DNA-Analytik
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DNA-Analytik
DNA-Analytik Dr. Holger Klapproth DNA-Sequencing Vom Genom zur Sequenz Sequenziermethoden • Enzymatisch: Didesoxymethode nach Sänger Markierte Primer Markierte DNA-Stränge 4 Farbstoffe / eine Reaktion (ABI) 1 Farbstoff, vier Reaktionen (ALF) radioaktiv • Chemisch: Maxam umd Gilbert, radioaktiv • Hochmodern pyrosequencing u.a. (auch enzym.) Terminatornukleotide O CH3 HN O HO P OH O O P OH O O P O O 5´ N O OH 2´ ddTTP Terminatorfarbstoffe O CH3 2 HN O HO P OH O O P OH O O P O O 5´ N O OH 2´ ddTTP Cy5 Endlich: die Sequenz Spezifikationen • bis zu 1000 Basen pro Lauf • heutzutage meist als Cycle-Sequenzing • Benötigt: Primer Nukleotide (dATP, dCTP, dGTP, dTTP) Didesoxynukleotide (ddATP, ddCTP...) • Marker (z.B. Cy5-ddCTP, markierte Primer) • Enzyme: Taq-Polymerase, T7-DNA-Polymerase Sänger Sequencing von Estevezj (Eigenes Werk) [CC-BY-SA-3.0 (http://creativecommons.org/licenses/by-sa/3.0)], via Wikimedia Commons Next Generation Sequencing Bsp.: Pyrosequenzing • • • • • • • • • • sequencing by synthesis Benötigt eine Einzelstrangvorlage Der Komplementärstrang wird enzymatisch aufgebaut Bei jedem Baseneinbau wird ein Molekül Pyrophosphat frei (PPi) PPi wird von einem Enzym in ATP umgewandelt, das als Substrat für die Luziferase dient -> Chemilumineszenz. Adenosine 5´ phosphosulfate wird statt ATP zugegeben Die anderen Basen werden einzeln zugegeben Mit Apyrase werden nach jeden Schritt die verbliebenen dNTPs abgebaut Es wird immer nur ein dNTP zugegeben. „Repeats“ geben stärkere Signale. Schnell – aber nur für 300-500 bp geeignet