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ENZYMATISCHE TRANSFORMATION VERSCHIEDENER
FLAVONOIDE DURCH DAS EXTRAZELLULÄRE PILZENZYM
AGROCYBE-AEGERITA-PEROXYGENASE
Vom Institutsrat des Internationalen Hochschulinstitutes Zittau und der Fakultät Mathematik und
Naturwissenschaften der Technischen Universität Dresden
genehmigte
DISSERTATION
zur Erlangung des akademischen Grades
doctor rerum naturalium
(Dr. rer. nat.)
vorgelegt
von Diplom-Chemikerin (FH)
Kateřina Barková (geb. Linhartová)
geboren am 16. April 1983 in Liberec (Tschechische Republik)
Gutachter: Herr Prof. Dr. Martin Hofrichter, TU Dresden - IHI Zittau
Frau Prof. Dr. Annett Fuchs, Hochschule Zittau/Görlitz
Herr Prof. Dr. Frieder Schauer, Universität Greifswald
Zittau, den 19. Juli 2013
I
Inhaltsverzeichnis
Inhaltsverzeichnis
Abbildungsverzeichnis .......................................................................................................................... IV
Tabellenverzeichnis................................................................................................................................ V
Abkürzungsverzeichnis ........................................................................................................................VII
Zusammenfassung ................................................................................................................................. XI
Summary .............................................................................................................................................XIII
Shrnutí ..................................................................................................................................................XV
1
2
Einleitung - Zielsetzung .................................................................................................................. 1
1.1
Schwerpunkt 1: Enzymatische Synthese................................................................................ 1
1.2
Schwerpunkt 2: Einfluss von Flavonoiden auf die Enzymbildung ........................................ 4
1.3
Vorgehensweise und Methoden ............................................................................................. 4
Stand der Forschung........................................................................................................................ 5
2.1
Flavonoide als kosmetisch und pharmazeutisch relevante Wirkstoffe .................................. 5
2.1.1
Vorkommen ....................................................................................................................... 6
2.1.2
Eigenschaften und Wirkungen........................................................................................... 7
2.1.3
Flavonoide und die menschliche Gesundheit .................................................................... 9
2.1.3.1
Antioxidative Wirkung ........................................................................................... 10
2.1.3.2
Schutz vor Herz-Kreislauf-Erkrankungen .............................................................. 13
2.1.3.3
Immunmodulatorische Wirkung ............................................................................. 14
2.1.3.4
Antimikrobielle Wirkung........................................................................................ 14
2.1.4
Biosynthese von Flavonoiden.......................................................................................... 15
2.1.5
Bioverfügbarkeit und Verstoffwechselung...................................................................... 19
2.1.6
Gewinnung von Flavonoiden und Oxyfunktionalisierung............................................... 20
2.1.6.1
Isolierung aus biologischen Materialien ................................................................. 20
2.1.6.2
Hydroxylierung – chemisch .................................................................................... 20
2.1.6.3
Hydroxylierung – biotechnologisch........................................................................ 22
2.2
Flavonoidreiche Pflanzen – Begründung der Auswahl........................................................ 23
2.2.1
Aronia melanocarpa ........................................................................................................ 24
2.2.2
Trifolium pratense ........................................................................................................... 24
2.2.3
Bellis perennis ................................................................................................................. 25
2.2.4
Fragaria ananassa .......................................................................................................... 25
2.3
Enzymatische Transformationen der Agrocybe-aegerita-Peroxygenase (AaeAPO) ........... 25
2.3.1
Agrocybe-aegerita-Peroxygenase (AaeAPO) – Aufbau und Katalysemechanismus ...... 26
2.3.2
Agrocybe-aegerita-Peroxygenase (AaeAPO) – Hydroxylierung / Oxygenierung........... 30
2.3.3
Agrocybe-aegerita-Peroxygenase (AaeAPO) – Funktion................................................ 31
II
Inhaltsverzeichnis
3
Material und Methoden ................................................................................................................. 32
3.1
Geräte und Chemikalien....................................................................................................... 32
3.2
Versuchsorganismen ............................................................................................................ 32
3.3
Kulturmedien ....................................................................................................................... 32
3.3.1
Agar-Medien.................................................................................................................... 32
3.3.2
Flüssigmedien.................................................................................................................. 32
3.3.2.1
Sojabohnenmehl-Medium....................................................................................... 32
3.3.2.2
Kirk-Acetat-Medium............................................................................................... 32
3.4
AaeAPO - Enzymgewinnung und Reinigung ...................................................................... 33
3.5
Bestimmung der Proteinkonzentration................................................................................. 33
3.6
Bestimmung enzymatischer Aktivitäten .............................................................................. 34
3.6.1
Laccase (Lacc, EC 1.10.3.2)............................................................................................ 34
3.6.2
Agrocybe aegerita (AaeAPO, EC 1.11.2.1)..................................................................... 34
3.6.3
Mangan-Peroxidase (MnP, EC 1.11.1.13)....................................................................... 35
3.7
Extraktionsmethoden ........................................................................................................... 35
3.7.1
3.7.1.1
Mikrowellenextraktion............................................................................................ 35
3.7.1.2
Ultraschallextraktion............................................................................................... 35
3.7.2
Fragaria ananassa .......................................................................................................... 36
3.7.3
Trifolium pratense, Bellis perennis.................................................................................. 36
3.7.4
Festphasenextraktion (SPE)............................................................................................. 36
3.8
Analysenmethoden............................................................................................................... 37
3.8.1
HPLC (high performance liquid chromatography) ......................................................... 37
3.8.1.1
HPLC-MS (Methoden 1, 2) .................................................................................... 37
3.8.1.2
HPLC-DAD (Methoden 3, 4) ................................................................................. 37
3.8.1.3
Präparative HPLC-DAD ......................................................................................... 38
3.8.2
4
Aronia melanocarpa ........................................................................................................ 35
NMR ................................................................................................................................ 39
Ergebnisse und Diskussion............................................................................................................ 40
4.1
Enzymgewinnung ................................................................................................................ 40
4.2
Enzymatische Transformationen ausgewählter Flavonoide mittels AaeAPO...................... 40
4.2.1
Orientierende Vorversuche.............................................................................................. 40
4.2.2
Variation der Reaktionsbedingungen der enzymatischen Transformationen .................. 47
4.2.2.1
Variation der Enzymkonzentration bei einmaliger Wasserstoffperoxidzugabe und
Durchführung von Langzeitversuchen ...................................................................................... 48
4.2.2.2
Diskontinuierliche mehrmalige Wasserstoffperoxidzugabe ................................... 51
4.2.2.3
Kontinuierliche Wasserstoffperoxidzugabe (Spritzenpumpenversuche) ................ 52
4.2.3
Enzymatische Versuche zu weiteren Flavonoiden .......................................................... 55
III
Inhaltsverzeichnis
4.2.3.1
Enzymatische Transformation von Flavanonen...................................................... 56
4.2.3.2
Enzymatische Transformation von Flavonen ......................................................... 61
4.2.3.3
Enzymatische Transformation von Flavonolen ...................................................... 66
4.2.3.4
Enzymatische Transformation von Isoflavonen ..................................................... 69
4.2.4
Strukturaufklärung........................................................................................................... 73
4.2.4.1
Referenzverbindungen ............................................................................................ 73
4.2.4.2
Ergebnisse der NMR-Analysen .............................................................................. 74
4.2.5
Vergleichende Diskussion der untersuchten Substanzklassen......................................... 88
4.2.6
Enzymatische Transformation – Intermediäre Epoxidbildung ........................................ 90
4.2.7
Enzymatische Transformation - Herkunft des Sauerstoffs .............................................. 92
4.2.8
Enzymatische Transformation - Kinetik.......................................................................... 93
4.3
Untersuchung flavonoidhaltiger Pflanzenextrakte............................................................... 95
4.3.1
Extraktherstellung............................................................................................................ 95
4.3.1.1
Beschleunigte Lösungsmittelextraktion (ASE)....................................................... 95
4.3.1.2
Mikrowellenextraktion............................................................................................ 95
4.3.1.3
Ultraschallextraktion............................................................................................... 96
4.3.2
Identifizierung der Inhaltsstoffe ...................................................................................... 96
4.3.2.1
Aroniabeeren-Extrakte............................................................................................ 96
4.3.2.2
Erdbeerblätter-Extrakte......................................................................................... 100
4.3.2.3
Gänseblümchen-Extrakte...................................................................................... 101
4.3.2.4
Rotklee-Extrakte ................................................................................................... 103
4.4
Wirkung der polyphenolischen Phytoextrakte auf die Enzymproduktion ......................... 105
4.4.1
Agrocybe aegerita.......................................................................................................... 105
4.4.1.1
4.4.2
Bjerkandera adusta........................................................................................................ 109
4.4.2.1
4.4.3
Lösungsmitteleinfluss (Ethanol) ........................................................................... 108
Lösungsmitteleinfluss (Ethanol) ........................................................................... 111
Vergleichende Diskussion der Induktionsversuche....................................................... 112
5
Ausblick ...................................................................................................................................... 114
6
Quellenverzeichnis ...................................................................................................................... 116
Anhang ................................................................................................................................................ 135
IV
Abbildungs-/Tabellenverzeichnis
Abbildungsverzeichnis
Abbildung 1: Strukturelle Klassifikation der Flavonoide ....................................................................................... 5
Abbildung 2: Derivate des 2-Phenylchromans – Einteilung nach dem Oxidationsgrad der C-Atome 2, 3 und 4 des
Chromanrings (links) und Beispiel für O-Glykosid (rechts). ......................................................................... 6
Abbildung 3: Vorgeschlagener Flavonoidtransportmechanismus (Transport: I direkt, II vesikulär); modifiziert
nach [Kitamura, 2006].................................................................................................................................... 6
Abbildung 4: Intramolekulare Wasserstoffbrücken beim 3, 5-Dihydroxyflavon, die zur Zyklisierung in zwei
Ringen (α, β) und zu einer geringeren Polarität der Verbindung führen........................................................ 7
Abbildung 5: Mögliche Eisen(II)-Quercetinchelate (1:1), Stabilität: IIIa>IIa>Ia [Leopoldini et al., 2006] ........... 8
Abbildung 6: Termination der Flavonoidradikalkette über Wasserstoffabstraktion von der benachbarten
Hydroxygruppe, die am Kohlenstoffatom mit positiver Spindichte gebunden ist [Seyoum et al., 2006]. ... 12
Abbildung 7: 3D-Darstellung der Spindichte im Luteolinradikal-4' (OH•). ......................................................... 12
Abbildung 8: Quercetin weist eine besonders starke antioxidative Wirkung auf.................................................. 13
Abbildung 9: Die häufigsten Hydroxylierungs- (einfacher Pfeil) bzw. Glykosylierungsstellen (doppelter Pfeil) an
Flavonen sowie Flavonolen (a) und Isoflavonen (b) [Stobiecki & Kachlicki, 2006] ................................... 13
Abbildung 10: Biosynthese der Flavonoide – schematische Darstellung mit enzymatischen Schritten, die zur
Bildung der Hauptverbindungsklassen der Flavonoide führen [Winkel, 2006]. .......................................... 16
Abbildung 11: Glykosylierung von Apigenin durch die UF7GT (UDP-Glucose:Flavonoid-7Glukosyltransferase)..................................................................................................................................... 17
Abbildung 12: Bildung von Hydroxybenzoesäuren ausgehend von Hydroxyzimtsäuren in Pflanzen. Enzyme: 1.
CoA-Ligase (Synthetase + ATP), Enoyl-CoA-Hydratase, 2. Dehydrogenase (NAD+ / FAD), 3.
βKetothiolase) ................................................................................................................................................ 18
Abbildung 13: Umsetzung von Dihydromyricetin zum violetten Delphinidin in einem transgenen Dianthus.
(Dianthus caryophyllus; copyright 2003-2006 by John Sangwon Lee, M. D. FAAP)................................. 19
Abbildung 14: Kristalle der (a) AaeAPO II (bei pH 8,5; Länge 1,2 mm), (b) AaeAPO II (bei pH 5,6) und (c)
AaeAPO II (bei pH 4,6), (d) orthorombisch flächenzentriertes Kristallgitter [Piontek et al., 2010] ............ 27
Abbildung 15: Häm (Fe markiert) (rechts) und seine nähere Umgebung an der proximalen Seite der AaeAPO
bestehend aus einem helikalen Segment, das ein Cystein (R1) beinhaltet. ................................................... 28
Abbildung 16: Extra- versus intrazelluläre Hydroxylierung von Naphthalin – AaeAPO versus CYP450
Monooxygenase [modifiziert nach Ullrich & Hofrichter, 2005].................................................................. 29
Abbildung 17: Hypothetischer katalytischer Zyklus der AaeAPO am Beispiel der Naphthalinhydroxylierung... 29
Abbildung 18: HPLC-Chromatogramme der Daidzeinumsetzung mittels AaeAPO in Gegenwart (b) und
Abwesenheit (c) von Vitamin C; Kontrolle ohne Enzym (a): ...................................................................... 44
Abbildung 19: Hypothetische Wege Peroxygenase-katalysierter Reaktionen mit Apigenin als phenolisches
Substrat......................................................................................................................................................... 45
Abbildung 20: Flavonoid-Redoxzyklus. ............................................................................................................... 46
Abbildung 21: Hemmung der AaeAPO-Aktivität durch DMF und DMSO .......................................................... 47
Abbildung 22: Vergleich der Daidzeiumsetzungen mittels AaeAPO im Kurzzeitversuch (b) und Langzeitversuch
(c), Kontrolle (a). 1 - Demethyltexasin, 2 - Daidzein................................................................................... 50
Abbildung 23: Zeitlicher Verlauf der Umsetzung von Apigenin in Abhängigkeit von der H2O2-Dosierung; 1x einmalige H2O2-Zugabe (1 mM); 10x - zehnmalige H2O2-Zugabe (portionsweise ad 1 mM). .................... 52
Abbildung 24: Vergleich der Daidzeinumsetzung mittels AaeAPO im Spritzenpumpenversuch über 8 h (b) und
im Lanzeitversuch (c), Kontrolle (a). 1 - Demethyltexasin, 2 – Daidzein.................................................... 55
Abbildung 25: Vergleich der UV-Vis-Spektren von Quercetagetin (durchgängige Linie) mit dem gefundenen
monohydroxylierten Isorhamnetin (gestrichelte Linie). ............................................................................... 68
Abbildung 26: Auf Basis von Referenzsubstanzen identifizierte Wege der Oxidation von Flavonoiden durch die
AaeAPO........................................................................................................................................................ 73
Abbildung 27: Enzymatische Umsetzungen (inklusive Folgereaktionen) für die Isoflavone Formononetin und
Biochanin A. ................................................................................................................................................ 74
Abbildung 28: Zeitlicher Verlauf der Umsetzung von Apigenin unter semikontinuierlicher Versuchsführung... 76
Abbildung 29: Chromatogramm zur präparativen Trennung von Apigenin (2) und seinem
Hydroxylierungsprodukt (1) mittels HPLC unter Angabe verschiedener Sammelfraktionen (Vials 1-3).... 79
Abbildung 30: 1H-NMR- (fett) und 13C-NMR-Daten des Apigenins.................................................................... 80
Abbildung 31: 1H- NMR- (fett) und 13C-NMR-Daten des 6-Hydroxyapigenins (Scutellarein)............................ 81
Abbildung 32: 1H-NMR- (fett) und 13C-NMR-Daten des 7-Hydroxyflavanons ................................................... 81
Abbildung 33: 1H-NMR- (fett) und 13C-NMR-Daten des 6,7-Dihydroxyflavanons. ............................................ 82
Abbildung 34: 1H-NMR- (fett) und 13C-NMR-Daten des 6-Hydroxyflavons. ...................................................... 83
V
Abbildung 35: 1H- NMR- (fett) und 13C-NMR-Daten des 5, 6-Dihydroxyflavons............................................... 84
Abbildung 36: 1H-NMR- (fett) und 13C-NMR-Daten des 7-Hydroxyflavons. ...................................................... 85
Abbildung 37: 1H-NMR- (fett) und 13C-NMR-Daten des 6,7-Dihydroxyflavons................................................. 85
Abbildung 38: 1H-NMR- (fett) und 13C-NMR-Daten des Luteolins. .................................................................... 87
Abbildung 39: 1H-NMR- (fett) und 13C-NMR-Daten des 6-Hydroxyluteolins. .................................................... 87
Abbildung 40: Veranschaulichung der „störenden“ Gruppen, die die AaeAPO-Katalyse erschweren................. 88
Abbildung 41: HPLC-Chromatogramme der Flavon-Umsetzung durch die AaeAPO mit eingefügten UV-VisSpektren der Edukte und Produkte:.............................................................................................................. 91
Abbildung 42: Reaktionsmechanismus der Flavonhydroxylierung mittels AaeAPO............................................ 91
Abbildung 43: Ausschnitt aus dem HPLC-Chromatogramm der Flavanon-Umsetzung durch die AaeAPO: ...... 92
Abbildung 44: HPLC-Chromatogramme der Daidzein-Umsetzung (b, c) durch AaeAPO in Gegenwart von
H216O2 (b) und H218O2 (c) mit eingefügten MS-Spektren der Produkte; a – Kontrolle ohne Enzym: .......... 92
Abbildung 45: Apparente Michaelis-Menten-Kinetik für Apigenin (Wasserstoffperoxidkonzentration 2,0 mM);
x-Achse: Substatkonzentration, y-Achse: Reaktionsgeschwindigkeit.......................................................... 94
Abbildung 46: HPLC-Elutionsprofil des Aronia-Extraktes (Mikrowellenextraktion, 50 ºC). .............................. 97
Abbildung 47: HPLC-Elutionsprofil des Aronia-Extraktes (Ultraschallextraktion, US4). ................................... 98
Abbildung 48: HPLC-Elutionsprofil des Aronia-Extraktes (Ultraschallextraktion, US5). ................................... 98
Abbildung 49: Erdbeerblätterextrakt: (ethanolisch):........................................................................................... 100
Abbildung 50: Erdbeerblätterextrakt: (Wasser/ethanolisch): .............................................................................. 101
Abbildung 51: Gänseblümchenextrakt (Wasser/ethanolisch): ............................................................................ 102
Abbildung 52: Gänseblümchen-Extrakt (ethanolisch): ....................................................................................... 103
Abbildung 53: Rotklee-Extrakt (Wasser/ethanolisch): ....................................................................................... 104
Abbildung 54: Rotklee-Extrakt (ethanolisch): .................................................................................................... 105
Abbildung 55: AaeAPO-Aktivität in Abhängigkeit von verschiedenen Ethanol-Konzentrationen (Zugabe an
unterschiedlichen Kulturtagen) .................................................................................................................. 108
Abbildung 56: Laccase-Aktivität in Abhängigkeit von verschiedenen Ethanol-Konzentrationen (Zugabe an
unterschiedlichen Kulturtagen) .................................................................................................................. 109
Tabellenverzeichnis
Tabelle 1: Fallstudien Ressourceneinsparung- und Umweltentlastungspotenziale biotechnologischer Verfahren
[OECD, 2001] (~…gleich, ?...keine Angaben; 7-ACA… 7-aminocephalosporanic acid)............................. 3
Tabelle 2: Antioxidative Schutzmechanismen zur Eliminierung aggressiver Sauerstoffspezies .......................... 10
Tabelle 3: Berechnete Differenzen der Bildungswärme im Zuge der Entstehung möglicher Radikale
ausgewählter Flavonoide [Seyoum et al., 2006]........................................................................................... 12
Tabelle 4: Fraktionssammler – stoffspezifische Sammelzeiten und Wellenlängen für 6-Hydroxyflavon, 7Hydroxyflavanon, 7-Hydroxyflavon und Luteolin....................................................................................... 39
Tabelle 5: Ausgewählte Eigenschaften der in den Vorvesuchen untersuchten Flavonoide. LM – Lösungsmittel,
MeOH – Methanol, DMF – N,N-Dimethylformamid. Bemerkung: Spektraldaten sind dem jeweiligen
Stoffzertifikat des Herstellers entnommen. .................................................................................................. 40
Tabelle 6: Versuchsreihe 1 zum Flavon (ohne Zusatz von DMF) ........................................................................ 41
Tabelle 7: Versuchsreihe 2 in 21 % (v/v) DMF; für alle Testverbindungen ......................................................... 41
Tabelle 8: Versuchsreihe 3 in 21 % (v/v) DMF und Gegenwart von Vitamin C; für alle Testverbindungen; 3b mit
H218O2; 3c für Flavon (57 μl bzw. 58 μl H2O, 0 μl DMF); 3d entspricht 3c mit H218O2 .............................. 42
Tabelle 9: Umsetzung verschiedener Flavonoide durch AaeAPO (orientierende Vorversuche)........................... 42
Tabelle 10: Versuchsschema 4 (Vitamin C, 21 % (v/v) DMF), Bsp. 1,9 U/l AaeAPO......................................... 48
Tabelle 11: Ergebnisse der Versuche unter einmaliger Wasserstoffperoxidzugabe, Reaktionszeit 2 min, TC –
total conversion ............................................................................................................................................ 48
Tabelle 12: Übersicht zu den Ergebnissen der Langzeitversuche ......................................................................... 50
Tabelle 13: Versuchsschema 5 (Vitamin C, 21 % (v/v) DMF) ............................................................................. 51
Tabelle 14: Übersicht zu den Ergebnissen der Langzeitversuche unter mehrmaliger Zugabe des Cosubstrates
(H2O2)........................................................................................................................................................... 51
Tabelle 15: Notwendige Mindestmenge an Wasserstoffperoxid für die AaeAPO-katalysierte Umsetzung
ausgewählter Flavonoide.............................................................................................................................. 52
Tabelle 16: Versuchsschema 6 (Vitamin C, 21 % (v/v) DMF) ............................................................................. 53
Tabelle 17: Übersicht zu den Ergebnissen der Spritzenpumpenversuche ............................................................. 53
Tabelle 18: Ausgewählte Eigenschaften der untersuchten Flavanone .................................................................. 56
VI
Tabelle 19: Übersicht zur enzymatischen Umsetzung von Flavanonen durch die AaeAPO (TC – total conversion)
...................................................................................................................................................................... 56
Tabelle 20: Ausgewählte Eigenschaften der untersuchten Flavone ...................................................................... 61
Tabelle 21: Übersicht zur enzymatischen Umsetzung von Flavonen durch die AaeAPO (TC – total conversion)
...................................................................................................................................................................... 62
Tabelle 22: Ausgewählte Eigenschaften der untersuchten Flavonole ................................................................... 66
Tabelle 23: Übersicht zur enzymatischen Umsetzung von Flavonolen durch die AaeAPO (TC – total conversion)
...................................................................................................................................................................... 67
Tabelle 24: Einige Stoffeigenschaften der Isoflavone........................................................................................... 70
Tabelle 25: Übersicht zur enzymatischen Umsetzung von Isoflavonen durch die AaeAPO (TC – total
conversion)................................................................................................................................................... 70
Tabelle 26: Versuchsschema zum Spritzenpumpenversuch unter semikontinuierlicher Zudosierung von Substrat
und Vitamin C (in 21 % v/v DMF) .............................................................................................................. 75
Tabelle 27: Versuchsschema: semikontinuierliche Langzeitversuche (Vitamin C, 21 % (v/v) DMF) ................. 76
Tabelle 28: Getestete SPE-Kartuschen ................................................................................................................. 77
Tabelle 29: SPE-Kartuschenauswahl in Bezug auf die Wiederfindung der ausgewählten Flavonoide (die
Kontrollen representieren die Anfangskonzentration; K1-K6 SPE-Kartuschen laut Tabelle 28) ................ 78
Tabelle 30: Präparation monohydroxylierter Flavonoidprodukte von ihren Substraten durch SPE-Vorbehandlung,
Trennung mittels präparativer HPLC und SPE-Nachbehandlung. ............................................................... 79
Tabelle 31: Die apparenten kinetische Konstanten der AaeAPO für Apigenin..................................................... 93
Tabelle 32: Katalytische Konstanten verschiedener AaeAPO-katalysierter Substrat-Umsetzungen im Vergleich
zur Apigenin-Umsetzung ............................................................................................................................. 94
Tabelle 33: Konstante Parameter der ASE-Extraktion.......................................................................................... 95
Tabelle 34: Variierte Parameter der Mikrowellenextraktion................................................................................. 96
Tabelle 35: Variierte Parameter der Ultraschallextraktion.................................................................................... 96
Tabelle 36: Gradientenmethode – Anthocyane ..................................................................................................... 96
Tabelle 37: Analytische Daten zu den Aronia-Extrakten;..................................................................................... 99
Tabelle 38: Aronia-Extrakte - Konzentration der häufigsten Polyphenole. .......................................................... 99
Tabelle 39: Analytische Daten der Erdbeerblätter-Extrakte; WE - Wasser/ethanolisch, E - ethanolisch, tR Retentionszeit. ............................................................................................................................................ 100
Tabelle 40: Analytische Daten der Bellis-perennis-Extrakte. ; WE - Wasser/ethanolisch, E - ethanolisch, tR Retentionszeit. ............................................................................................................................................ 101
Tabelle 41: Analytische Daten der Rotklee-Extrakte; WE - Wasser/ethanolisch, E - ethanolisch, sh – Schulter im
UV-Vis-Spektrum ...................................................................................................................................... 103
Tabelle 42: Verwendete Phytoextrakte* ............................................................................................................. 106
Tabelle 43: Maximale Enzymaktivitäten (AaeAPO, Laccase) nach Kulturtagen. (Probenzusammensetzung siehe
vorherige Tabelle) ...................................................................................................................................... 107
Tabelle 44: Verwendete Phytoextrakte (Erklärungen s. Tabelle 41)................................................................... 110
Tabelle 45: Maximale MnP-Aktivitäten an unterschiedlichen Kulturtagen........................................................ 111
Tabelle 46: Maximale Aktivität der MnP nach unterschiedlichen Kulturtagen .................................................. 112
Tabelle 47: Übersicht zur Wirkung der Phytoextrakte und des Lösungsmittels Ethanol auf die Enzymbildung
(AaeAPO, Laccase, MnP) .......................................................................................................................... 112
VII
Abkürzungsverzeichnis
7-ACA
7-AminoCephalosporanic Acid
4CL
4-Cumaroyl-CoA-Ligase
2-ODD
2-Oxoglutarat-abhängige Dioxygenase
α-KG
α-Ketoglutarat
AaeAPO
Agrocybe-aegerita- aromatic peroxygenase
Ab
Ausbeute
ABTS
2,2'-Azino-bis(3-ethylbenzthiazolin-6-sulfonat)
ACT
Acetyl-Transferase
ADP
Adenosindiphosphat
AG
Aktiengesellschaft
ANR
Anthocyanidin-Reduktase
ANS
Anthocyanidin-Synthase
API-ES
Atmospheric Pressure Electrospray Ionisation
APO
Aromaten-Peroxygenase (Aromatic PerOxygenase)
APT
Attached Proton Test
AsA
Ascorbinsäure
ASE
Beschleunigte Lösungsmittelextraktion (Accelerated Solvent Extraction)
ATP
Adenosintriphosphat
BE
Mikrowellen-Extrakt aus Gänseblümchen
BSA
Rinder-Serum-Albumin
C4H
Zimtsäure-4-Hydroxylase
CBG
Cytosolic beta-glucosidase
cDHA-R
cytosolische Dehydroascorbinsäure-Reduktase
CfuCPO
Chloroperoxidase vom Caldariomyces fumago
CHI
Chalcon-Isomerase
CHR
Chalcon-Reduktase
CHS
Chalcon-Synthase
CraAPO
Aromaten-Peroxygenase aus Coprinellus radians
CYP
Cytochrom P450; P ∼ Pigment; 450 ∼ Lage der Soret-Bande des Komplexes
mit Kohlenmonoxid bei 450 nm
DAD
Diodenarray Detektor
DEPT
Distortionless Enhancement by Polarization Transfer
DFR
Dihydroflavonol-4-Reduktase
DHA
Dehydroascorbinsäure
VIII
DHK
Dihydrokämpferol
DHM
Dihydromyricetin
DiOH-MeOFA
Dihydroxy-Methoxyflavanon
DMD
Dimethyldioxiran
DMF-d7
Heptadeutero-N, N-dimethylformamide (DCON(CD3)2, M = 80.14 g/mol)
DMID
2',7-Dihydroxy-4'-methoxyisoflavanol-Dehydratase
DMSO-d6
Hexadeutero-Dimethylsulfoxid ((CD3)2SO, M = 84.17 g/mol)
DNA
DeoxyriboNucleic Acid
DPPH
2,2-Diphenyl-1-picrylhydrazyl
E
ethanolisch
ER
endoplasmatisches Retikulum
ESI
Elektrospray-Ionisation
F2H
Flavanon-2-Hydroxylase
F3H (FHT)
Flavanon-3-Hydroxylase
F6H
Flavonoid -6-Hydroxylase
F8H
Flavonoid -8-Hydroxylase
F3'5'H
Flavonoid -3',5'-Hydroxylase
F3'H
Flavonoid -3'-Hydroxylase
F4'H
Flavonoid -4'-Hydroxylase
Fl-OH (Flav)
Flavonoid
FLS
Flavonol-Synthase
FNS (FS)
Flavon-Synthase
FPLC
Fast Protein Liquid Chromatography
GC
Gaschromatographie
gCOSY
2D COrrelation SpectroscopY
gHMBC
2D Heteronuclear Multiple Bond Correlation
gHSQC
2D Heteronuclear Single Quantum Correlation experiment oder Coherence
Glu
Glutamat
GPx
Guajakol-Typ Peroxidase
GSH
Glutathion
GST
Glutathion-S-Transferase
GT
Glycosyl-Transferase
HDL
High-Density Lipoprotein
ΔHf
Änderung der Bildungswärme
H218O2
isotopenmarkiertes Wasserstoffperoxid
HPLC
High Performance Liquid Chromatography
HRMS
High-Resolution Mass Spectrometry
IX
I2'H
Isoflavon-2'-Hydroxylase
IBX
Iodoxybenzoesäure
IF2'3'H
Isoflavon -2',3'-Hydroxylase
IFR
Isoflavon-Reduktase
IFS
Isoflavon-Synthase
in vitro
lat. „im Glas“; außerhalb eines lebenden Organismus
in vivo
lat. „im Lebendigen“; im lebenden Organismus
IOMT
Isoflavon-O-methyl-Transferase
kcat
Wechselzahl
kcat/Km
katalytische Effizienz
Km-Wert
Michaelis-Menten-Konstante
Kt.
Kulturtag
Lacc
Laccase
LAR
Leucoanthocyanidin-Reduktase
LiP
Lignin-Peroxidase
LDL
Low-Density Lipoprotein
LLE
Flüssig-Flüssig-Extraktion (Liquid-Liquid Extraction)
LM
Lösungsmittel
LPH
Lactase-phlorizin hydrolase
LRET
Long-Range Electron Transfer
MAE
Mikrowellenunterstützte Extraktion
MDA
Monodehydroascorbinsäure
MeOF
Methoxyflavon
MeOFA
Methoxyflavanon
MeOH
Methanol
MnP
Mangan-Peroxidase
MP-8
Microperoxidase-8
MS
Massenspektrometrie (Mass Spectrometry)
MW
Mikrowelle
NADPH
Nicotinsäureamid-Adenin-Dinukleotid-Phosphat
NMR
Kernspinresonanz (Nuclear Magnetic Resonance)
ODS
Octadecylsilan
OECD
die Organisation für wirtschaftliche Zusammenarbeit und Entwicklung
(Organisation for Economic Co-operation and Development)
OH-Gruppe
Hydroxygruppe
OMT
O-Methyl-Transferase
PAL
Phenylalanin-Ammoniak-Lyase
X
PcCYP
Cytochrom P450 vom Phanerochaete chrysosporium
PCR
Polymerase-Kettenreaktion (Polymerase Chain Reaction)
PEG
Polyethylenglycol
prepIEF
präparative isoelektrische Fokussierung
qRT-PCR
quantitative Echtzeit – PCR
(quantitative Real Time - Polymerase Chain Reaction)
ROS
hoch reaktive Sauerstoffspezies
sEtOH
saures Ethanol (0,1 Vol.-% H3PO4)
sh
Schulter im UV-Vis-Spektrum (shoulder in the spectrum)
SPE
Festphasenextraktion (Solid Phase Extraction)
TC
Total Conversion
TCA
Trichloressigsäure (TriChloroacetic Acid)
TE
Troloxequivalent
TM
Trockenmasse
tR
Retentionszeit
TriMeOFA
Trimethoxyflavanon
UF7GT
UDP-Glucose: Flavonoid-7-Glukosyltransferase
UPO
unspezifische Peroxygenase (Unspecific PerOxygenase)
Us
Umsatz (bezogen auf das Substrat)
US
Ultraschallextrakt
USAE
Ultraschallextraktion
UV-Vis -Spektroskopie UltraViolet–Visible spectroscopy
Veratrylalkohol
3,4-Dimethoxybenzylalkohol
vmax
max. Reaktionsgeschwindigkeit bei Substratsättigung
VP
Versatile Peroxidase
VR
Vestiton-Reduktase
WE
Wasser-ethanolisch
λmax
Wellenlänge maximaler Intensität
XI
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Die vorliegende Dissertation zum Thema Enzymatische Transformation verschiedener Flavonoide
durch das extrazelluläre Pilzenzym Agrocybe-aegerita-Peroxygenase befasst sich mit folgenden
Teilaufgaben:
1) Enzymproduktion:
Herstellung
und
Reinigung
der
Agrocybe-aegerita-Peroxygenase
(AaeAPO);
2) Enzymatische
Synthese
von
Flavonoiden
und
deren
Derivaten
ausgehend
von
Standardsubstanzen;
3) Analytische und spektroskopische Untersuchung der synthetisierten Verbindungen;
4) Enzymatische Synthese und Reinigung (scale-up ≥ 5 mg) von Apigenin-, Luteolin-, 6Hydroxyflavon-, 7-Hydroxyflavanon- sowie 7-Hydroxyflavonderivaten für die NMR-Analyse;
5) NMR-spektroskopische Analyse der gereinigten Flavonoide;
6) Extraktion von Flavonoiden aus ausgewählten Pflanzen: Aronia melanocarpa (Apfelbeere),
Fragaria ananassa (Gartenerdbeere), Bellis perennis (Gänseblümchen) und Trifolium
pratense (Rotklee) sowie analytische Untersuchung der Extrakte;
7) Untersuchungen zum Einfluss der Flavonoidextrakte auf die Enzymbildung durch Agrocybe
aegerita und Bjerkandera adusta;
8) Chemische Synthese von 4',6-Dihydroxyflavanon als Standardverbindung für die HPLC.
Die enzymatische Transformation von Flavonoidstandardverbindungen wurde mit einem neuen
Enzymtyp – der unspezifischen Peroxygenase des Lamellenpilzes Agrocybe aegerita (Südlicher
Ackerling) – durchgeführt; als Cosubstrat wurde Wasserstoffperoxid verwendet. Die Untersuchungen
haben gezeigt, dass das Enzym (AaeAPO) insgesamt über ein sehr breites Substratspektrum
bezüglich der Flavonoide (57) verfügt. Folgende Standardsubstanzen wurden untersucht: Flavone –
Acacetin, Amentoflavon, Apigenin, Apigenintrimethylether, Baicalein, Baicalein-7-methylether,
Chrysin, Chrysindimethylether, Flavon, 5-, 6-, 7-Hydroxyflavon, 6,7-Dihydroxyflavon, 2',6Dihydroxyflavon,
4',6-Dihydroxyflavon,
Methoxyluteolin,
Tangeretin
und
Luteolin,
Tectochrysin;
5-Methoxyflavon,
Isoflavone
–
4'-Methoxyflavon,
Biochanin
A,
6-
Daidzein,
Demethyltexasin, Formononetin, Genistein, Genistein-4',7-dimethylether, Glycitein und 5-Methyl-7methoxyisoflavon; Flavanone – Eriodictyol, Flavanon, Hesperetin, 2'-, 3'-, 4'-, 6-, 7-Hydroxyflavanon, 4',6-Dihydroxyflavanon, Isosakuranetin, 4'-, 5-, 6-Methoxyflavanon, Naringenin und
Pinocembrin; Flavonole – 3-Hydroxyflavon, 3,6-Dihydroxyflavon, Isorhamnetin, Kämpferol,
Myricetin, Quercetagetin, Quercetin und Quercetinpentamethylether; Flavonoidmonoglykoside Apigetrin, Genistin, Naringenin-7-O-glukosid und Orientin sowie das Flavonoiddiglykosid Rutin.
Hiervon konnten alle Verbindungen mit Ausnahme des Diglykosids Rutin, des Dimers Amentoflavon,
XII
Zusammenfassung
des 3-Hydroxyflavon sowie den Flavonoid-Derivaten mit besetzter C6-Position (Baicalein, Baicalein7-methylether, Demethyltexasin, 6,7-Dihydroxyflavon, 6-Methoxyluteolin, Quercetagetin) durch die
AaeAPO
umgesetzt
werden.
Dabei
entstanden
ein
oder
mehrere
monohydroxylierte,
dihydroxylierte, demethylierte oder anders derivatisierte Produkte, die anhand ihrer Massen- und
UV-Vis-Spektren in Verbindung mit den chromatographischen Retentionszeiten (HPLC) und
entsprechender Referenzsubstanzen identifiziert wurden. Darüber hinaus wurden ausgewählte
Produkte mittels NMR-Spektroskopie strukturell aufgeklärt. Die Ergebnisse belegen, dass Flavonoide
durch die AaeAPO regioselektiv in 6-Position hydroxyliert werden. Die Untersuchungen mit
isotopenmarkiertem Wasserstoffperoxid (H218O2) ergaben, dass der im Zuge der Hydroxylierungen
eingefügte Sauerstoff dem Peroxid entstammt (echte Peroxygenase-Reaktion). Weiterhin wurde am
Beispiel von Flavon nachgewiesen, dass die AaeAPO-katalysierte Hydroxylierung von Flavonoiden
über eine Epoxidzwischenstufe verläuft.
Gemische verschiedener Flavonoide wurden aus den einheimischen Pflanzen A. melanocarpa, F.
ananassa, T. pratense und B. perennis extrahiert und analytisch charakterisiert. Es kamen dabei die
Mikrowellenextraktion, Ultraschallextraktion sowie die beschleunigte Lösungsmittelextraktion
(accelerated solvent extraction, ASE) unter Verwendung von Ethanol, Ethanol-Wasser- oder
Glycerin-Wasser-Gemischen zum Einsatz. Die analytische Untersuchung der Extrakte erfolgte mittels
HPLC-DAD und HPLC-MS.
Weiterhin wurde der Einfluss von Flavonoiden auf die Enzymbildung durch A. aegerita und
Bjerkandera adusta (Rauchporling) untersucht. Die Extrakte von Apfelbeere, Gänseblümchen und
Rotklee stimulierten die Laccase-Produktion, während die AaeAPO-Aktivität im Vergleich zu
entsprechenden Kontrollen abnahm. Ähnlich wirkten Erdbeerblätter-Extrakte, wobei die Effekte hier
weniger deutlich ausgeprägt waren (möglicherweise aufgrund einer insgesamt niedrigeren
Flavonoidkonzentration in den mittels ASE gewonnenen Extrakten). Im Fall von B. adusta konnte
eine moderate Stimulierung der Mangan-Peroxidase-Bildung nach Zugabe der Extrakte beobachtet
werden. Außerdem zeigte sich, dass das Lösungsmittel Ethanol allein eine gewisse Stimulierung der
Laccase-Produktion in A. aegerita bewirkte und die AaeAPO wiederum gehemmt wurde. Die
beobachteten Effekte der Extrakte auf die Enzymproduktion sind deshalb sowohl auf die
Flavonoide als auch auf das Ethanol zurückzuführen.
XIII
Summary
Summary
The dissertation thesis entitled “Enzymatic transformation of diverse flavonoids by the extracellular
fungal enzyme Agrocybe aegerita peroxygenase” deals with following subtasks:
1) Enzyme preparation: production and purification of Agrocybe aegerita peroxygenase
(AaeAPO);
2) Enzymatic synthesis of flavonoids and their derivatives starting from standard substances;
3) Analytical and spectroscopic characterization of the synthesized compounds;
4) Enzymatic synthesis and purification (scale-up ≥ 5 mg) of apigenin, luteolin, 6hydroxyflavone, 7-hydroxyflavanone and 7-hydroxyflavone derivatives for NMR analysis;
5) NMR-spectroscopic analysis of purified flavonoids;
6) Extraction of flavonoids from selected plants: Aronia melanocarpa (Aronia), Fragaria
ananassa (Strawberry), Bellis perennis (Common daisy) und Trifolium pratense (Red clover),
and analytical characterization of the extracts;
7) Evaluation of the influence of flavonoid extracts on the enzyme production by Agrocybe
aegerita and Bjerkandera adusta
8) Chemical synthesis of 4',6-dihydroxyflavanone as reference compound for HPLC analysis.
The enzymatic transformation of flavonoid standard compounds was carried out with a novel
enzyme type – the unspecific peroxygenase of the agaric fungus Agrocybe aegerita (Black poplar
mushroom); hydrogen peroxide served as cosubstrat. The investigations have shown that the enzyme
(AaeAPO) posseses a generally broad substrate spectrum with respect to flavonoids (57). Following
standard substances were studied: Flavones – acacetin, amentoflavon, apigenin, apigenin
trimethylether, baicalein, baicalein 7-methylether, chrysin, chrysindimethylether, flavone, 5-, 6-, 7hydroxyflavones, 6,7-dihydroxyflavone, 2',6-dihydroxyflavone, 4',6-dihydroxyflavone, luteolin, 5methoxyflavone, 4'-methoxyflavone, 6-methoxyluteolin, tangeretin and tectochrysin; isoflavones –
biochanin A, daidzein, demethyltexasin, formononetin, genistein, genistein 4',7-dimethylether,
glycitein and 5-methyl 7-methoxyisoflavone; flavanones – eriodictyol, flavanone, hesperetin,
2'-, 3'-, 4'-, 6-, 7-hydroxyflavanones, 4',6-dihydroxyflavanone, isosakuranetin, 4'-, 5-, 6methoxyflavanones,
naringenin,
and
pinocembrin;
flavonoles
–
3-hydroxyflavone,
3,6-
dihydroxyflavone, isorhamnetin, kaempferol, myricetin, quercetagetin, quercetin and quercetin
pentamethylether; flavonoid monoglycosides - apigetrin, genistin, naringenin 7-O-glucoside and
orientin as well as the flavonoid glycoside rutin. Most of these compounds could be converted by
AaeAPO with following exceptions: the diglycoside rutin and the dimer amentoflavone as well as 3hydroxyflavone and its derivatives substituted at the C6 position (baicalein, baicalein 7-methylether,
demethyltexasin, 6,7-dihydroxyflavone, 6-methoxyluteolin, quercetagetin). In the course of the
XIV
Summary
reactions, one or several monohydroxylated, dihydroxylated, demethylated or otherwise
derivatized products, which were identified by means of their mass and UV-Vis spectra along with
the chromatographic retention times (HPLC) and respective reference substances. Furthermore, some
products were structurally determined by NMR spektroscopy. The results demonstrate that flavonoids
are regioselectively hydroxylated by AaeAPO at the 6-position. The use of isotope-labeled hydrogen
peroxide (H218O2) revealed that the oxygen introduced into the substrates came from the peroxide
(true peroxygenase reaction). Furthermore, the example of flavone showed that the AaeAPOcatalyzed hydroxylation of flavonoids proceeds via an epoxide intermediate.
Mixtures of different flavonoids were extracted from the domestic plants A. melanocarpa, F.
ananassa, T. pratense und B. perennis and analytically characterized. To this end, microwave and
ultrasonic-wave assisted extraction as well as accelerated solvent extraction (ASE) were used along
with ethanol, ethanol-water or glycerin-water mixtures as solvents. The extracts were analyzed by
HPLC-DAD und HPLC-MS.
Furthermore, the influence of flavonoids was studied on the enzyme production by A. aegerita and
Bjerkandera adusta. The extracts from Aronia, Common daisy and Red clover stimulated the
production of laccase, while the AaeAPO activity decreased compared to respective controls. The
same phenomenon though less pronounced was observed for the Strawberry extracts (probably due to
a lower overall concentration of flavoids in the extracts obtained with ASE). In the case of B. adusta, a
moderate stimulation of manganese peroxidase activity was observed after addition of plant extracts.
In this context, it turned out that the solvent ethanol as such has a stimulating effect on the production
of laccasse in A. aegerita while the activity of AaeAPO was again inhibited. Thus, the observed
effects of the extracts on the enzyme production can be attributed both to the flavonoids and
ethanol.
XV
Shrnutí
Shrnutí
Tato disertační práce na téma: „Enzymatická transformace různých flavonoidů pomocí Agrocybe
aegerita peroxygenázy“, zpracovává následující dílčí kapitoly:
1) Získání enzymu (Tvorba a čištění Agrocybe aegerita peroxygenázy, AaeAPO)
2) Enzymatická syntéza flavonoidů a jejich derivátů (eduktem jsou standardy)
3) Stanovení analytických a spektroskopických vlastností vyrobených látek
4) Enzymatická syntéza (scale-up, ≥ 5 mg) a čištění monohydroxylových derivátů apigeninu,
luteolinu, 6-hydroxyflavonu, 7-hydroxyflavanonu a 7-hydroxyflavonu na analýzu pomocí
NMR spektroskopie
5) Analýza pomocí NMR spektroskopie
6) Extrakce flavonoidů z následujících rostlin: Aronia melanocarpa (Temnoplodec černý,
aronie), Fragaria ananassa (Jahodník zahradní), Bellis perennis (Sedmikráska chudobka),
Trifolium pratense (Jetel luční); analýza získaných extraktů
7) Výzkumy zabývající se vlivem extraktů obsahujících flavonoidy na tvorbu vybraných enzymů
houbami Agrocybe aegerita a Bjerkandera adusta
8) Chemická syntéza standardu pro HPLC - 4´,6-dihydroxyflavanonu.
Enzymatické transformace byly provedeny pomocí nového typu enzymu – houbové peroxygenázy
z Polničky topolové (Agrocybe aegerita). Jako kosubstrát zde působí peroxid vodíku. Výzkumy
ukázaly, že daný enzym (AaeAPO) disponuje širokým spektrem substrátů z řad flavonoidů. Ze
zkoumaných standardů (flavony – acacetin, amentoflavon, apigenin, apigenintrimethylether, baicalein,
baicalein 7-methylether, chrysin, chrysindimethylether, flavon, 5-, 6-, 7-hydroxyflavon, 6,7dihydroxyflavon,
2',6-dihydroxyflavon,
4',6-dihydroxyflavon,
luteolin,
5-methoxyflavon,
4'-
methoxyflavon, 6-methoxyluteolin, tangeretin, tectochrysin ; isoflavony – biochanin A, daidzein,
demethyltexasin, formononetin, genistein, genistein-4',7-dimethylether, glycitein, 5-methyl-7methoxyisoflavon; flavanony – eriodictyol, flavanon, hesperetin, 2'-, 3'-, 4'-, 6-, 7-hydroxyflavanon,
4',6-dihydroxyflavanon, isosakuranetin, 4'-, 5-, 6-methoxyflavanon, naringenin, pinocembrin;
flavonoly
–
3-hydroxyflavon,
3,6-dihydroxyflavon,
isorhamnetin,
kaempferol,
myricetin,
quercetagetin, quercetin, quercetinpentamethylether; monoglykosidy flavonoidů - apigetrin, genistin,
naringenin 7-O-glukosid, orientin; diglykosid flavonolu – rutin) se podařilo enzymaticky přeměnit
všechny sloučeniny s výjimkou diglykosidu rutinu, dimeru amentoflavonu, 3-hydroxyflavonu a
následujících látek s obsazenou pozicí C6 (baicalein, baicalein-7-methylether, demethyltexasin, 6,7dihydroxyflavon, 6-methoxyluteolin, quercetagetin). Výsledkem byly jeden potažmo více
monohydroxylovaných, dihydroxylovaných, demethylovaných či jinak derivovaných produktů,
které byly identifikovány pomocí hmotnostních spekter, spekter UV-Vis i retenčních časů. Spektrum
XVI
Shrnutí
produktů bylo objasňováno buď za pomoci referenčních látek a nebo NMR spektroskopií. Z výsledků
enzymatických přeměn vyplývá, že AaeAPO regioselektivně hydroxyluje flavonoidy do pozice C6.
Výzkumy s těžkým peroxidem vodíku ukázaly, že kyslík vložený při hydroxylaci pochází z peroxidu
vodíku (důkaz reakce peroxygenázy). Dále bylo prokázáno, že u flavonoidů probíhá reakční
mechanismus hydroxylace pomocí AaeAPO přes epoxid.
S ohledem na zadání byly flavonoidy extrahovány z tuzemských rostlin Aronia melanocarpa,
Fragaria ananassa, Trifolium pratense a Bellis perennis. Extrakty byly poté analyticky stanoveny. Na
vyluhování bobulí arónie, květů jetele lučního a květů sedmikrásek byla použita mikrovlnná extrakce,
pro arónii dodatečně ještě extrakce za pomoci ultrazvuku, a ke získání výluhu z listů jahodníku
sloužila zrychlená extrakce rozpouštědlem (ASE). Následuje výčet použitých extrakčních činidel:
etanol, směsi etanolu s vodou a glycerinu s vodou. Analytické stanovení extraktů proběhlo pomocí
HPLC-DAD a HPLC-MS.
V neposlední řadě byl zkoumán vliv flavonoidů ve formě výluhů na tvorbu enzymů. V houbě
Agrocybe aegerita přispěly extrakty z arónie, sedmikrásky a jetele k pozitivní stimulaci při tvorbě
lakázy, na druhé straně došlo k výraznému poklesu aktivity AaeAPO. Podobně působily také výluhy z
listů jahodníku, jen byl celkový efekt méně patrný (pravděpodobně z důvodu celkově nižší
koncentrace flavonoidů v ASE-extraktech). V houbě Bjerkandera adusta (Šedopórka osmahlá) došlo
po přidání extraktů k mírné stimulaci tvorby manganové peroxidázy (MnP).
Samotné rouzpouštědlo etanol působilo pozitivně na tvorbu lakázy v Polničce topolové. Aktivita
enzymu AaeAPO byla naproti tomu utlumena (výjimečně stimulována). Tvorbu enzymů ovlivňují
tudíž, ať už pozitivně či negativně, jak flavonoidy tak i obsažený etanol.
1
Einleitung
1 Einleitung - Zielsetzung
Die Dissertation beschäftigt sich mit der enzymatischen Transformation von Flavonoiden. Sie ist
thematisch in zwei Schwerpunkte, „Enzymatische Synthese“ und „Einfluss auf die Enzymbildung“,
gegliedert, wobei der Fokus auf dem ersten Schwerpunkt liegt. Die einzelnen Themenfelder werden in
der folgenden Graphik zusammengefasst.
Enzymatische Transformationen verschiedener Flavonoide durch das extrazelluläre Pilzenzym
Agrocybe-aegerita-Peroxygenase
1. Schwerpunkt
2. Schwerpunkt
Enzymatische Synthese
Einfluss von Flavonoiden (in Form
oxyfunktionalisierter Flavonoide
flavonoidreicher Pflanzenextrakte) auf die
ausgehend von Standardverbindungen
Enzymbildung durch Pilze
1.1 Schwerpunkt 1: Enzymatische Synthese
Die heilende Wirkung von Naturstoffen, die auch als nachwachsende Rohstoffe aufgefasst werden
können, ist der Menschheit schon seit Jahrhunderten bekannt. In der jüngsten Zeit ist dieses Thema
wieder besonders aktuell geworden und wird derzeit breit in der Gesellschaft diskutiert. So zielen neue
Trends in der kosmetischen und pharmazeutischen Industrie darauf ab, verstärkt nachwachsende
Rohstoffe in kosmetischen und pharmazeutischen Produkten zu verwenden. Ein spezielles Ziel in der
Produktentwicklung ist dabei die Verbesserung der Schutzfunktion des Organismus gegenüber freien
Radikalen.
Freie Radikale sind chemische Spezies mit hoher Reaktivität, die zur Zerstörung biologischer
Moleküle wie Proteinen, Lipoproteinen, Desoxyribonucleinsäuren, Kohlenhydraten und ungesättigten
Fettsäuren führen [Pincemail, 1995]. Vor allem hoch reaktive Sauerstoffspezies (ROS) [ Stevens &
Miranda, 2002] beeinflussen und schädigen die Zelle sowohl durch direkte cytotoxische Effekte
(Membrandestruktion durch Induktion radikalischer Kettenreaktionen, Mutationen nukleärer und
mitochondrialer
DNA
etc.)
als
auch
indirekt
durch
Modifikation
intrazellulärer
Signaltransduktionskaskaden, die entzündliche und proliferative Prozesse regulieren. Das endogene
antioxidative System gewährleistet im gesunden Menschen ein natürliches Gleichgewicht zwischen
den intrazellulär vorhandenen Radikalen und deren Entgiftung durch enzymatische und nicht
enzymatische Radikalfänger.
2
Einleitung
Zu den nicht enzymatischen bzw. niedermolekularen Antioxidantien zählen lipophile Verbindungen
wie β-Carotin (Provitamin A), Tocopherole (Vitamin E) und Ubichinone sowie die hydrophilen
Substanzen L-Ascorbinsäure (Vitamin C), Glutathion und Harnsäure. Diese Moleküle übernehmen die
ungepaarten Elektronen radikalischer Verbindungen und werden auf diese Weise selbst zu Radikalen.
Im Unterschied zu den ursprünglich sehr reaktiven Radikalen sind die sekundär gebildeten Radikale
wesentlich stabiler, was zur Unterbrechung der Oxidationsketten führt [Hansen, 1998].
In ähnlicher Weise übernehmen auch Polyphenole (z. B. Flavonoide) die ungepaarten Elektronen der
ROS und bilden dabei stabile Radikale. Dadurch können sie, in Kombination mit ihrer Neigung zur
Komplexbildung, Metall-Ionen binden und schädigende radikalchemische Prozesse wie die LipidPeroxidation verhindern oder unterbrechen. Die aus Pflanzen isolierbaren polyphenolischen
Verbindungen sowie modifizierte Strukturen dieses Typs sind in den letzten Jahren verstärkt in den
Fokus der medizinischen Forschung gelangt. In der Fachliteratur finden sich zahlreiche Publikationen
zur Wirkung von Flavonoiden und verwandten Stoffen auf biologische Systeme, wobei das
Hydroxylierungsmuster eine große Rolle spielt [Benavente-Garcia et al, 2000]. Hieraus lässt sich ein
steigender Bedarf an diesen Verbindungen für die Zukunft ableiten, der nicht allein durch Extraktion
pflanzlicher Materialien zu decken sein wird.
Es ist allgemein bekannt, dass die direkte und selektive Einführung von Sauerstoff-Funktionen in nicht
aktivierte aromatische oder aliphatische Kohlenwasserstoffe ein Problem für die chemische Synthese
darstellt. Die Prozesse der chemischen Hydroxylierung erfordern meist aufwendige mehrstufige
Syntheseschritte, wie z. B. beim Cumolhydroperoxid-Verfahren oder der Diazotierung, die zur
Herstellung von Phenolen aus Benzol und Benzolderivaten eingesetzt werden.
Die Weiße Biotechnologie, zu der auch klassische industrielle Prozesse wie die fermentative
Ethanolherstellung gezählt werden, besitzt ein enormes ökonomisches Potential, insbesondere auch
für den chemischen Sektor. Im Zentrum steht die Biokatalyse, d. h. die Nutzung von Enzymen oder
mikrobiellen Zellen zur Produktion von Industrie- und Feinchemikalien, wobei Flavonoide zu den
Letzteren gerechnet werden [Struhalla & Fietz, 2005]. Feinchemikalien sind meist hoch
funktionalisiert, d. h. sie besitzen mehrere chemische Reaktionszentren, die häufig auch chiral sind.
Bei der oft komplexen und mehrstufigen Synthese dieser Strukturen erlaubt der Einsatz von
Biokatalysatoren - vor allem von Enzymen, die aufgrund ihrer eigenen Chiralität in der Lage sind,
Produktsynthesen mit hoher Enantioselektivität zu katalysieren [Struhalla & Fietz, 2005] - einen
geringeren Materialverbrauch, niedrigere Investitions- und Entsorgungskosten sowie einen
kleineren Energieverbrauch gegenüber klassischen chemischen Verfahren [Garthoff, 2006].
Fallstudien zu biotechnologischen Verfahren, die die Organisation für wirtschaftliche Zusammenarbeit
und Entwicklung (OECD) 2001 veröffentlicht hat, belegen diese umweltentlastenden Effekte:
3
Einleitung
Tabelle 1: Fallstudien Ressourceneinsparung- und Umweltentlastungspotenziale biotechnologischer
Verfahren [OECD, 2001] (~…gleich, ?...keine Angaben; 7-ACA… 7-aminocephalosporanic acid)
Verbindung Verbrauch
Energie
Vitamin B2
~
7-ACA
?
× Strom
Cephalexin
Emission in
Rohstoffe
Luft
Betriebskosten
Wasser
Ø -75 % fossile Rohstoffe Ø -50 % Ø -66 %
Ø -50 %
?
Ø -90 % Ø -33 %
Ø -90 %
?
Ø -80 % Ø -80 %
Ø
Ø Dampf
Acrylsäure
?
Ø
Ø
Ø
Ø -54 %
Für die Darstellung substituierter Flavonoide bieten sich Sauerstofffunktionen einführende
Biotransformationen, die auf der Aktivität von Oxidoreduktasen beruhen, als umweltschonende
Alternative an.
Derzeit beruhen solche Biotransformationen in erster Linie auf der Aktivität intrazellulärer
Oxidoreduktasen (z. B. vom Cytochrom P450-Typ), die komplexe Cosubstrate und akzessorische
Proteine benötigen. Die vorliegende Arbeit verfolgt den Ansatz, eine extrazelluläre Oxidoreduktase,
die unspezifischen Peroxygenase [IUBMB, 2012] aus dem agarikalen Basidiomyceten Agrocybe
aegerita (EC 1.11.2.1), als Biokatalysator zur Transformation von Flavonoiden einzusetzen
[Ullrich&Hofrichter, 2007]. Im Unterschied zu intrazellulären Oxidoreduktasen benötigt dieses
Enzym lediglich Wasserstoffperoxid als Cofaktor, das zu Wasser umgesetzt wird. Gleichzeitig
verlaufen die katalysierten Reaktionen unter schonenden Reaktionsbedingungen und erfordern, anders
als chemische Synthesen, keine aggressiven und umweltbelastenden Chemikalien. Somit werden auch
geringe Ansprüche an Regelungs- und Sicherheitstechniken gestellt. Für die zukünftige Anwendung
ist somit aus Sicht der Anlagensicherheit mit einem risikoentlastenden Potenzial zu rechnen [Rhein et
al., 2002]. Zusammenfassend ergibt sich aus dem avisierten Einsatz einer Peroxygenase zur
Flavonoidtransformation ein vielversprechender umweltschonender Ansatz.
Innerhalb des Schwerpunktes 1 des Dissertationsvorhabens sollten hydroxylierte Derivate von
Flavonoiden mit Hilfe der Agrocybe-aegerita-Peroxygenase synthetisiert werden.
Dieses Enzym verfügt insgesamt über ein sehr breites Substratspektrum und arbeitet, in Abhängigkeit
von den Reaktionsbedingungen und vom Substrat, dennoch regio- und enantioselektiv. Die Agrocybeaegerita- Peroxygenase (AaeAPO = Agrocybe aegerita aromatic peroxygenase) vereint verschiedene
Enzymaktivitäten in sich und verfügt gleichzeitig, als extrazelluläres Enzym, über eine hohe Stabilität.
Nicht zuletzt handelt es sich um das erste beschriebene extrazelluläre Enzym, das aromatische Ringe
zu hydroxylieren vermag.
4
Einleitung
1.2 Schwerpunkt
2:
Einfluss
von
Flavonoiden
auf
die
Enzymbildung
In der Dissertationsschrift von R. Ullrich [Ullrich, 2005, S. 76-7] wurde vermutet, dass die Bildung
der AaeAPO durch die im Sojabohnenmehlmedium enthaltenen Flavonoide (Isoflavone) [Aussenac et
al., 1998] induziert werden könnte. Deshalb wurde im zweiten Schwerpunkt der Dissertation der
Einfluss von flavonoidreichen Pflanzenextrakten auf die Enzymproduktion untersucht, um diese
Hypothese zu bestätigen oder zu widerlegen. Die zu variierenden Parameter waren dabei Herkunft,
Zusammensetzung und Konzentration der getesteten Inhaltsstoffe (aus den pflanzlichen Extrakten).
1.3 Vorgehensweise und Methoden
Entsprechend der Zielsetzung wurde zunächst Agrocybe aegerita in Schüttelkulturen und Bioreaktoren
kultiviert, um das gewünschte extrazelluläre Enzym (unspezifische Peroxygenase) zu gewinnen. Das
Zielprotein wurde nach Konzentrierung (tangentiale Ultrafiltration, 10 kDa cut off) stufenweise mittels
FPLC (fast protein liquid chromatography) und prepIEF (präparative isoelektrische Fokusierung)
gereinigt. Diese mikrobiologischen und biochemischen Arbeiten wurden am Internationalen
Hochschulinstitut (IHI) Zittau im Arbeitskreis von Martin Hofrichter durchgeführt.
Zur Bearbeitung des ersten Schwerpunkts wurde das gereinigte Enzym in Untersuchungen zur
enzymatischen Transformation von Standardverbindungen verwendet. Im Zentrum der Arbeiten
standen Hydroxylierungsreaktionen von Flavanonen, Flavonen, Isoflavonen und Flavonolen, die als
unsubstituierte Grundkörper, teilhydroxylierte oder teilmethoxylierte Verbindungen sowie als
Glykoside vorlagen.
Die Umsetzungen der Flavonoide wurden mit den nachfolgenden analytischen Verfahren verfolgt:
HPLC-DAD und HPLC-MS. Fünf Produkte wurden in größeren Mengen synthetisiert (Hochschule
Zittau/Görlitz), um mittels NMR (1H-NMR,
13
C-NMR, APT, gCOSY, gHMBC, gHSQC) eindeutig
indentifiziert werden zu können. Die letzten drei Untersuchungstechniken wurden in Zusammenarbeit
mit Lothar Hennig (Universität Leipzig) durchgeführt.
Im zweiten Schwerpunkt der Dissertation sollte der Einfluss von Flavonoiden auf die
Enzymproduktion (Peroxygenase, Laccase, MnP) untersucht werden. Dazu wurden mit Flavonoiden
angereicherte Pflanzenextrakte aus Aronia melanocarpa (Apfelbeere), Trifolium pratense (Rotklee),
Bellis perennis (Gänseblümchen) und Fragaria ananassa (Gartenerdbeere) den Pilzkulturen zugesetzt.
Die enzymatischen Aktivitäten in den Pilzkulturen wurden mittels Standard-Assays (u. a.
Veratrylalkohol- und ABTS-Oxidation) bestimmt. Die analytische Charakterisierung der Extrakte
erfolgte mittels HPLC-DAD. Diese Arbeiten erfolgten am Internationalen Hochschulinstitut Zittau
(Kultivierungen, Enzymassays, HPLC-MS, Fraktionierung) sowie an der Hochschule Zittau/Görlitz
(Extraktionen, UV-Vis-Spektroskopie, HPLC-DAD).
5
Stand der Forschung
2 Stand der Forschung
2.1 Flavonoide als kosmetisch und pharmazeutisch relevante
Wirkstoffe
Als kosmetisch und pharmazeutisch relevante Wirkstoffe werden zunehmend „multiaktive Wirkstoffe“
betrachtet. Es handelt sich dabei um chemisch definierte Substanzen, die den Grund- und Hilfsstoffen
eines Kosmetikums zugesetzt werden, um danach durch objektive Messmethoden mehrere kosmetisch
erwünschte Effekte nachweisen zu können. Eine wichtige Gruppe dieser Verbindungen sind die
Flavonoide [Eggensperger, 2000].
Sie gehören zu den verbreitetsten sekundären Pflanzeninhaltsstoffen. Schätzungsweise werden zwei
Prozent des gesamten Kohlenstoffs (ca. 109 Tonnen pro Jahr), der durch die Photosynthese in den
Pflanzen fixiert wird, zu Flavonoiden und deren Derivaten wie den
Anthocyanen umgesetzt [Habermehl, 2002].
Flavonoide umfassen verschiedene Substanzklassen, die entweder frei oder
als Methoxy- sowie Zuckerderivate vorkommen können. Sie bestehen
grundsätzlich aus drei Kohlenstoffringen mit zwei aromatischen (A und B)
und einem O-heterocyklischen Ring (C) [Eggensperger, 2000] (Ausnahme
2` 3`
1
4`
8
1` B 5`
O
7
A C 2 6`
6
3
5 4
Flavan
bilden die „einfachen Flavonoide“ Aurone und Chalkone) [Marais et al., 2006].
Flavonoide werden der Struktur nach in fünf Hauptgruppen eingeteilt, und zwar in Derivate des 2Phenylchromans und –chromons, Derivate des 3-Phenylchromans und -chromons (Isoflavonoide),
Derivate des 4- Phenylchromens und 4-Phenylcumarins (Neoflavonoide) [Marais et al., 2006;
Habermehl et al., 2002], Biflavonoide sowie „einfache Flavonoide“ [Marais et al., 2006].
O
O
OH
O
O
O
O
2-Phenylchroman 2-Phenylchromon 3-Phenylchroman 3-Phenylchromon HO
HO
O
O O
O
O
Auron
OH
O
OH O
Amentoflavon
(3', 8 - Biapigenin)
O
4-Phenylchromen 4-Phenylcumarin
OH
O
O
Chalkon
Abbildung 1: Strukturelle Klassifikation der Flavonoide
Nach dem Oxidationsgrad der C-Atome 2, 3 und 4 des Chromanrings erfolgt die Einteilung der
Derivate des 2-Phenylchromans und –chromons in Flavane, Flavanone, Flavanole, Flavandiole,
Flavone, Flavonole, Dihydroflavonole (auch Flavanonole genannt) [Marais et al., 2006; Habermehl et
6
Stand der Forschung
al., 2002] und Anthocyanidine [Habermehl et al., 2002]. Die meisten dieser Verbindungen liegen in
der Pflanze als O-Glycoside vor; als Zucker treten vor allem Glucose, Galaktose, Xylose, Rhamnose
und Zuckersäuren auf.
O
O
OH
O
Flavan
Flavanon
O
O
O
OH
Flavanonol
O
Flavon
O
O
Flavan-3-ol
Flavonol
Flavan-4-ol
HO
HO
+
O
O
OH
OH
O
OH
OH
O O
OH
OH
O
OH O
Apigenin-7-O-glukosid
Anthocyanidin
Abbildung 2: Derivate des 2-Phenylchromans – Einteilung nach dem Oxidationsgrad der C-Atome 2, 3
und 4 des Chromanrings (links) und Beispiel für O-Glykosid (rechts).
2.1.1 Vorkommen
Flavonoide kommen in allen Pflanzenteilen wie Blättern, Blüten, Wurzeln und Früchten vor [Rovellini
et al., 1997]. Da sie der Pflanze Schutz vor äußeren schädigenden Einflüssen bieten (z. B. UVStrahlung, Insekten- oder Pilzbefall), finden sich die höchsten Konzentrationen in den äußeren
Blättern (z. B. bei Salaten) oder in Schalen von Obst und Gemüse [Watzl et al., 2001]. Flavonoide
werden meist in den Vakuolen akkumuliert [Koes et al., 1994; Kitamura, 2006] (Ausnahme das
Arabidopsis-Zytoplasma) [Buer et al., 2004]. Um von der Oberfläche des endoplasmatischen
Retikulums (ER, Ort der Synthese) zum Speicherort zu gelangen, werden sie wahrscheinlich als
Glutathionkonjugate mit Hilfe von Glutathion-S-Transferasen transportiert (siehe Abbildung 3).
Abbildung 3: Vorgeschlagener Flavonoidtransportmechanismus (Transport: I direkt, II vesikulär);
modifiziert nach [Kitamura, 2006]
7
Stand der Forschung
Dieses Carrier-Protein (GST) kann die Flavonoide ebenfalls zum endoplasmatischen Retikulum
transportieren, da es nahe dem ER lokalisiert ist und die Orte der Flavonoidbiosynthese und des
Flavonoidimports benachbart sind [Kitamura, 2006]. Als Transporter für Anthocyane dienen
wahrscheinlich die Anthocyanoplaste, kleine rötlich gefärbte, vesikelähnliche Strukturen, die sie von
der Oberfläche des endoplasmatischen Retikulums zur Vakuole führen [Nozzolillo et al., 1988; Nozue
et al., 1993]. Der vesikuläre Transportmechanismus sowie die Speicherung der Flavonoide in
Vakuolen hängt mit dem Schutz des Zytosols vor potentiell toxischen Sekundärmetaboliten zusammen
[Kitamura, 2006]. Die einzelnen Pflanzenarten nutzen unterschiedliche Transportmechanismen, wobei
stets das GST beteiligt ist [Mueller & Walbot, 2001; Grotewold et al., 2001]. Eine Art kann aber auch
unterschiedliche Transportmechanismen für verschiedene Flavonoide verwenden [Winkel-Shirley et
al., 2002]. Pflanzen verfügen über Vakuolen unterschiedlicher Struktur und Funktion [Marty, 1999],
wobei noch unklar ist, in welchen Vakuolen Flavonoide tatsächlich gespeichert werden und ob etwa
Proanthocyanidine im gleichen Vakuolentyp wie Anthocyanidine vorkommen [Grubber et al., 1999].
Die meisten Flavonoide kommen in der Natur als Glykoside vor [Stobiecki & Kachlicki, 2006]. Mehr
als 80 verschiedene Zucker sind bisher in Flavonoidglykosiden nachgewiesen worden; allein vom
Quercetin sind 179 verschiedene Glykoside bekannt [Watzl et al., 2001]. Die meisten Flavonoide sind
an Glukose oder Rhamnose gebunden. Die Bindung der Zucker an Flavonole erfolgt meist Oglykosidisch in Position 3, bei Flavanonen [Harborne & Baxter, 1999b] und Flavonen O-glykosidisch
in Position 7, bei Flavonen häufig auch C-glykosidisch in den Positionen 6 und 8 [Harborne & Baxter,
1999] (vgl. Abbildung 9, S. 13).
Bei Insektenbefall oder Pilzinfektionen werden die Flavonoide durch Spaltung der glykosidischen
Bindung als Aglykone freigesetzt, da sie in dieser Form für die Organismen toxischer sind als die
Glycoside [Rovellini et al., 1997; Arcas et al., 2000; del Rio et al., 2004].
2.1.2 Eigenschaften und Wirkungen
Phenole reagieren wegen der Dissoziierbarkeit ihrer OH-Gruppe (Hydroxygruppe) sauer. Es sind
reaktive Substanzen, die, sofern keine sterische Hinderung durch zusätzliche Seitenketten besteht,
Wasserstoffbrücken ausbilden. So findet man bei vielen Flavonoiden nichtkovalente intramolekulare
Verknüpfungen (siehe Abbildung 4) [Wang et al., 2007].
O
OH
HO O α
β
Abbildung 4: Intramolekulare Wasserstoffbrücken beim 3, 5-Dihydroxyflavon, die zur Zyklisierung in
zwei Ringen (α, β) und zu einer geringeren Polarität der Verbindung führen.
Eine zweite wichtige Eigenschaft ist ihre Fähigkeit, mit Metallen Chelatkomplexe einzugehen
[Rovellini et al, 1997]. Ferrali et al. haben nachgewiesen, dass die Eisenchelatisierung mit Quercetin
8
Stand der Forschung
(siehe Abbildung 5) in Mäusen die Erythrocyten vor oxidativer Zerstörung schützt [Ferrali at al.;
1997]. Die metallvermittelte Radikalbildung wird durch Chelatbildung verhindert [Fernandez et al.,
2002], wobei in vielen Studien bestätigt wurde, dass die Chelate bessere Antioxidantien als die „freien
Flavonoide“ sind. [Anafas'ev et al., 2001; Moridani et al., 2003; De Souza et al., 2004]
Abbildung 5: Mögliche Eisen(II)-Quercetinchelate (1:1), Stabilität: IIIa>IIa>Ia [Leopoldini et al., 2006]
Flavonoide sind somit in der Lage, die Bioverfügbarkeit der Metalle herabzusetzen. Diese Eigenschaft
wird bei der Behandlung neurologischer Erkrankungen (Al(III)-Komplexe) [Deng et al., 2000] sowie
von Vergiftungen mit Schwermetallen (als Antidot) genutzt [Wang et al., 1992]. Weiterhin können bei
der Krebsbehandlung Lanthanoid(III)-Quercetinchelate durch Bindung an die DNA der Krebszelle die
Transkription unterbinden und somit ihr Wachstum verringern [Zhou et al., 2001]. Flavonoide
inhibieren zudem die Xanthin-Oxidase, indem sie an ihrem aktiven Zentrum binden [Cos et al., 1998].
Sie sind leicht oxidierbar und bilden dabei dunkel gefärbte Polymer-Aggregate. Weiterhin sind
Flavonoide, vor allem Flavone und Flavonole, z. B. in der Lage, durch Absorption der gefährlichen
UV-B Strahlung (280 bis 315 nm) die photosynthetisch aktiven Gewebe der Pflanzen vor Zerstörung
zu schützen [Haslam, 1998]. Eine wichtige physiologische Rolle der Flavonoide besteht deshalb im
Schutz der DNA vor UV-Strahlung und ROS [Feucht et al., 2004] sowie in der Kontrolle der
Gentranskription während des Wachstums [Buer et al., 2004].
Eine weitere Funktion ist der Fraßschutz vor Insekten sowie anderen herbivoren Tieren aufgrund ihres
bitteren Geschmacks [Lahtinen et al., 2004; Fukami & Nakajima, 1971]. Flavonoide sind nicht zuletzt
in der Lage, die Pflanze vor mikrobiellen Angriffen zu schützen [Mustafa et al.; 2003; Fernando et al.,
1999; Spinelli et al., 2006]. Aufgrund dieser Tatsache und der Erkenntnis, dass sich die Bildung von
Flavonoiden durch gezielte Induktion mit Prohexadion-Calcium [Römmelt et al., 1999] steigern lässt,
9
Stand der Forschung
wurde ein neues effektives Verfahren zur Bekämpfung des Feuerbrandes (Erwinia amylovora) im
Obstanbau (Äpfel) entwickelt [Römmelt et al., 2000].
Auf der anderen Seite gehören Anthocyanine zu den wichtigsten Insektenattraktanten, die aufgrund
charakteristischer Blütenfarben Insekten als Bestäuber anlocken [Clegg et al.; 2000; Jones & Reithel,
2001].
2.1.3 Flavonoide und die menschliche Gesundheit
Die Flavonoide wurden in den 1930er Jahren durch den Nobelpreisträger Albert von Szent-Györgyi
Nagyrapolt entdeckt und zunächst als Vitamin P beschrieben [Szent-Györgyi, 1937; Hollmann et al.;
1997; Eggensperger, 2000].
Viele Heilpflanzen verdanken ihre Wirkung den enthaltenen Flavonoiden (z. B. Aronia,
Erdbeerblätter, Gänseblümchen, Ginko, Kamille, Rotklee, um nur einige zu nennen). Flavonoide
neutralisieren
zellschädigendes
Wasserstoffperoxid,
aggressiven
Singulett-Sauerstoff
sowie
zelltoxische Aldehyde (z. B. Formaldehyd). Sie fördern das Redoxrecycling von Vitamin C, Vitamin
E [Hirano et al., 2001; Heim et al., 2002] und Gluthation. Sie gelten als antioxidative Schutzstoffe
wasserreicher Körperbereiche wie des Blutes, der Interzellulärflüssigkeit, des Gehirns und der
Rückenmarksflüssigkeit; weiterhin schützen sie Hornhaut, Linse und Glaskörper des Auges sowie die
Knochen und Bindegewebe vor oxidativem Stress [Grotewold et al., 2006].
Die chemische Diversität der Flavonoide ist eine Ursache für die Vielzahl pharmakologischer
Wirkungen, die für Vertreter dieser Stoffgruppe sowohl in vitro als auch in vivo nachgewiesen wurde
[Spilková et al., 1988]. Ihre Wirkung auf den Menschen ist von den einzelnen Inhaltsstoffen abhängig,
die sich wie folgt ausprägen: wachstumshemmend auf Bakterien und Viren (Grapefruitkern-Extrakte),
Schutz vor Gefäßleiden (Weinlaub), vor Herz-Kreislauf-Leiden (Rotwein, Crataegus sp., Rotklee)
[Spilková et al., 1988; Bradley, 1992; Ness & Powles; 1997; Zerykier, 2003], antikanzerogen
(Olivenblätter,
Aronia)
[Meirinhos
et
al.,
2005;
Malik
et
al.,
2003],
schmerz-
und
entzündungshemmend (Kamillenblüten, Aronia, Gänseblümchen) [Rovellini et al., 1997; Ohgami et
al., 2005; Bielenberg & Wilhelm, 1993], hypotensiv (Aronia) [Cyr et al., 2006; Nosreti, 2001],
diuretisch
(Erdbeerblätter)
(Gänseblümchen)
[Nazuruk
[Diener,
et.
al,
1954],
2001],
schweißtreibend
(Lindenblüten),
LDL-oxidationshemmend
spasmolytisch
(Cholesterinspiegel
normalisierend, Aronia) [Cyr et al., 2006; Nosreti, 2001; Schütz et al., 2004] oder antioxidativ
(Olivenblätter, Aronia, Rotklee) [Meirinhos et al., 2005; Kintlerova et al., 1998; Zerykier, 2003].
Einige Flavonoide können auch immunmodulatorisch [Kintlerova et al., 1998], antihepatotoxisch
[Reuster et al., 1975], antiallergisch [Kubo et al., 1981], antimutagen [Meirinhos et al., 2005],
blutreinigend (Gänseblümchen) [Nazuruk et. al, 2001] oder antifungal wirken [Ferrari et al., 1983]
[Królicky et al., 1984] sowie Schutz vor UV- und ionisierender Strahlung gewähren oder die
Gerinnungsparameter des Blutes verbessern [Rovellini et al., 1997] [Schünke et al., 1993]. Den
Isoflavonoiden werden zudem hormonähnliche (östrogene) Wirkungen zugeschrieben. [Braden &
McDonald, 1970].
10
Stand der Forschung
Die all diesen Wirkungen zugrunde liegenden Mechanismen sind äußerst vielfältig; hervorzuheben
sind folgende (bio)chemischen Eigenschaften:
Hemmung von Enzymen (Cyclooxygenase, Proteinkinase C, Lipoxygenase)
Hemmung der Freisetzung von endogener Mediatorsubstanzen (z. B. der Histaminfreisetzung)
das Abfangen von chemischen Radikalen.
Auf diese Weise beeinflussen Flavonoide den Metabolismus von Karzinogenen und Fremdstoffen
durch die Hemmung von Phase-I-Enzymen und die Induktion von Phase-II-Enzymen. Außerdem
wurde die Inhibierung von Enzymen nachgewiesen, die bei Entzündungsprozessen, der chemischen
Signalübertragung, dem Hormon-Metabolismus und Zellwachstum sowie der DNA-Synthese eine
Rolle spielen. Weitere protektive Eigenschaften beruhen auf der Fähigkeit, geschädigte Zellen durch
das Einleiten der Apoptose zum Absterben zu bringen oder Zelldifferenzierungsprozesse zu aktivieren
[Watzl et al., 2001].
2.1.3.1
Antioxidative Wirkung
Im Zuge vieler biochemischer Prozesse in der Zelle (einschl. des menschlichen Organismus) entstehen
aus dem lebensnotwendigen Sauerstoff aggressive Spezies (z. B. ROS), die den Organismus schädigen
und daher rasch beseitigt werden müssen [Bors & Saran, 1987]. Die aerobe Zelle hat effiziente
Mechanismen zur Zerstörung und Eliminierung aggressiver Sauerstoffspezies entwickelt. Diese
antioxidativen
Schutzmechanismen
lassen
sich
in
enzymatische
und
nicht
enzymatische
Entgiftungssysteme einteilen (siehe Tabelle 2 ) [Horn et al., 2005]. Sie kooperieren miteinander und
ergänzen sich, wobei Flavonoide z. B. in der Lage sind, die antioxidativen Enzyme auf genetischer
Ebene zu aktivieren [Elliot et al., 1992].
Tabelle 2: Antioxidative Schutzmechanismen zur Eliminierung aggressiver Sauerstoffspezies
Antioxidativ wirksame Enzyme
Antioxidativ wirksame chemische
Substanzen
Superoxid-Dismutase
β−Carotin (Provitamin A), Carotinoide
Katalase
Vitamin C (L-Ascorbinsäure)
Peroxidasen
Vitamin E (Tocopherole)
Glutathion-Peroxidase
Glutathion
Enzymatische Reparaturmechanismen
Harnsäure
Flavonoide
Phenolcarbonsäuren
Andere Phenole
Chlorophyllderivate
Kommt es zu einem Ungleichgewicht zwischen der Bildung von aggressiven Sauerstoffspezies und
den körpereigenen Abwehrmechanismen während des Metabolismus, kann sogenannter „oxidativer
11
Stand der Forschung
Stress“ entstehen [Bors & Saran, 1987]. Nach [Ferrari & Torres, 2003] erhöhen sich Zellschädigungen
im Alter durch eine verminderte Produktion antioxidativer Enzyme (Superoxid-Dismutase, Katalase)
und
Glutathion
(Tripeptid
mit
antioxidativer Wirkung); gleichzeitig
ist
die Effektivität
immunologischer Reaktionen reduziert. Die aggressiven Sauerstoffspezies [Stevens & Miranda, 2002],
hauptsächlich verschiedene Sauerstoffradikale, werden auf diese Weise, u. a. durch die oxidative
Schädigung von Lipoproteinen [Castelluccio et al.; 1995], Desoxyribonukleinsäuren [Castelluccio et
al.; 1995; Kawanishi et al., 2001], Lipiden, Proteinen und Kohlenhydraten, zur Ursache von
Krankheiten [Bors & Saran, 1987; Hansen, 1998]. Beispielsweise gilt die Oxidation von LDL durch
aggressive Sauerstoffspezies als erste Stufe der Entstehung der Arteriosklerose [Torrel et al., 1986;
Picemail et al., 1985].
Die Fähigkeit der Flavonoide, unter Abstraktion von Wasserstoff aus den phenolischen
Hydroxygruppen, reaktive Sauerstoff- (z. B. Superoxid, Hydroxylradikal) und Stickstoffverbindungen
(z. B. Peroxynitrit) abzufangen, bildet den Schwerpunkt ihrer antioxidativen Aktivitäten [Watzl et al.,
2001; Meirinhos, 2005].
Die Aktivität der Flavonoide (Fl-OH) als Radikalfänger wird häufig am Beispiel des DPPH-Radikals
(2,2-Diphenyl-1-pikrylhydrazyl-Radikal) mit nachfolgender Reaktion erklärt [van Acker et al., 1996;
Cotelle, 2001; Amić et al., 2003]:
Fl-OH + DPPH• → Fl-O• + DPPH2
Die primär gebildeten Flavonoidradikale können sich auf drei verschiedenen Wegen stabilisieren:
1. Dimerisierung:
Fl-O• + Fl-O• → Fl-O-O-Fl [Pannala et al., 2001; Amić et al., 2003]
2. Reaktion des Flavonoidradikals mit dem DPPH-Radikal:
Fl-O• + DPPH• → Fl-O + DPPH [Pannala et al., 2001; Amić et al., 2003]
3. Chinonbildung:
Fl-O• (Semichinon) → Fl=O (Chinon) + H+ +e- [Cotelle, 2001; Pannala et al., 2001; Yang et
al., 2001]
Die dritte Variante – Chinonbildung – ist dabei der wahrscheinlichste Mechanismus der zur
Termination der Radikalkette führt; er verläuft über eine weitere H-Abstraktion vom Flavonoidradikal
(siehe Abbildung 6).
Chinone werden ebenfalls bei der Disprortionierung gebildet: 2 Fl-O• => Fl=O (Chinon) + Fl-OH.
12
Stand der Forschung
Abbildung 6: Termination der Flavonoidradikalkette über Wasserstoffabstraktion von der benachbarten
Hydroxygruppe, die am Kohlenstoffatom mit positiver Spindichte gebunden ist [Seyoum et al., 2006].
Im Fall effizienter Radikalfänger muss deshalb die H-Abstraktion leicht möglich sein. Dies kann
anhand der Änderung der Bildungswärme der Flavonoidradikale (ΔHf) bewertet werden [van Acker et
al., 1996]. Zu stabilen Flavonoidradikalen werden Strukturen gezählt, bei denen die Änderung der
Bildungswärme < 35,4 kcal/mol ist, wie z. B. im Fall des Luteolins für die Atome C4' und C3' (siehe
Tabelle 3)
Tabelle 3: Berechnete Differenzen der Bildungswärme im Zuge der Entstehung möglicher Radikale
ausgewählter Flavonoide [Seyoum et al., 2006]
Flavonoid
ΔHf [kcal/mol]
C3
C2'
C3'
C4'
47,72 44,59
-
-
39,35
Kämpferol 30,91 47,92 46,58
-
-
38,22
Luteolin
47,83 45,01
-
33,48 33,39
31,17 46,97 45,67
-
33,49 33,27
Apigenin
Quercetin
-
C5
C7
Die Termination des Luteolinradikals-4'•OH verläuft dann in Anlehnung an Abbildung 6 durch eine
weitere H-Abstraktion von der Hydroxygruppe, die am Kohlenstoffatom mit der positiven Spindichte
– C3' gebunden ist (siehe Abbildung 7) [Dangles et al., 1999; Cotelle, 2001; Pannala et al., 2001].
Abbildung 7: 3D-Darstellung der Spindichte im Luteolinradikal-4' (OH•).
(rot – positiv ~höhere Aufenthaltswahrscheinlichkeit der ungepaarten Elektronen, blau – negativ, geringe
Aufenthaltswahrscheinlichkeit) [Seyoum et al., 2006]
13
Stand der Forschung
Besonders stark ist die antioxidative Wirkung der Flavonoide, wenn sie ein oder mehrere der
folgenden Strukturelemente aufweisen: eine ortho-Dihydroxystruktur im Ring B [Pinelli et al., 2000;
von Gadow et al., 1997], eine Doppelbindung zwischen C2 und C3 in Kombination mit einer
Ketogruppe am C4 und Hydroxygruppen in Positionen C3, C5 sowie C7 [Benavente-Garcia et al.,
2000].
OH
HO
O
OH O
OH
OH
Quercetin
Abbildung 8: Quercetin weist eine besonders starke antioxidative Wirkung auf.
Die ortho-Stellung der Hydroxygruppen bietet dem entstehenden Aroxylradikal hohe Stabilität (und
kann einfach in ein o-Chinon übergehen) [Pinelli et al., 2000]. Der Ring C kann von C2 bis zum C4
als α,β-ungesättigte Carbonylverbindung aufgefasst werden. Durch diese Anordnung steigert sie die
Eigenschaft des Flavonoids, die ungepaarten Elektronen zu delokalisieren und damit das entstehende
Radikal zu stabilisieren. Zusätzliche Hydroxygruppen unterstützen das Abfangen von Radikalen.
Die Glykosilierung (z. B. am C7) dagegen erschwert die Delokalisierung des Elektrons [BenaventeGarcia et al., 2000]. Strukturbedingt gibt es deshalb große Unterschiede im antioxidativen Potenzial
von Flavonoiden [von Gadow et al., 1997]. Interessanterweise entsprechen die „günstigsten“
Hydroxylierungsmuster den mit größter Häufigkeit in natürlichen Flavonoiden vorkommenden
Substituierungen (siehe Abbildung 9) [Stobiecki & Kachlicki, 2006].
8
7
O
6
5
O
4
2'
1'
2
3
3'
8
4'
5'
6'
(a)
7
6
5
O
2
3
4 1'
O 6'
2'
5'
3'
4'
(b)
Abbildung 9: Die häufigsten Hydroxylierungs- (einfacher Pfeil) bzw. Glykosylierungsstellen (doppelter
Pfeil) an Flavonen sowie Flavonolen (a) und Isoflavonen (b) [Stobiecki & Kachlicki, 2006]
Synergistische Effekte von Polyphenolen mit den antioxidativen Vitaminen C (L-Ascorbinsäure) und
E (α-Tocopherol) sowie Provitamin A (β-Carotin) werden ebenfalls angenommen [Zloch & Šídlová,
1977; Vinson & Bose, 1983]. Nicht zuletzt aufgrund dieser Synergieeffekte werden in der
Kosmetikindustrie vermehrt Pflanzenauszüge in Antifalten- oder Sonnencremes eingesetzt
[Ziolkowsky, 2006].
2.1.3.2
Schutz vor Herz-Kreislauf-Erkrankungen
Die kardiostimulierende Wirkung der Flavonoide (Quercetin, Rutin) wurde bereits im Jahre 1929
erstmals beschrieben [Akamatsu et al., 1929] und später mehrfach bestätigt [Jeney & Czimmer, 1936]
14
Stand der Forschung
[Zemánková-Kunzová et al., 1949]. Kämpferol [Chou Cheng Jen et al., 1982] sowie Luteolin wirken
nachweislich blutdrucksenkend [Jung-Xian et al., 1981].
Flavonoide können über eine Hemmung des Arachidonsäurestoffwechsels die Blutgerinnung
beeinflussen.
Die
Endprodukte
des
Arachidonsäurestoffwechsels,
die
Prostaglandine
und
Thromboxane, fördern die Thrombozytenaggregation und die Vasokonstriktion [Watzl et al., 2001].
Flavonoide, vor allem Luteolin [Schütz et al., 2004], Quercetin [Basarkar & Hatwalne, 1975] und
Biochanin A [Kazakov et al., 1980], schützen LDL-Lipoproteine vor Oxidation und können dadurch
den Blutcholesterinspiegel senken, jedoch ohne das nützliche HDL-Cholesterin zu beeinflussen.
2.1.3.3
Immunmodulatorische Wirkung
Viele in-vitro-Versuche sowie Beobachtungen in vivo deuten auf eine immunmodulatorische Wirkung
der Flavonoide hin. Meist äußert sich dies in einer Immunsuppression. Als zentrale Angriffspunkte der
Flavonoide im Immunsystem werden Protein- und Proteintyrosin-Kinasen angesehen. Diese für die
Zellaktivierung wichtigen Enzymsysteme werden durch bestimmte Flavonoide direkt gehemmt. So
verhindern Quercetin, Myricetin oder Kämpferol die Freisetzung von Histamin aus aktivierten
Mastzellen und basophilen Granulozyten [Watzl et al., 2001]; eine antiallergische Wirkung wird
ebenfalls von Baicalein hervorgerufen [Kubo et al., 1981]. Hinzu kommt eine Hemmung der Aktivität
von Lipoxygenasen, z. B. durch 7-Hydroxyethylquercetin [Spilková et al., 1988]. Diese Enzyme
katalysieren die Synthese von Leukotrienen, die Mediatoren von Entzündungsreaktionen und
allergischen Reaktionen sind [Watzl et al., 2001]. In vitro kann die Metabolisierung von
Arachidonsäure durch Flavonoide mit ortho-Hydroxygruppen als Sauerstoffradikalakzeptoren
unterdrückt werden (entzündungshemmende Wirkung) [Spilková et al., 1988]. Flavonoide
beeinflussen darüber hinaus das Schmerzempfinden, indem sie die Bildung von Prostaglandinen durch
Hemmung des Cyclooxygenase-Systems herabsetzen [Watzl et al., 2001].
2.1.3.4
Antimikrobielle Wirkung
Die antibakteriellen, antifungalen und antiviralen Wirkungen von Flavonoiden beruhen auf der
Änderung der Permeabilität der Zellmembran und auf der Bindung und Denaturierung von
Schlüsselenzymen [Rovellini et al., 1997].
Eine antibakterielle Aktivität gegen grampositive Bakterien wurde für Baicalein [Kubo et al., 1981]
und Sigmoidin A nachgewiesen [Fommum et al., 1983]. Quercetin und Myricetin erhöhen die
Resistenz der Magenschleimhaut und wirken somit antiphlogistisch bei Magengeschwüren, die vom
gramnegativen Bakterium Helicobacter pylori hervorgerufen werden [Barnaulov et al., 1984].
Eine antivirale Aktivität wurde in vitro z. B. für Quercetin gegenüber dem Herpes simplex-Virus Typ
1 gefunden [Beladi et al., 1981]. Die gleiche Verbindung ergab in vivo eine schwach protektive
Wirkung gegenüber dem Tollwuterreger [Watzl et al., 2001]. Ebenso wurde eine gewisse schützende
Wirkung verschiedener Flavonoide (u. a. Hesperidin, Quercitrin) bei Befall mit Grippeviren
beobachtet [Wacker & Eilmes, 1978].
15
Stand der Forschung
2.1.4 Biosynthese von Flavonoiden
Die Biosynthese aromatischer Verbindungen in Pflanzen basiert auf drei aufeinanderfolgenden
Reaktionswegen: dem Shikimisäureweg, der die Aminosäuren Phenylalanin, Tyrosin und Tryptophan
bildet, dem Phenylpropanoidweg, der zur Entstehung von Hydroxyzimtsäurederivaten führt - den
Präkursoren für von Flavonoiden und dem Zellwandpolymer Lignin sowie dem Flavonoidweg, in dem
die eigentlichen Flavonoide synthetisiert werden.
In die Flavonoidbiosynthese ist eine breite Palette an Enzymen eingebunden, angefangen von
Cytochrom-P450-Monooxygenasen über 2-Oxoglutarat-abhängige Dioxygenasen (2-ODD) bis hin zu
Glukosyl-Transferasen (GT), O-Methyl-Transferasen (OMT) sowie der kurzkettigen Dehydrogenase /
Reduktase (SDR) [Stafford, 1991].
Alle Präkursoren der Biosynthese der Polyphenole entstammen dem Kohlenhydrat-Stoffwechsel
(Erythrose, Pyruvat, Acetyl-CoA). Erythrose-4-phosphat und Phosphoenolpyruvat werden in mehreren
Schritten über den Shikimisäureweg (siehe Anhang A) in Phenylalanin umgewandelt. Der größte Teil
des Phenylalanins wird von den Pflanzen für die Proteinsynthese verwendet. Der Rest wird durch das
Enzym Phenylalaninammonium-Lyase (PAL, EC 4. 3. 1. 5, stereospezifische Eliminierung des
Amoniaks)
in
trans-Zimtsäure
umgewandelt.
An
der
Schnittstelle
des
Primär-
und
Sekundärmetabolismus spielt die PAL daher eine entscheidende Rolle [Boudet, 2007]. Durch das
Enzym Zimtsäure-4-Hydroxylase (eine P450-Monooxygenase) wird die Zimtsäure zu Cumarsäure
hydroxyliert. Diese wird mit Acetyl-CoA und dem Enzym 4-Cumaryl-CoA-Ligase in Cumaryl-CoA
umgewandelt [Austin et al.; 2003]. Cumaryl-CoA stellt die erste Schnittstelle in der Biosynthese
unterschiedlicher Präkursoren der Phenylpropanoide dar; hierzu gehören Monolignole, Stilbene,
Cumarine, Xanthone, phenolische Ester, Benzoesäurederivate, Flavonoide usw. [Boudet, 2007].
Insgesamt
sind
an
diesen
Stoffwechselwegen
mehr
als
16
Cytochrom-P450-abhängige
Monooxygenasen beteiligt, die ausgeprägt exotherme und deshalb irreversible Reaktionen
katalysieren. Dies führt zur strikten Diversifikation in spezielle Synthesewege [Ehlting et al., 2006].
Der Übersichtlichkeit halber wird hier in erster Linie die Biosynthese der Flavonoide betrachtet.
Ein Teil des Acetyl-CoA der Pflanzenzelle wird mit ATP und einem Hydrogencarbonatanion in
Malonyl-CoA, ADP und H+ umgewandelt. Drei der Malonyl-CoA-Moleküle reagieren mit dem
Cumaryl-CoA. Bereits an dieser Stelle spaltet sich die Biosynthese in zwei Richtungen, je nach dem,
welche Enzyme die Reaktion katalysieren. So kann durch eine von der Chalkon-Synthase katalysierten
Reaktion das p-Cumarsäure-CoA zum Naringeninchalkon (2',4',6', 4-Tetrahydroxychalkon) reagieren,
während bei Einwirkung von Chalkon-Synthase und Chalkon-Reduktase (CHR) aus p-CumarsäureCoA und Malonyl-CoA Trihydroxychalkone synthetisiert werden [Austin et al., 2003]. Die
Umsetzungen der CHR bieten somit den evolutionären Vorteil (z. B. im Fall der Leguminosen),
gezielt unikate Polyphenole (Deoxychalkone, Deoxyflavanonen) entstehen zu lassen, die exklusiv vor
einem Angriff durch Pflanzenpathogene schützen [Bomati et al., 2005] (vgl. Fraßschutz S. 8).
16
Stand der Forschung
Phenylalanin
PAL
C4H
CHS / CHR
Trihydroxychalcone
CHI
Liquiritigenin
IFS
Aurone
Isoflavon
IOMT
I2H
IFR
VR
DMID
Isoflavonoide
IFS
4CL
4-Cumaroyl-CoA
+ Malonyl-CoA
CHS
Naringeninchalcon
(Tetrahydroxychalcon)
CHI
Naringenin F3'H
F3H
F3'H
F3'5'H
3-Hydroxyflavanone
(Dihydroflavonole)
DFR
DFR
Flavan-4-ole
Eriodictyol
FNSI, FNSII
Flavone
FLS
Flavonole
LAR
Flavan-3,4-diole
(Leucoanthocyanidine)
2,3-trans-2R,3S-Flavan-3-ole
ANS
3-Hydroxyanthocyanidine
OMTs
ANR
2,3-cis-2R,3R-Flavan-3-ole
GTs
ACTs
Anthocyanine
Proanthocyanidine
Abbildung 10: Biosynthese der Flavonoide – schematische Darstellung mit enzymatischen Schritten, die
zur Bildung der Hauptverbindungsklassen der Flavonoide führen [Winkel, 2006].
Abküzungen: ACTs, Acetyl-Transferasen; ANR, Anthocyanidin-Reduktase; ANS, AnthocyanidinSynthase; C4H, Zimtsäure-4-Hydroxylase; CHI, Chalkon-Isomerase; CHR, Chalkon-Reduktase; CHS,
Chalkon-Synthase; 4CL, 4-Cumaryl-CoA-Ligase; DFR, Dihydroflavonol-4-Reduktase; DMID, 2',7Dihydroxy-4'-methoxyisoflavanol-Dehydratase; F3H, Flavanon-3-Hydroxylase; FNSI und FNSII, FlavonSynthase I und II; F3'H und F3'5'H, Flavonoid-3'- und Flavonoid-3',5'-Hydroxylase; GTs, GlukosylTransferasen; IOMT, Isoflavon-O-methyl-Transferase; IFR, Isoflavon-Reduktase; I2'H, Isoflavon-2'Hydroxylase; IFS, Isoflavon-Synthase; LAR, Leukoanthocyanidin-Reduktase; OMTs, O-MethylTransferase; PAL, Phenylalaninammonium-Lyase; VR, Vestiton-Reduktase.
Die beiden Gruppen von Zwischenprodukten (Trihydroxychalkone, Tetrahydroxychalkone) werden
wiederum auf verschiedenen Wegen weiter umgesetzt. Durch einen noch ungeklärten Mechanismus
können beide Substanzgruppen zu Auronen reagieren. Der zweite bzw. dritte Reaktionweg wird durch
die Chalkon-Isomerase II / Chalkon-Isomerase I unter Entstehung von Liquiritigenin bzw. Naringenin
(Flavanon) katalysiert. Die Chalkon-Isomerase I setzt nur Tetrahydroxychalkone um [Yan et al.,
2007]. Unter Vermittlung der Isoflavon-Synthase werden Isoflavone gebildet. Diese können wiederum
mittels verschiedener Enzyme (Isoflavon-O-Methyl-Transferase, Isoflavon-2'-Hydroxylase, IsoflavonReduktase, Vestiton-Reduktase, 2',7-Dihydroxy-4'-methoxyisoflavanol-Dehydratase) in verschiedene
Isoflavonoide umgewandelt werden [Winkel, 2006].
Vom farblosen Flavanon Naringenin, leiten sich die Flavone (z. B. Apigenin), Isoflavone (z. B.
Genistein), Flavan-4-ole und Dihydroflavonole (z. B. Dihydrokämpferol, DHK) ab. Dabei spielen v. a.
die Enzyme Flavonoid-3'- und 3',5'-Hydroxylase eine zentrale Rolle [Forkmann & Martens, 2001].
Naringenin wird durch die Enzyme Flavonoid-3'-Hydroxylase und Dihydroflavonol-4-Reduktase in
17
Stand der Forschung
Flavan-4-ol umgewadelt. Wenn anstelle von DFR die Flavon-Synthasen I und II wirksam sind,
entsteht das Flavon Apigenin.
Dihydrokaempferol (auch Aromadendrin genannt [Habermehl et al., 2002]) entsteht ausgehend vom
Naringenin unter Beteiligung folgender Enzyme: Flavanon-3-Hydroxylase, Flavonoid-3'- und 3',5'Hydroxylase [Winkel, 2006]. Es wird anschließend durch eine Flavonol-Synthase, die eine
Doppelbindung zwischen dem C2- und C3-Atom schafft, in ein Flavonol (Kämpferol), umgewandelt
oder durch katalytische Reduktion mittels Dihydroflavonol-4-Reduktase zu einem Flavan-3,4-diol,
Leucoanthocyanidin (Leucopelargonidin) umgesetzt [Habermehl et al., 2002]. Die Flavan-3,4-diole
werden
als
kurzlebige
Vorstufen
der
Anthocyane
und
Flavan-3-ole
sowie
deren
Kondensationsprodukten, den Proanthocyanidinen, angesehen. Die Leucoanthocyanidin-Dioxygenase
(Anthocyanidin-Synthase) überführt die Flavan-3,4-diole in Anthocyanidine. Diese dienen wiederum
als Ausgangsstoffe für a) Anthocyanine, wobei nachfolgende Enzyme einwirken: O-MethylTransferasen, Glucosyl-Transferasen, Acetyl-Transferasen; und b) für 2,3-cis-2R, 3R-Flavan-3-ole
(verantwortliches Enzym: Anthocyanidin-Reduktase). Flavan-3-ole entstehen ebenfalls aus Flavan-3,4diolen. Der Unterschied ergibt sich zum einen aus der Stereochemie (2,3-trans-2R, 3S-Flavan-3-ole)
und zum anderen aus dem einwirkenden Enzym (Leukoanthocyanidin-Reduktase) [Grotewold, 2006].
Die Synthese der Proanthocyanidine ist bisher im Detail noch nicht geklärt (Mechanismus der
Polymerisation, Transport zur Vakuole; siehe Anhang B) [Dixon et al., 2005]. Ein Zusammenspiel
verschiedener Enzyme ist wahrscheinlich. Wenn das reduzierende Cosubstrat (z. B. NADPH) limitiert
ist, kann das Kation mit Flavan-3-olen zu Dimeren, Oligomeren und Polymeren, den
Proanthocyanidinen, reagieren [Xie & Dixon, 2005]. Eine weitere Möglichkeit besteht in der
Kopplung von Flavan-3,4-diolen mit Flavan-3-olen [Forkmann & Martens, 2001].
Die Bildung von Glykosiden erfolgt in der Pflanze meist sekundär unter Beteiligung von GlykosylTransferasen [Boudet, 2007].
OH
HO
O
OH O
Apigenin
OH
O O
O
UF7GT HO
OH
HO
OH
OH O
Abbildung 11: Glykosylierung von Apigenin durch die UF7GT (UDP-Glucose:Flavonoid-7Glukosyltransferase).
Hydroxybenzoesäuren werden in Pflanzen aus den entsprechenden Hydroxyzimtsäuren gebildet,
indem ein Acetatrest nach Oxidation der Seitenkette der Hydroxyzimtsäuren entfernt wird [Ritter,
1994].
18
Stand der Forschung
O
HO
H2 O
OH CoASH HO
Hydroxyzimtsäure
OH O
O O
SCoA Ox.
aktivierte 3-Hydroxy3-(hydroxyphenyl)propionsäure
O
H
O
2
OH
SCoA
HO
HO
- O
aktivierte
SCoA Hydroxybenzoesäure
3-(Hydroxyphenyl)3-oxopropionsäure
Abbildung 12: Bildung von Hydroxybenzoesäuren ausgehend von Hydroxyzimtsäuren in Pflanzen.
Enzyme: 1. CoA-Ligase (Synthetase + ATP), Enoyl-CoA-Hydratase, 2. Dehydrogenase (NAD+ / FAD),
3. β-Ketothiolase)
Bei einigen Enzymen der Biosynthese überlappen sich mehrere katalytische Aktivitäten; z. B. verfügt
die FLS von Arabidopsis zusätzlich über eine F3H-Aktivität [Prescott et al., 2002]. Weiterhin ist es
interessant, die Flavonoidbiosynthese parallel in verschiedenen Pflanzen zu verfolgen, da hierbei die
gleiche Reaktion durch verschiedene Enzymunterklassen (EC 1.13./1.14.) katalysiert werden kann. So
gehört die F6H von Chrysosplenium americanum den 2-ODDs an [Anzellotti & Ibrahim, 2000],
während die F6H von Tagetes sp. eine P450-Monooxygenase ist. Unterschiede sind lediglich in der
Substratspezifität zu finden, wobei das Enzym aus Tagetes keine methylierten Subtrate akzeptiert
[Halbwirth et al., 2004]. Ein ähnliches Phänomen ist bezüglich der Flavon-Synthasen zu beobachten –
die FNSI ist eine 2-ODD, die FNSII wiederum eine P450-Monooxygenase [Britsch, 1990; Martens &
Forkmann, 1999].
Erste Erkenntnisse zur Regulation der Biosynthese der Flavonoide gehen auf das Jahr 1987 zurück
[Meyer et al., 1987]. Seitdem sind umfangreiche Befunde zu den verantwortlichen Genen
hinzugekommen. So ist heute bekannt, dass Strukturgene einzelne Biosynthese-Schritte kontrollieren
und regulatorische Gene den gesamten Syntheseweg oder Teile davon an- oder abschalten können.
Weitere Gene, im Zusammenhang mit Flavonoiden, sind für den pH-Wert in den Vakuolen, die
Wechselwirkung mit Metallionen oder die Kopigmentierung verantwortlich [Forkmann & Martens,
2001]. Die differentielle Genexpression bietet verschiedene Vorteile – sie kann „erwünschte“
Reaktionen fördern (z. B. Isoflavonoid- und Flavanolbildung zur Erhöhung der Pflanzenresistenz;
verstärkte Pigmentsynthese in Form von Flavonolen und Anthocyanen als UV-Schutz), und
unerwünschte Reaktionen vermeiden (z. B. Unterdrückung der CHS in Petunia, was eine männliche
Sterilität bedingt, die wiederum für die Entwicklung von pflanzlichen Hybriden notwendig ist) [Taylor
et al., 1992].
Beispiele für die erfolgreiche Anwendung molekularbiologischer Prinzipien im Zusammenhang mit
der Flavonoid-Synthese finden sich in der Zierpflanzenzucht. Ziel hierbei ist es oftmals, die
Blütenfarbe gezielt zu ändern, indem neue Gene eingefügt werden oder die Flavonoidbiosynthese in
Mutanten partiell unterdrückt wird [Tanaka et al., 1998; Mol, 1999; Davies, 2000]. So erhielt
beispielsweise ein Kultivar der weißen Nelke (Dianthus sp.), die nur DHK bildete, durch Einfügen
zweier zusätzlicher Gene (kodierend für DFR und F3'5'H aus Petunia) die Fähigkeit, DHM
(Dihydromyricetin) zu Leucodelphinidin und weiter zu Delphinidin umzusetzen, so dass eine
transgene Nelke mit violetten Blüten enstand [Holton, 1996].
19
Stand der Forschung
OH
HO
O
OH
OH
OH
OH
OH O
Dihydromyricetin
DFR
HO
O
OH
OH
OH
ANS
OH
OH OH
Leucodelphinidin
HO
+
O
OH
OH
OH
OH
Delphinidin
Abbildung 13: Umsetzung von Dihydromyricetin zum violetten Delphinidin in einem transgenen
Dianthus. (Dianthus caryophyllus; copyright 2003-2006 by John Sangwon Lee, M. D. FAAP)
Nicht nur auf genetischer Ebene lässt sich die Biosynthese von Flavonoiden beeinflussen. Werden
Pflanzen stärker belichtet, hat dies i.d.R. eine verstärkte Photosynthese zur Folge. Aufgrund dessen
wird mehr Acetyl-CoA gebildet, wodurch die Biosynthese der Flavonoide stimuliert wird, was
wiederum die Pflanzen farbiger erscheinen lässt (phänotypische Anpassung). Somit wirken sich die
Jahreszeit und der Erntezeitpunkt der Pflanzen auf den Flavonoidgehalt aus. Beispielsweise enthält
Kopfsalat im August geerntet 3- bis 5-mal mehr Flavonoide als im April [Watzl et al., 2001].
2.1.5 Bioverfügbarkeit und Verstoffwechselung
In der Nahrung liegen bis auf die Flavan-3-ole alle Flavonoide glykosidisch gebunden vor [Scalbert &
Williamson; 2000]. Lange Zeit wurde angenommen, dass nur Aglykone durch das Verdauungssystem
aufgenommen werden [Kühnau, 1976; Griffiths, 1982]. Neuere Studien scheinen aber zu belegen, dass
beispielsweise Quercetinglukoside ebenso und sogar besser als das entsprechende Aglykon resorbiert
werden [Hollman et al., 1995]. Die Flavonoidaglykone werden im Dünndarm durch die
Darmschleimhaut resorbiert, in der Leber glukuroniert (UDP-Glucuronyltransferasen), sulfatiert
(Sulfotransferasen) oder methyliert (O-Methyltransferasen), bevor sie mit dem Urin oder Stuhl wieder
ausgeschieden werden [Crespy et al., 1999]. Der Anteil der nichtderivatisierten Ausgangsflavonoide
liegt unter zwei Prozent, was auf eine intensive Metabolisierung im menschlichen Körper hindeutet
[Donovan et al., 1999]. Die Hälfte der Flavanole aus grünem und schwarzem Tee war z. B. nach einer
Verweilzeit von ein bis sechs Stunden wieder aus dem Körper verschwunden [Watzl et al., 2001].
Flavanololigomere können durch die Magensäure zu Epicatechinmonomeren und -dimeren gespalten
werden und somit anschließend im Dünndarm resorbiert werden [Hollman & Katan, 1997].
Im Fall der Flavonoidglykoside blieb lange das Problem der schwierig zu spaltenden β-glykosidischen
Bindung, die gegen Hydrolyse durch Salzsäure [Hertog et al., 1992] oder pankreatische Enzyme
beständig ist, ungelöst. Der Nachweis von Quercetin-4'-glukosid im Blutplasma in 20-fach höherer
Konzentration als Quercetin-3-rutinosid [Aziz et al., 1998; Hollman et al., 1999] führte jedoch zur
Annahme, dass die Absorption des Monoglukosides im Dünndarm möglich sein muss. Hollman et al.
haben deshalb postuliert, dass Quercetin-4'-glukosid durch einen intestinalen Na+-GlukoseKotransporter, ähnlich wie Naphthol-β-D-glukosid oder Phenyl-β-D-galaktosid in Ratten [Mizuma et
al., 1992; 1994], aktiv aufgenommen wird [Hollman et al.; 1995]. Erst Németh et al. konnten
nachweisen, dass die Deglykosylierung der Flavonoidglykoside im Dünndarm durch β-Glucosidasen
(LPH, CBG) des Epithels erfolgt [Németh et al.; 2003]. Eine Beeinflussung der Flavonoidaufnahme
20
Stand der Forschung
durch Bindung an Proteine in der Nahrung konnte für Quercetin und Kämpferol aus Tee, der mit oder
ohne Milch getrunken wurde, nicht nachgewiesen werden [Hollman et al., 2001].
Neben den Flavonolen und deren Glykoside werden auch Flavanole [Lee et al., 1995], Flavanone
[Fuhr & Kummert, 1995], Flavone [Shimoia et al., 1998], Isoflavone [Watanabe et al., 1998] und
Anthocyanine [Lapidot et al., 1998] im Menschen mit der Nahrung resorbiert.
2.1.6 Gewinnung von Flavonoiden und Oxyfunktionalisierung
2.1.6.1
Isolierung aus biologischen Materialien
Die Isolierung von Flavonoiden erfolgt meist aus Pflanzenmaterial, wobei mehrere Aspekte zu
beachten
sind.
Grundsätzlich
finden
sich
im
getrockneten
Pflanzenmaterial
weniger
Flavonoidkonjugate (v. a. acylierte Flavonoidglykoside) als im Rohmaterial, da sie ausgesprochen
temperaturempfindlich sind.
Die Gewinnung der Flavonoide aus Pflanzenmaterial erfolgt in mehreren Schritten – Extraktion,
Konzentration und Reinigung (LLE Flüssig-Flüssig-Extraktion, SPE Festphasenextraktion). Die
Polarität des verwendeten Lösungsmittels muss der zu extrahierenden Substanz angepasst werden.
Flavonoidaglykone werden folglich mit Lösungsmitteln mittlerer Polarität (Methylenchlorid,
Ethylether, Ethylacetat) extrahiert, polare Glykoside hingegen mit Ethanol, Methanol, Wasser oder
Gemischen genannter Lösungsmittel. Es können unterschiedliche Methoden für die Extraktion im
Labor verwendet werden: Mazeration (Kaltextraktion), Digestion (Heißextraktion), Perkolation
(Verdrängungsverfahren) [Bell, 2006], Soxhlett-Extraktion [Stobiecki & Kachlicki, 2006],
Mikrowellen unterstützte Extraktion [Kaufmann & Christen, 2002], Ultraschall-Extraktion [Herrera et
al., 2004; Rostagno et al., 2003], beschleunigte Lösemittelextraktion [Rostagno et al., 2004] oder
superkritische Extraktion mit Kohlendioxid [Kaiser et al., 2004].
Industriell werden Extrakte und Öle durch Mazeration, Digestion, Perkolation mit Lösungsmitteln
(evtl.
nach
enzymatischem
Wasserdampfdestillation
und
Aufschluss),
fraktionierte
Hochdruckextraktion,
Destillation
gewonnen.
Flüssig-Flüssig-Extraktion,
Diese
Extrakte
können
anschließend durch Membranfiltration (z. B. Ultrafiltration, Umkehrosmose) konzentriert oder mit
chromatographischen Methoden aufgetrennt werden [Blum, 1999]. In der Regel wird die Extraktion
eher zur Gewinnung von Substanzgemischen (z. B. Flavonoidaglykone) als zur Gewinnung einzelner
Verbindungen eingesetzt.
2.1.6.2
Hydroxylierung – chemisch
Die bekannten Verfahren der chemischen Hydroxylierung von Phenolderivaten erfordern meist
aufwendige mehrstufige Synthesen [Li et al., 2006] und haben eine komplizierte Produktgewinnung
zur Folge (z. B. bei der Herstellung von Katecholderivaten). Die Ausgangsverbindungen müssen als
Ether- oder Esterderivate vorliegen, deren Schutzgruppen nach der Reaktion abgespalten werden – oft
geschieht dies nur unvollständig, wodurch die Ausbeuten erheblich sinken und die Produktisolierung
erschwert wird [Allan & Robinson; 1924; Heap & Robinson, 1926; Baker et al.; 1933; Saxena et al.;
1985; Hoshino & Takeno; 1987; Varma et al.; 1998; Ganguly et al.; 2005; Kabalba et al., 2005].
21
Stand der Forschung
Methoxyflavanone werden ziemlich selektiv durch das Peroxid Dimethyldioxiran (DMD) in Position
C6
(5-Methoxyflavanon,
5-MeOFA;
4',5,7-Trimethoxyflavanon,
4',5,7-TriMeOFA)
bei
Raumtemperatur hydroxyliert. In saurem Milieu konnten die genanten Flavonoide mehrfach
hydroxyliert
werden
(5-MeOFA→6,8-DiOH-5-MeOFA;
4',5,7-TriMeOFA→6,8-DiOH-4',5,7-
TriMeOFA→3',6,8-TriOH-4',5,7TriMeOFA) ; 4'-Methoxyflavanon wurde einfach hydroxyliert und
zum
3'-Hydroxy-4'-methoxyflavanon
umgesetzt.
Unter
neutralen
Bedingungen
wurde
4'-
Methoxyflavanon zum 4'-Methoxyflavon dehydriert. Die Ausbeute der Dimethyldioxiran-katalysierten
Reaktionen betrugen 35-40 % [Bernini et al., 2000]. Die Schwächen dieser Methode bestehen in der
„stoffabhängigen“ Hydroxylierungsposition und dem nicht einheitlichen pH-abhängigen Verhalten der
Flavonoide (Hydroxylierung, Dehydrierung, Demethylierung). Im Jahre 2009 untersuchten Li et al.
die Hydroxylierung von Polymethoxyflavonen durch DMD und fanden eine Regioselektivität am C3
für 3',4',5,6,7,8-Hexamethoxyflavon (unter neutralen Bedingungen). Weitere Arbeiten der gleichen
Arbeitsgruppe zu diesem Substrat ergaben eine regioselektive Demethylierung der Methoxygruppe am
C5 in Anwesenheit von Salzsäure oder Trifluoressigsäure [Li et al., 2006, 2007].
Aktuelle Synthesen zielen auf die Verwendung neuartiger Katalysatoren, wie z. B. Iodoxybenzoesäure
(IBX), ab, die mit hoher Selektivität zur oxidativen Demethylierung phenolischer Methylarylether
[Quideau et al., 2008] oder zur Hydroxylierung von der Phenolderivaten geeignet ist (Phenol
[Magdziak et al., 2002], Naringenin [Selenski et al., 2006]). IBX erlaubt es ebenfalls, wenig
substituierte Flavonoide (C6→C5,6; C7→C7,8; C4',5,7→C3',4',5,7) in zwei Schritten (1. Oxidation
zum Chinon, 2. reduktive Aufarbeitung mittels Natriumdithionit) in ortho-Position zu hydroxylieren.
Die Reaktionen laufen bei Raumtemperatur oder erhöhter Temperatur (60 ºC, 80 ºC) bei C7hydroxylierten Flavonoiden ab und ergeben in Reaktionszeiten von 1-24 Stunden Ausbeuten von 7298% [Barontini et al., 2010]. Die Methode ist allerdings nicht geeignet, um 5-Hydroxyflavanon oder
5-Hydroxyflavon zu hydroxylieren (aufgrund der intramolekularen Wasserstoffbrücken [Exarchou et
al., 2002; siehe auch Abbildung 4, S. 7] wird die Ausbildung eines notwendigen Intermediats
(Iodanylkomplexes) gestört [Barontini et al., 2010]).
Ein weiteres Beispiel für einen selektiven chemischen Katalysator stellt Methyltrioxorhenium in
Kombination mit Wasserstoffperoxid dar. Obgleich Flavanone zu unerwünschten p-Benzochinon[Bernini et al., 2001, 2003, 2005] oder Benzodioxepinderivaten umgesetzt werden [Bernini et al.,
2001, 2003], gehen Flavone, in Abhängigkeit vom Substitutionsmuster, in 3-Hydroxy-2methoxyflavanonderivate (ausgehend vom Flavon; Ausbeute 62 %) oder in C6- oder C8hydroxylierte Derivate (ausgehend von 5,7-Dimethoxyflavon, Ausbeute 35 %) über. Das C8hydroxylierte Produkt wird dabei zwischenzeitlich partiell demethyliert (ca. 60 % am C5), in den
weiteren Schritten aber wieder methyliert, was inklusive der neu eingeführten Hydroxygruppe zum
5,7,8-Trimethoxyflavon führt. Auch das 6-Hydroxy-5,7-dimethoxyflavon unterliegt einer weiteren
Methylierung, so dass es in Baicaleintrimethylether übergeht [Bernini et al., 2008]. Die Schwächen
dieser Methode liegen in der nicht stattfindenden Flavanon-Hydroxylierung bzw. -Methylierung, der
22
Stand der Forschung
niedrigen Ausbeute im Vergleich zur IBX-Katalyse und den entstehenden Produktgemischen
(abgesehen von der Tatsache, dass am Ende die Zielprodukte in methoxylierter Form vorliegen).
Jüngere Untersuchungen haben ebenfalls gezeigt, dass Flavonoide in Gegenwart von Luftsauerstoff
durch γ−Strahlung hydroxyliert werden können (z. B. Naringenin→Eriodictyol, bis 150 Gy; danach
erfolgen Polymerisation oder Disproportionierung) [Nagy et al., 2008] oder elektrochemisch an einer
Platinelektrode, bevorzugt am B-Ring, oxidierbar sind [Masek et al., 2011]. Ausbeuten wurden in
diesen Studien nicht angegeben.
2.1.6.3
Hydroxylierung – biotechnologisch
Mit fast 600 Unternehmen nimmt Deutschland heute in Europa eine führende Position im
Biotechnologie-Bereich ein. Der Umsatz der reinen Biotechnologie-Unternehmen (ca. 500) ist
zwischen 2005 und 2008 um 42 % auf über 2,2 Milliarden Euro gestiegen. Über 40 % der Firmen
befassen sich mit Produkten für die Gesundheit (Rote Biotechnologie), knapp 8 % widmen sich der
Weißen Biotechnologie [BMBF, 2012]. Die Weiße Biotechnologie besitzt ein enormes ökonomisches
Potenzial, insbesondere im Bereich der (bio)chemischen Synthese. In ihrem Zentrum steht die
Biokatalyse, d. h. die Nutzung von Enzymen oder mikrobiellen Zellen zur Produktion von Spezialoder Feinchemikalien (z. B. Flavonoiden) [Struhalla & Fietz, 2005].
Flavonoide können mit Hilfe von Polyphenol-Oxidasen (EC 1.10.x), Peroxidasen (1.11.1.x),
Peroxygenasen (1.11.2.x), Dioxygenasen (EC 1.13.x) oder Monooxygenasen (EC 1.14.x) oxidiert
werden. Unter Einwirkung von Polyphenol-Oxidasen oder „klassischen“ Peroxidasen entstehen meist
Chinonderivate (vgl. enzymatische Bräunung), Dimere und Oligomere oder Spaltprodukte wie
polyphenolische Säuren [Schreier et l., 1985]. Für enzymatische Hydroxylierungen kommen somit nur
Peroxygenasen, Monooxygenasen und Dioxygenasen in Frage.
Bei den meisten Monooxygenasen handelt es sich um Cytochrom-P450-abhängige Enzyme, die
NAD(P)H und Sauerstoff sowie Elektronentransport-Proteine und Flavin-Reduktasen für ihre
katalytische Aktivität benötigen. Sie spielen eine wichtige Rolle sowohl bei der Oxidation der
Flavanoide zu den Flavonoiden (FSII - Flavonsynthase II [Stich & Forkmann, 1987], F2H - Flavanon2-Hydroxylase, IFS - Isoflavonsynthase) als auch bei der Hydroxylierung der aromatischen Ringe A
und B [Ibrahim & Anzellotti, 2003]. Der Ring B wird durch Flavonoid-3'-Hydroxylasen (F3'H,
pflanzlich: [Vaughan et al., 1969; Stotz et al., 1985; Stich & Forkmann, 1987], bakteriell: [Pandey et
al., 2011]), die Flavonoid-4'-Hydroxylase (F4'H, [Ortiz de Montellano & de Voss, 2005; Sono et al.,
1996]), die Flavonoid-3'5'-Hydroxylase (F3'5'H, [Forkmann & Martens, 2001; de Vetten et al., 1999])
und die Isoflavon-2'3'-Hydroxylase (IF2'3'H, [Hinderer et al., 1987; Gunia et al., 1991]) derivatisiert.
Die Flavonoid-A-Ring-Hydroxylasen greifen hingegen die Positionen C6 oder C8 an (F8H Flavonoid-8-Hydroxylase, pflanzlich: keine Isoflavon-Umsetzung [Halbwirth et al., 2004; Halbwirth
& Stich 2006], bakteriell: Isoflavon-Umsetzung [Klus & Barz, 1998; Halbwirth et al., 1998; LatundeDada et al., 2001]).
23
Stand der Forschung
Dioxygenasen übertragen beide Atome eines Sauerstoffmoleküls (O2) auf ein Substrat. Dabei werden
Cosubstrate / Cofaktoren wie Fe2+, 2-Oxoglutarat, Askorbat, NAD(P)H und Flavine benötigt [Ibrahim
& Anzellotti, 2003]. Sie spielen eine wichtige Rolle sowohl bei der Oxidation der Flavanoide zu
Flavonoiden (FSI - Flavon-Synthase I [Britsch, 1990; Martens et al., 2001]; FLS - Flavonol-Synthase
[Britsch et al., 1981]) als auch bei der Hydroxylierung der Ringe A und C (F6H - Flavonoid-6Hydroxylase [Anzellotti & Ibrahim, 2000], FHT - Flavanon-3-Hydroxylase [Forkmann & Heller,
1999; Wimmer et al., 1998]).
Es wurde gezeigt, dass eine Hydroxylase des Zygomyceten Absidia blakesleeana in der Lage ist, die
C4'-Position von Flavanon und Isoflavanon anzugreifen [Abul-Hajj et al., 1991]; nähere Information
zu diesem Enzym gibt es allerdings nicht.
Pflanzlichen Peroxygenasen [EC 1.11.2.3] führen laut BRENDA lediglich Epoxidierungen [Lequeu et
al., 2003; Hanano et al., 2006] und Sulfoxidationen durch; Flavonoide sind nicht unter ihren
Substraten [Hamberg & Hamberg, 1996]. Pilzliche Peroxygenasen [EC 1.11.2.1], z. B. aus Agrocybe
aegerita oder Coprinellus radians, epoxidieren/hydroxylieren verschiedene Aromaten, darunter
Toluol, Naphthalin [Ullrich & Hofrichter, 2005, Anh et al., 2007; Kluge et al., 2007] und Anthracen
[Aranda et al., 2010]; über eine Oxyfunktionalisierung von Flavonoiden durch diese Enzyme war bis
zum Beginn des vorliegenden Promotionsvorhabens nichts bekannt.
2.2 Flavonoidreiche Pflanzen – Begründung der Auswahl
Im Zuge der Entwicklung innovativer kosmetischer und pharmazeutischer Produkte wird nach dem
„idealen Pflanzenextrakt“ gesucht. Dieser sollte einerseits definierte, chemisch stabile Substanzen mit
günstigen galenischen Eigenschaften (gleichbleibende Zusammensetzung) und andererseits keine
bekannten Allergene enthalten [Schempp 2007]; außerdem sollten seine Inhaltsstoffe hautberuhigend
wirken (d. h. Hemmstoffe des Signalmoleküls Interleukin-1-alfa, das von Stresszellen ausgeschüttet
wird [Axterer et al. 2006]). Nicht zulezt sollten die verwendeten Pflanzen aus dem kontrollierten,
ökologischen Anbau stammen und die Extraktherstellung umweltfreundlich ablaufen [Schempp 2007].
Unter dieser Prämisse wurden Früchte/Blüten/Blätter folgender Pflanzen als besonders geeignet für
die vorliegende Arbeit ausgewählt:
Aronia melanocarpa (Apfelbeere; Beeren),
Trifolium pratense (Rotklee oder Wiesenklee; Blüten),
Bellis perennis (Gänseblümchen, Blüten),
Fragaria ananassa (Gartenerdbeere; Blätter).
Die Auswahl der Pflanzen erfolgte dabei auch nach folgenden Kriterien: Anteil potentieller Wirkstoffe
(Flavonoide),
die
Bekanntheit
der
Pflanze
(positive
Assoziationen
Marketingstrategien) und mögliche Anbauflächen in Deutschland.
mit
der
Pflanze,
24
Stand der Forschung
2.2.1 Aronia melanocarpa
Die auch als Apfelbeere bekannte Pflanze gehört zur Familie der
Rosengewächse (Rosaceae). Die Früchte der Aronia sind für ihren hohen
Gehalt an Anthocyaninen (Cyanidinglykoside) [Bermudez-Soto, 2004],
Vitamin E, K, β-Carotin sowie Vitamin B2, B9, C, PP, Eisen und Iod,
Kalzium, Mangan, Kupfer, Kalium, Phosphor, Zink [Strigl et al., 1995] bekannt. Untersuchungen von
[Slimestad et. al, 2005] belegen zudem einen hohen Gehalt an Chlorogen- und Neochlorogensäure; der
Gehalt an Flavonolen (Quercetinglykoside) ist allerdings vergleichweise niedrig [Kaczmarowicz et al.,
2004; Oszmiánski et al., 2005]. Der insgesamt hohe Flavonoidgehalt wird für die positiven
antioxidativen und immunmodulatorischen Eigenschaften der Beeren verantwortlich gemacht
[Kintlerova et al., 1998]. So tragen die Anthocyanine nachweislich zur Erniedrigung des Blutdrucks
und Cholesterolspiegels im Blut bei [Cyr et al., 2006; Nosreti, 2001]. Die Aronia wird ebenso als
Heilpflanze bei Darm- und Hauterkrankungen sowie bei Harnwegsinfektionen angewendet. Ohgami et
al. [Ohgami et al., 2005] berichteten über eine erhöhte entzündungshemmende Wirkung der
Aroniaextrakte im Vergleich zu einzelnen Flavonoiden bzw. Anthocyanidinen (synergistische Effekte
im Extrakt). Nicht zuletzt wurde festgestellt, dass die anthocyaninreichen Extrakte der Aronia das
Wachstum von menschlichen HT-29 Darmkrebszellen in vitro bis zu 90 % inhibieren (die normalen
Darmzellen NCM 460 wurden in ihrem Wachstum nur zu < 10 % inhibiert) [Malik et al., 2003]. Es
kann davon ausgegangen werden, dass die positiven Wirkungen der Pflanze insgesamt auf der hohen
antioxidativen Kapazität und den guten Radikalfängereigenschaften der Inhaltsstoffe beruhen
[Gasiorowski et al., 1997].
2.2.2 Trifolium pratense
Der Rot- oder Wiesenklee gehört zur Familie der Hülsenfrüchtler (Fabaceae). Die
Pflanze zeichnet sich durch einen besonders hohen Gehalt an den Isoflavonoiden
(Genistein und Daidzein) aus. Es gibt Hinweise darauf, dass diese Isoflavonoide
eine östrogenähnliche Wirkung besitzen und bei der Behandlung altersbedingter
oder hormonabhängiger Krankheiten (z. B. menopausale Symptome, Osteoporose,
Herz-Kreislauf-Erkrankungen) hilfreich sind [Bradley, 1992; Zerykier, 2003]. Es sind aus der Literatur
einige analytische Untersuchungen zu Rotklee-Extrakten bekannt [z. B. Polasek et al., 2007], die
jedoch keine Quantifizierung der Inhaltstoffe vorgenommen haben (identifizierte Isoflavonoide:
Daidzein, Daidzin, Genistein, Genistin, Formononetin, Ononin, Biochanin A, Sissotrin, Trifoside,
Calycosin, Pectolinaringenin, Pratensein, Pseudobaptigenin; identifizierte Flavonoide: Quercetin,
Isoquercetin, Hyperosid). In der Kosmetik werden dem Rotklee Anti-Aging-Eigenschaften
zugeschrieben, da er die Haut reinigt und den Zellstoffwechsel der Haut aktiviert [CTFA, 2007]. Der
Inhaltsstoff Genistein blockiert die α-Reduktase und beugt damit Akne und Haarausfall vor [He et al.,
1996]. Die flavonoiden Inhaltsstoffe des Rotklees gehören zu den guten Radikalfängern [Zerykier,
2003].
25
Stand der Forschung
2.2.3 Bellis perennis
Die umgangsprachlich als Gänseblümchen bezeichnete Pflanze gehört zur Familie
der Korbblütengewächse (Asteraceae) und zählt zu den bekanntesten Pflanzenarten
Mitteleuropas, die auch als Heilkraut und Futterpflanze von Bedeutung ist. In der
Medizin werden Gänseblümchen wegen der diuretischen, entzündungshemmenden,
schleimlösenden, krampfstillenden, und blutreinigenden Wirkung angewendet
[Bielenberg & Wilhelm, 1993; Nazuruk et. al, 2001]. Auch im Bereich der Kosmetik könnte die
reinigende Wirkung Anwendung finden, um etwa die Hautoberfläche sauber zu halten.
Untersuchungen von Nazuruk et al. haben gezeigt, dass Extrakte von Gänseblümchen sich durch einen
besonders hohen Gehalt an Flavonoiden auszeichnen. Es wurden dabei vier Flavonoidstrukturen, die
z. T. glykosyliert vorlagen, identifiziert (Apigenin, Apigeninglykoside, Kämpferol, Kämpferolglykoside, Isorhamnetinglykoside, Quercetin); weitere Strukturen sind zu erwarten. Die Blüten von B.
perennis enthalten neben Flavonoiden auch Saponine, ätherische Öle, Bitterstoffe, Schleime,
Gerbstoffe, phenolische Säuren, Vitamine und Minerale [Nazuruk et. al, 2001; Hagenmeyer et al.,
2006].
2.2.4 Fragaria ananassa
Erdbeeren gehören zur Familie der Rosengewächse (Rosaceae). Die
Blätter der Gartenerdbeere werden seit langem als Tee verwendet und
haben in der Volksmedizin aufgrund ihrer diuretischen, adstringierenden
und blutreinigenden Wirkung einen festen Platz [Diener, 1954].
Untersuchungen von Creasy et al. zeigten, dass in den Blättern ein
interessantes Spektrum an Flavonoiden (zwei Quercetinglycoside, zwei Kämpferolglycoside,
Cyanidin-3-glucosid, D-Catechin, Leucoanthocyanine) enthalten ist [Creasy et al., 1964]. Es bestünde
folglich die Möglichkeit, einen weiteren Teil der Pflanze (Blätter) einer Wertschöpfung zugänglich
und damit den Anbau von Erdbeeren noch attraktiver zu machen. Die Blätter wären nach der
dreijährigen Fruchtperiode der Pflanze sinvoll weiterverwendbar (Extraktgewinnung) und müssten
nicht länger kompostiert oder verbrannt werden.
2.3 Enzymatische
Transformationen
der
Agrocybe-aegerita-
Peroxygenase (AaeAPO)
Zu den Biokatalysatoren, die im Sinne der Weißen Biotechnologie Verwendung finden, gehören neben
Enzymproteinen auch stoffwechselaktive, ganze Zellen (vorzugsweise Mikroorganismen →
Ganzzellbiokatalyse). Aufgrund ihrer herausragenden Stoffwechselleistungen und vielfältigen
Enzymausstattung werden Mikroorganismen (v. a. Bakterien, Hefen, Schimmelpilze) schon seit
Jahrhunderten in industriellen Produktionsverfahren effektiv eingesetzt [Heiden et al., 2001]. Viele
Enzyme sind als katalytisch aktive Proteine auch in der Lage, komplexe biochemische Reaktionen
26
Stand der Forschung
außerhalb der lebenden Zelle durchzuführen. Sie spielen eine Rolle bei der Herstellung bestimmter
Spezial- und Feinchemikalien, aber auch in verschiedenen großtechnischen und Breitanwendungen
[BMBF, 2012; Braun et al., 2006; Ruttloff, 1994]. Die Haupteinsatzgebiete für Enzyme sind heute
Waschmittel (32 %), technische Prozesse (20 %) sowie die Herstellung von Lebensmitteln (33 %) und
Futtermitteln (11 %). Die Mehrzahl der in industriellen Prozessen eingesetzten Enzyme gehört zu den
Hydrolasen (z. B. Amylasen) und Isomerasen (Xylose-Isomerase), daneben finden auch vereinzelt
Oxidoreduktasen, Lyasen und Transferasen technische Anwendung [Festel et al., 2004].
Für die Herstellung hydroxylierter Flavonoidderivate kommen (wie bereits im Kapitel 2.1.6.3
beschrieben) lediglich Oxidoreduktasen aus den Gruppen der Peroxygenasen, Monooxygenasen und
Dioxygenasen in Frage. Die intrazellulären Monooxygenasen und Dioxygenasen benötigen für ihre
katalytische Aktivität komplexe und teure Cosubstrate / Cofaktoren [Ibrahim & Anzellotti, 2003].
Pilzliche Peroxygenasen kommen hingegen mit kostengünstigem Wasserstoffperoxid aus und sind
zudem als extrazelluläre Enzyme sehr stabil [Ullrich et al., 2004]. Daher wurden im Rahmen dieser
Dissertation hydroxylierte Derivate von Flavonoiden mit Hilfe einer gutuntersuchten, pilzlichen
Peroxygenase synthetisiert.
2.3.1 Agrocybe-aegerita-Peroxygenase
(AaeAPO)
–
Aufbau
und
Katalysemechanismus
Der Südliche Ackerling (Agrocybe aegerita) gehört zur Familie der Bolbitiaecae (Mistpilzartige) und
wächst im Holz und auf der Borke toter oder kranker Laubbäume (vorzugsweise Pappeln) sowie auf
mulchähnlichen Materialien [Ullrich & Hofrichter, 2005]. Es handelt sich um einen essbaren
Lamellenpilz (Agaricales), der zur großen Gruppe der Basidiomyceten (Ständerpilze) gehört [Ullrich
et al., 2004].
Ein neuartiges peroxidabhängiges Enzym des Pilzes wurde erstmals als Haloperoxidase (aufgrund der
Bromierung von Phenolen in Gegenwart von Bromid und H2O2) [Ullrich et al., 2004] beschrieben,
später jedoch als echte Peroxygenase erkannt [Kluge et al., 2008, Hofrichter et al. 2010]. Es stellt
einen funktionellen Hybriden aus Peroxidase und Cytochrom-P450-abhängiger Monooxygenase dar.
Das Enzym ist aufgrund seiner Peroxygenase-Eigenschaften (effiziente Übertragung von
peroxidbürtigem Sauerstoff) und seiner katalytischen „Vielseitigkeit“ einer neuen PeroxidaseSubklasse (EC 1.11.2) zugeordnet worden und bildet als unspezifische Peroxygenase (EC 1.11.2.1)
deren Leitenzym [IUBMB Enzyme nomenclature; Peter et al., 2011]. Neben der offiziellen
Bezeichnung unspecific peroxygenase (UPO; unspezifische Peroxygenase) wird in der Literatur auch
häufig die Abkürzung APO verwendet; diese steht für aromatic peroxygenase (AromatenPeroxygenase) und reflektiert die besondere Eigenschaft des Enzyms, aromatische Ringe zu
epoxidieren/hydroxylieren [Hofrichter et al. 2010]. Das Kürzel UPO oder APO wird i.d.R. durch den
ersten Buchstaben des Gattungsnamens und den beiden ersten Buchstaben des artspezifischen
Epithetons des jeweiligen Pilzes ergänzt (z. B. AaeAPO – Agrocybe aegerita aromatic peroxygenase).
27
Stand der Forschung
Eine Peroxygenase ist eine peroxidabhängige Oxidoreduktase, die den direkten Transfer eines
Sauerstoffatoms aus einem Peroxid (O-Donor, Elektronenakzeptor; vorzugsweise H2O2) auf ein
Substrat, das dabei oxidiert wird, vermittelt [Hanano et al., 2006].
R-H + H2O2 → R-OH + H2O
Die AaeAPO kristallisiert in einem orthorhombischen Gitter (siehe Abbildung 14) [Piontek et al.,
2010]; die charakteristische Färbung der Kristalle geht auf das als prosthetische Gruppe enthaltene
Häm zurück [Ullrich et al. 2004].
Abbildung 14: Kristalle der (a) AaeAPO II (bei pH 8,5; Länge 1,2 mm), (b) AaeAPO II (bei pH 5,6) und
(c) AaeAPO II (bei pH 4,6), (d) orthorombisch flächenzentriertes Kristallgitter [Piontek et al., 2010]
Die Molmasse des glykosylierten Enzyms beträgt 44-46 kDa, nach Deglykosylierung 37 kDa, d. h. bis
zu 20 % des fertigen Enzyms bestehen aus Zuckerderivaten [Piontek et al. 2010]. Untersuchungen zu
den Isoformen der AaeAPO ergaben, dass sechs chromatographisch unterscheibare Isoformen durch
den Pilz sekretiert werden [Ullrich & Hofrichter, 2005], von denen drei mit Hilfe der
Chromatofokussierung isoliert (pI 5,2; 5,6; 6,1) und hinsichtlich ihrer katalytische Aktivität untersucht
wurden [Ullrich et al., 2009]. Das Fehlen signifikanter Unterschiede im Substratspektrum deutete
dabei auf unterschiedlich glykosylierte Formen desselben Proteins hin. Allerdings haben
molekulargenetische Studien zur AaeAPO gezeigt, dass der Pilz über verschiedene Peroxygenasegene
verfügt; inwieweit diese allerdings exprimiert werden, ist unklar [Pecyna et al. 2009].
29 % der N-terminalen Sequenz und 27 % der gesamten Proteinsequenz der AaeAPO sind mit der
CfuCPO (Chlorperoxidase des Pilzes Caldariomyces fumago) identisch; zu P450-Enzymen besteht
keine nennenswerte Sequenzhomologie [Ullrich et al. 2004, Pecyna et al. 2009]. Eine hohe Homologie
wurde für verschiedene APOs agarikaler Pilze untereinander gefunden (z. B. 65 % Identität und 75 %
Ähnlichkeit der AaeAPO zur CraAPO, Aromaten-Peroxygenase aus Coprinellus radians).
Peroxygenasen sind mittlerweile in verschiedenen Pilzgruppen genetisch nachgewiesen und einige
auch auf Proteinebene isoliert und charakterisiert worden [Anh et al. 2007, Pecyna et al., 2009,
Hofrichter et al. 2010, Gröbe et al. 2011].
Als Häm-Thiolat-Protein [Häm – Typ b; Eisen-Protoporphyrin IX (siehe Abbildung 15), das nicht
kovalent gebunden ist] besitzt die AaeAPO im aktiven Zentrum ein Eisen, dass equatorial durch vier
28
Stand der Forschung
Porphyrin-Stickstoffatome und axial durch ein proximales Cystein (Cys36) sowie einen distalen
Liganden koordiniert wird [Pecyna et al., 2009]. Die distale Stelle dient als katalytisches Zentrum
(variiert im Laufe des katalytischen Zykluses) und wird durch Phenylalanine (Phe121 und Phe199)
eingegrenzt [Cirino & Arnold, 2002; Pecyna et al., 2009].
CH2
CH3
HC
6
4
H3C
A
N
1
1
R
21
CH
B
N
CH2
9
22
Fe
24
23
2
N R N
19
D
H3C
11
C
16
14
H2C
CH2
H2C
CH2
COOH
CH3
COOH
Abbildung 15: Häm (Fe markiert) (rechts) und seine nähere Umgebung an der proximalen Seite der
AaeAPO bestehend aus einem helikalen Segment, das ein Cystein (R1) beinhaltet.
Darstellung der Elektronendichte der AaeAPO bei einer Auflösung von 2,52 Ǻ, gerechnet nach
Dichtemodifikation in autoSHARP [Piontek et al., 2010] (links)
Betrachtet man das UV-Vis-Spektrum der gereinigten AaeAPO im Grundzustand, so ergeben sich
nahezu die gleichen spektrometrischen Charakteristika wie für P450-Enzyme (während zur CfuCPO
deutliche Unterschiede bestehen) [Segall et al., 1997; Ullrich & Hofrichter, 2005; Anh et al., 2007].
Das aktive Zentrum der AaeAPO zeichnet sich laut Röntgenstrukturanalyse durch einen relativ
breiteren Eingang aus, den auch größere Moleküle (z. B. Pyren oder Lignin-Dimere) passieren können
[Aranda et al., 2010; Kinne et al. 2011]. Im Fall der Umsetzung von monohalogenierten Pyridinen zu
den entsprechenden N-Oxiden wurde kein negativer Effekt eines sich vergrößernden Atomradius
festgestellt, im Gegenteil die Aktivität des Enzyms verhielt sich umgekehrt zur Elektronegativität der
Halogensubstituenten (I > Br > Cl > F) [Ullrich et al., 2008]. Phenylalanin (Phe204) ist in Kontakt mit
dem Häm und es existiert ein Pfad über weitere Phenylalanine bis zur Oberfläche des Enzyms (zum
Phe232) [Piontek et al., 2009]. Dies deutet auf einen sogenannten LRET (long-range electron transfer)
hin, der eine Oxidation polarer Substrate (ohne Sauerstoff-Transfer) an der Oberfläche ermöglicht
(z.B. ABTS → ABTS+•). Ein durch mehrere Carboxylgruppen (Glutamat, Häm-Propionat) in der
Struktur fixiertes Magnesium (Mg2+) verleiht der AaeAPO gemeinsam mit dem hohen
Glykosylierungsgrad eine hohe Stabilität sowie eine gute Wasserlösslichkeit [Pecyna et al., 2009].
Um einen Sauerstoff-Transfer vom Häm zum Substrat zu gewährleisten muss eine kritische
Entfernung von 2,5 Ǻ bis 3,5 Ǻ erreicht werden [Harris & Loew, 1998]. Aufgrund des relativ weiten
Hämkanals (ca. 7 Å) ist dies für viele Substrate der AaeAPO gegeben [Piontek et al., 2009].
Die meisten Hämproteine verfügen über Kreuzreaktivitäten (d. h. sie katalysieren auch Reaktionen, die
für andere Enzymgruppen typisch sind) [Cirino & Arnold, 2002; Guengerich et al., 2001; Zámocký et
al., 2008]. Auch die AaeAPO vereint mehrere katalytische Fähigkeiten in sich. Sie verhält sich wie
29
Stand der Forschung
eine klassische Peroxidase im Fall der Phenoloxidation (Bildung von p-Benzochinonen und
Kopplungsprodukten) oder sie agiert als Häm-Thiolat-Haloperoxidase (wenn z. B. Phenol bromiert
wird) [Ullrich & Hofrichter, 2005], als Katalase (wenn Wasserstoffperoxid in Abwesenheit eines
zweiten Substrates unter Sauerstoff-Freisetzung zersetzt wird) [Ullrich et al., 2004; Bernroitner et al.,
2009], als Etherase (O-Dealkylierung) [Kinne, 2010]) und nicht zuletzt als Mono[per]oxygenase
analog Cytochrom-P450-Enzymen (z. B. Oxidation von Naphthalin zum 1-Naphthol und 2-Naphthol;
siehe Abbildung 16) [Kluge et al., 2008, Ullrich & Hofrichter, 2005].
Zelle
Zelle
Zelle
CYP450
O2
H2 O
NAD(P)H+H+
NAD(P)+
OH
AaeAPO
H 2 O2 H 2 O
OH
Abbildung 16: Extra- versus intrazelluläre Hydroxylierung von Naphthalin – AaeAPO versus CYP450
Monooxygenase [modifiziert nach Ullrich & Hofrichter, 2005].
Die AaeAPO stellt das erste beschriebene extrazelluläre Enzym dar, das eine direkte aromatische
Oxygenierung mit Hilfe von H2O2 als Cosubstrat katalysiert.
Abbildung 17: Hypothetischer
Naphthalinhydroxylierung.
katalytischer
Zyklus
der
AaeAPO
am
Beispiel
der
(1) natives Enzym, (2) Eisen (III)-Peroxidkomplex (Komponente 0 – CYP450), (3) Häm – OxyferrylRadikalkation-komplex (Komponente I - Peroxidasen), (4) gedachter Übergangszustand protonierter
Komponente I/II-Substratkomplex. [Kinne, 2010]
30
Stand der Forschung
Die Reaktion läuft über einen Weg ab, der dem sogenannten peroxidase shunt einiger P450-Enzyme
ähnelt (siehe Abbildung 17) [Isin & Guengerich, 2007; Ullrich & Hofrichter, 2007]. Dieser alternative
Weg umgeht einen Teil des „natürlichen“ P450-Zyklus‘, inklusive des geschwindigkeitsbestimmenden
Schritts [Cirino & Arnold, 2002].
Über die genannten Reaktionen hinaus katalysiert die AaeAPO auch die N-Dealkylierung sekundärer
Amine (N-Methylanilin, [Kinne, 2010]).
2.3.2 Agrocybe-aegerita-Peroxygenase
(AaeAPO)
–
Hydroxylierung
/
Oxygenierung
Bisher sind zahlreiche biotechnologisch relevante Oxidationen bekannt geworden, die durch die
AaeAPO katalysiert werden, zum Beispiel Hydroxylierungen, Epoxidierungen, Alkohol- und
Aldehydoxidationen sowie Etherspaltungen. Das Enzym arbeitet dabei in einem pH-Bereich von 2,5
bis 9, wobei in den meisten Fällen ein Optimum um pH 7 beobachtet wurde. Die Reaktionen laufen oft
regio-, einige auch stereoselektiv ab; letzteres bevorzugt unter Bildung der (R)-Enantiomere
(Substrate: z. B. n-Heptan, n-Oktan [Peter et al., 2011], Ethylbenzol [Kluge et al., 2007], Propranolol
[Kinne et al., 2009b], 2-Phenoxypropionsäure [Kinne et al., 2008]).
Als Substrate der AaeAPO, die erfolgreich oxygeniert/ hydroxyliert wurden, seien weiterhin folgende
Beispiele genannt: Veratrylalkohol, Bezylalkohol, Anisalkohol [Ullrich, 2004], Toluol und Naphthalin
[Ullrich & Hofrichter, 2005], Ethylbenzol bis Pentylbenzol [Kluge et al., 2007], Pyridin (inkl. 3Methyl- und 3,5-Dimethylpyridin) [Ullrich et al., 2008], Tetrahydrofuran, Diethylether [Kinne et al.,
2009],
Dibenzothiophen
[Aranda
et
al.,
2009],
1-Methylnaphthalin,
2-Methylnaphthalin,
Dibenzofuran, Fluoren, Anthracen, Phenanthren, Pyren [Aranda et al., 2010], 4-Nitrophenol [Peng et
al., 2010], 4-Nitrotoluol [Kinne et al., 2010], Propan bis n-Hexadekan, Cyclopentan bis Cyclooktan,
Norcaran, Isobutan [Peter et al., 2011] sowie Diclofenac, Acetanilid, Carbamazepin, Ibuprofen,
Tolbutamid, etc. [Poraj-Kobielska et al., 2011].
Ein katalytisches Limit erreicht das Enzym im Fall großer Moleküle (z. B. Perylen [Aranda et al.,
2010], 17-α-Ethinylestradiol [Poraj-Kobielska et al., 2011], oligomerer PEG-Ether [Kinne et al.,
2009]), bei Verbindungen ohne abstrahierbaren Wasserstoff (Diphenylether [Kinne, 2010]), stark
verzweigten Substanzen (2,2,4,4-Tetramethylpentan [Peter et al., 2011]) und hochpolaren
Verbindungen (di- oder perchlorierte Pyridine, Nikotinsäure [Ullrich et al., 2008]). In den meisten
Fällen dürfte der fehlende direkte Kontakt des Substrates zum Ferryl-Sauerstoff der Komponente I für
die Inaktivität verantwortlich sein [Hofrichter & Ullrich, 2006, Isin & Guengerich, 2008]. Hinzu
kommt die relativ hohe Peroxidaseaktivität der AaeAPO (z. B. gegenüber Phenolen), die oftmals den
Einsatz von Radikalfängern notwendig macht [Ullrich et al., 2009; Piontek et al., 2010].
Die Umsetzung der genannten Verbindungen lässt vermuten, dass auch die Mehrringsysteme
der Flavonoide einer Oxygenierung oder anderweitigen oxidativen Modifikation durch die
31
Stand der Forschung
AaeAPO zugänglich sind. Alles in allem stellt das Enzym einen besonders versatilen
Biokatalysator mit großem Synthesepotenzial dar [Hofrichter & Ullrich, 2006; Manoj & Hager,
2008].
2.3.3 Agrocybe-aegerita-Peroxygenase (AaeAPO) – Funktion
Bisher kann über die natürliche Funktion der AaeAPO nur spekuliert werden. So wird angenommen,
dass das Enzym der Detoxifizierung von Pflanzeninhaltsstoffen dient (analog der Polaritätserhöhung
durch Phase-I-Reaktionen [Varazashivili et al., 2001]) oder mit dem Abbau polymerer Naturstoffe im
Zusammenhang steht (Lignin, Humus), indem es Sauerstofffunktionalitäten in aromatische Substrate
außerhalb der Pilzzelle einbaut [Ullrich & Hofrichter, 2005; Anh et al., 2007]. Die detoxifizierende
Funktion ist am wahrscheinlichsten, da Pilze ständig mit potentiell zytotoxischen Verbindungen in
ihrer Umgebung konfrontiert sind [Campoy et al., 2009; Kellner et al., 2010]. Ein Beispiel ist die
Demethylierung des methoxylierten Phytoalexins Pisatin, in deren Verlauf die Toxizität der
Verbindung drastisch sinkt [George et al., 2001; Kinne, 2010]. Außerdem könnte die AaeAPO als
„Substratdonator“ für andere phenoloxidierende Enzyme (z. B. Laccasen) fungieren [Kinne, 2010].
Vielversprechende Ansätze für einen praktischen Einsatz der AaeAPO und anderer Peroxygenasen
sind aus der Biosensorforschung bekannt geworden, u. a. zur Detektion von 4-Nitrophenol [Peng et
al., 2010] oder als Reagenz für chemoluminiszente Immunoassays [Vdovenko et al., 2010].
32
Material und Methoden
3 Material und Methoden
3.1 Geräte und Chemikalien
Eine Liste der verwendeten Geräte und Chemikalien befindet sich auf beigefügter CD;
Datei: Material und Methoden.doc.
3.2 Versuchsorganismen
Agrocybe aegerita (A1K)
Bjerkandera adusta (Ud1)
3.3 Kulturmedien
Alle Medien wurden, wenn nicht anders beschrieben, im Autoklaven bei 121 °C und 3 atm für 20 min
sterilisiert.
3.3.1 Agar-Medien
Die Stammhaltung des Pilzes Agrocybe aegerita erfolgte auf Soja-Agar:
Sojamehl
3,0 % (m/v)
Agar-Agar
2,0 % (m/v)
in dest. Wasser (pH = 6,5)
Die Stammhaltung von Bjerkandera adusta erfolgte auf Malzextrakt-Agar:
Malzextrakt
2,0 % (m/v)
Agar-Agar
2,0 % (m/v)
in dest. Wasser (pH = 5,5)
3.3.2 Flüssigmedien
3.3.2.1
Sojabohnenmehl-Medium
Zur Kultivierung von Agrocybe aegerita (A1K) in Submerskultur (→AaeAPO-Bildung) diente eine
3%-ige (m/v) Sojabohnenmehl-Suspension in destilliertem Wasser. Der pH-Wert der Suspension
betrug 6,5.
3.3.2.2
Kirk-Acetat-Medium
Zur Kultivierung von Bjerkandera adusta in Submerskultur (→MnP-Bildung) wurde ein Kirk-AcetatMedium nachfolgender Zusammensetzung verwendet:
Glucose
5,0 g
Magnesiumsulfatheptahydrat
0,5 g
Hefeextrakt
0,3 g
Calciumchlorid
0,1 g
Diammoniumtartrat
0,5 g
Natriumacetat
2,0 g
Kaliumdihydrogenphosphat
2,0 g
(Angaben pro Liter Medium)
33
Der pH-Wert wurde mit 50 %-iger Essigsäure auf 5,0 eingestellt. Zur Beimpfung der Medien wurden
Kolben (200 ml Flüssigmedium) mit 9 ml Homogenisat einer bewachsenen Agarplatte beimpft. Die
Homogenisierung einer Agarplatte erfolgte in 90 ml dest. H2O mittels Ultra-Turax.
3.4 AaeAPO - Enzymgewinnung und Reinigung
Das extrazelluläre Enzym AaeAPO wurde aus der Kulturflüssigkeit (Rohextrakt) des Pilzes A.
aegerita
gewonnen
(siehe
Anhang
D).
Nach
Erreichen
der
maximalen
Enzymaktivität
(Volumenaktivität) wurde die Pilzbiomasse von der enzymhaltigen Kulturflüssigkeit mittels Sieb
abgetrennt. Es folgte das Zentrifugieren und die Glasfaser-Filtration der AaeAPO - haltigen
Kulturbrühe. Das Kulturfiltrat wurde anschließend bei 12 °C mittels Ultrafiltration konzentriert (10
kDa-cut-off-Membran).
Zur Separation und Reinigung des extrazellulären Enzyms wurde ein ÄKTA-FPLC-System
(ÄKTAexplorer, Amersham Biotech) verwendet. Die Detektion der eluierten Proteine erfolgte bei 280
nm (Gesamtprotein), 420 nm (Soret-Bande der AaeAPO) sowie bei 540 nm (weitere Hämabsorption).
Für die IEC-FPLC wurde eine XK-16-Säule mit SP-Sepharose FF verwendet. Der starke
Kationenaustauscher besteht aus quervernetzter Agarose, die mit Sulfopropyl-Gruppen derivatisiert
ist. Als Fließmittel (A) diente 10 mM Natriumacetat (pH 4,5). Eine 2 M NaCl-Lösung in 10 mM
Natriumacetat pH 4,5 wurde als Elutionsmittel (B) verwendet. Die Flussrate betrug 13 ml/min bei
einer Fraktionsgröße von 7 ml. Nach dem Applizieren der Probe auf die Säule, erfolgte das Spülen der
Säule mit Laufmittel A (zweifaches Säulenvolumen), um nicht-gebundene Fremdproteine zu
entfernen. Danach wurde ein linearer Gradient (bis 30 % Eluent B) über 42 min gefahren.
Die weitere Reinigung erfolgte an einer Anionenaustauschersäule (MonoQ 10/100 GL). Der starke
Anionenaustauscher besteht aus MonoBeads (monodisperse, 10μm poröse Beads; stark hydrophil), die
mit quartären Ammonium-Gruppen derivatisiert sind. Als Fließmittel (A) diente 10 mM Natriumacetat
(pH 6,5). Eine 2 M NaCl-Lösung in 10 mM Natriumacetat pH 6,5 wurde als Elutionsmittel (B)
verwendet. Die Flussrate betrug 6 ml/min bei einer Fraktionsgröße von 3 ml. Nach dem Applizieren
der Probe auf die Säule, erfolgte das Spülen der Säule mit Laufmittel A (zweifaches Säulenvolumen),
um nicht-gebundene Fremdproteine zu entfernen. Danach wurde ein linearer Gradient (bis 30 %
Eluent B) über 27 min gefahren.
3.5 Bestimmung der Proteinkonzentration
Zur quantitativen Bestimmung der Proteinmenge wurde eine veränderte Methode nach Bradford
verwendet [Bradford, 1976; Zor & Selinger, 1996]. Dabei bildet der Farbstoff Coomassie-Brillantblau
G-250 im sauren Milieu mit Proteinen einen blaugefärbten Komplex. Als Folge verschiebt sich das
34
Absorptionsmaximum von 450 nm nach 595 nm. Die anschließende photometrische Vermessung
erfolgte in Mikrotiterplatten (96 Kavernen) mit dem Roti®-Nanoquant-Test nach einer Vorschrift des
Herstellers (ROTH, Karlsruhe, Deutschland). Als Standard wurde Rinder-Serum-Albumin (BSA)
verwendet.
3.6 Bestimmung enzymatischer Aktivitäten
Die
photometrische
Bestimmung
der
Enzymaktivitäten
erfolgte
bei
Raumtemperatur
in
Quarzglasküvetten. Die Enzymaktivitäten sind in U/l angegeben und wurden nach folgender
Gleichung berechnet.
Enzymaktivität[U/l] =
Extinktion [Abs/min] ⋅ VG [ml ] ⋅ 10 6
= Enzymaktivität[ μmol/min ⋅ l]
ε [l / mol ⋅ cm] ⋅ d [cm] ⋅ V [ml ]
3.6.1 Laccase (Lacc, EC 1.10.3.2)
Die Messung der Laccase-Aktivität erfolgte mittels ABTS, das über einen Ein-Elektronen-Transfer
zum semistabilen, dunkelgrün gefärbten ABTS-Radikalkation oxidiert wird (siehe Anhang C). Die
Reaktion wurde durch Zugabe des ABTS-Ammoniumsalzes gestartet und die Extinktionszunahme bei
420 nm (ε420 = 36.000 /mol*cm) über 30-60 s photometrisch verfolgt. Der Inkubationsansatz (1 ml)
war wie folgt zusammengesetzt:
Natriumcitratpuffer (pH 4,5)
50 mM
ABTS
0,3 mM
Enzymlösung
5-50 µl
3.6.2 Agrocybe aegerita (AaeAPO, EC 1.11.2.1)
Die Messung der AaeAPO-Aktivität erfolgte mittels Veratrylalkohol, das bei pH 7 zu Veratrylaldehyd
oxidiert wird (siehe Anhang C). Die Reaktion wurde durch Zugabe von Wasserstoffperoxid (100 mM)
gestartet und die Extinktionszunahme bei 310 nm (ε310 = 9.300 /mol*cm) über 10 s photometrisch
verfolgt.
Der Inkubationsansatz (1 ml) war wie folgt zusammengesetzt:
Kaliumphosphatpuffer (pH 7)
50 mM
Veratrylalkohol
5 mM
Wasserstoffperoxid
1 mM
Enzymlösung
100 µl
35
3.6.3 Mangan-Peroxidase (MnP, EC 1.11.1.13)
Zur Messung der MnP-Aktivität wurden die gebildeten Mn3+-Malonat-Komplexe detektiert (siehe
Anhang C). Die Reaktion wurde durch Zugabe von Wasserstoffperoxid (10 mM) gestartet und die
Extinktionszunahme bei 270 nm (ε270 = 11590 /mol*cm) über 30 s photometrisch verfolgt.
Der Inkubationsansatz (1 ml) war wie folgt zusammengesetzt:
Natriummalonatpuffer (pH 4,5)
50 mM
Wasserstoffperoxid
0,1 mM
Manganchloridtetrahydrat
0,5 mM
Enzymlösung
50 µl
3.7 Extraktionsmethoden
3.7.1 Aronia melanocarpa
A. melanocarpa wurde in Form gefrorener Früchte von der STOLLE Obst GmbH (Schiringswalde,
Deutschland) bezogen und nach dem Auftauen mit Hilfe der Mikrowellenextraktion (offenes System)
sowie Ultraschallextraktion extrahiert.
3.7.1.1
Mikrowellenextraktion
Die aufgetauten Beeren wurden mittels Küchenstabmixer homogenisiert; 50 g der homogenisierten
Beeren wurden mit 84 ml Ethanol und 84 μl Phosphorsäure (65 %) versetzt und einer NormaldruckMikrowellenextraktion unter folgenden Bedingungen unterzogen:
Phasen
Zeit [min]
Temperatur [°C]
0 – 0,5
25 Ö x*
Extraktionsphase
0,5 – 10,5
x*
Abkühlphase
10,5 – 18
x* Ö RT
Aufheizphase
* für x siehe 4.3.1.2
Anschließend wurde das Pflanzenmaterial über einen weitporigen Papierfilter filtriert und einer
nochmaligen Extraktion unterzogen. Beide Filtrate wurden vereinigt und im Vakuum eingeengt.
3.7.1.2
Die aufgetauten Beeren wurden mittels Küchenstabmixer homogenisiert; 50 g homogenisierte Beeren
wurden mit 84 ml Lösungsmittel (siehe 4.3.1.3) und 84 μl Phosphorsäure (65 %) versetzt. Die
Extraktion verlief unter gelegentlichem Rühren im Ultraschallbad über 30 min. Zur Vermeidung des
Abdampfens von Lösungsmittel bei erhöhter Temperatur wurde ein Rückflusskühler aufgesetzt.
Danach wurde das Pflanzenmaterial über einen weitporigen Papierfilter abfiltriert und einer
nochmaligen Extraktion unterzogen. Die beiden Filtrate wurden vereinigt und im Vakuum eingeengt.
36
3.7.2 Fragaria ananassa
Blätter von Fragaria ananassa wurden im Herst 2007 im eigenen
Garten (Druzcov, Tschechien) gesammelt, bei Raumtemperatur
unter dem Abzug getrocknet und im Papierbeutel durch drücken
und zerreiben
gründlich
zerkleinert.
Die
so gewonnenen
Erdbeerblätter wurden anschließend mittels ASE (beschleunigte
Lösungsmittelextraktion) extrahiert.
Dafür wurden 1,65 g der zerkleinerten Erdbeerblätter mit etwa 2 g
bis 3 g Hydromatrix vermengt (dient zur Aufnahme der Restfeuchte). Beide Komponenten wurden
homogenisiert und in die Extraktionszelle gefüllt. Die Extraktion erfolgte mit dem System ASE 200
(siehe Abbildung). Die Extrakte wurden in Extraktionsgläsern gesammelt. Die exakten Bedingungen
können dem Abschnitt 4.3.1.1 entnommen werden.
3.7.3 Trifolium pratense, Bellis perennis
Gänseblümchen und Rotklee wurden in Form getrockneter Blüten von der Firma Valdemar Grešík
NATURA s.r.o. (Tschechien) bezogen und mit einem Messerhomogenisator mechanisch zerkleinert.
Die Extraktion erfolgte mittels Mikrowellentechnologie; 5 g der homogenisierten Blüten wurden mit
84
ml
Ethanol
und
84
μl
Phosphorsäure
(65
%)
versetzt
und
einer
Normaldruck-
Mikrowellenextraktion mit folgenden Bedingungen unterzogen:
Phasen
Zeit [min]
Temperatur [°C]
0 – 0,5
25 Ö 50
Extraktionsphase
0,5 – 10,5
50
Abkühlphase
10,5 – 18
50 Ö RT
Aufheizphase
Anschließend wurde das Pflanzenmaterial über einen weitporigen Papierfilter filtriert und einer
nochmaligen Extraktion unterzogen. Die beiden Filtrate wurden vereinigt und im Vakuum eingeengt.
3.7.4 Festphasenextraktion (SPE)
Die Festphasenextraktion (solid phase extraction) wurde zum Konzentrieren bzw. zur Reinigung der
Reaktionsgemische bzw. der Eluate der präparativen HPLC genutzt. Die Kartuschen wurden zuerst
mit jeweils einer Säulenfüllung Methanol und dest. Wasser konditioniert. Danach erfolgte die
Probenaufgabe (Flavonoid-haltige Lösungen) und das Waschen mit einer Säulenfüllung dest. Wasser.
Die Kartuschen wurden trockengesaugt (für NMR-Untersuchungen noch mittels Stickstoff getrocknet)
und anschließend zweimal mit je einer halben Säulenfüllung Methanol eluiert, wobei sich die
Flavonoide von der Kartuschenmatrix lösten.
37
3.8 Analysenmethoden
3.8.1 HPLC (high performance liquid chromatography)
3.8.1.1
Die
HPLC-MS (Methoden 1, 2)
Analyse
der
Polyphenole/Flavonoide
(Vorversuche,
einige
Langzeitversuche,
Spritzenpumpenversuche, Phytoextrakte) erfolgte mit einem HPLC-MS-System der Firma Agilent
unter folgenden Bedingungen:
Stationäre Phasen:
Lichrospher RP 8, 100*4,5 mm, 5 μm
Synergi 4u Fusion RP18 80 Ǻ, 250*4,6 mm, 4 μm
Eluent A:
0,01 % Ammoniumformiat-Puffer pH 3,5
Eluent B:
Acetonitril
Gradient:
Lichrospher RP 8 (Methode 1)
Zeit [min]
Synergi Fusion RP 18 (Methode 2)
Eluent A
Eluent B
Fluss
Zeit
Eluent A
Eluent B
Fluss
[%]
[%]
[ml/min]
[min]
[%]
[%]
[ml/min]
0
95
5
1
0
95
5
1
5
95
5
1
5
50
50
1
20
0
100
1
20
10
90
1
22
95
5
1
22
95
5
1
25
95
5
1
25
95
5
1
Injektionsvolumen:
10 μl
Säulenofentemperatur: 40 °C
DAD-Scanbereich (200 bis 800) nm, Datenintervall 4 nm,
Detektor:
Wellenlängen 210 nm, 254 nm, 280 nm, 360 nm (oder stoffspezifisch)
MS-ESI-Massenbereich 220-630 m/z, Spannung 4000 V; positive ion mode,
70eV
3.8.1.2
HPLC-DAD (Methoden 3, 4)
Die Analysen der Langzeitversuche, die Kinetikversuche sowie die Analysen der Phytoextrakte
wurden an einer HPLC der Fa. Varian durchgeführt. Es wurde ein Diodenarray-Detektor verwendet.
Methode 3
Methode 4
Stationäre Phase: L-Column ODS RP18 120Ǻ,
Stationäre Phase: Synergi 4u Fusion RP18
250*4,5 mm, 5 μm
80Ǻ, 250*4,6 mm, 4 μm
Eluent A: 8 Vol.-% Acetonitril,
Eluent A: 0,01 % Ammoniumformiat-Puffer
0,05 M Phosphat-Puffer pH 2,1
pH 3,5
Eluent B: Acetonitril
Eluent B: Acetonitril
38
Gradient:
L-Column ODS RP 18 (Methode 3)
Zeit [min]
Synergi 4u Fusion RP 18 (Methode 4)
Eluent A
Eluent B
Fluss
Zeit
Eluent A
Eluent B
Fluss
[%]
[%]
[ml/min]
[min]
[%]
[%]
[ml/min]
0
95
5
1,2
0
95
5
1
7,5
87
13
1,2
5
50
50
1
8,5
84
16
1,2
20
10
90
1
10
85
15
1,2
22
95
5
1
20
75
25
1,2
25
95
5
1
22
95
5
1,2
25
95
5
1,2
Injektionsvolumen: 20 μl
Injektionsvolumen: 10 μl
Detektor: DAD-Scanbereich (200 bis 800) nm,
Datenintervall 4 nm, Wellenlängen 287 nm,
326 nm, 370 nm, 528 nm (oder stoffspezifisch)
254 nm, 280 nm, 360 nm (oder stoffspezifisch)
3.8.1.3
Präparative HPLC-DAD
Apigenin
Die Fraktionierung des Apigenins und seines monohydroxylierten Produktes erfolgte mittels
präparativer HPLC (Agilent) und DAD-Detektion unter folgenden Bedingungen:
Stationäre Phase:
Gemini NX 12 C18 110 Ǻ, 150*21,2 mm AXIA
Eluent A:
0,01 % Ammoniumformiat-Puffer pH 3,5
Eluent B:
Acetonitril
Gradient:
Gemini NX 12 C18, AXIA
Zeit [min]
Injektionsvolumen:
800 μl -1200 μl
Eluent A
Eluent B
Fluss
[%]
[%]
[ml/min]
0
95
5
5
40
45
55
5
60
0
100
5
61
95
5
5
71
95
5
5
336 nm
Fraktionssammler-Temperatur: 35 °C
Fraktionssammler-Sammelzeit:
31,7 min – 34,7 min
39
Luteolin, 6-Hydroxyflavon, 7-Hydroxyflavanon, 7-Hydroxyflavon
Die Fraktionierung weiterer Flavonoide und ihrer monohydroxylierten Produkte erfolgte unter den
gleichen Bedingungen wie für Apigenin mit Ausnahme von Sammelzeiten und den stoffspezifischen
Wellenlängen. Diese sind der nachfolgenden Tabelle zu entnehmen.
Tabelle 4: Fraktionssammler – stoffspezifische Sammelzeiten und Wellenlängen für 6-Hydroxyflavon, 7Hydroxyflavanon, 7-Hydroxyflavon und Luteolin
SammelzeitInterval [min]
Wellenlängen [nm]
6-Hydroxyflavon
7-Hydroxyflavanon
7-Hydroxyflavon
Luteolin
47,2 – 53,0
37,0 – 45,0
36,5 – 41,5
25,75 – 31,50
270, 285, 305
241, 278, 343
250, 267, 313
254, 280, 347
3.8.2 NMR
Die 1H- und
13
C-NMR spektroskopischen Analysen der ausgewählten Polyphenole Apigenin, 6-
Hydroxyflavon, 7-Hydroxyflavanon, 7-Hydroxyflavon, Luteolin und ihrer enzymatisch hergestellten
hydroxylierten Derivate erfolgten in DMSO-d6 bei Raumtemperatur mit den NMR-Systemen:
1. GEMINI 200
(Hochschule Zittau/Görlitz)
2. BRUKER Mercury 300BB
(Universität Leipzig)
3. BRUKER Mercury 400BB
(Universität Leipzig)
1
H-NMR 199,9850805 MHz
13
1
H-NMR 300,0846964 MHz
13
1
C-NMR 50,2863091 MHz,
C-NMR 75,4559885 MHz
H-NMR 400,0047477 MHz
13
C-NMR 100,5807333 MHz.
40
Ergebnisse und Diskussion
4 Ergebnisse und Diskussion
4.1 Enzymgewinnung
Da die Pilzkultivierung sowie die Enzymherstellung und -reinigung bereits etablierte Methoden
darstellten [Ullrich et al., 2004, 2009; Ullrich & Hofrichter, 2005], die lediglich erfolgreich angewandt
wurden, finden sich Angaben dazu (zeitlicher Verlauf der Enzymbildung, FPLC-Elutionsprofile, etc.)
nur im Anhang D der Dissertation.
4.2 Enzymatische Transformationen ausgewählter Flavonoide
mittels AaeAPO
4.2.1 Orientierende Vorversuche
Erste Vorversuche zur enzymatischen Transformation von Flavonoiden mittels AaeAPO sollten
zeigen, ob diese Verbindungsklasse prinzipiell als Substrat für das Enzym geeignet ist. Als potenzielle
Substrate wurden folgende Verbindungen eingesetzt: Apigenin, Flavon, Naringenin, Daidzein,
Kämpferol, Luteolin und Rutin. Diese Auswahl repräsentiert breites ein relativ breites Spektrum an
Flavonoidgrundstrukturen (Flavone, Flavanone, Isoflavone, Flavonolglykoside). Tabelle 5 listet einige
molekulare Eigenschaften der untersuchten Verbindungen auf.
Tabelle 5: Ausgewählte Eigenschaften der in den Vorvesuchen untersuchten Flavonoide. LM –
Lösungsmittel, MeOH – Methanol, DMF – N,N-Dimethylformamid. Bemerkung: Spektraldaten sind dem
jeweiligen Stoffzertifikat des Herstellers entnommen.
Nr. Flavonoid
Summenformel
Molmasse [g/mol]
UV-Vis- Spektrum [(LM); λmax [nm]]
1
C15H10O5
270,24
(MeOH-0,5 % DMF); 335
Apigenin
(DMF); 267, 337
2
Daidzein
C15H10O4
254,24
(MeOH); 250, 310
(DMF); 249, 302
3
Flavon
C15H10O2
222,24
(MeOH); 252, 294
(DMF); 252, 296
4
Kämpferol
C15H10O6
286,24
(MeOH-0,5%DMF); 267, 365
(DMF); 266, 366
5
Luteolin
C15H10O6
286,24
(MeOH); 254, 266, 347
(DMF); 253, 266, 348
6
Naringenin
C15H12O5
272,25
(MeOH); 288
(DMF); 289
7
Rutin
C27H30O16
610,53
(MeOH); 257, 358
(DMF); 256, 355
41
Zunächst wurden Stammlösungen (50 mM) der Verbindungen 1-7 in DMF hergestellt. Aufgrund der
geringen Löslichkeit der Verbindungen in Wasser (mit Ausnahme von Flavon) musste ein organisches
Lösungsmittel verwendet werden. Methanol konnte nicht eingesetzt werden, da es selbst ein Substrat
für die AaeAPO darstellt (Umsetzung zu Formaldehyd und Ameisensäure). Die Versuche wurden in
HPLC-Vials mit Einsätzen (300 µl inserts) durchgeführt. Das Gesamtvolumen des Reaktionsansatzes
betrug jeweils 200 μl. Zu jeder Reaktion wurde parallel eine Kontrolle mitgeführt (gleiche
Zusammensetzung, aber ohne Enzym).
Es wurden drei verschiedene Versuchsreihen durchgeführt (Tabellen 6-8). Die Reaktionen wurden mit
Wasserstoffperoxid unter Rühren gestartet. Nach ca. zwei Minuten wurde die Reaktion durch Zugabe
von 20 µl 50 %iger Trichloressigsäure (TCA) gestoppt und die Proben mittels HPLC-MS (Methode 1)
vermessen.
Tabelle 6: Versuchsreihe 1 zum Flavon (ohne Zusatz von DMF)
Substanz
Konzentration
Pipettier-Volumen
End-
(Stammlösung)
[μl]
Konzentration
Kalium-Phosphat-Puffer, pH=7
100 mM
100
50 mM
AaeAPO
200 U/ml
1
1 U/ml
H2O2
10 mM
20
1 mM
Flavon
50 mM
2
0,5 mM
Wasser
100 %
77 (78 control)
99 % (v/v)
Tabelle 7: Versuchsreihe 2 in 21 % (v/v) DMF; für alle Testverbindungen
Substanz
Konzentration
Pipettier-Volumen
End-
(Stammlösung)
[μl]
Konzentration
100 mM
100
50 mM
AaeAPO
200 U/ml
1
1 U/ml
H2O2
10 mM
20
1 mM
Flavonoid
50 mM
2
0,5
Wasser
100 %
37 (38 control)
79 % (v/v)
DMF
100 %
40
(20+1) % (v/v)
42
Tabelle 8: Versuchsreihe 3 in 21 % (v/v) DMF und Gegenwart von Vitamin C; für alle Testverbindungen;
3b mit H218O2; 3c für Flavon (57 μl bzw. 58 μl H2O, 0 μl DMF); 3d entspricht 3c mit H218O2
Substanz
Konzentration
Pipettier-Volumen
End-
(Stammlösung)
[μl]
Konzentration
100 mM
100
50 mM
AaeAPO
200 U/ml
1
1 U/ml
H2O2
10 mM
20
1 mM
Flavonoid
50 mM
2
0,5 mM
Vitamin C
40 mM
20
4 mM
Wasser
100 %
17 (18 control)
79 % (v/v)
DMF
100 %
40
(20+1) % (v/v)
Die Ergebnisse der Versuche sind in Tabelle 9 zusammengefasst.
Tabelle 9: Umsetzung verschiedener Flavonoide durch AaeAPO (orientierende Vorversuche)
Nr.
Produkte: [Molmasse] H216O2/H218O2, UV-Vis-
Substrat
Absorptionsmaxima (nm), Name, Versuchsreihe
OH
1
HO
[M+H]+ 287/289
O
λmax = (283, 337) nm
Scutellarein
OH O
Versuche 3, 3b
Apigenin [M+H]+ 271
2
HO
[M+H]+ 271/273
O
λmax = (256, 323) nm
O
OH
Demethyltexasin
+
Daidzein [M+H] 255
3
+
[M+H] 239/241*
O
λmax = (256, 321) nm
O
Flavon [M+H]+ 223
OH
4
HO
O
OH O
Versuche 3, 3b
OH
Kämpferol [M+H]+ 287
Versuche 1, 2, 3, 3c, 3d
[M+H]+ 239/241
λmax = (269, 306) nm
6-Hydroxyflavon
Versuche 1, 2, 3, 3c, 3d
[M+H]+ 303/305*
λmax = (273, 351) nm
Versuche 3, 3b
43
OH
5
HO
O
[M+H]+ 303/305*
OH
λmax = (278, 346) nm
OH O
Versuche 3, 3b
Luteolin [M+H]+ 287
6
[M+H]+ 540*
OH
O
HO
[M+H]+ 289/291*
λmax = (295, 359) nm
OH O
+
Naringenin [M+H] 273
Versuche 3, 3b
λmax = (289) nm
Versuch 2
[M+H]+ 291*
λmax = (294, 358) nm
Versuch 3b
7
OH
HO
O
OH O
OH
O
HO
O
OH
O O
keine Umsetzung
HO
OH
OH
OH
Rutin [M+H]+ 611
* Referenzverbindungen nicht vorhanden
Mit Ausnahme des Flavonoldiglykosids Rutin (7) wurden alle Substrate wenigstens teilweise
umgesetzt. In der Versuchsreihe 2 wurde eine vermehrte Polymerisation beobachtet (Dunkelfärbung
der Reaktionslösung). Apigenin (1), Daidzein (2), Luteolin (5) und Kämpferol (4) wurden selektiv an
einer Position monohydroxyliert. Die Umsetzung von Flavon (3) und Naringenin (6) in Gegenwart
von Vitamin C lieferte jeweils zwei monohydroxylierte Produkte. In Abwesenheit von Ascorbinsäure
wurde im Fall von Naringenin eine nicht weiter identifizierbare Verbindung (wahrscheinlich ein
dimeres Kopplungsprodukt) mit einer Masse von 540 gebildet.
Im Ergebnis der Voruntersuchungen wurde festgestellt, dass die Umsetzungen in den Versuchsreihen
3 (3b) am günstigsten verliefen. Die Anwesenheit von Ascorbinsäure in der Reaktionslösung
verhinderte die oxidative Polymerisation der Substrate bzw. Produkte [Osman et al., 1996]. Abbildung
18 zeigt bespielhaft die HPLC-Chromatogramme der Daidzeinumsetzung mit und ohne Vitamin C.
Die Produktzuordnung erfolgte mittels Referenzverbindungen.
44
HO
Absorption bei 254 nm [mAU]
2500
O
HO
O
2000
OH
HO
2
1500
2
1
O
O
OH
2
2
1000
200
[nm]
500
400
200
[nm]
1
c
b
a
0
0
5
10
400
15
Retentionszeit [min]
20
25
Abbildung 18: HPLC-Chromatogramme der Daidzeinumsetzung mittels AaeAPO in Gegenwart (b) und
Abwesenheit (c) von Vitamin C; Kontrolle ohne Enzym (a):
1 - Demethyltexasin, 2 – Daidzein; die Insets zeigen die UV-Vis-Spektren des Substrats und seines
Hydroxylierungsproduktes.
Ein Einfluss von Vitamin C auf das Produktspektrum wurde auch für die Microperoxidase-8 (MP-8)
beobachtet. Dieses hämhaltige Oligopeptid gehört zu den sogenannten „Minienzymen“ (tryptisches
Verdauungsprodukt von Cytochrom c) und nutzt wie die AaeAPO Wasserstoffperoxid als Cosubstrat
[Harbury et al., 1965]. Der durch die MP-8 bei der aromatischen Hydroxylierung (z. B. von Anilin)
übertragene Sauerstoff stammt ebenfalls aus dem Cosubstrat [Osman et al., 1996]. Es ähneln sogar die
Reaktionsbedingungen (7,5 μM MP8, 2,5 mM H2O2, 10 mM Anilin, 2 mM Vitamin C, 0,1 M
Kaliumphosphat-Puffer pH 7,6). In Abwesenheit von Ascorbinsäure arbeitet das Minienzym im
sogenannten „peroxidase mode“, wobei durch Ein-Elektron-Oxidation und Wasserstoff-Abstraktion
Phenoxyl-/ Flavonoxylradikale gebildet werden, die anschließend di-, oligo- oder polymerisieren
[Wang & Van Wart, 1989; Wang et al., 1991; Boersma et al., 2000]. In Anwesenheit von Vitamin C
wechselt die MP-8 in den sog. „P450 mode“, wobei aromatische Hydroxylierungen, O- und NDealkylierungen oder oxidative Dehalogenierungen katalysiert werden [Osman et al., 1996; Dorovska
et al., 1998; Boersma et al., 2000]. Auch die Chlorperoxidase (CfuCPO) kann zwischen diesen beiden
Modi sowie einem dritten, sog. „halide oxidation mode“ wechseln, aromatische Verbindungen
gehören jedoch nicht zu ihren Oxygenierungssubstraten (Originalzitat zur CPO, Hofrichter & Ullrich,
2006, Hofrichter et al., 2010).
Es ist davon auszugehen, dass konkurrierende Reaktionen auch im Verlauf der AaeAPO-Katalyse
ablaufen. Das Enzym verfügt über mehrere potentielle Bindungsstellen (mindestens zwei), an denen,
nach Entstehung der reaktiven Komponente I, Oxidationen stattfinden können. Je nach
Substrateigenschaften und pH werden die eine oder die andere oder beide Bindungsstellen genutzt.
Relativ hydrophobe Verbindungen, die in den Hämkanal (d = 7 Ǻ) passen und dabei einen
45
Mindestabstand zum Häm-Eisen von 2,3 Ǻ erreichen, werden durch den Ferryl-Sauerstoff oxidiert und
gleichzeitig oxygeniert (siehe Abbildung 19, peroxygenierender Weg c). Kleinere hydrophile
Verbindungen (Halogenide, Peroxide) können den hydrophilen Kanal nutzen, wobei nach Anlagerung
eines Halogenids (im Fall der AaeAPO vorzugsweise Bromid) an den Ferryl-Sauerstoff der
Komponente I die hypothetische Komponente X gebildet wird (siehe Abbildung 19, halogenierender
Weg a). Letztere zerfällt unter Freisetzung von Hypobromit (z. B. hypobromige Säure), das
unspezifisch organische Verbindungen zu halogenieren vermag [Hofrichter & Ullrich, 2006]. Sowohl
der Weg c als auch der Weg a sind Zwei-Elektronen-Oxidationen, die mit einem Sauerstoff-Transfer
verbunden sind. Es wird davon ausgegangen, dass sich eine weitere Bindungsstelle, die sog.
„Phenolbindungsstelle“, an der Enzymoberfläche befindet [Piontek et al, 2010, K. Piontek, persönliche
Mitteilung 2012]. Sie wird bevorzugt von größeren hydrophilen Molekülen (z. B. ABTS, Farbstoffe,
Phenolate, Polyphenole) besetzt, die nicht in den Hämkanal passen und/oder nur langsam in diesen
gelangen. Die Phenolbindungsstelle ist über einen LRET mit dem Häm verbunden, wobei ein
„electron hopping“ von einem Phenylalanin zum anderen angenommen wird [Piontek at al. 2010].
Diese Ein-Elektron-Oxidationen an der Enzymoberfläche führen in jedem Fall zur Radikalbildung,
obgleich nicht auszuschließen ist, dass auch Ein-Elektron-Oxidationen im Hämkanal stattfinden (siehe
Abbildung 19, peroxidativer Weg b) [Hofrichter, 2012].
O OH
O
OH
HO
O OH
OH
HO
O
O
OH
O
OH
OH O
OH O
O
HO
O
O
HO
O
OH O
OH O
OH
OH
HO
O
O
O
OH O
HO
O
O OH
HO
OH
O
HO
HO
O
OH
OH
O
OH O
Br
Abbildung 19: Hypothetische Wege Peroxygenase-katalysierter Reaktionen mit Apigenin als phenolisches
Substrat.
a) halogenierender Weg (halide oxidation mode), b) peroxidativer Weg (phenol oxidation mode),
c) peroxygenierender Weg (peroxygenation or P450 mode) [modifiziert nach Hofrichter et al., 2010, 2012]
46
Phenoxyl-/Flavonoxylradikale werden in Anwesenheit von Ascorbinsäure rückreduziert, was ihre
Kopplung und Polymerisation unterdrückt [Osman et al., 1996; Pérez & Nilo Mejia, 2002]. Die
Abbildung 20 zeigt den Flavonoid-Redoxzyklus in Pflanzen mit und ohne Vitamin C [Pérez & Nilo
Mejia, 2002].
Abbildung 20: Flavonoid-Redoxzyklus.
(1) mit Ascorbinsäure, (2) ohne Ascorbinsäure; GPx (Guajakol-Typ-Peroxidase), * lichtinduzierte Bildung
auf genetischer Ebene, Flav (Flavonoid), Flav • (Flavonoidradikal), AsA (Ascorbinsäure), MDA •
(Monodehydroascorbinsäureradikal),
DHA
(Dehydroascorbinsäure).
cDHA-R
(cytosolische
Dehydroascorbinsäure Reduktase) [Pérez & Nilo Mejia, 2002]
Die enzymatische Transformation (Oxyfunktionalisierung) der Flavonoide durch die AaeAPO verläuft
über den Weg c. Gleichzeitig wird auch der Weg b beschritten, der einen Großteil des
Wasserstoffperoxids verbraucht, dessen radikalische Produkte jedoch durch Vitamin C in phenolische
Flavonoide zurück reduziert werden. Dies führt insgesamt zu vergleichweise langsamen
Oxygenierungsreaktionen sowie zu einem niedrigen Umsatz. Das quantitative Verhältnis der Wege b
zu c ist substratabhängig.
Im Verlauf der orientierenden Vorversuche wurde ein weiteres interessantes Phänomen beobachtet:
Bei Abwesenheit von DMF stieg die Ausbeute an Hydroxylierungsprodukt für das Substrat Flavon
deutlich an. Es wurde angenommen, dass DMF entweder selbst als Substrat fungiert (KonkurrenzReaktion ähnlich wie im Fall von Methanol) oder die Aktivität der AaeAPO hemmt
(Inhibitorwirkung). Um diese Frage zu klären, wurden weitere Versuche durchgeführt – diesmal auch
mit DMSO als Lösungsmittel. Der Nachweis einer Umsetzung der Lösungsmittel DMF und DMSO
verlief negativ (Analytik mittels HPLC-MS), dagegen bestätigte sich die Hemmung der
Enzymaktivität (Abbildung 21).
relative Enzymaktivität [%]
47
100
DMF 20 U/l
80
DMSO 20 U/l
60
DMF 40 U/l
40
DMSO 40 U/l
20
0
0
5
10
20
Konzentration des Lösungsmittels
[Vol.-%]
Abbildung 21: Hemmung der AaeAPO-Aktivität durch DMF und DMSO
Abbildung 21 zeigt die Hemmung der Enzymaktivität der AaeAPO (gemessen mit Veratrylalkohol)
durch unterschiedliche Konzentration an DMF und DMSO (5 %-, 10 %- und 20 %-ige DMF- bzw.
DMSO-Lösungen). Die Volumenaktivitäten beziehen sich auf die Reaktionsansätze (Gesamtvolumen
1 ml, Enzymstammlösungen 20 U/ml bzw. 40 U/ml (davon jeweils 1 μl eingesetzt), 50 mM
Kaliumphosphatpuffer (pH 7), 5 mM Veratrylalkohol, 1 mM Wasserstoffperoxid). Mit steigendem
Lösungsmittelanteil sank die relative Enzymaktivität sowohl für DMF als auch DMSO. Die Abbildung
21 zeigt, dass die inhibierende Wirkung von DMSO auf die AaeAPO stärker ausgeprägt war als die
von DMF, weshalb es nicht als Lösungsmittel-Alternative geeignet war. Eine hemmende Wirkung von
DMF und DMSO ist auch für andere Hämenzyme (z. B. CYP2E1 (DMF); CYP2C8/2C9, CYP2C19,
CYP2E1 und CYP3A4 (DMSO)) beschrieben worden. [Tolando et al., 2001, Chauret et al., 1998]
4.2.2 Variation der Reaktionsbedingungen der enzymatischen
Transformationen
In weiteren Versuchen wurde geprüft, welchen Einfluss die Konzentration des Cosubstrats
Wasserstoffperoxid auf die Art und Menge der gebildeten Produkte hatte. Die Versuche wurden mit
den Verbindungen 1 bis 6 (siehe Tabelle 5) durchgeführt. Die Testbedingungen wurden wie folgt
geändert:
1.
Variation der Enzymkonzentration bei einmaliger Zugabe von Wasserstoffperoxid und
Durchführung von Langzeitversuchen
2.
Diskontinuierliche mehrmalige Wasserstoffperoxidzugabe
3.
Kontinuierliche Wasserstoffperoxid-Dosierung mittels Spritzenpumpen
48
4.2.2.1
Variation der Enzymkonzentration bei einmaliger Wasserstoffperoxidzugabe und
Durchführung von Langzeitversuchen
Die Versuche unter einmaliger Cosubstratzugabe wurden entsprechend dem Versuchsschema 4
durchgeführt. Die Variable stellte die AaeAPO-Endkonzentration dar (0,95 U/ml; 1,9 U/ml; 5,7 U/ml).
Dementsprechend wurde die zugegebene Menge an AaeAPO und Wasser in den Reaktionsansätzen
verändert. Nach zwei Minuten wurde die Reaktion durch Zugabe von 20 µl 50 %iger
Trichloressigsäure gestoppt und die Proben mittels HPLC-MS (Methode 1) vermessen.
Tabelle 10: Versuchsschema 4 (Vitamin C, 21 % (v/v) DMF), Bsp. 1,9 U/l AaeAPO
Substanz
Konzentration
Pipettier-Volumen
End-
(Stammlösung)
[μl]
Konzentration
100 mM
100
50 mM
AaeAPO
380 U/ml
1
1,9 U/ml
H2O2
10 mM
20
1 mM
Flavonoid
50 mM
2
0,5 mM
Vitamin C
40 mM
20
4 mM
Wasser
100 %
17
79 % (v/v)
DMF
100 %
40
(20+1) % (v/v)
Tabelle 11: Ergebnisse der Versuche unter einmaliger Wasserstoffperoxidzugabe, Reaktionszeit 2 min,
TC – total conversion
Nr.
Substrat
[Us] Umsatz bezogen auf das Substrat (TC [%]),
Quantifiziertes
Produkt
[Ab] Ausbeute* [%]
0,95 U/ml
1,9 U/ml
5,7 U/ml
[Us]
[Ab]
[Us]
[Ab]
[Us]
[Ab]
1
Apigenin
Scutellarein
43
35
48
42
41
29
2
Daidzein
Demethyltexasin
33
14
23
23
2
2
Flavon in Wasser 6-Hydroxyflavon
19
8
11
11
6
6
3
Flavon in DMF
6-Hydroxyflavon
n.b.
n.b.
13
0,3
7
0
4
Kämpferol
-
29
-
30
-
30
-
5
Luteolin
-
23
-
33
-
15
-
6
Naringenin
Eriodictyol
56
4
46
4
37
4
* soweit Referenzverbindungen vorhanden waren; n.b. nicht bestimmt
Die Tabelle 11 listet die Ergebnisse dieser Batch-Versuche auf. Der Theorie nach, sollte mit steigender
Enzymkonzentration der Umsatz ebenso wachsen. Dies konnte jedoch für keine der sechs getesteten
Substanzen beobachtet werden. Die ermittelten Zahlenwerte für die Umsätze erscheinen hingegen
49
willkürlich bezüglich der eingesetzten Enzymmenge und ohne erkennbaren Zusammenhang. Dies
deutet darauf hin, dass andere Faktoren als die Enzymkonzentration bestimmend/limitierend für die
Umsetzungen waren. Entscheidend könnte hierbei die ausgeprägte peroxidative Aktivität der AaeAPO
sein, die gerade im Fall größerer phenolischer Substrate wie den Flavonoiden, mit der
peroxygenierenden Aktivität konkurriert (vgl. Abbildung 19). Die Folge ist, dass eine Erhöhung der
Enzymmenge in Anwesenheit von Ascorbinsäure nicht zwangsläufig zu einer Erhöhung der
peroxygenierenden Aktivität führen muss, sondern, dass bildlich gesprochen, die bevorzugte
peroxidative (phenoloxidierende) Aktivität verstärkt „im Kreis geführt wird“. Eine zusätzliche
unproduktive Zersetzung des Cosubstrates (im Sinne der avisierten Flavonoid-Oxygenierung) könnte –
insbesondere für Daidzein, Flavon und Naringenin – die Katalase-Aktivität der AaeAPO darstellen.
Diese bewirkt, vor allem bei einmaliger Zugabe von Wasserstoffperoxid, dessen partielle Zersetzung
zu O2 und H2O [Ullrich & Hofrichter, 2005, Ullrich et al., 2008]. Katalaseähnliche Aktivitäten wurden
auch für die Chlorperoxidase [Sun et al., 1994] und pflanzliche Peroxidasen beschrieben [Zámocký et
al., 2001].
Als Konsequenz dieser Testreihe kann abgeleitet werden, dass Kurzzeitversuche unter einmaliger
Wasserstoffperoxidzugabe, auch in Gegenwart relativ hoher Enzymmengen, nur wenig geeignet sind,
um die Oxygenierung von Flavonoiden durch die AaeAPO zu untersuchen.
In einem weiteren Schritt wurde für alle Testsubstrate der zeitliche Verlauf ihrer Umsetzung
untersucht. Dazu wurden Probelösungen mit einem Gesamtvolumen von 1 ml vorbereitet. Die
Probenahme erfolgte nach 0 s, 10 s, 30 s, 1 min, 10 min, 30 min, 1 h, 2 h und 4 h, indem jeweils
100 μl Probe in ein mit 10 μl 50 %iger TCA gefülltes Vial überführt wurden. Anschließend wurden
die Proben mittels HPLC-DAD vermessen (Methode 4, Injektionsvolumen: 11 μl).
In den meisten Fällen war die die Geschwindigkeit der Oxygenierungsreaktionen zu niedrig, um eine
angemessene Umsetzung innerhalb von vier Stunden zu erreichen, weswegen Langzeitversuche
durchgeführt wurden. Diese erfolgten z. T. über mehrere Tage und führten zu deutlich höheren
Produktausbeuten. Die optimale Reaktionszeit bei einer Enzymaktivität von 1,9 U/ml betrug für
Apigenin und Daidzein sechs Tage, für Luteolin 56 Stunden, für Kämpferol zwei Tage, für Flavon
sieben Stunden und für Naringenin vier Stunden.
Die eingesetzte Enzymaktivität von 1,9 U/ml war im Vergleich zu anderen Peroxygenase-katalysierten
Reaktionen zwei- bis zehnmal höher [Ullrich et al., 2004; Kluge et al., 2007]. Der Grund hierfür ist
wiederum in dem bereits oben beschriebenen, unproduktiven H2O2-Verbrauch zu sehen, der eine
insgesamt geringe Reaktionsgeschwindigkeit bedingt. Ähnliches wurde bereits bei der Umsetzung von
Propranolol und Diclofenac in Gegenwart von Ascorbinsäure beobachtet [Kinne et al., 2009b].
50
Tabelle 12: Übersicht zu den Ergebnissen der Langzeitversuche
Nr.
Substrat
Quantifiziertes
Versuchsdauer
Produkt
[h]
Umsetzung bezogen
auf das Substrat
TC [%]
Ausbeute*
[%]
1
Apigenin
Scutellarein
144
91
40
2
Daidzein
Demethyltexasin
144
67
67
Flavon in Wasser
6-Hydroxyflavon
7
38
11
Flavon in DMF
6-Hydroxyflavon
7
1
<1
4
Kämpferol
-
48
83
-
5
Luteolin
-
56
84
-
6
Naringenin
Eriodictyol
4
76
8
7
Rutin
-
144
0
0
3
* soweit Referenzverbindungen vorhanden waren
Abbildung 22 zeigt drei vergleichende HPLC-Chromatogramme zur Daidzeinumsetzung nach zwei
Minuten bzw. sechs Tagen enzymatischer Behandlungsdauer.
2500
HO
O
HO
O
2000
OH
2
1500
HO
1
1000
200
[nm]
400
5
200
[nm]
1
10
OH
12
0
0
O
2
2
500
O
15
20
400
c
b
a
25
Abbildung 22: Vergleich der Daidzeiumsetzungen mittels AaeAPO im Kurzzeitversuch (b) und
Langzeitversuch (c), Kontrolle (a). 1 - Demethyltexasin, 2 - Daidzein.
51
4.2.2.2
Diskontinuierliche mehrmalige Wasserstoffperoxidzugabe
Um die Katalase-Aktivität der AaeAPO möglichst niedrig zu halten, wurde das Cosubstrat in mehreren
(zehn) Schritten zugegeben (die Endkonzentration im Ansatz war mit der einmaligen
Wasserstoffperoxidzugabe identisch). Zuerst wurden 150 μl 1 mM H2O2 zudosiert. Die nächsten
Zugaben erfolgten jeweils in 15-μl-Schritten ausgehend von einer 10 mM H2O2-Lösung (im
Stundenabstand: Stunde 1 bis 7, weiter nach 27 und 50 Stunden; Analytik: HPLC-DAD, Methode 4).
Tabelle 13: Versuchsschema 5 (Vitamin C, 21 % (v/v) DMF)
Substanz
Konzentration
Pipettier-Volumen
End-
(Stammlösung)
[μl]
Konzentration
100 mM
750
50 mM
AaeAPO
380 U/ml
7,5
1,9 U/ml
1 oder 10 mM
150 / 15
1 mM
Flavonoid
50 mM
15
0,5 mM
Vitamin C
40 mM
150
4
Wasser
100 %
127,5
79 % (v/v)
DMF
100 %
300
(20+1) % (v/v)
H2O2
Da sich Langzeitversuche bei einmaliger Wasserstoffperoxidzugabe bereits bewährt hatten (bezüglich
Umsatz und Ausbeute), wurde diese Vefahrensweise auch im Fall der mehrmaligen H2O2-Zugabe
angewendet.
Tabelle 14: Übersicht zu den Ergebnissen der Langzeitversuche unter mehrmaliger Zugabe des
Cosubstrates (H2O2)
Nr.
Substrat
Quantifiziertes
Versuchsdauer
Produkt
[h]
Umsetzung bezogen
auf Substrat
TC [%]
Ausbeute*
[%]
1
Apigenin
Scutellarein
50
97
44
2
Daidzein
Demethyltexasin
50
77
58
Flavon in Wasser
6-Hydroxyflavon
50
66
2
Flavon in DMF
6-Hydroxyflavon
50
10
<1
4
Kämpferol
-
27 (103)
94 (100)
-
5
Luteolin
-
27 (103)
97 (89)
-
6
Naringenin
Eriodictyol
50
91
8
3
* soweit Referenzverbindungen vorhanden waren
52
Die Ergebnisse bestätigen die Annahme, dass unter diesen Bedingungen vergleichbare oder höhere
Ausbeuten erreicht werden können. Die Umsetzungen verliefen im Vergleich zur einmaligen
Konzentration [mmol/ml]o
Cosubstratzugabe „gleichmäßiger“ (siehe Apigenin, Abbildung 23).
0.5
0.45
0.4
0.35
0.3
0.25
0.2
0.15
0.1
0.05
0
Substrat (1x)
Produkt (1x)
Substrat (10x)
Produkt (10x)
0
10
20
30
40
50
60
Zeit [h]
Abbildung 23: Zeitlicher Verlauf der Umsetzung von Apigenin in Abhängigkeit von der H2O2-Dosierung;
1x - einmalige H2O2-Zugabe (1 mM); 10x - zehnmalige H2O2-Zugabe (portionsweise ad 1 mM).
Interessanterweise setzte die Produktbildung erst ein, wenn eine definierte Cosubstratmenge erreicht
war (siehe Tabelle 15).
Tabelle 15: Notwendige Mindestmenge an Wasserstoffperoxid für die AaeAPO-katalysierte Umsetzung
ausgewählter Flavonoide.
Apigenin
H2O2 [mM]
0,3
Daidzein
0,3
Flavon
Flavon
DMF
H2O
0,1
0,2
Kämpferol Luteolin
0,3
0,9
Naringenin
0,4
Die Ergebnisse dieser Versuche (diskontinuierliche Wasserstoffperoxidzugabe) führten insgesamt zu
ähnlichen Ergebnissen wie die Langzeitversuche unter einmaliger Zugabe von H2O2.
4.2.2.3
Kontinuierliche Wasserstoffperoxidzugabe (Spritzenpumpenversuche)
Ähnlich wie im Fall der diskontinuierlichen Wasserstoffperoxidzugabe wurde auch durch
kontinuierliche Zudosierung des Cosubstrats versucht, die Katalase-Aktivität der AaeAPO möglichst
gering zu halten (die Endkonzentration war wiederum mit der einmaligen Wasserstoffperoxidzugabe
identisch, 1 mM). Zunächst wurde der Reaktionsansatz nach dem unten aufgeführten Pipettierschema
vorbereitet (Analytik: HPLC-MS, Methode 2).
53
Tabelle 16: Versuchsschema 6 (Vitamin C, 21 % (v/v) DMF)
Substanz
Konzentration
Pipettier-Volumen
End-
(Stammlösung)
[μl]
Konzentration
100 mM
100
50 mM
AaeAPO
380 U/ml
1
1,9 U/ml
Flavonoid-Standard
50 mM
2
0,5 mM
Vitamin C
40 mM
20
4 mM
DMF
100 %
40
(20+1) % (v/v)
Eine 1-ml-Hamiltonspritze wurde blasenfrei mit ca. 250 μl 5,4 mM H2O2 befüllt, mit einer Kapillare
versehen und in der Spritzenpumpe (syringe pump) befestigt. Die Kapillare wurde in den
Reaktionsansatz getaucht und unter kontinuierlichem Rühren die Reaktion gestartet. Die
Spritzenpumpe dosierte 19 μl 5,4 mM H2O2 pro Stunde, so dass die Gesamtdauer der Reaktion knapp
2 h betrug (Gesamtvolumen von 37 μl 5,4 mM H2O2). Die niedrigen Umsetzungen v. a. im Fall der
ansonsten gut reagierenden Substrate Apigenin und Luteolin erforderten die Verlängerung der
Reaktionszeit auf 8 h. Die Ergebnisse der Spritzenpumpenversuche fasst die nachfolgende Tabelle 17
zusammen.
Tabelle 17: Übersicht zu den Ergebnissen der Spritzenpumpenversuche
Nr.
Substrat
Produkte
(MS / Umsetzung nach 2 h (8 h) [%])
(MS / Ausbeute nach 2 h (8 h) [%],UV-Vis)
OH
HO
[M+H]+ 287 / 43 (100)
O
λmax = (284, 336) nm
1
OH O
Scutellarein
Apigenin [M+H]+ 271 / 51 (100)
HO
O
2
O
[M+H]+ 271 / 1 (89)
λmax = (258, 320) nm
OH
Demethyltexasin
Daidzein [M+H]+ 255 / 73 (89)
[M+H]+ 239*
O
3
O
[M+H]+ 239*#
λmax = (254, 322) λmax = (266, 293)
in Wasser
Flavon [M+H]+ 223 / 13 (22)
[M+H]+ 239 / 4 (3)
λmax = (270, 305)
nm
nm
nm
P1
P2
6-Hydroxyflavon
54
Nr.
Substrat
Produkte
(MS / Umsetzung nach 2 h (8 h) [%])
(MS / Ausbeute nach 2 h (8 h) [%],UV-Vis)
[M+H]+ 239*
O
[M+H]+ 239*#
[M+H]+ 239 / 0
λmax = (254, 321) λmax = (267, 296)
λmax = (270, 304)
in DMF
nm
nm
nm
Flavon [M+H]+ 223 / 6
P1
P2
6-Hydroxyflavon
O
OH
HO
O
[M+H]+ 303*
4
OH
OH O
λmax = (275, 349) nm
Kämpferol [M+H]+ 287 / 47 (30)
OH
HO
O
OH
[M+H]+ 303*
5
λmax = (282, 346) nm
OH O
Luteolin [M+H]+ 287 / 33 (95)
OH
O
HO
[M+H]+ 289*#
[M+H]+ 289*
λmax = (294, 356) λmax = (294, 358)
6
OH O
Naringenin [M+H]+ 273 / 77 (98)
[M+H]+ 289 / 7 (4)
λmax = (228, 287)
nm
nm
nm
P1
P2
Eriodictyol
OH
HO
7
O
OH O
OH
O
HO
O
OH
O O
HO
OH
OH
OH
Rutin [M+H]+ 611 / 10
#
neues Produkt
Die Versuche führten zu vergleichbaren qualitativen Ergebnissen wie im Fall der Vorversuche mit
kumulativer Cosubstratzugabe. Eine Ausnahme bildeten mit jeweils einem zusätzlichen Produkt (#)
Flavon und Naringenin.
Für Rutin konnte auch bei kontinuierlicher Wasserstoffperoxidzugabe keine Produktbildung
beobachtet werden. Der Grund hierfür liegt in der Größe und Hydrophilie des Diglykosids, das nicht
in die Enzymtasche passte. Dieses Phänomen korrespondiert mit anderen Studien, die den Einfluss der
Substratgröße an Hand oligomerer Ethylenglykole untersuchten und ab einer bestimmten Größe
55
(Hexaethyleglykol) keine Umsetzung durch die AaeAPO mehr feststellten [Kinne et al., 2009, Kinne
2010].
Aus quantitativer Sicht war die kontinuierliche Versuchsführung mit Ausnahme von Flavon am
effizientesten (2 h bzw. 8 h; vgl. das Beispiel Daidzein in Abbildung 24).
HO
O
HO
O
2000
OH
HO
2
1
1000
O
2
271
1
12
m/z
2
c
b
a
0
5
OH
255
m/z
500
0
O
[%]
1500
[%]
2500
10
15
20
25
Abbildung 24: Vergleich der Daidzeinumsetzung mittels AaeAPO im Spritzenpumpenversuch über 8 h (b)
und im Lanzeitversuch (c), Kontrolle (a). 1 - Demethyltexasin, 2 – Daidzein.
Die UV-Vis und MS-Daten der in den Vorversuchen identifizierten Produkte wurden in den
Versuchen unter kontinuierlicher Cosubstratzugabe bestätigt, korrigiert und vervollständigt (Tabelle
17). Zur weiteren Identifizierung einiger Produkte wurden 1H- und
13
C-NMR-Untersuchungen
durchgeführt.
4.2.3 Enzymatische Versuche zu weiteren Flavonoiden
Um das Substratspektrum der AaeAPO bezüglich Flavonoiden genauer zu erfassen, wurde eine
repräsentative Auswahl (57 Einzelverbindungen) verschiedener Flavonoidklassen (Flavanone,
Flavone, Flavonole, Isoflavone) sowie unterschiedlich hydroxylierte und/oder methoxylierte
Flavonoide getestet. Darauf aufbauend wurde die enzymatische Umsetzung in Abhängigkeit von der
Flavonoid-Grundstruktur sowie vom Hydroxylierungs-/Substitutionsmuster evaluiert und die
Ergebnisse mit entsprechenden Literaturdaten verglichen.
Alle Versuche wurden entsprechend dem Pipettierschema 4 (siehe Tabelle 10) unter kontinuierlicher
Peroxidzugabe (Spritzenpumpe) und in Anwesenheit von Ascorbinsäure durchgeführt, da sonst die
primär gebildeten hydroxylierten Flavonoide zu o-Chinonen und Polymerisationsprodukten oxidiert
werden können. Der zeitliche Verlauf der einzelnen Reaktionen wurde genauer betrachtet, wenn
Folgereaktionen oder Umsetzungen mit mehreren Produkten auftraten.
56
4.2.3.1
Enzymatische Transformation von Flavanonen
Der Tabelle 18 sind die Summenformeln, die Molmassen sowie die UV-Vis-Daten (lokale
Absorptionsmaxima) der untersuchten Flavanone zu entnehmen.
Tabelle 18: Ausgewählte Eigenschaften der untersuchten Flavanone
Nr. Flavanon
Summenformel
C15H12O6
Molmasse
[g/mol]
288,24
UV-Vis–Spektrum
(Lösungsmittel); λmax [nm]
(DMF); 228, 288
1
Eriodictyol
2
Flavanon
C15H12O2
224,25
(DMF); 218, 251, 320
3
Hesperetin
C16H14O6
302,3
(DMF); 227, 288
4
6-Hydroxyflavanon
C15H12O3
240,25
(DMF); 255, 356
5
7-Hydroxyflavanon
C15H12O3
240,25
(DMF); 232, 274, 310
6
2'-Hydroxyflavanon
C15H12O3
240,25
(DMF);252, 320
7
3'-Hydroxyflavanon
C15H12O3
240,25
(DMF); 251,320
8
4'-Hydroxyflavanon
C15H12O3
240,25
(DMF); 251, 321
9
4',6-Dihydroxyflavanon
C15H12O4
256,25
(DMF); 227, 356
10 Isosakuranetin
C16H14O5
286,29
(DMF); 226, 288
11 5-Methoxyflavanon
C16H14O3
254,29
(DMF); 213, 269, 331
12 6-Methoxyflavanon
C16H14O3
254,29
(DMF); 228, 253, 351
13 4'-Methoxyflavanon
C16H14O3
254,29
(DMF); 215, 251, 321
14 Naringenin
C15H12O5
272,25
(DMF); 288
15 Naringenin-7-O-glucosid
C21H22O10
434,40
(DMF); 229, 283
16 Pinocembrin
C15H12O4
256,27
(DMF); 211, 288
Tabelle 19 fasst die Ergebnisse der AaeAPO-katalysierten Flavanon-Umsetzungen zusammen. Sie
führt die Substrate in Verbindung mit den entstandenen Produkten sowie die prozentuale Umsetzung
(bezogen auf das Substrat) auf. Wenn Referenzverbindungen vorhanden waren, sind auch die
Produktausbeuten angegeben.
Tabelle 19: Übersicht zur enzymatischen Umsetzung von Flavanonen durch die AaeAPO (TC – total
conversion)
Substrat
(Struktur)
Nr.
TC
[%]
Produkte / Ausbeute [%]
(Struktur) und/oder [Masse]
OH
HO
O
OH
90
1
OH O
[M+H]+ 305*
[M+H]+ 305*
57
Substrat
(Struktur)
Nr.
TC
[%]
OH
O
2
43
O
HO
O
O
O
O
+
[M+H]+ 241 / 4
[M+H] 241 / 33
OCH 3
3
HO
O
OH
[M+H]+ 319*
96
OH O
OH
4
5
O
O
HO
30 HO
O
O
[M+H]+ 257 / 0,2
95
HO
O
O
[M+H]+ 257n
O
6
O
HO
O
HO
[M+H]+ 479*
70
OH
[M+H]+ 257*
[M+H]+ 300*
O
OH
O
O
7
OH
70
+
+
[M+H] 257*
[M+H] 257*
HO
O
[M+H]+ 273*
OH
OH
O
8
O
27 HO
O
[M+H]+ 257*
O
[M+H]+ 257 / 4
OH
OH
O
9
HO
O
O
O
2
HO
O
[M+H]+ 273*
OH
OH
58
Substrat
(Struktur)
Nr.
TC
[%]
OCH3
10 HO
O
100
[M+H]+ 303*
[M+H]+ 289*
[M+H]+ 289*
45
[M+H]+ 271*
[M+H]+ 271*
[M+H]+ 257*
[M+H]+ 271*
[M+H]+ 271*
OH O
O
11
H3CO O
12
O
O
H3CO
32
HO
O
[M+H] 241 / 8
O
O
HO
O
+
O
[M+H]+ 271*
O
[M+H]+ 257 / 12
[M+H] 241 / 8
OH
OH
14
O
77
O
HO
OH
OH
OCH 3
13
O
+
HO
O
OH
98
[M+H]+ 289*
[M+H]+ 439*
OH O
OH O
[M+H]+ 289 / 4
OH
15 HO
HO
16
O
O O
OH
HO
OH
8
[M+H]+ 451*
96
[M+H]+ 273*
OH O
O
OH O
n
Identifizierung mittels NMR
Flavanone sind durch eine gesättigte Bindung zwischen dem C2 und C3 sowie das Vorhandensein
eines Phenylsubstituenten in C2-Position (2-Phenylchromane) strukturell charakterisiert. Es wurden
unterschiedlich substituierte Flavanone untersucht, die bis zu vier Hydroxygruppen, Methoxygruppen
und/oder O-glykosidische Substituenten aufwiesen. Ziel war es, Selektivitätsregeln für die
enzymatische Hydroxylierung von Flavanonen durch die AaeAPO zu formulieren.
Anhand der Massenspektren der Produkte und den beobachteten Veränderungen im Vergleich zu den
Ausgangsverbindungen konnten zwei Reaktionstypen unterschieden werden:
Hydroxylierung (m/z +16) und Demethylierung (m/z -14).
59
Die Stammverbindung Flavanon (2) wurde mit mittlerem Umsatz [43 %] bevorzugt in C6-Position
hydroxyliert, in geringerem Umfang auch in C4'-Position. Eine Substitution der Positionen C6 und C4'
im Flavanon beeinflusste dementsprechend die Reaktivität des Enzyms. Bei Anwesenheit einer
Hydroxygruppe am C6 oder C4' fand nur eine moderate Umsetzung statt [(4): 30 %; (8): 27 %], wenn
beide Positionen hydroxyliert waren, wurden lediglich Spuren des Substrats am C3' oxidiert [(9): 2 %].
Die Hydroxylierungsreaktion wurde hingegen in Anwesenheit einer Methoxygruppe in C4'-Position
kaum beeinträchtigt [(3): 96 % und (13): 77 %]. Eine Methoxylierung der Position C6 wirkte
wiederum in ähnlicher Weise wie eine entsprechende Hydroxylierung [(12): 32 %].
Zu den weiteren Faktoren, die die Transformationen deutlich negativ beeinflussten oder vollständig
verhinderten, zählen die sterische Hinderung durch Carbohydrate ((15): 8 %). Besonders hohe
Umsätze wurden dagegen beobachtet, wenn die Position C7 hydroxyliert war ((1), (3), (5), (10), (14),
(16): 95 - 98 %). Hydroxygruppen in C2'- oder C3'- Position wirkten sich positiv auf die Umsetzung
des Flavanons aus [(6), (7): 70 %]. Eine Methoxygruppe in C5- Position (d. h. in ortho-Stellung zur
bevorzugten Hydroxylierungsstelle C6) hatte interessanterweise keinen Einfluss auf die Umsetzung im
Vergleich zur Stammverbindung Flavanon [(11): 45 %].
Die meisten gefundenen Produkte stellen die zugehörigen einfach oder zweifach hydroxylierten (z. B.
3'-Hydroxyflavanon (7)) Ausgangsverbindungen dar. Zu jeweils nur einem monohydroxylierten
Reaktionsprodukt wurden die Verbindungen Hesperetin (3), 7-Hydroxyflavanon (5), 4',6Dihydroxyflavanon (9), Naringenin-7-O-glucosid (15) sowie Pinocembrin (16) umgesetzt. Die übrigen
Substrate ergaben meist mehrere monohydroxylierte sowie anders derivatisierte Produkte oder Dimere
(Tabelle 19).
Auf Basis der vorliegenden Untersuchungen kann die C6-Position im heterocyclischen
Chromansystems klar als bevorzugte Hydroxylierungsstelle der AaeAPO definiert werden
[nachgewiesen für (2), (8) und (13)], gefolgt von der Position C4' im Phenylring [nachgewiesen für
(2) und (4)]. Sind beide Positionen mit Hydroxyl- oder Methoxygruppen substituiert, wird
wahrscheinlich nur noch die Position C3' in geringem Umfang hydroxyliert [positiver Abgleich der
Reaktionsprodukte der Umsetzung von 4',6-Dihydroxyflavanon (9) mit dem Folgereaktionsprodukt
der 3'-Hydroxyflavanontransformation].
Verglichen mit der Literatur verhält sich die AaeAPO bei der Hydroxylierung von Flavanon (2)
ähnlich wie ganze Zellen/Hyphen von Aspergillus niger oder Penicillium chermesinum, die ebenfalls
zwei Hydroxylierungsprodukte in den Positionen C6 und C4' bildeten [Kostrzewa-Suslow et al.,
2008]. Da beide Gattungen dieser ascomycetalen Schimmelpilze bekanntermaßen über komplexe
Cytochrom-P450-Systeme verfügen und für Ganzzell-Biotransformationen eingesetzt werden
[Yildirim et al., 2010, Bartmańska et al., 2005; Xiao et al., 2011], kann davon ausgegangen werden,
dass P450-Monooxygenasen die Reaktionen katalysierten. Theoretisch kämen auch Peroxygenasen
infrage, da es molekularbiologische Hinweise auf die Existenz dieser Enzyme in beiden Gattungen
60
gibt [Pecyna et al. 2009, Hofrichter et al. 2010]; der proteinchemische Nachweis ist allerdings noch
nicht gelungen.
Auch tierische P450-Enzyme (Kaninchen, CYP2B; Maus, CYP2A5) setzten Flavanon (2) zum 4'Hydroxyflavanon (8) um; beim CYP2A5 entstand zusätzlich 2'-Hydroxyflavanon (6), jedoch kein 6Hydroxyprodukt [Uno et al., 2008]. Naringenin (14) wurde durch pflanzliche Enzyme (Flavanon-3Hydroxylase (EC 1.14.11.9, Dioxygenase), Flavonoid-3'-Hydroxylase (EC 1.14.13.21, P450)) zu
jeweils einem monohydroxylierten Produkt [Position C3 - Dihydrokämpferol, Position C3'Eriodictyol (1)] umgesetzt [Amor et al., 2010a, 2010b]. Eriodictyol (1), das auch im Zuge der
AaeAPO-Katalyse entstand, wurde durch ganze Zellen des Basidiomyceten Phanerochaete
chrysosporium (ebenfall ein P450-reicher Pilz [149 P450s, Syed&Yadav 2012]) und das P450-Enzym
CYP1A aus Rattenleber-Mikrosomen gebildet [Nielsen et al., 1998; Kasai et al., 2009]. Mutanten des
Bakteriums
Streptomyces
lividans,
die
Biphenyl-Dioxygenasegene
aus
Pseudomonas
pseudoalcaligenes enthielten, bevorzugten hingegen die Hydroxylierung in den Positionen C2' oder
C3' [Chun et al., 2003], die von der AaeAPO nicht oder nur in geringem Umfang angegriffen wurden.
Die O-Demethylierung von Methoxygruppen (Etherase-Aktivität der AaeAPO) wurde nicht als
separate Reaktion beobachtet, sondern fand immer parallel zu den Hydroxylierungsreaktionen statt.
Der Umsatz variierte zwischen 32 % und 100 %. Demethylierungsreaktionen wurden an allen hierzu
untersuchten
Flavanonen
beobachtet
[Isosakuranetin
(10),
5-Methoxyflavanon
(11),
6-
Methoxyflavanon (12) und 4'-Methoxyflavanon (13)]. Die demethylierten Verbindungen wurden
parallel monohydroxyliert [Bsp.: 4'-Methoxyflavanon (13), das zu 4'-Hydroxyflavanon (8)
demethyliert und zu 4',6-Dihydroxyflavanon (9) monohydroxyliert wurde].
Aus der Literatur sind einige Beispiele für O-Demethylierungen von Flavanonen bekannt, jedoch
nicht
in
Verbindung
mit
Hydroxylierungsreaktionen.
So
wurden
Sakuranetin
und
7-
Methoxyeriodictyol durch eine P450-Monooxygenase des Zygomyceten Cunninghamella elegans
gespalten und Hesperetin (3) durch CYP1A1 und CYP1B1 aus der bakteriellen Blinddarmflora des
Schweins demethyliert [Labib et al., 2004; Abdel-Rahim et al., 2003].
O-Dealkylierungsreaktionen von Peroxygenasen und P450-Monooxygenasen gehören grundsätzlich
auch zu den Hydroxylierungsreaktion [Ortiz de Montellano & Co, 2005, Kinne et al. 2009, Hofrichter
& Ullrich 2010]. Es wird davon ausgegangen, dass eine solche Etherspaltung zunächst unter
Hydroxylierung eines dem Ether-Sauerstoff benachbarten C-Atoms (R1-O-CH2-R2) erfolgt, was zur
Entstehung eines instabilen Hemiacetals (R1-O-CHOH-R2) führt. In wässriger Umgebung zerfällt
dieses spontan unter Bildung eines Alkohols/Phenols (R1-OH) und eines Aldehyds (R2-CHO); im Fall
der Methoxyflavanone sind Hydroxyflavanone und Formaldehyd entstanden. Letzteres wurde nach
Derivatisierung mit 2,4-Dinitrophenylhydrazon nachgewiesen.
61
4.2.3.2
Enzymatische Transformation von Flavonen
Tabelle 20 listet die Summenformeln, die Molmassen sowie die UV-Vis-Daten der untersuchten
Flavone auf.
Tabelle 20: Ausgewählte Eigenschaften der untersuchten Flavone
Nr. Flavon
Summenformel
C16H12O5
Molmasse
[g/mol]
284,28
UV-Vis – Spektrum
[(LM); λmax [nm]]
(DMF); 212, 267, 330
17 Acacetin
18 Amentoflavon
C30H18O10
538,46
(DMF); 231, 267, 324
19 Apigenin
C15H10O5
270,25
(DMF); 211, 267, 336
20 Apigenin-7-O-glucosid
C21H20O10
432,38
(DMF); 214, 266, 335
21 Apigenin-4',5,7 -
C18H16O5
312,33
(DMF); 215, 264, 322
22 Baicalein
C15H10O5
270,24
(DMF); 216, 275, 322
23 Baicalein-7-methylether
C16H12O5
284,28
(DMF); 278, 320
24 Chrysin
C15H10O4
254,24
(DMF); 211, 268, 313
25 Chrysin-5,7-
C17H14O4
282,30
(DMF); 263, 306
26 Flavon
C15H10O2
222,24
(DMF); 251, 295
27 5-Hydroxyflavon
C15H10O3
238,25
(DMF); 268, 334
28 6-Hydroxyflavon
C15H10O3
238,25
(DMF); 228, 268, 304
29 7-Hydroxyflavon
C15H10O3
238,25
(DMF); 250, 308
30 6,7-Dihydroxyflavon
C15H10O4
254,25
(DMF); 265, 313
31 2',6-Dihydroxyflavon
C15H10O4
254,25
(DMF); 266, 331
32 4',6-Dihydroxyflavon
C15H10O4
254,25
(DMF); 273, 326
33 Luteolin
C15H10O6
286,24
(DMF); 253, 266, 347
34 5-Methoxyflavon
C16H12O3
252,38
(DMF); 264, 324
35 4'-Methoxyflavon
C16H12O3
252,38
(DMF); 219, 253, 317
36 6-Methoxyluteolin
C16H12O7
316,28
(DMF); 214, 271, 344
37 Orientin
C21H20O11
448,38
(DMF); 212, 255, 348
38 Tangeretin
C20H20O7
372,24
(DMF); 272, 322
39 Tectochrysin
C16H12O4
268,28
(DMF); 211, 267
trimethylether
dimethylether
Tabelle 21 fasst die Ergebnisse der Biotransformation der Flavone durch die AaeAPO zusammen.
62
Tabelle 21: Übersicht zur enzymatischen Umsetzung von Flavonen durch die AaeAPO (TC – total
conversion)
Substrat
(Struktur)
Nr.
TC [%]
83
[M+H]+ 301*
0
-
OCH3
17
HO
O
OH O
OH
HO
18
O
OH O
HO
O
OH
O OH
OH
OH
19
HO
O
HO
100
O
HO
OH O
OH O
[M+H]+ 287 / 100n
OH
20
O O
HO
HO
OH
O
OH
6
[M+H]+ 449*
[M+H]+ 449*
OH O
OCH3
21
H3CO
O
H3CO
22
23
24
O
0
-
0
-
OH O
H3CO
HO
[M+H]+ 299*
O
HO
HO
40
O
OH O
HO
O
HO
46
HO
OH O
25
H3CO
H3CO
O
O
O
OH O
[M+H]+ 271 / 46
4
[M+H]+ 299*
[M+H]+ 299*
63
Substrat
(Struktur)
Nr.
O
26
13
O
HO
[M+H]+ 239*
O
O
+
[M+H]+ 239*
[M+H] 239 / 4
O
O
27
OH
O
O
TC [%]
40
HO
OH O
28
29
[M+H]+ 255n
O
O
HO
30
O
HO
HO
[M+H]+ 255*
OH O
[M+H]+ 255n
31
HO
43
HO
O
+
[M+H] 255 / 43
O
HO
O
HO
O
O
30
OH O
0
-
O
O
OH
HO
22
[M+H]+ 271*
[M+H]+ 271*
[M+H]+ 271*
30
[M+H]+ 271*
[M+H]+ 271*
[M+H]+ 271*
O
OH
O
32
HO
O
OH
OH
33
HO
O
OH O
OH
HO
95
HO
O
OH O
[M+H]+ 303n
OH
64
Substrat
(Struktur)
Nr.
O
34
TC [%]
5
[M+H]+ 269*
[M+H]+ 269*
[M+H]+ 269*
[M+H]+ 269*
[M+H]+ 269*
H3CO O
OH
OCH 3
O
35
O
47
O
O
[M+H]+ 239*
OH
36
HO
O
H3CO
HO
HO
37
OH
0
-
10
-
25
[M+H]+ 359*
OH O
OH
OH
O
OH
HO
O
OH
OH O
38
39
OCH3
H3CO
H3CO
O
H3CO
H3CO
O
H3CO
O
OH O
HO
88
O
OH O
[M+H]+ 255 / 1
n
Identifizierung mittels NMR
Flavone unterscheiden sich strukturell von Flavanonen durch die Doppelbindung zwischen den
Atomen C2 und C3 (2-Phenylchromone). Im Rahmen der Dissertation wurden Verbindungen aus
dieser Gruppe untersucht, die mit bis zu fünf Hydroxygruppen substituiert waren. Darunter befanden
sich ausschließlich hydroxylierte, O- und C-glykosylierte sowie vollständig oder teilweise
methoxylierte Flavone. Auch im Fall der Flavone konnten anhand der Massenspektren zwei
Reaktionstypen – Hydroxylierung und Demethylierung – unterschieden werden.
Der Umsatz betrug für die Hydroxylierungsreaktionen zwischen 40 % und 100 % (mit Ausnahme des
schlecht löslichen Flavons). Die ermittelten Ergebnisse erlauben es wiederum Substitutionsmuster
abzuleiten, die die Transformationen positiv oder negativ beeinflussen oder sogar gänzlich verhindern.
65
So wurden Verbindungen, die am Chromen-4-on drei Substituenten (C5, C6, C7) trugen [Hydroxyoder Methoxygruppen, (22), (23), (36), wobei ein Substituent in Position C6 sitzen musste], nicht
umgesetzt.
Besonders
hohe
Substratumsätze
wurden
für
Verbindungen
registriert,
die
folgendes
Hydroxylierungsmuster aufwiesen: C5, C7 und C4' [(19): 100%, (33): 95%]. Waren die
Hydroxygruppen an diesen Positionen methyliert, sank der Substratumsatz [(17): 83%, (21): 40%];
besonders deutlich wurde dieses Phänomän im Fall der Verbindungen [(27): 40 %, (34): 5%].
Die in Tabelle 21 formelmäßig abgebildeten Produkte stellen ausschließlich die zugehörigen
monohydroxylierten Produkte dar. Die Substanzen Acacetin (17), Apigenin (19), Chrysin (24), 5Hydroxyflavon (27), 7-Hydroxyflavon (29) sowie Luteolin (33) wurden jeweils selektiv zu einem C6hydroxylierten Reaktionsprodukt umgesetzt. Somit kann die Position C6 auch als die bevorzugte
Hydroxylierungsstelle der Flavone angenommen werden. Im Zuge der Umsetzung der übrigen
Flavon-Substrate entstanden mehrere monohydroxylierte Produkte, deren Struktur in den meisten
Fällen allerdings nicht ermittelt werden konnte. Es wird hier aber ebenfalls von einer bevorzugten
Hydroxylierung der C6-Position ausgegangen, gefolgt von der Position C4', was anhand der
unsubstituierten Grundstruktur des Flavons (26) bestätigt werden konnte.
In der Literatur wurden in diesem Zusammenhang nur wenige Biotransformationen von Flavonen in
die Hydroxylierungsposition C6 beschrieben. So berichten Androutsopoulos et al. über die selektive
Hydroxylierung von Chrysin (24) zu Baicalein (22) durch menschliche P450-Monooxygenasen
(CYP1B1 und CYP1A1) [Androutsopoulos et al., 2009; Righi et al., 2010].
Die Mehrzahl der in der Literatur beschriebenen enzymatischen Hydroxylierungsreaktionen führten zu
4'-monohydroxylierten Produkten, wie zum Beispiel die Reaktion von Chrysin zu Apigenin [Griffiths
& Smith, 1972], von Baicalein zu Scutellarein [Kostrzewa-Suslow et al., 2007] und von Flavon zu
4'-Hydroxyflavon [Udupa & Chadha, 1978]. Weitere Beispiele finden sich bei [Ibrahim & Abul-Hajj,
1990b] und [Herath et al., 2008].
In der Literatur wurden weiterhin Beispiele für die Hydroxylierung der C3'-Position (Flavon → 3'Hydroxyflavon, PcCYP142c, PcCYP50c [Kasai et al., 2010], Apigenin → Luteolin, CYP1A [Nielsen
et al., 1998]) sowie der C2'-Position (6-Hydroxyflavon → 2',6-Dihydroxyflavon, gemischter
Biphenyl-Dioxygenase-Gencluster bphA1(2072)A2A3A4 von Pseudomonas pseudolacaligenes
exprimiert in Streptomyces lividans [Chun et al., 2003]) beschrieben. In einigen Fällen wurden auch
mehrere Produkte gebildet oder das Substrat mehrfach hydroxyliert [Ibrahim & Abul-Hajj, 1990;
Chun et al., 2003; Shindo et al. 2003, Kagami et al., 2008].
In Abhängikeit vom hydroxylierenden Enzym beeinflusst das Substitutionsmuster der Flavone
offensichtlich in unterschiedlicher Weise die Aktivität. Der Umsatz von 6-Hydroxyflavon (28) durch
die AaeAPO belief sich auf 30 %, ganze Zellen von Streptomyces fulvissimus setzten hingegen unter
vergleichbaren Bedingungen 60 % des Substrats um [Ibrahim & Abul-Hajj, 1990b]. Die Umsetzung
von Baicalein (22), dessen Positionen C5, C6 und C7 besetzt sind, wurde durch die AaeAPO
66
vollständig unterbunden, während die Verbindung von Penicillium chrysogenum (zu 5,7-Dihydroxy-6methoxyflavon und 5,7-Dihydroxy-4',6-dimethoxyflavon) und Chaetomium sp. (zu 5,7-Dihydroxy-6methoxyflavon) problemlos oxidiert wurde [Kostrzewa-Suslow et al., 2007].
Eine Demethylierung von Methoxygruppen durch die AaeAPO wurde für folgende Verbindungen
beobachtet: Apigenintrimethylether (21), Tangeretin (38) und Tectochrysin (39). Der Umsatz variierte
zwischen 25 % und 88 % und es wurde jeweils nur eine Methoxygruppe demethyliert; eine
gleichzeitige Hydroxylierung der Verbindungen (21), (38) und (39), wie im Fall der Flavanone, fand
nicht statt. Ein solches Reaktionsverhalten wurde dagegen für 4'-Methoxyflavon (35) gefunden. Die
AaeAPO setzte die Verbindung (35) unter Demethylierung zu 4'-Hydroxyflavon und zwei
unterschiedlich monohydroxylierten 4'-Methoxyflavonen um. Aufgrund eines übereinstimmenden
UV-Vis-Spektrums [mit 4',6-Dihydroxyflavon (32)] konnte eines dieser Produkte als 4'-Methoxy-6hydroxyflavon angenommen werden.
Laut Literatur können Flavone, die in den Positionen C2', C6 [Gallagher et al., 1953] und C5 [Horie et
al., 1997] methoxyliert sind, chemisch selektiv demethyliert werden. Biotechnologisch scheinen die
Positionen C4' und C7 durch P450-Enzyme [Nielsen et al., 2000] und die C7-Position durch ganze
Zellen von Aspergillus flavus [Herath et al., 2009] bevorzugt zu werden.
4.2.3.3
Enzymatische Transformation von Flavonolen
Der Tabelle 22 sind die Summenformeln, die Molmassen sowie die UV-Vis-Daten der untersuchten
Flavonole zu entnehmen.
Tabelle 22: Ausgewählte Eigenschaften der untersuchten Flavonole
Nr. Flavonol
Summenformel
C15H10O3
Molmasse
[g/mol]
238,25
UV-Vis–Spektrum [(LM);
[nm]]
(DMF); 242, 306, 342
40 3-Hydroxyflavon
41 3,6-Dihydroxyflavon
C15H10O4
254,25
(DMF); 232, 328
42 Isorhamnetin
C16H12O7
316,28
(DMF); 203, 254, 371
43 Kämpferol
C15H10O6
286,25
(DMF); 266, 368
44 Myricetin
C15H10O8
318,25
(DMF); 212, 253, 372
45 Quercetagetin
C15H10O8
318,25
(DMF); 259, 360
46 Quercetin
C15H10O7
302,24
(DMF); 208, 254, 371
47 Quercetin-3',4',3,5,7-
C20H20O7
372,38
(DMF); 215, 248, 340
C27H30O16
610,53
(DMF); 256, 355
λmax
pentamethylether
48 Rutin
Tabelle 23 fasst die Ergebnisse zur AaeAPO-katalysierten Biotransformation von Flavonolen in einer
Übersicht zusammen.
67
Tabelle 23: Übersicht zur enzymatischen Umsetzung von Flavonolen durch die AaeAPO (TC – total
conversion)
Substrat
(Struktur)
Nr.
O
40
OH
O
O
41
HO
0
-
28
OH
O
TC [%]
[M+H]+ 271*
[M+H]+ 271*
OH
HO
42
O
OH O
OCH 3
71
[M+H]+ 333*
47
[M+H]+ 303*
60
[M+H]+ 335*
0
-
OH
OH
HO
43
O
OH
OH O
OH
HO
44
O
OH
OH
OH
OH O
OH
HO
45
O
HO
OH
OH
OH O
OH
OH
HO
46
O
OH
HO
94
OH
OH O
HO
O
OH O
OH
OH
[M+H]+ 319 / 20
OCH3
47
H3CO
O
OCH3
OCH3
H3CO O
4
OH
HO
48
O
OH O
OH
O
HO
O
OH
O O
HO
OH
OH
OH
0
[M+H]+ 359*
[M+H]+ 359*
68
Flavonole sind durch die substituierte C3-Position (Hydroxy- oder Methoxygruppen, O-Glykoside)
und die Doppelbindung zwischen dem C2- und C3-Atom gekennzeichnet (d. h. es handelt sich um C3substituierte Flavone). Im Rahmen der Dissertation wurden Vertreter dieser Gruppe von Flavonoiden
untersucht, die bis zu sechs Hydroxygruppen im Molekül enthielten, sowie methoxylierte und
O-glykosylierte Verbindungen. Auf Basis der Massenspektren der Flavonol-Produkte konnten wie im
Fall der Flavanone und Flavone zwei Reaktionstypen unterschieden werden – Hydroxylierung und
Demethylierung.
Die Umsätze für die Hydroxylierungsreaktionen erreichten, in Abwesenheit störender Einflüsse, Werte
zwischen (47 und 94) %; Ausnahme bildete der Grundkörper 3-Hydroxyflavon (40), der nicht
umgesetzt wurde. Zu den strukturelle Eigenschaften, die die Transformationen negativ beeinflussten
oder vollständig unterbanden, gehörten das Vorhandensein einer Hydroxygruppe in C6-Position [vgl.
Quercetagetin (45), 3,6-Dihydroxyflavon (41)] oder die sterische Blockierung durch Zuckerreste
[Rutin (48)]. Die Hydroxylierung wurde in Gegenwart einer Methoxygruppe in der Position C3' nicht
gestört [siehe Isorhamnetin (42)].
Die identifizierten Produkte stellen ausschliesslich korrespondierende monohydroxylierte Substrate
dar. Selektiv wurden dabei die Substanzen Isorhamnetin (42), Kämpferol (43), Myricetin (44) sowie
Quercetin (46) zu jeweils einem Reaktionsprodukt umgesetzt. Quercetin (46) wurde durch
Hydroxylierung der C6-Position zum Quercetagetin (45) umgesetzt (Ausbeute 20 %). Auch im Fall
der drei anderen Verbindungen wird von einer Oxidation der Position C6 ausgegangen, weil diese
ähnliche Hydroxylierungsmuster und Umsetzungsraten wie Quercetin (46) aufwiesen. Darüber hinaus
ergab der Vergleich der UV-Vis-Spektren von Quercetagetin (45) und monohydroxyliertem
Isorhamnetin (42) eine hohe Ähnlichkeit (Abbildung 25).
A
200
250
300
350
400
Wellenlänge [nm]
450
Abbildung 25: Vergleich der UV-Vis-Spektren von Quercetagetin (durchgängige Linie) mit dem
gefundenen monohydroxylierten Isorhamnetin (gestrichelte Linie).
Die Umsetzung von 3,6-Dihydroxyflavon (41) durch die AaeAPO ergab zwei monohydroxylierte
Produkte unbekannter Struktur; das Pentahydroxyflavonol (45) wurde wahrscheinlich aufgrund der
besetzten 6-Position und/oder seiner hohen Polarität nicht umgesetzt. Die Unfähigkeit der AaeAPO
69
den Flavonol-Grundkörper [3-Hydroxyflavon (40)] anzugreifen, bleibt mysteriös. Inwieweit die
Struktur unter Bindung an das Häm-Eisen als Inhibitor wirkt (ähnlich wie DMSO oder Coumarin
[Barkova 2009 – nicht veröffentlicht (Kurzzeit&Langzeitversuche); Poraj-Kobielska, 2012]), bleibt in
zukünftigen Untersuchungen zu klären.
Aus der Literatur sind zahlreiche enzymatische Umsetzungen von Flavonolen bekannt. Morales et al.
beschrieben die Umsetzung von Myricetin (44) durch eine hypodermale Peroxidase Isoenzym B5 vom
Vitis vinifera; die Identität des Produktes blieb allerding ungeklärt [Morales et al., 1993].
Interessanterweise konnten P450-Enzyme aus Lebermikrosomen von Ratten Isorhamnetin (42),
Myricetin (44) und Quercetin (46) in vitro nicht umsetzen (möglicherweise aufgrund der gleichzeitig
besetzten Positionen C3' und C4'). Dagegen wurde Kämpferol (43) zu 12 % in Quercetin (46)
umgewandelt [Nielsen et al., 1998].
Quercetin wurde als Modellverbindung hinsichtlich möglicher Biotransformationen durch
Mikroorganismen und Enzyme besonders intensiv untersucht. Meerrettichperoxidase, z. B., bildete in
Gegenwart von Glutathion (GSH) mit Quercetin 6- oder 8-Glutathionylquercetin (in Abwesenheit von
GSH entstanden ca. 20 Produkte, darunter aber kein Quercetagetin (45) [Awad, 2000]). Das
grampositive Bakterium Streptomyces griseus bewirkte sowohl eine Methylierung (in Position C3'
zum Isorhamnetin (42) bzw. am C3'/C4' zum Dillenetin) als auch eine Hydroxylierung des Quercetins
(46) [in Position C5' zum Myricetin (44), in Position C8 zum Gossypetin]. Weiterhin ist die
Methylierung von Gossypetin zum 8-Methoxyquercetin bekannt [Hosny, 2001]. Die anaerobe
Umsetzung von Quercetin (46), Rutin (48) oder Kämpferol (43) durch Eubacterium ramulus lieferte
nach Ringöffnung phenolische Säuren (3,4-Dihydroxyphenylessigsäure aus Quercetin und Rutin, 4Hydroxyphenylessigsäure aus Kämpferol) [Schneider & Blaut, 2000].
Methoxylierte Flavonole wurden wie andere Methoxyflavonoide (s. oben) durch die AaeAPO
demethyliert. So wurde das vollständig methoxylierte Flavonoid Quercetinpentamethylether (47)
zu zwei monodemethylierten Produkten umgewandelt (Monohydroxyquercetintetramethylether).
Bei der Umsetzung von Isorhamnetin (42) entstand hingegen nur ein Produkt mit einer Masse [M+H]+
von 333. Diese entspricht der Isorhamnetin-Masse [M+H]+ 317 plus 16, was somit auf ein
monohydroxyliertes Produkt hindeutet. Wenn Isorhamnetin einfach demethyliert (317 minus 14) und
anschließend doppelt hydroxyliert (plus 32) würde, entstünde ein Produkt mit der Masse [M+H]+ 335.
Von einer Monodemethylierung von Isorhamnetin kann folglich nicht ausgegangen werden.
In der Literatur wurden keine vergleichbaren Reaktionen gefunden.
4.2.3.4
Enzymatische Transformation von Isoflavonen
Tabelle 24 listet die Summenformeln, die Molmassen sowie die UV-Vis-Daten der untersuchten
Isoflavone auf.
70
Tabelle 24: Einige Stoffeigenschaften der Isoflavone
Nr. Isoflavon
Summenformel
C16H12O5
Molmasse
[g/mol]
284,26
UV-Vis – Spektrum
[(LM); λmax [nm]]
(DMF); 261, 325
49 Biochanin A
50 Daidzein
C15H10O4
254,24
(DMF); 248, 300
51 Demethyltexasin
C15H10O5
270,24
(DMF); 257, 323
52 Formononetin
C16H12O4
268,26
(DMF); 249, 300
53 Genistein
C15H10O5
270,24
(DMF); 211, 259
54 Genistein-4',7-
C17H14O5
298,30
(DMF); 261
55 Genistin
C21H20O10
432,38
(DMF); 209, 262, 325
56 Glycitein
C16H12O5
284,27
(DMF); 260, 320
57 5-Methyl-7-
C17H14O3
266,39
(DMF); 251
dimethylether
methoxyisoflavon
Tabelle 25 fasst die Ergebnisse zur Biotransformation von Isoflavonen durch die AaeAPO zusammen.
Tabelle 25: Übersicht zur enzymatischen Umsetzung von Isoflavonen durch die AaeAPO (TC – total
conversion)
Substrat
(Struktur)
Nr.
HO
49
[M+H] 301*
HO
HO
52
287*
[M+H] 271 / 24
HO
O
HO
OH
O
OH
+
[M+H] 271 / 89
O
0
O
-
OH
HO
O
O
HO
OH
+
89
HO
OH O
OCH3
O
O
[M+H]+
+
69
50
51
HO
O
O
OH O
HO
TC
[%]
50
OCH3
O
O
+
HO
HO
OH
[M+H] 255 / 25
O
[M+H]+
O
OH
+
[M+H] 271 / 3
O
90
53
OH O
OH
[M+H]+ 287*
[M+H]+ 287*
285*
71
Substrat
(Struktur)
Nr.
H3CO
54
TC
[%]
HO
O
OCH3
O
O
O
HO
55 HO
OH
OH O
OH
56
H3CO
H3CO
O
86
OH O
HO
OH O
OH
[M+H]+
285*
+
[M+H] 271 / 1
[M+H]+ 449*
10
OH
HO
O
O
HO
35
O
[M+H]+ 301*
OH
O
OH
[M+H]+ 271/ 14
O
57
[M+H]+ 283*
31
O
Isoflavone sind einerseits durch einen Phenylring am C3-Atom des bicyclischen Rings und
andererseits durch die Doppelbindung zwischen dem C2 und C3 charakterisiert und werden deshalb
als 3-Phenylchromone bezeichnet. Im Rahmen der Dissertation wurden Vertreter dieser Gruppe von
Flavonoiden untersucht, die bis zu drei Hydroxygruppen und/oder Methoxy-, Methylgruppen oder
Zuckerreste enthielten. Auch im Zuge der enzymatischen Umsetzung von Isoflavonen durch die
AaeAPO wurden zwei Reaktionstypen beobachtet – Hydroxylierung und Demethylierung.
Die Umsätze für die Hydroxylierungsreaktionen betrugen, in Abwesenheit störender Einflüsse, bis zu
90 %. Generell stellen Isoflavone gute bis sehr gute Substrate für die AaeAPO dar; Details sind der
Tabelle 25 zu entnehmen.
Zu den strukturellen Charakteristika, die die Transformationen negativ beeinflussen, zählen die
sterische Hinderung durch Zucker [Genistein-7-O-glucosid (55)] sowie die Anwesenheit einer
Methylgruppe in C5-Position, d. h. in ortho-Stellung zur bevorzugten Hydroxylierungsposition C6 [5Methyl-7-methoxyisoflavon (57)].
Die Hydroxylierung wurde durch das Vorhandensein einer Methoxygruppe in C4'-Position nicht
gestört [Biochanin A (49)]. Die identifizierten Produkte stellen ausschliesslich zugehörige
monohydroxylierte Verbindungen dar. Selektiv wurden dabei die Substanzen Daidzein (50), Genistin
(55)
sowie
5-Methyl-7-methoxyisoflavon
(57)
zu
jeweils
einem
monohydroxylierten
Reaktionsprodukt umgesetzt [Daidzein (50) → Demethyltexasin (51); Ausbeute 89 %]. Während der
Umsetzung von Genistein (53) wurden zwei monohydroxylierte Produkte beobachtet. Auf Basis von
Literaturdaten (UV-Vis-Spektren) [Kulling et al., 2000], wird von einer bevorzugten Hydroxylierung
der C6-Position ausgegangen.
72
Verglichen mit der Literatur verlief die Hydroxylierung von Isoflavonen durch die grampositiven
Bakterien Nocardia farcinica und Streptomyces lincolnensis in ähnlicher Weise und lieferte selektiv in
C6-Position hydroxylierte Einzelprodukte [Park et al., 2008]. Im Unterschied hierzu wurden Daidzein
(50) und Genistein (53) durch Streptomyces avermitilis oder rekombinante P450-Enzyme (CYP1A1,
CYP1A2) regioselektiv in Position C3' [Pandey et al., 2010; Hu et al., 2009] oder durch die Isoflavon2'-Hydroxylase (CYP81C1) in Position C2' [Akashi et al., 1998] hydroxyliert.
Die AaeAPO war in der Lage, Isoflavone nicht nur zu hydroxylieren, sondern auch
Methoxyisoflavone zu demethylieren. Die meisten der untersuchten methoxylierten Isoflavone
unterlagen gleichzeitig beiden Reaktionstypen. Die Umsätze variierten zwischen 50 % und 86 %.
Die AaeAPO demethylierte die Verbindungen Formononetin (52) und Biochanin A (49) zum Daidzein
(50) bzw. Genistein (53) (Ausbeute ca. 25 %), die wiederum monohydroxyliert werden konnten
[Demethyltexasin (51): 3 % bzw. 6-Hydroxygenistein]. Gleichzeitig wurden Formononetin (52) und
Biochanin A (49) auch zum Texasin [Dyke et al., 1964] bzw. mono-Hydroxybiochanin A umgesetzt
[Tolleson et al., 2002]. Genisteindimethylether (54) wurde auf die gleiche Weise wie Formononetin
(52) entsprechend der Reaktionsfolge Demethylierung und nachfolgende Hydroxylierung umgesetzt.
Anstelle einer paralell erfolgenden Monohydroxylierung wurde aber das erste Reaktionsprodukt
nochmals unter Bildung von Genistein (53) demethyliert (Ausbeute 1 %). Die Verbindung Glycitein
(56) wurde jedoch nur demethyliert zu Demethyltexasin (51); Ausbeute 14 %.
In der Literatur findet sich eine Reihe von Biotransformationen, die Ähnlichkeiten mit der AaeAPOUmsetzung von Isoflavonen aufweisen. Menschliche Mikrosomen der Leber setzten beispielsweise
Formononetin (52) in vitro zu vier Produkten um, wobei Daidzein (50) und 6-Hydroxyformononetin
den AaeAPO-Produkten entsprechen [Roberts et al., 2004]. Ähnliches gilt für Biochanin A (49) und
seine Produkte Genistein (53) und 6-Hydroxybiochanin A. Die Biotransformation von Glycitein (56)
erfolgte in Eubacterium limosum [Hur & Rafii, 2000], Arthrobacter sp., Brevibaterium epidermis
sowie Micrococcus luteus [Klus & Barz, 1993; Klus & Barz, 1995] in analoger Weise zur ODemethylierung durch die AaeAPO (Produkt Demethyltexasin). Generell weist die enzymatische
Umsetzung von Isoflavonen viele Gemeinsamkeiten bei Bakterien und Pilzen auf.
73
4.2.4 Strukturaufklärung
4.2.4.1
Referenzverbindungen
Aufgrund verfügbarer Referenzverbindungen konnte das Produktspektrum der AaeAPO-katalysierten
Umsetzungen von Flavonoiden in weiten Teilen ermittelt werden. Die Aufklärung aller Produkte
gelang für die Oxidation von Daidzein, Chrysin, Flavanon, Glycitein, Tectochrysin und Quercetin.
Nachfolgend sind die entsprechenden Reaktionen formelmäßig dargestellt.
HO
H2 O2
AaeAPO
O
HO
H2 O2
AaeAPO
O
O
Daidzein
O
HO
O
OH
O
OH
Demethyltexasin
OH
OH
H2 O2
OH AaeAPO
HO
O
OH
OH O
Quercetagetin
HO
H2 O2
AaeAPO
O
O
H3CO
H2 O2
HO
AaeAPO
O
O
O
4`-Hydroxyflavanon
O
OH O
Chrysin
H2 O2
HO
AaeAPO
HO
O
O
Glycitein
+
O
6-Hydroxyflavanon
OH O
Tectochrysin
HO
OH
HO
O
Flavanon
H3CO
OH O
Baicalein
HO
OH
OH O
Quercetin
2
O
HO
OH O
Chrysin
HO
HO
OH
O
O
OH
Demethyltexasin
Abbildung 26: Auf Basis von Referenzsubstanzen identifizierte Wege der Oxidation von Flavonoiden
durch die AaeAPO
Im Fall der Umsetzung von Formononetin und Biochanin A konnten auf Grundlage von analytischen
und Literaturdaten (Ausschlussmethode; MS- u. UV-Vis-Spektren, Retentionszeiten) klare Indizien
für die Struktur der unbekannten Produkte und somit für die ablaufenden Reaktionfolgen gefunden
werden [Tolleson, 2002; Dyke, 1964; Roberts, 2004].
74
HO
H2 O2
HO
AaeAPO
O
O
OCH3
Formononetin
H2 O2
AaeAPO HO
HO
HO
H2 O2
HO
AaeAPO
O
OH O
OCH3
Biochanin A
H2 O2
AaeAPO HO
HO
O
O
Daidzein
H2 O2
HO
AaeAPO
HO
OH
O
O
OH
Demethyltexasin
O
O
Texasin
O
OH O
Genistein
OCH3
H2 O2
HO
AaeAPO
HO
O
OH O
OH
6-Hydroxygenistein
OH
O
OH O
OCH3
6-Hydroxybiochanin A
Abbildung 27: Enzymatische Umsetzungen (inklusive Folgereaktionen) für die Isoflavone Formononetin
und Biochanin A.
In ähnlicher Weise konnten die Produkte 4'-Hydroxyflavon und 3',4',6-Trihydroxyflavanon deduziert
werden. 4'-Hydroxyflavon entstand sowohl im Zuge der Flavonhydroxylierung als auch während der
Demethylierung von 4'-Methoxyflavon (gleiche MS- u. UV-Vis-Spektren, Retentionszeiten).
3',4',6-Trihydroxyflavanon wurde jeweils ausgehend von den Substraten 3'-Hydroxyflavanon und
4',6-Dihydroxyflavanon gebildet.
4.2.4.2
Ergebnisse der NMR-Analysen
Um die Annahmen zu den von der AaeAPO bevorzugten Hydroxylierungspositionen bei der
Flavonoidumsetzung weiter zu stützen, wurden ausgewählte Produkte, die nicht als Standards
verfügbar waren, strukturell aufgeklärt. Hierzu wurden NMR-Studien zu den Produkten fünf
verschiedener
Flavonoid-Oxidationen
durchgeführt
(Apigenin,
Luteolin,
7-Hydroxyflavanon,
6- Hydroxyflavon, 7-Hydroxyflavon).
Zunächst mussten die Produkte in ausreichender Menge hergestellt werden. Um dabei den
Enzymverbrauch zu minimieren, wurden semikontinuierliche Versuche durchgeführt, in deren
Verlauf,
neben
kontinuierlicher
Wasserstoffperoxiddosierung
(Spritzenpumpen),
eine
diskontinuierliche Zugabe von Substrat und Ascorbinsäure erfolgte. Dieser experimentelle Ansatz
wurde in einem ersten Schritt in kleinerem Maßstab getestet; nach positivem Verlauf wurde ein Scaleup realisiert. Im zweiten Schritt wurde die Reaktion gezielt unterbrochen, damit das primäre
75
Reaktionsprodukt vom Enzym nicht weiter umgesetzt wurde. Dies erfolgte durch Zugabe einer
50 %igen TCA-Lösung (Endkonzentration 5 % TCA).
Im dritten Schritt wurde das Produkt von der Reaktionslösung abgetrennt. Zuerst wurde das ProduktSubstrat-Gemisch mittels Festphasenextraktion (SPE) angereichert und in Methanol überführt. Die
Produktreinigung erfolgte mittels präparativer HPLC. Die so gewonnenen Produktfraktionen wurden
mittels SPE erneut konzentriert, das Produkt wiederum in Methanol überführt und bis zur Trockne
eingeengt. Die Festsubstanz wurde in deuteriertem DMSO-d6 gelöst und mittels NMR analysiert.
1) Semikontinuierliche Versuche
Die Versuche erfolgten zuerst im kleinen Maßstab sowohl unter einmaliger als auch kontinuierlicher
Cosubstratzudosierung.
a) Spritzenpumpenversuche
Der Reaktionsansatz nach dem unten aufgeführten Pipettierschema vorbereitet (Analytik: HPLC-MS,
Methode 2).
Tabelle 26: Versuchsschema zum Spritzenpumpenversuch unter semikontinuierlicher Zudosierung von
Substrat und Vitamin C (in 21 % v/v DMF)
Substanz
Konzentration
(Stammlösung)
100 mM
PipettierVolumen [μl]
500
320 U/ml
5
Flavonoid-Standard
50 mM
10
Vitamin C
40 mM
100
DMF
100 %
200
H2O
100 %
25
AaeAPO
Die Spritzenpumpe dosierte 20 μl 6,25 mM H2O2 pro Stunde zum Reaktionsansatz. Die Gesamtdauer
der Reaktion betrug je nach Substrat-Produkt-Verhältnis 42 h (Luteolin), 79 h (Apigenin), 133 h (7Hydroxyflavanon), 100 h (7-Hydroxyflavon) und 162 h (6-Hydroxyflavon). Abbildung 28 zeigt
beispielhaft den zeitlichen Verlauf der Umsetzung von Apigenin.
Der Abbildung 28 sind zwei zeitliche Maxima der Produktbildung zu entnehmen. Das erste Maximum
wurde nach 16 Stunden Reaktionszeit [d. h. nach Zudosierung von 10 µl Apigenin-Stammlösung (50
mM) und Erreichen einer Konzentration von 0,47 mM im Ansatz] erreicht. Das zweite Maximum
ergab sich nach einer Gesamtzugabe von 40 µl Apigenin (1,05 mM im Ansatz) nach 67 Stunden. Im
Fall von Luteolin wurde das Maximum an gebildetem Produkt nach 14 Stunden und einer
Gesamtzugabe von 20 μl (0,89 mM im Ansatz) erreicht.
7
16
6
14
5
12
10
4
8
3
6
2
4
1
2
0
0
100
0
20
40
60
80
Apigeninzugabe
Volumen [ul]
Peakfläche bei 360 nm
[AU*s] m
76
Peakfläche
Apigenin
[AU*s]
Peakfläche
Produkt [AU*s]
Zeit [h]
Abbildung 28: Zeitlicher
Versuchsführung
Verlauf
der
Umsetzung
von
Apigenin
unter
semikontinuierlicher
Die Produktbildung erreichte während der Umsetzung von 7-Hydroxyflavanon nach 34 Stunden
(Gesamtzugabe an Substrat 20 μl; 0,75 mM im Ansatz) ein Plateau, das bis zur Stunde 48 anhielt.
Parallel wurde der gleiche Versuch unter zusätzlicher diskontinuierlicher Vitamin-C-Zugabe
durchgeführt. Nach 64 Stunden (Gesamtzugabe an Substrat 30 μl; 0,68 mM im Ansatz und 300 μl
40 mM Vitamin C; 5,48 mM im Ansatz) wurde ein Plateau erreicht, das bis zur Stunde 101
(Gesamtzugabe an Substrat 35 μl; 0,61 mM im Ansatz und 400 μl Vitamin C, 5,57 mM im Ansatz)
anhielt. Dieses Plateau entsprach wiederum einem Maximum an Produkt. Die Produktausbeute konnte
auf diese Weise um 75 % gesteigert werden. Die weiteren Versuche wurden demensprechend unter
diskontinuierlicher Vitamin-C-Zugabe durchgeführt.
Im Fall der Verbindung 7-Hydroxyflavon wurde das Produktmaximum nach 96 Stunden erreicht
(Gesamtzugabe an Substrat 30 μl; 0,55 mM im Ansatz und 500 μl Vitamin C; 7,37 mM im Ansatz),
für 6-Hydroxyflavon nach 160 Stunden (Gesamtzugabe an Substrat 30 μl; 0,39 mM im Ansatz und
550 μl mM Vitamin C; 5,69 mM im Ansatz).
b) Langzeitversuche
Die Versuche unter einmaliger Cosubstratzugabe (H2O2) wurden nach dem folgenden Pipettierschema
vorbereitet.
Tabelle 27: Versuchsschema: semikontinuierliche Langzeitversuche (Vitamin C, 21 % (v/v) DMF)
Substanz
Konzentration
Stammlösung
100 mM
500
EndKonzentration
50 mM
77
Substanz
Konzentration
Stammlösung
380 U/ml
5
EndKonzentration
1,9 U/ml
H2O2
10 mM
100
1 mM
Flavonoid-Standard
50 mM
10
0,5 mM
Vitamin C
40 mM
100
4 mM
Wasser
100 %
85
79 % (v/v)
DMF
100 %
200
(20+1) % (v/v)
AaeAPO
Eine semikontinuierliche Prozessführung konnte im Fall der Langzeitversuche nicht erfolgreich
realisiert werden. Im Vergleich zu den Spritzenpumpenversuchen wurden im Zuge der Umsetzung von
Apigenin, Luteolin und 7-Hydroxyflavanon nur 33 %, 50 % bzw. 77 % Ausbeute erzielt. Überdies
wurde die optimale Produktbildung für Apigenin und Luteolin bereits nach der erstmaligen
Substratzugabe erreicht, so dass keine semikontinuierliche Versuchsführung möglich war. Im Fall von
7-Hydroxyflavanon funktionierte zwar das Konzept, die Produktausbeuten waren aber dennoch
geringer als in den Spritzenpumpenversuchen. Aus diesem Grund wurde die Produktbildung für
weitere Flavonoide (6-Hydroxyflavon, 7-Hydroxyflavon) nicht in Langzeitversuchen untersucht.
2) SPE – Kartuschenauswahl
Zunächst wurde substratspezifisch die geeignetste Festphase ermittelt. Die Tabelle 28 enthält eine
Übersicht der untersuchten Festphasen von drei unterschiedlichen Herstellern (Varian, Phenomenex,
Macherey-Nagel).
Tabelle 28: Getestete SPE-Kartuschen
K1 Varian BOND Elut PPL 50 mg / 1 ml
K2 Varian BOND Elut C18 100 mg / 1 ml
K3 Varian BOND Elut Plexa 60 mg / 1 ml
K4 Phenomenex Strata-X 33u Polymeric Reversed Phase 100 mg / 3 ml
K5 Macherey-Nagel Chromabond PA6 500 mg / 15 ml
K6 Macherey-Nagel Chromafix PA6 620 mg / x ml
Die Versuchslösungen wurden mit Hilfe gängiger Einsätze (Versuchsschema 5) vorbereitet, um auch
die Produktretention/-elution beobachten zu können. Weiterhin wurde sowohl auf den pH (eingestellt
mit TCA) als auch auf die DMF-Konzentration geachtet, um die Bedingungen der geplanten
Flavonoid-Umsetzungen möglichst versuchsnah nachzustellen. Die Ergebnisse sind der Tabelle 29 zu
entnehmen.
78
Tabelle 29: SPE-Kartuschenauswahl in Bezug auf die Wiederfindung der ausgewählten Flavonoide (die
Kontrollen representieren die Anfangskonzentration; K1-K6 SPE-Kartuschen laut Tabelle 28)
Konzentration [mmol/ml] oder Extinktion der Produkte [mAU]
Apigenin
Kontrolle
K1Waschen
K1 Elution
K2Waschen
K2 Elution
K3Waschen
K3 Elution
K4Waschen
K4 Elution
K5Waschen
K5 Elution
K6Waschen
K6 Elution
0,50
0
0,39
0
0,50
0
0,42
0
0,32
0
0,20
0
0,27
Monohydroxyapigenin
(bei 360 nm)
45
5
33
5
40
5
39
0
11
0
0
0
0
Luteolin
0,31
0,02
0,29
0,10
0,18
0,01
0,30
0
0,23
0
0,22
0
0,18
Monohydroxyluteolin
(bei 360 nm)
14
8
0
14
0
11
0
0
7 (P2 23)
0
0 (P2 20)
0
7 (P2 19)
7-Hydroxyflavanon
0,36
0
0,35
0
0,33
0
0,33
0
0,3
0
0,32
0
0,30
Dihydroxyflavanon
(bei 280 nm)
60
0
41
0
32
0
35
0
0
0
13
0
17
Eine optimale Retention und Elution (d. h. 100 %ige Wiederfindung) für die Probe „Apigenin &
Monohydroxyapigenin“ wurde mit der Kartusche 2 erreicht. Die anderen Varian-Kartuschen erwiesen
sich als ebenso geeignet. Bei Verwendung der Phenomenex-Kartusche eluierte das Produkt bereits
während des Waschschrittes. An den Kartuschen 5 und 6 (Machery-Nagel) blieb das Produkt
gebunden und auch Apigenin eluierte nur langsam.
Die Probe „Luteolin & Monohydroxyluteolin“ wurde insgesamt schlechter retentiert. Die besten
Ergebnisse (75 % Luteolin- und Produkt-Wiederfindung 50 %) wurden mit der PhenomenexKartusche erzielt. Im Fall der Varian-Kartuschen eluierte das Produkt (und teilweise auch das
Luteolin) schon während des Waschens. Die Kartuschen 5 und 6 ermöglichten eine 71 bzw. 58 %ige
Luteolin-Wiederfindung. Ein grundsätzliches Problem ergab sich aus der Umwandlung des
monohydroxylierten Produkts in ein Kopplungsprodukt (P2) mit der Retentionszeit 11,25 min.
Für die Aufarbeitung der Probe „7-Hydroxyflavanon & 7,x-Dihydroxyflavanon“ eignete sich
besonders die Kartusche 1 (97 bzw. 68 % Wiederfindung für 7-Hydroxyflavanon und sein Produkt).
Die Kartuschen 2 und 3 erbrachten eine ähnliche Leistung. Im Fall der Kartusche 4 konnte das
Produkt nicht eluiert werden. Die Macherey-Nagel Kartuschen ergaben nur eine ca. 25 %ige
Wiederfindung für das Produkt und waren deshalb für die Anreicherung kaum geeignet.
Für die Proben „7-Hydroxyflavon & 7,x-Dihydroxyflavon“ sowie „6-Hydroxyflavon & 6,xDihydroxyflavon“ eignete sich besonders die Kartusche 2 (analog Apigenin).
3)
Präparative HPLC
Die Gerätebeschreibung sowie die verwendeten Methoden und Bedingungen sind den Abschnitten 3.1
und 3.8.1.3 zu entnehmen. Die Abbildung 29 stellt das Chromatogramm zur präparativen
Fraktionierung von Apigenin (2) und seinem monohydroxylierten Produkt (1) dar.
79
1000
2
271
[%]
Vial 3
287
Vial 2
1
2000
Vial 1
2500
[%]
2
1
3000
m/z
m/z
500
0
0
25
30
35
40
45
Abbildung 29: Chromatogramm zur präparativen Trennung von Apigenin (2) und seinem
Hydroxylierungsprodukt (1) mittels HPLC unter Angabe verschiedener Sammelfraktionen (Vials 1-3).
Das Gesamtvolumen der gesammelten, produkthaltigen Fraktionen betrug 291 ml. Die Flüssigkeit
wurde mittels Rotationsverdampfer eingeengt, um den organischen Lösungsmittelanteil zu verringern
(Voraussetzung für die nachfolgende SPE). Der dabei ausgefallene Feststoff (Produkt 2) wurde
abfiltriert und gefriergetrocknet. Eine SPE-Kartusche BOND Elut MEGA BE – C18 (1 g / 6 ml)
wurde mit 220 ml der filtrierten Probe beladen und nach dem Trocknen unter Stickstoff mit 6 ml
Methanol eluiert. Beide Produktpräparate wurden auf ihre Reinheit mittels HPLC-DAD (Methode 4)
geprüft. Danach wurde die Lösung (Produkt 1) unter verringertem Druck in der SPE-Apparatur bis zur
Trockne eingeengt.
Die übrigen vier Substrat-Produkt-Gemische wurden in ähnlicher Weise, mit geringen Abweichungen
im Detail, aufgearbeitet. Die Tabelle 30 fasst diese detailierten Informationen für die einzelnen
Substrate (und ihre Produkte) zusammen.
Tabelle 30: Präparation monohydroxylierter Flavonoidprodukte von ihren Substraten durch SPEVorbehandlung, Trennung mittels präparativer HPLC und SPE-Nachbehandlung.
Substrat
Apigenin
7-Hydroxyflavanon
6-Hydroxyflavon
7-Hydroxyflavon
Luteolin
Gesamtvolumen der
Fraktionen
[ml]
291
Volumen
nach dem
Einengen
[ml]
220
132
100
230
150
298
150
185
130
SPE-Kartusche
MEGA BE C18
(1 g / 6 ml)
BOND Elut PPL
500 mg / 6 ml
MEGA BE C18
(1 g / 6 ml)
MEGA BE C18
(1 g / 6 ml)
Strata-X33u
Polymeric RP
(1 g / 12 ml)
Masse
Masse
des
des
Ausbeute
Substrates Produktes
[%]
[mg]
[mg]
27
5
19
24
5
21
35,7
12,5
35
35,7
22,6
63
28
5
18
80
Die Ausbeuten der enzymatischen Synthesen betrugen 18 % bis 63 %. Die Ausbeute nahm mit
steigender eingesetzter Substratmenge zu (die relativen Verluste bei der Aufarbeitung waren geringer).
4) NMR-Analyse der Edukte & Produkte semikontinuierlicher Versuchsführung
a) Apigenin & Scutellarein
Die Abbildung 30 und 31 zeigen die NMR-Daten für das Edukt Apigenin und das entstandene
Hydroxylierungsprodukt, das als 6-Hydroxyapigenin (Scutellarein) identifiziert wurde. Die eindeutige
Zuordnung der chemischen Verschiebungen erfolgte mittels APT und DEPT, durch Vergleich mit
Literaturdaten [Markham, 1978; Loo, 1986; Boyong, 1997; Kostrzewa-Suslow, 2007] sowie anhand
der von ACD/C+H-NMR Predictor-berechneten Werten.
Ein Vergleich der 1H-NMR-Spektren der beiden Verbindungen zeigt, dass im Produktspektrum das
Signal bei 6.19 ppm (Proton am C6) nicht mehr vorhanden ist und das Signal für das Proton am C8 im
Vergleich zum Apigenin tieffeldverschoben und nur noch als Singulett erscheint. Alle anderen
chemischen Verschiebungen haben sich nicht signifikant verändert.
In den
13
C-NMR-Spektren finden sich Veränderungen in den chemischen Verschiebungen für die
Kohlenstoffatome 5, 6 und 7 des A-Rings. Aus dem APT-Spektrum ist erkennbar, dass im Produkt das
Kohlenstoffatom C6 nicht mehr als CH-Signal, sondern als quartäres C-Atom erscheint. Somit lässt
sich eindeutig das Kohlenstoffatom C6 als Hydroxylierungsposition bestimmen.
[6.92]
[116.0]
[7.91]
[128.5]
[6.48]
[94.0]
[10.86]
HO
[164.2] 7
8
A
[6.19] 6
[98.9]
5
[161.5]
[157.4]
8a
4a
[103.8]
OH
[12.95]
O
1
2
[121.2]
B
3
2`
4` [161.2]
3` [6.92]
[116.0]
[7.91]
[128.5]
C
4
5`
6`
1`
[163.8]
[10.38]
OH
[6.76]
[102.9]
[181.8]
O
Abbildung 30: 1H-NMR- (fett) und 13C-NMR-Daten des Apigenins
1
H-NMR (DMSO-d6, 300,06 MHz): δ 6.19 (d, 4J = 2,1 Hz, 1H, Aromaten H, Ring A), 6.48 (d, 4J = 2.1
Hz, 1H, Aromaten H, Ring A), 6.76 (s, 1H, Ring C), 6.92 (d, 3J= 8,4 Hz, 2H, Aromaten H, Ring B),
7.91 (d, 3J= 8,4 Hz, 2H, Aromaten H, Ring B), 10.38 (s, 1H, -OH), 10.86 (s, 1H, -OH), 12.95 (s, 1H, OH);
13
C-NMR (DMSO-d6, 75,45 MHz): δ 94.0 (C8), 98.9 (C6), 102.9 (C3), 103.8 (C4a), 116.0 (C3',5'),
121.2 (C1'), 128.5 (C2',6'), 157.4 (C8a), 161.2 (C4'), 161.5 (C5), 163.8 (C2), 164.2 (C7), 181.8 (C4);
High resolution mass spectrum (HRMS, ESI) m/z 271 ([M+H]+).
81
[6.92]
[116.0]
[7.90]
[128.4]
[6.57]
[93.9]
HO
[149.7] 7
[153.3]
8
8a
A
[129.2] 6
HO
4a
5
[104.0]
[163.6]
2
4` [161.0]
B
[7.90]
[128.4]
[6.73]
[102.3]
3
4
3` [6.92]
[116.0]
2`
[121.5]
C
[182.1]
[147.1]
OH
[12.77]
6`
1`
O
1
OH
5`
O
Abbildung 31: 1H- NMR- (fett) und 13C-NMR-Daten des 6-Hydroxyapigenins (Scutellarein)
1
H-NMR (DMSO-d6, 400,00 MHz): δ 6.57 (s, 1H, Aromaten H, Ring A), 6.73 (s, 1H, Ring C), 6.92
(d, 3J= 8,1 Hz, 2H, Aromaten H, Ring B), 7.90 (d, 3J= 8,1 Hz, 2H, Aromaten H, Ring B), 12.77 (s, 1H,
-OH);
13
C-NMR (DMSO-d6, 100,06 MHz): δ 93.9 (C8), 102.3 (C3), 104.0 (C4a), 116.0 (C3',5'), 121.5 (C1'),
128.4 (C2',6'), 129.2 (C6), 147.1 (C5), 149.7 (C7), 153.3 (C8a), 161.0 (C4'), 163.6 (C2), 182.1 (C4);
HRMS (ESI) m/z 287 ([M+H]+).
b) 7-Hydroxyflavanon & 6,7-Dihydroxyflavanon
Die Abbildung 32 und Abbildung 33 zeigen die NMR-Daten für das Edukt 7-Hydroxyflavanon und
das entstandene Produkt, das als 6,7-Dihydroxyflavanon identifiziert wurde. Die eindeutige
Zuordnung der chemischen Verschiebungen erfolgte mittels APT, DEPT, zweidimensionalen NMRTechniken (gCOSY, gHMBC) und durch Vergleich mit Literaturdaten [Markham, 1978; Loo, 1986;
Boyong, 1997; Kostrzewa-Suslow, 2007] sowie anhand der vom ACD/C+H NMR Predictor
berechneten Werten.
[7.44]
[128.4]
[7.53]
[126.5]
[10.62]
HO
[164.6] 7
[6.39]
[102.5]
8
A
[6.54] 6
[110.6]
5
[163.0]
8a
4a
[113.5]
O
1
[5.59]
[78.9]
2
C
4
3
5`
6`
B
1`
[139.0]
2`
[7.44]
4` [128.5]
3` [7.44]
[128.4]
[7.53]
[126.5]
[3.13] / [2.71]
[43.2]
[189.8]
[7.68]
[128.5]
O
Abbildung 32: 1H-NMR- (fett) und 13C-NMR-Daten des 7-Hydroxyflavanons
1
H-NMR (DMSO-d6, 199.99 MHz): 2.71 (dd, 3J= 3,0 Hz, 2J= 16,8 Hz 1H, Ring C), 3.13 (dd, 3J= 12,7
Hz, 2J= 16,8 Hz 1H, Ring C), 5.59 (dd, 3J= 12.5 Hz, 4J= 2 Hz, 1H, Ring C), 6.39 (s, 1H, Aromaten H,
82
Ring A), 6.54 (dd, 3J= 8.8 Hz, 4J= 1.1 Hz, 1H, Aromaten H, Ring A), 7.41-7.47 (m, 3H, Aromaten H,
Ring B), 7.53 (d, 3J= 7.0 Hz, 2H, Aromaten H, Ring B), 7.68 (dd, 3J= 8.8 Hz, 4J= 1.1 Hz, 1H,
Aromaten H, Ring A), 10.62 (s, 1H, -OH);
13
C-NMR (DMSO-d6, 50.29 MHz): δ 43.2 (C3), 78.9 (C2), 102.5 (C8), 110.6 (C6), 113.5 (C4a), 126.5
(C2',6'), 128.4 (C3',5'), 128.5 (C4', C5), 139.0 (C1'), 163.0 (C8a), 164.6 (C7), 189.8 (C4);
HRMS (ESI) m/z 241 ([M+H]+).
Das 1H-NMR-Spektrum des Produkts zeigt keine Kopplung der Signale bei 6.54 ppm und 7.68 ppm,
stattdessen nur ein Singulett bei 7.09 ppm. In den
13
C-NMR-Spektren erkennt man im
Produktspektrum eine deutliche Tieffeldverschiebung für das Atom C6, was auf einen
„elektronenziehenden“ Substituenten hinweist. Zudem wechselt dieses Signal im APT seine
Orientierung. Zusammengenommen belegt dies eindeutig die Hydroxylierung des Kohlenstoffatoms
C6 im Ring A.
[7.41]
[129.2]
[7.50]
[127.2]
[6.39]
[104.0]
HO
[157.0] 7
8
A
[141.6] 6
HO
5
[154.8]
8a
4a
[113.2]
O
1
[5.48]
[79.7]
2
C
4
3
5`
6`
B
1`
[140.0]
2`
[7.38]
4` [129.0]
3` [7.41]
[129.2]
[7.50]
[127.2]
[3.02] / [2.66]
[44.0]
[190.6]
[7.09]
[111.1]
O
Abbildung 33: 1H-NMR- (fett) und 13C-NMR-Daten des 6,7-Dihydroxyflavanons.
1
H-NMR (DMSO-d6, 300, 08 MHz): δ 2.66 (dd, 3J= 3,0 Hz, 2J= 16,8 Hz 1H, Ring C), 3.02 (dd, 3J=
12,7 Hz, 2J= 16,8 Hz 1H, Ring C), 5.48 (dd, 4J= 3,0 Hz, 3J= 12,7 Hz 1H, Ring C), 6.39 (s, 1H,
Aromaten H, Ring A), 7.09 (s, 1H, Aromaten H, Ring A), 7.35-7.44 (m, 3H, Aromaten H, Ring B),
7.50 (d, 3J= 8,1 Hz, 2H, Aromaten H, Ring B);
13
C-NMR (DMSO-d6, 75,46 MHz): δ 44.0 (C3), 79.7 (C2), 104.0 (C8), 111.1 (C5), 113.2 (C4a), 127.2
(C2',6'), 129.0 (C4'), 129.2 (C3',5'), 140.0 (C1'), 141.6 (C6), 154.8 (C8a), 157.0 (C7), 190.6 (C4);
HRMS (ESI) m/z 257 ([M+H]+).
Die Zuordnung der 1H- und 13C-NMR-Signale zu den Positionen C5 und C8 (Ring A) wurde durch die
Anwendung zweidimensionaler NMR-Verfahren ermöglicht. Die gHSQC gehört zu den selektiven
heteronuklearen Methoden zur Bestimmung von CH-Kopplungen über eine Bindung. Sie ermöglicht
die direkte Zuordnung der 1H-NMR-Signale zu den korrespondierenden 13C-NMR-Signalen; für 6,7Dihydroxyflavanon ergaben sich folgende Paare: 44.0 x 2.66, 44.0 x 3.02, 79.7 x 5.48, 103.4 x 6.39,
111,1 x 7.09, 127.2 x 7.50, 129.0 x 7.38, 129.2 x 7.41 ppm.
Die gHMBC gehört zu den selektiven heteronuklearen Methoden zur Bestimmung der
Weitbereichskorrelationen über zwei bis vier Bindungen. Die höchste Signalstärke tritt bei
83
Korrelationen über drei Bindungen auf (3J). In den vorliegenden Spektren korrelieren stark (3J) 6.39
ppm mit 113.2 ppm und 141.6 ppm, sowie 7.09 ppm mit 154.8 ppm, 157.0 und 190.6 ppm. Eine
schwache Kopplung (4J oder 2J) ergibt sich für die Signale 6.39 ppm mit 111.1 ppm, 154.8 ppm, 157.0
ppm, 190.6 ppm sowie 7.09 ppm mit 141.6 ppm und 104.0 ppm. Daraus kann man entnehmen, dass
die 1H-NMR Signale bei 6,39 ppm und 7,09 ppm von Protonen an paraständigen Kohlenstoffatomen
am Ring A stammen. Die starke Kopplung des Signals bei 7.09 ppm mit dem Signal bei 190.6 ppm
legt die Zuordnung zum Kohlenstoffatom C5 des A-Rings fest.
c) 6-Hydroxyflavon & 5,6-Dihydroxyflavon
Die Abbildung 34 und Abbildung 35 zeigen die NMR-Daten für das Edukt 6-Hydroxyflavon und das
entstandene Produkt, das als 5,6-Dihydroxyflavon identifiziert werden konnte. Die eindeutige
Zuordnung der chemischen Verschiebungen erfolgte mittels APT, zweidimensionaler NMRTechniken (gCOSY, gHMBC) und anhand der vom ACD/C+H-NMR Predictor berechneten Werten.
Aus dem Vergleich der Edukt- und Produkt-1H-NMR-Spektren ergibt sich, dass das Singulett bei 7.37
ppm aus dem Ring A verloren ging. Bereits dies deutet auf eine Hydroxylierung des C5 im Ring A
hin. In den 13C-NMR-Spektren erkennt man im Produktspektrum eine starke Tieffeldverschiebung für
das Atom C5, was charakteristisch für elektronenziehende Substituenten ist. Zudem wechselt dieses
Signal im APT seine Orientierung. Insgesamt kann daraus abgeleitet werden, dass sich die
Hydroxylierungsposition am C5 im A-Ring befindet.
[7.64]
[129.1]
[8.08]
[126.2]
[7.70]
[119.8]
[7.31]
[123.2] 7
8
A
[154.9] 6
HO
[10.20]
5
[149.4]
8a
4a
[124.2]
O
1
B
[7.64]
4` [131.6]
1`
2
C
4
5`
6`
3
3` [7.64]
2`
[129.1]
[131.3]
[162.3]
[8.08]
[126.2]
[6.96]
[105.8]
[177.1]
[7.37]
[107.5]
O
Abbildung 34: 1H-NMR- (fett) und 13C-NMR-Daten des 6-Hydroxyflavons.
1
H-NMR (DMSO-d6, 199,99 MHz): δ 6.96 (s, 1H, Ring C), 7.31 (d, 3J= 8,8 Hz, 1H, Aromaten H,
Ring A), 7.37 (s, 1H, Aromaten H, Ring A), 7.61-7.66 (m, 3H, Aromaten H, Ring B), 7.70 (d, 3J= 8,8
Hz, 1H, Aromaten H, Ring A), 8.08 (d, 3J= 8,0 Hz, 2H, Aromaten H, Ring B), 10.20 (s, 1H, -OH);
13
C-NMR (DMSO-d6, 50.29 MHz): δ 105.8 (C3), 107.5 (C5), 119.8 (C8), 123.2 (C7), 124.2 (C4a),
126.2 (C2',6'), 129.1 (C3',5'), 131.3 (C1'), 131.6 (C4'), 149.4 (C8a), 154.9 (C6), 162.3 (C2), 177.1
(C4);
HRMS (ESI) m/z 239 ([M+H]+).
84
[7.58]
[129.9]
[8.08]
[127.2]
[7.09]
[107.4]
[7.26]
[123.7] 7
8
A
[141.6] 6
HO
5
[146.9]
8a
4a
[111.3]
[149.2]
OH
O
1
B
1`
2`
2
C
4
5`
6`
3
[7.61]
4` [132.9]
3` [7.58]
[129.9]
[131.5]
[164.8]
[8.08]
[127.2]
[7.00]
[105.2]
[184.3]
O
Abbildung 35: 1H- NMR- (fett) und 13C-NMR-Daten des 5, 6-Dihydroxyflavons
1
H-NMR (DMSO-d6, 400,00 MHz): δ 7.00 (s, 1H, Ring C), 7.09 (d, 3J= 9,2 Hz, 1H, Aromaten H,
Ring A), 7.26 (d, 3J= 9,2 Hz, 1H, Aromaten H, Ring A), 7.55-7.62 (m, 3H, Aromaten H, Ring B), 8.08
(dd, 4J= 1,6 Hz, 3J= 8,0 Hz, 2H, Aromaten H, Ring B),
13
C-NMR (DMSO-d6, 100,58 MHz): δ 105.2 (C3), 107.4 (C8), 111.3 (C4a), 123.7 (C7), 127.2
(C2',6'), 129.9 (C3',5'), 131.5 (C1'), 132.9 (C4'), 141.6 (C6), 146.9 (C8a), 149.2 (C5), 164.8 (C2),
184.3 (C4);
HRMS (ESI) m/z 255 ([M+H]+).
Anhand der APT-Spektren wurden die CHn–Gruppen des Produktes mit gerader (110.7, 130.9, 141.0,
146.3, 148.6, 164.2, 183.8 ppm) und ungerader (104.6, 106.9, 123.1, 126.7, 129.3, 132.3 ppm) Anzahl
von H-Atomen unterschieden (d. h. kein oder ein Wasserstoff vorhanden).
Die gCOSY-Spektren ermöglichten die Zuordnung der Wasserstoffatome, die miteinander koppeln:
7.09 und 7.26 ppm bzw. 7.58, 7.61 und 8.08 ppm. Somit konnten die aromatischen Ringe A und B
unterschieden werden.
Mit Hilfe von gHMBC wurden die Ringe A und B eindeutig beschrieben. Im Ring A korrelierten stark
(3J): 7.26 ppm mit 146.9 ppm und 149.2 ppm, sowie 7.09 ppm mit 111.3 ppm und 141.6 ppm, und
schwach (4J oder 2J): 7.26 ppm mit 141.6 ppm sowie 7.09 ppm mit 149.2 ppm und 123.7 ppm. Da die
Verschiebung 111.3 ppm nur dem C4a entsprechen konnte und die 123.7 ppm erfahrungsgemäß auf
den direkten nicht mit Sauerstoff substituierten Nachbarn hindeuten, konnten die Kohlenstoffatome 7
und 8 unterschieden werden. Im Ring B korrelierten stark (3J): 8.08 ppm mit 127.2 ppm, 132.9 ppm
und mit 164.8 ppm, 7.61 ppm mit 127.2 ppm und 7.58 mit 129.9 ppm und 131.5 ppm, und schwach (4J
oder 2J): 7.61 ppm mit 129.9 ppm und 131.5 ppm. Da die genaue Position der Verschiebung 8.08 ppm
im Ring B bekannt war und die 164.8 ppm nur einem mit Sauerstoff substituierten Kohlenstoff (C2,
Ring C) entsprechen konnte, wurde die molekulare Struktur des B-Rings eindeutig geklärt. Die
restliche Verschiebung von 105.2 ppm wurde dem C3 zugeordnet.
85
d) 7-Hydroxyflavon & 6,7-Dihydroxyflavon
Die Abbildung 36 und Abbildung 37 zeigen die NMR-Daten für das Edukt 7-Hydroxyflavon und das
entstandene Produkt, das als 6,7-Dihydroxyflavon identifiziert wurde. Die eindeutige Zuordnung der
chemischen Verschiebungen erfolgte mittels APT, zweidimensionaler NMR-Techniken (gHMBC) und
Vergleich der mittels ACD/C+H-NMR Predictor berechneten Werte.
[7.60]
[129.1]
[8.07]
[126.1]
[10.99]
HO
[162.8] 7
[6.90]
[102.5]
[157.5]
8
8a
A
[7.02] 6
[115.1]
4a
5
[116.1]
[7.93]
[126.5]
O
1
5`
6`
[7.60]
4` [131.5]
B
1`
3` [7.60]
[129.1]
2`
[131.2]
[162.1]
[8.07]
C
[126.1]
3 [6.95]
4
[106.5]
[176.5]
2
O
Abbildung 36: 1H-NMR- (fett) und 13C-NMR-Daten des 7-Hydroxyflavons.
1
(d, 3J= 8,8 Hz, 1H, Aromaten H, Ring A), 7.60-7.62 (m, 3H, Aromaten H, Ring B), 7.93 (d, 3J= 8,8
Hz, 1H, Aromaten H, Ring A), 8.07 (d, 3J= 7,0 Hz, 2H, Aromaten H, Ring B), 10.99 (s, 1H, -OH);
13
C-NMR (DMSO-d6, 50.29 MHz): δ 102.5 (C8), 106.5 (C3), 115.1 (C6), 116.1 (C4a), 126.1 (C2',6'),
126.5 (C5), 129.1 (C3',5'), 131.2 (C1'), 131.5 (C4'), 157.5 (C8a), 162.1 (C2), 162.8 (C7), 176.5 (C4);
HRMS (ESI) m/z 239 ([M+H]+).
[7.54]
[129.8]
[8.00]
[126.7]
[7.02]
[106.6]
HO
[153.7] 7
8
A
[145.6] 6
HO
5
[151.7]
8a
4a
[116.5]
O
1
B
1`
2`
2
C
4
5`
6`
3
[7.53]
4` [132.0]
3` [7.54]
[129.8]
[132.2]
[162.1]
[8.00]
[126.7]
[6.80]
[103.7]
[177.0]
[7.28]
[108.0]
O
Abbildung 37: 1H-NMR- (fett) und 13C-NMR-Daten des 6,7-Dihydroxyflavons.
1
H-NMR (DMSO-d6, 400 MHz): δ 6.80 (s, 1H, Ring C), 7.02 (s, 1H, Aromaten H, Ring A), 7.28 (s,
1H, Aromaten H, Ring A), 7.53-7.54 (m, 3H, Aromaten H, Ring B), 8.00 (d, 3J= 7,0 Hz, 2H,
Aromaten H, Ring B), 9.85 (s, 1H, -OH), 10.52 (s, 1H, -OH);
86
13
C-NMR (DMSO-d6, 100,58 MHz): δ 103.7 (C3), 106.6 (C8), 108.0 (C5), 116.5 (C4a), 126.7
(C2',6'), 129.8 (C3',5'), 132.0 (C4'), 132.2 (C1'), 145.6 (C6), 151.7 (C8a), 153.7 (C7), 162.1 (C2),
177.0 (C4);
HRMS (ESI) m/z 255 ([M+H]+).
Aus dem Vergleich der Edukt- mit den Produkt-1H-NMR-Spektren ergibt sich, dass das erste
Dublettpaar (7.02 ppm, 7.93 ppm) verloren ging und stattdessen ein Singulett bei 7.28 ppm auftritt. In
den
13
C-NMR-Spektren erkennt man für das Produkt eine ausgeprägte Tieffeldverschiebung für das
Atom C6, was Indiz für einen elektronenziehenden Substituenten ist. Zudem wechselt dieses Signal im
APT seine Orientierung. In Summe weisen diese Befunde klar auf eine Hydroxylierung des
Kohlenstoffatoms C6 im Ring A hin.
In den gHMBC-Spektren des Produktes korrelierten stark (3J): 8.00 ppm (C2') mit 162.1 ppm, 132.0
ppm und 126.7 ppm, und schwach (4J oder 2J): 8.00 ppm mit 129.8 ppm und 132.2 ppm. Die
Verschiebungen 162.1, 132.0, 126,7, 129.8 und 132.2 ppm entsprechen somit den Kohlenstoffatomen
C2, C4', C6', C3' bzw. C5', und C1'. Dem gHMBC Spektrum kann ebenfalls eine Bestätigung für das
C3-Atom entnommen werden, da der Mittelpunkt der Kopplungen bei 103.7 ppm unter 6.80 ppm liegt.
Damit war es möglich, die Ringe B und C eindeutig zuzuordnen. Weiterhin korrelierten stark (3J): 6.80
ppm (C3) mit 132.2 ppm (C1') und 116.5 ppm, und schwach (4J oder 2J): 6.80 ppm mit 162.1 ppm
(C2), 177.0 ppm (C4) und 108.0 ppm (C5). Die Verschiebung 116.5 ppm steht also für das
Kohlenstoffatom C4a und koppelt mit 6.80 ppm sowie mit 7.02 ppm, nicht aber mit 7.28 ppm. Somit
können die Verschiebungen 7.28 und 7.02 ppm den Atomern C5 und respektive C8 zugeordnet
werden. Im Ring A konnten nur die 13C-NMR-Werte 151.7 ppm und 153.7 ppm nicht eindeutig den
Atomen C8a und C7 zugeornet werden; der restliche Shift von 106.6 ppm entsprach allerdings genau
dem letzten verbliebenen Kohlenstoff - C5.
e) Luteolin & 6-Hydroxyluteolin
Die Abbildung 38 und Abbildung 39 zeigen die NMR-Daten für das Edukt Luteolin und das
entstandene Produkt, das als 6-Hydroxyluteolin identifiziert wurde. Die eindeutige Zuordnung der
chemischen Verschiebungen erfolgte mittels APT und durch Vergleich mit Literaturdaten [Markham,
1978; Boersma, 2002; Androutsopoulos, 2009] sowie auf Basis der vom ACD/C+H-NMR Predictor
berechneten Werte.
Aus dem Vergleich der Edukt- mit Produkt-1H-NMR-Spektren ergibt sich, dass das erste Dublettpaar
(6.18 ppm, 6.44 ppm) verschwindet und das Signal für das Proton am C8 im Vergleich zum Luteolin
tieffeldverschoben als Singulett erscheint. Alle anderen chemischen Verschiebungen änderten sich
nicht signifikant.
In den
13
C-NMR-Spektren finden sich Änderungen in den chemischen Verschiebungen für die
Kohlenstoffatome 5, 6 und 7 des A-Rings. Das APT-Spektrum zeigt, dass im Produkt das
87
Kohlenstoffatom C6 nicht mehr als CH-Signal, sondern als quartäres C-Atom detektiert wird. Daraus
lässt sich eindeutig ableiten, dass das Kohlenstoffatom C6 als Hydroxylierungsposition fungiert.
[6.88]
[116.1]
[7.39]
[119.0]
[6.44]
[93.9]
[10.86]
HO
[164.2] 7
8
A
[6.18] 6
[98.9]
5
[157.3]
8a
4a
[103.8]
[164.0]
2
[121.6]
B
3
4
2`
4` [149.8]
3` [145.8]
[9.44]
OH
[7.41]
[113.4]
C
[6.66]
[102.9]
[181.7]
[161.5]
OH
[12.96]
5`
6`
1`
O
1
[9.99]
OH
O
Abbildung 38: 1H-NMR- (fett) und 13C-NMR-Daten des Luteolins.
1
H-NMR (DMSO-d6, 300,06 MHz): δ 6.18 (d, 4J = 1,5 Hz, 1H, Aromaten H, Ring A), 6.44 (d, 4J = 1,5
Hz, 1H, Aromaten H, Ring A), 6.66 (s, 1H, Ring C), 6.88 (d, 3J= 8,1 Hz, 1H, Aromaten H, Ring B),
7.39 (s, 1H, Aromaten H, Ring B), 7.41 (d, 3J= 8,1 Hz, 1H, Aromaten H, Ring B), 9.43 (s, br, 1H, OH), 9.99 (s, br, 1H, -OH), 10.86 (s, br, 1H, -OH), 12.96 (s, 1H, -OH);
13
C-NMR (DMSO-d6, 75,45 MHz): δ 93.9 (C8), 98.9 (C6), 102.9 (C3), 103.8 (C4a), 113.4 (C2'),
116.1 (C5'), 119.0 (C6'), 121.6 (C1'), 145.8 (C3'), 149.8 (C4'), 157.3 (C8a), 161.5 (C5), 164.0 (C2),
164.2 (C7), 181.7 (C4);
HRMS (ESI) m/z 287 ([M+H]+).
[6.89]
[116.1]
[7.38]
[118.9]
[10.54]
HO
[149.5] 7
[6.55]
[93.8]
8
A
[129.2] 6
5
[8.74]
HO
[147.1]
[153.3]
8a
4a
[104.0]
OH
[12.78]
O
1
B
1`
[163.7]
2
[121.9]
3
2`
4` [149.7]
3` [145.8]
[9.44]
OH
[7.38]
[113.3]
C
4
5`
6`
[9.89]
OH
[6.63]
[102.3]
[182.0]
O
Abbildung 39: 1H-NMR- (fett) und 13C-NMR-Daten des 6-Hydroxyluteolins.
1
(d, 3J= 8,1 Hz, 1H, Aromaten H, Ring B), 7.38 (s, 1H, Aromaten H, Ring B), 7.38 (d, 3J= 8,1 Hz, 1H,
Aromaten H, Ring B), 8.74 (s, br, 1H, -OH), 9.44 (s, br, 1H, -OH), 9.89 (s, br, 1H, -OH), 10.54 (s, br,
1H, -OH), 12.96 (s, 1H, -OH);
88
13
C-NMR (DMSO-d6, 100,06 MHz): δ 93.8 (C8), 102.3 (C3), 104.0 (C4a), 113.3 (C2'), 116.1 (C5'),
118.9 (C6'), 121.9 (C1'), 129.2 (C6), 145.8 (C3'), 147.1 (C5), 149.5 (C7), 149.7 (C4'), 153.3 (C8a),
163.7 (C2), 182.0 (C4);
HRMS (ESI) m/z 303 ([M+H]+).
4.2.5 Vergleichende Diskussion der untersuchten Substanzklassen
Enzymatische Reaktionen der AaeAPO mit Flavonoiden
Die Biotransformation der Flavonoide verlief insgesamt – wenn „störende“ Substitutionsmuster
vermieden wurden – mit guten bis sehr guten Umsatzraten (≥ 40 %). Als störend wirkt sich bei allen
Verbindungsklassen eine besetzte C6-Position (TC: 0-30 %) oder eine Substitution durch Zuckerreste
(TC: bis 10 %) aus; hinzu kommt im Fall von Isoflavonen und Flavonen eine Methoxygruppe bzw.
eine Methylgruppe in C5-Position (TC: 4-31 %). „Ausreiser“ stellen das 4’-Hydroxyflavanon (TC: 27
%; C4' als zweite Vorzugsposition), Flavon (TC: 13 %; schlecht löslich) und 3-Hydroxyflavon (TC: 0
%; „mysteriös“) dar.
O
O O
O
HO
HO
HO
OH
O
OH
OH O
6-Hydroxyflavon
OH
O
H3 CO
O
5-Methoxyflavon
Abbildung 40: Veranschaulichung der „störenden“ Gruppen, die die AaeAPO-Katalyse erschweren.
Im Zuge der AaeAPO-Katalyse entstanden in den meisten Fällen ein oder mehrere monohydroxylierte
Produkte; im Fall der Flavanone zudem auch dihydroxylierte oder anders derivatisierte Verbindungen
(z. B. Dimere). Die Hydroxylierung erfolgt regioselektiv bevorzugt in C6-Position und in geringerem
Umfang in C4‘-Position. In Flavanonen fungiert die C3'-Position als dritte Hydroxylierungsstelle.
O-Demethyliert wurden bevorzugt Methoxygruppen in C4'-Position mit guten bis sehr guten
Umsatzraten (≥ 47 % [bei Flavonoiden ohne einer Methoxygruppe in C5-Position]; bei Isoflavonen im
begrenzten Umfang auch Methoxygruppen in C6-Position). Im Fall von Isoflavonen und Flavanonen
wurden gekoppelte Folgereaktionen beobachtet, wobei sowohl O-Demethylierungen als auch
Hydroxylierungen auftraten [TC: (32-100)%].
Diese Ergebnisse weisen Analogien zu Befunden aus Literatur auf. Zum einen können laut Barz et al.
Flavonoide erst nach Entfernung glykosidischer Gruppen als Peroxidase-Substrate fungieren [Barz,
1975a, 1975b, 1977, 1981], zum anderen wird von verschiedenen Oxygenasen bevorzugt die C6Position in Flavonoiden hydroxyliert. Beispielsweise oxidieren eine 2-Oxoglutarat-abhängige
Dioxygenase (Flavonol-6-Hydroxylase, F6H) aus dem Milzkraut Chrysosplenium americanum sowie
P450-Monooxygenasen vom F6H-Typ aus Tagetes spp. oder der Sojabohne (Glycine max) partiell
89
methoxylierte bzw. nicht methoxylierte Flavonole oder Isoflavonoide in dieser Weise [Anzellotti &
Ibrahim, 2000; Halbwirth et al., 2004; Latunde-Dada et al., 2001]. Ganze Zellen der Bakteriengattung
Micrococcus sind in der Lage, die Isoflavone Genistein und Biochanin A in C6-Position zu
hydroxylieren [Klus & Barz., 1998].
Gewinnung spezieller Flavonoide: Chemische Synthese versus biotechnologische Umsetzung versus
Extraktion aus Pflanzen
Am Beispiel von Apigenin und 6-Hydroxyapigenin (Scutellarein) werden nachfolgend die chemische
Synthese, biotechnologische Transformation und Extraktion aus Pflanzenmaterial miteinander
verglichen.
Die chemische Synthese oxyfunktionalisierter Flavonoide erfordert in der Regel mehrere Stufen – für
die Synthese von 6-Hydroxyapigenin werden laut Literatur mindestens sieben Schritte benötigt [Cui et
al., 2005; Zemplén et al., 1958; Zemplén et al., 1958b; Farkas et al., 1971]. Neue Möglichkeiten in
diesem Bereich haben Barontini et al. aufgezeigt, indem sie Flavonoide einer selektiven zweistufigen
Synthese unter Iodobenzoesäure-Katalyse unterwarfen. Die Edukte wurden dabei bevorzugt in orthoPosition hydroxyliert (d. h. Apigenin in Position C3'), so dass Scutellarein nicht gebildet wurde
[Barontini et al., 2010]. Alternative Wege eröffnen einstufige Biotransformationen mit P450Monooxygenasen, wobei auch hier mit “Limitationen“ gerechnet werden muss. So sind die P450Enzyme CYP1A und CYP3A aus Ratenlebermikrosomen zwar in der Lage, Apigenin zum
gewünschten Scutellarein umzuwandeln, allerdings entstehen während der Reaktion aufgrund der
mangelnden Selektivität der Enzyme auch andere Produkte (Isoscutellarein = 8-Hydroxyapigenin,
Luteolin, 4'-Hydroxyapigenin) [Gradolatto et al., 2004; Nielsen et al., 1998; Kostrzewa-Suslow et al.,
2007]. Darüber hinaus sind Mikrosomen nur unter relativ hohem Aufwand zu gewinnen und deshalb
für einen Einsatz im größeren Maßstab kaum geeignet.
Die Gewinnung von Scutellarein durch Extraktion aus Pflanzenmaterial wird v. a. in China betrieben
(Jinan Great Chemical Industry, Qingdao Sunrise Trading). Trotz mehrerer Studien, die den
Extraktionsprozess versuchten zu optimieren, können nur (0,7 bis 3,3) mg Scutellarein aus 1 g
Trockenmasse der Helmkräuter Scutellaria barbata [Goh et al., 2005] oder S. baicalensis [Zheljazkov
et al., 2007] gewonnen werden. Eine neue Extraktionsmethode nach Qian et al. verspricht höhere
Gehalte an Scutellarein, da sie das besonders flavonoidreiche Berufkraut Erigeron breviscapus als
Ausgangsmaterial nutzt. Da das Scutellarein hier aber vorzugsweise als Glykosid (Scutellarin)
vorliegt, muss der Extrakt nachfolgend einer sauren Hydrolyse und Umkristallisation unterzogen
werden [Qian et al., 2011]. Auch die verwendeten Extraktionsbedingungen (derzeit 120ºC, 48 h)
bedürfen noch einer Optimierung.
Für biotechnologische Umsetzungen wird Apigenin als Edukt benötigt, dessen Gewinnung meist
durch Extraktion erfolgt. Laut einem US-Patent von Benomelli kann Apigenin aus der Kamille
Matricaria chamomilla mit 4,5-6,0 % Ausbeute gewonnen werden [Benomelli, 1982]. Die derzeit
90
genutzte, industrielle Methode geht von Blättern des Teestrauchgewächses Adinandra nitida aus und
liefert ca. 2,5 % Ausbeute [Liu et al., 2008]. Häufig wird Apigenin auch aus dem Sellerie Apium
graveolens extrahiert [Han & Row, 2011].
Kombinierte chemisch-biotechnologische/enzymatische Synthesen oder klassische Extraktionsverfahren (zur Eduktgewinnung) mit nachgeschalteter selektiver Hydroxylierung durch die AaeAPO
oder andere Peroxygenasen könnten zukünftig die Grundlage für die Entwicklung industrieller
Verfahren zur Synthese komplexer Wirkstoffmoleküle auf Flavonoidbasis bilden. Solche Methoden
würden in jedem Fall die großtechnische Gewinnung der Peroxygenase-Enzyme voraussetzen.
4.2.6 Enzymatische Transformation – Intermediäre Epoxidbildung
Im Rahmen der Dissertation wurden Untersuchungen zum Mechanismus und Ablauf der
Hydroxylierung von Flavonoiden durch die AaeAPO durchgeführt. Kluge et al. hatten bereits
nachgewiesen, dass die Umsetzung von Naphthalin über eine Epoxid-Zwischenstufe verläuft [Kluge et
al., 2008]. Im sauren Reaktionsmedium hydrolysierte dieses Epoxid spontan unter Rearomatisierung
und Wasserfreisetzung. Das resultierende Produktgemisch bestand aus zum größeren Teil aus 1Naphthol (85-95 %) und zu einem kleineren Teil aus 2-Naphthol (5-15 %).
Die Untersuchungen hierzu wurden mit den beiden Flavonoid-Grundkörpern Flavon und Flavanon
durchgeführt. Ziel war es, mögliche intermediäre Epoxide der Verbindungen zu detektieren. Da solche
Epoxide stabiler im Alkalischen sind [Kluge et al., 2008], erfolgten die Versuche in
Kaliumphosphatpuffer (100 mM) bei pH 9.
Für die analytische Trennung und Charakterisierung der Produkte wurde die Methode 2 wie folgt
geändert:
1) analytische Säule: Gemini 3u C6-Phenyl 110 Å column (150 × 2 mm, 3 μm particle size) der
Firma Phenomenex mit einer Vorsäule des Typs C6-Phenyl Security Cartridge (4 × 2 mm)
2) Eluent A: 5 mM Ammoniumformiatpuffer (pH 8,0)
3)
Fluss: 0,2 ml/min.
Nach der Analyse wurde die Probe mittels TCA (Endkonzentration 5 %) angesäuert und erneuert
vermessen. Im Fall der Umsetzung von Flavon konnte das korrespondierende Epoxid auf Grundlage
des UV-Vis-Spektrums und der Retentionszeiten nachgewiesen und vom Folgeprodukt 6Hydroxyflavon unterschieden werden (siehe Abbildung 41, Peaks 2 und 3). Die MS-Spektren beider
Verbindungen waren identisch (Molpeaks bei 239 m/z).
91
4
2500
2000
2
3
200
400
[nm]
200
400
[nm]
4
O
O
500
O
O
HO
2
O
3
1
13
b
a
0
0
5
10
15
20
25
Abbildung 41: HPLC-Chromatogramme der Flavon-Umsetzung durch die AaeAPO mit eingefügten UVVis-Spektren der Edukte und Produkte:
(1) - 4'-Hydroxyflavon, (2) - Flavonoxid (Epoxid), (3) - 6-Hydroxyflavon, (4) - Flavon; (a) Probe vor dem
Ansäuern, (b) Probe nach dem Ansäuern.
Abbildung 42 zeigt den postulierten Ablauf der Peroxygenase-katalysierten Flavonhydroxylierung
unter intermediärer Epoxidbildung.
H2 O2
AaeAPO
- H2 O
O
O
O
oder
O
O
HO
O
HO
oder
HO
OH O
+
O
O
5,6-Epoxy-5,6-dihydroflavon
Flavon
kat. H
H2 O
O
6,7-Epoxy-6,7-dihydroflavon
O
O
kat. H
O
+
- H2 O
HO
O
6-Hydroxyflavon
5,6-Dihydro-5,6-dihydroxyflavon
6,7-Dihydro-6,7-dihydroxyflavon
Abbildung 42: Reaktionsmechanismus der Flavonhydroxylierung mittels AaeAPO.
Im Fall des Flavanons waren die Unterschiede in den UV-Vis-Spektren und HPLCChromatogrammen weniger deutlich ausgeprägt (Abb. 43). Es wird vermutet, dass der Peak bei 15,7
min (4) ein Epoxid darstellt, das sich nach dem Ansäuern langsam unter Bildung von zwei
monohydroxylierten
Flavanonen
(3)
und
(1)
zersetzte.
Da
eines
dieser
Produkte
als
4'-Hydroxyflavanon (1) identifiziert wurde, kann angenommen werden, dass es sich bei dem
intermediären Epoxid um 3',4'-Flavanonoxid handelt.
92
3
100
4
2
5
5
80
200
[nm]
200
500
[nm]
2
60
40
500
200
[nm]
500
3
1
4
20
3
b
4
a
0
0
14
15
16
17
Abbildung 43: Ausschnitt aus dem HPLC-Chromatogramm der Flavanon-Umsetzung durch die
AaeAPO:
(1) - 4'-Hydroxyflavanon, (2) - 6-Hydroxyflavanon, (3) - mohohydroxyliertes Flavanon mit
unbekannter Position der Hydroxygruppe, (4) – postuliertes Flavanonoxid,
(5) – Flavanon; (a) Probe vor dem Ansäuern, (b) Probe nach dem Ansäuern.
4.2.7 Enzymatische Transformation - Herkunft des Sauerstoffs
Frühere Studien zur AaeAPO-Katalyse hatten gezeigt, dass der in die Substrate eingeführte Sauerstoff
aus dem Cosubstrat Wasserstoffperoxid stammt [Kluge et al., 2008, Kinne et al. 2010].
2000
2
273
(%)
1600
50
0
260
1200
2
1
800
12
m/z
280
271
100
(%)
100
50
0
260
400
m/z
280
a
0
0
5
10
15
20
b
c
25
Abbildung 44: HPLC-Chromatogramme der Daidzein-Umsetzung (b, c) durch AaeAPO in Gegenwart von
H216O2 (b) und H218O2 (c) mit eingefügten MS-Spektren der Produkte; a – Kontrolle ohne Enzym:
(1) – Demethyltexasin (6-Hydroxydaidzein), (2) - Daidzein.
93
Um diesen Nachweis auch für die Flavonoid-Hydroxylierung zu erbringen, wurden Experimente mit
isotopenmarkiertem Wasserstoffperoxid (H218O2) durchgeführt (siehe Abbildung 44).
Der HPLC-MS-Analyse kann man entnehmen, dass im Zuge der AaeAPO-katalysierten
Daidzeinhydroxylierung in Anwesenheit von H218O2 (90 Atom%) diese 90 %
18
O in die
Hydroxygruppe des Demethyltexasins eingebaut wurden, was zu einer um 2 m/z größeren Masse des
zugehörigen Molpeaks (273 m/z) führte (im Vergleich zu Demethyltexasin, das in Gegenwart von
H216O2 gebildet wurde: 271 m/z). Dieses Ergebnis belegt, dass es sich bei der Daidzein-Umsetzung
durch die AaeAPO um eine echte Peroxygenase-Reaktion handelt, bei der der übertragene Sauerstoff
aus dem Cosubstrat Wasserstoffperoxid stammt.
4.2.8 Enzymatische Transformation - Kinetik
Da die Flavonoid-Hydroxylierungen durch AaeAPO grundsätzlich über längere Zeit (Studen bis Tage)
verliefen, war es äußerst schwierig, kinetische Untersuchungen durchzuführen. Hinzu kam die
Notwendigkeit die Reaktionen in Gegenwart von Vitamin C durchzuführen, um unerwünschte
Kopplungsreaktionen zu unterbinden (siehe Abschnitt 4.2.1). Die gewonnenen Daten sind deshalb in
doppelter Hinsicht als „scheinbare“ kinetische Konstanten (apparent kinetic constants) zu aufzufassen
[vgl. auch Kluge et al 2008, Kinne et al. 2009]. Nichtdestotrotz liefern sie wichtige Hinweise zur
Katalyse und erlauben es, die katalytische Effizienz größenordnungsmäßig einzuordnen.
Als ein gut umzusetzendes Substrat wurde Apigenin ausgewählt. Die Substratkonzentration wurde
zwischen 5 und 500 μM variiert und die Umsetzungen bei drei Wasserstoffperoxid-Konzentrationen
(1,8 mM, 2,0 mM, 2,2 mM) betrachtet. Die Substratabnahme wurde mittels HPLC analytisch verfolgt.
Die apparenten kinetischen Konstanten wurden mit dem Programm Sigma Plot 11.0 (Enzyme Kinetics
1.3) berechnet und sind der nachfolgenden Tabelle zu entnehmen.
Tabelle 31: Die apparenten kinetische Konstanten der AaeAPO für Apigenin
Wasserstoffperoxidkonzentration [mM]
1,8
2,0
2,2
Michaelis-Menten-Konstante (Km-Wert) [μM]
177
290
255
Max. Reaktionsgeschwindigkeit (vmax) [μΜ/s]
6,5
14,8
7,3
Wechselzahl (kcat) [1/s]
12
26
13
67,80 × 103
89,66 × 103
50,98 × 103
Katalytische Effizienz (kcat/Km) [1/Ms]
Trotzdem die ermittelten Werte erheblichen Schwankungen unterliegen, können Durchschnittwerte
berechnet werden (Km 240 µM, kcat 17 s-1, kcat/Km 7,0 × 104 M-1 s-1), die eine größenordnungsmäßige
Einordnung der Apigenin-Umsetzung im Vergleich zu anderen Substraten erlauben. So liegt die
katalytische Effizienz der AaeAPO für Apigenin zwischen den Werten für klassische Peroxidase- und
Peroxygenase-Substrate wie 2,6-Dimethoxyphenol (DMP; kcat/Km= 3,61 × 105 s-1 M-1) bzw.
94
Naphthalin (kcat/Km= 5,17 × 105 s-1 M-1) und der N-Oxidation von Pyridin (kcat/Km= 3,04 × 103 s-1 M-1)
[Ullrich et al., 2008, Kluge et al., 2008].
Abbildung 45: Apparente Michaelis-Menten-Kinetik für Apigenin (Wasserstoffperoxidkonzentration
2,0 mM); x-Achse: Substatkonzentration, y-Achse: Reaktionsgeschwindigkeit.
Ein detaillierter Vergleich mit den kinetischen Daten der AaeAPO für verschiedene Substrate ist der
Tabelle 32 zu entnehmen.
Tabelle 32: Katalytische Konstanten verschiedener AaeAPO-katalysierter Substrat-Umsetzungen im
Vergleich zur Apigenin-Umsetzung
Substrat/Produkt
Acetanilid/Acetaminophen
Km [µM]
1310
kcat [1/s]
1925
kcat/Km [1/M s]
1,5 × 106
Ethylbenzol/(R)-1-Phenylethanol
694
409
5,9 × 105
Naphthalin/1-Naphthol
320
166
5,2 × 105
Methyl-3,4-dimethoxybenzylether/3,4Dimethoxybenzaldehyd
Propylbenzol/(R)-1-Phenylpropanol
1430
720
5,0 × 105
480
194
4,1 × 105
2,6-DMP/Coeruglinon
298
108
3,6 × 105
1,4-Dimethoxybenzol/4-Methoxyphenol
360
106
2,9 × 105
Benzylalkohol/Benzaldehyd, Benzoesäure
1001
269
2,7 × 105
Propranolol/5-Hydroxypropranolol
442
59
1,3 × 105
Referenz
PorajKobielska
et al.,
2011
Kluge et
al., 2012
Kluge et
al., 2007
Kinne,
2010
Kluge et
al., 2012
Ullrich et
al., 2004
Kinne,
2010
Ullrich et
al., 2004
PorajKobielska
et al., 2011
95
Substrat/Produkt
Apigenin/6-Hydroxyapigenin
Veratrylalkohol/Veratrylaldehyd
Km [µM]
240
2367
kcat [1/s]
17
85
kcat/Km [1/M s]
7,0 × 104
3,6 × 104
3226
96
3,0 × 104
69
0,21
3,0 × 103
18400
37
2,0 × 103
Tetrahydrofuran/4-Hydroxybutanal
Pyridin/Pyridin-N-oxid
Cyclohexan/Cyclohexanol
Referenz
hier
Ullrich et
al., 2004
Kinne,
2010
Ullrich et
al., 2008
Peter et
al., 2011
Es ist ebenfalls interessant, diese kinetischen Parameter mit denen von funktionell ähnlichen Enzymen
zu vergleichen. Einige P450-Enzyme, die Flavonoide hydroxylieren (wie z. B. CYP105D aus
Streptomyces avermitilis), binden diese zwar mit höherer Affinität (Km-Werte um 20 μM), weisen aber
deutlich kleinere kcat-Werte und geringere katalytische Effizienzen auf (< 1 s-1 bzw. < 1,5 × 104 M-1
s-1) [Pandey et al., 2010; Gradolatto et al., 2004].
4.3 Untersuchung flavonoidhaltiger Pflanzenextrakte
4.3.1 Extraktherstellung
4.3.1.1
Beschleunigte Lösungsmittelextraktion (ASE)
Zur Extraktion der pflanzlichen Materialien wurde reines Ethanol oder ein Wasser-Ethanol-Gemisch
(50/50 v/v) eingesetzt. Die Extraktionstemperatur wurde zwischen 40 °C und 100 °C variiert. Die
statische Phase betrug in den meisten Versuchen 5 Minuten. Bei 60 °C wurde die statische Phase auf
20 Minuten verlängert. Weitere Parameter können der unten aufgeführten Tabelle entnommen werden.
Tabelle 33: Konstante Parameter der ASE-Extraktion
Vorheizen
1 min
Heizphase
5 min
Spülvolumen
120 %
Stickstoff-Spülzeit
100 s
Zyklen
3
Druck
1500 psi
4.3.1.2
Mikrowellenextraktion
Die Mikrowellenextraktion wurde als zweifache Extraktion durchgeführt. Konstante Parameter waren
die Einstrahlzeit, die Masse der Probe (50,17 g ± 0,65 g), Volumen und Art des Lösemittels (saures
Ethanol, sEtOH), der Druck (Normaldruck), die Anzahl der Wiederholungen (2) und die
Rührgeschwindigkeit. Zu den variierten Parametern gehörten Temperatur und Leistung (siehe
Tabelle).
96
Tabelle 34: Variierte Parameter der Mikrowellenextraktion
Temperatur [°C] Leistung [W]
40
360
50
600
60
600
70
600
80
700
90
800
100
905
4.3.1.3
Die Ultraschallextraktion wurde ebenfalls als zweifache Extraktion durchgeführt. Die konstanten
Parameter waren die Beschallungszeit, die Leistung, die Masse der Probe (50,04 g ± 0,11 g), das
Volumen des Lösemittels, der Druck (Normaldruck), die Anzahl der Wiederholungen (2) und die
Rührgeschwindigkeit. Zu den variierten Parametern gehörten Temperatur und Art des Lösemittels
(siehe Tabelle).
Tabelle 35: Variierte Parameter der Ultraschallextraktion.
Extraktionsmittel
Temperatur [°C]
saures EtOH
25
saures EtOH
50
saures EtOH
80
saures EtOH/Glycerin (50/50 v/v)
25
saures EtOH/Glycerin (50/50 v/v)
80
4.3.2 Identifizierung der Inhaltsstoffe
Nach der Extraktion (vgl. Kapitel 3.7 sowie 4.3.1) wurden die erhaltenen Phytoextrakte mittels HPLC
hinsichtlich ihres Gehalts an polyphenolischen Verbindungen analysiert. Zur Identifizierung und
Quantifizierung möglicher Inhaltsstoffe wurden folgende Standardverbindungen (gelöst in Methanol)
verwendet: Idaeinchlorid (0,25 mg/ml), Delphinidinchlorid (0,5 mg/ml), Cyanidinchlorid (1,0 mg/ml),
Chlorogensäure (1,0 mg/ml), Quercetin (1,0 mg/ml) und Eriodictyol (1,0 mg/ml).
4.3.2.1
Aroniabeeren-Extrakte
Zur Analyse wurde einer L-Column ODS Säule (25 cm, 4,5 mm, 5 μm, 12 nm; Fa. CERI, Japan) bei
einer Temperatur von 40 °C verwendet. Als mobile Phase diente ein Eluentengemisch, das unter
folgendem Gradienten gefahren wurde (Flussrate: 1,2 ml/min):
Tabelle 36: Gradientenmethode – Anthocyane
Eluent A: 8 Vol.-% Acetonitril, 0,05 M Phosphatpuffer (pH 2,1)
Eluent B: Acetonitril.
97
Zeit [min] Eluent A [%] Eluent B [%]
0
95
5
7,5
87
13
8,5
84
16
10
85
15
20
75
25
22
95
5
25
95
5
Zur Detektion wurde ein Diodenarray-Detektor benutzt (Scanbereich 200 bis 800 nm, Datenintervall 4
nm). Die Absorption (Chromatogramme) wurde bei folgenden Wellenlängen aufgezeichnet: 287 nm
(Eriodictyol), 326 nm (Chlorogensäure), 370 nm (Quercetin), 528 nm (Anthocyane). Zusätzlich
wurden die Extrakte mittels HPLC-MS (Methode 2) vermessen. Die Ergebnisse sind den Abbildungen
46 - 48 sowie der Tabelle 37 zu entnehmen.
Abbildung 46: HPLC-Elutionsprofil des Aronia-Extraktes (Mikrowellenextraktion, 50 ºC).
Absorption bei 287 nm (rote Linie), 326 nm (schwarze Linie), 370 nm (orange Linie) und bei 528 nm
(grüne Linie). Peakzuordnung: (1) Idaeinchlorid, (2) Anthocyanidinglykosid, (3) polyphenolische Säure,
(4) Delphinidinchlorid, (5) Cyanidinchlorid, (6) Chlorogensäure, (7) Eriodictyol, (8) Quercetin.
98
Abbildung 47: HPLC-Elutionsprofil des Aronia-Extraktes (Ultraschallextraktion, US4).
Absorption bei 287 nm (rote Linie), 326 nm (schwarze Linie), 370 nm (orange Linie) und 528 nm (grüne
Linie). Peakzuordnung: (1) Idaeinchlorid, (2) Anthocyanidinglykosid, (3) polyphenolische Säure, (4)
Delphinidinchlorid, (5) Cyanidinchlorid, (6) Chlorogensäure, (7) Eriodictyol, (8) Quercetin.
Abbildung 48: HPLC-Elutionsprofil des Aronia-Extraktes (Ultraschallextraktion, US5).
Absorption bei 287 nm (rote Linie), 326 nm (schwarze Linie), 370 nm (orange Linie) und bei 528 nm
(grüne Linie). Peakzuordnung: (1) Idaeinchlorid, (2) Anthocyanidinglykosid, (3) polyphenolische Säure,
(4) Delphinidinchlorid, (5) Cyanidinchlorid, (6) Chlorogensäure, (7) Eriodictyol, (8) Quercetin.
Wie die Abbildungen 46 - 48 zeigen, konnten in allen Extrakten Idaeinchlorid, Delphinidinchlorid,
Cyanidinchlorid, Chlorogensäure, Quercetin und Eriodictyol identifiziert werden.
99
Tabelle 37: Analytische Daten zu den Aronia-Extrakten;
MW - Mikrowellenextraktion (50 ºC, sEtOH), US4 - Ultraschallextraktion (25 ºC, sEtOH/Glycerin), US5 Ultraschallextraktion (80 ºC, sEtOH/Glycerin), tR - Retentionszeit
Nr. tR [min]
1
5,5
UV–Vis, λmax [nm]
235, 280, 517
Molpeak
[M-Cl] 449
2
6,7
235, 280, 518
[M-Cl] 419
3
7,8
243, 300sh, 326
4
8,1
279, 518
[M-CH3+H]+
419
[M-Cl] 303
5
10,6
236, 275, 525
[M-Cl] 287
6
11,1
242, 300sh, 327
7
22,0
228, 288
[M-CH3+H]+
369
[M+H]+ 289
8
22,9
208, 254, 371
[M+H]+ 303
Methode
MW, US4,
US5
MW, US4,
US5
MW, US4,
US5
MW, US4,
US5
MW, US4,
US5
MW, US4,
US5
MW, US4,
US5
MW, US4,
US5
Verbindung
Idaeinchlorid
Anthocyanidinglykosid
polyphenolische Säure
Delphinidinchlorid
Cyanidinchlorid
Chlorogensäure
Eriodictyol
Quercetin
Die Peaks Nr. 2 und 3 konnten wegen fehlender Standardverbindungen nicht identifiziert, aber
aufgrund der UV-Vis-Spektren, der Molpeaks (MS) sowie der Retentionszeiten bestimmten
Stoffgruppen zugeordnet werden. Die quantitative Analyse der Phytoextrakte bezüglich der
untersuchten Verbindungen ergab folgendes Ergebnis:
Tabelle 38: Aronia-Extrakte - Konzentration der häufigsten Polyphenole.
Ex (Extrakte): 2be – Mikrowellenextrakt aus Aroniabeeren (50 ºC, sEtOH), US4 – Ultraschallextrakt aus
Aroniabeeren (25 ºC, sEtOH/Glycerin), US5 – Ultraschallextrakt aus Aroniabeeren (80 ºC,
sEtOH/Glycerin).
Ex
Konz.
Idaein [mg/l] Delphinidin
[Vol.-%]
Cyanidin
Chlorogensäure Eriodictyol
Quercetin
[mg/l]
[mg/l]
[mg/l]
[mg/l]
[mg/l]
2be
100
1875
43
3,6
293
6,4
14
US4
100
2096
48
29
514
19
49
US5
100
2175
50
39
644
13
52
2be
1
19
0,4
0,0
2,9
0,1
0,1
2be
2
38
0,9
0,1
5,9
0,1
0,3
2be
3
56
1,3
0,1
8,8
0,2
0,4
US4
1
21
0,5
0,3
5,1
0,2
0,5
US4
3
63
1,4
0,9
15
0,6
1,5
US5
1
22
0,5
0,4
6,4
0,1
0,5
US5
3
65
1,5
1,2
19
0,4
1,6
100
4.3.2.2
Erdbeerblätter-Extrakte
Laut Literatur enthalten Erdbeerblätter (Fragaria spp.) die Wirkstoffe Kämpferol, Quercetin und
Cyanidin sowie deren Glykoside, Catechin, Gerbstoffe und Vitamin C [Creasy et al., 1964]. Die
Fragaria-Extrakte wurden sowohl mittels HPLC-DAD (Methode 4) als auch mittels HPLC-MS
(Methode 2) vermessen. Die Ergebnisse sind den Abbildungen 49 - 50 (Strukturvorschläge erfolgten
auf Grundlage der MS- und UV-Vis-Daten) sowie der Tabelle 39 zu entnehmen.
Tabelle 39: Analytische Daten der Erdbeerblätter-Extrakte; WE - Wasser/ethanolisch, E - ethanolisch, tR
- Retentionszeit.
Nr. tR
[min]
1
6,7
UV –Vis, λmax
[nm]
222, 276, 563
Molpeak Methode postulierte Verbindung
[M+H]+
318
E, WE
Petunidin
2
7,2
251, 296, 358
434
E, WE
Pelargonidin-3-O-D-galactosid
3
7,5
242, 372
465
E, WE
Quercetin-3-O-D-glucosid
4
8,0
256, 356
479
E
Isorhamnetin-3-O-D-galactosid
5
8,3
226, 306, 561
464
E, WE
Peonidin-3-O-D-glucosid
6
8,6
222, 266, 560
596
E
Cyanidin-3-O-(6''-O-p-Cumaroyl)glucosid
7
8,9
256, 357
479
E, WE
Isorhamnetin-3-O-D-glucosid
Abbildung 49: Erdbeerblätterextrakt: (ethanolisch):
1 - Petunidin, 2 - Pelargonidin-3-O-D-galactosid, 3 - Quercetin-3-O-D-glucosid, 4 - Isorhamnetin-3-O-Dgalactosid 5 - Peonidin-3-O-D-glucosid, 6 - Cyanidin-3-O-(6''-O-p-Coumaroyl)-glucosid, 7 Isorhamnetin-3O-D-glucosid
101
Quercetin- und Cyanidinglycoside sowie Hinweise auf andere Derivate konnten in den Extrakten
ebenfalls gefunden werden. Desweiteren werden Glycoside anderer Flavonoidaglykone (u. a.
Peonidin, Pelargonidin, Isorhamnetin) in den Extrakten vermutet.
Abbildung 50: Erdbeerblätterextrakt: (Wasser/ethanolisch):
1 - Petunidin, 2 - Pelargonidin-3-O-D-galactosid, 3 - Quercetin-3-O-D-glucosid, 4 - Peonidin-3-O-Dglucosid, 5 - Isorhamnetin-3-O-D-glucosid
4.3.2.3
Gänseblümchen-Extrakte
Die Analyse erfolgte mittels Methode 2. Die Ergebnisse sind den Abbildungen 51-52 (Vorschläge
anhand der MS- und UV-Vis-Daten) sowie der Tabelle 40 zu entnehmen.
Tabelle 40: Analytische Daten der Bellis-perennis-Extrakte. ; WE - Wasser/ethanolisch, E - ethanolisch, tR
- Retentionszeit.
PeakNr.
1
tR
[min]
7,6
UV - Vis
[nm]
252, 330
Molpeak Methode Verbindung (Vorschlag)
[M+H]+
625
E, WE
Isorhamnetinglucosidrhamnosid
2
7,9
255, 350
479
E, WE
Isorhamnetin-3-O-D-galactosid
3
8,2
250, 350
521
E, WE
Isorhamnetin-3-O-D-(6''-acetyl)galactosid
4
8,7
255, 353
493
E, WE
Kämpferol-3',5'-dimethylether-3-glucosid
5
8,9
254, 340
565
E, WE
Isorhamnetin-3-(6''-malonylglucosid)
6
9,0
267, 337
447
E, WE
Apigenin-7-O-D-glucuronid
102
PeakNr.
7
tR
[min]
9,5
UV - Vis
[nm]
252, 362
[M+H]+
331
WE
Quercetin-3,3'-dimethylether
8
10,2
267, 335
489
WE
9
10,3
268, 335
271
E, WE
10
10,4
267, 335
489
WE
Apigenin-4'-methylether-7-(6''acetylgalactosid)
Apigenin
Apigenin-4'-methylether-7-(6''acetylglucosid)
Abbildung 51: Gänseblümchenextrakt (Wasser/ethanolisch):
1 - Isorhamnetinglucosidrhamnosid, 2 - Isorhamnetin-3-O-D-galactosid, 3 - Isorhamnetin-3-O-D-(6''acetyl)galactosid, 4 - Kämpferol-3',5'-dimethylether-3-glucosid, 5 - Isorhamnetin-3-(6''-malonylglucosid),
6 - Apigenin-7-O-D-glucuronid, 7 - Quercetin-3,3'-dimethylether, 8 - Apigenin-4'-methylether-7-(6''acetylgalactosid), 9 - Apigenin, 10 - Apigenin-4'-methylether-7-(6''-acetylglucosid).
In den Extrakten aus Bellis perennis wurden alle in der Literatur [Nazuruk et. al, 2001; Hagenmeyer et
al., 2006] beschriebenen Flavonoide identifiziert (Apigenin, Apigeninglykoside, Kämpferolglykoside,
Isorhamnetinglykoside, Quercetin).
103
Abbildung 52: Gänseblümchen-Extrakt (ethanolisch):
1 - Isorhamnetinglucosidrhamnosid, 2 - Isorhamnetin-3-O-D-galactosid, 3 - Isorhamnetin-3-O-D-(6''acetyl)galactosid, 4 - Kämpferol-3',5'-dimethylether-3-glucosid, 5 - Isorhamnetin-3-(6''-malonylglucosid),
6 - Apigenin-7-O-D-glucuronid, 7 - Apigenin
4.3.2.4
Rotklee-Extrakte
Die Analyse erfolgte mittels Methode 2. Die Ergebnisse sind den Abbildungen 53-54 (Vorschläge
anhand der MS-, UV-Vis-Daten) sowie der Tabelle 41 zu entnehmen.
Tabelle 41: Analytische Daten der Rotklee-Extrakte; WE - Wasser/ethanolisch, E - ethanolisch, sh –
Schulter im UV-Vis-Spektrum
Nr. tR
[min]
1
6,4
UV - Vis
[nm]
218, 278
[M+H]+
367
E, WE
Kämpferolsulfat
2
6,8
257, 562, 670 433
E, WE
Flavonoidglykosid
3
7,1
268, 321
437
WE
Epitaxifolin-3-xylosid
4
7,6
255, 354
465
E, WE
Hyperosid, Isoquercitrin
5
7,8
264, 346
449
E, WE
Kämpferol-3-O-D-glucosid
6
8,2
254, 561
637
WE
Irisolon-4'-O-glucosylglucosid
7
8,4
257, 302sh
431
WE
Ononin
8
8,6
255, 348
535
WE
Isorhamnetin-3-glucuronid-7-sulfat
9
8,8
263, 336
535
E, WE
Kämpferol-3-(6''-malonylglycosid)
10
9,1
259, 329sh
447
WE
Sissostrin
104
Nr. tR
[min]
11 9,4
UV - Vis
[nm]
262, 328
[M+H]+
535
E, WE
Quercetin-7,3'-dimethylether-3-(6''acetylglucosid)
12
9,5
259, 310sh
517
E, WE
Formononetin-7-O-glucosid-6''-malonat
13
10,1
268, 557
547
WE
Afrormonin-7-O-D-(6''-malonylglucosid)
14
10,4
259, 328sh
271
E, WE
Genistein
15
10,6
259, 322sh
533
E, WE
4-Hydroxyrottlerin
16
11,4
224, 293, 557 283
WE
Pseudobaptigenin
17
11,6
248, 299
269
E, WE
Formononetin
18
12,6
220, 269
299
WE
5-O-Methylbiochanin
19
13,5
260, 322sh
285
E, WE
Homopterocarpin
Abbildung 53: Rotklee-Extrakt (Wasser/ethanolisch):
1 - Kämpferolsulfat, 2 - Flavonoidglykosid, 3 - Epitaxifolin-3-xylosid, 4 - Hyperosid/Isoquercitrin, 5 Kämpferol-3-O-D-glucosid, 6 - Irisolon-4'-O-glucosylglucosid, 7 - Ononin, 8 - Isorhamnetin-3-glucuronid7-sulfat, 9 Kämpferol-3-(6''-malonylglycosid), 10 - Sissostrin, 11 - Quercetin-7,3'-dimethylether-3-(6''acetylglucosid), 12 - Formononetin-7-O-glucosid-6''-malonat, 13 - Afrormonin-7-O-D-(6''malonylglucosid), 14 - Genistein, 15 - 4-Hydroxyrottlerin, 16 - Pseudobaptigenin, 17 - Formononetin, 18 5-O-Methylbiochanin, 19 - Homopterocarpin
In den Rotkleeextrakten wurden viele der in der Literatur [Polasek et al., 2007] beschriebenen
Flavonoide identifiziert (Isoflavonoide: Genistein, Genistin, Formononetin, Ononin, Sissotrin,
Pseudobaptigenin; Flavonoide: Quercetin, Hyperosid). Anhand der Analysenergebnisse werden
105
weitere
Inhaltsstoffe
vermutet
(Epitaxifolin-3-xylosid,
Kämpferolderivate,
Irisolon-4'-O-
glucosylglucosid, Isorhamnetinderivate, Afrormonin-7-O-D-(6''-malonylglucosid), 4-Hydroxyrottlerin,
5-O-Methylbiochanin, Homopterocarpin).
Abbildung 54: Rotklee-Extrakt (ethanolisch):
1 - Kämpferolsulfat, 2 - Genistin, 3 - Hyperosid, 4 - Kämpferol-3-O-D-glucosid, 5 - Kämpferol-3-(6''malonylglycosid), 6 - Quercetin-7,3'-dimethylether-3-(6''-acetylglucosid), 7 - Formononetin-7-O-glucosid6''-malonat, 8 - Genistein, 9 - 4-Hydroxyrottlerin, 10 - Formononetin, 11 – Homopterocarpin
4.4 Wirkung
der
polyphenolischen
Phytoextrakte
auf
die
Enzymproduktion
In diesem Kapitel wird der Einfluss der polyphenolischen Phytoextrakte aus einheimischen Pflanzen
auf die Enzymproduktion durch Flüssigkulturen der Pilze Agrocybe aegerita und Bjerkandera adusta
untersucht. Dazu wurden Agrocybe aegerita und Bjerkandera adusta in Gegenwart der o. g. Extrakte
kultiviert und die Enzymbildung verfolgt.
4.4.1 Agrocybe aegerita
A. aegerita wurde im Sojabohnenmehl-Medium (siehe 3.3.2.1, Anhang D) angezogen. Der
Versuchsansatz umfasste 15 (18, 10) Standkolben à 500 ml mit jeweils 200 ml Medium.
106
Die Phytoextrakte wurden am siebten Kulturtag (nach einsetzender Pelletbildung) nach folgendem
Schema zugegeben.
Proben- Nr. Aroniabeeren-Extrakte
Proben-Nr. übrige Extrakte
1
2
3
4
5
6
1
2
3
4
5
Kontrolle (Medium ohne Zusatz)
Medium mit 1 % Extrakt
Medium
mit
3
%
Extrakt
Tabelle 42: Verwendete Phytoextrakte*
Proben-
Extrakte
Nr.
2
3
4
5
6
Aroniabeeren
Erdbeerblätter
Rotklee
Gänseblümchen
2 ml 2be (MAE, 50 °C,
2 ml 60-64 (ASE,
2 ml TE (MAE,
2 ml BE; MAE,
sEtOH)
EtOH)
50 °C, sEtOH)
50°C, sEtOH
4 ml 2be (MAE, 50 °C,
6 ml 60-64 (ASE,
6 ml TE (MAE,
6 ml BE; MAE,
sEtOH)
EtOH)
50 °C, sEtOH)
50°C, sEtOH
6 ml 2be (MAE, 50 °C,
2 ml 65-69 (ASE,
2 ml Bell, Mac.,
2 ml Bell b, Mac.,
sEtOH)
EtOH/H2O 50:50 v/v)
EtOH/H2O)
EtOH/H2O
2 ml US5 (USAE,
6 ml 65-69 (ASE,
6 ml Bell, Mac.,
6 ml Bell b, Mac.,
80°C, sEtOH/Glycerin)
EtOH/H2O 50:50 v/v)
EtOH/H2O)
EtOH/H2O
6 ml US5 (USAE,
* MAE – Mikrowellenextraktion; USAE – Ultraschallextraktion; 2be – Mikrowellenextrakt aus Aroniabeeren, extrahiert bei
50 ºC mittels angesäuertem Ethanol; US4 – Ultraschallextrakt aus Aroniabeeren, extrahiert bei 25 ºC mittels angesäuertem
Ethanol/Glycerin-gemisch; US5 – Ultraschallextrakt aus Aroniabeeren, extrahiert bei 80 ºC mittels angesäuertem
Ethanol/Glyceringemisch
60-64 – ASE-Extrakt aus Erdbeerblättern, extrahiert bei 40, 60, 80 und 100 ºC mittels Ethanol; 65-69 – ASE-Extrakt aus
Erdbeerblättern, extrahiert bei (40, 60, 80 und 100) ºC mittels Ethanol/Wasser
TE – Mikrowellen-Extrakt aus Rotkleeblüten, extrahiert bei 50 ºC mittels angesäuertem Ethanol; Bell – Extrakt aus
Rotkleeblüten, extrahiert bei Raumtemperatur (RT) mittels Ethanol/Wasser (Maceration), bezogen von der Firma Bell
Flavors & Fragrances
BE – Mikrowellen-Extrakt aus Gänseblümchen, extrahiert bei 50 ºC mittels angesäuertem Ethanol; Bell b – Extrakt aus
Gänseblümchenblüten, extrahiert bei RT mittels Ethanol/Wasser (Maceration), bezogen von der Firma Bell Flavors &
Fragrances.
Um die Enzymproduktion zu verfolgen, wurden in gegebenen Abständen Proben (1 ml) steril
entnommen, zentrifugiert und analysiert. A. aegerita produzierte die beiden Enzyme Laccase und
107
AaeAPO. Die Abbildungen, die eine stimulierende bzw. hemmende Wirkung der Extrakte auf die
Aktivitäten der jeweiligen Enzyme zeigen, sind dem Anhang F zu entnehmen.
Aus den Versuchsdaten können folgende Erkenntnisse gewonnen werden: Unabhängig von der
Konzentration führt die Extraktzugabe zur Hemmung der AaeAPO-Bildung (im Fall der FragariaProben 2 und 3 besonders stark ausgeprägt) und zu einer Stimulation der Laccase-Produktion.
Letzteres kann eindeutig auf die Extrakte zurückgeführt werden, da sich mit steigender Extraktmenge
auch die Laccase-Aktivität erhöhte (Aroniabeeren, Trifolium). Tabelle 43 listet die maximalen EnzymAktivitäten für die jeweiligen Proben entsprechend der Kulturtage auf.
Tabelle 43: Maximale Enzymaktivitäten (AaeAPO, Laccase) nach Kulturtagen. (Probenzusammensetzung
siehe vorherige Tabelle)
Proben
1
2
3
4
5
6
21
21; 28
14; 24
21; 30
23; 30
23
1.645±214
534±38
257±38
609±159
1.040±74
242±18
11
17
24
28
17
28
235±19
466±51
607±61
1.270±156
606±18
2.970±1218
33
28; 35
50
33 (26)
33; 35
1.250
534±48
395±21
980±193
659±21
Tag (Laccasemax)
12
14
19; 23
14
14; 16
Laccase [U/l]
552
737
1.119±5
1.229±75
968±112
26; 28
31 (24)
49
28
39; 42
1.758±80
403±20
474±8
739±19
303±30
Tag (Laccasemax)
13; 14
19; 17
19; 17
17
13; 14
Laccase [U/l]
352±68
426±11
2.476±41
906±36
1.411±43
ARONIABEERENEXTRAKTE
Aktivität am
Kulturtag
Tag (AaeAPOmax)
AaeAPO [U/l]
Tag (Laccasemax)
Laccase [U/l]
ERDBEERBLÄTTEREXTRAKTE
Aktivität am
Kulturtag
Tag (AaeAPOmax)
AaeAPO [U/l]
ROTKLEEEXTRAKTE
Aktivität am
Kulturtag
Tag (AaeAPOmax)
AaeAPO [U/l]
108
Proben
1
2
3
4
5
19; 23
14; 16; 19
21; 23
21; 23; 26
21; 23
1.797±108
488±53
560±6
674±28
652±17
19; 21
19
14 (19)
16
19
6
GÄNSEBLÜMCHENEXTRAKTE
Aktivität am
Kulturtag
Tag (AaeAPOmax)
AaeAPO [U/l]
Tag (Laccasemax)
196±101
Laccase [U/l]
13.700±4269 2.650±86 9.222±273 15.601±3022
In wiederholten Versuchen wurden diese Befunde, d. h. eine Hemmung der AaeAPO-Bildung und eine
Stimulation der Laccase-Bildung, bestätigt. Dabei wirkten sich die ethanolischen Extrakte deutlicher
auf die AaeAPO-Hemmung aus als die wässrig-ethanolischen Extrakte. Im Fall der Stimulierung der
Laccase-Bildung ergaben sich erhebliche Unterschiede zwischen den einzelnen Proben, so dass keine
klare Tendenz in Bezug auf den Lösungsmitteleinfluss abgeleitet werden konnte.
4.4.1.1
Lösungsmitteleinfluss (Ethanol)
Im Zuge der Versuche mit dem Südlichem Ackerling (A. aegerita) wurde auch der Einfluss des
Lösungsmittels untersucht. Ethanol wurde an verschiedenen Kulturtagen (nach einsetzender
Pelletbildung) nach folgendem Schema zugegeben.
Proben Nr.
1
2
3
4
5
Medium mit 0,5 % EtOH
Medium mit 1 % EtOH
Medium mit 3 % EtOH
Aae APO Aktivität [U/l]
3000
2500
Aktivität (Zugabe7.Kt.)
2000
1500
1000
500
0
0
0.5
1
1.5
3
Ethanolkonzentration [Vol.-%]
Abbildung 55: AaeAPO-Aktivität in Abhängigkeit von verschiedenen Ethanol-Konzentrationen (Zugabe
an unterschiedlichen Kulturtagen)
109
Lacc Aktivität [U/l]
25000
20000
15000
10000
5000
0
0
0.5
1
1.5
3
Ethanolkonzentration [Vol.-%]
Abbildung 56: Laccase-Aktivität in Abhängigkeit von verschiedenen Ethanol-Konzentrationen (Zugabe
an unterschiedlichen Kulturtagen)
Die Abbildungen (55, 56) zeigen die stimulierende bzw. hemmende Wirkung von Ethanol auf die
Aktivität des jeweiligen Enzyms.
Die Ethanolzugabe führte in den untersuchten Kulturen i.d.R. zu einer Hemmung der AaeAPOProduktion. Ausnahmen bildeten die vier Kulturen, zu denen das Ethanol relativ spät gegeben wurde
(0,5 % EtOH oder 1 % EtOH am 12. Kulturtag sowie 1,5 % oder 3 % EtOH am 20. Tag). Die LaccaseBildung wurde hingegen durch alle ethanolhaltigen Proben stimuliert. Die größte Wirkung erzielte
dabei eine Ethanol-Konzentration von 3 %, die am 12. Kulturtag zugegeben wurde.
Wenn man die Wirkung der polyphenolischen Extrakte mit dem Einfluss von Ethanol (Zugabe in
beiden Fällen am 7. Kulturtag) vegleicht, erkennt man eine ähnliche Tendenz. Ohne Ethanol in den
Extrakten würden die Inhaltsstoffe (inklusive Flavonoide) die Laccase-Bildung im Fall von
Aroniabeeren und Gänseblümchenblüten leicht bzw. deutlich fördern und Erdbeerblätter und
Rotkleeblüten die Produktion des Enzyms hemmen. Die AaeAPO-Bildung scheint durch Aroniabeeren
und Gänseblümchenblüten minimal sowie durch Erdbeerblätter deutlich gefördert zu werden, während
Rotkleeblüten die Produktion des Enzyms negativ beeinflussen. Als potentielle Stimulatien
(Elizitoren) für die AaeAPO- bzw. Laccase-Bildung böten sich folglich Erdbeerblätter-Extrakte und
Bellis-perennis-Inhaltsstoffe an.
4.4.2 Bjerkandera adusta
Die Induktionsversuche mit dem Grauen Rauchporling wurden unter Verwendung der gleichen
Phytoextrakte wie die Versuche mit dem Südlichem Ackerling durchgeführt. Der Pilz wurde im Kirk-
110
Acetat-Medium kultiviert (siehe 3.3.2.2). Der Versuchsansatz umfasste 15 (10) Standkolben à 500 ml
mit jeweils 200 ml Medium. Die Extrakte wurden am achten Kulturtag gemeinsam mit jeweils 2 ml
250 mM Mangan(II)chloridlösung (2,5 mM; zur zusätzlichen Stimulation der Mangan-PeroxidaseBildung) nach einsetzender Pelletbildung entsprechend dem folgenden Schema zugegeben.
Proben-Nr.
1
2
3
4
5
C
Kontrolle A (ohne Extraktzusatz, mit MnCl2)
Medium mit 1% Extrakt
Kontrolle B (Medium ohne jeglichen Zusatz)
Tabelle 44: Verwendete Phytoextrakte (Erklärungen s. Tabelle 41)
Proben-
Extrakte
Nr.
2
3
4
5
Aroniabeeren
Erdbeerblätter
Rotklee
Gänseblümchen
2 ml 2be (MAE, 50 °C,
2 ml 60-64 (ASE,
2 ml TE (MAE,
2 ml BE; MAE,
sEtOH)
EtOH)
50 °C, sEtOH)
50°C, sEtOH
6 ml 2be (MAE, 50 °C,
6 ml 60-64 (ASE,
6 ml TE (MAE,
6 ml BE; MAE,
sEtOH)
EtOH)
50 °C, sEtOH)
50°C, sEtOH
2 ml US5 (USAE,
2 ml 65-69 (ASE,
2 ml Bell, Mac.,
2 ml Bell b, Mac.,
EtOH/H2O 50:50 v/v) EtOH/H2O)
6 ml US5 (USAE,
6 ml 65-69 (ASE,
EtOH/H2O 50:50 v/v) EtOH/H2O)
6 ml Bell, Mac.,
EtOH/H2O
6 ml Bell b, Mac.,
EtOH/H2O
Zum Verfolgen der Enzym-Bildung wurden wie im Abschnitt 4.4.1 beschrieben Proben (1 ml) steril
aus den Kolben entnommen, zentrifugiert und analysiert. B. adusta bildete im Unterschied zu
A. aegerita das Enzym Mangan-Peroxidase (MnP). In der Kontrolle (ohne Extrakte und MnCl2)
wurden MnP-Aktivitäten < 100 U/l gemessen (∅ 23 U/l). Die Abbildungen, die die stimulierende oder
hemmende Wirkung der einzelnen Extrakte auf die Aktivität der MnP belegen, sind dem Anhang F zu
entnehmen.
Die Zugabe von Aroniabeeren-, Erdbeerblätter-, Rotklee- oder Gänseblümchen-Extrakten zum KirkAcetat-Medium wirkte sich in fast allen Fällen mäßig positiv (13-336 %) auf die MnP-Bildung aus
[mit Ausnahme des 3 %igen ethanolischen (-63 %) und 1 %igen wasserethanolischen (-7 %) RotkleeExtraktes]. Dieses Ergebnis konnte in Wiederholungsversuchen bestätigt werden.
Tabelle 45 listet die maximale Enzymaktivität für die jeweiligen Proben entsprechend der Kulturtage
auf.
111
Tabelle 45: Maximale MnP-Aktivitäten an unterschiedlichen Kulturtagen.
Proben
1
2
3
4
5
21
25
28 (21)
28 (21)
21 (32)
659±86
871±76
985±18
824±28
977±84
20 (17)
24
34 (30)
24
24 (26)
600
868±141
1.492±16
733±87
917±23
14
17 (24)
26
24 (26)
24 (26)
790±68 1.137±45
294±65
739±26
895±53
Tag (MnPmax)
34; 36
32; 34
55 (46)
27
27 (39)
MnP [U/l]
622±40
711±26
ARONIABEEREN-EXTRAKTE
Aktivität am Kulturtag
Tag (MnPmax)
MnP [U/l]
ERDBEERBLÄTTER-EXTRAKTE
Tag (MnPmax)
MnP [U/l]
ROTKLEE-EXTRAKTE
Tag (MnPmax)
MnP [U/l]
GÄNSEBLÜMCHEN-EXTRAKTE
1.187±43 2.088±295 1.367±144
Die Erhöhung der Extraktkonzentration von 1 % auf 3 % (Aronia melanocarpa; Fragaria ananassa)
führte zu einer Verstärkung des stimulierenden Effekts um jeweils 13 %, 19 %, 72 % und 25 %. Die
Gänseblümchen-Extrakte bewirkten unabhängig von der Extraktkonzentration ein verzögertes
Erreichen des MnP-Aktivitätsmaximums.
4.4.2.1
Lösungsmitteleinfluss (Ethanol)
Auch im Fall des Grauen Rauchporlings wurde der Einfluss des Lösungsmittels Ethanol untersucht.
Ethanol wurde am achten Kulturtag (nach beginnender Pelletbildung) laut nachfolgendem Schema
zugegeben.
Proben-Nr.
1
2
3
4
5
Medium mit 1 % EtOH
Medium mit 3 % EtOH
Ethanol beeinflusste die Produktion von Mangan-Peroxidase insgesamt nur geringfügig; höhere
Ethanol-Konzentrationen führten zu einem verzögerten Erreichen des MnP-Aktivitätsmaximums.
112
Tabelle 46 listet die maximalen Enzymaktivitäten für die jeweiligen Proben entsprechend der
Kulturtage auf.
Tabelle 46: Maximale Aktivität der MnP nach unterschiedlichen Kulturtagen
Proben
1
2
3
4
5
0,0
0,5
1,0
1,5
3,0
Tag (MnPmax)
34; 36
32
32
39; 43
55
MnP [U/l]
622±40 806±47 390±23 761±234 873±259
Ethanol-Konzentration [Vol.-%]
4.4.3 Vergleichende Diskussion der Induktionsversuche
Im Rahmen der Dissertation wurde der Einfluss polyphenolischer Phytoextrakte aus einheimischen
Pflanzen auf die Enzymproduktion in Flüssigkulturen der Pilze Agrocybe aegerita sowie Bjerkandera
adusta untersucht. Die nachfolgende Tabelle fasst die Ergebnise summarisch zusammen.
Tabelle 47: Übersicht zur Wirkung der Phytoextrakte und des Lösungsmittels Ethanol auf die
Enzymbildung (AaeAPO, Laccase, MnP)
Enzyme
Aroniaextrakte
Erdbeerbläterextrakte
Rotkleeextrakte
Gäseblüchenextakte
Ethanol
AaeAPO
HEMMUNG
mäßige Hem.
Laccase
MnP
STIMULIERUNG
MÄßIGE STIMULIERUNG
kein Einfluss
Zusammenfassend kann festgestellt werden, dass die Phytoextrakte die AaeAPO-Bildung hemmen, die
Laccase-Produktion deutlich und die MnP-Bildung mäßig stimulieren. Im Fall der AaeAPO und
Laccase weisen die Ergebnisse auf eine zusätzliche hemmende bzw. stumulierende Wirkung von
Ethanol hin; das Aktivitätsprofil der MnP wird durch Ethanol kaum beeinflusst.
Die Stimulation und Induktion von Laccasen (kupferhaltige Diphenol-Oxidasen; EC 1.10.3.2) ist gut
untersucht. Der bekannteste Induktor – Kupfer in Form von Cu2+ – reguliert positiv die Transkription
der Gene poxa1b sowie poxc (Phenol-Oxidasen) im Austernseitling (Pleurotus ostreatus), wodurch die
Enzymsynthese und -sekretion gesteigert wird [Palmieri et al., 2000]. In ähnlicher Weise verhalten
sich andere holzzerstörende Pilze wie Trametes versicolor [Collins et al., 1997], Trametes pubescens
(lap2) [Galhaup et al., 2002], Phanerochaete chrysosporium [Dittmer et al., 1997] und Coriolopsis
rigida [Saparrat et al., 2002] sowie der phytopathogene Schlauchpilz Botryosphaeria rhodina MAMB05 [Dekker et al., 2007]. Für den Porling Trametes trogii wurde gezeigt, dass neben der Laccase- auch
die MnP-Bildung durch Zusatz von CuSO4 stimmuliert werden kann [Levin et al., 2002]. Außer
Kupfer bewirken auch andere anorganische und organische Substanzen eine Stimulation der Laccase-
113
Produktion, u. a.: MnSO4, FeCl3, ZnSO4, Veratrylalkohol, Vanillinsäure, Ferulasäure [Palmieri et al.,
2000], CaCl2 (bei Cryphonectria parasitica, Kalziumschock), LiCl (bei Rhizoctonia solani, als CaIonophor), Koffein [Crove et al., 2001] und andere Verbindungen. Man geht davon aus, dass Laccasen
in Pflanzen und Mikroorganismen unspezifisch als Stressantwort auf unterschiedliche externe Stimuli
gebildet werden [Baldrian, 2006, Mayer & Staples, 2002]. Auch die Wirkung von Lösungsmitteln
kann als Stressfaktor aufgefasst werden; so wirkten Ethanol und Isopropanol stimulierend auf die
Laccase-Bildung durch den anamorphen Basidiomyceten Rhizoctonia solani. Es wird angenommen,
dass solche Lösungsmittel Membranen und Membranproteine destabilisieren [Ingram & Buttke,
1984], was eine ähnliche zelluläre Reaktion im Pilz wie ein Hitzeschock zur Folge hat [Piper et al.,
1995]. Hitzeschock-regulierte Laccase- und Peroxidasegene sind für verschiedene Pilze beschrieben
worden [Li et al., 1995; Saloheimo et al., 1991].
Die stimmuliereunde Wirkung von Phenolen und aromatischen Aminen (p-Cresol, o-Toluidin) auf die
Laccase-Bildung durch Neurospora crassa wurde auf eine indirekte Beeinflussung der
Proteinsynthese zurückgeführt [Froehner & Eriksson, 1974]. Einige phenolische Verbindungen wie
3,5-Dihydroxytoluol oder Guaiacol können sogar das Verhältnis einzelner Laccase-Isoenzyme
regulieren (Laccase A, Laccase B in Trametes sp.) [Xiao et al., 2004]. Die hier beobachtete Anregung
der Laccase-Sekretion in A. aegerita als Antwort auf die phenolischen Inhaltsstoffe (Flavonoide) der
Phytoextrakte passt folglich gut in das bestehende Bild.
Eine Induktion der Peroxygenase-Bildung (einschl. AaeAPO) in Pilzen ist bisher nur für Sojabohnen
sowie deren Bestandteile und Spaltprodukte (Pepton) beschrieben worden [Ullrich et al., 2004, Anh et
al., 2007, Gröbe et al., 2011]. Der physiologische und molekulare Hintergrund dieses Phänomäns ist
noch nicht verstanden; Flavonoide (z. B. Genistein) [Mirzaei et al., 2012] scheiden aber offensichtlich
als Induktoren aus und führen eher, wie in der vorliegenden Arbeit gezeigt, zu einer Hemmung der
Peroxygenase-Bildung. Cytochrom-P450-Enzyme reagieren in vielfältiger Weise auf externe
chemische Stimuli wie Lösungsmittel oder aromatische Verbindungen [Peters et al., 2009, Hukkanen,
2012]. Im Fall von CYP2B4 wurde nachgewiesen, dass Ethanol und 3-Methylcholanthren als
Inhibitoren der enzymatischen Aktivität fungieren [Hlavica & Künzel-Mulas, 1993].
Die MnP-Bildung wurde in dem Weifäulepilz Phanerochaete chrysosporium durch Zugabe von
Mn(II)-Salzen [Murayama et al., 2009] sowie die Auswahl einer geeigneten N-Quelle (75 mg/l
NH4NO3, 150 mg/l L-Asparagin) [Krčmář et al., 1994] stimuliert. Polymere Ligninfraktionen erhöhten
die MnP-Aktivität in Panus tigrinus 8/18 [Leonťevskii et al., 1991], P. chrysosporium [Murayama et
al., 2009] und Dichomitus squalens [Pavko & Novotný, 2008]. Schwermetalle in Form von Kadmiumoder Kobaltsalzen (Cd2+, Co2+) hemmen die MnP-Aktivität auf Proteinebene. Sie wirken dabei als
kompetetive Inhibitoren und verhindern die Oxidation der Mn2+-Ionen [Harris et al., 1991, Youngs et
al., 2000]. Auch phenolische Substanzen und Pflanzeninhaltsstoffe beeinflussen das Aktivitätsprofil
der MnP, wobei sowohl positive als auch negative Befunde publiziert wurden [Hofrichter, 2002].
114
Ausblick
5 Ausblick
In der vorliegenden Arbeit wurden 57 Flavonoide unterschiedlicher Struktur und aus verschiedenen
Subklassen hinsichtlich ihrer Umsetzbarkeit durch eine pilzliche Peroxygenase (AaeAPO) untersucht.
Dabei wurden funktionelle Gruppen/Substituenten und Positionen identifiziert, die die Umsetzung
störten oder vollständig verhinderten. Dieser Ansatz könnte in zukünftigen Studien weiterverfolgt und
auf bisher nicht berücksichtigte Strukturen ausgedehnt werden (z. B. Cumarin- und Biphenylderivate).
Während der Biotransformationen entstanden z. T. Produkte, die nicht eindeutig identifiziert und
lediglich anhand ihrer Retentionszeiten (tR) sowie UV-Vis- und MS-Spektren beschrieben werden
konnten. Mittels einer erweiterten Palette an Standardsubstanzen, die speziell synthetisiert werden
müssten sowie durch eine verstärkte Nutzung der NMR-Analytik könnte diese Wissenslücke zeitnah
geschlossen werden. In diesem Zusammenhang steht die enzymatische Synthese größerer Mengen
spezifisch hydroxylierter Flavonoide, die hinsichtlich Umsatz und Ausbeute (einschl. Minimierung der
Reinigungsverluste) zu optimieren wäre. Ein Weg dorthin könnte im wiederholten Einsatz des Enzyms
liegen (z. B. durch Immobilisierung, Verwendung von Membranmodulen) sowie in der generellen
Erhöhung der Raum-Zeit-Ausbeute (u. a. durch Erhöhung der Ausgangsmenge an Substrat). Das
Problem der begrenzten Umsetzung von Flavonoidglykosiden könnte zukünftig durch den Einsatz von
Enzym-Cocktails, die neben unterschiedlichen Peroxygenasen auch Zucker abspaltende Enzyme
(Glykosidasen) enthalten, gelöst werden.
Weiterführende Untersuchungen zur Stimulation und Hemmung der Enzymbildung durch Pilze sollte
sich auf die Fraktionierung phenolischer und anderer Pflanzeninhaltsstoffe konzentrieren, um die
summarischen Effekte der einzelnen Komponenten eingrenzen und besser unterscheiden zu können.
Nicht zuletzt sollten solche Untersuchungen auf moderne molekularbiologische Methoden
zurückgreifen, die helfen können, die Targets und Pfade der Induktionskaskaden zu identifizieren.
Abschließend möchte ich ein recht ungewöhnliches Gebet erwähnen, auf das ich im Zuge meiner
Literaturrecherchen zum Thema „Weiße Biotechnologie“ gestoßen bin:
The Chemist’s Perspective
Oh Lord, I fall upon my knees
And pray that all my syntheses
Will no longer seem inferior
To those conducted by bacteria and fungi.
Organic Chemist’s Prayer (unknown origin)
Es ist unbestritten, dass die industrielle Biotechnologie dank verbesserter Verfahren dazu beiträgt,
„schmutzige“ Prozesse schrittweise zu ersetzen und so die Umwelt zu entlasten. Nur zwei Beispiele
115
Ausblick
seien in diesem Zusammenhang genannt: erstens Waschmittel-Enzyme, die bei 40 °C statt 60 °C ihre
volle Aktivität entfalten, was einer Ersparnis von einer Million Tonnen Kohlendioxid jährlich allein in
Deutschland entspricht [BMBF, 2012], und zweitens das Futtermittelenzym Phytase, das durch
Freisetzung von organisch gebundenem Phosphat für eine bessere Verfügbarkeit des natürlich
vorhandenen Phosphors im Getreide sorgt (100 g der Enzymformulierung helfen über 6 kg
Calciumphosphat zu sparen) [Balkenhohl, 2006]. Die biotechnologischen Verfahren sind aber nicht
per se den (klassischen) chemischen Verfahren überlegen - weder wirtschaftlich noch ökologisch. Es
ist eher so, dass die Biotechnologie zusätzliche und/oder ergänzende Produktionswege zur
herkömmlichen Chemie bietet. In jedem Einzelfall muss deshalb geprüft werden, welches Verfahren
hinsichtlich Kosten, Energieverbrauch, Ressourcenschonung und Emissionen das bessere ist und ob es
nicht möglich ist, Biotechnologie und Chemie in geeigneter Weise miteinander zu kombinieren
[Garthoff, 2006].
Und wer wird das Rennen im Fall der Flavonoide machen? Die Schlüsselfrage hierbei – wie auch in
anderen Bereichen der Weißen Biotechnologie – ist: Wird es zukünftig gelingen die avisierten
Biokatalysatoren (Enzyme) tatsächlich großtechnisch, d. h. im Tonnen-Maßstab, herzustellen?
116
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135
Anhang
Anhang
Anhang A: Shikimisäureweg
Anhang B: Proanthocyanidin-Biosynthese
Anhang C: Bestimmung enzymatischer Aktivitäten
Anhang D: Enzymgewinnung – AaeAPO
Anhang E: Synthese von 4`,6-Dihydroxyflavanon
Anhang
F:
Wirkung
der
polyphenolischen
Enzymproduktion (Abbildungen)
Danksagung
Versicherung an Eides statt
Thesen
Phytoextrakte
auf
die
Anhang
Anhang A: Shikimisäureweg
2-
O3 PO
O
-OOC O
HO COO2
1
OH
H H
+
3
H
O
NAD
HO H
OH
2
2H OH
- NADH O
OH - H2 O
OPO3 - PO 33H OH
4
H
O
Erythrose-42- - PO 4
OPO3
phosphat
3-Dehydrochinat
2-Keto-3-desoxy-arabinoheptulosonat-7-phosphat
+ H
H
COO-
Phosphoenolpyruvat
COO-
4
NADPH+H+
COO-
OH - H2 O
OH
- ADP
Shikimat
+
OH
O
5
ATP
COO-
- NADP
2-
HO
OH
3-Dehydroshikimat
COO-
8
O COO- - PO4
OH
5-Enoylpyruvatshikimat-3-phosphat
3-
OH
11
COO- Glu
OH
Tyrosin
O COO-
Chorismat
+
NAD
O
NH2
OH
-OOC
COO-
O3 PO
OH
COO-
- NADH
- CO2
-α-KG OH
4'-Hydroxyphenylpyruvat
O3 PO
6
COO3-
- PO4
Shikimat-3-phosphat
7
2-
O3 PO
2-
9
COOO
OH
Prephenat
10
- CO2
O
- H2O
COO12
Phenylpyruvat
Glu
-α-KG
NH2
COO-
Phenylalanin
Abbildung: Shikimisäureweg zur Synthese aromatischer Aminosäuren [Lehninger et al., 2001;
Akagi et al., 2009]
1) 2-Keto-3-desoxy-arabino-heptulosonat-7phosphat-Synthase
7) Chorismat-Synthase
8) Chorismat-Mutase
2) 3-Dehydrochinat-Synthase
9) Prephenat-Dehydrogenase
3) 3-Dehydrochinat-Dehydratase
10) Prephenat-Dehydratase
4) Shikimat-Dehydrogenase
11) Tyrosin-Transaminase
5) Shikimat-Kinase
12) Aromatische Aminosäure-
6) 5-Enolpyruvylshikimat-3-phosphatSynthase
Transaminase
Anhang
Anhang B: Proanthocyanidin-Biosynthese
2-
O
OH
+ H
H OH
COO2OPO 3
Phosphoenol- Erythrose-4phosphat
pyruvat
*
NH2
COO-
O 3 PO
COO-
OH
OH
3-Dehydroshikimat
O
COO-
1
O
5
OH O
Naringenin
6
HO
OH
4-Cumarat
OH
7
OH
O
3
HO
O
SCoA
O
SCoA
OH
OH
Gallat
OH
4-CumaroylCoA
8
OH
OH HO
4
OH
OH O
Naringeninchalcon
OH
O
COO-
3 HOOC
HO
OH
OH
Dehydroshikimat
COO-
OH
HO
HO
2
Cinnamat
Phenylalanin
COO-
*
OH
HO
O
OH
OH HO
9
O
OH
OH
OH
OH O
OH O
OH O
OH O
3',4',5',5,7-PentahydroxyDihydrokämpferol
Dihydroquercetin
Eriodictyol
flavanon
12
11
13
10
OH
OH
OH
OH
OH
O
O
O
O
H
H
HO
O
OH
OH
OH 14
OH
OH
OH
OH OH
OH OH
OH O
Leucodelphinidin
Leucocyanidin
Dihydromyricetin
15
17
16
18
OH
OH
OH
OH
OH
OH
+
+
HO
O
H
O
O
H
O
O
HO
O
OH
OH
OH
OH
OH
OH
OH
OH
OH
OH
OH
OH
(+)-Gallocatechin
19 GT ?
Flavan-3-ol
Glykoside ?
28 GST ?
HO
25
20
Delphinidin
21
OH
OH
O
OH
OH
(+)-Catechin
22
GT ?
Flavan-3-ol
Glykoside ?
27 H O
26 GST ?
OH
VT
(-)-Epigallocatechin VT MATE Transporter
Glykosidase? 29 CE?
R2
Anthocyanine
OH
und Derivate
HO
O
R1
OR 3 R 2
OH
OH
O
HO
R1
MATE Transporter
OR
3
30
n/2
Glykosidase?
OH
CE ?
Proanthocyanidine
Cyanidin
23
24
OH
O
OH
OH
OH
(-)-Epicatechin
Anthocyanine
und Derivate
Galloyl- ?
transferase
VAKUOLE
Abbildung: Biosynthese der Proanthocyanidine [nach Akagi et al., 2009]
Anhang
1)
PAL Phenylalanin-Ammoniak-Lyase
18)
ANS Anthocyanidin-Synthase
2)
C4H Zimtsäure-4-Hydroxylase
19)
? GT Glycosyl-Transferase
3)
4CL 4-Cumaroyl-CoA-Ligase
20)
GT, OMT Glycosyl-Transferase,
4)
CHS Chalcon-Synthase
5)
CHI Chalcon-Isomerase
21)
ANR Anthocyanidin-Reduktase
6)
F3'5'H Flavonoid-3',5'-Hydroxylase
22)
7)
F3H Flavanon-3-Hydroxylase
23)
ANR Anthocyanidin-Reduktase
8)
F3'H Flavonoid -3'-Hydroxylase
24)
GT, OMT Glycosyl-Transferase,
9)
10)
25)
11)
F3'5'H Flavonoid -3',5'-Hydroxylase
26)
? GST Glutathion-S-Transferase
12)
F3'H Flavonoid -3'-Hydroxylase
27)
13)
DFR Dihydroflavonol-4-Reduktase
28)
? GST Glutathion-S-Transferase
14)
DFR Dihydroflavonol-4-Reduktase
29)
? CE Kondensationsenzym (Bildung
15)
LAR Leucoanthocyanidin-Reduktase
von C-C-Bindungen durch Kondensation)
16)
ANS Anthocyanidin-Synthase
30)
17)
LAR Leucoanthocyanidin-Reduktase
* siehe Anhang A
? CE Kondensationsenzym
CA: (+)-Catechin (R1 –OH, R2 –H)
GC: (+)-Gallocatechin (R1 = R2 –OH)
CG: (+)-Catechin-3-O-Gallat (R1 –OH, R2 –H, R3 –Gallussäure (GA))
GCG: (+)-Gallocatechin-3-O-Gallat (R1 = R2 –OH, R3 –GA)
EC: (-)-Epicatechin (R1 –OH, R2 –H)
ECG: (-)-Epigallocatechin (R1 = R2 –OH)
EGCG: (-)-Epigallocatechin-3-O-Gallat (R1 = R2 –OH, R3 –GA)
MATE Extrusionstransporter für Multidrogen und toxische Verbindungen (lat. extrudere =
hinausstoßen, -treiben)
[Herrmann, 1995; Dixon et al., 2005; Lepiniec et al., 2006; publiziert in Akagi et al., 2009]
Anhang
Anhang C: Bestimmung enzymatischer Aktivitäten
1. Laccase: Oxidation von ABTS zum semistabilen ABTS-Kationradikal
-O3 S
S
N
N N
SO3 -
S
N
e-
-O3 S
S
N
N N
+
.
SO3-
S
N
2. AaeAPO: Oxidation von Veratrylalkohol zum Veratrylaldehyd
O
OH
+
O
O
Veratrylalkohol
- 2H
- 2e-
O
O
Veratrylaldehyd
3. MnP: Bildung der Mn3+-Malonat-Komplexe
3+
HOH
O O
O O
4 HO
ONa
+ 2 Mn 2 + +
H2 O2
- 4 NaOH
2
HO
HO
OH
Mn
O O
HOH
OH
+
2 OH
-
Anhang
Anhang D: Enzymgewinnung - AaeAPO
1) Fermentation im Rührkesselreaktor
Zur Gewinnung des Enzyms AaeAPO wurde der Pilz Agrocybe aegerita in einem Rührkesselreaktor
mit fünf Liter Fassungsvermögen in Sojamehl-Medium kultiviert. Abbildung 1 zeigt den zeitlichen
Verlauf der AaeAPO -Aktivität.
2000
1800
1600
1400
1200
1000
800
600
400
200
0
8.30
8.20
8.10
8.00
7.90
pH
Aae APO - Aktivität [U/l]
Aae APO - Aktivität nach Kulturtagen
7.80
7.70
7.60
10
12
14
16
18
Kulturtage [d]
20
22
24
Abbildung 1: Zeitlicher Verlauf der AaeAPO -Aktivität (gestrichelte Linie: Verlauf des pH-Wertes)
Der Anstieg der Enzymaktivität ging mit einer Farbänderung des Mediums einher (gelb ⇒ anthrazit).
Die maximale Enzymaktivität von 1542 U/l wurde am 19. Kulturtag erreicht, das Maximum des pHWertes (pH 8,3) am 18. Kulturtag. Am 20. Kulturtag kam es zu einem leichten Abfall der AaeAPO
Aktivität auf 1324 U/l sowie des pH-Wertes auf 8,2. Aufgrund dessen wurde die Kultivierung beendet.
Während der Fermentation wurde aufgrund einer intensiven Biomassebildung viel Flüssigkeit
verbraucht, so dass nur ca. 1 l Kulturfiltrat mit einer Gesamtaktivität von 1351 U AaeAPO geerntet
werden konnten.
2) Reinigung der AaeAPO
Der gewonnene Rohextrakt wurde grob durch ein Sieb filtriert und 7 Minuten bei 13.000 rpm
zentrifugiert. Weiter wurde die Enzymlösung durch Glasfaserfilter filtriert und mittels Ultrafiltration
(10 kDa cut-off-Membran) konzentriert. Das Konzentrat kann bei -20 °C für weitere
Reinigungsschritte gelagert werden.
Anhang
Die Reinigung wurde mittels Ionenaustauschchromatographie unter Verwendung eines FPLC-Systems
fortgesetzt. Dafür wurden mehrere Fermentoransätze vereinigt. Zuerst wurde die Probe mit 5 Vol.-%
Essigsäure auf pH 4,5 eingestellt, zentrifugiert, über Glasfaserfilter filtriert und mit 10 mM
Natriumacetatpuffer versetzt. Danach wurde das Filtrat auf die Kationenaustauschersäule SP
Sepharose FF in 2 Portionen (3800 U, 2500 U) geladen und mittels 30 %-igen Salzgradienten (Eluent
A: 10 mM NaAc-Puffer pH=4,5; Eluent B: 10 mM NaAc-Puffer pH=4,5 mit 2 M NaCl) das
Zielprotein von den noch im Rohextrakt enthaltenen Farbstoffen, anderen Proteinen und
160
900
140
Absorption [mAU]
Enzymaktivität [100 U/l]
1000
800
120
700
600
100
500
80
400
60
300
40
200
Leitfähigkeit [mS/cm]
Gradient [%B]
Verunreinigungen getrennt.
20
100
0
0
0
100
200
300
400
500
600
Elutionsvolumen [ml]
Abbildung 2: FPLC-Elutionsprofil der AaeAPO von A. aegerita an einem Kationenaustauscher (SPSepharose, 1. Lauf). Proteinabsorption bei 280 nm (gelb), bei 420 nm (violett), bei 540 nm (schwarz
gepunktet), NaCl-Gradient (grün), Leitfähigkeit (blau), AaeAPO - Aktivität (rot gestrichelt)
Die Kurve der AaeAPO - Aktivität bildet einen Peak zwischen 301 ml und 385 ml des eluierten
Laufmittels, der mit einem Anstieg der Absorption bei 280 nm (Gesamtprotein), 420 nm (SoretBande) sowie 540 nm (Häm) verbunden war. Fraktionen, die AaeAPO -Aktivität enthielten, wurden
vereinigt und mittels Ultrafiltration (10 kDa cut-off-Membran) in einer Rührzelle dialysiert (10 mM
NaAc-Puffer, pH=6) und auf ein Endvolumen von ca. 11 ml eingeengt.
Im letzten Reinigungsschritt erfolgte die Abtrennung des Zielproteins von noch vorhandenen
Fremdproteinen mit Hilfe der FPLC an einer Anionenaustauschersäule Mono Q 10 x 100 GL. Die
Probe wurde zuerst zentrifugiert und der Überstand mit 10 mM NaAc Puffer auf ca. 40 ml aufgefüllt.
Sie wurde wieder in 2 Portionen (2187 U, 2000 U) auf die Säule geladen und mittels eines 30 %-igen
Salzgradienten (Eluent A: 10 mM NaAc-Puffer pH=6,5; Eluent B: 10 mM NaAc-Puffer pH=6,5 mit 2
M NaCl) chromatographiert.
3500
60
3000
50
2500
40
2000
30
1500
20
1000
Leitfähigkeit [mS/cm]
Gradient [%B]
Absorption [mAU]
Enzymaktivität [100 U/l]
Anhang
10
500
0
0
0
50
100
150
200
Elutionsvolumen [ml]
Abbildung 3: FPLC-Elutionsprofil der AaeAPO von A. aegerita an einer MonoQ-Säule, 2. Lauf).
Proteinabsorption bei 280 nm (gelb), bei 420 nm (violett), bei 540 nm (schwarz gepunktet), NaCl-Gradient
(grün), Leitfähigkeit (blau), AaeAPO - Aktivität (rot gestrichelt).
Die Kurve der AaeAPO Aktivität bildete einen Peak zwischen 78 ml und 87 ml des eluierten
Laufmittels, der mit einem Anstieg der Absorption bei 280 nm (Gesamtprotein), 420 nm (SoretBande) sowie 540 nm (Häm) verbunden war. Fraktionen, die AaeAPO -Aktivität enthielten sowie frei
von anderen Proteinen (Verunreinigungen) waren, wurden vereinigt und mittels Ultrafiltration (10 kDa
cut-off-Membran) in einer Rührzelle dialysiert (10 mM Kaliumphosphat-Puffer, pH=6,5) sowie auf
Endvolumen von ca. 6 ml eingeengt. Die Rührzelle wurde mit Puffer gespült und die Enzymlösung
sterilfiltriert (Endvolumen ca. 11 ml).
Die spezifische Aktivität des Enzyms betrug nach der Reinigung 62 U/mg. Das gereinigte und
konzentrierte Enzym zeigte eine charakteristische rot-braune Farbe, die auf die prosthetische Gruppe
(Häm-Thiolat) des Enzyms zurückzuführen ist.
Die gesamte Reinigungsprozedur führte zu einem Aktivitätsverlust des Enzyms von ungefähr 33 %.
Anhang
Tabelle: Reinigung der extrazellulären AaeAPO von A. aegerita
Reinigungsschritt
Protein-
Volumen- Aktivität Spezifische Reinigungsfaktor Volumen
[U]
[ml]
Aktivität
konzentration
aktivität
[μg/ml]
[U/ml]
234
0,781
4600
3
Ultrafiltration 1
1359
3,095
2105
2
Ultrafiltration 2
3235
5,110
2351
2
758
3,588
6300
5
2
1800
SP Sepharose 1
539
29,166
2655
54
24
91
SP Sepharose 2
494
21,925
1535
44
19
70
8270
380,670
4187
46
20
11
1722
116,230
4184
67
30
36
6150
381,800
4200
62
27
11
Rohextrakt nach
Zentrifugieren
Zentrifugieren
1+2
[U/mg]
5890
1
680
460
Rührzelle
(eingeengt,
dialysiert)
MonoQ
Gereinigtes
Enzym
(sterilfiltriert)
Anhang
Anhang E: Synthese von 4',6-Dihydroxyflavanon
Da 4',6-Dihydroxyflavanon nicht käuflich erhältlich ist, aber als Standard für HPLC benötigt wurde,
erfolgte im Rahmen der Dissertation die chemische Synthese von 4',6-Dihydroxyflavanon nach der
zweistufigen
Chalconmethode
[Deodhar
et
al.,
2007].
Die
Synthese
wurde
unter
Mikrowellenbedingungen durchgeführt. Die ' Produkte wurden mittels HPLC/MS und NMR auf
Identität und Reinheit überprüft.
1) Synthese von 4,2',5'-Trihydroxychalcon
HO
CHO
O
HO
+
OH
OH
OH
4-Hydroxybenzaldehyd
2',5'-Dihydroxyacetophenon
O
OH
4,2',5'-Trihydroxychalcon
4,5 mmol 2',5'-Dihydroxyacetophenon und 4,6 mmol 4-Hydroxybenzaldehyd werden in 0,6 ml
Ethanol
gelöst.
Unter
Rühren
tropft
man
bei
Raumtemperatur
4
ml
60%
wässrige
Kaliumhydroxidlösung (w/w) zu. Das Reaktionsgemisch wird anschließend der Mikrowellenstrahlung
mit folgendem Temperaturprogramm ausgesetzt: Reaktionsmischung auf 100 °C erhitzen (1 min),
diese Temperatur 9 Minuten halten und danach folgt eine 10 minütige Abkühlphase. Zur Aufarbeitung
gibt man das Reaktionsmischung auf Eiswasser, säuert mit Salzsäure auf pH 5 an und extrahiert das
Produkt mit Essigester.
Die Produktreinigung erfolgt mittels Säulenchromatographie (Kieselgel / 70:30 (v/v) Essigester /
Petrolether) oder durch Umkristallisation aus 60 %-igem Ethanol (v/v).
42 % Ausbeute (90 % Reinheit).
Die analytischen Daten (NMR, ESI/MS) stimmen mit den Literaturangaben überein.
1
H-NMR (Aceton-d6, 199.9850805 MHz): δ = 6.82-7.13 (m, 4H, Aromaten H), 7.59-8.08 (m, 5H,
Aromaten H + CH=CH), 9.03 (s, 1H, -OH), 12.01 (s, 1H, -OH), 12.45 (s, 1H, -OH)
13
C-NMR (Aceton-d6, 50.2863091 MHz): δ = 115.5, 116.9, 118.2, 119.4, 120.8, 125.5, 127.5, 132.0,
146.4, 150.1, 157.9, 161.3, 194.5
HRMS (ESI) m/z = 256 (M+H+).
Anhang
2) Cyclisierung von 4,2',5'-Trihydroxychalcon
HO
O
HO
O
O
OH
OH
4,2',5'-Trihydroxychalcon
OH
4',6-Dihydroxyflavanon
0,86 mmol 4,2',5'-Trihydroxychalcon wurden in 11 ml Methanol gelöst, mit 1,8 ml konz. HCl
angesäuert und 48 Stunden unter Rückfluss gekocht. Anschließend wurde das Lösungsmittel im
Vakuum abdestilliert und der Rückstand mit Wasser versetzt. Das Produkt wurde abgesaugt,
getrocknet und aus 90 %-igem Ethanol umkristallisiert. 21 % Ausbeute (Reinheit 88 %).
Die analytischen Daten (NMR, ESI/MS) stimmen mit den Literaturangaben überein.
1
H-NMR (Aceton-d6, 199.9850805 MHz): δ = 2.68-3.15 (m, 2H, Ring C), 5.41 (d, 3J = 13,6 Hz, 1H),
6.88-7.42 (m, 6H, Aromaten H, Ring A, B), 8.28 (s, 1H, Aromaten H, Ring A), 8.46 (s, 1H, -OH),
12.00 (s, 1H, -OH);
13
C-NMR (Aceton-d6, 50.2863091 MHz): δ = 44.9, 80.1, 111.1, 116.0, 119.6, 121.9, 125.0, 128.6,
131.0, 152.3, 156.0, 158.3, 192.3
HRMS (ESI) m/z = 256 (M+H+).
Anhang
Anhang F: Wirkung der polyphenolischen Phytoextrakte
auf die Enzymproduktion (Abbildungen)
1) Agrocybe aegerita
2000
1800
1600
1400
1200
1000
800
600
400
200
0
Kulturtag 7
Kulturtag 14
Kulturtag 21
Kulturtag 28
Kulturtag 35
Kulturtag 42
Kulturtag 49
Kulturtag 9
Kulturtag 15
Kulturtag 23
Kulturtag 30
Kulturtag 37
Kulturtag 44
Kulturtag 11
Kulturtag 17
Kulturtag 24
Kulturtag 32
Kulturtag 39
Kulturtag 46
1A 1B 1C 2A 2B 2C 3A 3B 3C 4A 4B 4C 5A 5B 5C 6A 6B 6C
Proben
Abbildung 1: AaeAPO-Aktivität nach Kulturtagen (Ansatz mit Aronia-Extrakten)
10000
9000
8000
7000
6000
5000
4000
3000
2000
1000
0
Kulturtag 7
Kulturtag 14
Kulturtag 21
Kulturtag 28
Kulturtag 35
Kulturtag 42
Kulturtag 49
Kulturtag 9
Kulturtag 15
Kulturtag 23
Kulturtag 30
Kulturtag 37
Kulturtag 44
Kulturtag 11
Kulturtag 17
Kulturtag 24
Kulturtag 32
Kulturtag 39
Kulturtag 46
1A 1B 1C 2A 2B 2C 3A 3B 3C 4A 4B 4C 5A 5B 5C 6A 6B 6C
Proben
Abbildung 2: Laccase-Aktivität nach Kulturtagen (Ansatz mit Aronia-Extrakten)
Anhang
1400
1200
1000
800
600
400
200
0
1A
2A
2B
3A
3B
Proben
4A
4B
5A
5B
Kulturtag 7
Kulturtag 9
Kulturtag 12
Kulturtag 14
Kulturtag 16
Kulturtag 19
Kulturtag 21
Kulturtag 23
Kulturtag 26
Kulturtag 28
Kulturtag 30
Kulturtag 33
Kulturtag 35
Kulturtag 37
Kulturtag 40
Kulturtag 42
Kulturtag 44
Kulturtag 47
Kulturtag 50
Kulturtag 54
Kulturtag 56
Abbildung 3: AaeAPO -Aktivität nach Kulturtagen (Ansatz mit Fragaria-Extrakten)
1400
1200
1000
800
600
400
200
0
1A
2A
2B
3A 3B
Proben
4A
4B
5A
5B
Abbildung 4: Laccase-Aktivität nach Kulturtagen (Ansatz mit Fragaria-Extrakten)
Kulturtag 7
Kulturtag 9
Kulturtag 12
Kulturtag 14
Kulturtag 16
Kulturtag 19
Kulturtag 21
Kulturtag 23
Kulturtag 26
Kulturtag 28
Kulturtag 30
Kulturtag 33
Kulturtag 35
Kulturtag 37
Kulturtag 40
Kulturtag 42
Kulturtag 44
Kulturtag 47
Kulturtag 50
Kulturtag 54
Kulturtag 56
Anhang
2000
1800
1600
1400
1200
1000
800
600
400
200
0
1A 1B 1C 2A 2B 2C 3A 3B 3C 4A 4B 4C 5A 5B 5C
Proben
Kulturtag 11
Kulturtag 13
Kulturtag 14
Kulturtag 17
Kulturtag 19
Kulturtag 21
Kulturtag 24
Kulturtag 26
Kulturtag 28
Kulturtag 31
Kulturtag 33
Kulturtag 35
Kulturtag 39
Kulturtag 40
Kulturtag 42
Kulturtag 45
Kulturtag 47
Kulturtag 49
Abbildung 5: AaeAPO-Aktivität nach Kulturtagen (Ansatz mit Trifolium-Extrakten)
3000
2500
2000
1500
1000
500
0
Proben
Kulturtag 11
Kulturtag 13
Kulturtag 14
Kulturtag 17
Kulturtag 19
Kulturtag 21
Kulturtag 24
Kulturtag 26
Kulturtag 28
Kulturtag 31
Kulturtag 33
Kulturtag 35
Kulturtag 39
Kulturtag 40
Kulturtag 42
Kulturtag 45
Kulturtag 47
Kulturtag 49
Abbildung 6: Laccase-Aktivität nach Kulturtagen (Ansatz mit Trifolium-Extrakten) (Die Proben 3A, 4C
und 5A gehören zu den Ausreisern aufgrund des Bakterienbefalls am 24. Kulturtag.)
Anhang
Kulturtag 12
Kulturtag 14
Kulturtag 16
Kulturtag 19
Kulturtag 21
Kulturtag 23
Kulturtag 26
Kulturtag 28
Kulturtag 30
Kulturtag 33
Kulturtag 35
Kulturtag 37
Kulturtag 42
Kulturtag 44
Kulturtag 47
2000
1800
1600
1400
1200
1000
800
600
400
200
0
1A 1B 2A 2B 2C 3A 3B 3C 4A 4B 4C 5A 5B 5C
Proben
Abbildung 7: AaeAPO-Aktivität nach Kulturtagen (Ansatz mit Gänseblümchen-Extrakten)
20000
Kulturtag 12
Kulturtag 14
Kulturtag 16
Kulturtag 19
Kulturtag 21
Kulturtag 23
Kulturtag 26
Kulturtag 28
Kulturtag 30
Kulturtag 33
Kulturtag 35
Kulturtag 37
Kulturtag 42
Kulturtag 44
Kulturtag 47
18000
16000
14000
12000
10000
8000
6000
4000
2000
0
1A 1B 2A 2B 2C 3A 3B 3C 4A 4B 4C 5A 5B 5C
Proben
Abbildung 8: Laccase-Aktivität nach Kulturtagen (Ansatz mit Gänseblümchen -Extrakten)
Anhang
MnP Aktivität [U/l]
2) Bjerkandera adusta
1600
1400
1200
1000
800
600
400
200
0
Kulturtag 8
Kulturtag 11
Kulturtag 12
Kulturtag 14
Kulturtag 18
Kulturtag 21
Kulturtag 25
Kulturtag 28
Kulturtag 32
Proben
Abbildung 9: MnP-Aktivität nach Kulturtagen (Ansatz mit Aronia-Extrakten)
1600
1400
1200
1000
800
600
400
200
0
Kulturtag 13
Kulturtag 17
Kulturtag 20
Kulturtag 21
Kulturtag 23
Kulturtag 24
Kulturtag 26
Kulturtag 30
Kulturtag 34
1A
1B
2A
2B
3A 3B
Proben
4A
4B
5A
5B
Abbildung 10: MnP-Aktivität nach Kulturtagen (Ansatz mit Fragaria-Extrakten)
1400
Kulturtag 10
Kulturtag 12
Kulturtag 14
Kulturtag 17
Kulturtag 19
Kulturtag 21
Kulturtag 24
Kulturtag 26
Kulturtag 28
Kulturtag 31
Kulturtag 33
1200
1000
800
600
400
200
0
1A 1B 1C 2A 2B 2C 3A 3B 3C 4A 4B 4C 5A 5B 5C C
Proben
Abbildung 11: MnP-Aktivität nach Kulturtagen (Ansatz mit Trifolium-Extrakten)
Anhang
2500
Kulturtag 6
Kulturtag 13
Kulturtag 19
Kulturtag 22
Kulturtag 25
Kulturtag 27
Kulturtag 29
Kulturtag 32
Kulturtag 34
Kulturtag 36
Kulturtag 39
Kulturtag 41
Kulturtag 43
Kulturtag 46
Kulturtag 48
Kulturtag 51
Kulturtag 53
Kulturtag 55
2000
1500
1000
500
0
Proben
Abbildung 12: MnP-Aktivität nach Kulturtagen (Ansatz mit Gänseblümchen-Extrakten)
1200
Kulturtag 6
Kulturtag 13
Kulturtag 19
Kulturtag 22
Kulturtag 25
Kulturtag 27
Kulturtag 29
Kulturtag 32
Kulturtag 34
Kulturtag 36
Kulturtag 39
Kulturtag 41
Kulturtag 43
Kulturtag 46
Kulturtag 48
Kulturtag 51
Kulturtag 53
Kulturtag 55
1000
800
600
400
200
0
Proben
Abbildung 13: MnP-Aktivität nach Kulturtagen (Ansatz mit Ethanol) (Die Probe 5A stellt einen
Ausreisser dar.)
Danksagung
Danksagung
Die vorliegende Dissertation wurde am Internationalen Hochschulinstitut Zittau und an der
Hochschule Zittau/Görlitz (FH) durchgeführt. Die Untersuchungen wurden sowohl in Laboren der
Biochemie, der Organischen Chemie und der Molekülspektroskopie an der Hochschule Zittau/Görlitz
(FH) als auch in Laboren des IHI Zittau gemacht. Frau Prof. Dr. rer. nat. Annett Fuchs, Herrn Univ.Prof. Dr. rer. nat. habil. Martin Hofrichter und Herrn Prof. Dr. rer. nat. habil. Dieter Greif danke ich
für die perfekte Betreuung, zahlreiche interessante Diskussionen und Anregungen sowie für die
sprachliche Korrektur der Dissertation.
Mein Dank gehört ebenfalls Herrn Dr. rer. nat. René Ullrich für die Aufsicht bei der AaeAPOGewinnung und Reinigung. Herrn Dr. rer. nat. Matthias Kinne danke ich für die Einführung in die
HPLC-MS, ins Hantieren mit den Enzymen, in den graphischen Programm Grapher 6 sowie für
fruchtbare Diskussionen.
Herrn Dr. Lothar Hennig aus Leipzig gehört mein Dank für die Aufnahme der NMR-Spektren in hoher
Auflösung sowie mit den 2D-NMR-Techniken.
Für die freundliche Begleitung bei PCR-Versuchen bedanke ich mich bei Frau Dipl.-Ing. Britta Bittner
und Herrn Dipl.-Biol. Marek Pecyna.
Bei Monika Brandt, Ulrike Schneider, Heike Heidenreich, Gerlinde Liepelt, Dipl.-Ing. Sebastian Peter,
Dipl.-Ing. Marzena Poraj-Kobielska und dem ganzen IHI-Team möchte ich mich für ihre
Hilfsbereitschaft, Freundlichkeit sowie Geduld bedanken.
Frau Evelin Bürger, Frau Corina Lorenz, Herrn Prof. Ramm sowie allen anderen Mitarbeitern und
Lehrkräften der Hochschule Zittau/Görlitz (FH) danke ich für die freundliche Hilfsbereitschaft.
Der Deutschen Bundesstiftung Umwelt danke ich für die finanzielle Unterstützung meines
Dissertationsprojektes - namentlich danke ich der Frau Dr. Hedda Schlegel-Starmann für ihre Geduld.
Nicht zuletzt bedanke ich mich bei meinem Mann für seine Toleranz und der ganzen Familie, die mit
der Betreuung meiner kleinen Tochter Andrea mitgeholfen hat.
Hiermit versichere ich, dass ich die vorliegende Arbeit ohne unzulässige Hilfe Dritter und ohne
Benutzung anderer als der angegebenen Hilfsmittel angefertigt habe; die aus fremden Quellen direkt
oder indirekt übernommenen Gedanken sind als solche kenntlich gemacht.
Bei der Auswahl und Auswertung des Materials sowie bei der Herstellung des Manuskripts habe ich
keine Unterstützungsleistungen erhalten.
Weitere Personen waren an der Abfassung der vorliegenden Arbeit nicht beteiligt. Die Hilfe eines
Promotionsberaters habe ich nicht in Anspruch genommen. Weitere Personen haben von mir keine
geldwerten Leistungen für Arbeit erhalten, die nicht als solche kenntlich gemacht worden sind.
Die Arbeit wurde bisher weder im Inland noch im Ausland in gleicher oder ähnlicher Form einer
anderen Prüfungsbehörde vorgelegt.
Zittau, den 14. Dezember 2012
Kateřina Barková
Thesen
Thesen
zur Promotion „Enzymatische Transformation verschiedener Flavonoide
durch das extrazelluläre Pilzenzym Agrocybe-aegerita-Peroxygenase“ von
Diplom-Chemikerin (FH) Kateřina Barková
(eingereicht am 14. Dezember 2012)
1) Die pilzliche Peroxygenase AaeAPO aus Agrocybe aegerita verfügt insgesamt über
ein sehr breites Substratspektrum bezüglich der Flavonoide.
Von den untersuchten Standardsubstanzen (Flavone – Acacetin, Amentoflavon, Apigenin,
Apigenintrimethylether, Baicalein, Baicalein 7-Methylether, Chrysin, Chrysindimethylether,
Flavon, 5-, 6-, 7-Hydroxyflavon, 6,7-Dihydroxyflavon, 6,2´-Dihydroxyflavon, 6,4´Dihydroxyflavon,
Luteolin,
5-Methoxyflavon,
4´-Methoxyflavon,
6-Methoxyluteolin,
Tangeretin, Tectochrysin ; Isoflavone – Biochanin A, Daidzein, Demethyltexasin,
Formononetin,
Genistein,
Genistein-7,
4´-dimethylether,
Glycitein,
5-Methyl-7-
Methoxyisoflavon; Flavanone –Eriodictyol, Flavanon, Hesperetin, 6-, 7-, 2`-, 3`-, 4`Hydroxyflavanon, 6,4´-Dihydroxyflavanon, Isosakuranetin, 5-, 6-, 4´-Methoxyflavanon,
Naringenin, Pinocembrin; Flavonole – 3-Hydroxyflavon, 3,6-Dihydroxyflavon, Isorhamnetin,
Kämpferol,
Myricetin,
Flavonoidmonoglykoside -
Quercetagetin,
Apigetrin,
Quercetin,
Genistin,
Quercetinpentamethylether;
Naringenin
7-O-glukosid,
Orientin;
Flavonoldiglykosid – Rutin) konnten mit Ausnahme des Diglykosids Rutin, des Dimeres
Amentoflavon, des 3-Hydroxyflavons und der nachfolgenden Verbindungen mit der
besetzten
C6-Position
(Baicalein,
Baicalein-7-Methylether,
Demethyltexasin,
6,7-
Dihydroxyflavon, 6-Methoxyluteolin, Quercetagetin) alle Verbindungen umgesetzt
werden.
2) Die Flavonoide werden mittels AaeAPO regioselektiv in 6-Position hydroxyliert.
3) Der Reaktionsmechanismus der AaeAPO läuft bei Flavonoiden über eine Epoxidstufe
ab.
4) Der eingefügte Sauerstoff bei Hydroxylierungen entstammt dem Wasserstoffperoxid
(Hinweis auf eine echte Peroxygenase-Reaktion).
5) Die AaeAPO ist in der Lage, Flavonoide zu demethylieren (Apigenin-5,7,4`trimethylether, Biochanin A, Formononetin, Genistein-7,4`-dimethylether, Glycitein,
Isosakuranetin, 5-Methoxyflavanon, 6-Methoxyflavanon, 4`-Methoxyflavanon, , 4`Methoxyflavon, Quercetinpentamethylether, Tangeretin, Tectochrysin).
Thesen
6) Es ist möglich, ein scale-up (≥ 5 mg) in der enzymatischen Synthese durch
semikontinuierliche Versuchsführung zu realisieren. (nachgewiesen für Apigenin-,
Luteolin-, 6-Hydroxyflavon-, 7-Hydroxyflavanon- bzw. 7-Hydroxyflavonderivat)
7) Die Enzymproduktion der Agrocybe aegerita wird durch den Extraktzusatz (aus
jeweils Aronia melanocarpa, Fragaria ananassa, Trifolium pratense und Bellis
perennis) im Fall der Laccase stimuliert. Die AaeAPO -Aktivität wird dagegen
gehemmt.
8) Für Bjerkandera adusta kann eine moderate Stimulierung der MnP-Bildung nach der
Extraktzugabe beobachtet werden.
9) Die Zugabe von Ethanol bewirkte, dass die Laccase-Produktion in Agrocybe aegerita
stimuliert, die AaeAPO-Aktivität dagegen gehemmt wurde (betrachte Ausnahmefälle).
Im Gegensatz dazu beeinflusste es die Produktion der Mangan-Peroxidase nur
geringfügig.
10) Die stimulierende bzw. hemmende Wirkung auf die Enzymproduktion ist bei der
Agrocybe aegerita sowohl auf Flavonoide als auch auf Ethanol zurückzuführen.

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