influencia del riego sobre la verticilosis del olivo
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INFLUENCIA DEL RIEGO SOBRE LA VERTICILOSIS DEL OLIVO MARIO PÉREZ RODRÍGUEZ Febrero 2016 Departamento de Agronomía. Escuela Técnica Superior de Ingenieros Agrónomos y de Montes. Universidad de Córdoba TITULO: Influencia del riesgo sobre la Verticilosis del olivo. AUTOR: Mario Pérez Rodríguez © Edita: Servicio de Publicaciones de la Universidad de Córdoba. 2016 Campus de Rabanales Ctra. Nacional IV, Km. 396 A 14071 Córdoba www.uco.es/publicaciones [email protected] ESCUELA TÉCNICA SUPERIOR DE INGENIEROS AGRÓNOMOS Y MONTES DEPARTAMENTO DE AGRONOMÍA INFLUENCIA DEL RIEGO SOBRE LA VERTICILOSIS DEL OLIVO Memoria de Tesis para optar al grado de Doctor con Mención Internacional por la Universidad de Córdoba por el Ingeniero Agrónomo Mario Pérez Rodríguez Director: Dr. Fco. Javier López Escudero Córdoba, Febrero 2016 TÍTULO DE LA TESIS: INFLUENCIA DEL RIEGO SOBRE LA VERTICILOSIS DEL OLIVO DOCTORANDO/A: Mario Pérez Rodríguez INFORME RAZONADO DEL/DE LOS DIRECTOR/ES DE LA TESIS El doctorando Mario Pérez Rodríguez ha realizado la tesis doctoral titulada: “Influencia del riego sobre la verticilosis del olivo”. Este trabajo se considera finalizado y reúne los requisitos necesarios para su exposición y defensa. A lo largo de su investigación el Doctorando ha contribuido con diversas aportaciones de interés para la comunidad científica. Este trabajo supone un avance importante en el estudio de la influencia del riego sobre la enfermedad más grave del olivar en la actualidad. Los resultados obtenidos en esta tesis pueden ayudar al agricultor a establecer una estrategia de riego adecuada en aquellos olivares afectados por Verticilosis o en aquellas zonas donde en un futuro la enfermedad pueda estar presente. El trabajo ha sido realizado en el Departamento de Agronomía de la universidad de Córdoba y gran parte ha sido difundido en las siguientes publicaciones: Tres artículos en revistas de prestigio científico indexadas en la base de datos JCR, dos de ellos publicados y el tercero aceptado y en prensa. Tres comunicaciones a congresos internacionales, siendo dos de ellas comunicaciones orales. Tres comunicaciones nacionales siendo una de ellas una comunicación oral. Además de su línea de investigación, durante su tesis, el doctorando ha participado en otras investigaciones del departamento que le ha permitido una formación muy amplia en fitopatología, trabajando en otros patosistemas en los que estaban involucrados diversos patógenos que afectan foliarmente a varios cultivos leñosos de interés. Como resultado ha participado como autor principal o coautor en varias comunicaciones en congresos nacionales e internacionales y en otras revistas indexadas del área reconocidas en el Science Citation Index, o de carácter divulgativo. Por último, el doctorando ha sido codirector durante este periodo de varios proyectos de fin de carrera y una tesis de máster. Esta codirección le ha permitido transmitir sus conocimientos a otros estudiantes en formación. Por todo ello, se autoriza la presentación de la tesis doctoral. Córdoba,_12__ de ____Febrero___ de _2016_______ Firma del/de los director/es MENCIÓN DE DOCTORADO INTERNACIONAL La presente tesis cumple los requisitos establecidos por la universidad de Córdoba para la obtención del título de Doctor con Mención Internacional: Estancia internacional predoctoral de 3 meses (del 5 de Agosto del 2014 al 5 de Noviembre del 2014) en el Institute of Applied Plant Research of WageningenUR. El supervisor de la estancia fue el Dr. Jelle A. Hiemstra, Senior scientist of Wageningen UR/Applied Plant Research. La tesis cuenta con el informe previo de dos doctores externos con experiencia acreditada pertenecientes a alguna institución de educación superior o instituto de investigación diferente a España: Dr. Giovanni N. Bubici, Istituto per la Protezione Sostenible delle Piante (IPSP), U.O.S. Bari. Consiglio Nacionale delle Ricerche (CNR), Italy. Dr. George Karaoglanidis, Assistant Professor. Aristotles University of Thessaloniki. Faculty of Agriculture, Forestry and Natural Resources Thessaloniki, Greece. Como miembro del tribunal, un doctor perteneciente a alguna institución de educación superior o centro de investigación no español forma parte del tribunal evaluador de la tesis: Dr. Paula Baptista, Profesora de la escuela superior agraria. Instituto politécnico de Bragança, Portugal. Parte de la Tesis doctoral, de acuerdo a la normativa, se ha redactado y se presentará en dos idiomas, castellano e inglés. El Doctorando Fdo: Mario Pérez Rodríguez TESIS POR COMPENDIO DE ARTÍCULOS Esta tesis cumple el requisito establecido por la Universidad de Córdoba para su presentación como compendio de artículos. Consiste en un mínimo de 3 artículos publicados o aceptados en revistas incluidas en los tres primeros cuartiles de la relación de revistas del ámbito de la especialidad y referenciadas en la última relación publicada por Journal Citation Report (SCI): 1. Pérez-Rodríguez, M., Alcántara E., Amaro-Ventura M., Serrano N., Lorite I.J., Arquero O., Orgaz F., and López-Escudero F.J. 2015. Influence of irrigation frequency on the onset and development of Verticillium wilt of olive. Plant Disease 99:488-495. Datos de 2014 (JCR): índice de impacto 3.020, posición 40/204 y 1er cuartil en el área temática de Plant Sciencies. 2. Pérez-Rodríguez, M., Lorite I. J., Orgaz F., and López-Escudero F.J. 2015. Effect of the irrigation dose on Verticillium wilt of olive. Scientia Horticulturae 197: 564-567. Datos de 2014 (JCR): índice de impacto 1.365, posición 9/33 y 2º cuartil en el área temática de Horticultura. 3. Pérez-Rodríguez, M., Serrano, N., Arquero, O., Orgaz, F., Moral, J. , and LópezEscudero F.J. 2015. The effect of short irrigation frequencies on the development of Verticillium wilt in the susceptible olive cultivar ‘Picual’ at field conditions. Plant Disease (En prensa). Datos de 2014 (JCR): índice de impacto 3.020, posición 40/204 y 1 er cuartil en el área temática de Plant Sciencies. El Doctorando Fdo: Mario Pérez Rodríguez Los trabajos incluidos en esta tesis doctoral han sido parcialmente subvencionados por el Proyecto AGL2011–30137 del Ministerio de Ciencia e Innovación, co-financiado por fondos FEDER de la Unión Europea, y por el contrato (UG 400544) entre la Universidad de Córdoba y la Interprofesional del Aceite de Oliva Español. La portada de la tesis y las ilustraciones han sido realizadas por Luís Pérez González. AGRADECIMIENTOS En primer lugar quiero agradecer a mi familia todo el apoyo recibido, especialmente a mis padres, que siempre han estado allí para apoyarme y darme fuerzas para seguir a delante. A ti Espe, principalmente por tu paciencia y por ser algo más que mi mejor amiga. En pocas palabras, Por todo. A Fco. Javier López Escudero que aparte de ser un muy buen director de tesis, está siendo un muy buen compañero de trabajo. ¡Gracias! A Juan Moral Moral, por ayudarme siempre, por darme buenos consejos, por ser un buen amigo. A Paco González, sin su ayuda y apoyo con los trabajos de campo hubiera sido muy difícil sacar esto adelante. A Paco Orgaz, todas las conversaciones que he tenido contigo siempre me han aportado mucho. He tenido mucha suerte de que formaras parte de este proyecto. A Antonio Trapero por ofrecerme este trabajo, por ayudarme siempre con mis dudas. Si he llegado hasta este punto de mi vida profesional, es en parte gracias a ti. A Paqui Luque, todo lo que he aprendido en el laboratorio te lo debo a ti. Para mi eres más que una buena técnico laboratorio. A Diego Cabello, por los momentos pasados y por los que vendrán. A Beatriz Muñoz, espero que algún día volvamos a coincidir. A Conchi, por ser una buena amiga y además una excelente compañera de trabajo. A la interprofesional del aceite de oliva español por quererse involucrar en este proyecto. A todos las personas de la comunidad de Regantes de Santaella, especialmente a Sensi. A la Oficina Comarcal Agraria “Sierra Morena/Campiña de Jaén (Andujar, Jaén). A la Comunidad de Regantes “Ntra. Sra. De los Dolores” (Arjona. Jaén) y especialmente a Rafael Jiménez del Río por su ayuda. A Angela, está siendo duro y seguramente lo seguirá siendo, pero estoy convencido que acabarás la Tesis porque eres una buena investigadora y lo más importante, eres buena persona. A Mario, está siendo un placer compartir despacho contigo, se que llegarás lejos. A Mª Ángeles (La peliroja) por hacerme reír. A Esperanza, Luís, Mari Carmen, Francisco, Joaquín, Mª Ángeles, Eduardo, Antonio, María, Ana, Carlos Trapero, Carlos Agustí, y las otras muchas personas que conviven o que durante estos años han convivido conmigo en el departamento. A mis amigos de Córdoba, Alejandro, Ana, Pablo y Meli por hacerme disfrutar cada vez que he estado con vosotros. A mis amigos de Girona, Pau, Alex, Xevi etc…. Por vuestra amistad. A Luís Pérez por los dibujos y por tantas cosas más. A Mª Carmen Rodríguez, Belén Pérez, Beatriz Pérez, Rosa Rodríguez e Israel Araque. ¡Sois mi familia, gracias por todo! A Marçel, Blanca, Violeta, Carlota y a mis otros sobrinos. RESUMEN La Verticilosis del olivo (VO) causada por el hongo hifomiceto V. dahliae Kleb está considerada actualmente la enfermedad de suelo más grave de este cultivo. Durante las últimas décadas la expansión de VO en las zonas olivareras ha sido paralela a la reconversión de olivares de secano a regadío en plantaciones en las que antes la enfermedad no ocasionaba una incidencia elevada. Además, numerosas observaciones apuntan a que el desarrollo de esta enfermedad está siendo mucho más importante en los olivares de regadío que en los olivares de secano. El objetivo general de la presente Tesis Doctoral ha sido estudiar el efecto del manejo del riego en el desarrollo de la VO. En un primer experimento realizado en condiciones semicontroladas (microparcelas con suelo naturalmente infestado por el patógeno) se demostró que un riego diario favorece el inicio y desarrollo de la enfermedad en el cultivar susceptible Picual. Sin embargo, el progreso de VO en el cultivar Arbequina no se vio influenciado por las diferentes frecuencias de riego establecidas. Los bajos niveles de enfermedad obtenidos en el cultivar Frantoio para cualquiera de los tratamientos de riego estudiados claramente sugieren que el uso de cultivares resistentes pueden tener más impacto en el control de la enfermedad que la aplicación de determinadas frecuencias de riego. Los resultados obtenidos en estas condiciones experimentales sugieren que una reducción de la frecuencia del riego cuando se usan cultivares susceptibles en suelos naturalmente infestados por V. dahliae puede ser una estrategia eficaz para ralentizar el desarrollo de esta enfermedad. En las 70 fincas prospectadas en un zona del Valle del Guadalquivir afectada por VO se observó que la incidencia de la enfermedad era significativamente más importante (21.42%) en las plantaciones regadas con una dosis alta, valor medio: 2059 m3/ha (2012) y 1793.4 m3/ha (2013). Las plantaciones regadas con una dosis de riego menor, valor medio: 712.5 m3/ha (2012) y 741.5 m3/ha (2013), mostraron una incidencia de la enfermedad significativamente más baja (13.3%). Finalmente, las fincas en secano fueron las que mostraron el valor más bajo de incidencia (4%). Por consiguiente, de este estudio se deduce que una disminución de la dosis de riego puede ser una práctica cultural adecuada para controlar el desarrollo de VO. En los trabajos en condiciones de campo, el efecto de una frecuencia de riego diaria sobre la Verticilosis en el cultivar susceptible Picual, en general no fue significativamente diferente al efecto causado por una frecuencia de riego quincenal. El incremento de la incidencia y de la severidad durante la primavera y el otoño estuvo significativamente relacionado con el contenido de agua en el suelo de la misma y/o previa estación favorable. Además, en estos trabajos de campo se demostró que existe un porcentaje de contenido de agua en el suelo por encima del punto de marchitez permanente para el que los incrementos de severidad e incidencia de la enfermedad en las estaciones favorables (primavera y otoño) se mantienen en cero. Estos resultados sugieren que bajo las condiciones del Valle del Guadalquivir, dependiendo de la pluviometría de la zona, espaciar el riego o incluso no regar durante un periodo de tiempo puede ser un método factible para mantener el contenido de agua en el suelo por debajo del nivel que favorece la enfermedad. SUMMARY Verticillium wilt of olive (VWO) caused by the fungus Verticillium dahliae Kleb is considered the most severe disease of this crop. During the last decades the expansion of VWO has been parallel to the reconversion of dry-land into irrigated systems. Moreover, a number of observations suggest that disease development of VWO is more important in irrigated olive orchards than in orchards located in dry-land zones. In consequence, the general objective of this work has been to study the effect of irrigation on the VWO development. In a first experiment conducted in microplots filled with naturally infested soil, the daily irrigation frequency strongly encouraged the onset and development of VWO in the susceptible ‘Picual’ olive. However, disease progress in ‘Arbequina’ was not influenced by the irrigation frequency. Finally, the low disease rates recorded for ‘Frantoio’ clearly suggest that the use of resistant cultivars might have more impact on disease control than the application of certain irrigation frequencies that may be unfavorable for disease development in susceptible cultivars. Therefore, the results from this study strongly encourage a reduction in irrigation frequency when growing very susceptible cultivars in soils containing V. dahliae. In the 70 prospected olive orchards in a cultivated zone of Guadalquivir valley affected by VWO, disease incidence was significantly more severe (21.42%) in olive plantations irrigated with high irrigation doses; mean value of 2059 m3/ha (in 2012) and 1793.4 m3/ha (in 2013). Plantations watered with lesser doses, with average values of 712.5 (in 2012) and 741.5 (in 2013) m3/ha, showed a disease incidence significantly lower, which accounted for 13.3%. Finally, dry-land olive orchards showed the lowest disease incidence (4.0%). Consequently, data shows that the reduction in watering dosage could be an advisable cultural practice for controlling VWO in affected olive orchards. In field experiments, the effect of daily irrigation frequency on the disease development was not significantly different to the effect of biweekly irrigation frequency in general. In these field trials, and during the observation period, a significant correlation between disease incidence and severity increments during spring and fall with the soil water content of the same and/or previous favorable seasons was observed. Moreover, in these experiments, a percentage of soil water content above permanent wilting point which disease incidence and severity remained at zero was observed. Therefore, under the climatic conditions of the Guadalquivir valley, depending on rainfall of the zone, spacing out irrigation or even leaving the affected orchard on dry-land for a certain period of time may be a feasible method for keeping the soil water content below detrimental values for disease development. ABREVIATURAS ANOVA = análisis de varianza ABCPE = área bajo la curva de progreso de la enfermedad AUDPC = area under disease progress curve D = defoliante / defoliating DI = disease incidence DI50 = time in weeks from planting until 50% of the plants were affected FS = time from tree transplantation to the onset of disease symptoms M = mortality M50 = time in weeks from planting until 50% of the plants had died MDPR = maximum disease progress rate MM = time from symptom onset to plant death MS = mean severity MS50 = time in weeks from planting until the severity of the affected plants was equal to 2 MS/g = microsclerotia per gram MSPA = modified sodium polypectate agar MSWC = minimum soil water content in percentage ND = no defoliante / non-defoliating PCR= polymerase chain reaction PDA = potato dextrose agar TDR = time domain reflectometry qPCR = quantitative polymerase chain reaction VO = verticilosis del olivo WVO = verticillium wilt of olive ÍNDICE Página CAPÍTULO 1 (Introducción general y Objetivos) 1 INTRODUCCIÓN GENERAL…….…………………………….................. 1. El olivo: historia, importancia y distribución. ………..……………. 2. El riego en el olivar…………………………………………………… 2.1. Programación riegos……………………..…………………….… 2.2. Métodos de programación de riego basados en medidas en el suelo…………………………………………………………………... 3. La Verticilosis del Olivo………..…………………………………... 3.1. Historia, distribución e importancia.………………...…………… 3.2. Etiología y diagnóstico…………………………………………… 3.2.1. Etiología y gama de huéspedes……..………...…………… 3.2.2. Síntomas de la enfermedad…………………..…………… 3.3. Variabilidad patogénica……………………………….…………. 3.4. Ciclo biológico……………………………………....…………… 3.5. Fuente de inóculo y supervivencia……….………………….…… 3.6. Germinación de las estructuras de supervivencia.………….……. 3.7. Penetración del patógeno…….……………………………….….. 3.8. Conolización de la planta………………………………….……... 3.9. Desarrollo de síntomas………………………………………….... 3.10. Factores que contribuyen a la importancia y distribución de la Verticilosis del olivo………………………………………………….. 3.10.1. Factores que favorecen la persistencia, incremento y dispersión del patógeno…………………………………………... 3.10.2. Dispersión de Verticillium dahliae…………….…………. 3.10.3. El riego como factor agronómico que favorece el inicio y desarrollo de la enfermedad……………………………………… 3.10.4. Otros factores agronómicos que favorecen la enfermedad. 3.10.5. Factores ambientales: Temperatura, características edáficas y interaciones bióticas………………….………………. 3.11. Control integrado de la Verticilosis…………………………….. 3.11.1. Medidas antes de la plantación…………………………... 3.11.1.1. Uso de cultivares resistentes.……..…….……..... 3.11.2. Medidas después de la plantación………………….…….. 3.11.2.1. Métodos excluyentes…………………………… 3.11.2.2. Métodos erradicativos…….……………………. 3.11.2.2.1 Erradicación de agentes fitopatógenos en el agua de riego………………………………. 3.11.2.3. Métodos de escape……………………………… 3.11.2.3. Terápia………………………………………….. 4. Justificación de la Tesis doctoral………….………………………… 3 3 3 4 OBJETIVOS…………………………………………………………………. 5 5 5 6 6 9 10 11 12 12 13 14 14 14 14 15 16 19 20 21 21 22 23 24 24 25 26 26 27 27 Página CHAPTER 2 (Irrigation frequency in microplots) The influence of Irrigation frequency on the onset and disease development of Verticillium wilt of olive…...…..………...………………………..………. Abstract………………………………………………………………….. Introduction……………………………………………………………... Material and Methods………....……………………………………….. Experimental plot………………………………………………. Collecting and characterizing the soil naturally infested with V. dahliae……………………………………………………....... Soil properties…………………………………………………... Plant material…………………………………………………… Irrigation treatments…………………………………………… Microplot establishment and experimental design…………… Soil water content measurement in the microplots.................... ID of V. dahliae in microplot soil……………………………… Disease progression and tree development................................ Pathogen isolation………………………………………………. Data analysis................................................................................. Results....................................................................................................... ID of V. dahliae in the soil……………………………………… Disease symptoms……………………………………………….. Pathogen isolation from affected tissues………………………. Disease progression………………………………………….….. Discussion…………………………………………………………..…… Acknowledgments………………………………………………………. References..........………………………………………………………… Supplementary Figures............................................................................ 29 31 31 32 32 32 33 33 34 34 34 35 35 35 36 36 37 37 37 37 37 39 42 42 52 CHAPTER 3 (Irrigation dose) 55 Effect of the irrigation dose on Verticillium wilt of olive……………………. Abstract………………………………………………………………….. Introduction……………………………………………………………... Material and Methods………....……………………………………….. Disease surveys………………………………..………………… Data analysis…………………………………………………….. Results and Discussion………………………………………………….. Acknowledgments………………………………………………………. References…………………………………………….………………… Supplementary Figures............................................................................ 57 57 58 58 58 59 59 60 61 66 Página CHAPTER 4 (Irrigation frequency at field conditions) The effect of short irrigation frequencies on the development of Verticillium wilt in the susceptible olive cultivar ‘Picual’ at field conditions …………….. Abstract………………………………………………………………….. Introduction……………………………………………………………... Material and Methods………....……………………………………….. Field experimental plots………………………………………... Experiment I.….………………………………………….…....... Soil properties and Verticillium dahliae inoculum density........ Plant material…………………………………………………… Orchard establishment, experimental design and irrigation treatments……………………………………………………….. Experiment II…………………………………………………… Inoculating the experimental site and collecting and characterizing a naturally infested soil………………………... Plot infestation, orchard establishment, experimental design and irrigation treatments……………………………………….. Assessment of disease progression……………………………... Relationship between increase in disease parameters (incidence and severity) and soil water content in Experiments I and II..................................................................... Rainfall data……….……………………………………………. Data analysis.................................................................................. Results........................................................................................................ Inoculum density of Verticillium dahliae in the soil…………... Disease symptoms and pathogen isolation from affected tissues…………………………………………………….………. Disease progression…………………………………….……….. Rainfall at experimental plots…………………………….……. Relationship between the increase in disease parameters (incidence and severity) and soil water content……….………. Discussion……………………………………………………...………… Acknowledgments………………………………………………………. References..........………………………………………………………… Supplementary Figures............................................................................ 71 73 73 74 75 75 75 75 76 76 77 77 77 78 79 79 79 80 80 80 80 82 82 83 87 87 96 DISCUSIÓN GENERAL 101 CONCLUSIONS 109 Página BIBLIOGRAFIA (Introducción general y Discusión general) 113 ANEJO 1 (Estancia en el extranjero) 139 Estancia en el centro “Wageningen UR/Applied Plant Research Sector Flower Bulbs, Nursery Stock & Fruits” en Holanda..…….…………..……… Objetivo de la estancia…………………..……………………………… Experimento I: Inoculación de variedades de olivo………….……….. Material y Métodos................................................................................... Material Vegetal………………………………………………… Inoculación e incubación………………………………………. Diseño experimental………………………………………...…... Evaluación del progreso de la enfermedad................................. Visualización del patógeno……………………………………... Análisis de datos............................................................................ Resultados preliminares…………..……………………………………. Síntomas de la enfermedad…………………..………………… Progreso de la enfermedad……………………………………... Visualización del patógeno………………………………….….. 141 141 141 141 141 141 141 142 142 142 142 142 142 143 Experimento II: Distribución de Verticillium dahliae en plantones de Fresno y Arce………………………………………………………………… Material y Métodos……………………………………………………... Material Vegetal………………………………………………… Inoculación………………………………………………………. Recogida y procesado de muestras…………………………….. Resultados preliminares………………………………………………... Bibliografía………….…………………………………………………... Figuras suplementarias……………………………………………………… 144 144 144 144 144 145 145 146 ANEJO 2 (Producción científica) 149 Introducción General y Objetivos 1 2 Introducción y Objetivos INTRODUCCIÓN GENERAL 1. El olivo: historia, importancia y distribución. El olivo es la única especie que produce frutos comestibles dentro de la familia botánica Oleaceae y es una de las plantas cultivadas más antiguas (Zohary y Spiegel-Roy, 1975; Green, 2002). Probablemente fue domesticado del acebuche y originario de la región geográfica rodeada por el sur del Cáucaso, la Meseta Persa y la costa de Siria. Se extendió por Chipre hacia Anatolia, y a través de Creta hacia Egipto, hasta poblar todos los países del Mediterráneo. Más tarde, en la época de los largos viajes transoceánicos en los siglos XV y XVI, se extendió a las Américas, y más recientemente fue introducido y cultivado en Sudáfrica, China, Japón y Australia (Civantos, 2008). El cultivo del olivo se concentra entre las latitudes 30º-45º tanto en el hemisferio norte como en el hemisferio sur, en regiones con clima mediterráneo (López-Escudero y Mercado-Blanco, 2011). De este modo, el 97% del área de cultivo global (aproximadamente 10.5 millones de ha) se localiza en la Cuenca Mediterránea, el 1.5% en Asia, el 0.8% en América y el 0.01% en Asia. España es el principal productor con un 25% de la superficie mundial y cerca del 44% de la producción, seguido de Italia, Grecia, Túnez, Turquía, Siria y Marruecos (FAO, 2015). Andalucía es la comunidad autónoma con mayor superficie (65%) y mayor producción (85%) en España, donde el olivo constituye un cultivo con una gran importancia económica, ecológica y social (Barranco et al., 2008). Tradicionalmente, los olivares de la Cuenca Mediterránea tenían densidades de plantación variables, dependiendo de la topografía y la disponibilidad de agua, tendiéndose en la mayoría de los casos a marcos amplios y en secano. Sin embargo, en las últimas décadas y con el fin de aumentar la productividad, se ha producido una modernización del cultivo, principalmente en los siguientes aspectos: uso de plantas de vivero, altas densidades de plantación, laboreo reducido o no laboreo, uso de fertilizantes de síntesis química y riego por goteo (Barranco et al., 2008). 2. El riego en el olivar Tradicionalmente el olivar se ha cultivado en condiciones de secano ya que es capaz de sobrevivir a periodos importantes de sequía. Sin embargo, desde hace un tiempo, se ha comprobado que experimentalmente la práctica del riego aumenta considerablemente el rendimiento del olivar, incluso si las aportaciones de agua son reducidas (Orgaz y Fereres, 2008). A pesar de la resistencia a sequía, la productividad del olivo, responde negativamente a la falta de agua (tabla 1). 3 Capítulo 1 Tabla 1: Efectos del déficit hídrico en los procesos de crecimiento y producción del olivo. Proceso Período Efecto del deficit hídrico Reducción del número de flores al Crecimiento vegetativo Todo el año año siguiente Reducción número de flores. Aborto Desarrollo de yemas florales Febrero-Abril ovárico Floración Mayo Reduce fecundación Cuajado de frutos Mayo-Junio Aumenta la alternancia Disminuye el tamaño del fruto Crecimiento inicial del fruto Junio-Junio (menor número de células/fruto) Disminuye el tamaño del fruto Crecimiento posterior del fruto Agosto-Cosecha (menor tamaño de las células del fruto) Disminuye el contenido de Acumulación de aceite Julio-Noviembre aceite/fruto Fuente: Orgaz y Fereres, 2008 En Andalucía, independientemente del marco de plantación, las zonas olivareras acostumbran a consumir cantidades de agua inferiores a 2500 m3/ha y año, aunque los años de pluviometría raramente rebasan los 1500 m3/ha y año, cifra asignada por la Comunidad Hidrográfica del Guadalquivir en las concesiones administrativas (Pastor, 2005). Gracias a su mayor eficiencia potencial, el riego por goteo es el sistema de riego más utilizado en las zonas regables del olivar. Este tipo de sistema lleva al agricultor muchas veces, a aplicar elevadas frecuencia de riegos (normalmente diarias) durante un calendario fijo, ignorando el papel del suelo como almacén de agua (Orgaz y Fereres, 2008). 2.1. Programación de riegos. A efectos de la programación del riego, el suelo se considera como un depósito de agua con un nivel superior denominado Límite superior (LS) o Capacidad de campo. El concepto de LS hace referencia al contenido de agua en el que se estabiliza un suelo cuando cesa el drenaje libre tras ser saturado. Cuando un suelo está a LS se considera que está lleno de agua. El Límite inferior (LI) o punto de marchitez permanente corresponde al contenido de agua en el suelo para el que se produce una marchitez irreversible en el cultivo y por debajo de éste no puede extraer más agua. Dependiendo de la textura a efectos operativos, cada tipo de suelo tiene un valor de LS y LI determinado, expresado generalmente en porcentaje o en m3 de agua / m3 de suelo. A partir de estos dos puntos característicos se puede definir el intervalo de humedad disponible (IHD) como la diferencia entre los dos límites inferior y superior. IHD por tanto, es una medida de la capacidad de retención de agua en el suelo. 4 Introducción y Objetivos Aunque las plantas pueden extraer agua hasta LI, existe un punto intermedio a LS y LI a partir del cual se produce una reducción de la transpiración y por tanto de la fotosíntesis. Este valor expresado como fracción del IHD se denomina Nivel de Agotamiento Permisible (NAP). El NAP indica qué fracción del agua retenida por el suelo está disponible para el cultivo sin que afecte a su desarrollo. Esta fracción varía en función del cultivo, de su estado de desarrollo y de la demanda evaporativa. Para el caso del olivo no se dispone aún de información experimental precisa. Sin embargo, su naturaleza perenne, el buen desarrollo de su sistema radicular y su evapotranspiración relativamente baja, permiten deducir que un olivar adulto puede agotar hasta un 75% del agua disponible en el suelo sin que su producción se vea afectada. En cualquier caso, un olivar joven, cuyo crecimiento es más sensible, se estima que puede agotar solo hasta un 50% del agua disponible en el suelo (Orgaz y Fereres, 2008; Studeto et al., 2012). 2.2. Métodos de programación de riego basados en medidas en el suelo El contenido de agua en el suelo es un indicador de la disponibilidad de agua para la planta. Así, si disponemos del estado hídrico del suelo y conocemos los valores umbrales para los que hay que regar, podremos establecer una programación de riego. Existen diferentes métodos de medida del contenido de agua en el suelo. El método más sencillo y que toma una medida más directa y fiable es el método gravimétrico, aunque existen otros métodos de medida como el tensiómetro, los bloques de yeso, la sonda de neutrones o las medidas de la constante dieléctrica (Villalobos et al., 2002). Las técnicas para medir el contenido de agua en el suelo se basan en medir la constante dieléctrica del suelo que depende sobre todo de su contenido de agua. Dentro de estas técnicas tenemos el sistema TDR (Time Domain Reflectometry, 6050X1 Trase System I; Soil Moisture equipment Corp., Santa Barbara, CA, USA). Este sistema consiste en un osciloscopio conectado a dos varillas metálicas que se insertan en paralelo en el suelo. Si se aplica una diferencia de potencial a un extremo de las varillas, la energía se transmite a lo largo de las varillas hasta su extremo, donde son reflejadas hacia el osciloscopio. En el mismo se mide la evolución del potencial a lo largo del tiempo. La velocidad de transmisión de la onda en el viaje de ida y vuelta depende de una constante dieléctrica del medio (suelo que rodea las varillas) por lo que es posible deducir la constante dieléctrica a partir del tiempo de la onda a través de las varillas. A su vez, la constante dieléctrica del suelo depende sobre todo de su contenido de agua. Por ello el análisis de la onda nos permite estimar el contenido de agua (Villalobos et al., 2002). 3. La Verticilosis del olivo 3.1. Historia, distribución e importancia La Verticilosis del olivo (VO), causada por el hongo hifomiceto Verticillium dahliae Kleb, es hoy en día la enfermedad más preocupante y devastadora de este cultivo 5 Capítulo 1 en España y presumiblemente en todos los países de la Cuenca Mediterránea (Bubici y Cirulli, 2011; Jiménez-Díaz et al., 2012, López-Escudero and Mercado-Blanco 2011; Tsror 2011). Fue diagnosticada por primera vez en Italia (Ruggieri, 1946), y desde entonces ha sido descrita en California (Snyder et al. 1950), Grecia (Sarejanni et al., 1952; Zachos, 1963), Turquía (Saydam y Copcu, 1972) y diversos países del área Mediterránea. En España fue observada por primera vez en el año 1975 (Caballero et al., 1980), aunque existen descripciones anteriores de síntomas similares a la VO a los que se denominó “alagartado” del olivo (Benlloch, 1943). No hay disponibles valoraciones económicas exhaustivas de la importancia de la enfermedad, aunque se han realizado prospecciones en diferentes países. Por ejemplo, Thanassoulopoulos et al. (1979) estimaron una incidencia de la enfermedad del 2-3% y pérdidas de cosecha del 1% de la producción nacional griega. En Andalucía, prospecciones realizadas entre 1980 y 1983 en 122 plantaciones adultas en las provincias de Córdoba, Sevilla y Jaén, mostraron que la enfermedad estaba presente en el 38.5% de los casos, con una incidencia de hasta el 90% en algunas plantaciones (Blanco-López et al. 1984). En encuestas realizadas entre 1994 y 1996 se observó la presencia de la enfermedad en el 39.5% de las 122 plantaciones jóvenes consultadas. Dichas plantaciones se situaban lejos de las zonas donde la VO fue detectada por primera vez (Sánchez-Hernández et al., 1998). Desde entonces, en España esta enfermedad se ha extendido considerablemente, asociada principalmente al establecimiento de plantaciones intensivas jóvenes con cultivares de olivo susceptibles en suelos infestados por el patógeno (León-Gallego, M. 2000; LópezEscudero et al., 2010; Roca et al., 2015; Rodríguez et al., 2008, 2009, 2011). Asimismo, la incidencia registrada en muchas de las plantaciones afectadas se ha incrementado en los últimos años. En este sentido, López-Escudero et al. (2010) observaron una incidencia media del 20% en plantaciones afectadas por la VO en las principales provincias olivicultoras del Valle del Guadalquivir, Jaén, Córdoba y Sevilla. 3.2. Etiología y diagnóstico. 3.2.1. Etiología y gama de huéspedes. El agente causal de la VO es el hongo Hifomiceto Verticillium dahliae Kleb, un hongo hemibiótrofo haploide de suelo de reproducción sexual desconocida. Aunque diversos autores aseguran que una recombinación sexual podría haber ocurrido en el pasado (Milgroom et al., 2014; Short et al., 2015), Verticillium dahliae se reproduce asexualmente por medio de conidios, produciendo microesclerocios (ME) adaptados a soportar condiciones ambientales adversas (Trapero y Blanco-López, 2008; Klosterman et al., 2009). El género Verticillium se ha incluido tradicionalmente dentro de la clase Hyphomycetes, orden Moniliales, familia Moniliaceae. Sin embargo, en la clasificación actual de los hongos (Hibbett et al., 2007) se engloba dentro de los hongos mitospóricos, sin clasificación de taxa supragenéricos y se incluyen en la división Ascomycota, subdivisión Pezizomycotina, clase Sordariomycetes y familia Plectosphaerellaceae (Inderbitzin et al., 2011, Inderbitzin and Subbarao, 2014). 6 Introducción y Objetivos Verticillium dahliae se caracteriza por la formación de micelio y conidios hialinos, agrupados sobre el extremo de fialidas uninucleadas dispuestas en verticilos sobre conidióforos hialinos no ramificados (Figura 1). Figura 1. Conidióforos de Verticillium dahliae Las especies que comprenden el género Verticillium son las causantes de multitud enfermedades importantes que afectan a numerosos cultivos en todo el mundo, tanto a plantas herbáceas como leñosas. Asimismo, existen varias especies dentro de este género que son parásitas de algunos hongos basidiomicetos y de insectos (Isaac, 1949). Son típicos habitantes del suelo con un comportamiento necrotrofo obligado. Verticillium tiene un amplio rango de grupos taxonómicos, conteniendo unas 51 especies, entre las que se encuentran, aunque sin limitarnos, V. albo-atrum, V. dahliae, V. nigrescens, V. nubilium, V. longisporum o V. tricorpus. V. nigrescens, V. nubilum y V. longisporum se distinguen del resto debido a su capacidad de formar clamidosporas, teniendo además una fase saprofítica de importancia en el suelo. Por otra parte, V. tricorpus se caracteriza por la producción de un micelio oscuro, producir clamidosporas, ME y por tener una pigmentación amarillo-anaranjada (Qin et al., 2006). Verticillium tricorpus se caracteriza también por ser una especie saprófita y ser un agente causal de infecciones oportunistas (Inderbitzin and Subbarao, 2014; Seidl et al., 2015). Verticillium dahliae se diferencia morfológicamente del resto de especies del género, y particularmente de V. albo-atrum, por la formación ME, formados por septación 7 Capítulo 1 multilateral irregular y proliferación de células de una o varias hifas contiguas y que constituyen la estructura de resistencia de la especie (Isaac, 1967; Goud et al., 2003). Los ME, que constituyen las estructuras de supervivencia, infección y dispersión del hongo, le permiten sobrevivir en el suelo en ausencia de huéspedes durante varios años (Figura 2). Se producen en los tejidos senescentes de plantas infectadas al final de la fase parasítica del ciclo de vida del patógeno. Son de color negro o marrón y se originan por la hinchazón de las hifas y la posterior brotación lateral que da lugar a la formación de grupos de células (Hall y Ly, 1972; Perry y Evert, 1984). Figura 2. Colonia de microesclerocios de Verticillium dahliae sobre el medio de cultivo Agar Polipectato Sódico Verticillium dahliae presenta una amplia gama de plantas susceptibles, pudiendo causar enfermedad en más de 400 especies vegetales herbáceas y leñosas (Pegg y Brady, 2002). Entre los huéspedes más destacados de V. dahliae se encuentran cultivos herbáceos hortícolas (p.e., alcachofa, berenjena, coliflor, fresa, lechuga, melón, patata, pimiento, sandía y tomate), industriales (p.e., algodón, colza, lino, girasol, remolacha y tabaco), leguminosas (p.e., garbanzo, guisante, haba y lenteja) y ornamentales (p.e., clavel y crisantemo). Además del olivo, también afecta a otros cultivos leñosos frutales (p.e., aguacate, albaricoquero, almendro, cacao, manzano, melocotonero, nectarina, pistacho y vid), ornamentales (p.e., catalpa y rosal) y forestales (p.e. arce, castaño, fresno y olmo) (Bhat y Subbarao, 1999; Evans y Gleeson, 1973; Hiemstra y Harris, 1998; Pegg y Brady, 2002; Smith y Neely, 1979). Además de las plantas cultivadas, se han descrito numerosas plantas adventicias de hoja ancha que son huéspedes alternativos de V. dahliae. Algunos géneros de malas hierbas que pueden encontrarse en el olivar son susceptibles al patógeno (p.e., Anagallis, Lamium, Malva, Matricaria, Medicago, Senecio, Solanum, Veronica, etc.) lo que 8 Introducción y Objetivos contribuye a la multiplicación y dispersión del hongo en el suelo (Heale, 1988; Thanassoulopoulos et al., 1981; Vargas-Machuca et al., 1987; Yildiz et al., 2009). Por otra parte, aunque las especies monocotiledóneas, tanto cultivadas como adventicias, no se consideran huéspedes de V. dahliae, se conoce que el hongo tiene la capacidad de colonizar superficialmente las raíces de plantas resistentes a la infección sistémica, como es el caso de la avena, cebada, maíz o trigo (Benson y Ashworth, 1976; Levy e Isaac, 1976). 3.2.2. Síntomas de la enfermedad. En las condiciones climáticas del Valle del Guadalquivir se han descrito dos tipos de síndromes inducidos por infecciones de V. dahliae, “Apoplejía” (o forma aguda de la enfermedad) y “Decaimiento lento” (o forma crónica). La “apoplejía”, que se desarrolla normalmente entre final de invierno y principio de primavera, consiste en la necrosis regresiva rápida de brotes, ramas principales y ramas secundarias. Las hojas se vuelven de un color pajizo progresivamente y sufren un abarquillamiento hacia el envés, permaneciendo generalmente adheridas a las ramas (Figura 3A). La precocidad en la aparición y la severidad de este síndrome parece estar asociada a lluvias intensas en otoño y a temperaturas moderadas en otoño e invierno. Cuando la apoplejía ocurre en plantas jóvenes la muerte del árbol completo es muy común (Blanco-López et al., 1984; Jiménez Díaz et al., 2012; López Escudero y Blanco-López, 2001; López-Escudero y Mercado-Blanco 2011; Rodríguez Jurado et al., 1993). Por su parte, el “decaimiento lento”, que se desarrolla en primavera y progresa lentamente hasta el comienzo del verano, se caracteriza por la necrosis de inflorescencias (Figura 3B), por la defoliación en verde, que en ocasiones es muy intensa (Figura 3C) y por el momificado de frutos en crecimiento o ya maduros, que suelen permanecer adheridos a las ramas (Figura 3D). Ocasionalmente, ambos síndromes pueden aparecer en el mismo árbol, y afectar parcial o totalmente a la planta, siendo este último más frecuente en árboles jóvenes, mientras que los de más edad suelen mostrar unas ramas afectadas y otras asintomáticas. Por otra parte, en ocasiones aparece asociada a cualquiera de los dos síndromes una coloración violácea-purpúrea en la corteza de las ramas afectadas, y ocasionalmente una coloración marrón oscura en los tejidos vasculares. 9 Capítulo 1 Figura 3. Síntomas de la Verticilosis del olivo. A. Necrosis sectorial de brotes y ramas; B. Necrosis de inflorescencias; C. Síntomas de decaimiento lento: defoliación de hojas verdes o verde mate; D. Aceitunas momificadas y hojas cloróticas, enrolladas y necróticas en un olivo con decaimiento lento después del verano Los árboles infectados que no mueren debido a la enfermedad se pueden recuperar. Dichos árboles tienen la capacidad de producir tejido vascular nuevo que puede cubrir completamente los vasos de xilema necrosados, lo que permite el crecimiento de tejido vascular nuevo en tallos y ramas infectadas (López-Escudero y Blanco-López, 2001; 2005; Tjamos et al., 1991). 3.3.Variabilidad patogénica Verticillium dahliae muestra una amplia variabilidad fisiológica, genética, molecular y patogénica (López-Escudero et al., 2012; Papaioannou et al., 2013; Papaioannou y Typas, 2015; Pegg y Brady, 2002). Por ejemplo, dependiendo del medio donde crezca el hongo, sus colonias pueden mostrar capas y colores diferentes. Así también, este hongo puede mostrar una amplia diversidad de conidióforos y MS (Pegg y Brady, 2002; LópezEscudero et al., 2012). Por su parte, este patógeno no muestra patogenicidad huéspedespecífica, lo cual quiere decir que se muestra más virulento sobre el huésped del que procede (Bhat y Subbarao, 1999; Qin et al., 2006). 10 Introducción y Objetivos Los aislados de V. dahliae que infectan al olivo se pueden clasificar en dos patotipos diferentes: el defoliante (D), altamente virulento y el no defoliante (ND), menos virulento (Rodríguez Jurado et al., 1993; Dervis et al., 2007). Aunque ocasionalmente, los aislados D y ND pueden mostrar un grado similar de virulencia en inoculaciones artificiales (Dervis et al., 2010) Este patrón de virulencia también ocurre entre aislados de V. dahliae de algodón (Gossypium hirsutum), de manera que los aislados D y ND de algodón y olivo muestran virulencia cruzada (Schnathorst y Sibbett, 1971). Recientemente se ha reportado que los aislados de algodón ND y D corresponden con las razas 1 y 2 basadas en la respuesta diferencial de cultivares de tomate y lechuga (Hu et al., 2015). Actualmente, el uso de marcadores moleculares ha demostrado que la población de este patógeno es altamente clonal (Dobinson et al., 1998; Collado-Romero et al., 2006, 2008; Dung et al., 2013). Sin embargo, existen algunas excepciones al respecto (JiménezDíaz et al., 2006; Jiménez-Gasco et al., 2014). De hecho, estudios recientes sugieren que estas relaciones son más complejas y que es posible, como se ha comentado anteriormente, que la recombinación sexual pudiera haber sucedido en el pasado (Milgroom et al., 2014; Short et al., 2015). 3.4. Ciclo biológico. El ciclo biológico de V. dahliae se muestra de forma esquemática en la Figura 4. Figura 4. Ciclo de patogénesis de Verticillium dahliae en huéspedes leñosos (adaptado de Hiemstra y Harris, 1998). 11 Capítulo 1 Este ciclo está compuesto por las siguientes etapas: supervivencia y dispersión del inóculo, germinación de las estructuras de supervivencia (microesclerocios), penetración del patógeno en la planta, colonización del sistema vascular, desarrollo de síntomas y producción de nuevo inóculo. Al igual que sucede con la mayoría de hongos de suelo, V. dahliae sólo produce una generación de inóculo en una estación de crecimiento del huésped, es decir, es un patógeno monocíclico (Hiemstra y Harris, 1998). 3.5. Fuente de inóculo y supervivencia Verticillium dahliae sobrevive en el suelo mediante la producción de ME. Éstos representan el principal medio de dispersión del patógeno y su primera fuente de inóculo (Wilhelm, 1955; Schnathorst, 1981). Los ME se forman en los tejidos necrosados (especialmente hojas, ramas y tallos herbáceos) de la planta enferma durante las últimas etapas de la fase parasítica del ciclo de vida del patógeno, y son incorporados al suelo tras la degradación de los restos vegetales (Navas-Cortes et al., 2008; Tsror, 2011; Wilhelm y Taylor, 1965). Estas estructuras de resistencia pueden soportar las condiciones físicas, químicas y biológicas adversas que usualmente se dan en el suelo, permaneciendo viables en ausencia de plantas huéspedes hasta 14 años (Wilhelm, 1955). En contraste, las hifas y conidios de V. dahliae pierden la viabilidad en el suelo en un corto periodo de tiempo (Green, 1969; Schreiber y Green, 1962). La supervivencia del hongo se complementa por su carácter polífago sobre una amplia gama de huéspedes principales y alternativos, lo que le permite aumentar su población y persistencia en el suelo (Benson y Ashworth, 1976; Heale, 1988; Martinson y Horner, 1962; Vargas-Machuca et al., 1987). 3.6. Germinación de las estructuras de supervivencia Los ME en el suelo permanecen inactivos hasta que se produce su germinación en respuesta a los estímulos proporcionados por los exudados de las raíces de plantas huéspedes y no huéspedes (Butterfield y DeVay, 1977; Lacy y Horner, 1966; Levy e Isaac, 1976; Mol, 1995; Schreiber y Green, 1963). Schreiber y Green, (1963) sugirieron que los aminoácidos y otros elementos nitrogenados son los principales componentes que ayudan a los ME a superar la fungistasis del suelo. La germinación de los ME es mayor con exudados de especies huéspedes que con los de no huéspedes, probablemente por diferencias en la concentración de sustancias inductoras (Schreiber y Green, 1963). Lacy y Horner (1966) demostraron también que este patógeno era capaz de aumentar su población en la rizosfera de plantas inmunes. Los ME tienen incluso la capacidad de germinar y esporular repetidamente en un suelo secado y humedecido de forma periódica (Farley et al., 1971). La germinación repetida de los ME se interpreta como una estrategia de supervivencia de V. dahliae en el suelo (Farley et al., 1971; Menzies y Griebel, 1967). 12 Introducción y Objetivos La tasa de germinación también se ve influenciada por el estado de agua en el suelo. Egamov (1979) afirmó que los riegos periódicos estimulan la germinación de estas estructuras. Además, López-Escudero y Blanco López (2005) demostraron que el riego por goteo aumentaba el nivel de inóculo en el suelo. Estos autores encontraron una densidad significativamente mayor en la zona húmeda debajo de los goteros que en la zona seca más alejada de éstos. Igualmente, los incrementos de inóculo en las zonas bajo la influencia del bulbo húmedo eran mayores que en las zonas fuera de éste. Baard and Pauer (1981) sin embargo, no identificaron un aumento de ME en diferentes procesos de secado y humedecimiento del suelo. Xiao et al. (1998) durante su estudio, tampoco observó que un aumento de la frecuencia de riego aumentara la población del patógeno. En estudios más recientes (Valle, 2014) realizados por el grupo de patología agroforestal de la Universidad de Córdoba, se demostró que después de 2 años y medio de observaciones, un riego deficitario favorecía la disminución ME en el suelo. Igualmente, cabe especificar, que la germinación de los ME decrece linealmente con el potencial matricial de 0 a -1,5 MPa (Pegg y Braddy, 2002; Saadatmand et al., 2006). Sin embargo, un suelo en condiciones de saturación puede ser perjudicial para el patógeno. Así, Menzies (1962) y Nadakavukaren, (1960) observaron que un suelo inundado durante 6 semanas mataba todos los ME de V. dahliae. Pullman y Devay (1981) demostraron que mantener campos de algodón inundados o hacer una rotación con arroz eran métodos igualmente efectivos contra la erradicación de los ME de V. dahliae. En cualquier caso, y como ocurre en la mayoría de los hongos (Griffin, 1978), la germinación está más influenciada por la disminución del potencial matricial que del potencial osmótico. El resultado de la disminución del contenido de agua es la reducción del potencial matricial, lo que ocasiona también una reducción de la germinación. De este modo, el manejo del agua a medio o largo plazo puede ser un factor de extrema importancia en el control de la enfermedad (Saadatmand et al., 2006). 3.7. Penetración del patógeno El ciclo de infección comienza cuando las hifas desarrolladas por el patógeno entran en contacto con las raíces de las plantas (Jiménez-Díaz et al., 2012; Schnathorst, 1981). La penetración de las hifas infectivas en las raíces puede producirse por los puntos de emergencia de raíces laterales, por raicillas intactas, o bien a través de heridas provocadas naturalmente (por ejemplo, las causadas por nematodos), o por la acción del hombre (producidas por prácticas culturales) (Prieto et al., 2009; Rodríguez-Jurado et al., 1993; Schnathorst, 1981). Las hifas penetran en la raíz colonizando las células epidérmicas y el córtex, con un crecimiento tanto intercelular como intracelular. Una vez que ha tenido lugar la penetración, las hifas permanecen localizadas en las células corticales formando colonias (Evans y Gleeson, 1973; Prieto et al., 2009). 13 Capítulo 1 3.8.Colonización de la planta Verticillium dahliae coloniza los vasos xilemáticos mediante el crecimiento micelial. Durante ese proceso, la planta desarrolla dos tipos de defensas, las constitutivas, consistentes en barreras físicas y químicas y las inducidas por la propia planta, una vez ha penetrado el patógeno (Yadeta y Thomma, 2013). El éxito de la colonización también depende de otros parámetros como la densidad de inóculo (DI) del patógeno en el suelo y el grado de suberificación de las células del endodermo (Prieto et al., 2009). Cuando el patógeno se establece en el sistema vascular produce conidios, los cuales son transportados en sentido ascendente hasta los brotes superiores de la planta (Beckman, 1987). Los conidios germinan y producen hifas, que atraviesan los poros de las paredes laterales que comunican los vasos adyacentes o los poros de las placas de perforación, quedando el xilema colonizado transversal y longitudinalmente (Bishop y Cooper, 1983; RodríguezJurado, 1993). 3.9. Desarrollo de síntomas Al igual que ocurre en otras traqueomicosis, el desequilibrio en el balance hídrico es el principal responsable del síndrome que aparece en las plantas afectadas por V. dahliae (Fradin y Thomma, 2006; Hall y MacHardy, 1981). Este desequilibrio es debido a una reducción en el suministro de agua que se produce por la obstrucción mecánica de los vasos xilemáticos (Beckman, 1987). La invasión de los vasos xilemáticos por el patógeno va unida a la formación en éstos de tílides producidas por las células parenquimáticas adyacentes, junto con el desarrollo de geles de naturaleza polisacárida (Baídez et al., 2007; Rodríguez-Jurado et al., 1993). Además, en los vasos de xilema se depositan compuestos fenólicos pre-formados que muestran un efecto tóxico contra V. dahliae (Baídez et al., 2007). Los compuestos fenólicos tras su oxidación por enzimas polifenoloxidasas, dan lugar a la coloración castaño-oscura del tejido vascular. La presencia principalmente de los geles, tílides y estructuras del hongo en el xilema de la planta infectada contribuyen a la oclusión y reducción del flujo de savia bruta en el mismo, particularmente en el tallo y peciolos foliares, que junto con enzimas líticas fúngicas, fitohormonas vegetales y fitotoxinas contribuyen al desarrollo de los síntomas de Verticilosis (Beckman, 1987; Mace et al., 1981). 3.10. Factores que contribuyen a la importancia y distribución de la Verticilosis del olivo: epidemiología. Hay un elevado número de factores que contribuyen a la distribución e importancia de la VO, que pueden influir ya sea en el patógeno, en el huésped y/o en el ambiente: uso de material de propagación infectado, la eficacia en la dispersión del patógeno, el uso predominante de cultivares susceptibles, el mal uso del riego y la fertilización, el inadecuado manejo del suelo y las técnicas de cultivo, factores climáticos y edáficos, etc. 14 Introducción y Objetivos (López-Escudero y Mercado-Blanco, 2011). Sin embargo, el establecimiento de nuevas plantaciones en suelos infestados como consecuencia del cultivo previo con huéspedes de V. dahliae es la causa que se considera más importante de la actual distribución y dispersión de VO (Blanco-López et al., 1984, Bejarano-Alcázar et al., 1996; LópezEscudero y Blanco-López, 2001; Wilhelm y Taylor, 1965). En cualquier caso, la influencia de algunos de estos factores no ha sido contrastada científicamente hasta el momento, como ocurre con el riego o la fertilización. 3.10.1. Factores que favorecen la persistencia, incremento y dispersión del patógeno. El desarrollo epidémico de VO se ve favorecido por la prolongada supervivencia de los ME de V. dahliae en el suelo, donde son incorporados al final de la fase parasítica junto con los restos vegetales infectados (Wilhelm, 1955). Del mismo modo, el patógeno puede persistir, e incluso aumentar su DI en el suelo mediante la colonización de una amplia gama de cultivos herbáceos y leñosos, así como especies de flora silvestre. Por tanto, se debe prestar especial atención al uso de especies susceptibles como cubiertas vegetales ya que pueden contribuir a aumentar el número de propágulos infectivos del patógeno en la plantación. Además tal como se ha dicho en el epígrafe 3.2.1, este hongo tiene la capacidad de sobrevivir en algunas especies de gramineas (Benson y Ashworth, 1976; Martinson y Horner, 1962; Levy e Isaac, 1976). 3.10.2. Dispersión de Verticillium dahliae. El uso de material de propagación infectado o procedente de viveros donde se haya empleado suelo infestado se ha descrito como uno de los principales medios para la dispersión de V. dahliae (Hiemstra, 2015; Thanassoulopoulos, 1993). Obviamente, un paso inicial obligatorio para un control efectivo de la VO es la implementación de un programa de certificación orientado a producir plantones de olivo libres del patógeno (LópezEscudero y Mercado-Blanco, 2011). En olivo, además de los brotes y ramas infectadas, se ha demostrado la presencia de ME del patógeno en hojas infectadas (Estrada et al., 2008; Jiménez-Díaz et al., 2008; Tjamos y Botseas, 1987), en las inflorescencias (Trapero et al., 2011a) y en las propias semillas de las aceitunas (Karajeh 2006). En este contexto, la utilización como cubierta de restos de poda triturados procedentes de árboles afectados por la enfermedad, o la utilización de enmiendas vegetales con tejidos infectados por el patógeno puede contribuir a incrementar la DI de V. dahliae en el suelo (López-Escudero et al., 2008; Jiménez-Díaz et al., 2012). Los ME presentes en el suelo o en los restos de plantas infectadas pueden dispersarse por el viento (Easton et al., 1969; Klosterman et al., 2009; Tsror, 2011), la escorrentía (López-Escudero y Mercado-Blanco, 2011), el riego (García-Cabello et al., 2012; MorañoMoreno et al., 2008; Rodríguez-Jurado y Bejarano-Alcázar, 2007), el uso de estiércol 15 Capítulo 1 procedente de ganado alimentado con restos de plantas infectadas (López-Escudero y Blanco-López, 1999), por la utilización de aperos en el laboreo dentro de la parcela y entre parcelas (Wilhelm y Taylor, 1965; López-Escudero et al., 2008), y/o por el transporte humano de residuos de plantas infectadas (Navas-Cortés et al., 2008; Tjamos y Botseas, 1987; Tjamos y Tsougriani, 1990; Wilhelm and Taylor, 1965). 3.10.3. El riego como factor agronómico que favorece el inicio y el desarrollo de la enfermedad. La influencia del riego en el desarrollo de las Verticilosis ha sido estudiada principalmente en plantas herbáceas, sín embargo también hay algunos estudios referentes a cultivos leñosos, en los que está incluido el olivo. Talboys y Wilson (1970) no encontraron ningún efecto en la Verticilosis del lúpulo después de una época prolongada de lluvias. En un estudio pionero sobre la producción de látex en Guayule, Schneider (1948) demostró que la Verticilosis en este cultivo aumentaba a la vez que se incrementaba la frecuencia en el riego. El grupo de plantas regadas cada 4 semanas presentó un 42 % de incidencia final, el que se regaba cada 2 semanas un 62%, el grupo que se regaba semanalmente, un 77% de incidencia y en aquellas que no se habían regado, la incidencia fue de un 8%. Leyendecker (1950) obtuvo resultados similares en algodón. Por su parte, Schnathorst (1981) afirmó en sus experimentos en condiciones de secano, que las plantas resistentes a sequía, generalmente no se encontraban afectadas por la enfermedad. Sin embargo, los problemas aparecieron cuando el riego fue introducido de manera artificial. Karaca et al. (1971), también en cultivo de algodón, demostraron que la temperatura del suelo a una profundidad de 5 y 15 cm en Julio se reducía en 4 ó 5 grados después del riego, permitiendo al patógeno causar infecciones. En berenjena un aumento del riego acentuó el efecto negativo de V. dahliae reduciendo significativamente la producción y la calidad del fruto (Blestos et al., 1999). También, en alfalfa, en la que la Verticilosis está causada por V. albo-atrum, Palatinus (1983) demostró que la severidad de síntomas era mayor en condiciones de regadío que en condiciones de secano. Gossen y Jesperson (1990) observaron en este mismo cultivo, que un aumento de la frecuencia en el corte junto a un aumento del riego por aspersión también acentuaba el desarrollo de la enfermedad. Otros autores, como Xiao y Subbarao (1997), conjeturaron que la alta densidad de raíces en coliflor causada por un régimen elevado de riego podía explicar la alta incidencia y severidad de esta enfermedad en este cultivo, hecho que fue demostrado en sus estudios posteriores (Xiao y Subbarao, 2000). Cappaert et al. (1992; 1994) en sus trabajos realizados con patata llegaron a la misma conclusión. Además, Grimes y Yamada (1982) observaron en algodón que al reducir el riego disminuía la enfermedad, pero también la producción del cultivo, concluyendo que el control de la Verticilosis basado en estrategias de riego era un delicado balance entre el agua aportada, el progreso de la enfermedad y la productividad. Cappaert et al. (1994) también observaron en el cultivo de patata que, en condiciones de alta humedad (-0.01 MPa), V. dahliae causaba una reducción 16 Introducción y Objetivos de la biomasa en la parte aérea de las plantas. Todos estos estudios contrastan con los resultados obtenidos por Baard and Pauer (1981) que no identificaron un aumento de la enfermedad en los cultivos de algodón y estramonio cuando se les aplicó diferentes procesos de secado y humedecimiento del suelo. Otro efecto que puede causar un riego abundante es el incremento del movimiento de los conidios de Verticillium spp en el tejido vascular, aumentando la colonización y el desarrollo de la enfermedad (Cappaert et al., 1994; Powelson y Rowe, 1993; Xiao y Subbarao 1998). Asimismo, un aspecto a tener en cuenta, es que el efecto de la resistencia a la enfermedad parece prevalecer al efecto del riego. Este hecho se ha observado particularmente en cultivos herbáceos, aunque hay también algunas evidencias en cultivos leñosos, incluido el olivo. Por una parte, Pennypacker et al. (1991) afirmó que la resistencia a V. albo-atrum en alfalfa permanecía estable bajo condiciones de estrés hídrico; y Jefferson y Gossen (2002) concluyeron también en este cultivo que el efecto de la Verticilosis era mayor en variedades susceptibles sometidas a una alta frecuencia de riego en comparación con variedades resistentes. Wheeler et al. (2012) llegó a la misma conclusión en algodón, ya que en sus estudios los cultivares más resistentes sometidos a un riego óptimo actuaron mejor contra la enfermedad que los cultivares susceptibles. De hecho, algunos autores como Arbogast et al. (1999) han observado en patata que el estudio de la respuesta de diferentes cultivares a tratamientos de estrés hídrico podía ser una herramienta eficaz para evaluar la resistencia a esta enfermedad. El efecto de la salinidad en los cultivos herbaceos no está tampoco claramente separado del efecto del agua, de los ciclos de frecuencia de riego y de la resistencia del cultivar. Bershi (1981) y Kaufman et al. (1990) observaron que regar con agua salina aumentaba las infecciones de V. dahliae en algodón y patata. Otro de los parámetros que puede interaccionar es la densidad de plantación. Así Huisman y Grimes (1989) vieron en campos infestados de algodón que frecuencias bajas de riego y altas densidades de plantación (200.000 plantas/ha) la severidad de los síntomas (defoliación) disminuía. Sin embargo, cuando se aumentaba el número de riegos las plantas presentaban más defoliación. El riego también puede interaccionar con la fertilización realizada en este tipo de cultivo. Una alta dosis de riego acompañada con un aporte alto de nitrógeno incrementa el desarrollo de la enfermedad (Bell, 1992). Por norma general, el riego y el nitrógeno aumentan la producción de algodón, excepto si el cultivo se encuentra afectado por V. dahliae (Pegg y Brady, 2002). En cultivos leñosos la información científica es escasa (Hiemstra y Harris, 1998) aunque el efecto del riego ha sido estudiado en algunos huéspedes leñosos como el albaricoque (Vigouroux, 1984), Cacao (Emechebe, 1980), Arce (Shulfelt y Linderman, 1986) o el árbol de las tulipas (Morehart y Melchior, 1982). Shufelt y Liderman (1986) observaron en plantaciones de arce (Acer spp.) que el periodo de incubación de la enfermedad disminuía al aumentar el riego. Vigouroux (1984) en sus estudios con albaricoque (Prunus armeniaca) determinó que un riego abundante con altos niveles de 17 Capítulo 1 nitrógeno hacía que la enfermedad aumentara. En Moldavia, la Verticilosis en ciruela en los años 70, solo fue problemática en zonas de regadío (Gavrilenko et al., 1977). Caroselli (1957) sin embargo, vio que la Verticilosis en arce era mucho más severa en condiciones de estrés hídrico que en condiciones de humedad excesiva. En olivo, las pérdidas provocadas por esta enfermedad están aparentemente relacionadas con el regadío o elevadas dosis de riego (Al-Ahmad y Mosli, 1993; BlancoLópez y DeVay, 1987; Cirulli et al., 1988; Jiménez-Diaz et al. 2012; López-Escudero y Blanco-López, 2005; López-Escudero et al., 2010; López-Escudero y Mercado-Blanco 2011; Ruggieri 1948; Serrhini y Zeroual 1995). Existen estudios científicos que aseguran que la incidencia de la enfermedad y la prevalencia se incrementan significativamente cuando los olivares son reconvertidos de secano a regadío (López-Escudero et al., 2010; Rodríguez et al., 2008; 2011). Asimismo, se ha demostrado que el agua recogida de los pozos o la distribuida por las estaciones de bombeo utilizadas para regar los campos olivareros, es un medio importante de dispersión e infección del patógeno (García-Cabello et al. 2012; Rodríguez Jurado y Bejarano Alcázar, 2007). Además, López-Escudero et al., 2010 encontraron que el patotipo D de V. dahliae se encontraba con mayor frecuencia en los olivares en riego (79%) que en los olivares de secano (43%), mientras la presencia de aislados ND es la misma tanto en regadío como en secano. También, un inadecuado manejo del riego puede ser un factor predisponente a la enfermedad en las zonas de regadío. Por ejemplo, en Israel la Verticilosis del olivo aumentó considerablemente en los cultivares Barnea, Picual y Souri cuando estos fueron regados con agua salina con una concentración de sales de 4.2 ds/m (Levin et al. 2003a,b, 2007). También en olivo, se ha percibido en observaciones a largo plazo, empleando fotografías aéreas de los vuelos cartográficos de los diez últimos años sobre zonas de plantaciones afectadas plantadas con diferentes cultivares de olivo en la zona de Menjibar (Término municipal de Jaen, Valle del Guadalquivir) que la resistencia del cultivar Frantoio, no se vio alterada por la introducción del riego como sí ocurrió con el cultivar susceptible Picual (Ostos et al., 2015). El riego puede además intensificar la VO al incrementar la densidad de finas raíces aumentado la probabilidad de contacto entre las estructuras de resistencia del patógeno y el huésped, así como la translocación de conidios dentro de los vasos del xilema como resultado de un aumento de la transpiración (Fernández et al., 1991; Jiménez-Díaz et al., 2012; López-Escudero y Blanco-López 2005; López-Escudero y Mercado-Blanco, 2011). En este sentido, Rodríguez et al. (2008) afirmaron que el riego en combinación con plantaciones en alta densidad favorecía la incidencia de esta enfermedad. Estos resultados contrastan, sin embargo, con los obtenidos por Roca et al. (2015), los cuales observaron que las plantaciones de olivar en alta densidad parecían no tener un mayor desarrollo de la enfermedad que aquellas plantaciones de densidad de plantación más baja. Por otra parte, el efecto del riego sobre VO podría estar influenciado por la fisiología del árbol. El olivo está bien adaptado al clima mediterráneo, por lo que la conductancia 18 Introducción y Objetivos estomática es alta por la mañana, coincidiendo con una baja transpiración y reducida al mediodía, cuando la transpiración es alta (Orgaz y Fereres, 2008). Estas variaciones diurnas ocurren superpuestas a la variación estacional en evapotranspiración la cual es alta en primavera y verano y baja en otoño e invierno (Orgaz et al., 2006). A pesar del aparente efecto del riego en la VO, aún no existe ningún estudio científico con los objetivos expresos de abordar la influencia del agua de riego en el desarrollo de la enfermedad. 3.10.4. Otros factores agronómicos que favorecen el desarrollo de la enfermedad. La influencia de la fertilización en las enfermedades vasculares ha un amplio rango de cultivos (Datnoff et al., 2007; Huber y Tompson 2012; Pegg y Brady 2002). Sin embargo, la mayoría los estudios se cultivos herbáceos y en cualquier caso existe poca información en incluyendo al olivo. sido estudiada en 2007; Mcmahon, han realizado en especies leñosas, Numerosos estudios documentan que bajos niveles de nitrógeno ocasionan una disminución de la susceptibilidad a las Verticilosis (Isaac, 1957; Sivaparakasam y Rajagopalan, 1974; Sewell y Wilson, 1967; Talboys, 1987). Un alto contenido de nitrógeno en situaciones de deficiencia de potasio provoca sin embargo un incremento de la severidad de la enfermedad (Pegg y Brady, 2002; Presley, 1950; Presley y Dick, 1951; Young et al., 1959). El uso de diferentes fuentes de nitrógeno también puede influir en el grado de susceptibilidad de la planta. Algunos autores aseguran que el radical NH4-N causa una disminución del número de estructuras de resistencia del patógeno (Alitane, 2015; Pegg y Brady 2002). Esta disminución puede ser causada por las toxinas que genera este radical sobre el patógeno (Carns et al., 1964) o por el estímulo que ejerce este elemento en el crecimiento de la fauna antagonista (Chernyayeva et al., 1984). En cambio, según otros autores, el radical NO3-N aumenta el contenido de estructuras infectivas del patógeno (Muromtsev y Chernyaeva, 1979; Chernyayeva et al., 1984). Cabe remarcar también, que una aplicación inadecuada de estos dos elementos puede causar una alteración del pH que podría ser nociva para el patógeno y para la planta. La influencia de altas densidades de plantación sobre VO ha sido poco investigada. Roca et al. 2015 estudiaron, como ha sido comentado en los epígrafes anteriores, el efecto de densidades de plantación intensiva (>200 árboles/ha) o superintensiva (2000 árboles/ha, dispuesta en seto) sobre el desarrollo de VO. Estos autores, concluyeron que la densidad de plantación no alteraba la incidencia de VO en condiciones de campo. El laboreo de las plantaciones olivareras podría constituir un importante mecanismo de dispersión del patógeno (Hiemstra y Harris, 1988; Pegg y Braddy, 2002). Esta práctica cultural además, podría causar daños en las raicillas más superficiales de los olivos facilitando la infección por el patógeno (López-Escudero y Blanco-López 2011; Tjamos, 1993). Asimismo, la incorporación al suelo de restos de poda de material infectado o tener cerca de la plantación cultivos susceptibles a la enfermedad, constituye un aporte importante de 19 Capítulo 1 inóculo (López-Escudero et al., 2008). Obviamente, todas estas prácticas tendrían que evitarse en las áreas donde la VO esta presente. 3.10.5. Factores ambientales: Temperatura, características edáficas y interaciones bióticas. La temperatura óptima para V. dahliae oscila entre 22 y 25 ºC (López-Escudero y Mercado-Blanco, 2011). Éste es un rango de temperatura favorable para el desarrollo de muchas marchiteces provocadas por Verticillium spp. (Garber y Presley, 1971). En el caso de la VO, algunos datos indican que la severidad de los ataques se ve favorecida por temperaturas del aire comprendidas entre 20 y 25 ºC durante los días de primavera, seguidas de veranos con picos no superiores a 30-35ºC (López-Escudero y Blanco-López, 2001; Wilhelm y Taylor, 1965). La textura también parece tener un efecto variable en el patógeno y en la enfermedad como consecuencia de las complejas interacciones que tienen lugar en el suelo. En este sentido, prospecciones realizadas por López-Escudero et al. (2010) en el Valle del Guadalquivir demostraron que la incidencia de la enfermedad era significativamente más baja en olivares establecidos en suelos del tipo Alfisol (porcentaje medio del 12.9%) que en olivares establecidos en suelos del tipo Entisol, Inceptisol o Vertisol (USDA Soil Taxonomy). El grado de acidez de los suelos también puede afectar a V. dahliae. Normalmente este patógeno sobrevive en suelos neutros o alcalinos, pH 6-9. A pH de 5.5 o inferiores la producción de ME y la supervivencia del patógeno disminuye notablemente (LópezEscudero y Mercado-Blanco, 2011). Bell (1992) conjeturó que este hecho podía deberse a que en suelos ácidos los iones Mn y Al se acumulan en mayor proporción en las plantas en comparación con los suelos neutros. Orellana et al. (1975) también comprobaron que el aluminio se acumulaba en las plantas cuando el pH del suelo era bajo, lo que generaba una disminución del crecimiento del patógeno y una inhibición casi total de la germinación de ME. Otros autores también verificaron con sus estudios que la acidificación del suelo causada por Al2(SO4)3 reducía notablemente la formación de propágulos viables (Pegg y Brady, 2002). Por último, un aspecto relevante que puede tener importantes consecuencias epidemiológicas es la interacción entre V. dahliae y otros patógenos de suelo. Por ejemplo, Phytophthora megasperma o Phytophthora inundata, causantes de la podredumbre radical en olivo (Sánchez-Hernández et al., 1998) y V. dahliae pueden infectar de forma simultánea la planta (Sánchez-Hernández et al., 1998; Sánchez-Alcalá, 2005). Las infecciones provocadas por Phytophthora spp. podrían causar una modificación en el nivel de resistencia de cultivares resistentes a V. dahliae, incrementando su susceptibilidad o incluso ocasionando una ruptura de su resistencia al patógeno. 20 Introducción y Objetivos 3.11. Control integrado de la Verticilosis del olivo. La VO es una enfermedad muy difícil de controlar debido principalmente a: 1) una elevada supervivencia de las estructuras infectivas del patógeno; 2) el amplio rango de huéspedes que puede infectar, en muchos casos sin expresión de síntomas, y que actúan como reservorios del hongo y 3) la falta de efectividad de los fungicidas, debido a la localización de éste en el interior del xilema o en el suelo (López-Escudero y MercadoBlanco, 2011). De esta forma, el control no suele ser efectivo cuando se aplican medidas de forma individual, por lo que se aconseja la aplicación de una estrategia de control integrado antes y después de la plantación (Figura 5). Figura 5: Estrategia de Lucha integrada contra la Verticilosis del olivo (LópezEscudero y Mercado-Blanco, 2011). 3.11.1. Medidas antes de la plantación Este tipo de medidas de lucha son las más eficaces y económicas en el cultivo del olivo. Las dos más importantes son plantar en suelos no infestados y utilizar material vegetal libre de patógeno (López-Escudero y Mercado-Blanco, 2011). En relación al empleo de material libre de patógeno, actualmente existe un programa de certificación de material vegetal para la producción de plantas de olivo libres de V. dahliae, así como de otras enfermedades, regulado por el Real Decreto 1678/1999 del 21 Capítulo 1 Ministerio de Agricultura (Anónimo, 1999). Esta medida está justificada por la existencia de infecciones asintomáticas en olivo, cuya detección es primordial. Para la elección de suelos no infectados es esencial tener una información sobre los cultivos previos que se han sembrado con anterioridad en la parcela (Blanco-López y Jimenez-Díaz, 1995; Blanco-López et al., 2002; López-Escudero et al., 2003) y en el caso de que se hayan empleado cultivos susceptibles a V. dahliae se deberá estimar la existencia de ME en el suelo. El método de detección y cuantificación más manejado y más convencional es el que utiliza placas con medio de cultivo semi-selectivo APSM (Agar Polipectato Sódico Modificado) (Butterflied y Debay, 1997; Harris et al., 1993; Termorshuizen, 2000). En la actualidad han surgido diferentes técnicas derivadas de la metodología PCR que muestran resultados satisfactorios en la detección y cuantificación de Verticillium spp. donde se incluye V. dahliae, en suelos naturalmente infestados (Debode et al., 2011; Moradi et al., 2014). Si el resultado es positivo, se debe proceder a la desinfestación del suelo para reducir la población del patógeno. La solarización es uno de los métodos de control físico más efectivo (Katan, 1987, 2000; López-Escudero y BlancoLópez, 2001; Tjamos et al., 1991). La solarización suele emplearse para tratamientos puntuales, y consiste en cubrir el suelo con film de polietileno transparente y aplicar abundante agua, produciéndose el calentamiento húmedo progresivo del suelo con el calor procedente de la radiación solar hasta llegar a alcanzar temperaturas entre 35 y 60ºC, suficientemente altas como para matar a los ME del patógeno (Katan, 1987). 3.11.1.1. Uso de cultivares resistentes La opción más eficiente en la lucha contra la VO es el empleo de genotipos resistentes, ya sea por la evaluación de los cultivares de olivo existentes o por la obtención de nuevos genotipos de olivo resistentes al patógeno mediante la mejora genética. La resistencia de genotipos de olivo a la VO en inoculaciones controladas o en campos naturalmente infestados por el patógeno ha sido investigada por diferentes autores. (Abo Shkeer, 2010; Blanco-López 1984; Birem, 2010; Bubici y Cirulli, 2012; Caballero et al., 1980; García-Ruiz, 2014; García-Ruíz et al., 2014a; 2014b; 2014c; 2015: López-Escudero et al., 2004; 2007b; Martos-Moreno, 2003; Martos-Moreno et al, 2006; Trapero et al., 2013; 2015). Martos-Moreno et al. (2006) observaron que ‘Cornicabra’, ‘Picual’ y ‘Picudo’ eran cultivares extremadamente susceptibles a VO mientras que ‘Arbequina’ mostraba mayor resistencia, a pesar que anteriormente en inoculaciones artificiales se había incluido en el grupo de cultivares altamente susceptible al patotipo D de V. dahliae (López-Escudero et al., 2004). Estos resultados coinciden con las observaciones realizadas por Trapero et al. (2013) y Roca et al. (2015) en los que ‘Arbequina’ se mostró como un cultivar moderadamente resistente a la enfermedad. Trapero et al. (2013) en sus estudios observaron que los cultivares Bodoquera, Picual y Manzanilla de Sevilla eran altamente susceptibles a VO. Estos resultados a excepción de ‘Bodoquera’, coinciden con los 22 Introducción y Objetivos obtenidos en condiciones controladas por otros autores (García-Ruíz, et al., 2014a, 2014b, 2014c; López-Escudero et al., 2004, 2007b; Martos-Moreno et al. 2006). ‘Picual’, tal como se ha dicho en los párrafos anteriores, es altamente susceptible a VO. De hecho se suele usar rutinariamente en los experimentos como control susceptible y este puede ser severamente dañado incluso por muy bajas cantidades de inóculo en el suelo (López-Escudero y Blanco-López, 2007a). El cultivar Hojiblanca en campos altamente infestados por aislados altamente virulentos (patotipo D) se muestra altamente susceptible a esta enfermedad (Trapero et al., 2013). Este hecho coincide con los resultados obtenidos en condiciones controladas por otros autores (López-Escudero et al., 2004) y de campo (López-Escudero y Blanco-López, 2001). Sin embargo, se ha podido comprobar que este cultivar, en algunos campos comerciales donde los suelos están moderadamente infestados por V. dahliae, no es tan sensible a VO (López-Escudero y Mercado-Blanco, 2011). De forma similar a ‘Arbequina’, el cultivar griego Koroneiqui y el cultivar español Sevillenca muestran un nivel de resistencia mayor que los cultivares susceptibles en condiciones de campo (Trapero et al., 2011b, 2013) Por otra parte, los cultivares Changlot Real, Empeltre y Frantoio según diversos estudios muestran, en condiciones de campo, una reacción de resistencia a V. dahliae (López-Escudero et al., 2004; Martos-Moreno 2003; Trapero et al., 2013). El cultivar italiano Frantoio seguramente sea en España, el más conocido de los tres (Barranco et al., 2008). La respuesta de ‘Frantoio’ a VO ha sido bien documentada bajo condiciones controladas y de campo (Bubici y Cirulli, 2012; García-Ruíz et al. 2014a; 2014b, 2014c, 2015; López-Escudero et al., 2004, 2007b, Trapero et al., 2013, 2015). Sin embargo, este cultivar al igual que ‘Empeltre’ y ‘Changlot Real’, no exhiben una resistencia completa cuando éstos son plantados en suelos altamente infestados por V. dahliae (Trapero et al., 2013). En este sentido, se ha de comentar que hasta el momento el Departamento de Agronomía de la Universidad de Córdoba llevan realizando numerosos experimentos de evaluación de resistencia a VO en ambiente controlado y en condiciones de campo donde se ha estudiado el nivel de resistencia relativo alrededor de 250 cultivares nacionales y extranjeros y de más de 11000 genotipos (Abo Shkeer, 2010; Birem, 2010; García-Ruiz et al. 2014a, 2014b, 2014c; López-Escudero et al., 2004; 2007b; Martos-Moreno et al., 2006; Trapero et al. 2013, 2015; Valverde-Caballero, 2014). 3.11.2. Medidas después de la plantación Una vez establecida la plantación, las medidas de lucha deben de ir dirigidas a evitar la llegada del patógeno y disminuir la incidencia y severidad de la enfermedad. Las 23 Capítulo 1 estrategias deben consistir en la aplicación de métodos excluyentes, erradicativos y de escape (Jiménez-Díaz et al., 2012; López-Escudero y Mercado-Blanco, 2011). 3.11.2.1. Métodos excluyentes Estos métodos tienen como objetivo limitar o impedir el acceso del patógeno al campo y su posterior distribución, pudiendo aplicarse antes o después de la plantación. El hongo puede acceder a la plantación asociado a partículas de suelo, o bien, dispersarse mediante restos de tejidos de plantas infectadas a través del agua de escorrentía, del agua de riego o del viento. Por ello, las plantaciones de olivar deben situarse lejos de las zonas de influencia, por la pendiente o vientos dominantes, de cultivos huéspedes del patógeno. Los huertos dentro o en las proximidades de la plantación también deben ser evitados, así como el laboreo en la medida de lo posible (Trapero y Blanco-López, 2008). 3.11.2.2. Métodos erradicativos El objetivo es reducir la densidad de inóculo existente ya sea en el suelo o en el agua de riego (Ver epígrafe 3.11.2.2.1) y limitar su crecimiento mediante la aplicación de métodos culturales, físicos (solarización), biológicos o químicos (fungicidas). Tras la plantación, la acción de estos métodos suele estar dirigida a zonas localizadas de la plantación, evitando así problemas en la replantación de plantas muertas debido a la VO. En cuanto a los métodos culturales se encuentra la eliminación de los tejidos infectados por V. dahliae, que contribuyen a incrementar la población del patógeno en el suelo y a su dispersión (Tjamos y Botseas, 1987; Navas-Cortés et al., 2008). En olivares, la solarización como método físico erradicativo después de la plantación, puede llegar a ser una técnica muy efectiva, siempre que se utilice de manera localizada y dentro de una estrategia de control integrado (Jimenez-Diaz et al., 2012; López-Escudero y Mercado-Blanco, 2011; López-Escudero et al., 2001). La aplicación del control químico contra VO tiene severas limitaciones, principalmente debido a la inaccesibilidad de muchos productos activos al sistema vascular del olivo y a la persistencia y distribución de los ME en el suelo. Muchas sustancias han sido evaluadas, particularmente fungicidas sistémicos durante estos últimos años. A pesar de su eficacia en condiciones in vitro, no han mostrado ser efectivas en condiciones de campo (Jimenez-Díaz et al., 2012; López-Escudero y Mercado-Blanco, 2011; Tsror, 2011). Sin embargo, en estos últimos años se han evaluado numerosas enmiendas orgánicas en el control de patógenos de suelo (Bhat y Subbarao, 2001; Huang et al., 2006; Kirkegaard y Sarwar, 1998; Lazarovits et al., 2000; Tsror et al., 2007). Recientemente se han realizado experimentos en condiciones controladas de laboratorio y campo, para comprobar la efectividad de determinadas enmiendas orgánicas en el control de la VO. En estos estudios se ha comprobado que el compost de vid y el compost de alperujos mejorado 24 Introducción y Objetivos con microorganismos, fueron, entre las evaluadas, las enmiendas orgánicas más eficaces en el control de esta enfermedad (Varo-Suarez et al., 2015a). El control biológico de enfermedades mediante hongos o bacterias se ha considerado un método alternativo al empleo del control químico (Cook, 1993; Heydari y Pessarakli, 2010). Las interacciones que se dan entre planta/microorganismos son muy variadas, e incluyen mutualismo, comensalismo, neutralismo, competición, parasitismo, etc. (Bull et al., 2002; Bankhead et al., 2004; Chisholm et al., 2006 Fitter y Garbaye, 1994; Hoitink y Boehm, 1999). En el caso del olivo el control biológico mediante el empleo de microorganismos antagonistas a V. dahliae es una medida que puede ser aplicada de forma preventiva, o de manera paliativa una vez se haya producido la infección (López-Escudero y Mercado-Blanco, 2011). En este sentido Mercado-Blanco et al. (2004) observaron que Pseudomonas fluorescens, en plantones del cultivar Picual inoculados con V. dahliae, disminuía la severidad final de la enfermedad entre un 31% y un 82%. En ensayos posteriores, además se comprobó el carácter endófito de P. fluorescens PICF7 en olivo (Prieto y Mercado-Blanco, 2008). Varo-Suarez et al., (2015b) también observaron que la cepa de Fusarium oxysporum FO12 controlaba eficazmente la enfermedad en plantones de olivo del cultivar Picual bajo condiciones de invernadero. En olivo también se han desarrollado algunos estudios para evaluar la resistencia inducida en la que un organismo similar o estrechamente relacionado con el patógeno activa los mecanismos de defensa de la planta. Particularmente, Martos-Moreno (2003) evaluó la reducción de la VO ocasionada por aislados muy virulentos (defoliantes) cuando las plantas eran previamente inoculadas con aislados de baja virulencia (no defoliante). 3.11.2.2.1 Erradicación de agentes fitopatógenos en el agua de riego. El agua de riego, tal como se ha especificado en el epígrafe anterior, es una fuente de inóculo importante para la dispersión e infección del patógeno. Por esta razón existen múltiples técnicas disponibles para eliminar las distintas estructuras de V. dahliae, que se pueden agrupar en físicas o químicas. Entre las medidas físicas destaca la pasteurización. En el caso de V. dahliae, Bollen (1985) llegó a la conclusión que las estructuras de este patógeno pueden ser eliminadas con una exposición del agua a 90ºC durante 10 segundos. La pasteurización es un método muy efectivo pero tiene como desventaja su alto coste ya que requiere una alta inversión inicial (Hong et al., 2014). La luz ultravioleta es otro método erradicación utilizado. Este tipo de luz provoca daños letales en el ADN de los patógenos (Harm, 1984). Esta técnica se suele combinar con algún tipo de filtración que permite una mejor transmisión de la luz al medio y así mejorar su eficacia (Fynn et al., 2011). La tecnología de ultrasonidos para la eliminación de patógenos en el agua de riego se basa en cambios de presión en el interior del líquido que dan lugar a burbujas de cavitación. Heis (2015) estudió el efecto de esta técnica con diferentes tiempos de actuación sobre conidios de V. dahliae y en ninguno de los tiempos encontró diferencias significativas entre los conidios tratados y no tratados. Sin 25 Capítulo 1 embargo, otros autores obtuvieron resultados satisfactorios cuando utilizaron esta técnica contra bacterias (Ordoñez, 1984 y Scherba et al., 1991). La filtración también se presenta como medida física de interés. El filtrado con arena se ha mostrado en algunos casos efectivo para eliminar hongos fitopatogenos como Fusarium spp. (Minuto et al., 2008; Postman et al., 2000; Ruina et al., 1996; Van Os et al., 2000). La instalación de un humedal artificial formado por distintas capas de arena y grava ha sido eficaz contra algunas bacterias y algunos oomicetos (Headley et al., 2002; Ufer et al., 2008). También con el uso de membranas se han obtenido buenos resultados para erradicar multitud de patógenos (Ruina, 1988). En cualquier caso la aplicación de esta técnica requiere una alta inversión económica, por lo que este método de control es poco utilizado. Las medidas químicas tienen también como finalidad reducir los propágulos de los patógenos. La utilización de una sustancia clorada básica como el hipoclorito a diferentes dosis y tiempos de actuación ha mostrado eficacia en conidios pero no en ME de V. dahliae (Gómez-Galvez et al., 2013; Heis, 2015; Santos-Rufo y Rodríguez-Jurado, 2015). El dióxido de cloro se ha mostrado efectivo contra numerosos patógenos como Phytophthora spp., Colletotrichum spp., Penicillium spp., etc.. (Armitage, 1993; Chastagner y Riley, 2002; Copes et al., 2004; Krauthausen et al., 2011; Mebalds et al., 1996; Roberts y Reymond, 1994). El peróxido de hidrogeno y la combinación de este compuesto con distintos ácidos (en el que destaca el ácido peracético) ha mostrado resultados esperanzadores contra Fusarium y V. dahliae (Elmer, 2008; Gómez-Galvez et al. 2013; Heis, 2015). Por su parte, el uso de cobre y plata ha mostrado resultados dispares. Así, algunos investigadores obtuvieron resultados positivos en el control de algunos patógenos (Hallsall et al., 1997; Slade y Pegg, 1993). Sin embargo, Heis (2015) observó que se necesitaban dosis superiores a 600 ppm de cobre para disminuir la germinación de los ME de V. dahliae. Los surfactantes o biosurfactantes han resultado ser buenos compuestos contra algunos organismos oomicetos (Van West et al., 2003) pero no hay información disponible de su efecto sobre las estructuras infectivas de V. dahliae. 3.11.2.3. Métodos de escape Estos métodos reducen la eficacia para causar enfermedad y pueden actuar sobre diversas fases del ciclo de patogénesis: reduciendo la actividad del hongo, disminuyendo la probabilidad de contacto con la planta, limitando la infección y la colonización del huésped o atenuando los efectos de la enfermedad. Los métodos de escape más importantes són la reducción de laboreo (López-Escudero et al., 2008, 2010); el manejo del riego (LópezEscudero y Blanco-López, 2005; García-Cabello et al. 2012); y realizar una fertilización equilibrada (López-Escudero y Blanco-López, 2011; Tur, 2015). 3.11.2.4. Terapia Tal se ha comentado anteriormente, en estas últimas décadas se han utilizado productos fungicidas sistémicos (benomilo, carbendazim, fosetil-al y las mezclas de los anteriores con quinosol o prochloraz), algunos de ellos ya retirados del mercado, para el 26 Introducción y Objetivos control de esta enfermedad en olivos afectados. Ninguno de estos fungicidas mostraron resultados satisfactorios cuando se aplicaron via foliar y/o al suelo (Foldade et al., 2002; López-Escudero y Blanco-López, 1996; Mule et al., 2002; Petsikos-Panayotarou, 1980; Sánchez-Alcalá, 2005; Trapero y Blanco-López, 2008). De hecho, actualmente no se dispone de ningún fungicida efectivo contra V. dahliae en condiciones de campo (Tjamos, 1993; Trapero y Blanco-López, 2008). Sin embargo, algunas técnicas basadas en termoterapia efectivas en plantones de olivo para el control de esta enfermedad sí han resultado efectivas (Morello et al., 2015). 4. Justificación de la Tesis doctoral. La posible influencia del riego en el desarrollo de la VO ha generado en el agricultor ciertas dudas sobre el adecuado manejo del riego. Por esta razón en este trabajo se propone abordar este aspecto y clarificar científicamente la influencia del agua de riego, de su manejo y aplicación, sobre una de las enfermedades más importantes de este cultivo. OBJETIVOS El objetivo general de la presente Tesis Doctoral ha sido estudiar el efecto del manejo del riego en el desarrollo de la Verticilosis del olivo. Los objetivos específicos han sido: 1. Determinación de la influencia de la frecuencia de riego sobre el inicio y desarrollo de la Verticilosis del olivo en condiciones semicontroladas (Pérez-Rodríguez et al., 2015a; Capítulo 2). 2. Determinación de la influencia de la dosis de riego sobre el desarrollo de la Verticilosis del olivo en condiciones de campo (Pérez-Rodríguez et al., 2015b; Capítulo 3). 3. Determinación de la influencia de la frecuencia de riego en el inicio y desarrollo de la Verticilosis del olivo en condiciones de campo (Pérez-Rodríguez et al., 2015c; Capítulo 4). 27 28 Irrigation frequency in microplots 29 30 Irrigation Frequency in microplots THE INFLUENCE OF IRRIGATION FREQUENCY ON THE ONSET AND DEVELOPMENT OF VERTICILLIUM WILT OF OLIVE. Abstract The influence of irrigation frequency on the onset and development of Verticillium Wilt of Olive (VWO) was studied. A split-plot design in microplots with naturally infested soil was established for studying four irrigation frequencies for three olive cultivars with differing levels of disease resistance. Final disease incidence (DI) and mortality in ‘Picual’ plants subjected to daily irrigation treatment (T1) reached values of 100% and 63%, respectively. For ‘Picual’-T1 samples, the area under the disease progress curve values were significantly different between 15 December 2012 and 15 July 2013 (14.8% to 42.8%) compared to the average results of the other treatments, which were the following: weekly (T2), biweekly (T3) and deficit (T4) (0.4 to 11.5%). No significant differences between the irrigation treatments were observed in ‘Arbequina’, although the DI progressed consistently (60% in all treatments). In ‘Frantoio’ little disease developed. We conclude that a daily irrigation treatment encourages VWO development in the susceptible cultivar Picual. Therefore, in susceptible cultivars growing in infested soils under daily irrigation regimes, the extension of irrigation frequency may reduce disease incidence. In the context of an integrated control, the use of resistant cultivars seems to be more relevant than the detrimental effects observed in frequent irrigation schedules. Corresponding author: Pérez-Rodríguez, M. E-mail: [email protected]. This chapter has been published in: Pérez-Rodríguez, M., Alcántara, E., Amaro, M., Serrano N., Lorite I. J., Arquero O., Orgaz F., López-Escudero F. J., 2015. Influence of irrigation frequency on the onset and development of Verticillium wilt of olive. Plant Disease 99:488-495. 31 Chapter 2 Introduction The occurrence of vascular wilts due to the soil-borne pathogen Verticillium dahliae Kleb are particularly correlated with the irrigation regimes of many of their hosts, such as potato (Arbogast et al.1999), tomato (Harrington and Dovison 2000) or cotton (Blanco-López and De Vay 1987; Huisman and Grimes 1989). In olive, this pathogen causes Verticillium wilt of olive (VWO), a vascular disease that kills thousands of young and producing trees annually in the major areas of olive oil and table olive production around the world (Bubici and Cirulli 2011; López-Escudero and Mercado-Blanco 2011, 2012; Tsror 2011). In the Guadalquivir Valley of Andalucía (southern Spain), where nearly 900,000 ha of this commodity are planted (Anonymous 2013), the disease incidence (DI) and prevalence significantly increases when orchards are reconverted from dry lands to irrigated zones (López-Escudero et al. 2010; Rodríguez et al. 2008). Irrigation water collected from wells or delivered from pumping stations and used for watering olive orchards are an important means of dispersal of the infectious forms of this pathogen (García-Cabello et al. 2012; Rodríguez Jurado and Bejarano Alcázar 2007). Moreover, López-Escudero and Blanco-López (2005) have previously demonstrated that drip irrigation results in an increase in the abundance of this pathogen in the soil. In this study, we found that fungal populations in the soil were greater and increased at a faster rate over time in the wet zones surrounding the drippers compared with the dry areas away from them. In this context, olive growers and agronomists assume that increasing irrigation dosages or shortening irrigation frequencies provides some protection against Verticillium wilt onset and decreases severity. This has been previously reported in some woody hosts, such us maple (Shufelt and Linderman 1986). However, there is no scientific evidence as to how this agricultural practice affects disease prevalence and severity in olive. In this work, we studied the influence of irrigation frequency on the onset and development of VWO. Experiments were conducted in microplots using soil that was naturally infested with the pathogen. Materials and Methods Experimental plot The experiment was conducted under semi-controlled conditions in a plot located in Campus de Rabanales (Universidad de Córdoba, Spain) during the period December 2011 to October 2013. This plot consisted of a line of 40 concrete containers located above ground. Each plot was 1 m2 by 70 cm deep, open at the bottom, oriented north to south, and protected from rain and excessive sun by a galvanized steel cover. The microplots were filled with a soil that was naturally infested with V. dahliae. The 32 Irrigation Frequency in microplots microplots were planted with different olive cultivars and irrigated with several different irrigation frequencies, as explained below. Collecting and characterizing the soil naturally infested with Verticillium dahliae. The naturally infested soil was collected from a field located in the municipality of Utrera (Sevilla, southern Spain) in a marsh area annually cropped with V. dahliae hosts. In this zone, soils are heavily infested with highly virulent strains of V. dahliae (cotton-defoliating pathotype) (Bejarano-Alcazar et al. 1996) and VWO incidence and mortality develops quickly (Trapero et al. 2013). To assess the fungal population in the selected plot, approximately 40 100-g soil samples were collected from a depth of 25 to 30 cm using a cylindrical soil auger. Subsamples were bulked, crumbled, and mixed. The resulting soil samples were then air dried for 4 weeks at room temperature. Following the drying period, samples were sieved through a 0.8-mm sieve to remove organic debris and larger particles. Samples were then mixed manually and air-dried for an additional 1 to 2 weeks. The inoculum density (ID) of V. dahliae was estimated using the wet-sieving-technique described by Huisman and Ashworth (1974). A sample aliquot of 25 g was suspended in 100 ml of distilled water, shaken for 1 h at 270 rpm, and filtered through 150- and 35- µm sieves. The residue retained in the 35-µm sieve was recovered in 100 ml of distilled water. Finally, 1 ml of the suspension was plated onto a modified sodium polypectate agar medium (Butterfield and DeVay 1977) with 10 replicates. After a 14-day incubation at 22 ± 2 ºC in the dark, soil residues were removed with tap water and colonies of V. dahliae were counted under a stereoscope microscope. The ID in the soil was estimated using the number of colonies of V. dahliae observed and expressed as propagules or microsclerotia (MS) per gram of air-dried soil. A highly infested soil (21 MS/g) was chosen for the experiment. The isolation and molecular characterization of the pathogens in the soil used for the experiment were conducted using the methodology described by López-Escudero and Blanco-López (2005) and Mercado-Blanco et al. (2003). This analysis revealed that highly virulent strains of V. dahliae (defoliating pathotype) were prevalent in the soil. Soil properties The soil used for planting was a clay soil (pH in ClK= 7.45, organic matter = 1.57%, total CaCO3 equivalent = 25.64%, active CaCO3 = 3.33%, available K= 475 ppm, and available P= 8.4 ppm). The soil was repeatedly cultivated in previous years with cotton, tomato and alfalfa and surrounded by plots with similar crops. To determine the hydraulic properties of the soil, a 12-liter plastic pot filled with soil was watered to saturation and covered with a black plastic film to avoid evaporation. After the water was freely drained, the plastic pot was weighed and dried in an oven at 70 ºC for 7 days. The pot was then weighed to determine the mass of water and the mass of soil solid. The upper limit soil water content (θUL) was determined according to the 33 Chapter 2 gravimetric method using the following formula: θUL= (Vw)/(Vs), where Vw = the mass of water and Vs = the total volume of soil. The θUL value calculated for this soil was 0.37 m3 m-3. The available water in this soil was also assessed by measuring the lower limit of the soil water content (θLL). To calculate this variable, barley seeds were sown in a 12liers plastic pot filled with soil. When the plants reached maximum vegetative growth, the irrigation was cut. After plants had died, the soil water content was determined using the above formula. The θLL value calculated for this soil was 0.17 m3 m-3. Plant material Nine-month-old rooted olive cuttings of cultivars with differing levels of resistance to infections caused by V. dahliae were used in the experiment. The cultivars used were as follows: ‘Picual’ (susceptible to disease), ‘Arbequina’ (moderately susceptible) and ‘Frantoio’ (resistant) (López-Escudero et al. 2004; Martos-Moreno et al. 2006). The cuttings were clones of each cultivar. These were obtained from certificated mother olive plants free of pathogen infection from the World Olive Germplasm Bank (Caballero and Del Río 2008) from IFAPA, Centro ‘Alameda del Obispo’, Córdoba, Spain, and propagated according Caballero and Del Río (2010). At the beginning of the experiment, plants were 0.5-0.7 m high, with a single trunk, and with two or three secondary branches. The initial leaf area and aerial biomass of the plants were 297.1 cm2/plant and 11.7 g/plant, respectively, for ‘Picual’ plants, 283.2 cm2/plant and 12.6 g/plant, respectively, for ‘Arbequina’ plants, and 200 cm2/plant and 12.5 g/plant, respectively, for ‘Frantoio’ plants. Irrigation treatments. For this experiment, the following four irrigation frequencies were analyzed: daily (T1), weekly (T2), biweekly (T3), and deficit (T4). Irrigation scheduling (see below) was calculated using the relative soil water deficit (RSWD) parameter according to the following formula: RSWD = (θUL- θi)/(θUL- θLL), where θi is the volumetric soil water content. For the T1, T2 and T3 treatments, the RSWD parameter was generally < 0.9. For the T4 treatment, the RSWD parameter was generally ≥ 0.9. For this treatment, irrigation frequencies were greater in the spring and summer (approximately 20 days) and lower in the winter (approximately 40 days). Microplot establishment and experimental design. In October 2011, approximately 36 tons of the collected soil was carried from the Utrera Marsh to the experimental plot in Rabanales. The soil was homogenized by continuous crumbling and mixing using a tractor shovel at the experiment site. Each 34 Irrigation Frequency in microplots microplot was filled with 800 kg of soil (bulk density= 1300 Kg/m3). For the noninfested control microplots, the soil was sterilized. Olive plants were transplanted in December 2011. A split-plot design was used. Three microplots per cultivar and watering treatment were used, with 9 plants per microplot. Two non-infested control microplots, irrigated according to the T1 treatment, were assigned to each cultivar. Plants were drip irrigated using a programmable irrigation controller (Image 6 Rain Bird, Rain Bird Iberica S.A., Spain) connected to a PVC water pipe (50 mm diameter and 40 m long) extended along the container line. For each microplot, a stopcock, six branch lines (16 mm in diameter and 80 cm in length, and with 16.5 cm spacing), and 36 compensating drippers (2 liters/h, 6 per branch) (NetafimTM) were connected to the pipe. Soil water content measurement in the microplots. The soil water content in each microplot was recorded every 15 days using a time domain reflectometry (TDR) system (6050X1 Trase System I; Soil Moisture Equipment Corp., Santa Barbara, CA). Data were used for planning an irrigation schedule that was individually calculated for each treatment and microplot. The volumetric water content of each container (RSWD level) was maintained corresponding to its irrigation treatment. Inoculum density of Verticillium dahliae in microplot soil. The ID of the pathogen in the soil was assessed just before and at the end of the experiment for all individual microplots and for all treatments. A 100-g soil sample was taken from the 0-to 25-cm depth profile from each container using a cylindrical auger. The ID was quantified using the method described above. Disease progression and tree development. The experimental plot was surveyed periodically for 22 months after planting for disease symptoms, particularly during the most favorable environmental periods for disease development (for our conditions, these periods were spring, early summer and fall). Disease severity was estimated based on a 0-to-4 rating scale according to the percentage of plant tissue affected by any of the following symptoms: chlorosis, necrosis or defoliation (0 = no symptoms; 1 = 1-33%; 2 = 34-66%; 3 = 67-99%; 4 = dead plant). These values were used to build the progress curves for the DI of the affected plants and the mean severity of the symptoms over time during the recording period. Curves of mean severity over time were adjusted to the logistic model. The parameter ρ1 is the upper asymptote, ρ2 is related to initial level of disease severity, and ρ3 is the rate of the process (Hau et al. 1993, Navas-Cortés et al. 2008). 35 Chapter 2 For these curves, the maximum disease progress rate (MDPR) (the slope of the tangent line at the inflection point of the curve) was calculated as described by Moral and Trapero (2009). Moreover, the time elapsed between plantation establishment and when 50% of diseased trees (DI50), 50% of dead trees (M50) and 50% of the maximum values of disease severity (value=2) (MS50) were reached was also calculated for each treatment. At the end of the experiment, the area under the disease progress curve (AUDPC) was estimated as the percentage of the maximum possible value in the considered period according to the following formula based on Campbell and Madden (1990): AUDPC = [(t/2*(S2+2*S3+...+2Si-1+Si)/4*n]*100, where t = the interval in days between observations; Si = the final mean severity; 4 = the maximum disease rating; n = the number of observations. This value was also calculated for three other recording times during the assessment period in which the interaction between the irrigation treatment frequency and cultivar became significant. The final percentage of dead plants, or mortality (M), was also considered in estimating the severity of the reactions. The time that elapsed from transplanting to the onset of disease symptoms (FS) and the mean mortality time (MM) (mean time between the onset of disease symptoms and plant death) were determined for all irrigation-cultivar treatments. To avoid the incorporation of new inoculum into the soil, falling leaves and dried plant debris from dead shoots and buds from affected plants in infested microplots due to slow decline caused by pathogen infection (López-Escudero and Mercado-Blanco 2011) were removed periodically from the surface of the microplots. Pathogen isolation. Plant infection was confirmed by isolating the fungus from the affected shoots or leaf petioles of diseased plants. Affected woody tissue samples were washed in running tap water and the bark was removed. The tissue surface was then disinfected in 0.5% sodium hypochlorite for 1 min. Wood chips were placed on potato dextrose agar (PDA) plates and incubated at 24 ºC in the dark for 6 days. When affected tissues did not yield detectable pathogen cultures, shoot tissues were analyzed using polymerase chain reaction methods, as described by Mercado-Blanco et al. (2003). Data analysis. In this trial, an analysis of variance (ANOVA) of the parameters was performed using the Statistix 10.0 software program (Analytical Software, Tallahassee, FL, USA). The mean values of the analyzed parameters were compared using Fisher’s protected least significant differences test at P = 0.05. 36 Irrigation Frequency in microplots To determine whether there was significant interaction between the irrigation frequencies and the cultivars, an ANOVA was performed using the most representative disease parameter, AUDPCP, as the dependent variable. Data were analyzed in a splitplot design with the irrigation frequency as the main plot and the cultivars as the subplot. MM and FS parameters were analyzed using nonparametric Kaplan–Meier survival analysis (Kaplan and Meier 1958), in which the survival times were calculated as the week in which a plant died or showed disease symptoms for the first time. Pair-wise comparisons were tested using the log-rank test at P = 0.05 and performed using the SPSS software program (Statistical, Package for Social Sciences, SPSS Inc. Chicago). Nonlinear regression analyses were conducted using mentioned Statistix 10 software. A pseudo-R2 parameter was used to evaluate the appropriateness of the logistic model to describe the data. Results ID of V. dahliae in the soil. Soil analyses of ID at a depth of 20 cm revealed that pathogen MS were present in all microplots at the two recording times. ID in the container soil was homogeneous, with an average value of 9.8 MS/g. No significant differences were detected in the initial and final amounts of soil pathogens between microplots with different irrigation treatments and different cultivars Disease symptoms. During the experiment, the affected plants exhibited slow decline (López-Escudero and Mercado-Blanco, 2011). During the fall and early spring, plants showed chlorosis, dieback, and rolling of the leaves without the defoliation of green leaves. Necrosis and desiccation in flowers mainly occurred during the second year of observation in Picual and Arbequina trees. Defoliation and sudden wilt were frequently observed together in Picual under T1 treatment. Pathogen isolation from affected tissues. Tissues from the stems of all plants exhibiting foliar symptoms produced V. dahliae upon culturing on PDA after 3 or 4 days of incubation. Almost all isolates recovered from symptomatic plants corresponded to the defoliating pathotype of the pathogen. Disease progression The first symptomatic plant was recorded in ‘Picual’-T1 just 20 weeks after planting. In October 2012, 45 weeks after tree establishment, disease symptoms were 37 Chapter 2 observed affecting several plants of ‘Picual’ and ‘Arbequina’ (Table 1). The onset of symptom development was first observed in the daily-irrigated (T1) microplots planted with susceptible ‘Picual’ trees. The appearance of first symptoms was significantly earlier in ‘Picual’ plants under this treatment (an average of 46 weeks) compared to ‘Picual’ plants under other treatments and ‘Arbequina’ and ‘Frantoio’ plants, where differences were not detected (from 69 to 78 weeks) (Table 1). During the fall of 2012, a serious epidemic developed in ‘Picual’ plants under-T1 treatment; DI values reached 80% in 4 weeks (from September 15 to November 15) (Figure 1). By this time, the DI in other ‘Picual’ irrigation treatments (T2, T3, and T4) did not reach values greater than 20% (Figure 1). At the end of the assessment period, the DI in ‘Picual’ plants under T1 treatment reached 100 %. For other treatments, DI for this cultivar remained below 67% (Table 1). The 50% DI, (DI50) was reached earlier in trees under T1 treatment (41 weeks) than for trees subjected to other irrigation treatments (average of 76 weeks) (Table 2). Similar progression, in the parameters MS50 and M50 were observed for the ‘Picual’-T1 treatment (Table 2). The mean time from symptom onset to plant death was significantly shorter in trees under the treatments T1 and T3 (44.1 and 47.0 weeks, respectively) than for plants under T2 and T4 treatments (73.9 and 68.1 weeks, respectively) (Table 1). The percentage of trees killed by the pathogen in T1 was 63% after 22 months. The AUDPC ANOVA demonstrated that the interaction between the irrigation treatment and the cultivar was significant (P < 0.05) between 15 December 2012 and 15 July 2013. For this period, each cultivar was studied separately. ‘Picual’ trees that were irrigated daily (T1) reached AUDPC values of 14.8% in December 15; on average, ‘Picual’ trees under the remaining treatments reached AUDPC values of 0.4%. Significant differences continued past this date, because AUDPC was 42.8% for T1 compared with an average of 11.5% for T2, T3, and T4. From October 2013 onward, the differences were not statistically significant (Table 2 and Figure 2). Significant differences in disease progression in affected trees and in any of the investigated phytopathological parameters in the ‘Arbequina’ trees subjected to different irrigation treatments were not detected during the observation period. The onset of symptom development occurred at 72.2 weeks after plantation. In this cultivar, disease onset in the four irrigation treatments also began during the fall of 2012 and progressed at a moderate rate that was similar between treatments (Table 1 and 3; Figures 1 and 2). The pathogen caused disease symptoms in 60% of trees following the observation period. These plants exhibited low mean severity values (an average of 1.2), and only 1.8% of trees died (Table 1). The DI50 value recorded for ‘Arbequina’ plants was higher than that registered for ‘Picual’ plants (Table 3). No significant differences were detected in the AUDPC values during the observation period among the different irrigation treatments. 38 Irrigation Frequency in microplots The epidemic was significantly delayed in ‘Frantoio’. The first symptomatic plants were recorded 6 months later than had been observed in ‘Picual’ and ‘Arbequina’. The final DI value in the T1 treatment was 26%; for other treatments, DI did not reach values greater than 8% (Table 1 and Figures 1 and 2). In this resistant cultivar, a major increase in the DI occurred during the spring of 2013. The maximum final values of AUDPC were observed in the T1 trees, which reached 2.1%. Values of this parameter were lower in the T2, T3 and T4 treatments, accounting for 0.2, 1.6 and 0.6 %, respectively. The mean severity of the symptoms remained very low during the recording period. Only 3.7% of plants were killed by the pathogen at the end of the experiment in one of the treatments (T3) (Table 1). The largest seasonal increase in DI during the experiment occurred in the fall 2012 (23 and 19 trees of the ‘Picual’ and ‘Arbequina’ cultivars, respectively, out of 108 trees planted for each cultivar) (Figure 3). Remarkably, 19 of these trees were from the ‘Picual’-T1 treatment (Figure 3). In the winter of the second year after planting (2013), the number of newly affected plants was higher in ‘Arbequina’ (19 trees) than in the ‘Picual’ (10 trees), and the first ‘Frantoio’ plants (2 trees) began to show wilt symptoms. During the second spring, the number of trees affected by VWO was greater in the ‘Picual’ (30 newly affected plants) than in ‘Arbequina’ (20 trees) and ‘Frantoio’ (5 trees). When the final DI values were analyzed, only significant differences between cultivars (P = 0.00) were found. These values accounted for 72.2, 58.3 and 11.1% for ‘Picual’, ‘Arbequina’ and ‘Frantoio’ cultivars, respectively. Mean disease severity progress curves for ‘Picual’ and ‘Arbequina’ were well described by the logistic model (pseudo-R2 > 0.98), with the exception of the ‘Picual’-T1 treatment. This treatment was described by a logistic model with a double sigmoid pattern (pseudo-R2 > 0.98). No significant differences in MDPR were observed in ‘Picual’ and ‘Arbequina’ between irrigation frequencies; the average MDPR significantly higher for ‘Picual’ plants (0.0254) (Table 2) than for ‘Arbequina’ plants (0.0070) (Table 3). The disease progression curves for ‘Frantoio’ cultivar could not be fitted to any model (Figure 2). Discussion. The influence of irrigation frequency on the occurrence and development of Verticillium wilts has been studied in several hosts of Verticillium spp., particularly herbaceous plants (Bletsos et al. 1999; Cappaert et al. 1992, 1994; Jefferson and Gossen 2002; Pennypacker et al. 1991; Wheeler et al. 2012), Similar studies have been scarce in woody crops affected by Verticillium wilts, likely due to the difficulties associated with the experimental design and the length of the observation period necessary to obtain results. Therefore, this research provides novel information about the impact of irrigation schedules in the development of Verticillium wilt in an economically important woody crop, the olive tree. For vascular diseases in which transpiration is one of the major physiological function affected, an increase in irrigation dose or a shortening in irrigation 39 Chapter 2 frequency in the field may support disease development (López-Escudero and MercadoBlanco 2011). In our trial, the T1, T2 and T3 treatments were established to produce maximum plant growth using different irrigation frequencies. However, the volumetric soil water content in T4 prior to irrigation was below the allowable depletion. Therefore, although it has not been measured, a reduction in transpiration could have occurred only in T4 (Steduto et al. 2012). This would suggest that soil moisture in each treatment played a larger role in disease, than leaf transpiration. In addition, increases in root growth in wet soils could favor contact between susceptible olive roots with infective pathogen structures (Fernandez et al. 1991; Huisman 1982; López-Escudero and BlancoLópez 2005; Xiao and Subbarao 2000). This factor needs to be further clarified, so that factors such as the host variety or cultivar or other agronomical aspects may be involved. The symptoms in the affected trees were similar to those previously described in young olive trees planted in soils naturally infested with the pathogen (Blanco-López et al. 1984; López-Escudero and Blanco-Lopez 2001, Lopez-Escudero and Mercado-Blanco 2011) including dieback, wilting and slow decline (the defoliation of green leaves and flower death). These symptoms developed on ‘Picual’ trees under the daily-waterde treatment (T1). Three olive cultivars were chosen based on economic importance and the level of resistance to the pathogen. Worldwide, 'Picual' is the most important variety economically and is susceptible to VWO in both artificial inoculations and field conditions. 'Arbequina' has increased international economic relevance due to adaptation to intensive and hedgerow orchards; it has a similar level of susceptibility as ‘Picual’ following artificial inoculation but shows moderate susceptibility in field conditions. ‘Frantoio' is one of the more important Italian cultivars, and shows a high level of resistance to VWO in both artificial and natural inoculation scenarios (Barranco et al. 2010; López-Escudero and Mercado-Blanco 2011; Trapero et al. 2013). The results obtained under the experimental conditions of this study suggest that olive cultivars with diverse levels of resistance to VWO show differential reactions when subjected to differing irrigation frequencies. One of the major conclusions of this work is that a daily irrigation schedule strongly encourages the onset and development of VWO in the susceptible ‘Picual’ olive (Tables 1 and 2, Figures 1 to 3). The final DI values reached 100% and the AUDPC values remained significantly different from the remainder of the treatments between fall 2012 (14.7%) and the summer 2013 (42.8%). This effect was not observed in other irrigation frequencies in this cultivar, for which no significant differences were recorded for AUDPC. Meanwhile, disease progress in ‘Arbequina’ was not influenced by the irrigation frequency, and the AUDPC did not show significant differences between the four treatments over the observed time period (Tables 1 and 3, Figures 1 to 3), reaching a maximum average value of 14.6%. Finally, the low disease rates recorded for ‘Frantoio’ clearly suggest that the use of resistant cultivars might have more impact on disease control than the application of certain 40 Irrigation Frequency in microplots irrigation frequencies that may be unfavorable for disease development in susceptible cultivars. The period in which an increase in the number of affected trees occurred was similar among all treatments in ‘Picual’ and ‘Arbequina’; this period started in the fall of the second year after planting (October 2012) and peaked at the end of spring 2013 (Tables, Figure 1). Disease progression in ‘Picual’ plants under T1 followed a logistic model with a double sigmoid pattern; other cultivar-irrigation treatment combinations were fitted to a simple logistic curve (Figure 2). VWO incidence in our conditions (southern Spain) increases during two important periods (spring and fall) (López-Escudero and Blanco-López 2001; López-Escudero and Blanco-López 2004; Rodríguez-Jurado et al. 1993). A logistic model of a multiple sigmoid pattern has been successfully fitted the VWO epidemic by Navas-Cortes et al. (2008). Most likely, the influence of daily irrigation has helped encourage disease progression in the ‘Picual’-T1 treatment. For other treatments, a longer period of observation than our experimental conditions would be necessary in order to observe the onset and progression of disease. Several hypotheses could explain the accentuated disease progression in ‘Picual’ plants under T1 treatment. One of the most reasonable explanations is that plant infection occurred very soon after the establishment of the experiment. In our conditions, high and low temperatures during summer and winter, respectively, usually impede the disease progress; however, root infections could have occurred during the prior spring. In this study, these periods were similar, with some divergence between treatments. In the ‘Picual’-T1 treatment, the MDPR after the first summer (2012) was greater than in other treatments, despite not being statistically significant. Subsequently, the AUDPCP value increased to 14.8%, compared to an average of 0.4% for the T2, T3 and T4 treatments (Table 2). We conclude that daily irrigation created a more conducive soil environment for the establishment of infection due to a reduction in soil temperature during the summer. This would have also facilitated continuous infections from MS present in the soil and a reduction in the incubation period during the summer months. Karaca et al. (1971) reached similar conclusions; soil temperatures at depths of 5 and 15 cm in Anatolian cotton fields in July fell 4-5 ºC, after irrigation, allowing infection to occur. Temperatures registered during the winter of 2012-2013 were moderate, which also promotes disease development in general. Another possibility to consider is that the daily irrigation promoted more root development and more root tips, which would increase the number of infection sites. We assume that other factors are likely also implicated in disease development, including complex interactions involved with cultivar resistance that must be elucidated in new research. 41 Chapter 2 For this study, the observations were finalized in fall 2013. As of May 2013, the maximum number of affected `Picual'-T1 plants had been reached (27 plants), of which 63% had died. In the remaining treatments, the appearance of newly diseased plants stopped or slowed. A reduction in the DI after the third year was also observed in the studies mentioned above that were conducted in microplots; this was ascribed to the limitations of the microplot system (López-Escudero and Blanco-López 2007). Moreover, the vegetative growth of many plants was excessive by this time and did not allow for correct plant management. The results from this study strongly encourage a reduction in irrigation frequency when growing very susceptible cultivars in soils containing Verticillium dahliae. Acknowledgments This research was funded by a contract between the University of Córdoba and The Spanish Interprofessional Olive Oil Association. (UG 400544). We especially wish to thank the Oficina Comarcal Agraria “Las Marismas” (Lebrija, Sevilla) and the Sociedad Cooperativa Andaluza “Agroquivir” (Trajano, Sevilla) for their essential participation, for permitting the authors to collect the infested soil necessary for this study from its property, and their technical assistance. We also thank Francisco Gonzalez for his persevering technical assistance in the experimental plot. References Anonymous. 2013. Anuario de Estadística. Ministerio de Agricultura Alimentación y Medio ambiente. Online: http://www.magrama.gob.es. Arbogast, M., Powelson, M. L., Cappaert, M. R., and Watrud, L. S. 1999. Response of six potato cultivars to amount of applied water and Verticillium dahliae. Phytopathology 89:782-788. Barranco, D., Fernández-Escobar, R., and Rallo, L. 2010. Olive Growing. 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FS (Weeks) Cultivar Picual b Range Mean Mortality c (%) T1 (Daily) T2 (Weekly) T3 (Biweekly) T4 (Deficit) 20-77 41- 93 45-93 51-81 46 a 77 b 75 b 78 b 69 62.9 a 37.0 a 59.2 a 29.6 a 47.2 3.5 a 1.8 a 2.5 a 1.6 a 2.3 a 100 a 62.9 a 66.6 a 59.2 a 72.2 a 3.5 a 3.1 a 3.7 a 2.9 a 3.3 a 44.1 a 73.9 b 47.0 a 68.1 b T1 (Daily) T2 (Weekly) T3 (Biweekly) T4 (Deficit) 45-93 45- 77 45-72 41-77 76 b 74 b 69 b 70 b 72.2 3.7 3.7 1.8 1.0 a 0.9 a 1.5 a 1.3 a 1.2 b 59.3 a 55.5 a 59.3 a 59.3 a 58.3 a 1.4 a 1.5 a 2.5 a 1.9 a 1.8 b 89.0 c 88.9 c T1 (Daily) T2 (Weekly) T3 (Biweekly) T4 (Deficit) 57-93 74 55-93 65-81 75 b 74 b 74 b 73 b 74 3.7 0.9 0.3 a 0.1 a 0.2 a 0.1 a 0.2 c 25.9 a 3.7 a 7.4 a 7.4 a 11.1 b 0.6 a 0.3 a 1.4 a 0.7 a 0.7 c 17 - Treatments mean MS d Incidence (%) MS Affected e plants MM f (Weeks) Arbequina mean Frantoio mean a Trees were surveyed every 2 weeks for symptom development over 22 months (December 2011 to October 2013). The values listed in columns followed by the same letter were not significantly different at P= 0.05 b FS = The time from tree transplantation to the onset of disease symptoms. Differences were estimated according to the log rank test. c Mortality (%) = Differences were estimated according to Fisher's protected LSD test. d MS = Mean severity. Differences were estimated according to Fisher's protected LSD test. e MS affected plants = Mean severity of symptomatic plants. Differences were estimated according to Fisher's protected LSD test. f MM = The time from symptom onset to plant death. Differences were estimated according to the log rank test. 46 Irrigation Frequency in microplots Table 2. The progression of the disease parameters for ‘Picual’ olive trees in microplots, naturally infested with Verticillium dahliae and subjected to different irrigation frequencies a. AUDPC Treatments b c M50 d DI50 e MDPR f 15/12/2012 01/04/2013 15/07/2013 01/10/2013 MS 50 T1 (Daily) 14.8 a 26.7 a 42.8 a 48.4 a 57 74 41 0.047 a T2 (Weekly) 0.3 b 1.3 b 9.7 b 13.9 a -- -- 77 0.017 a T3 (Biweekly) 0.9 b 3.8 b 15.7 b 21.7 a 75 81 74 0.021 a T4 (Deficit) 0.05 b 1.8 b 9.2 b 13.3 a -- -- 77 0.016 a a The values in columns followed by the same letter were not significantly different at P = 0.05 according to Fisher's protected LSD test. b AUDPC = The standardized area under the disease progression curve calculated using the trapezoidal integration of severity values expressed as a percentage of the maximum theoretical curve. c MS50 = The time in weeks from planting until the severity of the affected plants was equal to 2. d M50 = The time in weeks from planting until 50% of the plants had died. e DI50 = Time in weeks from planting until 50% of the plants were affected. f The parameter derived from the logistic regression of the severity over time: the maximum disease progress rate (MDPR). 47 Chapter 2 Table 3. The progression of disease parameters in ‘Arbequina’ olive trees in microplots, naturally infested with Verticillium dahliae subjected to different irrigation frequencies a. AUDPC b 15/12/2012 01/04/2013 15/07/2013 01/10/2013 DI50 c T1 (Daily) 1.2 a 4.7 a 8.9 a 11.0 a 93 0.004 b T2 (Weekly) 1.2 a 4.4 a 8.8 a 10.5 a 72 0.005 b T3 (Biweekly) 1.8 a 8.7 a 16.7 a 19.7 a 63 0.010 b T4 (Deficit) 1.9 a 7.8 a 14.8 a 17.4 a 67 0.009 b Treatments a MDPR d The values in columns followed by the same letter were not significantly different at P = 0.05 according to Fisher's protected LSD test. b AUDPC = The standardized area under the disease progression curve calculated using the trapezoidal integration of severity values expressed as the percentage of a maximum theoretical curve. c DI50 = Time in weeks from planting until 50% of the plants were affected. d The parameter derived from the logistic regression of the severity over time: the maximum disease progress rate (MDPR). 48 Irrigation Frequency in microplots Fig. 1. Verticillium wilt disease incidence over time in the olive cultivars Picual (susceptible), Arbequina (moderately susceptible) and Frantoio (resistant) in microplots, naturally infested with Verticillium dahliae and subjected to four irrigation frequencies: Daily (T1), Weekly (T2), Biweekly (T3) and Deficit (T4). 49 Chapter 2 Fig. 2. Mean severity of symptoms of Verticillium wilt over time in the olive cultivars Picual (susceptible) Arbequina (moderately susceptible) and Frantoio (resistant) in microplots, naturally infested with Verticillium dahliae and subjected to four irrigation frequencies: Daily (T1), Weekly (T2), Biweekly (T3) and Deficit (T4). Disease severity was estimated on a 0 to 4 rating scale that reflected the percentage of plant tissue affected by any of the following symptoms: chlorosis, necrosis or defoliation (0 = no symptoms; 1 = 1 to 33%, 2 = 34 to 66%, and 3 = 67 to 99% affected tissue; and 4 = dead plant). A severity progression curve of the ‘Picual’-T1 treatment was described using a logistic model with a double sigmoid pattern. Other curves were well described using the logistic model. Curves of disease progression for the Frantoio cultivar could not be fitted to any model. 50 Irrigation Frequency in microplots Fig. 3. Number of symptomatic olive trees of the Picual (susceptible) Arbequina (moderately susceptible) and Frantoio (resistant) cultivars affected by Verticillium wilt in microplots, naturally infested with Verticillium dahliae and subjected to four irrigation frequencies: Daily (T1), Weekly (T2), Biweekly (T3) and Deficit (T4). 51 Chapter 2 SUPPLEMENTARY FIGURES Figures chapter 2 Collecting naturally infested soil (A) (B). Preparation of infested soil (C). Microplot filling (D). Irrigation system (A), (B). 52 Irrigation Frequency in microplots Measuring soil water in microplots (A). Grow of the plants with a deficit irrigation frequency (T4) and with a weekly irrigation frequency (T2) (B). Disease symptoms of affected plants. 53 Chapter 2 ‘Picual’ plants with a daily irrigation frequency (T1) dead by V. dahliae (A). Pathogen isolation from ‘Arbequina’ affected tissues (B). 54 Irrigation dose 55 56 Irrigation dose EFFECT OF THE IRRIGATION VERTICILLIUM WILT OF OLIVE DOSE ON Abstract From autumn 2012 to autumn 2013 a survey comprising 70 olive orchards was carried out in an Irrigation Community of the central Guadalquivir Valley, (Andalucía, Southern Spain) with the objective of studying the influence of the irrigation dose on Verticillium wilt (Verticillium dahliae Kleb.) of olive (VWO). The 93.1% of the visited orchards were planted with susceptible cultivars to V. dahliae (‘Picual’ and ‘Hojiblanca’). Mean disease incidence (DI) of the orchards accounted for 14.9%. In almost all investigated plantations disease onset occurred after farmers had introduced irrigation. In the case that it was present, the introduction of the irrigation always encouraged VWO development, and DI was positively associated with the number of years of irrigation, showing a linear trend (P=0.006). VWO was significantly more severe in olive plantations irrigated with high irrigation doses. The 47.1% of olive plantations were irrigated with mean values of 2059.9 (in 2012) and 1793.4 (in 2013) m3/ha, and showed the highest DI (21.42%). Plantations watered with lesser doses (the 28.6%) with average values of 712.5 (in 2012) and 741.5 (in 2013) m3/ha showed a DI significantly lower, which accounted for 13.3%. Finally, dry-land olive orchards (24.3%) showed the lowest DI (4.0%). Corresponding author: Pérez-Rodríguez, M. E-mail: [email protected]. This chapter has been published in: Pérez-Rodríguez, M., Lorite I. J., Orgaz F., López-Escudero F. J., 2015. Effect of the irrigation dose on Verticillium wilt of olive. Scientia Horticulturae 197: 564-567. 57 Chapter 3 Introduction Verticillium wilt (Verticillium dahliae Kleb.) of olive (VWO) is nowadays the most threatening disease in many of the olive producing countries (López-Escudero and Mercado Blanco, 2011; Tsor, 2011). From the last decade, several epidemiological aspects have been identified regarding the influence of irrigation on the development of the disease in olive orchards. López-Escudero and Blanco-López (2005) demonstrated that pathogen population in soil was higher in wet zones close to drippers used for irrigation than in dryer zones. Indeed, surveys conducted by López-Escudero et al. (2010) showed higher values of VWO incidence in infected irrigated orchards compared to dryland ones. García-Cabello et al. (2012) verified that microsclerotia, associated to soil particles and/or infected plant debris were distributed by irrigation systems. These effects may even be accentuated when using saline water (Levin et al., 2003). The most recent studies (Pérez-Rodríguez et al., 2015) evidence that daily irrigation frequencies favour VWO in susceptible cultivars when compared to more widely spaced in time irrigations. These studies have had the objective of identifying how this practice could influence on the development of VWO. However, information of the effect of different watering dosages on the disease remains still unknown. Therefore, objective of this research was to obtain and assess data from orchards in a representative zone of olive cultivation in Andalucía, for determining a best practice guide of irrigation under risk conditions, that allow ameliorate VWO control. Materials and methods Disease surveys During autumn 2012 and 2013 a survey comprising 70 olive orchards (53 irrigated, mainly by drip-irrigation, and 17 dry-land plantations) was carried out in an olive cultivated zone affected by VWO that belongs to the Genil-Cabra Irrigation Community of Córdoba province (southern Spain). In each orchard, companied by the farmer or a technician, a survey consisting of two parts was completed. First one comprised general information related to irrigation in the orchards (watering regime, number of years on irrigation, the estimated-by-farmer watering doses in the orchard, watering periods etc.). In a second part, information about the disease (first disease symptom onset, estimated mean disease incidence (DI) and tree mortality in the plantation) was recorded. Finally, the DI in a rectangular plot chosen at random in each olive orchard containing 100 trees was assessed. From some of affected trees, plant material samples were taken for confirming V. dahliae infections according to López-Escudero et al. (2010). Indeed, the Irrigation Community provided us the real value of water consumption for irrigation during the years 2012 and 2013 for the orchard zone where the plot was chosen for recording the DI. After assessing data, visited plots were classified in three groups depending on water consumption, regarding normal mean values of consumption in this crop: High (2400–1800 m3/ha), reduced (1400–500 m3/ha), and dry-land (just rainfall). Water consumption was correlated with the recorded phytopathological parameters. 58 Irrigation dose Data analysis Analyses of variance and Pearson’s correlation coefficient of the studied disease parameters (incidence and mortality as dependent variables) regarding irrigation recorded values (watering consumption of 2012 and 2013 years; number of years of irrigation, etc) were analyzed according to a completely randomized design using the Statistix 10.0 software program (Analytical Software, Tallahassee, FL, USA). Mean values were compared using the T-student test or the Fisher’s protected LSD test at P = 0.05 for two or more than two treatments, respectively. In addition, trend was studied using polynomial contrast. A principal component analysis (PCA) was carried out using Xlstat v.7.5.2 excel add-in software (http://www.xlstat.com, Addinsoft) in order to represent the relationship between DI and irrigation parameters and age of visited orchard. Results and discussion Present study provides novel information about the relationship between VWO incidence and water consumption in olive plantations. The disease was widespread in the 70 visited orchards, with a mean DI of 14.9%, values lightly lesser than those reported by López-Escudero et al. (2010), which accounted for 20.4% as a mean in affected trees in the Guadalquivir Valley. In the 94.3% of cases V. dahliae could be recovered from affected sampled tissues. The DI recorded inside the assessed plots was significantly higher in irrigated (18.5%) than in dry-farming (4.0%) olive orchards (Table 1). Also the values of DI estimated by farmer for the whole farm followed this pattern, accounting for 10.0 and 1.9%, respectively (Table 1). The estimated mortality values of the plantation did not showed significant differences between irrigation regimes, reaching an average of 2.0%. Previous reports (López-Escudero et al., 2010) also showed significant differences of DI between irrigated (20.7%) and dry-land (18.3%) orchards in the Guadalquivir Valley. Nevertheless, the DI in dry-land visited plots in present research was much lower (4.0%). Probably differences are due to that, in the former cited surveys, owner would have stopped of watering before the visit date as a consequence of the alarming disease progress in the plots. In this work we have also novelty demonstrated that water consumption has a strong influence on VWO (Table 2). Thus, plots classified as highly irrigated, according to water consumption in years 2012 and 2013, showed significantly higher values of DI (21.4%) than those irrigated with reduced doses (13.3%). Indeed, dry-land visited plots showed significantly lesser values of DI compared with irrigated ones (Table 2). Interestingly, the 93.1% of visited olive orchards were planted with olive cultivars ‘Picual’ and/or ‘Hojiblanca’, in which WVO develops very fast (López-Escudero and MercadoBlanco, 2011), particularly when irrigated frequently (Pérez-Rodríguez et al., 2015). Estimated values of DI and mortality that were provided by farmers did not show significant differences (Table 2). 59 Chapter 3 Other interesting results of this work is that in 70% of olive farms, disease symptoms onset coincided with the conversion of the orchard from dry-land into irrigation, and the DI progress was influenced by the number of years of irrigation. Thereby, nonirrigated orchards and those irrigated for less than one year showed significant lower DI (4.0%) than olive plantations irrigated for longer, that moved from 15.6% (from 2 to 4 year under irrigation) to 23.2% (more than 10 years of irrigation), following a linear trend (P=0.006) (Table 3). According to the Pearson test, DI recorded in plots was positively correlated with the water consumption for years 2012 (r=0.35, P=0.002), 2013 (r=0.25, P=0.03) and accumulated during both years (r=0.33, P=0.004). Nevertheless, the value of “r” is low, probably due to the influence of other factors on disease development, such as inoculum density of V. dahliae in soil, virulence of isolates, soil type, etc. As example, beside factors related to irrigation, recorded information from surveys showed that DI decreased linearly with the plant age (linear trend, P=0.003; data not shown). This finding corroborates results of previous surveys (López-Escudero et al., 2010). The Principal Component Analysis (PCA) showed that the first (PC1) and the second (PC2) principal components accounted for 68.4% of the total variance. The PC1 variance was explained (49.8%) by years of irrigation, water consumption of 2012 and 2013 and the accumulated consumption of both years (Figure 1A). The PC2 variance was explained (18.6%) by plant age and DI. This latter variable increased in the same direction than the irrigation dosage and years of irrigation. Moreover, age variable showed nearly opposite direction (Figure 1A). The plots clearly clustered into three groups of watering consumption (Figure 1B). Almost all highly irrigated plots were located in the higher DI zone. On the contrary, the dry-land plots occupied the opposite zone (Figure 1B). Indeed, DI increased in plots that have been irrigated for more than one year (Figure 1C). Finally, orchards with trees older than 30 years were located below the horizontal axis, while young orchards (3-6 year old) were distributed above this axis, despite both had high water consumption (Figure 1D). In summary, data shows that the reduction in watering dosage could be an advisable cultural practice for controlling VWO in affected olive orchards. Acknowledgment Research founded by a contract between the University of Córdoba and The Spanish Interprofessional Olive Oil Association (UG 400544). We want to thank to Mª Asensión Carmona Graciano and José Berlanga Mercado from the Comunidad de Regantes Genil Cabra for organizing the meetings with farmers. 60 Irrigation dose References García-Cabello, S., Pérez-Rodríguez, M., Blanco-López, M.A., López-Escudero, F.J., 2012. Distribution of Verticillium dahliae through watering systems in widely irrigated olive growing areas in Andalucia (southern Spain). Eur. J. Plant Pathol. 133, 877-885. Levin, A.G., Lavee, S., Tsror, L., 2003. Epidemiology and effects of verticillium wilt on yield of olive trees (cvs. Barnea and Souri) irrigated with saline water in Israel. Phytoparasitica 31, 333-343. López-Escudero, F.J., Blanco-López, M.A., 2005. Effects of drip irrigation on population of Verticillium dahliae in olive orchards. J. Phytopathol. 153, 238-239. López-Escudero, F.J., Mercado-Blanco, J., Roca, J.M., Valverde-Corredor, A., BlancoLópez, M.A., 2010. Verticillium wilt of olive in the Guadalquivir valley (southern Spain): Relations with some agronomical factors and spread of Verticillium dahliae. Phytopathol. Mediterr. 49, 370-380. López-Escudero, F.J., Mercado-Blanco, J., 2011. Verticillium wilt of olive: a case study to implement an integrated strategy to control a soil-borne pathogen. Plant Soil 344, 150. Pérez-Rodríguez, M., Alcántara, E., Amaro, M., Serrano, N., Lorite, I.J., Arquero, O., Orgaz, F., López-Escudero, F.J., 2015. The influence of irrigation frequency on the onset and development of verticillium wilt of olive. Plant Dis. 99, 488-495. Tsror, L., 2011. Epidemiology and control of Verticillium wilt on olive. Isr. J. Plant Sci. 59, 59-69. 61 Chapter 3 Table 1 Irrigation regime, disease incidence and mortality caused by Verticillium dahliae, in olive orchards surveyed at Guadalquivir Valley (Spain) a Disease incidence (%) In the Estimated for Estimated Factor Sub-factor surveyed the whole olive Mortality plot b orchard c (%) d Irrigation regime Irrigated 53 18.5 a 10 a 2.9 a Dry-farming 17 4.0 b 1.9 b 1.0 a a The values in columns followed by the same letter were not significantly different according to T-student test. b Incidence was recorded in a rectangular plot chosen at random containing 100 trees. c,d Incidence and Mortality according to farmers. Field (nº) 62 Irrigation dose Table 2 Water consumption, disease incidence and mortality caused by Verticillium dahliae, in olive orchards surveyed at Guadalquivir Valley (Spain) a Water consumption (m3/ha) Disease incidence (%) Groups Number Estimated for Estimated of of the In the surveyed the whole olive Mortality b c consumption fields 2012 2013 Accumulated plot d orchard e (%) f High 33 2059.9 1793.4 3853.3 21.4 a 12.7 a 3.8 a Reduced 20 712.5 741.5 1454.3 13.3 b 7.0 a 1.6 a Dry-land 17 3.3 0 3.3 4.0 c 1.9 a 1.0 a a The values in columns followed by the same letter were not significantly different at P = 0.05 according to Fisher's protected LSD test. b The plots were classified in three groups depending on water consumption: High (2400–1800 m3/ha), reduced (1400–500 m3/ha), and dry-land (just rainfall). c Accumulated consumption (m3/ha) of years 2012 and 2013. d Incidence was recorded in a rectangular plot chosen at random containing 100 trees. e, f Incidence and Mortality according to farmers. 63 Chapter 3 Table 3 Years of irrigation, disease incidence and mortality caused by Verticillium dahliae, in olive orchards surveyed at Guadalquivir Valley (Spain) a Disease incidence (%) Years of Number of Estimated In the Estimated for irrigation the fields surveyed the whole olive Mortality (%) d plot b orchard c 0-1 17 4.0 a 1.9 a 1.0 a 2-4 24 15.6 b 8.1 a 1.6 a 5-7 9 19.7 b 14.8 a 8.6 a 8-10 8 17.9 b 8.1 a 0.5 a > 10 12 23.2 b 13.7 a 3.1 a e ** Trend L NS NS a The values in columns followed by the same letter were not significantly different at P = 0.05 according to Fisher's protected LSD test. b Incidence was recorded in a rectangular plot chosen at random containing 100 trees. c,d Incidence and Mortality according to farmers. e NS, **, Non-significant or significant at P ≤ 0.01, respectively; L: linear. 64 Irrigation dose Figure 1 Principal Component Analysis of the data in which the associated vectors with the original variables have been represented (A) and the data have been colored according to: B) water consumption; C) Years of irrigation. Trees equal or higher 2 years were included in a single category due to the lack of significant differences between them in the ANOVA analysis (Table 3); and D) Age. 65 Chapter 3 SUPPLEMENTARY FIGURES Figures of chapter 3 66 Irrigation dose 67 Chapter 3 68 Irrigation dose Survey carried out in the olive orchards 69 Chapter 3 Location of studied area Symptomatic olive trees affected by Verticillium dahliae 70 Irrigation dose at field conditions 71 72 Irrigation frequency at field conditions THE EFFECT OF SHORT IRRIGATION FREQUENCIES ON THE DEVELOPMENT OF VERTICILLIUM WILT IN THE SUSCEPTIBLE OLIVE CULTIVAR ‘PICUAL’ AT FIELD CONDITIONS Abstract The effect of irrigation frequency (daily-T1, biweekly-T2, and dryland-T3) on Verticillium wilt of olive was studied in two fields that were naturally infested by Verticillium dahliae in southern Spain and planted to cultivar Picual. Disease onset (average 61 weeks after planting) and disease incidence (average 75.6%) did not differ among irrigation treatments in both fields. Irrigation consistently increased disease development regarding dryland treatment, but this effect varied over time. In Experiment I, T1 the area under the disease progress curve was greater on all recording dates (ranging from 15.8%-33.7%) in comparison to T3 (average 6.6%). Data for Experiment II were similar on the most favorable recording dates for disease (March-April). The T2 treatment effect varied over time depending on the season, rainfall and field, and was difficult to differentiate from T1 and T3. Significant correlation between disease incidence and severity increments during spring and fall with the soil water content of the same and/or previous favorable seasons was observed. Through these correlations, we detected soil water contents of 23.5-25.5% (Experiment I) and 23.5-23.6% (Experiment II), where the increments of disease parameters remained at zero. Therefore, spacing irrigation treatments, depending on rainfall, may be a feasible method for maintaining the soil moisture below levels that favor for disease development. Corresponding author: Pérez-Rodríguez, M. E-mail: [email protected]. This chapter has been published in: Pérez-Rodríguez, M., Serrano, N., Arquero, O., Orgaz, F., Moral, J. , and LópezEscudero F.J. 2015. The effect of short irrigation frequencies on the development of Verticillium wilt in the susceptible olive cultivar ‘Picual’ at field conditions. Plant Disease (Accepted, in press). 73 Chapter 4 Introduction The Spanish Research Group AGR-216 from the University of Cordoba has conducted experiments over the last four years to study the effect of irrigation on the onset and development of Verticillium wilt of olive (VWO), which is caused by Verticillium dahliae. Verticillium wilt is the most important disease of this tree crop in all areas where it is cultivated, and particularly in Andalucía (southern Spain; Jiménez-Díaz et al. 2012; López-Escudero and Mercado-Blanco 2011; Tsror 2011). There are several reports that excessive irrigation or soil moisture increased Verticillium wilt development in herbaceous hosts such as potato (Cappaert et al. 1992), cauliflower (Xiao and Subbarao 2000), eggplant (Bletsos et al. 1999), and cotton (Wheeler et al. 2012). Limiting the amount of water applied to the field may reduce severity of the disease in some plant species, such as potato (Cappaert et al. 1992). Berlanger and Powelson (2000) reported overwatering, particularly early in the growing season, resulted in increased infection and, thus, increased disease severity. Data on the effect of excess water on woody hosts of V. dahliae is scarce (Hiemstra and Harris 1998), but increased disease has been reported in some hosts, namely cacao (Emechebe 1980), apricot (Vigouroux 1984) and maple (Shufelt and Linderman 1986). Preliminary studies on the effect of excess soil moisture on VWO were conducted in semi-controlled conditions, i. e., in microplots filled with naturally infested soil, in which plants were watered daily, weekly, biweekly or with deficit irrigation (PérezRodríguez et al. 2015). In the same experiment, the interaction of irrigation treatments with olive cultivars with different levels of resistance to V. dahliae (‘Picual’, susceptible; ‘Arbequina’, moderately susceptible; and ‘Frantoio’, resistant) was also assessed. Daily irrigation resulted in greater VWO development in Picual compared to the other combinations of cultivar and irrigation frequency tested. However, there is little information about regarding the effect of irrigation frequencies on VWO disease progress in field conditions. This is difficult to study because the progress of Verticillium wilt in olive is modified by environmental changes, particularly by seasonal variations in rainfall and temperature over time but also by, e.g., differences in the inoculum density of the pathogen and its virulence, in the types of soil, and in cultural management. Nevertheless, we conducted long-term experiments at two locations in Spain to examine if short irrigation frequencies increase the risk of VWO in fields in which Verticillium dahliae is present in the soil. 74 Irrigation frequency at field conditions Materials and Methods Field experimental plots Experiment I. Soil properties and Verticillium dahliae inoculum density. The experiment was conducted in naturally infested soil in the municipality of Andújar (Jaen province, upper Guadalquivir Valley; X: 409.007,90763; Y: 4.204.618,5853, according to system ED50 / UTM zone 30N) in southern Spain from June 2013 to April 2015. The soil of the plot was clay soil (pH in ClK= 7.47, organic matter = 1.27%, total CaCO 3 equivalent = 31.60%, active CaCO3 = 14.24%, available K= 570 ppm, available P= 11.5 ppm, and organic N = 0.06%). The hydraulic properties of the soil were assessed using a 12 l plastic pot filled with the soil, which was watered to saturation and covered with a black plastic film to avoid evaporation. The pot was allowed to drain freely, and thereafter, it was weighed and dried in an oven at 70 ºC for 7 days. Then, the pot was again weighed to determine the mass of water and the mass of solid soil. The upper limit soil water content (θUL) was determined according to the gravimetric method using the following formula: θUL= (Vw)/(Vs), where Vw = the mass of water and Vs = the total volume of soil. The θUL value accounted for 0.32 m3 m-3. To determine the available water in this soil, the lower limit of the soil water content (θLL) was measured using barley seeds that were sown in a 12 l plastic pot filled with soil. Irrigation was cut when the plants reached maximum vegetative growth, and after plants had died, the soil water content was determined using the above formula. The θLL value was 0.18 m3 m-3. The plot had been cultivated with cotton for the five previous years, and it was surrounded by olive orchards severely affected by VWO. The initial inoculum density (ID) of V. dahliae of the plot soil was determined as described by Trapero et al. (2013). Forty 100 g soil subsamples were homogeneously taken from the plot from a depth of 2530 cm using a cylindrical auger. Subsamples were mixed, bulked and crumbled. Resulting soil sample was then air-dried under ambient conditions for three weeks. The sample was then passed through a 0.8 mm sieve to remove organic debris and large particles, mixed by hand and air-dried for an additional week. The V. dahliae ID was estimated by the wet sieving technique (Huisman and Ashworth 1974). An amount of 25 g of the sample was suspended in 100 ml of distilled water, shaken at 270 rpm for 1h and filtered through 150 and 35 µm sieves. The residue retained on the 35 µm sieve was recovered in 100 ml of distilled water. Finally, 1 ml of the suspension was plated onto plates (20 replications) of a modified sodium polypectate agar medium plates (MSPA, Butterfield and DeVay 1977). After 14 days of incubation at 22-24ºC in the dark, soil residues were removed with tap water, and colonies of V. dahliae counted under a stereoscope. The ID was estimated by the number of colonies of V. dahliae and expressed 75 Chapter 4 as propagules or microsclerotia per gram of air-dried soil. For this soil, ID reached 5.4 microsclerotia per gram of soil (MS/g). At the end of the experiment, the ID of the pathogen in soil was assessed for all irrigation treatments and quantified using the method described above. The isolation and molecular characterization of the pathogen in the soil were conducted using the methodology described by López-Escudero and Blanco-López (2005b) and Mercado-Blanco et al. (2003). This analysis revealed that the 82.7% of the soil isolates of the pathogen recovered from the soil were highly virulent strains (defoliating pathotype). Plant material. For planting, twenty-month-old rooted olive cuttings of the susceptible olive cultivar Picual (López-Escudero et al. 2004; Trapero et al. 2013) were used. The cuttings were collected from Verticillium dahliae-free mother olive plants from the World Olive Germplasm Bank (Caballero and Del Río 2008) from IFAPA, Research Center ‘Alameda del Obispo’, Córdoba, Spain, and propagated according to Caballero and Del Río (2010). At planting time, the plants were 1.3-1.5 m high with single trunk and three or four secondary branches. Orchard establishment, experimental design and irrigation treatments. The experimental olive orchard was established in June 2013. The plot occupied 0.2 ha (28 x 67.5 m), with an average slope of 4%. The orchard consisted of 5 rows (distance between rows = 7 m; between plants = 2.5 m). For soil management, reduced tillage and herbicide applications were used. A randomized block design with 5 blocks was used. There were twenty-seven plants per block (row), three irrigation treatments per block, and nine plants per treatment. Three irrigation frequencies were assessed: daily (T1), biweekly (T2), and dryland (T3). The plants were drip-irrigated using a programmable irrigation controller (Image 6 Rain Bird, Rain Bird Iberica S.A., Spain) connected to two 50-mm diameter and 40-m-long PVC water pipes extended in a direction perpendicular to the tree rows. From these pipes, two 16 mm pipes started per row (one for each treatment, T1 and T2) with two and twelve compensating drippers (NetafimTM, 8 l/h) per tree for T1 and T2 irrigation treatments, respectively. The soil water content in each treatment was recorded every fifteen days just before irrigation using a Time Domain Reflectometry (TDR) system (6050X1 Trase System I; Soil Moisture equipment Corp., Santa Barbara, CA, USA). Subsequently, in treatments T1 and T2, at every irrigation date (daily or every fifteen days, respectively), the soil was irrigated until it reached the upper limit of water content. 76 Irrigation frequency at field conditions Experiment II. Inoculating the experimental site and collecting and characterizing a naturally infested soil. Experiment II was conducted in a previously Verticillium dahliae–free site located in the Campus of Rabanales of the University of Córdoba (Córdoba province, middle Guadalquivir Valley; (X:349349.734175 m; Y:4197887.92704 m, according to system ED50 / UTM zone 30N) in Southern Spain, from December 2013 to May 2015. The selected site occupied 0.06 ha (19 x 30 m), had an average slope of 1.8% and was previously tilled by a tractor to remove weeds. One hundred tons of soil naturally infested by the pathogen was collected from a field located in the municipality of Utrera (Sevilla, southern Spain) in a marsh area annually cropped with V. dahliae hosts, primarily tomato, cotton and eggplant. The soil in this zone is heavily infested with highly virulent strains of V. dahliae (cotton-defoliating pathotype) and the VWO incidence and mortality develop quickly (Trapero et al. 2013). Indeed, soil from this zone was successfully used in previous studies to determine the effect of irrigation frequencies on VWO development in microplots (Pérez-Rodriguez et al. 2015). The ID of the collected soil, assessed as described above, was 1.2 microsclerotia per gram of soil (MS/g), and almost the 100% of soil isolates of the pathogen recovered from it were characterized as highly virulent strains (defoliating pathotype). As in Experiment I, the final value of ID was assessed for all irrigation treatments. The soil was a clay soil (pH in ClK= 7.45, organic matter = 1.57%, total CaCO3 equivalent = 25.64%, active CaCO3 = 3.33%, available K = 475 ppm, and available P = 8.4 ppm, and organic N = 0.07%). The hydraulic properties of the soil were assessed as described above. Thus θUL and θLL values of the soil in Experiment II accounted for 0.37 m3 m-3 and 0.17 m3 m-3, respectively. Plot infestation, orchard establishment, experimental design and irrigation treatments. In October 2011, the collected soil was transported by trucks to the Campus of Rabanales and was homogenized by continuous crumbling and mixing using a tractor shovel at the experiment site. In the plot, trenches (30 m long, 1 m wide, 70 cm deep) were dug and subsequently filled with the infested soil (bulk density=1,300 Kg/m3). During the filling, plastic sheets 2 mm thick were used for to line the trenches of soil and thus separate the different irrigation treatments (see below) and to prevent water from passing from one to another. The filled trenches were finally covered with a 10-cm layer of the original soil of the plot to prevent infested soil dispersal. ‘Picual’ plants that were of the same age as those in Experiment I and propagated with the same procedure were used for planting. The olive plantation was established in December 2013. The orchard consisted of 4 rows (distance between rows = 5 m, between plants = 2 m). The plot occupied 0.06 ha (20 x 30 m), with an average slope of 1.8%. For soil management, reduced tillage and herbicide applications were used. As in Experiment I, T1, T2, and T3 treatments were studied, and the plants were arranged according to a randomized block design with 4 blocks. There were fifteen plants per block (row), three 77 Chapter 4 irrigation treatments per block, and five plants per treatment. The irrigation system was installed and controlled as described for Experiment I. The soil water content in each treatment was recorded as in Experiment I, and the irrigation program was decided according to the same criteria. Assessment of disease progression Experiments I and II were inspected every two weeks for 23 and 18 months after planting, respectively, for disease symptoms. Disease severity was estimated based on a 0 to 4 rating scale according to the percentage of plant tissue affected by any of the following symptoms: chlorosis, necrosis or defoliation (0 = no symptoms; 1 = 1-33%; 2 = 34-66%; 3 = 67-99%; 4 = dead plant). These values were used to construct the progress curves for disease incidence (DI) and mean disease severity of the affected plants over time during the recording period. For both experiments, the curves of mean severity over time were adjusted to the logistic model (Pérez-Rodríguez et al. 2015). Moreover, the time that elapsed from the plantation establishment to the point where 50% of trees were diseased (DI50) was also calculated for each treatment. At the end of the experiment, the area under the disease progress curve (AUDPC) was estimated as the percentage of the maximum possible value in the considered period according to the following formula based on Campbell and Madden (1990): AUDPC = [(t/2*(S2+2*S3+...+2Si-1+Si)/4*n]*100, where t = the interval in days between observations, Si = the final mean severity, 4 = the maximum disease rating, and n = the number of observations. The final percentage of dead plants, or mortality (M), was also considered in estimating the severity of the reactions. The time that elapsed from the transplanting to the onset of disease symptoms (FS) was determined for all irrigation treatments. Plant infection was confirmed by isolating the fungus from the affected shoots or leaf petioles of diseased plants via microbiological methods, as described by LópezEscudero and Blanco-López (2001). Briefly, affected twigs showing disease symptoms mentioned above were collected from wilted plants (three 20cm long twigs per tree). When leaf petioles were used, ten defoliated leaves per tree were collected just after affected shoots in the tree were shaken. For pathogen isolation, pieces of collected twigs were washed in running tap water, bark was removed and woody tissues surface disinfesting in 0.5% sodium hypoclorite for 1 min. Chips of wood were placed onto potato dextrose agar (PDA) or acidified PDA. Plates were incubated at 24ºC in the dark for 5-6 days. Leaf petioles cut from defoliated leaves were processed in a similar way. Almost all affected samples were also analyzed using PCR methods according to the methodology of Mercado-Blanco et al. 2003, with the aim to determine the pathotype of the isolates recovered from trees. 78 Irrigation frequency at field conditions Relationship between increase in disease parameters (incidence and severity) and soil water content in Experiments I and II. Soil water content data and disease parameters (incidence and severity) were grouped by seasons: spring (1 April to 1 June), summer (15 June to 15 September), autumn (1 October to 15 December) and winter (1 January to 15 March). The effect of increase in disease parameters per day of each irrigation treatment was calculated as ((last day of season)-(first day of the next season– 1)). The soil water content in each of three treatments was computed as average values of all days of the season. A non-linear asymptotic regression model was used to evaluate the relationship between soil water content in percentage and increase in diseased parameters (incidence and severity). This equation has three parameters: a is the horizontal asymptote on the right-hand side when 0 < c < 1, a-b is the response when x=0 and c is the growth rate of the curve. The minimum soil water content (MSWC; the soil water content in percentage for which disease incidence and severity were zero) of these curves was calculated. Rainfall data. Rainfall data were collected from the two nearest official weather stations of The Junta de Andalucía to the experimental sites (Anonymous 2015). Then, the agroclimatic stations located in Finca La Paz (La Higuera de Arjona, Jaen province; UTM coordinates X: 411463.0 m and Y: 4200610.0 m; altitude = 267.0 m; latitude: 37º56'55''N; longitude: 04º00'27''W) and Finca Alameda del Obispo (Córdoba, Córdoba province; UTM coordinates X: 341399.0 m and Y: 4191480.0 m; altitude 117.0 m; latitude: 37º51'25''N; and longitude: 04º48'10''W), were used for the field trials at Andújar (Experiment I) and the University of Córdoba (Experiment II), respectively. Data analysis. For each trial, individual analyses of variance (ANOVA) of the evaluated parameters were performed using Statistix 10.0 program (Analytical Software). The data were analyzed in a randomized completed block design with studied diseased parameters as the dependent variable. The mean values of analyzed parameters were compared using Fisher’s protected least significant difference test at P=0.05. The FS parameter was analyzed using Kaplan-Meier survival analysis (Kaplan and Meier 1958), in which the survival times were calculated as the week showed diseased symptoms for the first time. Comparisons were tested using the log-rank test at P=0.05. The relationship between the increase in incidence, severity and the soil water content of the three treatments during each season was studied using the Pearson correlation, and then by a non-linear asymptotic regression model described above. The Akaike’s information criterion and pseudo-R2 parameter were used to evaluate the appropriateness of the logistic model and the asymptotic regression model to describe data. The effect of water content during seasons on the increase of incidence or severity during a given season was also studied by multiple linear regression analysis. We 79 Chapter 4 evaluate the appropriateness of multiple linear regression according to the significance of the estimated individual parameters and general significance of model (P ≤ 0.05), Mallow’s Cp statistic, Akaike’s information criterion, the coefficient of determination (R2), R2 adjusted for degrees of freedom (Ra2), and the pattern of residuals over predicted and independent variables. The collinearity among parameters was chequed according to Variance Inflaction Factor (VIF) Results Inoculum density of Verticillium dahliae in the soil. Soil analyses showed that the pathogen remained viable in the soil in both trials throughout the investigation period. The V. dahliae population detected in soil reached 5.4 ± 1.06 MS/grams and 1.2 ± 0.4 MS/grams in Experiment I and II, respectively. No significant differences (P>0.05) were detected in the initial and final amounts of infective propagules between different irrigation treatments. Disease symptoms and pathogen isolation from affected tissues. Typical symptoms of the disease (López-Escudero and Blanco-López 2001; Trapero et al. 2013), i.e., wilting, dieback, and/or defoliation, were usually observed in the affected plants. Wilting primarily started at the lower branches and developed as a generalized green leaf defoliation that affected the entire tree canopy. However, partial defoliations of green leaves affecting the higher branches were observed occasionally. Desiccation of flowers occurred during spring and early summer. Occasionally, primarily in early spring, affected plants exhibited wilt, chlorosis and rolling of leaves without the defoliation of green leaves. These plants became completely wilted, and necrotic leaves remained attached to shoots. Affected plants were consistently colonized by the pathogen and a collection of 57 V. dahliae isolates was obtained from both fields, of which 89% of recovered isolates corresponded to the defoliating pathotype, that was present in similar percentages in wilted trees from Experiment I (19 out of 23 isolates were classified as defoliating pathotypes) and Experiment II (32 out of 34 isolates). Disease progression. Verticillium wilt symptoms were first observed at 48 and 42 weeks in Experiments I and II, respectively (Table 1). Time to the onset of the disease symptoms from orchard establishment did not differ between irrigation treatments, and was very similar in the two experiments. (62.2 and 60.7 weeks for Experiments I and II, respectively). In Experiment I, the disease incidence increased faster in trees under T1 irrigation treatment compared to those in T2 and T3 irrigation treatments (Figure 1). For example, in mid-May 2014, DI was 33% in the T1 treatment and 17% and 2% in the T2 and T3 treatments, respectively. Throughout June 2014, there was little increase in the number of new diseased trees, however, starting in July, DI increased gradually and by October, DI was 89%, 64% and 54% for T1, T2 and T3, respectively (Figure 1). No significant differences between treatments were found (P=0.143) in the final DI values, which were 80 Irrigation frequency at field conditions 91.3%, 76.6% and 63.6% for T1, T2 and T3 treatments, respectively (Table 1 and Figure 1). In Experiment II, the progress of the DI was similar for the T1 and T2 treatments. The first plants were symptomatic in early October of 2014, and thereafter, the percentage of affected plants progressively increased until the end of the observations in spring of 2015, reaching final values of 83.7 and 78.7% of plants in the T1 and T2 treatments, respectively. DI increments were primarily recorded from September to December 2014 and in spring 2015. Although the final values of DI registered for T3 were not significantly different (P=0.355) from those of T1 and T2 (Table 1), the disease was considerably delayed in T3, and plants did not exhibit disease symptoms until April 2015 (Figure 1). Nevertheless, despite this delay in disease onset, 60% of the plants under the T3 treatment developed some of the symptoms described above during spring 2015 (Figure 1). After 23 months of observations in Experiment I, the percentage of trees killed by the pathogen in irrigated treatment T1 was not significantly higher than that of T2 (28.4% and 17.3%, respectively). However, plant mortality was significantly higher (P=0.04) than that of the T3 irrigation (6.4%; Table 1). In Experiment II, 18 months after planting, there were not differences in percentages of the dead plants among the three treatments, varying from 15% (T3 treatment) to 27.5% (T2 treatment; Table 1). The time that elapsed from the plantation establishment to the point where 50% of trees were diseased (DI50) for T1 treatment was 58 and 55 weeks in Experiment I and II, respectively (Table 2). For the other two treatements, the DI50 was greater than 61 weeks. Significant differences regarding the AUDPC among treatments varied depending on the recording period. In Experiment I, the AUDPC calculated for trees irrigated under T1 irrigated treatment in June 2014 was significantly higher (15.8%) than for trees that received T2 and T3 treatments (7.9% and 2.1%, respectively; Table 2). In August, the AUDPC of the trees that received T3 treatment was significantly lower (4.8%) than those that received irrigated treatment. From October 2014 until the end of the observations, the AUDPC for plants that received T1 treatment remained significantly higher than that for trees that received T3 treatment, whereas for treatment T2, this parameter remained in intermediate and not significantly different between T1 and T3 at the end of experiment (Table 2). In Experiment II significant differences in AUDPC values between irrigation and the T3 treatment were observed in March and April 2015 (Table 2). The mean disease severity progress curves for the three irrigation treatments in Experiment I were well described by a logistic model (pseudo-R2=0.98; Figure 2). In Experiment II, the T1 treatment was described by a logistic model with a double sigmoid pattern (pseudo-R2=0.99), and the disease progression curves for the T2 and T3 treatments could not be fitted to a logistic model (Figure 2). 81 Chapter 4 Rainfall at experimental plots. The accumulated precipitation at the study fields was 740.2 mm (from 1 June 2013 to 1 May 2015) and 927.6 mm (from 1 December 2014 to 15 May 2015) for Experiments I and II, respectively. Periods in which higher rainfall was recorded were winter 2013-2014 (289.4 and 309.8 mm for Experiments I and II, respectively) and fall 2014 (190.8 and 326.0 mm for Experiments I and II, respectively). 1 June 2013 and summer 2013 were particularly dry, and almost no rainfall was registered in Experiment I. The driest season in Experiment II was fall 2013. Relationship between the increase in disease parameters (incidence and severity) and soil water content. In Experiment I, the largest increase in DI occurred in summer 2014 in which an average of twenty newly diseased trees was recorded in all treatments (Figure 3). The largest symptom severity increments were observed in spring 2014 in trees that received the T1 irrigation treatment (Figure 3). The increment of DI observed in spring 2014 was significantly correlated with the soil water content recorded during this season (r=0.70; P=0.0033) and during the previous fall (year 2013; r=0.57; P=0.0252 Table 3 and Figure 3). Disease symptom increments showed high correlation with values of this parameter for the two seasons (r=0.65; P=0.0079 and r=0.8; P=0.0003 for spring 2014 and fall 2013, respectively). Indeed, in fall 2013, the soil water content in the three irrigation treatments was well differentiated and was 30%, 26% and 23% in the T1, T2 and T3 blocks, respectively (Figure 3). In spring 2014, these average soil water content values in T1 and T2 were more similar (T1= 30.5% and T2=28.6%), while the soil water content of the T3 treatment remained near 24% (Figure 3). By contrast, the increase in symptom severity in fall 2014 was correlated (r=0.54; P=0.037) only with the soil water content of spring 2014 (Table 3). In spring 2015, five and three new trees developed wilt symptoms in the T2 irrigation and T3 treatments, respectively. The average value of the soil water content of the three irrigation treatments was approximately 30% at this time (Figure 3). In this experiment I, the total water consumption after 23 months, in the T1 and the T2 treatments, was 68.9 and 54.7 m3, respectively. In Experiment II, disease onset occurred in fall 2014, when 8 and 6 diseased trees were recorded in the T1 and T2 treatments blocks, respectively (Figure 3). The increase in disease incidence and severity recorded during fall 2014 was significantly correlated with the soil water content measured in fall 2014 (r=0.67; P=0.0161 and r=0.71; P=0.009, respectively) and the previous spring (r=0.69; P=0.0116 and r=0.64; P=0.025, respectively; Table 3). However, the increase in disease incidence (R2=0.61; P=0.0142) and severity (R2=0.59; P=0.0168) during fall 2014 was better explained by multiple linear regression considering soil moisture in spring and fall 2014. Soil water content in Experiment II between the irrigation treatments in spring and fall 2014 differed similar to that observed in the Experiment I (Figure 3). Soil water 82 Irrigation frequency at field conditions content was 23%, 27% and 29% in the T3, T2 and T1 blocks respectively, just before irrigation in the spring and 23%, 25% and 28%, respectively, in the fall. In spring 2015, an increase in the number of diseased trees (6, 5 and 12 new trees in T1, T2 and T3, respectively) was again recorded, and disease severity showed the greatest increments (Figure 3). In this season, the water content of the soil was approximately 30% in the three treatments. In Experiment II, the total water consumption, in the T1 and T2 treatments after 18 months was 9.1 and 4.6 m3, respectively (Figure 3). The correlations between the soil water content and the increase of disease parameters (incidence and severity) were well described by a non-linear asymptomatic regression model in both fields (pseudo-R2 between 0.35 and 0.71) and the asymptote trended toward 30%. According to the equation previously mentioned (see Material and Methods section), MSWC accounted for average values of 24.3% and 23.6% for Experiments I and II, respectively. Discussion Among the agronomic factors that may influence VWO, the use of irrigation has always been identified as a key factor and has been mentioned in the best agricultural practices for this tree crop (Hiemstra 2015). However, the only data reported regarding the effect of irrigation on VWO was a study recently conducted by Pérez-Rodríguez et al. (2015) in semi-controlled conditions using microplots with naturally infested soil. The present research contributes new findings for clarifying the effect of irrigation on the onset and development of VWO, and confirms that the disease is promoted by short irrigation frequencies in large field trials in the susceptible cultivar Picual. Moreover, it provides novel data on the relationship between disease development and the soil water content as a result of different irrigation schedules, and consequently these data have important implications for the practical management of irrigation in commercial olive orchards. Under field conditions, we observed several differences in the results when comparing with those of the mentioned research conducted in microplots which will be discussed in this section (significant differences in disease development between irrigation treatments, decrease of trees killed by the pathogen, decrease of mean severity, time from tree plantation to the onset of disease symptoms was higher than microplot study, etc...). These differences are likely due, among other things, to the effect of the reduced soil volume of the containers (1 m2 by 70 cm deep) used in the microplot study, the limitation of the tree growth within the container due to the high tree density (9 plants per microplot), the changes in edaphic and water relationships (primarly involving evapotranspiration and soil water content), and that rainwater in the microplot study 83 Chapter 4 would not have affected the study since -the microplot rows were covered (PérezRodríguez et al. 2015). The pathogen population in the soils of both experimental fields was similar and did not vary over the observation period. This finding indicates that the periodic variations in soil moisture caused by the different irrigation schedules of treatments did not increase (in the case of irrigated blocks) or reduce (in the case of dryland blocks) the pathogen population. This contradicts what some authors have reported. For example, inoculum density in wet areas around the drippers in Verticillium-infested olive orchards was higher than in the dry areas (López‐Escudero and Blanco‐López 2005a). Moreover, Green (1980) reported changes in the soil profile variations in the number of microsclerotia recovered from naturally infected potato stems. It is possible that our study was not long enough to detect changes in V. daliae inoculum density. The onset of the disease symptoms did not differ between irrigation treatments in the two experiments (62.2 and 60.7 weeks for Experiment I and II, respectively) Table 1. Conversely, Pérez-Rodríguez et al. (2015) reported an effect of irrigation treatment on VWO disease onset. They observed disease symptoms in daily irrigated plants of ‘Picual’ that grew in microplots with naturally infested soil at 46 weeks after planting, which was 30 weeks before symptoms were observed on the trees of the biweekly and irrigation deficit treatments and approximately 15 weeks before disease was observed in the present study. It is possible that a more conducive soil environment for infections caused by V. dahliae microsclerotia occurred in the microplots compared to the natural conditions in field trials. Some authors have argued that the increase in root growth promoted by high soil moisture could facilitate contact between roots and the infective propagules of the pathogen (Emechebe 1980; Fernández et al. 1991; Huisman 1982; López-Escudero and Blanco-López 2005a; Saadatmand et al. 2006; Xiao and Subbarao 2000). Moreover, the lower soil temperature that occurs during summer in daily irrigated blocks, would also facilitate infection and reduce the incubation period. Karaca et al. (1971) reported in cotton this effect may be accentuated in microplots´ conditions by the limited volume of soil (Pérez-Rodríguez et al. 2015) but was not as marked in the experimental fields of the current research where this fact was not observed. The mean disease severity progress in Experiment I fitted to a logistic model (Figure 2), likely because symptom development was slower during summer 2014 in the three treatments. In Experiment II, only the daily irrigation treatment could be adjusted to a double sigmoid logistic model. This result agrees with the results obtained in previous studies (Pérez-Rodríguez et al. 2015), where the disease progression in 'Picual' plants subjected to a daily irrigation program followed the double sigmoid logistic model. Disease was consistently worse in the frequent irrigation treatments, T1 and T2, compared to reduced irrigation frequency (T3) in both field trials. Significant differences in the AUDPC values between irrigation treatments varied with the assessment time (Table 2). Thus, in Experiment I, T1 had significantly greater AUDPC values at all 84 Irrigation frequency at field conditions assessment dates compared to the T3 treatment. The values for T1 ranged from 15.8%, one year after planting (June 2014) to 33.7% at the final assessment (May 2015), whereas in the T3, accounted for an average value of 6.6% throughout the period. Moreover, in Experiment II, these values also significantly differed between T1 and T3 at recording dates during the most favorable months for disease development (March and April) in spring 2015. Under these field conditions, the effect of the T2 irrigated treatment was not different from either the T1 or T3 treatments over the course of the study. Thus, the T2 irrigation program scheduling favored disease development significantly more than T3 during August and October 2014 (Experiment I) and March and April 2015 (Experiment II), but was only different from T1 in spring (June 2014) of Experiment I The interactions between the studied parameters and the experimental variables under natural conditions (e.g., soil and the microbiological characteristics of the soil and environment) of the two study fields are sufficiently complex and further research is needed to explain their effect on VWO development. The final values of DI were similar in both experiments and did not differ between irrigation treatments. Thus these data suggest that the sum of the long-term effect of non-controlled parameters that influence disease development, such as temperature, inoculum density, the virulence of isolates, and other harmful agronomic practices, was similar in the two experimental trials. Based on our previous work on VWO in microplots, we suggest that disease development was directly influenced not by the frequency of irrigation schedule, but by the water content in the soil profile. Thus we hypothesize that VWO could be managed by adjusting water content in soil could to lower values that do not affect the physiology (particularly the growth) of the plants but do reduce the incidence and/or severity of symptoms. Indeed, we determined in our research during favorable periods for disease development exist values of soil water content for which increments of DI and severity remained at zero, Table 3. In the present study, we included T1 and T2 irrigation treatments because we wanted to compare two irrigation frequencies for which the soil water content was calculated to try to produce maximum plant growth. Moreover, the T3 treatment, in which the tree growth could be more affected depending on the rainfall, would be a good control regarding the influence on disease of keeping water low in the soil profile. The weekly irrigation treatment was not studied, as was done by Pérez-Rodriguez et al. (2015), because we thought that, at field conditions, its effect on disease development would be very difficult to differentiate from effect of the T1 irrigation. Furthermore, its omission allowed us to simplify the irrigation program. With this aim, correlations between the soil water content recorded in the soil profile and DI and severity were investigated. In the two fields, and during the observation period, a significant correlation between the DI and severity increments 85 Chapter 4 during spring and fall with the soil water content of the same and/or previous favorable seasons was observed (Table 3, Figure 3). All these relationships were well adjusted to an asymptotic model in which the asymptote trended toward a moisture content of 30%. The value was close to the water content in the upper limit of Experiment I (37%) and Experiment II (32%). Additionally, in Experiment II, it was observed that if the soil water content values in the spring and fall of 2014 were studied jointly, a higher correlation was obtained with the increasing incidence and severity of symptoms in the fall of 2014. These results demonstrate that the soil water content in our favorable seasons (spring and fall) influences VWO development. The reduction of the available water in soil, with the aim to reduce the impact of VWO, probably had an influence in the plant vegetative development, although, in our experiments we did not measured tree growth. Nevertheless, according to Steduto et al. (2012) and Villalobos et al. (2002), in young olive trees similar to the ones used in present study, the threshold values of soil water content that would not reduce tree growth would be 25% and 27% in Experiments I and II, respectively. Indeed, the values of incidence and symptom severity remained at zero when values of moisture content were reduced to 24.3% and 23.6% in Experiments I and II, respectively. Therefore, we think that most likely tree growth was also subsequently reduced. Total recorded rainfall in this treatment was 740.2 mm and 927.6 mm in Experiment I and II, respectively. The winter 2013-2014 (289.4 mm and 309.8 mm for Exp I and II, respectively) and fall 2014 were particularly wet (326.0 mm for Experiment II; Figure 3). However the winter of 2014-2015 was considerably drier than the previous year in both fields (53 and 67.8 mm in Experiments I and II, respectively), although the soil moisture content at the beginning of spring 2015 was close to the highest recorded water content in T3 treatments, particularly in Experiment II (Figure 3). Thus in this treatment, there were long periods without rainfall that may have had a negative influence on tree growth, which consequently reduced crop yield. This reduction in yield needs to be considered by farmers in cases of disease risk, although it is a fairly common practice for farmers to stop irrigation when the disease is increased alarmingly to prevent high mortality (López-Escudero et al. 2010). This was observed in Experiment I, in which the percentage of dead plants at the end of the observations was significantly higher in the T1 irrigation treatment (28.4%) than in the T3 treatment (6.4%). The data from this study suggests that, under the climatic conditions of the Guadalquivir Valley, careful scheduling of irrigation during periods of low rainfall in the spring and/or fall may be considered to manage VWO management since keeping the soil water content below 24 % may delay or slow disease development. For example, farmers could consider a biweekly irrigation frequency rather than daily irrigation, or even not irrigating the affected orchard for a period of time. However, the effect of reduced irrigation scheduling on yield needs to be determined. 86 Irrigation frequency at field conditions Acknowledgments This research was partially funded by Projects AGL2007–65766 (Spanish Ministerio de Ciencia e Innovación, co-financed by FEDER of the EU) and by a contract between the University of Córdoba and The Spanish Interprofessional Olive Oil Association (UG 400544). We thank the Oficina Comarcal Agraria “Sierra Morena/Campiña Jaén” (Andújar, Jaén), the Comunidad de Regantes “Ntra. Sra. de los Dolores” (Arjona, Jaén), and Rafael Jiménez del Río for technical assistance at plot of Experiment I. We are also grateful to the Oficina Comarcal Agraria “Las Marismas” (Lebrija, Sevilla) and the Sociedad Cooperativa Andaluza “Agroquivir” (Trajano, Sevilla) for permitting us to collect from their property the infested soil necessary for Experiment II. We also thank Francisco Gonzalez for his constant valuable support at both experimental plots and Juan Moral Moral who holds a Talent Hub fellowship launched by the Andalusian Knowledge Agency and cofounded by the European Union’s 7th FP. References Anonymous. 2015. Redes de estaciones agroclimáticas de Andalucía. Online publication. http://www.juntadeandalucia.es/agriculturaypesca/ifapa. Berlanger, I. and Powelson, M. L. 2000. Verticillium wilt. The Plant Health Instructor. Online publication. doi: 10.1094/PHI-I-2000-0801-01. Blanco-López, M. A., Jiménez-Díaz, R. M., and Caballero, J. M. 1984. Symptomatology, incidence and distribution of Verticillium wilt of olive trees in Andalucía. Phytopathol. Mediterr. 23:1-8. Bletsos, F. A., Thanassoulopoulos, C. C., and Roupakias, D. G. 1999. Water stress and Verticillium wilt severity on eggplant (Solanum melongena L.). Journal of Phytopathology 147:243–248. Butterfield, E. J., and Devay, J. E. 1977. 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The effect of irrigation frequency on the final estimated disease values in two experimental olive orchards of the susceptible cultivar ‘Picual’ established on naturally infested soils by Verticillium dahliae u. FS (Weeks) w Experiment and treatments Range Mean Mortality (%) 48-83 48-99 57.1 a 64.0 a 28.4 a 17.3 ab 48-99 65.4 a 62.2 42-70 42-70 66-70 55.8 a 58.5 a 67.8 a 60.7 x Incidence (%) MS Affected z plants 1.8 a 1.4 ab 91.3 a 76.6 a 2.1 a 1.7 a 6.4 b 17.3 0.8 b 1.3 63.6 a 77.2 1.4 a 1.7 20.0 a 27.5 a 15.0 a 20.8 1.2 a 2.0 a 1.3 a 1.5 83.7 a 78.7 a 60.0 a 74.1 1.5 a 2.5 a 1.9 a 1.9 MS y Experiment I T1 (Daily) T2 (Biweekly) T3 (Dryland) Mean Experiment II T1 (Daily) T2 (Biweekly) T3 (Dryland) Mean u Trees were surveyed every 2 weeks for symptom development over 23 months (June 2013 to April 2015) in Experiment I and 18 months (December 2013 to May 2015) in Experiment II. The values listed in columns followed by the same letter were not significantly different at P= 0.05. w FS = The time from orchard establishment to the onset of disease symptoms. Differences were estimated according to the log rank test. x Mortality (%) = Differences were estimated according to Fisher's protected (LSD) test. y MS = Mean severity. Differences were estimated according to Fisher's protected (LSD) test. z MS affected plants = Mean severity of symptomatic plants. Differences were estimated according to Fisher's protected (LSD) test. 90 Irrigation frequency at field conditions Table 2. Progression of the disease parameters in two experimental olive orchards of the susceptible cultivar ‘Picual’ established on naturally infested soils by Verticillium dahliae and subjected to different irrigation frequencies u. AUDPC (%)w from the beginning of the experiment to the date Experiments and treatments Experiment I T1 (Daily) T2 (Biweekly) T3 (Dryland) Experiment II T1 (Daily) T2 (Biweekly) T3 (Dryland) 1 Jun 2014 15 Aug 2014 1 Oct 2014 1 May 2015 DI50(weeks)x 15.8 a 7.9 b 2.1 b 22.0 a 12.8 a 4.8 b 24.5 a 15.6 a 6.9 b 33.7 a 22.9 ab 12.8 b 58 62 68 1 Dec 2014 15 Mar 2015 15 Apr 2015 15 May 2015 4.5 a 2.1 a 0.0 a 8.9 a 4.7 a 0.0 b 9.8 a 6.2 a 0.2 b 12.3 a 10.5 a 3.1 a 55 66 70 u Values in columns followed by the same letter were not significantly different at P = 0.05 according to Fisher's protected (LSD) test. w AUDPC = Standardized area under the disease progression curve calculated using the trapezoidal integration of severity values expressed as a percentage of the maximum theoretical curve. x DI50 = Time in weeks from planting until 50% of the plants were affected 91 Chapter 4 Table 3. Relationship between the volumetric water content in soil and Verticillium wilt disease incidence and severity in two experimental olive orchards of the susceptible cultivar ‘Picual’ established on naturally infested soils by Verticillium dahliae and subjected to different irrigation frequencies Experiment and period of recording the volumetric water contenta Pearson correlationc Disease parameterb Period of correlation Experiment I Fall 2013 Spring 2014 Fall 2013 Spring 2014 Spring 2014 Experiment II DI DI MS MS MS Spring 2014 Spring 2014 Spring 2014 Spring 2014 Fall 2014 Spring 2014 Fall 2014 Spring 2014 Fall 2014 a Asymptotic Regressiond r P Pseudo R2 MSWCe (%) 0.57 0.0252 0.35 23.6 0.70 0.0033 0.56 24.5 0.80 0.0003 0.64 23.5 0.65 0.0079 0.56 24.3 0.54 0.0370 0.29 25.5 DI DI MS Fall 2014 0.69 Fall 2014 0.67 Fall 2014 0.64 0.0116 0.70 23.6 0.0161 0.0250 0.54 0.71 23.5 23.6 MS Fall 2014 0.71 0.0090 0.56 23.6 Spring period runs from the 1 April to 1 June; Fall period runs from 1 October to 15 December. b DI = Disease incidence; MS = Mean severity c Pearson correlation coefficient were calculated by volumetric water content and incidence or severity values. d The relations were adjusted to a non-linear asymptotic regression model (Y= a-b*cx). e Parameter obtained from the asymptotic regression between volumetric soil water content and parameter studied; Minimum soil water content in percentage (MSWC) for which disease incidence and severity were 0. 92 Irrigation frequency at field conditions Fig. 1. Verticillium wilt disease incidence over time in the olive cultivar Picual in two experimental olive orchards, Experiment I and II, established on naturally infested soils by Verticillium dahliae and subjected to three irrigation frequencies: daily (T1), biweekly (T2) and dryland (T3). 93 Chapter 4 Fig. 2. Mean severity of symptoms of Verticillium wilt over time in the olive cultivar Picual in the two experimental olive orchards, Experiment I and II, established on soil naturally infested with Verticillium dahliae and subjected to three irrigation frequencies: daily (T1), biweekly (T2) and dryland (T3). Disease severity was estimated on a 0 to 4 rating scale that reflected the percentage of plant tissue affected by any of the following symptoms: chlorosis, necrosis or defoliation (0 = no symptoms 1 = 1 to 33%, 2 = 34 to 66%, 3 = 67 to 99% affected tissue, and 4 = dead plant). 94 Irrigation frequency at field conditions Fig. 3. Number of symptomatic olive trees, disease severity increase, soil water content and registered rainfall in two experimental olive orchards of the cultivar Picual, Experiment I and II, established on soils naturally infested by Verticillium dahliae and subjected to three irrigation frequencies: daily (T1), biweekly (T2) and dryland (T3). Disease severity was estimated on a 0 to 4 rating scale that reflected the percentage of plant tissue affected by any of the following symptoms: chlorosis, necrosis or defoliation (0 = no symptoms, 1 = 1 to 33%, 2 = 34 to 66%, 3 = 67 to 99% affected tissue, and 4 = dead plant). The soil water content was recorded every fifteen days just before watering, with a time domain reflectometry. Subsequently, in T1 and T2, at every irrigation date (daily or every fifteen days, respectively), the soil was irrigated until it reach the upper limit of soil water content. 95 Chapter 4 SUPPLEMENTARY FIGURES Figures of chapter 4 Croquis of Experimet I 96 Irrigation frequency at field conditions Field work. Measure of volumetric soil water content (A). Collecting natural infested soil (B). Experiment I: Symptoms of affected olive trees (A),(B) and (C). Row of trees with different irrigation treatments (T1) Daily Irrigated, (T3) Dryland (D). 97 Chapter 4 Croquis of Experiment II Experiment II: Conditioning the experimental plot (A). Collecting naturally infested soil in a marches zone. (B). Moving the soil to University of Córdoba. (C). Soil mixing and homogenization (D). 98 Irrigation frequency at field conditions Experiment II: Trenches opening (A). Trenches filling (B). Tree plantation (C). Treatments separated by buried plastic sheets (D). ‘Picual’ trees affected by V. dahliae. Olive tree daily irrigated (A). Trees biwikly irrigated (B). 99 100 Discusión General 101 102 Discusión General La Verticilosis del olivo (VO), causada por el hongo de suelo Verticillium dahliae Kelb, es actualmente la enfermedad más grave del olivo en la Cuenca Mediterránea y probablemente en la mayoría de las zonas olivareras del mundo (Jiménez-Díaz et al., 2012; López-Escudero y Mercado-Blanco, 2011; Tsror, 2011). En Andalucía, la presencia de VO en los campos de cultivo ha sido atribuida principalmente al uso de plantones infestados, a la aplicación de prácticas agronómicas inadecuadas y a la gran capacidad de dispersión y resistencia que tienen las estructuras infectivas y de supervivencia (microesclerocios) de este patógeno (Jiménez-Díaz et al., 2012; López-Escudero y Mercado-Blanco, 2011; Tsror, 2011). Durante las últimas décadas en Andalucía se ha observado, además, que la expansión de VO en las zonas olivareras ha sido paralela a la reconversión de olivares de secano a regadío en plantaciones en las que antes la enfermedad no era un problema grave (López-Escudero et al., 2010; Rodríguez et al., 2008, 2011). Por otra parte, numerosas observaciones parecen apuntar a que el aumento de las dosis y frecuencia del riego producen incrementos de la incidencia de las plantas afectadas y de la gravedad de las infecciones, provocando además una aparición más temprana de la enfermedad (Blanco-López et al., 1984; López-Escudero y Blanco-López, 2005). Estos hechos están generando al agricultor grandes dudas sobre el adecuado manejo del riego en las plantaciones. En este sentido, el grupo de Patología Agroforestal del Departamento de Agronomía de la Universidad de Córdoba inició hace varios años una línea de investigación para intentar dar una respuesta científica a la influencia del riego sobre la VO. Esta línea ha sido financiada por la Interprofesional del Aceite de Oliva Español (proyecto de investigación UG 400544). La presente tesis constituye una continuación de los trabajos realizados por López-Escudero y Blanco-López (2005) y García-Cabello et al. (2012) sobre la VO en relación al agua de riego. Además, esta tesis ha querido abordar la influencia de las variables epidemiológicas estudiadas en relación al riego sobre la resistencia varietal de esta enfermedad. Desde hace tiempo se ha comprobado que el riego es una práctica agronómica que aumenta considerablemente la producción del olivar. Este hecho ha llevado al agricultor a realizar aportaciones de agua muchas veces excesivas, tanto en dosis como en frecuencias de riego (Orgaz y Fereres, 2008). Por tanto, el aspecto que ha suscitado el interés entre los investigadores ha sido constatar científicamente si dosis y frecuencias elevadas de riego influyen favorablemente en el desarrollo de la enfermedad. La influencia del riego en el inicio y desarrollo de las Verticilosis ha sido estudiada particularmente en cultivos herbáceos (Arbogast, 1999; Bletsos et al., 1999; Cappaert et al., 1992; 1994; Harrington y Dobinson, 2000; Huisman y Grimes, 1989; Jefferson y Gossen, 2002; Pennypacker et al., 1991; Wheeler, 2012; Talboys y Wilson, 1970; Xiao et al., 1998; Xiao y Subbarao, 2000). En cultivos leñosos, este tipo de estudios han sido 103 Discusión General escasos (Hiemstra y Harris, 1998), seguramente debido a la complejidad de su diseño y a la necesidad de largos periodos de evaluación. En la investigación realizada por Pérez-Rodríguez et al. (2015a) (Capítulo 2) en condiciones semicontroladas (microparcelas) se estudió la influencia de cuatro frecuencias de riego (Diaria, Semanal, Quincenal y Deficitaria) en el inicio y desarrollo de la enfermedad sobre tres cultivares de olivo con diferente nivel de resistencia a VO. ‘Picual’ susceptible, ‘Arbequina’, moderadamente susceptible y ‘Frantoio’, resistente (López-Escudero y Mercado-Blanco 2011; Trapero et al. 2013). En este trabajo, la epidemia comenzó en el mismo periodo en todos los tratamientos de riego en los cultivares Picual y Arbequina. El primer incremento notable en el número de plantas afectadas se produjo en otoño del segundo año después de la plantación y finalizó a finales de la siguiente primavera. Durante este periodo se pudo comprobar que la progresión de la enfermedad en las plantas de ‘Picual’ sometidas a un tratamiento de riego diario seguía un modelo logístico de doble sigmoide (pseudo-R2 > 0.98). Sin embargo las combinaciones restantes, ‘Picual’ y ‘Arbequina’ con los diferentes tratamientos de riego, se ajustaron mejor a un modelo logístico simple (pseudo-R2 > 0.98) (Figura 2; Capítulo 2). El progreso de la enfermedad en nuestras condiciones (sur de España) es particularmente importante durante las estaciones de primavera y otoño (LópezEscudero y Blanco López, 2001; López-Escudero et al., 2004; Rodríguez-Jurado, 1993). Seguramente, el tratamiento de riego diario promovió el establecimiento y desarrollo de infecciones y/o síntomas de la VO en el cultivar susceptible Picual durante estos períodos. Esta interacción (‘Picual’- riego diario) provocó que al final del periodo de evaluación se alcanzara una incidencia del 100% y un 63% de plantas muertas (Figura 1 y Tabla 1; Capítulo 2). Debido probablemente al rápido progreso de la enfermedad en ‘Picual’- riego diario, la evolución de la epidemia se ajustó muy bien a un modelo logístico doble sigmoide, el cual ya fue utilizado con éxito por Navas-Cortés et al. (2008). Para las otras combinaciones cultivar-tratamiento creemos que sería necesario más tiempo de observación para su ajuste a un modelo de estas características (Figura 2; Capítulo 2), que en cualquier caso podría no ser posible por las limitaciones de espacio de los contenedores infestados. A partir de las curvas logísticas estudiadas se obtuvo el ratio de máximo desarrollo del progreso de la enfermedad (MDPR) (las pendientes de las rectas tangentes del punto de inflexión de cada curva). Este parámetro, que corroboró la mayor susceptibilidad del ‘Picual’ respecto ‘Arbequina’, ha sido utilizado por otros autores para describir el desarrollo de otras enfermedades de olivo (Moral y Trapero, 2009). Los valores del Área Bajo la Curva Progreso de la Enfermedad (ABCPE) reflejaron un mayor avance de la enfermedad en la interacción ‘Picual’- riego diario. Los otros parámetros estudiados sirvieron para caracterizar de forma detallada el progreso de la enfermedad en los diferentes tratamientos (Tabla 1, 2 y 3; Capítulo 2). 104 Discusión General Por otra parte, los resultados obtenidos de este estudio demuestran que cultivares con diferente nivel de resistencia a la VO muestran distintas reacciones, cuando se hayan sujetos a diferentes frecuencias de riego. Una programación de riego con una frecuencia diaria agravó el desarrollo de las infecciones de la VO en el cultivar susceptible Picual. En ‘Arbequina’, sin embargo, el desarrollo de síntomas no se vio influenciado por las diferentes frecuencias de riego estudiadas. Finalmente, los bajos niveles de enfermedad observados en ‘Frantoio’ sugieren claramente que, en el marco de un control integrado de la enfermedad, el uso de cultivares resistentes podría tener mucha mayor relevancia que el efecto negativo que provoca la aplicación de ciertas frecuencias de riego favorables para la enfermedad cuando se emplean cultivares susceptibles. Estos resultados coinciden con las observaciones de Jefferson y Gossen (2002) y Wheeler et al. (2012) que concluyeron en sus investigaciones en alfalfa y algodón, respectivamente, que la severidad de la Verticilosis era mayor en las variedades susceptibles sometidas a una alta frecuencia de riego que en las variedades resistentes sometidas a esa misma frecuencia. También se cuenta en olivo con los recientes resultados de Ostos et al. (2015) basados en estudios sobre ortofotos realizadas en un período de diez años sobre dos plantaciones vecinas de olivar sobre suelos infestados con V. dahliae en el término de Mengibar (provincia de Jaén). El uso de ‘Frantoio’, incluso introduciendo el riego tras dos años de la plantación, no ocasionó epidemias importantes durante el periodo estudiado en relación a la alta tasa de incidencia y mortalidad que se detectó anualmente durante los diez años de estudio en la plantación vecina, plantada con ‘Picual’ que se mantuvo además en secano. En consecuencia, creemos que los resultados obtenidos en este trabajo (PérezRodríguez et al., 2015a) (Capítulo 2) permiten recomendar frecuencias de riego más espaciadas en el tiempo que la diaria cuando se usan cultivares susceptibles de olivo en suelos infestados por V. dahliae. El estudio del efecto de la dosis de riego en el desarrollo de VO también ha sido otro de los objetivos de esta línea de investigación. En el trabajo realizado por PérezRodríguez et al., (2015b) (Capítulo 3) se evaluaron los datos de 70 fincas de olivar de una zona afectada por VO representativa del Valle del Guadalquivir, en el término de Santaella, en la provincia de Córdoba. Todas las fincas fueron visitadas junto al técnico o el propietario, con el fin de obtener la máxima y fiable información posible de cada parcela. En este trabajo se demostró que la VO se encuentra ampliamente distribuida en los campos prospectados y que el porcentaje de incidencia de la enfermedad (IE) en las fincas de regadío era significativamente más alto que en las fincas de secano (Tabla 1, Capítulo 3). En investigaciones previas este hecho ya había sido observado (LópezEscudero et al., 2010), aunque las conclusiones se obtuvieron de los datos de riego 105 Discusión General estimados por los agricultores. Sin embargo, este trabajo aporta mayor exactitud ya que gracias a la colaboración de la Comunidad de Regantes Genil-Cabra, pudimos conocer el consumo real de cada finca que se dispensó en cada una de las parcelas visitadas, concluyendo que éste tiene una influencia notable sobre la VO (Tabla 2; Capítulo 3). De hecho, las plantaciones con alto consumo (2400-1800 m3/ha) mostraron valores significativamente más altos de IE (21.4%) que aquellas regadas con una dosis reducida (1400-500 m3/ha), en las que se contabilizó una IE media de 13.3%. Por su parte, corroborando nuestras hipótesis de partida, en las plantaciones de secano prospectadas se observó un valor medio de IE del 4%, significativamente menor que el de las plantaciones de riego. Es importante remarcar que el 93% de las fincas prospectadas estaban plantadas con ‘Picual’ o ‘Hojiblanca’, cultivares que en campo han mostrado elevada susceptibilidad a la enfermedad en particular cuando se riegan frecuentemente (López-Escudero y Blanco-López, 2001; Pérez-Rodríguez et al., 2015a; Capítulo 2; Trapero et al., 2013; 2005). Además se pudo observar que el progreso de IE estaba significativamente relacionado, siguiendo una tendencia lineal (P=0.006), con los años que llevaban las explotaciones en regadío (Tabla 3; Capítulo 3). Con los datos obtenidos a través de las encuestas empleadas en las prospecciones de la zona descrita es muy razonable proponer que la reducción del riego podría ser una práctica cultural aconsejable para controlar VO en los olivares afectados por la enfermedad. En esta tesis doctoral también se ha explorado la influencia de la frecuencia de riego y su consecuente efecto en el contenido de humedad del suelo y en el desarrollo de la enfermedad en condiciones de campo. Estas investigaciones se han realizado solo con el cultivar Picual (susceptible y el más importante económicamente), ya que el estudio de la interacción riego-resistencia suponía en campo una elevada complejidad experimental, de espacio y coste. Además, atendiendo a los resultados obtenidos en la investigación previa (Pérez-Rodríguez et al., 2015a) (Capítulo 2) parecía la opción más lógica. Se ha estudiado en esta parte de las investigaciones la influencia de tres tratamientos de riego (Diario, Quincenal y Secano) en el desarrollo de VO en dos campos naturalmente infestados localizados en el sur de España. Los resultados en estas condiciones difirieron respecto a los obtenidos en la primera investigación en condiciones semicontroladas (Pérez-Rodríguez et al., 2015a) (Capítulo 2), ya que en los dos experimentos de campo la evolución de la enfermedad, en su época más favorable, muchas veces fue similar en los dos tratamientos de riego. Sin embargo, en esas mismas épocas, el desarrollo de la enfermedad fue siempre significativamente más pronunciado en los árboles con tratamientos de riego respecto a los de secano (Pérez-Rodríguez et al., 2015c, Tabla 2 del Capítulo 4). Las diferencias existentes entre los ensayos de campo (Capítulo 4) y el ensayo en microparcelas (Capítulo 3) seguramente estuvieron debidas a que el ensayo en condiciones semicontroladas se hallaba protegido de la lluvia. 106 Discusión General Por lo que hemos revisado en bibliografía y observado en campo, la influencia de un aumento de humedad, ocasionada por el riego, en el inicio y desarrollo de la enfermedad podría deberse a que un mayor contenido de agua de forma constante aumentara el crecimiento de las raíces de los árboles. Nosotros coincidimos con varios autores en que esto seguramente incrementó la probabilidad de contacto entre las raíces y las estructuras de supervivencia del patógeno (microesclerocios). (Emechebe, 1980; Fernández et al., 1991; Huisman, 1982; López-Escudero y Blanco-López, 2005; Saadatmand et al., 2006; Xiao y Subbarao, 2000). Los valores de contenido de humedad medidos con el ‘TDR’ cada quince días durante los periodos de observación en los experimentos permitieron estudiar la correlación existente entre el contenido de agua en el suelo y el incremento de los parámetros de enfermedad (incidencia y severidad). De esta forma se ha demostrado que en los dos ensayos de campo existió una correlación significativa entre los incrementos de los parámetros de enfermedad durante la primavera y el otoño y el contenido de agua en el suelo en la misma y/o anterior estación favorable para la enfermedad (Tabla 3, Capítulo 4). Esta correlación en uno de los campos, mejoró cuando se estudió de una manera conjunta el contenido de agua en el suelo de las dos estaciones favorables (misma época y anterior época). Como conclusión, estos resultados demuestran que el contenido de agua en el suelo en las estaciones favorables (primavera y otoño) de las zonas en las que se han establecido los experimentos de campo de este trabajo influye favorablemente al desarrollo de VO. Asimismo, en nuestros ensayos de campo (Pérez-Rodríguez et al., 2015c; Capítulo 4) no apreciamos que los riegos aplicados durante los meses de verano influyeran favorablemente sobre la VO. Sin embargo, se desprende del experimento realizado en microparcelas (Pérez-Rodríguez et al., 2015a; Capítulo 2) que, presumiblemente, debido al contenido limitado de volumen de suelo, los riegos de verano podrían a ver influido en el desarrollo de la enfermedad reduciendo la temperatura del suelo, favoreciendo así a que el hongo causara las primeras infecciones y se redujera el periodo de incubación (Figura 1 y 2 y Tabla 1; Capítulo 2). Este argumento también ha sido considerado por otros autores como Karaka et al. (1971) tras evaluar los resultados de sus ensayos de riego en algodón cultivado en campos infestados por V. dahliae. En los 2 experimentos de campo realizados (Pérez-Rodríguez et al., 2015c; Capitulo 4) también se observó que determinados contenidos de agua en el suelo no provocaban durante épocas consideradas como favorables, que la enfermedad progresara, permaneciendo los incrementos de incidencia y severidad de síntomas cercanos a cero. Este porcentaje de agua medido en el perfil del suelo varió en los Experimentos I y II entre 23.6% y 25.5% y 23.5% 23.6%, respectivamente. 107 Discusión General Este aspecto resulta interesante ya que según varios autores parece existir un valor umbral de contenido de agua en el suelo por debajo del cual el olivar reduce su crecimiento (Studeto et al., 2012; Villalobos et al., 2002). En el caso de los árboles utilizados en nuestro experimento, que eran jóvenes, este valor umbral resultó elevado (25 y 27% en los Experimentos I y II, respectivamente). Esto conlleva a pensar que no regar o espaciar los riegos en plantaciones con riesgo de verticilosis, aunque podría reducir el impacto de la enfermedad, podría ocasionar a su vez que el crecimiento de los árboles se viese afectado (Pérez-Rodríguez et al., 2015c; Capítulo 4). Sin embargo, el uso de esta estrategia de riego en un olivar adulto, gracias a un sistema radicular mejor desarrollado y a una evapotranspiración relativamente baja, podría afectar en menor medida su crecimiento y consecuentemente a su producción. Finalmente cabe mencionar que las periódicas variaciones del contenido de humedad provocadas por las programaciones de riego en los experimentos de campo y microparcelas no causaron ningún aumento o disminución del nivel de inóculo. Estos resultados coinciden con los obtenidos por Xiao et al. (1998) en coliflor. No obstante López-Escudero y Blanco-López (2005) observaron en diferentes olivares que el incremento de humedad provocado por el riego por goteo ocasionaba un aumento en la de la densidad de inóculo del patógeno respecto a las zonas que se hallaban fuera de los efectos del bulbo húmedo y que estas diferencias se incrementaban además con el tiempo. En nuestras investigaciones, el hecho de que el nivel de inóculo no variara significativamente entre los diferentes tratamientos de los experimentos realizados posiblemente se debió a que las observaciones no se prolongaron lo suficiente en el tiempo para detectar este tipo de alteraciones en la población del hongo en el suelo. La presente tesis doctoral supone un avance importante en el estudio de la influencia del riego sobre la enfermedad más grave del olivar en estos momentos. Los resultados obtenidos pueden ayudar al agricultor a establecer una estrategia de riego adecuada en aquellos campos afectados por VO o en aquellas zonas donde en un futuro la enfermedad pueda estar presente. 108 CONCLUSIONS 109 110 Conclusions After growing during two years in infested microplots by Verticillium dahliae, olive cultivars with diverse levels of resistance to Verticillium wilt of olive exhibit differential reactions when subjected to different irrigation frequencies. Daily irrigation schedule strongly encouraged the onset and development of the disease in the susceptible cultivar Picual when compared to the rest of treatments (weekly, biweekly and deficit). ‘Arbequina’ was not influenced by the irrigation frequency, showing final values of incidence close to the 60%, but moderate symptom severity. Finally, in the resistant cultivar Frantoio only very low disease rates were recorded in any of treatments (Chapter 2). In the context of an integrated control of the disease, these results have demonstrated that the extension of irrigation frequency in susceptible cultivars growing in infested soils by the pathogen may reduce disease incidence. Moreover, these suggest that the use of resistant cultivars seems to be more relevant than the detrimental effects observed in frequent irrigation schedules (Chapter 2). Surveys conducted during 2012 and 2013 in a representative olive growing area in the Guadalquivir Valley under disease risk conditions have novelty shown that the water consumption has a strong influence on Verticillum wilt of olive. The 47.1% of olive plantations classified as high irrigated (mean water consumption of 1900 m3/ha), showed the highest value of disease incidence (21.42%). Plantations watered with lesser doses (the 28.6%) (mean water consumption of 725 m3/ha) showed a disease incidence significantly lower, accounting for 13.3%. Finally, dry-land olive orchards (24.3%) showed the lowest Verticillium wilt incidence (4.0%). Therefore, these data shows that the reduction in watering dosage could be an advisable cultural practice for controlling the disease in affected olive orchards (Chapter 3). In 70% of olive visited farms, disease symptoms onset coincided with the conversion of the orchards from dry-land into irrigation, and disease incidence was influenced by the number of years of irrigation, following a linear trend (Chapter 3). As in semi-controlled conditions (infested microplots) (Chapter 2), disease progression in ‘Picual’ trees daily irrigated was clearly exacerbated at field conditions. One of the more plausible reasons is that increments of the root growth in wet soils could favor the contact between susceptible olive roots with infective pathogen structures. In addition, in field conditions, the effect of biweekly irrigation treatment was more difficult to differentiate of daily irrigation and dryland treatment, probably due to rain (Chapter 4). 111 Conclusions 112 Disease development, as recorded at field experiments, was directly influenced by the water content in the soil profile in our favorable seasons (spring and fall). Therefore, we have identified during these favorable periods for wilt progress an average value of volumetric soil water content for which disease incidence and severity remained at zero. In our experiments this average value was 24.3% in Experiment I and 23.5% in Experiment II (Chapter 4). Under the climatic conditions of the Guadalquivir Valley, spacing out irrigation across time in years in which low rainfall is registered in spring and/or fall may be a feasible method for keeping the volumetric soil water content below detrimental values for disease development. This could be achieved using a biweekly irrigation frequency instead daily irrigation, or even leaving the affected orchard on dryland for a certain period of time. (Chapter 4). Bibliografía (Introducción general y Discusión general) 113 114 Bibliografía (Introducción general y Discusión general) Abo Shkeer, F.M. 2010. Evaluación de la resistencia de cultivares del Banco Mundial de Germoplasma de Olivo (IFAPA, Alameda el Obispo, Córdoba) al patotipo defoliante de Verticillium dahliae y del contenido de etileno liberado por hojas de plantas infectadas. Tesis de Master de Producción, Protección y Mejora Vegetal, Universidad de Córdoba, España. Alitane, M. 2015. Influencia de componentes de la fertilización del olivo en la supervivencia y germinación de las estructuras infectivas de Verticillium dahliae. Tesis de Master de Olivicultura y Elaiotecnia, Universidad de Córdoba, España. Al-Ahmad, M.A., and Mosli, M.N. 1993. Verticillium wilt of olive in Syria. Bull OEPP/EPPO. 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Objetivos de la estancia Como actividad complementaria a la Tesis doctoral se realizó una estancia de 3 meses en Lisse, en el centro “Applied plant research, Sector flower bulb, nursery stock and fruits” (Praktijkonderzoek Plant & Omgeving, PPO), el cual pertenece a la Universidad de Wageningen. Los objetivos de esta estancia fueron conocer la distribución de Verticillium dahliae a lo largo de los haces vasculares en dos cultivares de olivo, ‘Picual’ (Susceptible) y ‘Frantoio’ (Resistente) y en dos especies forestales, arce (Acer sp.) (Susceptible) y fresno (Fraxinus sp.) (Resistente). Experimento I: Inoculación de variedades de olivo Material y métodos Material vegetal. En este experimento se utilizaron plantones de olivo de 9 meses de edad procedentes de un vivero comercial de Castro del Río (Córdoba). Los cultivares utilizados fueron ‘Picual’, susceptible a la enfermedad y ‘Frantoio’, resistente (LópezEscudero y Mercado Blanco, 2011). Mediante una compañía de transportes, las plantas fueron enviadas por carretera al centro de investigación en Lisse (Holanda). Inoculación Se inocularon 120 plantas (1.107 conidias/ml) con dos aislados V117 (defoliante) y V4 (no defoliante) transformados mediante Agrobacterium tumefasciens, con el gen GFP, cuya función era emitir luminiscencia con radiación ultravioleta. La inoculación de los plantones fue mediante el método descrito por López-Escudero et al. (2004). Dicha transformación y inoculación fue realizada por el Doctorando Mojtaba Keyha Saber, 2 semanas antes de que se iniciará la estancia. Este experimento se realizó durante dos meses y medio (Agosto-Octubre; 2014) en un invernadero a una temperatura de 22±5 ºC y a una iluminación de 216 μmol·m-2·s1 de luz fluorescente durante 14h/día. La humedad relativa dentro del invernadero osciló entre 50 al 70%. Diseño experimental. En este experimento se utilizó un diseño completamente alzar, con 20 plantones de olivo por cultivar y aislado inoculado, más 20 plantones de cada cultivar como testigo. 141 Anejo 1 Evaluación del progreso de la enfermedad. Semanalmente se tomaron datos de severidad de síntomas mediante una escala de 0 a 4 (0 = planta sana; 4 = planta muerta). Con los datos de severidad de la enfermedad se calculó el área bajo la curva progreso de la enfermedad en términos porcentuales (ABCPE) = [(t/2*(S2+2*S3+...+2Si-1+Si)/4*n]*100, donde t = es el intervalo en días entre observaciones, Si = Valor final de severidad, 4 = valor máximo de enfermedad, y n = número de observaciones. El porcentaje final de plantas muertas o Mortalidad (M) y el tiempo transcurrido entre el trasplante y el inicio de los primeros síntomas también fueron considerados. Visualización del patógeno Cada semana se recogío una planta de cada combinación cultivar-aislado inoculado y una planta testigo de cada cultivar. Una vez en el laboratorio se realizaron cortes histológicos de la parte radical, de la parte media del tallo y de la parte alta de cada planta, para su posterior visualización en el microscopio confocal. Análisis de los datos Para este experimento se utilizó un análisis de Varianza (ANOVA) para analizar los datos. Las medias de los valores analizados fueron comparadas mediante el test protegido de Fisher LSD (P=0.05). En este estudio, los parámetros de enfermedad fueron utilizados como variable dependiente. Los datos fueron analizados por el programa estadístico Statistix 10.0 (Analytical Software, Tallahassee, FL). Resultados Preliminares Síntomas de la enfermedad. Durante el experimento las plantas afectadas mostraron los dos síndromes característicos de la enfermedad, apoplejía y decaimiento lento. (López-Escudero y Mercado-Blanco, 2011). Durante el periodo de evaluación las plantas desarrollaron clorosis, marchitez, enrollamiento de las hojas hacia el envés y defoliación de hojas en verde. Progreso de la enfermedad Los primeros síntomas de la enfermedad se identificaron en la tercera semana de la inoculación tanto en las plantas de ‘Picual’ como en las de ‘Frantoio’. Sin embargo, el valor medio de severidad final en las plantas de ‘Frantoio’, independientemente del patotipo, fue muy bajo (Tabla 1). Durante el periodo de evaluación el porcentaje de plantas muertas en los plantones inoculados fue cero. El ABCPE demostró el progreso de la enfermedad en el cultivar Picual inoculado con el patotipo no defoliante V4 fue 142 Estancia en el extranjero significativamente mayor en comparación con las otras combinaciones cultivar-patotipo (Tabla 1). Visualización del patógeno Durante la estancia fue complicado encontrar estructuras de los dos aislados inoculados (V117, V4). Únicamente en la parte media del tallo de un plantón de ‘Picual’ se visualizó una clara colonización en los haces vasculares del aislado (V117). En las semanas previas al inicio de la estancia hubo una identificación positiva de los 2 aislados en el sistema radical. Tabla 1. Progresión de los parámetros de la enfermedad en plantas de ‘Picual’ y ‘Frantoio’ inoculadas con dos patotipos, V117 (defoliante) y V4 (no defoliante) en condiciones controladas de invernadero a. a Valores en columna seguidos de la misma letra no difirieron significativamente a un nivel de PS (SEMANAS) b ABCPE(%) d Incidenca (%) SM plantas afectadas Cultivar, patotipo Rango Media SM c Picual (V-117) 3-9 5.1 1.3 a 17.6 a 100 1.3 Picual (V-4) 3-7 4.7 1.8 a 27.2 b 100 1.8 Frantoio (V-117) 3-7 5 0.1 b 1.5 c 20 0.4 Frantoio (V-4) 3-7 5 0.06 b 1.0 c 20 0.2 probabilidad de P=0.05 según el test de la mínima diferencia significativa protegida de Fisher (LSD). b PS = Tiempo en semanas desde la inoculación hasta el inicio de los primeros síntomas. c SM = Severidad Media. d ABCPE = Área bajo la curva progresión de la enfermedad calculada utilizando la integración trapezoidal de los valores de severidad expresado como porcentaje respecto al valor máximo teórico. 143 Anejo 1 Experimento II: Distribución de Verticillium dahliae en plantones de Fresno y Arce. Material vegetal. Para este experimento se emplearon plantones de arce y de fresno de 3 años de edad que se plantaron en un campo naturalmente infestado (10 propágulos/gramo) localizado en Randwijk (Holanda). Inoculación A principios de agosto del año 2013, 115 plantones de arce y 101 plantones de fresno fueron inoculados (1.105conidios/ml) con un aislado no defoliante el cual era patogénico para ambas especies (Hiemstra, 1998). Para realizar esta inoculación se realizó una hendidura a una altura aproximada de 30 cm y mediante una inyección en el tronco se introdujo la suspensión conidial. Una vez introducido el inóculo, la herida se tapó con una cinta biodegradable. Esta inoculación fue realizada por el Dr. Jelle Hiemstra y el doctorando Motjaba Keykha Saber. Recogida y procesado de muestras Una semana antes del inicio de la estancia se arrancaron 8 árboles afectados por la enfermedad. 4 plantones de arce y 4 plantones de aresno. Una semana después, ya en el laboratorio, de cada árbol se cortaron 5 secciones de 10 cm. 2 por debajo del punto de inoculación y 3 por encima. De cada sección se extrajeron virutas de madera de la parte nueva y vieja. Las cuales se introdujeron en tubos eppendorff de 2 ml diferentes para la posterior extracción de ADN. La extracción de ADN de las muestras, 80 en total, se realizó con el Kit comercial de Qiagen, llamado DNeasy Plant Mini Kit. Una vez realizada la extracción de ADN, las muestras se conservaron en un congelador a -20ºC. A finales de septiembre se volvieron arrancar 16 árboles afectados por la enfermedad, 8 plantones de arce y 8 de fresno y se volvió a repetir el proceso descrito en el párrafo anterior. Una vez se obtuvo el ADN de todas las secciones, de cada muestra se realizó una qPCR a tiempo real, mediante la técnica SYBRGreen, con los primers específicos para V. dahliae desarrollados por Khanh Pham en el laboratorio de Lisse (Van Doorn et al., 2009), basados en secuencias ITS. Mediante la qPCR se obtuvo la cantidad de ADN de V. dahliae de cada muestra en nanogramos (ng) respecto al ADN total de la planta también en (ng). Además, de cada sección de cada muestra analizada se realizaron aislamientos del patógeno para corroborar los resultados obtenidos mediante las técnicas moleculares. 144 Estancia en el extranjero Resultados preliminares Los resultados de este trabajo actualmente están siendo elaborados para su posterior publicación. Bibliografía Hiemstra, J.A. 1998. Verticillium wilts of major tree hosts: Ash. En: Hiemstra, J.A., and Harris, D.C. (Eds.), A compendium of Verticillium wilts in tree species. Ponsen & Looijen, Wageningen, The Netherlands, pp. 35-36. López-Escudero, F.J., Del Río, C., Caballero, J.M., and Blanco-López, M.A. 2004. Evaluation of olive cultivars for resistance to Verticillium dahliae. Eur. J. Plant Pathol. 110: 79-85. López-Escudero, F.J., and Mercado-Blanco, J. 2011. Verticillium wilt olive: A case study to implement an integrated strategy to control a soil-borne pathogen. Plant Soil 344: 1-50. Van Doorn, J., Pham, K.T.K., and Hiemstra, J.A. 2009. Molecular detection of Verticillium dahliae in soil, in: 10th International Verticillium Symposium. Corfu Island, Greece. 145 Anejo 1 FIGURAS SUPLEMENTARIAS Figuras del anejo 1 Experimento I ubicado en un invernadero de la Universidad de Wageningen. A. Disposición de todas las plantas del ensayo. B. Plantón de Picual inoculado con el aislado V117 modificado genéticamente respecto a su testigo, 6 semanas después de realizar la inoculación. Campo experimental naturalmente infestado por V. dahliae (10 propágulos/gramo) localizado en Randwijk (Holanda). A. Síntomas de la enfermedad en fresno. B. Planta muerta de arce a causa de la enfermedad. 146 Estancia en el extranjero Sección de una rama de arce (Acer platanoides) y sección de una rama de Fresno (Fraxinus excelsior) afectados por la enfermedad. Procesado de las muestras de arce y fresno para la realización de aislamientos y extracción de ADN. 147 Anejo 1 Aislamientos de Verticillium dahliae sobre Arce (Acer platanoides). 148 Producción científica 149 150 Producción científica PRODUCCIÓN CIENTÍFICA DURANTE LA TESIS DOCTORAL Contribución a revistas internacionales de carácter científico (SCI) Chattaoui M., Raya, M.C., Bouri, M., Moral, J., Pérez-Rodriguez, M., TraperoCasas, A., Msallem, M., and Rhouma, A. 2015. Morphological, Physiological and molecular characterization of a Colletotrichum population associated to olive (Olea europaea) anthracnose in Northern Tunisia. J Appl. Microbiol. (Accepted, in Press). Chattaoui M., Raya, M.C., Bouri, M., Pérez-Rodríguez, M., Moral, J., Trapero, A., Msallem, M., and Rhouma, A. 2014. First report olive anthracnose caused by Colletotrichum acutatum in Tunisia. Plant Dis. (Doi: 10.1094/PDIS-05-13-0519PDN). Chattaoui, M., Rhouma, A., Msallem, M., Pérez, M., Moral, J., and Trapero, A. 2012. First Report of Botryospheria obtusa as Casual Agent of Olive Tree Branch Dieback in Tunisia. Plant Dis. 96: 905. García-Cabello, S., Pérez-Rodríguez, M., Blanco-López, M.A., and LópezEscudero, F.J. 2012. Distribution of Verticillium dahliae through watering systems in widely olive growing areas in Andalucia (southern Spain). Eur. J. Plant Pathol. 133: 877-885. Pérez-Rodríguez, M., Alcántara E., Amaro-Ventura M., Serrano N., Lorite I.J., Arquero O., Orgaz F., and López-Escudero F.J. 2015a. Influence of irrigation frequency on the onset and development of Verticillium wilt of olive. Plant Dis. 99: 488-495. Pérez-Rodríguez, M., Lorite I.J., Orgaz F., and López-Escudero F.J. 2015b. Effect of the irrigation dose on Verticillium wilt of olive. Scient. Horticult. 197: 564567. Pérez-Rodríguez, M., Serrano, N., Arquero, O., Orgaz, F., Moral, J. , and LópezEscudero F.J. 2015c. The effect of short irrigation frequencies on the development of Verticillium wilt in the susceptible olive cultivar ‘Picual’ at field conditions. Plant Dis. (Accepted, in press). 151 Anejo 2 Contribución a revistas de carácter divulgativo Moral J., Roca L.F, Romero J., Pérez M., Jurado J., Xaviér C.J., Cabello D., y Trapero A., 2014. Gestión integrada de la antracnosis del olivo. Vida Rural 379: 2-6. Aportaciones científicas en congresos nacionales Pérez-Rodríguez, M., Alcántara, E., Serrano, N., Lorite, I.J., Arquero, O., Orgaz, F., y López-Escudero, F.J. 2012. Efecto de la frecuencia de riego en la Verticilosis del Olivo, en: XVI Congreso Sociedad Española de Fitopatología (SEF), del 17 al 21 de Septiembre del 2012, Malaga, España. Libro de resúmenes, PAN-99:300. (Póster) Pérez-Rodríguez, M., Palma-Jiménez, M.J., Roca, L.F., Moral, J., y Trapero, A., 2012. Evaluación de fungicidas para el control de Neofusicoccum mediterraneum agente causal de la muerte de ramas de olivo, en: XVI Congreso Sociedad Española de Fitopatología (SEF), del 17 al 21 de Septiembre del 2012, Malaga, España. Libro de resúmenes, PAN-65:263. (Póster). Pérez-Rodríguez, M., Serrano, N., Arquero, O., Orgaz, F., Moral, J., y LópezEscudero F. J., 2014. Influencia de la frecuencia de riego en la Verticilosis del olivo en condiciones en condiciones semicontroladas y en campo, en XVII Congreso Sociedad Española de Fitopatología (SEF) del 7-10 de Octubre del 2014, Lleida, España. Libro de resúmenes, SIM6-6 (0-48) 1459. (Comunicación Oral). Aportaciones científicas en congresos internacionales Moral, J., Pérez-Rodríguez, M., Michailides, T.J., and Trapero, A. 2015. First report of the teleomorph of Neofusicoccum mediterraneum, a pathogen of olive, en: APS Annual meeting. Pasadena, California, USA 1-5 August 2015 (Póster). Pérez-Rodríguez, M., Alcántara E., Amaro-Ventura M., Serrano N., Lorite I.J., Arquero O., Orgaz F., López-Escudero F.J. 2013. Influence of irrigation frequency on the onset and development of Verticillium wilt of olive, en: 11 th International Verticillium Symposium-Göttingen, Germany 5-8 May 2013 (Comunicación oral). Pérez-Rodríguez, M., Lorite I.J., Orgaz F., and López-Escudero F.J. 2015. Effect of irrigation dose on Verticillium wilt of Olive, en: 7th Meeting of the IOBC/WPRS integrated protection of olive crops Kalamata 11-14 May 2015 (Póster). 152 Producción científica Pérez-Rodríguez, M., Serrano N., Lorite I.J., Arquero O., Orgaz F., and LópezEscudero F.J. 2015. Influence of irrigation frequency on the onset and development of Verticillium wilt of olive, en: 7th Meeting of the IOBC/WPRS integrated protection of olive crops Kalamata 11-14 May 2015 (Comunicación oral). Otras aportaciones Codirector del proyecto fin de carrera titulado: “Evolución de la población de Verticillium dahliae en el suelo en diferentes condiciones experimentales relacionadas con el riego en olivar.” Mayo 2014. Departamento de Agronomía. Universidad de Córdoba. Codirector del proyecto fin de carrera titulado: “Evolución de Materias activas para la eliminación de las estructuras infectivas de Verticillium dahliae en agua y residuos decantados”. Julio 2015. Departamento de Agronomía. Universidad de Córdoba. Codirector del proyecto fin de carrera titulado: “Influencia de la fertilización en la Verticilosis del olivo en plantaciones afectadas en las comarcas de Sierra Morena y de la Campiña de Jaén”. Septiembre 2015. Departamento de Agronomía. Universidad de Córdoba. Codirector de la Tesis de Fin de Máster de Producción, Protección y Mejora Vegetal titulada: “Influencia de componentes de la fertilización del olivo en la supervivencia y germinación de las estructuras infectivas de Verticillium dahliae”. Octubre 2015. Departamento de Agronomía. Universidad de Córdoba. 153 154 155