Applied Biosystems StepOne™ Real

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Einführungshandbuch
Applied Biosystems StepOne™
Real-Time PCR System
Relative Standardkurven- und vergleichende
CT-Analysen
Einführungshandbuch
Erste Schritte
Applied Biosystems StepOne™
Real-Time PCR System
Relative Standardkurven- und
Vergleichende CT-Analysen
Experimentelles
Design der
relativen
StandardkurvenAnalyse
Ansetzen der
relativen
StandardkurvenReaktionen
Durchführung der
relativen
Auswertung der
relativen
Experimentelles
Design der
vergleichenden CTAnalyse
Ansetzen der
vergleichenden CTReaktionen
Durchführung der
vergleichenden CTAnalyse
Auswertung der
vergleichenden
CT-Analyse
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Bestell-Nr. 4377743 Version B
06/2010
Inhalt
Vorwort . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . vii
Verwendung dieses Handbuchs . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . vii
Zugriff auf Informationen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . viii
Technischer Support . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . x
In diesem Dokument verwendete Sicherheitskonventionen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . xi
Symbole an den Geräten . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . xiii
Sicherheitshinweise auf Geräten . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . xv
Allgemeine Gerätesicherheit . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . xvi
Chemische Sicherheit . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . xvii
Sicherer Umgang mit Chemikalienabfällen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . xix
Elektrische Sicherheit . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . xx
LED-Sicherheit . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . xxi
Sicherer Umgang mit biologischen Gefahren . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . xxi
Sicherheit am Arbeitsplatz . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . xxii
Normen zu Sicherheit und elektromagnetischer Verträglichkeit (EMV) . . . . . . . . . . xxiii
Kapitel 1
Erste Schritte . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1
Informationen zum StepOne™-System . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2
Informationen zu relativen Standardkurven- und vergleichenden CT-Analysen . . . . . . . 4
Verwendung dieses Handbuchs . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 9
Informationen zur Beispielanalyse . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 10
Arbeitsablauf der Beispielanalyse . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 12
Kapitel 2
Experimentelles Design der relativen
Standardkurven-Analyse . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 15
Kapitelübersicht . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 16
Anlegen einer neuen Analyse . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 17
Definieren der Analyseeigenschaften . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 19
Definieren der Methoden und Materialien . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 21
Einrichten der Zielsequenzen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 24
Einrichten der Standards . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 27
Einrichten der Proben . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 29
Einrichten der relativen Quantifizierungseinstellungen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 31
Definieren des Laufprofils . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 32
Überprüfen des Pipettierprotokolls . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 34
Bestellen von Materialien für die Analyse . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 43
Beenden des Analysedesign-Assistenten . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 46
Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System Einführungshandbuch zu relativen Standardkurven- und
vergleichenden CT-Analysen
iii
Kapitel 3
Ansetzen der relativen StandardkurvenReaktionen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 49
Kapitelübersicht . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 50
Vorbereiten des Templates . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 51
Ansetzen der Probenverdünnungen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 53
Ansetzen der Standardverdünnungsreihe . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 55
Ansetzen des Reaktionsmixes . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 59
Vorbereiten der Reaktionsplatte . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 61
Kapitel 4
Durchführung der relativen StandardkurvenAnalyse . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 67
Vorbereiten des Laufs . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 69
Aktivieren der Benachrichtigungen (optional) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 71
Starten des Laufs . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 73
Überwachen des Laufs . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 76
Entnehmen der Reaktionsplatte und Übertragen der Daten . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 86
Kapitel 5
Auswertung der relativen StandardkurvenAnalyse . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 91
Abschnitt 5.1: Prüfen der Ergebnisse . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 93
Analyseauswertung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 94
Ansicht der Standardkurve . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 99
Ansicht der Amplifikationsdarstellung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 102
Ansicht der Genexpressionsdarstellung und Well -Tabelle . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 107
Veröffentlichen der Daten . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 110
Abschnitt 5.2: Fehlerbehebung (falls erforderlich) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 111
Ansicht der Auswertungseinstellungen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 112
Ansicht der QC-Zusammenfassung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 114
Herausnahme von Wells aus der Auswertung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 116
Ansicht der Multikomponentendarstellung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 118
Ansicht der Rohdatendarstellung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 120
Kapitel 6
Experimentelles Design der vergleichenden
CT-Analyse . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 123
Kapitelübersicht . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 124
Anlegen einer neuen Analyse . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 125
Definieren der Analyseeigenschaften . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 127
iv
Definieren der Methoden und Materialien . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 129
Einrichten der Zielsequenzen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 133
Einrichten der Proben . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 135
Einrichten der relativen Quantifizierungseinstellungen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 138
Definieren des Laufprofils . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 139
Überprüfen des Pipettierprotokolls . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 141
Bestellen von Materialien für die Analyse . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 147
Beenden des Analysedesign-Assistenten . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 150
Kapitel 7
Ansetzen der vergleichenden CT-Reaktionen . . . . . 153
Vorbereiten des Templates . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 155
Ansetzen der Probenverdünnungen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 156
Ansetzen des Reaktionsmixes . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 158
Vorbereiten der Reaktionsplatte . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 161
Kapitel 8
Durchführung der vergleichenden CT-Analyse. . . . . 165
Vorbereiten des Laufs . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 167
Analysedurchführung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 169
Kapitel 9
Auswertung der vergleichenden CT-Analyse . . . . . . 171
Section 9.1: Prüfen der Ergebnisse . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 173
Analyseauswertung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 174
Ansicht der Genexpressionsdarstellung und Well-Tabelle . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 179
Ansicht der Amplifikationsdarstellung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 181
Veröffentlichen der Daten . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 186
Section 9.2: Fehlerbehebung (falls erforderlich) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 187
Ansicht der Auswertungseinstellungen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 188
Ansicht der QC-Zusammenfassung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 190
Herausnahme von Wells aus der Auswertung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 192
Ansicht der Multikomponentendarstellung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 194
Ansicht der Rohdatendarstellung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 197
Anhang A
Alternative Analyseabläufe . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 199
Setup für Fortgeschrittene . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 200
QuickStart-Arbeitsablauf . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 201
Template-Arbeitsablauf . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 202
Arbeitsablauf für den Export/Import . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 203
v
Bibliografie . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 205
Glossar . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 207
Stichwortverzeichnis . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 221
vi
Vorwort
Verwendung dieses Handbuchs
Zweck dieses
Handbuchs
In diesem Handbuch wird die Durchführung von relativen Standardkurven- und
vergleichenden CT (∆∆CT)-Analysen auf dem Applied Biosystems StepOne™ Real-Time
PCR System (StepOne™-System) beschrieben. Dieses Handbuch erfüllt die folgenden
Funktionen:
• Es ist ein Tutorial für eine Beispielanalyse anhand von Daten, die mit der Applied
Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System Software (StepOne™-Software)
geliefert wurden.
• Es dient außerdem als Anleitung für Ihre eigenen Analysen.
Zielgruppe
Voraussetzungen
Dieses Handbuch ist für Labormitarbeiter und Laborleiter bestimmt, die mit dem
StepOne-System relative Standardkurven- und/oder vergleichende CT-Analysen
durchführen.
Dieses Handbuch basiert auf folgenden Voraussetzungen:
• Sie müssen sich mit dem Microsoft Windows® XP-Betriebssystem auskennen.
• Sie müssen mit Internet und Internetbrowsern umgehen können.
• Sie müssen sich mit DNA- bzw. RNA-Proben und ihrer Vorbereitung für den PCRProzess auskennen.
• Sie müssen sich mit Datenspeicherung, Datenübertragung, Kopieren und Einfügen
auskennen.
• Wenn Sie vorhaben, das StepOne-System in den vorhandenen Datenfluss des
Labors zu integrieren, müssen Sie über Netzwerkerfahrung verfügen.
Textkonventionen
Dieses Handbuch verwendet die folgenden Konventionen:
• Fett gedruckter Text weist auf Benutzeraktionen hin. Zum Beispiel:
Geben Sie 0 ein, und drücken Sie dann bei allen übrigen Feldern auf Enter.
• Kursiv gedruckter Text weist auf neue und wichtige Wörter hin und wird außerdem
zur Hervorhebung verwendet. Zum Beispiel:
Erstellen Sie vor einer Analyse immer eine neue Matrix.
• Ein rechtes Pfeilsymbol () trennt aufeinander folgende Befehle aus einem
Dropdown- oder Shortcut-Menü voneinander ab. Zum Beispiel:
Wählen Sie DateiÖffnen.
vii
Vorwort
Zugriff auf Informationen
Beachtungshinweise
In den Applied Biosystems-Dokumenten werden zwei Beachtungshinweise verwendet.
Jeder Begriff schreibt einen bestimmten Beachtungs- oder Handlungsgrad vor, wie
nachstehend erläutert:
Hinweis: - Weist auf interessante oder hilfreiche Informationen hin, die für die
Verwendung des Produkts jedoch nicht entscheidend sind.
WICHTIG! - Weist auf Informationen hin, die für die sachgemäße Verwendung des
Geräts, des Reagenzienkits oder die sichere Verwendung einer Chemikalie nötig sind.
Im Folgenden sind Beispiele für Beachtungshinweise aufgeführt:
Hinweis: Sie können auch über die Steuerkonsole auf die Kalibrierungsfunktion
zugreifen.
WICHTIG! Für die Verifizierung Ihrer Client-Verbindung benötigen Sie einen gültigen
Nutzernamen.
Sicherheitswarnbegriffe
In den Anwenderunterlagen werden auch Sicherheitswarnbegriffe verwendet. Weitere
Informationen finden Sie unter „Sicherheitswarnbegriffe“ auf Seite xi.
Dazugehörige
Dokumentation
Im Lieferumfang des StepOne-Systems ist die folgende Dokumentation enthalten:
Englische
BN
Deutsche
BN
Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System Getting
Started Guide for Genotyping Experiments
4376786
4377728
Started Guide for Presence/Absence Experiments
4376787
Started Guide for Relative Standard Curve and Comparative CT
Experiments
4376785
4377743
Started Guide for Standard Curve Experiments
4376784
4377737
Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System Installation,
Networking, and Maintenance Guide
4376782
4377799
Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System Installation
Quick Reference Card
4376783
4377793
Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System Site
Preparation Guide
4376768
4378360
—
—
Dokument
Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System Software
Help
viii
—
Vorwort
Die folgende Begleitdokumentation ist von Applied Biosystems erhältlich:
Dokument
BN
Amplification Efficiency of TaqMan® Gene Expression Assays Application Note
127AP05
Applied Biosystems High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kits Protocol
4375575
Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System Installation Performance
Verification Protocol
4376791
Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System Installation QualificationOperation Qualification Protocol
4376790
Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System Planned Maintenance
Protocol
4376788
Custom TaqMan® Gene Expression Assays Protocol
4334429
Primer Express® Software Version 3.0 Getting Started Guide
4362460
TaqMan® Gene Expression Assays Protocol
4333458
User Bulletin #2: Relative Quantitation of Gene Expression
4303859
Hinweis: Weitere Informationen finden Sie unter „Technischer Support“ auf Seite x.
Auf Informationen
der Software-Hilfe
zugreifen
In der Hilfefunktion der StepOne-Software finden Sie eine Beschreibung aller
Funktionen der Benutzeroberfläche. Sie haben folgende Möglichkeiten, um auf die
Hilfefunktion der StepOne-Software zuzugreifen:
• Drücken Sie auf F1.
• Klicken Sie auf
in der Symbolleiste.
• Wählen Sie HelpStepOne Help (HilfeStepOne-Hilfe).
So können Sie in der Hilfefunktion nach Themen suchen:
• Sehen Sie im Inhaltsverzeichnis nach.
• Suchen Sie nach einem bestimmten Thema.
• Suchen Sie im alphabetischen Index.
KundenFeedback
Applied Biosystems ist für Kommentare und Vorschläge zur Verbesserung der
Anwenderunterlagen dankbar. Sie können Ihre Kommentare an die folgende
E-Mail-Adresse schicken:
[email protected]
WICHTIG! Bitte schicken Sie an die oben angegebene E-Mail-Adresse nur Kommentare
und Vorschläge zu unseren Dokumentationen. Wenn Sie Unterlagen bestellen oder PDFDateien herunterladen möchten, oder wenn Sie eine technische Frage haben, gehen Sie
auf www.appliedbiosystems.com, und klicken Sie dort auf den Support-Link (siehe
„Technischer Support“ unten).
ix
Vorwort
Technischer Support
Technischer Support
Die aktuellen Service- und Support-Informationen für alle Standorte erhalten Sie durch
Klicken auf den Support-Link unter www.appliedbiosystems.com.
Auf der Support-Seite haben Sie die folgenden Möglichkeiten:
• In den häufig gestellten Fragen (FAQs) suchen
• Eine Frage direkt an den technischen Support richten
• Applied Biosystems-Anwenderunterlagen, Sicherheitsdatenblätter,
Analysezertifikate oder sonstige Dokumente bestellen
• PDF-Dokumente herunterladen
• Informationen über Kundenschulungen abrufen
• Softwareaktualisierungen und -Patches herunterladen
Darüber hinaus finden Sie auf der Support-Seite die weltweiten Telefon- und
Faxnummern der Kundenservice- und Verkaufsstellen von Applied Biosystems.
WICHTIG! Wenn Sie von diesem Handbuch dazu angewiesen werden, oder wenn
Sie einen Wartungstermin für Ihr StepOne™-Gerät vereinbaren möchten
(z. B. anberaumte Jahreswartung oder Temperaturprüfung/-kalibrierung),
kontaktieren Sie das Kundenservicezentrum von Applied Biosystems. Unter
http://www.appliedbiosystems.com/support/contact finden Sie die entsprechenden
Telefonnummern oder können eine E-Mail an das Kundenservicezentrum schicken.
x
Vorwort
In diesem Dokument verwendete Sicherheitskonventionen
Sicherheitswarnbegriffe
In den Applied Biosystems-Anwenderunterlagen wird durch Verwendung von vier
Sicherheitswarnbegriffen auf mögliche Gefahren hingewiesen. Jeder
Warnbegriff—WICHTIG, VORSICHT, WARNUNG, GEFAHR—beschreibt einen
bestimmten Beachtungs- oder Handlungsgrad, wie nachstehend erläutert.
Definitionen
WICHTIG! - Weist auf Informationen hin, die für die sachgemäße Verwendung des
Geräts, des Reagenzienkits oder die sichere Verwendung einer Chemikalie nötig sind.
– Weist auf eine potenzielle Gefahrensituation hin, deren
Missachtung zu kleineren oder moderaten Verletzungen führen könnte. Dieser Begriff
kann auch dazu verwendet werden, um auf sicherheitsgefährdende Handlungen
hinzuweisen.
– Weist auf eine potenzielle Gefahrensituation hin, deren
Missachtung zu Lebensgefahr oder schweren Verletzungen führen könnte.
– Weist auf eine unmittelbare Gefährdung hin, die bei Missachtung
lebensgefährlich ist oder zu schweren Verletzungen führt. Dieses Signalwort wird nur für
absolute Extremsituationen verwendet.
Mit Ausnahme der WICHTIG-Hinweise werden die Sicherheitswarnbegriffe in den
Applied Biosystems-Dokumenten zusammen mit einem Dreieck angezeigt, das ein
Gefahrensymbol enthält. Diese Gefahrensymbole sind mit den Gefahrensymbolen
identisch, die an den Applied Biosystems-Geräten angebracht sind (siehe „Sicherheitssymbole“ auf Seite xiii).
xi
Vorwort
Beispiele
WICHTIG! Sie müssen für jede 96-Well-Platte eine eigene Tabellenkalkulation zum
Eintragen der Proben erstellen.
CHEMISCHE GEFAHREN TaqMan® Universal PCR Master
Mix kann Augen- und Hautreizungen hervorrufen. Durch Schlucken oder Einatmen
können Beschwerden verursacht werden. Lesen Sie das Sicherheitsdatenblatt, und
befolgen Sie die Handhabungsanweisungen. Tragen Sie eine geeignete Schutzbrille
sowie Schutzkleidung und -handschuhe.
VERLETZUNGSGEFAHR Beim Betrieb des Geräts können
Heizdeckel und Heizblock Temperaturen von über 100 °C erreichen.
ELEKTRISCHE SPANNUNG Für einen sicheren Gerätebetrieb ist
die Aufrechterhaltung der Erdung unerlässlich. Betreiben Sie das System nie ohne
angeschlossenen Erdleiter.
xii
Vorwort
Symbole an den Geräten
Elektrische
Symbole an den
Geräten
In der unten stehenden Tabelle sind die auf den Applied Biosystems-Geräten
angebrachten elektrischen Symbole beschrieben.
Symbol
Beschreibung
Symbol
Weist auf die Ein-Position des
Hauptnetzschalters hin.
Dieses Symbol zeigt einen
möglichen Anschluss an die
Betriebserde eines anderen
Geräts an. Dies ist keine
geschützte Erdklemme.
Weist auf die Aus-Position des
Hauptnetzschalters hin.
Dieses Symbol zeigt eine
geschützte Erdklemme an, die
geerdet werden muss, bevor
andere elektrische Anschlüsse
zum Gerät hergestellt werden.
Weist auf einen Standby-Schalter
hin, mit dem das Gerät auf
Standby-Betrieb umgeschaltet
werden kann. Wenn der Schalter
auf Standby gestellt ist, können
gefährliche elektrische
Spannungen auftreten.
Ein mit diesem Symbol
gekennzeichneter Anschluss
kann Wechselstrom oder spannung erhalten oder abgeben.
Weist auf die Ein/Aus-Position
eines Hauptnetzdruckschalters
hin.
Sicherheitssymbole
Beschreibung
Ein mit diesem Symbol
gekennzeichneter Anschluss
kann Wechselstrom oder spannung und Gleichstrom oder spannung erhalten oder abgeben.
In der unten stehenden Tabelle sind die auf den Applied Biosystems-Geräten
angebrachten Sicherheitssymbole beschrieben. Die Symbole werden entweder allein
angezeigt oder mit einem Text, der die jeweilige Gefahr beschreibt (siehe
„Sicherheitshinweise auf Geräten“ auf Seite xv). Diese Sicherheitssymbole können auch
in Kombination mit den Hinweisen GEFAHR, WARNUNG und VORSICHT erscheinen,
die in diesem und anderen Begleitdokument(en) der Produkte verwendet werden.
Symbol
Beschreibung
Dieses Symbol fordert zwecks
näherer Informationen zum
Konsultieren des Handbuchs auf
und warnt den Anwender,
vorsichtig vorzugehen.
Weist auf heiße Oberflächen oder
andere Gefahren im
Zusammenhang mit hohen
Temperaturen hin und warnt den
Anwender, vorsichtig vorzugehen.
Symbol
Beschreibung
Weist auf das Vorhandensein
beweglicher Teile hin und warnt
den Anwender, vorsichtig
vorzugehen.
Weist auf Stromschlaggefahr hin
und warnt den Anwender,
vorsichtig vorzugehen.
Dieses Symbol weist auf einen
Laser im Geräteinnern hin und
warnt den Anwender, vorsichtig
vorzugehen.
xiii
Vorwort
Umweltsymbole
an den Geräten
Das folgende Symbol gilt für alle elektrischen und elektronischen Produkte von
Applied Biosystems, die nach dem 13. August 2005 auf den Markt gebracht wurden.
Symbol
Beschreibung
Dieses Produkt darf nicht im unsortierten Hausmüll entsorgt werden.Halten Sie
die lokalen Richtlinien der städtischen Abfallverordnung für eine ordnungsgemäße
Entsorgung ein, um Umweltschäden durch Elektro- und Elektronikgeräte zu
minimieren (WEEE).
Kunden aus der Europäischen Union:
Wenden Sie sich für Abholung und Recycling von Geräten an Ihren lokalen
Applied Biosystems Kundenservice. Unter www.appliedbiosystems.com finden
Sie eine Liste der Kundenservice-Niederlassungen in der Europäischen Union.
xiv
Vorwort
Sicherheitshinweise auf Geräten
Sicherheitshinweise auf Geräten
Die Hinweise VORSICHT, WARNUNG und GEFAHR können in Kombination mit den
im vorigen Abschnitt beschriebenen Sicherheitssymbolen an den Applied BiosystemsGeräten angebracht sein.
Anbringung der
Warnhinweise
English
Französisch
CAUTION Hazardous chemicals. Read the
Material Safety Data Sheets (MSDSs) before
handling.
ATTENTION Produits chimiques dangeureux.
Lire les fiches techniques de sûreté de
matériels avant la manipulation des produits.
CAUTION Hazardous waste. Refer to
MSDS(s) and local regulations for handling
and disposal.
ATTENTION Déchets dangereux. Lire les
fiches techniques de sûreté de matériels et la
régulation locale associées à la manipulation
et l'élimination des déchets.
CAUTION Hot surface.
ATTENTION Surface brûlante.
DANGER High voltage.
DANGER Haute tension.
WARNING To reduce the chance of electrical
shock, do not remove covers that require tool
access. No user-serviceable parts are inside.
Refer servicing to Applied Biosystems
qualified service personnel.
AVERTISSEMENT Pour éviter les risques
d'électrocution, ne pas retirer les capots dont
l'ouverture nécessite l'utilisation d'outils.
L’instrument ne contient aucune pièce
réparable par l’utilisateur. Toute intervention
doit être effectuée par le personnel de service
qualifié de Applied Biosystems.
CAUTION Moving parts.
ATTENTION Parties mobiles.
DANGER Class 3B (III) visible and/or invisible
LED radiation present when open and
interlocks defeated. Avoid exposure to beam.
DANGER Rayonnement visible ou invisible
d’un faisceau LED de Classe 3B (III) en cas
d’ouverture et de neutralisation des
dispositifs de sécurité. Evitez toute
exposition au faisceau.
Am StepOne-System befindet sich an der unten angezeigten Stelle ein Warnhinweis:
xv
Vorwort
Allgemeine Gerätesicherheit
Allgemeine Gerätesicherheit
VERLETZUNGSGEFAHR Die nicht sachgemäße Verwendung des
Geräts entsprechend den Vorgaben von Applied Biosystems kann zu Verletzungen oder
Schäden an dem Gerät führen.
Gerät bewegen
und anheben
VERLETZUNGSGEFAHR Das Gerät darf nur von dem im
geltenden Handbuch zur Standortvorbereitung genannten Personal oder Händler bewegt
und aufgestellt werden. Wenn Sie das Gerät nach seiner Installation an einen anderen
Standort verlegen wollen, versuchen Sie nicht, das Gerät ohne Hilfe oder geeignete
Hilfsmittel anzuheben oder zu bewegen, und wenden Sie immer geeignete
Hebetechniken an. Unsachgemäßes Anheben kann zu schmerzhaften und bleibenden
Rückenverletzungen führen. Je nach Gewicht kann das Anheben und Bewegen eines
Geräts mindestens zwei Personen erfordern.
Einzelcomputer
und -monitore
bewegen und
anheben
Versuchen Sie nicht, den Computer oder Monitor allein zu heben
oder zu bewegen. Je nach Gewicht des Computers oder Monitors sind dafür mindestens
zwei Personen erforderlich.
Bitte beachten Sie beim Anheben des Computers oder Monitors Folgendes:
• Stellen Sie sicher, dass Sie den Computer oder Monitor beim Anheben fest im Griff
haben.
• Vergewissern Sie sich, dass der Weg vom Ausgangsort bis zum Bestimmungsort
frei von Hindernissen ist.
• Drehen Sie beim Anheben eines Objekts nicht Ihren Oberkörper.
• Halten Sie Ihr Rückgrat gerade, und führen Sie die Hebebewegung aus den Beinen
heraus aus.
• Koordinieren Sie Hub- und andere Bewegungen vor ihrer Ausführung mit allen
Beteiligten.
• Heben Sie das Objekt nicht aus dem Verpackungskarton heraus, sondern kippen Sie
den Karton zur Seite, und halten Sie ihn fest, während eine andere Person den
Computer oder Monitor aus der Kiste zieht.
Gerät bedienen
Stellen Sie sicher, dass das gesamte Bedienpersonal des Geräts folgende
Voraussetzungen erfüllt:
• Es muss in den allgemeinen Sicherheitsvorkehrungen für Labors und den speziellen
Sicherheitsvorkehrungen für das Gerät unterwiesen worden sein.
• Es muss alle geltenden Sicherheitsdatenblätter (MSDSs) gelesen und verstanden
haben. Siehe „Informationen über Sicherheitsdatenblätter (MSDSs)“ auf Seite xvii.
Gerät reinigen
oder
dekontaminieren
xvi
Halten Sie vor Verwendung einer anderen Reinigungs- oder
Dekontaminierungsmethode als der vom Hersteller empfohlenen Methode mit diesem
Rücksprache, um sicherzustellen, dass das Gerät durch diese Alternativmethode nicht
beschädigt wird.
Vorwort
Chemische Sicherheit
Warnung
bezüglich
chemischer
Gefahren
CHEMISCHE GEFAHREN Lesen Sie vor Handhabung der
Chemikalien die vom Hersteller bereitgestellten Sicherheitsdatenblätter (MSDS),
und halten Sie alle relevanten Sicherheitsvorkehrungen ein.
CHEMISCHE GEFAHREN BEI LAGERUNG Abfallprodukte
niemals in Glasbehältern sammeln oder aufbewahren, da diese zerbrechen oder
zersplittern können. Reagenzien- und Abfallflaschen können Sprünge bekommen und
lecken. Alle Abfallflaschen sollten in einem Sicherheitsbehälter aus Polyethylen
niedriger Dichte mit befestigtem Deckel und in senkrechter Stellung arretierten Griffen
geschützt werden. Bei der Handhabung von Reagenzien- und Abfallflaschen
geeignete(n) Augenschutz, Bekleidung und Handschuhe tragen.
Chemische
Sicherheitsrichtlinien
Informationen
über Sicherheitsdatenblätter
(MSDSs)
So minimieren Sie die Gefährdung durch Chemikalien:
• Vor Lagerung, Handhabung oder Arbeiten mit Chemikalien oder Gefahrstoffen sind
die vom Chemikalienhersteller bereitgestellten Sicherheitsdatenblätter (MSDSs)
einzusehen und zu verinnerlichen (siehe „Informationen über
Sicherheitsdatenblätter (MSDSs)“ auf Seite xvii.)
• Der Kontakt mit Chemikalien ist möglichst gering zu halten. Bei der Handhabung
von Chemikalien entsprechende Personenschutzausrüstung tragen, wie z. B.
Schutzbrille, Handschuhe oder Schutzbekleidung. Weitere Sicherheitsrichtlinien
enthält das entsprechende Sicherheitsdatenblatt.
• Atmen Sie möglichst keine Chemikalien ein. Lassen Sie Chemikalienbehälter nicht
offen stehen, und verwenden Sie diese nur mit ausreichender Lüftung (zum Beispiel
Abzugshauben). Weitere Sicherheitsrichtlinien enthält das entsprechende
Sicherheitsdatenblatt.
• Prüfen Sie in regelmäßigen Abständen auf Chemikalienlecks oder -verschüttungen.
Bei Lecks oder Verschüttungen die vom Hersteller im entsprechenden
Sicherheitsdatenblatt empfohlenen Reinigungsmaßnahmen durchführen.
• Bezüglich der Lagerung, Handhabung und Entsorgung von Chemikalien sind
sämtliche lokalen, landesweiten/regionalen bzw. nationalen Gesetze und Auflagen
einzuhalten.
Die Chemikalienhersteller liefern neuen Kunden zusammen mit den gefährlichen
Chemikalien ein aktuelles Sicherheitsdatenblatt (MSDS). Außerdem legen sie nach
Aktualisierung eines Sicherheitsdatenblatts dem Kunden bei der nächsten Lieferung der
gefährlichen Chemikalie das aktualisierte Sicherheitsdatenblatt bei.
Sicherheitsdatenblätter enthalten die erforderlichen Sicherheitsangaben für die sichere
Lagerung, Handhabung, Beförderung und Entsorgung der betreffenden Chemikalie.
Jedes Mal, wenn Sie ein neues Sicherheitsdatenblatt mit einer gefährlichen Chemikalie
erhalten, müssen Sie das alte Sicherheitsdatenblatt damit ersetzen.
xvii
Vorwort
Sicherheitsdatenblätter
(MSDSs) erhalten
Die Sicherheitsdatenblätter für alle von Applied Biosystems gelieferten Chemikalien
stehen Ihnen 24 Stunden am Tag zur Verfügung. So können Sie Sicherheitsdatenblätter
beziehen:
1. Gehen Sie auf https://docs.appliedbiosystems.com/msdssearch.html
2. Machen Sie im Feld Search (Suche) auf der Seite MSDS Search
(Sicherheitsdatenblattsuche) die folgenden Angaben:
a. Geben Sie den Namen der Chemikalie, die Bestellnummer oder sonstige
Informationen ein, die Sie in dem jeweiligen Sicherheitsdatenblatt erwarten.
b. Wählen Sie die gewünschte Sprache.
c. Klicken Sie auf Search (Suche).
3. So können Sie die gewünschten Dokumente ansehen, herunterladen oder
ausdrucken:
a. Klicken Sie mit der rechten Maustaste auf den Dokumententitel.
b. Wählen Sie:
• Öffnen, um das Dokument anzuzeigen
• Ziel speichern unter, um eine PDF-Version des Dokuments unter dem
von Ihnen gewählten Zielpfad zu speichern
• Ziel drucken, um das Dokument zu drucken
4. So können Sie sich auf der Seite Search Results (Suchergebnisse) die Kopie eines
Sicherheitsdatenblattes per Fax oder E-Mail schicken lassen:
a. Wählen Sie unter dem Dokumententitel zwischen den Optionen Fax oder
Email (E-Mail).
b. Klicken Sie auf RETRIEVE DOCUMENTS (Dokumente abrufen) am
unteren Ende der Dokumentenliste.
c. Geben Sie die erforderlichen Informationen ein.
d. Klicken Sie auf View/Deliver Selected Documents Now (Ausgewählte
Dokumente jetzt ansehen/verschicken).
Hinweis: Kontaktieren Sie wegen Sicherheitsdatenblättern für Chemikalien, die nicht
von Applied Biosystems geliefert werden, den jeweiligen Chemikalienhersteller.
xviii
Vorwort
Sicherer Umgang mit Chemikalienabfällen
Sicherer Umgang mit Chemikalienabfällen
Gefährliche
Chemikalienabfälle
GEFÄHRLICHE ABFALLPRODUKTE Weitere Informationen
finden Sie in den Sicherheitsdatenblättern und den lokalen Vorschriften zu Handhabung
und Entsorgung.
GEFÄHRLICHE CHEMIKALIENABFÄLLE Die
Abfallprodukte von Applied Biosystems-Geräten sind potenzielle Gefahrstoffe und
können zu Verletzungen, Erkrankungen und zum Tod führen.
CHEMISCHE GEFAHREN BEI LAGERUNG Abfallprodukte
niemals in Glasbehältern sammeln oder aufbewahren, da diese zerbrechen oder
zersplittern können. Reagenzien- und Abfallflaschen können Sprünge bekommen und
lecken. Alle Abfallflaschen sollten in einem Sicherheitsbehälter aus Polyethylen
niedriger Dichte mit befestigtem Deckel und in senkrechter Stellung arretierten Griffen
geschützt werden. Bei der Handhabung von Reagenzien- und Abfallflaschen
geeignete(n) Augenschutz, Bekleidung und Handschuhe tragen.
Sicherheitshinweise für
Chemikalienabfälle
So minimieren Sie die Gefährdung durch Chemikalienabfälle:
• Vor der Lagerung, Handhabung oder Entsorgung von Chemikalienabfällen sind die
vom Chemikalienhersteller bereitgestellten Sicherheitsdatenblätter einzusehen und
zu verinnerlichen.
• Stellen Sie primäre und sekundäre Abfallbehälter bereit. (Der primäre
Abfallbehälter ist für die unmittelbar anfallenden Abfälle bestimmt. Der sekundäre
Behälter fängt die aus dem primären Behälter leckenden oder verschütteten
Chemikalienabfälle auf. Beide Behälter müssen mit dem Abfallmaterial kompatibel
sein und die landesweiten, nationalen und lokalen Richtlinien für die Lagerung von
Behältern einhalten.)
• Der Kontakt mit Chemikalien ist möglichst gering zu halten. Bei der Handhabung
von Chemikalien entsprechende Personenschutzausrüstung tragen, wie z. B.
Schutzbrille, Handschuhe oder Schutzbekleidung. Weitere Sicherheitsrichtlinien
enthält das entsprechende Sicherheitsdatenblatt.
• Atmen Sie möglichst keine Chemikalien ein. Lassen Sie Chemikalienbehälter nicht
offen stehen, und verwenden Sie diese nur mit ausreichender Lüftung (zum Beispiel
Abzugshauben). Weitere Sicherheitsrichtlinien enthält das entsprechende
Sicherheitsdatenblatt.
• Chemikalienabfälle unter einer Abzugshaube handhaben.
• Verschließen Sie einen Abfallbehälter nach seiner Leerung mit der dazugehörigen
Abdeckung.
• Der Inhalt von Abfallschalen und -flaschen ist gemäß den Regeln der Guten
Laborpraxis sowie der lokalen, landesweiten/regionalen bzw. nationalen
Umweltschutz- bzw. Gesundheitsschutzauflagen zu entsorgen.
xix
Vorwort
Elektrische Sicherheit
Abfallentsorgung
Wenn beim Betrieb des Geräts potenziell gefährliche Abfallprodukte erzeugt werden,
müssen Sie folgende Vorkehrungen einhalten:
• Charakterisieren Sie den von den jeweiligen Anwendungen, Reagenzien und
Substraten Ihres Labors erzeugten Abfall (gegebenenfalls anhand einer Analyse).
• Sorgen Sie für die Gesundheit und Sicherheit aller Labormitarbeiter.
• Vergewissern Sie sich, dass bei Lagerung, Überführung, Transport und Entsorgung
von Geräteabfällen alle lokalen, landesweiten/regionalen bzw. nationalen Auflagen
eingehalten werden.
WICHTIG! Radioaktive bzw. biogefährliche Stoffe erfordern u. U. spezielle
Handhabungsmaßnahmen und es gelten evtl. Entsorgungseinschränkungen.
Elektrische Sicherheit
STROMSCHLAGGEFAHR Wenn beim Betrieb des StepOneSystems die Geräteverkleidung nicht ordnungsgemäß angebracht ist, besteht die Gefahr
eines Stromschlags. Entfernen Sie die Geräteverkleidung nicht. Beim Entfernen der
Geräteverkleidung werden Hochspannungskontakte freigelegt.
Sicherungen
BRANDGEFAHR Unsachgemäß installierte Sicherungen oder
Hochspannungsversorgungen können das Kabelsystem des Geräts beschädigen und
einen Brand verursachen. Vergewissern Sie sich vor Einschalten des Geräts, dass die
Sicherungen ordnungsgemäß installiert sind und die Gerätespannung auf das Stromnetz
in Ihrem Labor ausgelegt ist.
BRANDGEFAHR Zur Aufrechterhaltung des Brandschutzes nur
aufgeführte und zertifizierte Ersatzsicherungen des angegebenen Typs und Nennwerts
verwenden.
Strom
ELEKTRISCHE SPANNUNG Die Aufrechterhaltung der Erdung
ist für den sicheren Gerätebetrieb unerlässlich. Das Gerät darf niemals bei
unterbrochener Erdung betrieben werden.
ELEKTRISCHE SPANNUNG Verwenden Sie für die Spannungsversorgung in Ihrem Labor nur entsprechend konfigurierte und genehmigte Kabel.
ELEKTRISCHE SPANNUNG Schließen Sie das System an eine
ordnungsgemäß geerdete Steckdose mit passender Stromstärke an.
Überspannungsnennwert
xx
Die Installationskategorie (Überspannungskategorie) für das StepOne-System ist II;
es ist als tragbares Gerät klassifiziert.
Vorwort
LED-Sicherheit
LED-Sicherheit
So sorgen Sie für einen sicheren LED-Betrieb:
• Das System ist von einem technischen Vertreter von Applied Biosystems zu warten.
• Alle Schaltbretter müssen beim Betrieb des Geräts angebracht sein. Bei korrekter
Installation sollte keine Strahlung nachweisbar sein. Wenn ein Schaltbrett beim
Betrieb des LEDs entfernt wird (bei Servicearbeiten mit deaktivierten
Sicherheitsverriegelungen), kann die LED-Strahlung die für die Klasse 3B
zulässigen Werte übersteigen.
• Entfernen Sie keine Sicherheitshinweise, und deaktivieren Sie nicht die
Sicherheitsverriegelungen.
Sicherer Umgang mit biologischen Gefahren
Allgemeine
biologische
Gefahren
BIOGEFÄHRDUNG Biologische Proben wie z. B. Gewebe,
Körperflüssigkeiten, infektiöse Substanzen sowie Menschen- und Tierblut können
ansteckende Krankheiten übertragen. Beachten Sie alle geltenden lokalen,
landesweiten/regionalen bzw. nationalen Vorschriften. Tragen Sie geeignete
Schutzausrüstung, die sich unter anderem aus Folgendem zusammensetzt: Schutzbrille,
Gesichtsschutz, Schutzbekleidung/Laborkittel und Handschuhe. Alle Arbeiten sind in
ordnungsgemäß ausgestatteten Einrichtungen unter Verwendung geeigneter
Sicherheitsausrüstung auszuführen (zum Beispiel Abfangvorrichtungen). Die
Mitarbeiter sind vor der Arbeit mit potenziell infektiösen Materialien gemäß der
geltenden Gesetze und der Anforderungen des Unternehmens/des Instituts zu schulen.
Lesen und befolgen Sie die im Folgenden aufgeführten geltenden Gesetze und
Richtlinien:
• Die vom US-Gesundheitsministerium (U.S. Department of Health and Human
Services) in Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories
(Biologische Sicherheit in mikrobiologischen und biomedizinischen Laboratorien)
veröffentlichten Richtlinien (Stock Nr. 017-040-00547-4; bmbl.od.nih.gov)
• Occupational Safety and Health Standards, Bloodborne Pathogens (OSHAStandards für blutgebundene Pathogene) (29 CFR§1910.1030;
www.access.gpo.gov/ nara/cfr/waisidx_01/ 29cfr1910a_01.html).
• Die Protokolle des Biosicherheitsprogramms Ihres Unternehmens/Instituts über die
Arbeit/den Umgang mit potenziell infektiösen Materialien.
Weitere Informationen über die Vorschriften für Biogefährdung finden Sie auf der
folgenden Website:
http://www.cdc.gov
xxi
Vorwort
Sicherheit am Arbeitsplatz
Sicherheit am Arbeitsplatz
Eine ergonomisch korrekte Einrichtung Ihres Arbeitsplatzes kann Beschwerden wie z. B.
Müdigkeit, Schmerzen und Verspannungen verringern oder verhindern. Sie können diese
Beschwerden minimieren oder verhindern, indem Sie Ihren Arbeitsplatz so einrichten,
dass eine neutrale oder entspannte Arbeitshaltung gefördert wird.
MUSKULOSKELETTAL- UND REPETITIVE
BEWEGUNGEN WARNHINWEIS Diese Gefahren sind auf potenzielle
Risikofaktoren zurückzuführen, wie unter anderem sich wiederholende
Bewegungsabläufe, ungünstige Körperhaltung, Überanstrengung, Verharren in
statischen Sitzpositionen, Anpressdruck und andere Umweltfaktoren des Arbeitsplatzes.
So können Sie das Risiko muskuloskelettaler Erkrankungen und repetitiver Bewegungen
minimieren:
• Verwenden Sie nur Geräte, die eine neutrale und bequeme Arbeitsposition
unterstützen und Ihnen einen einfachen Zugriff auf Tastatur, Monitor und Maus
ermöglichen.
• Platzieren Sie Tastatur, Maus und Monitor so, dass Sie eine entspannte Körper- und
Kopfhaltung einnehmen können.
xxii
Vorwort
Normen zu Sicherheit und elektromagnetischer Verträglichkeit (EMV)
Normen zu Sicherheit und
elektromagnetischer Verträglichkeit (EMV)
USamerikanische
und kanadische
Sicherheitsnormen
Das StepOne-System wurde auf die Einhaltung der folgenden Normen getestet:
UL 61010A-1/CAN/CSA C22.2 No. 1010.1-92: „Safety Requirements for Electrical
Equipment for Measurement, Control, and Laboratory Use, Part 1: General
Requirements“ (Sicherheitsbestimmungen für elektrische Mess-, Steuer-, Regel- und
Laborgeräte - Teil 1: Allgemeine Anforderungen)
UL 61010A-2-010/CAN/CSA 1010.2.010: „Particular Requirements for Laboratory
Equipment for the Heating of Materials“ (Besondere Anforderungen an Laborgeräte für
das Erhitzen von Stoffen)
Aktuelle FDA-Norm „Radiation Control for Health and Safety Act of 1968 Performance
Standard 21 CFR 1040.10 and 1040.11“ (Gesetz zur Strahlungskontrolle für Sicherheit
und Gesundheit von 1968)
Kanadische EMVNorm
Europäische
Sicherheits- und
EMVNormen
Das Gerät wurde auf Einhaltung der Norm ICES-001, Ausgabe 3, getestet: „Industrial,
Scientific, and Medical Radio Frequency Generators“ (Radiofrequenzgeneratoren für
Industrie, Wissenschaft und Medizin)
Sicherheit
Dieses Gerät hält die europäischen Sicherheitsbestimmungen ein
(Niederspannungsrichtlinie 73/23/EEC). Dieses Gerät wurde auf die Einhaltung der
folgenden beiden Normen getestet: EN 61010-1:2001, Sicherheitsbestimmungen für
elektrische Mess-, Steuer-, Regel- und Laborgeräte - Teil 1: Allgemeine Anforderungen.
EN 61010-2-010: „Besondere Anforderungen an Laborgeräte für das Erhitzen von
Stoffen“
EN 61010-2-081: „Besondere Anforderungen an automatische und semiautomatische
Laborgeräte für Analysen und andere Zwecke“
EN 60825-1: „Radiation Safety of Laser Products, Equipment Classification,
Requirements, and User’s Guide“ (Strahlungssicherheit von Laserprodukten,
Geräteklassifizierung, Anforderungen, und Benutzeranleitungen)
EMV
Dieses Gerät hält die europäischen Sicherheitsbestimmungen für Störemissionen und
Funkentstörung ein (EMC-Richtlinie 89/336/EEC). Dieses Gerät wurde auf die
Einhaltung der Norm EN 61326 (Gruppe 1, Klasse B) getestet: „Elektrische
Betriebsmittel für Leittechnik und Laboreinsatz – EMV-Anforderungen“
Australische EMVNormen
Dieses Gerät wurde auf die Einhaltung der Norm AS/NZS 2064 getestet: „Limits and
Methods Measurement of Electromagnetic Disturbance Characteristics of Industrial,
Scientific, and Medical (ISM) Radio-frequency Equipment“ (Grenzwerte und
Messverfahren für elektromagnetische Störeigenschaften von industriellen,
wissenschaftlichen und medizinischen Hochfrequenzgeräten (ISM))
xxiii
Vorwort
Normen zu Sicherheit und elektromagnetischer Verträglichkeit (EMV)
xxiv
Kapitel 1
Erste Schritte
Dieses Kapitel umfasst die folgenden Themen:
■ Informationen zum StepOne™-System . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2
■ Informationen zu relativen Standardkurven- und vergleichenden CT-Analysen. . . . 4
■ Verwendung dieses Handbuchs. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 9
■ Informationen zur Beispielanalyse . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 10
■ Arbeitsablauf der Beispielanalyse. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 12
Hinweis: Weitere Informationen über ein Thema dieses Handbuchs finden Sie in der
Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System Software Help, indem Sie
entweder F1 drücken, in der Symbolleiste auf
klicken oder HelpStepOne Help
(HilfeStepOne-Hilfe) wählen.
Hinweise
1
Kapitel 1 Erste Schritte
Informationen zum StepOne™-System
Das Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System (StepOne™-System)
verwendet fluoreszenz-basierende PCR Reagenzien (Polymerase Kettenreaktion) zur
Durchführung von:
• Quantitative Detektion von Zielsequenzen auf einer Nukleinsäure mittels EchtzeitAnalyse
• Quantitative Detektion von Zielsequenzen auf einer Nukleinsäure mittels Endpunktund Schmelzkurvenanalyse
Informationen zur
Datenerfassung
Das StepOne-System erfasst in Abhängigkeit von dem gewählten Laufprofil während
einer PCR an verschiedenen Punkten Fluoreszenzrohdaten:
Laufprofil
Echtzeit-Läufe
Standardkurve
Datenerfassungspunkt
Das System erfasst Daten nach jedem PCRExtensionsschritt.
Relative
Standardkurve
Vergleichender CT
(∆∆CT)
EndpunktLäufe
Genotypisierung
Das System erfasst Daten vor und nach der PCR.
Bei Genotypisierungsanalysen kann die StepOne™Software Daten auch während des Laufs anzeigen
(Echtzeit), was bei der Problembehebung eine große
Hilfe sein kann.
Positiv/Negativ
Das System erfasst Daten vor und nach der PCR.
Unabhängig vom Laufprofil besteht ein Datenerfassungspunkt bzw. eine Messung aus
drei Phasen:
1. Anregung: Das StepOne™-System strahlt alle Wells der Reaktionsplatte innerhalb
des StepOne-Systems aus, wodurch die Fluorophoren in jeder Reaktion angeregt
werden.
2. Emission: Die Optik des StepOne-Systems fokussiert die von den Wells der
Reaktionsplatte abgegebene Restfluoreszenz. Das daraus resultierende, vom System
erfasste Bild besteht nur aus dem Licht eines Wellenlängenbereichs.
3. Erfassung: Das StepOne-System erstellt eine digitale Darstellung der über einen
festgelegten Zeitraum erfassten Fluoreszenz. Die StepOne-Software speichert die
Fluoreszenzrohdaten zur Analyse. Falls erforderlich, führt die Software zusätzliche
Messungen durch, entsprechend der Anforderungen der für die Analyse
verwendeten Fluoreszenzreagenzien.
Nach Durchführung eines Laufs bestimmt die StepOne-Software anhand von
Kalibrierungsdaten (durch räumliche, Farbstoff- und Hintergrundkalibrierung) den Ort
und die Intensität von Fluoreszenzsignalen in jeder Messung, den mit dem jeweiligen
Fluoreszenzsignal verbundenen Farbstoff und die Aussagefähigkeit des Signals.
Hinweise
2
Unterstützte
Verbrauchsmaterialien
Das StepOne-System unterstützt die unten aufgelisteten Verbrauchsmaterialien.
Diese Verbrauchsmaterialien können sowohl mit Standard- als auch mit FastReagenzien/Protokollen verwendet werden.
Verbrauchsmaterial
Bestell-Nr.
• MicroAmp™ Fast Optical 48-Well Reaction Plates
• MicroAmp™ Optical 48-Well Adhesive Film
• 4375816
• 4375323
• MicroAmp™ Fast 8-Tube Strips
• MicroAmp™ Optical 8-Cap Strips
• 4358293
• 4323032
• MicroAmp® Fast Reaction Tubes with Caps
• 4358297
™
• MicroAmp Fast 48-Well Trays
• MicroAmp™ 48-Well Base Adaptor
• MicroAmp™ Splash Free 96-Well Base
• 4375282
• 4375284
• 4312063
D
F
G
A
E
B
B
A
C
#
C
C
Verbrauchsmaterial
A
MicroAmp™ Fast Optical 48-Well Reaction Plate
B
MicroAmp™ Fast 48-Well Tray
C
MicroAmp™ Splash Free 96-Well Base
D
MicroAmp™ Optical 8-Cap Strip
E
MicroAmp™ Fast 8-Tube Strip
F
MicroAmp® Fast Reaction Tubes with Caps
G
MicroAmp Optical 48-Well Adhesive Film
Hinweise
3
Informationen zu relativen Standardkurven- und vergleichenden CT-Analysen
Weitere
Informationen
Weitere Informationen:
• Informationen zum StepOne-System finden Sie in der Applied Biosystems
StepOne™ Real-Time PCR System Software Help.
Hinweis: Um auf die Hilfe zuzugreifen, wählen Sie in der StepOne-Software die
Option HelpStepOne Help (Hilfe StepOneHilfe).
• Informationen zu Standardkurven-Analysen finden Sie im Applied Biosystems
StepOne™ Real-Time PCR System-Einführungshandbuch zu StandardkurvenAnalysen.
• Informationen zu Genotypisierungsanalysen finden Sie im Applied Biosystems
StepOne™ Real-Time PCR System Einführungshandbuch zu
Genotypisierungsanalysen.
• Informationen zu Positiv-/Negativanalysen finden Sie im Applied Biosystems
StepOne™ Real-Time PCR System Getting Started Guide for Presence/Absence
Experiments.
Informationen zu relativen Standardkurven- und
Real-Time PCRAnalysen
Relative Standardkurven- und vergleichende CT (∆∆CT)-Analysen sind Real-Time PCRAnalysen. Für Real-Time PCR-Analysen gilt Folgendes:
• Das Gerät überwacht den Verlauf der PCR in Echtzeit (Kwok und Higuchi, 1989).
• Die Erfassung von Daten erfolgt während des PCR-Prozesses.
• Reaktionen werden durch den Zeitpunkt innerhalb der PCR charakterisiert, an dem
die Amplifikation einer Zielsequenz zum ersten Mal erkannt wird (Saiki et al.,
1985).
Hinweis: In diesem Handbuch bezieht sich der Begriff Analyse auf den gesamten
Analyseprozess, vom Analysedesign bis zur Datenanalyse.
Informationen
über relative
StandardkurvenAnalysen
In relativen Standardkurven-Analysen wird die Expressionsänderung einer Zielsequenz
in einer Probe relativ zur gleichen Zielsequenz in einer Referenzprobe bestimmt. Zur
Ermittlung der Ergebnisse wird eine Standardkurve verwendet, die aus einer
Verdünnungsreihe mit bekannter Menge erstellt wird.
Relative Standardkurven-Analysen werden normalerweise für folgende Zwecke
verwendet:
• Vergleich der Expressionsniveaus eines Gens in verschiedenen Geweben
• Vergleich der Expressionsniveaus eines Gens in einer behandelten und in einer
unbehandelten Probe
• Vergleich der Expressionsniveaus von Wildtyp- und mutierten Allelen
Hinweise
4
Komponenten
Die folgenden Komponenten werden für die Einrichtung von PCR-Reaktionen bei
relativen Standardkurven-Analysen benötigt:
• Probe: Probenmaterial, in dem die Menge an Zielsequenz unbekannt ist
• Referenzprobe: die Probe, die als Basis zum Vergleich der Ergebnisse verwendet
wird. Zum Beispiel würde sich in einer Studie über den Einfluss eines Medikaments
auf die Genexpression eine unbehandelte Kontrolle als Referenzprobe eignen.
• Standard: eine Probe mit bekannter Menge
• Standardverdünnungsreihe: eine Reihe von Verdünnungen des Standards (zum
Beispiel 1:2, 1:4, 1:8, 1:16, 1:32), die zur Erstellung einer Standardkurve verwendet
werden. Die Menge der Zielsequenz wird in allen Proben durch Interpolation von
der Standardkurve und die anschließende Division durch die Zielsequenzmenge der
Referenzprobe ermittelt. Da die Referenzprobe als der 1✕-Wert gesetzt wird,
werden alle anderen Mengen als ein n-facher Unterschied relativ zu ihr ausgedrückt.
Außerdem wird die Einheitsangabe der Standardkurve nicht bei den Berechnungen
berücksichtigt, weil die Probenmenge durch die Menge der Referenzprobe dividiert
wird. Folglich müssen von den Standards nur die relativen Verdünnungen bekannt
sein. Aus diesem Grund kann jede Stamm-cDNA, -RNA oder -DNA mit der
entsprechenden Zielsequenz zum Ansetzen von Standards verwendet werden.
• Endogene Kontrolle: ein Gen mit konstantem Expressionsniveau in allen Proben.
Mithilfe der endogenen Kontrolle können Schwankungen, die durch ungenaues
Pipettieren der cDNA zu jeder Reaktion entstanden sind, normalisiert werden.
• Replikate: identische Reaktionen mit identischen Komponenten und Volumina
• Negativkontrolle: Proben, die statt Template Wasser oder Puffer enthalten.
Negativkontrollen sollten nicht amplifiziert werden.
Informationen zu
vergleichenden
CT-Analysen
In vergleichenden CT (∆∆CT)-Analysen wird die Expressionsänderung einer Zielsequenz
in einer Probe relativ zur gleichen Zielsequenz in einer Referenzprobe bestimmt. Die
Ergebnisse werden anhand arithmetischer Formeln ermittelt.
Vergleichende CT-Analysen werden normalerweise für folgende Zwecke verwendet:
• Vergleich der Expressionsniveaus eines Gens in verschiedenen Geweben
• Vergleich der Expressionsniveaus eines Gens in einer behandelten Probe und in
einer unbehandelten Probe
• Vergleich der Expressionsniveaus von Wildtyp- und mutierten Allelen
Komponenten
Die folgenden Komponenten werden für die Einrichtung von PCR-Reaktionen für
vergleichende CT-Analysen benötigt:
• Probe: Proben, in denen die Menge an Zielsequenz unbekannt ist
• Referenzprobe: die Probe, die als Basis zum Vergleich der Ergebnisse verwendet
wird. Zum Beispiel würde sich in einer Studie über den Einfluss eines Medikaments
auf die Genexpression eine unbehandelte Kontrolle als Referenzprobe eignen.
Hinweise
5
• Endogene Kontrolle: ein Gen mit konstantem Expressionsniveau in allen Proben.
Mithilfe der endogenen Kontrolle können Schwankungen, die durch ungenaues
Pipettieren der cDNA zu jeder Reaktion entstanden sind, normalisiert werden.
• Replikate: identische Reaktionen mit identischen Komponenten und Volumina
• Negativkontrolle: Proben, die statt Template Wasser oder Puffer enthalten.
Negativkontrollen sollten nicht amplifiziert werden.
Relative
StandardkurvenAnalysen im
Vergleich mit
vergleichenden
CT-Analysen
Beachten Sie bei der Wahl zwischen relativer Standardkurven- und vergleichender CTAnalyse Folgendes:
Analysetyp
Beschreibung
Vorteil
Relative
Standardkurve
Verwendet eine Standardkurve
zur Bestimmung der
Expressionsänderung einer
Zielsequenz in einer Probe relativ
zur gleichen Zielsequenz in einer
Referenzprobe. Am besten für
Assays mit suboptimaler PCREffizienz geeignet.
Benötigt am wenigsten
Validierung, weil die PCREffizienzen der Zielsequenz und
der endogenen Kontrolle nicht
äquivalent sein müssen.
Da für jede Zielsequenz eine
Standardkurve zu erstellen ist,
werden mehr Reagenzien und
Platz in der Reaktionsplatte
benötigt.
Vergleichender
CT (∆∆CT)
Verwendet arithmetische
Formeln zur Bestimmung der
Expressionsänderung einer
Zielsequenz in einer Probe relativ
zur gleichen Zielsequenz in einer
Referenzprobe. Am besten für
Hochdurchsatzmessungen der
relativen Genexpression
mehrerer Gene in vielen Proben
geeignet.
• Die relativen
Zielsequenzniveaus in Proben
können ohne Standardkurve
bestimmt werden, wenn die
PCR-Effizienzen der
Zielsequenz und endogenen
Kontrolle relativ äquivalent
sind.
• geringerer
Reagenzienverbrauch
• mehr Platz in der
Reaktionsplatte
• Suboptimale Assays (mit
niedriger PCR-Effizienz)
können ungenaue Ergebnisse
liefern.
• Applied Biosystems
empfiehlt, dass Sie vor
Verwendung der
vergleichenden CT-Methode
sicherstellen, dass die PCREffizienzen für den
Zielsequenz-Assay und den
endogenen Kontroll-Assay in
etwa gleich sind.
PCR-Optionen
Einschränkung
Bei der Ausführung von Real-Time PCR-Reaktionen haben Sie die Wahl zwischen den
folgenden Möglichkeiten:
• Singleplex- und Multiplex-PCR (unten)
und
• 1-Schritt- und 2-Schritt-RT-PCR (Seite 7)
Hinweise
6
Singleplex im Vergleich zu Multiplex-PCR
Sie können zwischen zwei Arten von PCR-Reaktionen wählen:
• Singleplex-Reaktion mit einem einzigen Primer-/Sondenset im Reaktionsröhrchen
oder Well. Pro Reaktion kann nur eine Zielsequenz oder endogene Kontrolle
amplifiziert werden.
oder
• Multiplex-Reaktion mit zwei oder mehr Primer-/Sondensets im Reaktionsröhrchen
oder Well. Jedes Set amplifiziert eine bestimmte Zielsequenz oder endogene
Kontrolle.
WICHTIG! SYBR® Green-Reagenzien können nicht für Multiplex-Reaktionen
verwendet werden.
Zielsequenz-Primer-Set
Primer-Set zur
endogenen Kontrolle
Singleplex PCR
Multiplex PCR
cDNA
GR2331
1- im Vergleich zu 2-Schritt-RT-PCR
Sie können reverse Transkription (RT) und PCR in einer einzigen Reaktion (1-Schritt)
oder in verschiedenen Reaktionen (2-Schritt) ausführen. Die zu verwendende
Reagenzienkonfiguration hängt davon ab, ob Sie eine 1- oder 2-Schritt-RT-PCR
ausführen:
• In der 1-Schritt-RT-PCR werden RT und PCR in einem Puffersystem ausgeführt.
Dies hat den Vorteil, dass für die RT- und PCR-Amplifikation nur ein Reagenzgefäß
vorzubereiten ist. Sie können für die Durchführung einer 1-Schritt RT-PCR jedoch
nicht den Fast PCR Master Mix oder das „Carryover Prevention Enzyme“
AmpErase® UNG (Uracil-N-glycosylase) verwenden.
• Die 2-Schritt-RT-PCR wird in zwei getrennten Reaktionen ausgeführt: Zuerst wird
die gesamte RNA in cDNA revers transkribiert, anschließend wird die cDNA durch
PCR-Reaktion amplifiziert. Diese Methode ist für die Detektion multipler
Transkripte von einem einzigen cDNA-Template oder für die Speicherung von
cDNA-Aliquoten zur späteren Verwendung sinnvoll. Das AmpErase® UNG-Enzym
kann zur Verhinderung von Carryover-Kontamination eingesetzt werden.
Hinweis: Informationen über AmpErase® UNG finden Sie im Applied Biosystems
StepOne™ Real-Time PCR System-Reagenzienhandbuch.
Hinweise
7
Reagenzien
TaqMan®- und SYBR® Green-Reagenzien
Applied Biosystems bietet zur Verwendung mit dem StepOne-SystemTaqMan®- und
SYBR® Green-Reagenzien an. Beide Reagenzienarten werden in der unten stehenden
Tabelle kurz beschrieben.
Reagenzienart
TaqMan®-Reagenzien oder Kits
Verfahren
PCR und Detektion von cDNA
a. Assay-Komponenten
Beschreibung
MGB
Reverse primer
Sonde
TaqMan-Reagenzien verwenden eine
fluorogene Sonde zur Detektion eines
spezifischen PCR-Produkts, während es in
PCR-Zyklen vervielfältigt wird.
Vorteile
F
Forward primer
3'
Q
5'
cDNA Template
cDNA
3'
5'
LEGENDE
b. Denaturiertes Template und Glühen der Assay-Komponenten
• Erhöht die Spezifizität mithilfe einer Sonde.
Eine spezifische Hybridisierung zwischen
Sonde und Zielsequenz generiert ein
Fluoreszenzsignal.
• Bietet Multiplex-Möglichkeiten
• Optimierte Assays sind verfügbar
• Während der PCR kann ein 5′-NucleaseAssay durchgeführt werden.
• Kann sowohl bei 1- als auch 2-Schritt-RTPCR verwendet werden
3'
5'
Reverse primer
MGB
Sonde
F
3'
5'
FAM™-Farbstoff
Quencher
MGB
Minor Groove
Binder
AmpliTaq Gold ®
DNA Polymerase
3'
5'
Sonde
Reverse primer
Primer
F
Forward primer
MGB
5'
Q
3'
3'
5'
Template
Erweiterter Primer
Schritt 1: Reaktionsbeginn
Der SYBR® Green 1-Farbstoff
fluoresziert, wenn er
doppelsträngige DNA bindet.
SYBR Green-Reagenzien verwenden SYBR®
Green I-Farbstoff, einen Farbstoff, der an
doppelsträngige DNA bindet, um PCRProdukte während ihrer Akkumulation in den
PCR-Zyklen zu detektieren.
Schritt 2: Denaturierung
Wenn die DNA denaturiert
r ist, wird
der SYBR® Green 1-Farbstoff
freigesetzt und die Fluoreszenz wird
drastisch reduziert.
Vorteile
Bindet unspezifisch an alle doppelsträngigen
DNA-Sequenzen. Prüfen Sie zur Vermeidung
von falschen Positivsignalen anhand einer
Schmelzkurven- oder Gelanalyse, ob
unspezifische Produktformationen vorliegen.
F
Q
c. Signalerzeugung
Beschreibung
Einschränkungen
Zufalls-Primer
Q
Forward primer
SYBR® Green-Reagenzien
• Wirtschaftlich (es wird keine Sonde benötigt)
• Ermöglicht eine Schmelzkurvenanalyse, um
die Schmelztemperaturen aller PCRProdukte messen zu können.
• Kann sowohl bei 1- als auch 2-Schritt-RTPCR verwendet werden
RP
FORWARD
PRIMER
Schritt 3: Polymerisation
Während der Extension lagern
sich Primer an und das
PCR-Produkt entsteht.
REVERSE
PRIMER
Schritt 4: Polymerisation
abgeschlossen
Der SYBR® Green 1-Farbstoff
bindet an das doppelsträngige
Produkt, wodurch es zu einem
Nettoanstieg der im Gerät
detektierten Fluoreszenz kommt.
WICHTIG! Applied Biosystems rät von der Verwendung von TAMRA™-Farbstoff als
Reporter oder Quencher für das StepOne™-System ab.
Hinweise
8
Andere Reagenzien
Sie können andere fluoreszenzmarkierte Reagenzien mit dem StepOne-System
verwenden, mit Ausnahme der Folgenden:
• Die StepOne-Software berechnet automatisch die Reaktionsvolumen für die
TaqMan- und SYBR Green-Reagenzien, aber nicht für andere Reagenzien.
• Sie müssen mithilfe des Setups für Fortgeschrittene (und nicht mit dem
Analysedesign-Assistenten) Ihre eigene Analyse erstellen. Siehe „Setup für
Fortgeschrittene“ auf Seite 200.
Weitere
Informationen
Informationen über Echtzeit-PCR-Analysen, PCR-Optionen und Reagenzien finden Sie
im Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System-Reagenzienhandbuch.
Dieses Handbuch ist sowohl ein Tutorial als auch eine Anleitung für die Durchführung
eigener Analysen.
Verwendung des
Handbuchs als
Tutorial
Anhand der mit der StepOne-Software gelieferten Beispieldaten können Sie dieses
Handbuch als Tutorial für die Ausführung einer relativen Standardkurven- oder
vergleichenden CT-Analyse auf dem StepOne-System verwenden. Befolgen Sie die
Anweisungen in den jeweiligen Kapiteln:
Kapitel
Verfahren
Relative
Standardkurve
Vergleichender
CT
2
6
Erstellen Sie das Design der Analyse unter
Verwendung des Analysedesign-Assistenten in der
StepOne-Software.
3
7
Bereiten Sie die Analyse unter Verwendung der vom
Analysedesign-Assistenten in Kapitel 2 (relative
Standardkurven-Analyse) oder Kapitel 6 (vergleichende
CT-Analyse) berechneten Reagenzien und Volumina
vor.
4
8
Führen Sie die Analyse auf dem StepOne-Gerät aus
(eigenständige oder computergesteuerte
Konfiguration).
5
9
Werten Sie die Ergebnisse aus.
Weitere Informationen finden Sie unter „Informationen zur Beispielanalyse“ auf
Seite 10.
Hinweise
9
Informationen zur Beispielanalyse
Verwendung des
Handbuchs für
eigene Analysen
Nach Abschluss der Tutorial-Übungen in den Kapiteln 2 bis 9, dient dieses Handbuch als
Anleitung für den Arbeitsablauf mit dem Analysedesign-Assistenten für Ihre eigenen
relativen Standardkurven- oder vergleichenden CT-Analysen. Alle Verfahren in den
Kapiteln 2 bis 9 enthalten eine Reihe an Hinweisen mit Informationen zur Durchführung
der verschiedenen Aktionen für Ihre eigenen Analysen.
Außerdem können Sie einen der anderen von der StepOne-Software angebotenen
Arbeitsabläufe zur Durchführung Ihrer eigenen Analysen verwenden. Die unten stehende
Tabelle bietet einen Überblick über alle von der StepOne-Software angebotenen
Arbeitsabläufe.
Arbeitsablauf
Beschreibung
Siehe...
AnalysedesignAssistent
Der Assistent führt Sie durch bewährte Schritte zur
Eingabe Ihrer eigenen Analyseparameter.
Kapitel 2 oder
Kapitel 6
Setup für
Fortgeschrittene
Richten Sie eine neue und auf Ihrem eigenen Design
basierende Analyse ein. Diese Funktion bietet erfahrenen
Anwendern Flexibilität beim Design.
Seite 200
QuickStart
Führen Sie eine neue Analyse ohne Informationen über
die Platteneinrichtung durch.
Seite 201
Template
Richten Sie eine neue Analyse mithilfe der
Einrichtungsinformationen einer Vorlage (Template) ein.
Seite 202
Export/Import
Importieren Sie Analysedesigns aus ASCII-Textdateien,
die Informationen über die Analyseeinrichtung enthalten.
Seite 203
Zur Veranschaulichung, wie relative Standardkurven- und vergleichende CT-Analysen
durchgeführt werden, führt Sie dieses Handbuch durch die einzelnen Verfahren zur
Erstellung, Vorbereitung und Auswertung einer Beispielanalyse. Die Beispielanalyse
stellt eine typische Analyseeinrichtung dar, über welche Sie sich schnell mit dem
StepOne-System vertraut machen können.
Beschreibung der
relativen
StandardkurvenBeispielanalyse
Mithilfe der relativen Standardkurven-Beispielanalyse kann die Expression des
c-Myc-Transkriptionsfaktors (ein Onkoprotein, das die Transkription von wachstumsassoziierten Genen aktiviert) in Leber- und Nierengeweben verglichen werden.
Für die relative Standardkurven-Beispielanalyse gilt Folgendes:
• Bei den Proben handelt es sich um cDNA von aus Leber- und Nierengewebe
isolierter Gesamt-RNA.
• Die Zielsequenz ist humanes c-Myc.
• Die endogene Kontrolle ist humane Glycerinaldehyd-3-Phosphat-Dehydrogenase
(GAPDH).
• Bei der Referenzprobe handelt es sich um aus Nierengewebe isolierte RNA.
• Für das c-Myc (Zielsequenz) wird eine Standardkurve eingerichtet. Der für die
Standardverdünnungsreihe verwendete Standard ist eine cDNA-Probe in bekannter
Quantität von aus Lungengewebe isolierter RNA.
Hinweise
10
• Für GAPDH (endogene Kontrolle) wird eine Standardkurve eingerichtet. Der für die
• Die Analyse ist für Singleplex-PCR ausgelegt, wobei die Assays für Zielsequenz
(c-Myc) und endogene Kontrolle (GAPDH) in separaten Wells durchgeführt
werden.
• Für die 2-Schritt-RT-PCR werden Reaktionen eingerichtet. Der High-Capacity
cDNA Reverse Transcription Kit wird für die reverse Transkription verwendet,
während der TaqMan® Fast Universal PCR Master Mix für die PCR verwendet wird.
• Aus der Produktfamilie der Applied Biosystems TaqMan® Gene Expression Assays
werden Primer-/Sondensets ausgewählt:
– Die Assay-ID für den Zielsequenz-Assay (c-Myc) lautet Hs00153408_m1
(RefSeq NM_002467.3).
– Die Assay-ID für den endogenen Kontroll-Assay (GAPDH) lautet
Hs99999905_m1 (RefSeq NM_002046.2).
Reaktionsplattenbelegung
Die Reaktionsplattenbelegung für die relative Standardkurven-Analyse wird unten
angezeigt.
Beschreibung der
vergleichenden
CTBeispielanalyse
Anhand der vergleichenden CT-Beispielanalyse kann die Expression von TP53 (ein
Transkriptionsfaktor, der andere Gene reguliert) in Leber-, Nieren- und Hirngewebe
verglichen werden.
Für die vergleichende CT-Beispielanalyse gilt Folgendes:
• Bei den Proben handelt es sich um cDNA von aus Leber-, Nieren- und Hirngewebe
isolierter RNA.
• Die Zielsequenz ist TP53.
• Die Referenzprobe ist Hirn.
• Die endogene Kontrolle ist humanes GAPDH.
Hinweise
11
Arbeitsablauf der Beispielanalyse
• Die Analyse ist für Singleplex-PCR ausgelegt, wobei die Assays für Zielsequenz
(c-Myc) und endogene Kontrolle (GAPDH) in separaten Wells durchgeführt
werden.
• Für die 2-Schritt-RT-PCR werden Reaktionen eingerichtet. Der High-Capacity
cDNA Reverse Transcription Kit wird für die reverse Transkription verwendet,
während der TaqMan® Fast Universal PCR Master Mix für die PCR verwendet wird.
• Aus der Produktfamilie der Applied Biosystems TaqMan® Gene Expression Assays
werden Primer-/Sondensets ausgewählt:
– Die Assay-ID für den Zielsequenz-Assay (TP53) lautet Hs00153340_m1
(RefSeq NM_000546.2).
– Für das endogene Kontroll-Assay (GAPDH) wird das Human GAPD (GAPDH)
Endogenous Control-Kit (BN 4333764T) verwendet.
Reaktionsplattenbelegung
Die Reaktionsplattenbelegung für die vergleichende CT-Beispielanalyse wird unten
angezeigt.
Informationen
über die
Daten der
Beispielanalyse
Die Datendateien für die Beispielanalysen werden zusammen mit der StepOne-Software
installiert. Sie finden die Dateien für die Beispielanalysen auf Ihrem Computer:
<Laufwerk>:\Applied Biosystems\StepOne System\experiments\examples
Hierbei steht <Laufwerk> für das Computerlaufwerk, auf dem die StepOne-Software
installiert wurde. Die Software wird standardmäßig auf dem C-Laufwerk installiert.
Die Abbildung auf Seite 13 stellt den Arbeitsablauf für die relativen Standardkurven- und
vergleichende CT-Beispielanalysen dar.
Hinweise
12
Relative Standardkurven-Analyse
Analyse starten
Vergleichende CT (∆∆CT) -Analyse
Analyse starten
Experimentelles Design (Kapitel 6)
1. Legen Sie eine neue Analyse an.
2. Legen Sie die Analyseeigenschaften fest.
3. Legen Sie die Methoden und Materialien fest.
4. Richten Sie die Zielsequenzen ein.
5. Richten Sie die Standards ein.
6. Richten Sie die Proben ein.
7. Richten Sie die relative Quantifizierung ein.
8. Richten Sie das Laufprofil ein.
9. Überprüfen Sie das Pipettierprotokoll.
10.Bestellen Sie Materialien für die Analyse.
11.Beenden Sie den Analysedesign-Assistenten.
9. Bestellen Sie Materialien für die Analyse.
Ansetzen der Reaktionen (Kapitel 3)
1.
2.
3.
4.
5.
Bereiten Sie das Template vor.
Setzen Sie die Probenverdünnungen an.
Setzen Sie die Standardverdünnungsreihe an.
Setzen Sie für jede Zielsequenz einen Reaktionsmix an.
Bereiten Sie die Reaktionsplatte vor.
1. Bereiten Sie das Template vor.
2. Setzen Sie die Probenverdünnungen an.
3. Setzen Sie für jeden Zielsequenz-Assay einen
Reaktionsmix an.
4. Bereiten Sie die Reaktionsplatte vor.
Analysedurchführung (Kapitel 4)
1.
2.
3.
4.
5.
Bereiten Sie den Lauf vor.
Aktivieren Sie die Benachrichtigungseinstellungen.
Starten Sie den Lauf.
Überwachen Sie den Lauf.
Entladen Sie das Gerät, und übertragen Sie die Daten.
Analyseauswertung (Kapitel 5)
Abschnitt 1, Prüfen der Ergebnisse:
1. Werten Sie die Analyse aus.
2. Überprüfen Sie den Standardkurvenbildschirm.
3. Überprüfen Sie die Amplifikationsdarstellung.
4. Überprüfen Sie die Genexpressionsdarstellung/
Well-Tabelle.
5. Werten Sie die Daten aus.
Abschnitt 2, Fehlerbehebung (falls erforderlich):
1. Prüfen Sie die Analyseeinstellungen, und passen Sie
Grundlinie/Schwellenwert an.
2. Überprüfen Sie die QC-Zusammenfassung.
3. Nehmen Sie Wells heraus.
4. Überprüfen Sie die Multikomponentendarstellung.
5. Überprüfen Sie die Rohdatendarstellung.
Analyse beenden
1.
2.
3.
4.
Bereiten Sie den Lauf vor.
Aktivieren Sie die Benachrichtigungseinstellungen.
Starten Sie den Lauf.
Überwachen Sie den Lauf.
5. Entladen Sie das Gerät, und übertragen Sie die Daten.
2. Überprüfen Sie die Genexpressionsdarstellung/WellTabelle.
Analyse beenden
Hinweise
13
Hinweise
14
Kapitel 2
Experimentelles Design der relativen
Standardkurven-Analyse
■ Kapitelübersicht . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 16
■ Anlegen einer neuen Analyse . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 17
■ Definieren der Analyseeigenschaften . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 19
■ Definieren der Methoden und Materialien . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 21
■ Einrichten der Zielsequenzen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 24
■ Einrichten der Standards. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 27
■ Einrichten der Proben . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 29
■ Einrichten der relativen Quantifizierungseinstellungen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 31
■ Definieren des Laufprofils . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 32
■ Überprüfen des Pipettierprotokolls. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 34
■ Bestellen von Materialien für die Analyse . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 42
■ Beenden des Analysedesign-Assistenten . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 45
Hinweise
15
Kapitel 2 Experimentelles Design der relativen Standardkurven-Analyse
Kapitelübersicht
Kapitelübersicht
In diesem Kapitel wird erklärt, wie der Analysedesign-Assistent in der StepOne™Software für das experimentelle Design der relativen Standardkurven-Beispielanalyse
verwendet werden kann. Der Analysedesign-Assistent führt Sie durch die von Applied
Biosystems empfohlenen bewährten Schritte zur Eingabe von Designparametern für die
Beispielanalyse.
Arbeitsablauf der
Beispielanalyse
Der Arbeitsablauf für das experimentelle Design der mit diesem Einführungshandbuch
gelieferten Beispielanalyse ist nachfolgend abgebildet.
Hinweis: Erstellen Sie das Design der Beispielanalyse unter Verwendung des
Arbeitsablaufs des Analysedesign-Assistenten in der StepOne-Software. Beim Erstellen
Ihres eigenen Analysedesigns können Sie alternative Arbeitsabläufe auswählen (siehe
„Verwendung des Handbuchs für eigene Analysen“ auf Seite 10).
Analyse starten
5. Richten Sie die Standards ein.
8. Definieren Sie das Laufprofil.
11. Beenden Sie den Analysedesign-Assistenten.
Analyse beenden
Hinweise
16
Anlegen einer neuen Analyse
Legen Sie unter Verwendung des Analysedesign-Assistenten in der StepOne-Software
eine neue Analyse an.
Anlegen einer
Analyse
1. Doppelklicken Sie auf
(Shortcut der StepOne-Software), oder wählen Sie
StartAlle ProgrammeApplied BiosystemsStepOneStepOne v1.0.
2. Klicken Sie im Bildschirm Home (Startseite) auf
Design Wizard
(Analysedesign-Assistent), um den Analysedesign-Assistenten aufzurufen.
2
3. Unter „Software-Elemente“ finden Sie nachstehend weitere Informationen zur
Benutzung des Analysedesign-Assistenten.
SoftwareElemente
Die Elemente der StepOne-Software für den Design Wizard (Analysedesign-Assistent)
sind nachstehend dargestellt.
1. Menüleiste – Zeigt die in der Software verfügbaren Menüs an:
• File (Datei)
• Edit (Bearbeiten)
• Instrument (Gerät)
• Analysis (Auswertung)
• Tools (Extras)
• Help (Hilfe)
Hinweise
17
2. Symbolleiste – Zeigt die in der Software verfügbaren Tools an:
• New Experiment (Neue Analyse)
• Open (Öffnen)
• Close (Schließen)
• Send Experiment to Instrument (Analyse an Gerät senden)
• Download Experiment from Instrument (Analyse vom Gerät herunterladen)
3. Analysekopfzeile – Zeigt den Namen und Typ der Analyse und die Reagenzien für
die geöffnete Analyse an.
4. Navigationsbereich – Enthält Links zu allen Bildschirmen im AnalysedesignAssistenten:
• Experiment Properties (Analyseeigenschaften)
• Methods & Materials (Methoden und Materialien)
• Targets (Zielsequenzen)
• Relative Quantifizierungseinstellungen
• Standards
• Samples (Proben)
• Run Method (Laufprofil)
• Reaction Setup (Pipettierprotokoll)
• Materials List (Materialliste)
Hinweis: Der Analysedesign-Assistent zeigt anfangs den Analysetyp Quantitation Standard Curve (Quantifizierung - Standardkurve) an. Die verfügbaren Bildschirme
des Analysedesign-Assistenten können bei Auswahl eines anderen Analysetyps
variieren. Zum Beispiel wird der Bildschirm Relative Quantitation Settings
(Relative Quantifizierung – Einstellungen) erst angezeigt, wenn Sie den Analysetyp
der relativen Standardkurve oder des vergleichenden CT (∆∆CT) auswählen.
5. Analyse-Reiter – Für jede geöffnete Analyse wird ein Reiter angezeigt.
Hinweise
18
Definieren der Analyseeigenschaften
1
2
3
4
5
Geben Sie im Bildschirm Experiment Properties (Analyseeigenschaften)
kennzeichnende Angaben für die Analyse ein, und wählen Sie dann den Analysetyp,
den Sie einrichten wollen.
Informationen zur
Beispielanalyse
Bildschirm
Analyseeigenschaften
ausfüllen
• Die Analyse ist als Beispiel gekennzeichnet.
• Eine MicroAmp™ Fast Optical 48-Well Reaction Plate wird verwendet.
• Der Analysetyp ist Quantifizierung.
1. Klicken Sie in das Feld Experiment Name (Analysename), und geben Sie dann
Relative Standard Curve Example (relatives Standardkurven-Beispiel) ein.
Hinweis: Die Analysekopfzeile wird aktualisiert und zeigt den von Ihnen
eingegebenen Analysenamen an.
2. Klicken Sie in das Feld Barcode (Strichcode), und geben Sie dann den Strichcode
auf Ihrer PCR-Reaktionsplatte ein.
3. Klicken Sie in das Feld User Name (Benutzername), geben Sie dann den Example
User (Beispielbenutzer) ein.
Hinweise
19
4. Klicken Sie in das Feld Comments (Anmerkungen), geben Sie dann Standard
Curve Getting Started Guide Example (relatives Standardkurven-Beispiel aus
dem Einführungshandbuch) ein.
5. Wählen Sie als Analysetyp Quantitation (Quantifizierung) aus.
6. Klicken Sie auf Next> (Weiter).
1
2
3
4
5
Einrichtungshinweise
Beachten Sie bei der Einrichtung Ihrer eigenen relativen Standardkurven-Analyse
Folgendes:
• Geben Sie einen Analysenamen ein, der beschreibenden Charakter hat und sich
leicht merken lässt. Dieser Analysename wird automatisch als Analysedateiname
verwendet. Sie können bis zu 100 Zeichen in das Analysenamenfeld eingeben.
Hinweis: Sie dürfen im Analysenamenfeld die folgenden Zeichen nicht verwenden:
Schrägstrich (/), umgekehrter Schrägstrich (\), Größer-als-Zeichen (>), Kleiner-alsZeichen (<), Stern (*), Fragezeichen (?), Anführungszeichen ("), vertikale Linie (|),
Doppelpunkt (:) und Semikolon (;).
• Verwenden Sie MicroAmp™ Fast Optical 48-Well Reaction Plates, MicroAmp™ Fast
8-Tube Strips oder MicroAmp® Fast Reaction Tubes with Caps. Die FastVerbrauchsmaterialien können sowohl mit Fast- als auch mit Standardreagenzien
verwendet werden.
• (Optional) Geben Sie zur Identifizierung der PCR-Reaktionsplatte den Strichcode
ein. Sie können bis zu 100 Zeichen in das Strichcodefeld eingeben.
• (Optional) Geben Sie zur Identifizierung des Anwenders einen Benutzernamen ein.
Sie können bis zu 100 Zeichen in das Benutzernamensfeld eingeben.
• (Optional) Geben Sie Anmerkungen zur Beschreibung der Analyse ein. Sie können
bis zu 1000 Zeichen in das Anmerkungsfeld eingeben.
• Wählen Sie als Analysetyp Quantitation (Quantifizierung) aus.
Hinweise
20
Definieren der Methoden und Materialien
Weitere
Informationen
• Informationen zum Ausfüllen des Bildschirms Experiment Properties
(Analyseeigenschaften) finden Sie in der StepOne-Software-Hilfe, indem Sie auf
klicken oder F1 drücken.
• Informationen zu Verbrauchsmaterialien finden Sie unter „Unterstützte
Verbrauchsmaterialien“ auf Seite 3.
• Informationen zu Quantifizierungsanalysen finden Sie im Applied Biosystems
Wählen Sie im Bildschirm Methods & Materials (Methoden und Materialien)
Quantifizierungsmethode, Reagenzien, Heiz-/Kühlgeschwindigkeit und PCR-Template
für die Analyse aus.
Informationen zur
Beispielanalyse
Bildschirm
Methoden und
Materialien
ausfüllen
•
•
•
•
Verwenden Sie die Quantifizierungsmethode für relative Standardkurven.
Verwenden Sie TaqMan®-Reagenzien.
Verwenden Sie für den Lauf die Rampengeschwindigkeit FAST.
cDNA (präpariert aus Gesamt-RNA isoliert aus Leber-, Nieren- und Hirngewebe) ist
der Template-Typ. Bevor Sie ein cDNA-Template verwenden können, müssen Sie
die reverse Transkription durchführen, um die RNA in cDNA umzuwandeln (siehe
„Vorbereiten des Templates“ auf Seite 51).
1. Wählen Sie Relative Standard Curve (relative Standardkurve) als
Quantifizierungsmethode aus.
2. Wählen Sie als Reagenzien TaqMan® Reagents aus.
3. Wählen Sie als Rampengeschwindigkeit Fast (~40 Minuten für einen
vollständigen Lauf).
4. Wählen Sie als Template-Typ cDNA (komplementäre DNA).
Hinweise
21
1
2
3
4
Folgendes:
• Wählen Sie Relative Standard Curve (relative Standardkurve) als
Quantifizierungsmethode aus. In relativen Standardkurven-Analysen wird die
Expressionsänderung einer Zielsequenz in einer Probe relativ zur gleichen
Zielsequenz in einer Referenzprobe bestimmt. Zur Ermittlung der Ergebnisse wird
eine Standardkurve verwendet, die aus einer Verdünnungsreihe mit bekannter
Menge erstellt wird.Bei der Einrichtung Ihrer Reaktionsplatte sind bei relativen
Standardkurven-Methode Zielsequenzen, Standards, Proben, Referenzproben und
eine endogene Kontrolle notwendig.
• Wählen Sie die zu verwendenden Reagenzien aus:
– Wählen Sie TaqMan® Reagents aus, wenn Sie zur Detektion der Amplifikation
und zur Quantifizierung der Zielsequenzmengen in den Proben TaqManReagenzien verwenden möchten. TaqMan-Reagenzien bestehen aus zwei
Primern und einer TaqMan®-Sonde. Die Primer dienen der Amplifikation der
Zielsequenz. Die TaqMan-Sonde hybridisiert an die Zielsequenz und erzeugt bei
Amplifikation der Zielsequenz ein Fluoreszenzsignal.
WICHTIG! Applied Biosystems rät von der Verwendung von TAMRA™-Farbstoff
als Reporter oder Quencher für das StepOne™-System ab.
Hinweise
22
– Wählen Sie SYBR® Green Reagents aus, wenn Sie zur Detektion der
Amplifikation und zur Quantifizierung der Zielsequenzmengen in den Proben
SYBR Green-Reagenzien verwenden möchten. SYBR Green-Reagenzien
bestehen aus zwei Primern und dem SYBR Green-Farbstoff. Die Primer dienen
der Amplifikation der Zielsequenz. Der SYBR Green-Farbstoff erzeugt bei der
Bindung an doppelsträngige DNA ein Fluoreszenzsignal. Der SYBR GreenFarbstoff ist oftmals ein Bestandteil des SYBR Green Master Mix, der zur
Reaktion hinzugegeben wird. Gehen Sie bei Verwendung von SYBR GreenFarbstoff folgendermaßen vor:
Aktivieren Sie das Kontrollkästchen Include Melt Curve (Inklusive
Schmelzkurve), um eine Schmelzkurvenanalyse der amplifizierten Zielsequenz
auszuführen.
Wählen Sie als Heiz-/Kühlgeschwindigkeit Standard. Für SYBR GreenReagenzien steht kein Fast Master-Mix von Applied Biosystems zur Verfügung.
Hinweis: Sie können andere fluoreszenzbasierte Reagenzien auf dem StepOne-
System verwenden, jedoch müssen Sie dazu Ihre Analyse mit dem Arbeitsablauf
Advanced Setup (Setup für Fortgeschrittene) anstatt mit dem AnalysedesignAssistenten einrichten. Siehe „Setup für Fortgeschrittene“ auf Seite 200.
• Wählen Sie die geeignete Heiz-/Kühlgeschwindigkeit für den Gerätelauf aus:
– Wählen Sie Fast (~40 Minutes to Complete a Run) (Schnell (ca. 40 min. für
einen Lauf)), wenn Sie Fast-Reagenzien für die PCR-Reaktionen verwenden.
– Wählen Sie Standard (~2 Hours to Complete a Run) (Standard (ca. 2 Stunden
für einen Lauf)), wenn Sie Standardreagenzien für die PCR-Reaktionen
verwenden (einschließlich SYBR Green-Reagenzien und Standard-TaqManReagenzien).
• Wählen Sie das passende PCR-Template aus:
– Wählen Sie cDNA (complementary DNA) (cDNA (komplementäre DNA)),
wenn Sie eine 2-Schritt-RT-PCR durchführen und bereits eine reverse
Transkription zur Umwandlung der RNA in cDNA vorgenommen haben. Sie
geben komplementäre DNA zu den PCR-Reaktionen hinzu.
– Wählen Sie RNA, wenn Sie eine 1-Schritt-RT-PCR durchführen. Sie geben
Gesamt-RNA oder mRNA zu den PCR-Reaktionen hinzu.
– Wählen Sie gDNA (genomic DNA) (gDNA (genomische DNA)), wenn Sie die
gDNA bereits aus dem Gewebe oder der Probe extrahiert haben. Sie geben
gereinigte genomische DNA zu den PCR-Reaktionen hinzu.
Weitere
Informationen
• Informationen zum Ausfüllen des Bildschirms Methods & Materials (Methoden und
Materialien) finden Sie in der StepOne-Software-Hilfe, indem Sie auf
klicken
oder F1 drücken.
• Zur Verwendung der Quantifizierungsmethode für die vergleichende CT siehe
Kapitel 6 bis 9 in diesem Handbuch.
• Zur Verwendung der Standardkurven-Quantifizierungsmethode siehe StepOne™
Real-Time PCR System Einführungshandbuch zu Standardkurven-Analysen.
Hinweise
23
Einrichten der Zielsequenzen
• Informationen zu TaqMan- und SYBR Green-Reagenzien finden Sie im Applied
Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System-Reagenzienhandbuch.
• Informationen über PCR, einschließlich Singleplex- vs. Multiplex-PCR und 1Schritt- vs. 2-Schritt-RT-PCR, finden Sie im Applied Biosystems StepOne™ RealTime PCR System-Reagenzienhandbuch.
Geben Sie im Bildschirm Targets (Zielsequenzen) die Anzahl der Zielsequenzen ein, die
Sie in der PCR-Reaktionsplatte quantifizieren möchten, und richten Sie dann den Assay
für jede Zielsequenz ein.
Informationen zur
Beispielanalyse
Bildschirm
Targets
(Zielsequenzen)
ausfüllen
• Zwei Zielsequenzen werden in der Reaktionsplatte quantifiziert.
• Das Kontrollkästchen Set Up Standards (Standards einrichten) ist aktiviert. Wenn
dieses Kontrollkästchen aktiviert ist, zeigt die Software nach Fertigstellung des
Bildschirms Zielsequenzen automatisch den Bildschirm für die Standards an. Im
Bildschirm Standards können Sie eine Standardkurve für jeden Zielsequenz-Assay
einrichten (siehe „Einrichten der Standards“ auf Seite 27).
• Der Assay für Zielsequenz 1 wird als die von Ihnen untersuchte Zielsequenz
eingerichtet. In der Beispielanalyse ist dies humanes c-Myc (ein Onkoprotein, das
die Transkription von wachstums-assoziierten Genen aktiviert).
• Der Assay für Zielsequenz 2 wird als endogene Kontrolle eingerichtet. In der
Beispielanalyse ist dies das humane Glycerinaldehyd-3-Phosphat (GAPDH).
GAPDH dient als endogene Kontrolle, weil seine Expressionsstufen in der Regel
relativ stabil sind.
1. Klicken Sie in das Feld How many targets do you want to quantify in the
reaction plate? (Wie viele Zielsequenzen möchten Sie in der Reaktionsplatte
quantifizieren?), und geben Sie dann 2 ein.
Hinweis: Die Anzahl der Zeilen in der Tabelle mit den Zielsequenz-Assays wird
entsprechend der eingegebenen Zahl aktualisiert.
2. Aktivieren Sie das Kontrollkästchen Set Up Standards (Standards einrichten), um
für beide Zielsequenz-Assays Standards einzurichten.
Hinweis: Das Kontrollkästchen Set Up Standards (Standards einrichten) ist
standardmäßig aktiviert.
3. Richten Sie das Assay für Zielsequenz 1 ein:
a. Klicken Sie in das Eingabefeld Enter Target Name (Zielsequenzname
eingeben), und geben Sie dann c-Myc ein.
b. Wählen Sie im Dropdown-Menü Reporter FAM (Standardeinstellung).
Hinweise
24
c. Wählen Sie im Dropdown-Menü Quencher NFQ-MGB (Standardeinstellung).
d. Übernehmen Sie die Standardauswahl im Feld Color (Farbe).
eingeben), und geben Sie dann GAPDH ein.
Hinweis: Lassen Sie das Feld (Optional) Enter Gene Name (Optional: Gennamen
eingeben) für alle Zielsequenzen leer. Sie können nach der „Gene ID“ bzw. „Assay ID“
suchen, wenn Sie Ihre Materialien bestellen (siehe „Bestellen von Materialien für die
Analyse“ auf Seite 42).
1
3
4
2
Folgendes:
• Aktivieren Sie das Kontrollkästchen Set Up Standards (Standards einrichten).
Applied Biosystems empfiehlt, dass Sie für jeden Zielsequenz-Assay in der
Reaktionsplatte eine Standardkurve einrichten.
• Kennzeichnen Sie jeden Zielsequenz-Assay mit einem eindeutigen Namen und einer
Farbe. Sie können bis zu 100 Zeichen in das Feld für den Zielsequenznamen
eingeben.
Hinweise
25
• Wählen Sie für jede Probe eine endogene Kontrolle aus. Die endogene Kontrolle ist
eine Zielsequenz, die in allen zu untersuchenden Proben vorhanden ist. Sie sollte in
allen Probentypen gleich expremiert sein, unabhängig von Behandlung oder
Herkunft des Gewebes (Beispiele für endogene Kontrollen sind β-actin, GAPDH
und 18S ribosomal RNA [18S rRNA]). Die endogene Kontrolle wird zur
Normalisierung der PCR-Ergebnisse verwendet; die endogene Kontrolle
kompensiert variable Probenmengen, Nukleinsäure-Extraktionseffizienzen und
fehlerhafte Pipettenkalibrierung. Bitte beachten Sie dabei Folgendes:
– Eine endogene Kontrolle ist für jeden Probentyp erforderlich (zum Beispiel für
jedes Gewebe in einer verschiedene Gewebe vergleichenden Studie).
– Wenn Proben über mehrere Platten verteilt werden, muss jede Platte eine
endogene Kontrolle aufweisen. Darüber hinaus muss jede Plate eine endogene
Kontrolle für jeden Probentyp auf der Platte beinhalten.
• Wählen Sie den im Zielsequenz-Assay verwendeten Reporter-Farbstoff aus:
– Wählen Sie FAM, wenn der FAM™-Farbstoff an das 5′-Ende der TaqMan-Sonde
gebunden ist, die Sie zur Detektion der Zielsequenz verwenden.
– Wählen Sie JOE, wenn der JOE™-Farbstoff an das 5′-Ende der TaqMan-Sonde
– Wählen Sie VIC, wenn der VIC®-Farbstoff an das 5′-Ende der TaqMan-Sonde
– Wählen Sie SYBR, wenn Sie SYBR® Green-Farbstoff zur Detektion
doppelsträngiger DNA verwenden.
• Wählen Sie den im Zielsequenz-Assay verwendeten Quencher aus:
– Wählen Sie NFQ-MGB, wenn ein nicht fluoreszierender Quencher Minor
Groove Binder an das 3′-Ende der TaqMan-Sonde gebunden ist, die Sie zur
Detektion der Zielsequenz verwenden.
– Wählen Sie None (Keine), wenn Sie SYBR Green-Farbstoff verwenden.
WICHTIG! Applied Biosystems rät von der Verwendung von TAMRA™-Farbstoff
als Reporter oder Quencher für das StepOne™-System ab.
Weitere
Informationen
• Informationen zum Ausfüllen des Bildschirms Targets (Zielsequenzen) finden Sie
in der StepOne Software Help, indem Sie auf
• Zur Auswahl einer endogenen Kontrolle siehe Anwendungshinweis Using TaqMan®
Endogenous Control Assays to Select an Endogenous Control for Experimental
Studies.
Hinweise
26
Einrichten der Standards
Geben Sie im Bildschirm Standards die Anzahl der Punkte und Replikate für alle
Standardkurven in der Reaktionsplatte an. Geben Sie für jede Standardkurve die
Ausgangsmenge an, und wählen Sie den Verdünnungsfaktor aus.
Informationen zur
Beispielanalyse
Bildschirm
Standards
ausfüllen
• Für die Zielsequenz (c-myc) wird eine Standardkurve eingerichtet. Der für die
• Für die endogene Kontrolle (GAPDH) wird eine Standardkurve eingerichtet.
Der für die Standardverdünnungsreihe verwendete Standard ist eine cDNA-Probe in
bekannter Quantität von aus Lungengewebe isolierter RNA.
• Für jede Standardkurve:
– In der Standardkurve werden fünf Punkte verwendet.
– Für jeden Punkt werden drei Replikate verwendet. Replikate sind identische
Reaktionen mit identischen Reaktionskomponenten und -volumina.
– Die Ausgangsmenge ist 200 ng, und der Verdünnungsfaktor ist 1:10.
1. Klicken Sie in das Feld How many points do you need for each standard curve?
(Wie viele Punkte benötigen Sie für jede Standardkurve?), und geben Sie 5 ein.
2. Klicken Sie in das Feld How many replicates do you need for each point?
(Wie viele Replikate benötigen Sie für jeden Punkt?), und geben Sie dann 3 ein.
3. Definieren Sie den Bereich für Standardmengen für den c-Myc-Assay:
a. Klicken Sie in das Feld Enter Starting Quantity (Ausgangsmenge eingeben),
und geben Sie 200 ein.
b. Wählen Sie aus dem Dropdown-Menü Select Serial Factor (Verdünnungsfaktor
auswählen) 1:10.
4. Definieren Sie den Bereich für Standardmengen für den GAPDH-Assay:
a. Klicken Sie in das Feld Enter Starting Quantity (Ausgangsmenge eingeben),
b. Wählen Sie aus dem Dropdown-Menü Select Serial Factor (Verdünnungsfaktor
auswählen) 1:10.
5. Überprüfen Sie den Bereich Standard Curve Preview (Vorschau Standardkurve)
für jeden Assay. Die Standardkurven haben die folgenden Punkte: 200, 20, 2, 0,2
und 0,02.
Hinweise
27
1
2
3a
3b
5
Sofern erforderlich, nutzen Sie zur Ansicht
von GAPDH die Bildlaufleiste und führen Sie
anschließend die Schritte 4a und 4b aus.
Folgendes:
• Richten Sie für jede Zielsequenz in der Reaktionsplatte eine Standardkurve ein.
Die Zielsequenzen werden zuvor im Bildschirm Targets (Zielsequenzen) definiert
(„Einrichten der Zielsequenzen“ auf Seite 24).
• Geben Sie die Anzahl der Punkte für jede verwendete Standardkurve in der
Reaktionsplatte an. Applied Biosystems empfiehlt für jede Standardkurve eine
Mindestanzahl von fünf Verdünnungspunkten.
• Geben Sie für jeden Punkt in der Standardkurve die Anzahl der identischen
Reaktionen (Replikate) an. Applied Biosystems empfiehlt für jeden Punkt drei
Replikate.
• Da der Bereich der Standardmengen die Berechnungen der Amplifikationseffizienz
beeinflusst, sollten Sie sich einen geeigneten Bereich für die Standardmengen Ihres
Assays überlegen:
– Um präzisere Messungen der Amplifikationseffizienz zu erhalten, verwenden Sie
einen breiten Bereich für Standardmengen, der 5 bis 6 Log-Stufen umfasst. Wenn
Sie für die Standards einen breiteren Bereich für Standardmengen angeben,
müssen Sie ein PCR-Produkt oder ein hochkonzentriertes Template verwenden,
wie z. B. einen cDNA-Klon.
– Wenn Sie nur eine begrenzte Menge an cDNA-Template haben und/oder wenn
die Zielsequenz ein Transkript in geringer Kopienzahl ist oder wenn bekannt ist,
dass sie in einen bestimmten Bereich fällt, kann ein enger Bereich der
Standardmengen notwendig sein.
Hinweise
28
Einrichten der Proben
• Der Verdünnungsfaktor wird verwendet, um die Mengen in allen Punkten der
Standardkurve zu berechnen. Wenn Ihre Ausgangskonzentration die höchste
Konzentration ist, wählen Sie einen Verdünnungsfaktor wie z.B. 1:2, 1:3 usw.
Wenn Ihre Ausgangskonzentration die niedrigste Konzentration ist, wählen Sie
einen Konzentrationsfaktor wie 2✕, 3✕ usw.
Weitere
Informationen
• Informationen über das Ausfüllen des Bildschirms Standards finden Sie in der
StepOne-Software-Hilfe, indem Sie auf
• Informationen über Amplifikationseffizienz finden Sie in der Amplification
Efficiency of TaqMan® Gene Expression Assays Application Note.
Geben Sie im Bildschirm Samples (Proben) die Anzahl der Proben, Replikate und
Negativkontrollen ein, die Sie in die Reaktionsplatte aufnehmen möchten, geben Sie die
Probennamen ein, und wählen Sie dann die einzurichtenden Probe/ZielsequenzReaktionen aus.
Informationen zur
Beispielanalyse
Bildschirm
Samples (Proben)
ausfüllen
• Es werden zwei Proben verwendet: cDNA auf der Basis aus Leber- und
Nierengewebe isolierter RNA. Die Proben enthalten unbekannte Mengen des
c-Myc- (Zielsequenz) und des GAPDH-Gens (endogene Kontrolle).
• Es werden drei Replikate verwendet. Replikate sind identische Reaktionen mit
identischen Reaktionskomponenten und -volumina.
• Es werden drei Negativkontrollen verwendet. Negativkontrollreaktionen enthalten
Wasser statt der Proben und sollten keine Amplifikation zeigen.
1. Klicken Sie in das Feld How many samples do you want to test in the reaction
plate? (Wie viele Proben möchten Sie in der Reaktionsplatte testen?), und geben
Sie 2 ein.
Hinweis: Die Anzahl der Zeilen in der Tabelle mit den Proben wird entsprechend
der eingegebenen Zahl aktualisiert.
2. Klicken Sie in das Feld How many replicates do you need? (Wie viele Replikate
benötigen Sie?), und geben Sie 3 ein.
3. Klicken Sie in das Feld How many negative controls do you need for each target
assay? (Wie viele Negativkontrollen benötigen Sie für jeden Zielsequenz-Assay?),
Hinweise
29
4. Richten Sie Probe 1 ein:
a. Klicken Sie in das Feld Enter Sample Name (Probenname eingeben), und
geben Sie Liver (Leber) ein.
b. Übernehmen Sie die Standardauswahl im Feld Color (Farbe).
geben Sie Kidney (Niere) ein.
6. Wählen Sie All Sample/Target Reactions (Alle Probe/Zielsequenz-Reaktionen),
um alle Zielsequenzen in allen Proben zu testen.
7. Überprüfen Sie im Bereich Well Count (Well-Zählung), ob Folgendes erscheint:
• 12 unbekannte Wells
• 30 Standard-Wells
• 6 Negativkontroll-Wells
• 0 leere Wells
8. Unter dem Reiter View Plate Layout (Plattenbelegung ansehen):
a. Wählen Sie aus dem Dropdown-Menü Arrange Plate by (Platte belegen nach)
Rows (Zeilen) (Standardeinstellung).
b. Wählen Sie aus dem Dropdown-Menü Place Negative Controls in (Anordnung
der Negativkontrollen) Upper Left (Oben links) (Standardeinstellung).
8a
1
2
3
8b
4
5
6
7
Hinweise
30
Einrichten der relativen Quantifizierungseinstellungen
Folgendes:
• Kennzeichnen Sie jede Probe mit einem eindeutigen Namen und einer Farbe. Sie
können bis zu 100 Zeichen in das Probennamenfeld eingeben.
• Geben Sie die Anzahl der einzurichtenden identischen Reaktionen (Replikate) an.
Applied Biosystems empfiehlt für jede Probenreaktion drei Replikate.
• Geben Sie die Anzahl der einzurichtenden Negativkontrollreaktionen an. Applied
Biosystems empfiehlt für jeden Zielsequenz-Assay drei Negativkontrollreaktionen.
• Wählen Sie die gewünschte Kombination an Proben/Zielsequenz-Reaktionen aus:
– Wählen Sie All Sample/Target Reactions (Alle Proben/ZielsequenzReaktionen), um alle Zielsequenzen in allen Proben zu testen.
– Wählen Sie Specify Sample/Target Reactions (Proben/Zielsequenz-Reaktionen
angeben), um in jeder Probe die zu testenden Zielsequenzen festzulegen.
Hinweis: Im Analysedesign-Assistenten kann jede PCR-Reaktion nur eine Probe
und einen Zielsequenz-Assay enthalten.
Weitere
Informationen
Weitere Informationen zum Ausfüllen des Bildschirms Samples (Proben) finden Sie in
der StepOne-Software-Hilfe, indem Sie auf
Im Bildschirm Relative Quantitation Settings (Relative Quantifizierungseinstellungen)
wählen Sie die Referenzprobe und die endogene Kontrolle für die Durchführung der
relativen Quantifizierung aus.
Informationen zur
Beispielanalyse
Bildschirm
Relative
Quantifizierungseinstellungen
ausfüllen
• Niere wird als Referenzprobe verwendet.
• Als endogene Kontrolle wird GAPDH verwendet.
1. Wählen Sie aus dem Dropdown-Menü Which sample do you want to use as the
reference sample? (Welche Probe möchten Sie als Referenzprobe verwenden?)
Kidney (Niere) aus.
2. Wählen Sie aus dem Dropdown-Menü Which target do you want to use as the
endogenous control? (Welche Probe möchten Sie als endogene Kontrolle
verwenden?) GAPDH aus.
Hinweise
31
Definieren des Laufprofils
1
2
Folgendes:
• Wählen Sie eine Referenzprobe aus Ihren zuvor erstellten Proben aus („Einrichten
der Proben“ auf Seite 29). Die Amplifikationsergebnisse der Proben werden mit den
Amplifikationsergebnissen der Referenzproben verglichen, um die relative
Expression festzustellen.
• Wählen Sie eine endogene Kontrolle aus Ihren zuvor erstellten Zielsequenz-Assays
aus („Einrichten der Zielsequenzen“ auf Seite 24). Die Amplifikationsergebnisse
aus der endogenen Kontrolle werden verwendet, um die Differenzen in der zu jeder
Reaktion hinzugefügten Template-Menge bei den Amplifikationsergebnissen der
Zielsequenz zu normalisieren.
Weitere
Informationen
• Informationen über das Ausfüllen des Bildschirms Quantification Settings finden
Sie in der StepOne Software Help, indem Sie auf
• Zu Referenzproben (auch Kalibratoren genannt) und endogenen Kontrollen siehe
User Bulletin #2: Relative Quantitation of Gene Expression (Relative
Quantifizierung der Genexpression).
Überprüfen Sie im Bildschirm Run Method (Laufprofil) das Reaktionsvolumen und das
Thermoprofil für das Standardlaufprofil. Bei Bedarf können Sie das Standardprofil
bearbeiten oder es mit einem anderen aus der Laufprofil-Bibliothek ersetzen.
Informationen zur
Beispielanalyse
In der Beispielanalyse zur relativen Standardkurve wird das Standardlaufprofil
unverändert übernommen.
Hinweise
32
LaufprofilBildschirm
überprüfen
1. Klicken Sie entweder auf den Reiter Graphical View (Grafische Ansicht)
(Standardeinstellung) oder auf den Reiter Tabular View (Tabellarische Ansicht).
2. Überprüfen Sie, dass das Feld Reaction Volume Per Well (Reaktionsvolumen pro
Well) 20 µl anzeigt.
3. Überprüfen Sie, dass das Thermoprofil die nachfolgend abgebildete Halte- und
Zyklusphase anzeigt.
1
2
3
Folgendes:
• Geben Sie für das Reaktionsvolumen/Well eine Zahl zwischen 10 und 30 ein.
Das StepOne-System unterstützt Reaktionsvolumen zwischen 10 und 30 µl.
• Überprüfen Sie das Thermoprofil:
– Überprüfen Sie, dass das Thermoprofil für Ihre Reagenzien geeignet ist.
– Wenn Sie eine 1-Schritt-RT-PCR durchführen, fügen Sie einen Schritt für die
reverse Transkription ein.
Wenn Ihre Analyse ein anderes Thermoprofil erfordert, bearbeiten Sie das
Thermoprofil, oder ersetzen Sie das Laufprofil durch ein anderes Laufprofil aus der
Laufprofil-Bibliothek. Die Laufprofil-Bibliothek ist in der StepOne-Software
enthalten.
Weitere
Informationen
Weitere Informationen zur Laufprofil-Bibliothek oder zum Ausfüllen des Bildschirms
Run Method (Laufprofil) finden Sie in der StepOne-Software-Hilfe, indem Sie auf
Hinweise
33
Überprüfen des Pipettierprotokolls
Wählen Sie im Bildschirm Reaction Setup (Pipettierprotokoll) den Assay-Typ aus (wenn
Sie TaqMan-Reagenzien verwenden), prüfen Sie dann die berechneten Volumina für die
Vorbereitung der PCR-Reaktionen, Standardverdünnungsreihen und
Probenverdünnungen. Bei Bedarf können Sie das Reaktionsvolumen, überschüssige
Reaktionsvolumen, die Komponentenkonzentrationen, Standardkonzentrationen
und/oder die Konzentration der verdünnten Probe bearbeiten.
WICHTIG! Führen Sie diese Schritte für jeden Zielsequenz-Assay in der Reaktionsplatte
durch.
Informationen zur
Beispielanalyse
Pipettierprotokollbildschirm
ausfüllen
Es werden Applied Biosystems TaqMan® Gene Expression Assays verwendet.
Das Reaktionsvolumen pro Well beträgt 20 µl.
Zur Pipettierkorrektur beträgt das überschüssige Reaktionsvolumen 10 %.
Zu den Reaktionskomponenten gehören:
– TaqMan® Fast Universal PCR Master Mix (2-fach)
– c-Myc Assay Mix (20-fach)
– GAPDH Assay Mix (20-fach)
– Probe oder Standard
– Wasser
• Die Standardkonzentration in der Stammlösung beträgt 200 ng/µl.
• Die Konzentration der verdünnten Probe beträgt 5,0 ng/µl.
• Die Konzentration der Probenstammlösung beträgt 100 ng/µl.
•
•
•
•
Ausfüllen des Reiters Reaction Mix Calculations (Berechnung des Reaktionsmixes)
für den c-myc-Assay
1. Wählen Sie den Reiter Reaction Mix Calculations (Berechnung des
Reaktionsmixes) (Standardeinstellung).
2. Wählen Sie im Bereich Select Target (Zielsequenz auswählen) c-myc.
3. Wählen Sie aus dem Dropdown-Menü Assay Type (Assay-Typ) Inventorized/Made
to Order (Inventarisiert/auf Bestellung).
4. Überprüfen Sie, dass das Feld Reaction Volume Per Well (Reaktionsvolumen
pro Well) 20 µl anzeigt.
5. Überprüfen Sie, dass das Feld Excess Reaction Volume (Überschüssiges
Reaktionsvolumen) 10 % anzeigt.
Hinweise
34
6. Überprüfen Sie im Bereich Reactions for c-myc (Reaktionen für c-Myc) die
folgenden Einstellungen:
a. Überprüfen Sie, dass das Feld Master Mix Concentration (Master-Mix-
Konzentration) 2,0✕ anzeigt.
b. Überprüfen Sie, dass das Feld Assay Mix Concentration (Assay-Mix-
Konzentration) 20.0✕ anzeigt.
c. Überprüfen Sie die Komponenten und berechneten Volumina für die PCR-
Reaktionen:
Komponente
Volumen (µl) für 1 Reaktion
Master Mix (2-fach)
10.0
Assay-Mix (20-fach)
1.0
Probe (10-fach) oder
Standard
2,0 ‡
H2O
7,0
Gesamtvolumen
20,0
‡ Das Proben- oder Standardvolumen ist auf 10 % des gesamten
Reaktionsvolumens begrenzt.
7. Nehmen Sie im Bereich Standard Dilution Series for c-myc
(Standardverdünnungsreihe für c-Myc) die folgenden Einstellungen vor:
a. Klicken Sie in das Feld Standard Concentration in Stock
(Standardkonzentration in der Stammlösung), und geben Sie dann 200 ein.
b. Wählen Sie aus dem Dropdown-Menü der Maßeinheiten ng/µl
(Standardeinstellung).
c. Überprüfen Sie die berechneten Volumina für die Vorbereitung der
Standardverdünnungsreihe:
Verdünnungsstufe
Ursprung
UrsprüngVolumen des
liches
VerdünnungsVolumen
mittels (µl)
(µl)
Gesamtvolumen
(µl)
Standardkonzentration
(ng/µl)
1 [200]
Stammlösung
5,0
5,0
10,0
100,0
2 [20]
Verdünnung 1
1,0
9,0
10,0
10,0
3 [2]
Verdünnung 2
1,0
9,0
10,0
1,0
4 [0,2]
Verdünnung 3
1,0
9,0
10,0
0,1
5 [0,02]
Verdünnung 4
1,0
9,0
10,0
0,01
Hinweise
35
7a
7b
7c
für den GAPDH-Assay
2. Wählen Sie im Bereich Select Target (Zielsequenz auswählen) GAPDH.
4. Überprüfen Sie, dass das Feld Reaction Volume Per Well (Reaktionsvolumen
pro Well) 20 µl anzeigt.
Hinweise
36
6. Überprüfen Sie im Bereich Reactions for GAPDH (Reaktionen für GAPDH) die
Reaktionen:
Komponente
Master Mix (2-fach)
10,0
Assay-Mix (20-fach)
1,0
Probe (10-fach) oder
Standard
2,0 ‡
H2O
7,0
Gesamtvolumen
20,0
‡ Das Proben- oder Standardvolumen ist auf 10 % des gesamten
3
4
5
1
2
6a
6b
6c
Hinweise
37
7. Nehmen Sie im Bereich Standard Dilution Series for GAPDH
(Standardverdünnungsreihe für GAPDH) die folgenden Einstellungen vor:
a. Klicken Sie in das Feld Standard Concentration in Stock
(Standardkonzentration der Stammlösung), und geben Sie dann 200 ein.
b. Wählen Sie aus dem Dropdown-Menü der Maßeinheiten ng/µl
c. Überprüfen Sie die berechneten Volumina für die Vorbereitung der
Standardverdünnungsreihe:
Verdünnungsstufe
Ursprung
UrsprüngVolumen des
liches
VerdünnungsVolumen
mittels (µl)
(µl)
Gesamtvolumen
(µl)
(ng/µl)
1 [200]
Stammlösung
5,0
5,0
10,0
100,0
2 [20]
Verdünnung 1
1,0
9,0
10,0
10,0
3 [2]
Verdünnung 2
1,0
9,0
10,0
1,0
4 [0,2]
Verdünnung 3
1,0
9,0
10,0
0,1
5 [0,02]
Verdünnung 4
1,0
9,0
10,0
0,01
7a
7b
7c
Ausfüllen des Reiters Dilution Calculations (Berechnung der Probenverdünnung)
1. Wählen Sie den Reiter Sample Dilution Calculations (Berechnung der
Probenverdünnung) aus.
2. Klicken Sie in das Feld Diluted Sample Concentration (10✕ for Reaction Mix)
(Konzentration der verdünnten Probe (10-fach für Reaktionsmix)), und geben Sie
dann 5.0 (5,0) ein.
Hinweise
38
3. Wählen Sie aus dem Dropdown-Menü der Maßeinheiten ng/µl
4. Überprüfen Sie die berechneten Volumina für die Probenverdünnungen:
Konzentration der
Stammlösung
(ng/µl)
Probenvolumen (µl)
Volumen des
Verdünnungsmittels (µl)
Gesamtvolumen der
verdünnten
Probe (µl)
Leber
100,0
1,0
19,0
20,0
Niere
100,0
1,0
19,0
20,0
Probenname
1
2
3
4
Ausdrucken der Anleitung für das Pipettierprotokoll
Drucken Sie die ausführliche Anleitung für das Pipettierprotokoll aus, und speichern Sie
dann die Anleitung zur Kapitel 3, „Ansetzen der relativen Standardkurven-Reaktionen“.
1. Klicken Sie auf Print Reaction Setup (Pipettierprotokoll drucken).
1
2. Wählen Sie im Dialogfeld die folgenden Optionen aus:
• Detailed Reaction Setup Instructions (Ausführliche Anleitung für das
Pipettierprotokoll)
• Include Plate Layout (Inklusive Plattenbelegung)
• Use sample color (Probenfarbe verwenden)
Hinweise
39
3. Klicken Sie auf Print (Drucken).
2
3
4. Wählen Sie im Dialogfeld Print (Drucken) den Drucker und die Druckoptionen aus,
und klicken Sie dann auf OK.
Folgendes:
• Wenn Sie TaqMan-Reagenzien verwenden, wählen Sie den von Ihnen verwendeten
Assay-Typ aus:
– Wählen Sie Inventorized/Made to Order (Inventarisiert/auf Bestellung), wenn
Sie Applied Biosystems TaqMan® Gene Expression Assays (Inventorized or
Made to Order) oder Applied Biosystems Custom TaqMan® Gene Expression
Assays verwenden.
– Wählen Sie Custom (Benutzerdefiniert), wenn Sie mit der Primer Express®Software Ihre eigenen Assaydesigns einrichten.
• Sorgen Sie für überschüssiges Reaktionsvolumen, um den Verlust während der
Pipettierung auszugleichen. Applied Biosystems empfiehlt ein überschüssiges
Reaktionsvolumen von mindestens 10 %.
• Überprüfen Sie die Reaktionsmixkonzentrationen für jede Zielsequenz je nach
Bedarf:
– Bearbeiten Sie bei TaqMan-Reagenzien die Konzentrationen von Master-Mix
und Assay-Mix.
– Bearbeiten Sie SYBR Green-Reagenzien die Konzentrationen von Master Mix,
Forward Primer und Reverse Primer.
– Bearbeiten Sie bei einer 1-Schritt-RT-PCR die Konzentration der reversen
Transkriptase.
Hinweise
40
• Überprüfen Sie die Reaktionsmixkomponenten für jede Zielsequenz:
– Wenn Sie Fast PCR-Reaktionen ausführen, überprüfen Sie, dass Sie in den PCRReaktionen einen Fast Master-Mix verwenden.
– Wenn Sie Standard-PCR-Reaktionen ausführen, überprüfen Sie, dass Sie in den
PCR-Reaktionen einen Standard-Master-Mix verwenden.
– Überprüfen Sie bei einer 1-Schritt-RT-PCR, dass in den PCR-Reaktionen reverse
Transkriptase enthalten ist und ein spezifischer Puffer verwendet wird.
• Überprüfen Sie für jede Zielsequenz die Berechnungen der Standardverdünnungsreihe. Bearbeiten Sie bei Bedarf die Standardkonzentration in der
Stammlösung (einschließlich Maßeinheiten).
Hinweis: Für das Maßeinheitenfeld der Standard Concentration in Stock
(Standardkonzentration in der Stammlösung) können Sie aus dem Dropdown-Menü
ng oder µg auswählen oder eine andere Maßeinheit in das Feld eintragen (zum
Beispiel copies (Kopien), IU (IE, Internationale Einheiten), nmol, pg usw.). Die
Tabelle wird entsprechend Ihres Eintrags aktualisiert.
• Überprüfen Sie für jede Probe die Berechnungen der Probenverdünnung. Bearbeiten
Sie bei Bedarf die Konzentration der verdünnten Probe (einschließlich
Maßeinheiten) und die Konzentration der Stammlösung.
Weitere
Informationen
• Informationen über das Ausfüllen des Bildschirms Reaction Setup
(Pipettierprotokoll) finden Sie in der StepOne-Software-Hilfe, indem Sie auf
• Informationen über Applied Biosystems-Assays finden Sie in den folgenden
Protokollen:
– TaqMan® Gene Expression Assays Protocol
– Custom TaqMan® Gene Expression Assays Protocol.
Hinweise
41
Bestellen von Materialien für die Analyse
Überprüfen Sie im Bildschirm Materials List (Materialliste) die Liste der empfohlenen
Materialien für die Vorbereitung der PCR-Reaktionsplatte.
Sie können die empfohlenen Materialien im Applied Biosystems Store erwerben. Legen
Sie einen Einkaufskorb an, fügen Sie Artikel zur Einkaufsliste hinzu, und melden Sie
sich an, um Ihre Bestellung aufzugeben. Sie benötigen für den Zugriff auf den Applied
Biosystems Store einen unbeschränkten Internetzugang
Hinweis: Die StepOne-Software empfiehlt die zu bestellenden Materialien auf der
Grundlage Ihres Analysedesigns. Es wird angenommen, dass Sie zuerst Ihr
Analysedesign einrichten und Ihre Materialien bestellen, und dann die Reaktionsplatte
vorbereiten (Kapitel 3) und den Lauf starten (Kapitel 4), wenn Ihre Materialien
eintreffen.
Informationen zur
Beispielanalyse
Für die relative Standardkurven-Beispielanalyse werden die folgenden Materialien
empfohlen:
•
•
•
•
•
Bildschirm
Materialbestellung
ausfüllen
MicroAmp™ Optical 48-Well Adhesive Film
TaqMan® Fast Universal PCR Master Mix (2✕), No AmpErase® UNG
c-Myc-Assay Mix: Hs00153408_m1 (RefSeq NM_002467.3)
GAPDH Assay Mix: Hs99999905_m1 (RefSeq NM_002046.2)
1. So suchen Sie den Zielsequenz-Assay im Applied Biosystems Store:
a. Stellen Sie sicher, dass Ihr Computer mit dem Internet verbunden ist.
b. Klicken Sie in das Feld Enter Gene Name (Gennamen eingeben), geben Sie
c-myc ein, und klicken Sie dann auf Find Assay (Assay suchen).
c. Wählen Sie im Dialogfeld Find Assay Results (Ergebnisse der Assay-Suche)
die Zeile Hs00153408_m1 aus.
d. Klicken Sie in das Feld Enter Gene Name (Gennamen eingeben), geben Sie
GAPDH ein, und klicken Sie dann auf Find Assay (Assay suchen).
e. Wählen Sie im Dialogfeld Find Assay Results (Ergebnisse der Assay-Suche)
f. Klicken Sie auf Apply Assay Selection (Assay-Auswahl anwenden).
2. Füllen Sie den Bereich Experiment Materials List (Liste der Analysematerialien)
aus:
a. Wählen Sie aus dem Dropdown-Menü Display (Anzeigen) All Items (Alle
Artikel) aus (Standardeinstellung). Benutzen Sie bei Bedarf die rechte
Bildlaufleiste, um alle Artikel zu sehen.
Hinweise
42
b. Aktivieren Sie das Kontrollkästchen neben jedem der folgenden Artikel:
•
•
•
•
•
c-Myc-Assay Mix: Hs00153408_m1 (RefSeq NM_002467.3)
GAPDH Assay Mix: Hs99999905_m1 (RefSeq NM_002046.2)
Hinweis: Weitere Informationen zu den Artikeln erhalten Sie, wenn Sie auf
den Link der Bestellnummer klicken, der Sie mit dem Applied Biosystems
Store verbindet. Auf der Webseite geben Sie die Bestellnummer in das
Suchfeld (Search) ein und klicken dann auf
Go (Los!).
c. Klicken Sie auf Add Selected Items to Shopping List (Ausgewählte Artikel
zur Einkaufsliste hinzufügen).
3. Vergewissern Sie sich, dass die Experiment Shopping List (Einkaufsliste für die
Analyse) die gewünschten Materialien enthält und die Mengenangaben korrekt sind,
klicken Sie dann auf Order Materials in List (Materialien in der Liste bestellen).
1b,1d
2a
2c
2b
3
4. Geben Sie im Dialogfeld Order Materials - Log In (Materialien bestellen –
Anmelden) Ihren Benutzernamen und Ihr Passwort für den Applied Biosystems
Store ein, und klicken Sie dann auf Login and Submit (Anmelden und Bestellung
abschicken)
Hinweis: Wenn Sie beim Applied Biosystems Store noch kein Konto haben, klicken
Sie auf Register Now (Jetzt registrieren), um ein Kundenkonto anzulegen.
Hinweise
43
4
5. Nachdem Sie Ihre Bestellung abgegeben haben, klicken Sie auf Finish Designing
Experiment (Einrichtung des Analysedesigns fertigstellen).
Folgendes:
• Stellen Sie sicher, dass Ihr Computer über eine uneingeschränkte
Internetverbindung verfügt.
• Applied Biosystems empfiehlt die folgenden Versionen von Browser und Adobe®
Acrobat® Reader bei der Verwendung der Webseite von Applied Biosystems:
DesktopBetriebssystem
Netscape®
Navigator
Microsoft®
Internet Explorer
Adobe® Acrobat®
Reader
Windows®
98/NT/2000
ab v6.x
ab v6.x
ab v4.0
Macintosh® OS 9
oder neuer
ab v6.x
ab v5.2
ab v4.0
Hinweis: Stellen Sie sicher, dass Cookies und Java Script aktiviert sind, damit die
Webseite korrekt funktioniert.
• Wählen Sie alle Materialien aus, die Sie für Ihre Analyse benötigen, und fügen Sie
sie zu Ihrer Einkaufsliste hinzu.
Weitere
Informationen
Weitere Informationen zum Ausfüllen des Bildschirms Materials List (Materialliste)
finden Sie in der StepOne-Software-Hilfe, indem Sie auf
Hinweise
44
Beenden des Analysedesign-Assistenten
Um den Analysedesign-Assistenten zu beenden, überprüfen Sie die Plattenbelegung, und
wählen Sie dann eine Exit (Verlassen) Option.
Informationen zur
Beispielanalyse
Die StepOne-Software wählt die Anordnung der Wells in der Reaktionsplatte
automatisch aus. Für die relative Standardkurven-Beispielanalyse gilt Folgendes:
• Die Wells werden wie unten dargestellt angeordnet:
• Die Analyse wird so, wie sie ist, gespeichert und geschlossen.
Hinweis: Führen Sie zu diesem Zeitpunkt nicht den Lauf für die Beispielanalyse aus.
AnalysedesignAssistenten
fertigstellen
1. Überprüfen Sie im Fenster Review Plate for Experiment (Platte für Analyse
überprüfen) die Plattenbelegung. Überprüfen Sie, dass Folgendes vorhanden ist:
• 30 Standard-Wells
• 0 leere Wells
Hinweis: Sollte die Plattenbelegung fehlerhaft sein, klicken Sie auf Return to the
Wizard (Zurück zum Assistenten), und überprüfen Sie die eingegebenen Werte.
2. Klicken Sie auf Save Experiment (Analyse speichern).
Hinweise
45
2
1
3. Klicken Sie im Dialogfeld Save Experiment (Analyse speichern) auf Save
(Speichern), um den vorgeschlagenen Dateinamen und Zielpfad zu akzeptieren.
Die Beispielanalyse wird gespeichert und geschlossen, und Sie kehren zum
Bildschirm Home (Startseite) zurück.
Hinweis: Die Beispielanalyse wird standardmäßig im Ordner für Analysen unter
Applied Biosystems\StepOne System\experiments abgelegt.
3
Hinweise
46
Folgendes:
• Wählen Sie im Fenster Review Plate for Experiment (Platte für Analyse überprüfen)
die gewünschte Beendigungsoption:
– Klicken Sie auf Save Experiment (Analyse speichern), wenn Sie die Analyse
speichern und schließen möchten, ohne weitere Änderungen vorzunehmen oder
den Lauf zu starten.
– Klicken Sie auf Start Run for This Experiment (Lauf für diese Analyse
starten), wenn Sie die Analyse speichern und den Lauf starten möchten. Stellen
Sie sicher, dass die Reaktionsplatte in das Gerät eingelegt wurde.
– Klicken Sie auf Edit Plate Layout (Plattenbelegung bearbeiten), wenn Sie den
Arbeitsablauf Advanced Setup (Setup für Fortgeschrittene) zur Bearbeitung der
Plattenbelegung nutzen möchten.
– Klicken Sie auf Create Another Experiment Using the Design Wizard (Eine
weitere Analyse mit dem Analysedesign-Assistenten anlegen), wenn Sie die
Analyse speichern und schließen möchten, und dann mit dem AnalysedesignAssistenten eine neue Analyse anlegen möchten.
– Klicken Sie auf Return to the Wizard (Zurück zum Assistenten), wenn Sie zur
Analyse zurückkehren möchten, um mithilfe des Analysedesign-Assistenten
Änderungen vorzunehmen.
• Analysen werden standardmäßig im Ordner für Analysen unter Applied Biosystems\
StepOne System\experiments abgelegt. So können Sie diese Einstellungen ändern:
– Zur Änderung des Speicherpfads für eine bestimmte Analyse öffnen Sie im
Dialogfeld Save Experiment (Analyse speichern) das gewünschte
Zielverzeichnis.
– Zur Änderung des Standardspeicherpfads wählen Sie ToolsPreferences
(ToolsEinstellungen), wählen Sie dann den Reiter General (Allgemeines)
(Standardeinstellung). Wählen Sie im Feld Default Data Folder
(Standarddatenordner) den gewünschten Zielpfad.
Weitere
Informationen
Weitere Information zur Verwendung des Arbeitsablaufs Advanced Setup (Setup für
Fortgeschrittene) finden Sie unter „Setup für Fortgeschrittene“ auf Seite 200.
Hinweise
47
Hinweise
48
Kapitel 3
Ansetzen der relativen
Standardkurven-Reaktionen
■ Vorbereiten des Templates . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 51
■ Ansetzen der Probenverdünnungen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 53
■ Ansetzen der Standardverdünnungsreihe . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 55
■ Ansetzen des Reaktionsmixes. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 59
■ Vorbereiten der Reaktionsplatte . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 61
Hinweise
49
Kapitel 3 Ansetzen der relativen Standardkurven-Reaktionen
Kapitelübersicht
Kapitelübersicht
Dieses Kapitel beschreibt das Ansetzen der PCR-Reaktionen für die relative
Standardkurven-Analyse und gibt Hinweise zum Ansetzen von PCR-Reaktionen für Ihre
eigene relative Standardkurven-Analyse.
Arbeitsablauf der
Beispielanalyse
Der Arbeitsablauf für das Ansetzen der PCR-Reaktionen für die in diesem
Einführungshandbuch behandelte Beispielanalyse wird nachfolgend dargestellt.
Analyse starten
3. Setzen Sie die Standardverdünnungsreihe an.
4. Setzen Sie für jede Zielsequenz einen
Reaktionsmix an.
Analyse beenden
Hinweise
50
Vorbereiten des Templates
Bereiten Sie mithilfe des High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit das Template
für die PCR-Reaktionen (sowohl Proben als auch Standards) vor.
WICHTIG! Applied Biosystems empfiehlt für die reverse Transkription von Gesamt-
RNA in cDNA die Verwendung des High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit.
Die TaqMan® Gene Expression Assays sind zur Verwendung mit dem High-Capacity
cDNA Reverse Transcription Kit optimiert. Andere Protokolle wurden nicht auf ihre
Verwendbarkeit mit den TaqMan Gene Expression Assays geprüft.
Informationen zur
Beispielanalyse
Benötigte
Materialien
Bei der relativen Standardkurven-Beispielanalyse wird als Template für die PCRReaktionen cDNA verwendet, die mithilfe des High-Capacity cDNA Reverse
Transcription Kit aus Gesamt-RNA-Proben synthetisiert wurde.
• Für die Proben: aus Leber- und Nierengewebe isolierte Gesamt-RNA
• Für die Standards: aus Lungengewebe isolierte Gesamt-RNA
Hinweis: Sie müssen sowohl für die Proben als auch die Standards ein Template
vorbereiten.
• Ein High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit von Applied Biosystems:
Kit
Bestell-Nr.
High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit
(200 Reaktionen)
4368814
(1000 Reaktionen)
4368813
with RNase Inhibitor (200 Reaktionen)
4374966
4374967
Hinweis: Der High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit hieß früher High-
Capacity cDNA Archive Kit.
Hinweise
51
Template
vorbereiten
Verwenden Sie den High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit zur Synthetisierung
von einzelsträngigen cDNA aus den Gesamt-RNA-Proben. Führen Sie die folgenden
Schritte unter Beachtung der Anweisungen im Applied Biosystems High-Capacity cDNA
Reverse Transcription Kits Protocol aus:
1. Setzen Sie den RT-Master-Mix an.
CHEMISCHE GEFAHREN 10✕ RT-Puffer kann Reizungen
von Augen, Haut und Atemwegen verursachen. Lesen Sie das Sicherheitsdatenblatt,
und befolgen Sie die Handhabungsanweisungen. Tragen Sie eine geeignete
Schutzbrille sowie Schutzkleidung und -handschuhe.
2. Setzen Sie die cDNA-Reaktionen an.
3. Führen Sie auf einem Thermal Cycler eine reverse Transkription durch.
Vorbereitungshinweise
Bitte beachten Sie bei der Vorbereitung Ihrer eigenen relativen Standardkurven-Analyse
Folgendes:
• Applied Biosystems empfiehlt, zuerst DNA oder RNA aus dem Gewebe oder der
Probe zu extrahieren.
• Applied Biosystems empfiehlt die folgenden Templates:
– Komplementäre cDNA (cDNA): aus Gesamt-RNA mithilfe eines High-Capacity
cDNA Reverse Transcription Kit synthetisierte cDNA
– RNA: aus Gewebe oder Proben extrahierte gereinigte Gesamt-RNA oder mRNA
– Genomische DNA (gDNA): bereits aus Gewebe oder Proben extrahierte gDNA
Weitere
Informationen
• Informationen über die Vorbereitung der cDNA-Templates finden Sie im Applied
Biosystems High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kits Protocol
(BN 4375575). Das Protokoll ist nicht im Lieferumfang für die High-Capacity
cDNA Reverse Transcription Kits enthalten. Sie können das Protokoll von der
Applied Biosystems-Website Documents on Demand (Dokumente auf Anfrage)
herunterladen:
http://docs.appliedbiosystems.com/search.taf
• Informationen zur Vorbereitung von RNA- oder gDNA-Templates finden Sie im
Protokoll für die von Ihnen gewählten Reinigungsreagenzien. Eine Auflistung der
Reinigungsreagenzien von Applied Biosystems finden Sie auf der
Applied Biosystems-Website:
http://www.appliedbiosystems.com/
Hinweise
52
Ansetzen der Probenverdünnungen
Setzen Sie vor Zugabe der Proben zum endgültigen Reaktionsmix Probenverdünnungen
an. Verdünnen Sie die Proben mit den von derStepOne™-Software („Ausfüllen des
Reiters Dilution Calculations (Berechnung der Probenverdünnung)“ auf Seite 38)
berechneten Volumina.
Informationen zur
Beispielanalyse
• Probenverdünnungen sind nötig, weil das Probenvolumen in der StepOne-Software
auf 10 % des gesamten Reaktionsvolumens beschränkt ist. Das gesamte
Reaktionsvolumen beträgt 20 µl/Reaktion, d. h. das Probenvolumen beträgt
2 µl/Reaktion.
• Die Konzentration der Stammlösung beträgt 100 ng/µl. Nach Verdünnung der Probe
entsprechend der Tabelle zur Berechnung der Probenverdünnung hat die Probe eine
Konzentration von 5,0 ng/µl. Dies ist eine 10-fache Konzentration, wenn 2 µl zum
Volumen des endgültigen Reaktionsmixes von 20 µl dazugegeben werden. Die
Endreaktion hat dann eine 1-fache Konzentration.
• Die von der Software berechneten Volumina lauten:
Konzentration der
Stammlösung
(ng/µl)
Probenvolumen (µl)
Volumen des
Gesamtvolumen der
verdünnten
Probe (µl)
Leber
100,0
1,0
19,0
20,0
Niere
100,0
1,0
19,0
20,0
Probenname
Benötigte
Materialien
Probenverdünnungen
ansetzen
•
•
•
•
•
•
•
Wasser zur Verdünnung der Probe
Mikrozentrifugen-Röhrchen
Pipetten
Pipettenspitzen
Probenstammlösung
Vortexer
Zentrifuge
1. Beschriften Sie für jede verdünnte Probe ein separates Mikrozentrifugen-Röhrchen:
• Leber
• Niere
Hinweise
53
2. Geben Sie in jedes leere Röhrchen die erforderliche Wassermenge
(Verdünnungsmittel):
Reaktionsgefäß
Probenname
Volumen des
1
Leber
19,0
2
Niere
19,0
3. Geben Sie in jedes Röhrchen das erforderliche Volumen an Probenstammlösung:
Reaktionsgefäß
Probenname
Probenvolumen
(µl)
1
Leber
1,0
2
Niere
1,0
4. Vortexen Sie jede verdünnte Probe 3 bis 5 Sekunden, und zentrifugieren Sie die
Röhrchen kurz.
5. Legen Sie die verdünnten Proben solange auf Eis, bis Sie die Reaktionsplatte
vorbereitet haben.
Folgendes:
• Probenverdünnungen sind eventuell nötig, weil in der StepOne-Software das
Probenvolumen auf 10 % des gesamten Reaktionsvolumens beschränkt ist. Sie
müssen die Probenverdünnungen vor Zugabe der Proben zum endgültigen
Reaktionsmix ansetzen.
• Für eine optimale Leistung des TaqMan® Gene Expression Assays oder Custom
TaqMan® Gene Expression Assays verwenden Sie 10 bis 100 ng an cDNA-Template
pro 20-µl-Reaktion. Für Fast-Reagenzien empfiehlt Applied Biosystems 10 ng.
• Verwenden Sie TE-Puffer oder Wasser zur Verdünnung der Probe.
Weitere
Informationen
Weitere Informationen zu den Assays von Applied Biosystems finden Sie in den
folgenden Dokumenten:
• TaqMan® Gene Expression Assays Protocol
• Custom TaqMan® Gene Expression Assays Protocol.
Hinweise
54
Ansetzen der Standardverdünnungsreihe
Bereiten Sie die Standardverdünnungsreihe mit den von der StepOne-Software
berechneten Volumina vor („Ausfüllen des Reiters Reaction Mix Calculations
(Berechnung des Reaktionsmixes) für den c-myc-Assay“ auf Seite 34 und „Ausfüllen des
Reiters Reaction Mix Calculations (Berechnung des Reaktionsmixes) für den GAPDHAssay“ auf Seite 36):
Informationen zur
Beispielanalyse
• Die Standardkonzentration in der Stammlösung beträgt 200 ng/µl.
• Die von der Software für die c-Myc- und GAPDH-Assays berechneten Volumina
lauten:
Ursprung
Ursprüngliches
Volumen (µl)
Volumen des
Gesamtvolumen
(µl)
(ng/µl)
1 [200]
Stammlösung
5,0
5,0
10,0
100,0
2 [20]
Verdünnung 1
1,0
9,0
10,0
10,0
3 [2]
Verdünnung 2
1,0
9,0
10,0
1,0
4 [0,2]
Verdünnung 3
1,0
9,0
10,0
0,1
5 [0,02]
Verdünnung 4
1,0
9,0
10,0
0,01
Verdünnungsstufe
Benötigte
Materialien
Ansetzen der
Standardverdünnungsreihe für den
c-Myc-Assay
•
•
•
•
•
•
•
Wasser zur Verdünnung der Standards
Pipetten
Pipettenspitzen
Standardstamm
Vortexer
Zentrifuge
1. Beschriften Sie für jeden Standard ein separates Mikrozentrifugen-Röhrchen:
• c-Myc Std. 1
• c-Myc Std. 2
• c-Myc Std. 3
• c-Myc Std. 4
• c-Myc Std. 5
Hinweise
55
Reaktionsgefäß
Name des Standards
Hinzuzufügendes
Verdünnungsmittelvolumen (µl)
1
c-Myc Std. 1
5,0
2
c-Myc Std. 2
9,0
3
c-Myc Std. 3
9,0
4
c-Myc Std. 4
9,0
5
c-Myc Std. 5
9,0
3. Setzen Sie Verdünnung 1 im Röhrchen mit dem c-Myc Std. 1 an:
a. Vortexen Sie die Stammlösung 3 bis 5 Sekunden, und zentrifugieren Sie das
Röhrchen kurz.
b. Geben Sie mit einer neuen Pipette 5,0 µl Stamm in das Röhrchen mit dem c-
Myc Std. 1.
c. Vortexen Sie Std. 1 für 3 bis 5 Sekunden, und zentrifugieren Sie das
Reaktionsgefäß kurz.
a. Geben Sie mit einer neuen Pipette 1,0 µl der Verdünnung 1 in das Röhrchen mit
dem c-Myc Std. 2.
b. Vortexen Sie Std. 2 für 3 bis 5 Sekunden, und zentrifugieren Sie das
dem c-Myc Std. 3.
dem c-Myc Std. 4.
Hinweise
56
dem c-Myc Std. 5.
8. Legen Sie die Standards solange auf Eis, bis Sie die Reaktionsplatte vorbereitet
haben.
Ansetzen der
Standardverdünnungsreihe für den
GAPDH-Assay
1. Beschriften Sie für jeden Standard ein separates Mikrozentrifugen-Röhrchen:
• GAPDH Std. 1
• GAPDH Std. 2
• GAPDH Std. 3
• GAPDH Std. 4
• GAPDH Std. 5
Reaktionsgefäß
Name des Standards
Hinzuzufügendes
Verdünnervolumen
(µl)
1
GAPDH Std. 1
5,0
2
GAPDH Std. 2
9,0
3
GAPDH Std. 3
9,0
4
GAPDH Std. 4
9,0
5
GAPDH Std. 5
9,0
3. Setzen Sie Verdünnung 1 im Röhrchen mit dem GAPDH Std. 1 an:
a. Vortexen Sie die Stammlösung 3 bis 5 Sekunden, und zentrifugieren Sie das
Röhrchen kurz.
b. Geben Sie mit einer neuen Pipette 5,0 µl Stamm in das Röhrchen mit dem
GAPDH Std. 1.
c. Vortexen Sie Std. 1 für 3 bis 5 Sekunden, und zentrifugieren Sie das
dem GAPDH Std. 2.
Hinweise
57
dem GAPDH Std. 3.
dem GAPDH Std. 4.
dem GAPDH Std. 5.
8. Legen Sie die Standards solange auf Eis, bis Sie die Reaktionsplatte vorbereitet
haben.
Folgendes:
• Standardkurven sind für eine korrekte Analyse der Laufdaten von entscheidender
Bedeutung.
• Etwaige Fehler und Ungenauigkeiten bei der Erstellung der Verdünnungen wirken
sich direkt auf die Qualität der Ergebnisse aus.
• Die Genauigkeit der Ergebnisse hängt von der Qualität der Pipetten und
Pipettenspitzen sowie der sorgfältigen Abmessung und Mischung der Verdünnungen
ab.
• Verwenden Sie TE-Puffer oder Wasser zur Verdünnung der Standards.
Hinweise
58
Ansetzen des Reaktionsmixes
Setzen Sie den Reaktionsmix mit den von der StepOne-Software („Ausfüllen des Reiters
Reaction Mix Calculations (Berechnung des Reaktionsmixes) für den c-myc-Assay“ auf
Seite 34 und „Ausfüllen des Reiters Reaction Mix Calculations (Berechnung des
Reaktionsmixes) für den GAPDH-Assay“ auf Seite 36) berechneten Komponenten und
Volumina an.
Hinweis: Die Software berechnet alle Komponenten für die PCR-Reaktionen. Für das
Ansetzen des in diesem Abschnitt beschriebenen Reaktionsmixes benötigen Sie jedoch
nur Master-Mix, Assay-Mix und Wasser. Geben Sie die Probe oder den Standard hinzu,
wenn Sie die Reaktionsplatte vorbereiten (siehe „Vorbereiten der Reaktionsplatte“ auf
Seite 61).
Informationen zur
Beispielanalyse
• Der Reaktionsmix besteht aus folgenden Komponenten:
– c-Myc Assay Mix (20-fach)
– Wasser
• Die von der Software für die beiden Zielsequenz-Assays berechneten Volumina
lauten:
Komponente
Volumen (µl) für
1 Reaktion
Master Mix (2-fach)
10,0
Assay-Mix (20-fach)
1,0
H2O
7,0
Gesamtvolumen
18,0
Hinweis: Die Probe oder der Standard wird zu diesem Zeitpunkt nicht dazugegeben.
Benötigte
Materialien
•
•
•
•
•
Pipetten
Pipettenspitzen
Komponenten für den Reaktions-Mix (oben aufgelistet)
Zentrifuge
Hinweise
59
Reaktionsmix
ansetzen
WICHTIG! Setzen Sie für jeden Zielsequenz-Assay einen eigenen Reaktionsmix an.
1. Beschriften Sie für jeden Reaktionsmix ein Röhrchen von geeigneter Größe:
• c-Myc-Reaktionsmix
• GAPDH-Reaktionsmix
2. Geben Sie für den c-Myc-Assay die erforderlichen Volumina von jeder Komponente
in das Röhrchen mit dem c-Myc-Reaktionsmix:
Volumen (µl) für
1 Reaktion
Volumen (µl) für
24 Reaktionen
(Plus 10 %
Überschuss)
TaqMan® Fast Universal PCR
Master Mix (2-fach)
10,0
264,0
c-Myc Assay Mix (20-fach)
1,0
26,4
Wasser
7,0
184,8
Gesamtvolumen des
Reaktionsmixes
18,0
475,2
Komponente
3. Geben Sie für den GAPDH-Assay die erforderlichen Volumina von jeder
Komponente in das Röhrchen mit dem GAPDH-Reaktionsmix:
Volumen (µl) für
1 Reaktion
Volumen (µl) für
24 Reaktionen
(Plus 10 %
Überschuss)
Master Mix (2-fach)
10,0
264,0
GAPDH Assay Mix (20-fach)
1,0
26,4
Wasser
7,0
184,8
Gesamtvolumen des
Reaktionsmixes
18,0
475,2
Komponente
4. Durchmischen Sie den Reaktionsmix vorsichtig, indem Sie die Pipette von oben
nach unten bewegen, und verschließen Sie das Röhrchen anschließend.
5. Zentrifugieren Sie die Reaktionsgefäße kurz, um Luftblasen zu entfernen.
6. Legen Sie die Reaktionsmixe solange auf Eis, bis Sie die Reaktionsplatte vorbereitet
haben.
Hinweise
60
Vorbereiten der Reaktionsplatte
Folgendes:
• Wenn Sie mehr als eine Zielsequenz analysieren möchten, bereiten Sie für jede
Zielsequenz einen separaten Reaktionsmix vor.
• Berücksichtigen Sie bei Ihren Berechnungen einen Volumenüberschuss, mit dem
Sie die beim Transfer von Reagenzien auftretenden Verluste kompensieren können.
Applied Biosystems empfiehlt einen Volumenüberschuss von mindestens 10 %.
• Verwenden Sie alle erforderlichen Komponenten.
• Setzen Sie die Reagenzien entsprechend der Herstelleranweisungen an.
• Schützen Sie den Assay-Mix bis zu seiner Verwendung im Gefriergerät vor Licht.
Übermäßige Lichteinstrahlung kann die Funktion der Fluoreszenzsonden
beeinträchtigen.
• Führen Sie vor der Ausführung folgende Schritte durch:
– Schütteln Sie die Flasche, um den Master-Mix gründlich zu mischen.
– Suspendieren Sie den Assay erneut durch Vortexen, und zentrifugieren Sie das
– Legen Sie alle gefrorenen Proben auf Eis, um sie aufzutauen. Wenn sie aufgetaut
sind, suspendieren Sie die Proben erneut durch Vortexen, und zentrifugieren Sie
die Reaktionsgefäße kurz.
Weitere
Informationen
Weitere Informationen über das Ansetzen des Reaktionsmixes finden Sie in den
jeweiligen Protokollen der Reagenzien, die Sie bei den PCR-Reaktionen verwenden:
• Custom TaqMan® Gene Expression Assays Protocol
Setzen Sie die Reaktionen für jede Replikat-Gruppe an, und transferieren Sie sie auf die
Reaktionsplatte. Verwenden Sie die in der StepOne-Software angezeigte
Plattenbelegung.
Informationen zur
Beispielanalyse
• Es wird eine MicroAmp™ Fast Optical 48-Well Reaction Plate verwendet.
• Das Reaktionsvolumen beträgt 20 µl/Well.
• Die Reaktionsplatte enthält die folgenden Wells:
– 12 unbekannte Wells
– 30 Standard-Wells
– 6 Negativkontroll-Wells
– 0 leere Wells
Hinweise
61
• Die folgende Plattenbelegung wird von der StepOne-Software automatisch erstellt
und verwendet:
Benötigte
Materialien
Reaktionsplatte
vorbereiten
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
Pipetten
Pipettenspitzen
c-Myc-Reaktionsmix (von Seite 60)
GAPDH-Reaktionsmix (von Seite 60)
Wasser
c-Myc-Standards (von Seite 55)
GAPDH-Standards (von Seite 57)
Proben (von Seite 53)
Zentrifuge
1. Setzen Sie für jede Zielsequenz die Negativkontrollreaktionen an:
a. Geben Sie die unten angegebenen Volumina von Reaktionsmix und Wasser in
ein Reaktionsgefäß von geeigneter Größe.
Reaktionsgefäß
Reaktionsmix
ReaktionsmixVolumen (µl)
Wasservolumen
(µl)
1
c-Myc-Reaktionsmix
59,4
6,6
2
GAPDHReaktionsmix
59,4
6,6
Hinweise
62
b. Durchmischen Sie den Reaktionsmix vorsichtig, indem Sie die Pipette von
oben nach unten bewegen.
c. Zentrifugieren Sie das Reaktionsgefäß kurz, um Luftblasen zu entfernen.
d. Geben Sie je 20 µl der Negativkontrollreaktion in die entsprechenden Wells in
der Reaktionsplatte.
2. Setzen Sie für jede Replikat-Gruppe die Standardreaktionen an:
a. Geben Sie die unten angegebenen Volumina von Reaktionsmix und
Standardreaktion in Reaktionsgefäß von geeigneter Größe.
Reaktionsmi
x-Volumen
(µl)
Standard
Standardvolumen (µl)
c-MycReaktionsmix
59,4
c-Myc Std. 1
6,6
c-Myc Std. 2
c-MycReaktionsmix
59,4
c-Myc Std. 2
6,6
3
c-Myc Std. 3
c-MycReaktionsmix
59,4
c-Myc Std. 3
6,6
4
c-Myc Std. 4
c-MycReaktionsmix
59,4
c-Myc Std. 4
6,6
5
c-Myc Std. 5
c-MycReaktionsmix
59,4
c-Myc Std. 5
6,6
6
GAPDH Std 1 GAPDHReaktionsmix
59,4
GAPDH Std 1
6,6
7
59,4
GAPDH Std 2
6,6
8
59,4
GAPDH Std 3
6,6
9
59,4
GAPDH Std 4
6,6
10
59,4
GAPDH Std 5
6,6
Reaktionsgefäß
Standardreaktion
1
c-Myc Std. 1
2
Reaktionsmix
b. Durchmischen Sie die Reaktionen vorsichtig, indem Sie die Pipette von oben
nach unten bewegen, und verschließen Sie dann die Reaktionsgefäße.
c. Zentrifugieren Sie die Reaktionsgefäße kurz, um Luftblasen zu entfernen.
d. Geben Sie je 20 µl der Standardreaktion in die entsprechenden Wells in der
Reaktionsplatte.
Hinweise
63
3. Setzen Sie für jede Replikat-Gruppe die Reaktionen für die unbekannten Wells an:
a. Geben Sie die unten angegebenen Volumina von Reaktionsmix und Probe in
Reaktionsgefäße von geeigneter Größe.
Reaktions- Unbekannte
gefäß
Reaktion
Reaktionsmix
Probe
Probenvolumen (µl)
1
c-Myc-Leber
c-MycReaktionsmix
59,4
Leber
6,6
2
c-Myc-Niere
c-MycReaktionsmix
59,4
Niere
6,6
3
GAPDHLeber
GAPDHReaktionsmix
59,4
Leber
6,6
4
GAPDHNiere
GAPDHReaktionsmix
59,4
Niere
6,6
d. Geben Sie je 20 µl der unbekannten (Proben)reaktion in die entsprechenden
Wells in der Reaktionsplatte.
4. Versiegeln Sie die Reaktionsplatte mit optischem Klebefilm.
5. Zentrifugieren Sie die Reaktionsplatte kurz, um Luftblasen zu entfernen.
6. Legen Sie die Reaktionsplatte im Dunkeln solange auf Eis, bis Sie zur Ausführung
des Laufs bereit sind.
Folgendes:
• Stellen Sie sicher, dass Sie die richtigen Verbrauchsmaterialien verwenden.
• Stellen Sie sicher, dass die Anordnung der PCR-Reaktionen mit der in der StepOneSoftware angezeigten Plattenbelegung übereinstimmt. Sie haben die folgenden
Möglichkeiten:
– Entweder Sie akzeptieren die von der Software automatisch erstellte
Plattenbelegung
oder
– Sie ändern die Plattenbelegung in der Software mithilfe des Setups für
Fortgeschrittene (Advanced Setup).
Hinweise
64
Weitere
Informationen
• Weitere Informationen über die Vorbereitung der Reaktionsplatte finden Sie in den
– Custom TaqMan® Gene Expression Assays Protocol
• Informationen zu Verbrauchsmaterialien finden Sie im Abschnitt „Unterstützte
• Informationen über die Verwendung des Setups für Fortgeschrittene zur Änderung
der Plattenbelegung finden Sie im Abschnitt „Setup für Fortgeschrittene“ auf
Seite 200.
Hinweise
65
Hinweise
66
Kapitel 4
Durchführung der relativen
■ Vorbereiten des Laufs . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 69
■ Aktivieren der Benachrichtigungen (optional) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 71
■ Starten des Laufs. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 73
■ Überwachen des Laufs . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 76
■ Entnahme der Reaktionsplatte und Datenübertragung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 86
Hinweise
67
Kapitel 4 Durchführung der relativen Standardkurven-Analyse
Kapitelübersicht
Kapitelübersicht
In diesem Kapitel wird die Durchführung eines Laufs auf dem Applied Biosystems
StepOne™ Real-Time PCR System erklärt.
Arbeitsablauf der
Beispielanalyse
Der Arbeitsablauf für die mit diesem Einführungshandbuch gelieferte Beispielanalyse
wird nachfolgend dargestellt.
Analyse starten
Analyse vorbereiten (Kapitel 3)
1. Bereiten Sie den Lauf vor.
2. Aktivieren Sie die Benachrichtigungseinstellungen.
3. Starten Sie den Lauf.
4. Überwachen Sie den Lauf.
Analyse beenden
Hinweise
68
Vorbereiten des Laufs
Bereiten Sie den Lauf vor, indem Sie die Analyse öffnen und die versiegelte MicroAmp™
Fast Optical 48-Well Reaction Plate in das StepOne™-System einlegen.
Beispielanalyse
öffnen
1. Wenn die StepOne™-Software nicht bereits gestartet wurde, klicken Sie zweimal auf
(StepOne-Software-Shortcut), oder wählen Sie
StartAlle ProgrammeApplied Biosystems StepOneStepOne v1.0.
2. Klicken Sie im Bildschirm Home (Startseite) auf Open (Öffnen).
3. Gehen Sie im Dialogfeld Open (Öffnen) auf den Ordner experiments (Analysen)
(Standard).
4. Doppelklicken Sie auf Relative Standard Curve Example (relatives
Standardkurvenbeispiel), um die in Kapitel 2 erstellte Datei der Beispielanalyse
zu öffnen.
2
3
4
Hinweise
69
Einlegen der
Reaktionsplatte
VERLETZUNGSGEFAHR Beim Betrieb des Systems kann die
Temperatur des Heizblocks auf über 100 °C ansteigen. Wenn das System vor kurzem in
Betrieb war, fassen Sie es erst wieder an, wenn der Heizblock auf Zimmertemperatur
abgekühlt ist.
WICHTIG! Tragen Sie beim Arbeiten mit der Reaktionsplatte pulverfreie Handschuhe.
1. Öffnen Sie das Schubfach des Geräts.
2. Stellen Sie die Reaktionen in den Heizblock.
Die Ausrichtung der Reaktionsplatte hängt von der Art des verwendeten
Verbrauchsmaterials ab:
• Wenn Sie eine Reaktionsplatte verwenden, ist diese mit dem A1-Well hinten
links in den Heizblock einzulegen.
• Wenn Sie Reaktionsgefäßstreifen verwenden, legen Sie die Streifen in den
Heizblock ein.
A1
3. Schließen Sie vorsichtig das Schubfach des Geräts.
Hinweise
70
Aktivieren der Benachrichtigungen (optional)
Bei Aktivierung der Benachrichtigungseinstellungen werden Sie von der StepOneSoftware per E-Mail darauf aufmerksam gemacht, wenn das StepOne-System
den Lauf startet und beendet oder beim Lauf ein Fehler auftritt. Die Aktivierung der
Benachrichtigungseinstellungen ist optional und wirkt sich nicht auf die Leistung des
StepOne™-Systems oder die Dauer des Laufs aus.
WICHTIG! Die Funktion Benachrichtigungseinstellungen ist nur dann verfügbar, wenn
der von Ihnen verwendete Computer mit dem StepOne-System verbunden und an ein
Ethernet-Netzwerk angeschlossen ist.
Hinweis: Das Benachrichtigungssystem ist auch für Computer verfügbar, die ein
StepOne-System fernüberwachen. Weitere Informationen über Fernüberwachung finden
Sie unter „Fenüberwachung“ auf Seite 82.
Informationen zur
Beispielanalyse
Benachrichtigungseinstellungen
einrichten
Bei der Beispielanalyse ist die StepOne-Software so eingerichtet, dass 3 Anwender
benachrichtigt werden (Scientist (Wissenschaftler), Supervisor (Laborleiter) und
Technician (Techniker) @ mycompany.com), wenn das StepOne-System den Lauf
beendet oder während des Betriebs Fehler auftreten. Der für das Beispiel verwendete
SMTP-Server (www.mycompany.com) verwendet SSL-Verschlüsselung (Secure Sockets
Layer) und fordert vom Anwender eine Authentifizierung.
1. Klicken Sie im Navigationsbereich der StepOne-Software auf
2. Klicken Sie auf
Run (Lauf).
Notification Settings (Benachrichtigungseinstellungen).
3. Wählen Sie Enable Notifications (Benachrichtigungen aktivieren).
4. Legen Sie die Ereignisse fest, bei denen Benachrichtigungen verschickt werden
sollen:
a. Wählen Sie Instrument Error (Gerätefehler).
b. Wählen Sie Run Completed (Lauf abgeschlossen).
5. Machen Sie im Feld Enter e-mail addresses for notifications (E-Mail-Adressen für
Benachrichtigungen eingeben) die folgenden Eingaben:
[email protected], [email protected],
[email protected].
6. Geben Sie in das Feld Outgoing Mail Server (SMTP) (Ausgangsserver)
smtp.mycompany.com ein.
7. Legen Sie die Authentifizierungseinstellungen fest:
a. Wählen Sie No (Nein) bei Server requires authentication (Server verlangt
Authentifizierung).
b. Geben Sie in das Feld User Name (Benutzername) supervisor ein.
Hinweise
71
c. Geben Sie in das Feld Password (Passwort) password ein.
3
4
5
6
7a
7b
7c
Hinweise
für den Lauf
So richten Sie die automatische Benachrichtigung im StepOne-System ein:
• Ihr StepOne-System muss für die Verwendung in einem Netzwerk konfiguriert sein.
Siehe Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System- Handbuch zu
Installation, Netzwerkeinbindung und Wartung.
• Legen Sie die Ereignisse fest, über die Sie benachrichtigt werden möchten:
– Instrument Error (Gerätefehler) – Veranlasst das StepOne-System, die
angegebenen E-Mail-Empfänger über alle vom StepOne-System während eines
Laufs festgestellten Fehler zu informieren.
– Run Started (Lauf wurde gestartet) – Veranlasst das StepOne-System, die
E-Mail-Empfänger über jeden gestarteten Systemlauf zu informieren.
– Run Completed (Lauf ist abgeschlossen) – Veranlasst das StepOne-System,
die E-Mail-Empfänger über jeden abgeschlossenen Systemlauf zu informieren.
• Erfragen Sie die E-Mail-Adressen der Personen, die benachrichtigt werden sollen.
WICHTIG! Trennen Sie die Adressen durch Kommata voneinander ab ( , ).
• Fragen Sie Ihren Systemadministrator oder die IT-Abteilung nach folgenden
Informationen:
– Netzwerkadresse eines SMTP-Servers (Simple Mail Transfer Protocol) im LAN
– Ein Benutzername und ein Passwort für den Server, falls für den Zugriff
erforderlich.
– Die SSL-Einstellung (Secure Sockets Layer) des Servers (Ein oder Aus)
Hinweise
72
Starten des Laufs
Starten des Laufs
Starten Sie den Lauf entsprechend der Konfiguration Ihres StepOne-Systems. Wie Sie
den Lauf starten, hängt von der Konfiguration Ihres StepOne-Systems ab:
Konfiguration
Computergesteuterte
Konfiguration
starten
Beschreibung
Siehe...
Computergesteuert
Das gelbe StepOne-Systemkabel verbindet den
Computer mit dem StepOne-System.
„Computergesteuterte
Konfiguration starten“
unten
Eigenständig
• Der Computer und das StepOne-System sind
nicht miteinander verbunden, oder
• Der Computer und das StepOne-System sind
mit demselben Netzwerk verbunden.
„Eigenständige
Konfiguration starten“
auf Seite 74
Wenn Ihr Computer über das StepOne-Systemkabel direkt mit dem StepOne-System
verbunden ist, gehen Sie wie folgt vor:
1. Klicken Sie in der StepOne-Software auf
(Temperaturdarstellung).
2. Klicken Sie auf START RUN
Temperature Plot
(LAUF STARTEN).
2
1
Hinweise
73
Starten des Laufs
Eigenständige
Konfiguration
starten
Wenn Computer und StepOne-System nicht direkt mit dem gelben StepOne-Systemkabel
verbunden sind, gehen Sie wie folgt vor:
1. Wenn Ihr Computer und das StepOne-System an dasselbe Netzwerk angeschlossen
sind, führen Sie Schritte 1a bis 1f aus. Setzen Sie den Vorgang ansonsten bei
Schritt 2 fort.
a. Klicken Sie in der StepOne-Software auf
Send Experiment to Instrument
(Analyse an Gerät schicken).
b. Klicken Sie im Dialogfeld Send Experiment to Instrument (Analyse an Gerät
schicken) auf Browse (Suchen), wählen Sie die Datei Relative Standard
Curve Example.eds, und klicken Sie dann auf Open (Öffnen).
c. Wählen Sie das gewünschte StepOne-System im Dropdown-Menü Select
Instrument (Gerät auswählen).
Wenn Ihr StepOne-System nicht aufgeführt wird, richten Sie das Gerät
entsprechend den Anweisungen im Applied Biosystems StepOne™ Real-Time
PCR System-Handbuch zu Installation, Netzwerkeinbindung und Wartung für
die Fernüberwachung ein.
d. Klicken Sie auf Send Experiment (Analyse senden), um die Analyse über das
Netzwerk an das StepOne-System zu schicken.
1b
1c
experiments\Relative Standard Curve Example.eds
1d
e. Klicken Sie bei Aufforderung auf OK, um das Bestätigungsfenster zu
schließen.
f. Setzen Sie den Vorgang bei Schritt 6 fort.
2. Wenn Ihr StepOne-System nicht mit Ihrem Computer verbunden ist, führen Sie
Schritte 2a bis 2d aus, um die Analysedaten über ein USB-Laufwerk zu übertragen.
a. Schließen Sie das USB-Laufwerk an eine USB-Schnittstelle des Computers an.
b. Wählen Sie in der StepOne-Software
SaveSave As (Speichern Speichern unter).
c. Gehen Sie im Dialogfeld Save (Speichern) auf das USB-Laufwerk, und klicken
Sie dann auf Save (Speichern).
d. Entnehmen Sie das USB-Laufwerk aus dem Computer, und schließen Sie es an
die USB-Schnittstelle des StepOne-Systems an.
Hinweise
74
Starten des Laufs
o
3. Berühren Sie den Touchscreen des StepOne-Systems, und berühren Sie
anschließend
.
4. Berühren Sie im Bildschirm Main Menu (Hauptmenü) Browse Experiments
(Analysen durchsuchen).
5. Berühren Sie im Bildschirm Browse Methods (Methoden durchsuchen)
(Ordner).
6. Nehmen Sie im Bildschirm Choose an Experiment Category (Analysekategorie
wählen) die folgenden Einstellungen vor:
• Berühren Sie USB, wenn Sie die Analysedaten auf ein USB-Laufwerk
übertragen haben.
• Berühren Sie Default (Standard), wenn Sie die Analysedaten über eine
Netzwerkverbindung versandt haben.
7. Nehmen Sie im Bildschirm Browse USB/Default Experiments
(USB/Standardanalysen durchsuchen) die folgenden Einstellungen vor:
a. Berühren Sie Relative Standard Curve Example (relatives
Standardkurvenbeispiel), um die Analyse auszuwählen.
b. Berühren Sie
Start Run (Lauf starten).
5
7a
Relatives Standardkurvenbeispiel
7b
Hinweise
75
Überwachen des Laufs
8. Nehmen Sie im Bildschirm Run Parameters (Laufparameter) die folgenden
Einstellungen vor:
a. Berühren Sie das Feld Reaction Volume (Reaktionsvolumen), geben Sie über
den Tastenblock 20 µl ein, und berühren Sie dann Done (Fertig).
b. Berühren Sie Start Run (Lauf starten).
8a
20
8b
Überwachen Sie den Verlauf von einem Computer mit StepOne-Software oder vom
Touchscreen des StepOne-Systems aus. Die Überwachungsart hängt von der
Konfiguration Ihres StepOne-Systems ab:
Konfiguration
Computergesteuert
Beschreibung
Das StepOne-Systemkabel verbindet den
Eigenständig
(vernetzt)
Der Computer und das StepOne-System sind mit
demselben Netzwerk verbunden.
Eigenständig
(Basis)
Der Computer und das StepOne-System sind
nicht miteinander verbunden.
Siehe...
„Computergesteuerte
Überwachung“ unten
„Fenüberwachung“
auf Seite 82
„Überwachung in der
eigenständigen
Konfiguration“ auf
Seite 85
Hinweise
76
Computergesteuerte
Überwachung
verbunden ist, können Sie den Ablauf der Analyse entsprechend den folgenden
Beschreibungen in Real-Time anzeigen. Prüfen Sie den Lauf auf potenzielle Probleme,
indem Sie in regelmäßigen Abständen alle drei verfügbaren Darstellungen der StepOneSoftware aufrufen.
#
A
Ziel
Lauf stoppen
Maßnahme
1. Klicken Sie in der StepOne-Software auf STOP RUN (LAUF
STOPPEN).
2. Klicken Sie im Dialogfeld Stop Run (Lauf stoppen) auf eine
der folgenden Optionen:
– Stop Immediately (Sofort stoppen), um den Lauf sofort
zu stoppen.
– Stop after Current Cycle/Hold (nach aktuellem Zyklus
stoppen/anhalten), um den Lauf nach dem aktuellen
Zyklus zu stoppen oder anzuhalten.
– Cancel (Abbrechen), um den Lauf fortzusetzen.
B
C
D
E
Amplifikationsdaten in
Real-Time anzeigen
Wählen Sie
Amplification Plot (Amplifikationsdarstellung).
Siehe „Informationen zum Bildschirm Amplification Plot
(Amplifikationsdarstellung)“ auf Seite 78.
Temperaturdaten für
den Lauf in Real-Time
anzeigen
Wählen Sie
Temperature Plot (Temperaturdarstellung).
Ablauf im Bildschirm
Run Method (Laufprofil)
anzeigen
Wählen Sie
aktivieren/deaktivieren
Aktivieren oder deaktivieren Sie Enable Notifications
(Benachrichtigungen aktivieren).
Siehe „Informationen zum Bildschirm Temperature Plot
(Temperaturdarstellung)“ auf Seite 79.
Run Method (Laufprofil).
Siehe „Informationen zum Bildschirm Run Method (Laufprofil)“
auf Seite 81.
Hinweise
77
A
E
B
C
D
Informationen zum Bildschirm Amplification Plot (Amplifikationsdarstellung)
Im Amplifikationsdarstellungsbildschirm können Sie während eines Laufs anhand der
vom StepOne-System erfassten Fluoreszenzdaten Probenamplifikationen anzeigen.
Wenn eine Methode für die Anzeige von Daten in Echtzeit ausgewählt wurde, zeigt die
Amplifikationsdarstellung die Daten für die unter dem Reiter View Plate Layout
(Plattenbelegung anzeigen) ausgewählten Wells an. Die Darstellung stellt die
normalisierte Farbstofffluoreszenz (∆Rn) der Zyklusnummer gegenüber. Das unten
abgebildete Schaubild zeigt die bei der Beispielanalyse angezeigte
Amplifikationsdarstellung.
Hinweise
78
Anhand der Amplifikationsdarstellung können ungewöhnliche Amplifikationen
identifiziert und untersucht werden. Ungewöhnliche Amplifikationen sind:
• erhöhte Fluoreszenz in Negativkontroll-Wells
• nachweisbare Fluoreszenz zu einem bestimmten Zyklus (ermittelt aus vorherigen
ähnlichen Analyseläufen mit den gleichen Reagenzien unter den gleichen
Bedingungen)
Wenn Sie eine ungewöhnliche Amplifikation oder das vollständige Fehlen eines Signals
feststellen, beheben Sie den Fehler entsprechend den Angaben in der Hilfefunktion der
StepOne-Software (klicken Sie auf
in der Symbolleiste, oder wählen Sie
HelpStepOne Help (Hilfe StepOne-Hilfe)).
Hinweis: Um Daten in der Amplifikationsdarstellung anzuzeigen, wählen Sie die
gewünschten Wells unter dem Reiter View Plate Layout (Plattenbelegung anzeigen).
Informationen zum Bildschirm Temperature Plot (Temperaturdarstellung)
Während eines Laufs zeigt der Temperaturdarstellungsbildschirm die Temperaturen des
Heizblocks sowie des Heizdeckels und der Proben in Real-Time (berechnet) an. Das
unten abgebildete Schaubild zeigt die bei der Beispielanalyse angezeigte
Temperaturdarstellung.
Ziel
Maßnahme
A
Temperaturgraphen
hinzufügen/entfernen
Wählen Sie Sample, Heated Cover (Probe,
Heizdeckel) oder Sample Block (Heizblock), um die
damit jeweils verbundenen Daten in der Darstellung
anzuzeigen.
B
Die von der Darstellung
angezeigte Uhrzeit ändern
Wählen Sie View (Anzeigen) (Zeitdauer).
C
Y-Achse des Plots fixieren
Wählen Sie Fixed View (Fixierte Ansicht).
Hinweise
79
A
B
C
Der Bildschirm Temperature Plot (Temperaturdarstellung) kann bei der Identifizierung
von Hardware-Fehlern helfen. Prüfen Sie bei der Überwachung des Temperaturbildschirms die Darstellungen der Probe, des Heizdeckels und des Heizblocks auf
ungewöhnliches Verhalten.
• Normalerweise sollten sich die Darstellungen von Probe und Block ungefähr
widerspiegeln. Eine erhebliche Abweichung der Darstellungen kann auf ein
Problem hinweisen.
• Die Darstellung des Heizdeckels sollte die bei der Methode angegebene Temperatur
konstant halten. Eine Abweichung von der konstanten Temperatur kann auf ein
Problem hinweisen.
Wenn Sie eine ungewöhnliche Amplifikation feststellen, beheben Sie den Fehler
entsprechend den Angaben in der Hilfe der StepOne-Software (klicken Sie auf
in der
Symbolleiste, oder wählen Sie HelpStepOne Help (Hilfe StepOne-Hilfe)).
Hinweis: Die in der Gruppe Current Temperatures (Aktuelle Temperaturen) angezeigte
Beispieltemperatur ist ein Schätzwert.
Hinweise
80
Informationen zum Bildschirm Run Method (Laufprofil)
Nach Start eines Laufs zeigt das StepOne-System den Ablauf im Laufprofilbildschirm
an. Dieser Bildschirm zeigt den Verlauf in Bezug auf das Thermoprofil des Laufprofils
an. Das unten abgebildete Schaubild zeigt den bei der Beispielanalyse angezeigten
Laufprofilbildschirm.
Ziel
A
Laufprofil ändern
(Zyklen, Haltephase
oder Schmelzkurve
hinzufügen)
Maßnahme
1. Klicken Sie im Navigationsbereich auf
(Laufprofil).
Run Method
2. Führen Sie im Laufprofilbildschirm eine der folgenden
Aktionen aus:
– Geben Sie die Anzahl an Zyklen ein, die auf die
Zyklusphase anzuwenden sind.
– Wählen Sie Add Melt Curve Stage to End
(Schmelzkurvenphase am Ende zufügen), wenn Sie eine
Schmelzkurvenphase am Laufende hinzufügen möchten.
– Wählen Sie Add Holding Stage to End (Haltephase am
Ende zufügen), wenn Sie eine Haltephase am Laufende
hinzufügen möchten.
3. Klicken Sie auf Send to Instrument (An Gerät senden).
A
Hinweis: Wenn eine Warnung erscheint, klicken Sie auf den Fehler, um weitere
Informationen zu erhalten, und beheben Sie das Problem entsprechend den
Erläuterungen in der Hilfe der StepOne-Software (Klicken Sie auf
in der
Symbolleiste, oder wählen Sie HelpStepOne Help (Hilfe StepOne-Hilfe)).
Hinweise
81
Fenüberwachung
Wenn Ihr StepOne-System an ein Netzwerk angeschlossen ist, können Sie die
Fernüberwachungsfunktion der StepOne-Software verwenden, um den Ablauf in
Real-Time auf einem beliebigen Computer des Netzwerks anzuzeigen.
WICHTIG! Vernetzte Computer können das StepOne-Gerät nicht steuern, sondern nur
überwachen.
#
A
B
C
D
Ziel
Maßnahme
Amplifikationsdaten in
Real-Time anzeigen
Klicken Sie auf Amplification Plot (Amplifikationsdarstellung).
Temperaturdaten für
den Lauf in Real-Time
anzeigen
Klicken Sie auf Temperature Plot (Temperaturgraph).
Ablauf im Bildschirm
Run Method (Laufprofil)
anzeigen
aktivieren/deaktivieren
Siehe „Informationen zum Bildschirm Amplification Plot
(Amplifikationsdarstellung)“ auf Seite 78.
Siehe „Informationen zum Bildschirm Temperature Plot
(Temperaturdarstellung)“ auf Seite 79.
Klicken Sie auf Run Method (Laufprofil).
Siehe „Informationen zum Bildschirm Run Method (Laufprofil)“
auf Seite 81.
Aktivieren oder deaktivieren Sie Enable Notifications
(Benachrichtigungen aktivieren).
Siehe „Aktivieren der Benachrichtigungen (optional)“ auf
Seite 71.
D
A
B
C
Hinweise
82
So können Sie Ihr StepOne-System fernüberwachen:
1. Klicken Sie in der StepOne-Software auf InstrumentRemote Monitor (Gerät Fernüberwachung).
2. Wählen Sie in der Navigationsleiste Ihr StepOne-System.
Falls die Navigationsleiste Ihr StepOne-System nicht auflistet, gehen Sie wie folgt
vor:
a. Klicken Sie auf Add Instrument (Gerät hinzufügen).
b. Klicken Sie auf das Feld Instrument Name (Gerätename), und geben Sie dann
den Namen des Geräts ein.
c. Klicken Sie auf das Feld Host Name (Host-Name), und geben Sie die IP-
Adresse des Geräts ein.
d. Klicken Sie auf Save & Exit (Speichern und beenden).
2b
2c
2d
Hinweis: Weitere Informationen über die Konfiguration des StepOne-Geräts für die
Verwendung in einem Netzwerk oder zur Fernüberwachung finden Sie im Applied
Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System-Handbuch zu Installation,
Netwerkeinbindung und Wartung.
3. Klicken Sie für Ihr Gerät auf
(Überwachung dieses Geräts starten).
Hinweise
83
1
2
3
Hinweise
84
Überwachung
in der
eigenständigen
Konfiguration
Wenn Sie den Lauf auf dem StepOne-System gestartet haben, können Sie den Ablauf auf
dem Touchscreen verfolgen. Der Laufprofilbildschirm zeigt die Analysemethode an und
hebt die vom Gerät ausgeführten Thermoprofilphasen hervor.
#
Ziel
Maßnahme
A
Dem Lauf eine
Dissoziationsphase
hinzufügen
Berühren Sie
(Dissoziationskurve hinzufügen), und
berühren Sie dann OK.
B
Die verbleibende Zeit
für den Lauf anzeigen
Berühren Sie
Display Method Time (Laufprofilzeit
anzeigen), und berühren Sie dann
, um zum Bildschirm Run
Method zurückzukehren.
C
Lauf stoppen
Berühren Sie erst
Schaltflächen:
Stop und dann die folgenden
• Stop, um den Lauf zu stoppen bzw. anzuhalten, nachdem
das StepOne-System den aktuellen Zyklus beendet hat.
• Abort (Abbrechen), um den Lauf unverzüglich abzubrechen.
•
, um den Lauf unverändert fortzusetzen.
D
Analyseinformationen
anzeigen
Berühren Sie erst
View Method Information
(Laufprofilinformationen anzeigen) und dann
, um zum
Laufprofilbildschirm zurückzukehren.
E
Fehlerprotokoll
anzeigen
Berühren Sie die Statusleiste, um das Fehlerprotokoll
anzuzeigen.
D
B
A
C
E
Hinweise
85
Entnahme der Reaktionsplatte und Datenübertragung
Wenn das StepOne-System den Bildschirm Run History (Laufprotokoll) anzeigt,
entnehmen Sie die Reaktionsplatte aus dem StepOne-System, und übertragen Sie die
Analysedaten zur Analyse auf den Computer.
Entnahme der
Reaktionsplatte
Temperatur des Heizblocks auf über 100 °C ansteigen. Halten Sie sich solange vom
Heizblock fern, bis er auf Zimmertemperatur abgekühlt ist.
Hinweis: Wenn das StepOne-System einen Lauf abgeschlossen hat, speichert das System
die Laufinformationen bis zum Abschluss des nächsten Systemlaufs im Laufprotokoll.
1. Wenn der Bildschirm Run Report auf dem Touchscreen des StepOne-Systems
angezeigt wird, berühren Sie
.
3. Entnehmen Sie die Reaktionsplatte aus dem Heizblock.
4. Schließen Sie das Schubfach des Geräts vorsichtig.
WICHTIG! Schalten Sie das StepOne-System nach der Durchführung eines Laufs nicht
ab. Das Gerät schaltet automatisch in einen Ruhezustand, wenn es nicht im Gebrauch ist.
Hinweise
86
Datenübertragungsmethode
auswählen
Die Übertragung der Analyse zur Auswertung auf den Computer erfolgt in Abhängigkeit
von der Konfiguration des StepOne-Systems:
Konfiguration
Computergesteuert
Beschreibung
Siehe...
Das StepOne-Systemkabel verbindet den
„Kombinierte Datenübertragung“ unten
Eigenständig
(vernetzt)
mit demselben Netzwerk verbunden.
„Datenfern-übertragung“
auf Seite 87
Eigenständig
(Basis)
nicht miteinander verbunden.
„Eigenständige Datenübertragung“ auf Seite 88
Kombinierte
Datenübertragung
verbunden ist, müssen Sie nichts unternehmen. Die StepOne-Software überträgt die
Analysedaten nach dem Lauf automatisch auf das StepOne-System.
Datenfernübertragung
Wenn Ihr Computer und das StepOne-System mit demselben Ethernet-Netzwerk
verbunden sind, schicken Sie die Analysedaten über das Netzwerk an das StepOneSystem:
1. Klicken Sie in der StepOne-Software auf
Download Experiment from
Instrument (Analyse vom System herunterladen).
2. Wählen Sie im Dialogfeld Download Experiment from Instrument (Analyse vom
Gerät herunterladen) auf Select Instrument<your instrument> (Gerät auswählen
Ihr Gerät).
3. Wählen Sie ExperimentRelative Standard Curve Example (Analyse
relatives Standardkurvenbeispiel).
4. Klicken Sie im Feld Download File To (Datei speichern unter) auf Browse (Suchen),
wählen Sie den Ordner, in dem die Analysedaten gespeichert werden sollen, und
klicken Sie auf Select (Wählen).
5. Klicken Sie auf Download Experiment (Analyse herunterladen), um die Analyse
über das Netzwerk vom StepOne-System auf den Computer herunterzuladen.
2
4
3
5
Hinweise
87
6. Klicken Sie bei Aufforderung auf OK, um das Bestätigungsfenster zu schließen.
6
Eigenständige
Datenübertragung
Wenn Ihr Computer nicht mit dem StepOne-System verbunden ist, übertragen Sie die
Analysedaten mithilfe des USB-Laufwerks auf das StepOne-System:
1. Wenn das Gerät noch nicht mit einem USB-Laufwerk verbunden ist, schließen Sie
das Laufwerk an die USB-Schnittstelle an.
o
2. Aktivieren Sie den StepOne-Touchscreen durch eine Berührung, und berühren
Sie
.
3. Berühren Sie im Main Menu (Hauptmenü) Collect Results (Ergebnisse anzeigen),
um die Daten auf dem USB-Laufwerk zu speichern.
Wenn das StepOne-System das USB-Laufwerk nicht finden kann, drücken Sie auf
OK, warten Sie 30 Sekunden, und drücken Sie dann noch einmal auf Collect
Results (Ergebnisse abrufen).
4. Sobald die erfolgreiche Übertragung der Daten gemeldet wurde, berühren Sie OK.
5. Entnehmen Sie das USB-Laufwerk aus dem StepOne-System, und schließen Sie es
an die USB-Schnittstelle des Computers an.
Hinweise
88
6. Greifen Sie auf dem Computer-Desktop über den Windows-Explorer auf das USBLaufwerk zu.
7. Kopieren Sie die Datei Relative Standard Curve Example.eds in den folgenden
Ordner:
<drive>:\Applied Biosystems\StepOne System\experiments
Dabei ist <drive> das Computerlaufwerk, auf dem die StepOne-Software installiert
ist. Die Software wird standardmäßig auf dem C-Laufwerk installiert.
Hinweise
89
Hinweise
90
Kapitel 5
Auswertung der relativen
■ Abschnitt 5.1 Prüfen der Ergebnisse. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 93
■ Abschnitt 5.2 Fehlerbehebung (falls erforderlich) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 111
Hinweise
91
Kapitel 5 Auswertung der relativen Standardkurven-Analyse
Kapitelübersicht
Kapitelübersicht
Die StepOne™-Software wertet die Daten mithilfe der relativen StandardkurvenQuantifizierungsmethode aus. In Abschnitt 1 dieses Kapitels wird erklärt, wie die
ausgewerteten Daten unter Verwendung mehrerer Analysebildschirme geprüft und die
Daten veröffentlicht werden können. Wenn Sie zweifelhafte Ergebnisse erhalten, können
Sie in Abschnitt 2 dieses Kapitels nachlesen, wie Sie Schritte zur Fehlerbehebung
durchführen können.
Hinweis: Die relative Standardkurven-Beispielanalyse beinhaltet vier markierte Wells.
Die Markierungen stellen bekannte Probleme dar, die bei der Ausführung Ihrer eigenen
Analysen auftreten können. Es stehen Verfahren zur Verfügung, mit deren Hilfe die
Markierungen angezeigt oder Wells herausgelassen werden können.
Arbeitsablauf der
Beispielanalyse
Der Arbeitsablauf zum Auswerten der mit diesem Einführungshandbuch gelieferten
Beispielanalyse ist nachfolgend abgebildet.
Analyse starten
2. Überprüfen Sie den Standardkurvenbildschirm.
4. Überprüfen Sie die Genexpressionsdarstellung/Well-Tabelle.
Analyse beenden
Hinweise
92
Abschnitt 5.1 Prüfen der Ergebnisse
Abschnitt 5.1 Prüfen der Ergebnisse
Dieser Abschnitt umfasst die folgenden Themen:
■ Analyseauswertung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 94
■ Ansicht der Standardkurve . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 99
■ Ansicht der Amplifikationsdarstellung. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 102
■ Ansicht der Genexpressionsdarstellung und Well-Tabelle . . . . . . . . . . . . . . . . . . 107
■ Veröffentlichen der Daten . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 110
Hinweise
93
Analyseauswertung
Analyseauswertung
Die StepOne-Software wertet die Analyse aus und zeigt die Ergebnisse in den
Auswertungsbildschirmen an, zum Beispiel in den Bildschirmen Amplification Plot
(Amplifikationsdarstellung), QC Summary (QC-Zusammenfassung) usw.
Informationen zur
Beispielanalyse
Verwenden Sie für die Standardkurven-Beispielanalyse die Datei, die mit der StepOneSoftware installiert wird. Die Datei wurde mit denselben Analysedesignparametern
erstellt, die in Kapitel 2 angegeben sind, und dann auf einem StepOne™-System die
Analyse durchgeführt und ausgewertet.
Hier finden Sie die Datei für die Beispielanalyse auf Ihrem Computer:
Hierbei steht <Laufwerk> für das Computerlaufwerk, auf dem die StepOne-Software
installiert wurde. Die Software wird standardmäßig auf dem C-Laufwerk installiert.
Beispielanalyse
auswerten
1. Wenn die StepOne-Software noch nicht läuft, doppelklicken Sie auf
(Shortcut
der StepOne-Software) oder wählen Sie StartAlle ProgrammeApplied
BiosystemsStepOneStepOne v1.0.
3. Gehen Sie im Dialogfeld Open (Öffnen) in den Ordner examples (Beispiele).
4. Doppelklicken Sie auf Relative Standard Curve Example (relatives
Standardkurvenbeispiel), um die Datei der Beispielanalyse zu öffnen.
2
3
4
Hinweise
94
Analyseauswertung
5. Klicken Sie auf Analyze (Auswerten). Die Software wertet die Daten mithilfe der
Standardeinstellungen für die Auswertung aus.
5
6. Unter „Software-Elemente“ unten sowie unter „Navigationstipps“ auf Seite 97
finden Sie weitere Informationen zur Benutzung der Auswertungsbildschirme.
Hinweise
Beachten Sie Folgendes bei der Auswertung Ihrer eigenen relativen StandardkurvenAnalyse:
• Unmittelbar nach dem Lauf analysiert die StepOne-Software automatisch die Daten
unter Verwendung der Standardauswertungseinstellungen und zeigt anschließend
den Bildschirm Amplification Plot (Amplifikationsdarstellung) auf Ihrem
Computer an.
• Um die Daten erneut auszuwerten, wählen Sie alle Wells in der Plattenbelegung aus,
und klicken Sie dann auf Analyze (Auswerten).
SoftwareElemente
Die Elemente der StepOne-Software für die Auswertungsbildschirme (Analysis) sind
nachstehend dargestellt.
• File (Datei)
• Tools (Extras)
• Help (Hilfe)
• Open (Öffnen)
• Save (Speichern)
• Export (Exportieren)
• Print Report (Bericht drucken)
Hinweise
95
Analyseauswertung
4. Bereich Experiment Menu (Analysemenü) – Enthält Links zu den folgenden
Bildschirmen der Software:
• Bildschirme für Setup (Einrichtung)
• Bildschirme für Run (Lauf)
• Bildschirme für Analysis (Auswertung)
–Amplification Plot (Amplifikationsdarstellung)
–Standardkurve
–Genexpression
–Multicomponent Plot (Multikomponentendarstellung)
–Raw Data Plot (Rohdatendarstellung)
–QC Summary (Zusammenfassung der Qualitätskontrolle)
–Multiple Plots View (Ansicht mit mehreren Plots)
5. Plot-Bereich: Zeigt den ausgewählten Auswertungsbildschirm für die geöffnete
Analyse an.
6. Ansichtsreiter (View …): Zeigen die Plattenbelegung (Plate Layout) oder die WellTabelle (Well Table) für die geöffnete Analyse an.
1
2
3
6
4
7
5
Hinweise
96
Analyseauswertung
Navigationstipps
Auswahl der Wells
Um sich bestimmte Wells in den Auswertungsbildschirmen anzeigen zu lassen, wählen
Sie die Wells im Reiter View Plate Layout (Ansicht Plattenbelegung) wie folgt aus:
1. Um Wells eines bestimmten Typs auszuwählen, verwenden Sie die DropdownMenüs Select Wells With (Wells auswählen mit): Wählen Sie zunächst Sample
(Probe), Target (Zielsequenz) oder Task (Aufgabe) aus, und wählen Sie dann den
Namen der Probe, Zielsequenz oder Aufgabe aus.
2. Um einen einzelnen Well auszuwählen, klicken Sie in der Plattenbelegung auf den
gewünschten Well.
3. Sie können mehrere Wells auswählen durch Klicken und Ziehen über die
gewünschten Wells, Drücken der Steuerungstaste+Klick oder Drücken der
Umschalttaste+Klick in der Plattenbelegung.
4. Um alle 48 Wells auszuwählen, klicken Sie auf die linke obere Ecke der
Plattenbelegung.
1
4
Hinweise
97
Analyseauswertung
Anzeige mehrerer Plots
Mithilfe des Bildschirms Multiple Plots können Sie bis zu vier Darstellungen gleichzeitig
anzeigen. So navigieren Sie innerhalb des Bildschirms Multiple Plots:
1. Wählen Sie im Bereich Experiment Menu (Analysemenü) Analysis
Plots View (AuswertungAnsicht mit mehreren Plots).
2. Um vier Plots anzeigen zu lassen, klicken Sie auf
(Plots in 2x2-Matrix anzeigen).
Multiple
Show plots in a 2 ✕ 2 matrix
3. Um zwei Plots untereinander anzeigen zu lassen, klicken Sie auf
two rows (Plots untereinander anzeigen).
Show plots in
4. Um zwei Plots nebeneinander anzeigen zu lassen, klicken Sie auf
two columns (Plots nebeneinander anzeigen).
Show plots in
5. Um einen bestimmten Plot anzeigen zu lassen, wählen Sie den gewünschten Plot
aus dem Dropdown-Menü über jeder Plot-Anzeige.
5
2 3
4
Hinweise
98
Ansicht der Standardkurve
Im Bildschirm Standard Curve (Standardkurve) wird die Standardkurve für die als
Standards gekennzeichneten Proben angezeigt. Mithilfe der Standardkurve berechnet die
StepOne-Software die Menge einer unbekannten Zielsequenz.
Informationen zur
Beispielanalyse
In der Beispielanalyse für relative Standardkurven prüfen Sie im
Standardkurvenbildschirm die folgenden Werte:
• Steigung/Amplifikationseffizienz
• R2-Wert (Korrelationskoeffizient)
• CT-Werte
Ansicht
Standardkurve
Standard Curve (AuswertungStandardkurve).
Hinweis: Wenn im Standardkurvenbildschirm keine Daten angezeigt werden,
klicken Sie auf Analyze (Auswerten).
2. Lassen Sie sich alle 48 Wells im Standardkurvenbildschirm anzeigen, indem Sie
unter dem Reiter View Plate Layout (Ansicht Plattenbelegung) auf die linke obere
Ecke der Plattenbelegung klicken.
3. Wählen Sie aus dem Dropdown-Menü Target (Zielsequenz) All (Alle).
4. Wählen Sie aus dem Dropdown-Menü Plot Color (Darstellungsfarbe) Default
(Standard).
5. Klicken Sie auf
Show/Hide the plot legend (Darstellungslegende
anzeigen/ausblenden).
6. Sehen Sie sich die Werte unter der Standardkurve an. In der Beispielanalyse liegen
die Werte für jede Zielsequenz innerhalb der zulässigen Bereiche:
Zielsequenz
Steigung
R2-Wert
Amplifikationseffizienz (EFF%)
GAPDH
−3,438
1
95,363
c-Myc
−3,236
0,995
103,729
Hinweise
99
7. Prüfen Sie, dass alle Proben innerhalb der Standardkurve liegen. In der
Beispielanalyse liegen alle Proben (blaue Punkte) innerhalb der Standardkurve
(rote Punkte).
3
4
5
7
6
8. Prüfen Sie die CT-Werte:
a. Klicken Sie auf den Reiter View Well Table (Ansicht Well-Tabelle).
b. Wählen Sie aus dem Dropdown-Menü Group By (Gruppieren nach) Replicate
(Replikat).
c. Schauen Sie sich die Werte in der Spalte CT an. In der Beispielanalyse liegen
die CT-Werte innerhalb des erwarteten Bereichs (> 8 und < 35).
Hinweis: Die CT-Werte der Wells D7, D8 und E1 liegen >35 aufgrund der
niedrigen Zielsequenzmenge. Diese Wells müssen nicht von der Auswertung
ausgenommen werden.
Hinweise
100
8a
8b
8c
Auswertungshinweise
Achten Sie bei der Auswertung Ihrer eigenen relativen Standardkurven-Analyse auf
Folgendes:
• Steigungs-/Amplifikationseffizienzwerte: Die Amplifikationseffizienz wird
mithilfe der Steigung der Regressionsgeraden in der Standardkurve berechnet.
Eine Steigung von etwa −3,3 bedeutet eine optimale, 100%ige PCRAmplifikationseffizienz. Faktoren, die die Amplifikationseffizienz beeinflussen,
sind:
– Bereich der Standardmengen: Um eine korrekte und genaue
Effizienzbestimmung durchzuführen, verwenden Sie einen breiten Bereich für
Standardmengen, 5 bis 6 Log-Stufen (105 bis 106-fach).
– Anzahl der Standardreplikate: Um eine präzise Effizienzbestimmung
durchzuführen, nehmen Sie Replikate auf, um die Auswirkungen von
Pipettierfehlern zu reduzieren.
– PCR-Inhibitoren: PCR-Inhibitoren in der Reaktion können die
Amplifikationseffizienz herabsetzen.
2
• R -Werte (Korrelationskoeffizient): Der R2-Wert ist ein Maß für den Grad der
Übereinstimmung zwischen der Regressionsgeraden der Standardkurve und den
individuellen CT-Datenpunkten der Standardreaktionen. Ein Wert von 1,00 gibt eine
perfekte Übereinstimmung zwischen der Regressionsgeraden und den
Datenpunkten an. Wünschenswert ist ein R2-Wert > 0,99.
• CT-Werte: Der Schwellenwert-Zyklus (CT) ist der PCR-Zyklus, bei dem das
Fluoreszenzniveau den Schwellenwert erreicht. Wünschenswert ist ein CT-Wert > 8
und < 35. Ein CT-Wert < 8 zeigt an, dass die Reaktion zu viel Template enthält. Ein
CT-Wert > 35 zeigt eine geringe Menge Zielsequenz in der Reaktion an; bei CTWerten > 35 ist eine höhere Standardabweichung zu erwarten.
Hinweise
101
Ansicht der Amplifikationsdarstellung
Wenn Ihre Analyse die oben genannten Hinweise nicht erfüllt, beheben Sie den Fehler
wie folgt:
• nehmen Sie Wells heraus (siehe unter „Herausnahme von Wells aus der
Auswertung“ auf Seite 116)
oder
• wiederholen Sie die Analyse.
Weitere
Informationen
• Informationen zum Bildschirm Standard Curve (Standardkurve) finden Sie in der
• Informationen über Amplifikationseffizienz finden Sie in der Amplification
Efficiency of TaqMan® Gene Expression Assays Application Note.
Auf dem Bildschirm Amplification Plot (Amplifikationsdarstellung) wird die
Amplifikation aller Proben in den ausgewählten Wells angezeigt. Es stehen drei
Darstellungsvarianten zur Verfügung:
• ∆Rn vs Cycle (∆Rn über dem Zyklus): ∆Rn ist die Intensität des während des PCRLaufs generierten normalisierten Fluoreszenzsignals; daraus wird der CT berechnet.
Diese Darstellung zeigt ∆Rn als Funktion der Zyklusanzahl. Sie können diese
Darstellung dazu verwenden, eine unregelmäßige Amplifikation zu erkennen und zu
überprüfen und sich die Werte für Schwellenwert und Grundlinie anzusehen.
• Rn vs Cycle (Rn über dem Zyklus): Rn ist die normalisierte Fluoreszenz des
Reporter-Farbstoffs. Diese Darstellung zeigt Rn als Funktion der Zyklusanzahl. Sie
können diese Darstellung dazu verwenden, eine unregelmäßige Amplifikation zu
erkennen und zu überprüfen.
• CT vs Well (CT über den Wells): Der Schwellenwert-Zyklus (CT) ist der PCRZyklus, bei dem das Fluoreszenzniveau den Schwellenwert erreicht. Diese
Darstellung zeigt CT als Funktion der Well-Position. Sie können diese Darstellung
dazu verwenden, eine extreme Amplifikation (Ausreißer) zu lokalisieren.
Jede Darstellung kann in Form eines der folgenden Graphentypen betrachtet werden:
linear oder log10.
Informationen zur
Beispielanalyse
In der Standardkurven-Beispielanalyse prüfen Sie jede Zielsequenz in der
Amplifikationsdarstellung auf Folgendes:
• korrekte Werte für Grundlinie und Schwellenwert
• Ausreißer
Hinweise
102
Ansicht der
Amplifikationsdarstellung
Amplification Plot (AuswertungAmplifikationsdarstellung).
Hinweis: Wenn im Bildschirm Amplification Plot keine Daten angezeigt werden,
2. Lassen Sie die GAPDH-Wells in der Amplifikationsdarstellung anzeigen:
a. Klicken Sie auf den Reiter View Plate Layout (Ansicht Plattenbelegung).
b. Wählen Sie aus den Dropdown-Menüs Select Wells With (Wells auswählen
mit) zunächst Target (Zielsequenz) und dann GAPDH.
2a
2b
3. Im Bildschirm Amplification Plot:
a. Wählen Sie aus dem Dropdown-Menü Plot Type (Darstellungstyp) ∆Rn vs
Cycle (Rn über dem Zyklus).
b. Wählen Sie aus dem Dropdown-Menü Color Plot By (Darstellungsfarbe
entsprechend) Well.
c. Klicken Sie auf
4. Sehen Sie sich die Grundlinienwerte an:
a. Wählen Sie aus dem Dropdown-Menü Graph Type (Graphentyp) Linear.
b. Markieren Sie das Kontrollkästchen Baseline (Grundlinie), um den Start- und
Endzyklus anzuzeigen.
c. Prüfen Sie, dass die Grundlinie korrekt eingestellt ist. In der Beispielanalyse
wird die Grundlinie vor Beginn der Amplifikation eingestellt.
Hinweise
103
3a
4a
3b
3c
4b
5. Sehen Sie sich den Schwellenwert an:
a. Wählen Sie aus dem Dropdown-Menü Graph Type (Graphentyp) Log.
b. Wählen Sie aus dem Dropdown-Menü Target (Zielsequenz) GAPDH.
c. Markieren Sie das Kontrollkästchen Threshold (Schwellenwert), um den
Schwellenwert anzuzeigen.
d. Prüfen Sie, dass der Schwellenwert korrekt eingestellt ist. In der
Beispielanalyse liegt der Schwellenwert in der exponentiellen Phase.
5a
5b
5c
Hinweise
104
6. Stellen Sie eventuelle Ausreißer fest:
a. Wählen Sie aus dem Dropdown-Menü Plot Type (Darstellungstyp) CT vs Well
(CT über den Wells).
b. Schauen Sie nach Wells, die außerhalb der Amplifikationskurve liegen. In der
Beispielanalyse gibt es für GAPDH keine Ausreißer.
6a
7. Wiederholen Sie die Schritte 2 bis 6 für die c-Myc-Wells. In der Beispielanalyse ist
ein Ausreißer für c-Myc dargestellt (Well D1). Hinweise zur Herausnahme dieses
Wells finden Sie im Abschnitt Fehlerbehebung („Herausnahme von Wells aus der
Auswertung“ auf Seite 116).
Auswertungshinweise
Folgendes:
• Korrekte Werte für Grundlinie und Schwellenwert: Die StepOne-Software
berechnet die Werte für Grundlinie und Schwellenwert automatisch auf Grundlage
der Annahme, dass die Daten eine typische Amplifikationsdarstellung zeigen.
Eine typische Amplifikationsdarstellung weist Folgendes auf:
a. Plateauphase
b. lineare Phase
c. exponentielle (geometrische) Phase
d. Hintergrund
e. Grundlinie
Hinweise
105
a
b
Schwellenwert
c
∆Rn
d
Zyklus
e
WICHTIG! Versuchsfehler (wie Kontaminationen oder Pipettierfehler) können
atypische Amplifikationskurven verursachen, die zu falschen Berechnungen von
Grundlinie und Schwellenwert durch die StepOne-Software führen können. Aus
diesen Gründen empfiehlt Applied Biosystems, dass Sie sich nach Abschluss der
Auswertung die Amplifikationsdarstellung ansehen und die zugewiesenen Werte für
Grundlinie und Schwellenwert für jeden Well überprüfen.
• Ausreißer
wie folgt:
• Berichtigen Sie die Grundlinie und/oder den Schwellenwert manuell (siehe
„Ansicht der Auswertungseinstellungen“ auf Seite 112)
oder
Weitere
Informationen
Weitere Informationen zur Amplifikationsdarstellung finden Sie in der StepOneSoftware-Hilfe, indem Sie auf
Hinweise
106
Ansicht der Genexpressionsdarstellung und Well-Tabelle
Auf dem Bildschirm Gene Expression Plot werden die Ergebnisse der relativen
Quantifizierungsberechnungen im Genexpressionsprofil dargestellt. Es stehen zwei
• RQ vs Target: Gruppiert die Werte der relativen Quantifizierung (RQ) nach
Zielsequenz. Jede Probe wird für jede Zielsequenz geplottet.
• RQ vs Sample: Gruppiert die Werte der relativen Quantifizierung (RQ) nach Probe.
Jede Zielsequenz wird für jede Probe geplottet.
Jede Darstellung kann in Form eines der folgenden Graphentypen betrachtet
werden: linear, log10, Ln, log2.
Die Well-Tabelle zeigt für jeden Well in der Reaktionsplatte Daten an, darunter:
• Name von Probe und Zielsequenz, Aufgabe und Farbstoffe
• der berechnete Schwellenwert-Zyklus (CT), die normalisierte Fluoreszenz (Rn) und
Mengenwerte
• Markierungen
Informationen zur
Beispielanalyse
Ansicht der
Genexpressionsdarstellung/
Well-Tabelle
In der relativen Standardkurven-Beispielanalyse wird Folgendes geprüft:
• die Zielsequenzen im Bildschirm Gene Expression Plot auf das Expressionsniveau
(bzw. Änderung im Vielfachen) der Zielprobe in Relation zur Referenzprobe.
• die Well-Tabelle zur Beurteilung der Genauigkeit der Replikatgruppen
Expression (AuswertungGenexpression).
Gene
Hinweis: Wenn im Bildschirm Gene Expression Plot keine Daten angezeigt werden,
2. Im Bildschirm Gene Expression Plot:
a. Wählen Sie aus dem Dropdown-Menü Plot Type (Darstellungstyp) RQ vs
Sample (RQ im Vergleich zur Probe).
b. Wählen Sie aus dem Dropdown-Menü Graph Type (Graphentyp) Log10.
c. Wählen Sie aus dem Dropdown-Menü Orientation (Ausrichtung) Vertikal
Bars (Vertikale Leisten).
d. Klicken Sie auf
In der Beispielanalyse sind die Expressionsniveaus von c-Myc in Leber in Relation
zum Expressionsniveau der Referenzprobe (Niere) dargestellt. Da die Beispielprobe
mit sich selbst verglichen wird, ist das Expressionsniveau 1. Wenn das Ergebnis als
Graphentyp Log10 angezeigt wird, erscheint das Expressionsniveau der
Referenzproben im Graphen als 0 (log10 von 1 = 0).
Hinweise
107
2a
2b
2c
2d
3. Ansicht der Well-Tabelle
a. Wählen Sie im Bereich Experiment Menu (Analysenmenü) Analysis
Amplification Plot, und anschließend den Reiter View Well Table (Ansicht
Well-Tabelle).
(Replikat).
c. Zur Beurteilung der Genauigkeit der Replikatgruppen sehen Sie sich die Spalte
CT SD an. In der Beispielanalyse gibt es einen Ausreißer (Well D1). Hinweise
zur Herausnahme dieses Wells finden Sie im Abschnitt Fehlerbehebung
(„Herausnahme von Wells aus der Auswertung“ auf Seite 116).
Hinweise
108
3a
3b
3c
3c
Hinweis: Zum Ein-/Ausblenden von Spalten der Well-Tabelle aktivieren/deaktivieren Sie
den Spaltennamen im Dropdown-Menü Show in Table (in Tabelle anzeigen).
Auswertungshinweise
Folgendes:
• Abweichungen in der Genexpression (als Änderung des Vielfachen) in Relation zur
Referenzprobe.
• Standardabweichung in Replikatgruppen (CT SD-Werte). Nehmen Sie bei Bedarf
die Ausreißer aus („Herausnahme von Wells aus der Auswertung“ auf Seite 116).
Weitere
Informationen
Weitere Informationen zur Genexpressionsdarstellung bzw. zur Well-Tabelle finden Sie
in der StepOne-Software-Hilfe, indem Sie auf
Hinweise
109
Veröffentlichen der Daten
Sie können die Analysedaten auf verschiedene Weise ausgeben lassen:
•
•
•
•
•
•
Speichern der Darstellung als Bilddatei
Drucken der Darstellung
Drucken der Plattenbelegung
Erstellen von Folien
Drucken eines Berichts
Datenexport
Weitere Informationen zur Durchführung dieser Schritte finden Sie in der StepOneSoftware-Hilfe, indem Sie auf
Hinweise
110
Abschnitt 5.2 Fehlerbehebung (falls erforderlich)
Abschnitt 5.2 Fehlerbehebung (falls erforderlich)
■ Ansicht der Auswertungseinstellungen. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 112
■ Ansicht der QC-Zusammenfassung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 114
■ Herausnahme von Wells aus der Auswertung. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 116
■ Ansicht der Multikomponentendarstellung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 118
■ Ansicht der Rohdatendarstellung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 120
Hinweise
111
Ansicht der Auswertungseinstellungen
Das Dialogfeld Analysis Settings zeigt die Auswertungseinstellungen für den
Schwellenwert-Zyklus (CT), Markierungen, relative Quantifizierung und erweiterte
Optionen an. Sollten die Standardauswertungseinstellungen der StepOne-Software für
Ihre Analyse nicht geeignet sein, können Sie die Einstellungen im Dialogfeld Analysis
Settings ändern und ihre Analyse erneut auswerten.
Informationen zur
Beispielanalyse
Auswertungseinstellungen
prüfen
In der Beispielanalyse für relative Standardkurven werden die
Standardauswertungseinstellungen unverändert übernommen.
1. Wählen Sie im Bereich Experiment Menu (Analysemenü) Analysis Auswertung.
2. Klicken Sie zum Öffnen des Dialogfelds für die Auswertungseinstellungen auf
Analysis Settings.
3. In der Beispielanalyse werden die Standardauswertungseinstellungen für jeden
Reiter verwendet:
• CT Settings (CT-Einstellungen)
• Flag Settings (Markierungseinstellungen)
• Advanced Settings (Erweiterte Einstellungen)
Hinweise
112
Auswertungshinweise
Wenn Sie nicht bereits die optimalen Einstellungen für Ihre Analyse festgelegt haben,
verwenden Sie die Standardauswertungseinstellungen der StepOne-Software. Falls die
Standardeinstellungen für Ihre Analyse nicht geeignet sind, können Sie die folgenden
Parameter verändern:
• CT Settings (CT-Einstellungen): In diesem Reiter können Sie die Schwellen- und
Grundlinienwerte manuell einstellen. Wenn Sie die Schwellen- und
Grundlinienwerte manuell einstellen, empfiehlt Applied Biosystems die folgende
Vorgehensweise:
Einstellung
Schwellenwert
Empfehlung
Geben Sie für den Schwellenwert einen Wert ein, der folgende
Merkmale aufweist:
• Schwellenwert liegt über dem Hintergrund
• Schwellenwert liegt unterhalb der ebenen und linearen Bereiche
der Amplifikationskurve
• Schwellenwert liegt innerhalb der exponentialen Phase der
Amplifikationskurve.
Grundlinie
Wählen Sie die Werte für Zyklusstart und Zyklusende aus, sodass die
Grundlinie endet bevor die Amplifikation beginnt.
• Flag Settings (Markierungseinstellungen): Hier können Sie die folgenden
Einstellungen vornehmen:
– Empfindlichkeit einstellen, sodass mehr oder weniger Wells markiert werden
– Ändern der von der StepOne-Software vorgenommenen Markierungen
• Relative Q uantitation Settings (Relative Quantifizierungseinstellungen):
Hier können Sie die folgenden Einstellungen vornehmen:
– Ändern der Referenzprobe und/oder endogenen Kontrolle
– Auswählen des für die Bestimmung der RQ Min/Max-Werte (Konfidenzniveau
bzw. Standardabweichungen) zu verwendenden Algorithmus
• Advanced Settings (Erweiterte Einstellungen): Unter diesem Reiter können Sie die
Grundlinieneinstellungen für jeden Well einzeln ändern.
Weitere
Informationen
Weitere Informationen zu den Auswertungseinstellungen erhalten Sie in der Hilfe der
StepOne-Software durch Drücken von F1, wenn das Dialogfeld Analysis Settings
geöffnet ist.
Hinweise
113
Ansicht der QC-Zusammenfassung
Im Bildschirm QC Summary wird eine Liste der Markierungen der StepOne-Software
angezeigt, einschließlich der Markierungshäufigkeit und des Markierungsortes für die
geöffnete Analyse.
Informationen zur
Beispielanalyse
In der Standardkurven-Beispielanalyse prüfen Sie den Bildschirm QC Summary auf
Markierungen, die von den Analysedaten ausgelöst wurden:
• Wells D7, D8 und E1 erzeugten Daten, die die Markierung HIGHSD auslösten
• Well D1 erzeugte Daten, die die Markierung OUTLIERRG auslösten
Ansicht der QCZusammenfassung
QC Summary (Zusammenfassung zur Qualitätskontrolle).
Hinweis: Wenn im Bildschirm QC Summary keine Daten angezeigt werden,
2. Überprüfen Sie die Markierungszusammenfassung. In der Beispielanalyse ist der
Wert für markierte Wells gleich 4.
3. Schauen Sie in der Tabelle Flag Details (Markierungsdetails) die Spalten Frequency
(Häufigkeit) und Wells an, um herauszufinden, welche Markierungen in der
Analyse auftreten. In der Beispielanalyse:
• Die Markierung HIGHSD erscheint drei Mal, in den Wells D7, D8 und E1.
• Die Markierung OUTLIERRG erscheint einmal, in Well D1.
Hinweis: Eine 0 in der Spalte Frequency zeigt an, dass die Markierung in der
Analyse nicht vorkommt.
4. Um detaillierte Informationen zu der Markierung anzeigen zu lassen, klicken Sie für
jede Markierung in der Analyse auf die entsprechende Zeile. In der Beispielanalyse:
a. Die Markierung HIGHSD (Wells D7, D8 und E1) zeigt eine hohe
Standardabweichung in der Replikatgruppe an. Dies ist bei CT-Werten >35
aufgrund der niedrigen Zielsequenzmenge zu erwarten. Diese Wells müssen
nicht von der Auswertung ausgenommen werden.
b. Die Markierung OUTLIERRG (Well D1) zeigt einen Ausreißer in der
Replikatgruppe an. Fahren Sie mit „Herausnahme von Wells aus der
Auswertung“ auf Seite 116 fort, um den Well D1 auszunehmen.
Hinweise
114
2
3
4
Mögliche
Markierungen
Bei relativen Standardkurven-Analysen können durch die Analysedaten die unten
aufgeführten Flags (Markierungen) ausgelöst werden.
Sollte eine Markierung in einer Analyse nicht auftreten, ist die Häufigkeit gleich 0.
Ist die Häufigkeit > 0, tritt die Markierung an irgendeiner Stelle in der Analyse auf.
Die jeweilige Position wird in der Spalte Wells aufgeführt.
Markierung
Beschreibung
AMPNC
Amplifikation mit Negativkontrolle
BADROX
Schlechtes Signal der passiven Referenz
BLFAIL
Grundlinienalgorithmus fehlgeschlagen
CTFAIL
CT-Algorithmus fehlgeschlagen
EXPFAIL
Exponentialalgorithmus fehlgeschlagen
HIGHSD
Hohe Standardabweichung in Replikat-Gruppe
NOAMP
Keine Amplifikation
NOISE
Geräusch höher als bei anderen in der Platte
NOSIGNAL
Kein Signal im Well
OFFSCALE
Fluoreszenz geht über den Messbereich hinaus
OUTLIERRG
Ausreißer in Replikat-Gruppe
SPIKE
Hintergrundpeak
THOLDFAIL
Schwellenwertalgorithmus fehlgeschlagen
Hinweise
115
Herausnahme von Wells aus der Auswertung
Auswertungshinweise
Beachten Sie bei der Auswertung Ihrer eigenen relativen Standardkurven-Analyse
Folgendes:
• Klicken Sie zur Anzeige der Details zu Häufigkeiten > 0 jede Markierung in der
Tabelle Flag Details einzeln an. Bei Bedarf klicken Sie auf den Link zur
Fehlerbehebung (Troubleshooting), um Informationen zur Berichtigung der
Markierung anzeigen zu lassen.
• Markierungseinstellungen können wie folgt geändert werden:
Weitere
Informationen
Weitere Informationen zum Bildschirm QC Summary oder zu Markierungseinstellungen
Versuchsfehler können dazu führen, dass einige Wells ungenügend oder gar nicht
amplifiziert wurden. Diese Wells liefern im Normalfall CT-Werte, die von dem
Durchschnitt der anderen Replikat-Wells deutlich abweichen. Wenn diese Ausreißer in
die Berechnung einbezogen werden, kann dies fehlerhafte Messergebnisse zur Folge
haben. Zur Gewährleistung der Genauigkeit sollten Ausreißer aus der Auswertung
herausgenommen werden.
Informationen zur
Beispielanalyse
Wells
herausnehmen
In der Beispielanalyse für relative Standardkurven wird Well D1 mithilfe der WellTabelle von der Auswertung ausgenommen. Well D1 ist mit der Markierung
OUTLIERRG versehen (siehe „Ansicht der QC-Zusammenfassung“ auf Seite 114).
2. Wählen Sie im Bildschirm Amplification Plot (Amplifikationsdarstellung) CT vs.
Well aus dem Dropdown-Menü Plot Type (Darstellungstyp).
3. Wählen Sie den Reiter View Well Table (Ansicht Well-Tabelle).
4. In der Well-Tabelle:
a. Wählen Sie aus dem Dropdown-Menü Group By (Gruppieren nach)
Replicate (Replikat).
b. Suchen Sie nach Ausreißern in der Replikat-Gruppe (stellen Sie sicher, dass
diese markiert sind). In der Beispielanalyse ist Well D1 ein Ausreißer.
c. Aktivieren Sie das Kontrollkästchen Omit (Herausnehmen) neben Well D1.
Hinweise
116
3
4a
2
Well D1
4c
5. Klicken Sie auf Analyze (Auswerten), um die Analysedaten erneut ohne den
entfernten Ausreißer-Well D1 auszuwerten.
5
Auswertungshinweise
Durchsuchen Sie bei der Auswertung Ihrer eigenen relativen Standardkurven-Analyse
die Replikat-Gruppen sorgfältig nach Ausreißern. Falls erforderlich entfernen Sie die
Ausreißer manuell anhand der Well-Tabelle. Entfernen Sie die Ausreißer in Ihrer Analyse
gemäß der Ausführungen unter „Wells herausnehmen“ oben.
Hinweise
117
Ansicht der Multikomponentendarstellung
Weitere
Informationen
Weitere Informationen zum Herausnehmen von Wells aus der Auswertung finden Sie in
klicken oder F1 drücken. Suchen Sie in
der Hilfe nach den folgenden Themen zum Ausnehmen von Wells:
1. Klicken Sie auf den Reiter Search (Suche).
2. Geben Sie omit well (Well herausnehmen) ein.
3. Klicken Sie auf List Topics (Themen auflisten).
4. Doppelklicken Sie auf die gewünschten Themen.
In der Multikomponentendarstellung wird der vollständige Spektralbeitrag eines jeden
Farbstoffs in einem ausgewählten Well für die Dauer des PCR-Laufs angezeigt.
Informationen zur
Beispielanalyse
In der Standardkurven-Beispielanalyse prüfen Sie die Multikomponentendarstellung auf
Folgendes:
•
•
•
•
ROX™-Farbstoff (passive Referenz)
FAM™-Farbstoff (Reporter)
Spitzen, Tiefen und/oder plötzliche Änderungen
Amplifikation in den Negativkontroll-Wells
Multicomponent Plot (AuswertungMultikomponentendarstellung).
Hinweis: Wenn im Bildschirm Multicomponent Plot keine Daten angezeigt werden,
2. Im Bildschirm Multicomponent Plot können Sie Wells einzeln anzeigen lassen:
b. Wählen Sie ein Well aus der Plattenbelegung aus. Es wird in der
Multikomponentendarstellung angezeigt.
3. Wählen Sie aus dem Dropdown-Menü Plot Color (Darstellungsfarbe) Dye (Farbe).
4. Klicken Sie auf
5. Prüfen Sie das FAM-Farbsignal. In der Beispielanalyse steigt das FAM-Farbsignal
während des PCR-Verfahrens an, und weist so auf eine normale Amplifikation hin.
6. Prüfen Sie das ROX-Farbsignal. In der Beispielanalyse bleibt das ROX-Farbsignal
während des gesamten PCR-Verfahrens konstant, was auf typische Daten hinweist.
Hinweise
118
3
4
2a
2b
5
6
7. Wählen Sie die Negativkontoll-Wells nacheinander aus und prüfen Sie auf
Amplifikation. In der Beispielanalyse gibt es in den Negativkontroll-Wells keine
Amplifikation.
7
Hinweise
119
Ansicht der Rohdatendarstellung
Auswertungshinweise
Folgendes:
• Passive Referenz: Das Fluoreszenzniveau der passiven Referenz sollte während des
gesamten PCR-Verfahrens relativ konstant bleiben.
• Reporter-Farbe: Das Fluoreszenzniveau der Reporter-Farbe sollte einen flachen
Bereich für die Grundlinie, gefolgt von einem rapiden Anstieg der Fluoreszenz im
Verlauf der Amplifikation aufweisen.
• Unregelmäßigkeiten im Signal: Es sollten keine Spitzen, Tiefen und/oder
plötzlichen Änderungen im Fluoreszenzsignal auftreten.
• Negativkontroll-Wells: Es sollten keine Amplifikationen in den NegativkontrollWells auftreten.
Weitere
Informationen
Weitere Informationen zur Multikomponentendarstellung finden Sie in der StepOneSoftware-Hilfe, indem Sie auf
In der Rohdatendarstellung wird das Fluoreszenzsignal für jeden optischen Filter für die
ausgewählten Wells während der einzelnen Zyklen der Echtzeit-PCR im Rohzustand
(nicht normalisiert) angezeigt.
Informationen zur
Beispielanalyse
Ansicht der
Rohdatendarstellung
In der relativen Standardkurven-Beispielanalyse prüfen Sie die Rohdatendarstellung auf
einen stabilen Signalanstieg (keine abrupten Änderungen oder Einbrüche) für den
geeigneten Filter.
Data Plot (AuswertungRohdatendarstellung).
Raw
Hinweis: Wenn im Bildschirm Raw Data Plot keine Daten angezeigt werden,
2. Lassen Sie sich alle 48 Wells in der Rohdatendarstellung anzeigen, indem Sie im
Reiter View Plate Layout (Ansicht Plattenbelegung) auf die linke obere Ecke der
Plattenbelegung klicken.
3. Klicken Sie auf
4. Klicken Sie auf und ziehen Sie den Zeiger Show Cycle (Zyklus anzeigen) von
Zyklus 1 bis Zyklus 40. In der Beispielanalyse sehen Sie eine stabile Signalsteigung
von Filter 1, was einem FAM™-Farbfilter entspricht.
Hinweise
120
3
4
Das StepOne™-System verfügt über die folgenden Filter:
Filter
1
Farbstoff
FAM™ Farbstoff
SYBR® Green Farbstoff
2
JOE™ Farbstoff
VIC® Farbstoff
3
Auswertungshinweise
ROX™ Farbstoff
Achten Sie bei der Auswertung Ihrer eigenen relativen Standardkurven-Analyse bei
jedem Filter auf Folgendes:
• charakteristischer Signalanstieg
• keine abrupten Änderungen oder Einbrüche
Weitere
Informationen
Weitere Informationen zur Rohdatendarstellung finden Sie in der StepOne-SoftwareHilfe, indem Sie auf
Hinweise
121
Hinweise
122
Kapitel 6
Experimentelles Design der
vergleichenden CT-Analyse
■ Kapitelübersicht . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 124
■ Anlegen einer neuen Analyse . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 125
■ Definieren der Analyseeigenschaften . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 127
■ Definieren der Methoden und Materialien . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 129
■ Einrichten der Zielsequenzen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 133
■ Einrichten der Proben . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 135
■ Einrichten der relativen Quantifizierungseinstellungen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 138
■ Definieren des Laufprofils . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 139
■ Überprüfen des Pipettierprotokolls. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 141
■ Bestellen von Materialien für die Analyse . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 147
■ Beenden des Analysedesign-Assistenten . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 150
Hinweise
123
Kapitel 6 Experimentelles Design der vergleichenden CT-Analyse
Kapitelübersicht
Kapitelübersicht
In diesem Kapitel wird erklärt, wie der Analysedesign-Assistent in der StepOne™Software für die Einrichtung der vergleichenden CT (∆∆CT)-Beispielanalyse verwendet
werden kann. Der Analysedesign-Assistent führt Sie durch die von Applied Biosystems
empfohlenen bewährten Schritte zur Eingabe von Designparametern für die
Beispielanalyse.
Arbeitsablauf der
Beispielanalyse
Der Arbeitsablauf für das experimentelle Design der mit diesem Einführungshandbuch
gelieferten Beispielanalyse ist nachfolgend abgebildet.
Hinweis: Erstellen Sie das Design der Beispielanalyse unter Verwendung des
Arbeitsablaufs des Analysedesign-Assistenten in der StepOne-Software. Beim Erstellen
Ihres eigenen Analysedesigns können Sie alternative Arbeitsabläufe auswählen
(siehe „Verwendung des Handbuchs für eigene Analysen“ auf Seite 10).
Analyse starten
Analyse beenden
Hinweise
124
Legen Sie unter Verwendung des Analysedesign-Assistenten in der StepOne-Software
eine neue Analyse an.
Anlegen einer
Analyse
2. Klicken Sie im Bildschirm Home (Startseite) auf
Design Wizard
(Analysedesign-Assistent), um den Analysedesign-Assistenten aufzurufen.
2
3. Unter „Software-Elemente“ finden Sie nachstehend weitere Informationen zur
Benutzung des Analysedesign-Assistenten.
SoftwareElemente
Die Elemente der StepOne-Software für den Design Wizard (Analysedesign-Assistent)
sind nachstehend dargestellt.
• File (Datei)
• Tools (Extras)
• Help (Hilfe)
Hinweise
125
• Open (Öffnen)
4. Navigationsbereich – Enthält Links zu allen Bildschirmen im AnalysedesignAssistenten:
• Experiment Properties (Analyseeigenschaften)
• Methods & Materials (Methoden und Materialien)
• Targets (Zielsequenzen)
• Samples (Proben)
• Run Method (Laufprofil)
• Reaction Setup (Pipettierprotokoll)
• Materials List (Materialliste)
Hinweis: Der Analysedesign-Assistent zeigt anfangs den Analysetyp Quantitation Standard Curve (Quantifizierung - Standardkurve) an. Die verfügbaren Bildschirme
des Analysedesign-Assistenten können bei Auswahl eines anderen Analysetyps
variieren. Zum Beispiel wird der Bildschirm Relative Quantitation Settings
(Relative Quantifizierung – Einstellungen) erst angezeigt, wenn Sie den Analysetyp
der relativen Standardkurve oder des vergleichenden CT (∆∆CT) auswählen.
Hinweise
126
1
2
3
4
5
Geben Sie im Bildschirm Experiment Properties (Analyseeigenschaften)
kennzeichnende Angaben für die Analyse ein, und wählen Sie dann den Analysetyp,
den Sie einrichten wollen.
Informationen zur
Beispielanalyse
Bildschirm
Analyseeigenschaften
ausfüllen
In der vergleichenden CT (∆∆CT)-Beispielanalyse:
• Die Analyse ist als Beispiel gekennzeichnet.
• Eine MicroAmp™ Fast Optical 48-Well Reaction Plate wird verwendet.
• Der Analysetyp ist Quantifizierung.
1. Klicken Sie in das Feld Experiment Name (Analysename), und geben Sie dann
Comparative CT Example (vergleichende CT-Beispielanalyse) ein.
Hinweis: Die Analysekopfzeile wird aktualisiert und zeigt den von Ihnen
eingegebenen Analysenamen an.
2. Klicken Sie in das Feld Barcode (Strichcode), und geben Sie dann den Strichcode
auf Ihrer PCR-Reaktionsplatte ein.
3. Klicken Sie in das Feld User Name (Benutzername), geben Sie dann den Example
User (Beispielbenutzer) ein.
Hinweise
127
4. Klicken Sie in das Feld Comments (Anmerkungen), geben Sie dann Comparative
CT Getting Started Guide Example (Vergleichende CT-Beispielanalyse aus dem
Einführungshandbuch) ein.
5. Wählen Sie als Analysetyp Quantitation (Quantifizierung) aus.
1
2
3
4
5
Zur Einrichtung Ihrer eigenen vergleichenden CT-Analyse:
• Geben Sie einen Analysenamen ein, der beschreibenden Charakter hat und sich
leicht merken lässt. Dieser Analysename wird automatisch als Analysedateiname
verwendet. Sie können bis zu 100 Zeichen in das Analysenamenfeld eingeben.
Hinweis: Sie dürfen im Analysenamenfeld die folgenden Zeichen nicht verwenden:
Schrägstrich (/), umgekehrter Schrägstrich (\), Größer-als-Zeichen (>), Kleiner-alsZeichen (<), Stern (*), Fragezeichen (?), Anführungszeichen ("), vertikale Linie (|),
Doppelpunkt (:) und Semikolon (;).
• Verwenden Sie MicroAmp™ Fast Optical 48-Well Reaction Plates, MicroAmp™ Fast
8-Tube Strips oder MicroAmp® Fast Reaction Tubes with Caps. Die FastVerbrauchsmaterialien können sowohl mit Fast- als auch mit Standardreagenzien
verwendet werden.
• (Optional) Geben Sie zur Identifizierung der PCR-Reaktionsplatte den Strichcode
ein. Sie können bis zu 100 Zeichen in das Strichcodefeld eingeben.
• (Optional) Geben Sie zur Identifizierung des Anwenders einen Benutzernamen ein.
Sie können bis zu 100 Zeichen in das Benutzernamensfeld eingeben.
• (Optional) Geben Sie Anmerkungen zur Beschreibung der Analyse ein. Sie können
bis zu 1000 Zeichen in das Anmerkungsfeld eingeben.
• Wählen Sie als Analysetyp Quantitation (Quantifizierung) aus.
Hinweise
128
Weitere
Informationen
• Informationen zum Ausfüllen des Bildschirms Experiment Properties
(Analyseeigenschaften) finden Sie in der StepOne-Software-Hilfe, indem Sie auf
• Informationen zu Verbrauchsmaterialien finden Sie unter „Unterstützte
• Informationen zu Quantifizierungsanalysen finden Sie im Applied Biosystems
Wählen Sie im Bildschirm Methods & Materials (Methoden und Materialien)
Quantifizierungsmethode, Reagenzien, Heiz-/Kühlgeschwindigkeit und PCR-Template
für die Analyse aus.
Informationen zur
Beispielanalyse
Bildschirm
Methoden und
Materialien
ausfüllen
•
•
•
•
Die vergleichende CT-Quantifizierungsmethode wird verwendet.
Verwenden Sie TaqMan®-Reagenzien.
Verwenden Sie für den Lauf die Heiz-/Kühlgeschwindigkeit FAST.
cDNA (präpariert aus der gesamten RNA isoliert aus Gewebe von Leber, Nieren und
Gehirn) ist der Template-Typ. Bevor Sie ein cDNA-Template verwenden können,
müssen Sie die reverse Transkription durchführen, um die RNA in cDNA
umzuwandeln (siehe „Vorbereiten des Templates“ auf Seite 155).
1. Wählen Sie Comparative CT (∆∆CT) (vergleichende CT) als
Quantifizierungsmethode aus.
2. Wählen Sie als Reagenzien TaqMan® Reagents aus.
3. Wählen Sie als Heiz-/Kühlgeschwindigkeit Fast (~40 Minuten für einen
vollständigen Lauf).
4. Wählen Sie als Template-Typ cDNA (komplementäre DNA).
Hinweise
129
1
2
3
4
• Wählen Sie Comparative CT (∆∆CT) (vergleichende CT) als
Quantifizierungsmethode aus. In vergleichenden CT (∆∆CT)-Analysen wird die
Expressionsänderung einer Zielsequenz in einer Probe relativ zur gleichen
Zielsequenz in einer Referenzprobe bestimmt. Die Ergebnisse werden anhand
arithmetischer Formeln ermittelt. Bei der Einrichtung Ihrer Reaktionsplatte sind bei
der vergleichenden CT-Methode Zielsequenzen, Proben, Referenzproben und eine
endogene Kontrolle notwendig.
Hinweis: Bevor Sie die vergleichende CT-Methode verwenden, empfiehlt Applied
Biosystems, dass Sie die PCR-Effizienzen für den Ziel-Assay und den endogenen
Kontroll-Assay etwa gleich festlegen. Applied Biosystems TaqMan® Gene
Expression Assays und Custom TaqMan® Gene Expression Assays verfügen über
ähnliche Amplifikationseffizienzen von 100% (±10%).
• Wählen Sie die zu verwendenden Reagenzien aus:
– Wählen Sie TaqMan® Reagents aus, wenn Sie zur Detektion der Amplifikation
und zur Quantifizierung der Zielsequenzmengen in den Proben TaqManReagenzien verwenden möchten. TaqMan-Reagenzien bestehen aus zwei
Primern und einer TaqMan®-Sonde. Die Primer dienen der Amplifikation der
Zielsequenz. Die TaqMan-Sonde hybridisiert an die Zielsequenz und erzeugt bei
Amplifikation der Zielsequenz ein Fluoreszenzsignal.
WICHTIG! Applied Biosystems empfiehlt nicht die Verwendung von TAMRA™-
Farbstoff als Reporter oder Quencher mit dem StepOne™-System.
Hinweise
130
– Wählen Sie SYBR®Green-Reagenzien aus, wenn Sie zur Detektion der
Amplifikation und zur Quantifizierung der Zielsequenzmengen in den Proben
SYBR Green-Reagenzien verwenden möchten. SYBR Green-Reagenzien
bestehen aus zwei Primern und dem SYBR Green-Farbstoff. Die Primer dienen
der Amplifikation der Zielsequenz. Der SYBR Green-Farbstoff erzeugt bei der
Bindung an doppelsträngige DNA ein Fluoreszenzsignal. Der SYBR GreenFarbstoff ist oftmals ein Bestandteil des SYBR Green Master Mix, der zur
Reaktion hinzugegeben wird. Gehen Sie bei Verwendung von SYBR GreenFarbstoff folgendermaßen vor:
Aktivieren Sie das Kontrollkästchen Include Melt Curve (Inklusive
Schmelzkurve), um eine Schmelzkurvenanalyse der amplifizierten Zielsequenz
auszuführen.
Wählen Sie als Heiz-/Kühlgeschwindigkeit Standard. Für SYBR GreenReagenzien steht kein Fast Master-Mix von Applied Biosystems zur Verfügung.
Hinweis: Sie können andere fluoreszenzbasierte Reagenzien auf dem StepOne-
System verwenden, jedoch müssen Sie dazu Ihre Analyse mit dem Arbeitsablauf
Advanced Setup (Setup für Fortgeschrittene) anstatt mit dem AnalysedesignAssistenten einrichten. Siehe „Setup für Fortgeschrittene“ auf Seite 200.
• Wählen Sie die geeignete Heiz-/Kühlgeschwindigkeit für den Gerätelauf aus:
– Wählen Sie Fast (~40 Minutes to Complete a Run) (Schnell (ca. 40 min. für
einen Lauf)), wenn Sie Fast-Reagenzien für die PCR-Reaktionen verwenden.
– Wählen Sie Standard (~2 Hours to Complete a Run) (Standard (ca. 2 Stunden
für einen Lauf)), wenn Sie Standardreagenzien für die PCR-Reaktionen
verwenden (einschließlich SYBR Green-Reagenzien und Standard-TaqManReagenzien).
• Wählen Sie das passende PCR-Template aus:
– Wählen Sie cDNA (complementary DNA) (cDNA (komplementäre DNA)),
wenn Sie eine 2-Schritt-RT-PCR durchführen und bereits eine reverse
Transkription zur Umwandlung der RNA in cDNA vorgenommen haben. Sie
geben komplementäre DNA zu den PCR-Reaktionen hinzu.
– Wählen Sie RNA, wenn Sie eine 1-Schritt-RT-PCR durchführen. Sie geben
Gesamt-RNA oder mRNA zu den PCR-Reaktionen hinzu.
– Wählen Sie gDNA (genomic DNA) (gDNA (genomische DNA)), wenn Sie die
gDNA bereits aus dem Gewebe oder der Probe extrahiert haben. Sie geben
gereinigte genomische DNA zu den PCR-Reaktionen hinzu.
Hinweise
131
Weitere
Informationen
• Informationen über das Ausfüllen des Bildschirms Methods & Materials (Methoden
und Materialien) finden Sie in der StepOne-Software-Hilfe, indem Sie auf
• Informationen zur Bestimmung von PCR-Effizienzen finden Sie in der Hilfe der
StepOne Software, indem Sie auf
klicken oder F1 drücken. Innerhalb der
Software-Hilfe können Sie wie folgt suchen:
a. Klicken Sie auf den Reiter Search (Suche).
b. Geben Sie PCR efficiency (PCR-Effizienz) ein.
c. Klicken Sie auf List Topics (Themen auflisten).
d. Doppelklicken Sie auf Determine PCR Efficiency (PCR-Effizienz
•
•
•
•
bestimmen).
Zur Verwendung der Quantifizierungsmethode für relative Standardkurven siehe
Kapitel 2 bis 5 in diesem Handbuch.
Zur Verwendung der Standardkurven-Quantifizierungsmethode siehe StepOne™
Real-Time PCR System Einführungshandbuch zu Standardkurven-Analysen.
Informationen über TaqMan- und SYBR Green-Reagenzien finden Sie im Applied
Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System-Reagenzienhandbuch.
Informationen über PCR, einschließlich Singleplex- vs. Multiplex-PCR und 1Schritt- vs. 2-Schritt-RT-PCR, finden Sie im Applied Biosystems StepOne™ RealTime PCR System-Reagenzienhandbuch.
Hinweise
132
Geben Sie im Bildschirm Targets (Zielsequenzen) die Anzahl der Zielsequenzen ein, die
Sie in der PCR-Reaktionsplatte quantifizieren möchten, und richten Sie dann den Assay
für jede Zielsequenz ein.
Informationen zur
Beispielanalyse
Bildschirm
Targets
(Zielsequenzen)
ausfüllen
• Zwei Zielsequenzen werden in der Reaktionsplatte quantifiziert.
• Der Assay für Zielsequenz 1 wird als die von Ihnen untersuchte Zielsequenz
eingerichtet. In der Beispielanalyse ist dies TP53 (ein Transkriptionsfaktor, der
andere Gene reguliert).
• Der Assay für Zielsequenz 2 wird zur endogenen Kontrolle eingerichtet. In der
Beispielanalyse ist dies das humane Glycerinaldehyd-3-Phosphat (GAPDH).
GAPDH dient als endogene Kontrolle, weil seine Expressionsstufen in der Regel
relativ stabil sind.
1. Klicken Sie in das Feld How many targets do you want to quantify in the
reaction plate? (Wie viele Zielsequenzen möchten Sie in der Reaktionsplatte
quantifizieren?), und geben Sie dann 2 ein.
Hinweis: Die Anzahl der Zeilen in der Tabelle mit den Zielsequenz-Assays wird
entsprechend der eingegebenen Zahl aktualisiert.
eingeben), und geben Sie dann TP53 ein.
eingeben), und geben Sie dann GAPDH ein.
Hinweise
133
Hinweis: Lassen Sie das Feld (Optional) Enter Gene Name (Optional: Gennamen
eingeben) für alle Zielsequenzen leer. Sie können nach der „Gene ID“ bzw. „Assay ID“
suchen, wenn Sie Ihre Materialien bestellen (siehe „Bestellen von Materialien für die
Analyse“ auf Seite 147).
1
2
3
• Kennzeichnen Sie jeden Zielsequenz-Assay mit einem eindeutigen Namen und einer
Farbe. Sie können bis zu 100 Zeichen in das Feld für den Zielsequenznamen
eingeben.
• Wählen Sie für jede Probe eine endogene Kontrolle aus. Die endogene Kontrolle ist
eine Zielsequenz, die in allen zu untersuchenden Proben vorhanden ist. Sie sollte in
allen Probentypen gleich expremiert sein, unabhängig von Behandlung oder
Herkunft des Gewebes (Beispiele für endogene Kontrollen sind β-actin, GAPDH
und 18S ribosomal RNA [18S rRNA]). Die endogene Kontrolle wird zur
Normalisierung der PCR-Ergebnisse verwendet; die endogene Kontrolle
kompensiert variable Probenmengen, Nukleinsäure-Extraktionseffizienzen und
fehlerhafte Pipettenkalibrierung. Bitte beachten Sie dabei Folgendes:
– Eine endogene Kontrolle ist für jeden Probentyp erforderlich (zum Beispiel für
jedes Gewebe in einer verschiedene Gewebe vergleichenden Studie).
– Wenn Proben über mehrere Platten verteilt werden, muss jede Platte eine
endogene Kontrolle aufweisen. Darüber hinaus muss jede Plate eine endogene
Kontrolle für jeden Probentyp auf der Platte beinhalten.
Hinweise
134
• Wählen Sie den im Zielsequenz-Assay verwendeten Reporter-Farbstoff aus:
– Wählen Sie FAM, wenn der FAM™-Farbstoff an das 5′-Ende der TaqMan-Sonde
– Wählen Sie JOE, wenn der JOE™-Farbstoff an das 5′-Ende der TaqMan-Sonde
– Wählen Sie VIC, wenn der VIC®-Farbstoff an das 5′-Ende der TaqMan-Sonde
– Wählen Sie SYBR, wenn Sie SYBR® Green-Farbstoff zur Detektion
doppelsträngiger DNA verwenden.
• Wählen Sie den im Zielsequenz-Assay verwendeten Quencher aus:
– Wählen Sie NFQ-MGB, wenn ein nicht fluoreszierender Quencher Minor
Groove Binder an das 3′-Ende der TaqMan-Sonde gebunden ist, die Sie zur
Detektion der Zielsequenz verwenden.
– Wählen Sie None (Keine), wenn Sie SYBR Green-Farbstoff verwenden.
Farbstoff als Reporter oder Quencher mit dem StepOne™-System.
Weitere
Informationen
• Informationen zum Ausfüllen des Bildschirms Targets (Zielsequenzen) finden Sie
in der StepOne Software Help, indem Sie auf
• Zur Auswahl einer endogenen Kontrolle siehe Anwendungshinweis Using TaqMan®
Endogenous Control Assays to Select an Endogenous Control for Experimental
Studies.
Geben Sie im Bildschirm Samples (Proben) die Anzahl der Proben, Replikate und
Negativkontrollen ein, die Sie in die Reaktionsplatte aufnehmen möchten, geben Sie die
Probennamen ein, und wählen Sie dann die einzurichtenden Probe/ZielsequenzReaktionen aus.
Informationen zur
Beispielanalyse
• Es werden drei Proben verwendet: cDNA auf der Basis von aus Leber-, Nieren- und
Hirngewebe isolierter RNA. Die Proben enthalten unbekannte Mengen von TP53
(Zielsequenz) und GAPDH (endogene Kontrolle).
• Es werden drei Replikate verwendet. Replikate sind identische Reaktionen mit
identischen Reaktionskomponenten und -volumina.
• Es werden sechs Negativkontrollen verwendet. Negativkontrollreaktionen enthalten
Wasser statt der Proben und sollten keine Amplifikation zeigen. Die Software
schließt automatisch für jeden Ziel-Assay drei Negativkontrollen ein.
Hinweise
135
Bildschirm
Samples (Proben)
ausfüllen
1. Klicken Sie in das Feld How many samples do you want to test in the reaction
plate? (Wie viele Proben möchten Sie in der Reaktionsplatte testen?), und geben
Sie 3 ein.
Hinweis: Die Anzahl der Zeilen in der Tabelle mit den Proben wird entsprechend
der eingegebenen Zahl aktualisiert.
2. Klicken Sie in das Feld How many replicates do you need? (Wie viele Replikate
benötigen Sie?), und geben Sie 3 ein.
geben Sie Liver (Leber) ein.
b. Belassen Sie die Standardauswahl im Feld Color (Farbe).
geben Sie Kidney (Niere) ein.
geben Sie Brain (Hirn) ein.
b. Belassen Sie die Standardauswahl im Feld Color (Farbe).
6. Wählen Sie All Sample/Target Reactions (Alle Probe/Zielsequenz-Reaktionen),
um alle Zielsequenzen in allen Proben zu testen.
7. Überprüfen Sie im Bereich Well Count (Well-Zählung), ob Folgendes erscheint:
• 24 leere Wells
Hinweis: Die Software schließt automatisch für jeden Ziel-Assay drei
Negativkontrollen ein. Die Negativkontroll-Wells
angezeigt (Wells A1 bis A6).
werden in der Plattenbelegung
8. Wählen Sie unter dem Reiter Plate Layout (Plattenbelegung) aus dem DropdownMenü Arrange Plate by (Platte belegen nach) Rows (Zeilen) (Standardeinstellung).
Hinweise
136
8
1
2
3
4
5
6
7
Zur Einrichtung Ihrer eigenen CT-Analyse:
• Kennzeichnen Sie jede Probe mit einem eindeutigen Namen und einer Farbe. Sie
können bis zu 100 Zeichen in das Probennamenfeld eingeben.
• Geben Sie die Anzahl der einzurichtenden identischen Reaktionen (Replikate) an.
Applied Biosystems empfiehlt für jede Probenreaktion drei Replikate.
• Die Software schließt automatisch für jeden Ziel-Assay drei Negativkontrollen ein.
• Wählen Sie die gewünschte Kombination an Proben/Zielsequenz-Reaktionen aus:
– Wählen Sie All Sample/Target Reactions (Alle Proben/ZielsequenzReaktionen), um alle Zielsequenzen in allen Proben zu testen.
– Wählen Sie Specify Sample/Target Reactions (Proben/Zielsequenz-Reaktionen
angeben), um in jeder Probe die zu testenden Zielsequenzen festzulegen.
Hinweis: Im Analysedesign-Assistenten kann jede PCR-Reaktion nur eine Probe
und einen Zielsequenz-Assay enthalten.
Weitere
Informationen
Weitere Informationen zum Ausfüllen des Bildschirms Samples (Proben) finden Sie in
Hinweise
137
Im Bildschirm Relative Quantitation Settings (Relative Quantifizierungseinstellungen)
wählen Sie die Referenzprobe und die endogene Kontrolle für die Durchführung der
relativen Quantifizierung aus.
Informationen zur
Beispielanalyse
Bildschirm
Relative
Quantifizierungseinstellungen
ausfüllen
• Als Referenzprobe wird Hirn verwendet.
• Als endogene Kontrolle wird GAPDH verwendet.
1. Wählen Sie aus dem Dropdown-Menü Which sample do you want to use as the
reference sample? (Welche Probe möchten Sie als Referenzprobe verwenden?)
Brain (Hirn) aus.
2. Wählen Sie aus dem Dropdown-Menü Which target do you want to use as the
endogenous control? (Welche Probe möchten Sie als endogene Kontrolle
verwenden?) GAPDH aus.
1
2
• Wählen Sie eine Referenzprobe aus Ihren zuvor erstellten Proben aus („Einrichten
der Proben“ auf Seite 135). Die Amplifikationsergebnisse der Proben werden mit
den Amplifikationsergebnissen der Referenzproben verglichen, um die relative
Expression festzustellen.
• Wählen Sie eine endogene Kontrolle aus Ihren zuvor erstellten Zielsequenz-Assays
aus („Einrichten der Zielsequenzen“ auf Seite 133). Die Amplifikationsergebnisse
aus der endogenen Kontrolle werden verwendet, um die Differenzen in der zu jeder
Reaktion hinzugefügten Template-Menge bei den Amplifikationsergebnissen der
Zielsequenz zu normalisieren.
Hinweise
138
Weitere
Informationen
• Informationen über das Ausfüllen des Bildschirms Quantification Settings finden
Sie in der StepOne Software Help, indem Sie auf
• Zu Referenzproben (auch Kalibratoren genannt) und endogenen Kontrollen siehe
User Bulletin #2: Relative Quantitation of Gene Expression (Relative
Quantifizierung der Genexpression).
Überprüfen Sie im Bildschirm Run Method (Laufprofil) das Reaktionsvolumen und das
Thermoprofil für das Standardlaufprofil. Bei Bedarf können Sie das Standardprofil
bearbeiten oder es mit einem anderen aus der Laufprofil-Bibliothek ersetzen.
Informationen zur
Beispielanalyse
LaufprofilBildschirm
überprüfen
In der vergleichenden CT-Beispielanalyse wird das Standardlaufprofil unverändert
übernommen.
1. Klicken Sie entweder auf den Reiter Graphical View (Grafische Ansicht)
(Standardeinstellung) oder auf den Reiter Tabular View (Tabellarische Ansicht).
3. Überprüfen Sie, dass das Thermoprofil die nachfolgend abgebildete Halte- und
Zyklusphase anzeigt.
1
2
3
Hinweise
139
Weitere
Informationen
Weitere Informationen zur Laufprofil-Bibliothek oder zum Ausfüllen des Bildschirms
Run Method (Laufprofil) finden Sie in der StepOne-Software-Hilfe, indem Sie auf
• Überprüfen Sie das Thermoprofil:
– Überprüfen Sie, dass das Thermoprofil für Ihre Reagenzien geeignet ist.
– Wenn Sie eine 1-Schritt-RT-PCR durchführen, fügen Sie einen Schritt für die
reverse Transkription ein.
Wenn Ihre Analyse ein anderes Thermoprofil erfordert, bearbeiten Sie das
Thermoprofil, oder ersetzen Sie das Laufprofil durch ein anderes Laufprofil aus der
Laufprofil-Bibliothek. Die Laufprofil-Bibliothek ist in der StepOne-Software
enthalten.
Hinweise
140
Wählen Sie im Bildschirm Reaction Setup (Pipettierprotokoll) den Assay-Typ aus (wenn
Sie TaqMan-Reagenzien verwenden), prüfen Sie dann die berechneten Volumina für die
Vorbereitung der PCR-Reaktionen und Probenverdünnungen. Bei Bedarf können Sie das
Reaktionsvolumen, überschüssige Reaktionsvolumen, die Komponentenkonzentrationen
und/oder die Konzentration der verdünnten Probe bearbeiten.
WICHTIG! Führen Sie diese Schritte für jeden Zielsequenz-Assay in der Reaktionsplatte
durch.
Informationen zur
Beispielanalyse
Pipettierprotokollbildschirm
ausfüllen
Es werden Applied Biosystems TaqMan® Gene Expression Assays verwendet.
Das Reaktionsvolumen pro Well beträgt 20 µl.
Zur Pipettierkorrektur beträgt das überschüssige Reaktionsvolumen 10 %.
Zu den Reaktionskomponenten gehören:
– TP53 Assay Mix (20-fach)
– Probe
– Wasser
• Die Konzentration der verdünnten Probe beträgt 5,0 ng/µl.
• Die Konzentration der Probenstammlösung beträgt 100 ng/µl.
•
•
•
•
Ausfüllen des Reiters Berechnung des Reaktionsmixes für den TP53-Assay
2. Wählen Sie im Bereich Select Target (Zielsequenz auswählen) TP53.
6. Überprüfen Sie im Bereich Reactions for c-myc (Reaktionen für c-Myc) die
Hinweise
141
Reaktionen:
Komponente
Master Mix (2-fach)
10,0
Assay-Mix (20-fach)
1,0
Probe (10-fach)
2,0 ‡
H2O
7,0
Gesamtvolumen
20,0
‡ Das Probenvolumen ist auf 10 % des gesamten
3
4
5
1
2
6a
6b
6c
für den GAPDH-Assay
2. Wählen Sie im Bereich Select Target (Zielsequenz auswählen) GAPDH.
Hinweise
142
6. Überprüfen Sie im Bereich Reactions for GAPDH (Reaktionen für GAPDH) die
Reaktionen:
Komponente
Master Mix (2-fach)
10,0
Assay-Mix (20-fach)
1,0
Probe (10-fach)
2,0 ‡
H2O
7,0
Gesamtvolumen
20,0
‡ Das Probenvolumen ist auf 10 % des gesamten
3
4
5
1
2
6a
6b
6c
Hinweise
143
Ausfüllen des Reiters Dilution Calculations (Berechnung der Probenverdünnung)
1. Wählen Sie den Reiter Sample Dilution Calculations (Berechnung der
Probenverdünnung) aus.
2. Klicken Sie in das Feld Diluted Sample Concentration (10✕ for Reaction Mix)
(Konzentration der verdünnten Probe (10✕ für Reaktionsmix)), und geben Sie
dann 5.0 (5,0) ein.
3. Wählen Sie aus dem Dropdown-Menü der Maßeinheiten ng/µl
4. Überprüfen Sie die berechneten Volumina für die Probenverdünnungen:
Konzentration der
Stammlösung
(ng/µl)
Probenvolumen (µl)
Volumen des
Gesamtvolumen der
verdünnten
Probe (µl)
Leber
100,0
1,0
19,0
20,0
Niere
100,0
1,0
19,0
20,0
Hirn
100,0
1,0
19,0
20,0
Probenname
1
2
3
4
Hinweise
144
Ausdrucken der Anleitung für das Pipettierprotokoll
Drucken Sie die ausführliche Anleitung für das Pipettierprotokoll aus, und speichern Sie
dann die Anleitung zur Kapitel 7, „Ansetzen der vergleichenden CT-Reaktionen“.
1. Klicken Sie aufPrint Reaction Setup (Pipettierprotokoll drucken).
1
2. Wählen Sie im Dialogfeld die folgenden Optionen aus:
• Detailed Reaction Setup Instructions (Ausführliche Anleitung für das
Pipettierprotokoll)
• Include Plate Layout (Inklusive Plattenbelegung)
• Use sample color (Probenfarbe verwenden)
3. Klicken Sie auf Print (Drucken).
2
3
4. Wählen Sie im Dialogfeld Print (Drucken) den Drucker und die Druckoptionen aus,
und klicken Sie dann auf OK.
• Wenn Sie TaqMan-Reagenzien verwenden, wählen Sie den von Ihnen verwendeten
Assay-Typ aus:
– Wählen Sie Inventorized/Made to Order (Inventarisiert/auf Bestellung), wenn
Sie Applied Biosystems TaqMan® Gene Expression Assays (Inventorized or
Made to Order) oder Applied Biosystems Custom TaqMan® Gene Expression
Assays verwenden.
– Wählen Sie Custom (Benutzerdefiniert), wenn Sie mit der Primer Express®Software Ihre eigenen Assaydesigns einrichten.
Hinweise
145
• Sorgen Sie für überschüssiges Reaktionsvolumen, um den Verlust während der
Pipettierung auszugleichen. Applied Biosystems empfiehlt ein überschüssiges
Reaktionsvolumen von mindestens 10 %.
• Überprüfen Sie die Reaktionsmixkonzentrationen für jede Zielsequenz je nach
Bedarf:
– Bearbeiten Sie bei TaqMan-Reagenzien die Konzentrationen von Master-Mix
und Assay-Mix.
– Bearbeiten Sie SYBR Green-Reagenzien die Konzentrationen von Master Mix,
Forward Primer und Reverse Primer.
– Bearbeiten Sie bei einer 1-Schritt-RT-PCR die Konzentration der reversen
Transkriptase.
• Überprüfen Sie die Reaktionsmixkomponenten für jede Zielsequenz:
– Wenn Sie Fast-PCR-Reaktionen durchführen, überprüfen Sie, dass Sie in den
PCR-Reaktionen einen Fast Master-Mix verwenden.
– Wenn Sie Standard-PCR-Reaktionen durchführen, überprüfen Sie, dass Sie in
den PCR-Reaktionen einen Standard-Master-Mix verwenden.
– Überprüfen Sie bei einer 1-Schritt-RT-PCR, dass in den PCR-Reaktionen reverse
Transkriptase enthalten ist und ein spezifischer Puffer verwendet wird.
• Überprüfen Sie für jede Probe die Berechnungen der Probenverdünnung. Bearbeiten
Sie bei Bedarf die Konzentration der verdünnten Probe (einschließlich
Maßeinheiten) und die Konzentration der Stammlösung.
Weitere
Informationen
• Informationen über das Ausfüllen des Bildschirms Reaction Setup
(Pipettierprotokoll) finden Sie in der StepOne-Software-Hilfe, indem Sie auf
• Informationen über Applied Biosystems-Assays finden Sie in den folgenden
Protokollen:
– Custom TaqMan® Gene Expression Assays Protocol.
Hinweise
146
Überprüfen Sie im Bildschirm Materials List (Materialliste) die Liste der empfohlenen
Materialien für die Vorbereitung der PCR-Reaktionsplatte.
Sie können die empfohlenen Materialien im Applied Biosystems Store erwerben. Legen
Sie einen Einkaufskorb an, fügen Sie Artikel zur Einkaufsliste hinzu, und melden Sie
sich an, um Ihre Bestellung aufzugeben. Sie benötigen für den Zugriff auf den Applied
Biosystems Store einen unbeschränkten Internetzugang
Hinweis: Die StepOne-Software empfiehlt die zu bestellenden Materialien auf der
Grundlage Ihres Analysedesigns. Es wird angenommen, dass Sie zuerst Ihr
Analysedesign einrichten und Ihre Materialien bestellen, und dann die Reaktionsplatte
vorbereiten (Kapitel 7) und den Lauf starten (Kapitel 8), wenn Ihre Materialien
eintreffen.
Informationen zur
Beispielanalyse
Bildschirm
Materialbestellung
ausfüllen
Die in der vergleichenden CT-Beispielanalyse empfohlenen Materialien sind Folgende:
•
•
•
•
•
TP53 Assay Mix: Hs00153340_m1 (RefSeq NM_000546.2)
GAPDH Assay Mix: Human GAPD (GAPDH) Endogenous Control kit
(BN 4333764T)
1. So suchen Sie den Zielsequenz-Assay im Applied Biosystems Store:
a. Stellen Sie sicher, dass Ihr Computer mit dem Internet verbunden ist.
b. Klicken Sie in das Feld Enter Gene Name (Gennamen eingeben), geben Sie
TP53 ein, und klicken Sie dann auf Find Assay (Assay suchen).
c. Wählen Sie im Dialogfeld Find Assay Results (Ergebnisse der Assay-Suche)
d. Klicken Sie in das Feld Enter Gene Name (Gennamen eingeben), geben Sie
GAPDH ein, und klicken Sie dann auf Find Assay (Assay suchen).
e. Wählen Sie im Dialogfeld Find Assay Results (Ergebnisse der Assay-Suche)
die Zeile 4333764T aus.
f. Klicken Sie auf Apply Assay Selection (Assay-Auswahl anwenden).
2. Füllen Sie den Bereich Experiment Materials List (Liste der Analysematerialien)
aus:
a. Wählen Sie aus dem Dropdown-Menü Display (Anzeigen) All Items (Alle
Artikel) aus (Standardeinstellung). Benutzen Sie bei Bedarf die rechte
Bildlaufleiste, um alle Artikel zu sehen.
Hinweise
147
b. Aktivieren Sie das Kontrollkästchen neben jedem der folgenden Artikel:
•
•
•
•
•
TP53 Assay Mix: Hs00153340_m1 (RefSeq NM_000546.2)
GAPDH Assay Mix: Human GAPD (GAPDH) Endogenous Control kit
(BN 4333764T)
Hinweis: Weitere Informationen zu den Artikeln erhalten Sie, wenn Sie auf
den Link der Bestellnummer klicken, der Sie mit dem Applied Biosystems
Store verbindet. Auf der Webseite geben Sie die Bestellnummer in das
Suchfeld (Search) ein und klicken dann auf
Go (Los!).
c. Klicken Sie auf Add Selected Items to Shopping List (Ausgewählte Artikel
zur Einkaufsliste hinzufügen).
3. Vergewissern Sie sich, dass die Experiment Shopping List (Einkaufsliste für die
Analyse) die gewünschten Materialien enthält und die Mengenangaben korrekt sind,
klicken Sie dann auf Order Materials in List (Materialien in der Liste bestellen).
1b,1d
2a
2c
2b
3
Hinweise
148
4. Geben Sie im Dialogfeld Order Materials - Log In (Materialien bestellen –
Anmelden) Ihren Benutzernamen und Ihr Passwort für den Applied Biosystems
Store ein, und klicken Sie dann auf Login and Submit (Anmelden und Bestellung
abschicken)
Hinweis: Wenn Sie beim Applied Biosystems Store noch kein Konto haben, klicken
Sie auf Register Now (Jetzt registrieren), um ein Kundenkonto anzulegen.
4
5. Nachdem Sie Ihre Bestellung abgegeben haben, klicken Sie auf Finish Designing
Experiment (Einrichtung des Analysedesigns fertigstellen).
• Stellen Sie sicher, dass Ihr Computer über eine uneingeschränkte
Internetverbindung verfügt.
• Applied Biosystems empfiehlt die folgenden Versionen von Browser und Adobe®
Acrobat® Reader bei der Verwendung der Webseite von Applied Biosystems:
DesktopBetriebssystem
Netscape®
Navigator
Microsoft®
Internet Explorer
Adobe® Acrobat®
Reader
Windows®
98/NT/2000
ab v6.x
ab v6.x
ab v4.0
Macintosh® OS 9
oder neuer
ab v6.x
ab v5.2
ab v4.0
Hinweis: Stellen Sie sicher, dass Cookies und Java Script aktiviert sind, damit die
Webseite korrekt funktioniert.
• Wählen Sie alle Materialien aus, die Sie für Ihre Analyse benötigen, und fügen Sie
sie zu Ihrer Einkaufsliste hinzu.
Weitere
Informationen
Weitere Informationen zum Ausfüllen des Bildschirms Materials List (Materialliste)
Hinweise
149
Um den Analysedesign-Assistenten zu beenden, überprüfen Sie die Plattenbelegung, und
wählen Sie dann eine Exit (Verlassen) Option.
Informationen zur
Beispielanalyse
Die StepOne-Software wählt die Anordnung der Wells in der Reaktionsplatte
automatisch aus. Für die vergleichende CT-Beispielanalyse gilt Folgendes:
• Die Wells werden wie unten dargestellt angeordnet:
• Die Analyse wird so, wie sie ist, gespeichert und geschlossen.
Hinweis: Führen Sie zu diesem Zeitpunkt nicht den Lauf für die Beispielanalyse aus.
AnalysedesignAssistenten
fertigstellen
1. Überprüfen Sie im Fenster Review Plate for Experiment (Platte für Analyse
überprüfen) die Plattenbelegung. Überprüfen Sie, dass Folgendes vorhanden ist:
• 24 leere Wells
Hinweis: Sollte die Plattenbelegung fehlerhaft sein, klicken Sie auf Return to the
Wizard (Zurück zum Assistenten), und überprüfen Sie die eingegebenen Werte.
Hinweise
150
2. Klicken Sie auf Save Experiment (Analyse speichern).
2
1
3. Klicken Sie im Dialogfeld Save Experiment (Analyse speichern) auf Save
(Speichern), um den vorgeschlagenen Dateinamen und Zielpfad zu akzeptieren.
Die Beispielanalyse wird gespeichert und geschlossen, und Sie kehren zum
Bildschirm Home (Startseite) zurück.
Hinweis: Die Beispielanalyse wird standardmäßig im Ordner für Analysen unter
Applied Biosystems\StepOne System\experiments abgelegt.
3
Hinweise
151
Weitere
Informationen
Weitere Information zur Verwendung des Arbeitsablaufs Advanced Setup (Setup für
Fortgeschrittene) finden Sie unter „Setup für Fortgeschrittene“ auf Seite 200.
• Wählen Sie im Fenster Review Plate for Experiment (Platte für Analyse überprüfen)
die gewünschte Beendigungsoption:
– Klicken Sie auf Save Experiment (Analyse speichern), wenn Sie die Analyse
speichern und schließen möchten, ohne weitere Änderungen vorzunehmen oder
den Lauf zu starten.
– Klicken Sie auf Start Run for This Experiment (Lauf für diese Analyse
starten), wenn Sie die Analyse speichern und den Lauf starten möchten. Stellen
Sie sicher, dass die Reaktionsplatte in das Gerät eingelegt wurde.
– Klicken Sie auf Edit Plate Layout (Plattenbelegung bearbeiten), wenn Sie den
Arbeitsablauf Advanced Setup (Setup für Fortgeschrittene) zur Bearbeitung der
Plattenbelegung nutzen möchten.
– Klicken Sie auf Create Another Experiment Using the Design Wizard (Eine
weitere Analyse mit dem Analysedesign-Assistenten anlegen), wenn Sie die
Analyse speichern und schließen möchten, und dann mit dem AnalysedesignAssistenten eine neue Analyse anlegen möchten.
– Klicken Sie auf Return to the Wizard (Zurück zum Assistenten), wenn Sie zur
Analyse zurückkehren möchten, um mithilfe des Analysedesign-Assistenten
Änderungen vorzunehmen.
• Analysen werden standardmäßig im Ordner für Analysen unter Applied Biosystems\
StepOne System\experiments abgelegt. So können Sie diese Einstellungen ändern:
– Zur Änderung des Speicherpfads für eine bestimmte Analyse öffnen Sie im
Dialogfeld Save Experiment (Analyse speichern) das gewünschte
Zielverzeichnis.
– Zur Änderung des Standardspeicherpfads wählen Sie ToolsPreferences
(ToolsEinstellungen), wählen Sie dann den Reiter General (Allgemeines)
(Standardeinstellung). Wählen Sie im Feld Default Data Folder
(Standarddatenordner) den gewünschten Zielpfad.
Hinweise
152
Kapitel 7
Ansetzen der vergleichenden
CT-Reaktionen
■ Vorbereiten des Templates . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 155
■ Ansetzen der Probenverdünnungen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 156
■ Ansetzen des Reaktionsmixes. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 158
■ Vorbereiten der Reaktionsplatte . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 161
Hinweise
153
Kapitel 7 Ansetzen der vergleichenden CT-Reaktionen
Kapitelübersicht
Kapitelübersicht
Dieses Kapitel beschreibt das Ansetzen der PCR-Reaktionen für die vergleichende CT
(∆∆CT)-Beispielanalyse und gibt Hinweise zum Ansetzen der PCR-Reaktionen für Ihre
eigenen vergleichenden CT-Analysen.
Arbeitsablauf der
Beispielanalyse
Der Arbeitsablauf für das Ansetzen der PCR-Reaktionen für die mit diesem
Einführungshandbuch gelieferte Beispielanalyse wird nachfolgend dargestellt.
Analyse starten
3. Setzen Sie für jeden Zielsequenz-Assay einen
Reaktionsmix an.
Analyse beenden
Hinweise
154
Bereiten Sie mithilfe des High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit das Template
für die PCR-Reaktionen vor.
WICHTIG! Applied Biosystems empfiehlt für die reverse Transkription von Gesamt-
RNA in cDNA die Verwendung des High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit.
Die TaqMan® Gene Expression Assays sind für die Verwendung des High-Capacity
cDNA Reverse Transcription Kit optimiert. Andere Protokolle wurden nicht auf ihre
Verwendbarkeit mit den TaqMan Gene Expression Assays geprüft.
Informationen zur
Beispielanalyse
Benötigte
Materialien
Bei der vergleichenden CT-Beispielanalyse wird als Template für die PCR-Reaktionen
cDNA verwendet, die mithilfe des High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit aus
Gesamt-RNA-Proben synthetisiert wurde.
• aus Leber, Niere und Hirngewebe isolierte RNA
• ein High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit von Applied Biosystems:
Kit
Bestell-Nr.
(200 Reaktionen)
4368814
(1000 Reaktionen)
4368813
4374966
4374967
Hinweis: Der High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit hieß früher High-
Capacity cDNA Archive Kit.
Template
vorbereiten
Verwenden Sie den High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit zur Synthetisierung
von einzelsträngigen cDNA aus den Gesamt-RNA-Proben. Führen Sie die folgenden
Schritte unter Beachtung der Anweisungen im Applied Biosystems High-Capacity cDNA
Reverse Transcription Kits Protocol aus:
1. Setzen Sie den RT-Master-Mix an.
CHEMISCHE GEFAHREN 10✕ RT-Puffer kann Reizungen
von Augen, Haut und Atemwegen verursachen. Lesen Sie das Sicherheitsdatenblatt,
und befolgen Sie die Handhabungsanweisungen. Tragen Sie eine geeignete
Schutzbrille sowie Schutzkleidung und -handschuhe.
Hinweise
155
2. Setzen Sie die cDNA-Reaktionen an.
3. Führen Sie auf einem Thermal Cycler eine reverse Transkription durch.
Beachten Sie Folgendes bei der Vorbereitung Ihrer eigenen vergleichenden CT (∆∆CT)Analyse:
• Applied Biosystems empfiehlt, zuerst DNA oder RNA aus dem Gewebe oder der
Probe zu extrahieren.
• Applied Biosystems empfiehlt die folgenden Templates:
– Komplementäre cDNA (cDNA): aus Gesamt-RNA mithilfe eines High-Capacity
cDNA Reverse Transcription Kit synthetisierte cDNA
– RNA: aus Gewebe oder Proben extrahierte gereinigte Gesamt-RNA oder mRNA
– Genomische DNA (gDNA): bereits aus Gewebe oder Proben extrahierte gDNA
Weitere
Informationen
• Informationen über die Vorbereitung der cDNA-Templates finden Sie im Applied
Biosystems High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kits Protocol
(BN 4375575). Das Protokoll ist nicht im Lieferumfang für die High-Capacity
cDNA Reverse Transcription Kits enthalten. Sie können das Protokoll von der
Applied Biosystems-Website Documents on Demand (Dokumente auf Anfrage)
herunterladen:
http://docs.appliedbiosystems.com/search.taf
• Informationen zur Vorbereitung von RNA- oder gDNA-Templates finden Sie im
Protokoll für die von Ihnen gewählten Reinigungsreagenzien. Eine Auflistung der
Reinigungsreagenzien von Applied Biosystems finden Sie auf der
Applied Biosystems-Website:
http://www.appliedbiosystems.com/
Setzen Sie vor Zugabe der Proben zum endgültigen Reaktionsmix Probenverdünnungen
an. Verdünnen Sie die Proben mit den von der StepOne™-Software („Ausfüllen des
Reiters Dilution Calculations (Berechnung der Probenverdünnung)“ auf Seite 144)
berechneten Volumina.
Informationen zur
Beispielanalyse
• Probenverdünnungen sind nötig, weil das Probenvolumen in der StepOne-Software
auf 10 % des gesamten Reaktionsvolumens beschränkt ist. Das gesamte
Reaktionsvolumen beträgt 20 µl/Reaktion, d. h. das Probenvolumen beträgt
2 µl/Reaktion.
Hinweise
156
• Die Konzentration der Stammlösung beträgt 100 ng/µl. Nach Verdünnung der Probe
entsprechend der Tabelle zur Berechnung der Probenverdünnung hat die Probe eine
Konzentration von 5,0 ng/µl. Dies ist eine 10-fache Konzentration, wenn 2 µl
zum Volumen des endgültigen Reaktionsmixes von 20 µl dazugegeben werden.
Die Endreaktion hat dann eine 1-fache Konzentration.
• Die von der Software berechneten Volumina lauten:
Konzentration der
Stammlösung
(ng/µl)
Probenvolumen (µl)
Volumen des
Gesamtvolumen
der verdünnten
Probe (µl)
Leber
100,0
1,0
19,0
20,0
Niere
100,0
1,0
19,0
20,0
Hirn
100,0
1,0
19,0
20,0
Probenname
Benötigte
Materialien
Probenverdünnungen
ansetzen
•
•
•
•
•
•
•
Wasser zur Verdünnung der Probe
Pipetten
Pipettenspitzen
Probenstammlösung
Vortexer
Zentrifuge
1. Beschriften Sie für jede verdünnte Probe ein separates Mikrozentrifugen-Röhrchen:
• Leber
• Niere
• Hirn
Reaktionsgefäß
Probenname
Volumen des
1
Leber
19,0
2
Niere
19,0
3
Hirn
19,0
3. Geben Sie in jedes Röhrchen das erforderliche Volumen an Probenstammlösung:
Reaktionsgefäß
Probenname
Probenvolumen (µl)
1
Leber
1,0
2
Niere
1,0
3
Hirn
1,0
Hinweise
157
4. Vortexen Sie jede verdünnte Probe 3 bis 5 Sekunden, und zentrifugieren Sie die
Röhrchen kurz.
5. Legen Sie die verdünnten Proben solange auf Eis, bis Sie die Reaktionsplatte
vorbereitet haben.
Weitere
Informationen
Beachten Sie bei der Vorbereitung Ihrer eigenen vergleichenden CT-Analyse Folgendes:
• Probenverdünnungen sind eventuell nötig, weil in der StepOne-Software das
Probenvolumen auf 10 % des gesamten Reaktionsvolumens beschränkt ist. Sie
müssen die Probenverdünnungen vor Zufügen der Proben zum endgültigen
Reaktionsmix ansetzen.
• Für eine optimale Leistung des TaqMan® Gene Expression Assays oder Custom
TaqMan® Gene Expression Assays verwenden Sie 10 bis 100 ng an cDNA-Template
pro
20-µl-Reaktion. Für Fast-Reagenzien empfiehlt Applied Biosystems 10 ng.
• Verwenden Sie TE-Puffer oder Wasser zur Verdünnung der Probe.
Weitere Informationen zu den Assays von Applied Biosystems finden Sie in den
folgenden Dokumenten:
• Custom TaqMan® Gene Expression Assays Protocol.
Setzen Sie den Reaktionsmix mit den von der StepOne-Software („Ausfüllen des Reiters
Berechnung des Reaktionsmixes für den TP53-Assay“ auf Seite 141 und „Ausfüllen des
Reiters Reaction Mix Calculations (Berechnung des Reaktionsmixes) für den GAPDHAssay“ auf Seite 142) berechneten Komponenten und Volumina an.
Hinweis: Die Software berechnet alle Komponenten für die PCR-Reaktionen. Für das
Ansetzen des in diesem Abschnitt beschriebenen Reaktionsmixes benötigen Sie jedoch
nur Master-Mix, Assay-Mix und Wasser. Geben Sie die Probe hinzu, wenn Sie die
Reaktionsplatte vorbereiten (siehe „Vorbereiten der Reaktionsplatte“ auf Seite 161).
Informationen zur
Beispielanalyse
• Der Reaktionsmix besteht aus folgenden Komponenten:
– TP53 Assay Mix (20-fach)
– Wasser
Hinweise
158
• Die von der Software für die beiden Zielsequenz-Assays berechneten Volumina
lauten:
Komponente
Volumen (µl) für
1 Reaktion
Master Mix (2-fach)
10,0
Assay-Mix (20-fach)
1,0
H2O
7,0
Gesamtvolumen
18,0
Hinweis: Die Probe wird zu diesem Zeitpunkt nicht dazugegeben.
Benötigte
Materialien
Reaktionsmix
ansetzen
•
•
•
•
•
Pipetten
Pipettenspitzen
Komponenten für den Reaktions-Mix (oben aufgelistet)
Zentrifuge
WICHTIG! Setzen Sie für jeden Zielsequenz-Assay einen eigenen Reaktionsmix an.
1. Beschriften Sie für jeden Reaktionsmix ein Röhrchen von geeigneter Größe:
• TP53 Reaktionsmix
• GAPDH Reaktionsmix
2. Geben Sie für den TP53-Assay die erforderlichen Volumina von jeder Komponente
in das Röhrchen:
Volumen (µl) für
1 Reaktion
Volumen (µl) für
12 Reaktionen
(Plus 10 %
Überschuss)
Master Mix (2-fach)
10,0
132,0
TP53 Assay Mix (20-fach)
1,0
13,2
Wasser
7,0
92,4
Gesamtvolumen des
Reaktionsmix
18,0
237,6
Komponente
Hinweise
159
3. Geben Sie für den GAPDH-Assay die erforderlichen Volumina von jeder
Komponente in das Röhrchen mit dem GAPDH-Reaktionsmix:
Volumen (µl) für
1 Reaktion
Volumen (µl) für
12 Reaktionen
(Plus 10 %
Überschuss)
Master Mix (2-fach)
10,0
132,0
GAPDH Assay Mix (20-fach)
1,0
13,2
Wasser
7,0
92,4
Gesamtvolumen des
Reaktionsmix
18,0
237,6
Komponente
4. Durchmischen Sie den Reaktionsmix vorsichtig, indem Sie die Pipette von oben
nach unten bewegen, und verschließen Sie das Röhrchen anschließend.
5. Zentrifugieren Sie die Reaktionsgefäße kurz, um Luftblasen zu entfernen.
6. Legen Sie die Reaktionsmixe solange auf Eis, bis Sie die Reaktionsplatte vorbereitet
haben.
Weitere
Informationen
• Wenn Sie mehr als eine Zielsequenz analysieren möchten, bereiten Sie für jede
Zielsequenz einen separaten Reaktionsmix vor.
• Berücksichtigen Sie bei Ihren Berechnungen einen Volumenüberschuss, mit dem
Sie die beim Transfer von Reagenzien auftretenden Verluste kompensieren können.
Applied Biosystems empfiehlt einen Volumenüberschuss von mindestens 10 %.
• Verwenden Sie alle erforderlichen Komponenten.
• Setzen Sie die Reagenzien entsprechend der Herstelleranweisungen an.
• Schützen Sie den Assay-Mix bis zu seiner Verwendung im Gefriergerät vor Licht.
Übermäßige Lichteinstrahlung kann die Funktion der Fluoreszenzsonden
beeinträchtigen.
• Führen Sie vor der Ausführung folgende Schritte durch:
– Schütteln Sie die Flasche, um den Master-Mix gründlich zu mischen.
– Suspendieren Sie den Assay erneut durch Vortexen, und zentrifugieren Sie das
– Legen Sie alle gefrorenen Proben auf Eis, um sie aufzutauen. Wenn sie aufgetaut
sind, suspendieren Sie die Proben erneut durch Vortexen, und zentrifugieren Sie
die Reaktionsgefäße kurz.
Weitere Informationen über das Ansetzen des Reaktionsmixes finden Sie in den
• Custom TaqMan® Gene Expression Assays Protocol
Hinweise
160
Setzen Sie die Reaktionen für jede Replikat-Gruppe an, und transferieren Sie sie auf die
Reaktionsplatte. Verwenden Sie die in der StepOne-Software angezeigte
Plattenbelegung.
Informationen zur
Beispielanalyse
Benötigte
Materialien
• Es wird eine MicroAmp™ Fast Optical 48-Well Reaction Plate verwendet.
• Das Reaktionsvolumen beträgt 20 µl/Well.
• Die Reaktionsplatte enthält die folgenden Wells:
– 18 unbekannte Wells
– 6 Negativkontroll-Wells
– 24 leere Wells
• Die folgende Plattenbelegung wird von der StepOne-Software automatisch erstellt
und verwendet:
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
Pipetten
Pipettenspitzen
TP53-Reaktionsmix (von Seite 159)
GAPDH-Reaktionsmix (von Seite 159)
Wasser
Proben (von Seite 157)
Zentrifuge
Hinweise
161
Reaktionsplatte
vorbereiten
1. Setzen Sie für jede Zielsequenz die Negativkontrollreaktionen an:
a. Geben Sie die unten angegebenen Volumina von Reaktionsmix und Wasser in
ein Reaktionsgefäß von geeigneter Größe.
Röhrchen
Reaktionsmix
Wasservolumen
(µl)
1
TP53Reaktionsmix
59,4
6,6
2
GAPDHReaktionsmix
59,4
6,6
b. Durchmischen Sie den Reaktionsmix vorsichtig, indem Sie die Pipette von
oben nach unten bewegen.
c. Zentrifugieren Sie das Reaktionsgefäß kurz, um Luftblasen zu entfernen.
d. Geben Sie je 20 µl der Negativkontrollreaktion in die entsprechenden Wells in
der Reaktionsplatte.
2. Setzen Sie für jede Replikat-Gruppe die Reaktionen für die unbekannten Wells an:
a. Geben Sie die unten angegebenen Volumina von Reaktionsmix und Probe in
Reaktionsgefäße von geeigneter Größe.
Reaktionsgefäß
Unbekannte
Reaktion
Reaktionsmix
Probe
Probenvolumen (µl)
1
TP53-Leber
TP53Reaktionsmix
59,4
Leber
6.6
2
TP53-Niere
TP53Reaktionsmix
59,4
Niere
6,6
3
TP53-Hirn
TP53Reaktionsmix
59,4
Hirn
6,6
4
GAPDH-Leber
GAPDHReaktionsmix
59,4
Leber
6,6
5
GAPDH-Niere
GAPDHReaktionsmix
59,4
Niere
6,6
6
GAPDH-Hirn
GAPDHReaktionsmix
59,4
Hirn
6,6
d. Geben Sie je 20 µl der unbekannten (Proben)reaktion in die entsprechenden
Wells in der Reaktionsplatte.
3. Versiegeln Sie die Reaktionsplatte mit optischem Klebefilm.
Hinweise
162
4. Zentrifugieren Sie die Reaktionsplatte kurz, um Luftblasen zu entfernen.
5. Legen Sie die Reaktionsplatte im Dunkeln solange auf Eis, bis Sie zur Ausführung
des Laufs bereit sind.
Weitere
Informationen
• Stellen Sie sicher, dass Sie die richtigen Verbrauchsmaterialien verwenden.
• Stellen Sie sicher, dass die Anordnung der PCR-Reaktionen mit der in der StepOneSoftware angezeigten Plattenbelegung übereinstimmt. Sie haben die folgenden
Möglichkeiten:
– Entweder Sie akzeptieren die von der Software automatisch erstellte
Plattenbelegung
oder
– Sie ändern die Plattenbelegung in der Software mithilfe des Setups für
Fortgeschrittene (Advanced Setup).
• Weitere Informationen über die Vorbereitung der Reaktionsplatte finden Sie in den
– Custom TaqMan® Gene Expression Assays Protocol
• Informationen zu Verbrauchsmaterialien finden Sie im Abschnitt Seite 3.
• Informationen über die Verwendung des Setups für Fortgeschrittene zur Änderung
der Plattenbelegung finden Sie im Abschnitt „Setup für Fortgeschrittene“ auf
Seite 200.
Hinweise
163
Hinweise
164
Kapitel 8
Durchführung der vergleichenden
CT-Analyse
■ Vorbereiten des Laufs . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 167
■ Analysedurchführung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 169
Hinweise
165
Kapitel 8 Durchführung der vergleichenden CT-Analyse
Kapitelübersicht
Kapitelübersicht
In diesem Kapitel wird die Durchführung eines Laufs auf dem Applied Biosystems
StepOne™ Real-Time PCR System erklärt.
Arbeitsablauf der
Beispielanalyse
Der Arbeitsablauf für die mit diesem Einführungshandbuch gelieferte Beispielanalyse
wird nachfolgend dargestellt.
Analyse starten
Analysevorbereitung (Kapitel 7)
1. Bereiten Sie den Lauf vor.
2. Aktivieren Sie die Benachrichtigungseinstellungen.
3. Starten Sie den Lauf.
4. Überwachen Sie den Lauf.
Analyse beenden
Hinweise
166
Bereiten Sie den Lauf vor, indem Sie die Analyse öffnen und die versiegelte MicroAmp™
Fast Optical 48-Well Reaction Plate in das StepOne™-System einlegen.
Beispielanalyse
öffnen
1. Wenn die StepOne™-Software nicht bereits gestartet wurde, klicken Sie zweimal auf
(StepOne-Software-Shortcut), oder wählen Sie
StartAlle ProgrammeApplied Biosystems StepOneStepOne v1.0.
3. Gehen Sie im Dialogfeld Open (Öffnen) auf den Ordner experiments (Analysen)
(Standard).
4. Doppelklicken Sie auf Comparative CT Example (vergleichende CTBeispielanalyse), um die in Kapitel 6 erstellte Datei der Beispielanalyse zu öffnen.
2
3
4
Hinweise
167
Einlegen der
Reaktionsplatte
Temperatur des Heizblocks auf über 100 °C ansteigen. Wenn das System vor kurzem in
Betrieb war, fassen Sie es erst wieder an, wenn der Heizblock auf Zimmertemperatur
abgekühlt ist.
WICHTIG! Tragen Sie beim Arbeiten mit der Reaktionsplatte pulverfreie Handschuhe.
2. Stellen Sie die Reaktionen in den Heizblock.
Die Ausrichtung der Reaktionsplatte hängt von der Art des verwendeten
Verbrauchsmaterials ab:
• Wenn Sie eine Reaktionsplatte verwenden, ist diese mit dem A1-Well hinten
links in den Heizblock einzulegen.
• Wenn Sie Reaktionsgefäßstreifen verwenden, legen Sie die Streifen in den
Heizblock ein.
A1
3. Schließen Sie vorsichtig das Schubfach des Geräts.
Hinweise
168
Analysedurchführung
Führen Sie die folgenden Verfahren aus Kapitel 4 aus:
•
•
•
•
„Aktivieren der Benachrichtigungen (optional)“ auf Seite 71
„Starten des Laufs“ auf Seite 73
„Überwachen des Laufs“ auf Seite 76
„Entnahme der Reaktionsplatte und Datenübertragung“ auf Seite 86
Achten Sie darauf, dass Sie die Datei Comparative CT Example.eds und nicht die
Datei Relative Standard Curve Example.eds auswählen.
Hinweise
169
Hinweise
170
Kapitel 9
Auswertung der vergleichenden
CT-Analyse
■ Kapitelübersicht . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 172
■ Section 9.1 Prüfen der Ergebnisse . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 173
■ Section 9.2 Fehlerbehebung (falls erforderlich) . . . . . . . . . 187
Hinweise
171
Kapitel 9 Auswertung der vergleichenden CT-Analyse
Kapitelübersicht
Kapitelübersicht
Die StepOne™-Software wertet die Daten mithilfe der vergleichenden CT (∆∆CT)Quantifizierungsmethode aus. In Abschnitt 1 dieses Kapitels wird erklärt, wie die
ausgewerteten Daten unter Verwendung mehrerer Analysebildschirme geprüft und die
Daten veröffentlicht werden können. Wenn Sie zweifelhafte Ergebnisse erhalten, können
Sie in Abschnitt 2 dieses Kapitels nachlesen, wie Sie Schritte zur Fehlerbehebung
durchführen können.
Arbeitsablauf der
Beispielanalyse
Der Arbeitsablauf zum Auswerten der mit diesem Einführungshandbuch gelieferten
Beispielanalyse ist nachfolgend abgebildet.
Analyse starten
2. Überprüfen Sie die Genexpressionsdarstellung/Well-Tabelle.
5. Überprüfen der Rohdaten
Analyse beenden
Hinweise
172
Section 9.1 Prüfen der Ergebnisse
Section 9.1 Prüfen der Ergebnisse
■ Analyseauswertung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 174
■ Ansicht der Genexpressionsdarstellung und Well-Tabelle . . 179
■ Ansicht der Amplifikationsdarstellung. . . . . . . . . . . . . . . . . 181
■ Veröffentlichen der Daten . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 186
Hinweise
173
Analyseauswertung
Analyseauswertung
Die StepOne-Software wertet die Analyse aus und zeigt die Ergebnisse in den
Auswertungsbildschirmen an, zum Beispiel in den Bildschirmen Amplification Plot
(Amplifikationsdarstellung), QC Summary (QC-Zusammenfassung) usw.
Informationen zur
Beispielanalyse
Verwenden Sie für die vergleichende CT-Beispielanalyse die Datei, die mit der StepOneSoftware installiert wird. Die Datei wurde mit denselben Analysedesignparametern
erstellt, die in Kapitel 6 angegeben sind, und dann auf einem StepOne™-System die
Analyse durchgeführt und ausgewertet.
Hier finden Sie die Datei für die Beispielanalyse auf Ihrem Computer:
Dabei ist <drive> das Computerlaufwerk, auf dem die StepOne-Software installiert ist.
Das Standardlaufwerk für die Installation der Software ist das Laufwerk C:\.
Auswerten der
Beispielanalyse
1. Wenn die StepOne-Software noch nicht läuft, doppelklicken Sie auf
(Shortcut
der StepOne-Software) oder wählen Sie StartAlle ProgrammeApplied
BiosystemsStepOneStepOne v1.0.
3. Gehen Sie im Dialogfeld Open (Öffnen) in den Ordner examples (Beispiele).
4. Doppelklicken Sie auf Comparativ CT Example (Beispiel vergleichende CT),
um die Datei der Beispielanalyse zu öffnen.
2
3
4
Hinweise
174
Analyseauswertung
5. Klicken Sie auf Analyze (Auswerten). Die Software wertet die Daten mithilfe der
Standardeinstellungen für die Auswertung aus.
5
6. Unter „Software-Elemente“ unten sowie unter „Navigationstipps“ auf Seite 177
finden Sie weitere Informationen zur Benutzung der Auswertungsbildschirme.
Hinweise
Zur Auswertung Ihrer eigenen CT-Analyse:
• Unmittelbar nach dem Lauf analysiert die StepOne-Software automatisch die Daten
unter Verwendung der Standardauswertungseinstellungen und zeigt anschließend
den Bildschirm Amplification Plot (Amplifikationsdarstellung) auf Ihrem
Computer an.
• Um die Daten erneut auszuwerten, wählen Sie alle Wells in der Plattenbelegung aus,
und klicken Sie dann auf Analyze (Auswerten).
SoftwareElemente
Die Elemente der StepOne-Software für die Auswertungsbildschirme (Analysis) sind
nachstehend dargestellt.
1. Menüleiste: Zeigt die in der Software verfügbaren Menüs an:
• File (Datei)
• Tools (Extras)
• Help (Hilfe)
2. Symbolleiste: Zeigt die in der Software verfügbaren Tools an:
• Open (Öffnen)
• Save (Speichern)
• Export (Exportieren)
• Print Report (Bericht drucken)
Hinweise
175
Analyseauswertung
4. Bereich Experiment Menu (Analysemenü) – Enthält Links zu den folgenden
Bildschirmen der Software:
• Bildschirme für Setup (Einrichtung)
• Bildschirme für Run (Lauf)
• Bildschirme für Analysis (Auswertung)
–Amplification Plot (Amplifikationsdarstellung)
–Genexpression
–Multicomponent Plot (Multikomponentendarstellung)
–Raw Data Plot (Rohdatendarstellung)
–QC Summary (Zusammenfassung der Qualitätskontrolle)
–Multiple Plots View (Ansicht mit mehreren Plots)
5. Plot-Bereich: Zeigt den ausgewählten Auswertungsbildschirm für die geöffnete
Analyse an.
6. Ansichtsreiter (View …): Zeigen die Plattenbelegung (Plate Layout) oder die WellTabelle (Well Table) für die geöffnete Analyse an.
7. Reiter für Analysen: Für jede geöffnete Analyse wird ein Reiter angezeigt.
1
2
3
6
4
7
5
Hinweise
176
Analyseauswertung
Navigationstipps
Auswahl der Wells
Um sich bestimmte Wells in den Auswertungsbildschirmen anzeigen zu lassen, wählen
Sie die Wells im Reiter View Plate Layout (Ansicht Plattenbelegung) wie folgt aus:
1. Um Wells eines bestimmten Typs auszuwählen, verwenden Sie die DropdownMenüs Select Wells With (Wells auswählen mit): Wählen Sie zunächst Sample
(Probe), Target (Zielsequenz) oder Task (Aufgabe) aus, und wählen Sie dann den
Namen der Probe, Zielsequenz oder Aufgabe aus.
2. Um einen einzelnen Well auszuwählen, klicken Sie in der Plattenbelegung auf den
gewünschten Well.
3. Sie können mehrere Wells auswählen durch Klicken und Ziehen über die
gewünschten Wells, Drücken der Steuerungstaste+Klick oder Drücken der
Umschalttaste+Klick in der Plattenbelegung.
4. Um alle 48 Wells auszuwählen, klicken Sie auf die linke obere Ecke der
Plattenbelegung.
1
4
Hinweise
177
Analyseauswertung
Anzeige mehrerer Plots
Mithilfe des Bildschirms Multiple Plots können Sie bis zu vier Darstellungen gleichzeitig
anzeigen. So navigieren Sie innerhalb des Bildschirms Multiple Plots:
Plots View (AuswertungAnsicht mit mehreren Plots).
2. Um vier Plots anzeigen zu lassen, klicken Sie auf
(Plots in 2x2-Matrix anzeigen).
Multiple
Show plots in a 2 ✕ 2 matrix
3. Um zwei Plots untereinander anzeigen zu lassen, klicken Sie auf
two rows (Plots untereinander anzeigen).
Show plots in
4. Um zwei Plots nebeneinander anzeigen zu lassen, klicken Sie auf
two columns (Plots nebeneinander anzeigen).
Show plots in
5. Um einen bestimmten Plot anzeigen zu lassen, wählen Sie den gewünschten Plot
aus dem Dropdown-Menü über jeder Plot-Anzeige.
5
2 3
4
Hinweise
178
Auf dem Bildschirm Gene Expression Plot werden die Ergebnisse der relativen
Quantifizierungsberechnungen im Genexpressionsprofil dargestellt. Es stehen zwei
• RQ vs Target: Gruppiert die Werte der relativen Quantifizierung (RQ) nach
Zielsequenz. Jede Probe wird für jede Zielsequenz geplottet.
• RQ vs Sample: Gruppiert die Werte der relativen Quantifizierung (RQ) nach Probe.
Jede Zielsequenz wird für jede Probe geplottet.
linear, log10, Ln, log2.
Die Well-Tabelle zeigt für jeden Well in der Reaktionsplatte Daten an, darunter:
• Name von Probe und Zielsequenz, Aufgabe und Farbstoffe
• der berechnete Schwellenwert-Zyklus (CT), die normalisierte Fluoreszenz (Rn) und
Mengenwerte
• Markierungen
Informationen zur
Beispielanalyse
Ansicht der
Genexpressionsdarstellung/
Well-Tabelle
In der vergleichenden CT-Beispielanalyse prüfen Sie Folgendes:
• die Zielsequenzen im Bildschirm Gene Expression Plot auf das Expressionsniveau
(bzw. Änderung im Vielfachen) der Zielprobe in Relation zur Referenzprobe.
• die Well-Tabelle zur Beurteilung der Genauigkeit der Replikatgruppen
Expression (AuswertungGenexpression).
Gene
Hinweis: Wenn im Bildschirm Gene Expression Plot keine Daten angezeigt werden,
2. Im Bildschirm Gene Expression Plot:
a. Wählen Sie aus dem Dropdown-Menü Plot Type (Darstellungstyp) RQ vs
Sample (RQ im Vergleich zur Probe).
b. Wählen Sie aus dem Dropdown-Menü Graph Type (Graphentyp) Log10.
c. Wählen Sie aus dem Dropdown-Menü Orientation (Ausrichtung) Vertikal
Bars (Vertikale Leisten).
d. Klicken Sie auf
In der Beispielanalyse sind die Expressionsniveaus von TP53 in Leber und Niere in
Relation zum Expressionsniveau der Referenzprobe (Gehirn) dargestellt. Da die
Beispielprobe mit sich selbst verglichen wird, ist das Expressionsniveau 1. Wenn das
Ergebnis als Graphentyp Log10 angezeigt wird, erscheint das Expressionsniveau der
Referenzproben im Graphen als 0 (log10 von 1 = 0).
Hinweise
179
2a
2b
2c
2d
3. Ansicht der Well-Tabelle
a. Wählen Sie im Bereich Experiment Menu (Analysenmenü) Analysis
Amplification Plot, und anschließend den Reiter View Well Table (Ansicht
Well-Tabelle).
(Replikat).
c. Zur Beurteilung der Genauigkeit der Replikatgruppen sehen Sie sich die Spalte
CT SD an. In der Beispielanalyse gibt es keine Ausreißer.
Hinweise
180
3a
3b
3c
Hinweis: Zum Ein-/Ausblenden von Spalten der Well-Tabelle aktivieren/deaktivieren Sie
den Spaltennamen im Dropdown-Menü Show in Table (in Tabelle anzeigen).
Auswertungshinweise
Bei der Auswertung Ihrer eigenen CT-Analyse prüfen Sie Folgendes:
Weitere
Informationen
Weitere Informationen zur Genexpressionsdarstellung bzw. zur Well-Tabelle finden Sie
in der StepOne-Software-Hilfe, indem Sie auf
• Abweichungen in der Genexpression (als Änderung des Vielfachen) in Relation zur
Referenzprobe.
• Standardabweichung in Replikatgruppen (CT SD-Werte). Nehmen Sie bei Bedarf
die Ausreißer aus (siehe „Herausnahme von Wells aus der Auswertung“ auf
Seite 192).
Auf dem Bildschirm Amplification Plot (Amplifikationsdarstellung) wird die
Amplifikation aller Proben in den ausgewählten Wells angezeigt. Es stehen drei
• ∆Rn über dem Zyklus: ∆Rn ist die Intensität des während des PCR-Laufs
generierten normalisierten Fluoreszenzsignals; daraus wird der CT berechnet. Diese
Darstellung zeigt ∆Rn als Funktion der Zyklusanzahl. Sie können diese Darstellung
dazu verwenden, eine unregelmäßige Amplifikation zu erkennen und zu überprüfen
und sich die Werte für Schwellenwert und Grundlinie anzusehen.
Hinweise
181
• Rn über dem Zyklus: Rn ist die normalisierte Fluoreszenz des Reporter-Farbstoffs.
Diese Darstellung zeigt Rn als Funktion der Zyklusanzahl. Sie können diese
Darstellung dazu verwenden, eine unregelmäßige Amplifikation zu erkennen und zu
überprüfen.
• CT über den Wells: Der Schwellenwert-Zyklus (CT) ist der PCR-Zyklus, bei dem
das Fluoreszenzniveau den Schwellenwert überschreitet. Diese Darstellung zeigt CT
als Funktion der Well-Position. Sie können diese Darstellung dazu verwenden, eine
extreme Amplifikation (Ausreißer) zu lokalisieren.
linear oder log10.
Informationen zur
Beispielanalyse
In der vergleichenden CT-Beispielanalyse prüfen Sie die Zielsequenz in der
Amplifikationsdarstellung auf Folgendes:
• korrekte Werte für Grundlinie und Schwellenwert
• Ausreißer
Ansicht der
2. Lassen Sie die GAPDH-Wells in der Amplifikationsdarstellung anzeigen:
b. Wählen Sie aus den Dropdown-Menüs Select Wells With (Wells auswählen
mit) zunächst Target (Zielsequenz) und dann GAPDH.
2a
2b
Hinweise
182
3. Im Bildschirm Amplification Plot:
a. Wählen Sie aus dem Dropdown-Menü Plot Type (Darstellungstyp) ∆Rn vs
Cycle (Rn über dem Zyklus).
b. Wählen Sie aus dem Dropdown-Menü Color Plot By (Darstellungsfarbe
entsprechend) Well.
c. Klicken Sie auf
4. Sehen Sie sich die Grundlinienwerte an:
a. Wählen Sie aus dem Dropdown-Menü Graph Type (Graphentyp) Linear.
b. Markieren Sie das Kontrollkästchen Baseline (Grundlinie), um den Start- und
Endzyklus anzuzeigen.
c. Prüfen Sie, dass die Grundlinie korrekt eingestellt ist. In der Beispielanalyse
wird die Grundlinie vor Beginn der Amplifikation eingestellt.
3a
4a
3b
3c
4b
5. Sehen Sie sich den Schwellenwert an:
a. Wählen Sie aus dem Dropdown-Menü Graph Type (Graphentyp) Log.
b. Wählen Sie aus dem Dropdown-Menü Target (Zielsequenz) GAPDH.
c. Markieren Sie das Kontrollkästchen Threshold (Schwellenwert), um den
Schwellenwert anzuzeigen.
d. Prüfen Sie, dass der Schwellenwert korrekt eingestellt ist. In der
Beispielanalyse liegt der Schwellenwert in der exponentiellen Phase.
Hinweise
183
5a
5b
5c
6. Stellen Sie eventuelle Ausreißer fest:
a. Wählen Sie aus dem Dropdown-Menü Plot Type (Darstellungstyp) CT vs Well
(CT über den Wells).
b. Schauen Sie nach Wells, die außerhalb der Amplifikationskurve liegen. In der
Beispielanalyse gibt es für GAPDH keine Ausreißer.
6a
7. Wiederholen Sie die Schritte Schritte 2 bis 6 für die TP53-Wells. In der
Beispielanalyse gibt es für TP53 keine Ausreißer.
Hinweise
184
Auswertungshinweise
• Korrekte Werte für Grundlinie und Schwellenwert: Die StepOne-Software
berechnet die Werte für Grundlinie und Schwellenwert automatisch auf Grundlage
der Annahme, dass die Daten eine typische Darstellung der Amplifikation zeigen.
Eine typische Amplifikationsdarstellung weist Folgendes auf:
a. Plateauphase
b. lineare Phase
c. exponentielle (geometrische) Phase
d. Hintergrund
e. Grundlinie
a
b
Schwellenwert
c
∆Rn
d
Zyklus
e
WICHTIG! Versuchsfehler (wie Kontaminationen oder Pipettierfehler) können
atypische Amplifikationskurven verursachen, die zu falschen Berechnungen von
Grundlinie und Schwellenwert durch die StepOne-Software führen können. Aus
diesen Gründen empfiehlt Applied Biosystems, dass Sie sich nach Abschluss der
Auswertung die Amplifikationsdarstellung ansehen und die zugewiesenen Werte für
Grundlinie und Schwellenwert für jeden Well überprüfen.
• Ausreißer
wie folgt:
• Berichtigen Sie die Grundlinie und/oder den Schwellenwert manuell (siehe unter
„Ansicht der Auswertungseinstellungen“ auf Seite 188)
oder
Weitere
Informationen
Weitere Informationen zur Amplifikationsdarstellung finden Sie in der StepOneSoftware-Hilfe, indem Sie auf
Hinweise
185
Sie können die Analysedaten auf verschiedene Weise ausgeben lassen:
•
•
•
•
•
•
Speichern der Darstellung als Bilddatei
Drucken der Darstellung
Drucken der Plattenbelegung
Erstellen von Folien
Drucken eines Berichts
Datenexport
Weitere Informationen zur Durchführung dieser Schritte finden Sie in der StepOneSoftware-Hilfe, indem Sie auf
Hinweise
186
Section 9.2 Fehlerbehebung (falls erforderlich)
Section 9.2 Fehlerbehebung (falls erforderlich)
■ Ansicht der Auswertungseinstellungen. . . . . . . . . . . . . . . . . 188
■ Ansicht der QC-Zusammenfassung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 190
■ Herausnahme von Wells aus der Auswertung. . . . . . . . . . . . 192
■ Ansicht der Multikomponentendarstellung . . . . . . . . . . . . . 194
■ Ansicht der Rohdatendarstellung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 197
Hinweise
187
Das Dialogfeld Analysis Settings zeigt die Auswertungseinstellungen für den
Schwellenwert-Zyklus (CT), Markierungen, relative Quantifizierung und erweiterte
Optionen an. Sollten die Standardauswertungseinstellungen der StepOne-Software für
Ihre Analyse nicht geeignet sein, können Sie die Einstellungen im Dialogfeld Analysis
Settings ändern und ihre Analyse erneut auswerten.
Informationen zur
Beispielanalyse
prüfen
In der vergleichenden CT-Beispielanalyse werden die Standardauswertungseinstellungen
unverändert übernommen.
1. Wählen Sie im Bereich Experiment Menu (Analysemenü) Analysis Auswertung.
2. Klicken Sie zum Öffnen des Dialogfelds für die Auswertungseinstellungen auf
Analysis Settings.
3. In der Beispielanalyse werden die Standardauswertungseinstellungen für jeden
Reiter verwendet:
• CT Settings (CT-Einstellungen)
• Flag Settings (Markierungseinstellungen)
• Advanced Settings (Erweiterte Einstellungen)
Hinweise
188
Auswertungshinweise
Wenn Sie nicht bereits die optimalen Einstellungen für Ihre Analyse festgelegt haben,
verwenden Sie die Standardauswertungseinstellungen der StepOne-Software. Falls die
Standardeinstellungen für Ihre Analyse nicht geeignet sind, können Sie die folgenden
Parameter verändern:
• CT Settings: Unter diesem Reiter können Sie die Schwellen- und Grundlinienwerte
manuell einstellen. Wenn Sie die Schwellen- und Grundlinienwerte manuell
einstellen, empfiehlt Applied Biosystems die folgende Vorgehensweise:
Einstellung
Schwellenwert
Empfehlung
Geben Sie für den Schwellenwert einen Wert ein, der folgende
Merkmale aufweist:
• Schwellenwert liegt über dem Hintergrund
• Schwellenwert liegt unterhalb der ebenen und linearen Bereiche
der Amplifikationskurve
• Schwellenwert liegt innerhalb der exponentialen Phase der
Amplifikationskurve.
Grundlinie
Wählen Sie die Werte für Zyklusstart und Zyklusende aus, sodass die
Grundlinie endet bevor die Amplifikation beginnt.
• Flag Settings (Markierungseinstellungen): Hier können Sie die folgenden
Einstellungen vornehmen:
• Relative Q uantitation Settings (Relative Quantifizierungseinstellungen):
Hier können Sie die folgenden Einstellungen vornehmen:
– Ändern der Referenzprobe und/oder endogenen Kontrolle
– Auswählen des für die Bestimmung der RQ Min/Max-Werte (Konfidenzniveau
bzw. Standardabweichungen) zu verwendenden Algorithmus
• Advanced Settings (Erweiterte Einstellungen): Unter diesem Reiter können Sie die
Grundlinieneinstellungen für jeden Well einzeln ändern.
Weitere
Informationen
Weitere Informationen zu den Auswertungseinstellungen erhalten Sie in der Hilfe der
StepOne-Software durch Drücken von F1, wenn das Dialogfeld Analysis Settings
geöffnet ist.
Hinweise
189
Im Bildschirm QC Summary wird eine Liste der Markierungen der StepOne-Software
angezeigt, einschließlich der Markierungshäufigkeit und des Markierungsortes für die
geöffnete Analyse.
Informationen zur
Beispielanalyse
Ansicht der QCZusammenfassung
In der vergleichenden CT-Beispielanalyse prüfen Sie den Bildschirm QC Summary auf
Markierungen, die von den Analysedaten ausgelöst wurden. In der Beispielanalyse
wurden keine Markierungen ausgelöst.
QC Summary (Zusammenfassung zur Qualitätskontrolle).
Hinweis: Wenn im Bildschirm QC Summary keine Daten angezeigt werden,
2. Überprüfen Sie die Markierungszusammenfassung. In der Beispielanalyse ist der
Wert für markierte Wells gleich 0.
3. Schauen Sie in der Tabelle Flag Details (Markierungsdetails) die Spalten Frequency
(Häufigkeit) und Wells an, um herauszufinden, welche Markierungen in der
Analyse auftreten. In der Beispielanalyse ist der Wert für die Häufigkeit für alle
Markierungen gleich 0.
Hinweis: Eine 0 in der Spalte Frequency zeigt an, dass die Markierung in der
Analyse nicht vorkommt.
4. (Optional) Klicken Sie zur Anzeige der Einzelheiten zu einer Markierung auf das
jeweilige Flag.
2
3
4
Hinweise
190
Mögliche
Markierungen
Bei vergleichenden CT-Analysen können durch die Analysedaten die unten aufgeführten
Flags (Markierungen) ausgelöst werden.
Sollte eine Markierung in einer Analyse nicht auftreten, ist die Häufigkeit gleich 0. Ist
die Häufigkeit > 0, tritt die Markierung an irgendeiner Stelle in der Analyse auf. Die
jeweilige Position wird in der Spalte Wells aufgeführt.
Markierung
Beschreibung
AMPNC
Amplifikation mit Negativkontrolle
BADROX
Schlechtes Signal der passiven Referenz
BLFAIL
Grundlinienalgorithmus fehlgeschlagen
CTFAIL
CT-Algorithmus fehlgeschlagen
EXPFAIL
Exponentialalgorithmus fehlgeschlagen
HIGHSD
Hohe Standardabweichung in Replikat-Gruppe
NOAMP
Keine Amplifikation
NOISE
Geräusch höher als bei anderen in der Platte
NOSIGNAL
Kein Signal im Well
OFFSCALE
Fluoreszenz geht über den Messbereich hinaus
OUTLIERRG
Ausreißer in Replikat-Gruppe
SPIKE
Hintergrundpeak
THOLDFAIL
Schwellenwertalgorithmus fehlgeschlagen
Auswertungshinweise
Zur Auswertung Ihrer eigenen CT-Analyse:
Weitere
Informationen
Weitere Informationen zum Bildschirm QC Summary oder zu Markierungseinstellungen
• Klicken Sie zur Anzeige der Details zu Häufigkeiten > 0 jede Markierung in der
Tabelle Flag Details einzeln an. Bei Bedarf klicken Sie auf den Link zur
Fehlerbehebung (Troubleshooting), um Informationen zur Berichtigung der
Markierung anzeigen zu lassen.
• Markierungseinstellungen können wie folgt geändert werden:
Hinweise
191
Versuchsfehler können dazu führen, dass einige Wells ungenügend oder gar nicht
amplifiziert wurden. Diese Wells liefern im Normalfall CT-Werte, die von dem
Durchschnitt der anderen Replikat-Wells deutlich abweichen. Wenn diese Ausreißer in
die Berechnung einbezogen werden, kann dies fehlerhafte Messergebnisse zur Folge
haben. Zur Gewährleistung der Genauigkeit sollten Ausreißer aus der Auswertung
herausgenommen werden.
Informationen zur
Beispielanalyse
Wells
herausnehmen
In der vergleichenden CT-Beispielanalyse gibt es keine Ausreißer. Es müssen keine Wells
aus der Auswertung ausgeschlossen werden.
a. Wählen Sie aus dem Dropdown-Menü Group By (Gruppieren nach) Replicate
(Replikat).
diese markiert sind). In der Beispielanalyse gibt es keine Ausreißer.
Hinweise
192
3
4a
Auswertungshinweise
Durchsuchen Sie bei der Auswertung Ihrer eigenen vergleichenden CT-Analyse die
Replikat-Gruppen sorgfältig nach Ausreißern. Bei Bedarf entfernen Sie die Ausreißer
manuell anhand der Well-Tabelle:
a. Wählen Sie aus dem Dropdown-Menü Group By (Gruppieren nach) Replicate
(Replikat).
diese markiert sind).
c. Aktivieren Sie das Kontrollkästchen Omit neben den Ausreißer-Wells.
5. Klicken Sie auf Analyze, um die Analysedaten erneut ohne die entfernten
Ausreißer-Wells auszuwerten.
Hinweise
193
Weitere
Informationen
Weitere Informationen zum Ausnehmen von Wells aus der Auswertung finden Sie in der
klicken oder F1 drücken. Suchen Sie in der
Hilfe nach den folgenden Themen zum Ausnehmen von Wells:
1. Klicken Sie auf den Reiter Search (Suche).
2. Geben Sie omit well (Well herausnehmen) ein.
3. Klicken Sie auf List Topics (Themen auflisten).
4. Doppelklicken Sie auf die gewünschten Themen.
In der Multikomponentendarstellung wird der vollständige Spektralbeitrag eines jeden
Farbstoffs in einem ausgewählten Well für die Dauer des PCR-Laufs angezeigt.
Informationen zur
Beispielanalyse
In der vergleichenden CT-Beispielanalyse prüfen Sie die Multikomponentendarstellung
auf Folgendes:
•
•
•
•
Ansicht der
Multikomponentendarstellung
ROX™-Farbstoff (passive Referenz)
FAM™-Farbstoff (Reporter)
Spitzen, Tiefen und/oder plötzliche Änderungen
Amplifikation in den Negativkontroll-Wells
Multicomponent Plot (AuswertungMultikomponentendarstellung).
Hinweis: Wenn im Bildschirm Multicomponent Plot keine Daten angezeigt werden,
2. Im Bildschirm Multicomponent Plot können Sie Wells einzeln anzeigen lassen:
b. Wählen Sie ein Well aus der Plattenbelegung aus. Es wird in der
Multikomponentendarstellung angezeigt.
3. Wählen Sie aus dem Dropdown-Menü Plot Color (Darstellungsfarbe) Dye (Farbe).
4. Klicken Sie auf
5. Prüfen Sie das FAM-Farbsignal. In der Beispielanalyse steigt das FAM-Farbsignal
während des PCR-Verfahrens an, und weist so auf eine normale Amplifikation hin.
6. Prüfen Sie das ROX-Farbsignal. In der Beispielanalyse bleibt das ROX-Farbsignal
während des gesamten PCR-Verfahrens konstant, was auf typische Daten hinweist.
Hinweise
194
3
4
2a
2b
5
6
7. Wählen Sie die Negativkontoll-Wells nacheinander aus und prüfen Sie auf
Amplifikation. In der Beispielanalyse gibt es in den Negativkontroll-Wells keine
Amplifikation.
7
Hinweise
195
Auswertungshinweise
Weitere
Informationen
Weitere Informationen zur Multikomponentendarstellung finden Sie in der StepOneSoftware-Hilfe, indem Sie auf
• Passive Referenz: Das Fluoreszenzniveau der passiven Referenz sollte während des
gesamten PCR-Verfahrens relativ konstant bleiben.
• Reporter-Farbe: Das Fluoreszenzniveau der Reporter-Farbe sollte einen flachen
Bereich für die Grundlinie, gefolgt von einem rapiden Anstieg der Fluoreszenz im
Verlauf der Amplifikation aufweisen.
• Unregelmäßigkeiten im Signal: Es sollten keine Spitzen, Tiefen und/oder
plötzlichen Änderungen im Fluoreszenzsignal auftreten.
• Negativkontroll-Wells: Es sollten keine Amplifikationen in den NegativkontrollWells auftreten.
Hinweise
196
In der Rohdatendarstellung wird das Fluoreszenzsignal für jeden optischen Filter für die
ausgewählten Wells während der einzelnen Zyklen der Echtzeit-PCR im Rohzustand
(nicht normalisiert) angezeigt.
Informationen zur
Beispielanalyse
Ansicht der
Rohdatendarstellung
In der vergleichenden CT-Beispielanalyse prüfen Sie die Rohdatendarstellung auf einen
stabilen Signalanstieg (keine abrupten Änderungen oder Einbrüche) für den geeigneten
Filter.
Data Plot (AuswertungRohdatendarstellung).
Raw
Hinweis: Wenn im Bildschirm Raw Data Plot keine Daten angezeigt werden,
2. Lassen Sie sich alle 48 Wells in der Rohdatendarstellung anzeigen, indem Sie im
Reiter View Plate Layout (Ansicht Plattenbelegung) auf die linke obere Ecke der
Plattenbelegung klicken.
3. Klicken Sie auf
4. Klicken und Ziehen Sie den Zeiger Show Cycle (Zyklus anzeigen) von Zyklus 1 bis
Zyklus 40. In der Beispielanalyse sehen Sie eine stabile Signalsteigung von Filter 1,
was einem FAM™-Farbfilter entspricht.
Hinweise
197
3
4
Das StepOne™-System verfügt über die folgenden Filter:
Filter
1
Farbstoff
FAM™ Farbstoff
2
JOE™ Farbstoff
VIC® Farbstoff
3
Auswertungshinweise
ROX™ Farbstoff
Achten Sie bei der Auswertung Ihrer eigenen vergleichenden CT-Analyse bei jedem Filter
auf Folgendes:
• charakteristischer Signalanstieg
• keine abrupten Änderungen oder Einbrüche
Weitere
Informationen
Weitere Informationen zur Rohdatendarstellung finden Sie in der StepOne-SoftwareHilfe, indem Sie auf
Hinweise
198
Anhang A
Alternative Analyseabläufe
Dieser Anhang umfasst die folgenden Themen:
■ Setup für Fortgeschrittene. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 200
■ QuickStart-Arbeitsablauf . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 201
■ Template-Arbeitsablauf. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 202
■ Arbeitsablauf für den Export/Import . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 203
Hinweise
199
Anhang A Alternative Analyseabläufe
Setup für Fortgeschrittene
Setup für Fortgeschrittene
Wenn Sie eine relative Standardkurven- oder vergleichende CT (∆∆CT)-Analyse mithilfe
eines Arbeitsablaufs im Advanced Setup (Setup für Fortgeschrittene) der StepOne™Software einrichten, können Sie die Analyse nach Ihrem eigenen Design einrichten.
1. Richten Sie eine neue Analyse ein:
a. Doppelklicken Sie auf
b. Klicken Sie in der Spalte Set Up (Einrichten) auf
Advanced Setup
(Setup für Fortgeschrittene).
c. Klicken Sie im Navigationsbereich auf
Experiment Properties
(Analyseeigenschaften) (Standardeinstellung), und geben Sie anschließend die
Eigenschaften für die Beispielanalyse ein.
d. Klicken Sie im Navigationsbereich auf
Plate Setup (Platteneinrichtung),
und weisen Sie die Zielsequenzen, Standards (nur bei Standardkurven-Analysen)
und Proben zu.
e. Klicken Sie im Navigationsbereich auf
Run Method (Laufprofil), geben Sie
das Reaktionsvolumen ein, und passen Sie das Thermoprofil nach Bedarf an.
f. Klicken Sie im Navigationsbereich auf
Reaction Setup (Pipettierprotokoll),
und prüfen Sie anschließend die berechneten Volumina für die Vorbereitung der
PCR-Reaktionen, Standardverdünnungsreihen (nur bei StandardkurvenAnalysen) und Probenverdünnungen. Bearbeiten Sie diese bei Bedarf.
g. (Optional) Klicken Sie im Navigationsbereich auf
Materials List
(Materialliste), und wählen Sie die für die Analyse benötigten Materialien aus
bzw. kaufen Sie diese ein.
2. Setzen Sie die PCR-Reaktionen an:
a. Bereiten Sie das Template vor.
b. Setzen Sie die Probenverdünnungen an.
c. Bereiten Sie die Standardverdünnungsreihe vor (nur bei Standardkurven-
Analysen).
d. Setzen Sie den Reaktionsmix an.
e. Bereiten Sie die Reaktionsplatte vor.
3. Führen Sie die Analyse durch.
a. Beladen Sie das Gerät.
b. Starten Sie die Analyse.
c. Entladen Sie das Gerät.
Hinweise
200
QuickStart-Arbeitsablauf
QuickStart-Arbeitsablauf
Wenn Sie eine relative Standardkurven oder CT-Analyse mithilfe des Arbeitsablaufs
QuickStart erstellen, können Sie die Reaktionen im Gerät ohne Platteneinrichtung
ablaufen lassen.
Analysen).
2. Führen Sie einen QuickStart (Schnellstart) der Analyse durch:
b. Klicken Sie in der Spalte Run (Lauf) auf
QuickStart (Schnellstart).
c. Wählen Sie den Reiter Experiment Properties (Analyseeigenschaften), und
geben Sie die Analyseeigenschaften ein.
d. Klicken Sie auf den Reiter Run Method (Laufprofil) an, geben Sie das
Reaktionsvolumen ein, und passen Sie das Thermoprofil nach Bedarf an.
4. Beenden Sie die Platteneinrichtung.
Hinweise
201
Template-Arbeitsablauf
Template-Arbeitsablauf
Wenn Sie ein Template für eine relative Standardkurven- oder vergleichende CT-Analyse
erstellen, können Sie viele Analysen mit denselben Einrichtungsdaten erstellen.
1. Erstellen Sie ein Template.
b. Öffnen Sie eine vorhandene Analyse, oder erstellen Sie eine neue Analyse wie
unter Kapitel 2 bzw. Kapitel 6 beschrieben.
c. Wählen Sie DateiSave As Template (Als Template speichern).
d. Geben Sie in das Dialogfeld Save As Template (Als Template speichern) einen
Dateinamen ein, und klicken Sie anschließend zum Speichern des Templates
auf Save (Speichern).
e. Klicken Sie auf
Close (Schließen).
2. Erstellen Sie eine Analyse mithilfe eines Templates:
a. Wenn Sie sich noch nicht auf dem Bildschirm Home (Startseite) befinden,
klicken Sie auf Home.
b. Klicken Sie in der Spalte Set Up (Einrichten) auf
Template.
c. Wählen Sie im Dialogfeld Open (Öffnen) das in Schritt 1 erstellte Template
aus.
d. Ändern Sie die Analyse mithilfe der Werkzeuge im Arbeitsablauf Advanced
Setup (Setup für Fortgeschrittene).
e. Klicken Sie auf
Save (Speichern), geben Sie einen Dateinamen ein, und
klicken Sie zum Speichern der Analyse auf Save.
Analysen).
Hinweise
202
Arbeitsablauf für den Export/Import
Wenn Sie eine relative Standardkurven- oder vergleichende CT-Analyse mithilfe des
Arbeitsablaufs Export/Import erstellen, können Sie eine neue Analyse mit aus anderen
Analysen exportierten Daten einrichten.
2. Öffnen Sie eine vorhandene Analyse, oder erstellen Sie eine neue Analyse wie unter
Kapitel 2 bzw. Kapitel 6 beschrieben.
3. Exportieren Sie die Einrichtungsdaten aus der geöffneten Analyse wie folgt:
a. Wählen Sie File (Datei) Export.
b. Unter dem Reiter Export Properties (Exporteigenschaften) wählen Sie Setup
(Einrichten).
c. Wählen Sie im Dropdown-Menü One File (Eine Datei).
d. Wählen Sie im Dropdown-Menü File Type (Dateiart)
(*.txt).
e. Wählen Sie Open file(s) when export is complete (Datei(en) nach Abschluss
des Exports öffnen).
f. Klicken Sie auf Start Export (Export starten) und anschließend bei
Aufforderung Close Export Tool (Export-Tool schließen).
4. Erstellen Sie unter Verwendung der exportierten Datei als Vorlage die gewünschte
Platteneinrichtung:
a. Öffnen Sie die exportierte Textdatei in einem Tabellenkalkulationsprogramm
(z. B. Microsoft® Excel).
b. Ändern Sie die gewünschten Parameter in der Textdatei je nach Bedarf. Wenn
Sie damit fertig sind, speichern Sie die Datei als tabulatorgetrennte Textdatei
ab.
WICHTIG! Die Textdatei muss je nach Plattenbelegungsformat der StepOneSoftware formatiert sein. Weitere Informationen zum Plattenbelegungsformat
erhalten Sie in der Hilfe, indem Sie in der Symbolleiste auf
klicken oder
HelpStepOne Help (HilfeStepOne Hilfe) wählen.
5. Wenn Sie sich noch nicht auf dem Bildschirm Home (Startseite) befinden, klicken
Sie auf Home.
6. Klicken Sie in der Spalte Set Up (Einrichten) auf
für Fortgeschrittene).
Advanced Setup (Setup
Hinweise
203
7. Importieren Sie die Einrichtungsdaten:
a. Wählen Sie FileImport (Datei Importieren).
b. Klicken Sie auf Browse (Durchsuchen), wählen Sie die in Schritt 4 erstellte
Textdatei aus, und klicken Sie anschließend auf Select (Auswählen).
c. Klicken Sie auf Start Import (Import starten).
Analysen).
Hinweise
204
Bibliografie
Kwok, S. and Higuchi, R. 1989. Avoiding false positives with PCR. Nature
339:237–238.
Saiki, R.K., Scharf, S., Faloona, F., et al. 1985. Enzymatic amplification of β-globin
genomic sequences and restriction site analysis for diagnosis of sickle cell anemia.
Science 230:1350–1354.
205
Bibliografie
206
Glossar
AIF
Abkürzung für Assay-Informationsdatei.
Allel
Eine der verschiedenen in der Population auftretenden Ausprägungen einer
bestimmten Zielsequenz.
Alleldiskriminierungsdarstellung
Anzeige von Daten, die bei der Post-PCR-Messung erfasst wurden. Der sog. Allelic
Discrimination Plot ist eine grafische Darstellung des normalisierten Reportersignals
der Sonde für Allel 1 im Vergleich zum normalisierten Reportersignal der Sonde für
Allel 2.
Amplifikation
Teil des Gerätelaufs, während dessen die PCR zur Amplifikation der Zielsequenz
erfolgt. Für Quantifizierungsanalysen werden die während der Amplifikation
gemessenen Fluoreszenzdaten in einem sog. Amplification Plot dargestellt und zur
Berechnung von Ergebnissen verwendet. Wenn im StepOne™ -System für eine
Genotypisierungs- oder Positiv/Negativ-Analyse eine Amplifikation durchgeführt
wird, werden die während der Amplifikation gemessenen Fluoreszenzdaten in einem
Amplifikationsbildschirm dargestellt und können zur Fehlerbehebung verwendet
werden.
Anzeige von Daten, die während der Zyklusphase der PCR-Amplifikation erfasst
wurden. Diese können wie folgt angezeigt werden:
• Grundlinienkorrigiertes normalisiertes Reportersignal (∆Rn) über dem Zyklus
• Normalisierter Reporter (Rn) über dem Zyklus
• Schwellenwert-Zyklus (CT) über dem Well
Amplifikationseffizienz (EFF%)
Berechnete Effizienz der PCR-Amplifikation. Die Amplifikationseffizienz wird
mithilfe der Steigung der Regressionsgeraden in der Standardkurve berechnet.
Eine Steigung von etwa −3,3 bedeutet eine optimale, 100%ige PCR-Amplifikationseffizienz. Faktoren, die die Amplifikationseffizienz beeinflussen, sind:
• Bereich der Standardkonzentrationen - Um eine korrekte und genaue
Effizienzbestimmung durchzuführen, verwenden Sie einen breiten Bereich
von Standardkonzentrationen 5 bis 6 Log-Stufen (105 bis 106fach).
• Anzahl der Standardreplikate - Um eine präzise Effizienzbestimmung
durchzuführen, führen Sie Replikate durch, um die Auswirkungen von
Pipettierfehlern zu reduzieren.
• PCR-Inhibitoren - PCR-Inhibitoren in der Reaktion können die
Amplifikationseffizienz herabsetzen.
Amplikon
Ein mittels PCR amplifiziertes DNA-Segment.
207
Glossar
Analyse
Bezieht sich auf den gesamten Prozess der Durchführung eines Laufs mithilfe des
StepOne™ -Systems, einschließlich Einrichtung, Lauf und Auswertung. Analysetypen,
die Sie mit dem StepOne™-System durchführen können, sind:
•
•
•
•
•
•
Quantifizierung – Standardkurve
Quantifizierung – relative Standardkurve
Quantifizierung – vergleichender CT (∆∆CT)
Schmelzkurve
Genotypisierung
Positiv/Negativ
AnalysedesignAssistent
Funktion in der StepOne™ -Software, die Ihnen bei der Einrichtung der Analyse
entsprechend Ihrem Analysedesign hilft, indem Sie durch bewährte Schritte geführt
werden.
Analysename
Dieser Name wird während der Analyseeinrichtung eingegeben und dient der
Identifizierung der Analyse. Analysenamen dürfen nicht länger als 100 Zeichen sein
und keine der folgenden Zeichen enthalten: Schrägstrich (/), umgekehrter Schrägstrich
(\), Größer-als-Zeichen (>), Kleiner-als-Zeichen (<), Stern (*), Fragezeichen (?),
Anführungszeichen ("), vertikale Linie (|), Doppelpunkt (:) oder Semikolon (;).
Analysetyp
Analysetypen, die Sie mit dem StepOne™-System durchführen können, sind:
• Standardkurve
• Vergleichende CT (∆∆CT)
• Relative Standardkurve
• Schmelzkurve (nicht verfügbar im Analysedesign-Assistenten)
• Genotypisierung
• Positiv/Negativ
Der von Ihnen ausgewählte Analysetyp spiegelt sich in den Bildschirmen Setup,
Run und Analysis (Einrichtung, Lauf und Analyse) wieder.
Assay
Im StepOne-System™ eine PCR-Reaktion, die Primer zur Amplifikation einer
Zielsequenz und ein Reagenz zur Detektion amplifizierter Zielsequenzen enthält.
Assay ID
Eine Größe, die TaqMan®-Genexpressions- und TaqMan®-SNP-GenotypisierungsAssays von Applied Biosystems zugewiesen wird.
AssayInformationsdatei
(AIF)
Datei auf der CD, die bei jedem Assay mitgeliefert wird. Der Dateiname enthält die
Nummer des Strichcodes auf der Platte. Die Informationen im AIF werden in einem
tabulatorgetrennten Format bereitgestellt.
Assay-Mix
PCR-Reaktionskomponente in TaqMan®-Genexpressions-Assays und TaqMan®-SNPGenotypisierungs-Assays von Applied Biosystems, die aus Primern zur Amplifikation
einer Zielsequenz und einer TaqMan®-Sonde zur Detektion der Amplifikation der
Zielsequenz besteht.
Assays auf Bestellung
TaqMan®-Genomassays, die zum Zeitpunkt des jeweiligen Auftrags hergestellt
werden. Nur Assays, die die Anforderungen der Produktionsqualitätskontrolle
erfüllen, werden ausgeliefert.
208
Glossar
Aufgabe (Task)
Reaktionstyp, der in einem Well für die Zielsequenz oder den SNP-Assay durchgeführt
wird. Mögliche Aufgaben in Versuchen mit dem StepOne™-System sind:
•
•
•
•
•
•
Unbekannt
Negativkontrolle
Standard (Standardkurven- und relative Standardkurven-Analysen)
Positivkontrolle (Genotypisierungsanalysen)
IPC (Positiv/Negativ-Analysen)
Blockierte IPC (Positiv/Negativ-Analysen)
Ausgangsmenge
Entspricht bei der Definition einer Standardkurve oder Standardverdünnungsreihe der
größten oder geringsten Menge.
Ausreißer
Ein Datenpunkt in einem bestimmten Datensatz, der signifikant kleiner oder größer als
die anderen ausfällt.
Auto∆
Einstellung zur Erhöhung oder Reduzierung der Temperatur und/oder Zeit mit jedem
darauffolgenden Zyklus in einer Zyklusphase. Wenn Auto∆ aktiviert ist, werden die
Einstellungen durch ein Symbol im Thermoprofil angezeigt:
• Auto∆ ein:
• Auto∆ aus:
Automatische
Grundlinie
Analyseeinstellung, bei der die Grundlinien Start- und Endwerte für den Amplification
Plot (Amplifikationsdarstellung) von der Software berechnet werden. Die Software
verwendet Grundlinie und Schwellenwert zur Berechnung des Schwellenwert-Zyklus
(CT).
Automatischer CT
Analyseeinstellung, bei der Schwellenwert und Grundlinie in der Darstellung der
Amplifikation von der Software automatisch berechnet werden. Die Software
verwendet Schwellenwert und Grundlinie zur Berechnung des Schwellenwert-Zyklus
(CT).
Blockierte IPC
In Positiv/Negativ-Analysen die Aufgabe, die der IPC-Zielsequenz in Wells
zugewiesen wird, welche IPC-Inhibitoren statt des Proben-Templates enthalten. Siehe
auch unter Negativkontrolle mit blockierter IPC.
Chemie
Siehe unter Reagenzien.
Computergesteuerte
Konfiguration
Eine Systemkonfiguration, bei der das StepOne™-System durch das gelbe StepOne™Systemkabel mit einem angeschlossenen Computer direkt verbunden ist. Bei dieser
Konfiguration wird das StepOne™-System durch die StepOne™-Software auf dem
angeschlossenen Computer gesteuert.
CT
Abkürzung für Schwellenwert-Zyklus.
209
Glossar
Datenerfassung
Ein Prozess während des Gerätelaufs, bei dem eine Gerätekomponente von jedem Well
der Reaktionsplatte Fluoreszenzdaten erfasst. Das Gerät wandelt das Signal in
elektronische Daten um, und diese werden in der Analysedatei gespeichert. Ein
Datenerfassungspunkt wird durch ein Symbol im Thermoprofil angezeigt:
• Datenerfassung ein:
• Datenerfassung aus:
Delta Rn (∆Rn)
Abkürzung für grundlinienkorrigiertes normalisiertes Reportersignal.
Dissoziationskurve
Siehe unter Schmelzkurve.
EFF%
Siehe unter Amplifikationseffizienz (EFF%).
Eigenständige
Konfiguration
Eine Systemkonfiguration, bei der das StepOne™-System nicht durch das gelbe
StepOne™-Systemkabel mit einem Computer verbunden ist. Stattdessen wird ein
USB-Laufwerk ( ) verwendet, um die Daten zwischen den StepOne™Systemkomponenten zu übertragen. Bei dieser Konfiguration wird das StepOne™System durch den Touchscreen des Geräts gesteuert.
Endogene Kontrolle
Zielsequenz, die in allen analysierten Proben auf demselben Niveau vorhanden sein
sollte. Wird in relativen Standardkurven- und vergleichenden CT (∆∆CT)-Analysen zur
Normalisierung des Fluoreszenzsignals für die zu quantifizierende Zielsequenz
verwendet. Wird auch als Haushaltsgen bezeichnet.
Endpunktanalyse
Analyse, bei der die bei einer Post-PCR-Messung erfassten Fluoreszenzdaten zur
Berechnung von Ergebnissen für Genotypisierungs- oder Positiv/Negativ-Analysen
verwendet werden.
Endpunktmessung
Siehe unter Post-PCR-Messung.
Farbstoffe von
Fremdanbietern
Nicht von Applied Biosystems hergestellte Farbstoffe. Sie können zur Durchführung
von Real-Time PCR-Analysen auf dem StepOne™ -System Farbstoffe von
Fremdanbietern verwenden. Bevor Sie diese verwenden, führen Sie eine Kalibrierung
der jeweiligen Farbstoffe durch.
Farbstoff als Reporter oder Quencher mit dem ™-System.
Fernüberwachung
Funktion in der Software, die es Ihnen erlaubt, den Status eines vernetzten Gerätes
anzusehen, Analysen an das Gerät zu schicken und abgeschlossene Analysen auf Ihren
Computer herunterzuladen.
Forward Primer
Oligonukleotid, das an das 5′-Ende der Zielsequenz bindet. Der Reverse Primer und
der Forward Primer werden zusammen in PCR-Reaktionen eingesetzt, um die
Zielsequenz zu amplifizieren.
Grundlinie
In der Darstellung der Amplifikation eine an die Fluoreszenz angepasste Linie für eine
bestimmte Reihe von Zyklen. Wenn Sie die manuelle Grundlinienanalyseeinstellung
verwenden, empfiehlt Applied Biosystems, dass Sie frühe PCR-Zyklen für die
Festlegung der Grundlinie wählen.
210
Glossar
Grundlinienkorrigierter
normalisierter
Reporter (∆Rn)
Die Intensität des vom Reporter während der PCR-Amplifikation generierten
normalisierten Fluoreszenzsignals.
∆Rn = Rn (Endpunkt) − Rn (Grundlinie), dabei ist Rn = normalisierter Reporter.
Haltephase
Phase im Thermoprofil, die eine oder mehrere Schritte umfasst. Zum Beispiel können
Sie eine Haltephase zum Thermoprofil hinzufügen, um Enzyme zu aktivieren bzw. zu
deaktivieren oder um eine Reaktion zu inkubieren.
Haushaltsgen
Siehe unter Endogene Kontrolle.
Heiz-/
Kühlgeschwindigkeit
Geschwindigkeit, mit der die Temperaturrampe während des Geräteslaufs erscheint.
Mögliche Heiz-/Kühlgeschwindigkeiten sind Fast (schnell) und Standard.
Interne
Positivkontrolle (IPC)
In Positiv/Negativ-Analysen ein kurzes synthetisches DNA-Template, das zu PCRReaktionen hinzugegeben wird. Die IPC kann dazu verwendet werden, zwischen
richtig negativen Ergebnissen und Reaktionen, die durch PCR-Inhibitoren, eine
fehlerhafte Assay-Einrichtung oder einen Reagenzien- bzw. Gerätefehler beeinflusst
wurden, zu unterscheiden.
Inventarisierte Assays
TaqMan®-Genomassays, die hergestellt wurden, die Anforderungen der
Qualitätskontrolle bestanden haben und in ein Bestandsverzeichnis aufgenommen
wurden.
IPC
Abkürzung für Interne Positivkontrolle. In Positiv/Negativ-Analysen auch die Aufgabe
für die IPC-Zielsequenz in Wells, die ein IPC-Template enthalten.
IPC+
Positiv/Negativ-Bestimmung, wenn die interne Positivkontrolle (IPC) erfolgreich ist.
IPC-Inhibitor
Reagenz, das zu PCR-Reaktionen hinzugegeben wird, um die Amplifikation der
internen Positivkontrolle zu unterdrücken.
IPC-Wells mit
Negativkontrolle
In Positiv/Negativ-Analysen Wells, die ein IPC-Template und einen Puffer oder Wasser
statt des Proben-Templates in der PCR-Reaktion enthalten. In IPC-Wells mit
Negativkontrolle sollte nur das IPC-Template amplifizieren, da die Reaktion kein
Proben-Template enthält, siehe auch unter IPC+.
Kalibrator
Siehe unter Referenzprobe.
Konzentration der
verdünnten Probe
(10✕ für
Reaktionsmix)
Softwarefeld, das unter dem Reiter Sample Dilution Calculations (Berechnung der
Probenverdünnung) des Bildschirms Reaction Setup (Einrichten des
Pipettierprotokolls) angezeigt wird. Geben Sie für dieses Feld die Probenkonzentration
ein, die Sie bei allen Proben in einer Analyse zum Reaktionsmix hinzugeben möchten.
„10✕ for Reaction Mix“ gibt an, dass die Software annimmt, dass die Proben- oder
Standardkomponente des Reaktionsmix mit einer 10fachen Konzentration vorliegt.
Bei einer Konzentration der verdünnten Probe von 50,0 ng/µl (10✕) beträgt die
Endkonzentration der Probe in der Reaktion beispielsweise 5 ng/µl (1✕).
Laufprofil
Definition des Reaktionsvolumens und des Thermoprofils für den Gerätelauf.
Manuelle Grundlinie
Analyseeinstellung, bei der die Grundlinien-Start- und Endwerte für die
Amplifikationsdarstellung von der Software berechnet werden. Die Software
verwendet Grundlinie und Schwellenwert zur Berechnung der CT-Werte.
211
Glossar
Manueller CT
Analyseeinstellung, bei der Sie den Schwellenwert eingeben und auswählen, ob Sie die
automatische oder manuelle Grundlinienberechnung verwenden möchten. Die
Software verwendet den von Ihnen eingegebenen Schwellenwert und die Grundlinie
zur Berechnung des Schwellenwert-Zyklus (CT).
Menge
Die Zielsequenzmenge in den Proben bei Quantifizierungsanalysen. Absolute Mengen
können sich auf Kopienzahl, Masse, Molarität oder Virusbelastung beziehen. Relative
Mengen beziehen sich auf das Vielfache, um das sich die normalisierte
Zielsequenzmenge in der Probe und die normalisierte Zielsequenzmenge in der
Referenzprobe unterscheiden.
Multikomponentendarstellung
Anzeige von Daten, die während der Zyklusphase der Real-time PCR erfasst wurden.
Die Multikomponentendarstellung zeigt die Fluoreszenz für alle Zyklen in einem
Lauf.
Negativkontrolle (NC)
In Versuchen mit dem StepOne™-System die Aufgabe, die IPC-Zielsequenzen oder
SNP-Assays in Wells zugewiesen ist, welche Wasser oder einen Puffer statt des
Proben-Templates enthalten. In Wells mit Negativkontrolle sollte keine Amplifikation
der Zielsequenz erfolgen.
Negativkontrolle mit
blockierter IPC
In Positiv/Negativ-Analysen Wells, die IPC-Inhibitoren statt des Proben-Templates in
der PCR-Reaktion enthalten. In den durch die Negativkontrolle blockierten IPC-Wells
sollte keine Amplifikation erfolgen, da die Reaktion kein Proben-Template enthält und
die Amplifikation der IPC unterdrückt wird. Wird auch No Amplification Control
(NAC) genannt.
Nicht-fluoreszierender
Quencher Minor
Groove Binder
(NFQ-MGB)
Moleküle, die an das 3′-Ende der TaqMan®-Sonden gebunden sind. Bei intakten
Sonden unterdrückt der nicht-fluoreszierende Quencher (NFQ) die Abgabe eines
Fluoreszenzsignals durch den Reporterfarbstoff. Da der NFQ nicht fluoresziert,
erzeugt er schwächere Hintergrundsignale, und dies führt zu größerer Präzision in der
Quantifizierung. Der Minor Groove Binder (MGB) erhöht die Schmelztemperatur
(Tm) ohne Zunahme der Sondenlänge. Er erlaubt auch die Realisierung kürzerer
Sonden.
No Amplification
Control (NAC)
Siehe unter Negativkontrolle mit blockierter IPC.
No Template Control
(NTC)
Siehe Negativkontrolle (NC).
Normalisierte Menge
Menge einer Zielsequenz dividiert durch die Menge der endogenen Kontrolle.
Normalisierter
Reporter (Rn)
Fluoreszenzsignal des Reporterfarbstoffs normalisiert auf das Fluoreszenzsignal der
passiven Referenz.
Passive Referenz
Farbstoff, der ein Fluoreszenzsignal erzeugt. Da das Signal der passiven Referenz in
allen Wells konsistent sein sollte, wird es verwendet, um das Reporterfarbstoff-Signal
zu normalisieren und Fluoreszenzschwankungen auszugleichen, die durch geringe
Konzentrations- oder Volumenunterschiede zwischen den Wells entstanden sind.
Das Normalisieren auf das Signal der passiven Referenz ermöglicht eine hohe
Datengenauigkeit.
212
Glossar
Phase
Komponente des Thermoprofils. Eine Phase besteht aus einem oder mehreren
Schritten.
Plattenbelegung
Abbildung der 6 × 8-Gitterstruktur der Vertiefungen (Wells) und des ihnen
zugewiesenen Inhalts in der Reaktionsplatte. In der Software können Sie die
Plattenbelegung als Auswahlinstrument verwenden, um den Wells bestimmte Inhalte
zuzuordnen, Well-Zuordnungen sowie um die Ergebnisse anzusehen. Die
Plattenbelegung wird auf folgenden Bildschirmen angezeigt: AnalysedesignAssistent, Setup für Fortgeschrittene, Lauf und Analyse. Die Plattenbelegung kann
ausgedruckt, in einen Bericht übernommen, exportiert und als Folie für eine
Präsentation gespeichert werden.
Positivkontrolle
In Genotypisierungsanalysen die Aufgabe für den SNP-Assay in Wells, die ein ProbenTemplate mit einem bekannten Genotyp enthalten.
Post-PCR-Messung
Teil des Gerätelaufs in Genotypisierungs- und Positiv/Negativ-Analysen, der nach der
Amplifikation stattfindet. In Genotypisierungsanalysen werden die während der PostPCR-Messung erfassten Fluoreszenzdaten im sog. Allelic Discrimination Plot
(Alleldiskrimierungsdarstellung) dargestellt und zur Allelbestimmung verwendet.
In Positiv/Negativ-Analysen werden die während der Post-PCR-Messung erfassten
Fluoreszenzdaten im Positiv/Negativ-Plot dargestellt und zur Detektion verwendet.
Wird auch als Endpunktmessung bezeichnet.
Prä-PCR-Messung
Teil des Gerätelaufs in Genotypisierungs- und Positiv/Negativ-Analysen, der vor der
Amplifikation stattfindet. Fluoreszenzdaten, die bei der Prä-PCR-Messung erfasst
wurden, werden zur Normalisierung der Fluoreszenzdaten der Post-PCR-Messung
verwendet.
Primer/Sonden-Mix
PCR-Reaktionskomponente, die aus Primern zur Amplifikation der Zielsequenz und
einer TaqMan®-Sonde zur Detektion der Amplifikation der Zielsequenz besteht.
Primer-Mix
PCR-Reaktionskomponente, die den Forward Primer und Reverse Primer zur
Amplifikation der Zielsequenz enthält.
Probe
Das Template, das Sie untersuchen.
Probe oder Standard
(10✕)
Reaktionskomponente, die unter dem Reiter Reaction Mix Calculations (Berechnung
des Reaktionsmix) des Bildschirms Reaction Setup (Pipettierprotokoll) angezeigt
wird. Die Software nimmt an, dass die zum Reaktionsmix hinzugefügte Probe bzw.
der Standard in einer 10fachen Konzentration vorliegt. Wenn das Reaktionsvolumen
zum Beispiel 20 µl beträgt, beläuft sich das berechnete Proben- bzw. Standardvolumen
für 1 Reaktion auf 2 µl.
Probe/SNP-AssayReaktion
Kombination von Probe und SNP-Assay in einer PCR-Reaktion. Jede PCR-Reaktion
kann nur eine Probe und einen SNP-Assay enthalten.
Probe/ZielsequenzReaktion
Kombination von Probe und Zielsequenz in einer PCR-Reaktion. Im AnalysedesignAssistenten kann jede PCR-Reaktion nur eine Probe und eine Zielsequenz enthalten.
Probenbibliothek
Sammlung von Proben in der StepOne™-Software. Die Probenbibliothek enthält die
Probenbezeichnung und die Probenfarbe.
213
Glossar
Proben-DNA (10✕)
Reaktionskomponente, die auf dem Pipettierprotokollbildschirm angezeigt wird. Die
Software nimmt an, dass die zum Reaktionsmix hinzugefügte Proben-DNA in einer
10fachen Konzentration vorliegt. Wenn das Reaktionsvolumen zum Beispiel 20 µl
beträgt, beläuft sich das berechnete Probenvolumen für 1 Reaktion auf 2 µl.
Punkt
Ein Standard in einer Standardkurve. Die Standardmenge für jeden Punkt in der
Standardkurve wird auf der Grundlage der Ausgangsmenge und des
Verdünnungsfaktors berechnet.
Quantifizierungsmethode
Die in Quantifizierungsanalysen verwendete Methode zur Bestimmung der
Zielsequenzmenge in den Proben. Für Quantifizierungsanalysen sind drei
verschiedene Quantifizierungsmethoden verfügbar: Standardkurve, vergleichender CT
(∆∆CT) und relative Standardkurve.
Quencher
Molekül, das an das 3′-Ende der TaqMan®-Sonden gebunden ist, um zu verhindern,
dass der Reporter ein Fluoreszenzsignal abgibt, solange die Sonde intakt ist. Bei
TaqMan®-Reagenzien kann der nicht fluoreszierende Quencher Minor Groove Binder
(NFQ-MGB) als Quencher verwendet werden. Bei SYBR Green-Reagenzien wird
kein Quencher eingesetzt.
Farbstoff als Reporter oder Quencher mit dem StepOne-™System.
QuickStart
Funktion im StepOne™-System, die es Ihnen erlaubt, die Analyse ohne die Eingabe
von Platteneinrichtungsinformationen vorzunehmen.
R2-Wert
Regressionskoeffizient, berechnet aus der Regressionsgeraden in der Standardkurve.
Der R2-Wert gibt den Grad der Übereinstimmung zwischen der Regressionsgeraden
der Standardkurve und den individuellen CT-Datenpunkten der Standardreaktionen an.
Ein Wert von 1,00 gibt eine perfekte Übereinstimmung zwischen der
Regressionsgeraden und den Datenpunkten an.
Rampe
Die Rate, mit der sich die Temperatur während des Gerätelaufs ändert. Mit Ausnahme
des Schmelzkurven-Schritts wird die Rampe als Prozentsatz definiert. Beim
Schmelzkurven-Schritt hingegen wird die Rampe als Temperaturanstieg definiert.
In der grafischen Darstellung des Thermoprofils wird die Rampe durch eine diagonale
Linie angezeigt.
Räumliche
Kalibrierung
Ein Kalibrierungstyp des StepOne™ -Systems, bei dem das System die Positionen der
Wells im Heizblock abbildet. Räumliche Kalibrierungsdaten dienen der Software zur
Verknüpfung von Anstiegen der Fluoreszenz während eines Laufs mit spezifischen
Wells auf der Reaktionsplatte.
Reagenzien
Die PCR-Reaktionskomponenten, die Sie zur Amplifikation der Zielsequenz und zur
Detektion der Amplifikation verwenden. Arten von Reagenzien, die auf dem
StepOne™-System verwendet werden:
• TaqMan®-Reagenzien
• SYBR® Green-Reagenzien
• Andere Reagenzien
214
Glossar
Reaktionsmix
Lösung, die alle Komponenten für eine PCR-Reaktion enthält mit Ausnahme des
Templates (Probe, Standard oder Kontrolle).
Real-Time PCR
Prozess zur Erfassung von Fluoreszenzdaten während der PCR-Amplifikation. RealTime PCR-Daten werden zur Berechnung von Ergebnissen für
Quantifizierungsanalysen oder zur Fehlerbehebung bei Genotypisierungs- oder
Positiv/Negativ-Analysen verwendet.
Referenzprobe
In relativen Standardkurven- und vergleichenden CT (∆∆CT)-Analysen die Probe, die
als Ausgangsbasis für relative Quantifizierungen verwendet wird. Wird auch als
Kalibrator bezeichnet.
refSNP ID
Zahl, die die Referenz-SNP(refSNP)-Cluster-ID-Nummer bezeichnet. Wird durch die
Single Nucleotide Polymorphism Database (dbSNP) of Nucleotide Sequence Variation
(SNP-Datenbank der Variationen in Nukleotidsequenzen) generiert, Sie dient unter
anderem dazu, in den Lagerbeständen von Applied Biosystems nach einem SNPGenotypisierungs-Assay von Applied Biosystems zu suchen. Wird auch als rsNummer bezeichnet.
Regressionsgerade
In Standardkurven- und relativen Standardkurven-Analysen die Gerade bester
Übereinstimmung aus der Standardkurve. Formel für die Regressionsgerade:
CT = m [log (Qty)] + b
wobei m die Steigung, b der y-Achsenabschnitt und Qty die Standardmenge ist.
Siehe auch unter Regressionskoeffizienten.
Regressionskoeffizienten
Aus der Regressionsgeraden in Standardkurven berechnete Werte, dazu gehört der R2Wert, die Steigung und der y-Achsenabschnitt. Sie können die Werte der
Regressionskoeffizienten zur Bewertung der Qualität der Ergebnisse aus den
Standards benutzen, siehe auch unter Standardkurve.
Reihe
Siehe unter Standardverdünnungsreihe.
Reine Farbe
Reagenz, das den Fluoreszenzfarbstoff enthält. Farbstoffe werden zur Durchführung
einer Kalibrierung auf dem StepOne™-System verwendet, siehe auch unter
Systemfarbstoff.
Relative
StandardkurvenMethode
Quantifizierungsmethode für Quantifizierungsanalysen. Bei der relativen
Standardkurven-Methode werden Ergebnisse von Standards, einer Referenzprobe
und einer endogenen Kontrolle zur Bestimmung der relativen Menge einer
Zielsequenz in einer Probe verwendet.
Replikate
Gesamtzahl identischer Reaktionen mit identischen Komponenten und identischen
Volumina.
Replikat-Gruppe
Ein Satz identischer Reaktionen in einer Analyse.
Reporter
Fluoreszierender Farbstoff, der zur Detektion der Amplifikation verwendet wird.
Wenn Sie TaqMan®-Reagenzien verwenden, ist der Reporterfarbstoff an das 5′-Ende
gebunden. Wenn Sie SYBR® Green-Reagenzien verwenden, ist der Reporterfarbstoff
SYBR® Green-Farbstoff.
215
Glossar
Reporter-Derivat
(−Rn′)
Angezeigt in der y-Achse der Schmelzkurve. Das Reporterderivat-Signal ist das
negative erste Derivat der normalisierten Fluoreszenz des Reporters.
Reverse Primer
Oligonukleotid, das an das 3′-Ende der Zielsequenz bindet. Der Reverse Primer und
der Forward Primer werden zusammen in PCR-Reaktionen eingesetzt, um die
Zielsequenz zu amplifizieren.
Reverse Transkriptase
PCR-Reaktionskomponente, die RNA in cDNA umwandelt. Reverse Transkriptase
wird zur PCR-Reaktion hinzugegeben, um eine 1-Schritt-RT-PCR durchzuführen.
Rn
Abkürzung für normalisierter Reporter.
Rohdatendarstellung
Anzeige der Fluoreszenzamplitude für die ausgewählten Wells für alle Filter. Zeigt die
Fluoreszenzamplitude von allen Datenerfassungspunkten in einem Lauf an.
rs-Nummer
Siehe unter refSNP ID.
Schmelzkurve
Anzeige von Daten, die in der Schmelzkurvenphase erfasst wurden. Spitzenwerte in
der Schmelzkurve können die Schmelztemperatur (Tm) der Zielsequenz angeben oder
eine unspezifische PCR-Amplifikation identifizieren. Sie können die Schmelzkurve
als normalisierten Reporter (Rn) im Vergleich zur Temperatur oder als ReporterDerivat
(−Rn′) im Vergleich zur Temperatur anzeigen lassen.
Schmelzkurvenphase
Phase im Thermoprofil mit einem Temperaturanstieg zur Generierung einer
Schmelzkurve.
Schmelztemperatur
(Tm)
Punkt in der Schmelzkurve, an dem die Fluoreszenzniveaus ein Höchstniveau
erreichen und anzeigen, dass sich die doppelsträngige DNA in einzelsträngige DNA
auftrennt.
Schritt
Komponente des Thermoprofils. Ein Schritt wird durch die Temperatur, die Zeit, die
Rampe und den Datenerfassungsstatus definiert. Für Zyklusphasen wird ein Schritt
auch durch den Auto∆ Status definiert.
Schwellenwert
Fluoreszenzniveau über der Grundlinie und innerhalb des exponentiellen
Wachstumsbereichs des Amplification Plot (Amplifikationsdarstellung). Der
Schwellenwert kann automatisch bestimmt werden (siehe automatischer CT) oder er
kann manuell festgelegt werden (siehe manueller CT).
Schwellenwert-Zyklus
(CT)
Der PCR-Zyklus, bei dem ∆Rn den Schwellenwert in der Darstellung der
Amplifikation erreicht.
Serienfaktor
Numerischer Wert, der die Sequenz von Mengen in der Standardkurve definiert. Der
Serienfaktor und die Ausgangsmenge werden zur Berechnung der Standardmenge für
jeden Punkt in der Standardkurve verwendet. Wenn die Standardkurve beispielsweise
mit einem Serienfaktor von 1:10 oder 10 definiert ist, bedeutet das eine 10fache
Differenz zwischen zwei beliebigen nebeneinander liegenden Punkten in der Kurve.
Setup für
Fortgeschrittene
Funktion in der Step One™-Software, die es Ihnen erlaubt, die Analyse entsprechend
Ihrem eigenen experimentellen Design einzurichten.
216
Glossar
SNP
Abkürzung für Einzelnukleotid-Polymorphismus. Der SNP kann in einer
Basendifferenz oder Indel (Insertion/Deletion) bestehen.
SNP-Assay
In Genotypisierungsanalysen eine PCR-Reaktion, die Primer zur Amplifikation des
SNP und zwei Sonden zur Detektion unterschiedlicher Allele enthält.
SNP-Assay-Bibliothek
Sammlung von SNP-Assays in der StepOne™-Software.
Sonden-Mix
PCR-Reaktionskomponente, die eine TaqMan®-Sonde zur Detektion der
Amplifikation der Zielsequenz enthält.
Standard
Probe, die bekannte Mengen eines Standards enthält. Standardreaktionen werden in
Quantifizierungsanalysen verwendet, um Standardkurven zu generieren. Siehe auch
unter Standardkurve und Standardverdünnungsreihe.
Standardkurve
In Standardkurven- und relativen Standardkurven-Analysen:
• Die Kurve bester Übereinstimmung in einer Darstellung der CT-Werte aus den
Standardreaktionen, die gegen die Standardmengen aufgetragen werden, siehe
auch Regressionsgerade.
• Ein Satz von Standards, der eine Reihe bekannter Mengen enthält. Daten der
Standardkurven-Reaktionen werden zur Generierung der Standardkurve
verwendet. Die Standardkurve ist durch die Anzahl der Punkte in der Reihe, die
Anzahl der Standardreplikate, die Ausgangsmenge und den Verdünnungsfaktor
definiert, siehe auch Standardverdünnungsreihe.
StandardkurvenMethode
Quantifizierungsmethode für Quantifizierungsanalysen. Bei der StandardkurvenMethode werden Ergebnisse von Standards zur Bestimmung der absoluten Menge
einer Zielsequenz in einer Probe verwendet.
Standardmenge
Eine bekannte Menge in der PCR-Reaktion.
• Bei Standardkurven-Analysen: die bekannte Menge der Zielsequenz. Die
Maßeinheiten für Standardmengen können die Masse, Kopienzahl,
Virusbelastung oder sonstige Größen für die Messung der Zielsequenzmenge
betreffen.
• Bei relativen Standardkurven-Analysen: eine bekannte Menge im Standard. Die
Standardmenge kann sich zum Beispiel auf die Menge der cDNA oder die
Menge der Stammlösung beziehen. Die Einheiten sind für relative
Standardkurven-Analysen nicht relevant, da sie aus den Berechnungen
herausfallen.
Standardverdünnungsreihe
In Standardkurven- und relativen Standardkurven-Analysen ein Satz von Standards,
der eine Reihe bekannter Mengen enthält. Die Standardverdünnungsreihe wird durch
serielle Verdünnung von Standards hergestellt. Der Standardstamm wird zur
Herstellung der ersten Verdünnungsstufe verwendet, die erste Verdünnungsstufe wird
wiederum zur Herstellung der zweiten verwendet usw. Die zur Herstellung einer
Standardverdünnungsreihe notwendigen Volumina werden anhand der Anzahl der
Verdünnungsstufen, der Anzahl der Standardreplikate, der Ausgangsmenge, des
Verdünnungsfaktors und der Standardkonzentration in der Stammlösung definiert,
siehe auch unter Standardkurve.
217
Glossar
Steigung
Die Steigung gibt die Effizienz der PCR-Amplifikation für einen Assay an. Eine
Steigung von −3,3 bedeutet eine 100%ige Amplifikationseffizienz, siehe auch unter
Amplifikationseffizienz (EFF%).
SYBR® GreenReagenzien
PCR-Reaktionskomponenten, die aus zwei Primern zur Amplifikation der Zielsequenz
und SYBR® Green-Farbstoff zur Detektion doppelsträngiger DNA bestehen.
Systemfarbstoff
Von Applied Biosystems hergestellte und auf dem StepOne™ -System vorkalibrierte
Farbstoffe. Systemfarbstoffe:
•
•
•
•
•
FAM™ Farbstoff
JOE™ Farbstoff
ROX™ Farbstoff
VIC® Farbstoff
Farbstoff als Reporter oder Quencher mit dem ™-System.
TaqMan®-Reagenzien
PCR-Reaktionskomponenten, die aus Primern zur Amplifikation der Zielsequenz und
einer TaqMan®-Sonde zur Detektion der Amplifikation der Zielsequenz bestehen.
Temperaturdarstellung
Anzeige der Temperaturen für Probe, Heizdeckel und Heizblock während des
Systemlaufs.
Template
Nukleinsäuretyp, der zur PCR-Reaktion hinzugefügt wird. Das zu empfehlende
Template hängt jeweils vom Analysentyp ab.
Thermoprofil
Teil des Laufprofils, der Temperatur, Zeit, Rampe und Datenerfassungspunkte für alle
Schritte und Phasen des Gerätelaufs angibt.
Tm
Abkürzung für Schmelztemperatur (Tm).
Touchscreen
Geräteanzeige, mit der Sie durch Berührung das Gerät steuern.
unbekannt
In Quantifizierungsanalysen die Suche nach der Zielsequenz in Wells, die ein ProbenTemplate mit unbekannter Zielsequenzmenge enthalten.
In Genotypisierungsanalysen die Aufgabe für den SNP-Assay in Wells, die ein ProbenTemplate mit unbekanntem Genotyp enthalten.
In Positiv/Negativ-Analysen die Aufgabe für die Zielsequenz in Wells, die ein ProbenTemplate enthalten, in dem ein Vorhandensein der Zielsequenz nicht bekannt ist.
Verdünnungsfaktor
Siehe unter Verdünnungsfaktor.
Verdünnungsmittel
Reagenz, das zur Verdünnung einer Probe oder eines Standards verwendet wird, bevor
diese zur PCR-Reaktion hinzugegeben werden. Als Verdünnungsmittel kann Wasser
oder ein Puffer verwendet werden.
218
Glossar
Vergleichende CT
(∆∆CT)-Methode
Quantifizierungsmethode für Quantifizierungsanalysen. Bei der vergleichenden CT
(∆∆CT)-Methode werden Ergebnisse von einer Referenzprobe und einer endogenen
Kontrolle zur Bestimmung der relativen Menge einer Zielsequenz in einer Probe
verwendet.
Well auslassen
Maßnahme, die Sie nach der Analyse durchführen, um einen oder mehrere Wells aus
der Gesamtanalyse auszuschließen, bevor Sie die Daten erneut analysieren.
Well verwerfen
Maßnahme, die während der Analyse von der Software durchgeführt wird, um einen
oder mehrere Wells aus der weiteren Analyse auszuschließen, wenn einem Well eine
bestimmte Markierung zugewiesen wird.
y-Achsenabschnitt
Der y-Achsenabschnitt gibt den erwarteten Schwellenwert-Zyklus (CT) für eine Probe
mit einer Menge gleich 1 an (z. B. 1 ng/µl).
Zielsequenz
Die Nukleinsäuresequenz, die Sie amplifizieren und bestimmen möchten.
Zielsequenzbibliothek
Sammlung von Zielsequenzen in der StepOne™-Software.
Zielsequenzfarbe
Einer Zielsequenz zugeordnete Farbe, um diese in den Plattenbelegungs- und AnalyseDarstellungen zu identifizieren.
Zyklusphase
Phase im Thermoprofil, die wiederholt wird. Wenn die Zyklusphase zur Durchführung
einer PCR verwendet wird, nennt man sie Amplifikationsphase.
Zyklus-Schwellenwert
Siehe unter Schwellenwert-Zyklus (CT).
219
Glossar
220
Stichwortverzeichnis
Nummerische Einträge
1-Schritt-RT-PCR 7, 23, 24, 33, 41, 131, 132, 140, 146
2-Schritt-RT-PCR 7, 11, 12, 23, 24, 131, 132
A
Abfallentsorgung, Richtlinien xx
Abfallprodukte, Beschreibung xx
Allgemeine xxi
Alternative Analyseabläufe, siehe Arbeitsabläufe.
Amplifikationsdarstellung, typisch 105, 185
Amplifikationseffizienz 28, 29, 101, 102
Analyse vorbereiten
Arbeitsablauf 50, 154
Hinweise 54, 58, 61, 64, 156, 158, 160, 163
Probenverdünnungen 53, 156
Reaktionsmix
Ansetzen 59, 158
Reaktionsplatte 61, 161
Standardverdünnungsreihe 55
Template 51, 155
Weitere Informationen 52, 54, 61, 65, 156, 158,
160, 163
Analyseauswertung
Ansicht der Auswertungseinstellungen 112, 188
Ansicht der QC-Zusammenfassung 114, 190
Ansicht der Rohdatendarstellung 120, 197
Ansicht der Well-Tabelle 107, 179
Ansicht des Bildschirms Amplification Plot
(Amplifikationsdarstellung) 102, 107, 179,
181
Ansicht des Bildschirms Multicomponent Plot
(Multikomponentendarstellung) 118, 194
Ansicht des Standardkurvenbildschirms 99
Anzeigen des Bildschirms Multiple Plots
(Mehrfachdarstellung) 98, 178
Auswerten 94, 174
Datenausgabe 110, 186
Herausnahme von Wells 116, 192
Hinweise 95, 101, 105, 109, 113, 116, 117, 120,
121, 175, 181, 185, 189, 191, 193, 196, 198
Weitere Informationen 102, 106, 109, 113, 116,
118, 120, 121, 181, 185, 189, 191, 194,
196, 198
Analysedesign-Assistent
beenden 46, 150
Bildschirm Experiment Properties
(Analyseeigenschaften) 19, 127
Bildschirm Materials List (Materialliste) 43, 147
Bildschirm Methods & Materials (Methoden und
Materialien) 21, 129
Bildschirm Reaction Setup (Pipettierprotokoll) 34,
141
Bildschirm Run Method (Laufprofil) 32, 139
Bildschirm Samples (Proben) 29, 135
Bildschirm Standards 27
Bildschirm Targets (Zielsequenzen) 24, 133
Software-Elemente 125
Arbeitsablauf 68
Benachrichtigungseinstellungen aktivieren 71
Daten übertragen 86
Hinweise 72
Starten 73
Überwachen 76
vorbereiten 69, 167
Warnungen 81
Weitere Informationen 71, 81, 83
Andere fluoreszenzmarkierte Reagenzien 9
Anlegen einer neuen Analyse 17, 125
Applied Biosystems
kontaktieren x
Kunden-Feedback über Dokumentation ix
Technischer Support x
Applied Biosystems StepOne Real-Time PCR System.
Siehe StepOne-System.
Arbeitsablauf für den Export/Import 10, 203
Arbeitsabläufe
Beispielanalyse 13
Export/Import 10, 203
QuickStart 10, 201
Setup für Fortgeschrittene 200
Vorlagen 10, 202
Assays auf Bestellung 41, 145
Ausdrucken der Anleitung für das Pipettierprotokoll 40,
145
Ausreißer, siehe Herausnahme von Wells
Auswählen von Wells 97, 177
Auswertungsbildschirme
Bildschirm Amplification Plot
(Amplifikationsdarstellung) 102, 181
Bildschirm Gene Expression Plot
(Genexpressionsdarstellung) 107, 179
Bildschirm Multicomponent Plot
Bildschirm Multiple Plots (Mehrfachdarstellung) 98,
178
Bildschirm QC Summary (QCZusammenfassung) 114, 190
221
Bildschirm Raw Data Plot
(Rohdatendarstellung) 120, 197
Bildschirm Standard Curve (Standardkurve) 99
Navigationstipps 97, 177
Software-Elemente 95, 175
Well-Tabelle 107, 179
Ansicht 112, 188
CT 113, 189
erweitert 113, 189
Grundlinie 113, 189
Markierung 113, 189
relative Quantifizierung 113, 189
Schwellenwert 113, 189
C
Chemische Sicherheit xvii
chemische Sicherheit xvii
Computergesteuerte Konfiguration
Datenübertragung 87
Start 73
Überwachung 77
D
B
Beachtungshinweise, beschrieben viii
Beispielanalyse für relative Standardkurven
Arbeitsablauf 13
Auswerten 92
Beschreibung 10
Daten 12
Design 16
Lauf 68
Name 19
Benachrichtigungseinstellungen 71
Benötigte Materialien 51, 53, 55, 59, 62, 155, 157, 159,
161
Benutzerdefinierte Assays 41, 145
Bestellen von Materialien 43, 147
Bewegen und anheben, Sicherheit xvi
Bibliothek 33, 140
(Amplifikationsdarstellung)
Ansicht nach dem Lauf 102, 181
Während eines Laufs überwachen 78
Bildschirm Experiment Properties
(Analyseeigenschaften) 19, 127
Bildschirm Gene Expression Plot
(Genexpressionsdarstellung) 107, 179
Bildschirm Materials List (Materialliste) 43, 147
Bildschirm Methods & Materials (Methoden und
Materialien) 21, 129
Bildschirm Multicomponent Plot
Bildschirm Multiple Plots (Mehrfachdarstellung) 98,
178
Bildschirm QC Summary (QC-Zusammenfassung) 114,
190
Bildschirm Raw Data Plot (Rohdatendarstellung) 120,
197
Bildschirm Reaction Setup (Pipettierprotokoll) 34, 141
Bildschirm Run Method (Laufprofil) 32, 139
Während eines Laufs überwachen 81
Bildschirm Standards 27
222
Bildschirm Targets (Zielsequenzen) 24, 133
Bildschirm Temperature Plot
(Temperaturdarstellung) 79
biogefährlicher Abfall, Handhabung xx
Daten
Ausgeben 110, 186
Beispielanalyse 9, 12, 94, 174
Informationen zur Datenerfassung 2
übertragen 86
Daten übertragen 86
Datenausgabe 110, 186
DDCT-Analyse, siehe vergleichende CT-Analyse
Dokumentation, dazugehörig viii
E
Eigenständige Konfiguration
Datenfernübertragung 87
Datenübertragung 88
Fernüberwachung 82
Start 74
Überwachung 85
Elektrische Sicherheit xx
EMV-Normen xxiii
Endogene Kontrolle
Analysenkomponente 5, 6
auswählen 26, 134
Bildschirm Relative Quantitation Settings (Relative
Quantifizierungseinstellungen) 31, 138
Ergebnisse interpretieren 93, 173
Ergonomie, Sicherheit xxii
Experimentelles Design
Beenden des Analysedesign-Assistenten 46, 150
Bestellen von Materialien 43, 147
Definieren der Analyseeigenschaften 19, 127
Definieren der Methoden und Materialien 21, 129
Definieren des Laufprofils 32, 139
Einrichten der Proben 29, 135
Einrichten der Standards 27
Einrichten der Zielsequenzen 24, 133
Hinweise 20, 22, 25, 28, 31, 32, 33, 41, 45, 48, 128,
130, 134, 137, 138, 140, 145, 149, 152
Neu anlegen 17, 125
Software-Elemente 125
Überprüfen des Pipettierprotokolls 34, 141
Weitere Informationen 21, 23, 26, 29, 31, 32, 33,
42, 45, 48, 129, 132, 135, 137, 139, 140,
146, 149, 152
L
Fehlerbehebung
Ansicht der Auswertungseinstellungen 112, 188
Ansicht der QC-Zusammenfassung 114, 190
Ansicht der Rohdatendarstellung 120, 197
Ansicht des Bildschirms Multicomponent Plot
Grundlinienwert anpassen 113, 189
Markierungen 115, 191
Schwellenwert anpassen 113, 189
Lauf starten
Computergesteuerte Konfiguration 73
Eigenständige Konfiguration 74
Lauf überwachen
(Amplifikationsdarstellung) 78
Bildschirm Run Method (Laufprofil) 81
Bildschirm Temperature Plot
(Temperaturdarstellung) 79
Computergesteuerte Konfiguration 77
Eigenständige Konfiguration 85
Eigenständige Konfiguration (fern) 82
Lauf vorbereiten 69, 167
Laufprofil-Bibliothek 33, 140
G
M
GEFAHR, Beschreibung xi
Gefährdung, siehe Sicherheit
Gefahrensymbole siehe Sicherheitssymbole auf Geräten
Gefahrensymbole siehe Sicherheitssymbole, auf Geräten
Gefahrensymbole, siehe Sicherheitssymbole auf Geräten
Gefahrensymbole,siehe Sicherheitssymbole
Gerätebetrieb, Sicherheit xvi
Grundlinie
Korrekte Werte 105, 185
manuell anpassen 113, 189
Markierung AMPNC 115, 191
Markierung BADROX 115, 191
Markierung BLFAIL 115, 191
Markierung CTFAIL 115, 191
Markierung EXPFAIL 115, 191
Markierung HIGHSD 115, 191
Markierung NOAMP 115, 191
Markierung NOISE 115, 191
Markierung NOSIGNAL 115, 191
Markierung OFFSCALE 115, 191
Markierung OUTLIERRG 115, 191
Markierung SPIKE 115, 191
Markierung THOLDFAIL 115, 191
Markierungen
Auswertungseinstellungen 113, 189
bei relativen Standardkurven-Analysen 115
bei vergleichenden CT-Anaylsen 191
Multiplex-PCR 7, 24, 132
F
H
Heiz-/Kühlgeschwindigkeit 21, 23, 129, 131
High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kits 51,
155
Hilfesystem, zugreifen ix
Hinweise
Auswertung 95, 101, 105, 109, 113, 116, 117, 120,
121, 175, 181, 185, 189, 191, 193, 196, 198
Design 20, 22, 25, 28, 31, 32, 33, 41, 45, 48, 128,
130, 134, 137, 138, 140, 145, 149, 152
Lauf 72
sicherer Umgang mit Chemikalienabfällen xix
Vorbereitung 54, 58, 61, 64, 156, 158, 160, 163
I
In diesem Handbuch verwendete Konventionen vii
Installationskategorie xx
Inventarisierte Assays 41, 145
K
N
Navigationstipps
Anzeige mehrerer Plots 98, 178
Auswählen von Wells 97, 177
Negativkontrolle, Analysenkomponente 5, 6
Normen
EMV xxiii
Sicherheit xxiii
Normen zur elektromagnetischen Verträglichkeit,
SieheEMV-Normen
O
Online-Hilfe, siehe Hilfesystem
Kunden-Feedback, über Unterlagen von Applied
Biosystems ix
223
P
Proben
Analysenkomponente 5
Einrichten 29, 135
Einrichtungshinweise 31, 137
Probenreaktionen (unbekannte) 64, 162
Template vorbereiten 51, 155
Verdünnungen 53, 156
Probenbildschirm 29, 135
Probenverdünnungen
Ansetzen 53, 156
Berechnete Volumina 39, 53, 144, 157
Q
QuickStart-Arbeitsablauf 10, 201
R
Radioaktiver Abfall, Handhabung xx
Reagenzien
Andere fluoreszenzmarkierte 9
SYBR Green 8
TaqMan 8
Reaktionsmix
Berechnete Volumina 35, 37, 142, 143
Volumen 59, 159
Reaktionsplatte
Ansetzen 61, 161
Belegung 46, 150
Einlegen 70, 168
entnehmen 86
Reaktionsplatte einlegen 70, 168
Reaktionsplatte entnehmen 86
Referenzprobe
Bildschirm Relative Quantitation Settings (Relative
Quantifizierungseinstellungen) 31, 138
Ansetzen 50
Relative Standardkurven-Analysen
Im Vergleich mit vergleichenden CT-Analysen 6
Informationen 4
repetitive Bewegung, Sicherheit xxii
Replikat, Analysenkomponente 5, 6
Richtlinien
chemische Sicherheit xvii
S
Schulung, Informationen über x
Schwellenwert
Korrekte Werte 105, 185
manuell anpassen 113, 189
Setup für Fortgeschrittene 9, 10, 23, 48, 64, 131, 152,
163, 200
Sicherer Umgang mit Chemikalienabfällen xix
224
Sicherheit
Arbeitsplatz xxii
Bewegen/Anheben xvi
biologische Gefahren xxi
Chemikalienabfälle xix
chemische xvii
elektrische xx
Ergonomie xxii
Gerät bewegen und anheben xvi
Gerätebetrieb xvi
Hinweise xix
Konventionen xi
Normen xxiii
repetitive Bewegung xxii
Richtlinien xvii, xx
vor Betrieb des Geräts xvi
Vorschriften xix
Sicherheit am Arbeitsplatz xxii
Sicherheitsdatenblätter (MSDS), erhalten xviii
Sicherheitsdatenblätter (MSDSs)
Beschreibung xviii
Sicherheitsdatenblätter, abrufen x
Sicherheitshinweise, auf Geräten xv
Sicherheitsnormen xxiii
Sicherheitssymbole, auf Geräten xiii
Singleplex-PCR 7, 24, 132
Software-Elemente
Analysedesign-Assistent 125
Auswertungsbildschirme 95, 175
Standards
Einrichten 27
Einrichtungshinweise 28
Kontrollkästchen Standards einrichten 24, 25
Standardreaktionen 63
Verdünnen 55
Standardverdünnungsreihe
Ansetzen 55
Berechnete Volumina 36, 38
StepOne-System
Datenerfassung 2
Filter 121, 198
Konfigurationen 73, 76, 87
Reagenzien 8
Verbrauchsmaterialien 3
SYBR Green-Reagenzien 8, 23, 24, 26, 41, 121, 131,
132, 135, 146, 198
Symbole, Sicherheit xiii
T
TaqMan-Reagenzien 8, 22, 24, 26, 41, 121, 130, 132,
135, 146, 198
Technischer Support, kontaktieren x
Template. Siehe Proben.
U
Überspannungskategorie (Nennwert) xx
V
Verbrauchsmaterialien 20, 128
Siehe auch Benötigte Materialien. 3
Unterstützte 3
Vergleichende CT-Analysen
Im Vergleich mit relativen StandardkurvenAnalysen 6
Informationen 5
Vergleichende CT-Beispielanalyse
Ansetzen 154
Arbeitsablauf 13
Auswerten 172
Beschreibung 11
Daten 12
Design 124
Lauf 166
Name 127
Verwenden von Vorlagen 10, 202
Verwendung des Handbuchs
als Tutorial 9
für eigene Analysen 10
Voraussetzungen für die Verwendung dieses
Handbuchs vii
Vorschriften
Entsorgung von Chemikalienabfällen xix
VORSICHT, Beschreibung xi
W
WARNUNG, Beschreibung xi
Wells
auswählen 97, 177
Herausnahme 116, 192
Negativkontrolle 30, 46, 61, 136, 150, 161
Standard 30, 46, 61, 136, 150, 161
unbekannt 30, 46, 61, 136, 150, 161
Well-Tabelle 107, 179
Z
Zielsequenzen
Einrichten 24, 133
Einrichtungshinweise 25, 134
225
226
Worldwide Sales and Support
Applied Biosystems vast distribution and
service network, composed of highly trained
support and applications personnel,
reaches 150 countries on six continents.
For sales office locations and technical support,
please call our local office or refer to our
Web site at www.appliedbiosystems.com.
Applied Biosystems is committed to
providing the world’s leading technology
and information for life scientists.
Headquarters
850 Lincoln Centre Drive
Foster City, CA 94404 USA
Phone: +1 650.638.5800
Toll Free (In North America): +1 800.345.5224
Fax: +1 650.638.5884
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