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LABORWELT
Nr. 6 / 2005 - Vol. 6
Verbesserte
Labordiagnostik mit
Leukämie-Chip
Diagnostische Peptide
in Krebsprognose und
Therapie
Molekulardiagnostik
Tiermodelle: European
Conditional Mouse
Mutagenesis Program
Marktübersicht:
Diagnostische PCR
und Chipanalyse
Gendiagnostik:
Handlungsbedarf aus
Industriesicht
Molekulare Bildgebung
von Gehirntumoren
Microarray-Diagnostik
von Allergenen
BIOCOM AG
Das
-Themenheft
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Er forscht für Ihr Leben gern.
DR. CHRISTIAN KLEIN,
GESUNDHEITSPIONIER,
IST DEM KREBS AUF DER SPUR.
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Gemeinsam mit rund 10.000 Mitarbeitern
von Roche Diagnostics in Deutschland
arbeitet Dr. Christian Klein an Innovationen
für die Gesundheit. Mit Hilfe modernster
molekularbiologischer Verfahren forscht er
nach neuen Ansätzen in der Krebstherapie.
So kann er biologische und chemische
Substanzen schneller daraufhin überprüfen, ob sie sich zur Behandlung von Krebs
eignen. Vielversprechende Wirkstoffe lassen
sich auf diese Weise schneller finden – und
zu Medikamenten weiterentwickeln, die die
Therapiechancen und somit die Lebensqualität von Krebspatienten verbessern.
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09.11.2005 18:48:03 Uhr
I
Zum Thema
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
Molekulare Medizin
auf dem Prüfstand
Nach Jahrzehnten des Stillstands rückt ein wachsendes Verständnis
der molekularen Ursachen von Krebs eine bessere Diagnose, Prognose
und schließlich auch gezieltere Therapien in greifbare Nähe. Diese
neue Hoffnung der Krebsforscher formulierte DKFZ-Chef Prof. Dr.
Otmar Wiestler Mitte September auf einer Veranstaltung des Bundesforschungsministeriums in Berlin. Als erstes profitversprechendes
Anwendungsfeld des aus dem Humangenomprojekt genährten Erkenntniszuwachses haben Pharmafirmen wie Roche oder Bayer die
molekulare Diagnostik ausgemacht: Neben PCR-basierten Gentests
befinden sich bei den Unternehmen Multiplex-Verfahren wie etwa
Microarrays zur Diagnose von Leukämien (siehe Seite 6 ff.) und anderen Krebsarten in der Entwicklung. Ein Chip, der eine Voraussage
darüber ermöglicht, wie schnell Medikamente in der Leber abgebaut
werden, ist bereits am Markt. Ziel dieser Forschungsanstrengungen
ist es, die Therapie- und Medikamentenauswahl sowie -dosierung
besser auf den individuellen Patienten abzustimmen, eine genauere
Prognose zu ermöglichen und zugleich Targets zu identifizieren, die
sich bei einer möglichst großen Patientengruppe finden.
Bitte nutzen Sie unseren Kennziffer-Service: online unter
www.biocom.de oder auf unserer Fax-Seite (S. 53). Wenn
Sie ein Produkt interessiert, einfach Nummer ankreuzen,
Name und Adresse angeben und faxen/mailen – Sie
erhalten umgehend Informationen unserer Inserenten.
Interessenvertretungen (siehe S. 4) und Politik unterstützen den neuen
Hype der „individualisierten Medizin“ nach Kräften und versuchen
derzeit, Barrieren zu beseitigen, die einer Vermarktung entgegenstehen.
Ob dies tatsächlich eine signifikante medizinische Verbesserung zu vertretbaren Kosten erbringt, wird letztlich die Prüfung der Tests ergeben.
Einen Überblick über PCR- und Array-Diagnostika haben wir für Sie in
unserer Marktübersicht (siehe S. 43 ff.) zusammengestellt.
Neben der Expressions- und Proteinanalyse auf Chips oder Strips
(siehe S. 39) bieten besonders nicht-invasive, bildgebende Verfahren einen neuen Zugang zum molekularen Krankheitsgeschehen.
Empfindliche MRT-, Lumineszenz- und PET-Verfahren eröffnen die
in vivo-Beobachtung der Genexpression (siehe Seite 16) oder von
molekularen Tracern (siehe Seite 21), die sich als Biomarker, aber auch
zur Identifizierung bisher unbekannter Targets eignen.
In unserer neuen themenübergreifenden Rubrik Tech-Transfer (S. 4042) möchten wir Wissenschaftlern eine Plattform bieten, um aktuelle
Research Tools und Dienstleistungen vorzustellen. Über Ihre Anregungen zu diesem neuen Angebot würden wir uns sehr freuen.
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INHALT
STATEMENT
 Gendiagnostik: Informationelle Selbstbestimmung
ist unverzichtbar
4
Dierk Meyer-Lüerßen, Geschäftsführer,
Verband der Diagnostica-Industrie, Frankfurt am Main
REPORT
 Genexpressions-Analysen bei Leukämien:
Diagnostik der Zukunft?
6
Prof. Dr. Dr. Torsten Haferlach et al., MLL GmbH, München
WISSENSCHAFT
 Klinische Relevanz des Serumproteins Fetuin-A
– eines Regulators der Kalzifizierung
Dr. Vincent Brandenburg et al., Klinikum RWTH Aachen
BLITZLICHT
 Molekulare Bildgebung von Gehirntumoren
Prof. Dr. Andreas Jacobs et al., MPI f. neurolog. Forschung, Köln
BLITZLICHT
 Diagnostische Peptide: Spezifische Darstellung
und Therapie von Krebserkrankungen
10
16
21
Dr. Sabine Zitzmann et al., Schering AG, Berlin
WISSENSCHAFT
 Präparative Aufreinigung von Organellen
mit Immuno-Freeflow-Elektrophorese
24
Dr. Christoph Eckerskorn et al., BD Diagnostics, Martinsried
BLITZLICHT
 Association Studies of Complex Diseases
Greg Yap, Affymetrix Inc., Santa Clara, USA
NETZWERK
 EUCOMM – European Conditional Mouse
Mutagenesis Program
27
31
Prof. Dr. Wolfgang Wurst et al., GSF – Forschungszentrum
für Umwelt und Gesundheit, Neuherberg
BLITZLICHT
 Microarray-Diagnostik von Allergenen
Dr. Eva Ehrentreich-Förster et al., FhG IMBT, Nuthetal
BLITZLICHT
34
 Brustkrebs-Früherkennung mit SELDI-MS
39
 T E C H-T R A N S F E R
Diagnostik-Array-Service; Kinom-Array;
Tool für siRNA-Effizienz;
40
Dr. Christine König et al., LifeLines GmbH, Husum
Thomas Gabrielczyk
MARKTÜBERSICHT
Abstrakte Darstellung des Erbmoleküls DNA, der stofflichen Grundlage der heute vermarkteten PCR- und
Chip-basierten In vitro-Diagnostica.
© Getty Images, Photodisc Collection
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LABORWELT
 Diagnostische PCR- und Array-Analyse
43
 Stellenmarkt/Verbände
49
 Produktwelt
51
 Fax-Seite
53
 Termine/Impressum
54
6. Jahrgang | Nr. 6/2005 | 3
L E S E R F O R U M
Statement

Gendiagnostik:
InformationelleSelbstbestimmung
ist unverzichtbar
Dierk Meyer-Lüerßen
Geschäftsführer des Verbands der Diagnostica-Industrie (VDGH)
Die vorgezogene Bundestagswahl und ihr
verwirrendes Ergebnis haben ein Gesetzesvorhaben gehemmt, das für die künftige Nutzung der Labordiagnostik von großer Bedeutung ist: das Gendiagnostik-Gesetz. Durch
dieses Gesetz sollen die Rechte der Menschen
definiert und geschützt werden, die sich zur
Früherkennung vorhandener Krankheiten,
zur Abschätzung von Krankheitsrisiken sowie zur Diagnose einem Gentest unterziehen.
Ein klarer Rechtsrahmen kann der Akzeptanz
der Gendiagnostik nur gut tun.
Gentests sind heute in der Medizin bereits
weit verbreitet. Allerdings wird ihr wirtschaftliches Potential meist weit überschätzt.
Von den rund 1,8 Milliarden Euro, die die
gesamte Diagnostika-Industrie in Deutschland umsetzt, entfallen nach Schätzungen
des VDGH gerade einmal acht Millionen
auf industriell gefertigte Gentests. Ein deutlich größeres Volumen dürften die Gentests
erreichen, die individuell in Forschungseinrichtungen und Laboren entwickelt werden,
keinen industriellen Maßstab erreichen und
damit kaum erfaßt werden können.
Nimmt man alle molekularbiologischen
Testverfahren zusammen, die der LaborEBM als Kassenleistung enthält, dann dürfte
die Zahl der pro Jahr durchgeführten Tests
bei niedergelassenen Laborärzten, Kliniken
und genetischen Instituten etwa eine Million
erreichen.
Hoher medizinischer Nutzen
In deutlichem Kontrast zu ihrer noch sehr
geringen wirtschaftlichen Bedeutung steht
der medizinische Nutzen der Gendiagnostik.
Ohne sie sind viele Diagnosen gar nicht möglich. Ihre Ergebnisse sind aussagekräftiger
und genauer als die herkömmlicher labormedizinischer Verfahren.
Dank Gentests läßt sich bestimmen, ob
Kranke auf bestimmte Medikamente ansprechen oder nicht und die Behandlung danach
ausrichten. Daher wird diese Entwicklung
von vielen als willkommener Fortschritt
hin zu einer individualisierten Medizin
betrachtet.
4 | 6. Jahrgang | Nr. 6/2005
Umgekehrt wird die Aussagekraft dieser
Tests aber auch als Gefahr gesehen. Kommen
die Daten in falsche Hände, kann dem einzelnen zweifellos Schaden entstehen. Dies
gilt insbesondere für prädiktive Gentests
– also voraussagende Tests, mit denen genetische Anlagen erkannt werden sollen, die in
der Zukunft zum Ausbruch einer Krankheit
führen können, aber nicht müssen.
Denn die Art und Weise, in der sich Gene
auf den einzelnen auswirken, ist äußerst
komplex. Bei bestimmten seltenen Krankheiten liefern Prüfungen auf der Grundlage
der Nukleinsäure nahezu kategorische
Informationen über das Krankheitsrisiko.
In anderen Fällen sind ererbte Faktoren
von vergleichbarer Bedeutung wie externe
Faktoren, beispielsweise Ernährung und
Lebensstil.
Regelungen statt Totalverzicht
Gerade solche prädiktiven Tests werfen in
mehrfacher Hinsicht ethische Fragen auf:
Was nutzt es einem Betroffenen, durch einen Gentest zu wissen, daß er vermutlich
– sagen wir – an Alzheimer erkrankt, es
aber keine kausale Therapie dagegen gibt?
Könnten nicht Arbeitgeber die Einstellung
oder Förderung von Mitarbeitern von den
Ergebnissen solcher Tests abhängig machen?
Bleibt Betroffenen jeglicher Lebens- oder
Krankenversicherungsschutz versperrt, weil
die Versicherungen das Risiko ablehnen?
Die Antwort auf solche Fragen kann jedoch nicht auf den Verzicht auf die neuen
Diagnosemöglichkeiten hinauslaufen. Dazu
bieten diese modernen Testverfahren viel zu
viele Chancen, um Krankheiten aufzuspüren, zu verhindern oder ihren Verlauf positiv
zu beeinflussen.
Die Antwort kann nur lauten: Es muß
genau und verläßlich geregelt werden, wann
genetische Dispositionen ermittelt werden
dürfen, wie und ob sie dem Betroffenen nah
gebracht werden und wie Ärzte und Wissenschaft die Ergebnisse verwenden dürfen, wie
sie gespeichert und geschützt werden und
wer sie nicht verwenden darf.
Nach seinem Studium der Rechtswissenschaft in Heidelberg und Hamburg trat Dierk Meyer-Lüerßen in die
Rechtsabteilung des Bundesverbandes
der Pharmazeutischen Industrie e.V.
ein. Seine Aufgabengebiete waren
Referatsleiter Abteilung öffentliches
Recht, Kartellrecht und internationales
Recht. Nach siebenjähriger Tätigkeit
wechselte er 1982 als Geschäftsführer
zum Verband der Diagnostica-Industrie
e.V. Meyer-Lüerßen ist seit 1980 in Arbeitsgruppen der European Diagnostic
Manufacturers Association tätig und
war von 1995 bis 2003 auch Mitglied
in deren Vorstand. Seit 1978 hat er die
Zulassung als Rechtsanwalt in Frankfurt,
Schwerpunkt Diagnostika-Recht, er ist
Mitautor des „Wiko“ und des „Handbuch
des Medizinprodukterechts“.
Der Verband der Diagnostica-Industrie
hat sich daher frühzeitig für eine gesetzliche Regelung ausgesprochen. Denn ohne
Rahmenbedingungen, die die Rechte des
Individuums an seinen Gendaten sowie den
Umgang mit den Ergebnissen von Gentests
exakt regeln, ist keine öffentliche Akzeptanz
dieser wichtigen Testverfahren zu erwarten.
Auf diese Akzeptanz und auf diese Verfahren
können und sollten insbesondere die Patienten nicht verzichten.
Rahmen für ein Gendiagnostik-Gesetz
Der Verband der Diagnostica-Industrie
nimmt folgende Position ein:
– Individuelle genetische Informationen
sind persönlich und privat. Nur ihr
Besitzer darf entscheiden, ob sie mittels
genetischer Testung erlangt werden sollen
und wozu sie verwendet werden dürfen.
Weder Arbeitgeber noch Versicherungsunternehmen, weder Regierungen noch
medizinische Fachkräfte dürfen solche
Entscheidungen treffen.
– Alle persönlichen medizinischen Informationen, einschließlich der durch Gentests
LABORWELT
erlangten Daten, sind vertraulich. Allein der Betroffene hat das
Recht, über die Nutzung der Daten zu entscheiden.
– Genetische Prüfungen dürfen nur mit zuvor erteilter Einwilligung
(„informed consent“) durchgeführt werden. Der Begriff „informed
consent“ umfaßt die vollständige Darlegung von Nutzen, Risiken
und Grenzen der Prüfung, einschließlich Alternativen zu den
Prüfungen sowie therapeutische und präventive Möglichkeiten
nach der Prüfung.
– Eine genetische Prüfung sollte nur durchgeführt werden, wenn
dadurch dem Betroffenen oder seiner Familie ein Nutzen entsteht,
zum Beispiel eine Therapie möglich ist oder – auch das ist wichtig
– wenn ihm durch einen Test die vielleicht unbegründete Angst
vor einer Erkrankung genommen wird.
– Die Ergebnisse genetischer Prüfungen sollten dem Betroffenen
durch Fachkräfte und Psychologen erläutert werden. Er darf mit
den Ergebnissen nicht alleingelassen werden.
Der bisherige Entwurf des Gendiagnostik-Gesetzes wird diesen
Forderungen weitgehend gerecht. Er stellt den Menschen in den Mittelpunkt und gesteht ihm umfassende informationelle Freiheiten zu.
Der Betroffene behält jederzeit die Kontrolle über seine genetischen
Daten. Er kann jederzeit die Einwilligung zu Untersuchungen und
zur Verwendung der Ergebnisse widerrufen. Er kann es ablehnen,
die Ergebnisse einer Untersuchung zu erfahren und die Ergebnisse
vernichten lassen. Wichtig ist allerdings auch, daß ein zukünftiges
Gendiagnostik-Gesetz den berechtigten Interessen der medizinischen Forschung Rechnung trägt.
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Talk to Tecan
Kein Ende der Pauschalkritik an Gentests?
Der VDGH verbindet mit dem Gendiagnostik-Gesetz die Hoffnung,
daß durch die neuen Regelungen der Pauschalkritik an den neuen
Testverfahren der Wind aus den Segeln genommen und einer Blockade
der genetischen Untersuchungen entgegengewirkt wird.
Einen kleinen Wermutstropfen gibt es jedoch: Es ist bedauerlich,
daß die Gendiagnostik in eine Sonderrolle gedrängt wird. Die jetzt
geplanten Bestimmungen müßten auf alle medizinischen Tests und
die daraus gewonnenen persönlichen Daten angewandt werden. Es ist
nicht einzusehen, weshalb die Gefahr des Mißbrauchs der Ergebnisse
von Gentests größer und die Folgen schwerwiegender sein sollen als
von anderen medizinischen Test mit hohem Informationsgehalt.
Aus wissenschaftlicher Sicht sind alle genetischen Daten Teil eines
Gesamtspektrums an medizinischen Informationen und können
nicht als getrennte Kategorie betrachtet werden. Da sich bei allen
medizinischen Daten der Informationsgehalt in Abhängigkeit zu den
jeweiligen Gegebenheiten grundlegend ändern kann, sollten sie alle
denselben strengen Anforderungen an die Datenqualität entsprechen
und dasselbe hohe Maß an Vertraulichkeit genießen. Besondere
Erwägungen, soweit sie in Anbetracht des Informationsgehaltes
angemessen sind, sollten stets auf den Träger der Information, nicht
aber auf die Information als solche bezogen sein.
Auch bei anderen Tests ethische Probleme
Kennziffer 12 LW 06 · Informationen ordern? · www.biocom.de
LABORWELT

Auch – um ein Beispiel zu nennen – die bildgebende Diagnostik kann
ähnliche ethische Probleme aufwerfen, etwa wenn der Diagnose
keine Therapie folgen kann oder ein potentieller Arbeitgeber von
einem negativen Ergebnis erfährt und die Einstellung verweigert.
Nur weil bei den neuen Tests das Erbgut des Menschen untersucht
wird, soll offensichtlich mit zweierlei Maß gemessen werden.
Erfreulicherweise teilt der Nationale Ethikrat in diesem Punkt
die Haltung der Diagnostika-Hersteller und trifft in seiner Stellungnahme zur prädiktiven Diagnostik keine Unterscheidung zwischen
Gendiagnostik und herkömmlichen Verfahren.
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DNA-Microarrays
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Genexpressionsanalysen
bei Leukämien:
Diagnostik der Zukunft?
Prof. Dr. Dr. Torsten Haferlach, PD Dr. Susanne Schnittger, PD Dr. Wolfgang Kern,
PD Dr. Claudia Schoch, MLL Münchner Leukämielabor GmbH
Eine umfassende Leukämiediagnose beruht auf einer individuellen Kombination verschiedender Methoden. So kommen parallel eine Kombination von Zytomorphologie, Zytochemie,
Zytogenetik, Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung, Durchflußzytometrie und PCR-basierten
molekulargenetischen Methoden zum Einsatz. Seit kurzem ermöglicht nun die Technik der
Genexpressionsanalyse mit Microarrays eine simultane Expressionsmessung von Zehntausenden Genen. Die spezifische Signatur erlaubt anschließend das Erstellen eines molekularen
Fingerabdrucks. Es ist zu erwarten, daß die Anwendung von Microarrays zu einer verbesserten
molekularen Diagnostik, zu Fortschritten im pathogenetischen Verständnis von malignen und
benignen Erkrankungen sowie zur Entwicklung neuer Therapieoptionen führen wird. Es ist
darüber hinaus sehr wahrscheinlich, daß mit den Ergebnissen aus Microarray-Experimenten neue, krankheitsspezifische Zielmoleküle für maßgeschneiderte Medikamente sowie
individuelle Gene zum Nachweis minimaler Resterkrankung identifiziert werden. Neuere
Studien weisen auch darauf hin, daß sich Expressionsprofile mit prognostischen Parametern
korrelieren lassen. Auf der Basis von Genexpressionsprofilen könnte die Leukämiediagnostik
in absehbarer Zeit auf einer einzigen Plattform schnell, robust und – bei entsprechender
Anwendung – auch kostengünstiger als bisher erfolgen.
Key Words: Leukämie, Diagnostik, molekulare Marker, Genexpressionsanalyse, Microarrays
Abb. 1: Schematische Darstellung der Microarray-Technologie. Bei den DNA-OligonukleotidMicroarrays (linke Seite) wird pro Experiment eine Probe hybridisiert. Die Detektion erfolgt durch
einen Fluoreszenzfarbstoff und ergibt für jedes Gen einen absoluten Expressionswert. Bei den
gespotteten Microarrays (rechte Seite) wird die Test-RNA mit einer Kontroll-RNA co-hybridisiert.
Beide RNA-Spezies werden mit unterschiedlichen Fluoreszenzfarbstoffen markiert. Nach Detektion des Fluoreszenzsignals ergibt sich ein Verhältnis aus Test- und Kontroll-RNA. Im Schema
ist die Test-RNA überrepräsentiert, was einem überexprimierten Gen entspräche.
6 | 6. Jahrgang | Nr. 6/2005
Kennziffer 13 LW 06 · www.biocom.de
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Die Leukämiediagnostik und -klassifikation
beruhte bisher zum Teil auf relativ subjektiven Kriterien: Bei der klassischen Methode
der Diagnostik – die Zytomorphologie und
die Histologie – müssen sogenannte Blasten
quantifiziert werden. Zur genaueren Klassifikation dann ergänzend die Zytochemie zu
Rate gezogen. Daneben kommen die Multiparameter-Immunphänotypisierung, Zytogenetik, Fluoreszenz-in situ-Hybridisierung und
die Polymerase-Kettenreaktion (PCR) zur
Anwendung. Häufig führt nur eine Kombination der genannten Methoden zur Diagnose
der jeweiligen Sub-Entität und zur Wahl der
spezifischen Therapie1. Mit der MicroarrayTechnologie hat sich in den vergangenen fünf
Jahren zunächst in der Forschung eine neue
Methode etabliert, die eine Verbesserung der
Klassifikation von Leukämien zu ermöglichen scheint und damit in absehbarer Zeit
auch für die Routine-Diagnostik eingesetzt
werden könnte.
Microarray-Plattformen
Zwei verschiedene Methoden können unterschieden werden: DNA-Oligonukleotid-Microarrays und cDNA-gespottete Arrays (Abb.
1). Auf den DNA-Oligonukleotid-Microarrays werden genspezifische Sequenzen an
definierten Positionen auf dem Microarray insitu synthetisiert. Die zu untersuchende Probe
(ca. 5 µg Gesamt-RNA; entspricht ca. 1-8 x 106
Zellen) wird in cDNA umgeschrieben und in
einer nachfolgenden in-vitro-Transkription
amplifiziert. Dabei werden von der T7-RNAPolymerase biotinylierte Ribonukleotide in
die wachsenden cRNA-Stränge inkorporiert.
10 µg fragmentierte und Biotin-markierte
cRNA werden pro Experiment auf dem Microarray hybridisiert. Die Detektion erfolgt
nach Anfärben der DNA-cRNA-Hybride
mit Streptavidin-Phycoerythrin mittels eines
Argon-Ionen-Lasers. So finden sich beispielsweise auf dem aktuellen HG-U133 2.0 plus
Microarray der US-Firma Affymetrix rund
40.000 humane Gene durch jeweils 11 verschiedene Oligonukleotide repräsentiert. Als
interne mismatch-Kontrolle werden ebenfalls
sequenzspezifische Oligonukleotide mit einer
zentralen Punktmutation verwendet. Die
Ergebnisse sind sehr gut reproduzierbar.
Bei der Auswahl der Proben muß auf eine
möglichst homogene Zellzusammensetzung
geachtet werden. Leukämieproben haben
aber meist einen Anteil von mehr als 70% malignen Zellen – speziell nach Ficoll-Gradient
– und bieten deshalb für Genexpressionsanalysen eine gute Grundlage.
Eine umfassende, biomathematisch gestützte Analyse der Ergebnisse, die auf verschiedene Algorithmen zurückgreifen muß,
kann heute nur zum Teil durch bereits mitLABORWELT
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Grundlagen aufzeigte, stehen aktuell zunehmend Detailanalysen im Vordergrund.
Diese ermöglichen nicht nur eine sogenannte
“class prediction“ – also die Voraussage
einer Tumorart, basierend auf spezifischen
Genexpressionsprofilen ausgewählter informativer Gene2-7 –, sondern auch eine “class
discovery“ – das Entdecken neuer Sub-Entitäten in bisher nicht weiter unterscheidbaren
Tumorproben verschiedener Patienten 5.
Dabei werden im Einzelfall bereits in ersten
Arbeiten unterschiedliche Prognosegruppen
identifiziert. Dies wird mittelfristig über den
reinen Diagnostikaspekt hinaus auch therapeutische Konsequenzen haben.
Bisherige Ergebnisse
Abb. 2: Hierarchische Cluster-Analyse. Anordnung der Genexpressionsmuster nach Ähnlichkeiten mittels Software: Die Patienten werden in Spalten, die Gene in Reihen dargestellt. Rot steht
für „stark exprimiert“, grün für „schwach oder nicht exprimiert“.
gelieferte Software-Lösungen gewährleistet
werden. Es empfiehlt sich daher unbedingt,
Unterstützung durch eine versierte Biostatistik oder Bioinformatik zu nutzen, um nicht
trotz gelungener Analysen vor der Datenflut
kapitulieren zu müssen (Abb. 2).
Eine Vielzahl unterschiedlicher Fragestellungen wurde in den vergangenen Jahren mit Hilfe von Microarrays bearbeitet.
Neben neuen Erkenntnissen zu pathophysiologischen und ontogenetischen Zusammenhängen sind insbesondere die Daten
zu malignen Erkrankungen von Interesse.
Nach einer bahnbrechenden Arbeit von
Golub am Beispiel der akuten Leukämien
im Jahre 1999, die eine vielversprechende
Anwendbarkeit der Microarray-Technologie beschrieb und neue biostatistische
Wir konnten zeigen, daß die zytogenetisch
definierten AML-Subtypen AML mit t(8;21),
t(15;17) und inv(16) spezifische Expressionsprofile zeigen. Durch die definierten
Veränderungen des Karyotyps werden
Genexpressionsmuster hervorgerufen, die
mit Microarrays erfaßt werden können. Die
Expression eines Minimalsets von nur 13
Genen war letztlich ausreichend, um den
Karyotyp der jeweiligen AML-Probe vorherzusagen (Abb. 3, 4)8,9.
Wie robust aber schon jetzt die Genexpressionssignaturen sind, zeigen vergleichende
Analysen von Proben, bei denen wir publizierte Gene von kindlichen Leukämien verwendet haben6,7, um gleiche Leukämie-Entitäten bei Erwachsenen zu klassifizieren. Dies
gelang mit einer Genauigkeit von 100%10.
Ebenso ließ sich eine gute Korrelation der
Proteinexpression, gemessen durch die
Multiparameter-Immunphänotypisierung
mit den dazu gehörigen Genexpressionshöhen gleicher kodierender Gene, auf dem
Microarray nachweisen11.
Ebenso untersuchten wir den Einfluß der
Zeit von der Entnahme der Leukämieprobe
bis zur Aufarbeitung des Materials im Labor
und fanden eine extrem hohe Stabilität des
Musters von Genen, durch die die Leukämie
charakterisiert wird12.
In einer Analyse mit insgesamt 937 Patientenproben von 12 verschiedenen, klinisch
relevanten Leukämie-Subgruppen gelang
es uns – auch im Vergleich mit gesundem
Knochenmark – eine Voraussagegenauigkeit des Leukämie-Subtyps von 95,1% zu
erreichen13.
MILE-Studie
Abb. 3: Zweidimensionaler hierarchischer Cluster dreier unterschiedlicher, genetisch definierter
AML-Subgruppen (AML mit t(8;21); bzw. AML mit t(15;17); bzw. AML mit inv(16); jeder einzelne
Patient entspricht einer Spalte anhand informativer, differentiell exprimierter Gene (in Reihen
angeordnet).
8 | 6. Jahrgang | Nr. 6/2005
In einer großen prospektiven Studie (Microarray Innovations in LEukemia, MILEStudie) unter unserer wissenschaftlichen
Leitung und unter Federführung von Roche
Diagnostics wird derzeit prospektiv an 4.000
Proben der Wert von Microarrays für eine
zukünftige Routinediagnostik bei Leukämien untersucht. Die MILE-Studie wird Anfang
LABORWELT
2007 abgeschlossen sein. Gerade Studien, die
parallel die genannten Standardmethoden
der Leukämiediagnostik und Microarrays
am gleichen Material auf KlassifikationsGenauigkeit, Sensitivität und Spezifität
untersuchen, sind dringend notwendig. Dies
muß durch umfassende Software und – angesichts der großen Datenmengen – auch
Hardware unterstützt werden. Obwohl die
Aufarbeitung der Leukämieproben sich im
Rahmen eines standardisierten Arbeitens
eines molekularen Settings bewegt, sind
viele Aspekte der Gen-Auswahl, der bio-
Frage gemessen werden muß, überschaubar
sein. Schon mit weniger als 100 Genen ließ
sich vorhersagen, um welchen Tumor es sich
handelt. Diese Gene müssen mit Hilfe modernster und komplizierter Statistik-Modelle
und viel Software und Hardware aber erst
„erarbeitet“ werden. Neuere Studien weisen
darauf hin, daß sich Expressionsprofile auch
mit prognostischen Parametern korrelieren
lassen.
Auf der Basis von Microarrays und Genexpressionsprofilen könnte jedoch schon in
naher Zukunft die Leukämiediagnostik auf
einer einzigen Plattform schnell, robust und
– bei entsprechender Anwendung – auch
kostengünstiger erfolgen. Vorerst begleitend
zur täglichen Routinediagnostik wird sich
zeigen, ob einige der bisherigen Methoden
dann sukzessive ersetzt werden können.
Literatur
[1]
[2]
[3]
[4]
[5]
statistischen Analyse und der klinischen
Relevanz noch zu prüfen. Dies gilt umso
mehr, wenn es um Aussagen zur Prognose
und zur Therapiesteuerung gehen soll.
Fazit
Microarrays ermöglichen eine umfassende
simultane Expressionsanalyse von Zehntausenden Genen. Die gemessene spezifische
Signatur erlaubt anschließend die Erstellung
eines molekularen Fingerabdrucks. Es ist
zu erwarten, daß die Anwendung von Microarrays zu einer verbesserten molekularen
Diagnostik, zu Fortschritten im pathogenetischen Verständnis von malignen und
benignen Erkrankungen sowie zur Entwicklung neuer Therapieoptionen führen wird.
Es ist darüber hinaus sehr wahrscheinlich,
daß mit den Ergebnissen aus MicroarrayExperimenten neue, krankheits-spezifische
Zielmoleküle für maßgeschneiderte Medikamente identifiziert werden. Dabei wird
die Zahl der Gene, die für eine bestimmte
LABORWELT
[6]
[7]
[8]
[9]
[10]
[11]
[12]
[13]
Kolibri
PowerWaveTM HT
Korrespondenzadresse
Prof. Dr. Dr. Torsten Haferlach
MLL - Münchner Leukämie Labor GmbH
Max-Lebsche-Platz 31
D-81377 München
Tel.: +49-(89)-99017-0
Fax: +49-(89)-99017-111
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Abb. 4: Hauptkomponentenanalyse der gleichen AML-Patienten, basierend auf den unterschiedlichen Genexpressionsintensitäten.
Jede einzelne AML-Patientenprobe wird durch
eine farblich kodierte Kugel in einem dreidimensionalen Raum repräsentiert. Patientenproben mit ähnlichen Genexpressionsprofilen
befinden sich in räumlicher Nähe zueinander
und lassen sich in allen Fällen von den anderen AML-Subgruppen abgrenzen.
Haferlach T, Schoch C. Moderne Verfahren in der Leukämiediagnostik.
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6. Jahrgang | Nr. 2/2005 | 9
W I S S E N S C H A F T

Klinische Relevanz des
Serumproteins Fetuin A – einem
Regulator der Kalzifizierung
Dr. Cora Schäfer1, Prof. Dr. Willi Jahnen-Dechent1 und Dr. Vincent Brandenburg1,2
IZKF BIOMAT, 2Klinik für Nephrologie und klinische Immunologie (Medizinische Klinik II),
Universitätsklinikum der RWTH Aachen
1
Die bedeutendste Form der extraossären Kalzifizierung im Menschen ist die vaskuläre
Kalzifizierung. Sie begleitet komplizierend die intimale Atherosklerose oder tritt primär als
in der Media lokalisierte Kalzifikation im Rahmen der Arteriosklerose auf. Während in der
Vergangenheit die Weichgewebskalzifizierung – einschließlich der vaskulären Kalzifizierung
– als passiver Prozeß angesehen wurde, der durch Überschreiten eines kritischen Kalzium
x Phosphat-Produktes ausgelöst ist, zeigen neuere Veröffentlichungen, daß dieser Prozeß
durch eine Reihe von Regulatoren moduliert wird. Neben Gewebe-gebundenen lokalen
Hemmstoffen der Kalzifizierung gibt es auch systemische Regulatoren in Blut und Extrazellulärflüssigkeit. Neben niedermolekularen Modulatoren ist das Plasmaprotein FetuinA/alpha2-HS-Glykoprotein der Haupt-Hemmstoff im Blut. Fetuin-A kann Kristallwachstum
verhindern, indem es neu entstehende Kalziumphosphat-Partikel bindet und in löslicher
Form hält, bis sie aus der Zirkulation entfernt werden. Untersuchungen an Fetuin-A-defizienten Knock out-Mäusen offenbarten massive Weichgewebskalzifizierungen in einer
Reihe von Hauptorganen wie Niere, Lunge und Herz. Klinische Studien haben gezeigt, daß
Dialysepatienten über die bekannten Störungen im Kalziumphosphat-Haushalt hinaus auch
erniedrigte Fetuin-A-Serumspiegel aufweisen. Somit trägt das Fehlen dieses Hemmstoffs
der Kalzifizierung erheblich zur Erhöhung des Kalzifizierungsrisikos bei.
Key Words: Kalzifizierung, Kalziumphosphat, Plasmaproteine, Mausmodell, Fetuin-A,
Atherosklerose
Kalzium und Phosphat kommen in Form
von Hydroxyapatit als Knochenmineral vor,
sie sind aber auch essentiell für wesentliche
Stoffwechselprozesse im Körper. Dazu zählen zum Beispiel der Energiestoffwechsel
und die Signaltransduktion. Dies setzt voraus, daß jederzeit genügend Kalzium- und
Phosphationen aus dem Knochenreservoir
mobilisierbar und überall im Körper verfügbar sind. Das Blut und alle Extrazellulärflüssigkeiten stellen daher hinsichtlich
der Kalzium- und Phosphat-Löslichkeit
sogenannte „metastabile“ Lösungen dar.
Diese Lösungen präzipitieren zwar nicht
spontan Kalziumphosphat, sie ermöglichen
aber permanentes Kristallwachstum und
damit fortschreitende Präzipitation, sobald
sich Kristallkeime gebildet haben.
Regulatoren der Kalzifizierung
Wie ist es dann zu erklären, daß die Mineralisation nur gezielt in Knochen und Zähnen
stattfindet und nicht in der extrazellulären
Matrix von Weichgeweben?
In mehreren, erst kürzlich erschienen Artikeln wurde dieser Frage nachgegangen. Es
10 | 6. Jahrgang | Nr. 6/2005
wird deutlich, daß hierfür bestimmte Proteine
als Regulatoren notwendig sind. Murshed
und Mitarbeiter konnten zeigen, daß nur die
Extrazellulärmatrix von Zellen mineralisiert,
in denen das knochenspezifische Strukturprotein Kollagen-Typ I und gleichzeitig ein
Pyrophosphat-spaltendes Enzym, die Gewebe-unspezifische alkalische Phosphatase
gebildet werden1. Knochenbildende Zellen
(Osteoblasten) produzieren das Enzym alkalische Phosphatase in sehr großen Mengen und
ermöglichen so die Spaltung des inhibitorisch
auf die Mineralisierung wirkenden Pyrophosphats sowie anderer Phosphat-haltiger Moleküle, so daß Phosphat in genügender Menge
für die Knochenbildung zur Verfügung steht.
Demnach unterliegt der regulierte Prozeß der
Mineralisierung offensichtlich einem Gleichgewicht von aktivierenden und inhibierenden
Mechanismen.
Neben niedermolekularen Faktoren wie
dem genannten Pyrophosphat sind aus
genetischen Studien heute eine Reihe von
Proteinen bekannt, die den Prozeß der Kalzifizierung modulieren. Die überwiegende
Mehrheit ist durch die gezielte Deletion des
jeweils kodierenden Gens in Knock out-Mäu-
sen identifiziert worden. Das Ausschalten
der Pyrophosphatwirkung – einmal durch
Deletion des für die Produktion notwendigen Enzyms Ecto-Nukleotid-Pyrophosphatase-Phosphodiesterase 1 (Enpp1) oder
eines Transporters für Pyrophosphat (Ank)
– bewirkt in Mäusen die Kalzifizierung von
Gelenkknorpel. Ein weiteres Paradebeispiel
dafür, daß Proteine die KalziumphosphatPräzipitation spezifisch und ausschließlich in
den Geweben verhindern können, in denen
sie gebildet werden, ist das Matrix-Gla-Protein (MGP). Dieses weitgehend unlösliche
Protein ist in der Extrazellulärmatrix, in
Arterien und Knorpel lokalisiert. Die MGPKnock out-Maus weist erwartungsgemäß
arterielle und Knorpel-Kalzifizierungen auf,
was letztlich zur Ruptur der Aorta wenige
Wochen nach Geburt der Tiere führt.
Fetuin-A, ein systemischer Inhibitor
der Kalzifizierung
Den bisher beschriebenen, lokal wirkenden
Regulatoren der physiologischen Mineralisierung im Knochen oder der pathologischen Kalzifizierung in Weichgeweben steht
bislang ein einziges, systemisch inhibierend
wirkendes Plasmaprotein gegenüber, das
Fetuin-A/α2-HS-Glykoprotein (genetisches
Symbol: AHSG). Dieses etwa 60 kDa große
Glykoprotein wird in der Leber synthetisiert
und zirkuliert in einer relativ hohen Konzentration von 0,4-1,0 g/L. Es kann in vitro die
Kalziumphosphat-Präzipitation inhibieren,
indem es mit hoher Affinität an einen Kristallisationskeim bindet, dessen Wachstum
verhindert und ein kolloidales Aggregat
bildet2-4. Diesen löslichen hochmolekularen
Komplex haben wir in Analogie zu den
Lipoprotein-Partikeln, die die Zirkulation
von sonst unlöslichen Lipiden ermöglichen,
Calciprotein-Partikel (CPP) genannt. Einer
groben Schätzung zufolge ist Fetuin-A für
rund 50% des inhibitorischen Effekts von Serum gegenüber der spontanen Präzipitation
verantwortlich.
Phänotyp der Fetuin-A-Defizienz
Fetuin-A puffert und stabilisiert einen Überschuß von Kalzium und Phosphat im Blut,
der aus vermehrtem Knochenabbau resultiert
(siehe Abb. 1, S. 12). Die Stabilisierung des
Komplexes ist zwar nur vorübergehend,
aber unter Normalbedingungen ausreichend,
um effizient aus der Zirkulation entfernt zu
werden, so daß es nicht zu KalziumphosphatAblagerungen kommen kann. Mäusen, die
dieses Protein nicht mehr herstellen können,
fehlt dieser wichtige Stabilisations- und
Wegräum (Clearing)-Mechanismus. Dementsprechend zeigen Fetuin-A-Knock out-Mäuse
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W I S S E N S C H A F T
Weichgewebskalzifizierungen in einer Reihe
von Hauptorganen, wie etwa Lunge, Niere
und Herz5 (siehe Abb. 2). Bei älteren Fetuin-Adefizienten Mäusen kommt es aufgrund der
fortschreitenden Kalzifizierung in der Niere
zur Beeinträchtigung der Funktion. Danach
entwickelt sich nach klassischem Muster ein
sekundärer Hyperparathyreoidismus, wie
es auch bei Patienten mit terminaler Niereninsuffizienz zu beobachten ist6.
Nephelometrische Bestimmung
des Fetuin-A-Spiegels im Menschen
Abb. 1: Regulatoren der Kalzifizierung in Arterien und Weichgeweben. Ein zu hohes Kalzium x
Phosphat-Produkt, meist einhergehend mit einem sekundären Hyperparathyreoidismus, gilt als
Hauptrisikofaktor für ektopische Kalkablagerungen. Daneben gibt es eine Reihe von Proteinen,
die lokal auf bestimmte Stimuli hin im Gewebe exprimiert werden und dort die Kalzifizierung
aktivieren. Dieser Prozeß kann insbesondere bei einem relativen Mangel an Inhibitoren beschleunigt ablaufen.
A
B
Nach anfänglichen Messungen der Fetuin-A-Serumspiegel mit einem indirekten
ELISA-Assay verwenden wir jetzt die Methode der Nephelometrie als eine sehr verläßliche und schnelle Technik zur Messung
der Fetuin-A-Konzentration im Blut.
Die Nephelometrie wird mit dem gleichen
polyklonalen Fetuin-A-Kaninchen-Antikörper durchgeführt wie vorausgehende
ELISA-Messungen7. Die Übertragung der
mittels ELISA gewonnenen Konzentrationen
auf die Nephelometrie-Streulichtmessung
erfolgte durch entsprechende Verdünnungsreihen. Der polyklonale Fetuin-A-Kaninchen-Antikörper reagiert nicht mit Fetuin-B,
einem nahe verwandten Protein mit bisher
ungeklärter Funktion 8 . Die Präanalytik
gestaltet sich einfach, da sich Fetuin-A im
Serum auch nach zweitägiger Lagerung bei
Raumtemperatur stabil zeigte. Davon ausgenommen sind Proben von Patienten mit
Septikämie oder Coagulopathien, die eine
erhöhte proteolytische Aktivität im Serum
aufweisen können9.
Die Nephelometriemethode mißt linear
zwischen 0,05 und 2,6 g/L Fetuin-A im
Serum. Die Präzisionswerte sind für die
Intra-Assay-Präzision ein Variationskoeffizient (VK) von 7,75% und für die Präzision
von-Tag-zu-Tag ein VK von 8,5%.
Normwerte
Abb. 2: Makroskopische Ansicht von Herz und Lunge von 10 Monate alten Wildtyp- (A) und FetuinA-Knock out-Mäusen (B). Die Organe wurden nach Präparation mit Alizarinrot angefärbt. Während im Herzen der Knock out-Maus hauptsächlich linienförmige Strukturen positiv gefärbt sind,
waren in den Lungenflügeln eine Vielzahl kleiner rundlicher Kalziumphosphat-Präzipitate nachweisbar. In den Organen der Wildtyp-Maus konnten keine Kalzifizierungen festgestellt werden.
12 | 6. Jahrgang | Nr. 6/2005
In einem großem Kollektiv von fast 1.000
nicht dialysepflichtigen Patienten (80% mit
einer glomerulären Filtrationsrate von >60
ml/min, mittleres Alter 67 Jahre) konnte
ein Normwert für Fetuin-A von 0,4-1,0 g/L
definiert werden (siehe Abb. 3, S. 14).
Fetuin-A-Serumwerte sind geschlechtsabhängig. Frauen haben höhere Werte als
Männer. Darüber hinaus besteht eine Altersabhängigkeit (siehe Abb. 4, S. 14). Generell
treten bei allen getesteten Tierspezies die
höchsten Fetuin-A-Serumkonzentrationen
in der Phase des stärksten Knochenwachstums auf, was vermutlich damit zu tun hat,
daß in dieser Phase besonders viel Kalzium
und Phosphat im Körper mobilisiert werden
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following patents and/or sold under license from Oxford Gene Technology: U.S. Patent Nos. 5,445,934; 5,700,637; 5,744,305;
5,945,334; 6,054,270; 6,140,044; 6,261,776; 6,291,183; 6,346,413; 6,399,365; 6,420,169; 6,551,817; 6,610,482; 6,733,977; and
EP 619 321; 373 203 and other U.S. or foreign patents.
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09.11.2005 18:45:20 Uhr
W I S S E N S C H A F T
Abb. 3: Normalverteilung der Fetuin-A-Serumkonzentration in ca. 1.000 Patienten ohne Dialysepflichtigkeit. Normalwert 0,4 – 1,0 g/L.
und das mögliche Risiko ungewollter Kalzifizierung steigt. Interessanterweise waren
die ersten beobachteten Knock out-Mäuse
mit Kalzifizierung sämtlich ex-schwangere Weibchen10. Über ein ähnlich erhöhtes
Kalzifizierungsrisiko bei schwangeren
Frauen ist nichts bekannt. Allerdings kennt
man das Phänomen der physiologischen
Hyperkalzämie bei Schwangeren und stillenden Frauen. Es wird damit erklärt, daß
die Mütter große Mengen an Kalzium (und
Phosphat) mobilisieren müssen – zunächst
im Blut, dann in der Muttermilch –, um den
Bedarf des mineralisierenden Skeletts im
Baby zu decken. In dieser Situation sind die
Antikalzifizierungs-Strategien des Körpers
vermutlich besonders aktiv, und zwar erfolgreich, sonst gäbe es mehr Berichte über
Kalzifizierungen während der Schwangerschaft oder der Stillzeit.
die Plasmakonzentration herunterreguliert.
Da Dialysepatienten quasi permanent einen
Status der Mikroinflammation und somit
erniedrigte Fetuin-A-Spiegel und zudem
meist ein erhöhtes Niveau an Kalzium x
Phosphat-Produkt aufweisen, kommen in
diesem Kollektiv gleich zwei Risikofaktoren
zum tragen. Um dieses Risikopotential besser abschätzen zu können, haben wir einen
Assay (Nephelometrie) etabliert, um die
Fetuin-A-Serumspiegel zusammen mit dem
Hauptentzündungsparameter C-reaktives
Protein messen zu können.
Hinsichtlich der Vorhersage des Auftretens von Kalzifikationsereignissen sind
bestimmte punktuelle Fetuin-A-Werte nur
eingeschränkt verwertbar. Das liegt zum
einen daran, daß Fetuin-A immer gemeinsam mit anderen Auslösern der Kalzifikation
bewertet werden muß (z.B. dem Grad der
Inflammation, ausgedrückt in CRP-Werten,
oder dem Maß der Kalzium-Phosphat-Haushaltsstörung). Zum anderen ist möglicherweise nicht nur der absolute Fetuin-A-Wert
für das Verhindern der ektopen Kalzifikation
wichtig, sondern auch die Fähigkeit des
Individuums, bei Gefahr der Kalzifizierung
die Fetuin-A-Werte aufrechtzuerhalten.
In diesem Zusammenhang sind kürzlich
erschienene Arbeiten von Stenvinkel und
Mitarbeitern interessant. Sie zeigten, daß
Patienten mit dem 256Thr/Ser Fetuin-A
Allotyp12 unter Inflammation mit dem Fetuin-A-Serumspiegel „zusammenbrechen“.
Wir haben mittlerweile 10 Dialysepatienten mit Kalziphylaxie (akute, schwere,
lebensbedrohliche arterioläre Obstruktionserkrankung mit Kalziumphoshat-Ausfällung vornehmlich im subkutanen Fett) im
zeitlichen Verlauf beobachtet, bei denen die
Fetuin-A-Werte überwiegend im (unteren)
Normbereich lagen. Diese Patienten zeigten
jedoch alle gleichzeitig erhöhte Inflammationsmarker (CRP >20 mg/L). Fetuin-A ist
ein negatives Akutphase-Protein und möglicherweise wird sich (delta) Fetuin-A als
relevanter Prädiktor von Kalzifikationsereignissen erweisen. In einer Querschnittsanalyse bei Nicht-Dialysepatienten korreliert das
Fetuin-A mit dem hochsensitiven CRP im
Normbereich oder leicht erhöhten Bereich
nur schlecht. Erst oberhalb von 20 mg/L CRP
sinken in Kohorten-Querschnittsanalysen
die mittleren Serumwerte von Fetuin-A
deutlich ab. (Abb. 5).
Ausblick
Mäuse mit Fetuin-Defizienz, die auf verschiedenen genetischen Hintergründen
gezüchtet wurden, weisen unterschiedlich
starke Ausprägungen der Weichgewebskalzifizierung auf 6. Dies deutet auf wei-
Klinische Relevanz
des Fetuin-Spiegels
In Dialysepatienten treten vermehrt vaskuläre Kalzifizierungen als weitere Komplikation der beschleunigten urämischen
Atherosklerose auf. Das Ausmaß der Kalzifizierung korreliert mit der Mortalität in
der Dialysepopulation. In einer klinischen
Querschnittsstudie konnten wir zeigen, daß
die Fetuin-A-Plasmakonzentration in Dialysepatienten signifikant niedriger ist als in
Gesunden. Diese erniedrigte Konzentration
korrelierte mit einer erhöhten kardiovaskulären Mortalität7. Moe und Mitarbeiter
konnten zeigen, daß niedrige Fetuin-A-Serumspiegel bei Dialysepatienten auch mit
Koronararterienkalzifikation einhergehen11.
Fetuin-A ist ein Negativ-Akutphase-Protein,
das heißt, im Verlauf einer Entzündung wird
14 | 6. Jahrgang | Nr. 6/2005
Abb. 4: Fetuin-A-Serumkonzentration bei nierengesunden Probanden in Abhängigkeit vom Lebensalter (Minimum, 25% Perzentile, Median, 75% Perzentile, Maximum)
LABORWELT
Abb. 5: Fetuin-A-Serumkonzentration in Korrelation zum C-reaktiven Protein. In einem CRPBereich <10 mg/L besteht keine Korrelation zwischen dem Serumniveau von CRP und Fetuin-A.
LABORWELT
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Stenvinkel, P., Wang, K., Qureshi, A. R., Axelsson, J., Pecoits-Filho, R., Gao,
P., Barany, P., Lindholm, B., Jogestrand, T., Heimburger, O., Holmes, C.,
Schalling, M., and Nordfors, L. Kidney Int 67 (2005), 2383-2392.
Korrespondenzadresse
Dr. Vincent Brandenburg
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Universitätsklinikum Aachen
Pauwelsstraße 30, D-52074 Aachen
Tel.: +49-(0)241-80-80163 / -80157
Fax.: +49 (0)241-80-082 573
eMail: [email protected]
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
tere, genetisch determinierte protektive
Mechanismen und Modulatoren hin. Diese
gilt es in Zukunft zu identifizieren und zu
charakterisieren. Hieraus könnten sich neue
Behandlungsansätze für Risikopatienten,
wie etwa die Population der Dialysepatienten mit einem gestörten Mineralhaushalt,
ergeben.
Fetuin-A-Knock out-Mäuse auf dem
DBA/2 Stamm-Hintergrund entwickeln
ebenso wie Dialysepatienten eine Niereninsuffizienz mit sekundärem Hyperparathyreoidismus. Jedoch unterscheiden sich die
Krankheitsbilder hinsichtlich der Lokalisation
der Kalkablagerungen. Während in den Patienten vordringlich arterielle Kalzifizierungen
auftreten, sind diese in Mäusen den Ablagerungen in Hauptorganen wie Herz, Lunge
und Niere völlig untergeordnet5. Auch dies
deutet auf unterschiedliche Protektionsmechanismen und/oder Risikofaktoren bei den
zwei Spezies hin. Im Menschen gelten zum
Beispiel Rauchen, Diabetes, Bluthochdruck,
hohes LDL-Cholesterin und niedriges HDLCholesterin als bedeutende Risikofaktoren
der vaskulären Kalzifizierung. Diese Risikofaktoren müssen jedoch im Mausmodell erst
provoziert werden. Ein etabliertes Modell,
um Einflußfaktoren der Atherosklerose im
Tier untersuchen zu können, ist die Apolipoprotein E-defiziente Maus. Diese Mäuse entwickeln eine Hyperlipidämie und als Folge
bilden sich cholesterinreiche Ablagerungen
in Arterien, die sogenannten atherosklerotischen Plaques, die sekundär verkalken
können. Welchen Einfluß der systemische
Kalzifizierungsinhibitor Fetuin-A bei diesem
Prozeß spielt, wird momentan in Mäusen mit
doppelter Gendefizienz (Apolipoprotein E x
Fetuin-A) untersucht.
6. Jahrgang | Nr. 2/2005 | 15
B L I T Z L I C H T
Molecular Imaging

Molekulare Bildgebung
von Gehirntumoren
Sensitivität von FLT in der Diagnosestellung
insbesondere niedrigmaligner Gliome dem
MET unterlegen ist (78,3% vs. 91,3%). Allerdings werden bei höhergradigen Gliomen
Tumorareale aufgezeigt, die mit Hilfe von
MRT und MET nicht darstellbar sind (Abb.
1). Mit Reportersystemen (Reportergen,
Dr. Alexandra Winkeler, Dr. Lutz Kracht, Dr. Markus Klein, Parisa Monfared,
Dr. Yannic Waerzeggers und Prof. Dr. Andreas Jacobs,
Max Planck-Institut für neurologische Forschung, Zentrum für Molekulare Medizin (ZMMK)
und Klinik für Neurologie des Klinikums der Universität zu Köln
Key Words: Molecular Imaging, Positronen-Emissions-Tomographie, Gentherapie, Gehirntumore
Die nicht-invasive Lokalisierung und
Quantifizierung spezifischer molekularer
Prozesse, wie etwa die Expression zellulärer
Enzyme und Rezeptoren und die Aktivität
von Membrantransportern, läßt sich mit
Hilfe der Positronen-Emissions-Tomographie (PET) erreichen. Dabei macht man
sich die Enzym-vermittelte Anreicherung,
Transporter-vermittelte Konzentrierung
beziehungsweise Rezeptor-vermittelte
Bindung radioaktiv markierter spezifischer
Substrate oder Bindungspartner zunutze1.
Unter Verwendung von zellulären Markern
wie etwa 11C-Methionin (MET) oder 18F-Fluoro-L-Thymidin (FLT) ist es möglich, die
biologische Aktivität von Gehirntumoren
zu charakterisieren2. Auf der Basis von Berichten, daß FLT ein Maß für die zelluläre
Thymidinkinaseaktivität und damit einen
Surrogatmarker für proliferative Aktivität
von Tumoren darstellt, wurden eine kinetische Analyse sowie ein Vergleich mit dem
bereits etablierten Tracer 11 C-Methionin
durchgeführt. Dabei zeigte sich, daß die
Abb. 1: Parameter, die in der Diagnostik von Gliomen mittels bildgebender Verfahren (MRT/PET)
charakterisiert werden können. Biologisch aktive Tumoranteile eines Glioblastoms zeigen neben
einer Schrankenstörung im MRT einen relativ vermehrten Glukosestoffwechsel ([18F]FDG), eine
erhöhte Aminosäureaufnahme ([11C]MET) und eine Anreicherung von Thymidin als Marker für
DNA-Replikation ([18F]FLT) (aus [8]).
16 | 6. Jahrgang | Nr. 6/2005
Abb. 2: Prinzip der nicht-invasiven Quantifizierung von Genexpression mittels PET.
Die Genexpression der zellulären Thymidinkinase (blau) und Vektor-vermittelter HSV-1-tk
(rot) kann durch Bestimmung der Akkumulationsrate, Ki [ml/min/g], von radioaktiv
markierten Nukleosidanaloga (NUC), wie etwa
[18F]FLT, [124I]FIAU und [18F]FHBG, gemessen
werden. Dabei werden die Nukleosidanaloga
spezifisch durch die jeweilige Thymidinkinase
phosphoryliert, was zu ihrer Akkumulation in
der Zelle führt (aus [9]).
-probe) dagegen lassen sich Aussagen über
Ort, Dauer und Stärke der Genexpression
eines Reporters treffen. In Abhängigkeit
vom Promotor kommt es zur Expression des
Reportergens. Finden Genexpression und
Synthese des Reporters statt, so kommt es
zur Interaktion zwischen dem Reporter und
seinem Substrat und dabei zur Akkumulation der Reporterprobe. Bei dieser Interaktion
kann es sich, wie schon für endogene Prozesse beschrieben, um eine enzymatische
Reaktion zwischen einem Reporterenzym
und seinem Substrat oder um einen Rezeptor
und seinen Liganden handeln. Die Herpes-simplex-Virus-Typ1-Thymidinkinase
(HSV-1-tk) ist eines der am häufigsten genutzten PET-Reportergene. HSV-1-TK ist in
der Lage, verschiedene, radioaktiv markierte
Purin- und Pyrimidinnukleosidanaloga zu
phosphorylieren. Dadurch kommt es in
Zellen, welche HSV-1-TK exprimieren, zur
Akkumulation von spezifisch radioaktiv
markierten Nukleosidanaloga wie etwa
124
I-FIAU oder 18F-FHBG (Abb. 2), wobei
das Ausmaß der Akkumulation mit der
Stärke der Genexpression korreliert3. Mit
Hilfe dieses Reportersystems sind wir
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
Molekulares Imaging beschreibt die nicht-invasive bildliche Darstellung biologischer Prozesse
in vivo mit Hilfe von Magnetresonanz-, Radionuklid- oder optisch basierten bildgebenden
Verfahren. In den vergangenen Jahren kam es zur Entwicklung verschiedener Reportersysteme, mit deren Hilfe die Visualisierung und Analyse dynamischer Prozesse in vivo ermöglicht
wurde. Beispiele sind die endogene und exogene Genexpression, transkriptionelle Regulation und Signaltransduktion. Unser Hauptanwendungsgebiet des molekularen Imaging ist
die Dokumentation des bildgesteuerten Therapieverlaufes bei malignen Gehirntumoren. Im
Mittelpunkt der gegenwärtigen Anstrengungen, um Therapie und Verlauf von Patienten mit
Glioblastom zu verbessern, stehen drei Forschungsschwerpunkte: die Darstellung der biologischen Aktivität des Tumors mit Hilfe der Positronen-Emissions-Tomographie (PET; metabole
Charakterisierung); die Charakterisierung von PET-Markern, welche ein frühes Ansprechen
auf Chemo- und Gentherapie darstellen, sowie die Etablierung neuer biologischer Therapiestrategien (Gentherapie). Wir setzen dabei multimodale Techniken ein, um die hohe räumliche
Auflösung der Magnetresonanztomographie (MRT), die hohe Sensitivität der PET sowie die
Möglichkeit der Verknüpfung mit zellbiologischen Verfahren in der optischen Bildgebung in
optimaler Weise zu kombinieren.
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09.11.2005 18:47:22 Uhr
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Abb. 3: Bildliche Darstellung von HSV-1-Amplikonvektor-vermittelter Genexpression der
viralen Thymidinkinase (HSV-1-tk). Nacktmäusen mit je zwei Gli36ΔEGFR-wt-Tumoren sowie
einem stabil Thymidinkinase-exprimierenden
Tumor (p.c. Gli36ΔEGRF-TG17) wurde der HSVAmplikonvektor HSV-TIG injiziert. Einer der
beiden wt-Tumore wurde so in vivo transduziert,
wohingegen der zweite als Negativkontrolle
(n.c.) fungierte (Mikrofotografie). In der transaxialen bildlichen Darstellung der dazugehörigen
FHBG-PET-Aufnahme zeigt sich eine Akkumulation des Radioaktivsignals zum einen in der
Positivkontrolle, zum anderen um die Injektionsstelle des HSV-Amplikonvektors (aus [6]).
in der Lage, die exogene Genexpression
sowie transkriptionelle Regulation und
Signaltransduktion darzustellen und zu
quantifizieren. Die Expression des Reporters
ist abhängig von der Wahl des jeweiligen
Promotors beziehungsweise EnhancerElements, unter dessen Kontrolle sich das
Reportergen befindet. So kann zum Beispiel
die gewebespezifische Genexpression oder
Regulation untersucht werden. Beispiele dafür sind die nicht-invasive Darstellung des
PET-Markergens HSV-1-tk unter Kontrolle
des Albuminpromotors4 beziehungsweise
die transkriptionelle Regulation durch p535.
In diesem Zusammenhang ist das nicht-invasive Imaging des Transkriptionsfaktors
E2F1, dessen Expression in den meisten
Gliomen dereguliert ist, ein weiteres Forschungsprojekt unserer Arbeitsgruppe.
Gentherapeutische Strategien
und begleitendes Imaging
In experimentellen Gentherapiestudien,
in welchen HSV-1-Amplikonvirione als
Vektoren zum Einschleusen der viralen
Thymidinkinase genutzt wurden, konnten
durch proportionale Koexpression eines therapeutischen Gens indirekte Aussagen zur
Expression des Zweitgens getroffen werden6.
Dazu wurden HSV-1-Amplikonvektoren direkt in subkutane Tumore (Gli36ΔEGFR) von
Nacktmäusen injiziert. Imaging der HSV-1TK erfolgte mittels FHBG-PET, dabei stellt
[18F]FHBG (9-(4-[18F]fluoro-3-hydroxymethylbutyl)guanine) das spezifische Substrat
der viralen Thymidinkinase dar (Abb. 3).
 Fortsetzung S. 21
Abb. 4: Die Regulation von Genexpression
wurde mit verschiedenen Techniken untersucht. In Zellkultur wurden Gliomzellen mit
einem induzierbaren HSV-Amplikonvektor
infiziert, der das fluoreszierende Protein RFP
regulierbar exprimiert. Genexpression von rfp
wurde mittels Fluoreszenzmikroskopie in Anund Abwesenheit des Regulators Doxyzyklin
untersucht. In Gegenwart von Doxyzyklin
konnten RFP-positive Zellen nachgewiesen
werden. In vivo konnte eine regulierbare Genexpression von HSV-1-tk sowie firefly luciferase durch nicht-invasives Imaging mit Hilfe
von [18F]FHBG-PET und optischem Imaging
durch Biolumineszenz von Luciferase dargestellt werden10.
18 | 6. Jahrgang | Nr. 6/2005
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Unter Verwendung dieser HSV-1-Amplikonvektoren, welche therapeutische Gene und
PET-Markergene exprimieren, kann von der
PET-Markergenexpression indirekt auf die
Lokalisation und Stärke der therapeutischen
Genexpression geschlossen werden. Dabei
konnte die Transduktionseffizienz, gemessen mittels FHBG-PET, mit dem induzierten
therapeutischen Effekt, gemessen mittels
FLT-PET, korreliert werden.
Imaging regulierbarer Genexpression
Als weiterer Schritt in der Gentherapie
wurden regulierbare HSV-1-Amplikonvektoren etabliert, die es zulassen, die transduzierte Genexpression von außen mittels
bestimmter Liganden (z.B. Doxyzyklin) zu
steuern7. Dieser Steuerungsmechanismus
wurde sowohl in Zellkultur (Fluoreszenz)
als auch in vivo durch PET-Imaging sowie
optischer Bildgebung (Biolumineszenz)
untersucht. Für das in vivo-Imaging mittels
Biolumineszenz wurde als Reporter das
Luciferasegen von Photinus pyralis (firefly
luciferase) verwendet. Unter Zugabe des
Substrates D-Luciferin kommt es in Zellen,
die das Luciferasegen exprimieren, zur
Emission von Licht, welches mit Hilfe einer
CCD-Kamera detektiert werden kann. Regulation der Genexpression konnte in allen drei
verwendeten Methoden dargestellt werden
(Abb. 4). In Zukunft sollen diese Art von
Vektoren durch geeignete Kombination multimodaler Imagingtechniken noch genauere
Kenntnisse über Ort, Dauer und Höhe der
Genexpression eines therapeutischen Gens
sowie den Verlauf von gentherapeutischen
Studien liefern.
Literatur
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Korrespondenzadresse
Univ.-Prof. Dr. Andreas H. Jacobs
Laboratory for Gene Therapy and
Molecular Imaging
Max Planck Institute for
Neurological Research
Gleuelerstr. 50
D-50931 Köln
Tel.: +49-221-4726-219
Fax: +49-221-4726-298
eMail: [email protected].
mpg.de
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Diagnostische Peptide

Spezifische Darstellung
und Therapie von
Krebserkrankungen
Dr. Sabine Zitzmann, Research Laboratories, Schering AG, Berlin;
Eva-Maria Knapp, Klinische Kooperationseinheit Nuklearmedizin, DKFZ, Heidelberg;
Priv.-Doz. Dr. Walter Mier, Nuklearmedizin, Ruprecht-Karls-Universität, Heidelberg
Als diagnostische Peptide werden kleine Moleküle verwendet, die aus 5 bis 15 Aminosäuren
bestehen. Sie binden an spezifische Rezeptoren, die auf der Oberfläche von Tumorzellen
überexprimiert werden und reichern sich so im Tumor an. Wenn diese diagnostischen Peptide
zum Beispiel radioaktiv markiert werden, kann die Anreicherung durch bildgebende Verfahren
dargestellt und der Tumor und seine Tochtergeschwülste genau lokalisiert werden. Darüber
hinaus erlaubt die zusätzliche Information über die Rezeptordichte eine Einschätzung des
möglichen Erfolges einer Peptid-Radiotherapie. Neben der Weiterentwicklung natürlicher
Peptide ist die Suche nach neuen Tumor-affinen Peptiden ein wichtiger Schritt in die Richtung
der gezielten bildgebenden Tumordarstellung und Tumortherapie.
Key Words: Tumor imaging, diagnostische Peptide, Octreotid, Phagendisplay, PeptidTumortherapie
In der aktuellen Todesursachen-Statistik
rangieren Krebserkrankungen an zweiter
Stelle hinter den Herz-Kreislauferkrankungen. Heute ist jeder vierte Todesfall auf eine
Krebserkrankung zurückzuführen. Längst ist
Krebs nicht mehr nur Krebs, sondern wird
nach Entstehungsort und nach seinen spezifischen Eigenschaften unterschieden, was
Auswirkungen auf die Prognose und Therapie
der Erkrankung hat. Für die Diagnose der
Krebserkrankung stehen verschiedene bildgebende Verfahren zur Auswahl. Die wohl
bekannteste Möglichkeit ist die Computer-Tomographie (CT). Es handelt sich hier um eine
rein anatomische Darstellung von Körperteilen, bei der Röntgenstrahlung auf den Körper
trifft und von den verschiedenen Gewebearten
unterschiedlich stark abgeschwächt wird. Eine
weitere anatomische Bildgebungsmodalität ist
die Magnet-Resonanz-Tomographie (MRT),
auch als Kernspin-Tomographie bekannt. Hier
wird in einem starken Magnetfeld die Resonanz der im Körper befindlichen Wasserstoffatome gemessen. Das Verfahren ergibt ein
sehr genaues und differenziertes Bild aller
Körpergewebe. Vor allem nicht-knöcherne
Strukturen wie Weichteile, Organe, Gelenke,
und das Gehirn können mit hinreichend
guter Auflösung abgebildet werden. Die Positronen-Emissionstomographie (PET) stellt
ein weiteres bildgebendes Verfahren dar, das
sich durch die Möglichkeit der Darstellung
von Stoffwechselabläufen im untersuchten
Körper auszeichnet. Bei der PET werden
Radiopharmaka (auch Tracer genannt) eingesetzt. Radiopharmaka sind Substanzen, die
mit einem Radionuklid markiert sind. Gängige
Radionuklide sind: 18F, 11C, 13N, 15O (es handelt
sich dabei um die Positronen-emittierenden
radioaktiven Isotope der Elemente Fluor,
Kohlenstoff, Stickstoff oder Sauerstoff) oder
auch 62Cu oder 68Ga. Mit diesen radioaktiven
Tab. 1: Auswahl von natürlichen Peptiden, die für das Tumorimaging eingesetzt werden können
Ligand
Somatostatin
alpha-MSH
LHRH
VIP/PACAP
RGD
CCK-B/Gastrin
Neurotensin
Bombesin/GRP
Substanz P
Tumortyp-Selektivität
Neuroendokrine Tumoren, Nonhodkgin-Lymphome, Melanome,
Brusttumoren
Melanome
Prostatatumoren, Brusttumoren
SCLC, Kolontumoren, Magentumoren, Pankreastumoren
Blutgefäße von Tumoren
MTC, SCLC, Pankreastumoren, Astrocytome, stromaler Eierstockkrebs
SCLC, Kolontumoren, exokrine Pankreastumoren
SCLC, Kolontumoren, Glioblastome, Prostatatumoren
Glioblastome, Astrocytome, MTC, Brusttumoren, peritoneale Blutgefäße
6. Jahrgang | Nr. 6/2005 | 21
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Abb. 1: links: Positronen-Emissionstomographische (PET)-Untersuchung eines Patienten mit
fortschreitenden multiplen Lymphknotenmetastasen eines neuroendokrinen PankreaskopfTumors nach Injektion von 68Ga-DOTATOC. rechts: Schematische Darstellung der chemischen
Struktur des 68Ga-DOTATOC. Um das Potential des Targetings für die Therapie zu nutzen, kann
DOTATOC anstelle von 68Ga mit cytotoxischen Radionukliden wie 177Lu oder 90Y für die Endoradiotherapie eingesetzt werden.
Isotopen lassen sich Moleküle herstellen, die
der Organismus nicht von ihren nichtradioaktiven Pendants unterscheiden kann oder
die natürlichen Stoffen chemisch zumindest
ähneln (Abb. 1). Da die Detektoren für die
Radiotracer sehr empfindlich sind, erhält der
Patient nur eine geringe Strahlenbelastung,
welche die Dosiswerte im Vergleich zum CT
in der Regel unterschreitet.
Natürliche tumoraffine Peptide
Eine Weiterentwicklung der tumorspezifischen bildgebenden Darstellung wurde durch
die Erkenntnis möglich, daß sich Tumoren in
Abhängigkeit von ihrem Ursprung aufgrund
spezifischer Peptidrezeptoren vom restlichen
Gewebe unterscheiden. Peptide haben, im
Vergleich zu größeren Molekülen wie etwa
Antikörpern, entscheidende Vorteile. Da Peptide deutlich kleiner sind, gelangen sie schneller
und ohne sterische Behinderungen an ihr Ziel.
Sie werden meist schnell wieder ausgeschieden und erlauben so einen guten Kontrast
zwischen Tumor und umgebenden Gewebe.
Auch verursachen Peptide keine Immunantwort im Körper, wodurch aufwendige Humanisierungsversuche entfallen. Zudem kann die
Herstellung relativ schnell und kostengünstig
durch chemische Synthese erfolgen. Ein
Beispiel für ein natürliches tumorspezifische
Peptid und dessen Rezeptor ist das Vasoaktive
Intestinale Poly-Peptid (VIP). Die Rezeptoren
für VIP werden in neuroendokrinen Tumoren
sowie vielen anderen Tumoren (Adenokarzinome, Lymphome, Astrocytome, Glioblastome und Meningiome) überexprimiert1.
Somatostatin-Rezeptoren (SSTR) stellen eine
weitere Gruppe von Rezeptoren dar, die auf
der Mehrzahl aller neuroendokrinen Tumoren2
und Neuroblastomen, einigen medullären
Schilddrüsenkarzinomen, Prostatatumoren,
Phäochromozytomen und kleinzelligen
Lungentumoren exprimiert werden. Um ein
Peptid für ein Tumorimaging oder die Tumortherapie verwenden zu können, sind folgende
Punkte wichtig: Zunächst muß der Rezeptor,
an den das Peptid bindet, im Tumor in sehr
viel größerer Anzahl vorhanden sein als im
übrigen Körper. Das Peptid sollte stabil sein
und nicht oder nur langsam im Blut abgebaut
werden. Des weiteren ist eine ausreichende
Affinität und die Möglichkeit, das Peptid zu
markieren, ohne daß es seine Bindungseigenschaften verliert, notwendig.
Tumorimaging mit Octreotid
Abb. 2: oben: Elektronenmikroskopische Aufnahme eines filamentösen Phagen, wie er für das
Peptid-Phagendisplay verwendet wird. Daneben eine schematische Darstellung eines Phagen mit
den für die Peptid-Präsentation wichtigen Bestandteilen. unten: Zusammenfassung des in mehreren Zyklen durchlaufenen Selektionsprozesses, bei dem aus einer großen Anzahl verschiedener
Peptid-tragender Phagen, jene mit spezifisch bindenden Peptidmotiven angereichert werden.
22 | 6. Jahrgang | Nr. 6/2005
Somatostatin war eines der ersten Peptide,
welche auf ihr Potential zur Darstellung rezeptorüberexprimierender Tumoren getestet
wurde. Das natürliche Somatostatin wird
im Körper rasch enzymatisch abgebaut. Aus
diesem Grund wurden modifizierte Derivate
des Somatostatins synthetisiert, mit denen in
vivo eine deutlich verlängerte physiologische
Halbwertszeit erreicht werden kann. Das erfolgreichste ist das bereits seit 1982 bekannte
Octreotid (Sandostatin®)3. Hierzu wurde das
14 Aminosäuren lange, zyklische Somatostatin
auf acht Aminosäuren verkürzt und N-terminal mit dem Chelator Diethylentriaminpentaessigsäure (DTPA) zum DTPA-Phe1-Octreotid
konjugiert, um eine effiziente Markierung
mit 111In zu ermöglichen. 111In-DTPA-Phe1Octreotid ist mittlerweile ein registriertes
Radiopharmakon für die Verlaufskontrolle
von Patienten mit neuroendokrinen Tumoren4.
Die Darstellung mit 111In-DTPA-Phe1-Octreotid
ist insbesondere auch bei Patienten mit BrustLABORWELT
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karzinomen und Lymphomen erfolgreich.
Aber die Darstellung von Tumoren mit Hilfe
von Octreotid ist natürlich nur für die Tumore möglich, die den Somatostatin-Rezeptor
exprimieren.
Suche nach tumorspezifischen Peptiden
Um das Spektrum auch auf andere Tumoren
auszuweiten, gibt es Forschungsbemühungen, neue Tumor-spezifische Peptide zu
identifizieren. Ein Ansatz für die Suche nach
weiteren Tumor-affinen Peptiden ist das
Peptid-Phagendisplay.
Das Phagen-Display ist eine leistungsfähige Technologie, um neue Polypeptide für die
Anwendungen in der Biotechnologie und der
Medizin zu identifizieren. Das Prinzip, daß
Peptide auf der Oberfläche von filamentösen
Bakteriophagen präsentiert werden können,
wurde erstmals von Smith in den achtziger
Jahren beschrieben5. In den Phagenbibliotheken kann eine Vielzahl unterschiedlicher
Peptide auf den Phagen exprimiert werden.
Die Population der an die Zielstruktur
bindenden Klone kann mittels rationaler
Selektionstechniken angereichert werden und
so Moleküle mit der gewünschten Spezifität
für die ausgewählte Zielstruktur identifiziert
werden.
Der Prozeß des Phagen-Displays beginnt
mit der Herstellung einer großen Anzahl von
Peptid-tragenden Phagen („Bibliothek“). Der
Umfang einer solchen Phagenbibliothek kann
im Idealfall bis zu 1012 verschiedene Motive
umfassen. Phagen, die spezifisch bindende
Liganden tragen, können durch eine Serie
von Selektionszyklen isoliert werden.
Der Prozeß beginnt mit der Bindung der
Phagen an das Zielmolekül, einem anschließenden Waschschritt, um ungebundene Phagen zu entfernen, und endet mit der Elution
der gebundenen Phagen. Als nächster Schritt
erfolgt die Reamplifikation der spezifisch
gebundenen Phagen in Bakterien. Dieser
Selektionsvorgang kann mehrmals wiederholt werden, bis eine Population der „besten
Binder“ isoliert wird. Von diesen „Bindern“
wird das Genom isoliert und daraus die
Sequenz des affinen Peptides ermittelt. Anschließend kann das Insert als synthetisches
Peptid reproduziert werden. Die Selektion
der Phagen kann sowohl in vitro, also in der
Zellkultur6 oder mit isolierten Proteinen,
als auch in vivo, beispielsweise in Mäusen7,
erfolgen (Abb. 2).
Mittels solcher Selektionsschritte konnte
zum Beispiel ein Peptid isoliert werden,
welches spezifisch an Prostatatumorzellen
bindet8. Neben dieser selektiven Bindung
und Internalisierung zeigt das Peptid auch
eine gute Anreicherung im Tiermodell.
Allerdings wird dieses prostataspezifische
Peptid im Serum des Menschen schnell
abgebaut, weshalb zunächst Anstrengungen unternommen werden müssen, es zu
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stabilisieren, bevor es für einen Einsatz im
klinischen Bereich geeignet ist.
Neben der diagnostischen Darstellung der
Tumoren erlaubt der Einsatz Partikel-emittierender Radioisotope auch eine gezielte
Therapie mit tumorspezifischen Peptiden.
Die erfolgreiche bildliche Darstellung neuroendokriner Tumoren mit Octreotidderivaten
stimulierte die Entwicklung markierter Octreotid-Analoga für therapeutische Anwendungen. Die Erprobung von 90Y-DOTA0D-Phe1-Tyr3-Octreotid (DOTATOC) wird
derzeit in mehreren klinischen Zentren
durchgeführt. In einer Studie wurde zunächst eine darstellende Untersuchung mit
111
In-DTPA-Phe1-Octreotid durchgeführt, um
individuelle dosimetrische Abschätzungen
zu ermöglichen, bevor 90Y-DOTATOC zur
Therapie appliziert wurde. Dadurch konnte
nach rund 12 Monaten bei 27% der Patienten
eine Reduktion des Tumorvolumens und bei
64% ein stabiler Krankheitsverlauf erzielt
werden. Bei 13% der Patienten wurde eine
Progression beobachtet9. Die Berücksichtigung der Tatsache, daß dieses Patientenkollektiv aus bis dahin erfolglos behandelten
Patienten besteht, unterstreicht den enormen
Wert dieses Vorgehens.
der Somatostatin-Peptidderivate zeigt, kann
eine gezielte Anreicherung von Peptiden
im Tumor zu einer guten Darstellung der
Krebserkrankung und in einigen Fällen für
eine verbesserte und zielgerichtete Therapie
sorgen. Durch die Erforschung der schon
vorhandenen Peptide und die Suche nach
neuen tumorspezifischen Peptiden bietet sich
vielleicht bald die Möglichkeit, Krebserkrankungen frühzeitig zu diagnostizieren, den Patienten nichtinvasiv auf Tumoreigenschaften
zu untersuchen und effizientere Therapeutika
anzuwenden.
Literatur
[1]
[2]
[3]
[4]
[5]
[6]
[7]
[8]
[9]
Ausblick
Im Zuge eines immer besseren Verständnisses
der molekularen Mechanismen von Krebs,
werden zunehmend krankheitsrelevante Erkenntnisse in die Klinik und die Patientenbehandlung übertragen. Die Verwendung von
tumorspezifischen Peptiden zur Darstellung
von Tumoren und Metastasen eröffnet ein
neues weites Spektrum von Anwendungen
im klinischen Bereich. Wie sich am Beispiel
Miniadd_100205_90x60_4C
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Korrespondenzadresse
Dr. Sabine Zitzmann
Radiopharmaceuticals Research
Schering AG, Berlin
Tel.: +49-(0)30-468-11427
Fax: +49-(0)30-468-16609
eMail: [email protected]
14.02.2005
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6. Jahrgang | Nr. 6/2005 | 23
W I S S E N S C H A F T
Proteomics

Präparative Aufreinigung von
Organellen mit Immuno-FFE
Markus Islinger1, Heribert Mohr1, Alfred Völkl1, Anatomie und Zellbiologie,
Universität Heidelberg; Gerhard Weber, Christoph Eckerskorn; BD Diagnostics, Martinsried
Die überraschend niedrige Anzahl von Genen
in den Genomen höherer Organismen legt ein
komplexes Regulationswerk auf der Ebene
der Proteinexpression innerhalb einer Zelle
nahe, das eine Gesamtanzahl von mehreren
hunderttausend Proteinspezies erwarten
läßt. In dieser Hinsicht steht die Proteomforschung vor der Aufgabe, nicht nur die
Gesamtheit der in einem Organismus auftretenden Genprodukte zu erfassen, sondern
auch zwischen funktionell unterschiedlichen
Spleißvarianten und posttranlationalen Modifikationen, wie Phosphorylierungen und
Glycosylierungen zu unterscheiden. Die zunehmende Automatisierung der massenspektrometrischen Proteinanalytik erlaubt es zwar
mittlerweile, Proteine in hohem Durchsatz zu
identifizieren und zu quantifizieren, jedoch
erfordert der hohe dynamische Bereich in der
Abundanz unterschiedlicher Proteine meist
eine vorangehende Probenfraktionierung,
um auch gering vertretene, aber potentiell
physiologisch bedeutende Proteine zu erfassen. Diesbezüglich bietet die Isolierung
von Organellen die Möglichkeit, Zellen nicht
nur effektiv zu fraktionieren, sondern auch
identifizierte Proteine einer für das Organell
spezifischen Aufgabe zuzuordnen und so
erste Hinweise auf die Funktion bisher noch
unbekannter Proteine zu gewinnen.
Meist werden Organellen auf klassische
Weise über mehrere differentielle Zentrifugationsschritte und/oder Dichtegradientenzentrifugation gewonnen. Jedoch führen
diese Verfahren häufig zu Materialverlusten
und -veränderungen aufgrund der hohen
mechanischen Belastungen während des
Trennprozesses. Darüber hinaus erlauben sie
keine befriedigende Isolierung von Organellpopulationen mit ähnlicher Dichte. Als kon-
Abb. 1: BD Free Flow
ElectrophoresisSystem
24 | 6. Jahrgang | Nr. 6/2005
Abb. 2: a) Abtrennung eines peroxisomalen
Peaks von der Hauptmasse der Organellen.
Die IFFE wurde mit einer D-Fraktion der Rattenleber nach vorheriger Inkubation mit peroxisomalem Membranantikörper (anti-PMP70)
durchgeführt. b) Negativkontrolle einer ZonenFFE ohne vorherige Antikörperinkubation, Es
treten zwar Anreicherungen auf, jedoch keine
deutlich voneinander getrennten Einzelpeaks.
Die Farben verdeutlichen Fraktionen mit überwiegender Anreicherung folgender Organellen
im Trennprofil: gelb – Mikrosomen, grün –
Mitochondrien, rot – Peroxisomen.
tinuierliches, rein auf flüssigen Trennphasen
basierendes Verfahren stellt die Free-FlowElektrophorese (FFE) in beiderlei Hinsicht
eine Alternative zu herkömmlichen Trennmethoden dar. Sie arbeitet nach dem Prinzip
einer trägerfreien Elektrophorese, bei der
der Trennprozeß in Abwesenheit einer festen
Matrix stattfindet, wie beispielsweise Acrylamid in der Gelelektrophorese. Statt dessen
werden Analyte in einem kontinuierlichen
laminaren Fluß von Pufferlösungen durch ein
dazu senkrecht angelegtes elektrisches Feld
entsprechend ihrer Ladung und Mobilität
aufgetrennt (Abb. 1). In den vergangenen
Jahren konnten in der Tat unterschiedliche
Zellorganellen wie Mitochondrien1, Melanosomen2, sekretorische Vesikel3 oder Endosomen4 über klassische Zonenelektrophorese
gereinigt werden. Aufgrund der teilweise
hohen Ladungsheterogenität von Zellorganellen und ihrer Ähnlichkeit in anderen
physikalischen Eigenschaften bleiben solche
Fraktionen abhängig vom Ausgangsgewebe
jedoch häufig weiterhin mit anderen Organellpopulationen verunreinigt. Antigen-An-
Kennziffer 20 LW 06 · www.biocom.de

Als trägerfreie Separationstechnik unter kontinuierlichem Durchfluß bietet die Free-FlowElektrophorese (FFE) ein breites Applikationsspektrum bei der Trennung von biologischem
Probenmaterial wie Peptiden, Proteinen, Proteinkomplexen bis zu vollständigen, intakten
Zellorganellen. Hierbei spielt vor allem die hohe Modularität des Systems hinsichtlich der
verwendeten Trennprinzipien eine ausschlaggebende Rolle: So bieten sich Zonenelektrophorese, isoelektrische Fokussierung oder Isotachophorese als separierendes Prinzip an. Darüber
hinaus besteht jedoch die Möglichkeit, die hohe Affinität von Antigen-Antikörper-Reaktionen
für die Isolierung von Einzelsubstanzen aus komplexen biologischen Gemischen zu nutzen.
Diesbezüglich stellt die Technik der Immuno-Free-Flow-Elektrophorese eine effektive Methode
dar, intakte Organellen aus Zellhomogenaten zu isolieren, die – wenn überhaupt – sonst nur
durch aufwendige Zentrifugationsverfahren anzureichern sind.
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Abb. 3: a. SDS-PAGE von Peroxisomen nach Isolierung über Immuno-FFE (2) oder Dichtegradientenzentrifugation (3) im Vergleich zur Ausgangsfraktion (1). b. Immunoblotanalyse der durch
Immuno-FFE isolierten Peroxisomen. Zum Nachweis der Peroxisomen wurden polyklonale
Antikörper gegen Acyl-CoA-Oxidase (AOx), Uratoxidase (UOx) und PMP22 verwendet. Mitochondrien wurden mir einem Antiserum gegen ein nicht weiter charakterisiertes mitochondriales
Membranprotein detektiert. Ausgangsfraktion (D-Fraktion, A), Vereinigte Fraktionen 22-25 der
IFFE (B), vereinigte Fraktionen 31-35 der IFFE (C). c- Immunelektronenmikroskopie der IFFE-isolierten Peroxisomen mit Katalaseantikörper. Die einzelnen Organellen sind von einer durchgehenden Membran umgeben und weisen in ihrer Matrix hohe Konzentrationen von Katalase auf.
tikörperinteraktionen bieten die Möglichkeit,
Proteine mit hoher Affinität zu binden und
somit Einzelproteine hochspezifisch aus Proteingemischen über Affinitäts-Chromatographie
zu isolieren. Während sich die herkömmliche
Affinität-Chromatographie aufgrund der
hohen auftretenden Scherkräfte nicht zur
Aufreinigung intakter Organellen eignet,
stellt die Immuno-Free-Flow-Elektrophorese
(IFFE) diesbezüglich durch die in flüssiger
Phase stattfindende Trennung ein schonendes
und effektives Alternativverfahren für die
Isolierung von Organellen dar. Aufgrund ihres
nahezu identischen pIs sind Antikörper im
elektrischen Feld bei einem pH 8,0 weitgehend
unbeweglich, da sie nahezu keine Nettoladung
besitzen, und lassen sich daher als scharf geschnittener homogener Peak nahe der Anode
der FFE-Trennkammer fokussieren. Folglich
bewirkt der Antikörper-pI nach Kopplung
an spezifische Oberflächenmoleküle eines
Organells eine drastische Veränderung des
Masse/Ladungsverhältnisses und somit eine
deutlich verminderte Mobilität im elektrischen
Feld der FFE. Dies führt zu einer Ablenkung
der Antikörper-gekoppelten Organellen aus
der Hauptmasse des Partikelstroms.
Applikation
Zur Etablierung und Validierung dieses
Verfahrens wurden Rattenleber-Peroxisomen aus einem grob vorgereinigten Leberhomogenat (D-Fraktion5) aufgereinigt und
mit der Reinheit von herkömmlich durch
Dichtgradientenzentrifugation isolierten
Peroxisomen verglichen6. Zur Kopplung an
die Peroxisomen wurden D-Fraktion und ein
polyklonaler PMP70-Antikörper (peroxisomal
membrane protein of 70 kDa) für eine Stunde
26 | 6. Jahrgang | Nr. 6/2005
bei Raumtemperatur inkubiert. Durch Zentrifugation wurden die Organellen anschließend
von überschüssigem Antikörper getrennt
und in Puffer für die IFFE resuspendiert. Zur
Auftrennung wurde die Organellsuspension
fortlaufend in die Trennkammer eingebracht,
unter zonenelektrophoretischen Bedingungen
getrennt und kontinuierlich in 96 Fraktionen
auf Mikrotiterplatten gesammelt. Wie in
Abbildung 2a anhand des Absorptionsspektrums bei 280 nm dargestellt, wandern die
mit Antikörper beladenen Peroxisomen durch
die verringerte Ladungsdichte im elektrischen
Feld deutlich verlangsamt und werden dadurch als Seitenpeak deutlich vom Hauptpeak
der Mitochondrien abgetrennt. Ein Vergleich
mit einer ohne vorherige Antikörperbeladung
durchgeführten FFE (Abb. 2b) verdeutlicht
das Potential der Methode. Um die Reinheit
der mittels IFFE isolierten Peroxisomen zu
beurteilen, wurden das bei der SDS-PAGE
erhaltene Proteinmuster mit dem von Peroxisomen verglichen, die mit herkömmlicher
Dichtegradientenzentrifugation isoliert wurden. Wie in Abbildung 3a gezeigt, stimmen
beide Bandenmuster fast vollständig überein,
unterscheiden sich aber signifikant von der für
beide Separationstechniken verwendeten Ausgangsfraktionen. Auch im Immunoblot (Abb.
3b) verdeutlichen die peroxisomalen Markerproteine Acyl-CoA-Oxidase, Uratoxidase und
PMP22 die fast quantitative Aufreinigung der
Peroxisomen im Seitenpeak des Trennprofils.
Dagegen überwiegen in der Ausgangsprobe
(D-Pellet) Mitochondrien (MMP), die überwiegend im Hauptpeak des Trennprofils angereichert werden. Die Intaktheit der isolierten
Organellen demonstrieren die in Abbildung
3c dargestellten elektronenmikroskopischen
Schnitte. Die über IFFE isolierten Peroxisomen
sind von einer kontinuierlichen, gut erhaltenen
Membran umgeben. Die Immunmarkierung
mit Goldpartikeln gegen das peroxisomale
Matrixenzym Katalase zeigt eine intensive
Markierung des Organellinneren, während
nur wenige Partikel außerhalb zu finden sind,
so daß von nur geringen Verlusten während
der Homogenisation und Isolierung der Organellen auszugehen ist.
Wie in dieser Arbeit gezeigt, eignet sich
die Methode der Immuno-Free-Flow-Elektrophorese zur Gewinnung hochreiner Organellfraktionen von hoher Qualität, die folglich
direkt zur nachfolgenden Proteomanalyse
verwendet werden können. Die Beschränkung der Methode ist natürlich durch die
Verfügbarkeit relativ großer Antikörpermengen vorgegeben, die die Verwendung von in
großen Mengen, mit gleichbleibender Qualität produzierbarer monoklonaler Antikörper
voraussetzen.
Die eindeutige Stärke der Methode liegt
jedoch in ihrem Potential, auch physikalisch
sehr ähnliche Zellkompartimente voneinander trennen zu können7,8. Bei Verfügbarkeit
geeigneter Antikörper verspricht die IFFE
besonders im Bereich äußerst heterogener
Organellpopulationen, wie etwa synaptischer
Vesikel oder Mikrosomen, eine Auftrennung
in analysierbare, klar voneinander abzugrenzende Subfraktionen, die einen wertvollen
Beitrag zum Verständnis biologisch komplexer
Zellstrukturen leisten kann.
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mouse liver by immune free-flow electrophoresis.” Electrophoresis 23:
2130-7.
Korrespondenzadressen
Dr. Markus Islinger
Institut für Anatomie und Zellbiologie II
Universität Heidelberg
Im Neuenheimer Feld 307
D-69120 Heidelberg
[email protected]
PD Dr. Christoph Eckerskorn
BD Diagnostics, Preanalytical Systems
Im Innovationszentrum Biotechnologie
D-82152 Martinsried
[email protected]
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B L I T Z L I C H T
HD-Microarrays

Association studies
of complex diseases
Greg Yap, Vice President, DNA Products, Affymetrix Inc., Santa Clara, USA
Starting in the 1990s, a genome sequencing revolution began that propelled research into the
modern genetic era. Inexpensive, reliable, and automated DNA sequencing methods enabled
scientists to sequence the complete genomes of organisms ranging from lower bacteria and
viruses to higher plants, animals and humans. In the aftermath of this flood of information, we
are now faced with the far more daunting task of determining how knowledge of billions of
nucleotide bases can be put to practical use to improve human health and treat disease.
High-density microarray technology, invented
by Stephen P.A. Fodor and colleagues1-3, enables scientists to sift through enormous genome
sequences and identify important biological
information. Microarrays opened up an entire
new world to researchers, and have now given
scientists the ability to analyze gene expression
for the complete coding content of the human
genome in a single experiment. This objective
analysis method has helped scientists to discover the genetic pathways disrupted in diseases
ranging from cancer to multiple sclerosis, and
has enabled them to more accurately stratify
disease, predict patient outcome, and make
better therapeutic choices.
Now, the most recent generation of microarrays empower scientists to quickly genotype
10,000, 100,000 or even 500,000 SNPs distributed across the human genome, enabling
them to conduct previously impossible genetic
association studies of complex disease and
drug response. Similarly, researchers are also
using high-density microarrays for targeted
genotyping studies of more than 10,000 SNPs.
These new tools for disease mapping studies4-8, deliver the most markers and highest
resolutions available, and have already helped
pinpointing genes linked to diseases such
as sudden infant death syndrome6, neonatal
diabetes7, and macular degeneration9.
Manufacturing
The first step in creating a microarray suitable
for genome-wide analysis, required developing a scalable manufacturing technology1.
GeneChip microarrays are a classic Silicon
Valley innovation, combining several disciplines to create a new technology and more
useful research tool. The integration of semi-
conductor fabrication techniques, solid-phase
chemistry, random access combinatorial chemistry, molecular biology, and sophisticated robotics resulted in a unique photolithographic
manufacturing process capable of producing
high-density microarrays with millions of
probes on a single glass chip.
The photolithographic process begins by
coating a 5” x 5” wafer with a light-sensitive
chemical compound (i.e. protecting groups)
that prevents coupling between the glass
and the first nucleotide of the DNA probe
being created. Lithographic masks are used
to either block or transmit light onto specific
locations of the glass surface. The surface is
then covered with a solution containing either
adenine, thymine, cytosine or guanine, and
coupling occurs only at those locations on
the glass that have been deprotected through
illumination. The coupled nucleotide itselve
also bears a light-sensitive protecting group,
so the cycle can be repeated. In this way, the
microarray is built as the probes are synthesized through repeated cycles of combinatorial
chemistry – where combinations of probes are
simultaneously synthesized. Commercially
available arrays are manufactured at a density
of nearly 300 million probes per wafer. But,
depending on the demands of the experiment
and the number of probes required per array,
each wafer can be divided into hundreds of
individual arrays. A sampling of arrays from
every wafer is then used to test the entire lot
by running control hybridizations.
Combinatoric theory holds that the number
of compounds of length N, composed of Y
different subunits, is equal to YN, and one
can synthesize each of YN compounds in Y
times N steps. Applying this theory to the
genome, 25-mer probes are created by using
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6. Jahrgang | Nr. 6/2005 | 27
B L I T Z L I C H T
four nucleotides, A, C, T and G, enabling the
synthesis of roughly 1015 probes in 4 times 25,
or 100 steps. In this way, it’s possible to make
an array of virtually any size – including arrays
that can examine the entire 3.1 billion bases
in the human genome – in 100 steps or less.
By reducing array feature size, more probes
can be packaged onto the same size surface,
increasing the genetic processing power of
each individual array. For instance, the first
commercial GeneChip products shipped in
1994 had a feature size of 100 microns, that by
2005 have been reduced to 5 microns, allowing
400 times more content on each array.
The high data capacity offered by photolithographic manufacturing techniques has
provided scientists with tools to study up to
500,000 SNP genotypes per sample analyzed.
For any given SNP of two possible genotypes,
A or B, probes are synthesized on the array
corresponding to both alleles. Following hybridization of the target to the array, scientists
can then determine whether a SNP is an AA,
AB, or BB genotype by simply analyzing
whether the A allele probes have detected
their complementary sequence, or whether
the B allele probes have detected their complementary sequence, or whether both have
detected complementary sequences.
500K: Probe set strategy
Every SNP genotype represented on a genotyping microarray is measured through a
perfect match probe, as well as a mismatch
probe. The mismatch probe serves as an internal control, accounting for spurious signals
and cross-hybridization. Each probe-pair is
the basic unit used to call a SNP genotype.
However, to ensure highly accurate genotype
calls, GeneChip arrays routinely use multiple
probe pairs to call the genotype for each SNP
represented on the array (Fig. 1).
The first probe pair contains the SNP precisely in the center of the 25mer sequence. The
remaining probe pairs are positioned, or tiled,
to the right and the left of this central position.
This strategy is used to genotype the A and B
allele of every SNP from both sense and antisense strands of DNA. The need for high-density manufacturing technique quickly makes
itself obvious when genotyping large number
of SNPs – more than 10 million probes are used
to genotype the 500,000 SNPs represented on
the Human Mapping 500K Array Set.
500K: Assay
The key to array-based SNP genotyping demanded an assay that would not require allele
specific amplifications. And much the way a
single assay is used to prepare all transcripts
for whole-genome expression analysis, Affymetrix developed a whole genome sampling
assay (WGSA) that uses only one primer to
genotype hundreds of thousands of SNPs
distributed throughout the genome10. Previous
SNP mapping efforts have been hampered by
the need for locus-specific amplification and
the need for many tens of thousands of PCR
amplifications – an expensive and cumbersome undertaking.
The WGSA method uses a simple restriction
enzyme to digest genomic DNA, creating various sizes of DNA fragments, each containing
their respective SNPs. However, only certain
sized fragments are applied to the array, so it’s
critical to design microarray probes against
those SNPs that are present on the DNA fragments. For example, the Mapping 100K set
uses two separate restriction enzyme reactions,
each of which creates a pool of DNA fragments
containing over 50,000 SNPs to be genotyped.
The same strategy is now being used on the
500K to genotype up to 500,000 SNPs – more
SNPs than ever before possible.
Genotyping up to 10,000 custom SNPs
A new generation of genotyping microarrays and assays now enable researchers to
perform large-scale genotyping in their own
labs with their own panels of SNPs. Highdensity genome-wide genotyping of custom
Fig. 1: This microarray probe-set strategy enables scientists to quickly determine whether a genome contains 2 copies of the A allele (AA), two copies of the B allele (BB) or one copy of each (AB).
28 | 6. Jahrgang | Nr. 6/2005
SNPs for focused mapping studies or for
candidate-gene association studies requires a
method to simultaneously amplify thousands
of selected SNPs and an equally scalable way
to determine the genotype of each SNP under
study. Newly developed MegAllele assays and
GeneChip microarrays are now being used to
genotype up to 10,000 targeted SNPs using
only a single assay and a single microarray.
These assays offer researchers the ability
to focus on specific regions of the genome
more quickly and in greater detail than ever
before. Researchers studying candidate genes
or other regions of the genome have typically
genotyped relatively few SNPs per experiment
due to cost and ease-of-use hurdles. The new
array-based assay lets scientists successfully
genotype more of the SNPs they want in a
single, flexible assay.
Assay
Molecular Inversion Probe (MIP) technology
enables scientists to amplify up to 10,000 targeted SNPs in one highly multiplexed experiment that combines 10,000 different PCR reactions in a single tube. When the SNP sequence
is amplified during the PCR, a fluorescent base
is incorporated at the variable SNP position,
and depending on the genotype – either an A,
T, C or G – the DNA will contain either a green,
blue, purple or red fluorescent molecule.
Probe strategy
Researchers then use microarrays to detect each SNP sequence, image the associated fluorescent color and ultimately
determine the final genotype. Every probe
on the microarray surface is designed to
detect a different SNP by hybridizing to
a DNA sequence that acts as a SNP identifier;
each of the 10,000 PCR primers in the initial
MIP assay contains one of 10,000 unique
DNA sequences that serves as a unique tag
for each of the 10,000 single nucleotide polymorphisms.
The scalable targeted genotyping method
uses a four-color high-resolution scanner to
image the fluorescence associated with each
probe – red corresponds to a thymine genotype, green to a adenine genotype, blue to a
guanine genotype, and purple to a cytosine
genotype. If a SNP sequence is imaged as a
pure red square, scientists will know that both
alleles of the SNP contain a “T” nucleotide – a
“T/T” genotype – because only the thymine
nucleotides that were incorporated during
the MIP assay had red fluorescence.Likewise,
if the probe lights up as pure green, scientists
know both alleles are an “A” nucleotide – or a
“A/A” genotype – because green fluorescence
corresponds to adenine. If a probe fluoresces
yellow; however, scientists know that the SNP
contains one red “T” allele and one green “A”
allele that combine to make a yellow “T/A”
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B L I T Z L I C H T
mechanisms of drug response in patients, researchers will have made significant progress
on finding the next generation drug.
Already, leading pharmaceutical, biotech,
and university researchers have embraced
microarray genotyping technology. Researchers in a pharmacogenomic study at the Mayo
Clinic are using the 100K to investigate the
genetic basis for differential responses to
antihypertensive drugs in different patients
and populations. The scientists hope to
identify genes influencing drug response and
ultimately tailor antihypertensive therapy for
individual patients.
The way ahead
Fig. 2: Array manufacturing. Affymetrix production operator loads a wafer into the modular oligosynthesizer, which performs sequential addition of phosphor ammodites to the wafer.
genotype. By examining these combinations of
colors for as many as 10,000 SNPs on a single
array, researchers can determine the exact
genotype for each targeted SNP detected and
imaged on the microarray.
Discovering the genetics
of complex disease
High-density genotyping microarrays enable scientists to conduct whole-genome
association studies today to understand
the genetics of complex disease or drug
response. Scientists like Josephine Hoh at
the Yale University are able to home in on
disease-associated mutations by using 100K
SNP microarrays that provide the genetic
information processing power needed to
identify a key mutation associated with agerelated macular degeneration. Hoh’s recent
study, published in the April 2005 issue of
Science, scanned 100,000 SNPs from just 146
people; previous technologies that looked at
far fewer SNPs would have required Hoh to
study thousands of people to generate results
with the same scientific significance.
Larger association studies can also be designed to help identify the comprehensive
catalog of genes, pathways, and predictive
biomarkers associated with disease. The Serono Institute used the Mapping 100K Set to
identify 80 genes related to multiple sclerosis
(MS). Serono scientists expect to find many
more genes with the Mapping 500K Set, that
they expect will fall into five to ten different
disease pathways.
Often the ideal experiment tests a preexisting hypothesis about particular genes,
pathways, or regions of the genome. Dr. John
Todd of Cambridge University’s Juvenile
Diabetes Research Foundation/Wellcome
Trust Diabetes and Inflammation Laboratory
(DIL) is among the first to use MegAllele pan30 | 6. Jahrgang | Nr. 6/2005
els of 10,000 non-synonymous SNPs - SNPs
that change the sequences of proteins – for
a whole-genome association study to find
genes contributing to type 1 diabetes. Todd’s
research group is comparing the SNP profiles
between 1,000 control samples and 1,000 diabetic samples; he plans to analyze more than
20,000 DNA samples already collected from
diabetes patients and their relatives.
Discovering the genetics
of variable drug response
Studies to identify genes associated with drug
response, efficacy and toxicity may become
one of the most promising applications for
whole-genome DNA analysis. Microarrays
able to genotype more than 500,000 SNPs
distributed across the genome now allow
researchers to readily genotype large populations of responders vs. non-responders to a
given drug for phenotypes including efficacy
and toxicity. With these kinds of genetic studies, scientists hope to elucidate the genes
contributing to variable drug response.
In late-stage clinical trials for example,
microarray genotype analysis could be used to
stratify patient populations to eliminate poor
or toxic responders from key Phase III trials.
Such stratification would help ensure maximum effectiveness through clearer statistical
differentiation between drug and placebo,
while also reducing size and cost of trials and
improving the odds of drug approval. In addition, once a drug is on the market, patient
stratification could be used to accelerate drug
expansion into new indications through faster,
smaller, more definitive Phase IV trials, or to
establish medical superiority of a late-to-market drug relative to entrenched competitors in
an important class of patients. Genome-wide
genotype information will also fuel future
research. By better understanding genetic
Whole-genome genotyping microarrays provide scientists with a way of examining the
underlying genetics of responders and nonresponders without any of the assumptions or
limitations used in a candidate-gene approach.
For most drugs with variable responses, little is known about why they work in some
patients and why not in others. Genotyping
microarrays enable scientists to explore the
whole genome and identify predictive markers of disease and drug-response, that may
ultimately provide more tailored, effective
and safer courses of treatment and help avoid
the more than 100,000 annual fatalities from
adverse drug reactions in the US alone11.
References
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Contact
Greg Yap, Affymetrix Inc.
Vice President DNA Products
3380 Central Expressway
Santa Clara, CA 95051
Tel: +1-408-731-5000
Fax: +1-408-731-5380
www.affymetrix.com
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Forschungsförderung
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
EUCOMM: The European
Conditional Mouse
Mutagenesis Program
Dr. Thomas Floss, Dr. Cornelia Kaloff und Prof. Dr. Wolfgang Wurst
Institut für Entwicklungsgenetik, GSF-Forschungszentrum für Umwelt und Gesundheit,
Neuherberg
Eine der größten aktuellen Herausforderungen für die Biowissenschaften ist es, die Funktion
unserer Gene in Krankheit und Gesundheit aufzuklären. Die Mutation von Genen ist hierbei
ein wichtiges Hilfsmittel, denn sie führt zu Funktionsverlusten im Organismus; hierdurch
läßt sich erkennen, welche Aufgabe die Gene normalerweise erfüllen. Mäuse sind für die
Aufklärung von Genfunktionen ideale Modellorganismen, da sich das Erbgut von Mensch und
Maus zu etwa 99% gleicht und die grundlegende Physiologie beider Organismen sehr ähnlich
ist. Wissenschaftler gehen daher davon aus, durch die Mutation von Mausgenen und die Erzeugung von Mausmodellen einen besseren Einblick in die Entstehung genetisch bedingter
Volkskrankheiten erhalten zu können.
Die Europäische Union hat nun mit EUCOMM (European Conditional Mouse
Mutagenesis Program)1 ein ambitioniertes
europäisches Programm ins Leben gerufen,
in dessen Rahmen bis zu 20.000 Mausgene
durch Mutationen inaktiviert werden sollen
– dies entspricht etwa 70% des gesamten
Mausgenoms. Dieses ehrgeizige Ziel kann
nur durch die intensive internationale Zusammenarbeit hochrangiger Forschungsteams
erreicht werden. Das GSF-Forschungszentrum für Umwelt und Gesundheit in München/Neuherberg und das Sanger Institute
in Hinxton, Cambridge, Großbritannien,
spielen hierbei eine führende Rolle. Prof. Dr.
Wolfgang Wurst, Direktor des GSF-Instituts
für Entwicklungsgenetik, ist Koordinator von
EUCOMM, für das die EU in ihrem sechsten
Forschungsrahmenprogramm insgesamt 13
Millionen Euro zur Verfügung stellt.
Der im Rahmen von EUCOMM geplante
genomweite Mutageneseansatz ist notwendig, weil derzeit, laut OMIM-Datenbank
(www.ncbi.nlm.nih.gov), nur rund 2.000 Genorte mit menschlichen Krankheiten in Verbindung gebracht werden können. Bei etwa 3.500
Krankheiten sind die genetischen Grundlagen
immer noch unbekannt. Die in Mausmodellen
von der Wissenschaftsgemeinschaft insgesamt bisher vorgenommenen Inaktivierungen
(Knock-outs) von Genen belaufen sich zudem
auf lediglich 10% der bekannten Mausgene
(Stand 2004; Abb. 1). Zudem handelt es sich
bei nur etwa 100 aller Knock-outs um konditionale Inaktivierungen.
Das anstehende EUCOMM-Projekt ist die
derzeit weltweit größte Plattform zur Mutagenese des Mausgenoms. Das erklärte mittelfristige Ziel von EUCOMM ist es, der Wissenschaftsgemeinschaft für nahezu jedes Gen
eine konditionale Mutation in embryonalen
Stammzellen (ES-Zellen) der Maus zur Verfügung zu stellen. Vor allem ist es das Potential
der embryonalen Stammzelltechnologie mit
allen heute denkbaren Möglichkeiten zur
genetischen Manipulation und Hochdurchsatzanalyse, welches den Ausschlag gegeben
hat, EUCOMM zu diesem Zeitpunkt in Angriff zu nehmen. Embryonale Stammzellen
lassen sich zudem einfrieren und können so
einfach weltweit transportiert werden. Die
Effektivität dieses Ansatzes wurde in der
Abb. 1: Aus der Beschreibung genetisch bedingter Krankheiten kennen wir die Funktionen von lediglich etwa 2.000 humanen Genen (rechts). Auch
nach 15 Jahren Knock out-Technologie sind nur etwa 10% aller Mausgene mindestens einmal mutiert worden. Nur etwa 100 dieser 2.669 Mutanten
tragen konditionale Mutationen, die auch das Studium der Genfunktion zu bestimmten Zeitpunkten (links) oder in bestimmten Geweben erlauben.
Kennziffer 22 LW 06 · Informationen ordern? · www.biocom.de
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LABORWELT
6. Jahrgang | Nr. 6/2005 | 31
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Abb. 2: A. Das FLEX-System bietet die Möglichkeit zur konditionalen Mutagenese. Zwei mutagene Kassetten werden von einer Kombination von mutierten und Wildtyp-Rekombinase-Erkennungs-Sites flankiert. Die FLPe-Rekombinase wird jeweils nur zwischen den homologen Erkennungsstellen rekombinieren (hier: grün und grün oder gelb und gelb). Weil aber die Orientierung
der Sites gegenläufig ist, wird die Rekombinase die Kassette jeweils nur zwischen grün oder
gelb umdrehen. Dies sind jeweils transiente, reversible Zustände (hier gezeigt für Rekombination zwischen den gelben Sites). Dabei kommt jedoch immer eine gelbe bzw. eine grüne Site auf
die andere Seite der Kassette und ist nunmehr mit der jeweils anderen kompatiblen Site gleich
orientiert. In diesem Fall wird die Rekombinase zwischen diesen beiden Stellen rekombinieren
und dabei die nicht-kompatible Site dazwischen ausschneiden (step 1). Das Ergebnis ist in jedem
Fall das gleiche: die mutagene Kassette ist irreversibel in eine nicht-mutagene Richtung gedreht
und nunmehr von zwei inkompatiblen FLPe-Stellen flankiert. Nutzt man zwei unterschiedliche
Rekombinasen (hier Cre-Rekombinase und rote bzw. pinkfarbene loxP-Sites), so kann man auf
diese Weise Kassetten lediglich in bestimmten Geweben oder aber zu unterschiedlichen Zeitpunkten der Entwicklung mutagen wirken lassen beziehungsweise frühe Letalität umgehen.
B: Beim Targeted Trapping werden promotorlose konditionale Genfallenvektoren mit Hilfe der
homologen Rekombination in das erste Intron von Genen gebracht, welche in ES-Zellen zwar exprimiert, aber aus unterschiedlichen Gründen bislang nicht getrappt wurden. Dort funktionieren
sie genau wie konventionelle Genfallenkassetten. Diese promotorlosen Konstrukte haben eine
ungewöhnlich hohe Rekombinationsrate.
C: Beim Gene Targeting werden Selektionskassetten mit eigenen Promotoren benutzt, welche
nach der Drehung durch FLPe eliminiert werden können, weil sie zwischen zwei frt-sites lokalisiert sind. Auch dieser Ansatz wird eine Insertions-Mutagenese sein. Durch Einbringen einer
zweiten loxP-site in den Lokus können jedoch auch Cre-vermittelte Deletionen induziert werden.
Vergangenheit insbesondere von den Mitgliedern des International Gene Trap Consortium
(IGTC; www.igtc.org; Abb. 3) demonstriert.
Zusammengenommen wurden beim IGTC
mehr als 2.000 mutierte Maus-ES-Zellen von
der Wissenschaftsgemeinschaft angefordert,
um an allen Orten der Welt Mausmutanten zu
produzieren. Die Mitglieder des IGTC haben
sich auch bei der Akquisition von Fördermitteln gegenseitig inspiriert. Die europäischen
Partner des IGTC, namentlich das German
Gene Trap Consortium (Wolfgang Wurst)
und das Sanger Institute (Allan Bradley),
sind maßgeblich an der Realisation und Koordination von EUCOMM beteiligt, während
die nordamerikanischen Partner in Manitoba
(Geoff Hicks) und Toronto (Janet Rossant)
ein komplementäres Verbundprojekt (NorCOMM) auf der anderen Seite des Atlantik
anführen werden.
Das EUCOMM-Konsortium ist ein Zusammenschluß von 11 hochrangigen Institutionen aus vier europäischen Ländern.
Die EUCOMM-Partner werden konditionale
Mutationen in insgesamt bis zu 20.000 Mausgenen mithilfe von ‚gene trapping‘, ‚targeted
trapping‘ und ‚gene targeting‘-Ansätzen
generieren (siehe Abb. 2a-2c). Zudem werden bis zu 300 konditionale Mausmutanten
etabliert und archiviert werden.
Insbesondere zwei neue Technologien, die
FLEX-Technologie (Schnütgen et al, 2005; s.
Abb. 2a) und die ‚targeted trapping‘-Technologie (Friedel et al., 2005; s. Abb. 2b), werden
innerhalb des EUCOMM-Projektes in großem
Maßstab eingesetzt werden. Die targeted
trapping-Technologie ist, kurz gesagt, gene
trapping mit Hilfe der homologen Rekombination. Dabei können von Splice-AkzeptorGenfallenvektoren auch diejenigen Gene
angesteuert werden, die zwar in embryonalen
Stammzellen exprimiert werden, aber bislang
nicht durch gene trapping mutiert werden
konnten – entweder weil sie zu klein sind
oder weil ihr Expressionsniveau zu niedrig
ist. Da dieser targeted trapping-Ansatz aber
nur für in ES-Zellen exprimierte Gene effizient eingesetzt werden kann, müssen die nicht
exprimierten Gene durch gene targeting mu-
Abb. 3: Das Internationale Gene Trap Consortium (IGTC; www.igtc.org) ist ein Zusammenschluß der weltweit größten Gene
Trapping-Zentren, wobei das German Gene
Trap Consortium (GGTC; www.genetrap.de)
hinsichtlich der Anzahl der eingebrachten
Klone der größte Partner ist. Weitere Partner
sind das Sanger Institute, Großbritannien;
BayGenomics, USA; Fred Hutchinson, USA; Yamamoto, Japan; Mount Sinai, Toronto; ESCDB,
Manitoba; TIGEM, Italien.
32 | 6. Jahrgang | Nr. 6/2005
LABORWELT
tiert werden. Eine der entscheidenden Fragen
bei der Planung von EUCOMM war: Wann
sollte man vom gene trapping zum targeted
trapping beziehungsweise zum gene targeting wechseln? Dabei gab die Publikation
von Skarnes et al. (2004) wichtige Hinweise:
offensichtlich ist ‘gene trapping’ zur Mutation
von mehr als 60% des Genoms verwendbar.
Jedoch wird diese Technologie aufgrund des
unvermeidlichen Saturationseffektes, der
nach etwa 30% der Genommutation eintritt,
dann unwirtschaftlich, wenn pro 100 mutierten Klonen nur noch fünf oder weniger neue
Gene „gefangen“ werden (Abb. 4).
Unter Einsatz dieser Technologien wird das
EUCOMM-Konsortium die bislang weltweit
größte Ressource mutierter embryonaler
Stammzellen der Maus erzeugen und sie
der Wissenschaftsgemeinschaft frei zur Verfügung stellen.
8.
9.
10.
11.
Literatur
[1]
[2]
[3]
Das EUCOMM-Konsortium
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
GSF-Forschungszentrum für Umwelt und Gesundheit, München Neuherberg,
Deutschland Prof Dr. Wolfgang Wurst (Koordinator)
Prof. Dr. Martin Hrabé de Angelis
Wellcome Trust Sanger Institute, Hinxton, Großbritannien Prof. Dr. Allan
Bradley (Ko-Koordinator) Dr. William Skarnes Dr. Pentao Liu Dr. Tony Cox
Klinikum der Johann Wolfgang Goethe-Universität Frankfurt/MainProf. Dr.
Harald von Melchner
Charité Universitätsmedizin Berlin, Deutschland, Prof. Dr. Patricia Ruiz
Technische Universität Dresden, Deutschland, Prof. Dr. Francis Stewart
Gene Bridges GmbH, Heidelberg, Deutschland, Dr. Gary Stevens
Institut Clinique de la Souris, Strasbourg, Frankreich, Prof. Dr. Pierre Chambon, Prof. Dr. Johan Auwerx
European Molecular Biology Laboratory (EMBL), Monterotondo/Rom, Italien
Prof. Dr. Nadia Rosenthal
Medical Research Council, Mammalian Genetics Unit, Harwell, UK, Prof. Dr.
Steve Brown
Consiglio Nazionale Delle Ricerche, Istituto di Biologia Cellulare, Monterotondo/Rom, Italien, Prof. Dr. Glauco Tocchini-Valentini
Deutsches Ressourcenzentrum für Genomforschung GmbH (RZPD), Berlin/
Heidelberg, Deutschland, Dr. Bernhard Korn
[4]
Auwerx, J., Avner, P., Baldock, R., Ballabio, A., Balling, R., Barbacid, M.,
Berns, A., Bradley, A., Brown, S., Carmeliet, P., Chambon, P., Cox, R.,
Davidson, D., Davies, K., Duboule, D., Forejt, J., Granucci, F., Hastie, N., de
Angelis, M.H., Jackson, I., Kioussis, D., Kollias, G., Lathrop, M., Lendahl,
U., Malumbres, M., von Melchner, H., Müller, W., Partanen, J., RicciardiCastagnoli, P., Rigby, P., Rosen, B., Rosenthal, N., Skarnes, B., Stewart,
A.F., Thornton, J., Tocchini-Valentini, G., Wagner, E., Wahli, W., and Wurst,
W. (2004). The European dimension for the mouse genome mutagenesis
program. Nat. Genet. 36, 925-927.
Friedel, R.H., Plump, A., Lu, X., Spilker, K., Jolicoeur, C., Wong, K., Venkatesh,
T.R., Yaron, A., Hynes, M., Chen, B., Okada, A., McConnell, S.K., Rayburn, H.,
and Tessier-Lavigne, M. (2005). Gene targeting using a promoterless gene
trap vector (“targeted trapping”) is an efficient method to mutate a large
fraction of genes. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102,13188-13193.
Skarnes, W.C., von Melchner, H., Wurst, W., Hicks, G., Nord, A.S., Cox,
T., Young, S.G., Ruiz, P., Soriano, P., Tessier-Lavigne, M., Conklin, B.R.,
Stanford, W.L., and Rossant, J.; International Gene Trap Consortium (2004).
A public gene trap resource for mouse functional genomics. Nat. Genet.
36, 543-544.
Schnütgen, F., De-Zolt, S., Van Sloun, P., Hollatz, M., Floss, T., Hansen,
J., Altschmied, J., Seisenberger, C., Ghyselinck, N.B., Ruiz, P., Chambon,
P., Wurst, W., and von Melchner, H, (2005). Genomewide production of
multipurpose alleles for the functional analysis of the mouse genome.
Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102, 7221-7226.
Kontakt
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Dr. Cornelia Kaloff
Project Manager EUCOMM
eMail: [email protected]
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Abb. 4: Die Antwort auf die Frage, wann das Gene Trapping sich nicht mehr lohnt und auf das
Targeted Trapping sowie das Gene Targeting gewechselt werden sollte, ergibt sich aus der steigenden Saturation des Genoms mit Gene Trap-Mutationen: Nachdem etwa 25-30% der Gene in
ES-Zellen mutiert wurden, wird der Aufwand, neue Gene zu mutieren, höher als der Aufwand
beim Targeted Trapping. Mit dem Targeted Trapping wiederum können nur Gene mutiert werden,
die in ES Zellen exprimiert werden (ca.75-80%). Daher müssen die in ES-Zellen „stillen“ Gene per
Gene Targeting mutiert werden.
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6. Jahrgang | Nr. 2/2005 | 33
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Lebensmittel-Diagnostik
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Microarray-Diagnostik
von Allergenen
Dipl.-Biol. Dennie Andresen, Dr. Eva Ehrentreich-Förster, FhG IBMT, Nuthetal
Dipl.-Oecotroph. Eva-Maria Fiedler, Prof. Dr. Margitta Worm, Charité - Universitätsmedizin Berlin, Klinik für Dermatologie, Venerologie und Allergologie, Berlin
Dr. Matthias Kuhn, CONGEN Biotechnologie GmbH, Berlin
Ende November tritt eine verschärfte, europaweit gültige Kennzeichnungspflicht für Lebensmittel in Kraft, nach der sämtliche Inhaltsstoffe deklariert werden müssen. Um den
schnellen Nachweis einer großen Probenzahl zu ermöglichen und gleichzeitig preiswert
zu gestalten, wurden Möglichkeiten untersucht, die Detektion von Allergenen mit Hilfe von
Biochips zu ermöglichen.
Key Words: Nahrungsmittelallergie, Biochips, Real-time-PCR
Allergien beherrschen in zunehmendem
Maße unseren Alltag. Der Begriff selbst wurde erstmals 1906 von dem Wiener Kinderarzt Clemens von Pirquet geprägt. Seitdem
wächst die Zahl der Allergiker stetig. Nach
Angaben des Robert-Koch-Instituts in Berlin
haben 20% bis 30% der Bevölkerung schon
mindestens einmal in ihrem Leben eine allergische Krankheit durchlebt.
Als häufigste Auslöser von allergischen
Reaktionen werden heute vor allem Stoffe
aus dem „Umweltbereich“ und in Lebensmitteln diagnostiziert. Dabei können nahezu
alle Lebensmittel eine Allergie auslösen.
Verantwortlich hierfür sind Proteine und
Glykoproteine (Allergene), die von Natur
aus in einem Großteil der Lebensmittel
vorkommen und im Normalfall für den
Gesunden unschädlich sind.
Nahrungsmittelallergien –
Häufigkeiten, Symptome, Diagnostik
Nahrungsmittel-Unverträglichkeiten sind
in der Bevölkerung weit verbreitet. In der
Diagnostik und Therapie sind die Immunglobulin E (IgE)-vermittelten gegenüber den
nicht-IgE-vermittelten Unverträglichkeiten
zu unterscheiden. Der Begriff Allergie steht
für eine immunologisch vermittelte Unver-
Abb. 1: Häufigkeit von Nahrungsmitteln, die bei einer repräsentativen Gruppe von Erwachsenen
(Alter 18-79 Jahre) in der doppelblinden plazebo-kontrollierten Nahrungsmittelprovokation
(DBPCFC) positive Reaktionen hervorrufen [modifiziert nach 1].
34 | 6. Jahrgang | Nr. 6/2005
träglichkeit. Kinder unter drei Jahren sind
mit rund 6% die am häufigsten betroffene
Altersgruppe. Im Vergleich dazu sind etwa
3% der Erwachsenen von einer Nahrungsmittelallergie betroffen. Im Kindesalter sind
Kuhmilch und Hühnerei die Hauptallergene. Die allergische Reaktion verschwindet
allerdings bis zum Alter von fünf Jahren
bei etwa 85% der Kinder durch Toleranzentwicklung1-3.
Dementsprechend nimmt die Häufigkeit
von Allergien gegenüber Grundnahrungsmitteln mit steigendem Lebensalter ab.
Jugendliche und Erwachsene leiden in erster
Linie unter einer Allergie gegenüber Inhalationsallergenen, wie Hausstaubmilben,
Tierhaaren und den verschiedenen Pollenarten (Baum-, Gräser-, Beifußpollen). Bei der
klassischen Nahrungsmittelallergie kommt
es üblicherweise durch die orale Aufnahme
zu einer Sensibilisierung und dann – nach
erneuter Aufnahme – zu einer allergischen
Reaktion, zum Beispiel der Haut, der Mundschleimhaut oder dem Gastrointestinaltrakt.
Vor allem bei Erwachsenen ist ein anderer
Mechanismus häufiger. Hier kommt es
initial zu einer inhalativen Sensibilisierung
durch Pollenallergene. Aufgrund einer
Strukturähnlichkeit der Proteine (Allergene) kann es später zu einer Kreuzreaktion
der allergieauslösenden Antikörper gegen
Pollen und bestimmte Nahrungsmittel
kommen. Diese Allergieform wird pollenassoziierte Nahrungsmittelallergie genannt.
Zu den klassischen Kreuzallergenen bei
Birkenpollenallergie zählen die Haselnuß,
Stein- und Kernobst (zum Beispiel Apfel,
Pfirsich, Kirschen) und Gemüse wie Karotten und Sellerie. In eigenen Untersuchungen
zur Häufigkeit der Nahrungsmittelallergie
in Deutschland wurde gezeigt, daß Nüsse,
Stein- und Kernobst die häufigsten Auslöser
von allergischen Reaktionen bei Erwachsenen sind (vergl. Abb.1)1.
Die klinischen Reaktionen einer Nahrungsmittelallergie können unterschiedlich
schwer verlaufen, von sehr milden und
lokalen Reaktionen der Mundschleimhaut
(orales Allergie-Syndrom) über generalisierte Hautreaktionen (zum Beispiel Urtikaria)
bis zum anaphylaktischen Schock2,3.
Zur Diagnostik einer Nahrungsmittelallergie gehört neben den in vivo- (Hauttest) und
in vitro-Tests (IgE-Antikörperbestimmung)
auch die Eliminationsdiät mit anschließender doppelblinder Plazebo-kontrollierter
Nahrungsmittelprovokation (DBPCFC) zur
Überprüfung der klinischen Relevanz1,4. Die
Therapie der Wahl bei einer nachgewiesenen Nahrungsmittelallergie ist das strenge
Meiden der allergenen Nahrungsmittel. Ein
großes Problem für den Allergiker stellt die
derzeit noch gültige unzureichende Kennzeichnungspflicht dar. Viele allergische
Reaktionen werden unerwartet durch den
Verzehr von verarbeiteten NahrungsmitLABORWELT
Kennziffer 23 LW 06 · Informationen ordern? · www.biocom.de
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B L I T Z L I C H T
teln ausgelöst, die nur unvollständige Zutatenlisten aufweisen. In
jüngerer Zeit sichern sich viele Hersteller durch Warnhinweise wie
„Kann Spuren von Nüssen enthalten…“ ab. Dies verunsichert den
betroffenen Allergiker allerdings eher und stellt keine echte Hilfestellung für ihn dar.
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EU-Kennzeichnungspflicht
Die Richtlinie 2003/89/EG der Europäischen Union (EU) fordert,
bis spätestens 25. November 2005 sämtliche Zutaten, die in Europa
zu den häufigsten Auslösern von Lebensmittelallergien gehören,
sowie Erzeugnisse daraus, immer zu kennzeichnen. Dies gilt auch
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KURSBUCH BIOPOLITIK Vol. 2
mit Beiträgen von:
Klaus Arntz
Alfred Bach
Rudi Balling
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Harald Wilkoszewski
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Holger Zinke
Abb. 2: Sellerie-Nachweis mittels Real-time-PCR. Der Kurvenanstieg
zeigt deutlich das Vorhandensein von Sellerie an. Je früher die Kurven
ansteigen, desto mehr Sellerie ist in der Probe enthalten. So lassen
sich auch quantitative Aussagen ableiten.
für Zutaten, die nur während der Herstellung – etwa als Hilfsstoff
– mit dem Produkt in Berührung kommen. Gekennzeichnet werden
müssen glutenhaltige Getreide wie Weizen, Gerste, Roggen und
Hafer sowie Fisch, Krustentiere (Crustaceen), Eier, Erdnüsse, Soja,
Milch (einschließlich Laktose), Schalenfrüchte (Nüsse), Sellerie, Senf,
Sesamsamen, Schwefeldioxid und Sulfite5. Die beiden letztgenannten
zählen zu den Zusatzstoffen und stellen keine Nahrungsmittelallergene dar.
Zur Qualitätssicherung in der Lebensmittelproduktion und zur
Überwachung der Deklarationspflicht werden leistungsfähige,
sichere und robuste Nachweisverfahren benötigt.
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Der Nachweis von Allergenen ist heute auf die unterschiedlichste
Art und Weise möglich: So gibt es immunologische Proteintestkits
(ELISA), DNA-Test oder chemisch/enzymatische Tests. ELISATests werden momentan vor allem für die Bestimmung von Gluten
beziehungsweise Gliadin, von Ei- und Milchproteinen eingesetzt,
aber auch für den Nachweis von Hasel- und Erdnüssen. DNA-Tests
kommen dagegen vor allem beim Nachweis von Sellerie, Senf, Fisch,
Crustaceen, Soja, Pistazien, Wall- und Pekannüssen zum Einsatz.
Als enzymatische Tests sind der Sulfittest, zum Beispiel für Knoblauch, oder der Laktosetest für Backwaren oder Babynahrung
ausgelegt.
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6. Jahrgang | Nr. 6/2005 | 35
B L I T Z L I C H T
Wegen der Bedeutung des Nachweises von
Lebensmittelallergenen wird im Rahmen
eines Kooperationsprojektes (AllergenChip)
ein System auf der Basis eines DNA-Chips
zum parallelen Nachweis der wichtigsten
Lebensmittelallergene entwickelt.
Entwicklung eines
Biochip-Testsystems
Im Zuge der Assayoptimierung liegt ein entscheidender Fokus auf dem Einsparen von
Zeit und Kosten. Eine Möglichkeit hierfür
geschränkt sind, um mehrere verschiedene
Analyte parallel zu detektieren.
Eine Möglichkeit, dies zu umgehen,
bieten Microarrays. Durch ortsaufgelöste
Plazierung in Nanometer- bis MikrometerAbständen können bis zu mehrere tausend
DNA-Sonden in einem definierten Raster
für die parallele Analyse genutzt werden.
Aufgrund dieser Tatsache kann bereits
mit nur einem Fluoreszenzfarbstoff eine
Multiplexdetektion erfolgen. Wegen der
Miniaturisierung, die mit dem Einsatz eines
Microarrays erzielt wird, sind nur geringe
Abb. 3: Nachweis vier verschiedener Lebensmittelallergene mit Hilfe des AllergenChips. Oben
dargestellt ist der parallele Nachweis von Soja (6), Walnuß (7), Sellerie (8) und Sesam (10) aus
einem DNA-Gemisch. Im Modell wurden die vier verschiedenen Lebensmittelallergensequenzen
in der PCR amplifiziert und anschließend über Hybridisierung auf dem AllergenChip nachgewiesen. Das Chiplayout liegt in vierfacher Ausführung vor. Legende: 1. Negativkontrollen, 2. Hybridisierungskontrolle, 3. Haselnuß, 4. Erdnuß, 5. Mandel, 6. Soja, 7. Walnuß, 8. Sellerie, 9. Senf,
10. Sesam, 11. Gluten, 12. Fisch.
bietet die Möglichkeit der Multiplexanalyse,
also der parallele Nachweis verschiedener
Parameter in einem einzigen Versuchsansatz. Die PCR-Verfahren bieten die Voraussetzung, auch aus unterschiedlichsten
Lebensmittel- oder Rohstoffproben sensitiv
geringe Mengen oder Kontaminationen an
Lebensmittelallergenen zu detektieren. Die
Detektion erfolgt über die in der Lebensmittelanalytik immer mehr an Bedeutung
gewinnende Real-time-PCR mit spezifischen
Hybridisierungssonden. Ein Einzelnachweis
von Sellerie mittels Real-time-PCR ist in
Abbildung 2 (S. 31) gezeigt.
Nachteil dieses Verfahrens ist, daß ein
Multiplexing nur begrenzt möglich ist. Für
die Differenzierung der mit Allergenen
assoziierten DNA-Sequenzen müßten diese
jeweils mit verschiedenen Fluoreszenzfarbstoffen markiert werden. Hier kommt es zu
der Schwierigkeit, daß die herkömmlichen
Real-time-Cycler durch die Anzahl der
verfügbaren Detektionskanäle meist zu ein36 | 6. Jahrgang | Nr. 6/2005
Probenvolumina nötig, um eine Detektion
durchzuführen.
Als mögliche künftige Anwendungsmöglichkeit wurden die Entwicklung und der
Einsatz eines diagnostischen Low-densityMicroarrays innerhalb des AllergenChipProjektes definiert. Der AllergenChip soll in
der Lage sein, alle relevanten Lebensmittelallergene, die sogenannten „Big 8“, mit Hilfe
spezifischer DNA-Sonden zu detektieren.
Methodik
Der methodische Ablauf für die Analyse potentiell kontaminierter Lebensmittel umfaßt
im wesentlichen drei Schritte: Probenaufarbeitung, PCR und Detektion auf dem Chip.
Zu Beginn der Analyse wird aus der zu
analysierenden Lebensmittelprobe die DNA
isoliert und für die PCR aufgearbeitet. Für
die Aufarbeitung der Lebensmittelproben
hat die Firma Congen spezielle DNA-Isolationskits (SureFood PREP Allergen) entwickelt,
mit denen qualitativ hochwertige DNA aus
verschiedenen Lebensmittelmatrizes für die
weitere Anwendung extrahiert werden kann.
Die extrahierte Gesamt-DNA wird in einer
PCR eingesetzt. Für die Chip-PCR werden
die gleichen Primersysteme verwendet, die
auch in der Real-time-Diagnostik Anwendung finden und dort bereits validiert wurden. Während der PCR werden vorhandene
Kontaminationen mit DNA aus Lebensmittelallergenen sensitiv detektiert und über
einen entsprechend modifizierten Primer
mit dem Fluoreszenzfarbstoff Cy5 markiert.
Die Fluoreszenzmarkierung ermöglicht die
spätere Detektion auf dem Microarray. Eine
weitere Zeit- und Kostenersparnis kann mit
Multiplex-PCR-Verfahren erzielt werden.
Diese werden derzeit getestet.
Ein wichtiger Faktor ist die Sensitivität
des Gesamtassays. Diese wurde dahingehend optimiert, daß für alle Allergene eine
Nachweisgrenze im unteren ppm-Bereich
(< 10 ppm) erreicht wird.
Über die Hybridisierung an immobilisierten
Sonden erfolgt die Detektion auf dem AllergenChip. Liegt eine Kontamination mit der DNA
eines der gesuchten Lebensmittelallergene vor,
so kann das zuvor in der PCR amplifizierte
DNA-Produkt an die komplementäre Sonde
auf dem Chip hybridisieren und über die Fluoreszenzmarkierung ortsaufgelöst detektiert
werden. Die Auswertung und Quantifizierung
erfolgt mit Hilfe eines Microarray-Scanners
wie etwa dem im FhG-IBMT entwickelten
Low-cost-Scanner „Freader“.
In Modellversuchen konnten wir bereits
verschiedene Lebensmittelallergene erfolgreich mit Hilfe des AllergenChips parallel
nachweisen (Abb. 3). Eine Erweiterung auf
weitere relevante Lebensmittelallergene ist
derzeit in der Testphase.
Literatur
[1]
[2]
[3]
[4]
[5]
Zuberbier, T., Edenharter, G., Worm, M., Ehlers, I., Reimann, S., Hantke,
T., Roehr, C.C., Bergmann, K.E., Niggemann B.:Prevalence of adverse
reactions to food in Germany – a population study, Allergy 2004,
59:338-345.
Roehr CC, Edenharter G, Reimann S, Ehlers I, Worm M, Zuberbier T,
Niggemann B. Food allergy and non-allergic food hypersensitivity in
children and adolescents. Clin Exp Allergy. 2004,34:1534-41.
Moneret-Vautrin, D.A.,Morisset, M. Adult food allergy, Curr Allergy
Asthma Rep 2005, 5:80-5.
Sicherer, S.H., Teuber, S.: Current approach to the diagnosis and management of adverse reactions to foods; AAAAI Practice Paper; J Allergy
Clin Immunol 2004, 114: 1146-50.
Koch, S. Verpackte Lebensmittel: Was bedeutet das Zutatenverzeichnis
für den Allergiker? Ernährungs-Umschau 2005, 52:108-111.
Korrespondenzadresse
Dr. Eva Ehrentreich-Förster
FhG IMBT
Arthur-Scheunert-Allee 114-116
D-14558 Nuthetal
Tel.: +49-(0)33200-88293
Fax: +49-(0)33200-88452
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Proteomics
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Brustkrebsfrüherkennung
durch SELDI-MS
Dr. Christine König, LifeLines GmbH, Husum; Dr. Christoph Mundhenke, Dr. Ivor Meinhold,
PD Dr. Nicolai Maass, Frauenklinik, Universtätsklinikum Schleswig-Holstein Campus Kiel
Für die Diagnose des DCIS (ductal carcinoma in situ), einer frühen Form von Brustkrebs, wurde
das Proteom von Serumproben mittels SELDI-MS (surface enhanced laser desorption ionisation-mass spectroscopy) untersucht. In den Spektren wurden differentielle Peaks identifiziert
und diese auf ihre Eignung zur Prognose des Krankheitsstadiums untersucht.
Die Erfolgsaussichten bei der Behandlung
von Brustkrebs sind umso besser, je früher die
Krankheit diagnostiziert wird. Im typischen
Fall entwickelt sich Brustkrebs über die intraduktal wachsende Form des DCIS (ductal
carcinoma in situ) zum invasiven duktalen
Karzinom. Die Erkennung von DCIS kann mit
den bisherigen Verfahren – Palpation, Röntgen- und Ultraschalluntersuchung – schwierig
sein. Deshalb besteht die Notwendigkeit, ein
ergänzendes Verfahren zur besseren Diagnostik von DCIS zu entwickeln. Eine Diagnostik
anhand von Veränderungen im Proteom des
Serums würde für die Patientin eine deutlich
angenehmere Alternative zu den bisherigen
Verfahren darstellen, da hierfür nur wenige
Milliliter Blut abgenommen werden müssen.
Probensammlung
Die bisher durchgeführten proteombasierten Untersuchungen wurden mit geringen
Probenzahlen (<5) durchgeführt, da mit
den bisher verfügbaren Methoden deutlich weniger DCIS als invasive Karzinome
gefunden werden. Des weiteren sind nicht
alle proteombasierten Analysemethoden
hochdurchsatzfähig. Daher stellt die hier erreichte Probenzahl von 27 Kontrollen, 27 Mastopathie-, 26 DCIS- und 32 invasiv duktalen
Karzinom-Fällen eine deutliche Verbesserung
gegenüber bisherigen Untersuchungen dar.
In die Studie wurden Patientinnen mit einem
Anfangsverdacht auf Brustkrebs einbezogen.
Als Referenz diente die histopathologische
Befundung des entnommen Brustgewebes.
Das Einverständnis der einbezogenen Patientinnen und die Erlaubnis der zuständigen
Ethikkommission lagen vor.
Serumproteine je nach Beschaffenheit der
Oberfläche und den Eigenschaften der Proteine (pI und Hydrophobizität) in Abhängigkeit
des verwendeten Bindungspuffers2. Durch die
speziellen Oberflächen wird eine gleichmäßige
Kristallisation der Probe erreicht und eine
relative quantitative Bestimmung der Proteine
ermöglicht. Für die Untersuchungen der Seren
wurde ein Probenträger mit einer positiv geladenen Oberfläche verwendet und ein pH im
Bindungspuffer von 4,5 eingestellt.
Auswertung und Diagnose
In den Spektren wurden die Peaks detektiert und diese in bezug auf ihre Intensität
zwischen den verschiedenen Patientinnengruppen per ANOVA verglichen. Diejenigen
mit großen Unterschieden zwischen den Erkrankungsgruppen wurden auf ihre Eignung
zur Differenzierung zwischen den Gruppen
getestet. Hierfür wurden die Spektren per
Zufallsverfahren in eine Lern- und eine
Testgruppe eingeteilt und der diagnostische
Wert einzelner Peaks und Peakkombinationen getestet. Mit diesem Verfahren konnten
für die Kontrollgruppe Sensitivitäten und
Spezifitäten von 96% beziehungsweise 93%
erreicht werden. Für die Diagnose von DCIS
wurden Werte von 88% sowohl für die Sensitivität als auch für die Spezifität ermittelt.
Die Diagnose für die Mastopathie gelang mit
96% Sensitivität und 93% Spezifität. Für die
invasiven Karzinome lagen diese Werte bei
84% und 90%3. Die hier beschriebenen Werte
sind insbesondere für das DCIS besser als
die in der bisher zur Brustkrebsdiagnostik
verwendeten Methoden.
Aussichten
Die Überprüfung des prädiktiven Wertes in einer größer angelegten Studie sollte Aufschluß
darüber geben, inwiefern das beschriebene
Verfahren Eingang in das Screeningverfahren
für die Brustkrebsfrüherkennung finden kann
und welches Kollektiv am meisten von der
Diagnose profitieren wird.
Literatur
[1]
[2]
[3]
Merchant M., Weinberger SR. Electrophoresis. 2000 Apr; 21(6): 1164-77
Wiesner A. Curr. Pharm Biotechnology 2004, Fe; 5(1): 45-67
Mundhenke et al., eingereicht
Korrespondenzadresse
Dr. Christine König
LifeLines GmbH
Schleswiger Chaussee 14
D-25813 Husum
eMail: [email protected]
Serumanalyse per SELDI-MS
Für die Untersuchung des Serumproteoms
wurde die Methode der SELDI-MS verwendet1. Die Probenträger für diese Form der
MALDI-MS sind chemisch modifiziert und
ermöglichen eine differentielle Bindung der
LABORWELT
Abb. 1: Diagnostische Peaks in SELDI-MS-Spektren. In (A) ist eine Übersicht eines SELDI-MSSpektrums gezeigt. Aus dem Spektrum sind zwei Massenbereiche herausvergrößert, in (B) ist
der differentielle Peak um 3.295 Da dargestellt und in (C) ein Peak bei 4.132 Da.
6. Jahrgang | Nr. 6/2005 | 39
T E C H - T R A N S F E R
Microarrays

ASK-Chip: Gezielte Analyse
des menschlichen Kinoms
Dr. Achim Knappik, MorphoSys - Antibodies by Design, Martinsried;
Dr. Michael Kubbutat, ProQinase, Freiburg; Dr. Hans-Jürgen Volkmer, NMI, Reutlingen
Derzeit sind mehr als 500 Proteinkinasen des Menschen bekannt, die durch Phosphorylierungen die Aktivität von Proteinen modulieren, Zellsignale weiterleiten und damit nahezu
alle biologischen Prozesse beeinflussen. Proteinkinasen funktionieren als komplexes Netzwerk, das bei vielen Erkrankungen gestört ist. Medikamente, die einzelne Proteinkinasen
hemmen, können diese Störungen eventuell beheben.
Das gezielte Zusammenwirken komplexer Protein-Netzwerke im menschlichen
Körper ist eine Grundvoraussetzung für
das korrekte Ablaufen vieler molekularer
Prozesse. Eines der vielleicht bedeutendsten
Netzwerke hierbei ist das der Proteinkinasen
(PK), die die zweitgrößte Proteinfamilie im
menschlichen Genom überhaupt darstellen
– fast 2% aller menschlichen Gene kodieren
für Proteinkinasen. Die Enzyme fungieren
als Schaltelemente und beeinflussen die
meisten Funktionen im Stoffwechsel sowie
das Wachstum und die Differenzierung
der verschiedenen Zelltypen. Eine Reihe
von Kinasen steht folglich im Verdacht,
bei verschiedenen Krankheiten, wie Krebs,
Entzündungen oder Herz-Kreislauf-Erkrankungen, eine zentrale Rolle zu spielen. Der
gezielte Einsatz von Medikamenten könnte
theoretisch individuelle Fehlfunktionen einzelner Proteinkinasen und damit ausgelöste
Kettenreaktionen innerhalb des gesamten
Netzwerkes entgegenwirken. Bislang fehlen
jedoch ein umfangreiches Gesamtbild und
Verständnis dieses Netzwerkes, um die
Auswirkungen von Medikamenten auf das
Zusammenspiel aller Vertreter realistisch
abschätzen zu können. Die Medikamentenforschung in diesem Bereich benötigt
deshalb neue, optimierte Werkzeuge.
In einem solchen Projekt wollen derzeit die
Freiburger ProQinase als Geschäftseinheit
der KTB Tumorforschungs GmbH, das
Naturwissenschaftliche und Medizinische
Institut (NMI), Reutlingen, und die MorphoSys-Geschäftseinheit Antibodies by Design
ein neues Analyse-System etablieren. Das
vom Bundesministerium für Bildung und
Forschung (BMBF) geförderte Projekt hat sich
die Bereitstellung von Werkzeugen für die
Analyse aller menschlichen Proteinkinasen
– des menschlichen „Kinoms“ – zum Ziel
gesetzt. Hierbei werden sowohl die Proteinkinase-Plattform von ProQinase, spezifische
Antikörper aus der HuCAL®-Bibliothek von
Antibodies by Design als auch siRNA- und
BioChip-Technologien des NMI miteinander
kombiniert. Aus der Zusammenarbeit wird
ein adenoviraler siRNA-Kinom-Chip (ASK)
hervorgehen, der als Komplettsystem die
gleichzeitige Inhibition aller menschlichen
Proteinkinasen, und damit deren Funktionsanalyse ermöglichen wird.
Interdisziplinärer Ansatz
Ein solch interdisziplinärer Ansatz ist natürlich vor etliche Herausforderungen gestellt.
Von zentraler Bedeutung sind insbesondere
hinreichende Mengen gereinigter Proteinkinasen für die Antikörperentwicklung, die
Etablierung von Methoden zur gezielten
Abschaltung von Proteinkinasen in Primärzellinien und zugleich die Herstellung hochspezifischer Antikörper zur Validierung der
Abb.: Arrays aus immobilisierten Adenoviren für die Reverse Transduktion und Expression von Genen: Die Infektion einer immobilisierten Zielzelle
mit löslichen Adenoviren kann räumlich umgekehrt werden, indem Adenoviren immobilisiert werden, an die resuspendierte Zellen binden –
reverse Transduktion (links). Erfolgreiche Expression des Gens für das Green Fluorescent Protein (GFP) in Zellen nach reverser Transduktion eines
rekombinanten GFP-übertragenden Adenovirus. Zellen siedeln sich bevorzugt an virale Spots an (rechts).
40 | 6. Jahrgang | Nr. 6/2005
LABORWELT
T E C H - T R A N S F E R
Proteinkinasen-Expression. Derzeit herrscht
akuter Mangel an Antikörpern gegen einen
Großteil der Kinasen. Dieser Engpaß soll
im Rahmen des Projektes mit Hilfe der
HuCAL ® -Technologie von Antibodies by
Design behoben werden – bis zu 270 neue
Antikörper gegen Proteinkinasen sollen entwickelt werden. Zur gezielten Blockierung
der Expression ausgewählter Proteinkinasen
kommen short-interfering RNAs (siRNAs)
zum Einsatz, die durch rekombinante Vektoren endogen exprimiert werden. Erfolg oder
Mißerfolg des Abschaltens der gewünschten
Proteinkinasen wird dann mit Hilfe der Kinase-spezifischen Antikörper für jedes einzelne
siRNA-Konstrukt von ProQinase und dem
NMI überprüft.
Der ASK-Chip
RNA-Interferenz

Neuartiges siRNA-Design
verbessert RNA-Interferenz
Dr. Volker Patzel, Max-Planck-Institut für Infektionsbiologie, Berlin
Die RNA-Interferenz (RNAi) –. die Technik
mittels kurzer doppelsträngiger RNAMoleküle (siRNAs) über RNA-induzierte
Effektorkomplexe (RISC) gezielt Gene
auszuschalten – hat seit ihrer Entdeckung
vor wenigen Jahren die Molekularbiologie
Beim ASK-Chip (Adenoviraler siRNA Kinom
Chip) handelt es sich um einen neuartigen
Zellchip, der durchsatzfähige zelluläre
Systeme mit endogen exprimierter siRNA
verknüpft.
Methode
Auf einem Glasträger werden infektiöse
rekombinante Adenoviren in Form eines
Microarrays immobilisiert, die die Erbinformation funktionell validierter shRNASequenzen tragen. Auf solchen adenoviralen
Arrays ausgesäte Zellen werden spezifisch
auf den Spots durch Wechselwirkung mit
den immobilisierten Adenoviren festgehalten. Gleichzeitig können rekombinante Gene
durch die immobilisierten Adenoviren in die
Zellen übertragen werden.
Ausblick
Mit der im Projektverlauf erstellten Bibliothek
von validierten, adenoviralen Vektoren, die
die Expression aller humanen Kinasen durch
siRNA-vermittelte Inhibition dauerhaft
unterdrücken können, ist auch eine Analyse
von schwer transfizierbaren Zellen, wie zum
Beispiel primären Zellen, möglich. Das Arrayformat gewährleistet dabei die parallele und
miniaturisierte Übertragung von Genen im
erhöhten Durchsatz. Bisher fehlte ein Ansatz,
der eine parallele funktionelle Analyse aller
menschlichen Proteinkinasen in lebenden
Zellen und gleichzeitig eine Miniaturisierung
durch den Einsatz der Chip-Technologie
ermöglicht.
Korrespondenzadresse
Dr. Achim Knappik
Antibodies by Design –
a Division of MorphoSys
Tel: +49-(0)89-89927-234
Fax: +49-(0)89-89927-5234
eMail: [email protected], www.A-by-D.com
LABORWELT
gruppe von Dr. Volker Patzel in der von Prof.
Dr. Stefan Kaufmann geleiteten Abteilung
für Immunologie des Berliner Max-PlanckInstituts für Infektionsbiologie konnte
kürzlich zeigen, daß die bisher vernachlässigten Sekundärstrukturen der as-siRNAs die
RNAi-Effizienz entscheidend beeinflussen.
Je weniger Struktur die as-siRNA aufweist,
desto besser kann diese vermutlich RISC an
die mRNA heranführen, und desto aktiver ist
die siRNA. Am vielversprechendsten sind dabei völlig unstrukturierte as-siRNAs. Durch
gezielte Basenaustausche werden diese
hochaktiven, aber seltenen unstrukturierten
as-siRNAs außerdem in ausreichendem Maße
zugänglich gemacht.
Neues Tool
Abb: Nur unstrukturierte antisense-siRNAs
(links) können effizient RNA-Interferenz
(RNAi) induzieren. Auf der Basis einer neuen
Software können hochaktive unstrukturierte
antisense-siRNAs gezielt identifiziert und designt werden.
revolutioniert. SiRNAs sind heute einerseits
wichtige Werkzeuge bei der funktionalen
Validierung unbekannter Genfunktionen,
andererseits rücken sie zunehmend in den
Fokus einer RNA-basierten Wirkstoffentwicklung. Statistisch weist allerdings nur ein
kleiner Teil aller siRNAs, die sich gegen ein
bestimmtes Ziel(Target)-Gen richten lassen,
eine befriedigende Aktivität auf, und ein
treffsicheres Design aktiver Moleküle stellt
nach wie vor eine Herausforderung dar.
Gezielte Auswahl aktiver siRNAs
Bisher basierte die Auswahl aktiver siRNA
Duplexe, welche aus einer ‚antisense-siRNA’
(as-siRNAs) und einer ‚sense-siRNA’ bestehen, im wesentlichen auf der Berücksichtigung thermodynamischer Duplexparameter,
bestimmter Basenabfolgen und Basengehalte
sowie gegebenenfalls auf der Analyse von
Strukturen der Target-mRNAs. Die Arbeits-
Eine systematische Computeranalyse deutet
ferner darauf hin, daß auch bei den mikroRNAs (miRNAs) die Strukturen der den
as-siRNAs entsprechenden reifen miRNAs,
eine wichtige Rolle spielen. MiRNAs repräsentieren natürliche zelluläre Analoga zu den
siRNAs, und es wird heute davon ausgegangen, daß ein großer Teil der menschlichen
Genexpression durch miRNAs gesteuert
wird. Damit kommt dieser Arbeit neben der
anwendungsbezogenen auch eine grundlagenwissenschaftliche Bedeutung zu.
Die Ergebnisse dieser Arbeit, die in Kooperation mit dem Deutschen Rheuma-Forschungszentrum erfolgte, wurden kürzlich
in der Zeitschrift NATURE BIOTECHNOLOGY (online: 30. Oktober 2005, doi: 10.1038/nbt1151)
veröffentlicht. Das neuartige siRNA-Design
wurde in eine Software implementiert und
ist über das Steinbeis Transferzentrum
Nucleic Acids Design (www.stz-nad.com)
erhältlich.
Korrespondenzadresse
Dr. Volker Patzel, MBA
Arbeitsgruppenleiter
Abteilung für Immunologie
Campus Charité Mitte
Max-Planck-Institut für Infektionsbiologie
Schumannstraße 21/22
D-10117 Berlin
eMail: [email protected]
www.mpiib-berlin.mpg.de
6. Jahrgang | Nr. 6/2005 | 41
T E C H - T R A N S F E R
RZPD

Neuer Diagnostik–Service:
Der AmpliChip CyP450-Test
Dr. Florian Wagner, Dr. Johannes Maurer, Dr. Uwe Radelof
RZPD Deutsches Ressourcenzentrum für Genomforschung, Berlin
Das RZPD Deutsches Ressourcenzentrum für Genomforschung (www.rzpd.de) baut sein Service-Angebot im Bereich DNA-Microarray-Technologie um den Bereich DNA-Diagnostik aus.
Die Etablierung des AmpliChip CYP450-Tests von Roche Diagnostics erfolgt als konsequente
Erweiterung der Technologieplattform des RZPD: Seit 2001 ist das RZPD offizieller Affymetrix-Service-Provider; die NimbleGen-Technologie wird durch das RZPD seit 2004 exklusiv in
Deutschland und Österreich angeboten. Im Rahmen des Nationalen Genomforschungsnetzes
(NGFN) fungiert das RZPD als „Zentrale Microarray-Plattform“.
DNA-Microarrays wurden seit ihrer erstmaligen Beschreibung zu Beginn der neunziger
Jahre1 zu einem der wichtigsten Instrumente
der funktionellen Genomforschung weiterentwickelt. Inzwischen wird die DNAChiptechnologie auch in der Diagnostik
eingesetzt. Prominentes Beispiel ist der erste
in den USA und Europa für den klinischen
Einsatz zugelassene DNA-Chip mit CE-IVDKennzeichnung für die Routinediagnostik: der
AmpliChip® CyP450 von Roche Diagnostics.
Der Chip, der auf der Technologie des Microarray-Weltmarktführers Affymetrix basiert,
repräsentiert 33 Varianten der zwei Gene 2D6
und 2C19 der Cytochrom-P450-Genfamilie.
Die hauptsächlich in der Leber exprimierten
Genvarianten dieser beiden Enzyme sind an
der Verstoffwechselung von etwa 25% aller
verschreibungspflichtigen Medikamente beteiligt. Abhängig von der individuellen genetischen Ausstattung, die einen erheblichen Einfluß auf die Wirksamkeit und Verträglichkeit
der verabreichten Medikamente hat, erreichen
bei Standarddosierung viele Medikamente
keinen therapeutisch wirksamen Serumspiegel (bei sehr schnellen Metabolisierern), oder
es wird im umgekehrten Fall (bei langsamen
Metabolisierern) über einen längeren Zeitraum
ein so hoher Serumspiegel erreicht (Abb.1),
daß schwere Nebenwirkungen die Folge sind.
Signifikante Arzneimittelnebenwirkungen
treten in ca. 5% bis 10% aller Fälle medikamentöser Behandlung auf, nicht selten sogar mit
tödlichem Ausgang2,3. In Deutschland wird
mit jährlich 16.000 Todesfällen und 120.000
schweren Zwischenfällen gerechnet.
Der vom RZPD angebotene AmpliChip
CYP450-Test umfaßt folgende Schritte: Zunächst werden in zwei Multiplex-PCR-Reaktionen die allelischen Varianten von 2D6 und
2C19 amplifiziert. Ausgangsmaterial sind
lediglich 50 ng genomischer DNA, die aus
wenigen Millilitern Blut isoliert werden. Die
PCR-Amplifikate werden fragmentiert und
42 | 6. Jahrgang | Nr. 6/2005
mit Biotin endmarkiert. Für die automatisierte
Hybridisierung, das Färben und Scannen des
Chips wird das bewährte Affymetrix-System
eingesetzt. Die Analyse der Rohdaten erfolgt
mit der von Roche entwickelten CYP450Datenanalyse-Software. Zur Analyse jeder
einzelnen der 33 Genvarianten, die auf dem
Chip repräsentiert sind, greift die Software
auf die Daten jeweils eines Blocks von 240
25mer-Oligonukleotiden zurück. Auf Basis des
ermittelten Genotyps erfolgt für 2D6 und 2C19
eine Aussage über den Phänotyp. Für 2D6 sind
vier Varianten möglich, von „langsamer Metabolisierer“ über „eingeschränkter Metabolisierer“ und „normaler Metabolisierer“ bis hin
zu „sehr schneller Metabolisierer“. Langsame
Metabolisierer haben zwei defekte Allele, bei
sehr schnellen Metabolisierern liegen mehr als
zwei voll funktionsfähige Allele vor. Für 2C19
werden zwei Phänotypen vorhergesagt: langsamer oder normaler Metabolisierer. Auf der
Basis dieser Information kann der behandelnde Arzt eine individuelle Entscheidung für das
am besten geeignete Medikament und die für
den jeweiligen Patienten wirksamste Medikamentendosis treffen. Für Medikamente, die
von 2D6 und 2C19 umgesetzt werden, gibt es
bereits Dosisempfehlungen4-6. Die Spannbreite
der empfohlenen optimalen Dosen liegt zwischen 30% und 260% der Standarddosis, je
nach Schnelligkeit der Metabolisierung.
Vorteile der DNA-Chipdiagnostik liegen
gegenüber anderen Verfahren im Multiplexing sowie der Schnelligkeit: Der Test kann
an einem einzigen Arbeitstag durchgeführt
werden. Zudem kann die oft langwierige, mit
gesundheitlichen Risiken verbundene Ermittlung der optimalen Medikamentendosis – die
„Einstellung“ des Patienten – in vielen Fällen
vermieden werden.
Die DNA-Chip-Diagnostik ist derzeit noch
sehr kostenintensiv. Ihr gezielter Einsatz kann
jedoch helfen, weit höhere Folgekosten zu
vermeiden. Folgt die Preisentwicklung der
Abb. 1: Gezeigt ist die Serumkonzentration
eines Wirkstoffs in Abhängigkeit von der Zeit
für einen schlechten (oben), normalen (Mitte)
und sehr schnellen Metabolisierer (unten). Rot
= Nebenwirkungen, grün = therapeutisches
Fenster, grau = unwirksamer Bereich
Diagnostik-Arrays jener der ForschungsChips werden ihre Kosten mittelfristig
deutlich sinken – eine Tendenz, die durch die
Technologieentwicklung, einen umfangreicheren Einsatz und die Markteinführung von
Konkurrenzprodukten verstärkt wird. Roche
selbst testet bereits in umfangreichen klinischen Studien einen weiteren DNA-Chip zur
Leukämie-Klassifizierung, dessen Vermarktung Anfang 2007 starten soll (Seite 6 ff.).
Literatur
[1]
[2]
[3]
[4]
[5]
[6]
Fodor SP et al. (1991). Science 251, 767-773.
Lazarou J et al. (1998). JAMA 279, 1200-1205.
Schönhofer P (1999). Arzneimitteltherapie 17, 83-86.
Brockmöller J et al. (2000). Pharmacogenomics 1, 125-151.
Kirchheiner J et al. (2001). Acta Psychiatr Scand 104, 173-192.
Roots I et al. (2004). Drug Metab Rev 36, 617-638.
Korrespondenzadresse
Dr. Florian Wagner
RZPD Deutsches Ressourcenzentrum für
Genomforschung GmbH
Heubnerweg 6, D-14059 Berlin
Tel.: +49-(0)30-32639-179, Fax: -262
eMail: [email protected], www.rzpd.de
LABORWELT
LABORWELT
Qualitätskontrolle in der Lebensmittelüberwachung
Nachweis von 16S-rNA von Vertretern der Enterobacteriaceae-Familie (incl. E.coli und Salmonella) über
ENT-Primer sowie von BacillusArten (incl. Staphylococcus) über
BS-Primer
Bakterien
PCR-Kit für 50 Reaktionen
keine CE-Zertifizierung, für Forschungseinsatz
3. Anwendungsgebiete
4. Kurzbeschreibung des Produktes
5. Organismus/Krankheit
6. Technische Daten
7. CE-zertifiziert/Forschungseinsatz?
10. Preis (ab…Euro)
9. Extras / Besonderheiten
905,- D
Bacteria Screening PCR-Kit
2. Produktname
8. Service
Cambrex BioScience Verviers s.p.r.l.
Parc Industriel de Petit Rechain
4800 Verviers, Belgien
Technischer Service
Tel.: 0800-1825287
[email protected]
1. Firmendaten, Ansprechpartner
413,70 D
keine CE-Zertifizierung, für Forschungseinsatz
PCR-Kit für 48 Reaktionen
Anthrax
Schnellnachweis von spezifischen
Genen (PA und capA) in den beiden
virulenten Anthrax-Plasmiden pX01
und pX02
Anthrax-Nachweis zur Risikoeinschätzung in der Landwirtschaft
Bacillus anthracis PCR Detection
Kit
Cambrex BioScience Verviers s.p.r.l.
Parc Industriel de Petit Rechain
4800 Verviers, Belgien
Technischer Service
Tel.: 0800-1825287
[email protected]
591,65 D
keine CE-Zertifizierung, für Forschungseinsatz
2 cDNA-Chips
Krebs
Chip mit ca. 890 cDNA-Fragmenten
(250- 1.200 bp) aus 590 identifizierten und charakterisierten
humanen Krebs-Genen (mit GenNamen, ID-Nummern,
Zugangsnummern Genbank)
Identifizierung menschlicher
Krebsgene zu Forschungszwecken
Intelligene Human Cancer Chip
Ver. 4.0
Cambrex BioScience Verviers s.p.r.l.
Parc Industriel de Petit Rechain
4800 Verviers, Belgien
Technischer Service
Tel.: 0800-1825287
[email protected]
Für ein besonders effizientes Verfahren sorgt das innovative HTATMSlide12-Format des Biochips, mit
dem bis zu 12 Proben parallel
bearbeitet werden können. In Verbindung mit dem CheckScannerTM
und der CheckReportTM-Software
ist eine vollautomatische Analyse
und Auswertung der Ergebnisse
möglich.
gemäß der europäischen Richtlinie
98/79/EWG für in-vitro-Diagnostika (IVD) bzw. dem deutschen
Medizinproduktegesetz (MPG)
zertifiziert
Die Nachweisgrenzen liegen je
nach Erreger zwischen 100 und
5.000 CFU
Nachgewiesen werden folgende
parodontal pathogene Keime: P.
gingivalis, T. forsythia, T. denticola,
C. gracilis, C. rectus, E. nodatum,
F. nucleatum ssp., P. micros,
P. intermedia, P. nigrescens, S.
Gruppe, A. odontolyticus, V. parvula, A. actinomycetemcomitans, E.
corrodens, A. viscosus
Microarray-basiertes Nachweissystem zur Identifizierung 20 Parodontitis-assoziierter Keime
Parodontitis-Leitkeimbestimmung
ParoCheck® Kit 20
Greiner Bio-One GmbH
Maybachstraße 2
D-72636 Frickenhausen
Fax: +49-(0)7022-948-514
Dr. Jörg Stappert
[email protected]
Tel.: +49-(0)7022-948-0
Für ein besonders effizientes Verfahren sorgt das innovative HTATMSlide12-Format des Biochips, mit dem
bis zu 12 Proben parallel bearbeitet
werden können. In Verbindung mit
dem CheckScannerTM und der CheckReportTM-Software ist eine vollautomatische Analyse und Auswertung der
Ergebnisse möglich
Die Nachweisgrenzen liegen je nach
Art zwischen 0.05 und 1 % Produktanteil
in Kochkonserven
Schwein (Sus scrofa), Rind (Bos
taurus), Schaf (Ovis aries), Truthahn
(Meleagris gallopavo) , Huhn (Gallus
gallus), Pferd (Equus caballus), Esel
(Equus asinus), Ziege (Capra hircus
Microarry-basiertes Nachweissystem
zur Identifizierung von acht Tierarten
in Lebensmitteln. Das Kit umfaßt den
PCR-Mastermix, die Microarrays auf
HTATMSlide12-Plattformen, Hybridisierungs- und Waschpuffer sowie die
CheckReportTM-Software
Qualitätskontrolle in der Lebensmittelindustrie
CarnoCheck®
Greiner Bio-One GmbH
Maybachstraße 2
D-72636 Frickenhausen
Fax.: +49-(0)7022-948-514
Dr. Hinrich Habeck
[email protected]
Tel.: +49-(0)7022-948-0
M A R K T Ü B E R S I C H T
Marktübersicht: PCR- und Chip-Diagnostik
Das Multiplexing diagnostischer DNA-Tests, die bislang mit Hilfe der Polymerase-Kettenreaktion (PCR) durchgeführt wurden, eröffnet eine
massive Parallelisierung der Tests. Erstmals marktgerecht verwirklicht haben dies Weltmarktführer Roche Diagnostics und Affymetrix in
einem Chip-Test auf Arneimittelmetabolisierung. Doch innerhalb der Diagnostikbranche, die nach Angaben des VDGH im vergangenen Jahr
allein in Deutschland einen Umsatz von 450 Millionen Euro mit molekularen Diagnostika machte, sind weitere Tests in Entwicklung – zum
Beispiel Krebs-Arrays bei Bayer und Roche. Diese Marktübersicht wirft einen Blick auf die aktuellen, aber auch zukünftige Tests am Markt.
6. Jahrgang | Nr. 6/2005 | 43
44 | 6. Jahrgang | Nr. 6/2005
Die Nachweisgrenze liegt unter 20 CFU / ml oder unter
4 Kopien / PCR.
6. Technische Daten
10. Preis (ab…Euro)
9. Extras / Besonderheiten
Für ein besonders effizientes Verfahren sorgt das innovative HTATM-Slide12-Format des Biochips, mit dem
bis zu 12 Proben parallel bearbeitet werden können. In
Verbindung mit dem CheckScannerTM und der CheckReportTM-Software ist eine vollautomatische Analyse und
Auswertung der Ergebnisse möglich.
Mycoplasmen allgemein und Mycoplasma orale, Mycoplasma hyorhinis, Acholeplasma laidlawii, Mycoplasma
arginini, Mycoplasma fermentans, Mycoplasma hominis,
Mycoplasma gallisepticum, Mycoplasma pneumoniae,
Mycoplasma synoviae
5. Organismus/Krankheit
Zum Einsatz kommt die neueste Variante des Affymetrix-Systems mit Scanner Upgrade 7G und ParAllel-Erweiterung. Siehe auch www.microarray-facility.com
Human, Mouse, Rat, Drosophila, Arabidopsis
Analyse des Transkriptoms mit Hilfe der Affymetrix
GeneChip-Technologie
Ab 950,- D pro Expressionsanalyse
Der Service reicht von der RNA-Isolation über Microarray-Prozessierung bis hin zur vollständigen DatenAnalyse
Microarray-basiertes Nachweissystem zur Identifizierung von Mycoplasmen. Mit spezifischen Sonden können die neun häufigsten Mycoplasmen-Arten eindeutig
identifiziert werden. Darüber hinaus werden durch eine
universelle Sonde alle weiteren Mycoplasmen-Arten erfaßt. • Der Kit umfaßt den PCR-Mastermix, die Microarrays auf HTATM-Slide12-Plattformen, Hybridisierungsund Waschpuffer sowie die CheckReportTM-Software.
4. Kurzbeschreibung des Produktes
Target Development • Pathway Definitions • Drug interaction analysis • Animal model Screening
8. Service
Qualitätssicherung von Zellkulturen in Forschung und
Produktion
3. Anwendungsgebiete
Microarray Expression Profiling
• Whole genome Expression Arrays (div. Spezies)
• Exon-Arrays
Als Affymetrix Service Provider zugelassen. • Dienstleistungen können für Industrie wie Akademie erbracht
werden
MycoDtectTM
2. Produktname
The Microarray Facility Tübingen
Calwerstr. 7
72076 Tübingen
www.microarray-facility.com
Dr. Michael Bonin
7. CE-zertifiziert/Forschungseinsatz?
Greiner Bio-One GmbH
Maybachstraße 2
D-72636 Frickenhausen
Fax.: +49-(0)7022-948-514
Dr. Hinrich Habeck
[email protected]
Tel.: +49-(0)7022-948-0
1. Firmendaten, Ansprechpartner
Ab 400,- D pro SNP-Analyse
Der Service reicht von der DNA-Isolation über Microarray-Prozessierung bis hin zur vollständigen DatenAnalyse
Die Microarray Facility ist als Teil der Medizinischen
Genetik zur Diagnostik berechtigt. • Weiterhin ist sie
als Affymetrix Service Provider zugelassen. • Dienstleistungen können für Industrie wie Akademie erbracht
werden.
Zum Einsatz kommt die neueste Variante des Affymetrix-Systems mit Scanner Upgrade 7G und ParAllel-Erweiterung. Siehe auch www.microarray-facility.com.
Human, Mouse, Rat, Bovine • Mikrodeletionssyndrome
• Uniparentale Disomie-Diagnostik
Analyse genomweit verteilter SNPs mit Hilfe der Affymetrix GeneChip-Technologie und
ParAllel-Technologie
Linkage-Analysen • Assoziationsstudien • Deletions/
Duplikations-Screening • Copy-Number-Analysen
Microarray High Density SNP-Analysen
• whole genome SNP Arrays (10K, 100K, 500K) • MegAllel Arrays (flexible SNP Analysen) • Mouse, Rat, Bovine SNP-Analysen
The Microarray Facility Tübingen
Calwerstr. 7
72076 Tübingen
www.microarray-facility.com
Dr. Michael Bonin
Ab 400,- D pro Patient
Der Service reicht von der DNA-Isolation aus EDTABlut über die Microarray-Prozessierung bis hin zur
vollständigen Daten-Analyse und medizinischen
Befundung
Zum Einsatz kommt der erste CE-IVD und von der
FDA zugelassene diagnostische Microarray • Die
Microarray Facility ist als Teil der Medizinischen
Genetik zur Diagnostik zugelassen. • Weiterhin
ist sie als Affymetrix Service Provider zugelassen.
Dienstleistungen können für Industrie wie Akademie
erbracht werden
Diese Analyse ist die erste durch die FDA zugelassene Microarray-basierte diagnostische Anwendung
und beinhaltet eine sehr robuste Genotypisierung,
die Klinikern und niedergelassenen Ärzten hilft, eine
individualisierte Dosierung bestimmter Wirkstoffe
für den Patienten vorzunehmen. Siehe auch www.
microarray-facility.com
Human • Bei starken Nebenwirkungen von Medikamenten oder bei Non-Response von Wirkstoffen
Analyse von 33 Polymorphismen zur Einschätzung
des individuellen Metabolisierungsgrades verschiedener Wirkstoffe mit Hilfe des AmpliChip CYP450 und
der Affymetrix GeneChip-Technologie
Wirkstoffverträglichkeitstestung
• Dosierungsanpassung von Medikamenten
Wirkstoffverträglichkeitstestung mit Hilfe des
AmpliChip CYP450 Arrays von Roche
The Microarray Facility Tübingen
Calwerstr. 7
72076 Tübingen
www.microarray-facility.com
Dr. Michael Bonin
M A R K T Ü B E R S I C H T
LABORWELT
LABORWELT
Aqua Screen®
Nachweis von Legionellen in Wasser
Aqua Screen® ist das erste Komplettsystem zur Detektion kultivierbarer als auch nicht-kultivierbarer
Legionellen in Wasser. Das Aqua Screen® System
umfaßt alles: die Wasserfiltration, die DNA Extraktion
und die PCR-Diagnostik und führt so zu einer genauen
Quantifizierung der Legionellen-Genome in der Probe.
Das System bietet einen schnellen und effizienten Weg,
um den Legionellengehalt (weniger als 200 LegionellenPartikel pro Liter Wasser) in weniger als einem Tag zu
messen – der vollständige Prozeß dauert zwischen vier
und sechs Stunden.
2. Produktname
3. Anwendungsgebiete
4. Kurzbeschreibung des Produktes
ab 224,- D/25 Tests
Service: nein
10. Preis (ab…Euro)
Real-time PCR-Diagnostik Kits ab 179,- D/25 Tests.
Service: 69,- D/Test
Minerva Biolabs QP Kits sind auf allen gängigen realtime-Thermocyclern anwendbar
9. Extras / Besonderheiten
ab 178,- D
Taq DNA-Polymerase für die sensitive 16S rDNAAnalyse (MolTaq 16S) wird mit dem Kit frei geliefert.
Kit enthält Reagenz zur Lyse von Gram-positiven und
Gram-negativen Bakterien
Assay-Entwicklung
Minerva Biolabs bietet die vollständige LegionellenUntersuchung von der Aufarbeitung der Wasserprobe
bis hin zu einer leicht verständlichen Auswertung und
Beurteilung der quantitativen PCR-Ergebnisse. Senden
Sie uns einfach Ihre Wasserprobe zu. Wir senden Ihnen
innerhalb von 24 Stunden nach Erhalt der Probe das
Ergebnis.
8. Service
Minerva Biolabs bietet die vollständige LegionellenUntersuchung von der Aufarbeitung der Wasserprobe
bis hin zu einer leicht verständlichen Auswertung und
Beurteilung der quantitativen PCR-Ergebnisse. Senden
Sie uns einfach Ihre Wasserprobe zu. Wir senden Ihnen
innerhalb von 24 Stunden nach Erhalt der Probe das
Ergebnis.
CE Label
Onar®Lp–QP ist CE-registriert und für die klinische
Diagnostik zugelassen
Nein/Wasser-Diagnostik
7. CE-zertifiziert/Forschungseinsatz?
Bakterielle Sepsiserreger, Bakteriämie, Sepsis
Prä-analytischer Kit für die Nukleinsäure-basierte
Diagnostik mit Steigerung der Sensitivität, Spezifität und
Zuverlässigkeit der PCR-Analyse von Bakterien in Blut.
Sepsis-Diagnostik, PCR-Detektion und Identifizierung
von Bakterien in Blut und Blutprodukten. Qualitative
und/oder quantitative Analyse
MolYsis
Molzym
Bremen
Tel. +49-(0)421-2209777-0
[email protected]
Für die Isolierung reiner bakterieller DNA aus 0,2 – 0,5
ml Vollblut
Legionellen/respiratorische Erkrankungen
Onar® Lp-QP und Onar® Ls-QP sind In-Vitro-Diagnostika für den quantitativen Nachweis von Legionella
pneumophila bzw. Legionella spp. in klinischem Probenmaterial. Der Assay basiert auf der Polymerase-Kettenreaktion (PCR) und zeichnet sich durch eine extrem hohe
Sensitivität und nahezu 100%ige Spezifität aus. Minerva
Biolabs QP-Kits sind auf allen gängigen real-time-Thermocyclern anwendbar
Nachweis von Legionella pneumophila und Legionella
spp
Onar® Lp-QP & Onar® Ls-QP
Dr. Marc Bäuerle
Head of Marketing & Sales
Minerva Biolabs GmbH
Köpenicker Straße 325
D-12555 Berlin
Tel.: +49-(0)30-6576 2830
Fax: +49-(0)30-6576 2831
[email protected], www.minerva-biolabs.com
6. Technische Daten
5. Organismus/Krankheit
Dr. Marc Bäuerle
Head of Marketing & Sales
Minerva Biolabs GmbH
Köpenicker Straße 325
D-12555 Berlin
Tel.: +49-(0)30-6576 2830
Fax: +49-(0)30-6576 2831
[email protected], www.minerva-biolabs.com
1. Firmendaten, Ansprechpartner
Technical Support
Schulungen
CE-zertifiziert gemäß EU-Direktive 98/79/EG
Präzise Quantifizierung der HBV-DNA – durch Verwendung der fünf mitgelieferten Standards
Zuverlässige Ergebnisse – Überprüfung von Probenvorbereitung und erfolgreicher Amplifikation durch
eine mitgelieferte Interne Kontrolle • Hohe Sensitivität – Analytische Nachweisgrenze zwischen 3,8 und
5,8 IU/ml • Hohe Linearität — von 9 IU/ml bis 4 x 109
IU/ml (für artusTM HBV TM PCR Kits) • Verwendbar
mit den Real-time Geräten: • LightCycler® Instrument
• Rotor-GeneTM • ABI PRISM® 7000, 7700, 7900HT SDS
Eine Infektion mit dem Hepatitis B-Virus (HBV) führt
zu allgemeinem Krankheitsgefühl mit Appetitlosigkeit, Erbrechen und Abdominalbeschwerden. Bei 10
20 % der Infizierten treten Fieber, Exanthemen sowie
rheumatoiden Gelenk- und Muskelbeschwerden
auf. Eine fulminante akute Hepatitis tritt bei 1 % aller
Infizierten auf und endet häufig mit dem Tod. Bei 5
- 10 % aller Patienten manifestiert sich eine chronische Leberentzündung, die zu einer Leberzirrhose
bzw. einem primären hepatozellulären Karzinom
führen kann.
Die artusTM HBV PCR Kits basieren auf dem Nachweis
eines spezifischen Abschnitts des HBV-Genoms
durch Echtzeit-PCR. Sie enthalten alle notwendigen
Reagenzien für den zuverlässigen Nachweis und die
Quantifizierung von HBV-DNA
Die artusTM HBV PCR Kits erlauben den schnellen,
sensitiven und quantitativen Nachweis von HBV-DNA
aus EDTA-Plasma. Dies ist essentiell, um die antivirale Behandlung von Patienten zu überwachen.
artusTM HBV LC PCR Kit • artusTM HBV RG PCR Kit •
artusTM HBV TM PCR Kit
QIAGEN Diagnostics GmbH
Königstraße 4a
22767 Hamburg
www.qiagen-diagnostics.de
Dr. Jens Dannenberg
Tel.: +49-(0)40-413647-88
[email protected]
PCR & CHIP-DIAGNOSTIK
6. Jahrgang | Nr. 6/2005 | 45
46 | 6. Jahrgang | Nr. 6/2005
Die artusTM M. tuberculosis PCR Kits erlauben den
schnellen, sensitiven und quantitativen Nachweis der
DNA aller Mitglieder des M. tuberculosis-Komplexes
(M. tuberculosis, M. africanum, M. bovis, M. bovis BCG,
M. microti) aus Sputum, BAL, Bronchialsekret, Liquor,
Magensaft und Peritoneal-Punktat
Die artusTM M. tuberculosis PCR Kits basieren auf dem
Nachweis eines spezifischen Abschnitts des mykobakteriellen Genoms durch Echtzeit-PCR. Sie enthalten alle
notwendigen Reagenzien für die zuverlässige Detektion
und Quantifizierung der mykobakteriellen DNA.
Tuberkulose ist nach wie vor eine der bedeutendsten
Infektionskrankheiten der Welt. Die Übertragung der
Erreger erfolgt durch Aerosole, wobei eine Anstekkungsgefahr nur von Personen mit aktiver Tuberkulose
ausgeht. Im Primärstadium sind in erster Linie Teilbereiche der Lunge und zugehörige Lymphknoten von der
Infektion betroffen. In Abhängigkeit vom Immunstatus
des Patienten kann es jedoch auch zu einer Ansiedlung
von M. tuberculosis in anderen Organen kommen.
Präzise Quantifizierung mykobakterieller DNA – durch
Verwendung der mitgelieferten Standards •Zuverlässige Ergebnisse – Überprüfung von Probenvorbereitung
und erfolgreicher Amplifikation durch eine mitgelieferte
interne Kontrolle • Hohe Sensitivität – Analytische
Nachweisgrenze zwischen 6 und 10 Kopien/PCR (je
nach Kit) • Zugelassen für Diagnostik - CE-markiert
laut EU-Direktive 98/79/EG über In-vitro-Diagnostika •
Verwendbar mit den Real-time Geräten: • LightCycler®
Instrument • Rotor-GeneTM • ABI PRISM® 7000, 7700,
7900HT SDS
CE-zertifiziert gemäß EU-Direktive 98/79/EG
3. Anwendungsgebiete
4. Kurzbeschreibung des Produktes
5. Organismus/Krankheit
6. Technische Daten
7. CE-zertifiziert/Forschungseinsatz?
10. Preis (ab…Euro)
9. Extras / Besonderheiten
Technical Support • Schulungen
artusTM M. tuberculosis LC PCR Kit • artusTM M. tuberculosis RG PCR Kit • artusTM M. tuberculosis TM PCR Kit
2. Produktname
8. Service
QIAGEN Diagnostics GmbH
Königstraße 4a
22767 Hamburg
www.qiagen-diagnostics.de
Dr. Sven Cramer
Tel.: +49-(0)40-413647-74
[email protected]
1. Firmendaten, Ansprechpartner
Technical Support • Schulungen
CE-zertifiziert gemäß EU-Direktive 98/79/EG
Nachweis der genetischen Varianten G6722A und
C4762G mit dem LightCycler • Die Sensitivität liegt
zwischen 10 und 55 pg/PCR.
Die hereditäre Hämochromatose (HFE) ist eine autosomal rezessive Erbkrankheit, bei der im Körper übermäßig viel Eisen gespeichert wird. Sind Serumferritin- und
Transferrin-Werte dauerhaft zu hoch oder gibt es in
der Familie bereits einen Hämochromatosefall, sollte
eine Untersuchung auf die relevanten HFE-Mutationen
erfolgen. Für 90 % der Hämochromatosefälle sind die
Mutationen G6722A (Aminosäureposition C282Y) und
C4762G (Aminosäureposition H63D) des HFE-Gens verantwortlich. • Jeder zehnte Mensch in der kaukasischen
Bevölkerung trägt ein defektes Gen in sich, einer von 200
bis 400 Menschen erkrankt an Hämochromatose.
Der artusTM HFE LC PCR Kit basiert auf dem Nachweis
der genetischen Varianten des HFE-Gens durch Echtzeit-PCR. Die Reagenzien enthalten alle notwendigen
Komponenten zum Nachweis der genetischen Varianten
an den Nukleotidpositionen C4762G (entspricht Aminosäureposition H63D) und G6722A (entspricht Aminosäureposition C282Y). • Darüber hinaus ermöglicht das
artusTM HFE LC PCR Kit den Nachweis der Mutation an
der Nukleotidposition A4768T (entspricht Aminosäureposition S65C), die durch Schmelzkurvenanalyse gut von
der Mutation C4762G (Aminosäureposition H63D) unterschieden werden kann.
Der artusTM HFE LC PCR Kit erlaubt den zuverlässigen
und schnellen Nachweis klinisch relevanter genetischer
Varianten des HFE-Gens in humaner DNA. Diese Analyse ermöglicht die Abschätzung individueller Hämochromatoserisiken.
artusTM HFE LC PCR Kit
QIAGEN Diagnostics GmbH
Königstraße 4a
22767 Hamburg
www.qiagen-diagnostics.de
Dr. Jens Dannenberg
Tel.: +49-(0)40-413647-88
[email protected]
ab 450,- D
Affymetrix DX
CE, FDA-Zulassung, IVD-Einsatz
DX Microarray, basierend auf Affymetrix-Technologie
Leber/Depression, Herzinsuffizienz etc
Der AmpliChip CYP450 ist der weltweit erste Microarray
mit einer Zulassung (FDA, CE) für IVD-Anwendungen.
Anhand einer Blutprobe können der CYP450 2D6 und
2C19-Genotyp und -Phänotyp bestimmt werden. Das
Analyseresultat unterstützt die individuelle Therapiefindung und kann zu schnelleren Therapieerfolgen und
verringerten Nebenwirkungen führen.
Pharmakogenetik/Individualisierte Arzneimitteltherapie
AmpliChip CYP450-Test (CE-IVD)
Roche Diagnostics GmbH
Sandhofer Straße 116
68305 Mannheim
Dr. Andreas Görtz
[email protected]
ab 9,25D/St
Technische Beratung, Tel:. +49-(0)3641-681-91969
Zertifizierung nach DIN ISO 9001ff vorauss. 2. Quartal
2006
Geometrie: 75,6 mm x 25,0 mm (± 100 µm) • Dicke:
1,0 mm (± 50 µm) ±Ebenheit: ≤ 50 µm
Prinzipiell reagieren alle nukleophilen Gruppen
(NH2-, SH-, OH-) sofort und irreversibel zu eine
festen, kovalenten Bindung. Zusätzliche Schritte
zur Immobilisierung wie UV-crosslinking sind nicht
erforderlich. • Nexterion® Slide E ist verpackt in
stabilen Plastikboxen zu je 25 Stück
Die Epoxy-Oberfläche ermöglicht eine effiziente und
feste Bindung der Biomoleküle und sorgt für eine optimale Probenpräsentation. Die Nukleinsäuren reagieren sofort mit der Epoxy-modifizierten Oberfläche
des Glassubstrates und gehen eine feste, kovalente
Bindung ein. Die Dichte der Epoxygruppen auf der
Oberfläche ist über die gesamte Slide-Fläche konstant und sorgt für eine optimale Bindungskapazität.
besonders geeignet für alle aminomodifizierten und
unmodifizierten Oligonukleotide • ebenfalls geeignet
für cDNA/PCR-Proben
Nexterion® Slide E
Microarray Solutions
SCHOTT Jenaer Glas GmbH
Otto-Schott-Straße 13
07745 Jena
Tel.: 49-(0)3641-681-91966
Fax: +49-(0)3641-681-970
coatedsubstrate@ schott.com
M A R K T Ü B E R S I C H T
LABORWELT
LABORWELT
Technische Beratung Tel. +49-(0)3641-681-91969
ab 559,- D für 20 Anreicherungen. Attraktiver Markteinführungsrabatt bis 30.11.2005
394,- D für 20 Anreicherungen
824 ,- D für 50 Anreicherungen
10. Preis (ab…Euro)
ab 400,- D/St für Kit à 25 Slides mit den entsprechenden
Reagenzien
Erhöhung der Sensitivität von Nukleinsäurebasierten Nachweismethoden • Kombinierbar
mit verschiedenen Vervielfältigungsmethoden •
Gesamtsystem für die Extraktion der Gesamt-DNA
aus Vollblut mit anschließender Anreicherung
bakterieller DNA • Optimierte Methode zur Lyse
von Zellen durch Kombination von chemischen und
enzymatischen Verfahren • Effiziente Lyse auch von
schwer lysierbaren Bakterien ( z.B. Streptococcus
pyogenes) • Erfaßt die gesamte bakterielle DNA in
der Probe einschließlich DNA aus phagozytierten
und intrazellulären Bakterien sowie freie bakterielle
DNA • Anreicherung der bakteriellen DNA basiert
auf dem einzigartigen Funktionsprinzip der PureproveTM-Technologie
9. Extras / Besonderheiten
ab 19,- D/St
Servicetelefon: +49-3641-508430
Erhöhung der Sensitivität von Nukleinsäure-basierten
Nachweismethoden • Ermöglicht die Anreicherung von
bakterieller DNA aus komplexen biologischen Proben •
Erfaßt die gesamte bakterielle DNA in der Probe einschließlich DNA aus phagozytierten und intrazellulären
Bakterien sowie freie bakterielle DNA • Basiert auf der
spezifischen Bindung von nicht-methylierter DNA •
Kombinierbar mit jeder nachgeschalteten, molekularbiologischen Nachweismethode • Unabhängig von der
Art der biologischen Probe
LooxsterTM Blood wird ausschließlich für die Verwendung in Forschung und Entwicklung vertrieben.
SIRS-Lab ist zertifiziert nach DIN EN ISO 9001:2000
LooxsterTM Blood kombiniert effiziente Lyse auch
schwer lysierbarer Bakterien mit einer spezifischen
Anreicherung bakterieller DNA, basierend auf der
patentierten PureproveTM-Technologie
Probenvorbereitung für den Nukleinsäure-basierten
Nachweis von bakteriellen Erregern aus Vollblut.
Mit LooxsterTM Blood kann bakterielle DNA aus
Blutproben angereichert werden. LooxsterTM Blood
besteht aus der Extraktion der Gesamt-DNA mit anschließender Anreicherung bakterieller DNA. Hierzu
enthält der LooxsterTM Blood alle erforderlichen
Reagenzien und Verbrauchsmaterialien.
Innovatives System zur Probenvorbereitung für
Nukleinsäure-basierte Nachweise bakterieller
Erreger aus Vollblut
LooxsterTM Blood
SIRS-Lab GmbH
Winzerlaer Str. 2
07745 Jena
www.sirs-lab.de
Tel.: +49-(0)3641-508 430
Roberto C. Wolfer
Servicetelefon: +49-3641-508430
Technische Beratung Tel. +49-(0)3641-681-91969
LooxsterTM Universal wird ausschließlich für die Verwendung in Forschung und Entwicklung vertrieben.
SIRS-Lab ist zertifiziert nach DIN EN ISO 9001:2000
8. Service
Zertifizierung nach DIN ISO 9001ff vorauss. 2. Quartal
2006
Zertifizierung nach DIN ISO 9001ff vorauss. 2. Quartal
2006
7. CE-zertifiziert/Forschungseinsatz?
Mit LooxsterTM Universal kann unabhängig von der
Art der Probe bakterielle DNA angereichert werden.
Ausgehend von einer Gesamt-DNA-Präparation wird in
wenigen Wasch- und Elutionsschritten die bakterielle
DNA spezifisch angereichert. Hierzu enthält der LooxsterTM Universal alle erforderlichen Reagenzien und
Verbrauchsmaterialien.
LooxsterTM Universal basiert auf der patentierten PureproveTM-Technologie, die eine spezifische Bindung
bakterieller DNA ermöglicht.
verfügbar in verschiedenen Größen (25 Slides, 100
Slides, 500 Slides)
Kit-basierte Lösung bestehend aus Nexterion® Slide E,
Nexterion® 70mer Oligo Spot, Nexterion® 70mer Oligo
Pre-Hyb, Nexterion® 70mer Oligo Hyb, Nexterion® 70mer
Oligo Wash A, Nexterion® 70mer Oligo Wash B.
Somit sind die wichtigsten Schritte des Microarray-Prozesses: Spotten, Blocken, Hybridisieren und Waschen
abgedeckt. Alle Kit-Komponenten sind aufeinander
abgestimmt und optimiert für die Verwendung von
70mer Proben von Operon, aber auch für alle anderen
Oligonukleotidproben geeignet. • Der Kit gewährleistet
eine maximale Reproduzierbarkeit der Daten, und der
Aufwand zur Protokolloptimierung wird wesentlich
verringert.
Innovatives System zur Probenvorbereitung für nukleinsäure-basierte Nachweise bakterieller Erreger in medizinischer Forschung, Lebensmittel- und Umweltanalytik.
Geometrie: 75,6 mm x 25,0 mm (± 100 µm) • Dicke: 1,0
mm (± 50 µm) • Ebenheit: ≤ 50 µm • Prinzipiell reagieren alle nukleophilen Gruppen (NH2-, SH-, OH-) sofort
und irreversibel zu einer festen, kovalenten Bindung. •
Zusätzliche Schritte zur Immobilisierung wie UV-crosslinking sind nicht erforderlich. • Nexterion® Slide E ist
verpackt in stabilen Plastikboxen zu je 25 Stück
Durch die spezielle Beschichtung der Oberfläche wird
eine signifikante Erhöhung der Signalintensität erreicht
(bis zu 8mal höher im Vergleich zu konventionellen
Slides). • Die Epoxy-Oberfläche ermöglicht eine effiziente und feste Bindung der Biomoleküle und sorgt für
eine optimale Probenpräsentation. Die Nukleinsäuren
reagieren sofort mit der Epoxy-modifizierten Oberfläche
des Glassubstrates und gehen eine feste kovalente
Bindung ein. Die Dichte der Epoxygruppen auf der
Oberfläche ist über die gesamte Slide-Fläche konstant
und sorgt für eine optimale Bindungskapazität.
4. Kurzbeschreibung des Produktes
besonders geeignet für alle aminomodifizierten und
unmodifizierten Oligonukleotide
LooxsterTM Universal
6. Technische Daten
besonders geeignet für alle aminomodifizierten und
unmodifizierten Oligonukleotide • ebenfalls geeignet für
cDNA/PCR-Proben
3. Anwendungsgebiete
Nexterion® 70mer Oligo Microarraying Kit
SIRS-Lab GmbH
Winzerlaer Str. 2
07745 Jena
www.sirs-lab.de
Tel.: +49-(0)3641-508 430
Roberto C. Wolfer
Probenvorbereitung für den Nukleinsäure-basierten
Nachweis von bakteriellen Erregern
Nexterion® HiSens Slide E
2. Produktname
Microarray Solutions
SCHOTT Jenaer Glas GmbH
Otto-Schott-Straße 13
07745 Jena
Tel.: 49-(0)3641-681-91966
Fax: +49-(0)3641-681-970
coatedsubstrate@ schott.com
5. Organismus/Krankheit
Microarray Solutions
SCHOTT Jenaer Glas GmbH
Otto-Schott-Straße 13
07745 Jena
Tel.: 49-(0)3641-681-91966
Fax: +49-(0)3641-681-970
coatedsubstrate@ schott.com
1. Firmendaten, Ansprechpartner
PCR & CHIP-DIAGNOSTIK
6. Jahrgang | Nr. 6/2005 | 47
DECHEMA
Fachsektion Biotechnologie
Theodor-Heuss-Allee 25
D-60486 Frankfurt/Main
Tel.: +49-(0)-69-7564-289
Fax: +49-(0)-69-7564-272
www.dechema.de
Deutsche Gesell. für Proteomforschung
c/o MPI für Biochemie
Am Klopferspitz 18a
D-82152 Martinsried
Tel.: +49-(0)-89-8578-3964
Fax: +49-(0)-89-8578-2802
[email protected]
www.dgpf.org
Österreichische Gesell. für Biotechnologie
c/o Boehringer Ingelheim
Austria GmbH
Dr. Boehringer-Gasse 5-11
A-1121 Wien
Tel.: +43-(0)-1-80105-2311
Fax: +43-(0)-1-80105-9311
www.boku.ac.at/oegbt/
48 | 6. Jahrgang | Nr. 6/2005
RoboGene® Bird Flu H5N1 RNA Qualitative
Purification & Detection Modules
Qualitativer bzw. semi-quantitativen Direkterregernachweis anhand des RNA-Genoms
von H5N1 Vogelgrippeviren mittels Real-Time
Fluoreszenz PCR in verschiedenen Untersuchungmaterialien und Spezies
One-step Test zur Reinigung und zum spezifischen Direktnachweis von H5N1-Erregern bei
simultanem Nachweis einer internen KontrollRNA (Duplex-PCR)
2. Produktname
3. Anwendungsgebiete
4. Kurzbeschreibung des Produktes
V
E
5. Organismus/Krankheit
R
6. Technische Daten
B
Ä
N
D
Verband Deutscher Biologen
Corneliusstr. 6
D-80469 München
Tel.: +49-(0)-89-26024573
Fax: +49-(0)-89-26024574
[email protected]
www.vdbiol.de
Deutsche Gesellschaft für Genetik
c/o Genetisches Institut der
Universität Gießen
Heinrich-Buff-Ring 58-62
D-35392 Gießen
Tel.: +49-(0)-641-99-35463
Fax: +49-(0)-641-99-35469
www.gfgenetik.de
Gesellschaft für Signaltransduktion
c/o Prof. Dr. Ralf Hass
Med. Hochschule Hannover
AG Biochemie u. Tumorbiol.
D-30625 Hannover
Tel.: +49-(0)-511-532-6070
Fax: +49-(0)-511-532-6071
www.sigtrans.de
10. Preis (ab…Euro)
Empfohlene RT-PCR Enzyme nicht im Lieferumfang enthalten, lieferbar inklusive kompletter HTS Workstation (SpeedCyler 36/96,
SpeedScan PCR Endpunktreader, FasTrans
Pipettierautomat)
Einzelkomponenten Reagenz-Mix, HBV Kontroll-DNA, Sample-Tubes separat bestellbar,
telefonischer Customer-Support, auf Nachfrage praktisches Applikationstraining
8. Service
9. Extras / Besonderheiten
CE-Kennzeichnung angemeldet
E
7. CE-zertifiziert/Forschungseinsatz?
„Instant Buffer“-Technologie für die Probenvorbereitung, interne RNA-Kontrolle (synthetisches Gen) bereits stabilisiert in den RNAExtraktionsgefäßen enthalten, Kontroll-RNA in
Form „intelligenter“ PCR-Gefäße (beschichtete
PCR-Gefäße), TRIPLEHYB®-Detektionsformat
zum Echtzeit-Nachweis der Amplifikationsprodukte • Kit-Versionen sowohl für SpeedCycler,
ABI/iCycler, Rotor-Gene als auch LightCycler
erhältlich • Lieferbar im Umfang 50 bzw. 100
Tests pro Box, Lieferzeit: ca. 5-10 Tag
Geflügel, Mensch / Vogelgrippe H5N1
Analytik Jena Group
AJ Roboscreen GmbH
Delitzscher Strasse 135
D-04129 Leipzig
Tel.: +49-(0)341-9725970
Fax.: +49-(0)341)-9725979
www.roboscreen.com
Thomas Köhler
[email protected]
1. Firmendaten, Ansprechpartner
Empfohlene Taq-DNA-Polymerase nicht im
Lieferumfang enthalten, lieferbar inklusive
kompletter HTS-Workstation (SpeedCylcer
36/96, SpeedScan PCR Endpunktreader, FasTrans-Pipettierautomat)
Einzelkomponenten Reagenz-Mix, HBV Kontroll-DNA, Sample-Tubes separat bestellbar,
telefonischer Customer-Support, auf Nachfrage praktisches Applikationstraining
CE-Kennzeichnung voraussichtlich 04/2006
„Instant Buffer“-Technologie für die Probenvorbereitung, interne DNA-Kontrolle
(synthetisches Gen) bereits stabilisiert in den
DNA-Extraktionsgefäßen enthalten, HBV-Kontroll-DNA in Form „intelligenter“ PCR-Gefäße
(beschichtete PCR-Gefäße), TRIPLEHYB®
Detektionsformat zum Echtzeit-Nachweis
der Amplifikationsprodukte • Kit-Versionen
für SpeedCycler, ABI/iCycler, Rotor-Gene,
LightCycler als auch SmartCycler erhältlich
• Lieferbar im Umfang 50 bzw. 100 Tests pro
Box, Lieferzeit: ca. 5-10 Tage
Mensch / akute bzw. chronische HBV-Infektion
Test zur Reinigung und zum spezifischen
Direktnachweis von HBV-Erregern bei simultanem Nachweis einer internen Kontroll-DNA
(Duplex-PCR)
Quantitativer Direkterregernachweis anhand
des DNA-Genoms von Hepatitis B-Viren (HBV)
mittels Real-Time-Fluoreszenz-PCR in humanem Serum/Plasma.
RoboGene® Hepatitis B Virus (HBV) Purification
& Quantification Module
Analytik Jena Group
AJ Roboscreen GmbH
Delitzscher Strasse 135
D-04129 Leipzig
Tel.: +49-(0)341-9725970
Fax.: +49-(0)341)-9725979
Thomas Köhler
www.roboscreen.com
[email protected]
M A R K T Ü B E R S I C H T
Kontakt zu Verbänden
Im Jahr 2005 erscheint LABORWELT zweimonatlich. Alle Abonnenten des Branchen-Magazins |transkript sowie die Mitglieder der nachfolgenden
Gesellschaften erhalten LABORWELT regelmäßig mit freundlicher Empfehlung ihrer Organisationen. Wer sich darüber hinaus für einen Beitritt interessiert, erreicht die Gesellschaften unter folgenden Kontaktdaten:
Nationales Genomforschungsnetz
c/o DLR – Koblenzerstr. 112
53177 Bonn-Bad Godesberg
Tel.: +49-(0)-228-3821-331
Fax: +49-(0)-228-3821-332
[email protected]
www.ngfn.de
Deutsche Gesellschaft für Neurogenetik
c/o Institut für Humangenetik
Uni Gießen/Schlangenzahl 14
35392 Gießen
Tel.: +49-(0)-641-99-41600
Fax: +49-(0)-641-99-41609
www.med.uni-giessen.de
/genetik/dgng.html
Netzwerk Nutrigenomforschung
Arthur-Scheunert-Allee 114
14558 Bergholz-Rehbrücke
Tel.: +49-(0)-33200 88 385
Fax: + 49-(0)-33200 88 398
[email protected]
www.nutrigenomik.de
LABORWELT
S T E L L E N M A R K T
Akademischer Stellenmarkt
Veröffentlichen Sie Ihre Stellenanzeigen zielgruppengerecht in unserem akademischen Stellenmarkt, der allen nicht-kommerziellen Instituten für ihre
Stellenausschreibungen kostenlos zur Verfügung steht. Bitte senden Sie dazu ihre Anzeige (1/4 Seite 90 mm breit x 122,5 mm hoch, Logo – jpg oder tiff, 300
dpi Auflösung) an [email protected]. Annahmeschluß für die nächste LABORWELT-Ausgabe 1/06 (Erscheinungstermin 16.02.2006) ist der 27. Januar.
Paul-Ehrlich-Institut
Paul-Ehrlich-Straße 51 - 59, 63225 Langen, Telefon (06103) 77-11 00
Research activities at the Paul-Ehrlich-Institut (localized close to Frankfurt am Main) are based on the tradition of Paul Ehrlich’s work addressing questions in the fields of applied
and basic sciences. The section “Human Retroelements” of the Paul-Ehrlich-Institut has two open positions for highly motivated
PhD. STUDENTS E13/2 TVöD
The Grant-funded positions are available instantly for 3 years to study the biology of the human non-LTR retrotransposon SVA and the human endogenous retrovirus HERV-K. SVA
elements are fairly active and mobile in the human genome and closely related to the human LINE-1 retrotransposon, a major force shaping the human genome. SVAs and HERVK play an important role in genetic evolution and in the formation of genetic disorders and cancer. The projects to be worked on include: analysis of organization, structure and
evolution of SVA elements in the genomes of the primate /human lineage, characterization of the mechanism of SVA mobilization, identification of cis acting sequences and trans
acting factors controlling SVA and HERV-K transcription, epigenetic modifications involved in the regulation of retrotransposons, impact of HERV-K activation in cancer. For further
information see our website www.pei.de or contact Dr. Roswitha Löwer (06103/77-3400, [email protected]) and PD Dr. Gerald Schumann (06103/77-3105, [email protected]).
Candidates should hold a diploma or equivalent degree in Biology, Biochemistry or Chemistry and should have a strong background in molecular biology, cell biology and/or
genetics. Applications should include a detailed CV, copies of relevant documents and a brief description of research interests.
The annual salary of approximately 18.000 Euro before taxes and insurance will be in accordance with the -“Tarifvertrag öffentlicher Dienst”- (TVöD).
Non-residents will receive assistance in finding accommodation. Relocation expenses and/or a special allowance for living away from your present place of residence will be
paid in compliance with the legal regulations. Disabled applicants will be given preference over non-disabled competitors if their expertise and qualifications are equal. The
Paul-Ehrlich-Institut is an equal opportunity employer and women are encouraged to apply for this position.
Please send your application including a detailed CV, photo, a short summary of your professional career, and copies of your professional certificates to the “Personalreferat des Paul-Ehrlich-Instituts”, Paul-Ehrlich-Str. 51-59, 63225 Langen, Germany ([email protected]). Closing date: 24. November 2005
International Max Planck Research School
for Molecular and Cellular Life Sciences
Stellenausschreibung Nr. 38/2005 an der Bayerischen Landesanstalt für Landwirtschaft
– Institut für Pflanzenbau und Pflanzenzüchtung – Arbeitsbereich Genomanalyse (IPZ
1b) in Freising-Weihenstephan, ist im Rahmen eines DFG-Kooperationsprojektes
The International Max Planck Research School for Molecular and Cellular
Life Sciences in Munich, jointly conducted by the Max Planck Institutes
of Biochemistry, Neurobiology and Psychiatry in cooperation with the
Ludwig Maximilian University and the Technical University Munich, has
openings for,
wissenschaftliche/r Mitarbeiter/in (Doktorand/in)
PhD student positions
in international PhD program “Molecular and Cellular Life Sciences”
The interdisciplinary program, entirely taught in English, provides comprehensive training and research opportunities in molecular medicine, cell
biology, neurobiology, biochemistry and structural biology. The curriculum
includes introductory courses, interdisciplinary lecture series, advanced
method courses, tutorials/seminars and training in soft skills. Participants
are expected to graduate within 3-4 years.
Highly qualified candidates with a deep commitment to basic and/or clinical
research are invited to apply. Deadline for application is January 15, 2006;
classes will commence in October 2006.
For online application and further details, please visit our website.
Contact:
H.J. Schaeffer, PhD,
Program Coordinator
phone: 089 8578 2281
email: [email protected]
web: http://www.imprs-ls.de/
LABORWELT
International Max Planck
Research School for Molecular
and Cellular Life Sciences
Am Klopferspitz 18
82152 Martinsried/Munich
ab Frühjahr 2006 eine Stelle als
zu besetzen. Die Bezahlung erfolgt nach Vergütungsgruppe IIa/2 BAT.
Die Stelle ist vorerst auf 2 Jahre befristet.
Forschungsvorhaben: Fusarium-Resistenz von Winterweizen (Triticum aestivum):
Entwicklung und Kartierung funktioneller genetischer Marker mit Hilfe eines integrativen Ansatzes von Expressions- und Kandidatengenanalyse auf der Basis einer
validierten QTL-Karte
Aufgabenschwerpunkte:
– Etablierung eines Infektionssystems zur Untersuchung differentieller Genexpression während der Weizen-Fusarium-Interaktion.
– Identifizierung und Analyse differentiell exprimierter Gene mittels cDNAAFLP-Technik, quantitativer PCR und Northern Blots.
– Entwicklung molekularer Marker aus differentiellen cDNA-Fragmenten.
– QTL-Kartierung der funktionellen Marker in die bestehenden Populationen.
– Berechnung von Marker-Merkmal-Assoziationen.
Hierfür setzen wir folgende Qualifikationen und Fähigkeiten voraus:
– Abgeschlossenes Hochschulstudium der Agrar- oder Biowissenschaften
oder ähnliche Qualifikation, die zur Promotion berechtigt.
– Kenntnisse und Interesse an molekularbiologischen Methoden, insbesondere
auf dem Gebiet der Expressionsanalyse (RNA-Präparation, cDNA-Synthese,
RT-PCR) sowie an molekularen Markertechniken (AFLP, STS, SNP)
– Fähigkeit zum wissenschaftlichen Arbeiten.
– Erfahrungen mit statistischer Versuchsauswertung.
– Engagement, Flexibilität und Teamfähigkeit.
Ihre aussagekräftige Bewerbung richten Sie bitte – gerne auch per E-Mail – mit
Angabe der Stellenausschreibungsnummer – bis spätestens 20.12.2005 - an:
Bayerische Landesanstalt für Landwirtschaft, Sachgebiet AZV 2 „Personal“
Vöttinger Straße 38, 85354 Freising-Weihenstephan
E-Mail: [email protected]
Ansprechpartner im Institut: Hr. Dr. Schweizer - Tel. 08161/714065
Fr. Dr. Mikolajewski - Tel. 08161/714817
6. Jahrgang | Nr. 6/2005 | 49
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Micro-Wippenventil
mit Medientrennung
Mit einem Leichtgewicht (9 Gramm) im Rastermaß 10 mm und herausragenden Eigenschaften im Fluid-Handling hat Asco/Joucomatic seine Palette von Micro-Magnetventilen
erweitert. Der spezielle MICRO-Wippenmechanismus sorgt für höchste Sicherheit in
den sensiblen Einsatzbereichen der Analyse-,
Bio- und Medizintechnik.
Kennziffer 28 LW 06 · Informationen ordern? · www.biocom.de
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Aufreinigung genomischer DNA aus großen Volumina
Mit Tecans Freedom EVO gDNA XL aufgereinigte genomische DNA (gDNA) kann direkt
in Anwendungen wie Genotyping, GenomAnalysen oder PCR-Reaktionen eingesetzt
werden. Die genomische DNA kann aus
frischem, gekühltem oder auch gefrorenem
Vollblut extrahiert werden. Dazu werden die
Reagenzien vom Promega MagneSil Genomic
Large Volume System auf der Freedom EVOPlattform verwendet.
Der Freedom EVO gDNA XL ist ein leistungsfähiges, vollautomatisches System zur
Aufreinigung von gDNA in Primär-Röhrchen, ohne daß zusätzliche manuelle Schritte
notwendig sind. Das System erkennt das
Probenvolumen automatisch und skaliert die
benötigten Reagenzien entsprechend, ohne
zusätzliche Programmierschritte. Der Free-
dom EVO gDNA XL kann unbeaufsichtigt
betrieben werden und macht Zentrifugationsschritte und organische Lösungsmittel
überflüssig. Gerätegröße, Software und Protokolle sind skalierbar. Proben von 1 bis 10 ml
können einzeln oder in Chargen mit einer bis
96 Proben abgearbeitet werden.
Kennziffer 29 LW 06 · Informationen ordern? · www.biocom.de
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Instrument für die Pharmakogenomik in der Psychiatrie
Die medienberührten Teile der neuen Baureihe 067 bestehen aus hochwertigen Materialien wie PEEK (Gehäuse) und FFKM
(Membran).
Optimale Selbstentleerung, geringstes
Innenvolumen (13 µl), sehr gute Spülbarkeit,
dazu die Medientrennung zum Magnetantrieb sind die besonderen Eigenschaften des
Magnetventils. Der Einsatzbereich sind flüssige und gasförmige, hochreine und aggressive
Medien, im Druckbereich von Vakuum -0,9
bar bis 3 bar. Das Ventil ist in den Nennweiten
0,6 – 0,8 – 1,0 und 1,35 mm lieferbar.
Mit der geringen Leistungsaufnahme über
eine Power-Save-Elektronik ist auch ein Batteriebetrieb möglich. Der spezielle Wippenmechanismus in Verbindung mit der Trennmembran unterbindet den Wärmeeintrag
in das Medium und verhindert zusätzlich
den Klebeeffekt am Ventilsitz. Somit ist ein
sicheres Öffnen und Schließen sichergestellt.
Alle gängigen Steckeranordnungen, horizontal und vertikal mit Kontaktabständen von
2,54 mm und 5,08 mm sowie Kabellitzen, sind
als Standard lieferbar.
Bei den 2- und 3-Wegemagnetventilen können
vielfältige Anschlußvarianten ausgewählt
werden: Gewinde M5 und UNF, Schlauchtülle, Blocklösungen und spezielle kundenspezifische Variationen.
50 | 6. Jahrgang | Nr. 6/2005
Roche und die Mayo-Klinik entwickeln
gemeinsam den Prototypen eines IT-fähigen
Systems, mit dem das umfassende klinische
Know-how der Mayo-Klinik auf dem Gebiet
der Psychiatrie und der Pharmakogenomik
verfeinert und ausgeschöpft werden kann.
Das System nutzt dabei Patientendaten, die
mit dem AmpliChip CYP450-Test ermittelt
wurden. Es ist Roche Diagnostics’ erster
Diagnosetest auf Biochip-Basis, der im Januar
2005 von der FDA für die diagnostische Anwendung in den USA zugelassen wurde.
Der auf der DNA-Chip-Technologie von Affymetrix basierende Test erlaubt eine Analyse
des Genotyps der Cytochrom-P450-2D6- und
-2C19-Gene in der genomischen DNA aus
Blutproben von Patienten.
Die Testresultate gestatten es Ärzten,
bei der Wahl und Dosierung von Medikamenten zur Behandlung verschiedener
häufiger Krankheiten wie Herzerkrankungen, Schmerz und Krebs die für Patienten
charakteristische genetische Information zu
berücksichtigen.
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Neues Nukleinsäure-Präparationssystem QuickGene-610
Fujifilms erfolgreiche Serie an NukleinsäurePräparationssystemen wird um das QuickGene-610 erweitert. Aus größeren Probenmengen kann jetzt schnell und automatisch
hochreine Nukleinsäure mit noch größerer
Ausbeute präpariert werden.
Gegenüber den bisherigen Systemen
QuickGene-800 und QuickGene-810 läßt
QuickGene-610 das zehnfache Ausgangsvolumen zu. Während die anderen Fujifilm-Systeme DNA aus maximal 200 µl Probenvolumen extrahieren, kann das neue Gerät bis zu
2 ml Blut verarbeiten. QuickGene-610 besteht
neben dem platzsparenden Tischgerät aus
einem passenden Kit zur Nukleinsäure-Isolierung. Mit dem QuickGene DNA-Vollblut-Kit
S können sechs 2-ml-Proben in nur wenigen
Minuten verarbeitet werden. Damit sind
deutlich mehr Anschluß-Tests und -analysen
möglich. Zu geringe Ausgangsmengen für
die Untersuchung des Erbguts stellen kein
Problem mehr dar.
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Kompakt-System zur Zellkultivierung in Spinner-Flaschen Flexibles EC-Hochleistungsdes kompletten Kultivierungsprozesses. EinCellspin von Integra Biosciences ist ein
Detektionssystem
kompaktes Steuersystem zum Rühren von
Zellkulturen mit 100 bis 1.000 ml Volumen
und Rührgeschwindigkeiten von 5 bis
75 U/min. Das System besteht aus einer
feuchtigkeitsresistenten Rühreinheit und
einer abnehmbaren Steuereinheit. In bis zu
vier Spinnerflaschen gleichzeitig sorgt jede
Cellspin-Rühreinheit für einen schonenden
Kultivierungsprozeß. Die Cellspin-Flaschen
bieten ein vorteilhaftes Oberfläche-zu-Volumen-Verhältnis und garantieren so einen erhöhten Sauerstoffeintrag gegenüber anderen
gängigen Modellen. Die Standsicherheit der
Flaschen wird unabhängig von ihrer Größe
durch eine fixierende Ausbuchtung gewährleistet. Die Steuereinheit mit Permanentspeicher ermöglicht eine Vorprogrammierung
stellbar sind die automatische Anpassung der
Rührgeschwindigkeit, der Drehwinkel sowie
die Intervallpausen und Arbeitszeiten.
So können auch empfindliche Zellinien sicher kultiviert werden. Cellspin ermöglicht
dadurch sehr hohe Expressionsraten. Zwei
Cellspin-Systeme passen bequem in einen
herkömmlichen Brutschrank.
Kennziffer 32 LW 06 · Informationen ordern? · www.biocom.de
Die elektrochemische Detektion ist der anerkannte Standard für die hochempfindliche
und selektive Detektion in der HPLC. In
Verbindung mit ESA Biosciences’ patentierten
Elektroden ist der Coulochem III der einzige
EC-Detektor, der Redox-Funktionen in einer
einzelnen Zelle anbietet. Der mit allen HPLCSäulen kompatible Coulochem III bietet
die größte Vielfalt von Betriebsarten und
quantifiziert Pikogramm- bis FemtogrammMengen von oxidier- oder reduzierbaren neurochemischen, klinischen, pharmazeutischen,
Umwelt- und biologischen Verbindungen
innerhalb kürzester Zeit.

Kontinuierliches Dispensieren in Mikrotiterplatten
Thermo Electron hat seine Multidrop® Dispenser-Serie durch den neuen Multidrop
Combi erweitert. Er basiert auf der zuverlässigen Multidrop-Technologie und bietet
höhere Flexibilität, um den Anforderungen an
die Reagenzienausgabe in pharmazeutischen
und biotechnischen Laboren zu entsprechen.
Der Multidrop Combi arbeitet mit allen Standard-Plattenformaten (96-1.536) und paßt die
Plattenhöhe automatisch an. Hohe Präzision
über den Volumenbereich von 0,5 – 2.500 µl
garantiert reproduzierbare Ergebnisse.
Einfache Ansteuerbarkeit und Schnelligkeit
erleichtern die Integration in automatischen
Hochdurchsatz-Systemen. Zusammen mit
dem RapidStak-Stapler von Thermo bildet
der Multidrop Combi die zuverlässigste
Bench-Top-Automatisierungslösung für das
Dispensieren in Mikrotiterplatten.
Die moderne graphische Benutzeroberfläche vereinfacht, Abgabeparameter zu
wählen. Der Multidrop Combi kann sowohl
Flüssigkeiten verschiedener Viskositäten als
auch lebensfähige Zellen dispensieren.
Kennziffer 33 LW 06 · Informationen ordern? · www.biocom.de

Neues automatisches Gel-Dokumentationssystem
Berthold Technologies bietet mit dem
NightHAWK LB 984 ein neues Gel-Dokumentationssystem, das mit einer vollautomatischen digitalen CCD-Kamera ausgestattet
ist. Hohe Auflösung, Zoomfunktion und ein
Objektiv mit einem großen Brennweitenbereich stehen für die hervorragende Qualität
des Geräts. Die Kamera wird von der leicht
zu bedienenden HAWKview-Software
kontrolliert, die vielfältige Funktionen zur
Bildverarbeitung und Auswertung bietet.
Die Bilder werden als JPEG- oder TIFF-Daten
in einer integrierten Datenbank gespeichert.
Transilluminatoren sind in verschiedenen
Wellenlängen verfügbar (UV bis Blaulicht).
Mit den drei neuen Amphi-Farbstoffen
für die Protein-Elektrophorese und dem
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NightHAWK-Gel-Dokumentationssystem
bietet Berthold Technologies eine komplette
Lösung für jeden Proteomforscher.
Moderne Elektronik ermöglicht dem Coulochem III eine große Stabilität und sehr
niedrige Nachweisgrenzen. Darüber hinaus
ist das Integrated Organiser Module des
Coulochem III sehr platzsparend und bietet
eine geschützte, temperaturstabilisierte Umgebung für Säulen und Zellen.
Kennziffer 35 LW 06 · www.biocom.de
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Global Supplier Award 2005
YMC Co., Ltd. wurde mit dem 2005 Global
Supplier Award der Eli Lilly and Company
ausgezeichnet. YMC gilt als einer der führenden Anbieter von Kieselgel-Trägermaterialien
für die industrielle HPLC sowie Analyse von
pharmazeutischen Wertsubstanzen. Neben
Packungsmaterialien stellt YMC analytische
HPLC-Säulen her sowie Glassäulen und Geräte/Anlagen für die präparative Aufreinigung
von pharmazeutischen Substanzen. Ebenso
werden Auftragssynthesen und Methodenentwicklungen durchgeführt.
6. Jahrgang | Nr. 6/2005 | 51
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„Premier Application“-Status Präzise Werkzeuge verbessern PCR-Ergebnisse
Affymetrix Inc. hat das ArrayPlex-System von
Beckman Coulter Inc. zur „Premier Application“ für die automatisierte Ziel-RNA-Präparation erklärt. Dadurch kann Beckman Coulter
sein automatisches ArrayPlex-System nun
auch an Affymetrix-Kunden vertreiben.
Auch bei PCR-Verbrauchsmaterialien kommt
es auf die Qualität der Produkte an. Unterschätzt wird dabei oft die Qualität der eingesetzten Arbeitsmittel. Um nämlich qualitativ
hochwertige PCR-Produkte zu fertigen, ist es
einfach nötig die Anforderungen der Anwender und die Anwendung an sich zu kennen.
Deshalb werden PCR-Produkte von SLG®
von Molekularbiologen für Molekularbiologen in einer aufwändigen und hochpräzisen
Produktionsanlage gefertigt. Das umfaßt den
Einsatz erstklassiger Rohmaterialien ebenso
wie präzise Werkzeuge und kontrollierte
Fertigungsabläufe. Selbstverständlich sind
alle PCR-Produkte RNase- und DNase-frei
sowie frei von Metallen und Pyrogenen. So
entstehen hochwertige Produkte von gleichbleibender, verläßlichen Qualität.
Kennziffer 39 LW 06 · Informationen ordern? · www.biocom.de
Um sich für diesen Vorrangstatus zu qualifizieren, stellte Beckman Coulter unter
Beweis, daß es die hohen Qualitätsanforderungen von Affymetrix erfüllen kann. ArrayPlex ist ein schlüsselfertiges System, das
mit automatisierten Instrumenten, Software
und Protokollen auf der Biomek FX-Liquidhandling-Workstation arbeitet. Das Biomek
FX-System ermöglicht die automatische
Durchführung nahezu aller Forschungsanwendungen, einschließlich der Vorbereitung
von Proben für genetische Analysen.
Kennziffer 37 LW 06 · www.biocom.de
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G Storm-Thermocycler
Die neuen G Storm-Thermocycler von GRI
Ltd. im Vertrieb der AlphaMetrix Biotech
GmbH verbinden herausragende thermische
Eigenschaften mit einfacher Handhabung.
Ein farbiger Touchscreen mit selbsterklärender Bedienungsoberfläche macht das
Programmieren, das File-Management und
die Kontrolle des Cyclers so einfach wie nie
zuvor. Hier kann zwischen der geführten
manuellen Eingabe von neuen oder bereits
ausgearbeiteten Programmen oder der
Nutzung des Programm-Wizards gewählt
werden. Die Annealingtemperaturen und die
dazugehörigen Zeiten werden in Abhängigkeit der Benutzervorgaben berechnet. Jeder
Thermoblock des Cyclers hat vier unabhängige Temperaturkontroll-Sensoren und acht
Peltierelemente. Zur Optimierung von Protokollen ist die Gradientenprogrammierung
für alle Blöcke Standard. Gradienten können
zwischen 40 und 300 Grad variieren.
52 | 6. Jahrgang | Nr. 6/2005

RNeasy® Plus Mini-Kit mit gDNA Eliminator-Säulen
Der RNeasy Plus Mini-Kit von Qiagen verbindet eine schnelle und einfache RNA-Aufreinigung in weniger als 25 Minuten mit der
effektiven Abtrennung aller Verunreinigungen
durch genomische DNA. Der Kit eignet sich
für tierische Zellen sowie leicht aufzuarbeitende Gewebe und erzeugt aufgereinigte
RNA, die besonders für hochempfindliche
nachgeschaltete Anwendungen geeignet ist,
wie für die quantitative Real-time-RT-PCR.
Verunreinigungen durch genomische DNA
werden wirksam durch die Verwendung der
gDNA Eliminator-Spinsäulen im Zusammenspiel mit optimierten Lysepuffern verhindert.
Die Zell- oder Gewebelysate werden dabei
durch die Spinsäulen zentrifugiert, welche
schnell und hochselektiv die genomische DNA
aus den Lysaten abtrennen. Eine zeitraubende
DNase-Behandlung ist damit überflüssig.
Die Kombination von Buffer RLT Plus und
RNeasy-Spinsäulen führt so zu hohen und reproduzierbaren Gesamt-RNA-Ausbeuten. Der
Puffer sorgt dabei für optimale Lysebedingungen, um die Freisetzung der gesamten RNA in
der Probe zu gewährleisten. RNeasy-Spinsäulen binden die RNA mit hoher Affinität, so daß
Verunreinigungen vor der Elution wirksam
von der Säule gewaschen werden können. Das
Erzielen von hohen Agilent RIN-Werten deutet
dabei auf hochgradig intakte RNA.
Kennziffer 40 LW 06 · Informationen ordern? · www.biocom.de
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Flexibles RiOs™ 3 für Umkehrosmose-Wasser
Millipores RiOs 3-Wasseraufbereitungssystem
wurde für Anwendungsbereiche mit einem
täglichen Bedarf von 30 Litern hochreinem
Leitungswasser konzipiert. Es bedient unkritische Laboranwendungen wie das Waschen
von Hand oder die Pufferbereitung. Darüber
hinaus kann es auch als Brauchwasserbereiter
für Laborgerätewascher, Autoklaven und
Luftbefeuchter oder als Vorstufe für Reinstwassersysteme wie Millipores Synergy®- und
Milli-Q®-Systeme dienen.
Das RiOs 3 ist als Tischgerät oder mit
Wandhalterung erhältlich. Bei 20° C liefert
das Gerät 3 l Typ-III-Umkehrosmose-Wasser
pro Stunde. Das Wasser kann nach Bedarf
verwendet werden oder in einem 6 l fassenden Zwischentank gespeichert werden.
Die halbjährliche Wartung beschränkt sich auf
den Austausch der SmartPak™-Patrone, welche die Umkehrosmose-Membran enthält.
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Fax +49 (0)30 26 49 21-11
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 Beilage
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Institution:
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Anschrift: . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Tel./Fax: . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Auch im Internet unter www.biocom.de
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14.11.2005 11:24:07 Uhr
Impressum
LABORWELT (ISSN 1611-0854)
erscheint zweimonatlich im Verlag der
BIOCOM AG
Stralsunder Str. 58-59
D- 13355 Berlin
Tel./Fax: 030/264921-0 / 030/264921-11
eMail: [email protected]
Internet: www.biocom.de
Redaktion:
Dipl.-Biol. Thomas Gabrielczyk
Tel.: 030/264921-50
Anzeigenleitung:
E
R
V
I
C
19.-20.11.05: NGFN-Meeting 2005, Bonn
Info: Projektmanagement NGFN
(Tel./Fax: +49-228-3821-331/-332),
eMail: [email protected],
Web: www.science.ngfn.de)
20.-23.11.05: 43. Tutzing-Symposium:
Membranen und regenerative Medizin, Tutzing
Info: Dr. Karin Tiemann, DECHEMA e.V., Frankfurt a. M.
(Tel.: +49-69-7564-221, eMail: [email protected],
Web: www.dechema.de)
21.-22.11.05: Workshop: Monitoring von
klinischen Prüfungen, Heidelberg
Info: Monika Häring, FORUM, Institut für Management GmbH,
Heidelberg (Tel.: +49-6221-500-640,
eMail: [email protected],
Web: www.forum-institut.de)
21.-23.11.05: 7. Symposium Natural Attenuation
und 2. Statusseminar des BMBF-Förderschwerpunktes KORA, Frankfurt am Main
Oliver Schnell
Tel. 030/264921-45, eMail: [email protected]
Info: Sabine Sporleder, Dechema e.V., Frankfurt/M.
(Tel./Fax: +49-69-7564-129-235/-176,
Web: www.dechema.de)
Leserservice:
22.11.05: IT-Konzepte und -Lösungen im
Life Sciences-Bereich, Berlin
Angelika Werner
Tel. 030/264921-40
E
Info: Sun Microsystems GmbH (Tel.: +49-2102-4511-0,
Fax: +49-2102-4995-16, Web: www.sun.de)
Bildtechnik und Layout:
22.11.05: InnoPlanta Forum 2005, Magdeburg
Graphik-Design:
23.-24.11.05: BioNanoMaT –
Bioinspired Nanomaterials for Medicine and
Technologies, Marl
Heiko Fritz
Michaela Reblin
Druck
Mayer & Söhne, D- 86551 Aichach
Mitglieder der DECHEMA-Fachsektion
Biotechnologie, der Österreichischen
Gesellschaft für Biotechnologie ÖGBT, der
Gesellschaft für Genetik GfG, der Deutschen
Gesellschaft für Proteomforschung DGPF,
des Verbandes Deutscher Biologen
vdbiol, der Deutschen Gesellschaft für
Neurogenetik DGNG, der Gesellschaft für
Signaltransduktion STS, des Vereins zur
Förderung der Nutrigenomforschung,
der Biotechnologischen Studenteninitiative
e.V. (btS) sowie die Wissenschaftler des
Nationalen Genomforschungsnetzes NGFN
erhalten die Zeitschrift im Rahmen ihrer
Mitgliedschaft.
Für einen regelmäßigen Bezug von
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Fax (siehe Seite 53) erforderlich.
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Autoren. Alle Beiträge sind urheberrechtlich
geschützt. Ohne schriftliche Genehmigung
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Info: M. Neumann, DECHEMA e.V., Frankfurt/M.
(Tel.: +49-69-7564-254, eMail: [email protected],
Web: www.dechema.de)
24.-25.11.05: 2. Glycan-Forum, Berlin
Info: Dr. Gesche Harms, Charité Universitätsmedizin Berlin
(Tel./Fax: +49-30-8445-1548/-1541,
eMail: [email protected], Web: www.glyconet.de)
24.11.05: Vom Laborversuch zur
Herstellungserlaubnis, Hamburg
Info: TuTech Innovation GmbH
(Tel./Fax: +49-40-76629-6346/-6349,
eMail: [email protected],
Web: www.tutech.de/qz)
24.11.05: Drug Development – Academia –
Biotech – Pharma, Würzburg
Info: Bayern Innovativ GmbH
(Tel./Fax: +49-911-20671-140/-766)
eMail: [email protected],
Web: www.bayern-innovativ.de)
25.11.05: Festkolloquium anläßlich der Überreichung des DECHEMA-Preises 2005 der MaxBuchner-Forschungsstiftung, Frankfurt am Main
Info: DECHEMA e.V., Frankfurt/M.
(Tel.: +49-69-7564-375,
eMail: [email protected],
Web: www.dechema.de/kolloquien)
30.11.-01.12.05: EuroPLX 26 – Vereinbarungen
über Kollaborationen bei Dossiers, Lohnsynthese
und -herstellung, F&E-Dienstleistungen sowie
Aktiven Pharmazeutischen Wirkstoffen (APIs),
Porto (P)
Diese Ausgabe enthält eine Beilage der
Promega GmbH
Info: RauCon.Com, Dielheim
(Tel./Fax: +49-6222-980-70/-777,
eMail: [email protected],
Web: www.europlx.com)
© BIOCOM AG, Berlin
® BIOCOM ist eine geschützte Marke der
BIOCOM AG, Berlin
30.11.05: Neue molekularbiologische Ansätze in
der onkologischen Forschung, Mannheim
BIOCOM AG
®
54 | 6. Jahrgang | Nr. 6/2005
Info: Dr. Birgit Stadler, Universität Heidelberg
(Tel.: +49-6221-54-7815,
eMail: [email protected],
Web: www.afw.uni-hd.de)
01.12.05: German Biotech goes Wertschöpfung,
Frankfurt am Main
Info: GDCh, Vereinigung Chemie & Wirtschaft
(Tel./Fax: +49-69-619-942-73/-49,
eMail: [email protected],
Web: www.gdch-chemiewirtschaft.de
02.12.05: Germany and Europe –
Partnership in regenerative Medicine, Berlin
Info: Ulrike Schwemmer, Dt. Ges. für Regenerative Medizin e.V.
(Tel.: +49-69-619-951-19,
eMail: [email protected],
Web: www.gesellschaft-regenerative-medizin.de)
2.12.-3.12.05: 21. Ernst-Klenk-Symposium in
Molecular Medicine Atherosclerosis:
Mediators, Mechanisms and Interventions, Köln
Info: Dr. Großkopf-Kroiher, Zentrum für Molekulare Medizin,
Universität Köln, (Tel./Fax: +49-221-478-5552/-4833,
Web: www.zmmk.uni-koeln.de/klenk_2005/program
05.-06.12.05: 2. Statusseminar ChemBioNet,
Frankfurt am Main
Info: Renate Strauss/Barbara Feißt, DECHEMA e.V.
(Tel./Fax: +49-69-7564-333/-44,
Web: www.dechema.de)
07.-11.12.05: Workshop on Cell Biology &
Microscopy for PhD-students and young
Postdocs, Grünstadt an der Weinstraße
Info: (eMail: [email protected], Web: www.imb-jena.de)
08.12.05: Homogene Katalyse an festen Phasen:
Biomimetische Katalysatoren, Katalysatorrecyclierung und enantioselektive Katalyse,
Frankfurt am Main
Info: DECHEMA e.V., Frankfurt/M.
(Tel./Fax: +49-69-7564-375/-272,
eMail: [email protected],
Web: www.dechema.de/kolloquien)
08.12.05: Mit Biotechnologie wieder zur Apotheke
der Welt, Dresden
Info: biosaxony (Tel./Fax: +49-351-7965-105/-110,
eMail: [email protected], Web: www.biotop.de/termine)
12.-14.12.05: 7. Dresdner Sensor-Symposium,
Dresden
Info: Prof. Dr. J.P. Baselt, Forschungsgesellschaft für
Meßtechnik, Sensorik und Medizintechnik c/o Dechema
(Tel.: +49-69-7564-227,
eMail: [email protected],
Web: www.dechema.de)
19.01.06: Simulation zur Analyse und Optimierung von Bioprozessen, Frankfurt am Main
Info: DECHEMA e.V., Frankfurt/M.
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19.01.06: Deutschland – Gentechnologisches
Entwicklungsland?, Berlin
Info: Berlin-Brandenburgische Akademie der Wissenschaften
(Tel./Fax: +49-30-20370-0/-600,
eMail: [email protected],
Web: www.bbaw.de)
30.-31.01.06: Sichere Zulassung bei der FDA,
Düsseldorf
Info: Pharmaceutical Training Institute (PTI)
(Tel./Fax: +49-6196-585-131/-485,
eMail: [email protected],
Web: www.pti-aktuell.de)
13.-14.02.06: Seminar: Grundlagen der
Fermentation, Freising
Info: Prof. Dr. Franz Thurner, FH Weihenstephan/Fachbereich
Biotechnologie (Tel.: +49-08161-714059/-715116,
eMail: [email protected],
Web: www.fh-weihenstephan.de)
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Biologicals Manufacturing
22-23 November 2005, London, England
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ViB events are proud to announce our forthcoming conference on Biological
Manufacturing due to be held in London in November this year. We have built
upon the success of the previous conference and this time we have included
more case study presentations and more roundtable discussions to make it the
best ever conference to date.
We have continued to source the most experienced speakers in the industry to
share their thoughts and ideas with you over the two days. Our expert panel of
speakers include:
� Dr Tony Bradshaw, Bioprocessing Industry Development Director, BIOINDUSTRY
ASSOCIATION (UK)
� Stephanie Schnicke, PhD, Manager, Technical Regulatory Affairs, Pharmaceutical
Biotech Production and Development, ROCHE DIAGNOSTICS
� Dr Steve Berezenko, Director of Research and Development, DELTA BIOTECHNOLOGY
� Dr Klaus Kaiser, Manager for Downstream Processing of Antibodies, BAYER
HEALTHCARE
� Simon Rothen, COO, BERNA BIOTECH
� Christian Hofmann, Ph. D., Chief Scientific Officer, APIT LABORATORIES
� Dr. Juergen Frevert, Chief Scientific Officer, BIOTECON THERAPEUTICS
� Steffen Goletz, CEO, GLYCOTYPE
� Harry Boelens Ph.D., Director DSP Large Scale-1 (DSP LS-1), DIOSYNTH
BIOTECHNOLOGY EUROPE
Some of the topics our experts will cover during the two-days are:
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Manufacturing challenges in the production of cancer vaccines
Technology transfer
Stability and Formulation Issues in the Manufacture of Recombinant Albumin
Current trends in downstream processing
The use of disposables in biologicals production
GlycoEngineering and Glycoprofiling of cells and cell lines
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