Das molekulare Drehlager der ATP-Synthase

Transcription

Das molekulare Drehlager der ATP-Synthase
Dissertation zur Erlangung des Grades eines
Doktors der Naturwissenschaften
von
Martin Müller
Genehmigt vom Fachbereich Biologie/Chemie der
Universität Osnabrück
Osnabrück, im Juli 2004
Hauptberichterstatter: apl. Prof. Dr. Siegfried Engelbrecht
Berichterstatter: Prof. Dr. Wolfgang Junge
Datum der Prüfung: 15.07.2004
I
Inhaltsverzeichnis
Abkürzungen
1 Einleitung
1.1 Das atp-Operon von E. coli
1.2 Die Struktur der EFOF1-ATP-Synthase
1.3 Der Funktionsmechanismus der EFOF1-ATP-Synthase
1.3.1 Funktionsweise des F1-Motor/Generators
1.3.2 Funktionsweise des FO-Motor/Generators
1.3.3 Der C-terminale Bereich von γ als Lager des
γεc10-Komplexes
2 Material und Methoden
2.1 Reagenzien, Geräte und Lösungen
2.2 Stämme und Plasmide
2.2.1 E. coli DH5α
2.2.2 E. coli DK8
2.2.3 pBluescript II SK (+)
2.2.4 pKH7
2.2.5 pSE1
2.2.6 Vektorkarte der Deletionsmutanten pMM16, pMM20,
pMM17, pMM8, pMM18 und pMM19
2.2.7 Vektorkarte der Cystein-Doppelmutante pMM10
2.2.8 pMM6
2.2.9 pSW3
2.2.10 pGH7
2.3 Methoden
2.3.1 Allgemeine molekularbiologische Arbeitsmethoden
2.3.1.1 Transformation mit Plasmid-DNA
2.3.1.2 Isolierung von Plasmid-DNA
2.3.1.3 Restriktionsanalyse von Plasmid-DNA
2.3.1.4 Präparative Restriktionsschnittansätze
2.3.1.5 Agarose-Gelelektrophorese
2.3.1.6 Ligation von DNA-Fragmenten
2.3.1.7 Transformation mit Plasmid-DNA aus Ligationsansätzen
2.3.1.8 Herstellung kompetenter Zellen
2.3.1.9 Sequenzierung
2.3.1.10 Mutagenese durch PCR
2.3.2 Allgemeine biochemische Arbeitsmethoden
2.3.2.1 Bestimmung der Proteinkonzentration nach Sedmak und
Grossberg
2.3.2.2 Bestimmung der ATP-Hydrolyseaktivität nach LeBel
2.3.2.3 SDS-Gelelektrophorese
2.3.2.4 Zellanzucht von E. coli DK8-Mutanten
2.3.2.5 Aufreinigung von EF1
2.3.3 Herstellung von γ-Deletionsmutanten
2.3.3.1 Herstellung des γ-Subklons pMM4
VII
1
7
9
11
12
15
18
23
23
28
28
28
29
30
31
32
33
33
33
34
34
34
34
34
35
35
36
36
37
37
38
39
43
43
43
45
45
46
46
46
II
2.3.3.2 Mutagenese
2.3.3.3 Herstellung einer EFOF1-Deletionsmutante
2.3.3.4 Isolierung von EFOF1
2.3.4 Fluoreszenzmikrovideographie
2.3.4.1 Biotinylierung von EF1
2.3.4.2 Präparation von farbstoffmarkiertem F-Actin
2.3.4.3 Fluoreszenzmikroskopischer Rotationstest
2.3.5 Bestimmung von Aktivierungsenergien nach Arrhenius
2.3.6 Herstellung der Cystein-Doppelmutante MM10
2.3.7 Inhibierung von MM10-EF1 durch AMP-PNP, ADP und Azid
2.3.8 Oxidation und Reduktion von MM10-EF1
2.3.9 Dissoziation/Rekonstitution und Oxidation/Reduktion von
Cystein-Doppelmutanten
2.3.9.1 Oxidation und Farbstoffmarkierung von EF1
2.3.9.2 Dissoziation von EF1-Mutanten und Rekonstitution von
EF1-Hybriden
2.3.9.3 Reduktion und Reoxidation von EF1-Hybriden
3 Ergebnisse
3.1 Einfluß C-terminaler γ-Deletionen auf das Drehmoment und die
Hydrolyseaktivität der EF1-ATPase
3.1.1 Herstellung von EF1-γ-Deletionsmutanten
3.1.2 Arrhenius-Analyse der Deletionsmutanten
3.1.3 Bestimmung des durch die Deletionsmutanten erzeugten
Drehmoments
3.1.4 Herstellung einer EFOF1-γ-Deletionsmutante
3.2 Verknüpfung von Rotor und Stator: Die Cystein-Doppelmutante
MM10
3.2.3 Arrhenius-Analyse mit oxidiertem und reduziertem
MM10-EF1
3.2.5 Nachweis der Rotation des C-terminalen Bereichs der
Untereinheit γ relativ zu den α-Untereinheiten von EF1
3.2.6 Nachweis der Rotation von Untereinheit γ relativ zu den
β-Untereinheiten von EF1
4 Diskussion
4.1 Einfluß C-terminaler γ-Deletionen auf die Funktion von EF1
4.2 Folgen einer Rotor/Stator-Verknüpfung im
C-terminalen γ-Bereich für die Funktion von EF1
5 Zusammenfassung
6 Literatur
Publikationsliste
Anhang
47
51
51
53
53
53
54
59
61
66
66
67
67
68
68
71
71
71
78
82
85
87
87
89
92
94
94
101
107
107
114
124
127
III
Abbildungsverzeichnis
1.1
1.2
1.3
1.4
1.5
1.6
Struktur von Adenosintriphosphat (ATP)
Die Struktur der FOF1-ATP-Synthase aus E. coli
Das atp-Operon von E. coli
Modelle für den Funktionsmechanismus der ATP-Hydrolyse
Modell für den Funktionsmechanismus des FO-Motor/Generators
Der C-terminale Bereich von Untereinheit γ als Lager des EFOF1-Rotors
2.1
Mutagenese mit vier Primern und mit Hilfe vorhandener
Restriktionsschnittstellen
Mutagenese mit zwei Primern und Verdau der Templat-DNA durch DpnI
Nukleotid- und Aminosäuresequenz des C-terminalen Bereichs der Untereinheit
γ von pKH7 bzw. KH7 und den Deletionsmutanten
Aufbau der Durchflußküvetten
Schematische Darstellung des Versuchsaufbaus zur Bestimmung des
Drehmoments von EF1-Komplexen
Schematische Darstellung des Stahlengangs beim inversen Mikroskop
Olympus IX70
Schematische Darstellung des Versuchsaufbaus zur Bestimmung des
Drehmoments von EFOF1-Komplexen
Reaktionsschema des ATP-Hydrolyseaktivitätstests mit ATP-regenerierendem
System
2.2
2.3
2.4
2.5
2.6
2.7
2.8
3.1
3.2
3.3
3.4
3.5
3.6
3.7
3.8
3.9
3.10
3.11
3.12
3.13
3.14
3.15
Restriktionsanalyse der Deletionsmutanten und von pKH7
Anionenaustauschchromatographie von EF1
Wechselwirkung eines His-tags mit Ni-NTA-Material
SDS-Polyacrylamid Gelelektrophorese der Deletionsmutanten und von KH7
Schematische Darstellung von E. coli F1
Messung der ATP-Hydrolyseaktivität von EF1 mit ATP-regenerierendem
System
Graphische Darstellung der ATP-Hydrolyseaktivitäten der Deletionsmutanten
und von KH7-EF1 im Temperaturbereich von 5-40°C
Abnahme der ATP-Hydrolyseaktivität bei 35°C mit zunehmender
Deletionslänge
Arrhenius-Analyse von Deletionsmutanten-EF1 und Kontroll-EF1 (KH7)
Aktivierungsenergien Ea der Deletionsmutanten und KH7 für 20-35°C
Auftragung der Rotationsrate gegen die Filamentlänge
Vergleich des durch die Deletionsmutanten erzeugten durchschnittlichen
Drehmoments mit dem durch KH7-EF1 erzeugten durchschnittlichen
Drehmoment
Restriktionsanalyse von pMM21 und pSE1
SDS-Polyacrylamid Gelelektrophorese von SE1 und MM21
Einführung der Mutation γA285C in das Plasmid pKH7 durch PCR
1
3
7
14
16
20
41
42
48
54
55
57
58
60
72
75
76
76
77
78
79
80
81
81
84
85
86
87
88
IV
3.16
3.17
3.18
3.19
3.20
3.21
3.22
3.27
Schematische Darstellung der Cystein-Doppelmutante MM10
89
Zeitabhängigkeit der Oxidation und Reduktion von MM10-EF1
90
Kinetik der Oxidation von MM10-EF1 mit 100 µM DTNB
92
Kinetik der Reduktion von MM10-EF1 mit 20 mM DTT
92
SDS-Polyacrylamid Gelelektrophorese von reduziertem und oxidiertem MM10 93
Arrhenius-Analyse von reduziertem und oxidiertem MM10
93
Schematische Darstellung des Experiments zum Nachweis der Rotation
des C-terminalen Bereichs von γ relativ zu α
96
Nachweis der Rotation des C-terminalen Bereichs von γ relativ zu α
98
Abhängigkeit der ATP-Hydrolyseaktivität vom Markierungsgrad der Ni-NTAgereinigten MM10/MM6-EF1-Hybride
99
Schematische Darstellung der Cystein-Doppelmutante SW3
102
Schematische Darstellung des Experiments zum Nachweis der γ-Rotation
relativ zu β
104
Ergebnis des Versuchs zum Nachweis der Rotation von γ relativ zu β
105
4.1
Aufwindung der C-terminalen α-Helix bei der Rotation von γ
3.23
3.24
3.25
3.26
116
V
Tabellenverzeichnis
1.1
Zusammensetzung von EFOF1 und CFOF1
2.1
2.2
2.3
2.4
2.5
2.6
2.7
2.8
2.9
2.10
2.11
2.12
2.13
2.14
Pipettierschema für Ligationsreaktionen
Pipettierschema für Sequenzierungsreaktionen
Temperaturprogramm für Sequenzierungsreaktionen
Pipettierschema für die Bestimmung von Proteinkonzentrationen
Pipettierschema für die Bestimmung von ATP-Hydrolyseaktivitäten
Nukleotidsequenzen der PCR-Primer zur Herstellung von γ-Deletionsmutanten
Pipettierschema der PCR zur Herstellung von γ-Deletionsmutanten
PCR-Temperaturprogramm zur Herstellung von γ-Deletionsmutanten
Nukleotidsequenzen der Sequenzierungsprimer RP, FP und seqIII
Bezeichnung der γ-Deletions-Subklone
Nukleotidsequenz des Sequenzierungsprimers A3
Bezeichnung der γ-Deletionsmutanten
Bedingungen für die Extraktion von EFOF1
Pipettierschema für die Beladung der Durchflußküvetten für EF1-Rotationsexperimente
Pipettierschema für die Beladung der Durchflußküvetten für EFOF1-Rotationsexperimente
Nukleotidsequenzen der Primer zur Erzeugung der Mutation αP280C
Pipettierschema der PCR zur Erzeugung der Mutation αP280C
Temperaturprogramm der PCR zur Erzeugung der Mutation αP280C
Nukleotidsequenz des Sequenzierungsprimers seqI
Nukleotidsequenz des Sequenzierungsprimers A2
Nukleotidsequenzen der Primer zur Erzeugung der Mutation γA285C
Pipettierschema der PCR zur Erzeugung der Mutation γA285C
Temperaturprogramm der PCR zur Erzeugung der Mutation γA285C
Pipettierschema der dritten PCR zur Erzeugung der Mutation γA285C
Temperaturprogramm von PCR 3
Nukleotidsequenzen der Sequenzierungsprimer seqII, seqIII und seqIV
2.15
2.16
2.17
2.18
2.19
2.20
2.21
2.22
2.23
2.24
2.25
2.26
3.1
3.2
3.3
3.4
3.5
3.6
Bezeichnung der Deletionsmutanten
Wachstum der Deletionsmutanten und E. coli DK8 pKH7 auf Succinatmedium
Verdopplungszeiten, Ernteausbeuten und Proteinausbeuten für die
Deletionsmutanten und KH7
ATP-Hydrolyseaktivitäten der Deletionsmutanten und von KH7 im
Temperaturbereich von 5-40°C
Durchschnittliche Ausbeute an rotierenden Actin-Filamenten bei einer
Beobachtungszeit der Durchflußküvetten von 30 min
Bandenintensitäten bei der Oxidation von MM10-EF1
4
37
38
39
43
44
47
48
49
49
49
50
50
52
56
59
62
62
62
62
63
63
64
64
64
65
65
71
73
74
79
83
90
VI
3.7
3.8
3.9
3.10
Bandenintensitäten bei der Reduktion von MM10-EF1
Inhibierung von MM10-EF1 durch AMP-PNP, ADP und Azid
Fluoreszenzintensitäten der α2-, αγ- und α/β-Banden in Abbildung 3.23
Normalisierte ATP-Hydrolyseaktivitäten der reduzierten und reoxidierten
Hybrid-EF1-Komplexe
90
94
99
101
VII
Abkürzungen
AXXX
4-AB
Ac
ADP
6-AHS
Amp
AMP-PNP
ATP
Biotin-PEAC5Maleimid
bp
BSA
Da
DEAE
ddH2O
ddNTP
DMF
DMSO
DNA
dNTP
dsDNA
DTNB
DTT
E. coli
EDTA
EF1
EFO
EGTA
EtOH
FPLC
g
HEPES
HRP
IPTG
kDa
LB-Medium
LDH
M
MES
Absorption bei einer Wellenlänge von XXX nm
4-Aminobenzamidin
Acetat
Adenosindiphosphat
6-Aminohexansäure
Ampicillin
β, γ-Imidoadenosin-5´-triphosphat
Adenosintriphosphat
6-{N´-[2-(N-Maleimido)ethyl]-N-piperazinylamido}hexylD-biotinamid
Basenpaar(e)
Bovines Serumalbumin
Dalton (ein Dalton entspricht einem Zwölftel der Masse
eines 12C-Atoms)
Diethylaminoethyl
doppelt destilliertes H2O
Didesoxynukleotide
Dimethylformamid
Dimethylsulfoxid
Deoxyribonukleinsäure
Desoxynukleotide
doppelsträngige DNA (double-stranded DNA)
6,6´-Dinitro-3,3´-dithiodibenzoesäure
Dithiothreit
Escherichia coli
Ethylendiamintetraessigsäure
hydrophiler, katalytisch aktiver Teilkomplex der ATPSynthase von E. coli
hydrophober, membranintegrierter Teilkomplex der ATPSynthase von E. coli
Ethylenglycol-bis(β-aminoethylether)-N, N, N´, N´tetraessigsäure
Ethanol
fast performance liquid chromatography
Erdbeschleunigung (gravity)
N-(2-Hydroxyethyl)piperazin-N´-(2-ethansulfonsäure)
Meerrettichperoxidase (horse radish peroxidase)
Isopropyl-β-D-thiogalactopyranosid
Kilodalton
Medium nach Luria-Bertani
Lactat-Dehydrogenase
Konzentration in Mol pro Liter
2-(N-Morpholino)ethansulfonsäure
VIII
MOPS
MW
β-NADH
n.b.
NEM
NTA
ODXXX
ori
ox
PAGE
pBSK
PCR
PEP
PK
red
rep
rpm
RT
SDS
T
TBE
TCA
td
TES
TMR-ITC
TRIS
u
unc
UV
VT
(v/v)
(w/v)
X-Gal
3-(N-Morpholino)propansulfonsäure
Molmasse (molecular weight)
β-Nicotinamid-adenindinucleotid
nicht bestimmt
N-Ethylmaleimid
Nitrilotriessigsäure
optische Dichte bei einer Wellenlänge von XXX nm
Replikationsstart (origin of replication)
oxidiert
Polyacrylamid-Gelelektrophorese
pBluescript II SK (+) Vektor
Polymerasekettenreaktion (polymerase chain reaction)
Phosphoenolpyruvat
Pyruvat-Kinase
reduziert
Replikationsursprung
Umdrehungen pro Minute (revolutions per minute)
Raumtemperatur
Natriumlaurylsulfat (sodium dodecyl sulfate)
Drehmoment (torque)
TRIS-Borat-EDTA-Puffer
Trichloressigsäure
Verdopplungszeit
2-[(2-Hydroxy-1,1-bis[hydroxymethyl]ethyl)amino]ethansulfonsäure
Tetramethylrhodamin-5-isothiocyanat
Tris(hydroxymethyl)aminomethan
Einheit enzymatischer Aktivität (units)
veraltete Bezeichnung für die Gene des atp-Operons
Ultraviolett
Volumenteil
Volumenanteil
Gewichtsanteil (bezogen auf das Volumen einer Lösung)
5-Brom-4-Chlor-3-Indolyl-β-D-galaktopyranosid
Für Enzyme und Nukleotide wurden die allgemein üblichen Abkürzungen verwendet.
Aminosäuren wurden wie folgt bezeichnet:
Kennzeichnung der Untereinheit, Kennzeichnung der Aminosäure nach dem
Einbuchstabencode, Position der Aminosäure in der Untereinheit
Beispiel: αC280
Bei der Bezeichnung von Mutationen wurde die ursprüngliche Aminosäure mit aufgeführt:
Kennzeichnung der Untereinheit, Kennzeichnung der Aminosäure vor der Mutation nach
dem Einbuchstabencode, Position der Aminosäure in der Untereinheit, Kennzeichnung der
Aminosäure nach der Mutation nach dem Einbuchstabencode
Beispiel: αP280C
IX
Deletionen wurden wie folgt bezeichnet:
Kennzeichnung der Untereinheit, Großbuchstabe griechisches Delta, Kennzeichnung der
ersten deletierten Aminosäure nach dem Einbuchstabencode mit Position in der
Untereinheit, Bindestrich, Kennzeichnung der letzten deletierten Aminosäure nach dem
Einbuchstabencode mit Position in der Untereinheit
Beispiel: γ∆A284-V286
X
1
Einleitung
1 Einleitung
Adenosintriphosphat (ATP) ist der bedeutendste Überträger freier Enthalpie zum Antrieb
endergoner Prozesse für lebende Organismen. Die zentrale Rolle der Substanz im Energiestoffwechsel wurde erstmals 1941 von F. Lipmann und H. Kalckar erkannt (Lipmann
1941, Kalckar 1937). ATP ist ein Nukleotid und setzt sich aus drei Bestandteilen zusammen: der Base Adenin, dem Zucker Ribose und einer Kette von drei Phosphorylgruppen.
Letztere sind untereinander durch zwei Phosphorsäureanhydridbindungen verknüpft (Abb.
1.1).
NH2
O
-
O
O
P O P
-
O
O
-
O
N
O
P O
O
-
O
HO
N
N
N
OH
Abb. 1.1 Struktur von Adenosintriphosphat (ATP)
Bei der hydrolytischen Spaltung dieser Bindungen wird Energie freigesetzt, da sich zum
einen die negativen Ladungen der Triphosphateinheiten des ATP gegenseitig abstoßen und
zum anderen das Hydrolyseprodukt Orthophosphat (Pi) besser hydratisiert und resonanzstabilisiert ist als die entsprechende γ-Phosphorylgruppe im ATP. Unter Standardbedingungen wird bei der Hydrolyse von ATP zu ADP und Orthophosphat
ATP4- + H2O
ADP3- + HPO42- + H+
eine Enthalpie von ∆G°´ = - 30,5 kJ/mol freigesetzt.
In einer lebenden Zelle sind die Konzentrationen der an der Reaktion beteiligten Substanzen jedoch weit von den Standardkonzentrationen entfernt. So liegen die Konzentrationen
von ATP, ADP und Phosphat z. B. in einer E. coli-Bakterienzelle bei 3 mM, 0,4 mM und
6 mM (Kashket 1982). Damit liefert die Hydrolysereaktion von ATP unter zellulären Bedingungen eine freie Enthalpie von etwa ∆G = - 48 kJ/mol. Die freie Enthalpie wird im
Wesentlichen zum aktiven Transport von Ionen und Molekülen, zur Bewegung (z. B.
Muskelkontraktion) sowie zur Synthese von Makromolekülen und anderen Biomolekülen
verwendet. ATP ist nicht im eigentlichen Sinne eine Speicherform für freie Enthalpie,
denn der ATP-Umsatz in lebenden Zellen ist sehr hoch. So verbraucht ein Mensch pro Tag
etwa 75 kg ATP, der menschliche Körper verfügt jedoch nur über ca. 35 g des Nukleotids
(Neumüller 1979). In einer typischen Zelle wird ein ATP-Molekül innerhalb einer Minute
nach seiner Bildung verbraucht. ATP muß daher ständig aus ADP regeneriert werden.
2
Einleitung
Prokaryonten und Eukaryonten besitzen grundsätzlich zwei Möglichkeiten zur Regeneration von ATP. Zum einen können die Zellen exergone Teilschritte von Stoffwechselwegen
an die Übertragung von anorganischem Phosphat auf ADP (oder GDP) koppeln (Substratketten-Phosphorylierung). Beispiele hierfür sind die GTP-Bildung im Citrat-Zyklus und
die Bildung von 1,3-Bisphosphoglycerat im Rahmen der Glycolyse, das anschließend unter ATP-Bildung zu 3-Phosphoglycerat umgesetzt wird. Wesentlich effizienter ist die
ATP-Regeneration jedoch mit Hilfe von ATP-Synthasen. Diese Enzyme nutzen das durch
einen transmembranen Ionen-Konzentrationsgradienten hervorgerufene elektrochemische
Membranpotential zur Synthese von ATP aus ADP und anorganischem Phosphat. Darüber
hinaus sind sie in der Lage unter ATP-Hydrolyse einen transmembranen Ionen-Konzentrationsgradienten aufzubauen oder zu erhalten. Entsprechend der Bedeutung von ATP für
lebende Organismen sind ATP-Synthasen weit verbreitet. Die Enzyme werden in unterschiedliche Klassen eingeteilt. Zu den am besten untersuchten zählen die F-ATP-Synthasen, die in den inneren Mitochondrienmembranen, den Thylakoidmembranen von Chloroplasten und in Zellmembranen von Bakterien vorkommen. Weiterhin sind A-ATPSynthasen aus archäellen Bakterien und V-ATPasen, die in den Membranen von Vakuolen, Lysosomen, Endosomen und synaptischen Vesikeln vorkommen, bekannt. Die meisten der bislang bekannten Enzyme des V-Typs besaßen lediglich die Fähigkeit unter ATPHydrolyse einen Protonentransport zu katalysieren. Eine ATP-Synthese-Funktion für VATPasen konnte erstmals für die V-Typ H+-ATPase des thermophilen Eubakteriums
Thermus thermophilus nachgewiesen werden (Yokoyama et al. 2000).
Bei allen Enzymen der genannten Klassen handelt es sich um Membranproteine, die aus
einem membranintegrierten Komplex (FO, VO, AO), der die Ionentranslokation katalysiert,
und aus einem hydrophilen, peripheren Membranproteinkomplex (F1, V1, A1), der die
ATP-Synthese bzw. Hydrolyse katalysiert, bestehen. Die Benennung der F-ATP-Synthasen erfolgt üblicherweise nach ihrer Herkunft. So werden F-ATP-Synthasen aus Mitochondrien als MFOF1-ATP-Synthasen bezeichnet, Enzyme aus Thylakoidmembranen von
Chloroplasten als CFOF1-ATP-Synthasen und bakterielle F-ATP-Synthasen nach dem
Herkunftsbakterium, wie z. B. die F-ATP-Synthase aus E. coli, die als EFOF1-ATPSynthase bezeichnet wird.
In der einfachsten Form, der bakteriellen Form, bestehen FOF1-ATP-Synthasen aus 8
nichtidentischen Untereinheiten, die in stark unterschiedlichen Kopienzahlen im Enzym
vorkommen (α3:β3:γ:δ:ε:a:b2:c10-11) (Abb. 1.2).
3
Einleitung
Abb. 1.2 Die Struktur der FOF1-ATP-Synthase aus E. coli
Das Enzym besteht aus acht verschiedenen Untereinheiten, von denen a, b2 und ein Ring aus 10 cUntereinheiten (in E. coli) den Membranteil FO und α3, β3, γ, δ sowie ε den hydrophilen, katalytisch aktiven F1-Teil bilden. Weiterhin kann das Enzym in zwei Komplexe unterteilt werden, die
eine Relativrotation zueinander ausführen können. Hier wird im Allgemeinen der γεc10-Komplex
als Rotor und der ab2δα3β3-Komplex als Stator bezeichnet. Hoch aufgelöste Röntgenstrukturen
liegen für die Untereinheiten des F1-Teils (außer δ) vor. Die Struktur der Untereinheit c wurde
NMR-spektroskopisch ermittelt. Auch die Strukturen der Untereinheiten δ und b konnten durch
NMR-Spektroskopie bzw. röntgenkristallographisch teilweise aufgeklärt werden. Nur für Untereinheit a liegen bislang keine Strukturdaten vor. Die Abbildung zeigt für diese Untereinheit ein
von Rastogi und Girvin entwickeltes Modell (Rastogi und Girvin 1999) (Abb. nach Weber und
Senior 2003).
Die Untereinheiten a, b und c sind integrale Membranproteine und bilden den Membranteil FO. Die Untereinheiten α, β, γ, δ und ε bilden den katalytisch aktiven F1-Teil. Beide
Domänen sind über zwei Stiele, die durch die Untereinheiten b und γ/ε gebildet werden,
verbunden. Die bakterielle FOF1-ATP-Synthase aus E. coli und die chloroplastidäre
CFOF1-ATP-Synthase ähneln sich vom Aufbau und der Stöchiometrie der Untereinheiten
sehr stark (Tab. 2.1). Größere Unterschiede bestehen nur im Aufbau der FO-Domänen.
Während bei EFOF1 ein Verbindungsstiel durch ein b2-Homodimer gebildet wird ist CFO
mit CF1, neben den Untereinheiten γ und ε, durch ein Heterodimer aus den Untereinheiten
I und II verbunden, das auch in Cyanobakterien und Purpurbakterien vorkommt. Darüber
4
Einleitung
hinaus bestehen Unterschiede in der Stöchiometrie der c-Untereinheiten. Der in die
Membran integrierte Ring aus c-Untereinheiten wird bei EFO aus 10 c-Untereinheiten gebildet, während der Ring bei CFO offenbar 14 c-Untereinheiten enthält (Jiang et al. 2001,
Seelert et al. 2000).
Tab. 1.1 Zusammensetzung von EFOF1 und CFOF1
F1
FO
Untereinheiten
und Stöchiometrie
von EFOF1
α3
β3
γ
δ
ε
a
b2
Molmasse der
EFOF1-Untereinheiten [kDa]
55
50
31
19
14
30
17
c10
8
Untereinheiten
und Stöchiometrie
von CFOF1
α3
β3
γ
δ
ε
IV
I
II
III14
Molmasse der
CFOF1-Untereinheiten [kDa]
55
54
36
21
15
27
17
14
8
Die Molmassen sind jeweils für eine einzelne Untereinheit angegeben. Daten für EFOF1 entsprechend
Boyer 1997, für CFOF1 entsprechend McCarty 1992.
Mitochondriale F-ATP-Synthasen sind wesentlich komplexer aufgebaut (Collinson et al.
1994, Devenish et al. 2000). So besteht der bovine MFO-Komplex aus mindestens 10 Untereinheiten (a:b:c:d:e:f:g:A6L:F6:OSCP), wobei die Untereinheiten a, b und c jeweils zu
den gleichnamigen EFO-Untereinheiten homolog sind. Der MF1-Komplex wird durch die
Untereinheiten α, β, γ, δ und ε gebildet. Die Untereinheit OSCP des mitochondrialen FOKomplexes entspricht der bakteriellen δ-Untereinheit von EF1 und die mitochondriale δUntereinheit dem bakteriellen ε. Die mitochondriale ε-Untereinheit besitzt kein
bakterielles Homologon. Die anderen MF1-Untereinheiten entsprechen den gleichnamigen
EF1-Untereinheiten. Das bovine mitochondriale FOF1 aus Herzmuskelzellen besitzt für die
Forschung an ATP-Synthasen eine besondere Bedeutung, da von diesem Enzym 1994 die
erste hoch aufgelöste Röntgenstruktur eines F1-Komplexes verfügbar war (Abrahams et al.
1994).
Ebenfalls einen vergleichsweise komplexen Aufbau besitzen die archäellen AOA1-ATPSynthasen, die aus zehn unterschiedlichen Untereinheiten (A3:B3:C:D:E:F:G:H:I:Kx)
(Grüber et al. 2001) mit nicht genau bekannter Stöchiometrie bestehen, sowie die
vakuolären VOV1-ATPasen, die sich aus 13 unterschiedlichen Untereinheiten
(A3:B3:C:D:E:F:G2:H1-2:a:d:c4:c´:c´´) (Kawasaki-Nishi et al. 2003, Forgac 2000) zusammensetzen.
Die Gesamthöhe des mitochondrialen FOF1-Komplexes aus Hefezellen vertikal zur
Membranebene liegt bei etwa 190 Å, wobei der F1-Teil ca. 83 Å hoch ist, der FO-Teil 58 Å
und der im Wesentlichen durch die Untereinheit γ gebildete Verbindungsstiel zwischen F1
und FO ca. 50 Å (Stock et al. 1999). Der maximale Durchmesser des F1-Komplexes des
bovinen mitochondrialen Enzyms horizontal zur Membanebene beträgt ca. 100 Å
Einleitung
5
(Abrahams et al. 1994). Ähnliche Werte wurden für den CF1-Komplex ermittelt (90114 Å, Böttcher et al. 1995). Im Durchmesser des durch die c-Untereinheiten gebildeten
Ringes, der auch als Proteolipid-Ring bezeichnet wird, unterscheiden sich die FOKomplexe verschiedener Spezies aufgrund der unterschiedlichen Stöchiometrien. Der
Proteolipid-Ring des chloroplastidären FO-Komplexes aus 14 c-Untereinheiten besitzt
einen Außendurchmesser von 59-74 Å und einen Innendurchmesser von ca. 35 Å (Seelert
et al. 2000). Die Höhe des Ringes beträgt 73 Å. Damit ragen die c-Untereinheiten jeweils
etwa 15-17 Å zu beiden Seiten aus der Lipidmembran (Dicke ca. 41 Å) heraus. Die
Abmessungen für den Proteolipidring des MFO-Komplexes aus Hefezellen, der aus 10 cUntereinheiten besteht, liegen bei 42-55 Å für den Außendurchmesser und 17-27 Å für
den Innendurchmesser (Stock et al. 1999).
F-ATP-Synthasen nutzen das durch einen transmembranen Ionen-Konzentrationsgradienten hervorgerufene elektrochemische Membranpotential zur Synthese von ATP bzw. katalysieren unter ATP-Hydrolyse den transmembranen Transport von Ionen. Bei den Ionen
handelt es sich im Allgemeinen um Protonen, im Fall der FOF1-ATP-Synthasen aus den
Bakterien Propionigenium modestum, Ilyobacter tartaricus und Acetobacterium woodii
um Natrium-Ionen (Laubinger und Dimroth 1988, Meier et al. 2003, Reidlinger und
Müller 1994). Die Flußrichtung der Ionen ist dabei abhängig vom Funktionsmodus des
Enzyms. Fließen die Ionen durch den FO-Komplex aufgrund des Konzentrationsunterschiedes beiderseits der Membran in Richtung der Seite, auf der sich die F1-Komplexe der
Enzyme befinden, findet die Synthese von ATP statt. Unter ATP-Hydrolyse werden die
Ionen in die entgegengesetzte Richtung gepumpt. Zum Aufbau eines transmembranen
Protonen-Konzentrationsgradienten verfügen die Organismen über primäre Protonenpumpen, im Gegensatz zur ATP-Synthase, die als sekundäre Protonen- oder Ionenpumpe angesehen werden kann. In den Thylakoidmembranen der Chloroplasten führt der über die
Photosysteme I und II lichtinduzierte Elektronentransport zur transmembranen Protonentranslokation, die durch den Cytochrom b/f-Komplex katalysiert wird1. Bei photosynthetischen Bakterien kann die Protonentranslokation auch direkt durch lichtinduzierte
Protonenpumpen, wie z. B. Bakteriorhodopsin, erfolgen. Die Energie zur Regeneration
von ATP stammt bei phototrophen Organismen daher aus der Absorption von Lichtenergie. Chemotrophe Organismen gewinnen diese Energie durch die Oxidation von Nährstoffen (β-Oxidation, Citrat-Zyklus). Bei ihnen erfolgt der Aufbau des transmembranen Protonen-Konzentrationsgradienten durch die Komplexe I, III und IV der Atmungskette. Das
Prinzip der ATP-Regeneration, das aus der indirekten Kopplung zwischen einer primären
Protonenpumpe und der ATP-Synthase besteht, wurde erstmals von P. Mitchell in der
chemiosmotischen Theorie beschrieben (Mitchell 1961).
Darüber hinaus ist das Photosystem II durch die Reaktion der Wasserspaltung (2 H2O → O2 + 4 H+ + 4 e-)
auch unmittelbar am Aufbau eines transmembranen Protonen-Konzentrationsgradienten beteiligt.
1
6
Einleitung
Die Reaktionsrichtung der ATP-Synthasen wird im Wesentlichen durch die Thermodynamik vorgegeben. Hier spielt neben der Konzentration der beteiligten Substanzen auch die
Größe des transmembranen Protonen- bzw. Ionen-Konzentrationsgradienten sowie das
elektrische Membranpotential eine Rolle:
⎛
⎛ [ H + ]a
⎛ [ ATP ]c° ⎞
⎟⎟ − n H + ⎜ RT ln⎜⎜
∆GΣ = ∆G´° + RT ln⎜⎜
+
⎜
⎝ [ ADP ][ Pi ] ⎠
⎝ [ H ]i
⎝
⎞
⎞
⎟⎟ + F∆Ψ ⎟
⎟
⎠
⎠
oder
∆G Σ = ∆G P − n H + ∆µ~H +
∆G´° = Freie Standardreaktionsenthalpie der ATP-Synthese
nH+ = H+/ATP-Kopplungsverhältnis
∆Ψ = elektrische Potentialdifferenz (∆Ψ = Ψa - Ψi)
∆GP = Phosphorylierungspotential
~ + = elektrochemisches Membranpotential
∆µ
H
Die Indices a und i bezeichnen die äußere (Periplasma) und die innere Phase (Cytosol) der Bakterienzelle.
Ist die durch die Protonentranslokation verursachte transmembrane Potentialdifferenz gegenüber dem Phosphorylierungspotential ausreichend groß, wird die Phosphorylierung von
ADP ermöglicht (negative Werte für ∆GΣ). Dies ist im Allgemeinen die Reaktionsrichtung
der F-ATP-Synthasen in Mitochondrien und Chloroplasten. Bei Bakterien hängt die Reaktionsrichtung von den Wachstumsbedingungen ab. So nutzt zum Beispiel E. coli unter
aeroben Wachstumsbedingungen die F-ATP-Synthase ebenfalls zur Synthese von ATP.
Dagegen erfolgt bei der anaeroben Fermentation die ATP-Produktion nur mittels Substratketten-Phosphorylierung. Unter diesen Bedingungen wird die bakterielle F-ATP-Synthase
als Protonenpumpe verwendet und hydrolysiert ATP. Der auf diese Weise erzeugte Protonen-Konzentrationsgradient wird unter anderem für Transportprozesse und für die Flagellenrotation benötigt (Kasimoglu et al. 1996).
Die Reaktionsrichtung der chloroplastidären F-ATP-Synthase kann darüber hinaus durch
den Redoxzustand des Enzyms beeinflußt werden (Hisabori et al. 2002, Bald et al. 2001).
Im Dunkeln ist das lichtabhängige Elektronen- und Protonentransportsystem der Chloroplasten nicht aktiv. Zur Vermeidung unerwünschter ATP-Hydrolyse wird das unter
Lichteinwirkung üblicherweise reduziert vorliegende Enzym im Dunkeln oxidiert, wodurch die ATPase-Funktion des Enzyms blockiert wird.
Im Folgenden wird die Struktur und der Funktionsmechanismus der bakteriellen F-ATPSynthase aus E. coli genauer beschrieben. Dieses Enzym zählt zu den am besten untersuchten ATP-Synthasen. Aufgrund der strukturellen und funktionellen Ähnlichkeiten unter
den F-ATP-Synthasen verschiedener Organismen lassen sich Erkenntnisse über ein Enzym
jedoch im Allgemeinen auch auf die Enzyme anderer Spezies übertragen.
7
Einleitung
1.1 Das atp-Operon von E. coli
Die bakterielle EFOF1-ATP-Synthase besteht aus den acht unterschiedlichen Untereinheiten α, β, γ, δ, ε, a, b sowie c und ist chromosomal durch ein ca. 7 kb großes Operon codiert
(Walker et al. 1984) (Abb. 1.3). Das atp-Operon von E. coli enthält zusätzlich zu den acht
Genen für die verschiedenen Untereinheiten ein neuntes Gen (atpI) mit unbekannter
Funktion. Die EFOF1-ATP-Sythase wird constitutiv exprimiert und erreicht etwa einen
Anteil von 1,5-2% des Gesamtproteingehalts von Wildtyp-Zellen. Dies entspricht einer
Anzahl von etwa 3000 Proteinkomplexen pro Zelle (von Meyenburg et al. 1984).
bp
2000
4000
FO
atp-Operon
atpI
atpB
i
a
6000
8000
F1
atpE atpF
c
b
atpH
atpA
atpG
atpD
atpC
δ
α
γ
β
ε
P
T
polycistronische
mRNA
?
a
c10
b2
δ
α3
γ
β3
ε
Abb. 1.3 Das atp-Operon von E. coli
P Promotor; T Terminatorbereich
Die Codierung der ATP-Synthase durch ein einziges Operon ist bei Bakterien weit
verbreitet. So besitzen zum Beispiel Ilyobacter tartaricus (Meier et al. 2003), Clostridium
pasteurianum (Das und Ljungdahl 2003), das thermophile Bakterium PS3 (Ohta et al.
1988), Bacillus firmus OF4 (Ivey und Krulwich 1991), Bacillus megaterium (Brusilow et
al. 1989), Bacillus subtilis (Santana et al. 1994), Streptomyces lividans (Hensel et al. 1995)
und Clostridium thermoaceticum (Das und Ljungdahl 1997) die gleiche Struktur des
Operons wie E. coli. Leichte Abweichungen treten zum Beispiel bei Lactobacillus
acidophilus (Fehlen des atpI-Gens; Kullen und Klaenhammer 1999) und bei Streptococcus
sanguis sowie Streptococcus mutans auf (Fehlen des atpI-Gens und atpB und atpE
vertauscht; Kuhnert und Quivey 2003 sowie Smith et al. 1996). Acetobacterium woodii,
das eine natriumabhängige F-ATP-Synthase besitzt, verfügt über vier Kopien des atpEGens: atpE2 und atpE3 sowie zwei zu atpE1 fusionierte atpE-Kopien (Rahlfs et al. 1999).
Bei vielen photosynthetischen Organismen liegen die atp-Gene auf zwei getrennten
Operonen vor. So sind zum Beispiel bei Rhodobacter capsulatus (Borghese et al. 1998,
Borghese et al. 1998a) und Rhodospirillum rubrum (Falk und Walker 1988) die Gene für
die Untereinheiten des FO- und des F1-Komplexes getrennt. Auch eine Abspaltung der
letzten zwei Gene des atp-Operons, atpD und atpC, wie zum Beispiel bei dem
Cyanobakterium Synecchococcus sp. Stamm 6301 (Cozens und Walker 1987), bei
Anabaena Stamm PCC 7120 (McCarn et al. 1988) und bei Synechocystis Stamm PCC
6803 (Lill und Nelson 1991), ist bekannt. Die atp-Gene des thermophilen
8
Einleitung
Cyanobakteriums Synechococcus Stamm PCC 6716 sind in drei Bereiche aufgeteilt. Hier
bilden die Gene atpIBEF´FHA und atpDC zwei getrennte Operone. Den dritten Teil bildet
atpG (van Walraven et al. 1993).
Das E. coli-atp-Operon besitzt drei Promotorbereiche: den Hauptpromotor atpIp, 80110 bp strangaufwärts des Translationsstartpunktes von atpI, und zwei schwächere
Promotoren, atpB1p und atpB2p, die sich innerhalb der atpI-Sequenz befinden (Nielsen et
al. 1984). Die gesamte Sequenz des atp-Operons wird nach dem Transkriptionsstart in
eine, ca. 7 kb lange, polycistronische mRNA umgeschrieben. Dabei befindet sich der
Haupt-Transkriptionsstartpunkt 73 bp strangaufwärts des Translationsstartpunktes von atpI
(McCarthy 1988). Der Terminationsbereich liegt ca. 10-50 bp strangabwärts des Translationsstoppunktes von atpC (Walker et al. 1984). Mit Hilfe der polycistronischen mRNA
wird ein Proteinkomplex mit stark unterschiedlicher Stöchiometrie der einzelnen Untereinheiten exprimiert. Die Kontrolle der Expression erfolgt im Wesentlichen auf der
Translationsebene. Hier spielt vor allem die Effizienz der Translationsinitiation, die Stabilität der mRNA und die Translationskopplung eine Rolle (McCarthy 1990). Für die Initiation der Translation ist insbesondere die Bildung von Sekundärstrukturen im Bereich der
Translations-Initiations-Regionen (TIRs) von Bedeutung (McCarthy 1988). Relativ „offene“ Strukturen erlauben eine hohe Translationseffizienz (wie zum Beispiel bei atpE),
„geschlossene“ Strukturen nur eine geringe Effizienz (zum Beispiel bei atpC und atpH).
Insbesondere atpE besitzt eine hoch effiziente TIR. Mit Hilfe dieser Initiations-Region läßt
sich die Expression schwächer exprimierter atp-Gene deutlich steigern (McCarthy und
Bokelmann 1988).
Die Stabilität der atp-mRNA beeinflußt hauptsächlich die Translation der ersten Gene des
atp-Operons, atpI und atpB (McCarthy et al. 1991, Ziemke und McCarthy 1992). In E. coli
wird die mRNA im Bereich von atpB oder innerhalb des nichttranslatierten Bereichs zwischen atpB und atpE, möglicherweise schon bevor die Transkription des gesamten Operons vollständig abgeschlossen ist, endonukleatisch gespalten und das kleinere, 0,5-1 kb
lange, für die Untereinheiten I und a kodierende Fragment des Transkriptes weiter abgebaut (Patel und Dunn 1995). Die Halbwertzeit des atpB-Transkripts ist mit 1,6-2,5 min
etwa 2-3 mal geringer als die Halbwertzeiten der Transkripte von atpE bis atpD (Lagoni et
al. 1993, McCarthy et al. 1991). Für die Spaltung des atp-Transkriptes in E. coli ist offenbar insbesondere die Ribonuklease RNase E von Bedeutung (Patel und Dunn 1992). So
läßt sich in RNase E-defizienten Stämmen das 7-kb Vollängentranskript mittels northern
blot-Analysen nachweisen, in RNase E-haltigen Stämmen jedoch nur ein etwa 6,2-kb langes verkürztes Transkript.
Das atpI-Gen wird, im Vergleich zu den anderen atp-Genen, nur substöchiometrisch
exprimiert (Schramm et al. 1996). Neben der Instabilität der mRNA in diesem Bereich
spielt hier auch eine schwache Translations-Initiationseffizienz eine Rolle (Schneppe et al.
1991). Die Untereinheit I ist für einen funktionsfähigen EFOF1-ATP-Synthase-Komplex
nicht essentiell (Gay 1984), jedoch beeinflußt atpI geringfügig die Expression von atpB
(Hsu und Brusilow 1995).
Die Expression einiger Gene des atp-Operons wird darüber hinaus durch die Kopplung der
Translation gesteuert. So ist die Expression von atpE, atpF, atpH, atpA und atpG miteinander gekoppelt (Hellmuth et al. 1991, Angov und Brusilow 1994). Die Translationskopplung könnte einerseits durch Reinitiation der Translation eine zunehmend schwächere Expression bewirken (zum Beispiel bei atpE > atpF > atpH (c10 > b2 > δ1) sowie
atpA > atpG (α3 > γ1)), andererseits jedoch auch eine Zunahme der Expression (bei atpH <
Einleitung
9
atpA (δ1 < α3)), indem translatierende Ribosomen am Ende von atpH die Sekundärstruktur
der atpA-TIR beeinflussen (Rex et al. 1994).
1.2 Die Struktur der EFOF1-ATP-Synthase
Erkenntnisse über die Struktur von F1-Komplexen wurden vor allem anhand von mitochondrialen Enzymen aus Rinderherzen (Abrahams et al. 1994, van Raaij et al. 1996,
Abrahams et al. 1996, Orriss et al. 1998, Gibbons et al. 2000, Braig et al. 2000, Menz et al.
2001 und Menz et al. 2001a) und der Leber von Ratten (Bianchet et al. 1998) gewonnen.
Darüber hinaus sind Röntgenstrukturen von CF1 aus Spinat-Chloroplasten (Groth und Pohl
2001 und Groth 2002) sowie des α3β3-Komplexes des thermophilen Bakteriums PS3
(Shirakihara et al. 1997) bekannt. Die Struktur des F1-Komplexes von E. coli konnte 1999
nur mit einer Auflösung von 4,4 Å ermittelt werden (Hausrath et al. 1999). Für die Strukturbestimmung wurden daher zusätzlich die Daten der mit 2,8 Å aufgelösten Struktur von
bovinem MF1 (Abrahams et al. 1994) verwendet. Ein Jahr später gelang die Kristallisation
des γ´-ε-Komplexes von EF1 (mit einer verkürzten γ-Untereinheit, die als γ´ bezeichnet
wurde) mit einer Auflösung von 2,1 Å (Rodgers und Wilce 2000). Beide E. coli-Strukturen ließen sich aufgrund großer Übereinstimmungen miteinander kombinieren (Hausrath et
al. 2001).
Der F1-Komplex besteht aus drei α- sowie drei β-Untereinheiten, die abwechselnd angeordnet einen hexagonalen Ring bilden. Die Aminosäuresequenzen der Untereinheiten weisen in Teilbereichen große Ähnlichkeiten auf. So sind z. B. die Aminosäuresequenzen von
E. coli-α und -β zu ca. 35 % homolog und zu ca. 20 % identisch (Walker et al. 1984). Jede
der Untereinheiten besteht aus einer N-terminalen, sechssträngigen β-Faltblattstruktur,
einer zentralen Domäne, die durch α-Helices und β-Faltblattstrukturen gebildet wird und
auch die Nukleotidbindungsstellen enthält, sowie einer C-terminalen Domäne aus 7 (α)
bzw. 6 (β) α-Helices (Abrahams et al. 1994). Die Nukleotidbindungsstellen liegen asymmetrisch an den Kontaktflächen der α- und β-Untereinheiten. Die drei katalytisch aktiven
Bindungsstellen des Enzyms befinden sich vorwiegend innerhalb der β-Untereinheiten,
während die drei inaktiven Bindungsstellen mehr innerhalb der α-Untereinheiten liegen. In
den Ring des α3β3-Hexagons ragt Untereinheit γ mit zwei antiparallelen und leicht umeinander gewundenen α-Helices unterschiedlich weit hinein: mit einer längeren C-terminalen
und einer kürzeren N-terminalen α-Helix. Der C-terminale Bereich der Untereinheit γ
enthält viele hydrophobe Aminosäuren, darunter mehrere hoch-konservierte (Miki et al.
1988, Iwamoto et al. 1990), und wird von sechs hydrophoben Schleifen der α- und β-Untereinheiten umfasst. Aufgrund dieser Anordnung bezeichneten Abrahams et al. diesen
Bereich als „molekulares Lager“ (Abrahams et al. 1994). Zusammen mit ε bildet die Untereinheit γ den so genannten „zentralen Verbindungsstiel“, der den FO- mit dem F1-Teil
des Enzymkomplexes verbindet (Wilkens und Capaldi 1998).
Im Jahr 2000 gelang die Kristallisation eines mitochondrialen F1-Komplexes, der zusätzlich große Bereiche der Untereinheiten δ (homolog zu Untereinheit ε von EF1) und ε (kein
Homologon in EF1) umfasste (Gibbons et al. 2000). Weiterhin sind die Strukturen von
10
Einleitung
mitochondrialem δ anhand einer Hefe-FOF1-Struktur mit einer Auflösung von 3,9 Å (Stock
et al. 1999) sowie die Struktur von EF1-ε (Hausrath et al. 2001) bekannt. Die Untereinheit
ε (bzw. mitochondriales δ) besteht aus einer zehnsträngigen N-terminalen β-Faltblatt-Domäne und einer C-terminalen Domäne, die durch zwei α-Helices gebildet wird. Die Lage
der Untereinheit relativ zum α3β3-Hexagon und insbesondere die Anordnung der C-terminalen α-Helices weicht bei der MF1-Struktur (Gibbons et al. 2000) und der EF1-γ´εStruktur (Rodgers und Wilce 2000) erheblich voneinander ab. Die α-Helices der mitochondrialen δ-Untereinheit liegen flach auf dem durch die c-Untereinheiten gebildeten
Ring des MFO-Teils, während die α-Helices im Fall des E. coli-Enzyms hochgestreckt in
Richtung des EF1-Komplexes weisen. Tsunoda et al. zeigten anhand von Quervernetzungsmutanten, daß die Untereinheit ε von EFOF1 in beiden Konformationen vorliegen
kann und erklärten dies mit einer möglichen regulativen Funktion der Untereinheit, wobei
ε wie eine Art Sperrklinke wirkt. Danach würde im Fall des hochgestreckten ε eine Rotationsrichtung des Enzyms gesperrt, und damit die ATP-Hydrolysefunktion blockiert werden
(Tsunoda et al. 2001a).
Die Struktur der δ-Untereinheit von EF1 wurde durch NMR-Spektroskopie teilweise aufgeklärt (Wilkens et al. 1997, Wilkens et al. 1997a). Die N-terminale Domäne der Untereinheit wird durch ein Bündel von sechs α-Helices gebildet. Die Struktur der C-terminalen
Domäne konnte bislang nicht aufgelöst werden. Die Untereinheit ist für die Verknüpfung
des α3β3-Hexagons mit dem durch die Untereinheiten b2 gebildeten Verbindungsstiel von
Bedeutung, wobei die N-terminale Domäne mit dem α3β3-Hexagon und die C-terminale
Domäne mit dem C-terminalen Bereich der b-Untereinheiten wechselwirkt (Wilkens et al.
1997a, Häsler et al. 1999). Durch Elektronenmikroskopie an EFOF1, das mit monoklonalen
δ-Antikörpern markiert wurde, konnte gezeigt werden, daß die Bindungsstelle von δ am
α3β3-Hexagon am FO-abgewandten Pol des F1-Komplexes liegt (Wilkens et al. 2000).
Der membranintegrierte FO-Teil besteht aus den Untereinheiten a, b und c. Letztere ist mit
79 Aminosäuren die kleinste Untereinheit des Enzyms, jedoch zugleich diejenige mit der
höchsten Kopienzahl. Die Kopienzahl der c-Untereinheiten ist abhängig von der Spezies.
Chloroplastidäres CFO enthält einen Ring aus 14 c-Untereinheiten (Seelert et al. 2000), die
natriumtransportierende FOF1-ATP-Synthase aus dem Bakterium Ilyobacter tartaricus 11
c-Untereinheiten (Vonck et al. 2002) und mitochondriale ATP-Synthase aus Hefezellen
sowie bakterielle EFOF1-ATP-Synthase jeweils 10 c-Untereinheiten (Stock et al. 1999,
Jiang et al. 2001). Strukturuntersuchungen mittels NMR-Spektroskopie zeigten, daß isolierte c-Untereinheiten von E. coli aus zwei antiparallelen α-Helices, einer längeren Nterminalen und einer kürzeren C-terminalen, bestehen (Girvin et al. 1998). Im vollständigen Proteolipid-Ring liegt die C-terminale Helix auf der Außenseite und die N-terminale
Helix auf der Innenseite des Ringes. Die Helices sind durch eine polare Schleife verbunden, die mit den Untereinheiten γ und ε interagiert (Watts et al. 1995, Hermolin et al.
1999). Die C-terminale α-Helix enthält die für die Protonenleitung essentielle Aminosäure
D61 und besitzt aufgrund des Aminosäurerestes P64 einen Knick von etwa 30°.
An der Außenseite des c-Ringes befinden sich die Untereinheiten a und b (Birkenhäger et
al. 1995, Singh et al. 1996). Untereinheit b ist ein amphipatisches 156 Aminosäuren großes
Protein. Es besitzt am N-Terminus einen 33 Aminosäurereste langen, stark hydrophoben,
Bereich, der in die Zellmembran eingelagert ist. Der Rest des Proteins ist vorwiegend
hydrophil und ragt etwa 110 Å von der Membranoberfläche bis zur δ-Untereinheit des F1Komplexes aus der Membran (Rodgers und Capaldi 1998). Sowohl die Membrandomäne
Einleitung
11
der Untereinheit als auch die hydrophile Domäne liegt überwiegend α-helical vor
(Dmitriev et al. 1999, Del Rizzo et al. 2002). Der vollständige EFOF1-Komplex enthält ein
b2-Homodimer, wobei die hydrophilen Bereiche der Helices möglicherweise eine rechtsgängige Doppelhelix bilden. Diese Struktur bildet den so genannten „zweiten Verbindungsstiel“ der E. coli-ATP-Synthase.
Über die Struktur der Untereinheit a der E. coli-ATP-Synthase ist bislang am wenigsten
bekannt. Erst vor kurzem wurde mit einer geeigneten Aufreinigungsmethode für die Untereinheit eine wesentliche Voraussetzung für die NMR-spektroskopische Strukturanalyse
von Untereinheit a geschaffen (Dmitriev et al. 2004). Untereinheit a ist ein stark hydrophobes, 271 Aminosäuren großes Membranprotein. Die Untereinheit besitzt möglicherweise fünf transmembrane Bereiche, die durch zwei periplasmatische, extramembrane
Schleifen und zwei cytoplasmatische, extramembrane Schleifen miteinander verbunden
sind. Nach dem Modell von Valiyaveetil und Fillingame befindet sich der N-Terminus von
Untereinheit a auf der periplasmatischen Seite der Membran und der C-Terminus auf der
cytoplasmatischen Seite (Valiyaveetil und Fillingame 1998). Es wird angenommen, daß
die Untereinheiten a und c gemeinsam an der Protonentranslokation beteiligt sind
(Deckers-Hebestreit und Altendorf 1996, Valiyaveetil und Fillingame 1997).
1.3 Der Funktionsmechanismus der EFOF1-ATP-Synthase
F-ATP-Synthasen zählen zu den kleinsten, natürlich vorkommenden, molekularen Rotationsmotoren. Sie bestehen aus einem Rotor und einem Stator. Diese Einteilung ist willkürlich, da der Stator der Enzymkomplexe in der Zellmembran nicht fixiert ist, und das Enzym daher als Gesamtkomplex in der Membran eine thermisch bedingte Rotationsdiffusion ausführt. Rotor und Stator führen also lediglich eine Relativbewegung zueinander aus.
In der bakteriellen EFOF1-ATP-Synthase wird der Komplex aus den Untereinheiten
α3β3δb2a als Stator und der Untereinheitenkomplex γεc10 als Rotor bezeichnet. Das Enzym
läßt sich darüber hinaus in einen „Motor“ und einen „Generator“ unterteilen, die sich auf
einer gemeinsamen Welle befinden und je nach Funktionsrichtung (ATP-Synthese bzw.
ATP-Hydrolyse) ihre Rolle tauschen können. In ATP-Synthese-Richtung dient der FO-Teil
des Enzyms als drehmomenterzeugender Motor, der die elektrochemische Energie eines
transmembranen Protonen-Konzentrationsgradienten in die mechanische Energie einer
Rotationsbewegung umwandelt. Die Rotationsbewegung wird über die gemeinsame Welle
(γε) in den F1-Teil übertragen, der in diesem Fall als ATP-Generator betrieben wird. In
ATP-Hydrolyse-Richtung ändert sich die Rotationsrichtung der Welle, die nun vom F1Teil angetrieben wird. Die Energie dafür stammt aus der Hydrolyse von ATP. In diesem
Fall dient der FO-Komplex als Pumpe, die Protonen entgegen eines Konzentrationsgradienten transportieren kann. Zur Verbindung der Stator-Komponenten des FO- und des F1Teils dienen die Untereinheiten b2 und δ.
12
Einleitung
1.3.1 Funktionsweise des F1-Motor/Generators
Der F1-Teil der FOF1-ATP-Synthase enthält drei katalytisch aktive Nukleotidbindungsstellen, die sich hauptsächlich jeweils innerhalb der β-Untereinheiten befinden. In
Gegenwart substöchiometrischer ATP-Mengen erfolgt die Hydrolyse von ATP jeweils nur
unter Beteiligung einer Bindungsstelle. Unter diesen Bedingungen bindet das Enzym das
Substrat sehr fest. Die Dissoziationskonstante für die Bindung des ersten Nukleotids liegt
im Bereich von Kd1 ≈ 0,2-50 nM (Weber und Senior 1997, Futai et al. 2000). In diesem
Betriebsmodus der so genannten uni-site-Katalyse ist die Umsatzrate der ATP-Hydrolyse
sehr gering (Vmax ≈ 1 * 10-4 s-1 (Cross et al. 1982)). Mit zunehmender ATP-Konzentration
werden schließlich alle drei Nukleotidbindungsstellen mit Substrat belegt, jedoch mit abnehmender Bindungsaffinität (Kd2 ≈ 0,5-1 µM; Kd3 ≈ 10-25 µM). Gleichzeitig steigt die
Umsatzrate bei Belegung aller Bindungsplätze bis auf ca. Vmax ≈ 600 s-1 an. Das Enzym
zeigt also eine stark negative Kooperativität bei der Substratbindung und eine stark positive Kooperativität bezüglich der Enzymaktivität. Mit dem binding change Mechanismus
entwickelte P. D. Boyer ein Modell zur Erklärung dieser kooperativen Eigenschaften des
Enzyms (Boyer 1993). Dem binding change Mechanismus zufolge sind die drei an der
Katalyse beteiligten β-Untereinheiten zwar im Prinzip identisch, besitzen jedoch jederzeit
eine unterschiedliche Konformation und damit unterschiedliche Affinitäten für Nukleotide.
Die Benennung der drei Konformationszustände erfolgt nach der Substrataffinität der βUntereinheiten. Im O-Zustand (open) besitzt die entsprechende Untereinheit eine geringe
Substrataffinität und liegt unbesetzt vor. Die zweite Untereinheit bindet das Substrat mit
geringer Affinität (L-Zustand (loose binding)) und ist katalytisch inaktiv. Nur die Untereinheit mit hoher Substrataffinität (T-Zustand (tight binding)) ist zur Katalyse fähig. Wesentliches Merkmal des Mechanismus ist der energieabhängige Wechsel der Konformationszustände, so daß die katalytischen Untereinheiten periodisch die drei Konformationszustände durchlaufen. Zur Steuerung des Konformationswechsels sowie zur Kopplung der
ATP-Synthese bzw. Hydrolyse an einen Protonentransport schlug Boyer einen rotatorischen Mechanismus unter Beteiligung der kleineren Untereinheiten des F1-Komplexes vor.
Diese Vorstellung setzte sich jedoch erst nach der Aufklärung der mitochondrialen F1Struktur (Abrahams et al. 1994) durch, als erstmals die Rotation der Untereinheit γ relativ
zum α3β3-Hexagon anhand von biochemischen und biophysikalischen Methoden nachgewiesen werden konnte (Duncan et al. 1995, Sabbert et al. 1996). Schließlich gelang 1997
der direkte Nachweis der unidirektionalen γ-Rotation im α3β3γ-Komplex (vom FO-Teil aus
betrachtet, entgegen dem Uhrzeigersinn) durch einen mikrovideographischen Rotationstest, bei dem die γ-Rotation unter ATP-Hydrolyse mittels eines an der Untereinheit befestigten, fluoreszenzfarbstoffmarkierten Aktin-Filaments im Mikroskop sichtbar gemacht
werden konnte (Noji et al. 1997). In weiterentwickelten Rotationsexperimenten mit isolierten und anschließend immobilisierten FOF1-Komplexen konnte gezeigt werden, daß die
Untereinheit γ zusammen mit dem Proteolipid-Ring und Untereinheit ε eine Relativrotation zum α3β3δb2a-Komplex ausführt (Sambongi et al. 1999, Pänke et al. 2000, Tanabe et
al. 2001). Einen weiteren Nachweis der Aufteilung der FOF1-ATP-Synthase in Rotor
(c10γε) und Stator (α3β3δb2a) lieferten Nishio et al., die an immobilisiertem EFOF1-Komplexen, die in einer Membran eingebettet vorlagen, die Relativrotation der Untereinheit c
zu den Untereinheiten a und β nachweisen konnten (Nishio et al. 2002). Entsprechend der
Einleitung
13
dreizähligen Symmetrie des α3β3-Komplexes handelt es sich bei der γ-Rotation nicht um
eine gleichförmige, sondern um eine schrittweise Bewegung. Mit relativ großen Aktinfilamenten (Länge ca. 1 µm) als Rotationsindikatoren und in Gegenwart submikromolarer
ATP-Konzentrationen gelang zunächst der Nachweis einer Rotation in 120°-Schritten
(Yasuda et al. 1998). Durch die Verwendung von Gold-Kügelchen (Durchmesser ca.
40 nm) als Rotationsindikatoren konnte die Rotationsbewegung von γ mit Hilfe einer
Hochgeschwindigkeits-Kamera selbst in Gegenwart millimolarer ATP-Konzentrationen
zeitlich besser aufgelöst werden (Yasuda et al. 2001). Es konnte beobachtet werden, daß
sich ein 120°-Schritt aus einer 90°-Rotation, gefolgt von einer ca. 2 ms langen Pause, und
einer zweiten 30°-Rotation zusammensetzt1. Die Rotationsschritte erfolgen jeweils
innerhalb von etwa 0,25 ms. Die Dauer der Rotationspause vor dem 90°-Schritt ist stark
von der ATP-Konzentration abhängig und liegt im Bereich von einigen µs bis mehr als
20 ms. Es wird daher angenommen, daß diese Verweilzeit durch die Bindung von ATP an
eine freie Nukleotidbindungsstelle beendet wird und daß durch die Bindung der 90°Rotationsschritt erfolgen kann. Die zweite Rotationspause von ca. 2 ms Länge ist
unabhängig von der ATP-Konzentration. Während dieser Zeit findet wahrscheinlich die
Umsetzung des Substrats statt. Mit dem folgenden 30°-Rotationsschritt, der in Zusammenhang mit der Abspaltung des Hydrolyseprodukts steht, ist ein Katalysezyklus beendet.
Anfänglich sehr umstritten ist der rotatorische Mechanismus der F-ATP-Synthase heute im
Allgemeinen anerkannt (siehe jedoch Berden und Hartog 2000). Basierend auf den Prinzipien des binding change Mechanismus und der rotatorischen Funktionsweise der F-ATPSynthase wurden bislang zahlreiche Funktionsmechanismen, vorwiegend anhand von
Röntgenstrukturanalysen und Nukleotid-Bindungsstudien, für die ATP-Hydrolyse vorgeschlagen (Duncan et al. 1995, Bianchet et al. 1998, Nakamoto et al. 1999, Weber und
Senior 2000, Ren und Allison 2000, Yoshida et al. 2001, Menz et al. 2001a, Yasuda et al.
2001, Senior et al. 2002, Capaldi und Aggeler 2002). Die Mechanismen unterscheiden sich
im Wesentlichen durch die Belegung des Enzyms mit Nukleotiden sowie die Freisetzung
der Hydrolyseprodukte ADP und Pi. So schlagen Weber und Senior einen Mechanismus
vor, bei dem die Freisetzung der Hydrolyseprodukte während eines Zyklus (entsprechend
einer 120°-Rotation von γ) aus zwei verschiedenen β-Untereinheiten erfolgt. Demnach
wird Pi unmittelbar nach der Reaktion freigesetzt, während ADP erst im nächsten Zyklus
abgespalten wird (Abb. 1.4). Dagegen beinhalten die anderen Mechanismen die Freisetzung von ADP und Pi aus derselben β-Untereinheit innerhalb eines Katalysezyklus. Weiterhin wird die Frage der Nukleotid-Belegung diskutiert. Weber und Senior gehen vorwiegend anhand von Nukleotidbindungsstudien an EF1-β-Tryptophan-Mutanten (Weber et al.
1996) für das Erreichen physiologischer Umsatzraten der ATP-Hydrolyse/Synthese sowie
als Voraussetzung für die γ-Rotation von einer durchschnittlichen Belegung aller drei katalytischen Untereinheiten mit Nukleotiden aus (tri-site catalysis) (Weber und Senior
2001, Senior et al. 2002). Dagegen postuliert Boyer auf der Grundlage von kinetischen
Messungen einen bi-site Mechanismus (Boyer 2000 und 2002, Milgrom et al. 1998).
1
In einer späteren Arbeit wurden die Schrittweiten der Rotationsbewegung auf 80° und 40° geändert
(Shimabukuro et al. 2003).
14
Einleitung
A
B
M
M
MgADP
O
H
L
H
MgATP
MgATP
+ MgATP
- MgADP
L
M
MgADP
MgADP
H
M
L
H
H
MgADP
MgATP
MgATP
MgATP
L
M
M
L
MgATP
- Pi
+ MgATP
- MgADP Pi
M
MgADP
Pi
L
L
H
MgATP
MgATP
M
MgADP
H L
M H
MgATP MgADP
Pi
+
n Ho
n Hi+
H L
M H
MgATP MgADP
Pi
+
n Ho
n Hi+
Abb. 1.4 Modelle für den Funktionsmechanismus der ATP-Hydrolyse
Die drei katalytisch aktiven Zentren des F1-Komplexes sind durch Kreise dargestellt. H bezeichnet
das Zentrum mit hoher Nukleotidaffinität, M das mit mittlerer Affinität und L dasjenige mit geringer Affinität. O kennzeichnet eine leere Nukleotidbindungsstelle. (Abbildungen nach Weber und
Senior 2001, Weber und Senior 2003, Cross 1981).
A Der tri-site Mechanismus von Weber und Senior. Durchschnittlich sind alle drei Bindungsstellen während des Katalysezyklus mit Nukleotid belegt. Pi wird unmittelbar nach der Hydrolysereaktion abgespalten, MgADP erst im nächsten Zyklus. Damit verbleibt ein Nukleotid, als ATP gebunden und als ADP abgespalten, für mindestens zwei Zyklen (entsprechend einer 240°-Rotation
von γ) im Enzym und wird erst während des dritten Zyklus freigesetzt. B Der bi-site Mechanismus
nach Boyer. Das Enzym ist während des Katalysezyklus nur mit durchschnittlich zwei Nukleotiden belegt. Die Hydrolyseprodukte werden während eines Zyklus aus einer Bindungsstelle (in MKonformation) freigesetzt. Ein Nukleotid verbleibt damit maximal für zwei Zyklen im Enzym.
Auch Rotationsexperimente deuten auf einen bi-site Mechanismus hin (Yasuda et al.
2001). Untersuchungen, in denen die Rotation der F1-Untereinheit γ und gleichzeitig die
Bindung und Abspaltung von fluoreszierenden ATP-Analoga an den bzw. vom Enzymkomplex beobachtet werden konnte, unterstützen jedoch einen tri-site Mechanismus. In
diesen Experimenten konnte gezeigt werden, daß das fluoreszierende Nukleotid wenigstens während einer 240°-Rotation von γ im Enzym verbleibt und erst während des dritten
120°-Rotationsschrittes abgespalten wird (Nishizaka et al. 2004).
Eine entgegengesetzte Rotationsrichtung des FOF1-Rotorkomplexes für den ATP-Hydrolyse- und ATP-Synthesebetrieb wurde seit langem angenommen, jedoch sind Rotationsexperimente unter ATP-Synthese aufgrund der Notwendigkeit, die Untersuchungen an
membranintegrierten FOF1-Komplexen mit energetisierten Membranen durchzuführen,
erheblich schwieriger als Rotationsexperimente unter ATP-Hydrolyse. Der erste Nachweis
einer Relativbewegung von γ zum α3β3-Hexagon unter ATP-Synthese gelang 1997 (Zhou
et al. 1997). Anhand dieser Experimente konnten jedoch keine Aussagen über die Unidirektionalität und Richtung der γ-Rotation gewonnen werden. Dieser Nachweis gelang
2004 Diez et al., die durch Einzelmolekül-Fluoreszenz Resonanz Energie Transfer
Einleitung
15
(FRET)-Messungen mit in Liposomen eingebetteten EFOF1-Komplexen die entgegengesetzte Rotation bei ATP-Hydrolyse und -Synthese zeigen konnten (Diez et al. 2004). Einen
weiteren Nachweis für die Rotationsumkehr lieferten Itoh et al., die mit immobilisierten
F1-Komplexen, an deren γ-Untereinheit ein magnetisches Kügelchen befestigt worden war,
durch Anlegen eines äußeren, rotierenden Magnetfeldes ATP erzeugen und hydrolysieren
konnten (Itoh et al. 2004). Diese Untersuchungen zeigten, daß bei einer γ-Rotation im
Uhrzeigersinn (vom FO-Teil aus betrachtet) in Gegenwart von ADP und Pi ATP erzeugt
werden kann, während bei der umgekehrten Rotation die Hydrolyse von ATP erfolgt.
1.3.2 Funktionsweise des FO-Motor/Generators
Ähnlich wie für den F1-Komplex wurde schon seit langem auch für die zweite Motor/Generator-Einheit der FOF1-ATP-Synthase, den FO-Komplex, ein rotatorischer Mechanismus vermutet (Cox et al. 1986). Seitdem sind für die Funktionsweise des FO-Komplexes aus E. coli mehrere Modelle vorgeschlagen worden (Junge et al. 1997, Junge 1999,
Vik und Antonio 1994, Vik et al. 2000, Elston et al. 1998, Cross 2000, Howitt et al. 1996),
in denen die Protonierung und Deprotonierung der Aminosäure cD61 mit der schrittweisen
Rotation des Proteolipid-Ringes relativ zu den Untereinheiten a und b gekoppelt wird
(Abb. 1.5). Zugang zu dieser für die Protonentranslokation essentiellen Aminosäure erhalten die Protonen durch zwei innerhalb der Untereinheit a versetzt angeordneten Zugangskanälen, von denen einer eine Verbindung von cD61 zum Periplasma und der zweite
eine Verbindung von cD61 zum Cytoplasma herstellt. Weiterhin gehen die Modelle davon
aus, daß cD61 ausschließlich protoniert in Kontakt mit der Lipid-Membran treten kann
und ein Austausch von Protonen nur innerhalb der a-c-Grenzfläche erfolgen kann. In dem
Modell von W. Junge wird die ungerichtete thermisch induzierte Rotationsbewegung des
Proteolipid-Ringes durch die Anordnung der Zugangskanäle sowie die Richtung des
transmembranen Protonen-Konzentrationsgradienten in eine gerichtete Rotationsbewegung verwandelt. Vik et al. gehen von einer Beteiligung der Aminosäure aR210 aus, die,
in protonierter Form, deprotoniertes cD61 in Nachbarschaft zum neu protonierten cD61
elektrostatisch anzieht und auf diese Weise eine unidirektionale Rotation sicherstellt. In
beiden Modellen werden die Protonen während des transmembranen Transports durch die
c-Untereinheiten über einen Winkel von fast 360° transportiert. Die Vorstellung einer
Kopplung von c-Ring-Rotation und Protonentranslokation durch FO wurde von Suzuki et
al. (2002) experimentell unterstützt. In dieser Arbeit wurde anhand einer bC2/cC2Cystein-Doppelmutante der ATP-Synthase des thermophilen Bacillus PS3 (TFOF1) gezeigt, daß die Verknüpfung einer Rotor-Untereinheit c mit einer Stator-Untereinheit b sowohl den aktiven, ATP-abhängigen Protonentransport als auch die passive Protonenleitung
durch FO blockiert.
16
Einleitung
Abb. 1.5 Modell für den Funktionsmechanismus des FO-Motor/Generators
An der Protonentranslokation sind die essentiellen Aminosäuren cD61 und aR210 beteiligt. Zugang zu cD61 erhalten die Protonen über zwei mutmaßliche Ionenkanäle. Bei dem
transmembranen Übergang wird ein Proton über nahezu eine vollständige Umdrehung des
c-Ringes transportiert (Abbildung nach Weber und Senior 2003).
Ein ähnliches Modell zur Protonentranslokation wurde von P. Dimroth für die natriumtransportierende FOF1-ATP-Synthase aus Propionigenium modestum vorgeschlagen
(Dimroth et al. 1999). Im Unterschied zum EFO-Komplex, bei dem der Zugang von H+Ionen zur protonentransportierenden Aminosäure cD61 ausschließlich über zwei Ionenkanäle erfolgt, ist die Na+-bindende Region der c-Untereinheiten von P. modestum (cQ32,
cE65, cS66) (Kaim et al. 1997) jedoch von der cytoplasmatischen Seite aus frei zugänglich
(Kaim et al. 1998). Aufgrund dessen enthält dieses Modell nur einen Zugangskanal für
Natriumionen vom Periplasma zur Na+-Bindungsstelle. Die positiv geladene Aminosäure
aR227 blockiert eine Drehrichtung für Na+-beladene c-Untereinheiten und stellt so, ähnlich wie aR210 in EFO, eine gerichtete Rotation sicher. Im Unterschied zu den EFO-Modellen werden die transportierten Ionen im Modell von P. Dimroth nicht über etwa eine
volle Umdrehung des Proteolipid-Ringes transportiert, sondern können sofort nach dem
Austritt aus der a-c-Grenzfläche in das Cytoplasma abgespalten werden. Darüber hinaus
zeigten Untersuchungen an FOF1-Komplexen aus P. modestum die Bedeutung des elektrischen Potentials ∆Ψ für die Erzeugung von Drehmoment im FO-Komplex (Kaim und
Dimroth 1999).
Erste experimentelle Hinweise auf die Rotation des Proteolipid-Ringes relativ zu den Stator-Untereinheiten a und b konnten anhand von Rotationsexperimenten mit EFOF1-Komplexen gewonnen werden (Sambongi et al. 1999, Pänke et al. 2000). Diese Untersuchungen erfolgten jedoch mit isolierten EFOF1-Komplexen in Gegenwart von Detergenzien.
Einleitung
17
Daher wurde der Einwand erhoben, daß es unter diesen Bedingungen zu einem Verlust der
Wechselwirkungen zwischen dem Proteolipid-Ring und der Untereinheit a kommen
könnte und der c-Ring bei der Rotation des γε-Komplexes lediglich artifiziell mitgeführt
wird (Tsunoda et al. 2000). Rotationsexperimente mit membran-eingebetteten EFOF1Komplexen sowie Aktivitätsmessungen mit in Vesikeln rekonstituierten EFOF1-Komplexen, deren ε-Untereinheiten durch Disulfidbrücken sowohl mit γ als auch mit dem Proteolipid-Ring verknüpft wurden, bestätigten jedoch die Vorstellung von γεc10 als relativ zu
α3β3δb2a rotierendem Komplex (Nishio et al. 2002, Tsunoda et al. 2001). Auch durch Experimente, in denen die Untereinheit a von schwach mit [14C]DCCD markierten EFOF1Komplexen mit einzelnen c-Untereinheiten verknüpft werden konnte, ließ sich eine Relativbewegung der Untereinheiten a und c nachweisen (Hutcheon et al. 2001).
Die NMR-spekroskopische Aufklärung der Strukturen von gelösten E. coli-c-Untereinheiten bei unterschiedlichen pH-Werten führte zu modifizierten Modellen für den Funktionsmechanismus von EFO. Girvin et al. gelang die Strukturaufklärung von in ChloroformMethanol-Wasser gelöstem monomerem c bei pH 5 (Girvin et al. 1998). Unter diesen Bedingungen liegt cD61 in protonierter Form vor. Rastogi und Girvin ermittelten die Struktur
der Untereinheit bei pH 8 und damit in einer Form, in der cD61 deprotoniert ist (Rastogi
und Girvin 1999). Der wesentliche Unterschied zwischen beiden Strukturen besteht in
einer 140°-Rotation der C-terminalen Helix in der pH-8-Struktur im Uhrzeigersinn relativ
zur N-terminalen Helix der pH-5-Struktur (Fillingame et al. 2002). Obwohl die Rotation
der C-terminalen Helix nicht ursächlich auf die Protonierung bzw. Deprotonierung von
cD61 zurückgeführt werden konnte, wurden die Strukturen als ein Hinweis auf mögliche
strukturelle Konformationswechsel innerhalb der c-Untereinheiten angesehen. Auch die
Positionen von Disulfidbrücken in Mutanten, deren vierte transmembrane Helix von Untereinheit a mit der C-terminalen Helix von c-Untereinheiten verknüpft wurde, ließen sich
nur mit Hilfe einer Rotation der C-terminalen Helix der pH-5-Struktur erklären (Jiang und
Fillingame 1998). Ausgehend von einer Rotation der C-terminalen Helix der c-Untereinheiten (swiveling) formulierten Fillingame et al. sowie Rastogi und Girvin zwei Modelle
zur Funktionsweise von EFO (Fillingame et al. 2002, Rastogi und Girvin 1999). Ein wesentlicher Unterschied zwischen den beiden Modellen besteht in der Schrittweite der Rotation der C-terminalen Helix von c. Während Fillingame et al. eine Rotation um 140°
vorschlagen, um cD61 in die Nähe von aR210 zu bringen, beschreiben Rastogi und Girvin
eine Rotation um 220°. Die Aufklärung des Funktionsmechanismus des FO-Komplexes
wird wahrscheinlich erst mit der Aufklärung der Struktur von Untereinheit a und einer
genaueren Kenntnis der a-c-Grenzfläche möglich sein.
Die Kombination eines 3- bzw. 6-Schritt-Motors (F1) und eines 10-14-Schritt-Motors (FO)
erfordert die Kopplung durch eine elastische Verbindung (Junge et al. 2001). Es wird vermutet, daß diese Funktion durch die Rotor-Untereinheit γ (Cherepanov et al. 1999, Pänke
und Rumberg 1999) und das b2-Dimer des Stator-Komplexes (Dunn et al. 2000) erfüllt
wird. Darüber hinaus wird davon ausgegangen, daß eine elastische Kopplung zwischen
beiden Motoren geradezu eine Voraussetzung für das Erreichen physiologischer Umsatzraten von ATP-Synthese und -Hydrolyse darstellt, da ein elastisches Verbindungselement
zugleich eine Absenkung von Aktivierungshürden des Katalyseprozesses bewirkt
(Cherepanov und Junge 2001, Pänke et al. 2001).
18
Einleitung
1.3.3 Der C-terminale Bereich von γ als Lager des γεc10-Komplexes
Die Untereinheit γ spielt für die Zusammenlagerung eines funktionsfähigen F1-Komplexes
eine wesentliche Rolle. Zwar sind Proteinkomplexe aus α- und β-Untereinheiten von E.
coli in geringem Maß zur ATP-Hydrolyse fähig (Al-Shawi et al. 1990), jedoch werden
physiologische Umsatzraten erst mit α3β3γ-Komplexen erreicht (Dunn und Futai 1980). Es
wird angenommen, daß die Untereinheit, neben α/β-Wechselwirkungen, durch α/γ- und
β/γ-Interaktionen an der Steuerung der kooperativen Konformationswechsel der katalytisch aktiven β-Untereinheiten sowie an der Kopplung von ATP-Synthese bzw. -Hydrolyse
und Protonentranslokation beteiligt ist (Senior et al. 2002, Futai et al. 2000). Hier kommt
insbesondere den stark konservierten N- und C-terminalen Regionen der im Übrigen eher
schwach konservierten γ-Untereinheit eine besondere Bedeutung zu (Miki et al. 1988).
Untersuchungen an γ-Deletionsmutanten zeigten, daß Enzymkomplexe mit Deletionen in
diesen Bereichen (γ∆Q261-V286 und γ∆K21-A27) in vivo nicht mehr assembliert werden
(Miki et al. 1986, Kanazawa et al. 1985). Außerdem führt der Austausch konservierter
Aminosäuren im Bereich von γQ269 bis γE278 im Allgemeinen zu einer erheblichen Abnahme der ATP-Hydrolyseaktivität der entsprechenden EFOF1-Komplexe (Iwamoto et al.
1990). Dies deutet auf eine Beteiligung der C-terminalen Region von γ an der Steuerung
kooperativer Konformationswechsel von β-Untereinheiten hin. Eine besondere Bedeutung
haben in diesem Zusammenhang offenbar die hoch konservierten Aminosäuren γR268 und
γQ269. Greene und Frasch (2003) zeigten, daß der Austausch dieser Aminosäuren gegen
Aminosäuren, die keine ionischen Wechselwirkungen oder Wasserstoffbrücken mit der βRegion Y297-D305 ausbilden können, einen erheblichen Einfluß auf die ATP-Hydrolyseund -syntheseaktivität von EFOF1 besitzt. Sie nehmen an, daß bei der ATP-Synthese durch
die Wechselwirkungen zwischen γ und dem α3β3-Hexagon die Rotation des C-terminalen
γ-Bereichs während der über den c-Ring angetriebenen γ-Rotation jeweils so lange blockiert wird, bis in der leeren β-Nukleotidbindungsstelle des Enzyms Substrat gebunden
wird. Dagegen beeinflußen Mutationen in der N-terminalen γ-Region offenbar eher die
Kopplung von γ-Rotation und Protonentranslokation. Hier ist insbesondere die Mutante
γM23K zu nennen, die eine nahezu unveränderte ATP-Hydrolyseaktivität aufweist, deren
Fähigkeit zum ATP-Hydrolyse-getriebenen Protonenpumpen und die ATP-Syntheserate
jedoch deutlich reduziert ist (Shin et al. 1992, Al-Shawi et al. 1997). Dieser Effekt kann
durch zahlreiche Sekundärmutationen im Bereich von γR242 und γQ269-V280 aufgehoben werden (Nakamoto et al. 1993). Weitere Untersuchungen mit Sekundär- oder Suppressormutanten führten zur Identifikation von drei Bereichen der N- und der C-terminalen γRegion (γK18-Q35, γA236-M246 und γQ269-V280), die offenbar durch funktionelle
Wechselwirkungen an der Vermittlung der energetischen Kopplung zwischen FO- und F1Teil beteiligt sind (Nakamoto und Al-Shawi 1995). Der Befund, daß der EF1-Motor der γMutante M23K unter ATP-Hydrolyse mit ca. 50 pN nm ein ähnliches Drehmoment erzeugen kann wie entsprechende F1-Komplexe ohne diese Mutation, wurde als Hinweis darauf
angesehen, daß diese Mutation nicht die Katalyse, sondern die Kopplung von γ-Rotation
und Protonentranslokation beeinflußt (Omote et al. 1999).
Zwischen γ und den katalytisch aktiven β-Untereinheiten bestehen zahlreiche Wechselwirkungen. So interagiert die Region um γQ269 mit der β-Schleife D301-D305 (Omote et
Einleitung
19
al. 1998, Greene und Frasch 2003) und der Bereich um γC87 mit der stark konservierten
β-Schleife D380-D386 (Duncan et al. 1995, Feng et al. 1996). Darüber hinaus kann der
Effekt einer die Enzymaktivität nahezu vernichtenden Mutation, bei der die letzten 16
Aminosäuren des γ-C-Terminus verändert wurden und dieser zugleich um 7 Aminosäuren
verlängert wurde, durch die β-Mutationen R52C und G150D zumindest teilweise aufgehoben werden (Jeanteur-De Beukelaer et al. 1995).
Es wird angenommen, daß unter ATP-Hydrolyse eine Schwenkbewegung der C-terminalen Domäne von β um die „Gelenk“-Region βH179-G181 (bei Bacillus PS3; entspricht bei
E. coli der Region H170-G172), die möglicherweise unter Beteiligung der β-Schleife
D380-D386 auf γ übertragen wird (Hara et al. 2000), die γ-Rotation antreibt (Masaike et
al. 2000, Wang und Oster 1998). Wie auch immer der Übertragungsmechanismus genau
funktioniert; er erfolgt bei der FOF1-ATP-Synthase sehr effizient. Die Daten für das durch
den F1-Komplex unter ATP-Hydrolyse erzeugte Drehmoment liegen, abhängig von der
Berechnungsmethode, im Bereich von 40-50 pN nm (Noji et al. 1997, Sambongi et al.
1999, Pänke et al. 2001). Dies entspricht unter den gegebenen Nukleotid-Konzentrationsverhältnissen einer nahezu vollständigen Umwandlung von chemischer Energie in mechanische Energie (Yasuda et al. 1998, Wang und Oster 1998) und zeigt, daß es zwischen der
ATP-Hydrolyse im F1-Teil und der auf den FO-Teil übertragenen Drehbewegung keinen
Schlupf gibt (Pänke et al. 2001, Junge et al. 2001). Aufgrund der 1994 aufgeklärten
Struktur des bovinen, mitochondrialen F1-Komplexes wurde der C-terminale Bereich von
γ sowie der darum angeordnete Ring aus jeweils drei prolinreichen Schleifen der α- und
der β-Untereinheiten als ein mögliches Lager des F1-Motors bezeichnet (Abrahams et al.
1994). Durch die Übertragung der MF1-Struktur auf die Aminosäuresequenz von EF1 ergeben sich als Bestandteile eines möglichen EF1-γ-Lagers die α-Schleife R279-F286 und
die β-Schleife R260-Y267 sowie die C-terminale Region von γ im Bereich von A267V286 (Abb. 1.6). Sowohl die α- als auch die β-Schleife besteht aus Aminosäuremotiven,
deren Sequenz stark konserviert ist (Kataoka und Biswas 1991, Nurani und Franzén 1996,
Walker et al. 1984). Wie bereits erwähnt besitzt auch die γ-Untereinheit im Bereich der Cterminalen Region eine große Anzahl stark konservierter Aminosäuren. Weitere Bedeutung erlangt dieser Bereich des F1-Komplexes durch die große Zahl an ungeladenen und
hydrophoben Aminosäuren (Abb. 1.6). Abrahams et al. vermuteten als Funktion der vorwiegend hydrophoben Lager-Grenzflächen die „Schmierung“ des molekularen Lagers
(Abrahams et al. 1994).
20
Einleitung
Abb. 1.6 Der C-terminale Bereich von Untereinheit γ als Lager des EFOF1-Rotors
Die linke Abbildung zeigt eine schematische Darstellung des EF1-Komplexes. Zur besseren Übersicht enthält die Abbildung nur jeweils eine α- (links) und eine β-Untereinheit
(rechts). In der Mitte ist γ dargestellt. Der von Abrahams et al. aufgrund der MF1-Struktur
(Abrahams et al. 1994) als Lager bezeichnete Bereich ist durch Kugeldarstellung hevorgehoben (α/β-Lagerbuchse: schwarz; γ-Lagerzapfen: grau). Im bakteriellen Enzym aus E.
coli wird dieser Bereich durch die α-Schleife R279-P-P-G-R-E-A-F286, die β-Schleife
R260-M-P-S-A-V-G-Y267 sowie den C-terminalen Bereich von γ (A267-R-Q-A-S-I-TQ-E-L-T-E-I-V-S-G-A-A-A-V286) gebildet (stark konservierte Aminosäurereste sind jeweils durch Fettdruck markiert).
Die rechte Abbildung zeigt eine Vergrößerung des Lagerbereichs. Die Aminosäurereste
sind entsprechend ihrer Eigenschaften farblich markiert (basisch: blau; sauer: rot; ungeladen polar: grün; unpolar: gelb).
Aufgrund seiner strukturellen Besonderheiten wurde der C-terminale Bereich von γ bereits
anhand zahlreicher Mutationsstudien näher untersucht. Die Ergebnisse dieser Arbeiten, die
die Untersuchung von Punktmutanten, bei denen stark konservierte Aminosäurereste des
C-terminalen Bereichs von γ verändert wurden, sowie Studien an Deletionsmutanten umfassen, ließen sich nicht immer mit der Funktion des C-terminalen Bereichs von γ als Lagerzapfen vereinbaren. Zwar zeigten EFOF1-Komplexe, bei denen konservierte Aminosäurereste im Bereich von γ269-278 ausgetauscht wurden, im Allgemeinen eine deutlich
geringere ATP-Hydrolyseaktivität, jedoch führte die Entfernung von 4 bzw. 10 C-terminalen Aminosäureresten zu nach wie vor aktiven Proteinkomplexen bezüglich der ATPHydrolyse und -Synthese, wenn auch mit reduzierter Aktivität. Erst die Verkürzung des CTerminus um 18 Aminosäurereste führte zu einem inaktiven Enzym. Diese Befunde deuteten auf eine wesentliche Bedeutung insbesondere des Bereichs von γE269-γL276 für die
Einleitung
21
Funktion der EFOF1-ATP-Synthase hin, während die letzten 10 C-terminalen Reste von γ
offenbar für die Funktion des Enzyms zwar wichtig, aber nicht essentiell sind (Iwamoto et
al. 1990). Sokolov et al. fanden für die am C-Terminus um bis zu 14 Aminosäuren verkürzte γ-Untereinheit von CF1 sogar eine deutliche Zunahme der calciumabhängigen ATPHydrolyseaktivität. Erst bei einer Verkürzung um 18 bis 20 Aminosäuren fiel die Aktivität
des Enzyms deutlich unter die Aktivität des unverkürzten Wildtyp-Enzyms ab. Solokov et
al. schlossen daraus, daß das C-terminale Ende der Untereinheit γ für die katalytische
Funktion von CF1 nicht notwendig ist und stellten dessen vermutete Rolle als Lagerzapfen
des Rotors in Frage (Sokolov et al. 1999).
Die vorliegende Arbeit befasst sich mit der Rolle des C-terminalen Bereichs der Untereinheit γ für die Funktion der EFOF1-ATP-Synthase. Dabei werden im Rahmen dieser Arbeit
für die Überprüfung der Funktion der C-terminalen Region von γ als möglicher Lagerzapfen des γεc10-Rotors im Wesentlichen zwei Ansätze verfolgt. Zum einen werden die Auswirkungen von Verkürzungen des C-terminalen Bereichs insbesondere auf das von den
entsprechenden EF1-Komplexen erzeugte Drehmoment untersucht. Zum anderen werden
die Folgen einer Blockierung des möglichen Lagers durch die Verknüpfung der RotorUntereinheit γ mit der Stator-Untereinheit α untersucht. Die Bestimmung eines mechanischen Parameters wie des Drehmoments ist für ATP-Synthasen erst seit verhältnismäßig
kurzer Zeit möglich. 1997 entwickelten Noji et al. einen mikroskopischen Rotationstest,
der sich für diesen Zweck nutzen läßt. Dieses Verfahren wird im Rahmen dieser Arbeit für
die Drehmomentsbestimmung von EF1-Deletionsmutanten verwendet werden. Für die
Untersuchung der Folgen einer Blockierung des vermuteten Lagers wird darüber hinaus
ein biochemischer Rotationstest, der ursprünglich von Duncan et al. (1995) etabliert
wurde, eingesetzt werden.
22
Einleitung
23
Material und Methoden
2 Material und Methoden
2.1 Reagenzien, Geräte und Lösungen
Reagenzien
Salze, Puffersubstanzen und Lösungsmittel
ADP
Ampicillin, Coomassie Brilliant Blue R-250
AMP-PNP, Tetracyclin
ATP
Molekularbiologie
Ethidiumbromid
pBluescript II SK (+) Vektor
peqGold Universal Agarose
Select Peptone 140, Hefeextrakt, Agar,
Subcloning Efficiency DH5α Competent Cells
Längen- und Größenstandards
1 kb DNA-Leiter, 6x Beladungspuffer
Lambda DNA/PstI Marker, 24
Sigmamarker Low Range (M.W. 6500 – 66000)
Restriktionsendonukleasen
DNA-modifizierende Enzyme
Calf intestine Alkaline Phosphatase (CIAP)
T4 DNA Ligase
Plasmidisolierung und DNA-Isolierung aus
Agarosegelen
High Pure Plasmid Isolation Kit
QIAprep Spin Miniprep Kit, QIAquick Gel
Extraction Kit
Polymerasekettenreaktion
PCR-Primer
ThermoPol Buffer, dATP, dCTP, dGTP, dTTP
Roth (Karlsruhe), Sigma
(Taufkirchen), Biomol
(Hamburg), Riedel de Haën
(Seelze)
Calbiochem
(San Diego, CA, USA)
Roth (Karlsruhe)
Sigma (Taufkirchen)
Roche Diagnostics (Mannheim)
Sigma (Taufkirchen)
Stratagene
(Amsterdam, Niederlande)
Peqlab (Erlangen)
Gibco BRL (Paisley,
Schottland)
Peqlab (Erlangen)
MBI Fermentas (St. Leon-Rot)
Sigma (Taufkirchen)
MBI Fermentas (St. Leon-Rot),
New England Biolabs
(Frankfurt/Main)
MBI Fermentas (St. Leon-Rot)
New England Biolabs
(Frankfurt/Main)
Qiagen (Hilden)
MWG-Biotech (Ebersberg)
New England Biolabs
(Frankfurt/Main)
24
Sequenzierung
ABI Prism BigDye Terminator Cycle Sequencing
Ready Reaction Kit und ABI Prism BigDye Terminator
Cycle Sequencing Ready Reaction Kit v2.0
Primer
Proteinexpression und –isolierung
Benzonase
EDTA-free protease inhibitor cocktail tablets
Glycerin, D(+)-Saccharose, EDTA
L-Isoleucin, L-Valin
L-Asparagin, Thymin, Thiamin, EGTA,
4-Aminobenzamidin Dihydrochlorid,
6-Aminohexansäure, EGTA, DTT
Biochemie
β-Mercaptoethanol, NaN3
Bovine serum albumin (BSA), Glucose Oxidase,
Glucose, DTNB, NEM, Avidin, Desthiobiotin
Biotin-PEAC5-Maleimid
Gelfiltrationssäulen NAP-5, NAP-10, PD-10
Imidazol
Katalase, Octyl-β-D-Glucopyranosid
Ni-NTA-horseradish peroxidase conjugate,
Ni-NTA Superflow
Spectra/Por Dialysemembran, MWCO: 3500
Applied Biosystems
(Foster City, CA, USA)
MWG-Biotech (Ebersberg)
Merck (Darmstadt)
Roth (Karlsruhe)
Biomol (Hamburg)
Sigma (Taufkirchen)
Merck (Darmstadt)
Sigma (Taufkirchen)
Dojindo Laboratories
(Kumamoto, JP)
Amersham Biosciences
(Uppsala, Schweden)
Biomol (Hamburg)
Fluka (Buchs, CH)
Tetramethylrhodamin-5-isothiocyanat
Qiagen (Hilden)
Spectrum Laboratories (Rancho
Dominguez, CA, USA)
IBA (Göttingen)
ICN Biomedicals (Aurora,
Ohio, USA)
MoBiTec (Göttingen)
Arrhenius Analyse
Phosphoenolpyruvat, β-NADH, Pyruvat Kinase,
L-Lactat Dehydrogenase
Sigma (Taufkirchen)
Streptactin-Sepharose
Streptavidin
Geräte
Agarose-Gelelektrophoreseapparatur Horizon 11014
Autoklav Hiclave HV-50
Bildprozessor ARGUS
Blockthermostat 5121
Gibco BRL
(Gaithersburg, MD, USA)
Wolf (Geislingen)
Hamamatsu Photonics
(Hamamatsu, JP)
Stuart Scientific
(Redhill, Surrey, GB)
25
Blockthermostat Digi-Block
Digitales Photodokumentationssystem
mit Kamera Herolab EASY 429K
und Transilluminator UVP M-20E 302 nm
Fluoreszenzmikroskop IX 70
mit Quecksilberlampe U-RFL-T 200
und Objekttischsteuerung MCL-3
FPLC-Anlage ÄKTA explorer
Gelelektrophoresesystem PhastSystem
Heißluftfön PHG 560 E
Heißluftsterilisator
Homogenisator RZR1
Kamera Hamamatsu C 2400-08
mit Bildverstärker VS4-1845
und Kamera-Kontrolleinheit C 2400
Kühl-Tischzentrifuge 5402
Kühl-Tischzentrifuge Biofuge fresco
Kühlzentrifuge Avanti J-30 I
Magnetrührer MR 3001 K und MR 2000
Mikropipetten
Mikrowelle microwelle plus
Monitor PVM-145E
PCR-Gerät Mastercycler gradient
pH-Meßgerät Knick 766 Calimatic
Reagenzglas-Rotationsinkubator Modell TC-7
Reinstwassersystem Milli-Q académic
Ribi Cell Fractionator Model RF-1
Schlauchpumpe Easy-Load Masterflex XX80 ELO 05
Schüttelinkubator Gio Gyrotory Shaker
Spannungsquelle für Agarosegelelektrophorese
Spektrophotometer Hewlett-Packard 8453 E
Spektrophotometer Hitachi U-3000
mit Kühlthermostat Lauda RC6 CP
Ultrazentrifuge Optima L-70K
UV-Leuchttisch Fluo-Link TFL-20M 312nm
VHS-PAL Videorecorder Panasonic NV-HS 950
Waage Mettler Toledo AG 285
Waage Sartorius BL 1500 S
Laboratory Devices
(Holliston, MA, USA)
Herolab (Wiesloch)
UVP (San Gabriel, CA, USA)
Olympus Optical (Tokio, JP)
Olympus Optical (Tokio, JP)
Lang (Hüttenberg)
Pharmacia Biotech (Freiburg)
Pharmacia Biosystems
(Freiburg)
Bosch (Stuttgart)
Heraeus (Hanau)
Heidolph (Schwabach)
Hamamatsu Photonics
(Hamamatsu, JP)
Videoscope International
(Sterling, VA, USA)
Hamamatsu Photonics
(Hamamatsu, JP)
Eppendorf (Hamburg)
Heraeus Instruments (Osterode)
Beckman Coulter (Krefeld)
Heidolph (Schwabach)
Gilson (Middleton, WI, USA)
Siemens (München)
Sony (Köln)
Eppendorf (Hamburg)
Knick (Dülmen)
New Brunswick Scientific
(Edison, NJ, USA)
Millipore (Molsheim, FR)
Sorvall (Norwalk, Conn., USA)
Millipore (Bedford, MA, USA)
New Brunswick Scientific
(Edison, NJ, USA)
Pharmacia Biosystems
(Freiburg)
Hewlett-Packard (Böblingen)
Hitachi (Krefeld)
Lauda (Lauda-Königshofen)
Beckman Coulter (Krefeld)
Biometra (Göttingen)
Matsushita Electric (Osaka, JP)
Mettler Toledo (Greifensee,
Schweiz)
Sartorius (Göttingen)
26
Wasserbad Haake W13
mit Thermostat Haake D2
Wasserbad-Schüttelinkubator Type 1083
Wippschüttler WS 5
Thermo Haake (Karlsruhe)
Thermo Haake (Karlsruhe)
Gesellschaft für Labortechnik
(Burgwedel)
Edmund Bühler (Hechingen)
Lösungen
10x TBE
500x Ampicillinlsg.
625x Tetracyclinlsg.
BMKM-Puffer
1 M TRIS/Borsäure (pH 8,3); 0,9 M Borsäure; 10 mM EDTA
50 mg/ml Na-Ampicillin in 50% (v/v) EtOH
6,25 mg/ml Tetracyclin in 50% (v/v) EtOH
20 mM MOPS/KOH (pH 7,0); 10 mg/ml BSA; 5 mM MgCl2;
50 mM KCl
Dissoziationspuffer 50 mM MES/NaOH (pH 6,1); 1 M LiCl; 5 mM ATP; 0,5 mM
EDTA
Elutionspuffer
10 mM TRIS/HCl (pH 8,5)
Ethidiumbromidlsg. 10 mg/ml in H2O
G-Puffer
2 mM MOPS/KOH (pH 7,0); 0,2 mM CaCl2; 2 mM ATP
G2-Puffer
2 mM TRIS/HCl (pH 8,0); 2 mM CaCl2; 0,5 mM ATP; 0,5 mM
DTT
Gel-Entfärbelösung 25% (v/v) Methanol; 5% (v/v) HAc
Gel-Entwicklerlsg. A 400 mM NaAc/HAc (pH 6,0); 30% (v/v) Methanol; 6,3 mM
Na2S2O3
Gel-Färbelösung
0,05% Coomassie Brilliant Blue R-250; 50% (v/v) Methanol;
5% (v/v) HAc
HEPES-Puffer
100 mM HEPES/NaOH (pH 8,5); 50 mM KCl; 5 mM MgCl2
KG-Puffer
50 mM TRIS/HCl (pH 7,5); 50 mM KCl; 5 mM MgCl2;
10% (v/v) Glycerin
Lagerungspuffer
5 mM TRIS/HCl (pH 8,0); 10 mM MgCl2; 70 mM KCl;
20% (v/v) Glycerin
LB-Medium
5 g Select Peptone 140; 2,5 g Hefeextrakt; 5 g NaCl; ad 0,5 l ddH2O
(pH ca. 7,5)
LB/Agar-Medium
500 ml LB-Medium plus 7,5 g Agar
Lösung A
0,25% (w/v) CuSO4 • 5 H2O; 4,6% (w/v) NaAc • 3 H2O in
2 M HAc (pH 4,0)
Lösung B
5% (w/v) (NH4)6Mo7O24 • 4 H2O
Lösung C
2% (w/v) C7H9NO • ½ H2SO4; 5% (w/v) Na2SO3
Minimalmedium
34 mM KH2PO4; 64 mM K2HPO4; 0,3 mM MgSO4; 20 mM
(NH4)2SO4; 1 µM FeSO4; 1 µM ZnCl2; 10 µM CaCl2; 50 µg/ml
L-Isoleucin; 50 µg/ml L-Asparagin; 50 µg/ml L-Valin; 50 µg/ml
Thymin; 2 µg/ml Thiamin; 0,5% (v/v) Glycerin
MKM-Puffer
20 mM MOPS/KOH (pH 7,0); 5 mM MgCl2; 50 mM KCl
Natriumacetatpuffer 3 M NaAc/HAc (pH 5,2)
Nickel A
50 mM TRIS/HCl (pH 7,5); 2 mM MgCl2; 10% (v/v) Glycerin;
20 mM Imidazol
Nickel B
50 mM TRIS/HCl (pH 7,5); 2 mM MgCl2; 10% (v/v) Glycerin;
150 mM Imidazol
Ni-Elutionspuffer
27
50 mM TRIS/HCl (pH 7,5); 50 mM KCl; 5 mM MgCl2; 10% (v/v)
Glycerin; 150 mM Imidazol
Ni-Waschpuffer
50 mM TRIS/HCl (pH 7,5); 50 mM KCl; 5 mM MgCl2; 10% (v/v)
Glycerin; 20 mM Imidazol
Probenpuffer PP
100 mM TRIS/HCl (pH 8,0); 2% (w/v) SDS; 12,5% (v/v) Glycerin;
0,01% Bromphenolblau; 1 mM EDTA
Probenpuffer PP+
100 mM TRIS/HCl (pH 8,0); 2% (w/v) SDS; 2% (v/v) βMercaptoethanol; 12,5% (v/v) Glycerin; 0,01% Bromphenolblau;
1 mM EDTA
Puffer 1 +Saccharose 250 mM Saccharose; 100 mM TES/NaOH (pH 7,0); 40 mM
6-AHS; 20 mM MgAc2; 6 mM 4-AB; 0,25 mM EGTA
Puffer 1
100 mM TES/NaOH (pH 7,0); 40 mM 6-AHS; 20 mM MgAc2;
6 mM 4-AB; 0,25 mM EGTA
Puffer 2
50 mM TES/NaOH (pH 7,0); 40 mM 6-AHS; 6 mM 4-AB;
5% (v/v) Glycerin
Puffer 3
5 mM TES/NaOH (pH 7,0); 40 mM 6-AHS; 6 mM 4-AB; 1 mM
EDTA; 5 mM DTT (unmittelbar vor dem Gebrauch dazugegeben);
5% (v/v) Glycerin
Puffer 4
5 mM TES/NaOH (pH 7,0); 40 mM 6-AHS; 1 mM EDTA; 5 mM
DTT (unmittelbar vor dem Gebrauch dazugegeben); 5% (v/v)
Glycerin
Puffer A
50 mM TRIS/H2SO4 (pH 7,8); 10% (v/v) Methanol
Puffer B
50 mM TRIS/H2SO4 (pH 7,8); 500 mM Na2SO4; 10% (v/v)
Methanol
Puffer D
50 mM TRIS/HCl (pH 7,5); 50 mM KCl; 5 mM MgCl2; 10 mg/ml
BSA; 10% (v/v) Glycerin; 1% (w/v) Octyl-β-D-Glucopyranosid
Rekonstitutionspuffer 50 mM MES/NaOH (pH 6,0); 10% (v/v) Glycerin
S+G-Lösung
0,6% (w/v) Serva-Blau G-250; 3% Perchlorsäure
Silber-Färbelösung A 5% (w/v) Na2CO3 (pH 11,8)
Silber-Färbelösung B 0,18% (w/v) NH4NO3; 0,18% (w/v) AgNO3; 0,9% (w/v)
H4O40SiW12 • x H2O; 1,4% (v/v) 37% Formaldehydlösung
SOC-Medium
2 g Select Peptone 140; 0,55 g Hefeextrakt; 1 ml 1 M NaCl;
1 ml 1 M KCl; ad 98 ml ddH2O; autoklavieren; 1 ml
1 M MgCl2/1 M MgSO4 (sterilfiltriert); 1 ml 2 M Glucose
(sterilfiltriert); sterilfiltrieren
Stopplösung
10% (v/v) Glycerin; 5% (v/v) HAc
Streptactin A
20 mM TES/NaOH (pH 7,0); 5 mM MgCl2; 1 mM ADP; 15% (v/v)
Glycerin
Streptactin B
20 mM TES/NaOH (pH 7,0); 5 mM MgCl2; 1 mM ADP; 2,5 mM
Desthiobiotin; 15% (v/v) Glycerin
Succinat-Medium
34 mM KH2PO4; 64 mM K2HPO4; 0,3 mM MgSO4; 20 mM
(NH4)2SO4; 1 µM FeSO4; 1 µM ZnCl2; 10 µM CaCl2; 50 µg/ml
L-Isoleucin; 50 µg/ml L-Asparagin; 50 µg/ml L-Valin; 50 µg/ml
Thymin; 2 µg/ml Thiamin; 0,4% (w/v) Natriumsuccinat; 3% (w/v)
Agar
TFB 1
30 mM KAc/HAc (pH 5,8); 50 mM MnCl2; 100 mM RbCl; 10 mM
CaCl2; 15% (v/v) Glycerin
28
TFB 2
10 mM MOPS/HCl (pH 7,0); 75 mM CaCl2; 10 mM RbCl;
15% (v/v) Glycerin
5 mM TRIS/HCl (pH 8,0); 10 mM MgCl2; 0,2 mM EGTA;
10% (v/v) Glycerin
4 g Select Peptone 140; 2,5 g Hefeextrakt; 1,25 g NaCl; ad 0,5 l
ddH2O (pH ca. 7,5)
Waschpuffer
YT-Medium
2.2 Stämme und Plasmide
2.2.1 E. coli DH5α
Genotyp:
F- φ80lacZ∆M15 ∆(lacZYA-argF) U169 deoR recA1 endA1
hsdR17(rK-, mK+) phoA supE44 λ- thi-1 gyrA96 relA1
Dieser E. coli-Stamm besitzt das Gen lacZ∆M15, dessen Produkt durch α-Komplementation mit dem N-terminalen Fragment der β-Galaktosidase, dessen Gen sich auf einem geeigneten, durch Transformation in die Zelle überführten Plasmid befindet, die Selektion
von Plasmiden mit insertierten DNA-Fragmenten nach dem Blau/Weiß-System ermöglicht. Weiterhin enthält dieser Stamm die Mutationen recA1, wodurch homologe Rekombinationsprozesse verhindert werden, und endA1, wodurch die Aktivität der nicht-spezifischen Endonuklease I beseitigt wird. Dadurch wird eine stabile Replikation von Plasmiden
in hoher Kopienzahl ermöglicht. Dieser Stamm wurde für sämtliche Klonierungsarbeiten
verwendet.
2.2.2 E. coli DK8
Genotyp:
1100 ∆(uncB-uncC) ilv::Tn10
Dieser E. coli-Stamm wurde von Klionsky et al. hergestellt und kann aufgrund der Deletion ∆(uncB-uncC), die das ATP-Synthase-Operon von Untereinheit a (uncB) bis Untereinheit ε (uncC) umfasst, keine ATP-Synthase exprimieren (Klionsky et al. 1984). Für das
Wachstum auf nichtvergärbaren Kohlenstoffquellen ist der Stamm daher auf eine plasmidcodierte ATP-Synthase angewiesen. Die Unfähigkeit von atp-Deletionsmutanten zum
Wachstum auf Kohlenstoffquellen wie Succinat oder Malat beruht dabei nicht in erster
Linie auf dem Fehlen der ATP-Synthase, da diese Zellen auch weiterhin mit Hilfe des
Citronensäurezyklus bzw. dem Abbau von Pyruvat zu Acetat und ATP zur ATP-Gewinnung fähig sein sollten. Vielmehr beeinflußt bei dem Wachstum von atp-Mutanten auf
Succinat oder Malat offenbar ein verändertes ATP/ADP-Verhältnis die DNA-Struktur
(van Workum et al. 1996) und damit auch die Expression eines C4-Dicarbonsäure-Trans-
29
porters, wodurch die Zellen diese Substrate nicht mehr aufnehmen können (Boogerd et al.
1998).
Weiterhin besitzt der Stamm durch das Transposon Tn10 eine Tetracyclinresistenz (Foster
et al. 1981). Der E. coli-Stamm DK8 wurde für die Expression von plasmidcodierten EF1und EFOF1-Mutanten verwendet.
2.2.3 pBluescript II SK (+)
Der Vektor pBluescript II SK (+) ist ein 2961 bp großer high copy-Standard-Klonierungsvektor. Er stammt von dem Vektor pUC19 ab und verfügt neben der multiple cloning site
(MCS) über eine Ampicillinresistenz und das lacZ-Gen, dessen Produkt durch α-Komplementation mit dem C-terminalen Fragment der β-Galaktosidase eine Selektion von
erhaltenen Klonen nach dem Blau/Weiß-System ermöglicht. Weiterhin enthält der Vektor
Bindungsstellen für die Standardprimer M13 reverse (= RP) und M13 -20 (= FP) ober- und
unterhalb der MCS, die im Rahmen dieser Arbeit für die Sequenzierung von insertierten
Fragmenten verwendet wurden.
2641,XmnI
2524,ScaI
2413,PvuI
Amp
653
KpnI
ApaI
EcoO109
XhoI
f1 (+) origin
PvuI,497
AccI
PvuII,527
HincII
SalI
BssHII,619 ClaI
HindIII
lacZ
500
EcoRV
EcoRI
PstI
MCS
SmaI
2961 bps
XmaI
BssHII,792 BamHI
lac Promotor
SpeI
1000
XbaI
NotI
XmaIII
1500
BstXI
PvuII,975
DsaI
SacII
SacI
ColE1 origin
755
AflIII,1153
NaeI,328
2500
pBSK II (+)
2000
30
2.2.4 pKH7
Der Vektor pKH7 stammt ursprünglich von dem 3941 bp großen Plasmid pACYC177 ab,
dessen NheI/BamHI-Fragment (und damit auch die Kanamycin-Resistenz von
pACYC177) entfernt und durch ein Fragment, das die Schnittstellen HindIII und XbaI
enthält, ersetzt wurde. Innerhalb dieser Schnittstellen enthält pKH7 acht Gene des E. coli
atp-Operons von atpB (Untereinheit a) bis atpC (Untereinheit ε). Alle Wildtyp-Cysteine
(bC21, δC65, δC141, αC47, αC90, αC193, αC243, γC87, γC112 und βC137) wurden
durch Alanine ersetzt (Kuo et al. 1998) und ein His6-tag (Aminosäuresequenz:
MRGSHHHHHHGMATG…) am N-Terminus der Untereinheit β eingeführt. Weiterhin
enthält der Vektor die Mutation AAA → TGC an der Position des Codons für die 108.
Aminosäure der Untereinheit γ, wodurch ein Cystein in diese Untereinheit eingeführt
wurde (γK108C) (Noji et al. 1999). Ein Sequenzvergleich des atp-Operons von pKH7 mit
der Wildtyp-Sequenz von E. coli K12 ist im Anhang aufgeführt.
Der Vektor und dessen Derivate wurden im Rahmen dieser Arbeit zur Präparation von
EF1-Komplexen für Rotationsexperimente verwendet, da die entsprechenden Enzyme mit
dem Cystein γC108 eine Kontaktstelle für die Anbindung eines Actin-Filaments an die
Untereinheit γ verfügten.
HindIII,1
atpB
Amp
atpE
atpF
8000
rep
pKH7
7010,XbaI
2000
atpH
9235 bps
XhoI,2544
atpC
6000
atpA
4000
atpD
atpG
KpnI,3900
5347,SacI
His-tag
γC108
31
2.2.5 pSE1
Der Vektor pSE1 enthält wie pKH7 die acht Gene für die Untereinheiten a bis ε des E. coli
atp-Operons. Außerdem verfügt der Vektor über den His6-tag (Aminosäuresequenz:
MRGSHHHHHHGMATG…) am N-Terminus der Untereinheit β und einen Strep-tag
(Aminosäuresequenz: …AVASWSHPQFEK) am C-Terminus der Untereinheit c. Das
Genprodukt SE1 ist cysteinfrei. Ein Sequenzvergleich des atp-Operons von pSE1 mit der
Wildtyp-Sequenz von E. coli K12 ist im Anhang aufgeführt.
Der Vektor und dessen Derivate wurden im Rahmen dieser Arbeit zur Präparation von
EFOF1-Komplexen für Rotationsexperimente verwendet, da die entsprechenden Enzyme
mit den Strep-tags der c-Untereinheiten über eine Möglichkeit für die Anbindung eines
Actin-Filaments an den FO-Teil des Enzyms verfügten.
HindIII,1
NheI,1251
NsiI,1290
atpB
Amp
atpE
Strep-tag
atpF
8000
rep
pSE1
7037,XbaI
2000
atpH
9262 bps
atpC
XhoI,2571
6000
atpA
4000
atpD
atpG
KpnI,3927
5374,SacI
His-tag
32
2.2.6 Vektorkarte der Deletionsmutanten pMM16, pMM20, pMM17, pMM8,
pMM18 und pMM19
Die Deletionsmutanten pMM16 (γ-3, 9226 bp), pMM20 (γ-6, 9217 bp), pMM17 (γ-9,
9208 bp), pMM8 (γ-12, 9199 bp), pMM18 (γ-15, 9190 bp) und pMM19 (γ-18, 9181 bp)
stammen von dem Vektor pKH7 ab (in den Klammern ist jeweils die Größe der Deletion
in Aminosäuren und die Größe des Vektors in bp angegeben). Die Genprodukte verfügen
neben den His6-tags an den N-Termini der β-Untereinheiten über das Cystein γC108 und
zusätzlich über Deletionen von 9 bis 54 bp an den C-terminalen Bereichen der γ-Untereinheiten.
HindIII,1
atpB
Amp
atpE
atpF
8000
rep
pMMX
XbaI
2000
atpH
9181-9226 bps
XhoI,2544
atpC
6000
atpA
4000
atpD
atpG
SacI
KpnI,3900
His-tag
Bereich der
Deletionen
γC108
33
2.2.7 Vektorkarte der Cystein-Doppelmutante pMM10
Der Vektor pMM10 stammt von dem Plasmid pKH7 ab. Neben dem N-terminalen His6tag der Untereinheit β und dem Cystein γC108 verfügt der Vektor über die Mutationen
CCG → TGT an der Position der 280. Aminosäure von Untereinheit α sowie GCG →
TGT an der Position der 285. Aminosäure von Untereinheit γ, wodurch das Genprodukt
zwei zur Quervernetzung fähige Cysteine (αC280 und γC285) besitzt.
HindIII,1
atpB
Amp
atpE
atpF
8000
rep
pMM10
7010,XbaI
2000
atpH
9235 bps
XhoI,2544
atpC
6000
atpA
4000
atpD
αC280
atpG
KpnI,3900
5347,SacI
His-tag
γC285
γC108
2.2.8 pMM6
Das Plasmid pMM6 ist wie pMM10 ein pKH7-Derivat. Im Unterschied zu pMM10 verfügt pMM6 jedoch nur über die Mutationen AAA → TGC an der Position des Codons für
die 108. Aminosäure der Untereinheit γ (γK108C) und CCG → TGT an der Position des
Codons für die 280. Aminosäure von Untereinheit α (αP280C).
2.2.9 pSW3
Das Plasmid pSW3 ist ein pKH7-Derivat. Das Genprodukt enthält neben dem Cystein
γC108 aufgrund der Mutationen GCG → TGT (an der Position der 87. Aminosäure von
Untereinheit γ) und GAT → TGT (an der Position der 380. Aminosäure von Untereinheit
β) zwei zur Quervernetzung fähige Cysteine (βC380 und γC87) (Duncan et al. 1995). Das
Plasmid wurde von S. Winkler (Abteilung Biophysik, Universität Osnabrück) hergestellt
(Winkler 2001) und für diese Arbeit zur Verfügung gestellt.
34
2.2.10 pGH7
Das Plasmid pGH7 ist wie pSW3 ein pKH7-Derivat. Im Unterschied zu SW3 besitzt das
Genprodukt GH7 jedoch nur die Cysteine γC108 und βC380. Das Plasmid wurde von G.
Hikade (Abteilung Biophysik, Universität Osnabrück) hergestellt und für diese Arbeit zur
Verfügung gestellt. pGH7 wurde hergestellt, indem das XbaI/SacI-Fragment von pKH7
gegen das entsprechende Fragment aus pSW2 (ein pBSK-Derivat, daß das XbaI/SacIFragment aus pKH7 mit der Mutation βD380C enthält (Winkler 2001)) ersetzt wurde.
2.3 Methoden
2.3.1 Allgemeine molekularbiologische Arbeitsmethoden
2.3.1.1 Transformation mit Plasmid-DNA
Ein 100 µl-Aliquot kompetenter Zellen wurde auf Eis aufgetaut und mit 5-10 µl einer mit
sterilem ddH2O 1:100-verdünnten Plasmidlösung (ca. 10-20 ng DNA) versetzt. Nach
10 min Inkubation auf Eis wurde die Bakteriensuspension auf einer auf 37°C
vorgewärmten, antibiotikahaltigen Agarplatte ausgestrichen und über Nacht bei 37°C
inkubiert.
2.3.1.2 Isolierung von Plasmid-DNA
Plasmide für präparative Schnittansätze, Transformationen oder Restriktionsanalysen
wurden aus antibiotikahaltigen Über-Nacht-Kulturen gewonnen. Dazu wurden jeweils
10 ml LB-Medium entweder mit 20 µl einer Bakterien-Stammkultur versetzt, oder mit
einem Klon angeimpft, der mit einem sterilen Zahnstocher von einer Agarplatte
abgenommen wurde. Stammkulturen wurden angelegt indem 0,5 ml einer LB-Über-NachtKultur mit 0,5 ml sterilem Glycerin vermischt und bei -20°C gelagert wurden.
Für die Isolierung von Plasmid-DNA wurde der „QIAprep Spin Miniprep Kit“ (Qiagen)
oder der „High Pure Plasmid Isolation Kit“ (Roche Diagnostics) verwendet. Die Durchführung erfolgte jeweils nach den Angaben der Hersteller. Beide Kits arbeiten nach dem
gleichen Verfahren. Nach der alkalischen Lyse der Zellen, dem Abbau der RNA durch
RNase A sowie der Ausfällung von genomischer DNA, Proteinen und Zelltrümmern wird
die Plasmid-DNA in Gegenwart eines chaotropen Salzes (Guanidin-Hydrochlorid) an eine
Glasfaser- oder Silica-Oberfläche gebunden. Anschließend kann die Plasmid-DNA gewaschen und in einem Puffer mit geringer Salzkonzentration (10 mM TRIS/HCl pH 8,5)
eluiert werden.
35
Pro Säule wurden jeweils 6 ml Bakteriensuspension aus einer Über-Nacht-Kultur eingesetzt. Aus diesem Volumen konnten bis zu ca. 20 µg Plasmid-DNA isoliert werden. Die
Elution erfolgte mit ca. 80 µl Elutionspuffer. Die Reinheitsüberprüfung und Konzentrationsbestimmung von Nukleinsäurelösungen erfolgte durch die Aufnahme eines UV-Spektrums im Bereich von 220-320 nm. Die DNA-Konzentration wurde mit Hilfe der Gleichung
1 A260 dsDNA = 0,05 µg/µl
berechnet. Proteinverunreinigungen wurden anhand des Verhältnisses A260/A280 bestimmt.
Eine Plasmid-DNA-Lösung galt dann als nicht verunreinigt, wenn der Wert größer als 1,8
war.
2.3.1.3 Restriktionsanalyse von Plasmid-DNA
Restriktionsendonukleasen sind Enzyme, die bestimmte Sequenzen einer dsDNA erkennen
und den DNA-Strang anschließend spalten können. Sie werden in unterschiedliche Klassen eingeteilt. Restriktionsendonukleasen des Typs I spalten die DNA zufällig, oft weit
entfernt (> 1 kb) von ihrer Erkennungssequenz. Restriktionsendonukleasen des Typs III
erkennen spezifische Sequenzen der DNA und schneiden etwa 20-25 Nukleotide entfernt
davon. Bei den hier verwendeten Enzymen handelt es sich ausschließlich um Restriktionsendonukleasen des Typs II, die innerhalb ihrer meist Palindrom-artigen Erkennungssequenzen von üblicherweise 4-8 bp Länge schneiden und dabei Fragmente mit einem 5´Phosphat- und einem 3´-OH-Ende erzeugen. Die Enden sind entweder glatt oder besitzen
einen 5´- bzw. 3´-Überhang.
Für eine Restriktionsanalyse wurden in einem 10 µl-Reaktionsansatz ca. 0,6 µg PlasmidDNA mit 5-10 u Enzym versetzt und 1 h bei 37°C inkubiert. Anschließend wurde das Reaktionsergebnis anhand einer Agarose-Gelelektrophorese überprüft.
2.3.1.4 Präparative Restriktionsschnittansätze
Für die Klonierung eines DNA-Fragments in einen entsprechend geöffneten Vektor wurden größere Mengen DNA präpariert. Hierzu wurden in 70 µl-Ansätzen ca. 8-10 µg Plasmid-DNA mit jeweils 50 u pro Enzym versetzt und bis zu 4 h bei 37°C im Wasserbad
inkubiert. Zur Vermeidung der Religation von unvollständig geschnittenem Vektor wurde
die Vektor-DNA im Anschluß an einen präparativen Schnitt dephosphoryliert. Dazu wurden zunächst die im Schnittansatz enthaltenen Restriktionsenzyme durch 20 min Inkubation bei 65°C inaktiviert. Anschließend wurden die Reaktionslösungen im Eisbad abgekühlt und pro 70 µl-Schnittansatz mit 3 u Calf Intestine Alkaline Phophatase (CIAP) und
8 µl CIAP-Puffer versetzt. Nach 30 min Inkubation bei 37°C wurden 10 µl 6x Beladungspuffer zugegeben und die Proben auf ein präparatives Agarosegel aufgetragen.
36
2.3.1.5 Agarose-Gelelektrophorese
Die Agarose-Gelelektrophorese wurde zur Kontrolle des Reaktionsergebnisses von Restriktionsanalysen und PCR-Ansätzen sowie zur Aufreinigung von DNA-Fragmenten und
zur Abschätzung der Konzentration von Nukleinsäurelösungen verwendet. Das Verfahren
ermöglicht die Trennung von DNA-Fragmenten nach Größe und topologischer Form.
Dazu wurde Standardagarose durch mehrmaliges Aufkochen in 1x TBE-Elektrophoresepuffer gelöst und mit Ethidiumbromid (Endkonzentration 0,8 µg/ml) versetzt. Es wurden
hauptsächlich Gele mit einer Agarosekonzentration von 1% (w/v) verwendet. Diese Konzentration ist für einen Fragmentlängen-Trennbereich von 0,5-7 kb geeignet. Die Proben
wurden vor der Auftragung mit einem 6x Beladungspuffer der Firma Peqlab vermischt.
Die Auftrennung erfolgte bei analytischen Gelelektrophoresen (Probenvolumen 10-20 µl),
wie sie z.B. bei Restriktionsanalysen eingesetzt wurden, bei einer Spannung von 130 V
und bei präparativen Agarosegelen (Probenvolumen ca. 80 µl) zur Aufreinigung von
DNA-Fragmenten bei 80 V. Analytische Agarosegele wurden unter Beleuchtung mit UVLicht der Wellenlänge 302 nm fotografiert. Aufgetrennte DNA-Fragmente aus präparativen Schnittansätzen wurden durch Bestrahlung mit UV-Licht der Wellenlänge 312 nm
detektiert und zum Schutz vor Strahlenschäden möglichst schnell mit einem Skalpell aus
dem Gel herausgeschnitten. Die Isolation der DNA aus den Gelstücken erfolgte mit Hilfe
des „QIAquick Gel Extraction Kits“ der Firma Qiagen nach den Angaben des Herstellers.
Die Elution der Fragmente erfolgte mit jeweils 30 µl Elutionspuffer pro Säule, worauf sich
im Allgemeinen eine Konzentrationsabschätzung anhand einer Agarose-Gelelektrophorese
anschloß.
2.3.1.6 Ligation von DNA-Fragmenten
Zur Ligation von DNA-Fragmenten wurde die T4 DNA Ligase eingesetzt. Das Enzym
wird durch ATP unter Abspaltung von Pyrophosphat adenyliert und überträgt den Adenylrest anschließend auf die endständige 5´-Phosphatgruppe eines DNA-Fragments. Dadurch
wird ein nucleophiler Angriff einer benachbarten 3´-OH-Gruppe auf die 5´-Phosphatgruppe ermöglicht, wodurch nach Abspaltung von AMP der DNA-Strangbruch geschlossen werden kann. Das Enzym arbeitet am besten bei 37°C. Für die Reaktion ist jedoch die
räumliche Nähe von 3´-OH-Gruppe und adenylierter 5´-Phosphatgruppe erforderlich. Dies
wird bei Ligationen von DNA-Fragmenten mit 3´- bzw. 5´-Basenüberhang dadurch erreicht, daß sich die überhängenden Enden der Fragmente zu Doppelsträngen zusammenlagern. Um diese Bereiche thermisch nicht zu denaturieren wird die Reaktion daher im Allgemeinen bei 4-16°C durchgeführt.
Für eine Ligationsreaktion wurden in 30 µl-Ansätzen 50 ng Vektor-DNA und die fünffache Molmenge an Insert-DNA eingesetzt (Tab. 2.1). Zur Berechnung von Insert/VektorMolverhältnissen wurde die Näherungsgleichung 1 bp = 660 g/mol verwendet.
Für die Abschätzung der Ausbeute wurden bei Ligationsreaktionen stets Blindproben ohne
Zugabe von Insert-DNA mitgeführt.
37
Tab. 2.1 Pipettierschema für Ligationsreaktionen
10x T4 DNA Ligase-Puffer
Vektor-DNA
Insert-DNA
ddH2O (steril)
T4 DNA Ligase (400 u/µl)
Ligation
3 µl
50 ng
5x Molmenge des Vektors
ad 30 µl
1 µl
Blindprobe
3 µl
50 ng
ad 30 µl
1 µl
Die Ligationsansätze wurden über Nacht bei 16°C inkubiert.
2.3.1.7 Transformation mit Plasmid-DNA aus Ligationsreaktionen
Ein 100 µl-Aliquot kompetenter Zellen wurde auf Eis aufgetaut, mit 5-10 µl des Ligationsansatzes versetzt und 30 min auf Eis inkubiert. Anschließend erfolgte der Hitzeschock für 60 s bei 42°C, worauf die Zellen nochmals 2 min auf Eis gelagert wurden.
Nach der Zugabe von 400 µl SOC-Medium wurden die Transformationsansätze 1 h bei
37°C auf dem Rotationsinkubator inkubiert. Schließlich wurden 250 µl der Bakteriensuspensionen auf antibiotikahaltigen LB-Agarplatten ausgestrichen und über Nacht bei 37°C
inkubiert.
Bei der Transformation von E. coli DH5α mit pBSK-Derivaten konnte das Blau/WeißSelektionsverfahren verwendet werden. Diese Methode beruht darauf, daß Klone, deren
Plasmide kein in die multiple cloning site insertiertes DNA-Fragment besitzen, über eine
funktionsfähige β-Galactosidase verfügen, weswegen sie die farblose Substanz X-Gal zu
dem blauen Farbstoff 5,5-Dibrom-4,4-Dichlorindigo abbauen können. Für diese Nachweisreaktion wurden jeweils unmittelbar vor dem Ausstreichen eines Transformationsansatzes 80 µl X-Gal (2% (w/v) in DMF) und 1 µl IPTG (20 % (w/v) in H2O) auf der LBAgarplatte ausgestrichen.
2.3.1.8 Herstellung kompetenter Zellen
Kompetente E. coli DK8-Zellen wurden nach der Rubidiumchlorid-Methode hergestellt.
Dazu wurden 200 ml tetracyclinhaltiges YT-Medium mit 2 ml einer E. coli DK8-LBÜber-Nacht-Kultur angeimpft und bei 37°C auf dem Schüttelinkubator inkubiert bis eine
OD600 von ca. 0,5 erreicht wurde. Anschließend wurden die Zellen pelletiert (10 min, 5000
x g, 4°C), in 50 ml TFB 1 resuspendiert und 10 min im Eisbad inkubiert. Nach der anschließenden Zentrifugation (10 min, 5000 x g, 4°C) wurden die Zellen in 8 ml TFB 2
resuspendiert, in 100 µl-Portionen aliquotiert, in flüssigem Stickstoff schockgefroren und
schließlich bei -80°C gelagert.
38
2.3.1.9 Sequenzierung
Das Prinzip der DNA-Sequenzierung beruht auf der Kettenabbruchmethode von Sanger et
al. (1977), bei der eine DNA-Polymerase-Reaktion durch den Einbau von Didesoxynukleotiden stochastisch abgebrochen wird. Bei der automatischen Sequenzierungsmethode sind
die vier verschiedenen Didesoxynukleotide jeweils mit vier verschiedenen Fluoreszenzfarbstoffen markiert, so daß nach der elektrophoretischen Trennung der einzelnen ssDNAFragmente eine Detektion der Fragmente, die jeweils mit ddATP, ddCTP, ddGTP oder
ddTTP enden, möglich ist. Die Sequenzierung erfolgt ähnlich einer PCR. Eine Probe der
zu sequenzierenden DNA wird mit dem Sequenzierungsprimer, ein ca. 20-25 bp langes
Oligonukleotid, das den Startpunkt der Sequenzierung festlegt, und einer Lösung, die neben den markierten ddNTPs auch dNTPs sowie eine thermostabile DNA-Polymerase enthält, versetzt und anschließend ein Temperaturprogramm durchlaufen, das aus einem Denaturierungs-, einem Hybridisierungs- und einem Elongationsschritt besteht. Der Unterschied zur PCR besteht darin, daß die Sequenzierung mit nur einem Primer durchgeführt
wird, wodurch auch nur ein Strang der DNA jeweils bis zum Kettenabbruch kopiert wird.
Die Kopien können daher in den nachfolgenden Zyklen des Temperaturprogramms nicht
als Templat genutzt werden.
Für die im Rahmen dieser Arbeit durchgeführten Sequenzierungen wurde der „ABI
PRISM BigDye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit“ (Version 1.0 und 2.0)
der Firma Applied Biosystems verwendet. Das Pipettierschema für Sequenzierungsreaktionen zeigt Tabelle 2.2 und das verwendete Temperaturprogramm ist in Tabelle 2.3 angegeben. Die für die Sequenzierungsreaktion verwendeten und von der Firma MWG-Biotech
(Ebersberg) lyophilisiert gelieferten Sequenzierungsprimer wurden in sterilem ddH2O
resuspendiert (Endkonzentration: 100 pmol/µl) und bei -20°C gelagert. Von diesen
Stammlösungen wurden mit ddH2O verdünnte Lösungen hergestellt (Konzentration:
10 pmol/µl), die aliquotiert in 10 µl-Portionen ebenfalls bei -20°C gelagert und nach
Gebrauch verworfen wurden.
Tab. 2.2 Pipettierschema für Sequenzierungsreaktionen
800 ng
1 µl
4 µl
ad 20 µl
Komponenten
DNA-Templat (∼ 0,2 µg/µl; A260/A280 > 1,8)
Sequenzierungsprimer (10 pmol/µl)
Reaktions-Mix (markierte ddNTPs, dATP, dCTP, dITP,
dUTP, AmpliTaq DNA Polymerase FS, MgCl2,
TRIS-HCl-Puffer pH 9,0)
ddH2O (steril)
39
Tab. 2.3 Temperaturprogramm für Sequenzierungsreaktionen
Primäre Denaturierung
Hybridisierung*
Elongation*
Denaturierung*
Terminale Elongation
Kühlung
Temperatur
96°C
50°C
60°C
96°C
72°C
4°C
Dauer
60 s
15 s
240 s
30 s
300 s
bis zur weiteren
Verwendung
* Diese Temperaturschritte wurden 30x durchlaufen
Nach der Sequenzierungsreaktion wurden überschüssige fluoreszenzfarbstoffmarkierte
ddNTPs durch eine Ethanolfällung entfernt. Dazu wurden die 20 µl-Sequenzierungsansätze mit sterilem ddH2O auf 100 µl aufgefüllt und mit 10 µl 3 M Natriumacetatpuffer und
250 µl EtOH versetzt. Nach dem Zentrifugieren (15 min, 14000 rpm, RT) wurde der
Überstand dekantiert und das Pellet mit 300 µl 70% (v/v) EtOH durch kurzes Schwenken
gewaschen. Nach einem zweiten Zentrifugationsschritt (5 min, 14000 rpm, RT) wurde der
Überstand dekantiert, Lösungsmittelreste vorsichtig abgesaugt und das Pellet im Dunkeln
an der Luft getrocknet. Die Proben wurden anschließend durch U. Coja (Abteilung Spezielle Botanik, Universität Osnabrück) mit Hilfe eines Sequenziergerätes der Firma
Applied Biosystems (ABI PRISM 310 oder ABI PRISM 377) sequenziert. Es konnten pro
Einzelstrang-Sequenzierungsansatz ca. 500-700 Basen sequenziert werden.
2.3.1.10 Mutagenese durch PCR
Eine PCR dient der spezifischen Vervielfältigung einer DNA-Sequenz. Dazu müssen die
flankierenden Bereiche der zu amplifizierenden DNA bekannt sein, da zu diesen Bereichen komplementäre Oligonukleotide benötigt werden, die als gegenläufig gerichtete Primer eingesetzt werden. Die Primer sollten eine Länge von 20-30 Basen haben und möglichst weder mit sich selbst noch untereinander hybridisieren können. Weiterhin sollten sie
einen Anteil von 40-60% Guanin- und Cytosinbasen besitzen und nicht mehr als vier gleiche Basen nacheinander enthalten, um Fehlhybridisierungen und Leserasterverschiebungen zu vermeiden. Zur Vermeidung unspezifischer Amplifikation werden im PCR-Zyklus
möglichst hohe Hybridisierungstemperaturen verwendet, weswegen auch die Schmelztemperaturen der Primer ausreichend hoch (55-80°C) sein sollten. Die Primer sollten weiterhin am 3´-Ende ein bis zwei Guanin- oder Cytosinbasen besitzen, um insbesondere den
Elongationsstartpunkt zu stabilisieren. Die Amplifizierung wird durch das mehrfache
Durchlaufen eines Temperaturprogrammes erreicht, das aus einem Denaturierungs-, einem
Hybridisierungs- sowie einem Elongationsschritt besteht. Im Denaturierungsschritt wird
die DNA thermisch (meist bei ca. 95°C) denaturiert. Die Denaturierungszeit sollte möglichst kurz gehalten werden, da nahezu alle Komponenten des Reaktionsgemisches unter
diesen hohen Temperaturen leiden. So kann die Polymerase denaturiert werden, Nukleotide können hydrolysieren und Templat-DNA sowie Primer können depuriniert werden.
40
Im anschließenden Hybridisierungsschritt wird das Reaktionsgemisch soweit abgekühlt,
daß die Primer an die komplementären Bereiche auf der denaturierten Templat-DNA binden können. Die Hybridisierungstemperatur ist bei einer PCR ein wichtiger Parameter. Ist
sie zu hoch, findet eine Hybridisierung nicht statt. Ist sie dagegen zu niedrig, binden die
Primer eventuell unspezifisch unter Ausbildung von Fehlpaarungen an die Templat-DNA.
Daher werden vor einer PCR im Allgemeinen Test-PCR mit verschiedenen Hybridisierungstemperaturen durchgeführt, um eine Hybridisierungstemperatur zu finden, bei der
eine spezifische Produktbildung möglich ist. Im Folgenden wird bei PCR-Protokollen
ausschließlich das letztlich verwendete, optimierte PCR-Temperaturprogramm angegeben.
Hybridisierungstemperaturen liegen im Allgemeinen bei ca. 50-65°C. Der nächste Schritt
bei der PCR ist der Elongationsschritt, bei dem das Reaktionsgemisch wieder auf eine
Temperatur aufgeheizt wird (oft 68-72°C), bei der die verwendete thermostabile DNAPolymerase am besten arbeitet. Die Elongationszeit ist abhängig von der Länge des zu
amplifizierenden Produktes und von der Syntheserate der verwendeten DNA-Polymerase.
Bei der hier verwendeten DNA-Polymerase handelt es sich um eine rekombinante Form
der aus dem hyperthermophilen Archaebakterium Pyrococcus furiosus isolierten thermostabilen Pfu-DNA-Polymerase. Das Enzym wurde von C. Sanders (Abteilung Biophysik,
Universität Osnabrück) zur Verfügung gestellt. Es besitzt eine 3´-5´-Exonukleaseaktivität,
d.h. es ist in der Lage falsch eingebaute Nukleotide in 3´-5´-Richtung wieder aus dem neu
synthetisierten Strang zu entfernen. Durch diese Korrekturaktivität (proofreading) besitzt
das Enzym eine ca. zehnmal geringere Fehlerhäufigkeit je eingebauter Base (ca. 1*10-6)
als Polymerasen ohne Korrekturaktivität, wie z.B. die Taq-Polymerase (Fehlerhäufigkeit
ca. 1*10-5). Außerdem erzeugt das Enzym durch seine 3´-5´-Exonukleaseaktivität Amplifikationsprodukte mit glatten Enden und keinen Basenüberhang, wie z. B. die Taq-Polymerase. Ein Nachteil der Korrekturaktivität ist eine geringere Syntheserate. Die NukleotidEinbaurate ist bei der Pfu-Polymerase mit ca. 550 Nukleotiden pro Minute deutlich geringer als z.B. bei der Taq-Polymerase mit einer Syntheserate von ca. 2800 Nukleotiden/min
bei 70°C. Darüber hinaus kann die Pfu-DNA-Polymerase einzelsträngige Primer in 3´-5´Richtung abbauen, weswegen das Enzym auch stets als letzte Komponente in die auf Eis
gelagerten Reaktionsansätze gegeben wird.
41
X
Y
PCR
PCR
Y
X
PCR
Y
X
Verdau
Y
X
Klonierung
X
Y
Abb. 2.1 Mutagenese mit vier Primern und mit Hilfe vorhandener
Restriktionsschnittstellen
Die PCR kann auf verschiedene Weise zur Mutagenese eingesetzt werden. Ein Verfahren
zeigt Abbildung 2.1. Hierzu werden vier Primer benötigt. Zwei Primer, die in der Mitte die
Mutation tragen und komplementär zueinander sind, und zwei weitere Primer, die jeweils
in 5´- bzw. 3´-Richtung so weit von der Mutationsstelle entfernt liegen, daß sich zwischen
ihrer Bindungsstelle und der Mutationsstelle eine Restriktionsschnittstelle (X, Y) befindet.
Mit je einem mutierten und einem äußeren Primer werden nun in zwei PCR-Ansätzen
zwei Fragmente amplifiziert, die jeweils an einem Ende die Mutation tragen. Da beide
Fragmente im Bereich der mutierten Primer auch komplementär zueinander sind, können
beide PCR-Produkte nach der Aufreinigung in einer dritten PCR als Primer eingesetzt
werden, ohne das weiteres Templat dazugegeben wird. Die Ausbeute bei dieser dritten
PCR kann durch die Zugabe der äußeren Primer gesteigert werden. Nach der Aufreinigung
kann das mutierte Fragment mit Hilfe der Restriktionsenzyme X und Y in das Ausgangsplasmid kloniert werden.
42
A
B
P
P
PCR
PCR
P
Dpn I-Verdau
Dpn I-Verdau
P
Transformation
P
P
Ligation
Transformation
Abb. 2.2 Mutagenese mit zwei Primern und Verdau der Templat-DNA durch DpnI
Ein anderes Verfahren zur Mutagenese zeigt die Abbildung 2.2. Das Verfahren wurde von
Weiner et al. (1994) beschrieben und erlaubt ein relativ einfaches und schnelles Einführen
von Punktmutationen, Deletionen und Insertionen in doppelsträngige Plasmid-DNA. Zur
Einführung von Punktmutationen werden zwei komplementäre Primer benötigt, die in
ihrer Mitte die gewünschte Mutation tragen (Abb. 2.2 A). Anschließend wird eine PCRReaktion mit wenigen Zyklen durchgeführt, um die Wahrscheinlichkeit, unerwünschte
Zufallsmutationen zu erhalten, zu verringern. Im Anschluß an die PCR wird die TemplatDNA durch die Restriktionsendonuklease DpnI (Erkennungssequenz: 5´-Gm6ATC-3´)
fragmentiert. Voraussetzung dafür ist methylierte und hemimethylierte Templat-DNA, die
43
aus dam+-Stämmen, wie z.B. E. coli DH5α, isoliert wurde. Dam+-Bakterienstämme besitzen DNA-Methylasen, die spezifisch eine Methylgruppe von S-Adenosylmethionin auf die
N6-Position des Adeninrestes in der Erkennungssequenz 5´-GATC-3´ übertragen. Auf
diese Weise ist ein gezielter Abbau der nicht mutierten Templat-DNA möglich. Bei der
anschließenden Transformation werden daher nur mutierte, durch PCR hergestellte und
daher nicht methylierte Plasmide in kompetente Zellen überführt. Die in den neu synthetisierten Plasmiden enthaltenen Strangbrüche können nun durch E. coli-eigene DNA-Ligasen geschlossen werden. Diese Methode wurde im Rahmen dieser Arbeit zur Einführung
von Punktmutationen in verschiedene Untereinheiten der E. coli ATP-Synthase verwendet.
Die Methode läßt sich jedoch auch zur Einführung von Deletionen verwenden (Abb.
2.2 B). Dazu benötigt man zwei 5´-phosphorylierte Primer, die nicht komplementär
zueinander sind. Mit diesen Primern wird nun in einer PCR das gesamte Plasmid bis auf
den Deletionsbereich amplifiziert. Die nicht mutierte Templat-DNA kann anschließend
durch DpnI-Fragmentierung entfernt und das PCR-Produkt ligiert sowie in kompetente
Zellen überführt werden. Diese Methode wurde zur Einführung verschiedener Deletionen
im C-terminalen Bereich der Untereinheit γ verwendet.
2.3.2 Allgemeine biochemische Arbeitsmethoden
2.3.2.1 Bestimmung der Proteinkonzentration nach Sedmak und Grossberg
Zur Bestimmung von Proteinkonzentrationen wurden Proben einer proteinhaltigen Lösung
mit ddH2O auf 500 µl aufgefüllt und mit 500 µl S+G-Reagenz versetzt (Sedmak und
Grossberg 1994). Anschließend wurde die Absorption der Proben bei 595 nm gegen einen
Leerwert gemessen. Die Kalibrierung erfolgte durch die Messung einer Standardkurve mit
Lysozym in einem Konzentrationsbereich von 5-40 µg/ml.
Tab. 2.4 Pipettierschema für die Bestimmung von Proteinkonzentrationen
Probenvolumen
ddH2O
S+G-Reagenz
Leerwert
500 µl
500 µl
Probe
X µl
500 – X µl
500 µl
2.3.2.2 Bestimmung der ATP-Hydrolyseaktivität nach LeBel
Bei der ATP-Hydrolyse wird Phosphat (Pi) freigesetzt, das nach LeBel et al. (1978)
spektrophotometrisch nachgewiesen werden kann. Das Verfahren beruht auf der Reduktion des entstandenen Phosphomolybdat-Komplexes durch p-Methyl-Aminophenolsulfat
in einem Kupferacetat-Puffer.
44
Für den Aktivitätstest wurde zunächst eine Testlösung hergestellt:
Testlösung
250 mM TRIS/HCl (pH 8); 15 mM MgCl2; 50 mM ATP
Anschließend wurden Leerwert, Standardwerte und die Probenansätze pipettiert (Tab. 2.5)
und 5 min bei 37°C im Wasserbad inkubiert.
Tab. 2.5 Pipettierschema für die Bestimmung von ATP-Hydrolyseaktivitäten
Leerwert
Standard 1
(0,022 µmol Pi)
Standard 2
(0,044 µmol Pi)
Standard 3
(0,088 µmol Pi)
Standard 4
(0,131 µmol Pi)
Standard 5
(0,175 µmol Pi)
Probe 1
Probe 2
Probe 3
ddH2O (µl)
Testlösung
(µl)
400
395
Proteinlösung
(0,01 mg/ml)
100
100
K2HPO4Standardlösung
(4,4 µmol/ml)
5 µl
390
100
10 µl
-
380
100
20 µl
-
370
100
30 µl
-
360
100
40 µl
-
390
380
370
100
100
100
-
10 µl
20 µl
30 µl
-
Die Reaktion wurde durch Abkühlen der Proben im Eisbad sowie durch Zugabe von jeweils 500 µl eiskalter 0,5 M TCA gestoppt. Anschließend wurden die Proben mit jeweils
500 µl LeBel-Reagenz (6 VT Lösung A + 1 VT Lösung B + 1 VT Lösung C) versetzt und
5 min bei RT inkubiert. Schließlich wurde die Absorption der Proben gegen den Leerwert
bei einer Wellenlänge von 745 nm gemessen.
Anhand der Standardkurve läßt sich nun die in den Proben in 5 min freigesetzte Menge an
freiem Phosphat (Pi) berechnen (⇒ nPi [µmol]). Mit diesem Wert kann anschließend die
ATP-Hydrolyseaktivität u berechnet werden:
⎡ µmol ⎤
⎡ 1 ⎤
= 0,2 ⎢
u⎢
∗ n Pi [µmol ]
⎥
⎣ min ⎦
⎣ min ⎥⎦
(Gleichung 1)
Zur Berechnung der spezifischen Aktivität (u/mg) werden die Aktivitäten noch durch die
Enzymmenge in Milligramm geteilt.
Die Bestimmung der ATP-Hydrolyseaktivität nach dieser Methode ist nur in einem Absorptionsbereich (A745) von 0,1 bis 0,5 gültig.
45
2.3.2.3 SDS-Gelelektrophorese
Mit Hilfe der SDS-Gelelektrophorese lassen sich Proteine nach ihrem Molekulargewicht
auftrennen. Dazu wurden jeweils 60 µg einer Proteinprobe durch Zugabe des gleichen
Volumens an 20%iger (w/v) TCA-Lösung sowie mindestens 1 h Inkubation bei 4°C gefällt und abzentrifugiert (20 min, 14000 rpm, 4°C). Nach dem Entfernen des Überstandes
wurde der Niederschlag mit jeweils 1 ml kaltem Aceton gewaschen und nochmals zentrifugiert (10 min, 14000 rpm, 4°C). Nach dem Entfernen des Überstandes wurde das Pellet
an der Luft getrocknet. Das Pellet wurde entweder in 20 µl Probenpuffer PP (ohne β-Mercaptoethanol) oder in 20 µl Probenpuffer PP+ (mit β-Mercaptoethanol) resuspendiert und
4 min gekocht. Die Auftrennung erfolgte mit Hilfe des Phast-Gel Systems der Firma
Pharmacia nach den Angaben des Herstellers. Die Gele wurden mit Coomassie und/oder
Silber gefärbt. Für die Coomassie-Färbung wurden die Gele über Nacht in Gel-Färbelösung inkubiert und anschließend überschüssiger Farbstoff durch Waschen mit Gel-Entfärbelösung entfernt. Die Silberfärbung erfolgte mit Hilfe der Entwicklereinheit des PhastGel Systems nach den Angaben des Herstellers. Hierbei wurde das Gel durch Spülen mit
20% (w/v) TCA fixiert und mit Gel-Entwicklerlösung A reduziert. Für die Waschschritte
wurde 40% (v/v) MeOH verwendet. Die Färbereaktion erfolgte durch Inkubieren des Gels
in 5 ml Silber-Färbelösung A und 10 ml Silber-Färbelösung B für 5-10 min bei RT. Anschließend wurde das Gel über Nacht in Stopplösung gelagert, getrocknet und fotografiert.
2.3.2.4 Zellanzucht von E. coli DK8-Mutanten
Für die Zellanzucht von E. coli DK8-Mutanten wurden zunächst 125 ml ampicillinhaltiges
LB-Medium mit 125 µl einer entsprechenden DK8-Stammkultur angeimpft und 8-12 h bei
37°C auf dem Schüttelinkubator (ca. 200 rpm) inkubiert. Mit dieser Kultur wurde anschließend 1 l ampicillinhaltiges Minimalmedium angeimpft und 8-12 h bei 37°C inkubiert. Diese Vorkultur wurde zum Animpfen von 12-14 l Hauptkultur verwendet. Dazu
wurden 12-14x 1 l ampicillinhaltiges Minimalmedium mit einer entsprechenden Menge
Vorkultur angeimpft, so daß die Hauptkultur eine OD600 von 0,1 besaß. Die Zellen wurden
entweder über Tag bei 37°C inkubiert und bei einer OD600 von 0,8 geerntet oder über
Nacht inkubiert und bei einer OD600 von ca. 1,8 geerntet. Die Bakterien wurden pelletiert
(15 min, 4000 x g, 4°C), wobei aus 12 l Über-Tag-Hauptkulturen ca. 20-25 g Biofeuchtmasse und aus 12 l Über-Nacht-Hauptkulturen ca. 40-45 g gewonnen werden konnten. Die
Pellets wurden in 100 ml Puffer 1 + Saccharose, versetzt mit jeweils einer Tablette EDTAfreiem Protease Inhibitor Cocktail, pro 20-25 g Biofeuchtmasse resuspendiert und homogenisiert. In späteren Präparationen wurde der Inhibitor Cocktail nicht mehr verwendet.
Dies hatte keine Auswirkungen auf die Ausbeute oder die Qualität des Enzyms. Nach dem
Einfrieren in flüssigem Stickstoff wurden die Bakteriensuspensionen bis zur weiteren
Verwendung bei -80°C gelagert.
46
2.3.2.5 Aufreinigung von EF1
Die Reinigung von EF1 erfolgte mit einigen Modifikationen nach einem Verfahren, das
ursprünglich von Wise (1990) beschrieben wurde. Dazu wurde jeweils eine Portion eingefroren gelagerter Zellen (20-25 g Biofeuchtmasse resuspendiert in 100 ml Puffer 1 +
Saccharose) nach dem Auftauen mit Hilfe eines Ribi Zell-Fraktionators bei einem Druck
von 20000 psi (ca. 1380 bar) aufgeschlossen und anschließend Zelltrümmer sowie nicht
aufgeschlossene Zellen abzentrifugiert (20 min, 20000 x g, 4°C). Der Überstand, der neben Verunreinigungen auch Membranvesikel mit EFOF1 enthielt, wurde mit dem gleichen
Volumen an Puffer 1 verdünnt und zentrifugiert (60 min, 250000 x g, 4°C). Anschließend
wurden die Pellets in 100 ml Puffer 2 resuspendiert und homogenisiert. Nach einer weiteren Zentrifugation (60 min, 250000 x g, 4°C) wurden die Pellets in 100 ml Puffer 3 resuspendiert sowie homogenisiert. Schließlich wurden die Suspensionen nochmals zentrifugiert (60 min, 250000 x g, 4°C) und die Pellets in 100 ml Puffer 4 resuspendiert und
homogenisiert. Nach einer weiteren Zentrifugation (60 min, 250000 x g, 4°C) enthielt der
Überstand, neben Verunreinigungen, von Membanvesikeln abgelöstes EF1 und wurde mit
Hilfe einer Anionenaustauschchromatographie weiter aufgereinigt. Dazu wurde der mit
1 mM MgATP versetzte klare Überstand über eine mit 2 M NaCl gewaschene und mit
Puffer A äquilibrierte Tosoh Fractogel TSK-DEAE 650(S)-Säule (Gelbettvolumen 30 ml,
Flussrate 8 ml/min) gegeben. Die Elution von EF1 erfolgte durch Anlegen eines stufenweisen Salzgradienten durch Zugabe von Puffer B. EF1 wurde bei einer Na2SO4-Konzentration von 75-150 mM mit einer Ausbeute von 10-20 mg Protein pro 12 l Über-TagHauptkulturvolumen bis ca. 30-40 mg Protein pro 12 l bei Über-Nacht-Hauptkulturen
eluiert. Das Eluat wurde mit 1 mM MgATP sowie 2 mM DTT versetzt und durch Zugabe
von (NH4)2SO4 bis zu einer Endkonzentration von 3,2 M präzipitiert und bei 4°C gelagert.
2.3.3 Herstellung von γ-Deletionsmutanten
2.3.3.1 Herstellung des γ-Subklons pMM4
Die Herstellung von γ-Deletionsmutanten erfolgte mit Hilfe einer Mutagenese-Methode,
die von Weiner et al. (1994) beschrieben wurde. Dieses Verfahren erlaubt ein relativ einfaches und schnelles Einführen von Punktmutationen, Deletionen und Insertionen in doppelsträngige Plasmid-DNA. Bei dieser Methode wird nahezu das gesamte Templat-Plasmid in einem PCR-Verfahren durch eine thermostabile DNA-Polymerase kopiert. Aufgrund der Schwierigkeiten, die sich bei der Amplifikation langer DNA-Fragmente ergeben, wurde zur Herstellung der γ-Deletionsmutanten der Vektor pKH7 (9235 bp) nicht als
Templat in der PCR verwendet. Stattdessen wurde die Größe des zu amplifizierenden
DNA-Bereichs verringert, indem ein bestimmtes DNA-Fragment aus pKH7 herausgeschnitten und in einen Klonierungsvektor eingesetzt wurde. Hierzu wurden jeweils ca.
10 µg pKH7 und pBSK mit jeweils 50 u KpnI und SacI geschnitten. Das KpnI/SacIFragment von pKH7 enthält den gesamten codierenden Bereich für die Untereinheit γ und
47
einen Teil des codierenden Bereichs für β (βR1-βL162). Nach der Dephosphorylierung
des pBSK-Ansatzes mit CIAP wurden die Fragmente gelelektrophoretisch aufgereinigt
und anschließend aus dem Gel isoliert. Für die Ligation wurden 50 ng des
dephosphorylierten, KpnI/SacI-geöffneten pBSK-Vektors mit ca. 110 ng des KpnI/SacIFragments von pKH7 versetzt und über Nacht mit T4 DNA Ligase bei 16°C inkubiert.
Anschließend wurden kompetente E. coli DH5α-Zellen mit 5 µl des Ligationsansatzes
transformiert. Einzelne Klone wurden anhand einer Restriktionsanalyse auf eine
erfolgreiche Ligation geprüft und schließlich ein Klon (Bezeichnung: MM4) für die
Herstellung der γ-Deletionsmutanten verwendet. Durch die Herstellung des Plasmids
pMM4 (4306 bp) konnte die Größe des in der Mutagenese-PCR zu amplifizierenden
DNA-Bereichs ungefähr halbiert werden.
2.3.3.2 Mutagenese
Die von der Firma MWG-Biotech (Ebersberg) lyophilisiert gelieferten PCR-Primer (Tab.
2.6) wurden zunächst in sterilem ddH2O resuspendiert (Endkonzentration: 100 pmol/µl)
und bei -20°C gelagert. Von diesen Primer-Stammlösungen wurden verdünnte Primerlösungen mit einer Konzentration von 25 pmol/µl hergestellt, die aliquotiert in 10 µl-Portionen bei -20°C gelagert wurden und jeweils nach Gebrauch verworfen wurden.
Tab. 2.6 Nukleotidsequenzen der PCR-Primer zur Herstellung von γ-Deletionsmutanten
3´-5´-Primer
5´-3´-Primer
Nukleotidsequenz
5´-P-GGCCCCCGAGACGATCTCGGTGAGTTCCTG-3´
5´-P-GACGATCTCGGTGAGTTCCTGAGTAATGCTGG-3´
5´-P-GGTGAGTTCCTGAGTAATGCTGGCCTGACG-3´
5´-P-CTGAGTAATGCTGGCCTGACGAGCTTTGTTG-3´
5´-P-GCTGGCCTGACGAGCTTTGTTGTATACC-3´
5´-P-ACGAGCTTTGTTGTATACCAACTGCAGCTC-3´
5´-P-TAAACAGGTTATTTCGTAGAGGATTTAATATGAG-3´
Die Primer sind jeweils 5´-phosphoryliert.
Abbildung 2.3 zeigt einen Ausschnitt der Nukleotid- und Aminosäuresequenz von pKH7
bzw. KH7 sowie der hergestellten γ-Deletionsmutanten im C-terminalen Bereich von γ.
Die Bindungsstelle des 5´-3´-Primers ist durch Fettdruck hervorgehoben und die Bindungsbereiche der verschiedenen 3´-5´-Primer sind unterstrichen.
48
pKH7
pMM16
pMM20
pMM17
pMM8
pMM18
pMM19
...
A T D N G G S L I K E L Q L V Y N K A
...5´-GCGACCGACAATGGCGGCAGCCTGATTAAAGAGCTGCAGTTGGTATACAACAAAGCT
pKH7
pMM16
pMM20
pMM17
pMM8
pMM18
pMM19
R Q A S I T Q E L T E I V S G A A A V stop
268
270
272
274
276
278
280
282
284
286
CGTCAGGCCAGCATTACTCAGGAACTCACCGAGATCGTCTCGGGGGCCGCCGCGGTTTAAACA
CGTCAGGCCAGCATTACTCAGGAACTCACCGAGATCGTCTCGGGGGCC.........TAAACA
CGTCAGGCCAGCATTACTCAGGAACTCACCGAGATCGTC..................TAAACA
CGTCAGGCCAGCATTACTCAGGAACTCACC...........................TAAACA
CGTCAGGCCAGCATTACTCAG....................................TAAACA
CGTCAGGCCAGC.............................................TAAACA
CGT......................................................TAAACA
pKH7
pMM16
pMM20
pMM17
pMM8
pMM18
pMM19
β-start R G S H H H H H H G
...
GGTTATTTCGTAGAGGATTTAATATGAGAGGATCGCATCATCATCATCATCATGGTA-3´...
Abb. 2.3 Nukleotid- und Aminosäuresequenz des C-terminalen Bereichs der Untereinheit
γ von pKH7 bzw. KH7 und den Deletionsmutanten
Die Sequenz des 5´-3´-Primers ist durch Fettdruck hervorgehoben, während die zu den verschiedenen 3´-5´-Primern komplementären Bereiche unterstrichen sind.
Tab. 2.7 Pipettierschema der PCR zur Herstellung von γ-Deletionsmutanten
5 µl
1 µl
1µl
1 µl
ad 50 µl
1 µl
Komponenten
10x Thermo Pol Puffer
3´-5´-Primer (25 pmol/µl)
5´-3´-Primer (25 pmol/µl)
dNTP-Mix (jeweils 5 mM dATP, dCTP, dGTP, dTTP)
ddH2O (steril)
Pfu-DNA-Polymerase (2 u/µl)
Zu einem 50 µl-PCR-Ansatz (Tab. 2.7) wurden jeweils ca. 40 ng Templat-DNA (pMM4)
zugegeben und folgendes PCR-Temperaturprogramm durchlaufen (Tab. 2.8):
49
Tab. 2.8 PCR-Temperaturprogramm zur Herstellung von γ-Deletionsmutanten
Hybridisierung*
Elongation*
Denaturierung*
Kühlung
Temperatur
95°C
55°C
68°C
95°C
68°C
4°C
Dauer
300 s
60 s
540 s
60 s
600 s
bis zur weiteren
Verwendung
Im Anschluß an die PCR wurde die aus E. coli DH5α isolierte und daher methylierte und
hemimethylierte Templat-DNA pMM4 durch Zugabe von 20 u DpnI pro 50 µl-PCR-Ansatz und 1 h Inkubation bei 37°C fragmentiert (pMM4 besitzt 24 Erkennungssequenzen
für DpnI). Anschließend wurden die PCR-Produkte gelelektrophoretisch aufgereinigt und
nach der Isolierung aus dem Agarosegel ligiert. Dazu wurden jeweils ca. 50 ng der linear
vorliegenden PCR-Produkte mit 400 u T4 DNA Ligase über Nacht bei 16°C inkubiert und
schließlich kompetente E. coli DH5α-Zellen mit jeweils 8 µl der Ligationsansätze transformiert. Einzelne Klone wurden anhand einer Restriktionsanalyse überprüft und anschließend im Bereich zwischen den Restriktionsschnittstellen KpnI und SacI mit Hilfe der
in Tabelle 2.9 aufgeführten Primer durchsequenziert.
Tab. 2.9 Nukleotidsequenzen der Sequenzierungsprimer RP, FP und seqIII
Bezeichnung
RP
FP
seqIII
Nukleotidsequenz
5´-GGAAACAGCTATGACCATG-3´
5´-GTAAAACGACGGCCAGTG-3´
5´-GCCCAGGTCACCGGCATG-3´
Schließlich wurden 6 mutierte γ-Subklone (Tab. 2.10) zur Herstellung der γ-Deletionsmutanten verwendet. Dazu wurden präparative KpnI/SacI-Restriktionsschnitte mit den
Vektoren pKH7, pMM11, pMM15, pMM12, pMM22, pMM13 und pMM14 durchgeführt.
Tab. 2.10 Bezeichnung der γ-Deletions-Subklone
Deletion
γ∆A284-V286
γ∆S281-V286
γ∆E278-V286
γ∆E275-V286
γ∆I272-V286
γ∆Q269-V286
Bezeichnung
MM11
MM15
MM12
MM22
MM13
MM14
50
Der geöffnete Vektor pKH7 wurde dephosphoryliert und mit den KpnI/SacI-Fragmenten
der γ-Deletions-Subklone ligiert. Hierzu wurden in den Ligationsreaktionen jeweils ca.
100 ng geöffneter Vektor und ca. 100 ng mutiertes Fragment eingesetzt und mit jeweils
400 u T4 DNA Ligase über Nacht bei 16°C inkubiert. Kompetente E. coli DH5α-Zellen
wurden jeweils mit 10 µl der Ligationsansätze transformiert und auf ampicillinhaltigen
LB-Agarplatten ausgestrichen, die über Nacht bei 37°C inkubiert wurden. Einzelne Klone
wurden in LB-Medium angezogen und anhand einer Restriktionsanalyse sowie einer Sequenzierung mit dem Sequenzierungsprimer A3 (Tab. 2.11) auf eine erfolgreiche Ligation
überprüft.
Tab. 2.11 Nukleotidsequenz des Sequenzierungsprimers A3
Bezeichnung
A3
Nukleotidsequenz
5´-GCACCTCAAGAGCATCGTAC-3´
Von ausgewählten positiven Klonen wurden Stammkulturen angelegt (Tab. 2.12).
Tab. 2.12 Bezeichnung der γ-Deletionsmutanten
Deletion
γ∆A284-V286
γ∆S281-V286
γ∆E278-V286
γ∆E275-V286
γ∆I272-V286
γ∆Q269-V286
Bezeichnung
MM16
MM20
MM17
MM8
MM18
MM19
Plasmide positiver γ-Deletionsmutanten wurden anschließend isoliert und kompetente E.
coli DK8-Zellen mit jeweils ca. 15 ng der Plasmid-DNA transformiert. Jeweils ein Klon
pro Transformation wurde in LB-Medium angezogen und anhand einer Restriktionsanalyse überprüft.
Erfolgreich transformierte E. coli DK8-Klone wurden anhand des Wachstums auf Succinat-Agarplatten auf eine funktionsfähige ATP-Synthase getestet. E. coli-Stämme ohne
funktionsfähige ATP-Synthase sind aufgrund des Mangels an einem C4-DicarbonsäureTransporter nicht zum Wachstum auf nichtvergärbaren Kohlenstoffquellen, wie z.B. Succinat, fähig (Boogerd et al. 1998).
Dazu wurden Proben von E. coli DK8-Deletionsmutanten aus LB-Stammkulturen auf
Succinat-Agarplatten ausgestrichen und bis zu 3 Tagen bei 37°C inkubiert. Zur Bewertung
der Wachstumsgeschwindigkeit wurden E. coli DK8-Deletionsmutanten-Klone mit einer
Impföse von ampicillinhaltigen LB-Agarplatten abgenommen und auf Succinat-Agarplatten vereinzelt. Die Platten wurden 3 Tage bei 37°C inkubiert und anschließend fotografiert. Der Durchmesser einzelner Klone wurde mit Hilfe des Programms ImageProPlus 4.0
(Media Cybernetics, Silver Spring, MD, USA) ermittelt. Weiterhin wurden die E. coli
DK8-Deletionsmutanten auf ihr Wachstum in glycerinhaltigem Minimalmedium überprüft, indem jeweils eine Testanzucht in 1 l Minimalmedium durchgeführt wurde. Dazu
51
wurden jeweils 20 ml ampicillinhaltiges LB-Medium mit 20 µl einer entsprechenden
DK8-Stammkultur angeimpft und ca. 8 h bei 37°C inkubiert. Mit diesen Kulturen wurden
anschließend ampicillinhaltige Minimalmedium-Vorkulturen (Volumen jeweils 200 ml)
angeimpft, die ca. 12 h bei 37°C inkubiert wurden. Die Vorkulturen wurden verwendet um
jeweils 1 l ampicillinhaltiges Minimalmedium bis zu einer OD600 von 0,1 anzuimpfen. Die
Zellen wurden bei 37°C inkubiert und das Wachstum der Zellen anhand der Bestimmung
der OD bei einer Wellenlänge von 600 nm über einen Zeitraum von 14 h verfolgt.
2.3.3.3 Herstellung einer EFOF1-Deletionsmutante
Für die Herstellung einer EFOF1-Deletionsmutante wurde das KpnI/SacI-Fragment von
pMM15 (enthält die Deletion γ∆S281-V286) in den Vektor pSE1 eingesetzt. Dazu wurden
ca. 10 µg pSE1 und ca. 10 µg pMM15 mit jeweils 50 u KpnI und 50 u SacI geöffnet und
der geöffnete pSE1-Vektor mit CIAP dephosphoryliert. Anschließend wurden die DNAFragmente gelelektrophoretisch aufgereinigt. Für die Ligation wurden ca. 100 ng des
KpnI/SacI-geöffneten und dephosphorylierten pSE1-Vektors mit ca. 100 ng des
KpnI/SacI-Fragments von pMM15 versetzt und mit T4 DNA Ligase über Nacht bei 16°C
inkubiert. Nach der Transformation kompetenter E. coli DH5α-Zellen mit 10 µl des Ligationsansatzes wurden einzelne Klone in ampicillinhaltigem LB-Medium angezogen und
anhand einer Restriktionsanalyse überprüft. Der korrekte Einbau der Deletion in den
Vektor pSE1 wurde anhand einer Sequenzierung mit dem Sequenzierungsprimer A3 überprüft. Ein positiver Klon wurde ausgewählt und mit MM21 bezeichnet.
2.3.3.4 Isolierung von EFOF1
Nach der Transformation kompetenter E. coli DK8-Zellen mit pMM21 erfolgte die ÜberNacht-Bakterienanzucht eines erfolgreich transformierten DK8-Klons in 12 l glycerinhaltigem Minimalmedium nach dem in 2.3.2.4 beschriebenen Protokoll. Die Zellernte ergab
jeweils ca. 30 g Biofeuchtmasse. Die Zellen wurden in je 100 ml Puffer 1 + Saccharose
(versetzt mit jeweils einer Tablette EDTA-freiem Protease-Inhibitor Cocktail) resuspendiert, homogenisiert und bei -80°C gelagert. Nach dem Auftauen der Zellsuspension wurden die Zellen mit Hilfe eines Ribi Zell-Fraktionators bei 20000 psi aufgeschlossen und
anschließend Zelltrümmer abzentrifugiert (20 min, 20000 x g, 4°C). Der Überstand wurde
mit dem gleichen Volumen an Puffer 1 verdünnt und zentrifugiert (60 min, 250000 x g,
4°C). Anschließend wurde das Pellet in 100 ml Waschpuffer pro 20 g Biofeuchtmasse
aufgenommen und homogenisiert. Die Suspension wurde 30 min im Eisbad gerührt und
anschließend zentrifugiert (60 min, 250000 x g, 4°C). Das Pellet wurde in 100 ml Waschpuffer aufgenommen und homogenisiert. Anschließend wurde die Suspension nochmals
30 min im Eisbad gerührt und zentrifugiert (90 min, 250000 x g, 4°C). Das Pellet wurde in
16 ml Lagerungspuffer resuspendiert und die Suspension (in 2 ml-Portionen aliquotiert) in
flüssigem Stickstoff eingefroren und bei -80°C gelagert. Für einen Rotationstest wurden
52
jeweils 8 Aliquots nach dem Auftauen mit den folgenden Substanzen bis zu den angegebenen Endkonzentrationen versetzt (Tab. 2.13).
Tab. 2.13 Bedingungen für die Extraktion von EFOF1
Substanz
TRIS/HCl
ADP
EDTA-freier Inhibitorcocktail
Glycerin
MgCl2
ddH2O
Endkonzentration
50 mM (pH 7,5)
1 mM
1 Tablette
8,5% (v/v)
1,8 mM (zusätzlich zum MgCl2 aus dem
Lagerungspuffer, so daß sich eine
Endkonzentration von 5 mM ergibt)
ad 50 ml
Anschließend wurde die Lösung mit 2 ml 25% (w/v) Octylglucosid versetzt und 15 min
im Eisbad gerührt. Nach einer weiteren Zugabe von 2,4 ml 25% (w/v) Octylglucosid
wurde die Lösung 30 min im Eisbad gerührt und zentrifugiert (90 min, 100000 x g, 4°C).
Der Überstand enthielt neben Verunreinigungen EFOF1 und wurde durch Ni-NTA- und
Streptactin-Affinitätschromatographie weiter aufgereinigt. Dazu wurde der Überstand
zunächst mit 50 µg Avidin versetzt und 30 min bei 4°C inkubiert. Dadurch wurde im
Überstand enthaltenes Biotin mit Avidin abgesättigt, so daß die Bindung des Proteins auf
der Streptactin-Säule nicht gestört wurde. Die Lösung wurde dann mit dem gleichen Volumen an Streptactin A-Puffer auf 1% (w/v) Octylglucosid verdünnt und mit 5 ml Streptactin-Sepharosematerial versetzt. Das Säulenmaterial wurde zuvor mit Streptactin A-Puffer äquilibriert. Die Probe wurde 10 min auf dem Schüttler inkubiert und anschließend auf
eine PD10-Leersäule gegeben. Nach dem Waschen des Säulenmaterials mit 15 ml Streptactin A-Puffer + 1% (w/v) Octylglucosid erfolgte die Elution des Proteins durch Zugabe
von Streptactin B-Puffer + 1% (w/v) Octylglucosid in 0,5 ml-Fraktionen. Proteinenthaltende Fraktionen wurden vereinigt und die Lösung entweder direkt für den Rotationstest
(siehe 2.3.4.3) verwendet oder über eine Ni-NTA-Affinitätschromatographie weiter aufgereinigt. Dazu wurden 2 ml Ni-NTA-Material in einer NAP-5-Leersäule mit Nickel A-Puffer äquilibriert und ca. 4 ml des Streptactinsäulen-Eluats über die Säule gegeben. Anschließend wurde die Probe mit 5 ml Nickel A-Puffer + 1% (w/v) Octylglucosid gewaschen und durch Zugabe von Nickel B-Puffer + 1% (w/v) Octylglucosid in 0,5 ml-Fraktionen eluiert. Proteinenthaltende Fraktionen wurden vereinigt und für den Rotationstest
verwendet.
53
2.3.4 Fluoreszenzmikrovideographie
2.3.4.1 Biotinylierung von EF1
Für den mikrovideographischen Rotationstest wurde ein fluoreszenzfarbstoffmarkiertes,
biotinyliertes Aktinfilament, das in dem Test als Rotationsindikator dient, mit Hilfe von
Streptavidin an EF1 gebunden. Dazu wurde ebenfalls biotinyliertes EF1 benötigt. Hierzu
wurden zunächst 2-3 mg Proteinpräzipitat abzentrifugiert (10 min, 14000 rpm, 15°C) und
in 1 ml MKM-Puffer resuspendiert. Anschließend wurde das Protein durch Gelfiltration
über NAP-10-Säulen, die mit MKM-Puffer äquilibriert wurden, von (NH4)2SO4 gereinigt.
Nach Bestimmung der Proteinkonzentration wurde die Probe mit dem 20fachen molaren
Überschuß an Biotin-PEAC5-Maleimid (Stammlösung: 20 mM in DMSO) versetzt und
15-20 min bei RT inkubiert. Überschüssiges Biotin-PEAC5-Maleimid wurde durch eine
Ni-NTA-Affinitätschromatographie entfernt. Dazu wurde jeweils 1 ml Ni-NTA-Superflow
Suspension auf eine NAP-5-Leersäule gegeben und das Säulenmaterial mit MKM-Puffer
äquilibriert. Anschließend wurde die proteinhaltige Probe auf die Säule gegeben und mit 8
ml MKM-Puffer gewaschen. Die Elution erfolgte durch Zugabe von MKM-Puffer +
150 mM Imidazol in 0,5 ml Fraktionen. Proteinenthaltende Fraktionen wurden vereinigt,
mit 1 mM MgATP versetzt und entweder sofort in weiteren Messungen eingesetzt oder
mit 25% (v/v) Glycerin versetzt, in flüssigem Stickstoff schockgefroren und bis zur
weiteren Verwendung bei -80°C gelagert. Die Ausbeute betrug üblicherweise ca. 250 µg
Protein pro 500 µl Eluatvolumen.
2.3.4.2 Präparation von farbstoffmarkiertem F-Actin
Das für den Rotationstest verwendete F-Actin wurde nach einer von Pardee und Spudich
(1982) beschriebenen Methode aus Kaninchen-Muskelzellen gewonnen. Als Ausgangsmaterial wurde Muskel-Acetonpuder, das von G. Hikade (Abteilung Biophysik, Universität Osnabrück) präpariert wurde, verwendet. Zur Isolierung des Actins wurden 10 g
Acetonpuder, das bei -80°C gelagert wurde, langsam aufgetaut, in 200 ml G2-Puffer resuspendiert und über Nacht bei 4°C gerührt. Die Suspension wurde anschließend zentrifugiert (30 min, 20000 x g, 4°C) und der Überstand mit 100 mM KCl sowie 10 mM MgCl2
versetzt, wodurch die Polymerisierung von G-Actin zu F-Actin gestartet wurde. Nach 2 h
Rühren bei RT wurde KCl bis zu einer Endkonzentration von 0,8 M zugegeben und anschließend zentrifugiert (2 h, 100000 x g, 4°C). Die F-Actin enthaltenden Pellets wurden
in möglichst wenig Überstand resuspendiert und homogenisiert. Anschließend erfolgte
eine Dialyse (Dialysemembran: Spectra/Por, MWCO: 3500) gegen G2-Puffer bei 4°C für
ca. 18 h (Wechsel des Puffers in ca. 4 h-Intervallen), wodurch das Actin wieder in seine
monomere Form überführt wurde. Nicht zerfallenes F-Actin wurde durch Zentrifugation
(2 h, 100000 x g, 4°C) entfernt und der Überstand (G-Actin) in 2 ml-Fraktionen aliquotiert
und bei -80°C gelagert. Die Ausbeute lag bei ca. 45 mg G-Actin pro 10 g Acetonpuder.
Die Biotinylierung des gereinigten G-Actins wurde von H. Kenneweg (Abteilung Biophysik, Universität Osnabrück) durchgeführt. Dazu wurde jeweils ein 2 ml-Aliquot G-Actin
aufgetaut und in 1 ml G-Puffer aufgenommen. Durch Gelfiltration über eine PD10-Säule
54
gegen G-Puffer wurde die Probe von DTT gereinigt. Das Eluat wurde mit 200 µM BiotinPEAC5-Maleimid versetzt und 4 h bei RT inkubiert. Überschüssiges Biotin-PEAC5-Maleimid wurde durch eine Dialyse (Dialysemembran: Spectra/Por, MWCO: 3500) gegen 2 l
G-Puffer für 16 h sowie die anschließende zweifache Gelfiltration über PD10-Säulen gegen G-Puffer entfernt. Das biotinylierte G-Actin wurde in 100 µl-Aliquots (Konzentration
ca. 0,75 mg/ml) bei -80°C gelagert.
Zur Polymerisierung und Farbstoffmarkierung wurde jeweils ein Aliquot biotinyliertes GActin aufgetaut und mit 20 mM MOPS/KOH (pH 7,0), 100 mM KCl, 10 mM MgCl2 sowie Phalloidin-Tetramethylrhodamin-B-Isothiocyanat (PTMR) in einem molaren Verhältnis von 1:1 PTMR zu G-Actin versetzt und 3 h bei 4°C inkubiert. Hierbei werden ca. 200250 Farbstoffmoleküle pro µm an das F-Actinfilament gebunden. Die Proben wurden ohne
weitere Aufreinigung eingesetzt und bis zur weiteren Verwendung maximal 4 Wochen bei
4°C gelagert.
2.3.4.3 Fluoreszenzmikroskopischer Rotationstest
Der mikrovideographische Rotationstest dient zum Nachweis der Rotation bestimmter
Untereinheiten der ATP-Synthase relativ zu anderen Untereinheiten des Enzyms. Hierzu
wird EF1 (Abb. 2.5) oder EFOF1 (Abb. 2.7) über eine Stator-Untereinheit auf einer Glasplatte immobilisiert und ein Rotationsindikator, in diesem Fall ein Actinfilament, an eine
Rotor-Untereinheit des Enzyms gebunden. Nach der Zugabe von Substrat (ATP) zum Enzym kann die Rotation des Actin-Filaments unter dem Mikroskop beobachtet und aufgezeichnet werden. Für den Test wurden zunächst Durchflußküvetten (Abb. 2.4) hergestellt,
in denen das Enzym in geeigneter Weise immobilisiert werden konnte und in denen rotierende Actin-Filamente unter dem Mikroskop beobachtet werden konnten. Die Durchflußküvetten bestanden jeweils aus einem Objektträger (Abmessung: 26 x 76 mm, Dicke
0,15 mm; Menzel-Gläser, Braunschweig), einem Deckglas (Abmessung: 21 x 26 mm,
Dicke 0,15 mm; Menzel-Gläser, Braunschweig) und zwei Streifen Parafilm M (American
National Can, Chicago, IL, USA). Als Klebstoff für die Durchflußküvetten wurde Silikon
Hochvakuumfett leicht (Losimol, Hannover) verwendet. Die Beladung der Küvette erfolgte, indem eine Lösung auf einer Seite der Durchflußküvette in den Spalt zwischen
Objektträger und Deckglas pipettiert wurde, während überschüssige Lösung auf der anderen Seite der Küvette mit Hilfe eines Filterpapiers abgesaugt wurde.
Parafilmstreifen
Deckglas
Probenaufgabe
Abb. 2.4 Aufbau der Durchflußküvetten
Objektträger
55
a c tin fila m e n t
S tr e p a v id in
b
C
>
H is - ta g
=
>
A D P + P
i
A T P
Abb. 2.5 Schematische Darstellung des Versuchsaufbaus zur Bestimmung des
Drehmoments von EF1-Komplexen
Die Rotor-Untereinheit γ mit dem über das Cystein γC108 angebundenen Actinfilament ist in rot und die Stator-Untereinheiten α und β in
blau dargestellt (nach Winkler, 2001). Die Anbindung des Actinfilaments erfolgt durch Biotin-Streptavidin-Biotin-Wechselwirkungen.
Für den Rotationstest mit EF1-Proben (Tab. 2.14) wurde zunächst eine Durchflußküvette
mit Ni-NTA-Meerrettich-Peroxidase beschichtet und anschließend noch frei gebliebene
Protein-Bindungsstellen auf der Glasoberfläche mit BSA blockiert. Über die Ni-NTAFunktion der Meerrettich-Peroxidase konnte nun biotinyliertes EF1, das jeweils am NTerminus jeder β-Untereinheit einen His-tag enthielt, auf der Meerrettich-PeroxidaseSchicht immobilisiert werden. Anschließend wurde mit Hilfe von Streptavidin biotinyliertes F-Actin an das ebenfalls biotinylierte EF1 gebunden. Die Länge der F-Actin-Filamente wurde durch mehrmaliges Pipettieren durch eine 200µl-Pipettenspitze beeinflußt.
Auf diese Weise wurden die F-Actin-Filamente durch Zerscheren auf ca. 1-5 µm Länge
verkürzt. Nach jeder Beladung der Durchflußküvette mit proteinhaltiger Lösung erfolgte
ein Waschschritt durch Spülen mit BSA-haltigem MKM-Puffer (= BMKM-Puffer).
56
Tab. 2.14 Pipettierschema für die Beladung der Durchflußküvetten für EF1-Rotationsexperimente
Volumen
Komponenten
1.
2 x 25 µl
2.
3.
4.
5.
6.
7.
2 x 25 µl
2 x 25 µl
2 x 25 µl
2 x 25 µl
3 x 25 µl
2 x 25 µl
8.
9.
3 x 25 µl
2 x 25 µl
0,8 µM Ni-NTA-Meerrettich-Peroxidase Konjugat
in MKM-Puffer
Waschen mit BMKM-Puffer
5-10 nM EF1 in BMKM-Puffer
0,5 µM Streptavidin in BMKM-Puffer
200 nM biotinyliertes, fluoreszenzfarbstoffmarkiertes F-Actin in BMKM-Puffer
20 mM Glucose, 0,2 mg/ml Glucoseoxidase,
50 µg/ml Katalase, 0,5% (v/v) β-Mercaptoethanol,
5 mM ATP in BMKM-Puffer
Inkubationszeit
4 min
4 min
4 min
4 min
7 min
-
Schließlich wurden die immobilisierten Enzyme mit einer ATP-haltigen Lösung versetzt
und die Durchflußküvetten bis zu 30 min lang mit Hilfe eines Inversions-Fluoreszenzmikroskops nach rotierenden Actinfilamenten abgesucht. Die ATP-haltige Lösung enthielt
zur Reduzierung der Farbstoffausbleichung durch die lichtabhängige Oxidation des Farbstoffs TMR durch in der Probe gelösten Sauerstoff β-Mercaptoethanol und ein sauerstoffverbrauchendes System, das den Sauerstoff mit Glucose zu Gluconolacton und H2O2 umsetzt und das H2O2 zu H2O und O2 abbaut.
Glucoseoxidase:
2 Glucose + 2 O2
⇒
2 Gluconolacton + 2 H2O2
Katalase:
2 H2O2
⇒
2 H2O + O2
______________________________________________________________
Netto-Reaktion:
2 Glucose + O2
⇒
2 Gluconolacton + 2 H2O
57
Abb. 2.6 Schematische Darstellung des Strahlengangs beim inversen Mikroskop
Olympus IX70
L1, L2, L3: Linsen; Ab: Aperturblende; Fb: Feldblende; Af: Anregungsfilter BP 520-550; Ob: Objektiv (100x); St: dichroitischer Teilerspiegel
DM565; Spf: Sperrfilter BA580IF; Pp: Photoprojektiv; Grüner Pfeil: Anregungslicht; Oranger Pfeil: Fluoreszenzlicht
Im Mikroskop wurde die Durchflußküvette mit Hilfe einer Quecksilberdampflampe beleuchtet, deren Licht zuvor durch eine Sammellinse (L1, Abb. 2.6) in den Filterkubus UMWIG gelangte. Der Filterkubus bestand aus einem Satz von Interferenzfiltern, unter anderem dem dichroitischen Teilerspiegel DM565, dem Sperrfilter BA580IF und dem Anregungsfilter BP 520-550. Der Anregungsfilter ließ nur Licht der Wellenlängen 520-550 nm
passieren, mit dem die Probe durch das 100x/1.40 Öl-Immersionsobjektiv beleuchtet
wurde. Das rotverschobene Fluoreszenzlicht des Farbstoffs TMR, mit dem die Actin-Filamente markiert wurden, fiel durch das Objektiv auf den Teilerspiegel und wurde anschließend durch den Sperrfilter von Streulicht befreit. Das Fluoreszenzlicht passierte anschließend die Linse L3 und das Photoprojektiv und wurde von der Kamera C 2400-08
detektiert. Die Vergrößerung betrug 225x (Objektiv: 100x; L3: 1,5x; Photoprojektiv:
1,5x). Das Beobachtungsfeld hatte eine Größe von 54 x 42 µm. Rotierende Aktinfilamente
wurden mit Hilfe eines VHS-PAL-Videorecorders mit 25 Bildern/s (= 1 Bild pro 40 ms)
aufgezeichnet. Die Aufzeichnung wurde unmittelbar nach der Auffindung eines Rotators
gestartet und entweder nach der Ablösung des Actin-Filaments vom Enzym oder dem
Ausbleichen des Actin-Filaments oder vor einem Wechsel zu einem weiteren Rotator be-
58
endet. Innerhalb dieser Beobachtungszeiten setzten sich die Laufzeiten der Rotatoren aus
Stillstands- und Rotationsphasen zusammen. Die Laufzeiten einzelner Rotatoren konnten
zusätzlich zur Ablösung oder Ausbleichung des Actin-Filaments sowie dem Wechsel eines
Rotators durch einen irreversiblen Rotationsstopp innerhalb der Beobachtungszeit beendet
werden. Die Anteile von Stillstands- und Rotationsphasen innerhalb der Laufzeiten wurden durch Ausstoppen der Phasen mit Hilfe von zwei Stoppuhren ermittelt. Dazu wurde
mit einer Stoppuhr die Laufzeit eines Rotators bestimmt und mit einer zweiten Uhr die
Gesamtdauer der Rotationsphasen des Rotators. Die Videodaten von Rotationsphasen einzelner Rotatoren wurden mittels eines Framegrabbers (FlashBus, Integral Technologies,
Indianapolis, IN, USA) digitalisiert. Zur Bestimmung der Filamentlänge und der Rotationsgeschwindigkeit wurde das Programm ImageProPlus 4.0 (Media Cybernetics, Silver
Spring, MD, USA) verwendet.
b io tin
s tr e p ta c tin
s tre p -ta g
P
F Q H
K E
S
W
S
C
a c tin fila m e n t
a
c
A
>
H is - ta g
b
C
>
=
@
A D P + P
i
A T P
Abb. 2.7 Schematische Darstellung des Versuchsaufbaus zur Bestimmung des
Drehmoments von EFOF1-Komplexen
Die Rotor-Untereinheiten γ, ε und c mit dem über die C-terminalen
Strep-tags der c-Untereinheiten angebundenen Actin-Filament sind
in rot und die Stator-Untereinheiten α, β, δ, b und a in blau dargestellt (nach Pänke et al. 2000).
59
Für die Untersuchung von EFOF1-Proben (Abb. 2.7) wurde das Protokoll geringfügig modifiziert (Tab. 2.15). Zum einen wurden sämtliche Substanzen nach dem Blockieren freier
Bindungsplätze mit BSA in Puffer D gelöst in die Durchlußküvette pipettiert und zum
anderen wurde anstatt Streptavidin Streptactin zur Verknüpfung von Actin-Filament und
Enzym verwendet.
Tab. 2.15 Pipettierschema für die Beladung der Durchflußküvetten für EFOF1-Rotationsexperimente
Volumen
Komponenten
1.
2 x 25 µl
2.
3.
4.
5.
6.
7.
2 x 25 µl
2 x 25 µl
2 x 25 µl
2 x 25 µl
3 x 25 µl
2 x 25 µl
8.
9.
3 x 25 µl
2 x 25 µl
0,8 µM Ni-NTA-Meerrettich-Peroxidase Konjugat
in MKM-Puffer
5-10 nM EFOF1 in D-Puffer
Waschen mit D-Puffer
0,5 µM Streptactin in D-Puffer
200 nM biotinyliertes, fluoreszenzfarbstoffmarkiertes F-Actin in D-Puffer
20 mM Glucose, 0,2 mg/ml Glucoseoxidase,
50 µg/ml Katalase, 0,5% (v/v) β-Mercaptoethanol,
5 mM ATP in D-Puffer
Inkubationszeit
4 min
4 min
4 min
4 min
7 min
-
2.3.5 Bestimmung von Aktivierungsenergien nach Arrhenius
Für eine Arrhenius-Analyse wurden jeweils 2-3 mg Proteinpräzipitat abzentrifugiert
(10 min, 14000 rpm, 15°C) und der Niederschag in 1 ml MKM-Puffer resuspendiert. Das
im Niederschlag enthaltene (NH4)2SO4 wurde durch Gelfiltration über eine NAP-10-Säule,
die mit MKM-Puffer äquilibriert wurde, entfernt. Anschließend wurde jeweils 1 ml NiNTA-Superflow Suspension kurz abzentrifugiert und das Ni-NTA-Material mit MKMPuffer äquilibriert, die proteinenthaltende Probe dazugegeben und die Suspension auf eine
NAP-5-Leersäule gegeben. Nach dem Waschen der Probe mit 8 ml MKM-Puffer wurde
das Protein durch Zugabe von MKM-Puffer + 150 mM Imidazol in 0,5 ml Fraktionen
eluiert. Proteinenthaltende Fraktionen wurden vereinigt und die Probe mit 1 mM MgATP
versetzt. Die Ausbeute betrug üblicherweise ca. 250 µg Protein pro 500 µl Eluatvolumen.
Für eine Arrhenius-Analyse wurde die ATP-Hydrolyseaktivität spektrophotometrisch in
Gegenwart eines ATP-regenerierenden Systems gemessen (Abb. 2.8). Der Aktivitätstest
beruht darauf, daß das von einer ATPase hydrolysierte ATP durch Pyruvat-Kinase regeneriert wird (Stiggall et al. 1979). Das Enzym überträgt dabei die Phosphatgruppe von
Phosphoenolpyruvat auf das ADP, wobei ATP und Pyruvat entstehen. Das Pyruvat wird
anschließend durch Lactat-Dehydrogenase zu Lactat reduziert, wobei NADH zu NAD+
60
oxidiert wird. Da pro regeneriertem ATP ein NADH umgesetzt wird, ist die Abnahme der
NADH-Konzentration, die sich photometrisch bei 340 nm verfolgen läßt, ein Maß für die
ATP-Hydrolyseaktivität.
Phosphoenolpyruvat
ADP
+ Pi
Pyruvat-Kinase
ATPase
ATP
Pyruvat
NADH
Lactat-Dehydrogenase
NAD+
Lactat
Abb. 2.8 Reaktionsschema des ATP-Hydrolyseaktivitätstests mit ATP-regenerierendem
System
Für den Aktivitätstest wurden jeweils 150 ml einer ATPase-Testlösung hergestellt, die in
15 ml-Aliquots maximal 2 Wochen lang bei -20°C für den Einsatz bei Aktivitätsmessungen gelagert wurden.
ATPase-Testlösung 25 mM TRIS/HCl (pH 7,5); 25 mM KCl; 2 mM MgCl2; 5 mM
KCN; 2 mM PEP; 5 mM ATP; 0,35 mM β-NADH; 30 u/ml L-LDH;
30 u/ml PK
Für eine Messung wurde zunächst jeweils 1 ml der aufgetauten und im Eisbad gelagerten
ATPase-Testlösung 10 min bei der gewünschten Temperatur im Bereich von 5-40°C inkubiert (die Messungen erfolgten mit Hilfe eines Photometers mit temperierbarem Küvettenhalter). Anschließend wurde die Reaktion durch Zugabe von 1 µg EF1 gestartet und die
Absorptionsabnahme bei 340 nm für 5-30 min aufgezeichnet. Aus dem linear abfallenden
Bereich der Meßkurven wurde mit einem molaren Extinktionskoeffizienten für NADH
von ε = 6,22*106 cm2/mol (bei 340 nm) nach dem Lambert-Beerschen Gesetz die Aktivität
bestimmt (Stiggall et al. 1978). Es ergibt sich aus
E = ε ∗c∗d
(Gleichung 2)
61
mit einer Schichtdicke d = 1 cm und ∆cNADH = ∆cATP sowie der Definition für die ATPHydrolyseaktivität (1 u = 1 µmol hydrolysiertes ATP pro Minute) für die Berechnung der
Aktivität u (und entsprechend für die spezifische Aktivität u/mg):
u=
∆n ATP
∆t
∆E ⎡ µmol ⎤
⎡ µmol ⎤
⎢⎣ min ⎥⎦ = 6,22 ∗ ∆t ⎢⎣ min ⎥⎦ .
(Gleichung 3)
Für die Umrechnung von ATP-Hydrolyseaktivitäten in Umsatzraten wurde eine Molmasse
von EF1 von MW = 384000 g/mol verwendet. Damit ergibt sich:
1
u
µmol
1
=1
= 6,4 .
min∗ mg
mg
s
(Gleichung 4)
Die Umsatzrate gibt die Zahl hydrolysierter ATP-Moleküle pro ATPase-Komplex und
Sekunde an.
Als Ausgangsmaterial für die Herstellung der Cystein-Doppelmutante MM10 diente das
Plasmid pKH7. Die Mutation αP280C wurde nach dem in Abbildung 2.2 A beschriebenen
Verfahren in das Plasmid eingeführt. Die Mutagenese von γA285C erfolgte nach dem in
Abbildung 2.1 gezeigten Verfahren. Als Templat-DNA für die PCR wurden die Plasmide
pKH7 und pMM3 verwendet. Der Subklon pMM3 ist ein pBSK-Derivat, welches das
XhoI/KpnI-Fragment aus pKH7 enthält. Dieses Fragment enthält einen Teil des codierenden Bereichs für Untereinheit α (L66-W513) und einen Teil der nichtcodierenden Region
zwischen den Untereinheiten α und γ. Der Subklon wurde hergestellt, indem jeweils ca.
10 µg pKH7 und pBSK mit jeweils 50 u XhoI und KpnI geschnitten wurden und der geöffnete pBSK-Vektor mit CIAP dephosphoryliert wurde. Nach der Aufreinigung der Fragmente wurden ca. 50 ng des dephosphorylierten, XhoI/KpnI-geöffneten pBSK-Vektors mit
ca. 110 ng des XhoI/KpnI-Fragments von pKH7 versetzt und über Nacht mit T4 DNA Ligase bei 16°C inkubiert. Nach der Transformation kompetenter E. coli DH5α-Zellen mit
5 µl des Ligationsansatzes und der Anzucht einzelner Klone in jeweils 10 ml
ampicillinhaltigem LB-Medium wurden die Klone anhand einer Restriktionsanalyse auf
eine erfolgreiche Ligation überprüft und schließlich ein Klon (Bezeichnung: MM3) für die
Mutagenese von αP280C verwendet.
Die Erzeugung der Mutation αP280C erfolgte mit Hilfe einer PCR (Tab. 2.17 und 2.18),
wobei das Plasmid pMM3 als Templat-DNA verwendet wurde. Als Primer wurden die
Mutationsprimer mp4 und mp-4 (Tab. 2.16) eingesetzt.
62
Tab. 2.16 Nukleotidsequenzen der Primer zur Erzeugung der Mutation αP280C
Nukleotidsequenz
5´-GCTGCTCCGTCGTTGTCCAGGACGTGAAG-3´
5´-CTTCACGTCCTGGACAACGACGGAGCAGC-3´
mp4
mp-4
Tab. 2.17 Pipettierschema der PCR zur Erzeugung der Mutation αP280C
Komponenten
mp4 (25 pmol/µl)
mp-4 (25 pmol/µl)
dNTP-Mix (jeweils 2 mM dATP, dCTP, dGTP, dTTP)
ddH2O (steril)
5 µl
1 µl
1 µl
2,5 µl
ad 50 µl
1 µl
Zu den PCR-Ansätzen wurden jeweils ca. 50 ng Templat-DNA (pMM3) zugegeben und
folgendes Temperaturprogramm durchlaufen (Tab. 2.18):
Tab. 2.18 Temperaturprogramm der PCR zur Erzeugung der Mutation αP280C
Hybridisierung*
Elongation*
Denaturierung*
Kühlung
Temperatur
95°C
60°C
68°C
95°C
68°C
4°C
Dauer
300 s
60 s
540 s
60 s
600 s
bis zur weiteren
Verwendung
Anschließend wurden die PCR-Reaktionsansätze mit jeweils 20 u DpnI versetzt und 1 h
bei 37°C inkubiert. Nach dem Verdau der Templat-DNA durch DpnI erfolgte die Transformation von kompetenten E. coli DH5α-Zellen mit jeweils 3 µl der PCR-Ansätze. Einzelne Klone wurden in jeweils 10 ml ampicillinhaltigem LB-Medium angezogen und zunächst anhand einer Restriktionsanalyse überprüft. Das Einführen der Punktmutation
αP280C in das Plasmid pMM3 konnte jedoch nur durch eine Sequenzierung eindeutig
überprüft werden. Dazu wurden verschiedene Klone im Bereich zwischen den Schnittstellen XhoI und KpnI mit Hilfe der Sequenzierungsprimer RP, FP (Tab. 2.9) und seqI
(Tab. 2.19) durchsequenziert.
Tab. 2.19 Nukleotidsequenz des Sequenzierungsprimers seqI
Bezeichnung
seqI
Nukleotidsequenz
5´-AGAGCACGGCGCACTGGC-3´
63
Schließlich wurde ein mutierter pMM3-Klon für die Rückklonierung des XhoI/KpnIFragments mit der Mutation αP280C in den Vektor pKH7 verwendet. Dazu wurden ca.
10 µg pKH7 und ca. 3 µg des pMM3-Derivats mit jeweils 50 u XhoI und 50 u KpnI
geöffnet und die Fragmente nach der Dephosphorylierung des pKH7-Schnittansatzes gelelektrophoretisch aufgereinigt. Für die Ligation wurden ca. 40 ng des dephosphorylierten
und XhoI/KpnI-geöffneten pKH7 und ca. 40 ng des mutierten XhoI/KpnI-Fragments verwendet. Anschließend erfolgte die Transformation von kompetenten E. coli DH5α-Zellen
mit 5 µl des Ligationsansatzes. Einzelne Klone wurden anhand einer Restriktionsanalyse
sowie einer Sequenzierung mit dem Sequenzierungsprimer A2 (Tab. 2.20) auf eine erfolgreiche Ligation geprüft.
Tab. 2.20 Nukleotidsequenz des Sequenzierungsprimers A2
Bezeichnung
A2
Nukleotidsequenz
5´-GGAACGAACGCAGAAACG-3´
Schließlich wurde ein positiver Klon (Bezeichnung: MM6) für die Herstellung der
Cystein-Doppelmutante MM10 ausgewählt.
Für die Einführung der Mutation γA285C in das Plasmid pKH7 wurde zunächst dasselbe
Verfahren verwendet, wie zur Einführung der Mutation αP280C. Dazu wurde eine PCR
mit den Mutationsprimern mp3 und mp-3 (Tab. 2.21) und dem Subklon-Plasmid pMM4
(siehe 2.3.3.1) als Templat-DNA durchgeführt (Zusammensetzung der Reaktionsansätze
und Temperaturprogramm entsprechend Tab. 2.17 und Tab. 2.18). Mit diesem Verfahren
wurden jedoch jeweils nach dem DpnI-Verdau der Templat-DNA und der Transformation
von kompetenten E. coli-DH5α-Zellen auch nach Variation der Hybridisierungstemperaturen im Bereich von 50-60°C in keinem Fall Klone erhalten. Die Ursachen hierfür wurden nicht weiter untersucht, stattdessen wurde ein anderes Mutageneseverfahren genutzt.
Die Mutagenese wurde schließlich nach dem in Abbildung 2.1 gezeigten Verfahren mit
vier Primern durchgeführt (Tab. 2.21), wobei die Primer mp3 und mp-3 als Mutationsprimer und die Primer mp4 und HL347 als Außenprimer verwendet wurden.
Tab. 2.21 Nukleotidsequenzen der Primer zur Erzeugung der Mutation γA285C
Bezeichnung
mp3
mp-3
mp4
HL347
Nukleotidsequenz
5´-CTCGGGGGCCGCCTGTGTTTAAACAGG-3´
5´-CCTGTTTAAACACAGGCGGCCCCCGAG-3´
5´-GCTGCTCCGTCGTTGTCCAGGACGTGAAG-3´
5´-GGTACCAATGAGCTCCATCATGTTTA-3´
Zunächst wurden zwei PCR mit jeweils einem Mutations- und einem Außenprimer durchgeführt (Tab. 2.22).
64
Tab. 2.22 Pipettierschema der PCR zur Erzeugung der Mutation γA285C
5 µl
1 µl
1 µl
3 µl
ad 50 µl
1 µl
Komponenten PCR 1
mp3 (25 pmol/µl)
HL347 (25 pmol/µl)
dNTP-Mix (2 mM je dNTP)
ddH2O
Komponenten PCR 2
mp4 (25 pmol/µl)
mp-3 (25 pmol/µl)
ddH2O
Die PCR-Ansätze wurden mit jeweils ca. 20 ng pKH7-Templat-DNA versetzt und anschließend folgendes Temperaturprogramm durchlaufen (Tab. 2.23):
Tab. 2.23 Temperaturprogramm der PCR zur Erzeugung der Mutation γA285C
Hybridisierung*
Elongation*
Denaturierung*
Kühlung
Temperatur
95°C
55°C
68°C
95°C
68°C
4°C
Dauer
300 s
60 s
180 s
60 s
600 s
bis zur weiteren
Verwendung
Anschließend wurden die PCR-Produkte gelelektrophoretisch von der Templat-DNA gereinigt und aus dem Agarosegel isoliert. Nach der Konzentrationsabschätzung anhand eines Agarosegels wurde eine dritte PCR mit den Produkten von PCR 1 und 2 ohne weitere
Templat-DNA durchgeführt. Von den Produkten aus PCR 1 und 2 wurden jeweils ca.
0,4 pmol (Ansatz A), 0,04 pmol (Ansatz B) bzw. 0,004 pmol (Ansatz C) eingesetzt und
zur Steigerung der Ausbeute zusätzlich jeweils 25 pmol der Außenprimer HL347 und mp4
zugegeben (Tab. 2.24).
Tab. 2.24 Pipettierschema der dritten PCR zur Erzeugung der Mutation γA285C
mp4 (25 pmol/µl)
HL347 (25 pmol/µl)
ddH2O
Produkt aus PCR1 (ca. 7 ng/µl)
Produkt aus PCR 2
(ca. 50 ng/µl)
PCR 3
Ansatz A
5 µl
1 µl
1 µl
3 µl
ad 50 µl
20 µl
10 µl
PCR 3
Ansatz B
5 µl
1 µl
1 µl
3 µl
ad 50 µl
2 µl
1 µl
PCR 3
Ansatz C
5 µl
1 µl
1 µl
3 µl
ad 50 µl
0,2 µl
0,1 µl
1 µl
1 µl
1 µl
65
Anschließend wurde folgendes Temperaturprogramm durchlaufen (Tab. 2.25):
Tab. 2.25 Temperaturprogramm von PCR 3
Hybridisierung*
Elongation*
Denaturierung*
Kühlung
Temperatur
95°C
55°C
68°C
95°C
68°C
4°C
Dauer
300 s
60 s
240 s
60 s
600 s
bis zur weiteren
Verwendung
Die Produkte aus Ansatz A und B wurden gelelektrophoretisch aufgereinigt (im Fall von
Ansatz C wurde kein Produkt gebildet) und nach der Isolierung aus dem Agarosegel (Elutionspuffervolumen: 80 µl) mit KpnI und SacI geschnitten. Dazu wurden 70 µl des eluierten Produkts aus PCR 3 in einem 100 µl Restriktionsschnittansatz mit 40 u KpnI und
40 u SacI für 2 h bei 37°C inkubiert und anschließend gelelektrophoretisch aufgereinigt.
Das Produkt wurde für die Ligation mit KpnI/SacI-geöffnetem pKH7 verwendet. Dazu
wurden ca. 40 ng dephosphorylierter, KpnI/SacI-geöffneter pKH7 mit ca. 35 ng des
KpnI/SacI-geschnittenen PCR-Produkts versetzt und mit T4 DNA Ligase 1 h bei RT
inkubiert. Anschließend erfolgte die Transformation kompetenter E. coli DH5α-Zellen mit
5 µl des Ligationsansatzes. Einzelne Klone wurden in ampicillinhaltigem LB-Medium
angezogen und anhand einer Restriktionsanalyse überprüft, jedoch konnte auch hier die
korrekte Einführung der Mutation γA285C nur anhand einer Sequenzierung eindeutig
überprüft werden. Hierzu wurden einzelne Klone mit den Sequenzierungsprimern seqII,
seqIII und seqIV im Bereich zwischen den Schnittstellen KpnI und SacI durchsequenziert
(Tab. 2.26).
Tab. 2.26 Nukleotidsequenzen der Sequenzierungsprimer seqII, seqIII und seqIV
seqII
seqIII
seqIV
Nukleotidsequenz
5´-GAAATCGAAGGCAAGCTG-3´
5´-GCCCAGGTCACCGGCATG-3´
5´-ACCTACGCCCGCAAACAC-3´
Ein positiver Klon (Bezeichnung: MM9) wurde für die Herstellung der Cystein-Doppelmutante verwendet. Dazu wurden ca. 5 µg pMM6 und ca. 5 µg pMM9 mit jeweils 30 u
KpnI und 30 u SacI geöffnet und der pMM6-Schnittansatz anschließend durch Zugabe von
2 u CIAP dephosphoryliert. Die DNA-Fragmente wurden gelelektrophoretisch aufgereinigt. Nach der Isolierung aus dem Agarosegel wurden ca. 45 ng dephosphorylierter,
KpnI/SacI-geöffneter pMM6-Vektor mit ca. 40 ng des KpnI/SacI-Fragments von pMM9
versetzt und 1 h bei RT mit T4 DNA Ligase inkubiert. Anschließend erfolgte die Transformation kompetenter E. coli DH5α-Zellen mit 5 µl des Ligationsansatzes. Einzelne
66
Klone wurden in ampicillinhaltigem LB-Medium angezogen und anhand einer
Restriktionsanalyse sowie einer Sequenzierung mit den Sequenzierungsprimern A2 und
A3 (siehe Tab. 2.20 und Tab. 2.11) überprüft. Ein positiver Klon wurde ausgewählt und
mit MM10 bezeichnet.
Zur Bestimmung der ATP-Hydrolyseaktivität von MM10-EF1 in Gegenwart von Inhibitoren wurden ca. 5 mg MM10, das als (NH4)2SO4-Präzipitat vorlag, abzentrifugiert (10 min,
14000 rpm, 15°C), in 1 ml KG-Puffer resuspendiert und durch Gelfiltration über eine
NAP-10-Säule, die mit KG-Puffer äquilibriert worden war, von (NH4)2SO4 gereinigt. Anschließend wurden 2,5 ml Ni-NTA-Suspension kurz abzentrifugiert und das Ni-NTA-Material mit KG-Puffer äquilibriert. Nach der Zugabe des NAP-10-Eluats wurde die Suspension auf eine NAP-5-Leersäule gegeben und mit 10 ml Ni-Waschpuffer gewaschen. Die
Elution des Proteins erfolgte mit Ni-Elutionspuffer in 0,5 ml-Fraktionen. Proteinenthaltende Fraktionen wurden vereinigt (Ausbeute: ca. 3,5 mg Protein in 2 ml Eluatvolumen)
und das gereinigte Protein sowohl für Reduktions- und Oxidationsversuche als auch für
Inhibierungsexperimente verwendet. Für Inhibierungsexperimente wurden Aliquots der
Enzymlösung auf 0,01 mg/ml verdünnt und mit 1 mM AMP-PNP, 1 mM AMP-PNP und
1 mM ADP, 1 mM NaN3 sowie 1 mM NaN3 und 1 mM ADP versetzt. Als Kontrollen
dienten Ansätze, in denen kein Inhibitor zugegeben wurde und Ansätze, in denen weder
Inhibitor noch Protein zugegeben wurde. Die Lösungen wurden 30 min bei RT inkubiert
und anschließend die ATP-Hydrolyseaktivitäten der Proben mit Hilfe eines modifizierten
LeBel-Tests (vgl. 2.3.2.2) bestimmt. Dabei enthielten die Testlösungen für den LeBel-Test
zusätzlich jeweils 5 mM AMP-PNP, 5 mM AMP-PNP und 5 mM ADP, 5 mM NaN3 bzw.
5 mM NaN3 und 5 mM ADP, damit sowohl die Kalibrierung als auch der Aktivitätstest
jeweils in Gegenwart einer Konzentration von 1 mM des entsprechenden Inhibitors erfolgte.
Die Reinigung von MM10-EF1 mittels Gelfiltration und Ni-NTA-Affinitätschromatographie erfolgte wie unter 2.3.7 beschrieben. Aliquots des gereinigten Proteins (jeweils
ca. 0,9 mg in 0,5 ml Eluatvolumen) wurden mit 20 mM DTT bzw. 100 µM DTNB und
2 mM ATP versetzt und über Nacht bei RT inkubiert. Dadurch wurde MM10-EF1 in die
reduzierte bzw. in die oxidierte Form überführt. Die Oxidationsreaktion wurde durch Zugabe von 20 mM NEM und 10 min Inkubation bei RT abgestoppt. Anschließend wurden
die Reaktionsansätze durch Gelfiltration über NAP-5-Säulen, die mit KG-Puffer äquilibriert wurden, gereinigt. Das reduzierte MM10-EF1 (ca. 0,7 mg in 0,8 ml KG-Puffer)
wurde anschließend durch die Zugabe von 100 µM DTNB oxidiert und das oxidierte
MM10-EF1 durch Zugabe von 20 mM DTT reduziert. Zur Überprüfung des Reaktionsfortschritts wurden nach bestimmten Zeiten Proben der Reaktionsansätze für ein SDS-Poly-
67
acrylamidgel abgenommen. Die Proben wurden zum Abstoppen der Reaktionen jeweils
mit 20 mM NEM versetzt und 5 min bei RT inkubiert sowie anschließend bis zur Probenvorbereitung für das SDS-Gel bei -20°C gelagert.
2.3.9 Dissoziation/Rekonstitution und Oxidation/Reduktion von Cystein-Doppelmutanten
Das in diesem Kapitel beschriebene Verfahren dient dem biochemischen Nachweis einer
Rotationsbewegung der Rotor-Untereinheit γ relativ zum α3β3-Hexagon des Stators der
ATP-Synthase. Die Vorgehensweise entspricht dabei grundsätzlich einem von Duncan et
al. (1995) beschriebenen Verfahren, das für diese Arbeit in einigen Punkten modifiziert
wurde. Für das Experiment werden stets zwei verschiedene EF1-Cysteinmutanten benötigt.
Zum einen eine Cystein-Doppelmutante, die zwei unter oxidierenden Bedingungen
verbrückbare Cysteine enthält, wobei sich ein Cystein in γ und weitere jeweils in den αoder β-Untereinheiten befinden müssen. Zum anderen eine Cystein-Einfachmutante, die
nur über die entsprechenden α- oder β-Cysteine verfügt. Im Rahmen dieser Arbeit wurde
dieses Experiment in zwei Versionen durchgeführt. Als EF1-Mutantenpaare wurden dazu
MM10-EF1 (αC280/γC285) und MM6-EF1 (αC280) sowie SW3-EF1 (βC380/γC87) und
GH7-EF1 (βC380) verwendet. Im Folgenden wird die Durchführung des Experimentes am
Beispiel von MM10- und MM6-EF1 beschrieben. Die Durchführung erfolgte bei
Verwendung von SW3- und GH7-EF1 jedoch in gleicher Weise.
2.3.9.1 Oxidation und Farbstoffmarkierung von EF1
Zur Erzeugung einer Disulfidbrücke zwischen αP280C und γA285C von MM10-EF1 wurden zunächst ca. 15 mg Protein, das als Ammoniumsulfat-Präzipitat vorlag, abzentrifugiert
(10 min, 14000 rpm, 15°C) und in 2,5 ml KG-Puffer resuspendiert. Anschließend wurde
das Protein durch Gelfiltration über eine PD-10-Säule, die mit KG-Puffer äquilibriert
wurde, von (NH4)2SO4 und DTT gereinigt. Die Elution erfolgte mit 3,5 ml KG-Puffer. Für
die Oxidation wurde das Eluat mit 2 mM ATP und 100 µM DTNB versetzt und 16 h bei
RT inkubiert. Die Reaktion wurde durch die Zugabe von 20 mM NEM und 10 min Inkubation bei RT gestoppt. Anschließend wurde die Probe durch Gelfiltration über PD-10Säulen von überschüssigen Reagenzien gereinigt und zugleich auf Dissoziationspuffer
umgepuffert. Unlösliche Niederschläge wurden vor der Gelfiltration durch Zentrifugation
(5 min, 14000 rpm, 15°C) abgetrennt.
Zur Markierung von MM6-EF1 wurde der Fluoreszenzfarbstoff Tetramethylrhodamin-5isothiocyanat (TMR-ITC) verwendet. Dabei handelt es sich um einen Farbstoff, der über
seine Isothiocyanat-Gruppe (R-N=C=S) mit freien Aminogruppen, wie z.B. dem N-Terminus eines Proteins oder der ε-Aminogruppe von Lysin, reagieren kann, wobei ein Thioharnstoffderivat entsteht. Für die Farbstoffmarkierung von MM6-EF1 wurden ca. 30 mg
Protein, das als Ammoniumsulfat-Präzipitat vorlag, abzentrifugiert (10 min, 14000 rpm,
68
15°C) und in 5 ml HEPES-Puffer resuspendiert. Das in der Lösung vorliegende
(NH4)2SO4 und DTT wurde durch eine Gelfiltration über PD-10-Säulen gegen HEPESPuffer entfernt. Nach der Bestimmung der Proteinkonzentration wurde ein 50facher molarer Überschuß an TMR-ITC, das als DMSO-Stammlösung mit einer Konzentration von
20 mM vorlag, zugegeben und 1 h bei RT inkubiert. Unlöslicher Niederschlag wurde
durch Zentrifugation (5 min, 14000 rpm, 15°C) entfernt und überschüssiger Farbstoff
durch Gelfiltration über PD-10-Säulen gegen Dissoziationspuffer abgetrennt. Der
Markierungsgrad von MM6-EF1 wurde durch die Messung der Proteinkonzentration und
der Farbstoffkonzentration in der gereinigten Probe ermittelt. Die Farbstoffkonzentration
wurde durch die Messung der Absorption der Probe bei einer Wellenlänge von 555 nm
(Absorptionsmaximum von TMR) bestimmt. Zur Berechnung der Konzentration wurde
ein Extinktionskoeffizient von εTMR (555 nm) = 65000 cm-1 M-1 verwendet. Der
Markierungsgrad betrug üblicherweise 20-30 Farbstoffmoleküle pro MM6-EF1.
2.3.9.2 Dissoziation von EF1-Mutanten und Rekonstitution von EF1-Hybriden
Nach der Oxidation von MM10-EF1 und der Farbstoffmarkierung von MM6-EF1 wurden
beide EF1-Mutanten in einem Verhältnis von 1:2 (ca. 10 mg MM10-EF1 und ca. 20 mg
MM6-EF1) gemischt und in flüssigem Stickstoff eingefroren. Die Proben wurden bei RT
aufgetaut und erneut in flüssigem Stickstoff eingefroren und schließlich bei -80°C gelagert.
Nach dem Auftauen bei RT wurden die Proben mit Rekonstitutionspuffer auf eine Proteinkonzentration von 0,5 mg/ml verdünnt, unlöslicher Niederschlag abzentrifugiert (5 min,
14000 rpm, 15°C), und anschließend gegen Rekonstitutionspuffer, der zusätzlich 2,5 mM
MgATP enthielt, 16 h bei RT dialysiert (Dialysemembran: Spectra/Por, MWCO 3500).
Dazu wurden pro 60 ml Probe 4 l Dialysepuffer eingesetzt.
2.3.9.3 Reduktion und Reoxidation von EF1-Hybriden
Die rekonstituierten EF1-Hybride wurden zunächst anhand einer Ni-NTA-Affinitätschromatographie gereinigt. Dazu wurden jeweils 5 ml Ni-NTA-Superflow Suspension kurz
abzentrifugiert und das Säulenmaterial mit Rekonstitutionspuffer, der 2,5 mM MgATP
enthielt, äquilibriert. Anschließend wurde das Dialysat (siehe 2.3.9.2), aus dem unlösliche
Bestandteile durch Zentrifugation (5 min, 14000 rpm, 15°C) entfernt wurden, zu dem
Säulenmaterial gegeben. Nachdem die Suspension über eine NAP-10-Leersäule gegeben
wurde, erfolgte ein Waschschritt mit 10 ml Ni-Waschpuffer. Die Elution der gereinigten
EF1-Hybride erfolgte durch die Zugabe von Ni-Elutionspuffer in 0,5 ml Fraktionen. Proteinhaltige Fraktionen wurden zusammengegeben und der Markierungsgrad des gereinigten Produkts bestimmt. Die Ausbeute betrug üblicherweise ca. 1,5 mg Protein pro 3 ml
Eluat und der Markierungsgrad lag bei 2-4 Farbstoffmolekülen pro EF1-Hybrid. Aliquots
der EF1-Hybridlösung wurden nun mit 4 mM AMP-PNP, 4 mM AMP-PNP und 4 mM
ADP sowie 4 mM ATP versetzt. Zusätzlich wurde eine Probe mitgeführt, bei der kein
69
Nukleotid zugegeben wurde. Nach 2 h Inkubation bei RT wurden die Proben durch die
Zugabe von 20 mM DTT und Inkubation für 16 h bei RT reduziert. Nach einer weiteren
Zugabe von 20 mM DTT und 2 h Inkubation bei RT wurden die Proben durch Gelfiltration über NAP-10-Säulen gereinigt. Hierbei wurden folgende Gelfiltrationspuffer eingesetzt: 1) KG-Puffer für die Probe, die kein Nukleotid enthielt, und die Probe, die 4 mM
ATP enthielt; 2) KG-Puffer + 1 mM AMP-PNP für die Probe, die 4 mM AMP-PNP enthielt; 3) KG-Puffer + 1 mM AMP-PNP + 1 mM ADP für die Probe, die 4 mM AMP-PNP
und 4 mM ADP enthielt. Nach der Gelfiltration wurden jeweils wieder, wie oben beschrieben, Nukleotide zu den Proben gegeben. Die Proben wurden 2 h bei RT inkubiert
und anschließend durch eine zweifache Zugabe von jeweils 100 µM DTNB und Inkubation für 16 und 2 h bei RT reoxidiert. Die Reaktion wurde durch Zugabe von 20 mM NEM
und 10 min Inkubation bei RT gestoppt und die Proben durch Gelfiltration über NAP-10Säulen gegen KG-Puffer gereinigt. Nach jedem Reaktions/Reinigungs-Schritt wurden
Proben für die Bestimmung von Proteinkonzentration und ATP-Hydrolyseaktivität sowie
für eine SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese entnommen.
70
Ergebnisse
71
3 Ergebnisse
3.1 Einfluß C-terminaler γ-Deletionen auf das Drehmoment und die
Hydrolyseaktivität der EF1-ATPase
3.1.1 Herstellung von EF1-γ-Deletionsmutanten
Die Einführung von Deletionen in die C-terminale Region der Untereinheit γ der E. coli
ATP-Synthase erfolgte mit Hilfe der PCR. Dazu wurde als Ausgangsmaterial das 9235 bp
große Plasmid pKH7 verwendet, das für eine bis auf das Cystein γC108 cysteinfreie E.
coli ATP-Synthase codiert, die jeweils an den N-Termini der drei β-Untereinheiten über
His6-tags verfügt (Kuo et al. 1998, Noji et al. 1999). Zur Reduzierung der Plasmidgröße,
d.h. der Länge des in der PCR zu amplifizierenden DNA-Bereichs, wurde zunächst ein
bestimmter Teil des ATP-Synthase-Operons in einen Klonierungsvektor eingesetzt. Als
Klonierungsvektor wurde das Plasmid pBSK verwendet, in das unter Nutzung der Schnittstellen KpnI und SacI das entsprechende Fragment aus dem Vektor pKH7 kloniert wurde.
Das KpnI/SacI-Fragment von pKH7 enthält den codierenden Bereich für die Untereinheit
γ und einen Teil des codierenden Bereichs für β (βR1-βL162). Der für die Erzeugung der
Deletionsmutanten verwendete E. coli DH5α-Klon wurde mit MM4 bezeichnet. Die
Größe des in der folgenden PCR zu amplifizierenden DNA-Bereichs wurde auf diese
Weise ungefähr halbiert. Das Plasmid pMM4 umfasst 4306 bp.
Mit Hilfe von 5´-phosphorylierten Primern (Tab. 2.6) wurde jeweils die Größe der
Deletionen festgelegt. In den PCR-Ansätzen wurde jeweils das gesamte Plasmid pMM4
bis auf den durch die Primer ausgesparten Bereich (siehe Abb. 2.3) amplifiziert. Anschließend erfolgte die Entfernung der Templat-DNA (pMM4) durch einen DpnI-Verdau und
die Überführung der 5´-phosphorylierten PCR-Produkte mit Hilfe von T4 DNA Ligase in
ringförmige DNA-Moleküle. Nach der Transformation der Ligationsprodukte in E. coli
DH5α wurden einzelne Klone anhand von Restriktionsanalysen und Sequenzierungen auf
ein erfolgreiches Einführen der Deletionen geprüft und schließlich jeweils ein E. coli
DH5α-Klon pro Deletion für das Zurücksetzen der entsprechenden KpnI/SacI-Fragmente
in pKH7 ausgewählt. Die Bezeichnung der mutierten pBSK-Derivate ist in Tabelle 3.1
angegeben.
Tab. 3.1 Bezeichnung der Deletionsmutanten
Deletion
γ∆A284-V286
γ∆S281-V286
γ∆E278-V286
γ∆E275-V286
γ∆I272-V286
γ∆Q269-V286
pBSK-Derivate
MM11
MM15
MM12
MM22
MM13
MM14
pKH7-Derivate
MM16
MM20
MM17
MM8
MM18
MM19
Ergebnisse
72
Die für die Expression von EF1-Deletionsmutanten benötigten pKH7-Derivate wurden
hergestellt, indem pKH7 mit KpnI und SacI geöffnet und anschließend das entsprechende
Fragment einer pBSK-Deletionsmutante eingesetzt wurde. Nach Ligation und Transformation von E. coli DH5α wurden einzelne Klone anhand von Restriktionsanalysen und
Sequenzierungen überprüft und schließlich pro Deletion ein Klon ausgewählt (Tab. 3.1).
Die Plasmide pMM16 (γ-3), pMM20 (γ-6), pMM17 (γ-9), pMM8 (γ-12), pMM18 (γ-15)
und pMM19 (γ-18) unterscheiden sich von dem Ausgangsplasmid pKH7 nur durch die
Deletionen im C-terminalen Bereich der Untereinheit γ (Abb. 3.1). So ist das KpnI/SacIFragment von pKH7 1447 bp lang, während die entsprechenden Fragmente der Deletionsmutanten 1438 bp, 1429 bp, 1420 bp, 1411 bp, 1402 bp bzw. 1393 bp lang sind. Nach
der Transformation von E. coli DK8 wurden die Deletionsmutanten auf die Funktionsfähigkeit ihrer ATP-Synthase überprüft. Dazu wurden die Zellen auf Succinat-Agarplatten
ausgestrichen und drei Tage bei 37°C inkubiert. E. coli atp-Mutanten ohne funktionsfähige ATP-Synthase sind aufgrund des Mangels an einem C4-Dicarbonsäure-Transporter
nicht zum Wachstum auf nichtvergärbaren Kohlenstoffquellen in der Lage (Boogerd et al.
1998). Der Wachstums-Test auf Succinat-Agarplatten zeigte, daß E. coli DK8 transformiert mit den Plasmiden pMM16, pMM20, pMM17 und pMM8 auf Succinat-Medium
leben konnte, jedoch nicht mit den Plasmiden pMM18 und pMM19 (Tab. 3.2).
bp
10000
3000
2000
1500
1000
750
500
250
1
2
3
4
5
6
7
8
9
Abb. 3.1 Restriktionanalyse der Deletionsmutanten und von pKH7
Analytisches Agarosegel (1,5%), schwarz/weiß-invertiertes Photo;
1 1 kb DNA-Leiter; 2-9 KpnI/SacI-Doppelschnitt; 2,9 pKH7;
3 pMM16 (γ-3); 4 pMM20 (γ-6); 5 pMM17 (γ-9); 6 pMM8 (γ-12);
7 pMM18 (γ-15); 8 pMM19 (γ-18)
Ergebnisse
73
Weiterhin wurde die Wachstumsgeschwindigkeit der Deletionsmutanten auf SuccinatMedium untersucht. Dazu wurde der Durchmesser einzelner Deletionsmutanten-Klone
nach dreitägigem Wachstum der Zellen bei 37°C auf Succinat-Agarplatten ermittelt. Die
Ergebnisse zeigten für E. coli DK8 pKH7 und die DK8-Klone der Deletionsmutanten
MM16, MM20 und MM17 eine nahezu gleiche Wachstumsgeschwindigkeit, während die
Mutante MM8 eine deutlich verringerte Wachstumsgeschwindigkeit aufwies (Tab 3.2).
Tab. 3.2 Wachstum der Deletionsmutanten und E. coli DK8 pKH7 auf Succinatmedium
E. coli DK8 mit den
angegebenen Plasmiden
Wachstum auf SuccinatAgarplatten bei 37°C
ohne weiteres Plasmid
pKH7
pMM16 (γ-3)
pMM20 (γ-6)
pMM17 (γ-9)
pMM8 (γ-12)
pMM18 (γ-15)
pMM19 (γ-18)
−
+
+
+
+
+
−
−
Wachstumsgeschwindigkeit
auf Succinat-Agarplatten
bei 37°C
0
100
98 ± 15
95 ± 15
96 ± 15
66 ± 15
0
0
Die Zellen wurden auf Succinat-Agarplatten ausgestrichen bzw. vereinzelt und 3 Tage bei 37°C inkubiert
und schließlich fotografiert. Die Ermittlung der Klondurchmesser erfolgte mit Hilfe des Programms Image
Pro Plus von Media Cybernetics (Silver Spring, MD, USA). Der mittlere Durchmesser von E. coli DK8
pKH7-Klonen wurde gleich 100 gesetzt.
Die Deletionsmutanten MM16, MM20, MM17, MM8 sowie MM18 und MM19 wurden
anschließend für die Expression von EF1 verwendet. Für Kontrollmessungen wurde die
Mutante KH7 exprimiert. Aufgrund der sehr geringen Wachstumsgeschwindigkeit von E.
coli DK8 in succinathaltigem Minimalmedium wurden die Zellanzuchten nicht in diesem
Medium durchgeführt. Stattdessen wurde glycerinhaltiges Minimalmedium verwendet.
Für die Ermittlung der Verdopplungszeiten für das Wachstum in glycerinhaltigem Minimalmedium wurde die OD600 der Bakterienkulturen für bis zu 14 h verfolgt. Anhand der
Auftragung von ln OD600 gegen die Zeit t wurden aus den Steigungen der Ausgleichsgeraden der Wachstumskurven die maximalen spezifischen Wachstumsgeschwindigkeiten µmax
ermittelt und schließlich nach der Gleichung:
ln 2
µ max
= td
(Gleichung 5)
die Verdopplungszeiten td berechnet (Tab. 3.3).
Die Mutante E. coli DK8 pKH7 besitzt mit td = 139 min eine ähnliche Verdopplungszeit
wie E. coli DK8 ohne weiteres Plasmid. Mit zunehmender Größe der Deletion erhöht sich
die Verdopplungszeit zunächst leicht bis auf 157 min (γ-12) und ab einer Deletionslänge
von 12 Aminosäuren stärker bis auf 202 min (γ-15) bzw. 230 min (γ-18).
Ergebnisse
74
Tab. 3.3 Verdopplungszeiten, Ernteausbeuten und Proteinausbeuten für die Deletions-
mutanten und KH7
E. coli DK8 mit
den angegebenen
Plasmiden
ohne weiteres
Plasmid
pKH7
pMM16 (γ-3)
pMM20 (γ-6)
pMM17 (γ-9)
pMM8 (γ-12)
pMM18 (γ-15)
pMM19 (γ-18)
Verdopplungszeiten
td für Wachstum in
glycerinhaltigem
Minimalmedium bei
37°C [min]
139
Ernteausbeute in
Biofeuchtmasse pro
Liter
Anzuchtmedium
[g/l]
n.b.
Ausbeute an EF1
pro Liter
glycerinhaltigem
Minimalmedium*
[mg/l]
−
139 ± 6
145 ± 11
153 ± 8
156 ± 4
157 ± 10
202
230
2,3 ± 0,2
2,2
1,8
1,8
1,8 ± 0,1
1,8
1,5
1,5 ± 0,3
1,5
1,2
1,2
0,8 ± 0,2
−
−
* nach Anionenaustauschchromatogaphie
Die Ausbeute an Biofeuchtmasse pro Liter Anzuchtmedium sank mit zunehmender Länge
der Deletionen. So konnten bei einer üblichen Anzucht von KH7 oder MM16 (12 Liter
Anzuchtmedium, Zellernte bei OD600 = 0,8) 26-28 g Biofeuchtmasse geerntet werden,
während eine entsprechende Anzucht von MM19 nur ca. 18 g Biofeuchtmasse lieferte
(Tab. 3.3). Nach der Ernte wurden die Zellen mit Hilfe eines Ribi Zell-Fraktionators aufgeschlossen. In diesem Gerät werden die Zellen einem hohen Druck (ca. 1380 bar) ausgesetzt. Dadurch steigt der intrazellulare Druck ebenfalls an. Anschließend wird die Zellsuspension durch ein mit Stickstoffgas gekühltes Nadelventil gepreßt. Während des Austritts
der Zellen aus dem Nadelventil kommt es zu einem starken Abfall des extrazellulären
Druckes bis auf Atmosphärendruck und dadurch zum Aufplatzen der Zellen. Die Membran-Bruchstücke lagern sich nach diesem Prozess wieder zu Vesikeln zusammen, die neben anderen Membranproteinen auch die EFOF1-ATP-Synthase enthalten. Die ATPSynthase ist nun jedoch so orientiert, daß der F1-Teil des Proteins außerhalb des
Membranvesikels liegt, anstatt im Inneren wie in der intakten Bakterienzelle (Inside-OutVesikel). Nach dem Aufschluß der Zellen und dem Abzentrifugieren großer Zelltrümmer
wurden die Inside-Out-Vesikel durch Ultrazentrifugation isoliert, gewaschen und schließlich EF1 durch Zugabe eines EDTA-haltigen Puffers vom FO-Teil abgelöst. Der Überstand
der letzten Ultrazentrifugation bei der Präparation bildete den EF1-EDTA-Rohextrakt. Der
Rohextrakt wurde anschließend mit Hilfe einer Anionenaustauschchromatographie weiter
aufgereinigt. Dabei binden die EF1-Komplexe aufgrund ihrer an der Oberfläche zugänglichen negativen Ladungen an das positiv geladene Säulenmaterial (TSK-DEAE 650 (S)).
Durch die Zugabe von Anionen (z. B. SO42-) kann das gebundene Enzym wieder vom
Säulenmaterial verdrängt werden. EF1 wurde bei Sulfatkonzentrationen zwischen 75 und
150 mM vom Säulenmaterial eluiert (Abb. 3.2). Die Ausbeute an EF1 pro Liter Anzuchtmedium sank mit zunehmender Länge der Deletionen. So konnten bei einer üblichen 12
Liter-Anzucht von KH7 ca. 18 mg EF1 gewonnen werden, während die Ausbeute bei
Ergebnisse
75
2.5
50
2.0
40
1.5
30
1.0
20
EF1
0.5
10
0.0
0
0
100
200
300
400
500
600
Leitfähigkeit (mS/cm)
Extinktion E280 nm
MM8 nur ca. 10 mg Protein betrug (Tab. 3.3). Bei der Präparation von MM18 und MM19
konnten keine mit Hilfe des S+G-Proteintests (2.3.2.1) nachweisbaren Mengen an EF1
isoliert werden. Nach der Anionenaustauschchromatographie wurden die gereinigten Proteine mit MgATP versetzt und als Ammoniumsulfat-Präzipitate gelagert.
700
Volumen (ml)
Abb. 3.2 Anionenaustauschchromatographie von EF1
Durchgezogene Linie: Extinktion E280 nm; Gepunktete Linie: Leitfähigkeit
Typisches Chromatogramm einer EF1-Anionenaustauschchromatographie. Die Tosoh Fractogel TSK-DEAE 650 (S)-Säule (Gelbettvolumen: 30 ml) wurde mit jeweils 100 ml EF1-EDTA-Rohextrakt beladen.
1-3 mS/cm: Säulendurchlauf; 10 mS/cm: Elution von ATP und ADP (die
EF1-EDTA-Rohextrakte wurden zur Stabilisierung des Enzyms vor der
Chromatographie jeweils mit 1 mM MgATP versetzt); ca. 22 mS/cm:
Elution von EF1
Für weitere Messungen wurden die Proteine zusätzlich mit Hilfe der Ni-NTA-Affinitätschromatographie gereinigt. Dazu wurden die N-terminalen His-tags der β-Untereinheiten der EF1-Mutanten genutzt (Abb. 3.3). Für einen Rotationstest bzw. eine ArrheniusAnalyse wurden jeweils ca. 2-3 mg EF1 zunächst durch eine Gelfiltration von (NH4)2SO4
gereinigt und anschließend über eine Ni-NTA-Säule (beladen mit 1 ml Ni-NTA Superflow
Suspension) gegeben. Dabei konnten üblicherweise ca. 250 µg Protein in 500 µl Elutionspuffer von der Säule eluiert werden. Die Reinheit der Eluate wurde mit Hilfe der SDSPolyacrylamid-Gelelektrophorese überprüft (Abb. 3.4).
Ergebnisse
76
R
NH
O
C
HC
O
N
C
C H2
O
NH
O
N
N
C
Ni
N
HN
CH
-
O
CH 2
O
CH2
R
N
2+
-
HC
CH2
-
C
C
O
O
R
Abb. 3.3 Wechselwirkung eines His-tags mit Ni-NTA-Material
Zwei der sechs Koordinationsstellen des Nickel-Ions (grün) werden durch Stickstoff-Atome von Histidinresten eines His-tags besetzt (blau), während die restlichen vier Koordinationsstellen durch drei Sauerstoffund ein Stickstoff-Atom der Nitrilotriessigsäure (NTA) belegt werden (rot).
α/β
γ
MW γ [kDa]
KH7
89
7
31,3
MM16
82
12
30,9
MM20
69
9
30,3
MM17
79
10
30,0
MM8
77
8
29,9
KH7
75
11
31,5
Abb. 3.4 SDS-Polyacrylamid Gelelektrophorese der Deletionsmutanten und von KH7
SDS-PAGE (12,5%) in Gegenwart von 2% (w/v) SDS; Coomassie R-250 Anfärbung; Proteinkonzentration
1 mg/ml; jede Spur enthält 0,3 µg Protein (Markerkonzentration 1,5-2,7 mg/ml; die Spur enthält 0,5-0,8 µg
Protein); Die Tabelle unter der Abbildung gibt die Intensitäten der α/β- und der γ-Banden sowie das durch
einen Vergleich mit den Banden des Protein-Markers ermittelte Molekulargewicht der γ-Untereinheiten an.
Für die Analyse der Intensitäten und des Molekulargewichts wurde das Programm GelPro31 von
MediaCybernetics (Silver Spring, MD, USA) verwendet. Dabei wurde die Gesamtintensität jeder Spur
gleich 100 gesetzt.
Ergebnisse
77
Man erkennt die zunehmend geringe Größe der Untereinheit γ der Deletionsmutanten im
Vergleich zu KH7-γ. Anhand des Gels wurde für die γ-Untereinheit von KH7 ein Molekulargewicht von 31,4 kDa bestimmt. Bei MM8-γ liegt das Molekulargewicht nur noch
bei etwa 30,0 kDa. Darüber hinaus besitzen alle Mutanten und KH7 ein ähnliches α/β:γVerhältnis. Es kommt daher bei den Deletionsmutanten durch die Verkürzung des C-Terminus von γ offensichtlich nicht zu einem Verlust dieser Untereinheit.
Die Untersuchung der Folgen von Verkürzungen des C-Terminus der Untereinheit γ bei
EF1 erfolgte zum einen anhand der Bestimmung der Aktivierungsenergien der Enzyme für
die Hydrolyse von ATP. Zum anderen wurde das durch die Rotor-Untereinheit γ aufgebrachte Drehmoment bestimmt. Als Kontrollprobe diente jeweils die EF1-Mutante KH7,
die einen nicht verkürzten γ-C-Terminus besitzt.
Abb. 3.5 Schematische Darstellung von E. coli F1
Zur besseren Übersicht wurden zwei α- und zwei β-Untereinheiten weggelassen. In der Abbildung sind eine α-Untereinheit (links) und eine βUntereinheit (rechts) dargestellt. γ (Mitte) zeigt die Verkürzungen des CTerminus in Schritten von jeweils 3 Aminosäuren abwechselnd in grau
und schwarz.
Ergebnisse
78
3.1.2 Arrhenius-Analyse der Deletionsmutanten
Für die Bestimmung der Aktivierungsenergien der ATP-Hydrolyse durch die EF1-Deletionsmutanten (Abb. 3.5) und KH7-EF1 wurden die ATP-Hydrolyseaktivitäten der Enzyme
in einem Temperaturbereich von 5-40°C gemessen. Dabei wurde eine Produkthemmung
der Enzyme durch während der ATP-Hydrolyse erzeugtes ADP durch ein ATP-regenerierendes System verhindert. Hierbei wird durch EF1 erzeugtes ADP mit Hilfe von
Phosphoenolpyruvat und Pyruvat-Kinase zu ATP umgesetzt. Dabei entsteht Pyruvat, das
anschließend durch Lactat-Dehydrogenase mit Hilfe von NADH zu Lactat reduziert wird.
Für eine Aktivitätsmessung wurde jeweils 1 ml ATPase-Testlösung 10 min bei einer gewünschten Temperatur im Bereich von 5-40°C inkubiert. Anschließend erfolgte die Zugabe von jeweils 1 µg EF1 und der Start der Absorptionsmessung bei 340 nm. Da bei der
Reduktion von Pyruvat zu Lactat NADH verbraucht wird, sank bei der Aktivitätsmessung
die NADH-Absorption nach einer kurzen Übergangsphase zu Beginn der Messung konstant ab, bis das gesamte NADH der Testlösung verbraucht war und bei A340 ≈ -1,55 ein
konstanter Endwert erreicht wurde (Abb. 3.6). Anhand der Steigung des konstant abfallenden Bereichs der Meßkurven konnten nun nach Gleichung 3 (siehe 2.3.5) die ATPHydrolyseaktivitäten der Enzyme in units pro Milligramm EF1 berechnet werden (Tab. 3.4
und Abb. 3.7).
Absorptionsabnahme bei 340 nm
0.0
-0.2
-0.4
-0.6
-0.8
-1.0
-1.2
-1.4
-1.6
-1.8
0
100
200
300
400
500
600
Zeit (s)
Abb. 3.6 Messung der ATP-Hydrolyseaktivität von EF1 mit ATP-regenerierendem System
Die Reaktion wurde durch die Zugabe von 1 µg EF1 zu 1 ml temperierter
Testlösung in der Küvette gestartet. Nach dem Mischen erfolgte der Start
der Messung der Absorptionsabnahme bei 340 nm mit 2 s Verzögerung.
Die Absorptionsabnahme wurde bei geringen Meßtemperaturen bis zu
30 min verfolgt, bei hohen Temperaturen ca. 5 min. Für die Bestimmung
der Aktivität wurde nur der konstant abfallende Bereich der Meßkurven
(durch Pfeile markiert) verwendet.
Ergebnisse
79
Tab. 3.4 ATP-Hydrolyseaktivitäten der Deletionsmutanten und von KH7 im Temperatur-
bereich von 5-40°C
Temperatur
KH7
[°C]
[u/mg]
5
5,0 ± 0,2
10
11,2 ± 0,6
15
20,9 ± 1,3
20
33,0 ± 2,3
25
49,6 ± 4,0
30
70,5 ± 5,6
35
92,6 ± 8,3
40
117,2 ± 10,5
MM16 (γ-3)
[u/mg]
7,4 ± 0,4
13,5 ± 0,7
20,9 ± 1,3
29,1 ± 2,0
38,2 ± 3,1
50,4 ± 4,0
65,0 ± 5,8
83,3 ± 7,5
MM20 (γ-6)
[u/mg]
8,5 ± 0,5
12,5 ± 0,8
17,6 ± 1,1
22,9 ± 1,6
28,8 ± 2,0
36,8 ± 2,6
45,7 ± 3,7
52,7 ± 4,2
MM17 (γ-9)
[u/mg]
5,6 ± 0,2
7,3 ± 0,4
10,2 ± 0,5
14,3 ± 0,8
18,9 ± 1,1
23,7 ± 1,4
28,2 ± 1,7
30,0 ± 1,8
MM8 (γ-12)
[u/mg]
5,1 ± 0,2
6,6 ± 0,3
8,7 ± 0,4
11,5 ± 0,6
15,0 ± 0,8
19,0 ± 1,1
22,2 ± 1,5
22,0 ± 1,5
Hydrolyseaktivität von EF1 (u/mg)
140
KH7
MM16 (γ-3)
MM20 (γ-6)
MM17 (γ-9)
MM8 (γ-12)
120
100
80
60
40
20
0
280
285
290
295
300
305
310
315
T (K)
Abb. 3.7 Graphische Darstellung der ATP-Hydrolyseaktivitäten der Deletionsmutanten
und von KH7-EF1 im Temperaturbereich von 5-40°C
Die ATP-Hydrolyseaktivitäten der Deletionsmutanten und von KH7 waren im Bereich
von 5-40°C temperaturabhängig. So stiegen die Aktivitäten von 5 u/mg (KH7) bzw.
8,5 u/mg (MM20) bei 5°C bis auf ca. 22 u/mg (MM8) bzw. ca. 120 u/mg (KH7) bei 40°C
an. Bei MM8 fiel die Aktivität bei 40°C leicht ab, während es bei den anderen
Deletionsmutanten und bei KH7 erst ab Temperaturen von mehr als 40°C zu einem
Absinken der Aktivität kam. Auffällig bei dem Kontroll-EF1 KH7 war das
verhältnismäßig starke Abfallen der Aktivitäten bei tiefen Temperaturen, das sich ab ca.
20°C bemerkbar machte und auch leicht bei der Mutante MM16 im Bereich von 5-10°C
Ergebnisse
80
auftrat. Auch die Größe der Deletionen hatte einen Einfluß auf die Hydrolyseaktivitäten
der Enzyme. So sanken die ATP-Hydrolyseaktivitäten z. B. bei einer Temperatur von
35°C mit zunehmender Deletionslänge von 93 u/mg bei der Kontrollprobe KH7 bis auf
22 u/mg bei MM8 ab. Dies entspricht einem Abfall der Aktivität um ca. 75% (Abb. 3.8).
Hydrolyseaktivität von EF1 (u/mg)
120
T = 35°C
100
80
60
40
20
0
0
KH7
3
MM16 (γ-3)
6
9
12
MM20 (γ-6) MM17 (γ-9) MM8 (γ-12)
Länge der Deletion am γ-C-Terminus
Abb. 3.8 Abnahme der ATP-Hydrolyseaktivität bei 35°C mit zunehmender
Deletionslänge
Für die Ermittlung der Aktivierungsenergien wurden die ATP-Hydrolyseaktivitäten (Tab.
3.4) zunächst nach Gleichung 4 (siehe 2.3.5) in Umsatzraten umgerechnet.
Außerdem gilt nach Arrhenius:
k = A∗e
−
Ea
RT
(Gleichung 6)
k = Geschwindigkeitskonstante
A = präexponentieller Faktor
Ea = Aktivierungsenergie
R = Gaskonstante
Anhand einer Auftragung von d ln k gegen d (1/T) kann demnach die Aktivierungsenergie
einer Reaktion bestimmt werden. Dazu wurden die für verschiedene Temperaturen ermittelten Umsatzraten in logarithmierter Form gegen die reziproke Temperatur aufgetragen
(Abb. 3.9).
Ergebnisse
81
7
KH7
MM16 (γ-3)
MM20 (γ-6)
MM17 (γ-9)
MM8 (γ-12)
ln (Umsatzrate)
6
5
4
3
0.0032
0.0033
0.0034
0.0035
0.0036
1/T (1/K)
Abb. 3.9 Arrhenius-Analyse von Deletionsmutanten-EF1 und Kontroll-EF1 (KH7)
Aufgrund des Abfallens der Umsatzraten bei tiefen Temperaturen bei KH7 und MM16
und des leichten Abfallens der Umsatzraten bei hohen Temperaturen bei MM8 und MM17
wurden die Aktivierungsenergien nur anhand des Temperaturbereichs von 20-35°C berechnet (Abb. 3.10). In diesem Bereich wiesen alle Meßkurven eine im Rahmen der Meßgenauigkeit konstante Steigung auf.
Aktivierungsenergie Ea (kJ/mol)
80
70
60
50
40
30
20
10
0
0
KH7
3
MM16 (γ-3)
6
9
12
MM20 (γ-6) MM17 (γ-9) MM8 (γ-12)
Abb. 3.10 Aktivierungsenergien Ea der Deletionsmutanten und KH7 für 20-35°C
Die berechneten Werte für die Aktivierungsenergien der ATP-Hydrolyse durch die
Deletionsmutanten und KH7 betragen (jeweils in kJ/mol): 54 ± 8 (KH7), 41 ± 6
(MM16), 36 ± 5 (MM20), 35 ± 5 (MM17) und 34 ± 5 (MM8)
82
Ergebnisse
Die Aktivierungsenergien für die Hydrolyse von ATP sanken bei den Deletionsmutanten
von ca. 54 kJ/mol (Kontroll-EF1 KH7) um etwa 35% auf ca. 35 kJ/mol ab.
3.1.3 Bestimmung des durch die Deletionsmutanten erzeugten Drehmoments
Das durch die γ-Untereinheiten der mutierten EF1-Komplexe aufgebrachte Drehmoment
wurde mit Hilfe eines von Noji et al. (1997) etablierten Rotationstests ermittelt (Abb. 2.5).
Für den Rotationstest wurde EF1 mit Hilfe der N-terminalen His-tags der β-Untereinheiten
gerichtet auf einem Glasträger immobilisiert und unter Nutzung des einzigen Cysteinrestes
des Enzyms (γC108) über Biotin und Streptavidin ein mit dem Fluoreszenzfarbstoff TMR
markiertes, ca. 1-4 µm langes, Aktinfilament an die Rotor-Untereinheit γ gebunden. Anschließend wurde das Enzym mit einem ATP-haltigen Puffer versetzt und unter dem Mikroskop beobachtet. Für einen Rotationstest wurden, ähnlich wie für eine Arrhenius-Analyse, 2-3 mg EF1 durch Gelfiltration von (NH4)2SO4 gereinigt, jedoch vor der Reinigung
über Ni-NTA-Material zunächst mit Biotin-PEAC5-Maleimid an der Position γC108 biotinyliert. Bei der Ni-NTA-Affinitätschromatographie wurden Proteinausbeuten von ca.
250 µg EF1 pro 500 µl imidazolhaltigem Puffer erreicht. Das gereinigte, biotinylierte
Enzym wurde anschließend in einer Durchflußküvette über Ni-NTA-MeerrettichPeroxidase gerichtet auf einer Glasoberfläche immobilisiert, mit Streptavidin und
biotinyliertem, farbstoffmarkiertem F-Actin versetzt und schließlich ein ATP-haltiger
Puffer zugegeben. Das Weglassen auch nur einer dieser Komponenten (Ni-NTAMeerrettich-Peroxidase, biotinyliertes EF1, Streptavidin oder TMR-markiertes,
biotinyliertes F-Actin) führte zu einem Ausbleiben der Bindung von farbstoffmarkiertem
F-Actin, was mit Hilfe des Mikroskops überprüft werden konnte. Der ATP-haltige Puffer
enthielt zusätzlich ein sauerstoffverbrauchendes System aus Glucose, Glucoseoxidase und
Katalase, wodurch das Ausbleichen des Fluoreszenzfarbstoffs deutlich verlangsamt
werden konnte. Rotierende Actinfilamente wurden mit Hilfe eines VHS-PALVideorecorders mit einer Bildrate von 25 Bildern pro Sekunde (= 1 Bild pro 40 ms)
aufgezeichnet.
Die Ausbeute an Rotatoren pro Beobachtungszeit der Küvetten sank mit zunehmender
Deletionslänge der EF1-Mutanten stark ab. So konnten bei Experimenten mit KH7-EF1 bei
einer Küvetten-Beobachtungszeit von 30 min üblicherweise ca. 30-40 rotierende Filamente beobachtet werden, bei Experimenten mit MM8-EF1 durchschnittlich nur ein rotierendes Filament (Tab. 3.5). Alle beobachteten Rotatoren zeigten ausschließlich eine Rotation im Gegen-Uhrzeigersinn.
Ergebnisse
83
Tab. 3.5 Durchschnittliche Ausbeute an rotierenden Actin-Filamenten bei einer Beobach-
tungszeit der Durchflußküvetten von 30 min
EF1-Mutante
KH7
MM16 (γ-3)
MM20 (γ-6)
MM17 (γ-9)
MM8 (γ-12)
Ausbeute an Rotatoren
36 ± 10
15 ± 3
6±1
2±1
1±1
Insgesamt wurden für die Bestimmung des Drehmoments die Daten von 23 KH7-, 25
MM16-, 15 MM20-, 11 MM17- und 14 MM8-EF1-Rotatoren ausgewertet. Die Actin-Filamente der Rotatoren konnten auf unterschiedliche Weise an die Rotor-Untereinheit γ der
Enzyme gebunden sein. Zum einen konnten die Filamente über eines der beiden Filamentenden an das Enzym gebunden sein. Die Kontaktstelle konnte sich jedoch auch an einer
beliebigen Stelle zwischen den Filamentenden befinden, so daß die rotierenden Filamente
propellerartig drehten. Bei ca. 40% der untersuchten Rotatoren handelte es sich um propellerartige Rotatoren, unabhängig von der Art der verwendeten EF1-Mutante. Einzelne
Rotatoren wurden vom Zeitpunkt ihrer Auffindung entweder bis zum Ablösen des ActinFilaments vom Enzym, dem Ausbleichen des TMR-markierten Actin-Filaments oder dem
Wechsel zum nächsten Rotator mit Hilfe eines Videorecorders aufgezeichnet. Durch das
lichtabhängige Ausbleichen des Farbstoffs war die Beobachtungszeit einzelner Rotatoren
auf maximal etwa 3 min begrenzt. Darüber hinaus wurde die Beobachtungszeit von KH7und MM16-Rotatoren eher durch Wechsel zu einem weiteren Rotator begrenzt, während
z. B. MM8-Rotatoren, aufgrund der geringen Wahrscheinlichkeit zur Auffindung eines
weiteren Rotators, im Allgemeinen bis zum Ausbleichen oder Ablösen des ActinFilaments aufgezeichnet wurden. Die von Stillstandsphasen unterbrochenen Laufzeiten
einzelner Rotatoren, die zusätzlich zum Ablösen oder Ausbleichen des Actin-Filaments
sowie einem Wechsel zu einem nächsten Rotator auch durch einen irreversiblen
Rotationsstopp innerhalb der Beobachtungszeit eines Rotators begrenzt werden konnten,
variierten dabei von ca. 10 bis ca. 190 s. Etwa 60 ± 19% der Laufzeiten bildeten dabei die
Rotationsphasen. Dabei ließ sich keine Abhängigkeit der Anteile von Stillstands- und
Rotationsphasen an der Laufzeit von Rotatoren von der Deletionslänge der EF1-Mutanten
erkennen.
Ausgewählte Rotationsphasen einzelner Rotatoren wurden mit Hilfe eines Framegrabbers
digitalisiert und die Länge der Actinfilamente sowie die Rotationsgeschwindigkeit der
Filamente mit Hilfe des Programms ImageProPlus 4.0 (Media Cybernetics, Silver Spring,
MD, USA) bestimmt (Abb. 3.11).
Ergebnisse
84
KH7
MM16 (γ-3)
MM20 (γ-6)
MM17 (γ-9)
MM8 (γ-12)
-1
Rotationsrate (s )
10
1
0.1
0
1
2
3
4
5
Filamentlänge (µm)
Abb. 3.11 Auftragung der Rotationsrate gegen die Filamentlänge
Die in die Grafik eingezeichnete Kurve zeigt eine Linie gleichen Drehmoments für T = 51 pN nm.
Die Kurve wurde nach Gleichung 7 mit einer scheinbaren Viskosität an der Oberfläche des GlasObjektträgers von η = 2,4*10-3 kg/(ms) berechnet. Die Grafik enthält Daten von peitschenartigen
Rotatoren (Rotatoren, bei denen das Actin-Filament über eines der beiden Enden an das Enzym
angebunden ist) und propellerartigen Rotatoren (Rotatoren, bei denen sich die Kontaktstelle
zwischen Enzym und Filament mindestens 0,2 µm entfernt von einem der Filamentenden befindet).
Das aufgebrachte Drehmoment von propellerartigen Rotatoren wurde ermittelt, indem das
Drehmoment für jedes „Propellerblatt“ einzeln nach Gleichung 7 berechnet wurde und
anschließend beide Drehmomente addiert wurden. Die Grafik enthält Daten der folgenden
Anzahlen von Rotatoren: 23 (Kontrollprobe KH7), 25 (MM16 (γ-3)), 15 (MM20 (γ-6)), 11 (MM17
(γ-9)) und 14 (MM8 (γ-12)).
Die Bestimmung der Rotationsrate erfolgte durch das Auszählen der für eine vollständige
Umdrehung benötigten Anzahl von Bildern (40 ms pro Bild bei einer Bildrate von 25 Bildern pro Sekunde). Anhand dieser Daten konnte nun mit Hilfe der Gleichung:
⎞
⎛
⎟
⎜
3
2πνηL
⎛ 4π ⎞⎜
⎟
T =⎜
⎟⎜
⎝ 3 ⎠ ln⎛ L ⎞ − 0,447 ⎟
⎟
⎜ ⎜ ⎟
⎠
⎝ ⎝r⎠
mit:
(Gleichung 7)
T = Drehmoment in Nm
ν = Rotationsrate in s-1
η = Viskosität der Lösung an der Glasoberfläche (hier mit 2,4*10-3 kg/(ms) angenommen)
L = Länge des Actin-Filaments
r = Radius des Actin-Filaments (2,8 nm)
Ergebnisse
85
das von den EF1-Komplexen aufgebrachte Drehmoment berechnet werden (Hunt et al.
1994). Zur Berechnung des Drehmoments von Propeller-Rotatoren wurde jeweils das
Drehmoment eines einzelnen Propellerblatts nach Gleichung 7 berechnet und anschließend
die Drehmomente beider Propellerblätter addiert. Die Ergebnisse der Messungen sind in
Abbildung 3.12 dargestellt, wobei das durchschnittliche Drehmoment des Kontroll-EF1
KH7 gleich 100 % gesetzt wurde.
Durchschnittliches Drehmoment
im Vergleich zur Kontrolle (%)
140
120
100
80
60
40
20
0
0
KH7
3
6
9
12
MM16 (γ-3) MM20 (γ-6) MM17 (γ-9) MM8 (γ-12)
Abb. 3.12 Vergleich des durch die Deletionsmutanten erzeugten durchschnittlichen
Drehmoments mit dem durch KH7-EF1 erzeugten durchschnittlichen Drehmoment
Das Drehmoment der Kontrollprobe KH7 von 51 pN nm wurde gleich
100% gesetzt.
Die Deletionsmutanten weisen im Vergleich zum Kontroll-EF1 KH7 ein um ca. 20% verringertes Drehmoment auf. Es läßt sich jedoch mit zunehmender Deletionslänge keine
signifikante Abnahme des aufgebrachten Drehmoments feststellen.
3.1.4 Herstellung einer EFOF1-γ-Deletionsmutante
Zur Herstellung einer EFOF1-Deletionsmutanten wurde das KpnI/SacI-Fragment des Plasmids pSE1 gegen das entsprechende Fragment aus dem Plasmid pMM15 (γ-6) ersetzt.
Nach Ligation und Transformation wurden einzelne Klone anhand einer Restriktionsanalyse sowie einer Sequenzierung mit Hilfe des Primers A3 (Tab. 2.11) überprüft und
schließlich ein positiver Klon (Bezeichnung: MM21) ausgewählt (Abb. 3.13). Man erkennt das im Vergleich zum KpnI/SacI-Fragment von pSE1 (1447 bp) geringfügig kürzere
KpnI/SacI-Fragment der Deletionsmutante pMM21 (1429 bp). Damit stand ein pSE1-De-
Ergebnisse
86
rivat zur Verfügung, das über eine sechs Aminosäuren umfassende Deletion am C-Terminus der Untereinheit γ verfügte. Weiterhin enthält MM21 aufgrund der Abstammung des
KpnI/SacI-Fragments von pMM15 im Gegensatz zu SE1 das Cystein γC108.
bp
11501
5077
2838
2443
1700
Abb. 3.13 Restriktionsanalyse von pMM21 und pSE1
Analytisches Agarosegel (1,5%), schwarz/weiß-invertiertes Photo;
M Lambda DNA/PstI Marker, 24; 1 KpnI/SacI-Doppelschnitt von
pMM21; 2 KpnI/SacI-Doppelschnitt von pSE1
1159
1093
805
M 1 2
Nach der Transformation von E. coli DK8 mit pMM21 konnte durch einen positiven
Wachstumstest auf Succinat-Agarplatten die Funktionsfähigkeit der ATP-Synthase von
MM21 gezeigt werden. Weiterhin wurde anhand einer Test-Anzucht in glycerinhaltigem
Minimalmedium die Verdopplungszeit der Deletionsmutante MM21 von td = 265 min
ermittelt. Die Mutante besitzt damit im Vergleich zu E. coli DK8 pMM20 (td = 153 ±
8 min) eine erheblich größere Verdopplungszeit. Die MM21-Expression erfolgte in 12 x
1 Liter Über-Nacht-Kulturen mit einer Ausbeute von ca. 30 g Biofeuchtmasse. Nach dem
Zellaufschluß besaßen die mit Waschpuffer gewaschenen Membran-Vesikel-Suspensionen
eine Proteinkonzentration von ca. 3,4 mg/ml (Gesamtproteinmenge: ca. 340 mg) und eine
ATP-Hydrolyseaktivität von ca. 2,7 u/mg. Die weitere Präparation erfolgte durch das Herauslösen des Proteins aus den Membran-Vesikeln mit Hilfe eines Detergenz (Octyl-β-DGlucopyranosid) sowie der Aufreinigung des Extraktes über Streptactin-Sepharose- und
Ni-NTA-Material (Abb. 3.14). Das mit Hilfe einer Streptactin-Säule gereinigte MM21EFOF1 (Eluatmenge ca. 6 ml) besaß üblicherweise eine Proteinkonzentration von 0,20,25 mg/ml und eine ATP-Hydrolyseaktivität von ca. 27 u/mg und wurde teilweise direkt
für ein Rotationsexperiment eingesetzt und teilweise (ca. 4 ml) weiter über Ni-NTAMaterial aufgereinigt. Das Ni-NTA-Säuleneluat (etwa 1 ml) besaß üblicherweise eine
Proteinkonzentration von 0,02 mg/ml und eine ATP-Hydrolyseaktivität von ca. 60 u/mg.
Das SDS-Gel (Abb. 3.14) zeigt bei dem Ni-NTA-gereinigten Enzym eine verhältnismäßig
schwache α/β-Bande sowie eine γ-Bande. Dagegen sind bei dem über Streptactin-Material
gereinigten Enzym, neben Spuren der anderen Untereinheiten, im Wesentlichen die
Untereinheiten c und ε zu erkennen.
Ergebnisse
87
Abb. 3.14 SDS-Polyacrylamid Gelelektrophorese
von SE1 und MM21
SDS-PAGE (12,5%) in Gegenwart von 2% (w/v) SDS; Silberanfärbung; Proteinkonzentrationen: 3 mg/ml (SE1),
1 mg/ml (MM21); die Spuren enthalten 0,9 µg Protein (SE1)
bzw. 0,3 µg Protein (MM21), (Markerkonzentration 1,52,7 mg/ml; die Spur enthält 0,5 – 0,8 µg Protein); die Abbildung zeigt als Kontrolle SE1 und über Ni-NTA-Material bzw.
Streptactin-Sepharose-Material aufgereinigtes MM21
Im Rotationstest (Abb. 2.7) konnte zwar eine Anbindung von Actin-Filamenten an EFOF1Enzymkomplexe beobachtet werden, jedoch weder mit dem Ni-NTA gereinigten MM21EFOF1 noch mit dem über Streptactin-Sepharose gereinigten Material eine Rotation von
Actin-Filamenten.
3.2 Verknüpfung von Rotor und Stator: Die Cystein-Doppelmutante
MM10
Die Einführung der Mutation αP280C in das Plasmid pKH7 erfolgte nach der in Abbildung 2.2 A dargestellten PCR-basierten Methode mit Hilfe der Primer mp4 und mp-4
(Tab. 2.16). Als Templat-DNA für die PCR wurde das Plasmid pMM3 verwendet. Nach
dem Verdau der Templat-DNA durch DpnI und der Transformation kompetenter Zellen
mit dem PCR-Produkt wurde das KpnI/XhoI-Fragment von pKH7 gegen das entsprechende Fragment eines erfolgreich mutierten pMM3-Derivats getauscht. Das Ergebnis
dieser Ligation war das Plasmid pMM6. Eine entsprechende Vorgehensweise zur Einfüh-
Ergebnisse
88
rung der Mutation γA285C in das Plasmid pKH7 mit Hilfe der Mutationsprimer mp3 und
mp-3 (Tab. 2.21) führte zu keinem Erfolg. Nach der PCR mit dem Plasmid pMM4 als
Templat-DNA und dem anschließenden DpnI-Verdau wurden, auch nach Variation der
Hybridisierungstemperaturen im Bereich von 50-60°C in keinem Fall Klone erhalten.
Deshalb wurde hier auf das in Abbildung 2.1 beschriebene Verfahren zurückgegriffen,
wobei die Mutationsprimer mp3 und mp-3 sowie als Außenprimer die Oligonukleotide
mp4 und HL347 eingesetzt wurden.
A
B
bp
1700
C
bp
bp
2443
1700
2140
1159
1159
805
M
1
2
M 3
M
4
Abb. 3.15 Einführung der Mutation γA285C in das Plasmid pKH7 durch PCR
Analytische Agarosegele (A: 0,8%, B: 1,0%, C: 0,8%), schwarz/weissinvertierte Photos; M Lambda DNA/PstI Marker 24; A1 PCR-Produkt 1
(579 bp); A2 PCR-Produkt 2 (1637 bp); B3 PCR-Produkt 3 (2189 bp);
C4 KpnI/SacI-geschnittenes PCR-Produkt 3 (1447 bp)
Zunächst wurde in zwei getrennten PCR-Ansätzen mit Hilfe der Primer mp3 und HL347
ein 579 bp großes Fragment und mit Hilfe der Primer mp-3 und mp4 ein 1637 bp großes
Fragment hergestellt (Abb. 3.15, A1 und A2). Als Templat-DNA diente jeweils pKH7.
Beide Fragmente waren im Bereich der Mutationsprimer mp3 und mp-3 auf einer Länge
von 27 bp komplementär zueinander, weswegen die Fragmente in einer dritten PCR ohne
Zugabe weiterer Templat-DNA zu einem 2189 bp langen Fragment verbunden werden
konnten (Abb. 3.15, B3). Das Produkt der dritten PCR konnte nun nach einem KpnI/SacIDoppelschnitt (Abb. 3.15, C4, 1447 bp) mit dem KpnI/SacI-geöffneten, dephosphorylierten Vektor pKH7 ligiert werden. Ein positiver Klon dieser Ligation wurde nach der Sequenzierung im Bereich zwischen den Schnittstellen KpnI und SacI ausgewählt und mit
MM9 bezeichnet. Die Cystein-Doppelmutante MM10 wurde schließlich erzeugt, indem
das KpnI/SacI-Fragment von pMM6 gegen das entsprechende Fragment aus pMM9 ersetzt
wurde. Damit stand eine Mutante zur Verfügung, bei der eine Quervernetzung einer Stator-Untereinheit α mit der Rotor-Untereinheit γ möglich sein sollte (Abb. 3.16).
Ergebnisse
89
Gumbiowski et al. zeigten anhand von SDS-Gelelektrophoresen und α- bzw. γ-Blots, daß
diese Quervernetzung tatsächlich mit sehr hohen Ausbeuten (∼98%) gebildet werden kann
(Gumbiowski et al. 2001). Dazu wurde das Enzym 24 h bei RT mit 100 µM DTNB in
Gegenwart von 2 mM ATP oxidiert. Ein weiteres Ergebnis dieser Arbeit war, daß die
Quervernetzung von α und γ über die Cysteine αC280 und γC285 weder einen Einfluß auf
die ATP-Hydrolyseaktivität noch auf die Rotation der Untereinheit γ hat.
Abb. 3.16 Schematische Darstellung der Cystein-Doppelmutante MM10
Zur besseren Übersicht sind in der Darstellung zwei α- und zwei β-Untereinheiten weggelassen worden. Eine α-Untereinheit ist links zu sehen,
eine β-Untereinheit ist rechts abgebildet. In der Mitte befindet sich γ. Die
Position der Cysteine αC280 und γC285 ist in schwarz dargestellt. Darüber hinaus sind die letzten 12 Aminosäuren der Untereinheit γ hervorgehoben, die sich ohne Totalverlust der Enzymaktivität deletieren lassen
(siehe Kapitel 3.1).
Die Möglichkeit zur Verknüpfung der Cysteine αC280 und γC285 von MM10-EF1 mit
sehr hohen Ausbeuten wurde bereits von Gumbiowski et al. (2001) gezeigt. Im Rahmen
dieser Arbeit wurden darüber hinaus Experimente zur Ermittlung der Reaktionsgeschwindigkeit der Oxidationsreaktion (Verknüpfung von αC280 und γC285) und der Reduktionsreaktion (Aufspaltung der Disulfidbrücke) durchgeführt.
Ergebnisse
90
Abb. 3.17 Zeitabhängigkeit der Oxidation und Reduktion von MM10-EF1
SDS-PAGE (8-25%) in Gegenwart von 2% (w/v) SDS; Coomassie R-250Anfärbung; Proteinkonzentration 3 mg/ml; jede Spur enthält 0,9 µg Protein; linke
Bildhälfte Oxidation von reduziertem MM10-EF1 mit 100 µM DTNB; rechte
Bildhälfte Reduktion von oxidiertem MM10-EF1 mit 20 mM DTT; unter der
Abbildung ist jeweils der Zeitpunkt der Probenentnahme in Minuten angegeben;
die mit Hilfe des Programms GelPro 3.1 ermittelten Bandenintensitäten der αγ-,
α/β- und γ-Banden sind für die Oxidation in Tabelle 3.7 und für die Reduktion in
Tabelle 3.8 angegeben
Tab. 3.6 Bandenintensitäten bei der Oxidation von MM10-EF1
Bande
αγ
α/ β
γ
Start
1
76
11
2 min
16
70
4
5 min
19
68
3
10 min
20
67
2
20 min
20
65
2
30 min
21
60
1
90 min
20
67
1
Tab. 3.7 Bandenintensitäten bei der Reduktion von MM10-EF1
Bande
αγ
α/β
γ
Start
23
66
0
105 min
4
78
6
180 min
3
79
7
360 min
3
79
7
600 min
2
79
8
1440 min
1
78
9
Dazu wurden Proben von MM10-EF1 zunächst durch Zugabe von 2 mM ATP und 100 µM
DTNB in die oxidierte bzw. durch Zugabe von 20 mM DTT in die reduzierte Form überführt. Auch hier konnte gezeigt werden, daß eine Verknüpfung der Rotor-Untereinheit γ
mit der Stator-Untereinheit α über die Cysteine γC285 und αC280 keinen Einfluß auf die
Ergebnisse
91
ATP-Hydrolyseaktivität besitzt. Die Aktivität des reduzierten MM10-EF1 lag bei 114 ±
10 u/mg, während die Aktivität des oxidierten Enzyms 112 ± 4 u/mg betrug. Anschließend
wurde das reduzierte MM10-EF1 durch Zugabe von 100 µM DTNB oxidiert bzw. das oxidierte MM10-EF1 durch Zugabe von 20 mM DTT reduziert. Den Reaktionsansätzen wurden nach bestimmten Zeiten Proben für ein SDS-Gel (Abb. 3.17) entnommen. Man erkennt bei der Oxidation von MM10-EF1 die abnehmende Menge an freiem γ, während bei
der Reduktion mit zunehmender Reaktionsdauer die Menge an verknüpftem αγ abnimmt.
Zur Bestimmung des Reaktionsfortschritts wurden mit Hilfe des Programms GelPro 3.1
von MediaCybernetics (Silver Spring, MD, USA) die Bandenintensitäten der αγ- und der
γ-Banden ermittelt, wobei die Gesamtintensität aller Banden einer Spur jeweils gleich einem Wert von 100 gesetzt wurde (Tab. 3.6 und 3.7).
Die Intensitäten der αγ-Banden stiegen bei der Oxidation von 1 auf 20 an, während die
Intensitäten der γ-Banden von 11 auf 1 abfielen. Gleichzeitig sanken die Intensitäten der
α/β-Banden um etwa ein sechstel von 76 auf ca. 64. Im Fall der Reduktion dagegen sanken die Intensitäten der αγ-Banden von 23 auf 1 ab, während die Intensitäten der γ-Banden von 0 auf 9 anstiegen. Weiterhin stiegen bei der Reduktion die Intensitäten der α/βBanden von 66 auf ca. 78 um etwa ein sechstel an.
Die graphische Darstellung der Intensitätswerte gegen die Zeit (Abb. 3.18 und 3.19) zeigt,
daß die Oxidation von MM10-EF1 mit 100 µM DTNB nach 30 min zu ca. 90% (nach
30 min sind im Vergleich zum Startzeitpunkt der Reaktion nur noch etwa 10% freies γ
nachweisbar) erfolgt ist, während die Reduktion von MM10-EF1 mit 20 mM DTT eine
erheblich längere Zeit beanspruchte. Hier sank die Intensität der αγ-Bande erst nach etwa
600 min auf ca. 10% des Startwertes ab. Weiterhin ist bemerkenswert, daß weder bei der
Oxidation von MM10-EF1 mit 100 µM DTNB noch bei der Reduktion von MM10-EF1
mit 20 mM DTT ein vollständiger Umsatz erreicht wurde. So konnten bei der Oxidation
auch nach Inkubationszeiten von bis zu 24 h noch etwa 10% an freiem γ nachgewiesen
werden (Daten nicht gezeigt). Auch bei der Reduktionsreaktion konnten nach 24 h
Inkubation noch etwa 4% an verbrücktem αγ nachgeweisen werden (Abb. 3.17). Dagegen
können bei der Oxidation in Gegenwart von 100 µM DTNB und 2 mM ATP nach 24 h
Inkubationszeit Ausbeuten von nahezu 100% erreicht werden (siehe Abb 3.17: oxidierte
Probe zu Beginn der Reduktion, Abb. 3.20: MM10 ox. und Gumbiowski et al. 2001).
Ergebnisse
92
Oxidation (100 µM DTNB)
αγ
γ
28
26
24
22
20
Intensität
18
16
14
12
10
8
6
4
2
0
0
20
40
60
80
100
Zeit [min]
Abb. 3.18 Kinetik der Oxidation von MM10-EF1 mit 100 µM DTNB
Reduktion (20 mM DTT)
αγ
γ
28
26
24
22
20
Intensität
18
16
14
12
10
8
6
4
2
0
0
200
400
600
800
1000
1200
1400
1600
Zeit [min]
Abb. 3.19 Kinetik der Reduktion von MM10-EF1 mit 20 mM DTT
3.2.3 Arrhenius-Analyse mit oxidiertem und reduziertem MM10-EF1
Auch auf die Aktivierungsenergie der ATP-Hydrolyse durch MM10 hat die Ausbildung
einer Disulfidbrücke zwischen αC280 und γC285 keinen Einfluß. Für die Bestimmung der
Aktivierungsenergien wurden Proben von MM10-EF1 durch Zugabe von 20 mM DTT
reduziert bzw. durch Zugabe von 100 µM DTNB und 2 mM ATP oxidiert. Die Proben
wurden jeweils 24 h bei RT inkubiert.
Ergebnisse
93
Abb. 3.20 SDS-Polyacrylamid Gelelektrophorese von
reduziertem und oxidiertem MM10
SDS-PAGE (12,5%) in Gegenwart von 2% (w/v) SDS; Coomassie
R-250 Anfärbung; Proteinkonzentration 1 mg/ml; jede Spur enthält
0,3 µg Protein (Markerkonzentration 1,5 – 2,7 mg/ml; die Spur
enthält 0,5 – 0,8 µg Protein); die Abbildung zeigt über Ni-NTAMaterial aufgereinigtes MM10-EF1 nach der Reduktion mit 20 mM
DTT sowie nach Oxidation mit 100 µM DTNB in Anwesenheit von
2 mM ATP.
7
KH7
MM10 red.
MM10 ox.
ln (Umsatzrate)
6
5
4
3
0.0032
0.0033
0.0034
0.0035
0.0036
1/T (1/K)
Abb. 3.21 Arrhenius-Analyse von reduziertem und oxidiertem MM10
Die Messungen erfolgten in Gegenwart eines ATP-regenerierenden Systems. Die Messungen
wurden durch die Zugabe von 1 µg EF1 zu 1 ml temperierter Testlösung gestartet und die Abnahme der Absorption bei 340 nm für bis zu 30 min verfolgt. Für die Berechnung der ATP-Hydrolyseaktivitäten wurde ein molarer Absorptionskoeffizient von εNADH = 6,22 *106 cm2/mol (bei
340 nm und RT) verwendet (Stiggall et al. 1978). Für die Umrechnung der Aktivitäten in
Umsatzraten wurde eine Molmasse für EF1 von 384000 g/mol verwendet. Die Aktivierungsenergien wurden anhand der Steigungen der Meßkurven im Bereich von 20-35°C bestimmt. Zum
Vergleich enthält die Abbildung die Meßkurve des Kontroll-EF1 KH7 (siehe auch Abb. 3.9).
Ergebnisse
94
Anschließend wurden die Proben über Ni-NTA-Affinitätschromatographie gereinigt (Abb.
3.20) und für Aktivitätsmessungen mit einem ATP-regenerierendem System in einem
Temperaturbereich von 5-40°C verwendet. Im Bereich von 20-35°C besitzt MM10-EF1 im
reduzierten Zustand für die ATP-Hydrolyse eine Aktivierungsenergie von 42 ± 9 kJ/mol
und im oxidierten Zustand eine Aktivierungsenergie von 44 ± 9 kJ/mol (Abb. 3.21).
Zur Untersuchung der Inhibierung von MM10-EF1, die für den nachfolgend beschriebenen
biochemischen Rotationstest von Bedeutung ist, wurde die ATP-Hydrolyseaktivität des
Enzyms anhand des LeBel-Tests (siehe 2.3.2.2) in Gegenwart von jeweils 1 mM AMPPNP, 1 mM AMP-PNP und 1 mM ADP, 1 mM NaN3 sowie 1 mM NaN3 und 1 mM ADP
bestimmt (Tab. 3.8). Die ATP-Hydrolyseaktivität des nicht inhibierten Enzyms lag bei
75 u/mg. Die stärkste Inhibierung zeigte das Enzym in Gegenwart von 1 mM AMP-PNP.
Hier lag die Aktivität bei 3 u/mg und damit im Bereich der Empfindlichkeitsgrenze des
LeBel-Aktivitätstests. So konnten bei Aktivitätsmessungen bei denen Wasser anstatt einer
Enzymprobe vermessen wurde bis zu 8 u/mg gemessen werden. Auch bei Zugabe von
1 mM AMP-PNP und 1 mM ADP wurde eine nahezu vollständige Inhibierung erreicht.
Die Aktivität lag hier bei 9 u/mg. Leicht höhere Aktivitäten wurden dagegen mit NaN3
und NaN3/ADP ermittelt. Durch Zugabe dieser Substanzen konnte eine Inhibierung von
ca. 78% erreicht werden.
Tab. 3.8 Inhibierung von MM10-EF1 durch AMP-PNP, ADP und Azid
ohne Inhibitor
+ 1 mM AMP-PNP
+ 1 mM AMP-PNP + 1 mM ADP
+ 1 mM NaN3
+ 1 mM NaN3 + 1 mM ADP
ATP-Hydrolyseaktivität
[u/mg]
75
3
9
17
16
Inhibierung in %
0
96
88
77
79
Die Aktivitätsmessungen erfolgten jeweils in Gegenwart von 10 mM ATP und der in der Tabelle
angegebenen Konzentrationen an Inhibitoren. Die Ergebnisse sind Mittelwerte von jeweils zwei
Messungen.
3.2.5 Nachweis der Rotation des C-terminalen Bereichs der Untereinheit γ relativ zu
den α-Untereinheiten von EF1
Eine mögliche Erklärung für den ausbleibenden Einfluß einer Quervernetzung der
Cysteine αC280 und γC285 von MM10-EF1 auf die Funktion des Enzyms besteht darin,
daß der C-terminale Bereich von γ permanent, auch während der Rotation der Unterein-
Ergebnisse
95
heit, im α3β3-Hexagon fixiert ist (siehe Diskussion). Zur Überprüfung dieser Hypothese
wurde die rotatorische Mobilität des C-terminalen γ-Bereichs von EF1 anhand eines modifizierten biochemischen Rotationstests untersucht, der ursprünglich von Duncan et
al. (1995) entwickelt wurde, um die Rotation der Untereinheit γ bei der Hydrolyse von
ATP relativ zum α3β3-Hexagon zu zeigen. Dabei nutzten Duncan et al. zur Verknüpfung
von Rotor und Stator die Cysteine βD380C und γC87 einer E. coli F1-Mutante und
außerdem eine Mutante die nur das Cystein βC380 besaß (βD380C/γC87S). In diesen
Experimenten wurde die MgATP-induzierte Rotation der Untereinheit γ relativ zu β
gezeigt. Im Rahmen dieser Arbeit wurde dieses Experiment genutzt, um die Rotation (oder
das Ausbleiben der Rotation) des C-terminalen Bereichs von γ relativ zu α nachzuweisen.
Dafür wurde das Experiment von Duncan et al. entsprechend modifiziert (Abb. 3.22).
Für das Experiment wurden EF1-Komplexe benötigt, bei denen jeweils eine α-Untereinheit und die γ-Untereinheit durch eine Disulfidbrücke miteinander verknüpft und die beiden verbleibenden α-Untereinheiten, um eine Unterscheidung von der mit γ verknüpften
α-Untereinheit zu ermöglichen, markiert waren. Ein in dieser Weise vorbereitetes Enzym
konnte nach der Reduktion mit ATP versetzt und schließlich wieder oxidiert werden.
Sollte sich der C-terminale Bereich der Untereinheit γ während der katalytisch aktiven
Phase nicht relativ zu der unmarkierten α-Untereinheit gedreht haben, dann sollte eine im
SDS-Gel nachgewiesene αγ-Bande nach der Reoxidation keine Markierung aufweisen.
Dagegen sollte im Fall einer erfolgten Relativ-Drehung zu α die αγ-Bande mit einer gewissen Wahrscheinlichkeit (denn die γ-Untereinheit kann bei der Reoxidation wieder mit
der ursprünglichen, unmarkierten α-Untereinheit verknüpft werden) eine Markierung aufweisen. Darüber hinaus konnte das Enzym statt mit ATP auch z. B. mit Inhibitoren der F1ATPase versetzt werden, um deren Auswirkungen auf die Rotation des C-terminalen Bereichs der Untereinheit γ relativ zu α untersuchen zu können.
Für das Experiment wurden zunächst jeweils ca. 15 mg MM10-EF1 durch Gelfiltration
von (NH4)2SO4 und DTT gereinigt (Abb. 3.23, Spur 1; ATP-Hydrolyseaktivität: 142 ±
11 u/mg) und durch Zugabe von 100 µM DTNB sowie 2 mM ATP und Inkubation für
16 h bei RT oxidiert. Nach dem Stoppen der Reaktion durch Zugabe von NEM wurden
unlösliche Bestandteile abzentrifugiert, die Probe durch Gelfiltration gereinigt und auf
Dissoziationspuffer umgepuffert. Auf diese Weise wurden etwa 10-12 mg oxidiertes
MM10-EF1 erhalten (Spur 2). Die Quervernetzung von αC280 und γC285 in MM10-EF1
erfolgte mit einer sehr hohen Ausbeute, was durch eine SDS-Polyacrylamid
Gelelektrophorese gezeigt werden konnte. In Abbildung 3.23 Spur 2 ist kein freies γ mehr
zu erkennen.
Ergebnisse
96
MM10
MM6
αP280C / γA285C
αP280C
Oxidation
Farbstoffmarkierung
Dissoziation
Reassoziation +
Reinigung
+
+
+
Reduktion
Katalyse
Reoxidation
?
?
Abb. 3.22 Schematische Darstellung des Experiments zum Nachweis der Rotation des Cterminalen Bereichs von γ relativ zu α
Die Abbildung zeigt F1-Komplexe in schematischer Darstellung. α-Untereinheiten sind als Kreise dargestellt, β-Untereinheiten als Vierecke und die Untereinheit γ jeweils als Dreieck. Die Cysteine αC280 und
γC285 sind als schwarze Punkte dargestellt. Die His-tags der β-Untereinheiten sind als schwarze Striche
dargestellt. Als Ausgangsmaterial wurden MM10-EF1 und MM6-EF1 verwendet. Nach der Oxidation von
MM10-EF1 (Quervernetzung zwischen αP280C und γA285C) und der TMR-Markierung von MM6-EF1 (rot
dargestellt) wurden beide Enzyme miteinander vermischt und in die einzelnen Untereinheiten zerlegt
(Dissoziation). Die Reassoziation konnte zu verschiedenen Produkten führen. Zum einen konnten die neu
gebildeten EF1-Komplexe TMR-markiertes γ aus MM6-EF1 enthalten (diese Spezies spielt jedoch für das
weitere Experiment keine Rolle, da sie keine Quervernetzung zwischen α und γ ausbilden kann), zum
anderen unmarkiertes γ aus dem quervernetzten αγ-Komplex vom oxidierten MM10-EF1. Die anderen αbzw. β-Untereinheiten der neu gebildeten Enzyme konnten entweder TMR-markiert sein, oder auch
unmarkiert (rot schraffiert dargestellt). Nach der Reduktion wurden die EF1-Hybride z. B. mit ATP (und
damit in einen aktiven Zustand) versetzt und schließlich re-oxidiert. Je nach Position von γ sollte dann die
Quervernetzung von α und γ entweder zu einem ungefärbten (keine Rotation von γ relativ zu α) oder einem
gefärbten (Rotation von γ relativ zu α) führen.
Ergebnisse
97
Die Markierung von quervernetzungsfähigen α-Untereinheiten erfolgte duch die Färbung
von MM6-EF1 mit Tetramethylrhodamin-5-isothiocyanat (TMR-ITC). Dazu wurden jeweils ca. 30 mg MM6-EF1 durch Gelfiltration von (NH4)2SO4 und DTT gereinigt (Spur 3;
ATP-Hydrolyseaktivität: 148 ± 7 u/mg) und mit dem 50fachen molaren Überschuß an
TMR-ITC versetzt. Der Reaktionsansatz wurde 1 h bei RT inkubiert und anschließend
unlöslicher Niederschlag abzentrifugiert. Die Abtrennung überschüssigen Farbstoffs erfolgte durch Gelfiltration gegen Dissoziationspuffer. Der Markierungsgrad des MM6-EF1
wurde durch die Bestimmung der Proteinkonzentration und der Farbstoffkonzentration in
der gereinigten Probe ermittelt. Üblicherweise wurden Markierungsgrade von 20-30 Farbstoffmolekülen pro MM6-EF1 erreicht. Die Ausbeute lag bei ca. 20 mg markiertem MM6EF1 (Spur 5). Das Gel zeigt, daß alle Untereinheiten des Enzyms durch den Farbstoff markiert werden. In Spur 5 ist zudem eine hochmolekulare Bande zuerkennen. Banden dieser
Molmasse konnten auch bei der Oxidation von MM10-EF1 beobachtet werden. Anhand
von western-blot-Analysen konnte gezeigt werden, daß diese hochmolekularen Banden α,
jedoch kein γ enthalten (K. Gumbiowski, Abteilung Biophysik, Universität Osnabrück,
persönliche Mitteilung). Es handelt sich daher bei dieser Bande offensichtlich um ein α2Homodimer. Bei der Reinigung von überschüssigem Farbstoff wurde das markierte MM6EF1 zugleich auch auf Dissoziationspuffer umgepuffert. In diesem Puffer besaß sowohl
das oxidierte MM10-EF1 als auch das markierte MM6-EF1 keine meßbare ATP-Hydrolyseaktivität mehr.
Zur Dissoziation wurden das oxidierte MM10-EF1 und das farbstoffmarkierte MM6-EF1
im Verhältnis 1:2 (ca. 10 mg MM10-EF1 : ca. 20 mg MM6-EF1) vermischt und durch zwei
Frier-Tau-Zyklen dissoziiert (Vogel und Steinhart 1976). Mit einer relativ geringen Ausbeute lagerten sich die Fragmente der Dissoziation bei der anschließenden Dialyse wieder
zu funktionsfähigem EF1 zusammen. Dabei konnte es zur Bildung verschiedener HybridEF1-Moleküle kommen. So konnten die Enzyme unmarkiertes und mit α verknüpftes γ aus
dem oxidierten MM10-EF1, aber auch farbstoffmarkiertes γ ohne das Cystein γC285 aus
MM6-EF1 enthalten, wobei die letztere Spezies offensichtlich nicht in größeren Mengen
entstand, da in Abbildung 3.23 Spur 6 (Ni-NTA-gereinigtes Hybrid-EF1) kein freies, markiertes γ zu erkennen ist. Freies, markiertes γ ließ sich dagegen im Durchlauf der Ni-NTASäule nachweisen. Diese markierte Untereinheit wurde offensichtlich nicht bevorzugt in
neu reassoziierte EF1-Hybride eingebaut. Weiterhin konnten alle α- und β-Untereinheiten
der Hybrid-EF1-Moleküle (außer der mit γ quervernetzten α-Untereinheit aus MM10-EF1,
die ausschließlich unmarkiert vorliegen konnte) entweder TMR-markiert oder unmarkiert
sein. Für das weitere Experiment war nur Hybrid-EF1, das unmarkiertes γ aus MM10-EF1
mit dem Cystein γC285 enthielt, von Bedeutung, da nur dieses zur Ausbildung einer αγBande fähig war. Die Dialyseprodukte wurden schließlich, nach dem Abzentrifugieren
unlöslicher Bestandteile des Dialysats, mit Hilfe der N-terminalen His-tags der β-Untereinheiten über Ni-NTA-Material aufgereinigt. Üblicherweise konnten ca. 1,5 mg Protein
von der Ni-NTA-Säule eluiert werden (Abb. 3.23, Spur 6). Die Ausbeute (bezogen auf 30
mg zur Dissoziation eingesetztes Protein) betrug damit ca. 5%.
98
Ergebnisse
Abb. 3.23 Nachweis der Rotation des C-terminalen Bereichs von γ relativ zu α
Untere Bildhälfte: SDS-PAGE (8-25%) in Gegenwart von 2% (w/v) SDS; Coomassie R-250/Silber-Anfärbung; Proteinkonzentration 3 mg/ml; jede Spur enthält 0,9 µg Protein; Obere Bildhälfte: Aufnahmen der in
der unteren Bildhälfte dargestellten SDS-Gele unter Bestrahlung mit UV-Licht (Wellenlänge: 302 nm);
1 MM10-EF1 Ausgangsmaterial; 2 MM10-EF1 nach Oxidation mit 100 µM DTNB in Gegenwart von 2 mM
ATP für 16 h bei RT; 3 MM6-EF1 Ausgangsmaterial; 4 MM6-EF1 nach Oxidation mit 100 µM DTNB in
Gegenwart von 2 mM ATP für 24 h bei RT; 5 MM6-EF1 nach Markierung mit 50fachem molaren Überschuß an TMR-ITC für 1 h bei RT; 6 über Ni-NTA-Material gereinigtes reassoziiertes Hybrid-EF1; 7,8 ohne
Nukleotidzugabe reduziertes und re-oxidiertes Hybrid-EF1; 9,10 Hybrid-EF1 reduziert und re-oxidiert in
Gegenwart von 4 mM AMP-PNP; 11,12 Hybrid-EF1 reduziert und re-oxidiert in Gegenwart von 4 mM
AMP-PNP und 4 mM ADP; 13,14 Hybrid-EF1 reduziert und re-oxidiert in Gegenwart von 4 mM ATP; Reaktionsbedingungen für die Reduktion von Hybrid-EF1: zweifache Zugabe von jeweils 20 mM DTT und
Inkubation für 16 bzw. 2 h bei RT; Reaktionsbedingungen für die Re-Oxidation von Hybrid-EF1: zweifache
Zugabe von jeweils 100 µM DTNB und Inkubation für 16 bzw. 2 h bei RT; 15 nichtreduzierte Kontrollprobe, die jedoch durch zweifache Zugabe von 100 µM DTNB und Inkubation für 16 bzw. 2 h bei RT nachoxidiert wurde
Ergebnisse
99
Tab. 3.9 Fluoreszenzintensitäten der α2-, αγ- und α/β-Banden in Abbildung 3.23
ohne Nukleotid
red.
re-ox.
+ AMP-PNP
red.
+ AMP-PNP/ADP
re-ox.
red.
re-ox.
+ ATP
red.
re-ox.
Kontr.
ox.
α2
2
2
2
3
3
3
5
4
20
αγ
2
17
3
12
2
14
2
12
2
α/β
84
73
79
70
90
79
81
80
73
Die Ermittlung der Fluoreszenzintensitäten erfolgte mit Hilfe des Programms GelPro 3.1 von Media
Cybernetics (Silver Spring, MD, USA). Die Gesamtintensität aller Banden einer Spur wurde jeweils gleich
100 gesetzt.
Das Gel zeigte für das Ni-NTA-gereinigte Enzym eine fluoreszierende α/β-Bande, eine
nichtfluoreszierende αγ-Bande, eine fluoreszierende α2-Bande und eine weitere hochmolekulare Bande. Bei der Aufreinigung mittels Ni-NTA-Affinitätschromatographie konnten
neben reassoziierten Hybrid-EF1-Komplexen auch einzelne, nicht reassoziierte β-Untereinheiten isoliert werden, da diese über einen His-tag verfügten (Abb. 3.22). Der Markierungsgrad des reassoziierten Hybrid-EF1 lag im Allgemeinen bei ca. 1-4 Farbstoffmolekülen pro EF1. Es zeigte sich jedoch, daß für die Auswertung von unter UV-Beleuchtung
hergestellten Fluoreszenzbildern von SDS-Gelen ein Markierungsgrad von mindestens ca.
1,2 Farbstoffmolekülen pro EF1 erforderlich war.
140
ATP-Hydrolyseaktivität (u/mg)
130
120
110
100
90
80
70
60
50
40
30
20
10
0
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
3.0
3.5
4.0
Markierungsgrad
Abb. 3.24 Abhängigkeit der ATP-Hydrolyseaktivität vom Markierungsgrad der Ni-NTAgereinigten MM10/MM6-EF1-Hybride
Der Markierungsgrad von mit TMR markiertem Hybrid-EF1 wurde anhand der Proteinkonzentration und der TMR-Konzentration in der gereinigten Proteinprobe bestimmt. Die TMR-Konzentration wurde nach dem
Lambert-Beerschen Gesetz (Gleichung 2, 2.3.5) mit einem Extinktionskoeffizienten für TMR von εTMR = 65000 cm-1 M-1 bei 555 nm berechnet.
100
Ergebnisse
Weiterhin zeigte sich, daß die ATP-Hydrolyseaktivität der Ni-NTA-gereinigten HybridEF1-Komplexe offenbar stark von ihrem Markierungsgrad abhing. Je höher der Markierungsgrad war, desto geringer war die Aktivität der entsprechenden Enzyme (Abb. 3.24).
Das Ni-Eluat (Abb. 3.23, Spur 6) wurde nun unterschiedlich behandelt. Aliquots des Eluats wurden entweder ohne Zugabe von Nukleotid reduziert (Spur 7) oder nach Zugabe von
AMP-PNP (Spur 9), AMP-PNP und ADP (Spur 11) oder ATP (Spur 13) mit DTT reduziert. Man erkennt das durch die Reduktion freigesetzte γ und eine Verringerung der Intensitäten der αγ-Banden. Jedoch erfolgte die Reduktion in allen vier Fällen nicht vollständig,
was an den noch schwach vorhandenen αγ-Banden zu erkennen ist. Außerdem ist bei der
Reduktion ein nahezu vollständiges Verschwinden der α2-Bande und der zweiten hochmolekularen Bande zu beobachten. Nach der Reduktion wurden die Proben gereinigt, bis
auf die Kontrolle ohne Nukleotidzugabe mit Nukleotiden versetzt und reoxidiert. Die reoxidierten Proben sind in Abbildung 3.23 in den Spuren 8, 10, 12 und 14 zu sehen. Bei der
Reoxidation wird das farblose MM10-γ wieder kovalent mit einer α-Untereinheit verknüpft, was an dem Verschwinden der γ-Bande in den Spuren 8, 12 und 14 (in Spur 10 ist
noch ein Rest an freiem γ zu sehen) und den jeweils deutlich stärkeren αγ-Banden zu erkennen ist. Im Gegensatz zu dem Hybrid-EF1-Ausgangsprodukt (Spur 6) ist nun jedoch in
allen Fällen unter Bestrahlung mit UV-Licht eine Fluoreszenz der αγ-Banden zu erkennen
(Abb. 3.23 und Tab. 3.9). Nur in einem Kontrollexperiment weist die αγ-Bande keine
Fluoreszenzintensität auf (Spur 15). Diese Probe Hybrid-EF1 wurde bezüglich der Reinigungsschritte und Inkubationszeiten genauso behandelt wie die anderen Proben, jedoch
wurde diese Probe nicht mit Nukleotid versetzt und nicht reduziert. In einem weiteren
Kontrollexperiment wurde untersucht, ob MM6 unter oxidierenden Bedingungen möglicherweise über das Cystein γC108 eine Quervernetzung zwischen α und γ bilden kann.
Dazu wurde eine Probe von MM6-EF1 mit 2 mM ATP versetzt und durch Zugabe von
100 µM DTNB und Inkubieren für 16 h bei RT oxidiert. Nach dem Abstoppen der
Reaktion durch Zugabe von NEM wurde die Probe durch Gelfiltration gereinigt und eine
Probe auf ein SDS-Gel aufgetragen (Abb. 3.23, Spur 4). Man erkennt, daß MM6 unter
oxidierenden Bedingungen keine Verknüpfung von α und γ ausbilden kann.
In Tabelle 3.10 sind die ATP-Hydrolyseaktivitäten der Hybrid-EF1-Komplexe im reduzierten und reoxidierten Zustand aufgeführt. Aufgrund der Abhängigkeit der Aktivitäten
vom Markierungsgrad der Proben wurden zur besseren Vergleichbarkeit alle Aktivitäten
auf die Aktivität des entsprechenden Ni-Eluats bezogen, dessen Hydrolyseaktivität gleich
100 gesetzt wurde. Die Aktivitäten der reduzierten und reoxidierten Proben zeigten im
Vergleich zum jeweiligen Startmaterial einen leichten Anstieg, der möglicherweise auf die
zusätzlichen Reinigungsschritte nach der Reduktion und Re-Oxidation zurückzuführen ist.
Der Anstieg ist bei den mit ATP behandelten Proben am stärksten (Anstieg auf ca. 140)
und bei den mit Inhibitoren versetzten Proben am schwächsten ausgeprägt (Anstieg auf ca.
110). Die Aktivitätsmessungen erfolgten mit verdünntem Enzym in Gegenwart von
10 mM ATP und in Abwesenheit von zusätzlichen Inhibitoren. Daher ist im Fall der mit
AMP-PNP und ADP versetzten Proben aufgrund der Verdrängung der Inhibitoren durch
ATP keine ausgeprägte Inhibierung der Enzyme zu beobachten.
Ergebnisse
101
Tab. 3.10 Normalisierte ATP-Hydrolyseaktivitäten der reduzierten und reoxidierten
Hybrid-EF1-Komplexe
Ni-Eluat
Reduzierte Probe
Reoxidierte Probe
ohne Nukleotid
100
120
113
+ AMP-PNP
100
102
119
+ AMP-PNP/ADP
100
112
104
+ ATP
100
149
134
Die Hydrolyseaktivitäten der rekonstituierten und gereinigten Hybrid-EF1-Komplexe lagen, abhängig vom
Markierungsgrad der Komplexe, bei 40-110 u/mg (siehe Abb. 3.24). Zur besseren Vergleichbarkeit wurden
diese Aktivitäten auf einen Wert von 100 normalisiert und die Aktivitäten der reduzierten und reoxidierten
Proben auf diese Werte bezogen. Die Aktivitätsmessungen erfolgten mit verdünnten Enzymproben in Gegenwart von 10 mM ATP. Aufgrund der Verdrängung restlicher Spuren von Inhibitoren durch ATP kam es
bei diesen Messungen nicht zur Inhibierung der Enzyme.
Zusammenfassend kann festgestellt werden, daß der C-terminale Bereich von γ, ursprünglich verknüpft mit einer unmarkierten α-Untereinheit, im reduzierten Zustand in Anwesenheit von ATP, AMP-PNP, AMP-PNP und ADP sowie in Abwesenheit von Nukleotid,
aufgrund der Fluoreszenzmarkierung der αγ-Banden in den entsprechenden reoxidierten
Proben, seine Position relativ zu den drei α-Untereinheiten des F1-Komplexes verändert,
d.h. rotiert, haben muß.
3.2.6 Nachweis der Rotation von Untereinheit γ relativ zu den β-Untereinheiten von
EF1
Die in 3.2.5 beschriebene Beobachtung, das der C-terminale Bereich von γ auch in Anwesenheit von Inhibitoren der EFOF1-ATP-Synthase im reduzierten Zustand des Hybrid-EF1
seine Position relativ zum α3β3-Hexagon ändern kann, ist problematisch. Dies würde bedeuten, daß γ selbst im inhibierten EF1-Komplex rotieren kann. Dagegen zeigten Duncan
et al. (1995) mit einem ähnlichen Versuchsansatz unter Verwendung eines EF1-Mutantenpaares mit den Mutationen βD380C/γC87 und βD380C/γC87S, daß die βγ-Banden von
reoxidierten EF1-Hybridkomplexen, die im reduzierten Zustand mit MgADP und Azid,
EDTA und ATP sowie nur mit MgCl2-haltigem Puffer behandelt wurden, eine deutlich
geringere radioaktive Markierung aufwiesen, als Proben, die im reduzierten Zustand mit
MgATP behandelt wurden. In diesen Versuchen konnte also eine Inhibierung der Enzymkomplexe durch Abwesenheit von Nukleotiden oder Anwesenheit von EDTA bzw.
MgADP und Azid nachgewiesen werden. Zur Kontrolle des in 3.2.5 beschriebenen Experiments wurde daher der von Duncan et al. durchgeführte Versuch prinzipiell wiederholt,
jedoch unter den experimentellen Bedingungen des in 3.2.5 beschriebenen Versuchs. Dazu
wurde das EF1-Cystein-Mutantenpaar SW3 (βD380C/γC87) und GH7 (βD380C/γC87A)
verwendet. Die Enzyme wurden mit Hilfe der Plasmide pSW3 bzw. pGH7 exprimiert, die
von S. Winkler bzw. G. Hikade (jeweils Abteilung Biophysik, Universität Osnabrück)
hergestellt und für diese Arbeit zur Verfügung gestellt wurden.
Ergebnisse
102
SW3-EF1 ermöglicht die Ausbildung einer Disufidbrücke an der gleichen Position wie im
Experiment von Duncan et al. (Abb. 3.25). Die Durchführung des Experiments mit SW3EF1 und GH7-EF1 erfolgte analog zu der Vorgehensweise des MM10/MM6-Experiments
(siehe 3.2.5). Abbildung 3.26 zeigt ein Verlaufsschema des Experiments.
Für den Versuch wurden 15 mg SW3-EF1 (Abb. 3.27, Spur 1; ATP-Hydrolyseaktivität:
89 u/mg) durch Zugabe von 100 µM DTNB und 2 mM ATP sowie 16 h Inkubation bei RT
oxidiert (Spur 2) und etwa 30 mg GH7-EF1 (Spur 3; ATP-Hydrolyseaktivität: 79 u/mg)
durch Zugabe des 50-fachen molaren Überschusses an TMR-ITC sowie 1 h Inkubation bei
RT farbstoffmarkiert (Spur 5). Zusätzlich wurde eine Probe unmarkiertes GH7-EF1 durch
Zugabe von 100 µM DTNB in Gegenwart von 2 mM ATP durch 16 h Inkubation bei RT
oxidiert (Spur 4). Wie in Abbildung 3.27 zu sehen ist, kann GH7-EF1 jedoch unter oxidierenden Bedingungen keine Verknüpfung von β und γ ausbilden. Weiterhin ist in Abb. 3.27
jeweils über den βγ-Banden eine weitere Bande zu erkennen. In Analogie zum
MM10/MM6-Experiment (3.2.5) wird davon ausgegangen, daß es sich bei diesen Banden
um β2-Homodimere handelt. Die α-Untereinheiten von SW3 und GH7 enthalten kein
Cystein und sollten somit keine Dimere bilden können. Das oxidierte SW3-EF1 und das
farbstoffmarkierte GH7-EF1 wurden jeweils nach dem Abzentrifugieren unlöslicher Bestandteile durch Gelfiltration gereinigt und dabei zugleich auf Dissoziationspuffer umgepuffert. In diesem Puffer wiesen beide Enzyme keine messbare ATP-Hydrolyseaktivität
mehr auf. Auf diese Weise konnten ca. 13 mg oxidiertes SW3-EF1 und ca. 18 mg markiertes GH7-EF1 gewonnen werden. Der Markierungsgrad von GH7-EF1 betrug 18 Farbstoffmoleküle pro EF1-Komplex.
Abb. 3.25 Schematische Darstellung der Cystein-Doppelmutante SW3
Die Abbildung zeigt links eine α-, rechts eine β- und in der Mitte die γ-Untereinheit des EF1-Komplexes.
SW3 verfügt über die Cysteine βC380 und γC87, die jeweils schwarz markiert sind. Sie ermöglichen die
Ausbildung einer Disulfidbrücke an der gleichen Position, wie bei der von Duncan et al. (1995) genutzten
Mutante.
Ergebnisse
103
Das oxidierte SW3-EF1 und das farbstoffmarkierte GH7-EF1 wurden anschließend miteinander vermischt und durch zwei Frier-Tau-Zyklen dissoziiert. Nach dem Auftauen wurde
die Probe verdünnt und nach dem Abzentrifugieren von unlöslichen Bestandteilen dialysiert. Nachdem hiernach wiederum unlösliche Bestandteile entfernt wurden, wurden reassoziierte Hybrid-EF1-Komplexe mit Hilfe einer Ni-NTA-Affinitätschromatographie aus
dem Dialysat isoliert (Spur 6). Dabei lag die Ausbeute bei ca. 1 mg Protein in 2 ml Eluatvolumen. Bezogen auf ca. 30 mg zur Dissoziation eingesetztes Protein beträgt die Ausbeute damit ca. 3%. Der Markierungsgrad des gereinigten Hybrid-EF1 betrug 3,4 Farbstoffmoleküle pro EF1-Komplex. Das Eluat der Ni-NTA-Säule wies keine messbare ATPHydrolyseaktivität auf. Dies ist verständlich, da Hybrid-EF1-Komplexe mit einer Rotor/Stator-Verknüpfung über βC380 und γC87 keine Aktivität aufweisen sollten (vgl. auch
Duncan et al. 1995). Darüber hinaus zeigt es, daß die Hybrid-EF1-Spezies mit freiem markiertem γ aus GH7-EF1 offenbar keinen Beitrag zur Aktivität des Hybrid-Gemisches leistet. Das Ni-Eluat wurde nun in Abwesenheit von Nukleotid (Spur 7), in Gegenwart von
4 mM AMP-PNP und 4 mM ADP (Spur 9) und in Gegenwart von 4 mM ATP (Spur 11)
reduziert und anschließend re-oxidiert (Spur 8, 10 und 12). Die reduzierten Hybrid-Komplexe wiesen ATP-Hydrolyseaktivitäten von 51 u/mg (ohne Nukleotidzugabe), 43 u/mg
(+ AMP-PNP/ADP) sowie 54 u/mg (+ ATP) auf, während für die re-oxidierten Proben in
keinem Fall eine ATP-Hydrolyseaktivität nachgewiesen werden konnte.
Ergebnisse
104
SW3
GH7
βD380C / γC87
βD380C
Oxidation
Farbstoffmarkierung
Dissoziation
Reassoziation +
Reinigung
+
+
+
+
Reduktion
Katalyse
Reoxidation
?
?
3.26 Schematische Darstellung des Experiments zum Nachweis der γ-Rotation relativ zu β
Die F1-Komplexe sind entsprechend Abb. 3.22 dargestellt. Im Unterschied zum Experiment
mit MM10- und MM6-EF1 wird in diesem Fall jedoch die Untereinheit β mit γ verknüpft.
Da β über einen His-tag verfügt, kann nun bei der Reinigung des reassoziierten Proteins zusätzlich zu den anderen Bestandteilen auch nichtmarkiertes und nicht an Reassoziationsprozessen beteiligtes βγ aus oxidiertem SW3-EF1 isoliert werden.
Ergebnisse
105
3.27 Ergebnis des Versuchs zum Nachweis der Rotation von γ relativ zu β
Untere Bildhälfte: SDS-PAGE (8-25%) in Gegenwart von 2% (w/v) SDS; Coomassie R-250/Silber-Anfärbung; Proteinkonzentration 3 mg/ml; jede Spur enthält 0,9 µg Protein; Obere Bildhälfte: Aufnahme des in
der unteren Bildhälfte dargestellen SDS-Gels unter Bestrahlung mit UV-Licht der Wellenlänge 302 nm;
1 SW3-EF1 Ausgangsmaterial; 2 SW3-EF1 nach Oxidation mit 100 µM DTNB in Gegenwart von 2 mM ATP
für 16 h bei RT; 3 GH7-EF1 Ausgangsmaterial; 4 GH7-EF1 nach Oxidation mit 100 µM DTNB in Gegenwart von 2 mM ATP für 24 h bei RT; 5 GH7-EF1 nach Markierung mit 50fachem Überschuß an TMR-ITC
für 1 h bei RT; 6 über Ni-NTA-Material gereinigtes reassoziiertes Hybrid-EF1; 7,8 ohne Nukleotidzugabe
reduziertes und re-oxidiertes Hybrid-EF1; 9,10 Hybrid-EF1 reduziert und re-oxidiert in Gegenwart von 4 mM
AMP-PNP und 4 mM ADP; 11,12 Hybrid-EF1 reduziert und re-oxidiert in Gegenwart von 4 mM ATP; Reaktionsbedingungen der Reduktion und Re-Oxidation entsprechend 3.2.5
106
Ergebnisse
Unter Beleuchtung mit UV-Licht wiesen sowohl die βγ-Bande des Ni-NTA-gereinigten
Hybrid-EF1 als auch die βγ-Banden der re-oxidierten Hybrid-EF1-Komplexe äußerst
schwache Fluoreszenzintensitäten auf. Dabei zeigten die Fluoreszenzintensitäten kaum
gravierende Unterschiede. So ist die βγ-Fluoreszenz in Spur 6 (Hybrid-EF1 vor der Reduktion) noch am stärksten, in den Spuren 8, 10 und 12 ist sie jedoch etwa gleich schwach.
Hierbei ist insbesondere bemerkenswert, das die βγ-Bande in Spur 12 (Hybrid-EF1 reduziert in Gegenwart von ATP und anschließend re-oxidiert) im Vergleich zu den entsprechenden Banden in den Spuren 6, 8 und 10 keine deutlich stärkere Fluoreszenzintensität
aufwies. Dies würde dafür sprechen, daß die Untereinheit γ der Hybrid-EF1-Komplexe im
reduzierten Zustand und in Gegenwart von ATP und damit in einem katalytisch aktiven
Zustand (54 u/mg) keine Relativbewegung zu den drei β-Untereinheiten ausgeführt hat.
Dieses Ergebnis würde in einem klaren Widerspruch zu den Ergebnissen von Duncan et al.
stehen, die unzweifelhaft eine solche Relativ-Rotationsbewegung nachgewiesen haben
(Duncan et al. 1995).
Diskussion
107
4 Diskussion
4.1 Einfluß C-terminaler γ-Deletionen auf die Funktion von EF1
Im ersten Teil dieser Arbeit wurde die Funktion des C-terminalen Bereichs der F1-Untereinheit γ für den Mechanismus der EFOF1-ATP-Synthase anhand von Deletionsmutanten
untersucht. Dieser Bereich von γ wurde, zusammen mit den ihn umgebenden Schleifen der
Untereinheiten α und β, aufgrund der Struktur des Enzymkomplexes als ein mögliches
Lager des F1-Motors bezeichnet (Abrahams et al. 1994). In diesem Modell kommt dem Cterminalen Bereich von γ die Funktion eines Lagerzapfens zu, während die benachbarten
α- und β-Schleifen die entsprechende Lagerbuchse bilden.
Die Untersuchung umfasst die Ermittlung kinetischer Daten, d. h. von ATP-Hydrolyseaktivitäten und Aktivierungsenergien, sowie mechanischer Daten, d. h. dem durch die EF1Mutanten erzeugten Drehmoment. Zu diesem Zweck wurde der C-Terminus von EF1-γ in
Schritten von jeweils drei Aminosäuren bis maximal um 18 Aminosäurereste verkürzt und
die Auswirkungen dieser Eingriffe auf die ATP-Hydrolyseaktivitäten und die rotatorischen
Eigenschaften der entsprechenden Enzymkomplexe untersucht. Die maximale Deletionslänge von 18 Aminosäureresten wurde aufgrund einer früheren Arbeit einer japanischen
Arbeitsgruppe gewählt, woher bekannt war, daß ein um diesen Umfang verkürzter γ-CTerminus zur Funktionsunfähigkeit des EF1-Komplexes führt (Iwamoto et al. 1990). Die
Deletions-Schrittgröße von jeweils drei Aminosäureresten wurde aufgrund der α-helicalen
Struktur von γ in diesem Bereich gewählt. Hierdurch wurden jeweils annähernd einzelne
Windungen der C-terminalen Helix entfernt (eine komplette Windung einer α-Helix entspricht 3,6 Aminosäureresten). Sechs plasmidcodierte γ-Deletionsmutanten wurden mittels
PCR hergestellt und für die Expression in E. coli DK8, einem Stamm ohne chromosomal
codierte ATP-Synthase, verwendet. Wie erwartet, zeigte die DK8-Mutante mit der Deletion γ-18 im Wachstumstest auf Succinatmedium kein Wachstum. Darüber hinaus konnte
gezeigt werden, daß auch die Deletion γ-15 zu einem in vivo funktionsunfähigen Enzym
führt. Die entsprechende DK8-Mutante zeigte auf Succinatmedium ebenfalls kein
Wachstum.
Der Succinat-Wachstumstest wird seit langem für die Überprüfung der Funktionsfähigkeit
der ATP-Synthase von Bakterienstämmen verwendet (Butlin et al. 1971, Downie et al.
1979). Zwischen der Fähigkeit zum Wachstum auf Succinat als einziger Kohlenstoffquelle
und der Funktionsfähigkeit der ATP-Synthase besteht jedoch kein unmittelbarer Zusammenhang. Selbst Zellen ohne ATP-Synthase sollten mit Hilfe des Citrat-Zyklus oder dem
Abbau von Pyruvat zu Acetat auch mit Succinat, Fumarat oder Malat als einziger Kohlenstoffquelle ATP gewinnen können. Die Grundlage für den Succinat-Wachstumstest liegt
offenbar vielmehr in dem Einfluß des ATP/ADP-Verhältnisses in der Zelle auf die Struktur der DNA (van Workum et al. 1996). Boogerd et al. (1998) nehmen an, daß bei atpMutanten durch diesen Einfluß die Expression eines Repressors verstärkt wird, der seinerseits die Expression eines C4-Dicarbonsäure-Transporters unterdrückt. Die Unfähigkeit
von atp-Mutanten zum Wachstum auf C4-Dicarbonsäuren beruht daher offenbar darauf,
daß diese an sich metabolisierbaren Substrate von den Zellen nicht mehr aufgenommen
werden können.
Die Wachstumsgeschwindigkeit auf Succinatmedium wird dabei durch die γ-Deletionen
eher schwach beeinflußt. So ist erst bei der Deletion γ-12 ein deutlicher Abfall der
108
Diskussion
Wachstumsgeschwindigkeit der entsprechenden DK8-Mutante festzustellen. Die DK8Deletionsmutanten wurden darüber hinaus für die Expression von EFOF1-Komplexen sowie für die Isolierung von EF1-Komplexen verwendet. Wegen der geringen Wachstumsgeschwindigkeiten auf succinathaltigem Medium wurde zu diesem Zweck jedoch ein Minimalmedium mit Glycerin als einziger Kohlenstoffquelle eingesetzt. Dieses Medium erlaubt keine Selektion nach der Funktionsfähigkeit der ATP-Synthase. Auch Zellen ohne
funktionsfähige ATP-Synthase, oder ohne ATP-Synthase, können auf diesem Medium
wachsen, da einerseits Glycerin nach Phosphorylierung und Oxidation auf der Stufe des
Glycerinaldehydphosphats in den Stoffwechselweg der Glykolyse eingeschleust werden
kann und andererseits, im Unterschied zu C4-Dicarbonsäuren, möglicherweise selbst bei
einem veränderten ATP/ADP-Verhältnis, die Glycerinaufnahme in die Zelle unbeeinflußt
bleibt. Tatsächlich zeigt E. coli DK8 ohne ATP-Synthase bei Wachstum in glycerinhaltigem Minimalmedium die gleiche Verdopplungszeit wie E. coli DK8 mit funktionsfähiger
ATP-Synthase (KH7). Dagegen zeigen DK8-Mutanten mit den Deletionen γ-3, γ-6, γ-9
und γ-12 zunehmend leicht erhöhte Verdopplungszeiten und DK8-Mutanten mit funktionsunfähigen Enzymen (γ-15 und γ-18) stark vergrößerte Verdopplungszeiten. Der Unterschied in den Verdopplungszeiten von Mutanten ohne ATP-Synthase (z. B. DK8) und
Mutanten mit funktionsunfähiger ATP-Synthase (z. B. γ-15 und γ-18) kann mit der Abwesenheit von Plasmiden und der damit geringeren Belastung des Nukleotidstoffwechsels
erklärt werden. So besitzt z. B. auch E. coli DK8 pKH7 gegenüber E. coli DK8 den Vorteil einer funktionsfähigen ATP-Synthase, verfügt jedoch zum Nachteil über Plasmide. In
der Summe besitzen beide Stämme ungefähr die gleiche Verdopplungszeit von ca.
140 min.
Die Isolierung von EF1 führte mit zunehmender Größe der γ-Deletionen zu einer abnehmenden Ausbeute an Protein. So nahm die Ausbeute an Protein pro Liter Anzuchtmedium
von KH7 (γ-0) bis MM8 (γ-12) um etwa die Hälfte ab. Von den in vivo funktionsunfähigen EF1-Komplexen MM18 (γ-15) und MM19 (γ-18) konnten keine mit Hilfe des S+GProteintests nachweisbaren Mengen an EF1 isoliert werden. Dies deutet auf eine erheblich
reduzierte Expressionsrate oder einen verstärkten Abbau dieser funktionsunfähigen Enzymkomplexe hin. Im Rahmen dieser Arbeit wurde nicht näher untersucht, in welchem
Maße geringe Mengen dieser Proteinkomplexe tatsächlich exprimiert werden und ob diese
Enzyme anschließend in vollständig assemblierter Form vorliegen. Es kann aufgrund dieser Untersuchungen jedenfalls nicht ausgeschlossen werden, daß diese Enzymkomplexe
in Spuren gebildet werden. So gehen Iwamoto et al. (1990) sowie Miki et al. (1986) von
einer Bildung assemblierter, aber inaktiver EF1-Komplexe bis zu einer C-terminalen γDeletion von 18 Aminosäureresten aus. Diesen Arbeiten zufolge wird erst bei einer γ-Deletion von 26 Aminosäureresten (γQ261-V286) kein EF1 mehr gebildet. Deletionen zwischen 18 und 26 Aminosäureresten wurden dabei nicht untersucht. Der fehlgeschlagene
Isolierungsversuch von MM18- und MM19-EF1 zeigt jedoch, daß bereits der γ-Bereich
von Q269-Q274 einen erheblichen Einfluß auf die EF1-Bildung besitzt.
Die Reinheit der isolierten und Ni-NTA-gereinigten EF1-Mutanten wurde mit Hilfe der
SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese überprüft. Das Gel zeigt, neben schwachen Verunreinigungen, im Wesentlichen α/β- sowie γ-Banden (Abb. 3.4). Dabei stimmen die anhand
des Gels durch Vergleich mit dem Proteinmarker ermittelten Molmassen der γ-Untereinheiten gut mit berechneten Werten (Peptide Property Calculator, Northwestern University,
Chicago, IL, USA) für die Molmassen überein. Anhand des Gels wurden Molmassen von
Diskussion
109
31,4 kDa (KH7-γ), 30,9 kDa (γ-3), 30,3 kDa (γ-6), 30,0 kDa (γ-9) und 29,9 kDa (γ-12)
ermittelt. Die berechneten Werte liegen bei 31,356 kDa (KH7-γ), 31,115 kDa (γ-3),
30,899 kDa (γ-6), 30,558 kDa (γ-9) und 30,215 kDa (γ-12). Auffällig ist, daß es durch die
Verkürzungen des C-terminalen Bereichs offenbar nicht zu einem zunehmenden Verlust
der Untereinheit γ kommt. MM8-EF1 (γ-12) besitzt ein ähnliches α/β:γ-Verhältnis wie die
anderen EF1-Mutanten und wie KH7-EF1. Dies zeigt, daß sich Aminosäurereste, die
wesentlichen an einer Stabilisierung von γ im α3β3-Hexagon beteiligt sind, vom γ-CTerminus aus betrachtet erst jenseits von γE275 befinden. Vorstellbar ist auch, daß ein
verkürzter γ-C-Terminus aufgrund der Flexibilität der Untereinheit noch bis zu einem
gewissen Grad in den Bereich der α3β3-Lagerbuchse hineinverlagert oder durch
Wechselwirkungen mit der Lagerbuchse in diese hineingezogen werden kann.
Die ATP-Hydrolyseaktivitäten der isolierten EF1-Komplexe stimmen mit bereits von
Iwamoto et al. (1990) für γ-Deletionsmutanten ermittelten Werten gut überein. So fanden
Iwamoto et al. für EF1 mit C-terminalen γ-Deletionen von 4 bzw. 10 Aminosäureresten
63% bzw. 14% der ATP-Hydrolyseaktivität des entsprechenden Wildtyp-Enzyms (Messungen bei 37°C). In der vorliegenden Arbeit wurde für (γ-3)-EF1 70%, für (γ-6)-EF1 50%,
für (γ-9)-EF1 30% und für (γ-12)-EF1 24% der ATP-Hydrolyseaktivität des (γ-0)-EF1 KH7
gemessen (Messungen bei 35°C). Abweichungen bei der Bestimmung von ATP-Hydrolyseaktivitäten können hier zum einen aufgrund der unterschiedlichen Meßtemperaturen
auftreten, zum anderen wurden in dieser Arbeit isolierte, Ni-NTA-gereinigte Enzymkomplexe vermessen, während Iwamoto et al. die genannten Aktivitätsverhältnisse anhand von
EFOF1-haltigen Membranpräparationen bestimmt haben.
Darüber hinaus wurden im Rahmen dieser Arbeit die ATP-Hydrolyseaktivitäten der mutierten EF1-Komplexe und von KH7-EF1 für Temperaturen im Bereich von 5-40°C gemessen und anhand dieser Daten die Aktivierungsenergien der ATP-Hydrolyse durch diese
Enzyme bestimmt. Auffällig war dabei das verhältnismäßig starke Absinken der Aktivitäten von KH7-EF1 bei Temperaturen unter 20°C. Dieser Effekt trat auch bei (γ-3)-EF1 bei
Temperaturen von 5-10°C auf. Dagegen fiel die Hydrolyseaktivität von (γ-12)-EF1 im
Bereich hoher Temperaturen schon bei 40°C ab, während es bei den anderen Deletionsmutanten und KH7-EF1 erst bei Temperaturen von über 40°C zu einem Absinken der Aktivitäten kam. Im mittleren Temperaturbereich zeigten alle Enzyme einen exponentiellen
Anstieg der Hydrolyseaktivitäten. In der Arrhenius-Auftragung führte dies zu einer Verschiebung des linearen Bereichs der Meßkurven von (γ-12)-EF1 zu KH7-EF1 zu höheren
Temperaturen. Die Gründe für den Aktivitätsabfall von KH7-EF1 bei geringen Temperaturen (ca. 5-15°C) sind unbekannt, jedoch ist dieser Effekt für F1-Komplexe in der Literatur
bereits mehrfach beschrieben worden. So finden z. B. Dorgan et al. (1984) sowie Baracca
et al. (1989) für mitochondriales F1 und Grüber et al. (1994) für die ATP-Synthase aus
Micrococcus luteus ebenfalls starke Aktivitätsabfälle bei tiefen Temperaturen. Im Unterschied zu dem hier gefundenen Aktivitätsabfall von KH7-EF1, der zu einer stetig abfallenden Arrhenius-Kurve führt, handelt es sich bei den Arrhenius-Aktivierungsenergieprofilen
dieser Arbeiten jedoch um eindeutig zweiphasige Profile mit scharfen Übergängen bei ca.
18-20°C bzw. ca. 32°C. Als Gründe für den Aktivitätsabfall bei niedrigen Temperaturen
werden thermisch induzierte Konformationswechsel des Enzyms und Wechsel geschwindigkeitsbestimmender Reaktionsschritte des Aktivitätstests diskutiert. Adade et al. (1987)
sowie Al-Shawi und Senior (1988) gehen von einer reversiblen Kälte-Denaturierung aus.
Das es sich bei diesem Effekt nicht um einen irreversiblen Inhibierungsprozess handelt,
110
Diskussion
konnte auch in dieser Arbeit anhand von Aktivitätsmessungen bei 37°C mit KH7-EF1, das
zuvor 30 min bei 5°C inkubiert worden war, bestätigt werden. Das Enzym gewann nach
der Erwärmung seine ursprüngliche Aktivität zurück. Da der Aktivitätsabfall bei tiefen
Temperaturen nur KH7-EF1 und, in geringerem Maße (γ-3)-EF1, betrifft, muß es sich jedoch um einen Effekt handeln, der mit dem C-terminalen Bereich von γ in Verbindung
steht. Offenbar bestehen im Bereich tiefer Temperaturen für Enzyme mit vollständigen
bzw. geringfügig verkürzten γ-Untereinheiten bei der γ-Rotation Aktivierungshürden, die
für Enzyme mit stärker verkürzten γ-Untereinheiten nicht existieren.
Aufgrund der nichtlinearen Bereiche der Arrhenius-Aktivierungsenergieprofile wurden die
Aktivierungsenergien für die ATP-Hydrolyse durch KH7-EF1 und die Deletionsmutanten
nur anhand des Temperaturbereichs zwischen 20°C und 35°C bestimmt. Für KH7-EF1
konnte eine Aktivierungsenergie von Ea = 54 kJ/mol ermittelt werden. Dieser Wert stimmt
gut mit bereits von Al-Shawi und Senior (1988) für EF1 bestimmten Werten überein. In
dieser Arbeit wurden für die Aktivierungsenergie von EF1 anhand einer einphasigen
Arrhenius-Gerade für 23°C und 30°C Werte von jeweils 53,6 kJ/mol ermittelt.
Im Vergleich zu EF1 mit unverkürztem γ zeigten die γ-Deletionsmutanten eine um bis zu
35% verringerte Aktivierungsenergie (z. B. Ea (MM8-EF1) = 34 kJ/mol). Die Ursache
hierfür kann in zunehmend schwächeren Wechselwirkungen des C-terminalen Bereichs
von γ mit dem α3β3-Hexagon liegen. Die Abnahme der Aktivierungsenergien zeigt jedenfalls deutlich, daß die Verkürzung von γ nicht zu einem Auftreten höherer Aktivierungshürden aufgrund einer verschlechterten Führung des C-terminalen γ-Bereichs im α3β3Hexagon führt.
Anhand der Aktivitätsmessungen kann jedoch nicht geklärt werden, wodurch die mit der
Deletionslänge zunehmend geringere Aktivität der Mutanten hervorgerufen wird. Die geringere Aktivität einer mutierten Enzympopulation kann einerseits durch gleichermaßen
beeinträchtigte Enzymkomplexe (alle Enzyme aktiv, jedoch mit geringerer maximaler
Umsatzrate) erzeugt werden, jedoch andererseits auch durch ein verändertes Verhältnis
von aktiven und inaktiven Enzymkomplexen. Im letzteren Fall könnten aktive Enzymkomplexe durchaus „Wildtyp“-Aktivitäten erreichen, jedoch würde die Wahrscheinlichkeit, das sich die Enzyme in einem inaktiven Zustand befinden, durch die Mutation erhöht
werden. Die Mutation würde dann nicht die katalytischen Eigenschaften bzw. im Fall eines Motorproteins die mechanischen Eigenschaften des Enzyms betreffen, sondern in erster Linie die Stabilität des aktiven Protein-Komplexes.
Für die weitere Untersuchung der Auswirkungen von Verkürzungen des C-terminalen
Bereichs von γ auf die mechanischen Eigenschaften des EF1-Komplexes wurden die durch
die Enzymkomplexe erzeugten Drehmomente bestimmt. Dazu wurde ein Rotationstest
verwendet, der ursprünglich von Noji et al. (1997) etabliert wurde. Hierbei werden F1Komplexe über die N-terminalen β-Bereiche auf einem Glasträger immobilisiert und die
Rotation der γ-Untereinheit mit Hilfe eines Rotationsindikators (hier ein farbstoffmarkiertes Actinfilament) bei Zugabe eines ATP-haltigen Puffers direkt mikroskopisch beobachtbar gemacht.
Im mikrovideographischen Rotationstest konnten bei allen isolierten EF1-γ-Deletionsmutanten rotatorisch aktive EF1-Komplexe beobachtet werden. Die Ausbeute an rotierenden
Actinfilamenten zeigte jedoch eine starke Abhängigkeit von der Deletionslänge der EF1Mutanten. Bei einer durchschnittlichen Beobachtungszeit der Glas-Küvetten von 30 min
konnten etwa 30-40 KH7-EF1-Rotatoren gefunden werden. Wurden die Experimente mit
Diskussion
111
(γ-12)-EF1 durchgeführt, sank die Ausbeute auf durchschnittlich einen Rotator pro 30 min
Suchzeit ab.
Diese Ausbeuteangaben beziehen sich jedoch nur auf die Beobachtungszeit der Durchflußküvetten und nicht auf die Gesamtzahl der jeweils immobilisierten Enzymkomplexe.
Die Belegung der Küvettenoberfläche mit EF1-Komplexen konnte im mikrovideographischen Rotationstest nicht ermittelt werden. Auch der Belegungsgrad der Enzymkomplexe
mit Actinfilamenten war jeweils unbekannt. Weiterhin ist zu berücksichtigen, das verschiedene Faktoren einen Einfluß auf die Ausbeute an Rotatoren im mikrovideographischen Rotationstest besitzen. So wurden die verwendeten EF1-Komplexe nach der Biotinylierung durch eine Ni-NTA-Affinitätschromatographie von überschüssigem Biotin-Maleimid gereinigt. Die Enzyme lagen daher in einem imidazolhaltigen Puffer vor und wurden, mit BMKM-Puffer auf eine Konzentration von 5-10 nM verdünnt, in die Durchflußküvetten gegeben. Abhängig vom erforderlichen Verdünnungsverhältnis wurde daher auch
Imidazol mit in die Durchflußküvetten überführt und damit letztlich die Bindung von EF1
an die Ni-NTA-Meerrettich-Peroxidase beeinflußt. Je geringer das Verdünnungsverhältnis
war, desto stärker wurde eine Immobilisierung von EF1-Komplexen unterdrückt. Andererseits besitzt ein geringer Imidazolgehalt in der aufgegebenen Lösung auch den positiven
Effekt einer Entfernung unspezifisch gebundener Enzymkomplexe. Eine schwächere Belegung der Küvettenoberfläche mit Enzymen führt auch zu einer verminderten gegenseitigen Behinderung möglicher Rotatoren. Schließlich beeinflußt auch die Actinfilamentlänge
die Ausbeute an Rotatoren. Die Actinfilamente wurden für den Einsatz im Rotationstest
durch mehrmaliges Pipettieren auf eine Länge von 1-5 µm verkürzt. Die Zugabe von
überwiegend langen Filamenten kann die Ausbeute an Rotatoren senken, da diese Filamente eine erhebliche Last für die Enzymkomplexe darstellen und zudem mit höherer
Wahrscheinlichkeit mehrere Kontaktstellen auf der mit Proteinen belegten Glasoberfläche
besitzen. Aufgrund der Unkenntnis über die Gesamtbelegung der Küvetten mit EF1-Komplexen sowie der Unkenntnis über die durchschnittliche Actinfilamentlänge der immobilisierten Enzyme, stellen die genannten Ausbeuten keine exakte Angabe über eine Verteilung von aktiven und inaktiven Enzymen bei verschiedenen Enzympräparationen sondern
nur eine Tendenz dar.
Wesentlich exakter ließ sich dagegen das durch die Deletionsmutanten erzeugte Drehmoment im Verhältnis zum Drehmoment von KH7-EF1 bestimmen. Anhand der videographisch aufgezeichneten Rotatoren ließ sich die Rotationsrate und die Länge der Actinfilamente verhältnismäßig genau ermitteln. In die Gleichung zur Berechnung des erzeugten
Drehmoments geht jedoch nach Hunt et al. (1994) auch die Viskosität des Mediums ein,
welches das rotierende Actinfilament umgibt. In früheren Arbeiten zur Bestimmung des
durch F1 oder FOF1 erzeugten Drehmoments wurde hierfür die Viskosität des Wassers bei
20°C von η = 1*10-3 kg/(ms) eingesetzt (Noji et al. 1997, Yasuda et al. 1998, Sambongi et
al. 1999). Als Näherungswert für den überstehenden, proteinhaltigen Reaktionspuffer mag
dieser Wert gelten, jedoch ist für die effektive Viskosität, die auf ein ca. 10 nm über einer
Glasoberfläche rotierendes Actinfilament wirkt, aufgrund der Nähe von bewegtem Objekt
und statischer Oberfläche ein höherer Wert zu erwarten (Happel und Brenner 1983). Dieser Effekt wird weiterhin durch den direkten Kontakt des Actinfilaments mit der unebenen
und zudem mit Proteinen belegten Glasoberfläche (Oberflächenreibung) sowie durch Hindernisse, die eine Rotation des Filaments erschweren oder blockieren können, verstärkt
(Pänke et al. 2001). Mit einer angenommenen Viskosität von 1*10-3 kg/(ms) konnten in
dieser Arbeit für KH7-EF1-Rotatoren durchschnittliche Drehmomente von ca. 20 pN nm
112
Diskussion
ermittelt werden. Die Drehmomentsbestimmung anhand der Krümmung von Actinfilamenten, eine Methode, die die Problematik der Oberflächeneffekte umgeht, lieferte für
EFOF1 hingegen durchschnittliche Drehmomente von ca. 50 pN nm (Cherepanov und
Junge 2001, Pänke et al. 2001). Für die im Rahmen dieser Arbeit anhand der Rotationsgeschwindigkeit bestimmten Drehmomente wurde daher das durch KH7-EF1-Rotatoren erzeugte durchschnittliche Drehmoment auf 51 pN nm festgesetzt und mit diesem Wert eine
effektive Oberflächenviskosität von 2,4*10-3 kg/(ms) berechnet. Die Drehmomente der
Deletionsmutanten wurden entsprechend mit dieser Oberflächenviskosität bestimmt. Die
Ergebnisse zeigten für EF1-Komplexe mit verkürztem γ zwar um ca. 20% geringere
Drehmomente, jedoch keine zunehmende und damit eine von der Deletionslänge abhängige Drehmomentsabnahme. Die Rotation einzelner aktiver F1-Komplexe scheint durch
Deletionen im Bereich der vermuteten Lagerregion also kaum beeinflußt zu werden. Es
muß jedoch berücksichtigt werden, daß die Enzymkomplexe durch die verwendeten Rotationsindikatoren stark belastet werden. Die Länge der Actinfilamente (1-5 µm) übersteigt
den Durchmesser der EF1-Komplexe um etwa das 100-500fache. Im Rotationstest erreichen die Enzyme unter ATP-Hydrolyse bei Raumtemperatur maximale Rotationsraten von
ca. 5-10 s-1. In Lösung beträgt die ATP-Hydrolyseaktivität von KH7-EF1 bei 20°C etwa
33 u/mg. Dies entspricht einer Rotationsrate von ca. 70 s-1. Die Enzyme arbeiten im
Rotationstest unter optimalen Vorraussetzungen daher mit etwa 10fach verringerter
Umdrehungszahl. Effekte durch Mutationen, die einen Einfluß auf die maximale
Rotationsrate des Enzyms besitzen, können daher unter Umständen durch den
Rotationstest mit schwer belasteten Enzymen nicht erfasst werden. Darüber hinaus
beziehen sich die Drehmomentsbestimmungen nur auf einzelne Rotationsphasen aktiver
EF1-Komplexe, der Einfluß C-terminaler γ-Deletionen auf das Verhältnis von
Rotationsphasen und Rotationspausen wird dadurch nicht berücksichtigt. Seit langem ist
bekannt, das sich F1-Enzympopulationen aus aktiven und inaktiven Enzymkomplexen
zusammensetzen, wobei zwischen beiden Zuständen langsame Übergänge stattfinden
(Moyle und Mitchell 1975, Bulygin und Vinogradov 1991). Dabei wird der inaktive
Zustand mit einer MgADP-abhängigen, reversiblen Inhibierung des Enzyms erklärt
(Masaike et al. 2000). Auch im mikrovideographischen Rotationstest konnte
nachgewiesen werden, das F1-Komplexe, selbst in Anwesenheit hoher ATPKonzentrationen, offenbar aufgrund der reversiblen Inhibierung durch MgADP bis zu ca.
60 s lange Rotationspausen einlegen. Es konnte gezeigt werden, daß F1-Komplexe in
Gegenwart von 2 mM ATP durchschnittlich 33,5% der Zeit rotieren und 66,5% der Zeit
kurze oder lange Rotationspausen einlegen, wobei ein rotierender F1-Komplex
durchschnittlich alle 22 s eine Pause von mehr als 10 s einlegt (Hirono-Hara et al. 2001).
Hinweise auf ein erhöhtes Rotations/Rotationspausen-Verhältnis bei EF1-Komplexen mit
verkürztem γ im Vergleich zu KH7-EF1 konnten jedoch anhand der hier erhobenen Daten
nicht gefunden werden. Durchschnittlich rotierten KH7-EF1 sowie die Deletionsmutanten
unabhängig von der Deletionslänge (in Gegenwart von 5 mM ATP) 60% ± 19% der Zeit,
in der theoretisch eine Rotation des Actinfilaments möglich gewesen wäre. Diese Zeit
wird hier als Laufzeit bezeichnet. Die durchschnittliche Laufzeit der Rotatoren betrug
etwa 1 min. Rotatorlaufzeiten setzten sich aus Rotations- und Stillstandsphasen
zusammen, begannen und endeten jedoch stets mit einer Rotationsphase. Dabei konnte
nicht ermittelt werden, ob es sich bei dem letzten beobachteten Rotationsstopp um einen
irreversiblen Stopp, z. B. aufgrund der Verklemmung des Actinfilaments an einem Oberflächenhindernis, handelte, oder ob die möglicherweise folgende Rotationsphase nur z. B.
Diskussion
113
aufgrund eines Wechsels des beobachteten Rotators nicht mehr aufgezeichnet wurde.
Weiterhin konnte anhand der hier erhobenen Daten nicht ermittelt werden, aus welchem
Grund die Rotatoren innerhalb der Laufzeiten stoppten. Die Rotationspausen konnten zum
einen aufgrund der MgADP-Inhibierung erfolgen, zum anderen auch aufgrund von Oberflächeneffekten, wie z. B. dem (kurzfristigen) Verklemmen eines Actinfilaments an einem
Hindernis auf der Oberfläche des Objektträgers. Aufgrund der verhältnismäßig kurzen
Beobachtungszeit der Rotatoren und der Unkenntnis der Ursachen für die Rotationspausen
ist daher fraglich, ob das hier ermittelte Rotationspausen/Rotations-Verhältnis eine Aussage über den Effekt der MgADP-Inhibierung zuläßt. Lange Rotationspausen aufgrund der
MgADP-Inhibierung hätten als irreversible Rotationsstopps fehlinterpretiert werden können und zu einem Wechsel des beobachteten Rotators führen können. Untersuchungen
zum Rotations/Rotationspausen-Verhältnis von F1-Motoren erfordern lange Beobachtungszeiten von bis zu 500 s und die Verwendung von möglichst kleinen Rotationsindikatoren (Ausschaltung von Oberflächeneffekten) (vgl. Hirono-Hara et al. 2001). Anhand
der hier erhobenen Daten läßt sich daher nur feststellen, daß die mechanische Funktion
rotatorisch aktiver EF1-Komplexe durch die γ-Deletionen nicht beeinflußt wird.
In dieser Arbeit wurde weiterhin die Auswirkung einer C-terminalen γ-Deletion auf die
Rotation des EFOF1-Komplexes untersucht. Dazu wurde die Deletion γ-6 in das Plasmid
pSE1 eingeführt. Die Expression dieses Plasmids führt zu einem Enzymkomplex, der neben N-terminalen β-His-tags über C-terminale c-Strep-tags verfügt. Die Anbindung des
Rotationsindikators erfolgt hier über die Strep-tags der c-Untereinheiten mittels Strep-tag
– Streptactin – Biotin-Wechselwirkungen. Rotierende Aktinfilamente konnten bei der
Verwendung von (γ-6)-EFOF1 im Rotationstest jedoch nicht beobachtet werden. Das Enzym ist in vivo funktionsfähig, wie anhand eines positiven Succinat-Wachstumstests gezeigt werden konnte, jedoch zerfiel der Komplex bei der Probenvorbereitung für den Rotationstest offenbar in den FO- und den F1-Teil. So zeigten Proben des Ni-NTA-gereinigten
Proteins im SDS-Gel zwar die Anwesenheit von α/β- und γ-Untereinheiten, jedoch keine
FO-Untereinheiten mehr. Andererseits wies das Streptactin-gereinigte Enzym zwar Banden
der FO-Untereinheiten c und b auf, aber kaum eine Anwesenheit von F1-Untereinheiten.
Da die Ni-NTA-Reinigung jeweils nach der Streptactin-Reinigung erfolgte, ist zu vermuten, daß durch die Ni-NTA-Affinitätschromatographie lediglich EF1 aus dem Eluat der
Streptactin-Säulen isoliert wurde. Es muß daher davon ausgegangen werden, daß das Enzym bei der Reinigung in die Teilkomplexe zerfallen ist und das es sich bei der beobachteten Bindung von Actinfilamenten möglicherweise um eine unspezifische Bindung von
Filamenten an die proteinbedeckte Oberfläche des Objektträgers bzw. um die Anbindung
von Actinfilamenten an EFOF1-Komplexe ohne funktionelle Kopplung zwischen FO und F1
handelt. Möglicherweise spielt für den Zusammenhalt von FO und F1 der hier im Rotationstest vermessenen (γ-6)-EFOF1-Mutante auch das Cystein γC108, über das diese Mutante verfügt, eine Rolle. Für eine weitere Untersuchung von EFOF1-Deletionsmutanten
wäre daher, neben einer möglicherweise notwendigen Entfernung von γC108, eine Optimierung der Isolierungs- und Reinigungsprotokolle für die Probenvorbereitung von
EFOF1-Deletionsmutanten erforderlich.
Zusammenfassend ist gezeigt worden, daß die Verkürzung des C-terminalen Bereichs der
Untereinheit γ des EF1-Komplexes die Rotationsbewegung der Untereinheit bei ATP-Hydrolyse unter Last kaum beeinflußt (Drehmomentabnahme ca. 20%), jedoch die ATP-Hydrolyseaktivität unter lastfreien Bedingungen stark beeinträchtigt (Aktivitätsabnahme
Diskussion
114
ca. 75%). Dies deutet darauf hin, daß die letzten 12 Aminosäuren des C-Terminus von γ
eine eher geringe Bedeutung für die mechanische Funktion des EF1-Komplexes besitzen,
aber auf die Stabilität des aktiven Enzymkomplexes einen großen Einfluß haben. Aktive
Enzymkomplexe mit C-terminalen Deletionen von bis zu 12 Aminosäuren scheinen im
wesentlichen ähnlich zu arbeiten, wie EF1 mit vollständiger γ-Untereinheit. Jedoch wird
durch die Deletionen möglicherweise die Wahrscheinlichkeit erhöht, das die Enzymkomplexe reversibel in einen inaktiven Zustand gelangen, wodurch die Aktivitätsabnahme
erklärt werden könnte.
4.2 Folgen einer Rotor/Stator-Verknüpfung im C-terminalen γ-Bereich
für die Funktion von EF1
Im zweiten Teil dieser Arbeit wurden die Folgen einer Verknüpfung der Rotor-Untereinheit γ mit einer Stator-Untereinheit α im Bereich des vermuteten Lagerbereichs untersucht. Die Einführung einer solchen Verknüpfung mittels einer Disulfidbrücke sollte, aufgrund der räumlichen Nähe, insbesondere in einer Lagerregion mit hohen Ausbeuten
möglich sein. Darüber hinaus ist bei einer Blockierung der Rotation von Rotor- relativ zu
Statoruntereinheiten ein erheblicher Einfluß auf die Aktivität der ATP-Synthase zu erwarten. Dies wurde z. B. bereits anhand der Einführung von Disulfidbrücken zwischen γ
und β (Duncan et al. 1995) sowie γ und b (Suzuki et al. 2000) gezeigt. Für die Bildung
einer Disulfidbrücke zwischen α und γ wurden anhand einer vom mitochondrialen FOF1Komplex (Gibbons et al. 2000) abgeleiteten und auf EFOF1 übertragenen Struktur die
Aminosäurereste α280 und γ285 ausgewählt. Aufgrund dieser Struktur wurden für die
Abstände zwischen den Cα-Atomen von α280 und γ285 Werte von 5,8 Å, 11,1 Å und
13,4 Å erwartet. Nach Careaga und Falke (1992a/b) gilt als Voraussetzung für die Bildung
einer Disulfidbrücke unter anderem ein Abstand der beiden Cystein-Cβ-Atome von
mindestens 3,4 Å und maximal 4,6 Å. Abhängig von der Orientierung der Cα-CβBindungen (Bindungslänge ca. 1,5 Å) konnte daher das Erreichen dieses erforderlichen
Abstandes zwischen Cβ von αC280 und Cβ von γC285 erwartet werden. Eine
entsprechende αP280C/γA285C-EF1-Mutante wurde mittels PCR erzeugt und mit MM10
bezeichnet. E. coli DK8 zeigte sowohl mit der EF1-Mutanten MM10 als auch mit den
Vorläufern der Mutante MM6 (αP280C) und MM9 (γA285C) im Succinat-Wachstumstest
ein normales Wachstum. Dies deutet auf eine normale Funktion der EinzelCysteinmutanten als auch der Doppel-Cysteinmutante MM10 hin, die in vivo unter den
reduzierenden Bedingungen des E. coli-Cytosols keine Disulfid-Verknüpfung aufweist.
Darüber hinaus zeigte isoliertes und aufgereinigtes MM10-EF1 im Vergleich zu KH7-EF1
im ATP-Hydrolyseaktivitätstest keine abweichende Aktivität. Für beide Enzyme wurden
mit Hilfe des LeBel-Aktivitätstests Werte von 110-140 u/mg gemessen.
Gumbiowski et al. (2001) zeigten weiterhin, daß in MM10-EF1 eine Disulfidbrücke zwischen den Untereinheiten α und γ unter oxidierenden Bedingungen mit Ausbeuten von
mehr als 98% gebildet werden kann. Oxidierte MM10-EF1-Proben wiesen im SDS-Gel
eine hochmolekulare Bande auf, die neben α auch γ enthält, wie anhand von western blot-
Diskussion
115
Analysen nachgewiesen werden konnte. Weiterhin wurde gezeigt, daß die α/γ-Quervernetzung durch Reduktion mit DTT wieder vollständig entfernt werden kann. Überraschenderweise besaß die Bildung der Quervernetzung jedoch weder einen Einfluß auf die ATPHydrolyseaktivität von MM10-EF1 noch auf die Rotation der γ-Untereinheit von MM10EF1. Das Enzym zeigte im Rotationstest sowohl im oxidierten Zusatand als auch im reduzierten Zustand das gleiche Drehmoment wie das als Vergleichsprobe verwendete KH7EF1. Damit zeigte MM10-EF1 bezüglich der ATP-Hydrolyseaktivität und der Drehmomenterzeugung im oxidierten Zustand gravierende Unterschiede zu weiteren CysteinDoppelmutanten, bei denen Disulfidbrücken an den Positionen αA334C γL262C sowie
βD380C γC87 und damit in zunehmender Entfernung vom γ-C-Terminus eingeführt
werden konnten. Diese Enzyme ließen sich durch die Ausbildung der Disulfidbrücke, wie
erwartet, vollständig inhibieren (Gumbiowski et al. 2001).
Darüber hinaus konnte im Rahmen dieser Arbeit gezeigt werden, daß die Ausbildung einer
Disulfidbrücke zudem keinen signifikanten Einfluß auf die Aktivierungsenergie der ATPHydrolyse durch reduziertes und oxidiertes MM10-EF1 besitzt. Eine mögliche Erklärung
für die ausbleibende Inhibierung von oxidiertem MM10-EF1 und den fehlenden Einfluß
einer Quervernetzung zwischen αC280 und γC285 auf die Aktivierungsenergie lieferten
molekulardynamische Berechnungen an einem 30 Aminosäuren umfassenden Modell des
C-terminalen Bereichs von EF1-γ. In diesen Modellrechnungen wurde eine Disulfidbrücke
zwischen αC280 und γC285 durch die Fixierung des Sγ-Atoms von γC285 sowie eines
weiteren Carboxylgruppen-Sauerstoffatoms von γV286 simuliert und anschließend auf
vier Atome N-terminaler Aminosäurereste des Modells (L260, Q261, L262 und V263)
insgesamt ein Drehmoment von 56 pN nm ausgeübt. Die Ergebnisse deuteten darauf hin,
daß die durch die ATP-Hydrolyse erzeugte Kraft ausreicht, um die C-terminale α-Helix
von γ aufzuwinden und eine Rotation um N-Cα- und Cα-C´-Bindungen der α-Helix zu
ermöglichen (Gumbiowski et al. 2001). Weitere molekulardynamische Berechnungen an
einem dreidimensionalen Modell des vermuteten Lagerzapfens der γ-Untereinheit von
mitochondrialem F1, das 24 N-terminale Reste (γA1-K24) sowie 43 C-terminale Reste
(γT230-L272) umfasst, zeigten darüber hinaus, daß eine Aufwindung der γ-Untereinheit
selbst bei einem nicht künstlich (z. B. durch eine Disulfidbrücke) fixierten γ-C-Terminus
erfolgen kann. Nach diesen Berechnungen reichen die vorwiegend hydrophoben Wechselwirkungen des C-terminalen γ-Bereichs mit dem aus α- und β-Schleifen gebildeten
Ring aus, um bei der mit einem Drehmoment von 56 pN nm im Bereich von γK18-K21
und γD233-S236 angetriebenen Rotation von γ den C-terminalen Bereich der Untereinheit
ab γV257 zu fixieren (Abb. 4.1). Der Bereich der Aufwindung befindet sich demnach bei
γT253-V257. Dies entspricht, übertragen auf EF1-γ, dem Bereich γA267-S271 (Miki et al.
1988).
116
Diskussion
Abb. 4.1 Aufwindung der C-terminalen α-Helix bei der Rotation von γ
Die Abbildung zeigt das Modell eines Teils der γ-Untereinheit von MF1 (γA1-K24 und γT230L272). Die γ-Rotation wird durch Anlegen eines Drehmoments von 56 pN nm im Bereich von
γK18-K21 und γD233-S236 erzwungen. Die Abbildung zeigt die γ-Konformation nach Abschluß
der primären Äquilibrierung des Systems vor Beginn der erzwungenen Rotation (t = 1 ns), nach
einer halben Umdrehung (t = 17 ns), nach einer vollen Umdrehung (t = 23 ns) und nach Abschluß
der terminalen Äquilibrierung des Systems (t = 32 ns).
Die Modellrechnungen deuten darauf hin, daß die 15 C-terminalen Aminosäurereste von
EF1-γ selbst bei der Rotation der Untereinheit im aktiven Enzymkomplex möglicherweise
permanent im α3β3-Hexagon fixiert sind. Durch das Einführen einer Disulfidbrücke in
diesem Bereich würde dann lediglich ein bereits durch hydrophobe Wechselwirkungen
immobilisiertes Fragment von γ zusätzlich durch eine kovalente Bindung verankert werden. In diesem Fall würde der C-terminale Bereich von γ nicht die Funktion eines Lagerzapfens besitzen, sondern, ähnlich einem Bohrer im Bohrfutter, in dem durch die α- und
β-Untereinheiten gebildeten Ring fest eingespannt sein. Diese Vorstellung widerspricht
jedoch den Untersuchungen von Sabbert et al. (1996 und 1997), die anhand einer spektroskopischen Methode (polarized absorption recovery after photobleaching (PARAP)) mittels einer am vorletzten Aminosäurerest des C-Terminus von CF1-γ (γC322) angebrachten
Sonde (Eosin) unter ATP-Hydrolyse die Rotation auch des C-terminalen Bereichs von γ
nachgewiesen haben. Zur Überprüfung der Hypothese eines fest eingespannten γ-C-Terminus wurde im Rahmen dieser Arbeit ein biochemischer Rotationstest verwendet, der
ursprünglich von Duncan et al. (1995) etabliert wurde, um die Rotationsbewegung von γ
relativ zu den β-Untereinheiten des EF1-Komplexes nachzuweisen. Für diesen Rotationstest wird ein EF1-Komplex benötigt, dessen γ-Untereinheit mit einer Stator-Untereinheit α
oder β verknüpft ist und die beiden weiteren Stator-Untereinheiten jeweils markiert sind,
um eine Unterscheidung dieser Untereinheiten von der mit γ verknüpften Stator-Untereinheit zu ermöglichen. Nach Öffnung der Verknüpfung und der Versetzung des Enzyms in
einen aktiven Zustand kann nach der anschließenden erneuten Quervernetzung eine mögliche Relativrotation von γ zu den Stator-Untereinheiten anhand nun auftretender markierter αγ- oder βγ-Heterodimere nachgewiesen werden. Die Position der Verknüpfung
erlaubt dabei eine Identifizierung relativ zueinander rotierender Bereiche von Unterein-
Diskussion
117
heiten. Diese Methode erlaubt jedoch nicht die Untersuchung der Art der Rotation
(schrittweise oder gleichförmig) oder eine Ermittlung der Rotationsrichtung.
Im Unterschied zu Duncan et al., die radioaktiv markierte β-Untereinheiten zur Identifizierung verschiedener Positionen im α3β3-Hexagon nutzten, wurden hier fluoreszenzmarkierte α- und β-Untereinheiten verwendet. Die Überprüfung der rotatorischen Mobilität
des C-terminalen Bereichs von γ wurde mit Hilfe der EF1-Mutanten MM10 (αP280C,
γA285C) und MM6 (αP280C) durchgeführt. Beide Mutanten verfügen darüber hinaus
über das Cystein γK108C. Dieser Aminosäurerest, in einem anderen Zusammenhang für
die Anbindung von Actinfilamenten an EF1-Komplexe benötigt, wurde bei der Durchführung dieses Versuchs jedoch nicht genutzt.
Zur Erzeugung unmarkierter αγ-Heterodimere wurde zunächst MM10-EF1 mit Hilfe von
DTNB durch 16 h Inkubation bei RT vollständig oxidiert. Eine αγ-Verknüpfung unter
Beteiligung von γC108 konnte dabei ausgeschlossen werden, da MM6-EF1 (ohne γC285)
unter den gleichen oxidierenden Bedingungen, wie erwartet, keine αγ-Quervernetzung
ausbilden konnte. Quervernetzungsfähige α-Untereinheiten wurden durch die Markierung
von MM6-EF1 mit TMR-ITC bis zu Markierungsverhältnissen von 20-30 Farbstoffmolekülen pro F1-Komplex erzeugt. Die Farbstoffmarkierung mit TMR-ITC besitzt einen
Einfluß auf die ATP-Hydrolyseaktivität von EF1-Komplexen. So zeigten EF1-Komplexe
mit Markierungsverhältnissen von ca. 10 Farbstoffmolekülen pro EF1-Komplex bei einer
Ausgangsaktivität des unmarkierten Enzyms von ca. 110 u/mg nur noch ATP-Hydrolyseaktivitäten von etwa 50 u/mg und bei einem Verhältnis von ca. 20 lediglich noch 2030 u/mg. Dies deutet darauf hin, daß der unspezifisch mit zugänglichen Aminogruppen
eines Proteins (N-terminale Aminogruppen bzw. ε-Lysin-Aminogruppen) reagierende
Farbstoff TMR-ITC möglicherweise für die Aktivität des EF1-Komplexes notwendige
Konformationsänderungen, insbesondere der β-Untereinheiten, beeinträchtigt. Durch die
TMR-Markierung von EF1, bei der alle fünf unterschiedlichen Untereinheiten des
Enzymkomplexes markiert werden, wird darüber hinaus die Löslichkeit des Enzyms
beeinflußt. So kam es bei den Markierungsreaktionen stets zu einer starken
Niederschlagsbildung. Üblicherweise lagen die Proteinverluste bei Markierungsreaktionen
mit TMR-ITC bei ca. 30%. Weiterhin kam es bei der Markierung von MM6-EF1 offenbar
zu Nebenreaktionen, die bei dem Reaktionsprodukt zum Auftreten einer hochmolekularen
Bande führten. Eine entsprechende Bande konnte auch bei der Oxidation von MM10-EF1
mit DTNB beobachtet werden. Dabei konnte anhand von western blot-Analysen gezeigt
werden, daß diese Bande, die einer Molmasse von ca. 110 kDa entspricht, α, jedoch kein γ
enthält (K. Gumbiowski, Abteilung Biophysik, Universität Osnabrück, persönliche
Mitteilung). Es handelt sich daher sehr wahrscheinlich um eine α2-Bande (Verknüpfung
über αC280), die im Fall des markierten MM6-EF1 möglicherweise durch eine
luftsauerstoffabhängige Oxidation erzeugt wird.
Das oxidierte MM10-EF1 und das farbstoffmarkierte MM6-EF1 wurden anschließend zusammengegeben, dissoziiert und die Produkte der Dissoziation schließlich reassoziiert. Bei
der Reassoziation wurde die Bildung verschiedenster Produkte erwartet, von denen jedoch
anschließend mittels einer Ni-NTA-Affinitätschromatographie His-tag-haltige Produkte
isoliert wurden. Auch diese Produkte konnten eine unterschiedliche Zusammensetzung
aufweisen. Dabei wurden im wesentlichen zwei Hybrid-EF1-Spezies erwartet, die sich
hauptsächlich anhand der Herkunft ihrer γ-Untereinheiten unterscheiden lassen. Eine Spezies sollte unmarkiertes αγ aus MM10-EF1 enthalten, die zweite markiertes γ aus MM6-
118
Diskussion
EF1. Die weiteren α- und β-Untereinheiten der Hybrid-Enzyme konnten entweder markiert oder unmarkiert sein. Es zeigte sich jedoch, das die zweite Spezies bei der Reassoziation offenbar kaum gebildet wurde (das gereinigte Hybrid-EF1 zeigte keine fluoreszierende γ-Bande). Es muß daher angenommen werden, daß TMR-markiertes γ offenbar nicht
oder kaum an Reassoziationsprozessen beteiligt ist. Möglicherweise liegen hier auch γfreie α3β3-Ringe mit markierten α2-Dimeren aus MM6-EF1 vor, die den Einbau einer γUntereinheit nicht ermöglichen. Hierdurch läßt sich sowohl die Abwesenheit von fluoreszentem γ als auch die fluoreszierende α2-Bande der Hybrid-EF1-Komplexe erklären. Darüber hinaus sollten bei der Ni-NTA-Reinigung des Reassoziationsproduktes aufgrund ihrer
His-tags nicht an Reassoziationsprozessen beteiligte freie β-Untereinheiten mit aufgereinigt werden.
Zusätzlich zur αγ- und zur α2-Bande zeigte das MM10/MM6-Hybrid-EF1 eine weitere
hochmolekulare, nicht fluoreszierende Bande. Hierbei könnte es sich um α2γ aus MM10EF1 handeln, das zusätzlich zu einer Verknüpfung über αC280 γC285 eine Disulfidbrücke zwischen γC108 und αC280 einer weiteren α-Untereinheit aufweist. Auch hierbei
könnte es sich um das Produkt einer luftsauerstoffabhängigen Oxidationsreaktion im Verlauf der Dissoziation/Reassoziation handeln.
Die ATP-Hydrolyseaktivitäten der Hybrid-EF1-Komplexe zeigten, ähnlich wie die Aktivitäten von TMR-ITC-markierten EF1-Komplexen, eine Abhängigkeit vom Markierungsgrad der Enzyme. Möglicherweise aufgrund des bevorzugten Einbaus unmarkierter Untereinheiten sowie der verstärkten Ausfällung markierter Untereinheiten besaßen HybridEF1-Komplexe jedoch lediglich noch Markierungsverhältnisse von 1-4 Farbstoffmolekülen pro F1-Komplex. Bei der Bestimmung von ATP-Hydrolyseaktivitäten von EF1-Hybriden muß zudem berücksichtigt werden, das es sich bei den Hybrid-EF1-Proben um Mischungen unterschiedlicher Proteine mit unbekanntem Mengenverhältnis handelt, von
denen einige Spezies keinen oder nur einen äußerst geringen Beitrag zur Aktivität leisten
(z. B. nicht-reassoziierte β-Untereinheiten oder γ-freie α3β3-Ringe). Die Abhängigkeit der
Enzymaktivität vom Markierungsgrad bei EF1-Hybridkomplexen gilt daher nur bei jeweils
gleichen Anteilen dieser nichtproduktiven Bestandteile im Ni-NTA-Eluat.
Für das weitere Experiment spielte nur die Hybrid-EF1-Spezies eine Rolle, die nichtfluoreszentes αγ aus MM10-EF1 enthielt, da durch die anderen Bestandteile des Hybrid-Gemisches keine falsch positiven Ergebnisse zu erwarten waren. Aufgrund der Position des Histags (an β) sollten weder freie, markierte α-Untereinheiten, noch unmarkiertes, nicht reassoziiertes αγ bei der Ni-NTA-Affinitätschromatographie mit isoliert worden sein.
Die Ergebnisse des biochemischen Rotationstests mit MM10/MM6-Hybridkomplexen
lieferten deutliche Hinweise für eine rotatorische Mobilität des C-terminalen Bereichs der
Untereinheit γ im α3β3-Hexagon und sprechen damit gegen die durch molekulardynamische Berechnungen nahegelegte Vorstellung einer permanenten Fixierung der letzten 15
C-terminalen Aminosäurereste von γ im aktiven F1-Komplex. Die Ergebnisse unterstützen
damit die spektroskopischen Daten von Sabbert et al. (1996, 1997), die ebenfalls einen
Nachweis für die rotatorische Mobilität des γ-C-Terminus von (C)F1 geliefert haben.
Die rotatorische Mobilität des C-terminalen Bereichs von γ ließ sich in dem hier beschriebenen Experiment auch durch Inhibierung des reduzierten Hybrid-EF1 mit AMP-PNP und
AMP-PNP/ADP sowie durch Abwesenheit von Nukleotiden nicht einschränken. Auch die
in dieser Weise behandelten Proben lieferten nach der Re-Oxidation fluoreszierende αγBanden und damit einen Hinweis auf einen Positionswechsel von γ relativ zum unmar-
Diskussion
119
kierten α, mit dem die γ-Untereinheit vor der Reduktion verknüpft war. Die Fluoreszenzintensitäten der αγ-Banden der re-oxidierten EF1-Hybride waren im Vergleich zu den Intensitäten der entsprechenden Banden des SDS-Gels jedoch sehr gering. Die Fluoreszenzintensitäten dieser Banden zeigten durchschnittlich Anteile von etwa 14% an den GesamtFluoreszenzintensitäten der re-oxidierten Proben. Dies kann dadurch erklärt werden, daß
selbst bei einer völlig gleichverteilten Reaktion von γC285 mit den drei α-Cysteinen nur
maximal 2/3 aller αγ-Heterodimere ein fluoreszentes α hätten enthalten können, und dies
auch nur, falls alle entsprechenden EF1-Hybride die maximal möglichen zwei fluoreszenten α-Untereinheiten enthalten hätten. Es ist jedoch davon auszugehen, daß ein großer Teil
der Hybride anstatt von zwei fluoreszenten α-Untereinheiten neben dem unmarkierten α
aus MM10-EF1 noch weitere unmarkierte α-Untereinheiten enthalten hat.
Die offenbar ausbleibende Inhibierung der reduzierten EF1-Hybride durch AMP-PNP ±
ADP ist zunächst überraschend, da bekannt ist, daß AMP-PNP als nicht hydrolysierbares
ATP-Analogon F1-Komplexe stabilisiert und dementsprechend häufig bei der Kristallisation von F1-Komplexen verwendet wurde (Braig et al. 2000, Abrahams et al. 1996, Menz
et al. 2001, van Raaij et al. 1996). Zudem wurden in dieser Arbeit Messungen zur Inhibierung von MM10-EF1 mit AMP-PNP, ADP und Azid durchgeführt. Die Ergebnisse zeigten, daß MM10-EF1 durch Zugabe von 1 mM AMP-PNP im Rahmen der Messgenauigkeit
des LeBel-Aktivitätstests vollständig inhibiert werden kann.
Bei der Bewertung der Ergebnisse des Rotationstests unter Inhibierung mit AMP-PNP ±
ADP ist jedoch auch die lange Reaktionszeit der Reduktion zu berücksichtigen. Anhand
der Reaktionskinetik der Reduktion von MM10-EF1 mit 20 mM DTT wurde festgestellt,
daß für einen Umsatz von 90% eine Inkubationszeit von ca. 600 min erforderlich ist. Die
Oxidation von MM10-EF1 mit DTNB erfordert wesentlich kürzere Inkubationszeiten. Da
bei der Oxidation jedoch die auf eine rotatorische Mobilität zu testende Untereinheit kovalent im Enzym fixiert wird, sind selbst zu lange Inkubationszeiten bei der Oxidation für
das Problem der Inhibierung nicht von Bedeutung. Wesentlich ist die Dauer der Inkubationszeit der Reduktion. Wird sie zu kurz gewählt, erfolgt die Reduktion nur unvollständig
und die mögliche Ausbeute an fluoreszentem αγ wird bei der Re-Oxidation künstlich verringert. Wird sie dagegen zu lang gewählt, wird die Inhibierung von EF1 mit kompetetiven
Inhibitoren wie AMP-PNP zunehmend problematisch. In dem hier beschriebenen Rotationsexperiment wurden die EF1-Hybride über einen Zeitraum von insgesamt ca. 18 h reduziert. Die ausbleibende Inhibierung der C-terminalen γ-Rotation kann daher auch mit einem langsamen Austausch von AMP-PNP-Molekülen erklärt werden, so daß ein Bruchteil
der Hybrid-Enzymkomplexe während dieser Zeit stets unvollständig mit Inhibitoren belegt, oder sogar frei von Inhibitor-Molekülen, vorlag. In diesem Fall könnte γ möglicherweise frei und ungerichtet rotieren, wie im Fall der ohne Nukleotidzugabe reduzierten
EF1-Hybride. Eine Verringerung der Reduktions-Inkubationszeit wäre ohne gravierende
Ausbeuteverluste bis auf ca. 10 h möglich. Es ist jedoch davon auszugehen, daß das Problem der ausbleibenden Inhibierung nur durch eine noch wesentlich größere Reduzierung
der Reduktions-Inkubationszeit behoben werden kann. So reduzierten Duncan et al. (1995)
oxidierte Hybrid-EF1-Komplexe 1 min mit DTT und erhielten bei den im reduzierten Zustand mit ADP, Azid, EDTA oder nur mit Mg2+-haltigem Puffer behandelten Proben immerhin noch ungefähr 30% an markiertem βγ-Heterodimer, im Vergleich zu ca. 90% an
markiertem βγ-Heterodimer bei der im reduzierten Zustand mit ATP behandelten Probe
(100% entspricht hier der erwarteten Markierung bei einer völlig gleichverteilten Reaktion
120
Diskussion
von γ mit β). Eine Reduktions-Inkubationszeit von wenigen Minuten im MM10/MM6Experiment würde jedoch, aufgrund einer unvollständigen Reduktion, zu einem falsch
negativen Ergebnis führen.
In einem zweiten biochemischen Rotationsexperiment sollte die Möglichkeit einer Blockierung der rotatorischen Mobilität von γ über einen Zeitraum von ca. 18 h mit Hilfe von
kompetetiven Inhibitoren wie AMP-PNP und ADP überprüft werden. Die Durchführung
dieses Experiments entsprach dabei dem MM10/MM6-Rotationstest. Jedoch wurden hier
die EF1-Mutanten SW3 (βD380C, γC87) und GH7 (βD380C) verwendet. Dabei entspricht
die Position der Cysteine βD380C und γC87 in SW3 der Position der Cysteine in der von
Duncan et al. (1995) verwendeten EF1-Mutante. Wie bereits erwähnt war aufgrund dieser
Arbeit bekannt, daß die aus dieser Mutante abgeleiteten Hybrid-EF1-Komplexe bei der
Reduktion in Gegenwart von ADP, Azid, EDTA oder nur Mg2+-enthaltendem Puffer eine
Reduzierung der rotatorischen Mobilität von γ aufweisen sollten.
Der in dieser Arbeit mit SW3 und GH7 durchgeführte Rotationstest lieferte jedoch sowohl
für die Reduktion der EF1-Hybride in Abwesenheit von Nukleotiden, als auch für die Reduktion in Gegenwart von AMP-PNP und ADP sowie selbst für die Reduktion in Gegenwart von ATP nur äußerst schwache fluoreszente βγ-Banden, die kaum auf eine Rotation
von γ im reduzierten Zustand der entsprechenden EF1-Komplexe schließen lassen. Dagegen wiesen bereits die Ni-NTA-gereinigten SW3/GH7-Hybridkomplexe schwach fluoreszentes βγ auf. Die Bildung dieses Produktes kann nur auf eine luftsauerstoffabhängige
Oxidationsreaktion bei der Färbung oder Dissoziation von GH7-EF1 unter Beteiligung der
Cysteine βC380 und γC108 zurückgeführt werden, da SW3-EF1, ähnlich wie MM10-EF1,
nahezu vollständig oxidiert werden konnte. Ein vergleichbares Produkt wurde im
MM10/MM6-Rotationsexperiment nicht gebildet (möglicherweise aufgrund der größeren
Entfernung von γC108 αC280) bzw., wenn es gebildet wurde, nicht mit aufgereinigt.
Ein weiteres Problem des SW3/GH7-Experiments besteht darüber hinaus in der Position
des His-tags. Im Gegensatz zum MM10/MM6-Experiment (β-His-tag, Disulfidbrückenbildung über α) erfolgt hier die Reinigung der Reassoziationsprodukte und die Disulfidbrückenbildung mit Hilfe derselben Untereinheit, und zwar mit Hilfe von β. Allein dadurch sollten schon bei der Aufreinigung der Reassoziationsprodukte Bestandteile mit
isoliert werden, die nach Reduktion und Re-Oxidation ein falsch positives Ergebnis liefern
können, nämlich fluoreszentes, nicht-reassoziiertes β und unmarkiertes βγ aus SW3-EF1.
Das SW3/GH7-Experiment lieferte jedoch kein falsch positives Ergebnis, sondern vielmehr ein falsch negatives Ergebnis (keine verstärkte Fluoreszenz bei der mit ATP behandelten, re-oxidierten Probe). Über die Ursachen dafür kann hier nur spekuliert werden.
Eine Möglichkeit besteht darin, daß C380 von TMR-markiertem β durch den Farbstoff vor
einer Reaktion mit γC87 abgeschirmt wird. Dabei könnte das C380-nahe Lysin βK387
eine Rolle spielen. Darüber hinaus besteht die Möglichkeit, daß farbstoffmarkiertes β bei
der Reassoziation nicht in EF1-Hybride eingebaut wird, oder als einzelne Untereinheit nur
schwer löslich ist und bevorzugt ausfällt. Dieser Vorgang würde für das MM10/MM6Rotationsexperiment keine Bedeutung haben, da dieses Experiment ausschließlich die
korrekte Reassoziation fluoreszenter α-Untereinheiten erfordert.
Zur Optimierung des SW3/GH7-Rotationsexperimentes wird daher die Entfernung des
Cysteins γC108 aus SW3 und GH7 sowie die Verlagerung des His-tags von β auf die αUntereinheiten der Enzyme vorgeschlagen. Weiterhin könnte es erforderlich sein, einzelne
Diskussion
121
Lysinreste von α- oder β-Untereinheiten von GH7 zu entfernen, die nach der Reaktion mit
TMR-ITC an einer möglichen Abschirmung des Cysteins βC380 beteiligt sein könnten.
Das SW3/GH7-Rotationsexperiment lieferte damit über das Problem der Inhibierung von
MM10/MM6-Hybridkomplexen mit kompetetiven Inhibitoren wie AMP-PNP und ADP
über Zeiträume von etlichen Stunden keine Aussage.
Im folgenden soll schließlich untersucht werden, ob die fluoreszenten αγ-Banden im Fall
des ohne Nukleotidzugabe reduzierten MM10/MM6-Hybrid-EF1 bzw. im Fall des während der Reduktion mit ATP behandelten Enzyms möglicherweise artifiziell erzeugt worden sein könnten. Um ausschließen zu können, das diese Banden z. B. aufgrund von Verunreinigungen des Hybrid-EF1-Gemisches mit nicht-reassoziierten Untereinheiten oder
aufgrund eines Austausches von Disulfidbindungen gebildet wurden, ist bei dem Rotationsexperiment eine Kontroll-Probe mitgeführt worden, die bezüglich der Inkubationzeiten
und Reinigungsschritte wie die anderen Proben behandelt wurde, die jedoch nicht mit
Nukleotiden versetzt und nicht reduziert wurde. Bei dieser Probe handelte es sich im
Grunde um eine bezüglich des C-terminalen γ-Bereichs vollständig rotationsinhibierte
Negativprobe, ein Zustand, der durch den Einsatz kompetetiver Inhibitoren nicht erreicht
werden konnte. Wie erwartet, zeigte diese Probe nach der „Re“- bzw. Nach-Oxidation
jedoch keine fluoreszente αγ-Bande. Weiterhin wurde überprüft, ob das fluoreszente αγHeterodimer nach der Reduktion durch einen kontinuierlichen Dissoziations/Reassoziations-Prozess von F1-Molekülen hätte gebildet werden können. Zu diesem
Zweck wurde His-tag-freies Wildtyp-EF1 (BWU13 (Iwamoto et al. 1991)) mit TMR-ITC
markiert und mit unmarkiertem KH7-EF1 vermischt. Nach einer Über-Nacht-Inkubation
wurden beide Enzyme mit Hilfe einer Ni-NTA-Affinitätschromatographie getrennt und
das TMR-Markierungsverhältnis von KH7-EF1 bestimmt. Hierbei zeigte sich, daß KH7EF1 im Rahmen der Meßgenauigkeit keine Markierung aufwies (S. Winkler, Abteilung
Biophysik, Universität Osnabrück, persönliche Mitteilung). Dadurch konnte ausgeschlossen werden, daß es während der Inkubationsphasen der biochemischen Rotationsexperimente zu einem Austausch von Untereinheiten zwischen verschiedenen F1-Komplexen
gekommen sein könnte.
Es kann daher davon ausgegangen werden, daß die Bildung fluoreszenter αγ-Heterodimere im MM10/MM6-Rotationsexperiment ausschließlich auf eine Rotationsbewegung
von γ relativ zu α zurückzuführen ist, die erfolgte, während die entsprechenden HybridEF1-Komplexe reduziert vorlagen. Aufgrund des fehlenden Nachweises einer Inhibierung
dieser Rotationsbewegung mit kompetetiven Inhibitoren läßt sich jedoch keine Aussage
bezüglich der Ursachen der rotatorischen Mobilität des C-terminalen γ-Bereichs treffen.
Die fluoreszenten αγ-Heterodimere im MM10/MM6-Rotationsexperiment könnten im Fall
des im reduzierten Zustand mit ATP behandelten Hybrid-EF1 durch eine katalysebedingte
Rotation von γ erzeugt worden sein. Im Fall der ohne Nukleotidzugabe reduzierten EF1Hybride sowie der im reduzierten Zustand mit Inhibitoren behandelten Proben könnte die
Bildung fluoreszenter αγ-Heterodimere aufgrund einer ungerichteten Rotationsbewegung
von γ erfolgt sein, im letzteren Fall bedingt durch einen langsamen Austausch von Inhibitoren und der damit verbundenen zeitweisen unvollständigen Belegung der Enzyme mit
Inhibitoren. In beiden Fällen könnte die Bildung fluoreszenter αγ-Heterodimere jedoch
auch in erster Linie aufgrund einer hohen strukturellen Flexibilität der N-terminalen Bereiche von α und β sowie des C-terminalen Bereichs von γ erfolgt sein. Careaga und Falke
(1992 a/b) wiesen Disulfidbrückenbildungen aufgrund thermisch bedingter Bewegungen
122
Diskussion
von Peptidstrukturen über Distanzen von bis zu ca. 15 Å nach. Berücksichtigt man nur die
Entfernung zwischen γC285 und den drei α-Cysteinen C280 (maximaler Abstand etwa
13,4 Å) sollte daher in einem hochflexiblen „Lager“-Bereich γC285 allein aufgrund thermisch induzierter Fluktuationen die Reaktion mit allen drei α-Cysteinen möglich sein.
Jedoch müsste aufgrund der zu erwartenden Orientierung der Cystein-Seitenketten auch in
diesem Szenario zusätzlich eine Rotationsbewegung von γ erfolgen. Bezüglich des
MM10/MM6-Rotationsexperiments bleibt daher festzuhalten, daß das Experiment zwar
einen eindeutigen Hinweis auf die rotatorische Mobilität des C-terminalen γ-Bereichs im
α3β3-Hexagon lieferte, jedoch keine Informationen über die Ursachen dieser Mobilität.
Eine durch die molekulardynamischen Berechnungen nahegelegte Fixierung des C-terminalen γ-Bereichs spielt für die Funktion der EFOF1-ATP-Synthase in vivo jedoch offenbar
keine Rolle.
Abgesehen von einigen Beschränkungen der molekulardynamischen Berechnungen (wie z.
B. Berücksichtigung nur eines γ-Fragments für die Berechnungen, Fixierung der α- und βAminosäurereste der Lagerbuchse auf die Positionen der Kristallstruktur), die hauptsächlich in einer begrenzten Rechenkapazität begründet lagen, sind bei der Bewertung der Ergebnisse der molekulardynamischen Berechnungen auch die unterschiedlichen Zeitbereiche zu berücksichtigen, für die die Untersuchungen durchgeführt wurden. So decken die
molekulardynamischen Berechnungen etwa einen Zeitbereich von ca. 30 ns ab, während
der biochemische Rotationstest einen Zeitbereich von etlichen Stunden umfasst. In vitro
erfolgt die γ-Rotation bei maximalen ATP-Hydrolyseaktivitäten (∼ 120 u/mg) in einem
Zeitbereich von einigen Millisekunden (vgl. auch Sabbert et al. 1997). Hierdurch wird
deutlich, daß eine Übertragung der Ergebnisse von molekulardynamischen Berechnungen
auf tatsächlich im Enzym ablaufende Prozesse problematisch ist, wenn zum einen die Zeit
für katalytisch bedingte Enzymbewegungen zu kurz angesetzt wird und zum anderen auch
Fluktuationsbewegungen größerer Proteindomänen, wie z. B. der N-terminalen Bereiche
des α3β3-Ringes, die in einem Bereich von Mikrosekunden erfolgen (Sabbert et al. 1997),
außer Acht gelassen werden. Eine große strukturelle Flexibilität des Lagerbereichs der
EFOF1-ATP-Synthase muß jedoch allein schon aufgrund der erheblichen Eingriffe, die in
diesem Bereich ohne Totalverlust der Enzymaktivität vorgenommen werden können, angenommen werden. So kann der C-terminale γ-Bereich um bis zu 12 Aminosäurereste
verkürzt werden (Müller et al. 2002 und diese Arbeit), um 16 Aminosäurereste verlängert
werden (in Zusammenhang mit weiteren β-Mutationen) (Jeanteur-De Beukelaer et al.
1995) und selbst ohne Einsatz eines Polypeptid-Linkers mit GFP (green fluorescent protein) fusioniert werden (Prescott et al. 2003).
Zusammenfassend liefern die Ergebnisse dieser Arbeit folgendes Bild der Funktion des
molekularen Drehlagers der F-ATP-Synthase: Der C-terminale Bereich von Untereinheit
γ, dessen letzte 12 Aminosäurereste weniger die mechanische Funktion der ATP-Synthase
beeinflußen als vielmehr eine stabilisierende Funktion für den aktiven Enzymkomplex
besitzen, verfügt, zumindest in einem Zeitbereich von mehreren Stunden, über eine rotatorische Mobilität im α3β3-Hexagon. Die ursprüngliche Interpretation von Abrahams et al.
(1994), daß der C-terminale Bereich der Untereinheit γ als Welle in einer hydrophoben
Lagerbuchse gehalten wird, in der er sich frei drehen kann, wurde damit bestätigt. Zumindest die ATP-Hydrolysefunktion von EFOF1 kann jedoch auch bei einer festen Verknüpfung des C-terminalen γ-Bereichs mit dem α3β3-Hexagon uneingeschränkt aufrecht erhal-
Diskussion
123
ten werden, wie anhand der EF1-Mutante MM10 mit der Verknüpfung über αC280 und
γC285 gezeigt wurde. Diese Eigenschaft der EFOF1-ATP-Synthase kann aufgrund der
Ergebnisse dieser Arbeit nicht mit einer permanenten Fixierung des C-terminalen γ-Bereichs im α3β3-Hexagon auch ohne Disulfidverbindung erklärt werden. Auch mit einem
Aufbrechen der Verknüpfung durch die mittels ATP-Hydrolyse angetriebenen γ-Rotation
(liefert ca. 65 kJ/mol) läßt sich dieser Effekt aufgrund der Bindungsstärke von Disulfidverbindungen (ca. 200 kJ/mol) nicht erklären. Die Ursache hierfür muß vielmehr in einer
hohen strukturellen Flexibilität des gesamten Lagerbereichs liegen. Diese Flexibilität
könnte, neben einem langsamen Austausch von Inhibitoren während der Reduktionsphase,
auch für die ausbleibende Inhibierung der rotatorischen Mobilität des γ-C-Terminus durch
AMP-PNP ± ADP im MM10/MM6-Rotationsexperiment verantwortlich sein. Möglicherweise ist der C-terminale γ-Bereich deshalb selbst ohne katalytisch bedingte γ-Rotation
rotatorisch mobil. Der fehlende Einfluß einer Rotor/Stator-Verknüpfung im Lagerbereich
auf die ATP-Hydrolysefunktion konnte bisher nur für die Cystein-Doppelmutante MM10
nachgewiesen werden. Die genaueren Hintergründe dieser Eigenschaft der EFOF1-ATPSynthase werden jedoch zukünftig anhand weiterer Doppel-Cysteinmutanten
(αD336C/γK266C, αE284C/γA270C und αE284C/γT273C) näher untersucht werden. In
diesem Zusammenhang dürfte auch die Bestimmung der ATP-Synthese-Aktivität von oxidiertem MM10-EF1 interessant sein, da eine Rotor/Stator-Verknüpfung über αC280 und
γC285 aufgrund des Windungssinnes der C-terminalen α-Helix von γ möglicherweise
einen drehrichtungsabhängigen Effekt bewirken könnte.
Zusammenfassung
124
5 Zusammenfassung
1) Sechs verschiedene EF1-Deletionsmutanten mit verkürzten γ-Untereinheiten wurden mittels PCR hergestellt. Die Deletionen befinden sich jeweils am C-terminalen
Ende der Untereinheit und umfassen 3 (MM16), 6 (MM20), 9 (MM17), 12 (MM8),
15 (MM18) und 18 (MM19) Aminosäurereste.
2) Durch einen Wachstumstest auf Succinat-Agarplatten wurde festgestellt, daß die
von den Plasmiden pMM16, pMM20, pMM17 und pMM8 codierten ATP-Synthasen in E. coli DK8 funktionell exprimiert werden können, während pMM18 und
pMM19 funktionsunfähige ATP-Synthasen liefern. Die Wachstumsgeschwindigkeit der DK8-Mutanten MM16, MM20 und MM17 auf Succinatmedium wird
durch die Deletionen nicht beeinflußt. Hingegen besitzt E. coli DK8 pMM8 auf
diesem Medium eine um etwa 33% geringere Wachstumsgeschwindigkeit.
3) Die DK8-Klone MM16, MM20, MM17 und MM8 wurden für die Expression und
Isolierung von EF1-Komplexen verwendet. MM18 und MM19 lieferten keine mit
Hilfe des S+G-Proteintests nachweisbaren Mengen an EF1. Durch die Verkürzung
der Untereinheit γ kam es bei der Aufreinigung der Enzymkomplexe nicht zu einem verstärkten Verlust dieser Untereinheit. Aufgereinigtes KH7-EF1 (KontrollEF1 ohne Verkürzung des γ-C-Terminus) und die EF1-Komplexe der Deletionsmutanten wiesen ein ähnliches α/β:γ-Verhältnis auf.
4) Die ATP-Hydrolyseaktivitäten der EF1-Deletionsmutanten zeigten eine starke Abhängigkeit von der Deletionslänge. So fielen die Aktivitäten bei 35°C von 93 u/mg
(KH7-EF1) um ca. 75% auf 22 u/mg (MM8-EF1) ab. Dagegen sanken die Aktivierungsenergien für die ATP-Hydrolyse durch die EF1-Deletionsmutanten mit zunehmender Deletionslänge erheblich schwächer ab. Hier konnte für KH7-EF1 eine
Aktivierungsenergie von 54 kJ/mol und für MM8-EF1 35 kJ/mol ermittelt werden.
Dies entspricht einer Abnahme um ca. 35%.
5) Das durch die Rotor-Untereinheit γ erzeugte Drehmoment zeigte nur eine geringe
Abhängigkeit von der Deletionslänge. So wiesen die EF1-Komplexe der Deletionsmutanten gegenüber KH7-EF1 nur ein um ca. 20% verringertes Drehmoment
auf. Eine starke Abhängigkeit von der Deletionslänge wies im mikrovideographischen Rotationstest jedoch die Ausbeute an Rotatoren bezogen auf die Beobachtungszeit der Küvetten auf. Dabei nahm die Ausbeute von KH7-EF1 zu MM8-EF1
erheblich ab. Keine Abhängigkeit von der Deletionslänge zeigte dagegen das Rotations/Rotationspausen-Verhältnis innerhalb der Laufzeiten der Rotatoren, die von
etwa 10 – 190 s (durchschnittlich ca. 60 s) variierten. Aufgrund der verhältnismäßig kurzen Laufzeiten ist eine exakte Angabe des Rotations/Rotationspausen-Verhältnisses jedoch nicht möglich.
Zusammenfassung
125
6) Rotationsexperimente mit EFOF1-Komplexen, die über die C-terminale γ-Deletion
∆S281-V286 (γ-6) verfügten, scheiterten möglicherweise aufgrund der Instabilität
der Enzymkomplexe.
7) Da die Funktion aktiver EF1-Komplexe durch die γ-Deletionen offenbar kaum
beeinflußt wird, muß davon ausgegangen werden, daß die geringere ATP-Hydrolyseaktivität der Deletionsmutanten durch ein verändertes Verhältnis von aktiven und
inaktiven Enzymkomplexen hervorgerufen wird. Die Deletionen beeinflußen damit
weniger die mechanische Funktion des Enzyms sondern vielmehr die Stabilität aktiver Enzymkomplexe.
8) Mit der Mutante MM10 wurde ein EF1-Komplex erzeugt, der eine Verknüpfung
der Rotoruntereinheit γ mit einer Statoruntereinheit α über die Cysteine αC280
und γC285 ermöglichte. Eine Verknüpfung der beiden Untereinheiten konnte durch
Oxidation mit 100 µM DTNB in etwa 30 min zu >90% erreicht werden. Eine Öffnung der Disulfidbrücke durch Reduktion mit 20 mM DTT erforderte Inkubationszeiten von bis zu etwa 600 min (Ausbeute >90%). Die Bildung einer Disulfidbrücke zwischen αC280 und γC285 hatte weder einen Einfluß auf die ATP-Hydrolyseaktivität des Enzyms noch auf die Aktivierungsenergie der ATP-Hydrolyse
durch MM10-EF1.
9) MM10-EF1 ließ sich im ATP-Hydrolyse-Aktivitätstest über einen Zeitraum von 5
min durch Zugabe von 1 mM AMP-PNP nahezu vollständig hemmen (ca. 96%),
während sich mit 1 mM AMP-PNP + 1 mM ADP, 1 mM NaN3 und 1 mM NaN3 +
1 mM ADP nur Inhibierungsgrade von 77-88% erreichen ließen.
10) Durch einen biochemischen Rotationstest konnte die freie Drehbarkeit des Cterminalen Bereichs von γ im α3β3-Hexagon des EF1-Komplexes nachgewiesen
werden. Die Drehbarkeit ließ sich auch durch Zugabe von Inhibitoren des Enzymkomplexes im untersuchten Zeitbereich von Stunden nicht blockieren. Dadurch
kann nicht bewiesen werden, daß die rotatorische Mobilität des C-terminalen γ-Bereichs ausschließlich auf eine katalytisch bedingte γ-Rotation zurückzuführen ist.
Eine weitere Ursache für die rotatorische Mobilität könnte in einer hohen strukturellen Flexibilität des gesamten Lagerbereichs von EF1 bestehen. Der Rotationstest
zeigt jedoch, daß die durch molekulardynamische Berechnungen nahegelegte Fixierung des C-terminalen γ-Bereichs bei der γ-Rotation für die Funktion des EF1Komplexes offenbar keine Rolle spielt.
Ein weiterer biochemischer Rotationstest zum Nachweis der Inhibierung der γ Rotationsbewegung durch kompetetive Inhibitoren über einen Zeitraum von etwa 18 h
scheiterte offenbar aufgrund der experimentellen Auslegung des Versuchs.
126
Zusammenfassung
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Anhang
Im Folgenden ist ein Sequenzvergleich des atp-Operons von E. coli K12 mit den
Sequenzen der atp-Operone der Plasmide pKH7 und pSE1 aufgeführt. Über den
Basensequenzen ist jeweils die Aminosäuresequenz der Untereinheiten von EFOF1 von E.
coli K12 im Einbuchstabencode angegeben. Die Erkennungsstellen verwendeter
Restriktionsendonukleasen sind unterstrichen. Die erste Base der HindIIIErkennungssequenz wurde entsprechend Nielsen et al. (1981) gleich +1 gesetzt. Die
Basenbezifferung ist links und die Aminosäurebezifferung jeweils rechts angegeben. Der
Sequenzvergleich wurde mit Hilfe des Programms „Multalin“ angefertigt.
Literatur: Corpet, F. (1988) Multiple sequence alignment with hierarchical clustering.
Nucleic Acids Res. 16: 10881-10890
Internet-Addresse: http://www.toulouse.inra.fr/multalin.html
-27
K12
pKH7
pSE1
GGGTGGCCTG GACATTCGCA TTTGGCGAAG CTTTCAAAGT TCTGGCGATG
CGGCCCTCAT TCGTGCGCTC TAGGATCAAG CTTTCAAAGT TCTGGCGATG
CGGCCCTCAT TCGTGCGCTC TAGGATCAAG CTTTCAAAGT TCTGGCGATG
HindIII
24
K12
pKH7
pSE1
TTGGTGTTAC TGGTGGTGGC GTTGGCGGTT TTAAAGGCGG TATTCTTGCC
74
K12
pKH7
pSE1
GCTGATCGTT ACGTGGGTTT TGGTGCTGGT GGTTCAGATA CTGGCACCGG
124
K12
pKH7
pSE1
6
M A S
E N M
CTGTAATTAA CAACAAAGGG TAAAAGGCAT CATGGCTTCA GAAAATATGA
K12
pKH7
pSE1
174
23
T P Q D
Y I G
H H L
N N L Q
L D L
CGCCGCAGGA TTACATAGGA CACCACCTGA ATAACCTTCA GCTGGACCTG
K12
pKH7
pSE1
224
R T F
CGTACATTCT
CGTACATTCT
CGTACATTCT
K12
pKH7
pSE1
274
56
I N I
D S M
F F S V
V L G
L L F
AATCAATATT GACTCCATGT TCTTCTCGGT GGTGCTGGGT CTGTTGTTCC
> a
40
S L V D
P Q N
P P A
T F W T
CGCTGGTGGA TCCACAAAAC CCCCCAGCCA CCTTCTGGAC
CGCTGGTTGA TCCACAAAAC CCCCCAGCCA CCTTCTGGAC
CGCTGGTTGA TCCACAAAAC CCCCCAGCCA CCTTCTGGAC
K12
pKH7
pSE1
324
73
L V L F
R S V
A K K
A T S G
V P G
TGGTTTTATT CCGTAGCGTA GCCAAAAAGG CGACCAGCGG TGTGCCAGGT
K12
pKH7
pSE1
374
K F Q
AAGTTTCAGA
AAGTTTCAGA
AAGTTTCAGA
K12
pKH7
pSE1
424
106
K D M
Y H G
K S K L
I A P
L A L
GAAAGACATG TACCATGGCA AAAGCAAGCT GATTGCTCCG CTGGCCCTGA
K12
pKH7
pSE1
474
123
T I F V
W V F
L M N
L M D L
L P I
CGATCTTCGT CTGGGTATTC CTGATGAACC TGATGGATTT ACTGCCTATC
K12
pKH7
pSE1
524
D L L
GACCTGCTGC
GACCTGCTGC
GACCTGCTGC
K12
pKH7
pSE1
574
156
V V P
S A D
V N V T
L S M
A L G
TGTGGTTCCG TCTGCGGACG TGAACGTAAC GCTGTCTATG GCACTGGGCG
K12
pKH7
pSE1
624
173
V F I L
I L F
Y S I
K M K G
I G G
TATTTATCCT GATTCTGTTC TACAGCATCA AAATGAAAGG CATCGGCGGC
K12
pKH7
pSE1
674
F T K
TTCACGAAAG
TTCACGAAAG
TTCACGAAAG
K12
pKH7
pSE1
724
206
V N L
I L E
G V S L
L S K
P V S
TGTCAACTTA ATCCTTGAAG GGGTAAGCCT GCTGTCCAAA CCAGTTTCAC
K12
pKH7
pSE1
774
223
L G L R
L F G
N M Y
A G E L
I F I
TCGGTTTGCG ACTGTTCGGT AACATGTATG CCGGTGAGCT GATTTTCATT
90
T A I E
L V I
G F V
N G S V
CCGCGATTGA GCTGGTGATC GGCTTTGTTA ATGGTAGCGT
140
P Y I A
E H V
L G L
P A L R
CGTACATTGC TGAACATGTA CTGGGTCTGC CTGCACTGCG
190
E L T L
Q P F
N H W
A F I P
AGTTGACGCT GCAGCCGTTC AATCACTGGG CGTTCATTCC
K12
pKH7
pSE1
824
L I A
CTGATTGCTG
CTGATTGCTG
CTGATTGCTG
K12
pKH7
pSE1
874
256
W A I
F H I
L I I T
L Q A
F I F
GTGGGCCATT TTCCACATCC TGATCATTAC GCTGCAAGCC TTCATCTTCA
K12
pKH7
pSE1
924
M V L T
I V Y
L S M
A S E E
H
TGGTTCTGAC GATCGTCTAT CTGTCGATGG CGTCTGAAGA ACATTAATTT
974
240
G L L P
W W S
Q W I
L N V P
GTCTGTTGCC GTGGTGGTCA CAGTGGATCC TGAATGTGCC
K12
pKH7
pSE1
2
M E
ACCAACACTA CTACGTTTTA ACTGAAACAA ACTGGAGACT GTCATGGAAA
K12
pKH7
pSE1
1024
19
N L N M
D L L
Y M A
A A V M
M G L
ACCTGAATAT GGATCTGCTG TACATGGCTG CCGCTGTGAT GATGGGTCTG
K12
pKH7
pSE1
1074
A A I
GCGGCAATCG
GCGGCAATCG
GCGGCAATCG
K12
pKH7
pSE1
1124
52
E G A
A R Q
P D L I
P L L
R T Q
GGAAGGCGCA GCGCGTCAAC CTGATCTGAT TCCTCTGCTG CGTACTCAGT
K12
pKH7
pSE1
1174
69
F F I V
M G L
V D A
I P M I
A V G
TCTTTATCGT TATGGGTCTG GTGGATGCTA TCCCGATGAT CGCTGTAGGT
K12
pKH7
pSE1
1224
L G L
CTGGGTCTGT
CTGGGTCTGT
CTGGGTCTGT
> c
36
G A A I
G I G
I L G
G K F L
GTGCTGCGAT CGGTATCGGC ATCCTCGGGG GTAAATTCCT
Y V M F
A V A
ACGTGATGTT CGCTGTCGC. .......... ..........
ACGTGATGTT CGCTGTCGC. .......... ..........
ACGTGATGTT CGCTGTCGCT AGCTGGAGCC ACCCGCAGTT
Strep-tag
1274
K12
pKH7
pSE1
......GTAG TAAGCGTTGC TTTTATTTAA AGAGCAATAT CAGAACGTTA
......GTAG TAAGCGTTGC TTTTATTTAA AGAGCAATAT CAGAACGTTA
CGAGAAATAG TAAGCGATGC ATTTATTTAA AGAGCAATAT CAGAACGTTA
1324
K12
pKH7
pSE1
10
M N L
N A T
I L G Q
ACTAAATAGA GGCATTGTGC TGTGAATCTT AACGCAACAA TCCTCGGCCA
K12
pKH7
pSE1
1374
26
A I A
F V L
F V L F
C M K
Y V W
GGCCATCGCG TTTGTCCTGT TCGTTCTGTT CTGCATGAAG TACGTATGGC
GGCCATCGCG TTTGTCCTGT TCGTTCTGTT CGCCATGAAG TACGTATGGC
GGCCATCGCG TTTGTCCTGT TCGTTCTGTT CGCCATGAAG TACGTATGGC
K12
pKH7
pSE1
1424
43
P P L M
A A I
E K R
Q K E I
A D G
CGCCATTAAT GGCAGCCATC GAAAAACGTC AAAAAGAAAT TGCTGACGGC
K12
pKH7
pSE1
1474
L A S
CTTGCTTCCG
CTTGCTTCCG
CTTGCTTCCG
K12
pKH7
pSE1
1524
76
A T D
Q L K
K A K A
E A Q
V I I
CGCGACCGAC CAGCTGAAAA AAGCGAAAGC GGAAGCCCAG GTAATCATCG
K12
pKH7
pSE1
1574
93
E Q A N
K R R
S Q I
L D E A
K A E
AGCAGGCGAA CAAACGCCGC TCGCAGATTC TGGACGAAGC GAAAGCTGAG
K12
pKH7
pSE1
1624
A E Q
GCAGAACAGG
GCAGAACAGG
GCAGAACAGG
K12
pKH7
pSE1
1674
126
A E R
K R A
R E E L
R K Q
V A I
AGCCGAGCGT AAACGTGCCC GTGAAGAGCT GCGTAAGCAA GTTGCTATCC
K12
pKH7
pSE1
1724
143
L A V A
G A E
K I I
E R S V
D E A
TGGCTGTTGC TGGCGCCGAG AAGATCATCG AACGTTCCGT GGATGAAGCT
K12
pKH7
pSE1
1774
A N S
GCTAACAGCG
GCTAACAGCG
GCTAACAGCG
> b
60
A E R A
H K D
L D L
A K A S
CAGAACGAGC ACATAAGGAC CTTGACCTTG CAAAGGCCAG
110
E R T K
I V A
Q A Q
A E I E
AACGTACTAA AATCGTGGCC CAGGCGCAGG CGGAAATTGA
D I V D
K L V
A E L
ACATCGTGGA TAAACTTGTC GCTGAACTGT AAGGAGGGAG
> delta
15
S E F I
T V A
R P Y
A K A A
CTGAATTTAT TACGGTAGCT CGCCCCTACG CCAAAGCAGC
K12
pKH7
pSE1
M
GGGCTGATGT
GGGCTGATGT
GGGCTGATGT
K12
pKH7
pSE1
1874
31
F D F
A V E
H Q S V
E R W
Q D M
TTTTGACTTT GCCGTCGAAC ACCAAAGTGT AGAACGCTGG CAGGACATGC
K12
pKH7
pSE1
1924
48
L A F A
A E V
T K N
E Q M A
E L L
TGGCGTTTGC CGCCGAGGTA ACCAAAAACG AACAAATGGC AGAGCTTCTC
K12
pKH7
pSE1
1974
S G A
TCTGGCGCGC
TCTGGCGCGC
TCTGGCGCGC
K12
pKH7
pSE1
2024
81
G E Q
L D E
N G Q N
L I R
V M A
TGGTGAGCAA CTGGACGAAA ACGGTCAGAA CCTGATTCGG GTTATGGCTG
K12
pKH7
pSE1
2074
98
E N G R
L N A
L P D
V L E Q
F I H
AAAATGGTCG TCTTAACGCG CTCCCGGATG TTCTGGAGCA GTTTATTCAC
K12
pKH7
pSE1
2124
L R A
CTGCGTGCCG
CTGCGTGCCG
CTGCGTGCCG
K12
pKH7
pSE1
2174
131
A L S
E Q Q
L A K I
S A A
M E K
CGCACTGAGT GAACAACAGC TCGCGAAAAT TTCTGCTGCG ATGGAAAAAC
K12
pKH7
pSE1
2224
148
R L S R
K V K
L N C
K I D K
S V M
GTCTGTCACG CAAAGTTAAG CTGAATTGCA AAATCGATAA GTCTGTAATG
GTCTGTCACG CAAAGTTAAG CTGAATGCCA AAATCGATAA GTCTGTAATG
GTCTGTCACG CAAAGTTAAG CTGAATGCCA AAATCGATAA GTCTGTAATG
K12
pKH7
pSE1
2274
A G V
GCAGGCGTTA
GCAGGCGTTA
GCAGGCGTTA
65
L A P E
T L A
E S F
I A V C
TTGCGCCAGA AACGCTCGCC GAGTCGTTTA TCGCAGTTTG
TTGCGCCAGA AACGCTCGCC GAGTCGTTTA TCGCAGTTGC
TTGCGCCAGA AACGCTCGCC GAGTCGTTTA TCGCAGTTGC
115
V S E A
T A E
V D V
I S A A
TGAGTGAGGC TACCGCTGAG GTAGACGTCA TTTCCGCTGC
165
I I R A
G D M
V I D
G S V R
TCATCCGAGC GGGTGATATG GTCATTGATG GCAGCGTACG
K12
pKH7
pSE1
2324
G R L
E R L
A D V L
Q S
CGGTCGTCTT GAGCGCCTTG CAGACGTCTT GCAGTCTTAA GGGGACTGGA
K12
pKH7
pSE1
16
M Q L
N S T
E I S
E L I K
Q R I
GCATGCAACT GAATTCCACC GAAATCAGCG AACTGATCAA GCAGCGCATT
K12
pKH7
pSE1
2424
A Q F
GCTCAGTTCA
GCTCAGTTCA
GCTCAGTTCA
K12
pKH7
pSE1
2474
49
V S D
G V I
R I H G
L A D
C M Q
TGTAAGTGAC GGTGTTATCC GCATTCACGG CCTGGCCGAT TGTATGCAGG
TGTAAGTGAC GGTGTTATCC GCATTCACGG CCTGGCCGAT GCTATGCAGG
TGTAAGTGAC GGTGTTATCC GCATTCACGG CCTGGCCGAT GCTATGCAGG
> alpha
33
N V V S
E A H
N E G
T I V S
ATGTTGTGAG TGAAGCTCAC AACGAAGGTA CTATTGTTTC
K12
pKH7
pSE1
2524
66
G E M I
S L P
G N R
Y A I A
L N L
GTGAAATGAT CTCCCTGCCG GGTAACCGTT ACGCTATCGC ACTGAACCTC
Xho
K12
pKH7
pSE1
2574
E R D
GAGCGCGACT
GAGCGCGACT
GAGCGCGACT
I
83
S V G A
V V M
G P Y
A D L A
CTGTAGGTGC GGTTGTTATG GGTCCGTACG CTGACCTTGC
K12
pKH7
pSE1
2624
99
E G M
K V K
C T G R
I L E
V P V
CGAAGGCATG AAAGTTAAGT GTACTGGCCG TATCCTGGAA GTTCCGGTTG
CGAAGGCATG AAAGTTAAGG CTACTGGCCG TATCCTGGAA GTTCCGGTTG
CGAAGGCATG AAAGTTAAGG CTACTGGCCG TATCCTGGAA GTTCCGGTTG
K12
pKH7
pSE1
2674
116
G R G L
L G R
V V N
T L G A
P I D
GCCGTGGCCT GCTGGGCCGT GTGGTTAACA CTCTGGGTGC ACCAATCGAC
K12
pKH7
pSE1
2724
G K G
GGTAAAGGTC
GGTAAAGGTC
GGTAAAGGTC
K12
pKH7
pSE1
2774
149
P G V
I E R
Q S V D
Q P V
Q T G
TCCGGGCGTT ATCGAACGTC AGTCCGTAGA TCAGCCGGTA CAGACCGGTT
133
P L D H
D G F
S A V
E A I A
CGCTGGATCA CGACGGCTTC TCTGCTGTAG AAGCAATCGC
K12
pKH7
pSE1
2824
166
Y K A V
D S M
I P I
G R G Q
R E L
ATAAAGCCGT TGACTCCATG ATCCCAATCG GTCGTGGTCA GCGTGAATTG
K12
pKH7
pSE1
2874
I I G
ATCATCGGTG
ATCATCGGTG
ATCATCGGTG
K12
pKH7
pSE1
2924
199
I N Q
R D S
G I K C
I Y V
A I G
CATCAACCAG CGCGATTCCG GTATCAAATG TATCTATGTC GCTATCGGCC
CATCAACCAG CGCGATTCCG GTATCAAAGC TATCTATGTC GCTATCGGCC
CATCAACCAG CGCGATTCCG GTATCAAAGC TATCTATGTC GCTATCGGCC
K12
pKH7
pSE1
2974
216
Q K A S
T I S
N V V
R K L E
E H G
AGAAAGCGTC CACCATTTCT AACGTGGTAC GTAAACTGGA AGAGCACGGC
K12
pKH7
pSE1
3024
A L A
GCACTGGCTA
GCACTGGCTA
GCACTGGCTA
K12
pKH7
pSE1
3074
249
L Q Y
L A P
Y A G C
A M G
E Y F
ACTGCAATAC CTGGCACCGT ATGCCGGTTG CGCAATGGGC GAATACTTCC
ACTGCAATAC CTGGCACCGT ATGCCGGTGC CGCCATGGGT GAATACTTCC
ACTGCAATAC CTGGCACCGT ATGCCGGTGC CGCCATGGGT GAATACTTCC
K12
pKH7
pSE1
3124
266
R D R G
E D A
L I I
Y D D L
S K Q
GTGACCGCGG TGAAGATGCG CTGATCATTT ACGATGACCT GTCTAAACAG
K12
pKH7
pSE1
3174
A V A
GCTGTTGCTT
GCTGTTGCTT
GCTGTTGCTT
K12
pKH7
pSE1
3224
299
E A F
P G D
V F Y L
H S R
L L E
TGAAGCATTC CCGGGCGACG TTTTCTACCT CCACTCTCGT CTGCTGGAGC
K12
pKH7
pSE1
3274
316
R A A R
V N A
E Y V
E A F T
K G E
GTGCTGCACG TGTTAACGCC GAATACGTTG AAGCCTTCAC CAAAGGTGAA
183
D R Q T
G K T
A L A
I D A I
ACCGTCAGAC AGGTAAAACC GCACTGGCTA TCGATGCCAT
233
N T I V
V V A
T A S
E S A A
ACACCATCGT TGTGGTAGCA ACCGCGTCTG AATCCGCTGC
283
Y R Q I
S L L
L R R
P P G R
ACCGTCAGAT CTCCCTGCTG CTCCGTCGTC CGCCAGGACG
K12
pKH7
pSE1
3324
V K G
GTGAAAGGGA
GTGAAAGGGA
GTGAAAGGGA
333
K T G S
L T A
L P I
I E T Q
AAACCGGTTC TCTGACCGCA CTGCCGATTA TCGAAACTCA
K12
pKH7
pSE1
3374
349
A G D
V S A
F V P T
N V I
S I T
GGCGGGTGAC GTTTCTGCGT TCGTTCCGAC CAACGTAATC TCCATTACCG
K12
pKH7
pSE1
3424
366
D G Q I
F L E
T N L
F N A G
I R P
ATGGTCAGAT CTTCCTGGAA ACCAACCTGT TCAACGCCGG TATTCGTCCT
K12
pKH7
pSE1
3474
A V N
GCGGTTAACC
GCGGTTAACC
GCGGTTAACC
K12
pKH7
pSE1
3524
399
K I M
K K L
S G G I
R T A
L A Q
CAAGATCATG AAAAAACTGT CCGGTGGTAT CCGTACCGCT CTGGCACAGT
K12
pKH7
pSE1
3574
416
Y R E L
A A F
S Q F
A S D L
D D A
ATCGTGAACT GGCAGCGTTC TCTCAGTTTG CATCCGACCT TGACGATGCA
K12
pKH7
pSE1
3624
T R K
ACACGTAAGC
ACACGTAAGC
ACACGTAAGC
K12
pKH7
pSE1
3674
449
K Q Y
A P M
S V A Q
Q S L
V L F
GAAACAGTAT GCGCCGATGT CCGTTGCGCA GCAGTCTCTG GTTCTGTTCG
K12
pKH7
pSE1
3724
466
A A E R
G Y L
A D V
E L S K
I G S
CAGCAGAACG TGGTTACCTG GCGGATGTTG AACTGTCGAA AATTGGCAGC
K12
pKH7
pSE1
3774
F E A
TTCGAAGCCG
TTCGAAGCCG
TTCGAAGCCG
383
P G I S
V S R
V G G
A A Q T
CGGGTATTTC CGTATCCCGT GTTGGTGGTG CAGCACAGAC
433
Q L D H
G Q K
V T E
L L K Q
AGCTTGACCA CGGTCAGAAA GTGACCGAAC TGCTGAAACA
483
A L L A
Y V D
R D H
A P L M
CTCTGCTGGC TTACGTCGAC CGTGATCACG CTCCGTTGAT
K12
pKH7
pSE1
3824
499
Q E I
N Q T
G G Y N
D E I
E G K
GCAAGAGATC AACCAGACCG GTGGCTACAA CGACGAAATC GAAGGCAAGC
K12
pKH7
pSE1
3874
L K G I
L D S
F K A
T Q S W
TGAAAGGCAT CCTCGATTCC TTCAAAGCAA CCCAATCCTG GTAACGTCTG
3924
K12
pKH7
pSE1
1
(M) A
GCGGCTTGCC TTAGGGCAGG CCGCAAGGCA TTGAGGAGAA GCTCATGGCC
GCGGGTACCC TTAGGGCAGG CCGCAAGGCA TTGAGGAGAA GCTCATGGCC
GCGGGTACCC TTAGGGCAGG CCGCAAGGCA TTGAGGAGAA GCTCATGGCC
KpnI
> gamma
K12
pKH7
pSE1
3974
G A K
GGCGCAAAAG
GGCGCAAAAG
GGCGCAAAAG
18
E I R S
K I A
S V Q
N T Q K
AGATACGTAG TAAGATCGCA AGCGTCCAGA ACACGCAAAA
K12
pKH7
pSE1
4024
34
I T K
A M E
M V A A
S K M
R K S
GATCACTAAA GCGATGGAGA TGGTCGCCGC TTCCAAAATG CGTAAATCGC
K12
pKH7
pSE1
4074
51
Q D R M
A A S
R P Y
A E T M
R K V
AGGATCGCAT GGCGGCCAGC CGTCCTTATG CAGAAACCAT GCGCAAAGTG
K12
pKH7
pSE1
4124
I G H
ATTGGTCACC
ATTGGTCACC
ATTGGTCACC
K12
pKH7
pSE1
4174
84
D R D
V K R
V G Y L
V V S
T D R
AGACCGCGAC GTTAAACGCG TGGGCTACCT GGTGGTGTCG ACCGACCGTG
K12
pKH7
pSE1
4224
101
G L C G
G L N
I N L
F K K L
L A E
GTTTGTGCGG TGGTTTGAAC ATTAACCTGT TCAAAAAACT GCTGGCGGAA
GTTTGGCGGG TGGTTTGAAC ATTAACCTGT TCAAAAAACT GCTGGCGGAA
GTTTGGCGGG TGGTTTGAAC ATTAACCTGT TCAAAAAACT GCTGGCGGAA
K12
pKH7
pSE1
4274
M K T
ATGAAGACCT
ATGAAGACCT
ATGAAGACCT
68
L A H G
N L E
Y K H
P Y L E
TTGCACACGG TAATCTGGAA TATAAGCACC CTTACCTGGA
118
W T D K
G V Q
C D L
A M I G
GGACCGACAA AGGCGTTCAA TGCGACCTCG CAATGATCGG
GGACCGACTG CGGCGTTCAA GCCGACCTCG CAATGATCGG
GGACCGACAA AGGCGTTCAA GCCGACCTCG CAATGATCGG
K12
pKH7
pSE1
4324
134
S K G
V S F
F N S V
G G N
V V A
CTCGAAAGGC GTGTCGTTCT TCAACTCCGT GGGCGGCAAT GTTGTTGCCC
K12
pKH7
pSE1
4374
151
Q V T G
M G D
N P S
L S E L
I G P
AGGTCACCGG CATGGGGGAT AACCCTTCCC TGTCCGAACT GATCGGTCCG
K12
pKH7
pSE1
4424
V K V
GTAAAAGTGA
GTAAAAGTGA
GTAAAAGTGA
K12
pKH7
pSE1
4474
184
I V S
N K F
I N T M
S Q V
P T I
CATTGTCAGC AACAAATTTA TTAACACCAT GTCTCAGGTT CCGACCATCA
K12
pKH7
pSE1
4524
201
S Q L L
P L P
A S D
D D D L
K H K
GCCAGCTGCT GCCGTTACCG GCATCAGATG ATGATGATCT GAAACATAAA
K12
pKH7
pSE1
4574
S W D
TCCTGGGATT
TCCTGGGATT
TCCTGGGATT
K12
pKH7
pSE1
4624
234
L R R
Y V E
S Q V Y
Q G V
V E N
GCTGCGTCGT TATGTCGAAT CTCAGGTTTA TCAGGGCGTG GTTGAAAACC
K12
pKH7
pSE1
4674
251
L A S E
Q A A
R M V
A M K A
A T D
TGGCCAGCGA GCAGGCCGCC CGTATGGTGG CGATGAAAGC CGCGACCGAC
K12
pKH7
pSE1
4724
N G G
AATGGCGGCA
AATGGCGGCA
AATGGCGGCA
K12
pKH7
pSE1
4774
284
Q A S
I T Q
E L T E
I V S
G A A
TCAGGCCAGC ATTACTCAGG AACTCACCGA GATCGTCTCG GGGGCCGCCG
168
M L Q A
Y D E
G R L
D K L Y
TGTTGCAGGC CTACGACGAA GGCCGTCTGG ACAAGCTTTA
TGTTGCAGGC CTACGACGAA GGCCGTCTGG ACAAACTTTA
TGTTGCAGGC CTACGACGAA GGCCGTCTGG ACAAACTTTA
218
Y L Y E
P D P
K A L
L D T L
ACCTGTACGA ACCCGATCCG AAGGCGTTGC TGGATACCCT
268
S L I K
E L Q
L V Y
N K A R
GCCTGATTAA AGAGCTGCAG TTGGTATACA ACAAAGCTCG
K12
pKH7
pSE1
4824
> beta
A V
(M)
CGGTTTAAAC AGGTTATTTC GTAGAGGATT TAAGATG... ..........
CGGTTTAAAC AGGTTATTTC GTAGAGGATT TAATATGAGA GGATCGCATC
CGGTTTAAAC AGGTTATTTC GTAGAGGATT TAATATGAGA GGATCGCATC
His-tag
4874
10
K I V Q
V I G
AGATTGTCCA GGTAATCGGC
K12
pKH7
pSE1
A T G
.......... .......... GCTACTGGAA
ATCATCATCA TCATGGTATG GCTACTGGAA
ATCATCATCA TCATGGTATG GCTACTGGAA
K12
pKH7
pSE1
4924
A V V
GCCGTAGTTG
GCCGTAGTTG
GCCGTAGTTG
K12
pKH7
pSE1
4974
43
A L E
V Q N
G N E R
L V L
E V Q
TGCTCTTGAG GTGCAAAATG GTAATGAGCG TCTGGTGCTG GAAGTTCAGC
K12
pKH7
pSE1
5024
60
Q Q L G
G G I
V R T
I A M G
S S D
AGCAGCTCGG CGGCGGTATC GTACGTACCA TCGCAATGGG TTCCTCCGAC
K12
pKH7
pSE1
5074
G L R
GGTCTGCGTC
GGTCTGCGTC
GGTCTGCGTC
K12
pKH7
pSE1
5124
93
P V G
K A T
L G R I
M N V
L G E
CCCGGTAGGT AAAGCGACTC TGGGCCGTAT CATGAACGTA CTGGGTGAAC
K12
pKH7
pSE1
5174
110
P V D M
K G E
I G E
E E R W
A I H
CGGTCGACAT GAAAGGCGAG ATCGGTGAAG AAGAGCGTTG GGCGATTCAC
K12
pKH7
pSE1
5224
R A A
CGCGCAGCAC
CGCGCAGCAC
CGCGCAGCAC
K12
pKH7
pSE1
5274
143
T G I
K V I
D L M C
P F A
K G G
AACCGGTATC AAAGTTATCG ACCTGATGTG TCCGTTCGCT AAGGGCGGTA
AACCGGTATC AAAGTTATCG ACCTGATGGC TCCGTTCGCT AAGGGCGGTA
AACCGGTATC AAAGTTATCG ACCTGATGGC TCCGTTCGCT AAGGGCGGTA
27
D V E F
P Q D
A V P
R V Y D
ACGTCGAATT CCCTCAGGAT GCCGTACCGC GCGTGTACGA
77
R G L D
V K D
L E H
P I E V
GCGGTCTGGA TGTAAAAGAC CTCGAACACC CGATTGAAGT
127
P S Y E
E L S
N S Q
E L L E
CTTCCTACGA AGAGCTGTCA AACTCTCAGG AACTGCTGGA
K12
pKH7
pSE1
K12
pKH7
pSE1
5324
160
K V G L
F G G
A G V
G K T V
N M M
AAGTTGGTCT GTTCGGTGGT GCGGGTGTAG GTAAAACCGT AAACATGATG
5374
E L I
GAGCTCATTC
GAGCTCATTC
GAGCTCATTC
SacI
177
R N I A
I E H
S G Y
S V F A
GTAACATCGC GATCGAGCAC TCCGGTTACT CTGTGTTTGC
K12
pKH7
pSE1
5424
193
G V G
E R T
R E G N
D F Y
H E M
GGGCGTAGGT GAACGTACTC GTGAGGGTAA CGACTTCTAC CACGAAATGA
K12
pKH7
pSE1
5474
210
T D S N
V I D
K V S
L V Y G
Q M N
CCGACTCCAA CGTTATCGAC AAAGTATCCC TGGTGTATGG CCAGATGAAC
K12
pKH7
pSE1
5524
E P P
GAGCCGCCGG
GAGCCGCCGG
GAGCCGCCGG
K12
pKH7
pSE1
5574
243
E K F
R D E
G R D V
L L F
V D N
TGAGAAATTC CGTGACGAAG GTCGTGACGT TCTGCTGTTC GTTGACAACA
K12
pKH7
pSE1
5624
260
I Y R Y
T L A
G T E
V S A L
L G R
TCTATCGTTA CACCCTGGCC GGTACGGAAG TATCCGCACT GCTGGGCCGT
K12
pKH7
pSE1
5674
M P S
ATGCCTTCAG
ATGCCTTCAG
ATGCCTTCAG
K12
pKH7
pSE1
5724
293
L Q E
R I T
S T K T
G S I
T S V
TCTGCAGGAA CGTATCACCT CCACCAAAAC TGGTTCTATC ACCTCCGTAC
K12
pKH7
pSE1
5774
310
Q A V Y
V P A
D D L
T D P S
P A T
AGGCAGTATA CGTACCTGCG GATGACTTGA CTGACCCGTC TCCGGCAACC
227
G N R L
R V A
L T G
L T M A
GAAACCGTCT GCGCGTTGCT CTGACCGGTC TGACCATGGC
277
A V G Y
Q P T
L A E
E M G V
CGGTAGGTTA TCAGCCGACC CTGGCGGAAG AGATGGGCGT
K12
pKH7
pSE1
5824
T F A
ACCTTTGCGC
ACCTTTGCGC
ACCTTTGCGC
K12
pKH7
pSE1
5874
343
L G I
Y P A
V D P L
D S T
S R Q
TCTGGGTATC TACCCGGCCG TTGACCCGCT GGACTCCACC AGCCGTCAGC
K12
pKH7
pSE1
5924
360
L D P L
V V G
Q E H
Y D T A
R G V
TGGACCCGCT GGTGGTTGGT CAGGAACACT ACGACACCGC GCGTGGCGTT
K12
pKH7
pSE1
5974
Q S I
CAGTCCATCC
CAGTCCATCC
CAGTCCATCC
K12
pKH7
pSE1
6024
393
G M D
E L S
E E D K
L V V
A R A
GGGTATGGAT GAACTGTCTG AAGAAGACAA ACTGGTGGTA GCGCGTGCTC
K12
pKH7
pSE1
6074
410
R K I Q
R F L
S Q P
F F V A
E V F
GTAAGATCCA GCGCTTCCTG TCCCAGCCGT TCTTCGTGGC AGAAGTATTC
K12
pKH7
pSE1
6124
T G S
ACCGGTTCTC
ACCGGTTCTC
ACCGGTTCTC
K12
pKH7
pSE1
6174
443
K G I
M E G
E Y D H
L P E
Q A F
TAAAGGCATC ATGGAAGGCG AATACGATCA CCTGCCGGAG CAGGCGTTCT
K12
pKH7
pSE1
6224
Y M V G
S I E
E A V
E K A K
K L
ACATGGTCGG TTCCATCGAA GAAGCTGTGG AAAAAGCCAA AAAACTTTAA
6274
K12
pKH7
pSE1
327
H L D A
T V V
L S R
Q I A S
ACCTTGACGC AACCGTGGTA CTGAGCCGTC AGATCGCGTC
377
L Q R Y
Q E L
K D I
I A I L
TGCAACGTTA TCAGGAACTG AAAGACATCA TCGCCATCCT
427
P G K Y
V S L
K D T
I R G F
CGGGTAAATA CGTCTCCCTG AAAGACACCA TCCGTGGCTT
> epsilon
(M) A M
CGCCTTAATC GGAGGGTGAT ATGGCAATGA
9
T Y H L
D V V
CTTACCACCT GGACGTCGTC
K12
pKH7
pSE1
6324
S A E
AGCGCAGAGC
AGCGCAGAGC
AGCGCAGAGC
26
Q Q M F
S G L
V E K
I Q V T
AACAAATGTT CTCTGGTCTG GTCGAGAAAA TCCAGGTAAC
K12
pKH7
pSE1
6374
42
G S E
G E L
G I Y P
G H A
P L L
GGGTAGCGAA GGTGAACTGG GGATCTACCC TGGCCACGCA CCGCTGCTCA
K12
pKH7
pSE1
6424
59
T A I K
P G M
I R I
V K Q H
G H E
CCGCCATTAA GCCTGGTATG ATTCGCATCG TGAAACAGCA CGGTCACGAA
K12
pKH7
pSE1
6474
E F I
GAGTTTATCT
GAGTTTATCT
GAGTTTATCT
K12
pKH7
pSE1
6524
92
T V L
A D T
A I R G
Q D L
D E A
GACCGTTCTG GCCGACACCG CAATTCGCGG CCAGGATCTC GACGAAGCGC
K12
pKH7
pSE1
6574
109
R A M E
A K R
K A E
E H I S
S S H
GAGCCATGGA AGCGAAACGT AAGGCTGAAG AGCACATTAG CAGCTCTCAC
K12
pKH7
pSE1
6624
G D V
GGCGACGTAG
GGCGACGTAG
GGCGACGTAG
K12
pKH7
pSE1
6674
Q L R
V I E
L T K K
A M
GCAGCTGCGC GTTATCGAGT TGACCAAAAA AGCGATGTAA CACCGGCTTG
76
Y L S G
G I L
E V Q
P G N V
ATCTGTCTGG CGGCATTCTT GAAGTGCAGC CTGGCAACGT
126
D Y A Q
A S A
E L A
K A I A
ATTACGCTCA GGCGTCTGCG GAACTGGCCA AAGCGATCGC
6724
K12
pKH7
pSE1
AAAAGCACAA AAGCCAGTCT GGAAACAGGC TGGCTTTTTT TTGCGCGTGT
6774
K12
pKH7
pSE1
GACCCGTCCT GAATAGCGTT CACATAGATC CTGCTGATAT AAAACCCCCC
6824
K12
pKH7
pSE1
TGTTTTCCTG TTTATTCATT GATCGAAATA AGAGCAAAAA CATCCACCTG
6874
K12
pKH7
pSE1
ACGCTTAAAT TAAGGTACTG CCTTAATTTT CTGCAGACAA AAGGCGTGAC
6924
K12
pKH7
pSE1
GATGGTCGAA AATGGCGCTT TCGTCAGCGG GGATAATCCG TTATTGAACA
6974
K12
pKH7
pSE1
ATTTATCCTC TGTCCATTTC ACGATGAAAA AAATGTAGTT TTTTCAAGGT
7024
K12
pKH7
pSE1
GAAGCGGTTT AAATTCGTTC TCAAATTACA GTCAGGACGC GTATGTTGAA
GAAGCGGTTT GACTCTAGAG TCGACTCTAG CGGAGTGTAT ACTGGCTTAC
GAAGCGGTTT GACTCTAGAG TCGACTCTAG CGGAGTGTAT ACTGGCTTAC
XbaI
Danksagung
Vielen Dank an
apl. Prof. Dr. Siegfried Engelbrecht und Prof. Dr. Wolfgang Junge - die mir die Arbeit an
diesem interessanten Enzym überhaupt erst ermöglicht haben und die mich bei
der Erstellung dieser Arbeit in jeglicher Hinsicht unterstützt haben
Dr. Oliver Pänke - für die geduldige und intensive Einarbeitung in die Geheimnisse der
Fluoreszenzmikroskopie und zahlreiche wertvolle Diskussionen auch über
außeruniversitäre Themen
Jürgen Clausen - für zahllose fruchtbare Mensadiskussionen und die interessanten
historischen Exkursionen (das nächste Mal kuck ich vorher nach dem Auspuff)
Stephanie Winkler - für die angenehme Zusammenarbeit und für die Gespräche in den
„Wartezeiten“
Gaby Hikade und Hella Kenneweg - für die vielen Präps, die Unterstützung bei den
Rotationstests und und und…
Tobias Heidelmann - für die Versorgung mit Filmmaterial sowie für hitzige Debatten über
Gott und die Welt
Hendrik Sielaff - für die Hilfe bei Problemen mit diesen 0/'-Datenverarbeitungsmaschinen
Claudius Walter und Thorsten Mitschke - für etliche wüste Gemetzel
Ulrike Coja - für die gute Zusammenarbeit bei den Sequenzierungen
und an alle MitarbeiterInnen der Biophysik - für die schöne Zeit
Lebenslauf
Martin Müller
Persönliche Daten
06.04.1971
in Georgsmarienhütte geboren
Bildungsgang
08/77 – 07/81
08/81 – 07/83
08/83 – 05/90
Grundschule in Osnabrück-Voxtrup
Orientierungsstufe Schölerberg in Osnabrück
Käthe-Kollwitz-Gymnasium in Osnabrück
Abschluß: Abitur
06/90 – 08/91
09/91 – 12/91
01/92 – 07/92
Zivildienst in den Städtischen Kliniken Osnabrück
Anstellung als Pflegehelfer in den Städtischen Kliniken Osnabrück
Praktika bei verschiedenen metallverarbeitenden Firmen in
Osnabrück
Studium der Chemie an der Westfälischen Wilhelms-Universität in
Münster
Studienschwerpunkt: Biochemie
Abschluß: Diplom
Thema der Diplomarbeit: Klonierung, Expression und
Promotoranalyse des murinen Epidermis-Typ
Fettsäurebindungsproteins (mE-FABP)
wissenschaftlicher Mitarbeiter an der Universität Osnabrück
10/92 – 10/98
Ab 06/99

Das molekulare Drehlager der ATP-Synthase

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