Bacillus

III.1 Verderbsorganismen
B
Bacillus
Bacillus
Jürgen Baumgart
Taxonomie
Die Gattung Bacillus gehört zur Klasse Bacilli, Ordnung Bacillales, Familie Bacillaceae. Zur Familie Bacillaceae zählen neben der Gattung Bacillus und Geobacillus weitere 17 Gattungen (LUDWIG et al., 2008). Die Mehrzahl der Spezies der
Gattung Bacillus wird phylogenetisch in Subgruppen unterteilt (LUDWIG et al.,
2008):
a) Bacillus subtilis, amyloliquefaciens, atrophaeus, mojavensis, licheniformis,
sonorensis, vallismortis, einschließlich dem falsch klassifiziertem Paenibacillus popillae
b) Bacillus farraginis, fordii, fortis, lentus, galactosidilyticus
c) Bacillus asahii, bataviensis, benzoevorans, circulans, cohnii, firmus, flexus,
fumarioli, infernus, jeotgali, luciferensis, megaterium, methanolicus, niacini,
novalis, psychrosaccharolyticus, simplex, soli, vireti
d) Bacillus anthracis, cereus, mycoides, thuringiensis, weihenstephanensis
Nach Untersuchungen von VILAS-BÔAS et al. (2007), AUGER et al. (2008)
sowie RAU et al. (2009) ist diese Gruppe um Bacillus pseudomycoides und
„Bacillus cytotoxicus“ zu erweitern
e) Bacillus aquimaris, marisflavi
f) Bacillus badius, coagulans, thermoamylovorans, acidicola, oleronius, sporothermodurans
g) Bacillus alcalophilus, arsenicoselenatis, clausii, gibsonii, halodurans, horikoshii, krulwichiae, okhensis, okuhidensis, pseudoalcaliphilus, pseudofirmus
h) Bacillus arsenicus, barnaricus, gelatini, decolorationis
i) Bacillus carboniphilus, endophyticus, smithii
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j) Bacillus pallidus
k) Bacillus funiculus, panaciterrae
Die Typspezies der Gattung Bacillus ist B. subtilis (EUZÉBY, 2009).
Die Bezeichnung Bazillen wird vielfach als Synonym für „Aerobe Endosporenbildende Bazillen“ verwendet, obgleich neben dem Genus Bacillus zahlreiche
andere Gattungen zur Familie Bacillaceae und Paenibacillaceae gehören.
Allerdings haben von diesen nur wenige für den Bereich Lebensmittel eine Bedeutung (siehe Tab. 1).
Tab. 1
Lebensmittelrelevante Endosporen bildende Bakterien der
Ordnung Bacillales (BRENNER et al., 2005, LUDWIG et al., 2008)
Familie
Bacillaceae
Paenibacillacea
Gattung
Bacillus
Geobacillus
Typspezies
B. subtilis
G. stearother- P. polymyxa
mophilus
Paenibacillus
Alicyclobacil
laceae
Brevi-bacillus Alicyclobacillus
B. brevis
A. acidocaldarius
Eine Unterscheidung der einzelnen aeroben Sporenbildner aufgrund phänotypischer Merkmale ist sehr schwierig und unsicher. Hilfreich können dennoch
einige in der Tab 2 aufgeführten Merkmale sein.
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Tab. 2
Phänotypische Merkmale aerober Sporenbildner, die für
Lebensmittel bedeutend sind
Merkmale
Bacillus
Geobacillus
Paenibacillus
Brevibacillus
Alicyclobacillus
Aerobe Vermehrung
auf NA, pH 7,0 bei
65 ºC
negativ
positiv
negativ
negativ
negativ
Aerobe Vermehrung
auf NA, pH 7,0
30 ºC
55–65 ºC
30 ºC
30–40 ºC1)
negativ
Anaerobe
Vermehrung auf NA,
pH 7,0 bei 30 ºC
variabel
negativ
positiv2)
negativ1)
negativ
Oxidase
variabel
variabel
negativ3)
n.a.
n.a.
negativ
oder ±4)
negativ6)
variabel5)
n.a.
n.a.
Gas aus Glucose
Erklärungen: NA= Standard I-Nähragar; n.a.= nicht angegeben bzw. nur für
einzelne Spezies
1)
= Strikt aerob, Ausnahme: Brevibacterium laterosporus vermehrt sich anaerob (SHIDA et al.,
1996);
2)
= negativ Paenibacillus lactis, P. chibensis (BERGE et al., 2002, SCHELDEMAN et al., 2004).
3)
= positiv bei Paenibacillus glucanolyticus und P. thiaminolyticus (BERGE et al., 2002, SHIDA
et al., 1997);
4)
PRIEST, 1989;
5)
positiv: P. graminis, macerans, polymyxa, azotofixans, peoriae; negativ: P. odorifer, lautus,
glucanolyticus, chibensis, amylolyticus, pabuli (BERGE et al., 2002) und P. lactis (SCHELDEMAN et al., 2004);
6)
positiv bei G. thermoleovorans (NAZINA et al., 2001)
Eigenschaften (FRITZE und KLAUS, 2003, SLEPECKY und HEMPHILL, 2006)
Grampositive bis gramvariable, aerobe, z. T. fakultativ anaerobe, vorwiegend
Katalase-positive Stäbchen (B. popilliae, B. lentimorbus, B. larvae Katalase-
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negativ). Die Zellen liegen einzeln oder bilden Ketten. Zur heterogenen Gruppe
der Bazillen gehören psychrotrophe, mesophile und thermophile Arten, wie auch
acidophile und alkalophile Spezies. Auf Standard I-Nähragar oder anderen Medien ähnlicher Zusammensetzung bilden Bazillen unter aeroben Bedingungen
Endosporen. Die Sporen sind oval, rund oder zylindrisch. Einschlusskörper aus
Poly-β-Hydroxybutyrat, die bei vielen Bazillen nachweisbar sind, können zur
Verwechslung mit Endosporen führen (CLAUS und FRITZE, 1989). Die Sporen
tragende Zelle, das Sporangium, kann unterschiedliche Formen aufweisen, angeschwollen oder zylindrisch, je nach Ausbildung und Lage der Spore (zentral, parazentral, subterminal, terminal oder lateral). Die Spezies der „Cereus-Gruppe“
mit den Arten B. anthracis, B. cereus, B. mycoides, B. thuringiensis und B. weihenstephanensis sind sich phaeno- und genotypisch sehr ähnlich. So bilden sie
eine Lecithinase (Eigelbreaktion = Phospholipase C), die jedoch nicht bei allen
Stämmen nachweisbar und teilweise auch nur schwach ausgebildet ist.
Wachstumsparamter
(FRITZE und CLAUS, 2003, SLEPECKY und HEMPHILL, 2006)
• Vermehrungstemperatur und pH-Wert:
55 ºC und pH 4,5 (B. coagulans)
55 ºC und pH 7,0–7,2 (B. coagulans, B. licheniformis, B. smithii, B. thermoamylovorans)
30 ºC und pH 4,5 (B. coagulans)
30 ºC und pH 7,0–7,2 (B. cereus, B. circulans, B. coagulans, B. cohnii, B.
licheniformis, B. subtilis, B. megaterium, B. smithii)
5 ºC und pH 7,0–7,2 (B. psychrosaccharolyticus, B. weihenstephanensis)
Vielfach werden die aeroben Sporenbildner nach ihrer Vermehrungstemperatur eingeteilt (siehe Tab. 3) .
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Tab. 3
Einteilung lebensmittelrelevanter aerober Sporenbildner
nach der Vermehrunstemperatur
Gruppe
Gattung/Art
Vermehrungsbereich
Quelle
Obligat
thermophil
(Vermehrung bei
55 ºC, jedoch nicht
bei 37 ºC)
Alicyclobacillus
spp.
Optimum 42–60 ºC,
bei pH 2,0–6,0
MCCLURE, 2006
Geobacillus
thermophilus
Optimum 55–65 ºC
bei pH 6,0–8,5
NAZINA et al.,
2001
Bacillus
thermoaerophilus
40–60 ºC bei pH
7,0–8,0
MEIER-STAUFFER
et al., 1996
Bacillus coagulans,
smithii, subtilis u.a.
30 ºC und 50 ºC, z.T.
65 ºC (B. coagulans)
bzw. 70 ºC
(B. smithii)
NAKAMURA et al.,
1988, DE
BARTOLOMEO et
al., 1991
„Bacillus
cytotoxicus“
48–53 ºC, keine
Vermehrung < 17 ºC
AUGER et al.,
2008; RAU et. al.,
2009
Paenibacillus
macerans, polymyxa
30 ºC und 55–60 ºC
NAKAMURA et al.,
1988
Bacillus cereus,
B. sporothermodurans, pumilus,
megaterium,
licheniformis u.a.
Optimum 30 ºC, keine
Vermehrung < 10 ºC
VILAS-BÔAS et al.,
2007, MONTANARI
et al., 2004
Paenibacillus lactis,
circulans
30–48 ºC
SCHELDEMAN et
al., 2004
Brevibacillus brevis
Br. laterosporus
20–45 ºC
15–50 ºC
SHIDA et al.,1996;
ALLAN et al., 2005
Bacillus
weihenstephanensis,
B. circulans,
mycoides, lentus,
sphaericus
4–7 ºC, aber nicht bei
43 ºC
MCCLURE, 2006;
LECHNER et al.,
1998; AUGER et
al., 2008;
Fakultativ
thermophil
(Vermehrung bei
55 ºC und 37 ºC)
Mesophil
(Vermehrung
> 10 ºC und 45 ºC)
Psychrothroph
(Vermehrung bei
< 7 ºC)
• Minimaler aw-Wert: Meist 0,93–0,95, B. subtilis 0,90 (WAREING und
FERNANDES, 2007)
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Tenazität
• Hitzeresistenz
– B. sporothermodurans D140ºC = 4,7 sec, z-Wert 13,1−14 ºC (SCHELDEMAN et al., 2006
– B. coagulans D121 ºC = 0,24−1,68 min, z-Wert 9,2−11,4 ºC (MCCLURE,
2006)
– B. licheniformis D100 ºC = 4−13 min, z-Wert 6 ºC (SCHELDEMAN et al.,
2006)
– B. megaterium D100 ºC = 1 min (SETLOW und JOHNSON, 2007)
– B. subtilis D121 ºC = 0,1 min, z-Wert 7 ºC (MCCLURE, 2006)
– B. cereus D100 ºC = 2,0−5,4 min, z-Wert 9,4−10 ºC (MCCLURE, 2006)
– B. cereus D95 ºC = 2 min., z-Wert 8,5 ºC in Luncheon Meat (BYRNE et al.,
2006)
– B. oleronius D121 ºC = 2 min (SCHELDEMAN et al., 2006)
Die Hitzeresistenz der Sporen von B. sporothermodurans ist besonders hoch.
B. sporothermodurans wird aus diesem Grund auch als „highly heat-resistant
spore former“ (HHRS oder HRS) bezeichnet. Isoliert wurde diese Spezies aus
H-Milch-Produkten, in denen es jedoch nicht zum Verderb kommt (PETTERSSON et al., 1996; SCHELDEMAN et al., 2006).
• Resistenz gegenüber Gamma-Strahlen
– Bacillus cereus (Sporen) D10 (kGy) = 1,6 in frischen Lebensmitteln
(FARKAS, 2007)
Vorkommen und Verbreitung
Erdboden, Schmutz, Wasser, Tier, Mensch, zahlreiche verunreinigte Lebensmittel pflanzlicher und tierischer Herkunft, wie Kakao, Zucker (B. thermoae-
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rophilus), Gewürze, Rohmilch, pasteurisierte Milch (bes. B. cereus-Gruppe),
Reis, Getreideerzeugnisse, Fleisch, Fleischprodukte, tiefgefrorene Lebensmittel pflanzlicher und tierischer Herkunft, erhitzte Lebensmittel (PRIEST, 1989,
FRITZE und CLAUS, 2003, MATARANTE et al., 2004, BARTOSZEWICZ et al.,
2008).
Bedeutung
(FRITZE und CLAUS, 2003, JAY et al., 2005, MCCLURE, 2006, DANYLUK et al.,
2007, CORRY, 2007, BARTOSZEWICZ et al., 2008, FERNANDES, 2009)
• Verderb
– Sterilisierte Produkte: „Flat sour Verderb“ von Kondensmilch sowie
Koagulation durch B. coagulans und B. smithii.
– Pasteurisiertes Sauergemüse oder Früchte (Tomaten, Birnen, Feigen
usw.): „Flat sour Verderb“, Geruchsabweichungen durch B. coagulans.
– Pasteurisierte Milch, Sahne und Käse: Durch psychrotrophe und mesophile Spezies (z. B. B. subtilis, B. lentus, B. circulans, B. firmus, B.
cereus) kommt es zu Geruchs- und Geschmacksabweichungen (bitter,
ranzig, fruchtig, sauer) oder zur „süßen Gerinnung“ von Sahne und pasteurisierter Milch durch B. cereus. Besonders die psychrotrophen Arten,
wie B. circulans und B. weihenstephanensis können zum Verderb pasteurisierter Trinkmilch führen (MAYR et al., 1999).
– Erhitzte Fleischprodukte, z. B. Leber-, Blutwurstkonserven: Erweichungen durch verschiedene Bazillen, die meist aus Gewürzen stammen.
– Fleisch- und Blutwurstkonserven: „Flat sour Verderb“ durch B. licheniformis.
– Pasteurisierte Fruchterzeugnisse: Gasbildung durch B. licheniformis,
Erweichungen (Bildung von Pectatlyasen) durch B. subtilis (bes. Wurzelgemüse, Kürbis, Kartoffeln, Zwiebeln).
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– Nichtgesäuertes Brot (z. B. Weizen-und Weizenmischbrote): Fruchtiges
Aroma, Veränderung der Krume bis zum Fadenziehen durch B. subtilis,
B. licheniformis (PEPE et al., 2003).
• Erkrankungen durch Bazillen
Einige Spezies des Genus Bacilllus sind pathogen bzw. bilden Toxine, wie B.
anthracis, B. cereus, B. weihenstephanensis sowie „B. cytotoxicus“, eine thermotolerante Variante von B. cereus, die sich auch bei 53 ºC vermehrt. Toxinbildung wurde auch nachgewiesen bei Stämmen von B. pumilus, B. mojavensis, B. subtilis und bei B. licheniformis (FROM et al., 2005). Sporadisch traten
Erkrankungsfälle u.a. durch B. thuringiensis und B. lentus auf (LECHNER et al.,
1998, JAY et al., 2005, GRANUM, 2007, SETLOW und JOHNSON, 2007).
Nachweis
• Sporennachweis (CLAUS und FRITZE, 1989, FRITZE und CLAUS, 2003)
Zum Nachweis der Sporen ist eine Kultivierung auf einem Medium, z. B. Standard I-Nähragar, dem 20–50 mg/l MnSO4 zugesetzt wurden, erforderlich.
Der mikroskopische Nachweis der Endosporen sollte nicht im fixierten und gefärbten Präparat erfolgen. Bewährt hat sich folgende Methode: Auf einem Objektträger wird eine dünne Schicht (0,3–0,4 mm) Wasseragar (2 %ig) gegossen. Auf diesen wird ein Tropfen einer in phys. NaCl-Lösung suspendierten
Kultur gegeben und mit einem Objektträger bedeckt. Mikroskopiert wird unter
dem Phasenkontrast-Mikroskop und mit dem Öl-Immersions-Objektiv.
• Kultureller Nachweis von Bacillus spp.
Routinemethoden zum Nachweis mesophiler Spezies
Anreicherung
– Medium: Standard I-Nährbouillon oder Caseinpepton-SojamehlpeptonBouillon (CASO-Bouillon) oder ähnlich zusammengesetzte Medien.
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Nach der Beimpfung mit dem Lebensmittel wird eine Bouillon bei
80 °C 10 min im Wasserbad erhitzt und danach schnell abgekühlt, eine
zweite Bouillon bleibt unerhitzt.
– Bebrütung und Kultivierung: 30 °C 48−72 h und danach Subkultur auf
Standard I-Nährgar oder CASO-Agar (30 °C, 72 h). Auf Nähragar mit
0,8 % Pepton (am besten Soja-Pepton) und 0,3 % Fleischextrakt vermehren sich die meisten Bazillen optimal (FRITZE und CLAUS, 2003).
Keimzahlbestimmung
– Verfahren
Zunächst erfolgt die Untersuchung der unerhitzten Verdünnungen mit
dem Spatelverfahren oder der Spiralplattenmethode. Danach werden
dieselben Verdünnungen bei 80 °C 10 min im Wasserbad erhitzt, abgekühlt und wie die unerhitzten Verdünnungen untersucht.
– Medium: Standard I-Nähragar, Caseinpepton-Sojamehlpepton-Agar oder
ähnlich zusammengesetzte Medien + 20–50 mg MnSO4/l (zur Förderung
der Sporenbildung)
– Bebrütung: 30 °C für 48−72 h
• Routinemethode zum Nachweis psychrotropher Spezies
– Methode und Bebrütung
Spatel-, Spiralplatten-Methode oder Gusskultur. Medium: Standard INähragar oder CASO-Agar. Bebrütung 7 °C, 10 Tage
• Routinemethode zum Nachweis von Bacillus sporothermodurans
– Medium und Bebrütung
BHI-Agar, angereichert mit Vitamin B12, Bebrütung bei 37 °C
(SCHELDEMAN et al., 2006)
– Molekularbiologischer Nachweis
PCR-Methode (SCHELDEMAN et al., 2002)
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Bestätigung von Bacillus spp.
– Morphologische und biochemische Merkmale
Grampositive Stäbchen, Endosporen, Katalase-positiv. Die gleichen
Eigenschaften weisen jedoch auch die in Lebensmitteln zum Verderb
führenden Spezies der Gattungen Alicyclobacillus (Familie Alicyclobacillaceae) sowie Paenibacillus und Brevibacillus (Familie Paenibacillaceae) auf. Alicyclobacillus spp. wachsen allerdings nicht auf Nähragar
bei pH 7,0 und Spezies des Genus Geobacillus vermehren sich nicht bei
30 ºC, jedoch im Gegensatz zu den anderen Gattungen bei 65 ºC
(NAZINA et al., 2001).
Nur einige Spezies des Genus Bacillus können mit den Systemen API 50
CHB (Fa. bioMerieux.) identifiziert werden (BARBOSA et al., 2005). Eingesetzt werden kann auch das System GEN III Microplate, Fa. Biolog.
– Genotypische Merkmale
Eine Unterscheidung zwischen den Gattungen Bacillus, Brevibacillus
und Paenibacillus ist molekularbiologisch möglich, z. B. durch PCR
und Genamplifizierung der 16S rRNA mit spezifischen Primern (SHIDA
et al., 1996,1997, BARBOSA et al., 2005). Eine Identifizierung der Spezies erfolgt u.a. mit der RAPD-PCR (MATARANTE et al., 2004).
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