Sender Entkoppler Lock- Sender Empfänger Lock

Sender Entkoppler Lock- Sender Empfänger Lock

Praktikum – Modul 417 Strukturbiochemie
SS 2010
im Rahmen des Bachelorstudiengangs Molecular Life Sciences
Aufbau eines NMR-Spektrometers
Magnet
ShimSpulen
Probenkopf
Sender
Empfänger
Entkoppler
Lock Empfänger
LockSender
FeldRegulierung
Computer
ADC
Das Herz des Spektrometers ist der Computer. Er steuert und überwacht die Funktion aller
elektronischen Komponenten. Von hier aus werden NMR Experimente aufgesetzt und
gestartet. Der akquirierte FID wird auf dem Bildschirm angezeigt, kann Fourier-transformiert
und bearbeitet werden.
Der Sender wird von dem Computer entsprechend einem vordefinierten Pulsprogramm
angesteuert. Er generiert Radiofrequenzpulse (RF-Pulse), die zur Anregung der Probe im
Probenkopf dienen.
Der Empfänger bekommt die von der Probe emitierten Signale, die anschließend im AnalogDigital-Konverter (ADC) digitalisiert werden. Erst danach gelangen die Informationen zum
Computer zur weiteren Verarbeitung und Speicherung.
Zur Beobachtung von NMR Übergängen ist ein homogenes magnetisches Feld erforderlich.
Es wird von einer supraleitenden Magnetspule erzeugt (Solenoid, typische Materialien sind
Nb-Legierungen wie NbTi oder Nb3Sn). Die Supraleitfähigkeit ist bei einer Temperatur unter
6K gewährleistet, wofür der supraleitende Draht ständig in einem Behälter mit flüssigem
Helium (Sdp. 4K) eingetaucht sein muss. Um den Heliumverbrauch zu minimieren wird der
Helium-Tank von einem Tank mit flüssigem Stickstoff umgeben (77.4 K).
Der Magnet
Helium Einfüllport
Stickstoff Einfüllport
Probenlift
Supraisolierung und Hochvakuum
Stickstoff-Tank
Helium-Tank
Probe
Probenspinner
Supraleitende Magnetspule
Shim-Einheit
Probenkopf
Die Stärke des Magnetfeldes muss während der gesamten Zeit der Messung konstant bleiben,
da eine Veränderung der Feldstärke eine Veränderung der emittierten Frequenzen zur Folge
hat. Es ist die Aufgabe des so genannten Locksystems das magnetische Feld bei einer
bestimmten Feldstärke zu sperren. Dabei macht man sich die Frequenz des Deuteriumsignals
des Lösungsmittels zunutze. Das Locksystem ist im Wesentlichen ein separates Spektrometer
mit extra Lock-Sender und -Empfänger zur Beobachtung von Deuterium. Wenn die
Feldstärke variiert (drift) so verändert sich die Frequenz des empfangenen Deuteriumsignals.
Sie wird einige tausend Mal pro Sekunde gemessen. Das einzulockende Signal wird in
Dispersionsphase beobachtet und ermöglicht so die Richtung der Feldstärkeänderung zu
bestimmen. Die magnetische Feldstärke wird darauf hin geeignet nachjustiert, bis die
Frequenz des Deuteriumsignals wieder den Soll-Wert erreicht hat.
Abstimmen des Probenkopfes (tuning und matching)
Der Probenkopf ist der Teil des Spektrometers, der die Probe aufnimmt. Er übermittelt RFPulse an die Probe und detektiert die Signale von der Probe. Er enthält ein System zur
Probenrotation sowie zur Temperaturkontrolle.
Zur optimalen Übertragung der RF-Signale vom Sender zur Probe und von der Probe zum
Empfänger muss der Probenkopf abgestimmt werden, das sogenannte tuning und matching.
Über das tuning wird der Probenkopf so eingestellt, dass seine höchste Empfindlichkeit genau
bei der erwünschten Sender- bzw. Empfängerfrequenz liegt (Resonanz). Über das matching
wird sichergestellt, dass die maximale Leistung, welche an den Anschlüssen des
Probenkopfes ankommt, übertragen wird (Impedanzanpassung).
Shimmen
Zur Maximierung der Homogenität des Magnetfeldes und damit der Signalschärfe werden
Stromtragende Shim-Spulen verwendet. Durch das Einstellen einer geeigneten Stromstärke
werden Zusatzfelder erzeugt, die die Homogenität des Magnetfeldes wesentlich verbessern.
Das Einstellen der Ströme in den Shim-Spulen wird als shimmen bezeichnet.
Aufnahmetechnik
Die Puls-Fourier-Methode ermöglicht eine wesentlich höhere Akquisitionsgeschwindigkeit
als die klassische cw-Methode (continous wave: spektraler Bereich wird durch
Frequenzsweep oder Feldsweep durchfahren). Bei einem Fourier-1H-Spektrum lässt man
einen Hochfrequenzpuls von etwa 10 µs Länge senkrecht zur z-Achse auf die Probe
einwirken. Dieser Puls stellt keine monochromatische Welle dar, sondern überdeckt einen
Frequenzbereich von ca. ±500 kHz, d.h. alle Spins mit einer Resonanzfrequenz innerhalb
dieses Bereiches werden gleichzeitig angeregt. Um die Wirkung des Pulses zu verstehen ist es
sinnvoll den Vorgang im rotierenden Koordinatensystem zu betrachten. Dadurch wird der
Einfluss des äußeren Magnetfeldes mathematisch (!) aufgehoben und das magnetische
Gesamtmoment dreht sich um das eingestrahlte Feld B1 und zwar aus der z-Richtung in die
x,y-Ebene. Hier Induziert es in den Empfänger-Spulen eine Spannung deren Amplitude als
Funktion der Zeit registriert wird (FID: free induction decay). Außerdem ermöglicht die PulsFourier-Methode die Akkumulation von nacheinander gemessenen FIDs, wodurch die
Empfindlichkeit der NMR-Spektroskopie erheblich gesteigert werden konnte.
Im Computer werden die Daten in Form von diskreten Punkten gespeichert. Der zeitliche
Abstand der Punkte durch den der spektrale Bereich gegeben ist, heißt dwell time (DW). Die
dwell time ist abhängig von der spektralen Breite des Spektrums (spectral width, SW =
1/2DW). Die digitale Auflösung, die bei der Interpretation der Spektren eine große Rolle
spielt, ergibt sich aus der spektralen Breite des Spektrums dividiert durch die Zahl der
Digitalisierungspunkte (TD). Sie ist in der Einheit Hz angegeben. Durch Multiplikation der
dwell time mit der Zahl der Digitalisierungspunkte ergibt sich weiterhin die Akquisitionszeit
(AQ). Zwischen Anregungspuls und Beginn der Akquisition verwendet man einen pre scan
delay (DE), der verhindert, dass Seitenbanden des Anregungspulses den FID überlagern.
Nach der Anregung kehrt das magnetische Gesamtmoment wieder in die Richtung der
z-Achse zurück (Relaxation). Man unterscheidet zwei Zeitkonstanten der Relaxation, die
longitudinale Relaxationszeit T1 und die transversale Relaxatioszeit T2. T1 beschreibt die
Wiederherstellung
der
Besetzungsverhältnisse
der
Spinzustände
im
thermischen
Gleichgewicht, also den Aufbau der z-Magnetisierung. T2 dagegen beschreibt den Verlust der
Phasenkohärenz und somit die Rückkehr zur Gleichverteilung der magnetischen Momente in
der x,y-Ebene. Da sich die Messpule in der x,y-Ebene befindet, kann T1 nicht direkt gemessen
werden. T2 manifestiert sich dagegen in dem decay des FID, also in der Abnahme der x,yMagnetisierung über die Zeit.
Die Prozessierung von NMR-Daten
Fourier-Transformation
Aufgrund der gleichzeitigen Anregung aller Spins eines Moleküls mit der Puls-FourierMethode besteht der vom Computer aufgezeichnete FID aus einer Überlagerung von
harmonischen Funktionen. Der FID als Funktion der Zeit kann als solches nicht interpretiert
werden und muss erst durch eine mathematische Umwandlung, bekannt als FourierTransformation, in die Frequenzdomäne überführt werden. Die Transformation übernimmt
der Computer.
Bei der Umwandlung werden genaugenommen zwei Spektren erzeugt. Die FourierTransformation ist eine komplexe Funktion und enthält einen Real- und Imaginärteil. Jeder
Anteil für sich stellt ein eigenständiges Spektrum dar und enthält genau die gleiche
Information. Es ist somit auch egal welches Spektrum man sich anschaut. Eine Konsequenz
folgt trotzdem aus der Transformation. Die eine Hälfte der Digitalisierungspunkte des FID
steckt in dem Realanteil, die zweite Hälfte in dem Imaginäranteil. Die Fourier-Transformation
halbiert somit die digitale Auflösung.
Zero Filling
Die Messspule zeichnet die x,y-Magnetisierung in Abhängigkeit von der Zeit auf. Diese
nimmt aber mit der Zeitkonstante T2 ab, d.h. die meiste Information steckt in dem vordersten
Teil des FID, der kurz nach Öffnung des Empfängers aufgezeichnet wird. Während mit
fortschreitender Zeit der Gehalt an Information im FID abnimmt, bleibt das thermische
Rauschen in der Messelektronik gleich. Das Signal-Rausch-Verhältnis nimmt somit ab.
Es gibt einen Trick mathematisch das Signal-Rausch-Verhältnis zu verbessern, das
sogenannte zero filling. Verdoppelt man die Anzahl der Datenpunkte bei der FourierTransformation, dann werden diese an das Ende des FID angehängt. Jeder Datenpunkt besitzt
die Amplitude Null. Da bei dem zero filling dem Spektrum keine zusätzliche Information
zugefügt wird, bleibt der Informationsgehalt identisch. Das Rauschen nimmt dagegen um den
Faktor √2 ab. Ein zweiter Effekt ist eine Erhöhung der digitalen Auflösung. Ein zero filling
über den Faktor zwei hinaus bringt keine zusätzliche Verbesserung des Signal-RauschVerhältnises.
Phasenkorrektur
Phasenverschiebungen sowohl vom gesendeten als auch vom empfangenen Signal sind
innerhalb der Spektrometerhardware unvermeidbar und müssen deshalb korrigiert werden.
Phase
Frequenz
Frequenz
Die Phasenkorrektur nullter Ordnung wendet dieselbe Phasenkorrektur auf das gesamte
Spektrum an. Hierbei wird allen Phasenverschiebungen, die unabhängig von der
Signalfrequenz auftreten können, Rechnung getragen.
Die Phasenkorrektur erster Ordnung wendet eine Phasenkorrektur proportional zur
Signalfrequenz an. Dies ist notwendig, da Phasenverschiebungen gewöhnlich eine
frequenzabhängige Komponente besitzen.
Verwendung von Gewichtungsfunktionen (window functions)
Gewichtungsfunktionen sind Funktionen, mit denen der FID multipliziert werden kann. Sie
können
bestimmte
Bereiche
des
FID
unterschiedlich
gewichten.
Auch
die
Gewichtungsfunktionen erzeugen keine neuen Informationen im Spektrum. Durch
Anwendung einer Exponentialfunktion lässt sich z.B. das Rauschen im hinteren Bereich des
FID, und somit auch im Spektrum, künstlich reduzieren. Ein Nebeneffekt ist ein schnellerer
Abfall des FID auf Null, was dann wiederum zu einer künstlichen Linienverbreiterung führt.
Als Faustregel kann man sich merken, dass eine Verbesserung des Signal-RauschVerhältnisses eine Verschlechterung der Auflösung nach sich zieht. Eine Verbesserung der
Auflösung führt zu einer Verschlechterung des Signal-Rausch-Verhältnisses.
originaler FID
Gewichtungsfunktion
gewichteter FID
Gewichtungsfunktion
gewichteter FID
Zum Ablauf des Praktikums
Das Ziel dieses Praktikums ist es, einen Einblick über die Methode der hochauflösenden
magnetischen Kernresonanzspektroskopie in Lösung zu erhalten. Es beinhaltet eine
Demonstration am Spektrometer, sowie die Auswertung verschiedener ein- und
zweidimensionaler NMR-Experimente.
Am ersten Praktikumstag erfolgt zunächst die Demonstration eines PFT-Spektrometers. An
einer Beispielprobe (Saccharose) wird der Einfluss verschiedener Messparameter auf die
Spektren, die erhalten werden, vorgestellt (Digitale Auflösung, Akquisitionszeit, Homogenität
des Magnetfeldes). Anschließend gibt es eine Einführung in die Interpretation von NMRSpektren. Die Spektren von zwei Monosacchariden werden ausgewertet.
Am zweiten Praktikumstag erhalten Sie einen Spektrensatz für ein Disaccharid. Die Struktur
der
Verbindung
soll
mittels
1
H-NMR
sowie
über
homo-
und
heteronukleare
Korrelationsspektren (H,H-COSY, TOCSY, HSQC und NOESY) ermittelt werden.
Am dritten Praktikumstag folgt die Analyse eines Hexapeptids anhand eines 1H-, TOCSYund ROESY-Spektrums.
Zur Auswertung
Für die Anfertigung des Protokolls ist es wichtig die Zuordnung schon während der
Auswertung vernünftig mitzuschreiben. Dabei eignet es sich einerseits das 1H-NNR-Spektrum
auszudrucken und dort die Zuordnungen einzutragen. Zusätzlich kann man sich eine Tabelle
anfertigen, in der die zugeordneten Signale mit den chemischen Verschiebungen und
Kopplungskonstanten eingetragen werden. Weiterhin ist es sinnvoll sich die Korrelationen aus
dem COSY bzw. NOESY Spektrum aufzuschreiben.
Protokoll
Erstellen Sie im Anschluss an das Praktikum ein Protokoll. Gehen Sie auf die folgenden
Punkte ein:
-
Beschreiben Sie die verwendeten Experimente (kurz!). Was ist zu sehen?
-
Vergleichen Sie das TOCSY und das COSY-Experiment.
-
Diskussion der anomeren Protonen in den Glycosid-Spektren.
-
Diskussion der Verknüpfung des Disaccharids und des Peptids.
-
Interpretation
der
Spektren
nach
einem
der
beiden
vorgeschlagenen
Auswerteschemata.
Auswertung der NMR-Daten
1
H-NMR (500 MHz, CDCl3, TMS):  [ppm] = 5.41 (1H, d, 3JH,H = 3.8 Hz, H-1), 4.22 (1H, d,
3
JH,H = 8.8 Hz, H-3‘), 4.05 (1H, dd, 3JH,H = 8.6, 8.7 Hz, H-4‘), 3.92-3.87 (1H, m, H-5‘), 3.87-
3.79 (5H, m, H-5, H-6, H-6‘), 3.76 (1H, dd, 3JH,H = 9.6, 9.6 Hz, H-3), 3.68 (2H, s, H-1‘), 3.56
(1H, dd, 3JH,H = 3.8, 10.0 Hz, H-2), 3.47 (1H, dd, 3JH,H = 9.5, 9.5 Hz, H-4).
s: Singulett, d: Dublett, dd: Dublett vom Dublett, m: Multiplett
NOESY:
Alternativ kann die Auswertung in tabellarischer Form aufgeschrieben werden. Die Struktur,
welche die Korrelationen aufzeigt, braucht in diesem Fall nicht gezeichnet werden:
Signal  1H
[ppm]
1
5.41
Integral Mult. JH,H
[Hz]
1H
3.8
d
COSY NOESY
2
2, 1‘
2
3.56
1H
dd
3.8, 10.0 1, 3
1, 4
3
3.76
1H
dd
9.6, 9.6
2, 4
5
4
3.47
1H
dd
9.5, 9.5
3, 5
5
3.87-3.79
1H
m
6
3.87-3.79
2H
m
1‘
3.68
2H
s
3‘
4.22
1H
d
8.8
4‘
1‘, 5‘
4‘
4.05
1H
dd
8.6, 8.7
3‘, 5‘
6‘
5‘
3.92-3.87
1H
m
4‘, 6‘
6‘
3.87-3.79
2H
m
5‘
4
3
1, 3‘
4‘