Rekombinante Newcastle Disease Viren für die

Rekombinante Newcastle Disease Viren für die

Rekombinante Newcastle Disease Viren für die
Entwicklung von Markervakzinen- Möglichkeit der
simultanen Impfung gegen die Newcastle Krankheit
und die Aviäre Influenza
Inauguraldissertation
zur
Erlangung des akademischen Grades
doctor rerum naturalium (Dr. rer. nat.)
an der Mathematisch-Naturwissenschaftlichen Fakultät
der
Ernst-Moritz-Arndt-Universität Greifswald
vorgelegt von
Kristina Ramp
geboren am 03.11.1979
in Stralsund
Biedenkopf, den 21.10.2011
Dekan:
Prof. Dr. Klaus Fesser
1.Gutachter:
Prof. Dr. Dr. Thomas C. Mettenleiter
2.Gutachter:
Frau Prof. Dr. S. Rautenschlein
Tag der Promotion: 29.02.2012
Inhaltsverzeichnis
I.
Einleitung ..................................................................................................... 1
1. Das Newcastle Disease Virus (NDV) ..................................................... 1
1.1. Geschichte des Newcastle Disease Virus ................................ 1
1.2. Taxonomische Einordnung ...................................................... 2
1.3. Klinisches Bild .......................................................................... 3
1.4. Morphologie und Genomaufbau ............................................... 5
1.5. Aufbau und Funktion der einzelnen Virusproteine .................... 6
1.5.1. Die Oberflächenproteine ................................................. 6
1.5.2. Das Matrixprotein (M-Protein) ......................................... 8
1.5.3. Die Proteine des RNP-Komplexes .................................. 9
1.6. Replikation ................................................................................ 11
1.7. Virulenzdeterminanten .............................................................. 14
2. Das Aviäre Influenzavirus ...................................................................... 17
2.1. Geschichte der Aviären Influenzaviren ..................................... 17
2.2.Taxonomie ................................................................................. 18
2.3. Klinisches Bild .......................................................................... 18
2.4. Morphologie und Genomaufbau ............................................... 20
2.5. Aufbau und Funktion der einzelnen Virusproteine .................... 21
2.6. Replikation ................................................................................ 25
2.7. Wirtsspektrum........................................................................... 27
2.8. Virulenzdeterminanten .............................................................. 28
3. Die Entwicklung der reversen Genetik ................................................... 31
4. NDV als Vektor ...................................................................................... 34
5. Impfstoffe ............................................................................................... 37
II.
Zielstellung ................................................................................................... 43
III.
Zusammenfassende Darstellung und Diskussion der Ergebnisse ............... 44
III.A
„Influence of insertion site of the avian influenza virus haemagglutinin (HA)
gene within the Newcastle disease virus genome on HA expression” ....... 44
III.B
“Coexpression of avian influenza virus H5 and N1 by recombinant
Newcastle disease virus and the impact on immune response in
chickens” .................................................................................................... 46
III.C
“Pathogenicity and immunogenicity of different recombinant Newcastle
disease virus Clone 30 variants after in ovo vaccination”........................... 48
IV.
Literaturverzeichnis ...................................................................................... 50
V.
Influence of insertion site of the avian influenza virus haemagglutinin
(HA) gene within the Newcastle disease virus genome on HA expression .. 66
VI.
Coexpression of avian influenza virus H5 and N1 by recombinant
Newcastle disease virus and the impact on immune response in
chickens ....................................................................................................... 73
VII. Pathogenicity and immunogenicity of different recombinant Newcastle
disease virus Clone 30 variants after in ovo vaccination .............................. 85
VIII. Zusammenfassung der Dissertation ............................................................. 124
IX.
Summary ...................................................................................................... 127
X.
Anhang ......................................................................................................... 129
X.1. Publikationen ...................................................................................... 129
X.1.1. Eigenanteil an den zur Dissertation eingereichten
Publikationen............................................................................. 130
X.2. Tagungsbeiträge ................................................................................. 132
X.3. Eidesstattliche Erklärung .................................................................... 133
X.4. Danksagung ....................................................................................... 134
I. Einleitung 1. Das Newcastle Disease Virus (NDV)
1.1. Geschichte des Newcastle Disease Virus
Das Newcastle Disease Virus(NDV) ist die Erreger der atypischen Geflügelpest,
einer hoch ansteckenden Krankheit, insbesondere bei Hühner- und Puten, die zu
enormen wirtschaftlichen Verlusten in der Geflügelhaltung führen kann. Das NDV
konnte in über 200 Vogelspezies nachgewiesen werden und hat sich weltweit
verbreitet (Alexander 1997).
Bezüglich der Herkunft der Newcastle Krankheit werden drei verschiedene
Hypothesen diskutiert. Zum einen wird angenommen, dass im Südosten Asiens
virulente NDV-Stämme in den Geflügelbeständen immer präsent waren, aber bis
zum Einsetzen der weltweiten Industrialisierung nicht als ernstes Problem
wahrgenommen wurden. Als eine zweite Möglichkeit für das Auftreten der Newcastle
Krankheit wird das Vorkommen eines natürlichen NDV-Reservoirs in einigen anderen
Vogelspezies, insbesondere bei Psittaziden (Papageien) diskutiert. Erst durch das
Eindringen des Menschen in deren Lebensraum war die Möglichkeit der Übertragung
der NDV auf andere Spezies, wie z.B. Hühner und Puten, gegeben. Die dritte
Erklärung geht davon aus, dass sich virulente NDV Stämme durch Mutation aus
niedrig virulenten Isolaten gebildet haben (Alexander 2001).
Bereits im Jahre 1926 wurde das typische klinische Bild der Newcastle Krankheit
(Newcastle Disease, ND) auf Java, Indonesien (Kraneveld 1926) und in Newcastleon-Tyne, Großbritannien beschrieben (Doyle 1927). In der Literatur existieren aber
auch Hinweise darauf, dass Symptome einer ähnlichen Krankheit schon vor 1926
beschrieben wurden, aber infolge von Fehldiagnosen und fehlender Berichterstattung
nicht die Aufmerksamkeit der internationalen Veterinärmedizin erlangten (Halasz
1912; Levine 1964). Der Name „Newcastle Krankheit“ wurde von Doyle nach dem
gleichnamigem geographischen Ort der ersten Beschreibung der Krankheit in
Großbritannien zunächst als vorübergehende Bezeichnung gewählt (Doyle 1935),
überdauerte aber bis heute. Nach dem Auftreten der ND-Ausbrüche in Indonesien
und Großbritannien traten erste Symptome dieser Krankheit in Geflügel in Form von
milden respiratorischen, gepaart mit zentralnervösen Anzeichen in den Vereinigten
1
Staaten
in
der
1930er
Jahren
auf
(Beach
1942),
was
zunächst
als
„Pneumoenzephalitis“ bezeichnet wurde. Mit Hilfe serologischer Tests konnte der
Erreger eindeutig als NDV identifiziert werden (Beach 1944). Seitdem wurde NDV auf
der ganzen Welt isoliert, welche sowohl milde Erkrankungen, aber auch schwere
Verlaufsformen verursachten. Virulente NDV-Stämme verbreiteten sich ausgehend
vom Nahen Osten in zahlreichen panzootischen Ausbrüchen seit 1926 weltweit und
führten Ende der 1960er Jahre global zu schweren Verlaufsformen der ND. Gründe
für diese Ausbrüche sind in der Entwicklung der Geflügelindustrie, und der
Vermarktung der Geflügelnahrungsmittel zu sehen, aber auch der weltweite
Transport auf Luft- und Schifffahrtswegen hat sicher zur Ausbreitung der Krankheit
beigetragen. So konnte beispielsweise die Einfuhr exotischer Vögel in die USA
eindeutig mit NDV-Ausbrüchen zwischen 1970- 1972 in Verbindung gebracht werden
(Hanson 1972; Francis 1973). Im Westen Europas nahmen die Meldungen der ND in
den frühen 1990er Jahren merklich zu und erreichten 1994 mit 239 Ausbrüchen in
den Ländern der Europäischen Union ihren Höhepunkt. Zwischen 1991 und 1995 trat
die Mehrzahl der NDV-Ausbrüche in den Beneluxländern und in Deutschland auf. Ein
extensives Auftreten der ND konnte im Jahre 2000 mit 254 Ausbrüchen auch in
Italien dokumentiert werden (Alexander 2001).
Die im Jahre 1995 eingeführte Impfpflicht für alle Hühner- und Putenbestände
(Verordnung zum Schutz gegen die Geflügelpest und die Newcastle-Krankheit, 2005,
www.gesetze-im-internet.de/geflpestschv/index.html;
aktualisiert
2007)
in
Deutschland soll dem Auftreten der Newcastle Krankheit entgegenwirken und
resultierende wirtschaftliche Verluste minimieren.
1.2. Taxonomische Einordnung
NDV, auch als Aviäres Paramyxovirus Serotyp 1 (APMV-1) bezeichnet, gehört zur
Ordnung der Mononegavirales und wird innerhalb der Familie der Paramyxoviridae
und der Unterfamilie der Paramyxovirinae dem Genus Avulavirus zugeordnet (Mayo
2002; Fauquet, Mayo et al. 2005). Die verschiedenen NDV-Stämme weisen eine
hohe genetische und antigenetische Vielfalt auf (Alexander 1997; Aldous, Mynn et al.
2003; Kim, King et al. 2007). Zur Klassifizierung von NDV werden zwei Systeme
genutzt, die auf ähnlichen genomischen Informationen basieren (Miller, Decanini et
al. 2010). Das System von Aldous et al. gruppiert NDV in sechs Hauptlinien und
2
sechzehn Unterlinien (Aldous, Mynn et al. 2003; Snoeck, Ducatez et al. 2009),
während das Klassifizierungssystem nach Ballargi-Pordany et al. NDV in zwei
Hauptklassen einteilt, wobei Klasse I in neun und Klasse II in zehn Genotypen
unterteilt wird (Ballagi-Pordany, Wehmann et al. 1996; Czegledi, Ujvari et al. 2006;
Kim, King et al. 2007). Das im Rahmen dieser Arbeit verwendete NDV Clone 30 ist
ein Abkömmling des lentogenen NDV-Stammes La Sota und wird nach dem System
von Ballagi-Pordany der Klasse II, Genotyp II zugeordnet.
1.3. Klinisches Bild
NDV wird hinsichtlich des Schweregerades des klinischen Bildes der durch sie
verursachten ND in Hühnern anhand des Intrazerebralen Pathogenitätsindexes
(ICPI) in Eintagsküken in drei Pathotypen eingeteilt. Lentogene Stämme sind durch
einen ICPI von weniger als 0,7 gekennzeichnet. ICPI-Werte im Bereich 0,7 bis 1,5
kennzeichnen mesogene Isolate, wohingegen velogene Isolate einen ICPI von 1,5
bis 2,0 aufweisen. Velogene Isolate werden zusätzlich in viscerotrope und
neurotrope Stämme unterteilt. Die Ermittlung des ICPI-Wertes ist für die Bestimmung
der Virulenz der NDV gesetzlich vorgeschrieben (EU-Richtlinie 92/66/EWG). Ein
Indexwert von ≥0,7 charakterisiert seuchenrechtlich relevante ND-Viren (CEC 1992).
NDV wird über die Atemluft oder durch Aufnahme kontaminierter Nahrung
übertragen. Die Virusausscheidung erfolgt mit allen Se- und Exkreten infizierter Tiere
(Kot, Augen- und Nasensekret, Sperma, Eier), welche wiederum Futter, Wasser und
die Umgebung kontaminieren können. Das größte Risiko bei der Verbreitung der ND
ist die Verschleppung der Viren durch den Menschen (Kleidung, Schuhe) und seine
Gerätschaften
(z.B.
Transportfahrzeuge,
Eierbehälter,
Futtersäcke).
Weitere
Vektoren wie Schadnager oder freilebende Vögel (Tauben, Krähen, Sperlinge)
können das Virus ebenfalls verbreiten (Charlton 2000).
Haupteintrittspforten
des
NDV
sind
die
Zellen
des
Respirations-
und
Verdauungstraktes. In der Trachea kann NDV durch die Zilienbewegungen des
Epithels und durch Zell-Zell-Infektion verbreitet werden. Die klinischen Symptome der
ND hängen weitgehend von der Virulenz des Virusstammes, der Wirtsspezies und
deren Immunstatus ab. Die Inkubationszeit liegt bei circa vier bis sechs Tagen. Bei
den lentogenen NDV bleibt die Infektion meist auf den Respirationstakt beschränkt.
So zeigen junge Hühner oft respiratorische Symptome wie Husten, Niesen, Keuchen,
3
verbunden mit vermehrtem Nasen- und Tränensekret, wohingegen ältere Hühner
häufig nur mit einer Erniedrigung der Legeleistung reagieren. Werden jüngere
Hühner mit mesogenen NDV infiziert, können zusätzlich zu den respiratorischen
Symptomen, Störungen des zentralen Nervensystems (ZNS) auftreten. Kopf und
Nacken nehmen oft eine anormale Haltung ein („Sterngucker“) und die Mortalität
kann bis zu 50% betragen. In älteren Tieren fehlen oft ZNS-Symptome, aber es
kommt im Allgemeinen zur Verringerung der Eiqualität. Die Eier sind dünnschalig,
aufgeraut oder deformiert. Je nach Organtropismus des Virus verursachen velogene
NDV
unterschiedlich
schwere
Krankheitssymptome.
Kurzatmigkeit,
heftige
Durchfälle, Konjunktivitis und Lähmungserscheinungen werden oft beobachtet.
Zusätzlich kann es zu Verfärbungen und Schwellen des Gewebes oberhalb der
Augen verbunden mit dem Austritt von klebrigem Augen- und Nasensekret kommen.
Die Mortalität beträgt bereits zwei bis drei Tage nach Auftreten der ersten
Krankheitssymptome häufig 100%.
Auch beim Menschen kann es zu Infektionen mit NDV kommen. Dabei treten
grippeähnliche Symptome und Konjunktivitis auf (Hanson and Brandly 1955; Hanson
1972; Alexander 1997). Der Mensch ist als Wirt generell ungeeignet (sogenannter
dead- end host), da in ihm das Virus nur für einen kurzen Zeitraum und in geringen
Mengen vorliegt.
NDV weist eine hohe Tenazität auf. So sind infektiöse Viruspartikel im Knochenmark
und in der Muskulatur von Schlachtgeflügel bei -20°C noch nach 6 Monaten und bei
1°C nach 134 Tagen nachweisbar. In infizierten Eiern erfolgt eine Inaktivierung des
Virus erst nach 538 Tagen bei 4°C und in verseuchten Ställen bleibt NDV je nach
Umgebungstemperatur
30-35
Tage
infektiös.
Nach
Eintrocknung
kann
die
Infektiosität über Jahre hinweg konserviert bleiben (Rolle 2006). Durch alkoholische
Desinfektion (Ethanol, 1-Propanol, 2-Propanol) ist eine Dekontamination möglich.
4
1.4. Morphologie und Genomaufbau
NDV ist ein behülltes Einzelstrang-RNA-Virus mit einem nicht- segmentierten Genom
negativer Polarität. Die Virionen sind von pleomorpher Gestalt und haben einen
Durchmesser von 100-350 nm. Das RNA-Genom besteht aus sechs Genen, die für
die
Strukturproteine
Nukleoprotein
(NP-Protein),
Phosphoprotein
(P-Protein),
Matrixprotein (M-Protein), Fusionsprotein (F-Protein), Hämagglutinin-Neuraminidase
Protein (HN-Protein) und die RNA abhängige RNA-Polymerase (L-Protein) (Abb.1)
kodieren.
Abb.1: Schematische Darstellung eines Newcastle Disease Virions.
In die Virushülle, eine Lipiddoppelschicht, die von der Plasmamembran der Wirtszelle
stammt, sind die Oberflächenproteine F und HN eingelagert. An der Innenseite der
Virushülle befindet sich das Matrixprotein, das mit ihr assoziiert ist. Die Proteine NP,
P und L bilden zusammen mit dem einzelsträngigen RNA-Genom das Nukleokapsid,
das auch als Ribonukleoproteinkomplex (RNP-Komplex) bezeichnet wird. Der RNPKomplex ist als kleinste infektiöse Einheit Grundlage für die Replikation und
Transkription des Genoms.
Die Virusgene sind linear in der Reihenfolge 3´-NP-P-M-F-HN-L-5` angeordnet. Sie
werden von kurzen Sequenzabschnitten flankiert, die am 3’-Ende als Leadersequenz
und am 5`-Ende als Trailersequenz bezeichnet werden. Der offene Leserahmen
5
jedes einzelnen Gens wird zusätzlich von unterschiedlich langen nicht-kodierenden
Regionen und spezifischen Genstart- und Genendsequenzen flankiert. Zwischen den
jeweiligen Genen befinden sich unterschiedlich lange (1- 47 nt) intergene Regionen.
Abb.2: Schematische Darstellung des NDV-Genoms. Genstart ( ), Genende ( ),
nicht-kodierende Regionen ( )
Für das NDV-Genom sind bisher drei unterschiedliche Längen von 15186, 15192
und 15198 Nukleotiden ermittelt worden (Czegledi, Ujvari et al. 2006). APMV-1 der
Klasse I verfügen über das mit 15198 Nukleotiden längste Genom (Genotyp 1-9).
Frühe Isolate (1930-1960) der Klasse II (Genotyp I-IV) der APMV-1 besitzen ein RNA
Genom von 15186 Nukleotiden, wohingegen das Genom späterer Isolate (isoliert
nach 1960) der Klasse II (Genotyp V-VII) 15192 Nukleotide umfasst (Czegledi, Ujvari
et al. 2006). Alle drei Genomlängen entsprechen einem Vielfachen von sechs und
damit der für die Replikation nachgewiesenermaßen notwendigen „rule of six“
(Kolakofsky, Pelet et al. 1998; Peeters, Gruijthuijsen et al. 2000).
1.5. Aufbau und Funktion der einzelnen Virusproteine
1.5.1. Die Oberflächenproteine
Das Fusionsprotein (F-Protein)
Das Fusionsprotein ist in der Membran der Virionen verankert und vermittelt durch
Fusion der Virushülle mit der Zytoplasmamembran des Wirtes den Eintritt der
Virionen in die Wirtszelle (Scheid and Choppin 1973; Seto, Becht et al. 1974). Das
Fusionsprotein
wird
den
Typ
I
Membranproteinen
zugeordnet
und
als
Vorläuferprotein F0 (553 Aminosäuren (AS), 67 kDa) synthetisiert. F0 muss durch
zelluläre Proteasen gespalten werden, um die biologisch aktive Form zu erhalten, die
6
für den Infektionszyklus essentiell ist. Am Aminoterminus des F0 Proteins befindet
sich ein kurzes Signalpeptid, das die entstehende Polypeptidkette an die Membran
des rauen endoplasmatischen Retikulums (rER) bindet. Am Carboxyterminus des
Proteins verankert eine hydrophobe Domäne das F0-Protein in der Membran des
rER und das Signalpeptid wird abgespalten. Auf dem Weg zur Zelloberfläche wird
das Vorläuferprotein in den Zisternenstapeln des Golgi Apparates glykosyliert und
durch lokale Proteasen in den aminoterminalen F2-Anteil (116 AS, ~12 kDa) und den
carboxyterminalen F1-Anteil (437 AS, 55 kDa) gespalten (Nagai and Klenk 1977).
Dabei ist die Aminosäuresequenz im Bereich der proteolytischen Spaltstelle des F0Proteins (AS 112-117) entscheidend für die Spaltbarkeit und eine bedeutsame
Pathogenitätsdeterminante des NDV (Nagai, Klenk et al. 1976). Die F1- und F2Proteine bleiben über die Ausbildung einer Disulfidbrücke, bedingt durch die
Anwesenheit von zahlreichen Cysteinresten im carboxyterminalen Ende des F1Proteins und mindestens einem Cystein im F2-Protein, miteinander verbunden. Im
weiteren Verlauf interagiert dieser heterodimere Komplex zu Trimeren (Russell,
Paterson et al. 1994; Chen, Gorman et al. 2001). Der Aminoterminus des F1Proteins, der durch die proteolytische Spaltung ensteht und auch als Fusionspeptid
bezeichnet wird, stellt einen stark hydrophoben Bereich dar, der direkt an der Fusion
zwischen Virus- und Wirtszellmembran beteiligt ist. Eine zusätzliche hydrophobe
Domäne am Carboxyterminus des F1-Proteins verankert das Protein in der
Virushüllmembran (Nagai, Hamaguchi et al. 1989).
Das Hämagglutinin-Neuraminidase Protein (HN-Protein)
Das HN-Protein hat sowohl Hämagglutinin-, als auch Neuraminidase-Aktivitäten und
ist die wichtigste antigene Determinante der NDV. HN bindet an sialinsäurehaltige
Rezeptoren der Wirtszellmembran und vermittelt so die Adsorption der Viren.
Zusätzlich wird durch die Neuraminidase-Aktivität Sialinsäure von der Membran
abgespalten. Das ist für eine effiziente Ausbreitung der Viren von großer Bedeutung,
denn das Entfernen dieser Rezeptorgruppe verhindert die Aggregation von viralen
Partikeln während des Ausschleusungsprozesses (Budding) und erschwert die
Infektion derselben Zelle mit Viruspartikeln (Lamb and Parks 2007).
Das HN-Protein gehört zu den Typ II Membranproteinen und besteht aus einer
aminoterminalen
zytoplasmatischen
Domäne,
gefolgt
von
einer
Transmembrandomäne. Daran schließt sich eine außerhalb der Virusmembran
7
gelegene Stieldomäne an, auf welcher die große carboxyterminale Kopfregion
angeordnet ist, die für Rezeptorbindungsfähigkeit und enzymatische Aktivität
verantwortlich ist (Scheid, Caliguiri et al. 1972; Parks and Lamb 1990).
Genomsequenzvergleiche verschiedener NDV-Isolate zeigten die Existenz von
verschiedenen HN-Genotypen, die auf Positionsunterschiede des Stop-Kodons für
den offenen Leserrahmen (open reading frame, orf) des HN zurückzuführen sind.
Bisher wurden HN-Proteine von 616, 577 oder 571 AS isoliert (Sakaguchi, Toyoda et
al. 1989). Jüngst konnte von Bernhanu et al. zusätzlich ein HN-Protein von 581 AS in
malaysischen NDV-Isolaten detektiert werden (Berhanu, Ideris et al. 2010), was auf
eine Punktmutation (Nukleotidposition 8164) im Stop-Kodon des 571 AS langes HNProteins und eine dadurch bedingte verspätete Beendigung der Transkription
zurückzuführen ist.
Bei lentogenen NDV-Isolaten wurde ein HN-Protein mit 616 AS als Vorläuferprotein
HN0 nachgewiesen (Nagai, Klenk et al. 1976; Nagai and Klenk 1977), von welchem
ein Glykopeptidrest zur Aktivierung proteolytisch abgespalten wird (Garten, Kohama
et al. 1980; Schuy, Garten et al. 1984). Bei den meisten NDV-Stämmen werden
kürzere HN-Proteine von 577 oder 571 AS exprimiert, welche ohne posttranslationale
Spaltung funktionell sind (Alexander 1997). Interessanterweise wurden bisher die
kürzesten HN-Proteine von 571 AS nur in velogenen Isolaten gefunden.
Ein weiterer stammspezifischer Unterschied ist das Vorkommen von HNHomodimeren, bedingt durch ein Cystein an AS Position 123 im HN-Protein und die
daraus resultierende Bildung einer Disulfidbrücke zwischen 2 HN-Molekülen (Mirza,
Sheehan et al. 1993).
1.5.2. Das Matrixprotein (M-Protein)
Das M-Gen kodiert für ein Protein von 364 AS (40 kDa) (Nagai, Ogura et al. 1976;
Rott and Klenk 1977), das in den Virionen das am häufigsten vorkommende Protein
ist. Die Aminosäuresequenzen der M-Proteine verschiedener NDV-Isolate sind stark
homolog (mindestens 93%). Die Aminosäuren am Aminoterminus des M-Proteins
weisen einen leicht sauren Charakter auf, während der restliche Teil des Proteins
stark basisch und leicht hydrophob ist. Trotz der geringen Hydrophobizität weist das
M-Protein keine ausreichend langen Domänen auf, um als Transmembranprotein
agieren zu können (Chambers, Millar et al. 1986). Durch Fraktionierung von Virionen
konnte gezeigt werden, dass das M-Protein mit der Virusmembran interagiert (Nagai,
8
Ogura et al. 1976; Faaberg and Peeples 1988) und darüber hinaus in
Wechselwirkung mit den zytoplasmatischen Domänen der Gykoproteine F und HN
steht. Zusätzlich ist das M-Protein mit dem Nukleokapsid assoziiert. Durch diese
simultane Interaktion des M-Proteins mit der viralen Membran und dem Nukleokapsid
wird ihm eine zentrale Rolle bei der Virusmorphogenese und der Virusfreisetzung
zugeschrieben (Lamb and Parks 2007).
1.5.3. Die Proteine des RNP-Komplexes
Das Nukleoprotein (NP-Protein)
Das NP-Protein bildet die Haupkomponente des Nukleokapsids und besteht aus 489
AS (53 kDa). Generell unterscheidet man zwei strukturelle Regionen innerhalb des
NP-Proteins: eine aminoterminale Domäne, welche circa 60% des Proteins
repräsentiert, und eine carboxyterminale Domäne. Innerhalb der aminoterminalen
Region
gibt
es
einen
zentralen
Bereich,
der
unter
den
Vertretern
der
Paramyxovirinae hochkonserviert und essentiell für die Selbstassemblierung der NPProteine untereinander und mit der viralen RNA ist. Durch die enge Bindung der NPMoleküle an das RNA-Genom wird der Schutz der RNA vor zelleigenen Proteasen
gewährleistet und die RNA in ihren biologisch aktiven Zustand versetzt, der für die
Transkription essentiell ist. Die carboxyterminale Domäne des Proteins ist weniger
konserviert, aber wichtig für die Wechselwirkungen der NP-Proteine mit den
Proteinen P und L (Nagai, Hamaguchi et al. 1989; Lamb and Parks 2007).
Das Phosphoprotein (P-Protein)
Das P-Protein ist 395 AS lang (53- 56 kDa) und als Komponente des Nukleokapsids
essentiell für die virale RNA-Synthese. Die carboxyterminalen Regionen des Proteins
interagieren mit dem L-Protein und binden an die mit dem NP-Protein assoziierte
virale RNA. Zusätzlich wird über diese Domäne die Aggregation von P-Proteinen zu
Trimeren hervorgerufen. Das P-Protein ist ein essentieller Cofaktor in dem Komplex
aus L- und P-Protein, welcher für die Synthese der verschiedenen RNA-Produkte
verantwortlich ist, wobei das L-Protein die gesamte enzymatische Aktivität trägt
(Lamb and Parks 2007).
Durch die Insertion eines oder zweier Guanosinreste am konservierten Editierungort
(Nukleotid (nt) 2280-2287; UUUUUCCC, NDV Clone 30) konnten für NDV drei vom
9
P-Gen abgeleitete mRNA-Spezies nachgewiesen werden. Die von diesen mRNASpezies translatierten Proteine sind das P-Protein (uneditiert), das V-Protein
(Insertion eines Guanosinrestes; 238 AS; 36 kDa) und das W-Protein (Insertion
zweier Guanosinreste, 181 AS, 33 kDa) (Steward, Vipond et al. 1993). Die Proteine V
und W sind virale Nichtstrukturproteine, also Proteine, die zwar in infizierten Zellen,
aber nicht in den ND-Viruspartikeln nachzuweisen sind (Steward, Vipond et al. 1993).
Über die Bedeutung der Proteine V und W ist bis heute nur wenig bekannt. Für das
NDV
V-Protein,
speziell
für
die
carboxyterminale
Domäne,
konnte
eine
antagonistische Funktion im Interferon (IFN)-Stoffwechsel nachgewiesen werden
(Park, Shaw et al. 2003). Eine virale Blockierung der IFN-Antwort des Wirtes ist für
eine effektive Replikation der NDV und eine damit verbundene Ausbreitung der Viren
im Organismus essentiell (Park, Garcia-Sastre et al. 2003).
Wie für NDV konnten auch für andere Vertreter der Paramyxovirinae RNAEditierungsvorgänge und die Nutzung alternativer Leserahmen im P-Gen mit dem
Hervorbringen zusätzlicher viraler Struktur- und Nichtstrukturproteine nachgewiesen
werden (Kolakofsky, Pelet et al. 1998).
Die RNA abhängige RNA Polymerase (L-Protein)
Das L-Protein (L= large) ist mit 2204 AS und einem Molekulargewicht von 249 kDa
das größte NDV Protein. Sequenzanalysen einiger Vertreter der Paramyxoviren
zeigten, dass alle L-Proteine annähernd die gleiche Größe von zirka 2200 AS
besitzen (Lamb and Kolakofsky 2001). NDV-Partikel, als auch Virionen anderer
Paramyxoviridae, enthalten nur etwa 50 Kopien an L-Protein, die untereinander
assoziieren und gebunden an das P-Protein im Nukleokapsid vorkommen. Das LProtein ist eine RNA-abhängige RNA-Polymerase, welche aber nur im Komplex mit
dem P-Protein aktiv ist. Das P-Protein stellt dabei eine Brücken zur RNA her.
Zusätzlich ist das L-Protein aber auch für Methylierungsreaktionen, die Bildung von
Cap-Strukturen an den 5´-mRNA-Enden und die Polyadenylierung der 3´-mRNAEnden
verantwortlich
(Lamb
and
Parks
2007).
Obwohl
die
Amino-
und
Carboxytermino des L-Proteins unter den einzelnen Vertretern der Paramyxoviridae
verschieden sind, konnten in der Mitte des Polypeptids sechs hoch konservierte
Domänen (I-VI) identifiziert werden, die in Zusammenhang mit den multiplen
Funktionen des L Proteins zu stehen scheinen (Poch, Blumberg et al. 1990; Sidhu,
10
Menonna et al. 1993; Svenda, Berg et al. 1997; Kusumaningtyas, Tan et al. 2004;
Wise, Sellers et al. 2004; Kattenbelt, Stevens et al. 2006; Fuller, Brodd et al. 2010).
Durch die zusätzliche Interaktion der NP-Proteine mit den Proteinen L und P wird die
sichere Bindung des L-P Polymerasekomplexes an die RNA gewährleistet. Der
Komplex aus den Proteinen NP, P und L ist essentiell für die Transkription und
Replikation des RNA-Genoms, wobei die Aggregation zwischen dem NP- und PProtein ein entscheidendes Transkriptions-Terminationssignal darstellt (Lamb and
Parks 2007; Modrow, Falke et al. 2010).
1.6. Replikation
Die Wechselwirkung vom NDV mit Oberflächenrezeptoren der Wirtszelle ist der erste
Schritt für eine erfolgreiche Virusreplikation und eine wichtige Determinante der
viralen Wirtsspezifität. Die Anlagerung an die Wirtszelle erfolgt über das virale
Oberflächenprotein HN, das an Sialinsäure enthaltende Rezeptoren, wie Ganglioside
und Glykoproteine (Ferreira, Villar et al. 2004), auf der Wirtszelle bindet. Auf diese
Weise werden die virale Membran und die Zytoplasmamembran der Wirtszelle in
enge Nachbarschaft gebracht, wodurch die stark hydrophoben Aminosäuren am
Aminoterminus des F1-Proteins mit der Lipidschicht der Zytoplasmamembran
interagieren können, und so eine zusätzliche Verbindung zwischen Wirtszelle und
Viruspartikel geschaffen wird, die die Membranfusion unterstützt. Die Aufnahme der
NDV-Partikel erfolgt vorrangig über die pH-unabhängige direkte Verschmelzung der
Virushülle mit der Plasmamembran (Bratt and Gallaher 1969). Aber auch durch
Caveolae-vermittelte Endozytose (San Roman, Villar et al. 1999; Cantin, Holguera et
al. 2007) kann der Eintritt in die Wirtszelle erfolgen, woraufhin der RNP-Komplex in
das Zellinnere freigesetzt wird. Alle weiteren Schritte der Replikation finden nach
derzeitigem Kenntnisstand im Zytoplasma statt (Lamb and Parks 2007). Der RNPKomplex erfüllt im Laufe des Infektionszyklus zwei Aufgaben: die Transkription des
Genoms in geeignete mRNA-Spezies und die Synthese durchgehender RNAMoleküle in Positivstrangorientierung (Antigenom), die Voraussetzung für die Bildung
neuer Virusgenome sind. Zunächst wird am 3´-Ende der RNA eine nicht gecappte
und nicht polyadenylierte, zur Leader-Sequenz komplementäre RNA synthetisiert, die
vor dem Beginn des NP-Gens abbricht, und der regulatorische Aufgaben
zugesprochen
werden
(Kurilla,
Stone
11
et
al.
1985).
Die
Genstart-
bzw.
Genendsignalsequenzen
der
jeweiligen
Proteingene
dienen
der
Transkriptionsinitiation bzw. -termination. Der Transkriptionskomplex überspringt die
einzelnen intergenen Sequenzen, wodurch diese nicht in die entstehende mRNASequenz integriert werden. Dieses Start-Stop-Muster der Transkription wiederholt
sich, bis die mRNA des letzten Gens, L, synthetisiert ist. Beim Überspringen der
intergenen Regionen kann es passieren, dass der Enzymkomplex die Verbindung
zur RNA-Matrize verliert und die Transkription am 3´-Ende neu initiiert werden muss.
So bildet sich ein in 3´-5´-Richtung abfallender Transkriptionsgradient heraus (Wertz,
Moudy et al. 2002; Whelan, Barr et al. 2004). Alle viralen mRNAs sind gecappt und
polyadenyliert. Nach der Translation erster Transkripte und der Akkumulation viraler
Proteine erfolgt die Replikation des Negativstrang-RNA-Genoms, um durchgehende
virale RNA-Moleküle in Positivstrangorientierung, die auch als Antigenom bezeichnet
werden, zu bilden. Die Umschaltung von Transkription zur Replikation kann erst
erfolgen, wenn genügend NP-Proteine frei verfügbar sind. Diese lagern sich an die
Leader-RNA an und verhindern dadurch den Abbruch der Transkription an den
intergenen Sequenzen. Zusätzlich interagieren die NP-Proteine mit den P-Proteinen,
die wiederum mit der Polymerase (L) einen Komplex bilden und diese in ihrer
Aktivität so verändern, dass die Replikation gefördert wird. Die nun im Zytoplasma
vorliegenden Antigenome, die weder gecappt noch polyadenyliert sind, werden zur
Synthese neuer Virusgenome (negative Polarität) genutzt, die ebenfalls nicht
gecappt und polyadenyliert sind, aber sofort mit NP-Proteinen interagieren. Durch die
zusätzliche Anlagerung des P-Proteins zusammen mit dem L-Protein wird der RNPKomplex gebildet (Verhältnis L-Protein:P-Protein 1:10). Nach der gleichzeitigen
Translation der viralen Proteine F, HN und M am rauen endoplasmatischen
Retikulum erfolgt im Golgiapparat die Glykosylierung der HN- und F-Proteine und die
Spaltung des F0-Proteins in die Untereinheiten F1 und F2, die über eine
Disulfidbrücke in Kontakt bleiben. Entlang zellulärer Aktinfilamente werden die
Virusproteine zur Zellmembran transportiert (Rutter and Mannweiler 1977). Dort
werden die Glykoproteine F und HN in die Zellmembran integriert. Für das F-Protein
konnte gezeigt werden, dass es in Membran-Rafts, die sich durch eine veränderte
Lipid- und Protein-Zusammensetzung von der restlichen Membran unterscheiden,
eingefügt wird (Dolganiuc, McGinnes et al. 2003). Die M-Proteine lagern sich an der
Innenseite der Zytoplasmamembran an und interagieren sowohl mit den viralen
Glykoproteinen als auch mit den Proteinen des RNP-Komplexes. Im weiteren Verlauf
12
stülpt sich die Plasmamembran aus und die Viruspartikeln werden durch Knospung
(budding) an der Zelloberfläche freigesetzt (Simons and Garoff 1980; Lamb and
Parks 2007).
Die folgende Abbildung (Abb.2) gibt einen schematischen Überblick über den
Replikationszyklus von NDV.
Abb.3: Replikationszyklus von NDV.
13
1.7. Virulenzdeterminanten
In den letzten Jahren wurden zahlreiche Studien durchgeführt, um molekulare
Ursachen der unterschiedlichen Virulenzen von NDV herauszufinden. Bereits im
Jahre 1976 erkannten Nagai et al., dass die Aminosäurekonstellation in der Region
der
proteolytischen
Spaltstelle
des
Fusionsproteins
eine
entscheidende
Virulenzdeterminante ist (Nagai, Klenk et al. 1976). Die Spaltung des F0-Proteins in
die Untereinheiten F1 und F2 ist essentiell für den Replikationszyklus der NDV. Die
Anwesenheit basischer Aminosäuren, wie Arginin oder Lysin besonders an den
Positionen 113, 115 und 116 und eines Phenylalanins an Position 117 (112K/R-RK/Q-K/R-R-↓ F117) ist charakteristisch für die F0-Spaltstelle von mesogenen und
velogenen NDV Isolaten. Diese Aminosäurekonstellation kann durch ubiquitär
vorkommende, furinähnliche Proteasen gespalten werden (Gotoh, Ohnishi et al.
1992), was zur raschen Ausbreitung der NDV im gesamten Organismus führt. Im
Gegensatz dazu können lentogene NDV nur in Zellen des Respirations- und
Intestinaltraktes replizieren, in denen trypsinähnliche Proteasen lokalisiert sind, die
ein Aminosäuremotiv mit einzelnen basische Aminosäuren innerhalb der Spaltstelle
des F0-Proteins erkennen (112G-K/R-Q-G-R-↓ L117). Mit Hilfe der reversen Genetik
wurde es möglich, veränderte rekombinante NDV zu konstruieren, um weitere
Virulenzfaktoren aufzudecken. So führte die Änderung eines monobasischen
Aminosäuremotivs innerhalb der Region der F0-Spaltstelle in ein polybasisches
Aminosäuremotiv zu rekombinanten NDV, die durch einen ICPI von 1,3
gekennzeichnet waren, welcher charakteristisch für mesogene NDV Isolate ist
(Peeters, de Leeuw et al. 1999; Römer-Oberdörfer, Werner et al. 2003). Dadurch
konnte die Bedeutung der Aminosäurekonstellation innerhalb der F0-Spaltstelle
bestätigt werden (Nagai, Klenk et al. 1976), jedoch konnte der Phänotyp eines
velogenen Isolates mit einem ICPI Wert > 1,5 allein durch die Veränderung der
Spaltstellensequenz
nicht
beobachtet
werden.
Demzufolge
müssen
weitere
Regionen im NDV-Genom die Virulenz der ND-Viren mitbestimmen. Da neben dem
F-Protein das HN-Protein am Eintritt der Viren in die Wirtszelle beteiligt ist, könnte
auch das HN-Protein eine Virulenzdeterminante sein. So führte der Austausch des
HN-Gens des virulenten NDV-Isolates Beaudette C gegen das des lentogenen NDVIsolates La Sota zu einer Verminderung der Virulenz, wohingegen das HN-Gen von
Beaudette C im La Sota Hintergrund eine Steigerung der Virulenz bewirkte (Huang,
14
Panda et al. 2004). Ähnliche Ergebnisse erzielten de Leeuw et al. beim Austausch
der HN-Gene zwischen La Sota und dem virulenten NDV Isolat Herts 33 (de Leeuw,
Koch et al. 2005). Beide Studien zeigten eindeutig, dass HN an der Ausprägung der
Virulenz beteiligt ist. Im Gegensatz dazu führte in einer Studie von Wakamatsu et al.
der Austausch des HN-Gens eines virulenten NDV-Stammes in den lentogenen La
Sota Hintergrund weder zu einer Veränderung des ICPI-Wertes der resultierenden
NDV Rekombinante, noch zu einer Änderung der klinischen Symptome in Hühnern
(Wakamatsu, King et al. 2006).
Durch Sequenzanalysen des HN-Gens konnte in weiteren Arbeiten gezeigt werden,
dass die meisten NDV Stämme an Aminosäureposition (AS-Position) 123 ein Cystein
tragen, jedoch einzelne Isolate, wie z.B. das lentogene NDV-Isolat Clone 30, ein
Tryptophan. Cystein an AS-Position 123 ist für die Bildung von HN-Dimeren, die über
eine Disulfidbrücke verbunden sind, verantwortlich (Mirza, Sheehan et al. 1993;
McGinnes and Morrison 1994), welche wiederum einen positiven Einfluss auf die
Bindungsfähigkeit an die Wirtszelle und die Fusion der Virionen mit der
Zytoplasmamembran haben (McGinnes and Morrison 1994). Rekombinante NDV
(rNDV) mit einer polybasischen Spaltstelle im F-Protein und einem Cystein an ASPosition 123 im HN-Protein wiesen einen höheren Pathogenitätsindex auf als rNDV,
die nur die polybasische Spaltstelle trugen (Römer-Oberdörfer, Veits et al. 2006).
Dieses
Ergebnis
zeigt,
dass
die
Dimerisierung
des
HN-Proteins
zur
Virulenzsteigerung beitragen kann. Ein weiterer stammspezifischer Unterschied ist
die Existenz unterschiedlich langer HN-Proteine. Avirulente NDV (z.B. Queensland,
Ulster) exprimieren ein HN-Vorläuferprotein von 616 AS, wohingegen 577 AS für das
HN-Protein sowohl von lentogenen (z.B. Clone 30, B1) als auch von virulenten
Stämmen (z.B. Texas, Beaudette C) kodieren. Ein HN-Protein von 571 AS wurde
bisher nur für velogene Isolate (z.B. Miyadera, Herts 33) nachgewiesen. Dies lässt
die Hypothese zu, dass die Länge der für das HN-Protein kodierenden Sequenz die
Virulenz von NDV mitbestimmt. Jedoch konnte in einer Studie von Römer-Oberdörfer
et al., in der durch Mutation die Position des Stopkodons des HN-orf verändert
wurde, gezeigt werden, dass die Länge des HN-Proteins keine Rolle bei der Virulenz
der NDV zu spielen scheint (Römer-Oberdörfer, Werner et al. 2003). Unklar ist
jedoch, ob die Länge des HN-Proteins möglicherweise eine Bedeutung bei der
Fähigkeit der Viren, sich in den verschiedenen Organen des Wirtes zu vermehren
und auszubreiten, hat. In anderen Studien konnte der Beweis erbracht werden, dass
15
die Proteine des RNP-Komplexes die Virulenz von NDV maßgeblich mitbestimmen.
Eine Korrelation zwischen der Replikationseffizienz und der Virulenz im Wirt ist
wahrscheinlich. So führt eine effiziente Replikation zu einer gesteigerten RNASynthese und damit zu einer höheren Virusproduktion, welche wiederum die
Immunantwort des Wirtes überwinden und folglich zu einer erhöhten Viruslast und
Virulenz im Wirt führen könnte. Ein Austausch der Gene, die für die NP-, P- und LProteine des virulenten NDV-Isolates Herts 33 kodieren, gegen die des niedrig
virulenten NDV-Stammes AV324, führte zu einer Verminderung der Virulenz,
wohingegen der Ersatz der NP, P und L Gene von AV 324 gegen die von Herts 33 in
NDV-Rekombinanten resultierte, die durch eine höhere Virulenz gekennzeichnet
waren als AV 324 (Dortmans, Rottier et al. 2010). Diese Ergebnisse weisen darauf
hin, dass NDV mit RNP-Proteinen von virulenten Stämmen besser replizieren, als
diejenigen mit RNP-Proteinen von nicht virulenten Stämmen. Jedoch kamen Rout et
al. (Rout and Samal 2008) in ihrer Studie zu gegenteiligen Ergebnissen. Sie zeigten,
dass beim Austausch des L-Proteins des virulenten NDV Beaudette C gegen das des
lentogenen Stammes La Sota das resultierende rekombinante Virus besser repliziert
und eine höhere Virulenz aufweist als das Ausgangsvirus.
Das V-Protein, das durch Editierung der mRNA des P-Proteins entsteht, inhibiert die
die alpha/beta Interferon (IFN- α/β)-Antwort des Wirtes (Park, Shaw et al. 2003;
Lamb and Parks 2007). Die Cytokine IFN-α/β sind Mediatoren um Apoptose in
virusinfizierten Zellen auszulösen (Tanaka, Sato et al. 1998). Für eine erfolgreiche
Virusreplikation
ist
aber
das
Unterdrücken
proapoptotischer
Mechanismen
erforderlich, um eine effiziente Virusproduktion und Ausbreitung der Viren zu sichern
(Roulston, Marcellus et al. 1999). So zeigten rekombinante NDV mit einem Defekt in
der Expression des V-Proteins eine signifikante Verminderung der Pathogenität im
Wirt (Mebatsion, Verstegen et al. 2001; Park, Garcia-Sastre et al. 2003; Park, Shaw
et al. 2003), was darauf hinweist, dass die V-Proteinexpression direkt mit der
Virulenz der NDV korreliert. Interessant wäre in diesem Zusammenhang, ob die
Frequenz der P-Gen-mRNA-Editierung, und damit auch das Niveau der V-ProteinExpression, zwischen virulenten und avirulenten NDV Stämmen variiert. So wird
postuliert, dass die V-Proteinexpression bei virulenten NDV-Stämmen höher als bei
avirulenten Stämmen ist, wodurch eine effizientere Replikation und Ausbreitung
virulenter NDV erfolgen kann. Untersuchungen dazu sind derzeit aber nicht
veröffentlicht.
16
Zusammenfassend ist einzuschätzen, dass die Virulenz der NDV von verschiedenen
Faktoren bestimmt wird. Die Identifizierung dieser Faktoren ist sowohl für die
Entwicklung
neuartiger
Vakzinen
als
auch
für
die
Einschätzung
des
Seuchenpotentials neuer Isolate von großer Bedeutung.
2. Das Aviäre Influenzavirus
2.1. Geschichte der Aviären Influenzaviren
Die aviäre Influenza, auch Vogelgrippe genannt, wurde erstmalig 1878 in Piemont,
Italien von Perroncito beschrieben. 1901 brach in Deutschland die Krankheit im
Anschluss an eine Geflügelausstellung in Braunschweig aus (Greve 1901). In den
folgenden Jahren kam es zu zahlreichen Ausbrüchen in der ganzen Welt, die bis zu
den 1930er Jahren langsam abnahmen. Interessanterweise existieren Hinweise
darauf, dass das Virus der „Spanischen Grippe“, das über 50 Millionen Menschen in
den Jahren 1918/19 tötete, ursprünglich ein aviäres Influenzavirus des Subtyps
H1N1 gewesen war (Morens, Taubenberger et al. 2009). Die Zuordnung der aviären
Influenzaviren (AIV) zu den Influenza-A-Viren erfolgte 1955 (Schäfer 1955). Im Jahre
1983 kam es zu aviären Influenzaausbrüchen in Irland und den USA, 1992 in Mexiko
und 1997 in Hongkong. Alle diese Ausbrüche konnten den hochpathogenen AIV
(HPAI) der Subtypen H5 und H7 zugeordnet werden. Auch in den vergangenen
Jahren sorgten zahlreiche Ausbrüche der aviären Influenza, wiederum verursacht
durch HPAIV des Subtyps H5 und H7, in vielen Teilen der Erde für den Tod mehrerer
hundert Millionen Vögel (Horimoto and Kawaoka 1994; Capua and Alexander 2004;
Capua and Alexander 2007). Insbesondere der Subtyp H5N1, der seit 2005 auch
Europa erreicht hat, gilt als besonders virulent und hat zusätzlich zoonotisches
Potential. Weltweit sind bisher 566 bestätigte H5N1 Infektionen beim Menschen mit
332 Todesfolgen registriert worden (Stand Oktober 2011; www.who.int). Demzufolge
ist eine Kontrolle von HPAIV Infektionen sowohl für die Geflügelindustrie, als auch
zur Vermeidung humaner Infektionen, essentiell.
17
2.2.Taxonomie
Die aviären Influenzaviren gehören innerhalb der Familie der Orthomyxoviridae zum
Genus der Influenza-A-Viren (Alexander 1995). Zusätzlich werden auch die
Influenza-B- und Influenza-C-Viren zusammen mit den Thogotoviren und Isaviren in
die Familie der Orthomyxoviridae eingeordnet. Die Unterscheidung in Influenza-A-,
B- und C-Viren beruht auf antigenen Unterschieden im Nukleoprotein (NP-Protein)
und Matrixprotein (M1-Protein) und auf unterschiedlichen molekularen Eigenschaften
der Viren (Horimoto and Kawaoka 2005). Während die Influenza-B-Viren nur beim
Menschen und die Influenza-C-Viren zusätzlich im Schwein eine Infektion auslösen
können, wurden die Influenza-A-Viren in verschiedenen Wirten nachgewiesen,
sowohl in Vögeln als auch in Säugetieren (Wright 2007). Anhand der antigenen
Eigenschaften der Oberflächenproteine Hämagglutinin (HA) und Neuraminidase (NA)
werden die Influenza A-Viren in Subtypen unterteilt. Es werden 16 HA - und neun
NA-Untertypen unterschieden.
2.3. Klinisches Bild
Neben der Einordnung der AIV in die unterschiedlichen Subtypen (H1-H16, N1-9)
werden sie auch in zwei Pathotypen unterteilt. Entscheidend für diese Klassifizierung
sind das Ausmaß der Erkrankung und die Mortalitätsrate nach intravenöser
Applikation des betreffenden Virus an sechs Wochen alte Hühner (Bestimmung des
intravenösen Pathogenitätsindex, IVPI). AIV-Isolate mit einem IVPI>1,2 werden als
hochpathogene (von engl. highly pathogenic, HP) AIV bezeichnet, solche mit einem
IVPI<1,2 werden als gering pathogene (von engl. low pathogenic, LP) AIV eingestuft
(Geflügelpestverordnung 2007). Auf molekularer Basis können die HPAIV von den
LPAIV durch den Nachweis mehrerer aufeinanderfolgender basischer Aminosäuren
am Carboxyterminus der HA1-Untereinheit abgegrenzt werden. Dieses polybasische
Aminosäuremotiv wird von ubiquitär vorkommenden intrazellulären Proteasen
gespalten und befähigt so das Virus, in verschiedenen Geweben zu replizieren.
Dadurch werden im Wirt schwere klinische Symptome und eine Mortalitätsrate bis zu
100% verursacht. Alle bisher isolierten HPAIV gehörten den Subtypen H5 und H7 an.
18
Symptome der aviären Influenza bei Vögeln
Vor allem Hühner und Puten gelten als besonders anfällig für eine Infektion mit AIV
(Ellis, Bousfield et al. 2004; Kou, Lei et al. 2005; Liu, Xiao et al. 2005; Kelly, Hawkins
et al. 2008; Cardona, Xing et al. 2009). Zusätzlich sind aber auch andere
Vogelspezies, wie z.B. Enten, Gänse, Tauben, Papageien und heimische,
hühnerartige Vögel, wie Wachteln oder Fasanen, empfänglich für eine AIV-Infektion.
Aquatisch lebende Wildvögel stellen asymptomatische Überträger der AIV dar, da bei
ihnen alle 16 HA und 9 NA Varianten nachgewiesen werden konnten (Kawaoka,
Yamnikova et al. 1990; Webster, Bean et al. 1992; Röhm, Zhou et al. 1996; HulsePost, Sturm-Ramirez et al. 2005). AIV werden oral/fäkal übertragen, aber auch eine
aerogene Übertragung ist möglich. Eine Vermehrung der Viren findet primär im
Verdauungstrakt des Wirtes, mit einer anschließenden Ausscheidung der Viren über
den Kot, statt. Die klinischen Symptome variieren je nach Virulenz der AIV, der
Empfänglichkeit und des Immunstatus des Wirtes. Bei Infektionen mit HPAIV
reagieren die Tiere nach einer Inkubationszeit von Stunden bis wenigen Tagen
zuerst mit allgemeinen Schwächesymptomen wie Apathie oder Inappetenz, begleitet
vom hohen Fieber. Hinzu kommen schwere respiratorische Symptome, Diarrhö,
Ödeme an Kopf, Hals, Kamm, Füßen und Beinen und oft auch neurologische
Störungen. Bei Legehennen ist zusätzlich eine Abnahme der Legeleistung und der
Qualität der Eier (Dünnschaligkeit) zu beobachten. Häufig führt eine Infektion mit
HPAIV nach drei bis vier Tagen zu einer Mortalität von 100%. Im Gegensatz dazu
bleiben nach einer Infektion mit LPAIV die Symptome auf den Respirations- und/
oder Verdauungstrakt beschränkt und sind in der Regel milder. Häufig verlaufen
diese Infektionen auch gänzlich asymptomatisch und es werden nur geringe
Mortalitätsraten registriert (Capua and Alexander 2007).
Symptome der aviären Influenza beim Menschen
Eine Übertragung der AIV auf den Menschen erfolgt in der Regel über den
Respirationstrakt. Nach einer Inkubationszeit von zwei bis acht Tagen reagieren die
Patienten im Allgemeinen mit Fieber über 38°C, Kurzatmigkeit und Husten (Hui
2008). Schwere respiratorische Symptome bis hin zum Multiorganversagen und Tod
des Patienten sind häufige Befunde einer HPAIV-Infektion (H5N1). Die mittlere
Mortalitätsrate nach einer H5N1-Infektion beträgt 59,2% (Tran, Nguyen et al. 2004;
Chotpitayasunondh, Ungchusak et al. 2005; Lolekha, Sirivichayakul et al. 2005). Die
19
durchschnittliche Zeit zwischen Einsetzen der ersten Symptome und Tod des
Patienten wird dabei mit neun bis zehn Tagen angegeben (Abdel-Ghafar,
Chotpitayasunondh et al. 2008).
2.4. Morphologie und Genomaufbau
Im Elektronenmikroskop stellen sich die Influenzaviren oft als pleomorphe behüllte
Viruspartikel mit einem Durchmesser von 80-120 nm dar. Das Genom der InfluenzaA-Viren
besteht
aus
acht
einzelsträngigen
RNA-Segmenten
mit
negativer
Orientierung (virale RNA, vRNA). Die 3´- und 5´-Enden jeder einzelnen vRNA sind
über kurze Bereiche zueinander komplementär und bilden Doppelstränge aus, die
den Startpunkt für die Transkription und RNA-Replikation bilden. Jedes der acht
Gensegmente kodiert für ein bestimmtes Virusprotein. Nur Segment 7 und 8 kodieren
für zwei Polypeptide, die durch alternatives Spleißen der mRNA entstehen.
Zusätzlich wird durch Nutzung eines alternativen Leserahmens für das Segment 2
das Protein PB1-F2 gebildet. Demzufolge kodieren die acht Segmente für 11
Virusproteine (siehe folgende Tabelle) (Chen, Calvo et al. 2001; Palese and Shaila
2006).
Segment
vRNA
Virusprotein
Proteinlänge
(nt-Anzahl)
(AS-Anzahl)
1
2341
basisches Polymeraseprotein 2(PB2)
759
2
2341
basisches Polymeraseprotein 1(PB1),
PB1: 757
PB1-F2
PB1-F2: 87
3
2233
saures Polymeraseprotein (PA)
716
4
1778
Hämagglutinin (HA)
550
5
1565
Nukleoprotein (NP)
498
6
1413
Neuraminidase (NA)
454
7
1027
Matrixprotein (M1, M2)
M1: 252
M2: 97
8
890
Nichtstrukturprotein (NS1, NS2)
NS1: 230
NS2: 121
20
Im Nukleokapsid sind die RNA-Segmente über ihre gesamte Länge eng mit dem
Nukleoprotein (NP) assoziiert und bilden das Grundgerüst des RNP-Komplexes.
Zusätzlich binden pro Viruspartikel zirka 50 heterotrimere Polymerasekomplexe,
bestehend aus den Proteinen PB1, PB2 und PA, bevorzugt an den 3´-Enden der
RNA-Segmente. Das Matrixprotein (M1) ist an der Innenseite der von der Wirtszelle
abstammenden
Lipiddoppelschicht
angelagert
und
zusätzlich
mit
dem
Polymerasekomplex und dem Nichtstrukturprotein NS2 assoziiert, was für die virale
Replikation von Bedeutung ist. Die virale Hülle ist durchzogen von dem tetrameren
Protein M2, das als Ionenkanal fungiert und beim Eintritt des Virus in die Wirtszelle
für die Freisetzung der viralen Nukleinsäure, sowie für die spätere Morphogenese
verantwortlich ist. Des Weiteren sind in der Hüllmembran das Hämagglutinin (HA)
und die Neuraminidase (NA) eingelagert. Während HA essentiell für die
Virusadsorption an die Wirtszellmembran ist, ist NA wichtig für die Freisetzung neuer
Viruspartikel aus der Wirtszelle. Nach dem Eintritt des Virus in die Zelle werden
zusätzliche Nichtstrukturproteine exprimiert. Das NS2-Protein ist in die Modulation
der Immunantwort des Wirtes involviert und das PB2-F2 Protein ist bei apoptotischen
Vorgängen beteiligt (Gocnikova and Russ 2007; Hale, Randall et al. 2008).
2.5. Aufbau und Funktion der einzelnen Virusproteine
Das Hämagglutinin Protein (HA-Protein)
Das auf dem Gensegment 4 kodierte HA-Protein ist ein stabförmiger, trimerer
Proteinkomplex, der in der Hüllmembran der Virionen verankert ist, wobei der
Aminoterminus nach außen exponiert wird und die Verankerung des HA-Proteins in
der Virusmembran über den Carboxyterminus erfolgt. Die monomeren HAVorläuferproteine haben eine Länge von zirka 550 AS, von denen posttranslational
im rER ein kurzes aminoterminales Signalpeptid abgespalten wird. Auf dem
Transport durch den Golgiapparat werden sie durch Glykosylierung und Anfügen von
Palmitinsäureresten weiter modifiziert und interagieren zu Trimeren. Die Spaltung der
HA-Vorläuferproteine (HA0-Proteine) durch zelluläre Proteasen in die Untereinheiten
HA1 (36 kDa, modifiziert 50 kDa) und HA2 (26 kDa) ist essentiell für die
Fusionsaktivität (Klenk, Rott et al. 1975; Lazarowitz and Choppin 1975; Porter,
Barber et al. 1979). HA1 und HA2 bleiben unter Ausbildung einer Disulfidbrücke
21
miteinander verbunden. Die aminoterminale HA1-Untereinheit ist für die Adsorption
der Virionen an endständige Neuraminsäuren auf der Wirtszelle verantwortlich,
während der aminoterminale unpolare hydrophobe Abschnitt der HA2-Untereinheit
die Fusion der Virus- mit der Endosomenmembran zu Beginn des Replikationszyklus
bewirkt. Die Aminosäurekonstellation an der Spaltstelle des HA0-Proteins ist eine
wichtige Virulenzdeterminante der Influenzaviren.
Das HA-Protein ist das Hauptantigen, das während einer Influenzainfektion vom
adaptiven Immunsystem des Wirtes erkannt wird, in dessen Folge es zur
Generierung neutralisierender Antiköper kommt (Palese and Shaw 2007).
Das Neuraminidase Protein (NA-Protein)
Das RNA-Segment 6 kodiert für das 454 AS lange NA-Protein. Es ist neben dem HAProtein das zweite Glykoprotein, welches in der Membran der Virionen verankert ist.
Das NA-Protein ist ein Typ II Membranprotein, dessen Aminoterminus in das Innere
der Virionen ragt. An die hoch konservierte zytoplasmatische Domäne schließt sich
die hydrophobe Transmembranregion an, die den Anker für die Stiel- und
Kopfdomäne bildet. Die Kopfdomäne ist ein Homotetramer, wobei jedes Monomer
aus sechs β-Faltblattregionen besteht, die in Form eines Flugzeugpropellers
angeordnet sind. In der Kopfregion ist die enzymatische Aktivität des NA-Proteins
lokalisiert, welche dazu dient, nach erfolgter Infektion Neuraminsäurereste von der
Zelloberfläche und den Viruspartikeln zu entfernen. Dieser Vorgang spielt zum einen
bei der Loslösung der Virionen von der Wirtszelle eine Rolle und verhindert zum
anderen die Aggregation der Virionen untereinander (Palese and Compans 1976;
Palese and Garcia-Sastre 2002).
Antikörper gegen das NA-Protein sind in der Regel nicht neutralisierend, aber eine
Immunisierung mit NA kann die Krankheitssymptome einer Influenzainfektion mildern
(Kilbourne, Pokorny et al. 2004).
Die Matrixproteine (M1/ M2-Proteine)
Die Matrixproteine sind auf dem Gensegment 7 kodiert.
Das M1-Protein (252 AS) ist das am häufigsten vorkommende Protein in den
Influenza-A-Virionen und ist direkt an der Innenseite der Hüllmembran verankert. Das
M1-Protein besteht aus zwei kugelförmigen, schraubenförmig gedrehten Domänen,
die über eine Protease-empfindliche Region verbunden sind (Sha and Luo 1997;
22
Arzt, Baudin et al. 2001; Harris, Forouhar et al. 2001). Das M1-Protein ist sowohl mit
den zytoplasmatischen Domänen der Membranglykoproteine, als auch mit den
Proteinen des RNP-Komplexes und NS2- Proteinen verbunden. Daher wird dem M1Protein eine entscheidende Funktion beim Zusammenbau (Assembly) und beim
Ausschleusungsprozess (Budding) der Viren zugesprochen (Gomez-Puertas, Albo et
al. 2000; Latham and Galarza 2001).
Das M2-Protein (97 AS) entsteht durch alternatives Spleißen der mRNA des MSegments. Die M2-Proteine sind tetramere integrale Typ III Membranproteine und
fungieren in der Virionmembran als Ionenkanäle, die während der Anfangsphase der
Replikation Protonen aus den sauren Endosomen in das Innere der Virionen
schleusen, um dort den RNP-Komplex von den M1-Proteinen und NP-Proteinen zu
lösen (Hay 1992).
Das Nukleoprotein (NP-Protein)
Das RNA-Segment 5 kodiert für das 498 AS lange NP-Protein. Jedes RNA-Segment
liegt als RNP-Komplex vor, in dem die RNA durch NP-Proteine umhüllt wird und mit
dem heterotrimeren Polymerasekomplex assoziiert ist. Das NP-Protein ist reich an
Arginin und hat daher eine positive Ladung, welche wiederum für die Interaktion mit
den negativ geladenen Phosphatresten des viralen RNA-Grundgerüstes notwendig
ist. Die virale RNA bleibt gegenüber der Spaltung durch RNasen empfindlich
(Duesberg 1969). Das spricht für das Modell, dass die RNA die Außenseite der NPProteine umwickelt und ihre Basen nach außen exponiert, so dass sie für die
Polymerase zugänglich bleiben, ohne die RNP-Struktur aufzulösen (Baudin, Bach et
al. 1994). Die NP-Proteine sind für die strukturelle Organisation der RNP-Komplexe
unabdingbar. Strukturelle Analysen zeigten zusätzlich, dass die NP-Proteine mit dem
Polymerasekomplex in Kontakt stehen (Martin-Benito, Area et al. 2001; Area, MartinBenito et al. 2004).
Die basischen Polymeraseproteine (PB1/ PB2-Protein; PB1-F2)
Das PB1-Protein ist neben dem PB2-Protein und dem PA-Protein essentieller
Bestandteil des viralen RNA-Polymerase Komplexes. Das Gensegment 2 kodiert für
das 757 AS große Protein, das über seine amino- und carboxyterminalen Domänen
sowohl Kontakt zum PB1- als auch zum PA-Protein hat (Gonzalez, Zurcher et al.
1996; Ohtsu, Honda et al. 2002). Das PB1-Protein bindet an vRNA (Li, Ramirez et al.
23
1998; Gonzalez and Ortin 1999) und cRNA (von engl. complemantary) (Gonzalez
and Ortin 1999) und bewirkt so die Initiation der Transkription und Replikation.
Zusätzlich besitzt das PB1-Protein eine Endonukleaseaktivität, die notwendig ist, um
5´-Kappen-Oligonukleotide von Wirtszell-mRNA-Transkripten abzuspalten („cap
snatching“) (Krug 1981), welche wiederum essentiell für den Start der viralen
Transkription sind. Im Verlauf der Transkription/ Replikation katalysiert das PB1Protein das fortlaufende Einfügen von Nukleotiden (Braam, Ulmanen et al. 1983).
Das PB2-Protein umfasst 759 AS und wird durch Transkription/Translation des
RNA-Segmentes 1 synthetisiert. Es bildet mit den PB1-Protein und dem PA-Protein
den Polymerasekomplex. Das PB2-Protein ist für die Bindung der 5´-KappenOligonukleotide der Wirtszell-mRNA verantwortlich und daher notwendig für den
Transkriptionsstart (Ulmanen, Broni et al. 1981; Blaas, Patzelt et al. 1982). Es wird
dem PB2-Protein aber auch eine Rolle bei der Replikation zugesprochen
(Gastaminza, Perales et al. 2003).
Das Nichtstrukturprotein PB1-F2 wird durch Leserasterverschiebung (ORF+1) aus
dem PB1-Segment generiert. Es umfasst 87 AS und ist nach der Synthese in
Mitochondrien lokalisiert. Dort permeabilisiert es die Membran, was zum Freiwerden
von Cytochrom C führt, in dessen Folge Apoptose in der Wirtszelle induziert wird
(Chen, Calvo et al. 2001; Chanturiya, Basanez et al. 2004).
Das saure Polymeraseprotein (PA-Protein)
Das RNA-Segment 3 kodiert für das 716 AS große PA-Protein. Das PA-Protein bildet
die dritte Komponente des Polymerasekomplexes und hat Kontakt mit dem PB1Protein, aber nicht mit dem PB2-Protein. Das Einführen verschiedener Mutationen
innerhalb des PA-Proteins beeinflusst sowohl die Transkription als auch die
Replikation der Influenzaviren, was eine Beteiligung des PA-Proteins an beiden
Prozessen widerspiegelt (Fodor, Crow et al. 2002; Fodor, Mingay et al. 2003; Huarte,
Falcon et al. 2003). Zusätzlich wird dem PA-Protein eine proteolytische Aktivität
zugeschrieben (Sanz-Ezquerro, de la Luna et al. 1995).
Die Nichstrukturproteine (NS1/ NS2-Protein)
Die Nichtstrukturproteine sind auf dem RNA- Segment 8 kodiert.
Das NS1-Protein hat eine Länge von 230 AS und wird in großen Mengen in
infizierten Zellen exprimiert, nicht aber in Virionen eingebaut. Es kommt als Dimer
24
vor, bindet an RNA (Hatada and Fukuda 1992; Nemeroff, Qian et al. 1995) und
verhindert so den Export zellulärer mRNA aus dem Kern und das Spleißen von prämRNA. Zusätzlich unterdrückt NS1 die Interferonantwort virusinfizierter Zellen, was
wiederum zur ungehinderten Virusproduktion beiträgt (Garcia-Sastre 2005).
Das NS2-Protein umfasst 121 AS und wird durch alternatives Spleißen der prämRNA des Segmentes 8 generiert. Im Unterschied zum NS1-Protein konnte das
NS2-Protein bereits in Virionen in einer Kopienzahl von circa 120 Molekülen
nachgewiesen werden (Richardson and Akkina 1991). Das NS2-Protein bindet an
das zelluläre Kernexportprotein Crm1 (Neumann, Hughes et al. 2000) und
gleichzeitig an die im Kern neu synthetisierten viralen RNP-Komplexe (Yasuda,
Nakada et al. 1993; Akarsu, Burmeister et al. 2003), weshalb angenommen wird,
dass
das
NS2-Protein
durch
seinen
Kontakt
mit
der
zellulären
Kernexportmaschinerie für die Ausschleusung der viralen Genome durch die
Kernporen in das Zytoplasma notwendig ist.
2.6. Replikation
Über
die
Bindung
des
Oberflächenproteins
HA
an
zelluläre
N-
Acetylneuraminsäurereste erfolgt die Adsorption der Viruspartikel an die Wirtszelle,
was die rezeptorvermittelte Endozytose induziert. Durch Ansäuern der Endosomen
kommt es zur Konformationsänderung des HA-Proteins (HA2-Anteil) und die Fusion
der Vesikelmembran mit der Virusmembran wird ausgelöst. Gleichzeitig wird das
saure Milieu durch die M2-Ionenkanäle in das Innere der Virionen weitergeleitet
(Pinto, Holsinger et al. 1992) und bewirkt dort die Unterbrechung der Interaktion der
NP- mit den M1-Proteinen. Die nun freie virale RNA kann durch die Kernporen in den
Zellkern transportiert werden. Im Zellkern erfolgt die Transkription der viralen RNA
durch die RNA-abhängige RNA-Polymerase. Der Export der viralen mRNA in das
Zytoplasma wird über zelluläre und virale Proteine (NS1) vermittelt. Die
membranassoziierten Proteine HA, NA und M2 werden an den Ribosomen des
endoplasmatischen Retikulums translatiert und über den Golgiapparat und den
Golgivesikel an die Zelloberfläche transportiert. Im Golgiapparat erfolgt durch
zelluläre Proteasen außerdem die Spaltung des HA-Vorläuferproteins in HA1 und
HA2, die über die Ausbildung einer Disulfidbrücke miteinander verbunden bleiben.
Die Translation der anderen mRNA-Moleküle erfolgt an Ribosomen im Zytoplasma.
25
Die entstehenden viralen Proteine werden aufgrund von Signalsequenzen zurück in
den Zellkern transportiert. Durch die Anreicherung von NP-Proteinen im Zellkern wird
die Polymerase in ihrer Aktivität so verändert, dass ein Umschalten von Transkription
auf Replikation erfolgt und vollständige antigenomische RNA-Stränge synthetisiert
werden. Diese Antigenome komplexieren ihrerseits sofort mit NP-Proteinen und
dienen als Matrize zur Synthese neuer viraler RNA-Stränge in negativer Orientierung,
welche mit NP-, PB1-, PB2- und PA-Proteinen zu Nukleokapsiden assoziieren. Diese
bilden mit dem M1-Protein einen Komplex, der anschließend aus dem Zellkern zur
Plasmamembran transportiert wird. Der Export in das Zytoplasma wird dabei durch
das NS2-Protein vermittelt (Chen and Krug 2000). An der Plasmamembran erfolgt
nun die Interaktion der neu synthetisierten Membranproteine HA, NA und M2 mit den
M1-Protein-komplexierten Nukleokapsiden, erste Budding-Strukturen bilden sich aus
und die vollständigen Virionen werden von der Zelle abgeschnürt. Das NA-Protein
sorgt im letzten Schritt für die Abspaltung von Neuraminsäureresten auf Rezeptoren
der Virus- und der Wirtszellmembran, wodurch sich die Viruspartikel von der
Wirtszelle lösen können und zusätzlich eine Aggregation der Viruspartikel
untereinander verhindert wird (Palese, Tobita et al. 1974; Palese and Shaila 2006;
Palese and Shaw 2007).
Anigen-Drift und Antigen-Shift
Infolge der Genomorganisation und des Replikationsmechanismus der Influenza-AViren entstehen genetische Variationen durch zwei wesentliche Mechanismen:
Antigen-Drift und Antigen-Shift.
Antigen-Drift wird durch Punktmutationen im Genom hervorgerufen, ausgelöst durch
den fehlenden Korrekturmechanismus der RNA-Polymerase und die dadurch
bedingte hohe Fehlerrate beim Ablesen der Matrizen-RNA. Dieser Mechanismus wird
im Allgemeinen für die Anhäufung basischer Aminosäuren in der Region um die HA0Spaltstelle und die damit verbundene Veränderung von einem LPAIV- zu einem
HPAIV-Pathotyp verantwortlich gemacht. Kommt es bei den Punktmutationen wie
beim HA zur Veränderung von Oberflächenantigenen, kann es zur Bildung von
immunevasiven Viren kommen. Ist die wirtszellbindende Domäne des HA-Proteins
von diesen Mutationen betroffen, kann daraus eine Änderung der Wirtsspezifität
resultieren.
26
Antigen-Shift bezeichnet ein Prozess, bei dem einzelne virale Gensegmente
zwischen Influenza A-Subtypen ausgetauscht werden. Der Prozess tritt auf, wenn
zwei verschiedene Subtypen simultan eine Wirtszelle infizieren und es während der
Virusmorphogenese zum Mischen der einzelnen Gensegmente kommt. Dabei kann
es zur Generierung von Reassortanten kommen, für welche das Immunsystem des
Wirtes völlig naiv ist, wodurch das Entstehen einer Pandemie begünstigt werden
kann (Wright 2007).
2.7. Wirtsspektrum
Entscheidend für die Wirtsspezifität der Influenzaviren ist u.a. die Aminosäureabfolge
der sialinsäurebindenden Domäne der HA1-Untereinheit. Während aviäre Influenza
A-Viren an Sialinsäuren binden, die über eine α-2,3-Bindung an Glykoproteine und
Glykolipide der Wirtszelloberfläche gebunden sind, bevorzugen humane Influenza AViren α-2,6-gebundene Sialinsäuren (Couceiro, Paulson et al. 1993; Matrosovich,
Matrosovich et al. 2004). Die Ausstattung der Wirtszellen mit diesen beiden
Möglichkeiten der Sialinsäurebindung unterscheidet sich zwischen Mensch und Tier,
aber auch innerhalb der jeweiligen Spezies (Suzuki, Ito et al. 2000). So sind
beispielsweise
in
Enten
α-2,3-bindende
Sialinsäuren
auf
den
kryptischen
Epithelzellen des Darms zu finden und bedingen dort die Replikationsfähigkeit von
AIV. Im Gegensatz dazu ist im Menschen Sialinsäure in α-2,6-Bindung auf der
Oberfläche der Epithelzellen des Nasenrachenraums, der Trachea und den
Bronchien nachweisbar, was wiederum die Infektion mit humanen Influenzaviren in
diesem Bereich fördert (Shinya, Ebina et al. 2006). Allerdings exprimieren die
humanen Epithelzellen der Bindehaut und der unteren Atemwege α-2,3-gebundene
Sialinsäuren, was den Eintritt von AIV, z.B. H5N1, unterstützt und zu einer
dramatischen Infektion der unteren Atemwege führen kann (Ito, Suzuki et al. 2000;
Olofsson, Kumlin et al. 2005). In einigen Fällen zeigten speziell die H5N1-Subtypen
zusätzlich zu der Bindung an α-2,3-gebundene Sialinsäure eine geringe Affinität für
α-2,6-Bindungen, was auf eine erhöhte Fähigkeit der H5N1-Viren an humane
Zellrezeptoren zu binden, hindeutet (Stevens, Blixt et al. 2006; Yamada, Suzuki et al.
2006; Yang, Wei et al. 2007; Stevens, Blixt et al. 2008). Das Schwein nimmt bei der
Art der Sialinsäurebindung eine Sonderstellung ein. Die trachealen Epithelzellen
exprimieren sowohl α-2,3-, als auch α-2,6- gebundene Sialinsäure und befähigen so
27
gleichermaßen aviäre und humane Influenzaviren in die Zellen zu gelangen (Ito,
Couceiro et al. 1998). Somit steigt die Wahrscheinlichkeit für eine Reassortierung
und damit auch für das Entstehen neuer Virusvarianten. Auch wenn die HA-Bindung
für die virale Anheftung an Wirtszellrezeptoren entscheidend ist, ist dieser Prozess
nicht ausschließlich bestimmend für den Wirtstropismus. Zusätzlich muss der virale
Polymerasekomplex mit der zellulären Maschinerie des Wirtes kompatibel sein, damit
eine erfolgreiche Replikation stattfinden kann (Resa-Infante, Jorba et al. 2008;
Manzoor, Sakoda et al. 2009).
2.8. Virulenzdeterminanten
Als wichtige Virulenzfaktoren der AIV werden die Glykoproteine (HA- und NAProtein), das PB2-Protein und das NS1-Protein diskutiert.
Die Glykoproteine (HA- und NA-Protein)
Das
HA-Protein
ist
essentiell
für
die
Anheftung
der
Virionen
an
die
Wirtszellmembran mit der darauffolgenden Fusion der viralen mit der zellulären
Membran. Voraussetzung dafür ist die Spaltung des Vorläuferpeptids HA0 durch
zelluläre Proteasen in die Untereinheiten HA1 und HA2. Entscheidend für die
Spaltbarkeit ist die Aminosäureabfolge im Bereich der Spaltstelle und deren
Erkennung durch wirtsspezifische Proteasen. Das HA0-Protein von HPAIV (Subtyp
H5 und H7) weist mehrere basische AS innerhalb des Spaltbereiches auf (R-X-K/RR), die von ubiquitär vorkommenden, subtilisinähnlichen Proteasen erkannt und
gespalten werden. Demzufolge verursachen AIV mit polybasischer Sequenz im
Bereich der Spaltstelle schwere systemische Infektionen. Dagegen weist das HA0Protein der LPAIV und der nicht aviären Influenza-A-Viren, mit Ausnahme des
equinen H7N7 Influenzavirus (Kawaoka 1991), nur ein Arginin im Bereich der
Spaltstelle auf (Bosch, Orlich et al. 1979), welches Substrat für trypsin- ähnliche
Proteasen ist, die im Respirations- oder im Verdauungstrakt des Wirtes lokalisiert
sind. Dementsprechend ist die Virusreplikation auf diese Organe beschränkt und
AIV-Infektionen verlaufen milder oder sogar asymptomatisch. Weitere Ergebnisse,
zeigten, dass avirulente Stämme durch Antigen-Drift, die zu einer polybasischen
Sequenz im Bereich der HA0-Spaltstelle führt, den Phänotyp eines virulenten AIVStammes annehmen können (Kawaoka, Naeve et al. 1984; Garcia, Crawford et al.
28
1996; Pasick, Handel et al. 2005). Damit wurde bestätigt, dass die Spaltbarkeit des
HA0-Proteins bedeutend ist für die Pathogenität der AIV.
Das NA-Protein spaltet durch seine enzymatische Aktivität endständige Sialinsäuren
von Glykoproteinen und -lipiden. Das ist zum einen für das Andocken und die
Freisetzung von Virionen wichtig, zum anderen entfernt aber das NA-Protein auch
die Sialinsäure von der Muzinschicht des Respirations- und Verdauungstraktes des
Wirtes, wodurch das Virus die darunterliegenden Zielzellen erreichen kann (Palese,
Tobita et al. 1974). Wie das HA-Protein zeigt auch das NA-Protein bestimmte
Prioritäten bei der Art der Bindung von Sialinsäure an die Wirtszellmembran. So
spaltet aviäres NA-Protein α-2,3-gebundene Sialinsäure, aber nicht α-2,6-gebundene
Sialinsäure. Es konnte aber beobachtet werden, dass bei humanen Infektionen,
aviäre
N2-NA-Proteine
zusätzlich
die
Fähigkeit
erlangten,
α-2,6-gebundene
Sialinsäure zu spalten (Baum and Paulson 1991), was eine Anpassung des HAProteins an den α-2,6-Sialinsäurerezeptor des Menschen widerspiegelt.
Eine Pathogenität bestimmende Eigenschaft ist die Säureresistenz der NA-Aktivität.
Hierbei zeigte sich, dass die NA-Proteine von AIV resistenter gegenüber niedrigen
pH-Werten sind als humane NA-Proteine, was die Ausbreitung von AIV im
Intestinaltrakt begünstigt (Takahashi, Suzuki et al. 2001).
Zusätzlich scheint auch Anzahl der Aminosäuren, die für die Stielregion des NAProteins kodieren, die Virulenz der Influenza-A-Viren mitzubestimmen. So zeigten
AIV mit einer verkürzten Stielredion virulentere Eigenschaften (Matrosovich, Zhou et
al. 1999; Guan, Poon et al. 2004). Auch rekombinante Influenza-A-Viren mit einer
AS-Deletion innerhalb der Stielregion des NA-Proteins zeichneten sich durch erhöhte
Virulenz gegenüber dem Wildtyp aus (Munier, Larcher et al. 2010).
Das PB2-Protein
Das PB2-Protein ist als Bestandteil des viralen Polymerasekomplexes für die
Erkennung und Bindung der zellulären Kappen-Primer zuständig.
In zahlreichen Studien konnte beobachtet werden, dass die AS-Position 627 in PB2
eine wichtige Virulenzdeterminante bei der Adaptation von AIV an Säugetierzellen
ist. So konnte gezeigt werden, dass bei AIV-Infektionen des Menschen aviäre Viren
mit einem AS-Austausch von Glutaminsäure gegen Lysin an Position 627 selektiert
wurden (Fouchier, Schneeberger et al. 2004; Li, Guan et al. 2004; Puthavathana,
Auewarakul et al. 2005). Offensichtlich bestimmt die AS-Position 627 das virale
29
Replikationsvermögen in Säugezellen. So replizieren Influenzaviren mit einem Lysin
an dieser Position besser, als solche mit Glutaminsäure (Crescenzo-Chaigne, van
der Werf et al. 2002; Shinya, Hamm et al. 2004; Bogs, Kalthoff et al. 2011).
Das NS1-Protein
Durch Ausschalten der antiviralen IFN-Antwort des Wirtes trägt das NS1-Protein zur
Pathogenität der Influenza-A-Viren bei. Gewöhnlich führt eine Virusinfektion nach der
Erkennung viraler Nukleinsäure zur Bildung von IFN-α. Es wird eine zelluläre
Signalkaskade in Gang gesetzt, in deren Folge es zur Synthese von Proteinen
kommt, die zum einen die Proteinsynthese in infizierten Zellen hemmen und zum
anderen den Abbau von RNA fördern. Zusätzlich bewirkt IFN-α die Aktivierung
natürlicher Killer-Zellen (NK-Zellen), die wiederum in virusinfizierten Zellen Apoptose
auslösen (Janeway 2002). Das NS1-Protein bindet direkt an doppelsträngige RNAMoleküle, die als Intermediate während der viralen Transkription/Replikation gebildet
werden, sowie an Proteine der IFN-Signalkaskade (Talon, Horvath et al. 2000; Wang,
Li et al. 2000; Ludwig, Wang et al. 2002) und verhindert so die Initiation der
antiviralen IFN-Antwort des Wirtes. Es ist möglich, dass die NS1-Proteine
verschiedener Influenzaviren sich in ihrer Fähigkeit, mit dem zellulären IFN-System
zu interagieren und so die virale Pathogenität zu beeinflussen, unterscheiden. So
vermittelt beispielsweise das NS1-Protein des vom Menschen 1997 in Hong Kong
isolierten H5N1 Virus eine Resistenz gegen die antivirale IFN-Antwort des Wirtes,
erhöht dagegen aber die Transkription der proinflammatorischen Zytokine TNF-α und
IFN-β (Cheung, Poon et al. 2002; Seo, Hoffmann et al. 2002; Seo, Hoffmann et al.
2004), was zur dramatischen Verschlechterung des Allgemeinzustandes bis hin zum
Tod der Patienten führte. HPAIV NS1-Proteine tragen daher möglicherweise zum
Ungleichgewicht in der Zytokinsekretion des Wirtes bei (Yuen, Chan et al. 1998; To,
Chan et al. 2001).
30
3. Die Entwicklung der reversen Genetik
Mit der Entwicklung reverser genetischer Systeme (RGS) wurde es möglich,
infektiöse Viren aus klonierter cDNA zu generieren und somit durch gezielte
Veränderungen des Virusgenoms spezielle Fragestellungen zu untersuchen. Auch
ermöglicht die Anwendung der RGS, Fremdgene in das Virusgenom zu inserieren
und somit Viren als Vektoren zu nutzen.
Unter den tierpathogenen Viren waren es die DNA-Viren, die als erstes für Methoden
der rekombinanten DNA-Technologie zugänglich waren. Den Durchbruch erreichten
Goff und Berg. bereits 1976 nach Transfektion von Zellen mit einem modifizierten
Simian Virus 40, das DNA des Bakteriophagen Lambda enthielt, wodurch definierte
Virusmutanten generiert wurden ((Goff and Berg 1976). Durch homologe
Rekombination zwischen klonierter und viraler DNA war es einige Jahre später
möglich, größere DNA-Viren herzustellen, wie z.B. Herpesviren (Post and Roizman
1981), Pockenviren (Mackett, Smith et al. 1982; Panicali and Paoletti 1992),
Adenoviren (Jones and Shenk 1978) und Parvoviren (Samulski, Chang et al. 1989).
Die genetische Manipulation von Positivstrang-RNA-Viren gelang zuerst für die
Retroviren. So führte die Transfektion von Lamda-Phagen, welche die klonierte
cDNA eines Retrovirus inseriert hatten, zur Generierung replikationsfähiger
Viruspartikel und zur Integration der viralen Information in das Genom der Wirtszelle
(Wei, Gibson et al. 1981). Durch Transfektion von cDNA, abgeleitet von infektiöser
RNA, konnten verschiedene Positivstrang-RNA-Viren erzeugt werden, wie z.B.
Polioviren (Racaniello and Baltimore 1981) oder Togaviren (Rice, Levis et al. 1987;
Liljestrom, Lusa et al. 1991). Vorteil vieler DNA- und Positivstrang-RNA-Viren ist die
Infektiosität des nackten Genoms, welches sowohl zur Synthese viraler Proteine, als
auch als Template für die virale Replikation dient. Daher reicht in diesen Fällen die
Transfektion viraler genomischer Nukleinsäure aus, um einen Replikationszyklus zu
initiieren. Dagegen ist die genomische RNA von Negativstrang-RNA-Viren nicht
infektiös. Infektiöse Viruspartikel müssen ihre eigene RNA-abhängige RNAPolymerase in die Wirtszelle mitbringen, um die virusspezifische mRNA-Synthese zu
starten. Erst nach der intrazellulären Rekonstruktion des RNP-Komplexes ist die
Gewinnung rekombinanter Viren möglich. Für die Generierung von Influenzaviren
entwickelten Luytjes und Kollegen (Luytjes, Krystal et al. 1989) ein System, das die in
vitro Bildung eines biologisch aktiven RNP-Komplexes ermöglicht. Dieser wird durch
31
Mischen von cDNA-abgeleiteter RNA und gereinigten viralen Nukleoproteinen (NP)
und Polymeraseproteinen (PA, PB1 und PB2) hergestellt. Die RNPs werden
anschließend in Zellen transfiziert, die vorher mit einem Influenza-Helfer-Virus
infiziert wurden. Das Helfer-Virus stellt dabei in trans die viralen Proteine für die
Amplifikation des synthetischen RNP-Komplexes bereit. Durch den Austausch von
Gensegmenten (Reassortment) zwischen den Segmenten des Helfer-Virus und des
synthetischen Gens konnten definierte rekombinante Influenzaviren generiert
werden. Jedoch war diese Methode für nichtsegmentierte Negativstrang-RNA-Viren
nicht anwendbar. Der Vorgang der Rekombination bei diesen Viren ist ein äußerst
seltenes Ereignis ,lange RNAs von 10 - 18 kb müssten mutagenisiert werden, um ein
verändertes Virus zu erhalten. Die in vitro Assoziation der cDNA mit den Proteinen
des RNP-Komplexes war aufgrund der Länge der Nukleinsäure ineffektiv (Moyer,
Smallwood-Kentro et al. 1991; Smallwood and Moyer 1993). Den entscheidenden
Fortschritt brachten Fuerst et al. 1986 (Fuerst, Niles et al. 1986), indem sie DNA, die
für
die
RNA-Polymerase
der
Bakteriophage
T7
kodiert,
mit
einem
Transkriptionspromotor des Vaccinia Virus verbanden und das ganze Konstrukt iin
das
Vaccinia-Virus
Genom
integrierten.
Durch
gleichzeitige
Infektion
von
Säugetierzellen mit Vaccinia-Viren und Transfektion mit rekombinantem VacciniaVirus-Plasmid konnte die stabile Expression der T7-RNA-Polymerase der VacciniaRekombinanten erzielt werden. Wenig später stellten Pattnaik et al. die RNP-Proteine
NP, P und L mittels Expressionsplasmiden unter der Kontrolle des T7-RNAPolymerase-Promotors und konnten durch die gleichzeitige Anwesenheit des
rekombinanten T7-RNA-Polymerase-Vaccinia-Virus die Replikation von „defective
interfering particles“ des Vesikular-Stomatitis-Virus erreichen (Pattnaik and Wertz
1990). Wesentlich bei der Nutzung eines solchen Expressionssystems ist die
korrekte Generierung der Transkriptionsenden. Während die 5´-Enden eindeutig
durch den T7-Polymerase-Promotor gekennzeichnet waren, stellte die Generierung
des korrekten 3´-Endes ein Problem dar, das erst durch die Nutzung einer HepatitsDelta-Virus (HDV)-Ribozymsequenz (Perrotta and Been 1990; Perrotta and Been
1991) gelöst werden konnte. Virale cDNA wurde nun zwischen einer T7-PolymerasePromotorsequenz und der Ribozym-Sequenz, gefolgt von einer T7-PolymeraseTranskriptions-Terminationssequenz, kloniert. Durch die autokatalytische Spaltung
primärer Transkripten, durch die Ribozyme, unmittelbar nach der Virussequenz,
werden RNAs mit korrekten 3´Genomenden generiert. Dieses System wurde 1994
32
erstmalig für die Generierung von Tollwutviren angewandt (Conzelmann and Schnell
1994; Schnell, Mebatsion et al. 1994) und nachfolgend für weitere Vertreter aus der
Ordnung der Mononegavirales, wie z.B. für das Sendaivirus (Garcin, Pelet et al.
1995), Humanes Respiratorisches Synzytial-Virus (Collins, Hill et al. 1995), Vesicular
Stomatitis Virus (Lawson, Stillman et al. 1995; Whelan, Ball et al. 1995),
Rinderpestvirus (Baron and Barrett 1997), Humanes Parainfluenza Virus Typ 3
(Durbin, Hall et al. 1997; Hoffman and Banerjee 1997) und Simian Virus Typ 5 (He,
Paterson et al. 1997). Eine weitere Verbesserung wurde durch den Einsatz von
Zelllinien erreicht, die stabil die T7-RNA-Polymerase exprimieren. Dadurch konnten
auch attenuierte oder langsam replizierende rekombinante Viren, wie Masernviren
(Radecke, Spielhofer et al. 1995) oder Bovine Respiratorische Synzytial-Viren
(Buchholz, Finke et al. 1999) generiert werden.
Für die genetische Manipulation des NDV sind bisher fünf RGS beschrieben worden,
welche auf den lentogenen Stämmen La Sota (Peeters, de Leeuw et al. 1999), Clone
30 (Römer-Oberdörfer, Mundt et al. 1999), Hitchner B1 (Nakaya, Cros et al. 2001),
auf dem mesogenen Isolat Beaudette C (Krishnamurthy, Huang et al. 2000) und auf
dem velogenen NDV-Stamm Herts 33 (de Leeuw, Koch et al. 2005) basieren.
Für die Generierung der Rekombinanten des Vakzinestammes Clone 30 wurde das
virale Antigenom durch cDNA-Synthese, Amplifikation überlappender Fragmente und
anschließende Klonierung über entsprechende Restriktionsenzymschnittstellen in
den Vektor pX8δT (Schnell, Mebatsion et al. 1994) inseriert. Flankiert wird das
Antigenom am 5´-Ende durch eine T7-Polymerase-Promotor-Sequenz und am 3´Ende durch eine HDV-Ribozymsequenz, gefolgt von einer T7-PolymeraseTranskriptionsterminations-Sequenz. Durch die von der verwendeten Zelllinie stabil
exprimierte T7-Polymerase und deren
Bindung
am
T7-Promotor
wird
die
Transkription initiiert. Zwischen der Promotorsequenz und dem eigentlichen
Startpunkt der viralen Sequenz sind zur Transkriptionssteigerung drei Guanosinreste
inseriert worden. Um die enstehende RNA maximal zu schützen, ist das
Vorhandensein des Nukleo-, aber auch des Phosphoproteins und der RNAabhängigen RNA-Polymerase für die Bildung des RNP-Komplexes zwingend
erforderlich. Um das sicherzustellen, wurde der orf der Proteine NP, P und L in
Plasmide inseriert und unter die Kontrolle des T7-Promotors gestellt. Durch eine
IRES (internal ribosomal entry site)-Sequenz, die auf den T7-Promotor folgt, wird
33
eine Anlagerung der Transkripte an die Ribosomen mit anschließender Translation
gewährleistet (Römer-Oberdörfer, Mundt et al. 1999).
4. NDV als Vektor
Mit Hilfe der reversen Genetik war es nicht nur möglich, die Funktion einzelner
Virusproteine und genetischer Elemente zu untersuchen, sondern darüber hinaus
auch zusätzliche Gene in das NDV-Genom, zur Expression fremder Proteine, zu
inserieren. Entscheidend für die Expression ist dabei, dass die Fremdgene von
geeigneten Transkriptionsstart- und -stoppsignalen flankiert werden, die von der
RNA-abhängigen RNA-Polymerase erkannt werden.
Im Jahre 2000 zeigten Krishnarmurthy et al. durch die Insertion des Chloramphenicol
Acetyltransferase (CAT)-Gens in das Genom des virulenten NDV Isolates Beaudette
C, die generelle Möglichkeit, Fremdgene in das NDV-Genom zu inserieren und zur
stabilen Expression zu bringen (Krishnamurthy, Huang et al. 2000). Die
Fremdgeninsertion erfolgte dabei zwischen den Genen HN und L, was zur
Beeinträchtigung
der
Replikation
und
Attenuierung
der
resultierenden
Rekombinanten führte. In einer weiterführenden Studie von Huang et al. (Huang,
Krishnamurthy et al. 2001) erfolgte die CAT-Insertion vor dem NP-Gen, wodurch die
CAT-exprimierenden Rekombinanten weder in ihrer Replikation, noch in der Virulenz
beeinflusst wurden und es zusätzlich zur vermehrten CAT-Expression, im Vergleich
zu der Studie von Krishnarmurthy et al., kam. Die Autoren folgerten daraus, dass
entsprechend des beschriebenen Transkriptionsgradienten für Paramyxoviridae
(Wertz, Moudy et al. 2002; Whelan, Barr et al. 2004), die Insertion von Fremdgenen
an einem Ort im NDV-Genom, der dem 3´-Genomende möglichst nahe liegt, zu einer
erhöhten Expression des Fremdproteins führt. Das konnte in einer Studie von Zhao
et al. nicht bestätigt werden. In dieser Studie wurde das Gen für die Sekretorische
Alkalische Phosphatase (SEAP) in verschiedene intergene Regionen des NDVGenoms inseriert und gezeigt, dass die SEAP-Aktivität am höchsten war, wenn das
Transgen zwischen NDV M und F inseriert wurde und nicht bei dem näher zum 3’Genomende gelegenen Insertionsort zwischen P und M. Allerdings fügten Zhao et al.
das SEAP-Gen nicht vor dem NDV NP-Gen ein, dem Insertionsort, welcher dem 3´Genomende am nächsten liegt. Sie zeigten aber, dass Fremdgene an verschiedenen
Positionen
im
NDV-Genom
eingebracht
34
werden
können,
ohne
die
Replikationseffizienz der resultierenden Rekombinanten deutlich zu beeinflussen
(Zhao and Peeters 2003). Eine ebenfalls hohe und stabile Expression des
Fremdproteins konnte bei der Insertion des Gens für das grün fluoreszierende
Protein (GFP) in die intergenen Region zwischen F und HN des lentogenen NDV
Clone 30 beobachtet werden (Engel-Herbert, Werner et al. 2003).
Die Integration verschiedener Reportergene in das NDV-Genom zeigte, dass der
baukastenartige Charakter des NDV-Genoms für die Expression von Fremdproteinen
geeignet ist, eine wichtige Vorarbeit auch für die Nutzung des NDV als Vektor für die
Expression therapeutisch wichtiger Proteine.
Insertion von Genen anderer Viren in das NDV Genom
NDV repliziert in einer Vielzahl der gängigen Zelllinien und in embryonierten
Hühnereiern
und
verursacht
in
vivo
eine
starke
humorale
und
zelluläre
Immunantwort. Durch die Tatsache, dass NDV naturgemäß die Schleimhautzellen
des Respirations- und Verdauungstrakts infiziert, ist NDV besonders als Vektor
schützender Antigene von Pathogenen geeignet, die respiratorische Krankheiten
auslösen.
Viele bisherige Studien haben gezeigt, dass NDV als Vakzinevektor geeignet ist. So
führte die Insertion des VP2 Gens des Infektiösen Bursitis Virus (IBDV) in das NDVGenom zu Rekombinanten, die nach Immunisierung spezifsch pathogen freier (SPF)
Hühner sowohl zu einem Schutz gegen NDV, als auch gegen IBDV führten (Huang,
Elankumaran et al. 2004). Ebenfalls erfolgreich war die Konstruktion einer NDVRekombinante, die das Fusionsprotein (F-Protein) des respiratorischen Synzytialvirus
(RSV) exprimierten (Martinez-Sobrido, Gitiban et al. 2006). Mit NDV/RSV-F
immunisierte BALB/c Mäuse waren gegenüber einem RSV-Challenge geschützt.
Hohe Serum-Antikörper-Titer gegen das Fremdprotein wurden bei der Immunisierung
von Rhesusaffen und Afrikanischen Grünen Meerkatzen mit NDV-Rekombinanten
erzielt, die das HN-Protein des Humanen Parainfluenzavirus Typ 3 exprimierten
(Bukreyev, Huang et al. 2005). Besonders bei der Generierung von NDVRekombinanten, bei denen Gene des aviären Influenzavirus (AIV) im Genom
inseriert wurden, konnten in den letzten Jahren große Erfolge erzielt werden
(Nakaya, Cros et al. 2001; Swayne, Suarez et al. 2003; Park, Steel et al. 2006; Veits,
Wiesner et al. 2006; Ge, Deng et al. 2007; Römer-Oberdörfer, Veits et al. 2008;
Veits, Römer-Oberdörfer et al. 2008; Schröer, Veits et al. 2009; Dinapoli, Nayak et al.
35
2010). Die Etablierung verbesserter NDV-AIV-Vakzinen stand im Mittelpunkt dieser
Arbeit. Detaillierte Informationen über Impfstoffe gegen die aviäre Influenza werden
im Abschnitt 5 besprochen.
Insertion von tumorspezifischen Antigenen in das NDV Genom
Die onkolytische Aktivität von NDV ist seit lnagem bekannt (Cassel and Garrett 1965;
Cassel and Garrett 1966). NDV kann in humanen Tumorzellen, nicht aber in
normalen Humanzellen replizieren und ist daher für Forscher als ein „AntitumorWirkstoff“ interessant (Csatary 1971; Reichard, Lorence et al. 1992; Lorence,
Reichard et al. 1994; Sinkovics and Horvath 2000; Fabian, Csatary et al. 2007). Für
eine effektive Antitumor-Therapie ist aber die alleinige Behandlung mit NDV nicht
ausreichend (Parato, Senger et al. 2005). Daher wurde beispielsweise versucht,
Transgene in das NDV-Genom zu inserieren, die eine therapeutische Aktivität in den
infizierten Tumorzellen zeigen. So konnte über die Stimulation von humanen
Immunzellen (Janke, Peeters et al. 2008; Zhao, Janke et al. 2008) ein
Antitumoreffekt ausgelöst werden. Auch über die Bildung von Antikörpern, die von
NDV-Rekombinanten exprimiert werden, kann dem Wachstum von Tumoren
entgegengewirkt werden (Pühler, Willuda et al. 2008).
36
5. Impfstoffe
Für eine effektive Immunantwort nach einer Vakzinierung ist das Zusammenspiel
zwischen
angeborener
und
erworbener
Immunabwehr
notwendig.
Durch
antigenpräsentierenden Zellen (Makrophagen, dendritische Zellen, B-Lymphozyten)
werden virale Antigene den Zellen des erworbenen Immunsystems präsentiert und
anschließend eine antigenspezifische Immunantwort stimuliert. Diese setzt sich aus
der Aktivierung der humoralen Immunantwort mit der anschließenden Generierung
antigenspezifischer Antikörper und der zellulären Immunantwort, in deren Folge
zytotoxische T-Zellen (CD8+-Zellen) gebildet werden, zusammen. Die Generierung
antigenspezifischer Gedächtnisszellen (T- und B-Zellen) ist das Ziel einer jeden
Vakzinierung.
In der Regel wirken Lebendvakzinen effizienter als Totimpfstoffe (inaktivierte
Vakzine), da bei einer Vakzinierung mit inaktivierten Viren die Aktivierung der
zytotoxischen T-Zellen fehlt.
Impfung gegen die ND
Die Impfung gegen die ND stellt eine wichtige Möglichkeit dar, Tiere vor der
Krankheit zu schützen und die Ausbreitung der Viren zu kontrollieren. Es werden
dafür Tot - und Lebendimpfstoffe eingesetzt, wobei den Lebendimpfstoffen die größte
Bedeutung zukommt. Sie werden auf Grundlage attenuierter oder natürlich
vorkommender niedrig virulenter NDV hergestellt und können als Spray oder über
Trinkwasser an eine große Tierzahl verabreicht werden, was für die Geflügelhaltung
von großem Vorteil ist. Der Nachteil einer Lebendvakzinierung besteht darin, dass es
je nach verwendetem Impfstamm und Immunstatus des Wirtes zu klinischen
Symptomen kommen kann. Die lentogenen NDV-Isolate Hitchner B1 und La Sota,
die als Impfstoff zum Einsatz kommen, bieten einen guten Schutz gegen die ND,
wobei La Sota gerade in immunologisch naiven Tieren erhebliche Nebenwirkungen
verursachen kann und deshalb bei der Grundimmunisierung oft nicht verwendet wird.
Das Impfvirus Clone 30, das ein plaquegereinigtes La Sota-Isolat ist und über
hervorragende immunogene Eigenschaften verfügt, zeigt nach Immunisierung
minimale Nebenwirkungen. Lebendimpfstoffe aus mesogenen Isolaten, wie z.B.
Komarov (Saifuddin, Chowdhury et al. 1990) und Mukteswar (Alexander 1997),
werden
gewöhnlich
zur
Zweitimmunisierung
37
verwendet,
da
sie
schwere
Impfreaktionen im naiven Wirt hervorrufen können. Allerdings sind in den Ländern
der Europäischen Union (EU) laut der Entscheidung 93/152/EWG nur NDVLebendvakzinen zugelassen, die einen ICPI unter 0,4 bei Verabreichung von nicht
weniger als 107 EID50 (50% Eiinfektiöse Dosis) pro Vogel beziehungsweise weniger
als 0,5 bei Verabreichung von nicht weniger als 108 EID50 an jeden Vogel im ICPI
Test aufweisen.
Inaktivierte Vakzinen werden durch Vermehrung eines NDV im embryonierten
Hühnerei und anschließender Inaktivierung der infektiösen Allantoisflüssigkeit durch
Formalin oder β-Propiolaceton hergestellt. Durch diese Behandlung sind die Viren
nicht mehr replikationsfähig. Eine Applikation muss für jedes einzelne Tier erfolgen,
oft durch Injektion in den Oberschenkelmuskel. Diese Art der Impfstoffe führen zu
hohen NDV-Antikörpertitern im Tier und bietet einen guten Schutz gegen eine NDVInfektion. In Geflügelbetrieben werden inaktivierte Impfstoffe oft nach der primären
Immunisierung mit Lebendimpfstoffen eingesetzt (Alexander 2004).
Impfung gegen die aviäre Influenza
Attenuierte Influenza-Lebendvakzinen sind zwar in der Humanmedizin zugelassen
(Belshe 2004), aber infolge des hohen Risikos (besonders Subtyp H5 und H7) durch
Reassortierung
mit
zirkulierenden
Feldviren
oder
durch
Mutation
der
Spaltstellenregion im HA-Protein den Geno- und Phänotyp zu verändern und im
Ergebnis möglicherweise einem HPAIV zu entsprechen, findet diese Art von
Vakzinen bei der Immunisierung von Geflügel keine Anwendung. Inaktivierte
Influenzavollvirusvakzinen
erzeugen
im
Tier
eine
breite
Immunität
gegen
verschiedene kursierende Impfstämme. Sie erfordern aber eine individuelle Impfung
der Tiere durch Injektion, was zeitaufwendig und kostenintensiv ist.
Infolge einer AIV-Infektion werden Antikörper gegen HA-, NA-, NP- und beide MProteine gebildet, wobei nur die Antikörper gegen HA vor einer erneuten Infektion mit
AIV schützen (Potter and Oxford 1979). Antikörper gegen NA können aber die
Krankheitssymptome einer Influenzainfektion mildern (Kilbourne, Pokorny et al.
2004).
Während
HA-Antikörper
die
Anlagerung
an
sialinsäurehaltige
Wirtszellrezeptoren blockieren und damit die Fusion zwischen Virus- und
Wirtszellmembran inhibieren, hemmen NA-Antikörper die Freisetzung von neu
synthetisierten Viren aus der infizierten Zelle. Diese Tatsache förderte die
Entwicklung von Vektorvakzinen, welche das gewünschte Fremdprotein exprimieren
38
und im Wirt eine entsprechende Antikörperantwort induzieren. Dazu zählen die
rekombinanten Proteinvakzinen, die „virus-like-particles“ (VLP), die DNA-Vakzinen
und die viralen Vektorvakzinen. Bei den rekombinanten, proteinbasierenden
Vakzinen wird nur das gereinigte Protein zur Vakzinierung genutzt. So konnte jüngst
gezeigt werden, dass von transgenen Pflanzen (Nicotiana benthamiana) HA des
HPAIV H5N1 in hohen Konzentrationen gebildet wird und Hühner verabreicht, gegen
eine letale AIV-Belastungsinfektion schützen kann (Kalthoff, Giritch et al. 2010). Auch
rekombinantes HA, das durch Baculoviren in Insektenzellen generiert wurde, zeigte
eine Schutzwirkung in Hühnern gegen eine Infektion mit HPAIV (Crawford, Wilkinson
et al. 1999; Swayne, Perdue et al. 2000; Swayne, Beck et al. 2001).
Eine vielversprechende Möglichkeit, den Phänotyp eines Lebendvirus zu kopieren,
ist die Generierung von „virus-like-particles“ (VLP). VLPs enthalten virale Matrix- und
Hüllproteine, aber keine virale Nukleinsäure und sind daher auch nicht infektiös. Sie
induzieren
aber
eine
starke
humorale
und
zelluläre
Immunantwort.
Die
entsprechenden viralen Transgene werden einzeln oder in Kombination in einen
Vektor inseriert und durch ein zelluläres System zur Expression gebracht, in dessen
Folge es zum „Self-Assembly“ der viralen Proteine und zur Freisetzung der VLPs
kommt. Durch Zentrifugation über einen Dichtegradienten können die VLPs gereinigt
und für die Immunisierung gewonnen werden. Unter Verwendung eines BaculovirusExpressionssystems konnten VLPs generiert werden, die aus den Proteinen HA, NA
und M1 (Galarza, Latham et al. 2005; Pushko, Tumpey et al. 2005; Pushko, Tumpey
et al. 2007) oder nur aus HA und M1 (Quan, Huang et al. 2007) bestehen und deren
subkutane, intramuskuläre oder intranasale Applikation in kleinen Säugetieren
(Mäuse, Frettchen) neutralisierende Antikörper induzierten und einen Schutz
gegenüber einer homologen, aber auch heterologen HPAIV-Infektion des gleichen
Subtyps boten. Ob VLPs aus rekombinanten Baculoviren auch einen Schutz gegen
HPAIV beim Geflügel generieren können, wurde bisher nicht untersucht. Schutz
gegen eine HPAIV-Infektion in Hühnern vermittelten dagegen HA-exprimierende
VLPs, die auf der Grundlage des rekombinanten Venezuelanischen Equinen
Enzephalitis Virus (VEEV, Genus Alphavirus der Togaviridae) generiert wurden
(Schultz-Cherry, Dybing et al. 2000).
Für DNA-Vakzinen werden die gewünschten Gene in Expressionsplasmide unter der
Kontrolle eines eukaryotischen Promotors kloniert, anschließend in Bakterien
transformiert und mit der nachfolgenden Anzucht der plasmidenthaltenden Bakterien
39
vermehrt. Nach der Reinigung der Plasmid-DNA erfolgt die Applikation an den
Impfling. Oft wird aber auch die Plasmid-DNA in den attenuierten Bakterien belassen
und diese als Träger genutzt (Vecino, Quanquin et al. 2004; Pan, Zhang et al. 2009).
DNA-Vakzinen
induzieren
sowohl
eine
humorale,
als
auch
eine
zelluläre
Immunantwort, wodurch sie für die Applikation an Mensch und Tier attraktiv sind. So
schützten HA-Expressionsplasmide Hühner nach einmaliger Immunisierung vor einer
letalen H5- und H7-HPAIV-Infektion, selbst wenn die Übereinstimmung der
Aminosäuresequenz der HA zwischen Immunisierungs- und Infektionsantigen nur
90% betrug (Kodihalli, Goto et al. 1999; Kodihalli, Kobasa et al. 2000). Bei einer
gleichzeitigen Applikation von HA-Expressionsplasmiden und Plasmiden, die das AIV
NA, M oder NP enthalten, konnte die Schutzwirkung in Hühnern sogar noch
verbessert
werden
(Cherbonnel,
Rousset
et
al.
2003),
wohingegen
eine
Immunisierung mit DNA-Vakzinen, die nur für das AIV NP oder NA kodieren, zu einer
unzureichenden Immunantwort in Hühnern führte (Kodihalli, Kobasa et al. 2000;
Sylte, Hubby et al. 2007). Der Einsatz der DNA-Vakzinen in der Geflügelindustrie
bleibt dennoch fraglich, weil die Produktion mit hohen Kosten verbunden und die
individuelle intramuskuläre Applikation sehr zeitaufwendig ist.
Eine vielversprechende Möglichkeit für den Transfer von Fremdgenen in die
Wirtszelle und die effiziente Expression ist der Einsatz viraler Vektorvakzinen. Nach
intramuskulärer
oder
subkutaner
Applikation
an
Hühner
schützten
replikationsdefiziente Adenoviren mit inseriertem AIV H5- oder H7-Gen (Toro, Tang
et al. 2007; Toro, Tang et al. 2008) gegen eine HPAIV-Infektion. Auch eine in ovo
Vakzinierung scheint mit Adenovirus-Vektoren effizient zu sein (Toro, Tang et al.
2007), sie macht diese viralen Vektoren für die Massenimmunisierung von Geflügel
attraktiv. Ein Schutz gegen eine letale AIV-Infektion in Hühnern konnte ebenfalls von
einem
AIV-H5-exprimierenden
Rekombinanten
auf
Grundlage
des
replikationsdefizienten Modifizierten Vacciniavirus Ankara (MVA) generiert werden
(Kreijtz, Suezer et al. 2007; Veits, Römer-Oberdörfer et al. 2008).
Auch replikationskompetente virale Vektoren, die verschiedene immunogene AIVProteine exprimieren, können für die Immunisierung von Hühnern verwendet werden,
wie z.B. attenuierte DNA-Viren wie das Vogelpockenvirus (Taylor, Weinberg et al.
1988; Tripathy and Schnitzlein 1991; Webster, Kawaoka et al. 1991; Boyle, Selleck et
al. 2000; Swayne, Garcia et al. 2000; Qiao, Yu et al. 2003; Bublot, Pritchard et al.
2006; Qiao, Yu et al. 2006) oder das Virus der infektiösen Laryngotracheitis (ILTV)
40
(Lüschow, Werner et al. 2001; Veits, Luschow et al. 2003; Fuchs, Veits et al. 2007;
Pavlova, Veits et al. 2009; Pavlova, Veits et al. 2009) aber auch RNA-Viren wie das
NDV (Nakaya, Cros et al. 2001; Park, Steel et al. 2006; Veits, Wiesner et al. 2006;
Ge, Deng et al. 2007; Schröer, Veits et al. 2009; Dinapoli, Nayak et al. 2010; Nayak,
Kumar et al. 2010). Diese Art Vakzinen sind Lebendvakzinen und induzieren im Wirt
eine stabile Immunantwort, die das Geflügel gegen zwei Infektionen gleichzeitig
schützen könnten. Darüber hinaus sind Vektorvakzinen, die auf ILTV oder NDV
basieren, für die Massenapplikation in Geflügel geeignet, da sie über Trinkwasser
oder Spray verabreicht werden können. In zahlreichen Studien konnte bereits gezeigt
werden, dass H5- oder H7-exprimierende Vogelpockenvirus-Rekombinanten Hühner
und Enten vor einer Infektion mit AIV des gleichen Subtyps schützen (Taylor,
Weinberg et al. 1988; Tripathy and Schnitzlein 1991; Webster, Kawaoka et al. 1991;
Boyle, Selleck et al. 2000; Swayne, Garcia et al. 2000; Qiao, Yu et al. 2003; Bublot,
Pritchard et al. 2006). Die Koexpression von HA und NA führte sogar zu einer
Erhöhung der Schutzwirkung gegen HPAIV (Qiao, Yu et al. 2003; Qiao, Yu et al.
2006). Diese Ergebnisse führten dazu, dass AIV-Vakzinen auf Grundlage des
Vogelpockenvirus in den Vereinigten Staaten von Amerika (USA) zur Notfallimpfung
zugelassen sind und auch in Ostasien als Vakzinen genutzt werden. Gleichermaßen
erfolgreich ist der Gebrauch von H5- oder H7-exprimierenden ILTV-Rekombinanten
(Lüschow, Werner et al. 2001; Veits, Luschow et al. 2003; Fuchs, Veits et al. 2007;
Pavlova, Veits et al. 2009; Pavlova, Veits et al. 2009). NDV ist als Vektor für die
Entwicklung von bivalenten NDV-AIV-Vakzinen besonders geeignet, da eine
prophylaktische Immunisierung gegen NDV in vielen Ländern üblich ist. So wurden in
den letzten Jahren vielversprechende NDV-AIV-Rekombinanten generiert, bei denen
das AIV HA Gen entweder zwischen NDV P und M (Nakaya, Cros et al. 2001; Park,
Steel et al. 2006; Ge, Deng et al. 2007; Dinapoli, Nayak et al. 2010; Nayak, Kumar et
al. 2010) oder NDV F und HN (Veits, Wiesner et al. 2006; Schröer, Veits et al. 2009)
in das NDV Genom eingefügt wurde. Alle Rekombinanten vermittelten in Hühnern
einen Schutz gegen eine NDV-Infektion, aber auch gegen eine AIV-Infektion des
entsprechenden Subtyps. Wie für ILTV-AIV-Vakzinen war auch bei der NDV-AIVVakzine
das
Maß
der
Schutzwirkung
gegen
eine
AIV-Infektion
von
der
Sequenzhomologie der HA Proteine zwischen Vakzine- und Infektionsvirus abhängig
(Lüschow, Werner et al. 2001; Römer-Oberdörfer, Veits et al. 2008; Pavlova, Veits et
al. 2009). NDV-AIV-Vakzinen mit der Insertion von AIV H5 kamen bereits in Mexiko
41
zum Einsatz und wurden 2006 auch in China eingesetzt (van den Berg, Lambrecht et
al. 2008). Interessanterweise führte eine simultane Vakzinierung mit NDV-Vektoren,
die entweder für HA oder NA kodieren, nicht zu einer Steigerung der Schutzwirkung
(Nayak, Kumar et al. 2010), so wie es für H5- oder N1- exprimierende ILTV
Rekombinanten gezeigt werden konnte (Pavlova, Veits et al. 2009).
Allen Vektorvakzinen gemein ist, dass sie es ermöglichen, infizierte von vakzinierten
Tieren diagnostisch zu unterscheiden (DIVA-Diagnostik, DIVA= Differentiation of
Infected
from
Vaccinated
Animals).
Bei
der
DIVA-Diagnostik
wird
der
Antikörpernachweis gegen Virusproteine geführt, die nicht vom Impfstoff induziert
werden. Das ist von großer Bedeutung, da gegen HPAIV-immunisierte Tiere zwar
gegen die Symptome einer AIV-Erkrankung geschützt sind, aber in der Regel keine
sterile Immunität aufweisen und das Feldvirus weiterhin replizieren und über den Kot
ausgeschieden werden kann. Damit kann sich das Feldvirus ungehindert in der
Tierpopulation verbreiten und zu gesundheitlichen Problemen in nicht geimpften
Tieren führen. Durch das DIVA-Prinzip ist eine schnelle Erkennung neuer AIVInfektionen
möglich
und
entsprechende
schnellstmöglich eingeleitet werden.
42
Bekämpfungsmaßnahmen
können
II. Zielstellung
Infektionen des Wirtschaftsgeflügels mit Newcastle Disease Virus (NDV) oder
aviärem Influenzavirus (AIV) führen weltweit zu drastischen ökonomischen Verlusten.
Ein Ziel dieser Arbeit war die Generierung rekombinanter Vektorviren auf Basis des
NDV, die als Impfviren Geflügel sowohl gegen die Newcastle Krankheit als auch
gegen die aviäre Influenza schützen. In den vergangenen Jahren konnte bereits von
verschiedenen Arbeitsgruppen gezeigt werden, dass NDV als Vektor für die Insertion
von AIV Genen geeignet ist. Um höhere Antikörpertiter gegen AIV nach
Immunisierung zu induzieren, sollte im ersten Teil dieser Arbeit untersucht werden,
ob der Insertionsort des Fremdgens in das NDV Genom einen Einfluss auf die
Expressionsstärke hat, um auf diese Weise rekombinante Vektorviren zu generieren,
die im Wirt einen höheren Antikörpertiter nach der Impfung induzieren.
Im zweiten Teil der Arbeit sollte herausgefunden werden, ob nach Insertion des AIV
Neuraminidase (NA)-Gens in das NDV-Genom, allein oder in Kombination mit dem
AIV H5 Gen, rekombinante NDV generiert werden können, die nach Immunisierung
bei Hühnern AIV Antikörper induzieren die eine verbesserte Schutzwirkung gegen
eine AIV-Infektion vermitteln.
Gegenstand des dritten Teils der Arbeit war die Modifikation des NDV-Vektorvirus.
Dazu wurden in verschiedenen Genen des rekombinanten NDV Clone 30 (rNDV)
Punktmutationen generiert, um ein rekombinantes NDV zu erhalten, das in seiner
Sequenz der mit Hilfe des Genomesequenzers ermittelten Wildtypvirus NDV Clone
30 Sequenz entspricht. Die Virulenz des neu hergestellten Virus rNDVGu sollte mit
anderen rekombinanten NDV verglichen und seine Eignung als in ovo Impfvirus
untersucht werden.
43
III. Zusammenfassende Darstellung und Diskussion der Ergebnisse
III.A. „Influence of insertion site of avian influenza virus haemagglutinin (HA)
gene within the Newcastle disease virus genome on HA expression“
K. Ramp, M. Skiba, A. Karger, T.C. Mettenleiter and A. Römer-Oberdörfer
publiziert in:
Journal of general Virology (2011), 92, 355-360
Die Technik der reversen Genetik ermöglicht die Insertion von Fremdgenen in das
NDV-Genom und damit die Entwicklung von Vektorvakzinen. In den letzten Jahren
hat sich insbesondere die Expression von immunogenen Proteinen des aviären
Influenza Virus (AIV) nach Insertion der entsprechenden Gene in das NDV-Genom
zu einer hoffnungsvollen Option entwickelt, Geflügel gleichzeitig gegen die
Newcastle Krankheit und die aviäre Influenza zu schützen. Für eine effiziente
Immunisierung ist eine hohe Antikörperbildung essentiell, die unter anderem durch
das Niveau der Expression des Fremdproteins bestimmt wird. Die mRNA-Synthese
und folglich die Proteinexpression der Gene nichtsegmentierter Negativstrang-RNAViren folgt einem Transkriptionsgradienten, der vom 3´- zum 5´-Ende abfallend ist
(Wertz, Moudy et al. 2002; Whelan, Barr et al. 2004). In der hier vorliegenden Studie
wurden verschiedene NDV/AIV-Rekombinanten generiert, um zu untersuchen, ob
Transkription und Translation der inserierten Fremdgene dem beschriebenen NDVTranskriptionsgradienten
hochpathogenen
AIV
folgen.
Dafür
(HPAIV)
H5N1
wurde
das
Hämagglutinin-Gen
(A/chicken/Vietnam/P41/05)
an
des
drei
verschiedenen Stellen des NDV Clone 30-Genoms inseriert. Die Insertionsorte waren
zwischen den Genen, die für das P- und das M-Protein (NDVH5VPM), das M- und
das
F-Protein
(NDVH5VMF)
oder
das
F-
und
das
HN-Protein
kodieren
(NDVH5VFHN). Zusätzlich wurde das Neuraminidase-Gen des HPAIV Isolates
A/duck/Vietnam/TG24-01/05 vom Subtyp H5N1 allein (NDVN1FHN) oder in
Kombination mit dem HA-Gen in das NDV-Genom eingefügt (NDVH5VPMN1FHN).
Dabei zeigte sich, dass alle generierten NDV/AIV-Rekombinanten unabhängig vom
AIV H5-Insertionsort zu vergleichbaren Titern replizieren. Die gleichzeitige Insertion
von AIV H5 und N1 in das NDV-Genom beeinflusste die Replikationseffizienz der
Rekombinante trotz der der deutlichen Vergrößerung des Gesamtgenoms von über
44
3500 Nukleotiden ebenfalls nicht. Die Transkriptionsstärke der AIV H5- und N1mRNA wurde mit Hilfe der Northern Blot Analyse und die H5-Proteinexpression
zusätzlich durch Massenspektrometrie mit Hilfe der SILAC (stable isotope labelling
with amino acids in cell culture)- Methode (Ong, Blagoev et al. 2002; Skiba,
Mettenleiter et al. 2008) bestimmt. Hierbei konnte beobachtet werden, dass die AIVH5 RNA-Transkription als auch der AIV H5-Protein-Expressions am stärksten waren,
wenn das H5-Gen zwischen den NDV F- und HN-Genen inseriert worden war. Die
Unterschiede
in
der
H5-Expression
zwischen
den
einzelnen
NDV/AIV-
Rekombinanten waren aber nur gering, was darauf hinweist, dass die Expression von
Fremdgenen nicht dem Transkriptionsgradienten folgt (Wertz, Perepelitsa et al. 1998;
Sakai, Kiyotani et al. 1999; Lamb and Kolakofsky 2001).
Die Rekombinante NDVN1FHN, welche das AIV N1 Gen zwischen den F- und HNGenen trägt, zeigte eine stärkere N1 mRNA-Expression als die Rekombinante
NDVH5PMN1FHN, bei der zusätzlich das AIV H5 Gen zwischen den P- und MGenen des NDV inseriert worden war.
In Tierexperimenten ist nun zu untersuchen, ob die hier festgestellten Unterschiede
in der Proteinexpression auch einen Einfluss auf die Immunantwort nach einer
Vakzinierung und die daraus resultierende Schutzwirkung gegen eine HPAIV-und
NDV-Infektion haben.
45
III.B. „Coexpression of avian influenza virus H5 and N1 by recombinant
Newcastle disease virus does not enhance immune response in chickens“
K. Ramp, J. Veits, D. Deckers, M. Rudolf, C. Grund, T.C. Mettenleiter and A. RömerOberdörfer
publiziert in:
Avian Diseases, 55(3):413-421.2011
Avian Diseases Digest, 6(3):e11-e12.
Neutralisierende Antikörper gegen das Hämagglutinin-Protein (HA) des aviären
Influenza Virus (AIV) schützen Geflügel gegen eine AIV-Infektion. Der erfolgreiche
Einsatz von NDV als Vektor für die Expression von AIV H5 konnte in verschiedenen
Studien demonstriert werden, in denen das Fremdgen zwischen NDV P und M
(Nakaya, Cros et al. 2001; Park, Steel et al. 2006; Ge, Deng et al. 2007; Dinapoli,
Nayak et al. 2010; Nayak, Kumar et al. 2010) oder zwischen NDV F und HN (Veits,
Wiesner et al. 2006; Schröer, Veits et al. 2009) eingefügt wurde. Dabei vermittelten
die generierten NDV/AIV Rekombinanten in beiden Fällen einen Schutz gegen eine
NDV-Infektion und gegen eine AIV-Infektion vom selben Subtyp. Gegen eine
heterologe AIV H5 Belastungsinfektion waren die Tiere dagegen nicht vollständig
geschützt (Römer-Oberdörfer, Veits et al. 2008), was darauf hinweist, dass die
gebildeten Antikörper gegen das H5 das Belastungsvirus nicht vollständig
inaktivieren können. Da bei einer AIV-Infektion auch Antikörper gegen das
Oberflächenprotein Neuraminidase (NA) gebildet werden, könnten Antikörper gegen
HA und NA die Schutzwirkung gegen eine AIV-Infektion verbessern. Um dies zu
untersuchen wurden im Rahmen der vorliegenden Studie drei rekombinante NDV
generiert, die das HA und/oder NA des hochpathogenen AIV (HPAIV) H5N1
exprimieren, und deren Schutzwirkung gegen HPAIV in Hühnern analysiert. Dabei
wurde das lentogene NDV Isolat Clone 30 für die Insertion des HA des
hochpathogenen AIV (HPAIV) Isolates A/chicken/Vietnam/P41/05 (H5N1) und des
NA des HPAIV Isolates A/duck/Vietnam/TG24-01/05 (H5N1), genutzt. Das HA-Gen
wurde zwischen den NDV Genen P und M und/oder das NA-Gen zwischen NDV F
und HN eingefügt. Alle NDV/AIV Rekombinanten replizierten mit vergleichbaren
Titern in embryonierten Hühnereiern und exprimierten stabil HA und/oder NA. Im
46
Tierexperiment zeigte sich, dass Hühner, die mit den Rekombinanten immunisiert
worden waren, bei denen das AIV N1- und - H5-Gen oder nur das AIV H5-Gen in
das NDV Genom inseriert wurde, sowohl gegen zwei verschiedene HPAIV H5N1
Isolate (A/duck/Vietnam/TG24-01/05 (H5N1); A/swan/Germany/R65/06 (H5N1)), als
auch
gegen
eine
Belastungsinfektion
mit
einem
HPAIV
H5N2
Isolat
(A/chicken/Italy/8/98 (H5N2)) geschützt waren. Jedoch führte die simultane
Expression von AIV N1 und H5 nicht zu einer weiteren Verbesserung des Schutzes
vor einer letalen Infektion mit HPAIV wie sie für andere Systeme beschrieben worden
ist (Johansson 1999; Qiao, Yu et al. 2003; Pavlova, Veits et al. 2009). Die
Immunisierung von Hühnern mit der NDV/AIV Rekombinante, die nur das AIV N1Gen exprimiert, schützte die Tiere nicht vor einer letalen AIV-Infektion. Demzufolge
schützen gebildete NA-Antikörper nicht ausreichend vor einer AIV-Infektion, was
auch in anderen Studien gezeigt wurde (Pavlova, Veits et al. 2009; Nayak, Kumar et
al. 2010).
47
III.C. “Pathogenicity and immunogenicity of different recombinant Newcastle
disease virus Clone 30 variants after in ovo vaccination”
K.Ramp, E.Topfstedt, R.Wäckerlin, D.Höper, M.Ziller, T.C.Mettenleiter, C.Grund and
A.Römer-Oberdörfer
eingereicht: bei
Avian Diseases
Um Geflügel gegen die Newcastle Krankheit zu schützen wird gewöhnlich mit
lentogenen NDV Stämmen, wie z.B. La Sota, Clone 30, B1 oder V4 geimpft. Bei
älteren Hühnern erzeugt die Impfung selten klinische Symptome, wohingegen
jüngere Bestände oft mit Atemnot und Gewichtsreduktion reagieren (Gelb, King et al.
1996). Um diese Risiken zu mindern und um gleichzeitig den frühen Schutz von
Geflügelbeständen zu optimieren, wäre eine direkte Vakzinierung im Ei (in ovo) von
großem Vorteil (Alexander 2000). Eine in ovo Impfung wäre automatisierbar, was
sowohl eine Kostenersparnis als auch eine Stressreduktion für die Tiere bedeuten
würde. Allerdings sind die lentogenen NDV Impfstämme wie La Sota oder Clone 30
für Hühnerembryonen pathogen und daher für eine in ovo Impfung nicht geeignet.
Daher werden die klassischen Vakzinestämme entweder durch Alkylierungsmittel
modifiziert (Ahmad and Sharma 1992) oder als inaktivierte Ölemulsion in ovo injiziert
(Stone, Mitchell et al. 1997). Zurzeit ist nur der NDV-in ovo Impfstoff Poulvac
OVOlineTM (Fort Dodge) verfügbar, der aber aufgrund der nicht zufriedenstellenden
Schlupfrate sowie der unzureichenden Immunantwort und Schutzrate (Dilaveris,
Chen et al. 2007) kaum zur Anwendung kommt. Daher ist die Nachfrage nach einem
verlässlichen in ovo Impfstoff groß. Im Rahmen der hier durchgeführten Studie
wurden mit Hilfe der reversen Genetik zwei rekombinante NDV mit spezifischen
Mutationen generiert. Dabei wurde das rekombinante NDV (rNDV), das vom
lentogenen Impfstamm Clone 30 abstammt, als Grundlage verwendet. Eines der
generierten Viren weist einzelne Mutationen im F- und HN-Protein (analog zu (Mast,
Nanbru et al. 2006)) auf (rNDV 49). Um Sequenzunterschiede im P-, M-, F- und LGen
zwischen
rNDV
und
Clone
30,
die
durch
Bestimmung
der
Gesamtgenomsequenz mit Hilfe des Genome Sequenzers (Roche) ermittelt wurden,
zu korrigieren, wurde ein zweites Virus (rNDVGu) generiert. Die Virusrekombinanten
rNDV 49, rNDVGu, rNDV, sowie das Wildtypvirus Clone 30 wurden in vivo und in
48
vitro charakterisiert. Durch Applikation dieser Viren in ovo konnte die Pathogenität
von NDV für Hühnerembryonen näher analysiert werden. In den Ergebnissen zeigte
sich, dass die in vitro Replikation, die Mean Death Time (MDT) und der
Intrazerebrale Pathogenitätsindex (ICPI) von rNDV49 und rNDVGu mit rNDV
vergleichbar waren. Die rekombinanten NDVs (rNDV, rNDV49 und rNDVGu) und
Clone 30 wiesen mit einer MDT > 90 h einen für lentogene NDV charakteristischen
Wert auf. Dennoch wurden kleine Unterschiede in der Virulenz der Viren offenkundig,
und es konnte eine Reihung der Viren mit abnehmender Virulenz vorgenommen
werden: NDV Clone 30 > rNDVGu> rNDV~ rNDV49. Dieses Ergebnis stimmt mit den
ICPI Daten und den Überlebensraten der Hühner nach in ovo Impfung überein.
Interessanterweise zeigte rNDVGu, das dem Ausgangsvirus Clone 30 entsprechen
sollte, eine geringere Virulenz als Clone 30, jedoch eine etwas höhere als rNDV.
NDV Clone 30 ist ein über Plaquereinigung selektierter Abkömmling des NDV
Stammes La Sota. Es ist aber denkbar, dass es sich dabei um kein völlig homogenes
Virusmaterial handelt und in geringem Anteil enthaltene Quasispezies die Virulenz
des Virus mit beeinflussen. Die Attenuierung von rNDV und rNDV49 konnte dagegen
durch die höhere Überlebensrate der Hühner nach der in ovo Impfung bestätigt
werden. Dennoch sind beide rekombinanten Viren nicht ausreichend attenuiert, um
als in ovo Impfstoff zur Anwendung kommen zu können. Unsere Ergebnisse zeigen
zusätzlich, dass trotz ähnlicher ICPI Werte geringfügige Unterschiede in der Virulenz
von verschiedenen lentogenen NDV durch eine in ovo Applikation herausgefunden
werden können. In jedem Falle ist für eine in ovo Vakzine das Verhältnis zwischen
Immunogenität und Virulenz des Impfvirus von entscheidender Bedeutung.
49
IV. Literaturverzeichnis
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Influence of insertion site of the avian influenza virus
haemagglutinin (HA) gene within the Newcastle disease virus
genome on HA expression
66
Journal of General Virology (2011), 92, 355–360
Short
Communication
DOI 10.1099/vir.0.027268-0
Influence of insertion site of the avian influenza virus
haemagglutinin (HA) gene within the Newcastle
disease virus genome on HA expression
Kristina Ramp, Martin Skiba, Axel Karger, Thomas C. Mettenleiter
and Angela Römer-Oberdörfer
Correspondence
Angela Römer-Oberdörfer
Institute of Molecular Biology, Friedrich-Loeffler-Institut, Federal Research Institute for Animal
Health, Südufer 10, D-17493 Greifswald-Insel Riems, Germany
angela.roemer-oberdoerfer@fli.
bund.de
Received 17 September 2010
Accepted 9 November 2010
Members of the order Mononegavirales express their genes in a transcription gradient from 39 to
59. To assess how this impacts on expression of a foreign transgene, the haemagglutinin (HA) of
highly pathogenic avian influenza virus (HPAIV) A/chicken/Vietnam/P41/05 (subtype H5N1) was
inserted between the phosphoprotein (P) and matrix protein (M), M and fusion protein (F), or F and
haemagglutinin–neuraminidase protein (HN) genes of attenuated Newcastle disease virus (NDV)
Clone 30. In addition, the gene encoding the neuraminidase of HPAIV A/duck/Vietnam/TG24-01/
05 (subtype H5N1) was inserted into the NDV genome either alone or in combination with the HA
gene. All recombinants replicated well in embryonated chicken eggs. The expression levels of HAspecific mRNA and protein were quantified by Northern blot analysis and mass spectrometry, with
good correlation. HA expression levels differed only moderately and were highest in the
recombinant carrying the HA insertion between the F and HN genes of NDV.
Newcastle disease is a highly contagious infection of many
avian species that causes substantial economic losses in
the poultry industry worldwide. The causative agent is
Newcastle disease virus (NDV), a negative-strand RNA
virus belonging to the genus Avulavirus within the family
Paramyxoviridae (Fauquet et al., 2005) of the order
Mononegavirales. Its genome is 15 186 nt long and encodes
six structural proteins: the nucleoprotein (NP), phosphoprotein (P), matrix protein (M), fusion protein (F),
haemagglutinin–neuraminidase protein (HN) and the
RNA-dependent RNA polymerase (L). The additional
proteins V and W are transcribed from the P gene by an
RNA editing mechanism (Steward et al., 1993). Based on
its pathogenicity in chickens, NDV is categorized into
lentogenic, mesogenic and velogenic pathotypes. The
virulence of an NDV strain is determined by the activation
cleavage of the F protein by cellular proteases (Nagai et al.,
1976). A polybasic amino acid stretch between aa 112 and
116 of the F protein characterizes highly virulent NDV,
whereas NDV of low virulence exhibits only single basic
amino acids at this site (Collins et al., 1993; Glickman et al.,
1988; Millar et al., 1988; Toyoda et al., 1987). To protect
poultry from Newcastle disease, vaccination is practised
worldwide using either inactivated or live vaccines based
on lentogenic viruses such as NDV La Sota or Clone 30,
which are applied by spray or drinking water.
The generation of recombinant NDV (rNDV) by reverse
genetics (Krishnamurthy et al., 2000; Peeters et al., 1999;
Römer-Oberdörfer et al., 1999) has made NDV amenable
027268 G 2011 SGM
Printed in Great Britain
to genetic manipulation. Insertion of foreign genes into the
NDV genome has resulted in the development of bivalent
vector vaccines. For this purpose, efficient expression of
an immunogenic foreign protein by the NDV vector is
required. Expression levels of genes of non-segmented
negative-strand RNA viruses are regulated primarily by
their position relative to the single promoter, and also by
cis-acting sequences located at the beginning and end of
each gene. For vesicular stomatitis virus, it has been shown
that the amounts of mRNA and protein decrease following
the order of transcription from the 39-proximal to the 59distal end of the viral genome forming a transcription
gradient (Wertz et al., 2002; Whelan et al., 2004). To assay
whether this also applied to foreign transgenes, Zhao &
Peeters (2003) inserted the gene encoding secreted alkaline
phosphatase (SEAP) into different intergenic regions of the
NDV genome and showed that SEAP activities were highest
when the transgene was inserted between the NDV M and
F genes, and not between the more 39 insertion site between
P and M. These results did not correlate with the proposed
transcription gradient described for Mononegavirales.
Development of NDV vector vaccines expressing avian
influenza virus (AIV) immunogens has become a promising option to simultaneously fight two important virus
diseases of poultry. The negative-strand RNA genome of
influenza A viruses (family Orthomyxoviridae) consists of
eight segments coding for 11 proteins (Chen et al., 2001;
Palese & Shaw, 2007). The surface glycoproteins haemagglutinin (HA) and neuraminidase (NA) exist in different
355
K. Ramp and others
antigenic variations (H1–H16 and N1–N9), which are used
to classify influenza A virus into various subtypes (Fouchier
et al., 2005; Webster et al., 1992). A further classification into
low pathogenic (LP), notifiable low pathogenic (NLP) and
highly pathogenic (HP) pathotypes is made according to
their ability to elicit disease (Alexander, 1997). Outbreaks of
HPAIV are caused exclusively by the H5 and H7 subtypes.
Both also have the potential to cause zoonotic infections in
humans. Therefore, the control of HPAIV infections is
essential for the poultry industry and to prevent human
infections. Currently available influenza vaccines, based
on inactivated whole-virus preparations or attenuated live
virus, do not allow differentiation between infected and
vaccinated animals (the DIVA principle; reviewed by Fuchs
et al., 2009). This problem could be overcome by vector
vaccines. The successful use of NDV as a vector for the
expression of AIV HA has been described in different
studies, where the foreign gene was integrated between the P
and M genes (DiNapoli et al., 2010; Ge et al., 2007; Nakaya
et al., 2001; Park et al., 2006) or the F and HN genes (Schröer
et al., 2009; Veits et al., 2006). In both cases, the recombinant
viruses conveyed protection against NDV, as well as against
influenza infection of the corresponding subtype. However,
an improved virus vaccine that results in higher antibody
levels against AIV after immunization is desirable. Recently,
it was shown that co-immunization with infectious
laryngotracheitis virus (ILTV) recombinants expressing
H5 and N1 further increased the efficacy of an ILTV vector
vaccine (Pavlova et al., 2009). Enhanced protection against
lethal influenza virus infection has also been achieved by
other vector vaccines co-expressing HA and NA (Chen et al.,
1999; Johansson, 1999; Qiao et al., 2003).
In this study, we created different NDV/AIV recombinants
to analyse whether transcription of the foreign gene
followed the NDV transcription gradient (Lamb &
Kolakofsky, 2001; Sakai et al., 1999; Wertz et al., 1998). If
so, insertion of the AIV H5 gene in a more 39-proximal
position should result in higher protein yields. Therefore,
H5 of HPAIV A/chicken/Vietnam/P41/05 (H5N1) was
inserted into the NDV genome between the P and M, M
and F, or F and HN genes. In two additional recombinants,
N1 of HPAIV A/duck/Vietnam/TG24-01/05 (H5N1) was
inserted between the F and HN genes alone or together
with an H5 insertion between P and M (Fig. 1). All rescued
viruses were characterized in vitro, and the expression levels
of AIV HA and NA were determined by Northern blot
analysis. HA protein expression was also quantified by
mass spectrometry.
Lentogenic vaccine strain Clone 30 (GenBank accession no.
Y18898) served as the NDV backbone for all recombinant
viruses. Sequences for HA were based on HPAIV strain A/
chicken/Vietnam/P41/05 (H5N1) (GenBank accession no.
AM183672) and for NA on HPAIV A/duck/Vietnam/
TG24-01/05 (H5N1) (GenBank accession no. AM183678).
The sequence of H5 was identical to that of the previously described HA of recombinant NDVH5Vm (RömerOberdörfer et al., 2008). Recombinant NDVH5VmPM was
generated by insertion of the amplified H5 gene of
NDVH5Vm using primers with MluI sites, and gene end
as well as gene start signal sequences. The amplified
fragment consisted of an MluI site, the gene end signal
sequence of the NDV P gene, nucleotide T as an intergenic
region, the gene start signal sequence of the NDV HN gene,
the non-coding region of the NDV HN gene, the ORF of
AIV H5, the non-coding region of the NDV HN gene and
another MluI site. The NDV backbone was altered by the
introduction of an artificial single MluI site in front of the
P gene end signal sequence after back mutation of known
artificial MluI sites of the rNDV genome (RömerOberdörfer et al., 1999). NDVH5VmMF was obtained by
insertion of the H5 gene flanked by MluI sites into a newly
created single MluI site in front of the gene end signal
sequence of M using an NDV genome without other
artificial MluI sites. NDVN1FHN was generated by substitution of the H5Vm ORF by the N1 ORF using NcoI and
AflII sites. As the AIV N1 ORF contains an NcoI site,
insertion was carried out in two steps. The resulting N1
ORF sequence differed by 1 nt from the sequence in
GenBank as a result of the newly generated NcoI site, which
was used for cloning as described previously (Veits et al.,
Fig. 1. Schematic representation of the
genome organization of NDV and recombinants with insertion of the HA and/or NA genes
of HPAIV H5N1. Transcription control signals
are indicated by a triangle for the transcription
start and a shaded rectangle for the transcription stop sequences. ncr, Non-coding region.
356
Journal of General Virology 92
AIV HA expression from the NDV genome
2006). NDVH5VmPMN1FHN expressing AIV HA and
NA was constructed by substitution of the NotI–BsiWI
fragment of NDVH5VmPM by that of NDVN1FHN
(Fig. 1). Recovery of infectious NDV from cDNA was
performed on BSR-T7/5 baby hamster kidney cells, which
stably express phage T7 RNA polymerase (Buchholz et al.,
1999). The in vivo replication of recovered virus was determined in 10-day-old specific-pathogen-free (SPF) chicken
eggs, which were inoculated with 200 ml 103 TCID50 rNDV
ml21. Virus titres in allantoic fluid were determined on
QM9 cells. All the generated NDV/AIV recombinants
replicated well, independent of the AIV H5 insertion site,
although with a delay in onset of replication compared with
wild-type NDV Clone 30 (Fig. 2). All the generated NDV/
AIV recombinants reached a final titre (TCID50 ml21) of
108.0–108.5 (Fig. 2), demonstrating that neither integration
of the AIV H5 gene alone nor simultaneous integration of
the H5 and N1 genes into the NDV genome had a
detrimental effect on virus replication, despite the considerable size of the inserts of more than 3500 nt. Expression
and cleavability of the HA protein of the NDV/AIV
recombinants was determined by Western blot analysis.
Proteins of virus-infected chicken embryo fibroblasts
(CEFs) were separated by SDS-PAGE and transferred to
nitrocellulose membranes followed by incubation with
polyclonal monospecific rabbit serum directed against AIV
H5 or AIV N1, and incubation with the respective HRPlabelled secondary antibody. Three proteins of approximately 70, 50 and 25 kDa were detected after incubation with the AIV H5-specific antiserum, corresponding
to the uncleaved HA0 and the cleavage products HA1
and HA2 (Fig. 3a). The HA protein with a polybasic cleavage site expressed by the recombinants NDVH5VmPM,
NDVH5VmMF, NDVH5Vm and NDVH5VmPMN1FHN
Fig. 3. (a) Western blot analyses of NDV recombinants. Proteins of
infected CEFs were separated by SDS-PAGE and blotted onto
nitrocellulose. Membranes were incubated with monospecific rabbit
anti-AIV H5 serum and monospecific rabbit anti-AIV N1 serum.
Proteins were detected by chemiluminescence after incubation with
suitable HRP-labelled secondary antibodies. (b) Relative mRNA and
protein expression levels of AIV H5 in infected DF-1 cells. mRNA
was quantified by Northern blot analysis (shaded columns) and
protein by quantitative mass spectrometry using the SILAC
technique (filled columns). Error bars indicate the SD of three
independent experiments. Protein and mRNA levels were normalized to the NDV P expression levels from the same samples.
Fig. 2. Replication kinetics of wild-type NDV Clone 30 and
recombinants expressing one or two AIV proteins in embryonated
SPF chicken eggs. Eggs were infected with 200 ml 103 TCID50 ml”1
of the indicated viruses and the titres of progeny virus in allantoic
fluids were determined at the indicated time points by titration on
QM9 cells, followed by indirect immunofluorescence analysis.
http://vir.sgmjournals.org
was completely processed by cellular proteases. In contrast,
the HA0 protein with a monobasic cleavage site expressed by
NLPAIV H5N1 (A/common teal/Germany/Wv632/05), which
was used as a control, remained mainly uncleaved (Fig. 3a). As
expected, no HA protein was present in NDVN1FHN or
rNDV. Expression of the N1 protein was confirmed for the
recombinants NDVN1FHN, NDVH5VmPMN1FHN and
NLPAIV H5N1 (A/common teal/Germany/Wv632/05) with
an N1-specific antiserum (Fig. 3a). Size differences in the
357
K. Ramp and others
N1 proteins expressed by the NDV recombinants (A/duck/
Vietnam/TG24-01/05, GenBank accession no. AM183678)
and wild-type AIV (A/common teal/Germany/WV632/05,
GenBank accession no. AM913983.1) reflected differences in
the lengths of the ORFs (450 vs 470 aa, respectively) and
different numbers of potential glycosylation sites (three and
seven, respectively).
The relative H5- and N1-specific mRNA levels of the NDV/
AIV recombinants were determined by Northern blot
analysis. Total RNA was isolated from the virus-infected
CEFs, separated in denaturing agarose gels, transferred to
nylon membranes and hybridized with 32P-labelled antisense RNA specific for AIV H5, AIV N1 or NDV P. The
signals were quantified by radioluminography using a FLA3000 scanner (Fujifilm) and Advanced Image Data Analyser software (Raytest) for image analysis. The relative
mRNA levels of HA and NA were calculated by normalization of their absolute signals to the P-specific signal in
the same sample. For comparison of the different viruses,
the relative mRNA levels of H5 as well as of N1 were again
normalized to the level expressed by NDVH5VmPMN1FHN,
which was set to 1.0. H5 mRNA expression of NDVH5Vm
was 25 % higher compared with NDVH5VmPMN1FHN,
whereas the H5 mRNA expression of NDVH5VmPM and
NDVH5VmMF reached 94 and 71 % of the level found for
NDVH5VmPMN1FHN (Fig. 3b). As expected, insertion of
AIV H5 in a more 39-proximal position than N1 led to a
decrease in N1-specific mRNA. N1 mRNA expression from
NDVH5VmPMN1FHN amounted to 53 % of that observed
for NDVN1FHN (data not shown).
Relative HA protein expression levels in the NDV/AIV
mutants were assayed by a combination of two-dimensional (2D) electrophoresis and quantitative mass spectrometry using the stable isotope labelling with amino acids
in cell culture (SILAC) technique (Ong et al., 2002) with
some modifications (Skiba et al., 2008). This procedure is
highly precise and has been used for the quantification of
cellular proteins in proteome studies but also to determine
expression levels of viral proteins (Skiba et al., 2008, 2010).
In preceding 2D electrophoretic analyses with cell extracts
from uninfected and NDV-infected cells and cells infected
with one of the recombinants, HA, the NDV-specific P and
a number of cellular proteins were located in 2D gels and
identified by mass spectrometry and in 2D Western blots.
For the quantification experiment, extracts from cells infected with NDVH5VmMF, NDVH5VmPM and NDVH5Vm
were mixed with an extract from deuterium-labelled cell
cultures infected with NDVH5VmPMN1FHN as an internal
standard. The mix was separated by 2D electrophoresis and
the relative HA levels were determined by matrix-assisted
laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry.
For the calculation of HA-specific relative mRNA levels, the
relative expression level of the HA protein was normalized to
the expression level of NDV P, which was determined in the
same manner from P samples isolated from the same gel.
The relative HA protein levels were again normalized to the
internal standard, recombinant NDVH5VmPMN1FHN,
358
which was set to 1.0. As shown in Fig. 3(b), levels of HA
mRNA and protein expression correlated well, indicating
that HA mRNA and protein synthesis are tightly linked.
Maximum HA protein expression was observed after
infection with recombinant NDVH5Vm, which was
approximately twofold higher than after infection with
recombinant NDVH5VmMF in which the weakest expression was observed. As mentioned above, Zhao & Peeters
(2003) constructed a panel of NDV recombinants expressing
the reporter gene encoding SEAP in different positions
within the genome. The expression levels of SEAP were
highest after insertion between the M and F genes, and
lowest after insertion between NP and P. In our study, we
detected the highest mRNA and protein levels of AIV H5 for
NDV recombinants with the H5 insertion between F and
HN. Although Zhao & Peeters (2003) did not test the
insertion site between the F and HN genes, their results as
well as ours are in contrast to expression levels of NDV
proteins, which decrease from the 39-proximal to the 59distal end of the viral genome (Lamb & Kolakofsky, 2001;
Sakai et al., 1999; Wertz et al., 1998). As the foreign H5
transgene of all our recombinants was identical, differences
in H5 mRNA and protein level were caused by the different
insertion sites within the NDV genome.
Nevertheless, the observed differences in H5 expression levels
of our NDV recombinants were moderate, indicating that
transgenes can be inserted at different positions in the NDV
genome without severely affecting the replication capacity of
the recombinant virus. This result is consistent with the
results of Zhao & Peeters (2003) for expression of SEAP.
In summary, we showed that NDV can accommodate HA,
NA or both AIV glycoproteins, increasing the virus genome
by more than 3500 nt, without significantly affecting virus
replication. The in vitro expression levels of AIV H5 mRNA
and protein were to some extent influenced by the location
of the insertion site of the transgene within the NDV
genome. Transgenic HA expression levels were highest
when the HA gene was inserted between the NDV F and
HN genes. However, even then they were only twice as high
as the lowest expression level detected in our assay. Animal
experiments will be needed to demonstrate whether these
moderate differences in HA protein expression have an
effect on the immune response after vaccination and
protection of immunized chickens against HPAIV.
Acknowledgements
We thank Martina Lange, Barbara Bettin and Stefanie Jachmann for
technical assistance and Jutta Veits for academic discussions. This
research was supported by the European Commission (FP6; Project
no. 044141).
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influenza
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H5
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recombinant Newcastle disease virus and the impact on
immune response in chickens
73 AVIAN DISEASES 55:413–421, 2011
Coexpression of Avian Influenza Virus H5 and N1 by Recombinant Newcastle Disease
Virus and the Impact on Immune Response in Chickens
Kristina Ramp,A Jutta Veits,A Daniela Deckers,B Miriam Rudolf,C Christian Grund,C Thomas C. Mettenleiter,A and
Angela Römer-OberdörferAD
A
Institute of Molecular Biology, Friedrich-Loeffler-Institut, Federal Research Institute for Animal Health, Südufer 10,
D-17493 Greifswald-Insel Riems, Germany
B
Institute of Infectology, Friedrich-Loeffler-Institut, Federal Research Institute for Animal Health, Südufer 10,
D-17493 Greifswald-Insel Riems, Germany
C
Institute of Diagnostic Virology, Friedrich-Loeffler-Institut, Federal Research Institute for Animal Health, Südufer 10,
D-17493 Greifswald-Insel Riems, Germany
Received 12 January 2010; Accepted and published ahead of print 26 April 2011
SUMMARY. To analyze the contribution of neuraminidase (NA) toward protection against avian influenza virus (AIV)
infection, three different recombinant Newcastle disease viruses (NDVs) expressing hemagglutinin (HA) or NA, or both, of highly
pathogenic avian influenza virus (HPAIV) were generated. The lentogenic NDV Clone 30 was used as backbone for the insertion of
HA of HPAIV strain A/chicken/Vietnam/P41/05 (H5N1) and NA of HPAIV strain A/duck/Vietnam/TG24-01/05 (H5N1). The
HA was inserted between the genes encoding NDV phosphoprotein (P) and matrixprotein (M), and the NA was inserted between
the fusion (F) and hemagglutinin-neuraminidase protein (HN) genes, resulting in NDVH5VmPMN1FHN. Two additional
recombinants were constructed carrying the HA gene between the NDV P and M genes (NDVH5VmPM) or the NA between F
and HN (NDVN1FHN). All recombinants replicated well and stably expressed the HA gene, the NA gene, or both. Chickens
immunized with NDVH5VmPMN1FHN or NDVH5VmPM were protected against two different HPAIV H5N1 and also against
HPAIV H5N2. In contrast, immunization of chickens with NDVN1FHN induced NDV- and AIV N1–specific antibodies but did
not protect the animals against a lethal dose of HPAIV H5N1. Furthermore, expression of AIV N1, in addition to AIV H5 by
NDV, did not increase protection against HPAIV H5N1.
RESUMEN. Expresión simultánea de las proteı́nas H5 y N1 del virus de la influenza aviar mediante un virus recombinante de la
enfermedad de Newcastle y su efecto sobre la respuesta inmune en los pollos.
Para analizar la contribución de la neuraminidasa (NA) en la protección contra la infección por el virus de la influenza aviar, se
generaron tres diferentes virus recombinantes de la enfermedad de Newcastle que expresaban la hemaglutinina (HA) o la NA o
ambas proteı́nas de un virus altamente patógeno de la influenza aviar. Se utilizó la cepa lentogénica del virus de Newcastle Clone 30
como el esqueleto para la inserción del gene HA del virus de alta patogenicidad A/pollo/Vietnam/P41/05 subtipo (H5N1) y el gene
de la NA del virus A/pato/Vietnam/TG24-01/05 (H5N1) que es también un virus de alta patogenicidad. La HA se insertó entre los
genes que codifican a la fosfoproteı́na (P) y la proteı́na de la matriz viral (M), y la NA se insertó entre los genes que codifican a la
proteı́na de fusión (F) y la proteı́na hemaglutinina-neuraminidasa (HN), lo que resultó en el virus recombinante
NDVH5VmPMN1FHN. Dos virus recombinantes adicionales se construyeron portando el gene HA entre los genes P y M del
virus de Newcastle (NDVH5VmPM) o portando el gene NA entre los genes F y HN (NDVN1FHN). Todos los virus
recombinantes se replicaron adecuadamente y expresaron de manera estable los genes HA o NA, o ambos. Los pollos vacunados con
el virus NDVH5VmPMN1FHN o el virus NDVH5VmPM estaban protegidos contra dos virus diferentes de la influenza aviar de
alta patogenicidad subtipo H5N1 y un subtipo H5N2. En contraste, la inmunización de pollos con el virus NDVN1FHN indujo
anticuerpos especı́ficos contra el virus de Newcastle y contra el virus de la influenza aviar N1, pero no protegió a los animales contra
una dosis letal de un virus de alta patogenicidad H5N1. Además, la expresión de la proteı́na N1 junto con la H5 por el virus de
Newcastle, no aumentó la protección contra el virus de alta patogenicidad H5N1.
Key words: NDV, HPAIV, vaccine, H5
Abbreviations: AIV 5 avian influenza virus; Ct 5 threshold cycle; EID50 5 50% egg infectious dose; ELISA 5 enzyme-linked
immunosorbent assay; F 5 fusion protein; HA 5 hemagglutinin protein; HI 5 hemagglutination inhibition; HN 5 hemagglutininneuraminidase protein; HP 5 highly pathogenic; ICPI 5 intracerebral pathogenicity index; ILTV 5 infectious laryngotracheitis
virus; L 5 large protein; LP 5 low pathogenic; M 5 matrix protein; NA 5 neuraminidase protein; NDV 5 Newcastle disease virus;
NLP 5 notifiable low pathogenic; NP 5 nucleoprotein; orf 5 open reading frame; P 5 phosphoprotein; p.ch. 5 postchallenge;
p.i. 5 postimmunization; QM 5 quail muscle; R 5 reverse primer; rNDV 5 recombinant NDV; RT-PCR 5 reverse transcriptase
polymerase chain reaction; SDS-PAGE 5 sodium dodecylsulfate polyacrylamide gel electrophoresis; SPF 5 specific pathogen free;
TCID50 5 5 50% tissue culture infective dose
Avian influenza viruses (AIVs) belong to the genus Influenza A
within the Orthomyxoviridae family. Their genome consists of eight
RNA segments of negative polarity which code for 11 proteins
(7,19). The surface glycoproteins hemagglutinin (HA) and neuraminidase (NA) exist in different antigenic variations (H1–H16;
D
Corresponding author. E-mail: [email protected]
N1–N9), resulting in the classification of AIV into various subtypes
on the basis of their HA and NA type (10,31). Furthermore, AIV
strains are differentiated into low pathogenic (LP) or highly
pathogenic (HP) types according to their ability to elicit disease.
Notifiable low pathogenic (NLP) AIVs are an additional group that
specify H5 or H7 and has the potential to mutate spontaneously into
highly pathogenic viruses. HPAIV of H5 and H7 subtype cause
severe disease in poultry, which often results in mortality of up to
413
414
K. Ramp et al.
100%. On a molecular basis, HPAIV are characterized by multiple
basic amino acids at the HA0 cleavage site, resulting in cleavability of
HA by ubiquitous intracellular proteases (14,28). These viruses
propagate quickly in infected animals. NLPAIV (H5 and H7
subtype) and LPAIV are characterized by an HA0 with monobasic
cleavage site. These viruses cause only mild clinical signs of disease
(e.g., affection of the respiratory tract). The HA0 protein of these
viruses can only be cleaved by trypsin-like proteases located in the
respiratory and intestinal tracts of the host.
Outbreaks of highly pathogenic avian influenza are caused by
HPAIV of the H5 and H7 subtype and occurred in many parts of
the world (3,4,14), resulting in culling or death of several hundred
million birds. The most prominent HPAIV H5N1 emerged in
Europe in 2005. Furthermore, it has been recognized that AIVs have
intrinsic zoonotic character. H5N1 infections resulted in 549
confirmed human cases with 320 deaths worldwide through April
2011 (32). Therefore, the control of HPAIV infections is essential
for the poultry industry and for the prevention of human infections.
Currently, stamping out infected flocks is the preferred method of
eliminating an HPAI infection. However, destruction of food
resources is an economical and ethical problem. Currently available
influenza vaccines, primarily based on inactivated whole virus
preparations or attenuated live viruses, generally do not allow
differentiation between infected and vaccinated animals (DIVA
principle) (reviewed by Fuchs et al. (11)). This problem could be
overcome by vector vaccines. Different chicken viruses, attenuated
strains of DNA viruses such as fowlpox virus or infectious
laryngotracheitis virus (ILTV), or RNA viruses such as Newcastle
disease virus (NDV) have been used as vectors for the expression of
immunogenic AIV proteins (reviewed by Fuchs et al. (11)). Such
vaccines are advantageous because they can be used as live vaccines to
protect poultry against two different major infectious diseases.
Moreover, ILTV- and NDV-based vaccines are qualified for mass
application.
NDV belongs to the genus Avulavirus within the family
Paramyxoviridae. NDV exhibits a nonsegmented, negative-strand
RNA genome of about 15 kb that consists of six genes in the order
39–59 coding for the viral nucleoprotein (NP), phosphoprotein (P),
matrix protein (M), fusion protein (F), hemagglutinin-neuraminidase protein (HN) and RNA-dependent RNA polymerase or large
protein (L) (9). Additional proteins V and W are transcribed from
the P gene by an RNA editing mechanism (29). The successful use of
NDV as vector for the expression of AIV H5 has been described in
different studies, in which the foreign gene was inserted between the
P and M (8,12,17,20) or the F and HN genes (26,30). In both cases,
recombinant viruses conveyed protection against NDV as well as
AIV infection of the corresponding subtype. However, it was also
shown that protection against heterologous H5 challenge was less
efficient (25), indicating an insufficient antibody response or
inadequate antibodies produced by immunization with NDV H5.
Because an AIV infection leads to the formation of antibodies
against both surface proteins, HA and NA, it is reasonable to assume
that antibodies against both would enhance protection efficiency.
Pavlova et al. (21) showed that coimmunization of chickens with
ILTV recombinants expressing AIV H5 or AIV N1 significantly
improved their efficacy. Furthermore, the coexpression of HA and
NA by baculovirus (15) or fowlpox virus (23) enhanced protection
against homologous as well as heterologous HPAIV infection.
Immunization of African green monkeys with NDV expressing
either HA or NA resulted in protection from a virulent challenge (8),
also indicating an important role for NA in protection against AIV.
In contrast, immunization of chickens with NDV vector expressing
NA did not result in protection, and coimmunization with vectors
expressing either HA or NA did not improve protective performance
beyond that induced by HA-expressing NDV alone (18).
To analyze whether these results also apply to our vector/challenge
system and to check whether simultaneous coexpression of NA and
HA from the same vector could improve the protective efficiency of
recombinant NDV (rNDV), vector viruses expressing NA and HA
in combination or alone were generated and characterized in vitro,
and their protective efficacy against different highly pathogenic AIV
H5 was determined in chickens.
MATERIALS AND METHODS
Viruses and cells. The NDV vaccine strain Clone 30 was used for all
recombinants (24). The AIV isolates A/chicken/Vietnam/P41/05
(H5N1) and A/duck/Vietnam/TG24-01/05 (H5N1) were kindly
provided by P. Song Lien (National Centre for Veterinary Diagnosis,
Dongda, Vietnam). NLPAIV H5N1 (A/common teal/Germany/
Wv632/05), obtained from the National Reference Laboratory for
Avian Influenza at the Friedrich-Loeffler-Institut, and recombinant AIV
H5N1 (R65mono-V-ETR) (13) were used as controls. The viruses were
propagated in 10-day-old embryonated specific pathogen-free (SPF)
chicken eggs (Lohmann, Cuxhaven, Germany).
Recovery of infectious NDV from cDNA was done on BSR-T7/5
BHK cells, which stably express phage T7 RNA polymerase (1). Primary
chicken embryo fibroblasts and quail muscle cells (QM9) were used for
virus characterization.
Construction of rNDV expressing AIV H5, N1, or both. NDV
Clone 30 genome (GenBank accession Y18898) was used for the
insertion of AIV genes. Sequences of HA were based on HPAIV strain
A/chicken/Vietnam/P41/05 (H5N1; GenBank accession AM183672)
and of NA on HPAIV A/duck/Vietnam/TG24-01/05 (H5N1; GenBank
accession AM183678). The sequence of H5 was identical to that of our
previously described recombinant NDVH5Vm (25). The H5 gene was
amplified by Expand High Fidelity PCR System (Roche, Mannheim,
Germany) with the use of primers with MluI sites (in bold) and geneend as well as gene-start sequences (underlined). Primers PH5
HNMLUF (59-cacacgcgtattaagaaaaaatacgggtagaacggtaagagagg-39) and
PH5HNMLUR (59-cacacgcgttcaagagactattgac-39) were designed in
consideration of the rule of six, so that the number of nucleotides of
the whole genome was a multiple of six (2,22). The amplified fragment
contains a MluI site, gene end sequence, nucleotide T as intergenic
region, gene start sequence, noncoding region of NDV HN gene, open
reading frame (orf) of AIV H5, noncoding region of NDV HN, and
another MluI site. Recombinant NDVH5VmPM (Fig. 1) was generated
by insertion of the H5 gene of NDVH5Vm. The NDV backbone was
altered by introduction of an artificial single MluI site in front of the P
gene-end sequence after back-mutation of unwanted artificial MluI sites
in the rNDV genome (24). Mutations were done using the QuikChangeH II XL Site-Directed Mutagenesis Kit (Stratagene, Heidelberg,
Germany) and the following primers pairs (indicated is the forward
primer, the reverse primer (R) is complementary to the given sequence):
MPMLUVF (59-gggtagaaggtgtgaatctcgagtgcgagcccgaagcac-39)/R, MPM
LUHIF (59-ggctccttttttggccaattgtattcttgttgattttatcatattatgttag-39)/R, for
reversion of artificial MluI-sites, and MPINSMLUPMF (59-ccgtaattaatctagctacatttaagaacgcgtttaagaaaaaatacgggtagaattggag-39)/R, for insertion of an artificial MluI site between the P and M genes. NDVN1FHN
was generated by substitution of the H5Vm by the N1 gene using NcoI
and AflII sites (Fig. 1). Because AIV N1 contains an NcoI site within its
orf, cloning was done in two steps. The resulting N1 gene sequence
differs in one nucleotide from the GenBank sequence as a result of the
newly generated NcoI site, which was used for cloning as previously
described for the insertion of H5 (30). NDVH5VmPMN1FHN carries
both AIV HA and NA genes. It was constructed by substitution of a
NotI-BsiWI fragment of NDVH5VmPM by that of NDVN1FHN
(Fig. 1). More detailed information about cloning procedures will be
given on request.
415
Contribution of NA to protection against AIV by recombinant NDV
Fig. 1. Schematic representation of the genome organization of NDV and NDV recombinants with insertion of hemagglutinin, neuraminidase,
or both genes of HPAIV H5N1. Cleavage sites of NotI and BsiWI are labeled.
Transfection and virus recovery. The full-length clones were
cotransfected into BSR T7/5 cells (1) with support plasmids pCite NP,
pCite P, and pCite L expressing the NP, P, and L proteins of NDV Clone
30 using Lipofectamin 2000 (Invitrogen, Karlsruhe, Germany) at a
DNA:lipofectamin rate of 1:1.5 (mg:ml) following the manufacturer’s
instructions. Virus propagation was carried out as described previously (24).
Western blot analyses. Virions of rNDV, NDVN1FHN,
NDVH5VmPMN1FHN, NLPAIV H5N1, and recombinant AIV
H5N1 (R65mono-V-ETR) (13) were purified by centrifugation of respective allantoic fluids through a continuous cesium chloride gradient
(20%–45%). Proteins were separated by sodium dodecylsulfate polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) and transferred to nitrocellulose filters (Protran, Whatman, Dassel, Germany) using a Transblot SD
cell (Bio-Rad, München, Germany). Blots were incubated with polyclonal
monospecific rabbit sera directed against AIV-H5 (21), AIV-N1 (21), or
NDV-HN (26) followed by incubation with the anti-rabbit peroxidase–
labeled secondary antibodies (Dianova, Hamburg, Germany). Antibody
binding was detected by chemiluminescence using SuperSignalH West
Pico Chemiluminescent Substrate (Thermo Scientific, Schwerle, Germany) and the Chemi DocTM XRS+ imaging system (Bio-Rad).
Indirect immunofluorescence. To detect progeny virus, cells were
fixed 72 hr after transfection with acetone/methanol (1:1) and incubated
with monoclonal antibodies a-NDV-HN as previously described (24).
Kinetics of replication. Ten-day-old SPF chicken eggs were
inoculated with 200 ml of 103 50% tissue culture infective doses
(TCID50)/ml of rNDV. Allantoic fluids were harvested at the indicated
time points and titrated on QM9 cells, followed by indirect
immunofluorescence analysis using a rabbit a-NDV hyperimmune
serum and fluorescein isothiocyanate–conjugated goat a-rabbit immunoglobulin (H+L chain; SIFIN, Berlin, Germany).
Animal experiments. The intracerebral pathogenicity index (ICPI)
was determined according to the European Community Council
Directive 92/66/EEC (5) to assess the virulence of the generated
NDV/AIV recombinants.
An animal experiment was performed to examine whether immunization with NDVN1FHN expressing AIV N1 conveys protection
against infection with HPAIV H5N1. Eleven 3-wk-old SPF chickens
were immunized oculonasally with 106 50% egg infectious doses
(EID50)/animal) of NDVN1FHN. Three weeks after vaccination, the
animals were challenged oculonasally with 106 EID50/animal of HPAIV
H5N1 (A/duck/Vietnam/TG24-01/05). A control group of 11
nonimmunized chickens was likewise challenged.
In a second animal experiment, protective efficacy after immunization
with rNDV expressing AIV H5 in combination with N1 or alone was
investigated. Two groups of 30, 3-wk-old SPF chickens each were
immunized oculonasally with 106 EID50/animal of NDVH5VmPM or
NDVH5VmPMN1FHN, respectively. Challenge infection was carried
out oculonasally 3 wk later with 106 EID50/animal of HPAIV H5N1
(A/duck/Vietnam/TG24-01/05), 106 EID50/animal of HPAIV H5N1
(A/swan/Germany/R65/06), and 107.5 EID50/animal of HPAIV H5N2
(A/chicken/Italy/8/98), respectively. All animals were daily examined for
signs of disease and evaluated as healthy (score 0), ill (score 1; one of the
following signs: dyspnea, depression, diarrhea, cyanosis, edema, nervous
signs), severely ill (score 2; severe or more than one of the signs
mentioned above), or dead (score 3). A clinical score was calculated that
represents the mean value of all chickens per group for a period of
10 days. Blood samples were collected before immunization and at days
10 and 20 postimmunization (p.i.). At the end of the experiment
(21 days postchallenge [p.ch.]), the chickens were anesthetized with
50 mg/kg of ketamine (Cava Tiergesundheit, Düsseldorf, Germany) and
6 mg/kg of Xylazin (Riemser Arzneimittel AG, Greifswald, Germany),
exsanguinated, and submitted to postmortem examination.
HI test and ELISA. Presence of AIV or NDV antibodies in sera of
chickens was assessed by hemagglutination inhibition (HI) test
according to the standard procedure described in Commission of the
European Community Council directives (5,6). AIV NP antibodies
were detected by a commercially available influenza A antibody enzymelinked immunosorbent assay (ELISA), as recommended by the
manufacturer (IDVET, Montpellier, France).
A commercially available competitive ELISA test (IDVET) was used
for detection of anti-NA (N1-subtype) antibodies according to the
manufacturer’s instructions.
Analysis of virus shedding. Oropharyngeal as well as cloacal swabs
were collected on days 2–5, 7, 10, and 14 after HPAIV challenge
infection. RNA from swabs was prepared on a robotic platform (Tecan,
Crailsheim, Germany) using the Nucleo Spin kit (Macherey-Nagel,
Düren, Germany). The presence of AIV RNA was assayed by reverse
transcription (RT) and real-time polymerase chain reaction (PCR) based
on amplification of the M gene (27) and evaluated as previously
described (26).
RESULTS
Generation and stability of NDV/AIV recombinants. Three
different recombinant NDV/AIVs were generated expressing the AIV
H5, the AIV N1, or both genes. The AIV H5 gene was inserted
between P and M in NDVH5VmPM and the AIV N1 gene between F
and HN in NDVN1FHN. Recombinant NDVH5VmPMN1FHN
carries both genes with the H5 orf located between the P and M genes
and the N1 between F and HN (Fig. 1). All three NDV recombinants
were propagated over several egg passages. Presence of AIV-specific
genes was confirmed for all recombinants also after 10 egg passages by
RT-PCR with the use of primer pairs binding within the NDV genome
and within an AIV gene or flanking the AIV gene. The sequences of all
PCR fragments were in accordance with the respective recombinants.
Characterization of NDV/AIV recombinants. To assess the
virulence of the generated viruses, the pathogenicity for 1-day-old
chickens was determined after intracerebral inoculation. The
resulting ICPI values of the recombinants were between 0 and 0.1,
416
K. Ramp et al.
Fig. 2. Kinetics of replication in embryonated SPF chicken eggs of
parental virus rNDV and recombinants expressing one or two AIV
proteins. Eggs were infected with 200 ml of 103 TCID50/ml, and titers of
progeny virus in allantoic fluids collected at indicated time points were
determined by titration on QM9 cells, followed by indirect immunofluorescence.
demonstrating that they continue to be lentogenic. Thus, the
expression of HA, NA, or HA and NA of HPAIV did not noticeably
affect NDV virulence.
Furthermore, growth characteristics of the NDV/AIV recombinants in SPF embryonated chicken eggs were determined. All three
virus recombinants replicated with a delay in onset of replication but
reached final titers (log TCID50/ml) of between 108.0 and 108.5 72 hr
p.i. (Fig. 2), similar to the parental virus rNDV.
To analyze for presence of the AIV proteins, recombinant NDV/
AIV expressing N1 (NDVN1FHN) as well as H5 and N1
(NDVH5VmPMN1FHN) were purified and analyzed by immunoblotting in comparison to rNDV, wild type NLPAIV H5N1, or
recombinant AIV H5N1 (R65mono-V-ETR; Fig. 3). As expected,
no reactivity could be detected after incubation with the NDV HNspecific antiserum in AIV H5N1, whereas the presence of
NDV HN protein was verified in rNDV, NDVN1FHN, and
NDVH5VmPMN1FHN (Fig. 3A). AIV H5 was detected in wildtype NLPAIV H5N1 and NDVH5VmPMN1FHN under denaturing conditions as HA1 (about 50 kD) and HA2 (about 25 kD), the
cleavage products of HA0 (Fig. 3B). Expression of N1 from
NDVN1FHN and NDVH5VmPMN1FHN was also confirmed
by immunoblotting (Fig. 3C). Size differences between N1 proteins
of recombinant and wild-type NLPAIV result from different sizes of
the orfs and different numbers of potential glycosylation sites.
However, the N1 protein of recombinant HPAIV, whose N1
sequence matches more closely that of N1 of recombinant NDV/
AIV was comparable in molecular weight (Fig. 3C).
Protective efficacy against HPAIV in chickens. The protective
efficacy against HPAIV in chickens was examined after immunization with NDV/AIV recombinants NDVH5VmPMN1FHN,
NDVH5VmPM, and NDVN1FHN. In a first experiment, SPF
chickens were immunized with N1-expressing recombinant
NDVN1FHN and challenged 3 wk later with HPAIV H5N1 (A/
duck/Vietnam/TG24-01/05). As expected, all chickens remained
healthy after immunization. After challenge infection, all control
chickens died within 2 days. However, immunized chickens also
died, but with a delay of 1–2 days (Table 1). All immunized
chickens exhibited N1-specific antibodies on day 20 postimmunization (i.e., before challenge). Thus, infection with a NDV/AIV
recombinant expressing only the AIV N1 protein did not provide
protection against the lethal HPAIV H5N1 challenge but delayed
the beginning of illness and the time of death.
In a second animal experiment, NDVH5VmPMN1FHN and
NDVH5VmPM were tested in parallel for protection against
infection with homologous and nonhomologous HPAIV of H5
subtype. Two groups of 30 SPF chickens each were immunized
oculonasally with 106 EID50/animal of NDVH5VmPMN1FHN or
NDVH5VmPM. After immunization, most of the vaccinated
Fig. 3. Western blot analyses of NDV recombinants. Purified virions were separated on SDS-PAGE and blotted onto nitrocellulose. Membranes
were subsequently incubated with intermediate stripping steps with (A) monospecific rabbit a-NDV-HN serum and (B) monospecific rabbit a-AIVH5 serum. Monospecific rabbit a-AIV-N1 serum was used for detection of AIV NA (C). Proteins were detected by chemiluminescence after
incubation with anti-rabbit peroxidase–labeled secondary antibodies.
417
Contribution of NA to protection against AIV by recombinant NDV
Table 1. Efficacy of NDVN1FHN against HPAIV after immunization
on day 0, and results after H5N1 challenge infection on day 21.
Immunized chickens
Control
1/11
11/11 (ø24.64)
11/11
11/11 (ø25.18)
0/11
0/11
A
0 Immunization
10 N1-specific antibodies (ELISA)
NDV-specific antibodies (HI)
20 N1-specific antibodies (ELISA)
NDV-specific antibodies (HI)
Mortality
21 Challenge infectionB
22 Morbidity
Mortality
23 Morbidity
Mortality
24 Morbidity
Mortality
25 Mortality
3/11
0/11
11/11
0/11
9/11
2/11
11/11
NDVH5VmPM
immunizedA
NDVH5VmPMN1FHN
immunizedA
ControlA
NDV
0
10
20
0.0 (0/30)
5.2 (30/30)
5.4 (30/30)
0.0 (0/30)
4.8 (30/30)
5.3 (30/30)
0.0 (15/15)
AIV
0
10
20
0.0 (0/30)
3.3 (23/30)
4.3 (28/30)
0.0 (0/30)
3.2 (27/30)
4.5 (29/30)
0.0 (15/15)
Days p.i.
Result (positive/total)
Day
Table 2. Antibody levels (log2 HI titer).
0/11
0/11
0/11
11/11
0/11
—
11/11
A
Oculonasally with 106 EID50 NDVN1FHN.
Oculonasally with 106 EID50 influenza A/duck/Vietnam/TG24-01/
05 (H5N1).
B
animals developed antibodies against NDV and AIV, as demonstrated by HI titers against NDV and AIV (Table 2). The NDV
antibody response was detectable already on day 10 p.i. for all
animals (mean titer, 24.8–25.2), with a slight increase on day 20 p.i.
(mean titer, 25.3–25.4). On days 10 and 20 p.i., the numbers of AIV
antibody–positive animals were comparable (mean titer, 24.3–24.5
20 days p.i.; Table 2). Three weeks after immunization, 10 chickens
of each group together with five control animals were challenged
with A/duck/Vietnam/TG24-01/05 (H5N1; 106 EID50/animal), A/
swan/Germany/R65/06 (H5N1; 106 EID50/animal), and A/chicken/
Italy/8/98 (H5N2; 107,5 EID50/animal), respectively. All control
animals that had been challenged by either HPAIV H5N1 Germany
or HPAIV H5N1 Vietnam died within 3 days, and within 5 days
p.ch. with HPAIV H5N2 Italy (Fig. 4). Immunized chickens that
had been infected by HPAIV A/duck/Vietnam/TG24-01/05
(H5N1) survived a 10-day period, and most of them remained
healthy. Only one animal of the NDVH5VmPM immunized group
showed nervous signs (score 1) beginning from day 5 until day 10
p.ch., resulting in a clinical index of 0.1. Symptoms increased in
severity until day 14 p.ch., when the animal was euthanatized. After
challenge infection with HPAIV A/swan/Germany/R65/06 (H5N1),
animals immunized with NDVH5VmPM showed a clinical index of
0, whereas the clinical index of the NDVH5VmPMN1FHNimmunized group was 0.3 because of one dead chicken on day 6,
which succumbed to the AIV challenge infection. None of the other
immunized animals in this group exhibited any clinical signs.
Furthermore, all immunized chickens remained healthy after
infection with HPAIV A/chicken/Italy/8/98 (H5N2). Virus shedding of immunized chickens, assessed by real-time RT-PCR, was
very low. Only a few oropharyngeal and cloacal swabs were positive
and, in the majority of cases, exhibited high threshold cycle (Ct)
values (Fig. 5). Ct values are in good agreement with demonstration
of infectious virus, as had been shown recently (16). In contrast,
replication of the challenge virus was observed in most of the control
animals, resulting in lower Ct values (Fig. 5).
After challenge infection, the sera of immunized chickens were
examined for AIV NP antibodies to test the suitability of the
recombinants as marker vaccines. Whereas AIV NP–specific
antibodies were absent before challenge, most chickens of the
A
Average titer (no. positive/total).
groups challenged by HPAIV A/chicken/Italy/8/98 (H5N2) seroconverted (Fig. 6A). AIV NP antibodies were detected only in a few
chickens of the group that had been challenged by HPAIV A/swan/
Germany/R65/06 (H5N1; Fig. 6B) and in none of the chickens that
had been challenged by HPAIV A/duck/Vietnam/TG24-01/05
(H5N1; Fig. 6C).
DISCUSSION
Modern vector viruses are promising candidates for the
development of vaccines against HPAIV, which has become a
serious problem in poultry, especially in Asia. During a natural AIV
infection, antibodies against the surface proteins HA and NA are
generated. Whereas antibodies against HA block attachment to the
sialic acid–containing host cell receptor and inhibit fusion between
viral and host cell membranes, antibodies against NA reduce virus
replication by inhibiting virus release from infected cells. The
successful use of NDV as a vaccine vector for the expression of AIV
HA has been reported (8,12,20,26,30). However, the level of
protection against AIV was dependent on the homology between the
HA subtype expressed by the vector and the circulating field virus,
demonstrating a need for adaptation of vector vaccines (25). On the
basis of the lower mutation rate of NA (19), recombinants
coexpressing NA from the NDV genome could enhance protective
efficacy, even against heterologous AIV strains. Therefore, we
generated three NDV/AIV recombinants expressing HA or NA, in
combination or singly, and tested their protective efficacy against
homologous and heterologous H5 challenge virus in SPF chickens.
All three recombinants replicated well in embryonated chicken eggs.
Even the simultaneous integration into the NDV genome of
transgenes encoding H5 and N1 has no detrimental effect on
replication, indicating that NDV can accommodate two foreign
genes with more than 3500 additional nucleotides.
Antibodies against neuraminidase are thought to provide
protection by aggregation of virus on the cell surface, resulting in
reduced virus release and inhibition of virus spread. Qiao et al. (23)
observed the production of NA antibodies in chickens after
administration of a recombinant fowlpox virus that encoded both
AIV H5 and N1. Immunized chickens were completely protected
against HPAIV H5N1 challenge infection. However, in this study,
no protection rate was determined after immunization with a
recombinant expressing only N1. To test the protective effect of N1
alone, we constructed NDVN1FHN carrying the AIV N1 gene
between the NDV F and HN genes. After homologous challenge, all
immunized chickens died, but with a delay of 2 days compared with
the control animals. Interestingly, all immunized chickens had
detectable levels of anti-N1 antibodies on day 20 postimmunization,
418
K. Ramp et al.
Fig. 4. Clinical score after HPAIV challenge infection. NDVH5VmPM- or NDVH5VmPMN1FHN-immunized and nonimmunized chickens
were challenged with HPAIV A/duck/Vietnam/TG24-01/2005 (H5N1), HPAIV A/swan/Germany/R65/2006 (H5N1), or HPAIV A/chicken/Italy/
8/98 (H5N2), respectively. Animals were daily classified as healthy (0), moderately ill (1), severely ill (2), or dead (3). The average scores of all
animals per group and day are indicated.
indicating a solid immune response. However, antibodies against N1
were obviously not sufficient to protect against infection and death,
which parallels previous studies in chickens (18) but is in contrast to
the situation in African green monkeys (8). Similar results have been
obtained in chickens with an ILTV recombinant expressing AIV N1
(21).
Different apparent molecular masses of the N1 proteins of
HPAIV H5N1 (A/duck/Vietnam/TG24-01/05) and NLPAIV
H5N1 (A/teal/Germany/WV632/05) expressed by NDV recombinants, as detected by western blot analysis, arise from different sizes
of the orfs and different number of potential glycosylation sites.
Whereas the NA protein of the donor HPAIV H5N1 (A/duck/
Vietnam/TG24-01/05) contains 450 amino acids with three
potential N-glycosylation sites, NLPAIV H5N1 (A/common teal/
Germany/Wv632/05) possesses a NA of 470 amino acids with seven
potential N-glycosylation sites (Fig. 3).
To test whether coexpression of the two AIV surface proteins
could enhance the immune response, chickens were immunized with
NDVH5VmPMN1FHN, which expresses AIV HA of HPAIV
H5N1 (A/chicken/Vietnam/P41/05) and NA of HPAIV H5N1 (A/
duck/Vietnam/TG24-01/05), and with NDVH5VmPM, which
expresses only H5 of HPAIV H5N1 (A/chicken/Vietnam/P41/05).
Immunized chickens were challenged with HPAIV H5N1 of
different clades (Vietnam clade 2.1 and Germany clade 2.2) and
with HPAIV H5N2 (Italy). Protective efficacy of NDV/AIV vaccine
against homologous HPAIV has been demonstrated recently (8,30).
In our study, both recombinant viruses expressing HA of A/chicken/
Vietnam/P41/05 protected against two different HPAIV H5N1
(Vietnam and Germany) and against HPAIV H5N2 (Italy). Despite
clinical protection, AIV NP antibodies were detectable in most sera
of animals challenged with HPAIV H5N2, whereas only a few
animals challenged with HPAIV A/swan/Germany/R65/06 (H5N1)
and no chickens challenged with HPAIV A/duck/Vietnam/TG2401/05 (H5N1) developed AIV NP antibodies. Shedding of challenge
virus as detected by real-time PCR was very low, demonstrating a
comparable efficacy of NDVH5VmPMN1FHN and NDVH5VmPM
immunization. However, the lowest virus shedding was detected after
homologous challenge infection, whereas the highest levels were
observed after challenge with HPAIV H5N2, which is genetically most
distant from the transgene donor exhibiting only 94% amino acid
homology in the HA protein. Nevertheless, all chickens were protected
from clinical signs, independent of the vaccine virus. In contrast, in the
reverse experiment, animals immunized with a NDV/AIV recombinant expressing H5 of HPAIV A/chicken/Italy/8/98 (H5N2) were
insufficiently protected against challenge by HPAIV H5N1 (Vietnam
(25)). It is conceivable that antibodies produced in response to
immunization with NDVH5VmPM or NDVH5VmPMN1FHN
recognize a wider range of H5 epitopes of different origin, resulting in
broader protection.
A simultaneous coexpression of N1 and H5 by NDV
(NDVH5VmPMN1FHN) was successful but did not enhance
immune response or protection level, indicating a low relevance of
NA antibodies for protection of chickens against HPAIV challenge,
in contrast to previous studies in which coexpression of HA and NA
by baculovirus (15) and fowlpox virus (23) increased protection
against HPAIV infection. However, a negative effect of NA as an
additional antigen to HA on protection, as described by Nayak et al.
(18), was not observed.
Contribution of NA to protection against AIV by recombinant NDV
419
Fig. 5. Analyses of virus shedding. Presence of AIV M1 gene after challenge infection with HPAIV A/chicken/Italy/8/98 (H5N2) (A), A/swan/
Germany/R65/2006 (H5N1) (B), or A/duck/Vietnam/TG24-01/2005 (H5N1) (C) was detected by real time RT-PCR of RNA samples prepared
from oropharyngeal (o) and cloacal (c) swabs. The average (bars) and the minimal (line) Ct values, as well as the percentage of positive swabs per
group and day, are given.
420
K. Ramp et al.
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Fig. 6. Differentiation of infected from vaccinated animals on the
basis of antibodies against AIV NP. Sera of chickens collected after
immunization (20 days p.i.) and after challenge infection (21 days p.ch.)
with HPAIV A/chicken/Italy/8/98 (H5N2) (A), A/swan/Germany/R65/
2006 (H5N1) (B), or A/duck/Vietnam/TG24-01/2005 (H5N1) (C) were
r
investigated by a commercial AIV NP ELISA (IDVET). Values $45% are
indicative of the presence of AIV NP–specific antibodies.
Contribution of NA to protection against AIV by recombinant NDV
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421
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XX; cited 2011 Apr XX]. Available from: http://www.who.int/csr/disease/
avian_influenza/country/en
ACKNOWLEDGMENTS
We thank Martina Lange and Sabine Feistkorn for their excellent
technical assistance. E. Starick kindly helped with cloning of the NA
gene. This work was supported by European Commission (FP 6; Project
044141).
Summarized from Avian Diseases, Vol. 55, No. 3, 2011, Pages 413–421
Coexpression of Avian Influenza Virus H5 and N1 by Recombinant Newcastle Disease Virus and the Impact on Immune
Response in Chickens
Kristina Ramp, Jutta Veits, Daniela Deckers, Miriam Rudolf, Christian Grund, Thomas C. Mettenleiter, and Angela Römer-Oberdörfer
Contact Address: [email protected]
Important Findings
To analyze the contribution of neuraminidase (NA) toward
protection against avian influenza virus (AIV) infection, three
different recombinant Newcastle disease viruses (NDVs) expressing
hemagglutinin (HA) or NA, or both, of highly pathogenic avian
influenza virus (HPAIV) were generated. Chickens immunized with
NDVH5VmPMN1FHN or NDVH5VmPM were protected against
two different HPAIV H5N1 and also against HPAIV H5N2. In
contrast, immunization of chickens with NDVN1FHN induced
NDV- and AIV N1–specific antibodies but did not protect the
animals against a lethal dose of HPAIV H5N1. Furthermore,
expression of AIV N1, in addition to AIV H5 by NDV, did not
increase protection against HPAIV H5N1.
Significance of Findings
A simultaneous coexpression of N1 and H5 by NDV (NDVH5Vm
PMN1FHN) was successful but did not enhance immune response or
protection level, indicating a low relevance of NA antibodies for
protection of chickens against HPAIV challenge, in contrast to
previous studies in which coexpression of HA and NA by baculovirus
and fowlpox virus increased protection against HPAIV infection.
However, a negative effect of NA as an additional antigen to HA on
protection, as described by Nayak et al., was not observed.
Additional Information
Outbreaks of highly pathogenic avian influenza are caused by
HPAIV of the H5 and H7 subtype and occurred in many parts of the
world, resulting in culling or death of several hundred million birds.
The most prominent HPAIV H5N1 emerged in Europe in 2005.
Furthermore, it has been recognized that AIVs have intrinsic
Copyright E 2011, American Association of Avian Pathologists, Inc. 1933-5334 online
zoonotic character. H5N1 infections resulted in 549 confirmed
human cases with 320 deaths worldwide through April 2011.
Therefore, the control of HPAIV infections is essential for the
poultry industry and for the prevention of human infections.
Currently, stamping out infected flocks is the preferred method of
eliminating an HPAI infection. However, destruction of food
resources is an economical and ethical problem. Currently available
influenza vaccines, primarily based on inactivated whole virus
preparations or attenuated live viruses, generally do not allow
differentiation between infected and vaccinated animals. This
problem could be overcome by vector vaccines. Different chicken
viruses, attenuated strains of DNA viruses such as fowlpox virus or
infectious laryngotracheitis virus (ILTV), or RNA viruses such as
Newcastle disease virus (NDV) have been used as vectors for the
expression of immunogenic AIV proteins. Such vaccines are
advantageous because they can be used as live vaccines to protect
poultry against two different major infectious diseases. Moreover,
ILTV- and NDV-based vaccines are qualified for mass application.
NDV belongs to the genus Avulavirus within the family
Paramyxoviridae. The successful use of NDV as vector for the
expression of AIV H5 has been described in different studies, in which
the foreign gene was inserted between the P and M or the F and HN
genes. In both cases, recombinant viruses conveyed protection against
NDV as well as AIV infection of the corresponding subtype. However,
it was also shown that protection against heterologous H5 challenge
was less efficient, indicating an insufficient antibody response or
inadequate antibodies produced by immunization with NDV H5.
Because an AIV infection leads to the formation of antibodies against
both surface proteins, HA and NA, it is reasonable to assume that
antibodies against both would enhance protection efficiency.
However, immunization of chickens with NDV vector expressing
NA did not result in protection, and coimmunization with vectors
expressing either HA or NA did not improve protective performance
beyond that induced by HA-expressing NDV alone.
Co-expresión de Virus de Influenza Aviar H5 y N1 en Virus Recombinante de Enfermedad de Newcastle y Su Impacto
Sobre la Respuesta Inmune de Pollos
Kristina Ramp, Jutta Veits, Daniela Deckers, Miriam Rudolf, Christian Grund, Thomas C. Mettenleiter, y Angela Römer-Oberdörfer
Dirección para contactar: [email protected]
Hallazgos Importantes
Para analizar la contribución de la neuraminidasa (NA) a la
protección contra la infección por el virus de influenza aviar (AIV) se
generaron tres virus recombinantes de Newcastle (NDV) que
expresaban hemaglutinina (HA), NA o ambos de virus de influenza
Copyright E 2011, American Association of Avian Pathologists, Inc. 1933-5334 online
aviar altamente patógeno (HPAIV). Los pollos que fueron
inmunizados con los virus NDVH5VmPMN1FHN o
NDVH5VmPM se vieron protegidos contra dos virus de influenza
aviar de alta patogenicidad H5N1 distintos y contra un virus de alta
patogenicidad H5N2. En contraste, la inmunización de los pollos con
el virus NDVN1FHN indujo anticuerpos especı́ficos contra el virus de
Newcastle y contra el virus de la influenza aviar N1 pero no
proporcionó protección a los animales contra una dosis letal del
virus de alta patogenicidad H5N1. Además, la expresión de la proteı́na
Contribución de la NA a la protección contra IA mediante NDV
N1 del virus de la influenza aviar además de la H5 por parte del virus
de Newcastle no incrementó la protección contra el virus de alta
patogenicidad H5N1.
Relevancia de los Hallazgos
La expresión simultanea de N1 y H5 por parte del virus de
Newcastle (NDVH5VmPMN1FHN) fue un éxito pero no aumentó la
respuesta inmune o el nivel de protección lo que indica una baja
relevancia de los anticuerpos contra NA en la protección de los pollos
contra un desafı́o con un virus de influenza aviar de alta
patogenicidad, a diferencia de otros estudios en los que la
expresión simultanea de HA y Na por baculovirus y virus de la
viruela aviar incrementó la protección contra un virus de alta
patogenicidad. Sin embargo, no se observó un efecto negativo sobre
la protección de la NA como antı́geno adicional a la HA como lo
describe Nayak et al.
Información Adicional
Los brotes de influenza aviar altamente patogénica son ocasionados
por HPAIV subtipos H5 y H7 y ocurren en todo el mundo, lo cual
resulta en la eliminación o muerte de varios cientos de millones de aves.
El virus de la influenza aviar de alta patogenicidad H5N1 más relevante
emergió en Europa en el 2005. Además, se ha reconocido que los virus
de influenza aviar tienen un carácter zoonótico intrı́nseco. Infecciones en
el mundo ocasionadas por el subtipo H5N1 resultaron en 549 casos
confirmados en humanos con 320 muertes hasta abril de 2011. Por lo
tanto, el control de las infecciones por HPAIV es esencial para la
industria avı́cola y para la prevención de infecciones en humanos.
Actualmente el método preferido para detener la infección por un
virus de alta patogenicidad es eliminar parvadas infectadas. Sin embargo,
la destrucción de recursos alimenticios representa un problema tanto
económico como ético. Las vacunas disponibles actualmente tienen base
principalmente en preparaciones de virus inactivado o virus vivo
atenuado que en general no permiten la diferenciación entre animales
infectados y vacunados. Este problema puede ser resuelto por vectores
vacunales. Diversos virus de pollo, como los virus ADN de la viruela
aviar o virus de la laringotraqueitis infecciosa (ILTV) o virus ARN tales
como virus de la enfermedad de Newcastle, han sido utilizados como
vectores para la expresión de proteı́nas inmunogénicas del virus de la
influenza aviar. Dichas vacunas son ventajosas porque pueden ser
utilizadas como vacunas vivas para proteger a los pollos contra dos tipos
de infecciones importantes. Además, las vacunas basadas en el virus de la
laringotraqueı́tis infecciosa y la enfermedad de Newcastle se pueden
utilizar para aplicación en masa.
El virus de Newcastle pertenece al género Avulavirus dentro de la
familia Paramyxoviridae. El uso exitoso del virus de Newcastle como
vector para la expresión de la proteı́na H5 del virus de la influenza
aviar ha sido descrito en varios estudios en los cuales se inserta el gen
ajeno entre los genes P y M o F y HN del vector. En ambos casos los
virus recombinantes proporcionaron protección contra el virus de la
enfermedad de Newcastle al igual que contra la infección por el virus
de la influenza aviar del subtipo correspondiente. Sin embargo,
también se demostró que la protección contra un desafı́o de H5
heterólogo fue menos eficiente, indicando una respuesta por
anticuerpos insuficiente o una producción inadecuada de
anticuerpos en la inmunización por el virus de Newcastle H5.
Debido a que la infección por el virus de la influenza aviar conlleva
a la formación de anticuerpos contra ambas proteı́nas de superficie,
HA y NA, es razonable asumir que los anticuerpos contra ambos
aumentarı́a la eficiencia de protección. Sin embargo, la inmunización
de pollos con el vector de NDV que expresó NA no llevó a la
protección y a la co-inmunización con vectores que expresaron HA y
NA no mejoró el rendimiento de la protección más allá de la inducida
por el vector del virus de Newcastle que expresa únicamente HA.
VII. Pathogenicity and immunogenicity of different recombinant
Newcastle disease virus Clone 30 variants after in ovo
vaccination
85 1
Running title: Recombinant NDV for in ovo vaccination
Pathogenicity and immunogenicity of different recombinant Newcastle disease
virus Clone 30 variants after in ovo vaccination
5
Kristina Ramp*, Eylin Topfstedt*, Regula Wäckerlin#, Dirk Höper#, Mario Ziller,
Thomas C. Mettenleiter*, Christian Grund# and Angela Römer-Oberdörfer*1
*Institute of Molecular Biology, # Institute of Diagnostic Virology, Friedrich-Loeffler-Institut, Federal
Research Institute for Animal Health, Südufer 10, D-17493 Greifswald-Insel Riems, Germany
10
*1 Corresponding author: Angela Römer-Oberdörfer
Friedrich-Loeffler-Institut, Südufer 10
15
D-17493 Greifswald-Insel Riems
Email: [email protected]
Tel.: + 49 38351- 71 107
20
Fax: + 49 38351-71 275
Manuscript information:
25
Word counts: Summary: 248
Figures: 5
Text: 4,620
Tables: 5
1
2
Summary
Even though Newcastle Disease Virus (NDV) live vaccine strains can be applied to
one day-old-chickens, they are pathogenic to chicken embryos when given in ovo
30
three days before hatch. Based on the reverse genetics system, we modified
recombinant NDV (rNDV) that was established from lentogenic vaccine strain Clone
30 by introducing specific mutations within the fusion (F) protein and hemagglutininneuraminidase (HN) protein that had been recently suggested as responsible for
attenuation of selected vaccine variants (Mast et al. Vaccine 24:1756-1765, 2006)
35
resulting in rNDV49. Another recombinant (rNDVGu) was generated to correct
sequence differences between rNDV and vaccine strain NDV Clone 30. Recombinant
viruses: rNDV, rNDV49, and rNDVGu show a reduced virulence compared to NDV
Clone 30 represented by lower intracerebral pathogenicity indices and elevated
mean death time. After in ovo inoculation, hatchability was comparable for all infected
40
groups. However, only one chicken from NDV Clone 30 group survived a 21 day
observation period whereas survival rate of hatched chicks from groups receiving
recombinant NDV was between 40 and 80 % with rNDVGu being the most
pathogenic virus. Furthermore, recombinant viruses induced protection against
challenge infection with virulent NDV 21 days post hatch. Differences in antibody
45
response of recombinant viruses indicate that immunogenicity is correlated to
virulence. In summary, our data show that point mutations can reduce virulence of
NDV. However, alteration of specific amino acids in F and HN of rNDV did not lead to
further attenuation as indicated by their pathogenicity for chicken after in ovo
inoculation.
50
2
3
Keywords:
55
recombinant NDV, in ovo vaccine
Abbreviations:
CEF = chicken embryo fibroblasts
DNA = desoxyribonucleic acid
60
EID50 = mean egg infectious doses
FITC = fluorescein isothiocyanate
F protein = fusion protein
GS = genome sequencing
HI = hemagglutinin inhibition
65
HN protein = hemagglutinin-neuraminidase protein
ICPI = intracerebral pathogenicity index
IFA = indirect immunofluorescence assay
L = large protein
M = matrix protein
70
MDT = mean death time
moi = multiplicity of infection
ND = Newcastle disease
NDV = Newcastle disease virus
NP = nucleoprotein
75
PCR = polymerase chain reaction
P protein = phosphoprotein
POD = peroxidase
QM = quail muscle
3
4
RNA = ribonucleic acid
80
RT-qPCR = reverse transcriptase real time PCR
SDS = sodium dodecylsulfate
SPF = specific pathogen free
TCID50 = mean tissue culture infectious dose
4
5
Introduction
85
Newcastle disease (ND) is a highly contagious, severe infection in poultry worldwide
with a great impact on the poultry industry. Therefore, it is listed by the world
organisation
for
animal
health
OIE
as
(http://www.oie.int/fr/normes/mmanual/A_00038.htm).
a
The
notifiable
causative
disease
agent,
Newcastle Disease Virus (NDV), also designated avian paramyxovirus serotype 1
90
(APMV-1), belongs to the genus Avulavirus within the subfamily Paramyxovirinae,
family Paramyxoviridae (14, 19).
The genome of NDV consists of a non-segmented, single-stranded RNA of negative
polarity. Following the rule of six (26), the genome size can vary between 15,186
(class II genotype I-IV, early isolates), 15,192 (class II genotype V-VIII, late isolates)
95
or 15,198 nucleotides (nt) (class I) (8). The genome encodes six structural proteins,
the nucleoprotein (NP), the phosphoprotein (P), the matrix protein (M), the fusion
protein (F), the hemagglutinin-neuraminidase protein (HN), and the large RNA
dependent RNA polymerase (L). Two additional, presumably regulator proteins (V
and W) are generated by RNA editing during P gene transcription (33). The two
100
surface glycoproteins HN and F mediate receptor specific binding to the target cell
and virus entry. They are known determinants of viral virulence (17, 23, 24, 31).
Depending on the severity of clinical disease in chickens, three pathotypes, i.e.
lentogenic, mesogenic or velogenic NDV can be differentiated by their intracerebral
pathogenicity index (ICPI). A major pathogenicity determinant is represented by the
105
proteolytic cleavage site of the F protein (9, 21, 24, 25). The F protein of pathogenic,
i.e. mesogenic or velogenic NDV contains at least one pair of basic amino acids at
residues 115 and 116 plus a phenylalanine at residue 117 and a basic amino acid
(arginine)
at
residue
113
(http://www.oie.int/fr/normes/mmanual/A_00038.htm).
Infection by highly virulent, velogenic NDV leads to severe disease (5) with mortality
5
6
110
rates as high as 100%. In contrast, lentogenic NDV is in use for oral or spray live
vaccination and commonly used strains like LaSota, Clone30, B1 or V4 do not induce
clinical disease in adult chickens. Although vaccination may be performed on the first
day after hatch, depending on the age of chickens at the date of vaccination,
respiratory distress and a slight reduction in weight gain may occur (15). To minimize
115
these problems and to optimize early protection of chickens in ovo vaccination has
been discussed (4). In ovo vaccination is already commonly practised in the USA to
protect against Marek´s and infectious bursal disease (28). It offers the opportunity of
precise automated application which entails reduction of stress for animals and
reduction of costs. However, lentogenic NDV vaccine strains like La Sota or Clone 30
120
are pathogenic for chicken embryos, and therefore not suitable for in ovo application.
To minimize embryo pathogenicity, classical vaccine strains were either modified by
an alkylating agent (1) or injected in ovo as inactivated oil emulsion preparations
(34). A recombinant fowlpox virus engineered to express NDV surface proteins F and
HN as well as chicken interferon I or II was also tested for this purpose (27). Despite
125
promising results, the only commercial in ovo vaccine against NDV currently
available is the Poulvac OVOlineTM NDV-vaccine (Fort Dodge) which however, does
not guarantee acceptable immune response, hatch and protection rates in specific
pathogen free (SPF) chicken embryos (10). Therefore, a more reliable in ovo vaccine
against NDV is in strong demand. Recently, Mast et al. (18) isolated an NDV La Sota
130
escape mutant after immunoselection with neutralizing antibodies against epitopes in
the F and HN proteins. The selected mutant was more attenuated than the parental
NDV La Sota, exhibited a promising hatch rate, and good protection after challenge.
However, since the selected mutant has been characterized genetically only within
the F and HN genes it remained unclear whether fortuitous alterations in other
135
regions might have contributed to the observed attenuation.
6
7
Here, we describe the generation of two recombinant NDV which carry specific
mutation based on recombinant NDV (rNDV), derived from vaccine strain Clone 30.
One of them possesses alterations in the F - and HN protein as described by Mast et
al. (18) (rNDV 49). The second virus (rNDVGu) contains single site mutations in P, M,
140
F, and L genes to correct sequence variations between rNDV and the parental Clone
30 revealed by new generation whole genome sequencing. Both newly generated
NDV as well as rNDV and vaccine strain Clone 30 were biologically characterized in
vitro and in vivo. By applyication of these viruses in ovo residual pathogenicity of
NDV could be further dissected. The results on pathogenicity and immunogenicity
145
after in ovo application give further insight into the fine balance between virulence
and immunogenicity of NDV and elucidate part of their genetic background.
Materials and Methods
Determination of genome sequence of parental NDV Clone 30
In order to confirm the reference genomic sequence (GenBank accession number
150
Y18898) of NDV Clone 30 by genome analysis using the Genome Sequencer FLX
system (GS FLX, Roche, Mannheim, Germany), two libraries were prepared from
RNA extracted from purified virions (library 1) and from allantoic fluid (library 2),
respectively. To this end, nine RT-PCR products were generated from each
preparation covering the complete genome in overlapping amplicons (primers
155
available on request) by OneStep RT-PCR kit (Qiagen, Hilden, Germany). The GS
FLX system libraries were prepared using the modified protocol of Höper et al. (16).
The libraries were titrated and sequenced using the GS FLX instrument with the
LR70 chemistry and protocol (titration of library 2) or the SR70 chemistry and
protocol (titration of library 1 and sequencing both libraries). Prior to mapping, the
160
PCR-primer sequences were trimmed from the reads in order not to distort the
mapping results. The reads were mapped to the reference sequence (GenBank
7
8
accession Y18898) using the GS reference mapper software (Version 1.1.02.15,
Roche, Mannheim, Germany).
165
Construction of NDV recombinants: rNDV49 and rNDVGu
The plasmid pflNDV-1, expressing the full-length antigenome RNA of lentogenic NDV
vaccine strain Clone 30 (29), was used for cloning (Fig.1). Nucleotide modifications
were introduced according to a recently described attenuated NDV (18) using the
NotI-truncated pflNDV-1 (NA1) or a modified pUC-18 plasmid which contained the
170
3,899 bp NotI-BsiWI-fragment of pflNDV-1 (pUCAROG).
QuikChange II XL site
directed mutagenesis kit (Stratagene, Heidelberg, Germany) was used with
mutagenesis primers MPFD72YF/R for the truncated pflNDV-1, MPHNN115SF/R and
MPHNL229RF/R (MWG Biotech, Ebersberg, Germany, primers are given in Table 1)
for the pUC-18 plasmid to modify nucleotides encoding amino acids at position 72 of
175
the F protein (D to Y) , and at positions 115 (N to S) and 229 (L to R) of the HN
protein, resulting in NA1MUT and pUCAROGMUT, respectively. Afterwards, the
ApaI/NotI fragment and the NotI/BsiWI fragment of pflNDV-1 were substituted by the
corresponding modified fragment of NA1MUT and pUCAROGMUT, respectively,
resulting in the new full-length plasmid pflNDV49 (Figure 1A).
180
For generation of rNDVGu the full-length plasmid pflNDV-7, which is distinct from
pflNDV-1 (29) by deletion of artificial MluI-sites, was used as backbone for the
generation of the new full length plasmid with altered nucleotides corresponding to
the results of the updated sequence (alterations are given in Table 2). Nucleotides
were altered by site directed mutagenesis of plasmid DNA or RT-PCR of freshly
185
isolated RNA from wild type virus NDV Clone 30, followed by fragment substitution.
First, the P-, M- and F genes were adapted to the updated NDV Clone 30 sequence.
In detail, ApaI-NotI and NotI-SpeI fragments of pflNDV-7, containing nucleotides
8
9
which had to be altered (fragment I: nt 2,368, 3,667, 4,446; fragment II: nt 5,478)
were cloned into vector pGEM®-T Easy (Promega, Madison, USA) for a single site
190
directed mutagenesis (QickChange II XL muatagenesis kit, Stratagene) with given
primers (biomers.net GmbH, Ulm, Germany) (Table 1). The L-gene sequence was
modified in two steps. First, fragment III of NDV Clone 30 was amplified by RT-PCR
using freshly prepared RNA from allantoic fluid and primers P10AFLF and P14STUR
(Table 1) and cloned into pGEM®-T Easy. Second, nucleotides 13,852, 14,701 and
195
15,051 within the L gene were altered by mutagenesis with given primers (Table 1)
using the AflII-SacII fragment of pflNDV-7, resulting in a sequence that is in
correspondence to the updated NDV Clone 30 sequence (fragment IV). Fragments III
and IV were linked using the ApaI site of pGEM®-T Easy and the StuI site which is
available in fragment III as well as in fragment IV. The corresponding fragment of
200
pflNDV-7 was then substituted by fragments III and IV, using AflII- and SacII sites.
Finally, all fragments with nucleotide alterations were used for substitution of the
corresponding regions within the pflNDV-7 genome, resulting in the new plasmid
pflNDVGu (Figure 1B).
Cells and eggs
205
Quail muscle cells (QM9) and primary chicken embryo fibroblasts (CEF) used for in
vitro characterization, as well as T7-BSR cells, which stably express phage T7 RNA
polymerase (6) used for transfection and recovery of virus, were provided by the cell
culture
collection
of
the
Friedrich-Loeffler-Institut
(Insel
Riems,
Germany).
Embryonated SPF chicken eggs for virus propagation, serial passaging and animal
210
experiments were purchased from Lohmann, Cuxhaven, Germany and incubated at
37°C and 55% humidity.
9
10
Viruses
NDV Clone 30 vaccine (NobilisTM) and velogenic challenge virus NDV strain Herts
215
33/56 were obtained from Intervet, Boxmeer, The Netherlands. Recombinant NDV
(rNDV) based on vaccine strain Clone 30 has already been described (26).
Recovery of recombinant viruses
Transfection and virus recovery were done essentially as described (35). Briefly,
220
pflNDV49 and rNDVGu were cotransfected with the helper plasmids pCiteNP, pCiteP
and pCiteL expressing the NP, P and L proteins of NDV Clone 30 into T7-BSR cells
using Lipofectamin 2000 (Invitrogen, Karlsruhe, Germany) at a DNA:lipofectamin
ratio of 1:1,5 (µg:µl) following the manufacturer’s instruction. Cells were split 1:2 24 h
after transfection and further incubated for 48 h. Three days after transfection,
225
supernatant was harvested and inoculated into the allantoic cavity of 9- to 11-day-old
embryonated SPF chicken eggs. After 4 to 5 days of incubation, presence of the
virus in allantoic fluid was confirmed by hemagglutination test with chicken
erythrocytes and, after infection of QM9 cells with harvested allantoic fluid, by indirect
immunofluorescence using a polyclonal rabbit anti-NDV serum.
230
Indirect immunofluorescence (IFA)
Infected cells were fixed with acetone/methanol (1:1). Detection of NDV was done by
IFA using monoclonal antibody HN-10 (36) directed against NDV HN protein and
FITC-conjugated goat anti-mouse IgG F(ab)2 (Dako, Glostrup, Denmark) or NDV
235
hyperimmune serum and FITC-conjugated goat anti-rabbit (Sifin, Berlin, Germany).
10
11
Virus passaging and verification of altered sequences
Recombinant viruses were passaged ten times in embryonated SPF chicken eggs.
To this end, 9- to 11-day-old SPF chicken eggs were inoculated with an adequate
240
dilution of allantoic fluid of the previous passage. Three to four days after injection
into the allantoic cavity and incubation at 37 °C/5 5 % humidity, allantoic fluid was
harvested and examined for the presence of virus by hemagglutination test according
to the standard procedure described in the Commission of the European Community
Council Directive (CEC). Virus harvested after the second egg passage was used for
245
characterization. Viral titres were assessed as tissue culture infectious doses
(TCID50/ml) on QM9 cells. To verify presence of the mutations, viral RNA was
prepared from allantoic fluid of the second and tenth egg passage using Trizol
reagents (Invitrogen). One-Step-RT PCR (Qiagen, Hilden, Germany) with primers
which enclosed the altered sequences was carried out and PCR products were
250
directly sequenced with specific primers to confirm the alterations. Sequences of
primers are available on request.
Western Blot analyses
CEF cells were infected at a multiplicity of infection (moi) of 5, and cell lysates were
255
harvested 48 h p.i. Viral proteins were separated under denaturing conditions in a
11% sodium dodecyl sulphate (SDS) polyacrylamide gel, transferred to a
nitrocellulose membrane, and incubated with rabbit anti-NDV-F serum, which had
been prepared by inoculation of rabbits with a vaccinia recombinant expressing NDV
F essentially as already described for the generation of a rabbit anti-NDV-HN serum
260
(32). Subsequently, the membrane was incubated with peroxidase (POD) labelled
anti-rabbit antibodies (Dianova, Hamburg, Germany) after thorough washing. Binding
of POD labelled antibodies was detected by chemiluminescence with SuperSignal
11
12
West Pico Chemiluminescence Substrate (Pierce, Rockford, USA) on X-ray films
(Hyperfilm MP, Amersham Bioscience). Thereafter, the nitrocellulose was placed in
265
stripping buffer (25 mM Glycine-HCl pH 2.0, 1 % SDS), washed and incubated with
the rabbit anti-NDV-HN serum and POD labelled anti-rabbit antibodies followed by
detection. After another stripping step, proteins were detected after incubation with a
rabbit anti-NDV serum by chemiluminescence as described above.
270
Kinetics of replication
QM9- and CEF cells cultured in 24-well plates were infected with NDV Clone 30,
rNDV and rNDV49 at a moi of 0.1 (QM9) or 0.01 (CEF) and incubated at 37°C and
3% CO2 atmosphere. The inoculum was removed forty minutes after infection. Cells
were washed twice and overlaid with fresh medium. QM9 cells were additionally
275
treated with citrate buffer, pH 3.0, for 2 min to inactivate non-penetrated virus before
the fresh medium overlay. This treatment was not tolerated by CEFs. Cell
supernatants were harvested and frozen at the indicated time points in two
independent experiments. After thawing of the frozen samples, virus titres were
determined on QM 9 cells by indirect immunofluorescence using rabbit-anti NDV
280
serum and FITC conjugated anti-rabbit IgG (Sifin, Berlin, Germany).
Determination of mean death time (MDT)
Mean death time was evaluated according to the protocol given by Alexander (3).
Briefly, 100 µl of tenfold dilution between 10-3 and 10-10 of infectious allantoic fluid in
285
sterile saline were inoculated into the allantoic cavity of each of five 10-day old
embryonated SPF chicken eggs and incubated at 37°C. The remaining virus dilutions
were retained at 4 °C and 100 µl of each dilution w ere used for inoculation of another
five eggs 8 hours later. Each egg was examined twice daily for 7 days and any
12
13
embryo death was recorded. The minimum lethal dose was determined as the
290
highest virus dilution that causes death of all inoculated embryos. The MDT is the
mean time in hours to kill each embryo at the dose at which all embryos were killed.
Characterization of recombinant virus in vivo
The MDT and the intracerebral pathogenicity index (ICPI) were determined as
295
described (3, 22) to assess the pathogenicity of recombinant viruses in embryonated
SPF chicken eggs or SPF chickens, respectively.
In ovo vaccination
All animal experiments were conducted with White Leghorn chickens hatched from
300
SPF eggs (Lohmann Tierzucht, Cuxhaven, Germany) in accordance with German
animal rights legislation (M-V/TSD/7221.3-1.1-087/10). Groups of 30 SPF eggs each
were incubated at 38.5°C and 60% humidity until day 18 and subsequently, until
hatching at 37.5°C and 85% humidity. At day 18 of i ncubation embryonated eggs
were inoculated into the allantoic cavity with 104 EID50 of rNDV, rNDV49, rNDVGu or
305
wild type NDV Clone 30, respectively. At the same time, groups of 30 eggs each
were inoculated with 0.2 ml isotonic NaCl solution (mock) and were hatched together
with the respective vaccine group in the same incubator at the same time, serving as
contact controls (sentinel). Subsequently, hatchability was calculated as percentage
of hatched chickens from in ovo vaccinated groups. Control eggs were incubated
310
without inoculation and hatched at a separate location. The presence of vaccine virus
was tested by taking oropharyngeal swab samples at day one from 10 randomly
selected animals of each group and analyzed by a NDV NP gene-specific real time
RT-PCR (RT-qPCR). Subsequently, 15 animals of each vaccine group were housed
together with 15 chicks of the respective mock inoculated sentinel group in positive
13
14
315
pressure HEPA filtered isolation unit (IM1500, Montair Andersen, The Netherlands)
within S3 facilities. Animals were inspected daily for clinical signs and mortality and at
day 21 post hatch 10 randomly selected chickens from each group were challenged
intramuscularly with 106 EID50 of the velogenic NDV strain Herts 33/56 according to
the recommendation by the European Pharmacopoeia (11).
320
NP gene-specific RT-qPCR
RNA from swab samples was extracted with the QiAmp viral RNA mini kit (Qiagen)
according to manufacturer’s instructions and subsequently tested with TaqMan onestep RT-qPCR assay targeting the NDV NP gene, using the SuperScript III One-step
325
RT-PCR kit with Platinum Taq DNA polymerase (Invitrogen) on a MX3000P RealTime PCR System (Stratagene). In all tests, negative RNA preparation controls, and
negative as well as positive RT-PCR controls were included. Reactions were run in a
volume
of
25
µl,
containing
20pmol
primers
(NDVnp1066F:
5´-
GACAGYGACCAGATGAGCTT-3´; NDVnp1231R: 5´-CCTGAGCCTGAGCRTACTC330
3´) and 4 pmol of a dual-labeled 5’-nuclease (TaqMan) probe featuring FAM as
fluorophore at the 5’- terminus and BHQ1 as quencher at the 3’- terminus (5´-[FAM]ACATCATTYTGGMGACT-[BHQ1]-3´) containing locked nucleic acids (bold letters).
Reaction conditions were 30 min at 50°C for reverse transcription, followed by 15 min
at 95°C and 42 cycles of 30 s at 95°C for denaturat ion, 30 s at 55°C for primer
335
annealing and 30 s at 72°C for elongation. Fluoresc ence values were measured at
the end of the annealing step of each cycle.
Statistics
For the comparison of HI-titers and weights, appropriate Wilcoxon-tests were applied.
340
The analysis was performed using R version 2.8.1 (http://www.R-project.org) with
14
15
package exactRankTests). Box plots were drawn using Sigma Plot, Version 11;
Systat Software Inc.
Results
345
Determination of parental NDV Clone 30 sequence
Two DNA libraries, either from RNA of purified virions (library 1) or from RNA directly
recovered from allantoic fluid harvested from infected SPF chicken eggs (library 2),
were prepared for deep sequencing of NDV Clone 30. The sequencing yielded a total
of 1.108.923 nucleotides (11.609 reads) for library 1 and 339.580 nucleotides (2.245
350
reads) for library 2. Mapping the reads along the reference sequence that has been
obtained by Sanger sequencing identified 14 and 11 nucleotide differences within
library 1 and library 2, respectively. Five nucleotides of library 1 and two nucleotides
of library 2 had only minor reads and were not considered further. Consequently,
nine prominent alterations compared to Sanger sequencing remained (Table 2)
355
which resulted in 4 alteration of the amino acid sequence of the P protein (one), the F
protein (one), and the L protein (two).
Generation of recombinant NDV49 and rNDVGu
Based on the recombinant full-length plasmid pflNDV-1 of Clone 30 (29) two new
360
plasmids pflNDV49 and pflNDVGu were constructed in a multi-step cloning process.
In the F protein gene of pflNDV49 nucleotides 4,757 and 4,759 were altered from G
to T and from T to C, resulting in a modification of amino acid 72 from aspartic acid
(D) to tyrosine (Y). Amino acids 115 and 229 in the HN protein were altered from
asparagine (N) to serine (S) and from leucine (L) to arginine (R), respectively, by
365
mutation of nt 6,754-6,756 from AAT to TCC and of nt 7,096-7,098 from CTG to
AGA.
These mutations were introduced based on results which showed an
15
16
association of these mutations with attenuation of NDV for in vivo vaccination (18).
The plasmid pflNDVGu possesses all alterations according to the new established
NDV Clone 30 sequence, resulting in the appropriate amino acid modification within
370
the P, F, and L proteins (Table 2).
The corresponding recombinant virus was rescued after cotransfection of the fulllength plasmid with helper plasmids into T7-BSR cells, followed by propagation in
embryonated SPF chicken eggs as already described (29). Presence of the
modifications in the NDV genome was confirmed by amplification of the respective
375
genome regions and direct sequencing of the PCR product of the second as well as
of the tenth virus passage. Expression of NDV specific proteins was analyzed by
indirect immunofluorescence (data not shown) and western blot analyses (Figure 2)
using monospecific anti-NDV F- and HN sera, and NDV hyperimmune serum
demonstrating, as expected, no differences of protein pattern.
380
Characterization of generated recombinant virus
Replication of rNDV49 and rNDVGu in CEF, as well as, in QM9 cells was
comparable to the replication of parental NDV Clone 30 and rNDV. All viruses
replicated in CEF to final titres of 105-106 TCID50/ml, whereas no virus propagation
385
was detected after infection of QM9 cells (Figure 3) as expected for lentogenic NDV
strains.
To analyze, whether the introduced mutations modified virulence, MDT and ICPI of
NDV Clone 30, rNDV, rNDV49, and rNDVGu were determined. Both MDT and ICPI
(Table 3) were typical for a lentogenic NDV, demonstrating that the rNDV49 did not
390
become more virulent after alteration of the genome sequence. In contrast, the ICPI
of rNDVGu is higher than that of rNDV and rNDV49 but lower than the ICPI of the
parental NDV Clone 30 (Table 3).
16
17
In ovo vaccination
395
Recombinant viruses rNDV, rNDV49 and rNDVGu as well as vaccine strain NDV
Clone 30 were subsequently used for in ovo three days before hatch. The
hatchability of groups inoculated with recombinant viruses was lower (53 %-73 %)
than of most mock-inoculated control groups (above 80 %). Only the mock inoculated
control group to Clone 30 had a lower hatch rate comparable to the Clone 30
400
inoculated group (53 %) (Table 4). Virus infection of hatched chickens of inoculated
eggs was verified by RT-qPCR.
Chickens which had been hatched from mock
inoculated eggs, housed together with chickens from rNDVGu (1 out of 10) and NDV
Clone 30 (4 out of 10) infected eggs also showed presence of virus (Table 5). Major
differences between groups became evident comparing the 21 day survival rate.
405
Whereas only one of the animals vaccinated with NDV Clone 30 survived for 21 days
after hatch (p<0.001), survival rates of groups vaccinated with rNDVs varied between
80 % (rNDV), 53.8 % (rNDV49) and 40 % (rNDVGu) respectively. By comparison, the
groups of mock infected chicks, serving as sentinels, had survival rates up to 100 %
(rNDV/mock), but as low as 60 % when co-housed with NDV Clone 30 infected eggs
410
(Table 5). Impact on the development of the chickens by in ovo vaccination becomes
manifest by comparison of the weight of the animals before challenge (Fig. 4). A
significantly lower weight compared to the control group was evident for all
vaccinated groups and interestingly, also for the Clone30/mock - as well as
rNDV/mock -, and rNDV49/mock-infected sentinel groups (Fig. 4). Comparing
415
vaccinated and mock infected sentinel groups only the weight of rNDVGu/mock show
a tendency (p=0.01869) to be higher than rNDVGu, but by multiple analyses this
difference did not prove to be significant. With respect to antibody response
measured by hemagglutination inhibition (HI) (7) at day 21 post hatch, all animals
17
18
from the vaccinated groups tested seropositive, with highest antibody titer in the
420
rNDVGu inoculated animals (28.5±1.5). Also the one chicken from the Clone 30
inoculated group, surviving the 21 day observation period, exhibits a high antibody
titer (210). Interestingly, also the majority of animals from the mock infected sentinel
group tested seropositive (Fig. 5), highest antibody titer was detected in the group
Clone30/mock (27.6±0.7), followed by rNDVGu/mock (25.9±0.9), that both had significant
425
higher antibody titers than rNDV/mock (23.8±1.2), and rNDV49/mock (23.6±1.2).group
(26.7±1.4). However, antibody titers of mock infected sentinel animals are significant
lower than of the respective vaccinated groups. Irrespective of the antibody level, the
vaccinated as well as the mock infected contact groups were protected after
challenge with a virulent NDV (Herts33), whereas all non-vaccinated chickens died
430
within two days after challenge infection.
Discussion
In ovo vaccination was hampered in the past due to residual virulence of naturally
occurring NDV strains. Since the advent of reverse genetics for NDV it is possible to
specifically alter the NDV genome and, thus, develop viruses with tailored properties
435
(25, 30) that consist of defined genetic material. Here, we investigated, whether point
mutations within the F- and HN protein of an in vitro escape mutant of NDV La Sota
vaccine strain are responsible for its observed attenuation (18). To this end,
recombinant NDVs (rNDV49, rNDVGu) were generated with specific alterations
compared to recombinant NDV Clone 30 (29). In vitro replication, ICPI or MDT of
440
rNDV 49 and rNDVGu were comparable to rNDV (29). Both newly generated rNDVs
showed a similar electrophoretic protein profile and replicated well in CEF, but not in
QM9 cells. Replication properties are in agreement with earlier observations for NDV
with a monobasic amino acid sequence at the cleavage site of the F protein (30). The
recombinant NDVs (rNDV, rNDV49, and rNDVGu), as well as wild type NDV Clone
18
19
445
30 were lentogenic with a MDT > 90 h. However, slight differences in virulence
became apparent, resulting in a ranking of viruses NDV Clone 30 > rNDVGu > rNDV
~ rNDV49 with decreasing virulence. This finding coincides with the ICPI data and
the survival rate of chickens after in ovo vaccination.
Surprisingly, rNDVGu with restriction of one defined sequence resulted in a
450
decreased virulence compared to vaccine strain Clone 30. Even NDV Clone 30 was
derived from NDV strain La Sota as a biological clone, it is feasible that minor
species might still be included that are not reflected by genome sequencing,
considering only prominent alterations in comparison to reference sequence.
However, these minor species can possibly influence pathogenicity of the virus.
455
Additional attenuation was observed for rNDV, that differ in four amino acid
alterations in which one is in the P protein and two within the L protein. Therefore,
two proteins of the ribonucleoprotein (RNP) complex are altered and which may be
responsible for the observed difference in virulence. This finding matches with results
of Dortmans et al. (12) who found that the activity of the RNP complex is directly
460
related to virulence and that point mutation within the P and L protein can result in
alteration of virulence (13).
The attenuation of rNDV and rNDV 49 was confirmed after in ovo vaccination by a
higher survival rate of hatched chickens. However, both recombinant viruses are not
465
yet sufficiently attenuated for use as in ovo vaccine. Compared to previous
experiments (20), using 105 EID50/animal, reduction of infectious dose to
104EID50/animal improved hatchability considerably from 7 out of 30 to up to 22 and
16 out of 30. Nevertheless, hatchability after in ovo inoculation with recombinant
NDVs is still reduced compared to mock infected eggs. Even more dramatic is the
470
impact on the health status of the hatched chicken with reduced survival rates and
19
20
impaired growth of the chickens with some of them dwarfed. Interestingly, even from
mock infected eggs that served as sentinels, 6 out of 15 chicks of the NDV Clone
30/mock group died from infection transmitted by the virus-inoculated animals,
whereas the sentinel group to recombinant NDVs had survival rates between 85,7 %
475
to 100 %.
Concerning immunogenicity, the order of viruses was analog to the virulence. 21
days post hatch, the only chicken that survived NDV Clone 30 in ovo vaccination had
the highest HI-titer of 210. Moreover, the antibody titers of rNDVGu inoculated
chickens were significantly higher than those which received rNDV or rNDV49. A
480
comparable ranking in immunogenicity was observed for respective mock inoculated
sentinel groups. Upon challenge, all chickens were protected from highly pathogenic
NDV, independent from the vaccine virus. Furthermore, all chickens from mock
infected eggs that hatched and were raised together with vaccinated chickens were
protected from challenge infection, indicating efficient transmission of vaccine virus
485
by chickens hatched from vaccinated eggs.
Our results are in good agreement with previous data, showing that NDV vaccine
strains are pathogenic to chickens when inoculated in ovo (1, 2, 20). By site directed
mutagenesis recombinant viruses could be generated that exhibit a reduced
pathogenicity after in ovo vaccination with 104 EID50. However, none of the
490
recombinant NDV described here is sufficiently qualified for an in ovo vaccine. In
addition, our experiments demonstrate that, despite similar ICPI values, slight
differences in virulence of different lentogenic NDV can be distinguished after in ovo
application. Furthermore, investigation of rNDV49 indicated that the suggested
specific alteration in F and HN (18), actually did not further attenuate rNDV.
20
21
495
Generally, regardless whether vaccines are applied after hatching or in ovo, our
results underscore that a well defined balance between immunogenicity and
virulence is critical for success of vaccination.
500
Acknowledgement
We thank Martina Lange, Cornelia Illing and Katja Hartwig for excellent technical
assistance.
505
21
22
Figure legends
510
Figure 1:
Schematic presentation of genomes of new generated recombinant
NDV based on pflNDV-1(2929). Sites of restrictions enzymes which
were used for different cloning steps are given.
A) pflNDV49
B) pflNDVGu.
515
Figure 2:
Western blot analyses. CEF were infected at a moi of 5. Lysates of
infected cells were harvested 48 h p.i. and analyzed by Western blotting
using three different antibodies (α−NDV F, α−NDV HN, and α−NDV) as
described in material and methods.
520
Figure 3:
Replication kinetics of recombinant NDV (rNDV), rNDV49, rNDVGu, and
wild-type NDV Clone 30
A) in chicken embryofibroblast cell (CEF) infected with moi 0.01
B) in quail muscle cells (QM9) infected with moi 0.1
525
Figure 4:
Body mass of in ovo vaccinated and mock vaccinated sentinel chickens
Body weight of chicken was determined before challenge i.e. 21 days
post hatch. Labels above box plots indicate significant differences (p<
0.00833) of in ovo vaccinated chickens to the control animals (A) or
530
between mock vaccinated sentinels (B) to rNDVGu/mock group.
Figure 5:
Antibody response of in ovo vaccinated chicken before challenge
infection with virulent NDV.
22
23
535
Serum samples from chickens immunized with respective vaccines (A)
and mock vaccinated sentinel birds (B) collected at the day of challenge
i.e. 21 post hatch were tested for NDV specific antibodies by HI. Labels
above box plots indicate significant differences (p< 0.00833) between
respective vaccinated groups, to the control animals (* A) or to Clone30
540
vaccinated animals (*, B). Significant differences in between vaccinated
groups or mock infected groups are indicated by (a) or (b), whereas
differences (p<0.01667) between vaccinated and mock infected groups
are indicated by (m).
545
23
24
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28
* According to GenBank Accession number. Y 18898
11,297-11,318 5’-tgc aac gac cca tac tct ttc`-3’
12,919-12,900 5’-att gta gct gca atg ttg g-3’
P10AFLF
P14STUR
Sequence
5'-ccc gaa tct gcc caa gta caa gga ggc atg tgc-3'
5'-ctc tct ctt atc aga ttt ccg gag ctg caa aca aca gtg gg-3'
5'-ctc tgc gtt cca tca aca gag acg aca ccc aaa atc gg-3
5'-agt caa ccc agt cgc gga aac agt cag gaa aga ccg cag aac-3’
5’-gca act aat act gag aga atg gtt ttc tca gta gtg cag gc-3’
5’-cac cca gat cat cat gac aca aaa aac taa tct gtc ttg att att-3’
5’-cct tat ccg taa gca caa cca ggg gat ttg cct cgg cac ttg-3’
5’-cga ccc caa ctc agt ttt tga att cgg ttg ttt ata gga atc-3’
5’-aca tca ctt aaa cag tgc acg aga cag atc cta gag gtt aca-3’
5’-gcc aat tgt att ctt gtt gat tta atc ata tta tgt tag aaaaaa-3’
4,741-4,773
6,737-6,777
7,079-7,116
2,368-2,409
3,667-3,707
4,446-4,490
5,478-5,519
13,852-13,893
14,701-14,742
15,051-15,095
Binding position*
Sequences of primers used for mutagenesis and RT-PCR
MPFD72YF
MPHNN115SF
MPHNL229RF
MP2368F
MP3667F
MP4446F
MP5478F
MP13852F
MP14701F
MP15051F
name
Table 1:
RT-PCR
RT-PCR
mutagenesis
mutagenesis
mutagenesis
mutagenesis
mutagenesis
mutagenesis
mutagenesis
mutagenesis
mutagenesis
mutagenesis
application
Table 2: Sequence differences between NDV Clone 30 (GenBank Accession.number
Y18898) and their recombinants
nucleotide
number
Y18898
rNDVGu
rNDV
rNDV 49
region
Resulting
alteration
76
79
T
A
T
A
A
C
A
C
ncr NP gene
ncr NP gene
Mlu I site
2,368
T
A
T
T
P gene
L to Q
3,667
G
A
G
G
M gene
silent
4,446
C
T
C
C
ncr M gene
4,757
4,759
5,478
G
T
A
G
T
G
G
T
A
T
C
A
F gene
F gene
F gene
6,754
6,755
6,756
7,096
7,097
7,098
A
A
T
C
T
G
A
A
T
C
T
G
A
A
T
C
T
G
T
C
C
A
G
A
HN gene
HN gene
HN gene
HN gene
HN gene
HN gene
11,657
12,567
13,852
14,701
G
C
A
G
A
T
G
A
G
C
A
G
G
C
A
G
L gene
L gene
L gene
L gene
15,039
15,041
15,042
15,051
T
T
T
T
T
T
T
A
A
G
C
T
A
G
C
T
ncr L gene
ncr L gene
ncr L gene
ncr L gene
D to Y
K to R
N to S
L to R
G to R
T to I
silent
Mlu I site
Table 3
Mean death time (MDT) and intracerebral pathogenicity index (ICPI) of
investigated viruses.
Virus
Mean Death Time (MDT)
ICPI
rNDV
127 h
0.01
rNDV49
116 h
0.09
rNDVGu
105 h
0.125
97 h
0.29
NDV Clone 30
Table 4: Hatch rate of inoculated chicken eggs
rNDV
rNDV/mock
rNDV49
rNDV49/mock
rNDVGu
rNDVGu/mock
NDV clone 30
NDV clone 30/mock
inoculated
30
30
30
30
30
30
30
30
hatched hatchability hatch rate
22
73,3 %
84,6 %
26
86,7 %
16
53,3 %
64,0 %
25
83,3 %
18
60,0 %
72,0 %
25
83,3 %
16
53,3 %
100,0 %
16
53,3 %
hatchability: hatched chicks in relation to inoculated eggs
hatch rate: compares vaccinated animals in relation to mock inoculated sentinel birds
Table 5. Rate of infection, survival rate, and protection rate of hatched chicks
Rate of infection*
rNDV
rNDV/mock
rNDV49
rNDV49/mock
rNDVGu
rNDVGu/mock
NDV Clone 30
NDVClone 30/mock
control
9/10
0/10
10/10
0/10
10/10
1/10
10/10
4/10
0/10
Survival rate
(day 21)
12/15
15/15
7/13#
12/14#
6/15
14/15
1/15
9/15
15/15
(80 %)
(100 %)
(53,8 %)
(85,7 %)
(40 %)
(93,3 %)
(6,7 %)
(60 %)
(100 %)
Protection after
challenge infection
10/10
10/10
8/8
10/10
6/6
10/10
1/1
9/9
0/10
* infection was tested by RT-qPCR, ct <35 were considered positive
# chickens with straddling legs were euthanized, reducing the number of birds per
group
MluI
pflNDVGu
pflNDV-1
MluI
Figure 1B
pflNDV49
pflNDV-1
MluI
Figure 1A
NP
NP
NP
NP
P
ApaI
P
2368
P
ApaI
P
ApaI
M
M
3667
I
NotI
F
F
NotI
4446
F
F
5478
D 72 Y (GAT TAC)
M
M
NotI
II
BsiWI
HN
HN
SpeI
L 229 R (CTG AGA)
N 115 S (AAT TCC)
HN
HN
BsiWI
AflII
L
L
III
StuI
11657 12567
L
L
IV
13852
vector
X8δT
NotI
vector
X8δT
SacII
MluI NotI
14701 15051
MluI
MluI
V4
ne 9
g.
co
nt
ne
ro
l1
g.
co
nt
ro
l2
rN
D
u
rN
D
V
G
V
rN
D
N
D
V
C
lo
ne
30
Figure 2
100
70
55
F0
F1
40
35
α-NDV F
170
25
10
F2
170
HN
α-NDV HN
100
70
55
40
35
25
10
170
100
55
40
HN
F0
F1,NP,P
M
α-NDV
70
35
25
10
F2
Figure 3
log10TCID50/ml
0
0
2
4
6
8
CEF
Clone 30
Clone 30
rNDVGu
rNDV49
rNDVGu
rNDV
48
rNDV49
time p.i. (h)
rNDV
24
QM 9
72
Figure 4
Figure 5
12
m
a
*
10
12 / 12
m
m
b
a,b
*
*
B
A
a,b
9/9
6/6
HI-titer (log 2)
8
6/6
6
4
*
a
14 / 14
b
*
*
13 / 15
10 / 12
0 / 20
2
0
l
tro
n
Co
49
DV
rN
r
V
ND
Gu
k
k
0/m
r
e3
on
Cl
k
oc
oc
V
ND
rN
m
V/
4
D
rN
k
oc
9/m
DV
G
m
u/
rN
DV
oc
VIII. Zusammenfassung der Dissertation zum Thema:
„Rekombinante Newcastle Disease Viren für die Entwicklung von
Markervakzinen- Möglichkeit der simultanen Impfung gegen die Newcastle
Krankheit und die Aviäre Influenza“
vorgelegt von
Kristina Ramp
Zwei bedeutende Erkrankungen des Wirtschaftsgeflügels, die weltweit zu hohen
Verlusten führen können, sind die Newcastle Krankheit und die aviäre Influenza. Mit
der Verfügbarkeit des reversen genetischen Systems für das Newcastle Disease
Virus (NDV) wurde es möglich, NDV als Vektor für einzelne Proteine, z.B. des
aviären Influenzavirus (AIV) zu nutzen und so Viren zu generieren, die als Impfvirus
gegen beide Krankheiten einen Schutz vermitteln.
Um zu untersuchen, ob die Insertionsposition eines Transgens in das NDV-Genom
einen Einfluss auf die Höhe der Expression des Fremdproteins hat, wurde das
Hämagglutinin-Protein (HA)-Gen eines hochpathogenen (HP) AIV Isolates in die
intergene Region zwischen den Genen für das Phosphoprotein (P) und das
Matrixprotein (M), M und das Fusionsprotein (F) oder F und des HämagglutininNeuraminidase Proteins (HN) des attenuierten NDV Clone 30 inseriert. Zusätzlich
wurden Virusrekombinanten untersucht, die ein HPAIV Neuraminidase (NA)-Gen
zwischen den NDV Genen F und HN alleine oder in Kombination mit dem HA im
Insertionsort zwischen NDV P und M trugen. Die Quantifizierung der Expression der
HA- und NA-spezifischen mRNA wurde mit Hilfe der Northern Blot Analyse
durchgeführt. Die HA-Proteine wurden zusätzlich durch die Massenspektrometrie
identifiziert und durch die SILAC (stable isotope labelling with amino acids in cell
culture)-Technik quantifiziert. Dabei zeigte sich, dass die HA Expression auf
Transkript- und Proteinebene am höchsten war, wenn das HA-Gen zwischen NDV F
und HN inseriert wurde, sich jedoch nur moderat von den anderen untersuchten
Insertionsorten unterschied. Daraus kann gefolgert werden, dass die Wahl der
intergenen Region zum Einbau des Fremdgens im Genomabschnitt zwischen P und
124 HN nur einen geringfügigen Einfluss auf dessen Expression hat. Durch die simultane
Integration von HA und NA in das NDV-Genom konnte darüber hinaus gezeigt
werden,
dass
NDV
zwei
Transgene
und
damit
eine
Vergrößerung
des
Gesamtgenoms um über 3 kb toleriert und dabei effizient repliziert
Zusätzlich wurde untersucht, ob die gleichzeitige Insertion des NA- und HA-Gens zu
einer Steigerung der Immunantwort und folglich zu einem verbesserten Schutz vor
einer
hoch
virulenten
aviären
Influenzainfektion
führt.
Dazu
wurden
drei
verschiedene NDV/AIV Rekombinanten generiert, bei denen das HA-Gen zwischen
NDV P und M und/oder das NA-Gen zwischen NDV F und HN inseriert wurden. Die
Schutzwirkung der Rekombinanten wurde gegen drei verschiedene HPAIV des H5
Subtyps in Hühnern bestimmt. Hierbei zeigte sich, dass die Schutzwirkung vor einer
letalen HPAIV-Infektion durch die Insertion beider AIV Oberflächenproteingene in das
NDV Genom nicht besser war als bei alleiniger AIV HA Expression. Daraus kann
geschlossen werden, dass die NA-Antikörper nur einen geringen Beitrag bei der
Abwehr einer HPAIV Infektion leisten.
Im dritten Teil dieser Arbeit wurden durch die Sequenzierung des Gesamtgenoms
des lentogenen Impfvirus Clone 30 mit Hilfe des Genome Sequenzers (Roche) neun
Sequenzunterschiede im Vergleich zum ursprünglichen rekombinanten NDV (rNDV)
detektiert. Durch Mutagenese der betreffenden Nukleotide konnte ein NDV generiert
werden, das in seiner Sequenz dem Wildtypvirus Clone 30 entspricht. Die Virulenz
und Eignung als in ovo Impfvirus des resultierenden Virus (rNDVGu) wurde im
Vergleich zu den Virusrekombinanten rNDV, rNDV49, das durch einzelne
Punktmutationen im F- und HN-Gen charakterisiert ist, und dem Wildtypvirus NDV
Clone 30 untersucht. Bei der Bestimmung der Virulenz durch Ermittlung des
intracerebalen Pathogenitätsindex (ICPI) konnte eine Reihung der Viren mit
abnehmender Virulenz vorgenommen werden: NDV Clone 30 > rNDVGu > rNDV ~
rNDV49. Die geringere Virulenz des rNDVGu im Vergleich zum Ausgangsvirus Clone
30 deutet auf das Vorhandensein von Unterspezies in dem plaquegereinigtem NDV
Clone 30 und die daraus resultierende Beeinflussung der Virulenzeigenschaften hin.
Nach in ovo Applikation der drei hergestellten rekombinanten NDV und des
Wildtypvirus NDV Clone 30 konnte gezeigt werden, dass das Wildtypvirus für
Hühnerembryonen eine höhere Virulenz besitzt als die Virusrekombinanten. Die
geschlüpften Küken waren vor einer Infektion mit hochpathogenem NDV geschützt,
125 jedoch entsprachen die Schlupfraten nicht den Anforderungen für eine in ovo
Vakzine. Diese Untersuchungen zeigten aber auch, dass mit Hilfe der in ovo
Applikation eine deutlichere Unterscheidung der Restvirulenz lentogener NDV mit
ähnlichen ICPI-Werten möglich ist.
126 IX. Summary
„Recombinant Newcastle Disease Viruses for the development of marker
vaccines- a possibility to vaccinate simultaneously against Newcastle disease
and Avian influenza”
Newcastle Disease and Avian Influenza are important poultry diseases, which cause
high losses worldwide. With the availability of a reverse genetics system for
Newcastle disease virus (NDV), it was possible to use NDV as a vector for the
expression of foreign proteins, for example from avian influenza virus (AIV), to
generate bivalent vaccines which convey protection against both, NDV and AIV.
To analyze whether the insertion site of a heterologous transgene in the NDV
genome influences the level of expression of the foreign protein, the hemagglutinin
protein (HA)-gene of a highly pathogenic (HP) AIV was inserted into the intergenic
regions between the genes encoding the phoshoprotein (P) and the matrix protein
(M), M and the fusion protein (F), or F and the hemagglutinin-neuraminidase protein
(HN) of the attenuated NDV strain Clone 30. Additionally, the HPAIV neuraminidase
(NA)-gene was inserted between the NDV F and HN genes alone or in combination
with the HA gene located between the NDV P and M genes. The expression of HAand NA-specific mRNA was quantified by Northern blot analysis. Expressed HA
proteins were identified by mass spectrometry and quantified by SILAC (stable
isotope labelling with amino acids in cell culture)-technique. The results show that
expression of mRNA and protein was highest, when the HA gene was inserted
between NDV F and HN. However, the difference in comparison to other insertion
sites was only moderate. Therefore, it can be concluded that the location of the
intergenic NDV genome region for insertion of a foreign gene has only a minor
influence on the expression of the foreign gene. Moreover, by simultaneous
integration of HA and NA into the NDV genome it was demonstrated that NDV can
tolerate simultaneous insertion and expression of two transgenes, which did not
impair efficient viral replication despite the increase in genome size of more than 3 kb
.
127 It was also analyzed whether the simultaneous transgenic expression of the AIV NAand HA-genes from an NDV vector would enhance the immune response, resulting in
a better protection against HPAI infection. Three different NDV/AIV recombinants
were generated which carry the HA gene between NDV P and M, and/or the NA gene
between NDV F and HN. The protective efficacy was determined in chickens against
three different HPAIV of subtype H5. The results demonstrate that concomitant
expression of both AIV surface glycoproteins from the NDV genome did not improve
the protective efficacy against lethal HPAIV infection beyond the level seen with
transgenic expression of only HA. Therefore, NA contributes only little to the
protection against HPAIV infection.
Whole genome next generation sequencing and sequence comparisons revealed
nine differences within the NDV Clone 30 genome sequence in comparison to
recombinant NDV (rNDV). Altered nucleotides in rNDV were modified by
mutagenesis, resulting in rNDVGu which exhibited a closer match with the sequence
of parental NDV Clone 30. Virus virulence as well as its usefulness as an in ovo
vaccine were investigated for rNDVGu in comparison to rNDV, rNDV49 which is
characterized by several point mutations within the F- and HN genes, and NDV Clone
30. The determination of virulence after intracerebral inoculation resulted in a ranking
of viruses with decreasing virulence in the order NDV Clone 30 > rNDVGu > rNDV ~
rNDV49. Differences in virulence between rNDVGu and its parental strain NDV Clone
30 indicated the possible existence of minor species in the plaque purified NDV
Clone 30 influencing pathogenicity. After in ovo application of the three generated
recombinant NDVs and parental NDV Clone 30, parental virus exhibited higher
virulence in chicken embryos than the recombinant viruses. Hatched chickens were
protected from highly pathogenic NDV. However, hatch rates were decreased
preventing use of the investigated viruses for in ovo vaccination. Nevertheless, the
studies demonstrate that slight differences in virulence of lentogenic NDV can be
distinguished after in ovo application.
128 X. Anhang
X.1. Publikationen
Inverse regulation of the interferon-gamma receptor and its signaling in human
endometrial stromal cells during decidualization.
Fluhr H, Ramp K, Krenzer S, Licht P, Zygmunt M
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gene within the Newcastle disease virus genome on HA expression
K. Ramp, M. Skiba, A. Karger, T.C. Mettenleiter and A. Römer-Oberdörfer
Journal of Virology (2011), 92, 355-360
Coexpression of avian influenza virus H5 and N1 by recombinant Newcastle
disease virus and the impact on immune response in chickens
K. Ramp, J. Veits, D. Deckers, M. Rudolf, C. Grund, T.C. Mettenleiter and A. RömerOberdörfer
Avian Diseases, 55(3):413-421.2011
Avian Diseases Digest, 6(3):e11-e12.
Pathogenicity and immunogenicity of different recombinant Newcastle disease
virus Clone 30 variants after in ovo vaccination
K.Ramp, E.Topfstedt, R.Wäckerlin, D.Höper, M.Ziller, T.C.Mettenleiter, C.Grund and
A.Römer-Oberdörfer
eingereicht bei Avian Diseases
129 X.1.1. Eigenanteil an den zur Dissertation eingereichten Publikationen
A.
Influence of insertion site of the avian influenza virus haemagglutinin (HA)
gene within the Newcastle disease virus genome on HA expression
K. Ramp, M. Skiba, A. Karger, T.C. Mettenleiter, and A. Römer-Oberdörfer
Journal of Virology (2011), 92, 355-360
Für diese Publikation war ich zusammen mit Frau Dr. Römer- Oberdörfer an der
Generierung der NDV/AIV Rekombinanten beteiligt. Weiterführend habe ich die
betreffenden
Rekombinanten
in
vitro
(Replikationskinetiken,
Western-Blot)
charakterisiert. Alle Arbeitsschritte zur Bestimmung der AIV H5/N1 mRNAExpression durch Northern-Blot-Analyse (Probenherstellung, Generierung der AIV
H5-, AIV N1- und NDV P- Sonde, Durchführung und Auswertung der Blots) wurden
von mir durchgeführt. Bei der Quantifizierung der H5-Proteinexpression mittels der
SILAC-Technik habe ich die Infektion der DF1 Zellen mit den betreffenden
Rekombinanten, sowie die Isolierung der Zellextrakte übernommen. Herr M.Skiba hat
die darauffolgenden Arbeitsschritte zur Identifizierung und Quantifizierung der H5Proteine mittel SILAC-Technik durchgeführt. Des Weiteren war ich an der Erstellung
des Manuskripts maßgeblich beteiligt.
B.
Coexpression of avian influenza virus H5 and N1 by recombinant Newcastle
disease virus and the impact on immune response in chickens
K. Ramp, J. Veits, D. Deckers, M. Rudolf, C. Grund, T.C. Mettenleiter and A. RömerOberdörfer
Avian Diseases, 55(3):413-421.2011
Avian Diseases Digest, 6(3):e11-e12.
Für diese Veröffentlichung war ich an der Generierung der AIV H5/N1
Rekombinanten beteiligt. Die in vitro Charakterisierungen (z.B. Replikationskinetik,
Western Blot) der verschiedenen Rekombinanten wurden von mir durchgeführt. Für
130 das Manuskript habe ich die Arbeitsversion erstellt und war an der Bearbeitung der
Endversion beteiligt.
C.
Pathogenicity and immunogenicity of different recombinant Newcastle disease
virus Clone 30 variants after in ovo vaccination
K.Ramp, E.Topfstedt, R.Wäckerlin, D.Höper, M.Ziller, T.C.Mettenleiter, C.Grund and
A.Römer-Oberdörfer
eingereicht bei Avian Diseases
Für diese Publikation wurde von mir, auf der Grundlage der detektierten
Sequenzunterschiede zwischen rNDV und Wildtyp NDV Clone 30, das neue
rekombinante Virus rNDVGu hergestellt. Dazu war es notwendig, einzelne
Genomabschnitte durch Mutagenese so zu verändern, das die resultierende
Sequenz
der
des
Wildtyp
NDV
Clone
30
entsprach.
Die
umfangreiche
Charakterisierung des rNDVGu ist von mir durchgeführt worden. An der Erstellung
des Manuskripts habe ich mitgewirkt.
131 X.2. Tagungsbeiträge
Characterization of recombinant Newcastle Disease Virus expressing H5
protein of Avian Influenza A H5N1 with a monobasic HA cleavage site.
Kristina Ramp, Christian Grund, Thomas C. Mettenleiter, and Angela RömerOberdörfer
19th Annual Meeting of the Society of Virology, 18.-21.März 2009, Leipzig, poster
presentation
5th Orthomyxovirus Reseach Conference, 9.-12.September 2009, Freiburg, poster
presentation
Development of an improved recombinant NDV Clone 30.
Kristina Ramp, Dirk Höper, Thomas C. Mettenleiter, and Angela Römer-Oberdörfer
International Negative Strand Virus Meeting, 21.-25.Juni 2010, Brügge, Belgien,
poster presentation
132 X.3. Eidesstattliche Erklärung
Hiermit erkläre ich, dass diese Arbeit bisher von mir weder an MathematischNaturwissenschaftlichen Fakultät der Ernst-Moritz-Arndt-Universität Greifswald noch
einer anderen wissenschaftlichen Einrichtung zum Zwecke der Promotion eingereicht
wurde.
Ferner erkläre ich, dass ich diese Arbeit selbstständig verfasst und keine anderen als
die darin angegebenen Hilfsmittel und Hilfen benutzt und keine Textabschnitte eines
Dritten ohne Kennzeichnung übernommen habe.
133 X.4. Danksagung
Mein besonderer Dank geht an Herr Prof. Dr. Dr. Thomas C. Mettenleiter für die
Überlassung des Themas, den interessanten Diskussionen und Ideen und der steten
Unterstützung bei der Fertigstellung dieser Arbeit.
Frau Dr. Angela Römer- Oberdörfer möchte ich für die exzellente Betreuung, den
fachlichen und privaten Gesprächen, sowie für die Geduld bei der Anfertigung dieser
Arbeit danken.
Frau Dr. Jutta Veits danke ich für die Durchführung der Tierversuche, sowie für die
hilfreichen Tipps bei den Northern Blot Analysen.
Ein großes Dankeschön an Dr. Christian Grund für die Realisierung der unzähligen
ICPI- Teste.
Dr. Axel Karger und Dr. Martin Skiba danke ich für die Einblicke in die SILACTechnik.
Sandra Warlich, Martina Lange und Katja Hartwig danke ich für das harmonische
Klima im Labor und den unzähligen lustigen Momenten. Ihr seid mir sehr ans Herz
gewachsen.
Allen Freunden danke ich für die schöne Zeit außerhalb des Labors.
Bennet und Axel danke ich für den seelischen und moralischen Beistand.
Ein großes Dankeschön gilt meinen Eltern für ihre andauernde Unterstützung und ihr
großes Vertrauen.
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