stosowanie wysokiego ciśnienia w celu umożliwienia przepływu fazy ruchomej przez kolumnę [34]. W przypadku analiz lipidów technika ta wykazuje pewną przewagę w porównaniu z innymi metodami chromatograficznymi. Analiza ilościowa może być przeprowadzona tu znacznie łatwiej niż np. Za pomocą TLC, co więcej w przypadku HPLC poprzez znacznie mniejszy kontakt analitu z tlenem atmosferycznym ograniczono procesy utleniania [89]. Większość lipidów również ze względu na ograniczoną lotność nie może być analizowana za pomocą chromatografii gazowej. Wyższa temperatura analiz zwiększa również ryzyko izomeryzacji analizowanych lipidów np. nienasyconych kwasów tłuszczowych [27]. Dodatkowo w przypadku HPLC rozdzielane i analizowane związki mogą być gromadzone i poddawane dalszym analizom np. technikom spektroskopowym (dotyczy to analiz, w których nie stosuje się destrukcyjnej metody detekcji) [90]. 2.3.1.3.1 Chromatografia cieczowa w normalnym układzie faz (NP-LC) Chromatografia w normalnym układzie faz (ang. normal phase liquid chromatography, NP-LC) jest to typ chromatografii, w której faza stacjonarna jest bardziej polarna niż faza ruchoma. W chromatografii NP jako fazę stacjonarną stosuję się przede wszystkim żel krzemionkowy, a także fazy związane chemicznie, w których struktury wchodzą polarne grupy funkcyjne (aminowa, cyjanowa oraz diolowa). Jako fazę ruchomą wykorzystuje się niepolarne rozpuszczalniki organiczne, takie jak: heksan, chloroform, eter izopropylowy i in. [34]. W przypadku lipidów ten rodzaj chromatografii stosowany jest do rozdziału tej grupy związków na poszczególne klasy [39, 91, 92]. Technika ta jest dominującą metodą separacji 31 fosfolipidów [57, 58, 62]. Fosfolipidy rozdzielane są na zasadzie mechanizmu adsorpcji i ich retencja zależy od rodzaju części polarnej cząsteczki. Fazy te stosowane są również do podziału izomerów lizofosfolipidów (np. 1- i 2-acylo-LPC oraz 1- i 2-acylo-LPG) [93, 94] oraz mono- i diacylogliceroli [95]. NP-LC znalazło również zastosowanie do rozdziału preparatywnego fosfolipidów [96, 97], ceramidów [98], estrów etylowych kwasu dokozaheksaenowego (DHA) oraz dokozapentaenowego (DPA) [99] i wielu innych grup lipidów. Technika stosowana jest nawet do rozdziału enancjomerów diacylogliceroli w postaci diastereoizomerycznych pochodnych (np. karbaminianów) [75, 100]. Podobnie jak w przypadku chromatografii cienkowarstwowej, krzemionkowa faza stała w NP-LC może być impregnowana dodatkowymi związkami. W tym celu najczęściej stosuje się AgNO3. Fazy takie wykorzystuje się do rozdziału lipidów na grupy związków posiadające tę samą liczbę i konfigurację wiązań podwójnych. Ag-LC okazała się potężną techniką do analitycznego i półpreparatywnego rozdziału oraz izolowania izomerów kwasów tłuszczowych [101] oraz triacylogliceroli [102] różniących się nie tylko konfiguracją ale również położeniem wiązania podwójnego. Nie ma natomiast doniesień dotyczących podziału glicerofosfolipidów za pomocą tej techniki. Dużą wadą kolumn srebrowych jest ich niewielka trwałość. Bardziej stabilne złoża utworzono poprzez impregnowanie solami srebrowymi kolumny kationo-wymiennej (np. Nukleosil 5SA) [103]. Jednak złoże to mimo iż nie umożliwia rozdziału izomerów pozycyjnych to z powodzeniem zostało zastosowane do analizy triacylogliceroli oleju rybiego [75]. Krzemionkowa faza stała modyfikowana z kolei cyklodekstrynami została wykorzystana przez Abidiego i wsp. [104] do rozdziału fosfolipidów z soi w izokratycznym programie elucji. Jako fazę ruchomą zastosowano mieszaninę heksanu, izopropanolu, etanolu oraz wody z fosforanem tetrametyloamonu (TMAP), a jako system detekcji detektor UV. 2.3.1.3.2 Chromatografia cieczowa w odwróconym układzie faz (RP-LC) Chromatografia w odwróconym układzie faz (ang. reversed-phase liquid chromatography, RP-LC) jest to typ chromatografii, w której faza ruchoma jest bardziej polarna niż faza stacjonarna. W chromatografii RP lipidów najczęściej stosowana jest związana faza oktadecylosilanowa (C18) [105], w której grupy alkilowe na powierzchni żelu krzemionkowego mają 18 atomów węgla w łańcuchu [34]. Można jednak spotkać również 32 kolumny C5 oraz C8 [106, 107] oraz złoża bardziej „niestandardowe” np. kolumna Flufix z perfluorowaną fazą stałą zastosowaną do rozdziału cholesterolu oraz produktów degradacji fosfatydylocholiny [108]. Rozdział za pomocą RP-LC prowadzi zwykle do podziału poszczególnych klas lipidów na związki różniące się składem reszt acylowych w cząsteczce [109]. Mechanizm separacji lipidów na hydrofobowych fazach stacjonarnych ma charakter podziałowy. Stąd lipidy bardziej hydrofobowe są silniej zatrzymywane w fazie stacjonarnej i eluują z kolumny później niż lipidy bardziej polarne. Kolejność elucji zależy nie tylko od długości łańcucha węglowego ale również od stopnia nienasycenia reszt acylowych analizowanych lipidów [110]. Kolejność elucji lipidów w chromatografii cieczowej w odwróconym układzie faz (RP-LC) przedstawia się za pomocą tzw. Współczynnika ECL (ang. equivalent chain lengths) [111] dla kwasów tłuszczowych lub ECN (ang. equivalent carbon number) [110] dla pozostałych lipidów. Na przykład dla kwasu tłuszczowego składającego się z N atomów węgla i zawierającego w cząsteczce n wiązań podwójnych wartość ECL = N-2n. Oznacza to, że wraz ze wzrostem wartości ECL rośnie siła retencji danego kwasu tłuszczowego. Ogólnie rzecz biorąc każde wiązanie podwójne powoduje redukcję czasu retencji równe skróceniu łańcucha węglowego kwasu nasyconego o około dwie grupy metylenowe [112]. Dlatego np. kwasy 14:0 i 16:1 charakteryzują się bardzo zbliżonymi czasami retencji tworząc tzw. „parę krytyczną”. Analogicznie można wyznaczyć współczynnik ECN dla np. fosfatydylocholiny (PC). W tym przypadku ECN = CN-2n gdzie CN jest to suma atomów węgla reszt acylowych fosfolipidu, natomiast n to suma wiązań podwójnych. Zakładając, że PC zestryfikowana jest kwasami 16:0 i 18:1 otrzymujemy współczynnik ECN = 16. Wyznaczenie tych współczynników dla określonej mieszaniny lipidów dostarcza cennych informacji na temat możliwości pojawienia się par krytycznych podczas opracowywania metody rozdziału i umożliwia wprowadzenie zmian w celu uzyskania dobrego podziału wszystkich pików. Opublikowano wiele prac na temat sposobów ulepszania RP-HPLC w celu detekcji lipidów. Wprowadzono m.in. programowanie temperatury rozpuszczalników wpływając znacznie na polepszenie rozdzielczości pików oraz wzrost ilości rozpuszczalników jakie mogą być użyte do rozdziału lipidów, a które wykazują ograniczoną rozpuszczalność w wodnych eluentach stosowanych w RP-HPLC [75]. Badano również wpływ różnych rozpuszczalników i ich mieszanin na tworzenie się par krytycznych pomiędzy kwasami tłuszczowymi. Następnie 33 na podstawie uzyskanych informacji optymalizowano metody rozdziału złożonych mieszanin kwasów tłuszczowych lub ich pochodnych [111]. Opracowano również wiele metod umożliwiających rozdziały mieszanin triacylogliceroli [113, 114] oraz fosfolipidów [105, 115]. Można również stosować wstępne rozdziały klas lipidów za pomocą TLC lub NP-HPLC a następnie uzyskane frakcje poddawać rozdziałowi ze względu na skład kwasów tłuszczowych za pomocą RP-HPLC. Ogranicza to możliwość pokrywania się pików pochodzących od różnych klas lipidów [27, 75, 116-118]. W niektórych przypadkach w celu rozdziału fosfolipidów ze względu na rodzaj reszt acylowych, prowadzono wstępną hydrolizę fosfolipidów za pomocą fosfolipazy C. Usuwano w ten sposób polarną głowę a uzyskane cząsteczki diacyloglicerolu rozdzielano za pomocą RP-HPLC [119]. 2.3.1.3.3 Chromatografia cieczowa oddziaływań hydrofilowych (HILIC) Chromatografia cieczowa oddziaływań hydrofilowych (ang. hydrophilic interaction liquid chromatography, HILIC) jest alternatywną metodą rozdziału związków polarnych w chromatografii cieczowej. Nazwa została wprowadzona przez Alperta w 1990 roku w celu odróżnienia jej od chromatografii w normalnym układzie faz [120]. HILIC można scharakteryzować jako chromatografię w normalnym układzie faz (NP-LC), w której zastosowano standardowe fazy ruchome stosowane w chromatografii w odwróconym układzie faz (RP-LC) [121]. Podobnie jak w przypadku NP-LC stosowane są tu tradycyjne polarne fazy stałe, takie jak żel krzemionkowy, fazy diolowe czy cyjanowe [122]. Mimo iż zwykle technika HILIC stosowana jest do rozdziału małocząsteczkowych związków polarnych to przedstawiono również możliwość wykorzystania jej do rozdziału lipidów (głównie lipidów polarnych) [123]. Pierwsza izokratyczna metoda rozdziału pięciu klas fosfolipidów (wyizolowanych z osocza krwi oraz mózgu wieprzowego) za pomocą HILIC została zaproponowana dopiero w 2010 roku przez Schwalbe-Herrmanna i wsp. [124]. Jako fazę ruchomą zastosowali oni mieszaninę acetonitrylu : metanolu : 10mM octanu amonu (55:35:10, v/v/v). W warunkach tych fosfolipidy rozdzielały się nie tylko na poszczególne klasy ale również częściowo na grupy różniące się składem kwasów tłuszczowych. Scherer i wsp. [125] zaproponowali z kolei gradientowy rozdział sfingolipidów i ceramidów w układzie woda : acetonitryl (z dodatkiem kwasu mrówkowego oraz mrówczanu amonu). W przypadku tym zaobserwowano znaczne 34 poprawienie powtarzalności analiz jak i kształtu pików w porównaniu z analizami wykonywanymi techniką NP-LC. Dodatkową wadą technik NP-LC jest konieczność stosowania niepolarnych rozpuszczalników, które nie zapewniają optymalnych warunków jonizacji w przypadku detekcji ESI-MS (ang. electrospray ionization mass spectrometry). Technika HILIC znalazła także zastosowanie w oznaczaniu lipidów w produktach żywnościowych np. sfingomieliny w mięsie [126] czy fosfolipidów w mleku [127]. Jednak większość najnowszych doniesień literaturowych dotyczących rozdziału lipidów za pomocą HILIC związanych jest z lipidomiką czyli gałęzią nauki zajmującą się charakterystyką profilu lipidowego komórek, tkanek lub całych organizmów. Duży jej potencjał w tej dziedzinie został przedstawiony w metodzie oznaczania profilu lipidowego wiciowca Leishmania donovani [128] gdzie w połączeniu ze spektrometrem masowym z transformacją Fouriera zidentyfikowano 188 rodzajów cząsteczek lipidów polarnych oraz niepolarnych. Z kolei szczegółowa analiza roślinnego profilu lipidowego została ostatnio przedstawiona przez Okazakiego i wsp. [129]. Powyżej przedstawiono jedynie kilka przekładowych zastosowań techniki HILIC. W zaprezentowanych metodach można zauważyć jednak jej ogromny potencjał do rozdziału lipidów. Wg autora zainteresowanie tą techniką w analizie lipidów będzie rosło głównie ze względu na niesamowity rozwój w ostatnich latach, lipidomiki której podstawowym motorem napędowym jest spektrometria masowa, a w połączeniu z którą HILIC wykazuje przewagę nad innymi technikami m.in. NP-LC. 2.3.1.3.4 Chromatografia cieczowa z chiralnymi fazami stałymi W literaturze dotyczącej zagadnienia rozdziału enancjomerycznego lipidów za pomocą HPLC prezentowane są głównie metody rozdziału monoacylogliceroli (MAG), diacylogliceroli (DAG) oraz triacylogliceroli (TAG). Związki te stosowane są jako emulgatory w przemyśle spożywczym, kosmetycznym i farmaceutycznym. Poza tym ich czyste izomery wykorzystywane są w syntezie organicznej fosfolipidów, glikolipidów, proleków oraz strukturyzowanych lipidów. Jednak synteza czystych optycznie enancjomerów DAG i MAG tradycyjnymi metodami syntezy chemicznej jest niezwykle trudna. Obecnie w tym celu stosuje się lipazy katalizujące regioi stereoselektywne reakcje hydrolizy monoacylotrójglicerydów. Największym jednak problemem w tych metodach jest określenie stereoselektywności biokatalizatorów. W tym 35 celu niezbędne są metody analityczne umożliwiające rozdział i analizę enancjomerycznych produktów reakcji [130]. Do tego celu najczęściej stosuje się wysokosprawną chromatografie cieczowa z chiralną fazą stałą. Większość dostępnych obecnie metod przed rozdziałem za pomocą HPLC wymaga przeprowadzania rozdzielanych lipidów w różnego rodzaju pochodne. Takagi wraz ze współpracownikami przeprowadził rozdział enancjomeryczny MAG oraz DAG w postaci pochodnych dinitrofenylouretanowych (DNPU) [131-134]. Jako chiralne fazy stałe zastosowano żel krzemionkowy (Sumpax OA-4100) lub krzemionkę z grupami γaminopropylosilanowymi (Sumichiral OA-4100), modyfikowane dodatkowo N-(R)-1-(αnaftaleno)etyloaminokarbonylo-(S)-waliną. Autorzy ci opracowali również stereospecyficzną analizę triacylogliceroli za pomocą HPLC z chiralną fazą Sumichiral OA-4100. Z kolei Itabashi i wsp. do rozdziału 3,5-DNPU pochodnych di- oraz triacylogliceroli zastosowali kolumny chiralne z fazą stałą zawierającą chemicznie związany z krzemionką polimer R-(+)-1-(1-naftaleno)etyloaminy (NEA) [135-137]. Natomiast w celu rozdziału enancjomerów monoacylogliceroli, przeprowadzali je w pochodne 3,5-DNPU i rozdzielali za pomocą HPLC z faza aminopropylosilanowymi stałą w postaci modyfikowanego złoża krzemionkowego dodatkowo za z pomocą grupami γ- N-(S)-2-(4- chlorofenylo)isowalerianoilo-D-fenyloglicyny (CPVPG). Najnowsze metody rozdziału regioizomerów i enancjomerów mono-, di- oraz triacylogliceroli zostały przedstawione przez Denga i wsp. [130, 138, 139]. W celu pełnego rozdziału analizowanych lipidów, zastosowali oni system HPLC, w którym wykorzystano dwie różne kolumny (standardową kolumnę krzemionkową oraz kolumnę enancjoselektywną) połączone równolegle. Dużą zaleta tej metody jest fakt iż DAG i MAG mogą być analizowane bez przeprowadzania ich w pochodne, co nie tylko znacznie ułatwia analizę ale również ogranicza dodatkowe procesy (m.in. izomeryzacje poprzez migracje reszt acylowych), które mogą zachodzić podczas wstępnej derywatyzacji analitów i negatywnie wpływać na końcowy wynik analizy. Oprócz enancjomerycznego rozdziału glicerolipidów szczególnie ważnym zagadnieniem jest również możliwość analizy enancjomerów hydroksykwasów, które powstają w szlakach biosyntetycznych np. W wyniku działania lipooksygenazy w szlaku eikozanoidowym [53, 140]. Metoda taka została zaproponowana przez Takagiego i wsp. [141]. Całkowity rozdział 36 mieszanin racemicznych α-hydroksykwasów tłuszczowych o różnej długości łańcucha węglowego i w postaci pochodnych DNPU został przeprowadzony z zastosowaniem kolumny chiralnej (CPVPG) oraz fazy ruchomej składające się z heksanu, 1,2-dichloroetanu oraz etanolu. 2.3.1.3.5 Wielowymiarowa chromatografia cieczowa (MDLC) Rosnąca potrzeba identyfikacji i oznaczania lipidów w złożonych mieszaninach i matrycach biologicznych związana jest głównie z rozwojem lipidomiki. W celu właściwej analizy takich próbek, składniki mieszaniny powinny być rozdzielone zarówno w celu identyfikacji jak i analizy ilościowej. Niestety metody jednowymiarowej chromatografii cieczowej (1D LC – one-dimensional liquid chromatography) wykorzystujące jeden mechanizm rozdziału, bardzo często są niewystarczające do tego celu. Mieszaniny te wymagają metod charakteryzujących się znacznie większymi „zdolnościami” separacyjnymi, które mogą być zapewnione jedynie poprzez zastosowanie wielowymiarowej chromatografii cieczowej (MDLC - multidimensional liquid chromatography) łączącej różne metody separacyjne. Sprawność rozdziału może zostać polepszona poprzez połączenie różnych rodzajów kolumn chromatograficznych bądź poprzez wykorzystanie różnych konfiguracji analitycznych [142, 143]. Najczęściej wielowymiarowa separacja obejmuje dwie techniki rozdzielania podczas jednej analizy (2D LC - two-dimensional liquid chromatography) [144]. Koncepcja chromatografii wielowymiarowej wywodzi się z chromatografii cienkowarstwowej (TLC). Pierwszy dwukierunkowy rozdział za pomocą tej techniki (2D-TLC) został zaprezentowany już w 1944 roku [145]. W metodzie tej związki rozdzielone w pierwszym kierunku (pierwszy wymiar) były rozdzielane dodatkowo w drugim kierunku leżącym pod kątem prostym (ortogonalnie) w stosunku do pierwszego. Obecnie z powodzeniem technika ta nadal stosowana jest do rozdziału mieszanin lipidów [72, 146, 147]. Analizę lipidów w systemie dwuwymiarowym prowadzi się metodami opartymi na chromatografii gazowej (GCxGC), chromatografii cieczowej (LCxLC) oraz na połączeniu tych dwóch technik (LCxGC ). Dodatkowo techniki te można podzielić, ze względu na rodzaj przenoszenia rozdzielanych analitów pomiędzy wymiarami, na systemy: off-line, on-line oraz stop-and-go. 37 Off-line MDLC. W systemie off-line, na kolumnie pierwszej przeprowadza się wstępnym rozdział analizowanej mieszaniny na poszczególne frakcje, które zbiera się zazwyczaj w wialkach, następnie odparowuje się rozpuszczalnik i ponownie nastrzykuje na drugą kolumnę [148]. Prostym przykładem tej metody może być wstępne oczyszczanie próbki za pomocą ekstrakcji do fazy stałej (SPE), a następnie rozdział analitów za pomocą chromatografii cieczowej (LC) [144]. Off-line MDLC jest najstarszą techniką wielowymiarowej chromatografii cieczowej. Dużą zaletą tej metody jest brak konieczności integracji czasów rozdziału przeprowadzanych w obu wymiarach, możliwość zastosowania jednego chromatografu do przeprowadzenia rozdziału oraz możliwość modyfikacji analitów pomiędzy poszczególnymi wymiarami (np. derywatyzacja, zatężanie frakcji itp.). Mimo swojej prostoty posiada ona również kilka wad, takich jak praco- i czasochłonność, możliwość degradacji i strat analitu oraz możliwość tworzenia się artefaktów. Dodatkowo ze wzglądu na brak automatyzacji metoda ta charakteryzuje się niską powtarzalnością [148]. Mimo to, zostało opracowanych wiele metod z zastosowaniem tej techniki do rozdziału lipidów. Metoda off-line MDLC najczęściej stosowana jest do separacji i analizy triacylogliceroli (TAG). Ta grupa związków intensywnie badana była m.in. przez Laakso i wsp. [149-151] oraz Kallio i wsp. [152]. W pierwszym etapie TAG dzielono ze względu na rodzaj i stopień nienasycenia za pomocą wysokosprawnej chromatografii cieczowej z kolumną srebrową (Ag-HPLC), a następnie ze względu na ilość atomów węgla w resztach acylowych za pomocą chromatografii w odwróconym układzie faz (RP-HPLC). Podobne warunki analizy zostały ostatnio zastosowane przez Dugo i wsp. [153] w celu określenia profilu tłuszczowego mleka osła. W metodzie tej autorzy zastosowali jednak odwrotny układ technik separacji. Początkowo dzielili TAG za pomocą RP-HPLC, a następnie z wykorzystaniem Ag-HPLC. Stosując jako system detekcji spektrometr mas z jonizacją chemiczną pod ciśnieniem atmosferycznym (APCI-MS) zidentyfikowali oni 55 różnych triacylogliceroli [148]. Z kolei rozdział złożonych mieszanin TAG pochodzenia roślinnego oraz zwierzęcego za pomocą dwuwymiarowej chromatografii cieczowej z wykorzystaniem bezwodnej chromatografii w odwróconym układzie faz (NARP-HPLC) oraz Ag-HPLC został przedstawiony przez Holcapeka i wsp. [154]. On-line MDLC. W systemie on-line, określona objętość eluatu z kolumny pierwszej wprowadzana jest automatycznie na kolejne kolumny. System ten mimo możliwości 38 automatyzacji, stosunkowo krótkiego czasu analiz i wysokiej powtarzalności wymaga obecności określonych układów (modulatorów) łączących co najmniej dwie niezależne kolumny [143, 155]. Zadaniem modulatorów jest dzielenie i gromadzenie eluatu z pierwszego wymiaru oraz jego wprowadzenie na kolumny drugiego wymiaru. System online ze względu na tryb pracy można podzielić na tzw. heart-cutting, w którym tylko część substancji rozdzielonych na pierwszej kolumnie jest wprowadzana na kolumnę drugą, oraz comprehensive – pełny, w której wszystkie składniki z pierwszej kolumny są rozdzielane dodatkowo na kolumnie drugiej. W pewnym sensie można przyjąć, iż on-line MDLC stanowi rozwinięcie metody off-line [148]. Ze względu, iż system on-line jest całkowicie zautomatyzowany, prowadzone procesy rozdziału cechują się dużą powtarzalnością. Jednakże, bezpośrednie łączenie różnych mechanizmów rozdziału w chromatografii cieczowej jest niezwykle trudne do osiągnięcia. Głównym problemem jest brak rozpuszczalności eluentów stosowanych w wymiarze pierwszym i drugim, jak i możliwość wytrącania się składników buforów. Poza tym system ten wymaga aby analiza w wymiarze drugim pojedynczej frakcji uzyskanej w pierwszym wymiarze, na którą składa się przeniesienie frakcji z kolumny pierwszej na drugą, rozdział analitów i kondycjonowanie kolumny drugiej do warunków wyjściowych, były zakończone w czasie niezbędnym do zebrania kolejnej frakcji. Wymusza to konieczność przeprowadzenia rozdziału w wymiarze drugim w bardzo krótkim czasie (zazwyczaj 1 do 2 minut) i przyczynia się do znacznego obniżenia „zdolności rozdzielczych”. Problem ten częściowo można wyeliminować stosując technikę stop-and-go, w której wykorzystuje się zjawisko zatrzymywania przepływu eluentu na kolumnie w wymiarze pierwszym, gdy uzyskana wcześniej frakcja jest przenoszona i analizowana na kolumnie w wymiarze drugim. Dlatego też rozdział lipidów za pomocą tego systemu jest dużym wyzwaniem. Mimo to w literaturze prezentowane są metody analizy lipidów za pomocą on-line MDLC. Podobnie jak w przypadku systemów off-line wszystkie metody dotyczą głównie rozdziału jednej grupy lipidów tj. triacylogliceroli. Pierwsza metoda analizy triacylogliceroli olejów roślinnych w systemie on-line została zaproponowana przez Nakashima i wsp. [143]. W metodzie tej autorzy zastosowali dwie kolumny: w pierwszym wymiarze kolumnę srebrową typu microbore, natomiast w wymiarze drugim kolumnę C18. Z kolei Mondello i wsp. [142] zaproponowali trójwymiarową metodę Ag-LC x RP-LC-APCI-MS analizy TAG, 39 w której również zastosowano kolumnę srebrową typu microbore oraz dodatkowo krótką monolityczną kolumnę C18. System ten wykorzystano z powodzeniem m.in. do analizy triacylogliceroli w ryżu [142], mleku osła [156], oleju kukurydzianym [157] oraz innych olejach roślinnych [158]. 2.3.1.3.6 Fosfolipidy i liposomy w chromatografii cieczowej Pierwsze prace dotyczące zastosowania fosfolipidów i liposomów w chromatografii cieczowej jako fazy stacjonarnej zaprezentowane były ok. 30 lat temu. Do immobilizacji fosfolipidów stosowano różne materiały stałe. PC i SM immobilizowano stosując żel agarozowy [159], PS i cholesterol za pomocą poliakryloamidu [160], z kolei PC z żółtka jaja kurzego unieruchamiano wykorzystując cząstki polistyrenodiwinylobenzenowe [161] oraz żel krzemionkowy z grupami propyloaminowymi [162]. Obecnie do tworzenia fosfolipidowych i liposomowych faz stacjonarnych w LC stosuje się dwie główne techniki. Pierwsza polega na kowalencyjnym łączeniu pojedynczych fosfolipidów oraz ich pochodnych do krzemionki z grupami propyloaminowymi. Metoda ta nazywana jest techniką immobilizowanych sztucznych membran (IAM – immobilized artificial membrane) [163]. Druga procedura polega na unieruchamianiu liposomów w hydrofilowych żelach agarozowych lub agarozowo-dekstranowych. Otrzymana w ten sposób faza stała stosowana jest w tzw. immobilizowanej chromatografii cieczowej (ILC – immobilized liquid chromatography) [164]. Głównym celem stosowania fosfolipidowych i liposomowych faz stacjonarnych w LC jest wykorzystanie ich jako prostych modeli naturalnych membran w celu określania mechanizmu adsorbcji analitu w organizmie oraz jego zdolności do penetracji błon komórkowych [164]. Oddziaływania te zależą w dużym stopniu zarówno od rodzaju analitu jak i składu błon fosfolipidowych. 2.3.1.4 Chromatografia gazowa (GC) W chromatografii gazowej (GC) fazą ruchomą jest gaz, zwany w tym przypadku gazem nośnym. Natomiast fazą stacjonarną może być ciecz osadzona na nośniku stałym w postaci jednorodnego filmu (warstwy) lub ciała stałego – adsorbent. W pierwszym przypadku układ 40 nazywamy chromatografią podziałową (GLC – gas-liquid chromatography) natomiast w drugim, chromatografią adsorpcyjną (GSC – gas-solid chromatography) [34]. GC jest szybką i skuteczną metodą rozdzielania mieszanin związków, które w warunkach chromatografowania mają postać gazów lub par. Są to zatem takie substancje gazowe, ciekłe i stałe, których temperatura wrzenia lub sublimacji nie przekracza 400°C [67]. Chromatografia gazowa jest techniką stosunkowo „młodą”, gdyż pierwsze prace ukazały się dopiero w 1952 roku (Martin i James – GLC [165, 166], Cremer i Janak – GSC [167]). W tym samym roku zaproponowana została też pierwsza metoda rozdziału lotnych kwasów tłuszczowych za pomocą GC [165, 168]. Głównym zastosowaniem GC w analizie lipidów jest właściwie rozdział kwasów tłuszczowych. W ostatnich dziesięcioleciach rozdzielanie tej grupy związków przeprowadzane było głównie za pomocą jednowymiarowej kapilarnej chromatografii gazowej. W celu rozdziału kwasy tłuszczowe przeprowadza się w mniej polarne i bardziej lotne pochodne (najczęściej estry metylowe) [169-171]. Obecnie do tego celu najczęściej stosuje się trzy główne metody: estryfikację kwasową (HCl lub H2SO4/MeOH) [172], zmydlanie-estryfikację (KOH, HCl/MeOH) oraz estryfikację z zastosowaniem katalizatora w postaci trifluoroboru (BF3/MeOH) [171, 173]. W większości przypadków, rozdział pochodnych kwasów tłuszczowych prowadzony jest na poliglikolowych (np. poliglikol etylenowy - PEG) fazach stacjonarnych zapewniających efektywną separacje większości najważniejszych nasyconych i nienasyconych kwasów tłuszczowych. Natomiast do całkowitego rozdziału izomerów geometrycznych jak i kwasów ze sprzężonym układem wiązań podwójnych wymagane są długie (powyżej 100m) kolumny z fazą stacjonarną o wysokiej polarności (np. bis-cyjanopropylopolisiloksanowa) [143, 173]. W celu określenia profilu kwasów tłuszczowych poszczególnych grup lipidów w złożonych mieszaninach, konieczny staje się etap ich wstępnego rozdziału. W tym celu najczęściej stosuje się TLC, chromatografię kolumnową oraz HPLC. Otrzymane w ten sposób czyste frakcje poszczególnych lipidów poddaje się procesowi hydrolizy chemicznej, a otrzymane wolne kwasy tłuszczowe przeprowadza się w pochodne i rozdziela za pomocą GC [85, 173]. Mimo iż jednowymiarowe metody analizy kwasów tłuszczowych (1D GC) są zazwyczaj wystarczające do rozdziału i analizy kwasów tłuszczowych w matrycach lipidowych to jednak 41 w przypadku bardzo złożonych mieszanin wymagane są techniki wielowymiarowej chromatografii gazowej (MDGC). Wahl i wsp. [174] w celu rozdziału furanowych kwasów tłuszczowych w lipidowym ekstrakcie z tkanek rybich zastosowali technikę heart-cut MDGC. Analizowana mieszanina początkowo dzielona była na kolumnie HP-1 (100% metylopolisiloksan), po czym uzyskane określone frakcję przekazywane były on-line na kolumnę Stabilwax (100% PEG) w celu dalszej analizy. W ostatnich latach coraz większą popularność zyskują metody rozdziału kwasów tłuszczowych za pomocą techniki comprehensive MDGC (GCxGC). Za pomocą tej nowej techniki, piki eluowane z pierwszej kolumny dostają się do modulatora termicznego, którego zadaniem jest „wyłapywanie” każdej eluowanej frakcji rozdzielanej mieszaniny i przekazywanie jej na kolejną kolumnę. Rozdział w drugim wymiarze przeprowadzany jest zwykle bardzo szybko (5-10 sekund) w celu zapewnienia ciągłego rozdziału nowych frakcji uzyskiwanych z kolumny pierwszej. W ten sposób cała mieszanina dzielona jest w pojedynczej analizie w dwuwymiarowym (2D) systemie. Zazwyczaj kolumna pierwsza jest niepolarna (np. 100% metylopolisiloksan), natomiast druga jest kolumną o wyższej polarności (np. 85% metylo-, 7% fenylo-, 7% cyjanopropylo-, 1% winylo-polisiloksan) [175]. Pierwsza metoda GCxGC rozdziału kwasów tłuszczowych została zaprezentowana dopiero w 2001 roku przez Geusa i wsp. [175]. Autorzy ci zastosowali dwie kolumny: niepolarną (dimetylopolisiloksanową) oraz polarną (PEG) połączone modulatorem termicznym (ang. thermal sweeper). W wyniku analizy estry metylowe kwasów tłuszczowych uzyskanych z oleju ze śledzia podzielono ze względu na ilość atomów węgla jak również stopień nienasycenia. Co więcej w wyniku analizy zidentyfikowano m.in. nietypowe dziewiętnastowęglowe kwasy tłuszczowe, których obecność nie była widoczna podczas analiz jednowymiarowych. 2.3.1.5 Chromatografia z fazą ruchomą w stanie nadkrytycznym (SFC) Chromatografia z fazą ruchomą w stanie nadkrytycznym (SFC – supercritical fluid chromatography) jest techniką rozdzielania mieszanin związków chemicznych posiadającą właściwości pośrednie między chromatografią gazową a cieczową [34]. Technika ta po raz pierwszy zaprezentowana została w 1962 roku przez Klespera i wsp. [176]. Autorzy ci 42 przeprowadzili rozdział termolabilnych pochodnych porfirynowych za pomocą chlorofluorometanu w stanie nadkrytycznym stosując ciśnienie 140 barów oraz temperaturę pomiędzy 150 a 170°C. Jednak zastosowanie tej techniki przez następne 20 lat było bardzo ograniczone głównie ze względu na braki sprzętowe. Renesans w stosowaniu SFC nastąpił dopiero w latach 1981-82 kiedy to firma Hewlett-Packard zaprezentowała system SFC z zastosowaniem kolumn pakowanych [177]. Równocześnie Novotny i wsp. [178] po raz pierwszy zaproponowali możliwość zastosowania kolumn kapilarnych o przekroju otwartym (open tubular columns) w SFC. SFC jest techniką w której faza ruchoma występuje w stanie nadkrytycznym, tzn. że zarówno wartości temperatury jak i ciśnienia są powyżej wartości krytycznych. Substancja w stanie nadkrytycznym wykazuje właściwości pomiędzy gazem a cieczą. Ma ona gęstość zbliżoną do gęstości cieczy, lepkość zbliżoną do lepkości gazu, a współczynnik dyfuzji mniejszy niż dla gazu, ale wyższy niż dla cieczy. Gęstość cieczy w stanie nadkrytycznym sprawia, że ma on dobre właściwości rozpuszczalnikowe, substancje rozpuszczają się w nim jak w cieczy, podobnie jak w chromatografii cieczowej. W konsekwencji, nie jest wymagany etap odparowywania próbki, co jest konieczne w przypadku chromatografii gazowej (GC) i rozdział może być przeprowadzony w znacznie niższej temperaturze. Jest to szczególnie istotne podczas analiz związków termolabilnych. Jednocześnie mała lepkość płynu i niskie napięcie powierzchniowe powodują, że współczynnik dyfuzji fazy ruchomej jest wyższy niż dla cieczy, co skutkuje szybszym przenoszeniem masy, podobnie jak w chromatografii gazowej [34, 177]. Technika SFC została zastosowana m.in. do rozdziału lipidów polarnych takich jak fosfatydylocholina (PC), fosfatydyloetnoloamina (PE), fosfatydyloinozytol (PI) oraz fosfatydyloseryna (PS) [179]. Zbadano cztery rożne fazy stałe: diolową, cyjanopropylową, 2etylopirydynową oraz 4-etylopirydynową. Jako fazę ruchoma stosowano CO2 w celu rozdziału wszystkich fosfolipidów wymagany był dodatek modyfikatora polarności w postaci metanolu. Zbadano również wpływ dodatków zasadowych (izopropyloamina), kwasowych (kwas trifluorooctowy) oraz jonowych (octan amonu) na separację lipidów polarnych. Ostatnio Bamba i wsp. [180] zaprezentowali metodę SFC-MS umożliwiającą analizę złożonych mieszanin lipidów różniących się zarówno strukturą jak i polarnością. System ten zastosowano do rozdziału m.in. fosfolipidów, glikolipidów, triacylogliceroli oraz 43 sfingolipidów. Jako fazę stałą zastosowano pakowaną kolumnę cyjanową umożliwiającą podział lipidów na poszczególne grupy w czasie poniżej 15 minut oraz kolumnę ze złożem oktadecylosilanowym (C18) umożliwiającą nie tylko separację izomerów poszczególnych grup lipidów ale również podział tej grupy związków ze względu na stopień nienasycenia. Jako fazę ruchomą zastosowano ditlenek węgla (CO2) oraz dodatek metanolu jako polarnego modyfikatora fazy ruchomej. SFC znalazła również stosunkowo szerokie zastosowanie w analizie kwasów tłuszczowych, które mogą być analizowane bez konieczności przeprowadzania w pochodne [181]. Metody te stosowane były do określenia profilu kwasów tłuszczowych m.in. oleju rybiego [182], olejów roślinnych [183, 184] sera oraz mąki pszennej [185]. Zagadnienie analizy wolnych kwasów tłuszczowych za pomocą SFC zostało ostatnio szczegółowo omówione przez Senoransa i wsp. [181] w obszernym artykule przeglądowym. Z kolei Hirata i wsp. [186] opracowali metodę wielowymiarowej chromatografii z fazą ruchomą w stanie nadkrytycznym. W wymiarze pierwszym zastosowali kolumnę z niemodyfikowaną krzemionką gdzie kwasy tłuszczowe dzielone były ze względu na ilość wiązań podwójnych. Natomiast w wymiarze drugim złoże oktadecylosilanowe (C18) umożliwiało separacje pod kątem długości łańcucha węglowego. System ten został przez autorów zastosowany do oznaczenia estrów metylowych kwasów tłuszczowych w licznych tłuszczach zwierzęcych i olejach roślinnych. 2.3.1.6 Chromatografia wykluczania (SEC) W chromatografii wykluczania rozdzielanie składników próbki zależy od różnicy w wymiarach cząsteczek i/lub w ich kształcie. Próbka wprowadzana jest do kolumny wypełnionej fazą stacjonarną o określonych wymiarach cząstek i porów. Cząsteczki składników próbki, o wymiarach mniejszych niż wymiary porów cząstek wypełnienia kolumny, penetrują wewnątrz porów i zostają zatrzymane na kolumnie, natomiast cząsteczki o większych wymiarach eluują się z kolumny pierwsze [34]. Najbardziej istotnymi parametrami wpływającymi na rozdzielczość są: objętość porów, wielkość cząstek wypełnienia kolumny oraz rozkład wielkości porów. Metoda wysokosprawnej chromatografii wykluczania (HPSEC – high-performance size exclusion chromatography) znalazła swoje zastosowanie w analizie lipidów. W tym celu najczęściej stosuje się fazy stałe, o wielkości 44 cząstek w granicach 3-10µm, występujących w postaci żelu polimerowego (najczęściej kopolimeru styrenu i diwinylobenzenu – PS/DVB) o wielkości porów 50, 100 oraz 500 Å umożliwiających rozdział związków o masie cząsteczkowej w granicach 100-20000. Jako eluenty stosowane są pojedyncze rozpuszczalniki, jednak ich wybór ograniczony jest ze względu na nierozpuszczalność mieszanin związków tłuszczowych. Mimo, iż w określonych przypadkach spotkać można zastosowanie toluenu [187] i dichlorometanu [188] to jednak tetrahydrofuran (THF) [189-193] wiedzie prym jako eluent w analizie lipidów za pomocą HPSEC. Najczęściej stosowane natężenie przepływu występuje w granicach 0,5-1,5 ml/min umożliwiając przeprowadzenie pełnej analizy w czasie poniżej 30 minut [188]. Detekcja rozdzielanych lipidów możliwa jest dzięki zastosowaniu detektorów aerozolowego promieniowania rozproszonego (ELSD) [189, 194] oraz detektorów refraktometrycznych (RI) [187, 190-193]. Jednym z najczęściej spotykanych przykładów zastosowania techniki HPSEC jest analiza tłuszczy stosowanych w procesach głębokiego smażenia. W mieszaninach tych w wyniku stosowania wysokich temperatur dochodzi do licznych przemian triacylogliceroli takich jak termoliza, hydroliza, utlenienie oraz polimeryzacja [190]. Procesy te prowadzą do tworzenia się wolnych kwasów tłuszczowych, di- i monoacylogliceroli jak również struktur dimerycznych, trimerycznych, tetramerycznych oraz polimerów triacaylogliceroli różniących się masą cząsteczkową. Chromatograficzny rozdział tych nielotnych produktów dostarcza wiele cennych informacji na temat zmiany jakości tłuszczu podczas smażenia [189, 195]. Kolejnym bardzo ważnym zastosowaniem techniki HPSEC jest kontrola stabilności oksydacyjnej olejów roślinnych podczas przechowywania [191, 193, 195]. Stosując modelowe mieszaniny triacylogliceroli m.in. trioleinianu, ustalono poszczególne etapy procesu utleniania oraz zidentyfikowano pierwszorzędowe produkty utleniania tricaylogliceroli oraz tworzące się formy polimerowe tej grupy związków. Z kolei Rios i wsp. [196] oraz Marquez-Riuz i wsp. [192] zaproponowali metody HPSEC oznaczania składników tzw. tłuszczy „nisko-kalorycznych” wykorzystywanych w smażonych i pieczonych produktach żywnościowych. Przedstawili oni procedury rozdziału i analizy pochodnych tłuszczowych takich jak poliester sacharozy, trehalozy, sorbitolu czy rafinozy tworzonych poprzez estryfikację cząsteczek cukrowych kwasami tłuszczowymi [188]. 45 2.4 TECHNIKI ELEKTROMIGRACYJNE A LIPIDY Podstawą wszystkich technik elektromigracyjnych jest rozdział cząsteczek obdarzonych niezrównoważonym ładunkiem elektrycznym, czyli jonów, oparty na różnicy w prędkościach poruszania się jonów w stałym polu elektrycznym [67]. Wśród tych technik do rozdziału, analizy i charakterystyki lipidów obecnie najczęściej stosuje się kapilarne techniki elektromigracyjne takie jak: elektroforeza kapilarna (CE – capillary electrophoresis) [197], chromatografia elektrokinetyczna (EKC - electrokinetic chromatography) oraz elektrochromatografia kapilarna (CEC - capillary electrochromatography). Elektroforeza kapilarna (CE). Zjawisko elektroforezy, czyli migracji cząstek obdarzonych ładunkiem w polu elektrycznym w kierunku elektrody o przeciwnym znaku, znane było już pod koniec XIX wieku. Pierwszym, który zastosował w 1937 roku elektroforezę jako metodę rozdzielania, był A. W. Tiselius [198], a jego prace, dotyczące rozdzielenia białek, uhonorowane zostały Nagrodą Nobla [199]. Umieścił on w rurce z roztworem buforowym mieszaninę białek i podłączył do rurki elektrody. Stwierdził, iż białka migrują w kierunku elektrod z różną prędkością [67]. Uzyskane przez niego rozdziały nie były zbyt udane na skutek małej rozdzielczości, wynikającej z dyfuzji termicznej oraz konwekcji rozdzielanych cząsteczek. Dlatego w dalszym rozwoju elektroforezy wprowadzono środowiska antykonwekcyjne. Roztwór buforowy umieszczano w żelach takich jak agaroza, poli(akryloamid), proszek celulozowy, wata szklana. Prawdziwy przełom w rozwoju CE nastąpił w 1981 roku, kiedy ukazały się prace Jorgensona i Lukacsa [200-202]. Datę tę uznaje się za początek wysokosprawnej elektroforezy kapilarnej (HPCE – high performance capillary electrophoresis). Zastosowanie kapilar o średnicach 25-75 µm wypełnionych elektrolitem, znacznie ograniczyło wpływ wydzielanego ciepła nawet przy stosowaniu napięcia rzędu 30 kV i pozwoliło uzyskać wysokie sprawności. W kolejnych latach nastąpił dynamiczny rozwój metody w zakresie teorii oraz zastosowania jako metody analitycznej i aparatury pomiarowej [199]. Głównymi czynnikami wpływającymi na czas migracji poszczególnych składników próbki w elektroforezie kapilarnej są: rozmiar jonu, zgromadzony na nim niezrównoważony ładunek elektryczny oraz poziom przepływu elektroosmotycznego (EOF – electro-osmotic flow). Przepływ elektroosmotyczny zależy od ładunków rozmieszczonych na powierzchni kapilary [203]. W kapilarach krzemionkowych, w których wnętrze nie jest pokryte żadną 46 substancją chemiczną, ładunek ujemny powstaje w wyniku dysocjacji grup silanolowych na ścianach kapilary. Różnice w ilości tych grup wykazują duże wahania nawet dla kapilar tego samego producenta powodując znaczne zmiany czasów migracji oraz obniżają odporność (robustness) metody. Ładunek ujemny zgromadzony na powierzchni kapilary jest szczególnie ważnym problemem w przypadku dodatnio naładowanych związków zasadowych, przyciąganych elektrostatycznie przez ujemnie naładowane ściany kapilar. Zjawisko to wpływa m.in. na poszerzanie pików (ogonowanie) i wysoką zmienność ich powierzchni oraz niższą precyzję metody elektroforetycznej. Jedną z metod stosowaną w celu eliminacji tego zjawiska jest dodatek związków powierzchniowo czynnych takich jak fosfolipidy [204]. Zastosowanie fosfolipidów jak i liposomów w CE polega na ich immobilizacji na ściankach kapilar ze stopionej krzemionki (ang. fused-silica capillaries) celem zablokowania i eliminacji niepożądanych oddziaływań analitu ze ścianą kapilary [205-208]. Fosfolipidy tworzą na powierzchni kapilary tzw. Zabezpieczającą dwuwarstwę fosfolipidową (SPB – supported phospholipid bilayer). Przykładem tego jest zastosowanie syntetycznych fosfolipidów takich jak 1,2-dilauroilo-sn-glicerofosfatydylocholina (DLPC) [205] oraz 1,2dimirystoilo-sn-glicero-fosfatydylocholina (DMPC) [209] do rozdziału białek. W przypadku DLPC, %RSD (względne odchylenie standardowe) czasów migracji rozdzielanych białek wynosił ≤1,3% (n=16) dla analiz wykonanych tego samego dnia oraz ≤4% dla rozdziałów przeprowadzonych w ciągu trzech dni. Wartości te świadczą o wysokiej powtarzalności metody. Obserwowano również bardzo wysoką sprawność stosowanych kolumn kapilarnych (powyżej 1,4 mln półek teoretycznych/metr) dla białek zasadowych oraz umiarkowaną sprawność (powyżej 310 000 półek teoretycznych/metr) dla białek kwasowych. Z kolei odzyski białek w granicach 64-93% świadczą o zachodzących procesach adsorpcji co dodatkowo obrazuje zjawisko ogonowania pików białek zasadowych. Stosowane dwuwarstwy fosfolipidowe posiadają jednak kilka wad. Główną z nich jest ich niestabilność. Właściwość ta może być znacznie ograniczona poprzez zastosowanie dodatku jonów metali [210] lub poprzez wykorzystanie oligomerów fosfolipidowych [211, 212]. W tym ostatnim przypadku zaobserwowano również znaczne ograniczenie procesów adsorpcji białek do warstwy fosfolipidowej. 47 Chromatografia elektrokinetyczna (EKC). Technika separacji oparta na połączeniu elektroforezy oraz oddziaływaniach analitu z dodatkami (np. Związkami powierzchniowo czynnymi), tworzącymi fazę rozproszoną poruszającą się z różną prędkością. W celu rozdziału zarówno analit jak i faza powinny być naładowane [213]. Zainteresowanie lipidami i zastosowanie ich w EKC związane jest także głównie z fosfolipidami, a dokładniej tworzonymi przez nie pęcherzykami oraz strukturami liposomowymi stosowanymi jako pseudo fazy stacjonarne. Głównymi czynnikami odpowiadającymi za rozdział analitu w tych metodach są oprócz jego ruchliwości elektroforetycznej, oddziaływania z liposomami. Technika ta zwana jest liposomową elektrokinetyczną chromatografią kapilarną (LEKC – liposome electrokinetic capillary chromatography). W metodach tych najczęściej stosuje się ujemnie naładowane liposomy, a mechanizm rozdziału jest analogiczny jak w micelarnej elektrokinetycznej chromatografii kapilarnej (MEKC) [164]. W większości prac głównym fosfolipidem tworzącym stosowane struktury liposomowe jest fosfatydylocholina z żółtka jaja kurzego, soi ale również jej syntetyczne pochodne (np. 1-palmitoilo-2-oleilo-sn-glicero-fosfocholina (POPC) [210]). Ze względu na fakt iż liposomy fosfatydocholinowe posiadają niewielki ładunek ujemny dodatkowo do tworzenia struktur liposomowych stosuje się ujemnie naładowane fosfolipidy (najczęściej fosfatydyloserynę (PS)) [210, 214]. Pierwsza praca dotycząca zastosowania liposomów jako nośników w kapilarnych technikach elektromigracyjnych została zaprezentowana w 1995 roku przez Zhanga, Hjertena i Lindahla [215]. W metodzie tej do rozdziału kilku modelowych leków oraz peptydów zastosowali oni kapilarę z nośnikiem poliakrylamidowym oraz wysokie stężenie liposomów fosfatydylocholinowych. Obecnie wiele metod LEKC opracowuje się pod kątem poszukiwania prostych modeli lipidowych błon komórkowych w celu określania oddziaływań typu błona-analit [216, 217]. Liposomy stosowano również jako nośniki obojętnych cząsteczek analitu. Zbadano wpływ pH, buforów oraz składu liposomów na ich rozdział [214, 218, 219]. Wyniki pokazały iż lepsze rozdziały uzyskiwano wraz ze wzrostem stężenia lipidów i sumarycznego ujemnego ładunku liposomów. Boa i wsp. przedstawili również możliwość zastosowania struktur liposomowych 48 modyfikowanych lizozymem [220] oraz innymi białkami [221] do rozdziału m.in. enancjomerów aminokwasów. Bardzo obszerne omówienie tej fascynującej tematyki zostało zaprezentowane w licznych artykułach przeglądowych [164, 217, 222-225]. Kapilarna elektrochromatografia (CEC). Jest to technika rozdziału łącząca elektroforezę (CE) oraz wysokosprawną chromatografię cieczową (HPLC) [223, 226]. Rozdział odbywa się w kapilarach wypełnionych faza stacjonarną, a ruch fazy ruchomej wywołany jest przepływem elektroosmotycznym. Rozdzielane związki podlegają dwóm mechanizmom podziału: chromatograficznemu oraz elektroforetycznemu, co zapewnia bardzo wysoką sprawność [67]. Analogicznie jak w przypadku CE oraz EKC w kapilarnej elektrochromatografii stosowanymi lipidami są fosfolipidy oraz tworzone przez nie struktury pęcherzykowate i liposomy. Celem ich zastosowania jest ponownie modyfikacja ścian kapilar i tworzenie fazy umożliwiającej rozdział związków anionowych, kationowych jak i obojętnych [227] oraz stosowanie tych struktur jako modeli błon komórkowych w celu badania interakcji typu błona - analit [226-229]. 2.5 METODY DETEKCJI LIPIDÓW W CHROMATOGRAFII CIECZOWEJ Obecnie dostępnych jest wiele detektorów, które w połączeniu z chromatografią cieczową umożliwiają analizę lipidów [27, 230, 231]. Dlatego też w poniższym rozdziale przedstawione zostaną jedynie najbardziej popularne metody detekcji ze szczególnym uwzględnieniem detektorów aerozolowych. 2.5.1 Detektory refraktometryczne (RI) Detekcja, w przypadku tego rodzaju detektorów, polega na mierzeniu w sposób ciągły różnicy pomiędzy współczynnikiem załamania światła fazy ruchomej oraz rozdzielanych substancji. Jednak detektor ten wykazuje niską czułość (w porównaniu z np. detektorem UV) i jednocześnie wysoką wrażliwość na zmiany temperatury, ciśnienia, wartość natężenia przepływu oraz rodzaj rozpuszczalnika stosowanego jako faza ruchoma [232]. Jednak największą wadą tego detektora, jeżeli chodzi o analizę lipidów, jest konieczność stosowania wyłącznie elucji izokratycznej. Stosowanie tego systemu nie jest wystarczające do rozdziału 49 wielu mieszanin lipidowych m.in. separacja poszczególnych klas fosfolipidów [231]. Dlatego też jego zastosowanie w analizie lipidów jest stosunkowo niewielkie [93, 94]. 2.5.2 Detektory spektrofotometryczne UV Detektory spektrofotometryczne UV te działają na zasadzie absorpcji promieniowania w zakresie UV/Vis. Obecnie dostępne komercyjnie są trzy rodzaje tych detektorów. Najprostsze pracują przy jednej długości fali – 254 nm, natomiast inne umożliwiają płynną regulację długości fali w zakresie UV/Vis. Obecnie niezwykle popularne są detektory z matrycą fotodiodową (DAD- diode array detector) umożliwiające rejestrację całego widma danej substancji w trakcie jej przechodzenia przez detektor [34, 67]. Jednak warunkiem stosowania tych detektorów jest zdolność analizowanych substancji do absorpcji promieniowania w zakresie UV/Vis. Na przykład większość fosfolipidów absorbuje promieniowanie UV o długości fali w zakresie 190-237nm. Dlatego też ich detekcja jest niemożliwa w przypadku stosowania, jako fazy ruchomej, niektórych popularnych rozpuszczalników takich jak chloroform oraz dichlorometan, wykazujących silną absorpcję promieniowania UV w tym zakresie [107]. W celu detekcji fosfolipidów za pomocą detektorów UV stosowane są najczęściej takie rozpuszczalniki jak acetonitryl, metanol, woda, heksan oraz propan-2-ol [27, 233, 234]. Ze względu na te ograniczenia w celu detekcji lipidów za pomocą detektorów UV często wymagane jest przeprowadzenie tych związków w różnego rodzaju pochodne w celu polepszenia zdolności absorpcji promieniowania UV [235, 236]. 2.5.3 Detektory fluorescencyjne Detektory fluorescencyjne są jednymi z najbardziej czułych detektorów (ponad 100x bardziej czułe niż detektory absorpcyjne) stosowanych w chromatografii cieczowej. Dodatkowo detektory te charakteryzują się bardzo wysoką specyficznością i selektywnością oraz szerokim zakresem dynamicznym. Jednak ich odpowiedź w dużym stopniu zależy od rodzaju fazy ruchomej, dlatego w przypadku stosowania elucji gradientowej wymagany jest etap ich kalibracji [237, 238]. Ze względu na fakt, iż tylko kilka rzadko występujących lipidów wykazuje naturalną fluorescencje, w wielu przypadkach wymagany jest etap derywatyzacji analizowanych 50 związków. Najczęściej analizie poddaje się antracenowe i kumarynowe pochodne lipidów [111, 239]. 2.5.4 Detektory aerozolowe Większość ekstraktów lipidowych jest mieszaniną związków nasyconych oraz nienasyconych i z tego względu najbardziej odpowiednią metodą ich ilościowej analizy jest zastosowanie tzw. detektorów „masowych” lub „uniwersalnych” takich jak detektory aerozolowe. W urządzeniach tych wypływający z kolumny eluat poddawany jest ciśnieniowej nebulizacji (wytworzeniu aerozolu) oraz osuszeniu w strumieniu gazu obojętnego [240]. Wytworzony w ten sposób strumień cząsteczek analitu jest oznaczany: optycznie, w przypadku detektora światła rozproszonego (ELSD – evaporative light scattering detector) [241] oraz bardziej czułego kondensacyjnego detektora światła rozproszonego (CNLSD – condensation nucleation light scattering detector) [242] albo poprzez przeniesienie ładunku w przypadku detektorów naładowanego aerozolu (CAD –charged aerosol detectors) (Corona CAD, Corona Ultra) [241, 243]. Najmłodszym detektorem aerozolowym dostępnym komercyjnie jest detektor CNLSD zaprezentowany w 2009 roku jako detektor nano-ilości analitu (NQAD – nano-quantity analyte detector ). Na Rysunku 3 przedstawiony jest ogólny schemat detektora Corona CAD, stosowanego w mojej pracy jako główny system detekcji lipidów. Szczegółowe omówienie zasady działania tego detektora jak również pozostałych detektorów aerozolowych są przedstawione w kolejnych rozdziałach pracy (Rozdział 2.5.4.1 oraz 2.5.4.2 ). 51 Rys. 3. Schemat detektora naładowanego aerozolu Corona CAD. (http://coronacad.com) 2.5.4.1 Zasada działania detektorów aerozolowych Nebulizacja. Eluat opuszczający kolumnę wprowadzony jest do nebulizatora, gdzie za pomocą strumienia gazu tworzy się tzw. aerozol pierwszorzędowy. W tym celu wszystkie komercyjnie dostępne detektory stosują nebulizator pneumatyczny wykorzystujący sprężony gaz (azot lub powietrze) do rozpylania fazy ruchomej stosując efekt Venturiego. Charakterystyka wielkości kropel powstających przy wyjściu nebulizatora może być wyznaczona z równania Nukiyama-Tanasawy [244]: (1) gdzie: - średnica pojedynczej kropli o takim samym stosunku objętości do powierzchni jak całkowita suma kropel (µm) - napięcie powierzchniowe fazy ruchomej (dyna/cm) - gęstość fazy ruchomej (g/ml) - lepkość fazy ruchomej (dyna·s/cm) - różnica pomiędzy prędkością gazu i cieczy w nebulizatorze (m/s) - stosunek objętościowego natężenia przepływu cieczy i gazu (L/min) 52 Równanie to wskazuje, że stosunek objętości do powierzchni tworzonych kropel (ich wielkość) zależy od: właściwości fazy ruchomej (gęstości, lepkości oraz napięcia powierzchniowego), natężenia jej przepływu oraz ciśnienia stosowanego gazu. Tworzony w nebulizatorze pneumatycznym aerosol jest układem polidyspersyjnym (znajdują się w nim ciekłe kropelki o rożnych rozmiarach), którego charakterystyka (rozkład wielkości kropel) zależy od wspomnianych wyżej parametrów. Odparowanie rozpuszczalnika (fazy ruchomej). Aerosol pierwszorzędowy wytworzony w nebulizatorze poddawany jest następnie suszeniu poprzez odparowanie fazy ruchomej. W tym celu stosuje się dwie różne metody. Pierwsza polega na bezpośrednim przeniesieniu aerozolu do tuby osuszającej umieszczonej pomiędzy nebulizatorem a komorą (celką) detekcyjną. Najczęściej stosowane są dwa rodzaje tub osuszających: w postaci krótkiej 20-30 cm rurki lub 1-2 m rurki spiralnej [244]. Druga metoda wykorzystuje dodatkowo tzw. komorę nebulizacyjną przez którą wytworzony aerozol dostaje się do tuby osuszającej. Zadaniem komory jest zmniejszenie rozkładu rozmiarów kropel powstałego aerozolu poprzez usuwanie dużych kropel na drodze kondensacji na ścianach komory. Dzięki temu temperatura potrzebna do osuszenia pozostałych kropel aerozolu ulega znacznemu obniżeniu [245]. Aerozol pierwszorzędowy przeniesiony do komory nebulizacyjnej oraz tuby suszącej nazywamy aerozolem drugorzędowym. Zakres temperatur stosowanych w celu odparowania fazy ruchomej różni się w przypadku poszczególnych komercyjnie dostępnych detektorów aerozolowych. Dla detektora CAD Corona stała temperatura 35°C, bez możliwości jej zmian, została wyznaczona przez producenta. Jednak już w przypadku detektora Corona Ultra występuje możliwość kontroli temperatury w zakresie 5-35°C. Większy zakres zmiany temperatury możliwy jest w przypadku detektora NQAD (35-100°C) oraz ELSD (10-100°C) [243]. Średnica tworzonych w wyniku odparowywania rozpuszczalnika cząstek może być wyznaczona z następującego równania [246]: 53 (2) gdzie: - gęstość tworzonych cząstek (gęstość analitu) - stężenie analitu w fazie ruchomej - średnica początkowej kropli Wynika stąd iż, poczynając od mokrego aerozolu, którego charakterystyka zależy od właściwości rozpuszczalnika i natężenia przepływu gazu rozpylającego, właściwości aerozolu suchego na wyjściu z tuby osuszającej zależą również od stężenia i gęstości analitu [247]. Należy jednak pamiętać, iż na charakterystykę aerozolu suchego otrzymanego w tubie suszącej wpływa nie tylko proces odparowywania fazy ruchomej ale również dodatkowe zjawiska występujące podczas przenoszenia aerozolu takie jak kondensacja kropel na ściankach tuby oraz wzajemne łączenie się kropel. Dodatkowo występować może częściowe odparowanie lub sublimacja analitu. Co więcej, odparowanie rozpuszczalnika podczas tego procesu może być całkowite lub częściowe w zależności od zastosowanych parametrów takich jak długość tuby osuszającej, temperatury oraz właściwości fazy ruchomej [244]. Detekcja analitu. W przypadku detektora ELSD, suchy aerozol drugorzędowy z tuby osuszającej kierowany jest następnie do komory detekcyjnej tworząc tzw. aerozol trzeciorzędowy. W zależności od temperatury topnienia, aerozol może występować w postaci ciekłych lub stałych cząstek [244]. Chmura cząstek analitu powoduje rozpraszanie wiązki światła (laser lub lampa wolframowo-halogenowa). Ilość światła rozproszonego mierzona jest następnie przez fotopowielacz oraz fotodiody [245]. Podczas przechodzenia światła przez cząstki analitu, w zależności od ich wielkości, obserwuje się trzy główne zjawiska [248]: rozpraszanie Rayleigha (stosunek promienia cząstek (r) do długości fali (λ) < 0,05), rozpraszanie Mie (r/λ ≥ 0,05 ale r<λ) oraz zjawisko odbicia i dyfrakcji. W detektorach CAD strumień cząsteczek analitu po wyjściu z tuby osuszającej otrzymuje ładunek dodatni, przenoszony przez płynący w przeciwnym kierunku drugi strumień gazu pozytywnie naładowany (zazwyczaj N2+·) przez elektrodę koronową pod 54 wysokim napięciem. Wyładowanie koronowe jest to wyładowanie elektryczne spowodowane przez jonizację gazu otaczającego przewodnik. Wyładowanie to pojawia się, kiedy gradient potencjału przekracza pewną krytyczną wartość ale warunki są niewystarczające do powstania łuku elektrycznego [240]. Elektrostatycznie naładowane cząstki analitu są następnie kierowane przez pułapkę jonową do kolektora. Pułapka jonowa ma na celu wychwycenie jonów azotu, do których nie przyłączyły się cząsteczki analitu oraz usuniecie cząstek o średnicy poniżej 10 nm. W kolektorze następuje oddanie ładunków połączonych z cząstkami analitu. Oddany ładunek mierzony jest za pomocą czułego elektrometru, a jego wartość jest proporcjonalna do ilości analitu w badanej próbce [249]. W przypadku kondensacyjnego detektora światła rozproszonego (CNLSD) metoda detekcji jest bardzo podobna jak w przypadku ELSD z tym, że tu stosowany jest dodatkowy etap, w którym cząsteczki analitu z tuby osuszającej wprowadzane są do atmosfery par nasyconych, gdzie dochodzi do kondensacji par na powierzchni cząstek analitu. Powoduje to wzrost ich wielkości z małych (kilka nanometrów) do wielkości rzędu mikrometrów. Rezultatem tego jest znaczny wzrost rozproszenia światła i obniżenie granic oznaczalności [250]. Dodatkowo prowadzi to do bezpośredniej odpowiedzi liniowej detektora, szczególnie gdy stosuje się tzw. ekran dyfuzyjny, który dzieli cząstki ze względu na ich wielkość [242, 251]. 2.5.4.2 Wpływ różnych warunków detekcji na odpowiedź detektorów aerozolowych 2.5.4.2.1 Stężenie analitu Detektor światła rozproszonego (ELSD). Odpowiedź detektora jest złożoną funkcją zależną od intensywności rozpraszania światła przez cząstki trzeciego aerozolu. Zależna od wielkości cząstek, dyfuzja światła jest wynikiem rozpraszania Rayleigha albo rozpraszania Mie lub zjawiska odbicia i refrakcji. W przypadku dyfuzji Rayleigha, intensywność światła rozproszonego jest proporcjonalna do szóstej potęgi średnicy cząstek, dla Mie czwartej potęgi natomiast dla odbicia i refrakcji do potęgi drugiej [244]. Na rozmiar cząstek wpływa zarówno stężenie analitu jak i wielkość początkowych cząstek aerozolu (wzór 2, strona 54), co z kolei zależy od składu i właściwości fazy ruchomej oraz parametrów nebulizacji (wzór 1, strona 52) [252]. Im mniejsze cząstki aerozolu trzeciego tym mniejsza ilość światła rozproszonego i większa przewaga rozpraszania Rayleigha. Gdy rozmiar cząstek się zwiększa 55 np. W wyniku wzrostu stężenia ilości analitu, rozpraszanie Mie, a nawet odbicie i refrakcja są dominującymi mechanizmami. Te dwa mechanizmy prowadzą do wzrostu intensywności rozpraszania światła. Dodatkowo ilość wykrywanych cząstek również wzrasta wraz ze wzrostem stężenia substancji rozpuszczonej, co dodatkowo powoduje wzrost odpowiedzi. Ze względu na złożone mechanizmy rozpraszania światła oraz zróżnicowany rozkład rozmiarów cząstek aerozolu ELSD charakteryzuje się odpowiedzią nieliniową. Odpowiedź nieliniowa tego detektora opisywana jest najczęściej za pomocą modelu empirycznego [247, 252, 253]: (3) gdzie: – odpowiedź detektora (pole powierzchni piku) - ilość nastrzykniętego analitu - wartości zależne od rodzaju analitu i stosowanych warunków chromatograficznych Współczynnik wartości można współczynnika ma w tym wyrażeniu szczególne znaczenie, gdyż na podstawie jego określić dominujący mechanizm rozpraszania światła. Wartość waha się pomiędzy 0,67, gdy dominuje mechanizm odbicia-refrakcji, a wartością 2 charakterystyczną dla rozpraszania Rayleigha [244, 252]. Z kolei wartość współczynnika określa ilość światła rozproszonego przypadającego na jednostkę analitu. Jednak należy zaznaczyć, iż nie jest to wartość równoznaczna czułości detektora, którego nieliniowa odpowiedź jest funkcją co powoduje iż czułość detektora zmienia się wzdłuż linii kalibracji. W tym przypadku czułość detektora (S) wyznacza się jako pochodną modelu potęgowego [252]: (4) Z wyrażenia tego mogłoby wynikać, iż czułość detektora ELSD będzie wyższa w przypadku rozpraszania Rayleigha, gdzie współczynnik wykazuje najwyższą wartość (około 2), niż w przypadku rozpraszania Mie oraz odbicia-refrakcji. Niestety, małe cząstki 56 oraz krople wykazują znaczenie niższe właściwości rozpraszania światła niż cząstki większe dlatego z wysoką wartością związana jest niska wartość współczynnika . Kondensacyjny detektor światła rozproszonego (CNLSD). Wśród wszystkich detektorów aerozolowych detektory CNLSD wykazują najwyższą czułość [243]. Związane jest to ze stosowanym w ich przypadku procesem kondensacji cząstek nasyconej pary na suchych cząstkach trzeciego aerozolu [254]. W wyniku czego obserwuje się ogromy wzrost rozmiarów cząstek (np. Wzrost średnicy z 3 nm do 10 µm), co z kolei wpływa na znaczne zwiększenie stopnia rozproszenia światła. Kondensacja powoduje również znaczny wzrost masy cząstek analizowanego związku. Przy zmianie wielkości cząstki z 3 nm do 10 µm obserwuje się wzrost masy w granicach 1011. Ze względu, iż intensywność rozpraszania światła jest w przybliżeniu funkcją masy cząstek aerozolu zastosowanie procesu kondensacji powoduje znaczny wzrost odpowiedzi detektora. Detektor naładowanego aerozolu (CAD). Podstawy działania detektorów CAD są bardzo zbliżone do detektorów ELSD. Te same podstawy teoretyczne są stosowane do opisu procesów nebulizacji czy odparowywania fazy ruchomej. Główną różnicą jest odpowiedź detektora w stosunku do naładowanych cząstek trzeciego aerozolu. Wg Dixona i Petersona [246] czułość elektrycznego analizatora aerozolu (EAA – electrical aerosol analyzer) (Sm) wyznaczyć można, dla cząstek o średnicy > 10 nm, z następującego równania : (5) gdzie: – wyrażona jest w fA·m3·g-1 - średnica cząstek – gęstość cząstki aerozolu Wykazano także, iż na sygnał EAA, zależnego od gęstości cząstki aerozolu ( ), nie wpływa skład analizowanych cząstek [255, 256]. Ze wglądu, iż czułość detektora CAD zależy od wielkości cząstek, ustalenie odpowiedzi całego detektora jest zadaniem niezwykle złożonym. Dlatego do opisu odpowiedzi detektora CAD zastosowano empiryczny model 57 potęgowy stosowany również w przypadku detektorów ELSD (wzór 3, strona 56). Oczywiste jest, że wartości współczynnika nie należy interpretować jak w przypadku detektorów ELSD, a jego obecność świadczy jedynie o nieliniowej odpowiedzi tego detektora. Wartości bliska wartości 1 była jednak w wielu przypadkach obserwowana przez Dixona i Petersona, co dowodzi faktu, iż detektor CAD w określonych warunkach może wykazywać odpowiedź liniową [257]. Wśród obecnie dostępnych na rynku dwóch detektorów aerozolowych tj. Corona CAD oraz Corona Ultra, wyższą odpowiedź obserwuje się w przypadku tego drugiego. Związane jest to z faktem, iż detektor ten z założenia skonstruowany został pod kątem zastosowania w ultra wysokociśnieniowej chromatografii cieczowej (UHPLC - ultra high pressure liquid chromatography) i wykorzystano w nim bardziej wydajny nebulizator [243]. 2.5.4.2.2 Ciśnienie gazu oraz natężenie przepływu fazy ruchomej Wpływ zarówno ciśnienia gazu oraz natężenie przepływu fazy ruchomej można zrozumieć na podstawie równania Nukiyama-Tanasawy (wzór 1, strona 52). Wzrost ciśnienia gazu, a tym samym jego prędkości prowadzi do uzyskania aerozolu charakteryzującego się kroplami o mniejszej średnicy. Powoduje to iż w przypadku detektorów ELSD mechanizm rozpraszania światła przez mniejsze krople aerozolu przesuwa się w kierunku rozpraszania Rayleigha. Zjawisko to można łatwo zaobserwować poprzez zwiększanie ciśnienia gazu i obserwacje wzrostu wartości współczynnika w równaniu krzywej kalibracyjnej [244]. Jednak niewiele dostępnych obecnie komercyjnie detektorów aerozolowych posiada możliwość regulacji tego parametru. Detektory CAD (CAD Corona – 35 psi, 5 l/min; Corona Ultra 60 psi, 4 l/min)detektor NQAD (40 psi, 4,7 l/min) oraz większość dostępnych detektorów ELSD (parametry zależne od modelu) posiada stałą ustaloną przez producenta wartość ciśnienia oraz przepływu gazu. Jednym z wyjątków jest detektor 385-LC ELSD firmy Varian. Stosując ten detektor Hutchinson i wsp. [243] wykazali znaczny spadek odpowiedzi detektora wraz ze wzrostem natężenia przepływu gazu w zakresie 0,9 – 3,25 l/min. Najwyższą odpowiedź detektor ten wykazywał przy niskim przepływie w okolicy 1,2 l/min. Kolejnym niezwykle ważnym parametrem wpływającym na odpowiedź detektorów aerozolowych jest natężenie przepływu fazy ruchomej. Detektory stosowane w chromatografii można podzielić na takie, które mierzą stężenie analitu w fazie ruchomej 58 i takie, które mierzą absolutną ilość analitu niezależnie od fazy ruchomej [257]. Dla tych dwóch typów detektorów wraz ze zmianą natężenia przepływu fazy ruchomej obserwuje się różne odpowiedzi w stosunku do pola powierzchni i wysokości pików. Dla detektorów mierzących stężenie, wzrost natężenia przepływu fazy ruchomej powoduje zmniejszanie pola powierzchni pików, z jednoczesnym brakiem zmiany w ich wysokościach. W przypadku detektorów mierzących masę absolutną, wzrost natężenia przepływu powoduje wzrost wysokości pików natomiast pola ich powierzchni nie zmianują się. Mimo iż detektory aerozolowe klasyfikuje się jako detektory mierzące masę absolutną analitu to wyniki uzyskane przez Hazotte i wsp. [257] pokazują, iż detektory te nie wykazują do końca typowych dla nich właściwości, a bardziej są połączeniem obu typów detektorów. Podobne wnioski przedstawili ostatnio również Hutchinson i wsp. [243]. W przypadku detektora CAD wraz ze wzrostem natężenia przepływu fazy ruchomej obserwowano znaczny wzrost wysokości pików ale z jednoczesnym niewielkim wzrostem pola powierzchni. Wzrost wysokości pików można wyjaśnić wzrostem stężenia analitu w maksimum piku i opisać za pomocą równania [257]: (6) gdzie: – ilość nastrzykniętego analitu – liczba półek teoretycznych kolumny oraz - wewnętrzna średnica oraz długość kolumny - porowatość kolumny - współczynnik retencji Równanie to wskazuje, iż zwiększenie czułości można uzyskać m.in. dzięki zmniejszeniu wartości współczynnika retencji na przykład poprzez zastosowanie większego natężenia przepływu fazy ruchomej. Odwrotną zależność niż dla CAD autorzy zaobserwowali dla detektora ELSD, dla którego wraz ze wzrostem natężenia przepływu fazy ruchomej odpowiedź malała. Znacznie większe zmiany obserwowano, podobnie jak w przypadku CAD, dla wysokości pików niż dla 59 ich powierzchni. Autorzy założyli, iż ta niezrozumiała odwrotna tendencja wynika z charakterystyki konstrukcyjnej stosowanego detektora. Podobne zależności zostały zaobserwowane również wcześniej przez Deschampsa i wsp. [258]. Autorzy ci także założyli, iż spadek odpowiedzi detektora związany jest ze zmianą rozkładu wielkości cząstek wraz ze wzrostem natężenia przepływu. Poprzez zmniejszanie liczby dużych cząstek stopień intensywności rozpraszania światła ulegał znacznemu zmniejszeniu. Zaobserwowano również, przy wyższych wartościach przepływu, kondensacje dużych kropli aerozolu na ściankach komory nebulizacyjnej. Autorzy przypuszczają iż właśnie obecność tej komory jest czynnikiem wpływającym na obniżanie odpowiedzi detektora. Częściowo może to potwierdzać fakt, iż zjawisko przeciwne (wzrost odpowiedzi detektora wraz ze wzrostem wartości przepływu zgodne z równaniem 1; strona 52) obserwowane było podczas pionierskich prac dotyczących ELSD. W doświadczeniach tych aparatura pozbawiona była niskotemperaturowej komory nebulizacyjnej [258]. Z równania 6 (strona 59) wynika, iż wzrost czułości można dodatkowo uzyskać poprzez zmianę parametrów kolumny takich jak średnica wewnętrzna. W tym celu zarówno detektory CNLSD jak i CAD stosowano w metodach rozdziału za pomocą mikrokolumn (typu microbore). W doświadczeniach tych uzyskano znaczne obniżenie granic oznaczalności lipidów do poziomu pikogramów [257, 259]. 2.5.4.2.3 Temperatura tuby osuszającej i nebulizatora Wartość temperatury tuby osuszającej w detektorach aerozolowych wpływa znacząco na proces odparowywania rozpuszczalnika, co prowadzi do zmniejszenia rozmiarów cząstek aerozolu oraz zmian w rozkładzie wielkości cząstek aerozolu trzeciego i jego charakterystyki. Cząstki aerozolu w zależności od temperatury topnienia mogą występować w postaci stałej (wysoka temperatura topnienia) lub ciekłej (niska temperatura topnienia). Związki o wysokiej temperaturze topnienia mogą ulegać procesom wytrącania i krystalizacji prowadząc do cząstek o nieregularnych kształtach. Udowodniono również, iż struktury te w znacznie większym stopniu rozpraszają światło niż regularne cząstki o tych samych wymiarach ale w postaci ciekłej [260]. Jednocześnie wraz ze wzrostem temperatury obserwuje się częściowe odparowywanie analitu, prowadzące do zmniejszania się rozmiarów cząstek aerozolu [248, 253]. 60 Wpływ temperatury odparowywania na odpowiedź detektora ELSD został przedstawiony przez Deschampsa i wsp. [253]. W doświadczeniu zastosowano sześć związków różniących się strukturą oraz temperaturami topnienia. Wzrost temperatury powodował spadek odpowiedzi dla większości związków. Jednak właściwość ta w dużym stopniu zależała od rodzaju cząsteczki. Wartość współczynnika krzywej kalibracyjnej (patrz równanie 3, strona 56) malała natomiast wartość współczynnika rosła wraz ze wzrostem temperatury. Na tej podstawie zaproponowano hipotezę, iż wyższa temperatura odparowywania powoduje zmniejszanie się rozmiarów cząstek aerozolu, a przez to obniża odpowiedź detektora. Całkowicie odmienne wyniki zostały uzyskane ostatnio m.in. przez Hutchinsona i wsp. [243]. Porównywali oni odpowiedź detektora ELSD w stosunku do chininy. Wartość tego parametru rosła wraz ze wzrostem temperatury w zakresie 20-80°C. Zbadano również wpływ temperatury nebulizatora na pola powierzchni pików nie obserwując istotnego wpływu tego parametru. Tendencje te obserwowane były niezależnie od składu fazy ruchomej (acetonitryl : woda). Analogiczne wnioski zaprezentowali również inni autorzy [261]. 2.5.4.2.4 Skład fazy ruchomej Zmiany składu fazy ruchomej m.in. podczas elucji gradientowej powodują zmiany jej właściwości fizycznych takich jak np. napięcie powierzchniowe czy entalpia parowania. Zmiany te mają istotny wpływ na charakterystykę tworzonego aerozolu m.in. wielkość kropel i właściwości tego aerozolu do tworzenia suchych cząstek [248]. Parametr ten w połączeniu z nieliniową odpowiedzią detektora aerozolowego czyni analizę ilościową nieznanego analitu niezwykle trudnym zadaniem. Jest to jedna z głównych wad tego typu detektorów. Jednak ostatnio została przedstawiona metoda częściowego wyeliminowania tego problemu oparta na zjawisku tzw. kompensacji fazy ruchomej. Rozwiązanie to zostało zaproponowane przez Góreckiego i wsp. [262], a polega na wykorzystaniu dwóch odrębnych faz ruchomych o przeciwnym składzie. Jedna umożliwia elucje właściwą badanych związków i przepływa przez kolumnę chromatograficzną. Druga o dokładnie odwróconym składzie dostarczana jest przez inną pompę i dołączana do „właściwego” eluentu przy jego wyjściu z kolumny. Zapewnia to stały skład fazy ruchomej docierającej do detektora. 61 2.6 METODY ANALIZY POZYCYJNEJ FOSFOLIPDÓW Właściwości grupy polarnych lipidów - fosfolipidów zależą głównie od składu kwasów tłuszczowych, których zmienność wpływa na różnice w metabolizmie i właściwościach funkcjonalnych fosfolipidów [263-265]. Dlatego metody umożliwiające nie tylko ogólną analizę składu kwasów tłuszczowych, ale również ich rozmieszczenie w cząsteczce (analiza pozycyjna) są niezwykle istotne w celu głębszego poznania zależności pomiędzy rodzajem reszt acylowych, a właściwościami fosfolipidów. Większość metod pozycyjnej analizy fosfolipidów opiera się na regioselektywnej hydrolizie wiązania estrowego fosfolipidu w pozycji sn-1 za pomocą sn-1,3 specyficznych lipaz oraz w pozycji sn-2 wykorzystując fosfolipazę A2 (PLA2). Uwolnione kwasy tłuszczowe oczyszcza się i rozdziela za pomocą TLC lub chromatografii kolumnowej, a następnie analizuje stosując GC lub HPLC. Jedna z metod opracowana przez Cossignaniegio i wsp. [266] opiera się na enzymatycznej hydrolizie fosfatydylocholiny za pomocą PLA 2 z jadu kobry królewskiej (Ophiophagus hannah). Produkty reakcji: 1-acylo-lizofosfatydylocholina (1-acylo-LPC) oraz kwasy tłuszczowe uwolnione z pozycji sn-2 fosfolipidu rozdzielano za pomocą TLC. Kwasy tłuszczowe z 1-acylo-LPC poddawano procesowi transestryfikacji za pomocą metanolanu sodu do estrów metylowych (FAME). Natomiast kwasy tłuszczowe z pozycji sn-2 estryfikowano za pomocą eterowego roztworu diazometanu oraz metanolu. Otrzymane FAME analizowano za pomocą GC. W kolejnej metodzie Bergmeyer i wsp. [267] stosowali jako biokatalizator PLA2 z jadu pszczoły. Enzym ten stosowany jest często do hydrolizy nie tylko PC ale również fosfatydyloetanoloaminy (PE), fosfatydyloinozytolu (PI) oraz fosfatydyloseryny (PS). Reakcję hydrolizy prowadzono w mieszaninie eteru dietylowego oraz buforu boranowego (pH 8,9). 1-acylo-LPC oraz kwasy tłuszczowe z pozycji sn-2 ekstrahowano mieszaniną chloroform : metanol (2:1, v/v) i rozdzielano za pomocą TLC [268]. Estry metylowe kwasów tłuszczowych otrzymano stosując metodę bezpośredniej transmetylacji zaproponowanej przez Lepage i Roya [269]. Reakcję prowadzono w mieszaninie metanol : benzen (4:1, v/v) z dodatkiem chlorku acetylu. Uzyskane estry metylowe kwasów tłuszczowych analizowano za pomocą GLC. 62 Kolejnym biokatalizatorem hydrolizy fosfolipidów jest PLA2 z pszczoły miodnej (Apis mellifera) wykorzystywana do regioselektywnej analizy różnych klas fosfolipidów mięśniowych [270,271]. Opisane powyżej przykładowe metody analizy pozycyjnej przeprowadzane były z zastosowaniem jednego biokatalizatora i pojedynczej reakcji hydrolizy. Metody te, mimo iż charakteryzują się stosunkowo wysoką prostotą, wymagają spełnienia kilku warunków w celu otrzymania wiarygodnych wyników analizy. Po pierwsze stosowany biokatalizator musi charakteryzować się wysoką regioselektywnością w stosunku do konkretnego fosfolipidu, tak aby w czasie reakcji uwalnianie były jedynie kwasy tłuszczowe z określonej pozycji w cząsteczce. Drugim niezwykle ważnym aspektem jest stosowanie takich warunków reakcji, które w maksymalnym stopniu ograniczają procesy migracji reszt acylowych. Jedną z metod jest stosowanie buforu boranowego, obecność którego znacznie ogranicza ten niepożądany proces. Innym sposobem jest zastosowanie w procesie analizy pozycyjnej dwóch enzymów wykazujących selektywność do różnych pozycji fosfolipidu. W wyniku enzymatycznej reakcji hydrolizy otrzymuje się dwa regioizomery lizofosfolipidu, które hydrolizuje się chemicznie do kwasów tłuszczowych. Kwasy przeprowadza się w estry metylowe i analizuje się za pomocą chromatografii gazowej. Jedną z takich metod zaproponowali Adlercreutz i Wehtje [272]. Autorzy ci zastosowali dwa enzymy: lipazę z Mucor miehei (Lipozyme), katalizującą reakcję etanolizy wiązania estrowego cząsteczki fosfolipidu w pozycji sn-1, oraz PLA2 stosowaną do hydrolizy wiązania w pozycji sn-2. W przypadku PLA2 reakcję przeprowadzano w mieszaninie eter dietylowy : etanol. Z kolei Florin-Christensen i wsp. [273] jako biokatalizatory zastosowali PLA2 z jadu pszczoły oraz PLA1 z pierwotniaka Tetrahymena thermophila. Mimo iż większość procedur pozycyjnej analizy PLs opiera się na enzymatycznej hydrolizie, zaproponowano kilka alternatywnych metod. W jednej z nich Medina i wsp. [274] w celu określenia profilu kwasów tłuszczowych fosfolipidów zastosowali wysokorozdzielczą spektroskopię 13C-NMR. Jednak analiza fosfolipidów w tej technice jest trudna ze względu iż otrzymuje się widma ze słabo rozdzielonymi sygnałami. Znacznie lepsze rezultaty uzyskuje się podczas analiz pochodnych fosfolipidów (1,2-diacylogliceroli (DAG)) otrzymywanych w wyniku hydrolizy wiązania glicero-fosforanowego. W celu hydrolizy tego wiązania autorzy 63 zastosowali biokatalizator w postaci fosfolipazy C. Enzym ten, należący do grupy fosfodiesteraz, hydrolizuje wiązanie glicero-fosforanowe fosfolipidów z wytworzeniem DAG. Ostatnio pojawiło się wiele nowych metod analizy pozycyjnej lipidów z zastosowaniem spektrometrii masowej połączonej z chromatografią cieczową. Jedna z nich została zaproponowana przez Nakanishi i wsp. [275]. Metoda polega na początkowym rozdziale regioizomerów fosfatydylocholiny za pomocą ultra sprawnej chromatografii cieczowej (UPLC) z zastosowaniem kolumny C18 oraz identyfikacji rozdzielonych związków za pomocą ESIMS/MS. 3 OMÓWIENIE WYNIKÓW BADAŃ WŁASNYCH 3.1 OZNACZENIE PROFILU TŁUSZCZOWEGO ŻÓŁTKA JAJA KURZEGO Celem pierwszej części badań było opracowanie metod ekstrakcji frakcji lipidowej z żółtka jaja kurzego w celu określenia profilu tłuszczowego badanego materiału biologicznego. Po oznaczeniu profilu lipidowego opracowano metody ekstrakcji umożliwiające otrzymanie czystych ekstraktów poszczególnych grup lipidów. Na tym etapie głównym celem było uzyskanie jak najczystszych frakcji lipidów polarnych tj. fosfolipidów. Zadanie to wymagało opracowania metody, która nie tylko będzie stosowana w skali laboratoryjnej ale również półtechnicznej. 3.1.1 Ekstrakcja lipidów z żółtka jaja kurzego metodą Folcha Głównym materiałem biologicznym stosowanym w przedstawionej rozprawie doktorskiej było żółtko jaja kurzego. Przedmiotem badań była frakcja lipidowa tego materiału biologicznego, dlatego pierwszym zadaniem było określenie całkowitego profilu lipidowego żółtka jaja kurzego. Było to niezwykle istotne w procesie opracowywania metod ekstrakcji fosfolipidów, gdyż znajomość składu frakcji lipidowej pozwalała skoncentrować się na konkretnych grupach związków i wykorzystywać ich właściwości podczas opracowywania metod pozyskiwania czystych grup lipidów. Dobór właściwej metody ekstrakcji jest niezwykle ważny szczególnie w przypadku amfifilowych fosfolipidów. Związki te stanowią główny składnik membran komórkowych tworząc złożone struktury, które są silniej związane niż inne grupy lipidów, a przez to ich ekstrakcja jest znacznie utrudniona [62]. Do ekstrakcji 64 lipidów z surowego żółtka jaja kurzego zastosowano metodę zaproponowaną przez Folcha i wsp. [1]. Procedura ta jest uważana za klasyczną i jednocześnie najbardziej wiarygodną metodę całkowitej ekstrakcji lipidów [30]. Oparta jest na ekstrakcji mieszaniną chloroform : metanol (2:1, v/v) oraz przepłukaniu otrzymanego ekstraktu 0,05M roztworem NaCl. W pierwszym etapie procesu stosuje się dwudziestokrotny nadmiar mieszaniny chloroform : metanol (2:1, v/v) w stosunku do objętości żółtka (1 g w 20 ml mieszaniny rozpuszczalników). Uzyskany w ten sposób ekstrakt lipidowy przepłukuje się wodnym roztworem soli. Duża efektywność etapu płukania zależy od odpowiedniego stężenie jonów soli w roztworze co ogranicza przemieszczanie się lipidów (szczególnie dotyczy to lipidów kwasowych m.in. fosfatydyloglicerolu (PG), fosfatydyloseryny (PS), kwasu fosfatydowego (PA)) pomiędzy obiema fazami układu ekstrakcyjnego. Zastosowanie roztworu soli powoduje praktycznie całkowite usunięcie lipidów z fazy górnej (metanolowo-wodnej) układu. Wyjaśnieniem tego zjawiska jest fakt iż lipidy kwasowe są ekstrahowane z tkanki w postaci soli Na, K, Ca, Mg. W górnej fazie występują w formie zdysocjowanej natomiast w dolnej w niezdysocjowanej. Dodatek soli do fazy górnej powoduje cofnięcie procesu dysocjacji i transfer tej grupy lipidów do niepolarnej fazy dolnej układu ekstrakcyjnego. Górna faza zawiera wszystkie substancje nielipidowe natomiast dolna zawiera zasadniczo wszystkie lipidy z ekstrahowanej próbki. Objętość górnej i dolnej fazy stanowi odpowiednio 40 i 60% całkowitej objętości układu. Niezwykle ważne jest aby w opisanej metodzie końcowy stosunek objętościowy chloroformu, metanolu i wody (wraz z wodą z ekstrahowanej tkanki) wynosił 8:4:3. Zachowanie tych proporcji jest niezwykle istotne i musi być zachowane na stałym poziomie w celu zapewnienia wysokiej wydajności i powtarzalności procesu [1]. Uzyskane w ten sposób surowe ekstrakty lipidowe analizowałem za pomocą wysokosprawnej chromatografii cieczowej (HPLC) z detektorem naładowanego aerozolu (CAD). 3.1.2 Bezpośrednia analiza frakcji lipidowej z żółtka jaja kurzego za pomocą HPLC (metoda 1) Opracowałem trzy metody ilościowego jak i jakościowego oznaczania lipidów we frakcji lipidowej żółtka jaja kurzego za pomocą HPLC. W pierwszej metodzie zastosowałem system elucji gradientowej umożliwiający rozdział zarówno lipidów niepolarnych (cholesterol oraz triacyloglicerole) oraz fosfolipidów w jednym programie elucyjnym. Eluentem była 65 mieszanina składająca się z heksanu, propan-2-olu oraz wody. Analizę przeprowadziłem stosując kolumnę z diolową fazą stałą. Przykładowy chromatogram wraz z programem elucji gradientowej przedstawiony jest na Rys. 4. Rys. 4. Chromatogram CAD-HPLC frakcji lipidowej z żółtka jaja kurzego oraz stosowany program elucji gradientowej (A: H2O, B: Heksan, C: Propan-2-ol). Kolumna: Waters Spherisorb® S5W 5µm (150 x 4,6 mm); temperatura kolumny: 30°C. Mimo iż metoda ta umożliwiała rozdział wszystkich lipidów z żółtka jaja kurzego to jednak posiadała kilka wad, które ostatecznie wyeliminowały ją jako rutynową metodologię oznaczania tej grupy związków. Po pierwsze w celu rozdziału wszystkich grup lipidów (niepolarne i polarne) konieczne było zastosowanie elucji gradientowej rozpoczynającej się od eluentu bardzo niepolarnego (90% heksanu; 10% propan-2-olu) w celu rozdziału lipidów niepolarnych i łagodny wzrost polarności prowadzący do rozdziału fosfolipidów. Stopniowy narost polarności wymagany był ze względu na ograniczoną mieszalność eluentu początkowego i końcowego. Efekt ten widoczny był w postaci nieustabilizowanej linii podstawowej podczas stosowania szybkich zmian polarności eluentów w trakcie elucji gradientowej (Rys. 5). Czas przedstawionego programu elucji został skrócony o 15 minut w stosunku do programu przestawionego na Rys. 4. Spowodowało to znaczne pogorszenie stabilności linii podstawowej, szczególnie w czasie, w którym elucji ulegają fosfolipidy. Można zaobserwować, iż wzrost niestabilności linii bazowej ewidentnie związany jest z dodatkiem wody do eluentu. Fakt ten był również obserwowany przez innych autorów w przypadku detektora ELSD i związany był z niecałkowitym odparowywaniem rozpuszczalnika w nebulizatorze [57]. W przypadku detektora CAD zauważono również wpływ fazy stacjonarnej na odpowiedź detektora. W przypadku tzw. kolumn „krwawiących” 66 obserwuje się wzrost poziomu linii podstawowej wraz ze wzrostem ilości wody w eluencie [276]. Rys. 5. Niestabilna linia podstawowa powstała w wyniku dodatku wody do eluentu niepolarnego podczas elucji gradientowej (A: H2O, B: Heksan, C: Propan-2-ol). Kolumna: Waters Spherisorb® S5W 5µm (150 x 4,6 mm); temperatura kolumny: 30°C. Zastosowanie „łagodniejszego” wzrostu polarności poprzez wydłużenie czasu elucji gradientowej powodował iż linia podstawowa wykazywała znaczne polepszenie stabilności. Niestety prowadziło to do wydłużenia czasu analizy. Zastosowanie wody jako jednego z rozpuszczalników było jednak niezbędne do zapewnienia elucji fosfolipidów. Konieczność stosowania wody wywoływała kolejny problem. Ze względu na wysoką polarność woda posiada tendencje do silnej adsorpcji na powierzchni polarnej fazy stacjonarnej i tworzenia cienkiej wodnej warstwy [121, 122]. Dlatego w przypadku zastosowanej kolumny diolowej wymagany był bardzo długi czas (powyżej 1h przy przepływie 1,5 ml/min) stabilizacji fazy stacjonarnej do wyjściowych warunków stosowanego programu elucyjnego. Konieczność długiej stabilizacji fazy stacjonarnej przy stosowaniu gradientu o dużej różnicy polarności stosowanych eluentów była również obserwowana przez innych autorów w przypadku m.in. polarnych złóż monolitycznych [91]. Siła adsorpcji wody na powierzchni polarnej fazy stacjonarnej zależy m.in. od stężenia rozpuszczalnika organicznego. Wraz ze wzrostem stężenia rozpuszczalnika organicznego siła oddziaływań wody z powierzchnią polarnej fazy stacjonarnej wzrasta czyli adsorpcja wody jest wyższa gdy stosunek wody do rozpuszczalnika organicznego maleje [122]. Zjawisko to jest prawdopodobnie głównym czynnikiem wpływającym na długi czas stabilizacji stosowanej 67 w analizie fazy stałej. Oddziaływania te są na tyle duże, iż mimo długiego czasu stabilizacji nadal obserwowałem znaczne odchylenia czasów retencji (tR) przekraczające nawet dziewięciokrotnie zalecane zmiany (poniżej 0,05 minuty) tego parametru pomiędzy analizami wykonywanymi tego samego dnia [277]. Rozwiązaniem tego problemu mogłoby być zastosowanie nowych alternatywnych polarnych faz stałych do chromatografii w normalnym układzie faz. Jedną z takich kolumn oferuje firma YMC. Kolumna PVA-Sil® zawiera złoże, w którym krzemionka modyfikowana jest spolimeryzowanym alkoholem winylowym. Według producenta homogeniczna warstwa polimerowa związana chemicznie z powierzchnią krzemionki zapewnia stałą aktywność tej fazy przy zastosowaniu szerokiej gamy rozpuszczalników od heksanu do wody. Prowadzi to do znacznego skrócenia czasu kondycjonowania fazy stałej [258]. Ostatnio obserwuje się wzrost zainteresowania tym złożem do rozdziału lipidów [252, 258, 278]. Mnie jednak, przy zastosowaniu rozpuszczalników takich jak heksan, propan-2-ol oraz woda nie udało się uzyskać satysfakcjonującego podziału analizowanych frakcji lipidowych z wykorzystaniem tej fazy stałej. 3.1.3 Rozdział frakcji lipidowej za pomocą SPE oraz ich analiza z zastosowaniem HPLC (metoda 2) Ze względu na duże trudności w analizie wszystkich grup lipidów w pojedynczym procesie elucyjnym z wykorzystaniem dostępnych polarnych faz stałych postanowiłem zastosować wstępny rozdział lipidów polarnych i niepolarnych za pomocą ekstrakcji do fazy stałej (SPE), a następnie osobną analizę każdej z frakcji za pomocą różnych metod HPLC. Całkowity proces ekstrakcji i analizy przedstawiono na Schemacie 1. Podobne podejście do analizy lipidów można spotkać w niektórych metodach prezentowanych w literaturze [279]. W pracy zaprezentowane są metody, w których do rozdziału lipidów zastosowałem kolumnę z niemodyfikowaną krzemionką i kolumnę z diolową fazą stałą. 68 Schemat 1. Ogólny schemat ekstrakcji i rozdziału frakcji lipidowej żółtka jaja kurzego (metoda 2). 3.1.3.1 Rozdział lipidów polarnych i niepolarnych za pomocą ekstrakcji do fazy stałej (SPE) Pierwszym etapem prezentowanej metodologii jest rozdział frakcji tłuszczowych uzyskanych w procesie ekstrakcji metodą Folcha [1]. Rozdział lipidów polarnych od niepolarnych jest wskazany ze względu na trudności związane z jednoczesną analizą tych grup związków. Jako metodę rozdziału wybrałem technikę ekstrakcji do fazy stałej (SPE) z użyciem kolumienek krzemionkowych. Metodę tę zastosowałem z powodu dużej oszczędności czasu jak i prostoty wykonania. W celu wyboru odpowiednich warunków rozdziału zbadałem różne rozpuszczalniki. Ostatecznie chloroform i metanol okazały się najbardziej odpowiednie, zapewniając całkowity odzysk lipidów w granicach od 66,3% do 76,3%. Jest to odzysk z surowej frakcji lipidowej naniesionej na kolumienkę w ilości odpowiednio od 100 do 10 mg. Odzysk lipidów obliczono na podstawie masy uzyskanych frakcji lipidowych przed i po procesie rozdziału za pomocą SPE. Natomiast w celu oceny wpływu ilości frakcji lipidowej naniesionych na kolumienkę na odzysk poszczególnych grup 69 fosfolipidów oraz lipidów niepolarnych zastosowałem różne ilości frakcji lipidowej wyizolowanej z żółtka jaja kurzego (Tabela 1 oraz 2). Procentowy odzysk (RR - Recovery Rate) określiłem za pomocą HPLC i porównanie pól powierzchni poszczególnych analizowanych związków przed i po procesie rozdziału stosując następujące równanie: (7) gdzie: S‘ – pole powierzchni piku danego analitu przed rozdziałem ; S’’- pole powierzchni piku danego analitu po rozdziale. Wszystkie próbki były analizowane tego samego dnia, w czterech powtórzeniach oraz przez tę samą osobę w celu określenia powtarzalności. Precyzje procesu oznaczyłem stosując względne odchylenie standardowe średniej arytmetycznej (%RSD) obliczone według równania: (2) gdzie: SD – odchylenie standardowe średniej arytmetycznej ; średnia arytmetyczna z n powtórzeń. W celu określenia wpływu ilości frakcji lipidowej na odzysk fosfolipidów oznaczenie prowadziłem dla 10, 50 oraz 100 mg tej frakcji. Tabela 1. Wpływ ilości frakcji lipidowej z żółtka jaja kurzego na odzysk fosfolipidów po procesie rozdziału za pomocą SPE na złożu krzemionkowym (n=4). PLs Ilość Całkowity frakcji odzysk lipidowej fosfolipidów PE SD %RSD Odzysk (%) PC SD %RSD Odzysk (%) SM SD %RSD Odzysk (%) SD %RSD (mg) (%) 10 54,4 1,98 3,64 80,1 1,58 1,98 51,4 0,88 1,71 57,8 1,17 2,02 50 49,1 2,39 4,87 74,4 2,10 2,83 46,1 0,95 2,05 49,6 1,31 2,65 100 38,8 2,29 5,90 62,6 3,74 5,97 35,8 1,32 3,68 41,3 1,48 3,59 Odzyski fosfolipidów z ekstraktów lipidowych z żółtka jaja w przedstawionej metodologii wynoszą poniżej 55% i zależą w dużym stopniu od ilości frakcji lipidowej naniesionej na kolumienkę. Wraz ze wzrostem ilości frakcji wyjściowej odzysk maleje. 70 Zaobserwowałem, iż odzysk jest różny dla poszczególnych fosfolipidów. Najwyższym odzyskiem charakteryzowała się PE a najniższym PC. Dane uzyskane w pracy są zgodne z doniesieniami literaturowymi dotyczącymi rozdziału lipidów polarnych za pomocą SPE ze złożem krzemionkowym oraz z zastosowaniem metanolu jako eluentu końcowego [62]. Całkowity odzysk PLs w tych metodach wynosi około 50%. Znaczny wzrost odzysku fosfolipidów można otrzymać poprzez niewielką modyfikację przedstawionej metodyki. Zastosowanie jako eluentu końcowego mieszaniny metanol : chloroform : woda (5:3:2 v/v/v) zapenia praktycznie całkowity odzysk fosfolipidów [58]. Metoda ta została szczegółowo opisana w rozdziale dotyczącym analizy fosfolipidów z mleka gdzie uzyskanie wysokiego odzysku było niezbędne ze względu na ich niewielkie stężenie we frakcji tłuszczowej (ok. 0,3%) [2]. W przypadku mleka technikę SPE zastosowałem do zatężania próbek poprzez usuwanie lipidów niepolarnych. Usuwanie tej grupy związków jest również stosowane w przypadku, gdy w analizie HPLC jako fazę stałą do rozdziału fosfolipidów (PLs) stosuje się złoże niepolarne np. C18. W tym przypadku obecne długołańcuchowe lipidy niepolarne (C>20) mogą silnie i trwale oddziaływać ze złożem powodując zmiany jego właściwości. Tego typu związki (ang. column killers) są często powodem niszczenia kolumn chromatograficznych [280]. W przypadku analizy fosfolipidów z żółtka jaja kurzego usuwanie frakcji niepolarnej nie jest wymagane i mogą być one oznaczone bezpośrednio w surowym ekstrakcie lipidowym. Lipidy niepolarne praktycznie nie ulegają retencji w przedstawionych metodach HPLC i są eluowane w pierwszych 90 sek. stosowanych programów elucji. Wysokie stężenie fosfolipidów (ok. 50%) we frakcji uzyskanej z żółtka zapewnia wiarygodną analizę bez konieczności zatężania próbek. Rozdział lipidów polarnych od niepolarnych jest niezbędny w przypadku analizy jakościowej i ilościowej cholesterolu (Chol) oraz triacylogliceroli (TAG). Usunięcie fosfolipidów z analizowanej mieszaniny lipidowej jest konieczne ze względu na to, iż w stosowanej w pracy metodzie HPLC (heksan:propan-2-ol 90:10 v/v) nie ulegają one elucji. Do tego celu konieczne staje się użycie silnie polarnych rozpuszczalników w tym wody. Jednak jej zastosowanie pociąga za sobą wiele problemów co zostało przedstawione w poprzednim rozdziale (metoda 1). Potrzeba analizy lipidów niepolarnych była głównym powodem zastosowania metody SPE do rozdziału frakcji lipidowych różniących się polarnością. W tym przypadku podobnie jak dla fosfolipidów zbadano wpływ ilości frakcji 71 lipidowej naniesionej na kolumienkę na odzysk. Walidacje metody przeprowadziłem stosując mieszaninę fosfolipidów z żółtka jaja kurzego pozbawionych lipidów niepolarnych do których dodałem określone ilości TAG i Chol. Czyste fosfolipidy uzyskałem za pomocą przedstawionej powyżej metody SPE. Procentowy odzysk oznaczyłem poprzez porównanie pól powierzchni wzorców cholesterolu i tripalmitynianu glicerolu z powierzchnią pików analizowanych związków dodanych do mieszaniny fosfolipidów i rozdzielonych za pomocą SPE. Wszystkie doświadczenia wykonałem w czterech powtórzeniach, a wyniki zebrałem w Tabeli 2. Opracowana metoda umożliwia praktycznie całkowity odzysk lipidów niepolarnych. Niewielki spadek RR obserwowano wraz ze zwiększaniem ilości rozdzielanych lipidów. Stosowana metoda wykazuje również bardzo dużą powtarzalność oznaczoną za pomocą względnego odchylenia standardowego średniej arytmetycznej (%RSD). Uzyskane w wyniku podziału lipidy niepolarne i fosfolipidy analizowałem ilościowo i jakościowo za pomocą metod HPLC. Tabela 2. Wpływ ilości frakcji lipidowej z żółtka jaja kurzego na odzysk cholesterolu (Chol) i tripalmitynianu gliceryny (TriPal) po procesie rozdziału za pomocą SPE na złożu krzemionkowym (n=4). Chol TriPal Ilość Ilość analitu frakcji dodanego Odzysk fosfolipidowej do frakcji (%) (mg) lipidowej SD %RSD Odzysk (%) SD %RSD (mg) 10 2,5 99,9 1,18 1,17 100,1 1,72 1,71 50 5,0 99,4 0,97 0,97 99,8 3,31 3,27 100 10,0 97,8 3,45 3,52 95,5 3,04 3,18 3.1.3.2 Opracowanie metod analizy fosfolipidów żółtka jaja kurzego za pomocą HPLC W celu analizy fosfolipidów z żółtka jaja kurzego opracowałem dwie różne metody HPLC. Główną różnicą tych technik był rodzaj zastosowanej fazy stałej tj. diolowej lub niemodyfikowanej krzemionki. Typ zastosowanej fazy stałej w dużym stopniu wpływał na rozdział fosfolipidów. Różnice te zostaną szczegółowo przedstawione w kolejnych rozdziałach. 72 3.1.3.2.1 Analiza fosfolipidów z żółtka jaja kurzego za pomocą HPLC z zastosowaniem kolumny z krzemionkową fazą stałą (metoda 2,1) Pierwszą analizę fosfolipidów występujących w żółtku jaja kurzego przeprowadziłem za pomocą HPLC z krzemionkową fazą stałą oraz detektorem CAD. Przykładowy chromatogram mieszaniny wzorców fosfolipidów oraz stosowany program elucji gradientowej przedstawiony jest na Rys. 6. Rys. 6. Chromatogram CAD-HPLC mieszaniny wzorców fosfolipidów z żółtka jaja kurzego oraz stosowany program elucji gradientowej (A: bufor (1% HCOOH, 0,1% TEA), B: Heksan, C: Propan-2-ol). Kolumna: Waters Spherisorb® S5W 5µm (150 x 4,6 mm); temperatura kolumny: 30°C. W metodzie tej zastosowałem jako eluent mieszaninę heksanu, propan-2-olu oraz buforu (1% HCOOH, 0,1% TEA) umożliwiających rozdział wszystkich fosfolipidów żółtka jaja kurzego w 25 minutowym programie (17 min właściwego programu oraz 8 min stabilizacji). Stosowanie mieszaniny TEA (trietyloaminy) i kwasu mrówkowego (KM) jest bardzo często spotykane w przypadku analiz lipidów. Jego pozytywny wpływ na odpowiedź detektora ELSD jak i CAD został udowodniony przez Deschampsa i wsp. [253, 258]. Ze względu na duże podobieństwo tych detektorów wiele z założeń teoretycznych opracowanych dla detektora ELSD może być wykorzystane do charakterystyki detektora CAD. Dotyczy to głównie analogicznego procesu nebulizacji i odparowywania rozpuszczalnika, a etapy te w dużym stopniu wpływają na końcową odpowiedź obu detektorów. Zaproponowano kilka hipotez wyjaśniających wpływ dodatków do eluentu na odpowiedź. Zmiana może wynikać z poprawy geometrii piku (kształt, szerokość). Dla detektora CAD i ELSD, które są częścią systemu chromatograficznego wzrost odpowiedzi może być również związany ze zmianami właściwości aerosolu pierwszego (np. Zmiana napięcia powierzchniowego) jak i trzeciego, 73 głównie poprzez zmianę kształtu tworzących go cząstek. Wzrost odpowiedzi związany jest również z tworzeniem się kompleksów TEA-KM z cząsteczkami substancji rozpuszczonej. TEA-KM działają w tym przypadku jako tzw. „wzmacniacze” masy (ang. mass amplifier). Dodatki te wykazują również pozytywny wpływ na rozdzielczość [107, 281]. Co więcej TEA znacznie przyspiesza proces kondycjonowania kolumny dając pewność, że wszystkie lipidy które uległy adsorpcji w kolumnie zostały usunięte ze złoża w procesie elucji [279]. Szczegółowy opis teoretyczny tych zjawisk został przedstawiony we wstępie niniejszej pracy. W przedstawionej metodzie w przypadku dwóch związków (LPE oraz SM) obserwowałem wstępny podział piku na piki pochodzące od różnych submolekularnych pochodnych różniących się składem kwasów tłuszczowych. Podział ten najlepiej widoczny jest w przypadku 1-acylo-lizofosfatydylocholiny (1-acylo-LPC) dzielącej się na dwa dobrze rozdzielone piki. Każdy z pików należy do frakcji o określonym składzie kwasów tłuszczowych. Skład ten został częściowo udowodniony podczas analizy różnych frakcji 1-acylo-LPC uzyskanych za pomocą chromatografii kolumnowej (CHCl3:MeOH:H2O, 65:25:4 v/v/v). Otrzymane frakcje analizowałem za pomocą HPLC, natomiast skład kwasów tłuszczowych oznaczono za pomocą chromatografii gazowej z detektorem płomieniowojonizacyjnym (FID-GC). Chromatogramy przedstawiające analizę porównawczą HPLC i GC zaprezentowano na Rys. 7. W pierwszej frakcji, uzyskanej z chromatografii kolumnowej, otrzymano mieszaninę cząsteczek 1-acylo-LPC zawierających w pozycji sn-1 zarówno kwasy nienasycone jak i kwasy nasycone, głównie kwas palmitynowy i kwas stearynowy, które stanowiły sumarycznie ponad 87% wszystkich kwasów tłuszczowych. Kolejne frakcje zawierały już jedynie kwasy nasycone, których stosunek zmieniał się na korzyść kwasu palmitynowego. Trzecia frakcja jest to już praktycznie czysta 1- palmitoilolizofosfatydylocholina (93,4%). Przedstawione chromatogramy ukazują jedynie wstępne wyniki rozdziału lizofosfatydylocholiny obrazując jednocześnie potencjał badanej metody do pozyskiwania konkretnych frakcji lizofosfolipidowych o ustalonym składzie kwasów tłuszczowych. Jednak w celu opracowania metody cechującej się dużą powtarzalnością oraz selektywnością do konkretnych frakcji określonego lizofosfolipidu dalsze badania w tej materii są konieczne i będą kontynuowane. Celem przedstawionej analizy było jedynie zaprezentowanie wpływu rodzaju reszty acylowej fosfolipidu na podział chromatograficzny. W przypadku LPC udowodniono również, iż dwa główne piki pochodzą 74 od cząsteczek 1-acylo-LPC różniących się składem kwasów tłuszczowych, a nie jak przypuszczano od regioizomerów LPC różniących się położeniem reszty acylowej w cząsteczce (pozycja sn-1 lub sn-2). Rys. 7. Skład kwasów tłuszczowych różnych frakcji 1-acylo-lizofosfatydylocholiny (1-acylo-LPC) z żółtka jaja kurzego uzyskanych za pomocą chromatografii kolumnowej (CHCl 3 : MeOH : H2O, 65:25:4 v/v/v). Model odpowiedzi detektora oraz liniowość. Wg Międzynarodowej Konferencji do spraw Harmonizacji (ICH) liniowość procedury analitycznej to przedział zakresu pomiarowego, w którym wyniki danego testu (sygnał wyjściowy) są proporcjonalne do stężenia (ilości) danego analitu [282]. W przypadku większości metod analitycznych stosuje się model zależności prostoliniowej aby wykazać, że pojedynczy punkt krzywej kalibracyjnej zapewnia wystarczającą dokładność w przyjętym zakresie stężeń lub spodziewanych zawartości. Liniowość metody nie jest jednak warunkiem koniecznym. Dla metod analitycznych, które nie są liniowe, należy wykazać inną zależność matematyczną spełniającą kryteria funkcji kalibracyjnej [283]. Kryteriami akceptacji dla testu liniowości są najczęściej współczynnik korelacji (determinacji) R2 oraz wartość wyrazu wolnego funkcji liniowej [284]. R2 przyjmuje wartości z przedziału (0-1) i informuje o tym jaka część zmienności całkowitej zmiennej losowej y (odpowiedź detektora) została wyjaśniona regresją liniową względem x (ilość analitu). Informuje o tym w jakim procencie zmienność y jest objaśniana przez model. Jeżeli między zmiennymi x i y istnieje pełna zależność, to wszystkie punkty empiryczne leżą na prostej (R2=1). W przypadku metod analitycznych wartość R2≥0,999 jest dowodem na satysfakcjonującą liniowość walidowanej metody. Natomiast wartość wyrazu wolnego określającego punkt przecięcia się wykresu funkcji liniowej z osią rzędnych powinno być mniejsze niż kilka procent z odpowiedzi uzyskanej dla docelowej ilości analitu. 75 Dodatkowo dopasowanie (ang. goodness of fit) wyników do regresji liniowej może być ustalone według procedury opartej na resztowej sumie kwadratów (RSS, ang. residual sum of squares) [284, 285]. W metodzie tej przyjmuje się regresję liniową jako średnią i oblicza względne odchylenie standardowe średniej arytmetycznej (%RSD) uzyskanych wyników. Wartość %RSD nie powinna przekraczać 2,0%. W celu określenia modelu odpowiedzi detektora CAD w danej metodzie przygotowano mieszaninę wzorcową fosfolipidów żółtka jaja kurzego. Roztwory sporządzono w eluencie chloroform : metanol (2:1, v/v) zapewniającym dobrą rozpuszczalność wszystkich związków. Krzywe kalibracyjne każdego analizowanego fosfolipidu obliczono na podstawie wartości pól powierzchni pików uzyskanych poprzez nastrzyk 10 µl roztworów substancji wzorcowych. Analizowano następujące mieszaniny wzorców: PE (0,03-1,05 µg), LPE (0,031,42 µg), PC (0,03-1,44 µg), SM (0,03-1,33 µg) oraz LPC (0,03-1,28 µg). Przygotowałem co najmniej sześć różnych stężeń każdego związku oraz przeprowadzono trzykrotny nastrzyk każdej mieszaniny wzorców. Do określenia związku pomiędzy ilością poszczególnych substancji wzorcowych a odpowiedzią detektora CAD (pole powierzchni) zastosowałem dwie funkcje: liniową (y=a+bx) oraz potęgową (y=axb) w celu określenia, która z nich lepiej opisuje odpowiedź detektora w stosowanym zakresie stężeń. Te dwa modele opisu odpowiedzi detektora CAD są najczęściej proponowane w literaturze [246, 252]. Porównanie modeli odpowiedzi liniowej i potęgowej dla detektora CAD przedstawione są w Tabeli 3. Wyznaczone współczynniki obu funkcji opisujących odpowiedź detektora są przedstawione razem z odchyleniami standardowymi (±SD). Tabela 3. Krzywe kalibracyjne CAD-HPLC fosfolipidów żółtka jaj kurzego. PLs Zakres (µg) Model potęgowy (y=axb) Model liniowy (y=bx+a) Równanie R2 AICC Równanie R2 AICC 54,661(±0,27)x0,966(±0,01) 0,9998 -47,174 54,510 (±0,39)x+0,389(±0,17) 0,9996 -30,138 PE 0,03-1,05 LPE 0,03-1,42 62,466(±0,14)x0,976(±0,01) 0,9943 41,709 62,409 (±0,51)x-0,092(±0,18) 0,9941 42,481 PC 0,03-1,44 37,067(±0,69)x0,968 (±0,02) 0,9989 -14,166 36,572(±0,59)x+0,363(±0,21) 0,9987 -10,826 LPC 0,03-1,28 38,098(±0,51)x0,873 (±0,04) 0,9947 13,077 36,477 (±1,38)x+1,499(±0,60) 0,9916 22,995 SM 0,03-1,33 0,9982 14,795 63,694(±0,93)x+1,533(±0,69) 0,9970 25,959 65,444(±1,06)x0,922(±0,01) 76 Wysokie wartości współczynników determinacji w zakresie 0,9916 – 0,9998 obserwowano dla obu modeli. Jednak wartości te są wyższe dla wszystkich związków w przypadku modelu potęgowego. Oprócz współczynnika R2 do porównania modeli odpowiedzi detektora CAD zastosowałem kryterium informacyjne Akaikego (AIC). AIC jest obecnie uniwersalnym kryterium wyboru optymalnego modelu spośród wielu konkurujących ze sobą modeli objaśniających interesującą nas zmienną zależną [286, 287]. Najlepszy model to taki, który minimalizuje AIC (AIC osiąga najmniejszą wartość) tzn. minimalizuje ilość informacji utraconych, gdy model prawdziwy - nieznana prawda, rzeczywistość jest przybliżana przez model najlepszy. Zatem kryterium Akaikego pozwala stwierdzić, który z rozważanych modeli najlepiej opisuje rzeczywistość - jest najbardziej zgodny z danymi empirycznymi (najlepiej odzwierciedla dane empiryczne). Celem AIC jest przede wszystkim pokazanie, który model nadaje się (lepiej niż inny) do wysuwania predykcji. Powszechnie przyjmuje się, że modele różniące się o nie więcej niż 2 jednostki AIC są porównywalnie dobrymi modelami. AIC nie jest testem modelu w sensie testowania hipotez, lecz bardziej narzędziem selekcji modeli [288]. W przypadku niewielkich prób stosuje sie tzw. skorygowane kryterium Akaikego (AICc), które zastosowałem w niniejszej pracy. Wszystkie obliczenia oraz porównanie modeli wykonałem za pomocą programu OriginPro 8.0. Analiza wartości współczynników korelacji (R2) jak i kryterium informacyjnego Akaikego (AICc) wykazała, iż w przypadku wszystkich fosfolipidów model potęgowy lepiej opisuje odpowiedź detektora CAD w stosowanej metodyce. Czułość (S), granica wykrywalności (LOD) oraz granica oznaczalności (LOQ). Wyznaczenie czułości detektora jest proste gdy jego odpowiedź jest liniowa. Wg Międzynarodowej Unii Chemii Czystej i Stosowanej (IUPAC) czułość (S) jest to wartość współczynnika kierunkowego (nachylenie prostej kalibracyjnej) funkcji liniowej. Natomiast według ICH LOD to najmniejsza ilość substancji w próbce, która może być wykryta, lecz niekoniecznie oznaczona z odpowiednia dokładnością. Z kolei LOQ to najmniejsza ilość substancji w próbce, która może być oznaczona ilościowo z odpowiednią precyzją i dokładnością. W przypadku modelu liniowego odpowiedzi detektora granica wykrywalności (LOD) oraz granica oznaczalności (LOQ) mogą być wyliczone w oparciu o odchylenie standardowe (σ) odpowiedzi oraz wartość 77 współczynnika kierunkowego krzywej kalibracyjnej (S) za pomocą wzorów: LOD = 3,3(σ/S) oraz LOQ = 10(σ/S). Odchylenie standardowe odpowiedzi jest zazwyczaj obliczane jako odchylenie standardowe wyrazu wolnego regresji liniowej [284, 289]. Metoda ta jest jedną z procedur wyznaczania tych parametrów zalecaną przez ICH [277, 282]. Gdy funkcja odpowiedzi detektora nie jest liniowa, czułość zmienia się wraz ze stężeniem [241]. W przypadku detektora CAD, czułość może być wyrażona jako zmiana odpowiedzi na jednostkę zmiany stężenia: S = dy/dx = abxb−1. Czułość detektora wyznaczono dla najniższego stężenia stosowanego do sporządzenia krzywej kalibracyjnej. Wartości czułości detektora oraz wartości dwóch dodatkowych parametrów tj. granicy wykrywalności (LOD) oraz granicy oznaczalności (LOQ) przedstawione są w Tabeli 4. Czułość dla wszystkich badanych związków wykazuje zbliżoną wartość w granicach (38,9 – 66,9 mV/µg). Najwyższą czułość zaobserwowano w przepadku SM natomiast najniższą dla PC. Tabela 4. Czułość (S), granica wykrywalności (LOD) i granica oznaczalności (LOQ) fosfolipidów dla detektora CAD. Związek PE LPE PC LPC SM S (mV/µg) (abxb-1)a LOD (ng) (3,3 x σ/S)b LOQ (ng) (10 x σ/S)b 59,8 14,9 45,3 66,0 6,9 21,0 39,9 57,4 174,0 51,5 32,7 99,0 65,8 53,3 161,4 a a ,b – parametry uzyskane z modelu potęgowego; x – stężenie analizowanej substancji b σ – odchylenie standardowe odpowiedzi Precyzja. Precyzja metody analitycznej jest to stopień zgodności pomiędzy pojedynczymi wynikami analizy, gdy dana procedura jest stosowana dla wielokrotnie powtarzanych niezależnych oznaczeń jednorodnej próbki [282]. Najczęściej miarą precyzji jest odchylenie standardowe (SD) oraz względne odchylenie standardowe (%RSD). Kryteria akceptacji precyzji systemu HPLC dla wyników zawartości składnika głównego to %RSD≤1. Natomiast dla oznaczania składników na poziomie śladowym %RSD≤5 [284]. W celu oznaczenia precyzji systemu HPLC, a także powtarzalności nastrzyków przeprowadziłem dziesięciokrotny nastrzyk pojedynczego roztworu badanego związku w warunkach przedstawionych powyżej. Do tego celu użyłem roztworów substancji wzorcowych o zbliżonej masie. Powtarzalność metody określiłem na podstawie czasów retencji i pól powierzchni uzyskanych pików (Tabela 5). 78 Tabela 5. Powtarzalność odpowiedzi detektora CAD i czasów retencji fosfolipidów. Związek Ilość (µg) Powierzchnia piku (mV/min) Średnia SD RSD% Czas retencji (min) Średnia SD RSD% PE 0,16 9,172 0,161 1,757 7,587 0,020 0,263 LPE 0,21 8,898 0,181 2,090 9,655 0,010 0,159 PC 0,22 8,367 0,681 8,09 11,228 0,020 0,161 LPC 0,19 8,936 0,675 7,554 15,078 0,095 0,630 SM 0,20 14,557 0,967 6,647 11,727 0,024 0,216 Mimo iż układ wykazywał dużą powtarzalność czasów retencji (%RSD 0,159 – 0,630) to powtarzalność pól powierzchni analizowanych związków nie spełniała kryteriów akceptacji. Względne odchylenie standardowe tego parametru wahało sie w granicach 1,757 – 8,090. Ciekawym aspektem jest tu brak powtarzalności jedynie w przypadku odpowiedzi detektora (pól powierzchni). Z informacji przedstawianych w literaturze można by zakładać, że również powtarzalność czasów retencji powinna drastycznie spadać przy zastosowaniu wody jako składnika eluentu [121, 122]. Brak powtarzalności wyników w przypadku stosowania niemodyfikowanej krzemionki jako fazy stałej związane jest najczęściej z bardzo silną adsorbcją wody na jej powierzchni, co powoduje zmianę właściwości złoża. W powyższej metodzie na odpowiedź detektora CAD może wpływać fakt, iż kolumna krzemionkowa należy do tzw. kolumn krwawiących i wraz ze wzrostem ilości wody w eluencie krzemionka ulega rozpuszczeniu co skutkuje ujściem fazy stacjonarnej z kolumny. Częściowym dowodem na to może być fakt, iż wraz ze wzrostem ilości wody w eluencie obserwuje się wzrost szumów linii podstawowej. Rosnąca ilość wody w eluencie odpowiedzialna jest również ze wzrost niestabilności odpowiedzi detektora. Najwyższa powtarzalność (%RSD 1,757) obserwowana jest w przypadku PE i LPE (%RSD 2,090) ulegających elucji w mieszaninie rozpuszczalników o najniższej zawartości wody. Dlatego też w celu poprawy precyzji i powtarzalności procesu postanowiłem zastosować jako fazę stałą krzemionkę modyfikowaną podstawnikami 2,3-dihydoksypropylowymi (kolumna diolowa) wykazującą znacznie wyższą stabilność w przypadku eluentów wodnych. 79 3.1.3.2.2 Analiza fosfolipidów z żółtka jaja kurzego za pomocą HPLC z diolową fazą stałą (Metoda 2,2) Przedstawiona poniżej metoda jest modyfikacją procesu rozdziału i analizy fosfolipidów opisanego szczegółowo powyżej (metoda 2,1). Wprowadzone zmiany miały na celu poprawę precyzji metodologii HPLC. Jedną z głównych różnic jest zastosowana faza stała w postaci modyfikowanej za pomocą 2,3-dihydoksypropylowych podstawników krzemionki. Diolowa faza stała charakteryzuje się wysoką polarnością i zdolnością tworzenia wiązań wodorowych, a jednocześnie nie zawiera grup zdolnych do jonizacji poza nieprzereagowanymi grupami silanolowymi. Złoże to jest jedną z wielu faz stałych wykorzystywanych w chromatografii oddziaływań hydrofilowych (ang. hydrophilic interaction liquid chromatography; HILIC) [121, 122, 290]. Chromatografia ta umożliwia efektywny rozdział związków polarnych na polarnych fazach stałych. Z historycznego punktu widzenia HILIC jest przestawiany jako jeden z wariantów chromatografii w normalnym układzie faz (NP-LC) z typowymi eluentami stosowanymi w chromatografii w odwróconym układzie faz (RP-LC). Mechanizm rozdziału jest tu jednak znacznie bardziej skomplikowany niż w przypadku NP-LC, co szczegółowo zostało przedstawione m.in. przez Buszewskiego i wsp. [122] oraz McCalleya [291, 292]. Głównym powodem zastosowania tej fazy stałej w przedstawionej metodzie była stabilność w przypadku stosowania wodnej fazy ruchomej. Jako eluent zastosowano tu ponownie mieszaninę heksanu, propan-2-olu oraz buforu (0,1% trietyloaminy (TEA) oraz 1% kwasu mrówkowego). Wykorzystano metodę liniowej elucji gradientowej, w której stężenie heksanu utrzymywane było na stałym poziomie 40%. Polarność eluentu zwiększano poprzez obniżanie stężenia propan-2-olu na rzecz buforu. Elucje lipidów polarnych obserwowano, gdy udział wody w eluencie przekraczał 8%. Fakt ten potwierdzają również dane literaturowe, gdzie także zaobserwowano silną adsorpcję m.in. PC i LPC do polarnej fazy stacjonarnej i konieczność użycia fazy ruchomej o wysokiej zawartości wody w celu ich elucji [57]. Zwiększenie przepływu fazy ruchomej do wartości 1,5 ml/min umożliwiło nie tylko skrócenie czasu analizy ale również możliwość elucji fosfolipidów naturalnych w postaci pojedynczych pików. Wpływ tego parametru na rozdział był szczególnie widoczny w przypadku LPC, która przy obniżonej wartości przepływu dzieliła się na dwa główne piki pochodzące od różnych cząsteczek LPC różniących się rodzajem reszty acylowej. Tego typu właściwości naturalnych glicerofosfolipidów podczas rozdziału i analiz za 80 pomocą HPLC są często spotykane i trudne do wyeliminowania. Zjawisko to było obserwowane przez innych autorów m.in. W przypadku sfingomieliny, która dzieli się zazwyczaj na co najmniej dwa dobrze rozdzielone piki [252, 279, 281, 293]. Dlatego podczas analiz bardzo ważne jest użycie wzorców pochodzących z tego samego biologicznego źródła [27, 252]. Zastosowanie niewłaściwych substancji wzorcowych może wiązać się m.in. Z obserwowanymi różnicami w czasach retencji. W przeprowadzonych przeze mnie analizach czas potrzebny do rozdziału wszystkich fosfolipidów wynosił 9 minut. Po każdej analizie przed nastrzykiem kolejnej próbki wymagany był 10 minutowy czas stabilizacji fazy stałej do warunków początkowych. Przykładowy chromatogram wzorcowej mieszaniny fosfolipidów żółtka jaja kurzego uzyskany za pomocą detektora CAD wraz z programem elucji gradientowej przedstawiono na Rys. 8. Rys. 8. Chromatogram CAD-HPLC mieszaniny wzorców fosfolipidów z żółtka jaja kurzego oraz stosowany program elucji gradientowej (A: bufor (1% HCOOH, 0,1% TEA), B: Heksan, C: Propan-2-ol). Kolumna: Thermo Betasil DIOL 5µm (150 x 4,6 mm); temperatura kolumny: 20°C. Niemal wszystkie analizowane związki ulegały elucji w postaci pojedynczych pików. Wyjątkiem był pik LPE wykazujący wstępny podział na trzy niecałkowicie rozdzielone piki (Rys. 9). 81 Rys. 9. Pik lizofosfatydyloetanoloaminy (LPE) z żółtka jaja kurzego uzyskany w wyniku analizy HPLC (metoda 2,2). Model odpowiedzi detektora. W celu wyznaczenia najlepszego modelu odpowiedzi detektora CAD w przedstawionej metodzie przeprowadziłem doświadczenie analogiczne do opisanego w przypadku metody 2.1. Wzorcowe mieszaniny fosfolipidów przygotowałem w eluencie chloroform : metanol (2:1, v/v). Krzywe kalibracyjne każdego analizowanego związku obliczyłem na podstawie wartości pól powierzchni pików uzyskanych poprzez nastrzyk 10 µl roztworów substancji wzorcowych. Analizowałem następujące mieszaniny wzorców: PE (0,01-1,67 µg), LPE (0,01-2,17 µg), PC (0,01-2,62 µg), SM (0,01-1,94 µg) oraz LPC (0,01-2,11 µg). Przygotowałem sześć różnych stężeń każdego związku oraz przeprowadziłem trzykrotny nastrzyk każdej mieszaniny wzorców. Do określenia związku pomiędzy ilością poszczególnych substancji wzorcowych, a odpowiedzią detektora CAD (pole powierzchni) zastosowałem ponownie dwie funkcje: liniową (y=a+bx) oraz potęgową (y=axb). Porównanie modeli odpowiedzi liniowej i potęgowej dla detektora CAD przedstawione są w Tabeli 6. Kryteriami akceptacji właściwego modelu były ponownie wartości współczynnika R2 oraz AICc. Analiza wykazała, iż w przypadku wszystkich fosfolipidów ponownie model potęgowy lepiej opisuje odpowiedź detektora CAD w stosowanej metodyce. W przypadku PE różnica pomiędzy modelami wynosi jedynie nieco ponad 2 jednostki AICc co świadczy, iż oba modele porównywalnie dobrze opisują odpowiedź detektora. 82 Tabela 6. Krzywe kalibracyjne HPLC/CAD. Zakres (µg) PLs Model potęgowy (y=axb) Równanie R2 Model liniowy (y=bx+a) AICC Równanie R2 AICC PE 0,01-1,67 31,934 (±0,36)x0,9839(±0,02) 0,9994 -32,666 31,960 (±0,09)x-0,093(±0,01) 0,9993 -35,322 LPE 0,01-2,17 39,767(±0,25)x 0,9352(±0,01) 0,9989 3,283 37,979 (±0,27)x+0,602(±0,06) 0,9976 20,588 PC 0,01-2,62 40,279(±0,09)x 0,8819 (±0,02) 0,9985 16,4839 36,094 (±0,31)x+1,756(±0,24) 0,9948 47,657 LPC 0,01-2,11 35,309(±0,49)x 0,8698(±0,02) 0,9981 6,771 32,153 (±0,28)x+1,444(±0,06) 0,9936 36,896 SM 0,01-1,94 40,854 (±0,58)x0,9005(±0,01) 0,9993 -11,815 38,344 (±0,23)x+1,179(±0,08) 0,9966 24,454 Czułość (S), granica wykrywalności (LOD) oraz granica oznaczalności (LOQ). Wartości czułości detektora przedstawione są w Tabeli 7. Parametr ten dla wszystkich badanych związków wykazuje wartość w granicach (33,8 – 61,2 mV/µg) i rośnie wraz ze wzrostem zawartości buforu w fazie ruchomej. W przypadku wszystkich związków eluowanych przy wysokim stężeniu buforu zaobserwowałem znaczące obniżenie LOD i LOQ. Szczególnie widoczne jest to w przypadku PC, gdzie parametry te obniżyły się ponad dziesięciokrotnie. Na wartość tych parametrów mógł mieć wpływ również wzrost przepływu fazy ruchomej. Odpowiedź detektora CAD rośnie wraz ze wzrostem wartości przepływu fazy ruchomej [243]. Natomiast dla PE i LPE eluowanych przy niższej zawartości buforu wartości granicy wykrywalności oraz oznaczalności wzrosły dwukrotnie w porównaniu do metody 2.1. Tabela 7. Czułość (S), granica wykrywalności (LOD) i granica oznaczalności (LOQ) substancji wzorcowych dla detektora CAD. a b Związek S (mV/µg) (abxb-1)a LOD (ng) (3,3 x σ/S)b LOQ (ng) (10 x σ/S)b PE 33,8 35,1 106,5 LPE 43,1 19,5 59,0 PC 61,2 5,0 15,2 LPC 55,9 28,8 87,3 SM 58,2 33,2 100,6 a,b – parametry uzyskane z modelu potęgowego; x – stężenie analizowanej substancji σ – odchylenie standardowe odpowiedzi 83 Precyzja. W celu oznaczenia precyzji systemu HPLC, a także powtarzalności nastrzyków przeprowadziłem dziesięciokrotny nastrzyk pojedynczego roztworu badanego związku w warunkach przedstawionych powyżej. Do tego celu użyłem roztwory substancji wzorcowych o zbliżonej masie. Powtarzalność metody określiłem na podstawie czasów retencji i pól powierzchni uzyskanych pików (Tabela 8). Metoda wykazywała wysoką powtarzalność zarówno czasów retencji (%RSD = 0,276 – 0,582) jak i pól powierzchni (%RSD = 0,546 – 1,573). Uzyskana poprawa precyzji procesu była głównym celem modyfikacji metody 2.1. Tabela 8. Powtarzalność odpowiedzi detektora CAD i czasów retencji substancji wzorcowych. Związek Ilość (µg) Powierzchnia piku (mV/min) Średnia SD RSD% Czas retencji (min) Średnia SD RSD% PE 0,25 7,802 0,067 0,854 3,821 0,022 0,566 LPE 0,43 17,822 0,097 0,546 5,399 0,031 0,582 PC 0,39 16,736 0,250 1,497 6,682 0,032 0,477 LPC 0,32 12,151 0,191 1,573 7,920 0,025 0,315 SM 0,29 12,926 0,077 0,596 7,080 0,019 0,276 3.1.3.2.3 Opracowanie metody analizy lipidów niepolarnych z żółtka jaja kurzego za pomocą HPLC (metoda 2,3) Po opracowaniu metody analizy lipidów polarnych przystąpiłem do opracowywania metody analizy frakcji lipidów niepolarnych. Do rozdziału triacylogliceroli oraz cholesterolu postanowiłem zastosować kolumnę diolową. Diolowa faza stała była również stosowana przez innych autorów nie tylko do rozdziału fosfolipidów ale również lipidów niepolarnych [279]. Dodatkowo sprawdziłem także możliwość wykorzystania opracowanej metody do analizy barwnika żółtka jaja czyli luteiny w próbkach przygotowanych według metody SPE przedstawionej w poprzednim rozdziale (rozdz. 3,1,3). W celu doboru odpowiednich warunków rozdziału przygotowałem mieszaninę trzech substancji wzorcowych (cholesterolu, tripalmitynianu gliceryny oraz luteiny). Jako fazę stałą zastosowałem kolumnę diolową natomiast jako fazę ruchomą układ heksan : propan-2-ol (90:10 v/v). Detekcje rozdzielanych 84 związków przeprowadziłem za pomocą detektora CAD. Przykładowy chromatogram badanych substancji wzorcowych przedstawiony jest na Rys. 10. Rys. 10. Chromatogram mieszaniny wzorców lipidów niepolarnych z żółtka jaja kurzego oraz stosowany program elucji izokratycznej ( Heksan : Propan-2-ol 90:10; 1 ml/min). Kolumna: Thermo Betasil DIOL 5µm (150 x 4,6 mm); temperatura kolumny: 20°C. Model odpowiedzi detektora. Krzywe kalibracyjne sporządziłem analizując następujące mieszaniny wzorców: TriPal (0,02-1,44µg), cholesterol (0,01-0,69µg), luteina (0,04-0,48µg). Przygotowałem sześć różnych stężeń każdego związku oraz przeprowadziłem trzykrotny nastrzyk każdej mieszaniny. W celu opisu odpowiedzi detektora zastosowałem dwie funkcje: liniową (y=a+bx) oraz potęgową (y=axb). Porównując wartości R2 oraz AICc obliczone dla obu wariantów wybrałem model potęgowy jako najlepiej opisujący odpowiedź detektora. Porównanie modeli odpowiedzi liniowej i potęgowej dla detektora CAD przedstawione są w Tabeli 9. Tabela 9. Krzywe kalibracyjne CAD-HPLC PLs Zakres (µg) Model potęgowy (y=axb) Równanie R2 37,291(±0,56)x0,788(±0,01) 0,9982 Model liniowy (y=bx+a) AICC Równanie R2 AICC -9,828 33,236 (±0,27)x+3,461(±0,16) 0,9841 32,036 TriPal 0,02-1,44 Chol 0,01-0,69 53,868(±1,95)x0,884(±0,02) 0,9983 -19,615 55,513 (±0,98)x+1,227(±0,08) 0,9938 5,222 Lut 0,04-0,48 50,677(±0,09)x0,953(±0,00) 0,9994 -63,661 51,977(±0,22)x+0,392(±0,03) 0,9989 -52,162 85 Czułość (S), granica wykrywalności (LOD) oraz granica oznaczalności (LOQ). S, LOD i LOQ dla każdego ze związków przedstawione są w Tabeli 10. Najniższe granice wykrywalności i oznaczalności o wartościach odpowiednio 5,4 ng oraz 16,5 ng związku naniesionego na kolumnę obserwowałem w przypadku luteiny. Tabela 10. Czułość (S), granica wykrywalności (LOD) i granica oznaczalności (LOQ) substancji wzorcowych lipidów niepolarnych dla detektora CAD. a b Związek S (mV/µg) (abxb-1)a LOD (ng) (3,3 x σ/S)b LOQ (ng) (10 x σ/S)b TriPal 51,3 35,7 108,1 Chol 62,9 102,3 310,0 Lut 55,0 5,4 16,5 a,b – parametry uzyskane z modelu potęgowego; x – stężenie analizowanej substancji σ – odchylenie standardowe odpowiedzi Obserwowałem również wysoką precyzję i powtarzalność metody określonych na podstawie czasów retencji (%RSD=0,927-1,329) i pól powierzchni (%RSD=0,341-0,790) uzyskanych pików. Parametry te wyznaczyłem poprzez dziesięciokrotny nastrzyk pojedynczego roztworu każdego badanego związku (Tabela 11) Tabela 11. Powtarzalność odpowiedzi detektora CAD i czasów retencji substancji wzorcowych lipidów niepolarnych żółtka jaja kurzego. Związek Ilość (µg) Powierzchnia piku (mV/min) Średnia SD RSD% Czas retencji (min) Średnia SD RSD% TAG 0,38 17,694 0,139 0,790 1,958 0,019 0,962 Chol 0,18 11,988 0,040 0,346 3,026 0,031 0,927 Lut 0,28 15,394 0,052 0,341 5,157 0,068 1,329 86 3.1.4 Określenie profilu lipidowego żółtka jaja kurzego Opracowaną procedurę ekstrakcji SPE jak i metody analizy lipidów polarnych (metoda 2,2) oraz niepolarnych (metoda 2,3) za pomocą HPLC zastosowałem do oznaczenia profilu lipidowego żółtka jaja kurzego. Wszystkie klasy lipidów obecne w żółtku jaja kurzego były bardzo dobrze rozdzielone w stosowanych metodach wysokosprawnej chromatografii cieczowej. Analizowane związki występowały jako pojedyncze piki bez widocznych podziałów na frakcje różniące się składem kwasów tłuszczowych (Rys. 11). Rys. 11. Chromatogramy CAD-HPLC lipidów polarnych i niepolarnych żółtka jaja kurzego (szczegółowy opis poszczególnych zastosowanych metod HPLC przedstawiono w tekście). Kolumna: Thermo Betasil DIOL 5µm (150 x 4,6 mm); temperatura kolumny: 20°C. Analiza wykazała, iż fosfolipidami występującymi w żółtku jaja kurzego są PE, PC, SM oraz LPC. Natomiast frakcja lipidów niepolarnych to głównie triacyloglicerole wraz z niewielkimi ilościami cholesterolu. Frakcje lipidów polarnych oraz niepolarnych stanowią odpowiednio 51,9% oraz 48,1% całkowitej ilości lipidów w żółtku. Szczegółowe wyniki pełnej analizy frakcji lipidowej żółtka przedstawione są w Tabeli 12. Analizę wykonałem w trzech powtórzeniach. Powtarzalność procesu przedstawione są za pomocą wartości %RSD. Uzyskane wyniki są zgodne z danymi literaturowymi [279]. Przedstawiona metodologia nie umożliwia jednak analizy barwnika żółtka jaja czyli luteiny. Związane jest to prawdopodobnie z tym, iż do wydajnej ekstrakcji tego związku chemicznego wymagany jest etap hydrolizy estrów luteiny jak również uwolnienia jej z kompleksów z glicerydami, fosfolipidami i sterolami [294]. Dlatego w celu analizy luteiny w żółtku wymagana jest modyfikacja przedstawionego w pracy procesu ekstrakcji. 87 Tabela 12. Skład frakcji lipidowej z żółtka jaja kurzego (n=3) Lipidy a % SD %RSD 30,57 0,45 1,47 Lipidy niepolarneb 48,06 0,85 1,77 Triacyloglicerole 44,0 1,03 2,27 Cholesterol 4,06 0,31 7,39 - - - b 51,94 0,85 1,64 Fosfatydyloetanoloamina (PE) 6,50 0,18 2,78 - - - Fosfatydylocholina (PC) 43,78 0,66 1,52 Lizofosfatydylocholina (LPC) 0,79 0,06 7,24 Sfingomielina (SM) 0,93 0,02 2,59 Luteina Lipidy polarne Lizofosfatydyloetanoloamina (LPE) a b w odniesieniu do masy surowego żółtka; w odniesieniu do całkowitej zawartości lipidów 3.1.5 Analiza fosfolipidów w mleku i produktach mlecznych za pomocą HPLC (metoda 3) Przedstawiona w poprzednim rozdziale metoda analizy PLs z żółtka jaja kurzego (metoda 2,1) umożliwia analizę nie tylko PE, PC, SM, LPE, LPC ale również po niewielkiej modyfikacji analizę profilu fosfolipidowego w produktach mlecznych. W produktach tych oprócz wymienionych fosfolipidów występują dodatkowo m.in. fosfatydyloseryna (PS) oraz fosfatydyloinozytol (PI). Rosnące zainteresowanie lipidami polarnymi z produktów pochodzenia zwierzęcego (głównie mleka) związane jest z wysoką zawartością sfingolipidów wykazujących aktywność przeciwnowotworową, bakteriostatyczną oraz obniżania poziomu cholesterolu [295]. Jako metodę ekstrakcji lipidów zastosowałem metodę Folcha [1]. Stosowana tu mieszanina rozpuszczalnika niepolarnego i polarnego jest niezbędna w celu całkowitej ekstrakcji fosfolipidów. Dodatek rozpuszczalnika polarnego (najczęściej alkohol) jest niezbędny w celu uwolnienia lipidów polarnych ze struktur otoczek kuleczek tłuszczowych MFGM (ang. milk fat globule membrane). Jego działanie polega na dehydratacji i denaturacji białek oraz niszczeniu wiązań wodorowych pomiędzy białkami i lipidami. Ujemnym skutkiem stosowania rozpuszczalnika polarnego jest dodatkowa ekstrakcja związków nielipidowych, co wiąże się z błędami podczas np. Wagowego oznaczania lipidów uzyskanych w procesie ekstrakcji czy też ilościowego oznaczania fosfolipidów poprzez kolorymetryczne oznaczenie zawartości fosforu [295]. W przypadku analizy fosfolipidów za pomocą wysokosprawnej chromatografii cieczowej ze względu na niewielką zawartość fosfolipidów w mleku (3,6–479,5 mg/100 g produktu, 0,01–2,19% suchej masy oraz 0,1– 24,7% frakcji lipidowej) [281, 295, 296] przed analizą konieczny jest etap zatężania frakcji 88 fosfolipidowej. W tym celu zastosowałem modyfikacje metodologii SPE opisanej w rozdziale 3.1.3. Zmiana ta polegała na wykorzystaniu jako eluentu końcowego mieszaniny CHCl3 : MeOH : H2O (3:5:2 v/v/v) zamiast metanolu, co powodowało praktycznie całkowity odzysk fosfolipidów (ponad 95%). Odzyski poszczególnych grup lipidów po procesie oczyszczania za pomocą ekstrakcji do fazy stałej (SPE) przedstawione są w Tabeli 13. Procentowy odzysk określiłem za pomocą HPLC poprzez porównanie pól powierzchni poszczególnych klas fosfolipidów przed i po procesie rozdziału za pomocą SPE. Elucja jedynie metanolem zapewnia tylko 60% odzysk fosfolipidów. Związane jest to z faktem iż polarne fosfolipidy silnie oddziałują ze złożem krzemionkowym na zasadzie oddziaływań typu dipol-dipol oraz tworzenia wiązań wodorowych. Dlatego do ich elucji wymagana jest mieszanina rozpuszczalników o wysokiej polarności (sile elucji) [56]. Tabela 13. Odzysk fosfolipidów określony poprzez porównanie pól powierzchni pików uzyskanych poprzez bezpośrednią analizę wzorcowej mieszaniny fosfolipidów oraz fosfolipidów oczyszczonych z frakcji lipidowej mleka za pomocą SPE (n=6). PS PE PI PC SM Średnia 10,81 68,21 7,98 50,56 28,25 SD 0,50 0,91 0,42 0,46 1,12 %RSD 4,60 1,34 5,23 0,91 3,98 Oczyszczanie Średnia 10,30 66,37 8,19 50,83 28,19 za pomocą SD 0,34 0,87 0,30 1,07 0,77 SPE %RSD 3,26 1,30 3,71 2,10 2,74 Odzysk 95,3% 97,3% 102,6% 100,5% 99,8% Bezpośrednia analiza 89 Schemat ekstrakcji oraz rozdziału lipidów mleka przedstawiony jest na Schemacie 2. Schemat 2. Ogólny schemat ekstrakcji i rozdziału lipidów mleka (metoda 3). Otrzymaną frakcje fosfolipidów analizowałem za pomocą HPLC. Mimo znanych różnic w profilu fosfolipidowym mleka oraz żółtka jaja kurzego początkowo sprawdziłem możliwość zastosowania metodologii opracowanej do analizy PLs z żółtka jaja kurzego (metoda 2,2). W tym celu przygotowałem mieszaniny wzorców fosfolipidów występujących w mleku tj. PC PE SM PS PI i przeprowadziłem analizę. Uzyskany chromatogram wraz z programem elucji przedstawiony jest na Rys. 12. Rys. 12. Chromatogram CAD-HPLC mieszaniny wzorców fosfolipidów z mleka uzyskany po zastosowaniu metody analizy PLs z żółtka jaja kurzego (metoda 2,1)(A: bufor (1% HCOOH, 0,1% TEA), B: Heksan, C: Propan-2ol). Kolumna: Thermo Betasil DIOL 5µm (150 x 4,6 mm); temperatura kolumny: 20°C. 90 Ze względu na nakładanie się pików PS, PC oraz PI zastosowana metodologia nie może być stosowana w analizie fosfolipidów w mleku i produktach mlecznych. Interesujących informacji dostarczyła jednak analiza syntetycznych fosfolipidów (PS i PC), z jednym określonym rodzajem reszt acylowych w pozycji sn-1 jak i sn-2 cząsteczki. W przypadku tych związków obserwowałem dobry rozdział nawet przy zastosowaniu programu elucji który uniemożliwiał analizę tych samych fosfolipidów pochodzenia naturalnego (różny skład reszt acylowych). Przykładowy chromatogram z analizy składu mieszaniny reakcyjnej podczas enzymatycznej syntezy PS zaprezentowany jest na Rysunku 13. Oprócz dipalmitoilofosfatydyloseryny (DPPS) oraz dipalmitoilofosfatydylocholiny (DPPC) w mieszaninie reakcyjnej obserwowano również obecność substratu reakcji transfosfatydylacji fosfatydylocholiny tj. seryny jak i produktu enzymatycznej hydrolizy DPPC czyli kwasu dipalmitoilofosfatydowego (DPPA). Rys. 13. Chromatogramy mieszanin reakcyjnych podczas chemo-enzymatycznej syntezy fosfatydyloseryna (szczegółowy opis w tekście). Kolumna: Thermo Betasil DIOL 5µm (150 x 4,6 mm); temperatura kolumny: 20°C. Kolejnym etapem opracowywania właściwej metodologii do analizy fosfolipidów w mleku było zastąpienie diolowej fazy stałej niemodyfikowaną krzemionką. W tym przypadku zaobserwowałem polepszenie rozdziału analizowanych związków. Jednak nadal piki od PC, PS oraz PI częściowo się nakładały (Rys. 14). 91 Rys. 14. Chromatogram CAD-HPLC mieszaniny wzorców fosfolipidów z mleka uzyskany po zastosowaniu metodyki analizy PLs z żółtka jaja kurzego (metoda 2,1) oraz zastosowaniu kolumny z krzemionkową fazą stałą (A: bufor (1% HCOOH, 0,1% TEA), B: Heksan, C: Propan-2-ol). Kolumna: Waters Spherisorb® S5W 5 µm (150 x 4,6 mm); temperatura kolumny: 20°C. Mimo obiecującego wstępnego rozdziału fosfolipidów, nie udało się uzyskać satysfakcjonującej rozdzielczości. Dużym ograniczeniem podczas opracowywania właściwej metodologii było wysoka niestabilność linii podstawowej nawet przy niewielkich modyfikacjach gradientu, składu eluentów czy temperatury. Już sama zmiana diolowej fazy stacjonarnej na krzemionkową powodowała wzrost linii podstawowej z 23 do 49mV. Wzrost sygnału linii podstawowej związany jest z możliwością rozpuszczania krzemionki w eluentach wodnych co skutkuje ujściem fazy stacjonarnej z kolumny. W przypadku kolumny diolowej za wyższą stabilność złoża odpowiada obecność dodatkowej fazy chemicznej związanej z nośnikiem (krzemionką) [276]. Wzrost sygnału linii podstawowej był szczególnie widoczny w przypadku zwiększania temperatury kolumny. Wraz ze wzrostem temperatury znacznie zwiększała się niestabilność linii podstawowej szczególnie w przypadku zastosowanej kolumny z niemodyfikowaną krzemionką (Waters Spherisorb® S5W) (Rys. 15). 92 Rys. 15. Wpływ temperatury na stabilność linii podstawowej. Analizowana próbka: mieszanina PI, PE i PA z ziaren soi Glycine max. Kolejną wadą stosowania kolumny krzemionkowej był dwukrotnie dłuższy, w porównaniu do kolumny ze złożem diolowym, czas stabilizacji fazy stałej do warunków wyjściowych podczas stosowanej elucji gradientowej. W celu zapewnienia stabilności oraz powtarzalności analiz do dalszych badań mimo wstępnego gorszego rozdziału fosfolipidów zastosowałem kolumnę ze złożem diolowym. Punktem wyjścia przy opracowywaniu właściwej metodyki był program elucji stosowany do rozdziału lipidów polarnych żółtka jaja (metoda 2,1). Mimo wielu prób modyfikacji programu elucji m.in. Zmniejszenie narostu gradientu czy też zmiana siły elucji końcowego eluentu nie udało się uzyskać zadowalającego podziału fosfolipidów przy zastosowaniu mieszanin heksanu , propan-2-olu oraz buforu. W kolejnym etapie postanowiłem więc zbadać wpływ pH na rozdział. Większość metod chromatograficznego rozdziału fosfolipidów w produktach pochodzenia zwierzęcego opiera się na metodzie zaproponowanej przez Becarta i wsp. [297], w której jako bufor zastosowano roztwory trietyloaminy lub wodorotlenek amonu oraz kolumnę z niemodyfikowaną krzemionką [56, 295, 298]. Jednakże mimo dobrych rozdziałów metoda ta ze względu na stosowanie pH>7 znacznie skraca żywotność i sprawność kolumn chromatograficznych poprzez rozpuszczanie złoża krzemionkowego. Modyfikacja tej metody została zaproponowana przez Rombauta i wsp. [281, 295, 296]. W tej metodologii wodorotlenek amonu został zastąpiony buforem trietyloamina : kwas 93 mrówkowy o pH 3. Uzyskano w ten sposób nie tylko bardzo dobry rozdział fosfolipidów ale również znacznie zwiększono żywotność kolumny do ok. 1500 cykli. Jednakże przedstawione metody nie były możliwe do zastosowania w przypadku detektora CAD. Zbyt duża ilość regulatorów pH stosowanych w metodzie powodowała drastyczny wzrost sygnału detektora uniemożliwiając przeprowadzenie analiz. Zjawisko wpływu dodatków do fazy ruchomej na czułość CAD zostało zaobserwowane również przez innych autorów [299, 300]. Dlatego w przypadku detektora CAD wymagana była optymalizacja metodologii nie tylko pod kątem wartości pH eluentu ale również ilości dodanego regulatora pH. Z tego powodu przy opracowywaniu optymalnego składu eluentu zrezygnowałem z trietyloaminy wykorzystując jedynie kwas mrówkowy. Do rozdziału zastosowałem identyczny do stosowanego w metodzie 2,1 gradient, jednak zamiast buforu (1% HCOOH, 0,1% TEA) zastosowałem 13% roztwór kwasu mrówkowego. Uzyskany chromatogram rozdziału wzorców fosfolipidów z mleka za pomocą zmodyfikowanej metody przedstawiony jest na Rys. 16. Aby zaprezentować wpływ dodatku kwasu mrówkowego na rozdział badanych fosfolipidów uzyskany chromatogram porównałem z chromatogramem otrzymanym przy zastosowaniu analogicznej metody stosowanej do rozdziału fosfolipidów mleka (z buforem zawierającym 1% HCOOH oraz 0,1% TEA). Rys. 16. Wpływ dodatku kwasu mrówkowego na rozdział fosfolipidów z mleka (A: 13% HCOOH lub bufor (1%HCOOH, 0,1% TEA), B: Heksan, C: Propan-2-ol). Kolumna: Thermo Betasil DIOL 5 µm (150 x 4,6 mm); temperatura kolumny: 20°C. Dodatkową modyfikacją w stosunku do metody oznaczania fosfolipidów w żółtku jaja kurzego była również redukcja przepływu do wartości 1 ml/min. Spowodowane to było 94 koniecznością obniżenia zbyt wysokiego ciśnienia wstecznego w kolumnie (powyżej 180 barów (2600 psi)) obserwowanego przy przepływie 1,5 ml/min. Modyfikacja tego parametru przyczyniła się do obniżenia ciśnienia do ok. 150 barów (2175 psi). Skutkiem tego były również znaczące zmiany rozdziałów fosfolipidów. Na Rys. 17 przedstawiony jest wpływ zmiany natężenia przepływu na rozdział lizofosfatydylocholiny. Pojedynczy pik LPC występujący przy przepływie fazy ruchomej o wartości 1,5 ml/min dzieli się na dwa piki przy zmniejszeniu tego parametru do 1 ml/min. Na przedstawionych chromatogramach widoczny jest również wpływ dodatku regulatora pH na stabilność linii podstawowej. Wraz ze wzrostem ilości kwasu w eluencie sygnał linii podstawowej rośnie. Rys. 17. Wpływ zmiany przepływu eluentu oraz dodatku kwasu mrówkowego na rozdział, czas retencji lizofosfatydylocholiny (LPC) oraz odpowiedź detektora CAD (szczegółowy opis w tekście). Kolumna: Thermo Betasil DIOL 5 µm (150 x 4,6 mm); temperatura kolumny: 20°C. Po wstępnej analizie przeprowadzonych modyfikacji wyjściowego programu elucji wybrano optymalne warunki analizy fosfolipidów mleka: tj. kolumna z diolową fazą stałą, przepływ 1,0 ml/min, temperatura kolumny 20°C, 13% roztwór HCOOH jako eluent A. Całkowity czas analizy to 22 minut w tym 10 minut stabilizacji fazy stałej kolumny do warunków wyjściowych. W dalszej części badań przeprowadzołem walidacje opracowanej metodologii. Model odpowiedzi detektora. Wzorcowe mieszaniny fosfolipidów mleka przygotowałem standardowo w eluencie chloroform : metanol (2:1, v/v). Krzywe kalibracyjne każdego analizowanego związku obliczyłem na podstawie wysokości pików uzyskanych poprzez nastrzyk 10 µl roztworów substancji wzorcowych. Analizowałem następujące mieszaniny 95 wzorców: PS (0,02-1,66 µg), PE (0,01-1,57 µg), PI (0,03-2,00 µg), PC (0,03-2,16 µg), SM (0,031,99 µg). Przygotowałem sześć różnych stężeń każdego związku oraz przeprowadziłem trzykrotny nastrzyk każdej mieszaniny wzorców. Do określenia związku pomiędzy ilością poszczególnych substancji wzorcowych, a odpowiedzią detektora CAD (wysokość piku) zastosowałem funkcje liniową oraz potęgową. Porównanie modeli odpowiedzi liniowej i potęgowej dla detektora CAD przedstawione są w Tabeli 14. Analiza wartości współczynników korelacji (R2) jak i kryterium informacyjnego Akaikego (AICc) wykazała, iż w przypadku wszystkich fosfolipidów model potęgowy lepiej opisuje odpowiedź detektora. Tabela 14. Krzywe kalibracyjne HPLC/CAD PLs Zakres (µg) Model potęgowy (y=axb) Model liniowy (y=bx+a) Równanie R2 AICC Równanie R2 AICC 173,11(±0,89)x1,067(±0,01) 0,9993 46,812 180,67 (±1,28)x-5,241(±1,14) 0,9990 53,534 PS 0,02-1,66 PE 0,02-1,57 204,04(±0,82)x0,961(±0,01) 0,9994 45,353 200,64 (±1,45)x+1,979(±1,22) 0,9990 56,291 PI 0,03-2,00 261,22(±1,07)x0,867(±0,01) 0,9984 81,769 237,09(±1,33)x+13,283(±0,62) 0,9937 109,687 151,65(±0,88)x0,916(±0,01) 0,9994 45,466 0,9977 72,196 0,9982 86,511 0,9888 123,042 PC SM 0,03-2,16 0,03-1,99 286,42(±0,60)x0,813(±0,01) 141,87 (±1,57)x+5,136(±1,81) 248,81(±1,14)x+21,986(±0,88) Czułość (S), granica wykrywalności (LOD) oraz granica oznaczalności (LOQ). Ze względu na wybór modelu potęgowego odpowiedzi detektora CAD czułość została obliczona jako pochodna funkcji potęgowej (S=abxb-1) dla najniższego stężenia użytego w doświadczeniu. Wartości czułości przedstawione są w Tabeli 15. Tabela 15. Czułość (S), granica wykrywalności (LOD) i granica oznaczalności (LOQ) substancji wzorcowych dla detektora CAD. Związek Ilość nastrzykniętego związku (µg) PS 0,02 142,1 20,7 62,6 PE 0, 02 228,4 11,8 35,9 PI 0,03 361,0 9,8 29,6 PC 0,03 186,5 15,6 47,2 SM 0,03 448,6 4,4 13,4 S (mV/µg) LOD (ng) LOQ (ng) (abxb-1)a (3,3 x σ/S)b (10 x σ/S)b a a,b – parametry uzyskane z modelu potęgowego; x – stężenie analizowanej substancji b σ – odchylenie standardowe odpowiedzi; 96 Wartości czułości detektora wzrastały wraz ze wzrostem czasu retencji analizowanych związków co równoważne jest ze wzrostem stężenia wody w eluencie. Wyjątkiem jest tu fosfatydylocholina (PC) dla której czułość odpowiedzi detektora odbiega od tej zasady. Tendencji tej odpowiadają również wartości LOQ i LOD które malały wraz ze wzrostem czasów retencji analizowanych fosfolipidów. Zjawisko to było w pewnym sensie zaskoczeniem dla mnie, gdyż w literaturze [241, 247, 301, 302] opisywane są tendencje odwrotne tzn. Wzrost sygnału i czułości obserwowany jest gdy związek jest eluowany w fazie ruchomej o wysokim stężeniu rozpuszczalników organicznych. Odpowiedzi detektorów aerozolowych można zwiększyć poprzez zastosowanie dodatku TEA-kwasu mrówkowego do fazy ruchomej, co zostało szczegółowo przedstawione w poprzednich rozdziałach. Ostatnio jednak pojawiły się badania Novakowa i wsp. [300] potwierdzające uzyskane w poniższej pracy wyniki. Cytowani autorzy potwierdzili fakt wzrostu odpowiedzi detektora CAD wraz ze wzrostem stężenia kwasu mrówkowego w eluencie. Wzrost ten jednak był obserwowany jedynie w określonym zakresie stężeń tego kwasu. Precyzja. Precyzje systemu HPLC określiłem poprzez dziesięciokrotny nastrzyk pojedynczego roztworu badanego związku. Do tego celu użyłem roztwory substancji wzorcowych o zbliżonej masie. Powtarzalność metody określiłem na podstawie czasów retencji i wysokości uzyskanych pików (Tabela 16). Tabela 16. Powtarzalność odpowiedzi detektora CAD i czasów retencji substancji wzorcowych. Związek Ilość (µg) Wysokość piku (mV) Średnia SD RSD% Czas retencji (min) Średnia SD RSD% PS 0,4 65,266 0,17 0,27 4,635 0,03 0,77 PE 0,4 81,986 0,25 0,31 5,276 0,01 0,40 PI 0,5 141,47 0,87 0,61 6,625 0,01 0,14 PC 0,5 85,440 0,40 0,47 7,880 0,01 0,14 SM 0,5 162,79 0,80 0,49 8,309 0,01 0,13 97 Miarą powtarzalności systemu HPLC było względne odchylenie standardowe (%RSD). Wartości uzyskane w czasie analiz wskazują, iż stosowany system HPLC wykazuje wysoką powtarzalność. Dla średnich czasów retencji wszystkie wartości %RSD były niższe od 0,77. Również %RSD dla wysokości pików były poniżej wartości 0,61. 3.1.5.1 Analiza ilościowa fosfolipidów w mleku krowim Opracowana metoda analityczna została zastosowana do określenia profilu fosfolipidowego w mleku krowim. Przykładowy chromatogram uzyskany podczas analizy frakcji fosfolipidowej po procesie oczyszczania za pomocą SPE przedstawiony jest na Rys. 18. Rys. 18. Chromatogram frakcji fosfolipidowej mleka po procesie ekstrakcji do fazy stałej (SPE). Kolumna: Thermo Betasil DIOL 5µm (150 x 4,6 mm); temperatura kolumny: 20°C. Próbki mleka dostarczone była przez Katedrę Żywienia Zwierząt i Paszoznawstwa Uniwersytetu Rolniczego w Krakowie. Zawartość fosfolipidów w otrzymanych próbkach wynosiła od 24,3 do 31,3 mg/100 ml mleka (Tabela 17). Tabela 17. Wyniki ilościowej analizy fosfolipidów w mleku krowim (n=3). Próbka 1 2 3 4 Średnia SD %RSD Średnia SD %RSD Średnia SD %RSD Średnia SD %RSD 24.35 1.00 4.11 22.74 0.67 2.95 25.04 1.97 7.87 31.34 0.94 2.97 PS (%)a 8.60 0.20 2.32 8.19 0.30 3.66 8.46 0.73 8.63 8.06 0.61 7.87 PE (%)a 34.19 0.37 1.08 29.93 1.89 6.31 32.99 0.93 2.82 33.41 0.61 1.82 PI (%)a 7.69 0.35 4.55 11.49 0.52 4.52 7.91 0.07 0.88 10.28 0.21 2.04 PC (%)a 45.46 0.32 0.70 46.36 1.51 3.26 46.17 1.15 2.49 43.19 0.64 1.48 4.06 0.48 11.82 4.02 0.28 6.96 4.46 0.05 1.12 5.06 0.13 2.57 PLs (mg/100mL mleka SM (%) a a procentowy udział związku we frakcji fosfolipidowej 98 W analizowanej frakcji lipidów polarnych dominującymi związkami były PC i PE stanowiących odpowiednio 46,17% oraz 32,99% wszystkich oznaczonych lipidów polarnych. Stosunek tych dwóch fosfolipidów odbiega nieco od wartości literaturowych [295, 296], w których dominującym fosfolipidem jest PE. Na chromatogramie obecne są również dodatkowe niezidentyfikowane piki. Można przypuszczać iż pochodzą one od glukozyloceramidu (GluCer) lub laktozyloceramidu (LacCer) identyfikowanych przez innych autorów we frakcji lipidów polarnych mleka, a należących obok SM do grupy sfingolipidów [295, 296]. Początkowe piki o czasach retencji do 2,5 min pochodzą prawdopodobnie od pozostałości lipidów niepolarnych tj. triacylogliceroli (TAG), diacylogliceroli (DAG), monoacylogliceroli (MAG), wolnych kwasów tłuszczowych oraz cholesterolu i jego estrów, które są głównymi składnikami frakcji lipidów niepolarnych w mleku [39]. W Tabeli 17 przedstawiono również wartości odchyleń standardowych z czterokrotnej analizy dostarczonej próbki. Uzyskane wyniki świadczą o wysokiej powtarzalności opracowanej metodologii. 3.2 OKREŚLENIE PROFILU KWASÓW TŁUSZCZOWYCH LIPIDÓW ŻÓŁTKA JAJA KURZEGO Po oznaczeniu ilościowym lipidów żółtka jaja kurzego przystąpiłem do dalszych bardziej szczegółowych analiz dotyczących tej grupy związków. Jednym z pierwszych zadań było oznaczenie, które kwasy tłuszczowe wchodzą w skład danego lipidu oraz jakie pozycje zajmują w cząsteczce. Aby zrealizować te zadania konieczne okazało się opracowanie metody otrzymywania czystych frakcji poszczególnych lipidów. Na Schemacie 3 przedstawiono ogólną metodykę rozdziału lipidów żółtka jaja kurzego na poszczególne grupy oraz ich analizę pod kątem składu kwasów tłuszczowych i analizy pozycyjnej. Badania przeprowadziłem stosując jako materiał wyjściowy ekstrakty lipidowe żółtka uzyskane metodą Folcha [1]. Rozdział przeprowadzono za pomocą ekstrakcji do fazy stałej (SPE) z użyciem kolumienek krzemionkowych. Stosowano różne ilości wyjściowych ekstraktów lipidowych w zależności od tego czy głównym celem była analiza ogólna (50mg) czy tez pozycyjna (100mg) składu kwasów tłuszczowych w cząsteczkach badanych lipidów. Szczegółowe opisy przedstawionego schematu znajduje się w dalszej części tego rozdziału. 99 Schemat 3. Ogólny schemat rozdziału lipidów żółtka jaja kurzego na poszczególne grupy wraz z analizą składu kwasów tłuszczowych. 3.2.1 Rozdział lipidów żółtka jaja kurzego na poszczególne grupy za pomocą SPE W celu określenia profilu kwasów tłuszczowych poszczególnych lipidów niezbędna okazała się metoda ich rozdziału na poszczególne grupy. Jedną z metod bardzo często stosowaną do ich rozdziału jest chromatografia kolumnowa. Jako eluent stosuje się tu mieszaninę chloroform : metanol : woda (65:25:4 v/v/v) [303]. Zastosowanie tej techniki jest szczególnie przydatne w celu otrzymania dużych ilości czystych grup lipidów. Jednak do celów analitycznych wymagane są metody, które będą szybkie i nie wymagające dużej ilości poszczególnych związków w celu przeprowadzenia określonej analizy. Najdogodniejszą metodą okazała się ekstrakcja do fazy stałej, dzięki której posiadając jedynie 50-100 miligramów mieszaniny lipidów uzyskanych na drodze ekstrakcji metoda Folcha [1] można przeprowadzić w krótkim czasie pełną analizę poszczególnych grup lipidów żółtka jaja kurzego. Sam proces rozdziału wymaga użycia jedynie 35 ml rozpuszczalników i około 10 100 minut w celu przeprowadzenia całkowitego rozdziału lipidów na poszczególnie grupy. Jako fazę ruchomą zastosowano mieszaninę dwóch rozpuszczalników tj. metanolu i chloroformu. Rozdział przeprowadzono stosując trójstopniową elucje przedstawioną na schemacie 1 uzyskując 70,9 % oraz 64,5 % odzysk całkowity lipidów dla odpowiednio 50 i 100 mg wyjściowego ekstraktu. Podobne wartości odzysków lipidów za pomocą SPE z zastosowaniem kolumienek z niemodyfikowaną krzemionką były prezentowane przez innych autorów [62]. Wyniki dotyczące procesu oczyszczania wraz z ilością uzyskanych frakcji lipidowych przedstawione są w Tabeli 18. Najwyższe straty lipidów podczas procesu oczyszczania obserwowano w przypadku lipidów polarnych czyli fosfolipidów. Procedurę rozdziału przeprowadziłem w pięciu powtórzeniach dla każdego wariantu uzyskując wysoką powtarzalność wyników. W Tabeli 18 zamieszczone są również procentowe udziały poszczególnych grup lipidów uzyskanych za pomocą SPE w stosunku do całkowitej ilości wyjściowej frakcji lipidowej. Porównując te dane z wynikami uzyskanymi podczas analiz ilościowych tych samych próbek i przedstawionych w Tabeli 12 określiłem odzyski uzyskanych grup lipidów. Wraz ze wzrostem polarności związków oraz ilością ekstraktu początkowego naniesionego na kolumienkę obserwowałem spadek ich odzysków. Odzysk lipidów niepolarnych dla 50 oraz 100 mg wyjściowego ekstraktu wynosił odpowiednio 97,11% oraz 91,55% natomiast lipidów polarnych jedynie 47,74% (PC 50,71%, PE 62,61%) i 39,47% (PC 35,79%, PE 74,31). Niski poziom odzysku fosfolipidów związany jest z ich silnym oddziaływaniem z polarnym złożem krzemionkowym poprzez wiązania wodorowe i oddziaływania typu dipol-dipol. Dlatego zastosowanie metanolu jako eluentu nie prowadzi do całkowitej elucji tej grupy związków [56, 62]. Znacznie lepsze wyniki można uzyskać zwiększając polarność końcowego eluentu podczas elucji PC poprzez dodatek wody prowadzący do praktycznie całkowitego odzysku lipidów polarnych [56, 58]. Metoda ta została zaprezentowana w rozdziale dotyczącym analizy fosfolipidów w mleku (rozdz. 3.1.5). W metodzie tej rozdzielałem jedynie frakcje lipidów polarnych od niepolarnych i zastosowanie eluentu z wodą skutkowało całkowitym odzyskiem wszystkich fosfolipidów. Natomiast w prezentowanej powyżej metodologii zastosowałem system elucji umożliwiający selektywny rozdział fosfolipidów na poszczególne grupy. Dlatego jedyna możliwość podniesienia wartości sumarycznego odzysku lipidów polarnych występuje w ostatnim etapie elucji tj. elucji PC, gdzie można dodatkowo zastosować eluent z wodą. Prezentowana 101 powyżej metoda była wystarczająca do otrzymania odpowiedniej ilości czystych fosfolipidów, dając możliwość ich pełnej analizy pod kątem składu kwasów tłuszczowych. Zastosowanie metanolu przyspiesza również proces odparowywania rozpuszczalników w porównaniu do frakcji zawierających wodę przyczyniając się do oszczędności czasu podczas wykonywania analiz. Tabela 18. Odzysk poszczególnych grup lipidów żółtka jaja kurzego oczyszczanych za pomocą ekstrakcji do fazy stałej (SPE) (n=5) Frakcja Frakcja lipidów lipidowa niepolarnych (mg) 50 b Odzysk SD %RSD 23,30 44,00 (44,00%)a a b SD %RSD PE (mg) SD %RSD (mg) całkowity lipidów SD %RSD (%) 1,15 4,95 (46,67%)a 100 PC (mg) 10,1 0,17 1,71 (22,20%)a 1,73 3,94 15,67 (15,67%)a 2,03 0,06 2,84 70,9 2,39 3,36 0,29 5,97 64,5 2,29 3,55 (4,07%)a 0,58 3,68 4,83 (4,83%)a procentowy udział poszczególnych grup lipidów uzyskanych za pomocą SPE w stosunku do całkowitej ilości wyjściowej frakcji lipidowej cholesterol oraz triacyloglicerole 3.2.2 Analiza wolnych kwasów tłuszczowych za pomocą HPLC z detektorem CAD Pełna analiza frakcji lipidowych obejmuje zarówno ustalenie składu kwasów tłuszczowych jak i ich pozycji (sn-1 lub sn-2) w cząsteczce. Dotychczas w większości badań analizę taką przeprowadzano za pomocą chromatografii gazowej (GC) z detektorem FID. Pierwszym etapem tej analizy była hydroliza lipidów w 0,05M metanolowym roztworze NaOH, a następnie estryfikacja wolnych kwasów metanolem w reakcji katalizowanej BF3, która prowadziła do uzyskania lotnych estrów metylowych. Opracowana przeze mnie metoda analizy wolnych kwasów tłuszczowych za pomocą HPLC z detektorem CAD, umożliwia analizę tej grupy związków bez przeprowadzania ich w pochodne. Wymagany jest więc jedynie pierwszy etap tj. hydroliza lipidów do wolnych kwasów tłuszczowych. Metoda taka znacznie upraszcza analizę kwasów tłuszczowych. Eliminuje bowiem proces przeprowadzania kwasów tłuszczowych w ich pochodne w celu zwiększenia ich lotności czy też derywatyzacji do pochodnych zawierających grupy chromoforowe [304]. Otrzymywanie pochodnych kwasów tłuszczowych związane jest ze stosowaniem skomplikowanych praco- i czasochłonnych procedur. Unika się również niepożądanych procesów utleniania, czy też izomeryzacji podczas reakcji oraz wyższego 102 zużycia rozpuszczalników i odczynników. Wyeliminowanie procesu derywatyzacji jest możliwe jedynie w przypadku zastosowania odpowiednich detektorów. Obecnie w tym celu stosuje się najczęściej detektor ELSD oraz spektrometry masowe [304, 305]. W literaturze dotyczącej tego zagadnienia znalazłem tylko jedną pracę pokazującą możliwość stosowania detektora CAD do detekcji wolnych kwasów tłuszczowych [306]. Głównym celem tej części pracy było opracowanie prostej metody analizy kwasów tłuszczowych wchodzących w skład lipidów żółtka jaja kurzego. 3.2.2.1 Metoda analizy wolnych kwasów tłuszczowych za pomocą HPLC Do hydrolizy chemicznej lipidów zastosowałem 0,5M etanolowy roztwór NaOH. Stosowanie etanolu zamiast metanolu związane jest z możliwością występowania procesu estryfikacji wolnych kwasów tłuszczowych w przypadku zastosowania tego ostatniego. Stosując jako rozpuszczalnik 95% etanol wyeliminowano proces tworzenia się estrów etylowych kwasów tłuszczowych, które ze względu na wysoką lotność nie mogą być analizowane za pomocą detektora CAD. Rozdział chromatograficzny kwasów tłuszczowych prowadziłem za pomocą HPLC z zastosowaniem kolumny C18. Kolejność elucji, przy zastosowaniu tej metody, zależy nie tylko od długości łańcucha węglowego ale również od stopnia nienasycenia analizowanych kwasów, pozycji wiązania wielokrotnego oraz konfiguracji (cis/trans) wiązania podwójnego. Kolejność elucji, czy bardziej dokładnie siłę retencji kwasu tłuszczowego, w chromatografii cieczowej w odwróconym układzie faz (RP-LC) można przedstawić za pomocą tzw. Współczynnika ECL (ang. equivalent chain lengths) [111, 307]. Dla kwasu tłuszczowego składającego się z N atomów węgla i zawierającego w cząsteczce n wiązań podwójnych wartość ECL=N-2n. Oznacza to, wzrost siły retencji danego kwasu tłuszczowego, który powoduje wzrost wartości ECL. Ogólnie rzecz biorąc każde wiązanie podwójne powoduje redukcję czasu retencji równe skróceniu łańcucha węglowego kwasu nasyconego o około dwie grupy metylenowe [112]. Dlatego np. kwasy 16:1 i 18:2 charakteryzują się bardzo zbliżonymi czasami retencji tworząc tzw. „parę krytyczną”. Pierwszym etapem podczas opracowywania nowej metodyki rozdziału kwasów było wyznaczenie wśród analizowanych związków tzw. par krytycznych o podobnym lub identycznym współczynniku ECL. Było to ważne ze względu na wstępną selekcję grup 103 związków, które mogą stwarzać problemy przy doborze warunków rozdziału. Wszystkie analizowane kwasy tłuszczowe wraz z ich teoretycznymi wartościami ECL przedstawione są w Tabeli 19. Tabela 19. Współczynniki ECL oraz pary krytyczne analizowanych kwasów tłuszczowych. Teoretyczny współczynnik ECL Kwas tłuszczowy ECL wyznaczony doświadczalnie a (ECL=N-2n) Dokozaheksaenowy 22:6 (DHA) 10 13,3 Eikozapentaenowy 20:5 (EPA) 10 12,8 Linolenowy 18:3 12 13,2 Arachidonowy 20:4 12 14,0 Mirystynowy 14:0 14 14,0 Palmitooleinowy 16:1 14 14,0 Linolowy18:2 14 14,5 Palmitynowy 16:0 16 16,0 Oleinowy 18:1 16 15,9 Stearynowy 18:0 18 18,0 a b N- liczba atomów węgla; n – liczba wiązań podwójnych b Wyznaczono na podstawie regresji liniowej (Rys. 1) dla wariantu ACN 80%/30st.C Analizowane związki tworzą cztery grupy par krytycznych charakteryzujących się identycznymi teoretycznymi wartościami współczynnika ECL. W Tabeli 19 przedstawiono również wartości ECL kwasów nienasyconych, wyliczone na podstawie regresji liniowej wykresu przedstawionego na Rysunku 19. W literaturze, ECL kwasów nienasyconych jest liczony zwykle jedynie na podstawie retencji dwóch sąsiednich (przyległych) nasyconych kwasów tłuszczowych [307]. W przypadku liczenia ECL z regresji liniowej wartość ta przedstawia zmienność retencji poszczególnych kwasów nienasyconych w stosunku do całego szeregu homologicznego stosowanych kwasów nasyconych [111]. Otrzymane wartości ukazują pewne odstępstwa od teoretycznych założeń. Wraz ze wzrostem stopnia nienasycenia obserwuje się wzrost różnicy pomiędzy teoretycznymi i doświadczalnymi wartościami współczynnika ECL. Wartości te są porównywalne jedynie dla kwasów z pojedynczym wiązaniem podwójnym. Ze względu na dużą ilość par krytycznych spodziewałem się trudności podczas doboru odpowiednich warunków rozdziału analizowanych związków. W celu optymalizacji procesu rozdziału postanowiłem określić wpływ temperatury oraz rodzaju rozpuszczalnika 104 organicznego na rozdział kwasów tłuszczowych różniących się długością łańcucha węglowego oraz stopniem nienasycenia. Najbardziej znaczącym czynnikiem wpływającym na podział w procesach chromatograficznych jest wybór odpowiednio selektywnego układu faz tj. odpowiedniej fazy stałej oraz ruchomej [308]. Dlatego pierwszym etapem podczas opracowywania metody był wybór najbardziej optymalnych układów. Do badań zastosowałem fazę stałą w postaci krzemionki modyfikowanej grupami n-oktadecylosilanowymi (C18). Faza ta jest podstawowym wypełnieniem kolumn wykorzystywanych do rozdziału kwasów tłuszczowych w chromatografii cieczowej [111, 235, 304, 309, 310]. Jako fazy ruchome zastosowałem dwa, najczęściej stosowane w przypadku analiz kwasów tłuszczowych, rozpuszczalniki tj. metanol i acetonitryl [111, 304, 306, 307, 310, 311]. W dalszej części tego rozdziału opisano kilka doświadczeń mających na celu określenie wpływu temperatury oraz rodzaju rozpuszczalnika organicznego na rozdział kwasów tłuszczowych, a także wpływ tych parametrów na wartość współczynnika ECL. W oparciu o wyniki uzyskane z serii elucji izokratycznych opracowałem program elucji, który wykorzystano do oznaczenia profilu kwasów w lipidach żółtka jaja kurzego. 3.2.2.1.1 Wpływ długości łańcucha węglowego nasyconych kwasów tłuszczowych na współczynnik retencji (k) Współczynnik k rozdzielanych związków jest istotnym parametrem podczas opracowywania warunków rozdziału za pomocą LC. Określa on różnicę pomiędzy czasami retencji (tR) poszczególnych związków a zerowym czasem retencji (t0) podzieloną przez t0, który jest czasem przebywania w kolumnie substancji nie oddziałującej z fazą stacjonarną [67, 312]. W celu określenia wpływu długości łańcucha węglowego nasyconych kwasów tłuszczowych na logarytm współczynnika retencji k zastosowałem mieszaninę wzorcową czterech nasyconych kwasów tłuszczowych o różnej długości łańcucha węglowego (14:0 16:0 18:0 20:0). Oddziaływania węglowodorowych łańcuchów kwasów tłuszczowych z niepolarnymi fazami stałymi takimi jak C18 wynikają głównie z obecności sił dyspersyjnych. Dlatego też obserwuje się liniową zależność pomiędzy log k nasyconych kwasów tłuszczowych a ilością atomów węgla w łańcuchu [111, 304]. Zależności te dla badanych kwasów przedstawione są na Rys. 19. Współczynnik korelacji R2 dla wszystkich przypadków 105 był większy niż 0,99 w zakresie stosowanych temperatur oraz ilości rozpuszczalników organicznych. 2,5 2 MeOH 90%/30st.C 1,5 log k ACN 90%/30st.C MeOH 80%/30st.C 1 ACN 80%/30st.C MeOH 90%/10st.C 0,5 ACN 90%/10st.C 0 13 14 15 16 17 18 19 20 21 Ilosć węgli Rys. 19. Wykres zależności między logarytmem współczynnika retencji k nasyconych kwasów tłuszczowych a ilością atomów węgla w cząsteczce. 3.2.2.1.2 Wpływ rozpuszczalnika organicznego na wartości współczynnika retencji (k) oraz ECL kwasów tłuszczowych W chromatografii cieczowej faza ruchoma – rozpuszczalnik wywiera decydujący wpływ na zdolność rozdzielczą układu głównie ze względu na stosunkowo niewielką różnorodność typów dostępnych faz stałych [67,111]. Wpływ ilości metanolu oraz acetonitrylu na współczynnik retencji przedstawiono na Rys. 20 i 21. 1,8 1,6 14:0 1,4 16:0 1,2 16:1 18:1 log k 1 18:2 0,8 18:3 0,6 20:4 0,4 22:6 0,2 20:5 0 75 80 85 90 % MeOH Rys. 20. Wykres zależności między logarytmem współczynnika retencji k kwasów tłuszczowych, a ilością metanolu (30°C). 106 1,4 14:0 1,2 16:0 log k 1 16:1 0,8 18:1 18:2 0,6 18:3 0,4 20:4 0,2 22:6 20:5 0 70 75 80 85 90 95 % ACN Rys. 21. Wykres zależności między logarytmem współczynnika retencji k kwasów tłuszczowych, a ilością acetonitrylu (30°C). Wraz ze wzrostem ilości rozpuszczalnika organicznego w eluencie polarność fazy ruchomej maleje powodując liniowe obniżanie się wartości współczynnika retencji. Jednak wartości nachylenia prostych wykazują niewielką zmienność zarówno w przypadku acetonitrylu jak i metanolu dla grup kwasów tłuszczowych o takiej samej liczbie atomów węgla w łańcuchu (Tabela 20 i 21). Tabela 20. Wpływ ilości acetonitrylu na współczynnik k wolnych kwasów tłuszczowych. Wartości przecięcia osi Kwas tłuszczowy a a rzędnych (b) Współczynnik Stosunek współczynnika k dla a kierunkowy prostej (a) 80% i 90% ACN 14:0 3,01 -0,0295 1,92 16:0 3,69 -0,0342 2,16 16:1 3,22 -0,0319 2,06 18:0 4,60 -0,0415 2,44 18:1 3,85 -0,0363 2,29 18:2 3,46 -0,0343 2,19 18:3 2,98 -0,0306 2,01 20:0 5,09 -0,0439 2,82 20:4 3,47 -0,0356 2,28 20:5 2,99 -0,0316 2,09 22:6 3,34 -0,0350 2,22 Wartości regresji liniowej: log k = a(%ACN) + b 107 Tabela 21. Wpływ ilości metanolu na współczynnik k wolnych kwasów tłuszczowych. Wartości przecięcia osi Kwas tłuszczowy a a rzędnych (b) Współczynnik Stosunek współczynnika k dla a kierunkowy prostej (a) 80% i 90% MeOH 14:0 1,69 -0,3271 4,96 16:0 2,11 -0,3611 5,71 16:1 1,77 -0,3411 5,14 18:0 2,54 -0,4100 7,79 18:1 2,16 -0,3722 6,04 18:2 1,94 -0,3670 5,70 18:3 1,65 -0,3224 5,32 20:0 2,96 -0,4551 8,99 20:4 1,86 -0,3584 5,99 20:5 1,61 -0,3181 5,29 22:6 1,83 -0,3517 5,70 Wartości regresji liniowej: log k = a(%MeOH) + b Wraz z obniżaniem się ilości rozpuszczalników organicznych, wartość współczynnika k wzrasta bardziej w przypadku kwasów nasyconych niż kwasów nienasyconych o tej samej liczbie atomów węgla. Dodatkowo im dłuższy łańcuch węglowy tym wyższy wzrost współczynnika k przy obniżaniu ilości rozpuszczalnika organicznego w eluencie. Mówiąc inaczej, wraz ze wzrostem siły elucji fazy ruchomej, czas retencji dla związków o niższej hydrofobowości będzie malał znacznie szybciej [312]. W przypadku ACN tłumaczy się to oddziaływaniami π-π pomiędzy wiązaniem podwójnym kwasu nienasyconego a wiązaniem potrójnym grupy cyjanowej acetonitrylu [111, 312]. Oddziaływania te maleją wraz ze zmniejszaniem się ilości ACN i prowadzą do relatywnie wyższej retencji kwasów nienasyconych w porównaniu do kwasów nasyconych. Co więcej udowodniono również większe oddziaływania w przypadku konfiguracji cis wiązania podwójnego niż konfiguracji trans co zostało wykorzystane przez Chena i wsp. do rozdziału kwasów tłuszczowych o różnej konfiguracji wiązań podwójnych [111]. W przeprowadzonej przez mnie analizie wpływu rozpuszczalnika na współczynnik k obserwowałem podobne tendencje również w przypadku stosowania metanolu jako rozpuszczalnika. Bardzo szczegółowe porównanie wpływu ACN i MeOH na chemicznie modyfikowane fazy stałe w RP-LC zostały przedstawione przez Buszewskiego i innych [313]. Na Rys. 22 i 23 przedstawiony jest również wpływ metanolu oraz acetonitrylu na wartości ECL. Wartości te dla kwasów nienasyconych wzrastały wraz ze zmniejszaniem się ilości rozpuszczalnika organicznego. 108 17 16 16:1 ECL 18:1 15 18:2 18:3 20:4 22:6 14 20:5 13 75 80 85 90 95 %MeOH Rys. 22. Wpływ ilości metanolu na ECL nienasyconych kwasów tłuszczowych w 30°C. 17 16 15 16:1 ECL 18:1 14 18:2 18:3 13 20:4 22:6 12 20:5 11 70 75 80 85 90 95 ACN (%) Rys. 23. Wpływ ilości acetonitrylu na ECL nienasyconych kwasów tłuszczowych w 30°C. W przypadku metanolu w całym badanym zakresie stężeń tego rozpuszczalnika obserwowałem dobry rozdział pomiędzy kwasami nienasyconymi m.in. 18:1 oraz 18:2 oraz ich nasyconymi odpowiednikami 16:0 oraz 14:0. Stwierdziłem jednocześnie tworzenie się pary krytycznej pomiędzy wielonienasyconymi kwasami takimi jak 22:6 oraz 20:4. W przypadku wysokiego stężenia metanolu (>90%) zauważyć można również nagły spadek wartości ECL oraz pogarszanie się rozdzielczości pomiędzy większością badanych kwasów. 109 Dla ACN rozdział kwasu 18:1 oraz odpowiadającego mu kwasu 16:0 obserwowałem przy stężeniu acetonitrylu powyżej 80%. Natomiast kwas 18:2 praktycznie w całym zakresie stosowanych stężeń wykazywał różną wartość ECL niż odpowiadający mu kwas nasycony 14:0. Analizy wykazały także tworzenie się par krytycznych pomiędzy badanymi nienasyconymi kwasami, jednak w bardzo wąskim przedziale stężeń. Przy ilości ACN w granicach 80 – 85% dochodziło do pokrywania się wartości ECL kwasów 18:3 oraz 22:6. Natomiast przy stężeniu poniżej 75% bardzo podobne wartości ECL wyznaczono dla trzech kwasów: 14:0, 16:1 oraz 20:4. Podsumowując przedstawione powyżej wyniki można stwierdzić iż rozdział złożonych mieszanin kwasów tłuszczowych za pomocą RP-LC może okazać się bardzo trudnym zadaniem. Związane jest to głównie z faktem, iż wraz ze wzrostem ilości rozpuszczalnika organicznego kolejność elucji kwasów tłuszczowych z kolumny może ulegać zmianie i prawdopodobnie zastosowanie liniowej elucji gradientowej będzie niewystarczające do rozdziału wszystkich badanych kwasów tłuszczowych. 3.2.2.1.3 Wpływ temperatury na wartości współczynnika retencji (k) oraz ECL kwasów tłuszczowych W chromatografii cieczowej temperatura wpływa na wiele parametrów fizycznych takich jak rozpuszczalność, prężność pary, lepkość a także na retencję, sprawność rozdzielczą kolumny, selektywność, ciśnienie wsteczne kolumny oraz właściwości fazy stałej [314-319]. Parametr ten jest niezwykle ważny, szczególnie w przypadku analiz związków ulegających dysocjacji, gdyż wpływa on zarówno na wartość pKa analitu jak i pH stosowanego eluentu [315]. Wpływ temperatury na retencje analitu opisywany jest za pomocą równania Van’t Hoffa: (8) gdzie: – współczynnik retencji, -zmiana entalpii procesu chromatograficznego, zmiana entropii procesu chromatograficznego, bezwzględna oraz - stała gazowa, – - temperatura - objętościowy stosunek pomiędzy fazą ruchomą a fazą stałą. Równanie to opisuje liniową zależność logarytmu współczynnika retencji od odwrotności temperatury bezwzględnej i pozwala na obserwowanie zmian termodynamicznych w trakcie 110 procesu chromatograficznego. Liniowy przebieg tej zależności świadczy o stałym mechanizmie retencji w zakresie badanych temperatur [317]. W celu wyznaczenia zmiany entalpii oraz zmiany entropii retencji tworzy się wykres zależności 1/T (w Kelwinach) oraz ln k gdzie współczynnik kierunkowy prostej rzędnych natomiast wartość przecięcia osi . Mimo iż w większości przypadków przedstawiona zależność wykazuje wysoką liniowość, to możliwe jest, szczególnie dla szerokiego zakresu temperatur, występowanie zależności kwadratowej. Zjawisko to nie zostało jeszcze do końca wyjaśnione [319, 320]. W przypadku chromatografii odwróconej fazy, wartość entalpii oddziaływań mieści się zwykle w granicach -10 do -15 kJ/mol dla małych cząsteczek, podczas gdy większe związki charakteryzują się większymi (ujemnymi) wartościami entalpii. Związki z dużymi wartościami są bardziej „podatne” na zmiany temperatury niż związki charakteryzujące się małymi wartościami tego parametru co ma znaczący wpływ na selektywność [316]. Zwykle wykresy Van’t Hoffa są liniowe i w większości przypadków retencja maleje wraz ze wzrostem temperatury [321] co obserwowałem również w przypadku rozdzielanych w pracy kwasów tłuszczowych (Rysunek 24 i 25). 3 2,5 ln k 2 14:0 16:0 16:1 18:0 18:1 18:2 18:3 20:0 20:4 20:5 22:6 1,5 1 0,5 0 0,00315 0,0032 0,00325 0,0033 0,00335 0,0034 0,00345 0,0035 0,00355 1/T (K-1) Rys. 24. Wykresy Van’t Hoffa kwasów tłuszczowych (eluent: MeOH:H2O 90:10). 111 4,5 4 14:0 3,5 16:0 ln k 3 16:1 2,5 18:0 2 18:1 18:2 1,5 18:3 1 20:0 0,5 20:4 0 0,00315 20:5 0,00320 0,00325 0,00330 0,00335 0,00340 0,00345 0,00350 0,00355 22:6 1/T (K-1) Rys. 25. Wykresy Van’t Hoffa kwasów tłuszczowych (eluent: ACN:H2O 90:10) Przy stosowaniu acetonitrylu jako fazy ruchomej większość analizowanych kwasów tłuszczowych (z wyjątkiem 18:0 i 20:0) wykazywała wysoką liniowość w zakresie temperatur od 10 do 40°C (R2>0,99). Świadczy to o tym, iż zarówno jak i są zasadniczo niezależne od temperatury w całym jej zakresie stosowanym w doświadczeniu. Dla kwasów nasyconych (18:0 i 20:0) wraz ze zwiększaniem się długości łańcucha węglowego oraz obniżaniem temperatury kolumny obserwowałem wzrost odchyleń od liniowości. Za odstępstwa te odpowiada tzw. Zjawisko „przejścia fazowego” (ang. „phase transition”). Przejście to związane jest ze zmianą parametrów geometrycznych oktadecylosilanowej fazy stałej [319, 322], która wraz z obniżaniem temperatury zmienia swoją strukturę z formy przypominającej ciecz do formy bardziej uporządkowanej (struktura szczotkowa) [111]. W celu wyznaczenia punktu „przejścia fazowego” uzyskaną krzywą dzieli sie na dwie proste i wyznacza miejsce ich przecięcia [320]. Punkt „przejścia fazowego” (ok. 25°C) w przypadku stosowanej kolumny C18 wyznaczono z krzywych kwasów 18:0 i 20:0. Uzyskany wynik jest zgodny z danymi literaturowymi gdzie zjawisko to dla różnych kolumn C18 obserwowano w zakresie temperatur 20 - 50°C [319, 320, 323, 324]. Stosując metanol jako fazę ruchomą również obserwowałem spadek retencji wraz ze wzrostem temperatury. Widoczne są tu jednak znaczne odchylenia od liniowości dla wszystkich kwasów tłuszczowych. W punkcie przejścia fazowego (25°C) wyznaczonego dla ACN stwierdziłem znaczne zaburzenia wykresów Van’t Hoffa dla wszystkich kwasów z wyjątkiem kwasu stearynowego (18:0). Na Rysunkach 26 i 27 przedstawione są wykresy obrazujące dodatkowo zależność ECL od temperatury podczas elucji izokratycznej i z zastosowaniem dwóch rozpuszczalników 112 organicznych tj. metanolu oraz acetonitrylu. W obu przypadkach odnotowałem spadek wartości ECL wraz z obniżaniem temperatury. Większe zmiany tego parametru występują jednak w przypadku metanolu. Wraz z obniżaniem temperatury wzrastała również rozdzielczość analizowanych kwasów, co szczególnie widoczne jest przy stosowaniu ACN. W przypadku metanolu optymalną temperaturą rozdziału jest temperatura 25°C. W warunkach tych obserwuje się jedynie jedną parę krytyczną utworzoną pomiędzy kwasami 18:2 oraz 20:4. Obniżanie temperatury mimo możliwości rozdziału powyższej pary prowadzi do tworzenia się kolejnych dwóch par krytycznych pomiędzy kwasami 16:0/18:1 oraz 22:6/16:1. Podobną zależność obserwuje się przy podnoszeniu temperatury, gdzie tworzone są kolejne grupy kwasów o bardzo podobnych wartościach ECL: 18:2/22:6/20:4 oraz 20:5/18:3. W przypadku stosowania ACN optymalną temperaturą do rozdziału wszystkich kwasów jest 15°C. W tych warunkach nie obserwuje się tworzenia żadnych par krytycznych pomiędzy analizowanymi kwasami tłuszczowymi. Jednak wraz z obniżaniem temperatury obserwuje się wzrost lepkości fazy ruchomej, a w konsekwencji tego wzrost ciśnienia wstecznego kolumny. Dlatego biorąc pod uwagę ten fakt, jako optymalną temperaturą rozdziału w opisywanym przypadku przyjęto również wartość 25°C. 17 16 16:1 ECL 18:1 15 18:2 18:3 20:4 14 20:5 22:6 13 10 15 20 25 30 35 40 Temperatura (°C) Rys. 26. Wpływ temperatury na ECL nienasyconych kwasów tłuszczowych (eluent: MeOH:H2O, 90:10). 113 16 15 16:1 14 ECL 18:1 18:2 13 18:3 20:4 20:5 12 22:6 11 10 15 20 25 30 35 40 Temperatura (°C) Rys. 27. Wpływ temperatury na ECL nienasyconych kwasów tłuszczowych (eluent: ACN:H 2O, 90:10). 3.2.2.1.4 Opracowanie końcowej metody rozdziału kwasów tłuszczowych Na podstawie informacji uzyskanych z doświadczeń przedstawionych powyżej opracowałem optymalny program rozdziału 11 kwasów tłuszczowych o różnej długości łańcucha oraz stopniu nienasycenia. Jako fazę stałą zastosowałem kolumnę Thermo Betasil C18 5µm (4,6 x 150mm), z wykorzystaniem której przeprowadzono wszystkie powyższe doświadczenia. Jako fazę ruchomą stosowałem układ dwuskładnikowy ACN : H2O (1% HCOOH, 0,1% TEA), a do detekcji analizowanych związków detektor naładowanego aerozolu (CAD). Optymalną temperaturą kolumny okazała się temperatura 25°C. Jako system elucji zastosowałem program elucji gradientowej. Przykładowe chromatogramy wzorców kwasów tłuszczowych oraz kwasów tłuszczowych wchodzących w skład lipidów żółtka jaja kurzego wraz z programem elucji przedstawiłem na Rysunku 28. 114 Rys. 28. Chromatogramy CAD-HPLC wzorców kwasów tłuszczowych oraz kwasów tłuszczowych wchodzących w skład lipidów żółtka jaja kurzego wraz z programem elucji. Kolumna: Thermo Hypersil Gold C18 5µm (150 x 4,6 mm). W przedstawionym programie elucji zastosowałem początkowy powolny narost ilości ACN od 64 do 76%. Przy takim stężeniu stosowanego rozpuszczalnika organicznego dochodzi do elucji kwasów tłuszczowych o najniższej wartości ECL czyli 20:5 i 18:3. Wg wyników przedstawionych na Rysunku 23 stężenie ACN w ilości ok. 75% umożliwia dobry rozdział większości kwasów z wyjątkiem pary krytycznej 16:0/18:1. Dlatego też eluent ten zastosowałem do elucji izokratycznej i rozdziału kwasów charakteryzujących się wartością ECL poniżej 15. Dobra rozdzielczość pary krytycznej 16:0/18:1 obserwowałem przy 85% zawartości ACN w eluencie. Do rozdziału tej pary, po zakończeniu 3 minutowej elucji izokratycznej, zastosowałem bardzo szybki narost ilości ACN do wartości 95%. Wysokie stężenie ACN umożliwiło nie tylko rozdział tych kwasów ale również elucje kwasu 18:0. Dodatkowo na chromatogramie widoczny był pik wzorca kwasu rycynolowego. Ten osiemnastowęglowy kwas hydroksylowy ze względu na swoją wyższą polarność eluowany jest już w szóstej minucie programu. Mimo iż nie występuje on naturalnie w lipidach żółtka jaja kurzego, jego ilościowa analizę przeprowadziłem podczas oznaczania profilu kwasów tłuszczowych fosfatydylocholiny wzbogacanej enzymatycznie w ten kwas. 115 Model odpowiedzi detektora. W celu wyznaczenia modelu odpowiedzi detektora CAD w przedstawionej metodzie przygotowałem wzorcowe mieszaniny kwasów tłuszczowych w propan-2-olu. Krzywe kalibracyjne każdego analizowanego związku obliczono na podstawie powierzchni pików. Analizowane kwasy tłuszczowe wraz z ilościami każdego związku stosowanego do wyznaczenia krzywych kalibracyjnych przedstawione są w Tabeli 22. Tabela 22. Krzywe kalibracyjne HPLC/CAD kwasów tłuszczowych. Lp. Kwas tłuszczowy Zakres (µg) Model potęgowy (y=axb) Model liniowy (y=bx+a) Równanie R2 AICC Równanie R2 AICC 1 Kwas rycynolowy 0,0184,48 5,974(±0,01)x0,9383 (±0,01) 0,9994 -79,470 5,477 (±0,01)x+0,1837(±0,00) 0,9985 -52,509 2 Kwas eikozapentaenowy (EPA) (20:5) 0,0184,54 17,822(±0,06)x0,8696(±0,00) 0,9998 -71,186 14,594 (±0,03)x+1,7696 (±0,02) 0,9970 19,958 3 Kwas linolenowy (18:3) 0,0174,18 17,591(±0,01)x0,8681(±0,01) 0,9997 -51,760 14,517 (±0,05)x+1,6829(±0,02) 0,9969 15,592 4 Kwas dokozaheksaenowy (DHA)(22:6) 0,0194,93 21,631(±0,07)x0,8822(±0,00) 0,9998 -55,804 17,909 (±0,03)x+2,0252(±0,02) 0,9974 31,743 5 Kwas palmitoleinowy (16:1) 0,0763,82 13,164(±0,07)x0,7362 (±0,00) 0,9992 -47,422 8,9028 (±0,09)x+2,7889(±0,03) 0,9864 22,565 6 Kwas arachidonowy (20:4) 0,0184,57 23,358(±0,05)x0,8655 (±0,00) 0,9998 -49,549 18,988 (±0,10)x+2,4009(±0,07) 0,9967 36,739 7 Kwas linolowy (18:2) 0,0174,21 20,604(±0,11)x0,8347 (±0,00) 0,9996 -35,348 16,149 (±0,15)x+2,443(±0,08) 0,9949 35,729 8 Kwas palmitynowy (16:0) 0,0153,85 15,966(±0,03)x1,0143 (±0,00) 0,9988 -9,625 16,392 (±0,07)x-0,4678(±0,01) 0,9990 -13,959 9 Kwas oleinowy (18:1) 0,0174,24 21,588(±0,01)x0,9486 (±0,00) 0,9981 19,578 20,272 (±0,02)x+0,1331(±0,01) 0,9974 29,745 10 Kwas stearynowy (18:0) 0,0174,27 34,716(±0,07)x0,8857 (±0,00) 0,9983 37,433 29,658 (±0,03)x+1,9716(±0,06) 0,9949 69,036 Przy sporządzaniu krzywej nastrzykiwałem takie same ilości moli każdego kwasu. Przygotowałem dziewięć różnych stężeń każdego związku oraz przeprowadzałem trzykrotny nastrzyk każdej mieszaniny wzorców. Do opisu uzyskanych wyników zastosowałem dwie funkcje: liniową (y=a+bx) oraz potęgową (y=axb). Kryteriami akceptacji właściwego modelu były wartości współczynnika R2 oraz AICc. Analiza wykazała, iż w przypadku większości kwasów tłuszczowych model potęgowy lepiej opisuje odpowiedź detektora. Jedynie w przypadku kwasu palmitynowego obserwowałem tendencję odwrotną. 116 Dla wszystkich kwasów o liczbie atomów węgla w cząsteczce równej lub większej od 18 obserwowałem bardzo podobną odpowiedź detektora CAD. Natomiast w przypadku kwasów zawierających 16 lub mniej atomów węgla w cząsteczce widoczne było znaczne obniżenie odpowiedzi w porównaniu z pozostałymi kwasami. Związane jest to prawdopodobnie z częściowym odparowywaniem analizowanych związków w tubie osuszającej detektora. Nie do końca natomiast jest zrozumiała znacznie większa, w porównaniu z innymi kwasami, odpowiedź detektora dla kwasu stearynowego (18:0). Można przypuszczać iż związane jest to z dużą ilością rozpuszczalnika organicznego w eluencie, w którym ten kwas jest wymywany. Jednak również kwas 18:1 eluowany był w tej samej fazie ruchomej, a mimo to dla niego nie obserwowałem wyższej odpowiedzi. Czułość (S), granica wykrywalności (LOD) oraz granica oznaczalności (LOQ). W celu dodatkowej charakterystyki opracowanej metody dla każdego związku oznaczono czułość detektora, granice wykrywalności oraz granice oznaczalności (Tabela 23). Czułość detektora CAD wykazywała wysoką zmienność dla wszystkich badanych związków i mieściła się w granicach 4,7 – 28,7 mV/µg. Jednocześnie obserwowałem bardzo niskie wartości granicy oznaczalności poniżej 15ng dla wszystkich analizowanych kwasów. Tabela 23. Czułość (S), granica wykrywalności (LOD) i granica oznaczalności (LOQ) substancji wzorcowych dla detektora CAD. Związek S (mV/µg) (abxb-1)a LOD (ng) (3,3 x σ/S)b LOQ (ng) (10 x σ/S)b Kwas rycynolowy Kwas eikozapentaenowy (EPA) (20:5) Kwas linolenowy (18:3) Kwas dokozaheksaenowy (DHA)(22:6) Kwas palmitoleinowy (16:1) Kwas arachidonowy (20:4) Kwas linolowy (18:2) Kwas palmitynowy (16:0) Kwas oleinowy (18:1) Kwas stearynowy (18:0) a 7,2 4,6 13,9 26,1 7,6 22,9 26,1 1,3 3,8 30,4 7,6 23,0 19,1 12,1 36,6 34,7 4,7 14,4 33,7 10,8 32,6 15,3 6,5 19,7 25,2 1,3 4,0 49,0 4,7 14,3 a ,b – parametry uzyskane z modelu potęgowego; x – stężenie analizowanej substancji, b σ – odchylenie standardowe odpowiedzi Precyzja. Precyzje oraz powtarzalność systemu HPLC określiłem poprzez dziesięciokrotny nastrzyk pojedynczego roztworu badanego związku w warunkach przedstawionych powyżej. 117 Do tego celu stosowałem roztwory substancji wzorcowych o zbliżonej masie i identycznej ilości moli. Powtarzalność metody wyznaczyłem na podstawie czasów retencji i pól powierzchni uzyskanych pików (Tabela 24). Tabela 24. Powtarzalność odpowiedzi detektora CAD i czasów retencji substancji wzorcowych. Związek Kwas rycynolowy Kwas eikozapentaenowy (EPA) (20:5) Kwas linolenowy (18:3) Kwas dokozaheksaenowy (DHA)(22:6) Kwas palmitoleinowy (16:1) Kwas arachidonowy (20:4) Kwas linolowy (18:2) Kwas palmitynowy (16:0) Kwas oleinowy (18:1) Kwas stearynowy (18:0) Ilość (µg) (µmol) Powierzchnia piku (mV/min) Średnia SD RSD% Mean Czas retencji (min) SD 1,79 (0,006) 10,389 0,00 0,04 6,684 0,01 0,17 1,81 (0,006) 30,094 0,14 0,48 11,897 0,01 0,15 1,67 (0,006) 27,829 0,05 0,17 12,431 0,02 0,14 1,97 (0,006) 39,735 0,05 0,13 14,071 0,022 0,16 1,53 (0,006) 18,021 0,09 0,48 14,451 0,018 0,13 1,83 (0,006) 39,591 0,08 0,20 15,082 0,020 0,13 1,68 (0,006) 31,781 0,02 0,07 15,934 0,02 0,13 1,54 (0,006) 25,309 0,07 0,29 19,141 0,00 0,03 1,69 (0,006) 36,856 0,17 0,48 19,633 0,00 0,03 1,71 (0,006) 57,350 0,19 0,33 21,395 0,00 0,03 RSD% Wyniki tych analiz pokazały, że opracowana metoda charakteryzuje się bardzo wysoką powtarzalnością zarówno w przypadku czasów retencji (%RSD=0,03–0,17) jak i pól powierzchni (%RSD=0,04–0,48). 3.2.2.1.5 Oznaczenie profilu kwasów tłuszczowych lipidów żółtka jaja kurzego Opracowana i przedstawiona w poprzednim rozdziale metoda analityczna została zastosowana do określenia profilu kwasów tłuszczowych lipidów żółtka jaja kurzego tj. triacylogliceroli (TAG), fosfatydylocholiny (PC) oraz fosfatydyloetanoloaminy (PE). Uzyskane wyniki zostały zebrane w Tabeli 25. 118 Tabela 25. Procentowy skład kwasów tłuszczowych uzyskanych w wyniku chemicznej hydrolizy lipidów z żółtka jaja kurzego (n=3). FA Kwas mirystynowy (14:0) Kwas eikozapentaenowy (EPA) (20:5) Kwas linolenowy (18:3) Kwas dokozaheksaenowy (DHA)(22:6) Kwas palmitynowy (16:1) Kwas arachidonowy (20:4) Kwas linolowy (18:2) Kwas palmitynowy (16:0) Kwas oleinowy (18:1) Kwas stearynowy (18:0) TAG (%) SD %RSD PE (%) SD %RSD PC (%) SD %RSD 0,45 0,02 4,44 - - - - - - - - - - - - - - - 1,02 0,04 3,72 - - - - - - 0,1 0,01 5,97 6,96 0,17 2,44 2,24 0,14 6,37 5,98 0,02 0,35 - - - 1,2 0,09 7,26 0,38 0,01 2,63 14,86 0,08 1,24 5,13 0,14 2,83 17,43 0,20 1,16 14,2 0,19 1,34 15,4 0,04 0,23 24,09 0,13 0,52 17,52 0,66 3,75 33,64 0,43 1,27 46,24 0,15 0,32 18,37 0,68 3,69 27,14 0,80 2,96 4,31 0,16 3,62 27,82 1,52 5,47 15,25 0,39 2,59 Analiza danych z Tabeli 25 wskazuje na znaczące różnice składu kwasów tłuszczowych pomiędzy poszczególnymi lipidami. TAG były głównie zestryfikowane jedno- oraz wielonienasyconymi kwasami tłuszczowymi. Dominującym kwasem wchodzącym w skład cząsteczek TAG był kwas oleinowy (46,24%). W przypadku PE i PC ponad 45% wszystkich kwasów stanowiły kwasy nasycone. Jednakże w przypadku tych polarnych lipidów (w porównaniu do TAG) obserwowano wyższe stężenie kwasów wielonienasyconych. Różnice w profilu kwasowym można zauważyć również pomiędzy lipidami polarnymi. Fosfatydylocholina charakteryzowała się niższą zawartością kwasu arachidonowego i dokozaheksaenowego, a jednocześnie zawierała więcej osiemnastowęglowych nienasyconych kwasów tłuszczowych niż fosfatydyloetanoloamina. 3.3 ANALIZA POZYCYJNA FOSFOLIPIDÓW z ŻÓŁTKA JAJA KURZEGO Analiza składu kwasów tłuszczowych w lipidach żółtka jaja kurzego przedstawiona w poprzednim rozdziale dostarcza wiele cennych informacji dotyczących budowy cząsteczek lipidów. Do pełnego obrazu budowy cząsteczek potrzebne są bardziej szczegółowe informacje na temat rodzaju reszt acylowych występujących w poszczególnych pozycjach (sn-1 oraz sn-2) analizowanych związków. Istotne jest to szczególnie w przypadku określania profilu kwasów tłuszczowych fosfolipidów modyfikowanych zarówno w reakcjach 119 chemicznych jak i enzymatycznych [2, 7, 325-329]. Informacje te pozwalają nie tylko określić regioselektywność poszczególnych procesów ale również określić szczegółową budowę otrzymanych produktów, co wiąże się z ich właściwościami biologicznymi oraz technologicznymi [263-265]. Fosfolipidem najczęściej poddawanym procesom modyfikacji jest fosfatydylocholina. Związane jest to z jej szerokim zastosowaniem w przemyśle spożywczym, kosmetycznym oraz farmaceutycznym [4, 105, 330-333]. Związek ten jest również głównym lipidem polarnym poddawanym procesowi modyfikacji w Katedrze Chemii Uniwersytetu Przyrodniczego we Wrocławiu, gdzie realizowałem moją pracę. W związku z tym opracowanie metody analizy pozycyjnej PC stanowiło istotną część prowadzonych badań. W tym rozdziale zostaną przedstawione trzy różne metody, ich zalety i wady oraz możliwości zastosowania do różnych celów. Cechą wspólną przedstawionych procedur jest wykorzystanie w reakcjach regioselektywnej hydrolizy PC biokatalizatorów w postaci lipaz oraz fosfolipaz. W przypadku dwóch pierwszych metod przeprowadzono analizę pozycyjną fosfatydylocholiny z żółtka jaja kurzego oraz soi w celu określenia wpływu składu reszt acylowych na proces hydrolizy. Metoda trzecia jest metodą zoptymalizowaną pod kątem szybkości przeprowadzania analiz, gdyż w porównaniu ze znanymi z literatury i opracowanymi przez mnie procedurami umożliwia bardzo szybką analizę pozycyjną cząsteczki fosfolipidu. 3.3.1 Analiza pozycyjna fosfatydylocholiny (metoda i oraz II) Pierwsza opracowana i stosowana przez mnie metoda analizy pozycyjnej w fosfatydylocholinie zakładała uwolnienie kwasów zarówno w procesie hydrolizy enzymatycznej jak i chemicznej. Ogólny schemat procesu przedstawiony jest na Rysunku 29. 120 Rys. 29. Ogólny schemat procesu analizy pozycyjne fosfatydylocholiny (metoda i oraz II). Pierwszy etap procesu tj. hydroliza enzymatyczna PC do 1-acylo-LPC i kwasów tłuszczowych była przeprowadzana bezpośrednio w surowym żółtku jaja poprzez dodanie biokatalizatora w postaci fosfolipazy A2 (PLA2). Fosfatydylocholina, mimo iż w żółtku jest silnie adsorbowana na powierzchni cząsteczek LDL (ang. low-density lipoproteins) [334] to już po 60 minutach prowadzenia reakcji stopień jej hydrolizy wynosił powyżej 94% i to bez rozpuszczalników organicznych czy też substancji powierzchniowo czynnych [272]. Zwiększania czasu prowadzenia procesu, nie powodowało wzrostu ilości 1-acylo-LPC w mieszaninie reakcyjnej (Rys. 30). 120 94 100 % 80 60 PC 40 LPC 20 6.0 0 0 20 40 60 80 100 120 140 minuta Rys. 30. Hydroliza fosfatydylocholiny w surowym żółtku jaja kurzego za pomocą fosfolipazy A2. 121 Przedstawiona reakcja jest powszechnie stosowana w produkcji majonezu. Poprzez zwiększanie amfifilowych właściwości żółtka jaja kurzego wzrasta stabilność tworzonej w procesie produkcyjnym emulsji [335, 336]. Reakcja hydrolizy była kończona dodatkiem metanolu do mieszaniny reakcyjnej w celu wstępnej ekstrakcji powstałych lizofosfolipidów. Czystą 1-acylo-LPC otrzymywano za pomocą chromatografii kolumnowej (CHCl3 : MeOH : H2O, 65:25:4 v/v/v), a następnie hydrolizowano chemicznie a uwolnione kwasy tłuszczowe analizowano za pomocą GC lub HPLC. W ten sposób określano skład kwasów tłuszczowych występujących w pozycji sn-1 fosfatydylocholiny. Powyższa metoda może jednak być stosowana wyłącznie w przypadku fosfatydylocholiny w surowym żółtku jaja kurzego. W analizie PC w czystej postaci wymagane jest zastosowanie innych warunków reakcyjnych. Zewnątrzkomórkowe fosfolipazy takie jak np. stosowana w pracy fosfolipaza z trzustki wieprzowej wykazują znacznie większą (ok. 10 000 razy) aktywność hydrolityczną w stosunku do substratów tworzących luźno upakowane układy, takie jak np. micele. Związane jest to głównie ze zmianą konformacyjną enzymu podczas łączenia się z tymi strukturami. Fosfolipidy ciasno upakowane i te zdyspergowane, nie tworzące żadnych struktur, hydrolizowane są znacznie wolniej [337, 338]. Dlatego też w celu hydrolizy fosfatydylocholiny przez PLA2 wymagane były takie warunki reakcji, które faworyzowałyby tworzenie luźnych kompleksów tego związku. W pracy zastosowałem metodę zaproponowaną przez Morgado i wsp. [339]. Reakcja hydrolizy prowadzona była w izooktanie w obecności soli sodowej sulfobursztynianu dioktylu (AOT). W tym układzie PC formowała micele, w których polarne głowy skierowane były do środka tworzących się struktur, natomiast hydrofobowe łańcuchy kwasów tłuszczowych układały się w stronę rozpuszczalnika. Pozostałe składniki mieszaniny reakcyjnej tj. jony wapnia, woda oraz enzym tworzyły polarne środowisko wewnątrz miceli. AOT jako surfaktant zwiększał rozpuszczalność substratów oraz redukował lepkość medium reakcyjnego. Niezwykle istotna okazała się również kolejność dodawania poszczególnych reagentów. Najwyższą wydajność reakcji uzyskiwałem w procesie, w którym jako ostania do mieszaniny dodawana była fosfatydylocholina. Postęp procesu hydrolizy w czasie kontrolowałem za pomocą HPLC (Rys. 31). 122 Rys. 31. Chromatogramy mieszaniny reakcyjnej regioselektywnej enzymatycznej hydrolizy fosfatydylocholiny za pomocą PLA2 po 1 i 10 minutach prowadzenia procesu. Już po 30 sekundach prowadzenia procesu obserwowałem 67% stopień hydrolizy fosfatydylocholiny do 1-acylo-LPC. Natomiast całkowite przereagowanie następowało po 10 minutach. Uzyskana w ten sposób 1-acylo-LPC była oczyszczana za pomocą chromatografii kolumnowej (CHCl3:MeOH:H2O, 65:25:4 v/v/v), hydrolizowana chemicznie do kwasów tłuszczowych, które analizowano bezpośrednio za pomocą HPLC lub po procesie estryfikacji do estrów metylowych za pomocą GC . W ten sposób określano skład kwasów tłuszczowych występujących w pozycji sn-1 natywnej fosfatydylocholiny. W celu oznaczenia kwasów w pozycji sn-2 PC zastosowałem reakcję hydrolizy za pomocą fosfolipazy A1 (PLA1). Wykorzystałem identyczne warunki do tych stosowanych w hydrolizie PC przez PLA2. Porównanie przebiegu reakcji w czasie z wykorzystaniem tych dwóch biokatalizatorów przedstawione jest na Rysunku 32. 120 100 % 80 60 PLA2 40 PLA1 20 0 0 50 100 150 200 250 minuta Rys. 32. Postęp reakcji hydrolizy PC katalizowanej za pomocą PLA1 oraz PLA2 . W procesie z udziałem PLA1 jako biokatalizatora obserwowałem zmiany zarówno w wydajności procesu jak i czasie reakcji. Konwersję lecytyny do 2-acylo-LPC na poziomie 95,5% odnotowałem już po 2 godzinach procesu. Mimo dalszego prowadzenia reakcji 123 stopień hydrolizy substratu nie ulegał zwiększaniu i utrzymywał się na stałym poziomie 4,5% nawet przez okres 24 godziny. Przy dłuższym prowadzeniu procesu zaobserwowałem również spadek ilości głównego produktu reakcji czyli lizofosfatydylocholiny w czasie. Związane jest to prawdopodobnie ze zjawiskiem migracji reszt acylowych z pozycji sn-2 do sn-1 z utworzeniem bardziej stabilnej formy regioizomeru lizofosfatydylocholiny. Izomer ten następnie hydrolizowany był do glicerofosfatydylocholiny (GPC) powodując obniżenie ilości LPC w mieszaninie reakcyjnej. Zjawisko migracji wpływa szczególnie negatywnie na wydajność procesów modyfikacji enzymatycznej fosfolipidów. Dlatego podczas doboru odpowiednich warunków reakcji zjawisko to musi być brane pod uwagę [94, 326-328, 340]. Szczegółowe omówienie tego procesu przedstawiłem w następnym rozdziale pracy. Reakcja hydrolizy enzymatycznej PC za pomocą PLA1 była kończona po czasie około 120 min. Uzyskaną lizofosfatydylocholinę oczyszczano za pomocą chromatografii kolumnowej (CHCl 3 : MeOH : H2O, 65:25:4 v/v/v) i po hydrolizie chemicznej oznaczano skład kwasów tłuszczowych w pozycji sn-2 fosfatydylocholiny stosując HPLC lub GC. Zaletą przedstawionej powyżej metody jest brak wpływu migracji reszt acylowych na wynik końcowy analizy pozycyjnej. Związane jest to z tym iż skład pozycyjny przeprowadza się na podstawie otrzymanych regioizomerów LPC a nie uwolnionych w procesie hydrolizy enzymatycznej wolnych kwasów tłuszczowych. Jedynym czynnikiem na jaki może wpływać zjawisko migracji w tych procesach to wydajność reakcji hydrolizy. Przykładowe wyniki analizy fosfatydylocholiny żółtka jaja kurzego oraz soi przedstawione są w Tabeli 25. Wyniki te są porównane z danymi uzyskanymi z analizy pozycyjnej tych samych substratów ale za pomocą metody II opisanej poniżej. 3.3.2 Analiza pozycyjna fosfatydylocholiny (metoda III) Złożoność procesu analizy pozycyjnej przedstawionej powyżej, a także metod opisanych w literaturze [266, 268, 270-272] opierających się głównie na regioselektywnych hydrolizach fosfolipidów za pomocą dwóch enzymów, skłoniła mnie do opracowania prostszej procedury analizy pozycyjnej. Substratem w badaniach wstępnych była fosfatydylocholina z żółtka jaja kurzego oraz soi. Kluczowym etapem metody jest enzymatyczna etanoliza fosfatydylocholiny [326]. Ogólny schemat procesu przedstawiony jest na Rysunku 33. 124 Rys. 33. Ogólny schemat procesu analizy pozycyjnej fosfatydylocholiny (metoda III). Metoda ta charakteryzuje się bardzo prostym składem mieszaniny reakcyjnej w porównaniu do pozostałych prezentowanych w literaturze metod. W początkowej fazie mieszanina ta zawiera trzy składniki: 95% etanol, PC oraz immobilizowany enzym (sn-1,3 specyficzna lipaza z Mucor miehei). Immobilizowana struktura enzymu nie tylko zapewnia wysoką stabilność biokatalizatora, ale również ułatwia usuwanie go z mieszaniny reakcyjnej. Całkowita konwersja PC do 2-acylo-LPC zachodziła w czasie 8h (Rys. 34). 120 100 % 80 60 40 20 0 0 1 2 3 4 5 6 7 8 czas (h) Rys. 34. Reakcja enzymatycznej etanolizy fosfatydylocholiny katalizowanej sn-1,3 specyficzną lipazą z Mucor miehei. 125 Oprócz LPC, produktami reakcji były również wolne kwasy tłuszczowe uwolnione z pozycji sn-1 fosfatydylocholiny. Dodatkowo część uwolnionych kwasów występowała w postaci estrów etylowych. Obecność estrów etylowych identyfikowałem za pomocą chromatografii cienkowarstwowej (TLC) (heksan : eter dietylowy, 7:1 v/v) porównując ich wartości Rf z wartościami Rf wzorcowej mieszaniny tych związków. W przypadku stosowania jednej reakcji enzymatycznej do oznaczania profilu kwasów tłuszczowych, aby zapewnić wiarygodność wyników należy stosować układy, które będą uniemożliwiać migracje reszt acylowych podczas reakcji. Niestety ten bardzo ważny czynnik jest często pomijany w „jednoenzymatycznych” metodach analizy pozycyjnej stosowanych w literaturze [266]. Jednym z czynników ograniczających migracje reszt acylowych i jednocześnie umożliwiającym całkowitą hydrolizę PC jest stosowany w omawianej metodzie 95% etanol. Brak migracji w tych warunkach został udowodniony przez Adlercreutza i wsp. poprzez porównanie zmian stężenia dwóch regioizomerów w czasie za pomocą HPLC [326]. Podobne wyniki uzyskałem i ja stosując nową metodę analizy za pomocą HPLC umożliwiającą analizę PC oraz produktów jej hydrolizy w pojedynczym procesie chromatograficznym. Metoda ta została wykorzystana do określenia procesu migracji reszt acylowych nie tylko w etanolu ale również w najczęściej stosowanych mieszaninach reakcyjnych wykorzystywanych podczas reakcji modyfikacji fosfatydylocholiny [341]. Zagadnienie będzie szczegółowo omówione w kolejnym rozdziale (3,4) tej pracy. Całkowita hydroliza PC do 2-acylo-LPC umożliwiła wyeliminowanie procesu oczyszczania LPC za pomocą chromatografii kolumnowej i zastosowanie w tym celu prostej metody ekstrakcji w układzie ciecz-ciecz. Jako mieszaninę ekstrakcyjną zastosowano układ woda : heksan, 2:3 v/v. Frakcje heksanową zawierająca wolne kwasy tłuszczowe z pozycji sn1 badanej fosfatydylocholiny poddałem procesowi estryfikacji. Tak uzyskane estry etylowe analizowałem za pomocą GC, uzyskując profil kwasów tłuszczowych obecnych w pozycji sn-1 fosfatydylocholiny. W celu otrzymania czystej frakcji LPC przeprowadziłem jej wytrącenie ze zmrożonego acetonu (-20°C) i odwirowanie powstałego osadu. Otrzymaną lizofosfatydylocholinę hydrolizowałem chemicznie, a uwolnione kwasy tłuszczowe przeprowadzałem w estry etylowe, które analizowałem za pomocą GC. Uzyskałem w ten sposób skład kwasów tłuszczowych w pozycji sn-2 fosfatydylocholiny. 126 Przedstawiona wyżej metoda dodatkowo stosowana jest do otrzymywania 2-acyloLPC. Możliwe to jest gdyż stosowane warunki ekstrakcji ograniczają proces migracji reszt acylowych. Szczegóły dotyczące tego zagadnienia będą przedstawione w kolejnym rozdziale dysertacji. Porównanie uzyskanych wyników analizy pozycyjnej fosfatydylocholiny z żółtka jaja oraz soi metodą I, II oraz III zaprezentowane są w Tabelach 27 i 28. Tabela 27 Skład kwasów tłuszczowych fosfatydylocholiny z soi oznaczony z zastosowaniem lipazy z Mucor miehei (metoda a III) oraz fosfolipazy A1 i A2 (metoda II). a * Metoda III Metoda II Metoda III Metoda II Kwasy tłuszczowe ogółem sn-1 sn-1 sn-2 sn-2 16:0 13,6±0,06 27,7±0,9 29,5±0,3 3,1±0,5 2,8±0,3 18:0 3,7±0,02 13,7±1,2 12,7±0,3 0,7±0,1 0,8±0,2 18:1 10,6±0,06 8,6±0,2* 6,9±0,2 12,4±0,3* 10,8±0,2 18:2 65,9±0,09 42,3±1,3 44,8±0,8 77,0±0,4 78,5±0,6 18:3 6,2±0,04 6,4±0,5 5,9±0,1 6,8±0,1 7,1±0,6 Wyniki wyrażone jako procentowy udział poszczególnych kwasów tłuszczowych w stosunku do całkowitej ilości kwasów w określonej pozycji p < 0,01 w porównaniu do Metody 1 (test t-Studenta) Tabela 28 Skład kwasów tłuszczowych fosfatydylocholiny z żółtka jaj kurzego oznaczony z zastosowaniem lipazy z Mucor a miehei (metoda III) oraz fosfolipazy A1 i A2 (metoda I). a * Metoda III Metoda I Metoda III Metoda I Kwasy tłuszczowe ogółem sn-1 sn-1 sn-2 sn-2 16:0 37,0±0,07 62,5±0,5 60,8±1,2 1,1±0,6 0,6±0,1 16:1 0,4±0,06 2,9±0,3 3,3±0,2 0,2±0,08 0,3±0,04* 18:0 14,1±0,03 31,1±0,8 33,3±0,4 0,5±0,9 0,47±0,08 18:1 22,1±0,05 2,0±0,1 2,8±0,3 42,9±0,8 41,0±1,5* 18:2 21,2±0,07 1,0±0,09 0,8±0,1 44,0±0,7 45,1±0,5 20:4 3,9±0,1 - - 8,1±1,1 9,0±0,4 22:6 1,3±0,02 - - 3,2±0,8 3,4±0,3 Wyniki wyrażone jako procentowy udział poszczególnych kwasów tłuszczowych w stosunku do całkowitej ilości kwasów w określonej pozycji p < 0,01 w porównaniu do Metody 1 (test t-Studenta) 127 Porównując wyniki uzyskane dwiema różnymi metodami nie stwierdziłem znaczących różnic w składzie kwasów tłuszczowych. Natomiast określone profile kwasów tłuszczowych fosfatydylocholiny z soi i żółtka jaja kurzego wykazały znaczne różnice pomiędzy tymi związkami pod względem zawartości poszczególnych kwasów i ich miejscem w cząsteczce. W przypadku PC z żółtka jaja kurzego w pozycji sn-1 obserwowano głównie kwasy nasycone, natomiast grupa hydroksylowa w pozycji sn-2 zestryfikowana była głównie jednoi wielonienasyconymi kwasami tłuszczowymi. Z kolei głównym kwasem występującym w cząsteczce PC z soi był kwas linolowy (18:2) obserwowany zarówno w pozycji sn-1 jak i sn2. Podobnie jednak jak w przypadku PC z żółtka grupa hydroksylowa w pozycji sn-2 PC z soi zestryfikowana była dodatkowo głównie jedno- i wielonienasyconymi kwasami tłuszczowymi. 3.3.3 Analiza pozycyjna fosfatydylocholiny (metoda IV) Przedstawione metody analizy pozycyjnej kwasów w PC mimo swoich zalet posiadały jedną główną wadę tj. długi czas potrzebny do przeprowadzenia analizy pojedynczej próbki. Parametr ten staje się niezwykle ważny, gdy trzeba przeprowadzić większą liczbę analiz. Głównym czynnikiem wpływającym na czas przedstawionych procedur była reakcja enzymatycznej hydrolizy oraz proces rozdziału uzyskanych produktów reakcji. Całościowy schemat analizy pozycyjnej fosfolipidów z żółtka jaja kurzego, kolejnej czwartej metody opisanej w tym rozdziale, przedstawiony jest na Rysunku 35. 128 Rys. 35. Całościowy schemat procesu analizy pozycyjnej fosfolipidów żółtka jaja kurzego (metoda IV). Pierwszym etapem podczas optymalizacji procesu przedstawionego na Rysunku 35 był wybór odpowiednich warunków hydrolizy enzymatycznej. Postanowiłem, iż w metodologii zastosowana będzie tylko jedna reakcja hydrolizy, która jednocześnie umożliwi przeprowadzenie pełnej analizy pozycyjnej. W tym celu zdecydowałem się na reakcję hydrolizy stosowaną w przypadku metody 1 gdzie jako biokatalizator użyłem 129 fosfolipazy z trzustki wieprzowej (PLA2), a jako medium reakcyjne izooktan z dodatkiem AOT. Całkowitą hydrolizę substratu w przypadku tej reakcji obserwowałem już nawet po 10 minutach. W bardzo krótkim więc czasie otrzymywałem dwa produkty końcowe reakcji tj. kwasy tłuszczowe z pozycji sn-2 fosfatydylocholiny oraz 1-acylo-LPC. Na tym etapie postanowiłem też sprawdzić możliwość stosowania tej reakcji w przypadku innych fosfolipidów. Związane było to z koniecznością oznaczania profilu kwasów tłuszczowych nie tylko w przypadku fosfatydylocholiny ale również fosfatydyloetanoloaminy (PE). Stosując identyczne warunki reakcji jak w przypadku PC otrzymałem również dwa produkty hydrolizy czyli kwasy tłuszczowe z pozycji sn-2 cząsteczki oraz 1-acylo-lizofosfatydyloetanoloaminę (1acylo-LPE). Wynik ten wskazuje na uniwersalność proponowanej metody i możliwość stosowania jej w analizie pozycyjnej głównych fosfolipidów żółtka jaja kurzego. Kolejnym etapem był proces rozdziału otrzymanych produktów reakcji. W tym celu zastosowano dwie różne metody ekstrakcji do fazy stałej. Każda z nich stosowana była w przypadku innego fosfolipidu. Metody opracowano nie tylko w celu rozdziału kwasów tłuszczowych oraz lizofosfolipidów, ale również w celu oddzielenia tych związków od wyjściowego produktu czyli analizowanego fosfolipidu. Metody te opracowano w ten sposób aby w przypadku niecałkowitej hydrolizy glicerofosfolipidu, cząsteczki te nie wpływały na wynik analiz. Przedstawione procedury umożliwiają nie tylko skrócenie czasu rozdziału produktów do kilku minut ale również znacznie mniejsze zużycie rozpuszczalników w porównaniu do innych metod np. chromatografii kolumnowej. Jednak zastosowane metody nie umożliwiały oddzielenia AOT od głównych produktów reakcji hydrolizy. Dlatego we frakcji kwasów tłuszczowych obserwowano obecność tego związku. Jego ograniczona lotność okazała się niedogodnością przy stosowaniu chromatografii gazowej jako techniki analitycznej. W celu ominięcia tego problemu postanowiłem jako rutynową technikę analizy kwasów tłuszczowych zastosować HPLC. Dodatkowym atutem tego podejścia był również brak konieczności przeprowadzania wolnych kwasów tłuszczowych w ich bardziej lotne pochodne, co jest konieczne w przypadku GC. Chromatogramy HPLC z analizy pozycyjnej PC i PE z żółtka jaja kurzego przedstawione są na Rysunku 36. 130 Rys. 36. Przykładowe chromatogramy kwasów tłuszczowych uzyskanych podczas pozycyjnej analizy PC i PE. Kolumna: Thermo Hypersil Gold C18 5µm (150 x 4,6 mm). Przykładowe wyniki analizy pozycyjnej fosfolipidów żółtka jaja kurzego uzyskane za pomocą metody IV przedstawiono w Tabeli 29. Tabela 29 Skład kwasów tłuszczowych fosfatydylocholiny (PC) oraz fosfatydyloetanoloaminy (PE) z żółtka jaja kurzego a oznaczony z zastosowaniem fosfolipazy A2 (metoda IV). PE PC a Kwasy tłuszczowe ogółem sn-1 sn-2 Kwasy tłuszczowe ogółem sn-1 sn-2 16:0 33,6±0,43 68,3±0,67 3,8±0,09 17,5±0,66 37,1±1,7 7,5±0,04 16:1 1,2±0,09 - 0,7±0,05 - - - 18:0 15,3±0,39 26,0±0,2 - 27,8±1,5 59,6±1,1 - 18:1 27,1±0,8 3,9±0,04 44,9±0,09 18,4±0,7 3,3±0,7 24,4±0,4 18:2 15,4±0,04 0,9±0,02 34,1±0,23 14,2±0,2 - 23,6±0,2 20:4 5,1±0,14 - 10,9±0,05 14,9±0,2 - 29,2±0,08 22:6 2,2±0,14 0,5 5,42±0,06 6,9±0,2 - 15,2±0,6 Wyniki wyrażone jako procentowy udział poszczególnych kwasów tłuszczowych w stosunku do całkowitej ilości kwasów 131 Główną różnicą pomiędzy analizowanymi fosfolipidami były ilości wielonienasyconych kwasów tłuszczowych w cząsteczkach poszczególnych lipidów. PE charakteryzowała się ponad trzykrotnie większą ilością kwasów 20:4 oraz 22:6, które w przypadku obu fosfolipidów występowały jedynie w pozycji sn-2. W przypadku PC dominującym kwasem nienasyconym był kwas oleinowy. Jednak dla obu związków zauważyć można praktycznie identyczną sumaryczną ilość kwasów nasyconych występujących głównie w pozycji sn-1. 3.4 ANALIZA PROCESU MIGRACJI RESZT ACYLOWYCH W LIZOFOSFATYDYLOCHOLINIE 3.4.1 Opracowanie metody analizy fosfatydylocholiny i produktów jej hydrolizy za pomocą HPLC Ważnym celem przeprowadzonych badań było jakościowe i ilościowe oznaczenie produktów hydrolizy enzymatycznej fosfatydylocholiny (PC) oraz opracowanie łatwej i szybkiej metody analizy procesu migracji reszt acylowych w lizofosfatydylocholinach (LPC). Metodyka taka jest niezbędna w celu optymalizacji procesów enzymatycznej czy też chemicznej syntezy lub modyfikacji PC. Związane jest to z możliwością izomeryzacji cząsteczki lizoglicerofosfatydylocholiny do jej regioizomeru, który w przypadku reakcji enzymatycznych nie jest już substratem dla konkretnego biokatalizatora. Pełna analiza produktów hydrolizy daje również obraz procesów zachodzących w danej mieszaninie reakcyjnej. Tego typu metodologia może być również wykorzystana do określania stabilności liposomowych nośników leków w których obecność produktów degradacji PC wpływa na destabilizacje ich struktury [108] [93]. Opisywana w pracy metoda umożliwia analizę mieszaniny składającej się z 1,2dipalmitoilo-sn-glicero-3-fosfocholiny (DPPC) oraz produktów jej hydrolizy tj. 1-hydroksy-2palmitoilo-sn-glicero-3-fosfocholiny (2-palmitoilo-LPC), 1-palmitoilo-2-hydroksy-sn-glicero-3fosfocholiny (1-palmitoilo-LPC), sn-glicero-3-fosfocholiny (GPC) oraz kwasu palmitynowego (PA) w jednym procesie elucyjnym. Rozdział naturalnej fosfatydylocholiny z żółtka jaja kurzego i jej produktów hydrolizy jest również przedstawiony. Opracowana metodologia znalazła zastosowanie do badania procesu migracji reszt acylowych w 17 rozpuszczalnikach najczęściej stosowanych w chemicznej i enzymatycznej syntezie lub modyfikacji PC. W doświadczeniach jako związek modelowy zastosowano syntetyczną DPPC. Zastosowanie 132 fosfatydylocholiny z identycznymi łańcuchami acylowymi zarówno w pozycji sn-1 jak i sn-2 ułatwiło opracowanie metodologii HPLC jak i interpretacje uzyskanych chromatogramów. Było to niezwykle ważne do obserwacji nawet najmniejszych zmian w badanych mieszaninach. Naturalna PC jest mieszaniną cząsteczek zawierających kombinacje różnych reszt acylowych w pozycji sn-1 jak i sn-2, a przez to może dzielić się na poszczególne podklasy widoczne na chromatogramie jako pojedyncze piki [105], które w przypadku złożonych mieszanin mogą się wzajemnie nakładać utrudniając interpretacje [94]. Takie zjawisko zostało zaobserwowane dla rozdziału PC z żółtka jaja kurzego oraz jej produktów hydrolizy tj. 1-acylo i 2-acylo-LPC. Porównanie uzyskanych chromatogramów fosfatydylocholiny naturalnej i syntetycznej oraz ich produktów hydrolizy przedstawiono na Rysunku 37. Podczas opracowywania metody największym problemem okazała się duża różnica polarności analizowanych związków (głównie DPPC i GPC). Dlatego ważnym etapem było znalezienie odpowiedniej fazy stacjonarnej i ruchomej. Zbadałem kilka kolumn z różnym wypełnieniem m.in. C18 (RP) (Waters Spherisorb®ODS2), C8 (RP) (Merck LiChrosorb® RP-8), niemodyfikowana krzemionka (NP) (Waters Spherisorb®Silica), faza diolowa (HILIC) (Thermo Betasil Diol-100), fazy mieszane (RP/HILIC) (Dionex Acclaim® Mixed-Mode Hilic-1) oraz różne eluenty często używane do rozdziału fosfolipidów (acetonitryl, metanol, heksan, propan-2-ol, chloroform, woda) w różnych konfiguracjach. W przypadku kolumn C8 i C18 największym problemem było silne oddziaływanie DPPC z fazą stałą kolumny szczególnie zauważalne w przypadku kolumn C18. W celu rozdziału wszystkich związków wymagany był długi czas elucji, uzyskując jednocześnie bardzo szeroki pik od DPPC. Najlepsze rozdziały uzyskiwałem dla eluentów z dużą ilością metanolu. Jednakże w żadnym przypadku nie obserwowałem rozdziału regioizomerów LPC. Złoża krzemionkowe (NP) zapewniały rozdziały m.in. DPPC i LPC jednakże stosowana niepolarna faza ruchoma (heksan : propan-2-ol) z niewielką ilością buforu (1% HCOOH, 0,1% TEA) uniemożliwiała wiarygodną analizę GPC ze względu na jej polarność oraz nierozpuszczalność w rozpuszczalnikach organicznych. Dodatkowo niewielka ilość wody niezbędnej do elucji fosfolipidów, ze względu na swoją wysoką polarność była silnie adsorbowana na powierzchni krzemionki [121]. Wpływało to na niestabilność warunków rozdziału powodując m.in. odchylenia od czasów retencji analizowanych związków, a co za tym idzie wymagany był bardzo długi czas stabilizacji po każdej elucji gradientowej. Ten problem można rozwiązać poprzez zastosowanie chromatografii 133 hydrofilowych oddziaływań (HILIC; ang. Hydrofilic Interaction Chromatography) stosując kolumny ze złożem, w którym krzemionka związana jest z grupą polarną np. aminową, cyjanową, amidową czy diolową a jako eluenty stosuje się układy bufor : rozpuszczalnik organiczny [121]. W pracy użyłem kolumnę diolową oraz zastosowałem eluenty analogiczne jak w przypadku faz z niemodyfikowaną krzemionką ale z wyższym stężeniem buforu (1% HCOOH, 0,1% TEA). Uzyskałem podobne rozdziały jak w przypadku kolumny krzemionkowej. Jednak mimo większej ilości użytego buforu, pik GPC był równie szeroki i wykazywał dużą asymetryczność. We wszystkich powyższych metodach ze względu na duże różnice polarności związków zastosowałem elucje gradientową ze wzrastająca siłą elucji fazy ruchomej. Jednakże żadna z tych metod nie zapewniała rozdziału wszystkich produktów hydrolizy w pojedynczym procesie. Właściwy rozdział uzyskałem z zastosowaniem kolumny Dionex Acclaim®Mixed-Mode HILIC-1 oraz fazy ruchomej składającej się z acetonitrylu, metanolu i 0,01M octanu amonu (NH4OAc). W kolumnie zastosowano nową fazę stałą o bardzo interesujących właściwościach [342]. Jest to sferyczna krzemionka sfunkcjonalizowana odpowiednią grupą (nundecylodihydroksydimetylosilanową) zapewniającą jej właściwości charakterystyczne zarówno dla faz typu HILIC (przy wysokim stężeniu rozpuszczalników organicznych w eluencie) jak i RP (przy niskim stężeniu rozpuszczalników organicznych w eluencie). W porównaniu do tradycyjnych diolowych faz stałych (posiadających zazwyczaj trójwęglowe łańcuchy zakończone dwiema grupami hydroksylowymi) złoże to posiada znacznie dłuższy łańcuch alkilowy (jedenastowęglowy łańcuch zakończony dwiema grupami hydroksylowymi). Zapewnia to obok typowych oddziaływań obecnych w złożach typu HILIC dodatkowe oddziaływania hydrofobowe. Dzięki temu sorbent ten wykazuje duży potencjał rozdziału związków różniących się polarnością. Hydrofobowość złoża jest niższa niż analogicznej kolumny C8 ale wyższa niż konwencjonalnej fazy diolowej [342]. Schematyczny rysunek przedstawiający dane złoże i rozdział produktów hydrolizy PC zaprezentowane są na Rysunku 37. 134 Rys. 37. Ogólny schemat złoża kolumny Dionex Acclaim®Mixed-Mode HILIC-1 wraz z rozdziałem produktów hydrolizy fosfatydylocholiny oraz chromatogramy CAD-HPLC wraz z programem elucji: A) GPC B) PA C) 2palmitoilo-LPC D) 1-palmitoilo-LPC E) DPPC F) 1-acylo-LPC z żółtka jaja kurzego (bezpośrednio z mieszaniny reakcyjnej – enzymatyczna hydroliza za pomocą PLA2) G) 2-acylo-LPC z żółtka jaja kurzego (bezpośrednio z mieszaniny reakcyjnej - etanoliza) H) PC z żółtka jaja kurzego. Rozdział wszystkich związków przeprowadzono na fazie stałej o dwóch różnych charakterystykach. GPC i PA rozdzielono stosując eluent z mniejszą ilością rozpuszczalników organicznych zapewniając specyfikę RP kolumny. Następnie zwiększanie udziału fazy organicznej, a przez to siła elucji wzrastała powodując elucję i rozdział regioizomerów lizofosfatydylocholiny. Najwyższe stężenie fazy organicznej zapewniało elucję DPPC. Analiza naturalnej fosfatydylocholiny z żółtka jaja kurzego wykazała preferencje oddziaływań hydrofobowych charakterystycznych dla kolumn RP i powodowała podział tego związku na podklasy. Szczegóły mechanizmu dwóch typów retencji na różnych kolumnach 2-D HILIC-RP zostały ostatnio przedstawione przez Jandera i wsp. [343]. Podczas opracowywania przedstawionej w pracy metody jako rozpuszczalnik polarny stosowałem wodę dejonizowaną. Jednak uzyskiwane piki szczególnie dla DPPC wykazywały dużą asymetryczność (ok. 2,0). Znając spotykany często w przypadku złóż HILIC problem kształtu pików [344, 345] oraz możliwość jego zmniejszenia poprzez zastosowanie roztworów buforowych o wysokim stężeniu (do 100mM) zastosowałem dodatek buforu w postaci octanu amonu. Znaczącą poprawę asymetryczności (szczególnie dla DPPC) uzyskałem poprzez zastosowanie roztworu 100mM. Asymetryczność piku zmieniła się z 2,0 na 1,52. Niestety wysokie stężenie octanu amonu powodowało czterokrotny (w porównaniu 135 do wody dejonizowanej) wzrost sygnału detektora CAD. Dlatego zastosowano bufor o stężeniu dziesięciokrotnie niższym (10 mM) co poprawiło kształt piku (1,60) i jednocześnie wyeliminowało negatywny wpływ buforu na odpowiedź detektora. Ze względu na zastosowanie elucji gradientowej po każdej analizie wymagany był 20 minutowy czas stabilizacji w warunkach początkowych. Model odpowiedzi detektora. Krzywe kalibracyjne każdego analizowanego związku obliczyłem na podstawie wartości pól powierzchni pików uzyskanych poprzez nastrzyk 10 µl roztworów substancji rozpuszczonych w określonej objętości mieszaniny chloroform : metanol (2:1, v/v). Analizowałem następujące mieszaniny wzorców: GPC (0,019-6,17 µg), PA (0,19-7,70 µg), 1-palmitoilo-LPC (0,03-5,00 µg), 2-palmitoilo-LPC (0,03-5,00 µg) oraz DPPC (0,05-8,80 µg). Przygotowałem co najmniej sześć różnych stężeń każdego związku oraz przeprowadzono trzykrotny nastrzyk każdej mieszaniny wzorców. Podczas opracowywania metody zauważyłem, iż rozpuszczenie wzorca kwasu palmitynowego w mieszaninie acetonitryl : metanol (3:4, v/v) wpływało na poprawę symetryczności piku bez zmiany czasu retencji. Jednak w celu zapewnienia dobrej rozpuszczalności wszystkich wzorców zastosowałem mieszaninę chloroform : metanol (2:1,v/v), która wykazywała jednocześnie minimalny wpływ na proces rozdziału. Do określenia związku pomiędzy ilością poszczególnych substancji wzorcowych, a odpowiedzią detektora CAD (pole powierzchni) zastosowałem dwie funkcje: liniową (y=a+bx) oraz potęgową (y=axb). Porównanie modeli odpowiedzi liniowej i potęgowej dla detektora CAD przedstawione jest w Tabeli 30. Tabela 30. Krzywe kalibracyjne HPLC/CAD PLs Zakres (µg) Model potęgowy (y=axb) R2 AICC R2 0,84(±0,00) 0,9958 -20,212 AICC 9,476 (±0,03)x+1,9(±0,05) 0,9893 42,216 0,19-7,70 1,0552(±0,02) 7,098(±0,08)x 0,9949 8,898 7,650 (±0,10)x-0,345(±0,09) 0,9962 7,671 0,03-5,00 13,184(±0,13)x0,966(±0,01) 0,9985 15,660 12,082 (±0,05)x-0,817(±0,05) 0,9948 23,422 0,03-5,00 13,999(±0,12)x0,9652(±0,01) 0,9994 17,701 12,595 (±0,15)x-1,119(±0,03) 0,9931 25,720 0,05-8,80 43,844(±0,12)x0,8055 (±0,00) 0,9952 43,516 26,599 (±0,08)x+12,884(±0,18) 0,9840 116,269 Równanie GPC Kwas palmitynowy 1-palmitoiloLPC 2-palmitoiloLPC DPPC Model liniowy (y=bx+a) 0,02-6,17 12,876(±0,13)x Równanie 136 Kryteriami akceptacji właściwego modelu były wartości współczynnika R2 oraz AICc. Analiza wykazała, iż w przypadku większości związków model potęgowy lepiej opisuje odpowiedź detektora. Jedynie w przypadku kwasu palmitynowego odpowiedź detektora może być opisana z zastosowaniem obu modeli. W przypadku regioizomerów LPC odpowiedzi są bardzo zbliżone, co jest zrozumiałe, gdyż sygnał detektora CAD zależy od masy substancji, a jest niezależny od jej właściwości fizykochemicznych i spektroskopowych. Teoretycznie znaczy to, iż detektor generuje identyczny sygnał dla różnych związków o tej samej masie [247]. Niewielkie różnice wynikają prawdopodobnie z faktu, iż odpowiedź CAD należącego do detektorów aerozolowych zależy od składu fazy ruchomej. Związane jest to z faktem, iż na jego odpowiedź wpływa średnica tworzonych kropel aerozolu. Wymiary kropel zależą od wielu parametrów w tym gęstości i lepkości fazy ruchomej. W elucji gradientowej, w której skład eluentu zmienia się w czasie odpowiedź detektora też będzie się zmieniać wraz ze zmianą fazy ruchomej. Jest to jedna z głównych wad tego typu detektorów [247, 262]. Jednak ostatnio została przedstawiona metoda eliminująca ten problem oparta na zjawisku tzw. kompensacji fazy ruchomej. Rozwiązanie to zostało zaproponowane przez Góreckiego i wsp. [262]. Polega ono na wykorzystaniu dwóch odrębnych faz ruchomych o przeciwnym składzie. Jedna umożliwia elucje właściwą badanych związków i przepływa przez kolumnę chromatograficzną. Druga o dokładnie odwróconym składzie dostarczana jest przez inną pompę i dołączana do „właściwego” eluatu przy jego wyjściu z kolumny. Zapewnia to stały skład fazy ruchomej docierającej do detektora. W metodologii mojej pracy zastosowałem technikę bez kompensacji. Dlatego badane związki docierały do detektora w fazie ruchomej o innym składzie, co powodowało różnice w odpowiedzi detektora nawet dla substancji o takiej samej masie. Czułość (S), granica wykrywalności (LOD) oraz granica oznaczalności (LOQ). Najwyższą czułość zaobserwowałem w przepadku DPPC. Związane jest to z faktem, iż związek ten eluowany był w fazie ruchomej o wysokim stężeniu rozpuszczalników organicznych powodując wysoki sygnał i wzrost czułości detektora. Niska czułość dla kwasu palmitynowego prawdopodobnie wynikała z jego częściowego odparowywania. Związki charakteryzujące się lotnością w warunkach detekcji wykazują niską odpowiedź w przypadku detektora CAD. Było to szczególnie widoczne w przypadku próby analizy estru etylowego 137 kwasu palmitynowego. Mimo nastrzyku 3mM związku nie zaobserwowałem żadnego sygnału. Oprócz czułości detektora dla każdego analizowanego związku oznaczałem również dwa dodatkowe parametry tj. granice wykrywalności (LOD) oraz granice oznaczalności (LOQ). Wyniki zostały zebrane w Tabeli 31. Zgodnie z oczekiwaniami najniższą wartością LOD i LOQ charakteryzował się DPPC natomiast najwyższą kwas palmitynowy. Tabela 31 Czułość (S), granica wykrywalności (LOD) i granica oznaczalności (LOQ) substancji wzorcowych dla detektora CAD. Ilość nastrzykniętego S (mV/µg) LOD (µg/ml) LOQ (µg/ml) związku (Abxb-1)a (3,3 x σ/S)b (10 x σ/S)b (µg) Związek GPC 0,019 20,4 2,1 6,4 Kwas palmitynowy 0,19 6,8 4,0 12,2 1-palmitoilo-LPC 0,03 14,3 3,1 9,5 2-palmitoilo-LPC 0,03 15,2 2,7 8,3 DPPC 0,05 63 0,7 2,0 a a,b – parametry uzyskane z modelu potęgowego; x – stężenie analizowanej substancji b σ – odchylenie standardowe odpowiedzi (wyraz wolny; współczynnik przesunięcia prostej); Precyzja. Precyzję systemu HPLC określałem podobne jak poprzednio poprzez dziesięciokrotny nastrzyk pojedynczego roztworu badanego związku. Do tego celu użyłem roztwory substancji wzorcowych o tym samym stężeniu molowym (0,3mM). Powtarzalność metody określiłem na podstawie czasów retencji i pól powierzchni uzyskanych pików (Tabela 32). Tabela 32 Powtarzalność odpowiedzi detektora CAD i czasów retencji substancji wzorcowych. Związek Stężenie (mM) GPC Kwas palmitynowy 1-palmitoilo-LPC 2-palmitoilo-LPC DPPC 0,3 0,3 0,3 0,3 0,3 Powierzchnia piku (mV/min) Średnia SD RSD% 10,947 5,679 16,922 18,047 121,120 0,02 0,088 0,0407 0,2511 0,1129 0,22 1,56 0,14 0,95 1,68 Czas retencji (min) Średnia SD RSD% 3,573 3,977 10,257 9,592 20,513 0,01 0,008 0,022 0,016 0,038 0,28 0,20 0,21 0,17 0,18 138 Miarą powtarzalności systemu HPLC było względne odchylenie standardowe (RSD), które nie powinno przekraczać wartości 1% [284]. Dla średnich czasów retencji wszystkie wartości %RSD były niższe od 0,28%. Biorąc pod uwagę pola powierzchni, wartości %RSD były niewiele wyższe niż 1% tylko dla dwóch związków: kwasu palmitynowego oraz DPPC. 3.4.2 Hydroliza enzymatyczna DPPC oraz metoda oczyszczania produktów reakcji W pracy przedstawione są dwie metody enzymatycznej hydrolizy DPPC. Pierwsza szczegółowo opisana została w rozdziale 3.3.2 oparta jest na regioselektywnej etanolizie DPPC w pozycji sn-1. Podczas wyboru metody najważniejszymi aspektami były: po pierwsze znalezienie warunków reakcji, które wyeliminują zjawisko migracji reszt acylowych, po drugie zastosowanie możliwie najprostszej mieszaniny reakcyjnej. W tym celu zastosowałem 96% etanol jako medium reakcyjne. Rozpuszczalnik ten zapewniał stabilność uzyskanej lizoglicerofosfatydylocholiny przez około 12h. W tym czasie zaobserwowany stopień migracji reszty acylowej z pozycji sn-2 do sn-1 wynosił poniżej 2%. Inni autorzy obserwowali stabilność otrzymanego izomeru nawet przez 23 godziny [94]. Ważnym zagadnieniem okazał się również wybór właściwego biokatalizatora wykazującego specyficzność jedynie do pozycji sn-1 DPPC i umożliwiającego szybką oraz całkowitą konwersje DPPC do 2-palmitoilo-LPC. W tym celu zastosowano 1,3-specyficzną lipazę z Mucor miehei. Immobilizowana struktura enzymu umożliwiała łatwe usunięcie biokatalizatora z mieszaniny reakcyjnej a jednocześnie zapewniała jego stabilność w warunkach reakcji. Spełnienie tych wszystkich warunków było niezbędne w celu uzyskania czystego izomeru 2-palmitoilo-LPC za pomocą prostej techniki ekstrakcyjnej. Izomery 2-acylo-LPC wykazują niską stabilność i tendencje do izomeryzacji poprzez migracje reszty acylowej [326-329, 340]. Ze względu na tę właściwość uzyskanie czystego izomeru 2-acylo-LPC z zastosowaniem chromatografii cienkowarstwowej czy kolumnowej nie jest możliwe gdyż stosowane tam fazy stałe m.in. krzemionka, tlenek glinu przyspieszają procesy migracji [340]. Zjawisko migracji reszty acylowej z pozycji sn-2 do sn-1 obserwowałem podczas rozdziału produktów etanolizy enzymatycznej DPPC za pomocą chromatografii kolumnowej ze złożem krzemionkowym. W metodzie tej jako eluent zastosowałem mieszaninę chloroform : metanol : woda (65:25:4, v/v/v). Po procesie oczyszczania uzyskałem m.in. mieszaninę regioizomerów LPC o składzie: 87% 1-palmitoilo-LPC oraz 13% 2-palmitoilo-LPC, 139 kwas palmitynowy uwolniony z pozycji sn-1 DPPC i niewielkie ilości GPC. Kwas palmitynowy występował dodatkowo również w postaci estru etylowego. Zastosowana metoda chromatograficzna powodowała katalizę procesu migracji reszty acylowej z pozycji sn-2 do pozycji sn-1 prowadząc do uzyskania równowagowej mieszaniny LPC, w której dominującym izomerem był stabilniejszy izomer 1-palmitoilo-LPC. Dlatego w celu otrzymania izomeru 2palmitoilo-LPC o wysokiej czystości opracowano metodę oczyszczania opartą na ekstrakcji. Prosty skład mieszaniny reakcyjnej znacznie ułatwił opracowanie odpowiedniej metodyki. Po pierwsze enzym w postaci immobilizowanej został usunięty na drodze prostej filtracji. Natomiast 2-palmitoilo-LPC oddzielono od kwasu palmitynowego i jego estru etylowego poprzez wytrącenie ze zmrożonego acetonu (-20°C). Proces wytrącania powtórzono sześciokrotnie uzyskując frakcję regioizomerów LPC o czystości 97% (91% 2-palmitoilo-LPC oraz 6% 1-palmitoilo-LPC). Odzysk procesu ekstrakcji wynosił 94,5%. Przedstawiona powyżej metodologia jest pierwszą metodą umożliwiającą uzyskanie niestabilnego izomeru 2-acyloLPC o tak wysokiej czystości. Metoda ta jednak nie umożliwia całkowitego usunięcia GPC. Związane jest to z faktem nierozpuszczalności tego związku w acetonie. W przypadku bardziej stabilnego izomeru 1-acylo-LPC proces oczyszczania można prowadzić za pomocą technik chromatograficznych takich jak chromatografia kolumnowa czy TLC. Możliwość stosowania tych metod umożliwiło zastosowanie bardziej złożonej mieszaniny reakcyjnej podczas procesu hydrolizy DPPC. Zastosowano tu metodę hydrolizy enzymatycznej opisanej w rozdz. 3.3.1 oraz 3.3.3. Hydrolizowane cząsteczki DPPC występowały w mieszaninie w postaci odwróconych miceli [339]. Użytym biokatalizatorem była fosfolipaza A2 specyficzna do pozycji sn-2 fosfatydylocholiny. Składnikiem mieszaniny reakcyjnej na który zwróciłem szczególną uwagę był bufor Tris-HCl o pH 8,5. Zakładałem, iż dodatek tego buforu o zasadowym pH może powodować katalizę procesu migracji reszt acylowych [340] oraz hydrolizę wiązań estrowych w cząsteczce fosfolipidu. Jednakże stosując powyższą metodykę nie obserwowałem w mieszaninie reakcyjnej 2-acylo-LPC oraz GPC. Można wiec założyć, że w opisanych warunkach reakcji procesy hydrolizy i migracji nie zachodzą. Prawdopodobnie związane jest to z bardzo krótkim czasem reakcji (ok. 10minut) oraz niewielką ilością stosowanego buforu. Ze względu na złożoność mieszaniny reakcyjnej zastosowanie prostej metody ekstrakcji w celu uzyskania czystego izomeru 1-acylo-LPC było niemożliwe. Jednak względna stabilność tego związku umożliwia zastosowanie m.in. 140 chromatografii kolumnowej (chloroform : metanol : woda, 65:25:4, v/v/v) do jego oczyszczenia. Mimo iż metoda ta przyspieszała proces migracji reszty acylowej z pozycji sn-1 do sn-2 jednak był to proces znacznie wolniejszy niż w przypadku 2-palmitoilo-LPC. W wyniku procesu uzyskano 1-palmitoilo-LPC o wysokiej czystości (otrzymana frakcja zawierała 97% 1palmitoilo-LPC oraz 3% 2-palmitoilo-LPC). Taki skład był również obserwowany przez innych autorów w przypadku komercyjnie dostępnych preparatów 1-acylo-LPC [94]. W celu sprawdzenia wpływu ilości procesów oczyszczania (chromatografia kolumnowa) na końcowy skład mieszaniny oczyszczoną próbkę poddałem ponownemu analogicznemu rozdziałowi chromatograficznemu uzyskując podwojenie ilości izomeru 2-palmitoilo-LPC do ok. 7%. Z przeprowadzonego doświadczenia wynika, iż na skład końcowej mieszaniny izomerów LPC ma wpływ czas trwania procesu elucji i ekspozycji związku na oddziaływanie z krzemionkową fazą stałą o kwaśnym charakterze. 3.4.3 Stabilność izomerów lizoglicerofosfatydylocholiny Przedstawioną w rozdziale 3,4,1 metodę analizy za pomocą HPLC zastosowałem do zbadania stabilności izomerów LPC w 17 rozpuszczalnikach używanych najczęściej w enzymatycznych i chemicznych reakcjach syntezy lub modyfikacji fosfatydylocholiny [2, 7, 325, 329], a także do przygotowywania roztworów fosfolipidów do analiz [56, 108]. Większość artykułów przedstawia jedynie możliwość powolnej migracji reszt acylowych w rozpuszczalnikach organicznych [340], jednak brak jest informacji dotyczących porównania stabilności izomerów LPC w tych rozpuszczalnikach. Głównym problemem podczas doświadczenia były różnice rozpuszczalności badanych substancji. Bardzo dobrą rozpuszczalność GPC obserwowano dla wody, buforów oraz alkoholi. Jednak właściwość ta malała wraz ze wzrostem długości łańcucha alkilowego alkoholi oraz stężenia buforu. Nierozpuszczalność GPC obserwowano dla wszystkich rozpuszczalników organicznych dlatego proces hydrolizy w tych mieszaninach nie mógł być kontrolowany. Z kolei LPC nie była rozpuszczalna w izooktanie, octanie etylu oraz heksanie, dlatego zostały one odrzucone jako media reakcyjne. W niektórych rozpuszczalnikach (toluen, eter dietylowy, acetonitryl i aceton) zaobserwowano jedynie częściową rozpuszczalność LPC. Związek ten ulegał również wytrąceniu z acetonu i dichlorometanu przy obniżeniu temperatury poniżej 20°C. Dlatego podczas eksperymentu przedstawionym aspektom poświęciłem szczególną uwagę. 141 Określone ilości regioizomerów LPC rozpuściłem w ustalonej objętości rozpuszczalnika i mieszałem w temperaturze 20°C podczas całego doświadczenia. Każdy wariant wykonałem w trzech powtórzeniach. Z tak przygotowanych mieszanin w określonych odstępach czasowych pobierałem dokładne i ustalone ilości roztworu, które rozpuszczałem w mieszaninie chloroform : metanol (2:1, v/v) i analizowałem stosując metodę HPLC przedstawioną w rozdziale 3.4.1. Wyniki przeprowadzonych analiz zebrano w Tabelach 33 i 34. 3.4.3.1 1-Palmitoilo-LPC Wysoką stabilność 1-palmitoilo-LPC potwierdziłem w przypadku większości badanych rozpuszczalników organicznych. Powolną migrację obserwowałem dla chloroformu. Proces ten był szybszy w przypadku dodatku metanolu. Wzrost ilości (o ok. 1,5% ) odnotowałem w tym ostatnim rozpuszczalniku po czasie 96 godzin. Jednak izomer 1-palmitoilo-LPC wykazywał stabilność przez co najmniej 24 godziny. Jest to szczególnie istotne dlatego, iż badany rozpuszczalnik jest stosowany do przygotowywania roztworów substancji badanych w metodzie analitycznej przedstawionej wyżej (rozdział 3.4.1). W celu uzyskania wiarygodnych wyników wysoka stabilność badanego związku w warunkach analizy jest wymagana podczas walidacji metody. Interesującym wynikiem okazało się przyspieszanie procesu migracji w acetonitrylu gdzie po 96 godzinach ustalała się mieszanina równowagowa zawierająca około 92% 1-palmitoilo-LPC i 8% 2-palmitoilo-LPC. W przypadku alkoholi obserwowałem niewielkie zmiany stężenia 1-palmitoilo-LPC (poniżej 1%) oraz stałe stężenie GPC świadczące o braku procesów hydrolizy w tych warunkach. Wysoką stabilność badanego izomeru odnotowałem również dla 96% etanolu, jednak w tym przypadku obserwowano niewielki wzrost ilości GPC. Jeśli chodzi o bufory zastosowałem dwa stężenia tych roztworów aby sprawdzić czy ten parametr wpłynie na stabilność badanych substancji. Zastosowałem trzy wartości pH: 8,0, 7,4 oraz 5,6. W przypadku różnych stężeń nie stwierdziłem znaczącego wpływu tego parametru na proces migracji oraz hydrolizę. Zarówno pH kwaśne jak i zasadowe katalizowało proces migracji reszt acylowych. Jest to zgodne z wynikami uzyskanymi przez innych autorów [340]. Proces migracji jak i hydrolizy preferowany był w przypadku zasadowego pH. 142 3.4.3.2 2-Palmitoilo-LPC Bardzo interesujących informacji dostarczyła analiza roztworów mniej stabilnego izomeru LPC tj. 2-palmitoilo-LPC. Żaden z zastosowanych rozpuszczalników nie zapewniał stabilności badanego związków w czasie eksperymentu. Znaczące różnice obserwowano nawet pomiędzy rozpuszczalnikami organicznymi. Odwrotnie jak w przypadku izomeru 1palmitoilo-LPC, izomer 2-palmitoilo-LPC najwyższą stabilność, w przypadku rozpuszczalników organicznych, wykazywał w acetonitrylu. Ilość izomeru obniżyła się jedynie o 3% w ciągu 96 godzinnego doświadczenia. Najszybszą migracje w grupie rozpuszczalników organicznych obserwowałem dla eteru dietylowego. Pozostałe rozpuszczalniki zapewniały mniej więcej podobną stabilność badanej substancji. Szczególną uwagę zwróciłem na mieszaninę chloroform : metanol (2:1, v/v). W tym przypadku przeprowadziłem dodatkowe analizy mieszaniny po 8 i 13 godzinach w celu zbadania stabilności 2-palmitoilo-LPC w krótszych odstępach czasu. Było to niezbędne do określenia wiarygodności analiz wykonywanych podczas walidacji metody analitycznej. 2-Palmitoilo-LPC wykazywała stabilność przez 13 godzin. Czas ten był wystarczający do wykonania wszystkich niezbędnych analiz. W przypadku pozostałych badanych mieszanin (alkohole, woda, bufory) obserwowałem również wzrost ilości GPC. Zmiany po 96 godzinach były mniejsze niż 1,4%. Z wszystkich zastosowanych rozpuszczalników najwyższą stabilność 2-palmitolo-LPC zapewniały propan2-ol oraz bezwodny etanol. Zmiany w ilości głównego izomeru LPC były mniejsze niż 2% i 3% po czasie 96 godzin. Jednak znaczących różnic pomiędzy mieszaninami alkoholi nie obserwowałem przez 48 godzin. Przez 24 godziny wszystkie badane alkohole z wyjątkiem 96% etanolu zapewniały podobną stabilność badanego izomeru. Dodatek wody w przypadku etanolu katalizował proces migracji. W mieszaninach buforów podobnie jak dla izomeru 1palmitoilo-LPC najszybszą migracje obserwowano w środowisku zasadowym. Stan równowagi pomiędzy izomerami ustalał się w różnym czasie dla różnych wartości pH (pH 8,0 - 24 godziny; pH 7,4 - 72 godziny). Dla pH 5,6 migracja była dwukrotnie wolniejsza niż w przypadku dejonizowanej wody i po 96 godzinach w obu przypadkach nie obserwowałem stanu równowagi. 143 a Związek(%) 0 24 48 72 96 Aceton Acetonitryl Dichlorometan Eter dietylowy Toluen Chloroform: metanol (2:1, v/v) Chloroform 2-Propamol 96% Etanol Etanol bezwodny Metanol Woda dejonizowana Bufor pH 5,6 (2,0M) Bufor pH 5,6 (0,3M) Bufor pH 7,4 (0,3M) Bufor pH 8,0 (2,0M) Rozpuszczalnik Bufor pH 8,0 (0,3M) Czas (godz.) Tabela 33. Stabilność regioizomeru 1-palmitoilo-LPC w 17 różnych mieszaninach reakcyjnych. ( Ns, nierozpuszczalny) (n=3) 1-palmitoilo-LPC 97,3±0,7 97,5±0,7 96,2±0,9 97,2±1,0 97,2±0,9 96,7±1,2 96,8±0,3 97,0±0,7 96,3±0,5 96,8±0,6 98,4±0,8 96,4±0,7 98,2±0,6 98,5±0,4 97,8±0,5 98,0±0,7 96,9±1,0 2-palmitoilo-LPC 1,4±0,2 1,6±0,3 2,4±0,3 1,8±0,4 2,0±0,3 3,1±0,7 GPC 1-palmitoilo-LPC 1,2±0,1 0,9±0,1 1,6±0,2 1,4±0,3 0,9±0,1 1,8±0,2 1,9±0,3 1,4±0,2 1,5±0,3 1,5±0,3 Nsa 92,5±1,0 91,7±0,6 92,8±0,7 96,9±0,8 96,4±1,0 96,8±1,3 96,5±0,4 97,0±0,9 96,6±0,8 96,6±0,7 97,6±0,7 1,2±0,1 96,3±0,6 Ns Ns Ns Ns 98,1±0,7 98,4±0,7 97,8±0,9 98,0±0,8 Ns 96,9±0,9 2-palmitoilo-LPC 2,7±0,4 2,4±0,2 2,2±0,2 1,9±0,5 2,0±0,3 3,1±0,8 GPC 1-palmitoilo-LPC 1,8±0,4 1,3±0,2 1,9±0,3 1,3±0,2 1,2±0,7 0,3±0,07 1,6±0,3 1,5±0,1 1,3±0,1 1,4±0,2 Ns 92,5±1,1 91,9±0,8 92,6±1,0 96,3±0,9 96,6±0,8 94,9±1,0 95,8±0,6 96,6±0,3 96,6±0,8 97,0±0,5 97,5±0,6 1,5±0,3 96,0±0,7 Ns Ns Ns Ns 98,5±0,9 98,5±0,9 97,6±0,7 96,8±0,9 Ns 96,9±1,1 2-palmitoilo-LPC 6,0±0,2 2,5±0,2 2,4±0,1 1,5±0,4 3,2±0,5 3,1±0,7 GPC 1-palmitoilo-LPC 1,8±0,3 1,4±0,2 1,8±0,1 1,6±0,6 0,6±0,1 1,7±0,7 2,0±0,2 1,5±0,1 1,3±0,08 1,4±0,2 Ns 91,8±0,9 91,1±1,1 92,2±0,9 96,0±0,6 95,8±0,9 95,4±1,1 95,9±0,3 96,7±0,5 95,8±0,3 96,7±0,7 97,4±0,3 1,6±0,09 95,8±0,5 Ns Ns Ns Ns 98,1±0,9 98,2±0,7 97,4±0,9 93,2±0,8 Ns 96,8±0,8 2-palmitoilo-LPC 6,4±0,1 2,6±0,1 2,4±0,2 1,9±0,3 6,8±0,6 3,2±0,5 GPC 1-palmitoilo-LPC 1,7±0,2 2,2±0,4 1,7±0,2 1,7±0,4 0,8±0,09 0,5±0,1 1,9±0,4 1,5±0,09 1,7±0,1 1,4±0,1 Ns 89,3±1,4 91,1±0,9 92,1±0,7 94,9±1,1 95,9±1,0 94,4±0,9 96,3±0,2 96,2±0,2 95,2±0,5 96,1±0,8 97,4±0,3 1,8±0,2 94,6±0,6 Ns Ns Ns Ns 98,2±0,8 98,3±0,9 97,6±0,7 91,7±1,0 Ns 96,6±0,9 2-palmitoilo-LPC 7,5±0,2 6,7±0,4 6,0±0,5 2,9±0,3 3,7±0,1 5,0±0,2 1,8±0,2 2,2±0,4 2,5±0,2 2,6±0,1 2,7±0,2 1,8±0,4 1,7±0,3 2,4±0,4 8,3±0,8 3,4±0,6 GPC 3,2±0,4 2,2±0,3 1,9±0,3 2,2±0,2 0,4±0,0 0,6±0,1 1,8±0,4 1,6±0,2 2,3±0,3 1,5±0,08 Ns 2,7±0,4 Ns Ns Ns Ns Ns 1,6±0,2 7,1±0,5 6,6±0,3 6,7±0,3 2,2±0,4 5,2±0,3 5,6±0,2 6,1±0,4 1,4±0,3 1,8±0,4 2,1±0,2 2,3±0,4 1,8±0,5 2,4±0,4 2,7±0,2 3,3±0,1 1,5±0,1 2,9±0,2 3,5±0,3 4,1±0,3 1,3±0,1 1,8±0,1 2,1±0,2 2,1±0,1 1,6±0,5 1,5±0,4 1,9±0,2 1,8±0,2 2,2±0,3 2,1±0,2 2,1±0,3 2,5±0,1 1,6±0,2 1,9±0,1 1,6±0,1 1,9±0,2 2,4±0,2 1,5±0,2 1,6±0,1 1,5±0,3 1,8±0,4 2,2±0,2 2,2±0,1 2,4±0,3 2,6±0,4 144 a Związek (%) 0 24 48 72 96 Aceton Acetonitryl Dichloromet an Eter dietylowy Toluen Chloroform: metanol (2:1) Chloroform 2-Propamol 96% Etanol Etanol bezwodny Metanol Woda dejonizowa na Bufor pH 5,6 (2,0M) Bufor pH 5,6 (0,3M) Bufor pH 7,4 (0,3M) Bufor pH 8,0 (2,0M) Rozpuszczalnik Bufor pH 8,0 (0,3M) Czas (godz.) Tabela 34. Stabilność regioizomeru 2-palmitoilo-LPC w 17 różnych mieszaninach reakcyjnych. ( Ns, nierozpuszczalny) (n=3) 2-palmitoilo-LPC 90,7±0,3 91,3±0,5 88,6±0,3 94,2±0,3 93,7±1,0 96,3±0,6 89,9±0,6 90,4±0,8 90,7±1,0 90,2±0,5 93,7±1,0 89,1±0,3 92,9±2,0 89,6±1,9 92,5±1,7 92,2±1,5 92,4±2,3 1-palmitoilo-LPC 6,0±0,2 6,3±0,8 8,4±0,2 7,1±1,1 7,8±0,7 7,6±1,2 GPC 2-palmitoilo-LPC 3,3±0,09 1,7±0,1 3,1±0,2 3,2±0,3 1,6±0,2 0,7±0,1 3,3±0,2 2,5±0,3 2,2±0,1 2,5±0,3 Nsa 7,9±0,3 7,0±0,5 13,7±0,7 85,7±1,0 81,1±1,6 63,6±1,2 88,6±0,9 88,7±0,8 87,7±0,9 89,4±0,7 91,7±1,4 3,7±0,1 87,5±0,2 Ns Ns Ns Ns 89,9±1,9 86,0±2,1 90,5±1,5 91,8±1,3 Ns 90,4±2,0 1-palmitoilo-LPC 88,5±0,8 91,1±0,8 82,8±1,4 11,0±0,7 18,2±1,0 35,6±0,6 7,5±0,5 8,3±0,6 8,7±0,1 10,1±1,2 14,0±1,3 8,2±0,4 9,6±1,3 GPC 2-palmitoilo-LPC 3,6±0,1 8,0±0,2 3,5±0,3 3,3±0,2 1,7±0,5 0,8±0,2 3,9±0,4 3,0±0,1 3,6±0,3 2,8±0,1 Ns 8,0±0,6 81,1±2,0 75,2±0,9 56,4±1,4 82,6±1,1 88,0±1,0 83,7±1,1 88,4±1,1 90,6±0,6 3,7±0,1 84,9±0,6 Ns Ns Ns Ns 91,4±1,1 82,3±1,7 87,1±1,8 89,6±1,1 Ns 89,1±2,2 1-palmitoilo-LPC 87,6±1,1 91,9±1,1 88,3±0,8 15,7±1,2 22,5±0,7 42,9±1,6 13,4±0,4 8,6±0,2 13,5±0,6 8,6±0,3 9,4±0,2 11,3±0,3 8,6±0,8 17,7±1,1 12,9±0,8 10,4±0,5 10,9±1,5 GPC 2-palmitoilo-LPC 4,5±0,08 2,1±0,4 6,6±0,3 6,3±0,7 3,7±0,4 3,1±0,3 2,2±0,2 0,8±0,1 4,0±0,3 3,4±0,1 2,7±0,3 3,0±0,1 Ns 4,2±0,3 77,6±1,1 67,7±2,2 27,7±1,0 82,4±1,2 87,6±0,6 79,4±1,2 88,5±1,2 89,5±0,8 3,8±0,2 81,6±0,9 Ns Ns Ns Ns 85,5±2,1 73,5±1,5 84,4±2,0 89,3±1,2 Ns 88,0±1,9 1-palmitoilo-LPC 89,6±0,9 91,4±1,0 91,6±0,8 18,7±0,6 30,0±1,3 71,6±2,0 14,7±0,7 8,8±0,3 16,7±0,5 8,4±0,5 10,5±0,4 14,6±0,5 14,5±0,9 26,5±1,2 15,6±1,2 10,7±0,8 12,0±0,9 GPC 2-palmitoilo-LPC 3,8±0,2 2,2±0,08 4,2±0,2 3,7±0,0 2,3±0,6 0,8±0,1 4,1±0,5 3,6±0,2 3,9±0,3 3,1±0,2 Ns 6,4±0,3 6,1±0,5 4,0±0,1 72,1±2,0 67,1±1,4 18,6±0,7 76,3±1,8 87,1±0,3 76,0±1,4 88,2±0,9 86,5±1,0 3,8±0,1 77,6±1,0 Ns Ns Ns Ns 80,6±2,2 60,5±2,2 83,8±1,4 89,1±0,9 Ns 87,2±2,0 1-palmitoilo-LPC 89,7±1,0 91,5±0,9 91,5±1,2 23,4±1,0 30,2±1,0 80,5±1,9 19,2±1,1 9,4±0,2 20,5±0,7 8,6±0,1 13,5±0,3 18,5±0,6 19,3±1,0 39,5±0,9 16,2±0,9 10,9±0,2 12,8±1,0 3,9±0,1 3,9±0,4 GPC 7,0±0,6 1,9±0,2 6,0±0,6 8,3±0,4 2,6±0,2 2,3±0,1 4,5±0,09 4,5±0,4 4,7±0,1 2,6±0,3 5,0±0,5 0,9±0,2 6,8±0,2 4,5±0,1 7,1±0,4 8,3±0,2 3,5±0,2 7,1±0,7 8,7±0,8 3,5±0,1 7,3±0,2 7,8±0,5 3,2±0,2 Ns Ns 10,4±1,3 Ns 7,5±0,6 9,5±0,4 Ns Ns Ns 145 3.5 IZOLOWANIE FOSFOLIPIDÓW z ŻÓŁTEK JAJ ŚWIEŻYCH I LIOFILIZOWANYCH Bardzo ważnym etapem prowadzonych badań było opracowanie wydajnej metody izolowania fosfolipidów z żółtka jaja kurzego. Na tym etapie głównym celem było uzyskanie jak najczystszych frakcji lipidów polarnych tj. fosfolipidów. Zadanie to wymagało opracowania metody, która nie tylko będzie stosowana w skali laboratoryjnej, ale również półtechnicznej. Obecnie przemysłowe metody ekstrakcji fosfolipidów z żółtka jaja kurzego oparte są na dwóch technologiach. Pierwsza polega na wytrącaniu lipidów polarnych za pomocą zimnego acetonu, druga wykorzystuje nowe technologie i oparta jest na ekstrakcji za pomocą CO2 w stanie nadkrytycznym. Stosując te technologie otrzymuje się fosfolipidy o maksymalnej czystości ok. 95% [44]. W literaturze opisywanych jest wiele metod dotyczących ekstrakcji i otrzymywania lecytyny z jaj kurzych. W metodach tych najczęściej stosowane są takie rozpuszczalniki jak eter dietylowy, heksan, chloroform i etanol. Metody te często są wieloetapowymi procesami frakcjonowania co znacznie utrudnia ich wdrożenie w skali przemysłowej. Jedna z takich metod została zaproponowana przez Palaciosa i wsp. [29]. Jest to kilkunastoetapowy proces frakcjonowania umożliwiający uzyskanie fosfolipidów o czystości ok. 96%. W tej pracy przedstawiam metodę, która jest modyfikacją tej procedury. Celem było opracowanie metody znacznie prostszej, a jednocześnie umożliwiającej otrzymywanie fosfolipidów o bardzo wysokiej czystości i z wysoką wydajnością. Opracowana metoda izolowania oparta jest zasadniczo na: liofilizacji żółtka jaja kurzego, odtłuszczeniu acetonem, ekstrakcji lipidów polarnych z wykorzystaniem alkoholu oraz oczyszczaniu uzyskanej surowej frakcji fosfolipidowej poprzez wytrącanie lipidów polarnych w zmrożonym acetonie (Rysunek 38). Proces liofilizacji jest obecnie stosowany głównie do podnoszenia trwałości mikrobiologicznej surowców otrzymywanych z jaj poprzez obniżenie aktywności wody. Liofilizacja powoduje również wzrost wielkości granul lipoproteinowych [346], co może prowadzić do zwiększenia dostępności zawartych w nich fosfolipidów, a tym samym zwiększać wydajność procesu ekstrakcji. 146 Rys. 38. Schemat izolowania fosfolipidów z żółtka jaja kurzego. Głównym celem tej części badań było porównanie efektywności ekstrakcji fosfolipidów z użyciem różnych rozpuszczalników (metanol, etanol, propan-2-ol) oraz wykazanie, czy liofilizacja żółtek wpłynie na polepszenie wydajności oraz czystość i skład ekstraktów fosfolipidowych. Zawartość fosfolipidów oraz cholesterolu oznaczono metodami HPLC. Uzyskane wyniki zebrane są w Tabeli 35. Tabela 35 Skład frakcji fosfolipidowych izolowanych z żółtek jaj kurzych świeżych oraz liofilizowanych (n=3). Ekstrahent Etanol Metanol Rodzaj żółtka świeże Wydajnośća, % 6,7±0,3 7,6±0,5 7,8±0,4 7,7±0,3 5,7±0,8 2,9±0,5 Fosfolipidy ogółem, % 86,3±0,5 93,8±0,5 91,9±0,4 97,6±0,4 97,1±0,3 97,5±0,2 PC, % 70,4±0,2 73,7±0,3 71,5±0,4 75,3±0,6 74,0±0,7 77,3±0,8 PE, % 15,9±0,7 20,1±0,2 20,4±0,4 22,3±0,6 23,1±0,7 20,0±0,5 Cholesterol, % 0,35±0,12 0,19±0,08 0,26±0,13 0,15±0,07 0,28±0,04 0,17±0,05 a b w stosunku do masy całego żółtka; b liofilizowane świeże Propan-2-ol liofilizowane świeże liofilizowane wartość średnia ± odchylenie standardowe Wydajność procesu izolowania fosfolipidów z żółtek malała wraz ze zmniejszaniem się polarności stosowanego alkoholu. Najwyższą wydajność (7,8%) procesu obserwowano dla metanolu. W przypadku tego rozpuszczalnika nie obserwowałem istotnych różnic 147 w wydajności procesu dla żółtka świeżego i liofilizowanego. Dla pozostałych rozpuszczalników postać żółtka z którego ekstrahowano lipidy wpływała w dużym stopniu na wydajność. Ekstrakcja z udziałem etanolu jest wydajniejsza gdy stosujemy żółtko liofilizowane. Natomiast w przypadku propan-2-olu liofilizacja obniżała dwukrotnie wydajność ekstrakcji. Wpływ liofilizacji widoczny jest również w przypadku ogólnej ilości fosfolipidów uzyskiwanych w procesie izolowania. We wszystkich wariantach obserwowano wzrost zawartości fosfolipidów ogółem we frakcjach otrzymywanych z żółtek liofilizowanych w porównaniu do żółtek świeżych. Wynika to prawdopodobnie ze strat fosfolipidów na etapie odtłuszczania, gdzie obecność wody zwiększa rozpuszczalność fosfolipidów w acetonie w przypadku świeżych żółtek. Najwyższa zawartość fosfolipidów występowała dla frakcji uzyskanych poprzez ekstrakcję liofilizowanych żółtek metanolem (97,6%) oraz propan2-olem (97,5%). Dla propan-2-olu nie obserwowano jednak istotnych różnic w ilości fosfolipidów ogółem pomiędzy świeżym, a liofilizowanym żółtkiem. Usuwanie wody z żółtka wpływało również na wzrost zawartości poszczególnych fosfolipidów w uzyskiwanej frakcji. Wyjątkiem była fosfatydyloetanoloamina, której ilość w przypadku propan-2-olu malała podczas ekstrakcji z żółtek liofilizowanych w porównaniu z żółtkami świeżymi. Dodatkowo obserwowałem również zmianę stosunku ilości ekstrahowanej PC do PE dla procesów ekstrakcji fosfolipidów z różnych form żółtka. Dla etanolu stosunek ten malał (od 4,4 do 3,6), w przypadku propan-2-olu obserwowano wzrost (od 3,2 do 4,0) natomiast dla metanolu (3,5) nie ulegał on zmianie po zastosowaniu w procesie ekstrakcyjnym liofilizacji. Ze względu na docelowe zastosowanie uzyskanych ekstraktów fosfolipidowych w przemyśle spożywczym ważnym aspektem badań okazało się określenie zawartości cholesterolu. W przypadku wszystkich stosowanych alkoholi obserwowano około dwukrotny spadek zawartości tego związku w ekstraktach uzyskanych z żółtek liofilizowanych w porównaniu z żółtkami świeżymi. Etapem procesu, który w najwyższym stopniu wpływał na końcową zawartość cholesterolu był proces wytrącania fosfolipidów zmrożonym acetonem, co przedstawiono w Tabeli 36. Podczas tego etapu wykorzystano zjawisko różnic w rozpuszczalności fosfolipidów i cholesterolu w zimnym acetonie. 148 Tabela 36 Zawartość fosfolipidów i cholesterolu w surowych i oczyszczonych frakcjach fosfolipidowych (n=3). Ekstrahent Etanol Metanol Propan-2-ol Frakcja fosfolipidowa surowa oczyszczona surowa oczyszczona surowa oczyszczona Fosfolipidy ogółem, % 68,6±0,5 93,8±0,5 73,9±0,7 97,6±0,4 70,9±0,4 97,5±0,2 Cholesterol, % 0,86±0,22 0,19±0,08 0,91±0,1 0,15±0,07 1,2±0,13 0,17±0,05 Proces wytrącania fosfolipidów acetonem powodował znaczny wzrost czystości uzyskanych końcowych frakcji fosfolipidów o około 25% w stosunku do surowych ekstraktów alkoholowych. Obserwowano jednocześnie znaczący spadek (ok. 80%) zawartości cholesterolu w otrzymanych frakcjach. Podsumowując można stwierdzić, iż najlepszym rozpuszczalnikiem do ekstrakcji fosfolipidów jest metanol. Stosowanie tego alkoholu połączone z etapem wytrącania fosfolipidów zimnym acetonem umożliwia otrzymanie frakcji fosfolipidowej o czystości 97,6% z wysoką wydajnością 7,7% i zawartością cholesterolu 0,15%. Wyższą czystość otrzymanych mieszanin fosfolipidowych uzyskuje się z żółtek zliofilizowanych niż z żółtek surowych. Ważny zauważenia jest fakt, iż w celu otrzymania czystej frakcji fosfolipidowej pozbawionej cholesterolu wymagane jest pięciokrotne powtórzenie procesu wytrącania fosfolipidów zimnym acetonem. Na wydajność tego etapu wpływa również temperatura stosowanego acetonu. Wraz z obniżaniem temperatury zmniejsza się rozpuszczalność fosfolipidów, a przez to ogranicza się ich straty podczas ekstrakcji [43]. 149 4 PODSUMOWANIE I WOLNE WNIOSKI 1. Frakcję lipidową żółtka jaja kurzego izolowałem stosując metodę ekstrakcji zaproponowaną przez Folcha i wsp. Ilościowy skład uzyskanej mieszaniny lipidów analizowałem za pomocą wysokosprawnej chromatografii cieczowej (HPLC). W tym celu opracowałem dwie metody analizy. Pierwsza umożliwiała analizę wszystkich grup lipidów w pojedynczym procesie elucyjnym. W drugiej zastosowałem dodatkowo wstępny rozdział mieszaniny lipidowej na lipidy polarne i niepolarne za pomocą ekstrakcji do fazy stałe (SPE), a następnie osobną analizę HPLC każdej frakcji. 2. Oprócz metody Folcha, stosowanej głównie do celów analitycznych, opracowałem metodę umożliwiającą otrzymywanie czystych ekstraktów fosfolipidów z żółtka jaja kurzego. Procedura oparta jest na czterech podstawowych etapach: liofilizacji żółtek, odtłuszczeniu acetonem, ekstrakcji lipidów polarnych alkoholem oraz wytrącenie fosfolipidów ze zmrożonego acetonu. 3. Opracowaną metodę analizy fosfolipidów z żółtka jaja kurzego za pomocą HPLC zastosowałem dodatkowo, po niewielkiej modyfikacji, do analizy fosfolipidów w mleku krowim. Głównymi fosfolipidami mleka, występującymi w ilości 25 mg/100 ml mleka, są fosfatydylocholina (PC), fosfatydyloetanoloamina (PE), sfingomielina (SM), fosfatydyloseryna (PS) oraz fosfatydyloinozytol (PI). 4. Uzyskane surowe frakcje lipidów z żółtka jaja kurzego rozdzieliłem za pomocą ekstrakcji do fazy stałej w celu określenia profilu kwasów tłuszczowych poszczególnych lipidów (triacyloglicerole, fosfatydylocholina i fosfatydyloetanoloamina). Uzyskane lipidy hydrolizowałem chemicznie, a otrzymane wolne kwasy tłuszczowe oznaczyłem za pomocą HPLC z detektorem naładowanego aerozolu (Corona CAD). 5. W celu optymalizacji procesu rozdziału wolnych kwasów tłuszczowych za pomocą wysokosprawnej chromatografii cieczowej w odwróconym układzie faz (RP-HPLC) określiłem: wpływ długości łańcucha węglowego nasyconych kwasów tłuszczowych na współczynnik retencji (k) oraz wpływ rozpuszczalnika organicznego i temperatury na wartość współczynnika ECL. 150 6. Oznaczyłem także pozycyjne rozmieszczenie kwasów tłuszczowych w fosfolipidach z żółtka jaja kurzego. W tym celu opracowałem cztery różne procedury. W każdej z nich zastosowałem reakcję regioselektywnej hydrolizy fosfolipidów za pomocą biokatalizatora w postaci fosfolipazy A1, fosfolipazy A2 z trzustki wieprzowej lub sn1,3 specyficznej lipazy z Mucor miehei. Produkty reakcji oczyszczałem stosując chromatografie kolumnową, ekstrakcję w układzie woda : heksan lub SPE. Uzyskane kwasy tłuszczowe z pozycji sn-1 lub sn-2 analizowałem bezpośrednio za pomocą HPLC lub jako estry kwasów tłuszczowych stosując chromatografię gazową (GC). 7. Aby umożliwić kontrole reakcji modyfikacji fosfatydylocholiny opracowałem metodę analizy HPLC produktów jej hydrolizy tj. kwasów tłuszczowych, 1-acylolizofosfatydylocholiny, 2-acylo-lizofosfatydylocholiny oraz glicerofosfocholiny w pojedynczym procesie elucyjnym. 8. Metodę analizy produktów hydrolizy PC zastosowałem także do określenia wpływu rodzaju rozpuszczalnika oraz pH na proces migracji reszt acylowych w regioizomerach lizofosfatydylocholiny. 9. Podsumowując można stwierdzić iż, opracowane metody analityczne umożliwiają pełną charakterystykę frakcji lipidowej żółtka jaja kurzego. Dają one możliwość nie tylko ogólnego określenia składu frakcji lipidowej ale również uzyskania bardziej szczegółowych informacji dotyczących poszczególnych klas lipidów. Przedstawiłem możliwości zarówno analizy pozycyjnej jaki i ilościowego określania produktów hydrolizy fosfolipidów. Określiłem także wpływ składu mieszanin reakcyjnych na stabilność regioizomerów fosfatydylocholiny oraz opracowałem metody uzyskiwania tych niestabilnych izomerów w czystej postaci. Dodatkowo uniwersalność opracowanych metod analitycznych udowodniłem stosując je do charakterystyki frakcji lipidowych różnych produktów pochodzenia zarówno zwierzęcego (mleko, żółtko jaja kurzego) jak i roślinnego (lecytyna sojowa). 10. Mimo przeprowadzenia tak kompleksowych analiz planowane są dalsze badania m.in. W celu określenia wpływu rodzaju kwasu tłuszczowego (długość łańcucha, stopnia nienasycenia czy obecność dodatkowych grup funkcyjnych) oraz rodzaju części polarnej cząsteczki fosfolipidu na proces migracji reszt acylowych. Ze względu na najnowsze doniesienia dotyczące znaczenia różnych enancjomerów fosfolipidów 151 w procesach komórkowych planowane jest również opracowanie metod analitycznych umożliwiających rozdział i analizę tych izomerów konfiguracyjnych. 152 5 CZĘŚĆ DOŚWIADCZALNA 5.1 Metody ekstrakcji lipidów z żółtka jaja kurzego 5.1.1 Metoda ekstrakcji frakcji lipidowej z surowego żółtka jaja kurzego (metoda Folcha) Ekstrakcje lipidów z żółtka jaja kurzego przeprowadzono według metody Folcha i wsp. [1]. Surowe żółtko jaja kurzego ekstrahowano mieszaniną chloroform : metanol (2:1, v/v) o objętości dwudziestokrotnie większej niż objętość żółtka (1 g w 20 ml mieszaniny rozpuszczalników) przez 15 -20 minut z użyciem wytrząsarki rotacyjnej (200obr/min). Próbki odwirowano na wirówce (8000 obr/min, 10 min), supernatant zdekantowano. Uzyskany supernatant przepłukano 0,05M roztworem NaCl (0,2 objętości uzyskanego supernatantu; 4 ml r-ru NaCl/20 ml supernatantu) mieszając intensywnie przez kilka sekund z użyciem mieszadła typu Vortex. Następnie w celu rozdzielenia dwóch faz całość odwirowano na wirówce z zastosowaniem niskich prędkości (2000 obr/min, 10 min). Po odwirowaniu ostrożnie usunięto górną warstwę, a dolną chloroformową odparowano na wyparce próżniowej. 5.1.2 Metoda ekstrakcji frakcji lipidowej mleka (metoda Folcha) Ekstrakcje lipidów mleka przeprowadzono stosując metodę Folcha i wsp. [1]. Mleko (5 ml) ekstrahowano 100 ml mieszaniny chloroform : metanol (2:1, v/v) z dodatkiem 10 ml 0,05M NaCl przez 15 minut z użyciem wytrząsarki rotacyjnej (200 obr/min). Próbki odwirowano na wirówce (5000 obr/min, 10 min). Pobrano dolna warstwę chloroformową, a do górnej (wodno-metanolowej) dodano 70 ml chloroformu i ponownie ekstrahowano. Uzyskane frakcje chloroformowe połączono i odparowano rozpuszczalnik na wyparce rotacyjnej. 5.1.3 Metoda ekstrakcji fosfolipidów z surowego żółtka jaja kurzego Pierwszym etapem procesu było odtłuszczenie 30 g żółtka jaja kurzego poprzez ekstrakcje acetonem (2 x 50 ml, 10 min) z wykorzystaniem mieszadła magnetycznego. Otrzymane próbki odwirowano na wirówce (8000obr/min, 10 min), supernatant zdekantowano, a pozostałość ekstrahowano trzykrotnie 50 ml alkoholu (metanol, etanol lub propan-2-ol) przez 15 min. Po odwirowaniu osadów (8000obr/min, 10 min) ekstrakty 153 alkoholowe połączono i odparowano alkohol przy użyciu wyparki próżniowej. Następnie wytrącono fosfolipidy w układzie heksan : aceton. W tym celu surową frakcję fosfolipidową rozpuszczono w 40 ml heksanu i umieszczono w łaźni lodowej. Przy ciągłym mieszaniu (mieszadło magnetyczne) dodano 100 ml acetonu schłodzonego uprzednio do temperatury 20°C. Wytrącony osad fosfolipidów odwirowano (5000 obr/min, 5 min) otrzymując oczyszczoną frakcję fosfolipidów. 5.1.4 Metoda liofilizacji żółtek jaja kurzego Surowe żółtko jaja kurzego (30 g lub 90 g) poddawano zamrożeniu w -20°C i liofilizacji za pomocą aparatu Christ Alpha pod obniżonym ciśnieniem (3Pa) i w temperaturze -54°C przez około 18 godzin. Uzyskano w ten sposób liofilizat o masie 15 g lub 45 g. 5.1.5 Metoda ekstrakcji fosfolipidów ze zliofilizowanego żółtka jaja kurzego Liofilizat uzyskany z 30 g surowego żółtka jaja kurzego odtłuszczano poprzez ekstrakcje acetonem (2 x 50 ml, 10 min) na mieszadle magnetycznym. Następnie próbki odwirowano na wirówce (8000 obr/min, 10 min), supernatant zdekantowano, a pozostałość ekstrahowano trzykrotnie 50 ml alkoholu (metanol, etanol lub propan-2-ol) przez 15 min. Po odwirowaniu osadów (8000obr/min, 10 min) ekstrakty alkoholowe połączono, a alkohol odparowano na wyparce próżniowej. Następnie wytrącono fosfolipidy w układzie heksan : aceton. W tym celu surową frakcję fosfolipidową rozpuszczono w 40 ml heksanu i umieszczono w łaźni lodowej. Przy ciągłym mieszaniu (mieszadło magnetyczne) dodano 100 ml acetonu schłodzonego uprzednio do temp. -20°C. Wytrącony osad fosfolipidów odwirowano (5000 obr/min, 5 min) otrzymując oczyszczoną frakcję fosfolipidów. 5.2 Metody ekstrakcji lipidów z żółtka jaja kurzego za pomocą ekstrakcji do fazy stałej (SPE) 5.2.1 Metoda rozdziału lipidów z żółtka jaja kurzego na frakcje lipidów niepolarnych i polarnych Do ekstrakcji zastosowano kolumienki SPE z żelem krzemionkowym (Discovery® DSCSi SPE 500 mg) wraz z zestawem do ekstrakcji próżniowej SPE. Złoże kondycjonowano 50 ml eluentu, chloroform : metanol (95:5, v/v) w celu usunięcia potencjalnych zanieczyszczeń oraz powietrza. Na tak przygotowaną kolumienkę nanoszono następnie 50 lub 100 mg mieszaniny 154 lipidów rozpuszczonych w 0,2 ml mieszaniny chloroform : metanol (95:5, v/v). Najpierw eluowano lipidy niepolarne za pomocą 7,5 ml mieszaniny chloroform : metanol (95:5, v/v), następnie fosfolipidy 15 ml metanolu. 5.2.2 Metoda rozdziału lipidów mleka na frakcje lipidów niepolarnych i polarnych Rozdział przeprowadzono z zastosowaniem kolumienek SPE z żelem krzemionkowym (Discovery® DSC-Si SPE 500 mg) wraz z zestawem do ekstrakcji próżniowej SPE. Przed właściwym rozdziałem złoże kondycjonowano 10 ml mieszaniny chloroform : metanol (95:5, v/v). Frakcję lipidową (około 100 mg) rozpuszczano w 1,0 ml mieszaniny chloroform : metanol (95:5, v/v), nanoszono na kolumienkę i eluowano kolejno: lipidy niepolarne za pomocą 20 ml mieszaniny chloroform : metanol (95:5, v/v), oraz fosfolipidy, 10 ml metanolu oraz 10 ml mieszaniny chloroform : metanol : woda (3:5:2, v/v/v). 5.2.3 Metoda rozdziału lipidów z żółtka z dodatkowym podziałem lipidów polarnych Lipidy z żółtka jaja kurzego rozdzielono stosując kolumienki SPE z żelem krzemionkowym (Discovery® DSC-Si SPE 500 mg) wraz z zestawem do ekstrakcji próżniowej SPE. Kondycjonowanie fazy stałej przeprowadzono 50 ml mieszaniny chloroform : metanol (95:5, v/v). Na tak przygotowaną kolumienkę nanoszono następnie 50 lub 100 mg mieszaniny lipidów wyekstrahowanych z żółtka jaja kurzego i rozpuszczonych w 0,2 ml mieszaniny chloroform : metanol (95:5, v/v). Lipidy niepolarne eluowano 7,5 ml mieszaniny chloroform : metanol (95:5, v/v). Następnie eluowano fosfatydyloetanoloaminę (PE) stosując 15 ml mieszaniny chloroform : metanol (2:0,5, v/v) oraz fosfatydylocholinę (PC) 12 ml metanolu. 5.2.4 Metoda rozdziału produktów enzymatycznej hydrolizy fosfatydyloetanoloaminy (PE) oraz fosfatydylocholiny (PC) Do rozdziału produktów hydrolizy enzymatycznej PC i PE, przeprowadzonej według metody opisanej w rozdziale 5,4,6, zastosowano kolumienki SPE z żelem krzemionkowym (Discovery® DSC-Si SPE 500 mg). Złoże kondycjonowano 50 ml mieszaniny chloroform : metanol (95:5, v/v). Następnie na kolumienkę nanoszono około 20 mg mieszaniny poreakcyjnej (rozpuszczonej w 0,2 ml mieszaniny chloroform : metanol (95:5, v/v) składającej się z: kwasów tłuszczowych, lizofosfolipidu, AOT oraz śladowych ilości fosfolipidu. 155 Najpierw eluowano kwasy tłuszczowe oraz częściowo AOT za pomocą 10 ml mieszaniny chloroform : metanol (95:5, v/v), a następnie pozostałości AOT oraz śladowe ilości fosfolipidu. Do tego celu w przypadku PC zastosowano 15 ml mieszaniny chloroform : metanol (2:1, v/v), z kolei dla PE użyto 10 ml mieszaniny chloroform : metanol (2:0,5, v/v). Lizofosfolipidy w obu przypadkach eluowano 15 ml metanolu. 5.3 Metody analityczne 5.3.1 Analiza lipidów z żółtka jaja kurzego za pomocą chromatografii cienkowarstwowej (TLC) Chromatografie cienkowarstwową wykonano na płytkach aluminiowych pokrytych żelem krzemionkowym 60 F254 Merck. Jako eluenty stosowano różne mieszaniny rozpuszczalników (heksan, eter dietylowy, chloroform, metanol, woda). Stosowano dwa różne wywoływacze. Pierwszy był roztworem kwasu fosfomolibdenowego i siarczanu (VI) ceru w kwasie siarkowym o składzie 1% Ce(SO4)2 i 2% H3[P(Mo3O10)4] w 10% H2SO4. Drugi to 0,05% roztwór primuliny (aceton : woda, 8:2, v/v), a uwidocznienie plam na chromatogramie następowało po naświetleniu lampą UV emitującą fale o długości 365 nm. 5.3.2 Rozdział fosfolipidów z żółtka jaja kurzego za pomocą chromatografii kolumnowej Chromatografie kolumnową prowadzono na kolumnach szklanych z wypełnieniem w postaci żelu krzemionkowego (Kieselgel 60, 230-400 mesh, Merck). Stosowano eluent chloroform : metanol : woda (65:25:4, v/v/v). 5.3.3 Analiza estrów kwasów tłuszczowych za pomocą chromatografii gazowej (GC) Estry metylowe oraz etylowe kwasów tłuszczowych analizowano na aparatach: Varian CP-3380 lub Agilent Technologies 6890N z użyciem kolumnę TR Fame (30 m x 0,25 mm x 0,25 mm) i detektora płomieniowo-jonizacyjnego (FID). Program temperaturowy: temperatura dozownika 250°C, temperatura detektora 280°C, temperatura kolumny: początkowa 160°C (3 min), 160–220°C (narost 5°C/min), 220–260°C (narost 30°C/min), temperatura końcowa 260°C (3 min). Całkowity czas analizy 19,33 min. 156 5.3.4 Wysokosprawna chromatografia cieczowa (HPLC) 5.3.4.1 System HPLC Wszystkie analizy przeprowadzono z użyciem aparatu Dionex UltiMate 3000, wyposażonego w termostat kolumn TCC-3200, pompę typu DGP-3600A, autosampler WPS3000TSL oraz detektor naładowanego aerozolu Corona CAD. Zastosowano następujące ustawienia detektora CAD: ciśnienie N2 - 35 psi; filtr cyfrowy - None; zakres pracy - 100pA. Kontrola systemu HPLC i zbieranie danych prowadzono za pomocą programu Chromeleon 6,80 (Dionex Corporation). 5.3.4.2 Analiza fosfolipidów w normalnym układzie faz z krzemionkową fazą stałą Analizę przeprowadzono z użyciem kolumny Waters Spherisorb® S5W 5µm (150 × 4,6 mm) z prekolumną zawierającą analogiczną fazę stałą. We wszystkich doświadczeniach stosowano 10 µl nastrzyk próbki. Temperatura kolumny wynosiła 30°C. Identyfikacje analizowanych związków przeprowadzano na podstawie czasów retencji substancji wzorcowych. Tabela 37. Program elucji gradientowej a Faza ruchoma Czas (min) A (%) B (%) C (%) Przepływ (ml/min) 0,0 6,0 21,0 26,0 1 8 1 1 40 40 40 40 59 52 59 59 a b b c 1,0 1,0 1,0 1,0 c Bufor (1%HCOOH, 0,1% TEA), Heksan, Propan-2-ol 5.3.4.3 Analiza fosfolipidów z żółtka jaja kurzego w normalnym układzie faz z diolową fazą stałą Rozdział fosfolipidów przeprowadzono z użyciem kolumny Thermo Betasil DIOL 5 µm (150 × 4,6 mm) z prekolumną zawierającą analogiczną fazę stałą. Temperatura kolumny wynosiła 20°C. We wszystkich doświadczeniach stosowano 10 µl nastrzyk próbki. Analizowane fosfolipidy identyfikowano na podstawie czasów retencji substancji wzorcowych. 157 Tabela 38. Program elucji gradientowej a Faza ruchoma Czas (min) A (%) B (%) C (%) Przepływ (ml/min) 0,0 4,0 9,0 9,1 19,0 3 10 10 3 3 40 40 40 40 40 57 50 50 57 57 a b b c 1,5 1,5 1,5 1,5 1,5 c Bufor (1% kwas mrówkowy; 0,1% trietyloamina), Heksan, Propan-2-ol 5.3.4.4 Analiza fosfolipidów mleka w normalnym układzie faz z diolową fazą stałą Analizę przeprowadzono z użyciem kolumny Thermo Betasil DIOL 5µm (150 × 4,6 mm) z prekolumną zawierającą analogiczną fazę stałą w temperaturze 20°C. We wszystkich doświadczeniach stosowano 10 µl nastrzyk próbki. W celu identyfikacji analizowanych fosfolipidów porównywano ich czasy retencji z czasami retencji substancji wzorcowych. Tabela 39. Program elucji gradientowej a Faza ruchoma Czas (min) A (%) B (%) C (%) Przepływ (ml/min) 0,0 4,0 15,0 15,1 30,0 3 10 10 3 3 40 40 40 40 40 57 50 50 57 57 a b b c 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 c 13% kwas mrówkowy, Heksan, Propan-2-ol 5.3.4.5 Analiza lipidów niepolarnych w normalnym układzie faz z diolową fazą stałą W rozdziału lipidów niepolarnych zastosowano kolumnę Thermo Betasil DIOL 5µm (150 × 4,6 mm) wraz z prekolumną z analogiczną fazę stałą. Temperatura kolumny wynosiła 20°C. We wszystkich doświadczeniach nastrzykiwano 10 µl próbki a oznaczane związki identyfikowano na podstawie czasów retencji substancji wzorcowych. Tabela 40. Program elucji izokratycznej a Faza ruchoma Czas (min) B (%) C (%) Przepływ (ml/min) 0,0 7,0 90 90 10 10 a b 1,0 1,0 b Heksan Propan-2-ol 5.3.4.6 Analiza produktów hydrolizy fosfatydylocholiny W metodzie analizy produktów hydrolizy zastosowano kolumnę Dionex ACCLAIM® Mixed-Mode HILIC-1 5µm (150 × 4,6 mm) z prekolumną zawierającą analogiczną fazę stałą. Temperatura kolumny wynosiła 30°C. We wszystkich doświadczeniach nastrzykiwano 10 µl 158 próbki, a identyfikacje analizowanych związków przeprowadzano na podstawie czasów retencji substancji wzorcowych. Tabela 41. Program elucji gradientowej a Faza ruchoma Czas (min) A (%) B (%) C (%) Przepływ (ml/min) 0,0 15,0 22,0 22,1 47,0 26 1 1 26 26 30 20 20 30 30 44 79 79 44 44 a b b c 0,8 0,8 0,8 0,8 0,8 c Bufor (0,01M octan amonu), Acetonitryl, Metanol 5.3.4.7 Analiza kwasów tłuszczowych w odwróconym układzie faz (RP-HPLC) Wolne kwasy tłuszczowe rozdzielano stosując kolumnę Thermo Hypersil Gold C18 5µm (150 × 4,6 mm) z prekolumną zawierającą analogiczną fazę stałą. We wszystkich doświadczeniach nastrzykiwano 10 µl próbki. Temperatura kolumny wynosiła 25°C. Identyfikację analizowanych związków przeprowadzano na podstawie czasów retencji substancji wzorcowych otrzymanych według procedury opisanej w rozdziale 5,7. Tabela 42. Program elucji gradientowej a Faza ruchoma Czas (min) A (%) B (%) Przepływ (ml/min) 0,0 12,0 15,0 17,0 25,0 25,1 35,0 36 24 24 5 5 36 36 64 76 76 95 95 64 64 a b 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 b Bufor (1% kwas mrówkowy; 0,1% trietyloamina), Acetonitryl 5.3.5 Spektroskopia magnetycznego rezonansu jądrowego (1H NMR, 13C NMR, 31P NMR) Widma 1 H NMR, 13 C NMR, 31 P NMR wykonano dla roztworów związków w mieszaninie CDCl3 : MeOD (2:1 v/v) na spektrometrze Brucker Avance II 600 MHz (Laboratorium Badań Strukturalnych Wrocławskiej). W przypadku 1 NMR H NMR oraz tetrametylosilan (TMS). Natomiast w przypadku Wydziału 13 31 Chemicznego Politechniki C NMR jako wzorzec zastosowano P NMR zastosowano fosforan trifenylu (dodany do analizowanej próbki w zatopionej kapilarze, aby wyeliminować jego oddziaływanie ze związkiem). 159 5.3.6 Spektrometria mas Widma masowe wykonano na spektrometrze micrOTOF-Q firmy Bruker ze źródłem jonów ESI w Laboratorium Spektrometrii Mas Wydziału Chemicznego Uniwersytetu Wrocławskiego. 5.4 Metody chemicznej i enzymatycznej hydrolizy lipidów oraz syntezy estrów kwasów tłuszczowych 5.4.1 Synteza wzorców estrów etylowych kwasów tłuszczowych Wolne kwasy tłuszczowe (10mg) rozpuszczono w 2 ml etanolu. Następnie dodano 1 ml eteratu BF3 (48% BF3). Reakcję estryfikacji prowadzono przez 3 minuty w temperaturze wrzenia. Po tym czasie uzyskane estry etylowe ekstrahowano heksanem (2 ml) i przemywano nasyconym roztworem NaCl. Otrzymaną mieszaninę analizowano za pomocą TLC w układzie heksan : eter dietylowy (7:1; v/v). Frakcję heksanową osuszono dodatkowo bezwodnym MgSO4 i analizowano bezpośrednio za pomocą GC (metodologia analizy GC została szczegółowo przedstawiona w rozdziale 5.3.3.). Otrzymanie estrów etylowych potwierdzono dodatkowo stosując spektroskopię magnetycznego rezonansu jądrowego protonów (1H NMR). 5.4.2 Hydroliza chemiczna fosfolipidów i triacylogliceroli oraz synteza estrów metylowych uwolnionych kwasów tłuszczowych Lipidy (50mg) rozpuszczono w 2 ml 0,5 M metanolowego roztworu NaOH i ogrzewano pod chłodnicą zwrotną przez 2 minuty. Otrzymaną mieszaninę zawierającą zarówno kwasy tłuszczowe jak i ich estry metylowe ogrzewano przez 3 minuty z kompleksem trójfluoroboru (BF3) z metanolem (14%, 5 ml) w jego temperaturze wrzenia w celu estryfikacji pozostałych kwasów tłuszczowych. Po tym czasie uzyskane estry metylowe ekstrahowano heksanem (2 ml) i przemywano nasyconym roztworem NaCl. Otrzymaną mieszaninę analizowano za pomocą TLC w układzie heksan : eter dietylowy (7:1; v/v) oraz metodą chromatografii gazowej (GC) (rozdział 5.3.3). Identyfikacje analizowanych związków przeprowadzano na podstawie czasów retencji substancji wzorcowych. 160 5.4.3 Hydroliza chemiczna fosfolipidów oraz synteza estrów etylowych uwolnionych kwasów tłuszczowych Fosfolipidy (50mg) rozpuszczono w 2 ml 0,5M etanolowego roztworu NaOH i ogrzewano pod chłodnicą zwrotną przez 2 minuty. Otrzymaną mieszaninę zawierającą zarówno kwasów tłuszczowe jak i ich estry etylowe ogrzewano przez 3 minuty z eteratem trójfluoroboru (BF3) (48%, 1,5 ml) w jego temperaturze wrzenia w celu estryfikacji pozostałych kwasów tłuszczowych. Po tym czasie uzyskane estry etylowe ekstrahowano heksanem (2 ml) i przemyto nasyconym roztworem NaCl. Otrzymaną mieszaninę analizowano za pomocą TLC w układzie heksan : eter dietylowy (7:1; v/v) oraz metodą chromatografii gazowej (GC) (rozdział 5.3.3). Analizowane związki identyfikowano na podstawie czasów retencji substancji wzorcowych. 5.4.4 Hydroliza chemiczna triacylogliceroli oraz fosfolipidów w celu uzyskania kwasów tłuszczowych Rozpuszczono około 30 mg lipidów w 2 ml 0,5M etanolowego (95% etanol) roztworu NaOH. Reakcje prowadzono przez 45 min w 50°C. Otrzymaną mieszaninę zakwaszono stosując stężony kwas solny. W wyniku reakcji otrzymane kwasy tłuszczowe ekstrahowano 2 ml heksanu. Uzyskaną mieszaninę analizowano za pomocą TLC w układzie heksan : eter dietylowy (7:1; v/v) oraz metodą wysokosprawnej chromatografii cieczowej (HPLC) (rozdział 5.3.4.7), a analizowane związki analizowano na podstawie czasów retencji substancji wzorcowych. 5.4.5 Enzymatyczna regioselektywna hydroliza fosfolipidów w surowym żółtku jaja kurzego za pomocą fosfolipazy A2 Do 32,2 g świeżych żółtek jaja kurzego dodano 1,5 ml (15 000U) fosfolipazy A2 (Lecitase® 10L). Całość mieszano intensywnie na mieszadle magnetycznym przez 5h w temperaturze 25°C. Postęp reakcji hydrolizy monitorowano za pomocą TLC (chloroform : metanol : woda, 65:25:4, v/v/v) oraz HPLC. Po 5 h mieszaninę ekstrahowano trzykrotnie metanolem (3 x 100 ml). Ekstrakty połączono ze sobą, rozpuszczalnik odparowano pod zmniejszonym ciśnieniem, a pozostałość ekstrahowano dwukrotnie eterem dietylowym (2 x 80 ml). Z pozostałości po ekstrakcji odparowano rozpuszczalnik otrzymując 1,65g mieszaniny. 1-Acylo-lizofosfatydylocholinę (0,75 g) oraz 1-acylo-lizofosfatydyloetanoloaminę 161 (0,19 g) oczyszczono metodą chromatografii kolumnowej stosując jako eluent mieszaninę chloroform : metanol : woda (65:25:4, v/v/v). 5.4.6 Enzymatyczna regioselektywna etanoliza fosfatydylocholiny (PC) za pomocą sn-1,3 specyficznej lipazy z Mucor miehei Enzymatyczną etanolizę fosfatydylocholiny z żółtka jaja kurzego przeprowadzono według metody Adlercreutza i Wehtje [94]. 0,05 g PC rozpuszczono w 2,0 ml etanolu (95%), dodano 0,4 g (40U) immobilizowanej lipazy z Mucor miehei (Lipozyme) i mieszano na mieszadle magnetycznym w 25°C. Postęp reakcji hydrolizy monitorowano za pomocą TLC (chloroform : metanol : woda, 65:25:4, v/v/v) oraz HPLC. Analizę składu mieszaniny końcowej zbadano dodatkowo za pomocą TLC w układzie heksan : eter dietylowy (7:1, v/v) w celu wykrycia estrów etylowych kwasów tłuszczowych (FAEE). Reakcje przerwano po 8h oddzielając enzym poprzez filtracje i przepłukując dodatkowo 10 ml etanolu (95%). Etanol odparowano w 45°C na wyparce rotacyjnej pod obniżonym ciśnieniem. 5.4.7 Enzymatyczna regioselektywna hydroliza fosfatydylocholiny i fosfatydyloetanoloaminy za pomocą fosfolipazy A1 oraz fosfolipazy A2 Enzymatyczną hydrolizę PC lub PE z żółtka jaja kurzego przeprowadzono według metody opisanej przez Morgado i wsp. [339]. Do dwóch osobnych fiolek naważono 0,041 g PC lub PE (I fiolka) i 0,014 g AOT (II fiolka), a następnie rozpuszczono w 1,1 ml izooktanu. Mieszaniny inkubowano w temperaturze 40oC intensywnie mieszając na mieszadle magnetycznym. Po 0,5 h inkubacji do fiolki zawierającej AOT dodano 26,3 µl PLA1 lub PLA2 (263U) (w zależności od pozycji hydrolizowanego wiązania) oraz 17,6 µl buforu Tris-HCl (pH 8,5, 0,1M) zawierającego jony wapnia (0,75 M CaCl2) niezbędne do aktywności fosfolipazy. Reakcję rozpoczęto dodając roztwór zawierający PC (I fiolka) do mieszaniny zawierającej AOT, izooktan oraz enzym (II fiolka). Operację tą przeprowadzono przy intensywnym mieszaniu. Kolejność dodawania składników mieszaniny reakcyjnej jest niezwykle ważna dla wydajnej hydrolizy. Postęp reakcji hydrolizy monitorowano za pomocą TLC (chloroform : metanol : woda, 65:25:4, v/v/v) oraz HPLC (rozdział 5.3.4.3). Enzym oddzielono od pozostałych składników mieszaniny przesączając przez warstwę ziemi okrzemkowej (CELITE ® 545), przepłukując metanolem i odparowując nadmiar metanolu przy użyciu wyparki próżniowej. Uzyskaną w wyniku hydrolizy 1-acylo- lub 2-acylo-LPC oraz kwasy tłuszczowe 162 oczyszczano za pomocą chromatografii kolumnowej (chloroform : metanol : woda, 65:25:4, v/v/v) lub SPE wg metody przedstawionej w rozdziale 5.2.4. 5.5 Dwuenzymatyczne metody pozycyjnej analizy fosfatydylocholiny 5.5.1 Analiza składu kwasów tłuszczowych w pozycji sn-1 oraz sn-2 fosfatydylocholiny z żółtka jaja kurzego (metoda I) Pozycja sn-1. Pierwszym etapem była hydroliza PC w pozycji sn-2 w celu uzyskania 1acylo-lizofosfatydylocholiny (1-acylo-LPC). Reakcję przeprowadzono bezpośrednio w surowym żółtku jaja kurzego według procedury opisanej w rozdziale 5.4.4. Do 45 g świeżych żółtek jaja kurzego dodano 3,0 ml (30 000U) fosfolipazy A2 (Lecitase® 10L). Całość mieszano intensywnie na wytrząsarce rotacyjnej przez 2h w temperaturze 25°C. Postęp reakcji hydrolizy monitorowano za pomocą TLC (chloroform : metanol : woda, 65:25:4, v/v/v) oraz HPLC. Analizę przeprowadzono z użyciem kolumny Thermo Betasil DIOL 5 µm (150 x 4,6 mm), a jako eluentu mieszaniny buforu (1% HCOOH, 0,1%TEA), heksanu oraz propan-2-olu (patrz rozdział 5.3.4.3). Po tym czasie mieszaninę ekstrahowano trzykrotnie metanolem (3 x 160 ml). Frakcje zawierające 1-acylo-LPC połączono i odparowano do sucha w 60°C na wyparce rotacyjnej oraz poddano hydrolizie chemicznej, a uwolnione kwasy tłuszczowe przeprowadzono w estry metylowe wg metody przedstawionej w rozdziale 5.4.1. Uzyskane estry metylowe kwasów tłuszczowych analizowano za pomocą GC (patrz rozdział 5.3.3) uzyskując w ten sposób informacje na temat składu kwasów tłuszczowych w pozycji sn-1 glicerofosfatydylocholiny. Pozycja sn-2. 2-Acylo-lizofosfatydylocholinę (2-acylo-LPC) uzyskano poprzez enzymatyczną hydrolizę PC według metody opisanej przez Morgado i wsp. [339]. Do dwóch osobnych fiolek naważono 0,02 g PC oraz 2,0 mg AOT, a następnie rozpuszczono w 0,15 ml izooktanu. Mieszaniny inkubowano w temperaturze 40oC intensywnie mieszając na mieszadle magnetycznym. Po 0,5 h inkubacji do fiolki zawierającej AOT dodano 3,0 µl PLA1 oraz 3,0 µl buforu Tris-HCl (pH 8,5, 0,1 M) zawierającego jony wapnia (0,75 M CaCl2) niezbędne do aktywności fosfolipazy. Reakcję rozpoczęto dodając do mieszaniny zawierającej AOT, izooktan i enzym roztwór zawierający PC. Operację tą przeprowadzono przy intensywnym mieszaniu. Postęp reakcji hydrolizy monitorowano za pomocą TLC (chloroform : metanol : woda, 65:25:4, v/v/v). Enzym oddzielono od pozostałych składników 163 mieszaniny przesączając przez warstwę ziemi okrzemkowej (CELITE® 545), przepłukując metanolem i odparowując nadmiar metanolu na wyparce próżniowej. Uzyskaną w wyniku hydrolizy 2-acylo-LPC oczyszczano za pomocą chromatografii kolumnowej (chloroform : metanol : woda, 65:25:4, v/v/v). Następnie poddano ją hydrolizie chemicznej, a uwolnione kwasy tłuszczowe przeprowadzono w estry metylowe wg metody przedstawionej w rozdziale 5.4.1. Uzyskane estry metylowe kwasów tłuszczowych analizowano za pomocą GC (rozdział 5.3.3) uzyskując w ten sposób informacje na temat składu kwasów tłuszczowych w pozycji sn-1 PC. 5.5.2 Analiza składu kwasów tłuszczowych w pozycji sn-1 oraz sn-2 fosfatydylocholiny z soi oraz żółtka jaja kurzego (metoda II) Pozycja sn-1. Enzymatyczną hydrolizę PC z soi przeprowadzono według metody opisanej przez Morgado i wsp. [339]. Do dwóch osobnych fiolek naważono 0,02 g PC i 2,0 mg AOT, a następnie rozpuszczono w 0,15 ml izooktanu. Mieszaniny inkubowano w temperaturze 40oC intensywnie mieszając na mieszadle magnetycznym. Po 0,5 h inkubacji do fiolki zawierającej AOT dodano 3,0 µl PLA2 oraz 3,0 µl buforu Tris-HCl (pH 8,5, 0,1M) zawierającego jony wapnia (0,75 M CaCl2) niezbędne do aktywności fosfolipazy. Reakcję rozpoczęto dodając do mieszaniny składającej się z AOT, izooktanu i enzymu roztwór zawierający PC. Operację tą przeprowadzono przy intensywnym mieszaniu. Postęp reakcji hydrolizy monitorowano za pomocą TLC (chloroform : metanol : woda, 65:25:4, v/v/v). Enzym oddzielono od pozostałych składników mieszaniny przesączając przez warstwę ziemi okrzemkowej (CELITE® 545), przepłukując metanolem i odparowując nadmiar metanolu na wyparce próżniowej. Uzyskaną w wyniku hydrolizy 1-acylo-LPC oczyszczano za pomocą chromatografii kolumnowej (chloroform : metanol : woda, 65:25:4, v/v/v). Następnie poddano ją hydrolizie chemicznej, a uwolnione kwasy tłuszczowe przeprowadzono w estry metylowe wg metody przedstawionej w rozdziale 5.4.1. Uzyskane estry metylowe kwasów tłuszczowych analizowano za pomocą GC (rozdział 5.3.3) uzyskując w ten sposób informacje na temat składu kwasów tłuszczowych w pozycji sn-1 PC. Pozycja sn-2. Analizę składu kwasów tłuszczowych w pozycji sn-2 cząsteczki fosfatydylocholiny przeprowadzono według analogicznej metody przedstawionej dla analizy 164 w pozycji sn-1. Jedyną różnicą był rodzaj zastosowanego biokatalizatora (fosfolipazy A 1 – PLA1) katalizującego hydrolizę wiązanie estrowego w pozycji sn-1 cząsteczki. 5.6 Jednoenzymatyczne metody pozycyjnej analizy fosfatydylocholiny 5.6.1 Pozycyjna analiza fosfatydylocholiny (metoda III) Pozycja sn-1 oraz sn-2. Glicerofosfatydylocholinę hydrolizowano enzymatycznie wg metody zaproponowanej przez Adlercreutza i Wehtje [94]. 0,05g PC rozpuszczono w 2,0 ml etanolu (95%), dodano 0,4 g (40U) immobilizowanej lipazy z Mucor miehei (Lipozyme) i mieszano na mieszadle magnetycznym w 25°C. Postęp reakcji hydrolizy monitorowano za pomocą TLC (chloroform : metanol : woda, 65:25:4, v/v/v). Reakcje przerwano po 8h oddzielając enzym poprzez filtracje i przepłukując dodatkowo 10 ml etanolu (95%). Etanol odparowano w 45°C na wyparce rotacyjnej pod obniżonym ciśnieniem. Uzyskane produkty reakcji zawieszono w 2 ml wody i mieszano intensywnie na mieszadle typu vortex przez kilka sekund. Uzyskaną zawiesinę przeniesiono do 15 ml fiolki i dodano ostrożnie 3 ml heksanu w celu ekstrakcji kwasów tłuszczowych i estrów etylowych kwasów tłuszczowych uwolnionych z pozycji sn-1 hydrolizowanej cząsteczki. Taką mieszaninę mieszano na wytrząsarce rotacyjnej, a następnie rozdzielono na dwie frakcję: wodną oraz heksanową. Czystość frakcji heksanowej analizowano za pomocą TLC (eluent: heksan : eter dietylowy, 7:1, v/v). Heksan odparowano pod zmniejszonym ciśnieniem. Następnie do pozostałości zawierającej estry etylowe kwasów tłuszczowych oraz kwasy tłuszczowe dodano 2 ml bezwodnego etanolu i 1 ml eteratu BF3. Całość ogrzewano pod chłodnicą zwrotną w celu estryfikacji kwasów tłuszczowych. Postęp reakcji kontrolowano za pomocą TLC (heksan : eter dietylowy, 7:1, v/v). Po ochłodzeniu mieszaninę ekstrahowano 1 ml heksanu i przemyto 5 ml nasyconego roztworu NaCl. Ekstrakt heksanowy osuszono siarczanem magnezu i analizowano za pomocą GC (rozdział 5.3.3). Frakcje wodną zawierającą 2-acylo-LPC analizowano za pomocą TLC (chloroform : metanol : woda, 65:25:4, v/v/v) i odparowano w 60°C pod zmniejszonym ciśnieniem. Pozostałość rozpuszczono w 0,5 ml heksanu i przeniesiono do gilzy wirówkowej. Następnie dodano zmrożony aceton (-20°C, 10 ml) w celu wytrącenia 2-acylo-LPC i usunięcia niewyekstrahowanej pozostałości kwasów tłuszczowych i ich estrów etylowych. Mieszaninę odwirowywano przez około 1 minutę. Po tym czasie usunięto supernatant, a 10 mg czystej 165 2-acylo-LPC hydrolizowano chemicznie, a uwolnione kwasy estryfikowano do estrów etylowych według metody przedstawionej w punkcie 5. Uzyskane estry etylowe kwasów tłuszczowych analizowano na pomocą GC (rozdział 5.3.3) uzyskując skład kwasów tłuszczowych w pozycji sn-2 PC. 5.6.2 Pozycyjna analiza fosfatydylocholiny oraz fosfatydyloetanoloaminy (metoda IV) Pozycja sn-1 oraz sn-2. Enzymatyczną hydrolizę PC oraz PE w pozycji sn-2 przeprowadzono według metody opisanej przez Morgado i wsp. [339]. Do dwóch osobnych fiolek naważono 0,02 g fosfolipidu (PC lub PE) i 2,0 mg AOT, a następnie rozpuszczono w 0,15 ml izooktanu. Mieszaniny inkubowano w temperaturze 40oC intensywnie mieszając na mieszadle magnetycznym. Po 0,5 h inkubacji do fiolki zawierającej AOT dodano 3,0 µl PLA2 oraz 3,0 µl buforu Tris-HCl (pH 8,5, 0,1M) zawierającego jony wapnia (0,75 M CaCl2) niezbędne do aktywności fosfolipazy. Reakcję rozpoczęto dodając do mieszaniny z: AOT, izooktanem i enzymem mieszaninę zawierającą fosfolipid. Operację tą przeprowadzono przy intensywnym mieszaniu. Postęp reakcji hydrolizy monitorowano za pomocą TLC (chloroform : metanol : woda, 65:25:4, v/v/v). Enzym oddzielono od pozostałych składników mieszaniny przesączając przez warstwę ziemi okrzemkowej (CELITE® 545), przepłukując metanolem i odparowując nadmiar metanolu na wyparce próżniowej. Uzyskaną w wyniku hydrolizy mieszaninę 1-acylo-lizofosfolipidu oraz kwasów tłuszczowych uwolnionych z pozycji sn-2 cząsteczki fosfolipidu rozdzielano za pomocą ekstrakcji do fazy stałej (SPE). Rozdział przeprowadzono z zastosowaniem kolumienek SPE z żelem krzemionkowym (Discovery® DSC-Si SPE 500 mg) wraz z zestawem do ekstrakcji próżniowej SPE. Złoże kondycjonowano 50 ml eluentu chloroform : metanol (95:5, v/v). Mieszaninę produktów reakcji rozpuszczano w 0,2 ml mieszaniny chloroform : metanol (95:5, v/v), nanoszono na kolumienkę i eluowano kwasy tłuszczowe oraz AOT za pomocą 10,0 ml mieszaniny chloroform : metanol (95:5, v/v). Następnie w celu usunięcia niezhydrolizowanych fosfolipidów oraz pozostałości AOT stosowano: 10 ml mieszaniny chloroform : metanol (2:0,5, v/v) w przypadku fosfatydyloetanoloaminy oraz 15 ml eluentu chloroform : metanol (2:1, v/v) dla fosfatydylocholiny. 1-Acylo-LPC oraz 1-acylo-LPE eluowano w fazie końcowej 15 ml metanolu. 166 Frakcję kwasów tłuszczowych analizowano bezpośrednio za pomocą HPLC natomiast 1-acyloLPC oraz 1-acylo-LPE dodatkowo hydrolizowano według procedury przedstawionej w rozdziale 5.4.3. Uzyskane wolne kwasy tłuszczowe również analizowano za pomocą HPLC (rozdział 5.3.4.7). 5.7 Fosfolipidy syntetyczne 5.7.1 Przygotowanie kompleksu sn-glicero-3-fosfocholiny i chlorku kadmu (GPC x CdCl2) Sn-glicero-3-fosfocholinę (GPC) (7,71 g, 30 mmola) rozpuszczono w metanolu (50 ml) i dodano powoli do roztworu chlorku kadmu CdCl2x H2O (6,85 g, 30 mmola) w wodzie (20 ml). Zawiesinę mieszano w 0°C przez 4 godziny. Powstały osad oddzielono przez filtrację i przemyto metanolem (20 ml). Osad GPC x CdCl2 liofilizowano do uzyskania białego proszku dodatkowo suszonego przez 24 godziny pod obniżonym ciśnieniem i w obecności P2O5 za pomocą pistoletu suszącego w temperaturze wrzenia acetonu. 5.7.2 Synteza 1,2-dipalmitoilo-sn-glicero-3-fosfocholiny (DPPC) Kwas palmitynowy suszono przez wielokrotne odparowywanie bezwodnej mieszaniny CH2Cl2 : benzen (1:1, v/v). Następnie kompleks GPC x CdCl2 zawieszano w roztworze kwasu palmitynowego (1,03 g, 4 mmole) w suchym CH2Cl2 (30 ml) zawierającym 4-(dimetyloamino)pirydynę (244 mg, 2 mmole) i dodano N,N’-dicykloheksylokarbodiimid (DCC) (865 mg, 4,2 mmole) rozpuszczony w CH2Cl2 (10 ml). Zawiesinę mieszano w temperaturze pokojowej w atmosferze azotu. Postęp reakcji kontrolowano za pomocą HPLC (rozdział 5.3.4.3) oraz TLC (CHCl3 : MeOH : H2O, 65:25:4, v/v/v). Po 16 godzinach, wytracony osad usuwano przez filtrację, a chlorek kadmu i 4(dimetylo-amino)pirydynę za pomocą żywicy jonowymiennej Dowex 50W X8. Po 30 minutach mieszania żywica była usuwana przez filtracje, a rozpuszczalnik odparowywano pod zmniejszonym ciśnieniem. 1,2-dipalmitoilo-sn-glicero-3-fosfocholinę oczyszczano za pomocą chromatografii kolumnowej (CHCl3 : MeOH : H2O, 65:25:4, v/v/v) uzyskując 610 mg produktu o czystości >98%. 167 1,2-dipalmitoilo-sn-glicero-3-fosfocholina (DPPC) O O O O O O P O - O + N Biała substancja stała; Wydajność: 83,0 %; TLC Rf: 0,42 (CHCl3 – MeOH – H2O 65:25:4 v/v/v), HPLC Rt = 20,513 min; HRMS m/z obliczony dla [M+H]+ C24H51NO7P 734,5694, oznaczony 734,5705; 1 H NMR (600 MHz, CDCl3 – MeOD 2:1 v/v) δ: 0,89 (6H, t, J = 7,0 Hz, 2× CH3-16), 1,39 – 1,21 (48H, m, 2× 12 -CH2-), 1,56 – 1,66 (4H, m, 2× CH2-3), 2,32 (2H, t, J = 8,0 Hz, CH2-2), 2,34 (2H, t, J = 8,0 Hz, CH2-2), 3,23 (9H, s, -N(CH3)3), 3,59 - 3,65 (2H, m, CH2-β), 4,01 (2H, dd, 3JHP = 6,6 Hz, 3JH3’H2’ = 5,9 Hz, CH2-3’), 4,17 (1H, dd, 2J = 12,0, 3JH1’H2’ = 7,0 Hz, jeden z H-1’), 4,22 – 4,31 (2H, m, CH2-α), 4,43 (1H, dd, 2J = 12,0, 3JH1’H2’ = 3,0 Hz, jeden z H-1’), 5,24 (1H, m, H-2’); 13 C NMR (150 MHz, CDCl3 – MeOD 2:1 v/v) δ: 14,2 (2x C-16), 23,0 (2x C-15), 25,2 (C-3), 25,3 (C-3), 29,5-30,1 (2x C-4 – C-13), 32,3 (2x C-14), 34,5 (C-2), 34,6 (C-2), 54,4 (t, JCN = 3,7 Hz, N(CH3)3), 59,5 (d, 2JCP = 4,9 Hz, C-α), 63,1 (C-1’), 64,0 (d, 2JCP = 5,3 Hz, C-3’), 66,8 (dt, 3JCP = 6,9 Hz, 1JCN = 3,2 Hz, C-β), 70,8 (d, 3J= 7,8 Hz, C-2’), 174,0 (C-1), 174,4 (C-1); 31 P NMR (243 MHz, CDCl3 – MeOD 2:1 v/v) δ: -0,48; 5.7.3 Enzymatyczna etanoliza 1,2-dipalmitoilo-sn-glicero-3-fosfocholina (DPPC) do 1hydroksy-2-palmitoilo-sn-glicero-3-fosfocholiny (2-palmitoilo-LPC) DPPC (50 mg) rozpuszczono w 2,5 ml etanolu (96%), dodano 0,4 g (40U) immobilizowanej lipazy z Mucor miehei (Lipozyme) i mieszano na mieszadle magnetycznym w 25°C. Postęp reakcji hydrolizy monitorowano za pomocą TLC (chloroform : metanol : woda, 65:25:4, v/v/v) oraz HPLC (rozdział 5.3.4.3). Reakcje przerwano po 12h oddzielając enzym poprzez filtracje i przepłukując dodatkowo 10 ml metanolu. Rozpuszczalnik odparowano w 45°C na wyparce rotacyjnej pod obniżonym ciśnieniem. Pozostałość 168 rozpuszczono w 0,3 ml chloroformu. Całość umieszczono w łaźni wodnej i dodano 5 ml zmrożonego acetonu (-20°C) powodując wytrącenie 2-palmitoilo-LPC. Całość mieszano przez 5 minut na mieszadle magnetycznym. Po wyłączeniu mieszadła mieszaninę pozostawiono na kilka minut, a następnie usunięto roztwór znad osadu, a do pozostałości dodano kolejną porcję zimnego acetonu. Procedurę przemywania osadu acetonem powtórzono sześciokrotnie. Proces oczyszczania kontrolowano za pomocą TLC (heksan : eter dietylowy, 7:1, v/v) i HPLC (rozdział 5.3.4.3). Następnie aceton odparowano na wyparce rotacyjnej w 45°C uzyskując 32 mg mieszaniny o składzie: 3% GPC, 6% 1-palmitoilo-LPC oraz 91% 2palmitoilo-LPC. 1-hydroksy-2-palmitoilo-sn-glicero-3-fosfocholina (2-palmitoilo-LPC) OH O O O O P O - O + N Biała substancja stała; Wydajność: 94,5%; TLC Rf: 0,17 (CHCl3:MeOH:H2O, 65:25:4, v/v/v), HPLC Rt = 9,592 min; HRMS m/z wyliczony dla [M+H]+ C24H51NO7P 496,3398, oznaczony 496,3417; 1 H NMR(600 MHz, CDCl3 – MeOD 2:1 v/v) δ: 0,89 (3H, t, J=7,0 Hz, CH3-16), 1,22 - 1,36 (24H, m, 12x -CH2-), 1,58 - 1,66 (2H, m, CH2-3), 2,36 (2H, t, J=7,2 Hz, CH2-2), 3,23 (9H, s, -N(CH3)3), 3,60 – 3,64 (2H, m, CH2-β), 3,71 (1H, dd, 2J = 12,1, 3JH1’H2 = 4,9 Hz, jeden z H-1’), 3,75 (1H, dd, 2 J = 12,1, 3JH1’H2 = 5,2 Hz, jeden z H-1’), 3,98 – 4,06 (2H, m, CH2-3’), 4,23 – 4,31 (2H, m, CH2-α), 5,01 – 4,95 (1H, m, H-2’); 13 C NMR(150 MHz, CDCl3 – MeOD 2:1 v/v) δ: 14,2 (C-16), 23,0 (C-15), 25,2 (C-3), 29,5 – 30,0 (C-4 – C-13), 32,2 (C-14), 34,5 (C-2), 54,3 (t, JCN = 3,2 Hz, -N(CH3)3), 59,4 (d, 2JCP = 4,7 Hz, C-α), 60,2 (C-1’), 63,5 (d, 2JCP = 5,2 Hz, C-3’) , 66,7 (dt, 3JCP = 6,8 Hz, 1JCN = 3,2 Hz, C-β), 73,6 (d, 3J= 7,6 Hz, C-2’) , 174,3 (C-1); 31 P NMR(243 MHz, CDCl3 – MeOD 2:1 v/v) δ: - 0,06; 169 5.7.4 Enzymatyczna hydroliza 1,2-dipalmitoilo-sn-glicero-3-fosfocholiny (DPPC) do 1palmitoilo-2-hydroksy-sn-glicero-3-fosfocholiny (1-palmitoilo-LPC) Przygotowano dwie mieszaniny reakcyjne. Pierwsza zawierała: 0,041g DPPC w 1,1 ml izooktanu, druga 0,014g AOT również w 1,1 ml izooktanu. Mieszaniny inkubowano w temperaturze 40oC przez 0,5 godziny intensywnie mieszając na mieszadle magnetycznym. Po tym czasie do roztworu AOT dodano 26,3 µl PLA2 (263U) 17,6 µl buforu Tris-HCl (pH 8,5, 0,1M) zawierającego jony wapnia (0,75 M CaCl2). Reakcję hydrolizy rozpoczęto dodając do tak przygotowanej mieszaniny zawierającej AOT, izooktan, bufor oraz enzym inkubowany wcześniej roztwór zawierający DPPC. Postęp reakcji hydrolizy monitorowano za pomocą TLC (chloroform : metanol : woda, 65:25:4, v/v/v) oraz HPLC (rozdział 5.3.4.3). Reakcję przerwano po 10 minutach, enzym oddzielono od pozostałych składników mieszaniny przesączając przez warstwę ziemi okrzemkowej (CELITE® 545), przepłukując metanolem i odparowując nadmiar metanolu na wyparce próżniowej. Uzyskaną w wyniku hydrolizy 1palmitoilo-LPC oczyszczano za pomocą chromatografii kolumnowej (chloroform : metanol : woda, 65:25:4, v/v/v). Frakcję zawierające 1-palmitoilo-LPC połączono, a rozpuszczalnik odparowano na wyparce rotacyjnej w 45°C uzyskując 24,5 mg mieszaniny o składzie: 1,9% GPC, 1,3% 2-palmitoilo-LPC oraz 96,8% 1-palmitoilo-LPC. 1-Palmitoilo-2-hydroksy-sn-glicero-3-fosfocholina (1-palmitoilo-LPC) O O HO O O P O - O + N Biała substancja stała; Wydajność: 98,8%; TLC Rf: 0,17 (CHCl3:MeOH:H2O, 65:25:4, v/v/v), HPLC Rt = 10,257min; HRMS m/z wyliczony dla [M+H]+ C24H51NO7P 496,3398, oznaczony 496,3435; 1 H NMR(600 MHz, CDCl3 – MeOD 2:1 v/v) δ: 0,88 (3H, t, J=7,0 Hz, CH3-16), 1,19 - 1,32 (24H, m, 12x -CH2-), 1,57 - 1,65 (2H, m, CH2-3), 2,34 (2H, t, J=7,5 Hz, CH2-2), 3,22 (9H, s, -N(CH3)3), 3,58 – 3,64 (2H, m, CH2-β), 3,88 (1H, m, jeden z CH2-3’), 3,94 (1H, m, jeden z CH2-3’), 3,98 170 (1H, m, H-2’), 4,11 (1H, dd, 2J =11,3, 3JH1’H2 = 6,2 Hz, jeden z H-1’), 4,16 (1H, dd, 2J=11,3, 3JH1’H2 = 4,6 Hz, jeden z H-1’), 4,23 – 4,31 (2H, m, CH2-α); 13 C NMR(150 MHz, CDCl3 – MeOD 2:1 v/v) δ: 14,1 (C-16), 22,9 (C-15), 25,3 (C-3), 29,5 – 30,0 (C-4 – C-13), 32,2 (C-14), 34,4 (C-2), 54,3 (t, JCN = 3,7 Hz, -N(CH3)3), 59,4 (d, 2JCP = 5,0 Hz, C-α), 65,4 (C-1’), 66,8 (dt, 3JCP = 6,8 Hz, 1JCN = 3,2 Hz, C-β), 67,2 (d, 2JCP = 5,7 Hz, C-3’) , 69,0 (d, 3J= 6,8 Hz, C-2’) , 174,8 (C-1); 31 P NMR (243 MHz, CDCl3 – MeOD 2:1 v/v) δ: 0,11; 5.8 Badanie procesu migracji reszt acylowych w cząsteczce 1-palmitoilo-LPC oraz 2-palmitoilo-LPC W celu analizy procesu migracji reszt acylowych w cząsteczkach 1-palmitoilo-LPC oraz 2-palmitoilo-LPC zastosowano 17 różnych rozpuszczalników. Poszczególne regioizomery LPC (1 mg) rozpuszczano lub zawieszano w 0,5 ml odpowiedniego rozpuszczalnika w 25°C. Próbki (10 µl) pobierano w stałych odstępach czasu, rozpuszczano w 90 µl mieszaniny chloroform : metanol (2:1, v/v) i natychmiast analizowano za pomocą HPLC nastrzykując na kolumnę 10 µl roztworu. Rozdział HPLC prowadzono z zastosowaniem kolumny Acclaim® Mixed-Mode HILIC-1 5 µm (4,6 mm × 150 mm). Elucje gradientową prowadzono stosując mieszaninę 0,01M roztworu octanu amonu, acetonitrylu oraz metanolu (szczegółowy opis metodologii HPLC przedstawiono w rozdziale 5.3.4.6). 171 6 LITERATURA 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. 11. 12. 13. 14. 15. 16. 17. 18. 19. 20. 21. 22. 23. Folch J, Lees M, Stanley GHS: A simple method for the isolation and purification of total lipides from animal tissues. Journal of Biological Chemistry 1957, 226(1):497-509. Guo Z, Vikbjerg AF, Xu X: Enzymatic modification of phospholipids for functional applications and human nutrition. Biotechnology Advances 2005, 23(3):203-259. Bringe NA, Howard DB, Clark DR: Emulsifying Properties of Low-fat, Low-cholesterol Egg Yolk Prepared by Supercritical CO2 Extraction. Journal of Food Science 1996, 61(1):19-23. Bhardwaj U, Burgess DJ: Physicochemical properties of extruded and non-extruded liposomes containing the hydrophobic drug dexamethasone. International Journal of Pharmaceutics 2010, 388(1-2):181-189. Haraldsson G, Thorarensen A: Preparation of phospholipids highly enriched with n-3 polyunsaturated fatty acids by lipase. Journal of the American Oil Chemists' Society 1999, 76(10):1143-1149. Reddy J, Vijeeta T, Karuna M, Rao B, Prasad R: Lipase-catalyzed preparation of palmitic and stearic acid-rich phosphatidylcholine. Journal of the American Oil Chemists' Society 2005, 82(10):727-730. Chojnacka A, Gładkowski W, Kiełbowicz G, Wawrzeńczyk C: Enzymatic enrichment of eggyolk phosphatidylcholine with α-linolenic acid. Biotechnology Letters 2009, 31(5):705-709. Niezgoda N, Mituła P, Wawrzeńczyk C: Otrzymanie sprzężonego kwasu linolowego (CLA). Przemysł Chemiczny 2011, 90(5):949-957. Smuga DA, Smuga M, Swizdor A, Panek A, Wawrzenczyk C: Synthesis of dehydroepiandrosterone analogues modified with phosphatidic acid moiety. Steroids 2010, 75(13-14):1146-1152. Wawrzeńczyk C, Tubek B, Smuga D, Smuga M: Synthesis of 28- O -(1,2-diacyl-sn-glycero-3phospho)-betulin. Synthetic Communications 2012 DOI: 10.1080/00397911.2011.588817. Kączkowski J: Podstawy biochemii, Wydanie trzynaste edn. Warszawa; 2002. Fernandis AZ, Wenk MR: Membrane lipids as signaling molecules. Current Opinion in Lipidology 2007, 18(2):121-128 110,1097/MOL,1090b1013e328082e328084d328085. Irvine RF: Nuclear lipid signalling. Nat Rev Mol Cell Biol 2003, 4(5):349-361. Di Paolo G, De Camilli P: Phosphoinositides in cell regulation and membrane dynamics. Nature 2006, 443(7112):651-657. Sud M, Fahy E, Cotter D, Brown A, Dennis EA, Glass CK, Merrill AH, Murphy RC, Raetz CRH, Russell DW et al: LMSD: LIPID MAPS structure database. Nucleic Acids Research 2007, 35(suppl 1):D527-D532. van Meer G, Voelker DR, Feigenson GW: Membrane lipids: where they are and how they behave. Nat Rev Mol Cell Biol 2008, 9(2):112-124. Hannun YA, Obeid LM: Principles of bioactive lipid signalling: lessons from sphingolipids. Nat Rev Mol Cell Biol 2008, 9(2):139-150. Carrasco-Pancorbo A, Navas-Iglesias N, Cuadros-Rodríguez L: From lipid analysis towards lipidomics, a new challenge for the analytical chemistry of the 21st century. Part I: Modern lipid analysis. TrAC Trends in Analytical Chemistry 2009, 28(3):263-278. Vance DE, Vance JE: Biochemistry of Lipids, Lipoproteins and Membranes, 5th edn. New York: Elsevier Science; 2008. LIPID MAPS Nature website [http://www.lipidmaps.org/] The Lipid Library website [http://lipidlibrary.aocs.org/] The Cyberlipds website [http://www.cyberlipid.org/] Fahy E, Cotter D, Sud M, Subramaniam S: Lipid classification, structures and tools. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Molecular and Cell Biology of Lipids 2011, 1811(11):637-647. 172 24. 25. 26. 27. 28. 29. 30. 31. 32. 33. 34. 35. 36. 37. 38. 39. 40. 41. 42. 43. 44. The LipidBank website [http://lipidbank.jp/] Fahy E, Subramaniam S, Brown HA, Glass CK, Merrill AH, Murphy RC, Raetz CRH, Russell DW, Seyama Y, Shaw w et al: a comprehensive classification system for lipids. Journal of Lipid Research 2005, 46(5):839-862. Fahy E, Subramaniam S, Murphy RC, Nishijima M, Raetz CRH, Shimizu T, Spener F, van Meer G, Wakelam MJO, Dennis EA: Update of the LIPID MAPS comprehensive classification system for lipids. Journal of Lipid Research 2009, 50(Supplement):S9-S14. Peterson BL, Cummings BS: a review of chromatographic methods for the assessment of phospholipids in biological samples. Biomedical Chromatography 2006, 20(3):227-243. Taha AY, Metherel AH, Stark KD: Comparative analysis of standardised and common modifications of methods for lipid extraction for the determination of fatty acids. Food Chemistry 2012, 134(1):427-433. Palacios L, Wang T: Egg-yolk lipid fractionation and lecithin characterization. Journal of the American Oil Chemists' Society 2005, 82(8):571-578. Iverson S, Lang S, Cooper M: Comparison of the bligh and dyer and folch methods for total lipid determination in a broad range of marine tissue. Lipids 2001, 36(11):1283-1287. Bligh EG, Dyer WJ: A rapid method of total lipid extraction and purification. Canadian Journal of Biochemistry and Physiology 1959, 37(8):911-917. Schiller J, Süß R, Arnhold J, Fuchs B, Leßig J, Müller M, Petković M, Spalteholz H, Zschörnig O, Arnold K: Matrix-assisted laser desorption and ionization time-of-flight (MALDI-TOF) mass spectrometry in lipid and phospholipid research. Progress in Lipid Research 2004, 43(5):449488. Jensen WB: The Origin of the Soxhlet Extractor. Journal of Chemical Education 2007, 84(12):1913. Stepnowski P, Synak E, Szafranek B, Kaczyński Z: Techniki Separacji. Gdańsk: Uniwersytet Gdański; 2010. Luthria DL: Oil Extraction and Analysis: Critical Issues and Comparative Studies: AOCS Press; 2004. Matsler AL, Siebenmorgen TJ: Evaluation of Operating Conditions for Surface Lipid Extraction from Rice Using a Soxtec System. Cereal Chemistry Journal 2005, 82(3):282-286. Wang L, Weller CL: Recent advances in extraction of nutraceuticals from plants. Trends in Food Science & Technology 2006, 17(6):300-312. Schneider M: Lecithins: Sources, Manufacture & Uses. In. Edited by Szuhaj BF. Champaign, Illinois: The American Oil Chemists Society; 1989: 109-131. Rodríguez-Alcalá LM, Fontecha J: Major lipid classes separation of buttermilk, and cows, goats and ewes milk by high performance liquid chromatography with an evaporative light scattering detector focused on the phospholipid fraction. Journal of Chromatography a 2010, 1217(18):3063-3066. Suzumura M: Phospholipids in marine environments: a review. Talanta 2005, 66(2):422434. Sim JS: Extraction of fresh liquid egg yolk. Canadian Patent 1,335,054. In: Canadian Patent. vol. 1,335,054; 1995. Miyata K, Matsumoto H: Manufacture of purified egg-yolk ecithins.Japanese Patent 2,001,072,693. In.; 2001. Gładkowski W, Chojnacka A, Kiełbowicz G, Trziszka T, Wawrzeńczyk C: Isolation of Pure Phospholipid Fraction from Egg Yolk. Journal of the American Oil Chemists' Society 2012, 89(1):179-182. Joshi A, Paratkar SG, Thorat BN: Modification of lecithin by physical, chemical and enzymatic methods. European Journal of Lipid Science and Technology 2006, 108(4):363-373. 173 45. 46. 47. 48. 49. 50. 51. 52. 53. 54. 55. 56. 57. 58. 59. 60. 61. 62. 63. 64. 65. Teberikler L, Koseoglu S, Akgerman A: Selective extraction of phosphatidylcholine from lecithin by supercritical carbon dioxide/ethanol mixture. Journal of the American Oil Chemists' Society 2001, 78(2):115-120. Began G, Manohar B, Sankar KU: Enrichment of phosphatidyl choline – alcohol fractionation of carbon dioxide de-oiled lecithin from soybean (Glycine max). Zeitschrift für Lebensmitteluntersuchung und -Forschung a 1997, 205(5):360-363. Froning GW, Wehling RL, Cuppett SL, Pierce MM, Niemann L, Siekman DK: Extraction of Cholesterol and Other Lipids from Dried Egg Yolk Using Supercritical Carbon Dioxide. Journal of Food Science 1990, 55(1):95-98. Boselli E, Caboni MF: Supercritical carbon dioxide extraction of phospholipids from dried egg yolk without organic modifier. The Journal of Supercritical Fluids 2000, 19(1):45-50. Sahena F, Zaidul ISM, Jinap S, Karim AA, Abbas KA, Norulaini NAN, Omar AKM: Application of supercritical CO2 in lipid extraction – a review. Journal of Food Engineering 2009, 95(2):240253. Williams MA, McCluer RH: The Use of Sep-Pak™ C18 Cartridges During the Isolation of Gangliosides. Journal of Neurochemistry 1980, 35(1):266-269. Powell WS: Rapid extraction of oxygenated metabolites of arachidonic acid from biological samples using octadecylsilyl silica. Prostaglandins 1980, 20(5):947-957. Wachob GD: Analyses of Fats, Oils, and Lipoproteins. In. Edited by Perkins EG: American Oil Chemists’ Society,; 1991: 122–137. Christie WW: in Advances in Lipid Methodology – One,: Oily Press; 1992. Ebeler S.E. , Shibamoto T.: Lipid Chromatographic Analysis, . In. Edited by Shibamoto T. New York: Marcel Dekker; 1994: 1-49. Żwir-Ferenc A, Biziuk M: Polish J of Environ Stud 2006, 15(5):677-690. Avalli A, Contarini G: Determination of phospholipids in dairy products by SPE/HPLC/ELSD. Journal of Chromatography a 2005, 1071(1-2):185-190. Descalzo A, Insani E, Pensel N: Light-scattering detection of phospholipids resolved by HPLC. Lipids 2003, 38(9):999-1003. Narváez-Rivas M, Gallardo E, Ríos JJ, León-Camacho M: a new high-performance liquid chromatographic method with evaporative light scattering detector for the analysis of phospholipids. Application to Iberian pig subcutaneous fat. Journal of Chromatography a 2011, 1218(22):3453-3458. Ruiz-Gutiérrez V, Pérez-Camino MC: Update on solid-phase extraction for the analysis of lipid classes and related compounds. Journal of Chromatography a 2000, 885(1–2):321-341. Kim HY, Salem N: Separation of lipid classes by solid phase extraction. Journal of Lipid Research 1990, 31(12):2285-2289. Herchi W, Sakouhi F, Khaled S, Xiong Y, Boukhchina S, Kallel H, Curtis JM: Characterisation of the glycerophospholipid fraction in flaxseed oil using liquid chromatography-mass spectrometry. Food Chemistry, In Press, Corrected Proof. Caboni M, Menotta S, Lercker G: Separation and analysis of phospholipids in different foods with a light-scattering detector. Journal of the American Oil Chemists' Society 1996, 73(11):1561-1566. Persson E, Löfgren L, Hansson G, Abrahamsson B, Lennernäs H, Nilsson R: Simultaneous assessment of lipid classes and bile acids in human intestinal fluid by solid-phase extraction and HPLC methods. Journal of Lipid Research 2007, 48(1):242-251. Nielsen H: In situ Solid Phase Extraction of Phospholipids from Heat-Coagulated Egg Yolk by Organic Solvents. LWT - Food Science and Technology 2001, 34(8):526-532. Nielsen H: Production of phospholipids from spray-dried egg yolk by consecutive in situ solid phase extraction with acetone and ethanol. LWT - Food Science and Technology 2007, 40(8):1337-1343. 174 66. 67. 68. 69. 70. 71. 72. 73. 74. 75. 76. 77. 78. 79. 80. 81. 82. 83. 84. Nielsen H, Shukla VKS: In situ solid phase extraction of lipids from spray-dried egg yolk by ethanol with subsequent removal of triacylglycerols by cold temperature crystallization. LWT - Food Science and Technology 2004, 37(6):613-618. Szczepaniak W: Metody instrumentalne w analizie chemicznej. Warszawa; 2002. Entezami AA, Venables BJ, Daugherty KE: Analysis of lipids by one-dimensional thin-layer chromatography. Journal of Chromatography a 1987, 387(0):323-331. Skipski VP, Good JJ, Barclay M, Reggio RB: Quantitative analysis of simple lipid classes by thin-layer chromatography. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Lipids and Lipid Metabolism 1968, 152(1):10-19. Romans JR, Palmer IS: Photoreflectometric method for the quantitative analysis of neutral lipids after thin-layer chromatography. Analytical Biochemistry 1972, 49(2):580-584. Touchstone J, Chen J, Beaver K: Improved separation of phospholipids in thin layer chromatography. Lipids 1980, 15(1):61-62. Fuchs B, Süß R, Teuber K, Eibisch M, Schiller J: Lipid analysis by thin-layer chromatography— A review of the current state. Journal of Chromatography a 2011, 1218(19):2754-2774. Dudley P, Anderson R: Separation of polyunsaturated fatty acids by argentation thin layer chromatography. Lipids 1975, 10(2):113-115. Wilson R, Sargent JR: High-resolution separation of polyunsaturated fatty acids by argentation thin-layer chromatography. Journal of Chromatography a 1992, 623(2):403-407. Myher JJ, Kuksis A: General strategies in chromatographic analysis of lipids. Journal of Chromatography B: Biomedical Sciences and Applications 1995, 671(1-2):3-33. Allan D, Cockcroft S: a modified procedure for thin-layer chromatography of phospholipids. Journal of Lipid Research 1982, 23(9):1373-1374. Fuchs B, Süß R, Nimptsch A, Schiller J: MALDI-TOF-MS Directly Combined with TLC: a Review of the Current State. Chromatographia 2009, 69(0):95-105. Hojnacki JL, Nicolosi RJ, Hayes KC: Densitometric quantitation of neutral lipids on ammonium sulfate impregnated thin-layer chromatograms. Journal of Chromatography a 1976, 128(1):133-139. Luftmann H, Aranda M, Morlock GE: Automated interface for hyphenation of planar chromatography with mass spectrometry. Rapid Communications in Mass Spectrometry 2007, 21(23):3772-3776. Van Berkel GJ, Ford MJ, Deibel MA: Thin-Layer Chromatography and Mass Spectrometry Coupled Using Desorption Electrospray Ionization. Analytical Chemistry 2005, 77(5):12071215. Peng S, Edler M, Ahlmann N, Hoffmann T, Franzke J: a new interface to couple thin-layer chromatography with laser desorption/atmospheric pressure chemical ionization mass spectrometry for plate scanning. Rapid Communications in Mass Spectrometry 2005, 19(19):2789-2793. Zellmer S, Lasch J: Individual variation of human plantar stratum corneum lipids, determined by automated multiple development of high-performance thin-layer chromatography plates. Journal of Chromatography B: Biomedical Sciences and Applications 1997, 691(2):321-329. Bonté F, Pinguet P, Chevalier JM, Meybeck A: Analysis of all stratum corneum lipids by automated multiple development high-performance thin-layer chromatography. Journal of Chromatography B: Biomedical Sciences and Applications 1995, 664(2):311-316. Ingalls ST, Kriaris MS, Xu Y, DeWulf DW, Tserng K-Y, Hoppel CL: Method for isolation of nonesterified fatty acids and several other classes of plasma lipids by column chromatography on silica gel. Journal of Chromatography B: Biomedical Sciences and Applications 1993, 619(1):9-19. 175 85. 86. 87. 88. 89. 90. 91. 92. 93. 94. 95. 96. 97. 98. 99. 100. 101. Gładkowski W, Chojnacka A, Kiełbowicz G, Pisarski B, Trziszka T, Wawrzeńczyk C: Charakterystyka frakcji fosfolipidowych izolowanych z żółtek jaj pochodzących od kur Lohmann Brown i zielononóżki kuropatwianej. Przemysł Chemiczny 2009, 88(5):432-435. Roemen THM, Van der Vusse GJ: Application of silica gel column chromatography in the assessment of non-esterified fatty acids and phosphoglyserides in myocardial tissue. Journal of Chromatography B: Biomedical Sciences and Applications 1985, 344(0):304-308. Shaikh NA: Assessment of Various Techniques for the Quantitative Extraction of Lysophospholipids from Myocardial Tissues. Analytical Biochemistry 1994, 216(2):313-321. Hamilton J, Comai K: Rapid separation of neutral lipids, free fatty acids and polar lipids using prepacked silica sep-Pak columns. Lipids 1988, 23(12):1146-1149. Pulfer M, Murphy RC: Electrospray mass spectrometry of phospholipids. Mass Spectrometry Reviews 2003, 22(5):332-364. Marini D: HPLC of Lipids. In: Food analysis by HPLC. Edited by Nollt LML. New York: Marcel Dekker AG; 2000: 169-251. Graeve M, Janssen D: Improved separation and quantification of neutral and polar lipid classes by HPLC-ELSD using a monolithic silica phase: Application to exceptional marine lipids. Journal of Chromatography B 2009, 877(20-21):1815-1819. Moreau R: The analysis of lipids via HPLC with a charged aerosol detector. Lipids 2006, 41(7):727-734. Grit M, Crommelin DJA, Lang J: Determination of phosphatidylcholine, phosphatidylglycerol and their lyso forms from liposome dispersions by high-performance liquid chromatography using high-sensitivity refractive index detection. Journal of Chromatography a 1991, 585(2):239-246. Adlercreutz D, Wehtje E: a simple HPLC method for the simultaneous analysis of phosphatidylcholine and its partial hydrolysis products 1- and 2-acyl lysophosphatidylcholine. Journal of the American Oil Chemists' Society 2001, 78(10):10071011. Foglia TA, Jones KC: Quantitation of Neutral Lipid Mixtures Using High Performance Liquid Chromatography with Light Scattering Detection. Journal of Liquid Chromatography & Related Technologies 1997, 20(12):1829-1838. Ellingson JS, Zimmerman RL: Rapid separation of gram quantities of phospholipids from biological membranes by preparative high performance liquid chromatography. Journal of Lipid Research 1987, 28(8):1016-1018. Hurst WJ, Martin RA, Sheeley RM: The Preparative HPLC Isolation and Identification of Phospholipids from Soy Lecithin. Journal of Liquid Chromatography 1986, 9(13):2969-2976. Gildenast T, Lasch J: Isolation of ceramide fractions from human stratum corneum lipid extracts by high-performance liquid chromatography. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) Lipids and Lipid Metabolism 1997, 1346(1):69-74. Yamamura R, Shimomura Y: Industrial high-performance liquid chromatography purification of docosahexaenoic acid ethyl ester and docosapentaenoic acid ethyl ester from single-cell oil. Journal of the American Oil Chemists' Society 1997, 74(11):1435-1440. Christie W, Nikolova-Damyanova B, Laakso P, Herslof B: Stereospecific analysis of triacyl- snglycerols via resolution of diastereomeric diacylglycerol derivatives by high-performance liquid chromatography on silica. Journal of the American Oil Chemists' Society 1991, 68(10):695-701. Nikolova-Damyanova B, Momchilova S: Silver ion hplc for the analysis of positionally isomeric fatty acids. Journal of Liquid Chromatography & Related Technologies 2002, 25(1315):1947-1965. 176 102. 103. 104. 105. 106. 107. 108. 109. 110. 111. 112. 113. 114. 115. 116. 117. 118. 119. Smith EC, Jones AD, Hammond EW: Investigation of the use of argentation highperformance liquid chromatography for the analysis of triglycerides. Journal of Chromatography a 1980, 188(1):205-212. Christie WW: Silver ion chromatography using solid-phase extraction columns packed with a bonded-sulfonic acid phase. Journal of Lipid Research 1989, 30(9):1471-1473. Abidi SL, Mounts TL, Rennick KA: Separations of Major Soybean Phospholipids on βCyclodextrinbonded Silica. Journal of Liquid Chromatography 1994, 17(17):3705-3725. Schönherr C, Touchene S, Wilser G, Peschka-Süss R, Francese G: Simple and precise detection of lipid compounds present within liposomal formulations using a charged aerosol detector. Journal of Chromatography a 2009, 1216(5):781-786. Lin J-T, McKeon TA, Woodruff CL, Singleton JA: Separation of synthetic phosphatidylcholine molecular species by high-performance liquid chromatography on a C8 column. Journal of Chromatography a 1998, 824(2):169-174. Suchocka Z, Gronostajska D, Suchocki P, Pachecka J: New HPLC method for separation of blood plasma phospholipids. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis 2003, 32(45):859-865. De Miguel I, Roueche A, Betbeder D: Separation of dipalmitoyl phosphatidyl choline, cholesterol and their degradation products by high-performance liquid chromatography on a perfluorinated stationary bonded phase. Journal of Chromatography a 1999, 840(1):31-38. Mazzella N, Molinet J, Syakti AD, Dodi A, Doumenq P, Artaud J, Bertrand J-C: Bacterial phospholipid molecular species analysis by ion-pair reversed-phase HPLC/ESI/MS. Journal of Lipid Research 2004, 45(7):1355-1363. Perona JS, Ruiz-Gutierrez V: Simultaneous determination of molecular species of monoacylglycerols, diacylglycerols and triacylglycerols in human very-low-density lipoproteins by reversed-phase liquid chromatography. Journal of Chromatography B 2003, 785(1):89-99. Chen S-H, Chen K-C, Lien H-M: Determination of fatty acids in vegetable oil by reversedphase liquid chromatography with fluorescence detection. Journal of Chromatography a 1999, 849(2):357-369. Bravi E, Perretti G, Montanari L: Fatty acids by high-performance liquid chromatography and evaporative light-scattering detector. Journal of Chromatography a 2006, 1134(1– 2):210-214. Wojtusik MJ, Brown PR, Turcotte JG: Separation and detection of triacylglycerols by highperformance liquid chromatography. Chemical Reviews 1989, 89(2):397-406. Aitzetmüller K, Grönheim M: Separation of highly unsaturated triacylglycerols by reversed phase HPLC with short wavelength UV detection. Journal of High Resolution Chromatography 1992, 15(4):219-226. Dong J, Cai X, Zhao L, Xue X, Zou L, Zhang X, Liang X: Lysophosphatidylcholine profiling of plasma: discrimination of isomers and discovery of lung cancer biomarkers. Metabolomics 2010, 6(4):478-488. Wiley M, Przetakiewicz M, Takahashi M, Lowenstein J: An extended method for separating and quantitating molecular species of phospholipids. Lipids 1992, 27(4):295-301. Kim HY, Salem N: Application of thermospray high-performance liquid chromatography/mass spectrometry for the determination of phospholipids and related compounds. Analytical Chemistry 1987, 59(5):722-726. Kim HY, Salem N: Phospholipid molecular species analysis by thermospray liquid chromatography/mass spectrometry. Analytical Chemistry 1986, 58(1):9-14. Zhang L, Hu S, Cook L, Dovichi NJ: Analysis of aminophospholipid molecular species by methyl-β-cyclodextrin modified micellar electrokinetic capillary chromatography with laser-induced fluorescence detection. Electrophoresis 2002, 23(17):3071-3077. 177 120. 121. 122. 123. 124. 125. 126. 127. 128. 129. 130. 131. 132. 133. 134. 135. 136. 137. Alpert AJ: Hydrophilic-interaction chromatography for the separation of peptides, nucleic acids and other polar compounds. Journal of Chromatography a 1990, 499(0):177-196. Jandera P: Stationary phases for hydrophilic interaction chromatography, their characterization and implementation into multidimensional chromatography concepts. Journal of Separation Science 2008, 31(9):1421-1437. Buszewski B, Noga S: Hydrophilic interaction liquid chromatography (HILIC)—a powerful separation technique. Analytical and Bioanalytical Chemistry:1-17. Dodbiba E, Xu C, Payagala T, Wanigasekara E, Moon MH, Armstrong DW: Use of ion pairing reagents for sensitive detection and separation of phospholipids in the positive ion mode LC-ESI-MS. Analyst 2011, 136(8):1586-1593. Schwalbe-Herrmann M, Willmann J, Leibfritz D: Separation of phospholipid classes by hydrophilic interaction chromatography detected by electrospray ionization mass spectrometry. Journal of Chromatography a 2010, 1217(32):5179-5183. Scherer M, Leuthäuser-Jaschinski K, Ecker J, Schmitz G, Liebisch G: a rapid and quantitative LC-MS/MS method to profile sphingolipids. Journal of Lipid Research 2010, 51(7):2001-2011. Mora L, Hernández-Cázares A, Aristoy MC, Toldrá F, Reig M: Hydrophilic Interaction Chromatography (HILIC) in the Analysis of Relevant Quality and Safety Biochemical Compounds in Meat, Poultry and Processed Meats. Food Analytical Methods 2011, 4(1):121129. Donato P, Cacciola F, Cichello F, Russo M, Dugo P, Mondello L: Determination of phospholipids in milk samples by means of hydrophilic interaction liquid chromatography coupled to evaporative light scattering and mass spectrometry detection. Journal of Chromatography a 2011, 1218(37):6476-6482. Zheng L, T'Kind R, Decuypere S, von Freyend SJ, Coombs GH, Watson DG: Profiling of lipids in Leishmania donovani using hydrophilic interaction chromatography in combination with Fourier transform mass spectrometry. Rapid Communications in Mass Spectrometry 2010, 24(14):2074-2082. Okazaki Y, Kamide Y, Hirai M, Saito K: Plant lipidomics based on hydrophilic interaction chromatography coupled to ion trap time-of-flight mass spectrometry. Metabolomics:1-11. Piyatheerawong W, Iwasaki Y, Yamane T: Direct separation of regio- and enantiomeric isomers of diacylglycerols by a tandem column high-performance liquid chromatography. Journal of Chromatography a 2005, 1068(2):243-248. Takagi T, Ando Y: Enantiomer separations of mixtures of monoacylglycerol derivatives by HPLC on a chiral column. Lipids 1990, 25(7):398-400. Takagi T, Itabashi T: Rapid separations of diacyl- and dialkylglycerol enantiomers by high performance liquid chromatography on a chiral stationary phase. Lipids 1987, 22(8):596600. Takagi T, Okamoto J, Ando Y, Itabashi Y: Separation of the enantiomers of 1-alkyl-2-acyl-racglycerol and of 1-alkyl-3-acyl-rac-glycerol by high performance liquid chromatography on a chiral column. Lipids 1990, 25(2):108-110. Takagi T, Ando Y: Stereospecific analysis of triacyl-sn-glycerols by chiral high-performance liquid chromatography. Lipids 1991, 26(7):542-547. Itabashi Y, Kukis A, Marai L, Takagi T: HPLC resolution of diacylglycerol moieties of natural triacylglycerols on a chiral phase consisting of bonded (R)-(+)-1-(1-naphthyl)ethylamine. Journal of Lipid Research 1990, 31(9):1711-1717. Itabashi Y, Kuksis A, Myher JJ: Determination of molecular species of enantiomeric diacylglycerols by chiral phase high performance liquid chromatography and polar capillary gas-liquid chromatography. Journal of Lipid Research 1990, 31(11):2119-2126. Itabashi Y, Takagi T: High performance liquid chromatographic separation of monoacylglycerol enantiomers on a chiral stationary phase. Lipids 1986, 21(6):413-416. 178 138. 139. 140. 141. 142. 143. 144. 145. 146. 147. 148. 149. 150. 151. 152. 153. 154. Deng L, Nakano H, Iwasaki Y: Direct separation of regioisomers and enantiomers of monoacylglycerols by tandem column high-performance liquid chromatography. Journal of Chromatography a 2007, 1165(1–2):93-99. Iwasaki Y, Yasui M, Ishikawa T, Irimescu R, Hata K, Yamane T: Optical resolution of asymmetric triacylglycerols by chiral-phase high-performance liquid chromatography. Journal of Chromatography a 2001, 905(1–2):111-118. Christie WW: Some recent advances in the chromatographic analysis of lipids. Analusis magazine 1998, 26(3):30-40. Takagi T, Itabashi Y, Tsuda T: High-Performance Liquid Chromatographic Separation of 2Hydroxy Fatty Acid Enantiomers on a Chiral Slurry- Packed Capillary Column. Journal of Chromatographic Science 1989, 27(10):574-577. Mondello L, Tranchida PQ, Stanek V, Jandera P, Dugo G, Dugo P: Silver-ion reversed-phase comprehensive two-dimensional liquid chromatography combined with mass spectrometric detection in lipidic food analysis. Journal of Chromatography a 2005, 1086(1– 2):91-98. Tranchida PQ, Donato P, Dugo G, Mondello L, Dugo P: Comprehensive chromatographic methods for the analysis of lipids. TrAC Trends in Analytical Chemistry 2007, 26(3):191-205. Majors RE: Multidimensional and Comprehensive Liquid Chromatography. LCGC ASIA PACIFIC 2005, 8(4). Consden R, Gordon AH, Martin AJP: Qualitative analysis of proteins: a partition chromatographic method using paper. Biochem J 1944, 38(3):224-232. Kishimoto K, Urade R, Ogawa T, Moriyama T: Nondestructive Quantification of Neutral Lipids by Thin-Layer Chromatography and Laser-Fluorescent Scanning: Suitable Methods for “Lipidome” Analysis. Biochemical and Biophysical Research Communications 2001, 281(3):657-662. Nakane S, Tokumura A, Waku K, Sugiura T: Hen egg yolk and white contain high amounts of lysophosphatidic acids, growth factor-like lipids: Distinct Molecular species compositions. Lipids 2001, 36(4):413-419. Herrero M, Ibáñez E, Cifuentes A, Bernal J: Multidimensional chromatography in food analysis. Journal of Chromatography a 2009, 1216(43):7110-7129. Laakso P, Kallio H: Triacylglycerols of winter butterfat containing configurational isomers of monoenoic fatty acyl residues. I. Disaturated monoenoic triacylglycerols. Journal of the American Oil Chemists' Society 1993, 70(12):1161-1171. Laakso P, Kallio H: Triacylglycerols of winter butterfat containing configurational isomers of monoenoic fatty acyl residues. II. Saturated dimonoenoic triacylglycerols. Journal of the American Oil Chemists' Society 1993, 70(12):1173-1176. Laakso PH, Nurmela KVV, Homer DR: Composition of the triacylglycerols of butterfat and its fractions obtained by an industrial melt crystallization process. Journal of Agricultural and Food Chemistry 1992, 40(12):2472-2482. Kallio H, Korkiasaari K, Sjövall O, Suomela J-P, Linderborg K: The regiospecific position of 18∶1 cis and trans monoenoic fatty acids in milk fat triacylglycerols. Journal of the American Oil Chemists' Society 2006, 83(5):407-413. Dugo P, Kumm T, Lo Presti M, Chiofalo B, Salimei E, Fazio A, Cotroneo A, Mondello L: Determination of triacylglycerols in donkey milk by using high performance liquid chromatography coupled with atmospheric pressure chemical ionization mass spectrometry. Journal of Separation Science 2005, 28(9-10):1023-1030. Holčapek M, Velínská H, Lísa M, Česla P: Orthogonality of silver-ion and non-aqueous reversed-phase HPLC/MS in the analysis of complex natural mixtures of triacylglycerols. Journal of Separation Science 2009, 32(21):3672-3680. 179 155. 156. 157. 158. 159. 160. 161. 162. 163. 164. 165. 166. 167. 168. 169. 170. 171. 172. Dugo P, Cacciola F, Kumm T, Dugo G, Mondello L: Comprehensive multidimensional liquid chromatography: Theory and applications. Journal of Chromatography a 2008, 1184(1– 2):353-368. Dugo P, Kumm T, Chiofalo B, Cotroneo A, Mondello L: Separation of triacylglycerols in a complex lipidic matrix by using comprehensive two-dimensional liquid chromatography coupled with atmospheric pressure chemical ionization mass spectrometric detection. Journal of Separation Science 2006, 29(8):1146-1154. van der Klift EJC, Vivó-Truyols G, Claassen FW, van Holthoon FL, van Beek TA: Comprehensive two-dimensional liquid chromatography with ultraviolet, evaporative light scattering and mass spectrometric detection of triacylglycerols in corn oil. Journal of Chromatography a 2008, 1178(1–2):43-55. Dugo P, Kumm T, Crupi ML, Cotroneo A, Mondello L: Comprehensive two-dimensional liquid chromatography combined with mass spectrometric detection in the analyses of triacylglycerols in natural lipidic matrixes. Journal of Chromatography a 2006, 1112(1– 2):269-275. Malmqvist M, Malmqvist T, Möllby R: Phospholipids immobilized on beaded agarose by hydrophobic interaction as hydrophilic substrates for phospholipase C. FEBS Lett 1978, 90(2):243-246. Uchida T, Filburn CR: Affinity chromatography of protein kinase C-phorbol ester receptor on polyacrylamide-immobilized phosphatidylserine. Journal of Biological Chemistry 1984, 259(20):12311-12314. Retzinger GS, Meredith SC, Lau SH, Kaiser ET, Kézdy FJ: a method for probing the affinity of peptides for amphiphilic surfaces. Analytical Biochemistry 1985, 150(1):131-140. Miyake K, Kitaura F, Mizuno N, Terada H: Phosphatidylcholine-coated silica as a useful stationary phase for high-performance liquid chromatographic determination of partition coefficients between octanol and water. Journal of Chromatography a 1987, 389(0):47-56. Yang CY, Cai SJ, Liu H, Pidgeon C: Immobilized Artificial Membranes — screens for drug membrane interactions. Advanced Drug Delivery Reviews 1997, 23(1–3):229-256. Wiedmer SK, Riekkola M-L, Jussila MS: Phospholipids and liposomes in liquid chromatographic and capillary electromigration techniques. TrAC Trends in Analytical Chemistry 2004, 23(8):562-582. James AT, Martin AJP: Gas-liquid partition chromatography: the separation and microestimation of volatile fatty acids from formic acid to dodecanoic acid. Biochem J 1952, 50(5):679-690. James AT, Martin AJP: Gas-liquid partition chromatography. a technique for the analysis of volatile materials. Analyst 1952, 77(921):915-932. Janák J: Chromatography in the gas-solid system. Annals of the New York Academy of Sciences 1959, 72(13):606-612. James AT, Martin AJP: Gas–liquid chromatography: the separation and identification of the methyl esters of saturated and unsaturated acids from formic acid to n-octadecanoic acid. Biochem J 1956, 63(1):144-152. Brondz I: Development of fatty acid analysis by high-performance liquid chromatography, gas chromatography, and related techniques. Analytica Chimica Acta 2002, 465(1-2):1-37. Ichihara Ki, Fukubayashi Y: Preparation of fatty acid methyl esters for gas-liquid chromatography. Journal of Lipid Research 2010, 51(3):635-640. Seppänen-Laakso T, Laakso I, Hiltunen R: Analysis of fatty acids by gas chromatography, and its relevance to research on health and nutrition. Analytica Chimica Acta 2002, 465(1–2):3962. Nikkari T, Salo M, Maatela J, Aromaa A: Serum fatty acids in finnish men. Atherosclerosis 1983, 49(2):139-148. 180 173. 174. 175. 176. 177. 178. 179. 180. 181. 182. 183. 184. 185. 186. 187. 188. 189. 190. Gładkowski W, Kiełbowicz G, Chojnacka A, Gil M, Trziszka T, Dobrzański Z, Wawrzeńczyk C: Fatty acid composition of egg yolk phospholipid fractions following feed supplementation of Lohmann Brown hens with humic-fat preparations. Food Chemistry 2011, 126(3):10131018. Wahl HGn, Chrzanowski A, Mu¨ller C, Liebich HM, Hoffmann A: Identification of furan fatty acids in human blood cells and plasma by multi-dimensional gas chromatography-mass spectrometry. Journal of Chromatography a 1995, 697(1–2):453-459. de Geus H-J, Aidos I, de Boer J, Luten JB, Brinkman UAT: Characterisation of fatty acids in biological oil samples using comprehensive multidimensional gas chromatography. Journal of Chromatography a 2001, 910(1):95-103. Klesper E, Corwin AH, Turner DA: High pressure gas chromatography above critical temperatures. J Org Chem 1962, 27:700-701. Taylor LT: Supercritical fluid chromatography for the 21st century. The Journal of Supercritical Fluids 2009, 47(3):566-573. Novotny M, Springston SR, Peaden PA, Fjeldsted JC, Lee ML: Capillary Supercritical Fluid Chromatography. Analytical Chemistry 1981, 53(3):407A-414A. Yip H, Ashraf-Khorassani M, Taylor L: Feasibility of Phospholipids Separation by Packed Column SFC with Mass Spectrometric and Light Scattering Detection. Chromatographia 2007, 65(11):655-665. Bamba T, Shimonishi N, Matsubara A, Hirata K, Nakazawa Y, Kobayashi A, Fukusaki E: High throughput and exhaustive analysis of diverse lipids by using supercritical fluid chromatography-mass spectrometry for metabolomics. Journal of Bioscience and Bioengineering 2008, 105(5):460-469. Señoráns FJ, Ibañez E: Analysis of fatty acids in foods by supercritical fluid chromatography. Analytica Chimica Acta 2002, 465(1–2):131-144. Demirbüker M, Hägglund I, Blomberg LG: Separation of unsaturated fatty acid methyl esters by packed capillary supercritical fluid chromatography: Comparison of different column packings. Journal of Chromatography a 1992, 605(2):263-267. France JE, Snyder JM, King JW: Packed-microbe supercritical fluid chromatography with flame ionization detection of abused vegetable oils. Journal of Chromatography a 1991, 540(0):271-278. Choo Y, Ma A, Yahaya H, Yamauchi Y, Bounoshita M, Saito M: Separation of crude palm oil components by semipreparative supercritical fluid chromatography. Journal of the American Oil Chemists' Society 1996, 73(4):523-525. Artz W, Sauer R: An improved micro-extraction cell for supercritical fluid extraction and chromatography of fatty acids. Journal of the American Oil Chemists' Society 1992, 69(4):309-313. Hirata Y, Sogabe I: Separation of fatty acid methyl esters by comprehensive twodimensional supercritical fluid chromatography with packed columns and programming of sampling duration. Analytical and Bioanalytical Chemistry 2004, 378(8):1999-2003. Christopoulou C, Perkins E: High performance size exclusion chromatography of fatty acids, mono-, di- and triglyceride mixtures. Journal of the American Oil Chemists' Society 1986, 63(5):679-684. Dobarganes MC, Márquez-Ruiz G: Analytical evaluation of fats and oils by size-exclusion chromatography. Analusis magazine 1998, 26(3):61-65. Abidi S, Kim I, Rennick K: Determination of nonvolatile components of heated soybean oils separated with high-efficiency mixed-bed polystyrene/divinylbenzene columns. Journal of the American Oil Chemists' Society 1999, 76(8):939-944. Abidi S, Warner K: Molecular-weight distributions of degradation products in selected frying oils. Journal of the American Oil Chemists' Society 2001, 78(7):763-769. 181 191. 192. 193. 194. 195. 196. 197. 198. 199. 200. 201. 202. 203. 204. 205. 206. 207. 208. 209. 210. 211. Márquez-Ruiz G, Martín-Polvillo M, Dobarganes C: Effect of temperature and addition of αtocopherol on the oxidation of trilinolein model systems. Lipids 2003, 38(3):233-240. Márquez-Ruiz G, Pérez-Camino MC, Rios JJ, Dobarganes MC: Characterization of sucrose polyesters-triacylglycerols mixtures. Journal of the American Oil Chemists' Society 1994, 71(9):1017-1020. Martín-Polvillo M, Márquez-Ruiz G, Dobarganes M: Oxidative stability of sunflower oils differing in unsaturation degree during long-term storage at room temperature. Journal of the American Oil Chemists' Society 2004, 81(6):577-583. Soheili K, Artz W, Tippayawat P: Pan-heating of low-linolenic acid and partially hydrogenated soybean oils. Journal of the American Oil Chemists' Society 2002, 79(3):287290. de Greyt WF, Kellens MJ, Huyghebaert AD: Polymeric and oxidized triglyceride content of crude and refined vegetable oils — An overview. Lipid / Fett 1997, 99(8):287-290. Rios J, Pérez-Camino M, Márquez-Ruiz G, Dobarganes M: Isolation and characterization of sucrose polyesters. Journal of the American Oil Chemists' Society 1994, 71(4):385-390. Otieno AC, Mwongela SM: Capillary electrophoresis-based methods for the determination of lipids—A review. Analytica Chimica Acta 2008, 624(2):163-174. Tiselius A: a new apparatus for electrophoretic analysis of colloidal mixtures. Transactions of the Faraday Society 1937, 33:524-531. Pobożny E: Elektroforeza kapilarna. Analityka 2001, 2. Jorgenson JW, Lukacs KD: Zone electrophoresis in open-tubular glass capillaries. Analytical Chemistry 1981, 53(8):1298-1302. Jorgenson JW, Lukacs KD: High-resolution separations based on electrophoresis and electroosmosis. Journal of Chromatography a 1981, 218(0):209-216. Jorgenson JW, Lukacs KD: Free-zone electrophoresis in glass capillaries. Clinical Chemistry 1981, 27(9):1551-1553. Altria KD: Enhanced Capillary Electrophoresis Performance Using Dynamic Surface Coating. LC-GC Europe 2012, 25(4):201-206. Lucy CA, MacDonald AM, Gulcev MD: Non-covalent capillary coatings for protein separations in capillary electrophoresis. Journal of Chromatography a 2008, 1184(1–2):81105. Cunliffe JM, Baryla NE, Lucy CA: Phospholipid Bilayer Coatings for the Separation of Proteins in Capillary Electrophoresis. Analytical Chemistry 2002, 74(4):776-783. Wang C, Lucy CA: Oligomerized Phospholipid Bilayers as Semipermanent Coatings in Capillary Electrophoresis. Analytical Chemistry 2005, 77(7):2015-2021. Mansfield E, Ross EE, Aspinwall CA: Preparation and Characterization of Cross-Linked Phospholipid Bilayer Capillary Coatings for Protein Separations. Analytical Chemistry 2007, 79(8):3135-3141. Gulcev MD, Lucy CA: Factors Affecting the Behavior and Effectiveness of Phospholipid Bilayer Coatings for Capillary Electrophoretic Separations of Basic Proteins. Analytical Chemistry 2008, 80(5):1806-1812. Zhang H, Zhang C, Lajoie GA, Yeung KKC: Selective Sampling of Phosphopeptides for Detection by MALDI Mass Spectrometry. Analytical Chemistry 2005, 77(18):6078-6084. Hautala JT, Riekkola M-L, Wiedmer SK: Anionic phospholipid coatings in capillary electrochromatography: Binding of Ca2+ to phospholipid phosphate group. Journal of Chromatography a 2007, 1150(1–2):339-347. Lamparski H, O'Brien DF: Two-Dimensional Polymerization of Lipid Bilayers:Degree of Polymerization of Sorbyl Lipids. Macromolecules 1995, 28(6):1786-1794. 182 212. 213. 214. 215. 216. 217. 218. 219. 220. 221. 222. 223. 224. 225. 226. 227. 228. 229. 230. 231. Ross EE, Rozanski LJ, Spratt T, Liu S, O'Brie DF, Saavedra SS: Planar Supported Lipid Bilayer Polymers Formed by Vesicle Fusion. 1. Influence of Diene Monomer Structure and Polymerization Method on Film Properties†. Langmuir 2003, 19(5):1752-1765. Riekkola ML, JÖNSSON JA, SMITH RM: Terminology for analytical capillary electromigration techniques (IUPAC Recommendations 2003). Pure Appl Chem 2004, 76(2):443-451. Hautala JT, Wiedmer SK, Riekkola M-L: Influence of pH on formation and stability of phosphatidylcholine/phosphatidylserine coatings in fused-silica capillaries. Electrophoresis 2005, 26(1):176-186. Zhang Y, Zhang R, Hjertén S, Lundahl P: Liposome capillary electrophoresis for analysis of interactions between lipid bilayers and solutes. Electrophoresis 1995, 16(1):1519-1523. Wiedmer SK, Kulovesi P, Riekkola M-L: Liposome electrokinetic capillary chromatography in the study of analyte–phospholipid membrane interactions. Application to pesticides and related compounds. Journal of Separation Science 2008, 31(14):2714-2721. Owen RL, Strasters JK, Breyer ED: Lipid vesicles in capillary electrophoretic techniques: Characterization of structural properties and associated membrane-molecule interactions. ELECTROPHORESIS 2005, 26(4-5):735-751. Wiedmer SK, Jussila MS, Holopainen JM, Alakoskela J-M, Kinnunen PKJ, Riekkola M-L: Cholesterol-containing phosphatidylcholine liposomes: Characterization and use as dispersed phase in electrokinetic capillary chromatography. Journal of Separation Science 2002, 25(7):427-437. Wiedmer SK, Holopainen JM, Mustakangas P, Kinnunen PKJ, Riekkola M-L: Liposomes as carriers in electrokinetic capillary chromatography. Electrophoresis 2000, 21(15):3191-3198. Bo T, Wiedmer SK, Riekkola M-L: Phospholipid-lysozyme coating for chiral separation in capillary electrophoresis. Electrophoresis 2004, 25(12):1784-1791. Wiedmer SK, Bo T, Riekkola M-L: Phospholipid–protein coatings for chiral capillary electrochromatography. Analytical Biochemistry 2008, 373(1):26-33. Bilek G, Kremser L, Blaas D, Kenndler E: Analysis of liposomes by capillary electrophoresis and their use as carrier in electrokinetic chromatography. Journal of Chromatography B 2006, 841(1–2):38-51. Wiedmer SK, Shimmo R: Liposomes in capillary electromigration techniques. Electrophoresis 2009, 30(S1):S240-S257. Ou J, Dong J, Dong X, Yu Z, Ye M, Zou H: Recent progress in polar stationary phases for CEC. Electrophoresis 2007, 28(1-2):148-163. Simó C, Cifuentes A, Gallardo A: Drug delivery systems: polymers and drugs monitored by capillary electromigration methods. Journal of Chromatography B 2003, 797(1–2):37-49. Martma K, Fernaeus SZ, Land T, Shimmo R: Study of cell membrane based coatings in capillary electrochromatography. Procedia Chemistry 2010, 2(1):26-33. Wiedmer SK, Jussila M, Hakala RMS, Pystynen K-H, Riekkola M-L: Piperazine-based buffers for liposome coating of capillaries for electrophoresis. Electrophoresis 2005, 26(10):19201927. Gómez-Hens A, Manuel Fernández-Romero J: The role of liposomes in analytical processes. TrAC Trends in Analytical Chemistry 2005, 24(1):9-19. Mei J, Xu J-R, Xiao Y-X, Zhang Q-R, Feng Y-Q: Immobilized phospholipid capillary electrophoresis for study of drug–membrane interactions and prediction of drug activity. Talanta 2008, 75(1):104-110. Christie WW: Advances in Lipid Methodology – One. In. Edited by Christie WW: Oily Press; 1992: 239-271. Hoving EB: Chromatographic methods in the analysis of cholesterol and related lipids. Journal of Chromatography B: Biomedical Sciences and Applications 1995, 671(1–2):341-362. 183 232. 233. 234. 235. 236. 237. 238. 239. 240. 241. 242. 243. 244. 245. 246. 247. 248. 249. 250. 251. Stith BJ, Hall J, Ayres P, Waggoner L, Moore JD, Shaw WA: Quantification of major classes of Xenopus phospholipids by high performance liquid chromatography with evaporative light scattering detection. Journal of Lipid Research 2000, 41(9):1448-1454. Wang D, Xu W, Xu X, Zhou G, Zhu Y, Li C, Yang M: Determination of intramuscular phospholipid classes and molecular species in Gaoyou duck. Food Chemistry 2009, 112(1):150-155. Yoon TH, Kim IH: Phosphatidylcholine isolation from egg yolk phospholipids by highperformance liquid chromatography. Journal of Chromatography a 2002, 949(1-2):209-216. Czauderna M, Kowalczyk J: Separation of some mono-, di- and tri-unsaturated fatty acids containing 18 carbon atoms by high-performance liquid chromatography and photodiode array detection. Journal of Chromatography B: Biomedical Sciences and Applications 2001, 760(1):165-178. Dobson G, Deighton N: Analysis of phospholipid molecular species by liquid chromatography — atmospheric pressure chemical ionisation mass spectrometry of diacylglycerol nicotinates. Chemistry and Physics of Lipids 2001, 111(1):1-17. Lingeman H, Underberg WJM, Takadate A, Hulshoff A: Fluorescence Detection in High Performance Liquid Chromatography. Journal of Liquid Chromatography 1985, 8(5):789-874. Christie WW: Detectors for HPLC of lipids with special reference to evaporative lightscattering detection. In: Advances in Lipid Methodology – One. Edited by Christie WW: Oily Press; 1992: 239-271. Kaneda H, Kano Y, Kamimura M, Osawa T, Kawakishi S: Analysis of long-chain fatty acids in beer by an HPLC-fluorescence detection method. Journal of Agricultural and Food Chemistry 1990, 38(6):1363-1367. Identyfikacja substancji pochodzenia roślinnego z użyciem detektora CORONA CAD [http://bmz.wbbib.uj.edu.pl/documents/2167477/a798acdc-d723-4619-b4fb8d51de322cb3] Pierre C: Evaporative Light Scattering and Charged Aerosol Detector. In: Hyphenated and Alternative Methods of Detection in Chromatography. CRC Press; 2011: 145-160. Koropchak JA, Heenan CL, Allen LB: Direct comparison of evaporative light-scattering and condensation nucleation light-scattering detection for liquid chromatography. Journal of Chromatography a 1996, 736(1–2):11-19. Hutchinson JP, Li J, Farrell W, Groeber E, Szucs R, Dicinoski G, Haddad PR: Comparison of the response of four aerosol detectors used with ultra high pressure liquid chromatography. Journal of Chromatography a 2011, 1218(12):1646-1655. Chaminade P: Evaporative Light Scattering and Charged Aerosol Detector. In: Hyphenated and Alternative Methods of Detection in Chromatography. CRC Press; 2011: 145-160. Dreux M, Lafosse M, Morin-Allory L: The Evaporative Light Scattering Detector- a Universal Instrument for Non-Volatile Solutes in LC and SFC. LC·GC Int 1996, 9:148. Dixon RW, Peterson DS: Development and Testing of a Detection Method for Liquid Chromatography Based on Aerosol Charging. Analytical Chemistry 2002, 74(13):2930-2937. Vehovec T, Obreza A: Review of operating principle and applications of the charged aerosol detector. Journal of Chromatography a 2010, 1217(10):1549-1556. Charlesworth JM: Evaporative analyzer as a mass detector for liquid chromatography. Analytical Chemistry 1978, 50(11):1414-1420. Bachorz R: Corona CAD - nowa jakosć w detekcji HPLC. Laboratorium 2010, 7(8):48-49. Guo W, Koropchak JA, Yan C: Sensitive, universal detection for capillary electrochromatography using condensation nucleation light scattering detection. Journal of Chromatography a 1999, 849(2):587-597. Héron S, Dreux M, Tchapla A: Post-column addition as a method of controlling triacylglycerol response coefficient of an evaporative light scattering detector in liquid 184 252. 253. 254. 255. 256. 257. 258. 259. 260. 261. 262. 263. 264. 265. 266. 267. 268. 269. chromatography–evaporative light-scattering detection. Journal of Chromatography a 2004, 1035(2):221-225. Ramos RG, Libong D, Rakotomanga M, Gaudin K, Loiseau PM, Chaminade P: Comparison between charged aerosol detection and light scattering detection for the analysis of Leishmania membrane phospholipids. Journal of Chromatography a 2008, 1209(1-2):88-94. Deschamps FS, Baillet A, Chaminade P: Mechanism of response enhancement in evaporative light scattering detection with the addition of triethylamine and formic acid. Analyst 2002, 127(1):35-41. Allen LB, Koropchak JA: Condensation nucleation light scattering: a new approach to development of high-sensitivity, universal detectors for separations. Analytical Chemistry 1993, 65(6):841-844. Liu BYH, Pui DYH: On the performance of the electrical aerosol analyzer. Journal of Aerosol Science 1975, 6(3–4):249-264. Adachi M, Kousaka Y, Okuyama K: Unipolar and bipolar diffusion charging of ultrafine aerosol particles. Journal of Aerosol Science 1985, 16(2):109-123. Hazotte A, Libong D, Matoga M, Chaminade P: Comparison of universal detectors for hightemperature micro liquid chromatography. Journal of Chromatography a 2007, 1170(1– 2):52-61. Deschamps F, Gaudin K, Lesellier E, Tchapla A, Ferrier D, Baillel A, Chaminade P: Response enhancement for the evaporative light scattering detection for the analysis of lipid classes and molecular species. Chromatographia 2001, 54(9):607-611. Yang X, Koropchak JA: Condensation nucleation light scattering detection with microbore liquid chromatography for lipid analysis. Journal of Microcolumn Separations 2000, 12(4):204-210. Stolyhwo A, Colin H, Guiochon G: Use of light scattering as a detector principle in liquid chromatography. Journal of Chromatography a 1983, 265(0):1-18. Rashan Jr J, Chen R: Developing a versatile gradient elution LC/ELSD method for analyzing cellulose derivatives in pharmaceutical formulations. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis 2007, 44(1):23-28. Górecki T, Lynen F, Szucs R, Sandra P: Universal Response in Liquid Chromatography Using Charged Aerosol Detection. Analytical Chemistry 2006, 78(9):3186-3192. Leray C, Raclot T, Groscolas R: Positional distribution on n−3 fatty acids in triacylglycerols from rat adipose tissue during fish oil feeding. Lipids 1993, 28(4):279-284. Hac-Wydro K, Jedrzejek K, Dynarowicz-Latka P: Effect of saturation degree on the interactions between fatty acids and phosphatidylcholines in binary and ternary Langmuir monolayers. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces 2009, 72(1):101-111. Nwosu C, Boyd L, Sheldon B: Effect of fatty acid composition of phospholipids on their antioxidant properties and activity index. Journal of the American Oil Chemists' Society 1997, 74(3):293-297. Cossignani L, Santinelli F, Rosi M, Simonetti MS, Valfre F, Damiani P: Incorporation of n-3 PUFA into hen egg yolk lipids. II: Structural analysis of triacylglycerols, phosphatidylcholines and phosphatidylethanolamines. Italian Journal of Food Science 1994, 3:293-305 Bergmeyer HU, Grassi M, Walter HE. In: Methods of Enzymatic Analysis. Deerfield Beach: VCH; 1983: 283-291. Amate L, Ramírez M, Gil A: Positional analysis of triglycerides and phospholipids rich in long-chain polyunsaturated fatty acids. Lipids 1999, 34(8):865-871. Lepage G, Roy CC: Direct transesterification of all classes of lipids in a one-step reaction. Journal of Lipid Research 1986, 27(1):114-120. 185 270. 271. 272. 273. 274. 275. 276. 277. 278. 279. 280. 281. 282. 283. 284. 285. 286. Pérez-Palacios T, Antequera T, Muriel E, Martín D, Ruiz J: Stereospecific Analysis of Phospholipid Classes in Skeletal Muscle from Rats Fed Different Fat Sources. Journal of Agricultural and Food Chemistry 2007, 55(15):6191-6197. Pérez-Palacios T, Antequera T, Muriel E, Ruiz J: Stereospecific analysis of phospholipid classes in rat muscle. European Journal of Lipid Science and Technology 2006, 108(10):835841. Adlercreutz D, Wehtje E: An enzymatic method for the synthesis of mixed-acid phosphatidylcholine. Journal of the American Oil Chemists' Society 2004, 81(6):553-557. Florin-Christensen J, Narvaez-Vasquez J, Florin-Christensen M, Ryan CA: a Method for Distinguishing 1-Acyl from 2-Acyl Lysophosphatidylcholines Generated in Biological Systems. Analytical Biochemistry 1999, 276(1):13-17. Medina I, Sacchi R: Acyl stereospecific analysis of tuna phospholipids via high resolution 13C-NMR spectroscopy. Chemistry and Physics of Lipids 1994, 70(1):53-61. Nakanishi H, Iida Y, Shimizu T, Taguchi R: Separation and quantification of sn-1 and sn-2 fatty acid positional isomers in phosphatidylcholine by RPLC-ESIMS/MS. Journal of Biochemistry 2010, 147(2):245-256. Huang Z, Richards MA, Zha Y, Francis R, Lozano R, Ruan J: Determination of inorganic pharmaceutical counterions using hydrophilic interaction chromatography coupled with a Corona® CAD detector. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis 2009, 50(5):809814. Lloyd R. Snyder JJK, John W. Dolan: Introduction to Modern Liquid Chromatography, Third Edition, edn. Rabinovich-Guilatt L, Dubernet C, Gaudin K, Lambert G, Couvreur P, Chaminade P: Phospholipid hydrolysis in a pharmaceutical emulsion assessed by physicochemical parameters and a new analytical method. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics 2005, 61(1-2):69-76. Silversand C, Haux C: Improved high-performance liquid chromatographic method for the separation and quantification of lipid classes: application to fish lipids. Journal of Chromatography B: Biomedical Sciences and Applications 1997, 703(1-2):7-14. Nyeborg M, Pissavini M, Lemasson Y, Doucet O: Validation of HPLC method for the simultaneous and quantitative determination of 12 UV-filters in cosmetics. International Journal of Cosmetic Science 2010, 32(1):47-53. Rombaut R, Camp JV, Dewettinck K: Analysis of Phospho- and Sphingolipids in Dairy Products by a New HPLC Method. Journal of Dairy Science 2005, 88(2):482-488. Validation of Analytical Procedures: Text and Methodology Q2(R1), International Conference on Harmonisation, November 2005 [http://www.ich.org/] Małgorzata Kania MJ: Elementy walidacji metody analitycznej oznaczania w mieszaninie gazowej związków węglowodorowych oraz N2, O2, CO i CO2 za pomocą dwukanałowego, zaworowego chromatografu gazowego AGILENT 7890A. NAFTA-GAZ 2011, 11:812-824. Shabir GA: Validation of high-performance liquid chromatography methods for pharmaceutical analysis: Understanding the differences and similarities between validation requirements of the US Food and Drug Administration, the US Pharmacopeia and the International Conference on Harmonization. Journal of Chromatography a 2003, 987(12):57-66. Funk Werner DV, Gonnevert Gerhild: Quality Assurance in Analytical Chemistry, Second edn; 2007. Ludden T, Beal S, Sheiner L: Comparison of the Akaike Information Criterion, the Schwarz criterion and the F test as guides to model selection. Journal of Pharmacokinetics and Pharmacodynamics 1994, 22(5):431-445. 186 287. 288. 289. 290. 291. 292. 293. 294. 295. 296. 297. 298. 299. 300. 301. 302. 303. Bozdogan H: Model selection and Akaike's Information Criterion (AIC): The general theory and its analytical extensions. Psychometrika 1987, 52(3):345-370. Kukier Ł, Szydłowski M, Tambor P: Kryterium Akaike: prostota w języku statystyki. In. Lublin. Díaz-López R, Libong D, Tsapis N, Fattal E, Chaminade P: Quantification of pegylated phospholipids decorating polymeric microcapsules of perfluorooctyl bromide by reverse phase HPLC with a charged aerosol detector. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis 2008, 48(3):702-707. Wang X, Li W, Rasmussen HT: Orthogonal method development using hydrophilic interaction chromatography and reversed-phase high-performance liquid chromatography for the determination of pharmaceuticals and impurities. Journal of Chromatography a 2005, 1083(1-2):58-62. McCalley DV: Is hydrophilic interaction chromatography with silica columns a viable alternative to reversed-phase liquid chromatography for the analysis of ionisable compounds? Journal of Chromatography a 2007, 1171(1–2):46-55. McCalley DV: Study of the selectivity, retention mechanisms and performance of alternative silica-based stationary phases for separation of ionised solutes in hydrophilic interaction chromatography. Journal of Chromatography a 2010, 1217(20):3408-3417. Christie WW, Noble RC, Davies G: Phospholipids in milk and dairy products. International Journal of Dairy Technology 1987, 40(1):10-12. Yue X, Xu Z, Prinyawiwatkul W, King JM: Improving Extraction of Lutein from Egg Yolk Using an Ultrasound-Assisted Solvent Method. Journal of Food Science 2006, 71(4):C239-C241. Rombaut R, Dewettinck K: Properties, analysis and purification of milk polar lipids. International Dairy Journal 2006, 16(11):1362-1373. Rombaut R, Dewettinck K, Van Camp J: Phospho- and sphingolipid content of selected dairy products as determined by HPLC coupled to an evaporative light scattering detector (HPLC– ELSD). Journal of Food Composition and Analysis 2007, 20(3–4):308-312. Becart I, Chevalier C, Biesse JP: Quantitative analysis of phospholipids by HPLC with a light scattering evaporating detector – application to raw materials for cosmetic use. Journal of High Resolution Chromatography 1990, 13(2):126-129. Vaghela M, Kilara A: Quantitative analysis of phospholipids from whey protein concentrates by high-performance liquid chromatography with a narrow-bore column and an evaporative light-scattering detector. Journal of the American Oil Chemists' Society 1995, 72(6):729-733. Vervoort N, Daemen D, Török G: Performance evaluation of evaporative light scattering detection and charged aerosol detection in reversed phase liquid chromatography. Journal of Chromatography a 2008, 1189(1-2):92-100. Nováková L, Lopéz SA, Solichová D, Satínský D, Kulichová B, Horna A, Solich P: Comparison of UV and charged aerosol detection approach in pharmaceutical analysis of statins. Talanta 2009, 78(3):834-839. de Villiers A, Górecki T, Lynen F, Szucs R, Sandra P: Improving the universal response of evaporative light scattering detection by mobile phase compensation. Journal of Chromatography a 2007, 1161(1-2):183-191. Lísa M, Lynen F, Holcapek M, Sandra P: Quantitation of triacylglycerols from plant oils using charged aerosol detection with gradient compensation. Journal of Chromatography a 2007, 1176(1-2):135-142. Gladkowski W, Kielbowicz G, Chojnacka A, Gil M, Trziszka T, Dobrzanski Z, Wawrzenczyk C: Fatty acid composition of egg yolk phospholipid fractions following feed supplementation of Lohmann Brown hens with humic-fat preparations. Food Chemistry 2011, 126(3):10131018. 187 304. 305. 306. 307. 308. 309. 310. 311. 312. 313. 314. 315. 316. 317. 318. 319. 320. 321. 322. 323. Chen S-H, Chuang Y-J: Analysis of fatty acids by column liquid chromatography. Analytica Chimica Acta 2002, 465(1-2):145-155. Ruiz-Rodriguez A, Reglero G, Ibañez E: Recent trends in the advanced analysis of bioactive fatty acids. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis 2010, 51(2):305-326. Nair LM, Werling JO: Aerosol based detectors for the investigation of phospholipid hydrolysis in a pharmaceutical suspension formulation. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis 2009, 49(1):95-99. Özcimder M, Hammers WE: Fractionation of fish oil fatty acid methyl esters by means of argentation and reversed-phase high-performance liquid chromatography, and its utility in total fatty acid analysis. Journal of Chromatography a 1980, 187(2):307-317. Meyer VR: Practical High-Performance Liquid Chromatography, Fourth Edition edn: John Wiley &Sons, Ltd; 2004. Bravi E, Perretti G, Montanari L: Fatty acids by high-performance liquid chromatography and evaporative light-scattering detector. Journal of Chromatography a 2006, 1134(12):210-214. Lin J-T, McKeon TA, Stafford AE: Gradient reversed-phase high-performance liquid chromatography of saturated, unsaturated and oxygenated free fatty acids and their methyl esters. Journal of Chromatography a 1995, 699(1-2):85-91. Makahleh A, Saad B, Siang GH, Saleh MI, Osman H, Salleh B: Determination of underivatized long chain fatty acids using RP-HPLC with capacitively coupled contactless conductivity detection. Talanta 2010, 81(1-2):20-24. Aveldano MI, VanRollins M, Horrocks LA: Separation and quantitation of free fatty acids and fatty acid methyl esters by reverse phase high pressure liquid chromatography. Journal of Lipid Research 1983, 24(1):83-93. Bocian S, Felinger A, Buszewski B: Comparison of Solvent Adsorption on Chemically Bonded Stationary Phases in RP-LC. Chromatographia 2008, 68(0):19-26. Chester TL, Coym JW: Effect of phase ratio on van’t Hoff analysis in reversed-phase liquid chromatography, and phase-ratio-independent estimation of transfer enthalpy. Journal of Chromatography a 2003, 1003(1–2):101-111. McCalley DV: Effect of temperature and flow-rate on analysis of basic compounds in highperformance liquid chromatography using a reversed-phase column. Journal of Chromatography a 2000, 902(2):311-321. Greibrokk T, Andersen T: Temperature programming in liquid chromatography. Journal of Separation Science 2001, 24(12):899-909. McNeff CV, Yan B, Stoll DR, Henry RA: Practice and theory of high temperature liquid chromatography. Journal of Separation Science 2007, 30(11):1672-1685. Greibrokk T, Andersen T: High-temperature liquid chromatography. Journal of Chromatography a 2003, 1000(1–2):743-755. Guillarme D, Heinisch S, Rocca JL: Effect of temperature in reversed phase liquid chromatography. Journal of Chromatography a 2004, 1052(1–2):39-51. Heinisch S, Rocca J-L: Sense and nonsense of high-temperature liquid chromatography. Journal of Chromatography a 2009, 1216(4):642-658. Melander W, Campbell DE, Horváth C: Enthalpy—entropy compensation in reversed-phase chromatography. Journal of Chromatography a 1978, 158(0):215-225. Buszewski B, Bocian S, Zera R: Influence of temperature and pressure on the preferential adsorption of component of hydroorganic mobile phase in liquid chromatography. Adsorption 2010, 16(4):437-445. Cole LA, Dorsey JG: Temperature dependence of retention in reversed-phase liquid chromatography. 1. Stationary-phase considerations. Analytical Chemistry 1992, 64(13):1317-1323. 188 324. 325. 326. 327. 328. 329. 330. 331. 332. 333. 334. 335. 336. 337. 338. 339. 340. 341. Morel D, Serpinet J: Liquid chromatographic study of the two physical states of a densely bonded alkyl-silica and the corresponding retention processes. Journal of Chromatography a 1982, 248(2):231-240. Adlercreutz D, Budde H, Wehtje E: Synthesis of phosphatidylcholine with defined fatty acid in the sn-1 position by lipase-catalyzed esterification and transesterification reaction. Biotechnology and Bioengineering 2002, 78(4):403-411. Adlercreutz P, Virto C, Persson M, Vaz S, Adlercreutz D, Svensson I, Wehtje E: Enzymatic conversions of polar lipids. Principles, problems and solutions. Journal of Molecular Catalysis B: Enzymatic 2001, 11(4-6):173-178. Poisson L, Devos M, Godet S, Ergan F, Pencreac’h G: Acyl migration during deacylation of phospholipids rich in docosahexaenoic acid (DHA): an enzymatic approach for evidence and study. Biotechnology Letters 2009, 31(5):743-749. Rosseto R, Hajdu J: a rapid and efficient method for migration-free acylation of lysophospholipids: synthesis of phosphatidylcholines with sn-2-chain-terminal reporter groups. Tetrahedron Letters 2005, 46(16):2941-2944. Vikbjerg AF, Mu H, Xu X: Synthesis of structured phospholipids by immobilized phospholipase A2 catalyzed acidolysis. Journal of Biotechnology 2007, 128(3):545-554. Yavlovich A, Singh A, Tarasov S, Capala J, Blumenthal R, Puri A: Design of liposomes containing photopolymerizable phospholipids for triggered release of contents. Journal of Thermal Analysis and Calorimetry 2009, 98(1):97-104. Helmerich G, Koehler P: Functional properties of individual classes of phospholipids in breadmaking. Journal of Cereal Science 2005, 42(2):233-241. Koprivnjak O, Skevin D, Valic S, Majetic V, Petricevic S, Ljubenkov I: The antioxidant capacity and oxidative stability of virgin olive oil enriched with phospholipids. Food Chemistry 2008, 111(1):121-126. Oke M, Jacob JK, Paliyath G: Effect of soy lecithin in enhancing fruit juice/sauce quality. Food Research International 2010, 43(1):232-240. Anton M, Martinet V, Dalgalarrondo M, Beaumal V, David-Briand E, Rabesona H: Chemical and structural characterisation of low-density lipoproteins purified from hen egg yolk. Food Chemistry 2003, 83(2):175-183. Kim J, Lee C-S, Oh J, Kim B-G: Production of egg yolk lysolecithin with immobilized phospholipase A2. Enzyme and Microbial Technology 2001, 29(10):587-592. Dutilh CE, Groger W: Improvement of product attributes of mayonnaise by enzymic hydrolysis of egg yolk with phospholipase A2. Journal of the Science of Food and Agriculture 1981, 32(5):451-458. Kilby P, Primrose W, Roberts G: Changes in the structure of bovine phospholipase A2 upon micelle binding. Biochemical Journal 1995, 305:935-944. Mingarro I, Abad C, Braco L: Characterization of Acylating and Deacylating Activities of an Extracellular Phospholipase A2 in a Water-Restricted Environment. Biochemistry 1994, 33(15):4652-4660. Morgado MAP, Cabral JMS, Prazeres DMF: Hydrolysis of lecithin by phospholipase A2 in mixed reversed micelles of lecithin and sodium dioctyl sulphosuccinate. Journal of Chemical Technology & Biotechnology 1995, 63(2):181-189. Plueckthun A, Dennis EA: Acyl and phosphoryl migration in lysophospholipids: importance in phospholipid synthesis and phospholipase specificity. Biochemistry 1982, 21(8):17431750. Kiełbowicz G, Smuga D, Gładkowski W, Chojnacka A, Wawrzeńczyk C: An LC method for the analysis of phosphatidylcholine hydrolysis products and its application to the monitoring of the acyl migration process. Talanta 2012, 94(0):22-29. 189 342. 343. 344. 345. 346. Liu X, Pohl C: New hydrophilic interaction/reversed-phase mixed-mode stationary phase and its application for analysis of nonionic ethoxylated surfactants. Journal of Chromatography a 2008, 1191(1-2):83-89. Jandera P, Hájek T, Škeříková V, Soukup J: Dual hydrophilic interaction-RP retention mechanism on polar columns: Structural correlations and implementation for 2-D separations on a single column. Journal of Separation Science 2010, 33(6-7):841-852. Guo Y, Gaiki S: Retention behavior of small polar compounds on polar stationary phases in hydrophilic interaction chromatography. Journal of Chromatography a 2005, 1074(1-2):7180. Dell'Aversano C, Hess P, Quilliam MA: Hydrophilic interaction liquid chromatography-mass spectrometry for the analysis of paralytic shellfish poisoning (PSP) toxins. Journal of Chromatography a 2005, 1081(2):190-201. Laca A, Paredes B, Díaz M: a method of egg yolk fractionation. Characterization of fractions. Food Hydrocolloids 2010, 24(4):434-443. 190
EAc + H2O
O
