Principios de Biología Molecular

Principios de Biología Molecular
2º Curso de Postgrado en Salud
Reproductiva
Centro Rosarino de Estudios Perinatales
Gustavo Leguizamón
Unidad de Embarazo
de Alto Riesgo
Hitos en el camino hacia la
secuenciación de ADN
• 1940 reconocimiento de AND como
material de herencia
• 1953 estructura de la doble cadena
• 1966 decodificación del código genético
• 1972 tecnología del ADN recombinante
• 1975-1977 tecnología de la secuenciación
de ADN
Hitos en el camino hacia la
secuenciación de ADN
• 1983 mapeo genético de enfermedad
(Huntington)
• 1990 lanzamiento del PGH
• 1996 comienza la secuenciación
• 2001 borrador
Watson & Crick
•
Watson: zoologo, Crick: físico
•
“En 1947 Crick no poseia conocimientos
de biología ni de quimica orgánica o
cristalografía..” – www.nobel.se
•
Aplicando las reglas de Chagraff y las
imàgenes de rayos X de Rosalind Franklin
construyeron el modelo de la doble hélice
Watson & Crick with DNA model
•
En 1953 Nature: “It has not escaped our
notice that the specific pairing we have
postulated immediately suggests a
possible copying mechanism for the
genetic material.”
Rosalind Franklin with X-ray image of DNA
Porquè era necesario secuenciar
el genoma humano?
• Las enfermedades son producto de
interacciones del medio-genes
• Los progresos relacionados a
enfermedades asociadas a un gen
• Cáncer, cardiopatía, hipertensión:
asociadas a componente genético
™Múltiples genes comprometidos
™Difícil su estudio
Proyecto genoma humano:
objetivos
• Identificar los 30.000 a 35.000 genes
humanos
• Determinar la secuencia de los 3 millones
de pares de bases
• Almacenar la información en bases de
datos
• Mejorar las herramientas de análisis
• Transferencia de tecnología al sector
privado
• Analizar las implicancias éticas, legales y
sociales
Proyecto Genoma Humano
Major events in the history of Molecular Biology
2000-2001
• 2001 International
Human Genome
Sequencing: primer
borrador de la
secuencia del
genoma humano
Niveles de organización
• Nucleo = biblioteca
• Cromosomas = estantes
• Genes = libros
Purinas
Pirimidinas
DNA Components
•
Nitrogenous Base:
N is important for hydrogen bonding between bases
A – adenine with T – thymine (double H-bond)
C – cytosine with G – guanine (triple H-bond)
•
Sugar:
Ribose (5 carbon)
Base covalently bonds with 1’ carbon
Phosphate covalently bonds with 5’ carbon
Normal ribose (OH on 2’ carbon) – RNA
deoxyribose (H on 2’ carbon) – DNA
dideoxyribose (H on 2’ & 3’ carbon) – used in DNA sequencing
•
Phosphate:
negatively charged
Estructura del ADN
Azùcar
Fosfato
Base
(A,T, C or G)
Antiparalela
Double helix of DNA
• The double helix of DNA has these features:
Concentration of adenine (A) is equal to thymine
(T)
Concentration of cytidine (C) is equal to guanine
(G).
Watson-Crick base-pairing A will only base-pair
with T, and C with G
base-pairs of G and C contain three H-bonds,
Base-pairs of A and T contain two H-bonds.
G-C base-pairs are more stable than A-T basepairs
Two polynucleotide strands wound around each
other.
Double helix of DNA
• The DNA strands are assembled in the 5' to 3' direction by
convention, we "read" them the same way.
• The phosphate group bonded to the 5' carbon atom of one
deoxyribose is covalently bonded to the 3' carbon of the
next.
• The purine or pyrimidine attached to each deoxyribose
projects in toward the axis of the helix.
• Each base forms hydrogen bonds with the one directly
opposite it, forming base pairs (also called nucleotide pairs).
Superestructura
Lodish et al. Molecular Biology of the Cell (5th ed.). W.H. Freeman & Co., 2003.
The Histone Code
• State of histone tails govern TF access to
DNA
• State is governed by amino acid sequence
and modification (acetylation,
phosphorylation, methylation)
Lodish et al. Molecular Biology of the Cell (5th ed.). W.H. Freeman & Co., 2003.
DNA, RNA, and the Flow of Information
Replication
Transcription
Translation
Replicación del DNA
• Semiconservadora
• Diferentes
mecanismos para
cada cadena
DNA Æ RNA: Transcription
• DNA gets transcribed by
a protein known as RNApolymerase
• This process builds a
chain of bases that will
become mRNA
• RNA and DNA are similar,
except that RNA is single
stranded and thus less
stable than DNA
Also, in RNA, the base
uracil (U) is used
instead of thymine (T),
the DNA counterpart
Transcription
• Transcription is highly regulated. Most DNA is in a
dense form where it cannot be transcribed.
• To begin transcription requires a promoter, a small
specific sequence of DNA to which polymerase can
bind (~40 base pairs “upstream” of gene)
• Finding these promoter regions is a partially solved
problem that is related to motif finding.
• There can also be repressors and inhibitors acting in
various ways to stop transcription. This makes
regulation of gene transcription complex to
understand.
Definition of a Gene
•
Regulatory regions: up to 50 kb upstream of +1 site
•
Exons:
(UTR)
protein coding and untranslated regions
1 to 178 exons per gene (mean 8.8)
8 bp to 17 kb per exon (mean 145 bp)
•
Introns:
splice acceptor and donor sites, junk DNA
average 1 kb – 50 kb per intron
•
Gene size:
kb.
Largest – 2.4 Mb (Dystrophin). Mean – 27
Central Dogma Revisited
Transcription
Splicing
Nucleus
hnRNA
mRNA
Spliceosome
DNA
protein
Translation
Ribosome in Cytoplasm
Traducción
Traducción: codigo genético
degenerado
Overview of DNA to RNA to Protein
A gene is expressed in two steps
Transcription: RNA synthesis
Translation: Protein synthesis
Western blot (SDS PAGE)
• Gel de poliacrilamida (poro variable)
• Disociación de la proteina en unidades polipeptídicas
por rotura de puentes S-S (agente reductormercaptoetanol)
• El detergente SDS de carga negativa se une a la
regiones hidrofóbicas de la proteina desplegandola y
neutralizando su carga
• La migración es por tamaño ( no por forma ni carga)
• Identificación de proteinas
Western blot (SDS PAGE)
Western blot (SDS PAGE)
Tratamiento del trabajo del parto
prematuro:conclusiones parciales
• Tocolíticos: efectivos por 48-72 horas
• Corticoides: disminuyen la morbimortalidad neonatal
• Antibióticos: no son efectivos en el
tratamiento del TPP
Parto pretérmino: fundamentos de
la tocolisis
Contracción
Infección
RPM
Gemelos
?
?
?
Parto pretérmino
Tocolíticos: mecanismo de acción
Indometacina
Ca++
Bloqueantes cálcicos
Voltaje dependientes
V.Ind
Ocitocina
PGs
Ca++
Ca++
Ca++
AMPc
Prog
Calmodulina-Ca
MLK
Beta miméticos
A/M
Sulfato de Mg
Mecanismos de parto prematuro
Stress/Fisiológico
Infección
Eje
Hip Hip
CRH-Cortisol
Amnion
Abruptio
Inflamación
TNF
IL-1-6-8
Hemorragia
decidual
Trombina
COX
AA
PGs
PGDH
Proteasas
Inactivos
Gemelar/Poli
Distención
Stretching
Antecedentes (I): inducción de la
expresión de COX-2 mediante stretching
celular
Mecánico
Químico
Cox-2
Hipótesis
La síntesis de prostaglandinas en el amnios
esta incrementada en mujeres que
presentan parto prematuro secundario a
sobredistención (gemelos y polihidramnios).
Esto se debe a un aumento en la expresión y
actividad de la iso-enzima COX-2.
Leguizamón
Leguizamón et
et al
al AJOG
AJOG 2000
2000
Método
• Membranas de pacientes con parto
pretérmino secundario a sobredistención
controladas con membranas de pacientes sin
trabajo de parto
• Determinación de PG E2 en amnion (EIA)
• Determinación de la expresión de COX-1 y
COX-2 (Western Blot)
• Inhibición selectiva de COX-1 (SC 560) y de
COX-2 (SC 236)
Leguizamón
Leguizamón et
et al
al AJOG
AJOG 2000
2000
PGE22 (pg/mg tissue)
Producción de PGE2 en amnion
Gemelos y polihidramnios
4000
4000
*
* P < 0.05
2000
2000
00
*
NonNon- Twins
Twins PolyPolyLabor
hydramnios
Labor
hydramnios
Labor
Labor
Leguizamón
Leguizamón et
et al
al AJOG
AJOG 2000
2000
Expresión de COX-1 y COX-2 en pacientes
con parto pretérmino secundario a gemelos
y polihidramnios
Leguizamón
Leguizamón et
et al
al AJOG
AJOG 2000
2000
Amnion
Controles
DMSO DMSO
H2O
AA
INDOMETHACIN
AA
SC236 SC560
AA
AA
PGE2 ASSAY
Leguizamón et al 2.000
PGE 2 production (% of control)
Efecto de los inhibidores del COX sobre la
producción de PGE2 por el amnion
Indo
Indo
SC-236
SC-236
SC-560
SC-560
140
120
100
80
60
40
20
0
1
Leguizamón
Leguizamón et
et al
al AJOG
AJOG 2000
2000
2
3
4
Twins
Twins
5
6
7
8
PolyPolyhydramnios
hydramnios
Conclusión
El parto prematuro secundario a
embarazo múltiple o polihidramnios se
asocia a un aumento de la expresión y
actividad del COX-2 del amnion
Especulación: Los inhibidores selectivos de
la COX-2 podrían ser tocolíticos efectivos y
seguros
Leguizamón
Leguizamón et
et al
al AJOG
AJOG 2000
2000
Polymerase Chain Reaction (PCR)
• Polymerase Chain Reaction
(PCR)
Used to massively replicate DNA
sequences.
• How it works:
Separate the two strands with low heat
Add some base pairs, primer
sequences, and DNA Polymerase
Creates double stranded DNA
from a single strand.
Primer sequences create a
seed from which double
stranded DNA grows.
Repeat. Amount of DNA grows
exponentially.1→2→4→8→16→32→
64→128
Denaturation
Raise temperature to 94oC
to separate the duplex form
of DNA into single strands
Design primers
• To perform PCR, a 10-20bp sequence on
either side of the sequence to be amplified
must be known because DNA pol requires a
primer to synthesize a new strand of DNA
Annealing
• Anneal primers at 50-65oC
Annealing
• Anneal primers at 50-65oC
Extension
• Extend primers: raise temp to 72oC, allowing Taq
pol to attach at each priming site and extend a
new DNA strand
Extensiòn
• Extend primers: raise temp to 72oC, allowing Taq
pol to attach at each priming site and extend a
new DNA strand
Repeat
• Repeat the Denature, Anneal, Extension
steps at their respective temperatures…
Polymerase Chain Reaction
Polymerase Chain Reaction
• Problem: Modern
instrumentation cannot
easily detect single
molecules of DNA,
making amplification a
prerequisite for further
analysis
• Solution: PCR doubles
the number of DNA
fragments at every
iteration
1…
2…
4…
8…
DNA Arrays--Technical Foundations
•
An array works by exploiting the ability of a given mRNA
molecule to hybridize to the DNA template.
•
Using an array containing many DNA samples in an
experiment, the expression levels of hundreds or thousands
genes within a cell by measuring the amount of mRNA bound
to each site on the array.
•
With the aid of a computer, the amount of mRNA bound to the
spots on the microarray is precisely measured, generating a
profile of gene expression in the cell.
Tipos de Microarrarys
MICROARRAYS
GENÓMICOS
DE EXPRESIÓN
MUTACIONES
Microarray Genómico
• Detecta la presencia o ausencia de un gen y en cuántas
copias
•Microarray de Expresión
• Determina los niveles relativos de expresión (mRNA) de los
genes
Análisis por Microarrays
Duggan DJ. et al., Nature Genet. 21: 10-14 (Supplement) (1999).
An experiment on a microarray
In this schematic:
GREEN represents Control DNA
RED represents Sample DNA
YELLOW represents a combination of Control and Sample DNA
BLACK represents areas where neither the Control nor Sample DNA
Each color in an array represents either healthy (control) or diseased (sample)
tissue.
The location and intensity of a color tell us whether the gene, or mutation, is
present in
the control and/or sample DNA.
Tipos de Muestra
Diagnóstico Pre y Post-natal
• Sangre
• Líquido Amniótico
Células en Cultivo
Células sin cultivar
• Vellosidades Coriónicas
• Blastómeros
• Cuerpos Polares
• Productos de Aborto
Análisis mediante microarray de expresión
génica
• Objetivo: identificar patrones de expresión
génica durante el trabajo de parto
prematuro y de término en el humano y la
rata
• Análisis de microarray utilizando ARN
miometral de pacientes con:
o Parto prematuro con y sin trabajo de parto
o Parto de término con trabajo de parto
DNA Microarray
Millions of DNA strands
build up on each location.
Tagged probes become
hybridized to the DNA chip’s
microarray.
77 genes
incrementaron
su actividad (X2) en
pacientes con trabajo
de parto a tèrmino y
pretèrmino
PTNL PTL TL
Agrupación funcional en clusters de
genes de miometrio humano
Sin cambios
Aumento
Disminución
Bethin et al
Agrupación funcional en clusters de
genes de miometrio de rata
PTNL PTL TL
Activación de
diferentes genes en
el humano y en la
rata